5)

IV pielikumu aizstāj ar šādu: “ IV PIELIKUMS VASKU SATURA NOTEIKŠANA AR KAPILĀRĀS KOLONNAS GĀZU HROMATOGRĀFIJU 1. IZMANTOŠANAS JOMA Šajā metodē aprakstīta vasku satura noteikšana olīveļļās. Vaskus sadala pēc oglekļa atomu skaita molekulā. Šo metodi var jo īpaši izmantot, lai atšķirtu ar spiešanas paņēmienu iegūtu olīveļļu no olīvu izspaidu eļļas, ko iegūst pēc ekstrakcijas paņēmiena. 2. PRINCIPS Taukiem vai eļļai pievieno piemērotu iekšējo standartu, pēc tam hromatogrāfiski sadala hidrēta silikagela kolonnā. Testēšanas apstākļos iegūst frakciju, kas eluējas vispirms (kas satur savienojumus, kuru polaritāte ir mazāka nekā triglicerīdiem), un to tieši analizē ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju. 3. APARATŪRA 3.1. 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba 3.2. Stikla kolonna gāzes hromatogrāfijai, iekšējais diametrs 15,0 mm, augstums 30 līdz 40 cm, ar krānu 3.3. Piemērots gāzes hromatogrāfs ar kapilāro kolonnu, kas aprīkots ar tiešās ievadīšanas sistēmu kolonnā, kas sastāv no šādiem mezgliem: 3.3.1. Termostata kamera kolonnām (kolonnu krāsns) ar programmējamu temperatūru 3.3.2. Aukstās inžekcijas iekārta tiešai ievadīšanai kolonnā 3.3.3. Liesmas jonizācijas detektors un pārveidotājs/pastiprinātājs 3.3.4. Reģistrējošā iekārta/integrators ar maināmu papīra ātrumu darbam ar pārveidotāju/pastiprinātāju (3.3.3.), kuras atbildes reakcijas laiks ir ne lielāks par 1 s. (Var izmantot arī datorizētas sistēmas, kas nodrošina gāzes hromatogrāfijas datu iegūšanu, izmantojot personālo datoru.) 3.3.5. Stikla vai kvarca stikla kapilārā kolonna ar iekšējo diametru 0,25 līdz 0,32 mm, kas ir 8 līdz 12 m gara, ar vienādu no 0,10 līdz 0,30 μm šķidrās fāzes slāni. (Šim nolūkam piemērotas gatavas nopērkamās SE-52 un SE-54 tipa šķidrās fāzes.) 3.4. 10 μl tilpuma mikrošļirce ar rūdītu adatu inžekcijai uz kolonnas 3.5. Elektrovibrators 3.6. Rotācijas ietvaicētājs 3.7. Mufeļkrāsns 3.8. Analītiskie svari ar svēršanas precizitāti + 0,1 mg 3.9. Laboratorijas trauki 4. REAKTĪVI 4.1. Silikagels ar daļiņu izmēru no 60 līdz 200 μm Silikagelu uz vismaz 4 h ievieto mufeļkrāsnī 500 °C temperatūrā. Atdzesē un pievieno 2 % ūdens no ņemtā silikagela daudzuma. Lai maisījumu homogenizētu, to rūpīgi sakrata. Pirms lietošanas vismaz 12 h glabā tumšā vietā 4.2. n-heksāns, hromatogrāfijai 4.3. Etilēteris, hromatogrāfijai 4.4. n-heptāns, hromatogrāfijai 4.5. Laurilarahidāta standarta 0,1 % (m/v) šķīdums heksānā (iekšējais standarts). (Var izmantot arī palmitilpalmitātu vai miristilstearātu.) 4.5.1. Sudāns 1 (1-fenil-azo-2-naftols) 4.6. Nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, gāzes hromatogrāfijai 4.7. Palīggāzes: — tīrs ūdeņradis gāzes hromatogrāfijai, — tīrs gaiss gāzes hromatogrāfijai. 5. PROCEDŪRA 5.1. Hromatogrāfijas kolonnas sagatavošana Suspendē 15 g silikagela (4.1.) n-heksānā (4.2.) un pārnes kolonnā (3.2.). Nostādina. Sablīvē, izmantojot elektrovibratoru (3.5.), lai hromatogrāfijas slānis būtu homogenāks. Perkolē 30 ml n-heksāna attīrīšanai no piemaisījumiem. Ar svariem (3.8.) iesver precīzi 500 mg parauga 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.), un atbilstoši sagaidāmajam vasku saturam pievieno vajadzīgo daudzumu iekšējā standarta (4.5.). Piemēram, pievieno 0,1 mg laurilarahidāta, analizējot olīveļļu, vai 0,25 līdz 0,5 mg, analizējot olīvu izspaidu eļļu. Sagatavoto paraugu pārnes hromatogrāfijas kolonnā, izmantojot divas 2 ml porcijas n-heksāna (4.2.). Šķīdinātājam ļauj izplūst no kolonnas, līdz tā līmenis pazeminās līdz apmēram 1 mm virs absorbenta, un tad, lai attīrītu no dabīgi saturošajiem n-alkāniem, perkolē vēl 70 ml n-heksāna. Tad sāk eluēšanu hromatogrāfijai, savācot 180 ml n-heksāna/etilētera maisījuma (attiecībā 99:1) ar ātrumu apmēram 15 pilieni desmit sekunžu laikā. Parauga eluēšana jāveic istabas temperatūrā 22 ± 4 °C temperatūrā. NB! — n-heksāna/etilētera maisījums (99:1) jāsagatavo tajā pašā dienā. — Vasku pareizas eluēšanas vizuālai kontrolei maisījumam var pievienot 100 μl Sudānas 1 krāsvielas 1 % šķīdumu tajā. Tā kā krāsvielas aiztures laiks ir lielāks nekā vaskiem un mazāks nekā triglicerīdiem, eluēšana jāpārtrauc tūlīt pēc tam, kad krāsojums sasniedzis kolonnas apakšējo daļu, jo tas liecina, ka visi vaski jau ir eluēti no kolonnas. Šādi iegūto parauga frakciju ietvaicē rotācijas ietvaicētājā (3.6.) gandrīz sausu. Pēdējos apmēram 2 ml šķīdinātāja iztvaicē ar vāju slāpekļa plūsmu; pievieno 2–4 ml n-heptāna. 5.2. Gāzes hromatogrāfijas analīze 5.2.1. Sagatavošana Kolonnu uzstāda gāzes hromatogrāfam (3.3.), pievienojot ieeju kolonnā virskolonnas sistēmai, bet kolonnas izeju detektoram. Veic gāzes hromatogrāfijas aparatūras vispārēju pārbaudi (gāzes kontūru, detektora un reģistrācijas ierīces darbību, u. c.). Ja kolonnu izmanto pirmo reizi, tā vispirms jākondicionē. Nedaudz nesējgāzes izlaiž caur kolonnu, un tad ieslēdz gāzes hromatogrāfu. Pakāpeniski iesilda tā, lai apmēram četru stundu laikā sasniegtu 350 °C temperatūru. Šādu temperatūru uztur vismaz divas stundas, un pēc tam iekārtai noregulē vajadzīgos darba apstākļus (iestata gāzes plūsmu, aizdedz liesmu, pievieno elektroniskajai reģistrācijas iekārtai (3.3.4.), iestata kolonnas krāsns temperatūru, detektoru, u. c.), reģistrē signālu ar jutību, kas ir vismaz divas reizes augstāka par analīzei nepieciešamo jutību. Nulles līnijai jābūt taisnai, bez jebkādiem izsitieniem, un tā nedrīkst novirzīties. Negatīvas taisnvirziena novirzes liecina par neblīvumiem kolonnas savienojumu vietās; savukārt pozitīvas novirzes liecina, ka kolonna ir nepietiekami kondicionēta. 5.2.2. Darba apstākļu izvēle Parasti izmanto šādus apstākļus: — kolonnas temperatūra – 20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min sākumā 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′) — detektora temperatūra – 350 °C; — ievadītās vielas daudzums: 1 μl no n-heptāna šķīduma (2–4 ml); — nesējgāze: hēlijs vai ūdeņradis ar attiecīgajai gāzei pareizu lineāro ātrumu (sk. papildinājumā); — instrumenta jutība: atbilst turpmāk aprakstītajiem nosacījumiem. Apstākļus var izmainīt atbilstoši kolonnas un hromatogrāfa raksturlielumiem tā, lai tiktu izdalīti visi vaski un panākta pietiekama signālu izšķirtspēja (sk. attēlu); C32 iekšējā standarta aiztures laikam ir jābūt 18 ± 3 min. Visvairāk reprezentatīvā vaska signālam jābūt vismaz 60 % no pilnas skalas. Signālu integrēšanas parametri jānosaka tā, lai tiktu iegūts attiecīgo signālu laukumu pareizs novērtējums. NB! Ņemot vērā, ka beigu temperatūra ir augsta, pieļaujama līdz 10 % novirze no pilnas skalas vērtības. 5.3. Analīzes veikšana Ar 10 μl tilpuma mikrošļirci ņem 1 μl šķīduma paraugu; atvelk šļirces virzuli tā, lai iztukšotu adatu. Adatu ievieto inžektorā un pēc 1–2 sekundēm ātri ievada; pēc apmēram piecām sekundēm adatu lēnām izvelk. Veic reģistrāciju, līdz visi vaski ir pilnībā eluēti. Nulles līnijai noteikti jāatbilst nepieciešamajiem nosacījumiem. 5.4. Signālu identifikācija Signālus identificē pēc aiztures laikiem, tos salīdzinot ar tādos pašos apstākļos analizētiem tādu vasku maisījumiem, kuru aiztures laiki ir zināmi. Attēlā redzama neapstrādātas augstākā labuma olīveļļas vasku hromatogramma. 5.5. Daudzuma noteikšana Izmantojot integratoru, nosaka iekšējā standarta un alifātisko esteru C40 līdz C46 signālu laukumu. Aprēķina katra vaska estera saturu mg/kg eļļas pēc šādas formulas: kur Ax = katra estera signāla laukums, kvadrātmilimetros; As = iekšējā standarta signāla laukums, kvadrātmilimetros; ms = pievienotā iekšējā standarta masa, miligramos; m = analīzei ņemtā parauga masa, gramos. 6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA Norāda dažādu C40 līdz C46 vasku kopīgo saturu mg/kg eļļas (ppm). NB! Kvantitatīvi nosakāmie komponenti saistāmi ar C40 līdz un C46 esteru signāliem, izmantojot par paraugu olīveļļas vasku hromatogrammu turpmāk redzamajā attēlā. Ja esteris C46 parādās divas reizes, tad, lai to identificētu, ieteicams analizēt olīvu izspaidu eļļas vasku frakciju, kur C46 signāls ir viegli identificējams tāpēc, ka tas ir izteiktā pārākumā. Rezultātus uzdod ar precizitāti līdz vienam ciparam aiz komata. Attēls. Olīveļļas vasku hromatogramma (9) Papildinājums Gāzes lineārā ātruma noteikšana Pēc noregulēšanas darba normāliem darba apstākļiem gāzes hromatogrāfā ievada 1–3 μl metāna (vai propāna). Uzņem laiku, kādā gāze iziet cauri kolonnai no ievadīšanas mirkļa līdz tā signāla parādīšanās brīdim (tM). Gāzes lineāro ātrumu aprēķina pēc formulas L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros un tM ir laiks sekundēs.