3)

Pievieno šādas nodaļas: “B.49. IN VITRO ZĪDĪTĀJU ŠŪNU MIKROKODOLU TESTS IEVADS 1. In vitro mikrokodolu (MNvit) noteikšana ir genotoksicitātes tests mikrokodolu (MN) noteikšanai starpfāzu šūnu citoplazmā. Mikrokodoli var būt no acentriskiem hromosomu fragmentiem (t. i., tādiem, kuriem nav centromēra) vai no veselām hromosomām, kuras šūnu dalīšanās anafāzē nespēj atvirzīties uz šūnas poliem. Noteikšanā reģistrē klastogēno un aneigēno ķīmisko vielu (substanču un maisījumu) (1) (2) aktivitāti šūnās, kurās testējamās vielas iedarbības laikā vai pēc tās ir notikusi šūnu dalīšanās. Šī testēšanas metode (TM) ļauj izmantot testēšanas protokolu ar aktīna polimerizācijas inhibitoru citotalazīnu B (cytoB) vai bez tā. CytoB pievienošana pirms mērķmitozes ļauj identificēt un selektīvi analizēt mikrokodolu sastopamību šūnās, kurās noslēdzies viens mitozes cikls (jo šādās šūnās ir divi kodoli) (3) (4). Turklāt, ja ir pierādījumi tam, ka analizējamā šūnu populācijā ir notikusi mitoze, šī TM ļauj izmantot testēšanas protokolus, kuri neparedz citokinēzes bloķēšanu. 2. Papildus MNvit noteikšanas izmantojumam mikrokodolus inducējošu ķīmisku vielu (substanču un maisījumu) identificēšanai ir vēl citi noderīgi paņēmieni, kā iegūt informāciju par hromosomu bojājumu mehānismiem un mikrokodolu veidošanos, piemēram, citokinēzes bloķēšana, kinetohoru imūnķīmiskā iezīmēšana vai hibridizēšana ar centromēru/telomēru zondēm (fluorescenta in situ hibridizēšana, FISH) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Iezīmēšanas un hibridizēšanas procedūras var izmantot, ja pastiprinās mikrokodolu veidošanās un pētnieks vēlas noskaidrot, vai šā pastiprinājuma izraisītāja iedaba ir klastogēna un/vai aneigēna. 3. Mikrokodoli reprezentē meitasšūnām nodotos bojājumus, bet metafāzes šūnās uzskaitītās hromosomu aberācijas tālāk nodotas netiek. Tā kā mikrokodolu novērtējums interfāzes šūnās var būt relatīvi objektīvs, laboratorijas personāla vienīgais uzdevums ir noteikt, vai šūnās ir notikusi dalīšanās un cik daudz ir šūnu, kas satur mikrokodolu. Rezultātā uzskaiti preparātos iespējams paveikt relatīvi ātri, un analīzi var automatizēt. Tāpēc ir praktiski iespējams vienā apstrādes reizē uzskaitīt tūkstošiem, nevis simtiem šūnu un tādā veidā palielināt noteikšanas nozīmību. Visbeidzot, tā kā mikrokodoli var izveidoties no salīpošām hromosomām, ar šo metodi potenciāli var detektēt aneiploīdiju ierosinošos aģentus, kurus ir sarežģīti pētīt ar parastajiem hromosomu aberācijas testiem (piemēram, ESAO 473. testēšanas vadlīnijas; šā pielikuma B.10. nodaļa) (17). Tomēr ar MNvit noteikšanu, ja neizmanto tādus īpašus paņēmienus kā 2. punktā aprakstītais FISH, nav iespējams diferencēt poliploīdiju un klastogenitāti inducējošas ķīmiskas vielas. 4. MNvit noteikšana ir in vitro metode, kurā parasti izmanto cilvēka vai grauzēju šūnu kultūras. Tā dod visaptverošu pamatu hromosomu bojājumu potenciāla izpētei in vitro, jo ļauj detektēt gan aneigēnus, gan klastogēnus. 5. MNvit noteikšana ir noturīga un efektīva dažādu tipu šūnās, ar cytoB vai bez tā. Bagātīgs datu klāsts apstiprina MNvit noteikšanas derīgumu dažādās grauzēju šūnu līnijās (CHO, V79, CHL/IU un L5178Y) un cilvēka limfocītos (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Īpaši jāatzīmē starptautiskie validācijas pētījumi, kuru norisi koordinējusi Francijas Genotoksikoloģijas biedrība [Société Française de Toxicologie Génétique] (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22), un Starptautiskā Genotoksikoloģijas darbsemināra materiāli (4) (16). Veicot retrospektīvu validācijas pētījumu, pieejamos datus turklāt pēc zinātnisko pierādījumu nozīmīguma principa atkārtoti izvērtējis Eiropas Komisijas izveidotais Eiropas Alternatīvo metožu validēšanas centrs (ECVAM), un ECVAM zinātniskā padomdevēja komiteja (ESAC) šo testēšanas metodi ir akceptējusi kā zinātniski derīgu (32) (33) (34). Aprakstīta arī cilvēka TK6 limfoblastoīdo šūnu līnijas (35) HepG2 šūnu (36) (37) un Sīrijas kāmja embrija primāro šūnu (38) izmantošana, taču par tām nav bijis validācijas pētījumu. DEFINĪCIJAS 6. Definīcijas skatīt 1. papildinājumā. SĀKOTNĒJI APSVĒRUMI 7. In vitro testos parasti jāizmanto metaboliskajai aktivācijai eksogēns avots, izņemot ja šūnas attiecībā uz testējamām vielām ir metaboliski kompetentas. Eksogēnā metaboliskās aktivācijas sistēma nav pilnībā identiska in vivo apstākļiem. Jāpievērš uzmanība tam, lai novērstu apstākļus, kuros iegūst šķietami pozitīvus rezultātus, kas neliecina par testējamai vielai piemītošu mutagenitāti, bet kuru cēlonis ir vērā ņemamas izmaiņas pH vai osmozē vai paaugstināta citotoksicitāte (39) (40) (41). Ja testējamā viela tās pievienošanas laikā izmaina barotnes pH, tas jākoriģē, ieteicams, ar buferšķīdumu, ko pievieno izejas standartšķīdumam, lai pH visos tilpumos, koncentrācijās un barotnēs būtu vienāds. 8. Mikrokodolu indukcijas analīzē izšķiroša nozīme ir tam, lai apstrādātajās un neapstrādātajās kultūrās būtu notikusi mitoze. Mikrokodolu uzskaitei labākais laiks ir tad, kad testējamās vielas pievienošanas laikā vai pēc tam šūnās ir noslēgusies viena mitoze. METODES PRINCIPS 9. Uz cilvēka vai zīdītāju izcelsmes šūnu kultūrām iedarbojas ar testējamo vielu, izmantojot eksogēnu metaboliskās aktivācijas avotu un arī bez tā, izņemot ja lieto šūnas ar adekvātu metabolisko kapacitāti. Visos testos izmanto vienlaicīgas šķīdinātāja/nesēja kontroles (VC) un pozitīvās kontroles (PC) ķīmiskās vielas. 10. Uz šūnām iedarbojas ar testējamo vielu, un iedarbības laikā vai pēc tās šūnas kultivē pietiekami ilgu laiku, lai hromosomu vai vārpstiņas bojājumi izraisītu mikrokodolu veidošanos starpfāzu šūnās. Lai inducētu aneiploīdiju, parasti mitozei jānotiek testējamās vielas klātbūtnē. Savāktās un iekrāsotās starpfāzu šūnas analizē, lai tajās noteiktu mikrokodolu esību. Ideālā gadījumā mikrokodoli jāuzskaita tikai tajās šūnās, kurās mitoze noslēgusies testējamās vielas iedarbības laikā vai pēciedarbības periodā, ja tāds ir. Ar citokinēzes bloķētāju apstrādātās kultūrās uzskaita tikai divkodolu šūnas. Ja citokinēzes bloķētājs nav lietots, ir svarīgi parādīt, ka analizētajās šūnās, visticamāk, ir notikusi šūnu dalīšanās testējamās vielas iedarbības laikā vai pēc tās. Attiecībā uz visiem protokoliem ir svarīgi parādīt, ka šūnu savairošanās ir notikusi gan kontroles, gan apstrādātajā kultūrā; kultūrās, kurās uzskaita mikrokodolus (vai paralēlajās kultūrās), jānovērtē testējamās vielas inducētās citotoksicitātes vai citostāzes pakāpe. METODES APRAKSTS Preparāti 11. Var izmantot kultivētus primāros cilvēka perifēro asinsvadu limfocītus (5) (19) (42) (43) un vairākas grauzēju šūnu līnijas, piemēram, CHO, V79, CHL/IU, un L5178Y šūnas (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Ja izmanto citas šūnu līnijas un tipus, tas jāpamato ar uzskatāmi parādītu veiktspēju, kā aprakstīts iedaļā par pieņemamības kritērijiem. Mikrokodolu sastopamības biežums ietekmēs testa jutību, un tāpēc ieteicams izmantot šūnu tipus ar zemiem, stabiliem mikrokodolu veidošanās biežuma rādītājiem. 12. Cilvēka perifēro asinsvadu limfocīti jāiegūst no jauniem cilvēkiem (aptuveni 18–35 gadus veciem), kas ir veselīgi, nesmēķētāji un nav nesen bijuši saskarē ar genotoksisku ķīmisku vielu vai starojumu. Ja izmanto šūnas no vairāk nekā viena donora, jānorāda donoru skaits. Mikrokodolu sastopamības biežums palielinās līdz ar vecumu, un šī tendence ir izteiktāka sievietēm nekā vīriešiem (44); tas jāņem vērā, izvēloties grupējamās donoru šūnas. Barotne un kultivēšanas apstākļi 13. Kultūru uzturēšanai lieto piemērotas barotnes un ievēro atbilstošus kultivēšanas apstākļus (trauki kultūrām, CO2 koncentrācija, temperatūra un mitrums). Stabilām šūnu līnijām un celmiem regulāri jāpārbauda modālo hromosomu skaita stabilitāte un mikoplazmas neesība, un tos nedrīkst izmantot, ja konstatē mikoplazmu vai ja modālo hromosomu skaits ir mainījies. Jāzina, kāds ir normālais šūnas cikla laiks kultivēšanas apstākļos, ko izmanto testēšanas laboratorijā. Ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu, citokinēzes inhibitora koncentrācija jāoptimizē konkrētajam šūnu tipam un jāizraugās tāda, par kuru zināms, ka uzskaites vajadzībām tā dod labu divkodolu šūnu iznākumu. Šūnu kultūru sagatavošana 14. Stabilas šūnu līnijas un celmi: šūnas pavairo no pamatkultūrām, izsēj barotnē tādā blīvumā, lai kultūras nesaplūstu monoslānī un lai suspensiju kultūras nesasniegtu pārmērīgu blīvumu pirms šūnu savākšanas, un inkubē 37 °C temperatūrā. 15. Limfocīti: pilnu asins sastāvu, kas apstrādāts ar antikoagulantu (piemēram, heparīnu), vai tikai limfocītus kultivē, klātesot mitogēnam, piemēram, fitohemaglutinīnam (PHA), un tad uz to iedarbojas ar testējamo vielu un ar cytoB. Metaboliskā aktivācija 16. Ja izmanto šūnas ar nepietiekamu endogēno metabolisko kapacitāti, jālieto eksogēnas metabolizējošās sistēmas. Plašāk izmantojamā aktivācijas sistēma ir ar kofaktoru papildināta pēcmitohondriskā frakcija (S9), ko pagatavo no grauzēju aknām, kas apstrādātas ar enzīmstimulējošām vielām, piemēram, Aroclor 1254 (45) (46) vai fenobarbitona un β-naftoflavona maisījumu (46) (47) (48) (49). Pēdējā minētā kombinācija nav pretrunā ar Stokholmas Konvenciju par noturīgiem organiskajiem piesārņotājiem (50) un Regulu (EK) Nr. 850/2004 par noturīgiem organiskajiem piesārņotājiem (66) un jauktas funkcijas oksidāžu inducēšanā izrādījusies tikpat efektīva kā Aroclor 1254 (46) (47) (48) (49). S9 frakciju parasti izmanto koncentrācijā 1–10 % (tilp./tilp.) galīgajā testa barotnē. Metaboliskās aktivācijas sistēmas stāvoklis var būt atkarīgs no testējamo ķīmisko vielu klases, un dažos gadījumos var būt lietderīgi izmantot vairāk nekā vienu S9 koncentrāciju. 17. Ar gēnu inženierijas metodēm iegūtas šūnu līnijas, kas izteic specifiskos cilvēka vai grauzēju enzīmus, var atbrīvot no vajadzības pēc eksogēnas metaboliskās aktivācijas sistēmas, un tās var izmantot kā testa šūnas. Šādos gadījumos izmantojamo šūnu līniju izvēlei jābūt zinātniski pamatotai, piemēram, ar jauktas funkcijas oksidāžu atbilstību testējamās vielas metabolismam (51) un ar to reaģētspēju uz zināmiem klastogēniem un aneigēniem (skatīt daļu par pieņemamības kritērijiem). Jāatzīst, ka testējamo vielu nedrīkst metabolizēt ar izteiktām jauktas funkcijas oksidāzēm; šajā gadījumā negatīvs rezultāts neliecina, ka testējamā viela nespēj inducēt mikrokodolus. Testējamās vielas sagatavošana 18. Cietas ķīmiskās vielas jāizšķīdina atbilstošos šķīdinātājos vai nesējos un, ja vajadzīgs, pirms šūnu apstrādes jāatšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var tieši pievienot testēšanas sistēmā un/vai pirms šūnu apstrādes atšķaidīt. Gāzes vai gaistošas vielas jātestē ar attiecīgām standarta protokolu modifikācijām, piemēram, apstrādi veicot hermētiski noslēgtā traukā (52) (53). Ja dati par testējamo vielu preparātu stabilitāti liecina, ka tos uzglabāt nevar, izmanto svaigi pagatavotus preparātus. Testēšanas apstākļi Šķīdinātāji/nesēji 19. Šķīdinātājs vai nesējs nedrīkst reaģēt ar testējamo vielu vai nebūt saderīgs ar šūnu dzīvotspēju vai ar S9 aktivitātes uzturēšanu izmantotajās koncentrācijās. Ja nelieto labi zināmu šķīdinātāju/nesēju (piemēram, ūdeni, šūnu kultūras barotni, dimetilsulfoksīdu), lietojums jāpamato ar datiem par tā saderību ar testējamo vielu un to, ka izmantotais šķīdinātājs/nesējs nav genotoksisks. Vienmēr, kad tas iespējams, vispirms ieteicams izmantot ūdeni saturošus šķīdinātājus vai nesējus. CytoB kā citokinēzes bloķētājs 20. Viens no svarīgākajiem apsvērumiem MNvit metodes veiktspējas nodrošināšanā ir tāds, ka uzskaitītajām šūnām apstrādes laikā vai pēcapstrādes inkubēšanas laikā (ja tāds ir) ir jābūt pabeigušām mitozi. CytoB ir aģents, ko ļoti plaši izmanto kā citokinēzes bloķētāju, jo tas inhibē aktīna veidošanos un tādējādi neļauj meitasšūnām atdalīties pēc mitozes; rezultātā rodas divkodolu šūnas (5) (54), (55). Mikrokodolu uzskaiti tāpēc var veikt tikai tajās šūnās, kurās apstrādes laikā vai pēc tās ir beigusies mitoze. Vienlaikus var izmērīt testējamās vielas ietekmi uz šūnu savairošanās kinētiku. CytoB ieteicams izmantot kā citokinēzes bloķētāju cilvēka limfocītos, jo šūnu cikla ilgumi dažādās kultūrās un dažādiem donoriem atšķirsies un ne visi limfocīti reaģē uz PHA. Šūnu līniju testēšanā, lai noteiktu, vai uzskaites šūnas ir sadalījušās, izmanto citas metodes; tās ir apskatītas turpmāk (skatīt 26. punktu). 21. Laboratorijai jānosaka atbilstoša cytoB koncentrācija katram šūnu tipam, lai sasniegtu optimālu divkodolu šūnu sastopamību šķīdinātāja/nesēja kontroles kultūrās. Atbilstošas koncentrācijas cytoB parasti ir starp 3 un 6 μg/ml. Šūnu savairošanās un citotoksicitātes mērīšana un iedarbības koncentrācijas izvēle 22. Nosakot augstāko testējamās vielas koncentrāciju, kas jātestē, neizvēlas koncentrācijas, kas spēj radīt šķietami pozitīvas atbildes reakcijas, piemēram, tādas koncentrācijas, kas izraisa pārmērīgu citotoksicitāti, nogulsnes barotnē vai manāmi izmaina pH vai osmozi (39) (40) (41). 23. Mēra šūnu savairošanos, lai nodrošinātu, ka apstrādātajās šūnās testēšanas laikā ir beigusies mitoze un ka apstrāde tiek veikta attiecīgā citotoksicitātes līmenī (skatīt 29. punktu). Citotoksicitāti ar metabolisma aktivāciju un bez tās nosaka šūnās, kam vajadzīga metaboliskā aktivācija, izmantojot šūnu skaita relatīvo pieaugumu (RICC) vai populācijas relatīvo divkāršošanos (RPD) (formulas skatīt 2. papildinājumā), ja vien neizmanto cytoB. Ja izmanto cytoB, citotoksicitāti var noteikt, izmantojot replicēšanās indeksu (RI) (formulas skatīt 2. papildinājumā). 24. Kultūru apstrāde ar cytoB un vienkodola, divkodolu un daudzkodolu šūnu relatīvā sastopamības biežuma noteikšana kultūrā ir laba metode, kā kvantitatīvi izteikt ietekmi uz šūnu savairošanos un apstrādes citotoksisko vai citostatisko darbību (5), un nodrošina, ka uzskaitītas tiek tikai šūnas, kas apstrādes laikā vai pēc tās ir dalījušās. 25. Pētījumos ar cytoB citostāzi/citotoksicitāti var kvantitatīvi izteikt ar savairošanās indeksu pēc citokinēzes blokādes (CBPI) (5) (26) (56) vai tās var iegūt no RI, kas raksturo vismaz 500 šūnas vienā kultūrā (formulas skatīt 2. papildinājumā). Ja cytoB izmanto, lai novērtētu šūnu savairošanās pakāpi, CBPI vai RI jānosaka vismaz 500 šūnām vienā kultūrā. Šos mērījumus, cita starpā, var izmantot, lai noteiktu citotoksicitāti, salīdzinot vērtības apstrādātajās un kontroles kultūrās. Noderīgu informāciju var dot citu citotoksicitātes marķieru (piemēram, šūnu saplūšanas, šūnu skaita, apoptozes, nekrozes, metafāzes uzskaites) novērtēšana. 26. Pētījumos bez cytoB ir uzskatāmi jāparāda, ka kultūrā uzskaitītās šūnas ir beigušas dalīties apstrādes laikā vai pēc apstrādes ar testējamo vielu, citādi var iegūt šķietami negatīvu rezultātu. Metodes, kas izmantotas, lai nodrošinātu, ka uzskaitītas tiek dalīšanos beigušās šūnas, paredz iekļaut un pēc tam detektēt bromdeoksiuridīnu (BRDU), lai identificētu replicējušās šūnas (57), klonu veidošanos, kad šūnas no pastāvīgās šūnu līnijas apstrādā un uzskaita in situ uz mikroskopa priekšmetstikliņa (savairošanās indekss (PI)) (25) (26) (27) (28), vai arī populācijas relatīvās divkāršošanās (RPD) vai šūnu skaita relatīvā pieauguma (RICC) noteikšanu vai citas pārbaudītas metodes (16) (56) (58) (59) (formulas skatīt 2. papildinājumā). Noderīgu informāciju var dot citu citotoksicitātes vai citostāzes marķieru (piemēram, šūnu saplūšanas, šūnu skaita, apoptozes, nekrozes, metafāzes uzskaites) novērtēšana. 27. Jāizvērtē vismaz trīs analizējamas testējamās koncentrācijas. Lai to panāktu, var būt nepieciešams veikt eksperimentu, izmantojot lielāku skaitu savstarpēji tuvu esošu koncentrāciju un analizēt mikrokodolu veidošanos tādās koncentrācijās, kas nodrošina piemērotu citotoksicitāšu diapazonu. Alternatīva stratēģija ir veikt iepriekšēju citotoksicitātes testēšanu, lai galīgajā testā vajadzētu pētīt mazāku skaitu koncentrāciju. 28. Augstākajai koncentrācijai jārada 55 ± 5 % citotoksicitāte. Augstākās koncentrācijās kā sekundāra citotoksicitātes ietekme var rasties hromosomu bojājumi (60). Ja konstatē citotoksicitāti, izraudzītajām testējamām koncentrācijām jābūt diapazonā no koncentrācijas, kas rada 55 ± 5 % citotoksicitāti, līdz koncentrācijai, kas rada nelielu citotoksicitāti vai to nerada nemaz. 29. Ja citotoksiskums vai nogulsnes nav novērotas, augstākajai testējamai koncentrācijai jāatbilst 0,01 M, 5 mg/ml vai 5 μl/ml atkarībā no tā, kura ir mazākā. Analīzei atlasītajām koncentrācijām parasti jāatšķiras par ne vairāk kā 10 vienībām. Testējamām vielām, kam koncentrācijas–atbildes reakcijas līknes ir stāvas, var būt jātestē savstarpēji mazāk atšķirīgas koncentrācijas, lai uzskaiti varētu veikt arī kultūrās ar vidēju un zemu toksicitātes diapazonu. 30. Ja ierobežojošais faktors ir šķīdība, maksimālā koncentrācija (ja to neierobežo citotoksicitāte) ir zemākā koncentrācija, kurā kultūrās ir saredzamas minimālas nogulsnes, ar nosacījumu, ka tas netraucē uzskaitei. Nogulsnes jāvērtē ar tādām metodēm kā gaismas mikroskopija un kultivēšanas gaitā neizzūdošu vai (līdz apstrādes beigām) parādošos nogulšņu konstatēšana. Kontroles 31. Katrā eksperimentā jāiekļauj vienlaicīgas pozitīvās un šķīdinātāja/nesēja kontroles, ar metabolisma aktivāciju vai bez tās. 32. PC ir vajadzīga, lai pierādītu izmantoto šūnu spēju un testa protokola derīgumu klastogēnu un aneigēnu identificēšanai un apliecinātu S9 preparāta metabolisko kapacitāti. Ar PC būtu jāizmanto zināmi mikrokodolu veidošanās inducētāji tādās koncentrācijās, kurās sagaidāms neliels, bet reproducējams palielinājums salīdzinājumā ar fona līmeni, un tiek uzskatāmi parādīta testēšanas sistēmas jutība. PC vielu koncentrācijas izvēlas tā, lai to iedarbība būtu skaidri redzama, tomēr lai kodēto priekšmetstikliņu identitāti to nolasītājs nevarētu konstatēt uzreiz. 33. Lai uzskatāmi parādītu testēšanas sistēmas metabolisko kompetenci un spēju detektēt klastogēnus, jāizmanto klastogēns, kuram vajadzīga metabolisma aktivācija (piemēram, ciklofosfamīds vai benz[a]pirēns). Ja tas ir pamatoti, var lietot citas PC. Dažas PC, kam vajadzīga metabolisma aktivācija, noteiktos apstrādes apstākļos vai noteiktās šūnu līnijās var būt aktīvas bez eksogēnas metabolisma aktivācijas, un tāpēc izraudzītajā šūnu līnijā un izraudzītajās koncentrācijās jātestē vajadzība pēc metaboliskās aktivācijas un S9 preparāta aktivitāte. 34. Patlaban nav zināms neviens aneigēns, kam vajadzīga metaboliska aktivācija, lai tas kļūtu genotoksiski aktīvs (16). Aneigēnās aktivitātes jomā patlaban pieņemtās PC ir, piemēram, kolhicīns un vinblastīns. Var izmantot citas ķīmiskas vielas, ja tās inducē mikrokodolu veidošanos vienīgi vai galvenokārt aneigēnas aktivitātes rezultātā. Lai novērstu vajadzību pēc divām PC (klastogenicitātei un aneigenicitātei) bez metaboliskās aktivācijas, aneigenicitātes kontroli var izmantot par PC bez S9 un klastogenicitātes kontroli var lietot, lai testētu izmantotās metabolisma aktivācijas sistēmas piemērotību. Klastogenicitātes un aneigenicitātes PC jāizmanto šūnās, kurām nav vajadzīga S9. Ieteicamās PC norādītas 3. papildinājumā. 35. Ja ir pieejamas piemērotas ķīmiskās vielas, var apsvērt ar ķīmiskās vielas klasi saistītas PC izmantošanu. Visām izmantotajām PC jābūt piemērotām attiecīgajam šūnu tipam un aktivācijas apstākļiem. 36. Visās šūnu savākšanas reizēs jāparedz šķīdinātāja/nesēja kontroles izmantošana. Turklāt jāizmanto arī neapstrādāta NC (bez šķīdinātāja/nesēja), ja vien nav publicētu vai laboratorijā pieejamu vēsturisko kontroles datu, kas uzskatāmi parāda, ka izraudzītajam šķīdinātājam šādā koncentrācijā nav genotoksiskas vai citas kaitīgas iedarbības. TESTA PROCEDŪRA Apstrādes kārtība 37. Lai palielinātu varbūtību, ka aneigēns vai klastogēns tiek detektēts brīdī, kad tas ir aktīvs kādā konkrētā šūnas cikla posmā, ir svarīgi ar testējamo vielu apstrādāt pietiekamu skaitu šūnu visos to šūnas cikla posmos. Tādēļ šūnu līniju un primāro šūnu kultūru apstrādes kārtība var nedaudz atšķirties no limfocītu apstrādes, kam vajadzīga mitogēnā stimulācija, lai sāktos šūnas cikls; tas apskatīts 41.–43. punktā (16). 38. Teorētiski apsvērumi, kā arī publicētie dati (18), rāda, ka lielākā daļa aneigēnu un klastogēnu tiks detektēti īsā 3–6 stundu apstrādes periodā ar S9 vai bez tā, un turpinājumā sekos testējamās vielas noņemšana un augšanas periods 1,5–2,0 šūnas ciklu garumā (6). Šūnu paraugus ņem pēc laika perioda, kas atbilst aptuveni 1,5–2,0 parastajiem (t. i., neapstrādātu šūnu) šūnas cikliem, apstrādes sākumā vai beigās (skatīt 1. tabulu). Paraugu ņemšanas vai atveseļošanās laiku var pagarināt, ja ir zināms vai domājams, ka testējamā viela ietekmē šūnas cikla ilgumu (piemēram, ja testē nukleozīdu analogus). 39. Ņemot vērā S9 preparātu potenciālo citotoksicitāti kultivētās zīdītāju šūnās, apstrādi ar paildzinātu iedarbību 1,5–2,0 normālos šūnas ciklos veic tikai bez S9. Paildzinātā apstrādē ir iespējas šūnu apstrādi ar testējamo vielu veikt cytoB klātbūtnē vai bez tās. Šīs iespējas attiecas uz situācijām, kurās var būt bažas par iespējamo mijiedarbību starp testējamo vielu un cytoB. 40. Ierosinātā šūnu apstrādes kārtība ir parādīta 1. tabulā. Šo vispārīgo apstrādes kārtību var modificēt atkarībā no testējamās vielas stabilitātes vai reaģētspējas vai no konkrētām izmantoto šūnu augšanas īpatnībām. Visos variantos apstrādei jāsākas un jābeidzas, kad šūnu augšana ir eksponenciāla. Apstrādes kārtība sīkāk izklāstīta 41.–47. punktā. 1. tabula Šūnu apstrādes un savākšanas laiks MNvit noteikšanā Limfocīti, primārās šūnas un šūnu līnijas ar cytoB + S9 3–6 stundas apstrādā S9 klātbūtnē; aizvāc S9 un apstrādes barotni; pievieno jaunu barotni un cytoB; šūnas savāc pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem. – S9 Īslaicīga iedarbība Apstrādā 3–6 stundas; aizvāc apstrādes barotni; pievieno jaunu barotni un cytoB; šūnas savāc pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem. – S9 Ilgstoša iedarbība A variants. 1,5–2 normālu šūnas ciklu laikā apstrādā cytoB klātbūtnē; savāc iedarbības laika beigās. B variants. apstrādā 1,5–2 normālu šūnas ciklu laikā; aizvāc testējamo vielu; pievieno jaunu barotni un cytoB; šūnas savāc pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem. Šūnu līnijas bez cytoB (Apstrāde identiska iepriekš aprakstītajai, taču bez cytoB pievienošanas.) Limfocīti, primārās šūnas un šūnu līnijas ar cytoB 41. Limfocītiem visefektīvākā pieeja ir sākt testējamās vielas iedarbību 44–48 stundas pēc stimulēšanas ar PHA, kad cikla sinhronizācija būs zudusi (5). Sākotnējā noteikšanā šūnas 3–6 stundas apstrādā ar testējamo vielu S9 klātbūtnē vai bez tās. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, kas satur cytoB, un pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem šūnas savāc. 42. Ja abās sākotnējās noteikšanās ar īslaicīgu (3–6 stundu) apstrādi rezultāts ir negatīvs vai neskaidrs, nākamo apstrādi veic ar ilgstošāku iedarbību bez S9. Pieejami divi vienlīdz pieņemami apstrādes varianti. Tomēr iespējams, A variants ir labāks stimulētiem limfocītiem, jo eksponenciālā augšana 96 stundas pēc stimulēšanas sākuma var mazināties. Turklāt B variantā līdz galīgajam paraugu ņemšanas laikam šūnu kultūras nebūtu saplūdušas. — A variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā un apstrādes laika beigās šūnas savāc. — B variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un šūnas savāc pēc tam, kad beigušies vēl 1,5–2,0 normāli šūnas cikli. 43. Primārās šūnas un šūnu līnijas jāapstrādā līdzīgi kā limfocītus, izņemot to, ka nav nepieciešams tos 44–48 stundas stimulēt ar PHA. Uz šūnām, kas nav limfocīti, iedarbojas tā, ka pētījuma beigās šūnas joprojām atrodas logaritmiskajā augšanas posmā. Šūnu līnijas bez cytoB 44. Šūnas 3–6 stundas apstrādā S9 klātbūtnē vai bez tās. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un pēc 1,5–2,0 normāliem šūnas cikliem šūnas savāc. 45. Ja abās sākotnējās noteikšanās ar īslaicīgu (3–6 stundu) apstrādi rezultāts ir negatīvs vai neskaidrs, nākamo apstrādi veic ar ilgstošāku iedarbību. Pieejami divi vienlīdz pieņemami apstrādes varianti. — A variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā un apstrādes laika beigās šūnas savāc. — B variants. Šūnas apstrādā ar testējamo vielu 1,5–2,0 normālu šūnas ciklu laikā. Apstrādes barotni aizvāc un aizstāj ar svaigu barotni, un šūnas savāc pēc tam, kad beigušies vēl 1,5–2,0 normāli šūnas cikli. 46. Monoslāņa kultūrās 3–6 stundu apstrādes beigās vēl var būt mitotiskās šūnas (identificējamas kā apaļas un tādas, kas atdalās no virsmas). Tā kā mitotiskās šūnas viegli atdalās, tās var tikt aizvāktas kopā ar testējamo vielu saturošo barotni. Šīs šūnas jāsavāc, kad kultūras mazgā, un jāievieto atpakaļ kultūrā, lai šūnu savākšanas laikā nebūtu mitotiski dalošos šūnu un mikrokodolu zuduma. Šūnu kultūru skaits 47. Dublikātu kultūras jāizmanto katrai testējamās vielas koncentrācijai un nesēja/šķīdinātāja un NC kultūrām. Ja dublikātu kultūru variācija ir minimāla, ko pierāda ar vēsturiskiem laboratorijas datiem, ir pieņemami izmantot tikai vienu kultūru. Ja izmanto tikai vienu kultūru, ieteicams analizēt lielāku koncentrāciju skaitu. Šūnu savākšana un priekšmetstikliņu sagatavošana 48. Šūnas no katras kultūras savāc un apstrādā atsevišķi. Šūnu preparātu sagatavošana var ietvert hipotonisku apstrādi, bet tā nav nepieciešama, ja atbilstošu šūnu izklājumu panāk citā veidā. Var izmantot dažādus priekšmetstikliņu sagatavošanas paņēmienus, ja vien uzskaites vajadzībām tiek iegūti augstas kvalitātes šūnu preparāti. Šūnu citoplazma jāsaglabā, lai detektētu mikrokodolus un (ar citokinēzes bloķēšanas metodi) ticami identificētu divkodolu šūnas. 49. Priekšmetstikliņus iekrāsot var ar dažādām metodēm, piemēram, Giemsa vai luminiscences DNS specifiskām krāsvielām (59). Lietojot DNS specifisku krāsvielu (piemēram, akridīnoranžo (61) vai Hoechst 33258 ar pironīnu-Y (62)), iespējams izvairīties no daļas artefaktu, kas saistīti ar DNS nespecifisku krāsvielu izmantošanu. Antikinetohoru antivielas, FISH ar pancentromēriskām DNS zondēm vai in situ iezīmēšanu ar pancentromēriem specifiskām gruntskrāsām, kā arī atbilstošu DNS iekrāsošanu, var izmantot, lai identificētu mikrokodolu saturu (hromosomas/hromosomu fragmentus), ja vajadzīga informācija par to veidošanās mehāniku (15) (16). Citas metodes un diferenciāciju starp klastogēniem un aneigēniem var izmantot tad, ja pagātnē tā ir izrādījusies efektīva. Analīze 50. Visus priekšmetstikliņus, tostarp šķīdinātāja/nesēja un kontroles priekšmetstikliņus, pirms mikroskopiskās analīzes kodē. Alternatīvi, kodētus paraugus var analizēt, izmantojot validētas, automatizētas plūsmas citometriskā vai attēlu analīzes sistēmā. 51. Ar cytoB apstrādātās kultūrās mikrokodolu sastopamība jāanalizē vismaz 2 000 divkodolu šūnām vienā koncentrācijā (vismaz 1 000 divkodolu šūnās vienā kultūrā; divas kultūras vienā koncentrācijā). Ja izmanto tikai vienu kultūru, tajā jāuzskaita vismaz 2 000 divkodolu šūnu no katras koncentrācijas. Ja katrā koncentrācijā uzskaitei ir pieejamas ievērojami mazāk nekā 1 000 divkodolu šūnu katrā kultūrā vai 2 000 divkodolu šūnu, ja izmanto tikai vienu kultūru, un ja nav detektējams ievērojams mikrokodolu skaita pieaugums, testēšana jāatkārto ar lielāku daudzumu šūnu vai ar mazāk toksiskām koncentrācijām atkarībā no tā, kas ir piemērotāk. Jāraugās, lai neuzskaitītu divkodolu šūnas ar neregulāru formu vai tādas, kuru abi kodoli ir ļoti nevienādi; tāpat nevajag sajaukt divkodolu šūnas un nevienmērīgā izklājumā esošas daudzkodolu šūnas. Šūnās, kas satur vairāk nekā divus galvenos kodolus, mikrokodoli nav jāanalizē, jo šajās šūnās mikrokodolu vidējā izplatība var būt augstāka (63), (64). Vienkodola šūnu uzskaite ir pieņemama tad, ja ir pierādīts, ka testējamā vielas maina cytoB aktivitāti. 52. Ar cytoB neapstrādātās šūnu līnijās mikrokodoli jāuzskaita vismaz 2 000 šūnām vienā koncentrācijā (vismaz 1 000 šūnu vienā kultūrā; divas kultūras vienā koncentrācijā). Ja izmanto tikai vienu kultūru katrai koncentrācijai, no šīs kultūras jāuzskaita vismaz 2 000 šūnu. 53. Ja lieto cytoB, jānosaka CBPI vai RI, lai novērtētu šūnu savairošanos (skatīt 2. papildinājumu), izmantojot vismaz 500 šūnas katrā kultūrā. Ja apstrādi veic bez cytoB, ir būtiski sniegt uzskaitīto šūnu savairošanās pierādījumus, kā aprakstīts 24.–27. punktā. Pieņemamības kritēriji 54. Laboratorijai, kas ierosina izmantot MNvit noteikšanu, kas aprakstīta šajā TM, jāpierāda tās spēja ticami un pareizi detektēt ķīmiskās vielas ar zināmu aneigēnu un klastogēnu aktivitāti, ar metabolisko aktivāciju un bez tās, kā arī detektēt zināmas, negatīvi reaģējošas ķīmiskās vielas, izmantojot references vielas, kas uzskaitītas 3. papildinājumā. Kā pierādījumu savai spējai pareizi veikt šo TM laboratorijai jāsniedz pierādījumi par to, ka šūnās, kurās uzskaita mikrokodolu veidošanos, ir beigusies viena kodolu dalīšanās, ja testēšanu veic bez cytoB. 55. Ieteicamās references vielas ir ķīmiskās vielas, kas uzskaitītas 3. papildinājumā. Šo sarakstu var papildināt un tajā iekļautās ķīmiskās vielas aizstāt ar citām, ja šo ķīmisko vielu aktivitāte ir zināma un ja mikrokodolus tās inducē ar vienādiem darbības mehānismiem, un ja ir pierādīts, ka tās ir piemērotas ķīmiskajām vielām, kuras tiks testētas, izmantojot MNvit procedūru. Pamatojums var būt validācijas pētījums, kurš aptver daudzas un dažādas vai arī tikai dažas vielas, kas izvēlētas, ņemot vērā testējamās vielas ķīmisko klasi vai bojājumu rašanās mehānismu, kuru pēta. 56. Šķīdinātāja/nesēja kontrolei un neapstrādātām kultūrām būtu jāuzrāda reproducējami zema un stabila mikrokodolu sastopamība (parasti 5–25 mikrokodoli uz 1 000 šūnām visiem šūnu tipiem, kas minēti 11. punktā). Citiem šūnu tipiem var būt dažādi reakciju diapazoni, kas jānosaka, kad tos validē izmantošanai MNvit noteikšanā. Vēsturiskos kontroles diapazonus veido no datiem par negatīvo kontroli, šķīdinātāju un PC. Šīs vērtības jāizmanto, lemjot par to, vai eksperimentā izmantot vienlaicīgu NC/PC. 57. Ja noteikšanas vajadzībām ierosinātas sīkas izmaiņas testēšanas protokolā (piemēram, automatizēta, nevis manuāla uzskaite; jauns šūnu tips), šo izmaiņu efektivitāte jāpierāda, pirms modificēto protokolu var uzskatīt par pieņemamu izmantošanai. Efektivitātes pierādīšana ietver demonstrēšanu, ka ir iespējams detektēt hromosomu pārrāvumu un papildinājumu vai zaudējumu galvenos mehānismus un ka var iegūt atbilstošu pozitīvu un negatīvu rezultātu attiecībā uz atsevišķās vielas klasi vai daudzām dažādām vielām, kuras paredzēts testēt. DATI UN TESTĒŠANAS PĀRSKATS Rezultātu apstrāde 58. Ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu, mikrokodolu indukcijas novērtēšanai izmanto tikai divkodolu šūnas ar mikrokodoliem (neatkarīgi no mikrokodolu skaita šūnā). Atsevišķi uzskaitot šūnas ar vienu, diviem vai vairākiem mikrokodoliem, var iegūt noderīgu informāciju, bet tā nav obligāta. 59. Jānosaka vienlaicīgie citotoksiskuma un/vai citostāzes pasākumi visām apstrādātajām kultūrām un šķīdinātāja/nesēja kontroles kultūrām (58). Jāaprēķina CBPI vai RI visām apstrādātajām un kontroles kultūrām, to izsakot kā šūnas cikla kavēšanās mērījumus gadījumā, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu. Ja nav cytoB, izmanto RPD vai RICC, vai PI (skatīt 2. papildinājumu). 60. Norāda datus par atsevišķām kultūrām. Turklāt visus datus apkopo tabulas veidā. 61. Ķīmiskās vielas var inducēt mikrokodolu veidošanos MNvit tāpēc, ka tās inducē hromosomu pārrāvumu, hromosomu zaudējumu vai abus kopā. Var veikt papildu analīzi ar antikinetohoru antivielām vai centromēriem specifiskām in situ zondēm vai izmantot citas metodes, lai noteiktu, vai mikrokodolu inducēšanas mehānisms ir saistīts ar klastogēnu un/vai ar aneigēnu aktivitāti. Rezultātu izvērtējums un interpretācija 62. Nav prasības veikt verifikāciju, papildus testējot izteikti pozitīvu vai negatīvu reakciju. Neskaidri rezultāti jāprecizē, analizējot vēl 1 000 šūnu no visām kultūrām, lai saglabātu aklā nolasījuma principu. Ja šī pieeja nedod rezultātu, testēšanu turpina. Turpmākajā testēšanā jāapsver pētījuma parametru modifikācija pēc vajadzības plašākā vai šaurākā diapazonā. Pētījuma parametri, kurus varētu modificēt, ir testējamo koncentrāciju atšķirības, apstrādes un šūnu savākšanas laiks un/vai metabolisma aktivācijas apstākļi. 63. Ir vairāki pozitīva rezultāta kritēriji, kā, piemēram, mikrokodolus saturošo šūnu skaita pieaugums atkarībā no koncentrācijas vai statistiski nozīmīgs pieaugums. Vispirms rezultātus izvērtē no bioloģiskā skatpunkta. Apsverot, vai novērotās vērtības ir vēsturiskā kontroles diapazona robežās vai ārpus tām, var iegūt pieturas punktus, lai novērtētu reakcijas bioloģisko nozīmīgumu. Kā palīglīdzekli izmēģinājumu rezultātu novērtēšanai var izmantot piemērotas statistikas metodes (65). Tomēr statistiskās testēšanas rezultāti jānovērtē attiecībā uz devas un reakcijas mijiedarbību. Jāņem vērā arī reproducējamība un vēsturiskie dati. 64. Lai gan lielākajā daļā eksperimentu iegūst nepārprotami pozitīvus vai negatīvus rezultātus, tomēr dažkārt pēc iegūtajiem datiem nevar skaidri spriest par testējamās vielas aktivitāti. Šīs neviennozīmīgās vai apšaubāmās reakcijas var rasties neatkarīgi no tā, cik reizes eksperimentu atkārto. 65. Pozitīvs MNvit noteikšanas rezultāts liecina, ka testējamās vielas inducē hromosomu pārrāvumu vai hromosomu zaudējumu kultivētās zīdītāju šūnās. Negatīvs rezultāts liecina, ka konkrētajos testēšanas apstākļos testējamā viela nerada hromosomu pārrāvumu un/vai papildinājumu vai zaudējumu kultivētās zīdītāju šūnās. Testēšanas pārskats 66. Testēšanas pārskatā jāiekļauj vismaz šāda informācija, ja tā attiecas uz konkrēto noteikšanu. Testējamā ķīmiskā viela: — identifikācijas dati, CAS numurs un EK numurs, — fizikālās īpašības un tīrības pakāpe, — fizikāli ķīmiskās īpašības, kas attiecas uz testa veikšanu, — testējamās ķīmiskās vielas reaģētspēja ar šķīdinātāju/nesēju vai šūnu kultūras barotni. Šķīdinātājs/nesējs: — šķīdinātāja/nesēja izvēles pamatojums, — testējamās vielas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā. Šūnas: — izmantoto šūnu tips un avots, — izmantotā šūnu tipa piemērotība, — mikoplazmas neesība (attiecīgā gadījumā), — informācija par šūnu cikla ilgumu, šūnu skaita divkāršošanās laiks vai savairošanās indekss, — ja izmanto limfocītus: asins donoru dzimums, vecums un skaits (attiecīgā gadījumā), — ja izmanto limfocītus: vai iedarbojas uz pilnu asins sastāvu vai tikai uz atsevišķi izdalītiem limfocītiem, — pārneses reižu skaits (attiecīgā gadījumā), — šūnu kultūru uzturēšanas metodes (attiecīgā gadījumā), — hromosomu modālais skaits, — normālais šūnas cikla ilgums (negatīvā kontrole). Testēšanas apstākļi: — ja izmanto citokinēzes bloķētāju (piemēram, cytoB): vielas identitāte, koncentrācija un laika periods, kurā notiek iedarbība uz šūnām, — vielas koncentrāciju un šūnu kultūru skaita izvēles pamatojums, piemēram, dati par citotoksiskajām īpašībām un šķīdības robežām, ja tie ir pieejami, — barotnes sastāvs, CO2 koncentrācija (attiecīgā gadījumā), — testējamās vielas koncentrācijas, — pievienotā nesēja un testējamās vielas koncentrācija (un/vai tilpums), — inkubācijas temperatūra un ilgums, — apstrādes ar testējamo vielu ilgums, — šūnu savākšanas ilgums pēc apstrādes, — šūnu blīvums to izsējas laikā (attiecīgā gadījumā), — metabolisma aktivācijas sistēmas veids un sastāvs, norādot pieņemamības kritērijus, — pozitīvās kontroles ķīmiskā viela un negatīvā kontrole, — priekšmetstikliņu sagatavošanas metodes un izmantotais šūnu iekrāsošanas paņēmiens, — mikrokodolu identifikācijas kritēriji, — analizēto šūnu skaits, — citotoksicitātes mērīšanas metodes, — ar citotoksicitāti saistīta papildu informācija, — kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testēšanas rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs, — izmantotā statistiskās analīzes metode vai metodes, — metodes (piemēram, tādas kā kinetohoru antivielas izmantošana), lai noskaidrotu, vai mikrokodoli satur veselas vai fragmentētas hromosomas (attiecīgā gadījumā). Rezultāti: — citotoksicitātes mērīšanas veids, piemēram, CBPI vai RI, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas paņēmienu; RICC, RPD vai PI, ja citokinēzes bloķēšanas paņēmienu neizmanto; citi novērojumi (attiecīgā gadījumā), piemēram, šūnu saplūšana, apoptoze, nekroze, metafāzu skaits, divkodolu šūnu sastopamības biežums, — izgulsnēšanās pazīmes, — dati par apstrādes barotnes pH un osmozi, ja tie noteikti, — analīzei pieņemamu šūnu definīcija, — vienkodola, divkodolu un daudzkodolu šūnu sastopamība, ja izmanto citokinēzes bloķēšanas metodi, — katrai apstrādātajai un kontroles kultūrai atsevišķi norādīts to šūnu skaits, kurām ir mikrokodoli, un norādīts, vai mikrokodoli ir no divkodolu vai no vienkodola šūnām (attiecīgā gadījumā), — ja iespējams, reakcijas uz koncentrāciju novērtējums, — vienlaicīgas negatīvās (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvās kontroles ķīmiskie dati (koncentrācijas un šķīdinātāji), — vēsturiskie negatīvās (šķīdinātāja/nesēja) un pozitīvās kontroles ķīmiskie dati, norādot diapazonus, vidējās vērtības un standartnovirzes un ticamības intervālu (piemēram, 95 %), — statistiskā analīze; p-vērtības (attiecīgā gadījumā). Rezultātu apspriešana Secinājumi IZMANTOTĀ LITERATŪRA 1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4. 2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15. 3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246. 4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172. 5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104. 6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198. 7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43. 8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20. 9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302. 10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334. 11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213. 12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525. 13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20. 14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245. 15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219. 16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163. 17) OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines] 18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36. 19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60. 20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87. 21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124. 22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152. 23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208. 24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59. 25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116. 26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190. 27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71. 28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163. 29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134. 30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580. 31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152. 32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 November, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] 33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] 34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283. 35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115. 36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260. 37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328. 38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70. 39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205. 40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305. 41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886. 42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36. 43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18. 44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31-45. 45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215. 46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65. 47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177. 48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, 85. – 88. lpp. 49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59. 50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int/] 51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274. 52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 91. – 103. lpp. 53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801. 54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44. 55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112. 56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to “Report from the in vitro micronucleus assay working group”, Mutation Res., 564, 97-100. 57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65. 58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3. 59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184. 60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201. 61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247. 62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275. 63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247. 64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75. 65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, 463.–467. lpp. 66) Regulation (EC) No 850/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 on persistent organic pollutants and amending Directive 79/117/EEC, OV L 229, 30.4.2004., 5. lpp. 1. papildinājums Definīcijas Aneigēns: viela vai process, kas mijiedarbībā ar mitotiskā un mejotiskā šūnu dalīšanās cikla komponentiem izraisa šūnu vai organismu aneiploīdiju. Aneiploīdija: novirze no normālā diploīdā (vai haploīdā) hromosomu skaita par vienu vai vairākām atsevišķām hromosomām, bet ne par hromosomu pāri vai pāriem (poliploīdija). Apoptoze: programmēta šūnu nāve, ko raksturo virkne posmu, kuru rezultātā šūnas sabrūk, bet saglabā membrānu integritāti, un veidojas apoptotiskie ķermenīši, kurus iznīcina fagocīti vai kuri tiek fiziski izvadīti. Šūnu savairošanās: šūnu skaita pieaugums šūnu mitotiskās dalīšanās rezultātā. Centromērs: hromosomas DNS reģions, kurā abas hromatīdas ir saistītas un uz kura sānu pie sāna piestiprinājušās abas kinetohoras. Klastogēns: viela vai process, kas izraisa strukturālu hromosomālu aberāciju (novirzīšanos no normāltipa) šūnu vai organismu populācijās. Citokinēze: šūnas dalīšanās process, kas notiek tūlīt pēc mitozes un kura rezultātā izveidojas divas meitšūnas, katra ar savu kodolu. Savairošanās indekss pēc citokinēzes blokādes (CBPI): otrā dalīšanās viļņa šūnu proporcionālā daļa populācijās, kas saņēmušas pētāmo vielu, salīdzinājumā ar pētāmo vielu nesaņēmušo kontroles populāciju (formulu skatīt 2. papildinājumā). Citostāze: šūnu augšanas kavēšana (formulu skatīt 2. papildinājumā). Citotoksicitāte: šūnas nāvi izraisoša kaitīga ietekme uz šūnas struktūru vai funkcionalitāti. Genotoksisks: vispārīgs termins, kas aptver visu veidu bojājumus DNS vai hromosomās, tostarp sekvences pārtraukumus, pārkārtojumus, mutācijas, hromosomu aberācijas un aneiploīdiju. Ne visas genotoksiskās ietekmes rada mutācijas vai pastāvīgus hromosomu bojājumus. Starpfāzu šūnas: šūnas, kas neatrodas mitotiskajā stadijā. Kinetohora: proteīnus saturoša struktūra, kas sagrupējas pie centromēra hromosomā, ar kuru šūnas dalīšanās laikā saistās vārpstiņas šķiedras, nodrošinot secīgu meitashromosomu pārvietošanos uz meitasšūnu poliem. Mikrokodoli: mazi kodoli, kas papildus šūnu galvenajiem kodoliem mitozes vai mejozes telofāzē atsevišķi izveidojas, salīpot hromosomu fragmentiem vai veselām hromosomām. Mitoze: šūnas kodola dalīšanās process, kuru parasti sīkāk iedala šādās stadijās: profāze, prometafāze, metafāze, anafāze un telofāze. Mitotiskais indekss: metafāzē esošu šūnu skaita attiecība pret šūnu kopējo skaitu populācijā; raksturo šūnu savairošanās pakāpi šajā populācijā. Mutagēns: faktors, kas izraisa pārmantojamas DNS bāzu pāru sekvences vai sekvenču izmaiņas gēnos vai hromosomu struktūrā (hromosomu aberācijas). Neatdalīšanās: māshromatīdu neatdalīšanās, kas meitšūnu veidošanās procesā neļauj māshromatīdām pienācīgi atvirzīties vienai no otras un kuras rezultātā hromosomu skaits meitšūnās nav normāls. Poliploīdija: vienu vai vairākus hromosomu komplektus ietverošas skaitliskas hromosomu aberācijas šūnās vai organismos (pretstatā aneiploīdijai, kas skar vienu vai vairākas atsevišķas hromosomas). Savairošanās indekss (PI): citotoksicitātes mērīšanas paņēmiens, ja neizmanto cytoB (formulu skatīt 2. papildinājumā). Šūnu skaita relatīvais pieaugums (RICC): citotoksicitātes mērīšanas paņēmiens, ja neizmanto cytoB (formulu skatīt 2. papildinājumā). Populācijas relatīvā divkāršošanās (RPD): citotoksicitātes mērīšanas paņēmiens, ja neizmanto cytoB (formulu skatīt 2. papildinājumā). Replicēšanās indekss (RI): pabeigtu [šūnu dalīšanās] ciklu proporcionālā daļa kultūrā, kas saņēmusi pētāmo vielu, ekspozīcijas un atveseļošanās laikā salīdzinājumā ar pētāmo vielu nesaņēmušo kontroles kultūru (formulu skatīt 2. papildinājumā). Testējamā ķīmiskā viela (arī testējama viela): viela vai vielu maisījums, kuru testē ar šo TM. 2. papildinājums Citotoksicitātes novērtējuma formulas 1. Ja izmanto cytoB, citotoksicitātes novērtējuma pamatā ir savairošanās indekss pēc citokinēzes blokādes (CBPI) vai replicēšanās indekss (RI) (16) (58). CBPI rāda šūnas ciklu vidējo skaitu vienai šūnai laikā, kamēr uz to iedarbojas cytoB, un šo indeksu var izmantot, lai aprēķinātu šūnu savairošanos. RI rāda kodolu relatīvo skaitu apstrādātajās kultūrās salīdzinājumā ar kontroles kultūrām, un ar to var procentos (%) izteikt citostāzi: % citostāze = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} un: T = ar testējamo ķīmisko vielu apstrādātā kultūra C = nesēju saņēmusī kontroles kultūra kur: Tādā veidā CBPI ar vērtību 1 (visas šūnas ir vienkodola šūnas) ir līdzvērtīgs 100 % citostāzei. Citostāze = 100 – RI T = apstrādātās kultūras C = kontroles kultūras 2. Tādā veidā, ja RI ir 53 %, tas nozīmē, ka, salīdzinot ar kontroles kultūras šūnu skaitu, kuras dalījušās, izveidojot divkodolu un daudzkodolu šūnas, apstrādātajā kultūrā šādi dalījušies tikai 53 % no tāda paša šūnu skaita, t. i., ir 47 % citostāze. 3. Ja cytoBneizmanto, citotoksicitātes novērtējuma pamatā ieteicams likt šūnu skaita relatīvā pieauguma (RICC) vai populācijas relatīvās divkāršošanās (RPD) rādītājus (58), jo tie abi ņem vērā to šūnu populācijas daļu, kura ir dalījusies. kur: Populācijas divkāršošanās = [log (šūnu skaits pēc apstrādes ÷ šūnu skaits sākumā)] ÷ log 2 4. Tādā veidā, ja RICC vai RPD ir 53 %, tas uzrāda 47 % citotoksicitāti/citostāzi. 5. Ar savairošanās indeksu (PI) citotoksicitāti var novērtēt, saskaitot klonus, ko veido 1 šūna (cl1), 2 šūnas (cl2), 3 līdz 4 šūnas (cl4) un 5 līdz 8 šūnas (cl8). 6. PI ir ticis izmantots kā noderīgs un ticams citotoksicitātes parametrs arī bez cytoB iedarbības in situ kultivētām šūnu līnijām (25) (26) (27) (28). 3. papildinājums Veiktspējas novērtēšanai ieteicamās references vielas (16) Kategorija Ķīmiskā viela CAS Nr. EK Nr. 1. Klastogēni, kuriem metabolisma aktivācija nav vajadzīga Citozīnarabinozīds 147-94-4 205-705-9 Mitomicīns C 50-07-7 200-008-6 2. Klastogēni, kam ir vajadzīga metabolisma aktivācija Benz(a)pirēns 50-32-8 200-028-5 Ciklofosfamīds 50-18-0 200-015-4 3. Aneigēni Kolhicīns 64-86-8 200-598-5 Vinblastīns 143-67-9 205-606-0 4. Negatīvās vielas Di-(2-etilheksil)ftalāts 117-81-7 204-211-0 Nalidiksskābe 389-08-2 206-864-7 Pirēns 129-00-0 204-927-3 Nātrija hlorīds 7647-14-5 231-598-3 B.50. ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA: LOKĀLO LIMFMEZGLU NOTEIKŠANA (LLNA:DA) IEVADS 1. ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas un ES testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā tehnikas attīstību, regulatīvo prasību izmaiņas un dzīvnieku labturības apsvērumus. Ir pārskatīta B.42 – pirmā no testēšanas metodēm (TM) ādas sensibilizācijas noteikšanai pelēm jeb lokālo limfmezglu noteikšanas metode (LLNA; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) (1). Ir publicēti LLNA validācijas un ar to saistītā darba pārskati (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Lai mērītu limfocītu savairošanos, LLNA izmanto radioizotopisko timidīnu vai jodīnu, un tāpēc šīs metodes pielietošana ir ierobežota gadījumos, kad radioaktīvo komponentu iegāde, izmantošana vai apglabāšana ir problemātiska. LLNA:DA (izstrādātājs: Daicel Chemical Industies Ltd.) ir modificēta LLNA, kurā nav radioaktīvo komponentu un ar kuru kvantitatīvi nosaka adenozīntrifosfāta (ATP) saturu, par limfocītu savairošanās indikatoru izmantojot bioluminiscenci. LLNA:DA testēšanas metode ir validēta, to ir pārskatījusi starptautiska salīdzinošās izvērtēšanas komisija un ir rekomendējusi šo metodi kā tādu, kas ar dažiem ierobežojumiem uzskatāma par noderīgu ādu sensibilizējošu un nesensibilizējošu ķīmisku vielu identificēšanai (10) (11) (12) (13). Šī TM ir izstrādāta, lai novērtētu ķīmiskām vielām vai to maisījumiem piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu (dzīvniekiem). Šā pielikuma B.6. nodaļā un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās aprakstītā metode izmanto testēšanu ar jūrascūciņām, proti, maksimizācijas testu jūrascūciņām un Bīlera testu (14). LLNA (šā pielikuma B.42. nodaļa; ESAO 429. testēšanas vadlīnijas) un abas šīs metodes modifikācijas, kurās nav radioaktīvo komponentu, proti, LLNA:DA (šā pielikuma B.50. nodaļa; ESAO 442.a testēšanas vadlīnijas) un LLNA:BrdU-ELISA (šā pielikuma B.51. nodaļa; ESAO 442.b testēšanas vadlīnijas), visas ir pārākas par testēšanas metodēm ar jūrascūciņām, kas aprakstītas B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijās (14), dzīvnieku skaita samazinājuma un labāka izmantojuma ziņā. 2. Līdzīgi kā LLNA, ar LLNA:DA pēta ādas sensibilizācijas indukcijas fāzi un sniedz kvantitatīvus datus, kas piemēroti atbildes reakcijas uz devu novērtēšanai. Turklāt iespēja noteikt ādas sensibilizatorus, neizmantojot radioaktīvus DNS marķierus, atbrīvo no vajadzības risināt arodapstarošanas un radioaktīvo atkritumu apglabāšanas jautājumus. Tas savukārt ļauj ādas sensibilizatoru noteikšanai biežāk izmantot peles un turpināt samazināt jūrascūciņu izmantošanu ādas sensibilizācijas potenciāla testēšanā (t. i., B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (14). DEFINĪCIJAS 3. Definīcijas skatīt 1. papildinājumā. SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI 4. LLNA:DA metode ir modificēta LLNA, kura paredzēta ķīmisko vielu – potenciālu ādas sensibilizatoru identificēšanai un kurai ir zināmi ierobežojumi. Tas nenozīmē, ka visos gadījumos LLNA:DA būtu jālieto LLNA vai jūrascūciņu testa vietā (B.6; ESAO 406. testēšanas vadlīnijas) (14), bet gan to, ka šī noteikšana ir minētajam testam līdzvērtīga un to var izmantot kā alternatīvu, kuras pozitīvajam vai negatīvajam rezultātam vairs nav vajadzīgs papildu apstiprinājums (10) (11). Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder testējamās vielas identifikācija un ķīmiskā struktūra, fizikāli ķīmiskās īpašības, citu in vitro vai in vivo veikto toksicitātes testu rezultāti un toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām. Šī informācija jāizvērtē, lai noteiktu LLNA:DA piemērotību konkrētajai testējamai vielai (ņemot vērā atsevišķu veidu vielu nesaderību ar LLNA:DA; skatīt 5. punktu) un lai izraudzītos pareizu testējamās vielas devu. 5. LLNA:DA ir in vivo metode un kā tāda paredz dzīvnieku izmantošanu alerģiskās kontakta sensibilizējošās aktivitātes novērtējumā. Tomēr salīdzinājumā ar testēšanas metodēm, kurās izmanto jūrascūciņas (B.6; ESAO 406. testēšanas metode), tajā iespējams izmantot mazāku skaitu dzīvnieku (14). LLNA:DA turklāt piedāvā būtisku uzlabojumu (mazāk sāpju un ciešanu) dzīvnieku izmantojumā alerģiskās kontakta sensibilizējošās testēšanas vajadzībām, jo (atšķirībā no B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām) LLNA:DA nav jānoskaidro provocētās–inducētās ādas hipersensibilizācijas reakcijas. Neraugoties uz LLNA:DA priekšrocībām salīdzinājumā ar B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijām (14), šai metodei ir daži ierobežojumi, kuru dēļ tomēr jāizmanto B.6 vai ESAO 406. testēšanas vadlīniju metode (piemēram, dažu metālu testēšanā, šķietami pozitīva rezultāta konstatēšanas gadījumā dažiem ādas sensibilizatoriem [kā, piemēram, atsevišķām surfaktantu tipa vielām] (6) (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) vai testējamās vielas šķīdības labad). Turklāt vajadzība pēc jūrascūciņu testiem (B.6 un ESAO 406. testēšanas vadlīnijas (14)) var saglabāties attiecībā uz ķīmisko vielu klasēm vai vielām, kuru sastāvā ir funkcionālās grupas, par kurām ir pierādīts, ka tās darbojas kā potenciāli sajaucējfaktori (16). Ierobežojumus, kuri konstatēti LLNA gadījumā (1; šā pielikuma B.42. nodaļa) ieteicams attiecināt arī uz LLNA:DA (10). Turklāt LLNA:DA var nebūt piemērotākā metode tādu vielu testēšanai, kas ietekmē ATP koncentrācijas (piemēram, vielas, kam ir ATP inhibējoša iedarbība) vai kas ietekmē starpšūnu ATP mērījumu precizitāti (piemēram, ATP degradējošu enzīmu klātbūtne, ārpusšūnu ATP klātbūtne limfmezglā). Izņemot šādus minētos ierobežojumus, LLNA:DA jāvar izmantot jebkuras vielas testēšanai, ja vien testējamai vielai nav tādu īpašību, kas varētu ietekmēt LLNA:DA precizitāti. Ja stimulācijas indeksa (SI) vērtība ir robežās no 1,8 līdz 2,5, jāapsver neitrālam tuva pozitīva rezultāta iespējamība (skatīt 31.–32. punktu). Šā apgalvojuma pamatā ir validēšanas datubāze, kuru veido 44 vielas ar SI ≥ 1,8 (skatīt 6. punktu); LLNA:DA pareizi identificēja visus 32 LLNA sensibilizatorus, bet kļūdaini identificēja trīs no 12 LLNA nesensibilizējošajām vielām, kuru SI vērtības bija robežās no 1,8 līdz 2,5 (t. i., pozitīvs neitrālam tuvs rezultāts) (10). Tomēr, tā kā SI vērtību noteikšanai un testēšanas metodes prognozēšanas spējas aprēķināšanai tika izmantota viena un tā pati datu kopa, minētie rezultāti var būt pārāk augsts reālās prognozēšanas spējas novērtējums. TESTĒŠANAS METODES PRINCIPS 6. LLNA:DA pamatprincips ir tāds, ka sensibilizatori inducē limfocītu savairošanos limfmezglos, kuri drenē testējamās vielas saņemšanas vietu. Šī savairošanās ir proporcionāla devai un alergēna iedarbīgumam un ir vienkāršs paņēmiens, lai iegūtu kvantitatīvu sensitivitātes mērījumu. Savairošanās pakāpi nosaka, vidējo savairošanos katrā testējamās vielas grupā salīdzinot ar vidējo savairošanos kontroles grupā, kas saņēmusi tikai nesēju (VC). Nosaka attiecību starp vidējo progresiju grupās, kas saņēmušas pētāmo vielu, un progresiju VC grupā; tas ir stimulācijas indekss (SI). Lai testējamo vielu pamatoti turpinātu vērtēt kā potenciālu ādas sensibilizatoru, SI vērtībai jābūt ≥ 1,8. Šeit aprakstītās procedūras pamatā ir adenozīntrifosfāta (ATP) satura mērīšana ar bioluminiscenci (zināms, ka tas korelē ar dzīvo šūnu skaitu) (17), lai indicētu vairojošos šūnu skaita pieaugumu aurikulārajos limfmezglos (18) (19). Biolumuniscences metodē izmanto luciferāzi (enzīms), lai katalizētu gaismas rašanos no ATP un luciferīna šādā reakcijā: ATP + Luciferīns + O 2 Oksiluciferīns + AMP + PPi + CO 2 + Gaisma Emitētās gaismas intensitāte ir lineārā sakarībā ar ATP koncentrāciju, un to mēra ar luminometru. Luciferīna–luciferāzes noteikšana ir jutīga metode ATP kvantitatīvai noteikšanai, kam ir plašs lietojumu spektrs (20). METODES APRAKSTS Dzīvnieku sugas izvēle 7. Šim testam izvēlētā suga ir peles. LLNA:DA validēšanas pētījumi ir veikti vienīgi ar CBA/J līnijas dzīvniekiem, un tāpēc to uzskata par ieteicamo līniju (12) (13). Izmanto jaunas, pieaugušas sievišķā dzimuma peles, kas nav dzemdējušas un nav grūsnas. Pētījuma sākumā dzīvniekiem jābūt 8–12 nedēļu veciem, dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un ne lielākām par 20 % no vidējās masas. Citas līnijas un vīrišķā dzimuma dzīvniekus var izmantot, ja ir iegūts pietiekami daudz datu, lai parādītu, ka LLNA:DA atbildes reakcijā nav nozīmīgu atšķirību, kas specifiskas līnijai un/vai dzimumam. Turēšanas un barošanas apstākļi 8. Ja nav zinātniska pamatojuma, kāpēc peles būtu turamas katra atsevišķi, peles izmitina grupā (21). Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 ± 3 °C temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50–60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam atbilstoši secībai 12 stundas gaišas, 12 stundas tumšas. Barošanai var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens daudzumu. Dzīvnieku sagatavošana 9. Dzīvniekus izvēlas pēc nejaušības principa, marķē individuālai identificēšanai (bet nekādā veidā nemarķē ausis) un tur būros vismaz piecas dienas pirms testa sākuma, lai tos aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Pirms apstrādes uzsākšanas visus dzīvniekus apskata, lai pārliecinātos, ka tiem nav novērojami ādas bojājumi. Testa šķīdumu sagatavošana 10. Cietas ķīmiskās vielas pirms peļu ausu apstrādes izšķīdina vai suspendē, izmantojot šķīdinātājus vai nesējus, un vajadzības gadījumā atšķaida. Šķidras ķīmiskās vielas var izmantot gan atšķaidītas, gan neatšķaidītas. Nešķīstošas ķīmiskās vielas (kādas parasti izmanto medicīnas iekārtās) pirms peļu ausu apstrādes ekstrahē piemērotā šķīdinātājā, lai visas ekstrahējamās sastāvdaļas būtu pieejamas testēšanai. Ja dati par testējamo vielu stabilitāti liecina, ka tās uzglabāt nevar, katru dienu sagatavo svaigas testējamās vielas. Ticamības pārbaude 11. Metodes veiktspējas pienācīgumu parāda ar pozitīvās kontroles vielu (PC) palīdzību, kuras ar adekvātu un reproducējamu sensibilitāti reaģē uz sensibilizējošām testēšanas vielām un kuru reakcijas intensitāte ir sīki aprakstīta. Ieteicams paredzēt vienlaicīgu PC, jo tādā veidā var pierādīt laboratorijas spēju atkārtoti un sekmīgi īstenot noteikšanu, kā arī novērtēt iekšlaboratorijas un starplaboratoriju reproducējamību un rezultātu salīdzināmību. Pirms LLNA:DA ieteicams lietotājiem konsultēties ar atbildīgajām iestādēm, jo dažas regulatīvās iestādes pieprasa PC izmantošanu katrā individuālā pētījumā. Attiecīgi labāk ir ikreiz izmantot vienlaicīgu PC, jo tas ļauj neveikt papildu testēšanu ar dzīvniekiem, lai izpildītu prasības, kuras var izrietēt no PC neregulāras izmantošanas (skatīt 12. punktu). PC jādod pozitīva LLNA:DA atbildes reakcija tādā iedarbības līmenī, kurā ir sagaidāms stimulācijas indekss (SI) ≥ 1,8, salīdzinot ar negatīvās kontroles vielu (NC) grupu. PC deva jāizvēlas tā, lai neizraisītu pārmērīgu ādas kairinājumu vai sistēmisku toksicitāti un lai indukcija būtu atkārtojama, taču ne pārmērīga (piemēram, SI > 10 uzskata par pārmērīgu). Ieteicamākās PC ir 25 % heksilkanēļskābes aldehīds (Chemical Abstracts Service [CAS] Nr. 101-86-0) un 25 % eigenols (CAS Nr. 97-53-0) ar acetonu/olīveļļu (4:1 tilp./tilp.). Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas PC, kas atbilst iepriekš minētajiem kritērijiem. 12. Lai gan vienlaicīgas PC grupas izmantošana ir ieteicama, var būt situācijas, kad laboratorijās, kurās LLNA:DA veic regulāri (t. i., vismaz reizi mēnesī) un kurās tāpēc ir vēsturiska PC datubāze, kas pierāda laboratorijas spēju ar PC iegūt reproducējamus un pareizus rezultātus, piemērotāka var izrādīties periodiska PC izmantošana (t. i., vismaz reizi 6 mēnešos). LLNA:DA metodes adekvātu pārzināšanu var sekmīgi pierādīt, ar PC iegūstot konsekventus pozitīvus rezultātus vismaz 10 neatkarīgās testēšanas reizēs, kuras veiktas samērīgā laika periodā (t. i., ne ilgāk kā gada laikā). 13. Vienlaicīga PC grupa noteikti jāiekļauj, kad LLNA:DA notiek procedurālas izmaiņas (piemēram, augsti kvalificēta personāla nomaiņa, testēšanas metodes materiālu un/vai reaģentu nomaiņa, cits izmēģinājumu dzīvnieku piegādātājs), un šādas izmaiņas pienācīgi jādokumentē laboratorijas pārskatos. Jānovērtē šādu izmaiņu ietekme uz iepriekš izveidotās vēsturiskās datubāzes adekvātumu un tas, vai vajag veidot jaunu vēsturisku datubāzi, lai dokumentētu ar PC iegūtu rezultātu konsekvenci. 14. Pētniekiem jāapzinās, ka lēmums par periodisku, nevis vienlaicīgu PC izmantošanu ietekmēs to, kādā mērā par adekvātiem un pieņemamiem varēs uzskatīt negatīvos pētījumu rezultātus, kas bez vienlaicīgas PC iegūti periodiskās PC izmantošanas starplaikos. Piemēram, ja ar periodisko PC pētījumu iegūst šķietami negatīvu rezultātu, var apšaubīt negatīvu testējamās vielas rezultātu, kas iegūts iepriekšējā pieņemamā periodiskā PC pētījuma un nepieņemamā periodiskā PC pētījuma starplaikā. Tāpēc rūpīgi jāizvērtē, vai izmantot vienlaicīgu vai periodisku PC. Tāpat jāizvērtē, kādas ir iespējas vienlaicīgās PC grupā izmantot mazāk dzīvnieku, ja to var zinātniski pamatot un ja laboratorija ar saviem specifiskajiem vēsturiskajiem datiem var pierādīt, ka ir iespējams izmantot mazāk peļu (22). 15. Kaut arī PC jātestē nesējā, par kuru ir zināms, ka tas izrāda viendabīgu atbildes reakciju (piemēram, acetons/olīveļļa; 4:1 tilp./tilp.), var būt dažas reglamentējošas situācijas, kurās būs nepieciešama arī testēšana nestandarta nesējā (klīniski/ķīmiski piederīgs sastāvs) (23). Ja vienlaicīgo PC testē ar citu nesēju nekā testējamo vielu, vienlaicīgās PC vajadzībām jāparedz atsevišķs VC. 16. Ja vērtē vielas, kas pieder konkrētai ķīmisko vielu klasei vai kas dod noteikta diapazona reakciju, var izmantot salīdzināšanas vielas, kuras noder, lai parādītu, ka testēšanas metode darbojas un pienācīgi nosaka šā tipa vielām piemītošo ādas sensibilizācijas potenciālu. Pienācīgām salīdzināšanas vielām ir jāpiemīt šādām īpašībām: — strukturāla un funkcionāla līdzība ar testējamās vielas klases vielām, — labi zināmas fizikālās un ķīmiskās īpašības, — papildinoši dati no LLNA:DA, — papildinoši dati saistībā ar citiem dzīvniekiem un/vai cilvēku. TESTA PROCEDŪRA Dzīvnieku skaits un devu līmeņi 17. Uz devas grupu ar vismaz trim testējamās vielas koncentrācijām izmanto vismaz četrus dzīvniekus un vienlaicīgas NC grupu, kas saņem tikai testējamās vielas nesēju, un PC grupu (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). Jāapsver iespēja testēt vairākas PC devas, īpaši tad, ja PC testēšana ir periodiska. Izņemot apstrādi ar testējamo vielu, ar kontroles grupu dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem. 18. Devu un nesēja izvēlei jāpamatojas uz atsaucē (2) un (24) sniegtajiem ieteikumiem. Secīgas devas parasti izraugās no atbilstošas koncentrāciju rindas, kā 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, u. c. Koncentrāciju rindas izvēlei jābūt ar adekvātu zinātnisku pamatojumu. Jāizvērtē visa esošā toksikoloģiskā (piemēram, akūta toksicitāte un dermālais kairinājums) un struktūras un fizikālķīmiskā informācija par attiecīgo testējamo vielu (un/vai par struktūras ziņā saistītām vielām), ja tāda ir, un trīs secīgās koncentrācijas jāizraugās tā, lai augstākā no tām izraisītu stiprāko iedarbību, kura vēl nerada sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (24) (25). Ja šādas informācijas nav, sākumā var būt jāveic priekšskrīninga tests (skatīt 21.–24. punktu). 19. Nesējs nedrīkst pārmainīt vai maskēt testēšanas rezultātus, un tas jāizraugās tāds, lai šķīdība būtu iespējami lielāka, tā ļaujot iegūt augstāko reāli sasniedzamo koncentrāciju un iegūstot šķīdumu/suspensiju, kas būtu derīga testējamās vielas pielietošanai. Ieteicamie nesēji ir acetons/olīveļļa (4:1 tilp./tilp.), N,N-dimetilformamīds, metiletilketons, propilēnglikols un dimetilsulfoksīds (6), bet var izmantot arī citus, ja tam ir pietiekams zinātniskais pamatojums. Dažos gadījumos papildu kontrolei jāizmanto klīniski atbilstošs šķīdinātājs vai tirdzniecības preparāts, kura sastāvā testējamo vielu tirgo. Īpaši jārūpējas, lai nodrošinātu to, ka hidrofīlas vielas ir iekļautas nesēja sistēmā, kas mitrina ādu un tūlīt nenotek, un jāizmanto pienācīgi šķīdinātāji (piemēram, 1 % Pluronic® L92). Tādēļ ir jāizvairās no nesējiem, kas satur vienīgi ūdeni. 20. Izpētot no individuālām pelēm iegūtus limfmezglus, var novērtēt dzīvnieku savstarpējās atšķirības un iegūt testējamās vielas grupas un VC grupas mērījumu statistisku salīdzinājumu (skatīt 33. punktu). Turklāt PC grupas peļu skaita iespējamā samazinājuma izvērtējumam jēga ir vienīgi tad, ja dati ir par individuāliem dzīvniekiem (22). Dažas regulatīvās iestādes prasa, lai dati būtu par individuāliem dzīvniekiem. Regulāra datu vākšana par individuāliem dzīvniekiem dod priekšrocības dzīvnieku labturības ziņā, jo ļauj izvairīties no atkārtotas testēšanas gadījumā, ja vielas testēšanas rezultātus sākotnēji apkopo vienā veidā (piemēram, par apstrādes grupu), bet regulatīvās iestādes vēlāk izvirza citas prasības (piemēram, pieprasa datus par individuāliem dzīvniekiem). Priekšskrīninga tests 21. Ja nav informācijas, lai noteiktu augstāko testējamo devu (skatīt 18. punktu), jāveic priekšskrīninga tests, lai definētu ar LLNA:DA testējamo atbilstošo devas līmeni. Priekšskrīninga testa mērķis ir būt par orientieri ar LLNA:DA testējamā maksimālā devas līmeņa izvēlē, ja nav informācijas par koncentrāciju, kādā testējamā viela izraisa sistēmisku toksicitāti (skatīt 24. punktu) un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu (skatīt 23. punktu). Maksimālajam testējamās vielas devas līmenim vajadzētu būt 100 % (šķidrumiem) un augstākajai iespējamajai koncentrācijai (cietām vielām un suspensijām). 22. Priekšskrīninga testa apstākļi ir identiski pamata LLNA:DA apstākļiem, izņemot to, ka nevērtē progresiju limfmezglos un ka devas grupā var izmantot mazāku skaitu dzīvnieku. Ieteicamais skaits ir viens vai divi dzīvnieki katrā devas grupā. Visām pelēm ik dienas pārbauda to, vai apstrādes vietā nav klīnisku pazīmju, kas liecinātu par sistēmisku toksicitāti vai lokālu kairinājumu. Pirms testa un tā beigās (8. diena) reģistrē dzīvnieku ķermeņa masu. Katrai peles apskata abas ausis, un iespējamo apsārtumu novērtē pēc 1. tabulas punktu skalas (25). Auss biezumu mēra ar piemērotu mērierīci (piemēram, digitālo mikrometru vai “Peacock” tipa biezuma mērierīci) 1. dienā (pirms devas), 3. dienā (aptuveni 48 stundas pēc pirmās devas), 7. dienā (24 stundas pirms testēšanas beigām) un 8. dienā. Turklāt 8. dienā auss biezumu var mērīt ar auss caursišanas paņēmienu pēc tam, kad dzīvnieki ir humāni nonāvēti. Lokālu kairinājumu uzskata par pārmērīgu tad, ja jebkurā mērījumu dienā apsārtuma novērtējums pēc punktu skalas ir ≥ 3 un/vai auss biezums ≥ 25 % (26) (27). Lielākā deva, kas izmantojama LLNA:DA pamata testā, ir otrā zemākā deva priekšskrīninga koncentrāciju rindā (skatīt 18. punktu), kas neizraisa sistēmisku toksicitāti un/vai pārmērīgu lokālu ādas kairinājumu. 1. tabula Apsārtuma (eritēmas) skala Pazīmes Punktu skaits Apsārtuma nav 0 Vāji izteikts (gandrīz nemanāms) apsārtums 1 Izteikts apsārtums 2 Vidēji stiprs un ļoti stiprs apsārtums 3 Ļoti stiprs apsārtums (biešu sarkans) un kreveles, kas apsārtuma novērtēšanu padara neiespējamu 4 23. Papildus auss biezuma 25 % pieaugumam (26) (27) kairinātāju identificēšanai LLNA izmanto arī statistiski nozīmīgus auss biezuma pieauguma rādītājus apstrādātajām pelēm salīdzinājumā ar kontroles grupas pelēm (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Tomēr, lai gan statistiski nozīmīgs pieaugums var arī nesasniegt 25 % robežu, šādu pieaugumu neuzskata par pārmērīga kairinājuma izpausmi (30) (31) (32) (33) (34). 24. Turpmāk uzskaitītie klīniskie novērojumi, ja tie ir novērtējuma neatņemama daļa, var liecināt par sistēmisku toksicitāti (35), un tāpēc var parādīt, kāds būs LLNA:DA pamata testā izmantojamais maksimālais devas līmenis: nervu sistēmas darbības traucējumi (piemēram, piloarekcija, ataksija, drebuļi un krampji); uzvedības traucējumi (piemēram, agresivitāte, ar personīgo higiēnu saistītās uzvedības maiņa, jūtams aktivitātes samazinājums vai pieaugums); neraksturīga elpošana (piemēram, elpas vilcienu biežuma un intensitātes maiņa, kā apgrūtināta vai spazmatiska elpošana, trokšņi plaušās) un pārmaiņas barības un ūdens uzņemšanā. Turklāt novērtējumā jāņem vērā letarģijas pazīmes un/vai reakcijas samazināšanās un visas klīniskās pazīmes, kas liecina par vairāk nekā mirklīgām sāpēm un ciešanām, vai ķermeņa masas samazinājums par vairāk nekā 5 % laikā no 1. dienas līdz 8. dienai, kā arī mirstības rādītāji. Mirstoši dzīvnieki vai dzīvnieki, kuri uzrāda stipru sāpju un ciešanu pazīmes, ir humāni jānonāvē (36). Eksperimenta grafiks pamata pētījuma laikā 25. Eksperimenta grafiks ir šāds: — 1. diena: individuāli nosaka un reģistrē katra dzīvnieka masu, reģistrē klīniskos novērojumus. Izmantojot SLS šķīdumā iemērktu otiņu un katras auss aizmugures virsmu noklājot četros līdz piecos triepienos, uzliek 1 % nātrija laurilsulfāta (SLS) šķīdumu ūdenī. Stundu pēc apstrādes ar SLS katras auss aizmugures virsmu apstrādā ar 25 μl atšķaidījuma, kurš satur attiecīgo testējamo vielu, tikai nesēju vai PC (vienlaicīgu vai nesenu atkarībā no laboratorijas prakses un saistībā ar 11.–15. punktu). — 2., 3. un 7. diena: atkārto priekšapstrādi ar 1 % SLS šķīdumu ūdenī un testējamās vielas uzlikšanu kā 1. dienā. — 4., 5. un 6. diena: apstrāde nenotiek. — 8. diena: reģistrē katra dzīvnieka masu un klīniskos novērojumus. Aptuveni 24 līdz 30 stundas pēc tam, kad 7. dienā sākta vielas uzlikšana, dzīvniekus humāni nonāvē. No katras auss izgriež aurikulāros limfmezglus, kurus katrai pelei atsevišķi apstrādā fizioloģiskajā šķīdumā ar fosfātbuferi (PBS). Sīkus datus un diagrammas par limfmezglu identificēšanu un izgriešanu skatīt atsaucēs (22). Eksperimenta protokolā var iekļaut papildu parametrus, kas raksturo turpmāku ādas lokālo reakciju pamata pētījuma laikā, piemēram, auss apsārtuma novērtējumu pēc punktu skalas vai auss biezuma mērījumus (nosaka ar mērierīci vai ar auss caursišanas paņēmienu autopsijā). Šūnu suspensiju sagatavošana 26. No katrai pelei abās pusēs izgrieztām limfmezglu šūnām (LNC) sagatavo atsevišķu šūnu suspensiju; to dara, limfmezglus novietojot starp diviem priekšmetstikliņiem un viegli uzspiežot, lai tie pārplīstu. Kad audi vienmērīgi un plānā kārtā izlīdzinājušies, priekšmetstikliņus atdala vienu no otra. Uz abiem priekšmetstikliņiem esošos audus suspendē ar PBS, priekšmetstikliņu slīpā leņķī turot virs Petri trauciņa un skalojot ar PBS, un vienlaikus ar šūnu skrāpi tīrot priekšmetstikliņu no audiem. Tā kā NC dzīvnieku limfmezgli ir mazi, tie jāapstrādā ar sevišķu rūpību, lai novērstu SI vērtību izkropļojumus. Abu priekšmetstikliņu noskalošanai jāizmanto kopā 1 mL PBS. Petri trauciņā atrodošos LNC suspensiju homogenizē, nedaudz apmaisot ar šūnu skrāpi. Ar mikropipeti savāc 20 μL LNC suspensijas alikvotas, neskarot ar aci saredzamo membrānu, un pagatavo tās maisījumu ar 1,98 mL PBS, rezultātā iegūstot 2 mL paraugu. Pēc šīs pašas procedūras sagatavo otru 2 mL paraugu; tādā veidā no katra dzīvnieka iegūst divus paraugus. Šūnu savairošanās noteikšana (limfocītu ATP satura mērīšana) 27. ATP satura pieaugumu limfmezglos mēra ar luciferīna/luciferāzes metodi, izmantojot ATP mērīšanas komplektu, kas mēra bioluminiscenci, to izsakot relatīvās luminiscences vienībās (RLU). Noteikšanas laikam, kas aizrit no dzīvnieka nonāvēšanas brīža līdz ATP satura izmērīšanai, katra individuāla dzīvnieka gadījumā jābūt iespējami vienādākam un jāiekļaujas apmēram 30 minūtēs, jo uzskata, ka ATP saturs pēc dzīvnieka nonāvēšanas pakāpeniski samazinās (12). Tāpēc procedūru virkne, no aurikulāro limfmezglu izgriešanas līdz ATP izmērīšanai, jāpabeidz 20 minūtēs, ievērojot iepriekš noteiktu grafiku, kas visiem dzīvniekiem ir vienāds. ATP luminiscence jāmēra katrā 2 mL paraugā, tādā veidā no katra dzīvnieka iegūstot divus ATP mērījumu rezultātus. Turpmāko aprēķinu vajadzībām nosaka un izmanto vidējo ATP luminiscences rādītāju (skatīt 30. punktu). NOVĒROJUMI Klīniskie novērojumi 28. Ikviena pele vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz vietēju kairinājumu apstrādes vietā vai sistēmiskas toksicitātes klīniskajām pazīmēm. Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru peli izdarot individuālu ierakstu. Novērošanas plānā jāiekļauj kritēriji, kas ļauj tūlīt identificēt peles, kurām ir sistēmiskas toksicitātes, pārmērīga lokāla ādas kairinājuma vai ādas korozijas pazīmes, lai tām veiktu eitanāziju (36). Ķermeņa masa 29. Kā norādīts 25. punktā, individuālu dzīvnieku ķermeņa masa ir jānosaka testa sākumā un pirms plānotās humānās nonāvēšanas. REZULTĀTU APRĒĶINĀŠANA 30. Katras apstrādes grupas rezultātu izsaka ar vidējo SI. SI iegūst, vidējo RLU vērtību katrai pelei katrā testējamās vielas grupā un PC grupā dalot ar vidējo RLU vērtību katrai pelei šķīdinātāja/VC grupā. Tā VC grupās vidējais SI ir 1. 31. Lēmumu pieņemšanas procesā rezultātu uzskata par pozitīvu, ja SI ≥ 1,8 (10). Tomēr, nosakot, vai neitrālam tuvu rezultātu (t. i., ar SI vērtību robežās no 1,8 līdz 2,5) varētu uzskatīt par pozitīvu, var ņemt vērā arī devas un atbildes reakcijas stiprumu un šķīdinātāja/nesēja un PC reakcijas statistisko nozīmīgumu un konsekvenci (2) (3) (37). 32. Attiecībā uz neitrālam tuvu pozitīvu rezultātu ar SI vērtību robežās no 1,8 līdz 2,5, pirms apstiprināt, ka šis rezultāts ir pozitīvs, lietotāji var izvērtēt tādu papildu informāciju kā devas un atbildes reakcijas mijiedarbība, sistēmiskas toksicitātes vai pārmērīga kairinājuma pazīmes un, attiecīgā gadījumā, statistiskais nozīmīgums apvienojumā ar SI vērtībām (10). Jāņem vērā arī testējamās vielas dažādās īpašības, tostarp tas, vai tā strukturāli līdzinās jau zināmiem ādas sensibilizatoriem, vai tā izraisa pārmērīgu ādas kairinājumu pelēm un kāda veida atbildes reakcija uz devu ir novērota. Šie un citi apsvērumi sīkāk iztirzāti citur (4). 33. Datu vākšana par individuālām pelēm pavērs iespējas statistiskai analīzei par devas un atbildes reakcijas mijiedarbības esību un tās pakāpi šajos datos. Jebkurš statistisks novērtējums var ietvert devas un atbildes reakcijas mijiedarbības novērtējumu, kā arī pienācīgi koriģētus testējamo grupu salīdzinājumus (piemēram, devu pāri grupā un šīs grupas salīdzinājums ar vienlaicīgu šķīdinātāja/kontroles grupu). Statistiskā analīze var ietvert, piemēram, lineāro regresiju jeb Viljamsa [William’s] testu, ar ko analizē devas un atbildes reakcijas mijiedarbību tendences, un Daneta [Dunnett] testu, lai salīdzinātu devu pārus. Izvēloties attiecīgu statistiskās analīzes metodi, pētniekam jāapzinās iespējamās mainīgo lielumu nevienādības un citas ar to saistītās problēmas, kuru dēļ var būt nepieciešama datu pārveidošana vai neparametriskā statistiskā analīze. Visādā ziņā iespējams, ka pētniekam SI būs jāaprēķina un statistiskā analīze jāveic gan ar, gan bez dažiem punktveida datiem (respektīvi, neņemot vērā galējības jeb rupjas kļūdas). DATI UN TESTĒŠANAS PĀRSKATS Dati 34. Dati jāapkopo tabulā, uzrādot indivīdu RLU vērtības, grupas vidējo RLU vērtību uz dzīvnieku, attiecīgo kļūdas apzīmējumu (piem., SD, SEM) un vidējo SI katrai devas grupai salīdzinājumā ar vienlaicīgo šķīdinātāja/kontroles grupu. Testēšanas pārskats 35. Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai: Testējamā un kontroles viela: — identifikācijas dati (piemēram, CAS un EK numurs (ja ir); avots; tīrība; zināmie piemaisījumi; partijas numurs), — fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, gaistamība, stabilitāte, šķīdība), — maisījuma gadījumā: sastāvs un sastāvdaļu relatīvais procentuālais daudzums. Šķīdinātājs/nesējs: — identifikācijas dati (tīrība; koncentrācija (attiecīgā gadījumā); izmantotais tilpums), — nesēja izvēles pamatojums. Izmēģinājumu dzīvnieki: — CBA peļu avots, — dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms, — dzīvnieku skaits un vecums, — dzīvnieku avots, turēšanas un barošanas apstākļi utt. Testēšanas apstākļi: — ATP komplekta avots, partijas numurs un ražotāja kvalitātes nodrošinājuma/kvalitātes kontroles dati, — sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu un pielietošanu, — devu izvēles pamatojums, attiecīgā gadījumā iekļaujot priekšskrīninga testa rezultātus, — izmantotās nesēja un testējamās vielas koncentrācijas un pielietotās testējamās vielas kopējais daudzums, — sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot barības veidu/izcelsmi, ūdens izcelsmi), — sīks apstrādes un paraugu ņemšanas shēmas apraksts, — toksicitātes novērtēšanas metodes, — kritēriji, pēc kuriem testa rezultātu klasificē kā pozitīvu vai negatīvu, — sīkas ziņas par novirzēm no protokola un paskaidrojums par to, kādā veidā šī novirze ietekmē pētījuma plānu un rezultātus. Ticamības pārbaude: — jaunākās ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums, iekļaujot informāciju par testējamo vielu, tās koncentrāciju un nesēju, — vienlaicīgi un/vai vēsturiski PC un vienlaicīgi negatīvās (šķīdinātājs/nesējs) kontroles dati no testēšanas laboratorijas, — ja vienlaicīga PC nav paredzēta: datums un laboratorijas pārskats par nesenāko kārtējo PC un pārskats par agrāko PC datiem konkrētajā laboratorijā, kuri pamato vienlaicīgas PC neveikšanu. Rezultāti: — individuālu peļu masa dozēšanas sākumā un veicot plānoto nonāvēšanu; vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) katrai apstrādes grupai, — toksicitātes parādīšanās gaita un pazīmes, iekļaujot ādas kairinājumu ievadīšanas vietā, ja tāds ir, katram dzīvniekam, — dzīvnieka nonāvēšanas laiks un ATP mērījuma laiks katram dzīvniekam, — tabula ar individuālu peļu RLU vērtībām un SI vērtībām visām devām katrā apstrādes grupā, — vidējās vērtības un attiecīgais kļūdas apzīmējums (piem., SD, SEM) par RLU katrai pelei katrā apstrādes grupā un galējību jeb rupju kļūdu analīze katrā apstrādes grupā, — aprēķinātais SI un attiecīgs mainības mērs, kas ņem vērā to, ka ne testējamās vielas grupā, ne kontroles grupā dzīvnieki nav identiski, — devas un atbildes reakcijas sakarības, — attiecīgā gadījumā, statistiskā analīze. Rezultātu izvērtējums: — īss komentārs par rezultātiem, atbildes reakcijas uz devu analīzi un, attiecīgā gadījumā, statistisko analīzi ar secinājumu, vai testējamā viela jāuzskata par ādas sensibilizatoru. IZMANTOTĀ LITERATŪRA 1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002. 3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985-997. 4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-333. 5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59. 6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf] 7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258-273. 8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274-286. 9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249-257. 10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm] 11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf]. 12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1-10. 13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11-26. 14) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904. 16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96. 17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81-88. 18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127-132. 19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27-34. 20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346-370. 21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press. 22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf] 23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89. 24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31. 25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235. 27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]. 28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206. 29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94. 30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256. 31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, 491-506. 32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68. 33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728. 34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028. 35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm] 36) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53 563-79. 38) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] 1. papildinājums DEFINĪCIJAS Pareizība: pēc testēšanas metodes iegūto mērījumu rezultātu sakritības pakāpe ar pieņemtajām references vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas raksturlielums un viens no tās piemērotības aspektiem. Šo terminu bieži izmanto “atbilstības” vietā, ar to apzīmējot pēc testēšanas metodes iegūto pareizo rezultātu daļu (38). Salīdzināšanas viela: sensibilizējoša vai nesensibilizējoša viela, ko izmanto par standartu salīdzināšanai ar testējamo vielu. Salīdzināšanas vielai ir jābūt: (i) pastāvīgs un uzticams ieguves avots; (ii) struktūras un funkciju līdzība ar testējamo vielu klases vielām; (iii) zināmas fizikāli ķīmiskās īpašības; (iv) papildu datiem par zināmajiem iedarbības veidiem; (v) vielas zināmajam iedarbības stiprumam jāatbilst vēlamās reakcijas intensitātes diapazonam. Šķietams negatīvs: viela, kurai ar testēšanas metodi kļūdaini noteikta negatīva vai neaktīva reakcija, lai gan faktiski tā ir pozitīva vai aktīva. Šķietams pozitīvs: viela, kurai ar testēšanas metodi kļūdaini noteikta pozitīva vai aktīva reakcija, lai gan faktiski tā ir negatīva vai neaktīva. Bīstamība: potenciālā spēja kaitēt veselībai vai videi. Kaitīgā iedarbība kļūst nosakāma tikai tad, ja iedarbības intensitāte ir pietiekami liela. Starplaboratoriju reproducējamība: lielums, kas