Komisijas ceturtā direktīva (1972. gada 5. decembris), ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei



Oficiālais Vēstnesis L 083 , 30/03/1973 Lpp. 0021 - 0034

Speciālizdevums somu valodā: Nodaļa 3 Sējums 5 Lpp. 0115

Speciālizdevums grieķu valodā Nodaļa 03 Sējums 9 Lpp. 0114

Speciālizdevums zviedru valodā: Nodaļa 3 Sējums 5 Lpp. 0115

Speciālizdevums spāņu valodā: Nodaļa 03 Sējums 6 Lpp. 0230

Speciālizdevums portugāļu valodā Nodaļa 03 Sējums 6 Lpp. 0230

CS.ES Nodaļa 03 Sējums 02 Lpp. 12 - 25

ET.ES Nodaļa 03 Sējums 02 Lpp. 12 - 25

HU.ES Nodaļa 03 Sējums 02 Lpp. 12 - 25

LT.ES Nodaļa 03 Sējums 02 Lpp. 12 - 25

LV.ES Nodaļa 03 Sējums 02 Lpp. 12 - 25

MT.ES Nodaļa 03 Sējums 02 Lpp. 12 - 25

PL.ES Nodaļa 03 Sējums 02 Lpp. 12 - 25

SK.ES Nodaļa 03 Sējums 02 Lpp. 12 - 25

SL.ES Nodaļa 03 Sējums 02 Lpp. 12 - 25



Komisijas ceturtā direktīva (1972. gada 5. decembris), ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (73/46/EEK) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1970. gada 20. jūlija Direktīvu [1] par paraugu ņemšanas un analīžu barības Kopienas metožu ieviešanu barības oficiālajai kontrolei, kurā jaunākie grozījumi veikti ar 1972. gada 20. jūlija Direktīvu 72/275/EEK [2], un jo īpaši tās 2. pantu, tā kā minētajā direktīvā prasīts veikt oficiālu barības kontroli, izmantojot Kopienas paraugu ņemšanas un analīžu metodes, lai pārbaudītu atbilstību prasībām, kas normatīvo un administratīvo aktu noteikumos paredzētas attiecībā uz barības kvalitāti un sastāvu; tā kā 1971. gada 15. jūnija Direktīvā 71/250/EEK [3], 1971. gada 18. novembra Direktīvā 71/393/EEK [4] un 1972. gada 27. aprīļa Direktīvā 72/199/EEK [5] jau ir noteiktas vairākas analīžu Kopienas metodes; tā kā, ņemot vērā panākumus darbā, kas gūti kopš tā laika, ir ieteicams pieņemt ceturto metožu kopumu; tā kā šajā direktīvā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Barības pastāvīgās komitejas sniegto atzinumu, IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU. 1. pants Dalībvalstis prasa, lai barības oficiālās kontroles analīzes attiecībā uz dzīvnieku un augu tauku un eļļu mitruma saturu, kā arī magnija un kopšķiedras saturu barībā veiktu saskaņā ar šīs direktīvas I pielikumā aprakstītajām metodēm. Uz šīs direktīvas I pielikumā aprakstītajām metodēm attiecas Komisijas 1971. gada 15. jūnija Pirmās direktīvas 71/250/EEK pielikuma 1. daļas (Ievada) vispārīgie noteikumi. 2. pants Dalībvalstis nosaka, ka barības oficiālai kontrolei analīzes retinola (A vitamīna), tiamīna (eneirīna, B1 vitamīna), askorbīnskābes un dehidroaskorbīnskābes (C vitamīna) satura noteikšanai veic saskaņā ar šīs direktīvas II pielikumā aprakstītajām metodēm. Uz šīs direktīvas II pielikumā aprakstītajām metodēm attiecas Komisijas 1971. gada 15. jūnija Pirmās direktīvas 71/250/EEK pielikuma 1. daļas (Ievada) vispārīgie noteikumi, izņemot noteikumus par analizējamā parauga sagatavošanu. 3. pants Dalībvalstīs ne vēlāk kā līdz 1974. gada 1. janvārim stājas spēkā normatīvi un administratīvi akti, kas vajadzīgi, lai izpildītu šīs direktīvas prasības. Dalībvalstis par to tūlīt informē Komisiju. 4. pants Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm. Briselē, 1972. gada 5. decembrī Komisijas vārdā — priekšsēdētājs S. L. Mansholt [1] OV L 170, 3.8.1970., 2. lpp. [2] OV L 171, 29.7.1972., 39. lpp. [3] OV L 155, 12.7.1971., 13. lpp. [4] OV L 279, 20.12.1971., 7. lpp. [5] OV L 123, 29.5.1972., 6. lpp. -------------------------------------------------- I PIELIKUMS 1. MITRUMA SATURA NOTEIKŠANA DZĪVNIEKU UN AUGU TAUKOS UN EĻĻĀS 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt ūdens un gaistošo vielu saturu dzīvnieku un augu taukos un eļļās. 2. Pruncips Paraugu žāvē līdz nemainīgam svaram 103 °C temperatūrā. Masas zudumu nosaka sverot. 3. Iekārta 3.1. Plakans, apmēram 3 cm augsts trauks no nekorodējoša materiāla, 8 līdz 9 cm diametrā. 3.2. Apmēram 10 cm garš dzīvsudraba termometrs ar pastiprinātu bumbiņu un izplešanās cauruli augšgalā, kas graduēts no apmēram 80 °C līdz vismaz 110 °C. 3.3. Smilšu vanna vai elektriskā plītiņa. 3.4. Eksikators ar efektīvu žāvēšanas aģentu. 3.5. Analītiskie svari. 4. Procedūra Sausā, nosvērtā traukā (3.1.), kurā ir termometrs (3.2.) ar precizitāti līdz mg iesver apmēram 20 g homogenizēta parauga. Pastāvīgi maisot ar termometru, smilšu vannā vai uz elektriskās plītiņas (3.3.) silda tā, lai apmēram 7 minūtēs temperatūra paaugstinātos līdz 90 °C. Sildīšanas intensitāti samazina, sekojot tam, cik bieži no trauka dibena paceļas burbuļi. Temperatūra nedrīkst paaugstināties virs 105 °C. Maisa gar trauka dibenu, līdz pārstāj veidoties burbuļi. Lai pilnībā izdalītos viss mitrums, vairākas reizes temperatūru paaugstina līdz 103 °C ± 2 °C, starplaikos atdzesējot līdz 93 °C. Pēc tam eksikatorā (3.4.) ļauj atdzist līdz istabas temperatūrai un nosver. Šo operāciju atkārto tikmēr, kamēr divu secīgu svērumu masas atšķirības nepārsniedz 2 mg. NB: Parauga masas palielināšanās pēc atkārtotas karsēšanas liecina par tauku oksidēšanos, šādā gadījumā rezultātu aprēķina pēc svēruma, kas izdarīts, pirms sākusies masas palielināšanās. 5. Rezultātu aprēķināšana Procentos izteiktu parauga mitruma saturu aprēķina pēc šādas formulas: . M kur: M0 = analizējamā parauga masa gramos; M1 = trauka un tā satura kopējā masa pirms karsēšanas; M2 = trauka un tā satura kopējā masa pēc karsēšanas. Par 0,05 % mazāks rezultāts jāreģistrē kā "mazāks par 0,05 %". Atkārtojamība No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirības pēc absolūtā lieluma nedrīkst pārsniegt 0,05 %. 2. MAGNIJA NOTEIKŠANA — ar atomu absorbcijas spektrofotometriju — 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt magnija saturu barībā. Tā ir īpaši piemērota magnija satura noteikšanai, ja tas nepārsniedz 5 %. 2. Princips Paraugu pārpelno un izšķīdina atšķaidītā sālsskābē. Ja paraugā nav organisko vielu, to šķīdina atšķaidītā sālsskābē nepārpelnojot. Šķīdumu atšķaida un magnija saturu pēc standartšķīdumiem nosaka ar atomu absorbcijas spektrofotometriju pie 285,2 nm. 3. Reaģenti 3.1. Sālsskābe, analītiski tīra (a.t.), d: 1,16. 3.2. Koncentrēta sālsskābe, analītiski tīra (a.t.), d: 1,19. 3.3. Magnija lenta vai stieple, vai istabas temperatūrā izžāvēts magnija sulfāta heptahidrāts. 3.4. Stroncija sāls (hlorīda vai nitrāta) 2,5 % m/V šķīdums (= 76,08 g SrC12.6H2O a.t., vai 60,38 g Sr(NO3)2 a.t.). 3.5. Magnija standartšķīdums: ar precizitāti līdz mg ņem 1 g magnija (3.3.) iesvara, no kura iepriekš rūpīgi noņemta oksīda kārtiņa, vai attiecīgu daudzumu (10,143 g) magnija sulfāta heptahidrāta (3.3.). Pārnes 1000 ml tilpuma mērkolbā, pievieno 80 ml sālsskābes (3.1.), izšķīdina un uzpilda līdz 1000 ml ar ūdeni. Šā šķīduma 1 ml satur 1000 mg magnija. 4. Iekārta 4.1. Platīna, kvarca vai porcelāna tīģeļi. 4.2. Termostatējama elektriskā mufeļkrāsns. 4.3. Atomu absorbcijas spektrofotometrs. 5. Procedūra 5.1. Parauga šķīduma sagatavošana 5.1.1. Barība, kurā ir tikai minerālvielas Ar precizitāti līdz mg ņem 5 g parauga iesvara, ko ar 250 līdz 300 ml ūdens pārnes 500 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno 40 ml sālsskābes (3.1.), uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai un 30 minūtes vāra uz lēnas uguns. Ļauj atdzist, uzpilda līdz zīmei ar ūdeni, samaisa un filtrē caur sausu kroku filtru sausā vārglāzē. Filtrāta pirmos 30 ml izlej. Ja paraugā ir silīcija dioksīds, 5 g parauga apstrādā ar pietiekamu daudzumu (15-30 ml) sālsskābes (3.2.), uz ūdens vannas iztvaicē un uz vienu stundu ievieto žāvēšanas skapī 105 °C temperatūrā. Rīkojas, kā aprakstīts 5.1.2. punktā, sākot ar trešo teikumu. 5.1.2. Barība, kas galvenokārt sastāv no minerālvielām Ar precizitāti līdz mg tīģelī ņem 5 g parauga iesvara, ko mufeļkrāsnī 550 °C pārpelno, līdz pelnos nav ogles daļiņu, un ļauj atdzist. Slilīcija dioksīda atdalīšanai, pelnus apstrādā ar pietiekamu daudzumu (15-30 ml) sālsskābes (3.2.), uz ūdens vannas iztvaicē un uz vienu stundu ievieto žāvēšanas skapī 105 °C temperatūrā. Atlikumu izšķīdina 10 ml sālsskābes (3.1.) un ar siltu ūdeni pārnes 500 ml tilpuma mērkolbā. Atdzesē un uzpilda ar ūdeni līdz zīmei. Samaisa un filtrē sausā mērglāzē caur sausu kroku filtru. Izlej pirmos 30 ml filtrāta. 5.1.3. Barība, kuras galvenās sastāvdaļas ir organiskās vielas Ar precizitāti līdz mg tīģelī ņem 5 g parauga iesvara, ko mufeļkrāsnī 550 °C pārpelno, līdz pelnos nav ogles daļiņu. Pelnus izšķīdina 5 ml sālsskābes (3.2.), šķīdumu uz ūdens vannas iztvaicē un silīcija dioksīda pārvēršanai nešķīstošā formā vienu stundu žāvē žāvēšanas skapī 105 °C temperatūrā. Pelnus izšķīdina 5 ml sālsskābes (3.1.), ar siltu ūdeni pārnes 250 ml tilpuma mērkolbā, uzkarsē, līdz šķīdums sāk vārīties, ļauj atdzist un uzpilda ar ūdeni līdz zīmei. Samaisa un filtrē sausā mērglāzē caur sausu kroku filtru. Izlej pirmos 30 ml filtrāta. 5.2. Atomu absorbcijas mērīšana Atšķaidot standartšķīdumu (3.5.) ar ūdeni, pagatavo vismaz 5 kontrolšķīdumus ar pieaugošu koncentrāciju, kas atbilst spektrofotometra optimālajam mērīšanas diapazonam. Visiem šķīdumiem pievieno pa 10 ml stroncija sāls šķīduma (3.4.) un pēc tam uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml tilpumam. Saskaņā ar 5.1.1., 5.1.2. vai 5.1.3. punktu iegūtā filtrāta alikvoto daļu atšķaida ar ūdeni tā, lai magnija koncentrācija iegūtajā šķīdumā būtu kontrolšķīdumu koncentrāciju robežās. Sālsskābes koncentrācija šajā šķīdumā nedrīkst pārsniegt 0,4 N. Pievieno 10 ml stroncija sāls šķīduma (3.4.), un pēc tam uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml tilpumam. Analizējamā šķīduma un kontrolšķīdumu absorbciju mēra pie 285,2 nm. 6. Rezultātu aprēķināšana Magnija daudzumu paraugā aprēķina pēc kontrolšķīdumiem. Rezultātu izsaka procentos no parauga masas. Atkārtojamība No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība pēc relatīvā lieluma nedrīkst pārsniegt 5 %. 3. KOPŠĶIEDRAS NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt barībā tādas skābēs un sārmos nešķīstošas organiskās vielas, kas nesatur taukus un ko parasti sauc par kopšķiedru. 2. Princips Paraugu, kas vajadzības gadījumos tiek attaukots, secīgi apstrādā ar noteiktas koncentrācijas verdošiem sērskābes un kālija hidroksīda šķīdumiem. Atlikumu atdala, filtrējot azbesta klātbūtnē, mazgā, žāvē, sver un pārpelno 900 °C temperatūrā. Svara zudums pārpelnojot atbilst analizējamā parauga kopšķiedras saturam. 3. Reaģenti 3.1. Sērskābe, 0,26 N šķīdums. 3.2. Apstrādāts azbests: azbestam, kādu izmanto Guka tīģeļiem, pievieno apmēram pieckārtīgu daudzumu atšķaidītas sālsskābes (1 tilpuma daļa sālsskābes, d: 1,19 + 3 daļas ūdens). Maisījumu vāra apmēram 45 minūtes, ļauj atdzist un filtrē Bihnera piltuvē. Atlikumu uz filtra vispirms mazgā ar ūdeni, līdz mazgāšanas ūdens vairs nesatur sālsskābi, un pēc tam ar acetonu (3.6.). Azbestu žāvē žāvēšanas skapī, un pēc tam 2 stundas pārpelno 900 °C temperatūrā. Atdzesē un glabā slēgtā traukā. Šādi apstrādātu azbestu var izmantot vairākas reizes. Azbestam jāatbilst prasībām, kas 5. punktā noteiktas tukšā parauga analīzei. 3.3. Pretputu līdzeklis (piemēram, silikona emulsija). 3.4. Kālija hidroksīda šķīdums 0,23 N. 3.5. 0,5 N sālsskābes šķīdums. 3.6. Acetons. 3.7. Dietilēteris. 4. Iekārta 4.1. Vismaz 600 ml tilpuma vārglāzes ar 200 ml tilpuma atzīmēm. 4.2. Apmēram 4 mm biezi porcelāna diski aptuveni 80 mm diametrā, kuriem ir apmēram 32 caurumiņi ar aptuveni 4 mm lielu diametru. 4.3. Aptuveni 2 l tilpuma vakuumiltrēšanas kolbas ar 800 ml tilpuma atzīmi, gumijas aizbāzni un 120 mm diametra stikla piltuvi. 4.4. Apmēram 4 mm biezas 40 mm diametra filtrēšanas plāksnītes ar aptuveni 16 caurumiņiem 4 mm diametrā un ar slīpu malu, kas pieguļ piltuves (4.3.) konusam, plāksnītes ir pārklātas ar metāla sietu, kura acu izmērs ir 1 mm. Plāksnītēm un sietam jābūt no materiāla, kas iztur skābju un sārmu iedarbību. 4.5. Platīna vai kvarca tīģeļi pārpelnošanai. 4.6. Termostatējama elektriskā mufeļkrāsns. 4.7. Eksikators. 4.8. Azbesta filtrs: 2,0 g azbesta (3.2.) iejauc 100 ml ūdens. Filtrē ar vakuumu uz filtrēšanas plāksnītes, kas pārklāta ar stiepļu sietu (4.4.) un ievietota vakuumfiltrēšanas kolbas (4.3.) piltuvē. Savāc filtrātu, ko vēlreiz filtrē caur to pašu filtru. Filtrātu izlej. 5. Procedūra Ar precizitāti līdz mg ņem 3 g parauga iesvara un 2 g apstrādāta azbesta (3.2.), ko pārnes vārglāzē (4.1.), pievieno 200 ml sērskābes šķīduma (3.1.) un dažus pilienus putu dzēšanas emulsijas (3.3.). Strauji uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai un vāra precīzi 30 minūtes. Lai uzturētu pastāvīgu tilpumu, vārglāzi nosedz ar dzesinātāju, piemēram, 500 ml tilpuma apaļkolbu, kurā cirkulē auksts ūdens. Vārīšanos pārtrauc, pievienojot apmēram 50 ml auksta ūdens, un nekavējoties filtrē ar vakuumu caur saskaņā ar 4.8. punktu iepriekš sagatavotu azbesta filtru. Atlikumu uz filtra piecas reizes mazgā ar aptuveni 100 ml ļoti karsta ūdens tā, lai filtrāta kopējais tilpums būtu 800 ml. Atlikumu kvantitatīvi pārnes vārglāzē (4.1.), kurā viršanas regulēšanai ievietots porcelāna disks (4.2.). Pievieno 200 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.4.). Strauji uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai un vāra precīzi 30 minūtes. Pievieno apmēram 50 ml auksta ūdens un nekavējoties filtrē ar vakuumu caur saskaņā ar 4.8. punktu iepriekš sagatavotu azbesta filtru. Atlikumu mazgā ar ļoti karstu ūdeni, līdz mazgāšanas ūdenim ir neitrāla reakcija, ko pārbauda ar lakmusa papīru, tad trīs reizes ar acetonu (3.6.), kopā izlietojot apmēram 100 ml acetona. Atlikumu kvantitatīvi pārnes tīģelī pārpelnošanai (4.5.), ja vajadzīgs, sasmalcina un līdz nemainīgam svaram žāvē žāvēšanas skapī 130 °C temperatūrā. Atdzesē eksikatorā (4.7.) un ātri nosver. Tīģeli uz 30 minūtēm ievieto mufeļkrāsnī (4.6.) pārpelnošanai 900 °C temperatūrā. Atdzesē eksikatorā (4.7.) un ātri nosver. Ar apstrādātu azbestu (3.2.), piemērojot tādu pašu procedūru, veic tukšā parauga analīzi. Pārpelnojot 6 g azbesta, svara zudumi nedrīkst pārsniegt 10 mg. 6. Rezultātu aprēķināšana Procentos izteiktu parauga kopšķiedras saturu aprēķina pēc šādas formulas: 100 3 kur: a = analizējamā parauga svara zudumi pēc pārpelnošanas; b = tukšā parauga svara zudumi pēc pārpelnošanas. Atkārtojamība No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt: 0,3 % pēc absolūtā lieluma, ja kopšķiedras saturs ir mazāks par 10 %; 3,0 % pēc relatīvā lieluma, ja kopšķiedras saturs ir 10 % vai lielāks. 7. Piezīmes 7.1. Barība, kurā ir vairāk par 10 % eļļu un tauku, pirms analīzes jāattauko ar dietilēteri (3.7.). Šim nolūkam analizējamo paraugu (3 g iesvaru ar mg precizitāti) pārnes uz azbesta filtra (4.8.). Trīs reizes pārlej ar apmēram 50 ml dietilētera (3.7.), katru reizi pilnīgi nofiltrējot ar vakuumu. Attaukoto analizējamo paraugu kopā ar azbestu kvantitatīvi pārnes vārglāzē (4.1.), un turpina analīzi, kā aprakstīts 5. punktā. 7.2. Barību, kas satur tieši neekstraģējamas eļļas un taukus, 7.1. punktā aprakstītajā kārtībā attauko pēc iedarbības ar skābi un atlikuma mazgāšanas. Skābi no atlikuma trīs reizes mazgā ar acetonu (3.6.) (kopā 100 ml) un pēc tam trīs reizes ar dietilēteri (3.7.). Pēc tam atlikumu kvantitatīvi pārnes vārglāzē (4.1.) un analīzi turpina saskaņā ar aprakstu 5. punkta otrajā daļā (apstrāde ar kālija hidroksīda šķīdumu). 7.3. Ja barībā ir daudz kalcija (kalcija saturs virs 2 %), analizējamo paraugu (3 g iesvara ar mg precizitāti) pārnes vārglāzē (4.1.) ar 100 ml 0,5 N sālsskābes šķīduma (3.5.) un 5 minūtes nostādina vēsumā. Nekavējoties filtrē un mazgā ar aukstu ūdeni. Par filtrēšanas līdzekli izmanto 2,0 g azbesta, ko lieto vārīšanai ar sērskābi. Ja suspensija filtrējas slikti, to atšķaida ar acetonu (3.6.). Pēc tam rīkojas pēc apraksta 5. punktā. -------------------------------------------------- II PIELIKUMS 1. A VITAMĪNA (RETINOLA) NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Šī metode ļauj noteikt retinola (A vitamīna) daudzumu barībā, koncentrātos un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 10000 SV/kg izteikti pigmentētai barībai un 4000 SV/kg pārējai barībai [1]. Pēc retinola sagaidāmā satura produktus iedala divās grupās: A grupa: saturs zem 200000 SV/kg; B grupa: saturs 200000 SV/kg vai lielāks. 2. Princips Paraugu hidrolizē karstā kālija hidroksīda šķīdumā etanolā slāpekļa atmosfērā vai antioksidanta klātbūtnē. Maisījumu ekstraģē ar 1,2-dihloretānu. Ekstraktu iztvaicē un šķīdina petrolēterī. Šķīdumu hromatografē alumīnija oksīda kolonnā. B grupasproduktiemhromatografēšana vajadzīga tikai dažos gadījumos. A grupas produktos retinolu nosaka spektrofotometriski pie 610 nm pēc krāsota kompleksa, ko iegūst Kara-Praisa reakcijā, bet B grupas produktos — ar UV spektrofotometriju pie 325 nm. 3. Reaģenti a) izmanto A un B grupas produktu analīzēm 3.1. Etilspirts, 96 % V/V. 3.2. 10 % (m/V) nātrija askorbāta šķīdums. 3.3. Attīrīts slāpeklis. 3.4. 50 % (m/V) analītiski tīrs kālija hidroksīda šķīdums. 3.5. Kālija hidroksīda, analītiski tīrs 1 N šķīdums. 3.6. Kālija hidroksīda, analītiski tīrs 0,5 N šķīdums. 3.7. 1,2-dihloretāns, analītiski tīrs. 3.8. Petrolēteris, viršanas temperatūra: 30-50 °C. Ja vajadzīgs, attīra šādi: maisa 1000 ml petrolētera ar 20 ml koncentrētas sērskābes porcijām tikmēr, kamēr skābe nemaina krāsu. Skābi atdala, bet petrolēteri mazgā ar 500 ml ūdens, tad divas reizes ar 250 ml 10 % (m/V) nātrija hidroksīda šķīdumu un trīs reizes ar 500 ml ūdens. Skābi atdala, petrolēteri 1 stundu žāvē ar aktīvo ogli un bezūdens nātrija sulfātu, pēc tam filtrē un destilē. 3.9. Alumīnija oksīds, standartizēts pēc Brokmana: 8 stundas pārpelno 750 °C temperatūrā, ļauj atdzist eksikatorā un glabā tumša stikla pudelē ar pieslīpētu stikla aizbāzni. Pirms lietošanas hromatogrāfijā samitrina šādi: tumša stikla pudelē pārnes 10 g alumīnija oksīda un 0,7 ml ūdens, pudeli noslēdz ar aizbāzni un maisot 5 minūtes silda vāroša ūdens vannā. Ļauj atdzist. Šādi sagatavota alumīnija oksīda aktivitāti pārbauda, ar zināmu retinola (3.17.) daudzumu (apmēram 500 SV), veicot 5.3. un 5.4. punktā aprakstīto procedūru un nosakot atgūstamību. 3.10. Bāzisks alumīnija oksīds, 1. aktivitātes klase (Woelm, Merck ražojuma, vai tiem līdzvērtīgas kvalitātes). 3.11. Tīrs dietilēteris. Bāziska alumīnija oksīda kolonnā hromatogrāfiski atdala peroksīdus un ūdens zīmes (3.10.). (25 g alumīnija oksīda uz 250 ml dietilētera.) 3.12. Petrolētera (3.8.) 4, 8, 12, 16 un 20 % (V/V) šķīdums dietilēterī (3.11.). 3.13. Nātrija sulfīda 0,5 molārs šķīdums 70 % (V/V) glicerīnā, ko pagatavo no analītiski tīra nātrija sulfīda. b) izmanto tikai A grupas produktu analīzēm 3.14. Kristalizēts benzols, analītiski tīrs. 3.15. Hloroforms, analītiski tīrs. Bāziska alumīnija oksīda (3.10.) kolonnā atdala etanolu, fosgēnu un ūdens zīmes (50 g alumīnija oksīda uz 200 ml hloroforma; pirmos 50 ml ieteicams eluāta hromatografēt otrreiz). 3.16. Kara-Praisa reaģents: maisa apmēram 25 g analītiski tīra antimona trihlorīda (glabāts eksikatorā) ar 100 ml hloroforma (3.15.), līdz iegūst piesātinātu šķīdumu. Nedaudz antimona trihlorīda nogulšņu netraucē. Pievieno 2 ml analītiski tīra etiķskābes anhidrīda. Glabā ledusskapī tumša stikla pudelē ar pieslīpētu stikla aizbāzni. Šķīdumu var glabāt vairākas nedēļas. 3.17. Retinols — spektrofotometriski standartizēts. c) izmanto tikai B grupas produktu analīzēm 3.18. Izopropanols, hromatogrāfijai. 4. Iekārta 4.1. Ūdens vanna. 4.2. Vakuumietvaicēšanas iekārta ar dažāda tilpuma apaļkolbām. 4.3. Hromatogrāfijas caurules no stikla (garums 300 mm, iekšējais diametrs apmēram 13 mm). 4.4. Spektrofotometrs ar 10 mm kivetēm. Mērījumiem UV diapazonā vajadzīgas kvarca kivetes. 4.5. 365 nm UV lampas. 5. Procedūra NB: Visas operācijas jāveic, vairoties no tiešiem saules stariem, ja vajadzīgs, iekārtā no tumša stikla. 5.1. Analizējamais paraugs No smalki samalta parauga atkarībā no retinola sagaidāmā satura ņem analizējamo paraugu: koncentrātiem (ar saturu virs 20000 SV/g) 0,1 - 1,0 g; premiksiem (ar saturu no 400 līdz 20000 SV/g) 3,0 - 5,0 g; minerālvielu maisījumiem 10-20 g; A grupas produktiem — 30 g. Analizējamo paraugu nekavējoties pārnes 500 ml tilpuma kolbā ar pieslīpētu stikla aizbāzni. 5.2. Hidrolīze un ekstrakcija [2] Analizējamajam paraugam pievieno 40 ml etanola (3.1.), 2 ml nātrija askorbāta šķīduma (3.2.) [3], 10 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.4.) un 2 ml nātrija sulfīda šķīduma (3.13.). Silda 30 minūtes 70-80 oC temperatūrā ar atteces dzesinātāju, pēc tam atdzesē tekošā ūdenī. Pievieno 50 ml etanola (3.1.) un 100 ml 1,2-dihloretāna (3.7.), ko ņem ar pipeti. Enerģiski sakrata un tad augšējo slāni dekantē savācējtraukā. Savācējtraukā pievieno 150 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.5.), krata 30 sekundes un nostādina, līdz šķidrums noslāņojas. Dihloretāna slāni (apakšējo slāni) savāc savācējtraukā pievieno 40 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.6.), krata 10 sekundes un nostādina, līdz šķidrums noslāņojas. Dihloretāna slāni savāc savācējtraukā un 6-8 reizes mazgā ar 40 ml ūdens porcijām līdz neitrālai reakcijai (pārbauda ar fenolftaleīnu). Dihloretāna slāni savāc un ar filtrpapīra strēmelēm atdala ūdens paliekas. Ar vakuumu ūdens vannā 40 oC temperatūrā iztvaicē šķīduma alikvotu. Atlikumu ātri izšķīdina 5 ml petrolētera (3.8.). A grupas produktiem veic hromatogrāfiju pēc apraksta 5.3.1. punktā. B grupas produktiem - šķīdumu pārnes 50 ml tilpuma mērkolbā, uzpilda ar petrolēteri (3.8.) līdz zīmei, samaisa un mēra optisko blīvumu pēc apraksta 5.4.2. punktā. 5.3. Hromatogrāfija 5.3.1. A grupas produkti Hromatogrāfijas caurulē (4.3.) līdz 200 mm augstumam iepilda 10 g alumīnija oksīda (3.9.), kas pirms tam piesūcināts ar petrolēteri (3.8.). Caurulē pārnes šķīdumu, kas iegūts saskaņā ar 5.2. punktu, un nekavējoties pievieno 20 ml petrolētera (3.8.). Pēc kārtas zem spiediena vai daļēja vakuuma ar ātrumu 2 līdz 3 pilieni sekundē eluē pa 10 ml 4, 8, 12, 16 un 20 % petrolētera šķīdumus dietilēterī (3.12.). Vispirms eluējas karotīns [4] Retinols parasti eluējas ar 20 % petrolētera šķīdumu dietilēterī (3.12.). Eluēšanu novēro UV gaismā (kolonnu īslaicīgi apstarojot ar dzīvsudraba lampu). Fluorescējošā retinola zona precīzi nodalās no ksantofila zonām aiz tās. Eluāta frakciju, kas satur retinolu, savāc Erlenmeijera kolbā. 5.3.2. B grupas produkti Hromatografēšana jāizdara tikai tad, ja saskaņā ar 5.4.2. punktu veikto optiskā blīvuma mērījumu rezultāti neatbilst 5.4.2. punktā noteiktajām prasībām. Ja nākas izmantot hromatografēšanu, hromatogrāfijas kolonnā pārnes saskaņā ar 5.2. punktu iegūtā petrolētera šķīduma alikvotu, kura satur apmēram 500 SV retinola, un hromatografē pēc apraksta 5.3.1. punktā. 5.4. Optiskā blīvuma mērīšana 5.4.1. A grupas produkti Ar vakuumu iztvaicē saskaņā ar aprakstu 5.3.1. punktā iegūto eluātu, kas satur retinolu. Atlikumu izšķīdina 2 ml benzola (3.14.). Ņem 0,3 ml šā šķīduma un pievieno 3 ml Kara-Praisa reaģenta (3.16.). Izveidojas zils krāsojums. Precīzi 30 sekundes pēc reakcijas sākuma, ar spektrofotometru mēra optisko blīvumu pie 610 nm. Retinola saturu nosaka pēc standartlīknes, ko iegūst no pieaugošas koncentrācijas retinola standartšķīdumiem benzolā, kuri apstrādāti ar Kara-Praisa reaģentu (2 līdz 16 SV retinola standarta (3.17.) uz 0,3 ml benzola (3.14.) + 3 ml Kara-Praisa reaģenta (3.16.)). Standartlīkne jāpārbauda regulāri un pietiekami bieži, izmantojot standartšķīdumus un svaigi pagatavotu Kara-Praisa reaģenta šķīdumu. 5.4.2. B grupas produkti Ņem saskaņā ar 5.2. punktu iegūtā petrolētera šķīduma alikvotu, kas satur apmēram 200 SV retinola. Ar vakuumu iztvaicē un atlikumu izšķīdina 25 ml izopropanola (3.18.). Ar spektrofotometru mēra optisko blīvumu pie 325, 310 un 334 nm. Absorbcijas maksimums ir pie 325 nm. Retinola saturu šķīdumā aprēķina šādi: E325·18,30 = SV retinola/ml Tomēr optiskā blīvuma attiecībai E310: E325 un E334: E325 jābūt 6 : 7 = 0,857. Ja kāda no šīm attiecībām būtiski atšķiras no norādītā lieluma (< 0,830 vai >0,880), pirms optiskā blīvuma mērījumiem jāizdara hromatografēšana pēc 5.3.2. punktā aprakstītās metodes. Ja pēc hromatografēšanas veiktie optiskā blīvuma mērījumu rezultāti liecina, ka minētās attiecības joprojām būtiski atšķiras no 0,857 (< 0,830 vai >0,880), noteikšana jāizdara pēc A grupas produktiem noteiktās metodes. 6. Rezultātu aprēķināšana Retinola saturu paraugā aprēķina, ņemot vērā analizējamā parauga iesvara lielumu un analīzes gaitā izdarītos atšķaidījumus. Rezultātus izsaka SV retinola kilogramā barības, koncentrāta vai premiksa. Atkārtojamība No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt: - 20 % pēc relatīvā lieluma, ja retinola saturs ir mazāks par 75000 SV/kg, - 15000 SV, ja retinola saturs ir starp 75000 un 150000 SV/kg, - 10 % pēc relatīvās lieluma, ja retinola saturs ir starp 150000 un 250000 SV/kg, - 25000 SV, ja retinola saturs ir starp 25000 un 500000 SV/kg, - 5 % pēc relatīvā lieluma, ja retinola saturs ir lielāks par 500000 SV/kg. 2. TIAMĪNA (B1 VITAMĪNA, ENEIRĪNA) NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Ar šo metodi var noteikt tiamīna (eneirīna, B1 vitamīna) daudzumu barībā, koncentrātos un premiksos. Noteikšanas zemākā robeža ir 5 mg/kg (5 ppm). 2. Princips Šķīdumu sildot apstrādā ar atšķaidītu sērskābi un pēc tam fermentatīvi hidrolīzē. Iegūto šķīdumu oksidē sārmainā vidē. Izveidojušos tiohromu ekstraģē ar izobutanolu un nosaka fluorimetriski. 3. Reaģenti 3.1. Tiamīna standartšķīdums, 100 μg/ml: 1000 ml 0,2 N sērskābes šķīduma (3.2.) izšķīdina 112,3 mg tiamīna hidrogēnhlorīda, kas pirms tam līdz nemainīgam svaram izžāvēts vakuumā. Tumšā, vēsā vietā šķīdumu var glabāt vienu mēnesi. 3.2. Sērskābes 0,2 N šķīdums. 3.3. Tīrs nātrija hidrogēnsulfīts. 3.4. 20 % (m/V) analītiski tīra kālija fericianīda šķīdums. 3.5. 25 % (m/V) analītiski tīra kālija hidroksīda šķīdums. 3.6. Oksidēšanas maisījums: sajauc 2 ml kālija fericianīda (3.4.) šķīduma ar 48 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.5.). Šo šķīdumu nevar uzglabāt ilgāk par 4 stundām. 3.7. Izobutanols, analītiski tīrs. 3.8. 2,5 N nātrija acetāta šķīdums. 3.9. Vairāku fermentu preparāts, kas satur proteāzi, fosfatāzi un amilāzi (piemēram, Clarase). 3.10. Etilspirts, 96 % V/V. 4. Iekārta 4.1. Ūdens vanna. 4.2. Centrifūga (3500 apgr./min.) un 30 līdz 50 ml tilpuma mēģenes ar pieslīpētiem stikla aizbāžņiem. 4.3. Fluorimetrs. 5. Procedūra 5.1. Fermentatīvā hidrolīze Divās 250 ml tilpuma mērkolbās A un B pārnes vienādus daudzumus smalki samalta parauga, kurā ir apmēram 100 μg tiamīna, un 125 ml sērskābes šķīduma (3.2.). Tikai A kolbā pievieno 1,0 ml standartšķīduma (3.1.) (iekšējais standarts). Kolbas enerģiski sakrata un, laiku pa laikam sakratot, 15 minūtes silda uz verdoša ūdens vannas. Atdzesē līdz apmēram 45 °C. Abās kolbās pievieno 20 ml nātrija acetāta šķīduma (3.8.) un 0,5 g vairāku fermentu preparāta (3.9.), atstāj uz 20 minūtēm istabas temperatūrā. Pievieno 20 ml nātrija acetāta šķīduma (3.8.), uzpilda ar ūdeni līdz zīmei, homogenizē un filtrē. Savāc filtrātus A un B, vispirms izlejot to pirmos 15 ml. Sagatavo šādus šķīdumus: 5.1.1. T kontrolšķīdums Centrifūgas mēģenē (4.2.) pārnes 5 ml filtrāta A un apmēram 10 mg nātrija hidrogensulfīta (3.3.). Mēģeni uz 15 minūtēm iegremdē verdoša ūdens vannā un pēc tam ļauj atdzist līdz istabas temperatūrai. 5.1.2. A šķīdums (iekšējais standarts) un B šķīdums (paraugs) Vienā centrifūgas mēģenē (4.2.) pārnes 5 ml filtrāta A, bet otrā centrifūgas mēģenē (4.2.) — 5 ml filtrāta B. 5.2. Oksidēšana Šķīdumiem T, A un B pievieno 5 ml oksidējošā maisījuma (3.6.) un pēc vienas minūtes 10 ml izobutanola (3.7.). Mēģenes noslēdz ar aizbāžņiem un 5 sekundes enerģiski krata. Nostādina vienu minūti un centrifugē, lai atdalītu slāņus. No katras mēģenes 5 ml augšējā izobutanola slāņa šķīduma pārnes 25 ml tilpuma mērkolbās, uzpilda līdz zīmei ar etanolu (3.10.) un homogenizē (ekstrakti T, A un B). 5.3. Fluorescences mērīšana Mērījumus izdara pie viļņa garuma, pie kura fluorimetram ir optimāls atbildes signāls uz tiohroma fluorescenci. Apstaro pie apmēram 365 nm. Instrumenta nulli iestāda pēc ekstrakta T. Mēra ekstraktu A un B fluorescences intensitāti. 6. Rezultātu aprēķināšana Tiamīna saturu mg/kg parauga aprēķina pēc šādas formulas: c kur: a = ekstrakta A (iekšējā standarta) fluorescences intensitāte; b = ekstrakta B (parauga) fluorescences intensitāte; c = analizējamā parauga masa, g; d = analizējamajam paraugam pievienotais tiamīna daudzums μg (iekšējais standarts). Atkārtojamība No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt: 10 % pēc relatīvā lieluma, ja tiamīna saturs ir mazāks par 500 mg/kg, un 5 % pēc relatīvā lieluma, ja tiamīna saturs ir 500 mg/kg vai lielāks. 3. ASKORBĪNSKĀBES UN DEHIDROASKORBĪNSKĀBES (C VITAMĪNA) NOTEIKŠANA 1. Mērķis un darbības joma Ar šo metodes var noteikt askorbīnskābes un dehidroaskorbīnskābes (C vitamīna) kopējo saturu barībā, koncentrātos un premiksos. Noteikšanas zemākā robeža ir 5 mg/kg (5 ppm). Pēc C vitamīna sagaidāmā satura produktus iedala divās grupās: A grupa: saturs zem 10 g/kg; B grupa: saturs - 10 g/kg vai lielāks. 2. Princips Paraugu suspendē atšķaidītā metafosforskābes šķīdumā, ko ekstraģē ar hloroformu. Ūdens fāzi apstrādā ar 2,6-dihlorfenilindofenolu, pārvēršot askorbīnskābi dehidroaskorbīnskābē, un pēc tam ar 2,4-dinitrofenilhidrazīnu. Radušos hidrazonu ekstraģē ar etilacetāta, ledus etiķskābes un acetona maisījumu. Šķīdumu hromatografē silikagela kolonnā, eluātu iztvaicē un atlikumu izšķīdina atšķaidītā sērskābes šķīdumā. Ar spektrofotometru mēra šķīduma optisko blīvumu pie 509 nm. A grupas produktiem no eluāta, kas iegūts pēc hromatografēšanas kolonnā, ar plānslāņa hromatogrāfiju izolē hidrazonu. 3. Reaģenti 3.1. L-askorbīnskābes 0,05 % standartšķīdums: izšķīdina 50 mg analītiski tīras L-askorbīnskābes apmēram 20 ml metafosforskābes šķīduma (3.2.) un līdz 100 ml tilpumam uzpilda ar ūdeni. Sagatavo tieši pirms lietošanas. 3.2. Metafosforskābes šķīdums, 10 % (m/V): ūdenī izšķīdina 200 g piestā saberztas analītiski tīras metafosforskābes un līdz 2000 ml tilpumam uzpilda ar ūdeni. Glabā 4 °C temperatūrā. Šķīdums ir stabils vienu nedēļu. 3.3. Hloroforms, analītiski tīrs. 3.4. 2,6-dihlorfenilindofenola, analītiski tīrs, 0,5 % (m/V) šķīdums; sagatavo tieši pirms lietošanas. 3.5. Filtrēšanas līdzeklis (S vai S Nr. 121, vai tiem līdzvērtīgs). 3.6. 2,4-dinitrofenilhidrazīna 2 % (m/V) šķīdums skābē: 2 g 2,4-dinitrofenilhidrazīna izšķīdina 100 ml atšķaidītas sērskābes (25 ml analītiski tīras sērskābes (d: 1,84) atšķaida ar ūdeni līdz 100 ml). Vēsumā šķīdumu var glabāt vienu nedēļu. 3.7. Slāpeklis, vai 3.8. Oglekļa dioksīds. 3.9. Eilacetāta, a.t./ledus etiķskābes/acetona, a.t. maisījums 96/2/2 pēc tilpuma. 3.10. Dihlormetāna, a.t./ledus etiķskābes maisījums 97/3 pēc tilpuma. 3.11. Silikagels ar daļiņu lielumu 0,05 līdz 0,2 mm. 3.12. Štāla silikagels H plānslāņa hromatogrāfijai. 3.13. Atšķaidīta sērskābe: 200 ml tilpuma mērkolbā 105 ml ūdens uzpilda līdz zīmei ar analītiski tīru sērskābi d: 1,84. 3.14. Eluents plānslāņa hromatogrāfijai: sajauc 75 ml analītiski tīra dietilētera, 25 ml analītiski tīra etilacetāta un 4,0 ml 96 % (m/V) analītiski tīras ledus etiķskābes. Pēc 2 līdz 3 hromatogrāfijām gatavo no jauna. 4. Iekārta 4.1. Ūdens vanna, kas aprīkota ar 20 °C temperatūrā ieregulētu termostatu. 4.2. Centrifūga (3500 apgr./min.) un 40 līdz 50 ml tilpuma mēģenes ar pieslīpētiem stikla aizbāžņiem. 4.3. Rotācijas vakuumietvaicētājs ar 250 ml tilpuma kolbām. 4.4. Stikla caurules hromatogrāfijai: (garums 100 mm, iekšējais diametrs 20 mm) ar keramikas disku (piemēram, Alīna caurules). 4.5. Spektrofotometrs vai kolorimetrs ar filtriem un 10 mm kivetēm. 4.6. Aparāts plānslāņa hromatogrāfijai, silikagela plates (3.12.) ar 0,5 līdz 0,6 mm biezu silikagela slāni (piemērotākas ir gatavas nopērkamas plates.) Plates 2,5 līdz 3 stundas žāvē 120 līdz 130 °C temperatūrā žāvēšanas skapī. Pirms lietošanas atdzesē un glabā eksikatorā vismaz 24 stundas. 4.7. Žāvēšanas skapis, ieregulēts 120 līdz 130 °C temperatūrā. 5. Procedūra 5.1. Ekstrakcija Divās 250 ml tilpuma mērkolbās (ar pieslīpētiem stikla aizbāžņiem) A un B pārnes vienādus daudzumus smalki samalta parauga, kurā ir apmēram 200 μg C vitamīna. Tikai A kolbā pievieno 0,4 ml standartšķīduma (3.1.) (iekšējais standarts) un, uzmanīgi kratot, samaisa. Abās kolbās 4 °C temperatūrā pievieno 30 ml hloroforma (3.3.) un 25 ml metafosforskābes šķīduma (3.2.). Sakrata un nostādina 10 līdz 15 minūtes. Pievieno 25 ml ūdens, kolbas noslēdz ar aizbāžņiem, 10 sekundes enerģiski krata un uz 10 līdz 15 minūtēm ieliek ūdens vannā (4.1.). Centrifugē, lai atdalītu ūdens fāzi no hloroforma fāzes. Ar ūdens ekstraktiem A (iekšējais standarts) un B vienlaicīgi veic tālāk tekstā aprakstītās operācijas. 5.2. Oksidēšana Ar pipeti pārnes 40 ml augšējā ūdens slāņa (mazliet duļķainu) šķīdumu, kas iegūts saskaņā ar 5.1. punktu, reakcijas mēģenē, kurai ir pieslīpēts stikla aizbāznis, pievieno 0,5 līdz 1,0 ml 2,6-dihlorfenilindofenola šķīduma (3.4.) un samaisa. Izveidojas sarkans krāsojums, kam būtu jāsaglabājas vismaz 15 minūtes. Tad pievieno apmēram 300 mg filtrēšanas līdzekļa (3.5.), sakrata un filtrē caur sausu kroku filtru. Filtrāts var nebūt pilnīgi dzidrs. 5.3. Reakcija ar 2,4-dinitrofenilhidrazīnu un hidrazona ekstrakcija Ar pipeti centrifūgas mēģenē (4.2.) pārnes 10 ml filtrāta, kas iegūts saskaņā ar 5.2. punktu, pievieno 2 ml 2,4- dinitrofenilhidrazīna šķīduma (3.6.) un samaisa. Mēģenē nekavējoties ievada slāpekli (3.7.) vai oglekļa dioksīdu (3.8.), noslēdz ar aizbāzni un uz apmēram 15 stundām (uz nakti) iegremdē ūdens vannā (4.1.). Tad pievieno 3 ml ūdens, 20 ml etilacetāta/ledus etiķskābes/acetona maisījuma (3.9.) un apmēram 800 mg filtrēšanas līdzekļa (3.5.). Mēģenes noslēdz ar aizbāžņiem, 30 sekundes enerģiski krata un centrifugē. Iztvaicēšanas kolbā pārnes 15 ml šķidruma no augšējā slāņa, ietvaicē pie pazemināta spiediena rotora ietvaicētājā (4.3.), līdz iegūst eļļainu atlikumu. Atlikumu sildot 50 °C temperatūrā, izšķīdina 2 ml etilacetāta/ledus etiķskābes/acetona maisījuma (3.9.), atdzesē, pievieno 10 ml dihlormetāna/ledus etiķskābes maisījuma (3.10.) un samaisa. 5.4. Hromatografēšana kolonnā Hromatogrāfijas caurulē (4.4.) līdz 30 mm augstumam iepilda dihlormetāna/ledus etiķskābes maisījumu (3.10.). Enerģiski kratot, 5 g silikagela (3.11.) suspendē 30 ml dihlormetāna/ledus etiķskābes maisījuma (3.10.); suspensiju iepilda caurulē. Nostādina un pēc tam zem neliela spiediena sablīvē ar slāpekli (3.7.). Caurulē dekantē šķīdumu, kas iegūts saskaņā ar 5.3. punktu, kolbu izskalo ar nelielu daudzumu dihlormetāna/ledus etiķskābes maisījuma (3.10.), ko dekantē caurulē, tad to piepilda ar maisījumu (3.10.) un kolonnu skalo ar šo pašu maisījumu (3 līdz 4 porcijām pa 5 ml), līdz iegūst bezkrāsas eluātu. Dzeltenas krāsas eluātu izlej. Sarkanīgo zonu kolonnas augšdaļā eluē ar etilacetāta/ledus etiķskābes/acetona maisījumu (3.9.), eluātu savāc un iztvaicē. 5.4.1. A grupas produktiem (ar C vitamīna saturu zem 10 g/kg) atlikumu izšķīdina 2,0 ml etilacetāta/ledus etiķskābes/acetona maisījumā (3.9.) un tam nekavējoties izdara plānslāņa hromatogrāfiju pēc apraksta 5.5. punktā. 5.4.2. B grupas produktiem (ar C vitamīna saturu 10 g/kg un lielāku) eļļaino atlikumu šķīdina 4,0 ml atšķaidītas sērskābes (3.13.), enerģiski krata, lai atlikumu izšķīdinātu pilnīgi, un saskaņā ar 5.6. punktu mēra tā optisko blīvumu. 5.5. Plānslāņa hromatogrāfija Divos atkārtojumos izpilda turpmāk aprakstītās operācijas. Tievā līnijā uz plates (4.6.) pārnes 0,5 ml šķīduma, kas iegūts saskaņā ar 5.4.1. punktu. Ar eluēšanas šķīdumu (3.14.) vismaz 20 minūtes attīsta hromatogrāfijas kamerā, kas piesātināta ar šķīdinātāja tvaikiem, līdz precīzi nodalās sārti krāsotā hidrazona zona. āvē atklātā vietā. Atzīmē sārtās zonas robežas, zonu ar lāpstiņu nokasa un pulveri kvantitatīvi pārnes hromatogrāfijas caurulē (4.4.). Eluē vispirms vienreiz ar 2 ml un pēc tam divreiz ar 1,5 ml etilacetāta/ledus etiķskābes/acetona maisījuma (3.9.). Eluātu savāc nelielā kolbā (eluāta pēdējai daļai jābūt bezkrāsainai). Iztvaicē, eļļaino atlikumu šķīdina 4,0 ml atšķaidītas sērskābes (3.13.), enerģiski krata, lai atlikumu izšķīdinātu pilnīgi, un mēra šķīduma optisko blīvumu. 5.6. Optiskā blīvuma mērīšana Ar spektrofotometru pie 509 nm mēra optisko blīvumu 20 līdz 30 minūšu laikā pēc atlikuma izšķīdināšanas sērskābē. Mērījumus veic, salīdzināšanai izmantojot atšķaidītu sērskābi (3.13.). 5.7. Tukšā parauga analīze Pēc tādas pašas procedūras veic tukšā parauga analīzi. 6. Rezultātu aprēķināšana C vitamīna saturu g/kg parauga aprēķina pēc šādas formulas: · 2 · 10d kur: a = tukšā parauga optiskais blīvums; b = iekšējā standarta šķīduma optiskais blīvums; c = parauga šķīduma optiskais blīvums; d = analizējamā parauga masa gramos. Atkārtojamība No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt: 10 % pēc relatīvā lieluma, ja C vitamīna saturs ir mazāks par 10 g/kg, un 5 % pēc relatīvā lieluma, ja C vitamīna saturs ir 10 g/kg vai lielāks. [1] 1SV = 0,3 mg retinola. [2] Piena produktiem un produktiem, kuriem ir tieksme sabiezēt vai uzbriest, 5.2. punkta pirmajā un otrajā daļā norādītos reaģentus ņem divkāršā daudzumā. [3] Nātrija askorbāts nav jāpievieno, ja hidrolīzi izdara slāpekļa atmosfērā. [4] Karotīna satutru var noteikt pēc optiskā blīvuma mērjumiem pie 450 nm;E 1 %1 cm= 2600 --------------------------------------------------