Oficiālais Vēstnesis L 143 , 11/06/2003 Lpp. 0035 - 0049



Komisijas Lēmums (2003. gada 26. maijs), ar ko apstiprina Āfrikas cūku mēra diagnostikas rokasgrāmatu (izziņots ar dokumenta numuru C(2003) 1696) (dokuments attiecas uz EEZ) (2003/422/EK) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 2002. gada 27. jūnija Direktīvu 2002/60/EK, ar ko paredz īpašus noteikumus cīņai pret Āfrikas cūku mēri un groza Direktīvu 92/119/EEK attiecībā uz Tešenas slimību un Āfrikas cūku mēri [1], un jo īpaši tās 18. panta 3. punktu, tā kā: (1) Saskaņā ar Direktīvu 2002/60/EK jānosaka vienotas diagnostikas procedūras, paraugu ņemšanas metodes un laboratorisko pārbaužu rezultātu vērtēšanas kritēriji Āfrikas cūku mēra apstiprināšanai. (2) Saskaņā ar minēto direktīvu Kopienas references laboratorijai jautājumos, kas attiecas uz Āfrikas cūku mēri, apspriežoties ar Komisiju, ir jākoordinē dalībvalstīs izmantotās metodes slimības diagnostikai, inter alia organizējot periodiskas salīdzinošās pārbaudes un standarta reaģentu piegādi Kopienas līmenī. (3) Āfrikas cūku mēra vīrusu neuzskata par bīstamu cilvēku veselībai. (4) Ir izstrādātas laboratoriskās pārbaudes, kas ļauj ātri apstiprināt Āfrikas cūku mēri. (5) Ņemot vērā pēdējos gados gūto pieredzi cīņā pret Āfrikas cūku mēri, ir noteiktas vispiemērotākās paraugu ņemšanas procedūras un laboratorisko pārbaužu rezultātu vērtēšanas kritēriji šīs slimības pareizai diagnosticēšanai dažādos gadījumos. (6) Tādēļ ir lietderīgi apstiprināt rokasgrāmatu, kurā izklāstītas šīs procedūras un kritēriji. (7) Valstu diagnostikas laboratorijām jābūt tiesīgām modificēt atzītās laboratoriskās pārbaudes vai izmantot atšķirīgas pārbaudes, ja tām piemīt līdzvērtīgs jutīgums un specifiskums. (8) Šajā lēmumā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Pastāvīgās pārtikas aprites un dzīvnieku veselības komitejas atzinumu, IR PIEŅĒMUSI ŠO LĒMUMU. 1. pants 1. Ar šo apstiprina pielikumā iekļauto Āfrikas cūku mēra diagnostikas rokasgrāmatu. 2. Dalībvalstis nodrošina to, lai Āfrikas cūku mēris tiktu apstiprināts saskaņā ar procedūrām, paraugu ņemšanas metodēm un laboratorisko pārbaužu rezultātu vērtēšanas kritērijiem, kas paredzēti rokasgrāmatā un pamatojas uz: a) slimības klīnisko pazīmju un slimības izraisītu pēcnāves audu bojājumu atklāšanu; b) vīrusa, antigēna vai genoma atklāšanu cūkas audu, orgānu, asins vai izdalījumu paraugos; c) pierādījumu par specifisko antivielu veidošanos asins paraugos. 3. Atkāpjoties no 2. punkta, Direktīvas 2002/60/EK IV pielikumā minētās valstu diagnostikas laboratorijas var modificēt rokasgrāmatā minētās laboratoriskās pārbaudes vai izmantot atšķirīgas pārbaudes, ja tām piemīt līdzvērtīgs jutīgums un specifiskums. Ja izmanto modificētas vai atšķirīgas pārbaudes, to jutīgums un specifiskums jānovērtē periodiskās salīdzinošajās pārbaudēs, ko organizē Kopienas references laboratorija jautājumos, kas attiecas uz Āfrikas cūku mēri. 2. pants Šo lēmumu piemēro no 2003. gada 1 jūlija. 3. pants Šis lēmums ir adresēts dalībvalstīm. Briselē, 2003. gada 26. maijā Komisijas vārdā – Komisijas loceklis David Byrne [1] OV L 192, 20.7.2002., 27. lpp. -------------------------------------------------- PIELIKUMS ĀFRIKAS CŪKU MĒRA DIAGNOSTIKAS ROKASGRĀMATA I nodaļa Ievads, mērķi un definīcijas 1. Lai nodrošinātu vienotu procedūru izmantošanu Āfrikas cūku mēra (še turpmāk "ĀCM") diagnosticēšanai, šī rokasgrāmata: a) sniedz vadlīnijas un prasību minimumu attiecībā uz diagnostikas procedūrām, paraugu ņemšanas metodēm un klīnisko pārbaužu un pēcnāves apskates, kā arī laboratorisko pārbaužu rezultātu vērtēšanas kritērijiem pareizai ĀCM [1] diagnosticēšanai; b) nosaka obligātās bioloģiskās drošības prasības un kvalitātes standartus, kas jāievēro ĀCM diagnostikas laboratorijām un kas jāievēro attiecībā uz paraugu pārvadāšanu; c) nosaka ĀCM diagnosticēšanā izmantojamās laboratoriskās pārbaudes un ĀCM vīrusa izolāta ģenētiskajai tipizēšanai izmantojamās laboratorijas metodes. 2. Šī rokasgrāmata galvenokārt adresēta tām iestādēm, kas ir atbildīgas par cīņu pret ĀCM. Tādēļ tajā uzsvērti laboratorisko pārbaužu principi un pielietojums, kā arī to rezultātu vērtēšana, nevis sīki izstrādātas laboratorijas metodes. 3. Šajā rokasgrāmatā papildus definīcijām, kas minētas Direktīvas 2002/60/EK 2. pantā, piemēro šādas definīcijas: a) "iespējami inficētā saimniecība" ir saimniecība, kurā audzē cūkas un kurā ir viena vai vairākas ar ĀCM vīrusu iespējami inficētas cūkas, vai kontaktsaimniecība, kā definēts Direktīvas 2002/60/EK 2. panta k) punktā; b) "epidemioloģiskā apakšvienība" vai "apakšvienība" ir tāda ēka, vieta vai blakus esoša teritorija, kur saimniecībā esošo cūku grupas tiek turētas tādā veidā, ka tās bieži nonāk tiešā vai netiešā saskarē viena ar otru, bet vienlaikus tās ir nošķirtas no citām šīs saimniecības cūkām; d) "saskarē nonākušās cūkas" ir cūkas, kas dzīvoja saimniecībā tiešā saskarē ar vienu vai vairākām cūkām, par kurām ir aizdomas, ka pēdējās 21 dienas laikā tās ir inficētas ar ĀCM vīrusu. II nodaļa ĀCM apraksts, uzsverot diferenciāldiagnozi A. IEVADS 1. ĀCM izraisa DNS saturošs apvalka vīruss, kas pieder pie Asfarviridae dzimtas Asfivirus ģints. ĀCM vīrusa celmiem piemīt atšķirīga virulence, tomēr tiem nevar identificēt atšķirīgus serotipus. 2. ĀCM vīruss ir ļoti stabils inficēto cūku izdalījumos, cūku liemeņos un svaigā cūkgaļā, kā arī dažos cūkgaļas produktos. Lai nodrošinātu tā inaktivāciju vidē, jālieto pienācīgi dezinfekcijas līdzekļi. 3. Eiropā cūku inficēšanās dabiskā ceļā notiek galvenokārt orālā un nazālā veidā tiešā vai netiešā saskarē ar inficētām cūkām vai arī izbarojot ar vīrusu inficētu barību. Tomēr tajos apgabalos, kur sastopami vīrusu vektori [2], ļoti liela nozīme vīrusu noturīgumā un izplatībā ir to pārnešanai ar šiem vektoriem. ĀCM var izplatīties arī netiešā saskarē ar inficētiem materiāliem un ar kukaiņu kodumiem, mehāniski pārnesot ĀCM vīrusu. Iespējama slimības pārnešana arī ar inficētu kuiļu spermu. 4. Atsevišķiem dzīvniekiem inkubācijas periods ilgst apmēram piecas līdz piecpadsmit dienas, bet lauka apstākļos klīniskie simptomi saimniecībā var izpausties vairākas nedēļas pēc vīrusa ieviešanās vai pat vēlāk, ja vīrusa celmiem piemīt vāja virulence. 5. Ir sastopamas akūtas, subakūtas un hroniskas ĀCM formas, un atšķirība galvenokārt ir atkarīga no vīrusa virulences. 6. Cūkām, kas pēc infekcijas atveseļojas, virēmija saglabājas 40 līdz 60 dienas, un šīs cūkas kļūst par vīrusa nēsātājām. No cūkām, kas ir vīrusa nēsātājas, ĀCM vīruss ticis izdalīts līdz pat sešiem mēnešiem pēc infekcijas. B. AKŪTA FORMA 1. Saslimšanas pirmā klīniskā pazīme parasti ir augsta temperatūra (vairāk nekā 40 °C), kā arī vispārējs vājums, apetītes trūkums, strauja un apgrūtināta elpošana un izdalījumi no deguna un acīm. Cūkas izdara nekoordinētas kustības un tās spiežas cieši kopā. Sivēnmātēm visās grūsnības stadijās var sākties priekšlaicīga augļa izstumšana. Dažām cūkām var parādīties vemšana un aizcietējumi, bet citām var sākties asiņaina caureja. Parādās zemādas asinsvadu aizsprostojumi vai asinsizplūdumi, jo īpaši uz ekstremitātēm un ausīm. Pirms nāves, kas iestājas vienu līdz septiņas dienas pēc klīnisko pazīmju parādīšanās, var iestāties koma. Saslimstība un mirstība saimniecībā var sasniegt 100 %. Pēcnāves izmeklēšanas rezultāti norāda uz raksturīgu hemorāģisko sindromu ar vispārēju asinsvadu aizsprostojumu ķermenī, asiņainu šķidrumu krūšu un vēdera dobumā, palielinātu tumšas krāsas liesu, hemorāģiskiem limfmezgliem (jo īpaši nieru, kuņģa un aknu limfmezgliem), kas līdzinās asins recekļiem, petehiālu asiņošanu nierēs ([nieru] garozā, serdes piramīdās un nieru bļodiņā), vēdera serozajā apvalkā, kuņģa un zarnu gļotādā un sirdī (epikardā un endokardā), hidrotoraksu un petehiālu asiņošanu pleirā. 2. Kopumā klasiskā cūku mēra akūtā forma rada tādu klīnisko un patoloģisko ainu, kas ļoti līdzīga Āfrikas cūku mērim. Uz ādas un ausīm redzamo asiņošanu ir viegli pamanīt un tā var radīt aizdomas par akūtu klasisko vai Āfrikas cūku mēri. Dažas citas slimības rada līdzīgus audu bojājumus. Akūta Āfrikas cūku mēra saslimstības iespēja jāņem vērā arī gadījumos, kad pastāv aizdomas par streptodermiju, cūku reproduktīvo un respiratoro sindromu, saindēšanos ar kumarīnu, hemorāģisko purpuru, pēcatšķiršanas vispārējās novājēšanas sindromu, cūku dermatītu un nefropātijas sindromu, salmonellu vai pasterellu infekcijām vai kādiem citiem zarnu vai elpceļu saslimšanas sindromiem kopā ar drudzi, kas nepakļaujas ārstēšanai ar antibiotikām. C. SUBAKŪTAS FORMAS Slimības subakūtas formas biežāk sastopamas endēmiskos apgabalos. Subakūtai infekcijai raksturīgs viļņveida drudzis, vispārējs vājums un pneimonija. Sirds vājuma rezultātā var iestāties nāve. Subakūto formu gadījumā audu bojājumi ir līdzīgi tiem, kas sastopami slimības akūtajā formā, tikai mazāk izteikti. Raksturīgie audu bojājumi ir plaši asinsizplūdumi limfmezglos, nierēs un liesā, nosprostojumi plaušās un plaušu tūska, un dažos gadījumos intersticiāla pneimonija. D. HRONISKAS FORMAS Slimības hroniskās formas sastopamas reti. Hronisko formu gadījumā var novērot sekundāras baktēriju infekcijas. Tā kā hroniska ĀCM klīniskās pazīmes ir samērā nespecifiskas, diferenciāldiagnozē jāizvērtē vairākas citas slimības. Paaugstināta ķermeņa temperatūra var nebūt visiem dzīvniekiem, bet inficētā saimniecībā drudzi var konstatēt vismaz dažām cūkām. Hroniska ĀCM klīniskie simptomi var ietvert elpošanas traucējumus, priekšlaicīgu augļa izstumšanu, artrītu, hroniskas ādas čūlas vai nekrozi, kas nelīdzinās ĀCM vīrusu infekcijas raksturīgajai klīniskajai ainai. Audu bojājumi var būt minimāli vai to var nebūt. Histopatoloģisko izmeklējumu rezultātus raksturo palielināti limfmezgli un liesa, pleirīts un fibrinozs perikardīts, kā arī infiltrēts pneimonīts. Ir aprakstīta arī fokālā kazeozā nekroze un plaušu mineralizācija. III nodaļa Vadlīnijas par galvenajiem kritērijiem, kas jāņem vērā, lai saimniecību atzītu par ĀCM iespējami inficētu saimniecību 1. Lēmums atzīt saimniecību par iespējami inficētu jāpieņem, balstoties uz šādiem rādītājiem, kritērijiem un pamatojumiem: a) cūku klīniskie un patoloģiskie rādītāji. Galvenie klīniskie un patoloģiskie rādītāji, kas jāņem vērā, ir šādi: - drudzis apvienojumā ar visu vecumu cūku saslimstību un mirstību, - drudzis apvienojumā ar hemorāģisko sindromu; petehiālas un ekhimotiskas hemorāģijas, jo īpaši limfmezglos, nierēs, liesā (kas ir palielināta un tumšā krāsā, jo īpaši pie akūtām formām) un urīnpūslī, kā arī čūlas žultspūslī; b) epidemioloģiskie rādītāji. Galvenie epidemioloģiskie rādītāji, kas jāņem vērā, ir šādi: - cūkām ir bijusi tieša vai netieša saskare ar tādu saimniecību, kurā audzē cūkas un attiecībā uz kuru ir atzīts, ka tā ir bijusi inficēta ar ĀCM vīrusu, - cūkām, ko piegādājusi saimniecība, vēlāk ir konstatēta inficēšanās ar ĀCM vīrusu, - sivēnmātes ir mākslīgi apsēklotas ar spermu, kas iegūta no iespējami inficēta avota, - ir bijusi tieša vai netieša saskare ar tādas populācijas savvaļas cūkām, kur sastopams ĀCM, - cūkas tiek turētas āra apstākļos tādā apgabalā, kur savvaļas cūkas ir inficētas ar ĀCM vīrusu, - cūkas ir barotas ar pārtikas atkritumiem un pastāv aizdomas, ka šie pārtikas atkritumi nav apstrādāti tādā veidā, lai inaktivētu ĀCM vīrusu, - iespējams ir notikusi iedarbība, piemēram, saimniecībā, transportlīdzeklī utt. iekļuvušas personas no iespējami inficētām vai ar ĀCM vīrusu inficētām saimniecībām, - teritorijā, kur atrodas saimniecība, sastopami vīrusa vektori. 2. Saimniecība jāuzskata par iespējami inficētu saimniecību ikvienā gadījumā, ja saimniecībā radušās aizdomas par klasisko cūku mēri klīnisko vai patoloģisko rādītāju dēļ, taču klīniskie, epidemioloģiskie vai laboratoriskie izmeklējumi nav apstiprinājuši šo slimību vai nav ļāvuši identificēt citus slimības avotus vai izraisītājus minētajā saimniecībā. IV nodaļa Pārbaudes un paraugu ņemšanas procedūras A. VADLĪNIJAS UN PROCEDŪRAS CŪKU KLĪNISKĀM PĀRBAUDĒM UN PARAUGU ŅEMŠANAI IESPĒJAMI INFICĒTĀS SAIMNIECĪBĀS 1. Dalībvalstis nodrošina to, ka iespējami inficētās saimniecībās veic pienācīgas klīniskās pārbaudes, paraugu ņemšanu un laboratoriskos izmeklējumus, lai apstiprinātu vai izslēgtu ĀCM, saskaņā ar 2. līdz 6. punktā izklāstītajām vadlīnijām un procedūrām. Neatkarīgi no Direktīvas 2002/60/EK 4. panta 2. punktā minēto pasākumu pieņemšanas attiecīgajā saimniecībā šīs vadlīnijas un procedūras piemēro arī tajos saslimšanas gadījumos, kad ĀCM ir iekļauts diferenciāldiagnozē. Tas ietver arī gadījumus, kad cūkām novērotās slimības klīniskās pazīmes un epidemioloģiskā aina norāda uz ļoti zemu ĀCM saslimstības iespējamību. Visos citos gadījumos, kad ir aizdomas par vienas vai vairāku cūku inficēšanos ar ĀCM vīrusu, attiecīgajā iespējami inficētajā saimniecībā veic Direktīvas 2002/60/EK 4. panta 2. punktā minētos pasākumus. Vadlīnijas un procedūras, kas izklāstītas 2. līdz 6. punktā, mutatis mutandis piemēro arī gadījumā, kad pastāv aizdomas par kautuvē vai transportlīdzeklī esošo cūku saslimšanu ar ĀCM. 2. Kad valsts pilnvarots veterinārārsts ierodas iespējami inficētā saimniecībā, lai apstiprinātu vai izslēgtu ĀCM klātbūtni: - jāveic saimniecības produkcijas un [dzīvnieku] slimības vēstures pārbaude, ja šāda vēsture ir pieejama; pārbaude jāveic katrā saimniecības apakšvienībā, lai atlasītu klīniski pārbaudāmās cūkas. Klīniskajā pārbaudē jāiekļauj ķermeņa temperatūras mērīšana, un tā jāveic galvenokārt šādām cūkām vai šādu cūku grupai: - slimas cūkas vai cūkas ar anoreksiju, - cūkas, kas nesen ievestas no vietām, kur apstiprinājies infekcijas uzliesmojums, vai no citiem iespējami inficētiem avotiem, - cūkas, kuras tur tādās apakšvienībās, ko nesen apmeklējušas nepiederošas personas, kuras nesen nonākušas ciešā saskarē ar ĀCM iespējami inficētām vai inficētām cūkām vai attiecībā uz kurām atklājusies cita īpaši riskanta saskare ar iespējamu ĀCM vīrusu avotu, - cūkas, kurām jau ņemti paraugi un kuras seroloģiski pārbaudītas attiecībā uz ĀCM, gadījumos, ja šo pārbaužu rezultāti neļauj izslēgt ĀCM klātbūtni, vai saskarē nonākušās cūkas, - cūkas, kas nesen izcietušas slimību un atveseļojušās. Ja pārbaudē, kas veikta iespējami inficētajā saimniecībā, nav atklātas tādas cūkas vai tādu cūku grupa, kas minētas iepriekšējā daļā, kompetentā iestāde, neierobežojot pārējos pasākumus, kurus var piemērot attiecīgajā saimniecībā saskaņā ar Direktīvu 2002/60/EK, un ņemot vērā epidemioloģisko situāciju: - attiecīgajā saimniecībā veic papildu pārbaudes saskaņā ar 3. punktu, vai - nodrošina to, lai minētajā saimniecībā cūkām tiktu paņemti asins paraugi laboratorisko pārbaužu veikšanai (šajā gadījumā orientējoši izmanto paraugu ņemšanas procedūras, kas izklāstītas 5. punktā un F iedaļas 2. punktā), vai - līdz turpmākiem izmeklējumiem attiecīgajā saimniecībā pieņem vai patur spēkā pasākumus, kas paredzēti Direktīvas 2002/60/EK 4. panta 2. punktā, vai - izslēdz aizdomas par ĀCM klātbūtni. 3. Ja izdarīta atsauce uz šo punktu, klīnisko pārbaudi attiecīgajā saimniecībā jāveic cūkām, kas izlases veidā atlasītas apakšvienībās, attiecībā uz kurām ir konstatēts ĀCM vīrusa ienešanas risks vai ir aizdomas par tā ienešanu. Jāpārbauda vismaz tāds skaits cūku, lai šajās apakšvienībās ar 95 % ticamību varētu konstatēt drudzi, ja tas sastopams ar 10 % izplatību. 4. Ja iespējami inficētā saimniecībā konstatē nobeigušās vai mirstošas cūkas, jāveic pēcnāves apskate vēlams vismaz piecām no minētajām cūkām un jo īpaši tām cūkām, kam: - pirms nobeigšanās novērotas ļoti izteiktas slimības pazīmes, - bijis drudzis, - kas nobeigušās nesen. Ja šajās pārbaudēs netiek atklāti audu bojājumi, kas norāda uz ĀCM, bet, ņemot vērā epidemioloģisko situāciju, tiek uzskatīts par vajadzīgu veikt papildu izmeklējumus: - apakšvienībā, kurā tika turētas nobeigušās vai mirstošas cūkas, ir jāveic klīniska pārbaude atbilstoši 3. punktam un asins paraugu ņemšana atbilstoši 5. punktam, un - pēcnāves apskates var veikt trim līdz piecām saskarē nonākušām cūkām, jo īpaši, ja šīm cūkām vērojamas klīniskās pazīmes. Neatkarīgi no tā, vai ir audu bojājumi, kas norāda uz ĀCM, no cūkām, kam veikta pēcnāves apskate, jāsavāc orgānu vai audu paraugi virusoloģiskām pārbaudēm saskaņā ar V nodaļas B iedaļas 1. punktu. Šos paraugus vēlams ņemt no tādām cūkām, kas nobeigušās nesen. Ja tiek veikta pēcnāves apskate, kompetentajai iestādei jānodrošina tas, ka: - tiek veikti vajadzīgie piesardzības un higiēnas pasākumi, lai novērstu slimības izplatīšanos, un - mirstošas cūkas tiek nogalinātas humānā veidā saskaņā ar Padomes 1993. gada 22. decembra Direktīvu 93/119/EEK par dzīvnieku aizsardzību nokaušanas vai nogalināšanas laikā [3], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EK) Nr. 806/2003 [4]. 5. Ja iespējami inficētajā saimniecībā netiek atklātas citas klīniskās pazīmes vai audu bojājumi, kas norāda uz ĀCM, bet kompetentā iestāde uzskata, ka ar šiem rādītājiem nepietiek, lai apstiprinātu ĀCM uzliesmojumu, un ka tādēļ ir vajadzīgas laboratoriskās pārbaudes, laboratoriskām pārbaudēm ir jāņem asins paraugi no iespējami inficētajām cūkām un no citām cūkām katrā apakšvienībā, kurā tiek turētas iespējami inficētās cūkas, saskaņā ar šādām procedūrām: a) seroloģiskajiem testiem jāņem vismaz tāds skaits paraugu, lai attiecīgajā apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 10 % seroprevalanci; b) virusoloģiskajiem testiem ņemto paraugu skaits ir saskaņā ar kompetentās iestādes norādījumiem, kuros ņemts vērā visu veicamo testu diapazons, izmantojamo laboratorisko pārbaužu jutīgums un epidemioloģiskā situācija. 6. Ja pēc pārbaudes, kas veikta iespējami inficētajā saimniecībā, netiek konstatētas klīniskās pazīmes vai audu bojājumi, kas norāda uz ĀCM, bet, lai izslēgtu ĀCM, kompetentā iestādē uzskata par nepieciešamu veikt papildu laboratoriskās pārbaudes, orientējoši izmanto paraugu ņemšanas procedūras, kas noteiktas 5. punktā. B. PARAUGU ŅEMŠANAS PROCEDŪRAS SAIMNIECĪBĀ, JA CŪKAS IR NOGALINĀTAS PĒC SLIMĪBAS APSTIPRINĀŠANĀS 1. Lai varētu noteikt ĀCM vīrusa ienešanas veidu inficētajā saimniecībā un laika posmu, kas pagājis kopš tā ienešanas, gadījumos, kad saimniecībā cūkas tiek nogalinātas pēc slimības uzliesmojuma apstiprināšanās saskaņā ar Direktīvas 2002/60/EK 5. panta 1. punkta a) apakšpunktu, tās nogalinot, izlases veidā jāņem asins paraugi seroloģiskajiem testiem. 2. Paraugi jāņem vismaz no tāda cūku skaita, lai cūkām katrā saimniecības apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 10 % seroprevalanci [5]. Paraugi jāņem arī virusoloģiskajiem testiem saskaņā ar kompetentās iestādes norādījumiem, kuros ņemts vērā visu veicamo testu diapazons, izmantojamo laboratorisko pārbaužu jutīgums un epidemioloģiskā situācija. Apgabalos, kur agrāk novērota ar ĀCM vīrusu inficētu vektoru klātbūtne, jāsavāc arī attiecīgas Argazīdu dzimtas ērces virusoloģiskajiem testiem saskaņā ar kompetentās iestādes norādījumiem un Direktīvas 2002/60/EK III pielikumu. 3. Tomēr sekundāru uzliesmojumu gadījumos kompetentā iestāde var nolemt atkāpties no 1. un 2. punkta un noteikt citas paraugu ņemšanas procedūras, ņemot vērā epidemioloģisko informāciju, kas attiecīgajā izcelsmes vietā jau pieejama, un to, kādā veidā vīruss ienests saimniecībā, kā arī slimības potenciālo izplatību ārpus saimniecības. C. PARAUGU ŅEMŠANAS PROCEDŪRAS GADĪJUMOS, KAD CŪKAS TIEK NOGALINĀTAS, VEICOT AIZSARGPASĀKUMUS IESPĒJAMI INFICĒTAJĀ SAIMNIECĪBĀ 1. Lai varētu apstiprināt vai izslēgt ĀCM klātbūtni un iegūt papildu epidemioloģisko informāciju, gadījumos, kad cūkas tiek nogalinātas, veicot aizsargpasākumus iespējami inficētā saimniecībā saskaņā ar Direktīvas 2002/60/EK 4. panta 3. punkta a) apakšpunktu vai 7. panta 2. punktu, jāņem asins paraugi seroloģiskajiem testiem un asins paraugi virusoloģiskajiem testiem saskaņā ar 2. punktā noteikto procedūru. 2. Paraugu ņemšanai galvenokārt jāattiecas uz: - tādām cūkām, kam vērojamas pazīmes vai pēcnāves audu bojājumi, kuri norāda uz ĀCM, un cūkām, kas nonākušas ar tām saskarē, - citām cūkām, kurām varētu būt bijusi bīstama saskare ar inficētām vai iespējami inficētām cūkām vai attiecībā uz kurām pastāv aizdomas par ĀCM vīrusa infekciju. No šīm cūkām jāņem paraugi saskaņā ar kompetentās iestādes norādījumiem, kuros ņemta vērā epidemioloģiskā situācija. Turklāt cūkas paraugu ņemšanai no katras saimniecības apakšvienības jāizvēlas izlases veidā [6]. Šajā gadījumā seroloģiskajiem testiem jāņem vismaz tāds skaits paraugu, lai attiecīgajā apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 10 % seroprevalanci. Virusoloģiskajiem testiem ņemto paraugu veidam un izmantojamajam testam jābūt saskaņā ar kompetentās iestādes norādījumiem, kuros ņemts vērā visu veicamo testu diapazons, šo testu jutīgums un epidemioloģiskā situācija. D. PĀRBAUDES UN PARAUGU ŅEMŠANAS PROCEDŪRAS, KAS JĀVEIC PIRMS TIEK DOTA ATĻAUJA PĀRVIETOT CŪKAS NO SAIMNIECĪBĀM, KURAS ATRODAS AIZSARDZĪBAS VAI UZRAUDZĪBAS ZONĀ, UN GADĪJUMĀ, JA ŠĪS CŪKAS NOKAUJ VAI NOGALINA (DIREKTĪVAS 2002/60/EK 10. UN 11. PANTS) 1. Neierobežojot Direktīvas 2002/60/EK 11. panta 1. punkta f) apakšpunkta otrās daļas noteikumus, lai saskaņā ar minētās direktīvas 10. panta 3. punktu varētu dot atļauju pārvietot cūkas no saimniecības, kas atrodas aizsardzības vai uzraudzības zonā, valsts pilnvarotam veterinārārstam jāveic klīniskā pārbaude, kurai: - jānotiek 24 stundu laikā pirms cūku pārvietošanas, - jābūt saskaņā ar A iedaļas 2. punkta noteikumiem. 2. Gadījumā, ja cūkas jāpārvieto uz citu saimniecību, papildus tiem izmeklējumiem, kas jāveic saskaņā ar 1. punktu, katrā tās saimniecības apakšvienībā, kurā tiek turētas pārvietojamās cūkas, jāveic cūku klīniskā pārbaude, ieskaitot temperatūras mērīšanu daļai cūku. Jāpārbauda vismaz tāds skaits cūku, lai šajās apakšvienībās ar 95 % ticamību varētu konstatēt drudzi, ja tas sastopams ar 10 % izplatību. 3. Attiecībā uz cūkām, kas jāpārved uz kautuvi, pārstrādes rūpnīcu vai citām vietām, lai tur tās nogalinātu vai nokautu, papildus izmeklējumiem, kas jāveic saskaņā ar 1. punktu, katrā apakšvienībā, kurā tiek turētas pārvietojamās cūkas, jāveic cūku klīniskā pārbaude. Attiecībā uz cūkām, kas vecākas par trīs līdz četriem mēnešiem, šajā pārbaudē jāiekļauj temperatūras mērīšana daļai cūku. Jāpārbauda vismaz tāds skaits cūku, lai attiecīgajās apakšvienībās ar 95 % ticamību varētu konstatēt drudzi, ja tas sastopams ar 20 % izplatību. 4. Nokaujot vai nogalinot 3. punktā minētās cūkas, asins paraugi seroloģiskajiem testiem vai asins vai orgānu paraugi, piemēram, mandeles, liesa vai limfmezgli virusoloģiskajiem testiem jāņem no cūkām katrā tādā apakšvienībā, no kuras cūkas tiek pārvietotas. Jāņem vismaz tāds skaits paraugu, lai katrā apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 10 % seroprevalanci vai vīrusa prevalanci. Ņemto paraugu veidam un izmantojamajam testam jābūt saskaņā ar kompetentās iestādes norādījumiem, kuros ņemts vērā visu veicamo testu diapazons, šo testu jutīgums un epidemioloģiskā situācija. 5. Tomēr, ja, nokaujot vai nogalinot cūkas, tiek konstatētas klīniskās pazīmes vai pēcnāves audu bojājumi, kas norāda uz ĀCM, tad, atkāpjoties no 4. punkta, piemēro C iedaļas noteikumus par paraugu ņemšanu. 6. Direktīvas 2002/60/EK 10. panta 5. punktā un 11. panta 4. punktā paredzēto atkāpi var piešķirt tad, ja kompetentās iestādes nodrošina to, ka intensīvas paraugu ņemšanas un testēšanas sistēmu piemēro arī to 2., 3. un 4. punktā minēto cūku grupām, kas jāpārbauda vai kam jāņem paraugi. Saskaņā ar šo sistēmu jāņem vismaz tāds skaits asins paraugu, lai attiecīgajā cūku grupā ar 95 % ticamību varētu noteikt 5 % seroprevalenci. E. PĀRBAUDES UN PARAUGU ŅEMŠANAS PROCEDŪRAS, KAS JĀVEIC SAIMNIECĪBĀ SAISTĪBĀ AR POPULĀCIJAS ATJAUNOŠANU 1. Ja saimniecībā atsāk audzēt cūkas saskaņā ar Direktīvas 2002/60/EK 13. panta 3. punktu, jāpiemēro šādas paraugu ņemšanas procedūras: - asins paraugi jāsavāc ne agrāk kā 45 dienas pēc cūku audzēšanas atsākšanas, - ja atsāk audzēt kontrolcūkas, asins paraugi seroloģiskajiem testiem jāņem izlases veidā no tāda cūku skaita, lai katrā saimniecības apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 10 % seroprevalanci, - ja populāciju atjauno pilnībā, asins paraugi seroloģiskajiem testiem jāņem izlases veidā no tāda cūku skaita, lai katrā saimniecības apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 20 % seroprevalanci. 2. Ja saimniecībā atsāk audzēt cūkas saskaņā ar Direktīvas 2002/60/EK 13. panta 4. punktu, jāpiemēro šādas paraugu ņemšanas procedūras: - asins paraugi jāsavāc ne agrāk kā 45 dienas pēc cūku audzēšanas atsākšanas, - ja atsāk audzēt kontrolcūkas, asins paraugus seroloģiskajiem testiem jāņem izlases veidā no tāda cūku skaita, lai katrā saimniecības apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 5 % seroprevalanci, - ja populāciju atjauno pilnībā, asins paraugus seroloģiskajiem testiem jāņem izlases veidā no tāda cūku skaita, lai katrā saimniecības apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 10 % seroprevalanci. Pēc tam trešajā ievilkumā izklāstītā procedūra jāatkārto ne agrāk kā 60 dienas pēc pilnīgas populācijas atjaunošanas. 3. Pēc cūku populācijas atjaunošanas kompetentā iestāde nodrošina to, lai gadījumā, ja saimniecībā nezināmu iemeslu dēļ bijis kāds cūku slimības vai nāves gadījums, attiecīgajām cūkām nekavējoties veiktu ĀCM testus. Šos noteikumus piemēro līdz Direktīvas 2002/50/EK 13. panta 3. punkta a) un b) apakšpunktā un 4. punktā minēto cūku pārvietošanas ierobežojumu atcelšanai attiecīgajā saimniecībā. F. PARAUGU ŅEMŠANAS PROCEDŪRAS, KAS JĀVEIC AIZSARDZĪBAS ZONĀ IZVIETOTAJĀS SAIMNIECĪBĀS PIRMS IEROBEŽOJUMU ATCELŠANAS 1. Lai aizsardzības zonā varētu atcelt Direktīvas 2002/60/EK 10. pantā minētos pasākumus, visās šīs zonas saimniecībās: - jāveic klīniskā pārbaude saskaņā ar A iedaļas 2. un 3. punktā noteiktajām procedūrām, - jāņem asins paraugi seroloģiskajiem testiem, kā noteikts 2. punktā. 2. Jāņem vismaz tāds skaits asins paraugu, lai cūkām katrā saimniecības apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 10 % seroprevalanci. Tomēr Direktīvas 2002/60/EK 10. panta 5. punktā un 11. panta 4. punktā paredzēto atkāpi var piešķirt tikai tad, ja kompetentā iestāde nodrošina to, ka ņemto asins paraugu skaits katrā saimniecības apakšvienībā ar 95 % ticamību ļauj noteikt 5 % seroprevalenci. G. PARAUGU ŅEMŠANAS PROCEDŪRAS, KAS JĀVEIC UZRAUDZĪBAS ZONĀ IZVIETOTAJĀS SAIMNIECĪBĀS PIRMS IEROBEŽOJUMU ATCELŠANAS 1. Lai uzraudzības zonā varētu atcelt Direktīvas 2002/60/EK 11. pantā minētos pasākumus, visās saimniecībās, kas atrodas šajā zonā, saskaņā ar A iedaļas 2. punktā noteiktajām procedūrām jāveic klīniskā pārbaude. Turklāt asins paraugi seroloģiskajiem testiem jāņem no cūkām: - jebkurā citā saimniecībā, kurā paraugu ņemšanu kompetentā iestāde uzskata par nepieciešamu, - visos spermas savākšanas centros. 2. Ja saimniecībās, kas atrodas uzraudzības zonā, ņem asins paraugus seroloģiskajiem testiem, šajās saimniecībās ņemto asins paraugu skaitam jābūt saskaņā ar F iedaļas 2. punkta pirmā teikuma noteikumiem. Tomēr Direktīvas 2002/60/EK 10. panta 5. punktā un 11. panta 4. punktā paredzēto atkāpi var piešķirt tikai tad, ja kompetentā iestāde nodrošina to, ka katrā saimniecībā, kas atrodas uzraudzības zonā, tiek ņemti asins paraugi seroloģiskajiem testiem. Jāņem vismaz tāds skaits asins paraugu, lai katrā saimniecības apakšvienībā ar 95 % ticamību varētu noteikt 5 % seroprevalanci. H. SEROLOĢISKĀS UZRAUDZĪBAS UN PARAUGU ŅEMŠANAS PROCEDŪRAS, KAS JĀVEIC APGABALOS, KUR PASTĀV AIZDOMAS PAR SAVVAĻAS CŪKU SASLIMŠANU AR ĀCM VAI KUR IR APSTIPRINĀTA TO SASLIMŠANA 1. Ja savvaļas cūku seroloģisko uzraudzību veic apgabalos, kur ir apstiprināta saslimšana ar ĀCM vai ir aizdomas par saslimšanu ar ĀCM, ņemamo paraugu skaita noteikšanai iepriekš jānosaka pārbaudāmās mērķa populācijas lielums un ģeogrāfiskais apgabals. Parauga lielums jānosaka atkarībā no aprēķinātajiem dzīvajiem dzīvniekiem, nevis no nošautajiem dzīvniekiem. 2. Ja dati par populācijas blīvumu un lielumu nav pieejami, jānosaka paraugu ņemšanas ģeogrāfiskais apgabals, ņemot vērā pastāvīgu savvaļas cūku klātbūtni un dabiskos vai mākslīgos ierobežojumus, kas ļauj efektīvi novērst plašu un pastāvīgu dzīvnieku pārvietošanos. Ja šādi apstākļi nepastāv vai attiecībā uz plašām teritorijām, ieteicams noteikt apmēram 200 km2 lielus paraugu ņemšanas apgabalus, kur parasti mitinās apmēram 400 līdz 1000 savvaļas cūku. 3. Neierobežojot Direktīvas 2002/60/EK 15. panta 2. punkta c) apakšpunkta noteikumus, noteiktajā paraugu ņemšanas apgabalā paraugu ņemšanai jāatlasa vismaz tāds cūku skaits, lai ar 95 % ticamību varētu noteikt 5 % seroprevalanci. Šim nolūkam katrā noteiktajā apgabalā paraugi jāņem vismaz no 56 dzīvniekiem. 4. Paraugu ņemšanu virusoloģiskajiem testiem no savvaļas cūkām, kas nošautas vai atrastas beigtas, jāveic, kā noteikts V nodaļas B iedaļas 1. punktā. Ja uzskata par vajadzīgu veikt nošauto savvaļas cūku virusoloģisko uzraudzību, tā jāveic galvenokārt dzīvniekiem, kuri nav vecāki par vienu gadu. 5. Visiem uz laboratoriju nosūtāmajiem paraugiem jāpievieno anketa, kas minēta Direktīvas 2002/60/EK 16. panta 3. punkta h) apakšpunktā. V nodaļa Vispārējas procedūras un kritēriji paraugu ņemšanai un pārvadāšanai A. VISPĀRĒJAS PROCEDŪRAS UN KRITĒRIJI 1. Pirms paraugu ņemšanas iespējami inficētajā saimniecībā jāsagatavo saimniecības plāns un jāidentificē saimniecības epidemioloģiskās apakšvienības. 2. Katru reizi, kad uzskata, ka varētu būt vajadzīga atkārtota paraugu ņemšana no cūkām, visām cūkām, no kurām ņem paraugus, jābūt īpaši marķētām, lai tām varētu viegli veikt atkārtotu paraugu ņemšanu. 3. Visi paraugi jānosūta uz laboratoriju kopā ar attiecīgām veidlapām saskaņā ar kompetentās iestādes noteiktajām prasībām. Šajās veidlapās iekļauj sīkas ziņas par to cūku slimības vēsturi, no kurām ņemti paraugi, kā arī novērotās klīniskās pazīmes vai pēcnāves audu bojājumus. Ja cūkas tur saimniecībā, jāsniedz precīza informācija par to cūku vecumu, kategoriju un izcelsmes saimniecību, no kurām ņemti paraugi. Ieteicams ierakstīt katras tās cūkas atrašanās vietu saimniecībā, no kuras ņemti paraugi, norādot arī tās īpašo identifikācijas marķējumu. B. PARAUGU SAVĀKŠANA VIRUSOLOĢISKAJIEM TESTIEM 1. Piemērotākie paraugi ĀCM vīrusa, antigēna vai genoma noteikšanai beigtām vai humānā veidā nogalinātām cūkām ir mandeļu, limfmezglu (kuņģa un aknu, nieru, zemžokļu un retrofaringeālie), liesas, nieru un plaušu audi [7]. Autolizētu liemeņu gadījumā paraugam izvēlas visu garo kaulu vai krūšu kaulu. 2. No cūkām, kam ir drudža pazīmes vai citas slimības pazīmes, saskaņā ar kompetentās iestādes norādījumiem ņem nesarecējušu asiņu un/vai sarecējušu asiņu paraugus. C. PARAUGU TRANSPORTĒŠANA 1. Ieteicams, lai visi paraugi: - būtu pienācīgi identificēti, - tiktu transportēti un uzglabāti ūdens necaurlaidīgās tvertnēs, - tiktu turēti vēsumā ledusskapja temperatūrā; tomēr, ja sagaidāms, ka paraugus nogādās laboratorijā vēlāk nekā pēc 48 stundām, ir jāsazinās ar laboratoriju, lai saņemtu norādījumus par vispiemērotākajiem temperatūras apstākļiem pārvadāšanas laikā, - tiktu cik vien iespējams ātri nogādāti laboratorijā, - tiktu uzglabāti iepakojumā ar dzesēšanas elementiem vai sauso ledu, kas tos atvēsina, - kas ņemti no audiem un orgāniem, tiktu ievietoti atsevišķās noslēgtās plastikāta tvertnēs un tiktu pienācīgi marķēti. Tās savukārt jāievieto lielākās tvertnēs, kas izklātas ar pietiekoši absorbējošu materiālu, kas tos aizsargā un uzsūc jebkādu noplūdi, - ja iespējams, lai kompetentā persona tos transportētu tieši uz laboratoriju, lai nodrošinātu ātru un drošu piegādi. 2. Iepakojuma ārpusē jābūt marķējumam, kur norādīta saņēmējas laboratorijas adrese, un uz tā skaidri jānorāda šāds teksts: "Dzīvnieku patoloģiskais materiāls; ātri bojājas; trausls; atvērt tikai ĀCM laboratorijā." 3. Laboratorijas atbildīgā persona, kas saņem paraugus, savlaicīgi jāinformē par paraugu piegādi. 4. Nogādājot paraugus uz Kopienas ĀCM references laboratoriju [8] ar gaisa transportu, iepakojums jāmarķē saskaņā ar Starptautiskās gaisa transporta asociācijas (IATA) noteikumiem. VI nodaļa Virusoloģisko testu principi un izmantošana, kā arī to rezultātu vērtēšana A. VĪRUSA ANTIGĒNU NOTEIKŠANA 1. Tiešā imunofluorescences analīze (DIFT) Testa pamatā ir vīrusu antigēnu noteikšana ar mikroskopu – uztriepēs vai šauros kriostatiskos tāda orgānu materiāla griezumos, kas ņemts no iespējami ar ĀCM inficētām cūkām. Izmantojot FIT konjugētas [9] specifiskās antivielas, nosaka intracelulāros antigēnus. Inficēto šūnu citoplazmā parādās fluorescējošie insercijas organismi vai granulas. Piemēroti orgāni ir nieres, liesa un dažādi limfmezgli. Attiecībā uz savvaļas cūkām var izmantot arī kaulu smadzeņu šūnu uztriepes, ja to orgāni nav pieejami vai ir autolizēti. Analīzi var veikt divās stundās. Tā kā orgānu paraugus var iegūt tikai no beigtiem dzīvniekiem, to izmantošana skrīningam ir ierobežota. Šis ir ļoti jutīgs tests akūta ĀCM gadījumiem. Attiecībā uz subakūtām vai hroniskām formām DIFT jutīgums ir tikai apmēram 40 %, iespējams, antigēnu un antivielu kompleksu klātbūtnes dēļ, jo tie bloķē reakciju ar ĀCM konjugētu antivielu. Testa rezultātu ticamību var ierobežot neviennozīmīga krāsu reakcija, jo īpaši, ja trūkst atbilstošas pieredzes testa veikšanā vai pārbaudāmie orgāni ir autolizēti. 2. ELISA antigēnu noteikšanai Vīrusa antigēnus var noteikt, arī izmantojot ELISA metodi, bet tā ir ieteicama vienīgi slimības akūtām formām sakarā ar tās zemo jutīgumu, klātesot antigēna un antivielas kompleksiem. Antigēna ELISA jutīgumam jābūt pietiekoši augstam, lai dotu pozitīvu rezultātu tādu dzīvnieku gadījumā, kam vērojamas akūta ĀCM klīniskās pazīmes. Katrā gadījumā šo testu ir ieteicams izmantot vienīgi kā "ganāmpulka" testu un saistībā ar citiem virusoloģiskiem testiem. B. VĪRUSA IZOLĀCIJA UN NOTEIKŠANA AR HEMADSORBCIJAS TESTU (HAD) 1. Vīrusa izolācijas pamatā ir parauga materiāla uzsēšana pret vīrusu uzņēmīgām cūku izcelsmes šūnu kultūrām, monocītiem un makrofāgiem. ĀCM vīrusa izolēšanā priekšroku dod tādiem paraugiem kā nesadalītas asinis un leikocīti, kas iegūti no nesarecējušu asiņu paraugiem, vai orgāni, kuri minēti A iedaļas 1. punktā. Ja paraugā ir ĀCM vīruss, tas šūnās replicējas un inficētajās šūnās rodas raksturīgs citopātisks efekts. 2. HAD metode ir ieteicama ĀCM vīrusa izolātu noteikšanai tās augstā jutīguma un specifiskuma dēļ. HAD pamatā ir ĀCM vīrusa spēja replicēties cūku makrofāgu šūnās un izraisīt hemadsorbciju cūku eritrocītu klātbūtnē. Ap inficētajiem makrofāgiem izveidojas raksturīga eritrocītu "rozete". Tomēr neliels daudzums ĀCM savvaļas vīrusa celmu var arī neizraisīt hemadsorbciju, bet tie rada citopātisku efektu. Šos celmus var specifiski noteikt, izmantojot DIF testu šūnu kultūru nogulsnēm vai polimerāzes ķēdes reakciju (PĶR). 3. Vīrusa izolācija visvairāk piemērota tam, lai izmeklētu paraugus, kas ņemti no neliela dzīvnieku skaita, nevis lai veiktu masveida uzraudzību. Vīrusa izolācijas procedūra ir darbietilpīga un rezultātu iegūšanai nepieciešams vienu līdz trīs dienas ilgs laika posms. Nelielu vīrusa daudzumu atklāšanai paraugā varētu būt vajadzīgas vēl divas šūnu kultūras. Tādēļ līdz izmeklēšanas gala rezultātu iegūšanai var paiet līdz pat 10 dienām. Autolizēti paraugi var būt citotoksiski attiecībā pret šūnu kultūru un tādējādi to izmantošana var būt ierobežota. 4. Vīrusa izolāciju un identifikāciju ar HAD iesaka kā references testu, lai apstiprinātu agrāk veiktas ELISA, PĶR vai DIFT pozitīvos rezultātus. Tās ir ieteicamas arī tad, ja ĀCM jau ir apstiprināts ar citām metodēm, konkrēti, sākotnējā ĀCM uzliesmojuma vai ĀCM infekcijas gadījumā. Vīrusa raksturošanai un molekulārajai epidemioloģijai var izmantot ĀCM vīrusus, kas izolēti cūku makrofāgos. 5. Visi ĀCM vīrusa izolāti, kas iegūti no sākotnējiem ĀCM uzliesmojumiem, sākotnējiem savvaļas cūku ĀCM infekcijas gadījumiem vai ĀCM infekcijas gadījumiem kautuvēs vai transportlīdzekļos, jāapraksta dalībvalstu references laboratorijām vai citām laboratorijām, kuras pilnvarojusi attiecīgā dalībvalsts, vai Kopienas references laboratorijai saskaņā ar E iedaļas noteikumiem. Jebkurā gadījumā šie vīrusa izolāti nekavējoties jānosūta Kopienas references laboratorijai, lai papildinātu vīrusu kolekciju. C. VĪRUSA GENOMA NOTEIKŠANA 1. Lai noteiktu vīrusa genomu asins, seruma, audu vai orgānu paraugos, izmanto PĶR. Polimerāzes ķēdes reakcijā (PĶR) nelielus vīrusa DNS fragmentus pavairo līdz nosakāmiem daudzumiem. Izmantojot praimerus no labi saglabātiem genoma apgabaliem, var noteikt plaša spektra izolātus, kas pieder pie visiem zināmajiem genotipiem, ieskaitot tādus vīrusus, kas nav hemadsorbējoši, un izolātus ar zemu virulenci. Tā kā ar šo testu nosaka vienīgi vīrusa genoma secību, PĶR var būt pozitīva pat tad, ja vīrusu izolācijā (piem., autolizētos audos vai paraugos no cūkām, kas atveseļojas, vai cūkām, kuras atveseļojušās pēc slimības pārciešanas un kuras kļuvušas klīniskā ziņā veselas) neatklāj infekcijas vīrusu. 2. PĶR var izmantot ierobežotam skaitam paraugu, kas rūpīgi atlasīti no iespējami inficētajiem dzīvniekiem. Šo metodi iesaka izmantot citotoksiskiem orgānu paraugiem, ja vīrusa izolācija tādēļ nav iespējama (piemēram, paraugi, kas ņemti no savvaļas cūkām). 3. Polimerāzes ķēdes reakcijai (PĶR) piemērots parauga materiāls ir tie orgāni, kas aprakstīti attiecībā uz vīrusa izolāciju un serumu. Polimerāzes ķēdes reakcijā (PĶR) var analizēt arī ērču homogenātus. 4. PĶR var veikt vienā darba dienā. Tai nepieciešams pienācīgs laboratorijas aprīkojums, atsevišķas telpas un kvalificēts personāls. Pastāv tāda priekšrocība, ka infekcijas vīrusu nevajag replicēt laboratorijā. PĶR ir ļoti jutīga, bet tajā viegli var rasties infekcija, kas noved pie nepatiesi pozitīva rezultāta. Tādēļ ir svarīgi piemērot stingras kvalitātes kontroles procedūras. D. IETEICAMIE VIRUSOLOĢISKIE TESTI UN REZULTĀTU VĒRTĒŠANA Virusoloģiskie testi ir būtiski, lai apstiprinātu ĀCM. Vīrusa izolēšana un HAD jāuzskata par references virusoloģiskajiem testiem, un vajadzības gadījumā tie jāizmanto par apstiprinošiem testiem. Tos jo īpaši ieteicams izmantot tad, ja pozitīvi DIF vai PĶR rezultāti nav saistīti ar atklātām klīniskām pazīmēm vai slimības radītiem bojājumiem, un citos neskaidros gadījumos. Tomēr sākotnējo ĀCM uzliesmojumu var apstiprināt tad, ja attiecīgajām cūkām ir atklātas klīniskās pazīmes vai slimības radīti audu bojājumi un vismaz divi atsevišķi antigēna, genoma vai antivielas noteikšanas testi ir uzrādījuši pozitīvu rezultātu paraugiem, kas ņemti no vienas un tās pašas iespējami inficētās cūkas. Sekundāru ĀCM uzliesmojumu var apstiprināt tad, ja attiecīgajām cūkām papildus epidemioloģiskajai saiknei ar apstiprinātu ĀCM uzliesmojumu vai ĀCM infekcijas gadījumu ir atklātas klīniskās pazīmes vai slimības izraisīti audu bojājumi un antigēna, genoma vai antivielas noteikšanas tests ir uzrādījis pozitīvu rezultātu. Sākotnēju ĀCM infekcijas gadījumu savvaļas cūkām var apstiprināt ar vīrusa izolēšanu vai ja vismaz divi antigēna, genoma vai antivielas noteikšanas testi ir uzrādījuši pozitīvu rezultātu. Nākošos ĀCM infekcijas gadījumus savvaļas cūkām, attiecībā uz kurām ir noteikta epidemioloģiskā saikne ar iepriekš apstiprinātiem ĀCM infekcijas gadījumiem, var apstiprināt tad, ja antigēna, genoma vai antivielas noteikšanas tests ir uzrādījis pozitīvu rezultātu. E. ĀCM VĪRUSA IZOLĀTU ĢENĒTISKAIS RAKSTUROJUMS 1. ĀCM vīrusa izolāta ģenētisko raksturojumu iegūst, nosakot restrikcijas enzīmu modeļus un nukleotīdu secību vīrusa genoma daļās. Šo restrikcijas modeļu vai secību līdzība ar tiem, kas iegūti no iepriekšējiem vīrusa izolātiem, var norādīt uz to, vai slimības uzliesmojumus izraisa Eiropas vai Āfrikas molekulārā tipa vīrusi. ĀCM vīrusa izolātu ģenētiskajam raksturojumam ir ļoti liela nozīme, lai papildinātu esošās zināšanas par ĀCM molekulāro epidemioloģiju un vīrusu ģenētisko variāciju. Molekulārie dati ļauj klasificēt jaunus izolātus un sniedz informāciju par to iespējamo izcelsmi. 2. Ja vīrusa molekulāro raksturojumu nevar veikt valsts laboratorijā vai kādā citā laboratorijā, kas ir pilnvarota, lai nekavējoties diagnosticētu ĀCM, oriģinālais paraugs vai vīrusa izolāts cik vien iespējams ātri jānosūta Kopienas references laboratorijai, lai tur veiktu molekulāro raksturojumu. Dati attiecībā uz restrikcijas enzīmu analīzi un ĀCM vīrusa izolātu secību, kas ir to laboratoriju rīcībā, kuras ir pilnvarotas diagnosticēt ĀCM, ir jānosūta Kopienas references laboratorijai, lai šo informāciju varētu iekļaut šīs laboratorijas datu bāzē. Šajā datu bāzē iekļautajai informācijai ir jābūt pieejamai visām dalībvalstu references laboratorijām. Tomēr attiecībā uz publikācijām zinātniskajos žurnālos, ja to pieprasa attiecīgā laboratorija, Kopienas references laboratorija līdz šādu datu publicēšanai nodrošina to konfidencialitāti. VII nodaļa Seroloģisko testu principi un izmantošana, kā arī to rezultātu vērtēšana A. PAMATPRINCIPI UN DIAGNOSTISKĀ VĒRTĪBA 1. ĀCM specifisku antivielu noteikšana ir ieteicama attiecībā uz subakūtām un hroniskām formām, kā arī plaša mēroga testēšanas un ĀCM apkarošanas programmām vairāku apsvērumu dēļ: i) inficētās cūkas ķermenī strauji veidojas antivielas. Šajās cūkās antivielas parasti var atklāt seruma paraugos no septiņām līdz desmit dienām pēc inficēšanās; ii) nav pieejamas vakcīnas pret ĀCM. Tas nozīmē, ka ĀCM specifiskās antivielas ierosina vienīgi ĀCM vīrusu infekcija; iii) ilgstošā antivielu atbildes reakcija. Cūkām, kas atveseļojušās pēc slimības pārciešanas, specifiskās antivielas var noteikt ar augsta līmeņa rādītājiem daudzus mēnešus vai dažām šādām cūkām pat visu atlikušo dzīves laiku. Sivēniem var noteikt mātes izcelsmes ĀCM antivielas pirmajās desmit dzīves nedēļās. Mātes izcelsmes antivielu pussabrukšanas periods sivēniem ir apmēram trīs nedēļas. Ja ĀCM antivielas konstatē sivēniem, kas vecāki par trīs mēnešiem, tās nevarētu būt mātes izcelsmes antivielas. 2. Lai palīdzētu diagnosticēt ĀCM iespējami inficētās saimniecībās, serumā vai iesniegto orgānu plazmas eksudātos nosaka antivielas pret ĀCM vīrusu, lai novērtētu datus par infekcijas iekļūšanu apstiprināta uzliesmojuma gadījumā un kontroles un uzraudzības mērķiem. Seropozitīvu cūku atrašanās saimniecībā var sniegt vērtīgu informāciju par to, kādā veidā ĀCM vīruss iekļuvis saimniecībā. Ņemot vērā visus klīniskos, virusoloģiskos un epidemioloģiskos rādītājus, tās izpētes ietvaros, kas jāveic aizdomu gadījumā par ĀCM vai tās apstiprināšanās gadījumā, tomēr jāveic precīza seroloģisko testu rezultātu novērtēšana saskaņā ar Direktīvas 2002/60/EK 8. pantu. B. IETEICAMIE SEROLOĢISKIE TESTI 1. ĀCM seroloģiskai apstiprināšanai izvēlas ELISA, netiešo imunofluorescences analīzi (IIFT) un imunoblotinga testu (IB). Valstu laboratoriju veiktās seroloģiskās diagnostikas kvalitāte un efektivitāte regulāri jāpārbauda starplaboratoriju salīdzinošajos testos, ko regulāri organizē Kopienas references laboratorija. 2. ELISA tests ir drošākais un noderīgākais tests plaša mēroga seroloģiskiem pētījumiem. Tā pamatā ir tādiem vīrusu proteīniem piesaistītu ĀCM vīrusa antivielu noteikšana, kurus piesaista cietajai fāzei, pievienojot ar enzīmu konjugētu A proteīnu, kas, reaģējot ar attiecīgo substrātu, izraisa saskatāmu krāsu reakciju. 3. Valstu laboratorijām regulāri jāveic katras ELISA reaģentu partijas kvalitātes kontrole attiecībā uz jutīgumu un specifiskumu, izmantojot standartserumu komplektu, ko nodrošina Kopienas references laboratorija. Šajā komplektā iekļauj: - serumus no cūkām ĀCM vīrusu infekcijas agrīnajā fāzē (mazāk nekā 17 dienas pēc inficēšanās), - serumus no cūkām, kas atveseļojas (vairāk nekā 17 dienas pēc inficēšanās). ĀCM seroloģiskajā diagnostikā izmantojamajā ELISA testā jāatklāj visi standartserumi, kas iegūti no cūkām, kuras atveseļojas. Visiem rezultātiem, ko iegūst ar standartserumiem, jābūt reproducējamiem. Ieteicams noteikt arī visus agrīnās fāzes pozitīvos serumus. Rezultāti, ko iegūst ar standartserumiem no cūkām inficēšanās agrīnajā fāzē, norāda uz ELISA jutīgumu. 4. IIFT ir ātra metode, kam piemīt augsts jutīgums un specifiskums, lai noteiktu ĀCM antivielas serumos vai audu eksudātos. Tās pamatā ir tādu ĀCM antivielu noteikšana, kuras piesaistās vienslāņa MS šūnām, kas inficētas ar pielāgotu ĀCM vīrusu. Antivielu un antigēna reakciju nosaka ar marķētu fluoresceīna A proteīnu. Pozitīvie paraugi uzrāda specifisku fluorescenci pie inficēto šūnu kodoliem. DIFT un IIFT kombinēta izmantošana, testējot orgānus, asinis un eksudātus, kas savākti no dzīvniekiem ar ĀCM klīniskajām pazīmēm, var dot ātru un ticamu šīs slimības apstiprinājumu. 5. IB tests ir metode ar augstu specifiskumu un jutīgumu, kam pamatā ir tādu nitrocelulozes sloksnīšu izmantošana, kuras kā antigēnus satur vīrusu proteīnus. Specifisko antivielas un antigēna reakciju nosaka, pievienojot proteīna A peroksidāzes konjugātu un piemērotu substrātu. To ir īpaši lietderīgi izmantot, lai pārbaudītu serumus, kas nav devuši viennozīmīgu rezultātu ELISA testā. VIII nodaļa Obligātās drošības prasības ĀCM laboratorijām 1. Prasības, kas izklāstītas 1. tabulā, jāpilda katrā laboratorijā, kur pavairo ĀCM vīrusu, replicējot to šūnu kultūrās. Tomēr pēcnāves apskates, audu sagatavošanu DIFT vai PĶR vajadzībām un inaktivētu antigēnu seroloģisku izmantošanu var veikt, ievērojot mazāk stingrus noteikumus, ja ir izpildītas 1. tabulas obligātās prasības, tiek ievērota pamata higiēna un veikta noslēguma dezinfekcija, drošā veidā iznīcinot liemeņus, audus un serumus. 2. Prasības, kas izklāstītas 2. tabulā, jāpilda katrai laboratorijai, kur dzīvniekiem ievada ĀCM vīrusu. 3. Visi ĀCM vīrusa krājumi jāuzglabā drošā vietā, vai nu sasaldētā vai liofīlā stāvoklī. Katrai atsevišķajai ampulai jābūt skaidri marķētai un par vīrusu krājumiem, kā arī kvalitātes kontroles pārbaužu datiem un rezultātiem jāveic pilnīga uzskaite. Jāveic uzskaite arī par krājumiem pievienotajiem vīrusiem, norādot sīkus datus par avotu, un par citām laboratorijām nodotajiem vīrusiem. 4. Ievērojot bioloģiskās drošības principu, vienībām, kas strādā ar ĀCM vīrusu, ieteicams pievienot zonas, kurās nestrādā ar ĀCM vīrusu. Šīs pārējās zonas ir vajadzīgas, lai sagatavotu laboratorijas traukus un vidi, uzturētu un sagatavotu neinficētas šūnu kultūras, apstrādātu serumus un veiktu seroloģisko testēšanu (izņemot tās metodes, kur izmanto dzīvu ĀCM vīrusu) un nodrošinātu administratīvu un biroja darbu. 1. tabula Principi, kas jāievēro par bioloģisko drošību diagnostikas laboratorijās | Obligātās prasības. | Papildu prasības | Vispārējā vide | Normāls atmosfēras spiediens. Specializētas telpas, kurās veic tikai noteiktas procedūras. | Normāls atmosfēras spiediens. Augstas efektivitātes cietvielu daļiņu gaisa filtrs izplūstošajam gaisam. Specializētas telpas, ko izmanto vienīgi klasiskā cūku mēra vai ĀCM diagnostikas procedūrām. Iespējami inficētus notekūdeņus apstrādā (termiski vai ķīmiski), lai inaktivētu ĀCM vīrusu. | Laboratorijas apģērbs | Speciālas virsdrēbes, ko izmanto tikai vienībā, kurā strādā ar ĀCM vīrusu. Vienreizējās lietošanas cimdi visām darbībām ar inficēto materiālu. Virsdrēbes pirms iznešanas no vienības sterilizē vai mazgā augstā temperatūrā turpat vienībā. | Ienākot vienībā, apģērbu pilnībā nomaina. Laboratorijas apģērbu izmanto tikai vienībā, kurā strādā ar ĀCM vīrusu. Vienreizējās lietošanas cimdi visām darbībām ar inficēto materiālu. Apģērbu pirms iznešanas no vienības sterilizē vai mazgā augstā temperatūrā turpat vienībā. | Personāla kontrole | Vienībā ienāk tikai attiecīgi izraudzīts un apmācīts personāls. Izejot no vienības, mazgā un dezinficē rokas. Personāls nedrīkst ieiet telpās, kur atrodas cūkas, 48 stundas pēc iziešanas no vienības. | Vienībā ienāk tikai attiecīgi izraudzīts un apmācīts personāls. Izejot no vienības, mazgā un dezinficē rokas. Personāls nedrīkst ieiet telpās, kur atrodas cūkas, 48 stundas pēc iziešanas no vienības. | Aprīkojums | Bioloģiskās drošības kabinets (I vai II klases), ko izmanto visām darbībām ar dzīvu vīrusu. Kabinetam jābūt aprīkotam ar divkāršu augstas efektivitātes cietvielu daļiņu gaisa filtru izplūstošajam gaisam. Specializētajā laboratorijas telpā jābūt pieejamam visam aprīkojumam, kas vajadzīgs laboratorijas procedūrām. | 2. tabula Bioloģiskās drošības prasības attiecībā uz dzīvniekiem paredzētajām laboratorijas telpām | Prasības | Vispārējā vide | Ar negatīvu spiedienu regulējama ventilācija. Augstas efektivitātes cietvielu daļiņu gaisa filtrs izplūstošajam gaisam. Iekārta pilnīgai dekontaminācijai vai fumigācijai eksperimenta beigās. Visus cietos un šķidros atkritumus apstrādā (termiski vai ķīmiski), lai inaktivētu ĀCM vīrusu. | Laboratorijas apģērbs | Ienākot vienībā, apģērbu pilnībā nomaina. Apģērbu pirms iznešanas no vienības sterilizē vai mazgā augstā temperatūrā turpat vienībā. | Personāla kontrole | Apakšvienībā ienāk tikai attiecīgi izraudzīts un apmācīts personāls. Pirms iešanas dušā, apģērbu atstāj iekšpusē. Izejot no vienības, pilnībā nomazgājas dušā. Personāls nedrīkst ieiet telpās, kur atrodas cūkas, 48 stundas pēc iziešanas no vienības. | Aprīkojums | Vienībā jābūt visam aprīkojumam, kas vajadzīgs laboratorijas procedūrām. Visus materiālus, ko iznes no vienības, sterilizē vai – dzīvnieku paraugu gadījumā – dubultīgi iepako necaurlaidīgā tvertnē, kuras virsma ir dezinficēta transportēšanai uz ĀCM laboratoriju. | Dzīvnieki | Pirms izvešanas no vienības visi dzīvnieki jānokauj, pēcnāves apskate jāveic bioloģiski drošajā zonā un pēc ekspertīžu pabeigšanas liemeņi jāsadedzina. | [1] Lemjot par laboratoriskajām pārbaudēm vajadzīgo paraugu skaitu, ņem vērā arī izmantojamo pārbaužu jutību. Ja izmantojamās pārbaudes jutība nav ļoti liela, dzīvnieku skaits, kam jāņem paraugi, ir lielāks par šajā rokasgrāmatā norādīto skaitu. [2] Saskaņā ar Direktīvas 2002/60/EK 2. panta r) punktu. [3] OV L 340, 31.12.1993., 21. lpp. [4] OV L 122, 16.5.2003., 1. lpp. [5] Tomēr, ja piemēro Direktīvas 2002/60/EK 6. panta 1. punktā paredzēto atkāpi, paraugu ņemšana jāveic saimniecības apakšvienībās, kurās cūkas ir nogalinātas, neatkarīgi no tālākām pārbaudēm un paraugu ņemšanas, kas jāveic pārējām cūkām saimniecībā saskaņā ar kompetentās iestādes norādījumiem. [6] Tomēr, ja kompetentā iestāde ir ierobežojusi profilaktiskas nogalināšanas piemērošanu, lai to attiecinātu vienīgi uz to saimniecības daļu, kurā turētas cūkas, kas iespējami inficētas vai inficētas ar ĀCM vīrusu, saskaņā ar Direktīvas 2002/60/EK 4. panta 3. punkta a) apakšpunktu, paraugu ņemšana jāveic tajās saimniecības apakšvienībās, kur tika piemērots minētais pasākums, neatkarīgi no tālākām pārbaudēm un paraugu ņemšanas, kas jāveic pārējām cūkām saimniecībā saskaņā ar kompetentās iestādes norādījumiem. [7] Ieteicams savākt paraugus arī no līkumainās zarnas, jo tie var noderēt klasiskā cūku mēra diagnosticēšanai. [8] Kopienas references laboratorijai ir atklātā licence, kas tai ļauj saņemt diagnostiskos paraugus un ĀCM vīrusa izolātus no jebkuras citas dalībvalsts. Ja paraugu iegūst ārpus ES, šai laboratorijai pirms transportēšanas var pieprasīt ievešanas atļaujas kopiju un to var aploksnē pievienot iepakojuma ārpusē. [9] Fluoresceīna izotiocianāts. --------------------------------------------------