Komisijas Direktīva 92/95/EEK (1992. gada 9. novembris), ar kuru groza pielikumu Septītajā direktīvā 76/372/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei



Oficiālais Vēstnesis L 327 , 13/11/1992 Lpp. 0054 - 0062

Speciālizdevums somu valodā: Nodaļa 3 Sējums 45 Lpp. 0182

Speciālizdevums zviedru valodā: Nodaļa 3 Sējums 45 Lpp. 0182

CS.ES Nodaļa 3 Sējums 46 Lpp. 3 - 11

ET.ES Nodaļa 3 Sējums 46 Lpp. 3 - 11

HU.ES Nodaļa 3 Sējums 46 Lpp. 3 - 11

LT.ES Nodaļa 3 Sējums 46 Lpp. 3 - 11

LV.ES Nodaļa 3 Sējums 46 Lpp. 3 - 11

MT.ES Nodaļa 3 Sējums 46 Lpp. 3 - 11

PL.ES Nodaļa 3 Sējums 46 Lpp. 3 - 11

SK.ES Nodaļa 3 Sējums 46 Lpp. 3 - 11

SL.ES Nodaļa 3 Sējums 46 Lpp. 3 - 11



Komisijas Direktīva 92/95/EEK (1992. gada 9. novembris), ar kuru groza pielikumu Septītajā direktīvā 76/372/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1970. gada 20. jūlija Direktīvu 70/373/EEK par paraugu ņemšanas un analīžu Kopienas metožu ieviešanu barības oficiālajai kontrolei [1], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Spānijas un Portugāles Pievienošanās aktiem, un jo īpaši tās 2. pantu, tā kā Komisijas 1976. gada 1. marta Septītajā direktīvā 76/372/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei [2] un kas grozīta ar Direktīvu 81/680/EEK [3], ir noteiktas metodes, kas jāizmanto aflatoksīna B1 noteikšanai; tā kā, ņemot vērā jaunākās zinātnes un tehnikas atziņas, ir pamats šo metožu pielāgošanai; tā kā ir īpaši ieteicams, lai ir pieejama metode, ar kuru var kontrolēt ļoti mazus aflatoksīna daudzumus, kas noteikti ar Padomes 1973. gada 17. decembra Direktīvu 74/63/EEK, ar kuru nosaka nevēlamu vielu un produktu maksimāli pieļaujamo līmeni dzīvnieku ēdināšanā [4] un kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Direktīvu 91/132/EEK [5]; tā kā ir arī ieteicams, lai ir pieejama metode, ar ko var noteikt aflatoksīna B1 traucējošu vielu, piemēram, citrusaugļu mīkstuma, klātbūtnē; tā kā šajā direktīvā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Barības pastāvīgās komitejas atzinumu, IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU. 1. pants Direktīvas 76/372/EEK pielikumu groza saskaņā ar šīs direktīvas pielikumu. 2. pants Dalībvalstīs ne vēlāk kā līdz 1993. gada 1. oktobrim stājas spēkā normatīvie un administratīvie akti, kas vajadzīgi, lai izpildītu šīs direktīvas prasības. Dalībvalstis par tiem tūlīt informē Komisiju. Kad dalībvalstis pieņem šos aktus, tajos ietver atsauci uz šo direktīvu vai arī šādu atsauci pievieno to oficiālai publikācijai. Dalībvalstis nosaka procedūru, kas jāievēro, izdarot šādas atsauces. 3. pants Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm. Briselē, 1992. gada 9. novembrī Komisijas vārdā – Komisijas loceklis Ray Mac Sharry [1] OV L 170, 3.8.1970., 2. lpp. [2] OV L 102, 15.4.1976., 8. lpp. [3] OV L 246, 29.8.1981., 32. lpp. [4] OV L 38, 11.2.1974., 31. lpp. [5] OV L 66, 13.3.1991., 16. lpp. -------------------------------------------------- PIELIKUMS I. Tekstu A daļas "Viendimensijas plānslāņu hromatogrāfijas metode" 1. punktā "Mērķis un darbības joma" aizstāj ar šādu tekstu: "1. Mērķis un darbības joma Ar šo metodi kļūst iespējams noteikt aflatoksīna B1 līmeni izejvielās un vienkāršā dzīvnieku barībā. Šo metodi nevar pielietot, ja ir citrusaugļu mīkstuma klātbūtne. Zemākā noteikšanas robeža ir 0,01 mg/kg (10 ppb). Ja ir traucējošu vielu klātbūtne, jāatkārto analīze, izmantojot B metodi (augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija)." II. Tekstu B daļā "Divdimensiju plānslāņu hromatogrāfijas metode" aizstāj ar šādu tekstu: "B. AFLATOKSĪNA B1 NOTEIKŠANA. AUGSTAS IZŠĶIRTSPĒJAS ŠĶIDRUMA HROMATOGRĀFIJAS METODE 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ir paredzēta, lai noteiktu aflatoksīnu B1 dzīvnieku barībā, tostarp tādā, kas satur citrusaugļu mīkstumu. Zemākā noteikšanas robeža ir 0,001 mg/kg (1 ppb). 2. Princips Paraugu ekstrahē ar hloroformu. Ekstraktu filtrē un alikvoto daļu attīra ar florisila kaseti un pēc tam ar C18 kaseti. Galīgo atdalīšanu un noteikšanu panāk ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC), izmantojot apgrieztās fāzes C18 kolonnu, pēc tam pēckolonnas derivatizāciju ar jodu ūdenī un fluorescences noteikšanu. Piezīme: mikotoksīni ir ārkārtīgi toksiskas vielas. Manipulācijas jāveic šim mērķim paredzētā velkmes skapī. Īpaši drošības pasākumi jāveic, kad toksīni ir sausā veidā, to elektrostatiskās specifikas un izrietošās tendences disperģēties darba zonās dēļ. 3. Reaģenti 3.1. Hloroforms, kas stabilizēts ar 0,5 līdz 1,0 % etanola, pēc masas. Skatīt 10.2. apsvērumu. 3.2. Metanols ar HPLC tīrības pakāpi 3.6. punktā minētajam preparātam. 3.3. Acetons. 3.4. Acetonitrils ar HPLC tīrības pakāpi. 3.5. Eluenti: Sagatavojiet dienu pirms izmantošanas vai atdaliet gaisu no šķīdinātājiem ar ultraskaņas palīdzību. 3.5.1. Acetona (3.3.) un ūdens maisījums: 98 + 2 (v + v). 3.5.2. Ūdens un metanola (3.2.) maisījums: 80 + 20 (v + v). 3.5.3. Ūdens un acetona (3.3.) maisījums: 85 + 15 (v + v). 3.6. Kustīgā fāze augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijai. Ūdens, metanola (3.2.) un acetonitrila (3.4.) maisījums: 130 + 70 + 40 (v + v + v). N.B.: kustīgās fāzes šķīdinātāju sastāvu var būt nepieciešams pielāgot atkarībā no izmantotās HPLC kolonnas īpašībām. 3.7. Piesātināts joda šķīdums: 400 ml ūdens pievienojiet 2 g joda. Maisiet vismaz 90 minūtes un filtrējiet caur mambrānfiltru (4.15.). Pasargājiet piesātināto šķīdumu no gaismas, lai nepieļautu fotosabrukšanu. 3.8. Ar skābi nomazgāts celīts 545 vai līdzvērtīgs. 3.9. Florisila kasete (Waters SEP-PAK) vai līdzvērtīga. 3.10. C18 kasete (Waters SEP-PAK) vai līdzvērtīga. 3.11. Inerta gāze, piemēram, slāpeklis. 3.12. Aflatoksīna B1 standartšķīdums hloroformā ar koncentrāciju 10 μg/ml. Šā šķīduma koncentrāciju pārbauda šādi: nosaka šķīduma absorbcijas spektru no 330 līdz 370 nm, izmantojot spektrofotometru (4.23.). Nomēra absorbciju (A) pēc maksimuma, kas ir tuvu 363 nm. Aprēķina aflatoksīna B1 koncentrāciju mikrogramos uz mililitru šķīduma pēc formulas: Koncentrâcija (μg/ml) = = 13,991 × A 3.12.1. Aflatoksīna B1 rezerves standartšķīdums hloroformā. Kvantitatīvi pārnes 2,5 ml aflatoksīna B1 standartšķīduma (3.12.) uz 50 ml mērkolbu un koriģē līmeni līdz zīmei ar hloroformu (3.1.). Šo šķīdumu, labi noslēgtu un ietītu alumīnija folijā, uzglabā vēsā (4 °C) vietā tumsā. 3.13. Aflatoksīna B1 kalibrēšanas šķīdumi augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijai. N.B.: šo šķīdumu sagatavošanai izmanto stikla priekšmetus, kas nomazgāti ar skābi (skatīt 4. punktu "Aprīkojums"). 3.13.1. Kalibrēšanas šķīdums 4 ng/ml. Mērkolbai ar rezerves standartšķīdumu alumīnija folijā (3.12.1.) ļauj uzsilt līdz istabas temperatūrai (dažas stundas). Uz mērkolbu ar 50 ml tilpumu pārnes 400 μl rezerves standartšķīduma (200 ng aflatoksīna B1) un šķīdumu ietvaicē inertas gāzes plūsmā līdz sausam stāvoklim (3.11.). Iegūto atlikumu izšķīdina apmēram 20 ml ūdens/acetona maisījuma (3.5.3.), uzpilda līdz zīmei ar ūdens/acetona maisījumu un labi samaisa. 3.13.2. Kalibrēšanas šķīdums 3 ng/ml. Mērkolbā ar 10 ml tilpumu kvantitatīvi pārnes 7,5 ml kalibrēšanas šķīduma (3.13.1.), uzpilda līdz zīmei ar ūdens/acetona maisījumu (3.5.3.) un labi samaisa. 3.13.3. Kalibrēšanas šķīdums, 2 ng/ml. Uz mērkolbu ar 50 ml tilpumu kvantitatīvi pārnes 25 ml kalibrēšanas šķīduma (3.13.1.), uzpilda līdz zīmei ar ūdens/acetona maisījumu (3.5.3.) un labi samaisa. Šo šķīdumu arī dēvē par standartvielu, kas jāizmanto atkārtotai injekcijai HPCL (5.5.) laikā. 3.13.4. Kalibrēšanas šķīdums 1 ng/ml. Uz mērkolbu ar 10 ml tilpumu kvantitatīvi pārnes 2,5 ml kalibrēšanas šķīduma (3.13.1.), uzpilda līdz zīmei ar ūdens/acetona maisījumu (3.5.3.) un labi samaisa. 3.14. Ampula, kas satur aflatoksīnus B1, B2, G1 un G2 maisījumu, kuru attiecīgā koncentrācija 1 ml hloroformā ir apmēram 1, 0,5, 1 un 0,5 μg/ml. 3.14.1. Hromatogrāfijas testa šķīdums. Ampulas (3.14.) saturu pārnes mēģenē ar stikla aizbāzni vai stobriņā ar aizskrūvējamu vāku. Mēģenē ar stikla aizbāzni (kas izskalota ar skābi) (4.22.) pārnes 40 μl šā šķīduma. Hloroformu ietvaicē inertas gāzes (3.11.) plūsmā un atkārtoti izšķīdina 10 mililitros ūdens/acetona maisījuma (3.5.3.). 3.15. Reaģenti apstiprinājuma testam (6.). 3.15.1. Ar nātrija hlorīdu piesātināts šķīdums. 3.15.2. Granulēts bezūdens nātrija sulfāts. 4. Aprīkojums Uzmanību: Ja aflatoksīnu šķīdumiem ūdenī izmanto stikla priekšmetus, kas nav noskaloti ar skābi, var rasties zaudējumi. Īpaši jāparūpējas par jauniem stikla priekšmetiem un vienreizlietojamiem stikla priekšmetiem, piemēram, par stobriņiem, ar ko automātiski ņem paraugus, un Pastēra pipetēm. Tādēļ laboratorijas stikla priekšmeti, kas nonāk saskarē ar aflatoksīnu šķīdumiem ūdenī, dažas stundas jāmērcē atšķaidītā skābē (piemēram, sērskābē = 2 mol/l), tad, lai likvidētu visas skābes paliekas, labi jānoskalo ar destilētu ūdeni (piemēram, trīs reizes, pārbauda ar pH papīru). Praksē šāda apstrāde ir vajadzīga apaļkolbai (4.4.), mērkolbām, mērcilindriem, stobriņiem vai mēģenēm, ko izmanto kalibrēšanas šķīdumiem un galīgajiem ekstraktiem, (īpaši stobriņiem, ko izmanto automātiskai paraugu ņemšanai) un Pastēra pipetēm, ja tās izmanto, lai pārnestu kalibrēšanas šķīdumus vai ekstraktus. 4.1. Smalcinātājs – maisītājs. 4.2. Siets ar 1,0 mm acojumu (ISO R 565). 4.3. Mehāniskais kratītājs. 4.4. Rotācijas ietvaicētājs, kas aprīkots ar 150 līdz 250 ml apaļkolbu. 4.5. Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfs, inžektors ar gredzenu, kas piemērots 250 ml injekcijai. Skatīt ražotāja instrukcijas, lai daļēji vai pilnīgi aizvērtu gredzenu. 4.6. HPLC analītiskā kolonna: 3 μm vai 5 μm C18 pakojums. 4.7. Sūknis, kas nerada pulsācijas, lai pievadītu joda pēckolonnas reaģentu. 4.8. Nerūsējoša tērauda T-veida savienojums bez brīvā tilpuma (1/16” ×0,75 mm). 4.9. Spirālveida reakcijas spirāle no teflona vai nerūsējoša tērauda. Par piemērotiem ir atzīti 3000 × 0,5 mm līdz 5000 × 0,5 mm izmēri kombinācijā ar 5 μm vai 3 μm HPLC kolonnām. 4.10. Ar termostatu kontrolēta ūdens vanna, kura noregulēta uz 60 °C un kuras temperatūras regulēšana var būt precīzāka nekā 0,1 °C. 4.11. Fluorescences detektors ar 365 nm ierosas un 435 nm emisijas viļņu garumiem. (Filtra instrumentam: indukcijas viļņu garums > 400 nm). Ir iespējama vismaz 0,05 ng aflatoksīna B1 noteikšana. Zināms pretspiediens ir ieteicams (piemēram, izmantojot spiediena regulētāju vai teflona vai nerūsējoša tērauda spirāli, kas pievienota detektora izejas atverei), lai apslāpētu gaisa burbulīšus caurplūsmas šūnā. 4.12. Diagrammas lentes pašrakstītājs. 4.13. Elektronisks integrators (nav obligāts). 4.14. Kroku filtrpapīrs ar diametru 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 vai līdzvērtīgs. 4.15. Membrānfiltrs ar poru izmēru 0,45 μm, Millipore HAWP 04700 vai līdzvērtīgs. 4.16. Koniska 500 ml kolba ar stikla aizbāzni. 4.17. Stikla kolonna (iekšējais diametrs – apmēram 1 cm, garums – apmēram 30 cm), kas aprīkota ar Luira uzgali [Luer tip]. 4.18. Pret hloroformu izturīgs Luira noslēdzošais krāns (piemēram, Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 vai līdzvērtīgs). 4.19. Ķīmiski izturīga 10 ml šļirce ar Luira savienotāju. 4.20. Šļirce, kas piemērota HPLC 250 μl injekcijai (skatīt 4.5.). 4.21. Kalibrēšanas šķīdumu sagatavošanas 100 μl mikrošļirce (nosverot jāpārliecinās, ka precizitāte ir 2 % robežās). 4.22. Kalibrētas mēģenes ar 10 ml tilpumu un ar stikla aizbāžņiem. 4.23. Spektrofotometrs, kas piemērots mērījumu izdarīšanai spektra UV diapazonā. 4.24. Aprīkojums apstiprinājuma testam (6.). 4.24.1. Ar skābi izskalota 100 ml dalāmpiltuve ar noslēdzošu teflona krānu. 4.24.2. Karstuma kamera, 40 līdz 50 °C. 5. Procedūra 5.1. Parauga sagatavošana. Sasmalcina paraugu, lai tas iet caur attiecīgo sietu (4.2.). 5.2. Analizējamais paraugs. Nosver 50 g sagatavotā testa parauga koniskā kolbā (4.16.). 5.3. Ekstrakcija. Analizējamajam paraugam (5.2.) pievieno 25 g celīta (3.8.), 250 ml hloroforma (3.1.) un 25 ml ūdens. Kolbu aiztaisa un ar mehānisku kratītāju krata 30 minūtes (4.3.). Filtrē caur kroku filtrpapīru (4.14.). Savāc 50 ml filtrāta. Ja vajadzīgs, ņem filtrāta alikvoto daļu un atšķaida ar hloroformu līdz 50 ml tilpumam, lai aflatoksīna B1 koncentrācija nav lielāka kā 4 ng/ml. 5.4. Tīrīšana (procedūra jāveic ar būtiskiem pārtraukumiem). Uzmanību: - laboratoriju, kurā tiek veikta analīze, atbilstoši pasargājiet no dienasgaismas. Šo mērķi var efektīvi sasniegt, izmantojot: i) UV absorbējošu foliju uz logiem kombinācijā ar samazinātu apgaismojumu (bez tiešas dienasgaismas); ii) aizkarus vai žalūzijas kombinācijā ar mākslīgo apgaismojumu (luminiscences spuldzes ir pieņemamas), - šķīdumi, kas satur aflatoksīnu, pēc iespējas jāsargā no gaismas (jātur tumsā, jāizmanto alumīnija folija). 5.4.1. Florisila SEP-PAK attīrīšana 5.4.1.1. Kolonnas un kasetes komplekta sagatavošana Noslēdzošo krānu (4.18.) pievieno florisila kasetes (3.9.) īsākajam galam (skatīt 1. attēlu). Nomazgā kaseti un likvidē skābekli, ņemot 10 ml hloroforma (3.1.) un ar noslēdzošā krāna starpniecību ātri izlaižot 8 ml cauri kasetei ar šļirces palīdzību (4.19.). Garāko kasetes galu pievieno stikla kolonnai (4.17.) un atlikušos 2 ml hloroforma cauri kasetei ielaiž kolonnā. Aizver noslēdzošo krānu. Atdala šļirci. 5.4.1.2. Attīrīšana Kolonnas un kasetes komplektam pievieno filtrātu, kas savākts atbilstoši 5.3. punktam, un notecina ar gravitācijas palīdzību. Izskalo ar 5 ml hloroforma (3.1.) un pēc tam ar 20 ml metanola (3.2.). Eluātus izlej. Šo darbību laikā jānodrošina, ka kolonnas un kasetes komplekts nepaliek sauss. Aflatoksīnu eluē ar 40 ml acetona un ūdens maisījuma (3.5.1.) un savāc visu eluātu rotācijas ietvaicētāja (4.4.) apaļkolbā. Eluātu koncentrē rotācijas ietvaicētājā 40 °C līdz 50 °C līdz brīdim, kad vairs netiek destilēts acetons. (N.B.: šajā brīdī kolbā paliek apmēram 0,5 ml šķidruma. Eksperimenti ir parādījuši, ka turpmāka iztvaicēšana nav kaitīga un ka brīdī, kad palikuši 0,5 ml šķidruma, acetona daudzums nav būtisks. Acetona atlikums var izraisīt aflatoksīna B1 zaudējumus uz C18 kasetes). Pievieno 1 ml metanola (3.2.), kolbu sakrata, lai izšķīdinātu aflatoksīnu B1, kas atrodas uz kolbas sāniem, pievieno 4 ml ūdens un samaisa. Kaseti atvieno un izmet. Stikla kolonnu izskalo ar ūdeni un atstāj C18 attīrīšanas posmam. 5.4.2. C18SEP-PAK attīrīšana 5.4.2.1. Kolonnas un kasetes komplekta sagatavošana. Noslēdzošo krānu (4.18.) pievieno C18 kasetes (3.10.) īsākajam galam (skatīt 1. attēlu). Sagatavo kaseti un likvidē gaisu, ar noslēdzošā krāna starpniecību ātri izlaižot 10 ml metanola (3.2.) caur kaseti ar šļirci (4.19.). (Gaisa burbuļi kasetē ir redzami kā gaismas plankumi uz pārējā pelēcīgā fona.) Ņem 10 ml ūdens un izlaiž 8 ml cauri kasetei (pārslēdzoties no metanola uz ūdeni, nepieļauj gaisa iekļūšanu kasetē). Garāko kasetes galu pievieno stikla kolonnai (4.17.) un atlikušos 2 ml ūdens caur kaseti ielaiž kolonnā. Aizver noslēdzošo krānu. Atdala šļirci. 5.4.2.2. Attīrīšana Ekstraktu, kas savākts atbilstoši 5.4.1.2., kvantitatīvi pārnes uz stikla kolonnu (4.17.), kolbu izskalo divreiz ar 5 ml ūdens/metanola maisījuma (3.5.2.) un notecina ar gravitācijas palīdzību. Šo darbību laikā jānodrošina, ka kolonnas un kasetes komplekts nepaliek sauss. (Kad gaisa burbulīši izveidojas sašaurinājumā tuvu kasetei, aptur plūsmu un viegli uzsit pa stikla kolonnas augšdaļu, lai novāktu gaisa burbulīšus. Tad turpina.) Eluē ar 25 ml ūdens/metanola maisījuma. Eluātu izlej. Aflatoksīnu B1 eluē ar 50 ml ūdens/acetona maisījuma (3.5.3.) un savāc visu eluātu 50 ml mērkolbā. Uzpilda līdz zīmei ar ūdeni un sajauc: iegūto testa šķīdumu izmanto hromatogrāfijai (5.5.). Uzmanību: Galīgā ekstrakta filtrācija pirms HPLC parasti nav vajadzīga. Ja to uzskata par vajadzīgu, nedrīkst izmantot celulozes filtrus, jo tie var izraisīt aflatoksīna B1 zaudējumus. Pieņemami ir teflona filtri. 5.5. Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (Aprīkojuma uzstādīšanai skatīt 2. attēlu.) Jāatvēl pietiekoši daudz laika instrumentu sagatavošanai un stabilizēšanai. 1. piezīme: Plūsmas ātrumi, kas norādīti kustīgajai fāzei un pēckolonnas reaģentiem, ir tikai orientējoši. Iespējams, tie būs jāpielāgo, pamatojoties uz HPLC kolonnas rādītājiem. 2. piezīme: Detektora reakcija uz aflatoksīnu B1 ir atkarīga no temperatūras, tādēļ jāveic kompensācija saistībā ar novirzēm (skatīt 3. attēlu). Injicējot noteiktu aflatoksīna B1 standartvielu (3.13.3.) ar regulāriem intervāliem (piemēram, katrā trešajā injekcijā), aflatoksīna B1 lielākās vērtības starp šīm standartvielām var tikt koriģētas, izmantojot vidējo reakciju, ja atšķirība starp reakcijām uz secīgām standartvielām ir ļoti maza (< 10 %). Tādēļ injekcijas jāveic bez pārtraukumiem. Ja pārtraukumi ir vajadzīgi, pēdējai injekcijai pirms pārtraukuma un pirmajai injekcijai pēc pārtraukuma jābūt standartvielas injekcijai (3.13.3.). Tā kā kalibrēšanas līkne ir līnijveida un tā šķērso koordinātu sākuma punktu, aflatoksīna B1 daudzumu parauga ekstraktos nosaka tieši ar atsauci uz blakus standartiem. 5.5.1. HPLC sūkņa iestatījumi Uzstāda HPLC sūkni (4.5.), lai radītu plūsmu 0,5 vai 0,3 ml/min, attiecīgi 5 μm vai 3 μm HPLC kolonnā, izmantojot kustīgo fāzi (3.6.). 5.5.2. Pēckolonnas sūkņa iestatījumi Uzstāda sūkni (4.7.), lai joda piesātinātajam ūdens šķīdumam (3.7.) piedotu 0,2 līdz 0,4 ml/min plūsmu. Aptuveni: apmēram 0,4 vai 0,2 ml/min plūsmas ir ieteicamas kombinācijā ar attiecīgi kustīgās fāzes (3.6.) 0,5 un 0,3 ml/min plūsmām. 5.5.3. Fluorescences detektors Fluorescences detektoram (4.11.) uzstāda indukcijas viļņa garumu 365 nm un emisiju viļņa garumu 435 nm (filtra instrumentam > 400 nm). Detektora vājinātāju noregulē tā, lai pašrakstītāja pildspalva fiksētu aptuveni 80 % novirzes pilnā mērā attiecībā uz 1 ng aflatoksīna B1. 5.5.4. Inžektors Attiecībā uz visiem šķīdumiem injicē 250 μl daudzumus, ievērojot inžektora ražotāja instrukcijas. 5.5.5. Hromatogrāfiskās nošķiršanas pārbaude Injicē hromatogrāfisko testa šķīdumu (3.14.1.). Signāla pavājinājumam jābūt mazākam nekā 5 % no blakus esošo līknes virsotņu augstuma summas. 5.5.6. Sistēmas stabilitātes pārbaude Pirms katras analīžu virknes atbilstoši injicē standartvielu (3.13.3.), kamēr tiek panāktas stabilas līknes virsotņu zonas (N.B.: līknes virsotņu rādītājiem attiecībā uz aflatoksīnu B1 starp secīgām injekcijām nevajadzētu atšķirties par vairāk kā 6 %). Procesu nekavējoties turpina, pārbaudot linearitāti (5.5.7.). 5.5.7. Linearitātes pārbaude Injicē aflatoksīna B1 kalibrēšanas šķīdumus (3.13.1. līdz 3.13.4.). Katrā trešajā injekcijā izmanto standartvielu (3.13.3.), lai īstenotu korekcijas saistībā ar novirzēm mērījumos (N.B.: standartvielas mērījumu maksimumi nedrīkst atšķirties par vairāk kā 10 % 90 minūtēs). Korekcijas saistībā ar novirzēm veic saskaņā ar formulu 7. punktā. Kalibrēšanas grafikam jābūt līnijveida un jāšķērso koordinātu sākuma punktu Y provizoriskās vērtības divkāršas standartnovirzes robežās. Konstatētie lielumi nedrīkst atšķirties no nominālajām vērtībām par vairāk kā 3 %. Ja ir izpildītas šīs prasības, procesu nekavējoties turpina. Ja nav, identificē un izlabo problēmas avotus pirms turpināšanas. 5.5.8. Parauga ekstraktu injekcija Injicē attīrītus parauga ekstraktus (5.4.2.2.). Ik pēc diviem parauga ekstraktiem atkārto standartvielas (3.13.3.) injekciju, ievērojot šādu secību: standartviela, ekstrakts, ekstrakts, standartviela, ekstrakts, ekstrakts, standartviela utt. 6. Apstiprinājuma tests 6.1. Turpmāka ekstrakta (5.4.2.2.) apstrāde Galīgajam ekstraktam, kas iegūts atbilstoši 5.4.2.2. punktam, pievieno 5 ml nātrija hlorīda šķīdumu (3.15.1.). Katru ekstrahē vienu minūti trīs reizes ar 2 ml hloroformu (3.1.) dalāmpiltuvē (4.24.1.). Uzlejiet apvienotos hloroforma ekstraktus apmēram 1 g nātrija sulfāta (3.15.2.) 10 ml mēģenē. Mazu piltuvi (diametrs – 4 cm) var izmantot ar vatējumu sašaurinājuma vietā, ko klāj apmēram 1 g nātrija sulfāta. Nātrija sulfāta slāni nomazgā ar dažiem ml hloroforma un savāc mazgāšanas šķidrumu tajā pašā mēģenē. Hloroforma ekstraktu tajā pašā mēģenē ietvaicē līdz izžūšanai, izmantojot karstuma kameru (4.24.2.) un atkārtoti šķīdina 1 ml hloroforma. 6.2. Derivāta un plānslāņa hromatogrāfijas sagatavošana Skatīt Padomes Direktīvas 76/372/EEK pielikuma 5.6.2. punkta A metodi. 7. Rezultātu aprēķināšana Aflatoksīna B1 saturu (μm/kg) paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu: Aflatoksîna B1 saturs, izsakot μg/kg = m × V V × M × VfVc kur m m = P + P × 2 r st P (paraugs) = parauga B1 maksimuma zona P(st1) = aflatoksīna B1 maksimuma zona, kas rodas iepriekšējās standartvielas (3.13.3.) injekcijas rezultātā P(st2) = aflatoksīna B1 maksimuma zona, kas rodas nākamās standartvielas (3.13.3.) injekcijas rezultātā r(st) = standartvielā (3.13.3.) injicētais aflatoksīna B1 daudzums, izsakot ng Vm = injicētā parauga ekstrakta daudzums mililitros Vext = parauga ekstrakta galīgais tilpums mililitros, no kura var sagatavot jebkuru vajadzīgo atšķaidījumu (5.3.) M = parauga masa gramos Vf = uz florisila kaseti (5.4.1.2.) pārnestā filtrāta tilpums mililitros Vc = parauga ekstrahēšanai izmantotā hloroforma daudzums mililitros Ja procedūru izpilda atbilstoši šim protokolam, formulu noīsinās līdz: aflatoksīna B1 saturs, izsakot μg/kg = 20 × m. 7.1. Rezultātu aprēķināšanu var arī veikt, mērot pīķa augstumu. 8. Atkārtojamība: skatīt 10.1. punktu. 9. Reproducējamība: skatīt 10.1. punktu. 10. Apsvērumi 10.1. Precizitāte Starptautiskā līmenī veiktais barības koppētījums [1] uzrādīja 1. tabulā norādītos rezultātus attiecībā uz atkārtojamību un reproducējamību. Termins "atkārtojamība" (r), kas izmantots šeit, ir definēts kā lielākā attiecība, kura nav nozīmīga 95 % iespējamības līmenī, salīdzinot divus viena parauga rādījumus tajā pašā laboratorijā līdzīgos apstākļos. Termins "reproducējamība" (R) ir līdzīgi definēts, salīdzinot divas dažādas laboratorijas. Saskaņā ar ISO 3534 – 1977, 2.35 [2] un Komisijas Lēmumu 89/610/EEK [3] r un R ir arī norādīti 1. tabulā variāciju koeficientu veidā. 1. tabula Atkārtojamība (r) un reproducējamība (R), kas izteiktas kā attiecības un attiecīgie variāciju koeficenti (15 laboratorijas) Līmenis | r | R | CVr [4] | CVR | (μg/kg) | | | (%) | (%) | 8 & 14 | 1,4 | 1,7 | 11 | 18 | "CV 10.2. Hloroforma stabilizācija (3.1.) Florisila kasetes adsorbcijas raksturlielumi var izmainīties, ja izmanto stabilizētājvielas, kas nav etanols. Minētais ir jāpārbauda atbilstoši 10.3. punktam, ja nav pieejams aprakstītais hloroforms. 10.3. Precizitāte Metodes izmantošanas pareizību pārbauda, ja iespējams, veicot vairākus sertificētu standarta materiālu mērījumus. Ja tie nav pieejami, metodes darbība jāpārbauda ar atgūstamības eksperimentiem, ko veic attiecībā uz pastiprinātiem tukšiem paraugiem. Tā vidējās vērtības novirze no faktiskās vērtības, kas izteikta procentuāli no faktiskās vērtības, nedrīkst pārsniegt – 20 līdz + 10 % robežas. +++++ TIFF +++++ 1. attēls. Kolonnas un kasetes komplekts. +++++ TIFF +++++ 2. attēls: Šķidruma hromatogrāfijas plūsmas shēma ar joda pēckolonnas derivatizāciju +++++ TIFF +++++ 3. attēls. Kompensācija par novirzēm reakcijā uz aflatoksīna B1, injicējot standartvielu (3.13.3.) pēc regulāriem intervāliem" [1] Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. un Paulsch, W.E. (1991). Pārtikas piedevas un piesārņotāji [Food Additives and Contaminants] 8, 17-29. [2] ISO 3534-1977. [3] OV L 351, 2.12.1989., 39. lpp. [4] "variāciju koeficients --------------------------------------------------