2009R0152 — LV — 17.07.2014 — 004.001

Šis dokuments ir izveidots vienīgi dokumentācijas nolūkos, un iestādes neuzņemas nekādu atbildību par tā saturu

►B KOMISIJAS REGULA (EK) Nr. 152/2009 (2009. gada 27. janvāris), ar ko nosaka paraugu ņemšanas un analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei (Dokuments attiecas uz EEZ) (OV L 054, 26.2.2009, p.1)

Grozīta ar:









▼B

KOMISIJAS REGULA (EK) Nr. 152/2009

(2009. gada 27. janvāris),

ar ko nosaka paraugu ņemšanas un analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei

(Dokuments attiecas uz EEZ)







EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Eiropas Parlamenta un Padomes 2004. gada 29. aprīļa Regulu (EK) Nr. 882/2004 par oficiālo kontroli, ko veic, lai nodrošinātu atbilstības pārbaudi saistībā ar dzīvnieku barības un pārtikas aprites tiesību aktiem un dzīvnieku veselības un dzīvnieku labturības noteikumiem ( 1 ), un jo īpaši tās 11. panta 4. punkta a), b) un c) apakšpunktu, tā kā: (1) Direktīvas 70/373/EEK īstenošanai tika pieņemti šādi tiesību akti, kas paliek spēkā saskaņā ar Regulas (EK) Nr. 882/2004 61. panta 2. punktu: — Komisijas 1971. gada 15. jūnija Pirmā Direktīva 71/250/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei ( 2 ), — Komisijas 1971. gada 18. novembra Otrā Direktīva 71/393/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei ( 3 ), — Komisijas 1972. gada 27. aprīļa Trešā Direktīva 72/199/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei ( 4 ), — Komisijas 1972. gada 5. decembra Ceturtā Direktīva 73/46/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei ( 5 ), — Komisijas 1976. gada 1. marta Pirmā Direktīva 76/371/EEK par Kopienas metodes noteikšanu lopbarības oficiālās pārbaudes paraugu ņemšanai ( 6 ), — Komisijas 1976. gada 1. marta Septītā Direktīva 76/372/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei ( 7 ), — Komisijas 1978. gada 15. jūnija Astotā Direktīva 78/633/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei ( 8 ), — Komisijas 1981. gada 31. jūlija Devītā Direktīva 81/715/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei ( 9 ), — Komisijas 1984. gada 25. jūlija Desmitā Direktīva 84/425/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei ( 10 ), — Komisijas 1986. gada 9. aprīļa Direktīva 86/174/EEK, ar ko nosaka metodi mājputnu barības maisījumu enerģētiskās vērtības aprēķināšanai ( 11 ), — Komisijas 1993. gada 28. jūlija Vienpadsmitā Direktīva 93/70/EEK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodes barības oficiālai kontrolei ( 12 ), — Komisijas 1993. gada 17. decembra Divpadsmitā Direktīva 93/117/EK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodes oficiālai barības kontrolei ( 13 ), — Komisijas 1998. gada 3. septembra Direktīva 98/64/EK par Kopienas analīžu metodēm aminoskābju, kopeļļu, koptauku un olahindoksa noteikšanai dzīvnieku barībā un par Direktīvas 71/393/EEK grozījumiem ( 14 ), — Komisijas 1999. gada 20. aprīļa Direktīva 1999/27/EK par Kopienas metožu ieviešanu amprolija, diklazurila un karbadoksa noteikšanai barībā, ar ko groza Direktīvu 71/250/EEK, 73/46/EEK un atceļ Direktīvu 74/203/EEK ( 15 ), — Komisijas 1999. gada 23. jūlija Direktīva 1999/76/EK, ar ko nosaka Kopienas analīzes metodi lazalocīdnātrija noteikšanai barībā ( 16 ), — Komisijas 2000. gada 6. jūlija Direktīva 2000/45/EK, ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes A vitamīna, E vitamīna un triptofāna noteikšanai barībā ( 17 ), — Komisijas 2002. gada 26. jūlija Direktīva 2002/70/EK, ar ko nosaka prasības dioksīnu un dioksīniem līdzīgu PCB koncentrācijas noteikšanai barībā ( 18 ), — Komisijas 2003. gada 23. decembra Direktīva 2003/126/EK par dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļu noteikšanas analīzes metodi oficiālai lopbarības pārbaudei ( 19 ). (2) Tā kā Direktīvu 70/373/EEK aizstāja ar Regulu (EK) Nr. 882/2004, ir lietderīgi ar vienu regulu aizstāt minētās direktīvas īstenošanas aktus. Vienlaikus jāpielāgo metodes, ņemot vērā jaunākos zinātnes un tehnikas sasniegumus. Metodes, kas vairs neder to paredzētajam nolūkam, jāsvītro. Ir paredzēts pienācīgā laikā atjaunināt paraugu ņemšanas noteikumus, lai ņemtu vērā jaunākos sasniegumus attiecībā uz barības ražošanas, uzglabāšanas, pārvadāšanas un tirgošanas veidu, tomēr ir lietderīgi pagaidām saglabāt spēkā esošos noteikumus par paraugu ņemšanu. (3) Tāpēc jāatceļ Direktīva 71/250/EEK, 71/393/EEK, 72/199/EEK, 73/46/EEK, 76/371/EEK, 76/372/EEK, 78/633/EEK, 81/715/EEK, 84/425/EEK, 86/174/EEK, 93/70/EEK, 93/117/EK, 98/64/EK, 1999/27/EK, 1999/76/EK, 2000/45/EK, 2002/70/EK un 2003/126/EK. (4) Šajā regulā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Pārtikas aprites un dzīvnieku veselības pastāvīgās komitejas atzinumu, tā kā: IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.







▼M3

1. pants

Paraugu ņemšanu barības oficiālai kontrolei, īpaši saistībā ar sastāvdaļu noteikšanu, ieskaitot materiālu, kas satur ģenētiski modificētus organismus (ĢMO) vai sastāv no tādiem organismiem, vai ir no tiem ražots, barības piedevas, kas definētas Eiropas Parlamenta un Padomes Regulā (EK) Nr. 1831/2003 ( 20 ), nevēlamas vielas, kas definētas Eiropas Parlamenta un Padomes Direktīvā 2002/32/EK, ( 21 ) veic saskaņā ar I pielikumā aprakstītajām metodēm.

Paraugu ņemšanas metode, kas aprakstīta I pielikumā, ir piemērojama barības kontrolei saistībā ar pesticīdu atlieku noteikšanu, kas definēta Eiropas Parlamenta un Padomes Regulā (EK) Nr. 396/2005 ( 22 ), un pārbaudot atbilstību Regulai (ES) Nr. 619/2011.

▼B

2. pants

Paraugus analīzei sagatavo un rezultātus izsaka saskaņā ar metodēm, kas izklāstītas II pielikumā.

3. pants

Analīzes barības oficiālajai kontrolei veic, izmantojot metodes, kas izklāstītas III pielikumā (Analīzes metodes, lai kontrolētu barības līdzekļu un barības maisījumu sastāvu), IV pielikumā (Analīzes metodes, lai kontrolētu atļauto piedevu koncentrāciju barībā), V pielikumā (Analīzes metodes, lai kontrolētu nevēlamas vielas barībā) un VI pielikumā (Analīzes metodes, lai noteiktu dzīvnieku izcelsmes sastāvdaļas barības oficiālajai kontrolei).

4. pants

Mājputnu barības maisījumu enerģētisko vērtību aprēķina saskaņā ar VII pielikumu.

5. pants

VIII pielikumā izklāstītās analīzes metodes, lai kontrolētu vairs neatļautu piedevu nelikumīgu atrašanos barībā, izmanto apstiprināšanas nolūkos.

6. pants

Direktīvu 71/250/EEK, 71/393/EEK, 72/199/EEK, 73/46/EEK, 76/371/EEK, 76/372/EEK, 78/633/EEK, 81/715/EEK, 84/425/EEK, 86/174/EEK, 93/70/EEK, 93/117/EK, 98/64/EK, 1999/27/EK, 1999/76/EK, 2000/45/EK, 2002/70/EK un 2003/126/EK atceļ.

Atsauces uz atceltajām direktīvām uzskata par atsaucēm uz šo regulu un lasa saskaņā ar atbilstības tabulām IX pielikumā.

7. pants

Šī regula stājas spēkā divdesmitajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Savienības Oficiālajā Vēstnesī.

To piemēro no 2009. gada 26. augusta.

Šī regula uzliek saistības kopumā un ir tieši piemērojama visās dalībvalstīs.

▼M3









I PIELIKUMS

PARAUGU ŅEMŠANAS METODES

1. MĒRĶIS UN DARBĪBAS JOMA

Paraugus, kas paredzēti barības oficiālai kontrolei, ņem saskaņā ar turpmāk aprakstītajām metodēm. Šādi iegūtus paraugus uzskata par reprezentatīviem tā apjoma sastāvam, no kura tie ņemti.

Reprezentatīvas paraugu ņemšanas mērķis ir iegūt mazu daļiņu no partijas tādā veidā, ka jebkura konkrēta šīs daļiņas raksturlieluma noteikšana atainotu visas partijas raksturlieluma vidējo vērtību. Paraugu no partijas iegūst, dažādās atsevišķās partijas vietās atkārtoti ņemot elementārparaugus. Šos elementārparaugus apvieno sajaucot un izveidojot kopparaugu, no kura, reprezentatīvi sadalot, sagatavo reprezentatīvus gala paraugus.

Ja, vizuāli pārbaudot, kādas pārbaudāmās barības daļas kvalitatīvi atšķiras no pārējās barības tajā pašā partijā, šādas daļas atdala no pārējās barības un apstrādā kā atsevišķu apakšpartiju. Ja barību nav iespējams sadalīt atsevišķās apakšpartijās, to pārbauda kā vienu partiju. Šādos gadījumos to norāda paraugu ņemšanas pierakstos.

Ja barība, no kuras paraugi ņemti saskaņā ar šīs regulas noteikumiem, ir atzīta par ES prasībām neatbilstošu un ir daļa no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

2. DEFINĪCIJAS

— Partija : norādīts barības daudzums, kam ir kopīgi raksturlielumi, piemēram, izcelsme, veids, iesaiņojuma tips, fasētājs, izplatītājs vai marķējums, un – attiecībā uz ražošanas procesu – ražošanas vienība vienā un tajā pašā rūpnīcā, kas izmanto nemainīgus ražošanas parametrus, vai vairākas šādas vienības, ja šī barība tiek ražota nepārtrauktā secībā un uzglabāta kopā.

— Apjoms, no kura ņem paraugus : partija vai norādīta partijas vai apakšpartijas daļa.

— Aizplombēts paraugs : paraugs, kas ir noslēgts tādā veidā, lai nepieļautu piekļuvi paraugam, nesalaužot vai nenoņemot plombu.

— Elementārparaugs : daudzums, kas paņemts vienā punktā no apjoma, no kura ņem paraugu.

— Kopparaugs : visu elementārparaugu kopums, kas ņemti no viena un tā paša apjoma.

— Samazinātais paraugs : kopparauga daļa, kas no tā iegūta reprezentatīva samazinājuma procesā.

— Gala paraugs : samazinātā parauga daļa vai homogenizētā kopparauga daļa.

— Laboratorijas paraugs : paraugs, kas paredzēts laboratorijai (kāds saņemts laboratorijā) un kas var būt gala paraugs, samazinātais paraugs vai kopparaugs.

3. VISPĀRĪGI NOTEIKUMI

— Darbinieki, kuri ņem paraugus: paraugus ņem darbinieki, kurus kompetentās iestādes ir norīkojušas šā darba veikšanai.

— Paraugs jānoplombē tādā veidā, lai nepieļautu piekļuvi paraugam, nesalaužot vai nenoņemot plombu. Plombas apzīmējumam jābūt skaidri atpazīstamam un skaidri redzamam. Vai arī paraugu var ievietot tvertnē, kuru var aizvērt tādā veidā, lai to nevarētu atvērt, neglābjami nesabojājot tvertni vai trauku, tādējādi novēršot tvertnes vai trauka atkārtotu izmantošanu.

— Parauga identifikācija: paraugs neizdzēšami jāmarķē un jāidentificē tā, lai radītu nepārprotamu saikni ar parauga ņemšanas pierakstiem.

— No katra kopparauga paņem vismaz divus gala paraugus: vismaz vienu kontrolei (prasību izpildei) un vienu barības nozares uzņēmējam (aizstāvībai). Vajadzības gadījumā vienu gala paraugu var paņemt atsaucei. Ja viss kopparaugs ir homogenizēts, gala paraugus ņem no homogenizētā kopparauga, ja vien šāda procedūra nav pretrunā dalībvalsts noteikumiem par barības nozares uzņēmēja tiesībām.

4. IEKĀRTAS

4.1. Paraugu ņemšanas ierīcēm jābūt izgatavotām no materiāliem, kas nevar piesārņot paraugu ņemšanai izmantojamos produktus. Iekārtām, ko paredzēts izmantot vairākkārt, jābūt viegli tīrāmām, lai novērstu paraugu jebkādu savstarpēju piesārņošanu.

4.2. Iekārtas, ko iesaka cietās barības paraugu ņemšanai. 4.2.1. Manuāla paraugu ņemšana 4.2.1.1. Plakandibena lāpstiņa ar vertikālām malām. 4.2.1.2. Šķēpveida paraugu ņemšanas ierīce ar garu šķēlumu vai nodalījumiem. Šķēpveida paraugu ņemšanas ierīces izmēriem jāatbilst tā apjoma raksturlielumiem, no kura ņem paraugu, (konteinera dziļumam, maisa izmēriem utt.) un barības daļiņu lielumam. Ja šķēpveida paraugu ņemšanas ierīcei ir vairākas atveres, lai nodrošinātu, ka paraugu paņem dažādās vietās šķēpa garumā, atverēm jābūt atdalītām ar starpsienām vai pakāpienveidā izvietotām atverēm. 4.2.2. Mehāniska paraugu ņemšana Piemērotu mehānisku ierīci var izmantot, lai paņemtu paraugus no barības, kuru tajā brīdī pārvieto. Piemērota ierīce nozīmē to, ka, izmantojot to, paraugs tiek paņemts vismaz no visa plūsmas šķērsgriezuma. Paraugu ņemšanu no barības, kuru tajā brīdī pārvieto (lielā kustības ātrumā), var veikt ar automātiskām paraugu ņemšanas ierīcēm. 4.2.3. Sadalītājs Ja tas ir iespējams un lietderīgi, reprezentatīvai samazināto paraugu sagatavošanai izmanto ierīci, kas paredzēta paraugu sadalīšanai apmēram vienādās daļās.

5. KVANTITATĪVĀS PRASĪBAS ATTIECĪBĀ UZ ELEMENTĀRPARAUGU SKAITU

— Kvantitatīvās prasības, kas noteiktas 5.1. un 5.2. punktā attiecībā uz elementārparaugu skaitu, ir piemērojamas tādiem apjomiem, no kuriem ņem paraugus, kuri nepārsniedz 500 tonnu un no kuriem iespējams paņemt paraugus reprezentatīvā veidā. Iepriekš aprakstītā paraugu ņemšanas procedūra ir vienlīdz derīga arī daudzumiem, kas ir lielāki par noteikto maksimālo apjoma lielumu, no kura ņem paraugus, ja vien neņem vērā tabulā doto maksimālo elementārparaugu skaitu, elementārparaugu skaitu nosakot pēc kvadrātsaknes formulas, kas norādīta attiecīgajā procedūras daļā (sk. 5.3. punktu), un proporcionāli palielinot minimālo kopparauga lielumu. Tas neliedz lielu partiju sadalīt mazākās apakšpartijās un no katras apakšpartijas ņemt paraugus saskaņā ar 5.1. un 5.2. punktā aprakstīto procedūru.

— Apjoma lielumam, no kura ņem paraugus, jābūt tādam, lai varētu paņemt paraugu no katras tā daļas.

— Ļoti lielām partijām vai apakšpartijām (> 500 tonnu) un partijām, kuras pārvieto vai glabā tādā veidā, ka paraugu ņemšana nav iespējama saskaņā ar šīs nodaļas 5.1. un 5.2. punktā aprakstīto procedūru, jāpiemēro 5.3. punktā aprakstītā paraugu ņemšanas procedūra.

— Ja normatīvie akti nosaka, ka barības nozares uzņēmējam jāpakļaujas šai regulai saistībā ar obligātu uzraudzības sistēmu, barības nozares uzņēmējs pēc kompetentās iestādes atļaujas saņemšanas var atkāpties no šajā nodaļā paredzētajām kvantitatīvajām prasībām, lai ņemtu vērā darbības raksturlielumus, ja šis barības nozares uzņēmējs ir pierādījis kompetentajai iestādei paraugu ņemšanas procedūras atbilstību attiecībā uz reprezentativitāti.

— Izņēmuma gadījumos, ja aprakstīto paraugu ņemšanas metodi nav iespējams īstenot attiecībā uz kvantitatīvajām prasībām partijas nepieļaujamas komerciālas sabojāšanas dēļ (iesaiņojuma veida, transportēšanas veida, glabāšanas veida utt. dēļ), var izmantot paraugu ņemšanas alternatīvu metodi, ja vien tā ir pēc iespējas reprezentatīvāka un tiek pilnībā aprakstīta un dokumentēta.

5.1. Kvantitatīvās prasības elementārparaugiem attiecībā uz tādu vielu vai produktu kontroli, kas vienmērīgi sadalīti visā barībā

5.1.1. Neiesaiņota cietā barība







Apjoma lielums, no kura ņem paraugu Elementārparaugu skaita minimums ≤ 2,5 tonnas 7 > 2,5 tonnas √ 20 reiz tonnu skaits, kas veido apjomu, no kura ņem paraugus (1), līdz 40 elementārparaugiem (1) Ja iegūtais skaitlis ir daļskaitlis, to noapaļo līdz tuvākajam veselajam skaitlim.

5.1.2. Neiesaiņota šķidrā barība







Apjoma lielums, no kura ņem paraugu Elementārparaugu skaita minimums ≤ 2,5 tonnas vai ≤ 2 500 litru 4 (1) > 2,5 tonnas vai > 2 500 litru 7 (1) (1) Ja nav iespējams šķidrumu padarīt homogēnu, elementārparaugu skaits jāpalielina.

5.1.3. Iesaiņota barība

Barība (cietā un šķidrā) var būt iesaiņota somās, maisos, burkās, mucās utt., kuras tabulā apzīmētas kā vienības. No lielām vienībām (≥ 500 kg vai litru) paraugi jāņem saskaņā ar neiesaiņotai barībai paredzētajiem noteikumiem (sk. 5.1.1. un 5.1.2. punktu).







Apjoma lielums, no kura ņem paraugu Vienību skaita minimums, no kura jāņem (vismaz) viens elementārparaugs (1) no 1 līdz 20 vienību 1 vienība (2) no 21 līdz 150 vienību 3 vienības (2) no 151 līdz 400 vienību 5 vienības (2) > 400 vienību ¼ no kvadrātsaknes no to vienību skaita, kas veido apjomu, no kura ņem paraugus (3), līdz 40 elementārparaugiem (1) Gadījumā, ja vienības atvēršana var ietekmēt analīzi (piemēram, ātrbojīgas mitras barības gadījumā), elementārparaugs ir neatvērtā vienība. (2) Attiecībā uz vienībām, kuru saturs nepārsniedz 1 kg vai vienu litru, elementārparaugs ir vienas oriģinālās vienības saturs. (3) Ja iegūtais skaitlis ir daļskaitlis, to noapaļo līdz tuvākajam veselajam skaitlim.

5.1.4. Barības bloki un minerālvielu briketes

Par paraugu jāņem vismaz viens bloks vai brikete no apjoma, no kura ņem paraugu un kas sastāv no 25 vienībām, lielākais daudzums ir četri bloki.

Attiecībā uz blokiem vai briketēm, kuru svars nepārsniedz 1 kg, elementārparaugs ir viena bloka vai briketes saturs.

5.1.5. Rupja barība/lopbarība







Apjoma lielums, no kura ņem paraugu Elementārparaugu skaita minimums (1) ≤ 5 tonnas 5 > 5 tonnas √ 5 reiz tonnu skaits, kas veido apjomu, no kura ņem paraugus (2), līdz 40 elementārparaugiem (1) Ir atzīts, ka noteiktās situācijās (piemēram, skābbarība) nav iespējams paņemt vajadzīgos elementārparaugus, neradot partijai nepieļaujamus bojājumus. Šādās situācijās var piemērot paraugu ņemšanas alternatīvu metodi, un norādes paraugu ņemšanai no šādām partijām tiks izstrādātas pirms šīs regulas stāšanās spēkā. (2) Ja iegūtais skaitlis ir daļskaitlis, to noapaļo līdz tuvākajam veselajam skaitlim.

5.2. Kvantitatīvās prasības elementārparaugiem attiecībā uz tādu sastāvdaļu vai vielu kontroli, kuras varētu būt nevienmērīgi sadalītas barībā

Šīs kvantitatīvās prasības attiecībā uz elementārparaugiem izmantojamas šādās situācijās:

— aflatoksīnu, rudzu melno graudu, citu mikotoksīnu un kaitīgu botānisku piemaisījumu kontrole barības līdzekļos,

— savstarpējas piesārņošanās kontrole ar kādu sastāvdaļu, ieskaitot ģenētiski modificētu materiālu, vai vielu, kura varētu būs nevienmērīgi sadalīta barības līdzekļos.

Ja kontroles iestādei ir nopietnas aizdomas, ka šāda nevienmērīga izplatība ir arī savstarpējas piesārņošanās gadījumā ar kādu sastāvdaļu vai vielu barības maisījumos, var piemērot kvantitatīvās prasības, kas paredzētas tabulā.







Apjoma lielums, no kura ņem paraugu Elementārparaugu skaita minimums < 80 tonnu Skatīt kvantitatīvās prasības 5.1. punktā. Ņemamo elementārparaugu skaits jāreizina ar 2,5. ≥ 80 tonnu 100

5.3. Kvantitatīvās prasības attiecībā uz elementārparaugiem ļoti lielu partiju gadījumā

Attiecībā uz ļoti lieliem apjomiem, no kuriem ņem paraugus (apjomi > 500 tonnu), ņemamo elementārparaugu skaits = 40 elementārparaugu + √ tonnu skaita attiecībā uz tādu vielu vai produktu kontroli, kas vienmērīgi izplatīti visā barībā, vai 100 elementārparaugu + √ tonnu skaita attiecībā uz tādu sastāvdaļu vai vielu kontroli, kas varētu būt nevienmērīgi izplatītas barības līdzekļos.

6. KVANTITATĪVĀS PRASĪBAS ATTIECĪBĀ UZ KOPPARAUGU







Vajadzīgs viens kopparaugs uz apjomu, no kura ņem paraugus. Barības veids Kopparauga minimālais lielums (1) (2) 6.1. Neiesaiņota barība 4 kg 6.2. Iesaiņota barība 4 kg (3) 6.3. Šķidrā vai pusšķidrā barība 4 litri 6.4. Barības bloki vai minerālvielu briketes, 6.4.1. kas katrs sver vairāk nekā 1 kg 4 kg 6.4.2. kas katrs sver ne vairāk nekā 1 kg četru oriģinālo bloku vai brikešu svars 6.5. Rupja barība/lopbarība 4 kg (4) (1) Ja barība, no kuras ņem paraugus, ir vērtīga, var ņemt mazāku kopparauga daudzumu, ja vien to skaidri apraksta un dokumentē paraugu ņemšanas pierakstos. (2) Saskaņā ar Komisijas 2011. gada 24. jūnija Regulu (ES) Nr. 619/2011, ar ko nosaka paraugu ņemšanas un analīzes metodes barības oficiālajai kontrolei attiecībā uz tāda ģenētiski modificēta materiāla klātbūtni, kura atļaujas piešķiršanas procedūra nav pabeigta vai kura atļaujas termiņš ir beidzies (OV L 166, 25.6.2011., 9. lpp.), kopparaugam ģenētiski modificēta materiāla klātbūtnes kontrolei jāsatur vismaz 35 000 sēklu/graudu. Tas nozīmē, ka kukurūzai kopparauga lielumam jābūt vismaz 10,5 kg un sojas pupiņām – vismaz 7 kg. Citām sēklām un graudiem, piemēram, miežiem, prosai, auzām, rīsiem, rudziem, kviešiem un rapšiem, 4 kg kopparaugs atbilst vairāk nekā 35 000 sēklu. (3) Iesaiņotas barības gadījumā var arī nebūt iespējams sasniegt kopparauga lielumu 4 kg atkarībā no atsevišķo vienību lieluma. (4) Rupjas barības vai lopbarības ar zemu īpatsvaru (piemēram, sienu, salmiem) gadījumā kopparauga lielumam jābūt vismaz 1 kg.

7. KVANTITATĪVĀS PRASĪBAS ATTIECĪBĀ UZ GALA PARAUGIEM

Gala paraugi

Jāveic vismaz viena gala parauga analīze. Daudzums analīzei paredzētajā gala paraugā nedrīkst būt mazāks par turpmāk norādīto.







Cieta barība 500 g (1) (2) (3) Šķidrā vai pusšķidrā barība 500 ml (1) (1) Saskaņā ar Regulas (ES) Nr. 619/2011 noteikumiem gala paraugam ģenētiski modificēta materiāla klātbūtnes kontrolei jāsatur vismaz 10 000 sēklu/graudu. Tas nozīmē, ka kukurūzai gala parauga lielumam jābūt vismaz 3 000 g un sojas pupiņām – vismaz 2 000 g. Citām sēklām un graudiem, piemēram, miežiem, prosai, auzām, rīsiem, rudziem, kviešiem un rapšiem, 500 g gala paraugs atbilst vairāk nekā 10 000 sēklu. (2) Ja kopparauga lielums ir ievērojami mazāks par 4 kg vai litriem (sk. 6. punkta zemsvītras piezīmes), var ņemt mazāku daudzumu arī gala paraugā, ja vien to skaidri apraksta un dokumentē paraugu ņemšanas pierakstos. (3) Ja paraugus ņem no pākšaugiem, graudaugiem un koku riekstiem pesticīdu atlieku noteikšanai, minimālais gala parauga lielums ir 1 kg saskaņā ar Komisijas Direktīvas Nr. 2002/63/EK (OV L 187, 16.7.2002., 30. lpp.) noteikumiem.

8. PARAUGU ŅEMŠANAS METODE ĻOTI LIELĀM PARTIJĀM VAI PARTIJĀM, KO GLABĀ VAI TRANSPORTĒ TĀDĀ VEIDĀ, KA PARAUGU ŅEMŠANA VISĀ PARTIJĀ NAV IESPĒJAMA

8.1. Vispārīgi principi

Ja partijas transportēšanas vai glabāšanas veids neļauj paņemt elementārparaugus no visas partijas, paraugu ņemšana no šādām partijām pēc iespējas jāveic, kad partija ir kustībā.

Attiecībā uz lielām noliktavām, kas paredzētas barības glabāšanai, to operatori jāmudina uzstādīt noliktavā iekārtas, kas ļauj automātiski paņemt paraugus no visas glabātās barības.

Ja piemēro šeit 8. nodaļā paredzētās paraugu ņemšanas procedūras, barības nozares uzņēmēju vai tā pārstāvi informē par paraugu ņemšanas procedūru. Ja barības nozares uzņēmējs vai tā pārstāvis apšauba šo paraugu ņemšanas procedūru, tad barības nozares uzņēmējs par saviem līdzekļiem nodrošina iespēju kompetentajai iestādei paņemt paraugus no visas partijas.

8.2. Lielas partijas, ko pārvadā ar kuģi

8.2.1. Dinamiska paraugu ņemšana no lielām partijām, ko pārvadā ar kuģi

Paraugu ņemšanu no lielām partijām kuģos vēlams veikt, kamēr produkts ir kustībā (dinamiskā paraugu ņemšana).

Paraugu ņemšana jāveic no katra kausa (vienības, ko iespējams fiziski nodalīt). Kausus tomēr iztukšo daļēji citu pēc cita tā, ka pēc pārvietošanas uz glabāšanas telpām sākotnējais fiziskais dalījums vairs nepastāv. Paraugu ņemšanu tāpēc var veikt sākotnējās fiziskās nodalīšanas darbības laikā vai nodalīšanas laikā pēc pārvietošanas uz glabāšanas telpām.

Kuģa izkraušana var ilgt vairākas dienas. Parasti paraugu ņemšana jāveic regulāri visas izkraušanas laikā. Tomēr ne vienmēr ir iespējams vai ir piemēroti oficiālam inspektoram būt klāt paraugu ņemšanai visu izkraušanas darbību laiku. Tāpēc ir pieļaujams paraugu ņemšanu veikt no visas partijas daļas (no apjoma, no kura ņem paraugus). Elementārparaugu skaitu nosaka, ņemot vērā tā apjoma lielumu, no kura ņem paraugus.

Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

Pat ja oficiālos paraugus ņem automātiski, nepieciešama inspektora klātbūtne. Tomēr gadījumā, ja automātisko paraugu ņemšanu veic ar iepriekš iestatītiem parametriem, kurus paraugu ņemšanas laikā nevar mainīt, un elementārparaugus savāc aizzīmogotā tvertnē, novēršot jebkādu iespējamu krāpšanu, tad inspektora klātbūtne nepieciešama tikai paraugu ņemšanas sākumā, katru reizi, kad jāmaina paraugu tvertne, un paraugu ņemšanas beigās.

8.2.2. Paraugu ņemšana no kuģī pārvadātām partijām ar statisko paraugu ņemšanu

Ja paraugu ņemšanu veic statiski, jāpiemēro tāda pati procedūra, kāda paredzēta glabāšanas telpām (tvertnēm), kurām var piekļūt no augšas (sk. 8.4.1. punktu).

Paraugu ņemšana jāveic partijas/kausa pieejamajā daļā (no augšas). Elementārparaugu skaitu nosaka, ņemot vērā tā apjoma lielumu, no kura ņem paraugus. Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

8.3. Paraugu ņemšana no lielām partijām, ko glabā noliktavās

Paraugu ņemšana jāveic partijas pieejamajā daļā. Elementārparaugu skaitu nosaka, ņemot vērā tā apjoma lielumu, no kura ņem paraugus. Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

8.4. Paraugu ņemšana no glabāšanas vietām (silosiem)

8.4.1. Paraugu ņemšana no silosiem, kuriem var (viegli) piekļūt no augšas

Paraugu ņemšana jāveic partijas pieejamajā daļā. Elementārparaugu skaitu nosaka, ņemot vērā tā apjoma lielumu, no kura ņem paraugus. Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

8.4.2. Paraugu ņemšana no silosiem, kuriem nevar piekļūt no augšas (slēgtiem silosiem)

8.4.2.1. Silosi, kuriem nevar piekļūt no augšas (slēgti silosi) ar lielumu > 100 tonnu

No šādos silosos glabātas barības nav iespējams paņemt paraugus statiski. Tāpēc gadījumā, ja no barības šādā silosā jāņem paraugi un nav iespējas šo sūtījumu pārvietot, jāvienojas ar uzņēmēju, ka tam jāinformē inspektors par to, kad šis siloss tiks izkrauts, lai varētu veikt paraugu ņemšanu, kad barība būs kustībā.

8.4.2.2. Silosi, kuriem nevar piekļūt no augšas (slēgti silosi) ar lielumu < 100 tonnu

Paraugu ņemšana nozīmē to, ka kādā tvertnē ieber 50 līdz 100 kg barības un ņem paraugus no šā daudzuma. Šāds kopparauga lielums atbilst visai partijai, un elementārparaugu skaits attiecas uz daudzumu silosā, no kura barība iebērta traukā paraugu ņemšanai. Ja paraugus ņem no daļas no tās pašas kategorijas vai apraksta barības partijas un konstatē, ka šī partijas daļa neatbilst ES prasībām, tad uzskata, ka šādi trūkumi piemīt visai barībai šajā partijā, izņemot gadījumu, ja pēc sīka izvērtējuma nav atrasti pierādījumi, ka pārējā partijas daļa neatbilst ES prasībām.

8.5. Paraugu ņemšana no neiesaiņotas barības lielos, slēgtos traukos

No šādām partijām paraugus bieži vien var paņemt tikai tad, kad tās izkrauj. Noteiktos gadījumos nav iespējams tās izkraut ievešanas vai kontroles brīdī, tāpēc paraugu ņemšana jāveic tad, kad šādus konteinerus izkrauj.

9. INSTRUKCIJAS PARAUGU ŅEMŠANAI, SAGATAVOŠANAI UN IESAIŅOŠANAI

9.1. Vispārīga informācija

Paraugi jāņem un jāsagatavo bez liekas kavēšanās, ievērojot piesardzību, kas vajadzīga, lai nodrošinātu, ka produkts netiek nedz mainīts, nedz piesārņots. Instrumentiem, tāpat arī virsmām un paraugiem paredzētajiem traukiem jābūt tīriem un sausiem.

9.2. Elementārparaugi

Elementārparaugi jāņem izlases veidā no visa apjoma, no kura ņem paraugu, un tiem jābūt aptuveni vienāda lieluma.

Elementārparauga lielums ir vismaz 100 gramu vai 25 grami rupjai barībai vai lopbarībai ar zemu īpatsvaru.

Gadījumā, ja saskaņā ar noteikumiem par paraugu ņemšanas procedūru, kas paredzēti 8. punktā, jāņem mazāk nekā 40 elementārparaugu, elementārparaugu lielumu nosaka atkarībā no kopparauga vajadzīgā lieluma (skatīt 6. punktu).

Gadījumā, ja ņem paraugus no mazām iesaiņotas barības partijām, kur saskaņā ar kvantitatīvajām prasībām jāņem ierobežots elementārparaugu skaits, elementārparaugs ir vienas oriģinālās vienības saturs, kuras saturs nepārsniedz 1 kg vai vienu litru.

Ņemot paraugus no iesaiņotas barības, ko veido mazas vienības (piemēram, < 250 g), elementārparauga lielums ir atkarīgs no vienības lieluma.

9.2.1. Neiesaiņota barība

Attiecīgā gadījumā paraugu var ņemt laikā, kad apjomu, no kura jāņem paraugs, pārvieto (iekrauj vai izkrauj).

9.2.2. Iesaiņota barība

Pēc tam, kad izraudzīts 5. nodaļā norādītais paraugu ņemšanai vajadzīgais vienību skaits, ar šķēpveida ierīci vai lāpstiņu paņem daļu no katras vienības satura. Vajadzības gadījumā paraugus var ņemt pēc tam, kad katra vienība atsevišķi ir iztukšota.

9.2.3. Homogēna vai homogenizējama šķidrā vai pusšķidrā barība

Pēc tam, kad izraudzīts 5. nodaļā norādītais paraugu ņemšanai vajadzīgais vienību skaits, to saturu vajadzības gadījumā homogenizē un paņem noteiktu daudzumu no katras vienības.

Elementārparaugus var ņemt laikā, kad saturu ņem laukā no traukiem.

9.2.4. Nehomogenizējama šķidrā vai pusšķidrā barība

Pēc tam, kad izraudzīts 5. nodaļā norādītais paraugu ņemšanai vajadzīgais vienību skaits, paraugus paņem no dažādiem līmeņiem.

Paraugus var arī ņemt laikā, kad saturu ņem laukā no traukiem, bet pirmās frakcijas izmet.

Abos gadījumos kopējam paņemtajam tilpumam jābūt ne mazākam kā 10 litri.

9.2.5. Barības bloki un minerālvielu briketes

Pēc tam, kad izraudzīts 5. nodaļā norādītais paraugu ņemšanai vajadzīgais vienību skaits, paraugus ņem no katra bloka vai briketes. Ja pastāv aizdomas, ka bloks vai brikete nav homogēna, par paraugu var ņemt visu bloku vai briketi.

Attiecībā uz blokiem vai briketēm, kuru svars nepārsniedz 1 kg, elementārparaugs ir viena bloka vai briketes saturs.

9.3. Kopparaugu sagatavošana

Elementārparaugus samaisa, lai izveidotu vienu kopparaugu.

9.4. Gala paraugu sagatavošana

Materiālu katrā kopparaugā rūpīgi samaisa ( 23 ).

— Katru paraugu ievieto piemērotā traukā vai tvertnē. Veic visus vajadzīgos piesardzības pasākumus, lai novērstu jebkādas paraugu satura izmaiņas, to piesārņošanu vai atšķaidīšanu, kas varētu rasties pārvadāšanas vai uzglabāšanas laikā.

— Visā barībā vienmērīgi sadalītu sastāvdaļu vai vielu kontroles gadījumā kopparaugu var reprezentatīvi samazināt līdz vismaz 2,0 kg vai 2,0 litriem (samazinātais paraugs) ( 24 ), vēlams, izmantojot mehānisko vai automātisko sadalītāju. Pesticīdu atlieku klātbūtnes kontrolei pākšaugos, graudaugos un koku riekstos samazinātā parauga lieluma minimums ir 3 kg. Ja barības veids nepieļauj dalītāja lietošanu vai ja dalītājs nav pieejams, paraugu var samazināt ar kvartēšanas metodi. No samazinātajiem paraugiem tad sagatavo aptuveni vienāda lieluma gala paraugus (kontrolei, aizstāvībai un atsaucei), kuri atbilst 7. nodaļā norādītajām kvantitatīvajām prasībām. Sastāvdaļu kontroles gadījumā, ieskaitot ģenētiski modificētu materiālu, vai tādu vielu kontroles gadījumā, kuras varētu būt nevienmērīgi sadalītas barības līdzekļos, ar kopparaugu rīkojas šādi: — — pilnīgi homogenizē un pēc tam sadala gala paraugos vai — samazina līdz vismaz 2 kg vai 2 litriem ( 25 ), izmantojot mehānisko vai automātisko dalītāju. Tikai tādā gadījumā, ja barības veids nepieļauj dalītāja lietošanu, paraugu nepieciešamības gadījumā var samazināt ar kvartēšanas metodi. Ģenētiski modificēta materiāla klātbūtnes kontrolei atbilstīgi Regulas (ES) Nr. 619/2011 noteikumiem samazinātajam paraugam jāsatur vismaz 35 000 sēklu/graudu, lai varētu iegūt gala paraugus prasību izpildei, aizstāvībai un atsaucei vismaz 10 000 sēklu/graudu apjomā (skatīt zemsvītras piezīmi (**) 6. nodaļā un zemsvītras piezīmi (*) 7. nodaļā).

9.5. Paraugu iesaiņošana

Traukus vai pakas aizplombē un uz tiem uzliek etiķetes tā, lai tos nevarētu atvērt, nesabojājot plombu. Visa etiķete jāiestrādā plombā.

9.6. Paraugu nosūtīšana uz laboratoriju

Paraugu pēc iespējas drīzāk nosūta pilnvarotajai analīžu laboratorijai, līdzi nosūtot arī laborantam vajadzīgo informāciju.

10. PARAUGU ŅEMŠANAS PIERAKSTI

Par katru paraugu jāveic pieraksti, kas ļauj nepārprotami identificēt katru apjomu, no kura paņemts paraugs, un tā lielumu.

Šajos pierakstos jānorāda arī jebkuras atkāpes no šajā regulā paredzētās paraugu ņemšanas procedūras.

Papildus šo pierakstu nodošanai oficiālajai kontroles laboratorijai, pierakstus nodod barības nozares uzņēmējam un/vai barības nozares uzņēmēja norādītajai laboratorijai.









II PIELIKUMS

VISPĀRĪGI NOTEIKUMI PAR BARĪBAS ANALĪZES METODĒM

A. PARAUGU SAGATAVOŠANA ANALĪZEI

1. Mērķis

Turpmāk aprakstītā procedūra attiecas uz tādu paraugu sagatavošanu analīzei, kuri nosūtīti uz kontroles laboratoriju pēc paraugu ņemšanas saskaņā ar I pielikumā paredzētajiem noteikumiem.

Laboratorijas paraugi jāsagatavo tā, lai analīzes metodēs noteiktie iesvara daudzumi būtu homogēni un gala paraugiem reprezentatīvi.

2. Piesardzības pasākumi, kas jāievēro

Paraugu sagatavošanas procedūra, kas jāievēro, ir atkarīga no tā, kādas analīzes metodes tiks izmantotas un kādas sastāvdaļas vai vielas tiks kontrolētas. Tāpēc ir ārkārtīgi svarīgi nodrošināt, lai ievērotā paraugu sagatavošanas procedūra būtu atbilstoša izmantotajai analīzes metodei un nosakāmajām sastāvdaļām vai vielām.

Visas vajadzīgās darbības jāveic tā, lai pēc iespējas izvairītos no parauga piesārņošanas un novērstu izmaiņas tā sastāvā.

Lai pēc iespējas samazinātu gaisa un gaismas iedarbību uz paraugiem, to samalšanu, samaisīšanu un sijāšanu veic nekavējoties. Neizmanto dzirnavas un dzirnaviņas, kurās paraugs var jūtami sakarst.

Barību, kas ir īpaši jutīga pret karstumu, ieteicams samalt manuāli. Veic arī visu iespējamo, lai nodrošinātu, ka pašas ierīces nepiesārņo paraugu.

Ja paraugu nevar sagatavot, ievērojami nemainot mitruma saturu tajā, tad mitruma saturu nosaka pirms un pēc parauga sagatavošanas atbilstoši III pielikuma A daļā noteiktajai metodei.

3. Procedūra

3.1. Vispārīga procedūra

Apakšparaugus ņem no gala parauga. Dalīšana konusā un kvartēšana nav ieteicama, jo tad apakšparaugos var būt augsta šķelšanas kļūda.

3.1.1. Barība, ko var samalt dabīgā stāvoklī

— Izsijāto gala paraugu samaisa un savāc piemērotā tīrā, sausā un hermētiski noslēdzamā traukā. Lai nodrošinātu pilnīgu homogenizāciju, paraugu vēlreiz samaisa tieši pirms iesvara ņemšanas analīzēm (apakšparauga ņemšanas).

3.1.2. Barība, ko var samalt pēc kaltēšanas

— Ja analīzes metodēs nav noteikts citādi, tad gala paraugu izkaltē atbilstoši sākotnējās kaltēšanas procedūrai, kas aprakstīta 4.3. punktā III pielikuma A daļā minētajā mitruma noteikšanas metodē, līdz tā mitruma saturs samazinās un sasniedz 8–12 %. Pēc tam rīkojas, kā noteikts 3.1.1. punktā.

3.1.3. Šķidrā vai pusšķidrā barība

— Gala paraugu savāc piemērotā tīrā, sausā un hermētiski noslēdzamā traukā. Lai nodrošinātu pilnīgu homogenizāciju, paraugu rūpīgi samaisa tieši pirms iesvara ņemšanas analīzēm (apakšparauga ņemšanas).

3.1.4. Cita barība

— Gala paraugus, kurus nevar sagatavot atbilstoši kādai no iepriekšminētajām procedūrām, apstrādā, izmantojot jebkuru citu procedūru, ar kuru var nodrošināt, lai analīzēm ņemtais iesvars (apakšparaugs) būtu homogēns un gala paraugiem reprezentatīvs.

3.2. Īpaša procedūra gadījumos, kad pārbaudi veic, vizuāli apskatot vai ar mikroskopu, vai gadījumos, kad viss kopparaugs ir homogenizēts

— Ja pārbaudi veic, vizuāli apskatot (neizmantojot mikroskopu), pārbaudei izmanto visu laboratorijas paraugu.

— Ja pārbaudi veic ar mikroskopu, laboratorija var samazināt kopparaugu vai tālāk samazināt samazināto paraugu. Gala paraugus aizstāvības un, attiecīgā gadījumā, atsauces vajadzībām ņem, ievērojot procedūru, kas līdzvērtīga prasību izpildei izmantotā gala parauga ņemšanā izmantotajai procedūrai.

— Gadījumā, ja viss kopparaugs ir homogenizēts, gala paraugus ņem no homogenizētā kopparauga.

4. Paraugu glabāšana

Paraugi jāuzglabā temperatūrā, kurā nemainās to sastāvs. Paraugus, kuros paredzēts analizēt vitamīnus vai vielas, kas ir īpaši jutīgas pret gaismu, uzglabā tādos apstākļos, lai paraugam nekaitētu gaisma.

B. NOTEIKUMI ATTIECĪBĀ UZ REAĢENTIEM UN IERĪCĒM, KO IZMANTO ANALĪZES METODĒS

1. Ja vien analīzes metodēs nav noteikts citādi, tad visiem analītiskajiem reaģentiem jābūt analītiski tīriem (a. t.). Nosakot mikroelementus, reaģentu tīrība jāpārbauda ar tukšo analīzi. Atkarībā no iegūtajiem rezultātiem var būt vajadzīga reaģentu papildu attīrīšana.

2. Visās darbībās, kas ietver šķīdumu gatavošanu, atšķaidīšanu, skalošanu vai mazgāšanu un kas analīzes metodēs minētas, nenorādot izmantojamo šķīdinātāju vai atšķaidītāju, jālieto ūdens. Parasti izmanto demineralizētu vai destilētu ūdeni. Atsevišķos gadījumos, kas norādīti analīzes metodēs, ūdens attīrīšanai izmanto īpašas procedūras.

3. Ņemot vērā kontroles laboratoriju standarta aprīkojumu, analīzes metodēs norādīti tikai specifiski instrumenti un ierīces vai to īpašs izmantošanas veids. Tiem jābūt tīriem, īpaši gadījumos, kad jānosaka ļoti mazi vielu daudzumi.

C. ANALĪZES METOŽU PIEMĒROŠANA UN REZULTĀTU IZTEIKŠANA

1. Ekstrahēšanas procedūra

Vairākas metodes nosaka specifisku ekstrahēšanas procedūru. Parasti var izmantot citu ekstrahēšanas procedūru, kas nav minēta konkrētajā metodē, ja ir pierādīts, ka izmantotajai ekstrahēšanas procedūrai ir tāda pati ekstrahēšanas efektivitāte kā metodē minētajai procedūrai.

2. Attīrīšanas procedūra

Vairākas metodes nosaka specifisku attīrīšanas procedūru. Parasti var izmantot citu attīrīšanas procedūru, kas nav minēta konkrētajā metodē, ja ir pierādīts, ka izmantotā attīrīšanas procedūra dod tādus pašus analīžu rezultātus kā metodē minētā procedūra.

3. Noteikšanu skaits

Nevēlamu vielu analīzes gadījumā, ja pirmajā noteikšanā rezultāts ir ievērojami (> 50 %) zemāks nekā kontrolējamā specifikācija, nav vajadzīgs veikt papildu noteikšanu, ja vien tiek piemērotas atbilstošas kvalitātes procedūras. Citos gadījumos nepieciešama otrreizēja analīze (otra noteikšana), lai izslēgtu iekšējas savstarpējas piesārņošanas iespēju vai paraugu nejaušu samainīšanu. Atbilstības pārbaudei izmanto divu noteikšanu vidējo vērtību, ņemot vērā mērījumu neprecizitāti.

Ja kontrolē vielas vai sastāvdaļas deklarēto saturu un pirmajā noteikšanā rezultāts apstiprina deklarēto saturu, t. i., analīzes rezultāts atbilst pieņemamajam deklarētā satura variāciju diapazonam, tad nav vajadzīgs veikt papildu noteikšanu, ja piemēro atbilstošas kvalitātes procedūras. Citos gadījumos nepieciešama otrreizēja analīze (otra noteikšana), lai izslēgtu iekšējas savstarpējas piesārņošanas iespēju vai paraugu nejaušu samainīšanu. Atbilstības pārbaudei izmanto divu noteikšanu vidējo vērtību, ņemot vērā mērījumu neprecizitāti.

Dažos gadījumos minētais pieņemamais variāciju diapazons ir noteikts tiesību aktos, piemēram, Eiropas Parlamenta un Padomes 2009. gada 13. jūlija Regulā (EK) Nr. 767/2009 par barības laišanu tirgū un lietošanu un ar ko groza Eiropas Parlamenta un Padomes Regulu (EK) Nr. 1831/2003 un atceļ Padomes Direktīvu 79/373/EEK, Komisijas Direktīvu 80/511/EEK, Padomes Direktīvas 82/471/EEK, 83/228/EEK, 93/74/EEK, 93/113/EK un 96/25/EK un Komisijas Lēmumu 2004/217/EK ( 26 ).

4. Ziņošana par izmantoto analīzes metodi

Analīzes ziņojumā norāda izmantoto analīzes metodi.

5. Ziņošana par analīžu rezultātiem

Analīžu rezultātu izsaka veidā, kas noteikts analīzes metodē, līdz attiecīgam būtisko skaitļu skaitam un vajadzības gadījumā koriģē līdz mitruma saturam, kas gala paraugam bija pirms sagatavošanas.

6. Mērījumu neprecizitāte un atgūstamības procents nevēlamu vielu analīzes gadījumā

Attiecībā uz nevēlamām vielām Direktīvas 2002/32/EK nozīmē dzīvnieku barībai paredzētu produktu uzskata par neatbilstīgu šo vielu noteiktajam maksimāli pieļaujamam saturam, ja pēc analīžu rezultātiem, attiecinot uz barību ar mitruma saturu 12 %, secina, ka minēto vielu maksimāli pieļaujamais saturs ir pārsniegts, ņemot vērā mērījumu paplašināto neprecizitāti un atgūstamības korekciju. Lai novērtētu analīzes rezultātā iegūtās vielas koncentrācijas daudzuma atbilstību, to koriģē atbilstoši atgūstamības rādītājam un samazina atbilstoši mērījumu paplašinātās neprecizitātes koeficientam. Šo procedūru piemēro tikai tad, ja saskaņā ar analīzes metodi ir iespējams aplēst mērījumu neprecizitāti un atgūstamības korekciju (piemēram, to nav iespējams izmantot mikroskopiskā analīzē).

Analīžu rezultātus paziņo šādi (ciktāl izmantotā analīzes metode ļauj aplēst mērījumu neprecizitāti un atgūstamības procentu):

a) ar atgūstamības korekciju, norādot atgūstamības līmeni; atgūstamības korekcija nav vajadzīga, ja atgūstamības procents ir 90–110 %;

b) kā “x +/– U”, kur x ir analīzes rezultāts un U – mērījumu paplašinātās neprecizitātes procents, izmantojot pārklāšanās koeficientu 2, kas nodrošina aptuveni 95 % ticamības pakāpi.

Tomēr, ja analīzes rezultāts ir ievērojami (> 50 %) zemāks nekā kontrolējamā specifikācija un ja piemēro atbilstošas kvalitātes procedūras un analīzes nolūks ir tikai pārbaudīt atbilstību tiesību normām, tad analīžu rezultātu var paziņot bez atgūstamības korekcijas un minētajos gadījumos var neziņot par atgūstamības procentu un mērījumu neprecizitāti.

▼B









III PIELIKUMS

ANALĪZES METODES, LAI KONTROLĒTU BARĪBAS LĪDZEKĻU UN BARĪBAS MAISĪJUMU SASTĀVU

A. MITRUMA NOTEIKŠANA

1. Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt mitruma saturu barībā. Ja barība satur gaistošas vielas, piemēram, organiskās skābes, tad jāievēro, ka kopā ar mitruma saturu nosaka arī ievērojamu daudzumu gaistošo vielu.

Tā neietver piena produktu kā barības līdzekļu analīzi, minerālvielu un galvenokārt no minerālvielām sastāvošu maisījumu analīzi, dzīvnieku un augu tauku un eļļu un eļļas augu sēklu un augļu analīzi.

2. Princips

Paraugu žāvē norādītajos apstākļos, kas mainās atkarībā no barības īpašībām. Svara zudumu nosaka sverot. Ja analizē cietu barību, kurai ir augsts mitruma saturs, tad jāveic sākotnējā kaltēšana.

3. Ierīces

3.1. Drupinātājs no materiāla, kas neabsorbē mitrumu un ir viegli tīrāms, ļauj ātri un vienmērīgi sasmalcināt produktu, būtiski to nesakarsējot, un, cik iespējams, novērš saskari ar apkārtējo gaisu, kā arī atbilst 4.1.1. un 4.1.2. punktā minētajām prasībām (piemēram, āmurdzirnaviņas vai āmurdzirnaviņas ar ūdens dzesēšanu, saliekamās konusveida dzirnaviņas, palēninātu apgriezienu vai zobratu rupja maluma dzirnaviņas).

3.2. Analītiskie svari ar precizitāti līdz 1 mg.

3.3. Sausi konteineri no nerūsējoša metāla vai stikla ar vākiem, kas nodrošina hermētisku noslēgšanu; darba virsma, kas ļauj izklāt testa paraugu aptuveni 0,3 g/cm2 slānī.

3.4. Elektriskā izotermiskā krāsns (± 2 oC), kas tiek pienācīgi ventilēta un nodrošina iespēju ātri regulēt temperatūru ( 27 ).

3.5. Regulējams elektriskais vakuumžāvēšanas skapis, kas aprīkots ar eļļas sūkni un vai nu ar mehānismu karsta, sausa gaisa ievadīšanai, vai ar vielu, kas uzsūc mitrumu (piemēram, kalcija oksīdu).

3.6. Eksikators ar biezu, perforētu metāla vai porcelāna plāksni, kurā ir viela, kas efektīvi uzsūc mitrumu.

4. Procedūra

N.B.! Šajā iedaļā aprakstītās darbības jāveic tūlīt pēc paraugu iesaiņojumu atvēršanas. Analīzes jāatkārto vismaz divas reizes.

4.1. Sagatavošana

4.1.1. Barība, izņemot to, kas minēta 4.1.2. un 4.1.3. punktā

Ņem vismaz 50 g parauga. Vajadzības gadījumā sasmalcina vai sadala tā, lai novērstu mitruma satura izmaiņas (skatīt 6. punktu).

4.1.2. Labība un putraimi

Ņem vismaz 50 g parauga. Samaļ daļiņās, no kurām vismaz 50 % izsijājas caur sietu ar 0,5 mm acīm, un atlikums sietā ar 1 mm apaļu acojumu nepārsniedz 10 %.

4.1.3. Barība šķidrā vai pastas veidā un barība, kas galvenokārt sastāv no eļļām un taukiem

Ņem aptuveni 25 g parauga, nosver ar precizitāti līdz 10 mg, pievieno atbilstīgu daudzumu bezūdens smilts, kas nosvērta ar precizitāti līdz 10 mg, un maisa, līdz iegūst homogēnu produktu.

4.2. Kaltēšana

4.2.1. Barība, izņemot to, kas minēta 4.2.2. un 4.2.3. punktā

Nosver konteineru (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 1 mg. Nosvērtajā konteinerā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Konteineru bez vāka ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 103 oC. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, konteineru ievieto pēc iespējas ātri. Atstāj kaltēties četras stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 103 oC. Konteineram atkal uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg.

Barību, kas galvenokārt sastāv no eļļām un taukiem, kaltē krāsnī vēl papildu 30 minūtes 130 oC temperatūrā. Abu svēršanas rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt 0,1 % mitruma.

4.2.2. Labība, milti, putraimi un rupja maluma milti

Nosver konteineru (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā konteinerā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g sasmalcinātā parauga un izlīdzina. Konteineru bez vāka ieliek krāsnī, kas iepriekš sakarsēta līdz 130 oC. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, konteineru ievieto pēc iespējas ātri. Atstāj kaltēties divas stundas, skaitot no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 130 oC. Konteineram atkal uzliek vāku, izņem to no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg.

4.2.3. Barības maisījumi, kas satur vairāk nekā 4 % saharozes vai laktozes: barības līdzekļi, piemēram, ceratoniju augļi, hidrolizēti graudaugu produkti, iesala sēklas, kaltēti biešu graizījumi, zivju un cukura šķīstošie produkti; barības maisījumi, kas satur vairāk nekā 25 % minerālsāļu, tostarp kristalizācijas ūdeni. Nosver konteineru (3.3.) ar vāku ar precizitāti līdz 0,5 mg. Nosvērtajā konteinerā ar precizitāti līdz 1 mg iesver aptuveni 5 g parauga un izlīdzina. Konteineru bez vāka ieliek vakuuma krāsnī (3.5.), kas iepriekš sakarsēta 80 oC līdz 85 oC temperatūrā. Lai novērstu krāsns temperatūras pārmērīgu samazināšanos, konteineru ievieto pēc iespējas ātri. Palielina spiedienu līdz 100 toriem un zem šāda spiediena kaltē četras stundas – vai nu karsta, sausa gaisa plūsmā, vai izmantojot vielu, kas uzsūc mitrumu (aptuveni 300 g uz 20 paraugiem). Pēdējā gadījumā pēc paredzētā spiediena sasniegšanas vakuumsūkni atvieno. Kaltēšanas laiku skaita no brīža, kad krāsns temperatūra atkal sasniedz 80 oC līdz 85 oC. Krāsnī uzmanīgi atjauno atmosfēras spiedienu. Krāsni atver, konteineram tūlīt uzliek vāku, izņem konteineru no krāsns, 30 līdz 45 minūtes atdzesē eksikatorā (3.6.) un nosver ar precizitāti līdz 1 mg. Vēl 30 minūtes kaltē vakuuma krāsnī 80 oC līdz 85 oC temperatūrā un vēlreiz nosver. Abu svēršanas rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt 0,1 % mitruma.

4.3. Sākotnējā kaltēšana

4.3.1. Barība, izņemot to, kas minēta 4.3.2. punktā

Cietu barību ar augstu mitruma saturu, ko grūti sasmalcināt, sākotnēji kaltē šādi:

50 g nesasmalcināta parauga (ja vajadzīgs, tad saspiestu vai aglomerētu barību var nedaudz sadalīt) ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā konteinerā (piemēram, 20 ×12 cm alumīnija plāksnē ar 0,5 cm apmali). Atstāj kaltēties krāsnī 60 oC līdz 70 oC temperatūrā, līdz mitruma saturs ir samazinājies līdz 8–12 %. Izņem no krāsns, bez vāka atdzesē laboratorijā vienu stundu un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties sasmalcina, kā norādīts 4.1.1. punktā, un kaltē, kā norādīts 4.2.1. vai 4.2.3. punktā, atkarībā no barības īpašībām.

4.3.2. Labība

Graudus, kuru mitruma saturs pārsniedz 17 %, sākotnēji kaltē šādi:

50 g nesamaltu graudu ar precizitāti līdz 10 mg iesver piemērotā konteinerā (piemēram, 20 ×12 cm alumīnija plāksnē ar 0,5 cm apmali). Piecas līdz septiņas minūtes atstāj kaltēties krāsnī 130 oC temperatūrā. Izņem no krāsns, bez vāka atdzesē laboratorijā divas stundas un nosver ar precizitāti līdz 10 mg. Nekavējoties samaļ, kā norādīts 4.1.2. punktā, un izkaltē, kā norādīts 4.2.2. punktā.

5. Rezultātu aprēķināšana

Mitruma saturu (X), izteiktu procentos no parauga, aprēķina, izmantojot šādas formulas:

5.1. Kaltēšana bez sākotnējās kaltēšanas

kur:

m = testa parauga sākotnējais svars gramos,

m0 = izkaltētā testa parauga svars gramos.

5.2. Kaltēšana ar sākotnējo kaltēšanu

kur:

m = testa parauga sākotnējais svars gramos,

m1 = testa parauga svars gramos pēc sākotnējās kaltēšanas,

m2 = testa parauga svars gramos pēc sasmalcināšanas vai samalšanas,

m0 = izkaltētā testa parauga svars gramos.

5.3. Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nepārsniedz 0,2 % mitruma absolūtās vērtības.

6. Novērojums

Ja sasmalcināšana ir vajadzīga un ja tās rezultātā mainās produkta mitruma saturs, tad barības sastāvdaļu analīzes rezultāti jākoriģē, pamatojoties uz parauga mitruma saturu tā sākotnējā stāvoklī.

B. MITRUMA NOTEIKŠANA DZĪVNIEKU UN AUGU TAUKOS UN EĻĻĀS

1. Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt ūdens un gaistošo vielu saturu dzīvnieku un augu taukos un eļļās.

2. Princips

Paraugu žāvē līdz konstantam svaram (svara zudumam starp diviem secīgiem svērumiem jābūt mazākam par vai vienādam ar 1 mg) 103 oC temperatūrā. Svara zudumu nosaka sverot.

3. Ierīces

3.1. Plakandibena trauks, izgatavots no materiāla, kas izturīgs pret koroziju, apmēram 3 cm augsts un 8–9 cm diametrā.

3.2. Apmēram 10 cm garš termometrs ar pastiprinātu bumbiņu un izplešanās cauruli augšgalā, kas graduēts apmēram no 80 oC līdz vismaz 110 oC.

3.3. Smilšu vanna vai elektriskā plītiņa.

3.4. Eksikators ar vielu, kas efektīvi uzsūc mitrumu.

3.5. Analītiskie svari.

4. Procedūra

Sausā, nosvērtā traukā (3.1.), kurā ir termometrs (3.2.), ar precizitāti līdz tuvākajam mg iesver apmēram 20 g homogenizētā parauga. Pastāvīgi maisot ar termometru, smilšu vannā vai uz elektriskās plītiņas (3.3.) silda tā, lai apmēram septiņās minūtēs temperatūra paaugstinātos līdz 90 oC.

Karstumu samazina, sekojot tam, cik bieži no trauka dibena paceļas burbuļi. Temperatūra nedrīkst pārsniegt 105 oC. Turpina maisīt, skrāpējot gar trauka dibenu, līdz pārstāj veidoties burbuļi.

Lai pilnībā izdalītos viss mitrums, vairākas reizes temperatūru paaugstina līdz 103 oC ± 2 oC, starplaikos starp karsēšanām atdzesējot līdz 93 oC. Pēc tam eksikatorā (3.4.) ļauj atdzist līdz istabas temperatūrai un nosver. Minēto darbību atkārto tikmēr, kamēr svara zudums starp diviem secīgiem svērumiem vairs nepārsniedz 2 mg.

N.B.! Ja parauga svars pēc atkārtotas karsēšanas palielinās, tas liecina par tauku oksidēšanos, un tādā gadījumā rezultātu aprēķina, ņemot vērā svērumu, kas izdarīts pirms tam, kad svars sāka palielināties.

5. Rezultātu aprēķināšana

Mitruma saturu (X), izteiktu procentos no parauga, aprēķina, izmantojot šādu formulu:

kur:

m = testa parauga svars gramos,

m1 = trauka un tā satura kopējais svars gramos pirms karsēšanas,

m2 = trauka un tā satura kopējais svars gramos pēc karsēšanas.

Ja rezultāts ir mazāks par 0,05 %, tad tas jāreģistrē kā “mazāks par 0,05 %”.

Atkārtojamība

Mitruma satura starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 0,05 % absolūtās vērtības.

C. JĒLPROTEĪNA SATURA NOTEIKŠANA

1. Mērķis un darbības joma

Ar šo metodi var noteikt jēlproteīna daudzumu barībā, pamatojoties uz slāpekļa saturu, ko nosaka saskaņā ar Kjeldāla metodi.

2. Princips

Paraugu šķeļ ar sērskābi katalizatora klātbūtnē. Skābes šķīdumu neitralizē un noregulē tā reakciju līdz bāziskai ar nātrija hidroksīda šķīdumu. Amonjaku destilē un uztver noteiktā sērskābes daudzumā, kuras pārpalikumu titrē ar nātrija hidroksīda standartšķīdumu.

Alternatīvi – atbrīvoto amonjaku destilē borskābes šķīduma pārpalikumā, pēc tam titrē ar sālsskābes vai sērskābes šķīdumu.

3. Reaģenti

3.1. Kālija sulfāts.

3.2. Katalizators: vara (II) oksīds (CuO) vai vara (II) sulfāta pentahidrāts (CuSO4 5H2O).

3.3. Granulētais cinks.

3.4. Sērskābe, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Sērskābe, standarta volumetriskais šķīdums, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Sērskābe, standarta volumetriskais šķīdums, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Sērskābe, standarta volumetriskais šķīdums, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Metilsarkanais indikators; izšķīdina 300 mg metilsarkanā 100 mililitros etanola, σ = 95–96 % (v/v).

3.9. Nātrija hidroksīda šķīdums (var izmantot tehnisko) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Nātrija hidroksīds, standarta volumetriskais šķīdums c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Nātrija hidroksīds, standarta volumetriskais šķīdums c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Sālsskābē mazgāti, izkarsēti pumeka gabaliņi.

3.13. Acetanilīds (kušanas temp. = 114 oC, N-saturs = 10,36 %).

3.14. Saharoze (nesatur slāpekli).

3.15. Borskābe (H3BO3).

3.16. Metilsarkanā indikatora šķīdums: izšķīdina 100 mg metilsarkanā 100 mililitros etanola vai metanola.

3.17. Bromkrezolzaļā šķīdums: izšķīdina 100 mg bromkrezolzaļā 100 mililitros etanola vai metanola.

3.18. Borskābes šķīdums (10 g/l līdz 40 g/l atkarībā no izmantotās ierīces). Ja izmanto kolorimetrisko galarezultāta noteikšanu, tad metilsarkanais un bromkrezolzaļais indikators jāpievieno borskābes šķīdumiem. Ja sagatavo vienu litru borskābes šķīduma, tad pirms tilpuma korekcijas pievieno 7 ml metilsarkanā indikatora šķīduma (3.16.) un 10 ml bromkrezolzaļā šķīduma (3.17.). Atkarībā no izmantotā ūdens borskābes šķīduma pH līmenis dažādās partijās var būt atšķirīgs. Bieži vien, lai iegūtu pozitīvu tukšo analīzi, šķīdums jākoriģē, pievienojot nelielu sārma daudzumu. Piezīme. Parasti var iegūt labus korekcijas rezultātus, ja vienam litram 10 g/l borskābes pievieno apmēram 3 ml līdz 4 ml NaOH (3.11.). Šķīdumu uzglabā istabas temperatūrā un uzglabāšanas laikā sargā no gaismas un no amonjaka tvaiku avotiem.

3.19. Sālsskābes standarta volumetriskais šķīdums c(HCl) = 0,10 mol/l. Piezīme. Var izmantot citas volumetrisko šķīdumu koncentrācijas (3.5., 3.6., 3.7., 3.10., 3.11. un 3.19.), ja aprēķinos veic attiecīgas korekcijas. Koncentrāciju vienmēr izsaka līdz četriem cipariem aiz komata.

4. Ierīces

Ierīces, kas piemērotas šķelšanai, destilēšanai un titrēšanai saskaņā ar Kjeldāla metodi.

5. Procedūra

5.1. Šķelšana

No parauga ar precizitāti līdz 0,001 g ņem 1 g lielu iesvaru, ko pārnes šķelšanas aparāta kolbā. Pievieno 15 g kālija sulfāta (3.1.), atbilstošu daudzumu katalizatora (3.2.) (0,3 līdz 0,4 g vara (II) oksīda vai 0,9 līdz 1,2 g vara (II) sulfāta pentahidrāta), 25 ml sērskābes (3.4.) un, ja vajadzīgs, dažus pumeka gabaliņus (3.12.) un kolbas saturu samaisa.

Kolbu sākumā karsē uzmanīgi, ja vajadzīgs, laiku pa laikam maisot, līdz masa ir karbonizēta un vairs neputo; tad karsēšanu pastiprina, līdz šķidrums sāk pastāvīgi vārīties. Pietiek karsēt, kad vārošā skābe kondensējas uz kolbas sienām. Nedrīkst pieļaut kolbas pārkaršanu un organisko vielu daļiņu pielipšanu pie tās sienām.

Kad šķīdums kļūst dzidrs un gaiši zaļš, to turpina vārīt vēl divas stundas, tad ļauj atdzist.

5.2. Destilēšana

Uzmanīgi pievieno vajadzīgo ūdens daudzumu, lai nodrošinātu, ka sulfāti pilnībā izšķīst. Ļauj atdzist, tad, ja vajadzīgs, pievieno dažas cinka granulas (3.3.). Tad rīkojas, kā noteikts 5.2.1. vai 5.2.2. punktā.

5.2.1. Destilēšana sērskābē

Atkarībā no sagaidāmā slāpekļa satura destilācijas aparāta uztvērējkolbā precīzi iemēra 25 ml sērskābes (3.5. vai 3.7.). Pievieno dažus pilienus metilsarkanā indikatora (3.8.).

Šķelšanas kolbu pievieno destilācijas aparāta kondensatoram un kondensatora galu iemērc šķidrumā, kas ir uztvērējkolbā, vismaz 1 cm dziļi (skatīt 8.3. novērojumu). Nepieļaujot amonjaka zudumus (skatīt 8.1. novērojumu), šķelšanas kolbā lēnām ielej 100 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.9.). Kolbu karsē, līdz destilējas amonjaks.

5.2.2. Destilēšana borskābē

Ja destilāta amonjaka saturu titrē manuāli, tad izmanto tālāk minēto procedūru. Ja destilēšanas vienība ir pilnībā automatizēta un ietver arī destilāta amonjaka satura titrēšanu, tad jāievēro ražotāja norādījumi attiecībā uz destilēšanas vienības darbināšanu.

Savācējkolbu, kurā ir 25 ml līdz 30 ml borskābes šķīduma (3.18.), novieto zem kondensatora izplūdes tā, lai padeves caurule atrastos zem borskābes šķīduma pārākuma virsmas. Destilācijas vienību koriģē, lai tā izdalītu 50 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.9.). Destilācijas vienību darbina saskaņā ar ražotāja norādījumiem un atbrīvoto amonjaku destilē, pievienojot nātrija hidroksīda šķīdumu. Destilātu uztver borskābē, kura uzņem šķīdumu. Destilāta apjoms (destilācijas ar tvaiku laiks) ir atkarīgs no slāpekļa daudzuma paraugā. Ievēro ražotāja norādījumus.

Piezīme. Pusautomātiskajā destilēšanas vienībā nātrija hidroksīda pārpalikumu pievieno un tvaiku destilē automātiski.

5.3. Titrēšana

Rīkojas, kā noteikts 5.3.1. vai 5.3.2. punktā.

5.3.1. Sērskābe

Sērskābes pārpalikumu savācējkolbā titrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu (3.10. vai 3.11.) atkarībā no izmantotās sērskābes koncentrācijas, līdz tiek sasniegts galapunkts.

5.3.2. Borskābe

Savācējkolbas saturu titrē ar sālsskābes standarta volumetrisko šķīdumu (3.19.) vai ar sērskābes standarta volumetrisko šķīdumu (3.6.), izmantojot bireti, un nolasa izmantotā titranta daudzumu.

Ja piemēro kolorimetrisko galapunkta noteikšanu, tad galapunkts ir sasniegts, kad parādās pirmās sārtas krāsas zīmes. Provizoriski nosaka biretes rādījumu ar precizitāti līdz 0,05 ml. Izgaismots magnētiskā maisītāja trauks vai fotometrisks detektors var palīdzēt ieraudzīt galapunktu.

To var izdarīt automātiski, izmantojot tvaika destilētāju ar automātisko titrēšanu.

Jāievēro ražotāja norādījumi attiecībā uz konkrētā destilētāja vai destilētāja/titrētāja izmantošanu.

Piezīme. Ja izmanto automātisko titrēšanas sistēmu, tad titrēšana sākas tūlīt pēc destilācijas sākšanas un kad ir izmantots 1 % borskābes šķīdums (3.18.). Ja izmanto pilnībā automatizētu destilācijas vienību, tad amonjaka automātisko titrēšanu var veikt arī, ja galapunktu nosaka, izmantojot potenciometrisko pH sistēmu. Tādā gadījumā izmanto automātisko titrētāju ar pH mērītāju. pH mērītājs ir attiecīgi kalibrēts pH 4 līdz pH 7 diapazonā, ievērojot parastās laboratorijas pH kalibrēšanas procedūras. Titrēšanas pH galapunktu sasniedz pie pH 4,6, kas ir stāvākais punkts titrēšanas līknē (pārliekuma punkts).

5.4. Tukšā analīze

Lai apstiprinātu, ka reaģenti nesatur slāpekli, veic tukšo analīzi (šķelšanu, destilēšanu un titrēšanu), parauga vietā izmantojot 1 g saharozes (3.14.).

6. Rezultātu aprēķināšana

Aprēķinus veic atbilstoši 6.1. vai 6.2. punktam.

6.1. Titrēšanas aprēķins atbilstoši 5.3.1. punktam

Jēlproteīna saturu, kas izteikts procentos no svara, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

Vo = NaOH tilpums (ml) (3.10. vai 3.11.), ko izmanto tukšajā analīzē,

V1 = NaOH tilpums (ml) (3.10. vai 3.11.), ko izmanto parauga titrēšanā,

c = nātrija hidroksīda (3.10. vai 3.11.) koncentrācija (mol/l),

m = parauga svars (g).

6.2. Titrēšanas aprēķins atbilstoši 5.3.2. punktam

6.2.1. Titrēšana ar sālsskābi

Jēlproteīna saturu, kas izteikts procentos no svara, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

m = analizējamā parauga svars (g),

c = sālsskābes (3.19.) standarta volumetriskā šķīduma koncentrācija (mol/l),

V0 = tukšajā analīzē izmantotās sālsskābes tilpums (ml),

V1 = analizējamam paraugam izmantotās sālsskābes tilpums (ml).

6.2.2. Titrēšana ar sērskābi

Jēlproteīna saturu, kas izteikts procentos no svara, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

m = analizējamā parauga svars (g),

c = sērskābes standarta volumetriskā šķīduma (3.6.) koncentrācija (mol/l),

V0 = tukšajai analīzei izmantotās sērskābes (3.6.) tilpums (ml),

V1 = analizējamam paraugam izmantotās sērskābes (3.6.) tilpums (ml).

7. Metodes verifikācija

7.1. Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt:

— 0,2 % absolūtajā vērtībā, ja jēlproteīna saturs ir mazāks par 20 %,

— 1,0 % no lielākās vērtības, ja jēlproteīna saturs ir no 20 % līdz 40 %,

— 0,4 % absolūtajā vērtībā, ja jēlproteīna saturs ir lielāks par 40 %.

7.2. Precizitāte

Analizē (veicot šķelšanu, destilēšanu un titrēšanu) 1,5 līdz 2,0 g acetanilīda (3.13.) 1 g saharozes (3.14.) klātbūtnē; 1 g acetanilīda patērē 14,80 ml sērskābes (3.5.). Atgūstamībai jābūt vismaz 99 %.

8. Novērojumi

8.1. Ierīce var būt manuāla, pusautomātiska vai automātiska. Ja paraugs pēc šķelšanas jāpārvieto destilēšanai, tad pārnešana jāveic bez zudumiem. Ja destilācijas aparāta kolba nav aprīkota ar pilināmo piltuvi, tad nātrija hidroksīdu, lēnām lejot gar kolbas sienu, pievieno tieši pirms tās savienošanas ar kondensatoru.

8.2. Ja šķelšanas produkts sacietē, tad noteikšanu atkārto, lietojot lielāku daudzumu sērskābes (3.4.), nekā norādīts iepriekš.

8.3. Analizējot produktus ar zemu slāpekļa saturu, vajadzības gadījumā sērskābes (3.7.) tilpumu uztvērējkolbā var samazināt līdz 10 ml vai 15 ml un papildina līdz 25 ml ar ūdeni.

8.4. Regulārai analīzei, lai noteiktu jēlproteīnu, var izmantot alternatīvas analīzes metodes, bet šajā C daļā aprakstītā Kjeldāla metode ir standartmetode. Ar alternatīvo metodi (piemēram, DUMAS) iegūto rezultātu līdzvērtība salīdzinājumā ar standartmetodi jāpierāda attiecībā uz katru matrici atsevišķi. Tā kā ar alternatīvo metodi iegūtie rezultāti pat pēc līdzvērtības verifikācijas var nedaudz atšķirties no rezultātiem, kas iegūti ar standartmetodi, analīžu ziņojumā jāpiemin analīzes metode, kas izmantota jēlproteīna noteikšanai.

D. URĪNVIELAS NOTEIKŠANA

1. Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt urīnvielas daudzumu barībā.

2. Princips

Paraugu kopā ar dzidrināšanas aģentu iejauc ūdenī. Suspensiju filtrē. Urīnvielas saturu filtrātā nosaka pēc 4-dimetilaminobenzaldehīda (4-DMAB) pievienošanas, mērot optisko blīvumu pie 420 nm viļņu garuma.

3. Reaģenti

3.1. 4-dimetilaminobenzaldehīda šķīdums: izšķīdina 1,6 g 4-DAMB 100 mililitros 96 % etanola un pievieno 10 ml sālsskābes (ρ201,19 g/ml). Šo reaģentu var glabāt ne ilgāk par divām nedēļām.

3.2. Karesa I šķīdums: ūdenī izšķīdina 21,9 g cinka acetāta, Zn(CH3COO)2 2H2O, un 3 g ledus etiķskābes. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml.

3.3. Karesa II šķīdums: ūdenī izšķīdina 10,6 g kālija ferocianīda, K4 Fe (CN)6 3H2O. Papildina ar ūdeni līdz 100 ml.

3.4. Aktīvā ogle, kas neabsorbē urīnvielu (jāpārbauda).

3.5. Urīnviela, 0,1 % šķīdums (w/v).

4. Ierīces

4.1. Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.

4.2. Mēģenes: 160 × 16 mm ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem.

4.3. Spektrofotometrs.

5. Procedūra

5.1. Parauga analīze

Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz tuvākajam mg un kopā ar 1 g aktīvās ogles (3.4.) pārnes 500 ml tilpuma mērkolbā. Pievieno 400 ml ūdens un 5 ml Karesa I šķīduma (3.2.), maisa apmēram 30 sekundes un pievieno 5 ml Karesa II šķīduma (3.3.). Trīsdesmit minūtes maisa maisītājā. Papildina ar ūdeni līdz tilpumam, sakrata un filtrē.

Noņem 5 ml caurspīdīgā, bezkrāsainā filtrāta, pārnes mēģenēs ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem, pievieno 5 ml 4-DMAB šķīduma (3.1.) un samaisa. Mēģenes ievieto ūdens vannā 20 oC (+/– 4 oC) temperatūrā. Pēc piecpadsmit minūtēm ar spektrofotometru pie 420 nm mēra parauga šķīduma optisko blīvumu. Salīdzina ar reaģentu tukšās analīzes šķīdumu.

5.2. Kalibrēšanas līkne

Ņem pa 1, 2, 4, 5 un 10 ml urīnvielas šķīduma (3.5.), pārnes 100 ml tilpuma mērkolbās un papildina ar ūdeni līdz tilpumam. Ņem 5 ml no katra šķīduma, pievieno pa 5 ml 4-DMAB šķīduma (3.1.), homogenizē un iepriekš aprakstītajā veidā mēra optisko blīvumu pret kontrolšķīdumu, kas sastāv no 5 ml 4-DMAB un 5 ml ūdens, kurš nesatur urīnvielu. Konstruē kalibrēšanas līkni.

6. Rezultātu aprēķināšana

Urīnvielas daudzumu paraugā nosaka, izmantojot kalibrēšanas līkni.

Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.

7. Novērojumi

7.1. Ja urīnvielas saturs pārsniedz 3 %, tad paraugu samazina līdz 1 g vai sākotnēji pagatavoto šķīdumu atšķaida tā, lai 500 mililitros nebūtu vairāk par 50 mg urīnvielas.

7.2. Ja urīnvielas saturs ir zems, tad parauga iesvara masu palielina, ievērojot nosacījumu, ka no tā iegūtais filtrāts paliek caurspīdīgs un bezkrāsains.

7.3. Ja paraugs satur tādus vienkāršus slāpekļa savienojumus kā aminoskābes, tad optisko blīvumu mēra pie 435 nm.

E. GAISTOŠO SLĀPEKĻA BĀŽU NOTEIKŠANA

I. AR MIKRODIFŪZIJU

1. Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj barībā noteikt gaistošo slāpekļa bāžu saturu, kas izteikts kā amonjaks.

2. Princips

Paraugu ekstrahē ar ūdeni un šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala mikrodifūzijas ceļā, izmantojot kālija karbonāta šķīdumu, savāc borskābes šķīdumā un titrē ar sērskābi.

3. Reaģenti

3.1. Trihloretiķskābe, 20 % šķīdums (w/v).

3.2. Indikators: izšķīdina 33 mg bromkrezolzaļā un 65 mg metilsarkanā 100 mililitros 95–96 % (v/v) etanola.

3.3. Borskābes šķīdums: viena litra mērkolbā 200 mililitros 95–96 % (v/v) etanola un 700 mililitros ūdens izšķīdina 10 g borskābes. Pievieno 10 ml indikatora (3.2.). Samaisa un vajadzības gadījumā koriģē šķīduma krāsu līdz gaiši sarkanai, pievienojot nātrija hidroksīda šķīdumu. 1 ml tāda šķīduma koriģēs līdz 300 μg NH3.

3.4. Piesātināts kālija karbonāta šķīdums: 100 mililitros vāroša ūdens izšķīdina 100 g kālija karbonāta. Ļauj atdzist, filtrē.

3.5. Sērskābe 0,01 mol/l.

4. Ierīces

4.1. Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.

4.2. Stikla vai plastmasas Konveja trauks (skatīt diagrammu).

4.3. Mikrobiretes, kas kalibrētas 1/100 ml iedaļās.

5. Procedūra

Nosver 10 g parauga ar precizitāti līdz 1 mg un kopā ar 100 ml ūdens ielej 200 ml mērkolbā. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.1.), papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru.

Izmantojot pipeti, Konveja trauka centrā iepilina 1 ml borskābes šķīduma (3.3.) un 1 ml parauga filtrāta – trauka ārējā lokā. Daļēji nosedz ar ietaukotu vāku. 1 ml piesātināta kālija karbonāta šķīduma (3.4.) ātri iepilina ārējā lokā un aizver vāku, hermētiski noslēdzot trauku. Trauku uzmanīgi griež, lai tas rotētu horizontālā plaknē un abi reaģenti sajauktos. Iztur vai nu vismaz četras stundas istabas temperatūrā, vai vienu stundu 40 oC.

Ja izmanto mikrobireti (4.3.), tad gaistošās bāzes borskābes šķīdumā titrē ar sērskābi (3.5.).

Veic tukšo analīzi, izmantojot to pašu procedūru, bet bez analizējamā parauga.

6. Rezultātu aprēķināšana

1 ml H2SO40,01 mol/l atbilst 0,34 miligramiem amonjaka.

Rezultātu izsaka procentos no parauga masas.

Atkārtojamība

No viena parauga divās paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu starpība nepārsniedz:

— 10 % relatīvajā vērtībā, ja amonjaka saturs ir mazāks par 1,0 %,

— 0,1 % absolūtajā vērtībā, ja amonjaka saturs ir 1,0 % vai vairāk.

7. Novērojums

Ja amonjaka saturs paraugā pārsniedz 0,6 %, tad atšķaida sākotnējo filtrātu.

KONVEJA TRAUKS

Mērogs 1:1

II. DESTILĒJOT

1. Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj zivju miltos, kas praktiski nesatur urīnvielu, noteikt gaistošo slāpekļa bāžu saturu, izteiktu kā amonjaks. To piemēro tikai tad, ja amonjaka saturs ir mazāks par 0,25 %.

2. Princips

Paraugu ekstrahē ar ūdeni un šķīdumu dzidrina un filtrē. Gaistošās slāpekļa bāzes atdala viršanas temperatūrā, pievienojot magnija oksīdu, savāc konkrētā sērskābes daudzumā, kuras pārpalikumu attitrē ar nātrija hidroksīda šķīdumu.

3. Reaģenti

3.1. Trihloretiķskābe, 20 % šķīdums (w/v).

3.2. Magnija oksīds.

3.3. Pretputošanas emulsija (piemēram, silikons).

3.4. Sērskābe 0,05 mol/l.

3.5. Nātrija hidroksīda šķīdums 0,1 mol/l.

3.6. Metilsarkanā 0,3 % šķīdums 95–96 % (v/v) etanolā.

4. Ierīces

4.1. Rotācijas tipa maisītājs: aptuveni 35 līdz 40 apgr./min.

4.2. Kjeldāla tipa destilēšanas ierīce.

5. Procedūra

Ar precizitāti līdz 1 mg nosver 10 g parauga un kopā ar 100 ml ūdens ievieto 200 ml mērkolbā. Maisa maisītājā 30 minūtes. Pievieno 50 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.1.), papildina līdz vajadzīgajam tilpumam ar ūdeni, spēcīgi sakrata un izfiltrē caur kroku filtru.

Ņem tādu tīra filtrāta daudzumu, kas ir piemērots gaistošo slāpekļa bāžu domājamajam saturam (parasti der 100 ml). Atšķaida līdz 200 ml un pievieno 2 g magnija oksīda (3.2.) un dažus pilienus pretputošanas emulsijas (3.3.). Šķīduma reakcijai, pārbaudot ar lakmusa papīru, jābūt sārmainai; pretējā gadījumā pievieno vēl magnija oksīdu (3.2.). Rīkojas, kā noteikts analīzes metodes jēlproteīna satura noteikšanai 5.2. un 5.3. punktā (šā pielikuma C daļa).

Veic tukšo analīzi, izmantojot to pašu procedūru, bet bez analizējamā parauga.

6. Rezultātu aprēķināšana

1 ml H2SO40,05 mol/l atbilst 1,7 miligramiem amonjaka.

Rezultātu izsaka procentos no parauga.

Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nepārsniedz 10 % amonjaka relatīvās vērtības.

F. AMINOSKĀBJU (IZŅEMOT TRIPTOFĀNU) NOTEIKŠANA

1. Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt brīvās (sintētiskās un dabīgās) un kopējās (ar peptīdsaitēm saistītās un brīvās) aminoskābes barībā, izmantojot aminoskābju analizētāju. To izmanto, lai noteiktu šādas aminoskābes: cist(e)īns, metionīns, lizīns, treonīns, alanīns, arginīns, asparagīnskābe, glutamīnskābe, glicīns, histidīns, izoleicīns, leicīns, fenilalanīns, prolīns, serīns, tirozīns un valīns.

Pēc šīs metodes neatšķir aminoskābju sāļus un nediferencē D un L formas aminoskābes. To nevar izmantot, lai noteiktu triptofāna un aminoskābju hidroksianalogus.

2. Princips

2.1. Brīvās aminoskābes

Brīvās aminoskābes ekstrahē ar atšķaidītu sālsskābi. Līdzekstrahētās slāpekļa makromolekulas izgulsnē ar sulfosalicilskābi un atdala filtrējot. Filtrēto šķīdumu koriģē līdz pH 2,20. Aminoskābes sadala ar jonu apmaiņas hromatogrāfiju un pēc reakcijas ar ninhidrīnu nosaka fotometriski pie 570 nm.

2.2. Kopējās aminoskābes

Procedūru izvēlas atkarībā no nosakāmajām aminoskābēm. Pirms hidrolīzes cist(e)īns un metionīns jāoksidē attiecīgi līdz cisteīnskābei un metionīna sulfonam. Tirozīns jānosaka neoksidētu paraugu hidrolizātos. Visas pārējās 1. punktā minētās aminoskābes var noteikt oksidētā vai neoksidētā paraugā.

Oksidēšanu veic 0 oC temperatūrā ar peroksiskudrskābes/fenola maisījumu. Oksidēšanas reaģenta pārpalikumu sadala ar nātrija disulfītu. Oksidēto vai neoksidēto paraugu 23 stundas hidrolizē ar sālsskābi (3.20.). Hidrolizātu koriģē līdz pH 2,20. Aminoskābes sadala ar jonu apmaiņas hromatogrāfiju un pēc reakcijas ar ninhidrīnu nosaka fotometriski pie 570 nm (440 nm prolīnam).

3. Reaģenti

Jāizmanto ūdens bidestilāts vai līdzvērtīgas kvalitātes ūdens (vadītspēja < 10 μS).

3.1. Ūdeņraža peroksīds, w (w/w) = 30 %.

3.2. Skudrskābe, w (w/w) = 98–100 %.

3.3. Fenols.

3.4. Nātrija disulfīts.

3.5. Nātrija hidroksīds.

3.6. 5-sulfosalicilskābes dihidrāts.

3.7. Sālsskābe, blīvums apmēram 1,18 g/ml.

3.8. Trinātrija citrāta dihidrāts.

3.9. 2,2'-tiodietanols (tiodiglikols).

3.10. Nātrija hlorīds.

3.11. Ninhidrīns.

3.12. Petrolēteris, viršanas diapazons 40–60 oC.

3.13. Norleicīns vai cits savienojums, kas piemērots izmantošanai par iekšējo standartu.

3.14. Slāpekļa gāze (< 10 ppm skābekļa).

3.15. 1-oktanols.

3.16. Aminoskābes.

3.16.1. Standartvielas, kas minētas 1. punktā. Tīri savienojumi, kuri nesatur kristalizācijas ūdeni. Žāvē vakuumā virs P2O5 vai H2SO4 vienu nedēļu pirms izmantošanas.

3.16.2. Cisteīnskābe.

3.16.3. Metionīnsulfons.

3.17. Nātrija hidroksīda šķīdums, c = 7,5 mol/l. Ūdenī atšķaida 300 g NaOH (3.5.) un papildina līdz vienam litram.

3.18. Nātrija hidroksīda šķīdums, c = 1 mol/l. Ūdenī atšķaida 40 g NaOH (3.5.) un papildina līdz vienam litram.

3.19. Skudrskābes – fenola šķīdums. Samaisa 889 g skudrskābes (3.2.) ar 111 g ūdens un pievieno 4,73 g fenola (3.3.).

3.20. Hidrolīzes maisījums, c = 6 mol HCl/l, kas satur 1 g fenola/l. Pievieno 1 g fenola (3.3.) uz 492 ml HCl (3.7.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

3.21. Ekstrakcijas maisījums, c = 0,1 mol HCl/l, kas satur 2 % tiodiglikola. 8,2 ml HCl (3.7.) atšķaida apmēram ar 900 ml ūdens, pievieno 20 ml tiodiglikola (3.9.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni (3.7. un 3.9. punktā minētās vielas tieši nejaukt).

3.22. 5-sulfosalicilskābe, ß = 6 %. Izšķīdina 60 g 5-sulfosalicilskābes (3.6.) ūdenī un papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

3.23. Oksidēšanas maisījums (peroksiskudrskābe – fenols). Nelielā vārglāzē samaisa 0,5 ml ūdeņraža peroksīda (3.1.) ar 4,5 ml skudrskābes un fenola šķīduma (3.19.). Iztur 20–30 oC temperatūrā vienu stundu, lai izveidojas peroksiskudrskābe, tad atdzesē ledusvannā (15 min), pirms pievieno paraugam. Uzmanību: izvairīties no saskares ar ādu un valkāt aizsargapģērbu!

3.24. Citrāta buferšķīdums, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20 Izšķīdina 19,61 g nātrija citrāta (3.8.), 5 ml tiodiglikola (3.9.), 1 g fenola (3.3.) un 16,50 ml HCl (3.7.) apmēram 800 mililitros ūdens. Koriģē pH līmeni līdz 2,20. Papildina ar ūdeni līdz vienam litram.

3.25. Eluācijas buferšķīdumi, sagatavoti atbilstoši izmantotā analizētāja (4.9.) apstākļiem.

3.26. Ninhidrīna reaģents, sagatavots atbilstoši izmantotā analizētāja apstākļiem (4.9.).

3.27. Aminoskābju standarta šķīdumi. Minētos šķīdumus uzglabā temperatūrā zem 5 oC.

3.27.1. Aminoskābju izejas standartšķīdums (3.16.1.). c = 2,5 μmol/ml no katra sālsskābē. Var iegūt komerciāli.

3.27.2. Cisteīnskābes un metionīna sulfona izejas standartšķīdums, c = 1,25 μmol/ml. Izšķīdina 0,2115 g cisteīnskābes (3.16.2.) un 0,2265 g metionīna sulfona (3.16.3.) citrāta buferšķīdumā (3.24.) viena litra mērkolbā un papildina līdz zīmei ar citrāta buferšķīdumu. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā 12 mēnešus. Minēto šķīdumu neizmanto, ja izejas standartšķīdums (3.27.1.) satur cisteīnskābi un metionīna sulfonu.

3.27.3. Iekšējā standarta izejas standartšķīdums, piemēram, norleicīns, c = 20 μmol/ml. Izšķīdina 0,6560 g norleicīna (3.13.) citrāta buferšķīdumā (3.24.) mērkolbā un papildina līdz 250 ml ar citrāta buferšķīdumu. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā sešus mēnešus.

3.27.4. Standarta aminoskābju kalibrēšanas šķīdums izmantošanai ar hidrolizātiem, c = 5 nmol/50 μl cisteīnskābes un metionīnsulfona un c = 10 nmol/50 μl pārējo aminoskābju. Izšķīdina 2,2 g nātrija hlorīda (3.10.) 100 ml tilpuma vārglāzē ar 30 ml citrāta buferšķīduma (3.24.). Pievieno 4,00 ml aminoskābju izejas standartšķīduma (3.27.1.), 4,00 ml cisteīnskābes un metionīnsulfona izejas standartšķīduma (3.27.2.) un 0,50 ml iekšējā standarta izejas standartšķīduma (3.27.3.), ja to izmanto. Koriģē pH līmeni līdz 2,20, izmantojot nātrija hidroksīdu (3,18.). Kvantitatīvi pārnes 50 ml mērkolbā un papildina līdz zīmei ar citrāta buferšķīdumu (3.24.), un samaisa. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā trīs mēnešus. Skatīt arī 9.1. novērojumu.

3.27.5. Standarta aminoskābju kalibrēšanas šķīdums izmantošanai ar hidrolizātiem, kas sagatavoti atbilstoši 5.3.3.1. punktam, un izmantošanai ar ekstraktiem (5.2.). Kalibrēšanas šķīdumu sagatavo saskaņā ar 3.27.4. punktu, tikai nepievieno nātrija hlorīdu. Uzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC, ne ilgāk kā trīs mēnešus.

4. Ierīces

4.1. 100 vai 250 ml apaļkolba ar atteces kondensatoru.

4.2. 100 ml borsilikāta stikla pudele ar skrūvējamu korķi ar gumijas/teflona drīvējumu (piemēram, Duran, Schott) izmantošanai krāsnī.

4.3. Krāsns ar mehānisko ventilāciju un temperatūras regulatoru, kura precizitāte ir labāka par ± 2 oC.

4.4. pH mērītājs (trīs skaitļi aiz komata).

4.5. Membrānfiltrs (0,22 μm).

4.6. Centrifūga.

4.7. Rotācijas vakuumiztvaicētājs.

4.8. Mehāniskais kratītājs vai magnētiskais maisītājs.

4.9. Aminoskābju analizētājs vai augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas iekārta ar jonu apmaiņas kolonnu, ierīce ninhidrīnam, pēckolonnas derivatizācija un fotometrs. Kolonnu piepilda ar sulfonētiem polistirola sveķiem, kas spēj atdalīt aminoskābes citu no citas un no pārējiem ninhidrīnpozitīviem materiāliem. Plūsmu bufera un ninhidrīna līnijā nodrošina sūkņi, kuru plūsmas stabilitāte ir ±0,5 % periodā, kas ietver gan standarta kalibrēšanas norisi, gan parauga analīzi. Ar dažiem aminoskābju analizētājiem var izmantot hidrolīzes procedūras, kurās hidrolizātā nātrija koncentrācija ir c = 0,8 mol/l un hidrolizāts satur visu atlikušo skudrskābi no oksidācijas posma. Pārējās pietiekami labi neatdala dažas aminoskābes, ja hidrolizāts satur skudrskābes pārpalikumu un/vai augstu nātrija jonu koncentrāciju. Tādā gadījumā skābes tilpumu samazina, pēc hidrolīzes un pirms pH līmeņa korekcijas iztvaicējot apmēram līdz 5 ml. Iztvaicēšanu veic vakuumā augstākais 40 oC temperatūrā.

5. Procedūra

5.1. Parauga sagatavošana

Paraugu samaļ, lai tas izsijātos caur sietu ar 0,5 mm acojumu. Paraugi, kuros ir liels mitruma saturs, pirms malšanas vai nu jāizkaltē temperatūrā, kas nepārsniedz 50 oC, vai jāizžāvē ar izsaldēšanu. Paraugus, kuros ir liels tauku saturs, pirms malšanas ekstrahē ar petrolēteri (3.12.).

5.2. Brīvo aminoskābju noteikšana barībā un premiksos

Attiecīgu apjomu (1–5 g) sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver koniskā kolbā un pievieno 100,0 ml ekstrakcijas maisījuma (3.21.). Maisījumu 60 minūtes krata, izmantojot mehānisko kratītāju vai magnētisko maisītāju (4.8.). Ļauj nogulsnēm nogulsnēties un 10,0 ml šķīduma augšējā slāņa ar pipeti iepilina vārglāzē.

Pievieno 5,0 ml sulfosalicilskābes šķīduma (3.22.), vienlaikus maisot, un turpina maisīt ar magnētisko maisītāju piecas minūtes. Šķīduma augšējo slāni filtrē vai centrifugē, lai atdalītu visas nogulsnes. Ievieto 10,0 ml iegūtā šķīduma 100 ml vārglāzē un koriģē pH līmeni līdz 2,20, izmantojot nātrija hidroksīda šķīdumu (3.18.), pārnes uz attiecīga tilpuma mērkolbu, izmantojot citrāta buferšķīdumu (3.24.), un papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu (3.24.).

Ja izmanto iekšējo standartu, tad pievieno 1,00 ml iekšējā standarta (3.27.3.) uz katriem 100 ml galīgā šķīduma un papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu (3.24.).

Veic nākamo hromatogrāfijas posmu atbilstoši 5.4. punktam.

Ja ekstraktus nepārbauda tajā pašā dienā, tad tie jāuzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC.

5.3. Kopējo aminoskābju noteikšana

5.3.1. Oksidācija

No 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver:

— 100 ml apaļkolbā (4.1.) vaļējai hidrolīzei (5.3.2.3.) vai

— 250 ml apaļkolbā (4.1.), ja ir prasīta zema nātrija koncentrācija (5.3.3.1.), vai

— 100 ml pudelē ar skrūvējamu korķi (4.2.) slēgtai hidrolīzei (5.3.2.4.).

Nosvērtajā apjomā, no kura ņem paraugu, slāpekļa saturam jābūt apmēram 10 mg un mitruma saturam – ne vairāk par 100 mg.

Kolbu/pudeli ievieto ledusvannā un atdzesē līdz 0 oC, pievieno 5 ml oksidēšanas maisījuma (3.23.) un samaisa, izmantojot stikla lāpstiņu ar liektu galu. Kolbu/pudeli, kurā ir lāpstiņa, cieši noslēdz ar hermētisku plēvi, ievieto ledusvannu ar noslēgto trauku ledusskapī 0 oC temperatūrā un atstāj uz 16 stundām. Pēc 16 stundām izņem no ledusskapja un sadala oksidēšanas reaģenta pārpalikumu, pievienojot 0,84 g nātrija disulfīta (3.4.).

Rīkojas, kā noteikts 5.3.2.1. punktā.

5.3.2. Hidrolīze

5.3.2.1. Oksidēto paraugu hidrolīze

Oksidētajam paraugam, kas sagatavots atbilstoši 5.3.1. punktam, pievieno 25 ml hidrolīzes maisījuma (3.20.), raugoties, lai tiktu noskalotas visas parauga atliekas, kas pielipušas trauka malām un lāpstiņai.

Atkarībā no izmantotās hidrolīzes procedūras rīkojas, kā noteikts 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktā.

5.3.2.2. Neoksidēto paraugu hidrolīze

100 ml vai 250 ml apaļkolbā (4.1.) vai 100 ml pudelē, kas aprīkota ar skrūvējamu vāciņu (4.2.), ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver no 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.). Slāpekļa saturam iesvērtajā analizējamā paraugā jābūt apmēram 10 mg. Uzmanīgi pievieno 25 ml hidrolīzes maisījuma (3.20.) un samaisa ar paraugu. Rīkojas, kā noteikts 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktā.

5.3.2.3. Atvērtā hidrolīze

Maisījumam kolbā (kas sagatavots atbilstoši 5.3.2.1. vai 5.3.2.2. punktam) pievieno trīs stikla lodītes un vāra, maisījumam attecē nepārtraukti burbuļojot 23 stundas. Pēc hidrolīzes pabeigšanas kondensatoru noskalo ar 5 ml citrāta buferšķīduma (3.24.). Kolbu atvieno un atdzesē ledusvannā.

Rīkojas, kā noteikts 5.3.3. punktā.

5.3.2.4. S lēgtā hidrolīze

Pudeli ar maisījumu, kas sagatavots saskaņā ar 5.3.2.1. vai 5.3.2.2. punktu, ievieto krāsnī (4.3.) 110 oC temperatūrā. Pirmajā stundā, lai novērstu spiediena uzkrāšanos (kas notiek gāzveida vielu veidošanās dēļ) un lai novērstu sprādzienu, uz trauka augšas uzliek skrūvējamu vāciņu. Trauku neaizver ar vāciņu. Pēc vienas stundas trauku aizver ar vāciņu un atstāj krāsnī (4.3.) 23 stundas. Pēc hidrolīzes pabeigšanas pudeli izņem no krāsns, uzmanīgi atver pudeles vāciņu un pudeli ieliek ledusvannā. Atstāj atdzist.

Atkarībā no procedūras, kādu izmanto pH līmeņa korekcijai (5.3.3.), kvantitatīvi pārnes pudeles saturu 250 ml vārglāzē vai 250 ml apaļkolbā, izmantojot citrāta buferšķīdumu (3.24.).

Rīkojas, kā noteikts 5.3.3. punktā.

5.3.3. pH līmeņa korekcija

Lai koriģētu pH līmeni, atkarībā no aminoskābes analizētāja (4.9.) nātrija tolerances rīkojas atbilstoši 5.3.3.1. vai 5.3.3.2. punktam.

5.3.3.1. Hromatogrāfijas sistēmām (4.9.), kurām nepieciešama zema nātrija koncentrācija

Ja izmanto aminoskābju analizētājus, kuriem nepieciešama zema nātrija koncentrācija (kad skābes tilpums jāsamazina), ieteicams izmantot iekšējo izejas standartšķīdumu (3.27.3.).

Tādā gadījumā hidrolizātam pirms iztvaicēšanas pievieno 2,00 ml iekšējā izejas standartšķīduma (3.27.3.).

Pievieno divus pilienus 1-oktanola (3.15.) hidrolizātam, kas iegūts saskaņā ar 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktu.

Izmantojot rotācijas iztvaicētāju (4.7.), vakuumā un 40 oC grādu temperatūrā samazina tilpumu līdz 5–10 ml. Ja tilpumu nejauši samazina līdz mazāk nekā 5 ml, tad hidrolizāts jāizmet un analīze jāsāk no jauna.

Ar nātrija hidroksīda šķīdumu (3.18.) koriģē pH līmeni līdz 2,20 un rīkojas, kā noteikts 5.3.4. punktā.

5.3.3.2. Visiem pārējiem aminoskābju analizētājiem (4.9.)

Hidrolizātus, kas iegūti saskaņā ar 5.3.2.3. vai 5.3.2.4. punktu, daļēji neitralizē un, uzmanīgi maisot, pievieno 17 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.17.), un nodrošina, lai temperatūra būtu zem 40 oC.

Koriģē pH līmeni līdz 2,20 istabas temperatūrā, izmantojot nātrija hidroksīda šķīdumu (3.17.) un visbeidzot – nātrija hidroksīda šķīdumu (3.18.). Pāriet pie 5.3.4. punkta.

5.3.4. Parauga šķīdums hromatogrāfijai

Kvantitatīvi pārnes pH koriģēto hidrolizātu (5.3.3.1. vai 5.3.3.2.) ar citrāta buferšķīdumu (3.24.) 200 ml tilpuma mērkolbā un papildina līdz zīmei ar buferšķīdumu (3.24.).

Ja iekšējais standarts nav jau izmantots, tad pievieno 2,00 ml iekšējā standarta (3.27.3.) un papildina līdz zīmei ar citrāta buferšķīdumu (3.24.). Rūpīgi samaisa.

Pāriet pie hromatogrāfijas posma (5.4.).

Ja parauga šķīdumus nepārbauda tajā pašā dienā, tad tie jāuzglabā temperatūrā, kas zemāka par 5 oC.

5.4. Hromatogrāfija

Pirms hromatogrāfijas ekstraktu (5.2.) vai hidrolizātu (5.3.4.) sasilda līdz istabas temperatūrai. Maisījumu sakrata un piemērotu daudzumu izfiltrē caur 0,22 μm membrānfiltru (4.5.). Iegūto dzidro šķīdumu pakļauj jonu apmaiņas hromatogrāfijai, izmantojot aminoskābju analizētāju (4.9.).

Injekciju var veikt manuāli vai automātiski. Ir svarīgi, lai kolonnā standartu un paraugu analīzei tiktu pievienots vienāds šķīduma daudzums ± 0,5 %, izņemot gadījumus, kad izmanto iekšējo standartu, un lai nātrija/aminoskābes proporcijas standarta un parauga šķīdumos būtu pēc iespējas līdzīgākas.

Parasti kalibrēšanas posmu biežums ir atkarīgs no ninhidrīna reaģenta stabilitātes un analīžu sistēmas. Standartu vai paraugu atšķaida ar citrāta buferšķīdumu (3.24.), lai uzrādītu standarta maksimālo laukumu 30–200 % no parauga aminoskābes maksimālā laukuma.

Aminoskābju hromatogrāfija nedaudz atšķirsies atkarībā no izmantotā analizētāja tipa un sveķiem. Izvēlētajai sistēmai jāspēj atdalīt aminoskābes citu no citas un no ninhidrīnpozitīviem materiāliem. Darbības diapazonā hromatogrāfiskajai sistēmai jāsniedz lineāra atbilde uz pārmaiņām to aminoskābju daudzumos, ko pievieno kolonnā.

Kad analizē (nosakāmo aminoskābju) ekvimolāru šķīdumu, tad hromatogrāfijas posma laikā piemēro tālāk minētās attiecības, kas ir starp maksimālo augstumu un atstarpi starp signāliem. Tādam ekvimolāram šķīdumam jāsatur vismaz 30 % no katras aminoskābes maksimālās slodzes, ko var precīzi izmērīt, izmantojot aminoskābju analizētāja sistēmu (4.9.).

Lai atdalītu treonīnu un serīnu, attiecība starp maksimālo augstumu un atstarpi starp signāliem zemākajā no divām aminoskābēm, kuras pārklājas hromatogrammā, nedrīkst pārsniegt 2:10 (ja nosaka tikai cist(e)īnu, metionīnu, treonīnu un lizīnu, tad nepietiekama atdalīšana no blakusesošajiem maksimālajiem augstumiem negatīvi ietekmēs noteikšanu). Visām pārējām aminoskābēm atdalījumam jābūt precīzākam par 1:10.

Sistēmai jānodrošina, lai lizīns tiktu atdalīts no “lizīna artefaktiem” un ornitīna.

6. Rezultātu aprēķināšana

Parauga un standarta maksimumu laukumu mēra katrai atsevišķai aminoskābei un aprēķina daudzumu (X) gramos, cik aminoskābes ir kilogramā parauga.

Ja izmanto iekšējo standartu, pareizina ar:

A = maksimālais laukums, hidrolizāts vai ekstrakts,

B = maksimālais laukums, kalibrēšanas standartšķīdums,

C = maksimālais laukums, iekšējais standarts hidrolizātā vai ekstraktā,

D = maksimālais laukums, iekšējais standarts, kalibrēšanas standartšķīdums,

M = nosakāmās aminoskābes molmasa,

c = standarta koncentrācija μmol/ml,

m = parauga svars (g) (koriģēts līdz sākotnējam svaram, ja kaltēts vai attaukots),

V = ml kopējā hidrolizāta (5.3.4.) vai ml ekstrakta aprēķinātā kopējā atšķaidījuma tilpuma (6.1.).

Cistīnu un cisteīnu nosaka kā cisteīnskābi oksidētā parauga hidrolizātos, bet aprēķina kā cistīnu (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), izmantojot M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionīnu nosaka kā metionīna sulfonu oksidētā parauga hidrolizātos, bet aprēķina kā metionīnu, izmantojot metionīna M 149,21 g/mol.

Pievienoto brīvo metionīnu nosaka pēc tam, kad tas ekstrahēts kā metionīns, aprēķinam izmanto to pašu M.

6.1. Ekstraktu kopējo atšķaidījuma tilpumu (F), lai noteiktu brīvās aminoskābes (5.2.), aprēķina šādi: V = gala ekstrakta tilpums.

7. Metodes novērtējums

Minēto metodi pārbaudīja starptautiskā līmenī 1990. gadā, salīdzinot rezultātus starp laboratorijām, izmantojot četras dažādas barības (barības maisījumu cūkām, barības maisījumu broileriem, proteīnu koncentrātu un premiksu). Vidējo un standarta noviržu rezultāti, kas iegūti pēc galējo punktu likvidēšanas, ir norādīti tabulās šajā punktā.







Vidējie lielumi g/kg Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Barības maisījums broileriem 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Proteīnu koncentrāts 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premikss 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits.

7.1. Atkārtojamība

Iepriekš minētā savstarpējā salīdzinājuma atkārtojamība, kas izteikta kā “laboratorijas standartnovirze”, ir norādīta tālāk tabulā.







Laboratorijas standartnovirze (Sr) g/kg Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Barības maisījums broileriem 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Proteīnu koncentrāts 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premikss 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits.







Variācijas koeficients (%) laboratorijas standartnovirzei (Sr) Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Barības maisījums broileriem 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Proteīnu koncentrāts 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premikss 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits.

7.2 Atveidojamība

Starplaboratoriju standartnoviržu rezultāti, kas iegūti iepriekš minētajā savstarpējā salīdzinājumā, ir norādīti tālāk tabulā.







Starplaboratoriju standartnovirze (SR) g/kg Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Barības maisījums broileriem 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Proteīnu koncentrāts 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premikss 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits.







Variācijas koeficients (%) starplaboratoriju standartnovirzei (SR) Standartmateriāls Aminoskābe Treonīns Cist(e)īns Metionīns Lizīns Barības maisījums cūkām 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Barības maisījums broileriem 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Proteīnu koncentrāts 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premikss 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = iesaistīto laboratoriju skaits.

8. Standartmateriālu izmantošana

Metodes pareizu piemērošanu verificē, atkārtoti mērot sertificētus standartmateriālus, kad tie ir pieejami. Ir ieteicama kalibrēšana ar sertificētu aminoskābes kalibrēšanas šķīdumu.

9. Novērojumi

9.1. Tā kā starp aminoskābju analizētājiem ir atšķirības, tad par pamatnostādni ņem standarta aminoskābju (skatīt 3.27.4. un 3.27.5. punktu) un hidrolizāta (skatīt 5.3.4. punktu) kalibrēšanas šķīdumu galīgās koncentrācijas. Aparāta lineārās reakcijas diapazons jāpārbauda attiecībā uz visām aminoskābēm. Standartšķīdumu atšķaida ar citrāta buferšķīdumu, lai uzrādītu maksimālos laukumus diapazona vidū.

9.2. Ja izmanto augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas aprīkojumu, lai analizētu hidrolizātus, tad eksperimenta apstākļi jāoptimizē saskaņā ar ražotāja ieteikumiem.

9.3. Saskaņā ar šo metodi analizējot barību, kas satur vairāk par 1 % hlorīdu (barības koncentrātus, minerālbarību, papildbarību), var iegūt pazeminātus rezultātus attiecībā uz metionīnu, un tāpēc tā jāanalizē īpaši.

G. TRIPTOFĀNA NOTEIKŠANA

1. Mērķis un darbības joma

Šī metode ļauj noteikt kopējo un brīvo triptofānu barībā. Tajā neizšķir D un L formu.

2. Princips

Lai noteiktu kopējo triptofānu, paraugu hidrolizē sārmainos apstākļos ar piesātinātu bārija hidroksīda šķīdumu un 20 stundas karsē līdz 110 oC temperatūrai. Pēc hidrolīzes pievieno iekšējo standartu.

Lai noteiktu brīvo triptofānu, paraugu ekstrahē nedaudz skābā vidē iekšējā standarta klātbūtnē.

Triptofānu un iekšējo standartu hidrolizātā vai ekstraktā nosaka, izmantojot augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC) ar fluorescences noteikšanu.

3. Reaģenti

3.1. Jāizmanto ūdens bidestilāts vai līdzvērtīgas kvalitātes ūdens (vadītspēja < 10 μS/cm).

3.2. Standartviela: triptofāns (tīrība/saturs ≥ 99 %), kas izžāvēts vakuumā virs fosfora pentoksīda.

3.3. Iekšējā standartviela: α-metil-triptofāns (tīrība/saturs ≥ 99 %), kas izžāvēts vakuumā virs fosfora pentoksīda.

3.4. Bārija hidroksīda oktahidrāts (jārūpējas, lai Ba(OH)2 ·8 H2O pārmērīgi nepakļautu gaisa iedarbībai, lai izvairītos no BaCO3 veidošanās, kas varētu traucēt noteikšanu) (skatīt 9.3. novērojumu).

3.5. Nātrija hidroksīds.

3.6. Ortofosforskābe, w (w/w) = 85 %.

3.7. Sālsskābe, ρ201,19 g/ml.

3.8. Metanols, ekvivalents HPLC pakāpei.

3.9. Petrolēteris, viršanas diapazons 40-60 oC.

3.10. Nātrija hidroksīda šķīdums, c = 1 mol/l. Ūdenī atšķaida 40,0 g NaOH (3.5.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni (3.1.).

3.11. Sālsskābe, c = 6 mol/l. 492 ml HCl (3.7.) papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

3.12. Sālsskābe, c = 1 mol/l. 82 ml HCl (3.7.) papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

3.13. Sālsskābe, c = 0,1 mol/l. 8,2 ml HCl (3.7.) papildina līdz vienam litram ar ūdeni.

3.14. Ortofosforskābe, c = 0,5 mol/l. Paņem 34 ml ortofosforskābes (3.6.) un papildina līdz vienam litram ar ūdeni (3.1.).

3.15. Koncentrēts triptofāna šķīdums (3.2.), c = 2,50 μmol/ml. 500 ml tilpuma mērkolbā izšķīdina 0,2553 g triptofāna (3.2.) sālsskābē (3.13.) un papildina līdz zīmei ar sālsskābi (3.13.). Uzglabā –18 oC temperatūrā ne ilgāk kā četras nedēļas.

3.16. Koncentrēts iekšējais standartšķīdums, c = 2,50 μmol/ml. 500 ml tilpuma mērkolbā sālsskābē (3.13.) izšķīdina 0,2728 g α-metil-triptofāna (3.3.) un papildina līdz zīmei ar sālsskābi (3.13.). Uzglabā –18 oC temperatūrā ne ilgāk kā četras nedēļas.

3.17. Triptofāna kalibrēšanas standartšķīdums un iekšējais standarts. Ņem 2,00 ml koncentrēta triptofāna (3.15.) šķīduma un 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (α-metil-triptofāna) šķīduma (3.16.). Atšķaida ar ūdeni (3.1.) un metanolu (3.8.) aptuveni līdz tādam pašam tilpumam un aptuveni tādai pašai metanola koncentrācijai (10–30 %) kā gatavajam hidrolizātam. Minētais šķīdums jāsagatavo svaigs pirms izmantošanas. Sagatavošanas laikā jāuzmana, lai nepiekļūst tieša saules gaisma.

3.18. Etiķskābe.

3.19. 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanols.

3.20. Etanolamīns w (w/w) > 98 %.

3.21. 1 g 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanola (3.19.) šķīdums 100 mililitros metanola (3.8.).

3.22. Kustīgā fāze priekš HPLC: 3,00 g etiķskābes (3.18.) + 900 ml ūdens (3.1.) +50,0 ml 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanola (3.19.) šķīduma (3.21.) metanolā (3.8.) (1 g/100 ml). Izmantojot etanolamīnu (3.20.), pH līmeni koriģē līdz 5,00. Papildina ar ūdeni līdz 1 000 ml (3.1.).

4. Ierīces

4.1. HPLC iekārta ar fluorescences detektoru.

4.2. Šķidrumu hromatogrāfa kolonna, 125 × 4 mm, C18, 3 μm iesaiņojums, vai līdzvērtīga.

4.3. pH mērītājs.

4.4. Polipropilēna kolba, 125 ml tilpums, ar platu kaklu un skrūvējamu korķi.

4.5. Membrānfiltrs, 0,45 μm.

4.6. Autoklāvs, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bāri.

4.7. Mehāniskais kratītājs vai magnētiskais maisītājs.

4.8. Virpuļmikseris.

5. Procedūra

5.1. Paraugu sagatavošana

Paraugu samaļ, lai tas izsijātos caur sietu ar 0,5 mm acojumu. Paraugi, kuros ir liels mitruma saturs, pirms malšanas vai nu jāizkaltē temperatūrā, kas nepārsniedz 50 oC, vai jāizžāvē ar izsaldēšanu. Paraugus, kuros ir liels tauku saturs, pirms malšanas ekstrahē ar petrolēteri (3.9.).

5.2. Brīvā triptofāna noteikšana (ekstrakts)

Attiecīgu apjomu (1–5 g) sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 1 mg iesver koniskā kolbā. Pievieno 100,0 ml sālsskābes (3.13.) un 5,00 ml koncentrēta iekšējā standartšķīduma (3.16.). Krata vai maisa 60 minūtes, izmantojot mehānisko kratītāju vai magnētisko maisītāju (4.7.). Ļauj nogulsnēm nogulsnēties un 10,0 ml šķīduma augšējā slāņa ar pipeti iepilina vārglāzē. Pievieno 5 ml ortofosforskābes (3.14.). Koriģē pH līmeni līdz 3, izmantojot nātrija hidroksīdu (3.10.). Pievieno pietiekami daudz metanola (3.8.), lai galīgajā tilpumā metanola koncentrācija būtu no 10 līdz 30 %. Pārnes attiecīga tilpuma kolbā un atšķaida ar ūdeni līdz tilpumam, kas vajadzīgs hromatogrāfijai (aptuveni tikpat, cik ir kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.)).

Izfiltrē dažus ml šķīduma caur 0,45 μm membrānfiltru (4.5.), pirms šķīdumu iešpricē HPLC kolonnā. Veic nākamo hromatogrāfijas posmu atbilstoši 5.4. punktam.

Standartšķīdums un ekstrakti jāsargā no tiešas saules gaismas. Ja ekstraktus nav iespējams analizēt tajā pašā dienā, tad tos var uzglabāt 5 oC temperatūrā ne ilgāk kā trīs dienas.

5.3. Kopējā triptofāna (hidrolizāta) noteikšana

No 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga (5.1.) ar precizitāti līdz 0,2 mg iesver polipropilēna kolbā (4.4.). Slāpekļa saturs iesvērtajā analizējamā paraugā ir apmēram 10 mg. Pievieno 8,4 g bārija hidroksīda oktahidrāta (3.4.) un 10 ml ūdens. Samaisa virpuļmikserī (4.8.) vai ar magnētisko maisītāju (4.7.). Atstāj maisījumā ar teflonu pārklātu magnētu. Trauka sienas noskalo ar 4 ml ūdens. Uzliek skrūvējamu korķi un vaļīgi aiztaisa kolbu. Pārvieto uz autoklāvu (4.6.) ar vārošu ūdeni un tvaicē 30–60 minūtes. Aizver autoklāvu un tur karsē 110 (± 2) oC temperatūrā 20 stundas.

Pirms autoklāva atvēršanas temperatūru samazina, lai tā būtu nedaudz zem 100 oC. Lai novērstu Ba(OH)2 ·8 H2O kristalizāciju, siltajam maisījumam pievieno 30 ml istabas temperatūras ūdens. Viegli sakrata vai samaisa. Pievieno 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (α-metil-triptofāna) šķīduma (3.16.). Atdzesē traukus ūdenī/ledusvannā 15 minūtes.

Tad pievieno 5 ml ortofosforskābes (3.14.). Trauku tur dzesēšanas vannā un neitralizē ar HCl (3.11.), vienlaikus maisot, un pH līmeni koriģē līdz 3,0, izmantojot HCl (3.12.). Pievieno pietiekami daudz metanola, lai galīgajā tilpumā metanola koncentrācija būtu no 10 līdz 30 %. Pārnes atbilstoša tilpuma kolbā un atšķaida ar ūdeni līdz tilpumam, kas noteikts hromatogrāfijas vajadzībām (piemēram, 100 ml). Pievienojot metanolu, neveidojas nogulsnes.

Izfiltrē dažus ml šķīduma caur 0,45 μm membrānfiltru (4.5.), pirms šķīdumu iešpricē HPLC kolonnā. Veic nākamo hromatogrāfijas posmu atbilstoši 5.4. punktam.

Standartšķīdums un hidrolizāti jāsargā no tiešas saules gaismas. Ja hidrolizātus nav iespējams izanalizēt tajā pašā dienā, tad tos var uzglabāt 5 oC temperatūrā ne ilgāk kā trīs dienas.

5.4. HPLC noteikšana

Orientējoši izokrātiskajai eluācijai piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus (skatīt arī 9.1. un 9.2. novērojumu).







HPLC kolonna (4.2.): 125 × 4 mm, C18, 3 μm iesaiņojums, vai līdzvērtīga Kolonnas temperatūra: istabas temperatūra Kustīgā fāze (3.22.): 3,00 g etiķskābes (3.18.) + 900 ml ūdens (3.1.) +50,0 ml 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanola (3.19.) šķīdums (3.21.) metanolā (3.8.) 1 g/100 ml). pH līmeni koriģē līdz 5,00, izmantojot etanolamīnu (3.20.). Papildina ar ūdeni līdz 1 000 ml (3.1.) Plūsmas ātrums: 1 ml/min Kopējais norises laiks: apmēram 34 min Noteikšanas viļņa garums: ierosa 280 nm, emisija 356 nm Injekcijas tilpums: 20 μl

6. Rezultātu aprēķināšana

Aprēķina triptofāna (X) daudzumu gramos uz 100 g parauga.

A = iekšējā standarta maksimālais laukums, kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.),

B = triptofāna maksimālais laukums, ekstrakts (5.2.) vai hidrolizāts (5.3.),

V1 = koncentrētā triptofāna šķīduma (3.15.) tilpums mililitros (2 ml), ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17.),

c = koncentrētā triptofāna šķīduma (3.15.) koncentrācija μmol/ml (= 2,50), ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17.),

V2 = koncentrētā iekšējā standartšķīduma (3.16.) tilpums mililitros, ko pievieno ekstrahēšanas laikā (5.2.) (= 5,00 ml) vai hidrolizātam (5.3.) (=2,00 ml),

C = iekšējā standarta maksimālais laukums, ekstrakts (5.2.) vai hidrolizāts (5.3.),

D = triptofāna maksimālais laukums, kalibrēšanas standartšķīdums (3.17.),

V3 = koncentrētā iekšējā standartšķīduma (3.16.) tilpums mililitros (= 2,00 ml), ko pievieno kalibrēšanas standartšķīdumam (3.17.),

m = parauga svars gramos (koriģēts līdz sākotnējam svaram, ja kaltēts un/vai attaukots),

M = triptofāna molmasa (= 204,23 g/mol).

7. Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanās, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 10 % attiecībā pret lielāko rezultātu.

8. Koppētījuma rezultāti

Tika noorganizēts EK koppētījums (4. salīdzinājums starp laboratorijām), kurā līdz 12 laboratorijām analizēja trīs paraugus, lai sertificētu hidrolīzes metodi. Ar katru paraugu tika veiktas atkārtotas (5) analīzes. Rezultāti ir norādīti šajā tabulā.







1. paraugs Barība cūkām 2. paraugs Barība cūkām, papildināta ar L-triptofānu 3. paraugs Barības koncentrāts cūkām L 12 12 12 n 50 55 50 Vidējais [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2

L = to laboratoriju skaits, kas iesniedza rezultātus,

n = atsevišķo rezultātu skaits, kas iegūts pēc galējo punktu likvidēšanas (identificē ar Kohrana, Diksona galējo punktu testu),

sr = atkārtojamības standartnovirze,

SR = atveidojamības standartnovirze,

r = atkārtojamība,

R = atveidojamība,

CVr = atkārtojamības variācijas koeficients (%),

CVR = atveidojamības variācijas koeficients (%).

Tika noorganizēts cits EK koppētījums (3. salīdzinājums starp laboratorijām), kurā līdz 13 laboratorijām analizēja divus paraugus, lai sertificētu brīvā triptofāna ekstrahēšanas metodi. Ar katru paraugu tika veiktas atkārtotas (5) analīzes. Rezultāti ir norādīti šajā tabulā.







4. paraugs Kviešu un sojas maisījums 5. paraugs Kviešu un sojas maisījums (= 4. paraugs), kam pievienots triptofāns (0,457g/kg) L 12 12 n 55 60 Vidējais [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11

L = to laboratoriju skaits, kas iesniedza rezultātus,

n = atsevišķo rezultātu skaits, kas iegūts pēc galējo punktu likvidēšanas (identificē ar Kohrana, Diksona galējo punktu testu),

sr = atkārtojamības standartnovirze,

SR = atveidojamības standartnovirze,

r = atkārtojamība,

R = atveidojamība,

CVr = atkārtojamības variācijas koeficients (%),

CVR = atveidojamības variācijas koeficients (%).

Tika noorganizēt