Oficiālais Vēstnesis L 257 , 10/09/1981 Lpp. 0038 - 0046

Speciālizdevums somu valodā: Nodaļa 3 Sējums 13 Lpp. 0233

Speciālizdevums spāņu valodā: Nodaļa 03 Sējums 23 Lpp. 0070

Speciālizdevums zviedru valodā: Nodaļa 3 Sējums 13 Lpp. 0233

Speciālizdevums portugāļu valodā Nodaļa 03 Sējums 23 Lpp. 0070



Komisijas Devītā direktīva (1981. gada 31. jūlijs), ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (81/715/EEK) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1970. gada 20. jūlija Direktīvu 70/373/EEK par paraugu ņemšanas un analīžu Kopienas metožu ieviešanu barības oficiālajai kontrolei [1], kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Grieķijas Pievienošanās aktu, un jo īpaši tās 2. pantu, tā kā minētajā direktīvā ir prasīts veikt oficiālu barības kontroli, izmantojot paraugu ņemšanas un analīžu Kopienas metodes, lai pārbaudītu atbilstību prasībām, kas normatīvo un administratīvo aktu noteikumos paredzētas attiecībā uz barības kvalitāti un sastāvu; tā kā ar Komisijas Direktīvām 71/250/EEK [2], 71/393/EEK [3], 72/199/EEK [4], 73/46/EEK [5], 74/203/EEK [6], 75/84/EEK [7], 76/372/EEK [8] un 78/633/EEK [9], kurās jaunākie grozījumi izdarīti ar 1981. gada 30. jūlija direktīvu, jau ir noteiktas vairākas Kopienas analīžu metodes; tā kā, ņemot vērā sasniegumus kopš tā laika, ir ieteicams pieņemt devīto metožu kopumu; tā kā šajā direktīvā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Barības pastāvīgās komitejas sniegto atzinumu, IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU. 1. pants Dalībvalstis prasa, lai analīzes, ar ko barības oficiālās kontroles nolūkā nosaka avoparsīna un monensīnnātrija saturu, izdara saskaņā ar šīs direktīvas pielikumā aprakstītajām metodēm. 2. pants Dalībvalstīs stājas spēkā normatīvie un administratīvie akti, kas vajadzīgi, lai panāktu atbilstību šai direktīvai līdz 1981. gada 1. decembrim, un dalībvalstis par to tūlīt informē Kopienu. 3. pants Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm. Briselē, 1981. gada 31. jūlijā Komisijas vārdā — priekšsēdētājs Gaston Thorn [1] OV L 170, 3.8.1970., 2. lpp. [2] OV L 155, 12.7.1971., 13. lpp. [3] OV L 279, 20.12.1971., 7. lpp. [4] OV L 123, 29.5.1972., 6. lpp. [5] OV L 83, 30.3.1973., 21. lpp. [6] OV L 108, 22.4.1974., 7. lpp. [7] OV L 32, 5.2.1975., 26. lpp. [8] OV L 102, 15.4.1976., 8. lpp. [9] OV L 206, 29.7.1978., 43. lpp. -------------------------------------------------- PIELIKUMS 1. AVOPARSĪNA NOTEIKŠANA PĒC DIFŪZIJAS AGARA VIDĒ 1. MĒRĶIS UN PIEMĒROŠANAS JOMA Metode paredzēta avoparsīna noteikšanai barībā un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 2 mg/kg (2 ppm). Noteikšanu var traucēt poliēteru antibiotiku klātbūtne. 2. PRINCIPS Paraugu ekstrahē ar acetona/ūdens/sālsskābes maisījumu. Ekstrakta antibiotisko aktivitāti nosaka, mērot avoparsīna difūziju agara vidē, kas uzsēta ar Bacillus subtilis. Difūziju nosaka pēc mikroorganisma kavējuma zonu veidošanās. Pieņem, ka izmantoto antibiotisko vielu koncentrāciju intervālā šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotikas koncentrācijas logaritmam. 3. MIKROORGANISMS: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054). 3.1. Izejas kultūras uzturēšana Mēģenēs uz slīpagara barotnēm (4.1.) uzsēj Bacillus subtilis un inkubē diennakti 30 °C temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī apmēram 4 °C temperatūrā. Katru mēnesi uzsēj atkārtoti. 3.2. Sporu suspensijas gatavošana [1] No nesen sagatavotas slīpagara barotnes (3.1.) ar 2 — 3 ml sterila ūdens novāc pieaugumu. Ar šo suspensiju uzsēj 300 ml barotni (4.1.) Rū pudelē, ko inkubē no trim līdz piecām dienām 30 °C temperatūrā. Pieaugumu novāc ar 15 ml etilspirta (4.2.), iepriekš ar mikroskopu pārbaudot sporulāciju, un labi samaisa. Šo suspensiju var glabāt vismaz piecus mēnešus 4 °C temperatūrā. 4. BAROTNES UN REAĢENTI. 4.1. Barotne [2] Peptons | 6,0 g | Triptons | 4,0 g | Rauga ekstrakts | 3,0 g | Gaļas ekstrakts | 1,5 g | Glikoze | 1,0 g | Agars | 15,0 g | Ūdens | 1000 ml | pH 6,5 (pēc sterilizācijas) | | 4.2. Etilspirts, 20 % (V/V): atšķaida 200 ml etilspirta ar 800 ml ūdens. 4.3. Sālsskābe, d: 1,18 — 1,19. 4.4. Nātrija hidroksīds, 2 M šķīdums. 4.5. Fosfāta buferšķīdums, 0,1 M: Kālija dihidrogēnfosfāts, KH2PO4 13,6 g. Ūdens līdz 1000 ml. Noregulē pH līdz 4,5. 4.6. Acetona/ūdens/sālsskābes maisījums (4.3.): 65/32,5/2,5 (V/V/V). 4.7. Standartviela: avoparsīna sulfāts ar zināmu aktivitāti. 5. STANDARTŠĶĪDUMI Precīzi nosvērtu apmēram 10 mg standartvielas (4.7.) daudzumu izšķīdina fosfāta buferšķīdumā (4.5.) un atšķaida ar minēto buferšķīdumu, lai iegūtu rezerves šķīdumu, kas satur 100 μg avoparsīna mililitrā. Glabājot aizkorķētā kolbā 4 °C temperatūrā, šis šķīdums ir stabils līdz septiņām dienām. 5.1. Premiksiem Šo izejas šķīdumu pakāpeniski atšķaidot ar buferšķīdumu (4.5.), pagatavo šādus šķīdumus: S8 | 4,0 μg/ml | S4 | 2,0 μg/ml | S2 | 1,0 μg/ml | S1 | 0,5 μg/ml | 5.2. Barībai Šo izejas šķīdumu pakāpeniski atšķaidot ar buferšķīdumu (4.5.), pagatavo šādus šķīdumus: S8 | 2,0 μg/ml | S4 | 1,0 μg/ml | S2 | 0,5 μg/ml | S1 | 0,25 μg/ml | 6. EKSTRAKTA UN EKSPERIMENTA ŠĶĪDUMU GATAVOŠANA. 6.1. Premiksi Ar 10 mg precizitāti nosver paraugu, kas ir pietiekams, lai saturētu 10 — 100 mg avoparsīna. Pārnes uz 100 ml mērkolbu, kurā ir 60 ml maisījuma (4.6.), un 15 minūtes krata ar mehānisko kratītāju. Pārbauda pH un, ja vajadzīgs, ar sālsskābi (4.3.) noregulē līdz pH 2. Uzpilda līdz zīmei ar maisījumu (4.6.) un labi samaisa. Daļu izfiltrē caur piemērotu filtrpapīru, piemēram, vatmaņpapīru Nr. 1, izmetot pirmos 5 ml filtrāta. Ņem alikvotu daļu un ar nātrija hidroksīda šķīdumu (4.4.) noregulē pH līdz 4,5. Šo šķīdumu atšķaida ar buferšķīdumu (4.5.), lai iegūtu sagaidāmo avoparsīna koncentrāciju 4 μg/ml (= U8). Šo šķīdumu pakāpeniski atšķaidot (1 + 1) ar buferšķīdumu (4.5.), gatavo šķīdumu U4 (sagaidāmais saturs 2 μg/ml), U2 (sagaidāmais saturs 1 μg/ml) un U1 (sagaidāmais saturs 0,5 μg/ml). 6.2. Barība Nosver 50 g parauga un ar mehānisko kratītāju krata 100 ml mikstūras (4.6.) 30 minūtes. Ekstraktu attīra, centrifugējot slēgtās centrifūgas mēģenēs, ņem alikvotu daļu attīrītā ekstrakta (skat. tabulā tālāk tekstā) un ar nātrija hidroksīda šķīdumu (4.4.) noregulē pH līdz 4,5. Alikvoto daļu atšķaida ar buferšķīdumu (4.5.), lai iegūtu U8 (skat. tabulā tālāk tekstā). Šo šķīdumu pakāpeniski atšķaidot (1 + 1) ar buferšķīdumu (4.5.), gatavo šķīdumu U4 (sagaidāmais saturs 1 μg/ml), U2 (sagaidāmais saturs 0,5 μg/ml) un U1 (sagaidāmais saturs 0,25 μg/ml). Iepriekš pieņemtais avoparsīna līmenis (mg/kg) | 5 | 7,5 | 10 | 15 | 20 | 40 | Parauga svars (g (± 0, 1 g)) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | Maisījuma (4.6.) tilpums (ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | Attīrītā ekstrakta tilpums (ml) | 20 | 15 | 20 | 15 | 20 | 10 | Galīgais tilpums (ml): U8 | 25 | 25 | 50 | 50 | 100 | 100 | Sagaidāmā U8 koncentrācija (μg/ml) | 2 | apm. 2 | 2 | apm.2 | 2 | 2 | 7. EKSPERIMENTA NORISE 7.1. Eksperimenta vides uzsēšana 50 līdz 60 °C temperatūrā uzsēj eksperimenta vidi (4.1.) ar sporu suspensiju (3.2.). Priekšmēģinājumos uz platēm ar eksperimenta vidi (4.1.) nosaka, kāds sporu suspensijas daudzums ir vajadzīgs, lai ar dažādo koncentrāciju avoparsīnu iegūtu lielākās un skaidrākās kavējuma zonas. 7.2. Plašu sagatavošana Difūziju agarā veic uz platēm ar četru dažādu koncentrāciju standartšķīdumiem (S8, S4, S2 un S1) un četru koncentrāciju pārbaudes šķīdumiem (U8, U4, U2 un U1). Šo četru dažādo koncentrāciju ekstrakta šķīdumam un standartšķīdumam noteikti jābūt uz katras plates. Šajā nolūkā izvēlas pietiekami lielas plates, uz kurām agara barotnē var izveidot vismaz astoņas 10 līdz 13 mm diametraiedobes, kuru centri ir vismaz 30 mm attālumā cits no cita. Testu var veikt uz plates, kas izveidota no stikla plāksnes, uz kuras uzlikts 20 mm augsts anodēta alumīnija vai plastikas riņķis ar 200 mm diametru. Uz platēm lej tādu daudzumu barotnes (4.1.), kas uzsēta saskaņā ar 7.1., lai izveidojas apmēram 2 mm biezs slānis (60 ml uz plati ar 200 mm diametru). Ļauj sastingt horizontālā stāvoklī, izveido iedobes un tajās precīzi nomērītā daudzumā iepilda eksperimenta šķīdumus un standartšķīdumus (no 0,10 līdz 0,15 ml uz iedobi atkarībā no diametra). Katru koncentrāciju pārbauda vismaz četras reizes, lai katrā noteikšanā novērtētu vismaz 32 kavējuma zonas. 7.3. Inkubācija Plates inkubē 16 līdz 18 stundas 30 °C temperatūrā. 8. VĒRTĒŠANA Ar 0,1 mm precizitāti izmēra kavējuma zonu diametru. Uz puslogaritmiskā papīra atzīmē punktus, kas atbilst kavējuma zonu vidējam diametram atkarībā no koncentrācijas. Uzzīmē "atbilstošākās" līnijas attiecīgi standartšķīdumam un ekstraktam, piemēram, kā noteikts zemāk. Nosaka "atbilstošāko" punktu standarta zemākajam līmenim (SL) pēc formulas: SL = 10 Nosaka "atbilstošāko" punktu standarta augstākajam līmenim (SH) pēc formulas: SH = 10 Līdzīgi aprēķina "atbilstošākos" punktus ekstrakta zemākajam koncentrācijas līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), norādītajās formulās S1, S2, S4 un S8 aizstājot attiecīgi ar U1, U2, U4 un U8. Tajā pašā grafikā atzīmē aprēķinātos SL un SH lielumus, un, tās savienojot, iegūst "atbilstošāko" līniju standartšķīdumam. Līdzīgi atzīmē UH un UL, ko savienojot, iegūst "atbilstošāko" līniju ekstraktam. Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām vajadzētu būt paralēlām. Praktiskos nolūkos līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH-SL) un (UH-UL) neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma. Ja līnijas nav paralēlas, var atmest U1 un S1 vai U8 un S8, un SL, SH, UL un UH "atbilstošākās" līnijas aprēķināt pēc alternatīvām formulām: a)SL = 5 S1+ 2 S2– S46 | vai | 5 S2+ 2 S4– S86 | b)SH = 5 S4+ 2 S2– S16 | vai | 5 S8+ 2 S4– S26 | un līdzīgi aprēķina UL un UH. Alternatīvo "atbilstošāko" līniju paralelitāte būtu jāpārbauda tāpat kā minēts iepriekš. Ja rezultāti aprēķināti pēc trim līmeņiem, to norāda nobeiguma ziņojumā. Ja līnijas uzskata par paralēlām, aprēķina relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) pēc vienas no šādām formulām: Pēc četriem līmeņiem: log A U + U + U +U – S – S – S – S 8 х 0,602U4+U8+S4+S8– U1– U2– S1– S2 Pēc trim līmeņiem: log A = U +U +U – S – S – S 4 х 0,401U4+S4– U1– S1 vai log A = U +U +U – S – S – S 8 х 0,401U8+S8– U2– S2 Faktiskā aktivitāte = pieņemtā aktivitāte х relatīvā aktivitāte. Ja relatīvā aktivitāte neiekļaujas intervālā no 0,5 līdz 2,0, eksperimentu atkārto, attiecīgi koriģējot ekstrakta koncentrācijas, vai, ja tas nav iespējams, koriģējot standartšķīduma koncentrācijas. Ja relatīvā aktivitāte neiekļaujas vajadzīgajās robežās, iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu, un tas būtu jānorāda nobeiguma ziņojumā. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja paralelitāti tomēr nepanāk, noteikšana jāuzskata par neapmierinošu. 9. ATKĀRTOJAMĪBA. No viena parauga viena analītiķa divās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirībai nevajadzētu pārsniegt: - 2 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja avoparsīna saturs ir no 2 līdz 10 mg/kg, - 20 % no lielākā rezultāta, ja saturs ir no 10 līdz 25 mg/kg, - 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja saturs ir no 25 līdz 50 mg/kg, - 10 % no lielākā rezultāta, ja saturs pārsniedz 50 mg/kg. 2. MONENSĪNNĀTRIJA NOTEIKŠANA PĒC DIFŪZIJAS AGARA BAROTNĒ 1. MĒRĶIS UN PIEMĒROŠANAS JOMA Metode paredzēta monensīnnātrija noteikšanai barībā un premiksos. Zemākā noteikšanas robeža ir 10 mg/kg (10 ppm) [3]. 2. PRINCIPS Paraugu ekstrahē ar 90 % metilspirtu. Ekstraktam piemēro attiecīgas procedūras atkarībā no monensīnnātrija satura paraugā. Antibiotisko aktivitāti nosaka, mērot monensīnnātrija difūziju agara vidē, kas uzsēta ar Bacillus subtilis. Difūziju nosaka pēc mikroorganisma kavējuma zonu veidošanās. Pieņem, ka izmantoto antibiotisko vielu koncentrāciju intervālā šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotikas koncentrācijas logaritmam. Šīs eksperimenta sistēmas jutību samazina nātrija jonu klātbūtne. 3. MIKROORGANISMS: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054) 3.1. Izejas kultūras uzturēšana. Mēģenēs ar slīpagara barotnēm (4.1.) uzsēj Bacillus subtilis un inkubē diennakti 30 °C temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī apmēram 4 °C temperatūrā. Katru mēnesi uzsēj atkārtoti. 3.2. Sporu suspensijas gatavošana [4] No nesen sagatavotas slīpagara barotnes (3.1.) ar 2 līdz 3 ml sterila ūdens novāc pieaugumu. Ar šo suspensiju uzsēj 300 ml vides (4.1.) Rū pudelē un inkubē trīs līdz piecas dienas 30 °C temperatūrā. Pieaugumu novāc ar 15 ml 20 % etilspirta (4.3.), iepriekš ar mikroskopu pārbaudot sporulāciju, un labi samaisa. Šo suspensiju var glabāt vismaz piecus mēnešus apmēram 4 °C temperatūrā. 4. BAROTNES UN REAĢENTI 4.1. Barotne [5] Triptons | 10,0 g | Rauga ekstrakts | 3,0 g | Gaļas ekstrakts | 1,5 g | Glikoze | 1,0 g | Agars (atkarībā no kvalitātes) | 10,0 līdz 20,0 g | Ūdens | 1000 ml | pH 6,5 (pēc sterilizācijas). | | 4.2. Eksperimenta vide Glikoze | 10,0 g | Rauga ekstrakts | 2,5 g | Dikālija hidrogēnfosfāts K2HPO4 | 0,69 g | Kālija dihidrogēnfosfāts KH2PO4 | 0,45 g | Agars (atkarībā no kvalitātes) | 10,0 līdz 20,0 g | Ūdens | 1000 ml | pH 6 (pēc sterilizācijas). | | 4.3. Etilspirts, 20 % V/V: 200 ml etilspirta atšķaida ar 800 ml ūdens. 4.4. Metilspirts, bezūdens. 4.5. Metilspirts 90 % (V/V): 900 ml metilspirta (4.4.) atšķaida ar 100 ml ūdens. 4.6. Metilspirts 50 % (V/V): 500 ml metilspirta (4.4.) atšķaida ar 500 ml ūdens. 4.7. Granulēts alumīnija oksīds (alcoa F, 20 graudiņi; aktivēts alumīnija oksīds UG1: F. Lancaster and Co. vai līdzvērtīgs). 4.8. Standartvielas: monensīnnātrijs ar zināmu aktivitāti, piemēram, no Starptautiskās bioloģisko standartu laboratorijas. Centrālās veterinārās laboratorijas, Weybridge, UK-Surrey KT 15 3NB. 5. IEKĀRTA 5.1. Rotācijas ietvaicētājs ar 250 ml apaļkolbu. 5.2. Stikla caurule hromatogrāfijai ar 25 mm lielu iekšējo diametru, 400 mm gara un ar vaļēju galu 2 mm diametrā. 5.3. Stikla caurule hromatogrāfijai ar 11 mm iekšējo diametru, apmēram 300 mm gara un ar vaļēju galu 2 mm diametrā. 6. STANDARTŠĶĪDUMI Metilspirtā (4.4.) izšķīdina precīzi nosvērtu standartvielas (4.8.) daudzumu un atšķaida, lai iegūtu rezerves šķīdumu, kas satur 800 μg monensīnnātrija mililitrā. Glabājot aizkorķētās kolbās 4 °C temperatūrā, šis šķīdums saglabā stabilitāti līdz divām nedēļām. Šo rezerves šķīdumu pakāpeniski atšķaidot ar metilspirtu (4.6.), gatavo šādus šķīdumus: S8 | 8,0 μg/ml | S4 | 4,0 μg/ml | S2 | 2,0 μg/ml | S1 | 1,0 μg/ml | 7. EKSTRAKTA GATAVOŠANA 7.1. Ekstrakcija 7.1.1. Premiksi Nosver 2 g parauga, pievieno 100 ml 90 % metilspirta (4.5.), homogenizē un dažas minūtes centrifugē. Centrifugātu atšķaida ar 50 % metilspirtu (4.6.), lai iegūtu sagaidāmo monensīnnātrija saturu 8 μg/ml (= U8). 7.1.2. Barība, kurā monensīnnātrija līmenis nav zemāks par 50 ppm Nosver 10 līdz 20 g parauga, pievieno 100 ml 90 % metilspirta (4.5.), 15 minūtes homogenizē un ļauj nostāties. Ieliek kokvilnas vates tamponu stikla caurules (5.2.) šaurajā galā un pievieno alumīnija oksīdu (4.7.), maigi piedauzot, līdz kolonna sasniedz 75 — 80 mm augstumu. Dekantē ekstraktu uz alumīnija oksīda kolonnas, un savāc filtrātu. Atšķaida 30 ml filtrāta līdz 50 ml ar ūdeni. Pakāpeniski atšķaida ar 50 % metilspirtu (4.6.), lai iegūtu sagaidāmo monensīnnātrija saturu 8 μg/ml (= U8). 7.1.3. Barība, kurā monensīnnātrija līmenis ir zemāks par 50 ppm (līdz 10 ppm robežai). Nosver 10 līdz 20 g parauga, pievieno 100 ml 90 % metilspirta (4.5.), 15 minūtes homogenizē. Centrifugē, līdz kļūst skaidrs. Paraugam, kas satur 20 ppm monensīnnātrija, ņem 40 ml centrifugāta. Paraugam, kas satur 10 ppm, ņem 80 ml, un ar rotācijas ietvaicētāju (5.1.) ietvaicē līdz sausam stāvoklim temperatūrā, kas nepārsniedz 40 °C. Atlikumu izšķīdina 10 ml 90 % metilspirta (4.5.). Ieliek kokvilnas vates tamponu stikla caurules (5.3.) šaurajā galā, un pievieno alumīnija oksīdu (4.7.), maigi piedauzot, līdz kolonna sasniedz 75 — 80 mm augstumu. Dekantē atlikuma metilspirta šķīdumu uz alumīnija oksīda kolonnas un savāc filtrātu. Mazgā kolonnu ar 10 ml 90 % metilspirta (4.5.) un apvieno saskalas ar filtrātu. Vakuumā un temperatūrā, kas ir zemāka par 40 °C, ar rotācijas ietvaicētāju (5.1.) šķīdumu ietvaicē līdz sausam stāvoklim. Atlikumu izšķīdina 10 ml bezūdens metilspirta (4.4.) un uzpilda līdz 20 ml ar ūdeni. Šķīdumu vismaz piecas minūtes centrifugē ar ātrumu, kas nav mazāks par 4000 apgriezieniem minūtē. Pakāpeniski atšķaida ar 50 % metilspirtu (4.6.), lai iegūtu sagaidāmo monensīnnātrija saturu 8 μg/ml (= U8). 7.2. Eksperimenta šķīdumi Šķīdumu U8 pakāpeniski atšķaidot (1 + 1) ar 50 % metilspirtu (4.6.), gatavo šķīdumu U4 (sagaidāmais saturs: 4 μg/ml), U2 (sagaidāmais saturs 2 μg/ml) un U1 (sagaidāmais saturs 1 μg/ml). 8. EKSPERIMENTA NORISE 8.1. Eksperimenta vides uzsēšana Eksperimenta vidi (4.2.) uzsēj ar sporu suspensiju (3.2.) 50 — 60 °C temperatūrā. Priekšmēģinājumos uz platēm ar eksperimenta vidi (4.2.) nosaka, kāds sporu suspensijas daudzums ir vajadzīgs, lai ar dažādo koncentrāciju monensīnnātriju iegūtu lielākās un skaidrākās kavējuma zonas. 8.2. Plašu sagatavošana Difūziju agarā veic uz platēm ar četru dažādu koncentrāciju standartšķīdumiem (S8, S4, S2 un S1) un četru koncentrāciju eksperimenta šķīdumiem (U8, U4, U2 un U1). Šo četru dažādo koncentrāciju ekstrakta šķīdumam un standartšķīdumam noteikti jābūt uz katras plates. Šajā nolūkā izvēlas pietiekami lielas plates, uz kurām agara barotnē var izveidot vismaz astoņas 10 līdz 13 mm diametra iedobes, kuru centri ir vismaz 30 mm attālumā cits no cita. Testu var veikt uz plates, kas izveidota no stikla plāksnes, uz kuras uzlikts 20 mm augsts anodēta alumīnija vai plastikas riņķis ar 200 mm diametru. Uz platēm lej tādu daudzumu barotnes (4.2.), kas uzsēta saskaņā ar 8.1., lai izveidojas apmēram 2 mm biezs slānis (60 ml uz plati, kuras diametrs ir 200 mm). Ļauj sastingt horizontālā stāvoklī, izveido iedobes un tajās precīzi nomērītā daudzumā iepilda eksperimenta šķīdumu un standartšķīdumu (no 0,10 līdz 0,15 ml uz iedobi atkarībā no diametra). Katru koncentrāciju pārbauda vismaz četras reizes, lai katrā noteikšanā novērtētu vismaz 32 kavējuma zonas. 8.3. Inkubācija Plates inkubē apmēram 18 stundas 35 līdz 37 °C temperatūrā. 9. VĒRTĒŠANA Ar 0,1 mm precizitāti izmēra kavējuma zonu diametru. Katrai koncentrācijai atbilstīgo vidējo mērījumu atzīmē uz puslogaritmiskā papīra, parādot koncentrāciju logaritmu attiecībā pret kavējuma zonu diametriem. Uzzīmē "atbilstošākās" līnijas attiecīgi standartšķīdumam un ekstraktam, piemēram, kā norādīts zemāk. Nosaka "atbilstošāko" punktu standarta zemākajam līmenim (SL) pēc formulas: SL = 10 Nosaka "atbilstošāko" punktu standarta augstākajam līmenim (SH) pēc formulas: SH = 10 Līdzīgi aprēķina "atbilstošākos" punktus ekstrakta zemākajam koncentrācijas līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), norādītajās formulās S1, S2, S4 un S8 aizstājot attiecīgi ar U1, U2, U4 un U8. Uz tā paša puslogaritmiskā papīra atzīmē aprēķinātos SL un SH lielumus, un, tos savienojot, iegūst "atbilstošāko" līniju standartšķīdumam. Līdzīgi atzīmē UH un UL, ko savienojot, iegūst "atbilstošāko" līniju ekstraktam. Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām vajadzētu būt paralēlām. Praktiskos nolūkos līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH-SL) un (UH-UL) neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, var atmest U1 un S1 vai U8 un S8 un SL, SH, UL un UH "atbilstošākās" līnijas aprēķināt pēc alternatīvām formulām: a′)SL = 5 S1 + 2 S2 − S46 | vai | 5 S2 + 2 S4 − S86 | b′)SH = 5 S4 + 2 S2 − S16 | vai | 5 S8 + 2 S4 − S26 | un līdzīgi aprēķina UL un UH. Alternatīvo "atbilstošāko" līniju paralelitāti jāpārbauda tāpat kā iepriekš. Ja rezultāti aprēķināti pēc trim līmeņiem, tas būtu jānorāda nobeiguma ziņojumā. Ja līnijas uzskata par paralēlām, aprēķina relatīvās aktivitātes logaritmu (log A) pēc vienas no formulām: Pēc četriem līmeņiem: log A = U + U + U +U – S – S – S – S 8 х 0,602U4+U8+S4+S8– U1– U2– S1– S2 Pēc trim līmeņiem: log A = U + U + U – S – S – S 4 х 0,401U4+S4– U1– S1 vai log A = U + U + U − S − S − S 8 × 0,401U8 + S8 − U2− S2 relatīvā aktivitāte. Ja relatīvā aktivitāte neiekļaujas intervālā no 0,5 līdz 2,0, eksperimentu atkārto, attiecīgi koriģējot ekstrakta koncentrācijas, vai, ja tas nav iespējams, koriģējot standartšķīduma koncentrācijas. Ja relatīvo aktivitāti nevar iekļaut vajadzīgajās robežās, jebkurš iegūtais rezultāts jāuzskata par aptuvenu, un tas būtu jānorāda nobeiguma ziņojumā. Ja līnijas nav uzskatāmas par paralēlām, noteikšanu atkārto. Ja paralelitāti tomēr nepanāk, noteikšana jāuzskata par neapmierinošu. 10. ATKĀRTOJAMĪBA No viena parauga viena analītiķa divās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirībai nevajadzētu pārsniegt: - 20 % no lielākā rezultāta, ja monensīnnātrija saturs ir no 10 līdz 25 mg/kg, - 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja monensīnnātrija saturs ir no 25 līdz 50 mg/kg, - 10 % no lielākā rezultāta, ja saturs pārsniedz 50 mg/kg. [1] Var izmantot citas metodes, ja ir pierādīts, ka pēc tām iegūst līdzīgas baktēriju suspensijas. [2] Var lietot līdzīga sastāva standartbarotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus. [3] 1 mg monensīnnātrija ir līdzvērtīgs 1000 UK vienībām. [4] Var izmantot citas metodes, ja ir pierādīts, ka pēc tām iegūst līdzīgas sporu suspensijas. [5] Var izmantot līdzīga sastāva standartbarotnes, ar kurām iegūst tādus pašus rezultātus. --------------------------------------------------