Komisijas Direktīva 2004/73/EK (2004. gada 29. aprīlis), ar ko divdesmit devīto reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par to normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu, kas attiecas uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakojumu un marķēšanuDokuments attiecas uz EEZ.



CS.ES Nodaļa 13 Sējums 34 Lpp. 448 - 757

ET.ES Nodaļa 13 Sējums 34 Lpp. 448 - 757

HU.ES Nodaļa 13 Sējums 34 Lpp. 448 - 757

LT.ES Nodaļa 13 Sējums 34 Lpp. 448 - 757

LV.ES Nodaļa 13 Sējums 34 Lpp. 448 - 757

MT.ES Nodaļa 13 Sējums 34 Lpp. 448 - 757

PL.ES Nodaļa 13 Sējums 34 Lpp. 448 - 757

SK.ES Nodaļa 13 Sējums 34 Lpp. 448 - 757

SL.ES Nodaļa 13 Sējums 34 Lpp. 448 - 757



Komisijas Direktīva 2004/73/EK (2004. gada 29. aprīlis), ar ko divdesmit devīto reizi tehnikas attīstībai pielāgo Padomes Direktīvu 67/548/EEK par to normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu, kas attiecas uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakojumu un marķēšanu (Dokuments attiecas uz EEZ) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1967. gada 27. jūnija Direktīvu 67/548/EEK par to normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu, kas attiecas uz bīstamu vielu klasifikāciju, iepakošanu un marķējumu [1], un jo īpaši tās 28. pantu, tā kā: (1) Direktīvas 67/548/EEK I pielikumā ietverts bīstamo vielu saraksts, kurā ir informācija par katras tajā iekļautās vielas klasifikāciju un marķēšanu. Norādītais saraksts ir jāatjaunina, lai iekļautu papildu paziņotās jaunas vielas un papildu esošās vielas, kā arī pielāgotu esošos ierakstus tehnikas attīstībai, piemēram, noteiktu dažu vielu koncentrācijas robežas vidē. Attiecīgi ieraksti par dažām vielām ir arī jāsvītro un daži ieraksti jāsadala, jo klasifikācija vairs neattiecas uz visām minēto ierakstu vielām. Vielu, kas satur 1,3-butadiēnu, marķējums ir jāmaina, lai norādītu, ka viela šajā direktīvā būs klasificēta kā mutagēns. (2) Direktīvas 67/548/EEK V pielikumā izklāstītas vielu un preparātu fizikāli ķīmisko īpašību, toksiskuma un ekotoksiskuma noteikšanas metodes. Ir lietderīgi grozīt minēto pielikumu, lai līdz minimumam samazinātu dzīvnieku skaitu, ko izmanto eksperimentāliem nolūkiem saskaņā ar Padomes 1986. gada 24. novembra Direktīvu 86/609/EEK par dalībvalstu normatīvo un administratīvo aktu tuvināšanu attiecībā uz eksperimentāliem un citiem zinātniskiem nolūkiem izmantojamo dzīvnieku aizsardzību [2]. Attiecīgi ir jāpārskata subhroniskās orālās toksicitātes metodes B.1., B.4., B.5., B.31. un B.35. nodaļā. Turklāt, lai darītu pieejamu pilnveidotu subhroniskās orālās toksicitātes metodi, V pielikumam ir jāpievieno B.42. nodaļa. Visbeidzot, lai varētu noteikt īpašības, ko vēl pietiekami neietver V pielikumā iekļautās metodes, ir jāpievieno A.21. nodaļa par fizikāli ķīmiskajām īpašībām, B.43. nodaļa par subhronisko orālo toksicitāti un C.21. līdz C.24. nodaļa par toksicitāti uz vidi. (3) Šajā direktīvā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar atzinumu, ko sniegusi Komiteja, kas izveidota, lai tehniskas attīstībai pielāgotu direktīvas par tehnisku šķēršļu novēršanu tirdzniecībā ar bīstamajām vielām un preparātiem, IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU. 1. pants Direktīvu 67/548/EEK groza šādi. 1. Direktīvas I pielikumu groza šādi: a) priekšvārda K piezīmi aizstāj ar 1.A pielikumā izklāstīto tekstu; b) ierakstus, kas atbilst šīs direktīvas 1.B pielikumā izklāstītajiem, aizstāj ar minētajā pielikumā izklāstīto tekstu; c) šīs direktīvas 1.C pielikumā izklāstītos ierakstus iestarpina saskaņā ar Direktīvas 67/548/EEK I pielikumā izklāstītajiem ierakstiem; d) ierakstus ar indeksa numuriem 604–050–00–X, 607–050–00–8, 607–171–00–6 un 613–130–00–3 svītro; e) ierakstu ar indeksa numuru 048–002–00–0 aizstāj ar ierakstiem, kam indeksa numuri ir 048–002–00–0 un 048–011–00–X, kā norādīts šīs direktīvas 1.D pielikumā; f) ierakstu ar indeksa numuru 609–006–00–3 aizstāj ar ierakstiem, kam indeksa numuri ir 609–006–00–3 un 609–065–00–5, kā norādīts šīs direktīvas 1.D pielikumā; g) ierakstu ar indeksa numuru 612–039–00–6 aizstāj ar ierakstiem, kam indeksa numuri ir 612–039–00–6 un 612–207–00–9, kā norādīts 1.D pielikumā. 2. Šādi groza V pielikumu: a) šīs direktīvas 2.A pielikumā izklāstīto tekstu pievieno kā A.21. nodaļu; b) B.1. bis nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.B pielikumā izklāstīto tekstu; c) B.1. tris nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.C pielikumā izklāstīto tekstu; d) B.4. nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.D pielikumā izklāstīto tekstu; e) B.5. nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.E pielikumā izklāstīto tekstu; f) B.31. nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.F pielikumā izklāstīto tekstu; g) B.35. nodaļu aizstāj ar šīs direktīvas 2.G pielikumā izklāstīto tekstu; h) šīs direktīvas 2.H pielikumā izklāstīto tekstu pievieno kā B.42. un B.43. nodaļu; i) šīs direktīvas 21. pielikumā izklāstīto tekstu pievieno kā C.21. līdz C.24. nodaļu. 2. pants 1. Dalībvalstīs stājas spēkā normatīvi un administratīvi akti, kas vajadzīgi, lai vēlākais līdz 2005. gada 31. oktobrim nodrošinātu atbilstību šai direktīvai. Dalībvalstis tūlīt dara zināmus Komisijai minēto aktu tekstus, kā arī minēto aktu un šīs direktīvas atbilstības tabulu. Kad dalībvalstis pieņem minētos tiesību aktus, tajos ietver atsauci uz šo direktīvu vai arī šādu atsauci pievieno to oficiālai publikācijai. Dalībvalstis nosaka, kā izdarāmas šādas atsauces. 2. Dalībvalstis dara zināmus Komisijai galvenos valsts tiesību aktu noteikumus, ko tās pieņēmušas jomā, uz kuru attiecas šī direktīva. 3. pants Šī direktīva stājas spēkā divdesmitajā dienā pēc publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī. 4. pants Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm. Briselē, 2004. gada 29. aprīlī Komisijas vārdā — Komisijas locekle Margot Wallström [1] OV L 196, 16.8.1967., 1. lpp. Direktīvā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EK) Nr. 807/2003 (OV L 122, 16.5.2003., 36. lpp.). [2] OV L 358, 18.12.1986., 1. lpp. Direktīvā jaunākie grozījumi izdarīti ar Eiropas Parlamenta un Padomes Direktīvu 2003/65/EK (OV L 230, 16.9.2003., 32. lpp.). -------------------------------------------------- 1.A PIELIKUMS "K piezīme. Viela nav jāklasificē kā kancerogēna vai mutagēna, ja var pierādīt, ka tajā ir mazāk par 0,1 masas % 1,3-butadiēna (Einecs Nr. 203–450–8). Ja viela nav klasificēta kā kancerogēna vai mutagēna, būtu jālieto vismaz nekaitīguma frāzes (2–)9–16. Šī piezīme attiecas uz dažām I pielikumā norādītām kompleksām vielām, kas iegūtas no naftas" . -------------------------------------------------- 2.A PIELIKUMS A21. OKSIDĒJOŠĀS ĪPAŠĪBAS (ŠĶIDRUMI) 1. METODE 1.1. IEVADS Šī testa metode paredzēta, lai noteiktu šķidruma spēju palielināt degošu vielu degšanas ātrumu vai degšanas intensitāti, vai arī spēju veidot pašaizdegošos maisījumu ar degošu vielu, tos rūpīgi sajaucot. Metodes pamatā ir ANO oksidējošu šķidrumu tests (1), un tā ir šim testam līdzvērtīga. Tomēr tāpēc, ka šī metode A.21. galvenokārt paredzēta, lai ievērotu Direktīvā 67/548 noteiktās prasības, ir nepieciešams salīdzinājums tikai ar vienu standartvielu. Testēšana un salīdzinājums ar papildus standartvielām var būt vajadzīgi gadījumos, kad testu rezultātus izmanto citiem nolūkiem [1]. Šis tests nav jāveic gadījumos, kad vielas struktūrformula nepārprotami liecina, ka viela nevar stāties eksotermiskās reakcijās ar viegli uzliesmojošiem materiāliem. Pirms noteikt šo rādītāju, ir lietderīgi iegūt sākotnēju informāciju par testējamās vielas iespējamo sprādzienbīstamību. Šī metode nav izmantojama cietvielām, gāzēm, sprādzienbīstamām vai viegli uzliesmojošām vielām un organiskajiem peroksīdiem. Testēšanu pēc šīs metodes nav jāveic, ja jau ir pieejami attiecīgās vielas testēšanas rezultāti pēc ANO oksidējošu šķidrumu testa. 1.2. DEFINĪCIJAS UN MĒRVIENĪBAS Vidējais spiediena paaugstināšanās laiks ir vidējais laiks, kādā testējamais maisījums izraisa spiediena paaugstināšanos no 690 kPa līdz 2070 kPa virs atmosfēras spiediena. 1.3. STANDARTVIELA Par standartvielu izmanto (analītiski tīru) 65 % (masas %) slāpekļskābes ūdens šķīdumu [2]. Ja eksperimentators paredz, ka testēšanas rezultātus iespējams izmantos arī citiem nolūkiem, [3] var būt lietderīgi papildus testēt arī citas standartvielas [4]. 1.4. TESTA METODES PRINCIPS Testējamo šķidrumu masas attiecībā 1:1 sajauc ar celulozes šķiedru un ievieto spiedtvertnē. Ja maisījuma sajaukšanas vai ievietošanas laikā notiek pašaizdegšanās, testēšanu neturpina. Ja nenotiek pašaizdegšanās, testēšanu veic pilnībā. Maisījumu spiedientvertnē karsē, un nosaka vidējo laiku, kādā spiediens paaugstinās no 690 kPa līdz 2070 kPa virs atmosfēras spiediena. To salīdzina ar vidējo spiediena paaugstināšanās laiku, kāds ir standartvielas(–u) un celulozes maisījumam attiecībā 1:1. 1.5. KVALITĀTES KRITĒRIJI Piecu izmēģinājumu rezultāti ar vienu vielu nedrīkst atšķirties vairāk par 30 % no to vidējās aritmētiskās vērtības. Izbrāķē rezultātus, kas no vidējās aritmētiskās vērtības atšķiras vairāk par 30 %, testēšanu atkārto pēc maisījuma sajaukšanas un ievietošanas procedūras pilnveidošanas. 1.6. METODES APRAKSTS 1.6.1. Sagatavošana 1.6.1.1. Viegli uzliesmojoša viela Par viegli uzliesmojošu materiālu izmanto sausas celulozes šķiedras ar šķiedru garumu no 50 līdz 250 μm un vidējo diametru 25 μm [5]. Celulozi līdz nemainīgai masai 4 stundas žāvē līdz 25 mm biezā slānī 105 °C temperatūrā, pēc tam atdzesē un līdz lietošanai glabā eksikatorā virs žāvētāja. Sausas celulozes mitruma saturs nedrīkst pārsniegt 0,5 % no bezūdens masas [6], [7]. Lai to panāktu, žāvēšanas laiks, ja vajadzīgs, ir jāpagarina. Visai testēšanai jāizmanto celuloze no vienas un tās pašas partijas. 1.6.1.2. Iekārta 1.6.1.2.1. Spiedtvertne Nepieciešama spiedtvertne. Tvertne sastāv no 89 mm gara tērauda spiedtvertnes ar ārējo diametru 60 mm (sk. 1. att.). Cilindra pretējās pusēs izslīpētas divas plakanas virsmas (samazinot šķērsgriezumu līdz 50 mm), ko izmanto fiksēšanai, ieskrūvējot ventilācijas atveres ventili un aizdedzināšanas ventili. Tvertnes abos galos ir izveidots 19 mm dziļš urbums 20 mm diametrā ar iekšējo Lielbritānijas standarta 1 "cauruļvītni vai tai līdzvērtīgu metriskās sistēmas vītni. Spiediena novada īscauruli ieskrūvē spiedtvertnes liektajā virsmā 90o leņķī pret izslīpētajām plakanajām virsmām 35 mm attālumā no viena gala. Šim nolūkam līdz 12 mm dziļumam izveido urbumu un iegriež ½" Lielbritānijas standarta cauruļvītni (vai tai līdzvērtīgu metriskās sistēmas vītni), kas atbilst īscaurules vītnei. Ja vajadzīgs, hermētiskuma nodrošināšanai izmanto inerta materiāla blīvi. Īscaurules garums ārpus spiedtvertnes korpusa ir 55 mm, un tās urbuma diametrs ir 6 mm. Īscaurules galā ir urbums ar vītni, kurā ieskrūvē diafragmas tipa spiediena devēju. Var izmantot visas spiediena mērīšanas ierīces, kuru darbību neietekmē karstas gāzes vai sadalīšanās produkti, un kuru reakcijas laiks uz spiediena paaugstināšanos no 690 līdz 2070 kPa nepārsniedz 5 m/s. No īscaurules attālāko spiedtvertnes galu noslēdz ar aizdedzināšanas ventili, kas sastāv no diviem elektrodiem, no kuriem viens izolēts no ierīces aizbāžņa, bet otrs ar to savienots. Spiedtvertnes otru galu noslēdz ar pārraujamu disku (pārraušanas spiediens apmēram 2200 kPa), ko nostiprina ar uzgriezni, kurā ir 20 mm diametra urbums. Ja vajadzīgs, aizdedzināšanas ventiļa hermētiskuma nodrošināšanai izmanto inerta materiāla blīvi. Lietošanas laikā ierīci pareizā stāvoklī notur statīvā (2. att.). Tas parasti sastāv no mazleģēta tērauda pamatloksnes (235 mm x 184 mm x 6 mm) un 180 mm gara doba kvadrātveida šķērsgriezuma (70 mm x 70 mm x 4 mm) profila. No kvadrātveida šķērsgriezuma profila pretējās pusēs vienā galā izveidots izgriezums tā, ka izveidojas konstrukcija ar divām plakanām gludām kājām ar 86 mm garu neskartu daļu. Šīs plakanās daļas nogriež 60o leņķī pret horizontāli un piemetina pamatplatei. Pamatnes augšējā daļā vienā pusē izgriež 22 mm platu 46 mm dziļu spraugu tā, lai statīvā ievietojot spiedtvertnes mezglu ar aizdedzināšanas ventili uz leju, spraugā atrastos īscaurule. Apakšējai iekšējai virsmai piemetina 30 mm platu un 6 mm biezu tērauda gabaliņu, kas kalpo par starpliku. Spiedtvertni cieši fiksē ar divām pretējā virsmā ieskrūvētām 7 mm spārnskrūvēm. No apakšas spiedtvertni balsta divas 12 mm platas 6 mm biezas tērauda lentas, kas piemetinātas sānu gabaliem un pieguļ pamatnei. 1.6.1.2.2. Aizdedzināšanas sistēma Aizdedzināšanas sistēma sastāv no 25 cm garas 0,6 mm diametra nihroma stieples ar pretestību 3,85 omi/m. Stiepli uz 5 mm diametra stieņa savij spirālē un piestiprina aizdedzināšanas ventiļa elektrodiem. Spirāli savij kādā no 3. att. parādītajiem veidiem. Aizdedzināšanas spirāles apakšai jābūt vismaz 20 mm attālumā no tvertnes dibena. Ja elektrodi nav regulējami, aizdedzināšanas stieples gali starp spirāli un tvertnes apakšu jāizolē ar keramikas apvalku. Stiepli sakarsē no pastāvīga barošanas avota, kas nodrošina vismaz 10 A stipru strāvu. 1.6.2. Testa norise [8] Iekārtu ar uzmontētu spiediena devēju un aizdedzināšanas sistēmu, neuzstādot pārraujamo disku, nostiprina statīvā ar aizdedzināšanas ventili uz leju. Stikla vārglāzē ar stikla spieķīti sajauc 2,5 g testējamā šķidruma ar 2,5 g sausas celulozes [9]. Drošības labad sajaukšana jāveic, lietotājam atrodoties aiz aizsargekrāna. Ja maisījums aizdegas tā sajaukšanas vai iepildīšanas laikā, testēšana nav jāturpina. Maisījumu nelielās daļās sablīvējot pārnes spiedtvertnē un raugās, lai maisījums tiktu sablīvēts ap aizdedzināšanas spirāli un ir ar to labā kontaktā. Svarīgi, lai sablīvēšanas laikā spirāle netiktu deformēta, jo tādēļ var iegūt kļūdainus rezultātus [10]. Ievieto pārraujamo disku un to nostiprina, cieši ieskrūvējot uzgriezni. Uzpildīto tvertni ar pārraujamo disku uz augšu ievieto statīvā velkmes skapī vai dedzināšanas kamerā. Aizdedzināšanas ventiļa ārējos izvadus pieslēdz elektrībai un padod 10 A stipru strāvu. Laiks no maisījuma sajaukšanas līdz elektriskās strāvas ieslēgšanai nedrīkst pārsniegt 10 minūtes. Spiediena devēja signālu reģistrē, izmantojot piemērotu reģistrācijas sistēmu, kas nodrošina gan radītā spiediena izmaiņu novērtēšanu, gan pastāvīgu reģistrēšanu (piemēram, pārejas procesu reģistrētājs, kas apvienots ar diagrammas reģistrētāju). Maisījumu karsē, līdz saplīst pārraujamais disks, vai vismaz 60 sekundes. Ja pārraujamais disks nesaplīst, pirms iekārtu izjaukt, maisījumam ļauj atdzist, veicot piesardzības pasākumus, kas saistīti ar iespējamo spiediena paaugstināšanos iekārtā. Testējamās vielas un standartvielas(–u) izmēģinājumus atkārto piecas reizes. Atzīmē laiku, kādā paaugstinās spiediens no 690 kPa līdz 2070 kPa virs atmosfēras spiediena. Aprēķina vidējo spiediena paaugstināšanās laiku. Dažkārt vielas var izraisīt spiediena paaugstināšanos (pārlieku augstu vai pārāk zemu), ar to oksidējošajām īpašībām nesaistītu ķīmisko reakciju dēļ. Šādos gadījumos, lai noskaidrotu reakcijas raksturu, testēšana var būt jāatkārto, celulozes vietā izmantojot inertas vielas, piemēram, diatomītu (kizelguru). 2. REZULTĀTI Spiediena paaugstināšanās laiks testējamās vielas un standartvielas(–u) izmēģinājumos. Spiediena paaugstināšanās laiks izmēģinājumos ar inertu vielu, ja tie tiek veikti. 2.1. REZULTĀTU APSTRĀDE Aprēķina vidējo spiediena paaugstināšanās laiku testējamajai vielai un standartvielai(–ām). Aprēķina vidējo spiediena paaugstināšanās laiku izmēģinājumos ar inertu vielu (ja tiek veikti). Daži rezultātu piemēri norādīti 1. tabulā. 1. tabula Rezultātu piemēri [14] Viela [13] | Vidējais spiediena paaugstināšanās laiks 1:1 maisījumam ar celulozi (m/s) | Amonija dihromāts, piesātināts ūdens šķīdums | 20800 | Kalcija nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums | 6700 | Dzelzs nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums | 4133 | Litija perhlorāts, piesātināts ūdens šķīdums | 1686 | Magnija perhlorāts, piesātināts ūdens šķīdums | 777 | Niķeļa nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums | 6250 | Slāpekļskābe, 65 % | 4767 [11] | Perhlorskābe, 50 % | 121 [11] | Perhlorskābe, 55 % | 59 | Kālija nitrāts, 30 % ūdens šķīdums | 26690 | Sudraba nitrāts, piesātināts ūdens šķīdums | – [12] | Nātrija hlorāts, 40 % ūdens šķīdums | 2555 [11] | Nātrija nitrāts, 45 % ūdens šķīdums | 4133 | Inerta viela | | Ūdens – celuloze | – [12] | 3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA 3.1. PĀRSKATS PAR TESTU Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija: - testējamās vielas identifikācija, sastāvs, tīrība u.c.; - testējamās vielas koncentrācija; - izmantotās celulozes žāvēšanas procedūra; - izmantotās celulozes ūdens saturs; - mērījumu rezultāti; - testēšanas rezultāti ar inertu vielu, ja tā veikta; - aprēķinātais vidējais spiediena paaugstināšanās laiks; - atkāpes no minētās metodes un to iemesli; - papildu informācija vai piezīmes, kas attiecas uz rezultātu interpretāciju. 3.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA [15] Testēšanas rezultātus novērtē, ņemot vērā: a) vai notiek testējamās vielas un celulozes maisījuma pašaizdegšanās; un b) vidējā spiediena paaugstināšanās laika no 690 kPa līdz 2070 kPa salīdzinājumu ar standartvielai(–ām) noteikto. Šķidrums uzskatāms par oksidētāju, ja: a) notiek vielas maisījuma ar celulozi masas attiecībā 1:1 pašaizdegšanās; vai b) vielas, kuru maisījumiem ar celulozi masas attiecībā 1:1 testējot vidējais spiediena paaugstināšanās laiks ir vienāds vai mazāks nekā 65 masas % no slāpekļskābes ūdens šķīduma un celulozes (1:1 pēc masas) maisījumam noteiktā. Lai neiegūtu šķietami pozitīvus rezultātus, rezultātu interpretācijai ņem vērā arī rezultātus, kas iegūti, vielu testējot maisījumā ar inertu vielu. 4. LITERATŪRAS SARAKSTS (1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. AN publikācijas Nr.: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999. gads, 342. epp. Tests O.2: Šķdrumu oksidēšanas tests. +++++ TIFF +++++ Spiedtvertne A spiedtvertnes korpuss B plīstoša pārraujamā diska fiksācijas ventilis C aizdedzināšanas ventilis D mīksta svina paplāksne E pārraujamais disks F īscaurule G spiediena devēja stiprinājums H paplāksne J izolētais elektrods K iezemētais elektrods L izolācija M tērauda konuss N paplāksni deformējošā rieva +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ A aizdedzināšanas spirāle B izolācija C elektrodi D aizdedzināšanas ventilis Piezīme. Var izmantot jebkuru no abām konfigurācijām. [1] Piemēram, ANO transporta noteikumu programmā. [2] Skābe pirms testēšanas jātitrē, lai apstiprinātu tās koncentrāciju. [3] Piemēram, ANO transporta noteikumu programmā. [4] Piemēram, 1. norādē izmantoti 50 masas % perhlorskābes un 40 masas % nātrija hlorāta šķīdumi. [5] Piemēram, Vatmaņa celulozes pulveris kolonnu hromatogrāfijai CF 11, kataloga nr. 4021 050. [6] Apstiprina, piemēram, titrējot pēc Fišera metodes. [7] Šādu ūdens saturu var panākt arī, piemēram, 24 h karsējot 105 °C temperatūrā vakuumā. [8] Oksidētāju maisījumi ar celulozi jāuzskata par potenciāli sprādzienbīstamiem, un ar tiem jāstrādā, ievērojot attiecīgus piesardzības pasākumus. [9] Praktiski to var izdarīt, sagatavojot testējamā šķidruma 1:1 maisījumu ar celulozi lielākā daudzumā, nekā izmēģinājumiem vajadzīgs, un pārnesot 5 ± 0,1 g spiedtvertnē. Katram izmēģinājumam jāsagatavo jauns maisījums. [10] Jo īpaši nedrīkst saskarties spirāles blakus vijumi. [11] Starplaboratoriju salīdzinošajā izmēģinājumā noteiktā vidējā vērtība [12] Maksimālais spiediens of 2070 kPa nav sasniegts [13] Piesātinātie šķīdumi jāpagatavo 20 °C [14] Klasifikācijai pēc ANO transporta shēmas sk. 1. norādi [15] Izmantojot vairākas standartvielas, par rezultātu interpretāciju saskaņā ar ANO transporta noteikumiem sk. 1. norādē. -------------------------------------------------- 2.B PIELIKUMS B.1. bis AKŪTAIS PERORĀLAIS TOKSISKUMS – FIKSĒTĀS DEVAS METODE 1. METODE Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO 420. (2001) vadlīnijā noteiktajai metodei. 1.1. IEVADS Akūtā toksiskuma novērtēšanas tradicionālajās metodēs par beigu punktu izmanto dzīvnieku nobeigšanos. Jaunu pieeju akūtā toksiskuma noteikšanai, kuras pamatā ir vairāku fiksētu devu ievadīšana, 1984. gadā ieteica Britu Toksikoloģijas biedrība (1). Saskaņā ar šo pieeju izvairās par beigu punktu izmantot dzīvnieku nobeigšanos, tās vietā novērojot vairāku fiksētu devu toksiskuma pazīmes. Pēc Apvienotajā Karalistē (2) un starptautiski (3) in vivo veiktajiem validācijas pētījumiem šī procedūra 1992. gadā tika pieņemta par testa metodi. Tādejādi, izmantojot matemātiskos modeļus, fiksēto devu procedūras statistiskie raksturlielumi vēlāk tika novērtēti vairākos pētījumos (4), (5), (6). Modelēšanas pētījumi un in vivo pētījumi uzskatāmi parādījuši, ka procedūra ir reproducējama, tai jāizmanto mazāk dzīvnieku, izraisa mazāk ciešanu nekā tradicionālās metodes un nodrošina iespējas novērtēt vielas līdzvērtīgā veidā kā ar citām akūtā toksiskuma testa metodēm. Norādījumi par katrā konkrētā gadījumā piemērotāko testa metodi atrodami pamatnostādnēs par akūtā perorālā toksiskuma testēšanu Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (7). Šajās pamatnostādnēs ir arī papildu informācija par testa metodes B.1. bis veikšanu un pēc tās iegūto rezultātu interpretāciju. Saskaņā ar metodes principu galvenajos pētījumos izmanto tikai mēreni toksiskas devas, un jāizvairās lietot tādas devas, kurām varētu būt letāla iedarbība. Tāpat nav jāievada devas, par kurām ir zināms, ka tās izraisa izteiktas sāpju un briesmu sajūtas kodīgo vai stipri kairinošo īpašību dēļ. Bojā ejoši dzīvnieki, kā arī dzīvnieki, kas acīmredzami cieš sāpes vai pārdzīvo stipras un ilgstošas briesmu sajūtas, ir humāni jānonāvē, un interpretējot testa rezultātus, tie jāņem vērā tieši tāpat kā testos nobeigušies dzīvnieki. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu nonāvēt bojā ejošus dzīvniekus vai dzīvniekus, kuriem ir smagas ciešanas, kā arī norādījumi par paredzamu vai neizbēgamu nobeigšanos norādīti citās pamatnostādnēs (8). Metode sniedz informāciju par bīstamajām īpašībām un dod iespējas novērtēt un klasificēt vielas ar akūti toksisku iedarbību saskaņā ar Vispārējo saskaņoto ķīmisko vielu klasifikācijas sistēmu (VSS) (9). Pirms uzsākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra; fizikāli ķīmiskās īpašības; citu in vitro vai in vivo veikto testu rezultāti; toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā saistītām vielām; vielas paredzamo izmantošanas veidu(–iem). Šī informācija ir vajadzīga, lai nodrošinātu, ka testi tiek veikti cilvēku veselības aizsardzībai piemērotā veidā un tiek pareizi izraudzīta sākotnējā deva. 1.2. DEFINĪCIJAS Akūts perorāls toksiskums – attiecas uz to kaitīgo iedarbību, kāda ir 24 stundu laikā pēc vienas vai vairāku vielas devu ievadīšanas caur muti. Aizkavēta nāve – ir tad, ja dzīvnieks 48 stundu laikā nav nobeidzies vai neizbēgami nav gājis bojā, bet krīt vēlāk 14 dienu novērošanas perioda laikā. Deva – ievadītās testējamās vielas daudzums. Devu izsaka testējamās vielas svara veidā uz testa dzīvnieka svara vienību (piemēram, mg/kg). Izteikts toksiskums – ir vispārīgs termins, ar ko raksturo acīmredzamas toksiskas iedarbības pazīmes pēc testējamo vielu ievadīšanas (piemēram, sk. 3. norādi), un nākamās lielākās devas iedarbībā var sagaidīt izmēģinājuma dzīvnieku lielākās daļas nobeigšanos, izraisot stipras sāpes vai smagas un ilgstošas ciešanas (kritēriji noteikti Humane Endpoints Guidance Document (8)). VSS – Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu un maisījumu klasifikācijas sistēma. Kopīgs ESAO (cilvēku veselības un vides aizsardzība), ANO Bīstamo kravu pārvadājumu ekspertu komitejas (fizikāli ķīmiskās īpašības) un ILO – Starptautiskās darba organizācijas (kaitīguma paziņošana) pasākums, ko koordinē Ķīmisko vielu drošas apsaimniekošanas starporganizāciju programma (IOMC). Neizbēgama nāve – ir, ja miršana vai nāves iestāšanās sagaidāma pirms nākamā plānotā novērojumu laika. Pazīmes, kas liecina par šā stāvokļa iestāšanos grauzējiem var būt konvulsijas, gulēšana uz sāniem vai augšpēdus un drebēšana. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (8)). LD50 (vidējā letālā deva) – ir statistiski noteikta vielas deva, kas, ievadot perorāli, var izraisīt 50 % dzīvnieku nobeigšanos. LD50 vērtību izsaka kā testējamās vielas svaru uz testa dzīvnieka svara vienību (mg/kg). Robeždeva – attiecas uz devas augšējo ierobežojumu testā (2000 vai 5000 mg/kg). Mirstošs – atrašanās stāvoklī, kad mirst vai nav iespēju izdzīvot, arī saņemot ārstēšanu. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (8)). Prognozējama nāve – klīniskās pazīmes, kas liecina par nāves iestāšanos pēc zināma laika, nesagaidot eksperimenta plānotās beigas, piemēram – nespēja sasniegt ūdeni vai barību. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (8)). 1.3. TESTA METODES PRINCIPS Viena dzimuma dzīvnieku grupām dod pakāpeniski palielinātas fiksētas devas 5, 50, 300 un 2000 mg/kg (izņēmuma gadījumos var izmantot papildu fiksētu devu 5000 mg/kg, sk. 1.6.2. punktā) Sākotnējās devas līmeni izraugās pēc devu diapazona pētījumiem kā devu, kas var izraisīt toksiskas iedarbības pazīmes, bet kas nav stipri toksiska un neizraisa nobeigšanos. Klīniskās pazīmes un stāvokļi, kas saistīti ar sāpēm, ciešanām un neizbēgamu nāvi, sīki aprakstīti ESAO pamatnostādnēS (8). Atkarībā no toksiskuma pazīmēm vai mirstības papildu dzīvnieku grupām var ievadīt par to augstākas vai zemākas fiksētas devas. Šo procedūru turpina, līdz fiksētā deva izraisa izteiktas toksiskuma pazīmes, tiek konstatēts ne vairāk kā viens nobeigšanās gadījums, augstākajai devai netiek konstatētas toksiskas iedarbības pazīmes vai notiek nobeigšanās zemākās devas iedarbībā. 1.4. TESTA METODES APRAKSTS 1.4.1. Dzīvnieku sugu izvēle Ieteicamākā grauzēju suga ir žurkas, kaut arī var izmanot citas grauzēju sugas. Parasti izmanto sievišķā dzimuma īpatņus (7). Tas tāpēc, ka parasto LD50 testu literatūras pārskati liecina, ka abu dzimumu jutība daudz neatšķiras, taču gadījumos, kad tā ir atšķirīga, sievišķā dzimuma īpatņi ir nedaudz jutīgākI (10). Tomēr, ja dati par struktūras ziņā līdzvērtīgu vielu toksikoloģiskajām un toksikokinētiskajām īpašībām liecina, ka uz testējamās vielas iedarbību tēviņi varētu būt jutīgāki, testi jāveic ar vīrišķā dzimuma īpatņiem. Ja testus veic ar vīrišķā dzimuma īpatņiem, tas ir jāpamato. Jāizmanto jauni, veseli, pieauguši parasti izmantojamo laboratorijas līniju dzīvnieki. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Visiem testa dzīvniekiem testēšanas sākumā jābūt 8 līdz 12 nedēļas veciem un to svaram jābūt ± 20 % no testiem iepriekš izmantoto dzīvnieku vidējā svara. 1.4.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 °C (± 3 °C) temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50 – 60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Dzīvniekus būros var turēt grupās atbilstoši devai, bet to skaits vienā būrī nedrīkst apgrūtināt katra dzīvnieka novērošanu. 1.4.3. Dzīvnieku sagatavošana Veselus, pieaugušus, jaunus dzīvniekus izvēlas izlases veidā, marķē individuālai identificēšanai un tur būros vismaz 5 dienas pirms devu ievadīšanas sākuma, lai aklimatizētu laboratorijas apstākļiem. 1.4.4. Devu sagatavošana Parasti testējamās vielas jāievada visām pārbaudāmajām devām vienādā tilpumā, mainot ievadāmā preparāta koncentrāciju. Taču, ja jātestē gala produkts, kas ir šķidrums vai maisījums, vielas bīstamības novērtēšanai tā var būt jāizmanto neatšķaidītā testējamās vielas veidā, t.i., ar nemainīgu koncentrāciju, un tā ir arī dažu reglamentējošo iestāžu prasība. Jebkurā gadījumā nedrīkst pārsniegt ievadāmās devas maksimālo tilpumu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Grauzējiem šis tilpums parasti nedrīkst pārsniegt 1ml/100 g ķermeņa svara; tomēr ūdens šķīdumu gadījumā var ievadīt līdz 2 ml/100 g ķermeņa svara. Ņemot vērā ievadāmā preparāta sastāvu, vienmēr kad iespējams, ieteicams izmantot šķīdumu/suspensiju/emulsiju ūdenī, ja nē, tad šķīdumu/suspensiju/emulsiju eļļā (piemēram, kukurūzas eļļā), un tikai pēc tam šķīdumu citos nesējos. Ja par nesēju neizmanto ūdeni, jānoskaidro tā toksikoloģiskās īpašības. Ja nav datu par preparāta pietiekamu stabilitāti visā tā lietošanas laikā, devas jāsagatavo neilgi pirms ievadīšanas. 1.5. PROCEDŪRA 1.5.1. Devu ievadīšana Testējamo vielu dzīvniekiem ievada vienā devā, mākslīgi barojot, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Ja kādu apstākļu dēļ ievadīt vienā devā nav iespējams, to var dot mazākās daļās laika posmā, kas nepārsniedz 24 stundas. Pirms ievadīšanas dzīvniekus nedrīkst barot (piemēram, žurkas pārstāj barot iepriekšējā dienā, dodot tikai dzert ūdeni; peles nebaro 3 – 4 stundas iepriekš, dodot dzert tikai ūdeni). Pirms ievada testējamo vielu pēc nebarošanas perioda, dzīvnieki ir jānosver. Pēc testējamās vielas ievadīšanas žurkas var nebarot vēl 3 – 4 stundas, bet peles – 1 – 2 stundas. Ja devu ievada pa daļām ilgākā laika posmā, var būt nepieciešams dzīvniekiem dot barību un ūdeni atkarībā no šā laika posma ilguma. 1.5.2. Devu diapazona pētījums Devu diapazona pētījuma mērķis ir noteikt galvenajā pētījumā izmantojamo sākotnējo devu. Testējamo vielu atsevišķiem dzīvniekiem ievada pēc 1. pielikumā noteiktajām diagrammām. Devu diapazona pētījumu beidz, kad var pieņemt lēmumu par galvenajā pētījumā izmantojamo sākotnējo devu (vai kad pie mazākās fiksētās devas tiek konstatēta dzīvnieku nobeigšanās). Devu diapazona pētījumam attiecībā uz sākotnējo devu izraugās no fiksēto līmeņu devām 5, 50, 300 un 2000 mg/kg to devu, kurai paredzams izteikts toksiskums, par ko iespējams ir pierādījumi par tās pašas vielas vai struktūras ziņā līdzvērtīgu vielu in vitro un in vivo testu rezultātiem. Ja šādas informācijas nav, par sākotnējo devu izmanto 300 mg/kg. Katram dzīvniekam vielas ievadīšanas starplaikam jābūt vismaz 24 stundām. Visi dzīvnieki jānovēro vismaz 14 dienas. Augšējo devu 5000 mg/kg var izmantot tikai izņēmuma gadījumos, kad tā ir pamatota ar īpašām reglamentējošām prasībām (sk. 3. pielikumu). Pamatojoties ar dzīvnieku labturības apsvērumiem nav ieteicams testēt dzīvniekus ar VSS 5. kategorijas devām (2000 – 5000 mg/kg), un tās jātestē tikai tādos gadījumos, kad ir lielas iespējas, ka šādu testu rezultāti ir ļoti nepieciešami cilvēku vai dzīvnieku veselības vai vides aizsardzībai. Gadījumos, kad devu diapazona pētījumā nobeidzas dzīvnieks, kuram pārbaudīta mazākās fiksētās devas (5 mg/kg) iedarbība, parasti pētījumu izbeidz un attiecīgo vielu klasificē VSS 1. kategorijā (kā norādīts 1. pielikumā). Tomēr, ja ir nepieciešams precīzāks klasifikācijas apstiprinājums, papildus var veikt šādu fakultatīvu procedūru. Devu 5 mg/kg ievada vēl otram dzīvniekam. Ja arī šis otrs dzīvnieks nobeidzas, VSS 1. kategorija tiek apstiprināta, un pētījumi nekavējoties jāizbeidz. Ja šis otrais dzīvnieks nenobeidzas, devu 5 mg/kg ievada vēl ne vairāk kā trijiem dzīvniekiem. Tā kā ir augsts mirstības risks, ievērojot labturības apsvērumus, šiem dzīvniekiem devu ievada noteiktā secībā. Starplaikam, pēc kāda vielu ievada nākamajam dzīvniekam, ir jābūt pietiekami ilgam, lai varētu konstatēt, ka iepriekšējais dzīvnieks varētu izdzīvot. Ja tiek konstatēts otrs bojāejas gadījums, devu ievadīšanas noteikto secību nekavējoties pārtrauc un deva nevienam dzīvniekam vairāk nav ievadāma. Pēc otrā bojāejas gadījuma (neatkarīgi no dzīvnieku skaita, ar kuriem izdarīti testi testēšanas izbeigšanas laikā) tiek noteikts A rezultāts (2 vai vairāki bojāejas gadījumi), un tiek ievērots 2. pielikumā noteiktais klasifikācijas noteikums par 5 mg/kg fiksēto devu (1. kategorija, ja ir 2 vai vairāki bojāejas gadījumi vai 2. kategorija, ja tiek konstatēts ne vairāk kā viens bojāejas gadījums). Turklāt 4. pielikumā ir norādījumi par klasifikāciju ES sistēmā līdz laikam, kamēr tiek ieviesta jaunā VSS sistēma. 1.5.3. Galvenais pētījums 1.5.3.1. Dzīvnieku skaits un devu līmeņi Lēmumi, kas jāpieņem pēc testiem ar sākotnējo devu, ir norādīti diagrammās 2. pielikumā. Jāpieņem kāds no trijiem lēmumiem – testēšanu pārtraukt un piešķirt atbilstošu bīstamības klasi, veikt testus ar augstāko fiksēto devu, vai arī ar zemāko fiksēto devu. Tomēr, pamatojoties uz apsvērumiem, kas saistīti ar dzīvnieku aizsardzību, nav jātestē devu līmenis, kas devu diapazona pētījumā ir izraisījis dzīvnieku nobeigšanos (sk. 2. pielikumu). Līdzšinējā pieredze liecina, ka ticamākais sākotnējās devas testu rezultāts ir tāds, ka vielu iespējams klasificēt bez jebkādiem papildu testiem. Katra līmeņa devu testēšanai parasti izmanto pavisam piecus viena dzimuma dzīvniekus. Šo piecu dzīvnieku grupu izvēlas, izmantojot vienu dzīvnieku no devu diapazona pētījuma, kam ievadīta izraudzītā līmeņa deva un papildus vēl četriem dzīvniekiem (izņemot gadījumus, kad galvenajā pētījumā izmantotais devu līmenis nav bijis iekļauts devu diapazona pētījumā, taču parasti tā nav). Vielas ievadīšanas reižu starplaiku katram devu līmenim nosaka atkarībā no toksiskuma pazīmju parādīšanās, ilguma un smaguma. Vielas nākamās devas ievadīšana ir jāatliek līdz laikam, kamēr rodas pārliecība par iepriekš devu saņēmušo dzīvnieku izdzīvošanu. Ja vajadzīgs, lai novērotu aizkavētu toksisko iedarbību, ieteicams ievērot 3 līdz 4 dienu starplaiku katrai devu līmeņa ievadīšanai. Starplaiku var koriģēt pēc vajadzības, piemēram, gadījumos, kad atbildes reakcija uz vielas iedarbību nav pārliecinoša. Ja tiek pieņemts lēmums izmantot augstāko fiksēto devu 5000 mg/kg, jāievēro 3. pielikumā noteiktā procedūra (sk. arī 1.6.2. punktu). 1.5.3.2. Pieļaujamības tests Pieļaujamības testu galvenokārt izmanto gadījumos, kad eksperimenta veicēja rīcībā ir informācija, kas liecina, ka vielai iespējams nav toksiskas iedarbības, t.i., tā ir toksiska tikai devās, kas ierobežotas ar reglamentējošām pieļaujamības devām. Informāciju par testējamās vielas toksiskumu var iegūt pēc testu datiem ar līdzīgiem maisījumiem vai produktiem, ņemot vērā identitāti un to komponentu īpatsvaru, kuru toksiskums ir zināms. Šādās situācijās, kad nav informācijas par toksiskumu vai tā ir nepietiekama, vai arī sagaidāms, ka testējamā viela varētu būt toksiska, ir jāveic galvenais tests. Izmantojot parasto procedūru, devu diapazona pētījuma sākotnējo devu 2000 mg/kg (vai izņēmuma gadījumā 5000 mg/kg) ievada papildus četriem dzīvniekiem, ko izmanto pieļaujamības testam saskaņā ar šiem norādījumiem. 1.6. NOVĒROJUMI Pēc ievadīšanas pirmo 30 minūšu laikā dzīvniekus individuāli novēro vismaz vienreiz, pirmo 24 stundu laikā periodiski, īpašu uzmanību veltot pirmajām 4 stundām un pēc tam reizi dienā, pavisam 14 dienas, izņemot gadījumus, kad tie gājuši bojā vai pētījumi jāizbeidz, dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ tos humāni nonāvējot. Tomēr novērošanas ilgums nav stingri jānosaka. Tas jānosaka pēc toksiskuma reakcijām, to parādīšanās laika un atveseļošanās ilguma, un tādēļ novērojumu ilgumu var pagarināt, ja ir vajadzīgs. Laiki, kad parādās un izzūd toksiskuma pazīmes, ir svarīgi, īpaši ja tām ir tendence aizkavēties (11). Visus novērojumus regulāri reģistrē, par katru dzīvnieku izdarot individuālus reģistrus. Ja dzīvnieki turpina uzrādīt toksiskas iedarbības pazīmes, ir vajadzīgi papildu novērojumi. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar to ādu un apmatojumu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Uzmanība jāpievērš drebuļu, krampju, siekalošanās, caurejas, letarģijas, miega un komas novērojumiem. Jāņem vērā principi un kritēriji, kas apkopoti Humane Endpoints Guidance Document (8). Visi mirstošie dzīvnieki un dzīvnieki, kas izrāda lielu sāpju un ilgstošu briesmu sajūtu pazīmes, ir humāni jānonāvē. Ja dzīvnieki ir nonāvēti humānu apsvērumu dēļ vai atrasti nobeigušies, iespējami precīzi jāreģistrē nāves iestāšanās laiks. 1.6.1. Ķermeņa svars Visi dzīvnieki jānosver neilgi pirms testējamās vielas ievadīšanas, un pēc tam vismaz reizi nedēļā. Svara izmaiņas ir jāaprēķina un jāreģistrē. Testu beigās izdzīvojušos dzīvniekus nosver, tad humāni nonāvē. 1.6.2. Patoloģija Visus testa dzīvniekus (arī tos, kas testa laikā nobeigušies vai ar kuriem dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ pētījumi izbeigti), ir jāizdara pilna autopsija. Visas makroskopiskās patoloģiskās izmaiņas jāreģistrē par katru dzīvnieku. Var apsvērt arī orgānu, kuros parādās makroskopiskās patoloģijas pierādījumi, mikroskopisko izmeklēšanu dzīvniekiem, kas pēc sākotnējās devas izdzīvojuši 24 stundas vai ilgāk, jo tāda apskate var sniegt noderīgu informāciju. 2. DATI Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati ir jāapkopo tabulas veidā, norādot dzīvnieku skaitu, kas izmantots katrā testa grupā, dzīvnieku skaitu, kuriem parādījušās toksiskuma pazīmes, dzīvnieku skaitu, kuri testa laikā atrasti nobeigušies vai nonāvēti humānu apsvērumu dēļ, atsevišķo dzīvnieku nobeigšanās laiku, toksiskās iedarbības veidu un to atgriezeniskuma aprakstu un gaitu, kā arī autopsijā iegūtos novērojumus. 3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA 3.1. PĀRSKATS PAR TESTU Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija. Testējamā viela: - fizikālās īpašības, tīrība, un attiecīgos gadījumos arī fizikāli ķīmiskās īpašības (tostarp izomerizācija); - identifikācijas dati, tostarp CAS numuru. Nesējs (ja vajadzīgs): - nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens. Testa dzīvnieki: - izmantotā suga/līnija; - dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms; - dzīvnieku skaits, vecums un dzimums (tostarp, ja vajadzīgs, vīrišķā dzimuma īpatņu izmantošanu sievišķā dzimuma īpatņu vietā); - izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u.c.; Testu apstākļi: - sīkas ziņas par testējamās vielas preparātu, tostarp dati par ievadītā materiāla fizikālo formu; - sīkas ziņas par testējamās vielas ievadīšanu, iekļaujot dozēšanas tilpumus un dozēšanas laikus; - sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot veidu/izcelsmi, ūdens avotu); - sākotnējās devas izvēles pamatojums. Rezultāti: - datu tabula par atbildes reakcijām un devu līmeņiem (t.i., dzīvniekiem, kas uzrādījuši toksiskuma pazīmes, tostarp nobeigšanās gadījumus, iedarbības veidu, smagumu un ilgumu); - datu tabula par ķermeņa svaru un ķermeņa svara izmaiņām; - katra dzīvnieka svars ievadīšanas dienā un pēc tam ar nedēļas starplaikiem, kā arī nobeigšanās vai nonāvēšanas laikā; - nobeigšanās datums un laiks, ja tā notikusi pirms paredzētās nonāvēšanas; - toksiskuma pazīmju parādīšanās gaita katram dzīvniekam, un vai tās ir bijušas atgriezeniskas; - katra dzīvnieka autopsijas konstatācijas un histopatoloģiskās konstatācijas, ja tās pieejamas. Rezultātu apspriešana un interpretācija. Secinājumi. 4. LITERATŪRAS SARAKSTS (1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85–92. (2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279–291. (3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Felling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed–dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469–482. (4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed–dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313–324. (5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed–dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315–323. Human Exptl. Toxicol. (6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183–196. (7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. (8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19. (9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN–documents–521–14–no–24–no–0,FF.html]. (10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P, Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up–and–Down, Conventional LD50, and Fixed–Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231. (11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA. -------------------------------------------------- 2.C PIELIKUMS "B1.tris . AKŪTS PERORĀLS TOKSISKUMS – AKŪTA TOKISKUMA KLASES METODE 1. METODE Šī testa metode ir līdzvērtīga ESAO 423. (2001) vadlīnijā noteiktajai metodei. 1.1. IEVADS Šajā testā norādītā akūtā toksiskuma klases noteikšanas metode (1) ir posmveida procedūra, kuras katrā posmā izmanto 3 viena dzimuma dzīvniekus. Atkarībā no dzīvnieku mirstības un/vai mirstošo dzīvnieku skaita testējamās vielas akūtā toksiskuma noteikšanai vidēji var būt vajadzīgi 2 – 4 posmi. Šī procedūra ir reproducējama, tajā izmanto ļoti nelielu skaitu dzīvnieku, un pēc tās iespējams vielas klasificēt līdzvērtīgi kā pēc citām akūtā toksiskuma noteikšanas metodēm. Akūtā toksiskuma klases noteikšanas metodes pamatā ir biometriski novērtējumi (2), (3), (4), (5) ar fiksētām devām, kas ir atbilstoši atdalītas tā, lai vielu varētu novērtēt gan klasifikācijas vajadzībām, gan bīstamības noteikšanai. Kopš tās pieņemšanas 1996. gadā metode plaši in vivo validēta gan valstu līmenī (6), gan starptautiski (7) salīdzinājumā ar datiem, kas iegūti no literatūras. Norādījumi par katrā konkrētā gadījumā piemērotāko testa metodi atrodami pamatnostādnēs par akūtā perorālā toksiskuma testēšanu Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing (8). Šajās pamatnostādnēs ir arī papildu informācija par testēšanas metodes B.1. tris veikšanu un pēc tās iegūto rezultātu interpretāciju. Testējamās vielas devās, par kurām ir zināms, ka tās izraisa izteiktas sāpju un briesmu sajūtas kodīgo vai stipri kairinošo īpašību dēļ, nav jāievada. Bojā ejoši dzīvnieki, kā arī dzīvnieki, kas acīmredzami cieš sāpes vai pārdzīvo stipras un ilgstošas briesmu sajūtas, ir humāni jānonāvē, un interpretējot testēšanas rezultātus, tie jāņem vērā tieši tāpat kā testos nobeigušies dzīvnieki. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu nonāvēt bojā ejošus dzīvniekus vai dzīvniekus, kuriem ir smagas ciešanas, kā arī norādījumi par paredzamu vai neizbēgamu nobeigšanos doti citās atsevišķās pamatnostādnēs (9). Metodē izmanto iepriekš noteiktas fiksētas devas, un pēc tās iegūtie rezultāti dod iespējas vielas ar akūti toksisku iedarbību novērtēt un klasificēt saskaņā ar Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu klasifikācija (10). Šī metode principā nav paredzēta precīzai LD50 aprēķināšanai, bet ļauj noteikt iedarbības diapazonu, kurā ir sagaidāms letāls iznākums, jo šā testa galvenais beigu punkts ir kādas testa dzīvnieku daļas nobeigšanās. Pēc šīs metodes LD50 vērtību var noteikt tikai tādos gadījumos, kad vismaz divas devas izraisa nobeigšanos, kas ir augstāka nekā 0 % un zemāka nekā 100 %. Izmantojot iepriekš noteiktas devas, kas nav atkarīgas no konkrētās testējamās vielas, tās klasifikāciju tieši saistot ar dažādos stāvokļos novēroto dzīvnieku skaitu, uzlabo dažādās laboratorijās iegūto rezultātu atbilstību un atkārtojamību. Pirms sākt pētījumus, testēšanas laboratorijai jāņem vērā visa par testējamo vielu pieejamā informācija. Pie šādas informācijas pieder tās identifikācija un ķīmiskā struktūra; fizikāli ķīmiskās īpašības; citu in vitro vai in vivo veikto toksiskuma testu rezultāti; toksikoloģiskie dati par struktūras ziņā līdzīgām vielām; vielas paredzamais izmantošanas veids(–i). Šī informācija ir vajadzīga, lai nodrošinātu, ka testi tiek veikti cilvēku veselības aizsardzībai piemērotā veidā un tiek pareizi izraudzīta sākotnējā deva. 1.2. DEFINĪCIJAS Akūts perorāls toksiskums – ir kaitīgā iedarbība, kāda ir 24 stundu laikā pēc vienas vai vairāku vielas devu ievadīšanas caur muti. Aizkavēta nāve – ir tad, ja dzīvnieks 48 stundu laikā nav nobeidzies vai neizbēgami nav gājis bojā, bet nobeidzas vēlāk 14 dienu novērošanas perioda laikā. Deva – ir ievadītās testējamās vielas daudzums. Devu izsaka testējamās vielas svara veidā uz testa dzīvnieka svara vienību (piemēram, mg/kg). VSS – Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu un maisījumu klasifikācijas sistēma. Kopīgs ESAO (veselības un vides aizsardzība), ANO Bīstamo kravu pārvadājumu ekspertu komitejas (fizikāli ķīmiskās īpašības) un ILO – Starptautiskās darba organizācijas (kaitīguma paziņošana) pasākums, ko koordinē Ķīmisko vielu drošas apsaimniekošanas starporganizāciju programma (IOMC). Neizbēgama nāve – ir tad, ja miršana vai nāves iestāšanās sagaidāma pirms nākamā plānotā novērojumu laika. Pazīmes, kas liecina par šā stāvokļa iestāšanos grauzējiem var būt konvulsijas, gulēšana uz sāniem vai augšpēdus un drebēšana. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (9)). LD50 (vidējā letālā deva) – ir statistiski noteikta vielas deva, kas, ievadot perorāli, var izraisīt 50 % dzīvnieku nobeigšanos. LD50 vērtību izsaka kā testējamās vielas svaru uz testa dzīvnieku svara vienību (mg/kg). Robeždeva – attiecas uz devas augšējo ierobežojumu testā (2000 vai 5000 mg/kg). Mirstošs – atrašanās stāvoklī, kad mirst, vai nav iespēju izdzīvot arī saņemot ārstēšanu. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (9)). Prognozējama nāve – ir klīniskās pazīmes, kas liecina par nāves iestāšanos pēc zināma laika, nesagaidot eksperimenta plānotās beigas, piemēram, nespēja sasniegt ūdeni vai barību. (Sīkāk sk. Humane Endpoint Guidance Document (9)). 1.3. METODES PRINCIPS Metodes princips ir tāds, ka pamatojoties uz posmveida procedūru, kuras katrā posmā izmanto minimālu skaitu dzīvnieku, tiek iegūta klasifikācijai pietiekama informācija par testējamās vielas akūto toksiskumu. Vielu izmēģinājuma dzīvnieku grupai ievada perorāli vienā no noteiktajām devām. Vielu testē, izmantojot posmveida procedūru, katrā posmā izmanto trīs viena (parasti sievišķā) dzimuma dzīvniekus. Ar vielu saistīta testa dzīvnieku bojāeja vai tās neesamība nosaka nākamo posmu, t.i.: - turpmāka testēšana nav vajadzīga, - to pašu devu ievada vēl trijiem dzīvniekiem, - vēl trijiem dzīvniekiem ievada nākamo augstāko vai zemāko devu. Testa procedūra sīkāk aprakstīta I pielikumā. Metode dod iespējas testējamo vielu novērtēt, to klasificējot kādā no toksiskuma klasēm, kas noteiktas pēc fiksētām LD50 robežvērtībām. 1.4. METODES APRAKSTS 1.4.1. Dzīvnieku sugu izvēle Ieteicamākā grauzēju suga ir žurkas, lai gan var izmanot arī citas grauzēju sugas. Parasti izmanto sieviešu dzimuma īpatņus (9). Tas tāpēc, ka parasto LD50 testu literatūras apskati liecina, ka abu dzimumu jutība daudz neatšķiras, taču gadījumos, kad tā ir atšķirīga, sieviešu dzimuma īpatņi parasti ir nedaudz jutīgāki (11). Tomēr, ja dati par struktūras ziņā līdzīgu vielu toksikoloģiskajām un toksikokinētiskajām īpašībām liecina, ka uz testējamās vielas iedarbību tēviņi varētu būt jutīgāki, tests jāveic ar vīriešu dzimuma īpatņiem. Ja testu veic ar vīrišķā dzimuma īpatņiem, tas ir jāpamato. Ir jāizmanto jauni, veseli, pieauguši parasti izmantojamo laboratorijas līniju dzīvnieki. Mātītes nedrīkst būt iepriekš dzemdējušas vai grūsnas. Visiem testa dzīvniekiem testēšanas sākumā jābūt 8 līdz 12 nedēļas veciem un to ķermeņa svaram jābūt ± 20 % no testiem iepriekš izmantoto dzīvnieku vidējā svara. 1.4.2. Turēšanas un barošanas nosacījumi Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, jābūt 22 °C (± 3 °C) temperatūrai. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50 – 60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu dzeramā ūdens piegādi. Dzīvniekus būros var turēt grupās atbilstoši devai, bet to skaits vienā būrī nedrīkst apgrūtināt katra dzīvnieka novērošanu. 1.4.3. Dzīvnieku sagatavošana Veselus, pieaugušus, jaunus dzīvniekus izvēlas izlases veidā, marķē individuālai identificēšanai un tur būros vismaz 5 dienas pirms izmēģinājuma sākuma, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos. 1.4.4. Devu sagatavošana Parasti testējamās vielas jāievada visām pārbaudāmajām devām vienādā tilpumā, mainot ievadāmā preparāta koncentrāciju. Taču, ja jātestē gala produkts, kas ir šķidrums vai maisījums, vielas bīstamības novērtēšanai tā var būt jāizmanto neatšķaidītā veidā, t.i., ar nemainīgu koncentrāciju, un tā ir arī dažu reglamentējošo iestāžu prasība. Jebkurā gadījumā nedrīkst pārsniegt ievadāmo devas maksimālo tilpumu. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Žurkām tas parasti nedrīkst pārsniegt 1ml/100 g ķermeņa svara; tomēr ūdens šķīdumus var ievadīt līdz 2 ml/100 g ķermeņa svara. Ņemot vērā ievadāmā preparāta sastāvu, vienmēr, kad iespējams, ieteicams izmantot šķīdumu/suspensiju/emulsiju ūdenī, ja nē, tad šķīdumu/suspensiju/emulsiju eļļā (piemēram, kukurūzas eļļā), un tikai pēc tam šķīdumu citos nesējos. Ja nesējs nav ūdens, jānoskaidro tā toksiskās īpašības. Ja nav datu par preparāta pietiekamu stabilitāti visā tā lietošanas laikā, devas jāsagatavo neilgi pirms ievadīšanas. 1.5. PROCEDŪRA 1.5.1. Devu ievadīšana Testējamo vielu dzīvniekiem ievada vienā devā, mākslīgi barojot, izmantojot kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas kanulu. Ja kādu apstākļu dēļ ievadīt vienā devā nav iespējams, to var dot mazākās daļās laika posmā, kas nepārsniedz 24 stundas. Dzīvniekus pirms devu ievadīšanas nebaro (piemēram, žurkas pārtrauc barot iepriekšējā dienā, dodot tikai dzert, bet peles – 3 – 4 stundas pirms devu ievadīšanas). Pirms ievadīt testējamo vielu pēc nebarošanas perioda, dzīvnieki ir jānosver. Pēc testējamās vielas ievadīšanas žurkas var nebarot vēl 3 – 4 stundas, bet peles – 1 – 2 stundas. Ja vielas devu ievada pa daļām kādā laika posmā, atkarībā no tā ilguma var gadīties, ka dzīvnieki ir jānodrošina ar barību un ūdeni. 1.5.2. Dzīvnieku skaits un devu līmeņi Katrā posmā izmato trīs dzīvniekus. Devas līmeni, ko izmanto par sākotnējo devu, izvēlas kā vienu no četriem noteiktiem līmeņiem, t.i., 5, 50, 300 un 2000 mg/kg ķermeņa svara. Sākotnējam devas līmenim jābūt tādam, kas ar lielu varbūtību varētu izraisīt vismaz dažu devu saņēmušo dzīvnieku bojāeju. Diagrammās 1. pielikumā norādīta procedūra, kas jāievēro atkarībā no sākotnējās devas. Papildus 4. pielikumā ir norādījumi par klasifikāciju ES sistēmā līdz laikam, kamēr tiek ieviesta jaunā VSS sistēma. Ja pieejamā informācija liek domāt, ka pie lielākā sākotnējās devas līmeņa (2000 mg/kg ķermeņa svara) mirstība ir mazticama, tad ir jāizdara pieļaujamības tests. Ja par testējamo vielu nav informācijas, dzīvnieku labturības dēļ ir ieteicams izmantot sākotnējo devu 300 mg/kg ķermeņa svara. Laika intervālu starp vielas atkārtotu ievadīšanu izmēģinājumu dzīvnieku grupām nosaka atkarībā no toksiskuma pazīmju parādīšanās, ilguma un smaguma. Vielas nākamās devas ievadīšana ir jāatliek līdz laikam, kamēr rodas pārliecība par iepriekš devu saņēmušo dzīvnieku izdzīvošanu. Augšējo devu 5000 mg/kg ķermeņa svara var izmantot tikai izņēmuma gadījumos, kad tā ir pamatota ar īpašām reglamentējošām prasībām (sk. 2. pielikumu). Pamatojoties ar dzīvnieku labturības apsvērumiem nav ieteicams ar dzīvniekiem izmēģināt VSS 5. kategorijas devas (2000 – 5000 mg/kg), un tās jātestē tikai tādos gadījumos, ja ir lielas iespējas, ka šādu testu rezultāti ir ļoti nepieciešami cilvēku vai dzīvnieku veselības vai vides aizsardzībai. 1.5.3. Pieļaujamības tests Pieļaujamības testu galvenokārt izmanto gadījumos, kad eksperimenta veicēja rīcībā ir informācija, kas liecina, ka vielai varētu nebūt toksiskas iedarbības, t.i., tā ir toksiska tikai devās, kas ierobežotas ar reglamentējošiem dokumentiem. Informāciju par testējamā materiāla toksiskumu var iegūt pēc testu datiem ar līdzīgiem maisījumiem vai produktiem, ņemot vērā identitāti un to sastāvdaļu procentuālo īpatsvaru, kuru toksiskums ir zināms. Šādās situācijās, kad nav informācijas par toksiskumu vai tā ir nepietiekama, vai arī paredzams, ka testējamā viela varētu būt toksiska, ir jāveic galvenais tests. Pieļaujamības testu pie viena devas līmeņa 2000 mg/kg ķermeņa svara var izdarīt ar sešiem dzīvniekiem (katrā posmā pa trijiem). Izņēmuma gadījumos pieļaujamības testu var veikt ar devu 5000 mg/kg ķermeņa svara, izmantojot trīs dzīvniekus (sk. 2. pielikumu). Ja tiek konstatēta ar vielas ievadīšanu saistīta bojāeja, var būt nepieciešams veikt nākamās zemākās devas testus. 1.6. NOVĒROJUMI Pēc ievadīšanas pirmo 30 minūšu laikā dzīvniekus individuāli novēro vismaz vienreiz, pirmo 24 stundu laikā periodiski, īpašu uzmanību veltot pirmajām 4 stundām, un pēc tam reizi dienā, pavisam 14 dienas, izņemot gadījumus, kad dzīvnieki gājuši bojā vai pētījumi jāizbeidz, dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ tos humāni nonāvējot. Tomēr novērošanas ilgums nav stingri jānosaka. Tas ir jānosaka pēc toksiskās iedarbības reakcijām, to parādīšanās laika un atveseļošanās ilguma, un tādēļ ilgumu var pagarināt, ja uzskata par vajadzīgu. Laiki, kad parādās un izzūd toksiskuma pazīmes, ir svarīgi, īpaši ja tām ir tendence aizkavēties (12). Visus novērojumus sistemātiski reģistrē, par katru dzīvnieku izdarot individuālu reģistrēšanu. Ja dzīvniekiem turpinās toksiskās iedarbības pazīmes, ir vajadzīgi papildu novērojumi. Novērojot dzīvniekus, jāpievērš uzmanība izmaiņām, kas skar to ādu un apmatojumu, acis un gļotādas, kā arī elpošanas orgānus, asinsriti, veģetatīvo un centrālo nervu sistēmu, somatomotoriku un uzvedības reakcijas. Uzmanība jāpievērš drebuļu, krampju, siekalošanās, caurejas, letarģijas, miega un komas novērojumiem. Jāņem vērā principi un kritēriji, kas apkopoti Humane Endpoints Guidance Document (9). Visi mirstošie dzīvnieki un dzīvnieki, kas izrāda lielu sāpju un ilgstošu briesmu sajūtu pazīmes, ir humāni jānonāvē. Ja dzīvnieki ir nonāvēti humānu apsvērumu dēļ vai atrasti miruši, iespējami precīzi ir jāreģistrē nobeigšanās laiks. 1.6.1. Ķermeņa svars Visi dzīvnieki jānosver neilgi pirms testējamās vielas ievadīšanas, un pēc tam vismaz reizi nedēļā. Svara izmaiņas ir jāaprēķina un jāreģistrē. Testa beigās pirms humānas nonāvēšanas izdzīvojušos dzīvniekus nosver. 1.6.2. Patoloģija Visus testa dzīvniekus (arī tos, kas testa laikā nobeigušies vai ar kuriem dzīvnieku labturības apsvērumu dēļ pētījumi izbeigti), ir jāveic pilna autopsija. Visas patoloģiskās izmaiņas reģistrē par katru dzīvnieku. Var apsvērt arī orgānu, kuros parādās visas patoloģijas pierādījumi, mikroskopisko izmeklēšanu dzīvniekiem, kas izdzīvojuši 24 stundas vai ilgāk, jo tāda apskate var sniegt noderīgu informāciju. 2. DATI Norāda datus par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati ir jāapkopo tabulas veidā, norādot dzīvnieku skaitu, kas izmantots katrā testa grupā, dzīvnieku skaitu, kuriem parādījušās toksiskuma pazīmes, dzīvnieku skaitu, kuri testa laikā atrasti nobeigušies vai nonāvēti humānu apsvērumu dēļ, atsevišķo dzīvnieku nobeigšanās laiku, toksiskās iedarbības veidu un tā atgriezeniskuma aprakstu un gaitu, kā arī autopsijā iegūtie novērojumi. 3. PĀRSKATA SAGATAVOŠANA 3.1. Pārskats par testu Pārskatā par testu jāiekļauj šāda informācija: Testējamā viela: - fizikālās īpašības, tīrība, un attiecīgos gadījumos arī fizikāli ķīmiskās īpašības (ieskaitot izomerizāciju); - identifikācijas dati, tostarp CAS numuru. Nesējs (ja vajadzīgs): - nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens; Testa dzīvnieki: - izmantotā suga/līnija; - dzīvnieku mikrobioloģiskais statuss, ja tas zināms; - dzīvnieku skaits, vecums un dzimums (ietverot, ja vajadzīgs, vīrišķā dzimuma īpatņu izmantošanu sievišķā dzimuma īpatņu vietā); - izcelsme, turēšanas apstākļi, barība u.c. Testa apstākļi: - informācija par testējamās vielas preparātu, ietverot datus par ievadītā materiāla fizikālo formu; - sīkas ziņas par testējamās vielas ievadīšanu, iekļaujot ievadāmos tilpumus un ievadīšanas laikus; - sīkas ziņas par barības un ūdens kvalitāti (iekļaujot veidu/izcelsmi, ūdens avotu); - sākotnējās devas izvēles pamatojums. Rezultāti: - katra dzīvnieka atbildes reakciju datu tabula un devas līmenis (t.i., dzīvniekiem, kas uzrādījuši toksiskuma pazīmes, tostarp nobeigšanās gadījumus, iedarbības veidu, smagumu un ilgumu); - datu tabula par ķermeņa svaru un ķermeņa svara izmaiņām; - katra dzīvnieka svars ievadīšanas dienā un pēc tam ar nedēļas starplaikiem, kā arī nobeigšanās vai nonāvēšanas laikā; - nobeigšanās datums un laiks, ja tā notikusi pirms paredzētās nonāvēšanas; - toksiskuma pazīmju parādīšanās gaita katram dzīvniekam, un vai tās ir bijušas atgriezeniskas; - katra dzīvnieka autopsijā konstatētais un histopatoloģiskās konstatācijas, ja tās pieejamas. Rezultātu apspriešana un interpretācija. Secinājumi. 4. LITERATŪRAS SARAKSTS (1) Roll R., Hofer–Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86. (2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341. (3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute–Toxic–Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610. (4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute–Toxic–Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734. (5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, 129–134. (6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute–Toxic–Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455–470. 7 Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute–Toxic–Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670. 8 OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris. 9 OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19. (10) displaygeneral/ 0,3380,EN–documents–521–14–no–24–no–0,FF.html] OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http:// webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN–documents–521–14–no–24–no–0,FF.html] (11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up–and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223–231. (12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994 ). Chap. 16 Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA." -------------------------------------------------- 2.D PIELIKUMS Β.4. AKŪTS TOKSISKUMS – KAIRINĀJUMS/KODĪGA IEDARBĪBA UZ ĀDU 1. METODE Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO 404. (2002) vadlīnijā noteiktai metodei. 1.1. IEVADS Izstrādājot šo pilnveidoto metodi, īpaša vērība tika veltīta tās iespējamajiem uzlabojumiem, kas attiecas uz dzīvnieku labturību un visas esošās informācijas izvērtēšanu par testējamo vielu, lai neveiktu nevajadzīgus testus ar laboratorijas dzīvniekiem. Šajā metodē ietilpst arī ieteikums pirms vielas aprakstīto kodīgo/kairinošo īpašību pārbaudes in vivo testos par esošajiem atbilstīgajiem datiem veikt zinātnisko datu nozīmīguma analīzi. Ja esošie dati ir nepietiekami, tos var iegūt secīgā testēšanān (1). Testēšanas stratēģijā ietilpst validētu un vispārpieņemtu in vitro testu veikšana, un tā pievienota pielikumam, kurā aprakstīta šī metode. Bez tam attiecīgā gadījumā ieteicams sākotnējā testa in vivo trīs daļas veikt nevis vienlaicīgi, bet secīgi. Gan zinātniskās precizitātes dēļ, gan ņemot vērā dzīvnieku labturības apsvērumus, in vivo testus neveic, kamēr zinātnisko datu nozīmīguma analīzē nav izvērtēti visi pieejamie dati par vielas kodīgo/kairinošo iedarbību uz ādu. Šādi dati ir – ar cilvēkiem un/vai laboratorijas dzīvniekiem veiktajos pētījumos iegūtie zinātniskie dati, liecības par vienas vai vairāku struktūras ziņā līdzīgu vielu vai vielu maisījumu kodīgajām/kairinošajām īpašībām, dati, kas liecina, ka attiecīgajai vielai ir stipru skābju vai bāzu īpašības (2), (3), kā arī validētos un vispārpieņemtos in vitro vai ex vivo testos iegūti rezultāti (4), (5), (5.a). Šāda analīze samazina nepieciešamību veikt in vivo testus, nosakot kodīgās/kairinošās īpašības tādām vielām, par kurām citos pētījumos jau ir iegūts pietiekami daudz zinātnisku datu par šiem diviem galamērķiem. Ieteicamā secīgā testēšanas stratēģija, pie kuras pieder validētu un vispārpieņemtu in vitro vai ex vivo izmēģinājumu veikšana kodīgo/kairinošo īpašību noteikšanai, ir pievienota šīs metodes pielikumā. Šo stratēģiju izstrādājusi un vienprātīgi ieteikusi ESAO darba grupa (6), un tā pieņemta par ieteicamo testēšanas stratēģiju Vispārējā saskaņotā ķīmisko vielu klasifikācijas sistēma (VSS) (7). Šo stratēģiju ieteicams ievērot pirms in vivo testiem. Lai iegūtu zinātniski pamatotus datus par konkrētās vielas kodīgajām īpašībām/kairinošo iedarbību, testus ar jaunām vielām ieteicams veikt secīgos posmos. Attiecībā uz esošajām vielām, par kurām nav pietiekamu datu, kas raksturo to kodīgās/kairinošās īpašības, jāizmanto nepieciešamā stratēģija, kas vajadzīga, lai iegūtu trūkstošos datus. Ir jābūt pamatojumam par atšķirīgu testēšanas stratēģiju vai procedūru izmantošanu vai arī par lēmumu – neveikt testu secīgos posmos. Ja kodīgās vai kairinošās īpašības nav iespējams noteikt zinātnisko datu nozīmīguma analīzē, ievērojot secīgās testēšanas stratēģiju, jāveic atbilstoši in vivo testi (sk. pielikumā). 1.2. DEFINĪCIJAS Ādas kairinājums – ādas atgriezenisks bojājums, kas rodas pēc testējamās vielas aplicēšanas līdz 4 stundas ilgā ekspozīcijas laikā. Kodīga iedarbība uz ādu (ādas saēšana) – ir ādas neatgriezenisku bojājumu radīšana;, t.i., nekrozes novērošana caur epidermu un zemādā, kas rodas pēc testējamās vielas aplicēšanas līdz 4 stundas ilgā ekspozīcijas laikā. Kodīgajai iedarbībai parasti raksturīgas čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērojumu perioda beigās atkrāsošanās ādas izbalēšanas dēļ, rodas zonas, kurās izkritis apmatojums un veidojas rētas. Lai novērtētu neskaidrus bojājumus, jāveic histopataloģiski izmeklējumi. 1.3. TESTA METODES PRINCIPS Uz izmēģinājumu dzīvnieku ādas aplicē vienu devu testējamās vielas. Par kontroli izmanto tā paša izmēģinājumu dzīvnieka ādas neskartās daļas. Nosaka kairinājuma/kodīgās iedarbības pakāpi, ko atzīmē pēc noteiktiem intervāliem un iedarbības pilnīgai novērtēšanai apraksta sīkāk. Pētījumi jāveic tik ilgi, lai varētu novērtēt novērotās iedarbības atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Visos testa posmos dzīvnieki, kuriem ilgstoši novēro stipru ciešanu un/vai sāpju pazīmes, ir humāni jānonāvē, un atbilstoši jānovērtē testējamās vielas iedarbība. Kritēriji, pēc kuriem pieņemami lēmumi par to dzīvnieku humānu nonāvēšanu, kas iet bojā vai kuriem ir stipras ciešanas, atrodami literatūras sarakstā (8). 1.4. TESTA METODES APRAKSTS 1.4.1. Sagatavošana testiem in vivo 1.4.1.1. Dzīvnieku sugu izvēle Piemērotākais dzīvnieks laboratorijas izmēģinājumiem ir albīnais trusis, tiem izmanto jaunus veselus pieaugušus dzīvniekus. Jābūt atbilstošam pamatojumam, ja izmanto citu sugu dzīvniekus. 1.4.1.2. Dzīvnieku sagatavošana Apmēram 24 stundas pirms testa uzsākšanas dzīvniekiem muguras daļā no ķermeņa nocērp apmatojumu. Jāraugās, lai netiktu noberzta āda, un jāizmanto tikai tie dzīvnieki, kam ir vesela un nebojāta āda. Dažām trušu līnijām ir bieži spalvu kušķi, kas zināmos gadalaikos kļūst biezāki. Šādas vietas, kur apmatojums uz ķermeņa ir ļoti blīvs, testēšanai izmantot nevar. 1.4.1.3. Turēšanas un barošanas nosacījumi Dzīvnieki jātur atsevišķi. Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, trušiem nepieciešama 20 °C (± 3 °C) temperatūra. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50 – 60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim. 1.4.2. Testa procedūra 1.4.2.1. Testējamās vielas aplicēšana Testējamo vielu uztriepj uz nelielas ādas virsmas platības (apmēram 6 cm2) un šo vietu pārklāj ar marles gabaliņu, ko piestiprina ar nekairinošu plāksteri. Gadījumos, kad tieša aplicēšana nav iespējama (piemēram, šķidrumiem vai daļai pastu), testējamo vielu vispirms pārnes uz marles tamponu, ar kuru pēc tam apstrādā ādu. Marlei jābūt ne pārāk ciešā saskarē ar ādu, ko panāk, iedarbības laikā izmantojot piemērotu puspieguļošu pārsēju. Ja testējamā viela pārnesta uz marles tampona, tas ādai jāpiestiprina tā, lai vielai ar ādu būtu laba saskare un tā visā laukumā būtu sadalīta vienmērīgi. Jāpanāk, lai dzīvnieki nevarētu aiztikt marli, tādējādi izslēdzot iespēju, ka pārbaudāmā viela nonāk barības vadā vai elpošanas ceļos. Testējamās vielas, kas ir šķidrumi, parasti neatšķaida. Testējot cietvielas (kuras, ja uzskata par vajadzīgu, var saberzt pulverī), testējamā viela jāsamitrina ar ļoti nelielu daudzumu ūdens (vai vajadzības gadījumā citā piemērotā nesējā), kas ir pietiekams labas saskares nodrošināšanai ar ādu. Ja izmanto nevis ūdeni, bet citus nesējus, nesēja kairinošajai iedarbībai uz ādu, ja tāda ir, jābūt iespējami minimālai. Iedarbības perioda beigās, kas parasti ir 4 stundas, testējamās vielas atliekas no ādas noņem, ja iespējams, izmantojot ūdeni vai citu piemērotu šķīdinātāju, kas neietekmē izveidojušos atbildes reakciju uz vielu un nerada epidermas bojājumus. 1.4.2.2. Devas līmenis Uz pārbaužu vietas aplicē 0,5 ml šķidruma vai 0,5 g cietvielas vai pastas. 1.4.2.3. Sākotnējs tests (In vivo ādas kairinājuma/kodīgās iedarbības tests, izmantojot vienu dzīvnieku) Testi in vivo noteikti jāsāk ar vienu dzīvnieku, īpaši gadījumos, kad testējamā viela varētu būt kodīga. Tas atbilst secīgas testēšanas stratēģijai (sk. 1. pielikumu). Ja, spriežot pēc zinātnisko datu nozīmīguma analīzes, viela ir kodīga, ar dzīvniekiem nav nepieciešams veikt papildu testus. Ar lielāko daļu vielu, kas varētu būt kodīgas, parasti papildu testi in vivo nav vajadzīgi. Tomēr tādos gadījumos, kad nepietiekamu zinātnisku datu dēļ tiek uzskatīts, ka ir jāiegūst papildu dati, ar dzīvniekiem veic ierobežota apjoma testus pēc turpmāk aprakstītās pieejas. Vienam dzīvniekam secīgi aplicē trīs marles tamponus ar testējamo vielu. Pirmo marles tamponu noņem pēc trim minūtēm. Ja netiek novērota nopietna ādas reakcija, uzliek otru marles tamponu, ko noņem pēc stundas. Ja novērojumi šajā testa posmā liecina, ka ir humāni iedarbības laiku pagarināt līdz 4 stundām, uzliek trešo tamponu, ko noņem pēc četrām stundām, un novērtē atbildes reakciju. Ja kodīgā iedarbība tiek novērota pēc jebkuras no trijām secīgi veiktajām testējamās vielas iedarbībām, testus nekavējoties pārtrauc. Ja kodīgā iedarbība netiek konstatēta pēc pēdējā marles tampona noņemšanas, dzīvnieku novēro 14 dienas, ja kodīgā iedarbība neattīstās jau līdz šā termiņa beigām. Gadījumos, kad testējamā viela nevarētu būt kodīga, bet tai iespējama kairinoša iedarbība, vienam dzīvniekam uz četrām stundām aplicē vienu marles tamponu. 1.4.2.4. Apstiprinājuma tests (In vivo ādas kairinājuma tests, izmantojot papildu dzīvniekus) Ja sākotnējā testā kodīgums nav novērots, kairinošā iedarbība vai tās neesamība jāapstiprina izmēģinājumos ar diviem papildu dzīvniekiem, katram aplicējot vienu tamponu, kuru tur četras stundas. Ja kairinošā iedarbība novērota sākotnējā testā, apstiprinājuma testu var veikt secīgi, vai arī abus dzīvniekus vienlaicīgi pakļaujot vielas iedarbībai. Izņēmuma gadījumā, kad sākotnējs tests netiek veikts, diviem vai trijiem dzīvniekiem aplicē vienu tamponu, ko noņem pēc četrām stundām. Izmantojot divus dzīvniekus, un to abu reakcijas uz vielas iedarbību ir vienādas, turpmāka testēšana nav nepieciešama. Ja tā nav, jāveic testi ar vēl vienu dzīvnieku. Neskaidru reakciju novērtēšanai var būt nepieciešami vairāki papildu dzīvnieki. 1.4.2.5. Novērošanas periods Novērojumi jāveic pietiekami ilgi, lai pilnībā varētu novērtēt novērotās iedarbības atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Taču izmēģinājumi vienmēr jāpārtrauc uzreiz tad, ja dzīvniekiem parādās pastāvīgas smagu sāpju vai ciešanu pazīmes. Lai novērtētu iedarbības atgriezeniskumu, pēc tamponu noņemšanas dzīvnieki jānovēro līdz 14 dienām. Izmēģinājumus attiecīgi beidz drīzāk, ja iedarbības atgriezeniskumu konstatē pirms 14 dienu perioda beigām. 1.4.2.6. Klīniskie novērojumi un ādas reakciju klasificēšana Visiem dzīvniekiem jāpārbauda eritēmas un tūskas veidošanās pazīmes un iedarbība 60 minūtes pēc marles tampona noņemšanas, un turpmāk pēc 24, 48 un 72 stundām. Sākotnējā testā ar vienu dzīvnieku tūlīt pēc marles tampona noņemšanas apskata arī testēšanas vietu. Ādas reakcijas novērtē un reģistrē pēc turpmāk dotās klasifikācijas tabulas. Ja ir ādas bojājums, ko pēc 72 stundām nevar identificēt par kairinājumu vai kodīgas iedarbības rezultātu, iedarbības atgriezeniskuma noteikšanai novērojumi var būt jāturpina līdz 14. dienai. Papildus kairinājuma novērojumiem pilnībā jāraksturo un jāreģistrē arī visu veidu lokāla toksiska iedarbība, piemēram, ādas attaukošana un visu veidu sistēmiski kaitīga iedarbība (piemēram, ietekme uz toksiskuma klīniskajām pazīmēm un ķermeņa svara izmaiņām). Neskaidru reakciju noskaidrošanai var būt vajadzīgi histopatoloģiskie izmeklējumi. Ādas reakciju klasifikācija ir neizbēgami subjektīva. Lai veicinātu ādas reakciju klasifikācijas saskaņošanu un palīdzētu testēšanas laboratorijām, novērojumu veicējiem un interpretētājiem, personālam, kas veic novērojumus, jābūt pietiekami apmācītam par izmantojamo klasifikācijas sistēmu (sk. turpmāko tabulu). Var būt lietderīgi izmantot ilustrētus norādījumus par ādas kairinājuma un citu bojājumu klasifikāciju (9). 2. DATI 2.1. REZULTĀTU NOFORMĒŠANA Pētījumu rezultāti jāapkopo tabulas veidā testēšanas galīgajā pārskatā, kurā jāiekļauj visi 3.1. nodaļā uzskaitītie jautājumi. 2.2. REZULTĀTU IZVĒRTĒŠANA Ādas kairinājums punktos jānovērtē saistībā ar bojājumu raksturu un smagumu, to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Konkrētie punkti nav uzskatāmi par vielas kairinošo īpašību absolūtu standartu, jo tiek novērtēta arī testējamā materiāla citu veidu iedarbība. Gluži otrādi, atsevišķie punkti uzskatāmi par standartvērtībām, kuras jānovērtē saistībā ar visiem citiem pētījumā veiktajiem novērojumiem. Kairinošās iedarbības novērtējumā jāņem vērā ādas bojājumu atgriezeniskums. Ja līdz 14 dienu novērošanas perioda beigām saglabājas tādas reakcijas kā apmatojuma zaudējums (ierobežotā platībā), hiperkeratoze – ādas pārragošanās, hiperplāzija un plaisāšana, testējamā viela jāuzskata par kairinošu. 3. PĀRSKATS 3.1. TESTĒŠANAS PĀRSKATS Testēšanas pārskatā jābūt iekļautai šādai informācijai: Pamatojums testu veikšanai in vivo – iepriekš veiktajos testos iegūto zinātnisko datu nozīmīguma analīze, tostarp secīgajā testēšanas stratēģijā iegūto rezultātu analīze: - atbilstošu iepriekš veiktajos testos iegūto datu apraksts; - visos testēšanas stratēģijas posmos iegūtie dati; - in vitro veikto testu apraksts, tostarp sīkas ziņas par izmantotajām procedūrām, rezultātiem, kas iegūti ar testējamajām vielām un standartvielām; - in vivo pētījumam nepieciešamā zinātnisko datu nozīmīguma analīze. Testējamā viela: - identifikācijas dati, (piemēram, CAS numurs, avots, tīrība, zināmie piemaisījumi, partijas numurs); - fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, pH, gaistamība, šķīdība, stabilitāte); - attiecībā uz maisījumiem to sastāvs un atsevišķo komponentu relatīvais īpatsvars. Nesējs: - identifikācija, koncentrācija (ja vajadzīgs), izmantotais tilpums; - nesēja izvēles pamatojums. Testu dzīvnieki: - izmantotā suga/līnija, izvēles pamatojums gadījumos, kad neizmanto albīnos trušus; - katra dzimuma dzīvnieku skaits; - katra dzīvnieka svars testa sākumā un beigās; - vecums izmēģinājumu sākumā; - dzīvnieku izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, u.c. Testa apstākļi: - tampona pielikšanas vietas sagatavošanas paņēmiens; - sīkas ziņas par tamponam izmantotajiem materiāliem un tampona uzlikšanas paņēmienu; - sīkas ziņas par testējamās vielas sagatavošanu, aplicēšanu un noņemšanu. Rezultāti: - kairinošās/kodīgās iedarbības punktu tabulas veidā apkopoti dati par katru dzīvnieku visos novērojumu laikos; - visu novēroto bojājumu apraksts; - apraksts stāstījuma veidā par novēroto kairinošo iedarbību vai kodīgumu un histopatoloģiskajos izmeklējumos iegūtajiem datiem; - papildu ādas kairinājumam vai kodīgajai iedarbībai citas nevēlamas vietējas (piemēram, ādas attaukošanas) vai sistēmiska rakstura iedarbības apraksts. Rezultātu izvērtējums. 4. LITERATŪRAS SARAKSTS (1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. (2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26. (3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA _26, 709–720. (4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels. (5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, lpp. 483–524. (5.a) Testing Method B.40 Skin Corrosion. (6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22 – 24 January 1996 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/background.htm). (7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). (8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://wwwl.oecd.org/ehs/test/monos.htm). (9) EPA (1990). Adas of Dermal Lesions, (20T–2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Available from OECD Secretariat upon request]. I TABULA: ĀDAS REAKCIJAS KLASIFICĒŠANA Eritēmas un kreveļu veidošanās Eritēmas nav … | 0 | Ļoti viegla eritēma (tikko pamanāma) … | 1 | Labi izteikta eritrēma … | 2 | Mērena līdz smaga eritēma … | 3 | Smaga eritrēma (liellopa gaļas sarkanums) ar kreveļu veidošanos, kas nedod eritrēmas klasifikācijas iespējas … | 4 | Maksimāli iespējamie – 4 | Tūskas veidošanās Tūskas nav … | 0 | Pavisam neliela tūska (tikko pamanāma) … | 1 | Neliela tūska (skarto vietu var viegli noteikt pēc izteikta pietūkuma … | 2 | Mērena tūska (pietūkums apmēram 1 mm augstumā) … | 3 | Smaga tūska (pietūkums vairāk nekā 1 mm un ir plašāks nekā iedarbības vieta) … | 4 | Maksimāli iespējamie – 4 | Neskaidru reakciju noskaidrošanai var būt vajadzīgi histopatoloģiskie izmeklējumi. -------------------------------------------------- 2.E PIELIKUMS Β.5. AKŪTS TOKSISKUMS – KAIRINĀJUMS/KODĪGA IEDARBĪBA UZ ACĪM 1. METODE Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO 405. (2002)vadlīnijā noteiktajai metodei. 1.1. IEVADS Izstrādājot šo pilnveidoto metodi, īpaša vērība tika veltīta tās iespējamajiem uzlabojumiem, izvērtējot visu esošo informāciju par testējamo vielu, lai nav jāveic nevajadzīgus testus ar laboratorijas dzīvniekiem, un tādējādi ievērotu dzīvnieku labturības prasības. Šajā metodē ietilpst arī ieteikums par zinātnisko datu nozīmīguma analīzes (1) veikšanu saistībā ar esošajiem atbilstošajiem datiem pirms aprakstīto vielas kodīgo/kairinošo īpašību pārbaudes in vivo testos. Ja esošie dati ir nav pietiekami, tos var iegūt secīgā testēšanā (2), (3). Testēšanas stratēģijā ietilpst validētu un vispārpieņemtu in vitro testu veikšana, un tā pievienota pielikumam, kurā ir noteikta testa metode. Bez tam, pirms veikt in vivo testus kodīgās iedarbības testēšanai uz acīm, šādas iedarbības prognozēšanai ieteicams veikt in vivo testus kairinošās kodīgās iedarbības noteikšanai uz ādu. Gan zinātniskās precizitātes dēļ, gan ņemot vērā dzīvnieku labturības apsvērumus, in vivo testi nav jāveic, kamēr zinātnisko datu nozīmīguma analīzē nav izvērtēti visi pieejamie atbilstošie dati par vielas iespējamo kodīgo/kairinošo iedarbību uz acīm. Tie ir – ar cilvēkiem un/vai laboratorijas dzīvniekiem veiktajos pētījumos iegūtie dati, liecības par vienas vai vairāku struktūras ziņā saistītu vielu vai vielu maisījumu kodīgajām/kairinošajām īpašībām, dati, kas liecina, ka attiecīgajai vielai ir stipru skābju vai bāzu īpašības (4), (5), kā arī validētos un vispārpieņemtos in vitro vai ex vivo testos iegūti rezultāti par kodīgo un kairinošo iedarbību uz ādu (6), (6.a). Pētījumus var veikt pirms zinātnisko datu nozīmīguma analīzes vai pēc tās. Par dažām vielām šāda analīze var norādīt uz vajadzību veikt in vivo pētījumus par to kodīgumu/kairinošajām īpašībām, iedarbojoties uz acīm. Visos šādos gadījumos pirms pieņemt lēmumu veikt iedarbības testus uz acīm in vivo, ieteicams vispirms veikt pētījumus in vivo attiecīgās vielas iedarbībai saskarē ar ādu, un tos izvērtēt saskaņā ar testa metodi B.4 (7) Izmantojot zinātnisko datu nozīmības analīzi un secīgas testēšanas stratēģiju, samazinās vajadzība veikt in vivo testus to vielu kodīgās/kairinošās iedarbības noskaidrošanai uz acīm, par kurām citos pētījumos iegūtas pietiekami zinātniskie dati. Ja kodīgo vai kairinošo iedarbību uz acīm nevar noteikt, drīkst veikt izmēģinājumus in vivo kodīgās/kairinošās iedarbības noteikšanai uz acīm, izmantojot secīgas testēšanas stratēģiju pat pēc tam, kad jau ir veikti izmēģinājumi in vivo tās kodīgās un kairinošās iedarbības noteikšanai uz ādu. Ieteicamā secīgā testēšanas stratēģija, pie kuras pieder validētu un vispārpieņemtu in vitro vai ex vivo testu veikšana kodīgo/kairinošo īpašību noteikšanai, ir pievienota pielikumā, kurā ir šī testa metode. Šo stratēģiju izstrādājusi un vienprātīgi ieteikusi ESAO darba grupa (8), un tā pieņemta par ieteicamo stratēģiju Vispārīgā saskaņotā ķīmisko vielu klasifikācijas sistēmā (VSS) (9). Šo stratēģiju ieteicams ievērot pirms in vivo testiem. Lai iegūtu zinātniski pamatotus datus par konkrētās vielas kodīgajām īpašībām/kairinošo iedarbību, testus ar jaunām vielām ieteicams veikt secīgos posmos. Jāizmanto nepieciešamā stratēģija trūkstošo datu iegūšanai par esošajām vielām, par kurām nav pietiekamu datu, kas raksturo to kodīgās/kairinošās īpašības. Jābūt pamatojumam par lēmumu, kas attiecas uz atšķirīgu testēšanas stratēģiju vai procedūru izmantošanu, vai arī par lēmumu neveikt testu secīgos posmos. 1.2. DEFINĪCIJAS Acu kairinājums – izmaiņas acī, kas rodas pēc testējamās vielas aplikācijas uz acs ābola priekšējās virsmas un ir pilnīgi atgriezeniskas 21 dienas laikā pēc aplikācijas. Kodīga iedarbība uz acīm – acs ābola audu bojājums vai nopietni fiziski redzes bojājumi, kas rodas pēc testējamās vielas aplikācijas uz acs ābola priekšējās virsmas un nav pilnīgi atgriezeniski 21 dienas laikā pēc aplikācijas. 1.3. TESTA METODES PRINCIPS Uz izmēģinājuma dzīvnieka vienas acs ābola aplicē vienu devu testējamās vielas; otru aci izmanto kontroles nolūkos. Kairinājumu/kodīgo iedarbību uz aci novērtē pēc konjunktīvas, radzenes un varavīksnenes bojājumu pakāpes noteiktos laika intervālos. Lai iedarbību novērtētu pilnīgi, apraksta arī citu veidu iedarbību uz aci, kā ar kaitīgu sistēmisku iedarbību. Pētījumi jāveic tik ilgi, lai varētu novērtēt novērotās iedarbības atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Visos testu posmos dzīvnieki, kuriem ilgstoši novēro stipru ciešanu un/vai sāpju pazīmes, ir humāni jānonāvē, un atbilstoši jānovērtē testējamās vielas iedarbība. Kritēriji, pēc kuriem pieņemami lēmumi par to dzīvnieku humānu nonāvēšanu, kas iet bojā vai kuriem ir stipras ciešanas, atrodami literatūras sarakstā (10). 1.4. TESTA METODES APRAKSTS 1.4.1. Sagatavošana testiem in vivo 1.4.1.1. Dzīvnieku sugu izvēle Piemērotākais dzīvnieks laboratorijas izmēģinājumiem ir albīnais trusis, tiem izmanto jaunus veselus pieaugušus dzīvniekus. Jābūt atbilstošam pamatojumam, ja izmanto citu sugu vai līniju dzīvniekus. 1.4.1.2. Dzīvnieku sagatavošana Katram iepriekš atlasītam testa dzīvniekam 24 stundas pirms testa pārbauda abas acis. Dzīvnieki ar acu iekaisumu, okulārajiem defektiem vai radzenes bojājumiem nav izmantojami. 1.4.1.3. Turēšanas un barošanas nosacījumi Dzīvnieki jātur atsevišķi. Telpā, kurā tur izmēģinājumu dzīvniekus, trušiem nepieciešama 20 °C (± 3 °C) temperatūra. Lai gan, izņemot telpu uzkopšanas laiku, relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un vēlams ne vairāk kā 70 %, tas jāuztur 50 – 60 % robežās. Apgaismojumam jābūt mākslīgam, secība ir 12 stundas gaismas, 12 stundas tumsas. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzeramajam ūdenim. 1.4.2. Testa metode 1.4.2.1. Testējamās vielas aplicēšana Testējamo vielu katram dzīvniekam ievada acs konjunktīvas maisiņā, pirms tam viegli pavelkot apakšējo plakstiņu nost no acs ābola. Pēc tam plakstiņus apmēram vienu sekundi viegli tur kopā, lai viela neizplūstu. Otrā acs paliek neapstrādāta un to izmanto kontroles nolūkos. 1.4.2.2. Skalošana Testa dzīvniekiem acis nedrīkst skalot vismaz 24 stundas pēc testējamās vielas ievadīšanas, izņemot gadījumus, kad ievada cietvielas (sk. 1.4.2.3.2.), kā arī tad, kad novērojama tūlītēja kairinoša vai kodīga iedarbība. Vajadzības gadījumā pēc 24 stundām acis var izskalot. Izņemot gadījumus, kad tas ir zinātniski pamatoti, nav ieteicams veikt pētījumus ar otru dzīvnieku grupu, lai noskaidrotu skalošanas ietekmi. Ja ir vajadzīga otra dzīvnieku grupa, tai jāizmanto divi truši. Precīzi jādokumentē skalošanas apstākļi, piemēram, skalošanas laiks; skalojamā šķīduma sastāvs un temperatūra; tās ilgums, apjoms un ātrums. 1.4.2.3. Devas līmenis 1.4.2.3.1. Šķidrumu testēšana Šķidrumu testēšanai izmanto 0,1 ml devu. Vielas ievadīšanai tieši acī nedrīkst izmantot smidzinātājus. Pirms iepilināt acī 0,1 ml šķidra aerosola, tas vispirms jāizsmidzina un jāsavāc tvertnē. 1.4.2.3.2. Cietvielu testēšana Testējot cietvielas, pastas un vielas daļiņu veidā, izmantojamajam daudzumam jābūt 0,1 ml tilpumam vai ne vairāk kā 100 mg. Testējamais materiāls jāsaberž smalkā pulverī. Cietu vielu tilpums jāmēra pēc to vieglas sablīvēšanas, piemēram, mērtvertnē sakratot. Ja testējamā cietviela nav izvadīta no testa dzīvnieka acs ar fizioloģiskiem mehānismiem līdz pirmajam novērojumu termiņam 1 stundu pēc ievadīšanas, aci var izskalot ar sālsūdeni vai destilētu ūdeni. 1.4.2.3.3. Aerosolu testēšana Ieteicams pirms iepilināšanas acī visus ar sūkni vai propellentu izsmidzināmos aerosolus vispirms izsmidzināt un savākt tvertnē. Vienīgais izņēmums ir vielas aerosola balonā, kuras nav iespējams savākt tvertnē iztvaikošanas dēļ. Šādos gadījumos acs jātur atvērta, un testējamā viela jāievada acī, to izsmidzinot apmēram vienu sekundi no 10 cm attāluma tieši uz acs ābola. Attālumu var mainīt atkarībā no spiediena aerosola balonā un tā satura. Jāraugās, lai neradītu acs bojājumu no aerosola balona spiediena. Atsevišķos gadījumos var būt vajadzīgs novērtēt acs iespējamos "mehāniskos" bojājumus no aerosola balona spiediena spēka. Ar aerosola balonu ievadīto devu var noteikt, testu imitējot šādi – vielu izsmidzina uz nosvērta papīra gabala, uz kura novietots ekrāns ar truša acs lieluma atveri. Papīra masas palielinājumu izmanto acī iesmidzinātās devas aptuvenai noteikšanai. Gaistošām vielām devu var noteikt, uztvērēja tvertni nosverot pirms un pēc testējamās vielas izņemšanas. 1.4.2.4. Sākotnējs tests (In vivo acu kairinājuma/kodīgās iedarbības tests, izmantojot vienu dzīvnieku) Kā skaidri noteikts secīgās testēšanas stratēģijā (sk. 1. pielikumu), in vivo testi jāsāk, izmantojot vienu dzīvnieku. Ja pēc iepriekš aprakstītās procedūras iegūtie testa rezultāti liecina, ka vielai ir kodīga vai stipri kairinoša iedarbība uz acīm, turpmāko acs kairinājuma testēšanu neveic. 1.4.2.5. Vietējā anestēzija Pēc vajadzības katrā atsevišķā gadījumā var lietot vietējo anestēziju. Ja zinātnisko datu nozīmīguma analīze liecina, ka vielas iedarbība var radīt sāpes, vai arī sākotnējā testā noskaidrojas, ka rodas sāpju reakcija, pirms testējamās vielas iepilināšanas var lietot vietējo anestēziju. Rūpīgi jāizraugās vietējās anestēzijas veids, koncentrācija un deva tā, lai nodrošinātu, ka no tās lietošanas nerodas reakcijas atšķirības uz testējamās vielas iedarbību. Tāda pati anestēzija jādod acij, ko izmanto kontroles nolūkos. 1.4.2.6. Apstiprinājuma tests (In vivo ādas kairinājuma tests, izmantojot papildu dzīvniekus) Ja kodīga iedarbība nav novērota sākotnējā testā, kairinošā iedarbība vai tās neesamība jāapstiprina testos ar vienu vai diviem papildu dzīvniekiem. Ja sākotnējā testā novērota stipri kairinoša iedarbība, kas norāda uz iespējamu stipru (neatgriezenisku) iedarbību apstiprināšanas testā, apstiprinošo testu ieteicams veikt secīgi, vienā reizē izmantojot vienu dzīvnieku, nevis pakļaut vielas iedarbībai abus papildu dzīvniekus vienlaicīgi. Ja otrajam dzīvniekam konstatē kodīgu vai stipri kairinošu iedarbību, tests nav jāturpina. Papildu dzīvnieki var būt vajadzīgi vājas vai mēreni kairinošas iedarbības apstiprināšanai. 1.4.2.7. Novērošanas periods Novērojumi jāveic pietiekami ilgi, lai varētu pilnīgi novērtēt novērotās iedarbības lielumu, atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Taču izmēģinājumi vienmēr uzreiz jāpārtrauc tad, ja dzīvniekiem parādās pastāvīgas smagu sāpju vai ciešanu pazīmes (9). Lai noteiktu iedarbības atgriezeniskumu, dzīvnieki parasti jānovēro 21 dienu pēc testējamās vielas ievadīšanas. Izmēģinājumus attiecīgi beidz drīzāk, ja iedarbības atgriezeniskumu konstatē pirms 21 dienas perioda beigām. 1.4.2.7.1. Klīniskie novērojumi un acs reakciju klasificēšana Acis jāpārbauda 1, 24, 48 un 72 stundas pēc testējamās vielas aplicēšanas. Dzīvnieki testā nav jātur ilgāk par galīgas informācijas iegūšanai vajadzīgo laiku. Dzīvniekus ar ilgstošām smagu sāpju vai ciešanu pazīmēm nekavējoties humāni nonāvē un attiecīgi novērtē testējamo vielu. Humāni nonāvē dzīvniekus, kuriem pēc vielas iepilināšanas rodas šādi acs bojājumi – radzenes perforācija vai radzenes ievērojama čūla, tostarp stafiloma; asinis acs ābola priekšējā kamerā; 4. pakāpes radzenes aptumšošanās, kas saglabājas 48 stundas; nav refleksa uz gaismu (2. pakāpes varavīksnenes reakcija) ilgāk nekā 72 stundas; konjunktīvas plēves čūla; konjunktīvas vai mirkšķināšanas membrānas nekroze; vai noslīdēšana. Tā rīkojas tāpēc, ka šādi bojājumi parasti ir neatgriezeniski. Dzīvniekus, kuriem neveidojas acs bojājumi, var nonāvēt ne ātrāk kā 3 dienas pēc vielas iepilināšanas. Dzīvniekus ar viegliem līdz mēreniem bojājumiem jānovēro, līdz bojājumi beidzas, vai 21 dienu, kad pētījumus izbeidz. Novērojumi jāveic pēc 7, 14 un 21 dienas, lai novērtētu bojājumu stāvokli un to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Acs (konjunktīvas, radzenes, varavīksnenes) reakcijas pakāpes reģistrē visos novērojumos (I tabula). Reģistrē arī visus citus acs bojājumus (piemēram, radzenes apduļķošanos, krāsošanos) un kaitīgu sistēmisku iedarbību. Novēroto reakciju novērošanai var izmantot binokulāro lupu, pārnēsājamu spraugas lampu, bioloģisko mikroskopu vai citas piemērotas ierīces. Kad reģistrēti novērojumi pēc 24 stundām, turpmākām acu pārbaudēm var izmantot fluoresceīnu. Acs reakciju klasifikācija ir neizbēgami subjektīva. Lai veicinātu acu reakciju klasifikācijas saskaņošanu un palīdzētu testēšanas laboratorijām, kā arī novērojumu veicējiem un interpretētājiem, personālam, kas veic novērojumus, jābūt pietiekami apmācītiem par izmantojamo klasifikācijas sistēmu. 2. DATI 2.2. REZULTĀTU IZVĒRTĒŠANA Acu kairinājums jānovērtē saistībā ar bojājumu raksturu un smagumu, to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Konkrētie punkti nav uzskatāmi par vielas kairinošo īpašību absolūtu standartu, jo tiek novērtēta arī testējamā materiāla citu veidu iedarbība. Tāpēc atsevišķie punkti jāuzskata par standartvērtībām, un tiem ir nozīme tikai tad, ja tiek pamatoti ar pilnīgiem aprakstiem un visu novērojumu izvērtējumu. 3. PĀRSKATS 3.1. TESTA PĀRSKATS Testēšanas pārskatā jābūt šādai informācijai. Testa veikšanas in vivo pamatojums – iepriekš veikto testu rezultātu zinātnisko datu nozīmīguma analīze, tostarp pēc secīgās testēšanas stratēģijas iegūtos rezultātus; - atbilstošu iepriekš veiktajos testos iegūto datu apraksts; - visos testēšanas stratēģijas posmos iegūtie dati; - in vitro veikto testu apraksts, tostarp sīkas ziņas par izmantotajām procedūrām, rezultātiem, kas iegūti ar testējamajām un standartvielām; - veikto in vivo ādas kairinājuma/kodīgās iedarbības pētījumu apraksti, tostarp iegūtie rezultāti; - in vivo pētījumam nepieciešamā zinātnisko datu nozīmīguma analīze. Testējamā viela: - identifikācijas dati (piemēram, CAS numurs, avots, tīrība, zināmie piemaisījumi, partijas numurs); - fizikālās un fizikāli ķīmiskās īpašības (piemēram, pH, gaistamība, šķīdība, stabilitāte, reaģētspēja ar ūdeni); - maisījumiem – sastāvs un atsevišķo komponentu relatīvais īpatsvars; - ja izmantota vietējā anestēzija, tās identifikācija, tīrība, veids, deva un iespējamā mijiedarbība ar testējamo vielu. Nesējs: - identifikācija, koncentrācija (ja vajadzīgs), izmantotais tilpums; - nesēja izvēles pamatojums. Testa dzīvnieki: - izmantotā suga/līnija, izvēles pamatojums gadījumos, kad neizmanto albīnos trušus; - katra dzīvnieka vecums pētījuma sākumā; - katra dzimuma dzīvnieku skaits testa un kontroles grupās (ja vajadzīgs); - katra dzīvnieka svars testa sākumā un beigās; - izcelsme, turēšanas apstākļi, barība, u.c. Rezultāti: - visos novērojumu termiņos kairinājuma novērtēšanai izmantoto metožu apraksts (piemēram, pārnēsājamā spraugas lampa, bioloģiskais mikroskops, fluoresceīns); - tabulā apkopoti kairinošās/kodīgās iedarbības dati par katru dzīvnieku visos novērošanas termiņos līdz testa pārtraukšanai ar to; - novērotās kairinošās vai kodīgās iedarbības pakāpes un rakstura apraksts; - citu novēroto acs bojājumu apraksts (piemēram, vaskularizācija, radzenes saduļķošanās, saaugumu, rētaudu veidošanās, krāsojums); - ar aci nesaistīta kaitīga vietēja vai sistēmiska iedarbība un histopatoloģisko izmeklējumu rezultāti, ja tie veikti. Rezultātu apspriešana. 3.2. REZULTĀTU INTERPRETĀCIJA Ar dzīvniekiem iegūti acu kairinājuma pētījumu rezultātu ekstrapolācijas iespējas uz cilvēkiem ir derīgas tikai līdz zināmai pakāpei. Daudzos gadījumos albīnie truši pret acīm kodīgām vai kairinošām vielām ir jutīgāki nekā cilvēki. Interpretējot rezultātus, jāraugās, lai tiktu izslēgts kairinājums, ko rada sekundāra infekcija. 4. LITERATŪRAS SARAKSTS (1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429. (2) De Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies. Food Chem. Toxicol.35., 159–164. (3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177. (4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P, Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 – 26. (5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 – 231. (6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, lpp. 483–524. (6.a) Testing Method B.40 Skin Corrosion. (7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion. (8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm). (9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm). (10) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm). I TABULA: ACS BOJĀJUMU KLASIFIKĀCIJA Radzene Duļķošanās – blīvuma pakāpe (nolasījumi jāveic visblīvākajā zonā) [1] | Nav novērota čūlu veidošanās vai duļķošanās … | 0 | Izkaisītas vai difūzas duļķošanās zonas (izņemot normāla spīduma vieglu blāvumu); labi redzamas varavīksnenes daļas … | 1 | Labi izšķirama caurspīdīgā daļa; varavīksnenes daļas redzamas nedaudz neskaidri … | 2 | Perlamutra zona; varavīksnenes daļas redzamas; acs zīlītes izmērs tikko redzams … | 3 | Radzene necaurredzama; cauri duļķojumam varavīksnene nav samanāma … | 4 | Maksimāli iespējamie – 4 | Varavīksnene Norma … | 0 | Krokas redzami padziļinātas, hiperēmija, pietūkums, mērena radzenes hiperēmija; vai asinsizplūdums; varavīksnene reaģē uz gaismu (par reakciju uzskata arī vāju vai lēnu reakciju) … | 1 | Asiņošana, vispārējs bojājums, vai nav reakcijas uz gaismu … | 2 | Maksimāli iespējamie – 2 | Konjunktīva Apsārtums (attiecas uz plakstiņu un acs ābola konjunktīvu; izņemot radzeni un varavīksneni) | Norma … | 0 | Daži asinsvadi izteikti hiperēmiski (piepildīti) … | 1 | Difūza, tumšsarkana krāsa; atsevišķie asinsvadi grūti izšķirami … | 2 | Difūza tumši sarkana liellopu gaļas krāsa … | 3 | Maksimāli iespējamie – 3 | Hemoze Pietūkums (attiecas uz plakstiņiem un/vai mirkšķināšanas membrānām) | Norma … | 0 | Neliels pietūkums virs normas … | 1 | Acīmredzams pietūkums ar plakstiņu daļēju izgriešanos … | 2 | Pietūkums, plakstiņi gandrīz pusaizvērti … | 3 | Pietūkums, plakstiņi vairāk nekā pusaizvērti … | 4 | Maksimāli iespējamie – 4 | [1] JĀNORĀDA RADZENES DUĻĶOŠANĀS PLATĪBA -------------------------------------------------- 2.F PIELIKUMS B.31. PRENATĀLĀS ONTOĢENĒZES TOKSICITĀTES PĒTĪJUMS 1. METODE Šī metode ir ESAO 414. (2001) vadlīnijā noteiktās metodes kopija. 1.1. IEVADS Šī ontoģenēzes toksicitātes testa metode ir paredzēta, lai sniegtu vispārīgo informāciju par pirmsdzemdību iedarbības ietekmi uz grūsnu testa dzīvnieku un uz attīstošos organismu in utero; tā var iekļaut vērtējumu par iedarbību uz māti, kā arī par augļa nāvi, strukturālajām anomālijām vai augšanas izmaiņām. Funkcionāli bojājumi, kaut arī tie ir svarīga attīstības daļa, nav šīs testa metodes sastāvdaļa. Tos var testēt atsevišķā pētījumā vai kā papildinājumu šim pētījumam, izmantojot attīstības neirotoksicitātes testa metodi. Informācija par funkcionālu bojājumu un citu postnatālo iedarbību testa metodi attiecīgi skatīt Divu paaudžu reproduktīvās toksicitātes un attīstības neirotoksicitātes pētījumu testa metodē. Šai testa metodei atsevišķos gadījumos var būt vajadzīga īpaša pielāgošana, pamatojoties uz konkrētām zināšanām, piem., par testējamās vielas fizikāli ķīmiskajām vai toksikoloģiskajām īpašībām. Tāda pielāgošana ir pieņemama, ja pārliecinoši zinātniski dati liecina, ka pielāgojumi testu padarīs informatīvāku. Tādā gadījumā pētījuma pārskatā minētie zinātniskie dati ir rūpīgi jādokumentē. 1.2. DEFINĪCIJAS Ontoģenēzes toksikoloģija – pētījums par tādām blakusparādībām uz attīstošos organismu, kuras var izraisīt iedarbība pirms apaugļošanas, prenatālās attīstības laikā vai postnatāli līdz seksuālās nobriešanas laikam. Galvenās ontoģenēzes toksicitātes izpausmes iekļauj – 1) organisma nāvi, 2) strukturālas anomālijas, 3) izmainītu augšanu un 4) funkcionālus bojājumus. Ontoģenēzes toksikoloģiju agrāk bieži minēja kā teratoloģiju. Kaitīga iedarbība – jebkura ar vielas ievadīšanu saistīta tāda izmaiņa pret bāzes līniju, kas samazina organisma spēju izdzīvot, vairoties vai pielāgoties videi. Kas attiecas uz ontoģenēzes toksikoloģiju plašākajā nozīmē, tā iekļauj visas iedarbības, kas traucē normālu apaugļošanas produkta attīstību gan pirms dzimšanas, gan pēc tās. Izmainīta augšana – pēcnācēja orgāna vai ķermeņa svara vai lieluma izmaiņas. Izmaiņas (anomālijas) – attīstības strukturālas izmaiņas, kas iekļauj malformācijas un novirzes (28). Malformācija/ievērojama anomālija – strukturāla izmaiņa, ko uzskata par dzīvniekam kaitīgu (var būt arī letāla) un kas parasti ir reti sastopama. Novirze/neliela anomālija – strukturāla izmaiņa, ko uzskata par tādu, kam nav kaitīga iedarbība uz dzīvnieku; var būt pārejoša un kontroles populācijā var būt relatīvi bieži sastopama. Apaugļošanas produkts – apaugļotas olšūnas atvasinājumu summa jebkurā attīstības pakāpē no apaugļošanas līdz dzimšanai, iekļaujot augļapvalkus, kā arī embriju vai augli. Implantācija (nidācija) – blastocistas piestiprināšanās dzemdes epitēliālajam izklājumam, iekļaujot tās iziešanu caur dzemdes epitēliju un implantāciju endometrijā. Embrijs – organisma agrīnais vai attīstības posms, jo īpaši olšūnas apaugļošanās produkts, kas attīstās, pēc tam, kad parādījusies garenvirziena ass, un līdz laikam, kad izveidojušās visas galvenās struktūras. Embriotoksicitāte – kaitīga embrija normālajai struktūrai, attīstībai, augšanai un/vai dzīvotspējai. Auglis – nedzimis pēcnācējs pēcembrija laika posmā. Fetotoksicitāte – kaitīga augļa normālajai struktūrai, attīstībai, augšanai un/vai dzīvotspējai. Aborts – priekšlaicīga apaugļošanās produktu – embrija vai dzīvotnespējīga augļa izgrūšana no dzemdes. Resorbcija – apaugļošanas produkts, kas implantēts dzemd