Padomes Direktīva 98/57/EK (1998. gada 20. jūlijs) par Ralstonia Solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. apkarošanu



Oficiālais Vēstnesis L 235 , 21/08/1998 Lpp. 0001 - 0039

CS.ES Nodaļa 3 Sējums 23 Lpp. 375 - 413

ET.ES Nodaļa 3 Sējums 23 Lpp. 375 - 413

HU.ES Nodaļa 3 Sējums 23 Lpp. 375 - 413

LT.ES Nodaļa 3 Sējums 23 Lpp. 375 - 413

LV.ES Nodaļa 3 Sējums 23 Lpp. 375 - 413

MT.ES Nodaļa 3 Sējums 23 Lpp. 375 - 413

PL.ES Nodaļa 3 Sējums 23 Lpp. 375 - 413

SK.ES Nodaļa 3 Sējums 23 Lpp. 375 - 413

SL.ES Nodaļa 3 Sējums 23 Lpp. 375 - 413



Padomes Direktīva 98/57/EK (1998. gada 20. jūlijs) par Ralstonia Solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. apkarošanu EIROPAS SAVIENĪBAS PADOME, ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu, jo īpaši tā 43. pantu, ņemot vērā Komisijas priekšlikumu [1], ņemot vērā Eiropas Parlamenta atzinumu [2], ņemot vērā Ekonomikas un sociālo lietu komitejas atzinumu [3], tā kā kaitīgais organisms Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al. agrāk bija pazīstams kā Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; tā kā paredzams, ka Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kļūs par vispārpieņemto šā organisma apzīmējumu; tā kā šai direktīvā jāņem vērā minētā zinātniskā tendence; tā kā kartupeļu un tomātu audzēšana ieņem nozīmīgu vietu Kopienas lauksaimniecībā; tā kā kartupeļu un tomātu ražu pastāvīgi apdraud kaitīgi organismi; tā kā, aizsargājot kartupeļu un tomātu audzēšanu pret šādiem kaitīgiem organismiem, varētu ne tikai uzturēt ražošanas jaudu, bet arī palielināt lauksaimniecības produktivitāti; tā kā aizsardzības pasākumiem, lai novērstu kaitīgo organismu ievazāšanu atsevišķās dalībvalstīs, būs ierobežota iedarbība, ja šādi organismi netiks vienlaicīgi un metodiski kontrolēti visā Kopienā un netiks ierobežota to izplatīšanās; tā kā viens no kartupeļu un tomātu kaitīgajiem organismiem ir Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., kas izraisa kartupeļu tumšo gredzenpuvi un kartupeļu un tomātu bakteriālo vīti; tā kā šā patogēna izraisīto slimību uzliesmojumi ir bijuši konstatēti vairākās Kopienas daļās un vēl joprojām pastāv daži ierobežoti infekcijas avoti; tā kā visā Kopienā būs ievērojami apdraudēta kartupeļu un tomātu audzēšana, ja attiecībā uz minētajām kultūrām netiks veikti efektīvi pasākumi, lai noteiktu šā organisma atrašanās vietu un tā izplatību, lai nepieļautu tā parādīšanos un izplatīšanos un, konstatējot to, nepieļautu tā izplatīšanos un apkarotu to, lai izskaustu pavisam; tā kā šā mērķa sasniegšanai Kopienā jāveic konkrēti pasākumi tā kā dalībvalstij turklāt jābūt iespējai vajadzības gadījumā veikt papildu vai stingrākus pasākumus, ņemot vērā to, ka kartupeļu vai tomātu apritei Kopienā nav ierobežojumu, izņemot tos, kas noteikti Padomes 1976. gada 21. decembra Direktīvā 77/93/EEK par aizsargpasākumiem pret augiem vai augu produktiem kaitīgu organismu ievešanu Kopienā un to izplatīšanos Kopienā [4]; tā kā par šādiem pasākumiem jāziņo pārējām dalībvalstīm un Komisijai; tā kā, veidojot pasākumus, jāņem vērā, ka vajadzīgi sistemātiski oficiāli apsekojumi, lai noteiktu šā patogēna atrašanās vietu; tā kā šādiem apsekojumiem jāietver pārbaudes un attiecīgos gadījumos paraugu ņemšanas un testēšanas procedūras, ņemot vērā, ka slimība zināmos vides apstākļos var saglabāties latentā veidā un bez redzamām pazīmēm gan kartupeļu stādījumos, gan uzglabātajos kartupeļu bumbuļos; tā kā patogēna izplatībai stādījumos nav izšķirīga loma, jo tas var izplatīties arī ar virszemes ūdeņiem un dažiem saistītiem nakteņu dzimtas savvaļas augiem, tādēļ kartupeļu un tomātu stādījumu apūdeņošana, izmantojot inficētu ūdeni, rada risku, ka šie stādījumi inficēsies; tā kā patogēns var pārziemot arī kartupeļu un tomātu augos, kas iesējušies paši, un tie var kļūt par infekcijas avotu, no vienas veģetācijas perioda pārejot uz nākamo; tā kā patogēns izplatās arī, kartupeļiem saskares veidā inficējoties no jau inficētiem kartupeļiem un no stādīšanas, ražas novākšanas un apstrādes iekārtām vai transporta un uzglabāšanas konteineriem, kas inficējušies ar šo organismu iepriekšējā saskarē ar inficētiem kartupeļiem; tā kā patogēna izplatīšanos var ierobežot vai novērst, dekontaminējot minētos priekšmetus; tā kā šāda sēklas kartupeļu inficēšanās rada ievērojamu risku, ka patogēns turpinās izplatīties; tāpat arī sēklas kartupeļu latenta saslimšana rada ievērojamu risku, ka patogēns turpinās izplatīties, un to var novērst, izmantojot sēklas kartupeļus, kas iegūti oficiāli apstiprinātā programmā, kurā sēklas kartupeļiem ir veikta testēšana un tie ir atzīti par neinficētiem; tā kā tagadējās bioloģiskās un epidemioloģiskās zinātnes atziņas par Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. izturēšanos Eiropas apstākļos ir nepilnīgas, un paredzams, ka pēc dažām turpmākajām sezonām nāksies pārskatīt ierosinātos pasākumus; tāpat paredzams, ka tiks uzlabotas arī testu procedūras, ņemot vērā turpmākos pētījumus, jo īpaši attiecībā uz testa metožu precizitāti un specifiskumu, lai atlasītu un standartizētu optimālās pieejamās testa metodes; tā kā dalībvalstīm būtu vēlams cieši sadarboties ar Pastāvīgās augu veselības komitejas (še turpmāk "komiteja") komisiju, lai paredzētu sīkākus noteikumus šādos vispārējos pasākumos, kā arī dalībvalstu stingrākajos vai papildu pasākumos, kas tiek veikti, lai novērstu patogēna ievešanu to teritorijā, IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU. 1. pants Šī direktīva attiecas uz pasākumiem, kas dalībvalstīm jāveic pret Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., kurš agrāk bija pazīstams kā Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (še turpmāk "organisms"), attiecībā uz šā organisma saimniekaugiem, kas minēti I pielikuma I iedaļā (še turpmāk "uzskaitītais stādāmais materiāls"): a) lai noteiktu tā atrašanās vietu un izplatību; b) lai nepieļautu tā parādīšanos un izplatīšanos; un c) lai, konstatējot šo organismu, nepieļautu tā izplatīšanos un apkarotu to, lai izskaustu pavisam. 2. pants 1. Dalībvalstis reizi gadā veic sistemātiskus oficiālus apsekojumus, lai pārbaudītu organisma atrašanos uzskaitītajā stādāmajā materiālā, kas iegūts to teritorijā. Dalībvalstis veic riska novērtējumu, lai noteiktu citus iespējamos inficēšanās avotus, kas apdraud uzskaitītā stādāmā materiāla audzēšanu, un, izņemot gadījumu, ja šajā novērtējumā nav konstatēts risks, ka organisms varētu izplatīties, tās uzskaitītā stādāmā materiāla audzēšanas apvidos veic oficiālus mērķa apsekojumus, lai pārbaudītu organisma atrašanos augos, kas nepieder uzskaitītajam stādāmajam materiālam, tostarp nakteņu dzimtas savvaļas saimniekaugos, kā arī virszemes ūdeņos, kas tiek izmantoti uzskaitītā stādāmā materiāla apūdeņošanai vai apmiglošanai, un notekūdeņos, kas iegūti no uzskaitītā stādāmā materiāla rūpnieciskās pārstrādes vai pakotavas telpām un tiek izmantoti uzskaitītā stādāmā materiāla apūdeņošanai vai apmiglošanai. Šo mērķa apsekojumu apjomu nosaka atkarībā no konstatētā riska. Dalībvalstis var veikt arī oficiālus apsekojumus, lai pārbaudītu organisma atrašanos tādos materiālos kā augsnes substrāts, augsne un cietie atkritumi, kas iegūti no rūpnieciskās pārstrādes vai pakotavas telpām. 2. Oficiālos apsekojumus, kas minēti 1. punktā, veic: a) uzskaitītajam stādāmajam materiālam atbilstoši I pielikuma II iedaļas 1. punktā minētajām detaļām; un b) saimniekaugiem, kas nepieder uzskaitītajam stādāmajam materiālam, un ūdenim, tostarp notekūdeņiem, izmantojot piemērotas metodes un vajadzības gadījumā ņemot paraugus, kam laboratorijā veic oficiālu vai oficiāli uzraudzītu testēšanu; c) vajadzības gadījumā citam materiālam, izmantojot piemērotas metodes. Direktīvas 77/93/EEK izpratnē atbildīgās valsts struktūras nosaka šiem apsekojumiem sīki izstrādātus noteikumus par pārbaudes procedūru un paraugu skaitu, izcelsmi, stratifikāciju un ņemšanas laiku, pamatojoties uz saprātīgiem zinātniskiem un statistiskiem principiem un organisma bioloģiju, un, ņemot vērā attiecīgajā dalībvalstī pieņemtās uzskaitītā stādāmā materiāla un vajadzības gadījumā citu organisma saimniekaugu audzēšanas sistēmas. 3. Sīkākas ziņas par 1. punktā minētajiem oficiālajiem apsekojumiem un to rezultātiem katru gadu paziņo pārējām dalībvalstīm un Komisijai saskaņā ar I pielikuma II iedaļas 2. punkta noteikumiem. Šos paziņojumus iesniedz līdz 1. jūnijam, izņemot paziņojumus par kartupeļiem, ko izmanto kā saimniecībā pašu vajadzībām audzētu sēklu, kuri jāiesniedz līdz 1. septembrim. Sīkākās ziņas par kultūraugiem un to ražu sniedz saistībā ar iepriekšējā gada audzēšanas datiem. Komitejai var iesniegt sīkākas ziņas par paziņojumiem. 4. Saskaņā ar Direktīvas 77/93/EEK 16.a pantā izklāstīto procedūru nosaka: - piemērotas metodes, kā veikt apsekojumus un testēšanu laboratorijas, kas paredzēti 2. punkta pirmās daļas b) apakšpunktā. 5. Saskaņā ar Direktīvas 77/93/EEK 16.a pantā izklāstīto procedūru var noteikt: - piemērotas metodes, kā veikt apsekojumus, kas paredzēti 2. punkta pirmās daļas c) apakšpunktā; - sīkākus noteikumus par apsekojumiem, kas paredzēti 2. punkta otrajā daļā, lai izveidotu pielīdzināmu drošības līmeni dalībvalstu vidū. 3. pants Dalībvalstis nodrošina, lai to atbildīgajām valsts struktūrām tiktu ziņots par aizdomām vai apstiprinājumu, ka organisms parādījies to teritorijā. 4. pants 1. Ja pastāv aizdomas par organisma parādīšanos, tad dalībvalsts(-u) atbildīgās valsts struktūras nodrošina, lai laboratorijā tiktu veikti oficiāla vai oficiāli uzraudzīta testēšana, kurā uzskaitītajam stādāmajam materiālam izmanto II pielikumā noteikto atbilstošo metodi un ievēro III pielikuma 1. punkta nosacījumus, vai visos pārējos gadījumos jebkuru citu oficiāli apstiprinātu metodi, kas apstiprinātu vai noraidītu aizdomas par organisma parādīšanos. Ja aizdomas tiek apstiprinātas, tad piemēro III pielikuma 2. punktā noteiktās prasības. 2. Kamēr 1. punktā minētās aizdomas par organisma parādīšanos nav nedz apstiprinātas, nedz noraidītas, ikreiz, kad, rodoties aizdomām par organisma parādīšanos, ir: i) novērotas organisma izraisītās slimības diagnostikas pazīmes un iegūts pozitīvs rezultāts ātrajā skrīningā(-os), kas aprakstīts II pielikuma I iedaļas 1. punktā un II iedaļā; vai ii) iegūts pozitīvs rezultāts skrīningā(-os), kas aprakstīts II pielikuma I iedaļas 2. punktā un III iedaļā, dalībvalstu atbildīgās valsts struktūras attiecībā uz savu ražošanu: a) aizliedz augu un bumbuļu apriti no visiem kultūraugiem, to partijām vai sūtījumiem, no kuriem ņemti paraugi, izņemot gadījumu, ja attiecīgā struktūra kontrolē apriti un ja ir konstatēts, ka nav nosakāma riska, ka organisms varētu izplatīties; b) veic pasākumus, lai noskaidrotu aizdomu izcelsmi; c) lai nepieļautu organisma izplatīšanos, ievieš piemērotus papildu drošības pasākumus, kas pielāgoti novērtētā riska pakāpei, jo īpaši attiecībā uz uzskaitītā stādāmā materiāla audzēšanu un tādu sēklas kartupeļu partiju apriti, uz kurām neattiecas a) apakšpunkts, kuras izaudzēti audzēšanas vietā, kur ņemti a) apakšpunktā minētie paraugi. 3. Ja, rodoties aizdomām par organisma parādīšanos, pastāv risks, ka inficēsies uzskaitītais stādāmais materiāls vai virszemes ūdeņi citā(s) dalībvalstī(s) vai no turienes notikusi inficēšanās, tad dalībvalsts, kurā saņemts paziņojums par aizdomām par organisma parādīšanos, nekavējoties paziņo otrai (citām) dalībvalstij(-īm) sīkākas ziņas par šīm aizdomām atkarībā no noteiktā riska, un minētās dalībvalstis izveido atbilstošu sadarbību. Dalībvalsts(-is), kas saņēmusi(-ušas) šādu paziņojumu, ievieš drošības pasākumus saskaņā ar 2. punkta c) apakšpunktu un pēc vajadzības veic visus pārējos pasākumus saskaņā ar 1. un 2. punktu. 4. Saskaņā ar Direktīvas 77/93/EEK 16.a pantā izklāstīto procedūru var noteikt: - pasākumus, kas minēti 2. punkta c) apakšpunktā. 5. pants 1. Ja laboratorijā notikusi oficiāla vai oficiāli uzraudzīta testēšana, kurā, uzskaitītajam stādāmajam materiālam izmantojot II pielikumā noteiktās atbilstošās metodes vai visos pārējos gadījumos – jebkuras citas oficiāli apstiprinātas metodes, tiek gūts apstiprinājums, ka organisms atrodas paraugā, kas ņemts saskaņā ar šo direktīvu, tad dalībvalsts atbildīgās valsts struktūras, ņemot vērā saprātīgus zinātniskos principus, organisma bioloģiju un šajā dalībvalstī pieņemtās organisma saimniekaugu konkrētās audzēšanas, tirgvedības un pārstrādes sistēmas: a) uzskaitītajam stādāmajam materiālam: i) paredz izmeklēšanu, lai saskaņā ar IV pielikuma noteikumiem noteiktu inficēšanās apjomu un primāro(s) avotu(s), turpinot testēšanu vismaz visiem saistīto klonu sēklas kartupeļu krājumiem saskaņā ar 4. panta 1. punktu, un ii) atzīst par inficētu uzskaitīto stādāmo materiālu, kravu un/vai partiju, no kuras ņemts paraugs, kā arī mehānismus, transportlīdzekļus, kuģus, noliktavas vai to vienības un visus pārējos objektus, tostarp saiņojuma materiālu, kas atradušiesies saskarē ar uzskaitīto stādāmo materiālu, no kura ņemts paraugs; vajadzības gadījumā arī atzīst par piesārņotiem lauku(s), aizsargātu(-as) augkopības vienību(-as) un audzēšanas vietu(-as), kurās tika novākts uzskaitītais stādāmais materiāls un no kurām tika ņemts paraugs; ja paraugi ņemti augšanas periodā, atzīst par inficētiem lauku(s), augkopības vietu(-as) un vajadzības gadījumā aizsargātu(-as) augkopības vienību(-as), no kurām ņemts paraugs, un iii) saskaņā ar V pielikuma 1. punkta nosacījumiem nosaka apmēru, kādā pirms vai pēc ražas ievākšanas, audzēšanas, apūdeņošanas vai miglošanas gaitā vai ar saistītu klonu starpniecību iespējama saskares veida inficēšanās no jau apstiprinātas inficēšanās, un iv) norobežo teritoriju, pamatojoties uz atzinumu par inficēšanos saskaņā ar ii) daļu, iespējamās inficēšanās apmēru, kas noteikts saskaņā ar iii) daļu, un organisma iespējamo izplatīšanos saskaņā ar V pielikuma 2. punkta i) daļas noteikumiem; b) saimniekaugu kultūrām, kas nav minētas a) apakšpunktā, ja uzskaitītā stādāmā materiāla ražošana atzīta par apdraudētu: i) paredz izmeklēšanu saskaņā ar a) apakšpunkta i) daļu; un ii) atzīst par inficētiem organisma saimniekaugus, no kuriem ņemts paraugs; un iii) atbilstīgi a) apakšpunkta iii) un iv) daļai attiecīgi nosaka potenciālās inficēšanās apmēru un norobežo teritoriju saistībā ar uzskaitītā stādāmā materiāla audzēšanu; c) virszemes ūdeņiem (ieskaitot notekūdeņus no rūpnieciskās pārstrādes vai pakotavas telpām, kur notiek darbs ar uzskaitīto stādāmo materiālu) un saistītajiem nakteņu dzimtas saimniekaugiem, ja uzskaitītā stādāmā materiāla audzēšana atzīta par apdraudētu apūdeņošanas, apmiglošanas vai virszemes ūdeņu pārplūšanas dēļ: i) paredz izmeklēšanu, tostarp oficiālu apsekojumu, piemērotos laikos ņemot virszemes ūdeņu paraugus un vajadzības gadījumā savvaļas nakteņu dzimtas augu paraugus, lai noteiktu inficēšanās apmēru; un ii) atzīst par inficētiem virszemes ūdeņus, no kuriem ņemts(-i) paraugs(-i), pamatojoties uz i) daļā minētajā izmeklēšanā noskaidroto apmēru; un iii) nosaka potenciālās inficēšanās apmēru un norobežo teritoriju, pamatojoties uz atzinumu par inficēšanos saskaņā ar ii) daļu un organisma iespējamo izplatīšanos saskaņā ar V pielikuma 1. punkta un 2. punkta ii) daļas noteikumiem. 2. Dalībvalstis saskaņā ar V pielikuma 3. punkta noteikumiem nekavējoties paziņo pārējām dalībvalstīm un Komisijai par visiem inficēšanās gadījumiem, kas atzīti saskaņā ar 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu un 1. punkta c) apakšpunkta ii) daļu, un sniedz sīkākas ziņas par teritoriju, kas norobežota saskaņā ar 1. panta a) apakšpunkta iv) daļu un vajadzības gadījumā saskaņā ar 1. punkta c) apakšpunkta iii) daļu. Komitejai var iesniegt sīkākas ziņas par paziņojumiem, kas veikti saskaņā ar šo punktu. Dalībvalstis vienlaikus iesniedz Komisijai papildu paziņojumu, kas noteikts V pielikuma 4. punktā. Komitejas locekļiem nekavējoties sniedz sīkākas ziņas, kas paredzētas šajā punkta daļā. 3. Pēc 2. punktā minētā paziņojuma un tajā sniegto sīkāko ziņu saņemšanas pārējās paziņojumā norādītās dalībvalstis paredz izmeklēšanu saskaņā ar 1. punkta a) apakšpunkta i) daļu un vajadzības gadījumā saskaņā ar 1. punkta c) apakšpunkta i) daļu un atkarībā no nepieciešamības veic turpmākus pasākumus saskaņā ar 1. un 2. punktu. 6. pants 1. Dalībvalstis nosaka, ka uzskaitīto stādāmo materiālu, kas atzīts par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu, nedrīkst audzēt un ka ar to veic vienu no VI pielikuma 1. punkta pasākumiem, nodrošinot atbildīgo valsts struktūru kontroli un saņemot to apstiprinājumu, lai pēc tam varētu atzīt, ka nav nosakāmu organisma izplatīšanās draudu. 2. Dalībvalstis nosaka, ka uzskaitīto stādāmo materiālu, kas atzīts par iespējami inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iii) daļu un c) apakšpunkta iii) daļu, tostarp uzskaitīto stādāmo materiālu, kam konstatēts apdraudējums un kas iegūts audzēšanas vietās, kuras atzītas par iespējami inficētām saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iii) daļu, nedrīkst audzēt, un tam paredz piemērotu izmantojumu atbildīgo valsts struktūru kontrolē vai iznīcina kā noteikts VI pielikuma 2. punktā, lai pēc tam varētu atzīt, ka nav nosakāmu organisma izplatīšanās draudu. 3. Dalībvalstis nosaka, ka visus mehānismus, transportlīdzekļus, kuģus, noliktavas vai to vienības un visus pārējos objektus, tostarp saiņojuma materiālu, kas atzīti par inficētiem saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu vai atzīti par iespējami inficētiem saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iii) daļu un c) apakšpunkta iii) daļu, iznīcina vai dekontaminē, izmantojot piemērotas metodes, kas noteiktas VI pielikuma 3. punktā. Pēc dekontaminācijas šādus objektus vairs neuzskata par inficētiem. 4. Neietekmējot pasākumus, kas īstenoti saskaņā ar 1., 2. un 3. punktu, dalībvalstis nosaka, ka teritorijā, kas norobežota saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iv) daļu un c) apakšpunkta iii) daļu veic virkni pasākumu atbilstoši VI pielikuma 4.1. un 4.2. punktam. Sīkākas ziņas par šiem pasākumiem ik gadu paziņo pārējām dalībvalstīm un Komisijai. Komitejai var iesniegt sīkākas ziņas par šo paziņojumu. 7. pants 1. Dalībvalstis nosaka, ka sēklas kartupeļiem jāatbilst Direktīvas 77/93/EEK prasībām un jābūt tiešā veidā iegūtiem no kartupeļu materiāla, kurš iegūts oficiāli apstiprinātā programmā un kurā nav atrasts organisms pēc oficiālas vai oficiāli pārraudzītas testēšanas, izmantojot atbilstošo metodi, kas noteikta II pielikumā. Dalībvalsts veic minēto testēšanu: a) ja apstiprinājies, ka organisms atrasts to sēklas kartupeļu ražošanā: i) testējot iepriekšējo pavairojamo materiālu, tostarp veicot sākotnējo klonu selekciju un sistemātisku bāzes sēklas kartupeļu klonu testēšanu; vai ii) ja konstatēts, ka nepastāv klonu saistība, testējot visu bāzes sēklas kartupeļu klonus vai iepriekšējo pavairojamo materiālu, tostarp veicot sākotnējo klonu selekciju, un b) pārējos gadījumos visiem sākotnējās klonu selekcijas augiem vai bāzes sēklas kartupeļu vai iepriekšējā pavairojamā materiāla reprezentatīviem paraugiem. 2. Saskaņā ar Direktīvas 77/93/EEK 16.a pantā izklāstīto procedūru var pieņemt: - sīki izstrādātus noteikumus par to, kā piemērot 1. punkta otrās daļas a) apakšpunktu, - noteikumus par reprezentatīviem paraugiem, kas minēti 1. punkta otrās daļas b) apakšpunktā. 8. pants Dalībvalstis aizliedz saglabāt organismu un strādāt ar to. 9. pants Neierobežojot Direktīvas 77/93/EEK noteikumus, dalībvalstis drīkst atļaut piemērot izņēmumus no šīs direktīvas 6. un 8. pantā minētajiem pasākumiem saskaņā ar Direktīvā 95/44/EK [5] paredzētajiem noteikumiem attiecībā uz izmēģinājumiem vai zinātniskiem mērķiem un šķirņu selekcijas darbu. 10. pants Dalībvalstis saistībā ar savu ražošanu var pieņemt tādus papildu vai stingrākus pasākumus, kādi var būt vajadzīgi, lai apkarotu organismu vai nepieļautu tā turpmāku izplatīšanos, ciktāl tie atbilst Direktīvas 77/93/EEK noteikumiem. Sīkākas ziņas par šiem pasākumiem paziņo pārējām dalībvalstīm un Komisijai. Komitejai var iesniegt sīkākas ziņas par šo paziņojumu. 11. pants Šīs direktīvas pielikumu grozījumus, ņemot vērā zinātnes vai tehnikas atziņu attīstību, pieņem saskaņā ar Direktīvas 77/93/EEK 16.a pantā paredzēto procedūru. Komisija sagatavo ziņojumu, kur, ņemot vērā gūto pieredzi, ir pārskatīti šīs direktīvas II pielikumā noteiktās metodes un VI pielikuma 4.1. un 4.2. punktā paredzētie pasākumi, un ziņojumu iesniedz komitejai līdz 2002. gada 1. janvārim. 12. pants 1. Dalībvalstis pieņem normatīvus un administratīvus aktus, kas vajadzīgi, lai no 1999. gada 21. augusta izpildītu šīs direktīvas prasības. Tās par to tūlīt informē Komisiju. Kad dalībvalstis pieņem šos pasākumus, tajos iekļauj atsauci uz šo direktīvu vai arī šādu atsauci pievieno to oficiālajai publikācijai. Dalībvalstis nosaka paņēmienus, kā izdarīt šādas atsauces. 2. Dalībvalstis tūlīt dara Komisijai zināmus to tiesību aktu svarīgākos noteikumus, kurus tās pieņēmušas jomā, uz ko attiecas šī direktīva. Komisija par to informē pārējās dalībvalstis. 13. pants Šī direktīva stājas spēkā dienā, kad to publicē Eiropas Kopienu Oficiālajā Vēstnesī. 14. pants Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm. Briselē, 1998. gada 20. jūlijā Padomes vārdā — priekšsēdētājs W. Molterer [1] OV C 124, 21.4.1997., 12. lpp. un OV C 108, 7.4.1998., 85. lpp. [2] OV C 14, 19.1.1998., 34. lpp. [3] OV C 206, 7.7.1997., 57. lpp. [4] OV L 26, 31.1.1977., 20. lpp. Direktīvā jaunākie grozījumi izdarīti ar Komisijas Direktīvu 98/2/EK (OV L 15, 21.1.1998., 34. lpp). [5] OV L 184, 3.8.1995., 34. lpp. Direktīvā jaunākie grozījumi izdarīti ar Komisijas Direktīvu 97/46/EK (OV L 204, 31.7.1997., 43. lpp). -------------------------------------------------- I PIELIKUMS I IEDAĻA Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. 1. pantā minēto saimniekaugu saraksts Solanum tuberosum L.augi (ieskaitot bumbuļus), izņemot sēklas | Kartupeļi | Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. augi, izņemot augļus un sēklas | Tomāti | II IEDAĻA Apsekojumi 1. Direktīvas 2. panta 2. punkta a) apakšpunktā minētie oficiālie apsekojumi ir balstīti uz organisma bioloģiju un attiecīgās dalībvalsts īpašajām audzēšanas sistēmām, tie ietver: i) kartupeļiem: - vizuālu stādījumu pārbaudi un/vai sēklas un citu kartupeļu paraugu ņemšanu attiecīgajos laikos veģetācijas periodā vai glabātavā. Šiem paraugiem veic oficiālu vai oficiālā uzraudzībā veiktu vizuālu pārbaudi, pārgriežot bumbuļus, un - sēklas kartupeļiem un vajadzības gadījumā arī citiem kartupeļiem oficiālu vai oficiālā uzraudzībā veiktu laboratorijas testēšanu, izmantojot II pielikumā noteikto metodi; ii) tomātiem: - attiecīgajos laikos vizuālu pārbaudi vismaz to augu stādījumos, ko paredzēts pārstādīt profesionālai izmantošanai. 2. Paziņojumā par 2. panta 3. punktā minētajiem oficiālajiem apsekojumiem ietver šādas ziņas: i) kartupeļu apsekojumiem: - lēstā sēklas un citu kartupeļu stādījumu kopplatība hektāros, - stratifikācija pēc sēklas kategorijas un galda kartupeļiem, ja tas attiecas uz konkrēto gadījumu, – pēc reģiona, - testējamo paraugu skaits un to ņemšanas laiks, - vizuālo lauka pārbaužu skaits, - bumbuļiem veikto vizuālo pārbaužu skaits (un parauga lielums); ii) vismaz to tomātu stādījumu apsekojumiem, ko paredzēts pārstādīt profesionālai izmantošanai: - lēstais augu kopskaits, - vizuālo pārbaužu skaits; iii) citu saimniekaugu, izņemot kartupeļus un tomātus, tostarp nakteņu dzimtas savvaļas saimniekaugu apsekojumiem: - sugas, - paraugu skaits un to ņemšanas laiks, - paraugu ņemšanas vieta/upe, pēc vajadzības, - analīžu metode; iv) ūdens un rūpnieciskās pārstrādes vai pakotavas telpu notekūdeņu apsekojumiem: - paraugu skaits un to ņemšanas laiks, - paraugu ņemšanas vieta/upe/telpu atrašanās vieta, pēc vajadzības, - analīžu metode. -------------------------------------------------- II PIELIKUMS TESTA SHĒMA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOSTICĒŠANAI, NOTEIK- ŠANAI UN IDENTIFICĒŠANAI TESTA SHĒMAS DARBĪBAS JOMA Turpmākajā shēmā aprakstītas dažādas procedūras, kas saistītas ar: i) kartupeļu tumšās gredzenpuves diagnosticēšanu kartupeļu bumbuļos un bakteriālās vītes diagnosticēšanu kartupeļu un tomātu augos; ii) Ralstonia solanacearum noteikšanu kartupeļu bumbuļu paraugos; iii) Ralstonia solanacearum identificēšanu. Papildinājumos ir sniegtas sīkākas ziņas par testa materiālu sagatavošanu, t.i., barotnēm, buferšķīdumiem, šķīdumiem, reaģentiem. SATURS I IEDAĻA: | Testa shēmas piemērošana | 9 | 1.kartupeļu tumšās gredzenpuves diagnosticēšana kartupeļu bumbuļos un bakteriālās vītes diagnosticēšana kartupeļu un tomātu augos | 9 | 2.Ralstonia solanacearumnoteikšana un identificēšana kartupeļu bumbuļu paraugos | 11 | II IEDAĻA: | kartupeļu tumšās gredzenpuves diagnosticēšana kartupeļu bumbuļos un bakteriālās vītes diagnosticēšana kartupeļu un tomātu augos | 13 | 1.Pazīmes | 13 | 2.Ātrais(-ie) skrīnings(-i) | 13 | 3.Izolēšanas procedūra | 14 | 4.Apstiprinājuma tests(-i) | 14 | III IEDAĻA: | Ralstonia solanacearumnoteikšana un identificēšana kartupeļu bumbuļu paraugos | 17 | 1.Parauga sagatavošana testēšanai | 17 | 2.Imunofluorescences (IF) tests | 18 | 3.Enzīmsaistītā imūnsorbenta (ELISA) tests | 20 | 4.Polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR™) tests | 20 | 5.Selektīva uzsējuma tests | 22 | 6.Bioraudzes tests | 23 | 7.Bagātināšanas tests | 23 | 8.Patogenitātes tests | 23 | 1.papildinājums | Barotnes Ralstonia solanacearum izolēšanai un kultivēšanai | 24 | 2.papildinājums | Paraugu sagatavošanas materiāli | 25 | 3.papildinājums | IF testa materiāli | 26 | 4.papildinājums | Infekcijas pakāpes noteikšana IF testā | 27 | 5.papildinājums | ELISA testa materiāli | 28 | 6.papildinājums | PCR testa materiāli | 29 | 7.papildinājums | Selektīva uzsējuma un bioraudzes testa materiāli | 29 | Atsauces | 30 | I IEDAĻA TESTA SHĒMAS PIEMĒROŠANA 1. Kartupeļu tumšās gredzenpuves diagnosticēšana kartupeļu bumbuļos un bakteriālās vītes diagnosticēšana kartupeļu un tomātu augos Šī testa procedūra ir paredzēta kartupeļu bumbuļiem ar pazīmēm, kas raksturīgas kartupeļu tumšajai gredzenpuvei vai rada aizdomas par tādas esamību, un tomātu augiem ar pazīmēm, kas raksturīgas bakteriālajai vītei vai rada aizdomas par tādas esamību. Tā ietver ātro skrīningu, patogēna izolēšanu no inficētajiem stublāja vaskulārajiem audiem diagnostikas vidē un, ja iegūts pozitīvs rezultāts, kultūras identificēšanu ar Ralstonia solanacearum. +++++ TIFF +++++ Operāciju secības shēmā minētās norādes: () Pazīmju apraksts sniegts II iedaļas 1. punktā. () Ātrie skrīningi atvieglo prezumptīvo diagnozi. Piemēroti testi ir šādi: - stublāja vaskulāro audu strīmings (II iedaļas 2. punkts), - poli-β-hidroksibutirata granulu tests (II iedaļas 2. punkts), - IF tests (III iedaļas 2. punkts), - ELISA tests (III iedaļas 3. punkts), - PCR tests (III iedaļas 4. punkts). () Kaut arī patogēnu ir ļoti vienkārši izolēt no augu materiāla ar raksturīgām pazīmēm, izmantojot atšķaidījuma uzsējumu, vēlākās infekcijas fāzēs var neizdoties kultūras audzēšana. Saprofītiskās baktērijas, kas attīstās inficētos audos, var pāraugt patogēnu vai inhibēt to izolēšanas vidē. Ja izolēšanas tests ir negatīvs, taču ir raksturīgās slimības pazīmes, tad izolēšana jāatkārto, vēlams, veicot selektīva uzsējuma testu. () Ralstonia solanacearum tīrkultūru iespējams droši identificēt, veicot vismaz vienu II iedaļas 4.1. punktā minēto testu, apvienojot to ar patogenitātes testu (II iedaļas 4.3. punkts). Celma raksturojums nav obligāts, taču vēlams katrā jaunā gadījumā. 2. Ralstonia solanacearum noteikšana un identificēšana kartupeļu bumbuļu paraugos Šī procedūra ir paredzēta, lai kartupeļu bumbuļos noteiktu latentu infekciju ar viena vai, vēlams, vairāku skrīningu palīdzību, kurus, gūstot pozitīvu rezultātu, papildina patogēna izolēšana; un, ja ir izolētas raksturīgas kolonijas, seko tīrkultūras identificēšana ar Ralstonia solanacearum. +++++ TIFF +++++ Operāciju secības shēmā minētās norādes: () Parauga lielums Standarta lielums ir 200 bumbuļi. Tomēr šo procedūru var ērti izmantot arī paraugiem, kuros ir mazāk nekā 200 bumbuļu. () Skrīnings Viens skrīnings var nebūt pietiekami jutīgs vai drošs, lai paraugā noteiktu Ralstonia solanacearum. Tādēļ vēlams veikt vairāk nekā vienu skrīningu, un šo skrīningu pamatā vajadzētu izraudzīties dažādus bioloģiskos principus. () Imunofluorescences (IF) tests IF tests ir vispāratzīts skrīnings. Tā ir priekšrocība salīdzinājumā ar citiem testiem, kas vēl nav pilnībā izstrādāti vai validēti. Šo testu izmanto daudzu citu karantīnas baktēriju, piem., Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus noteikšanai. Ņemot vērā šajā metodē noteiktos nolasīšanas parametrus, tas ir tests ar augstu jutības pakāpi (noteikšanas robeža 10-10 šūnas vienā mililitrā kartupeļu ekstrakta granulveida nogulšņu). Testa rezultātu drošuma izšķirīgais kritērijs ir imūnseruma kvalitāte. Lietot drīkst tikai imūnserumu ar augstu titru (vismaz 2000 neapstrādātam imūnserumam), un visi testi jāveic ar imūnserumu vai tā atšķaidījumu, kura vērtība ir zemāka par norādīto. Priekšroka dodama netiešajai metodei. Tiešo metodi var izmantot, ja testa jutīguma pakāpe un specifiskums ir līdzvērtīgi netiešajai metodei. IF testam ir tāda priekšrocība, ka iespējams subjektīvi interpretēt šūnu iekrāsošanās morfoloģiju un fluorescences intensitāti, kas sniedz informāciju par reakcijas specifiskumu. Bieži sastopamas savstarpējas reakcijas ar seroloģiski radniecīgām no augsnes nākošām vai pie bumbuļiem pielipušām baktērijām, kam ir tāda pati šūnu morfoloģija kā Ralstonia solanacearum. IF testu var izmantot par vienīgo skrīningu, kaut arī gadījumos, kad ir aizdomas par savstarpējām reakcijām, vajadzētu veikt papildu skrīningu, kura pamatā ir atšķirīgs bioloģisks princips. Šādos gadījumos vispiemērotākais ir selektīva uzsējuma tests. () Selektīva uzsējuma tests Tā kā šai testā izmanto modificētu SMSA barotni un šai metodei paredzēto testēšanas metodiku, runa ir par jutīgu un selektīvu testu Ralstonia solanacearum noteikšanai. Rezultātu iegūst 3 līdz 6 dienās pēc parauga sagatavošanas. Patogēnu iegūst tieši kultūrā, un to var viegli identificēt. Lai pilnībā izmantotu testa potenciālu, vajag rūpīgi sagatavot bumbuļu pamatnes, lai novērstu sekundāro, kartupeļu bumbuļiem pielipušo baktēriju parādīšanos, kas barotnē konkurē ar Ralstonia solanacearum un var ietekmēt patogēna attīstību. Dažiem celmiem var būt lēna augšana, jo barotnes sastāvdaļas var ietekmēt mērķa organismu. Jāpievērš uzmanība arī tam, lai Ralstonia solanacearum atšķirtu no citām baktērijām, kas var attīstīties barotnē. Selektīvo uzsējumu var izmantot kā vienīgo skrīningu ar noteikumu, ka aizdomu gadījumos, ka negatīvs testa rezultāts iegūts tādēļ, ka Ralstonia solanacearum barotnē inhibējušas citas baktērijas, paraugu pārbauda vēlreiz, izmantojot citu testu, lai apstiprinātu vai noraidītu šo diagnozi. Šādos gadījumos vispiemērotākais ir IF tests. () ELISA tests ELISA tests, kopumā ņemot, nav tik jutīgs kā IF tests (noteikšanas robeža 10-10 šūnas vienā mililitrā kartupeļu ekstrakta granulveida nogulšņu). Šis tests ir lēts un ātri veicams, taču kopumā tajā biežāk parādās šķietami pozitīvi (savstarpējas reakcijas) un šķietami negatīvi (fenola molekulu inhibēšana kartupeļu ekstraktā). Prasības, kas izvirzītas imūnseruma specifiskumam, ir ārkārtīgi augstas. ELISA testu nevar izmantot kā vienīgo skrīningu. () PCR tests PCR ir tests ar ļoti liela jutīguma potenciālu, tomēr baktēriju attīstību bieži inhibē auga vai bumbuļu ekstrakta sastāvdaļas, kas izraisa šķietami negatīvu rezultātu. Dažām kartupeļu šķirnēm ir vairāk inhibitoru nekā citām. Tādēļ šādus inhibitorus vajag likvidēt. Inhibēšanu var samazināt atšķaidot, taču šādā gadījumā tiks atšķaidītas arī Ralstonia solanacearum populācijas. Visos parauga un testa sagatavošanas posmos jāpievērš liela vērība, lai novērstu inficēšanos, kas izraisītu šķietami pozitīvus testa rezultātus. Šķietami pozitīvi rezultāti var rasties arī no citu organismu secības homoloģijas. Šo iemeslu dēļ tiešo PCR nevar izmantot kā vienīgo skrīningu. () Bagātināšanas tests Izturot kartupeļu ekstrakta granulveida nogulšņu paraugus pusselektīvā buljonā, piemēram, modificētā SMSA buljonā, var notikt Ralstonia solanacearum vairošanās. Vēl svarīgāk, iespējams, ir tas, ka tādējādi tiek izšķīdināti arī ELISA vai PCR testa potenciālie inhibitori. Tādējādi bagātinātajā buljonā Ralstonia solanacearum var noteikt ar IF, ELISA un PCR testu. Neiesakām veikt tiešu uzsējumu no bagātināta buljona. Šīs bagātināšanas metodes vēl nav pilnībā izmēģinātas un testētas. Tās ietvertas tādēļ, ka tām piemīt liels potenciāls. Tomēr tās nevar izmantot kā vienīgās noteikšanas metodes, ņemot vērā relatīvo pieredzes trūkumu darbā ar tām. () Bioraudzes tests Bioraudzes testu izmanto. lai izolētu Ralstonia solanacearum no kartupeļu ekstrakta granulveida nogulsnēm, veicot selektīvu saimniekauga bagātināšanu, un to var veikt ar tomātu vai baklažānu augiem. Šim testam vajadzīgi optimāli inkubācijas apstākļi, kas noteikti šai metodē. Visticamāk, ka baktērijas, kas inhibē Ralstonia solanacearum SMSA barotnē, neietekmēs šā testa norisi. () Apstiprinājuma tests(-i) Ralstonia solanacearum tīrkultūru iespējams droši identificēt, veicot vismaz vienu II iedaļas 4.1. punktā minēto testu, apvienojot to ar patogenitātes testu (II iedaļas 4.3. punkts). Celma raksturojums nav obligāts, taču vēlams katrā jaunā gadījumā. II IEDAĻA KARTUPEĻU TUMŠĀS GREDZENPUVES DIAGNOSTICĒŠANA KARTUPEĻU BUMBUĻOS UN BAKTERIĀLĀS VĪTES DIAGNOSTICĒŠANA KARTUPEĻU UN TOMĀTU AUGOS 1. Pazīmes 1.1. Pazīmes kartupeļos Kartupeļu augi. Infekcijas agrīnajā fāzē auga galotnei dienā augstā temperatūrā apvīst lapas, taču naktī tās atgūstas. Vīte ātri kļūst neatgriezeniska un beidzas ar auga bojāeju. Šķērsām pārgriežot novītušo augu stublājus, to vaskulārie audi var nobrūnēt, un no griezuma vietas izdalās biezs, pienains šķidrums vai tāds viegli izdalās saspiežot. Ja nogrieztu stublāju vertikāli ievieto ūdenī, no vaskulārajiem kūlīšiem izplūst gļotu pavedieni. Kartupeļu bumbuļi. Kartupeļu bumbuļi jāpārgriež šķērsām netālu no to pamatnēm (stolona). Infekcijas agrīnajā fāzē vaskulārais gredzens ir mainījis krāsu no blāvi dzeltenas līdz gaiši brūnai, pēc dažām minūtēm vai, netālu no griezuma virsmas ar īkšķiem viegli saspiežot miziņu, no tā pēkšņi izdalās biezs, blāvs krēmkrāsas šķidrums. Vēlāk vaskulārā gredzena krāsa kļūst brūnāka, un nekroze var pāriet uz parenhimatozajiem audiem. Vēlākajās fāzēs no bumbuļu pamatnēm un acīm izplatās infekcija, tādējādi miziņā var rasties sarkanbrūni, nedaudz padziļināti bojājumi, no kuriem ar šķidrumu var izdalīties baktērijas, izraisot augsnes daļiņu pielipšanu. 1.2. Pazīmes tomātos Tomātu augi. Pirmā redzamā pazīme ir jaunāko lapu šļaugans izskats. Ja patogēnam ir labvēlīgi attīstības apstākļi (augsnes temperatūra ap 25 °C, augsts mitruma līmenis), dažu dienu laikā vienā auga pusē vai visam augam sākas epinastija un vīte, kas beidzas ar pilnīgu auga bojāeju. Ja apstākļi nav tik labvēlīgi (augsnes temperatūra zemāka nekā 21 °C), uz stumbra var attīstīties liels daudzums papildsakņu. Pa stumbru var novērot ejam gļotainu līniju, kas liecina par nekrozi vaskulārajā sistēmā. Ja stublāju pārgriež šķērsām, no vaskulārajiem audiem, kas kļuvuši brūni, izdalās bieza, balta vai dzeltenīga bakteriāla šķidruma pilieni. 2. Ātrie skrīningi Ātrie skrīningi atvieglo prezumptīvo diagnozi. Izmantot vienu vai vairākus no turpmākajiem testiem. Stublāju strīmings Ralstonia solanacearum atrašanos apvītušos kartupeļu vai tomātu stublājos var noteikt ar turpmāk aprakstītā vienkāršā prezumptīvā testa palīdzību. Nogriezt stublāju tieši virs zemes. Griezuma vietu ievietot vārglāzē ar ūdeni. Drīz vien no vaskulārajiem kūlīšiem pēkšņi izplūdīs bakteriālu gļotu pavedieni. Pārējām baktērijām, kas izraisa vaskulāras infekcijas kartupeļu vai tomātu augos, šis fenomens nav raksturīgs. Poli-ß-hidroksibutirāta (PHB) granulu noteikšana PHB granulas Ralstonia solanacearum šūnās kļūst redzamas, iekrāsojot ar Nīlas zilo A vai Sudānas melno B. Sagatavot izdalījumu vai suspendētu audu uztriepi uz priekšmetstikliņa vai sagatavot 48 stundas nogatavinātas kultūras uztriepi uz YPGA vai SPA (1. papildinājums). Sagatavot pozitīvas kontroles uztriepes no 2. biovara 3. rases celma un vajadzības gadījumā negatīva heterologā celma uztriepes. Ļauj nožūt. Priekšmetstikliņa apakšējo virsmu dažas reizes pārlaiž pār liesmu, līdz uztriepe ir nofiksējusies. Nīlas zilā tests 1) Uz fiksētās uztriepes uzliet Nīlas zilā A 1 % šķīdumu ūdenī. Izturēt 10 minūtes 55 °C temperatūrā. 2) Notecināt iekrāsoto šķīdumu. Ātri noskalot lēni tekošā krāna ūdenī. Lieko ūdeni nosusināt ar papīra salveti. 3) Uz uztriepes uzliet 8 % etiķskābes šķīdumu ūdenī. Izturēt vienu minūti istabas temperatūrā. 4) Noskalot lēni tekošā krāna ūdenī. Nosusināt ar papīra salveti. 5) Samitrināt vēlreiz ar pilienu ūdens. Uzlikt segstikliņu. 6) Iekrāsoto uztriepi pārbaudīt ar epifluorescences mikroskopu zem 450 nm eļļas slāņa, izmantojot tūkstoškārtīgu palielinājumu. Pārbaudīt, vai nav manāmas spilgti oranžas, fluorescējošas PHB granulas. Parastā gaismā arī pārbaudīt, vai granulas ir intracelulāras un vai šūnu morfoloģija ir raksturīga Ralstonia solanacearum. Sudānas melnā tests 1) Uz fiksētās uztriepes uzliet 0,3 % Sudānas melnā B šķīdumu 70 % etanolā. Izturēt 10 minūtes istabas temperatūrā. 2) Notecināt iekrāsoto šķīdumu. Ātri noskalot zem krāna. Notecināt lieko ūdeni. Lieko ūdeni nosusināt ar papīra salveti. 3) Uztriepi uz īsu brīdi iegremdēt ksilolā. Nosusināt ar papīra salveti. Uzmanību! Ksilols ir kaitīga viela. Strādāt velkmes skapī. 4) Uzliet uz uztriepes 0,5 %m/V safranīna šķīdumu ūdenī un 10 sekundes atstāt istabas temperatūrā. Uzmanību! Safranīns ir kaitīga viela. Strādāt velkmes skapī. 5) Noskalot lēni tekošā krāna ūdenī. Nosusināt ar papīra salveti. Uzlikt segstikliņu. 6) Pārbaudīt iekrāsoto uztriepi ar gaismas mikroskopu, izmantojot atstarotu gaismu, iegremdējot eļļā un izmantojot tūkstoškārtīgu palielinājumu. PHB granulas Ralstonia solanacearum šūnās iekrāsojas zilganmelnas. Šūnu sieniņas iekrāsojas sārtas. Pārējie testi Pārējie piemērotie skrīninga testi ir IF tests (III iedaļas 2. punkts), ELISA tests (III iedaļas 3. punkts) un PCR tests (III iedaļas 4. punkts). 3. Izolēšanas procedūra 3.1 No kartupeļu bumbuļa vaskulārā gredzena vai no kartupeļa vai tomāta auga stublāja vaskulārajiem šķiedru pavedieniem noņemt izdalījušos šķidrumu vai krāsu mainījušos audus. Suspendēt nelielā daudzumā sterila destilēta ūdens vai 50 mM fosfāta buferšķīduma. Atstāt neaiztiktu 5 līdz 10 minūtes. 3.2 Sagatavot desmitkāršo suspensijas atšķaidījuma rindu, piem., 1/10 un 1/100 vai vajadzības gadījumā vairāk. 3.3 Suspensijas standarttilpumu un atšķaidījumus pievienot universālajai barotnei (NA, YPGA un SPA, 1. papildinājums) un/vai Kelmana tetrazola barotnei (1. papildinājums), un/vai SMSA selektīvajai barotnei (7. pielikums). Izlīdzināt vai iztriept, izmantojot piemērotu atšķaidījuma uzsējuma metodi. Ja to uzskata par lietderīgu, sagatavot plates ar katru atsevišķo izmantoto barotni, pozitīva rezultāta kontrolei izmantojot atšķaidītu virulentu 2. biovara 3. rases celma Ralstonia solanacearum šūnu suspensijas kultūru. 3.4 Plates izturēt trīs dienas 28 °C. Izturēšanu drīkst pagarināt līdz sešām dienām, ja augšana noris lēni, taču uz SMSA platēm kolonijas bieži kļūst neraksturīgas un atmirst. Universālā barotnē Ralstonia solanacearum virulentie izolāti veido pērļaini baltas, plakanas, neregulāras šķidras konsistences kolonijas, kam bieži attīstās raksturīgi spirāles veida vijumi. Kelmana tetrazola barotnē Ralstonia solanacearum virulento izolātu tipiskās kolonijas ir krēmkrāsas, plakanas, neregulāras un ar šķidru konsistenci, to centrā veidojas asinssarkani spirāles veida vijumi. Ralstonia solanacearum nevirulentās formas veido sviestveida konsistences kolonijas tumši sarkanā krāsā. SMSA barotnē Ralstonia solanacearum virulento izolātu tipiskās kolonijas ir pienbaltā krāsā, neregulāras un šķidras konsistences, centrā tās ir iekrāsojušās asinssarkanas. Ralstonia solanacearum nevirulento formu veidotajām kolonijām nav tik šķidra konsistence, SMSA barotnē tās ir pilnīgi sārtā līdz sarkanā krāsā. 3.5 Kolonijas ar raksturīgu morfoloģiju, izmantojot subkultūru, attīrīt universālā barotnē. Novērst regulāru subkultūru veidošanos, kas varētu izraisīt virulences zudumu. 4. Apstiprinājuma tests(-i) 4.1. Ralstonia solanacearum identificēšana Identificēt Ralstonia solanacearum, izmantojot vismaz vienu no turpmākajām metodēm. Barības vielu un fermentu testi Piezīme: katrā testā iekļaut piemērotus kontroles celmus. Fluorescējošs pigments | - | PHB ieslēgumi | + | Oksidācijas/fermentācijas (O/F) tests | O+/F- | Katalāze | + | Kovaka (Kovac's) oksidāze | + | Nitrātu reducēšana | + | Citrātu izmantošana | + | Augšana 40 °C | - | Augšana 1 % NaCl | + | Augšana 2 % NaCl | - | Arginīna dihidrolāze | - | Želatīna sašķidrināšana | - | Cietes hidrolīze | - | Esulīna hidrolīze | - | Levāna veidošanās | - | Barotne un metodes minētas Lelliott & Stead, 1987. IF tests No kultūras un kontroles celma(-iem) sagatavot suspensiju ar 10 šūnām vienā mililitrā. Sagatavot divkāršu imūnseruma atšķaidījumu rindu. Veikt IF procedūru (III iedaļas 2. punkts). Kultūras IF titram jābūt vienādam ar pozitīvas kontroles titru. ELISA tests No kultūras un kontroles celma(-iem) sagatavot suspensiju ar vairāk nekā 104 šūnām vienā mililitrā. Veikt ELISA procedūru (III iedaļas 3. punkts). Kultūras ELISA vērtībai jābūt vienādai ar pozitīvas kontroles vērtību. PCR tests No kultūras un kontroles celma(-iem) sagatavot suspensiju ar 10 šūnām vienā mililitrā. Veikt PCR procedūru (III iedaļas 4. punkts). Kultūras PCR produktam jābūt tikpat lielam un ar tādu pašu restriktāzes analīzes (REA) shēmu kā pozitīvai kontrolei. In situ fluorescences hibridizācija (FISH) No kultūras un kontroles celma(-iem) sagatavot suspensiju ar 106 šūnām vienā mililitrā. Veikt FISH procedūru (van Beuningen et al, 1995), izmantojot OLI-1 PCR praimeru (Seal et al, 1993). Kultūrai jādod tāda pati reakcija kā pozitīvai kontrolei. Olbaltumvielu elektroforēzes aina Denaturētu veselu šūnu olbaltumvielas nošķir poliakrilamīda gēla elektroforēzē – PAGE (Stead, 1992a). Taukskābju sastāva profils (FAP) Kultūru un pozitīvu kontroles celmu triptāzes sojas agarā audzēt 48 stundas 28 °C temperatūrā un veikt FAP procedūru (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Kultūras profilam jābūt vienādam ar pozitīvas kontroles profilu. Norādītajos apstākļos raksturīgās taukskābes ir 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH un 18:1 2OH. 4.2. Celma raksturojums Celma raksturojums nav obligāts, tomēr tas ieteicams katrā jaunajā gadījumā, izmantojot vismaz vienu no turpmākajām metodēm. - Biovara noteikšana Ralstonia solanacearum iedala biovaros atkarîbâ no tâs spçjas veidot skâbi no trim heksozes spirta un trim cukura molekulâm (Hayward, 1964 & 1994): | Biovars | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | —Izmantojot: | | | | | | —maltozi | - | + | + | - | + | —laktozi | - | + | + | - | + | —celobiozi | - | + | + | - | + | —mannītu | - | - | + | + | + | —sorbītu | - | - | + | + | - | —dulcītu | - | - | + | + | - | Ar papildu testiem 2. biovaru iedala apakfenotipos (Hayward, 1994): | 2. biovars | 2-A biovars | 2-T biovars | Izmantojot trehalozi | - | + | + | Izmantojot inozitolu | + | - | + | Izmantojot D-ribozi | - | - | + | Pektolītiskā aktivitāte | zema | zema | augsta | Rases noteikšana Rasi (Buddenhagen et al., 1962) var noteikt, izmantojot patogenitâtes testu tomâtu augiem vai baklaÞâniem un tabakas augiem un hipersensivitâtes reakciju (HR) testu tabakas lapâm (Lozano and Sequeira, 1970). | [1]Rase | 1 | 2 | 3 | Reakcija: | | | | —tomātu augos/baklažānos | vīte | nav reakcijas | vīte | —tabakas augos | vīte | nav reakcijas | nav reakcijas | —tabakas lapās | nekroze (48 st.) un vīte (7 līdz 8 dienās) | HR (12 līdz 24 st.) | hloroze (2 līdz 8 dienas) | Rases raksturojums, izmantojot patogenitātes testu vai tabakas hipersensitivitātes testu, var nebūt pārāk precīzs, un to var atvasināt no biovara un sākotnējā dabiskā saimniekauga. Kultūru var raksturot arī: Genoma nospiedums Ralstonia solanacearum kompleksa celmu molekulāro diferenciāciju var veikt, izmantojot: RFLP analīzi (Cook et al, 1989) Atkārtotu PCR sekvenci [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al., 1995 Smith et al, 1995)] 4.3. Patogenitātes tests Tests domāts, lai apstiprinātu Ralstonia solanacearum diagnozi un novērtētu to kultūru virulenci, kas identificētas par Ralstonia solanacearum. Sagatavot no kultūras un pozitīvas kontroles celma inokulātu ar 10 šūnām vienā mililitrā. Inokulēt 5 līdz 10 tomātu vai baklažānu augus, kas, vēlams, būtu trešo īsto lapu fāzē vai vecāki (III iedaļas 6. punkts). Izturēt divas nedēļas 22 °C līdz 28 °C temperatūrā augsta relatīvā mitruma apstākļos, ik dienas apūdeņojot. Novērot, vai neparādās vīte un/vai epinastija, hloroze, augšanas aizture. Veikt izolēšanu no augiem ar slimības pazīmēm atbilstoši turpmākajam aprakstam: - no stublāja noņemt audu daļu 2 cm virs inokulācijas punkta, - sasmalcināt un suspendēt nelielā daudzumā sterila destilēta ūdens vai 50 mM fosfāta buferšķīduma. Tad iztriept uz plates, izturēt un pārbaudīt, vai parādījušās Ralstonia solanacearum tipiskās kolonijas. III IEDAĻA RALSTONIA SOLANACEARUM NOTEIKŠANA UN IDENTIFICĒŠANA KARTUPEĻU BUMBUĻU PARAUGOS Piezīme: Standartparauga lielums ir 200 bumbuļi. Tomēr šo procedūru var ērti izmantot arī paraugiem, kuros ir mazāk nekā 200 bumbuļu. 1. Parauga sagatavošana testēšanai Piezīme: Kartupeļu ekstrakta granulveida nogulsnes, ko iegūst šajā procedūrā, var izmantot arī Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus noteikšanai. Iespējas, kā rīkoties pirms testēšanas, ja to uzskata par lietderīgu: i) izturēt paraugu 25-30 °C temperatūrā līdz divām nedēļām, lai veicinātu zemo Ralstonia solenacearum populāciju vairošanos; ii) nomazgāt bumbuļus zem tekoša ūdens ar piemērotiem dezinfekcijas un mazgāšanas līdzekļiem. Ļaut bumbuļiem nožūt. 1.1 Ar tīru un dezinficētu skalpeli vai dārzeņu nazi noņemt mizu pie bumbuļa pamatnes, lai atsegtu vaskulāros audus. No bumbuļa pamatnes rūpīgi izgriezt mazu konusveida gabaliņu (3-5 mm diametrā). Raudzīties, lai nevaskulāro audu daudzums būtu pēc iespējas mazāks. Šādi apstrādāt katru bumbuli paraugā. Piezīme: šai fāzē var veikt bumbuļu vizuālo pārbaudi (II iedaļas 1. punkts). Atlikt malā bumbuļus ar nopietnām puves pazīmēm un testēt tos atsevišķi (II iedaļa). 1.2 Bumbuļu pamatnes savākt noslēgtā traukā. Bumbuļu pamatnes vajadzētu nekavējoties apstrādāt. Ja tas nav iespējams, uzglabāt tās ne ilgāk par 24 stundām vai 4 °C temperatūrā ne ilgāk par 72 stundām. 1.3 Pārstrādāt bumbuļu pamatnes, izmantojot vienu no turpmākajām metodēm. i) Pārlikt bumbuļu pamatnes piemērotā traukā. Pieliet pietiekami daudz macerācijas buferšķīduma (2. papildinājums), lai tas nosegtu bumbuļu pamatnes. Sasmalcināt bumbuļu pamatnes Waring Blender homogenizatorā vai Ultra Thurrax homogenizatorā, līdz panākta pilnīga homogenizācija. Izvairīties no pārmērīgas homogenizācijas. Ļaut macerātam iesūkties 15 līdz 30 minūtes. ii) Pārlikt bumbuļu pamatnes piemērotā traukā. Pieliet pietiekami daudz macerācijas buferšķīduma, lai tas nosegtu bumbuļu pamatnes. Uzlikt trauku uz kratītāja. Izturēt pie 50 līdz 100 apgr./min. 4 stundas 20 līdz 22 °C vai 16 līdz 24 stundas 4 °C temperatūrā. iii) Pārlikt bumbuļu pamatnes izturīgā, vienreiz lietojamā macerācijas maisiņā (, piem., Stomacher Lab Blender homogenizatora maisiņā, kura izmēri ir 105 mm × 150 mm, radioaktīvi sterils). Bumbuļu pamatnes rūpīgi sašķaidīt ar piemērotu instrumentu, piem., āmuru, līdz notikusi pilnīga homogenizācija. Pieliet pietiekami daudz macerācijas buferšķīduma, lai tas nosegtu bumbuļu pamatnes. Ļaut macerātam nostāties 15 līdz 30 minūtes. 1.4 Ekstrahēt baktērijas no pārstrādātajām bumbuļu pamatnēm, izmantojot vienu no turpmākajām metodēm. i) Macerātu viegli dekantēt centrifūgas stobriņā, pārpalikumus atstājot traukā vai maisiņā. Ja dekantētais macerāts ir duļķains, centrifugēt to temperatūrā, kas mazāka par 10 °C, ne vairāk kā180 g 10 minūtēs. Centrifugēt dekantēto macerātu vai centrifugātu, kas radies pēc pirmā centrifugēšanas posma, 7000 g 15 minūtes vai 10000 g 10 minūtes temperatūrā, kas zemāka par 10 °C. Noliet centrifugātu, neskarot granulveida nogulsnes. ii) Izfiltrēt macerātu caur filtrācijas sistēmu, kuras poru izmērs ir 40 līdz 100 μm. Uzlabot filtrāciju, izmantojot vakuuma sūkni. Filtrātu savākt centrifūgas stobriņā. Izmazgāt filtru ar macerācijas buferšķīdumu. Centrifugēt filtrātu 7000 g 15 minūtes vai 10000 g 10 minūtes temperatūrā, kas zemāka par 10 °C. Noliet centrifugātu, neskarot granulveida nogulsnes. 1.5 Atkārtoti suspendēt granulveida nogulsnes 1 ml granulveida nogulšņu buferšķīduma (2. papildinājums). Sadalīt tās divās vienādās daļās un katru daļu ievietot mikropudelītē. Vienu mikropudelīti izmantot testēšanai. Atlikušo ekstraktu testēšanas laikā saglabāt 4 °C. Otrai mikropudelītei pievienot 10-25 % (v/v) sterila glicerīna. Samaisīt. Uzglabāt –18 °C (dažas nedēļas) vai –70 °C (dažus mēnešus). 2. IF tests Izmantot Ralstonia solanacearum imūnserumu, vēlams, 3. rases 2. biovaru. Noteikt titru suspensijai no Ralstonia solanacearum homologa celma ar 106 šūnām vienā mililitrā, izmantojot piemērotu fluoresceīna izotiocianāta (FITC) konjugāta atšķaidījumu atbilstoši ražotāja norādījumiem. Neapstrādātā imūnseruma IF titram jābūt vismaz 1:2000. Izmantot daudzlauciņu priekšmetstikliņus, kuriem, vēlams, būtu 10 lodziņi vismaz 6 mm diametrā. Uz katra stikliņa uzlikt FITC konjugāta kontroli. Tests jāatkārto ar PBS kontroli, ja FITC kontrolē tiek novērota kāda pozitīva šūna. Sagatavot atsevišķus pozitīvas kontroles priekšmetstikliņus ar Ralstonia solanacearum attiecīgās rases un biovara celma suspensiju ar 10 šūnām vienā mililitrā. Izmantot vienu priekšmetstikliņu katrā testu komplektā. 2.1 Sagatavot testu priekšmetstikliņus, izmantojot vienu no turpmākajām procedūrām: i) Granulveida nogulsnēm ar samērā nelielu cietes daudzumu. Atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu standarttilpumu (15 μl atbilst lodziņam ar 6 mm diametru – lielākiem lodziņiem šo tilpumu proporcionāli palielināt) ar pipeti uzpilināt vienai lodziņu rindai. Atlikušo rindu var izmantot kā dublikātu vai otram paraugam, kā parādīts 1. attēlā. ii) Pārējām granulveida nogulsnēm: sagatavot atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu decimālatšķaidījumus, t.i., 1/10, 1/100 un 1/1000, granulveida nogulšņu buferšķīdumā. Nomērītu katra atšķaidījuma un atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu standarttilpumu (15 μl atbilst lodziņam ar 6 mm diametru – lielākiem lodziņiem šo tilpumu proporcionāli palielināt) ar pipeti uzpilināt lodziņu rindai. Atlikušo rindu var izmantot kā dublikātu vai otram paraugam kā parādīts 2. attēlā. 2.2 Pilieniem ļaut nožūt. Baktēriju šūnas nofiksēt uz priekšmetstikliņa, sakarsējot, apdedzinot ar liesmu vai izmantojot 95 % etanolu. 2.3 IF procedūra i) Sagatavojot testa priekšmetstikliņus atbilstoši 2.1. punkta i) daļai Sagatavot imūnseruma divkāršu atšķaidījumu komplektu IF buferšķīdumā (3. papildinājums): ¼ no titra (T/4), ½ no titra (T/2), titrs (T) un divkāršs titrs (2T). ii) Sagatavojot testa priekšmetstikliņus atbilstoši 2.1. punkta ii) daļai. Sagatavot imūnseruma darba atšķaidījumu IF buferšķīdumā. Darba atšķaidījums ir optimāli specifisks imūnseruma atšķaidījums, un parasti tam ir puse no titra vērtības. +++++ TIFF +++++ 1. attēlsTesta priekšmetstiklina sagatavošana atbilstoši 2.1. punkta i) dalai un 2.3. punkta i) dalai +++++ TIFF +++++ 2. attēlsTesta priekšmetstiklina sagatavošana atbilstoši 2.1. punkta ii) dalai un 2.3. punkta ii) dalai 2.3.1 Priekšmetstikliņus salikt uz mitrām papīra salvetēm. Testēšanas lodziņus pārklāt ar imūnseruma atšķaidījumu(-iem). Uz FITC lodziņiem uzpilināt PBS buferšķīdumu. Imūnseruma tilpumam, kas uzpilināts lodziņam, jābūt vienādam ar ekstrakta tilpumu. 2.3.2 Izturēt nosegtus 30 minūtes istabas temperatūrā. 2.3.3 Imūnseruma pilienus nopurināt no stikliņa un stikliņus rūpīgi nomazgāt IF buferšķīdumā. Piecas minūtes mazgāt PBS-Tween buferšķīdumā un pēc tam vēl piecas minūtes IF buferšķīdumā (3. papildinājums). Rūpīgi nosusināt lieko šķidrumu. 2.3.4 Priekšmetstikliņus salikt uz mitrām papīra salvetēm. Nosegt testa lodziņus un FITC lodziņu ar FITC konjugāta atšķaidījumu, ko izmantoja, lai noteiktu titru. Konjugāta tilpumam, kas uzklāts lodziņiem, jābūt vienādam ar lietoto imūnseruma tilpumu. 2.3.5 Izturēt nosegtus 30 minūtes istabas temperatūrā. 2.3.6 Nopurināt konjugāta pilienus no priekšmetstikliņa. Noskalot un nomazgāt kā minēts iepriekš (2.3.3. punktā). Rūpīgi nosusināt lieko šķidrumu. 2.3.7 Ar pipeti uz katra lodziņa uzpilināt 5-10 μl 0,1 M fosfātbuferēta glicerīna (3. papildinājums) vai līdzīgas saistvielas un uzlikt segstikliņu. 2.4 IF testa rezultātu nolasīšana Testa priekšmetstikliņus pārbaudīt ar epifluorescences mikroskopu, izmantojot filtrus, kas piemēroti FITC ierosai, iegremdējot eļļā un palielinot 500 līdz 1000 reizes. Lodziņus skenēt pa diviem diametriem, kas krustojas taisnā leņķī, un pa perimetru. Vispirms pārbaudīt pozitīvā kontrolparauga priekšmetstikliņu. Šūnām jābūt spilgti fluorescējošām un pilnīgi iekrāsotām. Piezīme: tests jāatkārto, ja krāsojumam ir novirze no normālā. Nolasīt testa priekšmetstikliņus. Vispirms pārbaudīt, vai FITC kontrolparauga lodziņos nav fluorescējošu šūnu. Ja FITC kontrolparaugā ir fluorescējošas šūnas, tas liecina par konjugāta nespecifisku saistīšanos, pašfluorescenci vai inficēšanos. Piezīme: atkārtot testu, ja novērota šāda parādība. Pārbaudīt, vai testa lodziņos ir atrodamas spilgti fluorescējošas šūnas ar Ralstonia solanacearum raksturīgu morfoloģiju. Fluorescences intensitātei jābūt tādai pašai kā pozitīvajam kontroles celmam tajā pašā imūnseruma atšķaidījumā. Šūnas, kas nav pilnībā iekrāsojušās vai fluorescē vāji, neņem vērā, izņemot, ja to ir daudz (skatīt IF testa rezultātu interpretēšanu). IF testa rezultātu interpretēšana: i) Ja nav atrastas spilgti fluorescējošas šūnas ar raksturīgo morfoloģiju, tad IF tests ir negatīvs. ii) Ja ir atrastas spilgti fluorescējošas šūnas ar raksturīgo morfoloģiju, noteikt vidējo šūnu skaitu mikroskopa lauciņā un aprēķināt šūnu skaitu (N) vienā mililitrā atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu (4. papildinājums). Populāciju ar apmēram 10 šūnām vienā mililitrā atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu uzskata par IF testa vismazāk nosakāmo koncentrāciju: - paraugiem, kam vienā mililitrā atkārtoti suspendētu granulveida nogulšņu N > 10 šūnu, IF testu uzskata par pozitīvu, - paraugiem, kam vienā mililitrā atkārtoti suspendētu granulveida nogulšņu N < 10 šūnu, IF testu var uzskatīt par pozitīvu, iii) ja imūnseruma titrā redzams liels skaits (> 10 šūnas/ml) nepilnīgi vai vāji fluorescējošu šūnu, jāveic otrs tests: - tests, kura pamatā ir cits bioloģiskais princips, vai - atkārtots IF tests, izmantojot otru imūnserumu vai desmitkārtīgu granulveida nogulšņu atšķaidījumu. 3. ELISA tests Pamatā ņemts Robinson-Smith et al., 1995. Izmantot Ralstonia solanacearum imūnserumu, vēlams, 3. rases 2. biovaru. Noteikt titru suspensijai ar 10 šūnām vienā mililitrā Ralstonia solanacearum homologā celma. Ieteicams izmantot NUNC-Polysorb mikrotitra plāksnes. Izmantot negatīvu kartupeļu ekstrakta kontroli un fosfātbuferēta fizioloģiskā nātrija hlorīda šķīduma (PBS) kontroli. Izmantot Ralstonia solanacearum attiecīgās rases un biovara celma suspensiju ar > 10 šūnām vienā mililitrā kā pozitīvu kontroli. Testēt tāpat kā paraugu(s), tomēr rūpīgi nodalot no paraugiem uz mikrotitra plāksnes. 3.1 Ar pipeti iepilināt mikropudelītē 100 līdz 200 μl atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu. 4 minūtes karsēt 100 °C temperatūrā. Mikropudelīti novietot uz ledus. 3.2 Pievienot tādu pašu tilpumu divkārša karbonāta pārklājuma buferšķīduma (5. papildinājums). Samaisīt. 3.3 Vismaz diviem mikrotitra plāksnes padziļinājumiem katrā iepildīt 100 μl alikvotās daļas. Izturēt vienu stundu 37 °C temperatūrā vai pa nakti 4 °C. 3.4 Aizvākt ekstraktu no padziļinājumiem. Padziļinājumus trīs reizes izmazgāt ar PBS-Tween buferšķīdumu (5. papildinājums), pēdējās mazgāšanas reizes šķīdumu atstājot padziļinājumos vismaz piecas minūtes. 3.5 Sagatavot piemērotu Ralstonia solanacearum imūnseruma atšķaidījumu bloķējošā buferšķīdumā (5. papildinājums). Iepildīt padziļinājumos 100 μl imūnseruma atšķaidījuma. Izturēt vienu stundu 37 °C temperatūrā. 3.6 Aizvākt imūnserumu no padziļinājumiem. Izmazgāt padziļinājumus kā aprakstīts iepriekš (3.4. punkts). 3.7 Sagatavot piemērotu bāziskā fosfatāzes konjugāta atšķaidījumu bloķējošā buferšķīdumā. Iepildīt padziļinājumos 100 μl konjugāta atšķaidījuma. Izturēt vienu stundu 37 °C temperatūrā. 3.8 Aizvākt imūnserumu no padziļinājumiem. Izmazgāt padziļinājumus kā aprakstīts iepriekš (3.4. un 3.6. punkts). 3.9 Sagatavot bāziskā fosfatāzes substrāta šķīdumu (5. papildinājums). Iepildīt padziļinājumos 100 μl. Izturēt tumsā istabas temperatūrā 30 minūtes līdz vienu stundu. 3.10 Nolasīt absorbciju pie 409 nm. ELISA testa rezultātu interpretēšana: ELISA tests ir negatīvs, ja parauga optiskais blīvums (OD) ir divreiz mazāks par negatīvās kontroles optisko blīvumu. ELISA tests ir pozitīvs, ja parauga optiskais blīvums (OD) ir divreiz lielāks par negatīvās kontroles optisko blīvumu. 4. PCR tests Par pamatu ņemts Seal et al., 1993. Piezīme: visos parauga sagatavošanas posmos un citās darbībās, kas saistītas ar PCR, jāizmanto pipetes uzgaļi ar filtru. Sagatavot suspensiju ar 10 šūnām vienā mililitrā Ralstonia solanacearum 3. rases 2. biovara celma kā pozitīvu kontroli. Testēt tāpat kā paraugu(s). 4.1 Ar pipeti iepilināt mikropudelītē 100 μl atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu. Alternatīvi iepildīt 90 μl atkārtoti suspendētu granulveida nogulšņu mikropudelītē, kurā atrodas 10 μl 0,5M NaOH. Samaisīt, vairākas reizes apgriežot mikropudelīti otrādi. 4.2 Četras minūtes karsēt 100 °C temperatūrā. Mikropudelīti nekavējoties novietot uz ledus. 4.3 Sagatavot vismaz divus decimālatšķaidījumus, piem., 1/10 un 1/100, vai vairāk, ja to uzskata par lietderīgu, sterilā destilētā vai ultratīrā ūdenī (UPW). 4.4 Sagatavot PCR reakcijas maisījumu (6. papildinājums) sterilā mēģenē, pievienojot turpmākās sastāvdaļas šādā secībā: Reakcijas tilpumam 50 μl: Sastāvdaļa | Daudzums | Galīgā koncentrācija | Sterils destilāts vai UPW | 30,8 µl – 33,8 µl | | 10 x PCR buferšķīdums | 5,0 µl | 1x | d-ATP | 1,0 µl | 0,2 mM | d-CTP | 1,0 µl | 0,2 mM | d-GTP | 1,0 µl | 0,2 mM | d-TTP | 1,0 µl | 0,2 mM | OLI-1 praimers (20 µM) | 2,5 µl | 1 µM | Y-2 praimers (20 µM) | 2,5 µl | 1 µM | Taq polimerāze (5U/µl) | 0,2 µl | 1,0 µU | Kopējais tilpums | 45 µl – 48 µl | | Vairākām reakcijām: Aprēķināt katras sastāvdaļas daudzumu vajadzīgajam reakciju skaitam. Sajaukt sastāvdaļas un iepildīt 45 līdz 48 μl maisījuma sterilās PCR mēģenēs. Mēģenes ar PCR reakcijas maisījumu turēt uz ledus. Reakcijas tilpumam 25 μl: Proporcionāli samazināt sastāvdaļu tilpumu. 4.5 PCR paplašināšana 4.5.1 Fakultatīvi: Vibrocentrifugēt mēģenes ar uzvārīto paraugu un pozitīvo kontroli. Noteiktajā secībā mēģenei ar PCR reakcijas maisījumu pievienot 2 līdz 5 μl paraugu(s), ūdens kontroli un pozitīvo kontroli. Mēģenes ievietot DNS termiskajā karstuma kamerā. 4.5.2 Palaist šādu programmu. 1 cikls: 2 minūtes 96 °C temperatūrā : matricas denaturācija. 50 cikli 20 sekundes 94 °C temperatūrā : denaturācija, 20 sekundes 68 °C temperatūrā : praimera renaturācija 30 sekundes 72 °C temperatūrā : atkārtojumu paplašināšana. 1 cikls v) 10 minūtes 72 °C temperatūrā : paplašināšanas turpināšana. 1 cikls vi) turēt 4 °C temperatūrā. Piezīme: Šie parametri paredzēti iekārtai Perkin Elmer 9600. Citiem termiskajiem cikliem var būt nepieciešams PCR reakcijas mēģenēs uzliet minerāleļļas virskārtu un/vai modificēt ii), iii) un iv) soļa ilgumu paplašināšanas profilā. 4.5.3 Izņemt mēģenes no termiskās karstuma kameras. Analizēt PCR produktu. Ja to nedara uzreiz, uzglabāt mēģenes 4 °C temperatūrā, ja tās paredzēts izmantot tajā pašā dienā, vai –18 °C, ja glabāšanas laiks paredzams ilgāks. 4.6 PCR produkta analīze PCR fragmentus nosaka ar agarozes gela elektroforēzi un iekrāso ar etīdija bromīdu. 4.6.1 Sagatavo piemērotu agarozes gēlu, viegli uzvārot agarozi tris-acetāt-elektroforēzes (TAE) buferšķīdumā. 4.6.2 Izkausēto agarozi atdzesēt līdz 50-60 °C, iepildīt elektroforēzes aparāta veidnē un ielikt suku. Šķīdumam ļaut sacietēt. 4.6.3 Izņemt suku. Gelu atkārtoti iegremdēt TAE, lai buferšķīdums to mazliet nosegtu (par 2 līdz 3 mm). 4.6.4 Uz parafilmas uzpilināt 3 μl pilienus papildinājuma buferšķīduma. Pievienot 12 μl PCR produkta vai nu no paraugiem, vai pozitīvās kontroles, vai ūdens kontroles un sajaukt, viegli iesūcot pipetes uzgalītī pirms papildināšanas. Norādītos tilpumus var mainīt, lai tie atbilstu padziļinājumu lielumam agarozes gelā. 4.6.5 Rūpīgi piepildīt gela padziļinājumus. References nolūkiem vismaz vienā padziļinājumā ievietot piemērotu DNS marķieri. 4.6.6 Vadus pieslēgt barošanas avotam un elektroforēzes aparātam. Veikt elektroforēzi ar 5-8 V/cm, līdz uzraudzības indikatora priekšpuse atrodas 1 cm attālumā no gela beigām. 4.6.7 Izslēgt barošanas avotu. Atvienot vadus no elektroforēzes aparāta. Gelu rūpīgi izņemt. Iegremdēt to etīdija bromīda šķīdumā 30 līdz 45 minūtes. Piezīme: strādājot ar etīdija bromīdu, allaž valkājiet vienreizējās lietošanas cimdus, jo tā ir spēcīga mutagēna viela! 4.6.8 Atkrāsot destilētā ūdenī 10 līdz 15 minūtes. 4.6.9 Parādīt paplašināto(s) DNS fragmentu(s), apskatot UV gaismā. Ralstonia solanacearum PCR produkts ar OLI-1 un Y-2 praimeriem ir 288 bp garš. Salīdzināt ar DNS marķieri un pozitīvo kontroli. Piezīme: ūdens kontrolei visos gadījumos jābūt negatīvai. Ja tā ir pozitīva, testu atkārtot. 4.6.10 Nofotografēt gelu, ja vajadzīgs paliekošs pieraksts. 4.6.11 Apstiprināt paplašinātā fragmenta autentiskumu ar restriktāzes analīzi (REA). 4.7 Restriktāzes analīze (REA) 4.7.1 No PCR produkta (4.5.3. punkts) 8,5 μl pārlikt jaunā mikropudelītē. Pievienot 1 μl desmitkārtīga fermenta buferšķīduma un 0,5 μl restriktāzes Ava II. 4.7.2 Samaisīt, viegli iesūcot pipetes galiņā. Ja uz stobriņa sienām paliek pilieni, vibrocentrifugēt mikrocentrifūgā. Izturēt vienu stundu 37 °C temperatūrā. 4.7.3 Analizēt izreaģējušo PCR fragmentu ar agarozes gela elektroforēzi kā aprakstīts iepriekš (4.6. punkts). PCR testa rezultātu interpretēšana: PCR tests ir negatīvs, ja nav atrasts raksturīgais 288 bp paraugs, bet ir atrasts Ralstonia solanacearum pozitīvās kontroles celma paraugs. PCR tests ir pozitīvs, ja ir atrasts 288 bp fragments un paplašinātā fragmenta REA analīze ir identiska Ralstonia solanacearum pozitīvās kontroles celmam. 5. Selektīva uzsējuma tests Par pamatu ņemts Elphinstone et al., 1996. 5.1 Veikt testu, izmantojot piemērotu atšķaidījumu uzsējuma metodi, piem.,: i) Sagatavot vismaz divus atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu decimālatšķaidījumus granulveida nogulšņu buferšķīdumā, t.i., 1/10 un 1/100 vai vairāk, ja to uzskata par lietderīgu. Atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu un katra atšķaidījuma standarttilpumu (50 līdz 100 μl) ar pipetīti uzpilināt uz modificētas SMSA selektīvās barotnes (7. papildinājums) un ar stikla stienīti sadalīt pa visu barotnes virsmu. Ja to uzskata par lietderīgu, izlīdzināt arī atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu atšķaidījumu ar 10 μl cilpu. Cilpu starp izlīdzināšanas reizēm apdedzināt. iii) Atkārtoti suspendēto granulveida nogulšņu nomērītu standarttilpumu (50 līdz 100 μl) uzlikt uz modificētas SMSA selektīvās barotnes un ar stikla stienīti sadalīt pa visu barotnes virsmu. Stienīti neapdedzinot noslaucīt gar vismaz divām citām modificētām SMSA platēm. 5.2 Lietojot to pašu atšķaidījuma uzsējuma metodi, uz atsevišķām modificētām SMSA platēm kā pozitīvu kontroli uzlikt virulenta Ralstonia solanacearum 3. rases 2. biovara celma suspensiju ar 10 šūnām vienā mililitrā. 5.3 Izturēt plates 28 °C temperatūrā. Plašu nolasīšanu sākt pēc trim dienām. Ja rezultāts ir negatīvs, izturēt līdz sešām dienām. Ralstonia solanacearum virulento izolātu kolonijas ir pienbaltā krāsā, plakanas, neregulāras un šķidras konsistences, vidū asinssarkanā krāsā, iekšpusē ar svītrām vai spirālveida veidojumiem. 5.4 Kolonijas ar raksturīgu morfoloģiju, pārsējot kultūru, attīrīt universālā barotnē (1. papildinājums). 5.5 Identificēt tīrkultūras (II iedaļas 4.1. punkts) un apstiprināt, ka kultūras pieder Ralstonia solanacearum, izmantojot patogenitātes testu (II iedaļa, 4.3. punkts). Selektīvā uzsējuma testa rezultātu interpretēšana: Selektīvā uzsējuma tests ir negatīvs, ja pēc sešām dienām nav izolētas baktēriju kolonijas vai ja nav izolētas tipiskas Ralstonia solanacearum baktēriju kolonijas, un ar noteikumu, ka nepastāv aizdomas, ka citu baktēriju koloniju inhibīcija, un ka Ralstonia solanacearum tipiskās kolonijas ir atrastas pozitīvajā kontrolē. Selektīvā uzsējuma tests ir pozitīvs, ja tiek izolētas Ralstonia solanacearum raksturīgas kolonijas. 6. Bioraudzes tests Par pamatu ņemts Janse, 1988. 6.1 Izmantot 10 ieņēmīgus tomātu vai baklažānu sējeņu testējamos augus, no kuriem katrs paraugs būtu trešo īsto lapu fāzē. Pirms inokulācijas testējamos augus nelaistīt 24 stundas. 6.2 Starp testējamajiem augiem sadalīt 100 μl atkārtoti suspendētu granulveida nogulšņu. Inokulēt tās stublājā starp dīgļlapām un vienā vai vairākās citās vietās. 6.3 Izmantojot tādu pašu paņēmienu, inokulēt 10 sējeņus ar Ralstonia solanacearum 2. biovara 3. rases virulenta celma suspensiju, kurai ir 106 šūnas vienā mililitrā, kā pozitīvu kontroli un ar granulveida nogulšņu buferšķīdumu kā negatīvu kontroli. Nodalīt pozitīvās kontroles augus no citiem augiem, lai novērstu savstarpēju inficēšanos. 6.4 Audzēt testējamos augus ne ilgāk kā četras nedēļas 22 līdz 28 °C temperatūrā un augsta relatīvā mitruma apstākļos, ik dienas aplaistot. Novērot, vai neparādās vīte un/vai epinastija, hloroze, aizkavēšanās augšanā. 6.5 Izolēt no inficētajiem augiem (II iedaļa). Identificēt tīrkultūras ar raksturīgu morfoloģiju (II iedaļas 4.1. punkts) un apstiprināt kultūru piederību Ralstonia solanacearum, izmantojot patogenitātes testu (II iedaļas 4.3. punkts). 6.6 Ja to uzskata par lietderīgu, pārbaudīt, vai nav inficējušās testējamo augu partijas, kas neuzrāda nekādas inficēšanās pazīmes. No katra testējamā auga paņemt 1 cm garu stublāja gabalu 2 cm virs inokulācijas punkta. Homogenizēt audus macerācijas buferī. Veikt atšķaidījuma uzsēšanas procedūru (III iedaļas 5.1. punkts). Ja ir pozitīvi rezultāti, identificēt tīrkultūras ar raksturīgu morfoloģiju (II iedaļas 4.1. punkts) un apstiprināt kultūru piederību Ralstonia solanacearum, veicot patogenitātes testu (II iedaļas 4.3. punkts). Bioraudzes testa rezultātu interpretēšana: Bioraudzes tests ir negatīvs, ja testējamie augi nav inficēti ar Ralstonia solanacearum, ar noteikumu, ka Ralstonia solanacearum parādās pozitīvajā kontrolē. Bioraudzes tests ir pozitīvs, ja testa augi ir inficēti ar Ralstonia solanacearum. 7. Bagātināšanas tests Par pamatu ņemts Elphinstone et al., 1996. 7.1 Iepildīt 100 μl atkārtoti suspendētu granulveida nogulšņu 3 ml modificēta SMSA buljona (7. papildinājums). 7.2 Izturēt 48 stundas, taču nekādā ziņā ne ilgāk par 72 stundām, 28 °C temperatūrā, mēģenes aizbāzni nenostiprinot cieši, lai notiktu ventilēšanās. 7.3 Nostiprināt aizbāzni un samaisīt. Sadalīt alikvotajās daļās IF testam (šīs iedaļas 2. punkts), ELISA testam (šīs iedaļas 3. punkts) un/vai PCR testam (šīs iedaļas 4. punkts). 8. Patogenitātes tests Skatīt II iedaļas 4.3. punktu. [1] Nav iekļauta 4. rase (patogēni tikai ingveram un dažiem citiem saimniekaugiem) un 5. rase (patogēni tikai zīdkoka ogām). -------------------------------------------------- III PIELIKUMS 1. Katrā aizdomu gadījumā par organisma parādīšanos, kam saņemts pozitīvs skrīninga(-u) rezultāts, izmantojot attiecīgo II pielikumā aprakstīto metodi uzskaitītajam stādāmajam materiālam vai visos pārējos gadījumos jebkuru citu oficiāli apstiprinātu metodi, kamēr tiek nogaidīts aizdomu apstiprinājums vai noraidījums, kas iegūstams, pabeidzot minēto metodi, jābloķē un atbilstoši jāiekonservē šādi materiāli: - ja iespējams, partija vai tās daļa, no kuras ņemts paraugs, oriģinālajā iesaiņojumā ar etiķeti, - ja iespējams, atlikusī paraugu daļa, - visi ekstrakta un papildu materiālu atlikumi, kas sagatavoti skrīningam(-iem), piem., imunofluorescences priekšmetstikliņi, un - visa attiecīgā dokumentācija, līdz minētā metode ir pabeigta līdz galam. 2. Ja tiek apstiprināta organisma atrašanās, jābloķē un attiecīgi jāiekonservē: - 1. punktā minētie materiāli, un - inficētā tomāta vai baklažāna materiāla paraugs, kurā atkarībā no konkrētā gadījuma inokulēts bumbuļu vai augu ekstrakts, un - organisma izolētā kultūra, līdz pagājis vismaz viens mēnesis pēc paziņojuma, kas veikts saskaņā ar 5. panta 2. punktu. -------------------------------------------------- IV PIELIKUMS 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta i) daļā minētajai izmeklēšanai atkarībā no konkrētā gadījuma jāietver šādi elementi. i) Audzēšanas vietās: - kur tiek audzēti vai ir auguši kartupeļi, kam pastāv klonu radniecība ar kartupeļiem, kuros atklāta infekcija ar organismu, - kur tiek audzēti vai ir auguši tomāti, kas iegūti no tā paša avota kā tomāti, kuri inficēti ar organismu, - kur tiek audzēti vai ir auguši kartupeļi vai tomāti, kas pakļauti oficiālai uzraudzībai, jo pastāv aizdomas par organisma parādīšanos, - kur tiek audzēti vai ir auguši kartupeļi, kam pastāv klonu radniecība ar kartupeļiem, kuri auguši tādās audzēšanas vietās, kur konstatēta inficēšanās ar organismu, - kur tiek audzēti kartupeļi vai tomāti un kas atrodas kaimiņos inficētajām audzēšanas vietām, tostarp tādas audzēšanas vietas, kuras lieto vienu ražošanas aprīkojumu un telpas tiešā veidā vai ar kopēja darbuzņēmēja starpniecību, - kur apūdeņošanai vai miglošanai tiek izmantoti virszemes ūdeņi no avota, par kuru pastāv aizdomas, ka tas inficējies ar organismu, vai par kuru šādas aizdomas ir apstiprinātas, - kur apūdeņošanai vai miglošanai izmantoto virszemes ūdeņu avots ir kopīgs ar tādām audzēšanas vietām, par kurām pastāv aizdomas, ka tās ir inficētas ar organismu, vai par kurām šādas aizdomas ir apstiprinātas, - kas ir pārplūdušas vai ir bijušas pārplūdušas ar virszemes ūdeņiem, par kuriem pastāv aizdomas, ka tie ir inficēti ar organismu, vai par kuriem šādas aizdomas ir apstiprinātas, un ii) virszemes ūdeņi, kuri izmantoti tāda(-u) lauka(-u) vai audzēšanas vietas (-u) apūdeņošanai vai miglošanai, kur konstatēta inficēšanās ar organismu, vai kuri pārpludinājuši to(s). -------------------------------------------------- V PIELIKUMS 1. Nosakot iespējamās inficēšanās apmēru saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iii) daļu un c) apakšpunkta iii) daļu, atkarībā no konkrētā gadījuma jāiekļauj šādi elementi: - uzskaitītais stādāmais materiāls, kas izaudzēts audzēšanas vietā, kura atzīta par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu, - audzēšanas vieta(s), kur pastāv ražošanas saikne ar uzskaitīto stādāmo materiālu, kurš atzīts par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu, tostarp audzēšanas vietas, kas tiešā veidā vai ar kopēja darbuzņēmēja starpniecību lieto vienu ražošanas aprīkojumu un telpas, - uzskaitītais stādāmais materiāls, kas audzēts iepriekšējā ievilkumā minētajā(s) audzēšanas vietā(s) vai tajā(s) atradies laikā, kad uzskaitītais stādāmais materiāls, kas atzīts par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu, atradies pirmajā ievilkumā minētajās audzēšanas vietās, - glabātavas, kurās noticis darbs ar uzskaitīto stādāmo materiālu no iepriekš minētajām audzēšanas vietām, - mehānismi, transportlīdzekļi, kuģi, glabātavas vai to daļas un visi pārējie objekti, tostarp saiņošanas materiāls, kas varēja nonākt saskarē ar uzskaitīto stādāmo materiālu, kurš atzīts par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu, - uzskaitītais stādāmais materiāls, kas uzglabāts kādā no iepriekšējā ievilkumā uzskaitītajām būvēm vai objektiem vai bijis ar to saskarē, līdz šīs būves un objekti ir iztīrīti un dezinficēti, - pēc tam, kad ir veikta 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta i) daļā minētā izmeklēšana un testēšana, kartupeļu bumbuļi vai augi, kuriem pastāv vertikāla vai horizontāla klonu radniecība ar uzskaitīto stādāmo materiālu, kas atzīts par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu, vai tomātu augi, kas iegūts no tā paša avota kā minētais uzskaitītais stādāmais materiāls, un kuriem inficēšanās iespējama klonu radniecības dēļ, kaut arī testu rezultāti attiecībā uz organisma klātbūtni būtu negatīvi, - iepriekšējā ievilkumā minētā uzskaitītā stādāmā materiāla audzēšanas vieta(s), - uzskaitītā stādāmā materiāla audzēšanas vieta(s), kur apūdeņošanai vai miglošanai ir izmantots ūdens, kas atzīts par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta c) apakšpunkta ii) daļu, - uzskaitītais stādāmais materiāls, kas audzēts laukos, kuri pārplūduši ar virszemes ūdeņiem, kas atzīti par inficētiem ar organismu. 2. Nosakot iespējamo organisma izplatību saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iv) daļu un c) apakšpunkta iii) daļu, i) 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iv) daļā minētajos gadījumos ņem vērā šādus elementus: - vai tuvumā neatrodas citas audzēšanas vietas, kur tiek audzēts uzskaitītais stādāmais materiāls, - sēklas kartupeļu kopējā audzēšana un izmantošana, - audzēšanas vietas, kur uzskaitītā stādāmā materiāla apūdeņošanai vai apmiglošanai izmanto virszemes ūdeņus, un kur pastāv vai ir pastāvējuši draudi, ka šie virszemes ūdeņi ir noplūduši vai plūdu veidā nākuši no audzēšanas vietas(-ām), kura(s) atzīta(s) par piesārņotu(-ām) saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu; ii) gadījumos, kad virszemes ūdeņi atzīti par inficētiem saskaņā ar 5. panta 1. punkta c) apakšpunkta ii) daļu: - audzēšanas vieta(s), kur uzskaitītais stādāmais materiāls tiek audzēts tieši līdzās virszemes ūdeņiem, kuri atzīti par piesārņotiem, vai kur pastāv risks, ka šādi ūdeņi varētu pārplūst, - jebkurš slēgts apūdeņošanas baseins, kas saistīts ar virszemes ūdeņiem, kuri atzīti par piesārņotiem. 3. Sīkākajām ziņām, kas paredzētas 5. panta 2. punkta pirmajā daļā, jāietver: - diena, kad saskaņā ar 4. pantu ziņots par aizdomām par organisma parādīšanos, un, atkarībā no konkrētā gadījuma, dienas, kad ņemti paraugi un apstiprināta inficēšanās ar organismu saskaņā ar 5. pantu; - sīkākas ziņas no atzinuma par inficēšanos un norobežotās zonas apraksts; 4. Sīkākajām ziņām papildu paziņojumā, kas paredzētas 5. panta 2. punkta otrajā daļā, jāietver: - kartupeļu sūtījumam vai partijai, kas atzīta par inficētu, – Direktīvas 77/93/EEK 7. un 8. pantā minētie sertifikāti, un kartupeļu audzētāju, kolektīvo noliktavu un nosūtīšanas centru pases numurs vai attiecīgi reģistrācijas numurs, - tomātu stādu sūtījumam vai partijai, kas atzīta par inficētu, – Direktīvas 77/93/EEK 7. un 8. pantā minētie sertifikāti, un pases numurs saskaņā ar Direktīvas 77/93/EEK V pielikuma A daļas I iedaļas 2.2. punktā minēto uzskaitījumu, - šķirnes nosaukums un kategorija sēklas kartupeļu krājumiem un pēc iespējas visos pārējos gadījumos, - pārējā informācija par apstiprināto slimības uzliesmojumu, kādu pieprasa Komisija. -------------------------------------------------- VI PIELIKUMS 1. Pasākumi, kas minēti 6. panta 1. punktā, ir: - sadedzināšana, vai - izmantošana lopbarībā pēc termiskās apstrādes, novēršot risku, ka organisms varētu izdzīvot, vai - aprakšana apglabāšanas vietā, kur būtu izslēgta iesūkšanās lauksaimniecības zemē vai saskare ar ūdens avotiem, kurus varētu izmantot lauksaimniecības zemes apūdeņošanai, vai - rūpnieciska pārstrāde, nekavējoties veicot piegādi tieši uz pārstrādes uzņēmumu, kam ir oficiāli apstiprinātas atkritumu iznīcināšanas iekārtas, kas atbilst šīs direktīvas VII pielikuma noteikumiem, vai - citi pasākumi, ja ir konstatēts, ka tie nerada nosakāmu organisma izplatīšanās risku; par šiem pasākumiem nekavējoties jāpaziņo Komisijai un pārējām dalībvalstīm. 2. Uzskaitītajam stādāmajam materiālam ir šādas piemērotas izmantošanas vai iznīcināšanas iespējas, kas minētas 6. panta 2. punktā un kas ir jāīsteno attiecīgās(-o) dalībvalsts(-u) atbildīgo valsts struktūru kontrolē, atbildīgajām valsts struktūrām savā starpā atbilstīgi sazinoties, lai visos gadījumos nodrošinātu organisma apkarošanu un iegūtu tās dalībvalsts valsts struktūras apstiprinājumu, kurā kartupeļus paredzēts iesaiņot vai pārstrādāt, atsaucoties uz pirmajā un otrajā ievilkumā minētajām atkritumu iznīcināšanas iekārtām: i) kartupeļu bumbuļiem: - izmantošana galda kartupeļu veidā, kas paredzēti cilvēku uzturam un iesaiņoti vietās, kurās ir pienācīgas atkritumu iznīcināšanas iekārtas, ko iespējams piegādāt tieši un izmantot bez pārsaiņošanas un kas paredzēti šādai tiešai piegādei un izmantošanai, vai - izmantošana galda kartupeļu veidā, kas domāti rūpnieciskai pārstrādei un ko paredzēts nekavējoties piegādāt tieši uz pārstrādes uzņēmumu ar piemērotām atkritumu iznīcināšanas iekārtām; - cits izmantošanas vai iznīcināšanas veids, ja tiek konstatēts, ka tas nerada nosakāmu organisma izplatīšanās risku, un ja to apstiprinājušas minētās atbildīgās valsts struktūras. Par šiem pasākumiem nekavējoties jāpaziņo Komisijai un pārējām dalībvalstīm, ii) citām augu daļām, tostarp stublājiem un nokritušajām lapām: - iznīcināšana, vai - citi izmantošanas vai iznīcināšanas veidi, ja ir konstatēts, ka tie nerada nosakāmu organisma izplatīšanās risku; par šiem pasākumiem paziņo Komisijai un pārējām dalībvalstīm. 3. Piemērotas objektu dekontaminācijas metodes, kas minētas 6. panta 3. punktā, ir tīrīšana un vajadzības gadījumā dezinfekcija, lai novērstu nosakāmu organisma izplatīšanās risku, tās piemēro dalībvalstu atbildīgo valsts struktūru uzraudzībā. 4. Norobežotajā(s) teritorijā(s), kuras(s) paredzēta(s) 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iv) daļā un c) apakšpunkta iii) daļā un minētas 6. panta 4. punktā, dalībvalstīm vajag īstenot virkni pasākumu, tostarp šādus: 4.1. Ja audzēšanas vietas ir atzītas par inficētām saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu: a) laukā vai aizsargātā augkopības vienībā, kas atzīta par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu: i) vai nu vismaz četrus veģetācijas gadus pēc tā(s) atzīšanas par inficētu: - veic pasākumus, lai novērstu nejaušu kartupeļu un tomātu augu, kā arī citu organisma saimniekaugu, tostarp nakteņu dzimtas nezāļu pašiesēšanos, un - neaudzē šādus augus: - kartupeļu bumbuļus vai augus, - tomātu stādus un sēklas, - ņemot vērā organisma bioloģiju: - citus saimniekaugus, - Brassica sugas augus, saistībā ar kuriem pastāv nosakāms organisma izdzīvošanas risks, - kultūras, saistībā ar kurām pastāv nosakāms organisma izplatīšanās risks; - pirmajā kartupeļu vai tomātu ražas sezonā, kas seko iepriekšējā ievilkumā noteiktajam periodam, ja laukā nav tādu kartupeļu un tomātu augu, kā arī citu saimniekaugu, tostarp nakteņu dzimtas nezāļu, kas izsējušies paši, vismaz divus secīgus veģetācijas gadus pirms stādīšanas: - kartupeļiem: galda kartupeļu audzēšanai drīkst stādīt tikai oficiāli sertificētus sēklas kartupeļus un - veic oficiālu apsekojumu, ieskaitot testēšanu, kā noteikts 2. panta 1. punktā, - kartupeļu vai tomātu ražas sezonā, kas seko iepriekšējā ievilkumā minētajai, un kad ir noslēgts pienācīgs augsekas cikls, no kartupeļiem stāda oficiāli sertificētus sēklas kartupeļus, izmantojot tos sēklaudzēšanai vai galda kartupeļu ražošanai, turklāt gan kartupeļiem, gan tomātiem veic 2. panta 1. punktā aprakstīto oficiālo apsekojumu; vai ii) piecus veģetācijas gadus pēc atzīšanas par inficētu: - veic pasākumus, lai novērstu nejaušu kartupeļu un tomātu augu, kā arī citu organisma saimniekaugu, tostarp nakteņu dzimtas nezāļu pašiesēšanos, un - pirmos trīs gadus laukā izveido un uztur papuvi vai labības sējumus atkarībā no noteiktā riska vai arī pastāvīgas ganības, tās bieži pļaujot, vai nodarbojas ar intensīvu graudzāļu audzēšanu, vai sēj graudzāles sēklaudzēšanai, pēc tam turpmākos divus gadus tur audzē augus, kuri nav organisma saimniekaugi un par kuriem nepastāv risks, ka organisms tajos varētu izdzīvot vai no tiem izplatīties, - pirmajā kartupeļu vai tomātu ražas sezonā pēc iepriekšējā ievilkumā minētā perioda: - kartupeļiem: stādīt drīkst tikai oficiāli sertificētus sēklas kartupeļus galda kartupeļu vai sēklas kartupeļu ražošanai un jāveic oficiāls apsekojums, ieskaitot testēšanu, kā noteikts 2. panta 1. punktā; b) citos laukos: - nākamajā veģetācijas gadā pēc to atzīšanas par inficētiem: - nestāda kartupeļu bumbuļus vai augus vai citus organisma saimniekaugus un veic pasākumus, lai novērstu kartupeļu un tomātu augu un atkarībā no vajadzības citu saimniekaugu, tostarp nakteņu dzimtas nezāļu pašiesēšanos, vai - kartupeļu bumbuļiem: stādīt drīkst oficiāli sertificētus sēklas kartupeļus tikai galda kartupeļu audzēšanai, ja atbildīgās valsts iestādes piekrīt, ka ir novērsts risks, ka pašizsēšanās veidā var vairoties kartupeļu un tomātu augi un citi organisma saimniekaugi, tostarp nakteņu dzimtas nezāles. Audzētajām kultūrām piemērotos laikos veic inspekcijas pārbaudes, un kartupeļu augos, kas pavairojušies paši, testējot pārbauda organisma atrašanos; turklāt kartupeļiem pārbauda bumbuļus no novāktās ražas; - pirmajā veģetācijas gadā pēc pirmajā ievilkumā minētā: - kartupeļiem: stādīt drīkst tikai oficiāli sertificētus sēklas kartupeļus sēklas kartupeļu vai galda kartupeļu ražošanai, - vismaz otrajā veģetācijas gadā pēc pirmajā ievilkumā minētā: - kartupeļiem: stādīt drīkst tikai oficiāli sertificētus sēklas kartupeļus vai oficiālā uzraudzībā audzētus sēklas kartupeļus, kas iegūti no oficiāli sertificētiem sēklas kartupeļiem, sēklas kartupeļu vai galda kartupeļu ražošanai, - visos veģetācijas gados, kas minēti iepriekšējos ievilkumos, veic pasākumus, lai novērstu kartupeļu un tomātu augu, kā arī pārējo organisma saimniekaugu, tostarp nakteņu dzimtas nezāļu pašizsēšanos, un veic oficiālu apsekojumu, kas aprakstīts 2. panta 1. punktā, turklāt audzējot sēklas kartupeļus audzē sēklaudzēšanai, notiek bumbuļu testēšana; c) uzreiz pēc platības atzīšanas par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu un visus turpmākos veģetācijas gadus līdz pirmajai atļautajai kartupeļu vai tomātu ražas sezonai (ieskaitot) laukā(-os), kas atzīts(-i) par piesārņotu(-iem) atbilstoši a) apakšpunktam: - visus mehānismus un glabātavas, kas atrodas audzēšanas vietā un ir saistīti ar kartupeļu vai tomātu audzēšanu, notīra un vajadzības gadījumā dezinficē, izmantojot piemērotas 3. punktā minētās metodes, - ievieš oficiālu apūdeņošanas un miglošanas programmu uzraudzību pēc vajadzības, ieskaitot to aizliegumu, lai novērstu organisma izplatīšanos; d) aizsargātā augkopības vienībā, kas atzīta par inficētu saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta ii) daļu, kad iespējams pilnīgi nomainīt audzēšanas substrātu: - nestāda kartupeļu bumbuļus vai augus vai citus organisma saimniekaugus, tostarp tomātu augus un sēklas, izņemot, ja minētajai vienībai ir veikti oficiāli uzraudzīti pasākumi, lai likvidētu organismu un izvāktu visu saimniekaugu materiālu, tostarp pilnībā nomainot audzēšanas substrātu un veicot šīs vienības tīrīšanu, kā arī vajadzības gadījumā dezinficējot to un visas iekārtas, ja pēc šādu pasākumu veikšanas atbildīgās valsts struktūras ir atļāvušas audzēt kartupeļus vai tomātus, un - kartupeļu audzēšanai izmanto oficiāli sertificētus sēklas kartupeļus vai mini bumbulīšus vai meristēmu kultūras, kas iegūti no testētiem avotiem, - ievieš oficiālu apūdeņošanas un miglošanas programmu uzraudzību pēc vajadzības, ieskaitot to aizliegumu, lai novērstu organisma izplatīšanos. 4.2 Dalībvalstis norobežotajā teritorijā, neierobežojot 4.1. punktā paredzētos pasākumus: a) nekavējoties un vismaz trīs audzēšanas gadus pēc tās atzīšanas par inficētu: (aa) gadījumos, kad norobežoto teritoriju nosaka saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iv) daļu: - izmantojot savas atbildīgās valsts struktūras, nodrošina kartupeļu bumbuļu vai tomātu audzēšanas, glabāšanas vai apstrādes telpu uzraudzību, kā arī tādu uzņēmumu uzraudzību, kas, izmantojot savu tehniku, sniedz darbuzņēmēja pakalpojumus kartupeļu vai tomātu audzētājiem, - pieprasa veikt minēto uzņēmumu mašīnu un glabāšanas telpu tīrīšanu un vajadzības gadījumā dezinfekciju, izmantojot piemērotas metodes, kas noteiktas 3. punktā, - pieprasa stādīt tikai sertificētu sēklas materiālu vai sēklu, kas iegūta oficiālā visu attiecīgās teritorijas kartupeļu stādījumu uzraudzībā, un veikt testēšanu pēc tādu sēklas kartupeļu stādījumu novākšanas, kas izaudzēti audzēšanas vietās, kuras atzītas par potenciāli inficētām saskaņā ar 5. panta 1. punkta a) apakšpunkta iii) daļu, - pieprasa, lai visos teritorijas uzņēmumos darbs ar novāktajiem sēklas kartupeļiem tiktu nodalīts no darba ar galda kartupeļiem, - veic oficiālu apsekojumu, kas aprakstīts 2. panta 1. punktā, (ab) gadījumos, kad virszemes ūdeņi ir atzīti par inficētiem saskaņā ar 5. panta 1. punkta c) apakšpunkta ii) daļu vai ir atzīts, ka tie var izplatīt organismu saskaņā ar V pielikuma 2. punktu: - katru gadu piemērotos laikos veic apsekošanu, ieskaitot virszemes ūdeņu un atbilstošo nakteņu dzimtas saimniekaugu paraugu ņemšanu attiecīgajos ūdens avotos un to testēšanu: - uzskaitītajam stādāmajam materiālam – saskaņā ar II pielikumā noteiktajām metodēm, vai - pārējos gadījumos – saskaņā ar jebkuru citu oficiāli apstiprinātu metodi, - ievieš oficiālu apūdeņošanas un miglošanas programmu uzraudzību, tostarp aizliegumu izmantot ūdeni, kas atzīts par inficētu, uzskaitītā stādāmā materiāla un vajadzības gadījumā citu saimniekaugu apūdeņošanai un miglošanai, lai novērstu organisma izplatīšanos. Šo aizliegumu var pārskatīt, pamatojoties uz rezultātiem, kas iegūti minētajā apsekojumā, kuru veic reizi gadā, - ja ir inficēti notekūdeņi, ievieš oficiālu uzraudzību to notekūdeņu novadīšanai, kas iegūti no rūpnieciskās pārstrādes vai pakotavas telpām, kurās notiek darbs ar uzskaitīto stādāmo materiālu; b) izveido programmu, lai piemērotā periodā vajadzības gadījumā nomainītu visus sēklas kartupeļu krājumus. -------------------------------------------------- VII PIELIKUMS Oficiāli apstiprinātajām atkritumu iznīcināšanas iekārtām, kas minētas VI pielikuma 1. punkta ceturtajā ievilkumā, jāatbilst šādām prasībām, lai novērstu organisma izplatīšanās risku: i) kartupeļu un tomātu pārstrādes atkritumus (tostarp izbrāķētos kartupeļus, to mizas un tomātus) un visus cietos atkritumus, kas saistīti ar kartupeļiem un tomātiem, iznīcina: - aprokot apglabāšanas vietā, kur būtu izslēgta to iefiltrēšanās lauksaimniecības zemē vai saskare ar ūdens avotiem, kurus varētu izmantot lauksaimniecības zemju apūdeņošanai. Atkritumus nogādā tieši uz apglabāšanas vietu, ievērojot aizsargpasākumus, lai atkritumi nepazustu, vai - sadedzinot; ii) rūpnieciskos notekūdeņus: pirms novadīšanas notekūdeņus, kuru sastāvā ir suspendētas cietās daļiņas, izfiltrē vai nostādina, lai atdalītu šīs daļiņas. Cietās daļiņas apglabā atbilstoši i) apakšpunkta noteikumiem. Tad notekūdeņus: - pirms to novadīšanas uzkarsē līdz vismaz 70 °C, uzturot šo temperatūru vismaz 30 minūtes, vai - novada citādi, saņemot oficiālu apstiprinājumu un oficiālā uzraudzībā, lai novērstu risku, ka notekūdeņi var nonākt saskarē ar lauksaimniecības zemi vai ūdens avotiem, ko var izmantot lauksaimniecības zemes apūdeņošanai. Sīkākas ziņas par šiem pasākumiem paziņo pārējām dalībvalstīm un Komisijai. --------------------------------------------------