I PIELIKUMS

3. panta 2. punktā minētās testēšanas metodes attiecīgā kaitīgā organisma noteikšanai un identifikācijai

1. Testēšana, izmantojot sporas

Noteikšanai un identifikācijai izmanto vasaras sporangijus un snaudsporas, ko iegūst no augsnes pēc tās izsijāšanas vai tieši no augu materiāla.

2. Noteikšanas metodes

Attiecīgā kaitīgā organisma sporu iegūšanai no augsnes izmanto vienu no šādām metodēm:

a) augsnes sijāšanas metode, ko aprakstījis Pratt (1976) (1);

b) augsnes sijāšanas metode, ko aprakstījis van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) zonālās centrifugēšanas metode augstas caurlaidspējas paraugu apstrādei, kā aprakstījis Wander et al. (2007) (3).

3. Identifikācijas metodes

Pēc attiecīgā kaitīgā organisma sporu iegūšanas tās identificē, izmantojot vienu no šādām metodēm:

a) morfoloģiskā identifikācija, izmantojot gaismas mikroskopu ar palielinājumu 100x–400 x;

b) konvencionālais PCR tests, izmantojot praimerus, ko izstrādājuši Lévesque et al. (2001) (4) un van den Boogert et al. (2005) (5);

c) reālā laika PCR tests, izmantojot praimerus un zondes atbilstoši van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d) reālā laika PCR tests, izmantojot praimerus un zondes atbilstoši Smith et al. (2014) (7).

4. Snaudsporu dzīvotspēja

Snaudsporu dzīvotspēju var noteikt, izmantojot mikroskopēšanu vai veicot bioloģisko pārbaudi. Sporangiju dzīvotspēju var noteikt, izmantojot mikroskopēšanu, lai pārbaudītu sporangijus laktofenolā vai ūdenī (Przetakiewicz 2015) (8). Sporangijus ar graudainu saturu vai ar nedaudz noapaļotu protoplazmu var uzskatīt par dzīvotspējīgiem. Sporangijus, kas ir pastāvīgi plazmolizēti vai bez acīmredzama satura, uzskata par mirušiem.

Alternatīvi vai šaubu gadījumā var veikt bioloģisko pārbaudi, kā aprakstīts IV pielikuma 3. punktā.

5. Patotipu noteikšana

Patotipu noteikšanai ir vajadzīgi svaigi izaugumi.

Inokulātu testam sagatavo, izmantojot vienu no šīm metodēm:

a) SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture) metode, kas sastāv no šādām divām darbībām: i) inokulāta sagatavošana. Vecus (nobrūnējušus) izaugumu audus sadala mazākās daļiņās un izžāvē istabas temperatūrā, līdz tie kļūst cieti. Sacietējušos audus samaļ manuāli vai mehāniski. Samalto materiālu izsijā caur sausu sietu, iegūstot frakciju no 25 līdz 75 μm, un tad izdala, izmantojot Pratt (1976)1 hloroforma metodi; ii) svaigu izaugumu sagatavošana. Aptuveni 10 mg izdalīto snaudsporu uzsmidzina uz 10 ml sterila destilēta ūdens virsmas mazā plastmasas Petri platē un inkubē tumsā 20 °C temperatūrā līdz dīgšanai. Kartupeļu bumbuļus ar maziem, aptuveni 1–2 mm gariem asniem ieliek caurspīdīgās plastmasas kastēs, kas izklātas ar samitrinātu papīra salveti, ar atzīmētajiem asniem uz augšu. Asniem apkārt ar šļirci apziež izkausētu vazelīnu, izveidojot gredzenu. Gredzenam ir jābūt nepārtrauktam un pietiekami augstam, lai noturētu sporu suspensiju un tā nenoplūstu. 10 ml dīgstošo snaudsporu vēl atšķaida līdz 20 ml ar sterilu ūdeni un iepilina gredzenos, izmantojot pipeti vai skalotni, līdz asns ir pilnībā iemērkts sporu suspensijā. Plastmasas kastēm uzliek vākus, un inkubē četras dienas 10 °C temperatūrā, pēc tam kastes atver, inokulātu un vazelīna gredzenus noņem, un kastes pārvieto uz mitru siltumnīcu 15–18 °C temperatūrā (16 stundas gaismā);

b) Spiekermann & Kothoff (1924) (9) metode;

c) Potoček et al. (1991) (10) metode;

d) Glynne-Lemmerzahl metode (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble and Glynne 1970 (13)).

Lai noteiktu visus patotipus, par kuriem zināms, ka tie ir būtiski Savienībā (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) un 38(Nevşehir), izmanto diferenciālu inficēšanas testu ar dažādām attiecīgā auga šķirnēm, kā norādīts tabulā. Inficēšanas testu veic, ievērojot protokolu, kas minēts d) punktā (Glynne-Lemmerzahl metode).

Kartupeļu šķirņu selektīvais jutīgums S. endobioticum patotipu noteikšanai

Šķirne S. endobioticum patotipi 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R “S”: ieņēmīga “R”: izturīga *: norāda vāju šķirnes ieņēmību pret S. endobioticum (“nenekrotisku soru grupu klātbūtne bez izaugumu veidošanās”).

(1) Pratt M. A. 1976. “A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil.”Annals of Applied Biology 82: 21. – 29. lpp.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. “Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents.”EPPO Bulletin 35: 25. – 31. lpp.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. “A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil.”European Journal of Plant Pathology 119: 165. – 174. lpp.

(4) Lévesque C. A., de Jong S. N., Ward L. J. & de Boer S. H. (2001) “Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart.”Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200. – 201. lpp.

(5) van den Boogert P. H. J. F., van Gent-Pelzer M. P. E., Bonants P. J. M., de Boer S. H., Wander J. G. N., Lévesque C. A., van Leeuwen G. C. M., Baayen R. P. 2005. “Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease.”European Journal of Plant Pathology 113: 47. – 57. lpp.

(6) van Gent-Pelzer M. P. E., Krijger M., Bonants P. J. M. 2010. “Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants.”European Journal of Plant Pathology 126: 129. – 133. lpp.

(7) Smith D. S., Rocheleau H., Chapados J. T., Abbott C., Ribero S., Redhead S. A., Lévesque C. A., De Boer S. H. 2014. “Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil.”Phytopathology 104: 422. – 432. lpp.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. “The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland.”American Journal of Potato Research 92:704-708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. “Testing potatoes for wart resistance.”Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114. – 115. lpp.

(10) Potoček, J., Krajíčková, K., Klabzubová, S., Krejcar, Z., Hnízdil, M., Novák, F., Perlová, V. 1991. “Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic.”Ochrana Rostlin 27: 191. – 205. lpp.

(11) Glynne MD. 1925. “Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum.”Annals of Applied Biology 12: 34. – 60. lpp.

(12) Lemmerzahl, J. 1930. “A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance.”Züchter 2: 288. – 297. lpp.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. “Wart disease of potatoes.”FAO Plant Protection Bulletin 18: 125. – 135. lpp.