Oficiālais Vēstnesis L 093 , 13/04/1991 Lpp. 0001 - 0048

Speciālizdevums somu valodā: Nodaļa 3 Sējums 37 Lpp. 0012

Speciālizdevums zviedru valodā: Nodaļa 3 Sējums 37 Lpp. 0012



Komisijas lēmums (1991. gada 14. februāris), ar ko nosaka dažas svaigpiena un termiski apstrādāta piena analīžu un testu metodes (91/180/EEK) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1985. gada 5. augusta Direktīvu 85/397/EEK par veselības un veterinārajām problēmām, kas ietekmē Kopienas iekšējo tirdzniecību ar termiski apstrādātu pienu [1], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Direktīvu 89/662/EEK [2], un jo īpaši tās 10. panta 2. punktu, tā kā 10. panta 2. punktā ir paredzēts, ka Komisija nosaka analīžu un testu metodes, kas pielietojamas, lai kontrolētu atbilstību svaigpiena un termiski apstrādāta piena standartiem; tā kā attiecībā uz svaigpienu ir jānosaka metodes, kas ļauj konstatēt dzīvotspējīgo mikroorganismu skaitu, dzīvotspējīgo šūnu skaitu, sasalšanas temperatūru un antibiotiku klātbūtni; tā kā attiecībā uz pasterizētu pienu ir jānosaka metodes, kas ļauj konstatēt patogēnu neesību, kolibaktēriju skaitu, dzīvotspējīgo mikroorganismu skaitu, fosfātu neesību, peroksidāzes klātbūtni, antibiotiku neesību un sasalšanas temperatūru; tā kā attiecībā uz sterilizētu pienu un ultrasterilizētu (ļoti augstā temperatūrā sterilizētu) pienu ir jānosaka metodes, kas ļauj konstatēt dzīvotspējīgo mikroorganismu skaitu un antibiotiku neesību; tā kā tehnisku apsvērumu dēļ ir lietderīgi vispirms noteikt analīžu un testu standartmetodes, lai nodrošinātu atbilstību standartiem; tā kā ir jāturpina izskatīt nosacījumus, pie kādiem piemērojamas analīžu un testu rutīnas metodes; tā kā, kamēr nav saņemti šādas izskatīšanas rezultāti, dalībvalstis ir atbildīgas par piemērotu rutīnas metožu izmantošanu, lai nodrošinātu atbilstību standartiem, kas noteikti Direktīvā 85/397/EEK; tā kā analīžu un testu standartmetožu noteikšana ietver veicamo analīzes procedūru noteikšanu un precizitātes kritēriju noteikšanu, lai nodrošinātu rezultātu vienotu skaidrojumu; tā kā šajā lēmumā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Pastāvīgās veterinārijas komitejas atzinumu, IR PIEŅĒMUSI ŠO LĒMUMU. 1. pants Svaigpiena analīzei un testēšanai ir šādas standarta procedūras: - sasalšanas temperatūras noteikšana, - mikroorganismu uzskaitījums — dzīvotspējīgo mikroorganismu noteikšana pie 30oC, - somatisko šūnu uzskaitījums, - antibiotiku un sulfonamīdu noteikšana. 2. pants Pasterizēta piena analīzei un testēšanai ir šādas standarta procedūras: - sasalšanas temperatūras noteikšana, - fosfatāzes aktivitātes noteikšana, - peroksidāzes aktivitātes noteikšana, - mikroorganismu uzskaitījums — dzīvotspējīgo mikroorganismu noteikšana pie 30oC, - mikroorganismu uzskaitījums — dzīvotspējīgo mikroorganismu noteikšana pie 21oC, - kolibaktēriju uzskaitījums — koloniju skaita noteikšana pie 30oC, - antibiotiku un sulfonamīdu noteikšana, - patogēno mikroorganismu noteikšana. 3. pants Ultrasterilizēta piena un sterilizēta piena analīzei un testēšanai ir šādas standarta procedūras: - mikroorganismu uzskaitījums — dzīvotspējīgo mikroorganismu noteikšana pie 30oC, - sasalšanas temperatūras noteikšana, - antibiotiku un sulfonamīdu noteikšana. 4. pants Analīžu un testu standarta procedūras, precizitātes kritēriju piemērošana un paraugu ņemšana jāveic saskaņā ar noteikumiem, kas izklāstīti 1. pielikumā. 5. pants Analīžu un testu standarta procedūras, kas minētas 1., 2. un 3. pantā, ir izklāstītas 2. pielikumā. 6. pants Šo lēmumu atkārtoti pārskata līdz 1992. gada 31. decembrim, lai ņemtu vērā zinātnes un tehnikas attīstību. 7. pants Šis lēmums ir adresēts dalībvalstīm. Briselē, 1991. gada 14. februārī Komisijas vārdā — Komisijas loceklis Ray Mac Sharry [1] OV L 226, 24.8.1985., 13. lpp. [2] OV L 395, 30.12.1989., 13. lpp. -------------------------------------------------- I PIELIKUMS SATURA RĀDĪTĀJS | | Lpp. | I. | Vispārīgie noteikumi… | 187 | II. | Paraugu ņemšana svaigpienam un termiski apstrādātam pienam… | 189 | I. VISPĀRĪGIE NOTEIKUMI 1. Ievads Apraksta vispārīgos noteikumus attiecībā uz reaģentiem, aprīkojumu, rezultātu izteikšanu, precizitāti un testu protokoliem. Dalībvalstu kompetentajām iestādēm un kontroles laboratorijām, kam uzdota piena paraugu ņemšana un testēšana, jāievēro vispārīgie noteikumi. 2. Reaģenti 2.1. Ūdens 2.1.1. Vienmēr, kad tiek minēts ūdens šķīdināšanai, atšķaidīšanai vai skalošanai, lieto destilētu ūdeni, dejonizētu ūdeni vai demineralizētu ūdeni ar vismaz līdzvērtīgas pakāpes tīrību, ja vien nav noteikts citādi. Ja to lieto mikrobioloģiskiem mērķiem, tam jābūt tīram no tādām vielām, kas var iespaidot vai ietekmēt mikroorganismu augšanu testa apstākļos. 2.1.2. Vienmēr, kad ir atsauces par "šķīdumu" vai "atšķaidīšanu" bez sīkāka norādījuma, tas nozīmē "šķīdumu ūdenī" vai "atšķaidīšanu ar ūdeni". 2.2. Ķimikālijas Visām izmantotajām ķimikālijām piemīt atzīta analītiskā reaģenta kvalitāte, ja vien nav noteikts citādi. 3. Aprīkojums 3.1. Aprīkojuma saraksti Atšķirīgajos standarta procedūrās norādītajos aprīkojuma sarakstos ir iekļauti tikai priekšmeti, kam ir īpašs pielietojums, un priekšmeti ar īpašu specifikāciju. 3.2. Analītiskie svari Ar analītiskajiem svariem apzīmē svarus, ar kuriem iespējams veikt svēršanu ar precizitāti līdz 0,1 mg. 4. Rezultātu izteikšana 4.1. Rezultāti Ja nav noteikts citādi, analītiskajā ziņojumā norādītais rezultāts ir vidējā aritmētiskā vērtība, ko iegūst no diviem testiem, kas atbilst šai metodei noteiktajam atkārtojamības kritērijam (5.1.). Ja atbilstības kritērijs nav izpildīts, tests ir jāatkārto vai rezultāts jāpasludina par nederīgu. 4.2. Procentuālās izteiksmes aprēķināšana Ja nav noteikts citādi, rezultātu aprēķina procentos no parauga masas. 5. Ticamības kritēriji: atkārtojamība un reproducējamība 5.1. Katrā procedūrā norādītos ticamības kritērijus definē šādi: 5.1.1. Atkārtojamība (r) ir lielums, kuru nesasniedz divu tādu testa rezultātu absolūtā starpība, kas iegūti, veicot vienu un to pašu procedūru identiskam testa materiālam tajos pašos apstākļos (tas pats laborants, tā pati iekārta, tā pati laboratorija un īss laika intervāls). 5.1.2. Reproducējamība (R) ir lielums, kuru nesasniedz divu tādu testa rezultātu absolūtā starpība, kas iegūti, veicot vienu un to pašu procedūru identiskam testa materiālam dažādos apstākļos (dažādi laboranti, dažādas iekārtas, dažādas laboratorijas un/vai dažādi laiki). 5.1.3. Ja nav noteikts citādi, katras procedūras atbilstošajos punktos norādītie atkārtojamības un reproducējamības kritēriju lielumi atspoguļo 95 % ticamības līmeni, kā definēts ISO 5725 otrajā, 1986. gada, izdevumā. Tos aprēķina no procedūras vērtēšanai izmantotu atzītu salīdzināmo pārbaužu rezultātiem. Tomēr dažām procedūrām netika veiktas salīdzināmās pārbaudes. Šajā gadījumā atkārtojamības un reproducējamības rādītāji tika iegūti aplēšu ceļā. 5.1.4. Salīdzināmās pārbaudes un koppētījumi, kas minēti 5.1.3. punktā, ir jāplāno un jāveic saskaņā ar starptautiskām pamatnostādnēm. 6. Testa protokols Testa protokols norāda uz analīzē lietoto metodi un iegūtajiem rezultātiem. Bez tam tajā minēti visi sīkākie procedūras punkti, kas nav tikuši uzskaitīti analīzes metodē vai arī tādi, kuri nav obligāti, kā arī visi apstākļi, kas varētu būt ietekmējuši iegūtos rezultātus. Testa protokols sniedz visu nepieciešamo informāciju pilnīgai parauga identificēšanai. II. PARAUGU ŅEMŠANA SVAIGPIENAM UN TERMISKI APSTRĀDĀTAM PIENAM 1. Piemērošanas joma un nozare Šajā procedūrā nosaka svaigpiena un termiski apstrādāta piena paraugu ņemšanas standarta procedūru. Paraugu ņemšanas un paraugu transportēšanas un uzglabāšanas procedūras piemēro svaigpienam, ko piegādā ražotājs, un svaigpienam un apstrādātam pienam glabāšanas tvertnēs un transportēšanas cisternās. Procedūras, kas norādītas 2., 4.4., 5. un 6. punktā, piemēro paraugu ņemšanai no tiešam patēriņam paredzēta termiski apstrādāta piena. 2. Vispārīge noteikumi Paraugu ņemšanu no svaigpiena un termiski apstrādāta piena kannās, tvertnēs, cisternās, utt., veic kvalificēts darbinieks, kas pirms tam ticis atbilstoši apmācīts. Ja tas uzskatāms par lietderīgu, kompetentās iestādes vai pārbaudes laboratorija dod norādījumus paraugu ņemšanas darbiniekiem attiecībā uz paraugu ņemšanas tehnoloģiju, lai nodrošinātu, ka paraugs ir reprezentatīvs attiecībā uz visu partiju un atbilst tai. Ja tas uzskatāms par lietderīgu, kompetentās iestādes vai pārbaudes laboratorija dod norādījumus paraugu ņemšanas darbiniekiem attiecībā uz parauga marķēšanu, lai nodrošinātu parauga nepārprotamu identifikāciju. 3. Paraugu ņemšanas aprīkojums 3.1. Vispārīgie noteikumi Paraugu ņemšanas aprīkojums ir izgatavots no nerūsējošā tērauda vai cita tādas pašas stiprības materiāla, un tā uzbūve ir piemērota paredzētajam uzdevumam (maisīšana, paraugu noņemšana, utt.). Gremdvirzuļiem un maisītājiem, ar ko sajauc šķidrumus tvertnēs, ir pietiekams virsmas laukums, lai pienācīgi samaisītu produktu, bet neradītu sasmakumu. Smeļamajiem kausiem jābūt ar stingru rokturi pietiekošā garumā, lai varētu aizsniegt paraugu jebkurā dziļumā. Smeļamā kausa tilpums nav mazāks par 50 ml. Paraugu traukiem un vākiem jābūt no stikla, piemērota metāla vai plastmasas. Materiāli, no kuriem izgatavots paraugu ņemšanas aprīkojums (tajā skaitā trauki un vāki), nedrīkst radīt paraugā nekādas izmaiņas, kas varētu ietekmēt pārbaužu rezultātus. Visas paraugu ņemšanas aprīkojuma un paraugu trauku virsmas ir tīras, sausas, gludas un bez plaisām, to stūri ir noapaļoti. 3.2. Paraugu ņemšanas aprīkojums mikrobioloģiskai pārbaudei Papildus tām prasībām, kas norādītas 3.1. punktā, paraugu ņemšanas aprīkojums, ieskaitot traukus, ir sterils. Ja vienu un to pašu paraugu ņemšanas aprīkojumu izmanto vairāku paraugu ņemšanai pēc kārtas, to tīra un sterilizē pēc katras paraugu ņemšanas atbilstoši pārbaudes laboratorijas vai kompetentās iestādes noteiktajiem norādījumiem vai prasībām un tā, lai nesabojātu nākošo paraugu. 4. Paraugu ņemšanas tehnoloģija 4.1. Vispārīgie noteikumi Neatkarīgi no tā, kādi testi jāveic, pienu pirms parauga noņemšanas rūpīgi sajauc ar manuāli vai mehāniski. Paraugu noņem tūlīt pēc sajaukšanas, kamēr piens vēl atrodas kustībā. Ja piena tvertnēs vienlaicīgi noņem vairākus piena paraugus dažādiem testiem, vispirms noņem paraugu mikrobioloģiskajai pārbaudei. Parauga lielums atkarīgs no testa vajadzībām. Izmantojamo paraugu trauku ietilpībai jābūt tādai, lai paraugs tās aizpildītu gandrīz pilnībā, tādējādi ļaujot pienācīgi sajaukt saturu pirms testēšanas, bet novērst sakulšanu transportēšanas laikā. 4.2. Manuāla paraugu ņemšana 4.2.1. Paraugu ņemšana no piena spaiņiem un kannām Samaisīšanai spainī vai kannā strauji virza augšup un lejup gremdvirzuli, nodrošinot, lai piens pienācīgi sajauktos un lai kannas sašaurinājuma daļai nepieliptu krējums. Paraugu, kas ir reprezentatīvs attiecībā uz visu kravu, iegūst saskaņā ar 4.2.4. punktu. 4.2.2. Paraugu ņemšana no lauku saimniecību piena cisternām vai tvertnēm, kas aprīkotas ar dzesēšanas ierīcēm Pienu maisa mehāniski vai manuāli, līdz tas kļuvis pietiekoši viendabīgs. Ja ir tāds piena daudzums, ko nevar sajaukt ar mehānisko maisītāju, tad maisīšanu veic manuāli. 4.2.3. Paraugu ņemšana no svaru kausa Ir svarīgi, lai, pienu nolejot svaru kausā, tas būtu pienācīgi samaisīts. Var būt nepieciešams veikt papildu maisīšanu manuāli vai mehāniski, lai nodrošinātu tauku vienmērīgu izkliedēšanos. Ja kravas apjoms, no kā jāņem paraugs, pārsniedz svaru kausa ietilpību, tad paraugu, kas ir reprezentatīvs attiecībā uz visu kravu, iegūst saskaņā ar 4.2.4. punktu. 4.2.4. Paraugu ņemšana no dalītas nefasētās kravas Ja piens, no kā jāņem paraugs, ir vairākās tvertnēs, ņem reprezentatīvu daudzumu no katras tvertnes un atzīmē to piena daudzumu, uz kādu attiecas katrs paraugs. Ja vien paraugi no katras tvertnes nav jātestē atsevišķi, šo reprezentatīvo daudzumu paraugus sajauc apjomos, kas ir proporcionāli daudzumam tajā tvertnē, no kuras tika ņemts katrs paraugs. Pēc sajaukšanas ņem paraugu(–us) no šiem kopējiem proporcionālajiem daudzumiem. 4.2.5. Paraugu ņemšana no lielām tvertnēm — glabāšanas tvertnēm, cisternvagoniem un autocisternām 4.2.5.1. Pirms paraugu ņemšanas pienu samaisa saskaņā ar attiecīgu procedūru Lai samaisītu liela apjoma glabāšanas tvertņu, cisternvagonu un autocisternu saturu, ieteicams veikt mehānisku maisīšanu (4.2.5.2.). Maisa atbilstoši laikposmam, kurā piens ir nostāvējies. Konkrētajos apstākļos pielietotās sajaukšanas procedūras efektivitāti nosaka atbilstība paredzētās analīzes uzdevumam; no sajaukšanās efektivitātes kritērija ir atkarīgs tas, vai ir vienādi analīžu rezultāti no dažādām kravas daļām ņemtiem paraugiem vai paraugiem, kas ņemti izliešanas laikā no tvertnes izvada ar noteiktiem intervāliem. Piena sajaukšanas procedūra uzskatāma par efektīvu, ja tauku satura starpība diviem šajos apstākļos ņemtiem paraugiem ir mazāka par 0,1 %. Lielā tvertnē, kam izvada atvere atrodas apakšā, noliešanas vietā var būt neliels daudzums piena, kas nav reprezentatīvs attiecībā uz visu saturu arī pēc samaisīšanas. Tāpēc priekšroka jādod paraugu ņemšanai caur lūku. Ja paraugus ņem no noliešanas izvada, notecina pietiekošu daudzumu piena, lai nodrošinātu, ka paraugi ir reprezentatīvi attiecībā uz visu kopumu. 4.2.5.2. Lielu tvertņu vai glabāšanas tvertņu, cisternvagonu vai autocisternu satura sajaukšanu var veikt: - ar cisternās iebūvētu mehānisko maisītāju, ko darbina elektromotors, - ar dzenskrūvi vai maisītāju, ko darbina elektromotors un kas novietots uz lūkas, maisītāju iegremdējot pienā, - cisternvagonu vai autocisternu gadījumā — pienam atkārtoti cirkulējot cisternas iztukšošanas sūkņiem pievienotā pārsūknēšanas šļūtenē, kas ievadīta lūkā, - ar tīri izfiltrētu saspiesto gaisu. Šajā gadījumā jālieto minimāls gaisa spiediens un tilpums, lai novērstu sasmakuma veidošanos. 4.3. Automatizēta vai daļēji automatizēta paraugu ņemšana Automatizētās vai daļēji automatizētās paraugu ņemšanas ierīces svaigpienam, ko piegādā ražotājs, var izmantot saskaņā ar norādījumiem, ko sniedz pārbaudes laboratorija vai cita kompetenta iestāde. Šādam aprīkojumam pirms lietošanas uzsākšanas un lietošanas laikā regulāri veic attiecīgas pārbaudes, kā noteikusi kompetentā iestāde. Jāpārbauda paraugu ņemšanas procedūru piemērotība, lai noteiktu: - mazāko savāktā piena daudzumu, kam var pareizi noņemt paraugu, - zudumus no jebkuras pārliešanas (kas ir saistīti ar parauga mazāko daudzumu), - spēju iegūt reprezentatīvu paraugu no kopuma pēc pienācīgas samaisīšanas. Izmantojot automatizētas vai daļēji automatizētas paraugu ņemšanas aprīkojumu, atbildīgā kompetentā valsts iestāde var noteikt kā obligātu: - mazāko piena daudzumu, no kā jāņem paraugi, - mazāko parauga daudzumu, - lielākos pieļaujamos zudumus no pārliešanas, - to, kādas analīzes var veikt vai kādus piesardzības pasākumus veic. 4.4. Paraugu ņemšana no tiešam patēriņam paredzēta termiski apstrādāta piena mazumtirdzniecības iesaiņojumā Paraugiem no tiešam patēriņam paredzēta termiski apstrādāta piena mazumtirdzniecības iesaiņojumā jābūt veselam aizzīmogotam iesaiņojumam. Ja iespējams, apstrādes uzņēmumā paraugi jāņem no iepakošanas aparāta vai atvēsināšanas telpas, cik drīz vien iespējams pēc pārstrādes. Pasterizēta piena gadījumā to veic tajā pašā dienā, kad notikusi pārstrāde. Paraugus ņem no katra termiski apstrādātā piena veida (pasterizēta, ultrasterilizēta un sterilizēta piena) tādā skaitā, kas atbilst veicamajām pārbaudēm, kā arī saskaņā ar norādījumiem, ko noteikusi pārbaudes laboratorija vai cita kompetenta iestāde. 5. Parauga identificēšana Paraugu marķē ar identifikācijas kodu, lai to varētu viegli identificēt, ievērojot norādījumus, ko sniegusi pārbaudes laboratorija vai kompetentā iestāde, lai tādējādi nodrošinātu parauga identitāti (skat. 2. punktu). 6. Parauga transportēšana un uzglabāšana Pārbaudes laboratorija sagatavo norādījumus attiecībā uz transportu, uzglabāšanu, kā arī intervālu starp paraugu ņemšanu un piena analīzi atbilstoši piena veidam un izmantojamai analīzes procedūrai. Norādījumus sagatavo saskaņā ar kompetento valsts iestādi. Norādījumos ietver šādus punktus: - transportēšanas un uzglabāšanas laikā jāveic piesardzības pasākumi, lai novērstu kaitīgu aromātu un tiešu saules staru iedarbību. Ja paraugiem izmantotais trauks ir caurspīdīgs, to uzglabā tumšā vietā, - svaigpiena paraugus, kas ņemti mikrobioloģiskajai analīzei, transportē un uzglabā temperatūrā no 0 oC līdz 4 oC. Intervāls starp paraugu ņemšanu un analīzi ir pēc iespējas mazāks, un tas nekādā gadījumā nepārsniedz 36 stundas. Kompetentā iestāde var apstiprināt uzglabāšanas temperatūru robežās no 0oC līdz 6 oC, ja intervāls starp paraugu ņemšanu un analīzi nepārsniedz 24 stundas, - pasterizēta piena paraugus, kas ņemti mikrobioloģiskajai analīzei, transportē un uzglabā temperatūrā no 0 oC līdz 4 oC. Intervāls starp paraugu ņemšanu un analīzi ir pēc iespējas mazāks, un tas nekādā gadījumā nepārsniedz 24 stundas, - piena paraugus, izņemot svaigpienu un pasterizētu pienu mikrobioloģiskajai analīzei, uzglabā laboratorijā saldēšanas apstākļos, un intervāls starp paraugu ņemšanu un analīzi ir pēc iespējas mazāks. Procedūrās ir noteikti īpaši piesardzības pasākumi attiecībā uz dažām analīzēm. -------------------------------------------------- II PIELIKUMS SATURA RĀDĪTĀJS | | Lpp. | I. | Sasalšanas temperatūras noteikšana … | 193 | II. | Fosfatāzes aktivitātes noteikšana … | 199 | III. | Peroksidāzes aktivitātes noteikšana … | 202 | IV. | Mikroorganismu uzskaitījums — dzīvotspējīgo mikroorganismu noteikšana pie 30 oC … | 203 | V. | Mikroorganismu uzskaitījums — dzīvotspējīgo mikroorganismu noteikšana pie 21 oC … | 208 | VI. | Kolibaktēriju uzskaitījums — koloniju skaita noteikšana pie 30 oC … | 212 | VII. | Somatisko šūnu uzskaitījums … | 216 | VIII. | Antibiotiku un sulfonamīdu noteikšana … | 222 | IX. | Patogēno mikroorganismu noteikšana … | 231 | I. SASALŠANAS TEMPERATŪRAS NOTEIKŠANA 1. Piemērošanas joma un nozare Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, kādā nosakāma sasalšanas temperatūra svaigpienam, pasterizētam, ultrasterilizētam un sterilizētam pilnpienam, daļēji nokrejotam pienam un vājpienam, izmantojot iekārtu (termistorkrioskopu), kurā termostatējamu vannu dzesē ar elektrisku saldētavas ierīci un dzīvsudraba termometrs ir aizstāts ar termistorzondi. Pastāv divu veidu instrumenti. Pirmais ir tāds instruments, ar ko meklē maksimālo sasalšanas temperatūru uz saldēšanas līknes "plato", bet otrs instruments komerciālu iemeslu dēļ ir noregulēts tā, lai veiktu nolasījumu noteiktu laika sprīdi pēc sasalšanas. Tā kā sasalšanas temperatūras līknes var atšķirties dažāda veida pienam, kā arī pienam un kalibrēšanai izmantotajam standarta šķīdumam, šajā standarta procedūrā jāizmanto plato meklēšanas instrumenti. Ikdienas pārbaužu mērījumiem var izmantot fiksētā laika instrumentus. Sasalšanas temperatūru var izmantot, lai noteiktu liekā ūdens proporcionālo daudzumu pienā, ja parauga skābums nepārsniedz 0,18 g pienskābes uz 100 ml (skat. 7.4. punktu). 2. Definīcija Piena sasalšanas temperatūra ir lielums, ko iegūst, veicot mērījumu saskaņā ar aprakstīto procedūru, un ko izsaka grādos pēc Celsija (oC). 3. Princips Piena analizējamo paraugu atdzesē līdz attiecīgai temperatūrai, atkarībā no instrumenta, un ar mehānisku vibrāciju izraisa kristalizāciju, kas liek temperatūrai strauji celties līdz plato, kas atbilst parauga sasalšanas temperatūrai. Instrumentu kalibrē, to noregulējot tā, lai iegūtu pareizus rādījumus diviem standarta šķīdumiem, izmantojot to pašu procedūru, ko piena paraugiem. Šādos apstākļos plato uzrāda piena sasalšanas temperatūru grādos pēc Celsija. 4. Iekārtas un stikla priekšmeti Parastais laboratoriju aprīkojums. 4.1. Krioskops Krioskops sastāv no termostatējamas dzesēšanas vannas, termistorzondes (pusvadītāja pretestības termometrs) ar pievienotu ķēdi un galvanometru vai nolasīšanas iekārtu, parauga maisītāja, ierīces sasaldēšanas uzsākšanai un paraugu ņemšanas caurulītēm. 4.1.1. Dzesēšanas vanna Var izmantot divu veidu dzesēšanas vannas. 4.1.1.1. Iegremdēšanas vanna Labi izolēta vanna, kas satur piemērotu dzesēšanas šķidrumu, ko maisa tā, lai temperatūras starpība jebkuros divos punktos šķidrumā nepārsniegtu 0,2 oC. Šķidruma temperatūras svārstības nepārsniedz 0,5 oC no nominālās vērtības, ko noteicis ražotājs. Dzesēšanas vannā ir svarīgi uzturēt pastāvīgu šķidruma līmeni. Dzesēšanas šķidrums nosedz visu paraugu ņemšanas caurulītes virsmu, kas atrodas zem tilpuma atzīmes. 4.1.1.2. Cirkulācijas vanna Piemērots dzesēšanas šķidrums nepārtraukti cirkulē ap paraugu ņemšanas caurulīti. Šķidruma temperatūras svārstības nepārsniedz 0,5 oC no nominālās vērtības, ko noteicis ražotājs. Piemērots dzesēšanas šķidrums ir 33 % (V/V) etān-1,2-diola (etilēnglikola) šķīdums ūdenī. 4.1.2. Termistors ar ķēdi Termistoram ir stikla zondes veids, kuras diametrs nepārsniedz 1,80 ± 0, 2 mm, bet elementa diametrs nepārsniedz 0,31 mm. Termistora laika konstante ir mazāka par divām sekundēm, un β rādītāja (skat. piezīmi) vērtība ir augsta. Jābūt tādam ekspluatācijas spriegumam, strāvas stiprumam un izkliedes konstantei, lai termistora temperatūra nepārsniegtu apkārtējo temperatūru vairāk par 0,0005 oC pie temperatūras – 0,512 oC. Pretestības maksimālā pielaide ir ± 5 %. Ja zonde ir krioskopā darba stāvoklī, stikla lodītes virsotne atrodas uz paraugu ņemšanas caurulītes ass un punktā, kas atrodas 44,6 ± 0, 1 mm zemāk par caurulītes augšgalu (skat. attēlu 15. lappusē). Šablons palīdz lietotājam noregulēt zondi šajā pozīcijā. Piezīme β nosaka termistora pretestibas un temperatūras parametrus saskaņā ar formulu: – × = βT2 kur: T ir temperatūra izteikta kelvinos, R ir pretestība omos pie temperatūras T, – × = βT2 ir temperatūras koeficients, β ir konstante, kas ir atkarīga no materiāla, no kura izgatavots termistors. Pastāvošajā praksē ir ieteicams, lai rādītājs būtu lielāks par 3000. 4.1.3. Mērījumi un nolasīšanas iekārta 4.1.3.1. Mērījumu princips Lietojamā instrumenta darbības pamatā ir pirmā plato sameklēšana uz sasalšanas temperatūras līknes. Plato ir līknes daļa, kurā temperatūra paliek nemainīga ± 0, 002 oC robežās vismaz 20 sekundes. 4.1.3.2. Manuāla darbināšana Termistora pretestību izlīdzina ar Vītstona tilta palīdzību vai līdzīgu ierīci, izmantojot kvalitatīvus stabilus rezistorus, kuru pielaide nepārsniedz ± 10 % un kuru temperatūras koeficients nepārsniedz 2 × 10 –5oC. Mainīgās (līdzsvarojošās) pretestības atkāpe no kopējās linearitātes nav lielāka par 0,3 % no tās maksimālās vērtības. Jābūt līdzekļiem, kas ļauj rezistorus noregulēt kalibrēšanai. Mērījumu skalas iedaļu intervāls nepārsniedz 0,001 oC. 4.1.3.3. Automatizēta darbība Nolasīšanas iekārta ļauj izšķirt vismaz 0,001 oC temperatūras diapazonā no 0 līdz – 1 oC. Nolasīšanas iekārtas un tai pievienotās ķēdes stabilitāte ir tāda, lai parauga temperatūras vairāki nolasījumi pēc kārtas neatšķirtos vairāk kā par 0,001 oC. Ķēdes linearitāte ir tāda, lai pie instrumenta pareizas ekspluatācijas temperatūras diapazonā no – 0,400 °C līdz – 0,600 °C neveidotos kļūdas, kas ir lielākas par ± 0, 001 oC. 4.1.4. Maisītājs Analizējamā parauga maisīšanai izmanto stiepli no metāla, kas nereaģē ar pienu, ar diametru no 1 līdz 1,5 mm. Noregulē maisītāja amplitūdu un maisītāju iestiprina vertikāli tā, lai tā apakšējais gals atrastos vienā līmenī ar termistorzondes galu. Pieļaujamā pielaide ir 1,5 mm abpus šim punktam. Maisītājs horizontāli vibrē pietiekošā amplitūdā, ko noteicis ražotājs (ne mazāk kā ± 1, 5 mm), nodrošinot to, ka noteikšanas gaitā analizējamajā paraugā saglabājas vienāda temperatūra. Maisītājs parastās darbības gaitā nekādā gadījumā nepieskaras termistorzondei un caurulītes sienai. 4.1.5. Ierīce sasaldēšanas uzsākšanai Tā var būt jebkāda ierīce, kuru darbinot, uzreiz sākas parauga sasaldēšana, lai analizējamā parauga temperatūra pieaugtu līdz sasalšanas temperatūrai. Šim nolūkam var izmantot maisītāju; viena metode ir tāda, ka uz vienu — divām sekundēm palielina vibrācijas amplitūdu, lai maisītājs atsistos pret paraugu ņemšanas caurulītes sienu. 4.1.6. Paraugu ņemšanas caurulītes Paraugu ņemšanas caurulītes (skat. 1. attēlu) ir izgatavotas no stikla, to garums ir 50,8 ± 0, 1 mm, ārējais diametrs ir 16,0 ± 0, 1 mm un iekšējais diametrs ir 13,5 ± 0, 1 mm. Caurulītes sienas biezums visā tās garumā neatšķiras vairāk kā par 0,1 mm. Caurulītēm jābūt ar tilpuma atzīmi 29,8 mm zem caurulītes gala (21 mm virs caurulītes pamata), lai norādītu parauga tilpumu 2,5 ± 0, 1 ml. 4.1.7. Elektroenerģijas pievads Spriegumu stabilizē pašā iekārtā vai ārpus tās, lai nominālā sprieguma svārstības nepārsniegtu ± 1 %, ja svārstības padeves spriegumā ir ± 6 %. 4.2. Analītiskie svari. 4.3. Vienas atzīmes mērkolbas ar ietilpību 1000 ml, A klase. 4.4. Labi vēdināms žāvējamais skapis, kas var uzturēt temperatūru 130 ± 1 oC, vai vēdināma elektriskā krāsns, kas var uzturēt temperatūru 300 ± 25 oC. 4.5. Eksikators. 5. Reaģenti 5.1. Borsilikāta stikla traukā destilēts ūdens, vārīts un atdzesēts līdz 20 ± 2 oC kolbā, kam pierīkota oglekļa oksīda absorbcijas caurule. 5.2. Nātrija hlorīds, kam piemīt analītiskā reaģenta kvalitāte, smalki samalts, piecas stundas žāvēts 300 ± 25 oC temperatūrā krāsnī, vai arī žāvēts vismaz 24 stundas žāvēšanas skapī 130 ± 1 oC temperatūrā, un jaudīgā eksikatorā atdzesēts līdz istabas temperatūrai. 5.3. Standartšķīdumu gatavošana Sverglāzē iesver attiecīgu daudzumu (skat. 1. tabulu) sausa nātrija hlorīda (5.2.). Izšķīdina destilētā ūdenī (5.1.), kvantitatīvi pārnes vienas atzīmes mērkolbā ar ietilpību 1000 ml un atšķaida ar ūdeni līdz atzīmei 20 ± 2 oC temperatūrā. Uzglabā apmēram 5 oC temperatūrā labi noslēgtās polietilēna pudelēs ar ietilpību, kas nepārsniedz 250 ml, ne ilgāk par diviem mēnešiem. Sasalšanas temperatūra nātrija hlorīda šķīdumiem pie 20 oC g Na Cl/l | oC | 6,859 | –0,408 | 7,818 | –0,464 | 8,149 | –0,483 | 8,314 | –0,492 | 8,480 | –0,502 | 8,646 | –0,512 | 8,811 | –0,521 | 8,977 | –0,531 | 9,143 | –0,541 | 10,155 | –0,600 | Pirms standartšķīduma lietošanas pudeli uzmanīgi apgriež otrādi un groza vairākas reizes, lai saturs pilnībā sajauktos. Standartšķīdumu nekādā gadījumā nedrīkst sajaukt tik spēcīgi, ka tajā iekļūst gaiss. Standartšķīduma paraugi jāņem no pudeles, ielejot šķīdumu tīrā, sausā vārglāzē, t.i., šim nolūkam nedrīkst lietot pipetes. Nedrīkst lietot šķīdumus, kuru saturs pudelēs ir tikai viena ceturtdaļa un kuri ir stāvējuši ilgāk par diviem mēnešiem, ja vien tie nav konservēti ar fungicīdu (piemēram, tiomersāla šķīdumu, 10 g/l). 6. Termistorkrioskopa kalibrēšana Krioskops jānoregulē tā, lai apkārtējā gaisa temperatūra neatšķirtos vairāk kā par 1 oC no tās temperatūras, kurā veic kalibrēšanu. Krioskops nedrīkst nokļūt saules gaismā vai caurvējā, vai telpas temperatūrā, kas pārsniedz 26-27 oC. Krioskopam jābūt lietošanas kārtībā saskaņā ar ražotāja norādījumiem, un tas jāieslēdz vismaz 12 stundas pirms kalibrēšanas. Pārbauda zondes pozīciju, maisītāja vibrācijas amplitūdu un dzesēšanas šķidruma temperatūru. Izvēlas divus standartšķīdumus (skat. iepriekš sniegto 1. tabulu), kas cieši ietver pārbaudāmo piena paraugu sasalšanas temperatūras paredzēto vērtību. Vēlams, lai sasalšanas temperatūru starpība abiem šķīdumiem nebūtu mazāka par – 0,100 oC. (Dažos šobrīt lietotos krioskopos termistoram pievienotā ķēde ir veidota tā, lai to noregulētu instrumenta mērīšanas diapazonā uz noteiktu sasalšanas temperatūras vērtību. Šādos gadījumos kalibrēšanas procedūru atvieglo, vienu standartšķīdumu ar šādu sasalšanas temperatūru izmantojot kā vienu no kalibrēšanas šķīdumiem; ražotājs norāda šo vērtību.) Ar pipeti iepilina 2,5 ± 0, 1 ml viena standartšķīduma tīrā, sausā paraugu ņemšanas caurulītē un darbina krioskopu. Piezīme Paraugu ņemšanas caurulītēm, ko lieto kalibrēšanā, jābūt no tā paša veida stikla, un tās jāskalo ar demineralizētu ūdeni vienlaikus ar caurulītēm, ko lieto piena paraugu testēšanā. Standartšķīdumu temperatūrai jābūt līdzīgai kā piena paraugiem. Regulēšanu veic ar kalibrēšanas vadības svirām, kā norādījis ražotājs, līdz krioskopa rādījums saskan ar standartšķīduma sasalšanas temperatūru. Procedūru atkārto ar otru standartšķīdumu, un šādi rīkojas pamīšus tik ilgi, līdz rādījumi attiecībā uz katru šķīdumu pēc kārtas atspoguļo pareizo sasalšanas temperatūras vērtību bez papildu regulēšanas. Tad krioskops ir gatavs lietošanai, un tas tieši uzrāda piena parauga sasalšanas temperatūru bez jebkādu korekciju piemērošanas. 7. Testa parauga sagatavošana 7.1. Paraugus vajadzības gadījumā uzglabā temperatūrā no 0 līdz 5 oC. 7.2. Paraugu atbrīvo no visiem redzamiem svešķermeņiem vai cietajiem sviesta taukiem, vajadzības gadījumā filtrējot tīrā, sausā traukā, tad paraugu viegli samaisa. Ja izmanto filtru, tam jābūt tādam, kas nereaģē ar pienu un ir efektīvs darbam laboratorijas temperatūrā. 7.3. Pienu var testēt, tam esot glabāšanas temperatūrā (no 0 līdz 5 oC), vai arī tas drīkst sasniegt laboratorijas temperatūru tieši pirms testa uzsākšanas. Tomēr standartšķīdumiem un piena paraugiem, tos lietojot, jābūt vienādai temperatūrai. 7.4. Nosaka piena titrējamo skābumu pēc iespējas tuvākā laikā ar sasalšanas temperatūras testu. Paraugi, kuru skābums pārsniedz 0,18 g pienskābes uz 100 ml piena, analīzei nav derīgi. 7.5. Ultrasterilizēts un sterilizēts piens pirms analīzes vismaz 20 minūtes atrodas atvērtā tvertnē. 8. Procedūra 8.1. Iepriekšējas pārbaudes Pārbauda dzesēšanas šķidruma līmeņa un temperatūras atbilstību ražotāja norādījumiem un, vajadzības gadījumā, vai termistorzonde atrodas tukšā paraugu ņemšanas caurulītē paraugu padziļinājumā. Ieslēdz krioskopu un pārliecinās, vai dzesēšanas šķidrums ir pienācīgi apmaisīts vai cirkulējis. Kad krioskops ir bijis ieslēgts vismaz 12 stundas, pārbauda dzesēšanas šķidruma temperatūru un maisītāja novietojumu, kā arī vibrēšanas amplitūdu. 8.2. Regulārā kalibrēšanas pārbaude Pirms katras lietošanas reizes mēra sasalšanas temperatūru nātrija hlorīda standartšķīdumam (piem., šķīdumam ar sasalšanas temperatūru – 0,512 oC), līdz divi nolasījumi pēc kārtas neatšķiras vairāk kā par 0,001 oC. Ja šo vērtību vidējais lielums atšķiras no standartšķīduma sasalšanas temperatūras vairāk kā par 0,002 oC, krioskopu atkārtoti kalibrē, kā aprakstīts 6. punktā. Ja krioskopu lieto nepārtraukti, regulāro kalibrēšanas pārbaudi veic vismaz reizi stundā. Jāņem vērā ražotāja norādījumi. 8.3. Sasalšanas temperatūras noteikšana pienam Parauga pudeli uzmanīgi apgriež otrādi un groza vairākas reizes, lai sajuktos tās saturs. Paraugu nekādā gadījumā nedrīkst sajaukt tik spēcīgi, ka tajā iekļūst gaiss. Ar pipeti iepilina 2,5 ± 0, 1 ml piena tīrā, sausā paraugu ņemšanas caurulītē un pārpalikumu noņem ar pipeti. Pārliecinās, ka zonde un maisītājs ir tīrs un sauss, vajadzības gadījumā rūpīgi noslaukot virzienā no apakšas uz augšu ar mīkstu, tīru, neplūksnojošu drānu. Paraugu ņemšanas caurulīti iegremdē kalibrētajā krioskopā atbilstoši ražotāja norādījumiem. Pienu atdzesē un uzsāk sasaldēšanu ražotāja norādītajā temperatūrā ar pielaidi 0,1 oC. (Dažos automātiskajos instrumentos šo temperatūru var novērot digitālajā nolasītājā; manuāli darbināmos instrumentos vajadzīgo precizitāti sasniedz tādējādi, ka sasalšana sākas tieši tad, kad galvanometra rādītāja smaile vai matlīnija sakrīt ar attiecīgo atzīmi.) Ja kāda iemesla dēļ sasalšana sākas pirms noteiktā temperatūras diapazona vai pēc tā, testu atceļ un atkārto ar citu piena analizējamo paraugu. Ja arī atkārtotais paraugs sasalst pirms noteiktās temperatūras, nākamā parauga porcija jāsasilda līdz 45 oC un jānotur piecas minūtes, lai izkustu kristāliskie tauki. Pēc tam vēlreiz atdzesē līdz pārbaudes temperatūrai un uzreiz testē. Piena temperatūra pēc sasalšanas uzsākšanas strauji ceļas līdz vērtībai, kas kādu laiku paliek nemainīga un pēc tam krītas. Sasalšanas temperatūra atbilst augstākajai temperatūrai, kas sasniegta šajā laikā; šo vērtību reģistrē. Piezīme Laiks, kurā temperatūra paliek nemainīga, un laika intervāls starp sasalšanas sākumu un augstākās temperatūras sasniegšanu dažādiem paraugiem atšķiras un attiecībā uz ūdeni un nātrija hlorīda standartšķīdumiem tas ir ievērojami īsāks nekā attiecībā uz pienu. Ir būtiski, lai reģistrētu pašu augstāko temperatūru. Ja mērījums izpildīts apmierinoši, izņem caurulīti, termistorzondi un maisītāju skalo ar ūdeni, to nosusinot ar mīkstu, tīru, neplūksnojošu drānu virzienā no apakšas uz augšu, un tad veic divkāršo noteikšanu citai piena parauga porcijai. Ja iegūtā sasalšanas temperatūru starpība ir lielāka par atkārtojamības vērtību (0,004 oC), veic divkāršu noteikšanu citai parauga porcijai. Ja abu noteikšanu rezultāti iekļaujas 0,004 oC robežās, vērtības jāreģistrē un jālieto gala rezultāta aprēķināšanai. 8.4. Zondes dzesēšana Pēc instrumenta lietošanas ievieto tukšu paraugu ņemšanas caurulīti paraugu padziļinājumā un pazemina ekspluatācijas galviņu, lai zonde būtu atdzisusi. (Dažos krioskopa modeļos tas nav iespējams; šādos gadījumos ir svarīgi nodrošināt, lai zonde būtu pienācīgi atdzesēta pirms mērījumu noteikšanas, piemēram, veicot vairākas noteikšanas tukšgaitā, līdz iegūst atbilstīgus nolasījumus.) 9. Rezultātu izteikšana 9.1. Aprēķināšana Ja pēc regulārās kalibrēšanas pārbaudes kalibrēšana ir apstiprināta, aprēķina vidējo no pieņemamām iegūtām divkāršām sasalšanas temperatūras vērtībām, noapaļojot līdz trešajai zīmei aiz komata. Ja divu pieņemamu divkāršo vērtību summa ir nepāra skaitlis, vidējais lielums jānoapaļo līdz tuvākajai pāra vērtībai, kā parādīts šajā piemērā: Sasalšanas temperatūra (oC) Divkāršās vērtībasvērtība | Vidējā | | | –0,544 | –0,545 | –0,544 | –0,545 | –0,546 | –0,546 | 9.2. Precizitāte 9.2.1. Atkārtojamība (r): 0,004 oC. 9.2.2. Reproducējamība (R): 0,006 oC. +++++ TIFF +++++ 1. attēlsTermistora krioskopa fragments, kas minēts 4.1. punktā (paraugu ņemšanas caurulītes novietojums attiecībā pret termistora lodīti un maisītāju) II. FOSFATĀZES AKTIVITĀTES NOTEIKŠANA 1. Piemērošanas joma un nozare Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, kādā nosakāma fosfatāzes aktivitāte pasterizētā pienā. 2. Definīcija 2.1. Fosfatāzes aktivitāte ir produktā esošas aktīvas sārmainās fosfatāzes daudzuma mērs, ko izsaka ar fenola daudzumu mikrogramos, ko procedūrā minētajos apstākļos atbrīvo ar 1 ml pasterizēta piena. 2.2. Piens, kura fosfatāzes aktivitāte ir zemāka par 4 μg/ml, ir uzskatāms par fosfatāzes negatīvu. 3. Princips Fosfatāzes aktivitāti novērtē pēc tā fenola daudzuma, kas atbrīvojas no paraugam pievienota dinātrija fenilfosfāta. Atbrīvotais fenols reaģē ar dibromhinonhlorimīdu, veidojot dibromindofenolu (zilganā krāsā), ko nosaka kolorimetriski pie 610 nm. Veic salīdzināšanu ar paraugu, kurā tika sadalīts fosfatāzes enzīms. 4. Reaģenti 4.1. Bārija borāta – bārija hidroksīda buferšķīdums 4.1.1. Izšķīdina ūdenī 50,0 g bārija hidroksīda [Ba(OH)2.8H2O] un uzpilda līdz 1000 ml. 4.1.2. Izšķīdina ūdenī 22,0 g borskābes [H3BO3] un uzpilda līdz 1000 ml. 4.1.3. No katra šķīduma 500 ml uzsilda līdz 50 oC temperatūrai, šķīdumus sajauc, strauji atdzesē līdz apmēram 20 oC, vajadzības gadījumā koriģē pH līdz 10,6 ± 0, 1, pievienojot 4.1.1 vai 4.1.2. punktā norādīto šķīdumu. Filtrē. Šķīdumu uzglabā cieši noslēgtā traukā. 4.1.4. Šķīdumu pirms lietošanas atšķaida ar tādu pašu ūdens daudzumu. 4.2. Krāsas attīstīšanas buferšķīdums Izšķīdina ūdenī 6,0 g nātrija metaborāta (NaBO2) vai 12,6 g (NaBO2.4H2O) un 20,0 g nātrija hlorīda (NaCl) un uzpilda līdz 1000 ml. 4.3. Buferšķīdums krāsas atšķaidīšanai Atšķaida ar ūdeni 10 ml krāsas attīstīšanas buferšķīduma (4.2.) līdz tilpumam 100 ml. 4.4. Bufersubstrāts Izšķīdina 0,1 g bezūdens dinātrija fenilfosfāta, kas nesatur fenolu, 100 ml buferšķīduma (4.1.3.), vai izšķīdina 0,5 g dinātrija fenilfosfāta 4,5 ml krāsas attīstīšanas buferšķīduma (4.2.), pievieno divus pilienus BQC šķīduma (4.6.) un atstāj 30 minūtes istabas temperatūrā. Šādi izveidojušos krāsvielu ekstrahē ar 2,5 ml butān-1-olu un ļauj nostāvēties, līdz atdalījies butān-1-ols. Butān-1-olu nolej un izmet. Vajadzības gadījumā ekstrakciju atkārto. Šķīdumu var uzglabāt dažas dienas ledusskapī; pirms lietošanas attīsta krāsu un atkārtoti ekstrahē. Bufera substrātu pagatavo tieši pirms lietošanas, atšķaidot 1 ml šā šķīduma ar bārija borāta — bārija hidroksīda buferšķīdumu (4.1.3.) līdz tilpumam 100 ml. 4.5. Cinka – vara nogulsnētājs Izšķīdina ūdenī 3,0 g cinka sulfāta (ZnSO4, 7H2O) un 0,6 g divvērtīgā vara sulfāta (CuSO4, 5H2O) un uzpilda līdz 100 ml. 4.6. 2,6-dibromhinonhlorimīda šķīdums (BQC šķīdums) Izšķīdina 40 ± 1 mg 2,6-dibromhinonhlorimīda (BQC) (C6H2Br2CINO6) 10 mililitros 96 % (V/V) etanola. Uzglabā tumšā pudelē ledusskapī. Šķīdumu izlej, ja tas ir mainījis krāsu vai stāvējis ilgāk par vienu mēnesi. 4.7. Divvērtīgā vara sulfāta šķīdums Izšķīdina ūdenī 0,05 g divvērtīgā vara sulfāta (CuSO4 · 5H2O) un uzpilda līdz 100 ml. 4.8. Fenola standartšķīdums 4.8.1. Iesver 200 ± 2 mg tīra bezūdens fenola, pārnes 100 ml tilpuma mērkolbā, pievieno ūdeni, samaisa un uzpilda līdz atzīmei. Šis standartšķīdums ledusskapī saglabājas stabils vairākus mēnešus. 4.8.2. Atšķaida ar ūdeni 10 ml standartšķīduma līdz tilpumam 100 ml un sajauc. 1 ml satur 200 μg fenola. 5. Iekārtas un stikla priekšmeti Piezīmes: a) Visi stikla priekšmeti, aizbāžņi un paraugu ņemšanas instrumenti ir rūpīgi jānotīra. Ieteicams tos skalot ar svaigi vārītu destilētu ūdeni vai apstrādāt ar tvaiku. b) Daži plastmasas aizbāžņu veidi var izraisīt piesārņojumu ar fenolu, un tos nav atļauts lietot. Parastais laboratoriju aprīkojums: 5.1. Analītiskie svari 5.2. Ūdens vanna, kurā var uzturēt temperatūru 37 ± 1 oC. 5.3. Spektrofotometrs, ar ko var nolasīt viļņu garumu 610 nm. 5.4. Mēģenes, 16 vai 18 mm × 150 mm, vēlamā gradācija 5 un 10 ml. 5.5. Pipetes 5.6. Atbilstīga lieluma stikla piltuves, piemēram, ar diametru 5 cm. 5.7. Salocīti filtri, vismaz 9 cm diametrā, vidējam filtrēšanas ātrumam. 5.8. Mērkolbas standartšķīdumu pagatavošanai. 6. Procedūra Piezīmes: a) Noteikšanas laikā izvairās no tiešas saules gaismas iedarbības. b) Jāizvairās no piesārņojuma ar siekalām vai sviedriem, kas var būt par cēloni kļūdainiem pozitīviem rezultātiem. Šajā ziņā īpašu vērību velta procedūrai, kurā pilina ar pipeti. 6.1. Testa parauga sagatavošana 6.1.1. Analīzi veic tieši pēc parauga ņemšanas. Pretējā gadījumā paraugu uzglabā ledusskapī, bet ne ilgāk kā divas dienas. 6.2. Analizējamais paraugs Ar pipeti iepilina katrā no divām mēģenēm (5.4.) 1 ml testa parauga, izmantojot vienu mēģeni kā kontroles vai tukšo paraugu. 6.3. Noteikšana 6.3.1. Tukšo paraugu divas minūtes silda verdošā ūdenī; mēģeni un vārglāzi ar verdošo ūdeni pārklāj ar alumīnija foliju, lai nodrošinātu visas mēģenes sakaršanu. Strauji atdzesē līdz istabas temperatūrai. 6.3.2. Tālākajā procedūras gaitā līdzīgi rīkojas ar tukšo paraugu un testa paraugu. Pievieno 10 ml bufera substrāta (4.4.) un sajauc. 6.3.3. Uzreiz pēc tam paraugus inkubē 60 minūtes ūdens vannā (5.2.), saturu pa laikam apmaisot (vismaz četras reizes). 6.3.4. Karsē divas minūtes verdošā ūdenī tādā pašā veidā kā 6.3.1. punktā. Strauji atdzesē līdz istabas temperatūrai. 6.3.5. Katrai mēģenei pievieno 1 ml cinka – vara nogulsnētāja (4.5.) un kārtīgi samaisa. 6.3.6. Filtrē caur sausu filtrpapīru, pirmos 2 ml nolej, vajadzības gadījumā atkārtoti filtrē, līdz filtrāts kļuvis pilnīgi dzidrs, un savāc 5 ml mēģenē. 6.3.7. Pievieno 5 ml krāsas attīstīšanas buferšķīduma (4.2.). 6.3.8. Pievieno 0,1 ml BQC šķīduma (4.6.), sajauc un 30 minūtes istabas temperatūrā ļauj attīstīties krāsai. 6.3.9. Izmēra absorbciju pret kontroles vai tukšo paraugu spektrofotometrā (5.3.) pie viļņu garuma 610 nm. 6.3.10. Ja absorbcija, kas izmērīta saskaņā ar 6.3.9. punktu, pārsniedz tāda standarta absorbciju, kurš satur 20 μg fenola katrā mēģenē, mērot saskaņā ar 6.4.4. punktu, tad noteikšanu atkārto ar attiecīgu parauga atšķaidījumu. Šādu atšķaidījumu pagatavo, sajaucot vienu tilpumu testa parauga ar attiecīgu tā paša testa parauga daļas tilpumu, kas rūpīgi sakarsēts līdz viršanai, lai dezaktivētu fosfatāzi. 6.4. Kalibrēšanas līknes sagatavošana 6.4.1. Sagatavo pienācīgu diapazonu atšķaidītu standartu, sākot no standarta fenola (4.8.2.), kas satur 0 (kontroles vai tukšais paraugs), 2, 5, 10 un 20 μg fenola mililitrā, un ar pipeti iepilina katrā no piecām mēģenēm attiecīgi 1 ml ūdens un 1 ml no četriem fenola standartšķīdumiem. 6.4.2. Pievieno katrai mēģenei 1 ml divvērtīgā vara sulfāta šķīduma (4.7.), 5 ml buferšķīduma krāsas atšķaidīšanai (4.3.), 3 ml ūdens un 0,1 ml BQC šķīduma (4.6.); sajauc. 6.4.3. Ļauj attīstīties krāsai 30 minūtes istabas temperatūrā. 6.4.4. Izmēra absorbciju pret kontroles vai tukšo paraugu spektrofotometrā pie viļņu garuma 610 nm (5.3.). 6.4.5. No absorbcijas vērtībām (6.4.4.), kas iegūtas attiecībā uz katru pievienotā fenola daudzumu (6.4.1.), izrēķina regresijas līniju ar mazāko kvadrātu metodi. 7. Rezultātu izteikšana 7.1. Aprēķināšana un formula 7.1.1. No absorbcijas rādījuma (6.3.9.) aprēķina fenola daudzumu, izmantojot iegūto regresijas līniju (6.4.5.). 7.1.2. Aprēķina fosfatāzes aktivitāti, izteiktu mikrogramos fenola uz mililitru pasterizētā piena, lietojot šādu formulu: Fosfatāzes aktivitāte = 2,4 × A × D, kur A ir fenola daudzums mikrogramos, iegūts atbilstoši 7.1.1. punktam; D ir atšķaidījuma pakāpe atšķaidījumam saskaņā ar 6.3.10. punktu (neatšķaidīšanas gadījumā D = 1); Koeficients 2,4 ir atšķaidījuma pakāpe (5/12 no 1 ml testa parauga); skat. 6.2. punktu saistībā ar 6.3.2., 6.3.5. un 6.3.6. punktu. 7.2. Precizitāte 7.2.1. Atkārtojamība (r): 2 μg fenola/ml. 7.2.2. Reproducējamība (R): 3 (provizoriski) μg fenola/ml. 7.2.3. Ja atšķaidījumu lieto saskaņā ar 6.3.10. punktu, ierobežojums, kas minēts 7.2.1. un 7.2.2. punktā, attiecas uz rezultātiem, ko iegūst no atšķaidītā parauga. III. PEROKSIDĀZES AKTIVITĀTES NOTEIKŠANA 1. Piemērošanas joma un nozare Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, kādā nosakāma fermenta peroksidāzes klātbūtne vai neesamība pienā, kontrolējot pasterizāciju. 2. Definīcija Pozitīva reakcija attiecībā uz peroksidāzi: ja piens ir pienācīgi pasterizēts, 30 sekundes pēc sajaukšanas parādās zila krāsa. Negatīva reakcija attiecībā uz peroksidāzi: krāsa neparādās 30 sekunžu laikā pēc sajaukšanas. 3. Princips Ferments peroksidāze noārda ūdeņraža peroksīdu. Atbrīvojušies skābekļa atomi oksidē 1,4-fenilēndiamīnu, pārvēršot purpurkrāsas indofenolā (Storča pārbaude). Krāsas intensitāte ir proporcionāla fermenta koncentrācijai. 4. Reaģenti 4.1. 1,4-fenilēndiamīna šķīdums Izšķīdina 2 g 1,4-fenilēndiamīna (C6H8N2) karstā (50 oC) ūdenī un uzpilda līdz 100 ml tilpumam. Šķīdumu uzglabā tumši brūnā pudelē ar stikla aizbāzni, vēsā un tumšā vietā. Vienu vai divas dienas pēc pagatavošanas 1,4-fenilēndiamīna šķīdums veido nogulsnes; tad tās ir jāizlej. 4.2. Ūdeņraža peroksīda šķīdums Izšķīdina ūdenī 9 ml 30 % ūdeņraža peroksīda un uzpilda līdz 100 ml tilpumam. Stabilizēšanas nolūkā pievieno 1 ml koncentrētas sērskābes uz litru šķīduma. Ūdeņraža peroksīda šķīdums ir stabils vienu mēnesi, ja to uzglabā vēsā, tumšā vietā un pudelē ar stikla aizbāzni, novēršot jebkādu saskari ar organiskajiem savienojumiem. 5. Procedūra 5.1. Ievieto 5 ml piena parauga tīrā mēģenē ar piemērotu aizbāzni. 5.2. Pievieno 5 ml 1,4-fenilēndiamīna šķīduma (4.1.). 5.3. Pievieno 2 pilienus ūdeņraža peroksīda šķīduma (4.2.). 5.4. Novēro krāsu reakciju 30 sekundes pēc sajaukšanas. Ja zilā krāsa parādās vēlāk nekā 30 sekundes pēc reaģentu pievienošanas, reakcija nav specifiska. IV. MIKROORGANISMU UZSKAITĪJUMS — DZĪVOTSPĒJĪGO MIKROORGANISMU NOTEIKŠANA PIE 30 oC 1. Piemērošanas joma un nozare Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, kādā veicams mikroorganismu uzskaitījums, nosakot koloniju skaitu pie 30 oC. Procedūru piemēro svaigpienam, pasterizētam pienam un ultrasterilizētam, kā arī sterilizētam pienam, kas 15 dienas inkubēts 30 oC temperatūrā. 2. Definīcija Ar jēdzienu "mikroorganismi" apzīmē organismus, kas, tos aerobi inkubējot aprakstītajos apstākļos, veido saskaitāmas kolonijas. 3. Princips Noteikto piena parauga daudzumu sajauc ar barotni Petri trauciņos un 72 stundas inkubē 30 oC temperatūrā. Saskaita kolonijas un aprēķina mikroorganismu skaitu 1 ml svaigpiena vai pasterizēta piena, vai 0,1 ml preinkubēta ultrasterilizēta vai sterilizēta piena. 4. Iekārtas un stikla priekšmeti Parastais laboratoriju aprīkojums: 4.1. Iekārtas 4.1.1. Karstā gaisa žāvēšanas skapis, ko var darbināt 170 līdz 175 oC temperatūrā. 4.1.2. Autoklāvs, ko var darbināt 121 ± 1 oC temperatūrā. 4.1.3. Inkubators 30 ± 1 oC temperatūras uzturēšanai jebkurā tā punktā. 4.1.4. pH-metrs ar temperatūras kompensāciju, ar precizitāti ± 0, 1 pH vienība. 4.1.5. Ūdens vanna, ko var darbināt 45 ± 1 oC temperatūrā. 4.1.6. Lēca ar palielinājumu 2–4x. 4.1.7. Lēca ar palielinājumu 8–10x. 4.1.8. Skaitītājs. 4.1.9. Maisītājs, ar ko var samaisīt 1 ml piena parauga vai iegūt decimālatšķaidījumu ar 9 ml atšķaidītāja un kura darbības pamatā ir mēģenes satura centrbēdzes rotēšana. 4.2. Stikla priekšmeti 4.2.1. Mēģenes ar piemērotiem aizbāžņiem un ar pietiekamu ietilpību, kas ļauj samaisīt 10 ml sākotnējā atšķaidījuma vai turpmākos decimālatšķaidījumus. 4.2.2. Kolbas ar tilpumu 150 līdz 250 ml vai mēģenes, apmēram 20 ml, barotnes ievietošanai. 4.2.3. Stikla vai sterila sintētiskā materiāla pipetes (noslēgtas ar vati) ar neatvērtu galu, ar nominālo tilpumu 1 ml un ar izejas atveri, kuras diametrs ir 1,75 līdz 3 mm. 4.2.4. Dzidra bezkrāsaina stikla vai sterila sintētiskā materiāla Petri trauciņi, ar apakšējo iekšējo diametru apmēram 90 — 100 mm. Iekšpusē mērītam dziļumama jābūt vismaz 10 mm. Trauka dibens nedrīkst būt nelīdzens, kas varētu ietekmēt koloniju skaitīšanu. 4.2.5. Stikla priekšmetu sterilizēšana. Stikla priekšmetus sterilizē pa vienam šādā kārtībā: a) ne mazāk kā vienu stundu turot 170 līdz 175 oC temperatūrā žāvēšanas skapī (4.1.1.), b) ne mazāk kā 20 minūtes turot 121 ± 1 oC temperatūrā autoklāvā (4.1.2.). Jāraugās, lai autoklāvā nodrošinātu pienācīgu tvaika iekļūšanu – piem., ja aprīkojumu sterilizē traukos, tie nedrīkst būt cieši noslēgti, vākiem jābūt vaļīgiem. Autoklāvā sterilizēti stikla priekšmeti jāžāvē, izpūšot tvaiku. Pipetes jāsterilizē žāvēšanas skapī (4.1.1.). 5. Barotne – agars dzīvotspējīgo mikroorganismu skaita noteikšanai pienam 5.1. Sastāvs: Rauga ekstrakts | 2,5 g | Triptons | 5,0 g | Glikoze D (+) jeb dekstroze | 1,0 g | Sausais vājpiens | 1,0 g | Agars | 10 līdz 15 g, atkarībā no izmantojamā agara recēšanas īpašībām | Ūdens | 1000 ml | Sausais vājpiens nesatur inhibitorus. Par to jāpārliecinās salīdzinājuma testos, izmantojot tādu sauso vājpienu, par kuru ir zināms, ka tas nesatur inhibitorus. Sagatavošana: Sastāvdaļas suspendē un šķīdina ūdenī šādā kārtībā: rauga ekstrakts, triptons, glikoze un visbeidzot sausais vājpiens. Suspensijas karsēšana veicina šo procedūru. Pievieno agaru un karsē līdz viršanai, pastāvīgi apmaisot, līdz agars pilnībā izšķīdis, vai tvaicē apmēram 30 minūtes. Vajadzības gadījumā filtrē caur filtrpapīru. Pārbauda pH līmeni ar pH-metru (4.1.4.) un vajadzības gadījumā regulē pH, lai pēc sterilizēšanas tas būtu 6,9 ± 0, 1 pie 25 oC, izmantojot (vismaz 0,1 mol/l) nātrija hidroksīda vai sālsskābes šķīdumu. 5.2. Barotnes izdalīšana, sterilizēšana un uzglabāšana Barotni (5.1.) izdala pa kolbām 100 līdz 150 ml porcijās vai 12 līdz 15 ml porcijās izdala pa mēģenēm (4.2.2.). Mēģenes un kolbas noslēdz ar aizbāžņiem. Sterilizē autoklāvā (4.1.2.) pie 121 ± 1 oC 15 minūtes. Pārbauda barotnes pH līmeni. Ja barotni neizlieto uzreiz, to uzglabā tumšā vietā temperatūrā no 1 līdz 5 C ne ilgāk kā vienu mēnesi pēc pagatavošanas. 5.3. Standarta dehidrēta barotne Barotni (5.1.) var pagatavot no standarta dehidrētas barotnes. Rīkojas pēc ražotāja norādījumiem, bet pirms izšķīdināšanas pievieno sauso vājpienu, ja tas neietilpst sastāvā. Noregulē pH līmeni 6,9 ± 0, 1 pie 25 oC, kā aprakstīts 5.1. punktā, un barotni izdala, sterilizē un uzglabā, kā aprakstīts 5.2. punktā. 6. Atšķaidītāji 6.1. Peptona / sāls šķīdums Sastāvs: Peptons | 1,0 g | Nātrija hlorīds(NaCl) | 8,5 g | Ūdens | 1000 ml | Sagatavošana: Sastāvdaļas izšķīdina ūdenī, vajadzības gadījumā karsējot. Pārbauda pH līmeni ar pH-metru (4.1.4.) un vajadzības gadījumā regulē pH, lai pēc sterilizēšanas tas būtu 7,0 ± 0, 1 pie 25 oC, izmantojot (vismaz 0,1 mol/l) nātrija hidroksīda vai sālsskābes šķīdumu. 6.2. Atšķaidītāja izdalīšana, sterilizēšana un uzglabāšana Izdala atšķaidītāju (6.1.) pa mēģenēm (4.2.1.) tādos daudzumos, lai pēc sterilizēšanas katrā mēģenā būtu 9,0 ± 0, 2 ml atšķaidītāja. Mēģenes noslēdz ar aizbāžņiem. Sterilizē autoklāvā (4.1.2.) pie 121 ± 1 oC 15 minūtes. Pārbauda barotnes pH līmeni. Ja atšķaidītāju neizlieto uzreiz, to uzglabā tumšā vietā temperatūrā no 1 līdz 5 oC ne ilgāk kā vienu mēnesi pēc pagatavošanas. 6.3. Standarta dehidrēti atšķaidītāji Atšķaidītāju (6.1.) var pagatavot no standarta dehidrētām tabletēm vai pulveriem. Rīkojas pēc ražotāja norādījumiem. Noregulē pH līmeni, kā aprakstīts 6.1. punktā, un atšķaidītāju izdala, sterilizē un uzglabā, kā aprakstīts 6.2. punktā. 7. Procedūra 7.1. Barotnes kausēšana Pirms mikrobioloģiskās pārbaudes uzsākšanas strauji atkausē vajadzīgo barotnes daudzumu un atlaidina 45 ± 1 oC temperatūrā ūdens vannā (4.1.5.). 7.2. Piena parauga sagatavošana Piena paraugu rūpīgi sajauc, lai mikroorganismi izdalītos pēc iespējas vienmērīgāk, strauji apgriežot otrādi piena parauga trauku 25 reizes. Jānovērš putošanās vai jāļauj putām noplakt. Analīzes paraugs jānoņem trīs minūšu laikā pēc sajaukšanas. 7.3. Sākotnējā atšķaidījuma (10–1) sagatavošana (svaigpienam un pasterizētam pienam) Ar sterilu pipeti (4.2.3.) pārnes 1 ml svaigpiena vai pasterizēta piena parauga (7.2.) uz 9 ml šķīdinātāja (6.1.), neļaujot saskarties pipetei ar šķīdinātāju. Šķīdinātāja temperatūrai jābūt apmēram vienādai ar piena parauga temperatūru. Šo sākotnējo atšķaidījumu 5 — 10 sekundes rūpīgi sajauc maisītājā (4.1.9.). Šādi tiek iegūts 10–1 sākotnējais atšķaidījums. 7.4. Turpmāko decimālatšķaidījumu sagatavošana (svaigpienam un pasterizētam pienam) Ar sterilu pipeti (4.2.3.) pārnes 1 ml sākotnējā atšķaidījuma (7.3.) uz 9 ml šķīdinātāja (6.1.), ievērojot 7.3. punkta norādījumus. Šādi tiek iegūts 10–2 atšķaidījums. Turpmāku decimālatšķaidījumu iegūšanai atkārto šīs darbības, līdz ir sagaidāms attiecīgais mikroorganismu skaits (8.1.1.). 7.5. Uzsēšana Petri trauciņos 7.5.1. Svaigpiens: ar sterilu pipeti (4.2.3.) pārnes 1 ml parauga un/ vai attiecīgā decimālatšķaidījuma uz trauciņu (4.2.4.). Jāpārbauda vismaz divi atšķaidījumi. Katru attiecīgi izvēlētu atšķaidījumu uzsēj vienā trauciņā (8.1.1.). 7.5.2. Pasterizēts piens: ar sterilu pipeti (4.2.3.) pārnes 1 ml parauga un/ vai attiecīgā decimālatšķaidījuma uz trauciņu (4.2.4.). Jāpārbauda vismaz divi atšķaidījumi. Katru attiecīgi izvēlētu atšķaidījumu uzsēj divos trauciņos (8.1.1.). 7.5.3. Ultrasterilizēts un sterilizēts piens (pārbaudīts pēc 15 dienu inkubācijas 30 oC temperatūrā — direktīvas A pielikuma VII nodaļas 5. punkts): ar sterilu pipeti (4.2.3.) pārnes 0,1 ml piena parauga (7.2.) uz trauciņu (4.2.4.). Sagatavo divus trauciņus. 7.6. Ieliešana Katrā uzsētajā trauciņā ielej 15 līdz 18 ml barotnes (7.1.). Uzreiz pēc ieliešanas sajauc, pietiekoši rotējot Petri trauciņu, lai pēc inkubācijas iegūtu vienmērīgi izkliedētas kolonijas. Intervāls starp piena parauga sagatavošanas beigām un analizējamās porcijas vai atšķaidījuma sajaukšanu ar barotni, atkarībā no piena veida, nepārsniedz 15 minūtes. Ļauj sacietēt uz tīras, vēsas horizontālas virsmas. 7.7. Petri trauciņu inkubācija Trauciņus pārnes uz inkubatoru (4.1.3.). Trauciņus inkubē, apgrieztus otrādi. Kraujot vienu virs otra, to skaits nepārsniedz sešus. Trauciņu kaudzēm nav jāsaskaras citai ar citu, kā arī ar inkubatora sienām vai griestiem. Inkubē 30 ± 1 oC temperatūrā 72 ± 2 stundas. 7.8. Koloniju skaitīšana Saskaita kolonijas Petri trauciņos, kas satur ne vairāk kā 300 kolonijas. Trauciņus pārbauda pie samazināta apgaismojuma. Lai atvieglotu skaitīšanu, var izmantot piemērotu lēcu (4.1.6.) un/ vai skaitītāju (4.1.8.). Nedrīkst sajaukt trauciņos nogulsnējušās vielas ar punktveida kolonijām. Šaubu gadījumā rūpīgi jāizpēta, ja vajadzīgs, izmantojot stiprāku lēcu (4.1.7.), lai atšķirtu kolonijas no svešķermeņiem. Kolonija, kas izplešas, uzskatāma par vienu koloniju. Ja mazāk par vienu ceturtdaļu trauciņa ir aizaugusi ar kolonijām, kas izplešas, tad saskaita kolonijas trauciņa neskartajā daļā un aprēķina attiecīgo daudzumu visam trauciņam. Ja vairāk par ceturtdaļu trauciņa ir aizaugusi ar kolonijām, kas izplešas, trauciņš ir jāizmet. 8. Rezultātu aprēķināšana un izteikšana 8.1. Svaigpiens un pasterizēts piens 8.1.1. Izmanto skaitļus no visiem trauciņiem, kuros ir no 10 līdz 300 koloniju (skat. 8.1.3. un 8.1.4. punktu). 8.1.2. Mikroorganismu skaitu 1 ml svaigpiena vai pasterizēta piena norāda formula: d kur: ∑C ir to koloniju summa, kas saskaitītas atbilstoši 8.1.1. punktam, (n1 + 0,1 n2) d ir vienāds ar uztrieptā parauga apjomu, n1 ir pirmajā atšķaidījumā saskaitīto trauciņu daudzums, n2 ir otrajā atšķaidījumā saskaitīto trauciņu daudzums, d ir atšķaidījuma pakāpe, no kuras tika iegūti pirmie saskaitītie daudzumi. Saskaitīto daudzumu norāda līdz diviem būtiskiem cipariem. Ciparu "pieci" noapaļo tā, lai pa kreisi blakusesošais cipars būtu pāra skaitlis. Piemērs (pasterizētam pienam): Atšķaidījums 10–2: 278 un 290 kolonijas. Atšķaidījums 10–3: 33 un 28 kolonijas. Skaits/ml | = 278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210-2 | | = 6290,022 | | = 28 590 | | = 29 000 | | = 2,9 × 104. | 8.1.3. Ja ir tikai tādi saskaitītie daudzumi, kas mazāki par 10, mikroorganismu skaitu mililitrā norāda "mazāk par 10 x d mililitrā", kur "d" ir apgriezti proporcionāls zemākajai atšķaidījuma pakāpei. 8.1.4. Ja ir tikai tādi saskaitītie daudzumi, kas pārsniedz 300 kolonijas, tomēr skaitīšana ir iespējama, aprēķina aplēsto daudzumu un reizina ar skaitli, kas ir apgriezti proporcionāls atšķaidījuma pakāpei. Norāda rezultātu "Aplēstais mikroorganismu skaits ml". 8.2. Ultrasterilizēts un sterilizēts piens Dzīvotspējīgo mikroorganismu skaita novērtējums, kas pārsniedz 10 kolonijas 0,1 ml, vairs nav uzskatāms par atbilstošu Direktīvas 85/397/EEK prasībām. 9. Precizitāte Pagaidām vēl nav pieejami starptautiski akceptētu salīdzināmo pārbaužu rezultāti. V. MIKROORGANISMU UZSKAITĪJUMS — DZĪVOTSPĒJĪGO MIKROORGANISMU NOTEIKŠANA PIE 21 oC 1. Piemērošanas joma un nozare Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, kādā veicams mikroorganismu uzskaitījums, pasterizētam pienam nosakot koloniju skaitu pie 21 oC, pēc tam, kad piens piecas dienas inkubēts 6 oC temperatūrā, lai noteiktu pasterizētā piena piesārņotības līmeni ar psihotropiem mikroorganismiem, kas spēj vairoties pienā 6 oC temperatūrā. 2. Definīcija Ar jēdzienu "mikroorganismi" apzīmē organismus, kas, tos aerobi inkubējot aprakstītajos apstākļos, veido saskaitāmas kolonijas. 3. Princips Pasterizēto pienu inkubē piecas dienas 6 oC temperatūrā. Noteiktu piena parauga daudzumu sajauc ar barotni Petri trauciņos un 25 stundas inkubē 21 oC temperatūrā. Saskaita kolonijas un aprēķina mikroorganismu skaitu 1 ml pasterizēta piena. 4. Iekārtas un stikla priekšmeti Parastais laboratoriju aprīkojums: 4.1. Iekārtas 4.1.1. Karstā gaisa žāvēšanas skapis, ko var darbināt 170 līdz 175 oC temperatūrā. 4.1.2. Autoklāvs, ko var darbināt 121 ± 1 oC temperatūrā. 4.1.3. Inkubatori, ar ko visos to punktos var uzturēt šādu temperatūru: a) 6 ± 0, 2 oC; b) 21 ± 1 oC. 4.1.4. pH-metrs ar temperatūras kompensāciju, ar precizitāti ± 0,1 pH vienība. 4.1.5. Ūdens vanna, ko var darbināt 45 ± 1 oC temperatūrā. 4.1.6. Lēca ar palielinājumu 2–4x. 4.1.7. Lēca ar palielinājumu 8–10x. 4.1.8. Skaitītājs. 4.1.9. Maisītājs, ar ko var samaisīt 1 ml piena parauga vai iegūt decimālatšķaidījumu ar 9 ml atšķaidītāja un kura darbības pamatā ir mēģenes satura centrbēdzes rotēšana. 4.2. Stikla priekšmeti 4.2.1. Mēģenes ar piemērotiem aizbāžņiem un ar pietiekamu ietilpību, kas ļauj samaisīt 10 ml sākotnējā atšķaidījuma vai turpmākos decimālatšķaidījumus. 4.2.2. Kolbas ar tilpumu 150 līdz 250 ml vai mēģenes, apmēram 20 ml, barotnes ievietošanai. 4.2.3. Stikla vai sterila sintētiskā materiāla pipetes (noslēgtas ar vati) ar neatvērtu galu, ar nominālo tilpumu 1 ml un ar izejas atveri, kuras diametrs ir 1,75 līdz 3 mm. 4.2.4. Dzidra bezkrāsaina stikla vai sterila sintētiskā materiāla Petri trauciņi, ar apakšējo iekšējo diametru apmēram 90 — 100 mm. Iekšpusē mērītam dziļumama jābūt vismaz 10 mm. Trauka dibens nedrīkst būt nelīdzens, kas varētu ietekmēt koloniju skaitīšanu. 4.2.5. Stikla priekšmetu sterilizēšana. Stikla priekšmetus sterilizē pa vienam šādā kārtībā: a) ne mazāk kā vienu stundu turot 170 līdz 175 oC temperatūrā žāvēšanas skapī (4.1.1.); b) ne mazāk kā 20 minūtes turot 121 ± 1 oC temperatūrā autoklāvā (4.1.2.). Jāraugās, lai autoklāvā nodrošinātu pienācīgu tvaika iekļūšanu – piem., ja aprīkojumu sterilizē traukos, tie nedrīkst būt cieši noslēgti, vākiem jābūt vaļīgiem. Autoklāvā sterilizēti stikla priekšmeti jāžāvē, izpūšot tvaiku. Pipetes jāsterilizē žāvēšanas skapī (4.1.1.). 5. Barotne – agars dzīvotspējīgo mikroorganismu skaita noteikšanai pienam 5.1. Sastāvs: Rauga ekstrakts | 2,5 g | Triptons | 5,0 g | Glikoze D(+) jeb dekstroze | 1,0 g | Sausais vājpiens | 1,0 g | Agars | 10 līdz 15 g, atkarībā no izmantojamā agara recēšanas īpašībām | Ūdens | 1000 ml | Sausais vājpiens nesatur inhibitorus. Par to jāpārliecinās salīdzinājuma testos, izmantojot tādu sauso vājpienu, par kuru ir zināms, ka tas nesatur inhibitorus. Sagatavošana: Sastāvdaļas suspendē un šķīdina ūdenī šādā kārtībā: rauga ekstrakts, triptons, glikoze un visbeidzot sausais vājpiens. Suspensijas karsēšana veicina šo procedūru. Pievieno agaru un karsē līdz viršanai, pastāvīgi apmaisot, līdz agars pilnībā izšķīdis, vai tvaicē apmēram 30 minūtes. Vajadzības gadījumā filtrē caur filtrpapīru. Pārbauda pH līmeni ar pH-metru (4.1.4.) un vajadzības gadījumā regulē pH, lai pēc sterilizēšanas tas būtu 6,9 ± 0, 1 pie 25 oC, izmantojot (vismaz 0,1 mol/l) nātrija hidroksīda vai sālsskābes šķīdumu. 5.2. Barotnes izdalīšana, sterilizēšana un uzglabāšana Barotni (5.1.) izdala pa kolbām 100 līdz 150 ml porcijās, vai 12 līdz 15 ml porcijās izdala pa mēģenēm (4.2.2.). Mēģenes un kolbas noslēdz ar aizbāžņiem. Sterilizē autoklāvā (4.1.2.) pie 121 ± 1 oC 15 minūtes. Pārbauda barotnes pH līmeni. Ja barotni neizlieto uzreiz, to uzglabā tumšā vietā temperatūrā no 1 līdz 5 oC ne ilgāk kā vienu mēnesi pēc pagatavošanas. 5.3. Standarta dehidrēta barotne Barotni (5.1.) var pagatavot no standarta dehidrētas barotnes. Rīkojas pēc ražotāja norādījumiem, bet pirms izšķīdināšanas pievieno sauso vājpienu, ja tas neietilpst sastāvā. Noregulē pH līmeni 6,9 ± 0, 1 pie 25 oC, kā aprakstīts 5.1. punktā, un barotni izdala, sterilizē un uzglabā, kā aprakstīts 5.2. punktā. 6. Atšķaidītāji 6.1. Peptona / sāls šķīdums: Sastāvs: Peptons | 1,0 g | Nātrija hlorīds (NaCl) | 8,5 g | Ūdens | 1000 ml | Sagatavošana: Sastāvdaļas izšķīdina ūdenī, vajadzības gadījumā karsējot. Pārbauda pH līmeni ar pH-metru (4.1.4.) un vajadzības gadījumā regulē pH, lai pēc sterilizēšanas tas būtu 7,0 ± 0, 1 pie 25 oC, izmantojot (vismaz 0,1 mol/l) nātrija hidroksīda vai sālsskābes šķīdumu. 6.2. Atšķaidītāja izdalīšana, sterilizēšana un uzglabāšana Izdala atšķaidītāju (6.1.) pa mēģenēm (4.2.1.) tādos daudzumos, lai pēc sterilizēšanas katrā mēģenē būtu 9,0 ± 0, 2 ml atšķaidītāja. Mēģenes noslēdz ar aizbāžņiem. Sterilizē autoklāvā (4.1.2.) pie 121 ± 1 oC 15 minūtes. Pārbauda atšķaidītāja pH līmeni. Ja atšķaidītāju neizlieto uzreiz, to uzglabā tumšā vietā temperatūrā no 1 līdz 5 oC ne ilgāk kā vienu mēnesi pēc pagatavošanas. 6.3. Standarta dehidrēti atšķaidītāji Atšķaidītāju (6.1.) var pagatavot no standarta dehidrētām tabletēm vai pulveriem. Rīkojas pēc ražotāja norādījumiem. Noregulē pH līmeni, kā aprakstīts 6.1. punktā, un atšķaidītājus izdala, sterilizē un uzglabā, kā aprakstīts 6.2. punktā. 7. Procedūra 7.1. Barotnes kausēšana Pirms mikrobioloģiskās pārbaudes uzsākšanas strauji atkausē vajadzīgo barotnes daudzumu un atlaidina 45 ± 1 o C temperatūrā ūdens vannā (4.1.5.). 7.2. Piena parauga sagatavošana 7.2.1. Neatvērtu pasterizēta piena iepakojumu vai, ja tas nav iespējams, reprezentatīvu paraugu, vismaz 100 ml, inkubē 120 ± 2 stundas 6 ± 0,5 oC temperatūrā inkubatorā (4.1.3. punkta a) apakšpunkts). 7.2.2. Pēc inkubēšanas piena paraugu rūpīgi sajauc, lai mikroorganismi izdalītos pēc iespējas vienmērīgāk, strauji apgriežot otrādi piena parauga trauku 25 reizes. Jānovērš putošanās vai jāļauj putām noplakt. Analīzes paraugs jānoņem trīs minūšu laikā pēc sajaukšanas. 7.3. Sākotnējā atšķaidījuma (10–1) sagatavošana Ar sterilu pipeti (4.2.3.) pārnes 1 ml parauga (7.2.2.) uz 9 ml šķīdinātāja (6.1.), neļaujot saskarties pipetei ar šķīdinātāju. Šķīdinātāja temperatūrai jābūt apmēram vienādai ar piena parauga temperatūru. Šo sākotnējo atšķaidījumu 5 līdz 10 sekundes rūpīgi sajauc, izmantojot maisītāju (4.1.9.). Šādi tiek iegūts 10– 1 sākotnējais atšķaidījums. 7.4. Turpmāko decimālatšķaidījumu sagatavošana Ar sterilu pipeti (4.2.3.) pārnes 1 ml sākotnējā atšķaidījuma (7.3.) uz 9 ml šķīdinātāja (6.1.), ievērojot 7.3. punkta norādījumus. Šādi tiek iegūts 10–2 atšķaidījums. Turpmāku decimālatšķaidījumu iegūšanai atkārto šīs darbības, līdz ir sagaidāms attiecīgais mikroorganismu skaits (8.1.). 7.5. Uzsēšana Petri trauciņos Ar sterilu pipeti (4.2.3.) pārnes 1 ml parauga un/ vai attiecīgā decimālatšķaidījuma uz trauciņu (4.2.4.). Jāpārbauda vismaz divi atšķaidījumi. Katru attiecīgi izvēlētu atšķaidījumu uzsēj divos trauciņos (8.1.). 7.6. Ieliešana Katrā uzsētajā trauciņā ielej 15 līdz 18 ml barotnes (7.1.). Uzreiz pēc ieliešanas sajauc, pietiekoši rotējot Petri trauciņu, lai pēc inkubācijas iegūtu vienmērīgi izkliedētas kolonijas. Intervāls starp piena parauga sagatavošanas beigām un atšķaidījuma sajaukšanu ar barotni nepārsniedz 15 minūtes. Ļauj sacietēt uz tīras, vēsas horizontālas virsmas. 7.7. Petri trauciņu inkubācija Trauciņus pārnes uz inkubatoru (4.1.3. punkta b) apakšpunkts). Trauciņus inkubē, apgrieztus otrādi. Kraujot vienu virs otra, to skaits nepārsniedz sešus. Trauciņu kaudzēm nav jāsaskaras citai ar citu, kā arī ar inkubatora sienām vai griestiem. Inkubē 21 ± 1 oC temperatūrā 25 stundas. 7.8. Koloniju skaitīšana Saskaita kolonijas Petri trauciņos, kas satur ne vairāk kā 300 kolonijas. Trauciņus pārbauda pie samazināta apgaismojuma. Lai atvieglotu skaitīšanu, var izmantot piemērotu lēcu (4.1.6.) un/ vai skaitītāju (4.1.8.). Nedrīkst sajaukt trauciņos nogulsnējušās vielas ar punktveida kolonijām. Šaubu gadījumā rūpīgi jāizpēta, ja vajadzīgs, izmantojot stiprāku lēcu (4.1.7.), lai atšķirtu kolonijas no svešķermeņiem. Kolonija, kas izplešas, uzskatāma par vienu koloniju. Ja mazāk par vienu ceturtdaļu trauciņa ir aizaugusi ar kolonijām, kas izplešas, tad saskaita kolonijas trauciņa neskartajā daļā un aprēķina attiecīgo daudzumu visam trauciņam. Ja vairāk par ceturtdaļu trauciņa ir aizaugusi ar kolonijām, kas izplešas, trauciņš ir jāizmet. 8. Rezultātu aprēķināšana un izteikšana 8.1. Izmanto skaitļus no visiem trauciņiem, kuros ir no 10 līdz 300 koloniju (skat. 8.3. un 8.4. punktu). 8.2. Mikroorganismu skaitu 1 ml pasterizēta piena norāda formula: d kur ∑C ir to koloniju summa, kas saskaitītas atbilstoši 8.1. punktam, (n1 + 0,1 n2) d ir vienāds ar uztrieptā parauga apjomu, kur n1 ir pirmajā atšķaidījumā saskaitīto trauciņu daudzums, n2 ir otrajā atšķaidījumā saskaitīto trauciņu daudzums, d ir atšķaidījuma pakāpe, no kuras tika iegūti pirmie saskaitītie daudzumi. Saskaitīto daudzumu norāda līdz diviem būtiskiem cipariem. Ciparu "pieci" noapaļo tā, lai pa kreisi blakusesošais cipars būtu pāra skaitlis. Piemērs: Atšķaidījums 10–2: 278 un 290 kolonijas. Atšķaidījums 10–3: 33 un 28 kolonijas. Skaits/ml | = 278 + 290 + 33 + 282 + 0,1 × 210–2 | | = 6290,022 | | = 28 590 | | = 29 000 | | = 2,9 × 104. | 8.3. Ja ir tikai tādi saskaitītie daudzumi, kas mazāki par 10, mikroorganismu skaitu mililitrā norāda "mazāk par 10 × d mililitrā", kur "d" ir apgriezti proporcionāls zemākajai atšķaidījuma pakāpei. 8.4. Ja ir tikai tādi saskaitītie daudzumi, kas pārsniedz 300 kolonijas, tomēr skaitīšana ir iespējama, aprēķina aplēsto daudzumu un reizina ar skaitli, kas ir apgriezti proporcionāls atšķaidījuma pakāpei. Norāda rezultātu "Aplēstais mikroorganismu skaits ml". 9. Precizitāte Pagaidām vēl nav pieejami starptautiski akceptētu salīdzināmo pārbaužu rezultāti. VI. KOLIBAKTĒRIJU UZSKAITĪJUMS — KOLONIJU SKAITA NOTEIKŠANA PIE 30 oC 1. Piemērošanas joma un nozare Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, kādā veicams kolibaktēriju uzskaitījums pasterizētā pienā, nosakot koloniju skaitu pie 30 oC. 2. Definīcija Ar jēdzienu "kolibaktērijas" apzīmē baktērijas, kas aprakstītajos apstākļos 30 oC temperatūrā veido raksturīgas kolonijas vai neraksturīgas kolonijas, kuras fermentē laktozi, veidojot gāzi. 3. Princips Noteikto piena parauga daudzumu sajauc ar barotni Petri trauciņos un 24 stundas inkubē 30 oC temperatūrā. Saskaita raksturīgas kolonijas un, vajadzības gadījumā, apstiprina neraksturīgu koloniju identitāti, pārbaudot spēju fermentēt laktozi. Pēc tam aprēķina kolibaktēriju skaitu 1 ml pasterizēta piena. 4. Iekārtas un stikla priekšmeti Parastais laboratoriju aprīkojums: 4.1. Iekārtas 4.1.1. Karstā gaisa žāvēšanas skapis, ko var darbināt 170 līdz 175 oC temperatūrā. 4.1.2. Autoklāvs, ko var darbināt 121 ± 1 oC temperatūrā. 4.1.3. Inkubators 30 ± 1 oC temperatūras uzturēšanai jebkurā tā punktā. 4.1.4. pH-metrs ar temperatūras kompensāciju, ar precizitāti ± 0,1 pH vienība. 4.1.5. Ūdens vanna, ko var darbināt 45 ± 1 oC temperatūrā. 4.1.6. Stieples adata no platīna un irīdija vai no niķeļa un hroma. 4.2. Stikla priekšmeti 4.2.1. Mēģenes ar piemērotiem aizbāžņiem un ar ietilpību 20 ml apstiprinājuma barotnei (5.2.), kā arī attiecīga lieluma Darema caurulītes lietošanai ar mēģenēm. 4.2.2. Kolbas ar tilpumu 150 līdz 250 ml cietajai selektīvajai barotnei (5.1.). 4.2.3. Stikla vai sterila sintētiskā materiāla pipetes (noslēgtas ar vati) ar neatvērtu galu, ar nominālo tilpumu 1-10 ml un ar izejas atveri, kuras diametrs ir 1,75 līdz 3 mm. 4.2.4. Dzidra, bezkrāsaina stikla vai sterila sintētiskā materiāla Petri trauciņi, ar apakšējo iekšējo diametru apmēram 90 — 100 mm. Iekšpusē mērītam dziļumama jābūt vismaz 10 mm. Trauka dibens nedrīkst būt nelīdzens, kas varētu ietekmēt koloniju skaitīšanu. 4.2.5. Stikla priekšmetu sterilizēšana: Stikla priekšmetus sterilizē pa vienam šādā kārtībā: a) ne mazāk kā vienu stundu turot 170 līdz 175 oC temperatūrā žāvēšanas skapī (4.1.1.); b) ne mazāk kā 20 minūtes turot 121 ± 1 oC temperatūrā autoklāvā (4.1.2.). Jāraugās, lai autoklāvā nodrošinātu pienācīgu tvaika iekļūšanu — piem., ja aprīkojumu sterilizē traukos, tie nedrīkst būt cieši noslēgti, kolbu vai pudeļu vākiem jābūt vaļīgiem. Autoklāvā sterilizēti stikla priekšmeti jāžāvē, izpūšot tvaiku. Pipetes jāsterilizē žāvēšanas skapī (4.1.1.). 5. Barotnes 5.1. Agars ar kristālvioleto, neitrāli sarkano, žulti un laktozi (VRBL agars). Cietā selektīvā barotne. Sastāvs: Peptons | 7 g | Rauga ekstrakts | 3 g | Laktoze (C12H22O11. H2O) | 10 g | Nātrija hlorīds (NaCl) | 5 g | Žults sāļi | 1,5 g | Neitrāli sarkanais | 0,03 g | Kristālvioletais | 0,002 g | Agars | 10 līdz 15 g (atkarībā no izmantojamā agara recēšanas īpašībām) | Ūdens | 1000 ml | Sagatavošana: Sastāvdaļas suspendē un izšķīdina ūdenī, atstāj vairākas minūtes nostāvēties, pēc tam kārtīgi samaisa. Pārbauda pH līmeni ar pH-metru (4.1.4.) un vajadzības gadījumā regulē pH, lai pēc vārīšanas tas būtu 7,4 ± 0, 1 pie 25 oC, izmantojot (vismaz 0,1 mol/l) nātrija hidroksīda vai sālsskābes šķīdumu. Strauji uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai, pa laikam apmaisot, un uzreiz 100 līdz 150 ml lielos daudzumos izdala sterilās kolbās (4.2.2.). Barotni atlaidina ūdens vannā (4.1.5.) pie 45 ± 1 oC. Izmantošanas brīdī jābūt pārbaudītai barotnes sterilitātei (skat. 6.4. punktu). Barotni izmanto trīs stundu laikā pēc pagatavošanas. 5.2. Briljantzaļā, laktozes un žults buljons. Apstiprinājuma barotne. Sastāvs: Peptons | 10 g | Laktoze (C12H22O11. H2O) | 10 g | Dehidrēta liellopu žults | 20 g | Briljantzaļais | 0,0133 g | Ūdens | 1000 ml | Sagatavošana: Sastāvdaļas izšķīdina ūdenī vārot. Pārbauda pH līmeni ar pH-metru (4.1.4.) un vajadzības gadījumā regulē pH, lai pēc sterilizēšanas tas būtu 7,2 ± 0, 1 pie 25 oC, izmantojot (vismaz 0,1 mol/l) nātrija hidroksīda vai sālsskābes šķīdumu. Barotni 10 ml porcijās izdala pa mēģenēm (4.2.1.), kurās ir Darema caurulītes. Mēģenes noslēdz ar aizbāžņiem. Sterilizē autoklāvā (4.1.2.) pie 121 ± 1 oC 15 minūtes. Darema caurulītēs pēc sterilizēšanas nav gaisa burbuļu. Pārbauda barotnes pH līmeni. Ja barotni neizlieto uzreiz, to uzglabā tumšā vietā temperatūrā no 0 līdz 5 oC ne ilgāk kā vienu mēnesi pēc pagatavošanas. 5.3. Standarta dehidrētas barotnes Barotnes (5.1., 5.2. punkts) var pagatavot no standarta dehidrētām barotnēm. Rīkojas pēc ražotāja norādījumiem. Noregulē pH līmeni un barotnes izdala, vāra vai sterilizē, kā aprakstīts 5.1. un 5.2. punktā. 6. Procedūra 6.1. Barotne Lieto barotni (VRBL agaru), kā aprakstīts 5.1. punktā. 6.2. Piena parauga sagatavošana Piena paraugu rūpīgi sajauc, lai mikroorganismi izdalītos pēc iespējas vienmērīgāk, strauji apgriežot otrādi piena parauga trauku 25 reizes. Jānovērš putošanās vai jāļauj putām noplakt. Analīzes paraugs jānoņem trīs minūšu laikā pēc sajaukšanas. 6.3. Uzsēšana Petri trauciņos Uzsēj 3 ml piena parauga (6.2.), ar sterilu pipeti (4.2.3.) pārnesot 1 ml piena parauga uz katru no trim trauciņiem (4.2.4.). 6.4. Ieliešana Katrā uzsētajā trauciņā ielej apmēram 12 ml VRBL agaru (6.1.). Uzreiz pēc ieliešanas sajauc, pietiekoši rotējot Petri trauciņu, lai pēc inkubācijas iegūtu vienmērīgi izkliedētas kolonijas. Intervāls starp piena parauga sagatavošanas beigām un analizējamās porcijas sajaukšanu ar barotni nepārsniedz 15 minūtes. Sterilitātes kontrolei sagatavo neuzsētu trauciņu ar 12 ml VRBL agara, ko izmanto uzsētajiem trauciņiem. Ļauj sacietēt uz tīras, vēsas horizontālas virsmas, līdz barotne ir gatava. Pēc pilnīgas sacietēšanas vismaz 4 ml VRBL agara (6.1.) uzlej uzsētās barotnes virsmai. Ļauj sacietēt. 6.5. Petri trauciņu inkubācija Trauciņus pārnes uz inkubatoru (4.1.3.). Trauciņus inkubē, apgrieztus otrādi. Kraujot vienu virs otra, to skaits nepārsniedz sešus. Trauciņu kaudzēm nav jāsaskaras citai ar citu, kā arī ar inkubatora sienām vai griestiem. Inkubē 30 ± 1 oC temperatūrā 24 ± 2 stundas. 6.6. Koloniju skaitīšana 6.6.1. Saskaita kolonijas Petri trauciņos, kas satur ne vairāk kā 150 kolonijas. Saskaita tumši sarkanās krāsas kolonijas, kuru diamters ir vismaz 0,5 mm, ar kolibaktērijām raksturīgām apņemošām nogulsnēm vai bez tām. 6.6.2. Ja visām vai dažām kolonijām ir neraksturīgs izskats (piem., no tipiskām kolonijām atšķirīga krāsa, lielums vai nogulšņu veidošanās), veic apstiprinājuma testu (6.7.). 6.7. Apstiprinājuma tests Atbilstoši 6.6.2. punkta norādēm veic apstiprinājuma testu piemērotam daudzumam (t.i., trim līdz piecām) neraksturīgu koloniju, ar stieples adatu (4.1.6.) uzsējot mēģenēs briljantzaļā, laktozes un žults buljonu (5.2.). Mēģenes inkubē 30 ± 1 oC temperatūrā 24 ± 2 stundas. Kolonijas, kas veido gāzi Darema caurulītē, apstiprina par kolibaktēriju kolonijām. 7. Rezultātu aprēķināšana un izteikšana 7.1. Izmanto saskaitītos daudzumus (skat. 7.4. punktu) no trauciņiem, kuros nav vairāk par 150 kolonijām. 7.2. Ja piemēro apstiprinājuma testu, kolibaktēriju koloniju skaitu aprēķina no apstiprināto kolibaktēriju koloniju procentuālā daudzuma. 7.3. Kolibaktēriju skaitu 1 ml pasterizēta piena norāda formula: n kur ∑C ir kolibaktēriju (7.1. punkts saistībā ar 7.2. punktu) koloniju kopējais skaits, kas konstatēts piena parauga (3 ml) pārbaudē, n ir pārbaudītā parauga (6.3.) daudzums mililitros (3 ml). Saskaitīto daudzumu norāda līdz diviem būtiskiem cipariem, ja ir vairāk par 100 kolonijām. Ciparu "pieci" noapaļo tā, lai pa kreisi blakusesošais cipars būtu pāra skaitlis. Ja ir tikai tādi saskaitītie daudzumi, kas pārsniedz 150 kolonijas, norāda rezultātu "Aplēstais kolibaktēriju skaits 1 ml". 8. Precizitāte Pagaidām vēl nav pieejami starptautiski akceptētu salīdzināmo pārbaužu rezultāti. VII. SOMATISKO ŠŪNU UZSKAITĪJUMS Ar šo procedūru precizē divas standarta procedūras, kādās veicams somatisko šūnu uzskaitījums: A. Mikroskopiskā metode. B. Fluoro optiski elektroniskā metode. A. Mikroskopiskā metode 1. Piemērošanas joma un nozare Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, kādā veicams somatisko šūnu uzskaitījums svaigpienam. Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, kādā veicams šūnu uzskaitījums piena paraugā, lai kalibrētu un pārbaudītu fluoro optiski elektroniskās metodes precizitāti (skat. B.1. punktu). 2. Definīcija Šajā procedūrā somatiskās šūnas ir šūnas, piem., leikocīti un epitēlijšūnas, kuru kodolus var skaidri iezīmēt ar metilēnzilo. 3. Princips Uz 1 cm2 priekšmetstikliņa uztriepj 0,01 ml piena. Uztriepi izžāvē un iezīmē. Skaitīšanu veic ar mikroskopu. Noteiktajā laukumā saskaitīto somatisko šūnu skaitu reizina ar reizināšanas koeficientu, iegūstot šūnu skaitu / ml. 4. Reaģenti Jālieto ķīmiski tīri reaģenti. Krāsvielas šķīdums: Sastāvs: Metilēnzilais | 0,6 g | Etanols - 99 % | 54 ml | 1,1,1-trihloretāns vai tetrahloretāns | 40 ml | Ledus etiķskābe | 6 ml | Brīdinājums Tetrahloretāns ir indīgs. Sagatavošana un piemērošana jāveic velkmes skapī. Sagatavošana: Etanolu un 1,1,1-trihloretānu vai tetrahloretānu samaisa pudelē un karsē ūdens vannā līdz temperatūrai 60 līdz 70 oC. Pievieno metilēnzilo, rūpīgi samaisa, 12 līdz 24 stundu laikā atdzesē ledusskapī līdz 4 oC temperatūrai un pievieno ledus etiķskābi. Filtrē, izmantojot filtru ar poru izmēru 10 līdz 12 mikroni vai mazāku, un uzglabā krāsvielas šķīdumu hermētiski noslēgtā pudelē. Ja izveidojušās daļiņas vai nogulsnes, pirms lietošanas filtrē vēlreiz. 5. Iekārtas un stikla priekšmeti 5.1. Mikroskops ar 500 līdz 1000 reižu palielinājumu. 5.2. Mikrošļirce, 0,01 ml, ar precizitāti ± 2 % vai augstāku. 5.3. Priekšmetstikliņš ar laukumu 20 mm × 5 mm, kas apzīmēts uztriepei, vai standarta priekšmetstikliņš un 20 mm × 5 mm matrica uztriepei. 5.4. Plītiņa ar līdzenu virsmu (30 līdz 50 oC) priekšmetstikliņu žāvēšanai. 5.5. Ventilators (fēns) uztriepes žāvēšanai. 5.6. Ūdens vanna, ko var darbināt 30 līdz 40 oC temperatūrā, piena parauga karsēšanai. 5.7. Priekšmetstikliņš ar daudzpakāpju mikrometru, ar 0,01 mm iedaļām. 6. Procedūra 6.1. Piena paraugs Piena paraugs jātestē sešu stundu laikā pēc parauga ņemšanas. Uzglabāšanas laikā parauga temperatūra nedrīkst pārsniegt 6 oC. Jāizvairās no sasalšanas. 6.2. Parauga sagatavošana laboratorijā Paraugu karsē ūdens vannā (5.6.) 30 līdz 40 oC temperatūrā. Tad rūpīgi sajauc. Atdzesē līdz temperatūrai, kurā kalibrēta mikrošļirce (5.2.), piem., 20 oC. 6.3. Priekšmetstikliņu pirmapstrāde Priekšmetstikliņus (5.3.) notīra, piemēram, ar etanolu, nosusina ar bezputekļu papīru, apstrādā ar liesmu un atdzesē. Uzglabā kārbā, lai izvairītos no putekļiem. 6.4. Uztriepes sagatavošana No sagatavotā parauga ņem 0,01 ml piena, izmantojot mikrošļirci (5.2.). Rūpīgi notīra šļirces ārpusi, kas saskaras ar pienu. Šļirci novieto uz priekšmetstikliņa (5.3.), un vispirms apvelk laukuma kontūru (20 mm × 5 mm). Tad laukumu aizpilda pēc iespējas vienmērīgāk. Uztriepi izžāvē uz plītiņas ar līdzenu virsmu (5.4.), līdz tā ir pilnīgi sausa. No katra piena parauga jāsagatavo un jāpārbauda vismaz divas uztriepes. 6.5. Uztriepju iezīmēšana Uz 10 minūtēm iemērc krāsvielas šķīdumā (4.). Žāvē, vajadzības gadījumā žāvēšanu pabeidzot ar ventilatoru (5.5.). Uztriepes iemērc krāna ūdenī, līdz ir izmazgājusies visa liekā krāsviela. Pēc tam vēlreiz nosusina un uzglabā, aizsargājot no putekļiem. 6.6. Mikroskopā novērojamā laukuma kalibrēšana Atkarībā no izvēlētā palielinājuma (500 līdz 1000 reizes) ar daudzpakāpju mikrometra priekšmetstikliņu (5.7.) nosaka mikroskopā novērojamā laukuma diametru. 7. Saskaitīšana un aprēķināšana 7.1. Šūnu saskaitīšana Izmanto mikroskopu (5.1.). Saskaita vienīgi šūnu kodolus, nevis šūnas. Tos var skaidri atšķirt, un, lai saskaitītu, vismaz pusei kodolu jābūt redzamiem mikroskopā novērojamā laukumā. Skaitīšanu veic joslās vai laukumos uztriepes vidējā trešdaļā, uzmanot, lai skaitīšana nenotiktu joslās vai laukumos, kas izvēlēti vienīgi uztriepes malās. Vismaz vienu reizi mēnesī jāpārbauda uztriepju rūpīga sagatavošana un tādējādi šo rezultātu drošums, veicot skaitīšanu dažādās uztriepes daļās. Saskaitīšānu var veikt, skaitot mikroskopā novērojamos laukumos, kas ir vienādi reprezentatīvi attiecībā uz visām uztriepes daļām. 7.2. Mazākais saskaitāmais šūnu daudzums Tā kā somatisko šūnu skaitīšanu ar mikroskopu var arī izmantot, lai standartizētu automātiskās un mehanizētās skaitīšanas metodes, saskaitīto daudzumu variāciju koeficients vienādiem paraugiem nedrīkst būt augstāks kā elektroniskajām ierīcēm. Variāciju koeficients piena paraugam, kas satur 400000 līdz 600000 šūnas/ ml, nevar pārsniegt 5 %. Katrā paraugā saskaitāmo somatisko šūnu skaitam, saskaņā ar Puasona sadalījuma raksturlielumiem, jābūt vismaz 400, lai atbilstu šai atkārtojamībai. Saskaņā ar Puasona sadalījumu M = V = s2, kur: M ir vidējā vērtība, V ir dispersija ur s ir standartnovirze Variāciju koeficients ir: CV = M vai CV = vai CV = M (vidējais) norāda uz saskaitīto daļiņu (šūnu) skaitu (t.i., 400 attiecībā uz CV = 5 %). 7.3. Reizināšanas koeficienta aprēķināšana Izmantojot 0,01 ml piena, reizināšanas koeficientu aprēķina saskaņā ar 7.3.1. un 7.3.2. punktu. 7.3.1. Skaitīšana uztriepes joslās Katras joslas garums, kurā veicama skaitīšana, ir 5 mm. Joslas platums atbilst mikroskopā novērojamā laukuma diametram, kas noteikts ar daudzpakāpju mikrometra priekšmetstikliņu (5.7.). Reizināšanas koeficients = 20 × 100d × b kur: d ir mikroskopā novērojamā laukuma diametrs mm, kas noteikts ar daudzpakāpju mikrometra priekšmetstikliņu (5.7.), b ir joslu skaits, kas saskaitītas pilnībā. 7.3.2. Mikroskopā novērojamo laukumu skaitīšana uztriepes vidējā trešdaļā vai ar tīkla palīdzību: Reizināšanas koeficients = Π × d × s = 12 732d2× s kur: d ir mikroskopā novērojamā laukuma diametrs mm, kas noteikts ar daudzpakāpju mikrometra priekšmetstikliņu (5.7.), s ir saskaitīto laukumu skaits. 7.4. Šūnu satura aprēķināšana Saskaitīto somatisko šūnu skaitu (7.1. un 7.2. punkts) reizina ar reizināšanas koeficientu (7.3.), iegūstot šūnu skaitu uz ml piena. 7.5. Precizitāte Variāciju koeficients (skat. 7.2. punktu) nedrīkst pārsniegt 5 %. Pagaidām vēl nav pieejami starptautiski akceptētu salīdzināmo pārbaužu rezultāti. B. Fluoro optiski elektroniskā metode 1. Piemērošanas joma un nozare Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, ko var izmantot pēc pienācīgas kalibrēšanas (skat. A.1. punktu), lai saskaitītu somatiskās šūnas svaigpienā, kas var būt arī ķīmiski konservēts. 2. Definīcija Šajā procedūrā somatiskās šūnas ir daļiņas, kurām pēc DNS iezīmēšanas somatisko šūnu kodolā piemīt minimālā fluorescences intensitāte. 3. Princips Daļu parauga (piem., 0,2 ml) rūpīgi samaisa ar buferšķīdumu un fluorescences šķīdumu. Pēc tam daļu šā maisījuma plānas kārtiņas veidā pārnes uz rotējošu disku, kurš mikroskopā pilda priekšmetstikliņa funkciju. Katra šūna veido elektrisko impulsu, kuru pastiprina un reģistrē. Somatisko šūnu skaitu izsaka tūkstošos uz ml. 4. Reaģenti Jālieto ķīmiski tīri reaģenti. Ūdenim jābūt destilētam vai dejonizētam, vai ar līdzvērtīgu tīrības pakāpi. 4.1. Buferšķīdums Sastāvs. Kālija hidrogēnftalāts | 51,0 g | Kālija hidroksīds | 13,75 g | Polietilēnglikol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenilēteris (piem., Triton X-100), 1 % pēc tilpuma | 10 ml | pH 5,7 līdz 5,9. Uzpilda ar ūdeni līdz 10000 ml. | | Sagatavošana: Atsevišķās sastāvdaļas samaisa. Uzglabā hermētiski noslēgtas ne ilgāk par septiņām dienām. 4.2. Fluorescences šķīdums (standartšķīdums) Sastāvs: Etīdija bromīds | 1,0 g. | Uzpilda ar ūdeni līdz 1000 ml. Sagatavošana: Etīdija bromīdu izšķīdina ūdenī. Uzglabā gaismu necaurlaidīgā un hermētiski noslēgtā pudelē ne ilgāk par diviem mēnešiem. 4.3. Fluorescences šķīdums (darba šķīdums) Sajauc 20 ml standartšķīduma (4.2.) ar buferšķīdumu (4.1.), lai iegūtu 1000 ml. Darba šķīdumu nelieto ilgāk par septiņām dienām. 4.4. Tīrīšanas šķīdums Sastāvs: Buferšķīdums (4.1.) | 10 ml | Polietilēnglikol-mono-p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenilēteris (piem., Triton X-100), 1 % pēc tilpuma | 10 ml | Amonjaks, 25 % pēc tilpuma | 25 ml | Uzpilda ar ūdeni līdz 10000 ml. Sagatavošana: Atsevišķās sastāvdaļas samaisa. Uzglabāšanas laiks nedrīkst pārsniegt 30 dienas. 5. Iekārtas un stikla priekšmeti 5.1. Skaitīšanas ierīce, kas darbojas pēc fluorescences optiskā principa. Piezīme Ierīce pirms lietošanas jākalibrē. Šādi nosaka attiecību starp skaitāmo daļiņu apjomu un robežvērtību, virs kuras veic skaitīšanu. Iekārtas kalibrēšanu veic atbilstoši ražotāja norādījumiem, izmantojot paraugus, kuros šūnu saturs ticis noteikts ar mikroskopisko metodi (A). 5.2. Ūdens vanna ar cirkulāciju, ko var darbināt 40 ± 1 oC temperatūrā. 5.3. Mēģene, pienācīgi noslēdzama, aptuveni 15 ml. 6. Piena paraugs 6.1. Paraugs jāuzglabā zemā temperatūrā mēģenē (5.3.). Ja paraugs nav ķīmiski konservēts, tam nevajag veikt skaitīšanu pirmajās 24 stundās pēc slaukšanas, jo saskaitītie daudzumi ir pārāk mazi. Uzglabāšanas temperatūra nedrīkst pārsniegt 6 oC. 6.2. Konservēšana Ķīmiskā konservēšana jāveic 24 stundu laikā. Konservēšana pēc paraugu ņemšanas jāveic, cik drīz vien iespējams. 6.2.1. Paraugu var ķīmiski konservēt, pievienojot kādu no šiem konservantiem: - ortoborskābe: ortoborskābes galīgā koncentrācija paraugā nedrīkst pārsniegt 0,6 g/ 100 ml. Šādi konservētu paraugu var uzglabāt turpmākās 24 stundas 6 līdz 12 oC temperatūrā, - k ālija dihromāts: kālija dohromāta galīgā koncentrācija nedrīkst pārsniegt 0,2 g/ 100 ml. Šādi konservētus paraugus var uzglabāt turpmākās 72 stundas 6 līdz 12 oC temperatūrā, - nātrija azīds: paraugus var konservēt ar nātrija azīdu līdz galīgai koncentrācijai 0,024 g/ 100 ml, ja paraugu atdzesē līdz temperatūrai 6 līdz 12oC uzreiz pēc paraugu ņemšanas un skaitīšanu veic 48 stundās pēc paraugu ņemšanas, - Bronopols: paraugu var konservēt ar bronopolu līdz galīgai koncentrācijai 0,05 g/ 100 ml, ja paraugu atdzesē līdz temperatūrai 6 līdz 12oC uzreiz pēc paraugu ņemšanas un skaitīšanu veic 72 stundās pēc paraugu ņemšanas. 6.2.2. Paraugu, kas jau ir konservēts ar ortoborskābi, var tālāk konservēt uz laiku līdz 48 stundām, izmantojot kālija dihromātu. Piezīme Attiecībā uz paraugiem, kas konservēti ar kālija dihromātu, jāievēro vietējie apstākļi attiecībā uz notekūdeņu novadīšanu. 7. Procedūra 7.1. Parauga pirmapstrāde Pārbaudāmo pienu pēc slaukšanas vismaz 24 stundas uzglabā apmēram 2 līdz 6 oC temperatūrā. Nav ieteicams slaukšanas dienā veikt skaitīšanu paraugiem bez pirmapstrādes, jo rezultātu līmenis var būt pārāk zems. Ja ir nepieciešams veikt skaitīšanu šādam paraugam, tā pirmapstrādi veic vismaz trīs stundas ar kālija dihromātu (skat. 6.2.1. punktu). 7.2. Sagatavošana Iepriekš apstrādāto paraugu (skat. 7.1. punktu) vai neapstrādāto paraugu, kurš ir stāvējis vismaz vienu dienu, karsē ūdens vannā (5.2.) līdz apmēram 40 oC temperatūrai. Pēc tam paraugu uzglabā istabas temperatūrā līdz skaitīšanai. 7.3. Šūnu skaita noteikšana Šūnu skaitu nosaka 15 minūšu laikā pēc karsēšanas beigām (skat. 7.2. punktu), izmantojot skaitīšanas ierīci (5.1.). Uzreiz pēc skaitīšanas paraugu rūpīgi samaisa, lai somatiskās šūnas izkliedētos pēc iespējas viendabīgāk. Parauga tālāka atšķaidīšana un sagatavošana notiek ierīcē automātiski. 8. Precizitāte Starptautiski akceptētu salīdzināmo pārbaužu dati attiecībā uz atkārtojamību (r) un reproducējamību (R) nav pieejami. Nākotnē tiks sniegti dati attiecībā uz precizitāti. Valsts līmenī pieejamie dati ļauj veikt šādas aplēses: 1) Šūnu skaits no 400000 līdz 500000 / ml - Atkārtojamības standartnovirze: sr = 20000 šūnas/ ml (atbilst variāciju koeficientam 5-4 %). - Reproducējamības standartnovirze: sR = 40000 šūnas/ ml (atbilst variāciju koeficientam 10-8 %). 9. Precizitātes kontrole Precizitāti kontrolē, izmantojot paraugus, kam zināms šūnu saturs, kas noteikts šūnu skaitīšanā ar mikroskopu kādā valsts references laboratorijā. VIII. ANTIBIOTIKU UN SULFONAMĪDU NOTEIKŠANA PIEMĒROŠANAS JOMA UN NOZARE Ar šo procedūru precizē standarta procedūru, kādā nosakāmas antibiotikas un sulfonamīdi svaigpienā un termiski apstrādātā pienā. Standarta procedūra: A. Kvalitatīvā metode Šī procedūra ir sākotnējā procedūra, kurā atlasa piena paraugus, kas satur antibiotikas, ieskaitot sulfonamīdus. Aprakstītā procedūra ir viena no virknes līdzīgu procedūru, kas kā testa organismu pamatā izmanto Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, ATTC10149. Šī procedūra ir izvēlēta par reprezentatīvu attiecībā uz šiem testiem. B. Penicilīna apstiprināšanas un identificēšanas procedūra Šī procedūra ir jāizmanto kvalitatīvās metodes rezultātu apstiprināšanai, lai identificētu penicilīnu un noteiktu penicilīna koncentrāciju. A. Kvalitatīvā metode 1. Piemērošanas joma un nozare Šī metode precizē antibiotiku un sulfonamīdu kvalitatīvo noteikšanu svaigpienā un termiski apstrādātā pienā, kuri pārsniedz tabulā noteiktās robežas: Dažādu antibiotiku un sulfonamīdu nosakāmā koncentrācija [1] | Testa jutība | Visi negatīvi | Visi pozitīvi | Benzilpenicilīns | 0,002 | 0,006 | Ampicilīns | 0,002 | 0,005 | Kloksacilīns | 0,015 | 0,035 | Nafcilīns | 0,006 | 0,011 | Tetraciklīns | 0,10 | 0,40 | Oksitetraciklīns | 0,20 | 0,45 | Hlortetraciklīns | 0,15 | 0,50 | Hloramfenikols | 7 | 15 | Dihidrostreptomicīns | 4 | 13 | Neomicīns | 1 | 22 | Kanamicīns | 9 | 28 | Bacitracīns | 0,06 | 0,14 | Eritromicīns | 1 | 2,25 | Rifamicīns | 0,01 | 0,14 | Diafenilsulfons | 0,01 | 0,1 | Sulfametazīns (Sulfadimidīns) | 0,5 | 1 | Rauga ekstrakts | 2 g | Peptons | 5 g | Gaļas ekstrakts | 1 g | Nātrija hlorīds | 5 g | Agars | 10-15 g | Ūdens | 1000 ml | Sagatavošana Sastāvdaļas izšķīdina ūdenī. Uzkarsē līdz viršanai, pa laikam apmaisot. Noregulē pH, lai pēc sterilizēšanas tas būtu 7,4 ± 0, 1 pie 25 oC. Izdala 10 ml daudzumus pa mēģenēm, lai iegūtu slīpagaru, vai 100 ml daudzumus pudelēs. Sterilizē 15 minūtes 121 ± 1 oC temperatūrā. 5.1.2. Agara barotne Sastāvs: Nātrija hlorīds | 2 g | Agars | 15 g | Ūdens | 1000 ml | Trimetoprima vai tetroksoprima šķīdums (skat. 5.1.3. punktu) | 10 ml | Sagatavošana. Sastāvdaļas, izņemot trimetoprimu vai tetroksoprimu, izšķīdina ūdenī. Uzkarsē līdz viršanai, pa laikam apmaisot. Pievieno trimetoprimu vai tetroksoprimu un 15 minūtes sterilizē 121 ± 1 oC temperatūrā; noregulē pH, lai pēc sterilizēšanas tas būtu 7,0 ± 0,1 pie 25 oC. 5.1.3. Trimetoprima vai tetroksoprima šķīdums Sastāvs: Trimetoprims | 5 mg | vai tetroksoprims | 30 mg | Etanols 96 % | 5 ml/30 ml | Ūdens līdz | 1000 ml | Sagatavošana Trimetoprimu vai tetroksoprimu izšķīdina etanolā (5 vai 30 ml) un atšķaida ar ūdeni. 5.1.4. Uzturviela Sastāvs: Rauga ekstrakts | 0,75 mg | Glikoze | 5,0 mg | Šķīstošā ciete | 8,0 mg | Bromkrezola sarkanais | 0,025 g | Ūdens līdz | 50 ml | Sagatavošana. Uzturvielas un indikatoru izšķīdina ūdenī, vajadzības gadījumā karsējot; filtrējot sterilizē. Uzturviela ir pieejama gatavā veidā tabletēs. 5.2. Penicilīna standartšķīdumi 5.2.1. Pagatavo penicilīna šķīdumu 60 μg/ml = (100 SV/ ml), sterilā pudelē ar atbilstošu aizbāzni izšķīdinot kristāliskā nātrija vai kālija benzilpenicilīnu sterilā destilētā ūdenī. 5.2.2. Pagatavo penicilīna darba šķīdumu, 1,25 ml penicilīna šķīdumu (5.2.1.) uzpildot ar sterilu destilētu ūdeni līdz 1000 ml. Šis darba šķīdums satur 0,075 μg (= 0,125 SV/ ml). 5.2.3. Pagatavo 75 ml penicilīna standartšķīduma, kas satur 0,004 μg/ml (= 0,0067 SV/ ml), 71 ml piena bez inhibitoriem (5.3.) pievienojot un samaisot ar 4 ml penicilīna darba šķīduma (5.2.2.). 5.2.4. Penicilīna šķīdumi, kas minēti 5.2.1. līdz 5.2.3. punktam, jāpagatavo testa veikšanas dienā. 5.3. Piens bez inhibitoriem Kontrolei sagatavo pienu bez inhibitoriem, sterilā destilētā ūdenī izšķīdinot sauso vājpienu (10 % m/V), kas iepriekš testēts un atzīts par inhibitorus nesaturošu. Kā alternatīvu var iepildīt pudelēs pietiekošu daudzumu svaiga nefasēta piena, kas testēts un atzīts par inhibitorus nesaturošu, vienu stundu karsēt 100 oC temperatūrā, pēc tam uzglabāt ledusskapī 0 līdz 6 oC temperatūrā ne ilgāk par vienu nedēļu. 5.4. Testa organisms 5.4.1. Par testa organismu izmanto Bacillus stearothermophilus var. calidolactus celmu ATCC10149. Celms ir identisks celmam C 953. 5.4.2. Testa kultūras uzturēšanai sagatavo izejas kultūru. Testa kultūru tur uz pārtikas slīpagara (5.1.1.). Slīpagaru uzsēj svītru veidā, izmantojot testa kultūras cilpu, un 48 stundas aerobi inkubē 63 ± 1 oC temperatūrā. Pēc inkubācijas mēģeni noslēdz, izmantojot sterilu gumijas aizbāzni. Šādi iegūto izejas kultūru var uzglabāt vairākus mēnešus ledusskapī 0 līdz 5 oC temperatūrā. 5.5. Testa kultūra (sporu suspensija) 5.5.1. Aseptiski pārnes 20 ml pārtikas agara (5.1.1.) uz sterilu Petri trauciņu (4.2.2.) un atdzesē līdz istabas temperatūrai. 5.5.2. Ar sterilu pipeti (4.2.4.) pārnes 5 ml sterila destilēta ūdens uz mēģeni ar izejas kultūru (5.4.2.) un nomazgā sporas no slīpagara, izmantojot sterilu cilpu. Šo sporu suspensiju uzglabā 0 līdz 5 oC temperatūrā un izlieto 36 stundu laikā. 5.5.3. Ar sterilu pipeti (4.2.4.) pārnes 0,5 ml sporu suspensijas (5.5.2.) uz Petri trauciņu (5.5.1.) un uzsējumu rūpīgi uztriepj visai virsmai ar liekta stikla stienīša palīdzību. Inkubē 16 līdz 18 stundas 63 ± 1 oC temperatūrā (4.1.1.). Izmantojot izejas kultūru (5.4.2.) vai kultūru, kas stāvējusi ilgāk par 36 stundām, uzsējums jāveic vismaz divas reizes, intervālam starp tām nepārsniedzot 36 stundas. 5.5.4. Ar sterilu pipeti (4.2.4.) pārnes 10 ml destilēta ūdens uz Petri trauciņu (5.5.3.) un ar stikla stienīša palīdzību sporas no virsmas virza uz suspensiju. Sporu suspensiju pārnes uz pudeli (4.2.3.), kurā ir 250 ml sterila destilēta ūdens. Pudeli noslēdz un rūpīgi sakrata. Kultūras, kam uzreiz neveic uzsējumu, jāuzglabā ledusskapī 0 līdz 6 oC temperatūrā. 5.5.5. Sporu suspensijai dzīvotspējīgo mikroorganismu noteikšanas agara barotnē, kas 16 līdz 18 stundas inkubēta 63 ± 1 oC temperatūrā, dzīvotspējīgo koloniju skaits ir no 5 līdz 10 miljoniem vienā ml. Sporu suspensijai jābūt vienmērīgi duļķainai; ja tajā ir pārslas vai nogulsnes, tā jāizmet un no izejas kultūras jāpagatavo jauna suspensija (5.4.2.). 5.6. Mēģeņu/ ampulu sagatavošana 5.6.1. Agara barotni (5.1.2.) izkausē un atdzesē līdz 55 oC. 5.6.2. Vienu daļu svaigas sporu suspensijas (5.5.4.) pievieno piecām daļām agara barotnes (5.6.1.) mēģenē vai pudelē un rūpīgi sajauc. 5.6.3. Uz sterilu mēģeni vai ampulu (4.2.6.) pārnes 0,3 ml uzsētās barotnes (5.6.2.), kas aprēķināta tā, lai veidotu 5 mm biezu slāni, tad noslēdz ar aizbāzni vai vāciņu, vai aizkausē galu. Mēģenes/ ampulas atdzišanai novieto vertikāli, ļaujot barotnei sacietēt, pēc tam ļauj nostāvēties vismaz 12 stundas. 5.6.4. Mēģenes/ ampulas var lietot tajā pašā dienā, tomēr tās var uzglabāt vairākus mēnešus, ja tās ir atdzesētas uzreiz pēc sagatavošanas un uzglabātas 0 līdz 6 oC temperatūrā. 6. Procedūra 6.1. Paraugi jātestē pēc iespējas drīzāk – vēlams 24 stundu laikā pēc paraugu ņemšanas — starplaikā turot paraugus 0 līdz 5 oC temperatūrā. Ja nav iespējams testēt paraugus 24 stundu laikā, tie jāuzglabā sasaldēti (– 30 līdz – 15 oC), lai pēc iespējas samazinātu penicilīna inaktivāciju. 6.2. Katru mēģeni/ ampulu marķē identificēšanai (5.6.) salasāmā un neizdzēšamā vaidā. Noņem vāciņu vai izņem aizbāzni. Vajadzīgo skaitu paraugu un kontroles paraugu (5.2. un 5.3. punkts), kas jāpārbauda, ievieto piemērotā statīvā (4.1.3.). 6.3. Katrai mēģenei/ ampulai pievieno 50 mikrolitrus uzturvielas, kas minēta 5.1.4. punktā. 6.4. Paraugu rūpīgi samaisa un ar šļirci (4.1.4.) pārnes 0,1 ml uz atbilstoši marķēto mēģeni/ ampulu. Katram pārnesamajam paraugam izmanto tīru vienreizējas lietošanas uzgali. 6.5. Darbību, kas aprakstīta 6.4. punktā, atkārto vēlreiz, piena parauga (5.2.3.) vietā izmantojot penicilīna standartšķīdumu, kas satur 0,004 μg/ ml (= 0,0067 SV/ ml) penicilīna. 6.6. Darbību, kas minēta 6.4. punktā, atkārto vēlreiz, piena parauga vietā izmantojot piena kontroles materiālu bez inhibitoriem (5.3.). 6.7. Mēģenes/ ampulas noslēdz, un statīvu ar mēģenēm/ ampulām ievieto ūdens vannā vismaz uz 2 ½ līdz 2 ¾ stundām 63 ± 1 oC temperatūrā (4.1.2.). 6.8. Statīvu ar mēģenēm/ ampulām izņem no ūdens vannas. 6.9. Pārbauda testa materiāla krāsu (skat. 7. punktu). 7. Rezultātu interpretācija 7.1. Testa materiāls purpursarkanā krāsā jebkurā piena paraugā vai kontroles mēģenēs/ ampulās norāda uz antiobiotiku vai sulfonamīdu klātbūtni paraugā atbilstoši vai aptuveni līmenim "visi pozitīvi", kas sniegts tabulā 39. lappusē. Testa materiāla pietiekošu jutīgumu apliecina tas, ka saglabājas penicilīna standartšķīduma (6.5.) mēģeņu/ ampulu purpursarkanā krāsa. 7.2. Purpursarkana krāsa vienīgi daļai testa materiāla, vai nevienmērīga krāsa kādā no piena parauga mēģenēm/ ampulām norāda uz inhibitoru klātbūtni paraugā 39. lappuses tabulā sniegto līmeņu robežās. 7.3. Dzeltena krāsa testa materiālam kādā no piena paraugiem vai kontroles mēģenēs/ ampulās norāda uz tādu vielu neesamību, kas ir inhibitori attiecībā pret testa organismu. 7.4. Ja purpursarkana krāsa ir visās pārbaudītajās mēģenēs/ ampulās, ieskaitot negatīvo kontroli, mēģenes/ ampulas nesatur dzīvotspējīgas sporas un paraugi atkārtoti jātestē ar svaigi sagatavotu testēšanas materiālu. 8. Rezultātu apstiprināšana 8.1. Visus paraugus, kam ir 7.1. un 7.2. punktā aprakstītā reakcija, apstiprina pēc "B metodes". Ja pirms apstiprināšanas ir nepieciešams uzglabāt piena paraugus, tie jāsasaldē, lai novērstu antibiotiku noārdīšanos. B. Penicilīna apstiprināšanas un koncentrācijas noteikšanas procedūra 1. Piemērošanas joma un nozare Procedūra precizē apstiprinājuma testu attiecībā uz penicilīnu vai citām antibiotikām un procedūru, kādā nosaka penicilīna koncentrāciju piena paraugos ar pozitīvu (A.7.1.) vai šaubīgu reakciju (A.7.2.). Dažādu antibiotiku jutību attiecībā uz šo procedūru skat. A.1. punktā. 2. Definīcija 2.1. Piena paraugs satur antibiotikas, ieskaitot sulfonamīdus, ja paraugs aprakstītajā procedūrā uzrāda skaidru inhibīcijas zonu vismaz 2 mm lielumā. 2.2. Ja paraugs, kas satur antibiotikas, ieskaitot sulfonamīdu (2.1.), un kam pievienota penicilināze (betalaktamāze), neuzrāda skaidru zonu vai uzrāda skaidru zonu ar mazāku diametru, nekā bez penicilināzes, tad inhibitors ir vai nu penicilīns, vai arī penicilīns un citas antibiotikas, ieskaitot sulfonamīdus. 2.3. Ja penicilināze (2.2.) nav inaktivējusi šo zonu, tad piena paraugā esošais inhibitors nav penicilīns, bet var būt cits atlikums (skat. Direktīvas 85/397/EEK A pielikuma VI nodaļas A.1.f un 2.b punktu). Dažus no pussintētiskajiem penicilīniem, piem., nātrija kloksacilīnu, penicilināze neinaktivē vai inaktivē tikai daļēji, vai arī tie ir pilnībā rezistenti, tāpēc tos neidentificē kā penicilīnu (skat. 7.3. punktu). 3. Princips Ar pārbaudāmo pienu piesūcinātu dzēšpapīru novieto uz agara barotnes virsmas, kam uzsēti Bacillus stearothermophilus, var. calidolactis. Sakarā ar organisma normālu augšanu, ko izraisījusi inkubācija, agars kļūst duļķains. Skaidra zona apkārt dzēšpapīram norāda uz tādu vielu klātbūtni pienā, kas kavē organismu augšanu. Skaidrās zonas lielums, līdztekus citiem aspektiem, ir atkarīgs no inhibitoru koncentrācijas pienā un to veida. 4. Iekārtas, stikla priekšmeti un aprīkojums 4.1. Iekārtas 4.1.1. Skat. A.4.1. punktu. 4.1.2. Ūdens vanna, ko var darbināt 80 ± 1 oC temperatūrā. 4.2. Stikla priekšmeti Skat. A.4.2. punktu. 4.3. Dzēšpapīri bez inhibitoriem, 9 līdz 13 mm diametrā, kas var absorbēt apmēram 130 mg piena (vēlams uzglabāt eksikatorā). 5. Barotnes, standartšķīdumi, penicilināzes šķīdums, reaģenti, testa organisms, utt. Barotnes sastāvdaļām jābūt piemērotām bakterioloģiskiem mērķiem. Izmantojamam ūdenim jābūt destilētam stikla traukā vai demineralizētam, ar vismaz līdzvērtīgu tīrības pakāpi. Tajā nedrīkst būt inhibitoru attiecībā pret testa organismu. 5.1. Barotnes 5.1.1. Pārtikas agars (A.5.1.1. punkts). 5.1.2. Testa materiāls inhibitoru noteikšanai Sastāvs: Rauga ekstrakts | 2,5 g | Triptons | 5 g | Glikoze | 1 g | Trimetoprima vai tetroksoprima šķīdums (A.5.1.3.) | 10 ml | Agars | 10-15 g (atkarībā no recēšanas īpašībām) | Ūdens | 1000 ml | Sagatavošana Pirms trimetoprima vai tetroksoprima šķīduma pievienošanas cietās sastāvdaļas pilnībā izšķīdina ūdenī, karsējot un apmaisot. Pēc trimetoprima vai tetroksoprima šķīduma pievienošanas jānoregulē pH, lai pēc sterilizēšanas tas būtu 8,0 + 0,1 pie 25 oC. Materiālu 15 minūtes sterilizē 121 ± 1 oC temperatūrā. 5.2. Penicilīna standartšķīdumi pienā Skat. A.5.2. punktu. Lai kvantitatīvi noteiktu inhibitorus (8.), sagatavo penicilīna standartšķīdumus pienā bez inhibitoriem (A.5.3.) šādā koncentrācijā: a) 0,004 μg/ml (0,0067 SV/ ml); b) 0,006 μg/ml (0,01 SV/ ml); c) 0,03 μg/ml (0,05 SV/ ml); d) 0,06 μg/ml (0,1 SV/ ml). 5.3. Penicilināzes šķīdums 5.3.1. Pietiekošu daudzumu penicilināzes (betalaktamāzes) izšķīdina sterilā destilētā ūdenī, iegūstot koncentrāciju 1000 U/ ml. Šo šķīdumu, vēlams sadalītu mazās porcijās, var uzglabāt līdz četrām nedēļām 0 līdz 5 oC temperatūrā. Piezīme Attiecībā uz penicilināzi nepastāv vienots starptautisks standarts. Šajā procedūrā pieņem, ka ar 10 vienībām penicilināzes pietiek, lai inaktivētu 0,6 μg (= 1 SV) penicilīna. Penicilināzes piegādes partijām, kuras koncentrācija nav zināma, ir jāpārbauda šā pieņēmuma atbilstība. Pretējā gadījumā ir attiecīgi jāizmaina penicilināzes šķīduma koncentrācija. 5.3.2. Penicilināzes vietā var izmantot gatavos dzēšpapīrus, kas sagatavoti ar penicilināzi, ja kontroles procedūrā konstatēts, ka tie satur pienācīgu penicilināzes daudzumu. 5.4. Testa organisms Skat. A.5.4. punktu. 5.5. Testa kultūra (sporu suspensija) Skat. A.5.5. punktu. 5.6. Testa plašu sagatavošana 5.6.1. Izkausē testa materiālu inhibitoru noteikšanai (5.1.2.) un atdzesē līdz 55 oC temperatūrai. 5.6.2. Pudelē pievieno vienu daļu svaigas sporu suspensijas (5.5.) tik daudz daļām testa materiāla inhibitoru noteikšanai (5.1.2.), lai iegūtu pienācīgu koloniju blīvumu uzsētajā testa materiālā, tad rūpīgi sajauc. 5.6.3. Uz sterilu Petri trauciņu (A.4.2.2.), kas iepriekš sakarsēts līdz 55 oC temperatūrai, pārnes uzsēto testa materiālu (5.6.2.), lai iegūtu 0,6 līdz 0,8 mm biezu slāni. Petri trauciņā ar iekšējo diametru 140 mm jābūt apmēram 15 ml testa materiāla, lai panāktu 0,8 mm biezumu. 5.6.4. Petri trauciņus pārceļ uz aukstu horizontālu virsmu, kas iepriekš pārbaudīta ar spirta līmeņrādi, noņem vāciņus un ļauj agara barotnei sacietēt. Kad barotne sacietējusi, vāciņus atliek atpakaļ uz trauciņiem, kurus tad apgriež otrādi, lai samazinātu kondensāciju uz agara barotnes virsmas. 5.6.5. Vēlams šādi sagatavotās testa plates izmantot tajā pašā dienā, tomēr tās var uzglabāt līdz divām nedēļām, ja tās uzreiz pēc sagatavošanas ievieto un uzglabā hermētiski noslēgtā polietilēna maisā 5 oC temperatūrā. 5.6.6. Paraugu identificēšanai marķē testa plašu apakšas. 6. Procedūra 6.1. Parauga sagatavošana 6.1.1. Paraugi, kas "A metodē" uzrāda pozitīvus vai šaubīgus rezultātus (A.7.1. un A.7.2. punkts), atkārtoti jātestē, pārbaudot kvalitatīvi un kvantitatīvi attiecībā uz penicilīnu. 6.1.2. Vispirms šos piena paraugus 10 minūtes karsē 80 ± 1 oC temperatūrā, lai novērstu termoneizturīgu nespecifisku inhibitoru ietekmi. 6.1.3. Pēc rūpīgas sajaukšanas apmēram 10 ml uzkarsētā testējamā piena pārnes uz piemērotu sterilu pudeli ar platu kaklu. Pienam pievieno apmēram 0,4 ml penicilināzes šķīduma (5.3.) un rūpīgi sajauc. 6.2. Inhibitoru noteikšana 6.2.1. Dzēšpapīru (4.3.) iemērc piena paraugā (6.1.2.), izmantojot tīru, sausu pinceti. Atbrīvojas no liekā piena, piespiežot dzēšpapīru pie paraugu pudeles sieniņas. Dzēšpapīru izklāj uz testa plates virsmas (5.6.) un viegli uzspiež ar pinceti. 6.2.2. Dzēšpapīriem, kas sagatavoti ar dažādaji