“I PIELIKUMS

Cietes satura un tās šķelšanās produktu, ieskaitot glikozi, fermentatīva noteikšana pārtikas produktos, izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC)

1. Darbības joma

Ar šo metodi nosaka cietes saturu un tās šķelšanās produktus, ieskaitot glikozi, cilvēka uzturā paredzētos pārtikas produktos, kas šeit turpmāk saukta “ciete”. Cietes saturu nosaka, veicot glikozes kvantitatīvo analīzi ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC) pēc cietes un tās šķelšanās produktu fermentatīvas pārveidošanās glikozē.

2. Kopējā glikozes satura un kopējā glikozes satura, kas izteikts kā “ciete”, definīcija

Kopējais glikozes saturs ir vērtība “Z”, ko aprēķina, kā noteikts šā pielikuma 7.2.1. punktā. Tā apzīmē cietes un visu tās šķelšanās produktu saturu, ieskaitot glikozi.

Regulas (EK) Nr. 1460/96 III pielikumā definēto cietes/glikozes saturu aprēķina, ņemot vērā kopējo glikozes saturu “Z” un saskaņā ar šīs regulas 2. panta 1. punkta noteikumiem.

Komisijas Regulas (EK) Nr. 1043/2005 (1) IV pielikuma 3. slejā minēto cietes (vai dekstrīna) saturu aprēķina, ņemot vērā kopējo glikozes saturu “Z” un saskaņā ar Komisijas Regulas (EK) Nr. 904/2008 (2) 2. panta 2. punkta 1. apakšpunkta noteikumiem.

Šā pielikuma 1. punktā minētais cietes saturs ir vērtība “E”, ko aprēķina, kā noteikts šā pielikuma 7.2.2. punktā. To izsaka % (m/m). Tas ir vienāds ar kopējo glikozes saturu “Z”, kas izteikts kā “ciete”. Minētā vērtība “E” neskar iepriekšminētos aprēķinus.

3. Princips

Paraugus homogenizē un suspendē ūdenī. Paraugos esošo cieti un tās šķelšanās produktus fermentatīvi pārveido glikozē divos posmos:

1) cieti un tās šķelšanās produktus daļēji pārveido šķīstošos glikozes ķēdes fragmentos, izmantojot termostabilo alfa-amilāzi 90 °C temperatūrā. Lai efektīvi pārveidotu, nepieciešams, lai paraugi būtu pilnīgi izšķīdināti vai arī suspensijā, kas satur ļoti mazas cietās daļiņas;

2) šķīstošos glikozes ķēdes fragmentus pārveido glikozē, izmantojot amilglikozidāzi 60 °C temperatūrā.

Produkti, kas satur lielu daudzumu proteīnu vai tauku, tiek dzidrināti un filtrēti.

Cukurus nosaka ar HPLC analīzi.

Tā kā fermentatīvās apstrādes laikā var notikt daļēja saharozes inversija, tiek veikta brīvo cukuru noteikšana ar HPLC analīzi, lai aprēķinātu koriģēto glikozes saturu.

4. Reaģenti un citi materiāli

Izmanto atzītas analītiskas kvalitātes reaģentus un demineralizētu ūdeni.

4.1. Glikoze, vismaz 99 %.

4.2. Fruktoze, vismaz 99 %.

4.3. Saharoze, vismaz 99 %.

4.4. Maltozes monohidrāts, vismaz 99 %.

4.5. Laktozes monohidrāts, vismaz 99 %.

4.6. Termostabilās alfa-amilāzes šķīdums (1,4-alfa-D-glikān-glikānhidrolāze) ar aktivitāti aptuveni 31 000 U/ml (1 U 3 minūtēs no cietes atbrīvo 1,0 mg maltozes pie pH 6,9 20 °C temperatūrā). Šis ferments var saturēt nelielus piemaisījumu daudzumus (piemēram, glikozi vai saharozi) un citus traucējošus fermentus. Uzglabā aptuveni 4 °C temperatūrā. Kā alternatīvu risinājumu, lai pagatavotu gala šķīdumu ar līdzīgu fermentu aktivitāti, var izmantot citus alfa-amilāzes avotus.

4.7. Amiloglikozidāze (1,4-alfa-D-glikān-glikohidrolāze) no Aspergillus niger, pulveris ar aktivitāti aptuveni 120 U/mg vai aptuveni 70 U/mg (1 U 1 minūtē no cietes atbrīvo 1 mikromolu glikozes pie pH 4,8 un 60 °C temperatūrā). Šis ferments var saturēt nelielus piemaisījumu daudzumus (piemēram, glikozi vai saharozi) un citus traucējošus fermentus (piemēram, invertāzi). Uzglabā aptuveni 4 °C temperatūrā. Kā alternatīvu risinājumu, lai pagatavotu gala šķīdumu ar līdzīgu fermentu aktivitāti, var izmantot citus amiloglikozidāzes avotus.

4.8. Cinka acetāta dihidrāts, p.a.

4.9. Kālija heksaciānoferrāts (II) (K4[Fe(CN)]6.3H2O), īpaši tīrs.

4.10. Bezūdens nātrija acetāts, p.a.

4.11. Ledus etiķskābe, vismaz 96 % (v/v).

4.12. Nātrija acetāta buferšķīdums (0,2 mol/l). Mērglāzē iesver 16,4 g nātrija acetāta (4.10. punkts). Izšķīdina ūdenī un ieskalo 1 000 ml mērkolbā. Atšķaida ar ūdeni līdz zīmei un ar etiķskābi koriģē pH vērtību līdz pH 4,7 (izmantojot pH-metru (5.7. punkts)). Šo šķīdumu var izmantot ne ilgāk kā 6 mēnešus, uzglabājot aptuveni 4 °C temperatūrā.

4.13. Amiloglikozidāzes šķīdums. Sagatavo šķīdumu no amiloglikozidāzes pulvera (4.7. punkts), izmantojot nātrija acetāta buferšķīdumu (4.12. punkts). Fermentu darbībai jābūt pietiekamai un atbilstošai tam cietes saturam, kas ir attiecīgajā parauga daudzumā (piemēram, aptuveni 600 U/ml aktivitāti iegūst, izmantojot 0,5 g amiloglikozidāzes pulvera ar 120 U/mg aktivitāti (4.7. punkts) 100 ml galīgajā tilpumā uz 1 g cietes daudzuma paraugā). Sagatavo tieši pirms lietošanas.

4.14. Standartšķīdumi. Sagatavo glikozes, fruktozes, saharozes, maltozes un laktozes šķīdumus ūdenī tādā veidā, kā parasti izmanto HPLC analīzē cukuru noteikšanai.

4.15. Dzidrināšanas reaģents (Kareza I šķīdums). Mērglāzē ūdenī izšķīdina 219,5 gramus cinka acetāta (4.8. punkts). Ieskalo 1 000 ml mērkolbā un pievieno 30 ml etiķskābes (4.11. punkts). Rūpīgi samaisa un uzpilda līdz zīmei ar ūdeni. Šo šķīdumu var izmantot ne ilgāk kā 6 mēnešus, ja to uzglabā istabas temperatūrā. Var izmantot citus dzidrināšanas reaģentus, kas līdzvērtīgi Kareza šķīdumam.

4.16. Dzidrināšanas reaģents (Kareza II šķīdums). Mērglāzē ūdenī izšķīdina 106,0 gramus kālija heksaciānoferrāta (II) (4.9. punkts). Ieskalo 1 000 ml mērkolbā. Rūpīgi samaisa un līdz zīmei uzpilda ar ūdeni. Šo šķīdumu var izmantot ne ilgāk kā 6 mēnešus, ja to uzglabā istabas temperatūrā. Var izmantot citus dzidrināšanas reaģentus, kas līdzvērtīgi Kareza šķīdumam.

4.17. HPLC kustīgā fāze. Sagatavo kustīgo fāzi, kādu parasti izmanto HPLC analīzē cukuru noteikšanai. Ja izmanto aminopropilsilikagela kolonnu, parastā kustīgā fāze ir, piemēram, HPLC vajadzībām piemērota ūdens un acetonitrila maisījums.

5. Aprīkojums

5.1. Laboratorijas standarta stikla trauki.

5.2. Kroku filtri, piem., 185 mm.

5.3. Membrānas filtri, 0,45 μm, piemēroti ūdens šķīdumiem.

5.4. Paraugu stobriņi, kas piemēroti HPLC automātiskajai paraugu ņemšanas ierīcei.

5.5. 100 ml mērkolbas.

5.6. Plastmasas šļirces, 10 ml.

5.7. pH-metrs.

5.8. Analītiskie svari.

5.9. Ūdens vanna ar termostatu, iespējams uzstādīt 60 °C un 90 °C temperatūru.

5.10. HPLC aparāts, kas piemērots cukuru analīzei.

6. Procedūra

6.1. Parauga sagatavošana dažādu veidu produktiem

Produktus homogenizē.

6.2. Parauga lielums

Parauga lielums tiek paredzēts, ņemot vērā norādījumus par sastāvdaļām un HPLC analīzes apstākļus (glikozes standartšķīduma koncentrācijas), un nepārsniedz:

Paraugu sver ar precizitāti līdz 0,1 mg.

6.3. Tukšā analīze

Tukšo analīzi veic kā pilnu analīzi (kā aprakstīts 6.4. punktā), nepievienojot paraugu. Tukšās analīzes rezultātu izmanto cietes satura aprēķināšanā (7.2. punkts).

6.4. Analīze

6.4.1. Paraugu sagatavošana

Paraugu homogenizē, kratot vai apmaisot. Izvēlēto analizējamo paraugu (6.2. punkts) iesver mērkolbā (5.5. punkts) un pievieno 70 ml silta ūdens.

Pēc izšķīdināšanas vai suspendēšanas pievieno 50 mikrolitrus termostabilas alfa-amilāzes (4.6. punkts) un karsē 30 minūtes 90 °C temperatūrā ūdens vannā (5.9. punkts). Cik vien ātri iespējams, paraugus atdzesē ūdens vannā līdz 60 °C temperatūrai un pievieno 5 ml amiloglikozidāzes šķīduma (4.13. punkts). Kontrolē pH vērtību tiem paraugiem, kuri var ietekmēt šķīduma pH reakciju, un vajadzības gadījumā to pielāgo līdz 4,6–4,8. Ļauj reaģēt 60 minūtes 60 °C. Paraugus atdzesē līdz istabas temperatūrai.

6.4.2. Dzidrināšana

Paraugiem ar lielu proteīnu vai tauku saturu ir jāveic dzidrināšana, pievienojot parauga šķidrumam 1 ml Kareza I šķīdumu (4.15. punkts). Pēc saskalošanas pievieno 1 ml Kareza II šķīdumu (4.16. punkts). Paraugu vēlreiz saskalo.

6.4.3. Sagatavošana HPLC analīzei

Paraugu mērkolbā atšķaida līdz zīmei ar ūdeni, homogenizē un filtrē caur kroku filtru (5.2. punkts). Savāc parauga ekstraktu.

Ekstraktu filtrē caur membrānas filtru (5.3. punkts) ar šļirci (5.6. punkts), kas iepriekš izskalota ar ekstraktu. Filtrātu savāc stobriņos (5.4. punkts).

6.5. Hromatogrāfija

HPLC veic tāpat, kā parasti cukuru analīzei. Ja HPLC analīze uzrāda maltozes piemaisījumus, tas norāda uz cietes nepilnīgu sadalīšanos, kas izraisa zemāku glikozes atgūstamību.

7. Rezultātu aprēķināšana un izteikšana

7.1. HPLC rezultātu aprēķināšana

Lai aprēķinātu cietes saturu, nepieciešami divu HPLC analīžu rezultāti, proti, paraugā esošo cukuru saturs pirms (“brīvie cukuri”) un pēc apstrādes ar fermentatīvo metodi (kā aprakstīts šajā metodē). Jāveic arī tukšā analīze, lai varētu koriģēt cukurus, kuri atrodas fermentos.

HPLC analīzē pīķu laukumu nosaka pēc integrēšanas un koncentrāciju aprēķina pēc kalibrēšanas ar standartšķīdumiem (4.14. punkts). Glikozes koncentrāciju (g/100 ml) tukšajā analīzē atņem no glikozes koncentrācijas (g/100 ml) pēc fermentatīvās apstrādes. Visbeidzot aprēķina cukuru saturu (g cukura/100 g parauga), izmantojot nosvērto parauga daudzumu, kā rezultātā iegūst:

1) HPLC analīzi pirms fermentatīvās apstrādes, iegūstot brīvo cukuru saturu (g/100 g): — glikoze G, — fruktoze F, — saharoze S;

2) HPLC analīzi pēc fermentatīvās apstrādes, iegūstot cukuru saturu (g/100 g): — glikoze pēc tukšās analīzes koriģēšanas (Ge cor), — fruktoze Fe, — saharoze Se.

7.2. Cietes satura aprēķināšana

7.2.1. Kopējā glikozes satura “Z” aprēķināšana

Ja fruktozes daudzums pēc fermentatīvās apstrādes (Fe) ir lielāks nekā fruktozes daudzums pirms fermentatīvās apstrādes (F), tad saharoze, kas atrodas paraugā, ir daļēji pārveidota fruktozē un glikozē. Tas nozīmē, ka jākoriģē atbrīvotā glikoze (Fe – F).

Z, galīgais glikozes saturs pēc korekcijas g/100 g:

Z = (Ge cor) – (Fe – F)

7.2.2. Kopējā glikozes satura, kas izteikts kā ciete, aprēķināšana:

E, “cietes” saturs g/100 g:

E = [(Ge cor) – (Fe – F)] × 0,9

8. Precizitāte

Šajā punktā sniegta informācija par metodes precizitātes datiem no starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas rezultātiem 2 paraugiem. Tie atspoguļo šajā pielikumā aprakstītās metodes izpildījuma prasības.

Starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas rezultāti (informācijai)

Starplaboratoriju salīdzinošā testēšana tika veikta 2008. gadā, piedaloties Eiropas muitas laboratorijām.

Precizitātes datu novērtēšana tika veikta saskaņā ar dokumentu “Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies”, W. Horwitz, (IUPAC technical report), Pure & Appl. Chem., 67. sēj., Nr. 2, 331.–343. lpp., 1995.

Precizitātes dati ir apkopoti šajā tabulā: