KOMISIJAS ĪSTENOŠANAS LĒMUMS (ES) 2015/1554

(2015. gada 11. septembris),

ar ko nosaka noteikumus Direktīvas 2006/88/EK piemērošanai attiecībā uz uzraudzībai un diagnostikas metodēm izvirzītajām prasībām

(izziņots ar dokumenta numuru C(2015) 6188)

(Dokuments attiecas uz EEZ)

EIROPAS KOMISIJA,

ņemot vērā Līgumu par Eiropas Savienības darbību,

ņemot vērā Padomes 2006. gada 24. oktobra Direktīvu 2006/88/EK par akvakultūras dzīvniekiem un to produktiem izvirzītajām dzīvnieku veselības prasībām, kā arī par konkrētu ūdensdzīvnieku slimību profilaksi un kontroli (1) un jo īpaši tās 49. panta 3. punktu, 50. panta 4. punktu, 57. panta b) punktu un 61. panta 3. punktu,

tā kā:

Direktīva 2006/88/EK nosaka minimālos profilaktiskos pasākumus attiecībā uz šīs direktīvas IV pielikumā minēto sarakstā iekļauto slimību (“sarakstā iekļautās slimības”) uzraudzību un agrīnu konstatēšanu ūdensdzīvnieku organismos un kontroles pasākumus, kas jāizmanto gadījumos, kur ir aizdomas par sarakstā iekļautajām slimībām vai to uzliesmojums. Tā nosaka arī prasības attiecībā uz statusa “slimības neskarts” iegūšanu dalībvalstīm vai to zonām vai iecirkņiem.

Pasaules Dzīvnieku veselības organizācijas (OIE) pieņemtajā Ūdensdzīvnieku veselības kodeksā ir noteikti standarti, kuru nolūks ir visā pasaulē uzlabot ūdensdzīvnieku veselību un saimniecībās audzēto zivju labturību, to vidū arī standarti, kas reglamentē ūdensdzīvnieku un to produktu drošu starptautisku tirdzniecību. Vairākās Ūdensdzīvnieku veselības kodeksa nodaļās ir ieteikumi par noteiktu diagnostisku testu lietošanu. Šādi OIE testi ir aprakstīti OIE Ūdensdzīvnieku slimību diagnostikas rokasgrāmatā (“Ūdensdzīvnieku diagnostikas rokasgrāmatā”). Lai nodrošinātu, ka Savienības prasības attiecībā uz ūdensdzīvnieku slimību diagnosticēšanu atbilst starptautiskajiem standartiem, šajā lēmumā noteiktajos noteikumos būtu jāņem vērā Ūdensdzīvnieku veselības kodeksa standarti un ieteikumi.

Jāmin, ka attiecībā uz daudzām sarakstā iekļautajām slimībām Ūdensdzīvnieku diagnostikas rokasgrāmatā ir sniegti vairāki laboratoriskos izmeklējumos izmantojami testi un procedūras. Lai Savienības līmenī attiecībā uz sarakstā iekļautajām slimībām unificētu diagostiskā darba zinātnisko bāzi, nepieciešams izvēlēties diagnostikas testus un procedūras no OIE ieteiktajiem un norādīt, kuriem vajadzētu būt obligātajiem testiem attiecībā uz to, lai veiktu laboratoriskus izmeklējumus uzraudzības programmās un izslēgtu vai apstiprinātu aizdomas par sarakstā iekļauto slimību klātbūtni. Lai gan dažos gadījumos būs nepieciešamas alternatīvas metodes un procedūras, būtu jāsniedz apraksti un daži zinātniski paskaidrojumi par to, kad un kā šīs alternatīvās metodes varētu izmantot. Īpaši nepieciešams tas varētu būt attiecībā uz detalizētākajām diagnostikas procedūrām.

IR PIEŅĒMUSI ŠO LĒMUMU.

1. pants

Priekšmets

Šis lēmums nosaka noteikumus par:

2. pants

Definīcijas

Šajā lēmumā izmanto šādas definīcijas:

3. pants

Minimālās prasības attiecībā uz izskaušanas un uzraudzības programmām

Ja attiecībā uz vienu vai vairākām sarakstā iekļautajām slimībām dalībvalstij, tās zonai vai iecirknim ir jāpiešķir, jāatceļ vai jāatjauno statuss “slimības neskarts”, dalībvalstis nodrošina, lai tiktu ievēroti I pielikumā noteiktie noteikumi par uzraudzības un izskaušanas programmām, buferzonām, paraugu ņemšanas metodēm un diagnostikas metodēm un II pielikumā noteiktās specifiskās metodes un detalizētās procedūras.

4. pants

Minimālās prasības attiecībā uz diagnostikas metodēm un specifiskajām procedūrām

Dalībvalstis nodrošina, ka laboratoriskos izmeklējumos ar nolūku apstiprināt vai izslēgt kādas sarakstā iekļautas slimības klātbūtni tiek izmantotas I pielikumā aprakstītās kontroles metodes un II pielikumā aprakstītās specifiskās diagnostikas metodes un detalizētās procedūras.

5. pants

Minimālie kontroles pasākumi attiecībā uz sarakstā iekļauto slimību ierobežošanu un minimālās prasības attiecībā uz ierobežošanas pasākumu atcelšanu dalībvalstīs, zonās vai iecirkņos, kas nav deklarēti par sarakstā iekļauto slimību neskartiem

Dalībvalstis nodrošina, ka, attiecībā uz vienu vai vairākām sarakstā iekļautajām slimībām dalībvalstī, tās zonā vai iecirknī, kurš nav deklarēts par minēto sarakstā iekļauto slimību neskartu, īstenojot šo slimību kontroles pasākumus un atceļot to ierobežošanas pasākumus, tiek izpildīti I pielikumā aprakstītie minimālie kontroles pasākumi un minimālās prasības attiecībā uz ierobežošanas pasākumu atcelšanu.

6. pants

Atcelšana

Lēmums 2001/183/EK, Lēmums 2002/878/EK un Lēmums 2003/466/EK tiek atcelti.

7. pants

Piemērošanas datums

Šo lēmumu piemēro no 2016. gada 1. aprīļa.

8. pants

Adresāti

Šis lēmums ir adresēts dalībvalstīm.

(1) OV L 328, 24.11.2006., 14. lpp.

(2) Komisijas 2001. gada 22. februāra Lēmums 2001/183/EK, ar ko nosaka paraugu ņemšanas plānus un diagnostikas metodes dažu zivju slimību atklāšanai un apstiprināšanai un ar ko atceļ Lēmumu 92/532/EEK (OV L 67, 9.3.2001., 65. lpp.).

(3) Komisijas 2003. gada 13. jūnija Lēmums 2003/466/EK par zonēšanas un valsts uzraudzības kritērijiem, rodoties aizdomām par saslimšanu ar lašu infekciozo anēmiju (ISA) vai gūstot tam apstiprinājumu (OV L 156, 25.6.2003., 61. lpp.).

(4) Komisijas 2002. gada 6. novembra Lēmums 2002/878/EK, ar ko nosaka paraugu ņemšanas plānus un diagnostikas metodes gliemju slimību bonamiozes (Bonamia ostreae) un marteiliozes (Marteilia refringens) noteikšanai un apstiprināšanai (OV L 305, 7.11.2002., 57. lpp.).

Robežzonai jābūt definētai katrā gadījumā atsevišķi, ņemot vērā faktorus, kas attiecībā uz WSD izplatīšanos uz saimniecībās audzētiem un savvaļas vēžveidīgajiem, ietekmē tādus riskus kā: ar WSD inficētās saimniecības vēžveidīgo mirstība pēc skaita, tās rādītājs un sadalījums; attālums līdz apkaimes saimniecībām un to biezība; saskarē esošās saimniecības; saimniecībās pārstāvētās sugas; slimības skartajās saimniecībās un to apkaimes saimniecībās izmantotā audzēšanas prakse; hidrodinamiskie apstākļi un citi epidemioloģiski nozīmīgi konstatēti faktori.

upju un ezeru sistēmās izraugās vienu vai vairākas no šādām sugām: Pacifastacus leniusculus, Astacus leptodactylus, Austropotamobius pallipes vai Orconectes limosus. Ja minēto sugu nav, paraugam jābūt reprezentatīvam attiecībā uz citām pārstāvētajām uzņēmīgajām desmitkājvēžu sugām. Tā kā uzņēmīgo saimniekorganismu klāsts ir plašs, tos var izraudzīties no tādām desmitkājvēžu ģintīm vai dzimtām, kuru uzņēmība ir eksperimentāli vai dabiski pierādīta;

jūras un grīvu sistēmu teritorijās izraugās vienu vai vairākas no šādām sugām: Carcinus maenas, Cancer pagurus, Eriocheir sinensis, Liocarcinus depurator, Liocarcinus puber, Crangon crangon, Homarus gammarus, Palaemon adspersus vai tīģergarneļu sugas, proti, Penaeus japonicus, Penaeus kerathurus, Penaeus semisulcatus. Ja minēto sugu nav, paraugam jābūt reprezentatīvam attiecībā uz citām pārstāvētajām uzņēmīgajām desmitkājvēžu sugām. Tā kā uzņēmīgo saimniekorganismu klāsts ir plašs, tos var izraudzīties no tādām desmitkājvēžu ģintīm vai dzimtām, kuru uzņēmība ir eksperimentāli vai dabiski pierādīta;

Oficiālajā izmeklēšanā ietilpst vismaz viens pēc Bonamia ostreae transmisijas perioda sākšanās ņemts paraugs ar 30 gliemenēm no uzņēmīgām sugām (ja aizdomu pamatā ir ziņojums par mirstību) vai ar 150 gliemenēm no uzņēmīgām sugām (ja ziņu par mirstību nav bijis). Ja transmisijas periods nav zināms, paraugus sāk ņemt ziemā vai pavasara sākumā. Paraugus testē, saskaņā ar II pielikuma 5. daļas I iedaļā aprakstītajām detalizētajām diagnostikas metodēm un procedūrām izmantojot i) punktā aprakstītās diagnostikas metodes:

visās par inficētām oficiāli deklarētajās saimniecībās vai gliemeņu audzēšanas teritorijās un visās citās saimniecībās vai gliemeņu audzēšanas teritorijās, kuras atrodas izveidotajās aizsardzības un uzraudzības zonās un kurās īstenots neizmantošanas periods, krājumus atjauno ar gliemenēm, kas iegūtas no dalībvalstīm, zonām vai iecirkņiem ar I kategorijas veselības statusu attiecībā uz inficēšanos ar Bonamia ostreae. Krājumus atjauno tikai pēc tam, kad visas par inficētām oficiāli deklarētās saimniecības ir saskaņā ar I.2.2. punkta c) apakšpunktu iztukšotas, iztīrītas, dezinficētas un tajās attiecīgi īstenots neizmantošanas periods;

Robežzonu katrā gadījumā definē atsevišķi, ņemot vērā faktorus, kas ietekmē tādus šīs sarakstā iekļautās slimības izplatīšanās riskus kā: ar Bonamia ostreae inficētās saimniecības vai gliemeņu audzēšanas teritorijas gliemeņu, arī savvaļas gliemeņu, mirstība pēc skaita, tās rādītājs, raksturojums pēc vecuma un sadalījuma; attālums līdz apkaimes saimniecībām vai gliemeņu audzēšanas teritorijām un to biezība, ieskaitot savvaļas gliemenes; tas, cik tuvu atrodas pārstrādes uzņēmumi, tādas saimniecības, ar kurām ir saskare, vai gliemeņu audzēšanas teritorijas; sugas, kas atrodas saimniecībās vai gliemeņu audzēšanas teritorijās, jo īpaši uzņēmīgās sugas un vektorsugas; slimības skartajās saimniecībās vai gliemeņu audzēšanas teritorijās un to apkaimes saimniecībās vai gliemeņu audzēšanas teritorijās izmantotā audzēšanas prakse; hidrodinamiskie apstākļi un citi epidemioloģiski nozīmīgi konstatēti faktori.

oficiālajā izmeklēšanā ietilpst vismaz viens pēc Marteilia refringens transmisijas perioda sākšanās ņemts paraugs ar 30 gliemenēm no uzņēmīgām sugām (ja aizdomu pamatā ir ziņas par mirstību) vai ar 150 gliemenēm no uzņēmīgām sugām (ja ziņu par mirstību nav bijis). Ja transmisijas periods nav zināms, paraugu ņemšanu sāk periodā, kurā ūdens temperatūra pārsniegusi 17 °C;

Robežzonu katrā gadījumā definē atsevišķi, ņemot vērā faktorus, kas ietekmē tādus Marteilia refringens izplatīšanās riskus kā: ar Marteilia refringens inficētās saimniecības vai gliemeņu audzēšanas teritorijas gliemeņu, arī savvaļas gliemeņu, mirstība pēc skaita, mirstības raksturojums pēc vecuma, mirstības rādītājs un sadalījums; attālums līdz apkaimes saimniecībām vai gliemeņu audzēšanas teritorijām un to biezība, ieskaitot savvaļas gliemenes; tas, cik tuvu atrodas pārstrādes uzņēmumi, tādas saimniecības, ar kurām ir saskare, vai gliemeņu audzēšanas teritorijas; sugas, jo īpaši uzņēmīgas sugas un vektorsugas, kas atrodas saimniecībās vai gliemeņu audzēšanas teritorijās; slimības skartajās saimniecībās vai gliemeņu audzēšanas teritorijās un to apkaimes saimniecībās un gliemeņu audzēšanas teritorijās izmantotā audzēšanas prakse; hidrodinamiskie apstākļi un citi konstatēti epidemioloģiski nozīmīgi faktori.

ja ražošanas vienībās vai ražošanas teritorijā atrodas Ostrea spp. vai Mytilus spp., no abām ģintīm jāņem pēc apjoma vienādi paraugi. Ja ir tikai viena no šīm ģintīm, paraugu ņem no tās. Ja nav ne Ostrea, ne Mytilus ģints pārstāvju, paraugam jābūt reprezentatīvam attiecībā uz visām citām pārstāvētajām uzņēmīgajām sugām;

Robežzona katrā gadījumā jādefinē atsevišķi, ņemot vērā faktorus, kas attiecībā uz ISA izplatīšanos uz saimniecībās audzētām zivīm vai savvaļas zivīm, ietekmē tādus riskus kā: ar genotipam “HPR deletēts” piederīgu ISAV inficētu vai ar apstiprinātu ISA slimu zivju mirstība pēc skaita, tās rādītājs un sadalījums; attālums līdz apkaimes saimniecībām un to biezība; attālums līdz tuvākajām kautuvēm; saskarē esošās saimniecības; saimniecībās pārstāvētās sugas; slimības skartajās saimniecībās un to apkaimes saimniecībās izmantotā audzēšanas prakse; hidrodinamiskie apstākļi un citi konstatēti epidemioloģiski nozīmīgi faktori.

tā krājumi atjaunoti ar zivīm, kas iegūtas no dalībvalstīm, zonām vai iecirkņiem, kuriem ir I kategorijas veselības statuss, vai no iecirkņiem, uz kuriem attiecina KHVD uzraudzības programmu (II kategorijas veselības statuss).

Robežzonai jābūt definētai katrā gadījumā atsevišķi, ņemot vērā faktorus, kas attiecībā uz KHVD izplatīšanos uz saimniecībās audzētām zivīm un savvaļas zivīm, ietekmē tādus riskus kā: zivju mirstība pēc skaita, mirstības rādītājs un sadalījums ar KHV inficētajā saimniecībā; attālums līdz apkaimes saimniecībām un to biezība; attālums līdz tuvākajām kautuvēm; saskarē esošās saimniecības; saimniecībās pārstāvētās sugas; slimības skartajās saimniecībās un to apkaimes saimniecībās izmantotā audzēšanas prakse; hidrodinamiskie apstākļi un citi konstatēti epidemioloģiski nozīmīgi faktori.

Mērķorientēta uzraudzība balstās uz to vietu regulāru monitorēšanu, kurās uzturas uzņēmīgas sugas. Vietas monitorē tad, kad sasniegti ūdens temperatūras līmeņi, kuros iespējama slimības attīstīšanās (> 15 °C), un ne agrāk kā divas nedēļas no datuma, kad šādas temperatūras sasniegtas. Jebkādas vietā atrastas slimas zivis vai zivis, kam vērojama anormāla izturēšanās, ņem paraugam un testē.

VHS klātbūtni uzskata par apstiprinātu, ja ar vienu vai vairākām no minētajām diagnostikas metodēm attiecībā uz VHSV tiek iegūti pozitīvi rezultāti. IHN klātbūtni uzskata par apstiprinātu, ja ar vienu vai vairākām no minētajām diagnostikas metodēm tiek iegūti pozitīvi rezultāti attiecībā uz IHNV. Pirmā VHS vai IHN gadījuma apstiprināšanā agrāk neinficētās dalībvalstīs, zonās vai iecirkņos balstās uz parasto vīrusa izolēšanas testu šūnu kultūrā vai uz RT-qPCR;

ir izpildītas I.2.2.1. punkta a), b) un c) apakšpunkta prasības. Ja neizmantošanas periodu īstenot nav tehniski iespējams, uz šīm saimniecībām attiecina kādu alternatīvu pasākumu, kas gandrīz līdzvērtīgi nodrošina IHNV, VHSV vai to abu iznīcināšanu saimniecības vidē;

Nosakot, cik bieži VHS, IHN vai to abu sakarā jāveic veselības pārbaudes I kategorijas veselības statusa iecirkņos, kuri atrodas kontinentālās teritorijās un kuru veselības statuss attiecībā uz VHS vai IHN saskaņā ar Direktīvas 2006/88/EK V pielikuma II daļas 2. punktu ir atkarīgs no apkārtējos dabiskajos ūdeņos esošo ūdensdzīvnieku populāciju veselības statusa, uzskata, ka risks aplipt ar VHS, IHN vai tām abām ir augsts.

I.2.2.2. Statusa “slimības neskarts” atgūšanas prasības, ko izvirza attiecībā uz kontinentāliem iecirkņiem, kuri sastāv tikai no vienas saimniecības, kas agrāk deklarēta par IHN, VHS vai to abu neskartu

visās saimniecībās, kas oficiāli deklarētas par inficētām ar VHS, IHN vai abām šīm sarakstā iekļautajām slimībām, un visās citās saimniecībās, kas izveidotajās aizsardzības un uzraudzības zonās, kuras minētas c) apakšpunktā, turētas neizmantotas, krājumus atjauno ar zivīm, kas iegūtas no dalībvalstīm, zonām vai iecirkņiem ar veselības statusu “slimības neskarts” (I kategorija) attiecībā uz VHS, IHN vai tām abām.

Robežzonai jābūt definētai katrā gadījumā atsevišķi, ņemot vērā faktorus, kas attiecībā uz sarakstā iekļautās slimības izplatīšanos uz saimniecībās audzētām zivīm un savvaļas zivīm, ietekmē tādus riskus kā: zivju mirstība pēc skaita, mirstības rādītājs un sadalījums ar VHS, IHN vai abām šīm slimībām inficētajā saimniecībā; attālums līdz apkaimes saimniecībām un to biezība; attālums līdz tuvākajām kautuvēm; saskarē esošās saimniecības; saimniecībās pārstāvētās sugas; slimības skartajās saimniecībās un to apkaimes saimniecībās izmantotā audzēšanas prakse; hidrodinamiskie apstākļi un citi konstatēti epidemioloģiski nozīmīgi faktori.

“kontinentāla zona” ir vienas vai vairāku dalībvalstu kontinentālajā daļā esoša ģeogrāfiski precīza teritorija ar homogēnu hidroloģisko sistēmu, kas aptver ūdens sateces teritorijas daļas no iztekas(-ām) līdz dabiskam vai mākslīgam šķērslim, kurš nepieļauj ūdensdzīvnieku augšupēju migrēšanu no zemākiem ūdens sateces teritorijas posmiem, vai visu ūdens sateces teritoriju no iztekas(-ām) līdz grīvai, vai arī vairākas ūdens sateces teritorijas kopā ar to grīvām (jo grīva rada epidemioloģisku saikni starp sateces teritorijām);

II PIELIKUMS

DETALIZĒTAS DIAGNOSTIKAS METODES UN PROCEDŪRAS

I. Ievads

Šajā pielikumā ir aprakstītas detalizētas procedūras attiecībā uz diagnostikas metodēm, kas jālieto, lai veiktu laboratoriskos izmeklējumus šā lēmuma I pielikumā aprakstītajās izskaušanas un uzraudzības programmās un lai saskaņā ar Direktīvas 2006/88/EK 57. panta b) punktu apstiprinātu vai izslēgtu aizdomas par šādu minētās direktīvas IV pielikuma II daļā iekļautu neeksotisku slimību (“sarakstā iekļauto slimību”) klātbūtni:

1. Virusālā hemorāģiskā septicēmija (VHS) 1. daļa 2. Infekciozā hematopoētiskā nekroze (IHN) 1. daļa 3. Koiju herpesvīruss (KHV) 2. daļa 4. Lašu infekciozā anēmija (ISA) 3. daļa 5. Marteilia refringens infekcija 4. daļa 6. Bonamia ostreae infekcija 5. daļa 7. Balto plankumu slimība (WSD) 6. daļa

II. Definīcijas

Šā pielikuma vajadzībām “transporta barotne” ir tāda barotne ar šūnu kultūru, kurā ir 10 % teļa seruma un 200 SV penicilīna, 200 μg streptomicīna un 200 μg kanamicīna uz mililitru, vai citas antibiotikas, kuru iedarbīgums ir pierādīts.

1. DAĻA

DETALIZĒTAS DIAGNOSTIKAS METODES UN PROCEDŪRAS IHN UN VHS UZRAUDZĪBAI UN APSTIPRINĀŠANAI

I. VHS un IHN uzraudzībai paredzētās diagnostikas metodes un procedūras

Ņemot paraugus un veicot laboratoriskus izmeklējumus ar I pielikuma 1. daļas II.1. un II.2. punktā aprakstītajām diagnostikas metodēm, lai, kā aprakstīts minētā pielikuma 1. daļas I iedaļā, iegūtu vai saglabātu veselības statusu “slimības neskarts” attiecībā uz IHN vai VHS, izmanto detalizētās diagnostikas metodes un procedūras, kas tālāk aprakstītas I.1. līdz I.6. punktā.

I.1. Zivju paraugu sagatavošana un nosūtīšana

I.1.1. Šūnu kultūru virusoloģiskai izmeklēšanai paredzētie audi

Pirms nosūtīšanas vai pārvešanas uz laboratoriju izmeklējamās orgānu daļas no zivs ķermeņa izņem ar steriliem secēšanas instrumentiem un ievieto sterilās plastmasas mēģenēs ar transporta barotni.

Šūnu kultūru virusoloģiskai izmeklēšanai un RT-qPCR piemērotais zivju materiāla daudzums ir atkarīgs no zivju lieluma. Piemēram, zivju kāpuriem, kuru garums ir mazāks nekā 4 cm, paraugam ņem visu ķermeni, 4 līdz 6 cm garām zivīm – iekšas kopā ar nierēm, savukārt lielākām zivīm – nieres, liesu, sirdi un/vai galvas smadzenes, bet vaislas zivīm nārsta laikā – olšūnu šķidrumu.

Olšūnu vai spermas šķidrumu vai orgānu daļas augstākais no desmit zivīm var ievākt vienā sterilā mēģenē, kurā ir vismaz 4 ml transporta barotnes, un tie veido vienu kopotu paraugu. Katra parauga audu svars ir vismaz 0,5 grami (g).

Šūnu kultūras virusoloģiskā izmeklēšana jāsāk iespējami drīz un ne vēlāk kā 48 stundas pēc paraugu ievākšanas. Izņēmuma gadījumos, ja pārbaudāmo materiālu aizsargā transporta barotne un ja pārvadāšanas laikā iespējams ievērot prasības attiecībā uz temperatūru, virusoloģisko izmeklēšanu var sākt vēlākais 72 stundas pēc materiāla ievākšanas.

I.1.2. Paraugi apgrieztās transkriptāzes polimerāzes ķēdes reakcijas analīzei (RT-PCR vai RT-qPCR)

Paraugus no zivīm ar sterilu instrumentu ņem saskaņā ar I.1.1. punktā aprakstīto procedūru un ievieto sterilās plastmasas mēģenēs ar transporta barotni. Vienā mēģenē var ievākt audus no 10 zivīm, un tie veido vienu kopotu paraugu. Tomēr, ja inokulāta apjoms ir neliels, var izmantot audus ne vairāk kā no piecām zivīm. Paraugus, ievērojot ražotāja ieteikumus, var arī kopot RNS stabilizējošos reaģentos, piemēram, izmantojot 0,2 g audu uz 1 ml reaģenta, lai arī katra zivs jāapstrādā atsevišķi un nav jāliek kopotos paraugos, jo ekstrahēšanai lietojamā materiāla ir maz.

Uz laboratoriju var sūtīt arī veselas zivis.

I.2. Zivju paraugu nosūtīšana

Lai laikā, kad paraugi tiek transportēti uz laboratoriju, nodrošinātu paraugu atdzesēšanu, mēģenes ar šūnu kultivēšanai vai RT-PCR/RT-qPCR analīzei paredzētiem zivju audiem transporta barotnē kopā ar pietiekamu daudzumu ledus – vai alternatīvas dzesēšanas vides ar tādu pašu dzesējošu iedarbību – ievieto izotermiskos konteineros, piemēram, polistirola kastēs ar biezām sienām. Tomēr nepieļauj paraugu sasalšanu. Parauga temperatūra pārvadāšanas laikā nevienu brīdi nedrīkst pārsniegt 10 °C, un transportēšanas kastē, to saņemot, vēl ir jābūt ledum vai arī vienam vai vairākiem aukstumblokiem vēl jābūt daļēji vai pilnīgi sasalušiem.

Ja pārvadāšanas laikā iespējams pildīt pirmajā daļā minētās prasības attiecībā uz temperatūru, uz laboratoriju var nosūtīt veselas zivis. Veselas zivis ietin absorbējošā papīrā, un visbeidzot tās nosūtīšanai ieliek plastikāta maisā. Sūtīt var arī dzīvas zivis.

I.3. Papildu diagnostiskā materiāla ievākšana

Ja attiecīgā diagnostikas laboratorija atļauj, ievākt un papildu izmeklējumiem sagatavot var arī citus zivs audus.

I.4. Paraugu sagatavošana šūnu kultūras izmeklēšanai un RT-qPCR

I.4.1. Sasaldēšana izņēmuma gadījumos

Ja rodas praktiskas grūtības, kuru dēļ paraugu apstrāde 48 stundu laikā pēc zivju audu ievākšanas nav iespējama, ir pieļaujams audu paraugus sasaldēt transporta barotnē – 20 °C vai zemākā temperatūrā un virusoloģisko izmeklēšanu veikt 14 dienu laikā. Tomēr pirms izmeklēšanas zivju audus sasaldē un atkausē tikai vienu reizi. Ir jāglabā pieraksti ar detalizētu informāciju par katru zivju audu paraugu sasaldēšanas iemeslu.

I.4.2. Orgānu homogenizēšana

Laboratorijā audus mēģenēs pilnīgi homogenizē (vai nu ar homogenizatoru Stomacher, blenderi, vai miezeri un piestu ar sterilām smiltīm) un pēc tam sākotnējā transporta barotnē suspendē.

Ja paraugu veido vesela zivs, kas īsāka par 4 cm, pēc tam, kad nodalīta ķermeņa daļa aiz zarnu atveres, šādu zivi sasmalcina ar sterilām grieznēm vai skalpeli. Ja paraugu veido vesela zivs, kuras garums ir no 4 līdz 6 cm, ievāc iekšas, arī nieres. Ja paraugu veido vesela zivs, kas garāka par 6 cm, audu paraugus ņem, kā aprakstīts I.1. punktā. Audu paraugus sasmalcina ar sterilām grieznēm vai skalpeli, homogenizē, kā aprakstīts šā punkta pirmajā daļā, un suspendē transporta barotnē.

Galīgo attiecību starp audu materiālu un transporta barotni laboratorijā koriģē, panākot 1:10.

I.4.3. Homogenizētā materiāla centrifugēšana

Homogenizēto materiālu 15 minūtes centrifugē atdzesētā centrifūgā 2 °C līdz 5 °C temperatūrā ar 2 000 līdz 4 000 × g, un ievāc centrifugātu, ko vai nu četras stundas 15 °C temperatūrā, vai visu nakti 4 līdz 8 °C temperatūrā var apstrādāt ar antibiotikām. Transporta barotnē nosūtītu paraugu centrifugātu ar antibiotikām var neapstrādāt.

Ja rodas praktiskas grūtības, kuru dēļ šūnas nevar inokulēt 48 stundu laikā pēc zivju audu paraugu paņemšanas, piemēram, sabojājies inkubators vai problēmas ar šūnu kultūrām, centrifugātu drīkst sasaldēt – 80 °C temperatūrā un virusoloģisko izmeklēšanu veikt 14 dienu laikā.

Ja ievākto centrifugātu 48 stundas pēc parauga ņemšanas uzglabā – 80 °C temperatūrā, to var atkārtoti izmantot tikai vienreiz – virusoloģiskajai izmeklēšanai.

Pirms šūnu inokulēšanas centrifugātu vienādās daļās samaisa ar attiecīgi atšķaidītiem kopotiem antiserumiem pret infekciozās pankreātiskās nekrozes (IPN) vīrusa vietējiem serotipiem un kopā ar šo maisījumu vismaz vienu stundu inkubē 15 °C temperatūrā vai ne vairāk kā 18 stundas – 4 °C temperatūrā. Šā antiseruma titrs 50 % plaku samazināšanās testā ir vismaz 1/2 000.

Visus inokulātus ar IPN vīrusa antiserumu apstrādā tāpēc, lai novērstu citopātisko efektu (CPE), ko inokulētās šūnu kultūrās rada IPN vīrusa attīstīšanās. Tas samazinās virusoloģisko pārbaužu ilgumu, kā arī to gadījumu skaitu, kur būtu jāuzskata, ka radies CPE liecina par VHSV vai IHNV.

Ja paraugi ir no ražošanas vienībām, kuras uzskata par brīvām no IPN, inokulātus ar IPN vīrusa antiserumu var neapstrādāt.

I.4.4. Paraugu gatavošana uzraudzības programmām, kuru pamatā ir RT-PCR un RT-pPCR

Ja paraugi ņemti transporta barotnē, īsteno I.4.2. un I.4.3. punktā aprakstīto procedūru. Pēc centrifugēšanas ievāc centrifugātu un ekstrahē RNS. Ja tieši pēc centrifugēšanas nav jāveic tālāka izmeklēšana, paraugus tūlīt sasaldē – 20 °C vai zemākā temperatūrā.

RNS stabilizējošā reaģentā konservētu zivju audu analizēšanas vajadzībām tālāku darbu ar atšķirīgā temperatūrā glabātiem paraugiem veic saskaņā ar šādu grafiku:

37 °C glabāti paraugi: viena diena,

25 °C glabāti paraugi: viena nedēļa,

4 °C glabāti paraugi: viens mēnesis,

– 20 °C glabāti paraugi: beztermiņa.

Ar kopotiem paraugiem RNS stabilizējošā reaģentā rīkojas tāpat kā ar atsevišķiem paraugiem RNS stabilizējošā reaģentā. RNS stabilizējošā reaģentā ievietoto kopotu paraugu apjoms nedrīkst pārsniegt apjomu, ko ekstrahēšanai ar RNS komplektiem (tādiem kā RNeasy Mini kits (Qiagen) vai līdzīgiem) ieteicis ražotājs. Ja kopotie paraugi ir lielāki, ekstrahēšanas komplektiem vai metodēm jābūt tādiem, kas atbilst šādi veidotiem kopotiem paraugiem.

RNS stabilizējošos reaģentos ievāktus paraugus neizmanto šūnu kultivēšanai.

I.4.5. RT-qPCR paredzētie kopotie paraugi

Tā kā šeit sniegto RT-qPCR protokolu jutība ir līdzvērtīga šūnu kultivēšanas metožu jutībai vai par to augstāka, PCR vajadzībām var izmantot centrifugātu, kas iegūts no barotnē ar šūnu kultūru homogenizēta zivju audu materiāla, kurš ņemts ne vairāk kā no 10 zivju kopotiem orgāniem. Salīdzinājumā ar šūnu kultivēšanu PCR testā izmanto daudz mazāk inokulāta, tāpēc, pirms likt kopā materiālu ekstrahēšanai, visi zivju audi rūpīgi jāhomogenizē.

Tas pats princips jāievēro arī tad, ja paraugus ievāc RNS stabilizējošos reaģentos. Tomēr minētajā gadījumā reprezentatīvu materiālu no zivīm, kuru skaits var sasniegt 10, bieži vien vienā mēģenē ievākt ir grūti, tāpēc zivju skaits kopotā paraugā jāsamazina līdz 2–5.

I.5. Šūnu kultūru virusoloģiskā izmeklēšana

I.5.1. Šūnu kultūras un barotnes

20 līdz 30 °C temperatūrā piemērotā barotnē, proti, Īgla barotnē MEM vai tās modificētā variantā, pievienojot 10 % liellopu embrionālā seruma un antibiotikas standartkoncentrācijās, audzē zilžaunu sauleszivs šūnu līnijas-2 (BF-2), varavīksnes foreles gonādu šūnu līnijas-2 (RTG-2) un vai nu Epithelioma papulosum cyprini (EPC), vai melngalvas mailītes (FHM) šūnas.

Ja šūnas kultivē slēgtos stobriņos, barotne jābuferē ar bikarbonātu. Barotni, ko izmanto šūnu kultivēšanai vaļējos traukos, var buferēt ar tris-(hidroksimetil)aminometāna-HCl (Tris-HCl) (23 mM) un nātrija bikarbonātu (6 mM). pH jābūt 7,6 ± 0,2.

Šūnu kultūrām, ko paredzēts inokulēt ar zivju audu materiālu, jābūt jaunām, parasti, ja vien iespējams, tās ir vienu dienu vecu šūnu kultūru monoslāņi; tomēr pieņemams vecuma diapazons ir 4 līdz 48 stundas. Šūnām inokulātā aktīvi jāaug.

I.5.2. Šūnu kultūru inokulēšana

Lai novērstu homoloģisku interferenci, ar antibiotikām apstrādāto orgānu suspensiju šūnu kultūrās inokulē divos atšķaidījumos, proti, primārajā atšķaidījumā un turklāt tā atšķaidījumā 1:10, tātad audu materiāla galīgie atšķaidījumi barotnē ar šūnu kultūru būs attiecīgi 1:100 un 1:1 000. Atbilstoši I.5.1. punktam inokulē vismaz divas no tajā minētajām šūnu līnijām. Attiecībai starp inokulāta apjomu un šūnu kultūru saturošās barotnes tilpumu jābūt apmēram 1:10.

Katram atšķaidījumam un katrai šūnu līnijai jāizmanto vismaz apmēram 2 cm2 šūnu platības, kas atbilst vienai 24 iedobju šūnu kultūras plates iedobei. Ja vien iespējams, izmanto šūnu kultūras plates.

I.5.3. Šūnu kultūru inkubēšana

Inokulētās šūnu kultūras 7 līdz 10 dienas inkubē 15 °C temperatūrā. Ja, liecinot par barotnes paskābināšanos, barotnei ar šūnu kultūru krāsa mainās no sarkanas uz dzeltenu, ar sterilu bikarbonāta šķīdumu vai ar līdzvērtīgām vielām koriģē pH, lai nodrošinātu, ka šūnas joprojām ir uzņēmīgas pret vīrusa infekciju.

Vismaz reizi sešos mēnešos vai tad, ja ir aizdomas par šūnu uzņēmīguma samazināšanos, saldētās VHSV un IHNV kultūras titrē, lai pārliecinātos par šūnu kultūru uzņēmību pret infekciju. Ja iespējams, izmanto III iedaļā aprakstīto procedūru.

I.5.4. Mikroskopija

Inokulētajām šūnu kultūrām regulāri (vismaz trīs reizes nedēļā) 40 līdz 150 reižu palielinājumā apskata, vai nav radies CPE. Ja novērojams nepārprotams CPE, tūlīt saskaņā ar I.6. punktu jāsāk vīrusa identificēšanas procedūras.

I.5.5. Šūnu pārsēšana

Ja pēc 7 līdz 10 dienas ilgas primārās inkubēšanas CPE nav radies, kultūru pārsēj uz jaunām šūnu kultūrām, izmantojot tādu pašu šūnu platību kā primārajai kultūrai.

Kad pagājušas 7 līdz 10 dienas pēc inokulēšanas, pa šūnu līnijām kopo visu primāro kultūru veidojošo kultūru vai iedobju barotnes (centrifugāta) alikvotas. Tad šos kopotos paraugus, kā aprakstīts I.5.2. punktā, neatšķaidītā veidā un atšķaidījumā 1:10 (iegūstot galīgos centrifugāta atšķaidījumus, attiecīgi 1:10 un 1:100) inokulē homoloģiskās šūnu kultūrās. Var arī primārās kultūras barotnes desmitprocentīgas alikvotas inokulēt tieši iedobē ar jaunu šūnu kultūru (pārsēšana no iedobes iedobē). Pirms atšķaidījumus inokulēt, tos, kā aprakstīts I.4.3. punktā, var iepriekš inkubēt ar IPN vīrusa antiserumu attiecīgā atšķaidījumā.

Pēc tam inokulētās kultūras 7 līdz 10 dienas inkubē 15 °C temperatūrā un apskata saskaņā ar I.5.4. punktu.

Ja toksisks CPE rodas pirmajās trijās inkubēšanas dienās, šūnas pārsēj šajā posmā, pēc tam 7 dienas inkubē un atkal pārsēj ar turpmāku septiņu dienu inkubēšanu. Ja toksisks CPE rodas vēlāk kā pēc trim dienām, šūnām var veikt vienu pasāžu un tās inkubēt tā, lai no pirmās inokulēšanas kopā būtu 14 dienas. Pēdējās septiņās inkubēšanas dienās nekādu toksicitātes pazīmju nedrīkst būt.

Ja par spīti apstrādei ar antibiotikām rodas bakteriāla kontaminācija, pirms pārsēšanas 15 līdz 30 minūtes 2 līdz 5 °C temperatūrā jāveic centrifugēšana ar 2 000 līdz 4 000 × g vai centrifugāta filtrēšana ar 0,45 μm filtru vai abas šīs darbības (membrāna ar zemu olbaltumvielu saistīšanas spēju). Turklāt pārsēšanā ievēro tās pašas procedūras, kas attiecībā uz toksisku CPE aprakstītas šā punkta ceturtajā daļā.

Ja CPE nerodas, testa rezultātu var paziņot par negatīvu.

I.6. Vīrusa identificēšana

Ja novērojumi liecina, ka šūnu kultūrā ir CPE, ievāc barotni (centrifugātu) un pārbauda ar vienu vai vairākiem šādiem paņēmieniem: imūnfermentatīvā analīze (ELISA), imūnfluorescence (IF), neitralizācija, RT-PCR vai RT-qPCR. Ja ar šiem testiem vienas nedēļas laikā vīrusu nav bijis iespējams galīgi identificēt, centrifugāts nekavējošai identifikācijai jānosūta uz Direktīvas 2006/88/EK VI pielikumā minētajām zivju slimībās specializētajām laboratorijām – valsts references laboratoriju vai ES references laboratoriju.

I.6.1. ELISA

Vīrusa izolāta identificēšanai izdara divslāņu ELISA ar divām antivielām. Mikrotitrēšanas platēs uzklāj pārklājumu, daudzumā 50 μl uz iedobi (0,9 pg) iepilinot no truša antiseruma pret IHNV vai VHSV iegūtu pierādītas kvalitātes attīrītu A proteīna imūnglobulīnu (Ig) karbonāta buferšķīdumā (pH 9,6) ar nātrija azīda saturu 15 mM, un no 18 stundām līdz 2 nedēļām inkubē 4 °C temperatūrā.

Šķīdumu platē katru paraugu, kas satur 1 % Triton X-100, un pozitīvos kontrolparaugus atšķaida ar buferšķīdumu (proti, liellopu seruma albumīnu fosfātu fizioloģiskajā buferšķīdumā PBS-T, BSA 1 %) četros atšķaidījumos: neatšķaidīts, 1:4, 1:16, 1:64. ELISA plates skalo fosfātu fizioloģiskajā buferšķīdumā, kas satur 0,05 % Tween-20 (PBS-T), un noskalotajā un ar pārklājumu klātajā ELISA platē ievada 50 μl no katras šķīdumu plates šķīdumu koncentrācijas.

Pēc tam ELISA plates 30 minūtes inkubē 37 °C temperatūrā. Tad plates skalo un 30 minūtes 37 °C temperatūrā inkubē ar specifiskām monoklonālajām antivielām (konkrētāk, VHSV identificēšanai ar MAb IP5B11 un IHNV identificēšanai attiecīgi ar Hyb 136-3). ELISA platē pievieno 50 μl truša pretpeles antivielas mārrutku peroksidāzes konjugāta atšķaidījumā ar PBS-T-BSA 1:1 000.

Visbeidzot pēc atkārtotas skalošanas ierosina reakcijas, katrā iedobē pievienojot 50 μl ortofenilēndiamīna (OPD). ELISA plates tumsā istabas temperatūrā inkubē 20 minūtes, un reakciju apstādina, katrā iedobē pievienojot 100 μl 0,5 M H2SO4.

ELISA lasāmierīcē monitorē absorbenci viļņa garumiem 492 un 620 nm. Pēc testa rezultātu salīdzināšanas ar pozitīvo un negatīvo kontroļu absorbences vērtībām paraugus apzīmē kā pozitīvus vai negatīvus. Kopumā paraugus, kam neatšķaidītam materiālam kopējā absorbence (A) < 0,5, uzskata par negatīviem, paraugus ar A vērtībām no 0,5 līdz 1,0 uzskata par aizdomīgiem un paraugus, kam A > 1,0, uzskata par pozitīviem.

Šajā punktā minēto ELISA variantu vietā var izmantot citus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

I.6.2. Imūnfluorescence – IF

Sarakstā minētos patogēnus VHSV un IHNV identificē, inficējot šūnas 96 iedobju “Black” platēs, parastajās 24 iedobju platēs vai uz 24 iedobju plates segstikliem. Ja IHNV, VHSV vai tos abus identificē, inficējot šūnas uz segstikliem, rīkojas pēc šāda protokola:

a) segstikliem uzsēj šūnas tādā blīvumā, lai pēc 24 stundu kultivēšanas būtu 60 % līdz 90 % konfluence. Ja iespējams, šajā nolūkā ieteicamas EPC šūnas, jo tās stingri pielīp stikla virsmām, tomēr tikpat labi var izmantot citas šūnu līnijas – tādas kā BF-2, RTG-2 vai FHM. 150 μl šūnu kultūras centrifugāta divos dažādos atšķaidījumos (1:10 un 1:1 000) dublikātā inokulē vienu dienu vecos monoslāņos un 24 stundas inkubē 15 °C temperatūrā;

b) pēc tam barotni ar šūnu kultūru izņem un inficētos šūnu monoslāņus fiksē ar 0,5 ml ledusauksta acetona ūdens šķīduma (80 % tilpumkoncentrācija). Fiksāciju 15 minūtes istabas temperatūrā veic velkmes skapī, pēc tam no acetona šķīduma atbrīvojas un segstikliņus vismaz 30 minūtes žāvē ar gaisu. Šajā posmā plates vai nu nekavējoties apstrādā, vai – 20 °C temperatūrā glabā turpmākai lietošanai;

c) specifiskas monoklonālas antivielas (konkrētāk, VHSV identificēšanai MAb IP5B11, savukārt IHNV identificēšanai attiecīgi Hyb 136-3) atšķaida 0,01 M PBST ar pH 7,2 tādā atšķaidījumā, kā ieteic MAb piegādātājs; fiksētajam monoslānim pievieno 50 līdz 100 μl uz iedobi, un plates mitrā kamerā vienu stundu inkubē 37 °C temperatūrā;

d) segstikliņus trīs reizes saudzīgi skalo ar 0,05 % Tween-20 saturošu fosfātu buferšķīdumu (PBS-T) un pēc pēdējās skalošanas no visa buferšķīduma atbrīvojas. Pēc tam šūnas vienu stundu inkubē 37 °C, par primāro antivielu lietojot peļu imūnglobulīna antivielu konjugātu fluorescīna izotiocianātā (FITC) vai tetrametilrodamīna-5-(un-6-) izotiocianātā (TRITC), saskaņā ar piegādātāja norādījumiem atšķaida, atkal skalo PBS-T un nožāvē. Iekrāsotās kultūras novieto uz priekšmetstikliņiem, izmantojot glicerīna sālsūdens šķīdumu, un pārbauda krītošā ultravioletā (UV) gaismā. Izmanto 10 × un 12 × okulārus un 25 × vai 40 × objektīva lupu ar skaitlisko apertūru attiecīgi < 0,7 un < 1,3.

Alternatīvi attiecībā uz šūnu kultūrām, fiksēšanu un standartkvalitātes antivielām var lietot citus IF paņēmienus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

I.6.3. Neitralizācija

No ievāktā centrifugāta, centrifugējot (2 000 līdz 4 000 × g) vai filtrējot caur membrānas filtru (0,45 μm) ar zemu olbaltumvielu saistīšanas spēju, atdala šūnas, un centrifugātu barotnē ar šūnu kultūru atšķaida 1:100 un 1:10 000.

Vismaz divu centrifugāta atšķaidījumu alikvotas atsevišķi sajauc ar vienādām turpmāk minēto reaģentu daļām un pēc tam 60 minūtes inkubē 15 °C temperatūrā:

a) serums, kas satur specifiskas grupas antivielas pret VHSV atšķaidījumā 1:50 (tilpumkoncentrācija);

b) serums, kas satur specifiskas grupas antivielas pret IHNV atšķaidījumā 1:50 (tilpumkoncentrācija);

c) kopots antiserums pret vietējiem IPNV serotipiem atšķaidījumā 1:50 (tilpumkoncentrācija);

d) tikai barotne (pozitīvais kontrolparaugs).

Katram vīrusa centrifugāta un seruma maisījumam inokulē vismaz divas šūnu kultūras, katru ar 50 μl, un pēc tam inkubē 15 °C temperatūrā. Kā aprakstīts I.5.4. punktā, pārliecinās, vai nerodas CPE.

VHSV celmus un izolātus, kas nereaģē neitralizācijas testos, identificē ar IF vai ar ELISA.

Alternatīvi var izmantot citus neitralizācijas testus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

I.6.4. RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1. Vīrusu RNS sagatavošana

Visas darbības ar RNS veic cimdos uz ledus.

RNS ekstrahē ar fenola–hloroforma metodi vai ar RNS afinitātes rotācijas stobriņiem saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Drīkst izmantot tirdzniecībā pieejamos RNS ekstrahēšanas komplektus, ar kuriem iegūstama augsti kvalitatīva RNS, kas piemērota izmantošanai turpmākajos punktos detalizēti aprakstītajos RT-PCR protokolos.

RNS atkārtoti suspendē destilētā no ribonukleāzes brīvā ūdenī (proti, ar 0,1 % dietilpirokarbonātu apstrādātā ūdenī) vai piemērotā eluēšanas buferšķīdumā.

I.6.4.2. RT-PCR

IHNV konstatēšanai izmanto šādus praimerus:

tiešais praimeris: 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

atgriezeniskais praimeris: 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Izmanto šādus ciklus (viensoļa RT-PCR): 1 cikls: 50 °C 30 min; 1 cikls: 95 °C 2 min; 30 cikli: 95 °C 30 s, 50 °C 30 s, 72 °C 60 s; 1 cikls: 72 °C 7 min un mērcēšana 4 °C temperatūrā.

VHSV konstatēšanai izmanto šādus praimerus:

VN tiešais: 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN atgriezeniskais: 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Izmanto šādus ciklus (viensoļa RT-PCR): 50 °C 30 min, 95 °C 15 min, 35 cikli ar 94 °C 30 s, 55 °C 30 s, 68 °C 60 s. Pēc tam 68 °C temperatūrā 7 minūtes ļauj notikt reakcijai.

RT-PCR reakciju daudzumu un specifiskumu izvērtē ar gela elektroforēzi 1,5 % agarozes gelā ar etīdija bromīdu un novēro UV caurgaismošanā. Attiecībā uz IHNV var novērot PCR amplikonu 693 bp. Attiecībā uz VHSV šis lielums ir 505 bp.

PCR rezultāti var variēties atkarībā no tās izpildīšanas apstākļiem, proti, atkarībā no izmantotā DNS amplifikatora var būt nepieciešams optimizēt amplificēšanas protokolus. Turklāt nepareizas praimeru hibridizācijas vai laboratoriskas kontaminācijas dēļ var tikt iegūti viltuspozitīvi rezultāti. Tāpēc, lai novērstu jebkādas šaubas, ir jāiekļauj pietiekami pozitīvie un negatīvie kontrolparaugi un sekvenēšanas amplikoni. Attiecībā uz VHSV praimeriem īpaši uzmanīgi jārīkojas ar BF-2 šūnām, jo praimeri var reaģēt ar šūnu līnijas DNS/RNS, dodot līdzīga izmēra viltuspozitīvu rezultātu. Testējot no BF-2 šūnām iegūtu centrifugātu, visi amplificētie PCR fragmenti jāsekvenē.

I.6.4.3. RT-qPCR VHSV noteikšanai

VHSV noteikšanai amplificēšanu veic ar šādiem praimeriem un provi:

tiešais praimeris: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′,

atgriezeniskais praimeris: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′

un prove: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

Viensoļa RT-PCR

Katrā plašu atkārtojumā iekļauj negatīvus veidnes kontrolparaugus un pozitīvus kontrolparaugus. Ciklēšanas nosacījumi: 50 °C 30 min, 95 °C 15 min, 40 cikli ar 94 °C 15 s, 60 °C 40 s, 72 °C 20 s; ja nepieciešams, koriģē. Aprakstītā varianta vietā var izmantot citus RT-PCR vai RT-qPCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

I.6.4.4. RT-qPCR IHNV noteikšanai

IHNV noteikšanai amplificēšanu veic ar šādiem praimeriem un provi:

tiešais praimeris: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′,

atgriezeniskais praimeris: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′

un prove: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

Divsoļu RT-qPCR

Tā kā turpmāk minētais tests ir atkarīgs no divsoļu amplifikācijas, ar abu reakciju mēģenēm ir jārīkojas ļoti piesardzīgi, lai nenotiktu kontaminēšanās.

Ciklēšanas nosacījumi (pēc RT soļa): 50 °C 2 min, 95 °C 10 min, 40 cikli ar 95 °C 15 s un 60 °C 1 min; ja nepieciešams, koriģē.

Aprakstītā varianta vietā var izmantot citus RT-PCR vai RT-qPCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

II. Detalizētas diagnostikas metodes un procedūras, ar kurām domājama uzliesmojuma gadījumā apstiprina vai izslēdz aizdomas par VHS, IHN vai tām abām

Ja ir nepieciešama laboratoriska izmeklēšana, lai saskaņā ar Direktīvas 2006/88/EK 57. panta b) punktu, izmantojot tās I pielikuma 1. daļas II.3. punktā aprakstītās diagnostikas metodes, apstiprinātu vai izslēgtu IHN, VHS vai tās abas, izmanto šādas detalizētas diagnostikas metodes un procedūras:

a) parastā vīrusa izolēšana, kam seko vīrusa identificēšana ar seroneitralizāciju vai ar imūnķīmiskām vai molekulārām metodēm;

b) vīrusa konstatēšana ar RT-PCR vai RT-qPCR;

c) citi diagnostiski paņēmieni, piemēram, IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

II.1. Parastā vīrusa izolēšana, kam seko vīrusa identificēšana

II.1.1. Paraugu izraudzīšanās

Izmeklēšanai ņem vismaz 10 zivis, kam vērojamas tipiskas IHN vai VHS pazīmes.

II.1.2. Zivju paraugu sagatavošana un nosūtīšana

Sagatavošanā un nosūtīšanā, ko veic parastās vīrusa izolēšanas vajadzībām, ievēro I.2. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.1.3. Papildu diagnostiskā materiāla ievākšana

Papildu materiāla vākšanā, ko veic parastās vīrusa izolēšanas vajadzībām, ievēro I.3. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.1.4. Paraugu sagatavošana šūnu kultūras izmeklēšanai

Paraugu sagatavošanā šūnu kultūras izmeklēšanai, ko veic parastās vīrusa izolēšanas vajadzībām, ievēro I.4. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.1.5. Šūnu kultūru virusoloģiska izmeklēšana

Virusoloģiskajā izmeklēšanā, ko veic parastās vīrusa izolēšanas vajadzībām, ievēro I.5. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.1.6. Vīrusa identificēšana

Vīrusa identificēšanā, ko veic parastās vīrusa izolēšanas vajadzībām, ievēro I.6. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.2. Vīrusa konstatēšana ar RT-qPCR

II.2.1. Paraugu ņemšana

Paraugu ņemšanā, ko veic, lai konstatētu vīrusus ar RT-qPCR, ievēro I.1.2. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.2.2. Zivju paraugu sagatavošana un nosūtīšana

Paraugus vīrusu konstatēšanai ar RT-qPCR sagatavo un nosūta, ievērojot I.2. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.2.3. Papildu diagnostiskā materiāla ievākšana

Papildu diagnostiskā materiāla ievākšanā, ko veic, lai konstatētu vīrusus ar RT-qPCR, ievēro I.3. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.2.4. Paraugu sagatavošana RT-qPCR vajadzībām

Paraugu sagatavošanā, ko veic, lai konstatētu vīrusus ar RT-qPCR, ievēro I.6.4.1. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.2.5. RT-qPCR

Vīrusa konstatēšanā ar RT-qPCR ievēro I.6.4.1., I.6.4.3. un I.6.4.4. punktā noteiktās metodes un procedūras.

II.3. Citi diagnostiskie paņēmieni

Saskaņā ar I.4.3. punkta aprakstu pagatavoto centrifugātu var iesniegt ELISA testam, netiešās imūnfluorescences antivielu testam (IFAT) vai RT-PCR attiecīgi saskaņā ar I.6.1., I.6.2. vai I.6.4. punktu. Audu materiālam var izmantot citus diagnostiskus paņēmienus, piemēram, sasaldētiem griezumiem – netiešo fluorescējošo antivielu testu (IFAT) vai formalīnā fiksētam audu materiālam – imūnhistoķīmisko analīzi. Šos ātros paņēmienus 48 stundu laikā no paraugu ņemšanas papildina ar vai nu II punkta a) apakšpunktam, vai II punkta b) apakšpunktam atbilstošu virusoloģisku izmeklēšanu, ja:

a) iegūts negatīvs rezultāts; vai

b) ar materiālu, kas ņemts no pirmā IHN vai VHS gadījuma audiem, iegūts pozitīvs rezultāts.

III. Titrēšanas procedūra, kurā pārliecinās par šūnu kultūru uzņēmību pret inficēšanos

Veicot I.5.3. punktā minēto titrēšanu, kurā pārliecinās par šūnu kultūru uzņēmību pret inficēšanos, ievēro šā punkta tālākajās daļās aprakstītās procedūras.

Izmanto vismaz divus VHSV izolātus un vismaz vienu IHNV izolātu. Izolāti pārstāv nozīmīgāko vīrusu grupu Eiropas Savienībā, proti, attiecībā uz VHSV viens patogēnisks izolāts, kas saldūdenī iegūts no varavīksnes foreles, un viens patogēnisks izolāts, kas jūras ūdenī iegūts no akmeņplekstes, bet attiecībā uz IHNV – viens patogēnisks celms, kas Eiropas Savienībā iegūts no varavīksnes foreles. Izmanto dalībvalstīs iegūtus izteiktus izolātus. VHSV vīrusam šūnu kultūrkolbās ar maziem šūnu kultūras pasāžas skaitļiem pavairo BF-2 vai RTG-2 līnijas partijas, savukārt IHNV vīrusam – EPC vai FHM līnijas partijas. Izmanto tādu barotni ar šūnu kultūru, kas satur vismaz 10 % seruma. Inokulēšanai izmanto zemu inficētspējas multiplicitāti (MOI) (< 1).

Kad iestājies pilnīgs CPE, šūnu kultūras centrifugātu 15 minūtes centrifugējot ar 2 000 × g, ievāc vīrusu, sterilizē caur 0,45 μm membrānas filtru un sadala pa etiķetētām kriomēģenēm. Vīrusu glabā – 80 °C temperatūrā.

Nedēļu pēc sasaldēšanas trīs replicētas mēģenes ar katru vīrusu zem auksta ūdens atkausē un titrē pa to attiecīgajām šūnu līnijām. Katru vīrusa izolātu atkausē un titrē vismaz reizi sešos mēnešos vai tad, ja ir aizdomas, ka ir samazinājies šūnu līnijas uzņēmīgums.

Titrēšanas procedūrām jābūt detalizēti aprakstītām un katrreiz jāievēro viena un tā pati procedūra.

Titrēšanā pēc beigupunkta atšķaidījuma katrā atšķaidījuma solī izmanto vismaz sešus replicētus paraugus. Titrus salīdzina ar iepriekš iegūtiem titriem. Ja jebkuram no trim vīrusu izolātiem salīdzinājumā ar sākotnējo titru tas samazinās par koeficientu 2 log vai vairāk, šūnu līniju uzraudzībā vairs neizmanto.

Ja laboratorijā tur dažādas šūnu līnijas, atsevišķi pārbauda katru līniju.

Par vismaz 10 gadiem glabā pierakstus.

2. DAĻA

DETALIZĒTAS DIAGNOSTIKAS METODES UN PROCEDŪRAS KHV SLIMĪBAS (KHVD) UZRAUDZĪBAI UN APSTIPRINĀŠANAI

I. Detalizētas diagnostikas metodes un procedūras KHVD klātbūtnes apstiprināšanai vai attiecīgu aizdomu izslēgšanai

Ja ir nepieciešama laboratoriska izmeklēšana, lai saskaņā ar Direktīvas 2006/88/EK 57. panta b) punktu, izmantojot tās I pielikuma 2. daļas III iedaļā aprakstītās diagnostikas metodes, apstiprinātu KHVD klātbūtni vai izslēgtu aizdomas par to, izmanto šīs daļas I.1.–I.2. punktā aprakstītās detalizētās diagnostikas metodes un procedūras.

I.1. Zivju paraugu sagatavošana

Diagnostiskiem nolūkiem nosūtīt un testēšanai ar parastajām uz PCR vai qPCR bāzētām metodēm izmantot var dzīvas vai nonāvētas un atsevišķi hermētiskās aseptiskās tvertnēs iepakotas zivis vai, alternatīvi, sasaldētus orgānus vai orgānu gabalus, kas konservēti 80 līdz 100 % spirtā vai vīrusu transporta barotnē (apstrādāšanai 48 stundu laikā no ievākšanas).

KHV konstatēšanai ievāc žaunas un nieres; turklāt nodalītā papildu paraugā var iekļaut liesu, galvas smadzenes un zarnas. Akūtos gadījumos audu materiālu no ne vairāk kā piecām zivīm var kopot.

Bez tam noteiktos gadījumos (proti, ja ir aizdomas par KHV, tā var rīkoties ar ļoti vērtīgām zivīm) var izmantot neletālus paraugus, piemēram, asinis, uztriepes no žaunām, žaunu biopsiju, gļotādu noskrāpējumus.

I.1.1. DNS ekstrahēšana

DNS ekstrahē saskaņā ar standartprocedūrām.

Drīkst izmantot tirdzniecībā pieejamos DNS ekstrahēšanas komplektus, ar kuriem iegūstama augsti kvalitatīva DNS, kas piemērota izmantošanai I.2. punktā minētajos PCR protokolos.

I.2. Ierosinātāju konstatēšana un identificēšana ar metodēm, kuru pamatā ir polimerāzes ķēdes reakcija (PCR)

I.2.1. qPCR KHV konstatēšanai

KHV konstatēšanai ar qPCR izmanto šādu qPCR testu:

tiešais praimeris (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′,

atgriezeniskais praimeris (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′

un prove (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Ciklēšanas nosacījumi: viens cikls ar 95 °C 15 min, kam seko 40 cikli ar 94 °C 15 s un 60 °C 60 s. Katrā plašu atkārtojumā iekļauj negatīvus veidnes kontrolparaugus un pozitīvus kontrolparaugus. Tomēr aprakstītā varianta vietā var izmantot citus qPCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

I.2.2. Parastā PCR KHV konstatēšanai

Izmanto šajā punktā aprakstīto testu, kurā mērķgēns ir KHV timīna kināzes (TK) gēns. Tomēr aprakstītā varianta vietā var izmantot citus PCR testus, kuriem ir pierādīts aprakstītajam testam līdzvērtīgs jutīgums un specifiskums.

Tiešais praimeris (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

atgriezeniskais praimeris (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Ciklēšanas nosacījumi: viens cikls ar 95 °C 5 min, pēc tam 35 cikli ar 95 °C 30 s, 52 °C 30 s, 72 °C 1 min un viens cikls ar 72 °C 10 min. Iegūtā produkta izmēram vajadzētu būt 409 bp.

PCR rezultāti var variēties atkarībā no tās izpildīšanas apstākļiem, proti, atkarībā no izmantotā DNS amplifikatora var būt nepieciešams optimizēt amplificēšanas protokolus. Turklāt nepareizas praimeru hibridizācijas vai laboratoriskas kontaminācijas dēļ var tikt iegūti viltuspozitīvi rezultāti. Katrā plašu atkārtojumā iekļauj negatīvus veidnes kontrolparaugus un pozitīvus kontrolparaugus. Tomēr aprakstītā varianta vietā var izmantot citus PCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

Pirmo konstatāciju kādā teritorijā vai nu apstiprina ar sekvenēšanas metodi, vai vīrusa tūlītējai identificēšanai nosūta uz Direktīvas 2006/88/EK VI pielikumā minētajām zivju slimībās specializētajām laboratorijām – valsts references laboratoriju vai ES references laboratoriju.

II. Detalizētās diagnostikas metodes un procedūras KHVD uzraudzībai

Veicot paraugu ņemšanu un laboratoriskus izmeklējumus ar I pielikuma 2. daļas II vai III iedaļā aprakstītajām diagnostikas metodēm, lai, kā aprakstīts minētā pielikuma 2. daļas I iedaļā, iegūtu vai saglabātu noteiktus veselības statusus attiecībā uz KHVD, izmanto detalizētās diagnostikas metodes un procedūras, kas aprakstītas tālāk šīs daļas II.1. un II.2. punktā.

II.1. Zivju paraugu sagatavošana

Ja iespējams, paraugus ņem no zivīm, kas ilgāku laiku turētas tādu temperatūru diapazonā, kurās iespējama vīrusa attīstīšanās, proti, divas līdz trīs nedēļas 15 °C līdz 26 °C temperatūrā. Ja iespējams, paraugus ievāc 24 stundas, taču ne vēlāk kā 72 stundas pēc tam, kad piekopta tāda saimniekošanas prakse, piemēram, tīklošana vai pārvadāšana, kuras rezultātā tādu zivju organismā, kam ir nēsātāja statuss, vīruss varētu no jauna aktivizēties.

KHVD uzraudzības nolūkiem var nosūtīt un testēšanai ar metodēm, kuru pamatā ir PCR, izmantot dzīvas vai nonāvētas un atsevišķi hermētiskās aseptiskās tvertnēs iepakotas zivis vai, alternatīvi, sasaldētus orgānus vai orgānu gabalus, kas konservēti 80 līdz 100 % spirtā vai vīrusu transporta barotnē (apstrādāšanai 48 stundu laikā no ievākšanas). KHVD uzraudzībai ievāc žaunu un nieru audus.

KHVD uzraudzības nolūkā iespējami izvairās no kopotiem paraugiem. Ja nepieciešami kopoti paraugi, kopot atļauts ne vairāk kā divu zivju audu materiālu. Lielākus paraugus homogenizē miezerī ar piestu vai ar homogenizatoru Stomacher un pirms dzidrināšanas paņem apakšparaugus DNS ekstrahēšanai. Var rīkoties arī tā, ka no katriem paraugā iekļautajiem audiem ievāc apakšparaugu, ko ievieto lizēšanas mēģenēs.

II.1.1. DNS ekstrahēšana

DNS ekstrahē saskaņā ar standartprocedūrām. Drīkst izmantot tirdzniecībā pieejamos DNS ekstrahēšanas komplektus, ar kuriem iegūstama augsti kvalitatīva DNS, kas piemērota izmantošanai II.2. punktā aprakstītajos PCR protokolos.

Pieņemama audu un barotnes attiecība ir masa/tilp. 1:9. Testus veic ar 20 līdz 25 mg audu materiāla.

II.2. KHVD uzraudzīšana ar metodēm, kuru pamatā ir PCR

KHV uzraudzībai izmanto qPCR. Ja teritorijā, kas agrāk nav apstiprināta par pozitīvu, parādās pozitīvi paraugi, testu rezultātus apstiprina vai nu ar:

a) paraugiem veiktas PCR vai divsoļu atgriezeniskās transkriptāzes PCR galaproduktu sekvenēšanu. Iegūtajai tīrajai konsensa sekvencei vismaz par 98 % jāatbilst etalonsekvencēm;

b) vai pretējā gadījumā paraugus var nosūtīt uz kādu valsts references laboratoriju apstiprināšanai.

II.2.1. qPCR KHV konstatēšanai

qPCR izmanto atbilstoši šādam aprakstam:

tiešais praimeris (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′,

atgriezeniskais praimeris (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′

un prove (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Ciklēšanas nosacījumi: viens cikls ar 95 °C 15 min, kam seko 50 cikli ar 94 °C 15 s un 60 °C 60 s.

qPCR rezultāti var variēties atkarībā no tās izpildīšanas apstākļiem, proti, atkarībā no izmantotā DNS amplifikatora var būt nepieciešams optimizēt amplificēšanas protokolus. Turklāt nepareizas praimeru hibridizācijas vai laboratoriskas kontaminācijas dēļ var tikt iegūti viltuspozitīvi rezultāti. Katrā plašu atkārtojumā iekļauj negatīvus veidnes kontrolparaugus un pozitīvus kontrolparaugus. Tomēr aprakstītā varianta vietā var izmantot citus qPCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

II.2.2. Parastā PCR KHV konstatācijas apstiprināšanai

Lai apstiprinātu KHV infekcijas klātbūtni, izmanto 2.1. tabulā aprakstīto parasto divsoļu atgriezeniskās transkriptāzes PCR, pēc kuras iegūto amplificēto materiālu sekvenē.

2.1. tabula

Praimeri un nosacījumi divsoļu atgriezeniskās transkriptāzes PCR testam, kurā mērķvīrusi ir visi karpu dzimtas herpesvīrusi (CyHV-1, CyHV-2 un CyHV-3)

Praimera nosaukums Sekvence Ciklēšanas nosacījumi Produkta izmērs CyHVpol-tiešais 5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ PCR pirmais raunds 1 ciklu: 95 °C, 2 min 40 ciklus: 95 °C, 30 s 55 °C, 30 s 72 °C, 45 s 1 ciklu: 72 °C, 10 min 362 bp CyHVpol-atgriezeniskais 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol-iekšējais tiešais 5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ PCR otrais raunds 1 ciklu: 95 °C, 2 min 40 ciklus: 95 °C, 30 s 55 °C, 30 s 72 °C, 45 s 1 ciklu: 72 °C, 10 min 339 bp CyHVpol-iekšējais atgriezeniskais 5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

PCR rezultāti var variēties atkarībā no tās izpildīšanas apstākļiem, proti, atkarībā no izmantotā DNS amplifikatora var būt nepieciešams optimizēt amplificēšanas protokolus. Turklāt nepareizas praimeru hibridizācijas vai laboratoriskas kontaminācijas dēļ var tikt iegūti viltuspozitīvi rezultāti. Katrā plašu atkārtojumā iekļauj negatīvus veidnes kontrolparaugus un pozitīvus kontrolparaugus. Aprakstītā varianta vietā var izmantot citus PCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

Sekvenēšanu var veikt laboratorija vai sekvenēšanā specializējušās ārpakalpojumu firmas. Sekvenēšanas rezultātus analizē, sekvences salīdzinot ar zināmām KHV etalonsekvencēm (Gen Bank piekļuves numuri AP008984, DQ657948 un DQ177346). Iegūtajai tīrajai konsensa sekvencei vismaz par 98 % jāatbilst minētajām etalonsekvencēm.

3. DAĻA

DETALIZĒTAS DIAGNOSTIKAS METODES UN PROCEDŪRAS LAŠU INFEKCIOZĀS ANĒMIJAS (ISA) UZRAUDZĪBAI UN APSTIPRINĀŠANAI

I. ISA uzraudzībai un kontrolei paredzētās paraugu ņemšanas procedūras

Ņemot paraugus un veicot laboratorisku izmeklēšanu I pielikuma 3. daļā izklāstīto uzraudzības vai izskaušanas programmu nolūkā vai ISA klātbūtnes apstiprināšanai vai izslēgšanai saskaņā ar Direktīvas 2006/88/EK 57. panta b) punktu, izmanto šīs iedaļas I.1., I.2. un I.3. punktā noteiktās detalizētās metodes un procedūras.

I.1. Zivju paraugu sagatavošana

Laboratoriskiem izmeklējumiem attiecībā uz ISA klātbūtni, ja vien iespējams, zivju paraugus nekopo. Tomēr ir pieņemami kopot 2 līdz 5 zivis ISA uzraudzības vajadzībām.

No visām zivīm, no kurām ņemti paraugi, ievāc paraugus apgrieztās transkriptāzes polimerāzes ķēdes reakcijas analīzei (RT-PCR). No zivs ar sterilu instrumentu izņem vidusnieres gabaliņu un to ievieto mikrocentrifūgas mēģenē, kur iepildīts RNS konservēšanas šķīdums (1 ml), kura lietderīgums ir pierādīts. Audus no ne vairāk kā piecām zivīm var ievākt vienā mēģenē ar transporta šķīdumu, un tie veido vienu kopotu paraugu. Viena parauga audu svaram jābūt 0,5 g. Ja zivis ir pārāk mazas, vajadzīgā parauga svara iegūšanai var nosauktajā secībā paņemt nieru, sirds, liesas, aknu vai vārtnieka aklās zarnas gabaliņus, lai iznākumā svars būtu 0,5 g.

Audus histoloģiskai izmeklēšanai ņem tikai no nesen nonāvētām zivīm ar normālu miesasbūvi, kurām novēro ISA klātbūtnei atbilstošas klīniskās pazīmes vai pēcnāves izmeklēšanas rezultātus. Ņem visu ārējo vai iekšējo bojājumu paraugus un no atsevišķām zivīm visos gadījumos ar skalpeļa palīdzību ņem vidusnieres, sirds, aknu, aizkuņģa dziedzera, zarnu, žaunu un liesas paraugus, ko ievieto 8–10 % tilpumkoncentrācijas fizioloģiskajā formalīna buferšķīdumā. Lai audi pietiekami labi saglabātos, fiksatīva un audu attiecībai jābūt vismaz 20:1. Imūnķīmiskajai analīzei (IHC) ņem vidusnieres un sirds paraugus.

No visām paraugu ņemšanai paredzētām zivīm ņem audus virusoloģiskai izmeklēšanai šūnu kultūrā. Ar sterilu instrumentu no zivīm ņem aknu, galvasnieres vai vidusnieres, sirds un liesas gabaliņus, un tos ievieto plastmasas mēģenēs, kurās iepildīti 9 ml transporta barotnes. Audus no ne vairāk kā piecām zivīm var ievākt vienā mēģenē ar transporta šķīdumu, un tie veido vienu kopotu paraugu. Viena parauga audu svaram jābūt 1,0 ± 0,5 g.

I.2. Zivju paraugu nosūtīšana

Ja pārvadāšanas laikā iespējams ievērot šā punkta trešajā daļā aprakstītās temperatūras prasības, uz laboratoriju var nosūtīt veselas zivis. Veselās zivis ietin absorbējošā papīrā un pārvadā plastikāta maisiņos, vēsumā, kā aprakstīts minētajā daļā.

Var sūtīt arī dzīvas zivis, taču tad transportēšana jāuzrauga zivju slimībās specializētajai valsts references laboratorijai un jāņem vērā papildu dezinficēšanas un biodrošības problēmas, kas rodas dzīvu zivju transportēšanā.

Virusoloģiskai izmeklēšanai vai RT-PCR analīzei paredzētos asins paraugus un mēģenes ar zivju audiem ievieto izotermiskos konteineros (tādos kā polistirola kastes ar biezām sienām) kopā ar pietiekamu daudzumu ledus vai aukstumbloku, kas ceļā uz laboratoriju nodrošina paraugu dzesināšanu. Paraugus nedrīkst sasaldēt, bet pārvadāšanas kastē, to saņemot, joprojām jābūt ledum vai arī vienam vai vairākiem aukstumblokiem joprojām jābūt daļēji vai pilnīgi sasalušiem. Ārkārtas apstākļos RT-PCR analīzei, kā arī virusoloģiskai izmeklēšanai paredzētos paraugus drīkst ātri sasaldēt un pārvest uz laboratoriju – 20 °C vai zemākā temperatūrā.

No RT-PCR analīzei paredzētiem audiem, ko glabā RNAlater, RNS atkarībā no paraugu glabāšanas temperatūras ekstrahē šādā laikā:

37 °C glabāti paraugi: viena diena,

25 °C glabāti paraugi: viena nedēļa,

4 °C glabāti paraugi: viens mēnesis,

– 20 °C glabāti paraugi: bez termiņa.

Ja zivju audi fiksatīvā jātransportē histoloģiskai izmeklēšanai, tie jānosūta hermētiskās mēģenēs triecienizturīgās tvertnēs. Šos paraugus nesasaldē.

Šūnu kultūras virusoloģiskā izmeklēšana jāsāk iespējami drīz un ne vēlāk kā 48 stundas pēc paraugu ievākšanas. Izņēmuma gadījumos, ja izmeklējamo materiālu aizsargā transporta barotne un ja pārvadāšanas laikā iespējams ievērot prasības attiecībā uz temperatūru, virusoloģisko izmeklēšanu var sākt vēlākais 72 stundas pēc materiāla ievākšanas.

I.3. Papildu diagnostiskā materiāla ievākšana

Ar nosacījumu, ka diagnostiskā laboratorija to ļauj, bez I.1. punktā minētajiem ievākt un papildu izmeklēšanai sagatavot var vēl citus zivju audus.

II. Detalizētas diagnostikas metodes un procedūras ISA uzraudzībai, tās klātbūtnes apstiprināšanai vai attiecīgu aizdomu izslēgšanai

Ja laboratorisku izmeklēšanu, ar kuru, kā aprakstīts I pielikuma 3. daļas I iedaļā, attiecībā uz ISA iegūst vai saglabā noteiktu veselības statusu vai saskaņā ar Direktīvas 2006/88/EK 57. panta b) punktu apstiprina ISA klātbūtni vai izslēdz aizdomas par to, veic ar I pielikuma 3. daļas II iedaļā aprakstītajām diagnostikas metodēm, izmanto turpmāk II.1. līdz II.5. punktā aprakstītās detalizētās metodes un procedūras.

II.1. Paraugu izmeklēšana ar RT-PCR

ISAV skrīningam izmantotā diagnostikas metode ir RT-qPCR. Tā kā atkarībā no veikšanas apstākļiem RT-qPCR rezultāti var atšķirties, jebkādu šaubu novēršanai jāiekļauj pietiekami pozitīvie un negatīvie kontrolparaugi, un amplikoni.

II.1.1. Kopējās RNS ekstrahēšana

Visas darbības ar RNS veic cimdos uz ledus.

Kopējo RNS ekstrahē ar fenola–hloroforma metodi vai saskaņā ar ražotāja norādījumiem ar RNS afinitātes rotācijas stobriņiem.

Attīrītu RNS atkārtoti suspendē destilētā no ribonukleāzes brīvā ūdenī (proti, ar 0,1 % dietilpirokarbonātu apstrādātā ūdenī).

Ekstrahētās RNS koncentrāciju un tīrību novērtē, mērot optisko blīvumu pie 260 nm un pie 280 nm. Var arī izmantot iekšējus kontrolparaugus, kuros mērķsegments ir vīrusa genoms, kā minēts II.1.3. punktā.

II.1.2. RT-PCR ISAV konstatēšanai

ISAV genoma amplificēšanai var izmantot vairākas RT-PCR metodes. Var veikt divsoļu RT-PCR, kurā RT un PCR reakcijas soļus izpilda divās atsevišķās mēģenēs. Tomēr var veikt arī viensoļa reakciju, kurā abas reakcijas izpilda vienā mēģenē. Ja vien iespējams, jāizmanto viensoļa metode, jo tad saturs nav jāpārvieto, tāpēc vienas mēģenes tests samazina krusteniskās kontaminācijas risku, turklāt to atzīst par tikpat jutīgu kā divsoļu metodi.

Izmanto šajā punktā aprakstītos praimerus un testu, proti, praimeru pāri ILA1 un ILA2, kuru mērķsegments ir 8. segments un kuri atzīti par piemērotiem ISAV konstatēšanai uzliesmojumu gadījumos un zivju vīrusa nēsātāju organismā. ILA2 atgriezeniskais praimeris neatbilst Ziemeļamerikas izolātiem, un tādos gadījumos izmanto alternatīvu praimeru komplektu.

Tiešais praimeris (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′,

atgriezeniskais praimeris (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Ciklēšanas nosacījumi: viens cikls ar 50 °C 30 min, viens cikls ar 94 °C 15 min, 40 cikli ar 94 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 60 s; viens cikls ar 72 °C 5 min. Iegūtā produkta izmērs 155 bp.

PCR rezultāti var variēties atkarībā no tās izpildīšanas apstākļiem, proti, atkarībā no izmantotā DNS amplifikatora var būt nepieciešams optimizēt amplificēšanas protokolus. Turklāt nepareizas praimeru hibridizācijas vai laboratoriskas kontaminācijas dēļ var tikt iegūti viltuspozitīvi rezultāti. Katrā plašu atkārtojumā iekļauj negatīvus veidnes kontrolparaugus un pozitīvus kontrolparaugus. Tomēr aprakstītā varianta vietā var izmantot citus RT-PCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

II.1.3. RT-qPCR ISAV konstatēšanai

Ar RT-qPCR iespējams panākt lielāku specifiskumu un, domājams, arī jutību. Ar šo metodi testu var izpildīt ātrāk, jo nav vajadzīgs gela elektroforēzes solis, turklāt tā mazina krusteniskās kontaminācijas risku, jo vīrusa genomiskās RNS daudzumu iespējams aplēst parauga mēģenē. RT-qPCR testam ir tāds trūkums, ka amplificētos produktus bieži vien nav iespējams sekvenēt. Tomēr, ja ir šaubas par amplificētā produkta specifiskumu, rezultāta apstiprināšanai jāizpilda vēl kāds ISAV specifisks tests.

Izmanto šajā punktā aprakstīto testu, kura mērķsegments ir 8. segments. Šis tests aptver Eiropas Savienības, Eiropas Brīvās tirdzniecības asociācijas un Ziemeļamerikas izolātus. Ja vien iespējams, izmanto viensoļa metodi, jo vienas mēģenes tests samazina krusteniskās kontaminācijas risku.

Tiešais praimeris: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′,

atgriezeniskais praimeris: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′

un prove: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.

Katrā plašu atkārtojumā iekļauj negatīvus veidnes kontrolparaugus un pozitīvus kontrolparaugus. Ciklēšanas nosacījumi: viens cikls ar 50 °C 30 min, viens cikls ar 95 °C 15 min, 40 cikli ar 94 °C 15 s, 60 °C 60 s; ja nepieciešams, koriģē. Aprakstītā varianta vietā var izmantot citus RT-PCR vai RT-qPCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

II.1.4. Amplificētu PCR produktu sekvenēšana

Tiešais praimeris (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;

atgriezeniskais praimeris (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.

Katrā plašu atkārtojumā iekļauj negatīvus veidnes kontrolparaugus un pozitīvus kontrolparaugus. Ciklēšanas nosacījumi (viensoļa RT-PCR): viens cikls ar 50 °C 30 min, viens cikls ar 94 °C 15 min, 40 cikli ar 94 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 60 s, viens cikls ar 72 °C 5 min; ja nepieciešams, koriģē. Aprakstītā varianta vietā var izmantot citus RT-PCR vai RT-qPCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

Alternatīvi HPR sekvenēšanai 6. segmentā var izmantot šādu metodi:

tiešais praimeris: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′,

atgriezeniskais praimeris: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′.

Produkta izmērs: 304 nt, ja HPR0.

Var izmantot arī RT-PCR testus ar tādu pašu jutīgumu un specifiskumu kā šajā punktā aprakstītajiem testiem.

Pirms sekvenēšanas amplificētā RT-PCR produkta tīrību pārbauda ar gela elektroforēzi. Ja iegūts tikai viens tīrs fragments, to attīra tieši pēc PCR reakcijas. Ja ir vairāki amplificēti fragmenti, ar gela elektroforēzi attīra interesējošo fragmentu. PCR fragmentus no šķīdumiem vai agarozes geliem attīra, PCR fragmentiem saskaņā ar ražotāja norādījumiem izmantojot afinitātes rotācijas stobriņus.

Sekvenēšanu ar amplifikācijas praimeru palīdzību izdara sekvenēšanā specializējušās ārpakalpojumu firmas. Sekvenēšanas rezultātus analizē ar meklēšanas rīku BLAST, un sekvences salīdzina ar citām zināmām sekvencēm ASV Nacionālā Biotehniskās informācijas centra (NCBI) nukleotīdu datubāzē.

Sekvenēšanai jānovērš jebkādas šaubas par amplificēta RT-PCR produkta specifiskumu.

II.2. ISAV izolēšana uz šūnu kultūrām

II.2.1. Paraugu sagatavošana

Audus var glabāt – 80 °C temperatūrā. Pirms izmeklēšanas audus sasaldē un atkausē tikai vienu reizi. Uzraudzības un kontroles nolūkiem izmeklēšanu veic iespējami drīz.

Katru paraugu (kopotos audus pārvadāšanas šķīdumā) pilnīgi homogenizē, izmantojot validētu homogenizētāju, 0 līdz 6 °C temperatūrā 15 minūtes centrifugē (2 000 līdz 4 000 × g), un centrifugātu pēc filtrācijas (0,45 μm) inkubē ar vienādu tilpumu pienācīgi atšķaidīta pret IPNV vietējiem serotipiem izstrādājušos antiserumu maisījuma. Antiseruma titram 50 % plātnīšu neitralizācijas testā jābūt vismaz 1:2 000. Maisījumu vienu stundu inkubē 15 °C temperatūrā. Šādi iegūst inokulātu.

Visu inokulātu apstrādei ar IPN vīrusa antiserumu (vīruss, kurš dažās Eiropas daļās sastopams 50 % zivju paraugu) ir mērķis novērst IPN vīrusa izraisītu CPE inokulētajās šūnu kultūrās. Šādu apstrādi var veikt, lai samazinātu virusoloģisko izmeklējumu ilgumu, kā arī to gadījumu skaitu, kuros būtu jāuzskata, ka CPE potenciāli liecina par ISAV. Ja paraugi ir no ražošanas vienībām, kuras uzskata par brīvām no IPN, inokulātus ar IPN vīrusa antiserumu var neapstrādāt.

II.2.2. Šūnu kultūru inokulēšana

Primārajai ISAV izolēšanai izmanto Atlantijas laša nieru (ASK) šūnas. Ņemot vērā celmu mainīgumu un to, ka dažādu celmu vairošanās spēja dažādās šūnu līnijās atšķiras, var izmantot arī citas šūnu līnijas, par kurām pierādīts, ka tās ir pietiekami produktīvas un jutīgas ISAV izolēšanai. Ja vien izmanto zemu pasāžas līmeni, uzskatāms, ka līdz šim zināmo vīrusu izolātu izolēšana un augšana ASK šūnās noris labvēlīgi. ASK šūnām var novērot izteiktāku citopātisko efektu (CPE) nekā citām uzņēmīgām šūnu līnijām, piemēram, SHK-1 (laša galvasnieres šūnas-1).

ASK (65. vai agrāks pārsējums) šūnas audzē daudziedobju platēs barotnē L-15, kas satur 10 % liellopu embrionālā seruma, 200 mM L-glutamīna tilpumkoncentrācijā 2 % un 50 mM 2-merkaptoetanola tilpumkoncentrācijā 0,08 %. Ar antiserumu apstrādātu orgānu suspensiju inokulē jaunu, aktīvi augošu šūnu kultūrās, raugoties, lai galīgajā atšķaidījumā audu materiāla attiecība pret kultūras barotni būtu 1:1 000. Par katru orgānu iedobē ar 2 ml kultivēšanas barotnes ievada 40 μl inokulāta suspensijas. Lai līdz minimumam samazinātu krusteniskās kontaminācijas risku, paraugiem no dažādām zivaudzētavas vietām izmanto atsevišķas plates ar 12 vai 24 iedobēm.

Vienu plati atstāj bez inokulāta un izmanto par negatīvo kontrolparaugu. Par pozitīvu kontrolparaugu izmantojamu ISAV standartizolātu atsevišķā platē inokulē šādi. Pirmajā iedobē inokulē simt μl ISAV izejpreparāta (minimālais titrs 107, audu kultūras inficējošā deva ar beigupunktu 50 % (TCID50 ml– 1)) un samaisa. Noteiktu šā materiāla tilpumu no pirmās iedobes pārvieto otrajā tā, lai iegūtais atšķaidījums būtu 1:10, un samaisa. Šo procedūru atkārto tā, lai desmitkārtīgu atšķaidījumu iegūtu sešās iedobēs. ISAV izejpreparātu – 80 °C temperatūrā var glabāt vismaz divus gadus, bet pēc atkausēšanas tas jāizlieto trīs dienu laikā. Jāraugās, lai testa platēs nepieļautu krustenisko kontamināciju ar pozitīvās kontroles materiālu. Lai izvairītos no šāda riska, pozitīvos kontrolparaugus sagatavo un ar tiem darbojas atsevišķi no testa platēm. Tā vietā, lai inokulēšanā katrreiz izmantotu pozitīvu kontrolparaugu, var ik sešus mēnešus testēt ASK šūnu jutīgumu pret ISAV izolātiem.

Paraugus ne ilgāk kā 15 dienas inkubē 15 ± 2 °C temperatūrā. Šūnu kultūras mikroskopā attiecībā uz CPE pārbauda divas reizes – laikā no piektās dienas līdz septītajai un no 12. līdz 14. dienai pēc inokulēšanas. Ja kādam kopotam paraugam vērojams CPE, nekavējoties saskaņā ar II.2.4. punktu jāsāk vīrusa identificēšanas procedūras. Ja līdz 14. dienai CPE netiek novērots, izdara netiešās imūnfluorescences antivielu testu (IFAT), hemadsorbcijas testu vai RT-PCR.

II.2.3. Šūnu pārsēšana

Šūnas pārsēj laikā starp 13. un 15. dienu. Attiecīgi atšķaidītu (1/10) kultūras centrifugātu ievada iedobēs, kurās ir svaigas, aktīvi augošas šūnas, un 14 ± 2 °C temperatūrā inkubē ne ilgāk kā 18 dienas. Šūnu kultūras mikroskopā attiecībā uz CPE pārbauda divas reizes – laikā no piektās dienas līdz septītajai un no 14. līdz 18. dienai pēc inokulēšanas. Ja kādam kopotam paraugam vērojams CPE, nekavējoties saskaņā ar II.2.4. punktu jāsāk vīrusa identificēšanas procedūras. Ja līdz 14. līdz 18. dienai CPE netiek novērots, veic hemadsorbcijas testu vai RT-PCR testu.

Ja citotoksicitāti novēro pirmajās septiņās inkubācijas dienās, šūnas pārsēj tajā posmā un 14 līdz 18 dienas inkubē, pēc tam tās atkal pārsēj un inkubē vēl 14 līdz 18 dienas. Ja citotoksicitāti novēro pēc septiņām dienām, šūnas pārsēj vienu reizi un no pirmās inokulēšanas inkubē pavisam 28 līdz 36 dienas.

Ja primārajā kultūrā vērojama bakteriāla kontaminācija, testu sagatavo vēlreiz, izmantojot – 80 °C temperatūrā glabāto audu homogenātu. Audu homogenātu pirms inokulēšanas 0 līdz 6 °C temperatūrā 15 līdz 30 minūtes centrifugē 4 000 × g, un centrifugātu filtrē (0,22 μm). Ja bakteriālu kontamināciju novēro šūnu pārsēšanas laikā, centrifugātu filtrē (0,22 μm), inokulē tikko pārsētām šūnām un inkubē vēl 14 līdz 18 dienas.

II.2.4. Vīrusa identificēšanas testi

Ja kaut vienā stadijā novēro CPE vai ja hemadsorbcijas tests ir pozitīvs, veic vīrusa identificēšanu. ISAV identificēšanā vēlamā metode ir RT-PCR saskaņā ar II.1. punktu un imūnfluorescences (IF) metode saskaņā ar II.2.6. punktu. Ja tiek uzskatīts, ka iespējama citu vīrusu klātbūtne, vīrusa identificēšanai veic papildu testus. Ja ar šiem testiem vīruss nedēļas laikā nav galīgi identificēts, centrifugātu nekavējošai identifikācijai nosūta tālāk uz:

a) Pasaules Dzīvnieku veselības organizācijas (OIE) references laboratoriju darbā ar ISA; vai

b) uz Direktīvas 2006/88/EK VI pielikumā minētajām zivju slimībās specializētajām laboratorijām – valsts references laboratoriju vai ES references laboratoriju.

II.2.5. Hemadsorbcija

Tā kā ISAV replicēšanās šūnu kultūrās ne vienmēr rada CPE, tad katrā iedobē saskaņā ar šo punktu veic RT-PCR testu vai hemadsorbcijas testu vai saskaņā ar II.2.6. punktu – IF testu.

No visām iedobēm, arī pozitīvo un negatīvo kontrolparaugu iedobēm, barotni ar šūnu kultūru izņem un ievieto etiķetētās sterilās mēģenēs. Katrā iedobē iepilda piecsimt μl skalotu truša vai zirga eritrocītu tilpumkoncentrācijā 0,2 % vai skalotas varavīksnes foreles vai Atlantijas laša eritrocītu suspensijas tilpumkoncentrācijā 0,05 % un istabas temperatūrā inkubē 45 minūtes. Pēc tam eritrocītu suspensiju izlej un katru iedobi divreiz izskalo ar barotni L-15. Katru iedobi pārbauda mikroskopā.

Ja uz ASK šūnu virsmas ir eritrocītu sakopojumi, ir iespējama inficēšanās ar ortomiksovīrusu. Ja hemadsorbcijas tests ir pozitīvs, nekavējoties saskaņā ar II.2.4. punktu veic vīrusa identificēšanas testu.

II.2.6. Imūnfluorescence (IF)

ASK (65. vai agrāks pārsējums) daudziedobju platēs audzē barotnē L-15, kas satur 10 % liellopu embrionālā seruma, 200 mM L-glutamīna tilpumkoncentrācijā 2 % un 50 mM 2-merkaptoetanola tilpumkoncentrācijā 0,08 %, un izmanto tad, kad konfluence pārsniegusi 50 %. Var izmantot arī citas šūnu līnijas vai barotni, kuru lietderīgums ir pierādīts. Divās iedobēs katrā iepilda 225 μl ar vīrusu varbūtēji inficētas kultūras centrifugāta, samaisa un 225 μl iepilda vēl divās iedobēs, iegūstot atšķaidījumu 1:5. Vēl divās iedobēs inokulātu neievada, un tās izmanto par kontrolparaugiem. Paraugiem no katras zivaudzētavas, kā arī vīrusa kontrolei izmanto atsevišķu plati. Vīrusa kontrolparaugam izmanto ISAV standartizolātu.

Plates inkubē 14 ± 2 °C temperatūrā un tās mikroskopiski pārbauda ne vēlāk kā 7 dienu laikā. Ja jau agrīnā stadijā novēro CPE, kā arī tad, ja 7 dienu laikā CPE nenovēro, nākamais solis ir fiksācija. Iedobes skalo ar fosfātu buferšķīdumu (PBS) un istabas temperatūrā 20 minūtes ar inkubācijas paņēmienu fiksē ar 80 % acetonu. Plates žāvē ar gaisa plūsmu un uzreiz nokrāso vai pirms krāsošanas ne ilgāk kā 24 stundas glabā 0 līdz 6 °C temperatūrā.

Replicētas iedobes krāso ar maisījumu no ISAV monoklonālajām antivielām (MAb) 3H6F8 un 1OC9F5vai ar citu MAb, kuras iedarbīgums un specifiskums ir pierādīti, pēc tam fosfātu buferšķīdumā atšķaida un 30 minūtes inkubē 37 ± 4 °C temperatūrā. Tad plates atbrīvo no monoklonālās antivielas un trīs reizes skalo ar 0,05 % Tween 20 fosfātu buferšķīdumā. Katrā iedobē iepilda ar fosfātu buferšķīdumu atšķaidītu peļu antivielas IgG un fluorescīna izotiocianāta konjugātu (FITC) un 30 minūtes inkubē 37 ± 4 °C temperatūrā. Monoklonālo antivielu un FITC konjugāta dažādo partiju atšķaidījumus katrā laboratorijā optimizē. Plates atbrīvo no antivielas un trīs reizes skalo 0,05 % Tween 20 fosfātu buferšķīdumā.

Tūlīt pēc tam iedobes pārbauda inversijas mikroskopā, kas pielāgots fluorescences mikroskopijai un aprīkots ar FITC ierosai piemērotu filtru. Ja novēro fluorescējošas šūnas, uzskata, ka tests ir pozitīvs. Pārbaude ir derīga tikai tad, ja pozitīvajiem kontrolparaugiem rezultāti ir pozitīvi, bet negatīvajiem – negatīvi.

II.3. Citu audu izmeklēšana

II.2.6. punktā minēto paņēmienu var izmantot arī citiem audiem, piemēram, aknām, liesai un sirdij, ja vien uz priekšmetstikliņu izdodas pārnest pietiekami daudz endotēlija šūnu, leikocītu vai limfocītu. Visiem audiem izmanto vienu un to pašu krāsošanas paņēmienu, lai gan dažus audus nebūtu vēlams krāsot ar propīdija jodīdu, bet gan šūnu tipu audu nospiedumā noteikt ar fāzu kontrastmikroskopu.

II.4. Histoloģija

No parafīnā ieguldītiem griezumiem ņem 5 μm biezus griezumus un krāso ar hematoksilīnu un eozīnu.

Klīniski slimu Atlantijas lašu organismā ir vērojamas mainīgas histoloģiskās pārmaiņas, taču to vidū var būt šādas:

a) vairāki eritrocīti centrālajā venozajā sinusā un plātnīšu kapilāros žaunās, kur var veidoties arī eritrocītu trombi;

b) atstatus no aknu lielajiem asinsvadiem vērojamas vairākperēkļu vai saplūdušas petehijas, hepatocītu nekroze vai abi; perēkļveida eritrocītu sakopojumi paplašinātos aknu sinusoīdos;

c) eritrocītu uzkrāšanās zarnu lamina propria asinsvados un varbūtēji asiņošana lamina propria;

d) eritrocītu uzkrāšanās rezultātā palielinājusies liesas stroma;

e) intersticiāla asiņošana – no vieglas vairākperēkļu līdz plašai difūzai – ar kanāliņu nekrozi asiņošanas vietās, eritrocītu uzkrāšanās nieru kamoliņos;

f) eritrofagocitoze liesā un sekundāra asiņošana aknās un nierēs.

II.5. Imūnhistoķīmija (IHC)

Formalīnā fiksētu audu parafinētiem griezumiem izmanto poliklonālas antivielas pret ISAV nukleoproteīnu. Izmeklē vidusnieri un sirdi (pārejas vieta, kurā ietilpst trīs kambari un vārsti). Patoloģisku pazīmju radītu aizdomu gadījumus pārbauda, izmantojot pozitīvu IHC. Histoloģiskos griezumus sagatavo pēc standartmetodēm.

1. Audu griezumu sagatavošana Audus saskaņā ar standartprotokoliem vismaz vienu dienu fiksē neitrālā 10 % formalīna fosfātu buferšķīdumā, atūdeņo ar pakāpeniski pieaugoša stipruma etilspirtu, dzidrina ar ksilēnu un iegulda parafīnā. Patomorfoloģijas un IHC vajadzībām apmēram 5 μm biezus griezumus (IHC vajadzībām – uz stikliņiem ar poli-L-lizīna apvalku) 20 minūtes karsē 56 °C līdz 58 °C (maksimāli 60 °C) temperatūrā, ar ksilēna palīdzību atvasko, ar pakāpeniski sarūkoša stipruma etilspirtu rehidratē, kā arī saskaņā ar 2. punktu krāso ar hematoksilīnu un eozīnu.

2. Krāsošanas procedūra IHC vajadzībām Jebkādu inkubēšanu veic istabas temperatūrā uz svārstplatformas, ja vien šajā lēmumā nav paredzēts citādi: a) antigēnu atgūšanu nodrošina, griezumus 2 × 6 minūtes vārot 0,1 M citrāta buferšķīdumā ar pH 6,0, pēc kā 20 min izdara bloķēšanu ar 5 % piena beztauku sausnas un 2 % kazas seruma 50 mM TBS šķīdumā (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6); b) pēc tam griezumus uz nakti inkubē ar primāru antivielu (monospecifisku truša antivielu pret ISAV nukleoproteīnu), kura atšķaidīta 1 % piena beztauku sausnas saturošā TBS, pēc tam trīsreiz skalo ar 0,1 % Tween 20 saturošu TBS; c) saistītu antivielu konstatēšanai griezumus 60 minūtes inkubē truša IgG antivielas sārmainās fosfatāzes konjugātā. Pēc galīgās skalošanas pievieno Fast Red (1 mg ml– 1) un naftola AS-MX fosfātu (0,2 mg ml– 1) ar 1 mM levamizola 0,1 M TBS (pH 8,2) un dod iespēju 20 minūtes attīstīties. Pēc tam griezumus skalo krāna ūdenī, kontrastam krāso ar Harisa hematoksilīnu un pārklāj ar pārklājbarotni uz ūdens bāzes. Katrā testa sagatavošanā iekļauj kontrolparaugus – attiecībā uz ISAV gan pozitīvus, gan negatīvus audu griezumus.

3. IHC rezultātu interpretēšana IHC testa rezultātus interpretē tā, kā aprakstīts a) un b) apakšpunktā: a) kontrolgriezumus par pozitīviem uzskata tad, ja kontrolgriezumiem skaidri saskatāms, ka endokarda asinsvadu endotēlija šūnu citoplazma un kodols ir iekrāsoti sarkani (sarkanīgi). Testa parauga griezumu uzskata par pozitīvu tikai tad, ja šādu skaidri saskatāmu sarkanu kodola iekrāsojumu konstatē endotēlija šūnām; b) kontrolgriezumus par negatīviem uzskata tad, ja tiem nav novērojama nekāda būtiska krāsas reakcija. Tā kā ortomiksovīrusa nukleoproteīnam vīrusa replikācijas stadijā ir raksturīga lokalizācija kodolā, taču bieži vien vienlaikus izteiktāk iekrāsota ir citoplazma, tāds citoplazmas iekrāsojums un cita veida iekrāsojums, kas nav lokalizēts kodolā, uzskatāms par nespecifisku vai neizšķirīgu. Pozitīvā gadījumā izteiktākās iekrāsojuma reakcijas parasti vērojamas sirds un nieru endotēlija šūnās. Ļoti plašos hemorāģiskos bojājumos endotēlija krāsojuma reakcijas var būt mazizteiktas vai vispār nav novērojamas, iespējams, inficētajās endotēlija šūnās notiekošas līzes dēļ.

4. DAĻA

DETALIZĒTAS DIAGNOSTIKAS METODES UN PROCEDŪRAS MARTEILIA REFRINGENS INFEKCIJAS UZRAUDZĪBAI UN APSTIPRINĀŠANAI

I. Detalizētas diagnostikas metodes un procedūras, ar kurām apstiprina inficēšanos ar Marteilia refringens

Ja paraugu ņemšanu un laboratorisku izmeklēšanu veic, lai, kā aprakstīts šā dokumenta I pielikuma 4. daļas I iedaļā, iegūtu vai saglabātu veselības statusu attiecībā uz inficēšanos ar Marteilia refringens vai lai saskaņā ar Direktīvas 2006/88/EK 57. panta b) punktu, izmantojot I pielikuma 4. daļas II iedaļā aprakstītās diagnostikas metodes, apstiprinātu minētās sarakstā iekļautās slimības klātbūtni vai to izslēgtu, izmanto šīs daļas I.1., I.2. un I.3. punktā aprakstītās detalizētās diagnostikas metodes un procedūras.

I.1. Paraugu ņemšanas procedūra

Lai varbūtība atrast inficētus dzīvniekus būtu lielāka, paraugus ņemot, priekšroka ir gliemenēm, kas pavērušās vai tikko nobeigušās.

Paraugam ņemtās austeres vai ēdamgliemenes plastmasas maisiņā, kura etiķete satur informāciju par austeru vai ēdamgliemeņu izcelsmi un īpašībām, 4 °C temperatūrā vai uz atdzesēta ledus tur ne ilgāk kā 24 stundas, ja paraugā ir pavērušās gliemenes, un ne ilgāk kā 72 stundas, ja tajā pavērušos gliemeņu nav. Pavērušās vai tikko nobeigušās gliemenes tur atsevišķi no citām gliemenēm.

Marteilia refringens histoloģiskai diagnosticēšanai izmanto 3 līdz 5 mm biezu audu griezumu, kurā ietilpst žaunas un sirds audi. Dažiem testiem, arī nospiedumiem un polimerāzes ķēdes reakcijai (PCR) izmanto gremošanas dziedzera audus.

I.2. Mikroskopiskie paņēmieni

I.2.1. Citoloģija (nospieduma citoloģija)

Kad gremošanas dziedzera audi apžāvēti uz absorbējoša papīra, uz priekšmetstikliņa atstāj vairākus nospiedumus. Priekšmetstikliņu preparātus ar gaisa plūsmu nožāvē, fiksē metilspirtā vai absolūtajā spirtā un nokrāso, saskaņā ar ražotāja norādījumiem izmantojot kādu no tirdzniecībā pieejamiem asins preparātu krāsošanas reaģentu komplektiem, tādu kā Diff-Quik®/Hemacolor®. Kad stikliņi krāna ūdenī noskaloti un nosusināti, tiem ar piemērotas sintētiskas gumijas palīdzību uzliek segstiklu. Priekšmetstikliņus vispirms novēro palielinājumā × 200 un pēc tam – iegremdētus eļļā palielinājumā × 1 000.

Rezultāts ir pozitīvs tad, ja novēro šūnas, kuru izmērs ir no 30 līdz 40 μm. Citoplazmu iekrāso bazofilie, savukārt kodolu – eozinofilie leikocīti. Var novērot blāvus lokus ap lielām, stipri iekrāsotām (atstarojošām) granulām un, lielākās šūnās, šūnu šūnā.

Šis paņēmiens izmantojams jebkādām parazītu sugām.

I.2.2. Histoloģija

Audu griezumus, kuros ietilpst žaunas, gremošanas dziedzeris, mantija un gonādas, vismaz 24 stundas fiksē Davidson fiksatīvā, pēc tam parastajā veidā apstrādā ar parafīnu histoloģiskai izmeklēšanai un krāso, piemēram, ar hematoksilīnu un eozīnu. Novērojumus veic arvien augstākā palielinājumā līdz × 1 000.

Rezultāts ir pozitīvs tad, ja novēro šūnas, kuru izmērs ir no 4 līdz 40 μm. Agrīnās stadijās ir vērojamas vairākkodolu šūnas un šūnas, kuru forma ir no sfēriskas līdz pagarinātai. Tās konstatē galvenokārt barības vada un kuņģa, dažkārt lūpu taustekļu epitēlijā. Sporulācija saistās ar šūnu dalīšanos šūnu iekšpusē un notiek gremošanas dziedzera kanāliņos un vados. Sporulācijas procesā rodas atstarojošas granulas, taču agrīnos posmos tās nenovēro. Infekcijas vēlīnās stadijās atsevišķus sporangijus novēro gremošanas trakta lūmenā. Citoplazmu iekrāso bazofilie, savukārt kodolu – eozinofilie leikocīti. Granulu krāsa var variēt no tumšoranžas līdz tumšsarkanai.

Šis paņēmiens izmantojams jebkādām parazītu sugām.

I.3. Molekulārie paņēmieni

I.3.1. DNS ekstrahēšana

DNS ekstrahē saskaņā ar standartprocedūrām.

Drīkst izmantot tirdzniecībā pieejamos DNS ekstrahēšanas komplektus, ar kuriem iegūstama augsti kvalitatīva DNS, kas piemērota izmantošanai I.3.2. punktā aprakstītajos PCR protokolos.

I.3.2. Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR)

Ir izstrādāti un publicēti vairāki PCR protokoli.

Jāizmanto tie PCR praimeri, kuru mērķrajons ir iekšējā transkribētā speisera (ITS1) rajons, jo tie spēj amplificēt tikai M. refringens.

PCR īsteno 50 μl tilpumā. PCR maisījumi satur buferšķīdumu (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9,0 25 °C temperatūrā] un 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP maisījuma, 1 μM tiešā un atgriezeniskā praimera, 0,02 vienības μl– 1 Taq DNS polimerāzes, un 10 līdz 100 ng ekstrahētas DNS. Kad DNS piecas minūtes denaturēta 94 °C, veic šādus 30 ciklus: denaturācija ar 94 °C 1 min, hibridizācija ar 55 °C 1 min, un – vienu minūti uz katru kilobāzes pāri – elongācija ar 72 °C. Veic pēdējo elongācijas soli – 10 minūtes 72 °C temperatūrā. M. refringens konstatēšanai izdara PCR ar praimeriem, kuru mērķrajons ir ITS1 (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ un 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).

Pozitīvie kontrolparaugi ir no stipri inficēta saimniekorganisma iegūta genomiskā DNS vai plazmīdu DNS, kurām ir mērķrajons.

Negatīvo kontrolparaugu sastāvā ir no neinficētiem saimniekorganismiem iegūta genomiskā DNS un PCR reaģenti bez mērķa DNS.

Pozitīvs rezultāts ir pozitīva PCR amplifikācija sagaidāmajā izmērā (412 bp), visu negatīvo kontrolparaugu rezultātiem esot negatīviem un visu pozitīvo kontrolparaugu rezultātiem – pozitīviem.

I.3.3. In situ hibridizācija (ISH)

Izstrādāti un publicēti ir vairāki ISH protokoli.

Izmanto provi, kuras mērķrajons ir rRNS gēnu kompleksa mazā apakšvienība, jo tā ir histoloģiski validēta.

Audu griezumus, kuros ietilpst žaunas un gremošanas dziedzeris, vismaz 24 stundas fiksē Davidson fiksatīvā un pēc tam parastajā veidā apstrādā ar parafīnu histoloģiskai izmeklēšanai. Nogriež 5 μm biezus griezumus, ko novieto uz priekšmetstikliņiem ar aminoalkilsilāna pārklājumu un pēc tam uz nakti karsē 40 °C karstā krāsnī. Griezumus atvasko, uz 10 minūtēm iegremdējot ksilēnā. Šo soli vienreiz atkārto un pēc tam atbrīvojas no šķīdinātāja, griezumus divreiz pēc kārtas uz 10 minūtēm iegremdējot absolūtā spirta peldēs. Pēc tam griezumus dehidratē, tos mērcējot augoša stipruma etilspirtā. Griezumus 37 °C temperatūrā 30 minūtes apstrādā ar proteināzi K (100 μg ml– 1) TE buferšķīdumā (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]). Stikliņus atūdeņo, tos mērcējot augoša stipruma etilspirtā, pēc tam ar gaisu nožāvē. Griezumus inkubē ar 100 μl hibridizācijas buferšķīduma (4 × SSC [citrāta fizioloģiskā standartšķīduma], 50 % formamīda, 1 × Denhardta šķīduma, 250 μg ml– 1 rauga tRNS, 10 % dekstrāna sulfāta), kas satur 10 ng (1 μl PCR reaģentu, kuri sagatavoti, kā aprakstīts I.3.2. punktā, izmantojot praimerus CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG un TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) proves, kas marķēta ar digoksigenīnu. Griezumus pārsedz ar in situ plastmasas segstikliņiem un uz piecām minūtēm novieto uz karstumbloka 95 °C temperatūrā. Pirms stikliņus 42 °C temperatūrā uz nakti atstāj hibridizēties mitrā kamerā, tos uz ledus vienu minūti atdzesina. Griezumus divreiz pa piecām minūtēm istabas temperatūrā skalo 2 × SSC un vienreiz 10 minūtes 42 °C temperatūrā skalo 0,4 × SSC. Konstatēšanas soļus veic saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc tam stikliņus skalo sterilā destilētā ūdenī (dH2O). Griezumu krāsu neitralizē ar Bismarck Brown Yellow, skalo ar dH2O un, izmantojot pārklājbarotni uz ūdens bāzes, uzliek segstikliņus.

Pozitīvie un negatīvie kontrolparaugi attiecīgi ir griezumi no zināmiem inficētiem un neinficētiem saimniekorganismiem.

Visiem negatīvajiem kontrolparaugiem esot negatīviem un visiem pozitīvajiem kontrolparaugiem – pozitīviem, par pozitīvu rezultātu liecina violeti melni iekrāsotas M. refringens šūnas zināmos mērķaudos.

I.3.4. Sekvenēšana

Sekvenēšanu veic kā vienu no apstiprinošas diagnosticēšanas galīgajiem soļiem. Mērķrajoni ir rDNS mazā apakšvienība un ITS1.

II. Detalizētas diagnostikas metodes un procedūras Marteilia refringens infekcijas uzraudzībai un apstiprināšanai

Lai īstenotu uzraudzības programmas un apstiprinātu Marteilia refringens infekcijas klātbūtni vai izslēgtu aizdomas par šo sarakstā iekļauto slimību saskaņā ar I pielikuma 4. daļas II iedaļas prasībām, izmantotajām diagnostikas metodēm un attiecīgajām procedūrām jāatbilst šādām 4.1. tabulas vadlīnijām.

4.1. tabula

Vadlīnijas attiecībā uz diagnostikas metožu izmantošanu uzraudzības programmās un Marteilia refringens infekcijas apstiprināšanai vai izslēgšanai

Metode Mērķorientēta uzraudzība Prezumptīvā diagnoze Apstiprinošā diagnoze Gremošanas dziedzera nospiedumi X X X vai Histopatoloģija X X vai In situ hibridizācija X un PCR X X X un Sekvenēšana X

5. DAĻA

DETALIZĒTAS DIAGNOSTIKAS METODES UN PROCEDŪRAS INFICĒŠANĀS AR BONAMIA OSTREAE UZRAUDZĪBAI UN APSTIPRINĀŠANAI

I. Bonamia ostreae infekcijas diagnosticēšanas procedūras

Ja paraugu ņemšanu un laboratorisku izmeklēšanu veic, lai, kā aprakstīts šā dokumenta I pielikuma 5. daļas I iedaļā, iegūtu vai saglabātu noteiktu veselības statusu attiecībā uz Bonamia ostreae vai lai saskaņā ar Direktīvas 2006/88/EK 57. panta b) punktu, izmantojot I pielikuma 5. daļas II iedaļā aprakstītās diagnostikas metodes, apstiprinātu minētās sarakstā iekļautās slimības klātbūtni vai to izslēgtu, izmanto turpmāk I.1., I.2. un I.3. punktā aprakstītās detalizētās diagnostikas metodes un procedūras.

I.1. Paraugu ņemšanas process

Lai varbūtība atrast inficētus dzīvniekus būtu lielāka, paraugus ņemot, priekšroka ir gliemenēm, kas pavērušās vai tikko nobeigušās.

Paraugam ņemtās austeres plastmasas maisiņā, kura etiķete satur informāciju par austeru izcelsmi un īpašībām, 4 °C temperatūrā vai uz atdzesēta ledus tur ne ilgāk kā 24 stundas, ja paraugā ir pavērušās gliemenes, un ne ilgāk kā 72 stundas, ja tajā pavērušos gliemeņu nav. Pavērušās vai tikko nobeigušās gliemenes tur atsevišķi no citām gliemenēm.

Bonamia ostreae histoloģiskai diagnosticēšanai izmanto 3 līdz 5 mm biezu audu griezumu, to vidū no žaunām un sirds audiem. Dažiem testiem, arī nospiedumiem un polimerāzes ķēdes reakcijai (PCR), izmanto gremošanas dziedzera audus.

I.2. Mikroskopiskie paņēmieni

I.2.1. Citoloģija (nospieduma citoloģija)

Kad žaunas vai sirds audi apžāvēti uz absorbējoša papīra, uz priekšmetstikliņa atstāj vairākus nospiedumus. Priekšmetstikliņu preparātus ar gaisa plūsmu nožāvē, fiksē metilspirtā vai absolūtajā spirtā un nokrāso, saskaņā ar ražotāja norādījumiem izmantojot kādu no tirdzniecībā pieejamajiem asins preparātu krāsošanas reaģentu komplektiem, konkrētāk, tādu kā Diff-Quik®/Hemacolor®. Kad stikliņi krāna ūdenī noskaloti un nosusināti, tiem ar piemērotas sintētiskas gumijas palīdzību uzliek segstiklu. Priekšmetstikliņus vispirms novēro palielinājumā × 200 un pēc tam – iegremdētus eļļā palielinājumā × 1 000.

Pozitīvs rezultāts būs mazu (2 līdz 5 μm platu) lodveida vai olveida organismu klātbūtne hemocītos. Tomēr parazīta klātbūtne iespējama arī ārpus šūnām. Šiem organismiem citoplazmā vērojami bazofilie leikocīti un kodolā – eozinofilie leikocīti (krāsa var atšķirties atkarībā no krāsošanas līdzekļa) un, tā kā uz priekšmetstikliņa tie izplūst, uz nospiedumiem tie var izskatīties platāki nekā histoloģiskā izmeklēšanā. Var būt novērojamas daudzkodolu šūnas. Šis paņēmiens izmantojams jebkādām parazītu sugām.

I.2.2. Histoloģija

Audu griezumus, kuros ietilpst žaunas un gremošanas dziedzeris, vismaz 24 stundas fiksē Davidson fiksatīvā, pēc tam parastajā veidā apstrādā ar parafīnu histoloģiskai izmeklēšanai un krāso, piemēram, ar hematoksilīnu un eozīnu. Novērojumus veic arvien augstākā palielinājumā līdz × 1 000.

Pozitīvs rezultāts ir parazītu klātbūtne, kas izpaužas kā ļoti mazas, 2 līdz 5 μm platas šūnas, kuras novērojamas hemocītos vai atsevišķi žaunu, zarnu un mantijas epitēlija saistaudos vai dobumos un bieži vien saistās ar spēcīgu iekaisuma reakciju. Lai izslēgtu jebkādas šaubas un uzstādītu pozitīvu diagnozi, vajadzīgs, lai parazīts būtu novērots hemocītā. Šis paņēmiens izmantojams jebkādām parazītu sugām.

I.3. Molekulārie paņēmieni

I.3.1. DNS ekstrahēšana

DNS ekstrahē saskaņā ar standartprocedūrām.

Drīkst izmantot tirdzniecībā pieejamos DNS ekstrahēšanas komplektus, ar kuriem iegūstama augsti kvalitatīva DNS, kas piemērota izmantošanai turpmāk aprakstītajos PCR protokolos.

I.3.2. Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR)

Izstrādāti un publicēti ir vairāki PCR protokoli.

Var izmantot divus PCR protokolus, kuros mērķrajons ir rDNS mazā apakšvienība:

a) pirmais ir parastā PCR, ar kuru amplificē vairākus Haplosporidia pārstāvjus, arī Bonamia spp. Praimeri, ko apzīmē kā Bo un Boas, ir attiecīgi 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ un 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3′, un to amplifikācijas produkts ir 300 bp. PCR maisījumi satur buferšķīdumu (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl [pH 9 25 °C temperatūrā] un 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP maisījuma, 1 μM tiešā un atgriezeniskā praimera, 0,02 vienības μl– 1 Taq DNS polimerāzes, un 0,2 ng μl– 1 DNS veidnes kopējā apjomā 50 μl. Vispirms paraugus DNS amplifikatorā ar 94 °C 5 min denaturē, pēc tam ar tiem veic 30 ciklus (94 °C viena min, 55 °C viena min, 72 °C viena min), pēc tam 10 minūtes 72 °C temperatūrā veicot galīgo paplašināšanu. Pozitīvie kontrolparaugi ir no stipri inficēta saimniekorganisma iegūta genomiskā DNS vai plazmīdu DNS, kurām ir mērķrajons. Negatīvo kontrolparaugu sastāvā ir no neinficētiem saimniekorganismiem iegūta genomiskā DNS un PCR reaģenti bez mērķa DNS. Pozitīvs rezultāts ir pozitīva PCR amplifikācija sagaidāmajā izmērā (proti, 300 bp), visiem negatīvajiem kontrolparaugiem esot negatīviem un visiem pozitīvajiem kontrolparaugiem – pozitīviem;

b) otrais PCR protokols ir SYBR ® Green reāllaika PCR. Ar tā palīdzību ir iespējams specifiski noteikt B. ostreae (aprakstīts zemāk) un to var kombinēt ar SYBR ® Green reāllaika PCR, kas dod iespēju specifiski noteikt B. exitiosa (Ramilo et al. 2013). Praimeri BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) un BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplificē 208 bp produktu. PCR maisījumi satur SYBR ® Green Master Mix (1X), 0,3 μM tiešā un atgriezeniskā praimera un 200 ng ekstrahētas DNS. Paraugus vispirms ar 95 °C 10 minūtes denaturē reāllaika detektēšanas sistēmā, pēc tam ar tiem izpilda 35 ciklus (ar 95 °C 30 s, ar 55 °C 45 s un ar 72 °C viena min). Ar temperatūras paaugstināšanās soli 0,5 °C/s analizē kušanas temperatūras līkni, to sākot 55 °C temperatūrā un beidzot 95 °C temperatūrā un pie katras temperatūras maiņas fiksējot fluorescenci. Pozitīvie kontrolparaugi ir no stipri inficēta saimniekorganisma iegūta genomiskā DNS vai plazmīdu DNS, kurām ir mērķrajons. Negatīvo kontrolparaugu sastāvā ir no neinficētiem saimniekorganismiem iegūta genomiskā DNS un PCR reaģenti bez mērķa DNS. Visiem negatīvajiem kontrolparaugiem esot negatīviem un visiem pozitīvajiem kontrolparaugiem – pozitīviem, pozitīvs rezultāts ir pozitīva PCR amplifikācija ar unikālu kušanas temperatūras maksimumu (ar nosacījumiem, kādus 2013. gadā publicējis Ramilo et al. – 78,25 ± 0,25 °C).

I.3.3. In situ hibridizācija (ISH)

Ir izstrādāti un publicēti vairāki ISH protokoli.

Izmanto provi, kuras mērķrajons ir rRNS gēnu kompleksa mazā apakšvienība, lai gan ir liecības, ka tā krusteniski reaģē ar dažiem citiem pie Haplosporidia dzimtas piederīgiem organismiem.

Audu griezumus, kuros ietilpst žaunas un gremošanas dziedzeris, vismaz 24 stundas fiksē Davidson fiksatīvā un pēc tam parastajā veidā apstrādā ar parafīnu histoloģiskai izmeklēšanai. Nogriež 5 μm biezus griezumus, ko novieto uz priekšmetstikliņiem ar aminoalkilsilāna pārklājumu un pēc tam uz nakti karsē 40 °C karstā krāsnī. Griezumus atvasko, uz 10 minūtēm iegremdējot ksilēnā. Šo soli vienreiz atkārto un pēc tam atbrīvojas no šķīdinātāja, griezumus divreiz pēc kārtas uz 10 minūtēm iegremdējot absolūtā spirta peldēs. Pēc tam griezumus rehidratē, tos mērcējot dilstoša stipruma etilspirtā. Griezumus pie 37 °C 30 minūtes apstrādā ar proteināzi K (100 μg ml– 1) TE buferšķīdumā (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]). Stikliņus atūdeņo, tos mērcējot augoša stipruma etilspirtā, pēc tam ar gaisu nožāvē. Griezumus inkubē ar 100 μl hibridizācijas buferšķīduma (4 × SSC [citrāta fizioloģiskā standartšķīduma], 50 % formamīda, 1 × Denhardta šķīduma, 250 μg ml– 1 rauga tRNS, 10 % dekstrāna sulfāta), kas satur 20 ng (2 μl PCR reakcijas, kas sagatavota, kā aprakstīts I.3.2. punktā, izmantojot praimerus Bo un Boas) proves, kas marķēta ar digoksigenīnu. Griezumus pārsedz ar in situ plastmasas segstikliņiem un uz piecām minūtēm novieto uz karstumbloka 95 °C temperatūrā. Pirms stikliņus 42 °C temperatūrā uz nakti atstāj hibridizēties mitrā kamerā, tos uz ledus vienu minūti atdzesina. Griezumus divreiz pa piecām minūtēm istabas temperatūrā skalo 2 × SSC un vienreiz 10 minūtes 42 °C temperatūrā skalo 0,4 × SSC. Konstatēšanas soļus izpilda saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc tam stikliņus skalo sterilā destilētā ūdenī (dH2O). Griezumu krāsu neitralizē ar Bismarck Brown Yellow, skalo ar dH2O un, izmantojot pārklājbarotni uz ūdens bāzes, uzliek segstikliņus.

Pozitīvie un negatīvie kontrolparaugi attiecīgi ir griezumi no zināmiem inficētiem un neinficētiem saimniekorganismiem.

Visiem negatīvajiem kontrolparaugiem esot negatīviem un pozitīvajiem – pozitīviem, pozitīvs rezultāts ir hemocītos novērojami iekrāsoti parazīti.

I.3.4. Sekvenēšana

Sekvenēšanu veic kā vienu no apstiprinošas diagnosticēšanas galīgajiem soļiem. Mērķrajoni ir rDNS mazā apakšvienība un ITS1.

II. Bonamia ostreae infekcijas uzraudzības un apstiprināšanas procedūras

Lai īstenotu uzraudzības programmas un saskaņā ar I pielikuma 5. daļas II iedaļas prasībām apstiprinātu Bonamia ostreae klātbūtni vai izslēgtu aizdomas par inficēšanos ar to, izmantotajām diagnostikas metodēm un attiecīgajām procedūrām jāatbilst šādām 5.1. tabulas vadlīnijām.

5.1. tabula

Vadlīnijas attiecībā uz diagnostikas metožu izmantošanu uzraudzības programmās un Bonamia ostreae infekciju apstiprināšanai vai izslēgšanai

Metode Mērķorientēta uzraudzība Prezumptīvā diagnoze Apstiprinošā diagnoze Sirds vai žaunu audu nospiedumi X X X vai Histopatoloģija X X vai In situ hibridizācija X un PCR X X X un Sekvenēšana X

6. DAĻA

DETALIZĒTAS DIAGNOSTIKAS METODES UN PROCEDŪRAS BALTO PLANKUMU SLIMĪBAS (WSD) UZRAUDZĪBAI UN APSTIPRINĀŠANAI

1. Diagnostikas procedūras WSSV konstatēšanai

Ja paraugu ņemšanu un laboratorisku izmeklēšanu veic I pielikuma 6. daļas I iedaļā aprakstīto uzraudzības un izskaušanas programmu vajadzībām un saskaņā ar Direktīvas 2006/88/EK 57. panta b) punktu WSSV klātbūtni apstiprinot vai aizdomas par inficēšanos ar to izslēdzot ar I pielikuma 6. daļas II iedaļā aprakstītajām diagnostikas metodēm, izmanto šīs daļas 2.–7. punktā aprakstītās detalizētās diagnostikas metodes un procedūras.

Šajā II pielikuma daļā aprakstītās metodes un procedūras ir pielāgotas no akreditētā ISO 17025 testa, ko izmanto vēžveidīgo slimībās specializētā Eiropas Savienības references laboratorija. Var izmantot alternatīvas pieejas, kurās izmanto līdzvērtīgus nosacījumus, vai komplektus, kurus ražojuši citi ražotāji, bet kuri piedāvā šajā daļā aprakstītajiem testiem līdzvērtīgu jutīgumu un specifiskumu. Visos gadījumos polimerāzes ķēdes reakcijā amplificēto produktu sekvenē, lai apliecinātu, ka tas identisks balto plankumu sindroma vīrusam (WSSV).

2. Paraugu ņemšanas procedūra

No vēžveidīgajiem iegūtus WSSV saturošus audus (vēderkājas un žaunas) var glabāt etilspirtā, RNAlater vai šai vajadzībai strauji sasaldēt – 80 °C. Stadijas, kas nepieciešamas WSSV identificēšanai no audu paraugiem, ir šādas: audu homogenizēšana, DNS ekstrahēšana, WSSV DNS īpatnējā amplificēšana ar PCR, amplificētā produkta vizualizācija uz gela, DNS attīrīšana un sekvenēšana, lai apstiprinātu patogēna identitāti.

3. Audu homogenizēšana

Audu saārdīšanai un homogenāta sagatavošanai piemērotā buferšķīdumā izmanto audu saārdītāju FastPrep un Lysing Matrix A mēģenes (MP Biomedicals). Audus nosver, ievieto Lysing Matrix A mēģenēs, piemērotā buferšķīdumā (lietošanai ar DNS audu komplektu (Qiagen) – G2 un 10 μl K proteināzes) atšķaida, līdz masa/tilp. ir 1/10 vai kā norādījis ražotājs, un divas minūtes homogenizē ar homogenizētāju FastPrep 24. Homogenizētus paraugus inkubē 56 °C vismaz četras stundas vai pa nakti. Paraugus apstrādā virpuļmikserī, divas minūtes centrifugē ar 9 000 rpm un 50 μl centrifugāta vai apjoma, kas līdzvērtīgs 5 mg audu (ekstrahēšanas komplektam optimāls audu svars), pievieno DNS ekstrahēšanai paredzētā parauga mēģenē un ar G2 buferšķīdumu apjomu palielina līdz 200 μl.

4. DNS ekstrahēšana

Kopējo DNS ekstrahē saskaņā ar ražotāja norādījumiem, izmantojot DNS audu ekstrahēšanas komplektu un EZ1 Advanced XL Biorobot (Qiagen). Katrai paraugu partijai apstrādā ekstrahēšanas kontrolparaugu (Calf Thymus DNS) un negatīvo kontrolparaugu (G2 buferšķīdums). DNS eluē 50 μl tilpumā. Lai nodrošinātu, ka ekstrahēšana beigusies sekmīgi, ar NanoDrop aparāta palīdzību nosaka DNS koncentrāciju visos paraugos un kontrolparaugos. Ja ekstrahētā DNS nav tūlīt nepieciešama, to sasaldē – 20 °C temperatūrā.

5. Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR), ar ko konstatē WSSV

WSSV konstatēšanai izmantojamā metode ir turpmākajās šā punkta daļās aprakstītais protokols, kurš paredzēts WSSV konstatēšanai ar divsoļu atgriezeniskās transkriptāzes PCR un kurā pirmajā un otrajā PCR raundā amplificē rRNS gēna 18 s 1 447 bp un 848 bp amplikonu.

Pirmā raunda PCR reakcijai jāsagatavo 50 μl tilpums, kurā galīgajās koncentrācijās ir 1 × GoTaq Buffer (Promega), 5mM MgCl2, 1 pmol/μl WSSV praimera 146 F1, 1 pmol/μl WSSV praimera 146 R1 (1. tabula), 0,25 mM dNTPs, 1,25 U Taq polimerāzes un 2,5 μl DNS. Reakciju ar visiem paraugiem izpilda dublikātā kopā ar negatīvu ekstrahēšanas kontrolparaugu, negatīvu PCR kontrolparaugu (DNS vietā pievienoti 2,5 μl H2O) un pozitīvu kontrolparaugu. Pozitīvais kontrolparaugs ir atšķaidīts WSSV plazmīds, kas saražots un validēts lietošanai attiecīgajā laboratorijā (pieejams no EURL).

Otrā raunda WSSV PCR reakciju sagatavo tāpat kā pirmā raunda reakciju, taču izmanto WSSV 146 F2/R2 praimeru komplektu un vēl vienu pozitīvu kontrolparaugu, ar kura palīdzību pārliecinās, vai šis PCR posms ir izdevies.

Praimeris Sekvence WSSV 146 F1 ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG WSSV 146 R1 TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA WSSV 146 F2 GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA WSSV 146 R2 TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT

Gan pirmā, gan otrā raunda PCR veic, izmantojot DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (vai tam līdzvērtīgu DNS amplifikatoru) ar šādiem ciklēšanas nosacījumiem. Sākotnējais solis ir denaturācija ar 94 °C 2 min, kam seko 94 °C 30 s, 62 °C 30 s, 72 °C 30 s, ko 30 ciklus atkārto, divu minūšu elongācijas solis ar 72 °C un turēšana pie 4 °C.

6. Gela elektroforēze

Gan pirmajā, gan otrajā PCR raundā iegūtos amplificētos PCR produktus padara redzamus 2 % agarozes gelos, kas pagatavoti, izmantojot TAE buferšķīdumu. 15 mikrolitrus no katra parauga apmēram 20 minūtes apstrādā pie sprieguma 120 volti un aplūko UV gaismā. Pozitīviem paraugiem pirmā raunda PCR produktiem intervāls būs 1 447 bp, savukārt otrā raunda PCR