A.

Veic bloķējošo vai salīdzinošo ELISA testu saskaņā ar šādu protokolu. Ar salīdzinošo ELISA testu, izmantojot monoklonālu antivielu 3-17-A3, var noteikt antivielas visiem zināmajiem infekciozā katarālā drudža vīrusa (BTV) serotipiem. Testa princips ir reakcijas pārtraukšana starp infekciozā katarālā drudža (BTV) antivielu un grupas specifisku monoklonālu antivielu (3-17-A3), pievienojot testa serumu. Testa serumā esošās infekciozā katarālā drudža vīrusa (BTV) antivielas bloķē monoklonālās antivielas (Mab) reaktivitāti, un tā rezultātā pēc fermentētas pretpeļu antivielas un hromogēna/substrāta pievienošanas vājinās sagaidāmā krāsas attīstība. Serumus var testēt vienā atšķaidījumā — 1:5 (krāsu reakcijas — 1. papildinājums) vai var titrēt (seruma titrēšanas metode — 2. papildinājums), lai norādītu atšķaidījuma beigu punktu. Inhibīcijas vērtības, kas augstākas par 50 %, var uzskatīt par pozitīvām. 1. Atbilstošas ELISA mikrotitra plāksnes. 2. Antigēns: piegādā kā šūnu ekstrakcijas koncentrātu, kas sagatavots, kā aprakstīts turpmāk, un ko uzglabā vai nu –20 °C, vai –70 °C. 3. Bloķējošais buferšķīdums: fosfāta buferšķīdums (PBS), kas satur 0,3 % BTV negatīvu pieaugušu liellopu serumu, 0,1 % (V/V) Tween-20 (piegādā kā polioksietilēna sorbitāna monolaurāta sīrupu) PBS. 4. Monoklonāla antiviela: 3-17-A3 (piegādā kā hibridomas audu kultūras centrifugātu) pret grupas specifisko polipeptīdu p7, uzglabā –20 °C temperatūrā vai liofilizētā veidā un pirms lietošanas atšķaida 1/100 ar bloķējošo buferšķīdumu. 5. Konjugāts: trušu pretpeļu globulīns (adsorbēts un eluēts), kas konjugēts pret mārrutku peroksidāzi un glabāts tumsā 4 °C temperatūrā. 6. Hromogēns un substrāts: Ortofenilēndiamīns (OPD-hromogēns) ar galīgo koncentrāciju 0,4 mg/ml sterilā destilētā ūdenī. Ūdeņraža peroksīds (30 % m/V substrāts) 0,05 % V/V, ko pievieno tieši pirms lietošanas (5 μl H2O2 uz 10 ml OPD). (Ar OPD darbojas uzmanīgi — valkā gumijas cimdus — aizdomas par mutagenitāti.) 7. Vienmolāra sērskābe: 26,6 ml skābes pievienots 473,4 mililitriem destilēta ūdens. (Jāatceras, ka skābi vienmēr pievieno ūdenim, bet ūdeni nekad nepievieno skābei.) 8. Orbitālais kratītājs 9. ELISA plates nolasītājs (testu var nolasīt vizuāli). Cc: konjugāta kontrole (bez seruma/bez monoklonālās antivielas); C++: izteikti pozitīva seruma kontrole; C+: vāji pozitīva seruma kontrole; C–: negatīva seruma kontrole; Cm monoklonālās antivielas kontrole (bez seruma).



1. papildinājums: Kontrolatšķaidījumu (1:5) formāts (40 serumu plate) Kontrole Testa serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E c+ c+ F c+ c+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



2. papildinājums: Seruma titrēšanas formāts (10 serumu plate) Kontrole Testa serumi 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1:5 1:5 B Cc C– 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E c+ c+ 1:80 1:80 F c+ c+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Konjugāta kontrole (Cc) : 1A un 1B iedobes ir tukšā parauga pārbaude, ko veido BTV antigēns un konjugāts. To var izmantot tukšā parauga pārbaudei ELISA nolasītājā. Mab kontrole (Cm) : 1. un 2. ailē G un H rindas ir monoklonālās antivielas kontrole, un tajā ietilpst BTV antigēns, monoklonālā antiviela un konjugāts. Šīs iedobes reprezentē maksimālo iekrāsošanos. Šīs kontroles vidējais optiskā blīvuma nolasījumu lielums ir inhibīcijas vērtība 0 %. Pozitīvā kontrole (C++, C–) : 1. un 2. ailes C-D-E-F rindas. Šajās iedobēs ir BTV antigēns, attiecīgi BTV izteikti un vāji pozitīvais imūnserums, Mab un konjugāts. Negatīva kontrole (C–) : Iedobes 2A un 2B ir negatīvās kontroles, kurās ir BTV antigēns, BTV negatīvais imūnserums, Mab un konjugāts. Testa serumi : Plašiem seroloģiskajiem pētījumiem un ātrajam skrīningam serums jātestē vienā atšķaidījumā — 1:5 (1. papildinājums). Alternatīvi — 10 serumus var testēt atšķaidījumu diapazonā no 1:5 līdz 1:640 (2. papildinājums). Tas dos dažas norādes par antivielu titru testa serumā. 1. BTV antigēnu atšķaida PBS līdz iepriekš titrētai koncentrācijai, īsu laiku apstrādā ar ultraskaņu, lai disperģētu saķepušus vīrusus (ja nav ultraskaņas aparatūras, tad enerģiski pipetē), un pievieno 50 μl visās ELISA plates iedobēs. Uzsit plates malām, lai disperģētu antigēnu. 2. Inkubē 60 minūtes 37 °C temperatūrā orbitālajā kratītājā. Plates trīs reizes skalo, ar nesterilu PBS uzpludinot un iztukšojot iedobes, un nosusina virs filtrpapīra. 3. Kontroliedobes: Pievieno Cc iedobēs 100 μl bloķējošā buferšķīduma. Pievieno 50 μl pozitīvās un negatīvās kontroles seruma atšķaidījumā 1:5 (10 μl seruma + 40 μl bloķējošā buferšķīduma) attiecīgajās iedobēs C–, C + un C++. Mab kontroles iedobēs pievieno 50 μl bloķējošā buferšķīduma. Kontroltitrēšanas metode: Katra testa serumu, atšķaidījumā 1:5 bloķējošā buferšķīdumā, pievieno dubultajām iedobēm no 3. līdz 12. ailē (10 μl seruma + 40 μl bloķējošā buferšķīduma), vai arī Seruma titrēšanas metode: Sagatavo katra testa parauga divkārša atšķaidījuma virknes (no 1:5 līdz 1:640) bloķējošā buferšķīdumā astoņās iedobēs vienkāršajās ailēs (no 3. līdz 12.). 4. Uzreiz pēc testa serumu pievienošanas Mab atšķaida 1:100 bloķējošajā buferšķīdumā un pievieno 50 μl visās plates iedobēs, izņemot tukšā parauga kontroli. 5. Inkubē 60 minūtes 37 °C temperatūrā orbitālajā kratītājā. Trīs reizes skalo ar PBS un nosusina. 6. Trušu pretpeļu koncentrātu atšķaida līdz 1/5000 bloķējošajā buferšķīdumā un visās plates iedobēs pievieno 50 μl. 7. Inkubē 60 minūtes 37 °C temperatūrā orbitālajā kratītājā. Trīs reizes skalo ar PBS un nosusina. 8. Atkausē OPD un tieši pirms izmantošanas katriem 10 ml OPD pievieno 5 μl 30 % ūdeņraža peroksīda. Visām plates iedobēm pievieno 50 μl. Ļauj krāsai attīstīties apmēram 10 minūtes un aptur reakciju ar 1 M sērskābes (50 μl uz iedobi). Krāsai ir jāattīstās Mab kontroles iedobēs un tajās iedobēs, kur ir serumi, kas nesatur antivielas pret infekciozo katarālo drudzi (BTV). 9. Plates pārbauda un reģistrē vai nu vizuāli, vai arī ar spektrofotometriskā nolasītāja palīdzību. Izmantojot programmatūru, izdrukā optiskā blīvuma (OB) vērtības un procentuālo inhibīciju (PI) attiecībā uz testa un kontroles serumiem, pamatojot ar vidējo vērtību, kas reģistrēta antigēna kontroles iedobēm. Datus, kas izteikti OB un PI vērtību veidā, izmanto, lai noteiktu, vai tests izpildīts pieļaujamās robežās. Augstākās kontroles robežas (UCL) un zemākās kontroles robežas (LCL) Mab kontrolei (antigēns plus Mab bez testa seruma) ir starp OD vērtībām 0,4 un 1,4. Visas plates, kas neatbilst iepriekšminētajiem kritērijiem, ir nederīgas. Ja nav pieejama datora programmatūra, izdrukā OD vērtības, lietojot ELISA drukātāju. Antigēna kontroles iedobēm aprēķina vidējo OD vērtību, kas ir vienāda ar 100 % vērtību. Nosaka 50 % OD vērtību un manuāli aprēķina katra parauga pozitivitāti un negativitāti. Procentuālās inhibēšanas (PI) vērtība = 100 – (katra testa kontroles OD/Cm vidējā OD) × 100. Dubultajās negatīvās kontroles serumu iedobēs un dubultajās tukšās analīzes iedobēs reģistrētajām PI vērtībām jābūt attiecīgi starp +25 % un –25 % un starp +95 % un +105 %. Neiekļaušanās šajās robežās nepadara plāksni par nederīgu, bet norāda uz fona krāsojuma veidošanos. Izteikti un vāji pozitīvās kontroles serumiem attiecīgi jāreģistrē PI vērtības starp +81 % un +100 % un starp +51 % un +80 %. Diagnostikas slieksnis testa serumam ir 50 % (PI 50 % vai OD 50 %). Paraugus, kam reģistrētās PI vērtības ir zemākas par 50 %, reģistrē kā negatīvus. Paraugus, kam reģistrētās PI vērtības attiecībā uz dubultajām iedobēm atrodas abpus slieksnim, uzskata par šaubīgiem; šādus paraugus var atkārtoti testēt kontroltestā un/vai titrējot. Arī pozitīvus paraugus var titrēt, lai varētu norādīt uz pozitīvā rezultāta pakāpi. Vizuālais nolasījums: Pozitīvos un negatīvos paraugus ir viegli atšķirt ar aci; vāji pozitīvus vai izteikti negatīvus paraugus var būt grūtāk skaidrot ar aci. 1. Skalo 40–60 Rū kolbas, kurās ir konfluentas BHK-21 šūnas, trīs reizes ar Īgla barotni, kas nesatur serumu, un Īgla barotnē, kas nesatur serumu, veic inficēšanu ar infekciozā katarālā drudža vīrusa 1. serotipu. 2. Inkubē 37 °C temperatūrā un katru dienu pārbauda attiecībā uz citopātisko efektu (CPE). 3. Kad CPE ir vērojams 90 līdz 100 % katras Rū mēģenes šūnu kārtiņai, vīrusu ievāc, nokratot visas šūnas, kas vēl pielipušas stiklam. 4. Centrifugē ar 2 000 līdz 3 000 apgriezieniem minūtē, lai granulētu šūnas. 5. Nolej centrifugātu un atkārtoti suspendē šūnas apmēram 30 ml PBS, kas satur 1 % Sarkosyl un 2 ml fenilmetilsulfonilfluorīda (līzes buferšķīdums). Tā rezultātā šūnas var veidot gelu un, lai šo efektu samazinātu, var pievienot vairāk līzes buferšķīduma. (NB: Fenilmetilsulfonilfluorīds ir kaitīgs — jārīkojas ārkārtīgi piesardzīgi.) 6. Šūnas uz 60 sekundēm atdala, izmantojot ultraskaņas zondi ar amplitūdu 30 mikronu. 7. Centrifugē 10 minūtes ar 10 000 apgriezieniem minūtē. 8. Centrifugātu uzglabā +4 °C temperatūrā un atlikušo šūnu granulātu atkārtoti suspendē 10 līdz 20 ml līzes buferšķīdumā. 9. Apstrādā ar ultraskaņu un dzidrina, katrā posmā uzglabājot centrifugātu, pavisam trīs reizes. 10. Centrifugātus sakrāj un centrifugē 120 minūtes +4 °C temperatūrā ar 24 000 apgriezieniem minūtē virs 5 ml 40 % saharozes spilvena (m/V PBS), izmantojot 30 ml Bekmaņa centrifūgas mēģenes un SW 28 rotoru. 11. Nolej centrifugātu, rūpīgi izžāvē mēģenes un atkārtoti suspendē granulu PBS, iedarbojoties ar ultraskaņu. Antigēnu uzglabā alikvotās daļās –20 °C temperatūrā. Infekciozā katarālā drudža ELISA antigēnu titrē ar netiešo ELISA. Divkāršus antigēna atšķaidījumus titrē attiecībā pret monoklonālās antivielas 3-17-A3 konstantu atšķaidījumu (1/100). Rīkojas pēc šāda protokola. 1. Infekciozā katarālā drudža (BTV) antigēnu atšķaida PBS visā mikrotitrēšanas platē divkāršas atšķaidīšanas sērijās (50 μl/iedobe), izmantojot daudzkanālu pipeti. 2. Inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā orbitālajā kratītājā. 3. Plates skalo trīs reizes ar PBS. 4. Katrai iedobei mikrotitrēšanas platē pievieno 50 μl monoklonālās antivielas 3-17-A3 (atšķaidīta 1/100). 5. Inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā orbitālajā kratītājā. 6. Plates skalo trīs reizes ar PBS. 7. Katrai iedobei mikrotitrēšanas platē pievieno 50 μl trušu pretpeļu globulīna, kas konjugēts attiecībā pret mārrutku peroksidāzi, izšķīdinātu līdz iepriekš titrētai optimālai koncentrācijai. 8. Inkubē vienu stundu 37 °C temperatūrā orbitālajā kratītājā. 9. Pievieno substrātu un hromogēnu, kā aprakstīts iepriekš. Reakciju aptur pēc 10 minūtēm, pievienojot vienmolāro sērskābi (50 μl/iedobe). Salīdzinošajā novērtējumā monoklonālajām antivielām jābūt vairākumā, tādēļ izvēlas tādu antigēna atšķaidījumu, kas atrodas uz titrēšanas līknes (nevis plato laukumā), kā rezultātā pēc 10 minūtēm iegūst optisko blīvumu apmēram 0,8.