Oficiālais Vēstnesis L 053 , 23/02/2002 Lpp. 0037 - 0042



Komisijas Lēmums (2002. gada 21. februāris), ar ko groza D pielikumu Padomes Direktīvai 90/426/EEK attiecībā uz Āfrikas zirgu mēri diagnosticējošām pārbaudēm (izziņots ar dokumenta numuru C(2002) 556) (Dokuments attiecas uz EEZ) (2002/160/EK) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1990. gada 26. jūnija Direktīvu 90/426/EEK par dzīvnieku veselības prasībām attiecībā uz zirgu dzimtas dzīvnieku pārvadāšanu un importu no trešām valstīm [1], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Lēmumu 2001/298/EK [2], un jo īpaši tās 23. pantu, tā kā: (1) Direktīvas 90/426/EEK D pielikumā ir aprakstīta komplementa saistīšanas reakcijas pārbaude, kas jāveic attiecībā uz Āfrikas zirgu mēra diagnozi. (2) Kopienas references laboratorija Alhetē (Spānija) 2000. gada novembrī uzņēma ikgadējo sanāksmi, kurā pulcējās ES dalībvalstu Āfrikas zirgu mēra references laboratorijas. Šajā sanāksmē atklājās zinātniskas liecības par to, ka Direktīvas 90/426/EEK D pielikumā aprakstītajai komplementa saistīšanas reakcijas pārbaudei ir nopietnas nepilnības, jo īpaši tādēļ, ka ar to var konstatēt antivielas vienīgi pēc nesenas inficēšanās vai vakcinācijas. Bez tam gandrīz visās Kopienas laboratorijās un arī lielākajās eksportētājvalstīs šo pārbaudi praksē aizstāj ar mūsdienīgu ELISA testu. (3) Starptautiski atzītie laboratoriju testi Āfrikas zirgu mēra antivielu noteikšanai ir aprakstīti Starptautiskā epizootiju biroja (OIE) Diagnostikas testu un vakcīnu standartu rokasgrāmatā [3]; tomēr esošajā redakcijā ir minēts tikai viens no šiem ELISA testiem. (4) Tādēļ ir lietderīgi grozīt Direktīvas 90/426/EEK D pielikumu, lai ņemtu vērā tehnikas attīstību un starptautiski apstiprinātus standartus. (5) Šajā lēmumā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Pastāvīgās veterinārijas komitejas atzinumu, IR PIEŅĒMUSI ŠĀDU LĒMUMU. 1. pants Direktīvas 90/426/EEK D pielikumu aizstāj ar šā lēmuma pielikumu. 2. pants Šis lēmums ir adresēts dalībvalstīm. Briselē, 2002. gada 21. februārī Komisijas vārdā — Komisijas loceklis David Byrne [1] OV L 224, 18.8.1990., 42. lpp. [2] OV L 102, 12.4.2001., 63. lpp. [3] 2000. gada ceturtā izdevuma 2.1.11. nodaļa. -------------------------------------------------- PIELIKUMS " D PIELIKUMS ĀFRIKAS ZIRGU MĒRIS DIAGNOSTIKA Reaģentus turpmāk aprakstītajiem fermentu imūnosorbcijas testiem (ELISA) var saņemt no Eiropas Kopienas References laboratorijas vai OIE Āfrikas zirgu mēra references laboratorijām. 1. KONKURENCES ELISA TESTS ĀFRIKAS ZIRGU MĒRA VĪRUSA (AHSV) ANTIVIELU ATKLĀŠANAI (OBLIGĀTAIS TESTS) Konkurences ELISA testu izmanto, lai atklātu specifiskas AHSV antivielas zirgu dzimtas sugu serumos. Jūrascūciņu plaša spektra poliklonāls imūnserums pret AHSV (turpmāk "jūrascūciņu imūnserums") ir specifisks serogrupai un ļauj atklāt visus zināmos AHS vīrusa serotipus. Testa pamatā ir princips, ka testa seruma paraugs pārtrauc reakciju starp AHSV antigēnu un jūrascūciņu imūnserumu. AHSV antivielas testa seruma paraugā konkurē ar antivielām jūrascūciņu imūnserumā, tā rezultātā pavājinās sagaidāmā krāsas reakciju (pēc enzīma marķētas antivielas pret jūrascūciņu un substrāta pievienošanas). Serumus var testēt vienkāršā atšķaidījumā kā 1 pret 5 (krāsu reakcijas metode) vai var titrēt (seruma titrēšanas metode), lai norādītu atšķaidījuma beigu punktus. Inhibīcijas vērtības, kas augstākas par 50 %, var uzskatīt par pozitīvām. Šeit aprakstīto testa protokolu lieto reģionālajā references laboratorijā attiecībā uz Āfrikas zirgu mēri Pirbraitā, Apvienotajā Karalistē. 1.1. Testa metode 1.1.1. Plākšņu sagatavošana 1.1.1.1. ELISA testa plāksnes pārklāj ar AHSV antigēnu, kas ekstrahēts no inficētajām šūnu kultūrām un izšķīdināts karbonāta/bikarbonāta bufervielā, pH 9,6. ELISA testa plāksnes atstāj pa nakti inkubēties 4 °C temperatūrā. 1.1.1.2. Plāksnes mazgā trīs reizes, ar fosfātu fizioloģisko buferšķīdumu (PBS) no pH 7,2 līdz pH 7,4, uzpludinot un iztukšojot iedobes, un nosusina uz higroskopiska papīra. 1.1.2. Kontroliedobes 1.1.2.1. Pozitīvos kontrolserumus titrē divkārša atšķaidījuma virknēs 1 ailē, no 1 pret 5 līdz 1 pret 640, bloķējošā buferšķīdumā (PBS, kas satur 0,05 % (V/V) Tween-20, 5,0 % (m/V) sausā vājpiena (Cadbury’s MarvelTM) un 1 % (V/V) pieaugušu liellopu seruma), iegūstot galīgo tilpumu 50 μl/iedobe. 1.1.2.2. Pievieno 50 μl negativā kontrolseruma atšķaidījumā 1 pret 5 (10 μl seruma + 40 μl blokējošā buferšķīduma) A un B iedobēm 2. ailē. 1.1.2.3. Pievieno 100 μl/iedobe blokējošā buferšķīduma C un D iedobēm 2. ailē (tukšā analīze). 1.1.2.4. Pievieno 50 μl blokējošā buferšķīduma E, F, G un H iedobēm 2. ailē (jūrascūciņu kontrole). 1.1.3. Krāsu reakcijas metode 1.1.3.1. Katru testa serumu atšķaidījumā 1 pret 5 bloķējošā buferšķīdumā pievieno dubultajām iedobēm no 3. līdz 12. ailē (10 μl seruma + 40 μl blokējošā buferšķīduma); vai 1.1.4. Seruma titrēšanas metode 1.1.4.1. Sagatavo katra testa parauga divkārša atšķaidījuma virknes (no 1 pret 5 līdz 1 pret 640) bloķējošā buferšķīdumā astoņās iedobēs vienkāršajās ailēs (no 3. līdz 12.); pēc tam 1.1.5. Pievieno 50 μl jūrascūciņu imūnserumu, kas iepriekš izšķīdināts bloķējošos buferšķīdumos, visām iedobēm, izņemot ELISA testa plāksnes tukšās analīzes iedobes (tagad visās iedobēs ir galīgais tilpums 100 μl). 1.1.5.1. Inkubē 1 stundu 37 °C temperatūrā orbitālajā kratītājā. 1.1.5.2. Plāksnes mazgā trīs reizes un nosusina tāpat kā iepriekš. 1.1.5.3. Pievieno 50 μl trusu pretjūrascūciņu mārrutku peroksidāzes (HRP) konjugāta, kas iepriekš izšķīdināts bloķējošā buferšķīdumā, katrai iedobei. 1.1.5.4. Inkubē 1 stundu 37 °C temperatūrā orbitālajā kratītājā. 1.1.5.5. Plāksnes mazgā trīs reizes un nosusina tāpat kā iepriekš. 1.1.6. Hromogēns Pagatavo hromogēna OPD (OPD = ortofenildiamīns) šķīdumu saskaņā ar ražotāja instrukcijām (0,4 mg/ml sterilā destilētā ūdenī) tieši pirms izmantošanas. Pievieno substrātu (ūdeņraža peroksīds = H2O2), lai iegūtu galīgo koncentrāciju 0,05 % (V/V) (1 pret 2000 no 30 % H2O2 šķīduma). Pievieno 50 μl OPD šķīduma katrai iedobei un atstāj stendā 10 minūtes istabas temperatūrā. Reakciju aptur, pievienojot 50 μl/iedobe 1M serskābes (H2SO4). 1.1.7. Nolasīšana Nolasījumu veic spektrofotometriski pie 492 nm. 1.2. Rezultātu izteikšana 1.2.1. Izmantojot programmatūru, izdrukā optiskā blīvuma (OB) vērtības un procentuālo inhibīciju (PI) attiecībā uz testa un kontroles serumiem, pamatojot ar vidējo vērtību, kas reģistrēta četrām jūrascūciņu kontroles iedobēm. Datus, kas izteikti OB un PI vērtību veidā, izmanto, lai noteiktu, vai tests izpildīts pieļaujamās robežās. Augšējās kontrolrobežas (UCL) un apakšējās kontrolrobežas (LCL) attiecībā uz jūrascūciņu kontroli atrodas attiecīgi starp OB vērtībām 1,4 un 0,4. Beigu punkta titram pozitīvai kontrolei, kas pamatota ar 50 % PI, jābūt 1 pret 240 (diapazonā no 1 pret 120 līdz 1 pret 480). Plāksne, kas neatbilst minētajiem kritērijiem, ir jāizbrāķē. Tomēr, ja pozitīvas kontroles seruma titrs ir lielāks par 1 pret 480 un testa paraugi joprojām ir negatīvi, tad negatīvos testa paraugus var pieņemt. Dubultajās negatīvās kontroles serumu iedobēs un dubultajās tukšās analīzes iedobēs reģistrētajām PI vērtībām jābūt attiecīgi starp + 25 % un – 25 % un starp + 95 % un + 105 %. Neiekļaušanās šajās robežās nepadara plāksni par nederīgu, bet norāda uz fona krāsojuma veidošanos. 1.2.2. Diagnostikas slieksnis (izslēgšanas vērtība) testa serumiem ir 50 % (PI 50 %). Paraugus, kam reģistrētās PI vērtības pārsniedz 50 %, reģistrē kā pozitīvus. Paraugus, kam reģistrētās PI vērtības ir zemākas par 50 %, reģistrē kā negatīvus. Paraugus, kam reģistrētās PI vērtības attiecībā uz dubultajām iedobēm atrodas abpus slieksnim, uzskata par šaubīgiem. Šādus paraugus var atkārtoti testēt pēc krāsu reakcijas un titrējot. Arī pozitīvus paraugus var titrēt, lai varētu norādīt uz pozitīvā rezultāta pakāpi. Krāsu reakcijas shēma -ve cont = negatīva kontrole. +ve cont = pozitīva kontrole. GP cont = jūrascūciņu kontrole. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | | + ve cont. | | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | A | 1:5 | – ve cont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | B | 1:10 | – ve cont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | C | 1:20 | Tukšā analīze | | | | | | | | | | | D | 1:40 | Tukšā analīze | | | | | | | | | | | E | 1:80 | GP cont. | | | | | | | | | | | F | 1:160 | GP cont. | | | | | | | | | | | G | 1:320 | GP cont. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | H | 1:640 | GP cont. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Testa serumi -ve cont = negatīva kontrole. +ve cont = pozitīva kontrole. GP cont = jūrascūciņu kontrole. | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | | + ve cont. | | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | Testa serumi | A | 1:5 | – ve cont. | 1:5 | | | | | | | | | 1:5 | B | 1:10 | – ve cont. | 1:10 | | | | | | | | | 1:10 | C | 1:20 | Tukšā analīze | 1:20 | | | | | | | | | 1:20 | D | 1:40 | Tukšā analīze | 1:40 | | | | | | | | | 1:40 | E | 1:80 | GP cont. | 1:80 | | | | | | | | | 1:80 | F | 1:160 | GP cont. | 1:160 | | | | | | | | | 1:160 | G | 1:320 | GP cont. | 1:320 | | | | | | | | | 1:320 | H | 1:640 | GP cont. | 1:640 | | | | | | | | | 1:640 | 2. NETIEŠAIS ELISA TESTS ĀFRIKAS ZIRGU MĒRA VĪRUSA (AHSV) ANTIVIELU ATKLĀŠANAI ( OBLIGĀTAIS TESTS) Šeit aprakstītais tests ir saskaņā ar testa aprakstu OIE Diagnostikas testu un vakcīnu standartu rokasgrāmatas 2000. gada ceturtā izdevuma 2.1.11. nodaļā. Rekombinētu VP7 proteīnu izmanto par antigēnu AHS vīrusa antivielu noteikšanai ar augstu jutības un specifiskuma indeksu. Citas priekšrocības ir tās, ka tas ir stabils un nav inficējošs. 2.1. Testa metode 2.1.1. Cietā fāze 2.1.1.1. ELISA testa plāksnes pārklāj ar rekombinētu AHSV-4 VP7, kas izšķīdināts karbonāta/bikarbonāta bufervielā, pH 9,6. Plāksnes atstāj pa nakti inkubēties 4 °C temperatūrā. 2.1.1.2. Plāksnes piecas reizes mazgā ar destilētu ūdeni, kas satur 0,01 % (V/V) Tween 20 (mazgāšanas šķīdumu). Viegli uzsit pa plāksnēm virs absorbējoša materiāla, lai atbrīvotos no atlikušajām mazgāšanas sastāvdaļām. 2.1.1.3. Plāksnes bloķē ar fosfātu fizioloģisko buferšķīdumu (PBS) + 5 % (m/V) vājpiens (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/iedobe, 1 stundu 37 °C temperaturā. 2.1.1.4. Atbrīvojas no bloķējošā šķīduma un viegli uzsit pa plāksnēm virs absorbējoša materiāla. 2.1.2. Testa paraugi 2.1.2.1. Testējamos seruma paraugus un pozitīvos un negatīvos kontrolserumus proporcijā 1 pret 25 izšķīdina PBS + 5 % (m/V) vājpiens + 0,05 % (V/V) Tween 20, 100 μl uz iedobi. Inkubē 1 stundu 37 °C temperatūrā. Lai veiktu titrēšanu, sagatavo divkārša atšķaidījuma virknes no 1 pret 25 (100 μl/iedobe), viens serums attiecībā uz vienu plāksnes aili, un tāpat rīkojas ar pozitīvajām un negatīvajām kontrolēm. Inkubē 1 stundu 37 °C temperatūrā. 2.1.2.2. Plāksnes nomazgā, kā aprakstīts 2.1.1.2. punktā. 2.1.3. Konjugāts 2.1.3.1. Izdala 100 μl/iedobe marrutku peroksidāzes (HRP) pretzirgu gammaglobulīna konjugāta, kas izšķīdināts PBS + 5 % piena + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubē 1 stundu 37 °C temperatūrā. 2.1.3.2. Plāksnes nomazgā, kā aprakstīts 2.1.1.2. punktā. 2.1.4. Hromogēns/substrāts 2.1.4.1. Pievieno 200 μl/iedobe hromogena/substrāta šķīduma (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetilaminobenzaldehīds) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzotiazolīnhidrazona hidrohlorīds) + 5 μl H2O2) Krāsas veidošanos aptur, apmēram pēc 5 līdz 10 minūtēm (pirms sāk iekrāsoties negatīvā kontrole), pievienojot 50 μl 3N H2SO4. Var izmantot arī citus hromogēnus, kā piemēram, ABTS (2,2’-azino-bis-[3-etilbenzotiazolīn-6-sulfoskābe]), TMB (tetrametilbenzidīns) vai OPD (ortofenildiamīns). 2.1.4.2. Veic plākšņu nolasījumus pie 600 nm (vai 620 nm). 2.2. Rezultātu interpretācija 2.2.1. Aprēķina izslēgšanas vērtību, pieskaitot negatīvās kontroles vērtībai 0,6 (0,6 ir standartnovirze, kādu iegūst 30 negatīvu serumu grupā). 2.2.2. Testa paraugi, kas uzrāda zemākas absorbcijas vērtības nekā izslēgšanas vērtība, uzskatāmi par negatīviem. 2.2.3. Testa paraugi, kas uzrāda lielākas absorbcijas vērtības nekā izslēgšanas vērtība + 0,15, uzskatāmi par pozitīviem. 2.2.4. Testa paraugi, kuru uzrādītās absorbcijas vērtības atrodas vidus posmā, ir šaubīgi, un rezultāta apstiprināšanai jālieto otra metode. 3. BLOĶĒJOŠAIS ELISA TESTS ĀFRIKAS ZIRGU MĒRA VĪRUSA (AHSV) ANTIVIELU ATKLĀŠANAI (OBLIGĀTAIS TESTS) Bloķējošais ELISA tests ir izstrādāts tā, lai atklātu specifiskās AHSV antivielas uzņēmīgu sugu serumos. VP7 ir lielākais antigēnais AHSV vīrusu proteīns, un tas saglabājas deviņos serotipos. Tā kā arī monoklonālā antiviela (Mab) ir vērsta pret VP7, pārbaudei piemīt augsta jutības un specifiskuma pakāpe. Turklāt rekombinētais VP7 antigēns ir pilnīgi nekaitīgs un tādēļ garantē augstu drošības pakāpi. Testa pamatā ir princips, ka ar to pārtrauc reakciju starp rekombinēto VP7 kā antigēnu, kas piesaistīts ELISA testa plāksnei, un VP7 specifisko konjugēto Mab. Antiviela testa serumos bloķē reakciju starp antigēnu un Mab, kā rezultātā vājinās krāsas reakcija. Šeit aprakstīto testu veic Eiropas Kopienas References laboratorijā attiecībā uz Āfrikas zirgu mēri Alhetē, Spānijā. 3.1. Testa metode 3.1.1. ELISA testa plāksnes 3.1.1.1. ELISA testa plāksnes pārklāj ar rekombinētu AHSV-4 VP7, kas izšķīdināts karbonāta/bikarbonāta bufervielā, pH 9,6. Plāksnes atstāj pa nakti inkubēties 4 °C temperatūrā. 3.1.1.2. Plāksnes piecas reizes mazgā ar fosfātu fizioloģisko buferšķīdumu (PBS), kas satur 0,05 % (V/V) Tween 20 (PBST). 3.1.1.3. Plāksni stabilizē, apstrādājot ar stabilizējošu šķīdumu (lai varētu ilgstoši uzglabāt 4 °C temperatūrā, nezaudējot aktivitāti), un nosusina uz higroskopiska materiāla. 3.1.2. Testa paraugi un kontroles Skrīningam: | tieši uz plāksnes testa serumus un kontroles atšķaida PBST 1 pret 10, iegūstot galīgo tilpumu 100 μl/iedobe. Inkubē 1 stundu 37 °C temperatūrā. | Titrēšanai: | sagatavo testa serumu un pozitīvo kontroļu divkārša atšķaidījuma virknes (100 μl/iedobe) no 1 pret 10 līdz 1 pret 1280 astoņās iedobēs. Negatīvo kontroli testē atšķaidījumā 1 pret 10. | 3.1.2.1. 3.1.2.2. 3.1.3. Konjugāts Pievieno 50 μl/iedobe ieprieks izšķīdināta mārrutku peroksidāzes (HRP) Mab (VP7 specifiskās monoklonālās antivielas) konjugāta katrai iedobei un viegli samaisa, lai nodrošinātu viendabīgumu. Inkubē 30 minūtes 37 °C temperatūrā. 3.1.4. Plāksnes piecas reizes mazgā ar PBST un nosusina, kā iepriekš norādīts. 3.1.5. Hromogēns/substrāts Pievieno 100 μl/iedobe hromogena/substrāta šķīduma [1 ml ABTS (2,2’-azino-bis-[3-etilbenzotiazolīn-6-sulfoskābe]) 5 mg/ml + 9 ml substrāta bufervielas (0,1 M fosfāta-citrāta buferšķīduma ar pH 4, kas satur 0,03 % H2O2] un inkubē 10 minūtes istabas temperatūrā. Krāsas veidošanos aptur, pievienojot 100 μl/iedobe 2 % (m/V) SDS (nātrija dodecilsulfāts). 3.1.6. Nolasīšana Nolasījumu veic pie 405 nm ELISA testa nolasītājā. 3.2. Rezultātu interpretācija 3.2.1. Analīzes izvērtējums Tests ir derīgs, ja negatīvās kontroles (NC) optiskais blīvums (OB) ir lielāks par 1,0 un pozitīvās kontroles (PC) OB ir mazāks par 0,2. 3.2.2. Izslēgšanas vērtības aprēķināšana Pozitīvā izslēgšanas vērtība NC - NC - PC x 0,3 Negatīvā izslēgšanas vērtība NC - NC - PC x 0,2 kur NC ir negatīvās kontroles OB un PC ir pozitīvās kontroles OB. 3.2.3. Rezultātu interpretācija Paraugi, kuru OB ir mazāks par pozitīvo izslēgšanas vērtību, ir uzskatāmi par pozitīviem attiecībā uz AHSV antivielām. Paraugi, kuru OB ir lielāks par negatīvo izslēgšanas vērtību, ir uzskatāmi par negatīviem attiecībā uz AHSV antivielām. Paraugi, kuru OB lielums atrodas starp šīm abām vērtībām, uzskatāmi par šaubīgiem, un dzīvniekiem vēlreiz jānoņem paraugi pēc divām līdz trim nedēļām. " --------------------------------------------------