A)

Veic bloķējošo vai salīdzinošo ELISA testu saskaņā ar šādu protokolu: Ar salīdzinošo ELISA testu, izmantojot monoklonālu antivielu 3-17-A3, var noteikt antivielas visiem zināmajiem infekciozā katarālā drudža vīrusa (BTV) serotipiem. Testa princips ir reakcijas pārtraukšana starp infekciozā katarālā drudža (BTV) antivielu un grupas specifisku monoklonālu antivielu (3-17-A3), pievienojot testa serumu. Testa serumā esošās infekciozā katarālā drudža vīrusa (BTV) antivielas bloķē monoklonālās antivielas (Mab) reaktivitāti, un tādēļ pēc fermentētas pretpeļu antivielas un hromogēna/substrāta pievienošanas vājinās sagaidāmā krāsas attīstība. Serumus var testēt vienā atšķaidījumā — 1:5 (krāsu reakcijas — 1. papildinājums) vai var titrēt (seruma titrēšanas metode — 2. papildinājums), lai norādītu atšķaidījuma beigu punktu. Inhibīcijas vērtības, kas augstākas par 50 %, var uzskatīt par pozitīvām. Materiāli un reaģenti 1. Atbilstošas ELISA mikrotitra plāksnes. 2. Antigēns: piegādā kā šūnu ekstrakcijas koncentrātu, kas sagatavots, kā aprakstīts turpmāk, un ko uzglabā vai nu – 20 °C, vai – 70 °C. 3. Bloķējošais buferšķīdums: fosfāta buferšķīdums (PBS), kas satur 0,3 % BTV negatīvu pieaugušu liellopu serumu, 0,1 % (V/V) Tween-20 (piegādā kā polioksietilēna sorbitāna monolaurāta sīrupu) PBS. 4. Monoklonāla antiviela: 3-17-A3 (piegādā kā hibridomas audu kultūras centrifugātu) pret grupas specifisko polipeptīdu VP7, uzglabā – 20 °C temperatūrā vai liofilizētā veidā un pirms lietošanas atšķaida 1/100 ar bloķējošo buferšķīdumu. 5. Konjugāts: trušu pretpeļu globulīns (adsorbēts un eluēts), kas konjugēts pret mārrutku peroksidāzi un glabāts tumsā 4 °C temperatūrā. 6. Hromogēns un substrāts: ortofenilēndiamīns (OPD-hromogēns) ar galīgo koncentrāciju 0,4 mg/ml sterilā destilētā ūdenī. Ūdeņraža peroksīds (30 % m/V substrāts) 0,05 % V/V, ko pievieno tieši pirms lietošanas (5 μl H2O2 uz 10 ml OPD). (Ar OPD darbojas uzmanīgi, valkā gumijas cimdus, jo pastāv aizdomas par mutagenitāti.) 7. Vienmolāra sērskābe: 26,6 ml skābes pievienoti 473,4 mililitriem destilēta ūdens. (Jāatceras, ka skābi vienmēr pievieno ūdenim, bet ūdeni nekad nepievieno skābei.) 8. Orbitālais kratītājs. 9. ELISA plates nolasītājs (testu var nolasīt vizuāli). Testa forma Cc: konjugāta kontrole (bez seruma/ bez monoklonālās antivielas); C++: izteikti pozitīva seruma kontrole; C+: vāji pozitīva seruma kontrole; C–: negatīva seruma kontrole; Cm: monoklonālās antivielas kontrole (bez seruma).



1. PAPILDINĀJUMS Kontrolatšķaidījumu (1:5) formāts (40 serumu plate) Kontrole Testa serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



2. PAPILDINĀJUMS Seruma titrēšanas formāts (10 serumu plate) Kontrole Testa serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Testa protokols Konjugāta kontrole (Cc) : 1A un 1B iedobes ir tukšā parauga pārbaude, ko veido BTV antigēns un konjugāts. To var izmantot tukšā parauga pārbaudei ELISA nolasītājā. Mab kontrole (Cm) : 1. un 2. ailes G un H rinda ir monoklonālās antivielas kontrole un tajā ietilpst BTV antigēns, monoklonālā antiviela un konjugāts. Šīs iedobes reprezentē maksimālo iekrāsošanos. Šīs kontroles vidējais optiskā blīvuma nolasījumu lielums ir inhibīcijas vērtība 0 %. Pozitīvā kontrole (C++, C+) : 1. un 2. ailes C-D-E-F rinda. Šajās iedobēs ir BTV antigēns, attiecīgi BTV izteikti un vāji pozitīvais imūnserums, Mab un konjugāts. Negatīva kontrole (C–) : 2A un 2B iedobe ir negatīvā kontrole, kurā ir BTV antigēns, BTV negatīvais imūnserums, Mab un konjugāts. Testa serumi : plašos seroloģiskajos pētījumos un ātrajā skrīningā serumus drīkst testēt vienā atšķaidījumā — 1:5 (1. papildinājums). Citos gadījumos 10 serumus drīkst testēt atšķaidījumu diapazonā no 1:5 līdz 1:640 (2. papildinājums). Tas dos dažas norādes par antivielu titru testa serumā. Procedūra 1. BTV antigēnu atšķaida PBS līdz iepriekš titrētai koncentrācijai, īsu laiku apstrādā ar ultraskaņu, lai disperģētu saķepušus vīrusus (ja nav ultraskaņas aparatūras, tad enerģiski pipetē), un pievieno 50 μl visās ELISA plates iedobēs. Viegli uzsit plates malām, lai disperģētu antigēnu. 2. Inkubē orbitālajā kratītājā 60 minūtes 37 °C temperatūrā. Plates trīs reizes skalo ar nesterilu PBS, uzpludinot un iztukšojot iedobes, un nosusina ar filtrpapīru. 3. Kontroliedobes: pievieno Cc iedobēs 100 μl bloķējošā buferšķīduma. Pievieno 50 μl pozitīvās un negatīvās kontroles seruma atšķaidījumā 1:5 (10 μl seruma + 40 μl bloķējošā buferšķīduma) attiecīgajās iedobēs C–, C + un C++. Mab kontroles iedobēs pievieno 50 μl bloķējošā buferšķīduma. Kontroltitrēšanas metode: katra testa seruma 1:5 atšķaidījumu bloķējošā buferšķīdumā pievieno 3.-12. ailes dubultajām iedobēm (10 μl seruma + 40 μl bloķējošā buferšķīduma), vai arī seruma titrēšanas metode: sagatavo katra testa parauga divkārša atšķaidījuma virknes (no 1:5 līdz 1:640) bloķējošā buferšķīdumā atsevišķu aiļu (no 3. līdz 12. ailei) astoņās iedobēs. 4. Uzreiz pēc testa serumu pievienošanas, Mab atšķaida 1:100 bloķējošajā buferšķīdumā un pievieno 50 μl visās plates iedobēs, izņemot tukšā parauga kontroli. 5. Inkubē orbitālajā kratītājā 60 minūtes 37 °C temperatūrā. Trīs reizes skalo ar PBS un nosusina. 6. Trušu pretpeļu koncentrātu atšķaida līdz 1/5000 bloķējošajā buferšķīdumā un visās plates iedobēs pievieno 50 μl. 7. Inkubē orbitālajā kratītājā 60 minūtes 37 °C temperatūrā. Trīs reizes skalo ar PBS un nosusina. 8. Atkausē o-fenilēndiamīna dihidrohlorīdu (OPD) un tieši pirms izmantošanas katriem 10 ml OPD pievieno 5 μl 30 % ūdeņraža peroksīda. Visām plates iedobēm pievieno 50 μl. Ļauj krāsai attīstīties apmēram 10 minūtes un aptur reakciju ar 1 molāru sērskābi (50 μl uz iedobi). Krāsai jāattīstās Mab kontroles iedobēs un tajās iedobēs, kur ir serumi, kas nesatur antivielas pret BTV. 9. Plates pārbauda un reģistrē vai nu vizuāli, vai arī ar spektrofotometriskā nolasītāja palīdzību. Rezultātu analīze Izmantojot programmatūru, testa un kontroles serumiem izdrukā optiskā blīvuma (OB) vērtības un procentuālo inhibīciju (PI), pamatojoties uz vidējo vērtību, kas reģistrēta antigēna kontroles iedobēs. Datus, kas izteikti OB un PI vērtību veidā, izmanto, lai noteiktu, vai tests izpildīts pieļaujamās robežās. Augstākās kontroles robežas (UCL) un zemākās kontroles robežas (LCL) Mab kontrolei (antigēns plus Mab bez testa serumiem) ir starp OB vērtībām 0,4 un 1,4. Visas plates, kas neatbilst iepriekšminētajiem kritērijiem, ir nederīgas. Ja nav pieejama datora programmatūra, OB vērtības izdrukā, lietojot ELISA drukātāju. Antigēna kontroles iedobēm aprēķina vidējo OB vērtību, kas ir vienāda ar 100 % vērtību. Nosaka 50 % OB vērtību un manuāli aprēķina katra parauga pozitīvo un negatīvo rezultātu. Procentuālās inhibēšanas (PI) vērtība = 100 – (katra testa kontroles OB/ Cm vidējais OB) × 100. Dubultajās negatīvās kontroles serumu iedobēs un dubultajās tukšās analīzes iedobēs reģistrētajām PI vērtībām jābūt attiecīgi starp + 25 % un – 25 % un starp + 95 % un + 105 %. Neiekļaušanās šajās robežās nepadara plāksni par nederīgu, bet norāda uz fona krāsojuma veidošanos. Izteikti un vāji pozitīvās kontroles serumiem attiecīgi jāreģistrē PI vērtības starp + 81 % un + 100 % un starp + 51 % un + 80 %. Diagnostikas slieksnis testa serumiem ir 50 % (PI 50 % vai OB 50 %). Paraugus, kam reģistrētās PI vērtības ir zemākas par 50 %, reģistrē kā negatīvus. Paraugus, kam reģistrētās PI vērtības attiecībā uz dubultajām iedobēm atrodas abpus slieksnim, uzskata par šaubīgiem; šādus paraugus var atkārtoti testēt kontroltestā un/vai titrējot. Arī pozitīvus paraugus var titrēt, lai varētu norādīt uz pozitīvā rezultāta pakāpi. Vizuālais nolasījums: pozitīvos un negatīvos paraugus ir viegli atšķirt ar acīm; vāji pozitīvus vai izteikti negatīvus paraugus var būt grūtāk noteikt ar acīm. Infekciozā katarālā drudža (BTV) ELISA antigēna sagatavošana 1. Skalo 40–60 Rū kolbas, kurās ir konfluentas BHK-21 šūnas, trīs reizes ar Īgla barotni, kas nesatur serumu, un veic šajā barotnē inficēšanu ar infekciozā katarālā drudža vīrusa 1. serotipu. 2. Inkubē 37 °C temperatūrā un katru dienu pārbauda attiecībā uz citopātisko efektu (CPE). 3. Kad CPE ir vērojams 90 %–100 % katras Rū kolbas šūnu kārtiņai, vīrusu ievāc, nokratot visas šūnas, kas vēl pielipušas stiklam. 4. Centrifugē ar 2 000 –3 000 apgriezieniem minūtē, lai granulētu šūnas. 5. Nolej centrifugātu un atkārtoti suspendē šūnas apmēram 30 ml PBS, kas satur 1 % Sarkosyl un 2 ml fenilmetilsulfonilfluorīda (līzes buferšķīdums). Tas var likt šūnām veidot gelu un, lai mazinātu šo efektu, var pievienot vairāk līzes buferšķīduma. (NB! Fenilmetilsulfonilfluorīds ir kaitīgs — jārīkojas ārkārtīgi piesardzīgi.) 6. Šūnas uz 60 sekundēm atdala, izmantojot ultraskaņas zondi 30 mikronu amplitūdā. 7. Centrifugē 10 minūtes ar 10 000 apgriezieniem minūtē. 8. Centrifugātu uzglabā + 4 °C temperatūrā, un atlikušo šūnu granulātu atkārtoti suspendē 10–20 ml līzes buferšķīdumā. 9. Apstrādā ar ultraskaņu un dzidrina, katrā posmā uzglabājot centrifugātu; kopumā to veic trīs reizes. 10. Centrifugātus sakrāj un centrifugē 120 minūtes + 4 °C temperatūrā ar 24 000 apgriezieniem minūtē caur 5 ml 40 % saharozes spilvena (m/V PBS), izmantojot 30 ml Bekmaņa centrifūgas mēģenes un SW 28 rotoru. 11. Nolej centrifugātu, rūpīgi izžāvē mēģenes un atkārtoti suspendē granulu PBS, iedarbojoties ar ultraskaņu. Antigēnu uzglabā alikvotās daļās – 20 °C temperatūrā. Infekciozā katarālā drudža (BTV) ELISA antigēna titrēšana Infekciozā katarālā drudža ELISA antigēnu titrē ar netiešo ELISA. Divkāršus antigēna atšķaidījumus titrē attiecībā pret monoklonālās antivielas 3-17-A3 konstantu atšķaidījumu (1/100). Rīkojas saskaņā ar šādu protokolu: 1. Atšķaidītu 1:20 BTV antigēnu titrē fosfāta buferšķīdumā (PBS) visā mikrotitrēšanas platē divkāršas atšķaidīšanas sērijās (50 μl/iedobe), izmantojot daudzkanālu pipeti. 2. Orbitālajā kratītājā inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā. 3. Plates trīs reizes skalo ar PBS. 4. Katrai iedobei mikrotitrēšanas platē pievieno 50 μl monoklonālās antivielas 3-17-A3 (atšķaidīta 1/100). 5. Orbitālajā kratītājā inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā. 6. Plates trīs reizes skalo ar PBS. 7. Katrai iedobei mikrotitrēšanas platē pievieno 50 μl trušu pretpeļu globulīna, kas konjugēts attiecībā pret mārrutku peroksidāzi, kura izšķīdināta līdz iepriekš titrētai optimālai koncentrācijai. 8. Orbitālajā kratītājā inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā. 9. Pievieno substrātu un hromogēnu, kā aprakstīts iepriekš. Reakciju aptur pēc 10 minūtēm, pievienojot vienmolāro sērskābi (50 μl/iedobe). Salīdzinošajā novērtējumā monoklonālajām antivielām jābūt vairākumā, tādēļ izvēlas tādu antigēna atšķaidījumu, kas atrodas uz titrēšanas līknes (nevis plato laukumā), tādējādi pēc 10 minūtēm iegūst apmēram 0,8 lielu optisko blīvumu.