I PIELIKUMS

Atbilstīgi 3., 4., 5. un 7. pantam veicamo testu shēma

1. VISPĀRĪGIE PRINCIPI ATTIECĪGĀ KAITĪGĀ ORGANISMA KLĀTBŪTNES NOTEIKŠANAI

1.1. Aizdomas par attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtni ir tad, ja ir iegūts pozitīvs rezultāts pirmajā noteikšanas testā, kas veikts attiecīgajam augam vai ūdens paraugos.

1.2. Attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtni apstiprina šādos gadījumos: a) ja pirmais vai otrais noteikšanas tests ir selektīvā izolācija, kuras rezultātā iegūst kolonijas ar tipisku morfoloģiju, un tiek iegūti pozitīvi rezultāti divos identifikācijas testos, kas veikti kolonijām; b) ja pirmais un otrais tests ir testi, kas nav selektīvā izolācija, un pēc parauga selektīvās izolācijas veikšanas tiek iegūtas kolonijas ar tipisku morfoloģiju, kurām veikti divi identifikācijas testi, abos iegūstot pozitīvu rezultātu. Viens no šiem diviem identifikācijas testiem ir tests, kas minēts 2.2. punkta e), f) un g) apakšpunktā.

2. TESTI

2.1. Noteikšanas testi

Noteikšanas testi ir tādi, lai tajos konsekventi noteiktu vismaz 104 šūnu vienā mililitrā atkārtoti suspendētu nogulšņu, kas iegūtas no asimptomātiskiem paraugiem.

Otrais noteikšanas tests ir balstīts uz bioloģiskajiem principiem vai nukleotīdu reģioniem, kas atšķiras no pirmajā noteikšanas testā izmantotajiem.

Noteikšanas testi ir šādi:

a) imūnfluorescences testi, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

b) attiecīgā kaitīgā organisma izolēšana daļēji selektīvajā barotnē mSMSA, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

c) konvencionālais PCR tests, izmantojot Pastrik et al., (2002) (1) praimerus, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

d) TaqMan® reālā laika PCR testi, izmantojot šādus praimerus un zondes: i) Weller et al. (2000) (2), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (izmantojot modificētu TaqMan® zondi, balstoties uz Weller et al. (2000) sniegto informāciju), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (tā dēvētais NYtor tests), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; iv) Massart et al. (2014) (5), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

e) LAMP (cilpmediētas izotermiskas amplifikācijas) tests, izmantojot Lenarčič et al. (2014) (6) praimerus (tikai simptomātiskam augu materiālam), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos.

2.2. Identifikācijas testi

Identifikācijas testi ir šādi:

a) imūnfluorescences testi, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

b) konvencionālie PCR testi, izmantojot Pastrik et al.(2002) praimerus, kā sīki aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

c) TaqMan® reālā laika PCR testi, izmantojot šādus praimerus un zondes: i) Weller et al. (2000), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; ii) Vreeburg et al. (2016) (izmantojot modificētu TaqMan® zondi, balstoties uz Weller et al. (2000) sniegto informāciju), kā sīki aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; iii) Vreeburg et al. (2018) (tā dēvētais NYtor tests), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; iv) Massart et al. (2014), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

d) LAMP (cilpmediētas izotermiskas amplifikācijas) tests, izmantojot Lenarčič et al. (2014) praimerus, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

e) filotipu specifiskais multipleksais konvencionālais PCR tests (Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

f) DNS svītrkodēšana (Wicker et al. (2007) (9), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

g) MALDI-TOF MS (van de Bilt et al.(2018) (10), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos.

3. PROCEDŪRU PLŪSMKARTES

Plūsmkarte Nr. 1. Diagnostikas procedūra attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtnes noteikšanai attiecīgā auga paraugos.

a Izolāciju var izmantot kā pirmo vai otro noteikšanas testu. Ja ir aizdomas par attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtni barotnē, kolonijas pārsēj, lai iegūtu tīrkultūras, kam veic divus identifikācijas testus.

b Viens no šiem diviem identifikācijas testiem ir tests, kas minēts 2.2. punkta e), f) un g) apakšpunktā. Lai apstiprinātu kaitīgā organisma klātbūtni, jāiegūst pozitīvs rezultāts abos identifikācijas testos.

c Trešais noteikšanas tests ir balstīts uz atšķirīgiem bioloģiskajiem principiem vai atšķirīgiem nukleotīdu reģioniem.

Plūsmkarte Nr. 2. Diagnostikas procedūra attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai ūdens paraugos.

a Viens no šiem diviem identifikācijas testiem ir tests, kas minēts 2.2. punkta e), f) un g) apakšpunktā. Lai apstiprinātu kaitīgā organisma klātbūtni, jāiegūst pozitīvs rezultāts abos identifikācijas testos.

4. PARAUGU SAGATAVOŠANA

4.1. Paraugi no asimptomātiskiem bumbuļiem

Standarta paraugā jābūt 200 bumbuļiem katram testam. Atbilstošā laboratorijas procedūra stolona pamatnes vadaudu apstrādei, lai iegūtu ekstraktu attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai, ir aprakstīta starptautiskajos diagnostikas standartos.

4.2. Paraugi no asimptomātiskiem attiecīgajiem augiem

Latentu infekciju noteikšanu veic stublāju segmentu vai lapu kātiņu apvienotiem paraugiem. Šo procedūru var piemērot līdz 200 stublāju daļām vai 200 lapu kātiņiem no dažādiem augiem vienā paraugā. Atbilstošā laboratorijas procedūra stublāju vai lapu kātiņu dezinficēšanai un apstrādei, lai iegūtu ekstraktu attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai, ir aprakstīta starptautiskajos diagnostikas standartos.

4.3. Paraugi no simptomātiska attiecīgo augu materiāla

Audu daļas aseptiski atdala no kartupeļu bumbuļa vadaudu gredzena vai no to attiecīgo augu stublāja vadaudiem, kam ir vītes pazīmes. Atbilstošā laboratorijas procedūra šo audu apstrādei, lai iegūtu ekstraktu attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai, ir sīki aprakstīta starptautiskajos diagnostikas standartos.

4.4. Virszemes vai recirkulācijas sistēmu ūdeņu (ieskaitot kartupeļu pārstrādes vai notekūdeņu izplūdes) paraugi

Galvenais tests attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai virszemes ūdeņu, recirkulācijas sistēmu ūdeņu un notekūdeņu (no kartupeļu pārstrādes) paraugos ir selektīvā izolācija. Atbilstošā laboratorijas procedūra ūdens paraugu apstrādei ir aprakstīta starptautiskajos diagnostikas standartos.

(1) Pastrik, K. H., Elphinstone, J. G., Pukall, R. (2002) “Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control”. European Journal of Plant Pathology 108, 831. – 842. lpp.

(2) Weller, S.A, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). “Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay.”Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R. A. M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R. M., de Haan, E. G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W. I. L., Tjou-Tam-Sin, N. N. A., van de Vossenberg B. T. L. H, Janse, J. D. (2016). “Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing.”Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112. – 121. lpp.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). “Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach.”EPPO Bulletin 48, 86. – 96. lpp.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M. H. (2014). “Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay.”European Journal of Plant Pathology 138, 29. – 37. lpp.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). “Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum.”PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J. F., Li, T. H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A. C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B. W., Timmis, J. N. (1997). “A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum).”Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19. – 30. lpp.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). “How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex”. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex” (redaktori Allen C, Hayward AC & Prior P), 449. – 461. lpp. American Phytopathological Society, St Paul, MN (ASV).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). “Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential.”Applied and Environmental Microbiology 73, 6790. – 6801. lpp.

(10) van de Bilt, Wolsink, M. H. L., Gorkink-Smits, P. P. M. A., Landman, N. M., Bergsma-Vlami, M. (2018). “Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum.”European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.