1972L0199 — LV — 27.08.1999 — 005.001

Šis dokuments ir izveidots vienīgi dokumentācijas nolūkos, un iestādes neuzņemas nekādu atbildību par tā saturu

►B KOMISIJAS TREŠĀ DIREKTĪVA (1972. gada 27. aprīlis), ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei (72/199/EEK) (OV L 123, 29.5.1972, p.6)

Grozīta ar:









▼B

KOMISIJAS TREŠĀ DIREKTĪVA

(1972. gada 27. aprīlis),

ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes barības oficiālajai kontrolei

(72/199/EEK)







EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1970. gada 20. jūlija Direktīvu ( 1 ) par paraugu ņemšanas un analīžu Kopienas metožu ieviešanu barības oficiālajai kontrolei un jo īpaši tās 2. pantu; tā kā minētā direktīva prasa, lai barības oficiālās kontroles veiktu, izmantojot Kopienas metodes paraugu ņemšanai un analīzei, lai pārbaudītu atbilstību prasībām, kas rodas saskaņā ar noteikumiem, kuri izklāstīti normatīvajos un administratīvajos aktos, kas attiecas uz barības kvalitāti un sastāvu; tā kā Komisijas 1971. gada 15. jūnija Direktīva 71/250/EEK ( 2 ) un 1971. gada 18. novembra Direktīva 71/393/EEK ( 3 ) jau ir noteikusi vairākas Kopienas analīžu metodes; tā kā, ņemot vērā turpmākajā darbā gūtos panākumus, būtu jāpieņem trešais metožu kopums; tā kā šajā direktīvā paredzētie pasākumi ir saskaņā ar Barības pastāvīgās komitejas atzinumu, IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU.







1. pants

Dalībvalstis prasa, lai analīzes barības oficiālajām kontrolēm attiecībā uz to cietes saturu, kopproteīnu, ar pepsīnu un sālsskābi izšķīdināmo kopproteīnu, brīvo un kopējo gosipolu un pepsīna aktivitāti tiktu veiktas, izmantojot metodes, kas aprakstītas šīs direktīvas I pielikumā.

▼M1 —————

▼B

2. pants

Dalībvalstis prasa, lai analīzes barības oficiālajai kontrolei ar mērķi noteikt un identificēt ►M4 ————— ◄ noteikt ►M4 ————— ◄ tilozīna un virginiamicīna līmeni barībā, veiktu, izmantojot šīs direktīvas II pielikumā aprakstītās metodes.

▼M1 —————

▼B

3. pants

Dalībvalstīs vēlākais līdz 1973. gada 1. jūlijam stājas spēkā normatīvi un administratīvi akti, kas vajadzīgi, lai izpildītu šīs direktīvas prasības. Par to tās nekavējoties informē Komisiju.

4. pants

Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm.









I PIELIKUMS

▼M5

1. CIETES NOTEIKŠANA

POLARIMETRISKĀ METODE

1. Mērķis un izmantošanas joma

Šī metode dod iespēju noteikt cietes daudzumus un lielmolekulāras cietes noārdīšanās produktu daudzumus barībā, lai pārbaudītu atbilstību Komisijas Direktīvai 86/174/EEK un Padomes Direktīvai 96/25/EK.

2. Princips

Metodi veido divas noteikšanas. Pirmajā noteikšanā karstu paraugu apstrādā ar atšķaidītu sālsskābi. Pēc dzidrināšanas un filtrēšanas polarimetriski izmēra šķīduma optisko griešanas spēju.

Otrajā noteikšanā paraugu ekstrahē ar 40 % etilspirtu. Pēc filtrāta paskābināšanas ar sālsskābi, dzidrināšanas un filtrēšanas tāpat kā pirmajā noteikšanā izmēra optisko griešanas spēju.

No abu mērījumu starpības, reizinot to ar zināmu koeficientu, iegūst parauga cietes saturu.

3. Reaģenti

3.1. 25 % (m/m) sālsskābe, d = 1,126 g/ml.

3.2. 1,128 % (m/V) sālsskābe. Koncentrācija ir jāpārbauda, titrējot 0,1 % (m/V) metilsarkanā šķīduma 94 % (V/V) etilspirtā klātbūtnē ar 0,1 m/l nātrija hidroksīda šķīdumu. 10 ml = 30,94 ml 0,1 mol/l NaOH.

3.3. Karesa šķīdums I: 21,9 g cinka acetāta Zn(CH3COO)2!!! error character !!! Β·2H2O un 3 g ledus etiķskābes izšķīdina ūdenī. Uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml.

3.4. Karesa šķīdums II: 10,6 g kālija ferocianīda [K4(Fe(CN)6]!!! error character !!! Β·3H2O izšķīdina ūdenī. Uzpilda ar ūdeni līdz 100 ml.

3.5. 40 % (V/V) etilspirts, d = 0,948 g/ml pie 20 °C.

4. Iekārta

4.1. 250 ml koniskā kolba ar standarta slīpēta stikla savienojumu un atteces dzesinātāju.

4.2. Polarimetrs vai saharimetrs.

5. Darba gaita

5.1. Parauga sagatavošana

Paraugu sasmalcina, līdz tas ir pietiekami smalks, lai izietu caur sietu ar 0,5 mm apaļām acīm.

5.2. Kopējās optiskās griešanas spējas (P vai S) noteikšana (sk. 7.1. piezīmi)

Nosver 2,5 g sasmalcinātā parauga ar precizitāti līdz mg un ievieto 100 ml mērkolbā. Pievieno 25 ml sālsskābes (3.2.), krata, lai testa paraugs vienmērīgi sadalītos, un pievieno vēl 25 ml sālsskābes (3.2.). Iegremdē kolbu verdoša ūdens vannā, pirmās trīs minūtes enerģiski un nepārtraukti kratot, lai novērstu aglomerātu veidošanos. Ūdens daudzumam ūdens vannā jābūt pietiekamam, lai vanna turpinātu vārīties, kad tajā ieliek kolbu. Kolbu no vannas nedrīkst izņemt, kad tā tiek kratīta. Precīzi pēc 15 minūtēm kolbu izņem no vannas, pievieno 30 ml auksta ūdens un tūlīt atdzesē līdz 20 °C.

Pievieno 5 ml Karesa šķīduma I (3.3.) un vienu minūti krata. Pēc tam pievieno 5 ml Karesa šķīduma II (3.4.) un vēlreiz vienu minūti krata. Uzpilda ar ūdeni līdz atzīmei, samaisa un filtrē. Ja filtrāts nav pilnīgi dzidrs (kas notiek reti), atkārto noteikšanu, izmantojot lielāku Karesa šķīduma I un II daudzumu, piemēram, 10 ml.

Ar polarimetru vai saharimetru izmēra šķīduma optisko griešanas spēju 200 mm mēģenē.

5.3. Optiskās griešanas spējas (P’ vai S’) noteikšana 40 % etilspirtā šķīstošām vielām

Nosver 5 g parauga ar precizitāti līdz mg, ievieto 100 ml mērkolbā un pievieno aptuveni 80 ml etilspirta (3.5.) (sk. 7.2. piezīmi). Atstāj kolbu 1 stundu istabas temperatūrā; šajā laikā sešas reizes enerģiski sakrata tā, lai testa paraugs labi sajauktos ar etilspirtu. Uzpilda ar etilspirtu (3.5.) līdz atzīmei, samaisa un filtrē. 50 ml filtrāta (= 2,5 g parauga) ievada ar pipeti 250 ml koniskajā kolbā, pievieno 2,1 ml sālsskābes (3.1.) un enerģiski sakrata. Koniskajai kolbai uzliek atteces dzesinātāju un kolbu iegremdē verdoša ūdens vannā. Precīzi pēc 15 minūtēm izņem konisko kolbu no vannas, saturu pārnes 100 ml mērkolbā, skalojot ar nelielu daudzumu auksta ūdens, un atdzesē līdz 20 °C. Dzidrina, izmantojot Karesa šķīdumu I (3.3.) un Karesa šķīdumu II (3.4.), uzpilda līdz atzīmei ar ūdeni, samaisa, filtrē un izmēra optiskās griešanas spēju, kā norādīts 5.2. punkta otrajā un trešajā daļā.

6. Rezultātu aprēķināšana

Cietes saturu ( %) aprēķina šādi:

6.1. Ar polarimetru izdarītajiem mērījumiem

P = kopējā optiskā griešanas spēja leņķa grādos

P’ = optiskā griešanas spēja leņķa grādos vielām, kas šķīst 40 % (V/V) etilspirtā

= tīras cietes īpatnēja optiska griešanas spēja. Šā koeficienta parasti pieņemtā skaitliskā vērtība ir šāda: + 185,9° : rīsu cietei, + 185,4° : kartupeļu cietei, + 184,6° : kukurūzas cietei, + 182,7° : kviešu cietei, + 181,5° : mieu cietei, + 181,3° : auzu cietei, + 184,0° : citu veidu cietei un cietes maisījumiem barības maisījumos.

6.2. Ar saharimetru izdarītajiem mērījumiem

S = kopējā optiskā griešanas spēja saharimetra grādos,

S’ = optiskā griešanas spēja saharimetra grādos vielām, kas šķīst 40 % (V/V) etilspirtā,

N = saharozes masa (g) 100 ml ūdens, kas, izmērot ar 200 mm mēģeni, dod 100 saharimetra grādu optiskās griešanas spēju. 16,29 g franču saharimetriem, 26,00 g vācu saharimetriem, 20,00 g jauktiem saharimetriem.

= tīras cietes īpatnējā optiskā griešanas spēja (sk. 6.1.).

6.3 Atkārtojamība

Starpība starp rezultātiem, kas iegūti divās paralēlās noteikšanas reizēs, kuras veiktas ar vienu paraugu, nedrīkst pārsniegt 0,4 pēc absolūtā lieluma, ja cietes saturs ir mazāks par 40 %, un 1,1 % pēc relatīvā lieluma, ja cietes saturs ir vienāds ar 40 %vai lielāks par tiem.

7. Piezīmes

7.1. Ja paraugs satur vairāk nekā 6 % karbonātu, rēķinot to kalcija karbonātam, tie pirms kopējās optiskās griešanas spējas noteikšanas ir jāiznīcina, apstrādājot ar precīzi atbilstīgu atšķaidītas sērskābes daudzumu.

7.2. Ja produktos ir augsts laktozes saturs, piemēram, piena pulverī vai vājpiena pulverī, tad pēc 80 ml etilspirta (3.5.) pievienošanas rīkojas šādi. Koniskajai kolbai uzliek atteces dzesinātāju un kolbu uz 30 minūtēm iegremdē ūdens vannā pie 50 °C. Atstāj atdzist un turpina analīzi, kā norādīts 5.3. punktā.

7.3. Ir zināms, ka šādas barības sastāvdaļas, ja tās barībā ir būtiskā daudzumā, rada traucējumus, nosakot cietes saturu ar polarimetrisko metodi, un sakarā ar kuriem varētu iegūt nepareizus rezultātus: — tādi (cukur-) biešu produkti kā (cukur-) biešu mīkstums, (cukur-) biešu melase, melasi saturošs (cukur-) biešu mīkstums, (cukur-) biešu vināze, (biešu) cukurs, — citrusaugļu mīkstums, — linsēklas; linsēklu rauši; linsēklu izvilkums, — rapšu sēklas; rapšu sēklu rauši; rapšu sēklu izvilkums; rapšu sēklu čaulas, — saulespuķu sēklas; saulespuķu sēklu izvilkums; saulespuķu sēklas, daļēji lobītas, ekstrahētas, — kopras rauši; kopras izvilkums, — kartupeļu mīkstums, — sausais raugs, — produkti, kuros ir daudz insulīna (piem., topinambūru čipsi un milti), — dradži.

▼M3

2. KOPPROTEĪNA NOTEIKŠANA

1. Mērķis un joma.

Ar šo metodi var noteikt kopproteīna daudzumu barībā pēc slāpekļa satura, ko nosaka saskaņā ar Kjeldāla metodi.

2. Princips.

Paraugu šķeļ ar sērskābi katalizatora klātbūtnē. Skābes šķīdumu neitralizē un noregulē tā reakciju līdz bāziskai ar nātrija hidroksīda šķīdumu. Amonjaku atdestilē un uztver noteiktā sērskābes daudzumā, sērskābes pārākumu titrē ar nātrija hidroksīda standartšķīdumu.

3. Reaģenti.

3.1. Kālija sulfāts.

3.2. Katalizators: vara (II) oksīds CuO vai vara (II) sulfāta pentahidrāts CuSO4 · 5H2O

3.3. Cinka granulas.

3.4. Sērskābe, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Sērskābe c(½H2SO4) = 0,5 mol/l.

3.6. Sērskābe c(½H2SO4) = 0,1 mol/l.

3.7. Metilsarkanais indikators; izšķīdina 300 mg metilsarkanā 100 ml etanola, σ = 95-96 % (v/v).

3.8. Nātrija hidroksīda šķīdums (var lietot tehnisko) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.9. Nātrija hidroksīda šķīdums, c = 0,25 mol/l.

3.10. Nātrija hidroksīda šķīdums, 0,1 mol/l.

3.11 3.11. Sālsskābē mazgāti, izkarsēti pumeka gabaliņi.

3.12. Acetanilīds (kušanas temp. = 114 °C, N = 10,36 %).

3.13. Saharoze (nesatur slāpekli).

4. Aparatūra.

Aparatūra, kas piemērota šķelšanai, destilēšanai un titrēšanai pēc Kjeldāla metodes.

5. Procedūra.

5.1. Šķelšana.

No parauga ar precizitāti līdz 0,001 g ņem 1 g lielu iesvaru, ko pārnes šķelšanas aparāta kolbā. Pievieno 15 g kālija sulfāta (3.1.), vajadzīgo daudzumu katalizatora (3.2.) – 0,3 līdz 0,4 g vara (II) oksīda vai 0,9 līdz 1,2 g vara (II) sulfāta pentahidrāta, 25 ml sērskābes (3.4.), dažus pumeka gabaliņus un kolbas saturu samaisa. Kolbu sākumā karsē uzmanīgi, ja vajadzīgs, laiku pa laikam maisot, līdz masa ir karbonizēta un neputo; tad karsēšanu pastiprina, līdz šķidrums sāk pastāvīgi vārīties. Karsēšana ir pietiekama, ja verdošā skābe kondensējas uz kolbas sienām. Nedrīkst pieļaut kolbas pārkaršanu un organisko vielu daļiņu pielipšanu pie tās sienām. Kad šķīdums kļūst dzidrs un gaiši zaļš, to turpina vārīt vēl divas stundas un pēc tam ļauj atdzist.

5.2. Destilācija.

Uzmanīgi pievieno vajadzīgo ūdens daudzumu, lai nodrošinātu pilnīgu sulfātu izšķīdināšanu. Ļauj atdzist un pēc tam pievieno dažas cinka granulas (3.3.).

Atkarībā no sagaidāmā slāpekļa satura analizējamajā paraugā, destilācijas aparāta uztvērējkolbā precīzi iemēra 25 ml. sērskābes šķīduma (3.5. vai 3.6.). Pievieno dažus pilienus metilsarkanā indikatora šķīduma (3.7.).

Šķelšanas kolbu pievieno destilācijas aparāta dzesinātājam, un dzesinātāja galu iemērc šķīdumā, kas ir uztvērējkolbā, vismaz 1 cm dziļi (skat. 8.3. piezīmi). Nepieļaujot amonjaka zudumus (skat. 8.1. piezīmi), šķelšanas kolbā lēnām pievieno 100 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.8.).

Kolbu karsē, līdz atdestilējas amonjaks.

5.3. Titrēšana.

Atkarībā no analīzei lietotās sērskābes koncentrācijas ar nātrija hidroksīda šķīdumu (3.9.) vai (3.10.) uztvērējkolbā līdz beigu punktam attitrē sērskābes pārākumu.

5.4. Tukšā parauga analīze.

Lai pārliecinātos, ka reaģenti nesatur slāpekli, veic tukšā parauga analīzi (šķelšanu, destilēšanu un titrēšanu), parauga vietā ņemot 1 g saharozes (3.13.).

6. Rezultātu aprēķināšana.

Kopproteīna saturu aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

V0 = tukšā parauga titrēšanai izlietotais NaOH šķīduma (3.9. vai 3.10.) tilpums (ml);

V1 = analizējamā parauga titrēšanai izlietotais NaOH šķīduma (3.9. vai 3.10.) tilpums (ml);

c = nātrija hidroksīda šķīduma (3.9. vai 3.10.) koncentrācija (mol/l);

m = parauga iesvars (g).

7. Metodes verifikācija.

7.1. Atkārtojamība.

No viena parauga divos atkārtojumos iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt:

0,2 % no absolūtā lieluma, ja kopproteīna saturs ir mazāks par 20 %;

1,0 relatīvo % no lielākā lieluma, ja kopproteīna saturs ir no 20 % līdz 40 %;

0,4 % no absolūtā lieluma, ja kopproteīna saturs ir lielāks par 40 %.

7.2. Precizitāte.

Analizē (veicot šķelšanu, destilēšanu un titrēšanu) 1,5 līdz 2,0 g acetanilīda (3.12.) 1 g saharozes (3.13.) klātbūtnē; 1 g acetanilīda patērē 14,80 ml sērskābes šķīduma (3.5.). Atgūstamībai jābūt vismaz 99 %.

8. Piezīmes.

8.1. Var izmantot ar roku darbināmas, pusautomātiskas vai automātiskas iekārtas. Ja paraugs pēc šķelšanas jāpārvieto destilēšanai, pārnešana jāveic bez kvantitatīviem zudumiem. Ja destilācijas aparāta kolba nav aprīkota ar pilināmo piltuvi, nātrija hidroksīda šķīdumu, lēnām lejot gar kolbas sienu, pievieno tieši pirms tās savienošanas ar dzesinātāju.

8.2. Ja šķelšanas produkts sacietē, analīzi atkārto, lietojot lielāku daudzumu sērskābes (3.4.) nekā norādīts iepriekš.

8.3. Analizējot produktus ar zemu slāpekļa saturu, ja vajadzīgs, sērskābes šķīduma (3.6.) daudzumu uztvērējkolbā var samazināt līdz 10 ml vai 15 ml, šķīduma tilpumu līdz 25 ml papildinot ar ūdeni.

▼B

3. AR PEPSĪNU UN SĀLSSKĀBI IZŠĶĪDINĀTĀ KOPPROTEĪNA NOTEIKŠANA

1. Mērķis un piemērošanas joma

Šī metode dod iespēju noteikt kopproteīna daļu, kas noteiktos apstākļos izšķīdināta ar pepsīnu un sālsskābi. Tā ir piemērojama visu veidu barībai.

2. Princips

Paraugu 48 stundas silda pie 40 oC pepsīna sālsskābes šķīdumā. Suspensiju nofiltrē un slāpekļa saturu filtrātā nosaka saskaņā ar kopproteīna noteikšanas metodi.

3. Reaģenti

3.1. Sālsskābe, d = 1,125.

3.2. Sālsskābe, 0,075 N.

3.3. 2,0 vien./mg pepsīns. Pepsīna aktivitāte ir definēta šā pielikuma 4. daļā aprakstītajā metodē, un tā ir jānosaka saskaņā ar minēto metodi.

3.4. Aptuveni 0,2 % (masa/tilp.) svaigi pagatavota pepsīna šķīduma sālsskābē (3.2.). Aktivitāte: 400 vien./l.

3.5. Pretputošanas emulsija (, piem., silikona emulsija).

3.6. Visi reaģenti, kas uzskaitīti kopproteīna noteikšanas metodes 3. punktā.

4. Aparatūra

4.1. Ūdens vanna vai inkubators, noregulēts pie 40 ± 1 oC.

4.2. Kjeldāla šķelšanas un destilācijas aparāts.

5. Darba gaita

5.1. Šķīduma sagatavošana (sk. 7.2. piezīmi)

Nosver 2 g parauga ar precizitāti līdz tuvākajam mg un ievieto 500 mērkolbā. Pievieno 450 ml pepsīna sālsskābes šķīduma (3.4.), kas iepriekš uzsildīts līdz 40 oC, un krata, lai novērstu aglomerātu veidošanos. Pārliecinās, ka suspensijas pH ir mazāks par 1,7. Ieliek kolbu ūdens vannā vai inkubatorā (4.1.) un atstāj uz 48 stundām. Sakrata pēc 8, 24 un 32 stundām. Pēc 48 stundām pievieno 15 ml sālsskābes (3.1.), atdzesē līdz 20 oC, uzpilda līdz zīmei ar ūdeni un nofiltrē.

5.2. Šķelšana

250 ml filtrāta ielej destilācijas aparāta kolbā (4.2.). Pievieno šķelšanai vajadzīgos reaģentus, kas norādīti kopproteīna noteikšanas metodes 5.1. punkta otrajā teikumā.

Homogenizē un uzkarsē līdz viršanai. Ja veidojas putas, pievieno dažus pilienus pretputošanas emulsijas (3.5.). Turpina enerģiski vārīt, līdz ūdens ir gandrīz pilnīgi iztvaicēts. Samazina sildīšanu un uzmanīgi aizvada pēdējās ūdens pēdas. Kad šķidrums kļūst dzidrs un bezkrāsains (vai gaiši zaļš, ja ir lietots varu saturošs katalizators), turpina vārīt vēl vienu stundu. Atstāj atdzist.

5.3. Destilēšana un titrēšana

Rīkojas, kā norādīts kopproteīnu noteikšanas metodes 5.2. un 5.3. punktā.

5.4. Tukšais mēģinājums

Izdara tukšo mēģinājumu, izmantojot to pašu darba gaitu, bet bez analizējamā parauga.

6. Rezultātu aprēķināšana

Atņem tukšajā mēģinājumā patērētās sērskābes daudzumu no analizējamā parauga patērētā sērskābes daudzuma. 1 ml 0,1 N sērskābes atbilst 14 mg slāpekļa.

Slāpekļa daudzumu reizina ar koeficientu 6,25. Rezultātu izsaka kā procentus no parauga svara.

Atkārtojamība

Viena parauga rezultātu starpība divās paralēlās noteikšanās nedrīkst pārsniegt:

— 0,4 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, mazākam par 20 %,

— 2,0 % relatīvo lielumu kopproteīna saturam, ne mazākam par 20 % un ne lielākam par 40 %,

— 0,8 pēc absolūtā lieluma kopproteīna saturam, lielākam par 40 %.

7. Piezīmes

7.1. Ar šo metodi iegūtajiem lielumiem nav tiešas saistības ar šķelšanu in vivo.

7.2. Produkti ar eļļas vai tauku saturu, kas pārsniedz 10 %, vispirms ir jāatbrīvo no taukiem, ekstrahējot ar petrolēteri (v.40. lpp. līdz 60 oC).

4. PEPSĪNA AKTIVITĀTES NOTEIKŠANA

1. Mērķis un piemērošanas joma

Šī metode dod iespēju noteikt aktivitāti pepsīnam, ko izmanto ar pepsīnu un sālsskābi izšķīdinātā kopproteīna noteikšanā.

2. Princips

Hemoglobīnu apstrādā ar pepsīnu sālsskābes vidē noteiktos apstākļos. Pēc tam proteīnu nehidrolizēto daļu izgulsnē trihloretiķskābē. Filtrātam pievieno nātrija hidroksīdu un Folina-Čikalteu (Folin-Ciocalteu) reaģentu. Pie 750 nm izmēra šā šķīduma optisko blīvumu un atbilstīgo tirozīna daudzumu nolasa no kalibrācijas līknes.

Definīcija: Pepsīna vienību definē kā šā fermenta daudzumu, kas metodes pielietošanas apstākļos minūtē atbrīvo hidroksiarilgrupu daudzumu, kuram, iekrāsotam ar Folina-Čikalteu reaģentu, ir optiskais blīvums, kas atbilst vienam mikromolam tirozīna, kurš iekrāsots tādā pašā veidā.

3. Reaģenti

3.1. Sālsskābe, 0,2 N.

3.2. Sālsskābe, 0,06 N.

3.3. Sālsskābe, 0,025 N.

3.4. Trihloretiķskābes 5 % (masa/tilp.) šķīdums.

3.5. Nātrija hidroksīda 0,5 N šķīdums.

3.6. Folina-Čikalteu reaģents. Ievieto 2 litru apaļdibena kolbā ar pieslīpēta stikla standartpievienojumu 100 g nātrija volframāta (Na2WO4,·2H2O), 25 g nātrija molibdāta (Na2MoO4, 2H2O) un 700 ml ūdens. Pievieno 50 ml fosforskābes (d = 1,71) un 100 ml koncentrētas sālsskābes (d = 1.19). Pievieno kolbai atteces dzesinātāju, uzkarsē līdz viršanai un šķīdumu lēni vāra 10 stundas.. Atstāj atdzist, atvieno atteces dzesinātāju, pievieno 175 g litija sulfāta (Li2SO4, ·2H2O), 50 ml ūdens un 1 ml broma. Vāra 15 minūtes, lai aizvadītu pārpalikušo bromu. Atstāj atdzist, pārnes šķīdumu 1 l mērkolbā, uzpilda ar ūdeni līdz zīmei, homogenizē un filtrē. Nedrīkst palikt zaļgans krāsojums. Pirms lietošanas atšķaida vienu tilpumu reaģenta ar diviem tilpumiem ūdens.

3.7. Hemoglobīna šķīdums Nosver hemoglobīna daudzumu (aptuveni 2 g proteīnu substrāta, kas noteikts saskaņā ar Ansona metodi), kas atbilst 354 mg slāpekļa ( 4 ), un ievieto 200 ml kolbā, kam ir pieslīpēts standartpievienojums. Pievieno dažus ml sālsskābes (3.2.), savieno kolbu ar vakuumsūkni un krata, līdz hemoglobīns ir pilnīgi izšķīdis. Atvieno vakuumu un, kratot, pievieno sālsskābi (3.2.), lai uzpildītu līdz 100 ml. Sagatavo tieši pirms lietošanas.

3.8. Standarta tirozīna šķīdums. Izšķīdina sālsskābē (3.1.) 181,2 mg tirozīna un uzpilda līdz 1 l ar to pašu skābi (izejas šķīdums). Ņem 20 ml un atšķaida ar sālsskābi (3.1.) līdz 100 ml. Šā šķīduma 1 ml satur 0,2 mikromolus tirozīna.

4. Aparatūra

4.1. Ūdens vanna, noregulēta uz 25 ± 0,1 oC ar ultratermostatu.

4.2. Spektrofotometrs.

4.3. Hronometrs ar precizitāti 1 sekunde.

4.4. pH metrs.

5. Darba gaita

5.1. Šķīduma sagatavošana (sk. 7.1. piezīmi)

Izšķīdina 150 mg pepsīna 100 ml sālsskābes (3.2.). Iepipetē 2 ml šķīduma 50 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar sālsskābi (3.3.). Ar pH metru izmērītajam pH jābūt 1,6 ± 0,1. Kolbu iegremdē ūdens vannā (4.1.).

5.2. Hidrolīze

Iepipetē mēģenē 5,0 ml hemoglobīna šķīduma (3.7.), uzsilda ūdens vannā līdz 25 oC, pievieno 1,0 ml pepsīna šķīduma, kas iegūts atbilstīgi 5.1. punktam, un samaisa ar vienā galā paresninātu stikla spieķīti apmēram ar 10 kustībām uz priekšu un atpakaļ. Atstāj mēģeni ūdens vannā pie 25 oC precīzi 10 minūtes, skaitot no pepsīna šķīduma pievienošanas (ilgums un temperatūra ir stingri jāievēro). Pēc tam pievieno 10,0 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.4.), kas iepriekš uzsildīts līdz 25 oC, homogenizē un nofiltrē caur sausu filtru.

5.3. Krāsojuma attīstīšana un optiskā blīvuma mērīšana

Iepipetē koniskajā kolbā 5,0 ml filtrāta, pievieno 10,0 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.5.) un, visu laiku kratot, pievieno 3,0 ml Folina-Čikalteu reaģenta (3.6.). Pēc 5 līdz 10 minūtēm ar spektrofotometru pie 750 nm nosaka šķīduma optisko blīvumu 1 cm šūnās pret ūdeni.

5.4. Tukšais mēģinājums

Katrai noteikšanai izdara tukšo mēģinājumu šādi:

Iepipetē mēģenē 5,0 ml hemoglobīna šķīduma (3.7.), uzsilda ūdens vannā (4.1.) līdz 25 oC, pievieno 10,0 ml trihloretiķskābes šķīduma (3.4.), kas iepriekš sasildīts līdz 25 oC, homogenizē, pēc tam pievieno 1,0 ml pepsīna šķīduma, kas iegūts saskaņā ar 5.1. punktu. Ar stikla spieķīti samaisa un atstāj mēģeni ūdens vannā (4.1.) precīzi 10 minūtes. Homogenizē un filtrē caur sausu filtru. Rīkojas, kā norādīts 5.3. punktā.

5.5. Kalibrēšanas līkne

Ievieto 50 ml koniskajās kolbās 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 un 5,0 ml alikvotās daļas tirozīna šķīduma (3.8.), kas attiecīgi atbilst 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 un 1,0 mikromoliem tirozīna. Sēriju beidz ar salīdzināšanas šķīdumu, kurā nav tirozīna. Tilpumus uzpilda līdz 5,0 ml ar sālsskābi (3.1.). Pievieno 10,0 ml nātrija hidroksīda šķīduma (3.5.) un, visu laiku kratot, pievieno 3,0 ml atšķaidīta Folina-Čikalteu reaģenta (3.6.). Izmēra optisko blīvumu, kā norādīts 5.3. punkta pēdējā teikumā. Uzzīmē kalibrācijas līkni, atliekot optiskos blīvumus pret tirozīna daudzumiem.

6. Rezultātu aprēķināšana

No kalibrēšanas līknes nolasa tirozīna daudzumu mikromolos, kas atbilst krāsainā šķīduma optiskajam blīvumam, koriģētam uz tukšo mēģinājumu.

Pepsīna aktivitāti tirozīna mikromolos uz mg minūtē pie 25 oC, aprēķina pēc formulas:

kur:

a = tirozīna daudzums mikromolos, nolasīts no kalibrēšanas līknes,

p = pepsīna daudzums, kas pievienots saskaņā ar 5.2. punktu.

7. Piezīmes

7.1. Izšķīdināmā pepsīna daudzumam jābūt tādam, lai galīgajos fotometrijas mērījumos iegūtu optisko blīvumu 0,35 ± 0,035.

7.2. Ar šo metodi iegūtas divas vienības uz mg atbilst 3,64 Ansona milivienībām uz mg (mikromoli tirozīna/mg. min. pie 35,5 oC) vai 36 400 komercvienības/g (mikromoli tirozīna/g 10 minūtēs pie 35,5 oC).

5. BRĪVĀ UN KOPĒJĀ GOSIPOLA NOTEIKŠANA

1. Mērķis un piemērošanas joma

Šī metode dod iespēju noteikt brīvā gosipola, kopējā gosipola un ķīmiski radniecīgu vielu līmeņus kokvilnas sēklās, kokvilnas sēklu miltos un kokvilnas sēklu raušos un kombinētajā barībā, kas satur šīs vielas, ja to ir vairāk par 20 ppm.

2. Princips

Gosipolu ekstrahē 3-amino-1-propanola klātbūtnē ar 2-propanola un heksāna maisījumu brīvā gosipola noteikšanai vai ar dimetilformamīdu kopējā gosipola noteikšanai. Gosipolu ar anilīnu pārvērš gosipoldianilīnā, kura optisko blīvumu mēra pie 440 nm.

3. Reaģenti

3.1. 2-propanola-heksāna maisījums. Samaisa 60 tilpuma daļas analīzes kvalitātes 2-propanola ar 40 tilpuma daļām heksāna.

3.2. Šķīdinātājs A: 1 litra mērkolbā ielej aptuveni 500 ml 2-propanola-heksāna maisījuma (3.1.), 2 ml 3-amino-1-propanola, 8 ml ledus etiķskābes un 50 ml ūdens. Uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Šis reaģents ir stabils vienu nedēļu.

3.3. Šķīdinātājs B: Iepipetē 2 ml 3-amino-1-propanola un 10 ml ledus etiķskābes 100 ml mērkolbā. Atdzesē līdz istabas temperatūrai un uzpilda līdz zīmei ar N,N-dimetilformamīdu. Šis reaģents ir stabils vienu nedēļu.

3.4. Anilīns, analīzes kvalitātes. Ja tukšajā mēģinājumā optiskais blīvums ir lielāks par 0,022, anilīnu pārdestilē virs cinka putekļiem, izmetot destilāta pirmo un pēdējo 10 % frakciju. Turot ledusskapī un brūnā, aizkorķētā pudelē, šis reaģents ir glabājams vairākus mēnešus.

3.5. Standarta gosipola šķīdums A: Ievieto 250 ml mērkolbā 27,9 mg gosipola acetāta. Izšķīdina un uzpilda līdz zīmei ar šķīdinātāju A (3.2.). Iepipetē 50 ml šā šķīduma 250 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar šķīdinātāju A. Šā gosipola šķīduma koncentrācija ir 0,02 mg mililitrā. Pirms lietošanas atstāj uz vienu stundu istabas temperatūrā.

3.6. Standarta gosipola šķīdums B: Ievieto 50 mērkolbā 27,9 mg gosipola acetāta. Izšķīdina un uzpilda līdz zīmei ar šķīdinātāju B (3.3.). Šā gosipola šķīduma koncentrācija ir 0,5 mg mililitrā.

Gosipola standartšķīdumi A un B paliek stabili 24 stundas, ja tos aizsargā no gaismas.

4. Aparatūra

4.1. Maisītājs (kratītājs): Aptuveni 35 apgr./min.

4.2. Spektrofotometrs.

5. Darba gaita

5.1. Analizējamais paraugs

Analizējamā parauga lielums ir atkarīgs no sagaidāmā gosipola satura paraugā. Ir ieteicams strādāt ar mazu analizējamo paraugu un relatīvi lielu filtrāta alikvoto daļu, lai ar iegūto gosipola daudzumu būtu iespējami precīzi fotometrijas mērījumi. Brīva gosipola noteikšanai kokvilnas sēklās, kokvilnas sēklu miltos un kokvilnas sēklu raušos analizējamam paraugam nebūtu jāpārsniedz 1 g. Kombinētās barības paraugs var būt līdz 5 g. Vairumā gadījumu piemērota ir 10 ml filtrāta alikvotā daļa. Tai būtu jāsatur 50 līdz 100 μg gosipola. Kopējā gosipola noteikšanai analizējamam paraugam būtu jābūt starp 0,5 g un 5 g, tā lai 2 ml filtrāta alikvotā daļa saturētu 40 μg līdz 200 μg gosipola.

Analīze būtu jāizdara istabas temperatūrā - aptuveni 20 oC.

5.2. Brīvā gosipola noteikšana

Analizējamo paraugu ievieto 250 ml kolbā ar pieslīpētu kaklu, kuras dibens ir klāts ar stikla drumslām. Ar pipeti pievieno 50 ml šķīdinātāja A (3.2.), aizkorķē kolbu un maisa maisītājā vienu stundu. Nofiltrē caur sausu filtru un savāc filtrātu mazā kolbā ar pieslīpētu kaklu. Filtrēšanas laikā piltuvi apklāj ar pulksteņstiklu. Iepipetē identiskas filtrāta alikvotās daļas, kas satur 50 μg līdz 100 μg gosipola, katrā no divām 25 ml mērkolbām (A un B), Vajadzības gadījumā tilpumu uzpilda līdz 10 ml ar šķīdinātāju A (3.2.). Pēc tam A kolbas saturu uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Šo šķīdumu izmanto kā salīdzināšanas šķīdumu, pret kuru mēra parauga šķīdumu.

Iepipetē 10 ml šķīdinātāja A (3.2.) katrā no divām citām 25 ml mērkolbām (C un D). C kolbas saturu uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Šo šķīdumu izmanto kā salīdzināšanas šķīdumu, pret kuru mēra tukšā mēģinājuma šķīdumu.

Pievieno 2 ml anilīna (3.4.) katrā no kolbām (D un B). Silda 30 minūtes virs vāroša ūdens vannas, lai attīstītu krāsu. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.), homogenizē un atstāj nostāvēties vienu stundu.

Ar spektrofotometru pie 440 nm nosaka optisko blīvumu tukšā mēģinājuma šķīdumam (D), salīdzinot ar salīdzināšanas šķīdumu (C), un optisko blīvumu parauga šķīdumam (B), salīdzinot ar salīdzināšanas šķīdumu (A), izmantojot 1 cm stikla šūnas.

Atņem tukšā mēģinājuma šķīduma optisko blīvumu no parauga šķīduma optiskā blīvuma (= koriģētais optiskais blīvums). No šā lieluma aprēķina brīvā gosipola saturu, kā norādīts 6. punktā.

5.3. Kopējā gosipola noteikšana

Analizējamo paraugu, kas satur 1 mg līdz 5 mg gosipola, ievieto 50 ml mērkolbā un pievieno 10 ml šķīdinātāja B (3.3.). Vienlaikus sagatavo tukšo mēģinājumu, ievietojot 10 ml šķīdinātāja B (3.3.) citā 50 ml mērkolbā. Abas kolbas silda 30 minūtes virs vāroša ūdens vannas. Atdzesē līdz istabas temperatūrai un abu kolbu saturu uzpilda līdz zīmei ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Homogenizē un atstāj nostādināšanai 10 - 15 minūtes, pēc tam filtrē un savāc filtrātus kolbās ar pieslīpētiem kakliem.

Iepipetē katrā no divām 25 ml mērkolbām 2 ml parauga filtrāta un iepipetē katrā no divām citām 25 ml mērkolbām 2 ml tukšā mēģinājuma filtrāta. Pēc tam katras sērijas vienas kolbas saturu uzpilda līdz 25 ml ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.). Šos šķīdumus izmanto kā standartšķīdumus.

Pievieno 2 ml anilīna (3.4.) katrā no divām pārējām kolbām. Silda 30 minūtes virs vāroša ūdens vannas, lai attīstītu krāsu. Atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz 25 ml ar 2-propanola-heksāna maisījumu (3.1.), homogenizē un atstāj nostāvēties vienu stundu.

Nosaka optisko blīvumu, kā norādīts 5.2. punktā attiecībā uz brīvu gosipolu. No šā lieluma aprēķina kopējā gosipola saturu, kā norādīts 6. punktā.

6. Rezultātu aprēķināšana

Rezultātus var aprēķināt vai nu no to īpatnējā optiskā blīvuma (6.1.), vai no kalibrācijas līknes (6.2.).

6.1. No īpatnējā optiskā blīvuma

Aprakstītajos apstākļos īpatnējie optiskie blīvumi ir šādi:







brīvam gosipolam: kopējam gosipolam:

Brīvā vai kopējā gosipola saturu paraugā aprēķina pēc formulas:

kur:

E = koriģētais optiskais blīvums, noteikts saskaņā ar 5.2. punktu,

p = parauga iesvars g,

a = filtrāta alikvotā daļa ml.

6.2. Aprēķināšana no kalibrēšanas līknes

6.2.1. Brīvs gosipols

Sagatavo divas sērijas 25 ml mērkolbu pa piecām mērkolbām katrā. Katras sērijas mērkolbās ar pipeti ievada attiecīgi 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 un 10,0 ml gosipola standartšķīduma A (3.5.). Ar šķīdinātāju A (3.2.) uzpilda šķīdumus līdz 10 ml. Katru sēriju pabeidz ar tukšo paraugu, kas 25 ml mērkolbā satur tikai 10 ml šķīdinātāja A (3.2.).

Pirmās sērijas kolbas, ieskaitot tukšo mēģinājumu, uzpilda ar heksāna/izopropanola maisījumu (3.1.) līdz zīmei (salīdzināšanas rinda).

Otrās sērijas kolbās, ieskaitot tukšo mēģinājumu, katrā pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Pēc tam krāsas attīstīšanai 30 minūtes silda virs vāroša ūdens vannas, atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar heksāna/izopropanola maisījumu (3.1.), sakrata un atstāj nostāvēties 1 stundu (standarta rinda).

Izmēra standartrindas šķīdumu ekstinkciju atbilstīgi 5.2. punkta nosacījumiem, salīdzinot ar atbilstīgiem salīdzināšanas rindas šķīdumiem. Uzzīmē kalibrācijas līkni, kurā atliek ekstinkcijas lielumus pret gosipola daudzumiem g.

6.2.2. Kopējais gosipols

Sagatavo sešas 50 ml mērkolbas. Pirmajā iepipetē 10 ml šķīdinātāja B (3.3.) un pārējās 2,0, 4,0 6,0 8,0 un 10,0 ml gosipola standartšķīduma B (3.6.). Katras kolbas saturu ar šķīdinātāju B papildina līdz 10 ml, 30 minūtes silda virs vāroša ūdens vannas, atdzesē līdz istabas temperatūrai, uzpilda līdz zīmei ar izopropanola/heksāna maisījumu (3.1.) un sakrata.

Šos šķīdumus iepipetē pa 2 ml divās rindās pa sešām 25 ml mērkolbām. Pirmās rindas kolbas uzpilda līdz zīmei ar izopropanola/heksāna maisījumu (3.1.) (salīdzināšanas rinda).

Otrās rindas kolbās katrā pievieno 2 ml anilīna (3.4.). Pēc tam 30 minūtes karsē virs vāroša ūdens vannas, atdzesē līdz istabas temperatūrai, ar izopropanola heksāna maisījumu (3.1.), uzpilda līdz zīmei, sakrata un atstāj nostāvēties 1 stundu (standartrinda).

Izmēra standartrindas šķīdumu ekstinkciju atbilstīgi 5.2. punkta nosacījumiem, salīdzinot ar atbilstīgiem salīdzināšanas rindas šķīdumiem. Uzzīmē kalibrācijas līkni, kurā atliek ekstinkcijas lielumus pret gosipola daudzumiem g.

6.3. Atkārtojamība

Viena parauga divu paralēlu noteikšanu rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt:

— ja gosipola saturs ir mazāks par 500 ppm – 15 relatīvos procentus,

— ja gosipola saturs ir 500 līdz 750 ppm – absolūto lielumu - 75 ppm,

— ja gosipola saturs ir 750 ppm un vairāk – 10 relatīvos procentus.









II PIELIKUMS

▼M4 —————

▼B

4. TILOZĪNA NOTEIKŠANA

- Pēc difūzijas agarā -

1. Mērķis un piemērošanas joma

Šī metode dod iespēju noteikt tilozīna saturu barībā, koncentrātos un premiksos, ja klāt ir vairāk par 2 ppm.

2. Princips

Paraugu apstrādā ar pH 8 fosfāta buferšķīdumu, kas iepriekš uzkarsēts līdz 80 oC, un pēc tam ekstrahē ar metilspirtu. Pēc centrifugēšanas ekstraktu atšķaida un tā antibiotisko aktivitāti nosaka, izmērot tilozīna difūziju agara barotnē ar Sarcina lutea uzsējumu. Par difūziju liecina kavēšanas zonu veidošanās mikroorganisma klātbūtnē. Šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotiku koncentrācijas logaritmam.

3. Mikroorganisms: Sarcina lutea ATCC Nr. 9341

3.1. Vecāku klona uzturēšana

Ar Sarcina lutea apsēj no barotnes (4.1.) ņemta slīpināta agara mēģeni un noregulē pH uz 7,0. Inkubē vienu nakti pie aptuveni 35 oC. Kultūru glabā ledusskapī un slīpi novietoto agaru no jauna ar to apsēj reizi mēnesī.

3.2. Baktēriju suspensijas pagatavošana

Baktērijas savāc no nesen pagatavotā slīpi novietotā agara mēģenes (3.1.), izmantojot 2 - 3 ml fizioloģiskā šķīduma (4.4.). Ar šo suspensiju apsēj Rū (Roux) kolbu, kas satur 250 ml barotnes (4.1.), kuras pH ir noregulēts uz 7,0. Inkubē 24 stundas pie 35 oC, pēc tam savāc baktērijas 25 ml fizioloģiskā šķīduma (4.4.). Homogenizē un atšķaida šo suspensiju, lai iegūtu aptuveni 75 % gaismas caurlaidību pie 650 nm.

Glabājot ledusskapī, šo suspensiju var izmantot vienu nedēļu.

Priekšmēģinājumos uz plāksnēm ar noteikšanas pamatbarotni (4.1.) nosaka uzsējamā materiāla daudzumu, kas dažādām izmantojamā tilozīna koncentrācijām dod iespējami lielākās kavēšanas zonas, kas vēl ir skaidras. Barotni uzsēj 48 - 50 oC temperatūrā.

4. Barotne un reaģenti

4.1. Noteikšanas pamatbarotne ( 5 )







glikoze 1 g triptiskais peptons 10 g gaļas ekstrakts 1,5 g rauga ekstrakts 3 g agars, atkarībā no kvalitātes 10 – 20 g destilēts ūdens līdz 1000 ml

Tieši pirms lietošanas vecāku klona uzturēšanai un baktēriju suspensijas pagatavošanai noregulē pH uz 7,0, bet noteikšanai pH noregulē uz 8,0.

4.2. Fosfāta buferšķīdums, pH 8







kālija dihidrogenfosfāts KH2PO4, analīzes kvalitātes, 0,523 g dikālija hidrogenfosfāts K2HPO4 analīzes kvalitātes, 16,730 g destilēts ūdens līdz 1000 ml

4.3. Fosfāta buferšķīdums, pH 7







kālija dihidrogenfosfāts KH2PO4, analīzes kvalitātes, 5,5 g dikālija hidrogenfosfāts K2HPO4 analīzes kvalitātes, 13,6 g destilēts ūdens līdz 1000 ml

4.4. Sterils fizioloģiskais šķīdums.

4.5. Tīrs metilspirts.

4.6. 40 % (tilp./tilp.) metilspirts.

4.7. Fosfāta buferšķīduma (4.2.) maisījums ar tīru metilspirtu tilpumu attiecībā 60/40.

4.8. Standartviela: zināmas aktivitātes tilozīns.

5. Standartšķīdumi

Standartvielu (4.8.) 3 stundas žāvē vakuumā (5 mm dzīvsudraba staba) žāvēšanas skapī 60 oC temperatūrā. Iesver mērkolbā 10 - 50 mg, izšķīdina 5 ml metilspirta (4.5.) un šķīdumu atšķaida ar fosfāta buferšķīdumu pH 7,0 (4.3.), lai iegūtu tilozīna bāzes koncentrāciju 1 000 μg/ml.

No šā izejas šķīduma, atšķaidot ar maisījumu (4.7.), pagatavo standarta darba šķīdumu S8, kas satur 2 μg/ml tilozīna bāzes.

Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 + 1), izmantojot maisījumu (4.7.), pagatavo šādas koncentrācijas:







S4 1 μg/ml S2 0,5 μg/ml S1 0,25 μg/ml

6. Ekstrahēšana

Koncentrātiem ņem 10 g analizējamā parauga. Premiksiem un barībai ņem 20 analizējamā parauga. Pievieno 60 ml fosfāta buferšķīdumu pH 8 (4.2.), kas iepriekš uzkarsēts līdz 80 oC, un homogenizē 2 minūtes (ar mājsaimniecības mikseri, Ultra Turrax utt.).

Atstāj nostāvēties 10 minūtes, pievieno 40 ml metilspirta (4.5.) un homogenizē 5 minūtes. Centrifugē ekstraktu, alikvotu daļu atšķaida ar maisījumu (4.7.), lai iegūtu paredzamo tilozīna koncentrāciju 2 μg/ml (= U8). Pēc tam secīgu atšķaidīšanu gaitā (1 + 1), izmantojot šķīdumu (4.7.), pagatavo koncentrācijas U4, U2 un U1.

Ja saturs ir mazāks par 10 ppm, rotācijas tvaicētājā pie 35 oC iztvaicē ekstraktu sausu un atlikumu izšķīdina 40 % metilspirtā (4.6.).

7. Noteikšanas metode

7.1. Barotnes apsēšana

Noteikšanas pamatbarotni (4.1.) noregulē uz 8,0 un 48 - 50 oC temperatūrā apsēj ar baktēriju suspensiju (3.2.).

7.2. Paplāšu sagatavošana

Difūziju agarā izdara paplātēs, izmantojot 4 standartšķīduma koncentrācijas (S8, S4, S2, S1) un 4 ekstrakta koncentrācijas (U8, U4, U2, U1). Četras ekstrakta un standartšķīduma koncentrācijas ir jāievieto katrā paplātē.

Tādēļ izvēlas paplātes, kas ir pietiekami lielas, lai tajās agara barotnē varētu izveidot vismaz 8 caurumus ar 10 - 13 mm diametru. Aprēķina apsētās barotnes (7.1.) daudzumu, kas vajadzīgs, lai nodrošinātu viendabīgu aptuveni 2 mm biezu pārklājumu. Analīzi vēlams izdarīt uz paplātēm, kas sastāv no plakana stikla plāksnēm, kas aprīkotas ar pilnīgi horizontālu alumīnija vai plastmasas gredzenu, kuram ir 200 mm diametrs un 20 mm augstums.

Dobumos iepipetē antibiotikas šķīduma precīzi nomērītus daudzumus starp 0,10 ml un 0,15 ml, atkarībā no dobumu diametra.

Katram paraugam difūziju atkārto vismaz 4 reizes ar katru koncentrāciju, tā lai katra noteikšana ietvertu 32 kavēšanas zonu novērtējumu.

7.3. Inkubācija

Paplātes inkubē vienu nakti pie 35 - 37 oC.

8. Novērtēšana

Izmēra kavēšanas zonu diametru, vēlams ar projicēšanu. Reģistrē mērījumus uz puslogaritmiskā papīra, atliekot koncentrācijas logaritmu pret kavēšanas zonu diametru. Uzzīmē standartšķīduma un ekstrakta kalibrēšanas līnijas. Ar nosacījumu, ka nenotiek traucēšana, abas līnijas ir paralēlas.

Relatīvās aktivitātes logaritmu aprēķina, izmantojot šādu formulu:

Faktiskā aktivitāte = paredzamā aktivitāte x relatīvā aktivitāte.

9. Atkārtojamība

Viena parauga divu paralēlu noteikšanu rezultātu starpība nedrīkst pārsniegt 10 % pēc relatīvā lieluma.

▼M2

5. VIRGINIAMICĪNA NOTEIKŠANA

— agara barotnē ar difūzijas metodi —

1. Mērķis un joma

Metode paredzēta virginiamicīna noteikšanai barībā un premiksos. Noteikšanas zemākā robeža ir 2 mg/kg (2 ppm) ( 6 ).

2. Princips

Paraugu ekstrahē ar Tween 80 šķīdumu metanolā. Ekstraktu dekantē vai centrifugē un atšķaida. Tā antibiotisko aktivitāti nosaka, novērtējot virginiamicīna difūziju agara vidē, kas apsēta ar Micrococcus luteus. Difūziju nosaka pēc mikroorganisma kavēšanas zonām. Pieņem, ka izmantojamo antibiotisko vielu koncentrāciju intervālā šo zonu diametrs ir tieši proporcionāls antibiotikas koncentrācijai.

3. Mikroorganisms: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Tīrkultūras uzturēšana

Mēģenēs uz slīpagara kultivēšanas barotnes (4.1.) izsēj Micrococcus luteus un inkubē 24 stundas 30 °C temperatūrā. Kultūru glabā ledusskapī apmēram 4 °C temperatūrā. Pārsēj reizi divās nedēļās.

3.2. Baktēriju suspensijas pagatavošana ( 7 )

Ar 2–3 ml nātrija hlorīda šķīduma (4.3.) noskalo pieaugumu no nesen pagatavota slīpagara (3.1.). Šo suspensiju izmanto 250 ml kultivēšanas barotnes (4.1.) apsēšanai Rū (Roux) kolbā, ko inkubē 18 līdz 20 stundas 30 °C temperatūrā. Pieaugumu noskalo ar 25 ml nātrija hlorīda šķīduma un samaisa. Sagatavo suspensijas desmitkārtīgu atšķidījumu nātrija hlorīda šķīdumā (4.3.). Suspensijas gaismas caurlaidībai pie 650 nm, mērot 1 cm kivetē pret nātrija hlorīda (4.3.) šķīdumu, jābūt 75 %. Šo suspensiju apmēram 4 °C temperatūrā var glabāt vienu nedēļu.

4. Kultivēšanas barotne un reaģenti

4.1. Kultivēšanas un pārbaudes barotne ( 8 )







Gaļas peptons 6,0 g Triptons 4,0 g Rauga ekstrakts 3,0 g Gaļas ekstrakts 1,5 g Glikoze 1,0 g Agars 10,0 līdz 20,0 g Ūdens 1 000 ml pH 6,5 (pēc sterilizēšanas)

4.2. Fosfātu buferšķīdums, pH 6







Kālija hidrogēnfosfāts, K2HPO4 2,0 g Kālija dihidrogēnfosfāts, KH2PO4 8,0 g Ūdens līdz 1 000 ml

4.3. Nātrija hlorīda 0,8 % (m/V) šķīdums: ūdenī izšķīdina 8 g nātrija hlorīda un atšķaida līdz 1 000 ml; sterilizē.

4.4. Metanols.

4.5. Fosfātu buferšķīduma (4.2.) un metanola (4.4.) maisījums: 80/20 (V/V).

4.6. Tween 80 0,5 % (m/V) šķīdums metanolā: metanolā (4.4.) izšķīdina 5 g Tween 80 un atšķaida ar metanolu līdz 1 000 ml.

4.7. Standartviela: virginiamicīns ar zināmu aktivitāti.

5. Standartšķīdumi

Metanolā (4.4.) izšķīdina precīzu standartvielas (4.7.) iesvaru un atšķaida ar metanolu (4.4.) tā, lai iegūtu rezerves standartšķīdumu, kas satur 1 000 μg virginiamicīna mililitrā.

Glabājot aizkorķētā kolbā 4 °C temperatūrā, šis šķīdums ir stabils līdz piecām dienām.

Šo rezerves šķīdumu pakāpeniski atšķaidot ar maisījumu (4.5.), pagatavo šādus šķīdumus:







s8 1 μg/ml s4 0,5 μg/ml s2 0,25 μg/ml s1 0,125 μg/ml

6. Ekstrakta un pārbaudes šķīdumu sagatavošana

6.1. Ekstrakcija

6.1.1. Produkti ar virginiamicīna saturu līdz 100 mg/kg

Iesver 50 g parauga, pievieno 200 ml šķīduma (4.6.) un krata 30 minūtes. Nostādina vai centrifugē, ņem 20 ml dzidrā šķīduma un temperatūrā, kas nepārsniedz 40 °C, rotācijas tvaicētājā ietvaicē līdz 5 ml tilpumam. Ietvaicēto šķīdumu atšķaida ar maisījumu (4.5.) tā, lai tajā būtu aptuveni 1 μg/ml virginiamicīna (= u8).

6.1.2. Produkti ar virginiamicīna saturu virs 100 mg/kg

Ņem līdz 10,0 g lielu paraugu, kas satur 1–50 mg virginiamicīna, pievieno 100 ml šķīduma (4.6.) un krata 30 minūtes. Nostādina vai centrifugē, tad atšķaida ar maisījumu (4.5.) tā, lai šķīdumā būtu aptuveni 1 μg/ml virginiamicīna (= u8).

6.2. Pārbaudes šķīdumi

No šķīduma u8 pagatavo šķīdumus u4 (aptuvenā koncentrācija: 0,5 μg/ml), u2 (aptuvenā koncentrācija: 0,25 μg/ml) un u1 (aptuvenā koncentrācija: 0,125 μg/ml), tos pakāpeniski atšķaidot (1 + 1) ar maisījumu (4.5.).

7. Pārbaudes procedūra

7.1. Pārbaudes barotnes apsēšana

Aptuveni 50 °C temperatūrā pārbaudes barotni (4.1.) apsēj ar baktēriju suspensiju (3.2.). Iepriekšējos izmēģinājumos uz plātnēm ar barotni (4.1.) nosaka baktēriju suspensijas daudzumu, kas vajadzīgs lielāko un skaidrāko mikroorganismu kavēšanas zonu iegūšanai ar dažādas koncentrācijas virginiamicīna šķīdumiem.

7.2. Plātņu sagatavošana

Difūziju caur agaru izdara uz plātnēm ar četru dažādu koncentrāciju standartšķīdumiem (s8, s4, s2 un s1) un četru koncentrāciju pārbaudes šķīdumiem (u8, u4, u2 un u1). Šo četru koncentrāciju ekstrakta šķīdumiem un standartšķīdumiem noteikti jābūt uz katras plātnes. Šim nolūkam izvēlas pietiekami lielas plātnes, uz kurām agara barotnē var izveidot vismaz astoņus iedobumus 10–13 mm diametrā, kuru centri ir attālināti vismaz par 30 mm. Testu var veikt uz plātnes, kas izveidota no stikla loksnes, uz kuras uzlikts 20 mm augsts anodēta alumīnija vai plastmasas riņķis ar 200 mm diametru.

Plātnēs salej tādu daudzumu barotnes (4.1.), kas apsēta saskaņā ar 7.1. punktu, lai iegūtu apmēram 2 mm biezu slāni (60 ml uz plātni ar 200 mm diametru). Atstāj sastingt horizontālā stāvoklī, izveido iedobumus un tajos precīzi izmērītā daudzumā iepilda pārbaudes šķīdumus un standartšķīdumus (no 0,10 līdz 0,15 ml iedobumā, atkarībā no diametra). Katru koncentrāciju pārbauda vismaz četras reizes, un tādējādi katrā analīzē jānovērtē vismaz 32 kavēšanas zonas.

7.3. Inkubēšana

Plātnes inkubē 16 – 18 stundas 30 ± 2 °C temperatūrā.

8. Novērtēšana

Ar precizitāti līdz 0,1 mm izmēra kavēšanas zonu diametru. Uz puslogaritmiskā papīra atzīmē punktus, kas atbilst kavēšanas zonu vidējam diametram atkarībā no koncentrācijas. Uzzīmē “atbilstošākās” līknes attiecīgi standartšķīdumam un ekstraktam, piemēram, šādi:

aprēķina “atbilstošāko” punktu standarta zemākajam līmenim (SL) pēc formulas:

a)

aprēķina “atbilstošāko” punktu standarta augstākajam līmenim (SH) pēc formulas:

b)

Līdzīgi aprēķina “atbilstošākos” punktus ekstrakta koncentrācijas zemākajam līmenim (UL) un augstākajam līmenim (UH), norādītajās formulās s1, s2, s4 un s8 aizstājot attiecīgi ar u1, u2, u4 un u8.

Tajā pašā grafikā atzīmē aprēķinātos SL un SH lielumus un tos savieno, iegūstot standartšķīdumam “atbilstošāko” līniju. Līdzīgi atzīmē UL un UH, ko savieno, iegūstot ekstraktam “atbilstošāko” līniju.

Ja nav nekādu traucējošu faktoru, abām līnijām vajadzētu būt paralēlām. Praktisku apsvērumu dēļ līnijas var uzskatīt par paralēlām, ja (SH–SL) un (UH–UL) neatšķiras vairāk par 10 % no to vidējā lieluma.

Konstatējot, ka līnijas nav paralēlas, var atmest u1 un s1 vai u8 un s8 un SL, SH, UL un UH “atbilstošākās” līknes var aprēķināt pēc alternatīvām formulām:







a′) SL = vai b′) SH = vai

un līdzīgi aprēķina UL un UH. Jāievēro tie paši paralelitātes kritēriji. Ja rezultāti aprēķināti pēc trim līmeņiem, to norāda gala ziņojumā.

Ja līnijas uzskata par paralēlām, atkarībā no tā, vai paralelitāte novērtēta pēc trim vai četriem līmeņiem, aprēķina relatīvās aktivitātes logaritmu (log A), izmantojot vienu no šādām formulām.

Pēc četriem līmeņiem:

c)

Pēc trim līmeņiem:

d)

vai

d′ )

Parauga ekstrakta aktivitāte = attiecīgā standartšķīduma aktivitāte × A

(u8 = s8 × A)

Ja relatīvā aktivitāte ir zemāka par 0,5 vai augstāka par 2,0, pārbaudi izdara atkārtoti, attiecīgi koriģējot ekstrakta koncentrācijas, bet, ja tas nav iespējams, tad koriģējot standartšķīdumu koncentrācijas. Ja nevar panākt, ka relatīvā aktivitāte ir vajadzīgajās robežās, iegūtais rezultāts uzskatāms par aptuvenu, un tas būtu jānorāda gala ziņojumā.

Ja nevar uzskatīt, ka līnijas ir paralēlas, noteikšanu izdara atkārtoti. Ja nevar panākt paralelitāti, noteikšana jāuzskata par neatbilstošu.

Rezultātu izsaka miligramos virginiamicīna uz barības kilogramu.

9. Atkārtojamība

No viena parauga viena operatora paralēlās noteikšanās iegūto rezultātu atšķirība nedrīkst pārsniegt:

— 2 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja virginiamicīna saturs nepārsniedz 10 mg/kg,

— 20 % no augstākā lieluma, ja virginiamicīna saturs ir no 10 līdz 25 mg/kg,

— 5 mg/kg pēc absolūtā lieluma, ja virginiamicīna saturs ir no 25 līdz 50 mg/kg,

— 10 % no augstākā lieluma, ja virginiamicīna saturs pārsniedz 50 mg/kg.