LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis L 54/1

KOMISIJAS REGULA (EK) Nr. 152/2009

(2009. gada 27. janvāris),

ar ko nosaka paraugu ņemšanas un analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei

(Dokuments attiecas uz EEZ)

EIROPAS KOPIENU KOMISIJA,

ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu,

ņemot vērā Eiropas Parlamenta un Padomes 2004. gada 29. aprīļa Regulu (EK) Nr. 882/2004 par oficiālo kontroli, ko veic, lai nodrošinātu atbilstības pārbaudi saistībā ar dzīvnieku barības un pārtikas aprites tiesību aktiem un dzīvnieku veselības un dzīvnieku labturības noteikumiem (1), un jo īpaši tās 11. panta 4. punkta a), b) un c) apakšpunktu,

tā kā:

(1) Direktīvas 70/373/EEK īstenošanai tika pieņemti šādi tiesību akti, kas paliek spēkā saskaņā ar Regulas (EK) Nr. 882/2004 61. panta 2. punktu: — Komisijas 1971. gada 15. jūnija Pirmā Direktīva 71/250/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (2), — Komisijas 1971. gada 18. novembra Otrā Direktīva 71/393/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (3), — Komisijas 1972. gada 27. aprīļa Trešā Direktīva 72/199/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (4), — Komisijas 1972. gada 5. decembra Ceturtā Direktīva 73/46/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (5), — Komisijas 1976. gada 1. marta Pirmā Direktīva 76/371/EEK par Kopienas metodes noteikšanu lopbarības oficiālās pārbaudes paraugu ņemšanai (6), — Komisijas 1976. gada 1. marta Septītā Direktīva 76/372/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (7), — Komisijas 1978. gada 15. jūnija Astotā Direktīva 78/633/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (8), — Komisijas 1981. gada 31. jūlija Devītā Direktīva 81/715/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (9), — Komisijas 1984. gada 25. jūlija Desmitā Direktīva 84/425/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei (10), — Komisijas 1986. gada 9. aprīļa Direktīva 86/174/EEK, ar ko nosaka metodi mājputnu barības maisījumu enerģētiskās vērtības aprēķināšanai (11), — Komisijas 1993. gada 28. jūlija Vienpadsmitā Direktīva 93/70/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodes barības oficiālai kontrolei (12), — Komisijas 1993. gada 17. decembra Divpadsmitā Direktīva 93/117/EK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodes oficiālai barības kontrolei (13), — Komisijas 1998. gada 3. septembra Direktīva 98/64/EK par Kopienas analīžu metodēm aminoskābju, kopeļļu, koptauku un olahindoksa noteikšanai dzīvnieku barībā un par Direktīvas 71/393/EEK grozījumiem (14), — Komisijas 1999. gada 20. aprīļa Direktīva 1999/27/EK par Kopienas metožu ieviešanu amprolija, diklazurila un karbadoksa noteikšanai barībā, ar ko groza Direktīvu 71/250/EEK, 73/46/EEK un atceļ Direktīvu 74/203/EEK (15), — Komisijas 1999. gada 23. jūlija Direktīva 1999/76/EK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodi lazalocīdnātrija noteikšanai barībā (16), — Komisijas 2000. gada 6. jūlija Direktīva 2000/45/EK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes A vitamīna, E vitamīna un triptofāna noteikšanai barībā (17), — Komisijas 2002. gada 26. jūlija Direktīva 2002/70/EK, ar ko nosaka prasības dioksīnu un dioksīniem līdzīgu PCB koncentrācijas noteikšanai barībā (18), — Komisijas 2003. gada 23. decembra Direktīva 2003/126/EK par dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu noteikšanas analīzes metodi oficiālai lopbarības pārbaudei (19).

(2) Tā kā Direktīvu 70/373/EEK aizstāja ar Regulu (EK) Nr. 882/2004, ir lietderīgi ar vienu regulu aizstāt minētās direktīvas īstenošanas aktus. Vienlaikus jāpielāgo metodes, ņemot vērā jaunākos zinātnes un tehnikas sasniegumus. Metodes, kas vairs neder to paredzētajam nolūkam, jāsvītro. Ir paredzēts pienācīgā laikā atjaunināt paraugu ņemšanas noteikumus, lai ņemtu vērā jaunākos sasniegumus attiecībā uz barības ražošanas, uzglabāšanas, pārvadāšanas un tirgošanas veidu, tomēr ir lietderīgi pagaidām saglabāt spēkā esošos noteikumus par paraugu ņemšanu.

(3) Tāpēc jāatceļ Direktīva 71/250/EEK, 71/393/EEK, 72/199/EEK, 73/46/EEK, 76/371/EEK, 76/372/EEK, 78/633/EEK, 81/715/EEK, 84/425/EEK, 86/174/EEK, 93/70/EEK, 93/117/EK, 98/64/EK, 1999/27/EK, 1999/76/EK, 2000/45/EK, 2002/70/EK un 2003/126/EK.

(4) Šajā regulā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Pārtikas aprites un dzīvnieku veselības pastāvīgās komitejas atzinumu,

IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.

1. pants

Paraugus barības oficiālajai kontrolei, lai noteiktu sastāvdaļas, piedevas un nevēlamas vielas, izņemot pesticīdu un mikroorganismu atliekas, ņem saskaņā ar metodēm, kas izklāstītas I pielikumā.

2. pants

Paraugus analīzei sagatavo un rezultātus izsaka saskaņā ar metodēm, kas izklāstītas II pielikumā.

3. pants

Analīzes barības oficiālajai kontrolei veic, izmantojot metodes, kas izklāstītas III pielikumā (Analīzes metodes, lai kontrolētu barības līdzekļu un barības maisījumu sastāvu), IV pielikumā (Analīzes metodes, lai kontrolētu atļauto piedevu koncentrāciju barībā), V pielikumā (Analīzes metodes, lai kontrolētu nevēlamas vielas barībā) un VI pielikumā (Analīzes metodes, lai noteiktu dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas barības oficiālajai kontrolei).

4. pants

Mājputnu barības maisījumu enerģētisko vērtību aprēķina saskaņā ar VII pielikumu.

5. pants

VIII pielikumā izklāstītās analīzes metodes, lai kontrolētu vairs neatļautu piedevu nelikumīgu atrašanos barībā, izmanto apstiprināšanas nolūkos.

6. pants

Direktīvu 71/250/EEK, 71/393/EEK, 72/199/EEK, 73/46/EEK, 76/371/EEK, 76/372/EEK, 78/633/EEK, 81/715/EEK, 84/425/EEK, 86/174/EEK, 93/70/EEK, 93/117/EK, 98/64/EK, 1999/27/EK, 1999/76/EK, 2000/45/EK, 2002/70/EK un 2003/126/EK atceļ.

Atsauces uz atceltajām direktīvām uzskata par atsaucēm uz šo regulu un lasa saskaņā ar atbilstības tabulām IX pielikumā.

7. pants

Šī regula stājas spēkā divdesmitajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

To piemēro no 2009. gada 26. augusta.

Šī regula uzliek saistības kopumā un ir tieši piemērojama visās dalībvalstīs. Briselē, 2009. gada 27. janvārī Komisijas vārdā – Komisijas locekle Androulla VASSILIOU

(1) OV L 165, 30.4.2004., 1. lpp.

(2) OV L 155, 12.7.1971., 13. lpp.

(3) OV L 279, 20.12.1971., 7. lpp.

(4) OV L 123, 29.5.1972., 6. lpp.

(5) OV L 83, 30.3.1973., 21. lpp.

(6) OV L 102, 15.4.1976., 1. lpp.

(7) OV L 102, 15.4.1976., 8. lpp.

(8) OV L 206, 29.7.1978., 43. lpp.

(9) OV L 257, 10.9.1981., 38. lpp.

(10) OV L 238, 6.9.1984., 34. lpp.

(11) OV L 130, 16.5.1986., 53. lpp.

(12) OV L 234, 17.9.1993., 17. lpp.

(13) OV L 329, 30.12.1993., 54. lpp.

(14) OV L 257, 19.9.1998., 14. lpp.

(15) OV L 118, 6.5.1999., 36. lpp.

(16) OV L 207, 6.8.1999., 13. lpp.

(17) OV L 174, 13.7.2000., 32. lpp.

(18) OV L 209, 6.8.2002., 15. lpp.

(19) OV L 339, 24.12.2003., 78. lpp.

I PIELIKUMS PARAUGU ŅEMŠANAS METODES 1. MĒRĶIS UN DARBĪBAS JOMA Paraugus, kas paredzēti barības oficiālajai kontrolei, ņem saskaņā ar tālāk aprakstītajām metodēm. Tādā veidā iegūtus paraugus uzskata par reprezentatīviem tā apjoma sastāvam, no kura tie ņemti. 2. DARBINIEKI, KURI ŅEM PARAUGUS Paraugus ņem darbinieki, kurus dalībvalstis ir norīkojušas šā darba veikšanai. 3. DEFINĪCIJAS Apjoms, no kura ņem paraugu, ir vienību veidojoša produkta daļa, kuras īpašības pieņem par viendabīgām. Elementārparaugs ir daudzums, kas paņemts vienā punktā no apjoma, no kura ņem paraugu. Kopparaugs ir elementārparaugu kopums no viena un tā paša apjoma, no kura ņem paraugu. Samazinātais paraugs ir kopparauga reprezentatīva daļa, kas no tā iegūta samazinājuma procesā. Gala paraugs ir samazinātā parauga daļa vai homogenizētā kopparauga daļa. 4. IERĪCES 4.1. Paraugu ņemšanas ierīcēm jābūt izgatavotām no materiāliem, kas nevar piesārņot paraugu ņemšanai izmantojamos produktus. Dalībvalstis drīkst oficiāli apstiprināt tādas ierīces. 4.2. Ierīces, ko iesaka cietās barības paraugu ņemšanai 4.2.1. Manuāla paraugu ņemšana 4.2.1.1. Plakandibena lāpstiņa ar vertikālām malām. 4.2.1.2. Šķēpveida paraugu ņemšanas ierīce ar garu šķēlumu vai nodalījumiem. Šķēpveida paraugu ņemšanas ierīces izmēriem jāatbilst apjoma, no kura ņem paraugu, raksturlielumiem (konteinera dziļumam, maisa izmēriem utt.) un barības daļiņu lielumam. 4.2.2. Mehāniska paraugu ņemšana Apstiprinātu mehānisku ierīci var izmantot, lai paņemtu paraugus no barības, kuru tajā brīdī pārvieto. 4.2.3. Sadalītājs Ierīci, kas paredzēta paraugu sadalīšanai apmēram vienādās daļās, var izmantot elementārparaugu ņemšanai, kā arī samazināto un gala paraugu sagatavošanai. 5. KVANTITATĪVĀS PRASĪBAS 5.A. Attiecībā uz tādu vielu vai produktu kontroli, kas vienmērīgi sadalīti visā barībā 5.A.1. Apjoms, no kura ņem paraugu Apjomam, no kura ņem paraugu, jābūt tādam, lai paraugu varētu paņemt no katras tā sastāvdaļas. 5.A.2. Elementārparaugi 5.A.2.1. Neiesaiņota barība: Elementārparaugu skaita minimums: 5.A.2.1.1. apjomi, no kuriem ņem paraugu, nepārsniedz 2,5 metriskās tonnas septiņi 5.A.2.1.2. apjomi, no kuriem ņem paraugu, pārsniedz 2,5 metriskās tonnas √ 20-kārtīgs to metrisko tonnu skaits, no kurām veidots apjoms, no kura ņem paraugu (1), augstākais līdz 40 elementārparaugiem 5.A.2.2. Iesaiņota barība: Paku, no kurām jāņem paraugs, minimālais skaits (2): 5.A.2.2.1. Pakas, kurās ir vairāk par vienu kg: 5.A.2.2.1.1. apjoms, no kura ņem paraugu, ja paku skaits ir no 1 līdz 4 visas pakas 5.A.2.2.1.2. apjoms, no kura ņem paraugu, ja paku skaits ir no 5 līdz 16 četras 5.A.2.2.1.3. apjoms, no kura ņem paraugu, ja paku skaits ir vairāk par 16 √ paku skaits, kas veido apjomu, no kura ņem paraugu (1), augstākais līdz 20 pakām 5.A.2.2.2. Pakas, kuru masa nepārsniedz 1 kg četras 5.A.2.3. Šķidrā vai pusšķidrā barība: Konteineru, no kuriem jāņem paraugs, minimālais skaits (2): 5.A.2.3.1. Konteineri, kuros ir vairāk par vienu litru: 5.A.2.3.1.1. apjoms, no kura ņem paraugu, ja konteineru skaits ir no 1 līdz 4 visi konteineri 5.A.2.3.1.2. apjoms, no kura ņem paraugu, ja konteineru skaits ir no 5 līdz 16 četras 5.A.2.3.1.3. apjoms, no kura ņem paraugu, ja konteineru skaits ir vairāk par 16 √ konteineru skaits, kas veido apjomu, no kura ņem paraugu (1), augstākais līdz 20 konteineriem 5.A.2.3.2. Konteineri, kuru tilpums nepārsniedz vienu litru četras 5.A.2.4. Barības bloki un minerālvielu briketes Obligātais bloku vai brikešu skaits, no kā jāņem paraugs (2): viens bloks vai brikete no apjoma, no kura ņem paraugu un kas sastāv no 25 vienībām, augstākais līdz četriem blokiem vai briketēm 5.A.3. Kopparaugs Prasīts ir viens kopparaugs no apjoma, no kura ņem paraugu. Kopējais elementārparaugu skaits, kas veido kopparaugu, ir ne mazāk kā: 5.A.3.1. Neiesaiņota barība 4 kg 5.A.3.2. Iesaiņota barība: 5.A.3.2.1. pakas, kuru masa ir vairāk par 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. pakas, kuru masa nepārsniedz 1 kg četru oriģinālpaku satura svars 5.A.3.3. Šķidrā vai pusšķidrā barība: 5.A.3.3.1. konteineri, kuros ir vairāk par vienu litru četri litri 5.A.3.3.2. konteineri, kuru tilpums nepārsniedz vienu litru četru oriģinālkonteineru satura tilpums 5.A.3.4. Barības bloki vai minerālvielu briketes: 5.A.3.4.1. katrs sver vairāk par 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. katrs sver ne vairāk par 1 kg četru oriģinālbloku vai brikešu svars 5.A.4. Gala paraugi Ja vajadzīgs, no kopparauga pēc samazināšanas iegūst gala paraugus. Jāanalizē vismaz viens gala paraugs. Analīzei paredzētā gala parauga apjoms ir ne mazāk kā: Cietā barība 500 g Šķidrā vai pusšķidrā barība 500 ml 5.B. Attiecībā uz tādu nevēlamu vielu vai produktu kontroli, kuri varētu būt nevienmērīgi izplatīti barībā, piemēram, aflatoksīni, melnie rudzu graudi, rīcinaugs un crotalaria barības līdzekļos (3) 5.B.1. Apjoms, no kura ņem paraugu: skatīt 5.A.1. punktu 5.B.2. Elementārparaugi 5.B.2.1. Neiesaiņota barība: skatīt 5.A.2.1. punktu 5.B.2.2. Iesaiņota barība: Paku, no kurām jāņem paraugs, skaita minimums: 5.B.2.2.1. apjoms, no kura ņem paraugu, kurā ietilpst no 1 līdz 4 pakām visas pakas 5.B.2.2.2. apjoms, no kura ņem paraugu, kurā ietilpst no 5 līdz 16 pakām četras 5.B.2.2.3. apjoms, no kura ņem paraugu, kurā ietilpst vairāk par 16 pakām √ paku skaits, kas veido apjomu, no kura ņem paraugu (1), augstākais līdz 40 pakām 5.B.3. Kopparaugi Kopparaugu skaits mainīsies atkarībā no tā, cik liels ir apjoms, no kura ņem paraugu. Kopparaugu minimālais skaits no apjoma, no kura ņem paraugu, ir norādīts tālāk. Kopējais elementārparaugu svars, kas veido katru kopparaugu, ir ne mazāk kā 4 kg. 5.B.3.1. Neiesaiņota barība Apjoma, no kura ņem paraugu, svars metriskajās tonnās: Kopparaugu minimālais skaits no viena apjoma, no kura ņem paraugu: līdz 1 1 vairāk par 1, līdz 10 2 vairāk par 10, līdz 40 3 vairāk par 40 4 5.B.3.2. Iesaiņota barība Apjoms, no kura ņem paraugu, izteikts paku skaitā: Kopparaugu minimālais skaits no viena apjoma, no kura ņem paraugu: no 1 līdz 16 1 no 17 līdz 200 2 no 201 līdz 800 3 vairāk par 800 4 5.B.4. Gala paraugi No katra kopparauga pēc samazināšanas iegūst gala paraugus. Jāanalizē vismaz viens gala paraugs no kopparauga. Analīzei paredzētā gala parauga svaram jābūt ne mazākam kā 500 g. 6. INSTRUKCIJAS PARAUGU ŅEMŠANAI, SAGATAVOŠANAI UN IESAIŅOŠANAI 6.1. Vispārīgas norādes Paraugi jāņem un jāsagatavo, cik vien ātri iespējams, ievērojot piesardzību, kas vajadzīga, lai nodrošinātu, ka produkts netiek nedz mainīts, nedz piesārņots. Instrumentiem, tāpat arī virsmām un paraugiem paredzētajiem konteineriem jābūt tīriem un sausiem. 6.2. Elementārparaugi 6.2.A. Attiecībā uz tādu vielu vai produktu kontroli, kas vienmērīgi sadalīti visā barībā Elementārparaugi jāņem izlases veidā no visa apjoma, no kura ņem paraugu, un tiem jābūt aptuveni vienāda lieluma. 6.2.A.1. Neiesaiņota barība Apjomu, no kura ņem paraugu, iedomāti sadala aptuveni vienādās daļās. Daļu skaits atbilst saskaņā ar 5.A.2. punktu prasītajam elementārparaugu skaitam, paraugus ņem izlases veidā – vismaz vienu paraugu no katras daļas. Attiecīgā gadījumā paraugu var ņemt laikā, kad apjomu, no kura jāņem paraugs, pārvieto (iekrauj vai izkrauj). 6.2.A.2. Iesaiņota barība Pēc tam, kad atbilstīgi 5.A.2. punktā minētajām norādēm izraudzīts paraugu ņemšanai vajadzīgais paku skaits, ar šķēpveida ierīci vai lāpstiņu paņem daļu no katras pakas satura. Vajadzības gadījumā paraugus var ņemt laikā, kad katra paka atsevišķi ir iztukšota. Visus gabalus sadala daļās, vajadzības gadījumā atdalot tos un pievienojot atpakaļ paraugam, katrā kopparaugā atsevišķi. 6.2.A.3. Homogenizēta vai homogenizējama šķidrā vai pusšķidrā barība Pēc tam, kad atbilstīgi 5.A.2. punktā minētajām norādēm izraudzīts paraugu ņemšanai vajadzīgais konteineru skaits, to saturu vajadzības gadījumā homogenizē un paņem noteiktu daudzumu no katra konteinera. Elementārparaugus var ņemt laikā, kad saturu ņem laukā no konteineriem. 6.2.A.4. Nehomogenizējama šķidrā vai pusšķidrā barība Pēc tam, kad atbilstīgi 5.A.2. punktā minētajām norādēm izraudzīts paraugu ņemšanai vajadzīgais konteineru skaits, paraugus paņem no dažādiem līmeņiem. Paraugus var arī ņemt laikā, kad saturu ņem laukā no konteineriem, bet pirmās frakcijas izmet. Abos gadījumos kopējam paņemtajam tilpumam jābūt ne mazākam kā 10 litri. 6.2.A.5. Barības bloki un minerālvielu briketes Pēc tam, kad atbilstīgi 5.A.2. punktā minētajām norādēm izvēlēts paraugu ņemšanai vajadzīgais bloku vai brikešu skaits, paraugus ņem no katra bloka vai briketes. 6.2.B. Attiecībā uz tādu nevēlamu vielu vai produktu kontroli, kuri varētu būt nevienmērīgi izplatīti barībā, kā aflatoksīni, melnie rudzu graudi, rīcinaugs un crotalaria barības līdzekļos Apjomu, no kura ņem paraugu, iedomāti sadala aptuveni vienādās daļās, un daļu skaits atbilst saskaņā ar 5.B.3. punktu prasītajam kopparaugu skaitam. Ja minētais skaits ir vairāk nekā viens, tad kopējo elementārparaugu skaitu, kas paredzēts 5.B.2. punktā, sadala vienmērīgi pa dažādām daļām. Tad ņem aptuveni vienādu izmēru paraugus (4) un tā, lai kopējais no katras daļas ņemtais paraugu daudzums nebūtu mazāks par 4 kg – daudzumu, kas prasīts katram kopparaugam. Elementārparaugus, kas paņemti no dažādām daļām, neapvieno kopā. 6.3. Kopparaugu sagatavošana 6.3.A. Attiecībā uz tādu vielu vai produktu kontroli, kas vienmērīgi sadalīti visā barībā Elementārparaugus samaisa, lai tie veidotu vienu kopparaugu. 6.3.B. Attiecībā uz tādu nevēlamu vielu vai produktu kontroli, kuri varētu būt nevienmērīgi izplatīti barībā, kā aflatoksīni, melnie rudzu graudi, rīcinaugs un crotalaria barības līdzekļos Elementārparaugus no katras tā apjoma daļas, no kura ņem paraugu, samaisa un sagatavo 5.B.3. punktā paredzēto kopparaugu skaitu, atzīmējot katra kopparauga izcelsmi. 6.4. Gala paraugu sagatavošana Materiālu katrā kopparaugā rūpīgi samaisa, līdz iegūst homogenizētu paraugu (5). Vajadzības gadījumā kopparaugu vispirms samazina vismaz līdz diviem kilogramiem vai diviem litriem (samazinātais paraugs), vai nu izmantojot mehānisko vai automātisko sadalītāju, vai ar kvartēšanas metodi. Tad sagatavo vismaz trīs aptuveni vienāda lieluma gala paraugus, kuri atbilst 5.A.4. vai 5.B.4. punktā norādītajām kvantitatīvajām prasībām. Katru paraugu ieliek atbilstošā konteinerā. Veic visus vajadzīgos piesardzības pasākumus, lai novērstu jebkādas paraugu satura izmaiņas, to piesārņošanu vai atšķaidīšanu, kas varētu rasties pārvadāšanas vai uzglabāšanas laikā. 6.5. Gala paraugu iesaiņošana Konteinerus vai pakas aizplombē un uz tiem uzliek etiķetes (visa etiķete jāiestrādā plombā) tā, lai konteinerus nevarētu atvērt, nesabojājot plombu. 7. PARAUGU ŅEMŠANAS PIERAKSTI Par katru parauga ņemšanu ir jāizdara ieraksts, kas ļauj viennozīmīgi identificēt katru apjomu, no kura paņemts paraugs. 8. PARAUGU GALAMĒRĶIS No katra kopparauga vismaz vienu gala paraugu pēc iespējas drīzāk nosūta pilnvarotajai analīžu laboratorijai, līdzi nosūtot arī laborantam vajadzīgo informāciju. (1) Ja iegūtais skaitlis ir daļskaitlis, tad to noapaļo uz augšu līdz nākamajam veselajam skaitlim. (2) Pakām vai konteineriem, kuru saturs nepārsniedz vienu kilogramu vai vienu litru, un blokiem vai briketēm, kas katrs sver ne vairāk par vienu kilogramu, elementārparaugs ir vienas oriģinālpakas vai konteinera saturs, viens bloks vai viena brikete. (3) Metodes, kas paredzētas 5.A. punktā, jāizmanto, lai kontrolētu aflatoksīnus, melnos rudzu graudus, rīcinaugu un crotalaria kompleksajā barībā un papildbarībā. (4) Iesaiņotai barībai daļu no to paku satura, no kurām jāņem paraugs, noņem, izmantojot šķēpveida ierīci vai lāpstiņu – vajadzības gadījumā pēc tam, kad pakas ir atsevišķi iztukšotas. (5) Visus gabalus sadala daļās (vajadzības gadījumā atdalot tos un pievienojot atpakaļ paraugam) katrā kopparaugā atsevišķi.

II PIELIKUMS VISPĀRĪGI NOTEIKUMI PAR BARĪBAS ANALĪZES METODĒM A. PARAUGU SAGATAVOŠANA ANALĪZEI 1. Mērķis Tālāk aprakstītās procedūras attiecas uz gala paraugu sagatavošanu analīzei, kurus nosūta kontroles laboratorijām pēc paraugu paņemšanas, ievērojot I pielikumā paredzētos noteikumus. Minētie paraugi jāsagatavo tā, lai analīzes metodēs noteiktie iesvara daudzumi būtu homogēni un gala paraugiem reprezentatīvi. 2. Piesardzības pasākumi, kas jāievēro Paraugu sagatavošanas procedūra ir atkarīga no tā, kādas analīzes metodes tiks izmantotas. Tāpēc ir ārkārtīgi svarīgi nodrošināt, lai ievērotā paraugu sagatavošanas procedūra būtu atbilstoša izmantotajai analīzes metodei. Visas vajadzīgās darbības jāveic tā, lai pēc iespējas izvairītos no parauga piesārņošanas un novērstu izmaiņas tā sastāvā. Lai samazinātu gaisa un gaismas iedarbību uz paraugiem, to samalšanu, samaisīšanu un sijāšanu veic iespējami ātri. Neizmanto dzirnavas un dzirnaviņas, kurās paraugs var ievērojami sakarst. Barību, kas ir īpaši jutīga pret karstumu, ieteicams samalt manuāli. Veic arī visu iespējamo, lai nodrošinātu, ka pašas ierīces nepiesārņo paraugu ar mikroelementiem. Ja paraugu nevar sagatavot, ievērojami nemainot mitruma saturu tajā, tad mitruma saturu nosaka pirms un pēc parauga sagatavošanas atbilstoši III pielikuma A daļā noteiktajai metodei. 3. Procedūra Paraugu sadala atbilstošos apakšparaugos analīzei un salīdzināšanai, izmantojot piemērotus sašķelšanas paņēmienus, piemēram, pamīšus iegrābjot ar lāpstiņu, stacionāri vai rotējoši jaucot. Dalīšana konusā un kvartēšana nav ieteicama, jo tad apakšparaugos var būt augsta šķelšanas kļūda. Salīdzināšanas paraugu tur piemērotā tīrā, sausā konteinerā ar hermētisku aizbāzni un analīzei sagatavo vismaz 100 g apakšparaugu, kā norādīts tālāk. 3.1. Barība, ko var samalt dabīgā stāvoklī Ja vien analīzes metodēs nav noteikts citādi, tad visu paraugu vajadzības gadījumā vispirms samaļ un tad izsijā caur kvadrātacu sietu ar 1 mm acojumu (saskaņā ar ISO R565 ieteikumu). Paraugus nedrīkst samalt pārāk smalki. Izsijāto paraugu samaisa un savāc piemērotā tīrā, sausā un hermētiski noslēdzamā konteinerā. Paraugu vēlreiz samaisa tieši pirms iesvara ņemšanas analīzēm. 3.2. Barība, ko var samalt pēc kaltēšanas Ja analīzes metodēs nav noteikts citādi, tad paraugu izkaltē atbilstoši sākotnējās kaltēšanas procedūrai, kas aprakstīta III pielikuma A daļā minētajā mitruma noteikšanas metodē, līdz tā mitruma saturs samazinās un sasniedz 8–12 %. Pēc tam rīkojas, kā noteikts 3.1. punktā. 3.3. Šķidrā vai pusšķidrā barība Paraugu savāc piemērotā tīrā, sausā un hermētiski noslēdzamā konteinerā. Paraugu vēlreiz rūpīgi samaisa tieši pirms iesvara ņemšanas analīzēm. 3.4. Cita barība Paraugus, kurus nevar sagatavot pēc kādas no iepriekšminētajām procedūrām, apstrādā, izmantojot jebkuru citu procedūru, ar kuru var nodrošināt, lai analīzēm ņemtais iesvars būtu homogēns un gala paraugiem reprezentatīvs. 4. Paraugu uzglabāšana Paraugi jāuzglabā temperatūrā, kurā nemainās to sastāvs. Paraugus, kuros paredzēts analizēt vitamīnus vai vielas, kas ir īpaši jutīgas pret gaismu, uzglabā brūna stikla konteineros. B. NOTEIKUMI ATTIECĪBĀ UZ REAĢENTIEM UN IERĪCĒM, KO IZMANTO ANALĪZES METODĒS 1. Ja vien analīzes metodēs nav noteikts citādi, tad visiem analītiskajiem reaģentiem jābūt analītiski tīriem (a. t.). Nosakot mikroelementus, reaģentu tīrība jāpārbauda ar tukšo analīzi. Atkarībā no iegūtajiem rezultātiem var būt vajadzīga reaģentu papildu attīrīšana. 2. Visās darbībās, kas ietver šķīdumu gatavošanu, atšķaidīšanu, skalošanu vai mazgāšanu un kas analīzes metodēs minētas, nenorādot izmantojamo šķīdinātāju vai atšķaidītāju, jālieto ūdens. Parasti izmanto demineralizētu vai destilētu ūdeni. Atsevišķos gadījumos, kas norādīti analīzes metodēs, ūdens attīrīšanai izmanto īpašus paņēmienus. 3. Ņemot vērā kontroles laboratoriju standarta aprīkojumu, analīzes metodēs norādīti tikai specifiski instrumenti un ierīces vai to īpašs izmantošanas veids. Tiem jābūt tīriem, īpaši gadījumos, kad jānosaka ļoti mazi vielu daudzumi. C. ANALĪZES METOŽU PIEMĒROŠANA UN REZULTĀTU IZTEIKŠANA 1. Ekstrahēšanas procedūra Vairākas metodes nosaka specifisku ekstrahēšanas procedūru. Parasti var izmantot citu ekstrahēšanas procedūru, kas nav minēta konkrētajā metodē, ja ir pierādīts, ka izmantotajai ekstrahēšanas procedūrai ir tāda pati ekstrahēšanas efektivitāte kā metodē minētajai procedūrai. 2. Attīrīšanas procedūra Vairākas metodes nosaka specifisku attīrīšanas procedūru. Parasti var izmantot citu attīrīšanas procedūru, kas nav minēta konkrētajā metodē, ja ir pierādīts, ka izmantotā attīrīšanas metode dod tādus pašus analīžu rezultātus analizētajai matricei kā metodē minētā procedūra. 3. Ziņošana par izmantoto analīzes metodi Katru barības sastāvā esošo vielu parasti nosaka, izmantojot vienu metodi. Ja ir paredzētas vairākas metodes, tad kontroles laboratorijā izmantotā konkrētā metode jānorāda analīzes ziņojumā. 4. Noteikšanu skaits Rezultāts, ko norāda analīzes ziņojumā, ir vidējā vērtība, ko iegūst pēc vismaz divām noteikšanām ar pietiekamu atkārtojamību, analizējot atsevišķas parauga daļas. Tomēr nevēlamu vielu analīzes gadījumā, ja pirmajā noteikšanā rezultāts ir ievērojami (> 50 %) zemāks nekā kontrolējamā specifikācija, nav vajadzīgs veikt papildu noteikšanu, ja tiek piemērotas atbilstošas kvalitātes procedūras. Ja kontrolē vielas vai sastāvdaļas deklarēto saturu un pirmajā noteikšanā rezultāts apstiprina deklarēto saturu, t. i., analīzes rezultāts atbilst pieņemamajam deklarētā satura variāciju diapazonam, tad nav vajadzīgs veikt papildu noteikšanu, ja piemēro atbilstošas kvalitātes procedūras. Dažos gadījumos minētais pieņemamais variāciju diapazons ir noteikts tiesību aktos, piemēram, Padomes Direktīvā 79/373/EEK (1). 5. Ziņošana par analīžu rezultātiem Analīžu rezultātu izsaka veidā, kas noteikts analīzes metodē, līdz attiecīgam būtisko skaitļu skaitam un vajadzības gadījumā koriģē līdz mitruma saturam, kas gala paraugam bija pirms sagatavošanas. 6. Mērījumu neprecizitāte un atgūstamības procents nevēlamu vielu analīzes gadījumā Attiecībā uz nevēlamām vielām Direktīvas 2002/32/EK nozīmē, tostarp dioksīniem un dioksīniem līdzīgiem polihlorbifeniliem, dzīvnieku barībai paredzētu produktu uzskata par neatbilstīgu šo vielu noteiktajam maksimāli pieļaujamam saturam, ja pēc analīžu rezultātiem secina, ka minēto vielu maksimāli pieļaujamais saturs ir pārsniegts, ņemot vērā mērījumu paplašināto neprecizitāti un atgūstamības korekciju. Lai novērtētu analīzes rezultātā iegūtās vielas koncentrācijas daudzuma atbilstību, to koriģē atbilstoši atgūstamības rādītājam un samazina atbilstoši mērījumu paplašinātās neprecizitātes koeficientam. Šo procedūru izmanto tikai tad, ja saskaņā ar analīzes metodi ir iespējams aplēst mērījumu neprecizitāti un atgūstamības korekciju (piemēram, to nav iespējams izmantot mikroskopiskā analīzē). Analīžu rezultātus paziņo šādi (ciktāl izmantotā analīzes metode ļauj aplēst mērījumu neprecizitāti un atgūstamības procentu): a) ar atgūstamības korekciju, norādot atgūstamības līmeni. Atgūstamības korekcija nav vajadzīga, ja atgūstamības procents ir 90–110 %; b) kā “x +/– U”, kur x ir analīzes rezultāts un U – mērījumu paplašinātās neprecizitātes procents, izmantojot pārklāšanās koeficientu 2, kas nodrošina aptuveni 95 % ticamības pakāpi. Tomēr, ja analīzes rezultāts ir ievērojami (> 50 %) zemāks nekā kontrolējamā specifikācija un ja piemēro atbilstošas kvalitātes procedūras un analīzes nolūks ir tikai pārbaudīt atbilstību tiesību normām, tad analīžu rezultātus var paziņot bez atgūstamības korekcijas, un minētajos gadījumos var neziņot par atgūstamības procentu un mērījumu neprecizitāti. (1) OV L 86, 6.4.1979., 30. lpp.

III PIELIKUMS ANALĪZES METODES, LAI KONTROLĒTU BARĪBAS LĪDZEKĻU UN BARĪBAS MAISĪJUMU SASTĀVU A. MITRUMA NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt mitruma saturu barībā. Ja barība satur gaistošas vielas, piemēram, organiskās skābes, tad jāievēro, ka kopā ar mitruma saturu nosaka arī ievērojamu daudzumu gaistošo vielu. Tā neietver piena produktu kā barības līdzekļu analīzi, minerālvielu un galvenokārt no minerālvielām sastāvošu maisījumu analīzi, dzīvnieku un augu tauku un eļļu un eļļas augu sēklu un augļu analīzi. 2. Princips Paraugu žāvē norādītajos apstākļos, kas mainās atkarībā no barības īpašībām. Svara zudumu nosaka sverot. Ja analizē cietu barību, kurai ir augsts mitruma saturs, tad jāveic sākotnējā kaltēšana. 3. Ierīces 3.1. Drupinātājs no materiāla, kas neabsorbē mitrumu un ir viegli tīrāms, ļauj ātri un vienmērīgi sasmalcināt produktu, būtiski to nesakarsējot, un, cik iespējams, novērš saskari ar apkārtējo gaisu, kā arī atbilst 4.1.1. un 4.1.2. punktā minētajām prasībām (piemēram, āmurdzirnaviņas vai āmurdzirnaviņas ar ūdens dzesēšanu, saliekamās konusveida dzirnaviņas, palēninātu apgriezienu vai zobratu rupja maluma dzirnaviņas). 3.2. Analītiskie svari ar precizitāti līdz 1 mg. 3.3. Sausi konteineri no nerūsējoša metāla vai stikla ar vākiem, kas nodrošina hermētisku noslēgšanu; darba virsma, kas ļauj izklāt testa paraugu aptuveni 0,3 g/cm2 slānī. 3.4. Elektriskā izotermiskā krāsns (± 2 oC), kas tiek pienācīgi ventilēta un nodrošina iespēju ātri regulēt temperatūru (1). 3.5. Regulējams elektriskais vakuumžāvēšanas skapis, kas aprīkots ar eļļas sūkni un vai nu ar mehānismu karsta, sausa gaisa ievadīšanai, vai ar vielu, kas uzsūc mitrumu (piemēram, kalcija oksīdu). 3.6. Eksikators ar biezu, perforētu metāla vai porcelāna plāksni, kurā ir viela, kas efektīvi uzsūc mitrumu. 4. Procedūra N.B.! Šajā iedaļā aprakstītās darbības jāveic tūlīt pēc paraugu iesaiņojumu atvēršanas. Analīzes jāatkārto vismaz divas reizes. 4.1. Sagatavošana 4.1.1. Barība, izņemot to, kas minēta 4.1.2. un 4.1.3. punktā Ņem vismaz 50 g parauga. Vajadzības gadījumā sasmalcina vai sadala tā, lai novērstu mitruma satura izmaiņas (skatīt 6. punktu). 4.1.2. Labība un putraimi Ņem vismaz 50 g parauga. Samaļ daļiņās, no kurām vismaz 50 % izsijājas caur sietu ar 0,5 mm acīm, un atlikums sietā ar 1 mm apaļu acojumu nepārsniedz 10 %. 4.1.3. Barība šķidrā vai pastas veidā un barība, kas galvenokārt sastāv no eļļām un taukiem Ņem aptuveni 25 g parauga, nosver ar precizitāti līdz 10 mg, pievieno atbilstīgu daudzumu bezūdens smilts, kas nosvērta ar precizitāti līdz 10 mg, un maisa, līdz iegūst homogēnu produktu. 4.2. Kaltēšana 4.2.1. Barība, izņemot to, kas minēta 4.2.2. un 4.2.3. punktā Nosver konteineru (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 1 mg. Nosvērtajā konteinerā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Konteineru bez vāka ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 103 oC. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, konteineru ievieto pēc iespējas ātri. Atstāj kaltēties četras stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 103 oC. Konteineram atkal uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. Barību, kas galvenokārt sastāv no eļļām un taukiem, kaltē krāsnī vēl papildu 30 minūtes 130 oC temperatūrā. Abu svēršanas rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt 0,1 % mitruma. 4.2.2. Labība, milti, putraimi un rupja maluma milti Nosver konteineru (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā konteinerā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g sasmalcinātā parauga un izlīdzina. Konteineru bez vāka ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 130 oC. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, konteineru ievieto pēc iespējas ātri. Atstāj kaltēties divas stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 130 oC. Konteineram atkal uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. 4.2.3. Barības maisījumi, kas satur vairāk nekā 4 % saharozes vai laktozes: barības līdzekļi, piemēram, ceratoniju augļi, hidrolizēti graudaugu produkti, iesala sēklas, kaltēti biešu graizījumi, zivju un cukura šķīstošie produkti; barības maisījumi, kas satur vairāk nekā 25 % minerālsāļu, tostarp kristalizācijas ūdeni. Nosver konteineru (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā konteinerā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Konteineru bez vāka ieliek vakuuma krāsnī (3.5.), kas iepriekš sakarsēta 80 oC līdz 85 oC temperatūrā. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, konteineru ievieto pēc iespējas ātri. Palielina spiedienu līdz 100 toriem un zem šāda spiediena kaltē četras stundas – vai nu karsta, sausa gaisa plūsmā, vai izmantojot vielu, kas uzsūc mitrumu (aptuveni 300 g uz 20 paraugiem). Pēdējā gadījumā pēc paredzētā spiediena sasniegšanas vakuumsūkni atvieno. Kaltēšanas laiku skaita no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 80 oC līdz 85 oC. Krāsnī uzmanīgi atjauno atmosfēras spiedienu. Krāsni atver, konteineram tūlīt uzliek vāku, izņem konteineru no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. Vēl 30 minūtes kaltē vakuuma krāsnī 80 oC līdz 85 oC temperatūrā un vēlreiz nosver. Abu svēršanas rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt 0,1 % mitruma. 4.3. Sākotnējā kaltēšana 4.3.1. Barība, izņemot to, kas minēta 4.3.2. punktā Cietu barību ar augstu mitruma saturu, ko grūti sasmalcināt, sākotnēji kaltē šādi: 50 g nesasmalcināta parauga (ja vajadzīgs, tad saspiestu vai aglomerētu barību var nedaudz sadalīt) ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā konteinerā (piemēram, 20 ×12 cm alumīnija plāksnē ar 0,5 cm apmali). Atstāj kaltēties krāsnī 60 oC līdz 70 oC temperatūrā, līdz mitruma saturs ir samazinājies līdz 8–12 %. Izņem no krāsns, bez vāka atdzesē laboratorijā vienu stundu un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties sasmalcina, kā norādīts 4.1.1. punktā, un kaltē, kā norādīts 4.2.1. vai 4.2.3. punktā, atkarībā no barības īpašībām. 4.3.2. Labība Graudus, kuru mitruma saturs pārsniedz 17 %, sākotnēji kaltē šādi: 50 g nesamaltu graudu ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā konteinerā (piemēram, 20 ×12 cm alumīnija plāksnē ar 0,5 cm apmali). Piecas līdz septiņas minūtes atstāj kaltēties krāsnī 130 oC temperatūrā. Izņem no krāsns, bez vāka atdzesē laboratorijā divas stundas un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties samaļ, kā norādīts 4.1.2. punktā, un izkaltē, kā norādīts 4.2.2. punktā. 5. Rezultātu aprēķināšana Mitruma saturu (X), izteiktu procentos no parauga, aprēķina, izmantojot šādas formulas: 5.1. Kaltēšana bez sākotnējās kaltēšanas kur: m = testa parauga sākotnējais svars gramos, m0 = izkaltētā testa parauga svars gramos. 5.2. Kaltēšana ar sākotnējo kaltēšanu kur: m = testa parauga sākotnējais svars gramos, m1 = testa parauga svars gramos pēc sākotnējās kaltēšanas, m2 = testa parauga svars gramos pēc sasmalcināšanas vai samalšanas, m0 = izkaltētā testa parauga svars gramos. 5.3. Atkārtojamība Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nepārsniedz 0,2 % mitruma absolūtās vērtības. 6. Novērojums Ja sasmalcināšana ir vajadzīga un ja tās rezultātā mainās produkta mitruma saturs, tad barības sastāvdaļu analīzes rezultāti jākoriģē, pamatojoties uz parauga mitruma saturu tā sākotnējā stāvoklī. B. MITRUMA NOTEIKŠANA DZĪVNIEKU UN AUGU TAUKOS UN EĻĻĀS 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt ūdens un gaistošo vielu saturu dzīvnieku un augu taukos un eļļās. 2. Princips Paraugu žāvē līdz konstantam svaram (svara zudumam starp diviem secīgiem svērumiem jābūt mazākam par vai vienādam ar 1 mg) 103 oC temperatūrā. Svara zudumu nosaka sverot. 3. Ierīces 3.1. Plakandibena trauks, izgatavots no materiāla, kas izturīgs pret koroziju, apmēram 3 cm augsts un 8–9 cm diametrā. 3.2. Apmēram 10 cm garš termometrs ar pastiprinātu bumbiņu un izplešanās cauruli augšgalā, kas graduēts apmēram no 80 oC līdz vismaz 110 oC. 3.3. Smilšu vanna vai elektriskā plītiņa. 3.4. Eksikators ar vielu, kas efektīvi uzsūc mitrumu. 3.5. Analītiskie svari. 4. Procedūra Sausā, nosvērtā traukā (3.1.), kurā ir termometrs (3.2.), ar precizitāti līdz tuvākajam mg iesver apmēram 20 g homogenizētā parauga. Pastāvīgi maisot ar termometru, smilšu vannā vai uz elektriskās plītiņas (3.3.) silda tā, lai apmēram septiņās minūtēs temperatūra paaugstinātos līdz 90 oC. Karstumu samazina, sekojot tam, cik bieži no trauka dibena paceļas burbuļi. Temperatūra nedrīkst pārsniegt 105 oC. Turpina maisīt, skrāpējot gar trauka dibenu, līdz pārstāj veidoties burbuļi. Lai pilnībā izdalītos viss mitrums, vairākas reizes temperatūru paaugstina līdz 103 oC ± 2 oC, starplaikos starp karsēšanām atdzesējot līdz 93 oC. Pēc tam eksikatorā (3.4.) ļauj atdzist līdz istabas temperatūrai un nosver. Minēto darbību atkārto tikmēr, kamēr svara zudums starp diviem secīgiem svērumiem vairs nepārsniedz 2 mg. N.B.! Ja parauga svars pēc atkārtotas karsēšanas palielinās, tas liecina par tauku oksidēšanos, un tādā gadījumā rezultātu aprēķina, ņemot vērā svērumu, kas izdarīts pirms tam, kad svars sāka palielināties. 5. Rezultātu aprēķināšana Mitruma saturu (X), izteiktu procentos no parauga, aprēķina, izmantojot šādu formulu: kur: m = testa parauga svars gramos, m1 = trauka un tā satura kopējais svars gramos pirms karsēšanas, m2 = trauka un tā satura kopējais svars gramos pēc karsēšanas. Ja rezultāts ir mazāks par 0,05 %, tad tas jāreģistrē kā “mazāks par 0,05 %”. Atkārtojamība Mitruma satura starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 0,05 % absolūtās vērtības. C. JĒLPROTEĪNA SATURA NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Ar šo metodi var noteikt jēlproteīna daudzumu barībā, pamatojoties uz slāpekļa saturu, ko nosaka saskaņā ar Kjeldāla metodi. 2. Princips Paraugu šķeļ ar sērskābi katalizatora klātbūtnē. Skābes šķīdumu neitralizē un noregulē tā reakciju līdz bāziskai ar nātrija hidroksīda šķīdumu. Amonjaku destilē un uztver noteiktā sērskābes daudzumā, kuras pārpalikumu titrē ar nātrija hidroksīda standartšķīdumu. Alternatīvi – atbrīvoto amonjaku destilē borskābes šķīduma pārpalikumā, pēc tam titrē ar sālsskābes vai sērskābes šķīdumu. 3. Reaģenti 3.1. Kālija sulfāts. 3.2. Katalizators: vara (II) oksīds (CuO) vai vara (II) sulfāta pentahidrāts (CuSO4 5H2O). 3.3. Granulētais cinks. 3.4. Sērskābe, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5. Sērskābe, standarta volumetriskais šķīdums, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6. Sērskābe, standarta volumetriskais šķīdums, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7. Sērskābe, standarta volumetriskais šķīdums, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8. Metilsarkanais indikators; izšķīdina 300 mg metilsarkanā 100 mililitros etanola, σ = 95–96 % (v/v). 3.9. Nātrija hidroksīda šķīdums (var izmantot tehnisko) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10. Nātrija hidroksīds, standarta volumetriskais šķīdums c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Nātrija hidroksīds, standarta volumetriskais šķīdums c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Sālsskābē mazgāti, izkarsēti pumeka gabaliņi. 3.13. Acetanilīds (kušanas temp. = 114 oC, N-saturs = 10,36 %). 3.14. Saharoze (nesatur slāpekli). 3.15. Borskābe (H3BO3). 3.16. Metilsarkanā indikatora šķīdums: izšķīdina 100 mg metilsarkanā 100 mililitros etanola vai metanola. 3.17. Bromkrezolzaļā šķīdums: izšķīdina 100 mg bromkrezolzaļā 100 mililitros etanola vai metanola. 3.18. Borskābes šķīdums (10 g/l līdz 40 g/l atkarībā no izmantotās ierīces). Ja izmanto kolorimetrisko galarezultāta noteikšanu, tad metilsarkanais un bromkrezolzaļais indikators jāpievieno borskābes šķīdumiem. Ja sagatavo vienu litru borskābes šķīduma, tad pirms tilpuma korekcijas pievieno 7 ml metilsarkanā indikatora šķīduma (3.16.) un 10 ml bromkrezolzaļā šķīduma (3.17.). Atkarībā no izmantotā ūdens borskābes šķīduma pH līmenis dažādās partijās var būt atšķirīgs. Bieži vien, lai iegūtu pozitīvu tukšo analīzi, šķīdums jākoriģē, pievienojot nelielu sārma daudzumu. Piezīme. Parasti var iegūt labus korekcijas rezultātus, ja vienam litram 10 g/l borskābes pievieno apmēram 3 ml līdz 4 ml NaOH (3.11.). Šķīdumu uzglabā istabas temperatūrā un uzglabāšanas laikā sargā no gaismas un no amonjaka tvaiku avotiem. 3.19. Sālsskābes standarta volumetriskais šķīdums c(HCl) = 0,10 mol/l. Piezīme. Var izmantot citas volumetrisko šķīdumu koncentrācijas (3.5., 3.6., 3.7., 3.10., 3.11. un 3.19.), ja aprēķinos veic attiecīgas korekcijas. Koncentrāciju vienmēr izsaka līdz četriem cipariem aiz komata. 4. Ierīces Ierīces, kas piemērotas šķelšanai, destilēšanai un titrēšanai saskaņā ar Kjeldāla metodi. 5. Procedūra 5.1. Šķelšana No parauga ar precizitāti līdz 0,001 g ņem 1 g lielu iesvaru, ko pārnes šķelšanas aparāta kolbā. Pievieno 15 g kālija sulfāta (3.1.), atbilstošu daudzumu katalizatora (3.2.) (0,3 līdz 0,4 g vara (II) oksīda vai 0,9 līdz 1,2 g vara (II) sulfāta pentahidrāta), 25 ml sērskābes (3.4.) un, ja vajadzīgs, dažus pumeka gabaliņus (3.12.) un kolbas saturu samaisa. Kolbu sākumā karsē uzmanīgi, ja vajadzīgs, laiku pa laikam maisot, līdz masa ir karbonizēta un vairs neputo; tad karsēšanu pastiprina, līdz šķidrums sāk pastāvīgi vārīties. Pietiek karsēt, kad vārošā skābe kondensējas uz kolbas sienām. Nedrīkst pieļaut kolbas pārkaršanu un organisko vielu daļiņu pielipšanu pie tās sienām. Kad šķīdums kļūst dzidrs un gaiši zaļš, to turpina vārīt vēl divas stundas, tad ļauj atdzist. 5.2. Destilēšana Uzmanīgi pievieno vajadzīgo ūdens daudzumu, lai nodrošinātu, ka sulfāti pilnībā izšķīst. Ļauj atdzist, tad, ja vajadzīgs, pievieno dažas cinka granulas (3.3.). Tad rīkojas, kā noteikts 5.2.1. vai 5.2.2. punktā. 5.2.1. Destilēšana sērskābē Atkarībā no sagaidāmā slāpekļa satura destilācijas aparāta uztvērējkolbā precīzi iemēra 25 ml sērskābes (3.5. vai 3.7.). Pievieno dažus pilienus metilsarkanā indikatora (3.8.). Šķelšanas kolbu pievieno destilācijas aparāta kondensatoram un kondensatora galu iemērc šķidrumā, kas ir uztvērējkolbā, vismaz 1 cm dziļi (skatīt 8.3. novērojumu). Nepieļaujot amonjaka zudumus (skatīt 8.1. novērojumu), šķelšanas kolbā lēnām ielej 100 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.9.). Kolbu karsē, līdz destilējas amonjaks. 5.2.2. Destilēšana borskābē Ja destilāta amonjaka saturu titrē manuāli, tad izmanto tālāk minēto procedūru. Ja destilēšanas vienība ir pilnībā automatizēta un ietver arī destilāta amonjaka satura titrēšanu, tad jāievēro ražotāja norādījumi attiecībā uz destilēšanas vienības darbināšanu. Savācējkolbu, kurā ir 25 ml līdz 30 ml borskābes šķīduma (3.18.), novieto zem kondensatora izplūdes tā, lai padeves caurule atrastos zem borskābes šķīduma pārākuma virsmas. Destilācijas vienību koriģē, lai tā izdalītu 50 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.9.). Destilācijas vienību darbina saskaņā ar ražotāja norādījumiem un atbrīvoto amonjaku destilē, pievienojot nātrija hidroksīda šķīdumu. Destilātu uztver borskābē, kura uzņem šķīdumu. Destilāta apjoms (destilācijas ar tvaiku laiks) ir atkarīgs no slāpekļa daudzuma paraugā. Ievēro ražotāja norādījumus. Piezīme. Pusautomātiskajā destilēšanas vienībā nātrija hidroksīda pārpalikumu pievieno un tvaiku destilē automātiski. 5.3. Titrēšana Rīkojas, kā noteikts 5.3.1. vai 5.3.2. punktā. 5.3.1. Sērskābe Sērskābes pārpalikumu savācējkolbā titrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu (3.10. vai 3.11.) atkarībā no izmantotās sērskābes koncentrācijas, līdz tiek sasniegts galapunkts. 5.3.2. Borskābe Savācējkolbas saturu titrē ar sālsskābes standarta volumetrisko šķīdumu (3.19.) vai ar sērskābes standarta volumetrisko šķīdumu (3.6.), izmantojot bireti, un nolasa izmantotā titranta daudzumu. Ja piemēro kolorimetrisko galapunkta noteikšanu, tad galapunkts ir sasniegts, kad parādās pirmās sārtas krāsas zīmes. Provizoriski nosaka biretes rādījumu ar precizitāti līdz 0,05 ml. Izgaismots magnētiskā maisītāja trauks vai fotometrisks detektors var palīdzēt ieraudzīt galapunktu. To var izdarīt automātiski, izmantojot tvaika destilētāju ar automātisko titrēšanu. Jāievēro ražotāja norādījumi attiecībā uz konkrētā destilētāja vai destilētāja/titrētāja izmantošanu. Piezīme. Ja izmanto automātisko titrēšanas sistēmu, tad titrēšana sākas tūlīt pēc destilācijas sākšanas un kad ir izmantots 1 % borskābes šķīdums (3.18.). Ja izmanto pilnībā automatizētu destilācijas vienību, tad amonjaka automātisko titrēšanu var veikt arī, ja galapunktu nosaka, izmantojot potenciometrisko pH sistēmu. Tādā gadījumā izmanto automātisko titrētāju ar pH mērītāju. pH mērītājs ir attiecīgi kalibrēts pH 4 līdz pH 7 diapazonā, ievērojot parastās laboratorijas pH kalibrēšanas procedūras. Titrēšanas pH galapunktu sasniedz pie pH 4,6, kas ir stāvākais punkts titrēšanas līknē (pārliekuma punkts). 5.4. Tukšā analīze Lai apstiprinātu, ka reaģenti nesatur slāpekli, veic tukšo analīzi (šķelšanu, destilēšanu un titrēšanu), parauga vietā izmantojot 1 g saharozes (3.14.). 6. Rezultātu aprēķināšana Aprēķinus veic atbilstoši 6.1. vai 6.2. punktam. 6.1. Titrēšanas aprēķins atbilstoši 5.3.1. punktam Jēlproteīna saturu, kas izteikts procentos no svara, aprēķina pēc šādas formulas: kur: Vo = NaOH tilpums (ml) (3.10. vai 3.11.), ko izmanto tukšajā analīzē, V1 = NaOH tilpums (ml) (3.10. vai 3.11.), ko izmanto parauga titrēšanā, c = nātrija hidroksīda (3.10. vai 3.11.) koncentrācija (mol/l), m = parauga svars (g). 6.2. Titrēšanas aprēķins atbilstoši 5.3.2. punktam 6.2.1. Titrēšana ar sālsskābi Jēlproteīna saturu, kas izteikts procentos no svara, aprēķina pēc šādas formulas: kur: m = analizējamā parauga svars (g), c = sālsskābes (3.19.) standarta volumetriskā šķīduma koncentrācija (mol/l), V0 = tukšajā analīzē izmantotās sālsskābes tilpums (ml), V1 = analizējamam paraugam izmantotās sālsskābes tilpums (ml). 6.2.2. Titrēšana ar sērskābi Jēlproteīna saturu, kas izteikts procentos no svara, aprēķina pēc šādas formulas: kur: m = analizējamā parauga svars (g), c = sērskābes standarta volumetriskā šķīduma (3.6.) koncentrācija (mol/l), V0 = tukšajai analīzei izmantotās sērskābes (3.6.) tilpums (ml), V1 = analizējamam paraugam izmantotās sērskābes (3.6.) tilpums (ml). 7. Metodes verifikācija 7.1. Atkārtojamība No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt: — 0,2 % absolūtajā vērtībā, ja jēlproteīna saturs ir mazāks par 20 %, — 1,0 % no lielākās vērtības, ja jēlproteīna saturs ir no 20 % līdz 40 %, — 0,4 % absolūtajā vērtībā, ja jēlproteīna saturs ir lielāks par 40 %. 7.2. Precizitāte Analizē (veicot šķelšanu, destilēšanu un titrēšanu) 1,5 līdz 2,0 g acetanilīda (3.13.) 1 g saharozes (3.14.) klātbūtnē; 1 g acetanilīda patērē 14,80 ml sērskābes (3.5.). Atgūstamībai jābūt vismaz 99 %. 8. Novērojumi 8.1. Ierīce var būt manuāla, pusautomātiska vai automātiska. Ja paraugs pēc šķelšanas jāpārvieto destilēšanai, tad pārnešana jāveic bez zudumiem. Ja destilācijas aparāta kolba nav aprīkota ar pilināmo piltuvi, tad nātrija hidroksīdu, lēnām lejot gar kolbas sienu, pievieno tieši pirms tās savienošanas ar kondensatoru. 8.2. Ja šķelšanas produkts sacietē, tad noteikšanu atkārto, lietojot lielāku daudzumu sērskābes (3.4.), nekā norādīts iepriekš. 8.3. Analizējot produktus ar zemu slāpekļa saturu, vajadzības gadījumā sērskābes (3.7.) tilpumu uztvērējkolbā var samazināt līdz 10 ml vai 15 ml un papildina līdz 25 ml ar ūdeni. 8.4. Regulārai analīzei, lai noteiktu jēlproteīnu, var izmantot alternatīvas analīzes metodes, bet šajā C daļā aprakstītā Kjeldāla metode ir standartmetode. Ar alternatīvo metodi (piemēram, DUMAS) iegūto rezultātu līdzvērtība salīdzinājumā ar standartmetodi jāpierāda attiecībā uz katru matrici atsevišķi. Tā kā ar alternatīvo metodi iegūtie rezultāti pat pēc līdzvērtības verifikācijas var nedaudz atšķirties no rezultātiem, kas iegūti ar standartmetodi, analīžu ziņojumā jāpiemin analīzes metode, kas izmantota jēlproteīna noteikšanai. D. URĪNVIELAS NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt urīnvielas daudzumu barībā. 2. Princips Paraugu kopā ar dzidrināšanas aģentu iejauc ūdenī. Suspensiju filtrē. Urīnvielas saturu filtrātā nosaka pēc 4-dimetilaminobenzaldehīda (4-DMAB) pievienošanas, mērot optisko blīvumu pie 420 nm viļņu garuma. 3. Reaģenti 3.1. 4-dimetilaminobenzaldehīda šķīdums: izšķīdina 1,6 g 4-DAMB 100 mililitros 96 % etanola un pievieno 10 ml sālsskābes (ρ201,19 g/ml). Šo reaģentu var glabāt ne ilgāk par divām nedēļām. 3.2. Karesa I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9 g cinka acetāta, Zn(CH3COO)2 2H2O, un 3 g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml. 3.3. Karesa II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6 g kālija ferocianīda, K4 Fe (CN)6 3H2O. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml. 3.4. Aktīvā ogle, kas neabsorbē urīnvielu (jāpārbauda). 3.5. Urīnviela, 0,1 % šķīdums (w/v). 4. Ierīces 4.1. Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min. 4.2. Mēģenes: 160 × 16 mm ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem. 4.3. Spektrofotometrs. 5. Procedūra 5.1. Parauga analīze Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz tuvākajam mg un kopā ar 1 g aktīvās ogles (3.4.) pārnes 500 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno 400 ml ūdens un 5 ml Karesa I šķīduma (3.2.), maisa apmēram 30 sekundes un pievieno 5 ml Karesa II šķīduma (3.3.). Trīsdesmit minūtes maisa maisītājā. Papildina ar ūdeni līdz tilpumam, sakrata un filtrē. Noņem 5 ml caurspīdīgā, bezkrāsainā filtrāta, pārnes mēģenēs ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem, pievieno 5 ml 4-DMAB šķīduma (3.1.) un samaisa. Mēģenes ievieto ūdens vannā 20 oC (+/– 4 oC) temperatūrā. Pēc piecpadsmit minūtēm ar spektrofotometru pie 420 nm mēra parauga šķīduma optisko blīvumu. Salīdzina ar reaģentu tukšās analīzes šķīdumu. 5.2. Kalibrēšanas līkne Ņem pa 1, 2, 4, 5 un 10 ml urīnvielas šķīduma (3.5.), pārnes 100 ml tilpuma mērkolbās un papildina ar ūdeni līdz tilpumam. Ņem 5 ml no katra šķīduma, pievieno pa 5 ml 4-DMAB šķīduma (3.1.), homogenizē un iepriekš aprakstītajā veidā mēra optisko blīvumu pret kontrolšķīdumu, kas sastāv no 5 ml 4-DMAB un 5 ml ūdens, kurš nesatur urīnvielu. Konstruē kalibrēšanas līkni. 6. Rezultātu aprēķināšana Urīnvielas daudzumu paraugā nosaka, izmantojot kalibrēšanas līkni. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. 7. Novērojumi 7.1. Ja urīnvielas saturs pārsniedz 3 %, tad paraugu samazina līdz 1 g vai sākotnēji pagatavoto šķīdumu atšķaida tā, lai 500 mililitros nebūtu vairāk par 50 mg urīnvielas. 7.2. Ja urīnvielas saturs ir zems, tad parauga iesvara masu palielina, ievērojot nosacījumu, ka no tā iegūtais filtrāts paliek caurspīdīgs un bezkrāsains. 7.3. Ja paraugs satur tādus vienkāršus slāpekļa savienojumus kā aminoskābes, tad optisko blīvumu mēra pie 435 nm. E. GAISTOŠO SLĀPEKĻA BĀŽU NOTEIKŠANA I. AR MIKRODIFŪZIJU 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj barībā noteikt gaistošo slāpekļa bāžu saturu, kas izteikts kā amonjaks. 2. Princips Paraugu ekstrahē ar ūdeni un šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala mikrodifūzijas ceļā, izmantojot kālija karbonāta šķīdumu, savāc borskābes šķīdumā un titrē ar sērskābi. 3. Reaģenti 3.1. Trihloretiķskābe, 20 % šķīdums (w/v). 3.2. Indikators: izšķīdina 33 mg bromkrezolzaļā un 65 mg metilsarkanā 100 mililitros 95–96 % (v/v) etanola. 3.3. Borskābes šķīdums: viena litra mērkolbā 200 mililitros 95–96 % (v/v) etanola un 700 mililitros ūdens izšķīdina 10 g borskābes. Pievieno 10 ml indikatora (3.2.). Samaisa un vajadzības gadījumā koriģē šķīduma krāsu līdz gaiši sarkanai, pievienojot nātrija hidroksīda šķīdumu. 1 ml tāda šķīduma koriģēs līdz 300 μg NH3. 3.4. Piesātināts kālija karbonāta šķīdums: 100 mililitros vāroša ūdens izšķīdina 100 g kālija karbonāta. Ļauj atdzist, filtrē. 3.5. Sērskābe 0,01 mol/l. 4. Ierīces 4.1. Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min. 4.2. Stikla vai plastmasas Konveja trauks (skatīt diagrammu). 4.3. Mikrobiretes, kas kalibrētas 1/100 ml iedaļās. 5. Procedūra Nosver 10 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg un kopā ar 100 ml ūdens ielej 200 ml mērkolbā. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.1.), papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru. Izmantojot pipeti, Konveja trauka centrā iepilina 1 ml borskābes šķīduma (3.3.) un 1 ml parauga filtrāta – trauka ārējā lokā. Daļēji nosedz ar ietaukotu vāku. 1 ml piesātināta kālija karbonāta šķīduma (3.4.) ātri iepilina ārējā lokā un aizver vāku, hermētiski noslēdzot trauku. Trauku uzmanīgi griež, lai tas rotētu horizontālā plaknē un abi reaģenti sajauktos. Iztur vai nu vismaz četras stundas istabas temperatūrā, vai vienu stundu 40 oC. Ja izmanto mikrobireti (4.3.), tad gaistošās bāzes borskābes šķīdumā titrē ar sērskābi (3.5.). Veic tukšo analīzi, izmantojot to pašu procedūru, bet bez analizējamā parauga. 6. Rezultātu aprēķināšana 1 ml H2SO40,01 mol/l atbilst 0,34 miligramiem amonjaka. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. Atkārtojamība No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nepārsniedz: — 10 % relatīvajā vērtībā, ja amonjaka saturs ir mazāks par 1,0 %, — 0,1 % absolūtajā vērtībā, ja amonjaka saturs ir 1,0 % vai vairāk. 7. Novērojums Ja amonjaka saturs paraugā pārsniedz 0,6 %, tad atšķaida sākotnējo filtrātu. KONVEJA TRAUKS Mērogs 1:1 II. DESTILĒJOT 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj zivju miltos, kas praktiski nesatur urīnvielu, noteikt gaistošo slāpekļa bāžu saturu, izteiktu kā amonjaks. To piemēro tikai tad, ja amonjaka saturs ir mazāks par 0,25 %. 2. Princips Paraugu ekstrahē ar ūdeni un šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala viršanas temperatūrā, pievienojot magnija oksīdu, savāc konkrētā sērskābes daudzumā, kuras pārpalikumu attitrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu. 3. Reaģenti 3.1. Trihloretiķskābe, 20 % šķīdums (w/v). 3.2. Magnija oksīds. 3.3. Pretputošanas emulsija (piemēram, silikons). 3.4. Sērskābe 0,05 mol/l. 3.5. Nātrija hidroksīda šķīdums 0,1 mol/l. 3.6. Metilsarkanā 0,3 % šķīdums 95–96 % (v/v) etanolā. 4. Ierīces 4.1. Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min. 4.2. Kjeldāla tipa destilēšanas ierīce. 5. Procedūra Ar precizitāti līdz 1 mg nosver 10 g parauga un kopā ar 100 ml ūdens ievieto 200 ml mērkolbā. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.1.), papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru. Ņem tādu tīra filtrāta daudzumu, kas ir piemērots gaistošo slāpekļa bāžu domājamajam saturam (parasti der 100 ml). Atšķaida līdz 200 ml un pievieno 2 g magnija oksīda (3.2.) un dažus pilienus pretputošanas emulsijas (3.3.). Šķīduma reakcijai, pārbaudot ar lakmusa papīru, jābūt sārmainai; pretējā gadījumā pievieno vēl magnija oksīdu (3.2.). Rīkojas, kā noteikts analīzes metodes jēlproteīna satura noteikšanai 5.2. un 5.3. punktā (šā pielikuma C daļa). Veic tukšo analīzi, izmantojot to pašu procedūru, bet bez analizējamā parauga. 6. Rezultātu aprēķināšana 1 ml H2SO40,05 mol/l atbilst 1,7 miligramiem amonjaka. Rezultātu izsaka procentos no parauga. Atkārtojamība Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nepārsniedz 10 % amonjaka relatīvās vērtības. F. AMINOSKĀBJU (IZŅEMOT TRIPTOFĀNU) NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt brīvās (sintētiskās un dabīgās) un kopējās (ar peptīdsaitēm saistītās un brīvās) aminoskābes barībā, izmantojot aminoskābju analizētāju. To izmanto, lai noteiktu šādas aminoskābes: cist(e)īns, metionīns, lizīns, treonīns, alanīns, arginīns, asparagīnskābe, glutamīnskābe, glicīns, histidīns, izoleicīns, leicīns, fenilalanīns, prolīns, serīns, tirozīns un valīns. Pēc šīs metodes neatšķir aminoskābju sāļus un nediferencē D un L formas aminoskābes. To nevar izmantot, lai noteiktu triptofāna un aminoskābju hidroksianalogus. 2. Princips 2.1. Brīvās aminoskābes Brīvās aminoskābes ekstrahē ar atšķaidītu sālsskābi. Līdzekstrahētās slāpekļa makromolekulas izgulsnē ar sulfosalicilskābi un atdala filtrējot. Filtrēto šķīdumu koriģē līdz pH 2,20. Aminoskābes sadala ar jonu apmaiņas hromatogrāfiju un pēc reakcijas ar ninhidrīnu nosaka fotometriski pie 570 nm. 2.2. Kopējās aminoskābes Procedūru izvēlas atkarībā no nosakāmajām aminoskābēm. Pirms hidrolīzes cist(e)īns un metionīns jāoksidē attiecīgi līdz cisteīnskābei un metionīna sulfonam. Tirozīns jānosaka neoksidētu paraugu hidrolizātos. Visas pārējās 1. punktā minētās aminoskābes var noteikt oksidētā vai neoksidētā paraugā. Oksidēšanu veic 0 oC temperatūrā ar peroksiskudrskābes/fenola maisījumu. Oksidēšanas reaģenta pārpalikumu sadala ar nātrija disulfītu. Oksidēto vai neoksidēto paraugu 23 stundas hidrolizē ar sālsskābi (3.20.). Hidrolizātu koriģē līdz pH 2,20. Aminoskābes sadala ar jonu apmaiņas hromatogrāfiju un pēc reakcijas ar ninhidrīnu nosaka fotometriski pie 570 nm (440 nm prolīnam). 3. Reaģenti Jāizmanto ūdens bidestilāts vai līdzvērtīgas kvalitātes ūdens (vadītspēja < 10 μS). 3.1. Ūdeņraža peroksīds, w (w/w) = 30 %. 3.2. Skudrskābe, w (w/w) = 98–100 %. 3.3. Fenols. 3.4. Nātrija disulfīts. 3.5. Nātrija hidroksīds. 3.6. 5-sulfosalicilskābes dihidrāts. 3.7. Sālsskābe, blīvums apmēram 1,18 g/ml. 3.8. Trinātrija citrāta dihidrāts. 3.9. 2,2'-tiodietanols (tiodiglikols). 3.10. Nātrija hlorīds. 3.11. Ninhidrīns. 3.12. Petrolēteris, viršanas diapazons 40–60 oC. 3.13. Norleicīns vai cits savienojums, kas piemērots izmantošanai par iekšējo standartu. 3.14. Slāpekļa gāze (< 10 ppm skābekļa). 3.15. 1-oktanols. 3.16. Aminoskābes. 3.16.1. Standartvielas, kas minētas 1. punktā. Tīri savienojumi, kuri nesatur kristalizācijas ūdeni. Žāvē vakuumā virs P2O5 vai H2SO4 vienu nedēļu pirms izmantošanas. 3.16.2. Cisteīnskābe. 3.16.3. Metionīnsulfons. 3.17. Nātrija hidroksīda šķīdums, c = 7,5 mol/l. Ūdenī atšķaida 300 g NaOH (3.5.) un papildina līdz vienam litram. 3.18. Nātrija hidroksīda šķīdums, c = 1 mol/l. Ūdenī atšķaida 40 g NaOH (3.5.) un papildina līdz vienam litram. 3.19. Skudrskābes – fenola šķīdums. Samaisa 889 g skudrskābes (3.2.) ar 111 g ūdens un pievieno 4,73 g fenola (3.3.). 3.20. Hidrolīzes maisījums, c = 6 mol HCl/l, kas satur 1 g fenola/l. Pievieno 1 g fenola (3.3.) uz 492 ml HCl (3.7.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni. 3.21. Ekstrakcijas maisījums, c = 0,1 mol HCl/l, kas satur 2 % tiodiglikola. 8,2 ml HCl (3.7.) atšķaida apmēram ar 900 ml ūdens, pievieno 20 ml tiodiglikola (3.9.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni (3.7. un 3.9. punktā minētās vielas tieši nejaukt). 3.22. 5-sulfosalicilskābe, ß = 6 %. Izšķīdina 60 g 5-sulfosalicilskābes (3.6.) ūdenī un papildina līdz vienam litram ar ūdeni. 3.23. Oksidēšanas maisījums (peroksiskudrskābe – fenols). Nelielā vārglāzē samaisa 0,5 ml ūdeņraža peroksīda (3.1.) ar 4,5 ml skudrskābes un fenola šķīduma (3.19.). Iztur 20–30 oC temperatūrā vienu stundu, lai izveidojas peroksiskudrskābe, tad atdzesē ledusvannā (15 min), pirms pievieno paraugam. Uzmanību: izvairīties no saskares ar ādu un valkāt aizsargapģērbu! 3.24. Citrāta buferšķīdums, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20 Izšķīdina 19,61 g nātrija citrāta (3.8.), 5 ml tiodiglikola (3.9.), 1 g fenola (3.3.) un 16,50 ml HCl (3.7.) apmēram 800 mililitros ūdens. Koriģē pH līmeni līdz 2,20. Papildina ar ūdeni līdz vienam litram. 3.25. Eluācijas buferšķīdumi, sagatavoti atbilstoši izmantotā analizētāja (4.9.) apstākļiem. 3.26. Ninhidrīna reaģents, sagatavots atbilstoši izmantotā analizētāja apstākļiem (4.9.). 3.27. Aminoskābju standarta šķīdumi. Minētos šķīdumus uzglabā temperatūrā zem 5 oC. 3.27.1. Aminoskābju izejas standartšķīdums (3.16.1.). c = 2,5 μmol/ml no katra sālsskābē. Var iegūt komerciāli. 3.27.2. Cisteīnskābes un metionīna sulfona izejas standartšķīdums, c = 1,25 μmol/ml. Izšķīdina 0,2115 g cisteīnskābes (3.16.2.) un 0,2265 g metionīna sulfona (3.16.3.) citrāta buferšķīdumā (3.24.) viena litra mērkolbā un papildina līdz zīmei ar citrāta buferšķīdumu. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā 12 mēnešus. Minēto šķīdumu neizmanto, ja izejas standartšķīdums (3.27.1.) satur cisteīnskābi un metionīna sulfonu. 3.27.3. Iekšējā standarta izejas standartšķīdums, piemēram, norleicīns, c = 20 μmol/ml. Izšķīdina 0,6560 g norleicīna (3.13.) citrāta buferšķīdumā (3.24.) mērkolbā un papildina līdz 250 ml ar citrāta buferšķīdumu. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā sešus mēnešus. 3.27.4. Standarta aminoskābju kalibrēšanas šķīdums izmantošanai ar hidrolizātiem, c = 5 nmol/50 μl cisteīnskābes un metionīnsulfona un c = 10 nmol/50 μl pārējo aminoskābju. Izšķīdina 2,2 g nātrija hlorīda (3.10.) 100 ml tilpuma vārglāzē ar 30 ml citrāta buferšķīduma (3.24.). Pievieno 4,00 ml aminoskābju izejas standartšķīduma (3.27.1.), 4,00 ml cisteīnskābes un metionīnsulfona izejas standartšķīduma (3.27.2.) un 0,50 ml iekšējā standarta izejas standartšķīduma (3.27.3.), ja to izmanto. Koriģē pH līmeni līdz 2,20, izmantojot nātrija hidroksīdu (3,18.). Kvantitatīvi pārnes 50 ml mērkolbā un papildina līdz zīmei ar citrāta buferšķīdumu (3.24.), un samaisa. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā trīs mēnešus. Skatīt arī 9.1. novērojumu. 3.27.5. Standarta aminoskābju kalibrēšanas šķīdums izmantošanai ar hidrolizātiem, kas sagatavoti atbilstoši 5.3.3.1. punktam, un izmantošanai ar ekstraktiem (5.2.). Kalibrēšanas šķīdumu sagatavo saskaņā ar 3.27.4. punktu, tikai nepievieno nātrija hlorīdu. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā trīs mēnešus. 4. Ierīces 4.1. 100 vai 250 ml apaļkolba ar atteces kondensatoru. 4.2. 100 ml borsilikāta stikla pudele ar skrūvējamu korķi ar gumijas/teflona drīvējumu (piemēram, Duran, Schott) izmantošanai krāsnī. 4.3. Krāsns ar mehānisko ventilāciju un temperatūras regulatoru, kura precizitāte ir labāka par ± 2 oC. 4.4. pH mērītājs (trīs skaitļi aiz komata). 4.5. Membrānfiltrs (0,22 μm). 4.6. Centrifūga. 4.7. Rotācijas vakuumiztvaicētājs. 4.8. Mehāniskais kratītājs vai magnētiskais maisītājs. 4.9. Aminoskābju analizētājs vai augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas iekārta ar jonu apmaiņas kolonnu, ierīce ninhidrīnam, pēckolonnas derivatizācija un fotometrs. Kolonnu piepilda ar sulfonētiem polistirola sveķiem, kas spēj atdalīt aminoskābes citu no citas un no pārējiem ninhidrīnpozitīviem materiāliem. Plūsmu bufera un ninhidrīna līnijā nodrošina sūkņi, kuru plūsmas stabilitāte ir ±0,5 % periodā, kas ietver gan standarta kalibrēšanas norisi, gan parauga analīzi. Ar dažiem aminoskābju analizētājiem var izmantot hidrolīzes procedūras, kurās hidrolizātā nātrija koncentrācija ir c = 0,8 mol/l un hidrolizāts satur visu atlikušo skudrskābi no oksidācijas posma. Pārējās pietiekami labi neatdala dažas aminoskābes, ja hidrolizāts satur skudrskābes pārpalikumu un/vai augstu nātrija jonu koncentrāciju. Tādā gadījumā skābes tilpumu samazina, pēc hidrolīzes un pirms pH līmeņa korekcijas iztvaicējot apmēram līdz 5 ml. Iztvaicēšanu veic vakuumā augstākais 40 oC temperatūrā. 5. Procedūra 5.1. Parauga sagatavošana Paraugu samaļ, lai tas izsijātos caur sietu ar 0,5 mm acojumu. Paraugi, kuros ir liels mitruma saturs, pirms malšanas vai nu jāizkaltē temperatūrā, kas nepārsniedz 50 oC, vai jāizžāvē ar izsaldēšanu. Paraugus, kuros ir liels tauku saturs, pirms malšanas ekstrahē ar petrolēteri (3.12.). 5.2. Brīvo aminoskābju noteikšana barībā un premiksos Attiecīgu apjomu (1–5 g) sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver koniskā kolbā un pievieno 100,0 ml ekstrakcijas maisījuma (3.21.). Maisījumu 60 minūtes krata, izmantojot mehānisko kratītāju vai magnētisko maisītāju (4.8.). Ļauj nogulsnēm nogulsnēties un 10,0 ml šķīduma augšējā slāņa ar pipeti iepilina vārglāzē. Pievieno 5,0 ml sulfosalicilskābes šķīduma (3.22.), vienlaikus maisot, un turpina maisīt ar magnētisko maisītāju piecas minūtes. Šķīduma augšējo slāni filtrē vai centrifugē, lai atdalītu visas nogulsnes. Ievieto 10,0 ml iegūtā šķīduma 100 ml vārglāzē un koriģē pH līmeni līdz 2,20, izmantojot nātrija hidroksīda šķīdumu (3.18.), pārnes uz attiecīga tilpuma mērkolbu, izmantojot citrāta buferšķīdumu (3.24.), un papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu (3.24.). Ja izmanto iekšējo standartu, tad pievieno 1,00 ml iekšējā standarta (3.27.3.) uz katriem 100 ml galīgā šķīduma un papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu (3.24.). Veic nākamo hromatogrāfijas posmu atbilstoši 5.4. punktam. Ja ekstraktus nepārbauda tajā pašā dienā, tad tie jāuzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC. 5.3. Kopējo aminoskābju noteikšana 5.3.1. Oksidācija No 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver: — 100 ml apaļkolbā (4.1.) vaļējai hidrolīzei (5.3.2.3.) vai — 250 ml apaļkolbā (4.1.), ja ir prasīta zema nātrija koncentrācija (5.3.3.1.), vai — 100 ml pudelē ar skrūvējamu korķi (4.2.) slēgtai hidrolīzei (5.3.2.4.). Nosvērtajā apjomā, no kura ņem paraugu, slāpekļa saturam jābūt apmēram 10 mg un mitruma saturam – ne vairāk par 100 mg. Kolbu/pudeli ievieto ledusvannā un atdzesē līdz 0 oC, pievieno 5 ml oksidēšanas maisījuma (3.23.) un samaisa, izmantojot stikla lāpstiņu ar liektu galu. Kolbu/pudeli, kurā ir lāpstiņa, cieši noslēdz ar hermētisku plēvi, ievieto ledusvannu ar noslēgto trauku ledusskapī 0 oC temperatūrā un atstāj uz 16 stundām. Pēc 16 stundām izņem no ledusskapja un sadala oksidēšanas reaģenta pārpalikumu, pievienojot 0,84 g nātrija disulfīta (3.4.). Rīkojas, kā noteikts 5.3.2.1. punktā. 5.3.2. Hidrolīze 5.3.2.1. Oksidēto paraugu hidrolīze Oksidētajam paraugam, kas sagatavots atbilstoši 5.3.1. punktam, pievieno 25 ml hidrolīzes maisījuma (3.20.), raugoties, lai tiktu noskalotas visas parauga atliekas, kas pielipušas trauka malām un lāpstiņai. Atkarībā no izmantotās hidrolīzes procedūras rīkojas, kā noteikts 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktā. 5.3.2.2. Neoksidēto paraugu hidrolīze 100 ml vai 250 ml apaļkolbā (4.1.) vai 100 ml pudelē, kas aprīkota ar skrūvējamu vāciņu (4.2.), ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver no 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.). Slāpekļa saturam iesvērtajā analizējamā paraugā jābūt apmēram 10 mg. Uzmanīgi pievieno 25 ml hidrolīzes maisījuma (3.20.) un samaisa ar paraugu. Rīkojas, kā noteikts 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktā. 5.3.2.3. Atvērtā hidrolīze Maisījumam kolbā (kas sagatavots atbilstoši 5.3.2.1. vai 5.3.2.2. punktam) pievieno trīs stikla lodītes un vāra, maisījumam attecē nepārtraukti burbuļojot 23 stundas. Pēc hidrolīzes pabeigšanas kondensatoru noskalo ar 5 ml citrāta buferšķīduma (3.24.). Kolbu atvieno un atdzesē ledusvannā. Rīkojas, kā noteikts 5.3.3. punktā. 5.3.2.4. S lēgtā hidrolīze Pudeli ar maisījumu, kas sagatavots saskaņā ar 5.3.2.1. vai 5.3.2.2. punktu, ievieto krāsnī (4.3.) 110 oC temperatūrā. Pirmajā stundā, lai novērstu spiediena uzkrāšanos (kas notiek gāzveida vielu veidošanās dēļ) un lai novērstu sprādzienu, uz trauka augšas uzliek skrūvējamu vāciņu. Trauku neaizver ar vāciņu. Pēc vienas stundas trauku aizver ar vāciņu un atstāj krāsnī (4.3.) 23 stundas. Pēc hidrolīzes pabeigšanas pudeli izņem no krāsns, uzmanīgi atver pudeles vāciņu un pudeli ieliek ledusvannā. Atstāj atdzist. Atkarībā no procedūras, kādu izmanto pH līmeņa korekcijai (5.3.3.), kvantitatīvi pārnes pudeles saturu 250 ml vārglāzē vai 250 ml apaļkolbā, izmantojot citrāta buferšķīdumu (3.24.). Rīkojas, kā noteikts 5.3.3. punktā. 5.3.3. pH līmeņa korekcija Lai koriģētu pH līmeni, atkarībā no aminoskābes analizētāja (4.9.) nātrija tolerances rīkojas atbilstoši 5.3.3.1. vai 5.3.3.2. punktam. 5.3.3.1. Hromatogrāfijas sistēmām (4.9.), kurām nepieciešama zema nātrija koncentrācija Ja izmanto aminoskābju analizētājus, kuriem nepieciešama zema nātrija koncentrācija (kad skābes tilpums jāsamazina), ieteicams izmantot iekšējo izejas standartšķīdumu (3.27.3.). Tādā gadījumā hidrolizātam pirms iztvaicēšanas pievieno 2,00 ml iekšējā izejas standartšķīduma (3.27.3.). Pievieno divus pilienus 1-oktanola (3.15.) hidrolizātam, kas iegūts saskaņā ar 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktu. Izmantojot rotācijas iztvaicētāju (4.7.), vakuumā un 40 oC grādu temperatūrā samazina tilpumu līdz 5–10 ml. Ja tilpumu nejauši samazina līdz mazāk nekā 5 ml, tad hidrolizāts jāizmet un analīze jāsāk no jauna. Ar nātrija hidroksīda šķīdumu (3.18.) koriģē pH līmeni līdz 2,20 un rīkojas, kā noteikts 5.3.4. punktā. 5.3.3.2. Visiem pārējiem aminoskābju analizētājiem (4.9.) Hidrolizātus, kas iegūti saskaņā ar 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktu, daļēji neitralizē un, uzmanīgi maisot, pievieno 17 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.17.), un nodrošina, lai temperatūra būtu zem 40 oC. Koriģē pH līmeni līdz 2,20 istabas temperatūrā, izmantojot nātrija hidroksīda šķīdumu (3.17.) un visbeidzot – nātrija hidroksīda šķīdumu (3.18.). Pāriet pie 5.3.4. punkta. 5.3.4. Parauga šķīdums hromatogrāfijai Kvantitatīvi pārnes pH koriģēto hidrolizātu (5.3.3.1. vai 5.3.3.2.) ar citrāta buferšķīdumu (3.24.) 200 ml tilpuma mērkolbā un papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu (3.24.). Ja iekšējais standarts nav jau izmantots, tad pievieno 2,00 ml iekšējā standarta (3.27.3.) un papildina līdz zīmei ar citrāta buferšķīdumu (3.24.). Rūpīgi samaisa. Pāriet pie hromatogrāfijas posma (5.4.). Ja parauga šķīdumus nepārbauda tajā pašā dienā, tad tie jāuzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC. 5.4. Hromatogrāfija Pirms hromatogrāfijas ekstraktu (5.2.) vai hidrolizātu (5.3.4.) sasilda līdz istabas temperatūrai. Maisījumu sakrata un piemērotu daudzumu izfiltrē caur 0,22 μm membrānfiltru (4.5.). Iegūto dzidro šķīdumu pakļauj jonu apmaiņas hromatogrāfijai, izmantojot aminoskābju analizētāju (4.9.). Injekciju var veikt manuāli vai automātiski. Ir svarīgi, lai kolonnā standartu un paraugu analīzei tiktu pievienots vienāds šķīduma daudzums ±0,5 %, izņemot gadījumus, kad izmanto iekšējo standartu, un lai nātrija/aminoskābes proporcijas standarta un parauga šķīdumos būtu pēc iespējas līdzīgākas. Parasti kalibrēšanas posmu biežums ir atkarīgs no ninhidrīna reaģenta stabilitātes un analīžu sistēmas. Standartu vai paraugu atšķaida ar citrāta buferšķīdumu (3.24.), lai uzrādītu standarta maksimālo laukumu 30–200 % no parauga aminoskābes maksimālā laukuma. Aminoskābju hromatogrāfija nedaudz atšķirsies atkarībā no izmantotā analizētāja tipa un sveķiem. Izvēlētajai sistēmai jāspēj atdalīt aminoskābes citu no citas un no ninhidrīnpozitīviem materiāliem. Darbības diapazonā hromatogrāfiskajai sistēmai jāsniedz lineāra atbilde uz pārmaiņām to aminoskābju daudzumos, ko pievieno kolonnā. Kad analizē (nosakāmo aminoskābju) ekvimolāru šķīdumu, tad hromatogrāfijas posma laikā piemēro tālāk minētās attiecības, kas ir starp maksimālo augstumu un atstarpi starp signāliem. Tādam ekvimolāram šķīdumam jāsatur vismaz 30 % no katras aminoskābes maksimālās slodzes, ko var precīzi izmērīt, izmantojot aminoskābju analizētāja sistēmu (4.9.). Lai atdalītu treonīnu un serīnu, attiecība starp maksimālo augstumu un atstarpi starp signāliem zemākajā no divām aminoskābēm, kuras pārklājas hromatogrammā, nedrīkst pārsniegt 2:10 (ja nosaka tikai cist(e)īnu, metionīnu, treonīnu un lizīnu, tad nepietiekama atdalīšana no blakusesošajiem maksimālajiem augstumiem negatīvi ietekmēs noteikšanu). Visām pārējām aminoskābēm atdalījumam jābūt precīzākam par 1:10. Sistēmai jānodrošina, lai lizīns tiktu atdalīts no “lizīna artefaktiem” un ornitīna. 6. Rezultātu aprēķināšana Parauga un standarta maksimumu laukumu mēra katrai atsevišķai aminoskābei un aprēķina daudzumu (X) gramos, cik aminoskābes ir kilogramā parauga. Ja izmanto iekšējo standartu, pareizina ar: A = maksimālais laukums, hidrolizāts vai ekstrakts, B = maksimālais laukums, kalibrēšanas standartšķīdums, C = maksimālais laukums, iekšējais standarts hidrolizātā vai ekstraktā, D = maksimālais laukums, iekšējais standarts, kalibrēšanas standartšķīdums, M = nosakāmās aminoskābes molmasa, c = standarta koncentrācija μmol/ml, m = parauga svars (g) (koriģēts līdz sākotnējam svaram, ja kaltēts vai attaukots), V = ml kopējā hidrolizāta (5.3.4.) vai ml ekstrakta aprēķinātā kopējā atšķaidījuma tilpuma (6.1.). Cistīnu un cisteīnu nosaka kā cisteīnskābi oksidētā parauga hidrolizātos, bet aprēķina kā cistīnu (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), izmantojot M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). Metionīnu nosaka kā metionīna sulfonu oksidētā parauga hidrolizātos, bet aprēķina kā metionīnu, izmantojot metionīna M 149,21 g/mol. Pievienoto brīvo metionīnu nosaka pēc tam, kad tas ekstrahēts kā metionīns, aprēķinam izmanto to pašu M. 6.1. Ekstraktu kopējo atšķaidījuma tilpumu (F), lai noteiktu brīvās aminoskābes (5.2.), aprēķina šādi: V = gala ekstrakta tilpums. 7. Metodes novērtējums Minēto metodi pārbaudīja starptautiskā līmenī 1990. gadā, salīdzinot rezultātus starp laboratorijām, izmantojot četras dažādas barības (barības maisījumu cūkām, barības maisījumu broileriem, proteīnu koncentrātu un premiksu). Vidējo un standarta noviržu rezultāti, kas iegūti pēc galējo punktu likvidēšanas, ir norādīti tabulās šajā punktā. Vidējie lielumi g/kg Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Barības maisījums broileriem 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Proteīnu koncentrāts 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premikss 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits. 7.1. Atkārtojamība Iepriekš minētā savstarpējā salīdzinājuma atkārtojamība, kas izteikta kā “laboratorijas standartnovirze”, ir norādīta tālāk tabulā. Laboratorijas standartnovirze (Sr) g/kg Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Barības maisījums broileriem 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Proteīnu koncentrāts 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premikss 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits.

Variācijas koeficients (%) laboratorijas standartnovirzei (Sr) Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Barības maisījums broileriem 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Proteīnu koncentrāts 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premikss 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits. 7.2 Atveidojamība Starplaboratoriju standartnoviržu rezultāti, kas iegūti iepriekš minētajā savstarpējā salīdzinājumā, ir norādīti tālāk tabulā. Starplaboratoriju standartnovirze (SR) g/kg Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Barības maisījums broileriem 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Proteīnu koncentrāts 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premikss 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits.

Variācijas koeficients (%) starplaboratoriju standartnovirzei (SR) Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Barības maisījums broileriem 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Proteīnu koncentrāts 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premikss 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits. 8. Standartmateriālu izmantošana Metodes pareizu piemērošanu verificē, atkārtoti mērot sertificētus standartmateriālus, kad tie ir pieejami. Ir ieteicama kalibrēšana ar sertificētu aminoskābes kalibrēšanas šķīdumu. 9. Novērojumi 9.1. Tā kā starp aminoskābju analizētājiem ir atšķirības, tad par pamatnostādni ņem standarta aminoskābju (skatīt 3.27.4. un 3.27.5. punktu) un hidrolizāta (skatīt 5.3.4. punktu) kalibrēšanas šķīdumu galīgās koncentrācijas. Aparāta lineārās reakcijas diapazons jāpārbauda attiecībā uz visām aminoskābēm. Standartšķīdumu atšķaida ar citrāta buferšķīdumu, lai uzrādītu maksimālos laukumus diapazona vidū. 9.2. Ja izmanto augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas aprīkojumu, lai analizētu hidrolizātus, tad eksperimenta apstākļi jāoptimizē saskaņā ar ražotāja ieteikumiem. 9.3. Saskaņā ar šo metodi analizējot barību, kas satur vairāk par 1 % hlorīdu (barības koncentrātus, minerālbarību, papildbarību), var iegūt pazeminātus rezultātus attiecībā uz metionīnu, un tāpēc tā jāanalizē īpaši. G. TRIPTOFĀNA NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt kopējo un brīvo triptofānu barībā. Tajā neizšķir D un L formu. 2. Princips Lai noteiktu kopējo triptofānu, paraugu hidrolizē sārmainos apstākļos ar piesātinātu bārija hidroksīda šķīdumu un 20 stundas karsē līdz 110 oC temperatūrai. Pēc hidrolīzes pievieno iekšējo standartu. Lai noteiktu brīvo triptofānu, paraugu ekstrahē nedaudz skābā vidē iekšējā standarta klātbūtnē. Triptofānu un iekšējo standartu hidrolizātā vai ekstraktā nosaka, izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC) ar fluorescences noteikšanu. 3. Reaģenti 3.1. Jāizmanto ūdens bidestilāts vai līdzvērtīgas kvalitātes ūdens (vadītspēja < 10 μS/cm). 3.2. Standartviela: triptofāns (tīrība/saturs ≥ 99 %), kas izžāvēts vakuumā virs fosfora pentoksīda. 3.3. Iekšējā standartviela: α-metil-triptofāns (tīrība/saturs ≥ 99 %), kas izžāvēts vakuumā virs fosfora pentoksīda. 3.4. Bārija hidroksīda oktahidrāts (jārūpējas, lai Ba(OH)2 ·8 H2O pārmērīgi nepakļautu gaisa iedarbībai, lai izvairītos no BaCO3 veidošanās, kas varētu traucēt noteikšanu) (skatīt 9.3. novērojumu). 3.5. Nātrija hidroksīds. 3.6. Ortofosforskābe, w (w/w) = 85 %. 3.7. Sālsskābe, ρ201,19 g/ml. 3.8. Metanols, ekvivalents HPLC pakāpei. 3.9. Petrolēteris, viršanas diapazons 40-60 oC. 3.10. Nātrija hidroksīda šķīdums, c = 1 mol/l. Ūdenī atšķaida 40,0 g NaOH (3.5.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni (3.1.). 3.11. Sālsskābe, c = 6 mol/l. 492 ml HCl (3.7.) papildina līdz vienam litram ar ūdeni. 3.12. Sālsskābe, c = 1 mol/l. 82 ml HCl (3.7.) papildina līdz vienam litram ar ūdeni. 3.13. Sālsskābe, c = 0,1 mol/l. 8,2 ml HCl (3.7.) papildina līdz vienam litram ar ūdeni. 3.14. Ortofosforskābe, c = 0,5 mol/l. Paņem 34 ml ortofosforskābes (3.6.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni (3.1.). 3.15. Koncentrēts triptofāna šķīdums (3.2.), c = 2,50 μmol/ml. 500 ml tilpuma mērkolbā izšķīdina 0,2553 g triptofāna (3.2.) sālsskābē (3.13.) un papildina līdz zīmei ar sālsskābi (3.13.). Uzglabā –18 oC temperatūrā ne ilgāk kā četras nedēļas. 3.16. Koncentrēts iekšējais standartšķīdums, c = 2,50 μmol/ml. 500 ml tilpuma mērkolbā sālsskābē (3.13.) izšķīdina 0,2728 g α-metil-triptofāna (3.3.) un papildina līdz zīmei ar sālsskābi (3.13.). Uzglabā –18 oC temperatūrā ne ilgāk kā četras nedēļas. 3.17. Triptofāna kalibrēšanas standartšķīdums un iekšējais standarts. Ņem 2,00 ml koncentrēta triptofāna (3.15.) šķīduma un 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (α-metil-triptofāna) šķīduma (3.16.). Atšķaida ar ūdeni (3.1.) un metanolu (3.8.) aptuveni līdz tādam pašam tilpumam un aptuveni tādai pašai metanola koncentrācijai (10–30 %) kā gatavajam hidrolizātam. Minētais šķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas. Sagatavošanas laikā jāuzmana, lai nepiekļūst tieša saules gaisma. 3.18. Etiķskābe. 3.19. 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanols. 3.20. Etanolamīns w (w/w) > 98 %. 3.21. 1 g 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanola (3.19.) šķīdums 100 mililitros metanola (3.8.). 3.22. Kustīgā fāze priekš HPLC: 3,00 g etiķskābes (3.18.) + 900 ml ūdens (3.1.) +50,0 ml 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanola (3.19.) šķīduma (3.21.) metanolā (3.8.) (1 g/100 ml). Izmantojot etanolamīnu (3.20.), pH līmeni koriģē līdz 5,00. Papildina ar ūdeni līdz 1 000 ml (3.1.). 4. Ierīces 4.1. HPLC iekārta ar fluorescences detektoru. 4.2. Šķidrumu hromatogrāfa kolonna, 125 × 4 mm, C18, 3 μm iesaiņojums, vai līdzvērtīga. 4.3. pH mērītājs. 4.4. Polipropilēna kolba, 125 ml tilpums, ar platu kaklu un skrūvējamu korķi. 4.5. Membrānfiltrs, 0,45 μm. 4.6. Autoklāvs, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bāri. 4.7. Mehāniskais kratītājs vai magnētiskais maisītājs. 4.8. Virpuļmikseris. 5. Procedūra 5.1. Paraugu sagatavošana Paraugu samaļ, lai tas izsijātos caur sietu ar 0,5 mm acojumu. Paraugi, kuros ir liels mitruma saturs, pirms malšanas vai nu jāizkaltē temperatūrā, kas nepārsniedz 50 oC, vai jāizžāvē ar izsaldēšanu. Paraugus, kuros ir liels tauku saturs, pirms malšanas ekstrahē ar petrolēteri (3.9.). 5.2. Brīvā triptofāna noteikšana (ekstrakts) Attiecīgu apjomu (1–5 g) sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 1 mg iesver koniskā kolbā. Pievieno 100,0 ml sālsskābes (3.13.) un 5,00 ml koncentrēta iekšējā standartšķīduma (3.16.). Krata vai maisa 60 minūtes, izmantojot mehānisko kratītāju vai magnētisko maisītāju (4.7.). Ļauj nogulsnēm nogulsnēties un 10,0 ml šķīduma augšējā slāņa ar pipeti iepilina vārglāzē. Pievieno 5 ml ortofosforskābes (3.14.). Koriģē pH līmeni līdz 3, izmantojot nātrija hidroksīdu (3.10.). Pievieno pietiekami daudz metanola (3.8.), lai galīgajā tilpumā metanola koncentrācija būtu no 10 līdz 30 %. Pārnes attiecīga tilpuma kolbā un atšķaida ar ūdeni līdz tilpumam, kas vajadzīgs hromatogrāfijai (aptuveni tikpat, cik ir kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.)). Izfiltrē dažus ml šķīduma caur 0,45 μm membrānfiltru (4.5.), pirms šķīdumu iešpricē HPLC kolonnā. Veic nākamo hromatogrāfijas posmu atbilstoši 5.4. punktam. Standartšķīdums un ekstrakti jāsargā no tiešas saules gaismas. Ja ekstraktus nav iespējams analizēt tajā pašā dienā, tad tos var uzglabāt 5 oC temperatūrā ne ilgāk kā trīs dienas. 5.3. Kopējā triptofāna (hidrolizāta) noteikšana No 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver polipropilēna kolbā (4.4.). Slāpekļa saturs iesvērtajā analizējamā paraugā ir apmēram 10 mg. Pievieno 8,4 g bārija hidroksīda oktahidrāta (3.4.) un 10 ml ūdens. Samaisa virpuļmikserī (4.8.) vai ar magnētisko maisītāju (4.7.). Atstāj maisījumā ar teflonu pārklātu magnētu. Trauka sienas noskalo ar 4 ml ūdens. Uzliek skrūvējamu korķi un vaļīgi aiztaisa kolbu. Pārvieto uz autoklāvu (4.6.) ar vārošu ūdeni un tvaicē 30–60 minūtes. Aizver autoklāvu un tur karsē 110 (± 2) oC temperatūrā 20 stundas. Pirms autoklāva atvēršanas temperatūru samazina, lai tā būtu nedaudz zem 100 oC. Lai novērstu Ba(OH)2 ·8 H2O kristalizāciju, siltajam maisījumam pievieno 30 ml istabas temperatūras ūdens. Viegli sakrata vai samaisa. Pievieno 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (α-metil-triptofāna) šķīduma (3.16.). Atdzesē traukus ūdenī/ledusvannā 15 minūtes. Tad pievieno 5 ml ortofosforskābes (3.14.). Trauku tur dzesēšanas vannā un neitralizē ar HCl (3.11.), vienlaikus maisot, un pH līmeni koriģē līdz 3,0, izmantojot HCl (3.12.). Pievieno pietiekami daudz metanola, lai galīgajā tilpumā metanola koncentrācija būtu no 10 līdz 30 %. Pārnes atbilstoša tilpuma kolbā un atšķaida ar ūdeni līdz tilpumam, kas noteikts hromatogrāfijas vajadzībām (piemēram, 100 ml). Pievienojot metanolu, neveidojas nogulsnes. Izfiltrē dažus ml šķīduma caur 0,45 μm membrānfiltru (4.5.), pirms šķīdumu iešpricē HPLC kolonnā. Veic nākamo hromatogrāfijas posmu atbilstoši 5.4. punktam. Standartšķīdums un hidrolizāti jāsargā no tiešas saules gaismas. Ja hidrolizātus nav iespējams izanalizēt tajā pašā dienā, tad tos var uzglabāt 5 oC temperatūrā ne ilgāk kā trīs dienas. 5.4. HPLC noteikšana Orientējoši izokrātiskajai eluācijai piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus (skatīt arī 9.1. un 9.2. novērojumu). HPLC kolonna (4.2.): 125 × 4 mm, C18, 3 μm iesaiņojums, vai līdzvērtīga Kolonnas temperatūra: istabas temperatūra Kustīgā fāze (3.22.): 3,00 g etiķskābes (3.18.) + 900 ml ūdens (3.1.) +50,0 ml 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanola (3.19.) šķīdums (3.21.) metanolā (3.8.) 1 g/100 ml). pH līmeni koriģē līdz 5,00, izmantojot etanolamīnu (3.20.). Papildina ar ūdeni līdz 1 000 ml (3.1.) Plūsmas ātrums: 1 ml/min Kopējais norises laiks: apmēram 34 min Noteikšanas viļņa garums: ierosa 280 nm, emisija 356 nm Injekcijas tilpums: 20 μl 6. Rezultātu aprēķināšana Aprēķina triptofāna (X) daudzumu gramos uz 100 g parauga. A = iekšējā standarta maksimālais laukums, kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.), B = triptofāna maksimālais laukums, ekstrakts (5.2.) vai hidrolizāts (5.3.), V1 = koncentrētā triptofāna šķīduma (3.15.) tilpums mililitros (2 ml), ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17.), c = koncentrētā triptofāna šķīduma (3.15.) koncentrācija μmol/ml (= 2,50), ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17.), V2 = koncentrētā iekšējā standartšķīduma (3.16.) tilpums mililitros, ko pievieno ekstrahēšanas laikā (5.2.) (= 5,00 ml) vai hidrolizātam (5.3.) (=2,00 ml), C = iekšējā standarta maksimālais laukums, ekstrakts (5.2.) vai hidrolizāts (5.3.), D = triptofāna maksimālais laukums, kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.), V3 = koncentrētā iekšējā standartšķīduma (3.16.) tilpums mililitros (= 2,00 ml), ko pievieno kalibrēšanas standartšķīdumam (3.17.), m = parauga svars gramos (koriģēts līdz sākotnējam svaram, ja kaltēts un/vai attaukots), M = triptofāna molmasa (= 204,23 g/mol). 7. Atkārtojamība Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 10 % attiecībā pret lielāko rezultātu. 8. Koppētījuma rezultāti Tika noorganizēts EK koppētījums (4. salīdzinājums starp laboratorijām), kurā līdz 12 laboratorijām analizēja trīs paraugus, lai sertificētu hidrolīzes metodi. Ar katru paraugu tika veiktas atkārtotas (5) analīzes. Rezultāti ir norādīti šajā tabulā. 1. paraugs Barība cūkām 2. paraugs Barība cūkām, papildināta ar L-triptofānu 3. paraugs Barības koncentrāts cūkām L 12 12 12 n 50 55 50 Vidējais [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2 L = to laboratoriju skaits, kas iesniedza rezultātus, n = atsevišķo rezultātu skaits, kas iegūts pēc galējo punktu likvidēšanas (identificē ar Kohrana, Diksona galējo punktu testu), sr = atkārtojamības standartnovirze, SR = atveidojamības standartnovirze, r = atkārtojamība, R = atveidojamība, CVr = atkārtojamības variācijas koeficients (%), CVR = atveidojamības variācijas koeficients (%). Tika noorganizēts cits EK koppētījums (3. salīdzinājums starp laboratorijām), kurā līdz 13 laboratorijām analizēja divus paraugus, lai sertificētu brīvā triptofāna ekstrahēšanas metodi. Ar katru paraugu tika veiktas atkārtotas (5) analīzes. Rezultāti ir norādīti šajā tabulā. 4. paraugs Kviešu un sojas maisījums 5. paraugs Kviešu un sojas maisījums (= 4. paraugs), kam pievienots triptofāns (0,457g/kg) L 12 12 n 55 60 Vidējais [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11 L = to laboratoriju skaits, kas iesniedza rezultātus, n = atsevišķo rezultātu skaits, kas iegūts pēc galējo punktu likvidēšanas (identificē ar Kohrana, Diksona galējo punktu testu), sr = atkārtojamības standartnovirze, SR = atveidojamības standartnovirze, r = atkārtojamība, R = atveidojamība, CVr = atkārtojamības variācijas koeficients (%), CVR = atveidojamības variācijas koeficients (%). Tika noorganizēts cits EK salīdzinājuma pētījums starp laboratorijām, kurā līdz septiņām laboratorijām analizēja četrus paraugus, lai sertificētu triptofānu hidrolīzei. Rezultāti ir norādīti tālāk. Ar katru paraugu tika veiktas atkārtotas (5) analīzes. 1. paraugs Barības maisījums cūkām (CRM 117) 2. paraugs Zivju milti ar zemu tauku saturu (CRM 118) 3. paraugs Sojas milti (CRM 119) 4. paraugs Sausais vājpiens (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Vidējais [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = to laboratoriju skaits, kas iesniedza rezultātus, n = atsevišķo rezultātu skaits, kas iegūts pēc galējo punktu likvidēšanas (identificē ar Kohrana, Diksona galējo punktu testu), sr = atkārtojamības standartnovirze, SR = atveidojamības standartnovirze, r = atkārtojamība, R = atveidojamība, CVr = atkārtojamības variācijas koeficients (%), CVR = atveidojamības variācijas koeficients (%). 9. Novērojumi 9.1. Ievērojot šādus īpašus hromatogrāfijas apstākļus, var labāk atdalīt triptofānu un α-metil-triptofānu. Izokrātiskā eluācija, pēc kuras notiek gradienta kolonnas tīrīšana: HPLC kolonna: 125 × 4 mm, C18, 5 μm iesaiņojums, vai īdzvērtīga Kolonnas temperatūr: 32 oC Kustīgā fāze: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanols, 95+5 (V+V) B: metanols Gradienta programma: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Plūsmas ātrums: 1,2 ml/min Kopējais norises laiks: apmēram 33 min 9.2. Hromatogrāfijas rezultāti atšķiras atkarībā no HPLC veida un izmantotā kolonnas iesaiņojuma materiāla. Izvēlētajai sistēmai jānodrošina triptofāna un iekšējā standarta bāzes līnijas atdalīšanās. Turklāt ir ļoti svarīgi sadalīšanās produktus atdalīt no triptofāna un iekšējā standarta. Lai pārbaudītu, vai iekšējais standarts nesatur piemaisījumus, izmanto hidrolizātus bez iekšējā standarta. Norises ilgumam jābūt pietiekamam, lai eluētu visus sadalīšanās produktus, citādi eluēšanas vēlie maksimumi var traucēt turpmāko hromatogrāfijas norisi. Darbības diapazonā hromatogrāfijas sistēma uzrāda lineāru reakciju. Lineāro reakciju mēra nemainīgā (normālā) iekšējā standarta koncentrācijā un mainīgās triptofāna koncentrācijās. Gan triptofāna, gan iekšējā standarta maksimumiem jābūt HPLC/fluorescences sistēmas lineārajā intervālā. Ja triptofāna un/vai iekšējā standarta maksimums(-i) ir pārāk mazs(-i) vai liels(-i), analīzi atkārto ar citu parauga apjomu un/vai citu galīgo tilpumu. 9.3. Bārija hidroksīds Laika gaitā bārija hidroksīda šķīdība samazinās. Līdz ar to HPLC noteiktais šķīdums ir neskaidrs un var uzrādīt zemu triptofāna saturu. H. JĒLEĻĻU UN JĒLTAUKU NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Ar šo metodi nosaka jēleļļas un jēltaukus barībā. Tā neattiecas uz eļļas augu sēklu un augļu analīzi. Abu turpmāk aprakstīto procedūru izmantošana ir atkarīga no barības īpašībām un sastāva, kā arī no iemesla, kādēļ tiek veikta analīze. 1.1. A procedūra. Tieši ekstrahējamās jēleļļas un jēltauki Šo metodi piemēro augu izcelsmes barības līdzekļiem, izņemot tos, kas iekļauti B procedūras darbības jomā. 1.2. B procedūra. Jēleļļas un jēltauki kopā Šo metodi piemēro dzīvnieku izcelsmes barības līdzekļiem un visiem barību maisījumiem. Tā jāizmanto visiem barības līdzekļiem, no kuriem bez iepriekšējas hidrolīzes nevar pilnībā ekstrahēt eļļas un taukus (piemēram, kviešu lipeklim, raugam, kartupeļu proteīniem un produktiem, kas pārstrādāti ar ekstrūzijas paņēmienu pārslojot vai karsējot). 1.3. Rezultātu interpretēšana Visos gadījumos, kad, izmantojot B procedūru, iegūst augstāku rezultātu, nekā izmantojot A procedūru, par patieso vērtību uzskata B procedūrā iegūto rezultātu. 2. Princips 2.1. A procedūra Paraugu ekstrahē ar petrolēteri. Pēc šķīdinātāja atdestilēšanas atlikumu izžāvē un nosver. 2.2. B procedūra Paraugu apstrādā ar sālsskābi karsējot. Maisījumu atdzesē un filtrē. Atlikumu skalo, žāvē un veic noteikšanu saskaņā ar A procedūru. 3. Reaģenti 3.1. Petrolēteris, viršanas diapazons 40–60 oC. Broma vērtībai jābūt mazākai par 1, un negaistošajam atlikumam – mazākam par 2 mg/100 ml. 3.2. Bezūdens nātrija sulfāts. 3.3. Sālsskābe, c = 3 mol/l. 3.4. Filtrēšanas palīgmateriāls, piemēram, kīzelgūrs, Hyflo-supercel. 4. Ierīces 4.1. Ekstrakcijas aparāts. Ekstraktoros ar sifonu (Soksleta aparātos) atteces ātrums ir tāds, lai tas nodrošinātu apmēram 10 ciklus stundā; ekstraktoros bez sifona atteces ātrums ir apmēram 10 ml minūtē. 4.2. Ekstrakcijas kapsulas, kuras nesatur petrolēterī šķīstošas vielas un kuru porozitāte atbilst 4.1. punkta prasībām. 4.3. Uz 75 ± 3 oC ieregulēts vakuuma žāvēšanas skapis vai uz 100 ± 3 oC ieregulēts parastais žāvēšanas skapis. 5. Procedūra 5.1. A procedūra (skatīt 8.1. punktu) Ar precizitāti līdz 1 mg iesver 5 g parauga, pārnes to uz ekstrakcijas kapsulu (4.2.) un nosedz ar attaukotas kokvilnas vates tamponu. Kapsulu ieliek ekstraktorā (4.1.) un ekstrahē sešas stundas ar petrolēteri (3.1.). Petrolētera ekstraktu savāc sausā, nosvērtā kolbā, kurā atrodas pumeka gabaliņi (2). Atdestilē šķīdinātāju. Atlikumu izžāvē, turot kolbu pusotras stundas žāvēšanas skapī (4.3.). Atstāj atdzist eksikatorā un nosver. Atkārtoti žāvē 30 minūtes, lai nodrošinātu, ka eļļu un tauku svars nemainās (divos secīgi veiktos svērumos svara zudumam jābūt mazākam par vai vienādam ar 1 mg). 5.2. B procedūra Nosver 2,5 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg (skatīt 8.2. punktu), ievieto 400 ml vārglāzē vai 300 ml koniskā kolbā un pievieno 100 ml sālsskābes (3.3.) un pumeka gabaliņus. Vārglāzi nosedz ar pulksteņstiklu vai koniskajai kolbai pievieno atteces kondensatoru. Maisījumu uzkarsē līdz viršanas temperatūrai un vienu stundu lēni vāra uz nelielas gāzes degļa liesmas vai elektriskās plītiņas. Neļauj produktam pielipt pie konteinera sienām. Atdzesē un pievieno tādu filtrēšanas palīgmateriāla (3.4.) daudzumu, kas ir pietiekams, lai novērstu eļļas un tauku zudumus filtrēšanas laikā. Izfiltrē caur samitrinātu, attaukotu, dubultu filtrpapīru. Atlikumu mazgā aukstā ūdenī līdz filtrāta neitrālai reakcijai. Pārbauda, vai filtrātā nav eļļu vai tauku. To klātbūtne liecina, ka paraugs pirms hidrolīzes jāekstrahē ar petrolēteri, izmantojot A procedūru. Dubulto filtrpapīru ar atlikumu novieto uz pulksteņstikla un žāvē pusotras stundas žāvēšanas skapī (4.3.) 100 ± 3 oC temperatūrā. Dubulto filtrpapīru ar sauso atlikumu ievieto ekstrakcijas kapsulā (4.2.) un nosedz ar attaukotas kokvilnas vates tamponu. Kapsulu ievieto ekstraktorā (4.1.) un rīkojas, kā norādīts 5.1. punkta otrajā un trešajā daļā. 6. Rezultāta izteikšana Atlikuma svaru izsaka procentos no parauga. 7. Atkārtojamība Viena laboranta divās paralēlās noteikšanās no viena parauga iegūtu rezultātu starpība nepārsniedz: — 0,2 % no absolūtās vērtības, ja jēleļļu un jēltauku saturs ir mazāks par 5 %, — 4,0 % no lielākā rezultāta skaitliskās vērtības, ja saturs ir no 5 līdz 10 %, — 0,4 % no absolūtās vērtības, ja saturs pārsniedz 10 %. 8. Novērojumi 8.1. Attiecībā uz produktiem ar augstu eļļu un tauku saturu, ko ir grūti sasmalcināt vai no kā nevar sagatavot homogēnu samazinātu testa paraugu, rīkojas šādi. Ar precizitāti līdz 1 mg nosver 20 g parauga un samaisa ar 10 g vai vairāk gramiem bezūdens nātrija sulfāta (3.2.). Ekstrahē ar petrolēteri (3.1.), kā norādīts 5.1. punktā. Iegūto ekstraktu papildina līdz 500 ml ar petrolēteri (3.1.) un samaisa. No šķīduma paņem 50 ml un ielej mazā, sausā, nosvērtā kolbā, kurā atrodas pumeka gabaliņi. Atdestilē šķīdinātāju, izžāvē un rīkojas, kā norādīts 5.1. punkta pēdējā daļā. Izdala šķīdinātāju no kapsulā palikušajiem ekstrakcijas atlikumiem, ko sasmalcina līdz 1 mm un pēc tam ievieto atpakaļ ekstrakcijas kapsulā (nepievieno nātrija sulfātu), un rīkojas, kā norādīts 5.1. punkta otrajā un trešajā daļā. Eļļu un tauku saturu aprēķina procentos no parauga, izmantojot šādu formulu: (10m1 + m2) × 5 kur: m1 = atlikuma svars gramos pēc pirmās ekstrakcijas (ekstrakta alikvotā daļa), m2 = atlikuma svars gramos pēc otrās ekstrakcijas. 8.2. Produktiem ar zemu eļļu un tauku saturu testa paraugu var palielināt līdz 5 g. 8.3. Barība lolojumdzīvniekiem ar augstu ūdens saturu pirms hidrolīzes un ekstrakcijas var būt jāsamaisa ar bezūdens nātrija sulfātu, kā noteikts B procedūrā. 8.4. 5.2. punktā minētajā gadījumā var būt efektīvāk atlikumu pēc filtrēšanas mazgāt ar karstu, nevis aukstu ūdeni. 8.5. Dažiem barības veidiem, iespējams, jāpagarina 1½ stundas žāvēšanas laiks. Nedrīkst pārkaltēt, jo tādējādi var iegūt pazeminātus rezultātus. Žāvēšanai var izmantot arī mikroviļņu krāsni. 8.6. Ja jēleļļu/jēltauku saturs pārsniedz 15 %, tad iesaka veikt iepriekšēju ekstrakciju pirms hidrolīzes, ievērojot A procedūru, un atkārtotu ekstrakciju, ievērojot B procedūru. Zināmā mērā tas ir atkarīgs no barības īpašībām un barībā esošās eļļas/tauku īpašībām. I. JĒLŠĶIEDRAS NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt barībā tādas skābēs un sārmos nešķīstošas organiskās vielas, kas nesatur taukus un ko parasti sauc par jēlšķiedru. 2. Princips Paraugu, ko attiecīgā gadījumā attauko, secīgi apstrādā ar noteiktas koncentrācijas vārošiem sērskābes un kālija hidroksīda šķīdumiem. Atlikumu ar filtrāciju atdala uz keramiskā stikla filtra, nomazgā, izžāvē, nosver un pārpelno temperatūras diapazonā no 475 līdz 500 oC. Svara zudums pārpelnojot atbilst testa parauga jēlšķiedras saturam. 3. Reaģenti 3.1. Sērskābe, c = 0,13 mol/l. 3.2. Pretputošanas viela (piemēram, n-oktanols). 3.3. Filtrēšanas palīgmateriāls (celīts 545 vai līdzvērtīgs), ko četras stundas karsē 500 oC temperatūrā (8.6.). 3.4. Acetons. 3.5. Petrolēteris, viršanas diapazons no 40 līdz 60 oC. 3.6. Sālsskābe, c = 0,5 mol/l. 3.7. Kālija hidroksīda šķīdums, c = 0,23 mol/l. 4. Ierīces 4.1. Karsēšanas vienība šķelšanai ar sērskābi un kālija hidroksīda šķīdumu, kas aprīkota ar pamatni filtrtīģelim (4.2.) un ar izplūdes cauruli ar krānu šķidrumu izplūdei un vakuumsūkni, var būt ar saspiestu gaisu. Pirms izmantošanas katru dienu vienību iepriekš sakarsē ar vārošu ūdeni piecas minūtes. 4.2. Stikla filtrtīģelis ar kausētu keramiskā stikla filtra šķīvi, kura poru lielums ir 40–90 μm. Pirms pirmās izmantošanas dažas minūtes sakarsē līdz 500 oC un atdzesē (8.6.). 4.3. Vismaz 270 ml cilindrs ar atteces kondensatoru, kas piemērots vārīšanai. 4.4. Žāvēšanas skapis ar termostatu. 4.5. Mufeļkrāsns ar termostatu. 4.6. Ekstrakcijas vienība ar pamatni filtrtīģelim (4.2.) un izplūdes cauruli ar vakuuma un šķidruma izplūdes krānu. 4.7. Savienotājgredzeni, lai samontētu karsēšanas vienību (4.1.), tīģeli (4.2.) un cilindru (4.3.) un savienotu auksto ekstrakcijas vienību (4.6.) un tīģeli. 5. Procedūra Ar precizitāti līdz 1 mg iesver 1 g sagatavotā parauga un ievieto to tīģelī (4.2.) (skatīt 8.1., 8.2. un 8.3. novērojumu), un pievieno 1 g filtrēšanas palīgmateriāla (3.3.). Samontē karsēšanas vienību (4.1.) un filtrtīģeli (4.2.), tad tīģeli savieno ar cilindru (4.3.). Ielej 150 ml vārošas sērskābes (3.1.) samontētajā cilindrā un tīģelī un vajadzības gadījumā pievieno dažus pilienus pretputošanas vielas (3.2.). 5 ± 2 minūtēs šķidrumu uzvāra un ļauj enerģiski vārīties precīzi 30 minūtes. Atver izplūdes caurules (4.1.) krānu un vakuumā filtrē sērskābi caur filtrtīģeli, un mazgā atlikumu ar trīs secīgām 30 ml vāroša ūdens devām, nodrošinot, lai atlikums uz filtra pēc katras mazgāšanas tiktu izžāvēts sauss. Aizver izplūdes krānu un ielej 150 ml vāroša kālija hidroksīda šķīduma (3.7.) samontētajā cilindrā un tīģelī, pievienojot dažus pilienus pretputošanas vielas (3.2.). 5 ± 2 minūtēs šķidrumu uzvāra un ļauj enerģiski vārīties precīzi 30 minūtes. Filtrē un atkārto mazgāšanas procedūru, kas izmantota sērskābes posmam. Pēc pēdējās mazgāšanas un žāvēšanas atvieno tīģeli un tā saturu un atkal savieno to ar auksto ekstrakcijas vienību (4.6.). Atlikumu tīģelī mazgā vakuumā ar trīs secīgām 25 ml acetona (3.4.) devām, nodrošinot, lai atlikums uz filtra pēc katras mazgāšanas tiktu izžāvēts sauss. Tīģeli žāvē krāsnī 130 oC temperatūrā līdz konstantam svaram. Pēc katras žāvēšanas atdzesē eksikatorā un ātri nosver. Tīģeli ievieto mufeļkrāsnī un vismaz 30 minūtes 475–500 oC temperatūrā pārpelno līdz konstantam svaram (divu secīgu svērumu svara zuduma starpībai jābūt mazākai par vai vienādai ar 2 mg). Pēc katras karsēšanas un pirms svēršanas vispirms atdzesē krāsnī un tad – eksikatorā. Veic tukšo analīzi bez parauga. Svara zudums pārpelnošanas rezultātā nedrīkst pārsniegt 4 mg. 6. Rezultātu aprēķināšana Jēlšķiedras saturu, izteiktu procentos no parauga, aprēķina, izmantojot šādu formulu: kur: m = parauga svars gramos, m0 = svara zudums gramos pēc pārpelnošanas noteikšanas laikā, m1 = svara zudums gramos pēc pārpelnošanas tukšās analīzes laikā. 7. Atkārtojamība No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt: — 0,6 % no absolūtās vērtības jēlšķiedru saturam, kas mazāks par 10 %, — 6 % no augstākā rezultāta, ja jēlšķiedras saturs ir vienāds ar vai lielāks par 10 %. 8. Novērojumi 8.1. Barība, kas satur vairāk par 10 % jēltauku, pirms analīzes jāattauko ar petrolēteri (3.5.). Filtrtīģeli (4.2.) un tā saturu savieno ar auksto ekstrakcijas vienību (4.6.), un atlikumu mazgā vakuumā ar trīs secīgām 30 ml petrolētera devām, nodrošinot, lai atlikums tiktu izžāvēts sauss. Tīģeli un tā saturu savieno ar karsēšanas vienību (4.1.) un rīkojas, kā aprakstīts 5. punktā. 8.2. Barība, kas satur taukus, kurus nevar ekstrahēt tieši ar petrolēteri (3.5.), jāattauko, kā norādīts 8.1. punktā, un vēlreiz jāattauko pēc vārīšanas ar skābi. Pēc vārīšanas ar skābi un turpmākas mazgāšanas tīģeli un tā saturu savieno ar auksto ekstrakcijas vienību (4.6.) un trīs reizes mazgā ar 30 ml acetona, un tad trīs reizes mazgā ar 30 ml petrolētera devām. Filtrē vakuumā, līdz paraugs ir sauss, un turpina analīzi, kā aprakstīts 5. punktā, vispirms apstrādājot ar kālija hidroksīdu. 8.3. Ja barība satur vairāk par 5 % karbonātu, kas izteikti kā kalcija karbonāts, tad tīģeli (4.2.) ar iesvērto paraugu savieno ar karsēšanas vienību (4.1.). Paraugu trīs reizes mazgā ar 30 ml sālsskābes (3.6.). Pēc katras pievienošanas paraugam ļauj vienu minūti pastāvēt, pirms to filtrē. Mazgā vienu reizi ar 30 ml ūdens, tad rīkojas, kā aprakstīts 5. punktā. 8.4. Ja izmanto stendveida aparātu (vairāki tīģeļi savienoti ar vienu un to pašu karsēšanas vienību), tad vienā seansā nedrīkst veikt divas individuālas noteikšanas ar vienu analīzes paraugu. 8.5. Ja pēc vārīšanas ir grūti filtrēt skābos un sārmainos šķīdumus, tad caur karsēšanas vienības izplūdes cauruli izpūš saspiestu gaisu un tad turpina filtrēšanu. 8.6. Lai pagarinātu stikla filtrtīģeļu kalpošanas laiku, pārpelnošanas temperatūra nepārsniedz 500 oC. Karsēšanas un dzesēšanas ciklos nedrīkst pieļaut pārmērīgas termiskās svārstības. J. CUKU