1991R2568 — LV — 01.11.2003 — 020.001

Šis dokuments ir izveidots vienīgi dokumentācijas nolūkos, un iestādes neuzņemas nekādu atbildību par tā saturu

Grozīta ar:







(*) Šis tiesību akts nekad nav publicēts latviešu valodā.









▼B

KOMISIJAS REGULA (EEK) Nr. 2568/91

(1991. gada 11. jūlijs)

par olīveļļas un olīvu izspaidu eļļas īpašībām un attiecīgajām analīzes metodēm







EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1966. gada 22. septembra Regulu Nr. 136/66/EEK par eļļas un tauku tirgus kopīgo organizāciju ( 1 ), kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EEK) Nr. 3577/90 ( 2 ) un jo īpaši tās 35.a pantu, tā kā Regulas Nr. 136/66/EEK pielikumā ir aprakstīta un definēta olīveļļa un olīvu izspaidu eļļa, ko tirgo katrā dalībvalstī, Kopienas iekšējā tirgū un tirdzniecībā ar trešām valstīm; tā kā, lai atšķirtu dažādu veidu eļļas, būtu jādefinē katras eļļas fizikālās un ķīmiskās īpašības un neapstrādātas olīveļļas organoleptiskās īpašības, lai garantētu attiecīgo produktu tīrību un kvalitāti, neskarot citus pastāvošos noteikumus; tā kā dažādu veidu eļļas īpašības būtu jānosaka vienveidīgi visā Kopienā; tā kā šajā nolūkā būtu jāizstrādā Kopienas metodes ķīmiskai analīzei un organoleptiskai novērtēšanai; tā kā būtu jāatļauj pārejas posmā izmantot citas dalībvalstīs piemērojamās analīzes metodes ar nosacījumu, ka, pastāvot rezultātu atšķirībai, kopējā metode ir izšķirošā; tā kā olīveļļas fizikālo un ķīmisko īpašību un analīzes metožu definīcija ir saistīta ar kombinētās nomenklatūras 15. nodaļas papildu piezīmju grozījumiem; tā kā neapstrādātas eļļas organoleptisko īpašību novērtēšana ietver atlasītu un apmācītu degustētāju žūriju izveidi; tā kā tādēļ būtu jānosaka šādu struktūru izveidei vajadzīgais laika posms; tā kā, ņemot vērā grūtības, ar ko dažas dalībvalstis sastapsies, izveidojot degustētāju žūrijas, būtu jāatļauj izmantot citu dalībvalstu žūrijas; tā kā, lai nodrošinātu olīvu izspaidu importam piemērojamās maksājumu sistēmas pareizu darbību, būtu jānosaka vienota metode eļļas satura noteikšanai šajos produktos; tā kā, lai nekaitētu tirdzniecībai, ir jāparedz, ka ierobežotu laika posmu drīkst tirgot eļļu, kas ir iepakota pirms šīs regulas stāšanās spēkā; tā kā ir jāatceļ Komisijas Regula (EEK) Nr. 1058/77 ( 3 ), kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EEK) Nr. 1858/88 ( 4 ); tā kā Eļļas un tauku pārvaldības komiteja nav iesniegusi atzinumu tās priekšsēdētāja noteiktajā termiņā, IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.







▼M20

1. pants

1. Eļļas, kuru īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 1. un 2. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par neapstrādātām olīveļļām Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 1. punkta a) un b) apakšpunkta nozīmē.

2. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 3. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par spīdīgo olīveļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 1. punkta c) apakšpunkta nozīmē.

3. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 4. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par rafinētu olīveļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 2. punkta nozīmē.

4. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 5. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par olīveļļu, kas sastāv no rafinētām olīveļļām un neapstrādātām olīveļļām Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 3. punkta nozīmē.

5. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 6. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par neapstrādātu olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 4. punkta nozīmē.

6. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 7. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par rafinētu olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 5. punkta nozīmē.

7. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 8. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 6. punkta nozīmē.

▼B

2. pants

1. Eļļas īpašības, kas paredzētas I pielikumā, nosaka saskaņā ar turpmāk izklāstītajām analīzes metodēm:

— brīvas taukskābes, ko izsaka kā oleīnskābes procentus, nosaka ar II pielikumā izklāstīto metodi,

— peroksīda skaitli nosaka ar III pielikumā izklāstīto metodi,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— sterīnu saturu nosaka ar V pielikumā izklāstīto metodi,

— eritrodiolu un uvaolu nosaka ar VI pielikumā izklāstīto metodi,

— piesātinātās taukskābes triglicerīdu 2. stāvoklī nosaka ar VII pielikumā izklāstīto metodi,

▼M20 —————

▼B

— spektrofotometriskajai analīzei izmanto IX pielikumā izklāstīto metodi,

— taukskābju sastāvu nosaka ar X A un X B pielikumā izklāstīto metodi,

— gaistošos halogenētos šķīdinātājus nosaka ar XI pielikumā izklāstīto metodi,

— neapstrādātas olīveļļas organoleptisko īpašību novērtēšanai izmanto XII pielikumā izklāstīto metodi,

▼M20 —————

▼M11

— stigmastadiēnus nosaka ar XVII pielikumā izklāstīto metodi,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Lai veiktu pārbaudes, kas paredzētas 3. punktā, analīzes, kuras minētas II, III, IX, X un XII pielikumā, un, ja vajadzīgs, visas kontrolanalīzes, kas nepieciešamas saskaņā ar valsts tiesību aktiem, veic pirms minimālā derīguma termiņa beigām. Ja paraugus ņem vairāk nekā četrus mēnešus pirms minimālā derīguma termiņa beigām, analīzes veic ne vēlāk kā ceturtajā mēnesī pēc tā mēneša, kad tika ņemts paraugs. Uz citām analīzēm, kas paredzētas minētajā regulā, neattiecas nekāds laika ierobežojums. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

2.a pants

Valsts iestādes vai to pārstāvji var pārbaudīt, vai paraugs atbilst deklarētajai kategorijai:

a) jebkādā kārtībā veicot analīzes, kas paredzētas I pielikumā;

b) vai ievērojot kārtību, kas izklāstīta I.b pielikumā par lēmumu pieņemšanas shēmu, līdz pieņem vienu no lēmumiem, kas iekļauts lēmumu pieņemšanas shēmā.

▼M19 —————

▼M5

►M19 3. ◄ pants

Ja konstatē, ka kādas eļļas organoleptiskās īpašības neatbilst tās aprakstam, attiecīgā dalībvalsts, neskarot jebkādas citas sankcijas, piemēro administratīvas finanšu sankcijas, kas nosakāmas atkarībā no atklātā pārkāpuma smaguma.

Novērtējot pārkāpumu, īpašu uzmanību velta normālos apstākļos uzglabātas eļļas īpašību dabiskajām izmaiņām.

Dalībvalstis katra pusgada sākumā informē Komisiju par atklāto pārkāpumu skaitu un veidu un par iepriekšējā pusgadā piemērotajām sankcijām.

▼M5

4. pants

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Ja dalībvalstīm rodas grūtības izveidot savā teritorijā degustēšanas žūrijas, tās var pieaicināt degustēšanas žūriju, kas apstiprināta kādā citā dalībvalstī.

3. Katra dalībvalsts izveido degustētāju žūriju sarakstu, ko veido profesionālās vai starpnozaru organizācijas saskaņā ar 1. punktā izklāstītajiem nosacījumiem, un nodrošina šo nosacījumu izpildi.

▼M19 —————

▼B

6. pants

1. Raušu un citu olīveļļas ieguves izspaidu (KN kodi 2306 90 11 un 2306 90 19) eļļas saturu nosaka ar XV pielikumā izklāstīto metodi.

2. Šā panta 1. punktā minēto eļļas saturu izsaka eļļas svara procentos no sausā materiāla svara.

▼M20

7. pants

Piemēro Kopienas noteikumus, kas attiecas uz piemaisījumu klātbūtni.

Attiecībā uz halogenētiem šķīdinātājiem ierobežojumi visām olīveļļu kategorijām ir šādi:

— katra konstatētā halogenētā šķīdinātāja maksimālais saturs: 0,1 mg/kg,

— konstatēto halogenēto šķīdinātāju kopējais maksimālais saturs: 0,2 mg/kg.

▼B

8. pants

1. Dalībvalstis paziņo Komisijai par pasākumiem, kas veikti, lai īstenotu šo regulu.

2. Dalībvalstis katra pusgada sākumā nosūta Komisijai paziņojumu par analītiskajiem datiem, kas attiecas uz iepriekšējā pusgadā izdarītajām analīzēm.

Rezultātus izskata Eļļas un tauku pārvaldības komiteja saskaņā ar Regulas Nr. 136/66/EEK 39. pantā izklāstīto kārtību.

9. pants

Ar šo ir atcelta Regula (EEK) Nr. 1058/77.

10. pants

1. Šī regula stājas spēkā trešajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Kopienu Oficiālajā Vēstnesī.

Tomēr XII pielikumā izklāstīto metodi piemēro ►M1 no 1992. gada 1. novembra ◄ , ja vien darbības neattiecas uz intervences sistēmu.

▼M5

Metode neattiecas uz neapstrādātu olīveļļu, kas sagatavota tirgum pirms 1992. gada 1. novembra.

▼B

2. Šo regulu nepiemēro olīveļļai un olīvu izspaidu eļļai, kas ir iepakota pirms šīs regulas stāšanās spēkā un laista tirgū līdz 1992. gada 31. oktobrim.

Šī regula ir saistoša kopumā un tieši piemērojama visās dalībvalstīs.









PIELIKUMI

Kopsavilkums







I pielikums Olīveļļas īpašības ▼M17 Ia pielikums Paraugu ņemšana no olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas, kas piegādāta tiešā iesaiņojumā, nepārsniedzot 100 litrus ▼M20 Ib pielikums Lēmumu pieņemšanas shēma ▼B II pielikums Brīvu taukskābju noteikšana III pielikums Peroksīda skaitļa noteikšana IV pielikums ►M6 Vasku satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzes - šķidruma hromatogrāfiju ◄ V pielikums Sterīnu sastāva un satura noteikšana, izmantojot gāzu hromatogrāfiju ar kapilāro kolonnu VI pielikums Eritrodiola un uvaola noteikšana VII pielikums Piesātināto taukskābju noteikšana triglicerīdu 2. stāvoklī ▼M20 ————— ▼B IX pielikums Spektrofotometriskie pētījumi ultravioletajā spektrā XA pielikums Taukskābju metilesteru analīze ar gāzu hromatogrāfiju Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil XI pielikums Gaistošo halogenēto šķīdinātāju noteikšana olīveļļā Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B XV pielikums Eļļas saturs olīvu izspaidās XVI pielikums Joda skaitļa noteikšana ▼M11 XVII pielikums: Stigmastadiēnu noteikšana augu eļļās ▼M13 Annex XVII: Method for determining the content of triglycerides with ECN ▼M19 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content

▼M20









I PIELIKUMS

OLĪVEĻĻAS VEIDU ĪPAŠĪBAS







Kategorija Skābums (%) * Peroksīda skaitlis mekv. O2/kg * Vaski mg/kg ** Piesātinātās skābes triglicerīdu 2. pozīcijā (%) Stigmasta- diēni mg/kg (1) Starpība starp HPLC ECN42 un teorētisko ECN42 K232 * K270 * Delta--K * Organolep- tisks novērtējums. Nevēlamu piegaršu vid. novērtējums (Md) * Organolep- tisks novērtējums. Augļu piegaršas vid. novērtējums (Mf) * 1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 1,5 ≤ 0,15 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Neapstrādāta olīveļļa ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 1,5 ≤ 0,15 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 2,5 Mf > 0 3. Spīdīgā olīveļļa > 2,0 — ≤ 300 (2) ≤ 1,5 ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 2,5 (3) — 4. Rafinēta olīveļļa ≤ ≤ ≤ 350 ≤ 1,8 — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 5. Jaukta olīveļļa, kas sastāv no rafinētām olīveļļām un neapstrādātām olīveļļām ≤ ≤ 15 ≤ 350 ≤ 1,8 — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ ,15 — — 6. Neapstrādāta olīvu izspaidu eļļa — — > 350 (4) ≤ 2,2 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 2,2 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olīvu izspaidu eļļa ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 2,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) To izomēru summa, ko var (vai nevar) sadalīt kapilārajā kolonnā. (2) Vai, ja nevēlamu piegaršu vidējais novērtējums ir mazāks par 2,5 vai vienāds ar 2,5 un augļu piegaršas vidējais novērtējums ir 0. (3) Eļļas ar vasku saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par spīdīgo olīveļļu, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir mazāks par 350 mg/kg vai vienāds ar 350 mg/kg vai ja eritrodiola un uvaola saturs ir mazāks par 3,5 % vai vienāds ar 3,5 %. (4) Eļļas ar vasku saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par neapstrādātu olīvu izspaidu eļļu, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir lielāks par 350 mg/kg un eritrodiola un uvaola saturs ir lielāks par 3,5 %.







Kategorija (1)Taukskābju saturs Trans-oleīnizomēru summa (%) Trans-linol- izomēru un trans-linolēnizomēru summa (%) Sterīna sastāvs Kopējie sterīni (mg/kg) Eritrodiols un uvaols (%) ** Miristīnskābe (%) Linolēnskābe (%) Arahīnskābe (%) Eikozēnskābe (%) Behenskābe (%) Lignocerīnskābe (%) Holesterīns (%) Brasikasterīns (%) Kampesterīns (%) Stigmasterīns (%) β-sitosterins (2) (%) δ-7-stigmasterins (%) 1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Neapstrādāta olīveļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Spīdīgā olīveļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 – ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Rafinēta olīveļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Jaukta olīveļļa, kas sastāv no rafinētām olīveļļām un neapstrādātām olīveļļām ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Neapstrādāta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 – ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 500 > 4,5 (4) 7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 600 > 4,5 (1) Citas klātesošās taukskābes (%): palmitīnskābe: 7,5 līdz 20,0; palmitoleīnskābe: ≤ 0,3 līdz 3,5; heptadekānskābe: ≤ 0,3; stearīnskābe: 0,5 līdz 5,0; oleīnskābe: 55,0 līdz 83,0; linolskābe: 3,5 līdz 21,0. (2) Delta-5-23-stigmastadienols + hlerosterins + β-sitosterins + sitostanols + Delta-5-avenasterins + Delta -5-24 stigmastadienols. (3) Eļļas ar vasku saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par spīdīgo olīveļļu, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir mazāks par 350 mg/kg vai vienāds ar 350 mg/kg vai ja eritrodiola un uvaola saturs ir mazāks par 3,5 % vai vienāds ar 3,5 %. (4) Eļļas ar vasku saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par neapstrādātu olīvu izspaidu eļļu, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir lielāks par 350 mg/kg un eritrodiola un uvaola saturs ir lielāks par 3,5 %. Piezīmes: a) Analīžu rezultāti jāizsaka ar tādu pašu zīmju skaitu aiz komata, kāds izmantots katrai īpašībai. Pēdējais cipars jāpalielina par vienu vienību, ja sekojošais cipars ir lielāks par 4. b) Eļļas kategoriju var mainīt vai var paziņot, ka eļļa neatbilst šajā regulā noteiktajām tīrības prasībām, ja tikai viena īpašība neatbilst noteiktajām vērtībām. c) Ja īpašība atzīmēta ar zvaigznīti * attiecībā uz eļļas kvalitāti, tas nozīme ka: — attiecībā uz spīdīgo olīveļļu – abi attiecīgie ierobežojumi vienlaikus var atšķirties no noteiktajām vērtībām, — attiecībā uz neapstrādātām olīveļļām – ja vismaz viens no šiem ierobežojumiem atšķiras no noteiktajām vērtībām, eļļas kategorija tiks mainīta, kaut tās arī turpmāk klasificēs vienā no neapstrādātās olīveļļas kategorijām. d) Ja īpašība ir atzīmēta ar divām zvaigznītēm **, tas nozīmē, ka attiecībā uz visiem olīvu izspaidu eļļas veidiem abi attiecīgie ierobežojumi vienlaikus var atšķirties no noteiktajām vērtībām.









Ia PIELIKUMS

PARAUGU ŅEMŠANA NO OLĪVEĻĻAS VAI OLĪVU IZSPAIDU EĻĻAS, KAS PIEGĀDĀTA TIEŠĀ IESAIŅOJUMĀ, NEPĀRSNIEDZOT 100 LITRUS

Šo paraugu ņemšanas metodi piemēro olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas piegādēm, kas nepārsniedz 125 000 litrus un iesaiņotas tiešā iesaiņojumā, nepārsniedzot 100 litrus.

Ja piegāde pārsniedz 125 000 litrus, tā jāsadala 125 000 litru lielās vai mazākās partijās. Ja piegāde ir mazāka par 125 000 litriem, tā veido vienu partiju. Tad metodi piemēro katrai partijai.

Primāro paraugu minimālo paraugu skaitu nosaka pēc partijas lieluma saskaņā ar 1. punktā ievietoto tabulu.

Primārā parauga lielumu nosaka, pamatojoties uz tiešā iesaiņojuma tilpību saskaņā ar 2.1. punktā ievietoto tabulu.

Definīcijas, kas sniegtas standartā EN ISO 5555 piemēro terminiem “piegāde”, “primārais paraugs” un “laboratorijas paraugs”.

“Partija” ir tādu pārdošanas vienību komplekts, kas ražotas, izgatavotas un iepakotas tādos apstākļos, ka eļļu, kuru satur katra pārdošanas vienība, uzskata par homogēnu attiecībā uz visām analītiskajām īpašībām.

1. PRIMĀRO PARAUGU SKAITS

Primāro paraugu minimālo skaitu nosaka pēc partijas lieluma saskaņā ar šo tabulu:







Partijas lielums (litros) ir mazāks par Primāro paraugu minimālais skaits 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Tiešajiem iesaiņojumiem, kas izraudzīti, lai veidotu primāro paraugu, partijā jāatrodas līdzās.

Šaubu gadījumā dalībvalstis palielina primāro paraugu skaitu.

2. PRIMĀRO PARAUGU SATURS

2.1. Primārajiem paraugiem jāietver:



Ja tiešā iesaiņojuma tilpība ir Primārajā paraugā ietver eļļu no a) 5 litri vai vairāk a) 3 tiešiem iesaiņojumiem b) 3 litri vai vairāk, bet mazāk nekā 5 litri b) 3 tiešiem iesaiņojumiem b) 2 litri vai vairāk, bet mazāk nekā 3 litri c) 3 tiešiem iesaiņojumiem d) 1 litrs vai vairāk, bet mazāk nekā 2 litri d) 6 tiešiem iesaiņojumiem e) 0,75 litri vai vairāk, bet mazāk nekā 1 litrs e) 6 tiešiem iesaiņojumiem f) mazāk nekā 0,75 litri f) trīskāršs eļļas daudzums no minimālā iesaiņojumu skaita, lai kopējā tilpība būtu vairāk par 1,5 litriem

2.2. Primāros paraugus uzglabā tiešajā iesaiņojumā līdz pat analīzes veikšanas brīdim. Tad eļļu primārajos paraugos attiecīgā gadījumā sadala 3 laboratorijas paraugos, lai veiktu: a) II, III, IX un X pielikumā minētās analīzes; b) XII pielikumā minēto analīzi; c) citas analīzes.

2.3. Iesaiņojumus, kas veido primāro paraugu, sadala saskaņā ar kontroles procedūrām, kuras paredzētas valsts tiesību aktos.

3. ANALĪZES UN REZULTĀTI

a) Katru 1. punktā minēto primāro paraugu sadala laboratorijas paraugos saskaņā ar standarta EN ISO 5555 2.5. punktu, un analizē šādi: — brīvo taukskābju noteikšana, kā minēts 2. panta 1. punkta pirmajā ievilkumā, — peroksīda skaitļa noteikšana, kā minēts 2. panta 1. punkta otrajā ievilkumā, — spektrofotometriskā analīze, kā minēts 2. panta 1. punkta astotajā ievilkumā, — taukskābju sastāva noteikšana, kā minēts 2. panta 1. punkta devītajā ievilkumā.

b) Ja viens no a) apakšpunktā minēto analīžu rezultātiem vismaz vienam no primārajiem paraugiem, kas ņemti no tās pašas partijas, neatbilst deklarētās eļļas kategorijas īpašībām, visu attiecīgo partiju deklarē par neatbilstošu. Ja a) apakšpunktā minēto analīžu rezultāti katram primārajam paraugam, kas ņemts no tās pašas partijas, nav vienādi, ņemot vērā attiecīgo metožu atkārtojamības īpašības, visu partiju deklarē kā nevienveidīgu partiju, un katram primārajam paraugam veic citas vajadzīgās analīzes. Pretējā gadījumā citas vajadzīgās analīzes veic vienam primārajam paraugam no minētās partijas.

b) Ja viens no b) apakšpunkta otrajā daļā minēto analīžu rezultātiem neatbilst deklarētās eļļas kategorijas īpašībām, visu attiecīgo partiju deklarē par neatbilstošu. Ja visi b) apakšpunkta otrajā daļā minēto analīžu rezultāti atbilst deklarētās eļļas kategorijas īpašībām, visu attiecīgo partiju deklarē par atbilstošu.

▼M20









Ib PIELIKUMS

LĒMUMU PIEŅEMŠANAS SHĒMA, LAI PĀRBAUDĪTU TO, VAI OLĪVEĻĻAS PARAUGS ATBILST DEKLARĒTAJAI KATEGORIJAI

Analīzi, kas vajadzīga, lai pārbaudītu to, vai olīveļļa vai olīvu izspaidu eļļa atbilst deklarētajai kategorijai, var veikt:

a) jebkādā izvēles secībā veicot analīzes, kas paredzētas, lai pārbaudītu atbilstību īpašībām, kuras precizētas I pielikumā, vai

b) lēmumu pieņemšanas shēmā norādītajā secībā veicot analīzes, kas precizētas lēmumu pieņemšanas shēmā, līdz pieņem vienu no lēmumiem, kurš iekļauts lēmumu pieņemšanas shēmā.

Analīzes, kas attiecas uz piemaisījumiem un kas vajadzīgas, lai pārbaudītu atbilstību Eiropas Kopienas standartiem, veic atsevišķi.

Lēmumu pieņemšanas shēma attiecas uz visām olīveļļas un olīvu izspaidu eļļas kategorijām. To veido tabulas, kuras numurētas no 1 līdz 11 un kuras izmanto, pamatojoties uz attiecīgās eļļas deklarēto kategoriju un tādā kārtībā, kā noteikts vispārīgajā tabulā.

Vispārīgās tabulas un 1. līdz 11. tabulas atšifrējums:

— dubulta līnija (=) norāda virzienu, kuram jāseko, ja ir atbilstība (pozitīva atbilde) kritērijiem, kas precizēti iepriekšējā lodziņā. Punktota līnija (…) norāda citu virzienu, kuram jāseko neatbilstības gadījumā,

— virsraksti lodziņos, kas iekļauti 1. līdz 11. tabulā, attiecas uz analīzēm, kuras paredzētas šajā regulā, pamatojoties uz atbilstības tabulu, kas dota šā pielikuma 1. papildinājumā,

— burti iekavās, kas norādīti negatīva lēmuma apļos 1. līdz 11. tabulā, savstarpēji norāda uz indikatīvo informāciju, kas sniegta šā pielikuma 2. papildinājumā. Burti paši par sevi nenozīmē to, ka jāveic analīzes vai ka norādītie pieņēmumi ir patiesi.









1. papildinājums

Atbilstības tabula starp šīs regulas pielikumiem un lēmumu pieņemšanas shēmā precizētajām analīzēm







– Skābums II pielikums Brīvo taukskābju noteikšana – Peroksīda skaitlis III pielikums Peroksīda skaitļa noteikšana – UV spektrometrija IX pielikums Spektrofotometriskā analīze – Organoleptiskais novērtējums XII pielikums Neapstrādātas olīveļļas organoleptiskā novērtēšana – 3,5-stigmastadiēni XVII pielikums Stigmastadiēnu noteikšanas metode augu eļļās – Trans-izomēri taukskābēs X.a un Taukskābju metilesteru analīze ar gāzu hromatogrāfiju X.b pielikums Taukskābju metilesteru pagatavošana – Taukskābju saturs X.a un Taukskābju metilesteru analīze ar gāzu hromatogrāfiju X.b pielikums Taukskābju metilesteru pagatavošana – ΔECN42 XVIII pielikums Triglicerīdu sastāva noteikšana ar ECN42 (starpība starp HPLC datiem un teorētisko saturu) – Sterīnu sastāvs un kopējais saturs V pielikums Sterīnu sastāva un satura noteikšana, izmantojot gāzu hromatogrāfiju ar kapilāro kolonnu – Eritrodiols un uvaols VI pielikums Eritrodiola un uvaola noteikšana – Vaski IV pielikums Vasku satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzes hromatogrāfiju – Alifātiskie spirti XIX pielikums Alifātisko spirtu noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju – Piesātinātās taukskābes 2. pozīcijā VII pielikums Piesātināto taukskābju noteikšana triglicerīdu 2. pozīcijā









2. papildinājums

1. tabula

a) Sk. neapstrādātu olīveļļu vai spīdīgo olīveļļu (Kvalitātes kritēriji – 2. tabula vai Kvalitātes un tīrības kritēriji – 4. tabula)

b) Sk. spīdīgo olīveļļu (Kvalitātes un tīrības kritēriji – 4. tabula)

2. tabula

a) Sk. spīdīgo olīveļļu (Kvalitātes un tīrības kritēriji – 4. tabula)

b) Sk. neapstrādātu augstākā labuma olīveļļu (Kvalitātes kritēriji – 1. tabula)

3. tabula

a) Rafinētas eļļas (olīvu vai citas) klātbūtne

b) Olīvu izspaidu eļļas klātbūtne

4. tabula

a) Sk. neapstrādātu augstākā labuma olīveļļu un neapstrādātu olīveļļu (Kvalitātes kritēriji – 1. tabula un 2. tabula)

b) Rafinētas eļļas (olīvu vai citas) klātbūtne

c) Olīvu izspaidu eļļas klātbūtne

d) Esterificētu eļļu klātbūtne

7. tabula

a) Olīvu izspaidu eļļas klātbūtne

b) Esterificētu eļļu klātbūtne

8. tabula

a) Rafinētas eļļas (olīvu vai citas) klātbūtne

b) Sk. spīdīgo olīveļļu (Kvalitātes un tīrības kritēriji – 4. tabula)

c) Esterificētu eļļu klātbūtne

11. tabula

(a) Esterificētu eļļu klātbūtne

▼B









II PIELIKUMS

BRĪVU TAUKSKĀBJU NOTEIKŠANA

1. SKĀBUMA NOTEIKŠANA

Brīvu taukskābju noteikšana olīveļļās. Brīvu taukskābju saturu izsaka kā skābumu, ko aprēķina parastā veidā.

1.1. Princips

Paraugu izšķīdina šķīdinātāju maisījumā un klātesošās brīvās skābes titrē ar kālija hidroksīda šķīdumu etanolā.

1.2. Reaktīvi

Visiem reaktīviem ir jābūt atzītas analītiskas kvalitātes un izmantojamam ūdenim jābūt divreiz destilētam vai līdzvērtīgas tīrības.

1.2.1. Dietilētera/etanola (95 tilp. %) maisījums vienādās tilpuma daļās. Piezīme: dietilēteris ir viegli uzliesmojošs un var veidot sprādzienbīstamus peroksīdus. To lietojot, ir jābūt īpaši piesardzīgiem. Dietilētera/etanola maisījumu tieši pirms lietošanas neitralizē ar kālija hidroksīda šķīdumu (1.2.2. punkts), pievienojot uz 100 ml maisījuma 0,3 ml fenolftaleīna šķīduma (1.2.3. punkts). Piezīme: ja nav iespējams lietot dietilēteri, var lietot šķīdinātāju maisījumu, kas sastāv no etanola un toluola. Vajadzības gadījumā etanolu var aizstāt ar 2-propanolu.

1.2.2. Kālija hidroksīds, KOH, titrēts etanola šķīdums, kura koncentrācija aptuveni 0,1 M/l vai vajadzības gadījumā 0,5 M/l. Ir jābūt zināmai kālija hidroksīda šķīduma etanolā precīzai koncentrācijai, un tā ir jāpārbauda tieši pirms lietošanas. Lieto šķīdumu, kas ir pagatavots vismaz piecas dienas pirms lietošanas un dekantēts brūna stikla pudelē ar gumijas aizbāzni. Šķīdumam jābūt bezkrāsainam vai iedzeltenam. Piezīme: stabilu bezkrāsainu kālija hidroksīda šķīdumu var pagatavot šādi. Uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai 1 000 ml etanola ar 8 g kālija hidroksīda un 0,5 g alumīnija skaidiņu un vienu stundu vāra ar atteces dzesinātāju. Tūlīt pārdestilē. Destilātā izšķīdina vajadzīgo kālija hidroksīda daudzumu. Atstāj uz dažām dienām un dzidro supernatantu dekantē no kālija karbonāta nogulsnēm. Šķīdumu var pagatavot arī bez destilācijas šādi: 1 000 ml etanola pievieno 4 ml alumīnija butilāta un maisījumu atstāj uz dažām dienām. Dekantē supernantantu un izšķīdina vajadzīgo daudzumu kālija hidroksīda. Šķīdums ir gatavs lietošanai.

1.2.3. Fenolftaleīna 10 g/l šķīdums 95 līdz 96 tilp. % etanolā vai sārmainā zilā 20 g/l šķīdums 95 līdz 96 tilp. % etanolā (stipri krāsotu tauku gadījumā).

1.3. Aparatūra

Parastais laboratoriju aprīkojums, tai skaitā:

1.3.1. Analītiskie svari;

1.3.2. 250 ml koniskā kolba;

1.3.3. 10 ml birete, graduēta pa 0,05 ml.

1.4. Procedūra

1.4.1. Parauga sagatavošana analīzei (Analīzi izdara ar filtrētu paraugu. Ja mitruma un piemaisījumu kopā ir mazāk par 1 %, paraugu lieto bez turpmākas apstrādes; ja to ir vairāk par 1 %, paraugs ir jāfiltrē.)

1.4.2. Parauga ņemšana Paraugu ņem atkarībā no paredzamā brīvo skābju satura saskaņā ar šādu tabulu:



Paredzamais skābju saturs Parauga masa (g) Svēršanas precizitāte (g) < 1 20 0,05 1 līdz 4 10 0,02 4 līdz 15 2,5 0,01 15 līdz 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Paraugu nosver koniskajā kolbā (1.3.2. punkts).

1.4.3. Noteikšana Paraugu (1.4.2. punkts) izšķīdina 50 līdz 150 ml iepriekš neitralizētā dietilētera un etanola maisījumā (1.2.1. punkts). Maisot titrē ar 0,1 M/l kālija hidroksīda šķīdumu (1.2.2. punkts) (sk. 2. piezīmi), līdz indikatora krāsa mainās (fenolftaleīna sārtā krāsa saglabājas vismaz 10 sekundes). 1. piezīme: titrēto kālija hidroksīda šķīdumu etanolā (1.2.2. punkts) var aizstāt ar kālija vai nātrija hidroksīda ūdens šķīdumu, ar noteikumu, ka ievadītā ūdens daudzums neizraisa fāzu atdalīšanos. 2. piezīme: ja vajadzīgais 0,1 M/l kālija hidroksīda daudzums ir lielāks par 10 ml, lieto 0,5 M/l šķīdumu. 3. piezīme: ja šķīdums titrēšanas laikā kļūst duļķains, pievieno pietiekami daudz šķīdinātāju (1.2.1. punkts), lai šķīdums kļūtu dzidrs.

1.5. Skābju saturs: izteikts oleīnskābes procentos

Skābju saturs svara procentos ir vienāds ar:

kur:

V = izlietotā titrētā kālija hidroksīda tilpums mililitros;

C = lietotā titrētā kālija hidroksīda precīzā koncentrācija M/l;

M = molmasa gramos skābei, ko izmanto rezultāta izteikšanai (= 282);

m = parauga masa gramos.

Rezultāts ►M6 divu aprēķinu ◄ aritmētiskais vidējais.









III PIELIKUMS

PEROKSĪDA SKAITĻA NOTEIKŠANA

1. DARBĪBASJOMA

Šis standarts apraksta eļļu un tauku peroksīda skaitļa noteikšanas metodi.

2. IZMANTOŠANASJOMA

Šis standarts ir piemērojams dzīvnieku un augu eļļām un taukiem.

3. DEFINĪCIJA

Peroksīda skaitlis ir to vielu daudzums paraugā, izteikts aktīvā skābekļa miliekvivalentos kilogramā, kuras oksidē kālija jodīdu aprakstītajos eksperimenta apstākļos.

4. PRINCIPS

Analīzes parauga apstrāde ar kālija jodīda šķīdumu etiķskābes un hloroforma šķīdumā. Atbrīvotā joda titrēšana ar standartizētu nātrija tiosulfāta šķīdumu.

5. APARATŪRA

Visam aprīkojumam jābūt brīvam no reducējošām vai oksidējošām vielām.

Piezīme: slīpētās virsmas nav jāeļļo.

5.1. 3 ml stikla svēršanas laiviņa.

5.2. Aptuveni 250 ml kolbas ar pieslīpētiem kakliem un aizbāžņiem, iepriekš izžāvētas un piepildītas ar sausu inertu gāzi (slāpekli vai, labāk, oglekļa dioksīdu).

5.3. 25 vai 50 ml birete, graduēta ik pa 0,1 ml.

6. REAKTĪVI

6.1. Hloroforms, kam ir analītiska reaktīva kvalitāte, atbrīvots no skābekļa, burbuļojot tam cauri tīras inertas gāzes straumīti.

6.2. Ledus etiķskābe, kam ir analītiska reaktīva kvalitāte, atbrīvota no skābekļa, burbuļojot tai cauri tīras, sausas inertas gāzes straumīti.

6.3. Kālija jodīda piesātināts ūdens šķīdums, nesen pagatavots, kas nesatur jodu un jodātus.

6.4. Nātrija tiosulfāta precīzi standartizēts 0,01 vai 0,002 N ūdens šķīdums, standartizēts tieši pirms lietošanas.

6.5. Cietes šķīdums, 10 g/l ūdens dispersija, nesen pagatavota no dabiskās šķīstošās cietes.

7. PARAUGS

Pievērš vērību, lai paraugu paņemtu un glabātu tumsā, turētu aukstumā un pilnīgi piepildītos stikla traukos, kas ir hermētiski noslēgti ar pieslīpētiem stikla vai korķa aizbāžņiem.

8. PROCEDŪRA

Analīzi izdara izkliedētā dienasgaismā vai mākslīgā apgaismojumā. Analizējamo paraugu ar precizitāti līdz tuvākajam 0,001 g nosver svēršanas laiviņā (5.1. punkts) vai, ja tādas nav, kolbā (5.2. punkts) saskaņā ar šādu tabulu atbilstīgi sagaidāmajam peroksīda skaitlim:







Sagaidāmais peroksīda skaitlis (mekv.) Analizējamā parauga masa (g) 0 līdz 12 5,0 līdz 2,0 12 līdz 20 2,0 līdz 1,2 20 līdz 30 1,2 līdz 0,8 30 līdz 50 0,8 līdz 0,5 50 līdz 90 0,5 līdz 0,3

Atver kolbu (5.2. punkts) un tajā ieliek stikla svēršanas laiviņu ar analīzes paraugu. Pievieno 10 ml hloroforma (6.1. punkts). Ātri maisot, analīzes paraugu izšķīdina. Pievieno 15 ml etiķskābes (6.2. punkts), pēc tam pievieno 1 ml kālija jodīda šķīduma (6.3. punkts). Nekavējoties aizkorķē, vienu minūti krata un atstāj tieši piecas minūtes tumšā vietā 15 līdz 25 °C temperatūrā.

Pievieno aptuveni 75 ml destilēta ūdens. Enerģiski kratot, izdalījušos jodu titrē ar nātrija tiosulfāta šķīdumu (6.4. punkts) (0,002 N šķīduma, ja sagaidāmie lielumi ir mazāki par 12, un 0,01 N šķīduma, ja sagaidāmie lielumi ir lielāki par 12), izmantojot par indikatoru cietes šķīdumu (6.5. punkts).

Vienam analizējamam paraugam izdara divas noteikšanas.

Vienlaikus izdara tukšo mēģinājumu. Ja tukšā mēģinājuma rezultāts pārsniedz 0,05 ml 0,01 N nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts), tad nomaina netīros reaktīvus.

9. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Peroksīda skaitli (PV), izteiktu aktīvā skābekļa miliekvivalentos kilogramā, aprēķina pēc formulas:

kur:

V = standartizēta nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts) ml skaits, kas izlietoti analīzē, kas ir koriģēts, lai ņemtu vērā tukšo mēģinājumu;

T = lietotā nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts) precīzā normalitāte;

m = analīzes parauga masa gramos.

Rezultāts ir divu izdarīto noteikšanu aritmētiskais vidējais.

▼M6









IV PIELIKUMS

VASKU SATURA NOTEIKŠANA AR KAPILĀRĀS KOLONNAS GĀZES - ŠĶIDRUMA HROMATOGRĀFIJU

1. DARBĪBAS JOMA

Metodē aprakstīta vasku satura noteikšanas procedūra taukos un eļļās testēšanas apstākļos.

Jo īpaši to var izmantot izspiestas olīveļļas atšķiršanai no eļļas, kas iegūta ar ekstrakcijas metodi (olīvu izspaidu eļļas).

2. PRINCIPS

Taukiem vai eļļai pievieno piemērotu iekšējo standartu, un tad hromatogrāfiski frakcionē kolonnā ar hidrētu silikagelu. Iegūst frakciju, kas testēšanas apstākļos eluējas vispirms (kura ir mazāk polāra par triglicerīdiem), un to tieši analizē, izmantojot kapilārās kolonnas gāzes - šķidruma hromatogrāfiju.

3. IEKĀRTA

3.1. 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba.

3.2. Stikla kolonna hromatogrāfijai ar iekšējo diametru 15 mm, kuras garums ir 30-40 cm.

3.3. Piemērots gāzes - šķidruma hromatogrāfs ar kapilāra kolonnu un sistēmu tiešai ievadīšanai kolonnā, un kurā ir: 3.3.1 tāda termostatējama krāsns kolonnām, kas var uzturēt vajadzīgo temperatūru ar precizitāti līdz 1 °C; 3.3.2. neapsildāms inžektors tiešai ievadīšanai kolonnā; 3.3.3. liesmas jonizācijas detektors un pārveidotājs - pastiprinātājs; 3.3.4. pašrakstītājs integrators ar maināmu papīra padeves ātrumu, kas var darboties kopā ar pārveidotāju-pastiprinātāju (3.3.3.), un kura atbildes laiks ir mazāks par 1 sekundi; 3.3.5. stikla vai kvarca kapilārā kolonna, 10 līdz 15 m gara ar iekšējo diametru 0,25 līdz 0,32 mm, kuras iekšējā virsma pārklāta ar SE-52, SE-54 vai tām līdzvērtīgu šķidro fāzi vienādā 0,10 līdz 0,30 μm biezā slānī.

3.4. Mikrošļirce ar adatu cietā apvalkā, ar tiešo ievadīšanas jaudu kolonnā 10μl.

4. REAĢENTI

4.1. Silikagels ar daļiņu izmēru 70 – 230 μm, firmas Merck artikuls 7754. Slikagelu četras stundas karsē krāsnī 500 °C temperatūrā. Ļauj atdzist, pievieno 2 % ūdens. Suspensiju homogenizē kratot. Pirms lietošanas vismaz 12 stundas tur tumšā vietā.

4.2. n-heksāns, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.3. Dietilēteris, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.4. n-heptāns, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.5. Laurilarahidāta 0,1 % standartšķīdums (masa/tilp.) heksānā (iekšējais standarts).

4.6. Nesējgāze: tīrs ūdeņradis, gāzes - šķidruma hromatogrāfijas kvalitātes.

4.7. Citas gāzes: — tīrs ūdeņradis, gāzes – šķidruma hromatogrāfijas kvalitātes, — tīrs gaiss, gāzes - šķidruma hromatogrāfijas kvalitātes.

5. PROCEDŪRA

5.1. Vasku frakcijas atdalīšana.

5.1.1 Hromatogrāfijas kolonas sagatavošana. Bezūdens n-heksānā suspendē 15 g silikagela, kas hidrēts līdz 2 %, un suspensiju pārnes kolonnā. Suspensijai ļauj nostāties. Lai hromatogrāfiskā josla būtu viendabīgāka, nostādināšanas beigās izmanto elektrisko kratītāju. Lai atdalītu piemaisījumus, kolonnai izlaiž cauri 30 ml n-heksāna.

5.1.2. Kolonnas hromatogrāfija Kolbā ar tilpumu 25 ml precīzi iesver 500 mg analizējamā parauga un atkarībā no sagaidāmā vasku satura vajadzīgajā daudzumā pievieno iekšējo standartu, piemēram, analizējot olīveļļu, pievieno 0,1 mg, bet, analizējot olīvu izspaidu eļļu - 0,25 mg līdz 0, 5 mg laurilarahidāta. Sagatavoto paraugu ar divām 2 ml lielām heksāna porcijām pārnes uz saskaņā ar 5.1. sagatavoto hromatogrāfijas kolonnu. Šķīdinātājam ļauj ieplūst absorbentā, līdz tā slāņa biezums virs absorbenta ir 1 mm. Tad sāk hromatogrāfisku eluēšanu; savāc 140 ml n-heksāna un dietilētera maisījuma tilpuma attiecībā 99:1, ko eluē ar ātrumu 15 pilieni 10 sekundēs (2,1 ml/min.). Iegūto frakciju rotācijas iztvaicētājā tvaicē līdz gandrīz viss šķīdinātājs ir izdalījies. Atlikušos 2 līdz 3 ml šķīdinātāja iztvaicē vājā slāpekļa plūsmā un tad pievieno 10 ml n-heptāna.

5.2. Gāzes - šķidruma hromatogrāfiskā analīze

5.2.1. Priekšdarbi un kolonas kondicionēšana. 5.2.1.1. Kolonnu ievieto gāzes - šķidruma hromatogrāfā, tās ieplūdes atveri pievieno ievadīšanas sistēmai, bet izplūdes atveri - detektoram. Pārbauda gāzes - šķidruma hromatogrāfa darbību (gāzes cilpas, detektoru, pašrakstītāju u.c.). 5.2.1.2. Kolonnu lietojot pirmo reizi, to ieteicams kondicionēt. Kolonnai laiž cauri nelielu gāzes plūsmu, un tad ieslēdz gāzes – šķidruma hromatogrāfu. Pakāpeniski uzsilda līdz temperatūrai, kas vismaz par 20 °C pārsniedz darba temperatūru (skat. piezīmi). Šādu temperatūru uztur vismaz divas stundas, tad noregulē aparatūru darba režīmā (regulē gāzes plūsmu, iededz liesmu, pievieno elektronisko pašrakstītāju, noregulē kolonnas sildīšanas krāsns temperatūru, noregulē detektoru u.c.). Reģistrē signālu ar jutību, kas vismaz divkārt pārsniedz analīzei nepieciešamo. Bāzes līnijai jābūt taisnai, bez dažādiem pīķiem, un tā nedrīkst novirzīties. Negatīva lineāra novirze liecina, ka kolonna nav pareizi pievienota; pozitīva novirze liecina, ka kolonna nav pienācīgi kondicionēta. Piezīme: Kondicionēšanas temperatūrai jābūt vismaz 20 °C zem izmantotajam eluentam norādītās maksimālās temperatūras.

5.2.2. Darba apstākļu izvēle. 5.2.2.1. Parasti izvēlas šādus darba apstākļus: — kolonnas temperatūra: sākumā 80 °C, tad ar ātrumu 30 °C minūtē to paaugstina līdz 120 °C, kuru sasniedzot, ieprogrammē temperatūras paaugstināšanos par 5 °C minūtē, līdz 340 °C, — detektora temperatūra: 350 °C, — nesējgāzes – ūdeņraža lineārais ātrums: 20 līdz 35 cm/s, — iekārtas jutība: 4 līdz 16 reižu lielāka par minimālo jutības iedaļu, — reģistrēšanas jutība: 1 līdz 2 mV no skalas apakšas, — pašrakstītāja ātrums: 30 cm/h, — ievadītais daudzums: 0,5 līdz 1μl šķīduma. Atbilstīgi kolonnas un gāzes - šķidruma hromatogrāfa īpašībām norādītos apstākļus var mainīt, lai iegūtu hromatogrammas, kas atbilst šādiem nosacījumiem: C32 iekšējā standarta izdalīšanas laikam jābūt 25 ± 2 minūtes, un vasku reprezentatīvākajam pīķim jābūt no 60 līdz 100 % robežās no skalas apakšas. 5.2.2.2. Hromatogrāfiskā pīķa integrēšanas parametrus nosaka tā, lai iegūtu pareizu attiecīgo pīķu laukuma novērtējumu.

5.2.3. Analīzes veikšana 5.2.3.1. Ar 10 μl tilpuma mikrosļirci ņem 1μl šķīduma; atvelkot virzuli, iztukšo adatu. Adatu ievada ievadīšanas sistēmā un pēc vienas vai divām sekundēm šļirci strauji iztukšo. Pēc apmēram piecām sekundēm adatu uzmanīgi izvelk. 5.2.3.2. Veic reģistrāciju, līdz vaski pilnībā eluējas. Bāzes līnijai vienmēr jāatbilst 5.2.1.2 punktā minētajām prasībām.

5.2.4. Pīķu identificēšana Pīķus identificē pēc izdalīšanas laika, tos salīdzinot ar tādos pašos apstākļos analizētu vasku maisījumu izdalīšanas laikiem, kas ir zināmi. 1. attēlā parādīta neapstrādātas olīveļļas vasku hromatogramma.

5.2.5. Kvantitatīvā analīze 5.2.5.1. Izmantojot integratoru, nosaka to pīķu laukumu, kas atbilst iekšējam standartam un C40 līdz C46 alifātiskajiem esteriem. 5.2.5.2. Aprēķina katram esterim atbilstošo vaska saturu, izsakot kā mg/kg taukvielu pēc šādas formulas: kur Ax = attiecīgajam esterim atbilstošā pīķa laukums; As = laurilarahidāta pīķa laukums; ms = pievienotā laurilarahidāta masa miligramos; m = noteikšanai ņemtā parauga masa gramos.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Norāda kā mg/kg taukvielās izteiktu atsevišķo vaskvielu saturu un kopējo vasku saturu.









PIELIKUMA PAPILDINĀJUMS

Gāzes lineārā ātruma noteikšana

Pēc darba apstākļu noregulēšanas, gāzes - šķidruma hromatogrāfā ievada 1 līdz 3 μl metāna (vai propāna). Nosaka laiku, kas paiet kamēr gāze iziet caur kolonnu, no tās ievadīšanas līdz pīķa parādīšanās brīdim (tM).

Lineāro ātrumu cm/s aprēķina pēc formulas L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros, un tM - laiks sekundēs.

▼B









V PIELIKUMS

STERĪNU SASTĀVA UN KONCENTRĀCIJAS NOTEIKŠANA, IZMANTOJOT GĀZU HROMATOGRĀFIJU AR KAPILĀRO KOLONNU

1. DARBĪBAS JOMA

Metode apraksta individuālo un kopējo sterīnu satura noteikšanu taukus saturošās vielās.

2. METODES PRINCIPS

Taukus saturoso vielu, pieliekot a-holestanolu kā iekšējo standartu, pārziepjo ar kālija hidroksīda šķīdumu etanolā un pēc tam nepārziepjoto daļu ekstrahē ar dietilēteri.

Sterīnu frakciju atdala no nepārziepjojamā ekstrakta ar hromatogrāfiju uz bāziska silikagēla plāksnes. No silikagēla reģenerētos sterīnus pārveido trimetilsililēteros un analizē ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA

3.1. 250 ml kolba ar pieslīpētu savienojumu, aprīkota ar atteces dzesinātāju.

3.2. 500 ml dalāmās piltuves.

3.3. 250 ml kolbas.

3.4. Komplekts analīzei ar plānslāņa hromatogrāfiju, izmantojot 20 × 20 cm stikla plāksnes.

3.5. Ultravioletā spuldze ar viļņa garumu 366 vai 254 nm.

3.6. 100 μl un 500 μl mikrošļirces.

3.7. Cilindrisks poraina stikla filtrs G 3 (porainība 15 līdz 40 μm), aptuveni 5 cm augsts un aptuveni ar 2 cm diametru, piemērots filtrēšanai pazeminātā spiedienā, ar 12/21 ārējo pieslīpējumu.

3.8. 50 ml vakuumpudele ar 12/21 iekšējo pieslīpējumu aprīkošanai ar stikla filtru (3.7. punkts).

3.9. 10 ml mēģene ar konisku apakšu un aizbāzni.

3.10. Ar sadales sistēmu aprīkots gāzu hromatogrāfs ar kapilāro kolonnu, kura sastāvdaļas ir šādas: 3.10.1. termostatējama kamera kolonnu vēlamās temperatūras uzturēšanai ar precizitāti līdz ± 1 °C; 3.10.2. termostatējama iztvaicēšanas iekārta (inžektors) ar silanizētu stikla iztvaicētāju; 3.10.3. liesmas jonizācijas detektors un pārveidotājs/pastiprinātājs; 3.10.4. reģistrējošā iekārta/integrators ar atbildes laiku ne lielāku par vienu sekundi un ar maināmu papīra ātrumu darbam ar pārveidotāju/pastiprinātāju (3.10.3. punkts).

3.11. 20 līdz 30 m gara stikla vai kvarca kapilārā kolonna ar iekšējo diametru 0,25 līdz 0,32 mm, pilnīgi pārklāta ar vienāda biezuma SE-52 vai SE-54 vai ar līdzvērtīgu šķidro fāzi, kuras slāņa biezums ir starp 0,10 un 0,30 μm.

3.12. Mikrošļirce gāzu hromatogrāfijai ar 10 μl tilpumu un rūdītu adatu.

4. REAKTĪVI

4.1. Kālija hidroksīds, aptuveni 2 N etanola šķīduma. 130 g kālija hidroksīda (minimālā koncentrācija 85 %) dzesējot izšķīdina 200 ml destilēta ūdens, pēc tam uzpilda ar etanolu līdz vienam litram. Šķīdumu glabā cieši noslēgtās tumša stikla pudelēs.

4.2. Dietilēteris, analītiskas tīrības.

4.3. Bezūdens nātrija sulfāts, analītiskas tīrības.

4.4. Stikla plāksnes, pārklātas ar silikagēlu, bez fluorescences indikatora, 0,25 mm biezas (var iegādāties tirdzniecībā, lietošanai gatavas).

4.5. Kālija hidroksīds, 0,2 N etanola šķīduma. 13 g kālija hidroksīda izšķīdina 20 ml destilēta ūdens un uzpilda ar etanolu līdz vienam litram.

4.6. Benzols, hromatogrāfijas kvalitātes. (sk. 5.2.2. punktu).

4.7. Acetons, hromatogrāfijas kvalitātes. (sk. 5.2.2. punktu).

4.8. Heksāns, hromatogrāfijas kvalitātes. (sk. 5.2.2. punktu).

4.9. Dietilēteris, hromatogrāfijas kvalitātes. (sk. 5.2.2. punktu).

4.10. Hloroforms, analītiskas tīrības. (sk. 5.2.2. punktu).

4.11. Standartšķīdums plānslāņa hromatogrāfijai: holesterīns vai fitosterīni, ►M6 2 % ◄ šķīdums hloroformā.

4.12. 2,7-dihlorfluoresceīna 0,2 % šķīdums etanolā. To padara nedaudz bāzisku, pievienojot dažus pilienus 2 N kālija hidroksīda šķīduma spirtā.

4.13. Bezūdens piridīns, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.14. Heksametildisilazāns.

4.15. Trimetilhlorsilāns.

4.16. Sterīnu trimetilsililēteru standartšķīdumi. Tos pagatavo pirms lietošanas no tīriem sterīniem vai sterīnu maisījumiem, kas iegūti no sterīnus saturošām eļļām.

4.17. α-holestanols, 0,2 % sķīdums (masa/tilp.) hloroformā (iekšējais standarts).

4.18. Nesējgāzes: ūdeņradis vai hēlijs, gāzu hromatogrāfijas tīrības.

4.19. Palīggāzes: — ūdeņradis, gāzu hromatogrāfijas tīrības, — gaiss, gāzu hromatogrāfijas tīrības.

5. PROCEDŪRA

5.1. Nepārziepjojamās vielas pagatavošana. 5.1.1. Ar 500 μl mikrosļirci 250 ml kolbā ievada tādu daudzumu 0,2 % α-holestanola šķīduma hloroformā (4.17), kas satur holestanola daudzumu, kurš atbilst aptuveni 10 % no noteikšanai ņemtā parauga alikvotās daļas. Piemēram, olīveļļas gadījumā uz 5 g parauga pievieno 500 μl 0,2 % α- holestanola sķīduma un ►M6 ————— ◄ olīvu izspaidu eļļas gadījumā pievieno 1 500 μl. Slāpekļa straumē iztvaicē sausu un pēc tam tajā pašā kolbā precīzi nosver 5 g sausa nofiltrēta parauga. ►M6 Eļļas ◄ , kas satur nozīmīgus holesterīna daudzumus, var uzrādīt pīķus ar aiztures laikiem, kas ir identiski holestanola aiztures laikam. Tādā gadījumā sterīnu frakcija ir jāanalizē divreiz — ar iekšējo standartu un bez tā ►M6 vai holestanola vietā izmanto betulinolu ◄ . 5.1.2. Pievieno 50 ml 2 N kālija hidroksīda šķīduma etanolā, uzliek atteces dzesinātāju un silda līdz lēnai viršanai uz ūdens vannas, visu laiku enerģiski maisot, līdz ir notikusi pārziepjošana (šķīdums kļūst dzidrs). Turpina sildīt 20 minūtes, pēc tam caur dzesinātāja augšgalu pievieno 50 ml destilēta ūdens, atvieno dzesinātāju un atdzesē kolbu aptuveni līdz 30 °C. 5.1.3. Kolbas saturu kvantitatīvi pārnes 500 ml dalāmajā piltuvē, vairākas reizes apskalojot ar destilētu ūdeni, kura kopējais daudzums ir aptuveni 50 ml. Pievieno aptuveni 80 ml dietilētera, enerģiski krata aptuveni 30 sekundes un ļauj noslāņoties (1. piezīme). Atdala apakšējo ūdens fāzi, savācot to citā dalāmajā piltuvē. Tieši tāpat ūdens fāzi ekstrahē vēl divas reizes, katrai ekstrakcijai izlietojot 60 līdz 70 ml dietilētera. 1. piezīme: radušos emulsiju var likvidēt, pievienojot nedaudz etilspirta vai metilspirta ar pulverizatoru. 5.1.4. Dietilētera ekstraktus apvieno dalāmajā piltuvē un mazgā ar destilētu ūdeni (50 ml katru reizi), līdz mazgājamam ūdenim ir neitrāla reakcija. Kad mazgājamais ūdens ir aizvadīts, ētera fāzi žāvē ar bezūdens nātrija sulfātu un nofiltrē uz bezūdens nātrija sulfāta iepriekš nosvērtā 250 ml kolbā, mazgājot dalāmo piltuvi un filtru ar mazu daudzumu dietilētera. 5.1.5. Ēteri destilē līdz dažiem ml, tad nelielā vakuumā vai slāpekļa straumē izžāvē sausu, žāvēšanu veic aptuveni 15 minūtes žāvēšanas skapī 100 °C temperatūrā, atdzesē eksikatorā un pēc tam nosver.

5.2. Sterīnu frakcijas atdalīšana. 5.2.1. Bāzisko plākšņu sagatavošana. Silikagēla plāksnes (4.4) uz 10 sekundēm pilnīgi iegremdē 0,2 N kālija hidroksīda šķīdumā etanolā (4.5. punkts), pēc tam divas stundas atstāj izžūt velkmē un beidzot uz vienu stundu ieliek žāvēšanas skapī 100 °C temperatūrā. Izņem no žāvēšanas skapja un glabā eksikatorā uz kalcija hlorīda līdz lietošanai (šādi apstrādātas plāksnes ir jāizlieto 15 dienu laikā). 2. piezīme: ja sterīnu frakcijas atdalīšanai izmanto bāziskā silikagēla plāksnes, nepārziepjojamās vielas nav jāapstrādā ar alumīnija oksīdu. Visi savienojumi ar skābju īpašībām (taukskābes un pārējie) tādā veidā paliek uz starta līnijas un sterīnu josla labi atdalās no alifātisko un triterpēnu spirtu joslas. 5.2.2. Plākšņu attīstīšanas kamerā ielej benzola/acetona maisījumu, kuru tilpumu attiecība ir 95:5, aptuveni 1 cm biezā slānī. Var lietot arī heksāna/dietilētera maisījumu, kuru tilpumu attiecība ir 65:35. Noslēdz kameru ar piemērotu vāku un atstāj aptuveni pusstundu, lai iestātos šķidruma/tvaiku līdzsvars. Kameras iekšējām virsmām var piestiprināt filtrpapīra sloksnes, kas iemērktas eluentā. Tas aptuveni par trešo daļu samazina attīstīšanas laiku un izraisa komponentu vienmērīgāku eluēšanu. 3. piezīme: lai sasniegtu pilnīgi atkārtojamus eluēšanas apstākļus, attīstīšanas maisījums katrai analīzei ir jānomaina. 5.2.3. Pagatavo aptuveni 5 % nepārziepjojamo vielu (5.1.5. punkts) šķīdumu hloroformā un ar 100 μl mikrošļirci uzvelk uz hromatogrāfijas plāksnes (5.2.1. punkts) iespējami tievu un vienādu svītru, aptuveni 2 cm atstatumā no viena gala, izlietojot 0,3 ml. Vienā līnijā ar šo svītru uzliek 2 līdz 3 ml sterīnu standartšķīduma (4.11. punkts) vienā plāksnes galā tā, lai sterīnu joslu varētu pēc attīstīšanas identificēt. 5.2.4. Plāksni ievieto attīstīšanas kamerā, kas ir sagatavota, kā noteikts 5.2.2. punktā. Vides temperatūrai jābūt starp 15 un 20 °C. Kameru tūlīt noslēdz ar vāku un atstāj eluēties, līdz šķīdinātāja līnija sasniedz aptuveni 1 cm no plāksnes augšējās malas. Plāksni izņem no attīstīšanas kameras un iztvaicē šķīdinātāju karsta gaisa plūsmā vai neilgu laiku atstāj plāksni velkmē. 5.2.5. Plāksni viegli un vienmērīgi apsmidzina ar 2,7-dihlorfluoresceīna šķīdumu. Aplūkojot plāksni ultravioletajā apgaismojumā, sterīnu joslu var identificēt pēc tā, ka tā ir vienā līnijā ar plankumu, kas ir iegūts no standartšķīduma. Joslas robežas apkārt fluorescējošajam plankumam apzīmē ar melnu zīmuli. 5.2.6. Ar metāla lāpstiņu noskrāpē silikagēlu apzīmētajā laukumiņā. Smalki sadrupināto noņemto materiālu novieto uz stikla filtra (3.7. punkts). Pievieno 10 ml karsta hloroforma, rūpīgi samaisa ar metāla lāpstiņu un vakuumā nofiltrē, savācot filtrātu stikla filtram pievienotajā vakuumpudelē (3.8. punkts). Nogulsnes trīs reizes uz filtra mazgā ar dietilēteri (katru reizi aptuveni 10 ml), filtrātu savācot tajā pašā filtram pievienotajā vakuumpudelē. Filtrātu ietvaicē līdz 4 līdz 5 ml tilpumam, atlikušo šķīdumu pārnes iepriekš nosvērtā 10 ml mēģenē (3.9. punkts), viegli sildot lēnā slāpekļa straumē, to iztvaicē sausu, vēlreiz uzpilina dažus pilienus acetona, atkal izžāvē sausu, ievieto žāvēšanas skapī 105 °C temperatūrā aptuveni uz 10 minūtēm, pēc tam ļauj eksikatorā atdzist un nosver. Mēģenē esošās nogulsnes sastāv no sterīnu frakcijas.

5.3. Trimetilsililēteru pagatavošana. 5.3.1. Mēģenes saturam, kas ir sterīnu frakcija, pievieno sililēšanas reaktīvu, kas sastāv no piridīna/heksametildisilazāna/trimetilhlorsilāna maisījuma, kuru tilpumu attiecība ir 9:3:1 (4. piezīme), pa 50 μl uz katru miligramu sterīnu. 4. piezīme: lietošanai gatavi šķīdumi ir pieejami tirdzniecībā. Ir pieejami arī citi silanizēšanas reaktīvi, tādi kā, piemēram, 0-bis-trimetilsililtrifluoracetamīds ar 1 % trimetilhlorsilānu, kas ir jāatšķaida ar vienādu tilpumu bezūdens piridīna. 5.3.2. Mēģeni aizkorķē, rūpīgi krata (bez apgriešanas), līdz sterīni ir pilnīgi izšķīduši. Atstāj vismaz 15 minūtes istabas temperatūrā, pēc tam dažas minūtes centrifugē. Dzidrais šķīdums ir gatavs gāzu hromatogrāfiskai analīzei. 5. piezīme: viegla opalescence, kas var veidoties, ir parasta un nerada traucējumus. Baltu pārslu veidošanās vai sārta krāsojuma parādīšanās norāda uz mitruma klātbūtni vai reaktīva sabojāšanos. Ja tā notiek, analīze ir jāatkārto.

5.4. Gāzu hromatogrāfiskā analīze. 5.4.1. Iepriekšējas darbības, kolonnas pakošana. 5.4.1.1. Kolonnu iemontē gāzu hromatogrāfā, pievienojot ieejas galu iztvaicētājam, kas ir pievienots plūsmas sadales sistēmai, un pievienojot izejas galu detektoram. Izdara vispārējās gāzu hromatogrāfa iekārtas pārbaudes (noplūdes no gāzu līnijām, detektora efektivitāti, plūsmas dalīšanas sistēmas un reģistrējošās sistēmas efektivitāti utt.). 5.4.1.2. Ja kolonnu lieto pirmoreiz, ir ieteicams to kondicionēt. Laiž lēnu gāzes plūsmu cauri kolonnai, pēc tam ieslēdz gāzu hromatogrāfu un pakāpeniski uzsilda līdz temperatūrai, kas ir vismaz 20 °C virs darba temperatūras (6. piezīme). Saglabā šo temperatūru vismaz divas stundas, pēc tam visu iekārtu noregulē darba režīmā (noregulē gāzu plūsmas un dalīšanu, liesmas degšanu, savienojumu ar elektronisko reģistrācijas iekārtu, kolonnas kameras temperatūru, detektoru un inžektoru), pēc tam reģistrē signālu, ņemot vērā jutību, kas ir vismaz divas reizes lielāka par analīzei paredzēto temperatūru. Nulles līnijai ir jābūt lineārai, bez jebkādiem pīķiem, un tā nedrīkst nobīdīties. Negatīva taisna līnija norāda uz noplūdēm kolonnas pievienojumu vietās; pozitīva nobīde norāda uz neatbilstīgu kolonnas kondicionēšanu. 6. piezīme: kondicionēšanas temperatūrai jābūt vismaz par 20 °C zemākai nekā lietojamai stacionārai fāzei paredzētajai maksimālajai temperatūrai. 5.4.2. Darba apstākļu izvēle. 5.4.2.1. Norādījumi par darba apstākļiem ir šādi: — kolonnas temperatūra: 260 ± 5 °C, — iztvaicētāja temperatūra: 280 °C, — detektora temperatūra: 290 °C, — nesējgāzes lineārais ātrums: hēlijam 20 līdz 35 cm/s, ūdeņradim 30 līdz 50 cm/s, — dalījuma attiecība: 1:50 līdz 1:100, — iekārtas jutība: 4 līdz 16 reižu lielāka par mazāko pārslēdzamo jutību, — reģistrēšanas jutība: 1 līdz 2 mV f.s., — papīra ātrums: 30 līdz 60 cm/h, — iešļircinātās vielas daudzums: 0,5 līdz 1 μl TMSE šķīduma. Šie apstākļi var mainīties atkarībā no kolonnas un gāzu hromatogrāfa īpašībām tā, lai iegūtu hromatogrammas, kas atbilst šādām prasībām: — β-sitosterīna aiztures laikam jābūt 20 ± 5 minūtes, — kampesterīna pīķim jābūt: olīveļļai (vidējais saturs 3 %) 15 ± 5 % no visas skalas; sojas eļļai (vidējais saturs 20 %) 80 ± 10 % no visas skalas, — visiem klātesošiem sterīniem jābūt atdalītiem. Turklāt vienlaikus, pīķiem esot atdalītiem, tiem ir jābūt izšķirtiem, t.i., pīķa līnijai ir jāatgriežas uz nulles līnijas, pirms sāk veidoties jauns pīķis. Nepilnīgu izšķiršanu tomēr var pieciest ar nosacījumu, ka pīķi ar relatīvo aiztures laiku TRR 1,02 var kvantitatīvi noteikt, izmantojot perpendikulu. 5.4.3. Analītiskā procedūra. 5.4.3.1. 10 ml mikrosļircē ievelk 1μl heksāna, pēc tam ievelk 0,5 μl gaisa un beidzot 0,5 lidz 1 μl parauga sķīduma. Paceļ šļirces virzuli, lai iztukšotu adatu. Izdur adatu cauri iešļircināšanas iekārtas membrānai un pēc vienas vai divām sekundēm strauji iešļircina, pēc apmēram piecām sekundēm lēni izvelk adatu. 5.4.3.2. Turpina reģistrēt, līdz klātesošie sterīnu TMSE ir pilnīgi eluēti. Nulles līnijai visu laiku ir jāatbilst prasībām (5.4.1.2. punkts). 5.4.4. Pīķu identificēšana. Individuālos pīķus identificē, pamatojoties uz aiztures laikiem un salīdzinot ar sterīnu TMSE maisījumiem, kas analizēti, ņemot vērā tādus pašus nosacījumus. Sterīni eluējas šādā secībā: holesterīns, brasikasterīns, 24-metilenholesterīns, kampesterīns, kampestanols, stigmasterīns, Δ7-kampesterīns, Δ5,23-stigmastadienols, klerosterīns, b-sitosterīns, sitostanols, Δ5-avenasterīns, Δ5,24-stigmastadienols, Δ7-sigmastenols, Δ7-avenasterīns. Sitosterīna aiztures laiki SE-52 un SE-54 kolonnās ir parādīti 1. tabulā. 1. un 2. zīmējumā parādītas dažu eļļu raksturīgas hromatogrammas. 5.4.5. Kvantitatīvā novērtēšana. 5.4.5.1. Izmantojot integratoru, aprēķina α-holestanola un sterīnu pīķu laukumus. Savienojumu pīķus, kas nav ietverti 1. tabulā, neņem vērā. Atbildes signāla koeficientam α-holestanolam ir jābūt vienādam ar 1. 5.4.5.2. Katra individuālā sterīna koncentrāciju mg/100 g taukus saturošās vielas aprēķina šādi: kur: Ax = sterīna x pīķa laukums ►M6 ————— ◄ ; As = α-holestanola piķa laukums ►M6 ————— ◄ ; ms = pievienotā α-holestanola masa miligramos; m = noteikšanai ņemtā parauga masa gramos.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

6.1. Individuālo sterīnu koncentrācijas uzdod kā mg/100 g taukus saturošās vielas un to summu — kā “kopējos sterīnus”.

6.2. Katra individuālā sterīna procentus aprēķina pēc attiecīgā pīķa laukuma attiecības pret sterīnu kopējo pīķu laukumu. kur: Ax = sterīna x pīķa laukums; ΣA = kopejais sterīnu pīķu laukums.









PIELIKUMA PAPILDINĀJUMS

Gāzes lineārā ātruma noteikšana

Gāzu hromatogrāfā, kas noregulēts atbilstīgi parastajiem darba apstākļiem, iešļircina 1 līdz 3 ml metāna (vai propāna) un izmēra laiku, kādā gāze iziet caur kolonnu no iešļircināšanas mirkļa līdz pīķa parādīšanās mirklim (tM).

Lineāro ātrumu izrēķina kā L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros un tM ir laiks sekundēs, kas izmērīts ar hronometru.







1. tabula Sterīnu relatīvie aiztures laiki Pīķis Identifikācija Relatīvie aiztures laiki SE 54 kolonna SE 52 kolonna 1. holesterīns Δ-5-holesten-3β-ols 0,67 0,63 2. holestanols 5α-holestan-3β-ols 0,68 0,64 3. brasikasterīns [24S]-24-metil-Δ-5,22-holestadien-3β-ols 0,73 0,71 4. 24-metilēnholesterīns 24-metilen-Δ-5,24-holesten-3β-ols 0,82 0,80 5. kampesterīns [24R]-24-metil-Δ-5-holesten-3β-ols 0,83 0,81 6. kampestanols [24R]-24-metil-holestan-3β-ols 0,85 0,82 7. stigmasterīns [24R]-24-etil-Δ-5,22-holestadien-3β-ols 0,88 0,87 8. Δ-7-kampesterins [24R]-24-metil-Δ-7-holesten-3β-ols 0,93 0,92 9. Δ-5,23-stigmastadienols [24R, S]-24-etil-Δ-5,23-holestadien-3β-ols 0,95 0,95 10. klerosterīns [24S]-24-etil-Δ-5,25-holastadien-3β-ols 0,96 0,96 11. β-sitosterins [24R]-24-etil-Δ-5-holestan-3β-ols 1,00 1,00 12. sitostanols 24-etil-holestan-3β-ols 1,02 1,02 13. Δ-5-avenasterīns [24Z]-24-etiliden-5-holesten-3β-ols 1,03 1,03 14. Δ-5,24-stigmastadienols [24R, S]-24-etil-Δ-5,24-holestadien-3β-ols 1,08 1,08 15. Δ-7-stigmastenols [24R, S]-24-etil-Δ-7,24-holestadien-3β-ols 1,12 1,12 16. Δ-7-avenasterins [24Z]-24-etiliden-Δ-7-holesten-3β-ols 1,16 1,16

1. zīmējums

Nerafinētas olīveļļas sterīnu frakcijas gāzu hromatogramma

2. zīmējums

Rafinētas olīveļļas sterīnu frakcijas gāzu hromatogramma









VI PIELIKUMS

ERITRODIOLA UN UVAOLA NOTEIKŠANA

IEVADS

Eritrodiols (parasti ar to saprot abus glikolus — eritrodiolu un uvaolu — kopā) ir nepārziepjojamās frakcijas sastāvdaļa, kas raksturīga dažu veidu taukus saturošām vielām. To ievērojami lielākās koncentrācijās atrod ar šķīdinātājiem ekstrahētā olīveļļā nekā citās eļļās, tādās kā spiestā olīveļļā un vīnogu kauliņu eļļā, kas arī to satur, un tādējādi eritrodiola klātbūtne var uzrādīt ar šķīdinātājiem ekstrahētas olīveļļas klātbūtni.

1. DARBĪBAS JOMA

Metode apraksta procedūru eritrodiola noteikšanai taukus saturošās vielās.

2. METODES PRINCIPS

Taukus saturošo vielu pārziepjo ar kālija hidroksīdu etanola šķīdumā. Nepārziepjojamo frakciju pēc tam ekstrahē ar dietilēteri un tīra, laižot caur alumīnija oksīda kolonnu.

Nepārziepjojamām vielām izdara plānslāņa hromatogrāfiju uz silikagēla plāksnes, līdz atdalās joslas, kas atbilst sterīnu un eritrodiola frakcijām. No plāksnes atpakaļiegūtos sterīnus un eritrodiolu pārvērš trimetilsililēteros un maisījumu analizē ar gāzu hromatogrāfiju.

Rezultātus izsaka eritrodiola procentos eritrodiola un sterīnu maisījumā.

3. APARATŪRA

3.1. V pielikumā (sterīnu satura noteikšana) aprakstītā aparatūra.

4. REAKTĪVI

4.1. V pielikumā (sterīnu satura noteikšana) aprakstītie reaktīvi.

4.2. Eritrodiola standartšķīdums, 0,5 % šķīdums hloroformā.

5. PROCEDŪRA

5.1. Nepārziepjojamās vielas pagatavošana

Kā aprakstīts V pielikuma 5.1.2. punktā.

5.2. Eritrodiola un sterīnu atdalīšana

5.2.1. Sk. V pielikuma 5.2.1. punktu.

5.2.2. Sk. V pielikuma 5.2.2. punktu.

5.2.3. Pagatavo nepārziepjojamo vielu 5 % šķīdumu hloroformā. Ar 0,1 ml mikrošļirci uzvelk uz hromatogrāfijas plates iespējami tievu un vienādu svītru, izlietojot aptuveni 0,3 ml šķīduma, aptuveni 1,5 cm no apakšējās malas. Vienā plāksnes galā uzliek dažus mikrolitrus holesterīna un eritrodiola šķīduma izmantošanai par standartu.

5.2.4. Plāksni ievieto attīstīšanas kamerā, kas ir sagatavota, kā noteikts 5.2.1. punktā. Vides temperatūrai būtu jābūt ap 20 °C. Kameru tūlīt noslēdz ar vāku un atstāj eluēties, līdz šķīdinātāja līnija sasniedz aptuveni 1 cm no plāksnes augšējās malas. Plāksni izņem no attīstīšanas kameras un iztvaicē šķīdinātāju karsta gaisa plūsmā.

5.2.5. Plāksni viegli un vienmērīgi apsmidzina ar 2,7-dihlorfluoresceīna šķīdumu spirtā. Plāksni apskatot ultravioletajā apgaismojumā, sterīna un eritrodiola joslas var identificēt pēc tā, ka tās ir vienā līnijā ar standartvielām. Iezīmē tieši aiz fluorescējošās joslas malas.

5.2.6. Ar metāla lāpstiņu noskrāpē silikagēlu iezīmētajos laukumiņos. Noskrāpēto materiālu no plāksnes pārnes 50 ml kolbā. Pievieno 15 ml karsta hloroforma, labi sakrata un caur stikla filtru nofiltrē tā, lai silikagēls tiktu pārnests uz filtra. Trīs reizes mazgā ar karstu hloroformu (katru reizi 10 ml), savācot filtrātu 100 ml kolbā. Filtrātu ietvaicē līdz 4-5 ml tilpumam, pārnes iepriekš nosvērtā 10 ml centrifūgas stobriņā ar konisku dibenu, izžāvē, maigi sildot slāpekļa straumē, un nosver.

5.3. Trimetilsililesteru pagatavošana

Kā aprakstīts V pielikuma 5.3. punktā.

5.4. Gāzu hromatogrāfiskā analīze

Kā aprakstīts iepriekš minētās metodes 5.4. punktā. Gāzu hromatogrāfa darba apstākļiem analizējot jābūt tādiem, lai izdarītu sterīnu analīzi un atdalītu TMSE no eritrodiola un uvaola.

Kad paraugs ir iešļircināts, turpina reģistrēšanu, līdz ir eluēti klātesošie sterīni, eritrodiols un uvaols. Pēc tam identificē pīķus (eritrodiola un uvaola aiztures laiki attiecībā pret β-sitosterīnu attiecīgi ir aptuveni 1,45 un 1,55) un aprēķina sterīnu pīķu laukumus.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

kur:

A1 = eritrodiola pīķa laukums ►M6 ————— ◄ ;

A2 = uvaola pīķa laukums ►M6 ————— ◄ ;

ΣAsterīnu = kopējais sterīnu pīķu laukums ►M6 ————— ◄ .

Rezultātus izsaka līdz vienai zīmei aiz komata.









VII PIELIKUMS

TAUKSKĀBJU NOTEIKŠANA TRIGLICERĪDU 2. STĀVOKLĪ EĻĻĀS UN TAUKOS

1. DARBĪBAS JOMA

Šis standarts apraksta tauku vai eļļu tās frakcijas sastāva noteikšanas metodi, kas ir esterificēta glicerīna 2. stāvoklī (jeb iekšējā stāvoklī).

2. PIEMĒROŠANAS JOMA

Šis standarts ir piemērojams eļļām un taukiem, kuru kušanas punkts ir zem 45 °C aizkuņģa dziedzera lipāzes darbības īpatnību dēļ.

Tas bez atrunām nav piemērojams eļļām un taukiem, kas satur nozīmīgus daudzumus taukskābju ar 12 vai mazāk oglekļa atomiem (kokosriekstu eļļa un palmu kodolu eļļa, sviesta tauki) vai stipri nepiesātinātu taukskābju (ar vairāk par četrām dubultsaitēm), kas satur 20 vai vairāk oglekļa atomus (zivju un jūras dzīvnieku eļļas), vai taukskābju, kurās ir skābekli saturošas grupas, kas nav skābes grupas.

3. PRINCIPS

Vajadzības gadījumā skābo eļļu un tauku neitralizācija šķīdinātājā. Tīrīšana, laižot caur alumīnija oksīda kolonnu. Triglicerīdu daļēja hidrolīze ar aizkuņģa dziedzera lipāzi noteiktā laika posmā. Radušos monoglicerīdu sadalīšana ar plānslāņa hromatogrāfiju un šo monoglicerīdu metanolīze. Šo metilesteru analīze ar gāzu šķidruma hromatogrāfiju.

4. APARATŪRA

4.1. 100 ml apaļkolba.

4.2. 25 ml apaļkolba ar pieslīpētu kaklu.

4.3. 1 m garš gaisa dzesinātājs, kas atbilst kolbai 4.2. punktā.

4.4. 250 ml koniskā kolba.

4.5. 50 ml vārglāze.

4.6. 500 ml dalāmā piltuve.

4.7. Stikla hromatogrāfijas kolonna ar 13 mm iekšējo diametru, 400 mm gara, aprīkota ar poraina stikla disku un krānu.

4.8. 10 ml centrifugēšanas stobriņš ar pieslīpētu stikla aizbāzni.

4.9. 5 ml birete, graduēta pa 0,05 ml.

4.10. 1 ml injekciju šļirce ar tievu adatu.

4.11. Mikrošļirce pilināšanai pa 3 līdz 4 μl.

4.12. Pulverizators plānslāņa hromatogrāfijai.

4.13. Stikla plāksnes plānslāņa hromatogrāfijai, 20 × 20 cm.

4.14. Stikla attīstīšanas kamera plānslāņa hromatogrāfijai ar pieslīpēta stikla vāku, piemērota 20 × 20 cm plāksnēm.

4.15. Pulverizators plānslāņa hromatogrāfijai.

4.16. Žāvēšanas skapis, kas noregulēts ap 103 ± 2 °C.

4.17. Termostats, regulējams starp 30 un 45 °C ar precizitāti 0,5 °C.

4.18. Rotācijas iztvaicētājs.

4.19. Elektriskais vibrāciju kratītājs, ar ko var enerģiski kratīt centrifūgas stobriņu.

4.20. Ultravioletā spuldze plānslāņa hromatogrāfijas plākšņu apskatīšanai.

4.21. pH mērs, 4.22. spirālveida maisītājs, 4.23. 5 ml birete, 4.24. hronometrs.

4.25. laboratorijas maisītājs, piemērots heterogēnu materiālu disperģēšanai un samaisīšanai.

5. REAKTĪVI

5.1. n-heksāns vai, ja tā nav, lakbenzīns (virš. 30. lpp. līdz 50 °C), hromatogrāfijas kvalitātes.

5.2. 2-propanols vai 95 tilp. % etanols, analītisko reaktīvu kvalitātes.

5.3. 2-propanola vai etanola ūdens šķīdums attiecībā 1:1.

5.4. Dietilēteris, peroksīdus nesaturošs.

5.5. Acetons.

5.6. Skudrskābe, vismaz 98 % (masa/masa).

5.7. Attīstīšanas šķīdinātājs: n-heksāna (5.1. punkts), dietilētera (5.4. punkts) un skudrskābes (5.6. punkts) maisījums, tilpumu attiecība 70:30:1.

5.8. Aktivēts alumīnija oksīds hromatogrāfijai, neitrāls, Brockmann I kvalitātes.

5.9. Silīcija dioksīds ar saistvielu, plānslāņa hromatogrāfijai piemērotas kvalitātes.

5.10. Piemērotas kvalitātes aizkuņģa dziedzera lipāze (1. un 2. piezīme).

5.11. Nātrija hidroksīds, 120 g/l ūdens šķīdums.

5.12. Sālsskābe, 6N ūdens šķīdums.

5.13. Kalcija hlorīds (CaCl2), 220 g/l ūdens šķīdums.

5.14. Nātrija holāts (fermentu kvalitātes), 1 g/l ūdens šķīdums.

5.15. Buferšķīdums: tris-hidroksimetilaminometāna 1 M ūdens šķīduma pH noregulē līdz 8, pievienojot sālsskābi (5.12. punkts) (pārbauda ar potenciometru).

5.16. Fenolftaleīns, 10 g/l šķīdums 95 tilp. % etanolā.

5.17. 2m, 7m-dihlorfluoresceīns, 2 g/l šķīdums 95 tilp. % etanolā, padarīts nedaudz sārmains, pieliekot vienu pilienu 1 N nātrija hidroksīda uz 100 ml.

5.18. neitralizēta eļļa, 5.19. nātrija hidroksīds, 0,1 N ūdens šķīdums, 5.20. nātrija holāts (fermentu kvalitātes), 200 g/l ūdens šķīdums, 5.21. gumiarābiks, 100 g/l ūdens šķīdums.

6. PARAUGA SAGATAVOŠANA

Ja parauga skābums, kas noteikts saskaņā ar II pielikumu, ir mazāks par 3 %, paraugu tīra tieši, laižot pār alumīnija oksīdu saskaņā ar 6.2. punktu.

Ja parauga skābums, kas noteikts saskaņā ar II pielikumu, ir lielāks par 3 %, paraugu neitralizē šķīdinātāja klātbūtnē saskaņā ar 6.1. punktu, pēc tam laiž pār alumīnija oksīdu saskaņā ar 6.2. punktu.

6.1. Neitralizēšana ar sārmu šķīdinātāja klātbūtnē Dalāmā piltuvē (4.6. punkts) ievada ap 10 g nerafinētas eļļas un pievieno 100 ml heksāna (5.1. punkts), 50 ml 2-propanola (5.2. punkts), dažus pilienus fenolftaleīna šķīduma (5.16. punkts) un nātrija hidroksīda (5.11. punkts) daudzumu, kas atbilst eļļas brīvajam skābumam, kam pieskaitīts 0,3 % pārākuma. Enerģiski krata vienu minūti, pievieno 50 ml destilēta ūdens, vēlreiz pakrata un atstāj atdalīties. Aizvada lielāko daļu heksāna, destilējot vakuumā rotācijas iztvaicētājā (4.18. punkts), eļļu žāvē vakuumā tīralāpekļa straumē 30 līdz 40 °C temperatūrā, līdz heksāns ir pilnīgi aizvadīts.

6.2. Tīrīšana uz alumīnija oksīda Pagatavo 15 g aktivēta alumīnija oksīda (5.8. punkts) suspensijas 50 ml heksāna (5.1. punkts) un maisot ielej to hromatogrāfijas kolonnā (4.7. punkts). Ļauj alumīnija oksīdam vienmērīgi izdalīties un ļauj šķīdinātāja līmenim samazināties līdz 1 — 2 mm virs absorbenta. Uzmanīgi ielej kolonnā 5 g eļļas šķīduma 25 mililitros heksāna (5.1. punkts); visu eluentu no kolonnas savāc apaļkolbā (4.1. punkts).

7. Hromatogrāfijas plākšņu sagatavošana Rūpīgi notīra stikla plāksnes (4.13. punkts) ar etanolu, lakbenzīnu un acetonu, lai atbrīvotos no tauku zīmēm. Koniskā kolbā (4.4. punkts) ievieto 30 g silīcija dioksīda pulvera (5.9. punkts). Pievieno aptuveni 60 ml destilēta ūdens. Aizkorķē un vienu minūti enerģiski krata. Suspensiju tūlīt pārnes uz sadalīšanas iekārtu (4.12. punkts) un tīrajām plāksnēm uzklāj 0,25 mm biezu slāni. Plāksnes žāvē gaisā 15 minūtes un pēc tam pusstundu — žāvēšanas skapī (4.16. punkts) 103 ± 2 °C temperatūrā. Pirms lietošanas plāksnes atdzesē eksikatorā līdz istabas temperatūrai. Pārdošanā ir sagatavotas plāksnes.

8. PROCEDŪRA 8.1. Hidrolīze ar aizkuņģa dziedzera lipāzi Centrifūgas stobriņā (4.8. punkts) nosver ap 0,1 g sagatavotā parauga; ja paraugs ir šķidra eļļa, rīkojas tieši kā turpmāk norādīts. Pievieno 20 mg lipāzes (5.10. punkts) un 2 ml buferšķīduma (5.15. punkts). Krietni, bet uzmanīgi sakrata, tad pievieno 0,5 ml nātrija holāta šķīduma (5.14. punkts) un 0,2 ml kalcija hlorīda šķīduma (5.13. punkts). Stobriņu aizkorķē ar pieslīpētu aizbāzni, uzmanīgi pakrata (izvairās samitrināt aizbāzni), stobriņu tūlīt ievieto termostatā (4.17. punkts) 40 ± 0, 5 °C temperatūrā un ar roku krata tieši vienu minūti. Izņem stobriņu no termostata un enerģiski krata elektriskajā kratītājā (4.19. punkts) tieši divas minūtes. Tūlīt atdzesē tekošā ūdenī; pievieno 1 ml sālsskābes (5.12. punkts) un 1 ml dietilētera (5.4. punkts). Aizkorķē un enerģiski krata elektriskajā kratītājā. Ļauj pastāvēt un ar šļirci (4.10. punkts) aizvāc organisko slāni, vajadzības gadījumā pēc centrifugēšanas. 8.2. Monoglicerīdu atdalīšana ar plānslāņa hromatogrāfiju Ekstraktu ar mikrošļirci (4.11. punkts) plānā, vienmērīgā, iespējami šaurā līnijā uzliek uz hromatogrāfiskās plāksnes aptuveni 1,5 cm no apakšējās malas. Plāksni ievieto labi piesātinātā attīstīšanas kamerā (4.14. punkts) un attīsta ar attīstīšanas šķīdinātāju (5.7. punkts) aptuveni pie 20 °C, līdz aptuveni 1 cm no plāksnes augšējās malas. Plāksni izžāvē gaisā attīstīšanas kameras temperatūrā un apsmidzina ar 2m, 7m-dihlorfluoresceīna šķīdumu (5.17. punkts). Ultravioletajā apgaismojumā (4.20. punkts) identificē monoglicerīda joslu (Rf aptuveni 0,035). 8.3. Monoglicerīdu analīze ar gāzu šķidruma hromatogrāfiju Ar lāpstiņu noņem joslu, kas iegūta 8.2. punktā (izvairoties noņemt uz starta līnijas palikušos komponentus), un pārnes metilēšanas kolbā (4.2. punkts). Savākto silīcija dioksīdu apstrādā ar metodēm, kas aprakstītas X B pielikumā, tā, lai monoglicerīdus pārvērstu metilesteros, un pēc tam esterus analizē ar gāzu hromatogrāfiju, kā aprakstīts X A pielikumā.

9. REZULTĀTU IZTEIKŠANA Taukskābju sastāvu 2. stāvoklī aprēķina līdz vienai zīmei aiz komata (3. piezīme).

10. PIEZĪMES 1. piezīme: lipāzes aktivitātes pārbaude. Pagatavo eļļas emulsiju, piemērotā kratītājā kratot maisījumu, kas sastāv no 165 ml gumiarābika šķīduma (5.21. punkts), 15 g sadrupināta ledus un 20 ml neitralizētas eļļas (5.18. punkts). Vārglāzē (4.5. punkts) ielej 10 ml šīs emulsijas, kam secīgi pievieno 0,3 ml nātrija holāta šķīduma (5.20. punkts) un 20 ml destilēta ūdens. Vārglāzi ieliek termostatā pie 37 ± 0, 5 °C (4. piezīme); ieliek pH metra elektrodus (4.21. punkts) un spirālveida maisītāju (4.22. punkts). No biretes (4.23. punkts) pa pilienam pievieno nātrija hidroksīda šķīdumu (5.19. punkts), līdz pH sasniedz 8,5. Pievieno pietiekami daudz lipāzes suspensijas ūdenī (sk. turpmāk). Tikko pH metrs rāda pH 8,3, iedarbina hronometru (4.24. punkts) un pilina nātrija hidroksīda šķīdumu (5.19. punkts) tādā ātrumā, lai saglabātu pH 8,3. Katru minūti nolasa patērētā sārma šķīduma tilpumu. Novēroto attēlo diagrammas veidā, atliekot nolasīto laiku uz abscisas, un sārma šķīduma mililitrus, kas vajadzīgi, lai uzturētu nemainīgu pH, uz ordinātas. Būtu jāiegūst lineāra diagramma. Iepriekš minētā lipāzes suspensija ir 1 tūkstošdaļas (masa/masa) suspensija. Katrai analīzei jāizlieto pietiekami daudz šīs suspensijas tā, lai četrās līdz piecās minūtēs būtu patērēts 1 ml sārma šķīduma. Parasti ir vajadzīgs 1 līdz 5 mg pulvera. Lipāzes vienību definē kā fermenta daudzumu, kas atbrīvo 10 miliekvivalentus skābes minūtē. Tad lietotā pulvera aktivitāti A, ko mēra lipāzes vienībās uz mg, apraksta formula: kur V ir nātrija hidroksīda šķīduma (5.19. punkts) minūtē patērēto ml skaits, kas aprēķināts no diagrammas, m ir analīzei ņemtā pulvera masa mg. 2. piezīme: lipāzes pagatavošana. Lipāzes ar pietiekamu lipāzes aktivitāti ir pieejamas pārdošanā. Bet ir arī iespējams tās šādi pagatavot laboratorijā. Atdzesē 5 kg cūku aizkuņģa dziedzeru līdz 0 °C; noņem apkārt esošos cietos taukus un saistaudus un samaļ blenderī, lai iegūtu šķidru mīklu. Šo mīklu ar maisītāju (4.25. punkts) maisa četras līdz sešas stundas ar 2,5 l bezūdens acetona un centrifugē. Atlikumu vēl trīs reizes ekstrahē ar tādu pašu tilpumu acetona, tad divreiz ar acetona un dietilētera maisījumu, tilpumu attiecība 1:1, un divreiz ar dietilēteri. Atlikumu 48 stundas žāvē vakuumā, lai iegūtu stabilu pulveri, kas ir jāglabā ledusskapī. 3. piezīme: visos gadījumos ir ieteicams noteikt kopējo taukskābju sastāvu tam pašam paraugam, jo salīdzināšana ar skābju sastāvu 2. stāvoklī palīdzēs interpretēt iegūtos skaitļus. 4. piezīme: hidrolīzes temperatūru uzstāda uz 37 °C, ja izmanto šķidru eļļu. Tomēr analizējamam paraugam to uzstāda uz 40 °C, lai varētu analizēt taukus ar kušanas temperatūru līdz 45 °C.

▼M20 —————

▼B









IX PIELIKUMS

SPEKTROFOTOMETRISKIE PĒTĪJUMI UV SPEKTRĀ

IEVADS

UV spektrofotometriskā analĪze var dot informāciju par tauku kvalitāti, to saglabāšanas stāvokli un tehnoloģisko procesu izraisītajām pārmaiņām tajos.

Absorbcija pie metodē noteiktajiem viļņu garumiem notiek konjugētu diēnu un triēnu sistēmu klātbūtnes dēļ. Šo absorbciju izsaka kā īpatnējo ekstinkciju E1 % 1cm (1 % tauku šķīduma ekstinkcija attiecīgā šķīdinātājā pie slāņa biezuma 1 cm), ko parasti apzīmē ar K (sauc arī par “ekstinkcijas koeficientu”).

1. DARBĪBAS JOMA

Metode apraksta tauku UV spektrofotom etriskās analīzes procedūru.

2. METODES PRINCIPS

Attiecīgos taukus šķīdina vajadzīgajā šķīdinātājā un pie noteiktiem viļņu garumiem nosaka ekstinkciju šķīdumam attiecībā pret tīru šķīdinātāju. Īpatnējās ekstinkcijas aprēķina pēc spektrofotometra nolasījumiem.

3. APRĪKOJUMS

3.1. Spektrofotometrs ekstinkcijas mērījumiem ultravioletajā spektra daļā starp 220 un 360 nm ar iespēju nolasīt atsevišķas nanometru vienības.

3.2. Taisnstūra kvarca kivetes ar vāciņiem, optiskais ceļš 1 cm. Ja kivetes piepildītas ar ūdeni vai citu piemērotu šķīdinātāju, tām savā starpā nav jāatšķiras vairāk par 0,01 ekstinkcijas vienību.

3.3. 25 ml mērkolbas.

▼M6

3.4. Hromatogrāfijas kolonna ar augšdaļas garumu 270 mm un diametru 35 mm un apakšējās daļas garumu 270 mm un diametru apmēram 10 mm.

▼B

4. REAKTĪVI

4.1. Spektrofotometriski tīrs izooktāns (2,2,4-trimetilpentāns). Attiecībā pret destilētu ūdeni tā caurlaidībai jābūt ne mazākai par 60 % pie 220 nm un ne mazākai par 95 % pie 250 nm vai: — spektrofotometriski tīrs cikloheksāns: attiecībā pret destilētu ūdeni tā caurlaidībai jābūt ne mazākai par 40 % pie 220 nm un ne mazākai par 95 % pie 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Bāzisks alumīnija oksīds hromatogrāfijai caur kolonnu, sagatavots un pārbaudīts, kā aprakstīts I pielikumā.

4.3. n-heksāns, hromatogrāfijas kvalitātes.

5. PROCEDŪRA

5.1. Attiecīgajam paraugam jābūt pilnīgi homogēnam un bez suspendētiem piemaisījumiem. Eļļas, kas istabas apkārtējās vides temperatūrā ir šķidras, ir jāfiltrē caur filtrpapīru aptuveni 30 °C temperatūrā, cieti tauki ir jāhomogenizē un jāfiltrē temperatūrā, kas nav augstāka par 10 °C virs kušanas punkta.

5.2. Precīzi nosver 0,25 g tā sagatavota parauga 25 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar noteikto šķīdinātāju un homogenizē. Iegūtajam šķīdumam ir jābūt pilnīgi dzidram. Ja novērojama opalescence vai duļķainība, ātri filtrē caur filtrpapīru.

5.3. Ar iegūto šķīdumu piepilda kiveti un izmēra ekstinkciju pie piemērota viļņu garuma starp 232 un 276 nm, salīdzināšanai izmantojot šķīdinātāju. Izmērītajiem ekstinkcijas lielumiem jābūt starp 0,1 un 0,8. Ja tā nav, mērījumi ir jāatkārto, lietojot pēc vajadzības koncentrētākus vai atšķaidītākus šķīdumus.

5.4. Ja ir jānosaka īpatnējā ekstinkcija pēc laišanas pāri alumīnija oksīdam, rīkojas šādi: 30 g bāziskā alumīnija oksīda suspensijas heksānā ievieto hromatogrāfijas kolonnā. Pēc adsorbenta nogulsnēšanās izvada heksāna pārākumu līdz līmenim aptuveni 1 cm virs alumīnija oksīda augšējās malas. Izšķīdina 10 g tauku, homogenizētu un nofiltrētu, kā aprakstīts 5.1. punktā, 100 ml heksāna un ielej šķīdumu kolonnā. Savāc eluātu un vakuumā iztvaicē visu šķīdinātāju temperatūrā zem 25 °C. Ar tā iegūtajiem taukiem tūlīt rīkojas tālāk, kā noteikts 5.2. punktā.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

6.1. Pieraksta pie dažādiem viļņu garumiem iegūtās īpatnējās ekstinkcijas (ekstinkcijas koeficientus), ko aprēķina šādi: kur: Kλ = īpatnējā ekstinkcija pie viļņa garuma λ; Eλ = ekstinkcija, kas izmērīta pie viļņa garuma λ; c = šķīduma koncentrācija g/100 ml; s = kivetes biezums cm. Rezultātus izsaka līdz divām zīmēm aiz komata.

6.2. Olīveļļas spektrofotometriskā analīze saskaņā ar EEK regulu oficiālo metodi paredz noteikt īpatnējo ekstinkciju izooktāna šķīdumā pie viļņu garumiem 232 un 270 nm un noteikt K, ko aprēķina šādi: kur Km ir īpatnējā ekstinkcija pie viļņu garuma m, maksimālās absorbcijas viļņu garums ir aptuveni 270 nm.









I PIELIKUMA PAPILDINĀJUMS

Alumīnija oksīda sagatavošana un tā aktivitātes pārbaude

A.1.1. Alumīnija oksīda sagatavošana

Alumīnija oksīdu, kas iepriekš trīs stundas žāvēts krāsnī 380 līdz 400 °C temperatūrā, ievieto hermētiski noslēdzamā traukā, pielej destilētu ūdeni attiecībā 5 ml uz 100 g alumīnija oksīda, tūlīt noslēdz trauku, atkārtoti sakrata, pēc tam pirms lietošanas ļauj nostāvēties vismaz 12 stundas.

A.1.2. Alumīnija oksīda aktivitātes pārbaude

Sagatavo hromatogrāfijas kolonnu ar 30 g alumīnija oksīda. Darbojoties, kā aprakstīts 5.4. punktā, maisījumu, kas sastāv no:

— 95 % neapstrādātas olīveļļas, kuras īpatnējā ekstinkcija pie 268 nm ir mazāka par 0,18,

— 5 % zemesriekstu eļļas, kas rafinēšanas procesā apstrādāta ar balināšanas zemi un kam īpatnējā ekstinkcija pie 268 nm nav mazāka par 4,

izlaiž caur kolonnu.

Ja pēc izlaišanas caur kolonnu maisījuma īpatnējā ekstinkcija pie 268 nm ir lielāka par 0,11, alumīnija oksīds ir pieņemams, pretējā gadījumā ir jāpalielina dehidratēšanas līmenis.









II PIELIKUMA PAPILDINĀJUMS

Spektrofotometra kalibrēšana

A.2. Iekārta ir periodiski jāpārbauda (vismaz reizi sešos mēnešos) attiecībā uz viļņu garumu atbilstību un uz signāla precizitāti.

A.2.1. Viļņu garumu var pārbaudīt, izmantojot dzīvsudraba tvaiku spuldzi vai piemērotus filtrus.

A.2.2. Lai pārbaudītu fotošūnas un fotopavairotāja signālu, rīkojas šādi: spektrofotometrijas veikšanai nosver 0,2000 g kālija hromāta un 1 000 ml mērkolbā izšķīdina 0,05 N kālija hidroksīda šķīdumā, un uzpilda līdz zīmei. Ņem precīzi 25 ml iegūtā šķīduma, pārnes 500 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar to pašu kālija hidroksīda šķīdumu. Izmēra tā iegūtā šķīduma ekstinkciju pie 275 nm, lietojot kālija hidroksīda šķīdumu kā salīdzināšanas šķīdumu. Lietojot 1 cm kiveti, izmērītajai ekstinkcijai jābūt 0,200 ± 0, 005.









X A PIELIKUMS

TAUKSKĀBJU METILESTERU ANALĪZE AR GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. DARBĪBAS JOMA

Šī metode dod vispārīgus norādījumus par gāzu hromatogrāfijas pielietošanu, izmantojot pakotās vai kapilārās kolonnas, lai noteiktu taukskābju metilesteru, kas iegūti saskaņā ar X B pielikumā norādīto metodi, maisījuma kvalitatīvo un kvantitatīvo sastāvu.

Šī metode nav lietojama polimerizētām taukskābēm.

2. REAKTĪVI

2.1. Nesējgāze

Inerta gāze (slāpeklis, hēlijs, argons, ūdeņradis utt.), kas ir rūpīgi izžāvēta un kas satur mazāk par 10 mg/kg skābekļa.

1. piezīme:

ūdeņradis, ko izmanto par nesējgāzi tikai ar kapilārām kolonnām, var divreiz palielināt analīzes ātrumu, bet tas ir bīstams. Ir pieejamas drošības ierīces.

2.2. Palīggāzes

2.2.1. Ūdeņradis (tīrība 99,9 %), bez organiskiem piemaisījumiem.

2.2.2. Gaiss vai skābeklis, bez organiskiem piemaisījumiem.

2.3. Salīdzināšanas standarts

Tīru taukskābju metilesteru maisījums vai zināma sastāva tauku metilesteri, vēlams, līdzīgi analizējamās taukainās vielas sastāvam.

Ir jārūpējas par polinepiesātināto taukskābju oksidācijas novēršanu.

3. APARATŪRA

Dotie norādījumi attiecas uz parasto gāzu hromatogrāfijas aprīkojumu, kurā izmanto pakotās un/vai kapilārās kolonnas un liesmas jonizācijas detektoru. Jebkura aparatūra, kuras efektivitāte un izšķirtspēja atbilst 4.1.2. punktā noteiktajai, ir piemērota.

3.1. Gāzu hromatogrāfs

Gāzu hromatogrāfā ir šādas sastāvdaļas.

3.1.1. Iešļircināšanas sistēma

Izmanto iešļircināšanas sistēmu vai nu ar:

a) pakotām kolonnām ar vismazāko iespējamo nelietderīgo tilpumu (šajā gadījumā iešļircināšanas sistēmai jābūt sildāmai līdz temperatūrai, kas ir par 20 līdz 50 °C augstāka nekā kolonnas temperatūra), vai ar

b) kapilārām kolonnām, šajā gadījumā iešļircināšanas sistēma ir īpaši izveidota izmantošanai ar šādām kolonnām. Iešļircināšanas sistēma var būt ar plūsmas dalīšanu, vai tā var būt “on column” veida, bez plūsmas dalīšanas.

2. piezīme: ja taukskābju, kurās ir mazāk par 16 oglekļa atomiem, nav klāt, var izmantot kustīgās adatas inžektoru.

3.1.2. Krāsns

Krāsnij jāspēj sildīt kolonnu vismaz līdz 260 °C un uzturēt vēlamo temperatūru 1 °C robežās ar pakoto kolonnu un 0,1 °C robežās ar kapilāro kolonnu. Pēdējā prasība ir īpaši svarīga, ja lieto kvarca kolonnu.

Visos gadījumos ir ieteicams izmantot sildīšanu ar temperatūras programmēšanu, jo īpaši taukskābēm, kurās ir mazāk par 16 oglekļa atomiem.

3.1.3. Pakotā kolonna

3.1.3.1. Kolonna, kas izgatavota no materiāla, kurš ir inerts pret analizējamām vielām (t.i., stikls vai nerūsējošais tērauds), kolonnai ir šādi izmēri: a) garums: 1 līdz 3 m. Relatīvi īsa kolonna būtu jālieto, analizējot garas virknes taukskābes (vairāk par C20). Analizējot skābes ar 4 vai 6 oglekļa atomiem, ir ieteicams izmantot 2 m garu kolonnu; b) iekšējais diametrs: 2 līdz 4 mm. 3. piezīme: ja ir klāt polinepiesātināti komponenti ar vairāk par trim dubultsaitēm, tie nerūsējošā tērauda kolonnā var sadalīties. 4. piezīme: var izmantot sistēmu ar pakotām dubultkolonnām.

3.1.3.2. Pakojums ietver šādas sastāvdaļas: a) nesēju: skābē mazgātu un silanizētu diatomītu vai citu piemērotu inertu nesēju ar šauru graudiņu lieluma diapazonu (25 μm diapazons robežās starp 125 un 200 μm) graudiņu vidējais lielums ir saistīts ar kolonnas iekšējo diametru un garumu; b) stacionārā fāze: poliesteru tipa polārs šķidrums (piem., dietilēnglikola polisukcināts, butāndiola polisukcināts, etilēnglikola poliadepāts u. c.), ciānsilikoni vai cits šķidrums, kas ļauj izdarīt vajadzīgo hromatogrāfisko sadalīšanu (sk. 4. punktu). Stacionārās fāzes daudzums ir 5 līdz 20 % (masa/masa) no pakojuma. Dažu veidu sadalīšanām var izmantot nepolāru stacionāro fāzi.

3.1.3.3. Kolonnas kondicionēšana Kolonnu, ja iespējams, atvieno no detektora, pakāpeniski uzsilda krāsni līdz 185 °C un caur tikko sagatavotu kolonnu laiž inertu gāzi ar ātrumu 20 līdz 60 ml/min. vismaz 16 stundas šajā temperatūrā un vēl divas stundas 195 °C temperatūrā.

3.1.4. Kapilārā kolonna

3.1.4.1. Caurule, izgatavota no materiāla, kas ir inerts pret analizējamām vielām (parastais stikls vai kvarcs). Iekšējais diametrs ir starp 0,2 un 0,8 mm. Iekšējo virsmu pirms pārklāšanas ar stacionāro fāzi attiecīgi apstrādā (piem., sagatavo virsmu, inaktivē). Vairumā gadījumu 25 m ir pietiekami.

3.1.4.2. Stacionārā fāze, parasti poliglikolu tipa (polietilenglikols 20 000), poliesteris (butāndiola polisukcināts) vai polārais polisiloksāns (ciānsilikoni). Ir piemērotas kolonnas ar ķīmiski piesaistītu stacionāro fāzi. 5. piezīme: pastāv iespējamība, ka polārie polisiloksāni varētu radīt grūtības linolēnskābes un skābju ar C20 identificēšanā un atdalīšanā. Pārklājums ir plāns, t. i., 0,1 līdz 0,2 μm.

3.1.4.3. Kolonnas montēšana un kondicionēšana Kapilāro kolonnu montēšanā, t. i., kolonnas ievietošanā krāsnī (atbalsts), pievienojumu montēšanā (hermētiskums), kolonnas galu ievietošanā inžektorā un detektorā (nelietderīgo tilpumu samazināšana) jāievēro parastā piesardzība. Kolonnu pievieno nesējgāzes plūsmai (piem., 0,3 bar (30 kPa) 25 m garai kolonnai ar iekšējo diametru 0,3 mm). Kolonnu kondicionē, programmējot krāsns temperatūru 3 °C/min. no apkārtējās vides temperatūras līdz temperatūrai, kas ir par 10 °C zemāka nekā stacionārās fāzes sadalīšanās temperatūras robeža. Krāsni uztur šajā temperatūrā vienu stundu, līdz stabilizējas nulles līnija. Pēc tam atgriežas pie 180 °C un turpina darbu izotermiskos apstākļos. 6. piezīme: piemērotas, iepriekš kondicionētas, kolonnas ir pieejamas pārdošanā.

3.1.5. Detektors, vēlams tāds, ko var karsēt līdz temperatūrai, kas ir lielāka par kolonnas temperatūru.

3.2. Šļirce

Šļirces maksimālā ietilpība ir 10 μl, un tā ir graduēta 0,1 μl iedaļās.

3.3. Reģistrējošā iekārta

Ja reģistrējošās iekārtas līkne ir jāizmanto, lai aprēķinātu analizējamā maisījuma sastāvu, ir vajadzīga augstas precizitātes elektroniskā reģistrēšanas iekārta, kas ir saderīga ar izmantojamo aparatūru. Reģistrējošajai iekārtai ir šādas īpašības:

a) atbildes ātrums mazāks par 1,5 sek., vēlams 1 sek. (atbildes ātrums ir laiks, kas vajadzīgs pašrakstītāja spalvai, lai pārvietotos no 0 līdz 90 % pēc pēkšņas 100 % signāla izraisīšanas);

b) papīra platums vismaz 20 cm;

c) papīra ātrums regulējams starp 0,4 un 2,5 cm/min.

3.4. Integrators

Ātrus un precīzus aprēķinus var izdarīt ar elektronisko integratoru. Tam ir jādod lineāra atbilde ar pietiekamu jutību, un nulles līnijas noviržu korekcijai ir jābūt apmierinošai.

4. PROCEDŪRA

Darbības, kas aprakstītas no 4.1. LĪDZ 4.3. punktam, attiecas uz liesmas jonizācijas detektora lietošanu.

Alternatīvi var izmantot gāzu hromatogrāfu ar katarometra detektoru (darbojas, pamatojoties uz vadītspējas izmaiņām atkarībā no temperatūras). Darba apstākļus tad maina, kā norādīts 6. punktā.

4.1. Analīzes apstākļi

4.1.1. Darba apstākļu izvēle 4.1.1.1. Pakotā kolonna Izvēloties analīzes apstākļus, jāņem vērā šādi mainīgie lielumi: a) kolonnas garums un diametrs; b) stacionārās fāzes īpašības un daudzums; c) kolonnas temperatūra; d) nesējgāzes plūsma; e) vajadzīgā izšķirtspēja; f) analīzes parauga lielums, ko izvēlas tā, lai detektora un elektrometra iekārta dotu lineāru atbildes reakciju; g) analīzes ilgums. Parasti 1. un 2. tabulā norādītie lielumi dod vēlamos rezultātus, t. i., vismaz 2 000 teorētisko šķīvju uz kolonnas garuma metru metilstearātam un tā eluēšana apmēram 15 minūtēs. Ja aparatūra ļauj, inžektora temperatūrai jābūt apmēram 200 °C un detektora temperatūrai — vienādai vai augstākai par kolonnas temperatūru. Parasti liesmas jonizācijas detektorā padodamā ūdeņraža plūsmas ātrums pret nesējgāzes ātrumu attiecas kā 1:2 līdz 1:1 atkarībā no kolonnas diametra. Skābekļa plūsma ir aptuveni 5 līdz 10 reižu lielāka par ūdeņraža plūsmu.



1. tabula Kolonnas iekšējais diametrs mm Nesējgāzes plūsmas ātrums ml/min. 2 15 līdz 25 3 20 līdz 40 4 40 līdz 60



2. tabula Stacionārās fāzes koncentrācija % (masa/masa) Kolonnas temperatūra °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapilārā kolonna Kapilārās kolonnas efektivitāte un caurlaidība nozīmē, ka sastāvdaļu atdalīšana un analīzes ilgums lielā mērā ir atkarīgs no nesējgāzes plūsmas ātruma kolonnā. Tādēļ ir jāoptimizē darba apstākļi, iedarbojoties uz šo parametru (vai, vienkāršāk sakot, uz kolonnas spiediena kritumu) atbilstoši tam, vai vēlas uzlabot sadalīšanu, vai ātri izdarīt analīzi.

4.1.2. Teorētisko šķīvju skaita (efektivitātes) un izšķirtspējas noteikšana (sk. 1. zīmējumu). Izdara analīzi metilstearāta un metiloleāta maisījumam aptuveni vienādās daļās (piemēram, kakao sviesta metilesteriem). Kolonnas temperatūru un nesējgāzes plūsmas ātrumu izvēlas tā, lai metilstearāta pīķa maksimumu reģistrētu aptuveni 15 minūtes pēc šķīdinātāja pīķa. Izlieto pietiekamu metilesteru maisījuma daudzumu, lai metilstearāta pīķis aizņemtu apmēram trīs ceturtdaļas no visas skalas. Teorētisko šķīvju skaitu n (efektivitāti) aprēķina pēc formulas: un izšķirtspēju R aprēķina pēc formulas: kur: dr1 ir aiztures attālums milimetros no hromatogrammas sākuma līdz metilstearāta pīķa maksimumam; ω1un ω2 ir attiecīgi metilstearāta un metiloleāta pīķu platums milimetros, kas mērīts starp līknes pārliekuma punktos novilkto tangenšu krustošanās punktiem ar nulles līniju; Δ ir attalums milimetros starp metilstearāta un metiloleāta pīķu maksimumiem; ▼M2 un izšķirtspējas indekss lr, aprēķinot pēc formulas: , kur: a = mazākā pīķa augstums, mērot no nulles līnijas; b = zemākā punkta augstums minimumā starp diviem blakusesošiem pīķiem, mērot no nulles līnijas. ▼B 1. zīmējums Hromatogramma teorētisko šķīvju skaita (efektivitātes) un izšķirtspējas noteikšanai Ir jāizvēlas tādi darba apstākļi, kas metilstearātam dod vismaz 2 000 teorētiskos šķīvjus uz kolonnas garuma metru un izšķirtspēju vismaz 1,25.

4.2. Analīzes paraugs

Ar šļirci (3.2. punkts) ņem 0,1 līdz 2 μl metilesteru šķīduma, kas sagatavots saskaņā ar X B pielikumu un iešļircina to kolonnā.

Ja esteri nav šķīdumā, sagatavo 100 mg/ml šķīduma heptānā, kas ir hromatogrāfijas kvalitātes, un iešļircina 0,1 līdz 1 μl šā šķīduma.

Ja analizē sastāvdaļas, kas ir klāt tikai zīmju daudzumos, analīzes paraugu var palielināt (līdz 10 reizēm).

4.3. Analīze

Parasti darba apstākļi ir tādi, kā definēts 4.1.1. punktā.

Tomēr ir iespējams strādāt zemākā kolonnas temperatūrā, ja ir jānosaka taukskābes ar mazāk nekā 12 oglekļa atomiem, vai augstākā temperatūrā, ja nosaka taukskābes ar vairāk nekā 20 oglekļa atomiem. Abos šajos gadījumos ir iespējams izmantot temperatūras programmēšanu. Piemēram, ja paraugs satur taukskābju metilesterus ar mazāk nekā 12 oglekļa atomiem, paraugu iešļircina 100 °C temperatūrā (vai 50 līdz 60 °C temperatūrā, ja klāt ir sviestskābe) un nekavējoties paaugstina temperatūru ar ātrumu 4 līdz 8 °C/min. līdz optimālajai. Dažos gadījumos var apvienot abas procedūras.

Pēc programmētās sildīšanas turpina eluēšanu nemainīgā temperatūrā, līdz ir eluēti visi komponenti. Ja aparātam nav programmētas sildīšanas, to izmanto divās nemainīgās temperatūrās starp 100 un 195 °C.

Ir ieteicams vajadzības gadījumā izdarīt analīzi uz divām nekustīgajām fāzēm ar dažādu polaritāti, lai pārbaudītu, vai nav klāt maskēti pīķi, piemēram, ja vienā paraugā ir klāt konjugēti C18:3 un C20:0, vai C18:3 un C18:2.

4.4. Standarthromatogrammas un standartdiagrammu pagatavošana

Analizē salīdzināšanas standartmaisījumu (2.3. punkts) tajos pašos darba apstākļos kā tie, kas izmantoti paraugam, un izmēra sastāvdaļu taukskābju aiztures laikus vai aiztures attālumus. Uz puslogaritmiskā diagrammu papīra katrai nepiesātinātības pakāpei izveido diagrammu, kas rāda aiztures laika vai attāluma logaritmu kā oglekļa atomu skaita funkciju. Izotermiskos apstākļos diagrammām par taisnas virknes skābēm ar vienu un to pašu nepiesātinātības pakāpi jābūt ar taisnām līnijām. Šīm līnijām jābūt aptuveni paralēlām.

Ir noteikti jāizvairās no analīzes apstākļiem, kuros pastāv “maskētie pīķi”, t.i., kuros izšķirtspēja nav pietiekama, lai sadalītu divas sastāvdaļas.

5. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

5.1. Kvalitatīvā analīze

Metilesteru pīķus paraugā identificē no 4.4. punktā pagatavotās diagrammas, vajadzības gadījumā interpolējot.

5.2. Kvantitatīvā analīze

5.2.1. Sastāva noteikšana

Izņemot īpašus gadījumus, izmanto iekšējās normalizācijas metodi, t. i., pieņem, ka visu parauga komponentu kopums ir pārstāvēts hromatogrammā tā, ka zem pīķiem esošo laukumu kopsumma ir 100 % no sastāvdaļām (pilnīga eluēšana).

Ja iekārtai ir integrators, izmanto skaitļus, kas iegūti no tā. Ja integratora nav, nosaka zem katra pīķa esošo laukumu, reizinot pīķa augstumu ar tā platumu, kāds ir pusē no augstuma, un vajadzības gadījumā ņem vērā dažādas jutības pārslēgšanas reģistrēšanas laikā.

5.2.2. Aprēķinu metode

5.2.2.1. Vispārējs gadījums Aprēķina dotā komponenta i saturu, izteiktu metilesteru masas procentos, nosakot attiecīgā pīķa laukumu procentos attiecībā pret visu pīķu laukumu summu, izmantojot šādu formulu: kur: Ai ir pīķa laukums, kas atbilst komponentam i; ∑A = visu piķu laukumu summa. Rezultātu nosaka līdz vienai zīmei aiz komata. 7. piezīme: šajā vispārējā gadījumā uzskata, ka uz relatīvajiem laukumiem pamatoto aprēķinu rezultāts pārstāv masas procentus. Ja šis pieņēmums nav pieļaujams, sk. 5.2.2.2. punktu.

5.2.2.2. Korekcijas koeficientu lietošana Dažos gadījumos, piemēram, tādu taukskābju klātbūtnē, kas satur mazāk par astoņiem oglekļa atomiem, vai tādu skābju klātbūtnē, kam ir otrējās grupas, ja izmanto siltumvadītspējas detektorus vai ja ir īpaši prasīta augstākā precizitātes pakāpe, ir jālieto korekcijas koeficienti, lai pīķu laukumu procentus pārvērstu komponentu masas procentos. Korekcijas koeficientus nosaka, izmantojot hromatogrammu, kas iegūta, analizējot zināma sastāva metilesteru standartmaisījumu darba apstākļos, identiskos ar parauga analīzes apstākļiem. Šim standartmaisījumam komponenta i masas procentus apraksta formula: kur: mi ir komponenta i masa standartmaisījumā; ∑m ir dazādo komponentu masu summa standartmaisījumā. No standartmaisījuma (4.4. punkts) hromatogrammas šādi aprēķina komponenta i procentus (laukums/laukums): kur: Ai ir komponentam i atbilstošā pīķa laukums, ∑A ir visu pīķu laukumu summa. Korekcijas koeficientu aprēķina šādi: Parasti korekcijas koeficientus izsaka attiecībā pret KC16, tātad relatīvie koeficienti kļūst Paraugā katra komponenta i saturs, izteikts metilesteru masas procentos, ir: Rezultātu nosaka līdz vienai zīmei aiz komata.

5.2.2.3. Iekšējā standarta lietošana Dažās analīzēs (piemēram, ja visas taukskābes nav kvantitatīvi jānosaka, kā tas ir gadījumā, ja skābes ar četriem vai sešiem oglekļa atomiem ir kopā ar skābēm, kurās ir 16 un 18 oglekļa atomi, vai ja ir jānosaka taukskābes absolūtais daudzums paraugā) ir jālieto iekšējais standarts. Bieži lieto taukskābes ar pieciem, 15 vai 17 oglekļa atomiem. Būtu jānosaka korekcijas koeficients (ja tāds ir) iekšējam standartam. Komponenta i masas procentus, izteiktus kā metilesterus, iegūst pēc formulas: kur: Ai ir komponentam i atbilstīgā pīķa laukums; As ir iekšējam standartam atbilstīgā pīķa laukums; K′i ir komponenta i korekcijas koeficients (attiecībā pret KC1); K′s ir iekšējā standarta korekcijas koeficients (attiecībā pret KC16); m ir noteikšanai ņemtā parauga masa miligramos; ms ir iekšējā standarta masa miligramos. Rezultātu nosaka līdz vienai zīmei aiz komata.

▼M2

6. ĪPAŠS GADĪJUMS — TAUKSKĀBJU TRANS — IZOMĒRU NOTEIKŠANA.

Ir iespējams noteikt trans — izomēru saturu taukskābēs ar oglekļa atomu skaitu no 10 līdz 24, atdalot metilesterus, izmantojot gāzu hromatogrāfijas kapilārās kolonnas ar īpatnējo polaritāti.

6.1. Kvarca kapilārā kolonna ar iekšējo diametru no 0,25 mm līdz 0,32 mm un garumu 50 m, pārklāta ar ciānpropisilikonu, pārklājuma kārtas biezums no 0,1 līdz 0,3 μm (veids SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 un līdzīga veida).

6.2. Metilesterus sagatavo, izmantojot X B pielikumā noteiktās procedūras. Piesardzības apsvērumu dēļ taukvielas ar brīvo skābju daudzumu virs 3 % ir jāneitralizē saskaņā ar VII pielikuma 6.1. punktu.

6.3. Kopumā gāzu hromatogrāfiju veic šādos apstākļos: — kolonnas temperatūra noregulēta no 150 °C līdz 230 °C (piemēram, 165 °C uz 15 minūtēm, tad, pieaugot par 5 °C minūtē, sasniedz 200 °C), — inžektora temperatūra: 250 °C, ja lieto sadales sistēmu, vai sākotnējā temperatūra, ja lieto “virs kolonnas” sistēmu, — detektora temperatūra: 260 °C, — nesējgāzes (hēlijs un ūdeņradis) plūsmas ātrums: 1,2 ml minūtē. Ievadītajam daudzumam jābūt tādam, lai izmantotajos jutīguma apstākļos tā pīķa augstums, kas atbilst arahīnskābes metilesteram, būtu vienāds ar 20 % no skalas apakšas vai lielāks.

6.4. Dažādo metilesteru identifikāciju veic, salīdzinot izdalīšanās laikus ar standarta maisījumu izdalīšanās laikiem (kā norādīts 2.3. punktā). Trans taukskābju esterus eluē pirms atbilstošajiem cis — izomēriem. Hromatogrammas piemērs ir sniegts 2. attēlā. 2.attēls Taukskābes trans – izomēru gāzu hromatogramma, izmantojot kapilāro kolonnu

6.5. Kolonnas efektivitātei, kas noteikta saskaņā ar 4.1.2. punktu, jābūt tādai, lai varētu atdalīt noteiktus kritiskos pārus, piemēram, pāri, ko veido trans — oleīnskābju masīvs un oleīnskābes pīķis, trans C18:1/cis C18:1, ar izšķirtspējas indeksu lielāku par 2.

6.6. Dažādo trans taukskābju procentuālo samēru aprēķina, ņemot vērā attiecību starp konkrētā pīķa virsmu un visu esošo pīķu virsmu summu. Ņem vērā: — trans oktadeci- skābju (T 18: 1), kas norādītas šīs regulas I pielikumā, kā transoleīnskābes izomēru summu, — cis–trans un trans–cis oktadekadiēn-skābju ((CT/TC) 18: 2), kas norādītas šīs regulas I pielikumā, kā translinolskābes izomēru summu, — trans–cis–trans, cis–cis–trans, cis–trans–cis, trans–cis–cis oktadekatriēn-skābju ((TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3), kas norādītas šīs regulas I pielikumā, kā translinolēnskābes izomēru summu procentuālo daudzumu. 8.piezīme. Ņemot vērā šīs metodes raksturīgās īpatnības, vēlams izteikt rezultātus ar 2 decimālzīmēm aiz komata.

▼B

►M2 7. ◄ ĪPAŠS GADĪJUMS — KATAROMETRA DETEKTORA IZMANTOŠANA (DETEKTORS DARBOJAS PĒC SILTUMA VADĪTSPĒJAS IZMAIŅU PRINCIPA)

Taukskābju metilesteru maisījuma kvalitatīvā un kvantitatīvā sastāva noteikšanai var izmantot arī gāzu hromatogrāfu ar detektoru, kura darbības pamatā ir siltuma vadītspējas izmaiņas (katarometrs). Ja to izmanto, 3. un 4. punktā norādītos nosacījumus ir jāmaina, kā parādīts 3. tabulā.

Kvantitatīvajā analīzē izmanto korekcijas koeficientus, kas norādīti 5.2.2.2. punktā.







3. tabula Mainīgais Lielumu nosacījumi Kolonna Garums: 2 līdz 4 m Iekšējais diametrs: 4 mm Nesējs Graudiņu lielums starp 160 un 200 μm stacionārās fāzes koncentrācija 15 līdz 25 % (masa/masa) Nesējgāze hēlijs vai, ja tā nav, ūdeņradis ar iespējami mazu skābekļa saturu Palīggāze nav vajadzīga inžektora temperatūra no 40 līdz 60 °C virs kolonnas temperatūras kolonnas temperatūra 180 līdz 200 °C nesējgāzes plūsma parasti starp 60 un 80 ml/min. iešļircinātā analīzes parauga lielums parasti starp 0,5 un 2 μl

►M2 8. ◄ ANALĪZES PROTOKOLS

Analīzes protokolā norāda metilesteru pagatavošanai un hromatogrāfijai lietotās metodes un iegūtos rezultātus. Tur norāda arī visus datus par darbu, kas nav norādīti šajā starptautiskajā standartā vai tiek uzskatīti par neobligātiem, kā arī datus par nejaušībām, kas varētu būt ietekmējušas rezultātus.

Analīzes protokols ietver visu informāciju, kas vajadzīga parauga pilnīgai identificēšanai.

▼M19









X B PIELIKUMS

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A : Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B : Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

(a) determination of difference between actual and theoretical content of triglycerides with ECN42 (ΔECN42): — method A will be applied to samples of all the oil categories after purification of the oil by passing it through a silica gel column;

(b) determination of the fatty acid composition: — method A will be applied directly to samples of the following oil categories: — — virgin olive oils with an acidity of less than 3,3 %, — refined olive oil, — olive oil (blend of virgin olive oils and refined olive oil), — refined olive-pomace oil, — olive-pomace oil (blend of virgin olive oils and refined olive-pomace oil); — method B will be applied directly to samples of the following oil categories: — — virgin olive oil with an acidity of more than 3,3 %, — crude olive-pomace oil;

(c) determination of trans-isomers of fatty acids: — method A will be applied directly to samples of the following oil categories: — — virgin olive oils with an acidity of less than 3,3 %, — refined olive oil, — olive oil (blend of virgin olive oils and refined olive oil), — refined olive-pomace oil, — olive-pomace oil (blend of virgin olive oils and refined olive-pomace oil); — method A will be applied to the following categories of oils after purification of the oil by passing it through a silica gel column: — — virgin olive oil with an acidity of more than 3,3 %, — crude olive-pomace oil.

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vac