Oficiālais Vēstnesis L 248 , 30/09/1996 Lpp. 0001 - 0230



Komisijas Direktīva 96/54/EK (1996. gada 30. jūlijs), ar ko divdesmit otro reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu (dokuments attiecas uz EEZ) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes Direktīvu 67/548/EEK (1967. gada 27. jūnijs) par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu [1], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Komisijas Direktīvu 94/69/EK [2], un jo īpaši tās 28. pantu, tā kā Direktīvas 67/548/EEK I pielikumā ir bīstamu vielu saraksts, to klasifikācija, marķējums un attiecīgā gadījumā to raksturojums attiecībā uz robežkoncentrācijām un citiem parametriem, kas ļauj novērtēt to apdraudējumu cilvēku veselībai un videi; tā kā I pielikuma bīstamu vielu saraksts ir jāpielāgo, ņemot vērā pašreizējās zinātnes un tehnikas atziņas; tā kā tādēļ ir jāizdara I pielikuma priekšvārda grozījumi, lai iekļautu piezīmes, kas attiecas uz preparātu marķēšanu, un iekļautu B tabulā jaunu organisko vielu grupu; tā kā I pielikuma bīstamu vielu saraksts satur vielas, attiecībā uz kurām Austrijai un Zviedrijai ar Austrijas, Somijas un Zviedrijas pievienošanās aktu ir piešķirta īpaša pagaidu klasifikācija un atkāpes no marķēšanas; tā kā Pievienošanās akts paredz šo vielu klasifikācijas un marķēšanas prasību pārskatīšanu; tā kā dažu šo vielu klasifikācija ir atbilstīgi pārskatīta; tā kā Direktīvas 67/548/EEK III pielikumā uzskaitīti uzraksti, ar kuriem norāda bīstamo vielu un preparātu radītā īpašā riska veidu; tā kā ir jāievieš uzraksts, kas norāda apdraudējumu veselībai, ieelpojot dažas vielas un preparātus; tā kā Direktīvas 67/548/EEK V pielikumā izklāstītas vielu un preparātu fizikāli ķīmisko īpašību, toksicitātes un ekotoksicitātes noteikšanas metodes; tā kā minētais pielikums ir jāpielāgo tehnikas attīstībai; tā kā Direktīvas 67/548/EEK VI pielikumā ir bīstamu vielu un preparātu klasifikācijas un marķēšanas vispārējie kritēriji; tā kā ir jāievieš kritēriji attiecībā uz vielām un preparātiem, kas ir bīstami veselībai, ja tos ieelpo; tā kā sensibilizējošu vielu un preparātu kritēriji ir jāgroza; tā kā ir jāievieš kritēriji propāna, butāna vai sašķidrinātas naftas gāzes (LPG) tvertņu marķēšanai; tā kā šīs direktīvas noteikumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi Komiteja to direktīvu pielāgošanai tehnikas attīstībai, kuru mērķis ir novērst tehniskus šķēršļus bīstamu vielu un preparātu tirdzniecībā, IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU. 1. pants Direktīvu 67/548/EEK ar šo groza šādi. 1. Direktīvas I pielikumu groza šādi: a) ar šādu tekstu aizstāj priekšvārda 4. piezīmi: "4. piezīme Preparāti, kuros ir šīs vielas, jāklasificē kā kaitīgi ar R65, ja tie atbilst VI pielikuma 3.2.3. iedaļā noteiktajiem kritērijiem."; b) pievieno šādu 5. piezīmi: "5. piezīme Gāzveida preparātu robežkoncentrācijas izsaka tilpuma procentos."; c) Direktīvas 67/548/EEK I pielikuma priekšvārda B tabulā pievieno šādu organisko vielu īpašu klasifikāciju: +++++ TIFF +++++ d) šīs direktīvas I pielikuma ieraksti aizstāj attiecīgos ierakstus; e) šīs direktīvas II pielikuma ierakstus pievieno pirmoreiz; f) ierakstus ar šādiem numuriem svītro: 008-002-00-3 612-045-00-9 648-011-00-5 648-025-00-1 648-157-00-X 648-158-00-5 648-159-00-0 649-192-00-3 g) šīs direktīvas III pielikumā parādītos ierakstus groza, visas norādes uz "R22" aizstājot ar "R65". 2. Direktīvas III pielikumam pievieno šādu uzrakstu: +++++ TIFF +++++ 3. Direktīvas V pielikuma B daļu groza šādi: a) ar šīs direktīvas IV A pielikuma tekstu aizstāj B daļas virsrakstu un vispārējo ievadu: toksicitātes noteikšanas metodes; b) šīs direktīvas IV B pielikuma tekstu ievieto pēc B.1. bis nodaļas; c) ar šīs direktīvas IV C pielikuma tekstu aizstāj B.6. nodaļu; d) ar šīs direktīvas IV D pielikuma tekstu aizstāj B.7. nodaļu; e) šīs direktīvas IV E pielikuma tekstu pievieno beigās. 4. Direktīvas VI pielikumu groza ar šīs direktīvas V pielikuma tekstiem, kā tajā norādīts. 2. pants 1. Neskarot 2. punktu, dalībvalstīs ne vēlāk kā līdz 1998. gada 31. maijam stājas spēkā normatīvie un administratīvie akti, kas vajadzīgi, lai izpildītu šīs direktīvas prasības. Dalībvalstis par to tūlīt informē Komisiju. 2. Ne vēlāk kā līdz 1997. gada 31. oktobrim dalībvalstīs stājas spēkā normatīvie un administratīvie akti, kas vajadzīgi, lai izpildītu šīs direktīvas V pielikuma F, I un J punktus. Dalībvalstis par to tūlīt informē Komisiju. 3. Kad dalībvalstis pieņem noteikumus, kas minēti 1. un 2. punktā, tajos ietver atsauci uz šo direktīvu vai arī šādu atsauci pievieno to oficiālajai publikācijai. Dalībvalstis nosaka šādu atsauču izdarīšanas kārtību. 3. pants Šī direktīva stājas spēkā divdesmitajā dienā pēc publicēšanas Eiropas Kopienu Oficiālajā Vēstnesī. 4. pants Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm. Briselē, 1996. gada 30. jūlijā Komisijas vārdā — Komisijas locekle Ritt Bjerregaard [1] OV L 196, 16.8.1967., 1. lpp. [2] OV L 381, 31.12.1994., 1. lpp. -------------------------------------------------- ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- ANEXO III — BILAG III — ANHANG III — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III — ANNEX III — ANNEXE III — ALLEGATO III — BIJLAGE III — ANEXO III — LIITE III — BILAGA III Index No +++++ TIFF +++++ -------------------------------------------------- IV A PIELIKUMS " B DAĻA: TOKSICITĀTES UN CITU IETEKMJU UZ VESELĪBU NOTEIKŠANAS METODES VISPĀRĒJS IEVADS B DAĻA A. PASKAIDROJUMS Vispārējā ievadā piemēro šādu numerāciju: B.15. Gēnu mutācijas – Saccharomyces cerevisiae B.16. Mitotiskā rekombinācija – Saccharomyces cerevisiae B.17. Zīdītājdzīvnieku izcelsmes šūnu gēnu mutācijas tests in vitro B.18. DNS bojājumi un reparācija – neprogrammēta DNS sintēze – zīdītājdzīvnieku šūnas in vitro B.19. Tests māshromatīdu reciprokās fragmentu apmaiņas noteikšanai in vitro B.20. Ar dzimumu saistīto recesīvo letālo mutāciju tests Drosophila melanogaster B.21. Zīdītājdzīvnieku izcelsmes šūnu transformāciju tests in vitro B.22. Letālo gēnu dominantās iedzimtības tests grauzējiem B.23. Zīdītājdzīvnieku izcelsmes dīgļšūnu citoģenētikas tests in vivo B.24. Peļu embriju in vivo ādas apsārtuma tests B.25. Tests ģenētiski mantojamu translokāciju noteikšanai pelēm B.26. Subhroniskās toksicitātes perorālais tests: 90 dienu vairākkārtējas perorālas devas, izmantojot grauzējus B.27. Subhroniskās toksicitātes perorālais tests: 90 dienu vairākkārtējas perorālas devas, izmantojot dzīvniekus, kas nav grauzēji B.28. Subhroniskās toksicitātes ādas tests 90 dienu vairākkārtējas dermālās devas tests, izmantojot grauzējus B.29. Subhroniskās toksicitātes inhalācijas tests 90 dienu vairākkārtējas inhalācijas devas tests, izmantojot grauzējus B.30. Hroniskās toksicitātes tests B.31. Teratogenitātes tests – grauzēji un dzīvnieki, kas nav grauzēji B.32. Kancerogenitātes tests B.33. Apvienotais hroniskās toksicitātes/kancerogenitātes tests B.34. Reproduktīvās toksicitātes tests vienai pēcnācēju paaudzei B.35. Reproduktīvās toksicitātes tests divām pēcnācēju paaudzēm B.36. Toksikokinētika B. ŠĀ PIELIKUMA TESTA METODĒS LIETOTO TERMINU VISPĀRĒJAS DEFINĪCIJAS i) Akūtā toksicitāte iekļauj kaitīgās ietekmes, kas novērojamas konkrētā laikposmā (parasti 14 dienas) pēc vielas vienas devas ievadīšanas. ii) Izteikta toksicitāte ir vispārīgs termins, kas apraksta skaidri redzamas toksicitātes pazīmes pēc testa vielas ievadīšanas. Tām jābūt pietiekamām, lai novērtētu bīstamību, un tām jābūt tādām, lai, palielinot ievadāmo devu, būtu sagaidāma smagu toksicitātes pazīmju izveidošanās un iespējama mirstība. iii) Deva ir ievadītās testa vielas daudzums. Devu izsaka kā svaru (gramos vai miligramos) vai kā testa vielas svaru uz testa dzīvnieka svara vienību (t.i., miligramos uz ķermeņa svara kilogramu), vai kā nemainīgu koncentrāciju dietā (miljonās daļās vai miligramos uz kilogramu barības). iv) Kritiskā deva ir lielākā no četrām fiksētajām devām, ko var ievadīt, neizraisot ar vielu saistītu mirstību (iekļaujot humānu nogalināšanu). v) Dozēšana ir vispārīgs termins, kas iekļauj devu, tās biežumu un ievadīšanas ilgumu. vi) LD50 (vidējā letālā deva) ir statistiski iegūta viena vielas deva, kas var izraisīt nobeigšanos 50 % no devu saņēmušiem dzīvniekiem. LD50 lielumu izsaka kā testa vielas svaru uz testa dzīvnieka svara vienību (miligramos uz kilogramu). vii) LC50 (vidējā letālā koncentrācija) ir statistiski iegūta vielas koncentrācija, kas iedarbības laikā vai noteiktā laikā pēc iedarbības var izraisīt nobeigšanos 50 % no noteiktajā laikā iedarbībai pakļautajiem dzīvniekiem. LC50 lielumu izsaka kā testa vielas svaru gaisa standarttilpumā (miligramos uz litru). viii) NOAEL ir saīsinājums no "no observed adverse effect level" (līmenis, pie kura nav novērojama negatīva ietekme), un tas ir lielākais devas vai iedarbības līmenis, pie kura nav novērojami ar vielas ievadīšanu saistīti negatīvi rezultāti. ix) Vairākkārtējās devas toksicitāte/subhroniskā toksicitāte iekļauj negatīvo ietekmi, kas novērojama, ja eksperimenta dzīvniekus neilgu laiku no dzīvnieka sagaidāmā mūža ilguma pakļauj atkārtotai ikdienas dozēšanai vai ķīmiskas vielas iedarbībai. x) Maksimālā panesamā deva(MTD ir augstākais devas līmenis, kas dzīvniekiem izraisa toksicitātes pazīmes, neradot būtisku ietekmi uz izdzīvošanu saistībā ar testu, kurā šī deva lietota. xi) Ādas kairinājums ir iekaisuma radītas pārmaiņas ādā pēc testa vielas pielietošanas. xii) Acu kairinājums ir pārmaiņas acīs pēc testa vielas pielietošanas uz acu priekšējās daļas. xiii) Ādas sensibilizācija (alerģiskais kontaktdermatīts) ir imunoloģiski nosacīta ādas reakcija uz vielu. xiv) Ādas korozija ir neatgriezenisks ādas audu bojājums pēc testa vielas pielietošanas laika posmā no 3 minūtēm līdz 4 stundām. xv) Toksikokinētika ir testa vielu absorbcijas, sadalīšanās, metabolisma un ekskrēcijas pētniecība. xvi) Absorbcija ir process(-i), kurā(-os) ievadāmā viela iekļūst organismā. xvii) Ekskrēcija ir process(-i), kurā(-os) ievadītā viela un/vai tās metabolīti tiek izvadīti no organisma. xviii) Sadalīšanās ir process(-i), kurā(-os) absorbētā viela un/vai tās metabolīti sadalās pa organismu. xix) Metabolisms ir process(-i), kurā(-os) fermentatīvās vai nefermentatīvās reakcijās mainās organismā ievadīto vielu struktūra. B. I Akūtā toksicitāte – vairākkārtējās devas/subhroniskā un hroniskā toksicitāte Vielas akūtās toksiskās ietekmes un toksicitāti uz orgānu vai sistēmu var novērtēt, izmantojot dažādus toksicitātes testus (B.1. līdz B.5. metode), no kuriem pēc vienas devas var iegūt provizorisku norādi par toksicitāti. Atkarībā no vielas toksicitātes var apsvērt pieļaujamā daudzuma testa pieeju vai pilnīgu LD50 noteikšanu, kaut arī ieelpošanas pētījumos nav precizēti pieļaujamā daudzuma testi, jo nav bijis iespējams definēt vienu robežlielumu iedarbībai ieelpojot. Ir jāvelta vērība metodēm, kas izmanto iespējami maz dzīvnieku un, cik iespējams, samazina dzīvnieku ciešanas, piemēram, nemainīgās devas metode (B.I bis metode) un akūtās toksiskās devas metode ( B.I tris metode). Pirmā līmeņa testos pirmajā testā iegūtos slēdzienus var papildināt tests, izmantojot otru sugu. Tādā gadījumā var izmantot standarttesta metodi vai metodi pielāgot mazākam dzīvnieku skaitam. Vairākkārtējās devas toksicitātes tests (B.7., B.8. un B.9. metode) iekļauj no atkārtotas iedarbības radušos toksisko ietekmju vērtējumu. Ir jāuzsver vajadzība izdarīt rūpīgus klīniskos novērojumus, lai iegūtu iespējami daudz informācijas. Šiem testiem jāpalīdz noskaidrot toksicitātes mērķa orgāni un toksiskās un netoksiskās devas. Turpmāka šo aspektu padziļināta izpēte var būt vajadzīga ilgtermiņa testos (B.26. līdz B.30. un B.33. metode). B. II Mutagenitāte – genotoksicitāte Mutagenitāte attiecas uz nepārejošu pārmantojamu izmaiņu izraisīšanu šūnu vai organismu ģenētiskā materiāla daudzumā vai uzbūvē. Šīs izmaiņas, "mutācijas", var iekļaut atsevišķu gēnu vai gēna segmentu, gēnu bloku vai veselas hromosomas. Ietekmes uz veselām hromosomām var būt strukturālas un/vai skaitliskas. Vielas mutagēno aktivitāti novērtē baktēriju gēnu mutāciju (punktmutāciju) in vitro mēģinājumos (B.13./14. metode) un/vai zīdītājdzīvnieku šūnu hromosomu strukturālo aberāciju testos (B.10. metode). Pieņemamas ir arī in vivo procedūras, piem., mikrokodolu tests (B.12. metode) vai kaulu smadzeņu šūnu metafāzu analīze (B.11. metode). Tomēr, ja nav kontrindikāciju, in vitro metodēm noteikti jādod priekšroka. Lielāku ražošanas apjomu gadījumā un/vai lai veiktu riska novērtējumu vai tā pārbaudes var būt vajadzīgi papildu pētījumi, lai vairāk izpētītu mutagenitāti vai lai izdarītu kancerogenitātes pirmsskrīninga testu, un šos pētījumus var izmantot vairākiem nolūkiem: lai apstiprinātu pamatpētījumā iegūtos rezultātus; lai izpētītu pamatpētījumā nepētītos beigu punktus; lai uzsāktu vai paplašinātu in vivo pētījumus. Šajā nolūkā B.15. līdz B.25. metode iekļauj gan in vivo, gan in vitro eikariotu sistēmas un bioloģisko beigu punktu paplašinātu diapazonu. Šie testi sniedz informāciju par punktmutācijām un citiem beigu punktiem organismos, kas ir sarežģītāki par pamatpētījumā izmantotajām baktērijām. Vispārējs princips ir, ka, apsverot turpmāku mutagenitātes pētījumu programmu, tā jāizveido tā, lai sniegtu attiecīgu papildu informāciju par vielas mutagēno un/vai kancerogēno potenciālu. Kādi pētījumi ir lietderīgi konkrētā gadījumā, to nosaka vairāki faktori, kas iekļauj vielas raksturīgās ķīmiskās un fizikālās īpašības, sākotnējo bakteriālo un citoģenētisko mēģinājumu rezultātus, vielas metabolisma profilu, citu toksicitātes pētījumu rezultātus un zināmos vielas izmantošanas veidus. Stingrs saraksts testu izvēlei tādēļ ir nepiemērots, ievērojot, ka var būt nepieciešams ņemt vērā dažādus faktorus. Daži testēšanas stratēģijas vispārējie principi ir noteikti Direktīvā 93/67/EEK, bet skaidra testēšanas stratēģija ir atrodama Riska novērtēšanas tehnisko norādījumu dokumentā, kas tomēr ir elastīgs un pēc vajadzības pielāgojams konkrētiem apstākļiem. Turpmāku pētījumu metodes tomēr ir sagrupētas šādi, pamatojoties uz to galveno ģenētisko beigu punktu: Pētījumi gēnu mutāciju (punktmutāciju) noskaidrošanai a) Tiešo vai atgriezenisko mutāciju pētījumi, izmantojot eikarotiskus mikroorganismus (Saccharomyces cerevisiae) (B.15. metode) b) In vitro pētījumi tiešo mutāciju noskaidrošanai zīdītājdzīvnieku šūnās (B.17. metode) c) Ar dzimumu saistītas recesīvas letalitātes pētījums ar Drosophila melanogaster (B.20. metode) d) Somatisko šūnu mutāciju in vivo tests, peļu embriju in vivo ādas apsārtuma tests (B.24. metode) Pētījumi hromosomu aberācijas noskaidrošanai a) Zīdītājdzīvnieku citoģenētiskie pētījumi in vivo; Jāapsver kaulu smadzeņu šūnu metafāzu analīze in vivo, ja tā nav iekļauta sākotnējā pētījumā (B.11. metode). Turklāt var citoģenētiski izpētīt dīgļa šūnas in vivo (B.23. metode). b) Zīdītājdzīvnieku šūnu citoģenētiskie pētījumi in vitro, ja tie nav iekļauti sākotnējā pētījumā (B.10. metode). c) Dominantas letalitātes pētījumi žurkām (B.22. metode). d) Tests ģenētiski pārmantojamu translokāciju noteikšanai pelēm (B.25. metode) Genotoksiskās ietekmes – ietekmes uz DNS Uz genotoksicitāti, par ko liecina tāda potenciāli kaitīga ietekme uz ģenētisko materiālu, kura nav obligāti saistīta ar mutagenitāti, var norādīt inducēti DNS bojājumi bez tiešiem pierādījumiem par mutācijām. Šādam pētījumam var būt piemērotas šādas metodes, kas izmanto eikariotiskus mikroorganismus vai zīdītājdzīvnieku šūnas: a) mitotiskas rekombinācijas saccharomyces cerevisiae;(B.16. metode) b) DNS bojājumi un izlabošana – neprogrammēta DNS sintēze – zīdītājdzīvnieku šūnas – in vitro;(B.18. metode) c) māshromatīdu apmaiņa zīdītājdzīvnieku šūnās – in vitro;(B.19. metode) Alternatīvas kancerogēnā potenciāla pētīšanas metodes Ir pieejami zīdītājdzīvnieku šūnu transformācijas testi, kuros mēra vielas spēju inducēt šūnu kultūrās morfoloģiskas un izturēšanās izmaiņas, kas, domājams, ir saistītas ar malignizāciju – in vivo, (B.21. metode). Transformācijām var izmantot daudzus dažādu šūnu veidus un kritērijus. Pārmantojamu ietekmju riska novērtējums zīdītājdzīvniekiem Ir pieejamas metodes, lai veseliem zīdītājdzīvniekiem pētītu pārmantojamas ietekmes, ko izraisījušas gēnu mutācijas (punktmutācijas), piem., tests peļu specifisku lokusu noteikšanai, lai noteiktu dīgļa šūnu mutācijas pirmajā paaudzē (nav iekļauts šajā pielikumā) vai hromosomu aberācijas, piem., peļu pārmantojamo translokāciju tests (B.25. metode). Šādas metodes var izmantot, novērtējot vielas iespējamo ģenētisko risku cilvēkam. Tomēr, ņemot vērā šiem testiem raksturīgo sarežģītību un vajadzīgo dzīvnieku ļoti lielo skaitu, jo īpaši specifiskā lokusa testā, pirms šo pētījumu uzsākšanas ir vajadzīgs stingrs pamatojums. B. III Kancerogenitāte Ķīmiskās vielas var raksturot kā genotoksiskus vai negenotoksiskus kancerogēnus atkarībā no domājamā darbības mehānisma. Pirmsskrīninga informāciju par vielas genotoksisko potenciālu var iegūt no mutagenitātes/genotoksicitātes pētījumiem. Papildu informāciju var iegūt no vairākkārtējās devas, subhroniskās vai hroniskās toksicitātes testiem. Vairākkārtējās devas toksicitātes tests, B.7. metode, un ilgāki vairākkārtējās devas pētījumi iekļauj vērtējumu par histopatoloģiskajām izmaiņām, kas novērotas vairākkārtējās devas toksicitātes testos, piem., par dažu audu hiperplāziju, kas var būt nozīmīga. Šie pētījumi un toksikokinētiskā informācija var palīdzēt identificēt ķīmiskās vielas ar kancerogēnu potenciālu, kurām šajā aspektā var būt vajadzīgi padziļināti pētījumi kancerogenitātes testā (B.32. metode) vai bieži apvienotā hroniskās toksicitātes/kancerogenitātes pētījumā (B.33. metode) B. IV Reproduktīvā toksicitāte Reproduktīvo toksicitāti var noteikt dažādi, piem., kā vīriešu dzimuma dzīvnieku un sieviešu dzimuma dzīvnieku reproduktīvo funkciju vai reproduktīvās spējas traucējumus, ko identificē kā "ietekmi uz auglību", vai kā nepārmantojamu kaitīgu ietekmju izraisīšanu pēcnācējiem, ko identificē kā "toksicitāti, kas ietekmē attīstību", kur ir iekļauta arī teratogenitāte un ietekmes laktācijas laikā. Teratogenitātes pētījumos, kas ir daļa no attīstības toksicitātes pētījumiem, testa metode (B.31. metode) galvenokārt attiecas uz perorālu ievadīšanu. Alternatīvi var izmantot citus ievadīšanas veidus atkarībā no testa vielas fizikālajām īpašībām vai izmantot ievadīšanas veidu, kas līdzīgs iedarbības veidam uz cilvēku. Tādos gadījumos testa metode ir attiecīgi jāpielāgo, ņemot vērā 28 dienu testa metožu atbilstīgos elementus. Ja ir vajadzīgs triju paaudžu reproduktivitātes (auglības) tests, aprakstīto divu paaudžu reproduktivitātes testa metodi (B.35. metode) var paplašināt, lai tā ietvertu trešo paaudzi. B.V Neirotoksicitāte Neirotoksicitāti var noteikt dažādos veidos, piem., kā funkcionālas izmaiņas un/vai strukturālas un bioķīmiskas izmaiņas centrālajā vai perifērajā nervu sistēmā. Provizoriskas norādes par neirotoksicitāti var iegūt no akūtās toksicitātes testiem. Vairākkārtējās devas toksicitātes tests (B.7. metode) iekļauj neirotoksikoloģisko ietekmju novērtējumu, un ir jāuzsver, ka, lai iegūtu iespējami daudz informācijas, ir jāizdara rūpīga dzīvnieku klīniskā novērošana. Metodei jāpalīdz identificēt potenciāli neirotoksiskas ķīmiskas vielas, kuras šajā ziņā var vajadzēt turpmāk izpētīt padziļināti. Turklāt ir svarīgi apsvērt vielu spēju izraisīt specifiskas neirotoksiskas ietekmes, kas varbūt nav nosakāmas citos toksicitātes pētījumos. Piemēram, ir novērots, ka dažas fosfororganiskās vielas izraisa aizkavētu neirotoksicitāti, ko var novērtēt ar B.37. un B.38. metodi, izmantojot vienas devas vai vairākkārtēju devu iedarbību. B.VI Imunotoksicitāte Imunotoksicitāti var noteikt dažādos veidos, piem., kā imūnsistēmas atbildes reakcijas apspiešanu un/vai pastiprināšanu, kas izraisa hiperjutību vai inducēto autoimunitāti. Vairākkārtējās devas toksicitātes tests, B.7. metode, iekļauj imunotoksisko ietekmju novērtēšanu. Metodei jāpalīdz identificēt potenciāli imunotoksiskas ķīmiskas vielas, kuras šajā ziņā var vajadzēt turpmāk izpētīt padziļināti. B.VII Toksikokinētika Toksicitātes datu interpretācijā un novērtēšanā palīdz toksikokinētikas pētījumi. Šie pētījumi ir paredzēti, lai izskaidrotu testējamās ķīmiskās vielas toksicitātes konkrētus aspektus, un rezultāti var palīdzēt plānot turpmākos toksicitātes pētījumus. Nav paredzēts, ka katrā gadījumā būs jānosaka visi parametri. Vienīgi retos gadījumos būs vajadzīga visa toksikokinētisko pētījumu secība (absorbcija, ekskrēcija, sadalīšanās un metabolisms). Attiecībā uz dažiem savienojumiem var būt ieteicams šo secību mainīt vai arī var būt pietiekams vienas devas pētījums (B.36. metode). Par absorbcijas raksturīgajām īpašībām pie paredzētā ievadīšanas veida un par metabolisma un sadalījuma audos iespējām norādi var sniegt arī informācija par ķīmisko struktūru (SAR) un fizikāli ķīmiskajām īpašībām. Informācija par toksikokinētiskajiem parametriem var būt arī no iepriekšējiem toksicitātes un toksikokinētikas pētījumiem. C. TESTA VIELAS RAKSTUROJUMS Pirms toksicitātes pētījuma uzsākšanas ir jābūt zināmai testa vielas uzbūvei, iekļaujot galvenos piemaisījumus, un tās attiecīgajām fizikāli ķīmiskajām īpašībām, iekļaujot stabilitāti. Testa vielas fizikāli ķīmiskās īpašības sniedz svarīgu informāciju, lai izvēlētos ievadīšanas veidu, katra konkrēta pētījuma plānu un veidu, kā rīkoties ar testa vielu un kā to glabāt. Pirms pētījuma uzsākšanas jāizveido analītiskā metode testa vielas kvantitatīvai un kvalitatīvai noteikšanai (ja iespējams, iekļaujot galvenos piemaisījumus) dozēšanas vidē un bioloģiskajā materiālā. Visa informācija, kas attiecas uz testa vielas identifikāciju, fizikāli ķīmiskajām īpašībām, tīrību un izturēšanos, ir jāiekļauj testa ziņojumā. D. DZĪVNIEKU KOPŠANA Toksicitātes testos būtiski svarīga ir stingra vides apstākļu kontrole un pareiza dzīvnieku kopšanas tehnika. i) Turēšanas apstākļi Vides apstākļiem eksperimenta dzīvnieku telpās vai iežogojumos ir jābūt testa dzīvniekiem piemērotiem. Žurkām, pelēm un jūrascūciņām piemēroti apstākļi ir telpas temperatūra 22 °C ± 3 °C ar relatīvo mitrumu 30 līdz 70 %; trušiem temperatūrai jābūt 20 °C ± 3 °C ar relatīvo mitrumu 30 līdz 70 %. Dažas eksperimenta metodes ir īpaši jutīgas pret temperatūras ietekmi, un tādos gadījumos datus par attiecīgajiem apstākļiem iekļauj testa metodes aprakstā. Visos toksisko ietekmju pētījumos temperatūra un mitrums ir jākontrolē, jāreģistrē un jāiekļauj pētījuma gala ziņojumā. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Sīkas ziņas par apgaismojuma apstākļiem ir jāreģistrē un jāiekļauj pētījuma gala ziņojumā. Ja metodē nav noteikts citādi, dzīvniekus var turēt atsevišķi vai turēt būros nelielās viena dzimuma grupās; turot grupās, vienā būri nedrīkst ievietot vairāk par pieciem dzīvniekiem. Ziņojumos par eksperimentiem ar dzīvniekiem ir svarīgi norādīt izmantoto būros turēšanas veidu un katrā būrī ievietoto dzīvnieku skaitu gan ķīmiskās vielas iedarbības laikā, gan arī katrā turpmākajā novērošanas laikposmā. ii) Barošanas apstākļi Diētai ir jāatbilst visām testējamās sugas vajadzībām attiecībā uz barību. Ja testa vielas dzīvniekiem ievada ar diētu, uzturvērtība var samazināties vielas un diētas sastāvdaļas savstarpējā iedarbībā. Šādas reakcijas iespēja ir jāņem vērā, interpretējot testu rezultātus. Var izmantot parastās laboratorijas diētas ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Diētas izvēli var ietekmēt vajadzība nodrošināt piemērotu testa vielas piejaukšanu, ja vielu ievada ar šo metodi. Diētas piesārņotāji, par kuriem ir zināms, ka tie ietekmē toksicitāti, nedrīkst būt klāt iedarbīgās koncentrācijās. E. DZĪVNIEKU LABTURĪBA Izstrādājot testu metodes, pienācīga vērība ir piegriezta dzīvnieku labturībai. Turpmāk ir doti daži piemēri, bet saraksts nav pilnīgs. Precīzs formulējums un/vai apstākļi ir jāmin metožu tekstos. - Akūtās orālās toksicitātes noteikšanai ir jāapsver divas alternatīvas metodes, "Nemainīgās devas metode" un "Akūtās toksiskās devas metode". "Nemainīgās devas metode" neizmanto nobeigšanos kā īpašu beigu punktu un izmanto mazāk dzīvnieku. "Akūtās toksiskās devas metode" izmanto akūtās orālās toksicitātes noteikšanai vidēji par 70 % mazāk dzīvnieku nekā B.1. metode. Abas šīs alternatīvās metodes izraisa mazāk sāpju un stresa nekā klasiskā metodoloģija. - Izmantojamo dzīvnieku skaitu samazina līdz zinātniski pieņemamam minimumam: izmantojot B.1. un B.3. metodi, uz devas līmeni izmanto tikai 5 viena un tā paša dzimuma dzīvniekus; tikai 10 dzīvniekus (un negatīvās kontroles grupā tikai 5) izmanto, lai noteiktu ādas sensibilizāciju ar maksimizācijas testu jūrascūciņām (B.6. metode); ir samazināts arī pozitīvajai kontrolei vajadzīgais dzīvnieku skaits mutagenitātes testā in vivo (B.11. un B.12. metode). - Dzīvnieku sāpes un briesmu sajūtas testa laikā iespējami samazina: dzīvniekus, kas uzrāda smagas un ilgstošas briesmu sajūtu un sāpju pazīmes, varbūt humāni jānogalina; testa vielu dozēšana nav jāizdara veidā, par ko ir zināms, ka tas izraisa izteiktas sāpes un briesmu sajūtas kodīgo un kairinošo īpašību dēļ (B.1., B.2. un B.3. metode). - No testēšanas ar neatbilstīgi lielām devām izvairās, ieviešot pieļaujamā daudzuma testus ne tikai akūtās toksicitātes testos (B.1., B.2. un B.3. metode), bet arī in vivo mutagenitātes testos (B.11. un B.12. metode). - Kairinošo īpašību testēšanas stratēģija tagad ļauj testu neizdarīt vai to samazināt līdz viena dzīvnieka pētījumam, ja var nodrošināt pietiekamus zinātniskos pierādījumus. Šādi zinātniskie pierādījumi var pamatoties uz vielas fizikāli ķīmiskajām īpašībām, citu jau veikto testu rezultātiem vai labi novērtētiem in vitro testiem. Piemēram, ja ar vielu ir izdarīts akūtās toksicitātes pētījums, izmantojot pieļaujamā daudzuma testa devas dermālo ievadīšanas veidu (B.3. metode), un ja ādas kairinājums nav novērots, turpmāka ādas kairinājuma testēšana (B.4. metode) var nebūt vajadzīga; materiāli, kas dermālā kairinājuma pētījumā ir uzrādījuši izteikti kodīgu vai smagu ādas kairinājumu (B.4. metode), nav turpmāk jāpārbauda acu kairinājuma testā (B.5. metode). F. ALTERNATĪVA TESTĒŠANA Eiropas Savienības zinātniskais mērķis ir izveidot un apstiprināt alternatīvas metodes, kas var sniegt to pašu informācijas līmeni kā pašreizējie testi ar dzīvniekiem, bet kas izmanto mazāk dzīvnieku, izraisa mazāk ciešanu vai pilnīgi izvairās izmantot dzīvniekus. Tādas metodes, kad tās kļūst pieejamas, jāņem vērā, kur vien iespējams, lai raksturotu bīstamību un izdarītu piemītošās bīstamības klasifikāciju un marķēšanu. G. NOVĒRTĒŠANA UN INTERPRETĀCIJA Novērtējot un interpretējot testus, ir jāņem vērā ierobežojumi, kādā mērā pētījumus ar dzīvniekiem un in vitro pētījumus var tieši ekstrapolēt uz cilvēku, un tādēļ pierādījumus par kaitīgu ietekmi uz cilvēkiem, ja pierādījumi ir pieejami, var izmantot testēšanas rezultātu apstiprināšanai. Šos rezultātus var izmantot, lai klasificētu un marķētu jaunas un pastāvošas ķīmiskas vielas attiecībā uz cilvēka veselības ietekmēšanu, pamatojoties uz raksturīgajām īpašībām, kas identificētas un kvantitatīvi noteiktas ar šīm metodēm. Atbilstīgie VI pielikuma klasificēšanas un marķēšanas kritēriji attiecas arī uz šajās testēšanas metodēs iekļauto testa protokolu beigu punktiem. Šos rezultātus var arī izmantot jaunu un pastāvošu vielu riska novērtēšanas pētījumos, un attiecīgajos pamatnostādņu dokumentos ir norādītas šiem mērķiem piemērotas testēšanas stratēģijas. H. LITERATŪRAS NORĀDES Vairums šo metožu ir izveidotas ESAO testēšanas pamatnostādņu programmas satvarā, un tās ir jāveic atbilstīgi Labas laboratorijas prakses principiem, lai iespējami plaši nodrošinātu "datu savstarpējo atzīšanu". Papildu informācija ir atrodama ESAO pamatnostādnēs un citur publicētā attiecīgā literatūrā. " -------------------------------------------------- IV B PIELIKUMS " B.1 tris AKŪTĀS (ORĀLĀS) TOKSICITĀTE – AKŪTĀS TOKSISKĀS DEVAS METODE 1. METODE 1.1. Ievads Akūtās toksiskās devas metode sniedz informāciju bīstamības novērtēšanai un bīstamības klasificēšanai. Metode izmanto trīs nemainīgas devas, kas ir pietiekami atšķirīgas, lai vielu varētu klasificēt, pamatojoties uz pētījuma rezultātiem. Turklāt šajā testa metodē aprakstītā procedūra ļauj izvēlēties trīs papildu nemainīgās devas, ko var izmantot kā alternatīvu izvēli noteiktos lēmumu posmos vai kā izvēli turpmākajā testēšanā. Papildu devu (vai kādas no papildu devām) lietošanu var apsvērt, ja ir vēlama vai nepieciešama turpmāka precizēšana. Metodē izmanto noteiktas sākuma devas, un tā nav paredzēta precīzai LD50 aprēķināšanai, bet ļauj noteikt iedarbības diapazonu, kurā ir sagaidāma letalitāte, jo šā testa galvenais beigu punkts ir daļas no dzīvniekiem nobeigšanās. Testa rezultātiem jādod iespēja izdarīt klasifikāciju saskaņā ar VI pielikuma kritērijiem. Tā kā pieejas būtība ir secīga noteikšana, tests var būt ilgāks nekā B.1. metodē aprakstītā procedūra. Šīs metodes galvenā priekšrocība ir tā, ka tai vajadzīgs mazāks dzīvnieku skaits nekā akūtās (orālās) toksicitātes (B.1) metodei un alternatīvajai nemainīgās devas metodei (B.1 bis). Skatīt arī Vispārējā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Skatīt Vispārējā ievada B daļu. 1.3. Testa metodes princips Vielu eksperimenta dzīvnieku grupai ievada perorāli vienā no noteiktajām devām. Vielu testē, izmantojot posmveida procedūru, katrā posmā izmanto trīs viena dzimuma dzīvniekus. Iepriekšējs diapazona atrašanas pētījums nav vajadzīgs. Ar vielu saistītas mirstības pastāvēšana vai nepastāvēšana vienā posmā devu saņēmušajiem dzīvniekiem noteiks nākošo posmu, t.i.: - turpmāka testēšana nav vajadzīga, - nākošo posmu veiks ar to pašu devu, bet ar otra dzimuma dzīvniekiem, - nākošo posmu veiks ar nākošo lielāko vai ar nākošo mazāko devas līmeni. 1.4. Testa metodes apraksts 1.4.1. Sagatavošanās Veselus, pieaugušus, jaunus dzīvniekus izvēlas pēc nejaušās izvēles, marķē individuālai identificēšanai un tur būros vismaz 5 dienas pirms testa sākuma, lai aklimatizētu laboratorijas apstākļos. Dzīvniekus būros var turēt grupās atbilstoši dzimumam un devai, bet dzīvnieku skaits uz būri nedrīkst traucēt katra dzīvnieka labu novērošanu. Testa vielu dzīvniekiem ievada vienā devā, mākslīgi barojot, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanālu. Vajadzības gadījumā testa vielu izšķīdina vai suspendē piemērotā nesējā. Ir ieteicams, ja tas iespējams, vispirms apsvērt ūdens šķīduma/suspensijas lietošanu, pēc tam apsvērt eļļas (piem., kukurūzas eļļas) šķīduma/emulsijas lietošanu un pēc tam iespējamu šķīdināšanu citos nesējos. Ir jāzina neūdens nesēju toksiskās īpašības un, ja tās nav zināmas, tad jānosaka pirms testa. Dzīvniekiem pirms dozēšanas nav jādod barība (piem., žurkām uz nakti vai pelēm 3-4 stundas); ūdens ir jādod. 1.4.2. Testa apstākļi 1.4.2.1. Testa dzīvnieki Ja nav kontrindikāciju, vēlamā grauzēju suga ir žurka. Mātītēm jābūt nedzemdējušām un negrūsnām. Pētījuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām, un tās nedrīkstētu pārsniegt ± 20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi. 1.4.2.2. Skaits un dzimums Katrā posmā izmanto trīs viena dzimuma dzīvniekus. Sākotnējā posmā var izmantot jebkura dzimuma dzīvniekus. 1.4.2.3. Devu līmeņi Devas līmeni, ko izmanto kā sākuma devu, izvēlas kā vienu no trim līmeņiem, t.i., 25, 200 un 2000 mg/kg ķermeņa svara. Sākotnējam devas līmenim jābūt tādam, kas, ļoti ticams, izraisīs vismaz dažu devu saņēmušo dzīvnieku mirstību. Atkarībā no sākotnējās devas var izmantot vienu no procedūru blokshēmām, kas aprakstītas 1. pielikumā. Lai izvēlētos dzimumu un sākotnējo devu, ir jāizmanto visa pieejamā informācija, iekļaujot informāciju par struktūras un aktivitātes sakarībām. Ja informācija liek domāt, ka pie lielākā devas līmeņa (2000 mg/kg ķermeņa svara) mirstība ir mazvarbūtīga, tad ir jāizdara pieļaujamā daudzuma tests. Ja par testējamo vielu nav informācijas, dzīvnieku labturības dēļ ir ieteicams izmantot sākotnējo devu 200 mg/kg ķermeņa svara. Dažkārt var būt vēlams precizēt informāciju vairāk, nekā ir iespējams pēc testa izdarīšanas ar trim nemainīgiem devas līmeņiem 25, 200 un 2000 mg/kg ķermeņa svara. Tādos gadījumos var apsvērt turpmāku testēšanu ar papildu nemainīgo devu līmeņiem 5, 50 vai 500 mg/kg ķermeņa svara. Devas, par kurām ir zināms, ka tās izraisa izteiktas sāpju un briesmu sajūtas kodīgo vai stipri kairinošo īpašību dēļ, nav jāievada. Laika intervālu starp vielas ievadīšanām grupām nosaka atkarībā no toksicitātes pazīmju parādīšanās, ilguma un smaguma. Vielas ievadīšana otra dzimuma dzīvniekiem vai nākošās devas ievadīšana ir jāatliek, līdz rodas pārliecība par iepriekš devu saņēmušo dzīvnieku izdzīvošanu. 1.4.2.4. Pieļaujamā daudzuma tests Pieļaujamā daudzuma testu pie viena devas līmeņa 2000 mg/kg ķermeņa svara var izdarīt ar trim katra dzimuma dzīvniekiem. Ja rodas ar vielu saistīta mirstība, var būt vajadzīga turpmāka testēšana ar devu 200 mg/kg (vai 500 mg/kg) ķermeņa svara. 1.4.2.5. Novērošanas laikposms Dzīvnieki parasti jānovēro 14 dienas, izņemot gadījumu, ja dzīvnieki ir jāizņem no pētījuma un humāni jānogalina dzīvnieku labturības iemeslu dēļ vai ja tie ir atrasti miruši. Tomēr novērošanas ilgums nav stingri jānosaka. Tas ir jānosaka no toksicitātes reakcijām, to parādīšanās laika un atveseļošanās ilguma, un tādēļ ilgumu var pagarināt, ja uzskata par vajadzīgu. Laiki, kad parādās un izzūd toksicitātes pazīmes, ir svarīgi, īpaši ja toksicitātes pazīmēm ir tendence aizkavēties. Visus novērojumus sistemātiski protokolē, par katru dzīvnieku izdarot individuālus pierakstus. 1.4.3. Procedūra Pēc barības nesaņemšanas laikposma dzīvnieki jānosver pirms testa vielas ievadīšanas. Pēc testa vielas ievadīšanas barību var nedot vēl 3-4 stundas. Ja devu ievada pa daļām laikposmā, var būt nepieciešams dzīvniekiem dot barību un ūdeni atkarībā no laikposma ilguma. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no izmēģinājumu dzīvnieka lieluma. Žurkām tilpumam parasti nav jāpārsniedz 1 ml/100 g ķermeņa svara; tomēr ūdens šķīdumu gadījumā var apsvērt 2 ml/100 g ķermeņa svara. Testa tilpuma izmaiņas ir jāsamazina līdz minimumam, pielāgojot koncentrāciju, lai nodrošinātu nemainīgu tilpumu pie visiem devu līmeņiem. Ja viena deva nav iespējama, devu var dot mazākās daļās laika posmā, kas nepārsniedz 24 stundas. Testa procedūra sīkāk ir aprakstīta 1. pielikumā. 1.4.3.1. Vispārēji novērojumi Rūpīgi klīniskie novērojumi dozēšanas dienā ir jāizdara vismaz divreiz vai biežāk, ja to norāda dzīvnieku atbildes reakcija uz devas ievadīšanu, un pēc tam vismaz vienreiz dienā. Visi mirstošie dzīvnieki un dzīvnieki, kas izrāda lielu sāpju un ilgstošu briesmu sajūtu pazīmes, ir humāni jānogalina. Dzīvniekus, kas nogalināti humānu iemeslu dēļ, uzskata par tādiem pašiem kā dzīvniekus, kas miruši testā. Ja dzīvnieki ir nogalināti humānu iemeslu dēļ vai atrasti miruši, iespējami precīzi ir jāprotokolē nobeigšanās laiks. Ja dzīvnieki turpina uzrādīt toksicitātes pazīmes, ir vajadzīgi papildu novērojumi. Novērojumos ir jāiekļauj ādas un apmatojuma, acu un gļotādu un arī elpošanas, asinsrites, veģetatīvās un centrālās nervu sistēmas un somatomotorās aktivitātes un izturēšanās veida izmaiņas. Uzmanība jāpievērš drebuļu, krampju, siekalošanās, caurejas, letarģijas, miega un komas novērojumiem. Visus novērojumus sistemātiski protokolē, par katru dzīvnieku izdarot individuālus pierakstus. 1.4.3.2. Ķermeņa svars Visi dzīvnieki jānosver īsu laiku pirms testa vielas ievadīšanas un pēc tam vismaz reizi nedēļā. Svara izmaiņas ir jāaprēķina un jāprotokolē. Testa beigās pirms humānas nogalināšanas izdzīvojušos dzīvniekus nosver. 1.4.3.3. Autopsija Visiem testa dzīvniekiem, iekļaujot tos, kas miruši testa laikā vai ir izņemti no pētījuma, izdara autopsiju. Katram dzīvniekam protokolē visas makroskopiskās patoloģiskās izmaiņas. Var apsvērt arī orgānu, kuros parādās makroskopiskās patoloģijas pierādījumi, mikroskopisko apskati dzīvniekiem, kas izdzīvojuši 24 stundas vai ilgāk, jo tāda apskate var sniegt noderīgu informāciju. 2. DATI Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati ir jāapkopo tabulas veidā, parādot dzīvnieku skaitu, kas izmantots katrā testa grupā, dzīvnieku skaitu, kuriem parādījušās toksicitātes pazīmes, dzīvnieku skaitu, kuri testa laikā atrasti miruši vai nogalināti humānu iemeslu dēļ, atsevišķo dzīvnieku nobeigšanās laiku, toksisko ietekmju un to atgriezenības aprakstu un gaitu, un autopsijas konstatācijas. Vispārēji norādījumi par klasificēšanas rezultātu interpretāciju doti 2. pielikumā. 3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA Testa ziņojums Ziņojumā, ja iespējams, iekļauj šādu informāciju. Testa dzīvnieki: - suga/līnija, - dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms, - dzīvnieku skaits, vecums un dzimums, - izcelsme, turēšanas apstākļi, diēta, u.c., - atsevišķo dzīvnieku svars testa sākumā, nedēļas intervālos pēc tam un testa beigās. Testa apstākļi: - nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens; - sīkas ziņas par testa vielas ievadīšanu, iekļaujot dozēšanas tilpumus un dozēšanas laikus, - sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot veidu/izcelsmi, ūdens izcelsmi), - sākotnējās devas izvēles pamatojums. Rezultāti: - atbildes reakciju datu tabula pēc katra dzīvnieka dzimuma un devas līmeņa (t.i., dzīvniekiem, kas uzrādījuši toksicitātes pazīmes, iekļaujot mirstību, ietekmju veidu, smagumu un ilgumu), - katra dzīvnieka toksicitātes pazīmju parādīšanās gaita un vai tās ir bijušas atgriezeniskas, - dzīvnieka autopsijas konstatācijas un histopatoloģiskās konstatācijas, ja tās pieejamas. Rezultātu izvērtējums. Secinājumi. 4. NORĀDES Šī metode ir analoga OECD TG 423. 1. PIELIKUMS TESTA PROCEDŪRA 1. Kā norādīts 1.4.2.3. punktā, sākotnējai devai jābūt tai, kas, sagaidāms, izraisīs vismaz dažu devu saņēmušo dzīvnieku mirstību. Informācija, ko var izmantot sākotnējās devas izvēlei, iekļauj: - fizikāli ķīmisko īpašību datus, - struktūras sakarības ar aktivitāti, - visus citu toksicitātes testu datus un - testa vielas paredzamo pielietojumu. 2. Attiecībā uz katru sākotnējo devu ir jāievēro procedūra, kas izklāstīta attiecīgās testēšanas shēmās, kuras iekļautas šajā pielikumā. Atkarībā no humāni nogalināto vai mirušo dzīvnieku skaita testa procedūra noris atbilstīgi norādītajām bultiņām. 3. Ja pie sākotnējās devas 25 vai 200 mg/kg ķermeņa svara nobeidzas tikai viens otra dzimuma dzīvnieks, tad parasti turpmāku testēšanu neizdara. Tomēr, ja citiem pieciem dzīvniekiem toksicitātes pazīmes nav novērotas, autopsijas laikā jāapsver iespēja, ka mirstība varbūt nav saistīta ar vielu. Tādā gadījumā tests ir jāturpina ar dozēšanu nākošajā augstākajā līmenī. 4. Ja pie devas 2000 mg/kg ķermeņa svara nobeidzas viens katra dzimuma dzīvnieks, ir sagaidāms, ka LD50 lielums pārsniegs 2000 mg/kg ķermeņa svara. Tomēr tādēļ, ka tas ir rezultāts uz robežlīnijas, ir rūpīgi jāapsver palikušo divu katra dzimuma dzīvnieku atbildes reakcijas, un, ja šiem dzīvniekiem parādās skaidras, izteiktas toksicitātes pazīmes, tad tas var būt iemesls klasifikācijai, kas atbilst LD50 lielumam 2000 mg/kg ķermeņa svara vai mazāk, vai būt pamats turpmākai testēšanai pie tā paša līmeņa. 5. Procedūra ļauj testēšanu izdarīt pie trijām papildu nemainīgajām devām (2. izvēle). Šo izvēli var izmantot, lai izvēlētos alternatīvu devu noteiktā izlemšanas punktā vai lai izvēlētos turpmāku testēšanu pēc attiecīgā testa pabeigšanas (1. izvēle). 1. izvēles testa procedūra ir norādīta ar resnajām bultiņām, bet 2. izvēles testa procedūrai izmantotas tievās bultiņas. a) Testa procedūra ar sākotnējo devu 25 mg/kg ķermeņa svara +++++ TIFF +++++ b) Testa procedūra ar sākotnējo devu 200 mg/kg ķermeņa svara +++++ TIFF +++++ c) Testa procedūra ar sākotnējo devu 2000 mg/kg ķermeņa svara +++++ TIFF +++++ 2. PIELIKUMS REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA, PAMATOJOTIES UZ TESTĒŠANU ATBILSTĪGI 1. IZVĒLEI Pelēkā krāsā iezīmētās ailes zem "turpmāka testēšana nenotiek" ailes šā pielikuma shēmās pārstāv klasifikācijas robežlielumus. Saskaņā ar testa procedūru, kas izklāstīta 1. izvēlē, ir jāseko attiecīgajai bultiņai tālāk uz leju, līdz tā sasniedz attiecīgo pelēko aili. a) Rezultātu interpretācija, pamatojoties uz testēšanu atbilstīgi 1. izvēlei Sākotnējā deva: 25 mg/kg ķermeņa svara +++++ TIFF +++++ b) Rezultātu interpretācija, pamatojoties uz testēšanu atbilstīgi 1. izvēlei Sākotnējā deva: 200 mg/kg ķermeņa svara +++++ TIFF +++++ c) Rezultātu interpretācija, pamatojoties uz testēšanu atbilstīgi 1. izvēlei Sākotnējā deva: 2000 mg/kg ķermeņa svara +++++ TIFF +++++ " -------------------------------------------------- IV C PIELIKUMS " B.6. ĀDAS SENSIBILIZĀCIJA 1. METODE 1.1. Ievads Piezīmes: Testu jutīgumu un to spēju noteikt potenciālos cilvēku ādas sensibilizatorus uzskata par svarīgu klasifikācijas sistēmā, kas attiecas uz sabiedrības veselības aizsardzību. Nav vienas testa metodes, kas adekvāti identificētu visas cilvēku ādu potenciāli sensibilizējošas vielas un kas attiektos uz visām vielām. Izvēloties testu, ir jāņem vērā tādi faktori kā vielas fizikālās īpašības, iekļaujot tās spēju iekļūt ādā. Ir izveidoti divi testu tipi, kuros izmanto jūrascūciņas: testi ar adjuvantiem, kuros alerģisko stāvokli veicina, izšķīdinot vai suspendējot testa vielu Freinda pilnajā adjuvantā (FCA), un testi bez adjuvantiem. Testi ar adjuvantiem parasti precīzāk paredz vielas iespējamo sensibilizējošo ietekmi uz cilvēku nekā metodes, kas neizmanto Freinda pilno adjuvantu, un tādēļ tie ir ieteicamākie testi. Maksimizācijas tests jūrascūciņām (GPMT) ir plaši lietojams tests ar adjuvantiem. Kaut arī, lai noteiktu vielas spēju izraisīt ādas sensibilizācijas reakciju, var izmantot vairākas citas metodes, par ieteicamāko metodi ar adjuvantiem uzskata GPMT. Daudzām ķīmisko vielu klasēm testus bez adjuvantiem (ieteicamākais no tiem ir Bīlera tests) uzskata par mazāk jutīgiem. Dažos gadījumos var būt pamatoti iemesli izvēlēties Bīlera testu, kas saistīts ar pielietošanu uz ādas, nevis ar intradermālu injekciju, kuru izmanto jūrascūciņu maksimizācijas testā. Ja izmanto Bīlera testu, ir jāsniedz zinātnisks pamatojums. Jūrascūciņu maksimizācijas tests (GPMT) un Bīlera tests ir aprakstīts šajā metodē. Var izmantot citas metodes ar nosacījumu, ka tās ir labi novērtētas un ir dots zinātnisks pamatojums. Ja atzītā skrīninga testā ir redzams pozitīvs rezultāts, testa vielu var apzīmēt kā potenciālu sensibilizatoru, un turpmāka testa ar jūrascūciņām izdarīšana var nebūt vajadzīga. Tomēr, ja šādā testā ir redzams negatīvs rezultāts, tests ar jūrascūciņām, izmantojot šajā testa metodē aprakstīto procedūru, ir jāizdara. Skatīt arī Vispārējā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Ādas sensibilizācija: (alerģiskais kontaktdermatīts) ir imunoloģiski nosacīta ādas reakcija uz vielu. Cilvēka atbildes reakcijas var raksturot nieze, apsārtums, uztūkums, mezgliņi, pūslīši, tulznas vai to apvienojums. Citu sugu atbildes reakcijas var atšķirties, un var būt redzams tikai apsārtums un uztūkums. Pakļaušana inducējošai iedarbībai: pētījuma objekta eksperimentāla pakļaušana testa vielas iedarbībai, lai inducētu hiperjutības stāvokli. Indukcijas laikposms: vismaz vienu nedēļu ilgs laikposms pēc pakļaušanas inducējošai iedarbībai, kura laikā var izveidoties hiperjutības stāvoklis. Provokatīvais mijiedarbības tests iepriekš apstrādāta pētījumu objekta eksperimentāla pakļaušana testa vielas iedarbībai pēc indukcijas laika posma, lai noteiktu, ka pētījumu objekts reaģē hiperjutīgi. 1.3. Standartvielas Lietotās eksperimenta metodes jutība un ticamība ir jānovērtē reizi sešos mēnešos, izmantojot vielas, par kurām ir zināms, ka tām ir vieglas līdz vidējas ādu sensibilizējošas īpašības. Pareizi izdarītā testā viegliem/vidējiem sensibilizatoriem ir sagaidāma vismaz 30 % atbildes reakcija testā ar adjuvantiem un vismaz 15 % testā bez adjuvantiem. Priekšroka ir dodama šādām vielām: CAS numurs | EINECS numurs | EINECS nosaukums | Parastais nosaukums | 101-86-0 | 202-983-3 | α-heksilkaneļaldehīds | α-heksilkaneļaldehīds | 149-30-4 | 205-736-8 | benzotiazol-2-tiols (merkaptobenzotiazols) | kaptakss | 94-07-7 | 202-303-5 | benzokaīns | nordkaīns | Var būt apstākļi, kad ar pienācīgu pamatojumu var izmantot citas kontroles vielas, kas atbilst iepriekšminētajiem kritērijiem. 1.4. Testa metodes princips Testa dzīvniekus sākotnēji pakļauj testa vielas iedarbībai, izmantojot intradermālas injekcijas un/vai pielietojot epidermāli (pakļaušana inducējošai iedarbībai). Pēc 10 līdz 14 dienu miera laikposma (indukcijas laikposms), kura laikā var izveidoties imūnreakcija, dzīvniekus pakļauj provokatīvās devas iedarbībai. Testa dzīvnieku ādas reakcijas apmēru un pakāpi provokatīvajā mijiedarbības testā salīdzina ar to, ko uzrāda kontrolgrupas dzīvnieki, kuriem indukcijas laikā izdarīts tukšais mēģinājums, un iegūst provokatīvo iedarbību. 1.5. Testa metožu apraksts Ja testa vielas noņemšanu uzskata par vajadzīgu, tas jāsasniedz, izmantojot ūdeni vai piemērotu šķīdinātāju, nemainot esošo atbildes reakciju vai epidermas veselumu. 1.5.1. Jūras cūciņu maksimizācijas tests (GPMT) 1.5.1.1. Sagatavošanās Veselas, jaunas, pieaugušas, albīnas jūrascūciņas vismaz piecas dienas pirms testa aklimatizē laboratorijas apstākļos. Pirms testa dzīvniekus izvēlas pēc nejaušās izvēles principa un iedala vielas ievadīšanas un kontroles grupās. Apmatojumu noņem cērpot, skujot vai varbūt ar ķīmisko depilāciju atkarībā no izmantotās testa metodes. Jāpievērš vērība, lai nenobrāztu ādu. Dzīvniekus nosver pirms testa uzsākšanas un testa beigās. 1.5.1.2. Testa apstākļi 1.5.1.2.1. Testa dzīvnieki Izmanto parasti izmantojamās albīno jūrascūciņu laboratorijas līnijas. 1.5.1.2.2. Skaits un dzimums Var izmantot vīriešu un/vai sieviešu dzimuma dzīvniekus. Ja izmanto mātītes, tām jābūt nedzemdējušām un negrūsnām. Vielas ievadīšanas grupā izmanto vismaz 10 dzīvniekus un kontrolgrupā vismaz 5 dzīvniekus. Ja izmanto mazāk nekā 20 testa un mazāk nekā 10 kontroles jūrascūciņas un ja nav iespējams secināt, ka testa viela ir sensibilizators, ir noteikti ieteicama papildu dzīvnieku testēšana, lai kopā būtu vismaz 20 testa dzīvnieki un 10 kontroles dzīvnieki. 1.5.1.2.3. Devu līmeņi Katrā pakļaušanā induktīvai iedarbībai testa vielas koncentrācijai jābūt dzīvnieka organismam sistēmiski labi panesamai un tai jābūt lielākajai, kas rada vieglu līdz vidēju ādas kairinājumu. Provokatīvajā mijiedarbības testā izmantotajai koncentrācijai jābūt lielākajai devai, kas kairinājumu nerada. Vajadzības gadījumā atbilstīgās koncentrācijas var noteikt ievadpētījumā, kurā izmanto divus vai trīs dzīvniekus. Jāņem vērā, ka šajā nolūkā jāizmanto dzīvnieki, kas saņem Freinda pilno adjuvantu (FCA). 1.5.1.3. Procedūra 1.5.1.3.1. Indukcija 0. diena – vielas ievadīšanas grupa Pleca rajonā, kas ir atbrīvots no apmatojuma, intradermāli ievada trīs pārus 0,1 ml tilpuma injekciju, tā lai no katra pāra viena injekcija būtu savā viduslīnijas pusē. 1. injekcija: FCA/ūdens vai FCA/fizioloģiskā sāls šķīduma maisījums attiecībā 1:1 (tilp./tilp.) 2. injekcija: testa viela piemērotā nesējā izraudzītajā koncentrācijā 3. injekcija: testa viela izraudzītajā koncentrācijā, kas sagatavota FCA/ūdens vai FCA/fizioloģiskā sāls šķīduma maisījumā attiecībā 1:1 (tilp./tilp.) 3. injekcijai ūdenī šķīstošās vielas pirms sajaukšanas ar FCA izšķīdina ūdens fāzē. Taukos šķīstošās vai nešķīstošās vielas pirms ūdens fāzes pievienošanas suspendē FCA. Testa vielas galīgā koncentrācija ir vienāda ar koncentrāciju, ko izmanto 2. injekcijā. 1. un 2. injekciju ievada tuvu vienu otrai un tuvāk galvai, bet 3. injekciju ievada testa laukuma kaudālajā daļā. 0. diena – kontroles grupa Intradermāli ievada trīs pārus 0,1 ml tilpuma injekciju tajās pašās vietās kā vielas ievadīšanas grupas dzīvniekiem. 1. injekcija: FCA/ūdens vai FCA/fizioloģiskā sāls šķīduma maisījums attiecībā 1:1 (tilp./tilp.) 2. injekcija: neatšķaidīts nesējs 3. injekcija: 50 % svars/tilp. attiecībā nesējs samaisīts ar FCA/ūdens vai FCA/fizioloģiskā sāls šķīduma 1:1 (tilp./tilp.) maisījumu. 5.-7. diena – vielas ievadīšanas un kontroles grupa Aptuveni divdesmit četras stundas pirms vietējās indukcijas pielietošanas, ja viela nekairina ādu, testa laukumu pēc nocirpšanas tuvu ādai un/vai noskūšanas apstrādā ar 0,5 ml 10 % nātrija laurilsulfāta vazelīnā, lai radītu vietēju kairinājumu. 6.-8. diena – vielas ievadīšanas grupa Testa laukumā vēlreiz notīra apmatojumu. Filtrpapīru (2x4 cm) pilnīgi piesātina ar testa vielu piemērotā nesējā, uzliek testa laukumam un tur saskarē ar ādu 48 stundas, izmantojot okluzīvu pārsēju. Nesēja izvēle ir jāpamato. Cietas vielas sasmalcina smalkā pulverī un iejauc piemērotā nesējā. Šķidrumus var attiecīgā gadījumā pielietot neatšķaidītus. 6.-8. diena – kontroles grupa Testa laukumā vēlreiz notīra apmatojumu. Testa laukumā līdzīgi pielieto tikai nesēju un tur saskarē ar ādu 48 stundas, izmantojot okluzīvu pārsēju. 1.5.1.3.2. Provocēšana 20.-22. diena – vielas ievadīšanas un kontroles grupa Vielas ievadīšanas un kontroles dzīvnieku sāniem notīra apmatojumu. Ar testa vielu piesātinātu kompresi vai pildītu iedobi pieliek vienam dzīvnieka sānam un attiecīgā gadījumā ar nesēju piesātinātu kompresi vai pildītu iedobi pieliek otram sānam. Kompreses tur saskarē ar ādu 24 stundas, izmantojot okluzīvu pārsēju. 1.5.1.3.3. Novērošana un izvērtēšana: vielas ievadīšanas un kontroles grupa - aptuveni 21 stundu pēc kompreses noņemšanas provocēto laukumu notīra un tuvu ādai nocērp un/vai noskuj un vajadzības gadījumā izdara depilāciju, - aptuveni 3 stundas vēlāk (aptuveni 48 stundas pēc provocēšanas sākuma) izdara ādas reakcijas novērojumus un protokolē saskaņā ar pielikuma papildinājumā parādītajām pakāpēm, - aptuveni 24 stundas pēc šo novērojumu izdarīšanas izdara otru (72 stundu) novērojumu un vēlreiz protokolē. Ir atbalstāmi aklie nolasījumi testa un kontroles dzīvniekiem. Ja ir jāprecizē pirmajā provocēšanā iegūtie rezultāti, ir jāapsver otrā provocēšana (t.i. atkārtota provocēšana) vajadzības gadījumā ar jaunu kontroles grupu aptuveni nedēļu pēc pirmās provocēšanas. Atkārtoto provocēšanu var izdarīt arī ar sākotnējo kontroles grupu. Visas ādas reakcijas un neparastas konstatācijas, iekļaujot organisma sistēmiskās reakcijas, ko izraisījušas indukcijas un provocēšanas procedūras, ir jānovēro un jāprotokolē saskaņā ar Magnusona/Kligmana novērtējuma skalu (sk. pielikuma papildinājumu). Lai precizētu neskaidras reakcijas, var izdarīt citas procedūras, piem., histopatoloģiskus izmeklējumus, ādas krokas biezuma mērījumus. 1.5.2. Bīlera tests 1.5.2.1. Sagatavošanās Veselas, jaunas, pieaugušas, albīnas jūrascūciņas vismaz piecas dienas pirms testa aklimatizē laboratorijas apstākļos. Pirms testa dzīvniekus izvēlās pēc nejaušās izvēles principa un iedala vielas ievadīšanas grupās. Apmatojumu noņem cērpot, skujot vai varbūt ar ķīmisko depilāciju atkarībā no izmantotās testa metodes. Jāpievērš vērība, lai nenobrāztu ādu. Dzīvniekus nosver pirms testa uzsākšanas un testa beigās. 1.5.2.2. Testa apstākļi 1.5.2.2.1. Testa dzīvnieki Izmanto albīno jūrascūciņu parasti izmantojamās laboratorijas līnijas. 1.5.2.2.2. Skaits un dzimums Var izmantot vīriešu un/vai sieviešu dzimuma dzīvniekus. Ja izmanto mātītes, tām jābūt nedzemdējušām un negrūsnām. Vielas ievadīšanas grupā izmanto vismaz 20 dzīvniekus un kontroles grupā vismaz 10 dzīvniekus. 1.5.2.2.3. Devu līmeņi Katrā inducējošā iedarbībā testa vielas koncentrācijai jābūt iespējami lielākajai, kas rada vieglu līdz vidēju ādas kairinājumu. Provokatīvajā mijiedarbības testā izmantotajai koncentrācijai jābūt lielākajai devai, kas kairinājumu nerada. Vajadzības gadījumā atbilstīgās koncentrācijas var noteikt ievadpētījumā, kurā izmanto divus vai trīs dzīvniekus. Par ūdenī šķīstošu testa materiālu nesēju ir lietderīgi izmantot ūdeni vai atšķaidītu nekairinošu virsmaktīvas vielas šķīdumu. Citu testa materiālu indukcijā ir vēlams 80 % etanola/ūdens maisījums un provocēšanā acetons. 1.5.2.3. Procedūra 1.5.2.3.1. Indukcija 0. diena – vielas ievadīšanas grupa Vienam sānam notīra apmatojumu (nocērp tuvu ādai). Testa kompreses sistēmai jābūt pilnīgi piesātinātai ar testa vielu piemērotā nesējā (nesēja izvēle ir jāpamato; šķidras testa vielas var attiecīgā gadījumā pielietot neatšķaidītas). Testa kompreses sistēmu pielieto testa laukumam un tur saskarē ar ādu, izmantojot okluzīvu kompresi vai iedobi un piemērotu pārsēju 6 stundas. Testa kompreses sistēmai jābūt okluzīvai. Kokvilnas spilventiņš ir piemērots un var būt apaļš vai četrstūrains, bet tam jābūt aptuveni 4-6 cm2. Lai nodrošinātu oklūziju, vēlams izmantot fiksāciju ar piemērotu fiksatoru. Ja izmanto apsaitēšanu, var būt vajadzīgas papildu pakļaušanas iedarbībai. 0. diena – kontroles grupa Vienam sānam notīra apmatojumu (nocērp tuvu ādai). Pielieto tikai nesēju līdzīgi kā vielas ievadīšanas grupai. Testa kompreses sistēmu tur saskarē ar ādu 6 stundas, izmantojot okluzīvu kompresi vai iedobi un piemērotu pārsēju. Ja var parādīt, ka tukšā mēģinājuma kontroles grupa nav vajadzīga, var izmantot kontroles grupu, kas neko nesaņem. 6.-8. un 13.-15. diena – vielas ievadīšanas grupa un kontroles grupa Rīkojas tāpat kā 0. dienā ar tā paša sāna to pašu testa laukumu (vajadzības gadījumā notīrot apmatojumu) 6.-8. dienā un vēlreiz 13.-15. dienā. 1.5.2.3.2. Provocēšana 27.-29. diena – vielas ievadīšanas un kontroles grupa Vielas ievadīšanas un kontroles grupas dzīvnieku neapstrādātajam sānam notīra apmatojumu (nocērp tuvu ādai). Okluzīvu kompresi vai iedobi, kas satur atbilstīgu testa vielas daudzumu maksimālā nekairinošā koncentrācijā pielieto uz vielas ievadīšanas un kontroles dzīvnieku neapstrādātā sāna aizmugures daļas. Attiecīgā gadījumā okluzīvu kompresi vai iedobi, kas satur tikai nesēju, arī pielieto uz vielas ievadīšanas un kontroles dzīvnieku neapstrādātā sāna aizmugures daļas. Kompreses vai iedobes 6 stundas tur saskarē ar ādu, izmantojot piemērotu pārsēju. 1.5.2.3.3. Novērošana un izvērtēšana - Aptuveni 21 stundu pēc kompreses noņemšanas provocētajā laukumā notīra apmatojumu, - aptuveni 3 stundas vēlāk (aptuveni 30 stundas pēc provocēšanas kompreses pielietošanas) izdara ādas reakcijas novērojumus un protokolē saskaņā ar pielikuma papildinājumā parādītajām pakāpēm, - aptuveni 24 stundas pēc 30 stundu novērojumiem (aptuveni 54 stundas pēc provocēšanas kompreses pielietošanas) vēlreiz izdara ādas reakcijas novērojumus un protokolē. Ir atbalstāmi aklie nolasījumi testa un kontroles dzīvniekiem. Ja ir jāprecizē pirmajā provocēšanā iegūtie rezultāti, ir jāapsver otrā provocēšana (t.i., atkārtota provocēšana) vajadzības gadījumā ar jaunu kontroles grupu aptuveni nedēļu pēc pirmās provocēšanas. Atkārtoto provocēšanu var izdarīt arī ar sākotnējo kontroles grupu. Visas ādas reakcijas un neparastas konstatācijas, iekļaujot organisma sistēmiskās reakcijas, ko izraisījušas indukcijas un provocēšanas procedūras, ir jānovēro un jāprotokolē saskaņā ar Magnusona/Kligmana novērtējuma skalu (sk. pielikuma papildinājumu). Lai precizētu neskaidras reakcijas, var izdarīt citas procedūras, piem., histopatoloģiskus izmeklējumus, ādas krokas biezuma mērījumus. 2. DATI (GPMT UN BĪLERA TESTS) Dati ir jāapkopo tabulas veidā, parādot katra dzīvnieka ādas reakcijas katrā novērošanā. 3. ZIŅOJUMA SASTĀDĪŠANA (GPMT UN BĪLERA TESTS) Ja skrīninga testu izdara pirms jūrascūciņu testa, tad testa apraksts vai norāde uz to (piem. vietējais limfmezglu tests (LLNA), peļu ausu pietūkuma tests (MEST)), iekļaujot sīkus datus par procedūru, ir jāsniedz kopā ar rezultātiem, kas iegūti ar testa vielām un standartvielām. Testa ziņojums (GPMT un Bīlera tests) Testa ziņojumā, ja iespējams, iekļauj šādu informāciju: Testa dzīvnieki: - izmantotā jūrascūciņu līnija, - dzīvnieku skaits, vecums un dzimums, - izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, u.c., - atsevišķo dzīvnieku svars testa sākumā. Testa apstākļi: - kompreses vietas sagatavošanas paņēmiens, - sīkas ziņas par izmantotajiem kompreses materiāliem un kompreses uzlikšanas paņēmienu, - ievadpētījuma rezultāti ar secinājumu par testā izmantojamām inducēšanas un provocēšanas koncentrācijām, - sīkas ziņas par testa vielas sagatavošanu, pielietošanu un noņemšanu, - nesēja izvēles pamatojums, - inducēšanā un provocēšanā izmantotās nesēja un testa vielas koncentrācijas un inducēšanā un provocēšanā izmantotais kopējais vielas daudzums. Rezultāti: - pēdējās jutības un ticamības pārbaudes rezultātu kopsavilkums (sk. 1.3.), iekļaujot informāciju par izmantoto vielu, koncentrāciju un nesēju, - visi novērojumi par katru dzīvnieku, iekļaujot vērtējumu, - sīki izstrādāts apraksts par novēroto ietekmju būtību un pakāpi, - histopatoloģiskas konstatācijas. Rezultātu izvērtējums Secinājumi 4. NORĀDES Šī metode ir analoga OECD TG 406. Papildinājums TABULA Magnusona/Kligmana novērtējumu skala kompreses provocēšanas testa reakcijām 0 = | nav redzamu izmaiņu | 1 = | atsevišķi vai plankumveida apsārtumi | 2 = | vidēji stipri un saplūduši apsārtumi | 3 = | intensīvs apsārtums un uztūkums | " -------------------------------------------------- IV D PIELIKUMS " B.7 VAIRĀKKĀRTĒJĀS DEVAS (28 DIENU) TOKSICITĀTE (ORĀLĀ) 1. METODE 1.1. Ievads Skatīt Vispārējā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Skatīt Vispārējā ievada B daļu. 1.3. Testa metodes princips Testa vielu perorāli ievada katru dienu pakāpeniskās devās vairākām testa dzīvnieku grupām, vienu devas līmeni uz grupu 28 dienu laikposmā. Vielas ievadīšanas laikposmā dzīvniekus katru dienu rūpīgi apskata, vai nav novērojamas toksicitātes pazīmes. Dzīvniekiem, kas nobeidzas vai ko nogalina testa laikā, izdara autopsiju, un eksperimenta beigās izdzīvojušos dzīvniekus nogalina, un tiem izdara autopsiju. Šī metode vairāk uzsver neiroloģiskās ietekmes kā īpašu beigu punktu un uzsver vajadzību izdarīt rūpīgus dzīvnieku klīniskos novērojumus, lai iegūtu iespējami daudz informācijas. Metodei jāidentificē vielas ar neirotoksisku potenciālu, kas varētu radīt vajadzību izdarīt šajā aspektā turpmākus padziļinātus pētījumus. Turklāt metode var dot norādi par imunoloģisko ietekmi un toksicitāti uz reproduktīvajiem orgāniem. 1.4. Testa metodes apraksts 1.4.1. Sagatavošanās Veselus, jaunus, pieaugušus dzīvniekus pēc nejaušās izvēles principa sadala kontroles un vielas saņemšanas grupās. Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo ietekmi. Dzīvniekiem piešķir īpašu identifikāciju, un līdz izmēģinājumu sākumam vismaz piecas dienas tur būros, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos. Testa vielu ievada mākslīgi barojot vai ar barību vai dzeramo ūdeni. Perorālās ievadīšanas metode ir atkarīga no pētījuma mērķa un no vielu fizikāli ķīmiskajām īpašībām. Vajadzības gadījumā testa vielu izšķīdina vai suspendē piemērotā nesējā. Ir ieteicams, ja tas iespējams, vispirms apsvērt ūdens šķīduma/suspensijas lietošanu, pēc tam apsvērt eļļas (piem., kukurūzas eļļas) šķīduma/emulsijas lietošanu un pēc tam iespējamu šķīdināšanu citos nesējos. Ir jābūt zināmām nesēju, kas nav ūdens, toksiskajām īpašībām. Ir jānosaka testa vielas stabilitāte nesējā. 1.4.2. Testa apstākļi 1.4.2.1. Testa dzīvnieki Ieteicamākā grauzēju suga ir žurkas, kaut arī var izmanot citas grauzēju sugas. Ir jāizmanto jauni, veseli, pieauguši parasti izmantojamo laboratorijas līniju dzīvnieki. Mātītēm jābūt nedzemdējušām un negrūsnām. Dozēšana jāsāk iespējami drīz pēc zīdīšanas pārtraukšanas un katrā ziņā ne vēlāk kā tad, kad dzīvnieki ir deviņas nedēļas veci. Izmēģinājuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām, un tās nedrīkst pārsniegt ± 20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi. Ja vairākkārtējās devas perorālu pētījumu izdara kā ilgtermiņa pētījuma iepriekšēju pētījumu, ir ieteicams abos pētījumos izmantot vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekus. 1.4.2.2. Skaits un dzimums Katram devas līmenim jāizmanto vismaz 10 dzīvnieki (pieci sieviešu dzimuma un pieci vīriešu dzimuma). Ja plāno izdarīt nogalināšanas pētījuma gaitā, skaits ir jāpalielina par tik dzīvniekiem, cik plānots nogalināt pirms pētījuma pabeigšanas. Turklāt 10 dzīvnieku satelītgrupai (pieci katra dzimuma dzīvnieki) var ievadīt augsta līmeņa devu 28 dienas un novērot 14 dienas pēc vielas ievadīšanas attiecībā uz toksisko ietekmju atgriezenību, noturību vai aizkavētu parādīšanos. Izmanto arī 10 kontroles dzīvnieku satelītgrupu (piecus katra dzimuma dzīvniekus). 1.4.2.3. Devu līmeņi Parasti jāizmanto vismaz trīs testa grupas un kontroles grupa. Izņemot testa vielas ievadīšanu, ar kontroles grupas dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat kā ar testa grupu dzīvniekiem. Ja vielas ievadīšanā izmanto nesēju, kontroles grupai jāsaņem lielākais izmantotais nesēja tilpums. Ja saskaņā ar citu datu izvērtējumu pie devas līmeņa 1000 mg/kg dzīvnieka svara dienā nav sagaidāma nekāda ietekme, var izdarīt pieļaujamā daudzuma testu. Ja piemēroti dati nav pieejami, var izdarīt diapazona atrašanas pētījumu, kas palīdzētu noteikt izmantojamās devas. Devu līmeņi jāizvēlas, ņemot vērā esošos toksicitātes un (toksisko)kinētikas datus, kas ir pieejami par vielu vai par radniecīgiem materiāliem. Augstākais devas līmenis ir jāizvēlas ar mērķi izraisīt toksiskas ietekmes, bet ne nobeigšanos vai smagas ciešanas. Pēc tam jāizvēlas devu līmeņi lejupejošā secībā, lai parādītu visas ar dozēšanu saistītās atbildes reakcijas un lai zemākais devas līmenis būtu nenovērotas nelabvēlīgas ietekmes līmenis (NOAEL). Lejupejošo devu līmeņu uzdošanai bieži optimāli ir divkārši līdz četrkārši intervāli un ceturtās testa grupas pievienošana bieži ir ieteicamāka par ļoti plašu (piem., vairāk par 10 reizēm) intervālu izmantošanu starp dozēšanām. Vielām, ko ievada ar barību vai dzeramo ūdeni, ir svarīgi nodrošināt, lai iesaistītie testa vielas daudzumi netraucētu normālu barības vai ūdens līdzsvaru. Ja testa vielu ievada ar barību, var izmantot nemainīgu koncentrāciju barībā (milj. daļas) vai nemainīgu devas līmeni uz dzīvnieka ķermeņa svaru; izmantotā alternatīva ir jānorāda. Ja vielu ievada, mākslīgi barojot, deva katru dienu jāievada līdzīgā laikā un pēc vajadzības jāpielāgo, lai uzturētu nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru. Ja vairākkārtējās devas pētījumu izmanto kā ilgtermiņa pētījuma iepriekšēju pētījumu, abos pētījumos jāizmanto līdzīga diēta. 1.4.2.4. Pieļaujamā daudzuma tests Ja pie viena devas līmeņa, kas ir vismaz 1000 mg/kg ķermeņa svara dienā vai līdzvērtīgs procentuālais daudzums barībā vai dzeramajā ūdenī, ievadot vielu ar barību vai dzeramo ūdeni (pamatojoties uz ķermeņa svara noteikšanām), testā, kuru izdara ar šā pētījuma veikšanai aprakstītajām procedūrām, nerodas novērojamas toksiskas ietekmes un ja toksicitāte nav sagaidāma, pamatojoties uz datiem par radniecīgas struktūras vielām, tad pilnu pētījumu, kurā izmanto trīs devu līmeņus, nevar uzskatīt par vajadzīgu. Pieļaujamā daudzuma testu pielieto, izņemot gadījumus, kad iedarbība uz cilvēkiem norāda, ka ir jāizmanto augstāks devas līmenis. 1.4.2.5. Novērošanas laikposms Novērošanas laikposmam jābūt 28 dienas. Satelītgrupas dzīvnieki, kas plānoti papildu novērojumiem, ir jātur vismaz vēl 14 dienas bez vielas saņemšanas, lai noteiktu toksisko ietekmju aizkavētu parādīšanos vai noturību, vai izveseļošanos no tām. 1.4.3. Procedūra Dzīvniekiem testa vielu ievada katru dienu septiņas dienas nedēļā 28 dienu laika posmā; ja vielu dozē piecas dienas nedēļā, tas ir jāpamato. Ja testa vielu dzīvniekiem ievada ar mākslīgo barošanu, tas jāizdara vienā devā, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no izmēģinājumu dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 1 ml/100 g ķermeņa svara, izņemot ūdens šķīdumus, ko var ievadīt 2 ml/100 g ķermeņa svara. Izņemot kairinošas un kodīgas vielas, kuru iedarbība lielākās koncentrācijās parasti ir izteiktāka, izmēģinājumiem lietotā tilpuma mainības ietekmi samazina, koriģējot tilpumu tā, lai pie visām devām tas būtu vienāds. 1.4.3.1. Vispārēji novērojumi Vispārējie klīniskie novērojumi jāizdara vismaz reizi dienā, vēlams katru dienu vienā(os) laikā(os) un ņemot vērā sagaidāmo ietekmju maksimuma laika posmu pēc dozēšanas. Dzīvnieku veselības stāvoklis ir jāprotokolē. Vismaz divreiz dienā visus dzīvniekus novēro attiecībā uz saslimstību un mirstību. Mirstoši dzīvnieki un dzīvnieki, kam ir smagas ciešanas, ja tie ievēroti, ir jāizņem, humāni jānogalina un tiem jāizdara autopsija. Vienreiz pirms pakļaušanas iedarbībai (lai varētu izdarīt salīdzināšanu vienam un tam pašam dzīvniekam) un pēc tam vismaz vienu reizi nedēļā jāizdara detalizēti visu dzīvnieku klīniskie novērojumi. Šie novērojumi jāizdara ārpus dzīvnieka turēšanas krātiņa standartnožogojumā ieteicams katru reizi vienā un tajā pašā laikā. Novērojumi rūpīgi jāprotokolē, vēlams izmantot vērtēšanas sistēmas, ko skaidri noteikusi testēšanas laboratorija. Ir jācenšas nodrošināt, lai izmaiņas testa apstākļos būtu minimālas un, ieteicams, lai novērošanu izdarītu novērotāji, kas nav informēti par vielas ievadīšanu. Protokolējamās pazīmēs ir jāiekļauj izmaiņas ādā, apmatojumā, acīs, gļotādā, sekrēcijas, izdalīšanās un veģetatīvā aktivitāte (piem. asarošana, piloarekcija, acs zīlītes diametrs un neraksturīga elpošana), bet ar to nav jāaprobežojas. Jāprotokolē arī izmaiņas gaitā, stājā un atbildes reakcijās uz manipulācijām, kā arī klonisko un tonisko kustību klātesamība, izmaiņas stereotipos (piem. pārmērīga kopšanās, atkārtota riņķošana) vai savāda izturēšanās (piem. pašsakropļošanās, staigāšana atmuguriski). Ceturtajā iedarbības nedēļā ir jānovērtē sensorās reakcijas uz dažāda veida kairinājumiem (piem., dzirdes, redzes un proprioceptīvajiem kairinātājiem), kā arī jānovērtē satveršanas stiprums un motoriskā aktivitāte. Sīkāki dati par izmantojamām procedūrām ir izklāstīti literatūrā (sk. Vispārējā ievada B daļu). Ceturtajā iedarbības nedēļā funkcionālos novērojumus var neizdarīt, ja pētījumu veic kā turpmāka subhroniska (90 dienu) pētījuma iepriekšēju pētījumu. Tādā gadījumā funkcionālie novērojumi ir jāiekļauj šajā vēlākajā pētījumā. No otras puses, vairākkārtējās devas pētījumā iegūtie funkcionālo novērojumu dati var atvieglot devu līmeņu izvēli turpmākajam subhroniskās toksicitātes pētījumam. Izņēmuma kārtā funkcionālos novērojumus var neizdarīt arī grupām, kas citā veidā uzrāda tik izteiktas toksicitātes pazīmes, ka tās ievērojami traucētu funkcionālo testu izdarīšanu. 1.4.3.2. Ķermeņa svars un barības/ūdens patēriņš Visi dzīvnieki jāsver vismaz reizi nedēļā. Barības un ūdens patēriņš ir jāmēra vismaz reizi nedēļā. Ja testa vielu ievada ar dzeramo ūdeni, arī ūdens patēriņš ir jāmēra vismaz reizi nedēļā. 1.4.3.3. Hematoloģija Testa laika posma beigās ir jāizdara šādi hematoloģiski izmeklējumi: hematokrītu, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaita, leikocītu skaita un leikocitārās formulas, trombocītu skaita un asins recēšanas laika/spējas noteikšana. Asins paraugi jāņem no nosauktas vietas tieši pirms dzīvnieku nogalināšanas procedūras vai kā daļa no tās un jāglabā piemērotos apstākļos. 1.4.3.4. Klīniskā bioķīmija Klīniskās bioķīmijas noteikšanas, lai izpētītu galvenās toksiskās ietekmes audos un konkrēti ietekmes uz nierēm un aknām, jāveic ar tiem asins paraugiem, kuri paņemti no katra dzīvnieka tieši pirms dzīvnieku nogalināšanas procedūras vai kā daļa no tās (tas neattiecas uz dzīvniekiem, kuri atrasti mirstoši un/vai nogalināti pētījuma gaitā). Ir ieteicams nedot dzīvniekiem barību uz nakti pirms asins analīžu ņemšanas [1]. Plazmā vai serumā nosaka nātriju, kāliju, glikozi, kopējo holesterīnu, urīnvielu, kreatinīnu, kopējās olbaltumvielas un albumīnu un vismaz divus fermentus, kas norāda uz hepatocelulārajām ietekmēm (piemēram, alanīna aminotransferāze, aspartāta aminotransferāze, alkalīnfosfatāze, gamma glutamiltranspeptidāze un sorbīta dehidrogenāze). Papildu fermentu (aknu vai citas izcelsmes) un žultsskābju noteikšana var sniegt noderīgu informāciju pie dažiem nosacījumiem. Neobligāti pēdējā pētījuma nedēļā var izdarīt šādas urīna analīzes, izmantojot urīna tilpuma savākšanu noteiktā laikā: izskats, tilpums, osmolalitāte vai īpatsvars, pH, olbaltumvielas, glikoze un asinis/asins šūnas. Turklāt ir jāapsver vispārēju audu bojājumu seruma marķieru pētījumi. Citas noteikšanas, kuras būtu jāveic, ja testa vielas zināmās īpašības ietekmē attiecīgās metaboliskās īpašības vai ja ir aizdomas par tādu ietekmi, iekļauj kalciju, fosforu, tukšas dūšas triglicerīdus, specifiskus hormonus, methemoglobīnu un holīnesterāzi. Tās ir jānosaka dažu klašu vielām vai atkarībā nogadījuma. Vispār ir vajadzīga elastīga pieeja, kas ir atkarīga no sugas un dotajai vielai novērotās un/vai sagaidāmās ietekmes. Ja agrākie izejas dati nav atbilstīgi, ir jāapsver hematoloģisko un klīniskās bioķīmijas rādītāju noteikšana, pirms uzsāk dozēšanu. 1.4.3.5. Autopsija Visiem pētījuma dzīvniekiem izdara pilnu detalizētu autopsiju, kurā iekļauj rūpīgu ķermeņa ārējās virsmas, visu atveru un galvaskausa dobuma, torakālā dobuma un vēdera dobuma un šo dobumu satura apskati. Aknas, nieres, virsnieru dziedzeri, sēklinieki, sēklinieku piedēkļi, liesa, smadzenes un sirds jāatbrīvo no attiecīgajiem apkārtējiem audiem un iespējami drīz pēc secēšanas jānosver, lai izvairītos no izžūšanas. Šādi audi jāglabā vispiemērotākajā fiksācijas vidē audu veida izmeklēšanai un paredzētai vēlākai histopatoloģiskai izmeklēšanai: visi audi ar makroskopiskiem bojājumiem, smadzenes (reprezentatīvi apgabali, iekļaujot lielās smadzenes, smadzenītes un iegarenās smadzenes/smadzeņu tiltu), muguras smadzenes, kuņģis, tievās un resnās zarnas (iekļaujot kopu limfātiskos, jeb Peijera mezgliņus), aknas, nieres, virsnieru dziedzeri, liesa, sirds, hipofīze, vairogdziedzeris, traheja un plaušas (konservētas, piepūšot ar fiksatoru un pēc tam iegremdējot), dzimumdziedzeri, akcesorie dzimumorgāni (piem., dzemde, prostata), urīnpūslis, limfmezgli (vēlams, viens limfmezgls, kas ir uz ievadīšanas ceļa, un otrs, kas ir attālu no ievadīšanas ceļa, lai konstatētu sistēmiskās ietekmes), perifēriskais nervs (sēžas nervs vai tibiālais nervs), vēlams, tiešā muskuļa tuvumā un kaulu smadzeņu izgriezums (vai, alternatīvi, svaigs kaulu smadzeņu aspirāts). Klīniskās un citas konstatācijas var ierosināt domu par vajadzību papildus izmeklēt citus audus. Ir jāsaglabā arī visi orgāni, ko uzskata par iespējamiem mērķa orgāniem, pamatojoties uz zināmajām testa vielas īpašībām. 1.4.3.6. Histopatoloģiskie izmeklējumi Visu kontroles grupas un lielākās devas grupas dzīvnieku konservētajiem orgāniem un audiem jāizdara pilni histopatoloģiskie izmeklējumi. Ja lielākās devas grupā ir novērotas ar dozēšanu saistītas izmaiņas, minētie izmeklējumi jāpaplašina uz visu citu dozēšanas grupu dzīvniekiem. Jāizmeklē visi makroskopiskie bojājumi. Ja izmanto satelītgrupu, histopatoloģiskā izmeklēšana jāizdara audiem un orgāniem, kuros ietekmes konstatētas vielu saņēmušajām grupām. 2. DATI Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati jāapkopo tabulā, katrai testa grupai parādot dzīvnieku skaitu testa sākumā, dzīvnieku skaitu, kas testa laikā ir nobeigušies vai humānu apsvērumu dēļ nogalināti, un katras nobeigšanās vai humānas nogalināšanas laiku, dzīvnieku skaitu, kam novērotas toksicitātes pazīmes, novēroto toksicitātes pazīmju aprakstu, iekļaujot toksisko ietekmju sākuma laiku, ilgumu un smagumu, dzīvnieku skaitu, kam novēroti audu bojājumi, bojājumu veidus un dzīvnieku, kuriem parādījušies katra tipa bojājumi, procentuālo daudzumu. Ja iespējams, skaitliskie rezultāti jānovērtē ar piemērotu un vispārpieņemtu statistikas metodi. Statistikas metodes un analizējamie dati jāizvēlas, plānojot pētījumu. 3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA Testa ziņojums Testa ziņojumā, ja iespējams, iekļauj šādu informāciju: Testa dzīvnieki: - izmantotā suga/līnija, - dzīvnieku skaits, vecums un dzimums, - izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, u.c., - atsevišķo dzīvnieku svars testa sākumā, nedēļas intervālos pēc tam un testa beigās. Testa apstākļi: - nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens, - devu izvēles pamatojums, - sīkas ziņas par testa vielas preparāta/diētas sagatavošanu, iegūto koncentrāciju, stabilitāti un homogenitāti, - sīkas ziņas par testa vielas ievadīšanu, - testa vielas koncentrācijas (milj. daļas) barībā vai dzeramajā ūdenī pārrēķins faktiskajā dienas devā (mg/kg ķermeņa masas dienā) attiecīgā gadījumā, - sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti. Rezultāti: - ķermeņa svars/ķermeņa svara izmaiņas, - barības patēriņš un attiecīgā gadījumā ūdens patēriņš, - dati par toksisko atbildes reakciju pa dzimumiem un devu līmeņiem, iekļaujot toksicitātes pazīmes, - klīnisko novērojumu specifika, smagums un ilgums (atgriezenība vai neatgriezenība), - sensorās aktivitātes, tvēriena stipruma un kustību aktivitātes vērtējums, - hematoloģiskie testi ar attiecīgajiem nulles līnijas lielumiem, - klīniskās bioķīmijas testi ar attiecīgajiem nulles līnijas lielumiem, - dati par ķermeņa svaru pēc nogalināšanas un orgānu svaru, - autopsijas konstatācijas, - visu histopatoloģisko konstatāciju sīki izstrādāts apraksts, - absorbcijas dati, ja tie ir pieejami, - attiecīgā gadījumā rezultātu statistiskā apstrāde. Rezultātu izvērtējums. Secinājumi. 4. NORĀDES Šī metode ir analoga OECD TG 407. " [1] Vairākiem mērījumiem serumā un plazmā, jo īpaši glikozes mērījumiem, vēlams ir nedot barību uz nakti. Galvenais iemesls, kādēļ tas ir vēlams, ir palielināta izkliede, ko neizbēgami rada barības došana un kas tiecas maskēt smalkākās ietekmes un padara grūtāku interpretāciju. No otras puses, tomēr barības nedošana uz nakti var traucēt dzīvnieku vispārējo metabolismu un jo īpaši barošanas pētījumos var traucēt pakļaušanu testa vielas ikdienas iedarbībai. Ja ir pieņemta barības nedošana uz nakti, klīniski bioloģiskās noteikšanas jāizdara pēc funkcionālo novērojumu veikšanas pētījuma 4. nedēļā. -------------------------------------------------- IV E PIELIKUMS " B.37. FOSFORORGANISKO VIELU AIZKAVĒTĀ NEIROTOKSICITĀTE PĒC AKŪTAS IEDARBĪBAS 1. METODE 1.1. Ievads Novērtējot vielu toksisko ietekmi, ir svarīgi ņemt vērā, ka dažu klašu vielas spēj izraisīt īpaša veida neirotoksicitāti, ko nevar noteikt citos toksicitātes pētījumos. Ir novērots, ka dažas fosfororganiskās vielas izraisa aizkavētu neirotoksicitāti, un tās ir jāuzskata par kandidātēm vērtēšanai. Lai identificētu vielas, kas var izraisīt aizkavēto polineiropātiju, var izmantot in vitro skrīninga testus, tomēr negatīvi in vitro rezultāti nav pierādījums, ka testa viela nav neirotoksiska. Skatīt Vispārējā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Fosfororganiskas vielas iekļauj organofosforskābes, organofosfonskābes vai organofosforamīdskābes vai radniecīgus tiofosforskābes, tiofosfonskābes vai tiofosforamīdskābes nelādētus fosfororganiskos esterus, tioesterus vai anhidrīdus, vai citas vielas, kas var izraisīt aizkavētu neirotoksicitāti, kura dažreiz ir novērojama šajā vielu klasē. Aizkavēta neirotoksicitāte ir sindroms, kas saistīts ar paildzinātu, aizkavētu ataksijas parādīšanos, muguras smadzeņu un perifērā nerva distālām aksonopātijām un ar neiropātiju saistītās esterāzes (NTE) kavēšanu un novecošanu nervu audos. 1.3. Standartvielas Standartvielu var pārbaudīt ar pozitīvu kontroles grupu kā līdzekli, lai parādītu, ka laboratorijas testa apstākļos testa sugas atbildes reakcijas nav ievērojami mainījušās. Plaši lietotas neirotoksiskas vielas piemērs ir tri-o-tolilfosfāts (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, CAS nomenklatūra: fosforskābes tris(2-metilfenil)esteris, pazīstams arī kā tris-o-krezilfosfāts. 1.4. Testa metodes princips Testa vielu ievada perorāli vienā devā mājas vistām, kas attiecīgā gadījumā ir aizsargātas no akūtas holīnerģiskas ietekmes. Dzīvniekus novēro 21 dienu, vai neparādās izturēšanās anomālijas, ataksija un paralīze. Pēc nejaušas izvēles no katras grupas izraudzītām vistām izdara bioķīmiskos mērījumus, jo īpaši ar neiropātiju saistītās esterāzes (NTE) kavēšanu, parasti 24 un 48 stundas pēc dozēšanas. Divdesmit vienu dienu pēc iedarbības atlikušās vistas nogalina un izdara izraudzītu nervu audu histopatoloģiskos izmeklējumus. 1.5. Testa metodes apraksts 1.5.1. Sagatavošanās Jaunas veselas pieaugušas vistas, kam nav traucējošu vīrusu slimību un kas nesaņem medikamentus, un kam nav nenormāla gaita, pēc nejaušās izvēles iedala vielas saņemšanas un kontroles grupās un aklimatizē laboratorijas apstākļos vismaz 5 dienas pirms pētījuma sākšanas. Jāizmanto būri vai norobežojumi, kas ir pietiekami plaši, lai vistas varētu brīvi kustēties un to gaita būtu viegli novērojama. Testa vielu parasti dozē perorāli, izmantojot mākslīgo barošanu, želatīna kapsulas vai līdzīgu metodi. Šķidrumus var dot neatšķaidītus vai izšķīdinātus piemērotā nesējā, piemēram, kukurūzas eļļā; cietas vielas, ja iespējams, ir jāizšķīdina, jo lielas cietu vielu devas želatīna kapsulās var efektīvi neuzsūkties. Ir jāzina neūdens nesēju toksiskās īpašības un, ja tās nav zināmas, tad jānosaka pirms testa. 1.5.2. Testa apstākļi 1.5.2.1. Testa dzīvnieki Ir ieteicams izmantot jaunas pieaugušas mājas dējējvistas (Gallus gallus domesticus), 8 līdz 12 mēnešus vecas. Ir jāizmanto standartlieluma šķirnes un līnijas, un vistām parasti jābūt izaudzētām apstākļos, kas ļauj brīvi kustēties. 1.5.2.2. Skaits un dzimums Papildus vielas saņemšanas grupai ir jāizmanto nesēja kontroles grupa un pozitīvā kontroles grupa. Ar nesēja kontroles grupu ir jārīkojas tāpat kā ar vielas saņemšanas grupu, izņemot to, ka netiek ievadīta testa viela. Katrā vistu grupā ir jāizmanto pietiekams putnu skaits, tā lai vismaz sešus putnus varētu nogalināt bioķīmiskajām noteikšanām (trīs katrā no diviem laika punktiem) un seši varētu izdzīvot 21 dienu ilgā pataloģiju novērošanas laikposmā. Pozitīvo kontroles grupu var testēt vienlaikus, vai arī tā var būt nesena agrākā kontroles grupa. Tajā ir jābūt vismaz sešām vistām, kas saņēmušas zināmu aizkavētas iedarbības neirotoksisku vielu, trim vistām bioķīmiskajiem izmeklējumiem un trim vistām patoloģiju izmeklējumiem. Ir ieteicams regulāri atjaunināt agrākos datus. Ir jāizveido jauni pozitīvas kontroles dati, ja testēšanas laboratorijā ir mainījusies kāda būtiska testa izdarīšanas sastāvdaļa (piem., līnija, barība, turēšanas apstākļi). 1.5.2.3. Devu līmeņi Lai noteiktu galvenajā pētījumā izmantojamo līmeni, ir jāizdara iepriekšējs pētījums, izmantojot grupas ar piemērotu vistu skaitu un devu līmeņiem. Šajā iepriekšējā pētījumā parasti ir vajadzīga neliela letalitāte, lai noteiktu galvenajam pētījumam piemērotu devu. Tomēr, lai novērstu nobeigšanos akūtu holīnerģisku ietekmju dēļ, var izmantot atropīnu vai citu aizsargājošu līdzekli, par ko ir zināms, ka tas netraucē aizkavētas neirotoksiskas atbildes reakcijas. Lai novērtētu maksimālo neletālo testa vielas devu, var izmantot dažādas testa metodes (sk. B.1.bis metodi). Devas izvēlē noderīgi var būt arī agrākie dati par vistām vai cita toksikoloģijas informācija. Testa vielas devas līmenim galvenajā pētījumā jābūt iespējami augstam, ņemot vērā devas izvēles iepriekšējā pētījuma rezultātus un augšējo robežas devu 2000 mg/kg ķermeņa svara. Mirstība, kas var būt sastopama, nedrīkst izjaukt pietiekama skaita dzīvnieku izdzīvošanu bioķīmiskajām analīzēm (seši) un histoloģiskajām analīzēm (seši) 21 dienas laikā. Tomēr, lai novērstu nobeigšanos akūtu holīnerģisku ietekmju dēļ, var izmantot atropīnu vai citu aizsargājošu līdzekli, par ko ir zināms, ka tas netraucē aizkavētas neirotoksiskas atbildes reakcijas. 1.5.2.4. Pieļaujamā daudzuma tests Ja novērojamu toksisku ietekmi neizraisa tests ar devas līmeni vismaz 2000 mg/kg ķermeņa svara dienā, izmantojot procedūras, kas aprakstītas šā pētījuma izdarīšanai, un ja toksicitāte nav sagaidāma, pamatojoties uz datiem par struktūras ziņā līdzīgām vielām, tad pētījumu ar lielāku devu var uzskatīt par nevajadzīgu. Pieļaujamā daudzuma testu pielieto, izņemot gadījumus, ja iedarbība uz cilvēkiem norāda, ka ir jāizmanto augstāks devas līmenis. 1.5.2.5. Novērošanas laikposms Novērošanas laikposms ir 21 diena. 1.5.3. Procedūra Pēc aizsargājoša līdzekļa ievadīšanas, lai novērstu nobeigšanos akūtas holīnerģiskas ietekmes dēļ, vienā devā ievada testa vielu. 1.5.3.1. Vispārīgi novērojumi Novērošana jāuzsāk tūlīt pēc pakļaušanas iedarbībai. Pirmo divu dienu laikā visas vistas ir rūpīgi jānovēro vairākas reizes un pēc tam vismaz reizi dienā 21 dienu laika posmā līdz plānotajai nogalināšanai. Ir jāprotokolē visas toksicitātes pazīmes, iekļaujot nenormālas izturēšanās parādīšanos, veidu, smagumu un ilgumu. Ataksija ir jānovērtē, izmantojot kārtas gradāciju skalu, kas sastāv no vismaz četriem līmeņiem, un jādokumentē paralīze. Vismaz divreiz nedēļā vistas, kas atlasītas patoloģiju pētījumiem, ir jāizņem no būriem un jāpakļauj pastiprinātas kustību aktivitātes laika posmam, piemēram, kāpšanai pa kāpnēm, lai atvieglotu minimālu toksisko ietekmju novērošanu. Mirstoši dzīvnieki un dzīvnieki, kam ir smagas ciešanas, ja tie ievēroti, ir jāizņem, humāni jānogalina un jāizdara autopsija. 1.5.3.2. Ķermeņa svars Visas vistas ir jānosver tieši pirms testa vielas ievadīšanas un vismaz reizi nedēļā pēc tam. 1.5.3.3. Bioķīmija Pēc nejaušās izvēles izraudzītas sešas vistas no vielas saņemšanas grupas un sešas vistas no nesēja kontroles grupas un trīs vistas no pozitīvās kontroles grupas (ja šo grupu pēta paralēli), jānogalina dažas dienas pēc dozēšanas un galvas smadzenes un muguras smadzenes jāsagatavo un jāanalizē, lai noteiktu ar neiropātiju saistītās esterāzes kavēšanas aktivitāti. Turklāt var arī būt noderīgi sagatavot un analizēt sēžas nerva audus, lai noteiktu ar neiropātiju saistītās esterāzes kavēšanas aktivitāti. Parasti trīs putnus no kontroles grupas un no katras vielas saņemšanas grupas nogalina pēc 24 stundām un trīs pēc 48 stundām, bet trīs pozitīvās kontroles grupas vistas nogalina pēc 24 stundām. Ja intoksikācijas klīnisko pazīmju novērošana (tās bieži var novērtēt, novērojot holīnerģisko pazīmju parādīšanās laiku) norāda, ka toksiskā viela var izdalīties ļoti lēni, tad var būt vēlams ņemt audu paraugus no trim putniem divos citos laikos starp 24 un 72 stundām pēc dozēšanas. Šiem paraugiem var izdarīt arī acetilholīnesterāzes (AchE) analīzes, ja to uzskata par lietderīgu. Tomēr in vivo var notikt spontāna AchE reaktivācija, un tādēļ vielas spēju kavēt AchE var novērtēt par zemu. 1.5.3.4. Autopsija Visu dzīvnieku (plānoti nogalināto un mirstošo nogalināto) autopsijā ir jāiekļauj galvas smadzeņu un muguras smadzeņu izskata novērojumi. 1.5.3.5. Histopatoloģiskie izmeklējumi Novērošanās laika posmā izdzīvojušo un bioķīmiskos pētījumos neizmantoto dzīvnieku nervu audi ir jāizmeklē mikroskopā. Audi ir jāfiksē in situ, izmantojot perfūzijas metodi. Audu griezumos jāiekļauj cerebellum (vidus garengriezuma līmenī), medulla oblongata, muguras smadzenes un perifērie nervi. Muguras smadzeņu griezumi ir jāņem no augšējā kakla daļas segmenta, torakālās vidusdaļas un jostasvietas daļas. Ir jāņem griezumi no tibiālā nerva un tā atzaru uz musculus gastrocnemius distālās daļas un no sēžas nerva. Griezumi ir jāiekrāso ar piemērotām mielīnam un aksoniem specifiskām krāsvielām. 2. DATI Ja šajā metodē izraudzītajos beigu punktos (bioķīmijas, histopatoloģijas un izturēšanās novērojumos) ir iegūti negatīvi rezultāti, parasti nav vajadzīga turpmāka testēšana attiecībā uz aizkavētu neirotoksicitāti. Neviennozīmīgu vai neskaidru rezultātu gadījumā attiecībā uz šiem beigu punktiem var būt vajadzīga turpmāka izvērtēšana. Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati ir jāapkopo tabulas veidā, kurā katrai testa grupai parādīts dzīvnieku skaits testa sākumā, dzīvnieku skaits, kam novēroti audu bojājumi, ietekmes uz izturēšanos vai bioķīmiskas ietekmes, minēto audu bojājumu vai ietekmju veids un ilgums un dzīvnieku procentuālais daudzums atbilstīgi katra bojājuma vai ietekmes veidam un smagumam. Šā pētījuma rezultāti ir jāvērtē, ņemot vērā izturēšanās, bioķīmisko un histopatoloģisko ietekmju un citu novēroto ietekmju biežumu, smagumu un korelācijas vielu saņēmušajās un kontroles grupās. Skaitliskie rezultāti ir jānovērtē ar piemērotām un vispāratzītām statistikas metodēm. Izmantojamās statistikas metodes jāizvēlas, plānojot pētījumu. 3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA Testa ziņojums Testa ziņojumā, ja iespējams, iekļauj šādu informāciju: Testa dzīvnieki: - izmantotā līnija, - dzīvnieku skaits un vecums, - izcelsme, turēšanas apstākļi u.c., - atsevišķo dzīvnieku svars testa sākumā. Testa apstākļi: - sīkas ziņas par testa vielas sagatavošanu, stabilitāti un homogēniskumu; attiecīgā gadījumā, - nesēja izvēles pamatojums, - sīkas ziņas par testa vielas ievadīšanu, - sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti, - devu izvēles pamatojums, - ievadīto devu specifikācija, iekļaujot sīkas ziņas par ievadītā materiāla nesēju, tilpumu un fizikālo formu, - aizsargājošā aģenta identifikācija un sīkas ziņas par tā ievadīšanu. Rezultāti: - dati par ķermeņa svaru, - toksiskās atbildes reakcijas dati pa grupām, iekļaujot mirstību, - klīniski novēroto pazīmju specifika, smagums un ilgums (atgriezenība vai neatgriezenība), - bioķīmisko metožu un konstatāciju sīki izstrādāts apraksts, - autopsijas konstatācijas, - visu histopatoloģisko konstatāciju sīki izstrādāts apraksts, - attiecīgā gadījumā rezultātu statistiskā apstrāde. Rezultātu izvērtējums. Secinājumi. 4. NORĀDES Šī metode ir analoga OECD TG 418. B.38. FOSFORORGANISKO VIELU AIZKAVĒTĀS NEIROTOKSICITĀTES 28 DIENU VAIRĀKKĀRTĒJAS DEVAS PĒTĪJUMS 1. METODE 1.1. Ievads Vērtējot vielu toksisko ietekmi, ir svarīgi ņemt vērā, ka dažu klašu vielas spēj izraisīt īpaša veida neirotoksicitāti, ko nevar noteikt citos toksicitātes pētījumos. Ir novērots, ka dažas fosfororganiskās vielas izraisa aizkavētu neirotoksicitāti, un tās ir jāuzskata par kandidātēm vērtēšanai. Lai identificētu tās vielas, kas var izraisīt aizkavētu polineiropātiju, var izmantot in vitro skrīninga testus; tomēr in vitro pētījumu negatīvie rezultāti nav pierādījums, ka testa viela nav neirotoksiska. Šis 28 dienu aizkavētās neirotoksicitātes tests sniedz informāciju par iespējamu veselības apdraudējumu, ko, sagaidāms, var radīt atkārtota iedarbība ierobežotā laika posmā. Tas sniedz informāciju par devas sakarību ar atbildes reakciju, un tajā var novērtēt nenovērotas nelabvēlīgas ietekmes līmeni, kas var būt noderīgs, lai noteiktu iedarbības drošības kritērijus. Skatīt arī Vispārējā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Fosfororganiskas vielas iekļauj organofosforskābes, organofosfonskābes vai organofosforamīdskābes vai radniecīgus tiofosforskābes, tiofosfonskābes vai tiofosforamīdskābes nelādētus fosfororganiskos esterus, tioesterus vai anhidrīdus vai citas vielas, kas var izraisīt aizkavētu neirotoksicitāti, kura dažreiz ir novērojama šai vielu klasei. Aizkavēta neirotoksicitāte ir sindroms, kas saistīts ar paildzinātu, aizkavētu ataksijas parādīšanos, muguras smadzeņu un perifērā nerva distālām aksonopātijām un ar neiropātiju saistītās esterāzes (NTE) kavēšanu un novecošanu audos. 1.3. Testa metodes princips Testa vielas dienas devas perorāli ievada mājas vistām 28 dienas. Dzīvniekus novēro vismaz reizi dienā attiecībā uz izturēšanās anomālijām, ataksiju un paralīzi laikā līdz 14 dienām pēc pēdējās devas: Pēc nejaušas izvēles no katras grupas izraudzītām vistām izdara bioķīmiskos mērījumus, jo īpaši ar neiropātiju saistītās esterāzes (NTE) kavēšanu, parasti 24 un 48 stundas pēc pēdējās devas. Divas nedēļas pēc pēdējās devas atlikušās vistas nogalina un izdara izraudzītu nervu audu histopatoloģiskos izmeklējumus. 1.4. Testa metodes apraksts 1.4.1. Sagatavošanās Jaunas veselas pieaugušas vistas, kam nav traucējošu vīrusu slimību un kas nesaņem medikamentus, un kam nav nenormāla gaita, pēc nejaušās izvēles iedala vielas saņemšanas un kontroles grupās un aklimatizē laboratorijas apstākļos vismaz 5 dienas pirms pētījuma sākšanas. Jāizmanto būri vai norobežojumi, kas ir pietiekami plaši, lai vistas varētu brīvi kustēties un to gaita būtu viegli novērojama. Katru dienu, septiņas dienas nedēļā ir jāizdara perorāla dozēšana vēlams ar mākslīgo barošanu vai ievadot želatīna kapsulas. Šķidrumus var dot neatšķaidītus vai izšķīdinātus piemērotā nesējā, piemēram, kukurūzas eļļā; cietas vielas, ja iespējams, ir jāizšķīdina, jo lielas cietu vielu devas želatīna kapsulās var efektīvi neuzsūkties. Ir jāzina neūdens nesēju toksiskās īpašības un, ja tās nav zināmas, tad jānosaka pirms testa. 1.4.2. Testa apstākļi 1.4.2.1. Testa dzīvnieki Ir ieteicams izmantot jaunas pieaugušas mājas dējējvistas (Gallus gallus domesticus), 8 līdz 12 mēnešus vecas. Ir ieteicams izmantot standartlielumu, šķirnes un līnijas, un vistām parasti jābūt izaudzētām apstākļos, kas ļauj brīvi kustēties. 1.4.2.2. Skaits un dzimums Parasti jāizmanto vismaz trīs testa grupas un nesēja kontroles grupa. Ar nesēja kontroles grupu ir jārīkojas tāpat kā ar vielas saņemšanas grupu, izņemot testa vielas ievadīšanu. Katrā putnu grupā ir jāizmanto pietiekams vistu skaits, tā lai vismaz sešus putnus varētu nogalināt bioķīmiskajām noteikšanām (trīs katrā no diviem laika punktiem) un seši putni varētu izdzīvot 14 dienu ilgā pataloģiju novērošanas laikposmā pēc vielas došanas. 1.4.2.3. Devu līmeņi Devu līmeņi jāizvēlas, ņemot vērā trīs aizkavētās neirotoksicitātes akūtā testa rezultātus vai par testa savienojumu pieejamos kinētikas datus. Augstākais devas līmenis ir jāizvēlas ar mērķi izraisīt toksiskas ietekmes, vēlams aizkavēto neirotoksicitāti, bet ne nobeigšanos vai acīmredzamas ciešanas. Pēc tam jāizvēlas devu līmeņi lejupejošā secībā, lai parādītu visas ar devām saistītās atbildes reakcijas un lai zemākais devas līmenis būtu nenovērotas nelabvēlīgas ietekmes līmenis. 1.4.2.4. Pieļaujamā daudzuma tests Ja novērojamu toksisku iedarbību neizraisa tests ar devas līmeni vismaz 1000 mg/kg ķermeņa svara dienā, izmantojot procedūras, kas aprakstītas šā pētījuma izdarīšanai, un ja toksicitāte nav sagaidāma, pamatojoties uz datiem par struktūras ziņā līdzīgām vielām, tad pētījumu ar lielāku devu var uzskatīt par nevajadzīgu. Pieļaujamā daudzuma testu pielieto, izņemot gadījumus, ja iedarbība uz cilvēkiem norāda, ka ir jāizmanto augstāks devas līmenis. 1.4.2.5. Novērošanas laikposms Visi dzīvnieki ir jānovēro vismaz reizi dienā pakļaušanas iedarbībai laikposmā un 14 dienas pēc tā, izņemot plānoto autopsiju. 1.4.3. Procedūra Dzīvniekiem testa vielu ievada katru dienu septiņas dienas nedēļā 28 dienu laikposmā. 1.4.3.1. Vispārēji novērojumi Novērošana jāuzsāk tūlīt pēc vielas ievadīšanas sākuma. Visas vistas ir rūpīgi jānovēro vismaz reizi dienā katrā no 28 dozēšanas dienām un 14 dienas pēc dozēšanas vai līdz plānotai nogalināšanai. Ir jāprotokolē visas toksicitātes pazīmes, iekļaujot to parādīšanās laiku, veidu, smagumu un ilgumu. Novērojumos ir jāiekļauj izturēšanās anomālijas, bet ar tām nav jāierobežojas. Ataksija ir jānovērtē, izmantojot kārtas gradāciju skalu, kas sastāv no vismaz četriem līmeņiem, un jādokumentē paralīze. Vismaz divreiz nedēļā vistas ir jāizņem no būriem un jāpakļauj pastiprinātas kustību aktivitātes laika posmam, piemēram, kāpšanai pa kāpnēm, lai atvieglotu minimālu toksisko ietekmju novērošanu. Mirstoši dzīvnieki un dzīvnieki, kam ir smaga briesmu sajūta vai ciešanas, ja tie ievēroti, ir jāizņem, humāni jānogalina un jāizdara autopsija. 1.4.3.2. Ķermeņa svars Visas vistas ir jānosver tieši pirms testa vielas pirmās ievadīšanas un vismaz reizi nedēļā pēc tam. 1.4.3.3. Bioķīmija Pēc nejaušās izvēles izraudzītas sešas vistas no vielas saņemšanas grupas un sešas vistas no nesēja kontroles grupas jānogalina dažas dienas pēc pēdējās devas, jāpreparē galvas smadzenes un muguras smadzenes un tajās jāanalizē ar neiropātiju saistītās esterāzes (NTE) kavēšanas aktivitāte. Turklāt var arī būt noderīgi sagatavot un analizēt sēžas nerva audus, lai noteiktu ar neiropātiju saistītās esterāzes (NTE) kavēšanas aktivitāti. Parasti pa trim putniem no kontroles grupas un no katras vielas saņemšanas grupas nogalina pēc 24 stundām un pa trim putniem pēc 48 stundām pēc pēdējās devas. Ja akūtā pētījuma vai citu pētījumu (piem., toksikokinētikas) dati norāda, ka vēlami ir citi nogalināšanas laiki pēc pēdējās dozēšanas, tad šie laiki ir jālieto, un pamatojums jādokumentē. Šiem paraugiem var izdarīt arī acetilholīnesterāzes (AchE) analīzes, ja to uzskata par lietderīgu. Tomēr in vivo var notikt spontāna AchE reaktivācija, un tādēļ vielas spēju kavēt AchE var novērtēt par zemu. 1.4.3.4. Autopsija Visu dzīvnieku (plānoti nogalināto un mirstošo nogalināto) autopsijā ir jāiekļauj galvas smadzeņu un muguras smadzeņu izskata novērojumi. 1.4.3.5. Histopatoloģiskie izmeklējumi Novērošanas laika posmā izdzīvojušo un bioķīmiskos pētījumos neizmantoto dzīvnieku nervu audi ir jāizmeklē mikroskopā. Audi ir jāfiksē in situ, izmantojot perfūzijas metodi. Audu griezumos jāiekļauj cerebellum (vidus garengriezuma līmenī), medulla oblongata, muguras smadzenes un perifērie nervi. Muguras smadzeņu griezumi ir jāņem no augšējā kakla daļas segmenta, torakālās vidusdaļas un jostasvietas daļas. Ir jāņem griezumi no tibiālā nerva un tā atzaru uz musculus gastrocnemius distālās daļas un no sēžas nerva. Griezumi ir jāiekrāso ar piemērotām mielīnam un aksoniem specifiskām krāsvielām. Sākotnēji visu kontroles grupas un lielākās devas grupas dzīvnieku konservētajiem audiem jāizdara mikroskopiskā izmeklēšana. Ja lielākās devas grupā ir ietekmes pierādījumi, ir jāizdara mikroskopiskā izmeklēšana arī vidējās un zemākās devas grupu vistām. 2. DATI Ja šajā metodē izraudzītajos beigu punktos (bioķīmijas, histopatoloģijas un izturēšanās novērojumos) ir iegūti negatīvi rezultāti, parasti nav vajadzīga turpmāka testēšana attiecībā uz aizkavēto neirotoksicitāti. Neviennozīmīgu vai neskaidru rezultātu gadījumā attiecībā uz šiem beigu punktiem var būt vajadzīga turpmāka izvērtēšana. Jānorāda dati par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati ir jāapkopo tabulas veidā, kurā katrai testa grupai parādīts dzīvnieku skaits testa sākumā, dzīvnieku skaits, kam novēroti audu bojājumi, ietekmes uz izturēšanos vai bioķīmiskas ietekmes, minēto audu bojājumu vai ietekmju veids un ilgums un dzīvnieku procentuālais daudzums atbilstīgi katra bojājuma vai ietekmes veidam un smagumam. Šā pētījuma rezultāti ir jāvērtē, ņemot vērā izturēšanās, bioķīmisko un histopatoloģisko ietekmju un citu novēroto ietekmju biežumu, smagumu un korelācijas katrā vielu saņēmušajā grupā un kontroles grupā. Skaitliskie rezultāti ir jānovērtē ar piemērotām un vispāratzītām statistikas metodēm. Statistikas metodes jāizvēlas, plānojot pētījumu. 3. ZIŅOJUMU SASTĀDĪŠANA Testa ziņojums Testa ziņojumā, ja iespējams, iekļauj šādu informāciju: Testa dzīvnieki: - izmantotā līnija, - dzīvnieku skaits un vecums, - izcelsme, turēšanas apstākļi u.c., - atsevišķo dzīvnieku svars testa sākumā. Testa apstākļi: - sīkas ziņas par testa vielas sagatavošanu, stabilitāti un homogēniskumu attiecīgā gadījumā, - nesēja izvēles pamatojums, - sīkas ziņas par testa vielas ievadīšanu, - sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti, - devu izvēles pamatojums, - devu specifikācija, iekļaujot sīkas ziņas par ievadītā materiāla nesēju, tilpumu un fizikālo formu, - citu laiku izvēles pamatojums bioķīmiskajām noteikšanām, ja tie nav 24 un 48 stundas. Rezultāti: - dati par ķermeņa svaru, - toksiskās atbildes reakcijas dati pa devu līmeņiem, iekļaujot mirstību, - nenovērojamas nelabvēlīgas ietekmes līmenis, - klīnisko novērojumu specifika, smagums un ilgums (atgriezenība vai neatgriezenība), - bioķīmisko metožu un konstatāciju sīki izstrādāts apraksts, - autopsijas konstatācijas, - visu histopatoloģisko konstatāciju sīki izstrādāts apraksts, - attiecīgā gadījumā rezultātu statistiskā apstrāde. Rezultātu izvērtējums. Secinājumi. 4. NORĀDES Šī metode ir analoga OECD TG 419. " -------------------------------------------------- V PIELIKUMS Skat. Komisijas Direktīvu 2001/59/EK, OV L 225, 21.8.2001., 1. lpp. --------------------------------------------------