I PIELIKUMS

Atbilstīgi 3., 4., 5., 7. un 8. pantam veicamo testu shēma

1. VISPĀRĪGIE PRINCIPI ATTIECĪGĀ KAITĪGĀ ORGANISMA KLĀTBŪTNES NOTEIKŠANAI

1.1. Aizdomas par attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtni ir tad, ja ir iegūts pozitīvs rezultāts pirmajā noteikšanas testā, kas veikts attiecīgajam augam. Simptomātiskam augu materiālam pirmais noteikšanas tests var būt selektīva izolācija.

1.2. Attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtni attiecīgo augu simptomātiskos paraugos apstiprina šādos gadījumos: a) ja pirmais noteikšanas tests ir selektīva izolācija, kuras rezultātā iegūst kolonijas ar tipisku morfoloģiju, pozitīvus rezultātus iegūst divos identifikācijas testos; b) ja pirmais noteikšanas tests ir cits tests, nevis selektīva izolācija: i) rezultātu uzskata par pozitīvu tikai tad, kad veikta parauga selektīvā izolācija un divos identifikācijas testos iegūts pozitīvs rezultāts; ii) pozitīvus rezultātus iegūst otrajā noteikšanas testā, kas nav selektīva izolācija.

1.3. Attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtni attiecīgo augu asimptomātiskos paraugos apstiprina šādos gadījumos: a) ja pozitīvu rezultātu iegūst otrajā noteikšanas testā ar nosacījumu, ka pirmais vai otrais noteikšanas tests ir molekulārais (uz DNS balstītais) tests (TaqMan® reālā laika PCR vai konvencionālais PCR); b) attiecībā uz paraugiem, kas ņemti dalībvalstī vai dalībvalsts apgabalā, par kuru zināms, ka attiecīgais kaitīgais organisms tajā nav sastopams, un paraugiem, kuru izcelsme ir citā dalībvalstī – ja pozitīvu rezultātu iegūst otrajā noteikšanas testā saskaņā ar a) apakšpunktu un ja veikta parauga selektīvā izolācija un divos identifikācijas testos iegūts pozitīvs rezultāts.

2. TESTI

2.1. Noteikšanas testi

Noteikšanas testi ir tādi, lai tajos konsekventi noteiktu vismaz 104 šūnu vienā mililitrā atkārtoti suspendētu nogulšņu.

Otrais noteikšanas tests ir balstīts uz bioloģiskajiem principiem vai nukleotīdu reģioniem, kas atšķiras no pirmajā noteikšanas testā izmantotajiem.

Noteikšanas testi ir šādi:

a) imūnfluorescences testi, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

b) FISH tests (van Beuningen et al. (1995) (1)), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

c) izolācija, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos. Jāizpilda viens no šiem diviem variantiem: i) tieša izolācija daļēji selektīvā (vai neselektīvā) barotnē, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; ii) pēc bagātināšanas, izmantojot bioloģisko pārbaudi, izolācija, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

d) konvencionālais PCR tests, izmantojot Pastrik et al., (2000) (2) praimerus, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

e) TaqMan® reālā laika PCR testi, izmantojot šādus praimerus un zondes: i) Schaad et al. (1999) (3), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (tā dēvētais NYtor tests), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; iii) Gudmestad et al. (2009), kas pielāgots ar Vreeburg et al. (2018)4, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; iv) Massart et al. (2014) (5), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos.

2.2. Identifikācijas testi

Identifikācijas testi ir šādi:

a) imūnfluorescences tests, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

b) konvencionālais PCR tests (Pastrik (2000)), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

c) TaqMan® reālā laika PCR testi, izmantojot šādus praimerus un zondes: i) Schaad et al. (1999), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; ii) Vreeburg et al. (2018) (tā dēvētais NYtor tests), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; iii) Gudmestad et al. (2009), kas pielāgots ar Vreeburg et al. (2018), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos; iv) Massart et al. (2014), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

d) DNS svītrkodēšana, kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos;

e) MALDI-TOF MS (Zaluga et al. (2011) (6)), kā aprakstīts starptautiskajos diagnostikas standartos.

3. PROCEDŪRU PLŪSMKARTES

Plūsmkarte Nr. 1. Diagnostikas procedūra attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtnes noteikšanai attiecīgā auga simptomātiskos paraugos

a Izolāciju var izmantot kā pirmo vai otro noteikšanas testu. Ja ir aizdomas par attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtni barotnē, kolonijas pārsēj, lai iegūtu tīrkultūras, kam veic divus identifikācijas testus. Lai apstiprinātu kaitīgā organisma klātbūtni, jābūt pozitīviem rezultātiem abos identifikācijas testos.

b Trešais noteikšanas tests ir balstīts uz atšķirīgiem bioloģiskajiem principiem vai atšķirīgiem nukleotīdu reģioniem.

Plūsmkarte Nr. 2. Diagnostikas procedūra attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai auga asimptomātiskos paraugos

a Izolāciju neizmanto.

b Trešais noteikšanas tests ir balstīts uz atšķirīgiem bioloģiskajiem principiem vai atšķirīgiem nukleotīdu reģioniem. Izolāciju neizmanto.

c Lai 1.3. punkta b) apakšpunktā minēto paraugu gadījumā apstiprinātu attiecīgā kaitīgā organisma klātbūtni pēc otrā pozitīvā noteikšanas testa, attiecīgais kaitīgais organisms ir jāizolē no parauga, bet pēc tam jāveic divi identifikācijas testi. Jābūt pozitīviem rezultātiem abos identifikācijas testos.

4. PARAUGU SAGATAVOŠANA

4.1. Paraugi no asimptomātiskiem bumbuļiem

Standarta paraugā jābūt 200 bumbuļiem katram testam. Atbilstošā laboratorijas procedūra stolona pamatnes vadaudu apstrādei, lai iegūtu ekstraktu attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai, ir aprakstīta starptautiskajos diagnostikas standartos.

4.2. Paraugi no asimptomātiska augu materiāla, kas nav bumbuļi

Latentu infekciju noteikšanu veic stublāju segmentu apvienotiem paraugiem. Šo procedūru var piemērot līdz 200 stublāju daļām no dažādiem augiem vienā paraugā. Atbilstošā laboratorijas procedūra stublāju segmentu dezinficēšanai un apstrādei, lai iegūtu ekstraktu attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai, ir aprakstīta starptautiskajos diagnostikas standartos.

4.3. Paraugi no simptomātiska attiecīgā auga

Audu daļas aseptiski atdala no bumbuļa vadaudu gredzena vai no to attiecīgo augu stublāja vadaudiem, kam ir vītes pazīmes. Atbilstošā laboratorijas procedūra šo audu apstrādei, lai iegūtu ekstraktu attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai, ir sīki aprakstīta starptautiskajos diagnostikas standartos.

(1) Van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D.(1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus noteikšana un identifikācija, īpašu uzmanību pievēršot luminiscentajai in situ hibridizācijai (FISH) un izmantojot speciālu 16S rRNA oligonukleotīdu zondi). Züchtungs Forschung 1, 266. – 269. lpp.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus noteikšana kartupeļu bumbuļos, izmantojot daudzkārtēju PCR ar saimnieka DNS koamplifikāciju). European Journal of Plant Pathology 106, 155. – 165. lpp.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus noteikšana kartupeļu bumbuļos, izmantojot BIOPCR un automatizētu reālā laika fluorescences detektēšanas sistēmu). Plant Disease 83, 1095. – 1100. lpp.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach (Četru reālā laika TaqMan PCR testu validācija Ralstonia solanacearum un/vai Ralstonia pseudosolanacearum, un/vai Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus noteikšanai kartupeļu bumbuļos, izmantojot statistiskās regresijas pieeju). EPPO Bulletin 48, 86. – 96. lpp.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay (Ralstonia solanacearum race 3 un Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus vienlaicīga noteikšana kartupeļu bumbuļos, izmantojot daudzkārtēju reālā laika PCR analīzi). European Journal of Plant Pathology 138, 29. – 37. lpp.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter (GyrB sekvencanalīze un MALDI-TOF MS kā augu patogēna Clavibacter identifikācijas instrumenti). Systematic and applied microbiology 34, 400. – 407. lpp., 10.1016/j.syapm.2011.05.001.