19)

C daļai pievieno šādas nodaļas: “C.47 Zivju agrīno attīstības stadiju toksiskuma tests IEVADS 1. Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO testēšanas norādījumiem 210 (2013. gads). Testi, ko veic zivju agrīnās attīstības stadijās, ir paredzēti, lai noteiktu ķimikāliju letālu un subletālu ietekmi uz testētajām stadijām un sugām. Tie sniedz vērtīgu informāciju, kā aplēst ķimikāliju hronisku letālu un subletālu ietekmi uz citām zivju sugām. 2. Testēšanas norādījumu 210 pamatā ir Apvienotās Karalistes priekšlikums, kas tika apspriests ESAO ekspertu sanāksmē Medmenhamā (Apvienotā Karaliste) 1988. gada novembrī un atjaunināts 2013. gadā, lai atspoguļotu pieredzi, kas gūta, izmantojot testēšanu, un ieteikumus no ESAO 2010. gada septembra semināra par zivju toksiskuma testēšanu (1). TESTĒŠANAS PRINCIPS 3. Zivis agrīnās attīstības stadijās tiek eksponētas dažādām ūdenī izšķīdinātas testējamās ķimikālijas koncentrācijām. Priekšroka dodama caurplūdes apstākļiem, tomēr, ja tas nav iespējams, pieļaujami arī pusstatiski apstākļi. Sīkākai informācijai jāizmanto ESAO norāžu dokuments par grūti testējamu vielu un maisījumu ūdenstoksiskuma testēšanu (2). Testu sāk, apaugļotus ikrus novietojot testa kamerās, un atkarībā no sugas turpina tik ilgi, cik nepieciešams, lai kontroles zivis sasniegtu zivju mazuļu attīstības stadiju. Letālo un subletālo ietekmi novērtē un salīdzina ar kontroles vērtībām, lai noteiktu zemāko novērojamās ietekmes koncentrāciju (LOEC) nolūkā noteikt i) nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC) un/vai ii) EC x (piemēram, EC 10, EC 20), izmantojot regresijas modeli, ar ko aplēš koncentrāciju, kas izraisītu x % pārmaiņas mērītajā ietekmē. Ziņošana par attiecīgajām ietekmes koncentrācijām un parametriem var būt atkarīga no tiesiskā regulējuma. EC x jābūt testējamo koncentrāciju diapazonā, lai EC x tiktu iegūts no interpolācijas, nevis no ekstrapolācijas (definīcijas sk. 1. papildinājumā). INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO ĶIMIKĀLIJU 4. Testējamā ķimikālija ir tā, kas tiek testēta. Jāzina testējamās ķimikālijas šķīdība ūdenī (sk. šī pielikuma A.6 nodaļu) un tvaika spiediens (sk. šī pielikuma A.4 nodaļu), un jābūt pieejamai tādai ticamai analītiskai metodei ķimikālijas daudzuma kvantitatīvai noteikšanai testa šķīdumos, kuras precizitāte un kvantitatīvās noteikšanas robeža ir zināma un norādīta ziņojumā. Lai gan testu veikt nav nepieciešams, akūtā toksiskuma testa rezultāti (sk. šī pielikuma C.1 vai C.49. nodaļu), vēlams tādi, kas veikti ar šim testam izvēlētajām sugām, var sniegt derīgu informāciju. 5. Ja ar šo testēšanas metodi testē maisījumu, pēc iespējas jāraksturo tā sastāvs, piemēram, norādot tā sastāvdaļu ķīmisko identitāti, to kvantitatīvo daudzumu un būtiskās īpašības (kā iepriekš minētās). Pirms testa metodi izmantot maisījuma obligātajai testēšanai, jāapsver, vai tā sniegs paredzētajam regulatīvajam nolūkam pieņemamus rezultātus. 6. Noderīga informācija ir struktūrformula, vielas tīrības pakāpe, šķīdība ūdenī, stabilitāte ūdens un gaismas iedarbībā, pKa, Pow un tūlītējas bionoārdāmības testa rezultāti (piemēram, šī pielikuma C.4. vai C.29. nodaļa). TESTA PAMATOTĪBA 7. Lai tests būtu pamatots, piemēro šādus nosacījumus: — izšķīdušā skābekļa koncentrācijai visā testa laikā jābūt > 60 % no gaisa piesātinājuma vērtības; — ūdens temperatūra starp testa kamerām vai starp secīgām dienām testa laikā nevienā brīdī nedrīkst atšķirties vairāk par ± 1,5oC, un tai jābūt temperatūru intervālā, kas norādīts attiecīgajai testa sugai (2. papildinājums); — testējamā koncentrācija obligāti jāizmēra analītiski; — apaugļoto ikru kopējai izdzīvotībai un izšķilšanās rezultātam kontrolgrupā un attiecīgā gadījumā šķīdinātāju kontrolgrupā ir jābūt lielākai par 2. papildinājumā norādītajiem robežlielumiem vai vienādai ar tiem. 8. Novērojot minimālas novirzes no pamatotības kritērijiem, sekas jāaplūko kopsakarā ar testa datu uzticamību, un šie apsvērumi jāatspoguļo ziņojumā. Ziņojumā jāatspoguļo ietekme uz izdzīvotību, izšķilšanos vai augšanu šķīdinātāja kontrolgrupā, tās salīdzinot ar negatīvajiem kontroles datiem, un tā jāapspriež kopsakarā ar testa datu uzticamību. METODES APRAKSTS Testa kameras 9. Var izmantot jebkādus stikla, nerūsējoša tērauda vai cita ķīmiski inerta materiāla traukus. Tā kā ir zināms, ka silikonam piemīt augsta lipofīlisko vielu absorbēšanas spēja, iespējami jāvairās izmantot silikona caurulītes caurplūdes pētījumos un silikona blīvējumus, kas ir saskarē ar ūdeni; jāizmanto, piemēram, monobloku stikla akvāriji. Traukiem jābūt pietiekami lieliem, lai tajos varētu notikt pienācīga kontrolēta augšana un tiktu uzturēta izšķīdušā skābekļa koncentrācija (piemēram, mazām zivju sugām pietiktu ar 7 l tvertni), kā arī atbilstība 19. punktā norādītajiem noslogojuma kritērijiem. Testa kameras testa izpildes vietā vēlams izvietot randomizēti. Tāds randomizēti izvietotu bloku plāns, kur katrā blokā ir pārstāvēta katra veida apstrāde, ir vēlamāks par pilnīgi randomizētu izvietojuma plānu. Testa kameras jāaizsargā no nevēlamiem traucējumiem. Testa sistēmai ir vēlams sagatavošanās posms, kurā pirms testa organismu ielaišanas tiek pierādīts, ka testējamās ķimikālijas koncentrācijas ir stabilas ekspozīcijas koncentrācijas. Sugu izvēle 10. Ieteicamās zivju sugas ir norādītas 1. tabulā. Tas neizslēdz citu sugu izmantošanu, bet tādā gadījumā iespējams, ka testa procedūra jāpielāgo, lai būtu nodrošināti piemēroti testa apstākļi. Tādā gadījumā sugas izvēles pamatojums un eksperimenta metode jāatspoguļo ziņojumā. Vaislas zivju turēšana 11. Dati par vaislas zivju turēšanu piemērotos apstākļos ir atrodami 3. papildinājumā un minētajās atsaucēs (3),(4),(5). Rīkošanās ar apaugļotiem ikriem, embrijiem un kāpuriem 12. No sākuma apaugļotus ikrus, embrijus un kāpurus galvenajā traukā var eksponēt mazākos stikla vai nerūsējoša tērauda traukos, kas aprīkoti ar sieta sānu vai galu, darot iespējamu, ka caur tiem plūst testa šķīdums. Neturbulentu plūsmu caur šiem mazajiem traukiem var radīt, tos piekarot turētājam, kas tos kustina augšup un lejup tā, lai organismi visu laiku būtu iegremdēti. Lašu dzimtas zivju apaugļotus ikrus var balstīt uz paliktņiem vai sietiem ar pietiekami lielām atverēm, lai kāpuri pēc izšķilšanās varētu tām izkrist cauri. 13. Ja galvenajā testa traukā ikru turēšanai izmanto ikru konteinerus, paliktņus vai sietus, pēc kāpuru izšķilšanās tie atbilstoši 3. papildinājuma norādēm jāizņem un jāatstāj tikai sieti, kas novērš kāpuru izkļūšanu no traukiem. Ja kāpurus pārvietot nav vajadzības, tos neeksponē gaisam un kāpuru izlaišanai no ikru konteineriem tīklu neizmanto. Šādas pārvietošanas laiks ir atkarīgs no sugas un jādokumentē ziņojumā. Tomēr pārvietošana nav vienmēr nepieciešama. Ūdens 14. Par testa ūdeni var izmantot jebkādu ūdeni, kurā testa sugas uzrāda pietiekamu ilgtermiņa izdzīvotību un augšanu (sk. 4. papildinājumu). Tā kvalitātei testa laikā jābūt nemainīgai. Lai nodrošinātu, ka atšķaidīšanas ūdens pārāk neietekmē testa rezultātu (piemēram, veidojot kompleksveida savienojumus ar testējamo ķimikāliju) vai negatīvi neietekmē vaislas zivju rādītājus, noteiktos starplaikos jāņem paraugi analīzei. Ja zināms, ka ūdens kvalitāte ir relatīvi nemainīga, tad, piemēram, reizi sešos mēnešos būtu jāveic smago metālu (piemēram, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), biežāk sastopamo anjonu un katjonu (piemēram, Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO42-), amonjaka, kopējo hlororganisko pesticīdu, kopējā organiskā oglekļa un suspendēto daļiņu mērījumi. Ja zināms, ka ūdens kvalitāte ir mainīga, mērījumi jāveic biežāk; biežums atkarīgs no kvalitātes mainīguma. Daži pieņemama atšķaidīšanas ūdens ķīmiskie parametri ir norādīti sarakstā 4. papildinājumā. Testa šķīdumi 15. Lai testa kamerām piegādātu koncentrāciju sēriju, caurplūdes testos ir vajadzīga sistēma, kas nepārtraukti piegādā un atšķaida testējamās ķimikālijas vielas izejšķīdumu (piemēram, dozējošais sūknis, proporcionālas atšķaidīšanas ierīce, piesātinātāja sistēma). Izejšķīdumu un atšķaidīšanas ūdens caurplūdums testa laikā jāpārbauda noteiktos starplaikos, un šie testa laikā nedrīkst mainīties vairāk kā par 10 %. Par piemērotu atzīst caurplūdumu, kas līdzvērtīgs vismaz pieciem testa kameras tilpumiem 24 stundās (3). Tomēr, ja ievēro 19. punktā specificēto noslogojumu, lai barība netiktu ātri aizskalota, ir iespējams izmantot zemāku caurplūdumu, piem., 2–3 testa kameras tilpumi. 16. Izraudzītās koncentrācijas testēšanas šķīdumus parasti gatavo, atšķaidot izejšķīdumu. Izejšķīdumu vēlams pagatavot, testējamo ķimikāliju atšķaidīšanas ūdenī gluži vienkārši iemaisot vai tajā iejaucot ar mehāniskiem līdzekļiem (piemēram, kratīšana un/vai apstrāde ar ultraskaņu). Piemērotas koncentrācijas izejšķīduma iegūšanai var izmantot piesātināšanas kolonnas (šķīdības kolonnas) vai pasīvas dozēšanas metodes (6). Šķīdinātāju par nesējvielu izmantot nav ieteicams. Tomēr, ja jāizmanto šķīdinātājs, paralēli jāveic šķīdinātāja kontrole, izmantojot tādu pašu šķīdinātāja koncentrāciju kā ķīmiskajā apstrādē, t. i., šķīdinātāja līmenim visās koncentrācijās, kā arī šķīdinātāja kontrolgrupā vēlams būt vienādam. Dažām atšķaidīšanas sistēmām tas var būt tehniski grūti izdarāms; tādā gadījumā šķīdinātāja koncentrācijai šķīdinātāja kontrolgrupā jābūt vienādai ar augstāko šķīdinātāja koncentrāciju apstrādes grupā. Grūti testējamām vielām jāizmanto ESAO norāžu dokuments Nr. 23 par grūti testējamu vielu un maisījumu ūdenstoksiskuma testēšanu (2). Ja izmanto šķīdinātāju, to izraugās atkarībā no vielas ķīmiskajām īpašībām. ESAO norāžu dokumentā Nr. 23 ir ieteikta maksimālā koncentrācija 100 μl/l. Lai izvairītos no šķīdinātāja iespējamās ietekmes uz mērītajiem beigupunktiem (7), šķīdinātāja koncentrāciju ieteicams saglabāt iespējami zemu. 17. Pusstatiskajā testā var izmantot divas atšķirīgas atjaunošanas procedūras. Vai nu jaunu testa šķīdumu sagatavo tīros traukos un izdzīvojušos ikrus un kāpurus uzmanīgi pārvieto uz jaunajiem traukiem, vai arī testa organismus atstāj testa traukos, nomainot daļu (vismaz divas trešdaļas) testa šķīduma / kontroles tilpuma. PROCEDŪRA Ekspozīcijas apstākļi Ilgums 18. Testu sāk uzreiz pēc ikru apaugļošanas, un vēlams tos testa šķīdumā iemērkt pirms blastodiska dalīšanās sākuma vai iespējami tuvu šai stadijai. Testa ilgums būs atkarīgs no izmantotās sugas. Daži ieteicamie ilgumi norādīti 2. papildinājumā. Noslogojums 19. Ar apaugļoto ikru skaitu testa sākumā jāpietiek, lai nodrošinātu atbilstību statistiskā testa nosacījumiem. Tos vienmērīgi izkliedē pa apstrādes grupām, un uz koncentrāciju izmanto vismaz 80 ikrus, ko sadala vienādi pa vismaz četrām replikātu testa kamerām. Noslogojumam (biomasai uz testa šķīduma tilpumu) jābūt pietiekami mazam, lai ikru un kāpuru stadijā, neizmantojot aerāciju, izšķīdušā skābekļa koncentrāciju varētu uzturēt vismaz 60 % apmērā no gaisa piesātinājuma vērtības. Caurplūdes testiem ir ieteikts noslogojums, kas nepārsniedz 0,5 g uz l mitrā svara 24 stundās un nevienā laikā nepārsniedz 5 g uz l šķīduma (3). Gaisma un temperatūra 20. Fotoperiods un ūdens temperatūra jāpielāgo testa sugai (sk. 2. papildinājumu). Barošana 21. Barībai un barošanai ir būtiska nozīme, un ir svarīgi, lai katrā attīstības stadijā no piemērota brīža tiktu piegādāta pareiza barība tādā daudzumā, ar ko pietiek normālai augšanai. Barošanai visos replikātos jābūt aptuveni vienādai, ja vien to nekoriģē atbilstoši mirstībai. Barības pārpalikumi un fēces jāizņem, lai neuzkrātos atkritumi. Detalizēti barošanas režīmi izklāstīti 3. papildinājumā, bet atbilstoši pieredzei barības un barošanas režīmi tiek nepārtraukti atjaunināti, lai paaugstinātu izdzīvotību un optimizētu augšanu. Dzīva barība bagātina vidi, tādēļ to izmanto papildus sausajai vai saldētajai barībai vai tās vietā, ja tas atbilst sugai un attīstības stadijai. Testēšanas koncentrācijas 22. Parasti nepieciešamas piecas testējamās ķimikālijas koncentrācijas ar vismaz četriem replikātiem katrai koncentrācijai, ko citu no citas šķir konstants koeficients, kurš nepārsniedz 2,2. Izraugoties testējamo koncentrāciju diapazonu, ja pieejama, jāņem vērā informācija par akūto testēšanu, vēlams ar tās pašas sugas zivīm, un/vai par iedarbības diapazona noteikšanas testiem (1). Tomēr, izraugoties testējamās koncentrācijas diapazonu, jāņem vērā visi informācijas avoti, arī tādi avoti kā analoģija un dati par akūto toksiskumu zivju embrijiem. Ja ir jānosaka tikai empīriskās NOEC, kā galīgais tests ir pieļaujams robežtests vai paplašinātais robežtests ar mazāk nekā piecām koncentrācijām. Ja testē mazāk nekā piecas koncentrācijas, tas jāpamato. Nav jātestē testējamās ķimikālijas koncentrācijas, kas pārsniedz 96 stundu LC 50 vai 10 mg/l, izvēloties no abiem mazāko lielumu. Kontrole 23. Atšķaidīšanas ūdens kontrolei un nepieciešamības gadījumā šķīdinātāja, kas satur šķīdinātāju kā nesējvielu, kontrolei jābūt tikai papildus testējamās ķimikālijas vielas koncentrāciju sērijai (sk. 16. punktu). Analītisko noteikšanu un mērījumu biežums 24. Pirms ekspozīcijas perioda sākuma jānodrošina pareiza ķimikālijas piegādes sistēmas darbība visos replikātos (piemēram, mērot testējamās koncentrācijas). Jānosaka nepieciešamās analītiskās metodes, tostarp attiecīga kvantitatīvās noteikšanas robeža (LOQ), un pietiekami jāzina vielas stabilitāte testa sistēmā. Lai raksturotu ekspozīciju, testa laikā testējamās ķimikālijas koncentrācijas nosaka regulāros intervālos. Noteikšanu veic vismaz piecas reizes. Ja izmanto caurplūdes sistēmas, testējamās ķimikālijas analītiskos mērījumus vienā replikātā no katras koncentrācijas veic vismaz reizi nedēļā, replikātus sistemātiski mainot. Papildu analītiskās noteikšanas bieži vien pavērs iespēju uzlabot testa rezultāta kvalitāti. Paraugi var būt jāfiltrē, lai likvidētu daļiņas (piemēram, izmantojot 0,45 μm poru izmēru), vai jācentrifugē, lai nodrošinātu, ka noteikšana ķimikālijai tiek veikta īstā šķīdumā. Lai samazinātu testējamās ķimikālijas adsorbciju, filtri pirms lietošanas ir jāpiesūcina. Ja izmērītās koncentrācijas nav 80–120 % no nominālās koncentrācijas, ir jānosaka ietekmes koncentrācijas un tās jāizsaka salīdzinājumā ar caurplūdes testos izmērīto aritmētisko vidējo koncentrāciju (sk. testa metodes C.20 6. papildinājumu par aritmētiskā vidējā aprēķināšanu (8)), kā arī jāizsaka salīdzinājumā ar pusstatiskajos testos izmērīto koncentrāciju ģeometriskajiem vidējiem (sk. ESAO norāžu dokumenta Nr. 23 par grūti testējamu vielu un maisījumu ūdenstoksiskuma testēšanu 5. nodaļu (2)). 25. Testa laikā vismaz reizi nedēļā visos testa traukos jāmēra izšķīdušais skābeklis, pH un temperatūra, un testa sākumā un beigās — ja tas pamatoti — sāļums un cietība. Vismaz vienā testa traukā vēlams pastāvīgi uzraudzīt temperatūru. Novērojumi 26. Embrionālās attīstības stadijas : embrionālā attīstības stadija brīdī, kad sākas eksponēšana testējamajai ķimikālijai, būtu jāverificē iespējami precīzi. To var izdarīt, izmantojot pienācīgi saglabātu un notīrītu ikru reprezentatīvu paraugu. 27. Izšķilšanās un izdzīvotība : novērojumi par izšķilšanos un izdzīvotību jāizdara vismaz reizi dienā, un skaits jāprotokolē. Ja agrīnā embriju attīstības stadijā (t. i., pirmajā vai otrajā testa dienā) uz ikriem novēro pelējumu, skartos ikrus saskaita un izņem. Nedzīvie embriji, kāpuri un zivju mazuļi jāizņem, tiklīdz tie pamanīti, jo tie var strauji sadalīties vai citas zivis tos var sašķaidīt. Nedzīvos īpatņus izņemot, ļoti jāraugās fiziski netraumēt blakus esošos ikrus/kāpurus. Nāves pazīmes atšķiras atkarībā no sugas un attīstības stadijas. Piemēram: — apaugļotiem ikriem: jo īpaši agrīnās stadijās — izteikts gaismas caurlaidības zudums un krāsas maiņa, ko rada olbaltumvielu koagulācija un/vai izgulsnēšanās, kā dēļ tie kļūst balti un necaurredzami; — embrijiem, kāpuriem un zivju mazuļiem: nekustīgums un/vai elpošanas kustību neesība, un/vai sirdsdarbības neesība, un/vai nereaģēšana uz mehānisku kairinājumu. 28. Anormāls izskats : anormālas ķermeņa formas kāpuru vai zivju mazuļu skaits jāprotokolē pietiekamos starplaikos atkarībā no testa ilguma un aprakstītās anomālijas. Jāņem vērā, ka anormāli kāpuri un zivju mazuļi ir sastopami dabā un ka dažām sugām to daudzums kontrolgrupā(-ās) var sasniegt vairākus procentus. Ja deformācijas un ar tām saistītā anormālā uzvedība ir uzskatāma par tik smagu, ka tas organismam rada ievērojamas ciešanas, un ir attīstījusies tik tālu, ka organisms neatkopsies, organismu no testa izņem. Šādus dzīvniekus eitanazē un turpmākā datu analīzē uzskata par mirstības gadījumiem. Lielākajai daļai sugu, kuras iesaka izmantot šajā testa metodē (9), (10), (11), (12), ir dokumentēta normāla embrionālā attīstība. 29. Anormāla izturēšanās : anomālijas, piemēram, hiperventilācija, nekoordinēta peldēšana, netipisks mierīgums un netipiska barošanās, jāreģistrē atkarībā no testa ilguma pietiekamos starplaikos (piemēram, reizi dienā siltūdeņu sugām). Šādas novērotas ietekmes, lai gan grūti kvantificējamas, var palīdzēt interpretēt mirstības datus. 30. Svars: Svars : testa beigās, ņemot par pamatu replikātus, visas izdzīvojušās zivis sver (norādot dzīvnieku skaitu replikātā un vidējo dzīvnieka svaru): priekšroku dod mitrajam svaram (nosusinātiem dzīvniekiem), tomēr var ziņot arī datus par saussvaru (13). 31. Garums : testēšanas beigās mēra individuālo garumu. Ieteicams ir kopējais garums, tomēr astes spuras trūdēšanas vai spuru erozijas gadījumā var izmantot standartgarumu. Visām zivīm konkrētajā testā izmanto vienu un to pašu metodi. Indivīda garumu var izmērīt, piemēram, ar bīdmēru, digitālo fotoaparātu vai kalibrētu lēcas mikrometru. Tipiskie minimālie garumi ir definēti 2. papildinājumā. DATI UN PĀRSKATS Rezultātu apstrāde 32. Ja ziņojumā jāatspoguļo NOEC, ieteicams, lai eksperimenta plāns un izvēlētais statistiskais tests nodrošinātu pietiekamu jaudu (80 % vai vairāk), lai varētu noteikt bioloģiski nozīmīgas izmaiņas beigupunktos. Koncentrāciju ar nozīmīgu ietekmi un parametru ziņošanu var regulēt normatīvie akti. Ja ziņojumā jāatspoguļo EC x, eksperimenta plānam un izvēlētajam regresijas modelim ir jānodrošina EC x noteikšana tā, lai (i) ziņojumā atspoguļotais EC x 95 % ticamības intervālā nebūtu nulle un lai tas nebūtu pārāk liels, (ii) paredzētās vidējās vērtības EC x 95 % ticamības intervālā nebūtu kontroles vidējā aritmētiskā vērtība; (iii) regresijas modelis nebūtu būtiski neatbilstīgs. Neatkarīgi no tā, kuru no abām pieejām izmanto, ir jāidentificē procentuālās pārmaiņas katram beigupunktam, ko ir svarīgi noteikt vai aplēst. Eksperimenta plāns jāizstrādā tā, lai tas būtu iespējams. Ja iepriekš aprakstītie nosacījumi EC x noteikšanai nav izpildīti, ir jāizmanto NOEC pieeja. Maz ticams, ka visiem beigupunktiem procentuālā pārmaiņa būs vienāda, nav ticams arī, ka izstrādās paveicamu eksperimentu, kurš atbilstu šiem nosacījumiem attiecībā uz visiem beigupunktiem, tāpēc, lai eksperimentu izstrādātu pareizi, galvenā uzmanība ir jāpievērš beigupunktiem, kas ir svarīgi konkrētajam eksperimentam. 5. un 6. papildinājumā attiecībā uz katru pieeju ir pieejamas tādas statistiskās plūsmas diagrammas un norādes, kas palīdz apstrādāt datus un izvēlēties lietošanai vispiemērotāko statistisko testu vai modeli. Var izmantot citas statistiskas pieejas, ja tās ir zinātniski pamatotas. 33. Variācijas būs jāanalizē katras replikātu kopas ietvaros, izmantojot dispersijas analīzi vai kontingences tabulu, un atbilstošās statistisko analīžu metodes jābalsta uz šādu analīzi. Lai individuālas koncentrācijas pa daudziem faktoriem salīdzinātu ar kontroļu rezultātiem, nepārtrauktām atbildreakcijām ir ieteicams descendents Džonkhīra-Terpstra vai Viljamsa tests, bet dihotomām reakcijām, kas atbilst monotonai reakcijai uz koncentrāciju, ja nav pierādījumu par ekstrabinominālo dispersiju (14) — descendents Kohrana-Armitāža tests. Ja ir pierādījumi par ekstrabinominālo dispersiju, ir ieteicama Kohrana-Armitāža testa Rao-Skota modifikācija (15) (16) vai Viljamsa vai Daneta (pēc arcsin-kvadrātsaknes transformācijas), vai Džonkhīra-Terpstra tests, ko piemēro replikātu daļām. Ja dati neatbilst monotonai atbildreakcijai uz koncentrāciju, nepārtrauktām atbildreakcijām var noderēt Daneta, Danna, vai Manna-Vitnija metode, bet dihotomām atbildreakcijām — Fišera precīzais tests (14) (17) (18). Izmantojot jebkuru statistisko metodi vai modeli, ir jārūpējas, lai tiktu izpildīti šīs metodes vai modeļa nosacījumi (piemēram, aplēsta un tad eksperimenta plānā un izvēlētajā testā vai modelī vērā ņemta mainība starp dažādām kamerām). Jānovērtē, vai datiem ir normālsadalījums, un 5. papildinājumā ir izklāstīts, kā rīkoties ar ANOVA atlikumiem. 6. papildinājums aplūko papildu apsvērumus regresijas pieejai. Jāapsver, vai neizmantot transformācijas, kas nodrošina atbilstību statistiskā testa nosacījumiem. Tomēr transformācijas, ar ko pielāgo regresijas modeli, ir jāizdara ļoti rūpīgi, jo, piemēram, 25 % pārmaiņa atbildreakcijā pirms datu transformācijas neatbilst 25 % pārmaiņai transformētajā atbildreakcijā. Analīzes vienība un eksperimenta vienība visās analīzēs ir testa kamera, nevis atsevišķas zivis, un tas ir jāatspoguļo gan hipotēžu testos, gan regresijā (3) (14) (19) (20). Testēšanas pārskats 34. Testēšanas pārskatā jāiekļauj šāda informācija: Testējamā ķimikālija: Vienas sastāvdaļas viela — fiziskais izskats, šķīdība ūdenī un papildu būtiskas fizikālķīmiskas īpašības; — ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChl kods, struktūrformula, tīrības pakāpe, attiecīgā gadījumā un cik praktiski iespējams — piemaisījumu ķīmiskā identitāte, utt. (attiecīgā gadījumā arī organiskā oglekļa saturs). Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi: — iespējami raksturota, piemēram, norādot sastāvdaļu ķīmisko identitāti (sk. iepriekš), kvantitatīvo daudzumu un būtiskas fizikālķīmiskas īpašības. Testa sugas: — zinātniskais nosaukums, līnija, izcelsme un apaugļoto ikru ievākšanas metode un turpmāka rīcība ar tiem. Testa apstākļi: — izmantotā testa metode (piemēram, pusstatiskā vai caurplūdes, noslogojums); — fotoperiods(-i); — testa plāns (piemēram, testa kameru un replikātu skaits, ikru skaits replikātā, testa kameras materiāls un lielums (augstums, platums, tilpums), ūdens tilpums testa kamerā); — izejšķīduma pagatavošanas metode un atjaunošanas biežums (ir jānorāda šķīšanu veicinošā viela, ja to lieto, un tās koncentrācija); — testējamās ķimikālijas dozēšanas metode (piemēram, sūkņi, atšķaidīšanas sistēmas); — metodes atgūstamības efektivitāte un nominālās testējamās koncentrācijas, kvantitatīvās noteikšanas robeža, mērījumu vidējās vērtības un standartnovirzes testa traukos, un metode, ar ko tās iegūtas un pierādījums, ka mērījumi raksturo testējamās ķimikālijas koncentrācijas īstā šķīdumā; — atšķaidīšanas ūdens raksturlielumi: testa vides pH, cietība, temperatūra, izšķīdušā skābekļa koncentrācija, atlikumu hlora līmeņi (ja mērīti), kopējais organiskais ogleklis (ja mērīts), suspendētās daļiņas (ja mērītas), sāļums (ja mērīts) un citi izdarītie mērījumi; — ūdens kvalitāte testa traukos: pH, cietība, temperatūra un izšķīdušā skābekļa koncentrācija, — sīka informācija par barošanu (piemēram, barības veids(-i), avots, dotais daudzums un biežums). Rezultāti, kas ziņojumā atspoguļoti atsevišķi (vai uz replikātu pamata) un kā vidējais lielums un attiecīgi variācijas koeficienti šādiem beigupunktiem: — pierādījumi, ka kontrolgrupa atbilst testa sugas vispārējam izdzīvotības pieņemamības standartam (2. papildinājums), — dati par mirstību katrā stadijā (embriju, kāpuru un zivju mazuļu) un kumulatīvā mirstība; — dienas līdz izšķilšanās brīdim, katru dienu izšķīlušos kāpuru skaits un izšķilšanās beigas; — veselu zivju skaits testa beigās; — dati par izdzīvojušo dzīvnieku garumu (norādīt standartgarumu vai kopējo garumu) un svaru; — morfoloģisko anomāliju biežums, apraksts un skaits, ja tādas ir, — ietekmju uz izturēšanos biežums, apraksts un skaits, ja tādas ir, — statistiskās analīzes pieeja (regresijas analīze vai dispersijas analīze) un datu apstrāde (statistiskais tests vai izmantotais modelis); — katrai novērtētajai atbildreakcijai nenovērojamās ietekmes koncentrācija (NOEC); — katrai novērtētajai atbildreakcijai zemākā novērojamās ietekmes koncentrācija (LOEC) (ar p = 0,05); — attiecīgā gadījumā katrai novērtētajai atbildreakcijai ECx un ticamības intervāli (piem., 90 % vai 95 %) un tās aprēķināšanai pielāgotā modeļa grafiks, devas – atbildreakcijas līknes slīpums, regresijas modeļa formula, lēstie modeļa parametri un to standartkļūda. Atkāpes no testa metodes. Rezultātu izvērtējums, tostarp tas, kā testa iznākumu ietekmē jebkādas novirzes no testa metodes. 1. tabula Testēšanai ieteicamās zivju sugas SALDŪDENS UPJU GRĪVU UN JŪRAS ZIVIS Oncorhynchus mykiss Varavīksnes forele Cyprinodon variegatus Karpzobveidīgo zivju suga Pimephales promelas Melngalvas mailīte Menidia sp. Saldūdens menīdija Danio rerio Zebrzivs Oryzias latipes Rīsa zivs vai medaka LITERATŪRA (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp. (4) Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. (8) Chapter C.20 of this Annex, Daphnia magna Reproduction Test. (9) Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 – 376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris. (15) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. (16) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. (17) Dunnett C. W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121. (18) Dunnett C. W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482–491. (19) Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. 1. papildinājums DEFINĪCIJAS Garums līdz astes spurai: attiecas uz garumu no purna gala līdz astes spuras galam un to izmanto zivīm, kurām grūti noteikt, kur beidzas mugurkauls (www.fishbase.org) Standartgarums: attiecas uz zivs garumu, kas nomērīts no purna gala līdz pēdējā skriemeļa mugurējam galam vai astes pamatnes sānu viduslīnijas mugurējai daļai. Vienkārši sakot, šajā mērījumā neņem vērā astes spuras garumu. (www.fishbase.org) Kopējais garums: attiecas uz zivs garumu, kas nomērīts no purna gala līdz astes spuras tālākajam galam, un to parasti mēra, abas puses saspiežot pa viduslīniju. Tas ir taisnas līnijas mērījums, ko nemēra pa ķermeņa izliekuma līniju (www.fishbase.org) 1. attēls Dažādu garuma lietojumu raksturojums Ķimikālija: viela vai maisījums. EC x: (ietekmes koncentrācija x % ietekmei) ir koncentrācija, kas konkrētajā ekspozīcijas periodā salīdzinājumā ar kontrolgrupu izraisa x % ietekmi uz testa organismiem. Piemēram, ES 50 ir aplēstā koncentrācija, kas definētajā ekspozīcijas periodā ietekmē testa beigupunktu 50 % no eksponētās populācijas. Zemākā novērojamas ietekmes koncentrācija ( LOEC ) ir testējamās ķimikālijas zemākā testētā koncentrācija, pie kuras, salīdzinot ar kontroli, ķimikālijai ir novērota statistiski nozīmīga ietekme (pie p < 0,05). Tomēr visām testējamām koncentrācijām, kas pārsniedz LOEC, jāuzrāda kaitīga iedarbība, kura ir vienāda vai lielāka par to, kas novērojama pie LOEC. Ja šos abus nosacījumus nevar nodrošināt, izsmeļoši jāpaskaidro, kāpēc izraudzīta šāda LOEC (un tādējādi NOEC). Norādījumi sniegti 5. un 6. papildinājumā. Nenovērojamās ietekmes koncentrācija ( NOEC ) ir testējamā koncentrācija, kura ir tieši zemāka par LOEC un kurai noteiktā iedarbības periodā salīdzinājumā ar kontroli nav statistiski nozīmīgas ietekmes (p < 0,05). UVCB : vielas ar nezināmu vai mainīgu sastāvu, kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiskie materiāli. IUPAC : Starptautiskā Teorētiskās un lietišķās ķīmijas savienība. SMILES : Vienkāršotas molekulāro datu ievades lineāras izteiksmes sistēma 2. papildinājums TESTA NOSACĪJUMI, ILGUMS UN IZDZĪVOTĪBAS KRITĒRIJI IETEICAMAJĀM SUGĀM SUGA TESTA NOSACĪJUMI IETEICAMAIS TESTA ILGUMS Tipiskais minimālais vidējais kopējais kontroles zivju garums pētījuma beigās (mm) (98) KONTROLGRUPAS IZDZĪVOTĪBA (minimums) Temperatūra (°C) Sāļums (0/00) Fotoperiods (stundas) Izšķilšanās rezultāts Pēcizšķilšanās rezultāts Saldūdens: Oncorhynchus mykiss Varavīksnes forele 10 ± 1.5 (99) 12–16 (100) 2 nedēļas pēc tam, kad kontrolgrupa brīvi barojusies (vai 60 dienas pēc izšķilšanās) 40 75 %. 75 %. Pimephales promelas Melngalvas mailīte 25 ± 1,5 16 32 dienas no testa sākuma (vai 28 dienas pēc izšķilšanās) 18 70 %. 75 %. Danio rerio Zebrzivs 26 ± 1,5 12–16 (101) 30 dienas pēc izšķilšanās 11 70 %. 75 %. Oryzias latipes Rīsa zivs vai medaka 25 ± 2 12–16 (101) 30 dienas pēc izšķilšanās 17 80 %. 80 %. Upju grīvu un jūras zivis Cyprinodon variegatus Karpzobveidīgo zivju suga 25 ± 1,5 15–35 (102) 1216 (101) 32 dienas no testa sākuma (vai 28 dienas pēc izšķilšanās) 17 75 %. 80 %. Menidia sp. Saldūdens menīdija 22–25 15–35 (102) 13 28 dienas 20 80 %. 60 %. 3. papildinājums TESTĒŠANAI IETEICAMĀS ZIVJU SUGAS SUGA BARĪBA (*9) PĒCIZŠĶILŠANĀS PĀREJAS LAIKS LAIKS LĪDZ PIRMAJAI BAROŠANAI Vaislas zivis Tikko izšķīlušies kāpuri Mazuļi Veids Biežums Saldūdens: Oncorhynchus mykiss Varavīksnes forele foreļu barība Nepiemēro (1) foreļu pirmā barība BSN 2–4 barošanas reizes dienā 14–16 dienas pēc izšķilšanās vai pie uzpeldēšanas (nav būtiski) 19 dienas pēc izšķilšanās vai pie uzpeldēšanas Pimephales promelas Melngalvas mailīte BSN, pārslveida barība FBS BSN BSN48, pārslveida barība 2–3 reizes dienā kad izšķilšanās ir 90 % 2 dienas pēc izšķilšanās Danio rerio Zebrzivs BSN, pārslveida barība Tirdzniecībā pieejama kāpuru barība, vienšūņi (2), proteīns (3) BSN48, pārslveida barība, BSN vienreiz dienā; pārslveida barība divreiz dienā kad izšķilšanās ir 90 % 2 dienas pēc izšķilšanās Oryzias latipes Rīsa zivs vai medaka pārslveida barība BSN, pārslveida barība (vai vienšūņi vai virpotāji) BSN48, pārslveida barība (vai virpotāji) BSN reizi dienā; pārslveida pārtika divreiz dienā vai pārslveida barība un virpotāji vienreiz dienā Nav piemērojams 6–7 dienas pēc nārstošanas Upju grīvu un jūras zivis: Cyprinodon varieqatus Karpzobveidīgo zivju suga BSN, pārslveida barība FBS BSN BSN48 2–3 barošanas reizes dienā Nav piemērojams 1 diena pēc izšķilšanās/ uzpeldēšanas Menidia sp. Saldūdens menīdija BSN48, pārslveida barība BSN BSN48 2–3 barošanas reizes dienā Nav piemērojams 1 diena pēc izšķilšanās/ uzpeldēšanas 4. papildinājums DAŽAS PIEŅEMAMA ATŠĶAIDĪŠANAS ŪDENS ĶĪMISKĀS ĪPAŠĪBAS Sastāvdaļa Robežkoncentrācija Daļiņas 5 mg/l Kopējais organiskais ogleklis 2 mg/l Nejonizēts amonjaks 1 μg/l Atlikušais hlors 10 μg/l Kopējie fosfororganiskie pesticīdi 50 ng/l Kopējie hlororganiskie pesticīdi un polihlorbifenili 50 ng/l Kopējais organiskais hlors 25 ng/l Alumīnijs 1 μg/l Arsēns 1 μg/l Hroms 1 μg/l Kobalts 1 μg/l Varš 1 μg/l Dzelzs 1 μg/l Svins 1 μg/l Niķelis 1 μg/l Cinks 1 μg/l Kadmijs 100 ng/l Dzīvsudrabs 100 ng/l Sudrabs 100 ng/l 5. papildinājums STATISTISKAS NORĀDES NOEC NOTEIKŠANAI Vispārīgi norādījumi Analīzes vienība ir replikāta tvertne. Tādējādi pastāvīgiem mērījumiem, piemēram, izmēram, aprēķina replikāta vidējo vērtību vai mediānu un analizējamie dati ir šīs replikātu vērtības. Jāpierāda izmantoto testu jauda, vēlams, izmantojot pietiekamus vēsturiskus datus katrai laboratorijai. Attiecībā uz katru beigupunktu kopā ar izmantojamo statistisko testu jānorāda izmēra ietekme, ko iespējams detektēt ar 75–80 % jaudu. Datubāzēs, kas šīs testa metodes izstrādes laikā pieejamas, ir noteikts, kādu jaudu var iegūt ar ieteicamajām statistiskajām procedūrām. Katrai atsevišķai laboratorijai tās spēja šo prasību attiecībā uz jaudu izpildīt ir jāpierāda, vai nu veicot pašai savu jaudas analīzi, vai pierādot, ka nevienai atbildreakcijai variācijas koeficients (CV) nepārsniedz šīs testēšanas vadlīnijas izstrādē izmantoto CV 90. procentili. Šie variāciju koeficienti atrodami 1. tabulā. Ja pieejamas tikai replikātu vidējās vērtības vai mediānas, replikāta CV var neņemt vērā. 1. tabula 90. procentiles CV izvēlētajām saldūdens sugām Suga Atbildreakcija CV_starp replikātiem CV_replikātos Varavīksnes forele Garums 17,4 9,8 Svars 10,1 28 Melngalvas mailīte Garums 16,9 13,5 Svars 11,7 38,7 Zebrzivs Garums 43,7 11,7 Svars 11,9 32,8 Gandrīz visu laboratorisko toksikoloģijas pētījumu vērtēšanai izmantoto statistisko testu uzdevums ir apstrādes grupas salīdzināt ar kontroli. Tāpēc nav pamata sagaidīt nozīmīgu ANOVA F-testa rezultātu, pirms nav lietots Daneta vai Viljamsa tests vai nozīmīgu Kruskala-Valisa testa rezultātu, pirms nav lietots Džonkhīra-Terpstra, Manna-Vitnija vai Danna tests (Hochberg and Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). Daneta testā ir iestrādāta kardinalitātes korekcija un, ja par vārtzini izmanto F-testu, tiek negatīvi ietekmēti tā pseidopozitīvie un pseidonegatīvie rezultāti. Līdzīgi, descendentā Viljamsa un Džonkšīra-Terpstra testā, kur katrā solī izmanto būtiskuma līmeni 0,05, saglabājas vispārējs pseidopozitīvu rezultātu līmenis 5 %, un šis līmenis, kā arī testu jauda tiek ietekmēta negatīvi, ja kā vārtzini lieto F-testu vai Kruskala-Valisa testu. Manna-Vitnija un Danna testi ir jākoriģē atbilstoši kardinalitātei, un ieteicams veikt Bonferoni-Holma korekciju. Lielākā daļa ieteikumu hipotēžu pārbaudei un šo testu pamatā esošo pieņēmumu verifikācijai ir sīki izskatīti OECD materiālā (2006), kas satur arī plašu bibliogrāfiju. Kontroļu apstrāde, ja izmanto šķīdinātāju Ja izmanto šķīdinātāju, ir jāizmanto gan atšķaidīšanas ūdens kontrole, gan šķīdinātāja kontrole. Abas kontroles jāsalīdzina, vērtējot katru atbildreakciju, un, ja būtiska atšķirība starp kontrolēm netiek konstatēta, tās jākombinē statistiskai analīzei. Pretējā gadījumā NOEC noteikšanai vai EC x aprēķiniem ir jāizmanto šķīdinātāja kontrole, bet ūdens kontrole nav jāizmanto. Sk. validitātes kritēriju ierobežojumu (7. punkts). Ar T-testu vai Manna–Vitnija testu, izmantojot garumu, svaru, izšķīlušos ikru daļu un kāpuru mirstību vai anormālu kāpuru daļu, kā arī izšķilšanās vai uzpeldēšanas pirmo vai pēdējo dienu (būtiskuma līmenis 0,05) un ignorējot visas apstrādes grupas, salīdzina šķīduma ūdens kontroli un šķīdinātāja kontroli. Šo testu rezultāti jāatspoguļo ziņojumā. Izmēru mērījumi (garums un svars) Atsevišķu zivju garuma un svara vērtību sadalījums var būt normāls vai logaritmiski normāls. Gan vienā, gan otrā gadījumā atbilstoši centrālo robežvērtību teorēmai un saskaņā ar datiem no vairāk nekā 100 ELS pētījumiem, kas veltīti trijām saldūdens sugām, replikātu vidējo aritmētisko vērtību sadalījums parasti būs normālsadalījums. Alternatīvi, ja dati vai vēsturiskās datubāzes liecina, ka atsevišķu zivju izmēra sadalījums ir logaritmiski normāls, var aprēķināt atsevišķo zivju vērtību replikātu vidējo logaritmu, un analizējamie dati tad var būt šo replikātu vidējo logaritmu antilogaritmi. Jānovērtē datu atbilstība normālsadalījumam un dispersijas homogenitātei. Šajā nolūkā ir jāizmanto ANOVA modeļa atlikumi ar koncentrāciju kā vienīgo skaidrojošās klases mainīgo. Var veikt vizuālu noteikšanu, izmantojot izkliedes diagrammas un histogrammas vai stumbra-lapu diagrammu. Var izmantot arī formālu testu, piemēram, Šapiro-Vilka vai Andersona-Darlinga testu. Atbilstību dispersijas homogenitātei var novērtēt, vizuāli izpētot to pašu izkliedes diagrammu vai formāli, izmantojot Lēvena testu. Normalitāte un dispersijas homogenitāte ir jānovērtē tikai parametriskiem testiem (piemēram, Viljams, Danets). Uzmanība ir jāpievērš iespējamajām izlecošām vērtībām un to ietekmei uz analīzi. Var izmantot Tukey izlecošo vērtību pārbaudi un to pašu iepriekš aprakstīto atlikumu diagrammu vizuālu pārbaudi. Jāatceras, ka novērojumi ir par visiem replikātiem, tāpēc izlecošā vērtība no analīzes jāizslēdz tikai pēc rūpīgas apsvēršanas. Statistiskie testi, kas izmanto eksperimenta plāna un bioloģisko prognožu īpašības, ir descendenti trenda testi, piemēram, Viljamsa un Džonkhīra-Terpstra. Šajos testos pieņem, ka koncentrācija–atbildreakcija ir monotona, un vērtē datu atbilstība šim pieņēmumam. To var izdarīt vizuāli, izmantojot replikātu vidējo aritmētisko vērtību pret testējamo koncentrāciju izkliedes diagrammu. Būs noderīgi šo izkliedes diagrammu salīdzināt ar segmentētu lineāru diagrammu, kurā ir savienotas pēc replikātu paraugu izmēra svērtās koncentrāciju vidējās aritmētiskās vērtības. Ja šī segmentētā lineārā diagramma stipri novirzās no monotonijas, tas var liecināt, ka var būt jāizmanto testi bez trenda. Var izmantot arī formālus testus. Vienkāršs formāls tests ir aprēķināt koncentrācijas vidējo aritmētisko vērtību lineāros un kvadrātiskos kontrastus. Ja kvadrātiskais kontrasts ir nozīmīgs, bet lineārais kontrasts nav nozīmīgs, tas liecina, ka monotonija, iespējams, ir problemātiska, kas ir papildus jāizvērtē, izmantojot diagrammas. Ja ir jāpārbauda normalitāte vai dispersijas homogenitāte, šos kontrastus var konstruēt, izmantojot datus, kas ir transformēti atbilstoši hierarhijai. Var izmantot alternatīvas procedūras, piemēram, Bartolomjū testu monotonijas noteikšanai, taču tas palielina komplicētību. 2. attēls NOEC izmēru mērījumu diagramma (garums un svars) Ja vien dati atbilst šo testu nosacījumiem, NOEC nosaka, descendenti piemērojot Viljamsa vai Džonkhīra-Terpstra testu. OECD (2006) sniedz sīkāku informāciju par šīm procedūrām. Ja dati neatbilst descendenta trenda testa nosacījumiem, var izmantot Daneta testu vai Tamheina-Daneta (T3) testu, katrā no kuriem ir iestrādātas kardinalitātes korekcijas. Šajos testos ir pieņēmums par normālsadalījumu, bet Daneta gadījumā arī par dispersijas homogenitāti. Ja šie nosacījumi nav izpildīti, var izmantot Danna neparametrisko testu. OECD (2006) satur detalizētu informāciju par visiem šiem testiem. 2. attēlā ir sniegts pārskats, kā izvēlēties nepieciešamo testu. Ikru izšķilšanās un kāpuru izdzīvošana Dati norāda, kāda daļa ikru individuālajos replikātos izšķīlušies vai kāda daļa kāpuru tajos izdzīvojuši. Šīs daļas ir jāizvērtē attiecībā uz ekstrabinominālo dispersiju, kas šādos mērījumos ir sastopama bieži, tomēr nav universāla. Diagramma 3. attēlā ir norādes testa izvēlei; sīkāku aprakstu sk. tekstā. Parasti izmanto divus testus. Tie ir Tarones C(α) tests (Tarone, 1979) un hī kvadrāta tests, ko katru piemēro atsevišķi katrai testējamajai koncentrācijai. Ja kaut vienā testējamajā koncentrācijā tiek konstatēta ekstrabinomināla dispersija, jāizmanto metodes tās regulēšanai. 1. formula Tarones C (α) tests (Tarone 1979) kur p ir proporcijas vidējā aritmētiskā vērtība dotajā koncentrācijā, m ir replikātu tvertņu skaits, nj ir subjektu skaits replikātā j, un xj ir reaģējušo, t. i. neizšķīlušos vai mirušo, subjektu skaits replikātā. Šo testu piemēro katrai koncentrācijai atsevišķi. Šo testu var uzskatīt par pielāgotu hī-kvadrāta testu, taču Tarones veiktās ierobežotas jaudas simulācijas parādīja, ka tā jauda ir lielāka nekā hī kvadrāta testam. 3. attēls NOEC ikru šķilšanās un kāpuru mirstības diagramma. Ja nav būtisku pierādījumu ekstrabinominālai dispersijai, var izmantot Kohrana-Armitāža descendenta testu. Šis tests neņem vērā replikātus, tāpēc, ja eksistē šādi pierādījumi, tiek ieteikta Kohrana-Armitāža testa (RSCA) Rao-Skota korekcija, kas ņem vērā replikātus, replikātu izmērus un ekstrabinominālo dispersiju. Alternatīvi testi ir descendenti Viljamsa un Džonkhīra-Terpstra testi un Daneta tests, kas aprakstīts attiecībā uz izmēru mērījumiem. Šie testi ir izmantojami gan gadījumos, kad ir vērojama ekstrabinomiāla mainība, gan gadījumos, kur tādas nav, taču to jauda ir mazliet zemāka (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). Pirmā vai pēdējā izšķilšanās vai uzpeldēšanas diena Atbildreakcija ir vesels skaitlis — testa diena, kurā attiecīgajā replikāta tvertnē veikts konkrētais novērojums. Vērtību intervāls parasti ir ļoti ierobežots un bieži liela daļa vērtību ir saistītas, piemēram, visiem kontroles replikātiem un varbūt vienai vai divām zemākajām testējamajām koncentrācijām tiek novērota viena un tā pati izšķilšanās diena. Parametriski testi, piemēram, Viljamsa and Daneta šādiem datiem nav piemēroti. Izņemot gadījumus, kad eksistē pierādījumi par nopietnām monotonijas problēmām, descendents Džonkhīra-Terpstra tests ir ļoti jaudīgs testā izmantotās ķimikālijas efektu noteikšanai. Pretējā gadījumā var izmantot Danna testu. Kāpuru anomālijas Atbildreakcija ir kaut kādā veidā anormālu kāpuru skaits. Šī atbildreakcija bieži vien ir reti sastopama un tai ir raksturīgas dažas tās pašas problēmas, kā, piemēram, pirmā izšķilšanās diena, kā arī dažreiz neparasta no koncentrācijas atkarīga atbildreakcija. Ja dati vismaz aptuveni atbilst monotonai koncentrācijai, efektu noteikšanu var jaudīgi izdarīt ar descendento Džonkhīra-Terpstra testu. Pretējā gadījumā var izmantot Danna testu. ATSAUCES Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952. Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. 6. papildinājums STATISTISKAS NORĀDES REGRESIJAS APLĒSĒM Vispārīgi norādījumi Modeļu pielāgošanai izmantotie novērojumi ir replikātu vidējās vērtības (garums un svars) vai procentuālais īpatsvars replikātā (ikru izšķilšanās un kāpuru mirstība) (ESAO 2006). Parasti ir ieteicams izmantot svērto regresiju, par svaru izmantojot replikātu paraugu apjomu. Iespējamas citas svēruma shēmas, piemēram, svērums, kurā izmanto paredzamo reakcijas vidējo aritmētisko vērtību vai tās kombināciju ar replikātu parauga apjomu. Nav ieteicams svēršanai izmantot vienas koncentrācijas paraugu dispersijas apgriezto vērtību (Bunke et al. 1999, Seber and Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). Ja atbildreakcija pirms analīzes tiek transformēta, ir jāsaglabā novērojumu neatkarība, bet EC x ar ticamības intervāla robežām ir jāizsaka sākotnējās mērvienības, nevis transformācijas vienībās. Piemēram, garuma logaritma izmaiņa par 20 % neatbilst 20 % garuma izmaiņai (Lyles et.al 2008, Draper and Smith 1999). Pārskats par ECx aplēsēm sniegts 4. attēla plūsmas diagrammā. Detaļas ir aprakstītas turpmāk tekstā. 4. attēls Diagramma replikāta vidējā garuma, svara, izšķīlušos ikru, vai kāpuru mirstības EC x aplēsei, sīkāku informāciju sk. tekstā. Apsvērumi attiecībā uz ikru šķilšanos un kāpuru mirstību Vērtējot ikru šķilšanos un kāpuru mirstību, parasti var izmantot samazināšanās modeli, ja vien netiek pielāgots turpmāk aprakstītais varbūtības modelis. T. i., jāmodelē neizšķīlušos ikru vai nobeigušos kāpuru procentuālais īpatsvars. Tas ir tāpēc, ka EC x raksturo tādu koncentrāciju, kurā notiek pārmaiņas, kas atbilst x % no kontroles vidējās aritmētiskās atbildreakcijas. Ja kontrolgrupā neizšķiļas 5 % ikru un tiek modelēta neizšķilšanās, tad EC 20 attiecas uz koncentrāciju, kurā notiek pārmaiņas, kas atbilst 20 % no kontrolgrupas ar piecprocentīgu neizšķilšanos; šajā gadījumā tā ir pārmaiņa 0,2*0,05 = 0,01, jeb 1 procentpunkts salīdzinājumā ar neizšķilšanos 6 %. Ar pieejamajiem datiem tik nelielu pārmaiņu jēgpilnā veidā aprēķināt nav iespējams, un tā nav bioloģiski nozīmīga. Savukārt, modelējot izšķīlušos ikru procentuālo īpatsvaru, kontrolgrupas procentuālais īpatsvars šajā piemērā būtu 95 %, tātad 20 % samazinājums salīdzinājumā ar kontroli atbilstu pārmaiņai 0,95*0,2 = 0,18, proti, izšķilšanās samazinājums no 95 % līdz 77 % (= 95–18), tādējādi iedarbību izraisošā koncentrācija ir aplēšama un, iespējams, interesē vairāk. Šī problēma parasti neietekmē izmēru mērīšanu, lai gan nevēlama ietekme uz izmēru parasti nozīmē izmēra samazināšanos. Izmēru modeļi (garums vai svars) un ikru šķilšanās vai kāpuru izdzīvotība Izņemot Braina-Kūzena hormētisko modeli, visi šie modeļi ir ESAO aprakstīti un ieteikti (2006). Tā dēvētie ESAO 2–5 ekotoksiskuma eksperimentos ir aprakstīti arī Slob (2002). Protams, ka noderīgi var būt arī daudzi citi modeļi. Bunke, et al. (1999) norāda vairākus šeit neiekļautus modeļus, un ir daudz atsauču uz citiem modeļiem. Turpmāk norādītie tiek ieteikti kā īpaši piemēroti ekotoksiskuma eksperimentiem un tos plaši izmanto. 5 testējamās koncentrācijas un kontrole — Bruce-Versteeg — Vienkāršs eksponenciāls (ESAO 2) — Eksponenciāls ar formas parametru (ESAO 3) — Vienkāršs eksponenciāls ar zemāko robežu (ESAO 4) 6 vai vairāk testējamās koncentrācijas un kontrole — Eksponenciāls ar formas parametru un zemāko robežu (ESAO 5) — Michaelis-Menten — Hill Ja ir vizuālas liecības par hormēzi (maz ticams, ja izmanto ikru izšķilšanos vai kāpuru mirstību, bet dažreiz novērota izmēru novērojumos) — Brain-Cousens Hormetic; Brain and Cousens (1989) Alternatīvi modeļi, ikru neizšķilšanās un kāpuru mirstība — Ja nav pierādījumu par ekstrabinominālo mainību un modeļa pielāgošanā tiek aplēsta kontroles incidence, minēto atbildreakciju pieaugošos modeļus var pielāgot, izmantojot probita (vai logistiskus) modeļus. Tā nav piemērotākā metode, jo par analīzes vienību izmanto individuālu rezultātu, nevis replikātu (Morgan 1992, O'Hara Hines and Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Viena modeļa atbilstība — Vizuāli salīdziniet katrai testējamajai koncentrācijai novēroto un paredzēto procentuālo samazinājumu (Motulsky and Christopoulos 2004, Draper and Smith 1999). — Izmantojot F-testu, regresijas kļūdas vidējā kvadrātu salīdziniet ar tīrās kļūdas vidējā kvadrātu (Draper and Smith 1999). — Pārliecinieties, ka visi modeļa nosacījumi ir būtiski lielāki par nulli (t. i., nosakiet, vai visi modeļa nosacījumi ir svarīgi) (Motulsky and Christopoulos 2004). — Regresijas atlikumu pret testējamo koncentrāciju iespējams atlikt log(konc.) skalā. Šis izkārtojums nedrīkst būt sistemātisks; punktiem ir jābūt randomizēti izkliedētiem gar horizontālo līniju nulles augstumā. — Datu normalitāte un dispersijas viendabība ir jānovērtē tādā pašā veidā, kā minēts 5. papildinājumā — Papildus tam ir jānovērtē regresijas modeļa atlikumu normalitāte, izmantojot tās pašas metodes, kas ir norādītas 5. papildinājumā ANOVA atlikumiem Modeļu salīdzināšana — Izmanto Akiake AICc kritērijus. Mazākas AICc vērtības liecina par labāku atbilstību un, ja AICc(B)-AICc(A) ≥ 10, A modelis ir gandrīz noteikti labāks, nekā B modelis (Motulsky and Christopoulos (2004). — Salīdziniet abus modeļus vizuāli, pārbaudot, cik labi tie atbilst iepriekš minētajiem viena modeļa kritērijiem. — Ir ieteicams pielietot taupības principu, proti, izmantot visvienkāršāko modeli, kas pietiekami atbilst datiem (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008). EC x aplēses kvalitāte EC x ticamības intervāls (CI) nedrīkst būt pārāk liels. Lai lemtu, cik liels var būt ticamības intervāls, lai EC x vēl būtu izmantojams, jāspriež statistiski. Ikru šķilšanās un izmēru datiem pielāgotu regresijas modeļu simulāciju dati rāda, ka EC x (x = 10, 20 vai 30) ar ticamības intervālu apmēram 75 % neaptver vairāk kā divas testējamās koncentrācijas. Tāds ir vispārīgs norādījums par pieņemamību, kā arī praktisks norādījums par to, kāds rezultāts ir sasniedzams. Daudzi autori apgalvo, ka ziņojumā jāatspoguļo visu modeļa parametru ticamības intervāli, un ka lieli parametru ticamības intervāli liecina par modeļu nepieņemamību (Ott and Longnecker 2008, Alvord and Rossio 1993, Motulsky and Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber and Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005). EC x ticamības intervāls (vai jebkurš cits modeļa parametrs) nedrīkst būt nulle (Motulsky and Christopoulos 2004). Šī regresija atbilst minimālajai būtiskajai starpībai, kas bieži tiek minētas hipotēžu pārbaudes pieejās (piemēram, Wang et al 2000). Tas atbilst arī gadījumam, kur LOEC atbildreakciju vidējo aritmētisko vērtību ticamības intervālā nav kontroles vidējās vērtības. Jāapsver, vai parametra aplēses ir zinātniski iespējamas. Piemēram, ja y0 ticamības intervāls ir ±20 %, nav ticama neviena EC 10 aplēse. Ja modelis koncentrācijā C paredz 20 % ietekmi un C un zemākās koncentrācijas maksimālā novērotā ietekme ir 10 %, tad EC 20 nav ticama (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005). Lai iegūtu EC x, vajadzētu iztikt bez ekstrapolācijas ārpus pozitīvo koncentrāciju intervāla (Draper and Smith 1999, OECD 2006). Piemēram, vispārīgos norādījumos var noteikt, ka EC x nedrīkst būt vairāk kā par 25 % zemāka par zemāko testēto koncentrāciju vai par 25 % pārsniegt augstāko testēto koncentrāciju. ATSAUCES Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96. Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121 OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000. C.48. Īsais zivju vairošanās tests IEVADS 1. Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO testēšanas vadlīnijai 229 (2012). Nepieciešamība izstrādāt un validēt zivju testu, ar kuru nosaka endokrīni aktīvas ķimikālijas, izriet no apsvērumiem, ka ķimikāliju līmeņi vidē, šīm ķimikālijām mijiedarbojoties ar cilvēku un savvaļas dzīvnieku endokrīno sistēmu, var šo sistēmu negatīvi ietekmēt. ESAO 1998. gadā uzsāka prioritāru rīcību, lai pārskatītu esošos norādījumus par potenciālu endokrīnās sistēmas traucējumu izraisītāju noteikšanu un testēšanu un izstrādātu jaunus. Viens no rīcības elementiem bija izstrādāt testēšanas norādījumus, kā noteikt ķimikālijas ar aktīvu iedarbību uz zivju sugu endokrīno sistēmu. Zivju vairošanās īsais tests tika pārbaudīts visaptverošā validācijas programmā, kurā īstenoja starplaboratoriju salīdzinošos pētījumus ar attiecīgām ķimikālijām, lai pierādītu, ka tests, kurā detektē ķimikālijas, kas ietekmē zivju vairošanos ar dažādu mehānismu, tostarp endokrīnās sistēmas mehānismu, starpniecību, ir atbilstīgs un ticams. Visi ESAO testēšanas norādījumu beigupunkti ir validēti melngalvas mailītēm, un daļa beigupunktu ir validēti Japānas medakai (t. i., vitelogenīns un sekundārās dzimumpazīmes) un zebrzivij (t. i., vitelogenīns). Validācijas darbu ir zinātniski recenzējusi gan ekspertu grupa, kurus izraudzījušies ESAO Testēšanas vadlīnijas programmas (6) izstrādes nacionālie koordinatori, gan neatkarīgu ekspertu grupa, kurus šim darbam norīkojusi Amerikas Savienoto Valstu Vides aizsardzības aģentūra (29). Tests nav izstrādāts tā, lai ar to noteiktu hormonālo traucējumu specifiskos mehānismus, jo testa dzīvniekiem nav skarta hipotalāma-hipofīzes-gonādu (HPG) ass, tāpēc reaģēšana uz ķimikālijām, kas iedarbojas uz hipotalāma-hipofīzes-gonādu asi, var notikt dažādos līmeņos. 2. Šī testēšanas metode apraksta in vivo skrīninga testu, kurā dzimumgatavību sasniegušus zivju tēviņus un nārstojošas mātītes tur kopā un ierobežotā dzīves cikla daļā (21 diena) eksponē kādai ķimikālijai. Pēc 21 dienas ekspozīcijas perioda mātītēm un tēviņiem mēra divus biomarķieru beigupunktus, kas ir testējamās ķimikālijas endokrīnās iedarbības vai androgēniskās iedarbības rādītāji; šie beigupunkti ir vitelogenīns un sekundārās dzimumpazīmes. Vitelogenīnu mēra melngalvas mailītei, Japānas medakai un zebrzivij, savukārt sekundārās dzimumpazīmes mēra melngalvas mailītei un Japānas medakai. Turklāt katru dienu visa testa laikā uzrauga kvantitatīvo auglību. Gonādas saglabā un histopataloģiju var novērtēt arī, lai izvērtētu testa dzīvnieku reproduktīvo veselību un pastiprinātu citu beigupunktu rezultātu svarīgumu. 3. Biotestu izmanto kā vairošanās in vivo skrīninga testu, un tā izmantošana jāskata kopā ar “OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (30). Šajā konceptuālajā pamatdokumentā zivju vairošanās īsais tests ir ieteikts 3. līmenī kā in vivo tests, kas sniedz datus par izvēlēto(-ajiem) endokrīno (-ajiem) mehānismu(-iem)/ceļu(-iem). SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI 4. Vitelogenīns (VTG) parasti veidojas oldējēju mugurkaulnieku mātīšu aknās atbildreakcijā uz organismā cirkulējošo endogēno estrogēnu. Tas ir olas dzeltenuma proteīnu prekursors, kas izstrādājas aknās un pa asinsrites sistēmu nonāk olnīcās, kur to uzņem un modificē attīstošās olšūnas. Nenobriedušu zivju mātīšu un tēviņu plazmā vitelogenīns gandrīz nav detektējams, jo organismā pietiekamā daudzumā nav cirkulējoša estrogēna, tomēr aknas vitelogenīnu spēj sintezēt un izdalīt, reaģējot uz eksogēnu estrogēnisku stimulāciju. 5. Vitelogenīna mērījumus izmanto, lai detektētu ķimikālijas ar dažādiem estrogēniskās iedarbības veidiem. Estrogēniskas iedarbības ķimikālijas var detektēt, mērot zivju tēviņu organismā inducējušos vitelogenīnu, un tas plaši dokumentēts zinātniski recenzētos izdevumos (piemēram, (7)). Vitelogenīna inducēšanās novērota arī pēc eksponēšanas aromatizējamiem androgēniem (8, 9). Zivju mātīšu organismā cirkulējošā estrogēna līmeņa pazemināšanās, piemēram, inhibējot aromatāzi, kas endogēno androgēnu pārvērš dabiskā estrogēnā 17β-estradiolā, samazina VTG līmeni, un pēc tā var noteikt aromatāzi inhibējošas ķimikālijas (10, 11). Bioloģiskā nozīme, kas piemīt vitelogenīna atbildreakcijai uz estrogēnu vai aromatāzes inhibēšanu, ir pierādīta un plaši dokumentēta. Tomēr VTG izstrādāšanos zivju mātīšu organismā var ietekmēt vispārējais toksiskums un neendokrīna veida toksiska iedarbība, piemēram, hepatotoksiskums. 6. Sekmīgi izstrādātas un standartizētas ir vairākas plaši izmantojamas mērīšanas metodes. Viens no piemēriem ir katrai sugai specifiskas imūnfermentatīvās analīzes (ELISA) metodes, kurās no atsevišķām zivīm ņemtos nelielos asins vai aknu paraugos imūnķīmiskā analīzē kvantitatīvi novērtē VTG izstrādāšanos (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). VTG mērījumiem izmanto melngalvas mailītes asinis, zebrzivs asinis vai galvas/astes homogenātu un Japānas medakas aknas. Japānas medakai konstatēta laba korelācija starp VTG mērījumiem asinīs un aknās (19). 6. papildinājumā sniegta ieteicamā paraugu ņemšanas kārtība VTG analīzei. Komplekti VTG mērījumu veikšanai ir plaši pieejami; šo komplektu pamatā jābūt validētai katrai sugai specifiskai ELISA metodei. 7. Atsevišķu zivju sugu tēviņu sekundārās dzimumpazīmes ir ārēji redzamas, kvantitatīvi novērtējamas un jutīgas pret organismā cirkulējošo endogēno androgēnu līmeni; tas attiecas uz melngalvas mailīti un Japānas medaku, taču neattiecas uz zebrzivi, kam kvantitatīvi novērtējamas sekundārās dzimumpazīmes nav novērojamas. Mātītēm, kas eksponētas ūdenī esošām androgēniskām ķimikālijām, var attīstīties tēviņu sekundārās dzimumpazīmes. Zinātniskajā literatūrā ir vairāki pētījumi, kuros attiecībā uz melngalvas mailīti (20) un Japānas medaku (21) dokumentēta šāda reakcija. Interpretējot tēviņu sekundāro dzimumpazīmju izpausmju samazināšanos, sakarā ar zemo statistisko ticamību jāsaglabā piesardzība, un jāņem vērā ekspertu viedoklis un pierādījumu svars. Zebrzivs izmantošana šajā testā ir ierobežota sakarā ar to, ka tai nav kvantitatīvi novērtējamu sekundāro dzimumpazīmju, kas reaģētu uz androgēniskas iedarbības ķimikālijām. 8. Galvenais rādītājs, kas liecina par melngalvas mailītes eksponēšanu eksogēnam androgēnam, ir kārpiņu skaits uz zivju mātītes purna. Japānas medakai galvenais rādītājs, kas liecina par eksogēnu eksponēšanu androgēniskām ķimikālijām, ir kārpiņveida izaugumu skaits zivju mātītēm. 5A papildinājumā un 5A papildinājumā norādītas procedūras, saskaņā ar kurām ieteicams izvērtēt attiecīgi melngalvas mailītes un Japānas medakas dzimumpazīmes. 9. Zivju 21 dienas tests ietver kvantitatīvu ikru veidošanās novērtējumu un gonādu saglabāšanu neobligātai histopatoloģiskai izpētei. Dažas pārvaldes iestādes var pieprasīt šo papildu beigupunktu, lai pilnīgāk izvērtētu testa dzīvnieku reproduktīvo veselību, vai gadījumos, kur vitelogenīna un sekundāro dzimumpazīmju raksturojums neatbilst ķīmiskajai ekspozīcijai. Lai gan daži beigupunkti var būt stipri diagnosticējoši (piemēram, VTG inducēšanās tēviņiem un kārpiņu veidošanās mātītēm), ne visi beigupunkti (piemēram, auglība un gonādu histopataloģija) testā paredzēti, lai viennozīmīgi identificētu specifiskus šūnu darbības mehānismus. Drīzāk beigupunktu komplekts, kopumā ņemot, ļauj izdarīt pieņēmumus attiecībā uz iespējamiem endokrīniem traucējumiem un tādējādi sniegt norādes turpmākai testēšanai. Lai gan auglība tieši neattiecas uz endokrīno sistēmu, ņemot vērā tās jutību uz zināmajām endokrīni aktīvajām ķimikālijām (5), tā ir svarīgs iekļaujams beigupunkts, jo ja tā un citi beigupunkti netiek ietekmēti, ir skaidrs, ka savienojums visticamāk nav endokrīni aktīvs. Tomēr, ja auglība ir ietekmēta, tas nopietni ietekmēs pierādījumu svara izvedumus. Norādes par datu interpretēšanu un testa rezultātu pieņemšanu sniegtas turpmāk šīs testa metodes aprakstā. 10. Šajā testa metodē minētās definīcijas ir minētas 1. papildinājumā. TESTĒŠANAS PRINCIPS 11. Testēšanas laikā reproduktīvā attīstības posmā esošus zivju tēviņus un mātītes kopā eksponē testēšanas traukos. Tā kā dzīvnieki ir pieauguši un reproduktīvā attīstības posmā, iespējams skaidri atšķirt dzimumus un visus beigupunktus analizēt dzimuma griezumā, un tas arī garantē jutību pret eksogēnām ķimikālijām. Dzimumu apstiprina testa nobeigumā makroskopiskā gonādu izmeklēšanā, kurā ar šķērēm atver vēdera apvidu. Pārskats par būtiskajiem biotesta nosacījumiem sniegts 2. papildinājumā. Testu parasti veic ar zivīm no nārstojošas populācijas; neizmanto dzīvniekus no novecojošām populācijām. Norādījumi par zivju vecumu un reproduktīvo statusu sniegti iedaļā par zivju izraudzīšanos. Testu veic ar trim ķīmiskās ekspozīcijas koncentrācijām, un, ja nepieciešams, nodrošina ūdens un šķīdinātāja kontrolgrupas. Katrā zebrzivs apstrādē izmanto divus traukus jeb replikātus (katrā traukā 5 tēviņi un 5 mātītes). Katrā melngalvas mailītes apstrādē izmanto četrus traukus jeb replikātus (katrā traukā 2 tēviņi un 4 mātītes). Tas nepieciešams, lai pielāgotos melngalvas mailītes tēviņu teritoriālajai uzvedībai, vienlaikus saglabājot pietiekamu testa jaudu. Katrā medakas apstrādē izmanto četrus traukus jeb replikātus (katrā traukā 3 tēviņi un 3 mātītes). Ekspozīcijas ilgums ir 21 diena, un zivju paraugus ņem ekspozīcijas 21. dienā. Kvantitatīvo auglību uzrauga katru dienu. 12. Ņemot paraugus 21. dienā, visus dzīvniekus humāni nonāvē. Melngalvas mailītei un Japānas medakai mēra sekundārās dzimumpazīmes (sk. 5.A papildinājumu un 5.B papildinājumu); VTG noteikšanai zebrzivs un melngalvas mailītes organismā ievāc asins paraugus, lai gan VTG zebrzivs organismā var noteikt arī ar galvas/astes paraugiem (6. papildinājums); Japānas medakas VTG analīzē izmanto aknu paraugus (6. papildinājums); potenciālai histopatoloģiskai izvērtēšanai ar fiksatoru apstrādā vai nu veselas vai preparētas gonādas (22). TESTA PIEŅEMAMĪBAS KRITĒRIJI 13. Lai testa rezultāti būtu pieņemami, jāizpilda šādi kritēriji: — ekspozīcijas perioda beigās mirstība ūdens (vai šķīdinātāja) kontrolgrupā nepārsniedz 10 procentus; — izšķīdušā skābekļa koncentrācijai visā ekspozīcijas periodā jābūt vismaz 60 procentiem no gaisa piesātinājuma vērtības; — ūdens temperatūras atšķirība starp testēšanas tvertnēm nevienā ekspozīcijas perioda brīdī nepārsniedz ± 1,5 °C, un testa sugām norādītajos temperatūras diapazonos (2. papildinājums) to uztur 2°C svārstību diapazonā; — ir pieejami dati, kas liecina, ka testējamās ķimikālijas koncentrācija šķīdumā ir uzturēta vidējo izmērīto vērtību diapazonā ± 20 %; — ir pieejami dati, ka visos replikātos pirms to ekspozīcijas ķimikālijai un kontroles replikātos testa laikā zivis aktīvi nārsto. METODES APRAKSTS Aparatūra 14. Parastais laboratorijas aprīkojums, jo īpaši: a. skābekļa un pH mērīšanas iekārtas; b. aprīkojums ūdens cietības un sārmainības noteikšanai; c. attiecīgs aprīkojums temperatūras regulēšanai un, vēlams, nepārtrauktai uzraudzībai; d. ķīmiski inerta materiāla tvertnes ar piemērotu ietilpību attiecībā uz ieteicamo noslogojumu un apdzīvotības blīvumu (sk. 2. papildinājumu); e. melngalvas mailītes un zebrzivs nārsta substrāts, nepieciešamā informācija sniegta 4. papildinājumā; f. pietiekami precīzi svari (t. i., ar precizitāti ± 0,5 mg). Ūdens 15. Par testa ūdeni var izmantot jebkādu ūdeni, kurā testa sugas uzrāda pietiekamu ilgtermiņa izdzīvotību un augšanu. Tā kvalitātei testa laikā jābūt nemainīgai. Ūdens pH jābūt diapazonā no 6,5 līdz 8,5, bet konkrētā testā tam jābūt ± 0,5 pH vienību diapazonā. Lai nodrošinātu, ka atšķaidīšanas ūdens pārāk neietekmē testa rezultātu (piemēram, kompleksējoties ar testējamo ķimikāliju), paraugus tā analīzei ņem ar noteiktiem starplaikiem. Smago metālu (piemēram, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd un Ni), galveno anjonu un katjonu (piemēram, Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, un SO4 2-), pesticīdu (piemēram, kopējo fosfororganisko pesticīdu un kopējo hlororganisko pesticīdu), kopējā organiskā oglekļa un suspendētu cietu vielu mērījumi, piemēram, jāizdara reizi trijos mēnešos, ja ir zināms, ka atšķaidīšanas ūdens kvalitāte ir relatīvi nemainīga. Ja ir pierādīts, ka vismaz viena gada laikā ūdens kvalitāte ir nemainīga, noteikšanu var veikt retāk un starplaiki var būt garāki (piemēram, reizi sešos mēnešos). Daži pieņemama atšķaidīšanas ūdens ķīmiskie parametri ir norādīti 3. papildinājumā. Testa šķīdumi 16. Izraudzītās koncentrācijas testa šķīdumus parasti gatavo, atšķaidot izejšķīdumu. Izejšķīdumu vēlams pagatavot, testējamo ķimikāliju atšķaidīšanas ūdenī vienkārši iemaisot vai tajā iejaucot ar mehāniskiem līdzekļiem (piemēram, kratīšana vai apstrāde ar ultraskaņu). Piemērotas koncentrācijas izejšķīduma iegūšanai var izmantot piesātināšanas kolonnas (šķīdības kolonnas). Nav ieteicams par nesējvielu izmantot šķīdinātāju. Tomēr, ja šķīdinātājs ir nepieciešams, vienlaikus nodrošina šķīdinātāja kontrolgrupu, kurai šķīdinātāja koncentrācija ir tāda pati kā grupām, ko apstrādā ar ķimikāliju. Grūti testējamām ķimikālijām tehniski labākais risinājums var būt šķīdinātājs; sk. ESAO norādījumu dokumentu par ūdenstoksiskuma testēšanu grūti testējamām vielām un maisījumiem (23). Šķīdinātāju izraugās atkarībā no vielas vai maisījuma ķīmiskajām īpašībām. Jāievēro ESAO norādījumu dokumentā ieteiktā maksimālā koncentrācija 100 μl/l. Tomēr nesen publicētā pārskatā (24) pausti papildu apsvērumi attiecībā uz šķīdinātāju izmantošanu endokrīnās sistēmas darbības testēšanā. Tāpēc, ja nepieciešams, tehniski pamatotās situācijās šķīdinātāja koncentrāciju samazina līdz minimumam (atkarībā no testējamās ķimikālijas fizikālķīmiskajām īpašībām). 17. Testēšanā izmanto caurplūdes sistēmu. Šāda sistēma (piemēram, dozējošais sūknis, proporcionālas atšķaidīšanas ierīce, piesātinātāja sistēma) nepārtraukti piegādā un atšķaida testējamās ķimikālijas izejšķīdumu, lai testēšanas tvertnēs nodrošinātu nemainīgu koncentrāciju. Izejšķīdumu un atšķaidīšanas ūdens caurplūdums testa laikā jāpārbauda noteiktos intervālos, vēlams, katru dienu, un testa laikā tas nedrīkst mainīties vairāk kā par 10 %. Jāraugās, lai neizmantotu nekvalitatīvas plastmasas caurules vai citus materiālus, kas satur bioloģiski aktīvas ķimikālijas. Izraugoties caurplūdes sistēmas materiālu, jāņem vērā testējamās ķimikālijas iespējama adsorbcija uz šā materiāla. Zivju turēšana 18. Testa zivis izvēlas no laboratorijas populācijas, vēlams, no viena bara, kas vismaz divas nedēļas pirms testa ir aklimatizējies tādos pašos ūdens kvalitātes un apgaismojuma apstākļos kā testa apstākļi. Svarīgi, lai noslogojums un apdzīvotības blīvums (definīcijas sk. 1. papildinājumā) būtu izmantotajai testa sugai piemēroti (sk. 2. papildinājumu). 19. Pēc 48 stundu sākumposma reģistrē mirstību un piemēro šādus kritērijus: — mirstība septiņās dienās pārsniedz 10 % no populācijas: grupu tālākai testēšanai neizmanto; — mirstība ir no 5 % līdz 10 % no populācijas: grupu aklimatizē vēl septiņas dienas; ja mirstība otru septiņu dienu laikā pārsniedz 5 %, grupu tālākai testēšanai neizmanto; — mirstība septiņās dienās ir mazāka par 5 % no populācijas: grupu pieņem. 20. Aklimatizācijas laikā, pirmsekspozīcijas un ekspozīcijas periodā zivis nedrīkst medikamentozi ārstēt. Pirmsekspozīcijas periods un zivju izraudzīšanās 21. Ieteicams vienas līdz divu nedēļu pirmsekspozīcijas periods, kurā zivis tādos pašos traukos kā testēšanas trauki. Zivis visā turēšanas laikā un ekspozīcijas fāzē baro ad libitum. Ekspozīcijas fāzi sāk ar aktīvi nārstojošām pieaugušām zivīm, kurām ir skaidri izteiktas dzimumatšķirības un kuras izraudzītas no reproduktīvi nobriedušiem laboratorijas dzīvniekiem (piemēram, ja testē melngalvas mailīti un medaku – ar skaidri redzamām sekundārajām dzimumpazīmēm). Tikai vispārīgu norādījumu līmenī (šos norādījumus nedrīkst izvērtēt atrauti no attiecīgās zivju grupas faktiskā reproduktīvā statusa) melngalvas mailītēm jābūt aptuveni 20 (±2) nedēļas vecām, pieņemot, ka tās visā dzīves ciklā audzētas 25±2 °C temperatūrā. Japānas medakām jābūt aptuveni 16 (±2) nedēļas vecām, pieņemot, ka tās visā dzīves ciklā audzētas 25±2 °C temperatūrā. Zebrzivīm jābūt aptuveni 16 (±2) nedēļas vecām, pieņemot, ka tās visā dzīves ciklā audzētas 26±2 °C temperatūrā. Ikru nēršana pirmsekspozīcijas posmā jānovērtē katru dienu. Ieteicams, lai pirms testa ekspozīcijas posma visās replikātu tvertnēs būtu novērojama nārstošana. Šajā posmā kvantitatīvas norādes par vēlamo ikru ražošanu dienā nav iespējamas, bet relatīvi parasti novēro, ka katrai sugai vidējais iznērstais daudzums ir > 10 ikri uz vienu mātīti dienā. Sadalot replikātus dažādajiem eksperimenta līmeņiem, jāizmanto attiecībā pret ikru ražošanas rezultātiem randomizēti izvietotu bloku plāns, lai būtu nodrošināts sabalansēts replikātu sadalījums. TESTĒŠANAS PLĀNS 22. Izmanto trīs testējamās ķimikālijas koncentrācijas, vienu kontrolgrupu (ūdens) un, ja nepieciešams, vienu šķīdinātāja kontrolgrupu. Šos datus var analizēt, lai noteiktu, vai starp apstrādes grupu un kontrolgrupu rezultātiem ir vērojamas statistiski būtiskas atšķirības. Šo analīžu mērķis nav tās izmantot riska novērtēšanā (25), bet gan gūt informāciju par to, vai jāturpina testēt ķimikālijas kaitīgā ietekme (t. i., attiecībā uz izdzīvotību, attīstību, augšanu un vairošanos). 23. Attiecībā uz zebrzivi eksperimenta 21. dienā no katra apstrādes līmeņa un no kontrolgrupas(-ām) paraugam ņem tēviņus un mātītes (5 tēviņus un 5 mātītes no katra no abiem replikātiem), kam mēra vitelogenīnu. Attiecībā uz medaku eksperimenta 21. dienā no katra apstrādes līmeņa un no kontrolgrupas(-ām) paraugam ņem tēviņus un mātītes (3 tēviņus un 3 mātītes no katra no četriem replikātiem), kam mēra vitelogenīnu un sekundārās dzimumpazīmes. Attiecībā uz melngalvas mailīti ekspozīcijas 21. dienā paraugam ņem tēviņus un mātītes (2 tēviņus un 4 mātītes no katra no četriem replikātiem), arī no kontrolgrupas(-ām), un tiem mēra vitelogenīnu un sekundārās dzimumpazīmes. Kvantitatīvi novērtē auglību, un potenciālai histopatoloģiskai izvērtēšanai ar fiksatoru apstrādā vai nu veselas vai preparētas gonādas. Testējamo koncentrāciju izvēle 24. Šā testa vajadzībām augstākā testējamās ķimikālijas koncentrācija ir vai nu diapazona noteikšanā, vai no citiem toksiskuma datiem konstatētā maksimāli pieļaujamā koncentrācija (turpmāk “MPK”), 10 mg/l, vai maksimālā šķīdība ūdenī — atkarībā no tā, kurš no šiem rādītājiem ir zemākais. MPK definē kā augstāko ķimikālijas testējamo koncentrāciju, kuras izraisītā mirstība nesasniedz 10 %. Šīs pieejas izmantošanai ir nepieciešami jau pieejami empīriski dati par akūto toksiskumu vai citi toksiskuma dati, ar kuriem iespējams noteikt MPK. MPK aplēšana var būt neprecīza, un parasti ir nepieciešams profesionāls viedoklis. 25. Ir nepieciešamas trīs testējamās koncentrācijas, kuras šķir nemainīgs koeficients, kas nepārsniedz 10, un atšķaidīšanas ūdens kontrole (un, ja vajadzīgs, šķīdinātāja kontrole). Ieteicamie atstatuma koeficienti ir no 3,2 līdz 10. PROCEDŪRA Testa zivju izraudzīšanās un svēršana 26. Ir svarīgi testa sākumā līdz minimumam samazināt zivju svara atšķirības. Piemērots izmēru diapazons dažādām sugām, ko ieteicams izmantot šajā testā, ir norādīts 2. papildinājumā. Visās testēšanā izmantoto zivju grupās katra atsevišķā zivju tēviņa un mātītes svara diapazons testa sākumā, ja iespējams, nepārsniedz ± 20 % no attiecīgā dzimuma vidējā aritmētiskā svara. Ieteicams pirms testēšanas nosvērt apakšparaugu no kopējā zivju parauga, lai novērtētu vidējo svaru. Ekspozīcijas apstākļi Ilgums 27. Testa ilgums ir 21 diena pēc pirmsekspozīcijas perioda. Ieteicamais pirmsekspozīcijas periods ir viena līdz divas nedēļas. Barošana 28. Zivis ad libitum baro ar piemērotu barību (2. papildinājums) pietiekamā daudzumā, lai uzturētu ķermeņa stāvokli. Jāraugās, lai nepieļautu mikrobu augšanu un ūdens duļķainību. Vispārīgs ieteikums ir dienas barības devu sadalīt divās vai trīs vienādās daļās un dienā zivīm izbarot vairākās reizēs ar vismaz triju stundu starplaiku. Ir pieņemama viena lielāka dienas deva, jo īpaši nedēļas nogalēs. 12 stundas pirms paraugu ņemšanas vai autopsijas zivis nebaro. 29. Izvērtē, vai zivju barībā nav kontaminantu, piemēram, hlororganisko pesticīdu, policiklisko aromātisko ogļūdeņražu (turpmāk “PAO”) un polihlorbifenilu (turpmāk “PHB”). Jāizvairās no barības ar paaugstinātu fitoestrogēnu līmeni, kas testā varētu ietekmēt atbildreakciju uz zināmu estrogēnu agonistu (piemēram, 17-bestradiolu). 30. Neapēstā barība un fekālijas no testēšanas traukiem jāizņem vismaz divas reizes nedēļā, piemēram, katras tvertnes apakšdaļa rūpīgi jāiztīra, izmantojot sifonu. Gaisma un temperatūra 31. Fotoperiods un ūdens temperatūra jāpielāgo testa sugai (sk. 2. papildinājumu). Analītisko noteikšanu un mērījumu biežums 32. Pirms ekspozīcijas perioda sākuma jānodrošina pareiza ķimikālijas piegādes sistēmas darbība. Jābūt apzinātām visām nepieciešamajām analītiskajām metodēm, nepieciešamas arī pietiekamas zināšanas par ķīmisko stabilitāti testa sistēmā. Testa laikā testējamās ķimikālijas koncentrācijas nosaka šādos regulāros starplaikos: atšķaidīšanas ūdens un izejšķīduma caurplūdumu vēlams pārbaudīt katru dienu, taču ne retāk kā divas reizes nedēļā, un testa laikā tas nedrīkst mainīties vairāk kā par 10 %. Ieteicams katrā tvertnē noteikt faktisko testējamās ķimikālijas koncentrāciju testa sākumā un reizi nedēļā pēc tam. 33. Rezultātus ieteicams balstīt uz izmērītajām koncentrācijām. Tomēr, ja visā testa laikā šķīdumā ir uzturēta apmierinoša testējamās ķimikālijas koncentrācija ± 20 % no nominālās koncentrācijas, rezultātu var balstīt uz nominālajām vai izmērītajām vērtībām. 34. Paraugiem var būt vajadzīga filtrēšana (piemēram, ar poru lielumu 0,45 μm) vai centrifugēšana. Vajadzības gadījumā ieteicama centrifugēšana. Tomēr arī filtrēšana var būt pieņemama, ja testēšanas materiāls neadsorbējas uz filtriem. 35. Testa laikā visos testa traukos vismaz reizi nedēļā jāmēra izšķīdušais skābeklis, temperatūra un pH. Kontrolēs un vienā augstākās koncentrācijas traukā vismaz reizi nedēļā jāmēra kopējā cietība un sārmainība. Vismaz vienā testa traukā vēlams pastāvīgi uzraudzīt temperatūru. Novērojumi 36. Testa laikā vai pēc tā beigām novērtē vairākas vispārīgas (piemēram, izdzīvotība) un bioloģiskas atbildreakcijas (piemēram, VTG līmeņi). Katru dienu kvantitatīvi jānovēro auglība. Turpmāk aprakstīta šo beigupunktu mērīšana, izvērtēšana un lietderība. Izdzīvošana 37. Zivis testēšanas laikā katru dienu jāapskata, jāreģistrē mirstība un nedzīvās zivis iespējami drīz jāizvāc. Nedzīvās zivis neaizstāj ne ar kontrolgrupas zivīm, ne ar zivīm no cita apstrādes trauka. Gonādu makroskopiskā izmeklēšanā nosaka testēšanas laikā mirušo zivju dzimumu. Izturēšanās un izskats 38. Jāreģistrē jebkāda anormāla izturēšanās (salīdzinājumā ar kontrolgrupām); tās var būt vispārīgas toksiskuma pazīmes, tostarp hiperventilācija, nekoordinēta peldēšana, līdzsvara zudums un netipisks mierīgums vai barošanās. Jāreģistrē arī izskata anomālijas (piemēram, asinsizplūdumi, krāsas zaudēšana). Datu interpretēšanā šādas toksiskuma pazīmes jāvērtē uzmanīgi, jo tās var liecināt par koncentrācijām, kurās nevar paļauties uz endokrīnās sistēmas biomarķieriem. Šādos novērojumos par izturēšanos var iegūt arī noderīgu kvalitatīvu informāciju, pēc kuras noteikt turpmākas iespējamas vajadzības zivju testēšanā. Piemēram, novērots, ka androgēniskām vielām eksponēti melngalvas mailītes tēviņi vai maskulinizētas mātītes izturas teritoriāli agresīvi, savukārt zebrzivīm estrogēniskas vai antiandrogēniskas ekspozīcijas rezultātā samazinās vai kavējas ierastā pārošanās un nārstošanas aktivitāte pēc rītausmas. 39. Tā kā apiešanās var noteiktos aspektos (galvenokārt krāsa) ātri mainīt izskatu, kvalitatīvos novērojumus svarīgi veikt, pirms dzīvniekus izņem no testa sistēmas. Līdzšinējā pieredze ar melngalvas mailīti liecina, ka dažas endokrīni aktīvās ķimikālijas sākotnēji var inducēt šādas ārējas izmaiņas: ķermeņa krāsa (gaiša vai tumša), krāsojuma struktūra (vertikālu joslu parādīšanās) un ķermeņa forma (galvas un krūšu apvidus). Tāpēc zivju izskata novērojumi jāizdara visā testēšanas laikā un pētījuma beigās. Auglība 40. Attiecībā uz replikātiem katru dienu jāreģistrē kvantitatīvi novērojumi par nārstošanu. Attiecībā uz replikātiem jāuzskaita ikru ražošana kā ikru skaits uz vienu izdzīvojušo mātīti dienā. Ikrus no testa kamerām izņem katru dienu. Lai zivis varētu nārstot normālos apstākļos, melngalvas mailītei un zebrzivij testa kamerā ievieto nārsta substrātus. 4. papildinājumā sniegta papildu informācija par zebrzivij (4.A. papildinājums) un melngalvas mailītei (4.B. papildinājums) ieteicamajiem nārsta substrātiem. Medakai nārsta substrātu nodrošināt nav nepieciešams. Humāna zivju nonāvēšana 41. Testa 21. dienā, t. i., beidzot ekspozīciju, zivis eitanazē ar pietiekamu daudzumu trikaīna (trikaīna metāna sulfonāts, metakaīns, MS-222 (CAS 886-86-2)), 100–500 mg/l gļotādu kairinājuma mazināšanai atšķaidot ar 300 mg/l NaHCO3 (nātrija bikarbonāts, CAS 144-55-8); pēc tam ņem asins vai audu paraugus, lai noteiktu VTG, kā paskaidrots iedaļā par vitelogenīnu. Sekundāro dzimumpazīmju novērtēšana 42. Dažas endokrīni aktīvas ķimikālijas var inducēt specifiskas sekundāras dzimumpazīmju izmaiņas (melngalvas mailītes tēviņu nārsta kārpiņu skaits, Japānas medakas tēviņu kārpiņveida izaugumi). Proti, ķimikālijas ar konkrētu iedarbības veidu var izraisīt anormālu sekundāro dzimumpazīmju parādīšanos pretējā dzimuma dzīvniekiem, piemēram, tādu androgēna receptoru agonistu kā trenbolons, metiltestosterons un dihidrotestoterons ietekmē melngalvas mailīšu mātītēm var sākt veidoties izteiktas nārsta kārpiņas vai medakas mātītēm — kārpiņveida izaugumi (11, 20, 21). Ir ziņas arī par to, ka estrogēna receptoru agonisti pieaugušiem melngalvas mailīšu tēviņiem var samazināt nārsta kārpiņu skaitu un muguras skausta segmenta lielumu (26, 27). Šādu izteiktu morfoloģisko īpatnību novērojumi var sniegt arī noderīgu kvalitatīvu un kvantitatīvu informāciju, pēc kuras noteikt turpmākas iespējamas vajadzības zivju testēšanā. Melngalvas mailītes nārsta kārpiņu skaitu un lielumu un medakas kārpiņveida izaugumu skaitu kvantitatīvi noteikt var tieši vai, praktiskāk, saglabātiem paraugiem. Melngalvas mailītes un medakas sekundāro dzimumpazīmju noteikšanai ieteicamās procedūras norādītas attiecīgi 5.A un 5.B papildinājumā. Vitelogenīns (VTG) 43. Ar heparinizētu mikrohematokrīta kapilārcaurulīti vai kardiālās punkcijas šļirci no astes artērijas/vēnas ņem asinis. Atkarībā no zivs lieluma no vienas melngalvas mailītes parasti ņem 5 līdz 60 μl un no zebrzivs — 5 līdz 15 μl. Plazmu no asinīm atdala centrifugējot, un līdz VTG analīžu veikšanai, pievienojot proteāzes inhibitorus, glabā –80 °C temperatūrā. Par audu avotu VTG noteikšanai var izmantot arī medakas aknas un zebrzivs galvas vai astes homogenātu (6. papildinājums). VTG mērījuma pamatā jābūt validētai homologai ELISA metodei, kurā izmanto homologu VTG standartvielu un homologas antivielas. Ieteicams izmantot metodi, ar ko ir iespējams konstatēt VTG, kura daudzums ir tikai daži ng/ml plazmā (vai ng/mg audos), kas atbilst fona līmenim testēšanā neeksponētu zivs tēviņu organismā. 44. VTG analīzes kvalitātes kontrolē izmanto standartvielas, sagataves un vismaz atkārtotas analīzes. Lai noteiktu minimālo parauga atšķaidījuma koeficientu, attiecībā uz katru ELISA metodi jātestē matrices ietekme (paraugatšķaidījuma ietekme). Katrā VTG testos izmantotā ELISA testa platē jābūt šādiem kvalitātes kontroles paraugiem: vismaz 6 kalibrācijas standarti, kas atbilst paredzamo VTG koncentrāciju diapazonam, un vismaz viens nespecifisks saistīšanās testa “tukšais paraugs” (analizē dublikātparaugu). Absorbcijai šajos tukšajos paraugos jābūt zemākai par 5 % no absorbcijas, kas vērojama maksimālās kalibrācijas standartam. No katra parauga atšķaidījuma analizē vismaz divas alikvotas (dublikātiedobes). Dublikātiedobes, kas atšķiras vairāk par 20 %, jāanalizē atkārtoti. 45. Kalibrācijas līkņu korelācijas koeficientam (R2) jāpārsniedz 0,99. Tomēr ar augstu korelāciju nepietiek, lai garantētu pietiekamu koncentrācijas prognozēšanu visos diapazonos. Papildus tam, ka jābūt pietiekami augstai korelācijai kalibrācijas līknē, katrai standarta koncentrācijai, ko aprēķina pēc kalibrācijas līknes, jābūt 70 līdz 120 % nominālās koncentrācijas. Ja nominālajām koncentrācijām (piemēram, zemākās koncentrācijās) ir tendence attālināties no kalibrācijas regresijas līknes, kalibrācijas līkni var būt nepieciešams sadalīt zemajā un augstajā diapazonā vai izmantot nelineāru modeli, kas pietiekami derētu absorbcijas datiem. Ja līkni sadala, abos līknes segmentos jābūt R2 > 0,99. 46. Noteikšanas robeža (LOD) ir zemākā analītiskā standarta koncentrācija, bet kvantitatīvās noteikšanas robeža (LOQ) ir zemākā analītiskā standarta koncentrācija, kas reizināta ar zemāko atšķaidījuma koeficientu. 47. Katrā VTG testu dienā analizē stiprinātu paraugu, kas gatavots, izmantojot vairākiem testiem kopīgu references standartvielu (7. papildinājums). Prognozētās koncentrācijas un izmērītās koncentrācijas attiecību testēšanas pārskatā norāda kopā ar katra attiecīgajā dienā veiktā testu kompleksa rezultātiem. Gonādu histopataloģijas novērtējums 48. Pārvaldes iestādes var pieprasīt veikt gonādu histopataloģiju, lai izpētītu HPG ass mērķorgānu pēc tā eksponēšanas ķimikālijai. Šim nolūkam ar fiksatoru apstrādā veselas vai preparētas gonādas. Ja vajadzīga histopataloģija, gonādā tiek meklētas specifiskas ar endokrīniem saistītas atbildreakcijas, lai būtu iespējams novērtēt testējamās ķimikālijas endokrīno aktivitāti. Būtiskās diagnostiskās atbildreakcijas ir oocīti sēkliniekos, Leidiga šūnu hiperplāzija, samazināta dzeltenuma veidošanās, palielināts spermatogonālo šūnu daudzums un perifolikulārā hiperplāzija. Pārējiem gonādu bojājumiem, piemēram, olšūnu atrēzijai, sēklinieku deģenerācijai un attīstības izmaiņām var būt dažādi cēloņi. Norāžu dokumentā par zivju gonādu histopataloģiju ir specificētas procedūras, kas jāizmanto gonādu secēšanā, fiksācijā, sekcijā un histopataloģiskā novērtēšanā (22). DATI UN TESTĒŠANAS PĀRSKATS Biomarķieru reakcijas novērtēšana ar dispersijas analīzi (turpmāk “ANOVA”) 49. Lai noteiktu ķimikālijas iespējamo aktivitāti, dažādās apstrādes grupās un kontrolgrupās iegūtā atbildreakcija jāsalīdzina, izmantojot dispersijas analīzi (ANOVA). Ja izmanto šķīdinātāja kontrolgrupu, attiecīgu statistisku testu, kurā salīdzina atšķaidīšanas ūdens kontrolgrupu un šķīdinātāja kontrolgrupu, veic attiecībā uz katru beigupunktu. Norādījumi par to, kā ar datiem par atšķaidīšanas ūdens kontrolgrupu un šķīdinātāja kontrolgrupu jārīkojas turpmākajā statistiskajā analīzē, atrodami OECD, 2006c (28). Visi bioloģiskās atbildreakcijas dati jāanalizē un testēšanas pārskatā jāiekļauj par katru dzimumu atsevišķi. Ja neizpildās parametriskajām metodēm vajadzīgie pieņēmumi – dati neatbilst normālsadalījumam (piemēram, Šapiro-Vilka tests) vai ir vērojama heterogēna dispersija (Bartleta tests vai Lēvena tests), jāapsver, vai pirms ANOVA veikšanas dati nebūtu jāpārveido tā, lai dispersijas homogenizētu, vai varbūt jāveic svērta ANOVA. Devas un atbildreakcijas nemonotonas sakarības gadījumā var izmantot Daneta (parametrisko) testu, kurā salīdzina vairākus pārus, vai Manna-Vitnija testu ar Bonferoni (neparametrisku) korekciju. Ja devas un atbildreakcijas sakarība ir aptuveni monotona, var izmantot citus statistiskos testus (piemēram, Džonkhīra-Terpstra testu vai Viljamsa testu). Lai būtu vieglāk lemt, kurš statistiskais tests būtu vispiemērotākais, 8. papildinājumā sniegta statistiska diagramma. Papildu informācija pieejama arī ESAO “Document on Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data” (28). Ziņojums par testa rezultātiem 50. Pētījuma rezultātos ietilpst: Testēšanas laboratorija: — atbildīgie darbinieki un viņu pienākumi pētījumā, — katra laboratorija ir pierādījusi kvalifikāciju, izmantojot vairākas reprezentatīvas ķimikālijas. Testējamā ķimikālija: — testējamās ķimikālijas īpašības, — fizikālais stāvoklis un attiecīgās fizikālķīmiskās īpašības, — testējamo koncentrāciju pagatavošanas metode un biežums; — informācija par stabilitāti un bionoārdāmību. Šķīdinātājs: — šķīdinātāja raksturojums (veids, izmantotā koncentrācija); — šķīdinātāja izraudzīšanās pamatojums (ja šķīdinātājs nav ūdens). Testa dzīvnieki: — sugas un līnija; — piegādātājs un konkrētā piegādātājiestāde, — zivju vecums testa sākumā un reproduktīvais/nārstošanas statuss; — dati par dzīvnieku aklimatizācijas procedūru; — zivju ķermeņa svars ekspozīcijas sākumā (zivju parauga apakšparaugs). Testēšanas apstākļi: — izmantotā testa metode (testa tips, noslogojums, apdzīvotības blīvums u. c.); — izejšķīdumu pagatavošanas metode un caurplūdes; — nominālās testējamās koncentrācijas, iknedēļas izmērītās testa šķīdumu koncentrācijas un izmantotā analīzes metode, mērījumu vidējās vērtības un standartnovirzes testa traukos un pierādījumi tam, ka mērījumi raksturo testējamās ķimikālijas koncentrācijas īstā šķīdumā; — atšķaidīšanas ūdens īpašības (tostarp pH, cietība, sārmainība, temperatūra, izšķīdušā skābekļa koncentrācija, atlikušā hlora līmenis, kopējais organiskais ogleklis, suspendētas cietās daļiņas un citi veiktie mērījumi); — ūdens kvalitāte testa traukos: pH, cietība, temperatūra un izšķīdušā skābekļa koncentrācija, — detalizēta informācija par barošanu (piemēram, barības(-u) veids(-i), avots, izbarotais daudzums un barošanas biežums, kā arī attiecīgo piesārņotāju (piemēram, PHB, PAO un hlororganisko pesticīdu) analīzes, ja tādas ir veiktas) Rezultāti — apliecinājums, ka kontrolgrupas atbildušas testa pieņemamības kritērijiem; — dati par mirstību ar jebkuru no testējamajām koncentrācijām un kontrolgrupās; — izmantotās statistiskās analīzes metodes, datu apstrāde un izmantoto metožu pamatojums; — bioloģisko novērojumu dati par morfoloģiskajām pazīmēm, arī par sekundārajām dzimumpazīmēm, ikru nēršanu un VTG; — datu analīzes rezultāti, ieteicams — tabulu un grafiku veidā; — novērojumi par zivju neraksturīgu izturēšanos un jebkāda redzama testējamās ķimikālijas izraisīta ietekme. NORĀDĪJUMI PAR TESTA REZULTĀTU INTERPRETĀCIJU UN PIEŅEMAMĪBU 51. Šajā iedaļā sniegti daži apsvērumi, kas jāņem vērā testa rezultātu interpretēšanā attiecībā uz dažādajiem mērītajiem beigupunktiem. Ja rezultāti liecina, ka testējamā ķimikālija izraisa acīmredzamu toksiskumu vai ietekmē testa dzīvnieka vispārīgo stāvokli, tie jāinterpretē piesardzīgi. 52. Nosakot testējamās ķimikālijas koncentrāciju diapazonu, jāraugās, lai netiktu pārsniegta maksimālā pieļaujamā koncentrācija, pie kuras iespējama jēgpilna datu interpretācija. Ir svarīgi veikt vismaz vienu apstrādi, kurā testējamās ķimikālijas toksiskās ietekmes pazīmes nav vērojamas. Slimību un toksiskas ietekmes pazīmes rūpīgi jānovērtē un jāatspoguļo ziņojumā. Piemēram, iespējams, ka VTG producēšanos zivju mātīšu organismā ietekmē arī vispārīgs toksiskums vai neendokrīna veida toksiska iedarbība, piemēram, hepatotoksiskums. Tomēr interpretāciju par ietekmi var nostiprināt, izmantojot citus apstrādes līmeņus, kuros nav vērojama sistēmiska toksiskuma maldinoša ietekme. 53. Attiecībā uz testa rezultātu pieņemamību jāņem vērā vairāki aspekti. Vispārīgs norādījums ir tāds, ka tēviņu un mātīšu organismā VTG līmeņiem kontrolgrupās attiecībā uz melngalvas mailītēm un zebrzivīm jābūt izteiktiem un jāatšķiras aptuveni par trīs lieluma kārtām un attiecībā uz Japānas medakām – aptuveni par vienu lieluma kārtu. Kontrolgrupās un apstrādes grupās novēroto vērtību diapazonu piemēri ir pieejami validācijas pārskatos (1, 2, 3, 4). Augstas VTG vērtības kontrolgrupas tēviņu organismā var ietekmēt testa reaģētspēju un tā spēju konstatēt vājus estrogēna agonistus. Zemas VTG vērtības kontrolgrupas mātīšu organismā var ietekmēt testa reaģētspēju un tā spēju konstatēt aromatāzes inhibitorus un estrogēna antagonistus. Norādījumos ir izmantoti validācijas pētījumi. 54. Ikru ražošanas kvantitatīvā noteikšana ir atkarīga no svarīgām variācijām [variācijas koeficients (CV) var variēties no 20 līdz 60 %], kas, CV tuvojoties 50 % vai augstākam procentam, ietekmē testa spēju noteikt būtisku par 70 % mazāku samazinājumu ikru ražošanā. Ja CV saglabājas zemākās robežās (apmēram 20–30 %), testam būs pieņemama jauda (80 %), un ar to varēs noteikt 40-50 % samazinājumu ikru ražošanā. Ja melngalvas mailītei izmanto testa plānu, kur katrā apstrādes līmenī ir četri replikāti, attiecībā uz auglības beigupunktu iegūst lielāku jaudu nekā ar testa plānu, kur ir tikai divi replikāti. 55. Ja laboratorija šādu testu iepriekš nav veikusi vai ja ir notikušas būtiskas pārmaiņas (piemēram, mainītas zivju līnijas vai piegādātājs), ir ieteicams veikt tehniskās kvalifikācijas pētījumu. Ieteicams izmantot ķimikālijas ar atšķirīgu iedarbības veidu vai ietekmi uz vairākiem testa beigupunktiem. Katra laboratorija tiek aicināta apkopot vēsturiskus kontroles datus par tēviņiem un mātītēm un veikt testu ar pozitīvu kontroles ķimikāliju, kurai ir zināma estrogēniska iedarbība (piemēram, 17β-estradiols koncentrācijā 100 ng/l vai zināms vājš agonists) un kura paaugstina VTG līmeni zivju tēviņu organismā, ar pozitīvu kontroles ķimikāliju, kura inhibē aromatāzi (piemēram, fadrozols vai prohlorāzs koncentrācijā 300 μg/l) un kura pazemina VTG līmeni zivju mātīšu organismā, un pozitīvu kontroles ķimikāliju, kurai ir androgēniska iedarbība (piemēram, 17β-trenbolons koncentrācijā 5 μg/l) un kura melngalvas mailītes un Japānas medakas mātītēm ierosina sekundāro dzimumpazīmju veidošanos. Lai būtu drošība par laboratorijas kvalifikāciju, šos datus var salīdzināt ar pieejamiem validācijas pētījumu datiem (1, 2, 3). 56. Kopumā VTG mērījumi jāuzskata par pozitīviem, ja salīdzinājumā ar kontrolgrupu vismaz augstākajā testēto vielu koncentrācijas līmenī ir konstatēts statistiski nozīmīgs VTG palielinājums (p < 0,05) tēviņu organismā vai statistiski nozīmīgs VTG samazinājums (p < 0,05) mātīšu organismā, un vispārīga toksiskuma pazīmes nav novērojamas. Pozitīvus rezultātus pamato, pierādot bioloģiski ticamu sakarību starp devu un atbildreakcijas līkni. Kā norādīts iepriekš, ne viss VTG samazinājums var būt endokrīnas izcelsmes, tomēr pozitīvs rezultāts kopumā jāinterpretē kā liecība par endokrīnu aktivitāti in vivo, un šādā gadījumā parasti ir jāveic papildu izmeklējumi, lai precizētu rezultātus. 57. Regulatori var prasīt gonādu histopataloģijas novērtējumu, lai noteiktu testa dzīvnieku reproduktīvo veselību un lai testa rezultātus varētu novērtēt pēc pierādījumu svara. Gonādu histopatoloģija var netikt prasīta, ja ir pozitīvs VTG vai kāda sekundāra dzimumpazīme (t. i., VTG palielinājums vai samazinājums vai sekundāro dzimumpazīmju inducēšanās). LITERATŪRA (1) OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.60, Paris. (2) OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1B). OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.61, Paris. (3) OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.78, Paris. (4) Owens JW (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (piekļuve 18/09/08). (5) US EPA (2007). Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. 15 December 2007. US Environmental Protection Agency, Washington, DC. 104 pp. (6) OECD (2008). Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.94, Paris. (7) Sumpter J.P. and S. Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives; 103 Suppl 7:173-8 Review. (8) Pawlowski S., et al. (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology; 68(3):277-91. (9) Andersen L., et al (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology; 76(3-4):343-52. (10) Ankley G.T., et al. (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences; 67(1):121-30. (11) Panter G.H., et al. (2004). Successful detection of (anti-)androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquatic Toxicology; 70(1):11-21. (12) Parks L.G., et al. (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25. (13) Panter G.H., et al. (1999). Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. CEFIC-EMSG research report reference AQ001. CEFIC, Brussels, Belgium. (14) Fenske M., et al. (2001). Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals. Comp. Biochem. Phys. C 129 (3): 217-232. (15) Holbech H., et al. (2001). Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119-131. (16) Rose J., et al. (2002). Vitellogenin induction by 17b-estradiol and 17a-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C 131: 531-539. (17) Brion F., et al. (2002). Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry; vol 21: 1699-1708. (18) Yokota H., et al. (2001). Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes). Jpn J Environ Toxicol 4:87–98. (19) Tatarazako N., et al. (2004). Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. Journal of Health Science 50:301-308. (20) Ankley G.T., et al. (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environmental Toxicology and Chemistry; 22(6): 1350-60. (21) Seki M, et al (2004). Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry; 23(3):774-81. (22) OECD (2010). Guidance Document on Fish Gonadal Histopathology. OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 123, Paris. (23) OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Series on Testing and Assessment, no. Series on Testing and Assessment. No. No. 23. Paris (24) Hutchinson T.H., et al. (2006a). Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; pp.69–92. (25) Hutchinson T.H., et al. (2006b). Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as “signposts,” not “traffic lights,” in risk assessment. Environmental Health Perspectives; 114 Suppl 1:106-14. (26) Miles-Richardson S.R., et al. (1999). Effects of waterborne exposure to 17B-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47, 129-145. (27) Martinovic D., et al. (2008). Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-tre