KOMISIJAS ĪSTENOŠANAS LĒMUMS (ES) 2016/1840

(2016. gada 14. oktobris),

ar ko groza Padomes Direktīvas 2009/156/EK IV pielikumu par Āfrikas zirgu mēra diagnostiku

(izziņots ar dokumenta numuru C(2016) 6509)

(Dokuments attiecas uz EEZ)

EIROPAS KOMISIJA,

ņemot vērā Līgumu par Eiropas Savienības darbību,

ņemot vērā Padomes 2009. gada 30. novembra Direktīvu 2009/156/EK par dzīvnieku veselības prasībām attiecībā uz zirgu dzimtas dzīvnieku pārvadāšanu un importu no trešām valstīm (1) un jo īpaši tās 20. pantu,

tā kā:

Direktīvas 2009/156/EK IV pielikumā ir izklāstītas Āfrikas zirgu mēra diagnostikas metodes, ko vajadzības gadījumā izmanto, lai testētu zirgu dzimtas dzīvniekus pirms to pārvietošanas Savienībā vai importēšanas no trešām valstīm.

Kā daļu no sava 2014. gada darba Eiropas Savienības references laboratorija attiecībā uz Āfrikas zirgu mēri (3) sagatavoja ziņojumu par Direktīvas 2009/156/EK IV pielikumā aprakstīto diagnostikas metožu tehnisko novērtējumu. Novērtējumā, kas Komisijai tika iesniegts 2015. gada maijā, secināts, ka konkurējošā imūnfermentatīvā analīze (ELISA) vairs nav pieejama, netiešā ELISA vairs netiek lietota, bet to var nodrošināt 4–6 mēnešus pēc pieprasījuma, un ka bloķējošā ELISA ir komerciāli pieejama un plaši izmantota paraugu analīzei kvalifikācijas testu uzdevumos, ko rīko Eiropas Savienības references laboratorija attiecībā uz Āfrikas zirgu mēri.

Turklāt ziņojumā uzsvērts, ka nukleīnskābes atpazīšanas metodēm ar atgriezeniskās transkriptāzes polimerāzes ķēdes reakciju (RT-PCR) ir priekšrocības pār seroloģiskās diagnostikas metodēm, jo tās ļauj slimību noteikt infekcijas sākuma stadijā. Turklāt lielākā daļa Eiropas Savienības dalībvalstu nacionālo references laboratoriju izmanto reāllaika RT-PCR metodes, tostarp Āfrikas zirgu mēra diagnosticēšanai, kas no 2009. gada līdz 2014. gadam veiktajos ikgadējos kvalifikācijas testu uzdevumos izrādījušās derīgas paredzētajam mērķim. Ziņojumā arī norādīts, ka ārpus Savienības ir daudz OIE references laboratoriju un citu laboratoriju ar konkrētu pieredzi Āfrikas zirgu mēra diagnosticēšanā, kuras ir ieviesušas vismaz vienu no reāllaika RT-PCR metodēm Āfrikas zirgu mēra genoma diagnosticēšanai.

Lai gan visas pieejamās reāllaika RT-PCR metodes Āfrikas zirgu mēra genoma diagnosticēšanai ir pietiekami jutīgas, laboratorijās tiek plaši izmantota Agüero et al. (2008) (4) aprakstītā procedūra. Guthrie et al. (2013) (5) aprakstītā metode tika īpaši izstrādāta, lai nodrošinātu, ka pēc Sauszemes dzīvnieku veselības kodeksā (6) noteiktā minimālā karantīnas perioda zirgus var droši transportēt no apgabaliem, kuros pastāv Āfrikas zirgu mēra risks.

Tādēļ Direktīvas 2009/156/EK IV pielikums būtu jāgroza, svītrojot konkurējošo ELISA un atjauninot netiešās un bloķējošās ELISA procedūras saskaņā ar 2.5.1. nodaļu Pasaules dzīvnieku veselības organizācijas (OIE) Sauszemes dzīvnieku diagnostisko testu un vakcīnu rokasgrāmatā, 2016. gada izdevumā, kas balstās uz 2012. gada maijā OIE pasaules delegātu sanāksmē pieņemto versiju (7) . Vienlaicīgi pielikumā būtu jāiekļauj arī Agüero et al. (2008) aprakstītā un Guthrie et al. (2013) aprakstītā reāllaika RT-PCR procedūra, lai padarītu šos aģentu noteikšanas testus pieejamus pirmspārvietošanas testēšanas nolūkā.

IR PIEŅĒMUSI ŠO LĒMUMU.

1. pants

Direktīvas 2009/156/EK IV pielikumu aizstāj ar šā lēmuma pielikumu.

2. pants

Šis lēmums ir adresēts dalībvalstīm.

(1) OV L 192, 23.7.2010., 1. lpp.

(2) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.01_AHS.pdf.

(3) Padomes 1992. gada 29. aprīļa Direktīva 92/35/EEK, ar ko paredz kontroles noteikumus un pasākumus Āfrikas zirgu mēra apkarošanai (OV L 157, 10.6.1992., 19. lpp.).

(4) Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. un Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325. – 328. lpp.

(5) Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30-35.

(6) http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahc/current/chapitre_ahs.pdf.

(7) Skatīt 2. zemsvītras piezīmi.

PIELIKUMS

“IV PIELIKUMS ĀFRIKAS ZIRGU MĒRIS DIAGNOSTIKA A DAĻA Seroloģiskie testi Turpmāk aprakstītās seroloģiskās metodes ir imūnfermentatīvās analīzes (ELISA), kas balstās uz 2.5.1. nodaļas B daļas 2. punktu Sauszemes dzīvnieku diagnostisko testu un vakcīnu rokasgrāmatā, 2016. gada izdevumā, kā pieņemts OIE pasaules delegātu sanāksmē 2012. gada maijā. VP7 vīrusa proteīns ir imūndominants Āfrikas zirgu mēra vīrusa (AHSV) lielākais antigēnais proteīns, un tas saglabājas deviņos serotipos. Rekombinētie AHSV-VP7 proteīni ir stabili un nekaitīgi, un piemēroti izmantošanai par antigēniem ELISA procedūrās AHSV antivielu noteikšanai ar augstu jutības un specifiskuma pakāpi (Laviada et al., 1992b (1); Maree un Paweska, 2005). Netiešā ELISA un bloķējošā ELISA ir divi AHS-VP7 ELISA testi, kas ir piemēroti Āfrikas zirgu mēra (AHS) seroliģiskajai diagnosticēšanai. 1. Netiešā ELISA Āfrikas zirgu mēra vīrusa (AHSV) antivielu noteikšanai Šajā metodē izmantotais konjugāts ir mārrutku peroksidāzes pretzirgu gammaglobulīns, kas reaģē ar zirgu, mūļu un ēzeļu serumu. Maree un Paweska (2005) (2) aprakstītajā metodē par konjugātu izmanto G proteīnu, kas reaģē ar zebru serumu. Antigēnu 4 līdz 6 mēnešu laikā pēc pieprasījuma var saņemt no Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), Spānijā. 1.1. Testa procedūra 1.1.1. Cietā fāze 1.1.1.1. ELISA plates pārklāj ar rekombinētu AHSV-4 VP7, kas izšķīdināts karbonāta/bikarbonāta bufervielā, pH 9,6. Plates atstāj pa nakti inkubēties 4 °C temperatūrā. 1.1.1.2. Plates piecas reizes mazgā ar destilētu ūdeni, kas satur 0,01 % (masas) Tween 20 (mazgāšanas šķīdumu). Viegli uzsit pa platēm virs absorbējoša materiāla, lai atbrīvotos no atlikušajām mazgāšanas sastāvdaļām. 1.1.1.3. Plates bloķē ar fosfātu fizioloģisko buferšķīdumu (PBS) pH 7,2 + 5 % (m/V) vājpiens (Nestlé Dry Skim Milk TM), 200 μl/iedobe, vienu stundu 37 °C temperatūrā. 1.1.1.4. Atbrīvojas no bloķējošā šķīduma un viegli uzsit pa platēm virs absorbējoša materiāla. 1.1.2. Testa paraugi 1.1.2.1. Testējamos seruma paraugus un pozitīvos un negatīvos kontrolserumus proporcijā 1 pret 25 izšķīdina PBS + 5 % (masas) vājpiens + 0,05 % (masas) Tween 20, 100 μl uz iedobi. Inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā. Lai veiktu titrēšanu, sagatavo divkārša atšķaidījuma virknes no 1 pret 25 (100 μl/iedobe), viens serums attiecībā uz vienu plates aili, un tāpat rīkojas ar pozitīvajām un negatīvajām kontrolēm. Inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā. 1.1.2.2. Plates piecas reizes mazgā ar destilētu ūdeni, kas satur 0,01 % (masas) Tween 20 (mazgāšanas šķīdumu). Viegli uzsit pa platēm virs absorbējoša materiāla, lai atbrīvotos no atlikušajām mazgāšanas sastāvdaļām. 1.1.3. Konjugāts 1.1.3.1. Izdala 100 μl/iedobe mārrutku peroksidāzes (HRP) pretzirgu gammaglobulīna konjugāta, kas izšķīdināts PBS + 5 % piena + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā. 1.1.3.2. Plates piecas reizes mazgā ar destilētu ūdeni, kas satur 0,01 % (masas) Tween 20 (mazgāšanas šķīdumu). Viegli uzsit pa platēm virs absorbējoša materiāla, lai atbrīvotos no atlikušajām mazgāšanas sastāvdaļām. 1.1.4. Hromogēns/substrāts 1.1.4.1. Pievieno 200 μl/iedobe hromogēna/substrāta šķīduma (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetilaminobenzaldehīds) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzotiazolīnhidrazona hidrohlorīds) + 5 μl H2O2). Krāsas veidošanos aptur, apmēram pēc 5 līdz 10 minūtēm (pirms sāk iekrāsoties negatīvā kontrole) pievienojot 50 μl 3N H2SO4. Var izmantot arī citus hromogēnus, kā, piemēram, ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etilbenzotiazolīn-6-sulfoskābe]), TMB (tetrametilbenzidīns) vai OPD (ortofenildiamīns). 1.1.4.2. Veic plašu nolasījumus pie 600 nm (vai 620 nm). 1.2. Rezultātu interpretācija 1.2.1. Aprēķina izslēgšanas vērtību, pieskaitot negatīvās kontroles vērtībai 0,06 (0,06 ir standartnovirze, kādu iegūst 30 negatīvu serumu grupā). 1.2.2. Testa paraugi, kas uzrāda zemākas absorbcijas vērtības nekā izslēgšanas vērtība, uzskatāmi par negatīviem. 1.2.3. Testa paraugi, kas uzrāda lielākas absorbcijas vērtības nekā izslēgšanas vērtība + 0,15, uzskatāmi par pozitīviem. 1.2.4. Testa paraugi, kuru uzrādītās absorbcijas vērtības atrodas vidus posmā, uzskatāmi par nepārliecinošiem, un rezultāta apstiprināšanai jālieto otra metode. 2. Bloķējošā ELISA Āfrikas zirgu mēra vīrusa (AHSV) antivielu noteikšanai Konkurējošā bloķējošā ELISA ir izstrādāta tā, lai noteiktu specifiskās AHSV antivielas jebkuras zirgu dzimtas sugas dzīvnieku, t. i., zirgu, ēzeļu, zebru un to krustojumu, serumos, novēršot šo specifiskuma problēmu, ar ko reizēm nācās saskarties, izmantojot netiešo ELISA. Testa princips ir bloķēt reakciju starp rekombinēto VP7 proteīnu, kas absorbēts uz ELISA plates, un konjugēto AHS-VP7 specifisko monoklonālo antivielu (Mab). Antiviela testa serumos bloķē reakciju starp antigēnu un Mab, kā rezultātā vājinās krāsas reakcija. Tā kā Mab ir vērsta pret VP7, pārbaudei piemīt augsta jutības un specifiskuma pakāpe. Konkurējošā bloķējošā ELISA ir komerciāli pieejama. 2.1. Testa procedūra 2.1.1. Cietā fāze 2.1.1.1. ELISA plates pārklāj ar 50-100 ng rekombinētu AHSV-4 VP7, kas izšķīdināts karbonāta/bikarbonāta bufervielā, pH 9,6. Plates atstāj pa nakti inkubēties 4 °C temperatūrā. 2.1.1.2. Plates trīs reizes mazgā ar 0,1× fosfātu fizioloģisko buferšķīdumu (PBS), kas satur 0,135 M NaCl un 0,05 % (masas) Tween 20 (PBST). Viegli uzsit pa platēm virs absorbējoša materiāla, lai atbrīvotos no atlikušajām mazgāšanas sastāvdaļām. 2.1.2. Testa paraugi un kontroles 2.1.2.1. Testējamos seruma paraugus un pozitīvos un negatīvos kontrolserumus proporcijā 1 pret 5 izšķīdina 0,35 M NaCl, 0,05 % (masas) Tween 20 un 0,1 % katona, 100 μl uz iedobi. Inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā. Lai veiktu titrēšanu, sagatavo testa seruma divkārša atšķaidījuma virknes no 1 pret 10 līdz 1 pret 280 astoņās iedobēs(100 μl/iedobe), viens serums uz vienu plates aili, un tāpat rīkojas ar pozitīvajām un negatīvajām kontrolēm. Inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā. 2.1.2.2. Plates piecas reizes mazgā ar 0,1× fosfātu fizioloģisko buferšķīdumu (PBS), kas satur 0,135 M NaCl un 0,05 % (masas) Tween 20 (PBST). Viegli uzsit pa platēm virs absorbējoša materiāla, lai atbrīvotos no atlikušajām mazgāšanas sastāvdaļām. 2.1.3. Konjugāts 2.1.3.1. Izdala 100 μl/iedobe mārrutku peroksidāzes konjugāta Mab anti-VP7. Iepriekš šīs Mab atšķaida 1/5 000–1/15 000StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Atsauce: SZ03) 1/1 šķīdumā destilētā ūdenī. Inkubē 30 minūtes 37 °C temperatūrā. 2.1.3.2. Plates piecas reizes mazgā ar 0,1× fosfātu fizioloģisko buferšķīdumu (PBS), kas satur 0,135 M NaCl un 0,05 % (masas) Tween 20 (PBST). Viegli uzsit pa platēm virs absorbējoša materiāla, lai atbrīvotos no atlikušajām mazgāšanas sastāvdaļām. 2.1.4. Hromogēns/substrāts Pievieno 100 μl/iedobe hromogēna/substrāta šķīduma, t. i., 1 ml ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etilbenzotiazolīn-6-sulfoskābe]) 5 mg/ml + 9 ml substrāta bufervielas (0,1 M fosfāta-citrāta buferšķīduma ar pH 4, kas satur 0,03 % H2O2) un inkubē 10 minūtes istabas temperatūrā. Krāsas veidošanos aptur, pievienojot 100 μl/iedobe 2 % (masas) SDS (nātrija dodecilsulfāts). 2.1.5. Nolasīšana Nolasījumu veic pie 405 nm ELISA nolasītājā. 2.2. Rezultātu interpretācija 2.2.1. Katra parauga bloķējošo procentuālo daļu (BP) nosaka, izmantojot šādu formulu, kur “Abs” ir antivielas: 2.2.2. Paraugi ar BP vērtību, kas pārsniedz 50 %, būtu jāuzskata par pozitīviem attiecībā uz AHSV antivielām. 2.2.3. Paraugi ar BP vērtību, kas ir zemāka par 45 %, būtu jāuzskata par negatīviem attiecībā uz AHSV antivielām. 2.2.4. Paraugi ar BP vērtību robežās no 45 % līdz 50 %, būtu jāuzskata par nepārliecinošiem un jātestē atkārtoti. Ja rezultāts atkal ir nepārliecinošs, dzīvniekiem veic atkārtotu testēšanu no paraugiem, kas noņemti ne agrāk kā divas nedēļas pēc tam, kad tika noņemti paraugi, kuri tika uzskatīti par nepārliecinošiem. B DAĻA Aģenta noteikšana Reāllaika atgriezeniskās transkriptāzes polimerāzes ķēdes reakcija (rRT-PCR) Aģentu noteikšanas testiem, kuru pamatā ir nukleīnskābju metodes, jānosaka references celmi no deviņiem AHSV vīrusa serotipiem. 2.1. punktā aprakstītā metode ir balstās uz 2.5.1. nodaļas B daļas 1.2. punktu Sauszemes dzīvnieku diagnostisko testu un vakcīnu rokasgrāmatā, 2016. gada izdevumā, kā pieņemts OIE pasaules delegātu sanāksmē 2012. gada maijā. Jebkuru RT-PCR metodi, ko Direktīvas 2009/156/EK kontekstā izmanto paraugu, vai nu asins, vai liesas, testēšanai, jāveic ar 2. punktā aprakstītai metodei pielīdzināmu vai augstāku jutību. Inaktivētu 1. līdz 9. serotipa vīrusa standarta celmus var saņemt no Eiropas Kopienas references laboratorijas vai OIE References laboratorijas attiecībā uz Āfrikas zirgu mēri Algetē, Spānijā. 1. Vīrusa RNS ekstrahēšana Lai nodrošinātu labu reakciju, no parauga nepieciešams ekstrahēt ļoti kvalitatīvu AHSV RNS. Nukleīnskābju ekstrahēšanu no klīniskajiem paraugiem var veikt ar dažādām iekšējām un komerciāli pieejamām metodēm. Komerciāli pieejamos testēšanas komplektos izmanto dažādas pieejas RNS izolācijai. Lielākā daļa balstās uz vienu no šādām procedūrām: — nukleīnskābju fenolhloroforma ekstrahēšana, — nukleīnskābju adsorbcija filtrēšanas sistēmā, — nukleīnskābju adsorbcija magnētisku lodīšu sistēmā. Turpmāk dots piemērs iekšējai RNS ekstrahēšanai: 1.1. 1 g audu paraugu homogenizē 1 ml denaturēšanas šķīdumā (4 M guanīdija tiocianāta, 25 mM nātrija citrāta, 0,1 M 2-merkaptoetanola, 0,5 % sarkozila). 1.2. Pēc centrifugēšanas supernatantam pievieno 1 μg rauga RNS, 0,1 ml 2 M nātrija acetāta pH 4 un 1 ml fenola, un 0,2 ml hloroforma/izoamilspirta maisījumu (49/1). 1.3. Suspensiju enerģiski sakrata un atdzesē uz ledus 15 minūtes. 1.4. Pēc centrifugēšanas ūdens fāzē esošā RNS ir ekstrahēts fenols, izgulsnēts etanols un atkārtoti suspendēta sterilā ūdenī. 2. Reāllaika RT-PCR procedūra 2.1. Grupai specifiskā reāllaika RT-PCR saskaņā ar Agüero et al., 2008 (3) Šī grupai specifiskā reāllaika RT-PCR attiecas uz AHSV VP7, un ar to var noteikt visus zināmos AHSV serotipus un patlaban apritē esošos mikrobu celmus. Tās izmantošana to Eiropas Savienības dalībvalstu valsts references laboratorijās, kas piedalījās Eiropas Savienības references laboratorijas organizētajos ikgadējos kvalifikācijas testos laikposmā no 2009. līdz 2015. gadam, sniegusi ļoti labus rezultātus. Turklāt starptautiskā strarplaboratoriju salīdzinošā testēšanā, kas 2015. gadā tika rīkota OIE references laboratoriju tīkla ietvaros, minētais protokols starp citiem ierindojās ļoti augstā pozīcijā. Praimera un zondes sekvences AHSV sugu vīrusu noteikšanai: — tiešais praimers 5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′ — atgriezeniskais praimers 5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′ — MGB-TaqMan zonde 5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′ 2.1.1. Primera krājumu koncentrāciju atšķaida līdz 8 μM darba koncentrācijai (“praimera darba krājumi 8 μM”), bet zondi atšķaida līdz 50 μM darba koncentrācijai (“zondes darba krājumi 50 μM”). Testa plates izkārtojums būtu jāizstrādā un jāielādē reāllaika PCR mašīnas programmatūrā. Izmantojot izkārtojumu par norādi, 2,5 μl no katra praimera darba krājumi 8 μM pievieno katrā iedobē, kas satur RNS paraugus, pozitīvās un vai negatīvās kontroles (praimera galīgā koncentrācija būs 1 μM 20 μM RT-PCR maisījuma). Plati tur uz ledus. 2.1.2. 2 μl izolētas RNS (testa paraugiem un pozitīvās kontroles) vai 2 μl no RNS brīva ūdens negatīvās reakcijas kontrolēs sajauc ar tiešo un atgriezenisko praimeru. Šo maisījumu denaturē, karsējot 5 minūtes 95 °C temperatūrā, kam seko ātra atdzesēšana uz ledus vismaz 5 minūtes. 2.1.3. Attiecīgu daudzumu vienpakāpes reāllaika RT-PCR galvenā maisījuma analizējamo paraugu skaitam sagatavo pēc ražotāja norādījumiem. 0,1μl zondes darba krājumi 50 μM pievieno katrā iedobē, kas satur RNS paraugus, (zondes galīgā koncentrācija būs 0,25 μM katrā iedobē, kas satur RNS paraugus). 13 μl vienpakāpes reāllaika RT-PCR galvenā maisījuma sadala katrā iedobē uz PCR plates, kas satur denaturētos praimerus un RNS. 2.1.4. Plati ievieto reāllaikā termoprocesorā, kas ieprogrammēts uz atgriezeniskās transkriptāzes un cDNS pastiprināšanas/fluorescences noteikšanu. Pastiprināšanas apstākļi ietver pirmo atgriezeniskās transkriptāzes pakāpi 25 minūtes 48 °C temperatūrā, kam seko 10 minūtes 95 °C temperatūrā (“karstā iedarbināšana”) un 40 cikli pa 15 sekundēm 95 °C temperatūrā, 35 sekundes 55 °C temperatūrā un 30 sekundes 72 °C temperatūrā (vai 40 cikli pa 2 sekundēm 97 °C un 30 sekundes 55 °C temperatūrā, ja izmanto reaģentus un termoprocesoru, kas pieļauj ātru reaģēšanu). Fluorescences datus iegūst 55 °C temperatūras pakāpes beigās. 2.1.5. Ja iegūtas netipiskas pastiprināšanas līknes, analīze uzskatāma par nederīgu un tā jāatkārto. Paraugus uzskata par pozitīviem, ja Ct vērtība (ciklu skaits, kuros reakcijā ģenerētā fluorescence šķērso fluorescences slieksni) ir mazāka par vai vienāda ar noteikto Ct slieksni (35) 40 PCR ciklos (Ct ≤ 35). Paraugi uzskatāmi par nepārliecinošiem, ja Ct vērtība ir augstāka nekā noteiktais Ct slieksnis (35) 40 PCR ciklos (Ct ≥ 35). Paraugi ir uzskatāmi par negatīviem, ja ir iegūta horizontālās pastiprināšanas līkne, kas nešķērso sliekšņa līkni 40 PCR ciklos. 2.2. Grupai specifiskā reāllaika RT-PCR saskaņā ar Guthrie et al., 2013 (4) Reāllaika RT-PCR, kurā izmanto fluorescences rezonanses enerģijas pārvades (FRET) zondes, lai noteiktu AHSV nukleīnskābi. Aprakstītā AHSV RT-PCR analīze tika izstrādāta, izmantojot sekvences no dažādiem patlaban apritē esošiem AHSV pamatcelmiem (Quan et al., 2010 (5)). Tajā ietilpst arī patentēta sintētiska ārēja kontroles analīze, lai pārbaudītu analīzes komponentu pareizu darbību. Vienpakāpes reāllaika PCR testēšanas komplekti ir pieejami tirdzniecībā. Turpmāk saskaņā ar Guthrie et al. (2013) sniegti daži pamatsoļi, kurus var mainīt atkarībā no vietējām/gadījumam specifiskām prasībām, izmantotajiem testēšanas komplektiem un pieejamā aprīkojuma. Praimera un zondes sekvences AHSV sugu vīrusu noteikšanai: — tiešais praimers 5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′ — atgriezeniskais praimers 5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′ — MGB-TaqMan zonde 5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′ 2.2.1. Praimera un zondes maisījuma standartšķīdumus gatavo 25× koncentrācijā 5 μΜ attiecībā uz tiešo un atgriezenisko praimeru un 3 μΜ attiecībā uz zondi. Testa plates izkārtojums būtu jāizstrādā un jāielādē reāllaika PCR mašīnas programmatūrā. Izmantojot izkārtojumu par norādi, 5 μl RNS paraugus, tostarp testa paraugus un pozitīvās un negatīvās kontroles, pievieno attiecīgajās plates iedobēs, kā paredzēts norādē. 2.2.2. RNS denaturē, karsējot 5 minūtes 95 °C temperatūrā, kam seko ātra atdzesēšana uz ledus vismaz 3 minūtes. 2.2.3. Attiecīgu daudzumu vienpakāpes reāllaika RT-PCR galvenā maisījuma analizējamo paraugu skaitam sagatavo pēc ražotāja norādījumiem. 1 μl no 25× praimera un zondes maisījuma standartšķīduma (iepriekš 2.2.1. punktā) iekļauj galvenajā maisījumā, lai katrā iedobē iegūtu galīgo koncentrāciju 200 nM attiecībā uz katru praimeru un 120 nM zondes. 20 μl galvenā maisījuma sadala katrā iedobē uz PCR plates, kas satur denaturētās RNS. 2.2.4. Plati ievieto reāllaikā termoprocesorā, kas ieprogrammēts uz atgriezeniskās transkriptāzes un cDNS pastiprināšanas/fluorescences noteikšanu atbilstoširažotāja norādēm. Pastiprināšanas apstākļi ietver, piemēram, pirmo atgriezeniskās transkriptāzes pakāpi 10 minūtes 48 °C temperatūrā, kam seko 10 minūtes 95 °C temperatūrā un 40 cikli pa 15 sekundēm 95 °C temperatūrā un 45 sekundes 60 °C temperatūrā. 2.2.5. Paraugi ir uzskatāmi par pozitīviem, ja AHSV RT-PCR analīzes normalizēta fluorescence pārsniedz 0,1 slieksni 36 PCR ciklos visos parauga atkārtojumos. Paraugi ir uzskatāmi par nepārliecinošiem, ja AHSV RT-PCR analīzes normalizēta fluorescence pārsniedz 0,1 slieksni starp 36 un 40 PCR cikliem visos parauga atkārtojumos. Paraugi ir uzskatāmi par negatīviem, ja AHSV RT-PCR analīzes normalizēta fluorescence nepārsniedza 0,1 slieksni 40 PCR ciklos visos parauga atkārtojumos un ja patentētās sintētiskas ārējas kontroles analīzes normalizēta fluorescence pārsniedza 0,1 slieksni 33 PCR ciklos.”

(1) M.D., Roy P. un Sanchez-Vizcaino J.M (1992b). Adaptation and evaluation of an indirect ELISA and immunoblotting test for African horse sickness antibody detection. In: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbiviruses: Proceedings of the Second International Symposium. Walton T.E. un Osburn B.l., Eds. CRC Press, Boca Raton, Florida, ASV, 646–650.

(2) Maree S. un Paweska J.T. (2005). Preparation of recombinant African horse sickness virus VP7 antigen via a simple method and validation of a VP7-based indirect ELISA for the detection of group-specific IgG antibodies in horse sera. J. Virol. Methods, 125 (1), 55–65.

(3) Agüero M., Gomez-Tejedor C., Angeles Cubillo M., Rubio C., Romero E. un Jimenez-Clavero A. (2008). Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus. J. Vet. Diagn. Invest., 20, 325–328.

(4) Guthrie AJ, MacLachlan NJ, Joone C, Lourens CW, Weyer CT, Quan M, Monyai MS, Gardner IA. Diagnostic accuracy of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay for detection of African horse sickness virus. Journal of Virological Methods. 2013;189(1):30-5.

(5) Quan, M., Lourens, C.W., MacLachlan, N.J., Gardner, I.A., Guthrie, A.J., 2010. Development and optimisation of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus. J. Virol. Methods 167, 45–52.