LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis L 220/1

KOMISIJAS REGULA (EK) Nr. 761/2009

(2009. gada 23. jūlijs),

ar kuru, pielāgojot tehnikas attīstībai, groza Regulu (EK) Nr. 440/2008 par testēšanas metožu noteikšanu saskaņā ar Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH)

(Dokuments attiecas uz EEZ)

EIROPAS KOPIENU KOMISIJA,

ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu,

ņemot vērā Eiropas Parlamenta un Padomes 2006. gada 18. decembra Regulu (EK) Nr. 1907/2006, kas attiecas uz ķimikāliju reģistrēšanu, vērtēšanu, licencēšanu un ierobežošanu (REACH), un ar kuru izveido Eiropas Ķimikāliju aģentūru, groza Direktīvu 1999/45/EK un atceļ Padomes Regulu (EEK) Nr. 793/93 un Komisijas Regulu (EK) Nr. 1488/94, kā arī Padomes Direktīvu 76/769/EEK un Komisijas Direktīvu 91/155/EEK, Direktīvu 93/67/EEK, Direktīvu 93/105/EK un Direktīvu 2000/21/EK (1), un jo īpaši tās 13. panta 3. punktu,

tā kā:

(1) Komisijas Regulā (EK) Nr. 440/2008 (2) ir noteiktas Regulas (EK) Nr. 1907/2006 piemērošanai izmantojamās testēšanas metodes vielu fizikāli ķīmisko īpašību, toksicitātes un ekotoksicitātes noteikšanai.

(2) Regula (EK) Nr. 440/2008 jāatjaunina, lai iekļautu tajā konkrētu testēšanas metožu izmaiņas un vairākas jaunas ESAO pieņemtas testēšanas metodes. Par šo priekšlikumu ir notikusi apspriešanās ar ieinteresētajām personām. Minētie grozījumi pielāgo attiecīgās metodes zinātnes un tehnikas attīstībai.

(3) Ir jāpārskata noteikumi par tvaika spiedienu, lai tajos iekļautu jauno efūzijas metodi.

(4) Ir jāpievieno jauna metode šķiedru vidējā svērtā ģeometriskā diametra mērīšanai.

(5) Ir lietderīgi papildināt Regulu (EK) Nr. 440/2008, iekļaujot tajā kā prioritāti jaunu in-vitro testēšanas metodi ādas kairinājuma noteikšanai, lai samazinātu izmēģinājumos izmantojamo dzīvnieku skaitu atbilstīgi Padomes 1986. gada 24. novembra Direktīvai 86/609/EEK par dalībvalstu normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz to dzīvnieku aizsardzību, kurus izmanto izmēģinājumos un citiem zinātniskiem mērķiem (3). Lai gan in-vitro testēšanas metode ādas kairinājuma noteikšanai joprojām tiek apspriesta ESAO, ir lietderīgi šajā izņēmuma gadījumā B.46. metodi iekļaut šajā regulā. B.46. metode ir jāatjaunina iespējami drīz, tiklīdz panākta vienošanās ESAO vai kļūst pieejama turpmāka informācija, kas pamato šādu pārskatīšanu.

(6) Noteikumi par aļģu augšanas kavēšanas testu ir jāpārskata, lai iekļautu tajos vēl citas sugas un panāktu atbilstību prasībām par bīstamības noteikšanu un ķīmisko vielu klasifikāciju.

(7) Ir jāpievieno jauna metode virszemes ūdeņu aerobās mineralizācijas noteikšanai ar biodegradācijas imitācijas testu un jauna metode Lemna ģints toksicitātes noteikšanai ar augšanas kavēšanas testu.

(8) Tāpēc attiecīgi jāgroza Regula (EK) Nr. 440/2008.

(9) Šajā regulā noteiktie pasākumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi atbilstīgi Regulas (EK) Nr. 1907/2006 133. pantam izveidotā komiteja,

IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.

1. pants

Regulas (EK) Nr. 440/2008 pielikumu groza šādi.

1. Pielikuma A daļu groza šādi: a) tās A.4. nodaļu aizstāj ar šīs regulas I pielikumā izklāstīto A.4. nodaļu; b) iekļauj šīs regulas II pielikumā izklāstīto A.22. nodaļu.

2. Pielikuma B daļu groza šādi: iekļauj šīs regulas III pielikumā izklāstīto B.46. nodaļu.

3. Pielikuma C daļu groza šādi: a) tās C.3. nodaļu aizstāj ar šīs regulas IV pielikumā izklāstīto C.3. nodaļu; b) iekļauj šīs regulas V un VI pielikumā izklāstīto C.25. un C.26. nodaļu.

2. pants

Šī regula stājas spēkā trešajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

Šī regula uzliek saistības kopumā un ir tieši piemērojama visās dalībvalstīs. Briselē, 2009. gada 23. jūlijā Komisijas vārdā – Komisijas loceklis Stavros DIMAS

(1) OV L 396, 30.12.2006., 1. lpp.

(2) OV L 142, 31.5.2008., 1. lpp.

(3) OV L 358, 18.12.1986., 1. lpp.

I PIELIKUMS A.4. TVAIKA SPIEDIENS 1. METODE Šī metode ir ekvivalenta OECD TG 104 (2004). 1.1. IEVADS Šajā A.4. metodes (1) pārstrādātajā versijā papildus ir iekļauta efūzijas metode – izotermiskā termogravimetrija, kas paredzēta tvaika spiediena noteikšanai vielām, kurām tas ir ļoti zems (līdz pat 10–10 Pa). Ņemot vērā vajadzību pēc noteikšanas metodēm, īpaši, lai noteiktu tvaika spiedienu vielām, kurām tas ir zems, tiek atkārtoti izvērtēti citi šie metodes paņēmieni izmantošanai citos spiediena intervālos. Termodinamiskā līdzsvara apstākļos tīras vielas tvaika spiediens ir atkarīgs tikai no temperatūras. Pamatprincipu aprakstu sk. (2)(3). Nevienu mērīšanas paņēmienu nevar izmantot visā tvaika spiedienu intervālā no mazāk kā 10–10 līdz 105 Pa. Šajā metodikā ir iekļautas astoņas tvaika spiediena mērīšanas metodes, kuras var izmantot dažādos tvaika spiediena intervālos. Metožu salīdzinājums, ņemot vērā to pielietojumu un mērījumu intervālu, dots 1. tabulā. Šīs metodes var izmantot tikai testēšanas apstākļos stabilu vielu tvaika spiediena noteikšanai. Ja šīs eksperimentālās metodes tehnisku iemeslu dēļ izmantot nevar, tvaika spiedienu var noteikt pēc aprēķina metodes, un ieteicamā aprēķinu metode ir aprakstīta pielikumā. 1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Vielas tvaika spiediens tiek definēts kā piesātināta tvaika spiediens virs cietas vai šķidras vielas. Jāizmanto SI sistēmas spiediena mērvienība, t. i., paskāls (Pa). Citas agrāk izmantotas mērvienības un sakarības starp tām ir šādas: 1 tors = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atm = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa SI sistēmas temperatūras mērvienība ir kelvins (K). Temperatūru no Celsija skalas grādiem kelvinos pārrēķina pēc šādas formulas: T = t + 273,15 kur T ir temperatūra kelvinos jeb termodinamiskā temperatūra un t ir temperatūra pēc Celsija. 1. tabula Mērīšanas metode Vielas Novērtētā atkārtojamība Novērtētā reproducējamība Ieteicamais intervāls Cietas vielas Šķidras vielas Dinamiskā metode ar zemu kušanas temp. Jā līdz 25 % no 1 līdz 5 % līdz 25 % no 1 līdz 5 % 103 Pa līdz 2 × 103 Pa 2 × 103 Pa līdz 105 Pa Statiskā metode Jā Jā no 5 līdz 10 % no 5 līdz 10 % no 10 Pa līdz 105 Pa no 10–2 Pa līdz 105 Pa (1) Izoteniskopa metode Jā Jā no 5 līdz 10 % no 5 līdz 10 % no 102 Pa līdz 105 Pa Efūzijas metode: tvaika spiediena svari Jā Jā no 5 līdz 20 % līdz 50 % no 10–3 līdz 1 Pa Efūzijas metode: Knudsena šūna Jā Jā no 10 līdz 30 % — no 10–10 līdz 1 Pa Efūzijas metode: izotermiskā termogravimetrija Jā Jā no 5 līdz 30 % līdz 50 % no 10–10 līdz 1 Pa Gāzes piesātināšanas metode Jā Jā no 10 līdz 30 % līdz 50 % no 10–10 līdz 103 Pa Rotējošā rotora metode Jā Jā no 10 līdz 20 % — no 10–4 līdz 0,5 Pa 1.3. METODES PRINCIPS Kopumā tvaika spiedienu nosaka dažādās temperatūrās. Ierobežotā temperatūru intervālā tīras vielas tvaika spiediena logaritms ir apgriezti proporcionāls termodinamiskajai temperatūrai saskaņā ar vienkāršotu Klapeirona-Klauziusa vienādojumu. kur: p = tvaika spiediens (Pa) ΔHv = iztvaikošanas siltums J mol–1 R = gāzu universālā konstante 8,314 J mol–1 K–1 T = temperatūra K 1.4. STANDARTVIELAS Standartvielas nav nepieciešamas. Tās galvenokārt izmanto metodes veiktspējas periodiskām pārbaudēm un pēc dažādām metodēm iegūtu rezultātu salīdzināšanai. 1.5. METODES APRAKSTS 1.5.1. Dinamiskā metode (Kotrela metode) 1.5.1.1. Princips Tvaika spiedienu nosaka, mērot vielas vārīšanās temperatūru pie dažādiem spiedieniem aptuveni no 103 līdz 105 Pa. Šo metodi ir ieteicams izmantot arī viršanas temperatūras noteikšanai. Šajā nolūkā metodi ieteicams izmantot līdz 600 K. Hidrostatiskā spiediena dēļ šķidrumu viršanas temperatūra 3 līdz 4 cm dziļumā ir par aptuveni 0,1 °C augstāka nekā uz virsmas. Kotrela metodē (4) termometru novieto tvaikos virs šķidruma virsmas, un virstošais šķidrums nepārtraukti apskalo termometra rezervuāru. Rezervuāru pārklāj plāns šķidruma slānis, kas ir līdzsvarā ar tvaiku pie atmosfēras spiediena. Tādējādi termometrs uzrāda faktisko viršanas temperatūru bez kļūdām, ko rada šķidruma pārkaršana vai hidrostatiskais spiediens. Sūknis, kuru pirmo reizi izmantojis Kotrels, ir parādīts 1. att. Mēģenē A atrodas virstošais šķidrums. Pamatnē iekausētā platīna stieple B veicina vienmērīgu viršanu. Sānu caurulīte C ir savienota ar dzesinātāju, un apvalks D aukstajam kondensātam neļauj nokļūt pie termometra E. Šķidrumam A virstot, piltuves uztvertie burbuļi un šķidrums pa diviem sūkņa F zariem apskalo termometra rezervuāru. 1. attēls 2. attēls Kotrela sūknis (4) A: Termopāris B: Vakuuma bufertvertne C: Manometrs D: Vakuums E: Mērīšanas punkts F: Sildelements, apm. 150 W 1.5.1.2. Aparatūra Ļoti precīzs aparāts, kas darbojas pēc Kotrela principa, parādīts 2. att. Tas sastāv no caurules ar viršanas sekciju apakšējā daļā, dzesinātāju vidusdaļā, kā arī izeju un uzmalu augšējā daļā. Kotrela sūkni ievieto viršanas sekcijā, ko silda ar elektrisko sildelementu. Temperatūru mēra, izmantojot termopāri apvalkā vai pretestības termometru, ko ievieto cauri uzmalai no augšas. Izeja savienota ar sistēmu spiediena regulēšanai. Tā sastāv no vakuumsūkņa, bufertvertnes, manostata spiediena regulēšanai, ievadot slāpekli, un manometra. 1.5.1.3. Procedūra Vielu ievieto viršanas sekcijā. Problēmas var radīt cietas vielas, kas nav pulvera veidā, taču tās dažkārt var atrisināt ar dzesēšanas apvalka sildīšanu. Aparātu noslēdz pie uzmalas, un vielu atgāzo. Putojošām vielām šo metodi izmantot nevar. Tad iestata zemāko nepieciešamo spiedienu un ieslēdz sildītāju. Tajā pašā laikā reģistrējošajai ierīcei pievieno temperatūras sensoru. Līdzsvars tiek sasniegts, kad pastāvīgā spiedienā tiek reģistrēta nemainīga viršanas temperatūra. Īpaša uzmanība jāpievērš tam, lai novērstu pārkaršanu viršanas laikā. Bez tam dzesinātājā ir jāpanāk tvaiku pilnīga kondensācija. Nosakot tvaika spiedienu cietām vielām ar zemu kušanas temperatūru, jāraugās, lai tās nenosprostotu dzesinātāju. Pēc līdzsvara punkta reģistrēšanas iestata augstāku spiedienu. Procesu šādi turpina, līdz tiek sasniegti 105 Pa (kopumā apmēram 5 līdz 10 mērījumu punkti). Pārbaudei līdzsvara punkti jāsasniedz, spiedienu pazeminot. 1.5.2. Statiskā metode 1.5.2.1. Princips Statiskajā metodē (5) tvaika spiedienu termodinamiskā līdzsvara stāvoklī nosaka noteiktā temperatūrā. Šī metode piemērota tvaika spiediena noteikšanai vielām un daudzkomponentu maisījumiem, kas ir šķidras vai cietas vielas, intervālā no 10 līdz 105 Pa, un arī intervālā no 1 līdz 10 Pa ar nosacījumu, ka tiek veikti nepieciešamie pasākumi. 1.5.2.2. Aparatūra Iekārta sastāv no vannas, kurā uztur pastāvīgu temperatūru (ar precizitāti ±0,2 K), parauga konteinera, kas pievienots vakuuma līnijai, manometra un sistēmas spiediena regulēšanai. Parauga kamera (3a. attēls) ir pievienota vakuuma līnijai ar vārstu un diferenciālo manometru (U-veida caurulīti ar piemērotu manometra šķidrumu), ko izmanto par nulles indikatoru. Diferenciālajā manometrā atkarībā no spiedienu intervāla un testējamās vielas ķīmiskajām īpašībām var izmantot dzīvsudrabu, silikonus un ftalātus. Tomēr, rūpējoties par vidi, no dzīvsudraba izmantošanas būtu pēc iespējas jāizvairās. Testējamā viela nedrīkst ievērojami šķīst, kas ir U-veida caurulītē, vai ar to reaģēt. U-veida caurulītes vietā var izmantot manometru (3.b attēls). Manometrā dzīvsudrabu var izmantot intervālā no parastā atmosfēras spiediena līdz 102 Pa, bet silikona šķidrumi un ftalāti ir piemēroti spiedieniem, kas ir zemāki par 102 Pa līdz 10 Pa. Ir citi manometri, ko var izmantot, ja spiediens ir zemāks par 102 Pa, un sildāmās membrānas kapacitātes manometrus var izmantot pat tad, ja spiediens ir zemāks par 10–1 Pa. Temperatūru mēra uz trauka ārējās sienas, kurā atrodas paraugs, vai pašā traukā. 1.5.2.3. Procedūra Izmantojot 3a. att. parādīto aparātu, uzpilda U-veida caurulīti ar izvēlēto šķidrumu, kas pirms mērījumiem paaugstinātā temperatūrā ir jāatbrīvo no gāzēm. Testējamo vielu ievieto aparātā un pazeminātā temperatūrā atbrīvo no gāzēm. Izmantojot daudzkomponentu paraugus, temperatūrai jābūt pietiekami zemai, lai nenotiktu materiāla sastāva izmaiņas. Līdzsvara iestāšanos paātrina ar maisīšanu. Paraugu var atdzesēt ar šķidro slāpekli vai sauso ledu, raugoties lai nenotiktu gaisa mitruma vai sūkņa šķidruma kondensācija. Virs parauga trauka atver vakuuma krānu un paraugu vairākas minūtes atgaiso ar vakuumu. Ja nepieciešams, atgaisošanu atkārto vairākas reizes. 3.a attēls 3.b attēls Sildot paraugu, kad krāns ir aizvērts, pieaug tvaika spiediens. Tādēļ izmainās šķidruma līdzsvars U-veida caurulītē. Lai to kompensētu, aparātā ievada slāpekli vai gaisu, līdz diferenciālais spiediena indikators atkal atrodas nulles stāvoklī. Tam nepieciešamo spiedienu nolasa ar manometru vai precīzāku instrumentu. Šis spiediens atbilst vielas tvaika spiedienam mērījuma temperatūrā. Izmantojot 3.b att. parādīto aparātu, tvaika spiedienu nosaka ar tiešiem mērījumiem. Tvaika spiedienu līdz nepieciešamajai maksimālajai temperatūrai nosaka piemērotos nelielos temperatūras intervālos (kopumā apmēram 5 līdz 10 mērījumu punkti). Pārbaudei jāatkārto nolasījumi zemās temperatūrās. Ja atkārtotos mērījumos noteiktās temperatūras neatbilst līknei, kas iegūta, temperatūru pakāpeniski paaugstinot, tam var būt šādi iemesli: i) paraugā vēl ir gaiss (piemēram, izteikti viskozu materiālu gadījumā) vai arī vielas ar zemu viršanas temperatūru, kas izdalās sildīšanas laikā; ii) izmantotajā temperatūras intervālā vielā ar vielu notiek ķīmiska reakcija (piemēram, sadalīšanās, polimerizācija). 1.5.3. Izoteniskopa metode 1.5.3.1. Princips Izoteniskopā (6) izmanto statiskās metodes principu. Pēc šīs metodes vielas paraugu pārnes rezervuārā, kuram uztur nemainīgu temperatūru un ir savienots ar manometru un vakuumsūkni. Piemaisījumi, kuru gaistamība ir lielāka nekā testējamajai vielai, tiek atdalīti ar degazāciju pazeminātā spiedienā. Parauga tvaika spiediens izvēlētajā temperatūrā tiek līdzsvarots ar inertas gāzes zināmu spiedienu. Izoteniskops tika izstrādāts, lai noteiktu atsevišķu šķidro ogļūdeņražu tvaika spiedienu, tas ir piemērots arī cietu vielu analīzei. Metode parasti nav piemērota daudzkomponentu sistēmām. Ja paraugs satur negaistošus piemaisījumus, rezultātu kļūda ir neliela. Ieteicamais noteikšanas intervāls ir no 102 līdz 105 Pa. 1.5.3.2. Aparatūra Mērinstrumenta paraugs parādīts 4. att. Pilnīgāks metodes apraksts ir atrodams ASTM D 2879–86 (6). 1.5.3.3. Procedūra Analizējot šķidrumu, pati viela kļūst par diferenciālā manometra šķidrumu. Izoteniskopā pārnes tik daudz šķidruma, lai piepildītu rezervuāru un manometra īso atzaru. Izoteniskopu pieslēdz vakuumam un atgaiso, tad piepilda ar slāpekli. Atbrīvošanu no gāzēm un attīrīšanu atkārto divas reizes, lai izdalītu atlikušo skābekli. Uzpildīto izoteniskopu novieto horizontāli tā, lai paraugs plānā slānī izklātu parauga rezervuāru un manometru. Sistēmā spiedienu samazina līdz 133 Pa, un paraugu uzmanīgi silda, līdz tas sāk vārīties (atbrīvošanai no izšķīdušajām gāzēm). Tad izoteniskopu novieto tā, lai paraugs ieplūstu atpakaļ rezervuārā un piepildītu manometra īso zaru. Uztur 133 Pa spiedienu. Parauga rezervuāra pagarināto galu ar nelielu liesmu silda, līdz sāk izdalīties un pietiekami izplešas testējamās vielas tvaiks, izspiežot daļu parauga no rezervuāra augšējās daļas manometra zarā, un izveidojas ar tvaiku pildīta telpa, kurā nav slāpekļa. Tad izoteniskopu novieto vannā, kurā uztur pastāvīgu temperatūru, un regulē slāpekļa spiedienu, līdz tas ir līdzsvarā ar testējamās vielas parauga tvaika spiedienu. Līdzsvara stāvoklī slāpekļa spiediens atbilst vielas tvaika spiedienam. 4. attēls Cietām vielām atkarībā no spiediena un temperatūras intervāliem izmanto tādus manometra šķidrumus kā silikonus vai ftalātus. Degazēto manometra šķidrumu iepilda izcilnī uz izoteniskopa garā zara. Tad testējamo cieto vielu ievieto parauga rezervuārā un paaugstinātā temperatūrā degazē. Pēc tam izoteniskopu noliec tā, lai manometra šķidrums ieplūstu U-veida caurulītē. 1.5.4. Efūzijas metode: tvaika spiediena svari (7) 1.5.4.1. Princips Testējamās vielas paraugu karsē nelielā krāsnī, kas novietota zem kupola, no kura atsūknēts gaiss. Krāsnij ir vāks ar sīkiem noteikta diametra urbumiem. Vielas tvaiki, izplūstot pa vienu no urbumiem, tiek novirzīti uz ļoti jutīgu svaru kausu, kas arī atrodas zem kupola, no kura evakuēts gaiss. Dažās konstrukcijās svaru kausam, uz kura kondensējas izplūstošais tvaiks, ir dzesēšanas kamera, nodrošinot siltuma aizvadīšanu termiskās kondukcijas ceļā, un to atdzesē starojums. Tvaika strūklas enerģija darbojas kā spēks uz svariem. Tvaika spiedienu var aprēķināt divos veidos: tieši, ņemot vērā spēku, kas darbojas uz svaru kausu, un iztvaikošanas ātrumu, izmantojot Herca-Knudsena vienādojumu (2): kur: G = iztvaikošanas ātrums (kg s–1 m–2) M = molmasa (g mol–1) T = temperatūra (K) R = gāzu universālā konstante (J mol–1 K–1) p = tvaika spiediens (Pa) Ieteicamais noteikšanas intervāls ir no 10–3 līdz 1 Pa. 1.5.4.2. Aparatūra Aparāta principiālo shēmu sk. 5. att. 5. attēls A: Pamata plāksne F: Dzesēšanas kamera un dzesēšanas stienis B: Mērinstruments ar kustīgu tinumu G: Iztvaicēšanas krāsns C: Kupols H: Djuāra trauks ar šķidro slāpekli D: Svari ar svaru kausu I: Parauga temperatūras mērīšana E: Vakuuma mērīšanas ierīce J: Testējamā viela 1.5.5. Efūzijas metode: Knudsena šūna 1.5.5.1. Princips Metodes pamatā ir testējamās vielas masas noteikšana, kas ultravakuuma apstākļos laika vienībā tvaika veidā pa mikroatveri izplūst no Knudsena šūnas (8). Izplūdušā tvaika masu var noteikt pēc šūnas masas zuduma, vai vielas tvaikus zemā temperatūrā kondensējot un ar hromatogrāfiju nosakot iztvaicētās vielas daudzumu. Tvaika spiedienu aprēķina pēc Herca-Knudsena vienādojuma (sk. 1.5.4.1.) un izmantojot no aparāta parametriem atkarīgus korekcijas koeficientus (9). Ieteicamais noteikšanas intervāls ir no 10–10 līdz 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2. Aparatūra Aparāta principiālo shēmu sk. 6. att. 6. attēls 1: Savienojums ar vakuumu 7: Vāks ar vītni 2: Platīna pretestības termometra vai temperatūras regulēšanas ierīces ligzdas 8: Spārnuzgrieznis 3: Vakuumkameras vāks 9: Skrūves 4: Blīve 10: Nerūsējošā tērauda efūzijas šūnas 5: Alumīnija vakuumkamera 11: Sildelements 6: Mehānisms efūzijas šūnu ievietošanai un izņemšanai 1.5.6. Efūzijas metode: izotermiskā termogravimetrija 1.5.6.1. Princips Šīs metodes pamatā ir testējamās vielas palielināta iztvaikošanas ātruma noteikšana paaugstinātās temperatūrās pie atmosfēras spiediena, izmantojot termogravimetriju (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Iztvaikošanas ātrumi vT tiek iegūti, uz testējamo vielu iedarbojoties ar lēnu inertas gāzes plūsmu un atbilstošos laika periodos nosakot masas zudumus izotermiskos apstākļos pie definētajām temperatūrām T (kelvinos). Tvaika spiedienus pT aprēķina no vT vērtībām, izmantojot lineāru sakarību starp tvaika spiediena logaritmu un iztvaikošanas ātruma logaritmu. Ja nepieciešams, izmantojot log pT regresiju atkarībā no 1/T, var veikt ekstrapolāciju 20 un 25 °C. Šī metode ir piemērota vielām, kuru tvaika spiediens ir pat 10–10 Pa (10–12 mbar) un tīrības pakāpe ir iespējami tuvu 100 %, lai izvairītos no kļūdām noteikto masas zudumu interpretācijā. 1.5.6.2. Aparatūra Eksperimentālās iekārtas principiālā shēma 7. att. 7. attēls Parauga nesējplāksnīti, kas piekārta mikrosvariem kamerā ar kontrolējamu temperatūru, izkustina sausa gāzveida slāpekļa plūsma, kas nes iztvaicētās testējamās vielas molekulas. Izplūstot no kameras, vielu sorbcijas iekārtā uztver no gāzes plūsmas. 1.5.6.3. Procedūra Testējamo vielu homogēnā slānī uzklāj uz stikla plāksnītes ar nelīdzenu virsmu. Analizējot cietas vielas, plāksni vienmērīgi samitrina ar vielas šķīdumu piemērotā šķīdinātājā un žāvē inertā atmosfērā. Lai veiktu mērījumus, pārklāto plāksni piekar termogravimetriskajā analizatorā, un pēc tam masas zudumus mēra nepārtraukti kā laika funkciju. Iztvaikošanas ātrumu vT noteiktā temperatūrā aprēķina, izmantojot parauga plāksnes masas zudumu Δm kur F ir ar testējamo vielu pārklātās plāksnītes virsmas laukums, parasti parauga plāksnītes virsmas laukums, un t – laiks, kurā novēro masas zudumu Δm. Tvaika spiedienu pT aprēķina kā funkciju no iztvaikošanas ātruma vT: log pT = C + D log vT kur C un D ir ar izmantoto eksperimentālo iekārtu saistītas konstantes, kas atkarīgas no mērījumu kameras diametra un gāzes plūsmas ātruma. Šīs konstantes jānosaka vienreiz, analizējot vairākus savienojumus ar zināmu tvaika spiedienu un aprēķinot log pT regresiju atkarībā no log vT (11)(21)(22). Tvaika spiedienu pT atkarībā no temperatūras T (kelvinos) apraksta ar sakarību log pT = A + B 1/T kur A un B ir konstantes, ko nosaka, aprēķinot log pT regresiju pēc 1/T. Izmantojot šo vienādojumu, ar ekstrapolāciju var aprēķināt tvaika spiedienu jebkurā citā temperatūrā. 1.5.7. Gāzes piesātināšanas metode (23) 1.5.7.1. Princips Pār testējamo vielu istabas temperatūrā laiž inertas gāzes plūsmu ar noteiktu ātrumu, kas ir pietiekami mazs, lai nodrošinātu gāzes piesātināšanos. Gāzes fāzes piesātinājumam ir būtiska nozīme. Pārnesto vielu uztver, parasti izmantojot sorbentu, un nosaka tās daudzumu. Kā alternatīvu tvaika sorbcijai un tai sekojošai vielas daudzuma noteikšanai var izmantot analītiskās metodes, kurās notiek vielas pārnese, piemēram, gāzu hromatogrāfiju, lai kvantitatīvi noteiktu pārnestās vielas daudzumu. Tvaika spiedienu aprēķina pieņemot, ka ir spēkā ideālas gāzes likums, un tāpēc gāzu maisījuma kopējais spiediens ir vienāds ar tās atsevišķo komponentu spiedienu summu. Testējamās vielas parciālo spiedienu, t. i., tvaika spiedienu, aprēķina, zinot gāzes kopējo tilpumu un tās pārnestās vielas masu. Gāzes piesātināšanas metode ir izmantojama vielām šķidru un cietu vielu veidā. To var izmantot pat tik zema tvaika spiediena noteikšanai kā 10–10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). Šī metode ir drošākā tvaika spiedieniem, kas ir zemāki par 103 Pa. Virs 103 Pa noteiktās tvaika spiediena vērtības parasti ir paaugstinātas, iespējams, aerosolu veidošanās dēļ. Tā kā tvaika spiedienu mēra istabas temperatūrā, nav nepieciešams ekstrapolēt paaugstinātās temperatūrās iegūtus datus, kas bieži rada nopietnas kļūdas. 1.5.7.2. Aparatūra Jāizmanto kamera, kurā uztur pastāvīgu temperatūru. Shēmā 8. att. parādīta kamera ar trijiem cietu vielu un trijiem šķidru vielu paraugu turētājiem, kas dod iespējas veikt cietas vai šķidras vielas parauga analīzi trijos atkārtojumos. Temperatūru uztur ar precizitāti vismaz ±0,5 °C vai ar augstāku precizitāti. 8. attēls Parasti par inertu nesējgāzi izmanto slāpekli, taču atsevišķos gadījumos var būt nepieciešama cita gāze (24). Nesējgāzei jābūt sausai. Gāzes plūsmu, ko regulē ar adatvārstiem (apm. 0,79 mm atvere), sadala 6 daļās un pa vara caurulīti ar iekšējo diametru 3,8 mm ievada kamerā. Pēc temperatūras līdzsvarošanas gāze plūst cauri paraugam, uztvērējam ar sorbentu un izplūst ārā no kameras. Cietās vielas paraugu ievieto stikla caurulītē ar iekšējo diametru 5 mm, un tās abus galus noslēdz ar stikla vates aizbāžņiem (sk. 9. att.). Šķidru vielu paraugu turētājs un sorbcijas sistēma parādīta 10. att. Labāk reproducējamus šķidrumu tvaika spiediena mērījumu rezultātus iegūst, ja turētāju piepilda ar stikla lodītēm vai inertu sorbentu, piemēram, silīcija dioksīdu, uz kuru virsmas uznesta šķidra viela. Otra iespēja ir nesējgāzi laist cauri rupjam fritam un barbotēt caur testējamo vielu, kas ir šķidruma veidā. 9. attēls 10. attēls Sorbcijas sistēmā ir plūsmai pretējā un aizmugurējā sorbenta daļa. Pie ļoti zema tvaika spiediena sorbents vielu aiztur tikai nelielā daudzumā, un par nopietnu problēmu var kļūt adsorbcija uz stikla vates un stikla caurulītes sieniņām posmā starp paraugu un sorbentu. Cits efektīvs iztvaicētās vielas uztveršanas paņēmiens ar izmantot uztvērēju, ko dzesē ar cietu CO2. Tas nerada pretspiedienu uz piesātināšanas kolonnas, un uztvertā viela ir kvantitatīvi vienkārši pārnesama. 1.5.7.3. Procedūra Nesējgāzes plūsmas ātrumu mēra istabas temperatūrā. Plūsmas ātrumu eksperimenta laikā kontrolē pietiekami bieži, lai nodrošinātu, ka nesējgāzes tilpums tiek noteikts precīzi. Ieteicams veikt nepārtrauktus masas plūsmas mērījumus. Gāzes fāzes piesātināšanai var būt vajadzīgs visai ilgs kontakta laiks, un tāpēc pavisam neliels gāzes plūsmas ātrums (25). Eksperimenta beigās priekšējo un aizmugurējo sorbenta daļu analizē atsevišķi. Vielu no katras sorbenta daļas atsevišķi desorbē ar šķīdinātāju. Iegūtajos šķīdumos kvantitatīvi nosaka no abām sorbenta daļām desorbētās vielas masu. Analītiskās metodes izvēle (arī sorbenta un desorbcijas šķīdinātāja izvēle) ir atkarīga no testējamās vielas īpašībām. Desorbcijas efektivitāti novērtē, noteikta lieluma paraugu pārnesot uz sorbenta, desorbējot un nosakot atgūstamību. Desorbcijas efektivitāte jāpārbauda, izmantojot parauga koncentrāciju testēšanas apstākļos, vai tai iespējami līdzīgu koncentrāciju. Lai pārliecinātos par nesējgāzes piesātināšanos ar testējamo vielu, noteikšanu veic pie trijiem atšķirīgiem gāzes plūsmas ātrumiem. Ja aprēķinātais tvaika spiediens nav atkarīgs no plūsmas ātruma, gāzi uzskata par piesātinātu. Tvaika spiedienu aprēķina pēc šāda vienādojuma: kur: p = tvaika spiediens (Pa) W = iztvaikojušās testējamās vielas masa (g) V = piesātinātas gāzes tilpums (m3) R = gāzu universālā konstante 8,314 (J mol–1 K–1) T = temperatūra (K) M = testējamās vielas molmasa (g mol–1) Jāveic izmērītā tilpuma korekcija, ņemot vērā spiediena un temperatūras atšķirības plūsmas mērīšanas ierīcē un piesātināšanas kamerā. 1.5.8. Rotējošā rotora metode 1.5.8.1. Princips Šajā metodē izmanto rotējošā rotora viskozimetru, kurā mērelements ir magnētiskajā laukā piekārta neliela izmēra tērauda lodīte, kas griežas rotējošā laukā (26)(27)(28). Uztveršanas spoles ļauj noteikt rotācijas ātrumu. Kad lodīte ir sasniegusi noteikto rotācijas ātrumu, parasti apmēram 400 apgr./s, aktivāciju pārtrauc, un ātrums sāk palēnināties gāzes radītās berzes dēļ. Rotācijas ātruma samazināšanos mēra kā laika funkciju. Tvaika spiedienu nosaka pēc tērauda lodītes palēninājuma, kas atkarīgs no spiediena. Ieteicamais noteikšanas intervāls ir no 10–4 līdz 0,5 Pa. 1.5.8.2. Aparatūra Eksperimentālās iekārtas shematisks zīmējums parādīts 11. att. Mērelements ir apvalkā ar pastāvīgu temperatūru, ko regulē ar 0,1 °C precizitāti. Parauga konteineru ievieto atsevišķā apvalkā, kurā arī regulē temperatūru ar 0,1 °C precizitāti. Visās pārējās iekārtas daļās tiek uzturēta augstāka temperatūra, lai novērstu kondensāciju. Visa aparatūra ir pievienota sistēmai, kas tajā rada dziļu vakuumu. 11. attēls 2. REZULTĀTI UN PĀRSKATS 2.1. REZULTĀTI Tvaika spiediens, izmantojot jebkuru no minētajām metodēm, jānosaka vismaz divās temperatūrās. Ieteicams izmantot trīs vai vairāk temperatūras intervālā no 0 līdz 50 °C, lai pārbaudītu tvaika spiediena līknes linearitāti. Izmantojot efūzijas metodi (Knudsena šūnu, izotermisko termogravimetriju) un gāzes piesātināšanas metodi, ieteicamais noteikšanas temperatūru intervāls ir nevis 0 līdz 50 °C, bet gan 120 līdz 150 °C. 2.2. TESTĒŠANAS PĀRSKATS Testēšanas pārskatā jāiekļauj šāda informācija: — izmantotā metode, — vielas precīzs apraksts (identitāte un piemaisījumi) un attīrīšanas paņēmieni, ja to veic, — vismaz divas tvaika spiediena un temperatūras vērtības – un ieteicams trīs vai vairāk – intervālā no 0 līdz 50 °C (vai 120 līdz 150 °C), — vismaz vienai temperatūrai ir jābūt 25 °C vai par to zemākai, ja tas ir iespējams saskaņā ar izvēlēto metodi, — visi izejas dati, — log p pret 1/T līkne, — aprēķinātais tvaika spiediens 20 vai 25 °C temperatūrā. Ja novērojamas testējamās vielas pārvērtības (agregātstāvokļa maiņa, sadalīšanās), jānorāda šāda informācija: — pārvērtības veids; — temperatūra, kurā pārvērtība notiek pie atmosfēras spiediena; — tvaika spiediens 10 un 20 °C zem izmaiņu temperatūras un 10 un 20 °C virs šīs temperatūras (izņemot, ja ir pāreja no cieta agregātstāvokļa gāzveida stāvoklī). Jānorāda visa rezultātu interpretācijai nepieciešamā informācija, īpaši ziņas par piemaisījumiem un vielas fizikālo stāvokli. 3. LITERATŪRA (1) Eiropas Kopienu Oficiālais Vēstnesis L 383 A, 26–47 (1992). (2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London. (3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. (4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. (5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa – Static method. (6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. (7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use –Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method. (8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. (9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. (10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521–532. (11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000) (12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22–28 (13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269–278. (14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122. (15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147. (16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393–400. (17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161–168. (18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27–31. (19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310. (20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512–20. (21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range – 25 °C to 150 °C. (22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002) (23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal Register, Washington DC (24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. (25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. (26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. (27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. (28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Izmantojot kapacitātes manometru Papildinājums Aprēķina metode IEVADS Pēc aprēķina metodes noteiktās tvaika spiediena vērtības var izmantot: — lai izvēlētos piemērotākās eksperimentālās metodes; — aptuvenas vērtības vai robežvērtības noteikšanai gadījumos, kad eksperimentālā metode nav izmantojama tehnisku iemeslu dēļ. APRĒĶINA METODE Šķidru un cietu vielu tvaika spiedienu var aprēķināt, izmantojot modificētu Vatsona korelāciju (a). Eksperimentāli jānosaka tikai viršanas punkts normālos apstākļos. Šī metode ir piemērota tvaika spiediena aprēķināšanai, kas ir intervālā no 105 Pa līdz 10–5 Pa. Detalizēta informācija par metodi ir sniegta “Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b). Sk. arī OECD Environmental Monograph No 67 (c). APRĒĶINĀŠANA Tvaika spiedienu aprēķina pēc formulas: kur: T = temperatūra, kurai aprēķina tvaiku spiedienu Tb = viršanas punkts normālos apstākļos Pvp = tvaika spiediens temperatūrā T ΔHvb = iztvaikošanas siltums ΔZb = saspiežamības faktors (novērtēts kā 0,97) m = empīrisks koeficients, kas atkarīgs no vielas fizikālā stāvokļa attiecīgajā temperatūrā Turklāt kur KF ir empīrisks koeficients, kas ir atkarīgs no vielas polaritātes. Vairākiem savienojumu tipiem KF koeficienti norādīti literatūras avotā (b). Bieži ir pieejami dati par viršanas punktu pazeminātā spiedienā. Šajā gadījumā tvaika spiedienu aprēķina: kur T1 ir viršanas punkts pazeminātā spiedienā P1. PĀRSKATS Izmantojot aprēķina metodi, pārskatā pilnībā jādokumentē viss aprēķins. LITERATŪRA (a) Watson, K. M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. (b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D. H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. (c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

II PIELIKUMS A.22. GARUMU SVĒRTAIS ĢEOMETRISKAIS VIDĒJAIS ŠĶIEDRU DIAMETRS 1. METODE 1.1. IEVADS Šī metode apraksta Garumu svērtā ģeometriskā vidējā šķiedru diametra (GSĢVD) mērīšanas procedūru mākslīgām minerālajām šķiedrām (MMŠ). Sakarā ar to, ka kopumam noteiktais GSĢVD ar 95 % varbūtību atrodas 95 % ticamības līmeņu starpā (GSĢVD ± divas standartkļūdas), tad ziņojumā norādītā vērtība (testa vērtība) būs zemākais parauga 95 % ticamības līmenis (t. i., GSĢVD – 2 standartkļūdas). Šī metode pamatojas uz HSE nozares procedūras projekta redakciju (1994.gada jūnijs), kas apstiprināta ECFIA un HSE sanāksmē Česterā 26.9.1993. un izstrādāta otrajam starplaboratoriju izmēģinājumam un pamatojoties uz to (1,2). Šī mērījumu metode var tikt izmantota, lai raksturotu šķiedru diametru nesakārtotā stāvoklī esošām vielām vai produktiem, kas satur MMŠ, ieskaitot ugunsizturīgas keramikas šķiedras (UKŠ), mākslīgas stikla šķiedras (MSŠ), kristāliskās un polikristāliskās šķiedras. Svēršana pēc garumiem ir līdzeklis kā kompensēt paraugu ņemšanas vai materiāla apstrādes nodarītā garu šķiedru pārrāvuma ietekmi uz diametra sadalījumu. Ģeometriskos statistiskos datus (ģeometriskos vidējos) izmanto, lai novērtētu MMŠ diametru izmēru sadalījumu, jo šiem diametriem parasti ir izmēru sadalījums, kas aproksimējamas uz logaritmisko normālo. Gan garuma, gan diametra mērīšana ir nogurdinošs un darbietilpīgs darbs, bet ja mēra tikai tās šķiedras, kas pieskaras bezgalīgai tievai līnijai SEM redzes laukā, tad dotās šķiedras izvēles varbūtība ir proporcionāla tās garumam. Tā kā minētais ņem vērā garumu garuma svēršanas aprēķinos, tad vienīgais mērījums, kas ir nepieciešams, ir diametrs, bet GSĢVD-2SE var aprēķināt kā aprakstīts turpmāk. 1.2. DEFINĪCIJAS Daļiņa: objekts ar garuma pret platumu attiecību mazāku par 3:1. Šķiedra: objekts ar garuma pret platumu attiecību (aspekta attiecība) vismaz 3:1. 1.3. PIELIETOJUMI UN IEROBEŽOJUMI Šī metode ir izstrādāta, lai apskatītu diametru sadalījumu, kurās vidēji diametri sastāda no 0,5 μm līdz 6 μm. Lielākus diametrus var izmērīt, izmantojot mazākus SEM palielinājumus, bet metodes pielietojamība smalkākām šķiedru sadalījumam pakāpeniski samazinās, tāpēc ieteicams pielietot TEM (transmisijas elektronisko mikroskopu), ja vidējais diametrs ir mazāks par 0,5 μm. 1.4. TESTĒŠANAS METODES PRINCIPS No šķiedru paklāja vai vaļīgām šķiedrām ņem kādu reprezentatīvu serdes paraugu skaitu. Vaļīgām šķiedrām samazina garumu, pielietojot sasmalcināšanas procedūru un attiecīgi sagatavoto reprezentatīvo paraugu disperģē ūdenī. Alikvotas ekstrahē un filtrē caur polikarbonāta filtru ar 0,2 μm lielām porām un sagatavo pētīšanai ar skenēšanas elektroniskās mikroskopijas (SEM) metodi. Šķiedru diametrus mēra pie attēla palielinājuma ×10 000 vai vairāk (1), izmantojot līnijas šķērsojuma metodi, iegūstot nesagrozītu vidējā diametra novērtējumu. Zemāko 95 % ticamības intervālu (pamatojoties uz vienas puses testu) aprēķina, lai novērtētu mazāko materiāla šķiedras ģeometriskā vidējā diametra vērtību. 1.5. TESTEŠANAS METODES APRAKSTS 1.5.1. Drošība/piesardzības pasākumi Jāsamazina personu ekspozīcija gaisā lidojošām šķiedrām un jāizmanto velkmes skapis vai kamera ar cimdiem, strādājot ar sausām šķiedrām. Periodiski jāpārbauda personu ekspozīcija, lai novērtētu aizsardzības metožu efektivitāti. Strādājot ar MMŠ, jāvalkā vienreizējas lietošanas cimdi, lai samazinātu ādas kairinājumu un novērstu abpusēju piesārņošanu. 1.5.2. Aparatūra/iekārta — Prese un presforma, kas spēj nodrošināt 10 MPa. — Polikarbonāta filtri ar kapilārporām 0,2 μm (filtra diametrs 25 mm). — Celulozes estera membrānas filtrs ar 5 μm porām, kas izmantojams kā palīgfiltrs. — Stikla ierīce filtrēšanai (vai vienreizējas lietošanas filtrēšanas sistēmas), kas paredzēta 25 mm diametra filtram (piem., Millipore stikla komplekts mikroanalīzei, tips XX10 025 00). — Svaigs destilēts ūdens, kas nofiltrēts caur filtru ar 0,2 μm lielām porām, lai atdalītu mikroorganismus. — Pārklājums uzsmidzinātājs ar zelta vai zelta/pallādija anodu. — Skenējošais elektronu mikroskops ar izšķirtspēju līdz 10 nm un palielinājumu x10 000. — Dažādi piederumi: lāpstiņas, 24. tipa skalpelis, pincete, SEM lampas, oglekļa līme vai oglekļa līmlente, sudraba putekļi. — Ultraskaņas zonde vai galda ultraskaņas vanna. — Rīks serdes paraugu ņemšanai vai parauga ņemšanas urbis serdes paraugu ņemšanai no MMŠ paklāja. 1.5.3. Testa procedūra 1.5.3.1. Paraugu ņemšana Paklāju un segu gadījumā šķērsgriezuma paraugu ņemšanai jāizmanto 25 mm rīks serdes paraugu ņemšanai vai parauga ņemšanas urbis. Paraugus ņem vienādās atstarpēs maza paklāja gabala platumā vai ņem pēc nejaušības principa izvēlētās vietās, ja rīcībā ir garāki paklāja gabali. Tos pašus piederumus var izmantot, ņemot paraugus pēc nejaušības principa no vaļīgām šķiedrām. Ja iespējams, jāņem seši paraugi, lai atspoguļotu nesakārtotā materiāla telpisko neviendabīgumu. Seši serdes paraugi jāsasmalcina 50 mm diametra presformā pie 10 MPa. Materiālu samaisa ar lāpstiņu un atkārtoti saspiež pie 10 MPa. Pēc tam materiālu izņem no presformas un glabā noslēgtā stikla traukā. 1.5.3.2. Paraugu sagatavošana Ja nepieciešams, no organiskajām saistvielām var atbrīvoties, ievietojot šķiedru krāsnī pie 450 °C aptuveni uz vienu stundu. Paraugs jānoskalda un jāsadala četrās daļas (tas jādara putekļu aizsargkamerā). Mazu parauga daudzumu (< 0,5 g) pievieno ar lāpstiņu 100 ml svaiga destilēta ūdens, kas nofiltrēts caur 0,2 μm membrānas filtru (var izmantot alternatīvus augstākās tīrības ūdens avotus, ja šo avotu atbilstība ir pierādīta). Rūpīgi disperģē, pielietojot ultraskaņas zondi ar jaudu 100 W, zondi noregulējot tā, ka notiek kavitācija. (Ja zondes nav pieejama, jāpielieto šāda metode: nepārtraukti sakrata un apgroza 30 sekunžu laikā; apstrādā ar ultraskaņu galda ultraskaņas vannā 5 minūšu laikā; pēc tam atkal sakrata un apgroza turpmāko 30 sekunžu laikā). Tūlīt pēc šķiedras dispērģēšanas jāņem vairākas alikvotas (piem., trīs alikvotas pa 3, 6 un 10 ml) ar platmutes pipeti. Katrai alikvotai veic vakuuma filtrēšanu caur 0,2 μm polikarbonāta filtru ar 5 µm lielu poru MEC palīgfiltru, izmantojot 25 mm stikla filtra piltuvi ar cilindrisku trauku. Aptuveni 5 ml nofiltrētā destilēta ūdens jāielej piltuvē un alikvotu lēnām pilina ūdenī ar pipetes palīdzību, turot pipetes galu zem meniska. Pēc pilināšanas pipete un trauks rūpīgi jānoskalo, jo tievām šķiedrām ir tendence novietoties uz virsmas. Piesardzīgi noņem filtru un atdala no palīgfiltra, pēc tam ievieto traukā žāvēšanai. Nogriež ceturtdaļu vai pusi no nofiltrētās nogulsnes filtra, izmantojot 24.tipa skalpeli ar šūpojošo kustību. Nogriezto daļu piesardzīgi piestiprina pie SEM galviņas ar oglekļa līmlenti vai oglekļa līmi. Sudraba putekļus jāuzklāj vismaz trīs vietās, lai uzlabotu elektrisko kontaktu filtra un galviņas malās. Kad līme/sudraba putekļi ir izžuvuši, jāuzsmidzina aptuveni 50 nm bieza zelta vai zelta/pallādija kārta uz nogulsnes virsmas. 1.5.3.3. SEM kalibrēšana un darbība 1.5.3.3.1. Kalibrēšana SEM kalibrēšana jāpārbauda vismaz vienu reizi nedēļā (ideāli būtu reizi dienā) ar sertificētā kalibrēšanas režģa palīdzību. Kalibrēšana jāārbauda pēc sertificētā etalona un ja izmērītā vērtība (SEM) neatbilst ±2 % no sertificētās vērtības, tad SEM kalibrēšana jāregulē un jāpārbauda atkārtoti. SEM jābūt spējīgam izšķirt vismaz minimālo saskatāmu diametru 0,2 µm, izmantojot reālo parauga matricu pie palielinājuma × 2 000. 1.5.3.3.2. Darbība SEM jāpielieto pie palielinājuma 10 000 (2) apstākļos, kas nodrošina labu izšķiršanu ar pieņemamu attēlu pie lēniem skenēšanas ātrumiem, piemēram, 5 sekundes uz kadru. Kaut gan ekspluatācijas prasības dažādiem SEM var būt dažādas, parasti labākas redzamības un izšķiršanas nodrošināšanai relatīvi mazu atomsvaru materiālu gadījumā jāpielieto paātrinājuma spriegumi 5–10 keV ar mazu punktu izmēru uzstādīšanu un īsu darba attālumu. Veicot lineāro pārskatīšanu, jāizmanto 0o slīpums, lai minimizētu atkārtotu nostādīšanu fokusā, vai, ja SEM ir centrētā režīmā, jāizmanto pret centru mērāmais darba attālums. Mazāku palielinājumu var izmantot, ja materiāls nesatur mazas (pēc diametra) šķiedras un šķiedru diametri ir lieli (> 5 μm) 1.5.3.4. Izmēru noteikšana 1.5.3.4.1. Pētījums pie maza palielinājuma, novērtējot paraugu Paraugs jāpēta vispirms pie maza palielinājuma, meklējot lielu šķiedru sablīvēšanās pierādījumus un novērtējot šķiedras blīvumu. Pārmērīgas sablīvēšanās gadījumā ieteicams sagatavot jaunu paraugu. Lai nodrošinātu statistisko precizitāti, jāmēra minimāls šķiedru daudzums, turklāt ir ieteicams liels šķiedru blīvums, jo tukšu lauku pētīšana ir laikietilpīga un neveicina analīzi. Tomēr ja filtrs ir pārblīvēts, tad grūti izmērīt visas mērāmās šķiedras, jo lielākās šķiedras var aizsegt mazākās un tās var tikt nepamanītas. GSĢVD pārvērtēšanas tendence iespējama gadījumā, ja šķiedru blīvums pārsniedz 150 šķiedras uz milimetru lineārās pārskatīšanas. Savukārt, maza šķiedru koncentrācija palielina analīzes laiku un bieži izdevīgāk būtu sagatavot paraugu ar šķiedru blīvumu, kas tuvāks optimālam, nekā turpināt skaitīt uz filtra ar mazu šķiedru koncentrāciju. Optimālam šķiedru blīvumam jādod vidēji viena vai divas saskaitāmās šķiedras uz redzeslauku pie 5 000 palielinājuma. Tomēr optimālais blīvums ir atkarīgs no šķiedru izmēra (diametra), tāpēc nepieciešams, lai operators pamatotos uz profesionālu pieredzi, lai noteiktu, vai šķiedru blīvums ir vai nav tuvs optimālam. 1.5.3.4.2. Šķiedru diametra svēršana attiecībā pret garumiem Jāskaita tikai tās šķiedras, kas pieskaras (vai šķērso) bezgalīgo tievo līniju SEM ekrānā. Šim nolūkam jānovelk horizontāla (vai vertikāla) līnija caur ekrāna centru. Alternatīva varētu būt viena punkta izmantošana ekrāna centrā un nepārtrauktas skenēšanas uzsākšana vienā virzienā filtrā. Jāmēra un jāreģistrē diametrs katrai šķiedrai ar garuma pret platumu attiecību, kas ir lielāka par 3:1, un kas pieskaras vai šķērso šo punktu. 1.5.3.4.3. Šķiedru izmēru noteikšana Ieteicams izmērīt vismaz 300 šķiedras. Katru šķiedru mēra tikai vienu reizi krustošanās punktā ar punktu vai līniju, kas novilkta attēlā (vai krustošanās punkta tuvumā, ja šķiedras malas ir neskaidras). Ja gadās šķiedras ar neregulāriem šķērsgriezumiem, tad jāveic mērījums, kas atspoguļotu vidējo šķiedru diametru. Jāievēro piesardzība, nosakot malas un mērot īsāko atstarpi starp šķiedru malām. Izmēru noteikšanu var veikt līnijās vai ārlīnijās, izmantojot saglabātus attēlus vai fotogrāfijas. Ieteicams pielietot pusautomātiskas attēla mērīšanas sistēmas, kas datus lejupielādē tieši izklājlapā, jo šīs sistēmas ļauj ietaupīt laiku, novērš kopēšanas kļūdas un var automatizēt aprēķinus. Garu šķiedru gali jāapskata pie maza palielinājuma, lai pārliecinātos, ka tie nav ielocījušies atpakaļ mērāmajā redzes laukā un tiek izmērīti tikai vienu reizi. 2. DATI 2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE Parasti šķiedru diametriem nav normālā sadalījuma. Tomēr, veicot logaritmisko pārveidošanu, var iegūt sadalījumu, kas aproksimējama uz normālo. Aprēķina n šķiedru diametru (D) naturālā logaritma (lnD) aritmētisko vidējo (vidējais lnD) un standartnovirzi (SDlnD). (1) (2) Standartnovirzi dala ar mērījumu skaita (n) kvadrātsakni, iegūstot standartkļūdu (SElnD). (3) Divkāršoto standartkļūdu atskaita no vidējā un aprēķina šo vērtību eksponenciāli (vidējo atskaitot divkāršoto standartkļūdu), iegūstot ģeometrisko vidējo (formulā apzīmēts kā LWGMD) mīnuss divas ģeometriskās standartkļūdas. (4) 3. ZIŅOJUMS TESTA PĀRSKATS Testa pārskatā jāiekļauj vismaz šāda informācija: — GSĢVD-2SE vērtība. — Attiecīgs pamatojums jebkādām atkāpēm, it īpaši tādām, kas varētu ietekmēt rezultātu precizitāti un pareizību. 4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA 1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. 2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) Šī palielinājuma vērtība norādīta 3 µm šķiedrām, 6 µm šķiedrām būtu piemērotāks × 5 000 palielinājums. (2) Attiecībā uz 3 μm šķiedrām, skatīt iepriekšējo piezīmi.

III PIELIKUMS B.46. ĀDAS KAIRINĀJUMA NOTEIKŠANA AR CILVĒKA EPIDERMAS REKONSTRUKCIJAS MODEĻA IN VITRO TESTU 1. METODE 1.1. IEVADS Ādas kairinājums ir atgriezeniska audu bojājuma veidošanās ādā ne ilgāk kā 4 stundas pēc testējamās vielas aplicēšanas [saskaņā ar Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) vielu klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizēto sistēmu (GHS)] (1). Šajā testēšanas metodē aprakstīta noteikšanas procedūra in vitro, pēc kuras, atkarībā no vajadzīgās informācijas, var noteikt vielu izraisīto ādas kairinājumu kā pakāpeniskas loģiski secīgas testēšanas stratēģijas (2) atsevišķu testu. Ādas kairinājuma novērtēšanai parasti veic laboratorijas izmēģinājumus ar dzīvniekiem (sk. B.4. metodi) (3). Lai dzīvniekiem neradītu sāpes un ciešanas, ņemot vērā ar dzīvnieku labturību saistītus apsvērumus, ar B.4. metodi nosaka ādas kairinājumu/kodīgu jeb korozīvu iedarbību uz ādu pēc pakāpeniskas loģiski secīgas testēšanas stratēģijas, izmantojot validētas in vitro un ex vivo metodes. Kodīgo īpašību noteikšanai saskaņā ar B.4. metodē paredzēto secīgas testēšanas stratēģiju var izmantot pavisam trīs validētas in vitro testēšanas metodes un testēšanas norādījumus, attiecīgi B.40., B.40.bis un TG 435 (4, 5, 6). Šajā testēšanas metodē izmanto cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus (kuriem par šūnu avotu izmanto cilvēka epidermas keratinocītus, ādai reprezentatīvu audu un citoloģisko arhitektūru), kuriem kopumā ir ļoti līdzīgas bioķīmiskās un fizioloģiskās īpašības ar cilvēka ādas virsējo daļu, t. i., epidermu. Pēc šīs testēšanas metodes identificē ANO GHS 2. kat. klasificētās kairinošās vielas. Šajā testēšanas metodē noteikti arī veiktspējas raksturlielumi tādu līdzīgu vai modificētu testēšanas metožu novērtēšanai, kurās izmanto cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus (7). Divām in vitro testēšanas metodēm EpiSkin™ un EpiDerm™, kurās izmanto cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus un kas ir pieejamas tirgū, veikti pirmsvalidācijas, optimizācijas un validācijas pētījumi (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17). Šie standarti balstās uz R 38. Noteikto aspektu pārrēķināšana GHS mērķiem ir adresēta standartā 25. Metodes ar veikšanu ekvivalentas EpiSkin™ (validētā 1. standartmetode) ir ieteikta par aizstājēju in vivo testam ar izmēģinājumu trušiem, kuru izmanto GHS 2. kat. kairinošo vielu klasifikācijai. Metodes ar veikšanu ekvivalentas EpiDerm™ (validētā 2. standartmetode) ir ieteikta izmantošanai tikai par skrīninga testu vai kā pakāpeniskas loģiski secīgas testēšanas stratēģijas daļu GHS 2. kat. kairinošo vielu klasifikācijai. Lai cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļa in vitro testēšanas metodes ādas kairinājuma noteikšanai varētu izmantot reglamentācijas nolūkiem, jānosaka to ticamība, piemērotība (precizitāte) un izmantošanas ierobežojumi, lai atbilstoši šajā testēšanas metodē (papildinājumā) noteiktajiem veiktspējas standartiem nodrošinātu to salīdzināmību ar validēto 1. standartmetodi. Atbilstoši šajā testēšanas metodē noteiktajām prasībām validētas vēl divas citas cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļa in vitro testēšanas metodes, un pēc tām iegūtie rezultāti ir līdzīgi rezultātiem, kas iegūti, izmantojot validēto 1. standartmetodi (18). Šīs metodes ir modificētā EpiDerm™ testēšanas metode (modificēta 2. standartmetode) un SkinEthic RHE™ testēšanas metode (līdzīga 1. standartmetodei). 1.2. DEFINĪCIJAS Šajā testēšanas metodes aprakstā izmanto šādas definīcijas. Precizitāte. Pēc testēšanas metodes iegūto mērījumu rezultātu sakritības pakāpe ar attiecīgajām references vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas raksturlielums un viens no tās piemērotības aspektiem. Šo terminu bieži izmanto ar nozīmi “sakritība” vai atbilstība, ar to domājot pareizu rezultātu daļu, ko iegūst pēc testēšanas metodes. Partijas kontrolviela. Standartviela, kas izraisa audu dzīvotspējas vidēja stipruma reakciju. Šūnu dzīvotspēja. Parametrs, kas raksturo šūnu populācijas kopējo aktivitāti, piemēram, šūnu mitohondriju dehidrogenāžu spēju reducēt vitālo krāsvielu MTT (3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds, tiazolilzilais), kas, atkarībā no nosakāmā testēšanas beigu punkta un izmantotā testēšanas plāna testa, korelē ar dzīvo šūnu kopējo skaitu un/vai dzīvotspēju. ET50 . Ekspozīcijas laiks, kas pēc noteiktas koncentrācijas ķīmiskā marķiera aplicēšanas nepieciešams šūnu dzīvotspējas samazināšanai par 50 %, sk. arī IC50. Šķietami negatīvi rezultāti. Visu to vielu daļa, kurām ir attiecīgā veida iedarbība, bet kuras ar konkrēto testēšanas metodi tiek kļūdaini identificētas par vielām bez attiecīgā veida iedarbības. Tas ir viens no metodes veiktspējas raksturlielumiem. Šķietami pozitīvi rezultāti. Visu to (neaktīvo) vielu daļa, kurām nav attiecīgā veida iedarbības, bet kuras ar konkrēto testēšanas metodi tiek kļūdaini identificētas par vielām ar šādu iedarbību. Tas ir viens no metodes veiktspējas raksturlielumiem. Nefiksēta deva. Uz ādas aplicētais testējamās vielas daudzums, kas ir lielāks par ādas virsmas pilnīgai un vienmērīgai pārklāšanai nepieciešamo daudzumu. GHS (Ķīmisko vielu klasificēšanas un marķēšanas Globāli harmonizētā sistēma): Sistēma, saskaņā ar kuru vielas un maisījumus klasificē pēc kaitīgās iedarbības veidiem un to intensitātes uz cilvēka veselību un vidi, kā arī paredz atbilstošu saziņas elementu izmantošanu, piemēram, piktogrammas, signālvārdus, bīstamības apzīmējumus, drošības apzīmējumus un drošības datu lapas, kuru mērķis ir sniegt informāciju, kas nepieciešama cilvēku (tostarp darba devēju, strādājošo, transporta darbinieku, patērētāju un avārijas dienestu darbinieku) un vides aizsardzībai pret to kaitīgo iedarbību (1) un ieviesta ES ar Regulu (EK) Nr. 1272/2008. IC50 . Ķīmiskā marķiera koncentrācija, pie kuras audu dzīvotspēja pēc noteikta ekspozīcijas laika samazinās par 50 % (IC50), sk. arī ET50. Veiktspējas standarti. Pamatojoties uz validētu standartmetodi noteikti standarti, pēc kuriem novērtē pēc noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Tajos ietilpst I) testēšanas metodes būtiskie komponenti; II) obligāti izmantojamās standartvielas, kas izraudzītas no tām vielām, kuras izmantotas attiecīgās validētās testēšanas metodes veiktspējas pieņemamības uzskatāmai parādīšanai; kā arī III) salīdzināmi pareizības un ticamības līmeņi, kuru pamatā ir attiecīgajai validētajai testēšanas metodei noteiktie konkrētie līmeņi un kuru nodrošināšanu ar novērtējamo testēšanas metodi var uzskatāmi parādīt ar obligāti izmantojamajām standartvielām. Ticamība. Raksturo pēc testēšanas metodes iegūto rezultātu reproducējamību, metodi dažādos laikos pēc viena protokola atkārtoti izmantojot vienā un vairākās laboratorijās. To novērtē, aprēķinot reproducējamību vienā laboratorijā un vairākās laboratorijās. Jutība. Ar konkrēto testēšanas metodi pareizi klasificēto pozitīvo jeb aktīvo vielu daļa, kurām ir attiecīgā veida iedarbība. Jutība raksturo testēšanas metodes precizitāti, ar kādu iegūst nepārprotami skaidrus rezultātus, un tā ir svarīgs faktors, kas jāņem vērā, novērtējot testēšanas metodes piemērotību. Specifiskums. Ar konkrēto testēšanas metodi pareizi klasificēto negatīvo jeb neaktīvo vielu daļa, kurām nav attiecīgā veida iedarbības. Specifiskums raksturo testēšanas metodes precizitāti, ar kādu iegūst nepārprotami skaidrus rezultātus, un tas ir svarīgs faktors, kas jāņem vērā, novērtējot testēšanas metodes piemērotību. Ādas kairinājums. Atgriezeniska audu bojājuma veidošanās ādā ne ilgāk kā 4 stundas pēc testējamās vielas aplicēšanas. Ādas kairinājums ir vietēja ar imūnsistēmu nesaistīta reakcija, kas parādās neilgi pēc kairinātāja iedarbības (24). Tās svarīgākā iezīme ir procesu atgriezeniskums, kas saistīti ar iekaisuma reakcijām un ar iekaisuma procesu saistītā kairinājuma raksturīgo klīnisko pazīmju (ādas apsarkums, pietūkums, niezēšana un sāpes) lielāko daļu. 1.3. PIELIETOJUMI UN IEROBEŽOJUMI Cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļa testus, kas aprakstīti šajā testēšanas metodē, var izmantot tikai vielu kā ādas kairinātāju klasifikācijai ANO GHS 2. kat. klasē. Ar tiem nav iespējams konstatēt vielas, kuras var klasificēt ANO GHS 3 kat. klasē, tāpēc visas pārējās vielas ar tiem nevar klasificēt (noteikt to kategorijas klasi). Atkarībā no reglamentācijas vajadzībām, esošo testu uzlabojumiem un jaunu vai līdzīgu testu izstrādāšanas, kā arī iespējamu jaunu beigu punktu iekļaušanu, šī testēšanas metode var būt regulāri jāpārskata. Pēc šīs testēšanas metodes iespējams identificēt kairinošas vielas gan atsevišķi, gan daudzkomponentu maisījumos (19), taču tā nedod pareizu priekšstatu par vielas kodīgumu jeb korozīvo iedarbību uz ādu. To nevar izmantot gāzu un aerosolu testēšanai, jo šādu maisījumu un preparātu testēšanas rezultāti vēl nav novērtēti validācijas pētījumā. 1.4. METODES PRINCIPS Testējamo vielu topikāli aplicē uz cilvēka epidermas rekonstrukcijas trīsdimensiju modeļa, kuru veido normāli cilvēka epidermas keratinocīti, kultivēti tā, lai veidotos labi diferencētas daudzslāņu cilvēka epidermas modelis. Tam ir bazālais, spinālais un granulārais slānis, daudzslāņu stratum corneum ar lamelāriem lipīdu starpšūnu slāņiem, kuru uzbūve ir līdzīga kā in vivo. Cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļa testa princips pamatojas uz premisu, ka difūzijas rezultātā kairinošas vielas var nokļūt stratum corneum un šīm vielām ir citotoksiska iedarbība uz šūnām slāņos zem tā. Šūnu dzīvotspēju novērtē pēc vitālās krāsvielas MTT [3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds, tiazolilzilais; EINECS Nr. 206–069–5, CAS Nr. 298–93–1)] konversijas ar dehidrogenāzi par zilas krāsas formazāna sāli, kura daudzumu audu ekstraktā nosaka kvantitatīvi (20). Kairinošas vielas tiek klasificētas pēc šūnu dzīvotspējas samazināšanās zemāk par kādu noteiktu iepriekš pieņemtu robežvērtību (kas ANO GHS 2. kat. klases kairinošajām vielām ir ≤ 50 %). Vielas, kuru iedarbībā šūnu dzīvotspēja nesamazinās zem šīs robežvērtības, netiek klasificētas (t. i., ja > 50 % bez kat. klases). Cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļu sistēmas var izmantot cietu vielu, šķidrumu, puscietu materiālu un vasku testēšanai. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumu veidā, cietas vielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja iespējams, cietas vielas jātestē smalka pulvera veidā. Tā kā cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļu testu sistēmu validācijai izmantotas 58 vielas, kas izraudzītas no dažādām vielu klasēm, sagaidāms, ka šīs metodes izmantojamas gandrīz visām klasēm piederīgo vielu testēšanai (16). Validācija iekļauj 13 GHS 2. kat. kairinātājus. Tam vajadzētu būt pieminētam, ka skābes, bāzes, sāļi un citas neorganiskas vielas, kas nav kodīgas netika iekļautas validācijā un dažas zināmas organisko kairinātāju klases tādas kā hidroperoksīdi, fenoli un virsmaktīvās vielas netika iekļautas vai iekļautas tikai ierobežotā apjomā. 1.5. PRASMES DEMONSTRĒŠANA Pirms sākt plaši izmantot kādu ar šo testēšanas metodi saistītu validētu testu, tehniskās prasmes uzskatāmai parādīšanai laboratorijas var izmantot desmit vielas, kas norādītas 1. tab. Pēc šīs testēšanas metodes atsevišķi neklasificē vielas, ko var klasificēt ANO GHS 3. kat. Līdzīgām jaunām metodēm, kas izstrādātas saskaņā ar šo testēšanas metodi un kuras ir strukturāli un funkcionāli līdzīgas validētām standartmetodēm, kā arī validēto metožu modifikācijām jāatbilst šīs testēšanas metodes papildinājumā aprakstītajiem veiktspējas standartiem, kuri jāizmanto attiecīgās jaunās testēšanas metodes ticamības un precizitātes uzskatāmai parādīšanai pirms tās izmantošanas testēšanai, kas saistīta ar reglamentāciju. 1. tabula. Papildinājumā minēto standartvielu izlases kopa Viela CAS Nr. In vivo reakcija Fizikālais stāvoklis GHS kategorija Naftalīnetiķskābe 86–87–3 0 Cietv. Neklas. Izopropanols 67–63–0 0,3 Šķidr. Neklas. Metilstearāts 112–61–8 1 Cietv. Neklas. Heptilbutirāts 5870–93–9 1,7 Šķidr. Iesp. 3. kat. Heksilsalicilāts 6259–76–3 2 Šķidr. Iesp. 3. kat. Ciklamenaldehīds 103–95–7 2,3 Šķidr. 2. kat. 1-bromheksāns 111–25–1 2,7 Šķidr. 2. kat. Butilmetakrilāts 97–88–1 3 Šķidr. 2. kat. 1-metil-3-fenil-1-piperazīns 5271–27–2 3,3 Cietv. 2. kat. Heptanāls 111–71–7 4 Šķidr. 2. kat. 1.6. METODES APRAKSTS Turpmāk aprakstīti ādas kairinājuma noteikšanai izmantojamo cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļu testu komponenti un procedūras. Cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus var izveidot, sagatavot vai tie ir nopērkami gatavi (piemēram, EpiSkin™, EpiDerm™ un SkinEthic RHE™). EpiSkin™, EpiDerm™ un SkinEthic RHE™ testēšanas metožu standartprotokoli ir atrodami [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu](21, 22, 23). Testēšana jāveic, ievērojot turpmāk aprakstītos noteikumus. 1.6.1. Cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļu komponenti 1.6.1.1. Vispārīgas prasības par modeli Epitēlija izveidošanai jāizmanto normāli cilvēka keratinocīti. Zem funkcionāla stratum corneum jābūt vairākiem dzīvotspējīgu epitēlija šūnu slāņiem (bazālajam slānim, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum jābūt daudzslāņu, ar raksturīgo lipīdu profilu, kas izveido funkcionālo barjeru, kura novērš citotoksisko marķieru, piemēram, nātrija dodecilsulfāta (SDS) vai Triton X-100, ātru penetrāciju. Barjeras funkciju novērtē, nosakot koncentrāciju, pie kuras ķīmiskais marķieris pēc noteikta ekspozīcijas laika samazina audu dzīvotspēju par 50 % (IC50), vai nosakot ekspozīcijas laiku, pēc kura noteiktas fiksētas koncentrācijas ķīmiskā marķiera iedarbībā audu dzīvotspēja samazinās par 50 % (ET50). Modeļa aizturēšanas īpašībām jānovērš ap stratum corneum esošā materiāla pāreja dzīvotspējīgos audos, kuras dēļ var tikt nepareizi modelēta faktiskā iedarbība uz ādu. Ādas modelis nedrīkst būt kontaminēts ar baktērijām, vīrusiem, mikoplazmu un sēnītēm. 1.6.1.2. Prasības par modeļa funkcionalitāti 1.6.1.2.1. Dzīvotspēja Ieteicamākā metode dzīvotspējas noteikšanai ir MTT (20). Ar negatīvo kontroli (NC) apstrādāto audu krāsvielas ekstrakta (šķīduma) optiskajam blīvumam (OD) jābūt vismaz 20 reizes lielākam par ekstrakcijas šķīduma optisko blīvumu. Jādokumentē ar NC apstrādāto audu stabilitāte kultūrā (jābūt ar salīdzināmiem dzīvotspējas rādītājiem) visas testa ekspozīcijas laikā. 1.6.1.2.2. Barjeras funkcija Stratum corneum un tā lipīdu sastāvam jābūt tādiem, lai aizturētu citotoksisku ķīmisko marķieru, piemēram, nātrija dodecilsulfāta (SDS) vai Triton X-100), ātru penetrāciju, ko nosaka pēc IC50 vai ET50. 1.6.1.2.3. Morfoloģija Atbilstoši kvalificētam personālam jāveic ādas/epidermas rekonstrukcijas modeļa histoloģiski izmeklējumi, lai demonstrētu modeļa līdzību cilvēka ādas/epidermas struktūrai (ieskaitot daudzslāņu stratum corneum). 1.6.1.2.4. Reproducējamība Ar konkrētu modeli iegūtajiem rezultātiem uzskatāmi jāparāda to reproducējamība laikā, šim nolūkam vēlams kontrolei izmantot piemērotu vielu partijas kontrolei (standartvielu) (sk. papildinājumu). 1.6.1.2.5. Modeļa kvalitātes kontrole (KK) Visām lietojamām epidermas modeļu partijām jāatbilst noteiktiem ražojuma kvalitātes kritērijiem, no kuriem svarīgākie ir dzīvotspēja (1.6.1.2.1. punkts) un barjeras funkcija (1.6.1.2.2. punkts). Ādas modeļa piegādātājiem (vai pašiem testētājiem gadījumos, kad izmanto pašizgatavotus modeļus) jānosaka IC50 vai ET50 vērtību pieņemamības intervāls (augšējā un apakšējā robeža). Pēc audu saņemšanas laboratorijā jāpārbauda to barjeras funkcija. Kairinošās iedarbības prognozēšanai ir derīgi tikai ar prasībām atbilstošiem audu modeļiem noteiktie rezultāti. Kā piemērs turpmāk norādīti validētajām standartmetodēm noteiktie pieņemamības intervāli. 2. tabula. Partiju kvalitātes kontroles pieņemamības intervāli Apakšējā pieņemamības robežvērtība Pieņemamības intervāla vidējā vērtība Augšējā pieņemamības robežvērtība Validētā 1. standartmetode (18 h iedarbība ar nātrija dodecilsulfātu SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validētā 2. standartmetode (1 % Triton X100) ET50 = 4,8 h ET50 = 6,7 h ET50 = 8,7 h 1.6.1.3. Testējamās vielas un kontrolvielas aplicēšana Testējamo paraugu un kontrolparaugu sērijām jābūt pietiekamam atkārtojumu skaitam (katrā sērijā vismaz trīs atkārtojumi). Testējamās vielas, kas ir šķidras vai cietas vielas, uz ādas virsmas vienmērīgā slānī jāaplicē pietiekamā daudzumā, raugoties, lai netiktu testēta nefiksēta deva (sk. definīciju 1.2. punktā), t. i., minimāli 25 μl/cm2 vai 25 mg/cm2. Testējot cietas vielas, lai nodrošinātu pietiekami labu kontaktu ar ādu, pirms to aplicēšanas epidermas virsma jāsamitrina ar dejonizētu vai destilētu ūdeni. Ja iespējams, cietas vielas jātestē smalka pulvera veidā. Ekspozīcijas perioda beigās testējamais materiāls no ādas virsmas rūpīgi jānoskalo ar piemērotu buferšķīdumu vai 0,9 % NaCl. Atkarībā no lietotā cilvēka ādas epidermas rekonstrukcijas modeļa ekspozīcijas laiks var būt no 15 līdz 60 min, bet inkubēšanas temperatūra no 20 līdz 37 °C. Sīkāk par šo triju metožu standartoperāciju procedūrām (SOP) sk. (21, 22, 23). Jāizmanto paralēlas negatīvās kontroles (NC) un pozitīvās kontroles (PC), lai uzskatāmi parādītu, ka katrā noteikšanā šūnu dzīvotspēja (NC), barjeras funkcija un audu jutība (PC) ir iepriekš noteiktajā vērtību pieņemamības intervālā. Par pozitīvo kontrolvielu var izmantot nātrija dodecilsulfāta 5 % šķīdumu ūdenī. Par negatīvo kontrolvielu var izmantot ūdeni vai fizioloģisko šķīdumu ar fosfātbuferi (PBS). 1.6.1.4. Šūnu dzīvotspējas noteikšana Testēšanas procedūras svarīgākais elements ir ievērot, ka dzīvotspējas mērījumus nedrīkst veikt tūlīt pēc testējamo vielu ekspozīcijas un ka noskalotajiem audiem jaunā barotnē ir vajadzīgs pietiekami ilgs pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks. Šajā laikā izzūd vāja kairinājuma pazīmes un parādās nepārprotamas citotoksiskas iedarbības izpausmes. Testēšanas optimizācijas posmā noskaidrots (9, 10, 11, 12, 13), ka optimālais pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks ir 42 h, un tas tāpēc izmantots testēšanas standartmetožu validācijā. Šūnu dzīvotspējas mērīšanai izmantojamā validētā kvantitatīvā metode ir MTT konversijas noteikšana. Tā ir audu trīsdimensiju modelim piemērota metode. Ādas paraugu uz 3 stundām pārnes atbilstošas koncentrācijas (piemēram, 0,3–1 mg/ml) MTT šķīdumā. Pēc tam veic nogulsnētā zilas krāsas formazāna produkta ekstrakciju ar šķīdinātāju (piemēram, izopropanolu vai paskābinātu izopropanolu) un nosaka formazāna koncentrāciju, mērot optisko blīvumu pie viļņa garuma 570 nm ± 30 nm. Testējamās vielas optiskās īpašības vai ķīmiskās reakcijas ar MTT var traucēt noteikšanu, un tāpēc dzīvotspēja var būt noteikta nepareizi (jo testējamā viela var gan kavēt, gan veicināt krāsas veidošanos vai atkrāsošanos). Tas var notikt gadījumos, kad testējamo vielu pilnībā nenoskalo no ādas vai tad, ja tā penetrē epidermā. Ja testējamais materiāls tieši iedarbojas uz vitālo krāsvielu MTT, tam ir krāsa vai krāsa izveidojas ekspozīcijas laikā, testējamo vielu radīto dzīvotspējas mērījumu traucējumu noteikšanai un korekcijām jāizmanto papildu kontroles. Precīzu aprakstu par to, kā noteikt MTT tiešu reducēšanu, sk. validēto standartmetožu testēšanas protokolu (21, 22, 23). Nespecifisks krāsojums (NSC), kura cēlonis ir traucējumi, nedrīkst būt lielāks par 30 % no NC (korekcijām). Ja NSC > 30 %, testējamā viela nav piemērota testēšanai pēc šīs testēšanas metodes. 1.6.1.5. Noteikšanas rezultātu pieņemamības kritēriji No testēšanai derīgu audu modeļu partijām (sk. 1.6.1.2.5. punktu) ar negatīvās kontroles vielu apstrādātajiem audiem noteiktajām optiskā blīvuma vērtībām jāraksturo to kvalitāte visos nosūtīšanas un saņemšanas cikla posmos un visos ādas kairinājuma noteikšanas protokola procesos. Negatīvajā kontrolē noteiktās optiskā blīvuma vērtības nedrīkst būt zemākas par vēsturisko datu noteiktu zemāko vērtību. Arī datiem par audiem, kas apstrādāti ar pozitīvās kontroles vielu, t. i., nātrija dodecilsulfāta (SDS) 5 % šķīdumu ūdenī, katras atsevišķas noteikšanas apstākļos jāraksturo audiem saglabājusies jutība un to spēja reaģēt uz ķīmisko kairinājumu (piemēram, šūnu dzīvotspēja ≤ 40 % validētajai 1. standartmetodei un ≤ 20 % validētajai 2. standartmetodei). Jānosaka attiecīgi kritēriji par atkārtojumos noteikto rezultātu pieļaujamo mainību (piemēram, ja par šādu kritēriju izmanto standartnovirzi, tai jābūt ≤ 18 %). 2. DATI 2.1. DATI Par katru noteikšanu, arī par atkārtotiem eksperimentiem, ja tos veic, tabulas veidā apkopo visus datus par testējamā parauga visiem atkārtojumiem (piemēram, optiskā blīvuma vērtības, datus par testējamās vielas ietekmi uz šūnu dzīvotspēju un tās klasifikācijas datus). Par katru izmēģinājumu variantu jānorāda rezultāta vidējā vērtība ± standartnovirze. Par katru testējamo vielu un testējamo vielu, kurai ir krāsa, jādokumentē novērotā iedarbība ar MTT reaģentu. 2.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA Katram testējamajam paraugam iegūtās optiskā blīvuma vērtības var izmantot dzīvotspējīgo šūnu daļas aprēķināšanai salīdzinājumā ar negatīvo kontroli (NC), kuru pieņem par 100 %. Precīzi jānosaka un jādokumentē šūnu dzīvotspējas robežvērtība, pēc kuras identificē un atšķir testējamās kairinošās vielas no šādi neklasificētajām vielām, kā arī testēšanas rezultātu izvērtēšanai izmantotās statistiskās procedūras, un uzskatāmi jāparāda to piemērotība. Veicot testēšanu pēc validētajām standartmetodēm, kairinošas iedarbības prognozēšanai izmanto šādas robežvērtības. Uzskatāms, ka testējamā viela izraisa tādu ādas kairinājumu, ka tā jāklasificē ANO GHS 2. kat.: i) ja audu šūnu dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcapstrādes inkubēšanas laika ir mazāka vai vienāda ar (≤) 50 %. Testējamo vielu neklasificē kā ādas kairinājumu izraisošu: ii) ja audu šūnu dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcapstrādes inkubēšanas laika ir lielāka par (>) 50 %. 3. ZIŅOŠANA 3.1. TESTĒŠANAS PĀRSKATS Testēšanas pārskatā jāiekļauj šāda informācija. Testējamās un kontrolvielas: — ķīmiskais nosaukums, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums un CAS numurs, ja zināms, — vielas tīrība un sastāvs (masas procentos), — fizikāli ķīmiskās īpašības, kas attiecas uz testēšanu (piemēram, fizikālais stāvoklis, stabilitāte un iztvaikošanas spēja, pH, šķīdība ūdenī, ja tās ir zināmas), — testējamās/kontrolvielas sagatavošana pirms testēšanas, ja veikta (piemēram, sildīšana, sasmalcināšana), — glabāšanas apstākļi. Ādas modeļa un testēšanas protokola izmantošanas pamatojums. Testēšanas apstākļi: — izmantotā šūnu sistēma; — šūnu dzīvotspējas mērīšanai izmantotās mērierīces (piemēram, spektrofotometra) kalibrēšanas dati un viļņa garums, pie kura veikti dzīvotspējas mērījumi; — pilnīga informācija par izmantoto ādas modeli un tā veiktspējas raksturlielumiem. Tajā jānorāda vismaz: i) šūnu dzīvotspēja, ii) barjeras funkcija, iii) morfoloģija, iv) rezultātu reproducējamība un ticamības raksturlielumi, v) modeļa kvalitātes kontrole (KK); — informācija par izmantoto testēšanas procedūru; — testēšanai lietotās devas, ekspozīcijas laiks un pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks; — ja ir, testēšanas procedūras modifikāciju apraksts; — vēsturiskie dati par modeli. No tiem jānorāda vismaz: i) kvalitātes kontroles datu pieņemamība saskaņā ar vēsturiskajiem datiem par partiju kontroles rezultātiem, ii) pozitīvās un negatīvās kontroles datu pieņemamība, ņemot vērā pozitīvās un negatīvās kontroles vidējās vērtības un vērtību intervālus; — izmantotie novērtēšanas kritēriji un iedarbības prognozes modelim izraudzīto robežvērtību pamatojums. Rezultāti: — tabulas veidā apkopoti dati par atsevišķiem testa paraugiem; — citu novēroto efektu apraksts. Rezultātu novērtējums. Secinājumi. 4. LITERATŪRA 1. United Nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. 2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Available at:http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. 3. Test Method B.4. ACUTE TOXICITY; DERMAL IRRITATION/CORROSION. 4. Test Method B.40. IN VITRO SKIN CORROSION: TRANSCUTANEOUS ELECTRICAL RESISTANCE TEST TER. 5. Test Method B.40 BIS. IN VITRO SKIN CORROSION: HUMAN SKIN MODEL TEST. 6. OECD (2006). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Adopted July 19, 2006. Available at: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. 7. ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 8. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, 57–93. 9. Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765–770. 10. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107–114. 11. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests – An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351–367. 12. Cotovio, J., Grandidier, M.–H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329–249. 13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30,109–129. 14. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559–601. 15. Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 pp. + annexes. Available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 16. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603–619. 17. J. Cotovio, M.–H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy -Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol.14, 351–358. 18. ESAC statement on updated EpiDerm and similar SkinEthic assays. 5 November 2008. 19. EC (2006). Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. Official Journal of the European Union L396/1 of 30.12.2006. OPOCE, Luxembourg. 20. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55–63. 21. EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (January 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test – 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 22. EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (October 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 23. SkinEthic RHE™ SOP. Will be available under Download Study Documents, at: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 24. Harvell, J.D., Lamminstausta, K, Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, pp 7–18 25. Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, November 13, 2008. Papildinājums Veiktspējas raksturlielumu noteikšana ādas kairinājuma in vitro testēšanas metodēm, kurās izmanto cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus IEVADS Izmantojot vielas, kas aptver visu ādas reakcijas klasifikācijas Dreiza (Draize) skalu, jānosaka ticamība un precizitāte visām procedūrām, kuras izmanto saskaņā ar šo testēšanas metodi. Novērtēšanai izmantojot 20 ieteicamās standartvielas (2. tab.), testēšanas metodēm jābūt tādām ticamības un precizitātes raksturlielumu vērtībām, kas ir salīdzināmas ar validētajai 1. standartmetodei noteiktajām vērtībām (3. tab.) (1). Prasības attiecībā uz ticamību un precizitāti noteiktas turpmāk II un III iedaļā. Iekļautas neklasificētas un (ANO GHS 2. kat.) klasificētas vielas no attiecīgajām vielu klasēm tā, tā lai novērtējamās testēšanas metodes ticamība un ar izmantošanu prognozēšanai saistīto raksturlielumu vērtības (jutība, specifiskums, šķietami negatīvo un šķietami pozitīvo rezultātu daļa, precizitāte) varētu salīdzināt ar attiecīgajām validētajai 1. standartmetodei noteiktajām vērtībām. Pirms jaunu vielu testēšanas jānosaka izmantojamās testēšanas metodes ticamība un iespējas ar tās palīdzību pareizi identificēt ANO GHS 2. kat. klasificētās kairinošās vielas. VEIKTSPĒJAS STANDARTI Veiktspējas standartiem ir trīs šādi elementi: I) testēšanas metodes būtiskie komponenti, II) standartvielas un III) rezultātu precizitātes un ticamības raksturlielumu vērtības (2). Šie veiktspējas standarti noteikti pēc ECVAM veiktā ādas kairinājuma noteikšanas validācijas pētījuma rezultātiem (3). I) Testēšanas metodes būtiskie komponenti Vispārīgas prasības par modeli Epitēlija izveidošanai jāizmanto normāli cilvēka keratinocīti. Zem funkcionāla stratum corneum jābūt vairākiem dzīvotspējīgu epitēlija šūnu slāņiem (bazālajam slānim, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum jābūt daudzslāņu, ar raksturīgo lipīdu profilu, kas izveido funkcionālo barjeru, kura novērš citotoksisko ķīmisko marķieru, piemēram, SDS vai Triton X-100, ātru penetrāciju. Barjeras funkciju novērtē, nosakot koncentrāciju, pie kuras ķīmiskais marķieris pēc noteikta ekspozīcijas laika samazina audu dzīvotspēju par 50 % (IC50), vai nosakot ekspozīcijas laiku, pēc kura noteiktas fiksētas koncentrācijas ķīmiskā marķiera iedarbībā audu dzīvotspēja samazinās par 50 % (ET50). Modeļa aizturēšanas īpašībām jānovērš ap stratum corneum esošā materiāla pāreja dzīvotspējīgos audos, kuras dēļ var tikt nepareizi modelēta faktiskā iedarbība uz ādu. Ādas modelis nedrīkst būt kontaminēts ar baktērijām, vīrusiem, mikoplazmu un sēnītēm. Prasības par modeļa funkcionalitāti Dzīvotspēja Ieteicamākā metode dzīvotspējas noteikšanai ir MTT (4). Ar NC apstrādāto audu krāsvielas ekstrakta (šķīduma) optiskajam blīvumam jābūt vismaz 20 reizes lielākam par ekstrakcijas šķīduma optisko blīvumu. Jādokumentē ar NC apstrādāto audu stabilitāte kultūrā (jābūt ar salīdzināmiem dzīvotspējas rādītājiem) visas testa ekspozīcijas laikā. Barjeras funkcija Stratum corneum un tā lipīdu sastāvam jābūt tādiem, lai aizturētu citotoksisku ķīmisko marķieru, piemēram, SDS vai Triton X-100), ātru penetrāciju, ko nosaka pēc IC50 vai ET50. Morfoloģija Atbilstoši kvalificētam personālam jāveic ādas/epidermas rekonstrukcijas modeļa histoloģiski izmeklējumi, lai demonstrētu modeļa līdzību cilvēka ādas/epidermas struktūrai (ieskaitot daudzslāņu stratum corneum). Reproducējamība Ar konkrētu modeli iegūtajiem rezultātiem uzskatāmi jāparāda to reproducējamība laikā, šim nolūkam vēlams kontrolei izmantot piemērotu vielu partijas kontrolei (standartvielu) (sk. definīcijas 1.2. iedaļā). Modeļa kvalitātes kontrole (KK) Visām lietojamām epidermas modeļu partijām jāatbilst noteiktiem ražojuma kvalitātes kritērijiem, no kuriem svarīgākie ir dzīvotspēja (4. punkts) un barjeras funkcija (5. punkts). Ādas modeļa piegādātājiem (vai pašiem testētājiem gadījumos, kad izmanto pašizgatavotus modeļus) jānosaka IC50 vai ET50 vērtību pieņemamības intervāls (augšējā un apakšējā robeža). Pēc audu saņemšanas laboratorijā jāpārbauda to barjeras funkcija. Kairinošās iedarbības prognozēšanai ir derīgi tikai ar prasībām atbilstošiem audu modeļiem noteiktie rezultāti. Kā piemērs turpmāk norādīti validētajām standartmetodēm noteiktie pieņemamības intervāli. 1. tabula. Partiju kvalitātes kontroles kritēriju piemēri Apakšējā pieņemamības robežvērtība Pieņemamības intervāla vidējā vērtība Augšējā pieņemamības robežvērtība Validētā 1. standartmetode (18 h iedarbība ar SDS) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Validētā 2. standartmetode (1 % Triton X100) ET50 = 4,8 h ET50 = 6,7 h ET50 = 8,7 h II) Standartvielas Validētām standartmetodēm strukturāli un funkcionāli pietiekami līdzīgu tādu jaunu testēšanas metožu vai nedaudz modificētu standartmetožu ticamības un precizitātes noteikšanai, kurās izmanto cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus in vitro, lieto standartvielas, ar kurām iegūst pēc attiecīgās validētās 1. standartmetodes veiktspējas ziņā salīdzināmus rezultātus (1). 2. tab. norādītās 20 standartvielas ir dažādām vielu klasēm piederošas kairinošas vielas, tostarp arī ANO GHS 2. kat. vielas. No tām 10 ir ANO GHS 2. kat. vielas, 3 ir vielas, ko var klasificēt ANO GHS 3. kat., un 7 ir par kairinošām neklasificējamas vielas. Pēc šīs testēšanas metodes atsevišķi neklasificē vielas, ko var klasificēt ANO GHS 3. kat. Šīs standartvielas ir standartvielu minimālais kopums, kas jālieto ādas kairinājuma testēšanas metodes precizitātes un ticamības noteikšanai, izmantojot cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeli. Gadījumos, kad kāda no norādītajām vielām nav pieejama, var izmantot citas vielas, par kurām ir piejami atbilstoši dati in vivo izmēģinājumos. Ja nepieciešams, testēšanas metodes precizitātes un ticamības noteikšanas uzlabošanai standartvielu minimālajam kopumam papildus var izmantot citām vielu klasēm piederošas vielas, par kurām ir pieejami atbilstoši dati, kas iegūti in vivo izmēģinājumos. 2. tabula. Standartvielas cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļu precizitātes un ticamības noteikšanai Viela (1) CAS Nr. EINECS Nr. Fizikālais stāvoklis In vivo reakcija GHS in vitro kat. GHS in vivo kat. 1-brom-4-hlorbutāns 6940–78–9 230–089–3 Šķidr. 0 2. kat. Neklas. Dietilftalāts 84–66–2 201–550–6 Šķidr. 0 Neklas. Neklas. Naftalīnetiķskābe 86–87–3 201–705–8 Cietv. 0 Neklas. Neklas. Alilfenoksiacetāts 7493–74–5 231–335–2 Šķidr. 0,3 Neklas. Neklas. Izopropanols 67–63–0 200–661–7 Šķidr. 0,3 Neklas. Neklas. 4-metil-tio-benzaldehīds 3446–89–7 222–365–7 Šķidr. 1 2. kat. Neklas. Metilstearāts 112–61–8 203–990–4 Cietv. 1 Neklas. Neklas. Heptilbutirāts 5870–93–9 227–526–5 Šķidr. 1,7 Neklas. Iesp. 3. kat. Heksilsalicilāts 6259–76–3 228–408–6 Šķidr. 2 Neklas. Iesp. 3. kat. Triizobutilfosfāts 126–71–6 204–798–3 Šķidr. 2 2. kat. Iesp. 3. kat. 1-dekanols 112–30–1 203–956–9 Šķidr. 2,3 2. kat. 2. kat. Ciklamenaldehīds 103–95–7 203–161–7 Šķidr. 2,3 2. kat. 2. kat. 1-bromheksāns 111–25–1 203–850–2 Šķidr. 2,7 2. kat. 2. kat. 2-hlormetil-3,5-dimetil-4-metoksipiridīna hidrohlorīds 86604–75–3 434–680–9 Cietv. 2,7 2. kat. 2. kat. a-terpineols 98–55–5 202–680–6 Šķidr. 2,7 2. kat. 2. kat. di-n-propildisulfīds 629–19–6 211–079–8 Šķidr. 3 Neklas. 2. kat. butilmetakrilāts 97–88–1 202–615–1 Šķidr. 3 2. kat. 2. kat. 5–(1,1-dimetiletil)-2-metilbenzotiols 7340–90–1 438–520–9 Šķidr. 3,3 2. kat. 2. kat. 1-metil-3-fenil-1-piperazīns 5271–27–2 431–180–2 Cietv. 3,3 2. kat. 2. kat. Heptanāls 111–71–7 203–898–4 Šķidr. 4 2. kat. 2. kat. Vielas, kas norādītas 2. tab., ir reprezentatīva daļa no 58 vielām, kas izmantotas ECVAM starptautiskajā ādas kairinājuma testēšanas validācijas pētījumā (1). To izvēles pamatā ir šādi kritēriji: — vielas ir komerciāli piejamas, — tās ir visam Dreiza (Draize) ādas kairinājuma reakcijas intervālam reprezentatīvas (no nekairinošām līdz stipri kairinošām), — tās ir ar precīzi noteiktu ķīmisko struktūru, — tās ir reprezentatīvas validētās metodes reproducējamībai un izmantojamībai prognozēšanai, kas noteikta ECVAM veiktajā validācijas pētījumā, — vielas ir reprezentatīvas validācijas procesā izmantotajām ķīmiskajām funkcijām, — tās nav ekstrēmi toksiskas (piemēram, kancerogēnas vai reproduktīvajai sistēmai toksiskas), un to lietošana nav saistīta ar pārlieku augstām atkritumu apsaimniekošanas izmaksām. III) Rezultātu precizitātes un ticamības raksturlielumu vērtības Testēšanas metodes veiktspējas rakstulielumiem, kas saistīti ar rezultātu izmantojamību prognozēšanai (jutība, specifiskums, šķietami negatīvie un šķietami pozitīvie rezultāti, precizitāte), jābūt ar validētajai 1. standartmetodei noteiktajiem (3. tab.) salīdzināmiem, t. i., jutībai jābūt vienādai vai lielākai (≥) par 80 %, specifiskumam jābūt vienādam vai lielākam (≥) par 70 %, un precizitātei jābūt vienādai vai lielākai (≥) par 75 %. Ar izmantojamību prognozēšanai saistīto raksturlielumu vērtības jāaprēķina, izmantojot visas klasifikācijas, kas norādītajām 20 standartvielām noteiktas dažādās laboratorijās, kas piedalījās validācijā. Katras vielas klasifikāciju attiecīgajā laboratorijā nosaka pēc šūnu dzīvotspējas vidējās vērtības, kas noteikta vairākām testējamo paraugu sērijām (vismaz trīs derīgas sērijas). 3. tabula. Validētās 1. standartmetodes veiktspēja (2) Testēšanas metode Vielu skaits Jutība Specifiskums Šķietami negatīvi rezultāti Šķietami pozitīvi rezultāti Precizitāte Validētā 1. standartmetode (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Validētā 1. standartmetode (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % Novērtējamās testēšanas metodes ticamībai jābūt salīdzināmai ar validēto standartmetožu ticamību. Reproducējamība vienā laboratorijā Reproducējamībai vienā laboratorijā jābūt tādai, ka pēc vienā laboratorijā dažādās neatkarīgās 20 standartvielu testēšanas sērijās iegūtajiem rezultātiem noteiktās vielu klasifikācijas (2. kat./ neklasificējamas) sakritība ir vienāda vai lielāka (≥) par 90 %. Starplaboratoriju reproducējamība Starplaboratoriju reproducējamībai nav būtiskas nozīmes gadījumos, kad attiecīgo testēšanas metodi paredzēts izmantot tikai vienā laboratorijā. Metodēm, kuras paredzēts izmantot vairākās laboratorijās, starplaboratoriju reproducējamībai ir jābūt tādai, ka pēc vismaz trijās laboratorijās dažādās neatkarīgās 20 standartvielu testēšanas sērijās iegūtajiem rezultātiem noteiktās vielu klasifikācijas (2. kat./ neklasificējamas) sakritība ir vienāda vai lielāka (≥) par 80 %. LITERATŪRA 1. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559–601. 2. OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paris. 3. ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Available under Download Study Documents, at http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Accessed on 27.10.2008. 4. Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55–63. 5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603–619. (1) Šīs 20 standartvielas ir to 58 vielu reprezentatīva paraugkopa, kuras sākotnēji tika izmantotas 1. standartmetodes (EpiSkin™) validācijai. Testēto vielu pilnīgu uzskaitījumu un to izraudzīšanās kritērijus sk. (5). (2) 3. tabulā norādītas 1. standartmetodes raksturlielumu veiktspēja, jo pēc tās iespējams pareizi identificēt kairinošas vielas (ANO GHS 2. kat.) un šādi neklasificētas vielas (neklasificējamas vielas un vielas, kuras var klasificēt ANO GHS 3. kat.), šīs vērtības noteiktas, izmantojot attiecīgi 58 un 20 (2. tab.) standartvielas. (3) EpiSkin™ (4) Balstoties uz 13 GHS kat. 2 kairinātājiem. (5) Balstoties uz 45 GHS kat. 3 kairinātājiem vai GHS ne kategorijas ķīmiskajām vielām.

IV PIELIKUMS C.3. SALDŪDENS AĻĢU UN CIĀNBAKTĒRIJU (ZILAĻĢU) AUGŠANAS INHIBĒŠANAS TESTS 1. METODE Šī metode ir ekvivalenta OECD TG 201 (2006). 1.1. IEVADS Testēšanas metodes periodiski pārskata un pilnveido, ņemot vērā zinātnes attīstību. C.3. testēšanas metode bija jāpārstrādā, iekļaujot papildu sugas un izpildot noteiktās prasības par bīstamības novērtējumu un vielu klasifikāciju. Metode pārstrādāta, ņemot vērā plašo praktisko pieredzi, jaunākās zinātniskās atziņas pētījumos par toksisko iedarbību uz aļģēm un izmantošanas pieredzi reglamentēšanas jomā, kas iegūta kopš sākotnējās pieņemšanas. 1.2. DEFINĪCIJAS Šajā testēšanas metodē ir izmantotas šādas definīcijas un saīsinājumi: Biomasa: ir populācijas dzīvās vielas sausais svars (sausna), kas izteikts noteiktā tilpuma vienībā; piemēram, mg aļģu sausnas/litrā testa šķīduma. Parasti “biomasa” tiek definēta kā masa, taču šajā testēšanas metodes aprakstā šis vārds tiek lietots, lai apzīmētu masu tilpuma vienībā. Bez tam šajā testā parasti mēra biomasas aizstājējparametrus, tādus kā šūnu skaitu, fluorescenci utt., un lietotais termins “biomasa” līdz ar to attiecas arī uz šiem aizstājējparametru mērījumiem. Variācijas koeficients: ir parametra mainības bezdimensijas mērs, ko nosaka kā standartnovirzes attiecību pret vidējo vērtību. Šo koeficientu var izteikt arī procentos. Kontroles kultūru atkārtojumu vidējā īpatnējā augšanas ātruma vidējo variācijas koeficientu aprēķina šādi: 1. Izmantojot konkrētā atkārtojuma ikdienas / katras sekcijas augšanas ātrumus, aprēķina vidējā īpatnējā augšanas ātruma variācijas koeficientu procentos. 2. Lai iegūtu kontroles kultūru atkārtojumu ikdienas / katras sekcijas īpatnējā augšanas ātruma vidējo variācijas koeficientu, aprēķina visu 1. punktā noteikto vērtību vidējo lielumu. ECx : ir testa barotnē izšķīdinātās testējamās vielas koncentrācija, kas noteiktajā iedarbības periodā izraisa testa organisma x % (piemēram, 50 %) augšanas inhibēšanu (periodu norāda, ja tas atšķiras no pilna vai normālā testēšanas laika). Lai nepārprotami norādītu efektīvās koncentrācijas EC vērtību, kas iegūta no augšanas ātruma vai arī iznākuma, izmanto attiecīgi simbolus “ErC” un “EyC”. Audzēšanas barotne: ir pilnvērtīga sintētiska barotne, kurā aug testa aļģes, kad tās pakļauj testējamās vielas iedarbībai. Testējamā viela parasti tiek izšķīdināta barotnē. Augšanas ātrums (vidējais īpatnējais augšanas ātrums): ir biomasas pieauguma logaritms iedarbības laikā. Zemākā novērojamās ietekmes koncentrācija (LOEC): ir zemākā pārbaudītā koncentrācija, kādā testējamā viela noteiktajā iedarbības laikā statistiski nozīmīgā līmenī, salīdzinot ar kontroli, samazina augšanu (pie p < 0,05). Tomēr visām koncentrācijām, kas pārsniedz LOEC, ir jārada tikpat kaitīga vai kaitīgāka iedarbība, kā LOEC. Ja abus nosacījumus izpildīt nav iespējams, ir rūpīgi jāizskaidro, kā tika izvēlēta LOEC (un līdz ar to arī NOEC). Nenovērojamās ietekmes koncentrācija (NOEC): ir testējamā koncentrācija tieši zem LOEC. Atbildes reakcijas mainīgais lielums: toksiskuma rādītājs, ko ar dažādu aprēķina metožu palīdzību iegūst no jebkura mērītā parametra, kas apraksta biomasu. Šajā metodē atbildes reakcijas mainīgie ir augšanas ātrums un iznākums, ko iegūst tieši, mērot biomasu vai izmantojot kādu no minētajiem aizstājējparametri. Īpatnējais augšanas ātrums: ir atbildes reakcijas mainīgais, ko definē kā novērojamā parametra (šajā testēšanas metodē – biomasas) naturālo logaritmu starpību attiecīgā laika periodā. Iznākums: ir mērāmā mainīgā vērtība iedarbības perioda beigās, no kuras ir atņemta mērāmā mainīgā vērtība iedarbības perioda sākumā, t. i., biomasas pieaugums testēšanas laikā. 1.3. TESTA PIELIETOJUMS Šī testēšanas metode ir vieglāk izmantojama ūdenī šķīstošām vielām, kas testa apstākļos, visticamāk, paliks ūdens šķīdumā. Testējot gaistošas, izteikti adsorbējošas, krāsainas vielas, kā arī tādas vielas, kas slikti šķīst ūdenī, vai arī vielas, kas var ietekmēt barības vielu vai minerālvielu pieejamību barotnē, var būt nepieciešamas aprakstītā procesa modifikācijas (piemēram, noslēgta sistēma, testa trauku kondicionēšana). Norādījumi par dažām izmantojamajām modifikācijām ir sniegti (2)(3) un (4). 1.4. METODES PRINCIPS Šī testa mērķis ir noteikt, kā viela ietekmē saldūdens mikroaļģu un/vai ciānbaktēriju augšanu. Eksponenciāli augošus testa organismus periodiski audzētās kultūrās pakļauj testējamās vielas iedarbībai laika posmā, kas parasti ilgst 72 stundas. Lai gan tests ir diezgan īslaicīgs, tas ļauj izvērtēt iedarbību uz vairākām paaudzēm. Sistēmas atbildes reakcija ir dažādu testējamās vielas koncentrāciju iedarbībai pakļauto aļģu kultūru sēriju (testa vienības) augšanas samazināšanās. Atbildes reakciju vērtē kā iedarbības koncentrāciju funkciju, salīdzinot ar atkārtojumu, iedarbībai nepakļauto kontroles kultūru, vidējo augšanu. Lai pilnībā izpaustos sistēmas reakcija uz toksisko iedarbību (optimālā jutība), kultūrām ļauj neierobežoti eksponenciāli augt, nodrošinot pietiekami daudz barības vielu un nepārtrauktu gaismu pietiekami ilgu laiku, lai varētu izmērīt īpatnējā augšanas ātruma samazināšanos. Augšanu un augšanas inhibēšanu skaitliski nosaka, izmērot aļģu biomasu kā laika funkciju. Aļģu biomasu definē kā sausnas masu tilpuma vienībā, tas ir, mg aļģu litrā testa šķīduma. Tomēr sausnas masa ir grūti mērāma, tāpēc tiek izmantoti aizstājējparametri. Visbiežāk izmantotais no šiem aizstājējiem parametriem ir šūnu skaits. Citi aizstājējparametri ir šūnu tilpums, fluorescence, optiskais blīvums, u. c. Jānosaka pārrēķināšanas koeficients attiecīgā aizstājējparametra pārvēršanai biomasā. Testa mērķis ir augšanas inhibēšana, ko izsaka kā biomasas logaritmisko pieaugumu (vidējais īpatnējais augšanas ātrums) iedarbības perioda laikā. Izmantojot testējamajos šķīdumos noteiktos vidējos īpatnējos augšanas ātrumus, aprēķina koncentrāciju, kas izraisa augšanas ātruma konkrēto x % inhibēšanu (piemēram, 50 %), un izsaka kā ErCx (piemēram, ErC50). Šīs metodes veikšanai ES noteiktajos ietvaros rezultātu aprēķināšana vajadzētu būt balstītai uz vidējo specifisko augšanas ātrumu apstākļiem, kas aprakstīti zemāk 2.2. sadaļā. Šajā testēšanas metodē izmantotais atbildes reakcijas papildu mainīgais ir iznākums, kas var būt nepieciešams, lai izpildītu dažu valstu specifiskas reglamentējošas prasības. To definē kā biomasu iedarbības perioda beigās, no kura atņem biomasu iedarbības perioda sākumā. Izmantojot testējamo šķīdumu sērijās noteikto iznākumu, aprēķina koncentrāciju, kas izraisa iznākuma konkrēto x % inhibēšanu (piemēram, 50 %) un izsaka kā EyCx (piem., EyC50). Turklāt zemāko novērojamās ietekmes koncentrāciju (LOEC) un koncentrāciju, pie kuras ietekme nav novērojama (NOEC), var noteikt statistiski. 1.5. INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO VIELU Testēšanas apstākļu noteikšanai var būt noderīga informācija par testējamās vielas struktūrformulu, tīrības pakāpi, stabilitāti gaismā, stabilitāti testēšanas apstākļos, gaismu absorbējošajām īpašībām, pKa, kā arī transformācijas pētījumu rezultātiem, ieskaitot bioloģiskās noārdīšanas spēju ūdenī. Jāzina pārbaudāmās vielas šķīdība ūdenī, sadalījuma koeficients sistēmā oktanols/ūdens (Pow) un tvaika spiediens, un jābūt pieejamai validētai metodei vielas daudzuma noteikšanai pārbaudāmajā šķīdumā ar zināmu atgūstamību un kvalitatīvās noteikšanas robežu. 1.6. STANDARTVIELA Standartvielas, piemēram, 3,5-dihidrofenolu, ko izmanto starptautiskajās starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas programmās (4), var lietot testēšanas procedūras pārbaudei. Zaļaļģēm par standartvielu var izmantot kālija dihromātu. Testēšanu ar standartvielām vēlams veikt vismaz divas reizes gadā. 1.7. TESTA DERĪGUMS Lai tests būtu derīgs, ir jāizpilda šādi veiktspējas kritēriji: — Kontroles kultūru biomasai 72 stundu laikā ir jāpieaug eksponenciāli, vismaz 16-kārtīgi. Tas atbilst īpatnējam augšanas ātrumam 0,92 dienā–1. Biežāk izmantotajām sugām augšanas ātrums ir būtiski lielāks (skatīt I pielikumu). Šo kritēriju var neizpildīt, ja izmanto sugas, kas aug lēnāk par I pielikumā norādītajām. Tādā gadījumā testēšanas laiks jāpagarina, lai iegūtu vismaz 16-kārtīgu kontroles kultūru pieaugumu, visu testa laiku saglabājot eksponenciālu augšanu. Testa laiku var saīsināt līdz vismaz 48 stundām, lai testa laikā saglabātu neierobežotu eksponenciālu augšanu, kamēr ir sasniegts minimālais pieauguma koeficients 16. — Katras sekcijas īpatnējo augšanas ātrumu vidējais variācijas koeficients (0.–1. diena, 1.–2. diena un 2.–3. diena 72 stundu testam) kontroles kultūrās (sk. “Variācijas koeficients” sadaļu 1.2) nedrīkst pārsniegt 35 %. Par katras sekcijas īpatnējā augšanas ātruma aprēķināšanu sk. 2.2.1 otrajā daļā. Šis kritērijs attiecas uz kontroles kultūru atkārtojumu variācijas koeficientu vidējo vērtību. — Testa laikā kontroles kultūru atkārtojumu vidējo īpatnējo augšanas ātrumu variācijas koeficients testos ar Pseudokirchneriella subcapitata un Desmodesmus subspicatus nedrīkst pārsniegt 7 %. Mazāk analizētām sugām šai vērtībai nevajadzētu pārsniegt 10 %. 1.8. METODES APRAKSTS 1.8.1. Aparatūra Traukiem un citai aparatūrai, kas saskaras ar testa šķīdumiem, jābūt no stikla vai cita ķīmiski inerta materiāla. Priekšmeti ir rūpīgi jāmazgā, lai novērstu iespējamo organisko vai neorganisko piesārņotāju ietekmi uz aļģu augšanu vai testēajmo šķīdumu sastāvu. Testēšanai izmantojamie trauki parasti ir stikla kolbas, kurām jābūt pietiekami lielām, lai nodrošinātu kultūras tilpumu, kas nepieciešams mērījumiem testa laikā, kā arī atbilstošai CO2 masas pārnesei no atmosfēras (sk. 1.8.9. otro daļu). Jāņem vērā, ka šķidruma tilpumam jābūt analītiskajām noteikšanām pietiekami lielam (sk. 1.8.11 piekto daļu). Turklāt nepieciešama kāda no šīm iekārtām vai tās visas: — iekārta kultūras audzēšanai: ir ieteicams izmantot skapi vai kameru, kurā vajadzīgo inkubācijas temperatūru var uzturēt ar precizitāti ±2 °C, — instrumenti apgaismojuma mērīšanai: jāuzsver, ka mērījuma rezultātu ietekmē gaismas intensitātes mērīšanas metode un īpaši uztvērēja (kolektora) tips. Mērījumus ieteicams veikt, izmantojot sfērisku (4π) uztvērēju, kas reaģē uz tiešo un atstaroto gaismu visos leņķos virs mērījuma plaknes un zem tās, vai 2 π uztvērēju, kas reaģē uz visu gaismu virs mērījumu plaknes, — iekārtas aļģu biomasas noteikšanai. Šūnu skaitu, kas ir biežāk izmantotais aļģu biomasas aizstājējparametrs, var noteikt, izmantojot daļiņu elektronisko skaitītāju, mikroskopu ar skaitīšanas kameru vai arī plūsmas citometru. Citus biomasas aizstājējparametrus var mērīt, izmantojot plūsmas citometru, fluorimetru, spektrofotometru vai kolorimetru. Aprēķinos ieteicams izmantot pārrēķināšanas koeficientu šūnu skaita pārvēršanai sausnas masā. Lai ar spektrofotometru iegūtu derīgus mērījumus pie zemas biomasas koncentrācijas, var būt nepieciešams izmantot kivetes ar optisko ceļu vismaz 4 cm. 1.8.2. Testa organismi Var izmantot vairākas brīvi dzīvojošu mikroaļģu un zilaļģu sugas. 1. pielikumā uzskaitītie celmi ir pierādījuši savu piemērotību izmantošanai šajā testēšanas metodē izklāstītajai procedūrai. Izmantojot citas sugas, jānorāda celms un/vai izcelsme. Ir jāapstiprina, ka izvēlēto testa aļģu eksponenciālo augšanu, saglabājot noteiktos apstākļus, ir iespējams nodrošināt visu testa laiku. 1.8.3. Audzēšanas barotne Ieteicams izmantot divas alternatīvas barotnes: OECD un AAP barotnes. Šo barotņu sastāvs norādīts 2. pielikumā. Jāievēro, ka sākotnējais pH un buferietilpība (spēja uzturēt nemainīgu pH) abām barotnēm ir atšķirīga. Tāpēc testēšanas rezultāti atkarībā no izmantotās barotnes var būt dažādi, īpaši analizējot vielas, kas jonizējas. Barotnes var būt nepieciešams modificēt noteiktiem mērķiem, piemēram, analizējot metālus vai helātus veidojošas vielas, vai arī veicot testēšanu pie dažādām pH vērtībām. Modificētas barotnes izmantošana ir sīki jāapraksta un jāpamato (2)(3). 1.8.4. Biomasas sākotnējā koncentrācija Testa kultūru sākotnējai biomasai ir jābūt vienādai visās testa kultūrās un pietiekami mazai, lai kultūra visu inkubācijas periodu varētu augt eksponenciāli, neiztērējot barības vielas. Sākotnējā biomasa nedrīkst pārsniegt 0,5 mg/l sausnas masas. Šīs ir ieteiktās sākotnējās šūnu koncentrācijas: Pseudokirchneriella subcapitata: 5 × 103-104 šūnas/ml Desmodesmus subspicatus 2–5 × 103 šūnas/ml Navicula pelliculosa 104 šūnas/ml Anabaena flos-aquae 104 šūnas/ml Synechococcus leopoliensis 5 × 104-105 šūnas/ml 1.8.5. Testējamās vielas koncentrācija Koncentrāciju intervālu, kurā iespējama iedarbība, var noteikt, ņemot vēr