PIELIKUMS

Regulas (EK) Nr. 440/2008 pielikumu groza šādi:

pievieno B.53., B.54., B.55., B.56., B.57. un B.58. nodaļu.

“B.53. ONTOĢENĒZES NEIROTOKSICITĀTES PĒTĪJUMS

IEVADS

1. Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 426 (2007. gads). Kopenhāgenā 1995. gada jūnijā ESAO Reproduktīvās un ontoģenēzes toksicitātes darbgrupa apsprieda vajadzību atjaunināt esošos ESAO testēšanas norādījumus reproduktīvās un ontoģenēzes toksicitātes jomā un izstrādāt jaunus norādījumus attiecībā uz beigupunktiem, kas vēl nav aprakstīti (1). Darbgrupa ieteica, ka ontoģenēzes neirotoksicitātes testēšanas norādījumi ir jāsagatavo atbilstoši ASV EPA norādījumiem, kuri pēc minētā datuma ir pārskatīti (2). 1996. gada jūnijā Kopenhāgenā notika otrā konsultatīvā sanāksme ar mērķi informēt sekretariātu par jauno ontoģenēzes neirotoksicitātes testēšanas norādījumu izklāstu, aptverot galvenos aspektus, piemēram, norādījumus par dzīvnieku sugu izvēli, devas došanas periodu, testēšanas periodu, novērtējamos beigupunktus un rezultātu novērtēšanas kritērijus. ASV neirotoksicitātes riska novērtēšanas norādījumi tika publicēti 1998. gadā (3). 2000. gada oktobrī vienlaicīgi notika ESAO ekspertu konsultatīvā sanāksme un ILSI Riska zinātnes institūta seminārs, un 2005. gadā Tokijā notika ekspertu konsultatīvā sanāksme. Minēto sanāksmju mērķis bija pārrunāt zinātniskos un tehniskos jautājumus saistībā ar pašreizējiem testēšanas norādījumiem, un sanāksmēs sniegtie ieteikumi (4)(5)(6)(7) tika ņemti vērā, izstrādājot šo testēšanas metodi. Papildu informācija par šīs testēšanas metodes izmantošanu, iegūto rezultātu interpretāciju un terminoloģiju ir pieejama ESAO Norādījumu dokumentā Nr. 43 “Reproduktīvās toksicitātes testēšana un novērtējums” (8) un Norādījumu dokumentā Nr. 20 “Neirotoksicitātes testēšana” (9).

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI

2. Vairākas ķīmiskās vielas cilvēkiem un citām sugām rada ontoģenēzes neirotoksicitātes risku (10)(11)(12)(13). Lai pārbaudītu un novērtētu ķīmiskās vielas toksiskās īpašības, var būt nepieciešams noteikt potenciālo ontoģenēzes neirotoksicitāti. Ontoģenēzes neirotoksicitātes pētījumus izstrādā tā, lai varētu iegūt datus, tostarp devas un atbildes reakcijas raksturojumu, par tādu iespējamu funkcionālu un morfoloģisku ietekmi uz pēcnācēja nervu sistēmu attīstības procesā, kuras iemesls var būt ekspozīcija in utero un dzīves sākumā.

3. Ontoģenēzes neirotoksicitātes pētījumu var veikt kā reproduktīvās toksicitātes un/vai pieaugušu dzīvnieku neirotoksicitātes pētījumā ietilpstošu pētījumu (piemēram, B.34. (14), B.35. (15), B.43. (16) testēšanas metode) vai to pievienot prenatālās ontoģenēzes toksicitātes pētījumam (piemēram, B.31. (17) testēšanas metode). Ja ontoģenēzes neirotoksicitātes pētījumu iekļauj citā pētījumā vai tādam pētījumam pievieno, ir ļoti svarīgi saglabāt abu pētījumu integritāti. Visiem testiem jābūt saskaņā ar piemērojamiem tiesību aktiem vai valdības un iestāžu norādījumiem par laboratorijas dzīvnieku izmantošanu pētījumos (piemēram, 18).

4. Pirms pētījuma sākšanas testēšanas laboratorijai ir jāizskata visa pieejamā informācija par testējamo ķīmisko vielu. Šādā informācijā ietilpst ķīmiskās vielas identitāte un struktūra, fizikālķīmiskās īpašības, citu to in vitro vai in vivo toksicitātes testu rezultāti, kur attiecīgā viela izmantota, toksikoloģiskie dati par strukturāli līdzīgām ķīmiskajām vielām un vielas paredzamais(-ie) lietošanas veids(-i). Šī informācija ir vajadzīga, lai nodrošinātu, ka tests atbilst nolūkam aizsargāt cilvēku veselību un ka tiek pareizi izraudzīta sākotnējā deva.

TESTA PRINCIPS

5. Testējamo ķīmisko vielu ievada grūsniem dzīvniekiem un dzīvniekiem laktācijas periodā. Mātītes testē, lai novērtētu iedarbību uz grūsnām un barojošām mātītēm, un minētie pētījumi var arī sniegt salīdzinošu informāciju (par mātītēm un pēcnācējiem). Pēcnācējus, kuriem veic neirotoksicitātes novērtējumu, no metiena izvēlas nejaušināti. Pētījumā izdara novērojumus, lai noteiktu būtiskus neiroloģiskus un uzvedības traucējumus, arī lai novērtētu fizisko attīstību, uzvedības ontoģenēzi, motorisko aktivitāti, motoriskās un sensoriskās funkcijas un mācīšanos un atmiņu, kā arī smadzeņu svaru un neiropatoloģiju postnatālās attīstības periodā un pieaugušam dzīvniekam.

6. Ja testēšanas metodi izmanto kā atsevišķu pētījumu, papildu pieejamos dzīvniekus katrā grupā var izmantot noteiktām neiroizturēšanās, neiropatoloģiskām, neiroķīmiskām vai elektrofizioloģiskām procedūrām, kuras dod iespēju papildināt šai testēšanas metodē ieteicamajos standartizmeklējumos iegūtos datus (16)(19)(20)(21). Minētās papildu procedūras var īpaši noderēt, ja empīriskie novērojumi, gaidāmā iedarbība vai mehānismi/darbības veidi norāda uz noteikta veida neirotoksicitāti. Minētās papildu procedūras var izmantot gan mātītēm, gan mazuļiem. Turklāt var izmantot arī ex vivo vai in vitro procedūras, ja vien tās neietekmē in vivo procedūru integritāti.

SAGATAVOŠANĀS TESTAM

Dzīvnieku sugu izvēle

7. Testā ieteicamā suga ir žurka, bet vajadzības gadījumā var izmantot citas sugas. Tomēr jāņem vērā, ka šīs testēšanas metodes norādes attiecībā uz grūsnību un pēcdzemdību periodu atbilst parasti izmantotajām žurku līnijām, un ja izmanto citas sugas vai netipiskas dzīvnieku līnijas, jāizvēlas salīdzināmi periodi. Izmantojot citas sugas dzīvniekus, izvēle ir jāpamato ar toksikoloģijas, farmakokinētikas un/vai citiem datiem. Pamatojumā jānorāda, vai ir pieejams konkrētajai sugai raksturīgās pēcdzemdību neiroizturēšanās un neiropatoloģijas novērtējums. Ja iepriekš veiktos testos radušās bažas, jāapsver, vai neizmantot sugu/līniju, ar kuru radušās bažas. Dažādu sugu žurkām atbildes reakcija ir atšķirīga, un tāpēc ir jābūt pierādījumiem, ka izvēlētās līnijas vaislība un jutība ir atbilstīga. Ir jādokumentē citu sugu datu ticamība un jutība attiecībā uz ontoģenēzes neirotoksicitātes noteikšanu.

Turēšanas un barošanas nosacījumi

8. Temperatūrai eksperimenta dzīvnieku turēšanas telpā jābūt 22 ± 3 °C. Lai gan relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, izņemot telpu uzkopšanas laiku, vēlams, ne vairāk kā 70 %, jācenšas nodrošināt mitrumu 50–60 % robežās. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas tumsā. Apgaismojuma ciklu var mainīt arī pirms pārošanās un uz visu pētījuma laiku, lai novērtētu funkcionālos un uzvedības beigupunktus laikā, kad telpās ir tumšs (sarkanajā apgaismojumā), t. i., laikā, kad dzīvnieki parasti ir aktīvi (22). Ja tiek mainīts gaismas un tumsas cikls, ir jānodrošina attiecīgs aklimatizācijas periods, lai dzīvnieki varētu pielāgoties jaunajam ciklam. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim. Ir jāreģistrē barības un ūdens veids un ir jāpārbauda, vai tie nav piesārņoti.

9. Dzīvniekus būros var turēt atsevišķi vai nelielās viendzimuma grupās. Pārošanas procedūras jāveic attiecīgajam nolūkam piemērotos būros. Pārotos dzīvniekus pēc kopulācijas vai ne vēlāk kā no grūtniecības 15. dienas tur atsevišķi dzemdību vai maternitātes būros. Būrus izvieto tā, lai iespējami mazinātu būru novietojuma varbūtējo ietekmi. Tuvojoties dzemdībām, sapārotajām mātītēm ir jānodrošina piemēroti un iepriekš noteikti materiāli migas veidošanai. Ir labi zināms, ka grūsnības laikā nepiemērota apiešanās vai stress var radīt negatīvas sekas, izraisīt augļa zaudēšanu un augļa un postnatālās attīstības izmaiņas. Lai izvairītos no augļa zaudēšanas, ko izraisa ar vielas ievadīšanu nesaistīti faktori, ar grūsniem dzīvniekiem ir jārīkojas uzmanīgi un ir jāizvairās no ārējo faktoru radīta stresa, piemēram, no pārmērīga ārpuses trokšņa.

Dzīvnieku sagatavošana

10. Pētījumā ir jāizmanto veseli dzīvnieki, kuri ir aklimatizējušies laboratorijas apstākļos un kuriem eksperimentālas procedūras iepriekš nav veiktas, izņemot gadījumus, kur pētījums ietilpst citā pētījumā (skatīt 3. punktu). Testa dzīvniekiem ir jānorāda suga, līnija, izcelsme, dzimums, svars un vecums. Visus dzīvnieku marķē ar individuālu identifikācijas numuru. Visās testa grupās, cik vien tas praktiski iespējams, dzīvnieku svaram un vecumam jābūt vienādam, pētāmās sugas un līnijas standarta diapazonā. Visiem devas līmeņiem jāizmanto pieaugušas mātītes, kas nav dzemdējušas. Brāļus un māsas nedrīkst pārot, un jāraugās, lai to nepieļautu. Grūsnības 0. diena ir diena, kad novērots maksts embols un/vai sperma. Iegādājoties grūsnus dzīvniekus, tiem ir jānodrošina pietiekams aklimatizācijas periods (piemēram, 2–3 dienas). Sapārotās mātītes nejaušināti jāsadala kontroles un vielas ievadīšanas grupā, un dzīvnieki grupās ir jāsadala iespējami vienmērīgi (piemēram, grupās ieteicams ar stratificētas nejaušināšanas procedūru nodrošināt vienmērīgu sadalījumu pēc svara vai citos aspektos). Pa grupām vienmērīgi jāsadala ir arī mātītes, ko apsēklojis viens un tas pats tēviņš.

PROCEDŪRA

Dzīvnieku skaits un dzimums

11. Testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanai paredzēto grūsno mātīšu skaitam katrā testa un kontroles grupā jābūt pietiekamam, lai nodrošinātu, ka tiek iegūts pietiekams skaits pēcnācēju neirotoksicitātes izvērtēšanai. Katrā devu līmenī ieteicams izmantot 20 metienus. Ja metienu kopskaits uz grupu ir nodrošināts un ja replicēto devu izmantošanu atspoguļo, izmantojot piemērotu statistisku modeli, drīkst izmantot replicētu devu ievadīšanas modeļus un modeļus, kuros atšķiras devu ievadīšanas sākumpunkts.

12. Pēc piedzimšanas 4. dienā vai pirms tam (piedzimšanas diena ir 0. diena pēc piedzimšanas), mazuļu skaits katrā metienā jākoriģē, liekos mazuļus nejaušināti likvidējot, lai nodrošinātu vienādu metienu lielumu (23). Metienu lielums nedrīkst pārsniegt izmantotās grauzēju līnijas metiena vidējo lielumu (8–12). Metienā ir jāatstāj iespējami vienāds skaits vīriešu un sieviešu dzimuma mazuļu. Selektīva mazuļu likvidēšana, piemēram, balstoties uz ķermeņa svaru, nav pieļaujama. Pēc metiena standartizēšanas (lieko likvidēšanas) un pirms funkcionālo beigupunktu turpmākas testēšanas katram atsevišķam mazulim, ko paredzēts izmantot testēšanai pirms vai pēc atšķiršanas no mātes, piešķir unikālu identifikāciju, izmantojot jebkādu mazuļiem piemērotu, humānu identifikācijas metodi (piemēram, (24)).

Dzīvnieku grupēšana funkcionālajiem un uzvedības testiem, smadzeņu svara noteikšanai un neiropatoloģiskai izvērtēšanai

13. Šī testēšanas metode paredz iespēju izmantot dažādas pieejas, kā in utero un laktācijas periodā eksponētus dzīvniekus grupēt izmantošanai funkcionālos un uzvedības testos, dzimumbrieduma testos, smadzeņu svara noteikšanai un neiropatoloģiskai izvērtēšanai (25). Atsevišķi var iekļaut citus neiroizturēšanās funkciju (piemēram, sociālās uzvedības), neiroķīmijas vai neiropatoloģijas testus, ja tas neapdraud pamata testu integritāti.

14. Beigupunktu novērtēšanai mazuļus no katras grupas, kas saņem vienādu devu, izraugās un sadala 4. dienā pēc piedzimšanas vai vēlāk. Mazuļus atlasa tā, lai visos testos no katra vienas devas grupas metiena pēc iespējas būtu pārstāvēti abi dzimumi. Motoriskās aktivitātes testos visos vecuma posmos pirms atšķiršanas no mātes testē vienu un to pašu vīrišķā un sievišķā dzimuma mazuļu pāri (skatīt 35. punktu). Dažādos citos uzvedības testēšanas testos var izmantot vienu un to pašu tēviņa un mātītes pāri vai citus pārus. Lai kognitīvo funkciju mērījumos izvairītos no ietekmes, kas saistīta ar vecumu un iepriekšēju apmācību (26) (27), no mātes atšķirto mazuļu un pieaugušo dzīvnieku kognitīvo funkciju testu rezultātu salīdzināšanai var būt nepieciešams ņemt atšķirīgus mazuļus. Mazuļus atšķirot no mātes (21. dienā pēc piedzimšanas), tos, kurus neizraugās testēšanai, var humāni nonāvēt. Visas mazuļu sadalījuma izmaiņas ir jāreģistrē. Statistiskajai mērvienībai ir jābūt metienam (vai mātītei), nevis mazulim.

15. Ir dažādi veidi, kā mazuļus iedalīt pārbaudēm pirms un pēc atšķiršanas no mātes, kognitīvajiem testiem, patoloģiju pārbaudēm utt. (skatīt 1. attēlu, kur sniegta vispārīga shēma, un 1. papildinājumu, kur norādīti iedalījuma piemēri). Ieteicamais minimālais dzīvnieku skaits pārbaudēm pirms un pēc atšķiršanas no mātes katrā devas grupā ir šāds:

Klīniskie novērojumi un ķermeņa svars Visi dzīvnieki Detalizēti klīniskie novērojumi 20 no katra dzimuma (1 no katra dzimuma uz metienu) Smadzeņu svars (pēc fiksācijas) 11.–22. dienā pēc piedzimšanas 10 no k. dzimuma (1 no metiena) Smadzeņu svars (bez fiksācijas), apmēram 70. dienā pēc piedzimšanas 10 no k. dzimuma (1 no metiena) Neiropatoloģija (iegremdēšana vai fiksācija ar perfūziju), 11.–22. dienā pēc piedzimšanas 10 no k. dzimuma (1 no metiena) Neiropatoloģija (fiksācija ar perfūziju) apmēram 70. dienā pēc piedzimšanas 10 no k. dzimuma (1 no metiena) Dzimumbriedums 20 no k. dzimuma (1 no k. dzimuma uz metienu) Citi attīstības parametri (pēc izvēles) Visi dzīvnieki Uzvedības ontoģenēze 20 no k. dzimuma (1 no k. dzimuma uz metienu) Motoriskā aktivitāte 20 no k. dzimuma (1 no k. dzimuma uz metienu) Motoriskās un sensoriskās funkcijas 20 no k. dzimuma (1 no k. dzimuma uz metienu) Mācīšanās un atmiņa 10 no k. dzimuma (1) (1 no metiena)

Dozēšana

16. Izmanto vismaz trīs devu līmeņus un vienlaicīgas kontroles grupu. Devu līmeņu intervālam jābūt tādam, lai būtu vērojama toksiskās iedarbības gradācija. Ja vien augstāko devas līmeni neierobežo ķīmiskās vielas fizikālķīmiskās vai bioloģiskās īpašības, šis līmenis jāizvēlas ar mērķi izraisīt maternālo toksicitāti (piemēram, klīniski simptomi, samazināts ķermeņa svara pieaugums (ne vairāk kā 10 %) un/vai pazīmes, ka mērķorgānu toksicitāti ietekmē devas līmenis). Augstākā deva var būt līdz 1 000 mg uz kg ķermeņa svara dienā, izņemot atsevišķus gadījumus. Piemēram, sagaidāmā cilvēku ekspozīcija var norādīt uz to, ka jāizmanto augstāka deva. Lai noteiktu augstāko devas līmeni, kas jāizmanto un kam būtu jārada minimāls maternālās toksicitātes līmenis, var arī veikt izmēģinājuma pētījumus vai iepriekšējus devu līmeņa noteikšanas pētījumus. Ja tas, ka testējamā ķīmiskā viela ietekmē attīstību, konstatēts ontoģenēzes toksicitātes standartpētījumā vai izmēģinājuma pētījumā, augstākais devas līmenis ir maksimālā deva, kas neradīs pārmērīgu pēcnācēja toksicitāti vai bojāeju in utero vai neonatālajā periodā un ar ko pietiek, lai pamatoti izvērtētu toksicitāti. Zemākajam devas līmenim būtu jābūt tādam, lai nerastos maternālās vai ontoģenēzes toksicitātes, tostarp neirotoksicitātes, pazīmes. Devu līmeņi jāizraugās to samazinājuma virzienā tā, lai parādītos jebkāda ar devu saistīta atbildes reakcija un lai zemākais devas līmenis būtu nenovērojamas nelabvēlīgas ietekmes līmenis (NOAEL), vai jāizraugās noteikšanas robežai tuvas devas, kas varētu palīdzēt noteikt etalondevu. Devu līmeņu noteikšanai to samazinājuma virzienā optimums bieži vien ir divkārši līdz četrkārši intervāli, un bieži vien ir ieteicamāk pievienot ceturto devu grupu, nevis izmantot ļoti plašu devu intervālu (piemēram, vairāk nekā 10 reizes).

17. Devu līmeņi ir jāizvēlas, ņemot vērā visus esošos toksicitātes datus, kā arī papildu informāciju par testējamās ķīmiskās vielas vai ar to saistītu materiālu metabolismu un toksikokinētiku. Minētā informācija var arī palīdzēt parādīt devu došanas režīma piemērotību. Vai devas mazuļiem nedot tieši, ir jāapsver, balstoties uz ekspozīciju un farmakokinētisko informāciju (28)(29). Pirms veikt pētījumus ar tiešu devu došanu, ir rūpīgi jāizvērtē priekšrocības un trūkumi (30).

18. Vienlaicīgas kontroles grupai jāsaņem placebo vai nesējviela, ja pēdējo testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanai izmanto. Visiem dzīvniekiem parasti jādod vienāds testējamās ķīmiskās vielas vai nesējvielas tilpums attiecībā pret ķermeņa svaru. Ja devu došanā izmanto nesējvielu vai citu piedevu, jāņem vērā šādas īpašības – ietekme uz testējamās ķīmiskās vielas uzsūkšanos, izplatīšanos, metabolismu vai aizturi; tāda ietekme uz testējamās ķīmiskās vielas ķīmiskajām īpašībām, kas var mainīt tās toksiskās īpašības; un ietekme uz barības un ūdens patēriņu vai dzīvnieku barojuma stāvokli. Nesējvielas ietekme nedrīkst traucēt pētījuma interpretāciju, tai nedrīkst piemist neiroizturēšanās toksicitāte un tā nedrīkst ietekmēt reprodukciju vai attīstību. Jaunām nesējvielām papildus nesējvielas kontroles grupai jāizmanto placebo saņēmēja kontroles grupa. Ar kontroles grupas(-u) dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupas dzīvniekiem.

Devu ievadīšana

19. Jāizraugās tāds testējamās ķīmiskās vielas vai nesējvielas ievadīšanas ceļš, kas visvairāk atbilst cilvēka ekspozīcijas gadījumam, un jābalstās uz pieejamo informāciju par tās metabolismu un izplatīšanos testa dzīvnieku organismā. Testējamo ķīmisko vielu parasti ievada orāli (piemēram, ar mākslīgo barošanu vai ar uzturu vai dzeramo ūdeni), bet, ņemot vērā vielas īpašības un tās paredzamo vai zināmo iedarbību uz cilvēkiem, var izmantot arī citus veidus (piemēram, caur ādu vai ar inhalāciju) (papildu norādījumi ir sniegti Norādījumu dokumentā Nr. 43(8)). Izraudzītais ievadīšanas ceļš ir jāpamato. Testējamā ķīmiskā viela katru dienu ir jāievada aptuveni vienā laikā.

20. Katram dzīvniekam ievadīto devu parasti izvēlas atkarībā no pēdējā noteiktā individuālā ķermeņa svara. Tomēr grūsnības pēdējā trešdaļā deva jānosaka piesardzīgi. Ja vielu saņēmušajām mātītēm ir novērojama pārmērīga toksicitāte, tādi dzīvnieki ir humāni jānonāvē.

21. Testējamo ķīmisko vielu vai nesējvielu sapārotajām mātītēm ievada vismaz katru dienu, sākot ar implantācijas brīdi (grūsnības 6. dienā), visu laktācijas periodu (21. diena pēc piedzimšanas), lai mazuļus testējamai ķīmiskai vielai eksponētu prenatālās un postnatālās neiroloģiskās attīstības periodā. Ja pierādījumi liecina, ka kāds (cits) eksperimenta plāns cilvēka ekspozīcijas gadījumam ir vairāk piemērots, devas ievadīšanas sākuma vecumu, kā arī tās ievadīšanas ilgumu un biežumu var koriģēt. Devas ievadīšanas ilgumu citām sugām pielāgo tā, lai nodrošinātu ekspozīciju visos smadzeņu attīstības sākumposmos (piemēram, periodos, kas līdzvērtīgi cilvēka smadzeņu attīstībai prenatālajā periodā un postnatālā perioda sākumā). Devu var sākt ievadīt, grūsnībai sākoties (tās 0. dienā), bet jāņem vērā, ka testējamā ķīmiskā viela var izraisīt (augļa) bojāeju pirms implantācijas. Ja devu ievada, sākot ar grūsnības 6. dienu, minētais risks nepastāv, bet tādā gadījumā attīstības stadijās no grūsnības 0. dienas līdz 6. dienai deva nebūtu ievadīta. Ja laboratorija iegādājas sapārotus dzīvniekus, grūsnības 0. dienā devu ievadīt sākt nav iespējams, un tādā gadījumā devu var sākt ievadīt grūsnības 6. dienā. Testēšanas laboratorijai devu došanas režīms ir jānosaka, ņemot vērā attiecīgo informāciju par testējamās ķīmiskās vielas ietekmi, iepriekšēju pieredzi un loģistikas apsvērumus; var būt gadījumi, kur devu turpina ievadīt arī pēc atšķiršanas no mātes. Atnešanās dienā dzīvniekiem, kam dzemdību process vēl nav beidzies, devu ievadīt nedrīkst. Kopumā tiek pieņemts, ka mazuļi testējamo ķīmisko vielu saņem ar mātes pienu, tomēr, ja trūkst pierādījumu tam, ka pēcnācējs joprojām ir eksponēts ķīmiskajai vielai, ir jāizvērtē iespēja mazuļiem pārbaudāmo vielu ievadīt tieši. Pierādījumu tam, ka testējamā ķīmiskā viela joprojām iedarbojas, var sniegt, piemēram, farmakokinētiskā informācija, pēcnācēja toksicitāte vai biomarķieru izmaiņas (28).

NOVĒROJUMI

Mātīšu novērošana

22. Visas mātītes vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro attiecībā uz to veselības stāvokli, tostarp saslimstību un mirstību.

23. Vielas ievadīšanas un novērošanas periodā periodiski jāveic detalizētāki klīniskie novērojumi (vismaz divas reizes attiecībā uz devu ievadīšanu grūsnības laikā un divas reizes attiecībā uz devu ievadīšanu laktācijas periodā), katrā devas līmenī izmantojot vismaz desmit mātītes. Dzīvnieki ir jānovēro ārpus turēšanas būra, un tas jādara par vielas ievadīšanu neinformētiem apmācītiem tehniskajiem darbiniekiem, dzīvnieku stresa un novērotāja neobjektivitātes mazināšanai un atsevišķo novērotāju iegūto rezultātu ticamības paaugstināšanai izmantojot standartprocedūras. Ja iespējams, ieteicams, ka attiecīgā pētījuma ietvaros novērojumus veic viens un tas pats tehniskais darbinieks.

24. Novērotās pazīmes ir jāreģistrē. Kad vien tas īstenojams, ir jāreģistrē arī novēroto pazīmju izpausmes stiprums. Klīniskajos novērojumos jāiekļauj (bet ne tikai) pārmaiņas ādā, apmatojumā, acīs, gļotādās, sekrēcijas un veģetatīvā aktivitāte (piemēram, asarošana, piloerekcija, acs zīlītes diametrs, neraksturīga elpošana un/vai elpošana caur muti un neparastas urinācijas vai defekācijas pazīmes).

25. Jāatzīmē arī neparastas atbildes reakcijas, kas izpaužas ķermeņa stāvoklī, aktivitātes līmenī (piemēram, samazināta vai pastiprināta standartiežogojuma pētīšana) un kustību koordinācijā. Jāreģistrē pārmaiņas gaitā (piemēram, gāzelēšanās, ataksija), stājā (piemēram, sakumpusi mugura) un atbildes reakcijās uz manipulācijām, novietošanu vai citiem vides stimuliem, kā arī klonisko vai tonisko kustību esamība, krampji, drebēšana, stereotipiska (piemēram, pārmērīga apmatojuma laizīšana, neparastas galvas kustības, atkārtota riņķošana) vai savāda izturēšanās (piemēram, košana vai pārmērīga laizīšana, pašsakropļošanās, staigāšana atpakaļvirzienā, skaņu izdošana) vai agresivitāte.

26. Toksicitātes pazīmes ir jāreģistrē, norādot arī to sākšanās dienu, laiku, smagumu un ilgumu.

27. Dzīvnieki ir jānosver vielas ievadīšanas reizē vismaz reizi nedēļā visu pētījuma laiku, dzemdību dienā vai neilgi pirms tās, kā arī 21. pēcdzemdību dienā (atšķiršanas brīdī). Pētījumos ar mākslīgo barošanu mātītes ir jāsver vismaz divas reizes nedēļā. Deva ir attiecīgi jāpielāgo, katru reizi nosakot ķermeņa svaru. Grūsnības un laktācijas periodā barības patēriņu mēra vismaz reizi nedēļā. Ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar dzeramo ūdeni, vismaz reizi nedēļā ir jāmēra ūdens patēriņš.

Pēcnācēju novērošana

28. Visi pēcnācēji vismaz reizi dienā ir rūpīgi jānovēro un jāreģistrē toksicitātes, saslimstības un mirstības pazīmes.

29. Vielas ievadīšanas un novērošanas laikā jāizdara detalizētāki pēcnācēju klīniskie novērojumi. Pēcnācēji (vismaz viens mazulis no katra dzimuma metienā) ir jānovēro par vielas ievadīšanu neinformētiem apmācītiem tehniskajiem darbiniekiem, dzīvnieku stresa un novērotāja neobjektivitātes mazināšanai un atsevišķo novērotāju iegūto rezultātu ticamības paaugstināšanai izmantojot standartprocedūras. Ja iespējams, ieteicams, ka novērojumus veic viens un tas pats tehniskais darbinieks. Ir jāuzrauga vismaz 24. un 25. punktā minētie beigupunkti, ņemot vērā attīstības stadiju, kas tiek novērota.

30. Visas pēcnācēja toksicitātes pazīmes ir jāreģistrē, norādot arī to sākšanās dienu, laiku, smagumu un ilgumu.

Fiziskie parametri un attīstības parametri

31. Pārmaiņas attīstības parametros (piemēram, auss gliemežnīcas atvēršanās, acu atvēršanās, priekšzobu parādīšanās) pirms atšķiršanas no mātes cieši korelē ar ķermeņa svaru (30)(31). Ķermeņa svars var būt vislabākais fiziskās attīstības rādītājs. Tāpēc attīstības parametrus ieteicams mērīt tikai tad, ja jau ir pierādījumi, ka no šiem beigupunktiem varēs gūt papildu informāciju. Minēto parametru novērtēšanas laiks ir norādīts 1. tabulā. Atkarībā no gaidāmās ietekmes un sākotnējo mērījumu rezultātiem var būt ieteicams noteikt papildu laikus vai veikt mērījumus citās attīstības stadijās.

32. Novērtējot fizisko attīstību, ieteicams ņemt vērā pēcdzimumakta vecumu, nevis postnatālo vecumu (33). Ja mazuļus pārbauda dienā, kad tos atšķir no mātes, pārbaudi ieteicams veikt pirms faktiskās atšķiršanas, lai izvairītos no nelabvēlīgās ietekmes, ko rada stress sakarā ar mazuļa atšķiršanu no mātes. Turklāt pārbaudes pēc atšķiršanas no mātes mazulim nedrīkst veikt divās pirmajās pēcatšķiršanas dienās.

1. tabula

Fiziskās un attīstības atšķirību novērtējuma grafiks un funkcionālie/uzvedības beigupunkti (2)

Vecuma periodi Beigupunkti Pirms atšķiršanas (3) Pusaugu dzīvnieki (3) Jauni pieaugušie (3) Fiziskie parametri un attīstības parametri Ķermeņa svars un klīniskie novērojumi reizi nedēļā (4) vismaz reizi divās nedēļās vismaz reizi divās nedēļās Smadzeņu svars 22. dienā pēc piedzimšanas (5) beigās Neiropatoloģija 22. dienā pēc piedzimšanas (5) beigās Dzimumbriedums — pēc vajadzības — Citi attīstības parametri (6) pēc vajadzības — — Funkcionālie/uzvedības beigupunkti Uzvedības ontoģenēze vismaz divi mērījumi Motoriskā aktivitāte (tostarp pieraduma veidošanās) 1–3 reizes (7) — vienu reizi Motoriskās un sensoriskās funkcijas — vienu reizi vienu reizi Mācīšanās un atmiņa — vienu reizi vienu reizi

33. Dzīvie mazuļi ir jāsaskaita un jāsadala pēc dzimuma, piemēram, veicot vizuālu pārbaudi vai izmērot anogenitālo atstatumu (34)(35), un katrs metiena mazulis ir atsevišķi jānosver iespējami drīz pēc dzimšanas, laktācijas periodā – vismaz reizi nedēļā un vismaz reizi divās nedēļās pēc laktācijas perioda. Vērtējot dzimumbriedumu, no katra metiena vismaz vienam tēviņam un vienai mātītei ir jānosaka dzīvnieka vecums un ķermeņa svars tad, kad notiek maksts atvēršanās (36) vai preputiālā atdalīšanās (37).

Uzvedības ontoģenēze

34. Izraudzītu uzvedības modeļu ontoģenēze attiecīgā vecumā jāmēra vismaz vienam mazulim no katra dzimuma metienā, un visās testēšanas dienās visu uzvedības modeļu novērtēšanā izmanto vienus un tos pašus mazuļus. Lai noteiktu normālu attiecīgā uzvedības modeļa ontoģenēzi vai ar vielas ievadīšanu saistītas ontoģenēzes izmaiņas, mērījumu dienas attiecīgajā periodā ir jāsadala vienmērīgi (38). Turpmāk tekstā ir minēti daži uzvedības modeļi, kuru ontoģenēze varētu būt jānovērtē: iztaisnošanas reflekss, negatīvā ģeotakse un motoriskā aktivitāte (38)(39)(40).

Motoriskā aktivitāte

35. Motoriskā aktivitāte ir jāmonitorē (41)(42)(43)(44)(45), pirms mazulis tiek atšķirts no mātes un pieauguša dzīvnieka dzīves posmā. Kā veikt pārbaudi, kad mazulis ir atšķirts no mātes, sk. 32. punktā. Testēšanas seansam ir jābūt pietiekami ilgam, lai vielu nesaņēmušiem kontroldzīvniekiem tā laikā izveidotos pieradums. Motorisko aktivitāti ļoti ieteicams izmantot, lai novērtētu uzvedības ontoģenēzi. Visās uzvedības ontoģenēzes testēšanas sesijās pirms mazuļa atšķiršanas no mātes ir jāizmanto vieni un tie paši dzīvnieki. Testēšana ir jāveic pietiekami bieži, lai ontoģenēzes aspektā varētu novērtētu pieraduma veidošanos sesijas laikā (44). Šajā nolūkā var būt jāizmanto trīs vai vairāk periodi pirms atšķiršanas no mātes un atšķiršanas dienā (piemēram, 13., 17. un 21. dienā pēc piedzimšanas). Tie paši vai tā paša metiena dzīvnieki arī ir jātestē pieauguša dzīvnieka dzīves posmā tuvu pētījuma beigām (piemēram, 60.–70. diena pēc piedzimšanas). Pēc nepieciešamības testēšanu veic papildu dienās. Motoriskā aktivitāte jāmonitorē ar automātisku aktivitātes reģistrēšanas iekārtu, kurai jāspēj konstatēt gan aktivitātes pieaugumu, gan samazināšanos (t. i., saskaņā ar ierīces mērījumiem pamataktivitātes līmenis nedrīkst būt tik zems, lai nevarētu noteikt aktivitātes samazināšanos, vai tik augsts, lai nevarētu noteikt aktivitātes paaugstināšanos). Katra ierīce ir jātestē, izmantojot standartprocedūras, lai iespēju robežās nodrošinātu, ka visā darbības laikā ierīču kopums darbojas uzticami. Iespēju robežās vielas ievadīšanas grupas attiecībā uz ierīcēm jāsadala vienmērīgi. Katrs dzīvnieks ir jāpārbauda atsevišķi. Vielas ievadīšanas grupās jānodrošina arī testēšanas laiku līdzsvars, lai nelabvēlīgu ietekmi neradītu aktivitātes diennakts ritmi. Ir jācenšas nodrošināt, lai izmaiņas testa apstākļos būtu minimālas un nebūtu sistemātiski saistītas ar vielas ievadīšanu. Starp mainīgajiem lielumiem, kas var ietekmēt daudzus uzvedības mērījumus, tostarp motorisko aktivitāti, ir trokšņa līmenis, testēšanas būra izmērs un forma, temperatūra, relatīvais mitrums, apgaismojums, aromāts, dzīvnieka turēšanas būra vai jauna testēšanas būra izmantošana un apkārtējās vides ietekme.

Motoriskās un sensoriskās funkcijas

36. Motoriskās un sensoriskās funkcijas ir detalizēti jāpārbauda vismaz vienu reizi pusaudzībā un vienu reizi jauna pieaugušā dzīvnieka dzīves posmā (piemēram, 60.–70. dienā pēc piedzimšanas). Kā veikt pārbaudi, kad mazulis ir atšķirts no mātes, sk. 32. punktā. Ir jāveic pietiekamas pārbaudes, lai nodrošinātu pietiekami daudz sensorisko modalitāšu (piemēram, somatosensorika, vestibulārs) un motorisko funkciju (piemēram, spēks, koordinācija) paraugu. Daži motorisko un sensorisko funkciju testu piemēri ir atliecējmuskuļa reflekss (46), iztaisnošanās reflekss (47)(48), pierašana pie dzirdes kairinātājiem (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) un impulsa testi (55).

Mācīšanās un atmiņas testi

37. Asociatīvās mācīšanās un atmiņas tests ir jāveic pēc dzīvnieka atšķiršanas no mātes (piemēram, 25. dienā (± 2 dienas)) un jauniem pieaugušiem dzīvniekiem (60. dienā pēc piedzimšanas vai vēlāk). Kā veikt pārbaudi, kad mazulis ir atšķirts no mātes, sk. 32. punktā. Minētajos divos attīstības posmos var izmantot vienu(-s) un to(-s) pašu(-us) vai atsevišķu(-us) testu(-us). Iespējamas nelielas atkāpes, izvēloties mācīšanās un atmiņas testu(-us) žurkām, kas atšķirtas no mātes, un pieaugušām žurkām. Tomēr testiem ir jābūt izstrādātiem tā, lai tie atbilstu diviem kritērijiem. Pirmkārt, mācīšanās ir jānovērtē kā izmaiņas, kas vairākos atkārtotas mācīšanās mēģinājumos vai sesijās vērojamas savstarpējā salīdzinājumā, vai – attiecībā uz testiem ar vienu mēģinājumu – salīdzinājumā ar etalonstāvokli, kas kontrolē mācīšanās pieredzes neasociatīvo ietekmi. Otrkārt, papildus standarta mācīšanai (iemaņu apgūšana) testā(-os) ir jāiekļauj daži atmiņas (īstermiņa vai ilgtermiņa) novērtēšanas pasākumi, bet šādu atmiņas novērtēšanu pārskatā var iekļaut tikai tad, ja tajā pašā testā ir iegūts mērījums attiecībā uz iemaņu apgūšanu. Ja mācīšanās un atmiņas testa(-u) rezultāti liecina par testējamās ķīmiskās vielas ietekmi, jāapsver, vai neveikt papildu testus, lai izslēgtu citu interpretāciju, kuras pamatā ir sensoriskas izmaiņas, motivācijas un/vai kustībspējas izmaiņas. Papildus minētajiem diviem kritērijiem, ja informācijas avotos attiecīga informācija ir pieejama, mācīšanās un atmiņas testu ieteicams izraudzīties, ņemot vērā pierādītu jutību pret ķīmiskajām vielām, kas pieder pie testējamās vielas klases. Ja minētā informācija nav pieejama, lai nodrošinātu atbilstību minētajiem kritērijiem, var sagatavot, piemēram, šādus testus: pasīvā izvairīšanās (43)(56)(57), kavēta pielāgošanās stāvoklim pieaugušām žurkām (58) un žurku mazuļiem (59), ožas kondicionēšana (43)(60), Morris ūdens labirints (61)(62)(63), Bīla vai Cincinati labirints (64)(65), radiāllabirints (66), T veida labirints (43) un ar grafiku kontrolētas uzvedības apguve un saglabāšana (26)(67)(68). Citi testi ir aprakstīti literatūras avotos par žurkām, kas atšķirtas no mātes (26)(27), un pieaugušām žurkām (19)(20).

Autopsija

38. Mātesdzīvniekus pēc pēcnācēja atšķiršanas var humāni nonāvēt.

39. Pēcnācējus neiropatoloģiski izvērtē, izmantojot to dzīvnieku audus, kas humāni nonāvēti 22. dienā pēc piedzimšanas vai agrāk, laikā no 11. dienas līdz 22. dienai pēc piedzimšanas, kā arī pētījuma beigās. Attiecībā uz pēcnācējiem, ko nonāvē 22. dienā pēc piedzimšanas, jānovērtē smadzeņu audi, bet attiecībā uz dzīvniekiem, kurus nonāvē pētījuma beigās – centrālās nervu sistēmas (CNS) audi un perifērās nervu sistēmas (PNS) audi. Dzīvniekiem, kas nonāvēti 22. dienā pēc piedzimšanas vai agrāk, fiksāciju var veikt, vai nu iegremdējot šķīdumā vai veicot perfūziju. Dzīvniekiem, kas nonāvēti pētījuma beigās, jāveic fiksācija ar perfūziju. Audu paraugu sagatavošana visos aspektos, sākot ar dzīvnieku perfūziju un beidzot ar audu paraugu secēšanu, audu apstrādi un priekšmetstikliņu krāsošanu, ir jāplāno līdzsvaroti, lai katrā partijā būtu reprezentatīvi paraugi no katras devu grupas. Papildu norādījumi par neiropatoloģiju ir pieejami ESAO Norādījumu dokumentā Nr. 20 (9), sk. arī (103).

Audu paraugu apstrāde

40. Ir jāreģistrē visas autopsijā konstatētās būtiskās anomālijas. Paņemtajiem audu paraugiem ir jābūt no visiem galvenajiem nervu sistēmas reģioniem. Audu paraugi ir jāsaglabā piemērotā fiksācijas šķīdumā un jāapstrādā saskaņā ar standartizētiem publicētiem histoloģijas protokoliem (69)(70)(71)(103). Iegremdēšana parafīnā ir pieļaujama CNS un PNS audiem, bet, ja ir vajadzīga labāka izšķirtspēja, papildus iegremdēšanai epoksīdsveķos pēc fiksācijas var būt lietderīgi izmantot osmiju (piemēram, perifērajiem nerviem, ja ir aizdomas par perifēro neiropātiju, un/vai veicot perifēro nervu morfometrisko analīzi). Morfometriskās analīzes nolūkā iegūtie smadzeņu audi jāiegremdē piemērotā līdzeklī visiem devu līmeņiem vienlaicīgi, lai nerastos sarukuma artefakti, kas var būt saistīts ar pārāk ilgu uzglabāšanu fiksācijas šķīdumā (6).

Neiropatoloģiskā izmeklēšana

41. Kvantitatīvās izmeklēšanas mērķi ir šādi:

i) noteikt nervu sistēmas rajonus, kur novērotas neiropatoloģiskas izmaiņas;

ii) noteikt, kāda veida neiropatoloģiskās izmaiņas izriet no testējamās ķīmiskās vielas iedarbības; un

iii) noteikt neiropatoloģisko izmaiņu smaguma pakāpi.

Reprezentatīvas histoloģiskas audu paraugu daļas attiecīgi apmācītam patologam ir mikroskopiski jāizmeklē attiecībā uz neiropatoloģisku izmaiņu liecībām. Visas neiropatoloģiskās izmaiņas ir subjektīvi jāiedala pēc smaguma pakāpes. Lai novērtētu smadzeņu daļas dzīvniekiem, kas humāni nonāvēti 22. dienā pēc piedzimšanas vai agrāk, var pietikt ar hematoksilīna un eozīna krāsvielu. Tomēr CNS un PNS audu daļām, kas iegūtas no dzīvniekiem, kuri ir nonāvēti pētījuma beigās, ieteicams izmantot mielīnu (piemēram, luxol fast zilais/cresyl violetais) un sudraba krāsvielu (piemēram, Bielschowsky vai Bodians krāsvielu). Ievērojot profesionāla patologa spriedumu un ņemot vērā novērotās izmaiņas, var uzskatīt, ka noteikta veida izmaiņu noteikšanai un raksturošanai ir lietderīgi izmantot citas krāsvielas, (piemēram, nervu audu šķiedru skābes proteīnu (GFAP) vai lecitīna histoķīmiju, lai novērtētu nervu audu un mikroskopisko nervu audu izmaiņas (72), fluoronefrītu, lai atklātu nekrozi (73)(74), vai sudraba krāsvielu, kas speciāli paredzēta nervu deģenerācijas konstatēšanai (75)).

42. Ir jāizdara morfometrisks (kvantitatīvs) izvērtējums, jo šādi dati var palīdzēt noteikt ar vielas ievadīšanu saistītu ietekmi, un tiem ir būtiska nozīme, interpretējot ar vielas ievadīšanu saistītas smadzeņu svara vai morfoloģijas atšķirības (76)(77). Nervu audu paraugi ir jāņem un jāsagatavo tā, lai varētu veikt morfometrisku izvērtējumu. Morfometriskais izvērtējums var aptvert, piemēram, noteiktu smadzeņu daļu lineāru vai reģionālu mērījumu (78). Lai varētu veikt lineāru vai reģionālu mērījumu, ir jāizmanto homologas daļas, kas rūpīgi izraudzītas pēc drošām mikroskopiskām atšķirībām (6). Lai noteiktu ar vielas ievadīšanu saistītu ietekmi uz tādiem parametriem kā daudzums vai šūnu skaits noteiktos neiroanatomiskos reģionos, var izmantot stereoloģiju (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43. Smadzenēs jāmeklē jebkādas liecības par neiropatoloģiskām izmaiņām, kas saistītas ar vielas ievadīšanu, un no visām galvenajām smadzeņu daļām (piemēram, ožas sīpols, smadzeņu pusložu garoza, hipokamps, bazālie gangliji, talāms, hipotalāms, vidussmadzenes (jumts, tegmentum un smadzeņu kājiņas), tilts, garenās smadzenes, smadzenītes) ir jāpaņem pietiekami paraugi, lai būtu iespējams veikt rūpīgu pārbaudi. Ir svarīgi visiem dzīvniekiem smadzeņu daļas ņemt vienā līmenī. Pieaugušiem dzīvniekiem, kas humāni nonāvēti pētījuma beigās, ir jāņem paraugi no attiecīgajām muguras smadzeņu un PNS daļām. Izmeklējamo vietu skaitā jāiekļauj acs ar acs nervu un tīkleni, muguras smadzenes pie kakla un muguras paresninājumiem, dorsālo un ventrālo saknīšu šķiedras, proksimālais sēžas nervs, proksimālais tibiālais nervs (pie ceļa) un tibiālā nerva apakšstilba muskuļa zari. Muguras smadzeņu un perifēro nervu griezumiem nepieciešams gan šķērsgriezums, gan garengriezums.

44. Neiropatoloģiskajā izvērtējumā jāiekļauj arī nervu sistēmas attīstības traucējumu pazīmju pārbaude (6)(85)(86)(87)(88)(89), kā arī šūnu izmaiņas (piemēram, neironu vakuolizācija, deģenerācija, nekroze) un audu izmaiņas (piemēram, glioze, leikocītu infiltrācija, cistu veidošanās). Šajā sakarā ar vielas ievadīšanu saistītu ietekmi ir svarīgi nošķirt no normālas attīstības gadījumiem, kādi iespējami tajā attīstības stadijā, kādā dzīvnieks bijis nonāvēšanas brīdī (90). Būtisku izmaiņu piemēri, kas liecina par attīstības traucējumiem, ir (ne tikai) šādi:

— ožas sīpolu, smadzeņu vai smadzenīšu kopējā izmēra vai veida izmaiņas,

— dažādu smadzeņu daļu relatīvā izmēra izmaiņas, tostarp smadzeņu daļu izmēra palielināšanās vai samazināšanās, kas saistīta ar parasti pārejošu šūnu vai aksonu projekciju populāciju (piemēram, smadzenīšu ārējais ģeneratīvais slānis, lielais smadzeņu saiklis) zaudēšanu vai noturīgumu,

— savairošanās, migrācijas un diferenciācijas izmaiņas, uz ko norāda reģioni, kur konstatēta pārmērīga apoptoze vai nekroze, ektopisku, dezorientētu vai izkropļotu neironu klasteri vai izkliedētas populācijas vai smadzeņu garozas struktūru dažādu līmeņu relatīvā izmēra izmaiņas,

— mielinizācijas modeļu izmaiņas, tostarp kopējā izmēra samazināšanās vai mieliniēto struktūru iekrāsošanas izmaiņas,

— hidrocefālijas pazīmes, jo īpaši ventrikulu palielināšanās, smadzeņu kanāla stenoze un smadzeņu garozas biezuma samazināšanās.

Devas un atbildes reakcijas sakarības analīze attiecībā uz neiropatoloģiskajām pārmaiņām

45. Kvalitatīvu un kvantitatīvu neiropatoloģisku izmeklēšanu ieteicams izdarīt saskaņā ar turpmāk tekstā aprakstīto pakāpenisko procedūru. Vispirms griezumus no augstākās devas grupas salīdzina ar kontroles grupas griezumiem. Ja augstākās devas grupas dzīvniekiem neiropatoloģiskas izmaiņas netiek konstatētas, turpmāki izmeklējumi nav jāveic. Ja augstākās devas grupas dzīvniekiem konstatē neiropatoloģiskas izmaiņas, ir jāizmeklē vidēji lielās un mazās devas grupas dzīvnieki. Ja nāves vai citādu nevēlamu toksicitātes izpausmju dēļ augstākās devas grupa tiek likvidēta, izmeklējumi neiropatoloģisku izmaiņu noteikšanai ir jāveic augstākās un vidēji lielās devas grupās. Ja neirotoksicitātes pazīmes dzīvniekiem ir konstatētas mazāko devu grupās, neiropatoloģiskie izmeklējumi ir jāveic attiecīgajām grupām. Ja kvalitatīvas vai kvantitatīvas izmeklēšanas rezultātā tiek konstatētas kādas ar vielas ievadīšanu saistītas neiropatoloģiskas izmaiņas, izvērtējot visus dzīvniekus no visām devu grupām, ir jānosaka, kāda ir šo izmaiņu sastopamības un audu bojājumu vai morfometrisko izmaiņu biežuma un smaguma atkarība no devas. Šai izvērtēšanai jāaptver visas smadzeņu daļas, kurās konstatētas jebkādas neiropatoloģiskas izmaiņas. Attiecībā uz katru bojājuma veidu ir jāapraksta smaguma pakāpes noteikšanai izmantotās īpašības, arī īpatnības, kas izmantotas katras pakāpes diferencēšanai. Katra bojājuma veida biežums un smaguma pakāpe ir jādokumentē, un ir jāveic statistiskā analīze, lai novērtētu sakarību starp devu un atbildes reakciju. Ieteicams izmantot kodētus priekšmetstikliņus (91).

DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA

Dati

46. Par datiem veido atsevišķu pārskatu un tos apkopo tabulā, par katru testa grupu norādot izmaiņu veidu un to mātīšu, katra dzimuma pēcnācēju un metienu skaitu, kam attiecīgā izmaiņa konstatēta. Ja pēcnācēji pēc piedzimšanas tiek eksponēti tieši, ir jāreģistrē ekspozīcijas ceļš, ilgums un periods.

Rezultātu izvērtēšana un interpretācija

47. Ontoģenēzes neirotoksicitātes pētījums sniedz informāciju par to, kāda ietekme ir atkārtotai eksponētībai ķīmiskajai vielai in utero un postnatālās attīstības sākumā. Tā kā tiek uzsvērti gan vispārīgās toksicitātes, gan ontoģenēzes neirotoksicitātes beigupunkti, pētījuma rezultāti dod iespēju tādu ietekmi uz neiroloģisko attīstību, kura sastopama bez vispārīgas maternālas toksicitātes, atšķirt no tādas ietekmes uz attīstību, kura izpaužas tikai pie līmeņiem, kas ir toksiski arī mātesdzīvniekam. Tā kā starp pētījuma plānu, statistisko analīzi un datu bioloģisko nozīmīgumu pastāv sarežģīta mijiedarbība, pienācīgai ontoģenēzes neirotoksicitātes datu interpretācijai ir nepieciešams ekspertu viedoklis (107)(109). Interpretējot testa rezultātus, ir jāizmanto zinātnisko datu nozīmīguma pieeja (20)(92)(93)(94). Ir jāizvērtē arī (sastopamie) uzvedības un morfoloģisko konstatējumu modeļi, kā arī liecības par sakarību starp devu un atbildes reakciju. Šajā raksturojumā ir jāiekļauj visu ontoģenēzes neirotoksicitātes novērtēšanā būtisko pētījumu dati, arī dati, kas iegūti epidemioloģiskos pētījumos vai atsevišķos gadījumos ar cilvēkiem un eksperimentālos pētījumos ar dzīvniekiem (piemēram, toksikokinētiskie dati, dati par struktūru un aktivitāti un dati no citiem toksicitātes pētījumiem). Tas attiecas arī uz sakarību starp testējamās ķīmiskās vielas devām un neirotoksisko iedarbību uz katru dzimumu vai tās neesamību, sastopamību un pakāpi (20)(95).

48. Izvērtējot datus, ir jākomentē to bioloģiskais un statistiskais nozīmīgums. Statistiskā analīze ir jāuzskata par rīku, kas vada, nevis nosaka rezultātu interpretāciju. Statistiskā nozīmīguma trūkums nedrīkst būt vienīgais pamatojums tam, lai secinātu, ka ar vielas ievadīšanu saistītas ietekmes nav, un statistiskais nozīmīgums nedrīkst būt vienīgais pamatojums secinājumam, ka pastāv ar vielas ievadīšanu saistīta ietekme. Lai izvairītos no iespējamiem maldīgi negatīviem konstatējumiem un no tipiskajām negatīva rezultāta pierādīšanas grūtībām, ir jāaplūko pieejamie pozitīvās un vēsturiskās kontroles dati, jo īpaši tad, ja ar vielas ievadīšanu saistītas ietekmes nav (102) (106). Maldīgi pozitīvu rezultātu varbūtība ir jāizskata, ņemot vērā datu kopējo statistisko novērtējumu (96). Izvērtējumā jānorāda sakarība starp konstatētajām neiropatoloģiskajām un uzvedības izmaiņām, ja tāda pastāv.

49. Visi rezultāti ir jāanalizē, izmantojot statistiskus modeļus, kas atbilst eksperimenta plānam (108). Parametriskās vai neparametriskās analīzes izvēle ir jāpamato, ņemot vērā tādus faktorus kā datu veids (transformētie vai netransformētie) un to sadalījums, kā arī izraudzītās statistiskās analīzes metodes relatīvais noturīgums. Statistiskās analīzes metode jāizvēlas, ņemot vērā pētījuma nolūku un plānu, lai mazinātu I tipa (maldīgi pozitīvs) un II tipa (maldīgi negatīvs) kļūdas (96)(97)(104)(105). Attīstības pētījumos, kuros izmanto tādas šķirnes, kurām vienā metienā ir vairāki pēcnācēji un tie tiek testēti, metiens ir jāiekļauj statistikas modelī, lai ierobežotu I tipa kļūdu skaita pieaugumu (98)(99)(100)(101). Statistiskajai mērvienībai ir jābūt metienam, nevis mazulim. Eksperimenti ir jāveido tā, lai viena metiena atsevišķie dzīvnieki nebūtu atsevišķu novērojumu objekti. Visi beigupunkti, kurus atkārtoti mēra vienam un tam pašam subjektam, ir jāanalizē ar tādiem statistiskiem modeļiem, kuros būtu ņemts vērā, ka minētie mērījumi nav neatkarīgi.

Testēšanas pārskats

50. Testēšanas pārskatā jāietver vismaz turpmāk minētā informācija.

Testējamā ķīmiskā viela:

— fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikālķīmiskās īpašības,

— identifikācijas dati, tostarp avots,

— preparāta tīrība un zināmie un/vai paredzamie piemaisījumi.

Nesējviela (attiecīgā gadījumā):

— nesējvielas izvēles pamatojums, ja nesējviela nav ūdens vai fizioloģiskais šķīdums.

Testa dzīvnieki:

— izmantotā suga un līnija un pamatojums, ja testējamā suga nav žurka,

— testa dzīvnieku piegādātājs,

— dzīvnieku skaits, vecums pētījuma sākumā un dzimums,

— izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, ūdens u. c.,

— katra dzīvnieka svars testa sākumā.

Testēšanas apstākļi:

— devu izvēles pamatojums,

— devas ievadīšanas ceļa un laika pamatojums,

— ievadīto devu specifikācija, iekļaujot sīkus datus par ievadītā materiāla nesējvielu, tilpumu un fizikālo formu,

— sīka informācija par testējamās ķīmiskās vielas maisījuma/barības preparāta sagatavošanu, sasniegto preparāta koncentrāciju, stabilitāti un homogenitāti,

— mātīšu un pēcnācēju unikālai identifikācijai izmantotā metode,

— sīks apraksts par kārtību, kā veic nejaušināto izlasi, lai sadalītu mātītes vielas ievadīšanas grupās, izlasītu liekos mazuļus likvidēšanai un tos iedalītu testa grupās,

— sīka informācija par testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanu,

— testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas (milj. daļas) barībā/dzeramajā ūdenī vai ieelpotajā gaisā pārrēķins faktiskajā devā (mg uz kg no ķermeņa svara dienā)(attiecīgā gadījumā),

— telpas apstākļi,

— sīka informācija par barības un ūdens kvalitāti (piemēram, ūdensvada ūdens vai destilēts ūdens),

— pētījuma sākuma un beigu datums.

Novērojumu un testa procedūras:

— sīks apraksts par procedūrām, ko izmanto, lai standartizētu novērojumus un procedūras, kā arī vērtēšanas novērojumos izmantotās darba definīcijas,

— visu izmantoto testa procedūru saraksts un to izmantošanas pamatojums,

— sīki uzvedības/funkcionālo, patoloģisko, neiroķīmisko vai elektrofizioloģisko procedūru dati, arī informācija un sīkas ziņas par automātiskajām ierīcēm,

— testēšanas procedūrās izmantotās kalibrēšanas, ierīču ekvivalences nodrošināšanas un vielas ievadīšanas grupu līdzsvarošanas procedūras,

— īss pamatojums visiem lēmumiem, kas saistīti ar profesionālu spriedumu.

Rezultāti (atsevišķi un kopējie, attiecīgā gadījumā arī vidējā vērtība un dispersija):

— dzīvnieku skaits pētījuma sākumā un beigās,

— to dzīvnieku un metienu skaits, ko izmanto katrai testēšanas metodei,

— katra dzīvnieka identifikācijas numurs un metiens, pie kura pieder attiecīgais dzīvnieks,

— metiena lielums un vidējais svars dzimšanas brīdī, pēc dzimuma,

— ķermeņa svars un ķermeņa svara izmaiņu dati, tostarp mātīšu un pēcnācēju ķermeņa svars pēc nonāvēšanas,

— barības patēriņa dati un attiecīgā gadījumā ūdens patēriņa dati (piemēram, ja testējamo ķīmisko vielu ievada ar ūdeni),

— dati par toksisko atbildes reakciju pa dzimumiem un devu līmeņiem, arī toksicitātes pazīmes vai mirstība, tostarp attiecīgā gadījumā nāves iestāšanās brīdis un cēlonis,

— detalizētos klīniskos novērojumos konstatētas ietekmes veids, smagums un ilgums, sākšanās diena, laiks un tālākā attīstība,

— visu attīstības parametru (svars, dzimumbriedums un uzvedības ontoģenēze) rādītāji katrā novērošanas reizē,

— sīks apraksts par visiem uzvedības, funkcionāliem, neiropatoloģiskiem, neiroķīmiskiem un elektrofizioloģiskiem konstatējumiem pa dzimumiem, arī palielinājums un samazinājums salīdzinājumā ar kontroldzīvniekiem,

— autopsijas atrades,

— smadzeņu svars,

— diagnozes, kas secinātas no neiroloģiskām pazīmēm un bojājumiem, arī dabiski sastopamas slimības vai stāvokļi,

— atražu paraugu attēli,

— mazjaudas attēli, ar kuriem var novērtēt morfometrijai izmantoto daļu homoloģiju,

— dati par uzsūkšanos un metabolismu, arī papildu dati no atsevišķa toksikokinētikas pētījuma, ja tādi ir,

— rezultātu statistiskā apstrāde, arī datu analīzē izmantotie statistiskie modeļi, un rezultāti neatkarīgi no to būtiskuma,

— pētījumā iesaistīto personu saraksts, arī profesionālā sagatavotība.

Rezultātu izvērtējums:

— informācija par atbildes reakciju uz devu pa dzimumiem un grupām,

— jebkādas citas toksiskas ietekmes sakarība ar secinājumu par testējamās ķīmiskās vielas neirotoksisko potenciālu pa dzimumiem un grupām,

— jebkādas ar toksikokinētiku saistītas informācijas ietekme uz secinājumiem,

— līdzība ar zināmu neirotoksisku vielu ietekmi,

— dati, kas apliecina testēšanas metodes ticamību un jutību (t. i., pozitīvās kontroles dati un vēsturiskie kontroldati),

— vai pastāv korelācija starp neiropatoloģisko un funkcionālo ietekmi,

— NOAEL vai etalondeva mātītēm un pēcnācējiem pa dzimumiem un grupām.

Secinājumi:

— datu vispārējās interpretācijas izvērtēšana, balstoties uz rezultātiem, arī secinājums par to, vai testējamā ķīmiskā viela izraisījusi ontoģenēzes neirotoksicitāti un kāds bijis NOAEL.

LITERATŪRA

(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13-14 June 1995.

(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Available: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Available: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23-25 October 2000.

(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008 Available: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Available: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1 st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14) Šā pielikuma B.34. nodaļa “Toksicitātes ietekme uz vienas paaudzes reproduktīvo funkciju”.

(15) Šā pielikuma B.35. nodaļa “Divu paaudžu reproduktīvās toksicitātes pētījums”.

(16) Šā pielikuma B.43. nodaļa “Žurku neirotoksicitātes pētījums”.

(17) Šā pielikuma B.31. nodaļa “Prenatālās ontoģenēzes toksicitātes pētījums”.

(18) Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīva 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību. OV L 276, 20.10.2010., 33. lpp.

(19) WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Available: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20) WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Available: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1 st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, 67. – 100. lpp.

(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, 37. – 82. lpp.

(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669.

(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, 287. – 351. lpp.

(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, 181. – 211. lpp.

(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30.

(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. 125. – 145. lpp.

(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, 84. – 107. lpp.

(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, 3. – 41. lpp.

(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056–1060.

(90) Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

(95) Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A “best practices” approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

1. attēls

Vispārīga testēšanas shēma, ko izmanto funkcionālajiem/uzvedības testiem, neiropatoloģiskajai izvērtēšanai un smadzeņu svara noteikšanai. Šī diagramma ir saskaņā ar 13.–15. punkta aprakstu (PND = diena pēc piedzimšanas). 1. papildinājumā ir minēti dzīvnieku iedalījuma piemēri.

1. papildinājums 51. Iespējamā sadalījuma piemēri ir aprakstīti turpmāk tekstā un apkopoti tabulā. Šie piemēri ir sniegti, lai parādītu, ka pētījuma dzīvniekus atbilstoši dažādām testēšanas paradigmām var iedalīt grupās dažādos veidos. 1. piemērs 52. Vienu grupu ar 20 mazuļiem no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) izmanto uzvedības ontoģenēzes pārbaudei pirms dzīvnieka atšķiršanas no mātes. No minētajiem dzīvniekiem 10 mazuļus no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) humāni nonāvē 22. dienā pēc piedzimšanas. Smadzenes izgriež, nosver un apstrādā histopatoloģiskai izvērtēšanai. Turklāt ievāc datus par smadzeņu svaru, izmantojot smadzenes (bez fiksācijas) no pārējiem 10 tēviņiem un 10 mātītēm katrā devas līmeņa grupā. 53. Citu grupu ar 20 dzīvniekiem no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) izmanto funkcionālā/uzvedības testā pēc dzīvnieka atšķiršanas no mātes (detalizēti klīniskie novērojumi, motoriskā aktivitāte, reakcijas uz dzirdes kairinātājiem un kognitīvās funkcijas pārbaude pusaugu dzīvniekiem) un dzimumbrieduma vecuma novērtēšanā. No minētajiem dzīvniekiem 10 mazuļus no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) pētījuma beigās (apmēram 70. dienā pēc piedzimšanas) iemidzina ar anestēziju un veic fiksāciju ar perfūziju. Pēc papildu fiksācijas in situ smadzenes izgriež un apstrādā neiropatoloģiskai izvērtēšanai. 54. Lai pārbaudītu kognitīvās funkcijas jauniem pieaugušiem dzīvniekiem (piemēram, 60.–70. dienā pēc piedzimšanas), izmanto trešo grupu ar 20 mazuļiem no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena). No minētajiem dzīvniekiem 10 dzīvniekus no katra dzimuma uz devas līmeni (1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) pētījuma beigās nonāvē, un izgriež un nosver smadzenes. 55. Pārējos 20 dzīvniekus no katra dzimuma grupā saglabā iespējamām papildu pārbaudēm. 1. tabula Mazuļa Nr. (8) Pārbaudei iedalīto mazuļu skaits Izmeklēšana/tests T M 1 5 20 t + 20 m Uzvedības ontoģenēze 10 t + 10 m 22. dienā pēc piedzimšanas nosver smadzenes/pārbauda neiropatoloģiju/morfometriju 10 t + 10 m 22. dienā pēc piedzimšanas nosver smadzenes 2 6 20 t + 20 m Detalizēti klīniskie novērojumi 20 t + 20 m Motoriskā aktivitāte 20 t + 20 m Dzimumbriedums 20 t + 20 m Motoriskās un sensoriskās funkcijas 20 t + 20 m Mācīšanās un atmiņa (25. diena pēc piedzimšanas) 10 t + 10 m Nosver jauno pieaugušo dzīvnieku smadzenes/pārbauda neiropatoloģiju/morfometriju ~ 70. dienā pēc piedzimšanas 3 7 20 t + 20 m Mācīšanās un atmiņa (jauniem pieaugušiem dzīvniekiem) 10 t + 10 m Nosver jauno pieaugušo dzīvnieku smadzenes ~ 70. dienā pēc piedzimšanas 4 8 — Saglabā dzīvniekus aizstāšanai vai papildu pārbaudēm 2. piemērs 56. Vienu grupu ar 20 mazuļiem no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) izmanto uzvedības ontoģenēzes pārbaudei pirms dzīvnieka atšķiršanas no mātes. No minētajiem dzīvniekiem 10 mazuļus no katra dzimuma uz devas līmeni (1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) humāni nonāvē 11. dienā pēc piedzimšanas. Smadzenes izgriež, nosver un apstrādā histopatoloģiskai izvērtēšanai. 57. Citu grupu ar 20 dzīvniekiem no katra dzimuma uz devas līmeni (1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) izmanto, lai veiktu pārbaudes pēc dzīvnieka atšķiršanas no mātes (detalizēti klīniskie novērojumi, motoriskā aktivitāte, dzimumbrieduma vecuma novērtējums un motoriskās un sensoriskās funkcijas). No minētajiem dzīvniekiem 10 mazuļus no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) pētījuma beigās (apmēram 70. dienā pēc piedzimšanas) iemidzina ar anestēziju un veic fiksāciju, izmantojot perfūziju. Pēc papildu fiksācijas in situ smadzenes izgriež, nosver un apstrādā neiropatoloģiskai izvērtēšanai. 58. Lai pieaugušiem un jauniem pieaugušiem dzīvniekiem pārbaudītu kognitīvās funkcijas, izmanto 10 mazuļus no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena). Kognitīvās funkcijas pārbaudēm 23. dienā pēc piedzimšanas un pārbaudēm ar jauniem pieaugušiem dzīvniekiem izmanto dažādus dzīvniekus. Pētījuma beigās pieaugušos testētos 10 dzīvniekus no katra dzimuma grupā nonāvē, izgriež un nosver smadzenes. 59. Tos pārējos 20 dzīvniekus no katra dzimuma uz grupu, ko testam neizraugās, nonāvē un likvidē pēc atšķiršanas no mātes. 2. tabula Mazuļa Nr. (9) Pārbaudei iedalīto mazuļu skaits Izmeklēšana/tests T M 1 5 20 t + 20 m Uzvedības ontoģenēze 10 t + 10 m 11. dienā pēc piedzimšanas nosver smadzenes/pārbauda neiropatoloģiju/morfometriju 2 6 20 t + 20 m Detalizēti klīniskie novērojumi 20 t + 20 m Motoriskā aktivitāte 20 t + 20 m Dzimumbriedums 20 t + 20 m Motoriskās un sensoriskās funkcijas 10 t + 10 m Nosver jauno pieaugušo dzīvnieku smadzenes/pārbauda neiropatoloģiju/morfometriju ~ 70. dienā pēc piedzimšanas 3 7 10 t + 10 m (10) Mācīšanās un atmiņa (23. diena pēc piedzimšanas) 3 7 10 t + 10 m (10) Mācīšanās un atmiņa (jauniem pieaugušiem dzīvniekiem) Nosver jauno pieaugušo dzīvnieku smadzenes 4 8 — Dzīvniekus nonāvē un likvidē 21. dienā pēc piedzimšanas. 3. piemērs 60. Vienu grupu ar 20 mazuļiem no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) izmanto smadzeņu svara noteikšanai un neiropatoloģiskai novērtēšanai 11. dienā pēc piedzimšanas. No minētajiem dzīvniekiem 10 mazuļus no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) humāni nonāvē 11. dienā pēc piedzimšanas, un smadzenes izgriež, nosver un apstrādā, lai varētu veikt histopatoloģisko izvērtēšanu. Turklāt smadzeņu svara datus iegūst, bez fiksācijas izmantojot smadzenes, kas ņemtas no pārējiem 10 tēviņiem un 10 mātītēm katrā devas līmeņa grupā. 61. Citu grupu ar 20 dzīvniekiem no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) izmanto uzvedības ontoģenēzes pārbaudei (motoriskā aktivitāte), testiem pēc dzīvnieka atšķiršanas no mātes (motoriskā aktivitāte, dzimumbrieduma vecuma novērtējums) un pieaugušu dzīvnieku kognitīvo funkciju pārbaudei. 62. Citu grupu ar 20 dzīvniekiem no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) izmanto motorisko un sensorisko funkciju pārbaudēm (reakcija uz dzirdes kairinātājiem) un detalizētiem klīniskajiem novērojumiem. No minētajiem dzīvniekiem 10 mazuļus no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) ar anestēziju iemidzina un veic fiksāciju, pētījuma beigās izmantojot perfūziju (apmēram 70. dienā pēc piedzimšanas). Pēc papildu fiksācijas in situ smadzenes izgriež, nosver un apstrādā neiropatoloģiskai izvērtēšanai. 63. Citu grupu ar 20 mazuļiem no katra dzimuma uz devas līmeni (t. i., 1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) izmanto jaunu pieaugušu dzīvnieku kognitīvās funkcijas pārbaudēm. No minētajiem dzīvniekiem 10 dzīvniekus no katra dzimuma grupā (1 tēviņu un 1 mātīti no katra metiena) pētījuma beigās nonāvē un izgriež un nosver smadzenes. 3. tabula Mazuļa Nr. (11) Pārbaudei iedalīto mazuļu skaits Izmeklēšana/pārbaude T M 1 5 10 t + 10 m 11. dienā pēc piedzimšanas nosver smadzenes/pārbauda neiropatoloģiju/morfometriju 10 t + 10 m 11. dienā pēc piedzimšanas nosver smadzenes 2 6 20 t + 20 m Uzvedības ontoģenēze (motoriskā aktivitāte) 20 t + 20 m Motoriskā aktivitāte 20 t + 20 m Dzimumbriedums 20 t + 20 m Mācīšanās un atmiņa (27. diena pēc piedzimšanas) 3 7 20 t + 20 m Reakcija uz dzirdes kairinātājiem (pusaudžiem un jauniem pieaugušiem dzīvniekiem) 20 t + 20 m Detalizēti klīniskie novērojumi 10 t + 10 m Nosver jauno pieaugušo dzīvnieku smadzenes/pārbauda neiropatoloģiju/morfometriju ~ 70. dienā pēc piedzimšanas 4 8 20 t + 20 m Mācīšanās un atmiņa (jauniem pieaugušiem dzīvniekiem) 10 t + 10 m Nosver jauno pieaugušo dzīvnieku smadzenes

2. papildinājums Definīcijas Ķīmiskā viela: viela vai maisījums. Testējamā ķīmiskā viela: jebkura viela vai maisījums, ko pārbauda, izmantojot šo testēšanas metodi.

B.54. UTEROTROPAIS BIOTESTS AR GRAUZĒJIEM: ESTROGĒNO ĪPAŠĪBU ĪSĀ SKRĪNINGA TESTS

IEVADS

1. Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 440 (2007. gads). ESAO 1998. gadā sāka augsti prioritāru darbību, lai par iespējami endokrīnās sistēmas darbības traucējumus izraisošu vielu skrīningu un pārbaudēm pārskatītu esošos norādījumus un izveidotu jaunus (1). Viens no apakšpasākumiem bija izveidot testēšanas norādījumus “Uterotropajam biotestam ar grauzējiem”. “Uterotropajam biotestam ar grauzējiem” veica vērienīgu validācijas programmu, arī sagatavoja detalizētu pamatinformāciju (2)(3) un īstenoja vērienīgus laboratoriju un starplaboratoriju pētījumus, lai pierādītu biotesta piemērotību un reproducējamību ar spēcīgu estrogēnu standartvielu, vājiem estrogēna receptoru agonistiem, spēcīgu estrogēna receptoru antagonistu un negatīvu ķīmisko standartvielu (4)(5)(6)(7)(8)(9). Šī testēšanas metode B.54 ir radīta, izmantojot testēšanas programmā gūto pieredzi un šīs programmas rezultātus, kas gūti ar estrogēnu agonistiem.

2. Uterotropais biotests ir īss skrīninga tests, kas tika izstrādāts 20. gs. 30. gados (27)(28) un ko ekspertu komiteja pirmo reizi standartizēja skrīningam 1962. gadā (32)(35). Tās pamatā ir dzemdes svara pieaugums vai uterotropa atbildes reakcija (recenziju sk. 29. punktā). Ar to novērtē ķīmiskās vielas spēju izraisīt dabiskā estrogēna agonistiem vai antagonistiem (piemēram, 17 ß estradiols) pielīdzināmu bioloģisko aktivitāti, tomēr antagonistu noteikšanai to izmanto daudz retāk nekā agonistu noteikšanai. Dzemde uz estrogēnu reaģē divos veidos. Sākotnējā reakcija ir tās svara pieaugums, kas saistīts ar ūdens uzsūkšanos. Pēc tam svara pieaugums ir saistīts ar audu augšanu (30). Žurku un peļu dzemdes reakcijas ir kvalitatīvi salīdzināmas.

3. Biotestu izmanto kā in vivo skrīninga testu, un tas būtu jāskata kopā ar “ESAO konceptuālo pamatdokumentu: endokrīnās sistēmas darbības traucējumus izraisošu vielu testēšana un novērtēšana” (2. papildinājums). Minētajā konceptuālajā regulējumā uterotropais biotests ir iekļauts 3. līmenī kā in vivo tests, kas sniedz informāciju par vienu atsevišķu endokrīnās sistēmas mehānismu, t. i., estrogenitāti.

4. Uterotropo biotestu ir paredzēts iekļaut in vitro un in vivo testu sērijā, kuros identificē ķīmiskās vielas, kas var ietekmēt endokrīnās sistēmas darbību, un ar kuru palīdzību var novērtēt riskus cilvēku veselībai un videi. Lai novērtētu testa veiktspēju estrogēnisku ķīmisko vielu identificēšanā, ESAO validācijas programmā tika izmantoti gan stipri, gan vāji estrogēnu agonisti (4)(5)(6)(7)(8). Šādi tika labi pierādīta testa procedūras jutība attiecībā uz estrogēnu agonistiem, kā arī laboratorijas un starplaboratoriju pētījumu reproducējamība.

5. Attiecībā uz negatīvām ķīmiskām vielām validācijas programmā iekļāva tikai vienu “negatīvu” ķīmisko standartvielu, kura uterotropā biotestā, kā arī in vitro receptoru saistīšanās testā un receptoru testā jau atzīta par negatīvu, bet ir izvērtēti ar ESAO validācijas programmu nesaistīti papildu testa dati, ar kuriem papildus pamatots uterotropā biotesta specifiskums estrogēnu agonistu skrīningā (16).

SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI

6. Estrogēnu agonisti un antagonisti darbojas kā estrogēna α un β receptoru ligandi, un tie var attiecīgi aktivizēt vai nomākt receptoru transkripciju. Tas var radīt veselības apdraudējumus, tostarp negatīvi ietekmēt reprodukciju un attīstību. Tāpēc ir nepieciešams ķīmiskas vielas ātri novērtēt un izvērtēt kā iespējamus estrogēna agonistus vai antagonistus. Kāda liganda afinitātei ar kādu estrogēna receptoru vai tam, ka in vitro aktivizējas ziņotājgēnu transkripcija, ir informatīva nozīme, tomēr tas ir tikai viens no faktoriem, kas nosaka iespējamu bīstamību. Bīstamību var noteikt arī, piemēram, metaboliska aktivēšanās un dezaktivēšanās, vielai iekļūstot ķermenī, tās izplatīšanās mērķaudos un izdalīšanās no organisma, – tas vismaz daļēji atkarīgs no ievadīšanas ceļa un testējamās ķīmiskās vielas. Tas nozīmē, ka testējamās ķīmiskās vielas iespējamā darbība piemērotos apstākļos ir jāpārbauda in vivo, izņemot gadījumus, kad ķīmiskās vielas īpašības attiecībā uz uzsūkšanos – izplatīšanos – metabolismu – izdalīšanos attiecīgu informāciju jau nodrošina. Dzemdes audi ātri un spēcīgi aug, ja tos stimulē ar estrogēnu, jo īpaši laboratoriju grauzējiem, kuru estrālais cikls ir apmēram 4 dienas. Grauzēju sugas, jo īpaši žurkas, bieži izmanto arī toksicitātes pētījumos bīstamības raksturošanai. Tāpēc grauzēju dzemde ir atbilstošs mērķorgāns estrogēna agonistu un antagonistu in vivo skrīningam.

7. Šīs testēšanas metodes pamatā ir ESAO validācijas pētījumā izmantotie protokoli, par kuriem laboratoriju un starplaboratoriju pētījumos apstiprināts, ka tie ir uzticami un atkārtojami (5)(7). Pašlaik ir pieejamas divas metodes, proti, metode, kurā izmanto pieaugušas mātītes, kam ir izoperētas olnīcas, un metode, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, kam olnīcas nav izoperētas. ESAO validācijas testa programma apliecināja, ka abu minēto metožu jutība un reproducējamība ir salīdzināma. Metode ar nenobriedušiem dzīvniekiem gan ir nespecifiskāka sakarā ar to, ka šādiem dzīvniekiem nedarbojas hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass, bet salīdzinājumā ar metodi, kurā izmanto pieaugušas mātītes, kurām ir izoperētas olnīcas, tai ir lielāks pētījuma tvērums, jo ar šo metodi var konstatēt ķīmiskas vielas, kas iedarbojas uz hipotalāma, hipofīzes un gonādu asi, nevis tikai uz estrogēna receptoru. Žurkas hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass darbojas apmēram no 15 dienu vecuma. Pirms tam pubertāti, piemēram, ar GnRH, paātrināt nevar. Mātītēm, kas gandrīz sasniegušas pubertātes vecumu, pirms maksts atvēršanās ir vairāki klusie periodi, kuru rezultātā nenotiek maksts atvēršanās vai ovulācija, bet notiek hormonu svārstības. Ja ķīmiskā viela tieši vai netieši stimulē hipotalāma, hipofīzes un gonādu asi, tas var izraisīt agrīnu pubertātes iestāšanos, agrīnu ovulāciju un paātrinātu maksts atvēršanos. Augšanu stimulē un maksts atvēršanos paātrina ne vien ķīmiskas vielas, kas iedarbojas uz hipotalāma, hipofīzes un gonādu asi, bet arī tāda barība, kas gan nav estrogēniska, taču ir ar augstāku metabolizējamas enerģijas līmeni. Minētās ķīmiskās vielas neizraisīs uterotropo atbildes reakciju mātītēm, kurām ir izoperētas olnīcas, jo šo dzīvnieku hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass nedarbojas.

8. Dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ priekšroka jādod metodei, kurā izmanto nenobriedušas žurkas, lai dzīvniekiem pirms tam netiktu veiktas operācijas un lai mazinātu dzīvnieku neizmantojamību, piemēram, attiecībā uz dzīvniekiem, kam ir estrālā cikla sākšanās pazīmes (sk. 30. punktu).

9. Uterotropās atbildes reakcijas cilme nav tikai estrogēniska, proti, reakciju var izraisīt arī ķīmiskās vielas, kas nav estrogēnu agonisti vai antagonisti. Piemēram, relatīvi liela progesterona, testosterona vai dažādu sintētisko progestīnu deva arī var radīt stimulētu atbildes reakciju (30). Ja konstatēta atbildes reakcija, var veikt histoloģiskus izmeklējumus attiecībā uz maksts keratinizāciju un pārragošanos (30). Neatkarīgi no atbildes reakcijas iespējamā cēloņa, uterotropajā biotestā gūstot pozitīvu rezultātu, parasti jārīkojas, lai iegūtu precīzāku informāciju. Papildu liecības par estrogenitāti var iegūt in vitro testēšanā, piemēram, estrogēna receptora saistīšanās testos un transkripcijas aktivizēšanās testos, vai citos in vivo testos, piemēram, mātīšu pubertātes testā.

10. Tā kā uterotropo biotestu izmanto par in vivo skrīninga testu, izraudzītajā validācijas pieejā ir gan ņemti vērā dzīvnieku labturības apsvērumi, gan izmantota diferencētas testēšanas stratēģiju. Šajā sakarā centieni bija vērsti uz to, lai stingri apstiprinātu reproducējamību un jutību attiecībā uz estrogenitāti – kas ir galvenā problēma daudzu ķīmisko vielu gadījumā, –, bet maz tika darīts attiecībā uz testa daļu, kas skar antiestrogenitāti. Tā kā vielu ar izteikti antiestrogēniskām īpašībām (ko neaizēno kaut kāda estrogēniska darbība) ir ļoti maz, testēšanā tika izmantots tikai viena izteikti antiestrogēniska viela. Tāpēc šajā testēšanas metodē ir aplūkots estrogenitātes protokols, bet protokols, kurā ir aprakstīts antagonista tests, ir iekļauts Norādījumu dokumentā (37). Izteikti antiestrogēniskas darbības ķīmiskajām vielām paredzētā testa reproducējamību un jutību skaidrāk definēs vēlāk, kad testa procedūra jau kādu laiku būs izmantota un kad būs identificēts vairāk ķīmisko vielu ar šādu iedarbības veidu.

11. Ir atzīts, ka visām procedūrām, kas saistītas ar dzīvniekiem, ir jāatbilst vietējiem dzīvnieku labturības standartiem; turpmāk tekstā minētie labturības un apiešanās nosacījumi ir minimālie standarti, un lielāks spēks ir vietējam regulējumam, piemēram, Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīvai 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (38). ESAO ir izdevusi arī citus noteikumus par humānu izturēšanos pret dzīvniekiem (25).

12. Tāpat kā visos testos, kur izmanto dzīvus dzīvniekus, ir ļoti svarīgi pirms testa sākuma pārliecināties, ka attiecīgie dati ir tiešām vajadzīgi. Piemēram, divi gadījumi, kur minētie dati var būt vajadzīgi, ir šādi:

— augsta ekspozīcijas iespējamība (konceptuālā regulējuma 1. līmenis, 2. papildinājums) vai estrogenitātes pazīmes (2. līmenis), – lai noskaidrotu, vai šāda ietekme ir iespējama in vivo,

— ietekme, kas liecina par estrogenitāti 4. vai 5. līmeņa in vivo testos, – lai pamatotu, ka attiecīgā ietekme ir saistīta ar estrogenitātes mehānismu, ko nevar noskaidrot in vitro testā.

13. Šajā testēšanas metodē minētās definīcijas ir minētas 1. papildinājumā.

TESTA PRINCIPS

14. Uterotropā biotesta jutība tiek nodrošināta dzīvnieku testēšanas sistēmā, kurā nedarbojas hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass, un attiecīgi ir zems endogēnais cirkulējošā estrogēna līmenis. Tādā gadījumā ir zems dzemdes svara izejlielums un reakcija uz estrogēna ievadīšanu notiek maksimālā diapazonā. Grauzēju mātītēm minētajām prasībām atbilst divi estrogēnjutīgi stāvokļi:

i) nenobriedušas mātītes pēc atšķiršanas un pirms pubertātes, un

ii) jaunas pieaugušās mātītes, kurām izoperētas olnīcas un nodrošināts pietiekams laiks, lai varētu samazināties dzemdes audu apjoms.

15. Testējamo ķīmisko vielu ievada katru dienu ar mākslīgo barošanu vai zemādas injekciju. Testējamo ķīmisko vielu pakāpeniskās devās saņem ne mazāk kā divas eksperimenta dzīvnieku grupas (norādījumus sk. 33. punktā), katrai grupai izmantojot vienu devas līmeni un ievadot vielu trīs dienas pēc kārtas, ja izvēlēta metode, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, un ievadot vielu vismaz trīs dienas pēc kārtas, ja izvēlēta metode, kurā izmanto pieaugušas mātītes, kam izoperētas olnīcas. Dzīvniekiem izdara autopsiju apmēram 24 stundas pēc pēdējās devas ievadīšanas. Estrogēna agonistu gadījumā novērtē vidējo dzemdes svaru grupās, kurās dzīvnieki saņem testējamo ķīmisko vielu, salīdzinājumā ar nesējvielas grupu, lai konstatētu, vai vērojams statistiski nozīmīgs pieaugums. Testa grupas dzīvnieku vidējā dzemdes svara statistiski nozīmīgs pieaugums liecina par pozitīvu atbildes reakciju šajā biotestā.

METODES APRAKSTS

Dzīvnieku sugas izraudzīšanās

16. Var izmantot parastās laboratorijas grauzēju līnijas. Piemēram, validācijas procesā tika izmantotas Sprague un Dawley un Wistar līnijas žurkas. Neizmanto līnijas, par kurām ir zināms vai par kurām ir aizdomas, ka to dzemde mazāk reaģē uz testējamo ķīmisko vielu. Laboratorijai ir jāpierāda izmantotās līnijas jutība, kā norādīts 26. un 27. punktā.

17. Žurkas un peles uterotropajā biotestā izmanto kopš 20. gs 30. gadiem. ESAO validācijas pētījumi tika veikti tikai ar žurkām, pieņemot, ka ir sagaidāms, ka abas sugas būs līdzvērtīgas, un tāpēc metodes validācijai pasaulē jāpietiek ar vienu sugu, lai taupītu resursus un aizsargātu dzīvniekus. Parasti reproduktīvās un ontoģenēzes toksicitātes pētījumos izmanto žurkas. Tā kā par pelēm ir ievērojama vēsturisko datu bāze, lai uterotropā biotesta metodes tvērumu attiecībā uz grauzējiem paplašinātu un par testa sugu izmantotu arī peles, ar tām ierobežotā apjomā tika veikts validācijas pēcpētījums (16). Saskaņā ar sākotnējo nolūku taupīt resursus un aizsargāt dzīvniekus ir izraudzīta pieeja, kura balstās uz vielu salīdzināmību, kurā testējamās ķīmiskās vielas un iesaistītās laboratorijas izmanto ierobežotā skaitā un arī nepārbauda kodētus paraugus. Šis validācijas pētījums, kurā izmanto vielu salīdzināmības pieeju, attiecībā uz uterotropo biotestu ar jaunām pieaugušām pelēm, kurām ir izoperētas olnīcas, apliecina, ka iegūtie kvalitatīvie un kvantitatīvie dati par žurkām un pelēm ir līdzīgi. Ja uterotropā biotesta rezultātus izmanto kā ilgtermiņa pētījuma priekšpētījumu, abos pētījumos var izmantot vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekus. Vielu salīdzināmības pieeja tika izmantota tikai ar pelēm, kurām ir izoperētas olnīcas, un ziņojums nenodrošina tādu uzticamu datu kopumu, ar kuriem būtu iespējams validēt metodi, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, un tāpēc metode, kur izmanto nenobriedušas peles, nav šīs testēšanas metodes tvērumā.

18. Tātad dažos gadījumos žurku vietā var izmantot peles. Ir jāpamato attiecīgās sugas izmantošana, ņemot vērā toksikoloģiskos, farmakokinētiskos un/vai citus kritērijus. Izmantojot peles, var būt jāmaina protokols. Piemēram, peles proporcionāli ķermeņa svaram patērē vairāk barības nekā žurkas, un tāpēc peļu barībā fitoestrogēnu saturam ir jābūt mazākam nekā žurku barībā (9)(20)(22).

Turēšanas un barošanas apstākļi

19. Visām procedūrām ir jāatbilst vietējiem laboratorijas dzīvnieku labturības standartiem. Minētie labturības un apiešanās nosacījumi ir minimālie standarti, un lielāks spēks ir vietējiem noteikumiem, piemēram, Eiropas Parlamenta un Padomes 2010. gada 22. septembra Direktīvai 2010/63/ES par zinātniskiem mērķiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību (38). Eksperimenta dzīvnieku telpas temperatūrai jābūt 22 °C (ar nobīdi ± 3 °C). Gaisa relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, ieteicams, ne vairāk kā 70 %, izņemot uzkopšanas laiku. Vēlamais gaisa relatīvais mitrums ir 50–60 %. Telpās ir jābūt mākslīgajam apgaismojumam. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur apgaismojumā, bet 12 stundas tumsā.

20. Laboratorijas dzīvnieku barību un dzeramo ūdeni dzīvnieki saņem ad libitum. Jaunus pieaugušos dzīvniekus var turēt atsevišķi vai būros grupās līdz trīs dzīvniekiem katrā būrī. Tā kā nenobriedušie dzīvnieki ir jauni, ieteicams tos turēt, veidojot sociālās grupas.

21. Ir zināms, ka augsts fitoestrogēnu līmenis laboratorijas dzīvnieku barībā veicina dzemdes svara pieaugumu tādā apmērā, kas ir pietiekams, lai interferētu ar uterotropo biotestu (13)(14)(15). Augsts fitoestrogēnu un metabolizējamās enerģijas līmenis laboratorijas dzīvnieku barībā var izraisīt arī agrīnu pubertātes iestāšanos nenobriedušiem dzīvniekiem. Fitoestrogēnu klātbūtni galvenokārt veicina sojas un sējas lucernas izstrādājumu iekļaušana laboratorijas dzīvnieku barībā, un fitoestrogēna koncentrācija dažādās laboratorijas dzīvnieku barības partijās ir atšķirīga (23). Ķermeņa svars ir svarīgs mainīgais, jo patērētās barības daudzums ir saistīts ar ķermeņa svaru. Tāpēc ar vienu un to pašu barību faktiskais patērētais fitoestrogēna daudzums dažādām sugām un dažādiem vecumiem var atšķirties (9). Nenobriedušas žurku mātītes attiecībā pret ķermeņa svaru var patērēt apmēram divreiz vairāk barības nekā jaunas pieaugušas žurku mātītes, kurām ir izoperētas olnīcas. Jaunas pieaugušas peles attiecībā pret ķermeņa svaru var patērēt apmēram četras reizes vairāk barības nekā jaunas pieaugušas žurku mātītes, kurām ir izoperētas olnīcas.

22. Tomēr uterotropā biotesta rezultāti (9)(17)(18)(19) liecina, ka ierobežotā daudzumā fitoestrogēni barībā ir pieņemami, un tas nemazina biotesta jutību. Var vadīties no tā, ka nenobriedušām Sprague un Dawley un Wistar sugas žurku mātītēm fitoestrogēnu līmenis barībā nedrīkst pārsniegt 350 μg genisteīna aizstājēju uz gramu laboratorijas dzīvnieku barības (6)(9). Šāda barība būtu piemērota, arī testējot jaunas pieaugušas žurkas, kam ir izoperētas olnīcas, jo jaunas pieaugušas žurkas attiecībā pret ķermeņa svaru patērē mazāk barības nekā nenobriedušas žurkas. Ja izmanto pieaugušas peles, kurām ir izoperētas olnīcas, vai žurkas, kuras ir jutīgākas pret fitoestrogēnu, fitoestrogēna daudzums barībā ir attiecīgi jāsamazina (20). Turklāt atšķirīgs metaboliskās enerģijas līmenis barībā var izraisīt pubertātes sākuma laika nobīdi (21)(22).

23. Pirms pētījuma sākšanas ir rūpīgi jāizvēlas barība, lai fitoestrogēna (norādījumus sk. (6)(9)) vai metabolizējamās enerģijas līmenis nebūtu pārāk augsts, jo tas var nelabvēlīgi ietekmēt pētījuma rezultātus (15)(17)(19)(22)(36). Abu minēto faktoru pārbaudei ir svarīga nozīme laboratorijas izmantotās testa sistēmas pareizas darbības nodrošināšanā, kā norādīts 26. un 27. punktā. Drošības apsvērumu dēļ, ievērojot labas laboratorijas prakses noteikumus, ir jāsagatavo katras pētījuma laikā izmantotās barības partijas reprezentatīvi paraugi, lai būtu iespējams noteikt fitoestrogēnu līmeni (piemēram, gadījumā, ja salīdzinājumā ar vēsturiskiem kontroldatiem ir vērojams liels dzemdes kontrolsvars, vai ja izpaužas nepietiekama atbildes reakcija uz estrogēna standartvielu, 17 α etinilestradiolu). Alikvotas ir jāanalizē pētījumā vai jāsasaldē –20 °C temperatūrā vai tā, lai paraugs nesāktu sadalīties pirms analīzes.

24. Daži guļvietas materiāli var saturēt dabiskas estrogēniskas vai antiestrogēniskas ķīmiskās vielas (piemēram, kukurūzas vālīte ietekmē ciklu žurkām un uzskatāms, ka tai piemīt antiestrogēniskas īpašības). Ir jāizvēlas guļvietas materiāls, kas satur iespējami maz fitoestrogēnu.

Dzīvnieku sagatavošana

25. Eksperimenta dzīvniekus, kuriem neizpaužas slimības vai fiziskās kroplības, nejaušināti sadala kontroles un vielas ievadīšanas grupās. Būrus izvieto tā, lai iespējami samazinātu būru novietojuma varbūtējo iedarbību. Katram dzīvniekam ir jāpiešķir atsevišķa identifikācija. Aklimatizācijas periodā līdz atšķiršanai ieteicams nenobriedušus dzīvniekus turēt būros kopā ar māti vai to māti, kuras aprūpē ir nodoti dzīvnieku mazuļi. Jauniem pieaugušiem dzīvniekiem un nenobriedušiem dzīvniekiem, kurus piegādā ar māti vai māti, kuras aprūpē ir nodots mazulis, aklimatizācijas periodam pirms pētījuma sākuma ir jābūt apmēram 5 dienām. Ja nenobriedušus dzīvniekus saņem jau atšķirtus no mātes, nepieciešamais aklimatizācijas periods var būt īsāks, jo testējamās ķīmiskās vielas ievadīšana ir jāsāk uzreiz pēc atšķiršanas (sk. 29. punktu).

PROCEDŪRA

Laboratorijas kvalifikācijas verificēšana

26. Laboratorijas kvalifikāciju var pārbaudīt ar divām pieejām:

— periodiskās verifikācijās, kurās izmanto sākotnēju pozitīvās kontroles izejdatu pētījumu (sk. 27. punktu). Vismaz ik pēc 6 mēnešiem un katru reizi, kad notiek izmaiņas, kas var ietekmēt testa rezultātus (piemēram, jauns barības preparāts, izmaiņas to darbinieku sastāvā, kas veic sekcijas, tiek izmantoti citas līnijas dzīvnieki vai cits piegādātājs utt.), testa sistēmas (dzīvnieku modeļa) reaģētspēju pārbauda, izmantojot attiecīgu devu estrogēna standartvielas (pamatojoties uz pozitīvās kontroles izejdatu pētījumu, kas aprakstīts 27. punktā), resp., 17α-etinilestradiola (CAS Nr. 57-63-6) (EE),

— vienlaicīgās kontrolēs, katrā testēšanā iekļaujot grupu, kurai ievada attiecīgu estrogēna standartvielas devu.

Ja sistēma reaģē nepareizi, ir jāpārbauda un attiecīgi jāmaina eksperimenta apstākļi. Ieteicamā estrogēna standartvielas deva, ko izmanto abās pieejās, ir apmēram ED 70–80.

27. Pozitīvās kontroles izejdatu pētījums – pirms laboratorija pirmo reizi veic pētījumu, izmantojot šo testēšanas metodi, laboratorijas kvalifikācija ir jāpārbauda dzīvnieku modeļa reaģētspējas testēšanā, nosakot atbildes reakciju uz estrogēna standartvielas devu – ne mazāk kā četrām devām 17α-etinilestradiola (CAS Nr. 57-63-6) (EE). Ietekmi uz dzemdes svaru salīdzina ar vēsturiskiem datiem (sk. literatūras sarakstu (5)). Ja pozitīvās kontroles izejdatu pētījumā negūst vēlamos rezultātus, ir jāpārbauda un jāmaina eksperimenta apstākļi.

Dzīvnieku skaits un stāvoklis

28. Katrā devu saņemšanas un kontroles grupā jābūt vismaz 6 dzīvniekiem (gan metodei, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, gan metodei, kurā izmanto pieaugušus dzīvniekus, kam ir izoperētas olnīcas).

Nenobriedušu dzīvnieku vecums

29. Uterotropā biotestā izmantojot nenobriedušus dzīvniekus, ir jānorāda dzīvnieku dzimšanas datums. Devu ievadīšana ir jāsāk pietiekami agri, nodrošinot, lai pēc testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanas vēl nebūtu konstatējams ar pubertāti saistīts endogēnā estrogēna fizioloģiskais pieaugums. No otras puses, ir liecības, ka ļoti jauni dzīvnieki var būt mazāk jutīgi. Lai noteiktu vislabāko vecumu, katrai laboratorijai būtu jāņem vērā savi pamatdati par nobriešanu.

Parasti žurkām devu var sākt ievadīt uzreiz pēc agrīnas atšķiršanas 18. dienā pēc piedzimšanas (piedzimšanas diena ir 0. diena pēc piedzimšanas). Ieteicams beigt žurkām ievadīt devu 21. dienā pēc piedzimšanas, bet noteikti pirms 25. dienas pēc piedzimšanas, jo šajā vecumā sāk darboties hipotalāma, hipofīzes un gonādu ass un var sākt paaugstināties endogēnais estrogēna līmenis, un tas izraisa dzemdes svara vidējā izejlieluma un grupas standartnovirzes pieaugumu (2)(3)(10)(11)(12).

Olnīcu izoperēšanas procedūra

30. Žurku un peļu mātītēm, kurām izoperē olnīcas (kontroles grupas un vielas saņemšanas grupas), to dara 6–8 nedēļu vecumā. Minimālais laiks no olnīcu izoperēšanas brīža līdz pirmajai devas ievadīšanas dienai žurkām ir 14 dienas, lai dzemdes audi varētu samazināties līdz minimālam stabilam izejlielumam. Pelēm minimālais laiks no olnīcu izoperēšanas brīža līdz pirmajai devas ievadīšanas dienai ir 7 dienas. Pietiek ar nelielu daudzumu olnīcas audu, lai radītu ievērojamu estrogēnu cirkulācijas līmeni (3), tāpēc pirms izmantošanas dzīvnieki ir jāpārbauda, vismaz piecas dienas pēc kārtas (piemēram, žurkām 10.–14. dienā pēc olnīcu izoperēšanas) pārbaudot maksts uztriepē iegūtas epitēlija šūnas. Ja konstatē estrālā cikla sākšanās pazīmes, dzīvniekus izmantot nedrīkst. Turklāt izgriezto olnīcu vietas ir jāpārbauda autopsijā, lai pārliecinātos, ka nav palikušas olnīcas audu daļas. Ja olnīcas audu daļas ir palikušas, attiecīgo dzīvnieku aprēķinos neizmanto (3).

31. Olnīcu izoperēšanas procedūras sākumā dzīvnieku, kuram ir ievadīta vajadzīgā anestēzijas deva, nogulda uz vēdera. Iegriezumam, ar kuru atver dorsāli laterālo vēdera sienu, jābūt apmēram 1 cm garam un jāatrodas vidū starp paribi un gūžas kaulu, un dažus milimetrus uz sāniem no jostas muskuļa sānu malas. Olnīcu izņem no vēdera dobuma un novieto sterilā vietā. Olnīcu izgriež olvada un dzemdes savienojuma vietā. Pārliecinās, ka nav lielas asiņošanas, aizšuj vēdera dobumu un ādu savelk ar skavām vai piemērotu ķirurģisko diegu. Savienojuma vietas shematiski ir attēlotas 1. attēlā. Ir jāizmanto atbilstošs pēcoperācijas pretsāpju līdzeklis, ko iesaka grauzēju aprūpes jomā specializējies veterinārārsts.

Ķermeņa svars

32. Metodē, kurā izmanto pieaugušus dzīvniekus, kam izoperētas olnīcas, ķermeņa svars nekorelē ar dzemdes svaru, jo pēdējo ietekmē hormoni, piemēram, estrogēni, nevis augšanas faktori, kas regulē ķermeņa apmērus. Lietojot metodi, kurā izmanto nenobriedušus dzīvniekus, gluži pretēji, nobriešanas laikā ķermeņa svars ir saistīts ar dzemdes svaru (34). Tāpēc, lietojot metodi, kurā izmanto nen