Komisijas Direktīva 88/302/EEK (1987. gada 18. novembris), ar ko devīto reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu



Oficiālais Vēstnesis L 133 , 30/05/1988 Lpp. 0001 - 0127

Speciālizdevums somu valodā: Nodaļa 15 Sējums 14 Lpp. 0003

Speciālizdevums zviedru valodā: Nodaļa 15 Sējums 14 Lpp. 0003

CS.ES Nodaļa 13 Sējums 009 Lpp. 90 - 216

ET.ES Nodaļa 13 Sējums 009 Lpp. 90 - 216

HU.ES Nodaļa 13 Sējums 009 Lpp. 90 - 216

LT.ES Nodaļa 13 Sējums 009 Lpp. 90 - 216

LV.ES Nodaļa 13 Sējums 009 Lpp. 90 - 216

MT.ES Nodaļa 13 Sējums 009 Lpp. 90 - 216

PL.ES Nodaļa 13 Sējums 009 Lpp. 90 - 216

SK.ES Nodaļa 13 Sējums 009 Lpp. 90 - 216

SL.ES Nodaļa 13 Sējums 009 Lpp. 90 - 216



Komisijas Direktīva 88/302/EEK (1987. gada 18. novembris), ar ko devīto reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes Direktīvu 67/548/EEK (1967. gada 27. jūnijs) par normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķēšanu [1], kura sesto reizi grozīta ar Direktīvu 79/831/EEK [2], un jo īpaši tās 19. pantu, tā kā Direktīvas 67/548/EEK 3. panta 1. punkts paredz, ka vielu un preparātu fizikāli ķīmisko īpašību, toksicitātes un ekotoksicitātes noteikšanai izmanto V pielikumā norādītās metodes; tā kā Direktīvas 67/548/EEK 3. panta 2. punkts paredz, ka vielas vai preparāta faktisko vai iespējamo apdraudējumu videi vērtē pēc VII un VIII pielikumā izklāstītajām īpašībām; tā kā V pielikuma redakcijā, kas pievienota Komisijas Direktīvai 84/449/EEK [3], pašlaik ir iekļautas tikai tādas testa metodes, kas attiecas uz VII pielikumā aplūkotajām īpašībām, un tālab jāsniedz arī tādu testa metožu apraksts, kuras attiecas uz VIII pielikumā aplūkotajām īpašībām; tā kā šīs direktīvas noteikumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi Komiteja, kas atbild par to, kā tehnikas attīstībai pielāgot direktīvas par tehnisko šķēršļu novēršanu bīstamu vielu un preparātu tirdzniecībā, IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU. 1. pants Direktīvas 67/548/EEK V pielikumu papildina ar šīs direktīvas pielikuma tekstu. 2. pants Dalībvalstis līdz 1988. gada 31. decembrim pieņem un publicē noteikumus, kas vajadzīgi, lai izpildītu šīs direktīvas prasības, un tūlīt par to informē Komisiju. Šos noteikumus dalībvalstis sāk piemērot ne vēlāk kā 1989. gada 30. jūnijā. 3. pants Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm. Briselē, 1987. gada 18. novembrī Komisijas vārdā — Komisijas loceklis Stanley Clinton Davis [1] OV 196, 16.8.1967., 1./67. lpp. [2] OV L 259, 15.10.1979., 10. lpp. [3] OV L 251, 19.9.1984., 1. lpp. -------------------------------------------------- PIELIKUMS Šeit aplūkotās testa metodes kalpo tādu toksisko un ekotoksisko īpašību noteikšanai, kuras norādītas Padomes Direktīvas 79/831/EEK VIII pielikumā. Turpmāk ir aplūkotas testa metodes, kas attiecas uz VIII pielikumā norādīto 1. un 2. līmeni, lai arī tās nav savstarpēji nodalītas atkarībā no piederības dažādiem līmeņiem. SATURS | Lpp. | B DAĻA: Metodes toksicitātes noteikšanai … | 93 | Vispārīgs ievads: B daļa … | 93 | Subhroniskās toksicitātes noteikšana pēc perorālas aplikācijas – atkārtota perorāla aplikācija grauzējiem (90 dienu laikā) … | 97 | Subhroniskās toksicitātes noteikšana pēc perorālas aplikācijas – atkārtota perorāla aplikācija dzīvniekiem, kas nepieder pie grauzēju sugām (90 dienu laikā) … | 101 | Subhroniskās toksicitātes noteikšana pēc ārīgas aplikācijas – atkārtota ārīga aplikācija grauzējiem (90 dienu laikā) … | 105 | Subhroniskās toksicitātes noteikšana pēc inhalācijas – toksicitātes noteikšana grauzējiem pēc atkārtotas inhalācijas (90 dienu laikā) … | 109 | Teratogenitātes noteikšana grauzējiem un citu sugu dzīvniekiem … | 113 | Hroniskās toksicitātes noteikšana … | 116 | Kancerogenitātes noteikšana … | 121 | Vienlaicīga hroniskās toksicitātes un kancerogenitātes noteikšana … | 126 | Toksicitātes ietekme uz vienas paaudzes reproduktīvo funkciju … | 132 | Toksicitātes ietekme uz divu paaudžu reproduktīvo funkciju … | 136 | Toksikokinētika … | 140 | Mutagenitātes noteikšana kopā ar kancerogenitātes priekšnovērtējumu … | 144 | —gēnu mutācijas Saccharomyces cerevisiae šūnās … | 144 | —mitotiskā rekombinācija Saccharomyces cerevisiae šūnās … | 147 | —gēnu mutāciju noteikšana zīdītāju šūnās in vitro… | 150 | —DNS bojājumi un to reparācija – neprogrammēta DNS sintēze zīdītāju šūnās in vitro… | 153 | —māshromatīdu apmaiņa zīdītāju šūnās in vitro… | 157 | —ar dzimumu saistīto recesīvo letālo mutāciju noteikšana (Drosopbila melanogaster) … | 160 | —zīdītāju šūnu transformācija in vitro… | 162 | —dominanto letāļu noteikšana grauzējiem … | 165 | —zīdītāju dzimumšūnu citoģenētika in vivo… | 168 | —peļu plankumainības tests … | 171 | —pārmantojamo translokāciju noteikšana pelēm … | 174 | C DAĻA: Ekotoksicitātes noteikšanas metodes … | 177 | Vispārīgs ievads: C daļa …. | 177 | Aļģu augšanas kavēšanas tests … | 178 | Toksicitātes noteikšana sliekām: mākslīgās augsnes tests … | 184 | Biodegradācija: Cāna-Vellena tests … | 188 | Biodegradācija: aktīvo dūņu imitācijas testi … | 195 | Biodegradācija: aktīvo dūņu respirācijas inhibīcijas tests … | 207 | Biodegradācija: modificēts SCAS tests … | 212 | B. DAĻA. METODES TOKSICITĀTES NOTEIKŠANAI VISPĀRĪGS IEVADS: B DAĻA ILGLAICĪGI PĒTĪJUMI Subhroniskā, hroniskā toksicitāte un kancerogenitāte Pārbaudāmās vielas un tās maisījumu raksturojums Lai noteiktu pārbaudāmās vielas toksicitāti, iepriekš jānoskaidro tās sastāvs un galvenie piemaisījumi, kā arī svarīgākās fizikāli ķīmiskās īpašības, ieskaitot vielas noturīgumu. Pārbaudāmās vielas fizikāli ķīmiskajām īpašībām ir svarīga nozīme, izvēloties tās ievadīšanas veidu, plānojot subhroniskās un hroniskās toksicitātes vai kancerogenitātes pētījumus, kā arī tās lietošanas un uzglabāšanas režīmu. Pamatojoties uz datiem par vielas ķīmisko uzbūvi un fizikāli ķīmiskajām īpašībām, var arī spriest par tās absorbcijas īpatnībām, izmantojot paredzēto ievadīšanas veidu, kā arī par vielas un tās metabolītu iespējamo izplatīšanos audos. Datus par vielas toksikokinētiskajiem parametriem var iegūt arī no iepriekšējiem toksicitātes un toksikokinētikas pētījumiem. Pirms uzsākt izpēti, jāizstrādā analītiskās metodes pārbaudāmās vielas (ja iespējams, arī tās galveno piemaisījumu) kvalitatīvajai un kvantitatīvajai noteikšanai ievadāmajā maisījumā un bioloģiskajā materiālā. Izmēģinājumu dzīvnieki – dzīvnieku sugu un līniju izvēle Tā kā dzīvniekus pakļauj vielas iedarbībai gandrīz visa mūža garumā, parasti pētījumos cenšas izmantot tādu sugu dzīvniekus, kuru mūžs ir samērā īss un kuru turēšana nesagādā grūtības. Būtu ļoti vēlams zināt, cik bieži izmantoto līniju dzīvniekiem spontāni rodas slimības un audzēji, kad tos tur līdzīgos apstākļos. Dzīvnieku līnijām jābūt labi izpētītām un bez iedzimtiem defektiem. Šajā ziņā zināmas priekšrocības ir inbredlīnijām un F1 hibrīdiem, lai gan izmantošanai der arī autbredlīniju dzīvnieki, kas veido noslēgtu populāciju, ja vien par tiem ir uzkrāts pietiekami daudz pamatdatu. Dzīvnieku aprūpe, nodrošināšana ar uzturu un ūdeni Izmēģinājumus un pētījumus ar dzīvniekiem veic saskaņā ar attiecīgās valsts tiesību aktiem, ievērojot humānas attieksmes principus un jaunākos sasniegumus dzīvnieku labturības jomā citur pasaulē. Lai iegūtu ticamus rezultātus, stingri jākontrolē apkārtējie apstākļi un jāizmanto piemērotas dzīvnieku aprūpes metodes. Ja pārbaudāmo vielu ievada atkārtoti, tādi faktori kā dzīvnieku turēšanas apstākļi, nejaušas slimības, ārstēšana ar zālēm, piemaisījumi uzturā, gaisā vai ūdenī, izmantotie pakaiši un vispārējie dzīvnieku aprūpes apstākļi var ievērojami ietekmēt pētījumu iznākumu. Vispār jāzina, kā ķīmiskie sterilizācijas līdzekļi iespaido pētījumu rezultātus. Uzturam jāatbilst visām izmantoto dzīvnieku sugu prasībām attiecībā uz uzturvielām un tajā nedrīkst būt piemaisījumi, kas var ietekmēt testa rezultātus. Grauzēji saņem barību un ūdeni ad libitum, turklāt vismaz reizi nedēļā barība jāatjauno. Pašlaik izmanto trīs uztura veidus – parasto, sintētisko un dažādas “īpaša sastāva formulas”. Neatkarīgi no izvēlētā uztura piegādātājiem regulāri jāuzrauga pamatbarības uzturvērtība un piemaisījumu līmenis un šī informācija jāpievieno katrai barības partijai, ko saņem laboratorija. Būtu ļoti vēlams noskaidrot, kā uztura režīms ietekmē vielmaiņu, kā arī audzēju attīstību un dzīvnieku mūža ilgumu. Bez tam testu laboratorija var veikt pamatbarības kontrolanalīzes, lai noteiktu uzturlīdzekļu sastāvdaļas un nejaušus piemaisījumus, tostarp kancerogēnus. Šajā gadījumā analīžu rezultāti jāsaglabā un jāiekļauj galīgajā ziņojumā, ko sagatavo pēc katras vielas testa. Plaši izplatītos uztura komponentus, kas veicina kanceroģenēzi (piem., antioksidantus, nepiesātinātās taukskābes, selēnu), nedrīkst ietvert uzturā iedarbīgā koncentrācijā. Tā kā vairāki plaši izplatītie uztura piemaisījumi, iespējams, ietekmē kancerogenitātes testa rezultātus, īpaša uzmanība jāvelta pesticīdu atlieku, hlororganisko savienojumu, policiklisko aromātisko ogļūdeņražu, estrogēnu, smago metālu, nitrozamīnu un mikotoksīnu noteikšanai uzturā. Ja pārbaudāmo vielu pievieno ūdenim vai barībai, ir svarīgi pārbaudīt vielas noturīgumu. Pirms pētīt atkārtotas devas iedarbību, pienācīgi jāpārbauda vielas noturīgums un homogenitāte, lai noteiktu uztura pagatavošanas un uzraudzības biežumu. Ja uzturu sterilizē, ir jānoskaidro, kā sterilizācija ietekmē pārbaudāmo vielu un uztura komponentus. Vajadzības gadījumā šī procedūra attiecīgi jākoriģē. Veicot kancerogenitātes testu, pētniekiem jāapzinās, ka izmantotais ūdens var saturēt piesārņojumus. Parasti šim nolūkam der ūdens, kas paredzēts lietošanai pārtikā, un jābūt pieejamiem datiem par tā sastāvu. Var gadīties, ka, dzīvniekiem augot, pārbaudāmās vielas koncentrācija uzturā ir jākoriģē, lai nodrošinātu pietiekami nemainīgu pārbaudāmās vielas uzņemšanu attiecībā uz ķermeņa svaru. Barības uzturvērtībai, ko saņem kontroles un izmēģinājumu dzīvnieki, jābūt pēc iespējas līdzīgai. Tātad ir jāņem vērā uzturam pievienotās pārbaudāmās vielas uzturvērtība. Pieredze rāda, ka, pārbaudāmā viela, kurai nav uzturvērtības, parasti neatstāj ievērojamu ietekmi uz barības uzturvērtību, ja tās saturs nepārsniedz 5 %. 1. Iedarbība pēc inhalācijas Metode iedarbīguma robežas noteikšanai nepastāv, jo līdz šim nav izdevies noteikt vienotu inhalācijas iedarbīguma robežu. 2. Teratogenitātes pētījumi Šī testa metode galvenokārt balstās uz perorālu ievadīšanu. Pastāv arī iespēja izmantot citus ievadīšanas veidus, ko nosaka pārbaudāmās vielas fizikālās īpašības vai tas, kādā veidā tā parasti iekļūst cilvēku organismā. Šādos gadījumos testa metode atbilstoši jākoriģē, ņemot vērā attiecīgos kritērijus, kas ir 28 dienu ilgā testa pamatā. 3. Toksikokinētika Toksikokinētiskie pētījumi atvieglo toksicitātes datu interpretāciju un izvērtēšanu. Šie pētījumi ļauj noskaidrot konkrētus jautājumus saistībā ar pārbaudāmās ķīmiskās vielas toksicitāti, un to rezultāti var palīdzēt plānot tālākus toksicitātes pētījumus. Katrā atsevišķā gadījumā nav jānosaka visi parametri. Tikai retos gadījumos ir jāveic pilnīga un secīga visu toksikokinētisko parametru (absorbcijas, izdalīšanas, izplatīšanās organismā un metabolisma) izpēte. Testējot dažus savienojumus, ieteicams izdarīt izmaiņas šajā secībā vai arī pietiek ar vienas devas ievadīšanu. Definīcijas Toksikokinētika | pēta pārbaudāmo vielu absorbciju, izplatīšanos organismā, to metabolismu un izdalīšanos. | Absorbcija | ir vielas uzsūkšanās un asimilācija pēc tās ievadīšanas organismā. | Ekskrēcija | ir ievadītas vielas un/vai tās metabolītu izvadīšana no organisma. | Izplatīšanās | organismā ir ievadītas vielas un/vai tās metabolītu izplatīšanās audos un orgānos. | Metabolisms | ir vielmaiņas procesi, kuru ietekmē notiek izmaiņas ievadītu vielu struktūrā, tām iesaistoties fermentatīvās vai nefermentatīvās reakcijās. | 4. Akūtas un subakūtas iedarbības pētījumi ar citas sugas dzīvniekiem Pētījumi, kuros izmanto citas sugas dzīvniekus, ļauj papildināt secinājumus, kas izdarīti pēc iepriekšējiem pētījumiem. Veicot šādus pētījumus, var izmantot jau iepriekš norādīto testa metodi vai pielāgot to mazākam dzīvnieku skaitam. 5. Auglības pētījumi Ja reproduktīvās funkcijas tests aptver trīs paaudzes, metodi, kas norādīta divu paaudžu reproduktīvās funkcijas testam, var piemērot arī trešajai paaudzei. 6. Mutagenitātes pētījumi Mutagenitātes papildu testi kopā ar kancerogenitātes priekšnovērtējumu Direktīvas VIII pielikumā ir minētas papildu pārbaudes mutagenitātes padziļinātai izpētei vai kancerogenitātes priekšnovērtējumam. Šajā iedaļā minētās pārbaudes parasti var izmantot abiem minētajiem mērķiem. Ievads Vielas mutagēnās iedarbības sākotnējā novērtēšana paredz gēnu mutāciju (punktmutāciju) noteikšanu baktērijām un citoģenētisko bojājumu noteikšanu zīdītāju šūnās (in vitro vai in vivo); metodes, kas izmantojamas šajos pamatpētījumos, ir aplūkotas iepriekš. Šajā iedaļā ir iztirzāti papildu pētījumi, kas var kalpot kā apstiprinājums un/vai papildinājums rezultātiem, kuri gūti pamatpētījumos, un tie ir izmantojami vairākiem mērķiem: 1. pamatpētījumos iegūto rezultātu apstiprināšanai; 2. pamatpētījumos neizpētītu parametru noskaidrošanai; 3. in vivo pētījumu ierosināšanai vai papildināšanai. Aplūkoto testu diapazons aptver eikariotu sistēmas gan in vitro, gan in vivo, kā arī paredz lielāku bioloģisko parametru skaitu. Šie testi ļauj iegūt informāciju par punktmutācijām organismos, kam ir sarežģītāka uzbūve nekā pamatpētījumos izmantotajām baktērijām, un sniedz sīkākus datus par vielas spēju inducēt hromosomu aberācijas. Ir aplūkotas arī citas testa metodes, kas kalpo ne tikai punktmutāciju un hromosomu aberāciju noteikšanai. Tās ļauj iegūt papildu datus un vajadzības gadījumā ir iekļaujamas testu shēmās. Apsverot tālāko mutagenitātes pētījumu programmu, jāievēro vispārējs princips, ka tai jānodrošina papildu informācija par attiecīgās vielas mutagenitāti un/vai kancerogenitāti. Faktiski veicamie pētījumi katrā konkrētā gadījumā būs atkarīgi no daudziem faktoriem, piemēram, no vielas ķīmiskajām un fizikālajām īpašībām, iepriekšējiem pētījumiem ar baktērijām un citoģenētikas pētījumiem, vielas metabolisma īpatnībām, citu toksicitātes pētījumu rezultātiem, kā arī no zināmiem vielas izmantošanas veidiem. Tādēļ pārāk stingra testu atlases shēma ir nepieņemama, ņemot vērā daudzos faktorus, kuri reizēm ir jāpatur prātā. Tomēr daži vispārēji principi var ieviest zināmu skaidrību. Ja viens no pamatpētījumiem uzrāda pozitīvus rezultātus, papildu pētījumos ir jāiekļauj vismaz viena metode, ar kuru var pārbaudīt to pašu ģenētisko parametru. Ja abi pamatpētījumi izrādās negatīvi, kā papildu pētījumu parasti izmanto gēnu mutāciju un hromosomu aberāciju noteikšanu. Var gadīties, ka ir lietderīgi iegūt papildu datus, izmantojot tālāk norādītos indikatortestus. Šādas izpētes metodes šeit apkopotas, balstoties uz galvenajiem pārbaudāmajiem ģenētiskajiem parametriem. Gēnu mutāciju (punktmutāciju) noteikšana Lai sīkāk izpētītu vielas spēju izraisīt gēnu mutācijas (punktmutācijas), var izvēlēties vienu no šeit minētajām metodēm: a) turpvērsto vai atpakaļvērsto mutāciju noteikšana eikariotiskajiem mikroorganismiem (Saccharomyces cerevisiae); b) turpvērsto mutāciju noteikšana zīdītāju šūnās in vitro; c) ar dzimumu saistīto recesīvo letālo mutāciju noteikšana (Drosophila melanogaster); d) mutāciju noteikšana somatiskajās šūnās in vivo – peļu plankumainības tests. Hromosomu aberāciju noteikšana Lai sīkāk izpētītu vielas spēju izraisīt hromosomu aberācijas, var izvēlēties vienu no šeit minētajām testa metodēm: a) zīdītāju citoģenētiskā analīze in vivo; šim nolūkam ieteicams analizēt metafāzes plātnes, kas iegūtas no kaula smadzeņu šūnām in vivo, ja tas nav izdarīts, veicot sākotnējo pārbaudi (pamatpētījumus); bez tam var citoģenētiski izmeklēt dzimumšūnas in vivo; b) zīdītāju šūnu citoģenētiskā izpēte in vitro, ja tas nav izdarīts, veicot sākotnējo pārbaudi; c) dominanto letāļu noteikšana grauzējiem; d) pārmantojamo translokāciju noteikšana pelēm. Indikatortesti, pētot iedarbību uz DNS Ir pieejamas metodes, ar kurām var noteikt, ka viela iedarbojas uz DNS, lai gan tā rezultātā nerodas mutācijas. Šie pētījumi var papildināt informāciju, kas gūta mutagenitātes pētījumos, un var būt noderīgi, interpretējot šādu pētījumu rezultātus. Ja rodas vajadzība pēc šādiem pētījumiem, var izvēlēties kādu no šeit minētajām metodēm, kas paredz eikariotisko mikroorganismu vai zīdītāju šūnu izmantošanu: a) mitotiskā rekombinācija Saccharomyces cerevisiae šūnās; b) DNS bojājumi un to reparācija – neprogrammēta DNS sintēze – zīdītāju šūnās (in vitro); c) māshromatīdu apmaiņa zīdītāju šūnās (in vitro). Citi indikatortesti kancerogenitātes noteikšanai Ir pieejamas metodes, ar kurām var noteikt zīdītāju šūnu transformāciju, kas ļauj kvantitatīvi novērtēt vielas spēju inducēt izmaiņas šūnu kultūru morfoloģijā un vairošanās dinamikā, kuras saista ar šūnu ļaundabīgo transformāciju in vivo. Var izmantot virkni dažādu šūnu tipu un transformācijas kritēriju. Riska novērtēšana attiecībā uz ģenētiski pārmantojamiem defektiem zīdītājos Pastāv metodes, ar kurām zīdītājiem var noteikt tādus ģenētiski pārmantojamus defektus, kas radušies gēnu mutāciju (punktmutāciju) (specifisko lokusu noteikšana pelēm [1]) vai hromosomu aberāciju (ģenētiski pārmantojamo translokāciju noteikšana pelēm) rezultātā. Šīs metodes var izmantot, lai izvērtētu ģenētisko risku, ko cilvēkiem var radīt kāda viela. Tomēr, ņemot vērā, ka šie testi ir visai sarežģīti un to veikšanai ir nepieciešams ļoti liels dzīvnieku skaits, jo īpaši specifisko lokusu noteikšanai, šo pētījumu uzsākšana nav iedomājama bez pārliecinoša pamatojuma. SUBHRONISKĀS TOKSICITĀTES NOTEIKŠANA PĒC PERORĀLAS APLIKĀCIJAS ATKĀRTOTA PERORĀLA APLIKĀCIJA GRAUZĒJIEM (90 DIENAS) 1. METODE 1.1. Ievads Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.3. Standartvielas Nav. 1.4. Metodes būtība Pārbaudāmo vielu dažādās devās katru dienu 90 dienu laikā perorāli ievada izmēģinājumu dzīvniekiem, kas sadalīti vairākās grupās, un vienas grupas dzīvnieki saņem vienādu devu. Ekspozīcijas laikā dzīvniekus katru dienu novēro un reģistrē toksiskuma pazīmes. Dzīvniekus, kas miruši izmēģinājuma laikā, secē un, beidzoties izmēģinājumam, secē arī izdzīvojušos dzīvniekus. 1.5. Kvalitātes kritēriji Nav. 1.6. Metodes apraksts Sagatavošanas darbi Vismaz piecas dienas pirms izmēģinājuma dzīvniekus pieradina pie dzīvošanas un barošanas apstākļiem, kādi būs izmēģinājuma laikā. Veselus un jaunus dzīvniekus pirms izmēģinājuma sadala apstrādes un kontroles grupās. Pārbaudāmo vielu var pievienot barībai, ievadīt ar zondi, kapsulās vai pievienot dzeramajam ūdenim. Visu izmēģinājuma laiku dzīvnieki saņem pārbaudāmo vielu pēc vienādas shēmas. Ja izmanto šķīdinātāju vai citas piedevas, kas atvieglo pārbaudāmās vielas ievadīšanu vajadzīgajā devā, ir jāpārliecinās, ka tām nepiemīt toksiska iedarbība. Vajadzības gadījumā var izmantot agrāk iegūtus datus. Testa apstākļi Izmēģinājumu dzīvnieki Ja nav kontrindikāciju, vēlams izmantot žurkas. Jāizmanto jauni un veseli dzīvnieki, kas pieder pie plaši izmantojamām laboratorijas dzīvnieku līnijām, kamēr tie nav sasnieguši 6 nedēļu vecumu, un jebkurā gadījumā žurku vecums nedrīkst pārsniegt 8 nedēļas. Uzsākot izmēģinājumus, dzīvnieku ķermeņa svara svārstības nedrīkst būt lielākas par ± 20 % no vidējā svara. Ja subhroniskās toksicitātes pārbaudi pēc perorālas aplikācijas veic pirms ilglaicīgas pārbaudes, abos pētījumos jāizmanto tās pašas sugas un līnijas dzīvnieki. Dzīvnieku skaits un dzimums Vienu un to pašu devu ievada vismaz 20 (10 sieviešu un 10 vīriešu kārtas) dzīvniekiem. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Ja dzīvnieku nonāvēšana paredzēta arī izmēģinājuma laikā, to skaits ir jāpalielina par to dzīvnieku skaitu, kuri tiks nokauti izmēģinājuma gaitā. Bez tam var izveidot papildu grupu no 20 dzīvniekiem (pa 10 no katra dzimuma), kas 90 dienas saņem lielāko devu, un pēc aplikācijas 28 dienu laikā novēro, vai toksiskā iedarbība ir atgriezeniska, noturīga vai novēlota. Izmantotās devas Jāizmanto vismaz trīs dažādas devas, un jābūt kontroles grupai. Ar kontroles grupas dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat, kā ar pārējiem dzīvniekiem, bet tie nesaņem pārbaudāmo vielu. Ja izmanto šķīdinātāju, lai atvieglotu pārbaudāmās vielas ievadīšanu vajadzīgajā devā, kontroles dzīvnieki saņem tādu pašu daudzumu šķīdinātāja kā dzīvnieki, kas saņem lielāko vielas devu. Jāizvēlas tāda lielākā deva, kas ir toksiska, bet kas neizraisa vai gandrīz neizraisa dzīvnieku nāvi. Viela vismazākajā devā nedrīkst būt toksiska. Ja ir pieejami aptuveni dati par to, ar kādām devām saskaras cilvēki, vismazākajai devai jābūt lielākai par tām. Būtu vēlams, ka vidēji lielās devas toksiskums izpaužas minimāli. Ja izmanto vairākas vidējā intervāla devas, to toksiskajai iedarbībai jābūt manāmi atšķirīgai. Dzīvnieku grupās, kas saņem mazo un vidēji lielo devu, jābūt zemam mirstības līmenim, lai varētu statistiski novērtēt rezultātus. Ja pārbaudāmo vielu pievieno barībai, vielas koncentrācijai barībā (ppm vai mg/kg barības) jābūt nemainīgai vai jāizmanto deva, kas ir nemainīga attiecībā pret dzīvnieku ķermeņa svaru; jebkura atkāpe no šīs shēmas ir jāpamato. Ja vielu ievada ar zondes palīdzību, to katru dienu ievada vienādā laikā. Izmantotās devas ir jākoriģē pēc noteikta laika posma (ik pēc nedēļas vai ik pēc divām nedēļām), lai tās būtu nemainīgas attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru. Iedarbīguma robežas noteikšana Ja 90 dienu ilgajā testā, ko veic pēc tālāk aplūkotās metodes, izmanto vienu devu, kas ir 1000 mg/kg ķermeņa svara dienā vai pat lielāka, un tā atbilst devai, ar kādu parasti saskaras cilvēki (ja tāda deva ir zināma), un vielai šajā devā nav novērota toksiska iedarbība, var uzskatīt, ka tālāka testēšana nav nepieciešama. Ja maztoksiskas vielas pievieno barībai, ir svarīgi pārliecināties, ka pārbaudāmās vielas daudzums vai citas tās īpašības neiespaido ierasto uztura režīmu. Novērošanas periods Dzīvniekus novēro katru dienu, reģistrējot toksiskuma pazīmes, kā arī to parādīšanās brīdi, pakāpi un ilgumu. Jāreģistrē nāves iestāšanās brīdis, kā arī laiks, kad parādās vai izzūd toksiskuma pazīmes. Testa norise Dzīvnieki parasti saņem pārbaudāmo vielu 7 dienas nedēļā 90 dienu laikā. Dzīvnieki papildu grupās, kas paredzētas tālākai novērošanai, turpmākās 28 dienas nesaņem pārbaudāmo vielu, lai varētu izsekot, kā tie atveseļojas un cik ilgi saglabājas toksiskā iedarbība. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar to ādu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Katru nedēļu jānosaka barības patēriņš (un ūdens patēriņš, ja pārbaudāmo vielu pievieno dzeramajam ūdenim), un dzīvnieki katru nedēļu jānosver. Pastāvīga dzīvnieku novērošana ļauj iespēju robežās samazināt izmēģinājumu dzīvnieku bojāeju kanibālisma, audu autolīzes vai nepareizu turēšanas apstākļu dēļ. Beidzoties izmēģinājumam, visus izdzīvojušos dzīvniekus, izņemot papildu grupas dzīvniekus, secē. Pamanot mirstošus dzīvniekus, tos uzreiz nošķir no pārējiem un secē. Visus dzīvniekus, tostarp arī kontroles dzīvniekus, parasti pakļauj šādām pārbaudēm: a) Pirms pārbaudāmās vielas aplikācijas un izmēģinājuma beigās jāveic ja ne visu dzīvnieku, tad vismaz to, kas saņēmuši lielāko devu, un kontroles dzīvnieku oftalmoloģiskā izmeklēšana, izmantojot oftalmoskopu vai piemērotu līdzvērtīgu aparātu. Ja novēro izmaiņas acīs, jāpārbauda visi dzīvnieki. b) Beidzoties izmēģinājumam, jāveic hematoloģiskā izmeklēšana, ieskaitot hematokrīta, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaita, leikocītu skaita un leikocītu formulas, kā arī asins recēšanas spēju, piemēram, recēšanas laika, protrombīna laika, tromboplastīna laika vai trombocītu skaita noteikšanu. c) Beidzoties izmēģinājumam, jāveic arī asins klīniskās bioķīmijas izmeklējumi. Šie izmeklējumi visos gadījumos attiecas uz elektrolītu sastāvu, ogļhidrātu metabolismu, aknu un nieru darbību. Atsevišķu analīžu izvēle ir atkarīga no konkrētās vielas iedarbības veida. Ieteiktās analīzes ietver kalcija, fosfora, hlorīdu, nātrija, kālija, glikozes pēc badošanās (badošanās ilgums ir atkarīgs no dzīvnieku sugas), seruma glutamātpiruvāttransamināzes [2], seruma glutamātoksalacetāttransamināzes [3], ornitīndekarboksilāzes, gamma-glutamiltranspeptidāzes, urīnvielas slāpekļa, albumīna, plazmas kreatinīna, kopējā bilirubīna un seruma olbaltumvielu noteikšanu. Citas analīzes, kas jāveic, lai gūtu vispusīgu toksikoloģisko novērtējumu, paredz lipīdu, hormonu, skābju/bāzu līdzsvara, methemoglobīna un holīnesterāzes aktivitātes noteikšanu. Vajadzības gadījumā var veikt arī citas klīniskās bioķīmijas analīzes, lai padziļināti izpētītu vielas iedarbību. d) Urīnanalīze parasti nav jāveic, ja vien nepastāv varbūtība, ka viela var būt toksiska, vai to apstiprina novērojumi. Ja agrāk iegūtie dati ir nepietiekami, pirms uzsākt izmēģinājumu, jāapsver iespēja noteikt hematoloģiskos un klīniskās bioķīmijas rādītājus. Autopsija Visiem dzīvniekiem veic pilnu autopsiju, kas paredz ķermeņa ārējās virsmas, visu atveru, kā arī galvaskausa, krūškurvja un vēdera dobuma un to satura apskati. Aknas, nieres, virsnieru dziedzerus un sēkliniekus nosver uzreiz pēc sekcijas, kamēr tie ir mitri un nesažuvuši. Piemērotā vidē jāsaglabā šādi orgāni un audi, lai turpmāk būtu iespējama to histopatoloģiskā izmeklēšana: visi orgāni ar makroskopiskiem bojājumiem, smadzenes, ieskaitot iegarenās smadzenes/tiltu, smadzenīšu garozu un smadzeņu garozu, hipofīze, vairogdziedzeris/epitēlijķermenīši, aizkrūts dziedzera audi, traheja un plaušas, sirds, aorta (siekalu dziedzeri), aknas, liesa, nieres, virsnieru dziedzeri, aizkuņģa dziedzeris, gonādas, dzemde (papildu dzimumorgāni), (āda), barības vads, kuņģis, divpadsmitpirkstu zarna, tukšā zarna, līkumainā zarna, aklā zarna, lokzarna, taisnā zarna, urīnpūslis, limfmezglu paraugi, (sievišķais piena dziedzeris), (augšstilba muskulatūra), perifērās nervu sistēmas nervi, krūškauls ar kaula smadzenēm, (acis), (augšstilba kauls ar locītavas virsmu), (triju līmeņu muguras smadzenes – no kakla, vidējā torakālā un gurnu rajona) un (ārpusorbītas asaru dziedzeri). Iekavās iekļautie audi jāpārbauda tikai tad, ja novēro toksiskuma pazīmes vai viela iedarbojas tieši uz šo orgānu. Histopatoloģiskā izmeklēšana a) Vispusīga orgānu un audu histopatoloģiskā izmeklēšana veicama visiem kontroles dzīvniekiem un dzīvniekiem, kas saņēmuši lielāko vielas devu. b) Jāizpēta visi orgāni ar makroskopiskiem bojājumiem. c) Iedarbības skartie orgāni jāizmeklē arī pārējās dzīvnieku grupās. d) Histopatoloģiski jāizmeklē infekcijas klātbūtne plaušās dzīvniekiem, kam ievadīta mazā un vidēji lielā deva, jo šādi var ērti novērtēt dzīvnieku veselības stāvokli. Tāpat jāapsver, vai būtu histopatoloģiski jāizmeklē aknas un nieres šo grupu dzīvniekiem. Turpmākā histopatoloģiskā izmeklēšana šo grupu dzīvniekiem parasti nav jāveic, bet to obligāti veic dzīvniekiem, kam ievadīta lielā deva, un tā skar orgānus, kuros novēroti bojājumi. e) Ja izmanto papildu grupu, histopatoloģiski jāizmeklē audi un orgāni, uz kuriem iedarbojas pārbaudāmā viela apstrādāto dzīvnieku grupās. 2. IEGŪTIE DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot dzīvnieku skaitu katrā izmēģinājumu grupā testa sākumā, to dzīvnieku skaitu, kam novēroti bojājumi, un dzīvnieku procentuālo īpatsvaru ar katra tipa bojājumiem. Iegūtie rezultāti jānovērtē, izmantojot piemērotu statistikas metodi. Var izmantot jebkuru atzītu statistikas metodi. 3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA 3.1. Testa ziņojums Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas: - dzīvnieku suga, līnija, izcelsme, turēšanas apstākļi, uzturs, - testa apstākļi, - izmantotās devas (jānorāda arī šķīdinātājs, ja tādu izmanto) un koncentrācijas, - toksiskās reakcijas atkarībā no dzimuma un devas, - netoksiska deva, ja var noteikt, - nāves iestāšanās brīdis izmēģinājuma laikā vai norāde, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši, - toksiskās iedarbības vai citas iedarbības raksturojums, - saindēšanās simptomu parādīšanās brīdis un to tālākā attīstība, - dati par barības patēriņu un ķermeņa svaru, - oftalmoloģijas dati, - hematoloģiskie izmeklējumi un to rezultāti, - klīniskās bioķīmijas izmeklējumi un iegūtie dati (arī urīnanalīzes rezultāti, ja tādi ir), - autopsijas rezultāti, - sīks histopatoloģisko izmeklējumu apraksts, - rezultātu statistiskā apstrāde, ja iespējams, - rezultātu iztirzājums, - rezultātu interpretācija. 3.2. Izvērtējums un interpretācija Skat. vispārīgā ievada B daļu. 4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skat. vispārīgā ievada B daļu. SUBHRONISKĀS TOKSICITĀTES NOTEIKŠANA PĒC PERORĀLAS APLIKĀCIJAS ATKĀRTOTA PERORĀLA APLIKĀCIJA DZĪVNIEKIEM, KAS NEPIEDER PIE GRAUZĒJU SUGĀM (90 DIENAS) 1. METODE 1.1. Ievads Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.3. Standartvielas Nav. 1.4. Metodes būtība Pārbaudāmo vielu dažādās devās katru dienu 90 dienu laikā perorāli ievada izmēģinājumu dzīvniekiem (kas nepieder pie grauzējiem), kas sadalīti vairākās grupās, un vienas grupas dzīvnieki saņem vienādu devu. Ekspozīcijas laikā dzīvniekus katru dienu novēro un reģistrē toksiskuma pazīmes. Dzīvniekus, kas miruši izmēģinājuma laikā, secē un, beidzoties izmēģinājumam, secē arī izdzīvojušos dzīvniekus. 1.5. Kvalitātes kritēriji Nav. 1.6. Metodes apraksts Sagatavošanas darbi Vismaz piecas dienas pirms izmēģinājuma dzīvniekus pieradina pie dzīvošanas un barošanas apstākļiem, kādi būs izmēģinājuma laikā. Veselus un jaunus dzīvniekus pirms izmēģinājuma pēc nejaušības principa sadala apstrādes un kontroles grupās. Pārbaudāmo vielu var pievienot uzturam vai ievadīt kapsulās, ja tā ir ērtāk. Var izmantot arī citus perorālas aplikācijas veidus. Visu izmēģinājuma laiku pārbaudāmā viela dzīvniekiem jāsaņem pēc vienādas shēmas. Ja izmanto šķīdinātāju vai citas piedevas, kas atvieglo pārbaudāmās vielas ievadīšanu vajadzīgajā devā, ir jāpārliecinās, ka tām nepiemīt toksiska iedarbība. Vajadzības gadījumā var izmantot agrāk iegūtus datus. Testa apstākļi Izmēģinājumu dzīvnieki Visplašāk izmantotie dzīvnieki, kas nepieder pie grauzējiem, ir suņi; ieteicams izmantot noteiktas šķirnes suņus. Šim nolūkam der arī citu sugu dzīvnieki, kas nav grauzēji. Jāizmanto jauni un veseli dzīvnieki, un, ja tie ir suņi, vispiemērotākais vecums ir no 4 līdz 6 mēnešiem, bet ne lielāks par 9 mēnešiem. Ja subhroniskās toksicitātes testu pēc perorālas aplikācijas veic pirms ilglaicīgā testa, abos pētījumos jāizmanto tās pašas sugas/šķirnes dzīvnieki. Dzīvnieku skaits un dzimums Vienu un to pašu vielas devu ievada vismaz 8 (4 sieviešu un 4 vīriešu kārtas) dzīvniekiem. Dzīvnieku skaitam izmēģinājuma beigās jābūt pietiekami lielam, lai varētu statistiski izvērtēt toksiskās iedarbības rezultātus. Izmantotās devas Jāizmanto vismaz trīs dažādas devas, un jābūt kontroles grupai. Ar kontroles grupas dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat, kā ar pārējiem dzīvniekiem, tie tikai nesaņem pārbaudāmo vielu. Jāizvēlas tāda lielākā deva, kas ir toksiska, bet kas neizraisa dzīvnieku nāvi. Vielas mazākā deva nedrīkst būt toksiska. Ja ir pieejami aptuveni dati par to, ar kādām devām saskaras cilvēki, vismazākajai devai jābūt lielākai par tām. Būtu vēlams, ka vidēji lielās devas toksiskums izpaužas minimāli. Ja izmanto vairākas vidējā intervāla devas, to toksiskajai iedarbībai jābūt manāmi atšķirīgai. Grupās, kurās dzīvniekiem ievadīta mazā un vidēji lielā deva, arī nedrīkst būt nāves gadījumu. Ja maztoksiskas vielas pievieno uzturam, ir svarīgi pārliecināties, ka pārbaudāmās vielas daudzums neiespaido ierasto uztura režīmu. Ja pārbaudāmo vielu pievieno uzturam, vielas koncentrācijai barībā (ppm vai mg/kg barības) jābūt nemainīgai vai jāizmanto deva, kas ir nemainīga attiecībā pret dzīvnieku ķermeņa svaru; jebkura atkāpe no šīs shēmas ir jāpamato. Ja vielu ievada tiešā veidā, piem., kapsulā, to katru dienu ievada tajā pašā laikā, vajadzības gadījumā ik pēc nedēļas pielāgojot devu, lai tā būtu nemainīga attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa svaru. Ja subhroniskās toksicitātes testu veic pirms ilglaicīga testa, parasti abos pētījumos jānodrošina līdzīgs uzturs. Iedarbīguma robežas noteikšana Ja 90 dienu ilgajā pārbaudē, ko veic pēc turpmāk aplūkotās metodes, izmanto vienu devu, kas ir 1000 mg/kg ķermeņa svara dienā vai pat lielāka, un tā atbilst devai, ar kādu parasti saskaras cilvēki (ja tāda deva ir zināma), un vielai šajā devā nav novērota toksiska iedarbība, var uzskatīt, ka turpmāka testēšana nav nepieciešama. Ja maztoksiskas vielas pievieno barībai, ir svarīgi pārliecināties, ka pārbaudāmās vielas daudzums vai citas tās īpašības neiespaido ierasto uztura režīmu. Novērošanas periods Dzīvniekus novēro katru dienu, reģistrējot toksiskuma pazīmes, kā arī to parādīšanās brīdi, pakāpi un ilgumu. Jāreģistrē nāves iestāšanās brīdis, kā arī laiks, kad parādās vai izzūd toksiskuma pazīmes. Testa norise Dzīvnieki parasti saņem pārbaudāmo vielu 7 dienas nedēļā 90 dienu laikā. Tomēr, galvenokārt aiz praktiskiem apsvērumiem, ja vielu nepievieno uzturam, uzskata, ka ir pieļaujama tās ievadīšana piecas dienas nedēļā. Novērojot dzīvniekus, galvenā uzmanība jāpievērš izmaiņām, kas skar ādu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku, uzvedības reakcijas. Katru nedēļu jānosaka barības patēriņš (un ūdens patēriņš, ja pārbaudāmo vielu pievieno dzeramajam ūdenim), un dzīvnieki katru nedēļu jānosver. Katru dienu dzīvniekus pakļauj rūpīgai klīniskajai pārbaudei un gādā par to, lai samazinātu dzīvnieku zudumus izmēģinājuma laikā. Beidzoties ekspozīcijas laikam, visus izdzīvojušos dzīvniekus secē. Pamanot mirstošus dzīvniekus, tos uzreiz nošķir no pārējiem un secē. Visus dzīvniekus, tostarp arī kontroles dzīvniekus, parasti pakļauj šādām pārbaudēm: a) Pirms pārbaudāmās vielas aplikācijas un izmēģinājuma beigās jāveic ja ne visu dzīvnieku, tad vismaz to, kas ir saņēmuši lielāko devu, un kontroles dzīvnieku oftalmoloģiskā izmeklēšana, izmantojot oftalmoskopu vai piemērotu līdzvērtīgu aparātu. Ja novēro izmaiņas acīs, ir jāpārbauda visi dzīvnieki. b) Izmēģinājuma sākumā un pēc tam ik pēc mēneša vai izmēģinājuma vidū un visbeidzot izmēģinājuma beigās jāveic hematoloģiskā izmeklēšana, kas ietver hematokrīta, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaita, leikocītu skaita un leikocītu formulas, kā arī asins recēšanas spēju, piemēram, recēšanas laika, protrombīna laika, tromboplastīna laika vai trombocītu skaita noteikšanu. c) Asins klīniskās bioķīmijas izmeklējumi jāveic izmēģinājuma sākumā, pēc tam ik pēc mēneša vai izmēģinājuma vidū un visbeidzot izmēģinājuma beigās. Šie izmeklējumi visos gadījumos attiecas uz elektrolītu sastāvu, ogļhidrātu metabolismu, aknu un nieru darbību. Atsevišķu analīžu izvēle ir atkarīga no konkrētās vielas iedarbības veida. Ieteiktās analīzes ietver kalcija, fosfora, hlorīdu, nātrija, kālija, glikozes pēc badošanās (badošanās ilgums ir atkarīgs no dzīvnieku sugas/šķirnes), seruma glutamātpiruvāttransamināzes [4], seruma glutamātoksalacetāttransamināzes [5], ornitīndekarboksilāzes, gamma-glutamiltranspeptidāzes, urīnvielas slā pekļa, albumīna, plazmas kreatinīna, kopējā bilirubīna un seruma olbaltumvielu noteikšanu. Citas analīzes, kas jāveic, lai gūtu vispusīgu toksikoloģisko novērtējumu, paredz lipīdu, hormonu, skābju/bāzu līdzsvara, methemoglobīna un holīnesterāzes aktivitātes noteikšanu. Vajadzības gadījumā var veikt arī citas klīniskās bioķīmijas analīzes, lai padziļināti izpētītu vielas iedarbību. Pirms asins paraugu ņemšanas dzīvniekiem, ja tie nav grauzēji, kādu laiku (ne ilgāk kā 24 stundas) jābadojas. d) Urīnanalīze parasti nav jāveic, ja vien nepastāv varbūtība, ka viela var būt toksiska, vai to apstiprina novērojumi. Autopsija Visiem dzīvniekiem veic pilnu autopsiju, kas paredz ķermeņa ārējās virsmas, visu atveru, kā arī galvaskausa, krūškurvja un vēdera dobuma un to satura apskati. Aknas, nieres, virsnieru dziedzerus, vairogdziedzeri (kopā ar epitēlijķermenīšiem) un sēkliniekus nosver uzreiz pēc sekcijas, kamēr tie ir mitri un nesažuvuši. Piemērotā vidē jāsaglabā šādi orgāni un audi, lai turpmāk būtu iespējama to histopatoloģiskā izmeklēšana: visi orgāni ar makroskopiskiem bojājumiem, smadzenes, ieskaitot iegarenās smadzenes/tiltu, smadzenīšu garozu un smadzeņu garozu, hipofīze, vairogdziedzeris/epitēlijķermenīši, aizkrūts dziedzera audi, (traheja), plaušas, sirds, aorta, siekalu dziedzeri, aknas, liesa, nieres, virsnieru dziedzeri, aizkuņģa dziedzeris, gonādas, dzemde (papildu dzimumorgāni), (āda), žultspūslis, barības vads, kuņģis, divpadsmitpirkstu zarna, tukšā zarna, līkumainā zarna, aklā zarna, lokzarna, taisnā zarna, urīnpūslis, limfmezglu paraugi, (sievišķais piena dziedzeris), (augšstilba muskulatūra), perifērās nervu sistēmas nervi, (acis), krūškauls ar kaula smadzenēm, (augšstilba kauls ar locītavas virsmu) un (triju līmeņu muguras smadzenes – no kakla, vidējā torakālā un gurnu rajona). Iekavās iekļautie audi jāpārbauda tikai tad, ja novēro toksiskuma pazīmes vai viela iedarbojas tieši uz šo orgānu. Histopatoloģiskā izmeklēšana Vispusīga orgānu un audu histopatoloģiskā izmeklēšana veicama visiem kontroles dzīvniekiem un dzīvniekiem, kam ievadīta lielākā deva. Turpmāka histopatoloģiskā izmeklēšana citās dzīvnieku grupās skar orgānus, kuros novēroti bojājumi pēc lielās devas ievadīšanas, vai ja uz tādu vajadzību norāda klīniskie novērojumi. 2. IEGŪTIE DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot dzīvnieku skaitu katrā izmēģinājuma grupā testa sākumā, to dzīvnieku skaitu, kam novēroti bojājumi, bojājumu tipus un dzīvnieku procentuālo īpatsvaru ar katru bojājuma tipu. Iegūtie rezultāti jānovērtē, izmantojot piemērotu statistikas metodi. Var izmantot jebkuru atzītu statistikas metodi. 3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA 3.1. Testa ziņojums Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas: - dzīvnieku suga, šķirne vai līnija, izcelsme, turēšanas apstākļi, uzturs, - testa apstākļi, - izmantotās devas (jānorāda arī šķīdinātājs, ja tādu izmanto) un koncentrācijas, - toksiskās reakcijas atkarībā no dzimuma un devas, - netoksiska deva, ja var noteikt, - nāves iestāšanās brīdis izmēģinājuma laikā vai norāde, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši, - toksiskās iedarbības vai citas iedarbības raksturojums (īpaši ņem vērā klīnisko izmeklējumu rezultātus), - atsevišķu saindēšanās simptomu parādīšanās brīdis un to tālākā attīstība, - barības patēriņš un ķermeņa svara izmaiņas, - oftalmoloģijas dati, - hematoloģiskie izmeklējumi un to rezultāti, - klīniskās bioķīmijas izmeklējumi un to rezultāti (arī urīnanalīzes rezultāti, ja tādi ir), - autopsijas rezultāti, - sīks histopatoloģisko izmeklējumu apraksts, - rezultātu statistiskā izvērtēšana, ja iespējams, - rezultātu iztirzājums, - rezultātu interpretācija. 3.2. Izvērtējums un interpretācija Skat. vispārīgā ievada B daļu. 4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skat. vispārīgā ievada B daļu. SUBHRONISKĀS TOKSICITĀTES NOTEIKŠANA PĒC ĀRĪGAS APLIKĀCIJAS ATKĀRTOTA ĀRĪGA APLIKĀCIJA GRAUZĒJIEM (90 DIENAS) 1. METODE 1.1. Ievads Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.3. Standartvielas Nav. 1.4. Metodes būtība Pārbaudāmo vielu dažādās devās katru dienu 90 dienu laikā uztriepj uz ādas izmēģinājumu dzīvniekiem, kas sadalīti vairākās grupās, un vienas grupas dzīvnieki saņem vienādu devu. Aplikācijas laikā dzīvniekus katru dienu novēro un reģistrē toksiskuma pazīmes. Dzīvniekus, kas miruši izmēģinājuma laikā, secē un, beidzoties izmēģinājumam, secē arī izdzīvojušos dzīvniekus. 1.5. Kvalitātes kritēriji Nav. 1.6. Metodes apraksts Sagatavošanas darbi Vismaz piecas dienas pirms izmēģinājuma dzīvniekus pieradina pie dzīvošanas un barošanas apstākļiem, kādi būs izmēģinājuma laikā. Veselus, jaunus dzīvniekus pirms izmēģinājuma pēc nejaušības principa sadala apstrādes un kontroles grupās. Neilgi pirms izmēģinājuma dzīvniekiem uz muguras nocērp apmatojumu. Ādu var arī noskūt, bet tas jādara 24 stundas pirms izmēģinājuma. Parasti ik pēc nedēļas cirpšanu vai skūšanu atkārto. Cērpot vai skujot apmatojumu, jāuzmanās, lai nenobrāztu ādu. Pārbaudāmās vielas aplikācijai jāsagatavo ne mazāk kā 10 % no ķermeņa virsmas. Lemjot par to, cik lielai ādas virsmai jābūt brīvai no apmatojuma, lai to apstrādātu ar vielu, ņem vērā dzīvnieku svaru. Pārbaudot cietas vielas, kuras vajadzības gadījumā var saberzt pulverī, pārbaudāmā viela jāsamitrina ar pietiekamu daudzumu ūdens vai, ja nepieciešams, ar piemērotu šķīdinātāju, lai tai būtu laba saskare ar ādu. Šķidrumus parasti pārbauda neatšķaidītā vaidā. Parasti aplikāciju veic vienreiz dienā 5 līdz 7 dienas nedēļā. Testa apstākļi Izmēģinājumu dzīvnieki Var izmantot pieaugušas žurkas, trušus vai jūrascūciņas. Var izmantot arī citas sugas dzīvniekus, bet tad šī izvēle ir jāpamato. Uzsākot izmēģinājumu, svara svārstību diapazonam jābūt ± 20 % no vidējā svara. Ja subhroniskās toksicitātes testu, izmantojot ārīgu aplikāciju, veic pirms ilglaicīga testa, abos pētījumos jāizmanto tās pašas sugas un līnijas dzīvnieki. Dzīvnieku skaits un dzimums Vienu un to pašu devu izmēģina vismaz uz 20 (10 sieviešu un 10 vīriešu kārtas) dzīvniekiem ar veselu ādu. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Ja dzīvnieku nonāvēšana paredzēta arī izmēģinājuma laikā, to skaits ir jāpalielina par to dzīvnieku skaitu, kuri tiks nokauti izmēģinājuma gaitā. Bez tam var izveidot papildu grupu no 20 dzīvniekiem (pa 10 no katra dzimuma), kas 90 dienas saņem lielāko devu, un 28 dienu laikā pēc aplikācijas novēro, vai toksiskie simptomi ir atgriezeniski, noturīgi vai novēloti. Izmantotās devas Jāizmanto vismaz trīs dažādas devas, kā arī jābūt kontroles grupai un, ja lieto šķīdinātāju, jābūt vēl vienai kontroles grupai, kurā dzīvnieki saņem tikai šķīdinātāju. Ekspozīcijas laiks ir vismaz 6 stundas dienā. Pārbaudāmās vielas aplikāciju katru dienu veic vienādā laikā, un vajadzīgais vielas daudzums ik pa laikam jāpielāgo (ik pēc nedēļas vai divām nedēļām), lai tās deva būtu nemainīga attiecībā pret dzīvnieku ķermeņa svaru. Ar kontroles grupas dzīvniekiem rīkojas tieši tāpat, kā ar pārējiem dzīvniekiem, tie tikai nesaņem pārbaudāmo vielu. Ja izmanto šķīdinātāju, kas atvieglo pārbaudāmās vielas ievadīšanu vajadzīgajā devā, kontroles dzīvnieki saņem tādu pašu daudzumu šķīdinātāja, kā dzīvnieki, kas saņem lielāko vielas devu. Jāizvēlas tāda lielākā deva, kas ir toksiska, bet kas neizraisa vai reti izraisa dzīvnieku nāvi. Vielas mazākā deva nedrīkst būt toksiska. Ja ir pieejami aptuveni dati par to, ar kādām devām saskaras cilvēki, vismazākajai devai jābūt lielākai par tām. Būtu vēlams, ka vidēji lielās devas toksiskums izpaužas minimāli. Ja izmanto vairākas vidējā intervāla devas, to toksiskajai iedarbībai jābūt manāmi atšķirīgai. To dzīvnieku grupās, kas saņem mazo un vidēji lielo devu, jābūt zemam mirstības līmenim, lai varētu statistiski izvērtēt rezultātus. Ja pārbaudāmās vielas aplikācija izraisa smagu ādas iekaisumu, tās koncentrācija jāsamazina, un tādēļ var samazināties vai neizpausties citi toksicitātes simptomi, lietojot lielo devu. Ja ādai ir nopietni bojājumi, var gadīties, ka izmēģinājums ir jāpārtrauc, un jauna pārbaude jāveic ar mazāku koncentrāciju. Iedarbīguma robežas noteikšana Ja sākotnējā pārbaudē izmanto 1000 mg/kg devu vai pat lielāku devu, kas atbilst devai, ar kādu parasti saskaras cilvēki (ja tā ir zināma), un tai nenovēro toksisku iedarbību, var uzskatīt, ka turpmāka testēšana nav nepieciešama. Novērošanas periods Izmēģinājumu dzīvniekiem katru dienu pārbauda toksiskuma pazīmes. Tiem reģistrē nāves iestāšanās brīdi, kā arī laiku, kad parādās vai izzūd toksiskuma pazīmes. Testa norise Katru dzīvnieku tur atsevišķā būrī. Dzīvniekus parasti apstrādā ar pārbaudāmo vielu 7 dienas nedēļā 90 dienu laikā. Dzīvnieki papildu grupās, kas paredzētas tālākai novērošanai, turpmākās 28 dienas nesaņem pārbaudāmo vielu, lai varētu izsekot, kā tie atveseļojas un cik ilgi saglabājas toksiskā iedarbība. Ekspozīcijas ilgums ir vismaz 6 stundas dienā. Pārbaudāmā viela vienmērīgi jāuztriepj uz ādas virsmas, kas veido aptuveni 10 % no kopējās ķermeņa virsmas. Ja vielas ir ļoti toksiskas, apstrādājamo ādas virsmu var samazināt, bet tai vienalga jābūt pēc iespējas lielākai, un viela jāuztriepj cik iespējams plānāk un vienmērīgāk. Pārbaudāmās vielas saskari ar ādu ekspozīcijas laikā nodrošina ar poraina marles pārsēja un nekairinoša plākstera palīdzību. Apstrādātā vieta vēl papildus pienācīgi jāpārklāj, lai nostiprinātu marles pārsēju ar pārbaudāmo vielu un lai dzīvnieki nevarētu norīt pārbaudāmo vielu. Lai pārbaudāmā viela nenonāktu barības vadā, var daļēji ierobežot dzīvnieku kustību, taču pilnīga imobilizācija nebūtu vēlama. Beidzoties ekspozīcijas laikam, pārbaudāmās vielas atlikums no ādas jānoņem, ja iespējams, izmantojot ūdeni vai citu piemērotu ādas mazgāšanas līdzekli. Dzīvniekus katru dienu novēro, reģistrējot toksiskuma pazīmes, kā arī to parādīšanās brīdi, pakāpi un ilgumu. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar ādu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas Katru nedēļu jānosaka barības patēriņš, un katru nedēļu dzīvnieki jānosver. Pastāvīga dzīvnieku novērošana ļauj novērst dzīvnieku zudumus izmēģinājuma laikā kanibālisma, audu autolīzes vai nepareizu turēšanas apstākļu dēļ. Beidzoties izmēģinājumam, visus izdzīvojušos dzīvniekus, izņemot papildu grupas dzīvniekus, secē. Pamanot mirstošus dzīvniekus, tos uzreiz nošķir no pārējiem un secē. Visus dzīvniekus, tostarp arī kontroles dzīvniekus, parasti pakļauj šādām pārbaudēm: a) Pirms pārbaudāmās vielas aplikācijas un testa beigās jāveic ja ne visu dzīvnieku, tad vismaz to, kas ir saņēmuši lielāko devu, un kontroles dzīvnieku oftalmoloģiskā izmeklēšana, izmantojot oftalmoskopu vai piemērotu līdzvērtīgu aparātu. Ja novēro izmaiņas acīs, ir jāpārbauda visi dzīvnieki. b) Beidzoties izmēģinājumam, jāveic hematoloģiskā izmeklēšana, kas ietver hematokrīta, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaita, leikocītu skaita un leikocītu formulas, kā arī asins recēšanas spēju, piemēram, recēšanas laika, protrombīna laika, tromboplastīna laika vai trombocītu skaita noteikšanu. c) Beidzoties izmēģinājumam, jāveic arī asins klīniskās bioķīmijas izmeklējumi. Šie izmeklējumi visos gadījumos attiecas uz elektrolītu sastāvu, ogļhidrātu metabolismu, aknu un nieru darbību. Atsevišķu analīžu izvēle ir atkarīga no konkrētās vielas iedarbības veida. Ieteiktās analīzes ietver kalcija, fosfora, hlorīdu, nātrija, kālija, glikozes pēc badošanās (badošanās ilgums ir atkarīgs no dzīvnieku sugas), seruma glutamātpiruvāttransamināzes [6], seruma glutamātoksalacetāttransamināzes [7], ornitīndekarboksilāzes, gamma-glutamiltranspeptidāzes, urīnvielas slāpekļa, albumīna, plazmas kreatinīna, kopējā bilirubīna un kopējo seruma olbaltumvielu noteikšanu. Citas analīzes, kas jāveic, lai gūtu vispusīgu toksikoloģisko novērtējumu, paredz lipīdu, hormonu, skābju/bāzu līdzsvara, methemoglobīna un holīnesterāzes aktivitātes noteikšanu. Vajadzības gadījumā var veikt arī citus klīniskās bioķīmijas izmeklējumus, lai padziļināti izpētītu vielas iedarbību. d) Urīnanalīze parasti nav jāveic, ja vien nepastāv varbūtība, ka viela var būt toksiska, vai to apstiprina novērojumi. Ja agrāk iegūtie dati ir nepietiekami, pirms uzsākt izmēģinājumu, jāapsver iespēja jau iepriekš noteikt hematoloģiskos un klīniskās bioķīmijas rādītājus. Autopsija Visiem dzīvniekiem veic pilnu autopsiju, kas paredz ķermeņa ārējās virsmas, visu atveru, kā arī galvaskausa, krūškurvja un vēdera dobuma un to satura apskati. Aknas, nieres, virsnieru dziedzerus un sēkliniekus nosver uzreiz pēc sekcijas, kamēr tie ir mitri un nesažuvuši. Piemērotā vidē jāsaglabā šādi orgāni un audi, lai turpmāk būtu iespējama to histopatoloģiskā izmeklēšana: visi orgāni ar makroskopiskiem bojājumiem, smadzenes, ieskaitot iegarenās smadzenes/tiltu, smadzenīšu garozu un smadzeņu garozu, hipofīze, vairogdziedzeris/epitēlijķermenīši, aizkrūts dziedzera audi, (traheja), plaušas, sirds, aorta, siekalu dziedzeri, aknas, liesa, nieres, virsnieru dziedzeri, aizkuņģa dziedzeris, gonādas, dzemde, papildu dzimumorgāni, žultspūslis (ja ir), barības vads, kuņģis, divpadsmitpirkstu zarna, tukšā zarna, līkumainā zarna, aklā zarna, lokzarna, taisnā zarna, urīnpūslis, limfmezglu paraugi, (sievišķais piena dziedzeris), (augšstilba muskulatūra), perifērās nervu sistēmas nervi, (acis), (krūšu kauls ar kaula smadzenēm), (augšstilba kauls ar locītavas virsmu), (triju līmeņu muguras smadzenes – no kakla, vidējā torakālā un gurnu rajona) un (ārpusorbītas asaru dziedzeri). Iekavās iekļautie audi jāpārbauda tikai tad, ja novēro toksiskuma pazīmes vai viela iedarbojas tieši uz šo orgānu. Histopatoloģiskā izmeklēšana a) Vispusīgu normālas un apstrādātas ādas, orgānu un audu histopatoloģisko izmeklēšanu veic visiem kontroles dzīvniekiem un dzīvniekiem, kas ir saņēmuši lielāko devu. b) Jāizpēta visi orgāni ar makroskopiskiem bojājumiem. c) Jāizpēta iedarbības skartie orgāni arī pārējās dzīvnieku grupās. d) Ja izmanto žurkas, histopatoloģiski jāizmeklē infekcijas klātbūtne dzīvnieku plaušās pēc mazās un vidēji lielās devas aplikācijas, jo šādi var ērti novērtēt dzīvnieku veselības stāvokli. Turpmāko histopatoloģisko izmeklēšanu šajās dzīvnieku grupās parasti neveic, bet to obligāti veic dzīvniekiem pēc lielās devas aplikācijas, un tā attiecas uz orgāniem, kuriem ir novēroti bojājumi. e) Ja izmanto papildu grupu, histopatoloģiski jāizmeklē audi un orgāni, uz kuriem iedarbojas pārbaudāmā viela pēc aplikācijas pārējās grupās. 2. IEGŪTIE DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot dzīvnieku skaitu katrā izmēģinājumu grupā testa sākumā, to dzīvnieku skaitu, kam novēroti bojājumi, bojājumu tipus un dzīvnieku procentuālo īpatsvaru ar katru bojājuma tipu. Iegūtie rezultāti jānovērtē, izmantojot piemērotu statistikas metodi. Var izmantot jebkuru atzītu statistikas metodi. 3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA 3.1. Testa ziņojums Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas: - dzīvnieku suga, līnija, izcelsme, turēšanas apstākļi, uzturs, - testa apstākļi, - izmantotās devas (jānorāda arī šķīdinātājs, ja tādu izmanto) un koncentrācijas, - toksiskās reakcijas atkarībā no dzimuma un devas, - netoksiska deva, ja var noteikt, - nāves iestāšanās brīdis izmēģinājuma laikā vai norāde, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši, - toksiskās iedarbības vai citas iedarbības raksturojums, - atsevišķu saindēšanās simptomu parādīšanās brīdis un to tālākā attīstība, - barības patēriņš un ķermeņa svara izmaiņas, - oftalmoloģijas dati, - hematoloģiskie izmeklējumi un to rezultāti, - klīniskās bioķīmijas izmeklējumi un to rezultāti (arī urīnanalīzes rezultāti, ja tādi ir), - autopsijas rezultāti, - sīks histopatoloģisko izmeklējumu apraksts, - rezultātu statistiskā apstrāde, ja iespējams, - rezultātu iztirzājums, - rezultātu interpretācija. 3.2. Izvērtējums un interpretācija Skat. vispārīgā ievada B daļu. 4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skat. vispārīgā ievada B daļu. SUBHRONISKĀS TOKSICITĀTES NOTEIKŠANA PĒC INHALĀCIJAS TOKSICITĀTES NOTEIKŠANA GRAUZĒJIEM PĒC ATKĀRTOTAS INHALĀCIJAS (90 DIENAS) 1. METODE 1.1. Ievads Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.3. Standartvielas Nav. 1.4. Metodes būtība Vairākas izmēģinājumu dzīvnieku grupas katru dienu noteiktā laika posmā pakļauj dažādu pārbaudāmās vielas koncentrāciju iedarbībai, kopumā 90 dienu garumā; vienas grupas dzīvnieki saņem vielu vienādā koncentrācijā. Ja lieto nesējvielu, kas palīdz iegūt vajadzīgu pārbaudāmās vielas koncentrāciju atmosfērā, jābūt kontroles grupai, kas saņem tikai nesējvielu. Ekspozīcijas laikā dzīvniekus katru dienu novēro un reģistrē toksiskuma pazīmes. Testa laikā mirušos dzīvniekus secē un, beidzoties testam, secē arī izdzīvojušos dzīvniekus. 1.5. Kvalitātes kritēriji Nav. 1.6. Metodes apraksts Sagatavošanas darbi Vismaz piecas dienas iepriekš dzīvniekus pieradina pie dzīvošanas un barošanas apstākļiem, kādi būs izmēģinājuma laikā. Veselus, jaunus dzīvniekus pirms izmēģinājuma pēc nejaušības principa sadala apstrādes un kontroles grupās. Ja nepieciešams, pārbaudāmajai vielai var pievienot piemērotu šķīdinātāju, kas palīdz iegūt atbilstošu vielas koncentrāciju atmosfērā. Ja izmanto šķīdinātāju vai citas piedevas, kas atvieglo pārbaudāmās vielas ievadīšanu vajadzīgajā devā, ir jāpārliecinās, ka tās nav toksiskas. Vajadzības gadījumā var izmantot agrāk iegūtus datus. Testa apstākļi Izmēģinājumu dzīvnieki Ja nav kontrindikāciju, vēlams izmantot žurkas. Jāizmanto jauni un veseli dzīvnieki, kas pieder pie plaši izplatītajām laboratorijas dzīvnieku līnijām. Uzsākot izmēģinājumus, dzīvnieku ķermeņa svara svārstību diapazons nedrīkst pārsniegt ± 20 % no vidējā svara. Ja subhroniskās toksicitātes testu pēc inhalācijas veic pirms ilglaicīga testa, abos pētījumos jāizmanto tās pašas sugas un līnijas dzīvnieki. Dzīvnieku skaits un dzimums Ekspozīcijas laikā vienu un to pašu devu saņem vismaz 20 dzīvnieki (10 mātītes un 10 tēviņi). Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Ja dzīvnieku nonāvēšana paredzēta arī izmēģinājuma laikā, to skaits ir jāpalielina par to dzīvnieku skaitu, kuri tiks nokauti izmēģinājumu gaitā. Bez tam var izveidot papildu grupu no 20 dzīvniekiem (pa 10 no katra dzimuma), kas 90 dienas saņem lielāko koncentrāciju, un 28 dienu laikā pēc inhalācijas novēro, vai toksiskā iedarbība ir atgriezeniska, noturīga vai novēlota. Koncentrācija ekspozīcijas laikā Jāizmanto vismaz trīs dažādas koncentrācijas, kā arī jābūt kontroles grupai, bet ja izmanto nesējvielu, jābūt arī kontroles dzīvniekiem, kas saņem tikai nesējvielu tās lielākajā koncentrācijā. Ar kontroles dzīvniekiem rīkojas tāpat kā ar pārējiem dzīvniekiem, tie tikai nesaņem pārbaudāmo vielu. Jāizvēlas tāda lielākā koncentrācija, kas ir toksiska, bet kas neizraisa vai reti izraisa dzīvnieku nāvi. Ja ir pieejami aptuveni dati par to, ar kādām devām saskaras cilvēki, vismazākajai devai jābūt lielākai par tām. Būtu vēlams, ka vidēji lielās koncentrācijas toksicitāte izpaužas minimāli. Ja izmanto vairākas vidējā intervāla koncentrācijas, to toksiskajai iedarbībai jābūt manāmi atšķirīgai. Dzīvnieku grupās, kas saņem mazo un vidēji lielo devu, jābūt zemam mirstības līmenim, lai varētu statistiski izvērtēt rezultātus. Ekspozīcijas ilgums Katru dienu ekspozīcijas ilgums pēc līdzsvara iestāšanās inhalācijas kamerā ir 6 stundas. Var būt arī cits ekspozīcijas ilgums atkarībā no konkrētām prasībām. Aprīkojums Izmēģinājumos ar dzīvniekiem izmanto inhalācijas iekārtas, kas nodrošina dinamisku gaisa plūsmu (vismaz 12 gaisa maiņas stundā), pietiekamu skābekļa koncentrāciju un vienmērīgu atmosfēru ekspozīcijas laikā. Ja izmanto inhalācijas kameru, tās konstrukcijai jābūt tādai, kas neļauj dzīvniekiem drūzmēties un maksimāli nodrošina pārbaudāmās vielas iedarbību ekspozīcijas laikā. Lai kamerā būtu noturīga atmosfēra, izmēģinājumu dzīvnieku kopējais “tilpums” parasti nedrīkst pārsniegt 5 % no kameras tilpuma. Var izmantot kameras, kas nodrošina dzīvnieku mutes un deguna, galvas vai visa ķermeņa saskari ar vielu; pirmajā un otrajā gadījumā samazinās iespēja uzņemt vielu citādā veidā, nevis ieelpojot. Novērošanas periods Visu ekspozīcijas un atveseļošanās laiku izmēģinājumu dzīvniekus katru dienu apskata un reģistrē toksiskuma pazīmes. Tiem reģistrē nāves iestāšanās brīdi, kā arī laiku, kad parādās vai izzūd toksiskuma pazīmes. Testa norise Dzīvniekus 90 dienu laikā katru dienu, 5-7 dienas nedēļā, pakļauj pārbaudāmās vielas iedarbībai. Dzīvnieki papildu grupās, kas paredzētas tālākai novērošanai, turpmākās 28 dienas nesaņem pārbaudāmo vielu, lai varētu izsekot, kā tie atveseļojas un cik ilgi saglabājas toksiskā iedarbība. Izmēģinājuma laikā jānodrošina 22 ± 3 oC temperatūra. Parasti jānodrošina 30-70 % relatīvais mitrums, lai gan atsevišķos gadījumos (piem., ja izmanto aerosolus) to nevar panākt. Ekspozīcijas laikā dzīvniekus nebaro un nedzirda. Jāizmanto dinamiskā inhalācijas sistēma, kas nodrošina pienācīgu koncentrācijas kontroli. Lai noteiktu vajadzīgo pārbaudāmās vielas koncentrāciju, iesaka veikt priekšizpēti. Gaisa plūsma jānoregulē tā, lai visā inhalācijas kamerā būtu nodrošināti vienādi apstākļi. Sistēmai pēc iespējas ātrāk jānodrošina nemainīgi ekspozīcijas apstākļi. Jāveic šādu parametru mērījumi un uzraudzība: a) gaisa plūsmas ātrums (nepārtraukti); b) pārbaudāmās vielas faktiskā koncentrācija inhalācijas zonā. Vielas koncentrācijas svārstības ekspozīcijas laikā nedrīkst pārsniegt ± 15 % no vidējās vērtības. Tomēr, ja izmanto putekļus un aerosolus, to nevar tik viegli panākt, un tad ir pieļaujams plašāks svārstību diapazons. Visā izmēģinājuma laikā katru dienu pēc iespējas jācenšas nodrošināt nemainīgu vielas koncentrāciju. Gatavojoties izmēģinājumam, jāveic daļiņu lieluma analīze, lai noteiktu aerosola koncentrācijas noturīgumu. Šī analīze ekspozīcijas laikā jāveic pēc iespējas biežāk, lai pārliecinātos, ka daļiņu sadalījums pēc lieluma paliek nemainīgs; c) temperatūra un gaisa mitrums; d) ekspozīcijas laikā un pēc tam regulāri veic novērojumus un tos reģistrē; jābūt atsevišķiem pierakstiem par katru dzīvnieku. Dzīvniekus novēro katru dienu, reģistrējot toksiskuma pazīmes, kā arī to parādīšanās brīdi, pakāpi un ilgumu. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar ādu, acis, gļotādas, elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Katru nedēļu jānosaka barības patēriņš, un katru nedēļu dzīvnieki jānosver. Sistemātiska dzīvnieku novērošana ļauj novērst dzīvnieku zudumus izmēģinājuma laikā kanibālisma, audu autolīzes vai nepareizu turēšanas apstākļu dēļ. Beidzoties ekspozīcijas laikam, visus izdzīvojušos dzīvniekus secē. Pamanot mirstošus dzīvniekus, tos uzreiz nošķir no pārējiem un secē. Visus dzīvniekus, arī kontroles dzīvniekus, parasti pakļauj šādām pārbaudēm: a) pirms pārbaudāmās vielas aplikācijas un izmēģinājuma beigās jāveic ja ne visu dzīvnieku, tad vismaz to, kas saņēmuši lielāko devu, un kontroles dzīvnieku oftalmoloģiskā izmeklēšana, izmantojot oftalmoskopu vai piemērotu līdzvērtīgu aparātu. Ja novēro izmaiņas acīs, jāpārbauda visi dzīvnieki; b) beidzoties izmēģinājumam, ir jāveic hematoloģiskā izmeklēšana, kas ietver hematokrīta, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaita, leikocītu skaita un leikocītu formulas, kā arī asins recēšanas spēju, piemēram, recēšanas laika, protrombīna laika, tromboplastīna laika vai trombocītu skaita noteikšanu; c) beidzoties izmēģinājumam, ir jāveic arī asins klīniskās bioķīmijas izmeklējumi. Šie izmeklējumi visos gadījumos attiecas uz elektrolītu sastāvu, ogļhidrātu metabolismu, aknu un nieru darbību. Atsevišķu analīžu izvēle ir atkarīga no konkrētās vielas iedarbības veida. Ieteiktās analīzes ietver kalcija, fosfora, hlorīdu, nātrija, kālija, glikozes pēc badošanās (badošanās ilgums ir atkarīgs no dzīvnieku sugas), seruma glutamātpiruvāttransamināzes [8], seruma glutamātoksalacetāttransamināzes [9], ornitīndekarboksilāzes, gamma-glutamiltranspeptidāzes, urīnvielas slāpekļa, albumīna, plazmas kreatinīna, kopējā bilirubīna un kopējo seruma olbaltumvielu noteikšanu. Citas analīzes, kas jāveic, lai gūtu vispusīgu toksikoloģisko novērtējumu, paredz lipīdu, hormonu, skābju/bāzu līdzsvara, methemoglobīna un holīnesterāzes aktivitātes noteikšanu. Vajadzības gadījumā var veikt arī citas klīniskās bioķīmijas analīzes, lai padziļināti izpētītu vielas iedarbību; d) urīnanalīze parasti nav jāveic, ja vien nepastāv varbūtība, ka viela var būt toksiska, vai to apstiprina novērojumi. Ja agrāk iegūtie dati ir nepietiekami, pirms uzsākt izmēģinājumu, jāapsver iespēja jau iepriekš noteikt hematoloģiskos un klīniskās bioķīmijas rādītājus. Autopsija Visiem dzīvniekiem veic pilnu autopsiju, kas paredz ķermeņa ārējās virsmas, visu atveru, kā arī galvaskausa, krūškurvja un vēdera dobumu un to satura apskati. Aknas, nieres, virsnieru dziedzerus un sēkliniekus nosver uzreiz pēc sekcijas, kamēr tie ir mitri un nesažuvuši. Piemērotā vidē jāsaglabā šādi orgāni un audi, lai turpmāk būtu iespējama to histopatoloģiskā izmeklēšana: visi orgāni ar makroskopiskiem bojājumiem, plaušas, kas jāizņem saudzīgi un pilnībā, jānosver un jāapstrādā ar piemērotu fiksatoru, šādi nodrošinot plaušu struktūras saglabāšanu (uzskata, ka plaušu perfūzija ar fiksatoru ir noderīgs paņēmiens), smadzenes, ieskaitot iegarenās smadzenes/tiltu, smadzenīšu garozu un smadzeņu garozu, hipofīze, vairogdziedzeris/epitēlijķermenīši, aizkrūts dziedzera audi, traheja, sirds, aorta, siekalu dziedzeri, aknas, liesa, nieres, virsnieru dziedzeri, aizkuņģa dziedzeris, gonādas, dzemde (papildu dzimumorgāni), (āda), žultspūslis (ja ir), barības vads, kuņģis, divpadsmitpirkstu zarna, tukšā zarna, līkumainā zarna, aklā zarna, lokzarna, taisnā zarna, urīnpūslis, limfmezglu paraugi, (sievišķais piena dziedzeris), (augšstilba muskulatūra), perifērās nervu sistēmas nervi, (acis), krūšu kauls ar kaula smadzenēm, (augšstilba kauls ar locītavas virsmu) un (triju līmeņu muguras smadzenes – no kakla, vidējā torakālā un gurnu rajona). Iekavās iekļautie audi jāpārbauda tikai tad, ja novēro toksiskuma pazīmes vai viela iedarbojas tieši uz šo orgānu. Histopatoloģiskā izmeklēšana a) Vispusīgu elpošanas orgānu un citu orgānu un audu histopatoloģisko izmeklēšanu veic visiem kontroles dzīvniekiem un dzīvniekiem, kas saņēmuši lielāko devu. b) Jāizpēta visi orgāni ar makroskopiskiem bojājumiem. c) Jāizpēta iedarbības skartie orgāni arī pārējās dzīvnieku grupās. d) Histopatoloģiski jāizmeklē dzīvnieku plaušas pēc mazās un vidēji lielās devas aplikācijas, jo šādi var ērti novērtēt dzīvnieku veselības stāvokli. Turpmāko histopatoloģisko izmeklēšanu šo grupu dzīvniekiem parasti neveic, bet to obligāti veic dzīvniekiem pēc lielās devas aplikācijas, un tā attiecas uz orgāniem, kuriem ir novēroti bojājumi. e) Ja izmanto papildu grupu, histopatoloģiski jāizmeklē audi un orgāni, uz kuriem iedarbojas pārbaudāmā viela, par ko liecina novērojumi citās dzīvnieku grupās. 2. IEGŪTIE DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot dzīvnieku skaitu katrā izmēģinājumu grupā testa sākumā, to dzīvnieku skaitu, kam ir novēroti bojājumi, bojājumu tipus un dzīvnieku procentuālo īpatsvaru ar katru bojājuma tipu. Iegūtie rezultāti jānovērtē, izmantojot piemērotu statistikas metodi. Var izmantot jebkuru atzītu statistikas metodi. 3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA 3.1. Testa ziņojums Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas: - dzīvnieku suga, līnija, izcelsme, turēšanas apstākļi, uzturs, - testa apstākļi: inhalācijas iekārtas apraksts, norādot tās konstrukciju, modeli, izmērus, gaisa avotu, makrodaļiņu un aerosolu ģenerēšanas sistēmu, gaisa kondicionēšanas paņēmienu, izplūdes gaisa apstrādi un dzīvnieku turēšanas apstākļus izmēģinājumu kamerā, ja tādu izmanto. Jāapraksta ierīces temperatūras, gaisa mitruma un, vajadzības gadījumā, aerosolu koncentrācijas noturīguma vai daļiņu lieluma noteikšanai; ekspozīcijas parametri, kas jāapkopo tabulā, norādot vidējās vērtības, kā arī svārstību diapazonu (piem., standartnovirzi) un minot arī: a) gaisa plūsmas ātrumu inhalācijas iekārtā; b) gaisa temperatūru un mitrumu; c) nominālo koncentrāciju (inhalācijas iekārtā ievadītais pārbaudāmās vielas kopējais daudzums, kas izdalīts ar gaisa daudzumu); d) nesējvielas tipu, jā tādu izmanto; e) faktisko vielas koncentrāciju inhalācijas zonā; f) daļiņu vidējo lielumu (vajadzības gadījumā), - dati par toksiskajām reakcijām atkarībā no dzimuma un koncentrācijas, - netoksiska deva, ja var noteikt, - nāves iestāšanās brīdis izmēģinājuma laikā vai norāde, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši, - toksiskās iedarbības vai citas iedarbības raksturojums, - atsevišķu saindēšanās simptomu parādīšanās brīdis un to tālākā attīstība, - barības patēriņš un ķermeņa svara izmaiņas, - oftalmoloģijas dati, - veiktie hematoloģiskie izmeklējumi un to rezultāti, - klīniskās bioķīmijas izmeklējumi un to rezultāti (arī urīnanalīzes rezultāti, ja tādi ir), - autopsijas rezultāti, - sīks histopatoloģisko izmeklējumu apraksts, - rezultātu statistiskā apstrāde, ja iespējams, - rezultātu iztirzājums, - rezultātu interpretācija. 3.2. Izvērtējums un interpretācija Skat. vispārīgā ievada B daļu. 4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skat. vispārīgā ievada B daļu. TERATOGENITĀTES NOTEIKŠANA GRAUZĒJIEM UN CITU SUGU DZĪVNIEKIEM 1. METODE 1.1. Ievads Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.3. Standartvielas Nav. 1.4. Metodes būtība Pārbaudāmo vielu dažādās devās vai koncentrācijās izmēģinājuma laikā ievada vairākām grūsnu mātīšu grupām tā, lai tas sakrīt ar grūtniecības posmu, kurā notiek organoģenēze; vienas grupas dzīvnieki saņem vienādu devu Grūsno mātīti īsi pirms paredzamās atnešanās nokauj, izņem dzemdi un pārbauda tās saturu. Ar šo metodi nosaka embrionālo toksicitāti un fetotoksicitāti. 1.5. Kvalitātes kritēriji Nav. 1.6. Metodes apraksts Sagatavošanas darbi Līdzīga vecuma un lieluma veselas un jaunas neapaugļotas mātītes vismaz piecas dienas pirms izmēģinājuma pieradina pie laboratorijas apstākļiem un pēc tam tās sapāro ar vaislīgiem tēviņiem. Apsēklotas mātītes pēc nejaušības principa sadala apstrādes grupās. Pārošanās var noritēt dabīgā veidā, bet var izmantot arī mākslīgo apsēklošanu. Pārbaudāmo vielu mātītes saņem katru dienu visu organoģenēzes laiku, sākot no implantācijas. Dienu pirms atnešanās augļus izņem, veicot histerektomiju, un reģistrē iekšējo orgānu vai skeleta anomālijas, tostarp augšanas nomākšanu, novēlotu osifikāciju un hemorāģijas. Testa apstākļi Izmēģinājumu dzīvnieki Šim nolūkam parasti izmanto žurkas, peles, kāmjus un trušus. Tomēr vēlams izmantot žurkas un trušus. Jāizmanto dzīvnieki, kas pieder pie plaši izplatītām laboratorijas dzīvnieku līnijām. Izvēlētās līnijas dzīvniekiem jābūt vaislīgiem un uzņēmīgiem pret teratogēniem. Katru dzīvnieku tur atsevišķā būrī. Dzīvnieku skaits un dzimums Katru devu pārbauda vismaz uz 20 grūsnām žurkām, pelēm vai kāmju mātītēm, vai uz 12 grūsnām trušu mātītēm. Šādi tiek nodrošināts pietiekams metienu un mazuļu daudzums, lai varētu novērtēt pārbaudāmās vielas teratogenitāti. Izmantotās devas Jāizmanto vismaz trīs dažādas devas, un jābūt kontroles grupai. Ja pārbaudāmo vielu ievada kopā ar šķīdinātāju, ir jābūt kontroles grupai, kurā dzīvnieki saņem tikai šķīdinātāju. Jāizmanto šķīdinātājs ar labi zināmām toksiskām īpašībām; tas nedrīkst iedarboties kā teratogēns vai ietekmēt reproduktīvo funkciju. Ar kontroles grupas(-u) dzīvniekiem rīkojas tāpat kā ar pārējiem dzīvniekiem, tie tikai nesaņem pārbaudāmo vielu. Ja pārbaudāmās vielas fizikālās/ķīmiskās vai bioloģiskās īpašības to pieļauj, jāizvēlas tāda lielākā deva, kas mātītes organismā izraisa redzamas saindēšanās pazīmes, piemēram, nelielu svara zudumu, bet neizraisa vairāk kā 10 % dzīvnieku mirstību. Pārbaudāmās vielas mazākā deva nedrīkst izraisīt redzamus simptomus. Vidēji lielā(s) deva(s), kas atrodas starp maksimālo un minimālo devu, jāizvēlas pēc ģeometriskā principa. Iedarbīguma robežas noteikšana Ja maztoksiska viela, kuras deva ir vismaz 1000 mg/kg, neuzrāda embriotoksicitāti vai teratogenitāti, tās tālākā pārbaude, izmantojot citas devas, nav vajadzīga. Ekspozīcijas laiks Izmēģinājuma laikā dienu skaitīšanu sāk no dienas, kad makstī novēro korķi un/vai spermu (ja iespējams to pārbaudīt). Jāizvēlas tāds ekspozīcijas laiks, kas aptver gandrīz visu organoģenēzi. Žurkām un pelēm tas var ilgt no 6. līdz 15. dienai, kāmjiem – no 6. līdz 14. dienai, bet trušiem – no 6. līdz 18. dienai. Ja sākumpunktu nosaka, pamatojoties uz pārošanās novērojumiem vai uz mākslīgo apsēklošanu, pārējos termiņus koriģē, pievienojot tiem pa vienai dienai. Pastāv arī iespēja ekspozīcijas laiku pagarināt līdz vienai dienai pirms paredzamās atnešanās. Novērošanas periods Vismaz vienreiz dienā jāveic rūpīga klīniskā pārbaude. Bez tam dzīvniekus katru dienu novēro un gādā par to, lai samazinātu to zudumus izmēģinājuma laikā. Testa norise Pārbaudāmo vielu ievada perorāli vai ar zondes palīdzību. Pārbaudāmo vielu katru dienu ievada pēc iespējas vienādā laikā. Sieviešu kārtas dzīvnieki visu izmēģinājuma laiku ik dienas saņem pārbaudāmo vielu. Vajadzīgo devu var izvēlēties pēc mātīšu svara brīdī, kad sākas pārbaudāmās vielas aplikācija, vai arī, ņemot vērā straujo svara pieaugumu grūtniecības laikā, dzīvniekus regulāri nosver un vielas devu nosaka pēc kārtējās svēršanas. Toksiskuma pazīmes reģistrē uzreiz pēc atklāšanas, norādot to parādīšanās brīdi, smaguma pakāpi un ilgumu. Mātītes, kurām novēro grūtniecības pārtrūkšanas vai priekšlaicīgas atnešanās pazīmes, jānokauj un jāpakļauj rūpīgai makroskopiskai apskatei. Dzīvnieku novērošanu pēc vielas aplikācijas turpina pat līdz pēdējai dienai pirms atnešanās termiņa; šādi var nodrošināt novērošanu gandrīz visu grūtniecības laiku, gādājot par to, lai netiktu apgrūtināta rezultātu interpretācija, mazuļiem piedzimstot dabīgā ceļā. Novērojot dzīvniekus, galvenā uzmanība jāpievērš izmaiņām, kas skar ādu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Katru nedēļu jānosaka barības patēriņš. Tāpat dzīvnieki katru nedēļu jānosver. Autopsija Katru mātīti, kas mirusi izmēģinājuma laikā vai tūlīt pēc tā beigām, jāapskata makroskopiski, reģistrējot visas anomālijas vai patoloģiskās izmaiņas, kuras būtu varējušas ietekmēt grūtniecības gaitu. Uzreiz pēc nāves iestāšanās jāizņem dzemde un jāpārbauda tās saturs, reģistrējot nedzīvu embriju vai augļu, kā arī dzīvu augļu skaitu. Parasti ir iespējams aptuveni noteikt augļu bojāejas brīdi dzemdē. Žurku un trušu mātītēm var noteikt dzelteno ķermeņu skaitu olnīcās. Jānosaka augļu dzimums, katru augli nosver un reģistrē tā svaru, kā arī aprēķina vidējo svaru. Pēc augļu izņemšanas tiem veic ārēju apskati. Vienu trešdaļu vai pusi no katra žurku, peļu un kāmju metiena preparē un reģistrē skeleta anomālijas, pārējo metiena daļu preparē un pārbauda mīksto audu anomālijas, izmantojot attiecīgās metodes. Katru truša augli rūpīgi secē un reģistrē iekšējo orgānu un skeleta anomālijas. 2. IEGŪTIE DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot dzīvnieku skaitu katrā izmēģinājumu grupā testa sākumā, grūsno matīšu skaitu, dzīvo augļu, kā arī tādu augļu skaitu un procentuālo īpatsvaru, kam novērotas mīksto audu vai skeleta anomālijas, un to attiecību katrā metienā. Rezultāti jānovērtē, izmantojot piemērotu statistikas metodi. Var izmantot jebkuru atzītu statistikas metodi. 3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA 3.1. Testa ziņojums Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas: - dzīvnieku suga, līnija, izcelsme, turēšanas apstākļi, uzturs, - testa apstākļi, - izmantotās devas (jānorāda arī šķīdinātājs, ja tādu izmanto) un koncentrācijas, - dati par toksiskajām reakcijām atkarībā no devas, - netoksiska deva, ja var noteikt, - nāves iestāšanās brīdis izmēģinājuma laikā vai norāde, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši, - toksiskās iedarbības vai citas iedarbības raksturojums, - atsevišķu saindēšanās simptomu parādīšanās brīdis un to tālākā attīstība, - barības patēriņš un ķermeņa svara izmaiņas, - grūtniecības ilgums un dati par metienu (arī agrāk iegūtie dati), - dati par augļiem (dzīvie/nedzīvie, dzimums, mīksto audu un skeleta defekti), - dati par metienu (dzīvie/nedzīvie, dzimums, mīksto audu un skeleta defekti katrā metienā), - rezultātu statistiskā apstrāde, - rezultātu iztirzājums, - rezultātu interpretācija. 3.2. Izvērtējums un interpretācija Skat. vispārīgā ievada B daļu. 4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skat. vispārīgā ievada B daļu. HRONISKĀS TOKSICITĀTES NOTEIKŠANA 1. METODE 1.1. Ievads Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.3. Standartvielas Nav. 1.4. Metodes būtība Izmantojot attiecīgo aplikācijas veidu, pārbaudāmo vielu parasti ievada septiņas dienas nedēļā vairākām izmēģinājumu dzīvnieku grupām; katra grupa saņem vienādu devu, un ekspozīcijas laiks aptver ievērojamu mūža daļu. Pārbaudāmās vielas ekspozīcijas laikā un pēc tam izmēģinājumu dzīvniekus katru dienu novēro un reģistrē toksiskuma pazīmes. 1.5. Kvalitātes kritēriji Nav. 1.6. Metodes apraksts Sagatavošanas darbi Vismaz piecas dienas pirms izmēģinājuma dzīvniekus pieradina pie dzīvošanas un barošanas apstākļiem, kādi būs izmēģinājuma laikā. Veselus, jaunus dzīvniekus pirms izmēģinājuma pēc nejaušības principa sadala apstrādes un kontroles grupās. Testa apstākļi Izmēģinājumu dzīvnieki Šim nolūkam ieteicams izmantot žurkas. Atkarībā no iepriekš veikto pētījumu rezultātiem var izmantot arī citu sugu dzīvniekus (ne tikai grauzējus). Izmanto jaunus un veselus dzīvniekus, kas pieder pie plaši izplatītām laboratorijas dzīvnieku līnijām, un vielu sāk ievadīt uzreiz pēc atšķiršanas. Uzsākot izmēģinājumus, dzīvnieku ķermeņa svara svārstības nedrīkst būt lielākas par ± 20 % no vidējā svara. Ja subhroniskās toksicitātes noteikšanu pēc perorālas aplikācijas veic pirms ilglaicīga testa, abos pētījumos jāizmanto tās pašas sugas/šķirnes un līnijas dzīvnieki. Dzīvnieku skaits un dzimums Ja izmanto grauzējus, vienu un to pašu devu ievada vismaz 40 dzīvniekiem (20 mātītēm un 20 tēviņiem), vienlaikus jābūt arī kontroles grupai. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Ja dzīvnieku nonāvēšana paredzēta arī izmēģinājuma laikā, to skaits ir jāpalielina par to dzīvnieku skaitu, kuri tiks nokauti izmēģinājuma gaitā. Ja izmantotie dzīvnieki nav grauzēji, ir pieļaujams mazāks dzīvnieku skaits, bet tāpat katrā grupā jābūt vismaz pa četriem katra dzimuma īpatņiem. Izmantotās devas un aplikācijas biežums Jāizmanto vismaz trīs dažādas devas, un vienlaikus jābūt kontroles grupai. Vielas lielākajai devai jābūt izteikti toksiskai, neizraisot pārmērīgi augstu mirstību. Viela vismazākajā devā nedrīkst būt toksiska. Vidēji lielo devu(-as) izvēlas pa vidu starp lielo un mazo devu. Izvēloties šīs devas, jāņem vērā iepriekšējo toksicitātes testu un pētījumu rezultāti. Parasti pārbaudāmo vielu ievada katru dienu. Ja vielu pievieno dzeramajam ūdenim vai uzturam, tai visu laiku jābūt pieejamai dzīvniekiem. Kontroles dzīvnieki Vienlaikus jābūt kontroles dzīvniekiem, kas no pārējiem dzīvniekiem atšķiras tikai ar to, ka tie nesaņem pārbaudāmo vielu. Atsevišķos gadījumos, piemēram, pēc aerosolu inhalācijas vai pēc perorālas aplikācijas, kad izmanto emulgatoru, kura bioloģiskā iedarbība nav zināma, vienlaikus jāizmanto negatīvā kontroles grupa. Negatīvās kontroles grupa atšķiras no pārējām grupām tikai ar to, ka šie dzīvnieki nesaņem pārbaudāmo vielu vai šķīdinātāju/nesējvielu. Ievadīšanas veids Divi galvenie ievadīšanas veidi ir perorāla aplikācija un inhalācija. Ievadīšanas veida izvēle ir atkarīga no pārbaudāmās vielas fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām, kā arī no tā, kādā veidā cilvēki parasti nonāk saskarē ar šo vielu. Ārīga aplikācija var radīt nopietnas grūtības no praktiskā viedokļa. Par vispārējo hronisko toksicitāti, vielai uzsūcoties caur ādu, parasti spriež pēc rezultātiem, kas gūti pēc perorālas ievadīšanas, un pēc tā, cik lielā mērā tā uzsūcas caur ādu, par ko liecina iepriekš veiktie toksicitātes testi, izmantojot ārīgu aplikāciju. Perorāla aplikācija Ja pārbaudāmā viela organismā nonāk caur kuņģa-zarnu traktu, un ja tieši tādā veidā tā var apdraudēt cilvēkus, ieteicams izmantot perorālu aplikāciju, ja tam nav kontrindikāciju. Dzīvnieki var saņemt pārbaudāmo vielu kopā ar uzturu, dzeramo ūdeni vai kapsulās. Dzīvnieki parasti saņem vielas devu katru dienu septiņas dienas nedēļā, jo, ja vielu ievada tikai piecas dienas nedēļā, “tukšajā laikā” dzīvnieki var atkopties, toksicitātes simptomi iet mazumā, kas savukārt ietekmēs rezultātus un to novērtēšanu. Tomēr, galvenokārt aiz praktiskiem apsvērumiem, uzskata, ka ir arī pieļaujama vielas ievadīšana piecas dienas nedēļā. Inhalācijas tests Tā kā, veicot inhalācijas testus, rodas lielākas tehniskas grūtības nekā tad, kad izmanto citus aplikācijas veidus, šeit sniegti sīkāki norādījumi attiecībā uz šo testu izmantošanu. Turklāt jāpiezīmē, ka atsevišķos gadījumos kā veiksmīgu alternatīvu var izmantot intratraheālu instilāciju. Izvēloties ilglaicīgu ekspozīciju, parasti ņem vērā cilvēku iespējamo saskari ar vielu, tālab dzīvniekus katru dienu piecas reizes nedēļā uz sešām stundām ievieto inhalācijas kamerā ar vienmērīgu vielas koncentrāciju (periodiskā ekspozīcija) vai, ņemot vērā iespējamo vielas klātbūtni apkārtējā vidē, tos katru dienu 7 reizes nedēļā uz 22-24 stundām pakļauj vielas iedarbībai (nepārtrauktā ekspozīcija), katru dienu vienādā laikā paredzot vienu stundu dzīvnieku barošanai un inhalācijas kameras apkopšanai. Parasti abos gadījumos dzīvnieki saņem pārbaudāmo vielu noteiktā koncentrācijā. Galvenā atšķirība starp periodisko un nepārtraukto ekspozīciju ir tā, ka pirmajā gadījumā, beidzoties iedarbībai, dzīvnieki var atkopties 17-18 stundu laikā, un nedēļas nogalē šis atkopšanās laiks ir vēl garāks. Periodiskās vai nepārtrauktās ekspozīcijas izvēle ir atkarīga no pētījuma mērķiem un no izvēlētā modeļa, kas simulē apstākļus, kādos cilvēki nonāk saskarē ar vielu. Šeit tomēr jārēķinās ar dažām tehniskām grūtībām. Piemēram, nepārtrauktās ekspozīcijas priekšrocības, modelējot apkārtējas vides apstākļus, var mazināt tas, ka ekspozīcijas laikā dzīvnieki jābaro un jāizmanto daudz sarežģītākas (un precīzākas) aerosola un tvaika ģenerēšanas un kontroles metodes. Inhalācijas kameras Izmēģinājumos ar dzīvniekiem izmanto inhalācijas kameras, kas nodrošina dinamisku gaisa plūsmu (vismaz 12 gaisa maiņas stundā), pietiekamu skābekļa koncentrāciju un vienmērīgu atmosfēru ekspozīcijas laikā. Kontroles un izmēģinājumu dzīvniekiem izmanto vienādas uzbūves un konstrukcijas inhalācijas kameras, kas nodrošina līdzvērtīgus ekspozīcijas apstākļus, izņemot pārbaudāmās vielas klātbūtni. Gaisa spiediens kamerā parasti ir nedaudz pazemināts, lai izvairītos no pārbaudāmās vielas izplūšanas apkārtējā vidē. Kamerās jābūt pietiekami daudz vietas izmēģinājumu dzīvniekiem. Parasti, lai kamerā būtu noturīga atmosfēra, izmēģinājumu dzīvnieku kopējais “tilpums” nedrīkst pārsniegt 5 % no kameras tilpuma. Jāveic šādu parametru mērījumi un uzraudzība: i) gaisa plūsma – ieteicams pastāvīgi kontrolēt gaisa plūsmas ātrumu kamerā; ii) koncentrācija – pārbaudāmās vielas koncentrācijas svārstības ekspozīcijas laikā nedrīkst pārsniegt ± 15 % no tās vidējās vērtības; iii) temperatūra un gaisa mitrums – ja izmanto grauzējus, temperatūrai jābūt 22 ± 2 oC, gaisa mitrumam kamerā jābūt 30-70 %, izņemot gadījumus, kad pārbaudāmās vielas suspendēšanai kameras atmosfērā izmanto ūdeni. Abi šie parametri nepārtraukti jāuzrauga; iv) daļiņu lieluma mērījumi – ja izmanto šķidros vai cietos aerosolus, kameras atmosfērā jānosaka daļiņu sadalījums pēc lieluma. Aerosola daļiņām jābūt tādā lielumā, lai izmēģinājumu dzīvnieki tos varētu ieelpot. Kameras atmosfēras paraugi jāņem dzīvnieku inhalācijas zonā. Daļiņu sadalījumam gaisa paraugā jābūt tādam pašam kā gaisā, ko elpo dzīvnieki, un tam gravimetriski jāatbilst aerosola suspensijai kopumā pat tad, ja liela daļa aerosola nav ieelpojama. Gatavojot iekārtu izmēģinājumam, pietiekami bieži jāveic daļiņu lieluma analīze, lai pārliecinātos par aerosola noturīgumu; ekspozīcijas laikā tā jāveic tik bieži, lai pienācīgi noteiktu daļiņu sadalījuma nemainīgumu gaisā, ko ieelpo dzīvnieki. Pārbaudes ilgums Dzīvnieki saņem pārbaudāmo vielu vismaz 12 mēnešus. Testa norise Dzīvnieku novērošana Vismaz vienreiz dienā dzīvniekus pakļauj rūpīgai klīniskajai pārbaudei. Bez tam dzīvniekus katru dienu novēro un gādā par to, lai samazinātu to zudumus izmēģinājuma laikā, piemēram, secējot vai iesaldējot mirušos dzīvniekus un nošķirot vai nokaujot vārgus vai mirstošus īpatņus. Dzīvnieki rūpīgi jānovēro, reģistrējot jebkuru toksicitātes simptomu parādīšanos un tālāko attīstību, kā arī jāsamazina dzīvnieku zudumi slimību, autolīzes vai kanibālisma dēļ. Visiem dzīvniekiem reģistrē klīniskos simptomus, tostarp neiroloģiskās izmaiņas un izmaiņas acīs, kā arī mirstību. Jāreģistrē toksisko reakciju parādīšanās un tālākā attīstība, arī aizdomīgu audzēju rašanās. Pirmo 13 nedēļu laikā katram dzīvniekam vienreiz nedēļā reģistrē ķermeņa svaru, vēlāk to dara vismaz ik pēc četrām nedēļām. Pirmo 13 nedēļu laikā katru nedēļu nosaka barības patēriņu, bet vēlāk apmēram ik pēc trim mēnešiem, ja vien veselības stāvokļa vai ķermeņa svara izmaiņu dēļ tas nav jādara citādi. Hematoloģiskā izmeklēšana Hematoloģiskā izmeklēšana (piemēram, hemoglobīna satura, hematokrīta skaitļa, kopējā eritrocītu skaita, kopējā leikocītu skaita, trombocītu un citu asins recēšanas rādītāju noteikšana) jāveic pēc trim mēnešiem, sešiem mēnešiem un tad apmēram ik pēc sešiem mēnešiem un vēl pēc izmēģinājuma beigām, ņemot asins paraugus no visiem katras grupas dzīvniekiem, ja tie nepieder pie grauzējiem, vai no 10 katra dzimuma žurkām. Ja iespējams, pēc katra laika intervāla paraugi jāņem no tām pašām žurkām. Bez tam, ja tie nav grauzēji, asins paraugs jāņem arī pirms izmēģinājuma. Ja klīniskie novērojumi liecina par dzīvnieku veselības pasliktināšanos pētījuma laikā, šiem dzīvniekiem nosaka asins ainu. Asins ainas noteikšanai izmanto asins paraugus no dzīvniekiem, kas saņēmuši augstāko devu, un no kontroles dzīvniekiem. Dzīvniekiem, kas saņem vielu mazākā devā(s), asins ainu nosaka tikai tad, ja starp dzīvniekiem, kas saņēmuši augstāko devu, un kontroles dzīvniekiem novēro lielas svārstības vai uz to norāda patoloģiskās izmaiņas. Urīnanalīze Paraugus urīnanalīzei ņem no visiem katras grupas dzīvniekiem, ja tie nepieder pie grauzējiem, vai no 10 katra dzimuma žurkām, ja iespējams, no tām pašām žurkām un ar tādu pašu laika intervālu kā hematoloģiskajiem izmeklējumiem. Grauzējiem, katram dzīvniekam atsevišķi vai visiem viena dzimuma/grupas paraugiem kopumā, veic šādas analīzes: - izskats – tilpums un īpatnējais blīvums, katram dzīvniekam, - olbaltumvielas, glikoze, ketoni, asins (puskvantitatīvi) urīnā, - nogulsnes (puskvantitatīvi). Klīniskā bioķīmija Apmēram ik pēc sešiem mēnešiem un pēc izmēģinājuma beigām visiem katras grupas dzīvniekiem, ja tie nepieder pie grauzējiem, vai 10 katra dzimuma žurkām, ja iespējams, visos laika intervālos no tām pašām žurkām, ņem asins paraugus klīniskās bioķīmijas izmeklējumiem. Bez tam, ja tie nav grauzēji, asins paraugs jāņem arī pirms izmēģinājuma. No šiem paraugiem iegūst plazmu un veic šādas analīzes: - kopējā olbaltumvielu koncentrācija, - albumīna koncentrācija, - aknu funkcionālā darbība (piemēram, sārmainās fosfatāzes aktivitāte, glutamātpiruvāttransamināzes [10] aktivitāte un glutamātoksalacetāttransamināzes [11] aktivitāte), gamma-glutamiltranspeptidāze, ornitīndekarboksilāze, - ogļhidrātu metabolisms, piemēram, glikoze pēc badošanās, - nieru funkcionālā darbība, piemēram, urīnvielas slāpeklis asinīs. Autopsija Visiem dzīvniekiem, arī tiem, kas miruši izmēģinājuma laikā, vai nokauti veselības stāvokļa dēļ, jāveic pilna autopsija. Pirms nokaušanas dzīvniekiem ņem asins paraugu asins ainas noteikšanai. Jāsaglabā visi audi ar makroskopiskām izmaiņām, audzēji vai audzējiem līdzīgi veidojumi. Jāmēģina rast korelāciju starp autopsijas datiem un mikroskopijas rezultātiem. Visi orgāni un audi jāsaglabā histopatoloģiskajai izmeklēšanai. Tas parasti attiecas uz šādiem orgāniem un audiem – smadzenēm [12] (iegarenās smadzenēs/tilts, smadzenīšu garoza, smadzeņu garoza), hipofīzi, vairogdziedzeri (kopā ar epitēlijķermenīšiem), aizkrūts dziedzeri, plaušām (kopā ar traheju), sirdi, aortu, siekalu dziedzeriem, aknām [13], liesu, nierēm [14], virsnieru dziedzeriem [15], barības vadu, kuņģi, divpadsmitpirkstu zarnu, tukšo zarnu, līkumaino zarnu, aklo zarnu, lokzarnu, taisno zarnu, dzemdi, urīnpūsli, limfmezgliem, aizkuņģa dziedzeri, gonādām [16], papildu dzimumorgāniem, sievišķo piena dziedzeri, ādu, muskulatūru, perifērās nervu sistēmas nerviem, muguras smadzenēm (kakla, vidējais torakālais un gurnu rajons), krūškaulu ar kaula smadzenēm, augšstilba kaulu (kopā ar locītavu) un acīm. Vislabākais veids, kā saglabāt plaušu un urīnpūšļa audus, ir piepildīt šos orgānus ar fiksatoru; pienācīga plaušu histopatoloģiskā izmeklēšana pēc inhalācijas nav iespējama bez šādas apstrādes. Veicot īpašus klīniskos pētījumus, piemēram, pēc inhalācijas, jāpārbauda visi elpošanas orgāni, ieskaitot degunu, rīkli un balseni. Ja ir veikti citi klīniskie izmeklējumi, tajos iegūtie dati jāapkopo pirms mikroskopiskās pārbaudes, jo tie var sniegt svarīgu informāciju patologam. Histopatoloģija Mikroskopā jāpārbauda visas patoloģiskās izmaiņas, it īpaši audzējus un citus veidojumus jebkurā orgānā. Bez tam ir ieteicams veikt šeit norādītās procedūras: a) visu uzglabāto orgānu un audu mikroskopiskā izpēte kopā ar vispusīgu pārskatu par visām patoloģiskajām izmaiņām, kas novērotas: 1. izmēģinājuma laikā mirušiem vai nokautiem dzīvniekiem; 2. dzīvniekiem, kuri saņēmuši lielāko devu, un kontroles dzīvniekiem; b) jāpārbauda orgāni vai audi dzīvniekiem, kas saņēmuši mazāku pārbaudāmās vielas devu, un kuros, iespējams, vielas ietekmē, radušās anomālijas; c) ja testa rezultāti liecina par to, ka parastais dzīvnieku mūža ilgums ir ievērojami samazinājies vai ka radušās sekas var ietekmēt toksisko reakciju, jāpārbauda dzīvnieki nākamajā devas grupā, kā tas norādīts iepriekš; d) lai pienācīgi novērtētu izmaiņas, kas novērotas dzīvniekiem pēc vielas aplikācijas, jābūt informācijai par to, cik bieži izmantotās līnijas dzīvniekiem tādos pašos laboratorijas apstākļos reģistrē spontāni radušās anomālijas, proti, jābūt iepriekš iegūtiem datiem par kontroles dzīvniekiem. 2. IEGŪTIE DATI Dati jāapkopo tabulā, norādot dzīvnieku skaitu katrā izmēģinājuma grupā testa sākumā, to dzīvnieku skaitu, kam novērotas izmaiņas, un katra izmaiņu tipa procentuālo īpatsvaru. Rezultāti jānovērtē, izmantojot piemērotu statistikas metodi. Var izmantot jebkuru atzītu statistikas metodi. 3. ZIŅOJUMA SAGATAVOŠANA 3.1. Testa ziņojums Testa ziņojumā, ja iespējams, jānorāda šādas ziņas: - dzīvnieku suga, līnija, izcelsme, turēšanas apstākļi, uzturs, - testa apstākļi: inhalācijas iekārtas apraksts, norādot tās konstrukciju, modeli, izmērus, gaisa avotu, makrodaļiņu un aerosolu ģenerēšanas sistēmu, gaisa kondicionēšanas paņēmienu, izplūdes gaisa apstrādi un dzīvnieku turēšanas apstākļus izmēģinājumu kamerā, ja tādu izmanto. Apraksta ierīces temperatūras, gaisa mitruma un, vajadzības gadījumā, aerosolu koncentrācijas noturīguma vai daļiņu lieluma noteikšanai. Ekspozīcijas režīms: šie dati jāapkopo tabulā, norādot vidējās vērtības, kā arī svārstību diapazonu (piemēram, standartnovirzi) un, ja iespējams, minot arī: a) gaisa plūsmas ātrumu inhalācijas iekārtā; b) gaisa temperatūru un mitrumu; c) nominālo koncentrāciju (inhalācijas iekārtā ievadītais pārbaudāmās vielas kopējais daudzums, kas izdalīts ar gaisa daudzumu); d) nesējvielas tipu, jā tādu izmanto; e) faktisko vielas koncentrāciju inhalācijas zonā; f) daļiņu vidējo lielumu (vajadzības gadījumā), - izmantotās devas (jānorāda arī nesējviela, ja tādu izmanto) un koncentrācijas, - dati par toksiskajām reakcijām atkarībā no dzimuma un devas, - netoksiska deva, - nāves iestāšanās brīdis izmēģinājuma laikā vai norāde, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši, - toksiskās iedarbības vai citas iedarbības raksturojums, - atsevišķu saindēšanās simptomu parādīšanās brīdis un to tālākā attīstība, - barības patēriņš un ķermeņa svara izmaiņas, - oftalmoloģijas dati, - hematoloģiskie izmeklējumi un to rezultāti, - klīniskās bioķīmijas izmeklējumi un to rezultāti (arī urīnanalīzes rezultāti, ja tādi ir), - autopsijas rezultāti, - sīks histopatoloģisko izmeklējumu apraksts, - rezultātu statistiskā apstrāde, ja iespējams, - rezultātu iztirzājums, - rezultātu interpretācija. 3.2. Izvērtējums un interpretācija Skat. vispārīgā ievada B daļu. 4. IZMANTOTĀ LITERATŪRA Skat. vispārīgā ievada B daļu. KANCEROGENITĀTES NOTEIKŠANA 1. METODE 1.1. Ievads Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.2. Definīcijas Skat. vispārīgā ievada B daļu. 1.3. Standartvielas Nav. 1.4. Metodes būtība Izmantojot attiecīgo aplikācijas veidu, pārbaudāmo vielu parasti ievada septiņas dienas nedēļā vairākām izmēģinājumu dzīvnieku grupām; katra grupa saņem vienādu devu, un ekspozīcijas laiks aptver ievērojamu mūža daļu. Ekspozīcijas laikā un arī vēlāk izmēģinājumu dzīvniekus katru dienu novēro un reģistrē toksiskuma pazīmes, jo īpaši audzēju rašanos. 1.5. Kvalitātes kritēriji Nav. 1.6. Metodes apraksts Vismaz piecas dienas pirms izmēģinājuma dzīvniekus pieradina pie dzīvošanas un barošanas apstākļiem, kādi būs izmēģinājuma laikā. Veselus, jaunus dzīvniekus pirms izmēģinājuma pēc nejaušības principa sadala apstrādes un kontroles grupās. Izmēģinājumu dzīvnieki Atkarībā no iepriekš veikto pētījumu rezultātiem var izmantot arī citu sugu dzīvniekus (ne tikai grauzējus). Izmanto jaunus un veselus dzīvniekus, kas pieder pie plaši izplatītām laboratorijas dzīvnieku līnijām, un vielu sāk ievadīt uzreiz pēc atšķiršanas. Uzsākot izmēģinājumus, dzīvnieku ķermeņa svara svārstības nedrīkst būt lielākas par ± 20 % no vidējā svara. Ja subhroniskās toksicitātes noteikšanu pēc perorālas aplikācijas veic pirms ilglaicīga testa, abos pētījumos jāizmanto tās pašas sugas/šķirnes un līnijas dzīvnieki. Dzīvnieku skaits un dzimums Ja izmanto grauzējus, vienu un to pašu devu ievada vismaz 100 dzīvniekiem (50 mātītēm un 50 tēviņiem), un vienlaikus jābūt arī kontroles grupai. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Ja dzīvnieku nonāvēšana paredzēta arī izmēģinājuma laikā, to skaits ir jāpalielina par to dzīvnieku skaitu, kuri tiks nokauti izmēģinājuma gaitā. Izmantotās devas un aplikācijas biežums Jāizmanto vismaz trīs dažādas devas, un vienlaikus jābūt kontroles grupai. Jāizvēlas tāda augstākā deva, kas izraisa nenozīmīgas toksiskuma pazīmes, piemēram, nelielus ķermeņa svara zudumus (līdz 10 %), un ievērojami neietekmē dzīvnieku mūža garumu, ja vien tas nav saistīts ar audzēju rašanos. Vielas vismazākā devā nedrīkst traucēt dzīvnieku normālo augšanu, attīstību un mūža ilgumu vai izraisīt jebkādus toksicitātes simptomus. Parasti tai vajadzētu sasniegt vismaz 10 % no lielās devas. Vidēji lielo devu(-as) izvēlas pa vidu starp lielo un mazo devu. Izvēloties šīs devas, jāņem vērā iepriekšējo toksicitātes testu un pētījumu rezultāti. Parasti pārbaudāmo vielu ievada katru dienu. Ja to pievieno dzeramajam ūdenim vai uzturam, tai visu laiku jābūt pieejamai dzīvniekiem. Kontroles dzīvnieki Vienlaikus jābūt kontroles dzīvniekiem, kas no pārējiem dzīvniekiem atšķiras tikai ar to, ka tie nesaņem pārbaudāmo vielu. Īpašos gadījumos, piemēram, ja izmanto inhalācijas testu ar aerosolu vai perorālu aplikāciju ar emulgatoru, kura bioloģiskā aktivitāte nav zināma, papildus jābūt negatīvās kontroles grupai, kas nesaņem nesējvielu. Ievadīšanas veids Trīs galvenie ievadīšanas veidi ir perorāla vai ārīga aplikācija un inhalācija. Ievadīšanas veida izvēle ir atkarīga no pārbaudāmās vielas fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām, kā arī no tā, kādā veidā cilvēki parasti nonāk saskarē ar šo vielu. Perorāla aplikācija Ja pārbaudāmā viela organismā nonāk caur kuņģa-zarnu traktu un ja tieši tādā veidā tā var apdraudēt cilvēkus, ieteicams izmantot perorālu aplikāciju, ja tam nav kontrindikāciju. Dzīvnieki var saņemt pārbaudāmo vielu kopā ar uzturu, dzeramo ūdeni vai kapsulās. Dzīvnieki parasti saņem vielas devu katru dienu septiņas dienas nedēļā, jo, ja vielu ievada tikai piecas dienas nedēļā, “tukšajā laikā” dzīvnieki var atkopties, toksicitātes simptomi iet mazumā, kas savukārt ietekmē rezultātus un to novērtēšanu. Tomēr, galvenokārt aiz praktiskiem apsvērumiem, uzskata, ka ir arī pieļaujama vielas ievadīšana piecas dienas nedēļā. Ārīga aplikācija Ārīgu aplikāciju, uztriepjot vielu uz ādas, var izvēlēties tad, ja simulē vienu no galvenajiem veidiem, kā viela iekļūst cilvēku organismā, un kā modeli ādas bojājumu inducēšanai. Inhalācijas tests Tā kā, veicot inhalācijas testus, rodas lielākas tehniskas grūtības nekā tad, kad izmanto citus aplikācijas veidus, šeit sniegti sīkāki norādījumi attiecībā uz šo testu izmantošanu. Jāpiezīmē, ka atsevišķos gadījumos kā veiksmīgu alternatīvu var izmantot intratraheālu instilāciju. Izvēloties ilglaicīgu ekspozīciju, parasti ņem vērā cilvēku iespējamo saskari ar vielu, tālab dzīvniekus katru dienu piecas reizes nedēļā uz sešām stundām ievieto inhalācijas kamerā ar vienmērīgu vielas koncentrāciju (periodiskā ekspozīcija) vai, ņemot vērā iespējamo vielas klātbūtni apkārtējā vidē, tos katru dienu 7 dienas nedēļā uz 22-24 stundām pakļauj vielas iedarbībai (nepārtrauktā ekspozīcija), katru dienu vienādā laikā paredzot vienu stundu dzīvnieku barošanai un inhalācijas kameras apkopšanai. Parasti abos gadījumos dzīvnieki saņem pārbaudāmo vielu noteiktā koncentrācijā. Galvenā atšķirība starp periodisko un nepārtraukto ekspozīciju ir tā, ka pirmajā gadījumā, beidzoties iedarbībai, dzīvnieki var atkopties 17-18 stundu laikā, un nedēļas nogalē šis atkopšanās laiks ir vēl garāks. Periodiskās vai nepārtrauktās ekspozīcijas izvēle ir atkarīga no pētījuma mērķiem un no izvēlētā modeļa, kas simulē apstākļus, kādos cilvēki nonāk saskarē ar vielu. Šeit tomēr jārēķinās ar dažām tehniskām grūtībām. Piemēram, nepārtrauktās ekspozīcijas priekšrocības, modelējot apkārtējas vides apstākļus, var mazināt tas, ka ekspozīcijas laikā dzīvnieki jābaro un jāizmanto daudz sarežģītākas (un precīzākas) aerosola un tvaika ģenerēšanas un kontroles metodes. Inhalācijas kameras Izmēģinājumos ar dzīvniekiem izmanto inhalācijas kameras, kas nodrošina dinamisku gaisa plūsmu (vismaz 12 gaisa maiņas stundā), pietiekamu skābekļa koncentrāciju un vienmērīgu atmosfēru ekspozīcijas laikā. Kontroles un izmēģinājumu dzīvniekiem izmanto vienādas uzbūves un konstrukcijas inhalācijas kameras, kas nodrošina līdzvērtīgus ekspozīcijas apstākļus, izņemot pārbaudāmās vielas klātbūtni. Gaisa spiediens kamerā parasti ir nedaudz pazemināts, lai izvairītos no pārbaudāmās vielas izplūšanas apkārtējā vidē. Kamerās jābūt pietiekami daudz vietas izmēģinājumu dzīvniekiem. Parasti, lai kamerā būtu noturīga atmosfēra, izmēģinājumu dzīvnieku kopējais “tilpums” nedrīkst pārsniegt 5 % no kameras tilpuma. Jāveic šādu parametru mērījumi un uzraudzība: i) gaisa plūsma – ieteicams pastāvīgi kontrolēt gaisa plūsmas ātrumu kamerā; ii) koncentrācija – ikdienas ekspozīcijas laikā pārbaudāmās vielas koncentrācijas svārstības nedrīkst pārsniegt ± 15 % no tās vidējās vērtības. Visā izmēģinājuma laikā katru dienu pēc iespējas jācenšas nodrošināt nemainīgu vielas koncentrāciju; iii) temperatūra un gaisa mitrums – ja izmanto grauzējus, temperatūrai jābūt 22 ± 2 oC, gaisa mitrumam kamerā jābūt 30-70 %, izņemot gadījumus, kad pārbaudāmās vielas suspendēšanai kameras atmosfērā izmanto ūdeni. Abi šie parametri nepārtraukti jāuzrauga; iv) daļiņu lieluma mērījumi – ja izmanto šķidros vai cietos aerosolus, kameras atmosfērā jānosaka daļiņu sadalījums pēc lieluma. Aerosola daļiņām jābūt tādā lielumā, lai izmēģinājumu dzīvnieki tās varētu ieelpot. Kameras atmosfēras paraugi jāņem dzīvnieku inhalācijas zonā. Daļiņu sadalījumam gaisa paraugā jābūt tādam pašam kā gaisā, ko elpo dzīvnieki, un tam gravimetriski jāatbilst aerosola suspensijai kopumā pat tad, ja liela daļa aerosola nav ieelpojama. Gatavojot iekārtu izmēģinājumam, pietiekami bieži jāveic daļiņu lieluma analīze, lai pārliecinātos par aerosola noturīgumu; ekspozīcijas laikā tā jāveic tik bieži, lai pienācīgi noteiktu daļiņu sadalījuma nemainīgumu gaisā, ko ieelpo dzīvnieki. Testa ilgums Kancerogenitātes pētījumi aptver izmēģinājumu dzīvnieku parastā mūža ilguma lielāko daļu. Pētījumi ar pelēm un kāmjiem ilgst 18 mēnešus, ar žurkām – 24 mēnešus, taču, ja izmanto dažas dzīvnieku līnijas, kam ir garāks mūža ilgums un/vai retāk reģistrē spontāni radušos audzējus, to ilgumu pelēm un kāmjiem pagarina līdz 24 mēnešiem, bet žurkām – līdz 30 mēnešiem. Tomēr šādus pagarinātos pētījumus var pārtraukt, ja izdzīvojušo dzīvnieku skaits pēc mazākās devas aplikācijas vai kontroles grupā ir sasniedzis 25 %. Ja pētījuma beigās atklājas, ka atkarībā no dzimuma dzīvnieki reaģē krasi atšķirīgi, datus par katru dzimumu apkopo atsevišķi. Ja priekšlaicīgi mirst tikai dzīvnieki, kas saņēmuši lielo devu, jo tā ir izteikti toksiska, pētījumi nav jāpārtrauc, ja vien citās dzīvnieku grupās nerodas problēmas toksicitātes dēļ. Negatīvs testa iznākums ir atzīstams par vērā ņemamu, ja dzīvnieku zudumi izmēģinājuma laikā autolīzes, kanibālisma vai tehnisku problēmu dēļ nepārsniedz 10 % un visās grupās ne mazāk kā 50 % dzīvnieku ir izdzīvojuši pēc 18 mēnešiem, ja tās ir peles, un pēc 24 mēnešiem, ja tās ir žurkas. Testa norise Dzīvnieku novērošana Novērojot dzīvniekus, katru dienu jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar ādu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas Pastāvīga dzīvnieku novērošana ļauj iespēju robežās samazināt dzīvnieku zudumus izmēģinājuma laikā kanibālisma, audu autolīzes vai nepiemērotu turēšanas apstākļu dēļ. Pamanot mirstošus dzīvniekus, tos uzreiz nošķir no pārējiem un secē. Visiem dzīvniekiem reģistrē klīniskās pazīmes un nāves iestāšanos. Īpaši uzmanīgi jāseko audzēju attīstībai, reģistrējot katra skaidri saskatāma vai sataustāma audzēja parādīšanās brīdi, atrašanās vietu, izmērus, izskatu un tālāko attīstību. Izmēģinājuma pirmo 13 nedēļu laikā barības patēriņš (un ūdens patēriņš, ja pārbaudāmā viela pievienota dzeramajam ūdenim) jānosaka katru nedēļu un pēc tam apmēram ik pēc trim mēnešiem, ja vien veselības stāvokļa vai ķermeņa svara izmaiņu dēļ nav jārīkojas citādi. Izmēģinājuma pirmo 13 nedēļu laikā vienreiz nedēļā jāreģistrē katra dzīvnieka ķermeņa svars, bet vēlāk to dara vismaz ik pēc četrām nedēļām. Klīniskās pārbaudes Hematoloģija Ja dzīvnieku novērojumi izmēģinājuma gaitā liecina par veselības stāvokļa pasliktināšanos, šiem dzīvniekiem pārbauda asins ainu. Pēc 12 mēnešiem, 18 mēnešiem un pirms nokaušanas visiem dzīvniekiem ņem asinis un gatavo uztriepes. Asins ainas noteikšanai izmanto asins paraugus no dzīvniekiem pēc lielās devas aplikācijas un no kontroles dzīvniekiem. Ja šie dati, it īpaši tie, kas iegūti pirms nokaušanas, kā arī autopsijas rezultāti norāda uz tādu vajadzību, asins ainu pārbauda arī nākamās(-o) grupas(-u) dzīvniekiem, kas saņēmuši mazāku devu(-as). Autopsija Visiem dzīvniekiem, arī tiem, kas miruši izmēģinājuma laikā vai nokauti veselības stāvokļa dēļ, veic pilnu autopsiju. Jāsaglabā visi skaidri saredzami audzēji vai audi ar patoloģiskām izmaiņām un audzējiem līdzīgi veidojumi. Piemērotā vidē jāsaglabā šādi orgāni un audi, lai turpmāk būtu iespējama to histopatoloģiskā izmeklēšana: smadzenes (ieskaitot iegareno smadzeņu/tilta audu paraugus, smadzenīšu garozu, smadzeņu garozu), hipofīze, vairogdziedzeris/epitēlijķermenīši, aizkrūts dziedzera audi, traheja un plaušas, sirds, aorta, siekalu dziedzeri, aknas, liesa, nieres, virsnieru dziedzeri, aizkuņģa dziedzeris, gonādas, dzemde, papildu dzimumorgāni, āda, barības vads, kuņģis, divpadsmitpirkstu zarna, tukšā zarna, līkumainā zarna, aklā zarna, lokzarna, taisnā zarna, urīnpūslis, limfmezglu paraugi, sievišķais piena dziedzeris, augšstilba muskulatūra, perifērās nervu sistēmas nervi, krūškauls ar kaula smadzenēm, augšstilba kauls (ar locītavu), triju līmeņu muguras smadzenes (no kakla, vidējā torakālā un gurnu rajona) un acis. Vislabākais veids, kā saglabāt plaušu un urīnpūšļa audus, ir piepildīt šos orgānus ar fiksatoru; pienācīga plaušu histopatoloģiskā izmeklēšana pēc inhalācijas nav iespējama bez šādas apstrādes. Pēc inhalācijas testa jāsaglabā visi elpošanas orgāni, ieskaitot deguna dobumu, rīkli un balseni. Histopatoloģija a) Orgānu un audu pilnu histopatoloģisko izmeklēšanu veic visiem pārbaudes laikā mirušiem vai nokautiem dzīvniekiem, kā arī visiem kontroles dzīvniekiem un dzīvniekiem pēc lielo devu aplikācijas. b)