10)

pievieno šādu C.27., C.28., C.29. un C.30. nodaļu: “C.27. TOKSICITĀTES TESTS AR NOSĒDUMU UN ŪDENS HIRONOMĪDIEM, IZMANTOJOT PIESĀTINĀTUS NOSĒDUMUS IEVADS 1. Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (turpmāk – TG) 218 (2004. gads). Šī testēšanas metode ir izstrādāta ietekmes novērtēšanai, kuru izraisa ķīmisko vielu ilgstoša iedarbība uz nosēdumos dzīvojošiem saldūdens divspārņu kārtas kāpuriem Chironomus sp. Tās pamatā ir esošie toksicitātes testēšanas protokoli attiecībā uz Chironomus riparius un Chironomus tentans, kas ir izstrādāti Eiropā (1) (2) (3) un Ziemeļamerikā (4) (5) (6) (7) (8) un kam veikta salīdzinošā izpēte (1) (6) (9). Var izmantot arī citas hironomīdu sugas, piemēram, Chironomus yoshimatsui, par ko pieejami detalizēti apraksti (10) (11). 2. Šajā testēšanas metodē izmantotais ekspozīcijas scenārijs paredz nosēdumu piesātināšanu ar testējamo ķīmisko vielu. Atbilstīgā ekspozīcijas scenārija izvēle ir atkarīga no paredzētā testēšanas pielietojuma. Nosēdumu piesātināšanas scenārija mērķis ir imitēt ķīmisko vielu akumulācijas līmeņus nosēdumos. Šī ekspozīcijas sistēma paredz nosēdumu un ūdens testēšanas sistēmas nosēdumu piesātināšanu. 3. Vielas, kas jātestē, lai noskaidrotu to iedarbību uz nosēdumos dzīvojošiem organismiem, parasti nosēdumos pastāv ilgstoši. Nosēdumos dzīvojošie organismi var tikt pakļauti iedarbībai dažādos veidos. Katra ekspozīcijas veida relatīvā nozīme un laiks, kas paiet, lai rastos vispārēja toksiska iedarbība, ir atkarīgs no attiecīgās ķīmiskās vielas fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām. Tādu vielu gadījumā, kam ir spēcīga adsorbēšanās spēja (piemēram, ar log Kow > 5) vai kas izveido homopolāru saiti ar nosēdumiem, būtisks ekspozīcijas veids var būt piesārņotas barības uzņemšana. Lai nodrošinātu, ka izteikti lipofīlu vielu toksicitāte tiek novērtēta pietiekami precīzi, var apsvērt nosēdumiem pievienotās barības izmantošanu pirms testējamās ķīmiskās vielas pievienošanas. Lai ņemtu vērā visus iespējamos ekspozīcijas veidus, šī testēšanas metode koncentrējas uz ilgtermiņa ekspozīciju. Testēšana ilgst 20–28 dienas C. riparius un C. yoshimatsui sugām un 28–65 dienas C. tentans sugai. Ja īpašiem nolūkiem ir vajadzīgi īstermiņa dati, piemēram, lai izpētītu nestabilas ķīmiskās vielas ietekmi, pēc 10 dienām var pārtraukt papildu atkārtojumus. 4. Mērītie mērķparametri ir izšķīlušos pieaugušo īpatņu kopējais skaits un izšķilšanās laiks. Ir ieteicams kāpuru izdzīvošanas un augšanas mērījumus veikt tikai pēc 10 dienām, ja ir vajadzīgi papildu īstermiņa dati, pēc vajadzības izmantojot papildu atkārtojumus. 5. Ieteicams izmantot izstrādātus nosēdumus. Izstrādātiem nosēdumiem ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar dabīgiem nosēdumiem: — tiek samazināta eksperimentālā mainība, jo šādi nosēdumi izveido atkārtojamu “standartizētu matricu” un nav nepieciešams atrast nepiesārņotus un tīrus nosēdumu avotus, — testēšanu var sākt jebkurā laikā, nesaskaroties ar sezonālu mainību testēšanas nosēdumos, un nav nepieciešams nosēdumus iepriekš apstrādāt, lai tos attīrītu no vietējās faunas, turklāt izstrādātu nosēdumu izmantošana samazina izmaksas, kas saistītas ar pietiekamu nosēdumu daudzumu savākšanu dabā regulāras testēšanas vajadzībām, — izstrādātu nosēdumu izmantošana ļauj salīdzināt toksicitāti un attiecīgi klasificēt vielas. 6. Definīcijas dotas 1. papildinājumā. TESTĒŠANAS PRINCIPS 7. Vispirms hironomīdu kāpurus jebkurā attīstības stadijā pakļauj testējamās ķīmiskās vielas koncentrāciju diapazona iedarbībai nosēdumu un ūdens sistēmās. Nosēdumus piesātina ar testējamo ķīmisko vielu un pēc tam pirmās attīstības stadijas kāpurus ievieto testēšanas vārglāzēs, kurās nostabilizējušās nosēdumu un ūdens koncentrācijas. Hironomīdu izšķilšanos un attīstības ātrumu mēra testēšanas beigās. Kāpuru izdzīvošanu un svaru var noteikt jau pēc 10 dienām, ja vajadzīgs (izmantojot papildu atkārtojumus pēc vajadzības). Šos datus analizē, vai nu izmantojot regresijas modeli, lai aplēstu koncentrāciju, kas izraisītu × % samazinājumu attiecībā uz izšķilšanos vai kāpuru izdzīvošanu vai augšanu (piemēram, EC 15, EC 50 utt.), vai izmantojot statistiskās hipotēzes testu, lai noteiktu koncentrācijas līmeni, pie kura nav novērojama ietekme (NOEC) / koncentrācijas līmeni, pie kura novērojama mazākā ietekme (LOEC). Statistiskās hipotēzes testam ir nepieciešams salīdzināt ietekmes vērtības ar kontroles vērtībām, izmantojot statistiskus testus. INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO VIELU 8. Ir jābūt zināmai testējamās ķīmiskās vielas šķīdībai ūdenī, tās tvaika spiedienam, izmērītajai vai aprēķinātajai daļai nosēdumos un stabilitātei ūdenī un nosēdumos. Jābūt pieejamai uzticamai analītiskajai metodei, ar ko būtu iespējams kvantificēt testējamo ķīmisko vielu ūdens virsējā slānī, porūdenī un nosēdumos ar zināmu un apstiprinātu precizitāti un noteikšanas ierobežojumu. Lietderīga informācija ietver testējamās ķīmiskās vielas struktūrformulu un tīrību. Tāpat lietderīgi ir zināt testējamās vielas ķīmisko sadalīšanos (piemēram, izkliedēšanās, abiotiskā un biotiskā noārdīšanās utt.). Papildu norādījumi par tādu vielu testēšanu, kuras ir sarežģīti testēt to fizikālo un ķīmisko īpašību dēļ, pieejami atsaucē (12). ĶĪMISKĀS STANDARTVIELAS 9. Periodiski var testēt ķīmiskās standartvielas, lai pārliecinātos, ka testēšanas protokols un apstākļi ir uzticami. Toksisko standartvielu, kas sekmīgi izmantotas salīdzinošajos testos un validēšanas pētījumos, piemēri ietver lindānu, trifluralīnu, pentahlorfenolu, kadmija hlorīdu un kālija hlorīdu (1) (2) (5) (6) (13). TESTA DERĪGUMS 10. Lai tests būtu derīgs, piemēro šādus nosacījumus: — izšķilšanās apmēram kontroles traukos jābūt vismaz 70 % testēšanas beigās (1) (6), — C. riparius un C. yoshimatsui izšķilšanās līdz pieaugušiem īpatņiem no kontroles traukiem jānotiek 12–23 dienu laikā pēc to ievietošanas traukos; C. tentans ir vajadzīgas 20–65 dienas, — testēšanas beigās katrā traukā jānosaka pH un izšķīdušā skābekļa koncentrācija; skābekļa koncentrācijai jābūt vismaz 60 % no gaisa piesātinājuma vērtības (turpmāk – ASV) izmantotajā temperatūrā, savukārt pH ūdens virsējā slānī jābūt 6–9 diapazonā visos testēšanas traukos, — ūdens temperatūra nedrīkstētu atšķirties vairāk kā par ± 1,0 °C; ūdens temperatūru varētu kontrolēt ar izotermisku telpu, un tādā gadījumā temperatūra telpā ir jāapstiprina atbilstīgos laika intervālos. METODES APRAKSTS Testēšanas trauki 11. Pētījumu veic 600 ml stikla vārglāzēs ar 8 cm diametru. Der arī citi trauki, bet tiem jānodrošina piemērots ūdens virsējā slāņa un nosēdumu dziļums. Nosēdumu virsmai jābūt pietiekamai, lai nodrošinātu 2–3 cm2 telpu katram kāpuram. Nosēdumu slāņa dziļuma attiecībai pret ūdens virsējā slāņa dziļumu jābūt 1:4. Testēšanas traukiem un citām iekārtām, kas saskarsies ar testēšanas sistēmu, jābūt pilnībā izgatavotām no stikla vai cita ķīmiski inerta materiāla (piemēram, teflona). Sugu izvēle 12. Testēšanā vēlams izmantot sugu Chironomus riparius. Arī Chironomus tentans ir piemēroti, bet grūtāk apstrādājami, un tiem vajadzīgs ilgāks testēšanas periods. Var izmantot arī Chironomus yohimatsui. Sīka informācija par kultūru metodēm attiecībā uz Chironomus riparius ir sniegta 2. papildinājumā. Informācija par kultūras apstākļiem ir pieejama arī attiecībā uz citām sugām, t. i., Chironomus tentans (4) un Chironomus yoshimatsui (11). Sugu noteikšana ir jāapstiprina pirms testēšanas, bet nav vajadzīga pirms katras testēšanas reizes, ja organismi ir iegūti no laboratorijā kultivētas kultūras. Nosēdumi 13. Vēlams izmantot izstrādātus nosēdumus (saukti arī par rekonstituētajiem, mākslīgajiem vai sintētiskajiem nosēdumiem). Tomēr, ja izmanto dabīgos nosēdumus, tie ir jāraksturo (vismaz pH, organiskā oglekļa sastāvs, ieteicama arī tādu citu parametru noteikšana kā C/N attiecība un granulometrija) un tajos nedrīkstētu būt nekāda piesārņojuma un citu organismu, kas varētu konkurēt ar hironomīdiem vai baroties ar tiem. Ieteicams arī pirms izmantošanas hironomīdu toksicitātes testā dabīgos nosēdumus kondicionēt septiņasS dienas tādos pašos apstākļos, kādi pastāvēs testēšanas laikā. Šajā testā (1) (15) (16) ir ieteicams izmantot šādus izstrādātus nosēdumus, par pamatu izmantojot mākslīgu augsni, ko izmanto C.8. testēšanas metodē (14): a) 4–5 % (saussvars) kūdras – pēc iespējas pietuvināta pH 5,5–6,0 apmērā; ir svarīgi izmantot pulverizētu kūdru, kas smalki samalta (daļiņu izmērs ≤ 1 mm) un kas ir izžāvēta vienīgi ar gaisu; b) 20 % (saussvars) kaolīna mālu (kaolinīta saturam vēlams būt virs 30 %); c) 75–76 % (saussvars) kvarca smilšu (pārsvarā tām jāsastāv no smalkām smiltīm, proti, vairāk nekā 50 % daļiņu jābūt 50–200 μm izmērā); d) pievieno dejonizētu ūdeni, lai iegūtu galīgā maisījuma mitruma saturu 30–50 % diapazonā; e) pievieno ķīmiski tīras kvalitātes kalcija karbonātu (CaCO3), lai koriģētu galīgā nosēdumu maisījuma pH 7,0 ± 0,5 apmērā; galīgā maisījuma organiskā oglekļa saturam jābūt 2 % (± 0,5), un tas jākoriģē, izmantojot atbilstīgus daudzumus kūdras un smilšu saskaņā ar a) un c) apakšpunktu. 14. Jābūt zināmam kūdras, kaolīna mālu un smilšu avotam. Nosēdumu sastāvdaļas ir jāpārbauda, lai pārliecinātos, ka tajās nav ķīmiska piesārņojuma (piemēram, smago metālu, hlororganisko savienojumu, fosfororganisko savienojumu utt.). Izstrādātu nosēdumu sagatavošanas piemērs ir aprakstīts 3. papildinājumā. Ir pieņemami samaisīt arī sausas sastāvdaļas, ja tiek pierādīts, ka pēc ūdens virsējā slāņa pievienošanas nenotiek nosēdumu sastāvdaļu atdalīšanās (piemēram, kūdras daļiņu peldēšana pa ūdens virsmu) un ka kūdra vai nosēdumi ir pietiekami kondicionēti. Ūdens 15. Jebkurš ūdens, kas atbilst 2. un 4. papildinājumā noteiktajiem pieņemama atšķaidīšanas ūdens ķīmiskajiem raksturlielumiem, ir piemērots kā testēšanas ūdens. Jebkāds piemērots ūdens, proti, dabīgs ūdens (virszemes vai gruntsūdens), rekonstituēts ūdens (sk. 2. papildinājumu) vai krāna ūdens, no kura attīrīts hlors, ir izmantojams kā kultūras turēšanas un testēšanas ūdens, ja hironomīdi tajā bez stresa pazīmēm izdzīvo kultivēšanas un testēšanas laikā. Testēšanas sākumā testēšanas ūdens pH jābūt 6–9 diapazonā, savukārt kopējā cietība nedrīkst pārsniegt 400 mg/l kā CaCO3. Tomēr, ja tiek prognozēta mijiedarbība starp cietības joniem un testējamo vielu, jāizmanto zemākas cietības ūdens (tādēļ šādā situācijā nedrīkst izmantot Elendt barotni M4). Visa pētījuma laikā jāizmanto viena veida ūdens. Ūdens kvalitātes raksturlielumi, kas uzskaitīti 4. papildinājumā, jānosaka vismaz divreiz gadā vai tad, kad ir aizdomas, ka šie raksturlielumi varētu būt būtiski izmainījušies. Rezerves šķīdumi – piesātināti nosēdumi 16. Izraudzītās koncentrācijas piesātinātos nosēdumus parasti sagatavo, testējamās vielas šķīdumu tieši pievienojot nosēdumiem. Dejonizētā ūdenī izšķīdinātas testējamās vielas rezerves šķīdumu samaisa ar izstrādātajiem nosēdumiem, izmantojot velmēšanas dzirnavas, barības jaucēju vai manuālu jaukšanu. Ja testējamā viela ir ūdenī mazšķīstoša, to var izšķīdināt pēc iespējas mazākā tilpumā piemērota organiska šķīdinātāja (piemēram, heksāna, acetona vai hloroforma). Šo šķīdumu pēc tam samaisa ar 10 g smalku kvarca smilšu katram testēšanas traukam. Šķīdumam ļauj iztvaikot, un tam ir pilnībā jāpazūd no smiltīm. Pēc tam smiltis samaisa ar piemērotu daudzumu nosēdumu katrā testēšanas vārglāzē. Testējamās vielas šķīdināšanai, disperģēšanai vai emulģēšanai drīkst izmantot tikai tādus preparātus, kas viegli izgaist. Jāpatur prātā, ka testējamās vielas nodrošinātās smiltis un smilšu maisījums ir jāņem vērā, sagatavojot nosēdumus (t. i., tādēļ nosēdumi ir jāsagatavo, izmantojot mazāk smilšu). Jāuzmanās, lai nodrošinātu, ka nosēdumiem pievienotā testējamā viela ir nosēdumos viscaur un vienmērīgi izkliedēta. Ja vajadzīgs, var analizēt paraugus, lai noteiktu homogenitātes pakāpi. TESTĒŠANAS PLĀNS 17. Testēšanas plāns attiecas uz testēšanas koncentrāciju skaita un intervālu izvēli, trauku skaitu katram koncentrācijas līmenim un kāpuru skaitu traukā. Ir aprakstīti plāni ietekmes koncentrāciju (turpmāk – EC) punktu noteikšanai, NOEC noteikšanai un pieļaujamā daudzuma testēšanas veikšanai. Regresijas analīzes plāns 18. Testēšanā izmantotajām koncentrācijām ir jāaptver ietekmes koncentrācija (piemēram, EC 15, EC 50) un koncentrāciju diapazons, kurā ir jānoskaidro testējamās vielas ietekme. Tas, ka ietekmes koncentrācija ir testēšanā izmantoto koncentrāciju diapazonā, parasti uzlabo ietekmes koncentrāciju (EC x) noteikšanas precizitāti un it sevišķi derīgumu. Jāizvairās no ekstrapolācijas krietni zem zemākās pozitīvās koncentrācijas vai virs augstākās koncentrācijas. Ir lietderīgi veikt orientējošu diapazona noteikšanas testēšanu, lai izvēlētos izmantojamo koncentrāciju diapazonu (sk. 27. punktu). 19. Ja ir jānosaka EC x, jātestē vismaz piecas koncentrācijas un trīs atkārtojumi katrai koncentrācijai. Jebkurā gadījumā ieteicams izmantot pietiekamu daudzumu testēšanas koncentrāciju, lai nodrošinātu modeli pamatotām aplēsēm. Koeficients starp koncentrācijām nedrīkstētu pārsniegt 2 (izņēmums varētu būt gadījumi, kad devu un atbildes reakcijas līknei ir sekls slīpums). Katras apstrādes atkārtojumu skaitu var samazināt, ja palielina testēšanas koncentrāciju skaitu ar dažādām atbildes reakcijām. Atkārtojumu skaita palielināšana vai testēšanas koncentrāciju intervālu samazināšana parasti noved pie šaurākiem testēšanas ticamības intervāliem. Ir vajadzīgi papildu atkārtojumi, ja kāpuru izdzīvošanu un augšanu nosaka jau pēc 10 dienām. NOEC/LOEC noteikšanas plāns 20. Ja ir jānosaka LOEC vai NOEC, jāizmanto [iecas testēšanas koncentrācijas ar vismaz četreim atkārtojumiem un koeficients starp koncentrācijām nedrīkstētu pārsniegt 2. Atkārtojumu skaitam jābūt pietiekamam, lai nodrošinātu pietiekamu statistisko nozīmību un varētu konstatēt 20 % atšķirību no kontroles traukiem pie 5 % nozīmības līmeņa (p = 0,05). Attiecībā uz attīstības ātrumu parasti ir piemēroti veikt dispersijas analīzi (turpmāk – ANOVA), piemēram, Dunnett testu vai Williams testu (17) (18) (19) (20). Attiecībā uz izšķilšanās koeficientu var izmantot Cochran-Armitage, Fisher pieeju (ar Bonferroni korekciju) vai Mantel-Haenszel testu. Pieļaujamā daudzuma tests 21. Pieļaujamā daudzuma testu (1 testēšanas koncentrācija un kontroles trauks) var veikt, ja orientējošā diapazona noteikšanas testā netika konstatēta ietekme. Pieļaujamā daudzuma testa mērķis ir veikt testēšanu ar pietiekami augstu koncentrāciju, lai lēmumu pieņēmēji varētu izslēgt testējamās vielas iespējamu toksisku ietekmi, un pieļaujamo daudzumu nosaka tādā koncentrācijā, kādas iestāšanos neprognozē nekādā gadījumā. Ieteicams 1 000 mg/kg (saussvars). Parasti ir vajadzīgi vismaz seši atkārtojumi gan apstrādei, gan kontrolei. Ir jāpanāk pietiekama statistiskā nozīmība, lai varētu noteikt 20 % atšķirību no kontroles trauka pie 5 % nozīmības līmeņa (p = 0,05). Ar metrisku atbildes reakciju (attīstības ātrums un svars) t-tests parasti ir piemērota statistiskā metode, ja dati atbilst šā testa prasībām (normalitāte, homogēnas dispersijas). Var izmantot nevienlīdzīgas dispersijas t-testu vai ar parametriem nesaistītu testu, piemēram, Wilcoxon-Mann-Whithey testu, ja nav atbilstības iepriekš norādītajām prasībām. Attiecībā uz izšķilšanās koeficientu ir piemērota Fisher pieeja. PROCEDŪRA Ekspozīcijas apstākļi Piesātinātās nosēdumu un ūdens sistēmas sagatavošana 22. Testējamās vielas pievienošanai ir ieteicams izmantot testēšanas C.8. metodē “Toksicitātes noteikšana sliekām” aprakstīto piesātināšanas procedūru (14). Piesātinātos nosēdumus ievieto traukos un pievieno ūdens virsējo slāni, lai izveidotu nosēdumu un ūdens tilpuma attiecību 1:4 (sk. 11. un 15. punktu). Nosēdumu slāņa dziļumam jābūt 1,5–3 cm. Lai izvairītos no nosēdumu sastāvdaļu atdalīšanās un smalku daļiņu atkārtotas suspensijas ūdens stabā testēšanas ūdens pievienošanas laikā, nosēdumus var pārklāt ar plastmasas ripu ūdens uzliešanas laikā, bet pēc tam ripu nekavējoties noņem. Šim nolūkam der arī citas ierīces. 23. Testēšanas trauki ir jāapsedz (piemēram, ar stikla plāksnēm). Ja vajadzīgs, pētījuma laikā ūdens līmeņus papildina līdz sākotnējam tilpumam, lai kompensētu ūdens iztvaikošanu. Tam jāizmanto destilēts vai dejonizēts ūdens, lai novērstu sāļu uzkrāšanos. Stabilizācija 24. Tiklīdz ir sagatavoti piesātinātie nosēdumi ar ūdens virsējo slāni, ir vēlams ļaut testējamai vielai nodalīties no ūdens fāzes un nogulsnēties uz nosēdumiem (3) (4) (6) (13). To vēlams īstenot tādos pašos temperatūras un aerācijas apstākļos, kādus izmanto testēšanā. Atbilstīgais līdzsvara iestāšanās laiks ir atkarīgs no konkrētajiem nosēdumiem un ķīmiskās vielas un var būt stundas vai dienas un retos gadījumos ilgt līdz pat vairākām nedēļām (4–5 nedēļas). Tā kā šajā laikā varētu noārdīties daudzas ķīmiskās vielas, līdzsvara iestāšanās netiek gaidīta, bet līdzsvarošanai ir ieteicams dot 48 stundas. Šā turpmākas līdzsvarošanās perioda beigās ir jānosaka testējamās vielas koncentrācija ūdens virsējā slānī, porūdenī un nosēdumos, proti, vismaz augstākā un zemākā koncentrācija (sk. 38. punktu). Šie testējamās vielas analītiskie mērījumi ļauj aprēķināt masas bilanci un noteikt rezultātus, pamatojoties uz izmērītajām koncentrācijām. Testēšanas organismu pievienošana 25. Četras līdz piecas dienas pirms testa organismu pievienošanas testēšanas traukos no kultūrām jāizņem oliņas un tās jāievieto nelielos traukos ar audzēšanas barotni. Var izmantot noturētu barotni no rezerves kultūras vai svaigi sagatavotu barotni. Ja izmanto svaigi sagatavotu barotni, kultūras barotnei jāpievieno neliels daudzums barības, piemēram, zaļaļģes un/vai daži pilieni filtrāta no smalki samaltas zivju barības pārslu suspensijas (sk. 2. papildinājumu). Jāizmanto tikai svaigi izdētas oliņas. Parasti kāpuri sāk šķilties dažas dienas pēc oliņu izdēšanas (2–3 dienas Chironomus riparius 20 °C un 1–4 dienas Chironomus tentans 23 °C un Chironomus yoshimatui 25 °C), un kāpuru augšana notiek četrās attīstības stadijās, no kurām katra ilgst 4–8 dienas. Testēšanā jāizmanto pirmās attīstības stadijas kāpuri (2–3 vai 1–4 dienas pēc izšķilšanās). Knišļu attīstības stadiju var pārbaudīt, izmantojot galvas kapsulas platumu (6). 26. Katrā testēšanas traukā ar piesātinātiem nosēdumiem un ūdeni pēc nejaušības principa ievieto 20 pirmās attīstības stadijas kāpurus, izmantojot neasu pipeti. Kāpuru ievietošanas laikā testēšanas traukos ir jāpārtrauc ūdens aerācija, un šis pārtraukums jāturpina vēl 24 stundas pēc kāpuru ielaišanas (sk. 25. un 32. punktu). Saskaņā ar izmantoto testēšanas plānu (sk. 19. un 20. punktu) izmantoto kāpuru skaits uz katru koncentrāciju ir vismaz 60, lai noteiktu EC punktus, un 80, lai noteiktu NOEC. Testēšanas koncentrācijas 27. Diapazona noteikšanas tests varētu būt lietderīgs, lai noteiktu koncentrāciju diapazonu galīgajam testam. Šim nolūkam izmanto virkni atšķirīgu testējamās vielas koncentrāciju. Lai hironomīdiem nodrošinātu tādu pašu virsmas blīvumu, kādu izmantos galīgajā testēšanā, hironomīdus pakļauj katras testējamās vielas koncentrācijas iedarbībai uz tādu laiku, kas ļauj aplēst aptuvenās testēšanas koncentrācijas. Atkārtojumi nav vajadzīgi. 28. Lēmumu par testēšanas koncentrācijām galīgajam testam pieņem, pamatojoties uz diapazona noteikšanas testa rezultātiem. Jāizmanto un saskaņā ar 18.–20. punktu jāizvēlas vismaz piecas koncentrācijas. Kontroles trauki 29. Testā ir jāietver kontroles trauki, kuros nav testējamās vielas, bet ir nosēdumi un kuriem nodrošina atbilstīgu skaitu atkārtojumu (sk. 19. un 20. punktu). Ja testējamās vielas pievienošanai ir izmantots šķīdums (sk. 16. punktu), jāizmanto arī nosēdumu šķīduma kontroles trauks. Testēšanas sistēma 30. Izmanto statiskas sistēmas. Izņēmuma gadījumos, piemēram, ja ūdens kvalitātes specifikācijas nav piemērotas testa organismam vai ietekmē ķīmisko līdzsvaru (piemēram, izšķīdušā skābekļa līmeņi pārmērīgi pazeminās, izvadproduktu koncentrācija pārmēru paaugstinās vai no nosēdumiem ekstrahējas minerāli un ietekmē pH un/vai ūdens cietību), var izmantot daļēji statiskas vai caurplūdes sistēmas ar ūdens virsējā slāņa periodisku vai nepārtrauktu atjaunošanu. Tomēr parasti derēs un ir ieteicamas citas ūdens virsējā slāņa kvalitātes uzlabošanas metodes, piemēram, aerācija. Barība 31. Kāpuri ir jābaro, vēlams, katru dienu vai vismaz trīs reizes nedēļā. Katram jaunam kāpuram pirmās 10 dienas pietiek ar zivju barību (suspensija ūdenī vai smalki samalta barība, piemēram, TetraMin vai TetraPhyll, sk. 2. papildinājumu) 0,25–0,5 mg apmērā (0,35–0,5 mg C. yoshimatui). Nedaudz vairāk barības varētu vajadzēt vecākiem kāpuriem, proti, 0,5–1 mg uz kāpuru dienā, ar ko vajadzētu pietikt līdz testēšanas beigām. Ja tiek novērota sēnīšu augšana vai ja kontroles traukos ir novērota mirstība, barības porcija ir jāsamazina visos apstrādes traukos un kontroles traukos. Ja sēnīšu vairošanos neizdodas apturēt, tests ir jāatkārto. Ja tiek testētas vielas, kam ir spēcīga adsorbēšanās spēja (piemēram, ar log Kow > 5) vai kas izveido homopolāru saiti ar nosēdumiem, barības daudzumu, kurš vajadzīgs organismu izdzīvošanas un dabīgas augšanas nodrošināšanai, var pievienot izstrādātajiem nosēdumiem pirms stabilizācijas perioda. Šādam nolūkam jāizmanto augu materiāls, nevis zivju barība, proti, var pievienot 0,5 % (saussvars) smalki samaltas lapas, piemēram, nātres (Urtica dioica), zīdkoka (Morus alba), baltā āboliņa (Trifolium repens) vai spinātu (Spinacia oleracea) lapas, vai citu augu materiālu (Cerophyl vai alfa-celulozi). Inkubācijas apstākļi 32. Kad ir pagājušas, vēlams, 24 stundas pēc kāpuru ielaišanas, testēšanas traukos ūdens virsējam slānim nodrošina lēnu aerāciju, ko turpina visā testēšanas laikā (jāuzmanās, lai izšķīdušā skābekļa koncentrācija nepazeminās zem 60 % no ASV). Aerāciju nodrošina caur stikla Pastēra pipeti, kas piestiprināta 2–3 cm virs nosēdumu slāņa (t. i., vienu vai dažus burbuļus sekundē). Testējot gaistošas ķīmiskās vielas, var apsvērt iespēju nosēdumu un ūdens sistēmai aerāciju nenodrošināt. 33. Testēšanu veic nemainīgā 20 °C (± 2 °C) temperatūrā. C. tentans un C. yoshimatui ieteicamā temperatūra ir attiecīgi 23 °C un 25 °C (± 2 °C). Piemēro 16 stundu apgaismojuma ilgumu, un gaismas intensitātei jābūt 500–1 000 luksiem. Ekspozīcijas ilgums 34. Ekspozīcija sākas brīdī, kad kāpuri tiek ielaisti piesātinātajos un kontroles traukos. Maksimālais ekspozīcijas ilgums ir 28 dienas C. riparius un C. yoshimatsui un 65 dienas C. tentans. Ja knišļi izšķiļas ātrāk, testēšanu var pārtraukt ne mazāk kā pēc piecām dienām pēc pēdējā pieaugušā īpatņa izšķilšanās kontroles traukā. Novērojumi Izšķilšanās 35. Nosaka pilnībā izšķīlušos knišļu tēviņu un mātīšu attīstības laiku un kopējo skaitu. Tēviņus ir viegli atšķirt pēc to spalvainās antenas. 36. Testēšanas trauki ir jānovēro vismaz trīs reizes nedēļā, lai vizuāli novērtētu jebkādas anomālijas (piemēram, nosēdumu pamešana, neparasta peldēšana) salīdzinājumā ar kontroles traukiem. Paredzamās izšķilšanās periodā katru dienu jāskaita izšķīlušies knišļi. Katru dienu reģistrē pilnībā izšķīlušos knišļu dzimumu un skaitu. Pēc identificēšanas knišļus izņem no traukiem. Oliņas, kas izdētas pirms testēšanas pabeigšanas, ir jāreģistrē un jāizņem, lai novērstu kāpuru atjaunošanos nosēdumos. Jāreģistrē arī redzamo kūniņu skaits, kuras nav izšķīlušās. Norādījumi par izšķilšanās mērīšanu ir sniegti 5. papildinājumā. Augšana un izdzīvošana 37. Ja ir jāsniedz dati par kāpuru izdzīvošanu un augšanu pēc 10 dienām, sākumā jāietver papildu testēšanas trauki, lai tos varētu izmantot šim nolūkam. Šo papildu trauku nosēdumus izkāš, izmantojot 250 μm sietu, lai saglabātu kāpurus. Nāves kritēriji ir nekustīgums vai atbildes reakcijas trūkums uz mehānisku kairinājumu. Neatgūtie kāpuri arī jāuzskata par mirušiem (kāpurus, kas nomiruši testēšanas sākumā, iespējams, ir noārdījuši mikrobi). Nosaka izdzīvojušo kāpuru saussvaru (bez pelniem) katrā testēšanas traukā un aprēķina vidējo atsevišķo saussvaru katrā traukā. Ir lietderīgi noteikt, kurai attīstības stadijai pieder izdzīvojušais kāpurs. Šim nolūkam var izmantot katra īpatņa galvas kapsulas platuma mērījumu. Analītiskie mērījumi Testējamās vielas koncentrācija 38. Pirms testēšanas sākšanas (t. i., pirms kāpuru ielaišanas) vismaz no viena katras koncentrācijas trauka paņem nosēdumu kopējos paraugus, lai analītiski noteiktu testējamās vielas koncentrāciju nosēdumos. Ir ieteicams testēšanas sākumā (sk. 24. punktu) un beigās analizēt vismaz ūdens virsējā slāņa, porūdens un nosēdumu paraugus no augstākās un zemākās koncentrācijas. Šāda testējamās vielas koncentrācijas noteikšana sniedz informāciju par testējamās vielas attīstību/sadalīšanos ūdens un nosēdumu sistēmā. 39. Ja veic starpposma mērījumus (piemēram, septītajā dienā) un ja analīzei ir vajadzīgi lieli paraugi, ko nevar paņemt no testēšanas traukiem, neietekmējot testēšanas sistēmu, jāveic analītiska noteikšana no paraugiem, kuri ņemti no papildu testēšanas traukiem, kas saņēmuši tādu pašu apstrādi (ietverot testa organismus), bet netiek izmantoti bioloģiskajiem novērojumiem. 40. Lai izolētu starpūdeni, ieteicama centrifugēšana, piemēram, 10 000 g 4 °C temperatūrā 30 minūtes. Tomēr, ja tiek pierādīts, ka testējamā viela neadsorbējas uz filtriem, var būt pieņemami izmantot arī filtrēšanu. Dažos gadījumos var būt neiespējami analizēt koncentrācijas porūdenī, jo parauga izmērs ir pārāk mazs. Fizikālie un ķīmiskie parametri 41. Atbilstīgi ir jānosaka testēšanas trauku pH un temperatūra (sk. 10. punktu). Testēšanas sākumā un beigās jānosaka arī cietība un amonjaks kontroles traukos un vienā testēšanas traukā ar augstāko koncentrāciju. DATI UN PĀRSKATU SAGATAVOŠANA Rezultātu apstrāde 42. Šā testa mērķis ir noteikt testējamās vielas ietekmi uz attīstības ātrumu un pilnībā izšķīlušos knišļu tēviņu un mātīšu kopējo skaitu vai – 10 dienu testa gadījumā – ietekmi uz kāpuru izdzīvošanu un svaru. Ja nav nekādu norāžu par statistiski atšķirīgu jutību atkarībā no dzimuma, tēviņu un mātīšu rezultātus var apvienot, lai veiktu statistisko analīzi. Jutības atšķirības starp dzimumiem var statistiski novērtēt, piemēram, ar χ2 – r × 2 testu. Ja vajadzīgs, pēc 10 dienām ir jānosaka kāpuru izdzīvošana un vidējais atsevišķais saussvars katrā traukā. 43. Ietekmes koncentrācijas, kas izteiktas saussvarā un pamatotas uz to, vēlams aprēķināt, pamatojoties uz izmērītajām koncentrācijām nosēdumos testēšanas sākumā (sk. 38. punktu). 44. Lai aprēķinātu punktu aplēsi EC 50 vai jebkurai citai EC x, kā patiesus atkārtojumus var izmantot statistiku par situāciju pirms ievietošanas traukos. Aprēķinot ticamības intervālu jebkurai EC x, jāņem vērā mainība starp traukiem vai ir jāpierāda, ka šī mainība ir tik maza, ka to var neņemt vērā. Ja modeli aprīko saskaņā ar mazāko kvadrātu metodi, statistika par situāciju pirms ievietošanas traukos ir jākoriģē, lai uzlabotu mainības homogenitāti. Tomēr EC x vērtības ir jāaprēķina pēc tam, kad atbildes reakcija ir atkoriģēta atpakaļ uz sākotnējo vērtību. 45. Ja statistiskās analīzes mērķis ir noteikt NOEC/LOEC ar hipotēzes testu, jāņem vērā mainība starp traukiem, piemēram, ar ieligzdotu ANOVA. Var arī izmantot stabilākus testus (21) situācijās, kad ir pārkāpti parastie ANOVA pieņēmumi. Izšķilšanās koeficients 46. Izšķilšanās koeficienti ir kvantitatīvi dati, ko var analizēt ar Cochran-Armitage testu, kuru īsteno pakāpeniski, ja ir paredzama monotona devas un atbildes reakcijas attiecība un ja šie dati atbilst šādai prognozei. Ja minētais tests analīzei neder, var izmantot Fisher pieeju vai Mantel-Haenszel testu ar Bonferroni-Holm koriģētajām p-vērtībām. Ja pastāv liecības par lielāku mainību starp atkārtojumiem ar vienu un to pašu koncentrāciju, nekā to norādītu binomināls sadalījums (nereti uz to atsaucas kā uz “papildu binominālu” mainību), tad jāizmanto stabils Cochran-Armitage vai Fisher pieejas tests, kā ierosināts atsaucē (21). Nosaka katrā traukā izšķīlušos knišļu summu (ne), ko dala ar ielaisto kāpuru skaitu (na): kur: ER = izšķilšanās koeficients; ne = katrā traukā izšķīlušos knišļu skaits; na = katrā traukā ielaisto kāpuru skaits. 47. Lieliem paraugu apjomiem piemērota alternatīva, ja pastāv papildu binomināla mainība, ir iespēja izšķilšanās koeficientu uzskatīt par nepārtrauktu atbildes reakciju un izmantot tādas procedūras kā William tests, ja ir paredzama monotona devas un atbildes reakcijas attiecība un ja tas atbilst šiem izšķilšanās koeficienta datiem. Dunnett tests būtu piemērots, ja monotonuma nav. Šajā kontekstā liels parauga apjoms tiek definēts kā gadījums, kad gan izšķīlušos īpatņu skaits, gan neizšķīlušos īpatņu skaits pārsniedz piecus katrā atkārtojumā (traukā). 48. Lai piemērotu ANOVA metodes, izšķilšanās koeficienta vērtības ir vispirms jāpārvērš ar arcsin kvadrātsaknes transformāciju vai ar Freeman-Tukey transformāciju, lai iegūtu aptuveno normālo sadalījumu un izlīdzinātu mainības. Izmantojot absolūto periodiskumu, var piemērot Cochran-Armitage, Fisher pieejas (Bonferroni) vai Mantel-Haenszel testus. Arcsin kvadrātsaknes transformāciju piemēro, ņemot izšķilšanās koeficienta kvadrātsaknes inverso sinusu (sin–1). 49. Izšķilšanās koeficientiem EC x vērtības aprēķina, izmantojot regresijas analīzi (vai, piemēram, probit (22), logit, Weibull, atbilstīgu tirdzniecībā pieejamu programmatūru utt.). Ja regresijas analīze ir nesekmīga (piemēram, tiek iegūtas mazāk nekā divas daļējas atbildes reakcijas), izmanto citas ar parametriem nesaistītas metodes, tādas kā slīdošā vidējā vai vienkāršā interpolācija. Attīstības ātrums 50. Vidējais attīstības laiks ir vidējais laikposms starp kāpuru ielaišanu (testa 0. diena) un testa knišļu izšķilšanos. (Lai aprēķinātu patieso attīstības laiku, jāapsver kāpuru vecums ielaišanas brīdī.) Attīstības ātrums ir attīstības laika apgrieztā vērtība (vienība: 1/diena) un ir kāpuru vienas dienas attīstības daļa. Attīstības ātrums ir ieteicamāks, lai novērtētu šos nosēdumu toksicitātes pētījumus, jo tā mainība ir mazāka un tas ir homogēnāks un tuvāks normālam sadalījumam salīdzinājumā ar attīstības laiku. Tādējādi efektīvas parametru testēšanas procedūras var izmantot drīzāk ar attīstības ātrumu, nevis ar attīstības laiku. Attiecībā uz attīstības ātrumu kā nepārtrauktu atbildes reakciju EC x vērtības var aplēst, izmantojot regresijas analīzi (piemēram, (23) (24)). 51. Turpmākajiem statistiskajiem testiem pieņem, ka pārbaudes dienā × novēroto knišļu skaits ir izšķīlies vidējā laika intervālā starp dienu × un dienu x – l (l = pārbaudes intervāla ilgums, parasti viena diena). Katrā traukā vidējo attīstības ātrumu (x) aprēķina šādi: kur: : vidējais attīstības ātrums katrā traukā; i : pārbaudes intervāla indekss; m : pārbaudes intervālu maksimālais skaits; : pārbaudes intervālā i izšķīlušos knišļu skaits; ne : kopējais knišļu skaits, kas izšķīlušies eksperimenta beigās; (= ) xi : intervālā i izšķīlušos knišļu attīstības ātrums. kur: dayi : pārbaudes diena (dienas kopš ielaišanas); li : pārbaudes intervāla i ilgums (dienas, parasti viena diena). Testēšanas pārskats 52. Testēšanas pārskatā jāietver vismaz šāda informācija: Testējamā viela: — fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikāli ķīmiskās īpašības (šķīdība ūdenī, tvaika spiediens, sadalīšanās koeficients augsnē (vai nosēdumos, ja pieejams), stabilitāte ūdenī utt.), — ķīmiskās identifikācijas dati (vispārpieņemtais nosaukums, ķīmiskais nosaukums, struktūrformula, CAS numurs utt.), ietverot tīrību un analītisko metodi, ar ko ir iespējams kvantificēt testējamo vielu. Testēšanas sugas: — izmantotie testa dzīvnieki: suga, zinātniskais nosaukums, organismu avots un pavairošanas apstākļi, — informācija par oliņu un kāpuru apstrādi, — testa dzīvnieku vecums ielaišanas brīdī testēšanas traukos. Testēšanas apstākļi: — izmantotie nosēdumi, t. i., dabīgi vai izstrādāti nosēdumi, — dabīgajiem nosēdumiem – nosēdumu paraugu ņemšanas vietas atrašanās vieta un apraksts, ietverot, ja iespējams, piesārņojuma vēsturi; raksturlielumi – pH, organiskā oglekļa saturs, C/N attiecība un granulometrija (ja vajadzīgs), — izstrādāto nosēdumu sagatavošana: sastāvdaļas un raksturlielumi (organiskā oglekļa saturs, pH, mitrums utt. testēšanas sākumā), — testēšanas ūdens sagatavošana (ja izmanto rekonstituētu ūdeni) un raksturlielumi (skābekļa koncentrācija, pH, vadītspēja, cietība utt. testēšanas sākumā), — nosēdumu un ūdens virsējā slāņa dziļums, — ūdens virsējā slāņa un porūdens tilpums; mitru nosēdumu svars ar porūdeni un bez tā; — testēšanas trauki (materiāls un izmērs), — nosēdumu piesātināšanas metode: izmantotās testēšanas koncentrācijas, atkārtojumu skaits un šķīdums, ja tas izmantots, — piesātinātās nosēdumu un ūdens sistēmas stabilizēšanās līdzsvara fāze: ilgums un apstākļi, — inkubācijas apstākļi: temperatūra, apgaismojuma cikls un intensitāte, aerācija (regularitāte un intensitāte), — sīka informācija par barošanu, arī par barības veidu, sagatavošanu, daudzumu un barošanas režīmu. Rezultāti: — testēšanas nominālās koncentrācijas, izmērītās testēšanas koncentrācijas un visu analīžu rezultāti, lai noteiktu testējamās vielas koncentrāciju testēšanas traukā, — ūdens kvalitāte testēšanas traukos, t. i., pH, temperatūra, izšķīdušais skābeklis, cietība un amonjaks, — iztvaikojušā testēšanas ūdens aizvietošana, ja tā veikta, — izšķīlušos knišļu tēviņu un mātīšu skaits katrā traukā un katru dienu, — to kāpuru skaits katrā traukā, kas neizšķīlās par knišļiem, — kāpuru vidējais atsevišķais saussvars katrā traukā un katrā attīstības stadijā, ja vajadzīgs, — izšķilšanās īpatsvars katrā atkārtojumā un testēšanas koncentrācijā (knišļu tēviņu un mātīšu datus apvieno), — pilnībā izšķīlušos knišļu vidējais attīstības ātrums katrā atkārtojumā un apstrādes līmenī (knišļu tēviņu un mātīšu datus apvieno), — toksisko mērķparametru aplēses, piemēram, EC x (un saistītie ticamības intervāli), NOEC un/vai LOEC, kā arī to noteikšanai izmantotās statistiskās metodes, — rezultātu apspriešana, arī ietekme uz testēšanas rezultātiem, kuru rada atkāpes no šīs testēšanas metodes. LITERATŪRA (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Šā pielikuma C.8. nodaļa “Toksicitātes noteikšana sliekām”. (15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. (21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. 1. papildinājums DEFINĪCIJAS Šajā testēšanas metodē ir izmantoti šādi termini: Izstrādāti nosēdumi jeb rekonstituēti, mākslīgi vai sintētiski nosēdumi ir tādu materiālu maisījums, ko izmanto, lai imitētu dabīgu nosēdumu fizikālās sastāvdaļas. Ūdens virsējais slānis ir ūdens, ar ko nosegti nosēdumi testēšanas traukā. Starpūdens jeb porūdens ir ūdens, kas aizņem telpu starp nosēdumiem un augsnes daļiņām. Piesātināti nosēdumi ir nosēdumi, kam pievienota testējamā viela. Testējamā ķīmiskā viela ir jebkāda viela vai maisījums, ko testē, izmantojot šo testēšanas metodi. 2. papildinājums Ieteikumi attiecībā uz Chironomus riparius kultūru 1. Chironomus kāpurus var audzēt kristalizācijas traukos vai lielākās tvertnēs. Smalkas kvarca smiltis izklāj plānā, aptuveni 5–10 mm slānī tvertnes apakšā. Ir pierādīts arī, ka var kā piemērotu substrātu izmantot Kieselguhr (piemēram, Merck, 8117. pants) (pietiek ar plānāku slāni tikai dažu mm augstumā). Pēc tam pievieno piemērotu ūdeni, lai dziļums būtu vairāki centimetri. Ūdens līmenis ir jāpaaugstina pēc vajadzības, lai aizvietotu iztvaikoto daudzumu un novērstu izžūšanu. Ūdeni var apmainīt, ja vajadzīgs. Jānodrošina lēna aerācija. Kāpuru audzēšanas trauki jātur piemērotā būrī, kas nepieļaus izšķīlušos pieaugušo īpatņu izbēgšanu. Būrim jābūt pietiekami lielam, lai būtu iespējama izšķīlušos pieaugušo īpatņu spietošana, pretējā gadījumā nenotiks kopulācija (ne mazāks kā apm. 30 × 30 × 30 cm). 2. Būri jātur istabas temperatūrā vai nemainīgas vides telpā 20 ± 2 °C ar 16 stundu apgaismojuma periodu (intensitāte apm. 1 000 luksi) un 8 stundu tumsas periodu. Ir norādīts, ka gaisa mitrums zem 60 % RH var kavēt reprodukciju. Ūdens atšķaidīšanai 3. Var izmantot jebkuru piemērotu dabīgu vai sintētisku ūdeni. Bieži izmanto akas ūdeni, krāna ūdeni, no kura attīrīts hlors, un mākslīgas barotnes (piemēram, Elendt M4 vai M7 barotni, sk. turpmāk). Ūdenim pirms izmantošanas jānodrošina aerācija. Ja vajadzīgs, kultūras ūdeni var atjaunot, izmantoto ūdeni no kultivēšanas traukiem uzmanīgi nolejot vai sifonējot, nesadragājot kāpuru kūniņas. Kāpuru barošana 4. Chironomus kāpuri ir jābaro ar zivju barības pārslām (TetraMin®, TetraPhyll® vai citu līdzīga zīmola patentētu zivju barību), katrā traukā dienā ievietojot aptuveni 250 mg. Barību var dot kā sausu samaltu pulveri vai kā suspensiju ūdenī, proti, 1,0 g barības pārslu pievieno 20 ml destilēta ūdens un samaisa, līdz iegūst homogēnu maisījumu. Šo sagatavi var izbarot aptuveni 5 ml apmērā katrā traukā katru dienu (pirms lietošanas sakratīt). Vecāki kāpuri var saņemt vairāk barības. 5. Barošanu pielāgo atbilstīgi ūdens kvalitātei. Ja kultivēšanas barotne kļūst duļķaina, barošana ir jāsamazina. Barības papildinājumi ir rūpīgi jāuzrauga. Pārāk maz barības izraisīs kāpuru emigrāciju vertikālā ūdens slāņa virzienā, savukārt pārāk daudz barības izraisīs mikrobu aktivitātes pieaugumu un samazinās skābekļa koncentrācijas. Abas situācijas var novest pie mazākiem augšanas ātrumiem. 6. Izveidojot jaunus kultivēšanas traukus, var pievienot dažas zaļaļģu (piemēram, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) šūnas. Izšķīlušos pieaugušo īpatņu barošana 7. Dažos testos ir iegūtas liecības, ka kokvilnas spilventiņš, kas piesūcināts ar piesātinātu saharozes šķīdumu, var nodrošināt barību izšķīlušiem pieaugušiem īpatņiem. Izšķilšanās 8. Divdesmit grādu ± 2 °C temperatūrā pieaugušie īpatņi sāks šķilties no kāpuru audzēšanas traukiem aptuveni pēc 13–15 dienām. Tēviņus ir viegli atšķirt pēc to spalvainās antenas. Oliņas 9. Tiklīdz vairošanas būrī ir pieaugušie īpatņi, visi kāpuru audzēšanas trauki ir jāpārbauda trīs reizes nedēļā, lai konstatētu izdētās želatīnveidīgās oliņas. Ja tās tiek atklātas, oliņas ir uzmanīgi jāizņem. Tās ir jāievieto nelielā šķīvī, kurā ir vairošanās ūdens paraugs. Oliņas izmanto, lai izveidotu jaunus kultivēšanas traukus (piemēram, 2–4 oliņu kopas katrā traukā), vai tās izmanto toksicitātes testēšanā. 10. Pirmās attīstības stadijas kāpuriem ir jāizšķiļas pēc 2–3 dienām. Jaunu kultivēšanas trauku izveide 11. Pēc tam, kad ir izveidotas kultūras, katru nedēļu vai retāk var izveidot jaunu kāpuru kultivēšanas trauku atkarībā no testēšanas prasībām un vecos traukus izņem no būriem pēc pieaugušo īpatņu izšķilšanās. Ar šādu sistēmu var nodrošināt regulāru pieaugušo īpatņu piegādi ar minimāliem pārvaldības pasākumiem. Testēšanas šķīdumu M4 un M7 sagatavošana 12. Elendt (1990. gads) ir aprakstījis M4 barotni. M7 barotni sagatavo tāpat kā M4 barotni, izņemot 1. tabulā norādītās vielas, kurām koncentrācijas M7 barotnē ir četras reizes mazākas nekā M4 barotnē. Pašlaik tiek gatavota publikācija par M7 barotni (Elendt, individuāls paziņojums). Testēšanas šķīdumu nevajadzētu sagatavot saskaņā ar Elendt un Bias (1990. gads), jo NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 un K2HPO4 koncentrācijas, kas norādītas rezerves šķīdumu sagatavošanai, ir nepiemērotas. M7 barotnes sagatavošana 13. Katru rezerves šķīdumu (I) sagatavo atsevišķi un apvienoto rezerves šķīdumu (II) pagatavo no šiem rezerves šķīdumiem (I) (sk. 1. tabulu). Piecdesmit mililitrus apvienotā rezerves šķīduma (II) un 2. tabulā norādītos daudzumus no katra makrobarības rezerves šķīduma iemaisa 1 litrā dejonizēta ūdens, lai sagatavotu M7 barotni. Vitamīnu rezerves šķīdumu sagatavo, pievienojot 3 vitamīnus dejonizētam ūdenim, kā norādīts 3. tabulā, un neilgi pirms izmantošanas galīgajai M7 barotnei pievieno 0,1 ml apvienotā vitamīnu rezerves šķīduma. (Vitamīnu rezerves šķīdumu glabā sasaldētu mazos alikvotos.) Barotnei nodrošina aerāciju un to stabilizē. LITERATŪRA BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. 1. tabula Barotnes M4 un M7 mikroelementu rezerves šķīdumi Rezerves šķīdumi (I) Daudzums (mg), ko pievieno 1 litram dejonizēta ūdens Lai sagatavotu apvienoto rezerves šķīdumu (II), samaisa turpmāk norādītos rezerves šķīdumu (I) tilpumus (ml) un pievieno 1 litram dejonizēta ūdens Galīgās koncentrācijas testa šķīdumos (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

2. tabula Makrobarības rezerves šķīdumi barotnei M4 un M7 Daudzums, ko pievieno 1 litram dejonizēta ūdens (mg) Makrobarības rezerves šķīdumu tilpums, ko pievieno, lai sagatavotu barotni M4 un M7 (ml/l) Galīgās koncentrācijas testa šķīdumos M4 un M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

3. tabula Vitamīnu rezerves šķīdums barotnei M4 un M7. Visus trīs vitamīnu šķīdumus apvieno, lai sagatavotu vienu vitamīnu rezerves šķīdumu Daudzums, ko pievieno 1 litram dejonizēta ūdens (mg) Vitamīnu rezerves šķīduma tilpums, ko pievieno, lai sagatavotu barotni M4 un M7 (ml/l) Galīgās koncentrācijas testa šķīdumos M4 un M7 (mg/l) Tiamīna hidrohlorīds 750 0,1 0,075 Ciānkobalamīns (B12) 10 0,1 0,0010 Biotīns 7,5 0,1 0,00075 LITERATŪRA Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. 3. papildinājums IZSTRĀDĀTU NOSĒDUMU SAGATAVOŠANA Nosēdumu sastāvs Izstrādāto nosēdumu sastāvam jābūt šādam: Sastāvdaļa Raksturlielumi % no nosēdumu saussvara Kūdra Sfagnu sūnu kūdra, kuras pH ir pēc iespējas tuvāk 5,5–6,0 vērtībai, bez redzamām augu atliekām, smalki samalta (daļiņu izmērs: ≤ 1 mm) un izžāvēta ar gaisu 4–5 Kvarca smiltis Smilšu graudu izmērs: > 50 % daļiņu jābūt 50–200 μm diapazonā 75–76 Kaolīna māli Kaolinīta saturs: ≥ 30 % 20 Organiskais ogleklis Koriģē, pievienojot kūdru un smiltis 2 (± 0,5) Kalcija karbonāts CaCO3, pulverizēts, ķīmiski tīrs 0,05–0,1 Ūdens Vadītspēja: ≤ 10 μS/cm 30–50 Sagatavošana Kūdru izžāvē gaisā un samaļ smalkā pulverī. Vajadzīgā daudzuma kūdras pulvera suspensiju dejonizētā ūdenī sagatavo, izmantojot efektīvu homogenizēšanas ierīci. Šīs suspensijas pH koriģē ar CaCO3 līdz 5,5 ± 0,5 vērtībai. Suspensiju kondicionē vismaz divas dienas, viegli maisot 20 ± 2 °C temperatūrā, lai stabilizētu pH un izveidotu stabilu mikrobu sastāvdaļu. Vēlreiz mēra pH, kam jābūt 6,0 ± 0,5. Pēc tam kūdras suspensiju samaisa ar citām sastāvdaļām (smiltīm un kaolīna māliem) un dejonizētu ūdeni, lai iegūtu homogēnus nosēdumus ar ūdens saturu 30–50 % diapazonā no nosēdumu sausā svara. Vēlreiz mēra galīgā maisījuma pH un to koriģē 6,5–7,5 vērtībā ar CaCO3, ja vajadzīgs. Ņem nosēdumu paraugus, lai noteiktu saussvaru un organiskā oglekļa saturu. Pēc tam, pirms izstrādātos nosēdumus izmanto hironomīdu toksicitātes testēšanā, ir ieteicams tos kondicionēt septiņas dienas tādos pašos apstākļos, kādi būs testā. Glabāšana Mākslīgo nosēdumu sausās sastāvdaļas var arī uzglabāt sausā un vēsā vietā istabas temperatūrā. Izstrādātos (mitros) nosēdumus nedrīkstētu uzglabāt pirms to izmantošanas testā. Tie ir jāizmanto tūlīt pēc septiņu dienu kondicionēšanas perioda, kas pabeidz to sagatavošanu. LITERATŪRA Šā pielikuma C.8. nodaļa “Toksicitātes noteikšana sliekām”. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. 4. papildinājums Atšķaidīšanai piemērota ūdens ķīmiskie raksturlielumi Viela Koncentrācijas Daļiņas < 20 mg/l Kopējais organiskais ogleklis < 2 mg/l Nejonizēts amonjaks < 1 μg/l Cietība kā CaCO3 < 400 mg/l (17) Atlikumu hlors < 10 μg/l Kopējie fosfororganiskie pesticīdi < 50 ng/l Hlororganisko pesticīdu un polihlorbifenīlu kopējais saturs < 50 ng/l Kopējais organiskais hlors < 25 ng/l 5. papildinājums Norādījumi par hironomīdu kāpuru šķilšanās uzraudzību Uz testēšanas vārglāzēm izvieto izšķilšanās slazdus. Šie slazdi ir nepieciešami, sākot no 20. dienas līdz testēšanas beigām. Turpmāk ir attēlots izmantotā slazda paraugs. A. Neilona aizsegs B. Apgāzts plastmasas trauks C. Bezlūpu ekspozīcijas vārglāze D. Ūdens apmaiņas aizsega lūkas E. Ūdens F. Nosēdumi C.28. TOKSICITĀTES TESTS AR NOSĒDUMU UN ŪDENS HIRONOMĪDIEM, IZMANTOJOT PIESĀTINĀTU ŪDENI IEVADS 1. Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (turpmāk – TG) 219 (2004. gads). Šī testēšanas metode ir izstrādāta ietekmes novērtēšanai, kuru izraisa ķīmisko vielu ilgstoša iedarbība uz nosēdumos dzīvojošiem saldūdens divspārņu kārtas kāpuriem Chironomus sp. Tās pamatā galvenokārt ir BBA norādījumi par nosēdumu un ūdens testēšanas sistēmas izmantošanu ar mākslīgu augsni un ūdens staba ekspozīcijas scenārijs (1). Tāpat ir ņemti vērā esošie toksicitātes testēšanas protokoli attiecībā uz Chironomus riparius un Chironomus tentans, kas ir izstrādāti Eiropā un Ziemeļamerikā (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) un kam veikta salīdzinošā izpēte (1) (6) (9). Var izmantot arī citas hironomīdu sugas, piemēram, Chironomus yoshimatsui, par ko pieejami detalizēti apraksti (10) (11). 2. Šajā testēšanas metodē izmantotais ekspozīcijas scenārijs paredz ūdens piesātināšanu. Atbilstīgā ekspozīcijas scenārija izvēle ir atkarīga no paredzētā testēšanas lietojuma. Ūdens ekspozīcijas scenārija, kas ietver ūdens staba piesātināšanu, mērķis ir imitēt pesticīdu aerosolu pārvietošanās gadījumus, un šis scenārijs ietver sākuma maksimālās koncentrācijas porūdenī. Šis scenārijs var noderēt arī citiem ekspozīcijas veidiem (tostarp ķīmisko vielu noplūdēm), izņemot akumulācijas procesus, kas ilgst ilgāk nekā testēšanas periods. 3. Vielas, kas jātestē, lai noskaidrotu to iedarbību uz nosēdumos dzīvojošiem organismiem, parasti nosēdumos pastāv ilgstoši. Nosēdumos dzīvojošie organismi var tikt pakļauti iedarbībai dažādos veidos. Katra ekspozīcijas veida relatīvā nozīme un laiks, kas paiet, lai rastos vispārēja toksiska iedarbība, ir atkarīgs no attiecīgās ķīmiskās vielas fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām. Tādu vielu gadījumā, kam ir spēcīga adsorbēšanās spēja (piemēram, ar log Kow > 5) vai kas izveido homopolāru saiti ar nosēdumiem, būtisks ekspozīcijas veids var būt piesārņotas barības uzņemšana. Lai nodrošinātu, ka izteikti lipofīlu vielu toksicitāte tiek novērtēta pietiekami precīzi, var apsvērt nosēdumiem pievienotās barības izmantošanu pirms testējamās ķīmiskās vielas pievienošanas. Lai ņemtu vērā visus iespējamos ekspozīcijas veidus, šī testēšanas metode koncentrējas uz ilgtermiņa ekspozīciju. Tests ilgst 20–28 dienas C. riparius un C. yoshimatsui sugām un 28–65 dienas C. tentans sugai. Ja īpašiem nolūkiem ir vajadzīgi īstermiņa dati, piemēram, lai izpētītu nestabilu ķīmisko vielu ietekmi, pēc 10 dienām var pārtraukt papildu atkārtojumus. 4. Mērītie mērķparametri ir izšķīlušos pieaugušo īpatņu kopējais skaits un izšķilšanās laiks. Ir ieteicams kāpuru izdzīvošanas un augšanas mērījumus veikt tikai pēc 10 dienām, ja ir vajadzīgi papildu īstermiņa dati, pēc vajadzības izmantojot papildu atkārtojumus. 5. Ieteicams izmantot izstrādātus nosēdumus. Izstrādātiem nosēdumiem ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar dabīgiem nosēdumiem: — tiek samazināta eksperimentālā mainība, jo šādi nosēdumi izveido atkārtojamu “standartizētu matricu” un nav nepieciešams atrast nepiesārņotus un tīrus nosēdumu avotus, — testēšanu var sākt jebkurā laikā, nesaskaroties ar sezonālu mainību testēšanas nosēdumos, un nav nepieciešams nosēdumus iepriekš apstrādāt, lai tos attīrītu no vietējās faunas, turklāt izstrādātu nosēdumu izmantošana samazina izmaksas, kas saistītas ar pietiekamu nosēdumu daudzumu savākšanu dabā regulāras testēšanas vajadzībām, — izstrādātu nosēdumu izmantošana ļauj salīdzināt toksicitāti un attiecīgi klasificēt vielas; toksicitātes dati, ko ieguva testēšanā ar dabīgiem un mākslīgiem nosēdumiem, bija salīdzināmi vairākām ķīmiskajām vielām (2). 6. Definīcijas dotas 1. papildinājumā. TESTĒŠANAS PRINCIPS 7. Vispirms hironomīdu kāpurus jebkurā attīstības stadijā pakļauj testējamās vielas koncentrāciju diapazona iedarbībai nosēdumu un ūdens sistēmās. Testēšanas sākumā pirmās attīstības stadijas kāpurus ievieto testēšanas vārglāzēs, kurās ir nosēdumu un ūdens sistēma, un pēc tam ūdeni piesātina ar testējamo vielu. Hironomīdu izšķilšanos un attīstības ātrumu mēra testēšanas beigās. Kāpuru izdzīvošanu un svaru var noteikt jau pēc 10 dienām, ja vajadzīgs (izmantojot papildu atkārtojumus pēc vajadzības). Šos datus analizē, vai nu izmantojot regresijas modeli, lai aplēstu koncentrāciju, kas izraisītu × % samazinājumu attiecībā uz izšķilšanos, kāpuru izdzīvošanu vai augšanu (piemēram, EC 15, EC 50 utt.), vai izmantojot statistiskās hipotēzes testēšanu, lai noteiktu NOEC/LOEC. Statistiskās hipotēzes testēšanā ir nepieciešams salīdzināt ietekmes vērtības ar kontroles vērtībām, izmantojot statistiskus testus. INFORMĀCIJA PAR TESTĒJAMO VIELU 8. Ir jābūt zināmai testējamās ķīmiskās vielas šķīdībai ūdenī, tās tvaika spiedienam, izmērītajai vai aprēķinātajai daļai nosēdumos un stabilitātei ūdenī un nosēdumos. Jābūt pieejamai uzticamai analītiskajai metodei, ar ko būtu iespējams kvantificēt testējamo ķīmisko vielu ūdens virsējā slānī, porūdenī un nosēdumos ar zināmu un apstiprinātu precizitāti un noteikšanas ierobežojumu. Lietderīga informācija ietver testējamās ķīmiskās vielas struktūrformulu un tīrību. Tāpat lietderīgi ir zināt testējamās vielas ķīmisko sadalīšanos (piemēram, izkliedēšanās, abiotiskā un biotiskā noārdīšanās utt.). Papildu norādījumi par tādu vielu testēšanu, kuras ir sarežģīti testēt to fizikālo un ķīmisko īpašību dēļ, pieejami atsaucē (12). ĶĪMISKĀS STANDARTVIELAS 9. Periodiski var testēt ķīmiskās standartvielas, lai pārliecinātos, ka testēšanas protokols un apstākļi ir uzticami. Toksisko standartvielu, kas sekmīgi izmantotas salīdzinošajā testēšanā un validēšanas pētījumos, piemēri ietver lindānu, trifluralīnu, pentahlorfenolu, kadmija hlorīdu un kālija hlorīdu (1) (2) (5) (6) (13). TESTA DERĪGUMS 10. Lai tests būtu derīgs, piemēro šādus nosacījumus: — izšķilšanās apmēram kontroles traukos jābūt vismaz 70 % testēšanas beigās (1) (6), — C. riparius un C. yoshimatsui izšķilšanās līdz pieaugušiem īpatņiem no kontroles traukiem jānotiek 12–23 dienu laikā pēc to ievietošanas traukos; C. tentans ir vajadzīgas 20–65 dienas, — testēšanas beigās katrā traukā jānosaka pH un izšķīdušā skābekļa koncentrācija; skābekļa koncentrācijai jābūt vismaz 60 % no gaisa piesātinājuma vērtības (turpmāk – ASV) izmantotajā temperatūrā, savukārt pH ūdens virsējā slānī jābūt 6–9 diapazonā visos testēšanas traukos, — ūdens temperatūra nedrīkstētu atšķirties vairāk kā par ± 1,0 °C; ūdens temperatūru varētu kontrolēt ar izotermisku telpu, un tādā gadījumā temperatūra telpā ir jāapstiprina atbilstīgos laika intervālos. METODES APRAKSTS Testēšanas trauki 11. Pētījumu veic 600 ml stikla vārglāzēs ar 8 cm diametru. Der arī citi trauki, bet tiem jānodrošina piemērots ūdens virsējā slāņa un nosēdumu dziļums. Nosēdumu virsmai jābūt pietiekamai, lai nodrošinātu 2–3 cm2 telpu katram kāpuram. Nosēdumu slāņa dziļuma attiecībai pret ūdens virsējā slāņa dziļumu jābūt 1:4. Testēšanas traukiem un citām iekārtām, kas saskarsies ar testēšanas sistēmu, jābūt pilnībā izgatavotām no stikla vai cita ķīmiski inerta materiāla (piemēram, teflona). Sugu izvēle 12. Testēšanā vēlams izmantot Chironomus riparius sugas. Arī Chironomus tentans ir piemēroti, bet grūtāk apstrādājami, un tiem vajadzīgs ilgāks testēšanas periods. Var izmantot arī Chironomus yohimatsui. Sīka informācija par kultūru metodēm attiecībā uz Chironomus riparius ir sniegta 2. papildinājumā. Informācija par kultūras apstākļiem ir pieejama arī attiecībā uz citām sugām, t. i., Chironomus tentans (4) un Chironomus yoshimatsui (11). Sugu noteikšana ir jāapstiprina pirms testēšanas, bet nav vajadzīga pirms katras testēšanas reizes, ja organismi ir iegūti no laboratorijā kultivētas kultūras. Nosēdumi 13. Vēlams izmantot izstrādātus nosēdumus (saukti arī par rekonstituētajiem, mākslīgajiem vai sintētiskajiem nosēdumiem). Tomēr, ja izmanto dabīgos nosēdumus, tie ir jāraksturo (vismaz pH, organiskā oglekļa sastāvs, ieteicama arī tādu citu parametru noteikšana kā C/N attiecība un granulometrija) un tajos nedrīkstētu būt nekāds piesārņojums un citi organismi, kas varētu konkurēt ar hironomīdiem vai baroties ar tiem. Ieteicams arī pirms izmantošanas hironomīdu toksicitātes testēšanā dabīgos nosēdumus kondicionēt septiņas dienas tādos pašos apstākļos, kādi pastāvēs testēšanā. Šajā testā (1) (15) (16) ir ieteicams izmantot šādus izstrādātus nosēdumus, par pamatu izmantojot mākslīgu augsni, ko izmanto C.8. testēšanas metodē (14): a) 4–5 % (saussvars) kūdras – pēc iespējas pietuvināta pH 5,5–6,0 apmērā; ir svarīgi izmantot pulverizētu kūdru, kas smalki samalta (daļiņu izmērs ≤ 1 mm) un kas ir izžāvēta vienīgi ar gaisu; b) 20 % (saussvars) kaolīna mālu (kaolinīta saturam vēlams būt virs 30 %); c) 75–76 % (saussvars) kvarca smilšu (pārsvarā tām jāsastāv no smalkām smiltīm, proti, vairāk nekā 50 % daļiņu jābūt 50–200 μm izmērā); d) pievieno dejonizētu ūdeni, lai iegūtu galīgā maisījuma mitrumu 30–50 % diapazonā; e) pievieno ķīmiski tīras kvalitātes kalcija karbonātu (CaCO3), lai koriģētu galīgā nosēdumu maisījuma pH 7,0 ± 0,5 apmērā; f) galīgā maisījuma organiskā oglekļa saturam jābūt 2 % (± 0,5), un tas jākoriģē, izmantojot atbilstīgus daudzumus kūdras un smilšu saskaņā ar a) un c) apakšpunktu. 14. Jābūt zināmam kūdras, kaolīna mālu un smilšu avotam. Nosēdumu sastāvdaļas ir jāpārbauda, lai pārliecinātos, ka tajās nav ķīmiska piesārņojuma (piemēram, smago metālu, hlororganisko savienojumu, fosfororganisko savienojumu utt.). Izstrādātu nosēdumu sagatavošanas piemērs ir aprakstīts 3. papildinājumā. Ir pieņemami samaisīt arī sausas sastāvdaļas, ja tiek pierādīts, ka pēc ūdens virsējā slāņa pievienošanas nenotiek nosēdumu sastāvdaļu atdalīšanās (piemēram, kūdras daļiņu peldēšana pa ūdens virsmu) un ka kūdra vai nosēdumi ir pietiekami kondicionēti. Ūdens 15. Jebkurš ūdens, kas atbilst 2. un 4. papildinājumā noteiktajiem pieņemama atšķaidīšanas ūdens ķīmiskajiem raksturlielumiem, ir piemērots kā testēšanas ūdens. Jebkāds piemērots ūdens, proti, dabīgs ūdens (virszemes vai gruntsūdens), rekonstituēts ūdens (sk. 2. papildinājumu) vai krāna ūdens, no kura attīrīts hlors, ir izmantojams kā kultūras turēšanas un testēšanas ūdens, ja hironomīdi tajā bez stresa pazīmēm izdzīvo kultivēšanas un testēšanas laikā. Testēšanas sākumā testēšanas ūdens pH jābūt 6–9 diapazonā, savukārt kopējā cietība nedrīkst pārsniegt 400 mg/l kā CaCO3. Tomēr, ja tiek prognozēta mijiedarbība starp cietības joniem un testējamo vielu, jāizmanto zemākas cietības ūdens (tādēļ šādā situācijā nedrīkst izmantot Elendt barotni M4). Visa pētījuma laikā jāizmanto viena veida ūdens. Ūdens kvalitātes raksturlielumi, kas uzskaitīti 4. papildinājumā, jānosaka vismaz divreiz gadā vai tad, kad ir aizdomas, ka šie raksturlielumi varētu būt būtiski izmainījušies. Rezerves šķīdumi – piesātināts ūdens 16. Testēšanas koncentrācijas aprēķina, pamatojoties uz koncentrācijām ūdens stabā, t. i., ūdens virsējā slānī virs nosēdumiem. Izraudzīto koncentrāciju testēšanas šķīdumus parasti gatavo, atšķaidot rezerves šķīdumu. Rezerves šķīdumus vēlams pagatavot, izšķīdinot testējamo vielu testēšanas barotnē. Lai iegūtu piemērotas koncentrācijas rezerves šķīdumu, dažos gadījumos var nākties izmantot šķīdinātājus vai dispersantus. Piemērotu šķīdinātāju piemēri ir acetons, etilspirts, metilspirts, etilēnglikola monoetilēteris, etilēnglikola dimetilēteris, dimetilformamīds un trietilēnglikols. Dispersanti, ko var izmantot, ir Cremophor RH40, Tween 80, metilceluloze 0,01 % un HCO-40. Šķīdinātājas vielas koncentrācijai galīgajā testēšanas barotnē jābūt minimālai (t. i., ≤ 0,1 ml/l) un vienādai visās apstrādēs. Ja tiek izmantota šķīdinātāja viela, tai nedrīkst būt ievērojama ietekme uz izdzīvošanu vai redzama negatīva ietekme uz hironomīdu kāpuriem, ko var atklāt, pateicoties kontroles traukiem, kuri saņem tikai šķīdumu. Jebkurā gadījumā ir jācenšas izvairīties no šādu materiālu izmantošanas. TESTĒŠANAS PLĀNS 17. Testēšanas plāns attiecas uz testēšanas koncentrāciju skaita un intervālu izvēli, trauku skaitu katram koncentrācijas līmenim un kāpuru skaitu traukā. Ir aprakstīti plāni ietekmes koncentrāciju (turpmāk – EC) punktu noteikšanai, NOEC noteikšanai un pieļaujamā daudzuma testa veikšanai. Regresijas analīze ir ieteicamāka nekā hipotēzes testēšanas pieeja. Regresijas analīzes plāns 18. Testēšanā izmantotajām koncentrācijām ir jāaptver ietekmes koncentrācija (piemēram, EC 15, EC 50) un koncentrāciju diapazons, kurā ir jānoskaidro testējamās vielas ietekme. Tas, ka ietekmes koncentrācija ir testēšanā izmantoto koncentrāciju diapazonā, parasti uzlabo ietekmes koncentrāciju (EC x) noteikšanas precizitāti un it sevišķi derīgumu. Jāizvairās no ekstrapolācijas krietni zem zemākās pozitīvās koncentrācijas vai virs augstākās koncentrācijas. Ir lietderīgi veikt orientējošu diapazona noteikšanas testēšanu, lai izvēlētos izmantojamo koncentrāciju diapazonu (sk. 27. punktu). 19. Ja ir jānosaka EC x, jātestē vismaz piecas koncentrācijas un trīs atkārtojumi katrai koncentrācijai. Jebkurā gadījumā ieteicams izmantot pietiekamu daudzumu testēšanas koncentrāciju, lai nodrošinātu modeli pamatotām aplēsēm. Koeficients starp koncentrācijām nedrīkstētu pārsniegt 2 (izņēmums varētu būt gadījumi, kad devu un atbildes reakcijas līknei ir sekls slīpums). Katras apstrādes atkārtojumu skaitu var samazināt, ja palielina testēšanas koncentrāciju skaitu ar dažādām atbildes reakcijām. Atkārtojumu skaita palielināšana vai testēšanas koncentrāciju intervālu samazināšana parasti noved pie šaurākiem testēšanas ticamības intervāliem. Ir vajadzīgi papildu atkārtojumi, ja kāpuru izdzīvošanu un augšanu nosaka jau pēc 10 dienām. NOEC/LOEC noteikšanas plāns 20. Ja ir jānosaka LOEC/NOEC, jāizmanto piecas testēšanas koncentrācijas ar vismaz četriem atkārtojumiem un koeficients starp koncentrācijām nedrīkstētu pārsniegt 2. Atkārtojumu skaitam jābūt pietiekamam, lai nodrošinātu pietiekamu statistisko nozīmību un varētu konstatēt 20 % atšķirību no kontroles traukiem pie 5 % nozīmības līmeņa (p = 0,05). Attiecībā uz attīstības ātrumu parasti ir piemēroti veikt dispersijas analīzi (turpmāk – ANOVA), piemēram, Dunnett testu vai Williams testu (17) (18) (19) (20). Attiecībā uz izšķilšanās koeficientu var izmantot Cochran-Armitage, Fisher pieeju (ar Bonferroni korekciju) vai Mantel- Haenszel testu. Pieļaujamā daudzuma testēšana 21. Pieļaujamā daudzuma testēšanu (viena testēšanas koncentrācija un kontroles trauks) var veikt, ja orientējošā diapazona noteikšanas testā netika konstatēta ietekme. Pieļaujamā daudzuma testēšanas mērķis ir norādīt, ka testējamās vielas toksiskā vērtība ir lielāka par testēto robežkoncentrāciju. Šajā testēšanas metodē nav iespējams ierosināt ieteikto koncentrāciju, lēmums par to ir jāpieņem regulatoriem. Parasti ir vajadzīgi vismaz seši atkārtojumi gan apstrādei, gan kontrolei. Ir jāpanāk pietiekama statistiskā nozīmība, lai varētu noteikt 20 % atšķirību no kontroles trauka pie 5 % nozīmības līmeņa (p = 0,05). Ar metrisku atbildes reakciju (attīstības ātrums un svars) t-testēšana parasti ir piemērota statistiskā metode, ja dati atbilst šā testa prasībām (normalitāte, homogēnas dispersijas). Var izmantot nevienlīdzīgas dispersijas t-testēšanu vai ar parametriem nesaistītu testu, piemēram, Wilcoxon-Mann-Whithey testu, ja nav atbilstības iepriekš norādītajām prasībām. Attiecībā uz izšķilšanās koeficientu ir piemērota Fisher pieeja. PROCEDŪRA Ekspozīcijas apstākļi Piesātinātās ūdens un nosēdumu sistēmas sagatavošana 22. Atbilstīgus daudzumus izstrādātu nosēdumu (sk. 3. papildinājuma 13. un 14. punktu) pievieno testēšanas traukā, lai izveidotu vismaz 1,5 cm dziļu slāni. Ūdeni pielej 6 cm biezā slānī (sk. 15. punktu). Nosēdumu slāņa dziļuma attiecība pret ūdens slāņa dziļumu nedrīkstētu pārsniegt 1:4, un nosēdumu slānis nedrīkstētu būt dziļāks par 3 cm. Nosēdumu un ūdens sistēmai jānodrošina lēna aerācija septiņas dienas, pirms tiek ielaisti testēšanas organismi (sk. 14. punktu un 3. papildinājumu). Lai izvairītos no nosēdumu sastāvdaļu atdalīšanās un mazu daļiņu atkārtotas suspensijas ūdens stabā testēšanas ūdens pievienošanas laikā, nosēdumus var pārklāt ar plastmasas ripu ūdens uzliešanas laikā, bet pēc tam ripu nekavējoties noņem. Šim nolūkam der arī citas ierīces. 23. Testēšanas trauki ir jāapsedz (piemēram, ar stikla plāksnēm). Ja vajadzīgs, pētījuma laikā ūdens līmeņus papildina līdz sākotnējam tilpumam, lai kompensētu ūdens iztvaikošanu. Tam jāizmanto destilēts vai dejonizēts ūdens, lai novērstu sāļu uzkrāšanos. Testēšanas organismu pievienošana 24. Četras līdz piecas dienas pirms testēšanas organismu pievienošanas testēšanas traukos no kultūrām jāizņem oliņas un tās jāievieto nelielos traukos ar audzēšanas barotni. Var izmantot noturētu barotni no rezerves kultūras vai svaigi sagatavotu barotni. Ja izmanto svaigi sagatavotu barotni, kultūras barotnei jāpievieno neliels daudzums barības, piemēram, zaļaļģes un/vai daži pilieni filtrāta no smalki samaltas zivju barības pārslu suspensijas (sk. 2. papildinājumu). Jāizmanto tikai svaigi izdētas oliņas. Parasti kāpuri sāk šķilties dažas dienas pēc oliņu izdēšanas (2–3 dienas Chironomus riparius 20 °C un 3–4 dienas Chironomus tentans 23 °C un Chironomus yoshimatui 25 °C), un kāpuru augšana notiek četrās attīstības stadijās, no kurām katra ilgst 4–8 dienas. Testēšanā jāizmanto pirmās attīstības stadijas kāpuri (2–3 vai 1–4 dienas pēc izšķilšanās). Knišļu attīstības stadiju var pārbaudīt, izmantojot galvas kapsulas platumu (6). 25. Katrā testēšanas traukā ar piesātinātiem nosēdumiem un ūdeni pēc nejaušības principa ievieto 20 pirmās attīstības stadijas kāpurus, izmantojot neasu pipeti. Kāpuru ievietošanas laikā testēšanas traukos ir jāpārtrauc ūdens aerācija, un šis pārtraukums jāturpina vēl 24 stundas pēc kāpuru ielaišanas (sk. 24. un 32. punktu). Saskaņā ar izmantoto testēšanas plānu (sk. 19. un 20. punktu) izmantoto kāpuru skaits uz katru koncentrāciju ir vismaz 60, lai noteiktu EC punktus, un 80, lai noteiktu NOEC. 26. Kad ir pagājušas 24 stundas kopš kāpuru ielaišanas, ūdens virsējo slāni piesātina ar testējamo vielu un atsāk lēnu aerāciju. Nelielus testējamās vielas šķīdumu tilpumus pievieno zem ūdens virsmas, izmantojot pipeti. Pēc tam ūdens virsējais slānis ir uzmanīgi jāsamaisa, neizkustinot nosēdumus. Testēšanas koncentrācijas 27. Diapazona noteikšanas tests varētu būt lietderīgs, lai noteiktu koncentrāciju diapazonu galīgajam testam. Šim nolūkam izmanto virkni atšķirīgu testējamās vielas koncentrāciju. Lai hironomīdiem nodrošinātu tādu pašu virsmas blīvumu, kādu izmantos galīgajā testēšanā, hironomīdus pakļauj katras testējamās vielas koncentrācijas iedarbībai uz tādu laiku, kas ļauj aplēst aptuvenās testēšanas koncentrācijas. Atkārtojumi nav vajadzīgi. 28. Lēmumu par testēšanas koncentrācijām galīgajam testam pieņem, pamatojoties uz diapazona noteikšanas testa rezultātiem. Jāizmanto un saskaņā ar 18.–20. punktu jāizvēlas vismaz piecas koncentrācijas. Kontroles trauki 29. Testēšanā ir jāietver kontroles trauki, kuros nav testējamās vielas, bet ir nosēdumi un kuriem nodrošina atbilstīgu skaitu atkārtojumu (sk. 19. un 20. punktu). Ja testējamās vielas pievienošanai ir izmantots šķīdums (sk. 16. punktu), jāizmanto arī nosēdumu šķīduma kontroles trauks. Testēšanas sistēma 30. Izmanto statiskas sistēmas. Izņēmuma gadījumos, piemēram, ja ūdens kvalitātes specifikācijas nav piemērotas testēšanas organismam vai ietekmē ķīmisko līdzsvaru (piemēram, izšķīdušā skābekļa līmeņi pārmērīgi pazeminās, izvadproduktu koncentrācija pārmēru paaugstinās vai no nosēdumiem ekstrahējas minerāli un ietekmē pH un/vai ūdens cietību), var izmantot daļēji statiskas vai caurplūdes sistēmas ar ūdens virsējā slāņa periodisku vai nepārtrauktu atjaunošanu. Tomēr parasti derēs un ir ieteicamas citas ūdens virsējā slāņa kvalitātes uzlabošanas metodes, piemēram, aerācija. Barība 31. Kāpuri ir jābaro, vēlams, katru dienu vai vismaz trīs reizes nedēļā. Katram jaunam kāpuram pirmās 10 dienas pietiek ar zivju barību (suspensija ūdenī vai smalki samalta barība, piemēram, TetraMin vai TetraPhyll, sk. 2. papildinājumu) 0,25–0,5 mg apmērā (0,35–0,5 mg C. yoshimatui). Nedaudz vairāk barības varētu vajadzēt vecākiem kāpuriem, proti, 0,5–1 mg uz kāpuru dienā, ar ko vajadzētu pietikt līdz testēšanas beigām. Ja tiek novērota sēnīšu augšana vai ja kontroles traukos ir novērota mirstība, barības porcija ir jāsamazina visos traukos un jākontrolē. Ja sēnīšu attīstību neizdodas apturēt, testēšana ir jāatkārto. Ja tiek testētas vielas, kam ir spēcīga adsorbēšanās spēja (piemēram, ar log Kow > 5) vai kas izveido homopolāru saiti ar nosēdumiem, barības daudzumu, kurš vajadzīgs organismu izdzīvošanas un dabīgas augšanas nodrošināšanai, var pievienot izstrādātajiem nosēdumiem pirms stabilizācijas perioda. Šādam nolūkam jāizmanto augu materiāls, nevis zivju barība, proti, var pievienot 0,5 % (saussvars) smalki samaltas lapas, piemēram, nātres (Urtica dioica), zīdkoka (Morus alba), baltā āboliņa (Trifolium repens) vai spinātu (Spinacia oleracea) lapas, vai citu augu materiālu (Cerophyl vai alfa-celulozi). Inkubācijas apstākļi 32. Kad ir pagājušas, vēlams, 24 stundas pēc kāpuru ielaišanas, testēšanas traukos ūdens virsējam slānim nodrošina lēnu aerāciju, ko turpina visa testēšanas laikā (jāuzmanās, lai izšķīdušā skābekļa koncentrācija nepazeminās zem 60 % no ASV). Aerāciju nodrošina caur stikla Pastēra pipeti, kas piestiprināta 2–3 cm virs nosēdumu slāņa (t. i., vienu vai dažus burbuļus sekundē). Testējot gaistošas ķīmiskās vielas, var apsvērt iespēju nosēdumu un ūdens sistēmai aerāciju nenodrošināt. 33. Testēšanu veic nemainīgā 20 °C (± 2 °C) temperatūrā. C. tentans un C. yoshimatui ieteicamā temperatūra ir attiecīgi 23 °C un 25 °C (± 2 °C). Piemēro 16 stundu apgaismojuma ilgumu, un gaismas intensitātei jābūt 500–1 000 luksiem. Ekspozīcijas ilgums 34. Ekspozīcija sākas brīdī, kad kāpuri tiek ielaisti piesātinātajos un kontroles traukos. Maksimālais ekspozīcijas ilgums ir 28 dienas C. riparius un C. yoshimatsui un 65 dienas C. tentans. Ja knišļi izšķiļas ātrāk, testēšanu var pārtraukt ne mazāk kā pēc piecām dienām pēc pēdējā pieaugušā īpatņa izšķilšanās kontroles traukā. NOVĒROJUMI Izšķilšanās 35. Nosaka pilnībā izšķīlušos knišļu tēviņu un mātīšu attīstības laiku un kopējo skaitu. Tēviņus ir viegli atšķirt pēc to spalvainās antenas. 36. Testēšanas trauki ir jānovēro vismaz trīs reizes nedēļā, lai vizuāli novērtētu jebkādas anomālijas (piemēram, nosēdumu pamešana, neparasta peldēšana) salīdzinājumā ar kontroles traukiem. Paredzamās izšķilšanās periodā katru dienu jāskaita izšķīlušies knišļi. Katru dienu reģistrē pilnībā izšķīlušos knišļu dzimumu un skaitu. Pēc identificēšanas knišļus izņem no traukiem. Oliņas, kas izdētas pirms testa pabeigšanas, ir jāreģistrē un jāizņem, lai novērstu kāpuru atjaunošanos nosēdumos. Jāreģistrē arī redzamo kūniņu skaits, kuras nav izšķīlušās. Norādījumi par izšķilšanās mērīšanu ir sniegti 5. papildinājumā. Augšana un izdzīvošana 37. Ja ir jāsniedz dati par kāpuru izdzīvošanu un augšanu pēc 10 dienām, sākumā jāietver papildu testēšanas trauki, lai tos varētu izmantot šim nolūkam. Šo papildu trauku nosēdumus izkāš, izmantojot 250 μm sietu, lai saglabātu kāpurus. Nāves kritēriji ir nekustīgums vai atbildes reakcijas trūkums uz mehānisku kairinājumu. Neatgūtie kāpuri arī jāuzskata par mirušiem (kāpurus, kas nomiruši testēšanas sākumā, iespējams, ir noārdījuši mikrobi). Nosaka izdzīvojušo kāpuru sauso svaru (bez pelniem) katrā testēšanas traukā un aprēķina vidējo atsevišķo saussvaru katrā traukā. Ir lietderīgi noteikt, kurai attīstības stadijai pieder izdzīvojušais kāpurs. Šim nolūkam var izmantot katra īpatņa galvas kapsulas platuma mērījumu. Analītiskie mērījumi Testējamās vielas koncentrācija 38. Testēšanas sākumā (vēlamāk tad, kad ir pagājusi viena stunda pēc testējamās vielas pievienošanas) un beigās analizē vismaz ūdens virsējā slāņa, porūdens un nosēdumu paraugus no augstākās un zemākās koncentrācijas. Šāda testējamās vielas koncentrācijas noteikšana sniedz informāciju par testējamās vielas attīstību/sadalīšanos ūdens un nosēdumu sistēmā. Nosēdumu paraugu ņemšana testēšanas sākumā var ietekmēt testēšanas sistēmu (piemēram, var tikt izņemti testēšanas kāpuri), tādējādi analītisku mērījumu vajadzībām testēšanas sākumā un laikā jāizmanto papildu testēšanas trauki, ja tas ir atbilstīgi (sk. 39. punktu). Mērījumi nosēdumos var nebūt nepieciešami, ja testējamās vielas sadalīšanās starp ūdeni un nosēdumiem ir skaidri noteikta ūdens/nosēdumu pētījumā salīdzināmos apstākļos (piemēram, nosēdumu un ūdens attiecība, pievienošanas veids, organiskā oglekļa saturs nosēdumos). 39. Ja veic starpposma mērījumus (piemēram, septītajā dienā) un ja analīzei ir vajadzīgi lieli paraugi, ko nevar paņemt no testēšanas traukiem, neietekmējot testēšanas sistēmu, jāveic analītiska noteikšana no paraugiem, kuri ņemti no papildu testēšanas traukiem, kas saņēmuši tādu pašu apstrādi (ietverot testēšanas organismus), bet netiek izmantoti bioloģiskajiem novērojumiem. 40. Lai izolētu starpūdeni, ieteicama centrifugēšana, piemēram, 10 000 g 4 °C temperatūrā 30 minūtes. Tomēr, ja tiek pierādīts, ka testējamā viela neadsorbējas uz filtriem, var būt pieņemami izmantot arī filtrēšanu. Dažos gadījumos var būt neiespējami analizēt koncentrācijas porūdenī, jo parauga izmērs ir pārāk mazs. Fizikālie un ķīmiskie parametri 41. Atbilstīgi ir jānosaka testēšanas ūdens pH un izšķīdušais skābeklis un testēšanas trauku temperatūra (sk. 10. punktu). Testēšanas sākumā un beigās jānosaka arī cietība un amonjaks kontroles traukos un vienā testēšanas traukā ar augstāko koncentrāciju. DATI UN PĀRSKATU SAGATAVOŠANA Rezultātu apstrāde 42. Šā testa mērķis ir noteikt testējamās vielas ietekmi uz attīstības ātrumu un pilnībā izšķīlušos knišļu tēviņu un mātīšu kopējo skaitu vai – 10 dienu testēšanas gadījumā – ietekmi uz kāpuru izdzīvošanu un svaru. Ja nav nekādu norāžu par statistiski atšķirīgu jutību atkarībā no dzimuma, tēviņu un mātīšu rezultātus var apvienot, lai veiktu statistisko analīzi. Jutības atšķirības starp dzimumiem var statistiski novērtēt, piemēram, ar χ2 – r × 2 testu. Ja vajadzīgs, pēc 10 dienām ir jānosaka kāpuru izdzīvošana un vidējais atsevišķais saussvars katrā traukā. 43. Ietekmes koncentrācijas, kas izteiktas kā koncentrācijas ūdens virsējā slānī, vēlams aprēķināt, pamatojoties uz izmērītajām koncentrācijām testēšanas sākumā (sk. 38. punktu). 44. Lai aprēķinātu punktu aplēsi EC 50 vai jebkurai citai EC x, kā patiesus atkārtojumus var izmantot statistiku par situāciju pirms ievietošanas traukos. Aprēķinot ticamības intervālu jebkurai EC x, jāņem vērā mainība starp traukiem vai ir jāpierāda, ka šī mainība ir tik maza, ka to var neņemt vērā. Ja modeli aprīko saskaņā ar mazāko kvadrātu metodi, statistika par situāciju pirms ievietošanas traukos ir jākoriģē, lai uzlabotu mainības homogenitāti. Tomēr EC x vērtības ir jāaprēķina pēc tam, kad atbildes reakcija ir atkoriģēta atpakaļ uz sākotnējo vērtību. 45. Ja statistiskās analīzes mērķis ir noteikt NOEC/LOEC ar hipotēzes testēšanu, jāņem vērā mainība starp traukiem, piemēram, ar ieligzdotu ANOVA. Var arī izmantot stabilākus testus (21) situācijās, kad ir pārkāpti parastie ANOVA pieņēmumi. Izšķilšanās koeficients 46. Izšķilšanās koeficienti ir kvantitatīvi dati, ko var analizēt ar Cochran-Armitage testu, kuru īsteno pakāpeniski, ja ir paredzama monotona devas un atbildes reakcijas attiecība un ja šie dati atbilst šādai prognozei. Ja minētais tests analīzei neder, var izmantot Fisher pieeju vai Mantel- Haenszel testu ar Bonferroni-Holm koriģētajām p-vērtībām. Ja pastāv liecības par lielāku mainību starp atkārtojumiem ar vienu un to pašu koncentrāciju, nekā to norādītu binomināls sadalījums (nereti uz to atsaucas kā uz “papildu binominālu” mainību), tad jāizmanto stabils Cochran-Armitage vai Fisher pieejas tests, kā ierosināts atsaucē (21). 47. Nosaka katrā traukā izšķīlušos knišļu summu (ne), ko dala ar ielaisto kāpuru skaitu (na): kur: ER = izšķilšanās koeficients; ne = katrā traukā izšķīlušos knišļu skaits; na = katrā traukā ielaisto kāpuru skaits. 48. Lieliem paraugu apjomiem piemērota alternatīva, ja pastāv papildu binomināla mainība, ir iespēja izšķilšanās koeficientu uzskatīt par nepārtrauktu atbildes reakciju un izmantot tādas procedūras kā William tests, ja ir paredzama monotona devas un atbildes reakcijas attiecība un ja tas atbilst šiem izšķilšanās koeficienta datiem. Dunnett tests būtu piemērots, ja monotonuma nav. Šajā kontekstā liels parauga apjoms tiek definēts kā gadījums, kad gan izšķīlušos īpatņu skaits, gan neizšķīlušos īpatņu skaits pārsniedz piecus katrā atkārtojumā (traukā). 49. Lai piemērotu ANOVA metodes, izšķilšanās koeficienta vērtības ir vispirms jāpārvērš ar arcsin kvadrātsaknes transformāciju vai ar Tukey-Freeman transformāciju, lai iegūtu aptuveno normālo sadalījumu un izlīdzinātu mainības. Izmantojot absolūto periodiskumu, var piemērot Cochran-Armitage, Fisher pieejas (Bonferroni) vai Mantel- Haenszel testu. Arcsin kvadrātsaknes transformāciju piemēro, ņemot izšķilšanās koeficienta kvadrātsaknes inverso sinusu (sin–1). 50. Izšķilšanās koeficientiem EC x vērtības aprēķina, izmantojot regresijas analīzi (vai, piemēram, probit (22), logit, Weibull, atbilstīgu tirdzniecībā pieejamu programmatūru utt.). Ja regresijas analīze ir nesekmīga (piemēram, tiek iegūtas mazāk nekā divas daļējas atbildes reakcijas), izmanto citas ar parametriem nesaistītas metodes, tādas kā slīdošā vidējā vai vienkāršā interpolācija. Attīstības ātrums 51. Vidējais attīstības laiks ir vidējais laikposms starp kāpuru ielaišanu (testa 0. diena) un testēšanas knišļu izšķilšanos. (Lai aprēķinātu patieso attīstības laiku, jāapsver kāpuru vecums ielaišanas brīdī.) Attīstības ātrums ir attīstības laika apgrieztā vērtība (vienība: 1/diena) un ir kāpuru vienas dienas attīstības daļa. Attīstības ātrums ir ieteicamāks, lai novērtētu šos nosēdumu toksicitātes pētījumus, jo tā mainība ir mazāka un tas ir homogēnāks un tuvāks normālam sadalījumam salīdzinājumā ar attīstības laiku. Tādējādi efektīvas parametru testēšanas procedūras var izmantot drīzāk ar attīstības ātrumu, nevis ar attīstības laiku. Attiecībā uz attīstības ātrumu kā nepārtrauktu atbildes reakciju EC x vērtības var aplēst, izmantojot regresijas analīzi (piemēram, (23) (24)). 52. Turpmākajiem statistiskajiem testiem pieņem, ka pārbaudes dienā x novēroto knišļu skaits ir izšķīlies vidējā laika intervālā starp dienu x un dienu x – l (l = pārbaudes intervāla ilgums, parasti 1 diena). Katra trauka vidējo attīstības ātrumu ( ) aprēķina šādi: kur: : vidējais attīstības ātrums katrā traukā; i : pārbaudes intervāla indekss; m : pārbaudes intervālu maksimālais skaits; : pārbaudes intervālā i izšķīlušos knišļu skaits; ne : kopējais knišļu skaits, kas izšķīlušies eksperimenta beigās (= ) xi : intervālā i izšķīlušos knišļu attīstības ātrums. kur: dayi : pārbaudes diena (dienas kopš ielaišanas); li : pārbaudes intervāla i ilgums (dienas, parasti viena diena). Testēšanas pārskats 53. Testēšanas pārskatā jāietver vismaz šāda informācija: Testējamā viela: — fizikālās īpašības un attiecīgā gadījumā fizikālās un ķīmiskās īpašības (šķīdība ūdenī, tvaika spiediens, sadalīšanās koeficients augsnē (vai nosēdumos, ja pieejams), stabilitāte ūdenī utt.), — ķīmiskās identifikācijas dati (vispārpieņemtais nosaukums, ķīmiskais nosaukums, struktūrformula, CAS numurs utt.), ietverot tīrību un analītisko metodi, ar ko ir iespējams kvantificēt testējamo vielu. Testēšanas sugas: — izmantotie testēšanas dzīvnieki: suga, zinātniskais nosaukums, organismu avots un pavairošanas apstākļi, — informācija par oliņu un kāpuru apstrādi, — testēšanas dzīvnieku vecums ielaišanas brīdī testēšanas traukos. Testēšanas apstākļi: — izmantotie nosēdumi, t. i., dabīgi vai izstrādāti nosēdumi, — dabīgajiem nosēdumiem – nosēdumu paraugu ņemšanas vietas atrašanās vieta un apraksts, ietverot, ja iespējams, piesārņojuma vēsturi; raksturlielumi – pH, organiskā oglekļa saturs, C/N attiecība un granulometrija (ja vajadzīgs), — izstrādāto nosēdumu sagatavošana: sastāvdaļas un raksturlielumi (organiskā oglekļa saturs, pH, mitrums utt. testēšanas sākumā), — testēšanas ūdens sagatavošana (ja izmanto rekonstituētu ūdeni) un raksturlielumi (skābekļa koncentrācija, pH, vadītspēja, cietība utt. testēšanas sākumā), — nosēdumu un ūdens virsējā slāņa dziļums, — ūdens virsējā slāņa un porūdens tilpums; mitru nosēdumu svars ar porūdeni un bez tā, — testēšanas trauki (materiāls un izmērs), — rezerves šķīdumu un testēšanas koncentrāciju sagatavošanas metode, — testējamās vielas pievienošana: izmantotās testēšanas koncentrācijas, atkārtojumu skaits un šķīdums, ja tas izmantots, — inkubācijas apstākļi: temperatūra, apgaismojuma cikls un intensitāte, aerācija (regularitāte un intensitāte), — sīka informācija par barošanu, arī par barības veidu, sagatavošanu, daudzumu un barošanas režīmu. Rezultāti: — testēšanas nominālās koncentrācijas, izmērītās testēšanas koncentrācijas un visu analīžu rezultāti, lai noteiktu testējamās vielas koncentrāciju testēšanas traukā, — ūdens kvalitāte testēšanas traukos, t. i., pH, temperatūra, izšķīdušais skābeklis, cietība un amonjaks, — iztvaikojušā testēšanas ūdens aizvietošana, ja tā veikta, — izšķīlušos knišļu tēviņu un mātīšu skaits katrā traukā un katru dienu, — to kāpuru skaits katrā traukā, kas neizšķīlās par knišļiem, — kāpuru vidējais atsevišķais saussvars katrā traukā un katrā attīstības stadijā, ja vajadzīgs, — izšķilšanās īpatsvars katrā atkārtojumā un testēšanas koncentrācijā (knišļu tēviņu un mātīšu datus apvieno), — pilnībā izšķīlušos knišļu vidējais attīstības ātrums katrā atkārtojumā un apstrādes līmenī (knišļu tēviņu un mātīšu datus apvieno), — toksisko mērķparametru aplēses, piemēram, EC x (un saistītie ticamības intervāli), NOEC un/vai LOEC, kā arī to noteikšanai izmantotās statistiskās metodes, — rezultātu apspriešana, arī ietekme uz testēšanas rezultātiem, kuru rada atkāpes no šīs testēšanas metodes. LITERATŪRA (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Šā pielikuma C.8. nodaļa “Toksicitātes noteikšana sliekām”. (15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. (21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. 1. papildinājums DEFINĪCIJAS Šajā metodē ir izmantoti šādi termini: Izstrādāti nosēdumi jeb rekonstituēti, mākslīgi vai sintētiski nosēdumi ir tādu materiālu maisījums, ko izmanto, lai imitētu dabīgu nosēdumu fizikālās sastāvdaļas. Ūdens virsējais slānis ir ūdens, ar ko nosegti nosēdumi testēšanas traukā. Starpūdens jeb porūdens ir ūdens, kas aizņem telpu starp nosēdumiem un augsnes daļiņām. Piesātināts ūdens ir testēšanas ūdens, kam pievienota testējamā viela. Testējamā ķīmiskā viela ir jebkāda viela vai maisījums, ko testē, izmantojot šo testēšanas metodi. 2. papildinājums Ieteikumi attiecībā uz Chironomus riparius kultūru 1. Chironomus kāpurus var audzēt kristalizācijas traukos vai lielākās tvertnēs. Smalkas kvarca smiltis izklāj plānā, aptuveni 5–10 mm slānī tvertnes apakšā. Ir pierādīts arī, ka kā piemērotu substrātu var izmantot Kieselguhr (piemēram, Merck, 8117. pants) (pietiek ar plānāku slāni tikai dažu mm augstumā). Pēc tam pievieno piemērotu ūdeni, lai dziļums būtu vairāki cm. Ūdens līmenis ir jāpaaugstina pēc vajadzības, lai aizvietotu iztvaikoto daudzumu un novērstu izžūšanu. Ūdeni var apmainīt, ja vajadzīgs. Jānodrošina lēna aerācija. Kāpuru audzēšanas trauki jātur piemērotā būrī, kas nepieļaus izšķīlušo pieaugušo īpatņu izbēgšanu. Būrim jābūt pietiekami lielam, lai būtu iespējama izšķīlušo pieaugušo īpatņu spietošana, pretējā gadījumā nenotiks kopulācija (ne mazāks kā apm. 30 × 30 × 30 cm). 2. Būri jātur istabas temperatūrā vai nemainīgas vides telpā 20 ± 2 °C ar 16 stundu apgaismojuma periodu (intensitāte apm. 1 000 luksi) un astoņu stundu tumsas periodu. Ir norādīts, ka gaisa mitrums zem 60 % RH var kavēt reprodukciju. Ūdens atšķaidīšanai 3. Var izmantot jebkuru piemērotu dabīgu vai sintētisku ūdeni. Bieži izmanto akas ūdeni, krāna ūdeni, no kura attīrīts hlors, un mākslīgu līdzekli (piemēram, Elendt M4 vai M7 barotni, sk. turpmāk). Ūdenim pirms izmantošanas jānodrošina aerācija. Ja vajadzīgs, kultūras ūdeni var atjaunot, izmantoto ūdeni no kultivēšanas traukiem uzmanīgi nolejot vai sifonējot, nesadragājot kāpuru kūniņas. Kāpuru barošana 4. Chironomus kāpuri ir jābaro ar zivju barības pārslām (TetraMin®, TetraPhyll® vai citu līdzīga zīmola patentētu zivju barību), katrā traukā dienā ievietojot aptuveni 250 mg. Barību var dot kā sausu samaltu pulveri vai kā suspensiju ūdenī, proti, 1,0 g barības pārslu pievieno 20 ml destilēta ūdens un samaisa, līdz iegūst homogēnu maisījumu. Šo sagatavi var izbarot aptuveni 5 ml apmērā katrā traukā katru dienu (pirms lietošanas sakratīt). Vecāki kāpuri var saņemt vairāk barības. 5. Barošanu pielāgo atbilstīgi ūdens kvalitātei. Ja kultivēšanas barotne kļūst duļķaina, barošana ir jāsamazina. Barības papildinājumi ir rūpīgi jāuzrauga. Pārāk maz barības izraisīs kāpuru emigrāciju vertikālā ūdens slāņa virzienā, savukārt pārāk daudz barības izraisīs mikrobu aktivitātes pieaugumu un samazinās skābekļa koncentrācijas. Abas situācijas var novest pie mazākiem augšanas ātrumiem. 6. Izveidojot jaunus kultivēšanas traukus, var pievienot dažas zaļaļģu (piemēram, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) šūnas. Izšķīlušos pieaugušo īpatņu barošana 7. Dažos testos ir iegūtas liecības, ka kokvilnas spilventiņš, kas piesūcināts ar piesātinātu saharozes šķīdumu, var nodrošināt barību izšķīlušiem pieaugušiem īpatņiem. Izšķilšanās 8. Divdesmit grādu ± 2 °C temperatūrā pieaugušie īpatņi sāks šķilties no kāpuru audzēšanas traukiem aptuveni pēc 13–15 dienām. Tēviņus ir viegli atšķirt pēc to spalvainās antenas. Oliņas 9. Tiklīdz vairošanas būrī ir pieaugušie īpatņi, visi kāpuru audzēšanas trauki ir jāpārbauda trīs reizes nedēļā, lai konstatētu izdētās želatīnveidīgās oliņas. Ja tās tiek atklātas, oliņas ir uzmanīgi jāizņem. Tās ir jāievieto nelielā šķīvī, kurā ir vairošanās ūdens paraugs. Oliņas izmanto, lai izveidotu jaunus kultivēšanas traukus (piemēram, 2–4 oliņu kopas katrā traukā), vai tās izmanto toksicitātes testēšanā. 10. Pirmās attīstības stadijas kāpuriem ir jāizšķiļas pēc 2–3 dienām. Jaunu kultivēšanas trauku izveide 11. Pēc tam, kad ir izveidotas kultūras, katru nedēļu vai retāk var izveidot jaunu kāpuru kultivēšanas trauku atkarībā no testēšanas prasībām un vecos traukus izņem no būriem pēc pieaugušo īpatņu izšķilšanās. Ar šādu sistēmu var nodrošināt regulāru pieaugušo īpatņu piegādi ar minimāliem pārvaldības pasākumiem. Testēšanas šķīdumu M4 un M7 sagatavošana 12. Elendt (1990. gads) ir aprakstījis M4 barotni. M7 barotni sagatavo tāpat kā M4 barotni, izņemot 1. tabulā norādītās vielas, kurām koncentrācijas M7 barotnē ir četras reizes mazākas nekā M4 barotnē. Pašlaik tiek gatavota publikācija par M7 barotni (Elendt, individuāls paziņojums). Testēšanas šķīdumu nevajadzētu sagatavot saskaņā ar Elendt un Bias (1990. gads), jo NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 un K2HPO4 koncentrācijas, kas norādītas rezerves šķīdumu sagatavošanai, ir nepiemērotas. M7 barotnes sagatavošana 13. Katru rezerves šķīdumu (I) sagatavo atsevišķi un apvienoto rezerves šķīdumu (II) pagatavo no šiem rezerves šķīdumiem (I) (sk. 1. tabulu). 50 mililitrus apvienotā rezerves šķīduma (II) un 2. tabulā norādītos daudzumus no katra makrobarības rezerves šķīduma iemaisa vienā litrā dejonizēta ūdens, lai sagatavotu M7 barotni. Vitamīnu rezerves šķīdumu sagatavo, pievienojot trīs vitamīnus dejonizētam ūdenim, kā norādīts 3. tabulā, un neilgi pirms izmantošanas galīgajai M7 barotnei pievieno 0,1 ml apvienotā vitamīnu rezerves šķīduma. (Vitamīnu rezerves šķīdumu glabā sasaldētu mazos alikvotos.) Barotnei nodrošina aerāciju un to stabilizē. 1. tabula Barotnes M4 un M7 mikroelementu rezerves šķīdumi Rezerves šķīdumi (I) Daudzums (mg), ko pievieno 1 litram dejonizēta ūdens Lai sagatavotu apvienoto rezerves šķīdumu (II), samaisa turpmāk norādītos rezerves šķīdumu (I) tilpumus (ml) un pievieno 1 litram dejonizēta ūdens Galīgās koncentrācijas testēšanas šķīdumos (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (18) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 • 4 H2O (18) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (18) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (18) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 • 6 H2O (18) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (18) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 • 2 H2O (18) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 • 2 H2O (18) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 • 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA • 2 H2O (18) (19) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 • 7 H2O (18) (19) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249 2. tabula Makrobarības rezerves šķīdumi barotnei M4 un M7 Daudzums, ko pievieno 1 litram dejonizēta ūdens (mg) Makrobarības rezerves šķīdumu tilpums, ko pievieno, lai sagatavotu barotni M4 un M7 (ml/l) Galīgās koncentrācijas testēšanas šķīdumos M4 un M7 (mg/l) CaCl2 • 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 • 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 • 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184 3. tabula Vitamīnu rezerves šķīdums barotnei M4 un M7 Visus trīs vitamīnu šķīdumus apvieno, lai sagatavotu vienu vitamīnu rezerves šķīdumu.

Daudzums, ko pievieno 1 litram dejonizēta ūdens (mg) Vitamīnu rezerves šķīduma tilpums, ko pievieno, lai sagatavotu barotni M4 un M7 (ml/l) Galīgās koncentrācijas testēšanas šķīdumos M4 un M7 (mg/l) Tiamīna hidrohlorīds 750 0,1 0,075 Ciānkobalamīns (B12) 10 0,1 0,0010 Biotīns 7,5 0,1 0,00075 LITERATŪRA BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. 3. papildinājums IZSTRĀDĀTU NOSĒDUMU SAGATAVOŠANA Nosēdumu sastāvs Izstrādāto nosēdumu sastāvam jābūt šādam: Sastāvdaļa Raksturlielumi % no nosēdumu saussvara Kūdra Sfagnu sūnu kūdra, kuras pH ir pēc iespējas tuvāk 5,5–6,0 vērtībai, bez redzamām augu atliekām, smalki samalta (daļiņu izmērs: ≤ 1 mm) un izžāvēta ar gaisu 4–5 Kvarca smiltis Smilšu graudu izmērs: > 50 % daļiņu jābūt 50–200 μm diapazonā 75–76 Kaolīna māli Kaolinīta saturs: ≥ 30 % 20 Organiskais ogleklis Koriģē, pievienojot kūdru un smiltis 2 (± 0,5) Kalcija karbonāts CaCO3, pulverizēts, ķīmiski tīrs 0,05-0,1 Ūdens Vadītspēja: ≤ 10 μS/cm 30-50 Sagatavošana Kūdru izžāvē gaisā un samaļ smalkā pulverī. Vajadzīgā daudzuma kūdras pulvera suspensiju dejonizētā ūdenī sagatavo, izmantojot efektīvu homogenizēšanas ierīci. Šīs suspensijas pH koriģē ar CaCO3 līdz 5,5 ± 0,5 vērtībai. Suspensiju kondicionē vismaz divas dienas, viegli maisot 20 ± 2 °C temperatūrā, lai stabilizētu pH un izveidotu stabilu mikrobu sastāvdaļu. Vēlreiz mēra pH, kam jābūt 6,0 ± 0,5. Pēc tam kūdras suspensiju samaisa ar citām sastāvdaļām (smiltīm un kaolīna māliem) un dejonizētu ūdeni, lai iegūtu homogēnus nosēdumus ar ūdens saturu 30–50 % diapazonā no nosēdumu sausā svara. Vēlreiz mēra galīgā maisījuma pH un to koriģē 6,5–7,5 vērtībā ar CaCO3, ja vajadzīgs. Ņem nosēdumu paraugus, lai noteiktu saussvaru un organiskā oglekļa saturu. Pēc tam, pirms izstrādātos nosēdumus izmanto hironomīdu toksicitātes testēšanā, ir ieteicams tos kondicionēt septiņas dienas tādos pašos apstākļos, kādi būs testā. Glabāšana Mākslīgo nosēdumu sausās sastāvdaļas var arī uzglabāt sausā un vēsā vietā istabas temperatūrā. Izstrādātos (mitros) nosēdumus nedrīkstētu uzglabāt pirms to izmantošanas testā. Tie ir jāizmanto tūlīt pēc septiņu dienu kondicionēšanas perioda, kas pabeidz to sagatavošanu. LITERATŪRA: Šā pielikuma C.8. nodaļa “Toksicitātes noteikšana sliekām”. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. 4. papildinājums Atšķaidīšanai piemērota ūdens ķīmiskie raksturlielumi Viela Koncentrācijas Daļiņas < 20 mg/l Kopējais organiskais ogleklis < 2 mg/l Nejonizēts amonjaks < 1 μg/l Cietība kā CaCO3 < 400 mg/l (20) Atlikumu hlors < 10 μg/l Kopējie fosfororganiskie pesticīdi < 50 ng/l Hlororganisko pesticīdu un polihlorbifenīlu kopējais saturs < 50 ng/l Kopējais organiskais hlors < 25 ng/l 5. papildinājums Norādījumi par hironomīdu kāpuru šķilšanās uzraudzību Uz testēšanas vārglāzēm izvieto izšķilšanās slazdus. Šie slazdi ir nepieciešami, sākot no 20. dienas līdz testēšanas beigām. Turpmāk ir attēlots izmantotā slazda paraugs. A. : Neilona aizsegs B. : Apgāzts plastmasas trauks C. : Bezlūpu ekspozīcijas vārglāze D. : Ūdens apmaiņas aizsega lūkas E. : Ūdens F. : Nosēdumi C.29. VIEGLAS BIONOĀRDĪŠANĀS SPĒJA – CO2 HERMĒTISKI NOSLĒGTOS TRAUKOS (BRĪVĀ TILPUMA TESTS) IEVADS 1. Šī testēšanas metode ir līdzvērtīga ESAO Testēšanas norādījumiem (turpmāk – TG) 310 (2006. gads). Šī testēšanas metode ir skrīninga metode, ko izmanto, lai novērtētu ķīmisko vielu bionoārdīšanās spēju, un kas nodrošina līdzīgu informāciju, kādu var iegūt sešās testēšanas metodēs, kuras aprakstītas šā pielikuma C.4.-A–C.4.-F nodaļā. Tāpēc ķīmisku vielu, kas uzrāda pozitīvus rezultātus saskaņā ar šo testēšanas metodi, var uzskatīt par viegli bionoārdāmu un tātad ātri noārdāmu vidē. 2. Parasti mazšķīstošu un spēcīgi adsorbējošu ķīmisko vielu testēšanai kā pirmo izvēlas iedibināto oglekļa dioksīda (CO2) metodi (1), kuras pamatā ir Sturm sākotnējais tests (2), ar ko novērtē organisku ķīmisko vielu bionoārdīšanos, mērot oglekļa dioksīdu, kuru rada mikrobu darbība. To izvēlas arī šķīstošām (bet ne gaistošām) ķīmiskajām vielām, jo tiek plaši uzskatīts, ka oglekļa dioksīda veidošanās ir vienīgais neapšaubāmais mikrobu darbības pierādījums. Izšķīdušā organiskā oglekļa piesaisti var veicināt fizikālie un ķīmiskie procesi, proti, adsorbcija, izgaišana, nogulsnēšanās, hidrolīze, kā arī mikrobu darbība, un daudzas nebioloģiskas reakcijas patērē skābekli. CO2 no organiskām ķīmiskajām vielām reti kad veidojas abiotiski. Sākotnējā un modificētajā Sturm testā (1) (2) CO2 tiek piesaistīts šķidrajā fāzē un pārvietots uz absorbējošajiem traukiem ar smidzināšanu (t. i., gaisa burbuļiem, kas apstrādāti tā, lai tie šķidrumā piesaistītu CO2), savukārt saskaņā ar Larson pieeju (3) (4) CO2 tiek pārvietots no reakcijas trauka uz absorbētājiem, cauri brīvajam tilpumam laižot gaisu bez CO2 un papildus nepārtraukti kratot testēšanas trauku. Reakcijas trauku krata tikai saskaņā ar Larson modificēto pieeju. Maisīšana ir noteikta vienīgi nešķīstošām vielām ISO 9439 (5) un sākotnējā ASV redakcijā (6), un abos minētajos dokumentos ir norādīta smidzināšana, nevis brīvā tilpuma aizvietošana. Saskaņā ar citu oficiālu ASV EPA metodi (7), kuras pamatā ir Gledhill metode (8), kratīto reakcijas trauku noslēdz, nepieļaujot gaisa piekļuvi, un radušos CO2 savāc iekšējā alkalīna uztvērējā tieši no gāzes fāzes tāpat kā klasiskajās Warburg/Barcroft respirometra kolbās. 3. Savukārt attiecībā uz neorganisku oglekli ir pierādīts, ka vairāku ķīmisko vielu gadījumā tas akumulējas barotnē, piemērojot standarta modificēto Sturm testu (9). Noārdoties 20 mg C/l anilīna, tika konstatēta neorganiskā oglekļa koncentrācija līdz 8 mg/l apmērā. Tādējādi CO2 savākšana alkalīna uztvērējos nenodrošināja patiesu atspoguļojumu par kopējo CO2 daudz