(6)

pievieno turpmāk norādīto C.31 līdz C.46 nodaļu: “ C.31. SAUSZEMES AUGU TESTS: DĪGSTU UZDĪGŠANAS UN DĪGSTU AUGŠANAS TESTS IEVADS 1. Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 208 (2006. gads). Testēšanas metodes tiek regulāri pārskatītas, ņemot vērā zinātnes attīstību un piemērojamību izmantošanai regulējumā. Šī atjauninātā testa metode ir izstrādāta, lai novērtētu ķīmisko vielu iespējamo ietekmi uz dīgstu uzdīgšanu un augšanu. Tā neattiecas uz hronisku ietekmi vai ietekmi uz vairošanos (t. i., sēklu un ziedu veidošanos, augļu nobriešanu). Lai nodrošinātu, ka tiek izmantotas atbilstošas testēšanas metodes (piemēram, testējot metālus/metāla savienojumus, jāņem vērā pH un saistīto pretēji lādēto jonu ietekme), jāņem vērā ekspozīcijas apstākļi un testējamās ķīmiskās vielas īpašības (1). Šī testa metode neattiecas uz augiem, kas pakļauti ķīmisko vielu izgarojumiem. Testa metode ir piemērojama vispārēju ķīmisko vielu, biocīdu un kultūraugu aizsardzības līdzekļu (ko dēvē arī par augu aizsardzības līdzekļiem vai pesticīdiem) testēšanai. Tā ir izstrādāta, pamatojoties uz esošām metodēm (2)(3)(4)(5)(6)(7). Tika ņemtas vērā arī citas atsauces, kas attiecas uz augu testēšanu (8)(9)(10). Izmantotās definīcijas ir dotas 1. papildinājumā. TESTA PRINCIPS 2. Testā izvērtē ietekmi uz augstāko augu dīgstu uzdīgšanu un agrīnu augšanu pēc ekspozīcijas testējamai ķīmiskajai vielai augsnē (vai citā piemērotā augsnes matricā). Sēklas novieto saskarē ar augsni, kas apstrādāta ar testējamo ķīmisko vielu, un ietekmi parasti novērtē 14 līdz 21 dienu pēc tam, kad kontrolgrupā uzdīgst 50 % dīgstu. Izmērāmais mērķis ir vizuāls dīgstu uzdīgšanas novērtējums, asnu saussvars (alternatīvi – asnu svaigsvars) un atsevišķos gadījumos asnu garuma novērtējums, kā arī redzamas kaitīgas ietekmes uz dažādām auga daļām novērtējums. Šos mērījumus un novērojumus salīdzina ar neapstrādātu kontrolgrupas augu rezultātiem. 3. Atkarībā no prognozējamā ekspozīcijas ceļa testējamā ķīmiskā viela ir jāiestrādā augsnē (vai, iespējams, mākslīgā augsnes matricā) vai ar to jāapstrādā augsnes virskārta, kas pienācīgi atspoguļo iespējamo ķīmiskās vielas ekspozīcijas ceļu. Iestrādi augsnē veic, apstrādājot tādu augsni, kas ņemta ārpus rizosfēras. Pēc augsnes apstrādes to pārvieto uz podiņiem, tad attiecīgo augu sugu sēklas iesētj augsnē. Virsmas apstrādi veic jau podiņos ievietotai augsnei, kurā sēklas jau ir iesētas. Testa vienības (kontrolgrupas un apstrādātas augsnes ar sēklām) pēc tam novieto atbilstošos apstākļos, lai veicinātu dīgšanu/augšanu. 4. Atkarībā no pētījuma mērķa testu var veikt, lai noteiktu devas un atbildreakcijas līkni vai kā robežtestu vienai koncentrācijai/rādītājam. Ja vienas koncentrācijas/rādītāja testa rezultāti pārsniedz noteiktu toksiskuma līmeni (piemēram, novēro ietekmi, kas lielāka par x %), veic diapazona noteikšanas testu, lai noteiktu augšējo un apakšējo toksicitātes robežu, pēc tam veicot vairākus koncentrācijas/ rādītāja testus, lai izveidotu devas un atbildreakcijas līkni. Jāizmanto piemērota statistiskā analīze, lai noskaidrotu iedarbīgo koncentrāciju ECx vai iedarbīgo apstrādes rādītāju ERx (piemēram, EC25, ER25, EC50, ER50) attiecībā uz visjutīgāko interesējošo parametru vai parametriem. Tāpat arī šajā testā var aprēķināt nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC) un zemāko novērojamās ietekmes koncentrāciju (LOEC). INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO ĶĪMISKO VIELU 5. Turpmāk minētā informācija ir noderīga ķīmiskās vielas paredzamā ekspozīcijas ceļa identifikācijai un testa izstrādāšanai: struktūrformula, tīrības pakāpe, šķīdība ūdenī, šķīdība organiskos šķīdinātājos, 1-oktanola/ūdens sadalījuma koeficients, augsnes sorbcijas spēja, tvaika spiediens, ķīmiskā stabilitāte ūdenī un gaismā un bioloģiskās noārdīšanās spēja. TESTA DERĪGUMS 6. Lai testu varētu uzskatīt par derīgu, kontrolgrupām jāatbilst šādiem testa kritērijiem: — dīgstu uzdīgšana ir vismaz 70 %; — dīgstiem nav redzama fitotoksiska ietekme (piemēram, hloroze, nekroze, vīte, lapu un stublāja deformācijas), un augi uzrāda tikai konkrētās sugas augšanas un morfoloģijas parastās variācijas; — pētījuma laikā vidējais izdīgušo kontrolgrupas dīgstu izdzīvošanas rādītājs ir vismaz 90 %; — konkrētās sugas vidiskie apstākļi ir identiski, un barotne satur vienādu daudzumu augsnes matricas, augšanas veicināšanas barotnes vai tā paša avota substrāta. ĶĪMISKĀ STANDARTVIELA 7. Ķīmisko standartvielu var regulāri testēt, lai pārliecinātos, ka testa veiktspēja un konkrēto testa augu atbildreakcija, kā arī testa apstākļi laika gaitā nav būtiski mainījušies. Alternatīvi kontrolgrupās veiktus vēsturiskos biomasas vai augšanas mērījumus var izmantot, lai novērtētu testa sistēmas veiktspēju konkrētā laboratorijā, un tos var izmantot par laboratorijas iekšējās kvalitātes kontroles pasākumiem. TESTĒŠANAS METODES APRAKSTS Dabiska augsne – mākslīgs substrāts 8. Augus var audzēt podos, izmantojot smilšainu smilšmālu, smilšmālainu smilti vai smilšainu, mālainu smilšmālu, kas satur līdz 1,5 procentiem organiskā oglekļa (aptuveni 3 procenti organisko vielu). Var izmantot arī komerciālo stādu augsni vai sintētisko augsnes maisījumu, kas satur līdz 1,5 procentus organiskā oglekļa. Mālainas augsnes nevajadzētu lietot, ja ir zināms, ka testējamajai ķīmiskajai viela ir augsta māltiece. Lauka augsne jāizsijā līdz 2 mm daļiņu lielumam, lai to homogenizētu un atdalītu rupjās daļiņas. Pārskatā jāiekļauj informācija par gatavās augsnes veidu un tekstūru, organiskā oglekļa %, pH līmeni un sāls saturu, kā arī elektrovadītspēju. Augsne ir jāklasificē atbilstoši standarta klasifikācijas shēmai (11). Augsni var pasterizēt vai karsēt, lai samazinātu augsnes patogēnu ietekmi. 9. Dabiska augsne var sarežģīt rezultātu interpretēšanu un mainīgo fizikālķīmisko īpašību un mikroorganismu populāciju dēļ palielināt mainīgumu. Šie mainīgie savukārt ietekmē mitrumnoturspēju, ķīmisko vielu saistīšanas spēju, aerāciju un barības vielu un mikroelementu saturu. Papildus šo fizisko faktoru atšķirībām būs arī ķīmisko īpašību atšķirības, piemēram, atšķirīgs pH līmenis un redokspotenciāls, kas var ietekmēt testējamās ķīmiskās vielas bioloģisko pieejamību (12)(13)(14). 10. Mākslīgos substrātus parasti neizmanto augu aizsardzības līdzekļu testēšanai, taču tie var būt noderīgi vispārēju ķīmisku vielu testēšanai vai gadījumos, kad ir nepieciešams samazināt dabisko augšņu mainīgumu un palielināt testa rezultātu salīdzināmību. Izmantojamajiem substrātiem ir jāsastāv no inertiem materiāliem, lai mazinātu mijiedarbību ar testējamo ķīmisko vielu, ar šķīdinātāja nesēju vai abiem. Skābē mazgātas kvarca smiltis, minerālvate un stikla pērlītes (piemēram, 0,35–0,85 mm diametrā) ir atzītas par piemērotu inertu materiālu, kas minimāli absorbē testējamo ķīmisko vielu (15), nodrošinot, ka ķīmiskā viela būs maksimāli pieejama dīgstiem caur saknēm. Nepiemēroti substrāti ir vermikulīts, perlīts vai citi materiāli ar augstu absorbcijas spēju. Jānodrošina uzturvielas augu augšanai, lai nodrošinātu, ka augi netiek pakļauti stresam barības vielu trūkuma dēļ, un, ja iespējams, tas ir jānovērtē, veicot ķīmiskās analīzes vai vizuāli novērtējot kontrolgrupas augus. Kritēriji testa sugu atlasei 11. Sugu atlasei jābūt saprātīgi plašai, piemēram, attiecībā uz to taksonomisko daudzveidību augu valstī, to izplatību, pieejamību, konkrētai sugai raksturīgo dzīves ciklu un dabisko areālu, lai iegūtu plašu atbildreakciju klāstu (8)(10)(16)(17)(18)(19)(20). Izvēloties iespējamās testa sugas, jāņem vērā turpmāk norādītie rādītāji: — suga ir vienādas sēklas, kas ir viegli pieejamas no uzticamā standarta sēklu avotā vai avotiem un kam raksturīga konsekventa, uzticama un vienmērīga dīgšana, kā arī vienāda dīgstu augšana; — augs ir piemērots testēšanai laboratorijā, un ar to var iegūt ticamus un reproducējamus rezultātus vienā un vairākās testēšanas iekārtās; — testēšanā iekļautās sugas augu jutīgumam jāsaskan ar to augu atbildreakcijām, kas atrodami vidē un eksponēti ķīmiskajai vielai; — tie jau iepriekš zināmā mērā izmantoti toksicitātes testos, un to izmantošana, piemēram, herbicīdu biotestos, smago metālu skrīningā, sāļuma vai minerālvielu stresa testos vai allelopātijas pētījumos norāda uz to jutīgumu pret daudziem dažādiem faktoriem; — tie ir piemēroti šajā testa metodē izmantotajiem augšanas apstākļiem; — tie atbilst testa derīguma kritērijiem. Dažas no vēsturiski testos visvairāk izmantotajām sugām ir uzskaitītas 2. pielikumā, un potenciālās sugas, kas nav kultūraugi, ir 3. papildinājumā. 12. Testā iekļauto sugu skaits ir atkarīgs no attiecīgajām normatīvajām prasībām, tāpēc tas šajā testa metodē nav norādīts. Testējamās ķīmiskās vielas ievadīšana 13. Ķīmiskā viela ir jāpievieno piemērotam nesējam (piemēram, ūdenim, acetonam, etilspirtam, polietilēnglikolam, akāciju sveķiem (gumiarābikam), smiltij). Var testēt arī maisījumus (preparātus vai preparātu maisījumus), kas satur aktīvās vielas un dažādas palīgvielas. Iestrāde augsnē/mākslīgā substrātā 14. Ķīmiskās vielas, kas ir ūdenī šķīstošas vai suspendētas ūdenī, var pievienot ūdenim, un pēc tam šķīdumu sajauc ar augsni, izmantojot atbilstošas maisīšanas ierīces. Šī veida testēšana var būt lietderīga, ja ekspozīcija ķīmiskajai vielai notiek caur augsni vai augsnes porūdeni un ja pastāv bažas par uzņemšanu ar saknēm. Pievienojot testējamo ķīmisko vielu, nedrīkst pārsniegt augsnes ūdensnoturspēju. Pievienotā ūdens tilpumam ir jābūt vienādam visās testa koncentrācijās, bet tas jāierobežo, lai novērstu augsnes salipšanu. 15. Ķīmiskās vielas ar vāju šķīdību ūdenī izšķīdina piemērotā gaistošā šķīdinātājā (piemēram, acetons, etanols) un sajauc ar smiltīm. Šķīdinātāju pēc tam no smiltīm var atdalīt, izmantojot gaisa plūsmu, vienlaikus nepārtraukti maisot smiltis. Apstrādātās smiltis sajauc ar eksperimentālo augsni. Izveido otro kontrolparaugu, kurā pievieno tikai smiltis un šķīdinātāju. Visiem testa apstrādes paraugiem un otrajam kontrolparaugam pievieno vienādu daudzumu smilšu, kas sajauktas ar šķīdinātāju, kurš pēc tam atdalīts. Cietu, nešķīstošu testējamo ķīmisko vielu gadījumā sauso augsni un ķīmisko vielu sajauc piemērotā maisīšanas ierīcē. Pēc tam augsni ieliek podos un nekavējoties iesēj sēklas. 16. Ja augsnes vietā izmanto mākslīgo substrātu, ķīmiskās vielas, kas šķīst ūdenī, var izšķīdināt barības vielu šķīdumā tieši pirms testa sākuma. Ķīmiskās vielas, kas nešķīst ūdenī, bet kuras var suspendēt ūdenī, izmantojot šķīdinātāja nesējvielu, būtu jāpievieno barības vielu šķīdumam kopā ar nesējvielu. Ūdenī nešķīstošas ķīmiskās vielas, kurām nav pieejama netoksiska ūdenī šķīstoša nesējviela, jāizšķīdina piemērotā gaistošā šķīdinātājā. Šķīdumu sajauc ar smiltīm vai stikla pērlītēm, kas novietotas rotācijas vakuumierīcē, un iztvaicē, atstājot uz smiltīm vai lodītēm viendabīgu ķīmiskās vielas pārklājumu. Nosvērta pērlīšu daļa jāekstrahē ar to pašu organisko šķīdinātāju un ķīmiski jātestē, pirms tiek piepildīti stādīšanas konteineri. Virsas apstrāde 17. Attiecībā uz kultūraugu aizsardzības līdzekļiem apstrādei ar testējamo ķīmisko vielu bieži izmanto augsnes virsas apsmidzināšanu ar testa šķīdumu. Visām iekārtām, ko izmanto testu veikšanai, tostarp iekārtām, ko izmanto testējamās ķīmiskas vielas sagatavošanai un administrēšanai, jābūt tā konstruētām un ar tādu jaudu, lai testus ar šo ierīci varētu veikt pareizi un tie nodrošinātu reproducējamu pārklājumu. Visa augsnes virsa jānoklāj vienmērīgi. Būtu jāizvairās no situācijas, kad ķīmiskā vielu tiek adsorbēta vai reaģē ar aprīkojumu (piemēram, plastmasas caurulēm un lipofilajām ķīmiskajām vielām vai tērauda daļām un elementiem). Testējamo ķīmisko vielu izsmidzina uz augsnes virsas, imitējot tipisku uzklāšanu ar izsmidzinātāju. Kopumā izsmidzināšanas apjomam jābūt atbilstošiem parastā lauksaimniecības praksē izmantotajam un apjoms (ūdens daudzums utt.) ir jāietver pārskatā. Jāizvēlas tāds sprauslu veids, kas nodrošina vienmērīgu augsnes virsas noklāšanu. Ja tiek izmantoti šķīdinātāji un nesējvielas, jāizveido otra kontrolaugu kopa, kas saņem tikai šķīdinātāju/nesējvielu. Tas nav jādara, ja augu aizsardzības līdzekļus testē kā preparātus. Testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas/rādītāja verifikācija 18. Apstrādes koncentrācijas/rādītāji jāapstiprina, veicot attiecīgu analītisko verifikāciju. Šķīstošām vielām visas testa koncentrācijas/rādītājus var verificēt un apstiprināt, analizējot augstāko testā izmantoto šķīduma koncentrāciju, dokumentējot turpmāko atšķaidīšanu un izmantojot kalibrētas vielas uzklāšanas iekārtas (piemēram, kalibrēti analītiskie stikla trauki, smidzinātāja iekārtas kalibrēšana). Nešķīstošām ķīmiskajām vielām sastāvdaļu materiāla verifikācija jānodrošina ar augsnei pievienotās testējamās ķīmiskās vielas nosvēršanu. Ja nepieciešams uzrādīt homogenitāti, var būt nepieciešams veikt augsnes analīzes. PROCEDŪRA Testēšanas plāns 19. Vienas sugas sēklas tiek iesētas podos. Podos iesēto augu sēklu skaits ir atkarīgs no augu sugas, poda izmēra un testa ilguma. Jānodrošina tāds augu skaits podā, lai būtu atbilstoši augšanas apstākļi un podi testa veikšanas laikā nebūtu pārblīvēti. Maksimālais augu blīvums ir aptuveni 3–10 sēklas uz 100 cm2, atkarībā no sēklu izmēra. Piemēram, ieteicams viens vai divi kukurūzas, sojas pupiņu, tomātu, gurķu vai cukurbiešu augi 15 cm traukā, trīs rapša vai zirņu augi 15 cm traukā un 5 līdz 10 sīpolu, kviešu, vai citu sīku sēklu 15 cm traukā. Sēklu skaitam un replikātu podu (replikāts saskaņā ar definīciju ir pods, tāpēc augi vienā podā neveido replikātu) skaitam jābūt pietiekamam optimālai statistiskai analīzei (21). Jāievēro, ka mainīgums būs lielāks tām testa sugām, kurām izmanto mazāku skaitu lielu sēklu vienā podā (replikātā), salīdzinot ar testa sugām, kurām katrā podā iespējams izmantot lielāku skaitu sīku sēklu. Stādot vienādu skaitu sēklu katrā podā, šo mainību var samazināt līdz minimumam. 20. Kontrolgrupas izmanto, lai nodrošinātu, ka novērotā ietekme ir saistīta tikai ar ekspozīciju testējamai ķīmiskajai vielai vai attiecināma uz to. Atbilstošajai kontrolgrupai ir visos aspektos jābūt identiskai testa grupai, izņemot to, ka tā netiek eksponēta testējamai ķīmiskajai vielai. Attiecīgajā testā visiem testa augiem, tostarp kontrolgrupai, vajadzētu būt no viena avota. Lai novērstu neobjektivitāti, testa un kontrolgrupas podi jāizraugās pēc nejaušības principa. 21. Būtu jāizvairās izmantot sēklas, kas pārklātas ar insekticīdu vai fungicīdu (t. i., “apstrādātas” sēklas). Tomēr dažas regulējošās iestādes atļauj noteiktu ārpussistēmas saskares fungicīdu (piemēram, kaptāna, tirama) lietošanu (22). Ja ir bažas par patogēniem sēklās, sēklas uz neilgu laiku var iemērkt vājā 5 % hipohlorīta šķīdumā, pēc tam kārtīgi noskalot tekošā ūdenī un izžāvēt. Nav atļauta nekāda korektīva apstrāde ar citu augu aizsardzības līdzekli. Testa apstākļi 22. Testa apstākļi būtu jātuvina tiem apstākļiem, kas nepieciešami normālai testa sugu un varietāšu augšanai (4. papildinājumā ir norādīti testa apstākļu piemēri). Arī dīgstošie augi jātur atbilstoši labai dārzkopības praksei kontrolētas vides kamerās, augšanas kamerās vai siltumnīcās. Izmantojot augšanas iekārtas, šāda prakse parasti ietver kontroli un šādu datu pietiekami biežu (piemēram, ik dienas) reģistrāciju: temperatūra, mitrums, oglekļa dioksīda koncentrācija, gaisma (intensitāte, viļņu garums, fotosintēzes aktivitātei atbilstošā spektra daļa) un gaismas periodu, laistīšanas līdzekļi utt., lai nodrošinātu labu augšanu, ko novērtē ar izraudzītās sugas kontrolaugiem. Siltumnīcā temperatūru kontrolē, izmantojot ventilēšanas, apkures un/vai dzesēšanas sistēmas. Turpmāk norādīti apstākļi, kas ieteicami testēšanai siltumnīcās: — temperatūra: 22 °C ± 10 °C; — mitrums: 70 % ± 25 %; — fotoperiods: gaisma vismaz 16 stundas; — gaismas intensitāte: 350 ± 50 μE/m2/s. Ja gaismas intensitāte nokrītas zem 200 μE/m2/s, viļņu garuma 400–700 nm, var būt nepieciešama papildu apgaismošana, izņemot noteiktām sugām, kuru prasības pēc gaismas ir zemākas. Pētījuma laikā jāmonitorē un pārskatā jāiekļauj informācija par vides apstākļiem. Augi audzējami neporainos plastmasas vai glazētos podos ar paplāti vai paliktni zem tiem. Laiku pa laikam podi ir jāpārvieto, lai līdz minimumam samazinātu mainību augu augšanā (audzēšanas iekārtu testēšanas apstākļu atšķirību dēļ). Podiem ir jābūt pietiekami lieliem, lai nodrošinātu normālu augšanu. 23. Augsnes barības vielas var papildināt, cik nepieciešams, lai uzturētu labu dzīvotspēju. Par papildu barības vielu nepieciešamību un padeves laiku var spriest, novērojot kontrolaugus. Testa konteineros ieteicama laistīšana no apakšas (piemēram, izmantojot stikla šķiedras daktis). Tomēr sākotnēji var izmantot laistīšanu no augšas, lai stimulētu sēklu dīgšanu; paraugos, kur veikta augsnes virsas apstrāde, tas atvieglos ķīmiskās vielas virzību augsnē. 24. Konkrētajiem augšanas apstākļiem ir jābūt piemērotiem testa sugām un testējamajām ķīmiskajām vielām. Kontrolaugi un apstrādātie augi ir jāglabā vienādos vides apstākļos, tomēr būtu jāveic piemēroti pasākumi, lai novērstu šķērsekspozīciju (piemēram, gaistošām ķīmiskajām vielām) starp dažādiem apstrādes testējamās ķīmiskās vielas paraugiem un kontrolgrupām. Vienas koncentrācijas/rādītāja testēšana 25. Lai noteiktu ķīmiskās vielas koncentrāciju/rādītāju, ar kuru veikt vienas koncentrācijas/rādītāja (provocēšanas/robežas) testu, ir jāņem vērā vairāki faktori. Vispārējām ķīmiskām vielām tie ietver arī vielas fizikālķīmiskās īpašības. Attiecībā uz augu aizsardzības līdzekļiem jāņem vērā testējamās ķīmiskās vielas fizikālķīmiskās īpašības un izmantošanas modelis, testējamās ķīmiskās vielas maksimālā koncentrācija vai lietojuma deva, lietošanas reižu skaits vienā sezonā un/vai noturība. Lai noteiktu, vai vispārējai ķīmiskai vielai piemīt fitotoksiskas īpašības, to var būt lietderīgi pārbaudīt testā maksimālajā līmenī – 1 000 mg/kg sausas augsnes. Diapazona noteikšanas tests 26. Ja nepieciešams, diapazona noteikšanas testu var veikt, lai gūtu norādījumus par koncentrācijām/rādītājiem, kas jātestē galīgajā devas un atbildreakcijas pētījumā. Diapazona noteikšanas testā testa koncentrācijām/rādītājiem jābūt ar plašiem intervāliem (piemēram, 0,1, 1,0, 10, 100 un 1 000 mg/kg sausas augsnes). Augu aizsardzības līdzekļu koncentrācijas/rādītāji varētu būt balstīti uz ieteicamo vai maksimālo koncentrāciju vai lietošanas rādītāju, piemēram, 1/100, 1/10, 1/1 no ieteicamās/maksimālās koncentrācijas vai lietošanas rādītāja. Vairāku koncentrāciju/daudzumu testēšana 27. Vairāku koncentrāciju/rādītāju testa mērķis ir noteikt devas un atbildreakcijas sakarību un noteikt ECx vai ERx vērtību uzdīgšanai, biomasai un/vai redzamajai ietekmei, salīdzinot ar kontrolgrupām, kuras nav eksponētas vielai, saskaņā ar pārvaldes iestāžu prasībām. 28. Koncentrāciju vai rādītāju skaitam un intervāliem būtu jābūt pietiekamiem, lai varētu iegūt uzticamu devas un atbildreakcijas sakarību un regresijas vienādojumu, kā arī aplēst ECx vai ERx vērtības. Izraudzītajām koncentrācijām/rādītājiem būtu jāietver nosakāmās ECx vai ERx vērtības. Piemēram, ja ir nepieciešama EC50 vērtība, būtu vēlams veikt testēšanu pie rādītājiem, kas rada 20 līdz 80 % ietekmi. Lai to sasniegtu, ieteicamais testa koncentrāciju/rādītāju skaits ir vismaz pieci ģeometriskā progresijā un neapstrādātā kontrole intervālos ar kvocientu, kas nepārsniedz trīs. Katrā apstrādes grupā un kontrolgrupā ir jābūt vismaz četriem replikātiem un kopā vismaz 20 sēklām. Tādiem augiem, kam ir zema dīgtspēja vai mainīgi augšanas paradumi, var būt nepieciešams izmantot vairāk replikātu, lai uzlabotu testa statistisko jaudu. Ja tiek izmantots lielāks skaits testa koncentrāciju/rādītāju, replikātu skaitu var samazināt. Ja ir jānosaka NOEC, var būt nepieciešams izveidot vairāk replikātu, lai panāktu vēlamo statistisko jaudu (23). Novērojumi 29. Novērošanas periodā, proti, 14 līdz 21 dienu pēc tam, kad ir izdīguši 50 % no kontrolgrupas augiem (arī šķīdinātāja kontrolgrupas augiem, ja tāda ir), augus novēro bieži (vismaz reizi nedēļā, bet, ja iespējams, ik dienas) attiecībā uz to uzdīgšanu un redzamo fitotoksiskumu un mirstību. Testa beigās reģistrē izdzīvojušo augu uzdīgšanas un biomasas procentuālos mērījumus, kā arī redzamo kaitīgo ietekmi uz dažādām auga daļām. Tas ietver uzdīgušo dīgstu izskata anomālijas, kavētu augšanu, hlorozi, krāsas zaudēšanu, mirstību un ietekmi uz augu attīstību. Galīgo biomasu var izmērīt, izmantojot izdzīvojušo augu galīgo vidējo sauso dzinumu svaru, ievācot dzinumus pie augsnes virskārtas un tos žāvējot līdz nemainīgam svaram 60 °C temperatūrā. Galīgo biomasu var mērīt, arī izmantojot svaigu dzinumu svaru. Ja to prasa pārvaldes iestādes, beigupunkts var būt arī dzinumu garums. Būtu jāizmanto vienota vizuālo bojājumu uzskaites sistēma, lai novērtētu toksicitātes atbildreakcijas. Piemēri kvalitatīvā un kvantitatīvā vizuālā novērtējuma veikšanai ir doti atsaucēs (23)(24). DATI UN PĀRSKATU SAGATAVOŠANA Statistiskā analīze Vienas koncentrācijas/rādītāja tests 30. Dati par katru augu sugu ir jāanalizē, izmantojot piemērotu statistisko metodi (21). Jāreģistrē testa koncentrācijas/rādītāja ietekmes līmenis vai arī attiecīgās ietekmes nesasniegšana pie testa koncentrācijas/rādītāja (piemēram, < x % ietekme, novērota pie y koncentrācijas vai rādītāja) Vairāku koncentrāciju/rādītāju tests 31. Devas un atbildreakcijas sakarību nosaka regresijas vienādojuma izteiksmē. Var izmantot dažādus modeļus, piemēram, ECx vai ERx noteikšanai (piemēram, EC25, ER25, EC50, ER50) un tā uzdīgšanas ticamības robežām var būt piemēroti binārie dati, logita, probita, Veibula, Spīrmena–Kerbera saīsinātā metode. Dīgstu augšanu (svars un garums) kā nepārtrauktus ECx vai ERx beigupunktus un to ticamības robežas var aprēķināt, izmantojot atbilstošu regresijas analīzi (piemēram, Brūsa–Ferštēga (Bruce-Versteeg) nelineārās regresijas analīzi (25)). Kad vien iespējams, visjutīgākajām sugām R2 ir jābūt 0,7 vai augstākam un izmantotajām testa koncentrācijām/rādītājiem jāietver 20 % līdz 80 % ietekmes. Ja jānosaka NOEC, būtu jādod priekšroka jaudīgu statistisko testu izmantošanai un tie būtu jāizvēlas, balstoties uz datu sadalījumu (21)(26). Testēšanas pārskats 32. Testēšanas pārskatā jāparāda pētījumu rezultāti, kā arī sīks testa apstākļu apraksts, detalizēta rezultātu apspriešana, datu analīze un analīzes rezultātā izdarītie secinājumi. Jāsniedz arī pārskats tabulas veidā un rezultātu kopsavilkums. Pārskatā iekļauj turpmāk norādītos elementus. Testējamā ķīmiskā viela: — ķīmiskās vielas identifikācijas dati, attiecīgās testējamās ķīmiskās vielas īpašības (piemēram, log Pow, šķīdība ūdenī, tvaika spiediens un informācija par vielas apriti vidē un mijiedarbību ar to, kā arī uzvedība, ja informācija ir pieejama); — informācija par testa šķīduma pagatavošanu un testa koncentrāciju verifikāciju, kā norādīts 18. punktā. Testa suga: — informācija par testa organismu: suga/varietāte, augu dzimtas, zinātniskie un vispārpieņemtie nosaukumi, pēc iespējas sīkāka informācija par sēklu avotu un vēsturi (t. i., piegādātāja nosaukums, dīgtspēja procentos, sēklu lieluma klase, grupas vai partijas numurs, sēklu ievākšanas gads vai augšanas sezona, dīgtspējas novērtējuma datums), dzīvotspēja utt.; — testēto viendīgļlapju un divdīgļlapju sugu skaits; — sugu izraudzīšanās pamatojums; — sēklu uzglabāšanas, apstrādes un uzturēšanas apraksts. Testa apstākļi: — testēšanas iekārta (piemēram, augšanas kamera, fitotrons vai siltumnīca); — testēšanas sistēmas apraksts (piemēram, podu izmēri, podu materiāli un augsnes daudzums); — augsnes apraksts (augsnes tekstūra vai tips: augsnes daļiņu sadalījums un klasifikācija, fizikālķīmiskās īpašības, tostarp organisko vielu %, organiskā oglekļa % un pH); — augsnes/substrāta (piemēram, augsnes, mākslīgās augsnes, smiltšu un citu) sagatavošana pirms testa; — barotnes apraksts, ja tādu izmanto; — testējamās ķīmiskās vielas lietojums: lietošanas metodes apraksts, aprīkojuma apraksts, ekspozīcijas rādītāji un apjomi, tostarp ķīmiskā verifikācija, kalibrēšanas metodes apraksts un lietošanas laika vides apstākļu apraksts; — augšanas apstākļi: gaismas intensitāte (piemēram, PAR, fotosintēzes aktivitātei atbilstošā spektra daļa), fotoperiods, maksimālā/minimālā temperatūra, laistīšanas grafiks un metode, mēslošana; — sēklu skaits podā, augu skaits uz devu, replikātu (podu) skaits uz ekspozīcijas rādītāju; — kontrolparaugu veids un skaits (negatīvi un/vai pozitīvi kontrolparaugi, arī šķīdinātāja kontrolparaugs, ja tādu izmanto); — testa ilgums. Rezultāti: — tabula par katra replikāta, testa koncentrācijas/rādītāja un sugas beigupunktiem; — uzdīgušo dīgstu skaits un procentuālais salīdzinājums ar kontrolparaugiem; — biomasas mērījumi (dzinumu saussvars vai svaigsvars) procentos no kontrolparaugiem; — augu dzinumu garums procentos no kontrolparaugiem, ja to mēra; — testējamās ķīmiskās vielas iedarbībā radušos redzamo bojājumu procentuālā vērtība un kvalitatīvs un kvantitatīvs redzamo bojājumu apraksts (hloroze, nektroze, vīte, lapu un stublāju deformācija, kā arī nenovērota ietekme), salīdzinot ar kontrolgrupas augiem; — izmantotās vērtējuma skalas apraksts, ar kuru novērtē redzamos bojājumus, ja tiek sniegts vizuāls vērtējums; — viena rādītāja pētījumiem pārskatā jāiekļauj bojājumi procentos; — ECx vai ERx (piemēram, EC50, ER50, EC25, ER25) vērtības un ar tām saistītās ticamības robežas. Ja ir veikta regresijas analīze, norāda regresijas vienādojuma standartkļūdu un individuālo parametru novērtējuma standartkļūdu (piemēram, virziena koeficients, krustpunkts); — NOEC (un LOEC) vērtība, ja tā aprēķināta; — statistisko procedūru un izmantoto pieņēmumu apraksts; — šo datu un testētās sugas devas un atbildreakcijas sakarības grafisks attēlojums. Ziņo par atkāpēm no testa procedūrām, kas aprakstītas šajā testa metodē, un jebkuriem neraksturīgiem notikumiem testa laikā. LITERATŪRA (1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Ind. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. (13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. (19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OECD (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (22) Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. (26) Šā pielikuma C33. nodaļa “Slieku vairošanās tests (Eisenia fetida/Eisenia andrei)”. 1. papildinājums Definīcijas Aktīvā sastāvdaļa (AS) (vai aktīvā viela (AV)) ir viela, ar ko paredzēts nodrošināt īpašu bioloģisko ietekmi (piemēram, insektu kontroli, augu slimību kontroli, nezāļu kontroli apstrādes zonā); to dēvē arī par tehniskās tīrības pakāpes aktīvo sastāvdaļu, aktīvo vielu. Ķīmiskā viela ir viela vai to maisījums. Kultūraugu aizsardzības līdzekļi (CPP) vai augu aizsardzības produkti (PPP) , vai pesticīdi ir tādas vielas ar noteiktu bioloģisko aktivitāti, ko ar nolūku lieto kultūraugu aizsargāšanai pret kaitēkļiem (piemēram, sēnīšu slimībām, kukaiņiem un konkurējošiem augiem). ECx. X % ietekmes koncentrācija vai ERx. x % ietekmes rādītājs ir koncentrācija vai rādītājs, kas mērītajā testa beigupunktā rada nelabvēlīgas x % izmaiņas salīdzinājumā ar kontrolgrupu (piemēram, par 25 % vai 50 % samazina dīgstu uzdīgšanu, dzinumu svaru, galīgo augu skaitu vai palielina vizuālos bojājumus, kas attiecīgi atbilstu EC25/ER25 vai EC50/ER50). Uzdīgšana ir koleoptila vai dīgļlapas parādīšanās virs augsnes virsas. Preparāts ir komerciāls produkts, kas satur aktīvo vielu (aktīvo sastāvdaļu), pazīstams arī kā galapreparāts (8) vai tipisks galapatēriņa produkts (TEP). Zemākā novērojamās ietekmes koncentrācija (LOEC) ir zemākā testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, pie kuras novērota ietekme. Šajā testā koncentrācijai, kas atbilst LOEC, attiecīgajā ekspozīcijas periodā, salīdzinot ar kontrolgrupu, ir statistiski nozīmīga ietekme (p < 0,05) un tā ir augstāka par NOEC vērtību. Nemērķa augi ir augi, kas neatrodas mērķaugu zonā. Attiecībā uz kultūraugu aizsardzības līdzekļiem tas parasti attiecas uz augiem ārpus apstrādes zonas. Nenovērojamās ietekmes koncentrācija (NOEC) ir testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, pie kuras nav novērota nekāda ietekme. Šajā testā koncentrācijai, kas atbilst NOEC, attiecīgajā ekspozīcijas periodā, salīdzinot ar kontrolgrupu, nav statistiski nozīmīgas ietekmes (p < 0,05). Fitotoksiskums: kaitīgās novirzes (saskaņā ar mērījumiem un vizuālo novērtējumu) no normāla augu izskata un augšanas konkrētas ķīmiskās vielas ietekmē. Replikāts ir eksperimenta vienība, kas reprezentē kontrolgrupu un/vai apstrādes grupu. Šajos pētījumos audzēšanas pods pēc definīcijas ir replikāts. Vizuāls novērtējums: vizuālo bojājumu novērtējums, kura pamatā ir auga stāves, augtspēja, anomāliju, hlorozes, nekrozes un vispārējā izskata novērojumi, ko salīdzina ar kontrolgrupu. Testējamā ķīmiskā viela ir jebkura viela vai to maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi. 2. papildinājums To augu sugu saraksts, kas vēsturiski izmantoti testēšanā Dzimta Suga Vispārpieņemtie nosaukumi DIVDĪGĻLAPJI (DICOTYLEDONAE) Čemurziežu Daucus carota Savvaļas burkāns Kurvjziežu Helianthus annuus Vasaras saulgrieze Kurvjziežu Lactuca sativa Dārza salāti Krustziežu Sinapis alba Baltā sinepe Krustziežu Brassica campestris var. chinensis Ķīnas kāposts Krustziežu Brassica napus Rapsis Krustziežu Brassica oleracea var. capitata Galviņkāposts Krustziežu Brassica rapa Ripsis Krustziežu Lepidium sativum Dārza cietķērsa Krustziežu Raphanus sativus Rutks (redīss) Balandu Beta vulgaris Biete Ķirbju Cucumis sativus Lauka gurķis Tauriņziežu Glycine max (G. soja) Soja Tauriņziežu Phaseolus aureus Zeltainā pupiņa Tauriņziežu Phaseolus vulgaris Parastā pupiņa Tauriņziežu Pisum sativum Sējas zirnis Tauriņziežu Trigonella foenum-graecum Grieķu trigonella Tauriņziežu Lotus corniculatus Ragainais vanagnadziņš Tauriņziežu Trifolium pratense Pļavas āboliņš Tauriņziežu Vicia sativa Sējas vīķis Linu Linum usitatissimum Sējas lins Sūreņu Fagopyrum esculentum Sējas griķis Nakteņu Solanum lycopersicon Parastais tomāts VIENDĪGĻLAPJI (MONOCOTYLEDONAE) Liliju Allium cepa Dārza sīpols Graudzāļu Avena sativa Sējas auza Graudzāļu Hordeum vulgare Parastais miezis Graudzāļu Lolium perenne Daudzgadīgā airene Graudzāļu Oryza sativa Sējas rīss Graudzāļu Secale cereale Sējas rudzi Graudzāļu Sorghum bicolor Parastais sorgo Graudzāļu Triticum aestivum Parastais kviesis Graudzāļu Zea mays Parastā kukurūza 3. papildinājums Potenciālais saraksts sugām, kas nav kultūraugi ESAO potenciālās sugas augu toksicitātes testiem Piezīme: turpmākajā tabulā ir sniegta informācija par 52 sugām, kas nav kultūraugi (katram ierakstam iekavās ir sniegtas atsauces). Uzdīgšanas rādītāji ir aizgūti no publicētās literatūras, un tie ir paredzēti tikai kā vispārēja norāde. Individuālā pieredze var atšķirties atkarībā no sēklu izcelsmes un citiem faktoriem. DZIMTA, sugas botāniskais nosaukums (vispārpieņemtais nosaukums latviešu valodā) Dzīves ilgums (9) un dzīvotne Sēklas svars (mg) Dīgšanas vai augšanas fotoperiods (10) Augšanas dziļums (mm) (11) Dīgšanas ilgums (dienas) (12) Īpaša apstrāde (13) Toksicitātes tests (14) Sēklu piegādātāji (15) Citas atsauces (16) APIACEAE Torilis japónica (Japānas sārtburkšķis) А, В traucējumu skartas platības, dzīvžogi, ganības (16, 19) 1,7–1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) aukstā stratifikācija (7, 14, 18, 19), var būt nepieciešama nobriešana (19), dīgšanu inhibē tumsa (1, 19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5) PĒC (5) ASTERACEAE Bellis perennis (ilgziedu mārpuķīte) Ρ pļavas, aramlauki, velēnas platības (16, 19) 0,09–0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) apstarošana neietekmē dīgšanu (18, 19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (4, 14) PĒC (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (zilā rudzupuķe) A lauki, ceļmalas, klajas dzīvotnes (16) 4,1–4,9 (4, 14) L = D (14) 0–3 (2, 4, 14) 14–21 (100 %) (14) nav īpašu apstrādes nosacījumu (2, 4) PĒC (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (melnā zilgalvīte) Ρ lauki, ceļmalas, klajas dzīvotnes (16, 19) 2,4–2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) var būt nepieciešama nobriešana (18, 19), dīgšanu imhibē tumsa (19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 14, 26) PĒC (5, 22, 26) A Inula helenium (helēniju ālante) Ρ mitrāji, traucējumu skartas vietas (16) 1–1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) nav īpašu apstrādes nosacījumu (4) PĒC (4) A, F Leontodon hispidus (matainā vēlpiene) Ρ lauki, ceļmalas, traucējumu skartas platības (16, 19) 0,85 -1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) dīgšanu kavē tumsa (17, 18, 19) nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 23) PĒC (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (pūkainā saulcerīte) Β, Ρ traucējumu skartas vietas (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) nav īpašu apstrādes nosacījumu (4, 14, 33) PĒC (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (Kanādas zeltgalvīte) Ρ ganības, klajas dzīvotnes (16) 0,06–0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14–21 (11) sajaukt ar smiltīm vienādās proporcijās un mērcēt 500 vienībās glutaraldehīdā uz miljonu vienību šķīdinātāja 24 stundas (11), nav īpašu apstrādes nosacījumu (4) PĒC (4) E, F Xanthium pensylvanicum (Pensilvānijas smaildadzis) A lauki, klajas dzīvotnes (16) 25–61 (14, 29) 0(1) 5(29) dīgšanu var inhibēt tumsa (1), mērcēt siltā ūdenī 12 stundas (29) PIRMS un PĒC (31) A Xanthium spinosum (dzeloņainais smaildadzis) A klajas dzīvotnes (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) skarifikācija (14), nav īpašu apstrādes nosacījumu (6) PIRMS un PĒC (6) A Xanthium strumarium (dziedzerainais smaildadzis) A lauki, klajas dzīvotnes (16) 67,4 (14) L = D (14) 10–20 (6, 21) nav īpašu apstrādes nosacījumu (6, 14, 21) PIRMS un PĒC (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (pļavas ķērsa) Ρ lauki, ceļmalas, velēnas platības (16, 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) dīgšanu inhibē tumsa (18, 19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 14, 22) PĒC (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (pļavas spulgnaglene) Ρ (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) var būt nepieciešama nobriešana (18), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 14, 15, 22–26) PĒC (5, 15, 22–26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (baltā balanda) A laukmales, traucējumu skartas platības (16, 19) 0,7–1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) apstrāde atšķiras atkarībā no sēklu krāsas (19), sausumā ir miera periods (19), dīgšanu inhibē tumsa (1, 18, 19), aukstā stratifikācija (18), nav īpašu apstrādes nosacījumu (14, 34) PIRMS un PĒC (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (divšķautņu asinszāle) Ρ lauki, aramzeme, klajas dzīvotnes (16, 19) 0,1 –0,23 (14, 19) L= D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) dīgšanu inhibē tumsa (1, 18, 19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 14, 15, 25, 27) PĒC (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (īvjlapu ipomeja) A ceļmalas, klajas dzīvotnes, labības lauki (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10–20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) apstarošana neietekmē dīgšanu (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (6, 21) PIRMS un PĒC (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (apaļais dižmeldrs) Ρ aramzeme, ganības, ceļmalas (16, 30) 0,2 (14) L= D (14) 0 (1) 10–20 (6, 10) 12 (91 %) (10) dīgšanu inhibē tumsa (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (6, 10, 14) PIRMS un PĒC (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (ragainais vanagnadziņš) Ρ zālainas platības, ceļmalas, klajas dzīvotnes (16, 19) 1–1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) skarifikācija (14, 19), apstarošana neietekmē dīgšanu (18, 19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (23, 25) PĒC (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (platlapu kasija, platlapu senna) A mitri meži (16) 23–28 (9) L = D (14) L > D (9) 10–20 (6,9) mērcēt sēklas ūdenī 24 stundas (9), skarifikācija (14), sēklu dzīvotspēja atšķiras atkarībā no krāsas (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (6) PĒC (6,9) A Sesbania exaltata (kaņepju sebānija) A aluviāla augsne (16) 11–13 (9, 14) L > D (9) 10–20 (9, 21) mērcēt sēklas ūdenī 24 stundas (9), apstarošana neietekmē dīgšanu (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (21) PIRMS un PĒC (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (pļavas āboliņš) Ρ lauki, ceļmalas, aramzeme (16, 19) 1,4–1,7 (14, 19) L= D (14) 1 (50 %) (19) skarifikācija (14, 18), var būt nepieciešama nobriešana (19), apstarošana neietekmē dīgšanu (1, 19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5) PĒC (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (sirds mātere) Ρ klajumi (16) 0,75–1,0 (4, 14) L= D (14) 0 (4) nav īpašu apstrādes nosacījumu (4, 14) PĒC (4) F Mentha spicata (krūzmētra) Ρ mitrāji (16) 2,21 (4) 0 (4) nav īpašu apstrādes nosacījumu (4) PĒC (4) F Nepeta cataria (īstā kaķumētra) Ρ traucējumu skartas platības (16) 0,54 (4, 14) L= D (14) 0 (4) nav īpašu apstrādes nosacījumu (2, 4, 14) PĒC (2,4) F Prunella vulgaris (parastā brūngalvīte) Ρ aramlauki, zālainas platības, traucējumu skartas vietas (16, 19) 0,58–1,2 (4, 14, 19) L= D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) dīgšanu inhibē tumsa (18, 19), lielākas sēklas dīgst labāk (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (4, 14, 22) PĒC (4, 22) A, F Stachys officinalis (ārstniecības pātaine) Ρ pļavas, laukmales (19) 14–18 (14, 19) L= D (14) 7 (50 %) (19) nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 14, 22) PĒC (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (Teofrasta virvene) A lauki, klajas dzīvotnes (16) 8.8 (14) L= D (14) 10–20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) skarifikācija (14), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 10, 21) PIRMS un PĒC (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (dzeloņainā alteja) A lauki, ceļmalas (16) 3,8 (14) L= D (14) 10–20 (6, 21) skarifikācija (14), apstarošana neietekmē dīgšanu (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (6, 21) PIRMS un PĒC (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (zīda magone) A lauki, aramzeme, traucējumu skartas vietas (16, 19) 0,1–0,3 (4, 14, 19, 29) L= D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) aukstā stratifikācija un skarifikācija (1, 19, 32), nav īpašu apstrādes nosacījumu (4, 14, 29) PĒC (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis, (parastā smilga) zālieni, ganības (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) dīgšanu inhibē tumsa (1, 17–19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (10) PĒC (10) A, E Alopecurus myosuroides (peļastīšu lapsaste) A lauki, klajas dzīvotnes (16) 0,9–1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) skarifikācija (14), apstrādāt ar 101 mg/L KNO3 (14), siltā stratifikācija (1), dīgšanu inhibē tumsa (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (34) PIRMS un PĒC (28, 34) A 32 Avena fatua (vēja auza) A apstrādājamas platības, klajumi (16) 7–37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10–20 (6, 10) 3 (70 %) (18) skarifikācija (7, 32), dīgšanu inhibē tumsa (1) aukstā stratifikācija (1, 18), nav īpašu apstrādes nosacījumu (6, 10, 14) PIRMS un PĒC (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (īstā jumtauza) A lauki, ceļmalas, aramzeme (16) 0,45–2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) nobriešanas periods (1, 7, 32), dīgšanu inhibē gaisma (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (14) PIRMS un PĒC (28, 31) A Cynosurus cristatus (parastā sekstaine) P lauki, ceļmalas, klajumi (16, 19) 0,5–0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) apstarošana neietekmē dīgšanu (19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (14, 29) PĒC (5) A Digitaria sanguinalis (asinssarkanā pasāre) A lauki, velēnas platības, klajumi (16) 0,52–0,6 (14, 30) L = D (14) 10–20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) skarifikācija, aukstā stratifikācija un nobriešana (1, 7, 14, 32), apstrādāt ar 101 mg/L KNO3 (14), dīgšanu inhibē tumsa (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (21) PIRMS un PĒC (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (parastā gaiļsāre) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10–20 (7, 21) skarifikācija (7, 32), apstarošana neietekmē dīgšanu (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (3, 14, 21) PIRMS un PĒC (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (Kanādas savvaļas rudzi) P upmalas, traucējumu skartas vietas (16) 4–5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14–28 (11) nav īpašu apstrādes nosacījumu (2, 11) PĒC (2) C, D, E Festuca pratensis (pļavas auzene) P lauki, mitrāji (16, 19) 1,53–2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) nav īpašu apstrādes nosacījumu (10, 19) PĒC (10) A 7 Hordeum pusillum (pundurmiezis) A ganības, ceļmalas, klajumi (16) 3,28 (14) siltā stratifikācija (1), apstarošana neietekmē dīgšanu (1) PIRMS (31) 7 Phieum pratense (pļavas timotiņš) P ganības, aramlauki, traucējumu skartas vietas (16, 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0–10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) dīgšanu inhibē tumsa (19), apstarošana neietekmē dīgšanu (17), nav īpašu apstrādes nosacījumu (10, 14, 17, 19) PĒC (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (dārza vējgriķis) A klajumi, ceļmalas (16) 5–8 (4, 14, 29) L = D (20) 0–2 (4, 29) aukstā stratifikācija 4–8 nedēļas (1, 2, 4, 20, 29), apstarošana neietekmē dīgšanu (1) PIRMS un PĒC 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (skābeņlapu sūrene) A mitra augsne (16) 1,8–2,5 (14) L > D (6) 5 (94 %) (18) apstarošana neietekmē dīgšanu (1), dīgšanu inhibē tumsa (18), aukstā stratifikācija (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5) PIRMS un PĒC (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (Pensilvānijas sūrene) A lauki, klajumi (16) 3,6–7 (14, 29) 2 (29) aukstā stratifikācija 4 nedēļas 0–5 °C temperatūrā (1, 29), dīgšanu inhibē tumsa (1) PIRMS (31) A, E Polygonum persicaria (blusu sūrene) A traucējumu skartas platības, aramzeme (16, 19) 2,1 –2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) skarifikācija, aukstā stratifikācija, apstrāde ar glutaraldehīdu (14), aukstā stratifikācija, nobriešana (17–19), dīgšanu inhibē tumsa (19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (13) PĒC (13) A 32 Rumex crispus (cirtainā skābene) P aramlauki, ceļmalas, klajumi (16, 19) 1,3–1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) dīgšanu inhibē tumsa (18, 19), var būt nepieciešama nobriešana (18), nav īpašu apstrādes nosacījumu (4, 14, 33) PĒC (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (tīruma pavirza) A aramlauki, klajumi, traucējumu skartas vietas (16, 19) 0,4–0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) aukstā stratifikācija, apstrāde ar glutaraldehīdu (1,14, 18, 19, 32), dīgšanai nepieciešama gaisma (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (2, 4) PĒC (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (kodīgā gundega) Ρ aramlauki, ceļmalas, klajumi (16, 19) 1,5–2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41–56 (19, 29) nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 14, 22, 24–26) PĒC (5, 22, 24–26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (pilsētas bitene) Ρ dzīvžogi, mitrāji (16, 19) 0,8–1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) dīgšanu inhibē tumsa (18, 19), siltā stratifikācija (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 14, 22, 25, 26) PĒC (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (ķeraiņu madara) A aramlauki, mitrāji, traucējumu skartas vietas (16, 19) 7–9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) aukstā stratifikācija (1, 18, 19), apstarošana neietekmē dīgšanu (18, 19), gaisma inhibē dīgšanu (1), nav īpašu apstrādes nosacījumu (6, 14) PIRMS un PĒC (6, 28) A 32 Galium mollugo (mīkstā madara) Ρ dzīvžogu vaļņi, klajumi (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) nav īpašu apstrādes nosacījumu (5, 14, 22, 24, 26, 29) PĒC (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (sarkanā uzpirkstīte) Β, Ρ dzīvžogi, klajumi (16, 19) 0,1–0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) dīgšanu inhibē tumsa (1, 17–19), nav īpašu apstrādes nosacījumu (4, 22–26) PĒC (4, 22–26) D, G, F Veronica persica (Persijas veronika) A aramlauki, klajumi, traucējumu skartas vietas (16, 19) 0,5–0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3(19) 5 (96 %) (18) dīgšanu inhibē tumsa (18, 19), aukstā stratifikācija (18), nav īpašu apstrādes nosacījumu (14) PIRMS un PĒC (28) A 32 Sēklu piegādātāji Piegādātāja ID Informācija par piegādātāju A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344–4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586–3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431–7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873–3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274–7333 www.thompson-morgan.com ATSAUCES (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. (6) Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. pp 197 – 208. (7) Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. (10) Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. pp. 151 – 156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Personal communication. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. (13) Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. (14) Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. (16) Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. (18) Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. (19) Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London (20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. (21) Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. (22) Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. (23) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. (24) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. (25) Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. (26) Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. (27) Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. pp. 1021-1028. (28) McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Personal communication. (34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. 4. papildinājums Noteiktām kultūraugu sugām piemērotu augšanas apstākļu piemēri Ir noskaidrots, ka turpmāk minētie apstākļi ir piemēroti 10 kultūraugu sugām un tos var izmantot kā orientierus arī testiem augšanas kamerās, kuros izmanto dažas citas sugas: oglekļa dioksīda koncentrācija: 350 ± 50 daļiņas uz miljonu; relatīvais gaisa mitrums: 70 ± 5 % gaišajos periodos 90 ± 5 % tumšajos periodos; temperatūra: 25 ± 3 °C dienā, 20 ± 3 °C naktī; fotoperiods: 16 stundas gaismā/8 stundas tumsā, pieņemot, ka vidējais viļņu garums ir no 400 līdz 700 nm; gaismas spilgtums – 350 ± 50 μE/m2/s, mērot lapotnes augšā. Kultūraugu sugas: — parastais tomāts (Solanum lycopersicon); — lauka gurķis (Cucumis sativus); — dārza salāti (Lactuca sativa); — soja (Glycine max); — galviņkāposts (Brassica oleracea var. capitata); — savvaļas burkāns (Daucus carota); — sējas auza (Avena sativa); — daudzgadīgā airene (Lolium perenne); — parastā kukurūza (Zea mays); — dārza sīpols (Allium cepa). C.32. SĪKSLIEKU VAIROŠANĀS TESTS IEVADS 1. Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (TG) 220 (2004. gads). Tā ir izveidota, lai izvērtētu ķīmisko vielu ietekmi uz sīkslieku Enchytraeus albidus (Henle, 1873) vairošanos augsnē. Tā galvenokārt balstīta uz metodi, ko izstrādāja Vācijas Federatīvā vides pārvalde (1) un kas ir pārbaudīta starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā (2). Tika apsvērtas arī citas testēšanas metodes, ar kurām testēt ķīmisko vielu toksicitāti sīksliekām (Enchytraeidae) un sliekām (3)(4)(5)(6)(7)(8). SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI 2. Augsnē mītošie sīkslieku (Enchytraeus) ģints posmtārpi ir ekoloģiski piemērotas sugas ekotoksikoloģiskajai testēšanai. Lai gan sīksliekas bieži vien ir sastopamas augsnēs, kur mīt sliekas, ir arī tiesa, ka tās bieži lielā daudzumā sastopamas augsnēs, kur slieku nav. Sīksliekas var izmantot laboratorijas testos, kā arī lauka un jauktajos pētījumos. No praktiskā viedokļa daudzas sīkslieku sugas ir viegli kopt un audzēt, un to vairošanās laiks ir ievērojami īsāks nekā sliekām. Tādēļ vairošanās testa ilgums sīkslieku gadījumā ir tikai 4–6 nedēļas, turpretī Kalifornijas sarkano hibrīdslieku (Eisenia fetida) gadījumā tas ir astoņas nedēļas. 3. Pamatinformāciju par sīkslieku ekoloģiju un ekotoksikoloģiju zemes vidē var atrast (9)(10)(11)(12). TESTĒŠANAS PRINCIPS 4. Pieaugušas sīksliekas pakļauj virknei testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju, kas tiek iejaukta mākslīgā augsnē. Testu var iedalīt divos posmos: a) diapazona noteikšanas tests, ja nav pieejama pietiekama informācija; tajā mirstība ir galvenais beigupunkts, ko izvērtē pēc divu nedēļu ekspozīcijas, un b) galīgais vairošanās tests, kurā izvērtē kopējo jauno īpatņu un izdzīvojušo vecāku skaitu. Galīgā testa ilgums ir sešas nedēļas. Pēc pirmajām trīs nedēļām pieaugušos tārpus aizvāc un reģistrē morfoloģiskās izmaiņas. Pēc nākamajām trīs nedēļām saskaita no vecāku producētajiem kokoniem izšķīlušos pēcnācējus. Testējamai ķīmiskajai vielai eksponēto dzīvnieku vairošanās rādītājs tiek salīdzināts ar kontrolgrupu vairošanās rādītāju, lai noteiktu i) nenovērojamās ietekmes koncentrāciju (NOEC) un/vai ii) ECx (piemēram, EC10, EC50), ar regresijas modeli aplēšot koncentrāciju, kas izraisītu vairošanās rādītāja samazināšanos par x %. Testējamām koncentrācijām būtu jāaptver ECx (piemēram, EC10, EC50), lai ECx tiktu interpolēts, nevis ekstrapolēts. INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO ĶĪMISKO VIELU 5. Vēlams zināt testējamās ķīmiskās vielas šķīdību ūdenī (log Kow), augsnes ūdens sadalījuma koeficientu (piemēram, šā pielikuma C.18 vai C.19. nodaļā) un tvaika spiedienu. Ir vēlama papildu informācija par testējamās ķīmiskās vielas apriti augsnē, piemēram, fotolīzes un hidrolīzes rādītāju. 6. Šo testa metodi var izmantot ūdenī šķīstošām un nešķīstošām ķīmiskajām vielām. Tomēr attiecīgi atšķirsies arī testējamās ķīmiskās vielas lietošanas veids. Šī testēšanas metode nav izmantojama nedz gaistošām ķīmiskajām vielām, t. i., ķīmiskajām vielām, kurām Henrija konstante vai gaisa/ūdens sadalījuma koeficients ir lielāks nekā viens, nedz arī ķīmiskajām vielām, kuru tvaika spiediens pārsniedz 0,0133 Pa 25 °C temperatūrā. TESTA DERĪGUMS 7. Lai tests būtu derīgs, kontrolparaugos tam jāatbilst šādiem izpildes kritērijiem: — pieaugušo indivīdu mirstība nedrīkst pārsniegt 20 % diapazona noteikšanas testa beigās un pēc pirmajām trīs vairošanās testa nedēļām; — pieņemot, ka testa sākumā uz vienu trauku tika izmantoti 10 pieaugušie indivīdi, testa beigās uz vienu trauku jābūt izšķīlušamies vidēji vismaz 25 jaunajiem īpatņiem; — vidējā jauno īpatņu skaita variācijas koeficients nedrīkst pārsniegt 50 % vairošanās testa beigās. Ja tests neatbilst iepriekš minētajiem derīguma kritērijiem, tas jāizbeidz, ja vien nav pamatot testa turpināšanu. Pamatojums būtu jāiekļauj testēšanas pārskatā. ĶĪMISKĀ STANDARTVIELA 8. Ķīmiskā standartviela ir vai nu jātestē regulāros intervālos, vai, iespējams, jāiekļauj katrā testā, lai pārliecinātos, ka testējamo organismu reakcija laika gaitā nav būtiski mainījusies. Piemērota ķīmiskā standartviela ir karbendazīms, kam ir pierādīta ietekme uz sīkslieku izdzīvošanu un vairošanos (13)(14), vai arī var izmantot citas ķīmiskās vielas ar labi izpētītiem toksicitātes datiem. Starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā izmantoja karbendazīma preparātu, kas pazīstams ar komercnosaukumu Derosal™, ko piegādā AgrEvo Company (Frankfurte, Vācija) un kas satur 360 g /l (32,18 %) aktīvās vielas (2). Starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā noteiktā vairošanās EC50 bija diapazonā 1,2 ± 0,8 mg aktīvās vielas (AV)/kg sausmasas (2). Ja testa sērijā iekļauj pozitīvu toksisko standartu, izmanto vienu koncentrāciju un replikātu skaitam jābūt tādam pašam kā kontrolgrupas paraugu skaitam. Karbendazīma gadījumā ir ieteicamā testējamā koncentrācija ir 1,2 mg AV/kg sausmasas (karbendazīmu testējot kā šķidru preparātu). TESTA APRAKSTS Aparatūra 9. Testēšanas traukiem jābūt izgatavotiem no stikla vai cita ķīmiski inerta materiāla. Piemērotas ir stikla burkas (piemēram, ar tilpumu 0,20–0,25 litri un diametru ≈ 6 cm). Traukiem jābūt ar caurspīdīgiem vākiem (piemēram, no stikla vai polietilēna), kas ir izveidoti tā, lai samazinātu ūdens iztvaikošanu, vienlaikus atļaujot gāzu apmaiņu starp augsni un atmosfēru. Vākiem jābūt caurspīdīgiem, lai gaisma varētu izkļūt cauri. 10. Nepieciešams laboratorijas standartaprīkojums, jo īpaši: — žāvēšanas skapis; — stereomikroskops; — pH-metrs un fotometrs; — piemēroti, precīzi svari; — piemērota temperatūras kontroles ierīce, — piemērota mitruma kontroles ierīce (nav vajadzīga, ja ekspozīcijas traukiem ir vāki); — inkubators vai maza telpa ar gaisa kondicionētāju; — pincetes, āķi vai cilpas; — gaismas baseins. Mākslīgās augsnes sagatavošana 11. Šajā testā (5)(7) izmanto mākslīgo augsni ar šādu sastāvu (pamatojoties uz saussvariem, kas žāvēti līdz konstantam svaram 105 °C temperatūrā): — 10 % gaisā žāvētas un smalki samaltas sfagnu kūdras (ir pieņemams daļiņu izmērs 2 ± 1 mm); pirms to izmanto testā, ieteicams pārbaudīt, vai augsne, kas sagatavota ar svaigu kūdras paraugu, ir piemērota tārpu audzēšanai; — 20 % kaolīna mālu (kaolinīta saturam vēlams būt virs 30 %); — apmēram 0,3 līdz 1,0 % kalcija karbonāta (CaCO3, pulverizēta, analītiskās tīrības pakāpes), lai iegūtu pH 6,0 ± 0,5; pievienojamā kalcija karbonāta daudzums galvenokārt atkarīgs no kūdras kvalitātes/veida; — apmēram 70 % gaisā žāvētu kvarca smilšu (atkarībā no nepieciešamā CaCO3 daudzuma), lielākoties smalku smilšu, kas vairāk nekā par 50 % sastāv no daļiņām ar izmēru 50 līdz 200 mikroni. Pirms izmantot augsni galīgajā testā, ir ieteicams pierādīt mākslīgās augsnes piemērotību tārpu audzēšanai un testa derīguma kritēriju izpildei. Ir īpaši ieteicams veikt šādu pārbaudi, lai pārliecinātos, ka testa izpilde nav traucēta, ja organiskā oglekļa saturs mākslīgajā augsnē ir samazināts, piemēram, samazinot kūdras saturu līdz 4–5 % un attiecīgi palielinot smilšu saturu. Šādi samazinot organiskā oglekļa saturu, var samazināties testējamās ķīmiskās vielas iespēja adsorbēties augsnē (organiskajā ogleklī) un palielināties testējamās ķīmiskās vielas pieejamība tārpiem. Ir pierādīts, ka Enchytraeus albidus var atbilst vairošanās derīguma kritērijiem, ja tās testē lauka augsnēs ar zemāku organiskā oglekļa saturu, nekā minēts iepriekš (piemēram, 2,7 %) (15), un ir gūta pieredze – lai gan ierobežota – ka to var panākt arī ar mākslīgu augsni, kas satur 5 % kūdras. Piezīme: izmantojot dabisko augsni papildu (piemēram, augstāka līmeņa) testēšanā, arī ir jāpierāda augsnes piemērotība un testa derīguma kritēriju izpilde. 12. Augsnes sausās sastāvdaļas rūpīgi samaisa (piemēram, liela izmēra laboratorijas maisītājā). Tas jādara vismaz vienu nedēļu pirms testa sākšanas. Samaisītā augsne divas dienas jāuzglabā, lai līdzsvarotu/stabilizētu skābumu. pH noteikšanā izmanto augsnes un 1 M kālija hlorīda (KCl) vai 0,01 M kalcija hlorīda (CaCl2) šķīduma maisījumu attiecībā 1:5 (sk. (16) un 3. papildinājumu). Ja augsnes skābums pārsniedz vajadzīgo diapazonu (sk. 11. punktu), to var pielāgot, pievienojot atbilstošu daudzumu CaCO3. Ja augsne ir pārāk sārmaina, to var koriģēt, pievienojot vairāk maisījuma, kas minēts 11. punktā, bet izlaižot CaCO3. 13. Mākslīgās augsnes maksimālo ūdensnoturspēju (WHC) nosaka saskaņā ar 2. papildinājumā aprakstītajām procedūrām. Vienu vai divas dienas pirms testa sākšanas sauso mākslīgo augsni iepriekš samitrina, pievienojot pietiekami daudz dejonizēta ūdens, lai iegūtu apmēram pusi galīgā ūdens satura, kas ir 40 līdz 60 % maksimālās ūdensnoturspējas. Testa sākumā iepriekš samitrinātā augsne tiek sadalīta daļās atbilstoši testējamo koncentrāciju (un attiecīgā gadījumā ķīmiskās standartvielas) un kontrolgrupas paraugu skaitam. Mitruma saturu pielāgo 40–60 % maksimālās WHC, pievienojot testējamās ķīmiskās vielas šķīdumu un/vai destilētu vai dejonizētu ūdeni (sk. 19.–21. punktu). Mitruma saturu nosaka testa sākumā un beigās (izžāvējot līdz konstantam svaram 105 °C temperatūrā), un tam jābūt tārpu izdzīvošanai optimālajā intervālā. Augsnes mitruma saturu var aptuveni pārbaudīt, maigi saspiežot augsni rokās; ja mitruma saturs ir atbilstošs, starp pirkstiem jāparādās sīkiem ūdens pilieniem. Testējamo dzīvnieku izvēle un sagatavošana 14. Ieteicamās testēšanas sugas ir Enchytraeus albidus (Henle, 1837), Enchytraeidae dzimtas pārstāve (Oligochaeta kārta, Annelida tips). Enchytraeus albidus ir viena no lielākajām sīkslieku sugām – ir reģistrēti īpatņi garumā līdz 35 mm (17)(18). E. albidus ir izplatīta visā pasaulē un ir sastopama jūras, saldūdens un sauszemes vidēs, galvenokārt trūdošā organiskajā materiālā (jūraszālēs, kompostā) un reti pļavās (9). Tās lielā ekoloģiskā tolerance un dažas morfoloģiskās variācijas var liecināt par to, ka pastāv dažādas rases. 15. E. albidus ir komerciāli pieejama kā zivju barība. Ir jāpārbauda, vai kultūra nav kontaminēta ar citu kultūru, parasti ar mazākām sugām (1) (19). Ja rodas kontaminācija, visi tārpi ir jānomazgā ar ūdeni Petri platē. Tad ir jāizvēlas pieauguši E. albidus īpatņi (izmantojot stereomikroskopu), lai aizsāktu jaunu kultūru, bet pārējos tārpus nelieto. E. albidus var viegli audzēt plašā klāstā dažādu organisko materiālu (sk. 4. papildinājumu). E. albidus dzīves cikls ir īss, jo briedums tiek sasniegts laikā no 33. (18 °C) līdz 74. dienai (12 °C) (1). Testēšanai var tikt izmantotas tikai tās kultūras, kas laboratorijā vismaz piecas nedēļas (vienu paaudzi) uzglabātas bez problēmām. 16. Arī citas sīkslieku (Enchytraeus) ģints sugas ir piemērotas, piemēram, E. buchholzi (Vejdovsky, 1879) vai E. crypticus (Westheide & Graefe, 1992) (sk. 5. papildinājumu). Ja izmanto citas sīkslieku sugas, tās ir skaidri jāidentificē un pārskatā jāsniedz pamatojums, kādēļ izraudzīta šī suga. 17. Testos izmantojamie dzīvnieki ir pieauguši tārpi. Tiem jābūt oliņām (baltiem plankumiem) jostiņas rajonā un jābūt aptuveni vienāda izmēra (apmēram 1 cm gariem). Pavairošanas kultūras sinhronizācija nav nepieciešama. 18. Ja sīksliekas neaudzē viena un tā paša veida augsnē un apstākļos (ieskaitot barošanas apstākļus), ko izmantos galīgajā testā, tās vismaz 24 stundas līdz 3 dienas jāaklimatizē. Pieaugušo indivīdu skaits, kas ir lielāks nekā nepieciešams testa veikšanai, sākumā jāaklimatizē, lai būtu iespēja noraidīt bojātus vai citādi nepiemērotus īpatņus. Aklimatizācijas perioda beigās testam izvēlas tikai tārpus, kuriem ir oliņas un kuri neizrāda uzvedības anomālijas (piemēram, nemēģina izkļūt no augsnes). Tārpus uzmanīgi izvāc ar juveliera pinceti, āķiem vai cilpām un novieto uz Petri plates ar nelielu daudzumu svaiga ūdens. Šim nolūkam vislabāk izmantot rekonstituētu svaigu ūdeni atbilstoši šā pielikuma C.20. nodaļai (Daphnia magna vairošanās tests), jo dejonizēts, demineralizēts vai krāna ūdens var būt tārpiem kaitīgs. Tārpus pārbauda ar stereomikroskopu un nelieto tos, kuriem nav oliņu. Rūpīgi aizvāc visas ērces vai lēcastes, kas varētu būt inficējušas kultūras. Veselīgos tārpus, ko neizmanto testā, novieto atpakaļ izejkultūrā. Testējamo koncentrāciju sagatavošana Ūdenī šķīstoša testējamā ķīmiskā viela 19. Pagatavo testējamās ķīmiskās vielas šķīdumu dejonizētā ūdenī daudzumā, kas ir pietiekams visiem vienas testējamās koncentrācijas replikātiem. Ieteicams izmantot atbilstošu ūdens daudzumu, lai panāktu nepieciešamo mitruma saturu, t. i., 40–60 % maksimālās ūdensnoturspējas WHC (sk. 13. punktu). Katru testējamās ķīmiskās vielas šķīdumu pirms iemaisīšanas testēšanas traukā rūpīgi sajauc ar vienu paraugu iepriekš samitrinātas augsnes. Ūdenī nešķīstoša testējamā ķīmiskā viela 20. Ja ķīmiskā viela nešķīst ūdenī, bet šķīst organiskajos šķīdinātājos, testējamo ķīmisko vielu var izšķīdināt mazākajā iespējamā piemērotas nesējvielas (piemēram, acetona) tilpumā. Jāizmanto tikai gaistoši šķīdinātāji. Nesējvielu izsmidzina vai iejauc nelielā daudzumā (piemēram, 2,5 g) smalku kvarca smilšu. No nesējvielas atbrīvojas, to vienu stundu iztvaicējot velkmes skapī. Šo kvarca smilšu un testējamās ķīmiskās vielas maisījumu pievieno iepriekš samitrinātajai augsnei un rūpīgi samaisa ar atbilstošu daudzumu dejonizēta ūdens, lai iegūtu nepieciešamo mitruma saturu. Galīgo maisījumu sadala pa testēšanas traukiem. 21. Ja ķīmiskā viela vāji šķīst ūdenī un organiskajos šķīdinātājos, 2,5 g smalki samaltu kvarca smilšu uz katru testēšanas trauku samaisa ar tādu testējamās ķīmiskās vielas daudzumu, ar kuru var iegūt vēlamo testēšanas koncentrāciju. Šo kvarca smilšu un testējamās ķīmiskās vielas maisījumu pievieno iepriekš samitrinātajai augsnei un rūpīgi samaisa ar atbilstošu daudzumu dejonizēta ūdens, lai iegūtu nepieciešamo mitruma saturu. Galīgo maisījumu sadala pa testēšanas traukiem. Procedūru atkārto katrai testējamajai koncentrācijai un sagatavo arī atbilstošus kontrolparaugus. 22. Parasti ķīmiskās vielas netestē koncentrācijās, kas pārsniedz 1 000 mg/kg augsnes sausmasas. Tomēr testēšana augstākās koncentrācijās var būt nepieciešama sakaņā ar konkrēta testa mērķiem. TESTĒŠANAS NORISE Testa grupas un kontrolgrupas 23. Katras testējamās koncentrācijas gadījumā testēšanas traukā ievieto testējamās augsnes daudzumu, kas atbilst 20 g saussvara (sk. 19.–21. punktu). Sagatavo arī kontrolgrupas paraugus bez testējamās ķīmiskās vielas. Katram traukam pievieno barību atbilstoši 29. punktā aprakstītajai procedūrai. Katram testēšanas traukam pēc nejaušības principa iedala desmit tārpus. Tārpus rūpīgi pārvieto uz katru trauku un novieto uz augsnes virsas, izmantojot, piemēram, juveliera pinceti, āķus vai cilpas. Testējamo koncentrāciju un kontrolgrupas replikātu skaits ir atkarīgs no izmantotā testēšanas plāna (sk. 34. punktu). Testēšanas traukus pēc nejaušības principa izvieto testēšanas inkubatorā, un ik nedēļu tos pēc nejaušības principa pārkārto. 24. Ja testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanai izmanto nesējvielu, papildus testa sērijai ir jāsagatavo viena kontrolsērija ar kvarca smiltīm, kas apsmidzinātas vai sajauktas ar šo šķīdinātāju. Šķīdinātāja vai disperģētājvielas koncentrācijai jābūt tādai pašai, kādu izmanto testēšanas traukos ar testējamo ķīmisko vielu. Ja ķīmiskā viela jāievada saskaņā ar 21. punktā aprakstītajām procedūrām, ir jānodrošina kontrolsērija ar papildu kvarca smilšu daudzumu (2,5 g uz trauku). Testēšanas apstākļi 25. Testēšanas temperatūra ir 20 ± 2 °C. Lai atturētu tārpus no līšanas ārā no augsnes, testu veic kontrolētos gaismas un tumsas ciklos (vēlams – 16 stundas gaismas un 8 stundas tumsas) pie 400 līdz 800 luksu apgaismojuma testēšanas trauku rajonā. 26. Lai pārbaudītu augsnes mitrumu, traukus testēšanas sākumā un turpmāk reizi nedēļā nosver. Svara zudumu kompensē, pievienojot atbilstošu daudzumu dejonizēta ūdens. Jāpiebilst, ka ūdens zudumu var samazināt, uzturot augstu gaisa mitrumu (>80 %) testēšanas inkubatorā. 27. Mitruma saturs un pH jāmēra gan diapazona noteikšanas, gan galīgā testa sākumā un beigās. Mērījumi jāveic kontrolgrupas un apstrādātajos (visu koncentrāciju) augsnes paraugos, kas sagatavoti un uzturēti tādā pašā veidā kā testa kultūras, bet nesatur tārpus. Barība šiem augsnes paraugiem būtu jāpievieno tikai testēšanas sākumā, lai veicinātu mikrobu aktivitāti. Pievienotās barības daudzumam jābūt tādam pašam kā testējamajām kultūrām pievienotajam. Testēšanas laikā šiem traukiem nav nepieciešams pievienot papildu barību. Barošana 28. Var izmantot barību, kas spēj uzturēt sīkslieku populāciju. Ir konstatēts, ka piemērots barības materiāls ir auzu pārslas – vēlams, iepriekš autoklavētas, lai izvairītos no mikrobioloģiskās kontaminācijas (piemērota ir arī karsēšana). 29. Pirms tārpu ievietošanas katrā traukā vispirms augsnē iemaisa barību (50 mg samaltu auzu pārslu). Turpmāk barību pievieno ik nedēļu līdz 21. dienai. 28. dienā barošanu neveic, jo pieaugušie indivīdi šajā posmā ir aizvākti, bet jaunajiem tārpiem turpmāk ir vajadzīgs salīdzinoši maz papildu barības. Testēšanas laikā barošana nozīmē 25 mg samaltu auzu pārslu uz trauku, ko rūpīgi uzber uz augsnes virskārtas, lai izvairītos no tārpu savainošanas. Lai samazinātu sēnīšu augšanu, auzu pārslas būtu jāaprok augsnē, apsedzot ar nelielu daudzumu augsnes. Ja barība netiek apēsta, būtu jāsamazina barības porcija. Diapazona noteikšanas testa plāns 30. Kad nepieciešams, diapazona noteikšanas testu veic, piemēram, ar piecām testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijām – 0,1, 1,0, 10, 100 un 1 000 mg/kg (augsnes saussvara). Viens replikāts katrai apstrādei un kontrolgrupai ir pietiekami. 31. Diapazona noteikšanas testa ilgums ir divas nedēļas. Testa beigās izvērtē tārpu mirstību. Tārpu reģistrē kā beigtu, ja tas nereaģē uz mehānisko kairinājumu priekšējā galā. Papildu informācija par mirstību var noderēt, arī izlemjot par koncentrāciju intervālu galīgajam testam. Tādēļ vajadzētu reģistrēt arī izmaiņas pieaugušo uzvedībā (piemēram, nespēju ierakties augsnē; gulēšanu nekustīgā stāvoklī pret testēšanas trauka stikla sienu) un morfoloģijā (piemēram, atvērtu brūču klātbūtni), kā arī jauno īpatņu klātbūtni. Pēdējo rādītāju var noteikt ar 6. papildinājumā aprakstīto iekrāsošanas metodi. 32. LC50 var aptuveni noteikt, aprēķinot mirstības datu ģeometrisko vidējo. Nosakot koncentrāciju intervālu galīgajam testam, pieņem, ka ietekme uz vairošanos ir līdz pat 10 reizes zemāka nekā LC50. Tomēr tā ir empīriska sakarība, katrā konkrētā gadījumā tā var atšķirties. Papildu novērojumi diapazona noteikšanas testā, piemēram, jauno īpatņu klātbūtne, var palīdzēt precizēt testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju intervālu, ko izmantot galīgajā testā. 33. Lai pareizi noteiktu LC50, ieteicams veikt testu, izmantojot vismaz četrus katras testējamās ķīmiskās vielas koncentrācijas replikātus un adekvātu skaitu koncentrāciju, lai pie minētajām koncentrācijām iegūtu vismaz četras atbildreakcijas vidējās vērtības, kuru starpība būs statistiski nozīmīga. Attiecīgos gadījumos izmanto arī līdzīgu skaitu kontrolgrupu koncentrāciju un replikātu. Galīgā vairošanās testa plāns 34. Pamatojoties uz starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas rekomendācijām (2), var piedāvāt trīs testa plānus. — NOEC noteikšanai būtu testē vismaz piecas koncentrācijas ģeometriskā progresijā. Katrai testējamajai koncentrācijai ieteicami četri replikāti, kā arī vēl astoņi kontrolreplikāti. Katrai nākamajai koncentrācijai būtu jābūt ne vairāk kā 1,8 reizes lielākai nekā iepriekšējai. — ECx (piemēram, EC10, EC50), noteikšanai būtu jātestē vismaz piecas koncentrācijas, un tām būtu jāaptver ECx, lai ECx varētu interpolēt, nevis ekstrapolēt. Katrai testējamajai koncentrācijai ieteicami vismaz četri replikāti, kā arī vēl četri kontrolreplikāti. Kvocients var atšķirties, t. i., būt mazāks vai vienāds ar 1,8 paredzamajā ietekmes diapazonā un lielāks nekā 1,8 augstākām vai zemākām koncentrācijām. — Kombinēta pieeja ļauj noteikt gan NOEC, gan ECx. Būtu jāizmanto astoņas apstrādes koncentrācijas ģeometriskā progresijā. Katrai apstrādei ieteicami četri replikāti, kā arī vēl astoņi kontrolreplikāti. Katrai nākamajai koncentrācijai būtu jābūt ne vairāk kā 1,8 reizes lielākai nekā iepriekšējai. 35. Jāizmanto desmit pieauguši tārpi uz testēšanas trauku (sk. 23. punktu). Barību testēšanas traukam pievieno testēšanas sākumā un turpmāk reizi nedēļā (sk. 29. punktu) līdz 21. dienai ieskaitot. 21. dienā augsnes paraugus rūpīgi pārmeklē ar rokām, novēro un saskaita dzīvos pieaugušos tārpus un pieraksta izmaiņas uzvedībā (piemēram, nespēja ierakties augsnē; nekustīga gulēšana pret testēšanas trauka stikla sienu) un morfoloģijā (piemēram, atvērtas brūces). Tad visi pieaugušie tārpi tiek aizvākti no testēšanas traukiem un testēšanas augsnes. Testēšanas augsni, kas satur producētos kokonus, inkubē trīs papildu nedēļas tajos pašos testēšanas apstākļos, izņemot to, ka barošana notiek tikai 35. dienā (t. i., 25 mg samaltu auzu pārslu uz trauku). 36. Pēc trīs nedēļām saskaita jaunos izšķīlušos tārpus. Ieteicamā metode balstās uz iekrāsošanu ar bengāļu sarkano (sk. 6. papildinājumu), lai gan piemērotas ir arī citas mitrās (bet ne karstās) ekstrakcijas un flotācijas tehnikas sk. 6. papildinājumu) (4)(10)(11)(20). Iekrāsošana ar bengāļu sarkano ir ieteicama tāpēc, ka suspendēto māla daļiņu radītās duļķes var traucēt augsnes substrāta mitrajai ekstrakcijai. Robežtests 37. Ja diapazona noteikšanas testā pie augstākās koncentrācijas (t. i., 1 000 mg/kg) nenovēro nekādu ietekmi, vairošanās testu var veikt kā robežtestu, izmantojot 1 000 mg/kg, lai pierādītu, ka vairošanās NOEC ir lielāka nekā šī vērtība. Testa kopsavilkums un grafiks 38. Testēšanas posmus var rezumēt šādi: Laiks Diapazona noteikšanas tests Galīgais tests – 7. diena vai agrāk — Sagatavojiet mākslīgo augsni (sauso sastāvdaļu samaisīšana) — Sagatavojiet mākslīgo augsni (sauso sastāvdaļu samaisīšana) – 5. diena — Pārbaudiet mākslīgās augsnes pH — Izmēriet augsnes maksimālo WHC — Pārbaudiet mākslīgās augsnes pH — Izmēriet augsnes maksimālo WHC – 5. līdz – 3. diena — Sašķirojiet tārpus aklimatizācijai — Sašķirojiet tārpus aklimatizācijai – 3. līdz 0. diena — Aklimatizējiet tārpus vismaz 24 stundas — Aklimatizējiet tārpus vismaz 24 stundas – 1. diena — Iepriekš samitriniet mākslīgo augsni un sadaliet pa partijām — Iepriekš samitriniet mākslīgo augsni un sadaliet pa partijām 0. diena — Sagatavojiet izejšķīdumus — Ievadiet testējamo ķīmisko vielu — Iesveriet testa substrātu testēšanas traukos — Iemaisiet barību — Ievietojiet tārpus — Izmēriet augsnes pH un mitruma saturu — Sagatavojiet izejšķīdumus — Pievienojiet Ievadiet ķīmisko vielu — Iesveriet testa substrātu testēšanas traukos — Iemaisiet barību — Ievietojiet tārpus — Izmēriet augsnes pH un mitruma saturu 7. diena — Pārbaudiet augsnes mitruma saturu — Pārbaudiet augsnes mitruma saturu — Barojiet 14. diena — Nosakiet pieaugušo īpatņu mirstību — Aplēsiet jauno īpatņu skaitu — Izmēriet augsnes pH un mitruma saturu — Pārbaudiet augsnes mitruma saturu — Barojiet 21. diena — Novērojiet pieaugušo īpatņu uzvedību — Aizvāciet pieaugušos īpatņus — Nosakiet pieaugušo īpatņu mirstību — Pārbaudiet augsnes mitruma saturu — Barojiet 28. diena — Pārbaudiet augsnes mitruma saturu — Nebarojiet 35. diena — Pārbaudiet augsnes mitruma saturu — Barojiet 42. diena — Saskaitiet jaunos tārpus — Izmēriet augsnes pH un mitruma saturu DATI UN PĀRSKATU SAGATAVOŠANA Rezultātu apstrāde 39. Lai gan 7. papildinājumā ir sniegts īss apskats, šai testēšanas metodei nav galīgu statistisku norādījumu par testa rezultātu analizēšanu. 40. Diapazona noteikšanas testā galvenais beigupunkts ir mirstība. Vajadzētu reģistrēt arī izmaiņas pieaugušo īpatņu uzvedībā (piemēram, nespēju ierakties augsnē, gulēšanu nekustīgā stāvoklī pret testēšanas trauka stikla sienu) un morfoloģijā (piemēram, atvērtas brūces), kā arī jauno īpatņu klātbūtni. Lai noteiktu LC50, parasti būtu jālieto probita analīze (21) vai logistiskā regresija. Tomēr gadījumos, kad šī analīzes metode nav piemērota (piemēram, ja ir pieejamas mazāk nekā trīs daļēji nāvējošas koncentrācijas), var izmantot alternatīvas metodes. Šīs metodes var būt slīdošie vidējie (22), saīsinātā Spīrmena–Kerbera metode [Spearman-Karber method] (23) vai vienkārša interpolācija (piemēram, LC0 un LC100 ģeometriskais vidējais, ko aprēķina, izvelkot kvadrātsakni no LC0 un LC100 reizinājuma). 41. Galīgajā testā beigupunkts ir vaislība (t. i., radušos jauno īpatņu skaits). Tomēr, tāpat kā diapazona noteikšanas testā, galīgajā pārskatā ir jāiekļauj arī visas kaitējuma pazīmes. Statistiskajai analīzei jāaprēķina vairošanās aritmētiskais vidējais un standartnovirze katrai apstrādes un kontroles grupai. 42. Ja ir veikta dispersijas analīze, standartnovirzi (s) un brīvības pakāpes (df) var aizstāt ar summārās dispersijas aplēsi, kas iegūta attiecīgi no ANOVA un tās brīvības pakāpēm, ar nosacījumu, ka dispersija nav atkarīga no koncentrācijas. Šajā gadījumā izmantojiet atsevišķās kontroles un apstrādes dispersijas. Šīs vērtības parasti aprēķina ar komerciālu statistikas programmu, par replikātiem izmantojot katra trauka rezultātus. Ja negatīvo un šķīdinātāja kontroļu datu apkopošana šķiet saprātīgāka nekā testēšana, salīdzinot ar vienu no tām, tās būtu jātestē, lai pārliecinātos, ka tās nav būtiski atšķirīgas (piemērotus testus sk. 45. punktā un 7. papildinājumā). 43. Papildu statistiskā testēšana un slēdziens ir atkarīgs no tā, vai replikātu vērtības atbilst normālsadalījumam un to dispersija ir homogēna. NOEC noteikšana 44. Priekšroka ir jaudīgu testu lietošanai. Būtu jāizmanto informācija, piemēram, no iepriekšējās pieredzes ar starplaboratoriju salīdzinošo testēšanu vai citiem vēsturiskiem datiem, par to, vai dati ir aptuveni normāli sadalīti. Būtiskāka ir dispersijas homogenitāte (homoskedastiskums). Pieredze liecina, ka nereti dispersija palielinās, palielinoties vidējām vērtībām. Tādos gadījumos homoskedastiskumu var panākt ar datu transformāciju. Tomēr šādai transformācijai būtu jābalstās uz pieredzi ar vēsturiskiem datiem, nevis pētāmajiem datiem. Homogēnu datu gadījumā būtu jāveic vairāki t-testi, piemēram, Viljamsa tests (Williams' test) (α = 0,05, vienpusējais) (24)(25) vai dažos gadījumos – Daneta tests (Dunnett's test) (26)(27). Jānorāda, ka nevienlīdzīgas replikācijas gadījumā, tabulas t vērtības jāizlabo atbilstoši Daneta un Viljamsa ieteikumiem. Reizēm atbildreakcijas nepalielinās/nesamazinās regulāri, jo ir plaša variācija. Tādā gadījumā – ja ir izteikta novirze no monotonitātes – piemērotāks ir Daneta tests. Ja ir novirzes no homoskedastiskuma, var būt pamatoti uzmanīgāk izmeklēt iespējamo ietekmi uz dispersijām, lai varētu izlemt, vai t-testus var izmantot bez būtiskiem jaudas zudumiem (28). Alternatīvi var izmantot multiplu U-testu, piemēram, Bonferoni U-testu (Bonferroni U-test) saskaņā ar Holmu (29), vai, ja šie dati ir heteroskedastiski, bet citādi ir atbilst pamatā esošai monotonai devas atbildreakcijai, citu neparametrisku testu, piemēram, Džonkhīra–Terpstras testu (Jonckheere-Terpstra) (30)(31) vai Šērlija testu (Shirley test) (32)(33); kopumā tie būtu vēlamāki nekā nelīdzvērtīgās dispersijas t-testi (sk. arī shēmu 7. papildinājumā). 45. Ja ir veikts robežtests un izpildās parametriskās testēšanas procedūras priekšnosacījumi (normālsadalījums, homogenitāte), var izmantot pāru Stjūdenta t-testu (Student t-test), ja ne – Manna–Vitnija U-testa procedūru (Mann-Whitney U-test) (29). ECx noteikšana 46. Lai aprēķinātu ECx vērtību, lineārās vai nelineārās regresijas analīzē izmanto katras apstrādes vidējās vērtības pēc tam, kad ir iegūta atbilstoša devas–atbildreakcijas funkcija. Attiecībā uz tārpu augšanu kā nepārtrauktu atbildreakciju ECx vērtības var aplēst, izmantojot piemērotu regresijas analīzi (35). Kā piemērotas funkcijas bināriem datiem (mirstībai/izdzīvošanai un pēcnācēju skaitam) minamas normālā sigmoīda, logistiskā vai Veibula (Weibull) funkcija, kas satur divus līdz četrus parametrus, no kuriem daži var modelēt arī hormētiskas atbildreakcijas. Ja devas–atbildreakcijas funkcija piemeklēta ar lineāras regresijas analīzi, ar regresijas analīzi būtu jākonstatē būtisks r2 (determinācijas koeficients) un/vai virziena koeficients, pirms nosaka ECx,, regresijas analīzē atrastajā vienādojumā ievietojot vērtību, kas atbilst x % kontroles vidējā. 95 % ticamības intervālu aprēķina pēc Fīlera (Fieller) (citēts Finneja (Finney) darbā (21)) vai citām modernām, atbilstošām metodēm. 47. Alternatīvi atbildreakciju modelē kā modeļa parametra procentuālo daļu vai proporciju, kas tiek interpretēta kā kontroles vidējā reakcija. Tādos gadījumos normālo (logistisko, Veibula) sigmoīdo līkni bieži vien viegli pielāgot rezultātiem, izmantojot probita regresijas procedūru (21). Tādos gadījumos svēršanas funkcija jāpielāgo metriskām atbildreakcijām, kā norādījis Kristensens (Christensen) (36). Savukārt tad, ja ir novērota hormēze, probita analīze būtu jāaizstāj ar četru parametru logistisko vai Veibula funkciju, kas pielāgota ar nelineāras regresijas procedūru (36). Ja datiem nevar piemeklēt piemērotu devas–atbildreakcijas funkciju, ECx un tās ticamības intervālu aprēķināšanai var izmantot alternatīvas metodes, piemēram, slīdošos vidējos pēc Tompsona (Thompson) (22) un saīsināto Spīrmena–Kerbera metodi (23). TESTĒŠANAS PĀRSKATS 48. Testēšanas pārskatā jāiekļauj turpmāk norādītā informācija. Testējamā ķīmiskā viela: — fizikālais veids un attiecīgās fizikālķīmiskās īpašības (piemēram, šķīdība ūdenī, tvaika spiediens); — testējamās ķīmiskās vielas ķīmiskais nosaukums IUPAC nomenklatūrā, CAS numurs, partija, sērija, struktūrformula un tīrība; — parauga derīguma termiņš. Testējamās sugas: — izmantotie testa dzīvnieki: suga, zinātniskais nosaukums, organismu izcelsme un audzēšanas apstākļi. Testēšanas apstākļi: — mākslīgās augsnes sastāvdaļas un sagatavošana; — testējamās ķīmiskās vielas ievadīšanas metode; — testēšanas apstākļu apraksts, tostarp temperatūras, mitruma satura, pH u. c. raksturojums; — eksperimenta plāna un procedūru pilnīgs apraksts. Testa rezultāti: — pieaugušo tārpu mirstība pēc divām nedēļām un jauno īpatņu skaits diapazona noteikšanas testa beigās; — pieaugušo tārpu mirstība pēc trīs nedēļu ekspozīcijas un pilnīgi dati par jaunajiem īpatņiem galīgā testa beigās; — visi novērotie testa organismu fiziskie vai patoloģiskie simptomi un uzvedības izmaiņas; — vairošanās LC50, NOEC un/vai ECx (piemēram, EC50, EC10), ja kāds no šiem rādītājiem ir piemērojams, norādot ticamības intervālus un piemeklētā modeļa grafiku, kas izmantots tā aprēķināšanai, visa rezultātu interpretācijai noderīgā informācija un novērojumi. Jāziņo par atkāpēm no procedūrām, kas aprakstītas šajā testēšanas metodē, un visiem neraksturīgiem notikumiem testēšanas laikā. LITERATŪRA (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. and Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. (3) Westheide, W. and Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam, (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. (5) Šā pielikuma C.8. nodaļa “Slieku akūtas toksicitātes tests”. (6) ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. (7) ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. (8) Rundgren, S. and A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H. and C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. (10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. (11) Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. (14) Römbke, J. and Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. (15) Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. (16) ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. (17) Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. (18) Nielsen, C.O. and Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. (19) Bouguenec, V. and Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. (20) Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. (21) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19-76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. (24) Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. (25) Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. (26) Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. (27) Dunnett, C.W., (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. (28) Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361 (29) Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. (30) Jonckheere, A. R. (1954); A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133-145. (31) Terpstra, T. J. (1952); The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, Indagationes Math. 14, 327-333. (32) Shirley, E. A. (1979); The comparison of treatment to control group means in toxicology studies, Applied Statistics 28, 144-151. (33) Williams, D.A. (1986); A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control, Biometrics 42, 183-186. (34) Sokal, R.R. and F.J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York. (35) Christensen, E.R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213-221. (36) Van Ewijk, P.H. and J.A. Hoekstra. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25-32. 1. papildinājums DEFINĪCIJAS Šajā testēšanas metodē ir izmantotas turpmāk sniegtās definīcijas. Ķīmiskā viela ir viela vai to maisījums. ECx (ietekmes koncentrācija, pie kuras ietekme ir x %) ir koncentrācija, kas konkrētā ekspozīcijas periodā uz testa organismiem atstāj x % ietekmi salīdzinājumā ar kontrolgrupu. Šajā testā ietekmes koncentrācijas izsaka kā testējamās ķīmiskās vielas masas un augsnes sausmasas attiecību. LC0 (neletālā koncentrācija) ir testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, kas noteiktā laika periodā nenonāvē nevienu no tai eksponētajiem testa organismiem. Šajā testā LC0 izsaka kā testējamās ķīmiskās vielas masas un augsnes sausmasas attiecību. LC50 (medianālā letālā koncentrācija) ir testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, kas noteiktā laika periodā nonāvē 50 % no tai eksponētajiem testa organismiem. Šajā testā LC50 izsaka kā testējamās ķīmiskās vielas masas un augsnes sausmasas attiecību. LC100 (pilnīgi letālā koncentrācija) ir testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija, kas noteiktā laika periodā nonāvē 100 % no tai eksponētajiem testa organismiem. Šajā testā LC100 izsaka kā testējamās ķīmiskās vielas masas un augsnes sausmasas attiecību. LOEC (zemākā novērojamās ietekmes koncentrācija) ir zemākā testējamās ķīmiskās vielas koncentrācija ar statistiski nozīmīgu ietekmi (p < 0,05). Šajā testā LOEC izsaka kā testējamās ķīmiskās vielas masas un augsnes sausmasas attiecību. Visām koncentrācijām, kas ir lielākas nekā LOEC, normāli vajadzētu būt ietekmei, kas statistiski atšķiras no kontrolgrupas rādītāja. Jebkādas atkāpes no iepriekš minētā, nosakot LOEC, jāpamato testēšanas pārskatā. NOEC (nenovērojamās ietekmes koncentrācija) ir testējamās ķīmiskās vielas augstākā koncentrācija, kas ir tieši zem LOEC un kurai nav novērojamas ietekmes. Šajā testā NOEC atbilstošajai koncentrācijai konkrētā ekspozīcijas periodā nav statistiski nozīmīgas ietekmes (p < 0,05) salīdzinājumā ar kontrolgrupu. Vairošanās ātrums ir vidējais izšķīlušos jauno tārpu skaits uz pieaugušo skaitu testēšanas laikā. Testējamā ķīmiskā viela ir jebkura viela vai to maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi. 2. papildinājums Maksimālās ūdensnoturspējas noteikšana Mākslīgās augsnes ūdensnoturspējas noteikšana Turpmākā metode ir atzīta par pieņemamu. Tā ir aprakstīta ISO DIS 11268-2 C pielikumā. Ievāciet noteiktu daudzumu (piemēram, 5 g) testējamās augsnes substrāta ar piemērotu ierīci (gliemežcauruli u. c.). Nosedziet caurules apakšu ar filtrpapīra gabalu un pēc uzpildīšanas ar ūdeni novietojiet to uz statīva ūdens vannā. Caurule pakāpeniski jāiegremdē, līdz ūdens līmenis pārsniedz augsnes virsējo līmeni. Tad tā jāatstāj ūdenī apmēram uz trīs stundām. Tā kā nav iespējams iegūt visu ūdeni, kas uzsūcies augsnes kapilāros, augsnes paraugam būtu divas stundas jāļauj notecēt, novietojot cauruli uz ļoti slapju smalki samaltu kvarca smilšu dobītes noslēgtā traukā (lai novērstu izžūšanu). Tad paraugs jānosver un jāizžāvē līdz konstantai masai 105 °C. Ūdensnoturspēju (WHC) var aprēķināt šādi: kur: S = ūdens piesātinātais substrāts + caurules masa + filtrpapīra masa T = tara (caurules masa + filtrpapīra masa) D = substrāta sausmasa ATSAUCES: ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. 3. papildinājums Augsnes PH noteikšana Turpmākā metode augsnes pH noteikšanai balstās uz aprakstu ISO 10390 (“Augsnes kvalitāte – pH noteikšana”). Noteiktu augsnes daudzumu vismaz 12 stundas žāvē istabas temperatūrā. Tad vismaz 5 gramus augsnes suspendē piecreiz lielākā tilpumā vai nu 1 M analītiskās tīrības pakāpes kālija hlorīda (KCl), vai 0,01 M analītiskās tīrības pakāpes kalcija hlorīda (CaCl2) šķīduma. Tad suspensiju kārtīgi krata piecas minūtes. Pēc kratīšanas suspensijai ļauj nosēsties vismaz 2 stundas, bet ne ilgāk kā 24 stundas. Tad izmēra šķidrās fāzes pH ar pH mērītāju, kas pirms katra mērījuma kalibrēts, izmantojot atbilstošu buferšķīdumu sēriju (piemēram, pH 4,0 un 7,0). ATSAUCES: ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. 4. papildinājums Enchytraeus sugu kultivēšanas apstākļi Enchytraeus albidus (kā arī citas sīkslieku (Enchytraeus) ģints sugas) var kultivēt lielās plastmasas kastēs (piemēram, 30 × 60 × 10 cm), kas aizpildītas ar mākslīgās augsnes un nekontaminētas dabiskas dārza augsnes maisījumu attiecībā 1:1. Jāizvairās no komposta materiāla izmantošanas, jo tas var saturēt toksiskas ķīmiskās vielas, piemēram, smagos metālus. Pirms izmantošanas augsne jāatbrīvo no faunas (piemēram, sasaldējot). Var izmantot arī substrātu tikai no mākslīgās augsnes, bet vairošanās ātrums var būt zemāks nekā tas, ko var panākt ar jauktas augsnes substrātu. Kultivēšanai izmantojamā substrāta pH jābūt 6,0 ± 0,5. Kultūru glabā tumsā 15 līdz 20 °C ± 2 °C temperatūrā. Jāizvairās no temperatūras, kas ir augstāka nekā 23 °C. Jārūpējas, lai augsne būtu mitra, bet ne slapja. Par pareizu augsnes mitruma saturu liecina mazu ūdens lāsīšu parādīšanās starp pirkstiem, maigi saspiežot augsni. Jāizvairās no bezskābekļa apstākļu rašanās, nodrošinot to, ka kultūras konteineru vāki nodrošina adekvātu gāzu apmaiņu ar atmosfēru. Augsne katru nedēļu ir rūpīgi jāuzirdina, lai veicinātu apskābekļošanu. Tārpus var barot ar auzu pārslām. Auzas jāglabā noslēgtos traukos un jāautoklavē vai jāuzkarsē pirms izmantošanas, lai izvairītos no miltu ērču (piemēram, Glyzyphagus sugas, Astigmata, Acarina) vai plēsīgu ērču (piemēram, Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina) invāzijas. Pēc termiskas apstrādes barība ir jāsamaļ, lai to var viegli uzkaisīt uz augsnes virskārtas. Laiku pa laikam auzu pārslas var papildināt ar vitamīniem, pienu vai mencu aknu eļļu. Citi piemēroti barības avoti ir pārtikas raugs un zivju barība TetraMin. Barošana notiek apmēram divas reizes nedēļā. Atbilstošs daudzums auzu pārslu tiek uzkaisīts augsnes virskārtai vai arī rūpīgi iemaisīts substrātā augsnes uzirdināšanas laikā, lai veicinātu apskābekļošanu. Absolūtais dodamās barības daudzums ir atkarīgs no tārpu skaita substrātā. Barības daudzums būtu jāpalielina, ja tā visa tiek apēsta dienas laikā pēc uzkaisīšanas. Pretējā gadījumā, ja barība joprojām palikusi virskārtā, kad pienācis otrās barošanas laiks (pēc nedēļas), tās daudzums ir jāsamazina. Barība, kas kontaminēta ar sēnīšu kolonijām, jāaizvāc un jāaizstāj. Pēc trīs mēnešiem tārpi jāpārliek svaigi sagatavotā substrātā. Kultivēšanas apstākļi uzskatāmi par apmierinošiem, ja tārpi: a) nemēģina atstāt augsnes substrātu, b) ātri pārvietojas cauri augsnei, c) ir ar spīdīgu ārējo virsmu bez pielipušām augsnes daļiņām, d) ir vairāk vai mazāk bālgani, e) kultūrās ir atrodami dažādos vecumos un f) nepārtraukti vairojas. 5. papildinājums Testa norise ar citām sīkslieku ģints (Enchytraeus) sugām Sugu izvēle Var izmantot ne tikai E. albidus, bet arī citas sīkslieku sugas, taču tad attiecīgi ir jāpielāgo testa procedūra un derīguma kritēriji. Tā kā daudzas sīkslieku sugas ir viegli pieejamas un ir viegli uzturamas laboratorijā, vissvarīgākais kritērijs, kas mudina izvēlēties citu sugu, nevis E. albidus, ir ekoloģiskais nozīmīgums un papildus – salīdzināms jutīgums. Sugas maiņai var būt arī formāli iemesli. Piemēram, valstīs, kurās E. albidus nav sastopama un to nevar importēt (piemēram, karantīnas ierobežojumu dēļ), vajadzēs izmantot citas sīkslieku sugas. Piemērotu alternatīvu sugu piemēri — Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe, 1992). Pēdējos gados šo sugu bieži izmanto ekotoksikoloģiskajos pētījumos, jo tās pārstāvjus ir vienkārši audzēt un testēt. Tomēr tā ir sīka un to ir sarežģ