1991R2568 — LV — 01.03.2014 — 026.001

Šis dokuments ir izveidots vienīgi dokumentācijas nolūkos, un iestādes neuzņemas nekādu atbildību par tā saturu

Grozīta ar:







(*) Šis tiesību akts nekad nav publicēts latviešu valodā.









▼B

KOMISIJAS REGULA (EEK) Nr. 2568/91

(1991. gada 11. jūlijs)

par olīveļļas un olīvu izspaidu eļļas īpašībām un attiecīgajām analīzes metodēm







EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1966. gada 22. septembra Regulu Nr. 136/66/EEK par eļļas un tauku tirgus kopīgo organizāciju ( 1 ), kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EEK) Nr. 3577/90 ( 2 ) un jo īpaši tās 35.a pantu, tā kā Regulas Nr. 136/66/EEK pielikumā ir aprakstīta un definēta olīveļļa un olīvu izspaidu eļļa, ko tirgo katrā dalībvalstī, Kopienas iekšējā tirgū un tirdzniecībā ar trešām valstīm; tā kā, lai atšķirtu dažādu veidu eļļas, būtu jādefinē katras eļļas fizikālās un ķīmiskās īpašības un neapstrādātas olīveļļas organoleptiskās īpašības, lai garantētu attiecīgo produktu tīrību un kvalitāti, neskarot citus pastāvošos noteikumus; tā kā dažādu veidu eļļas īpašības būtu jānosaka vienveidīgi visā Kopienā; tā kā šajā nolūkā būtu jāizstrādā Kopienas metodes ķīmiskai analīzei un organoleptiskai novērtēšanai; tā kā būtu jāatļauj pārejas posmā izmantot citas dalībvalstīs piemērojamās analīzes metodes ar nosacījumu, ka, pastāvot rezultātu atšķirībai, kopējā metode ir izšķirošā; tā kā olīveļļas fizikālo un ķīmisko īpašību un analīzes metožu definīcija ir saistīta ar kombinētās nomenklatūras 15. nodaļas papildu piezīmju grozījumiem; tā kā neapstrādātas eļļas organoleptisko īpašību novērtēšana ietver atlasītu un apmācītu degustētāju žūriju izveidi; tā kā tādēļ būtu jānosaka šādu struktūru izveidei vajadzīgais laika posms; tā kā, ņemot vērā grūtības, ar ko dažas dalībvalstis sastapsies, izveidojot degustētāju žūrijas, būtu jāatļauj izmantot citu dalībvalstu žūrijas; tā kā, lai nodrošinātu olīvu izspaidu importam piemērojamās maksājumu sistēmas pareizu darbību, būtu jānosaka vienota metode eļļas satura noteikšanai šajos produktos; tā kā, lai nekaitētu tirdzniecībai, ir jāparedz, ka ierobežotu laika posmu drīkst tirgot eļļu, kas ir iepakota pirms šīs regulas stāšanās spēkā; tā kā ir jāatceļ Komisijas Regula (EEK) Nr. 1058/77 ( 3 ), kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EEK) Nr. 1858/88 ( 4 ); tā kā Eļļas un tauku pārvaldības komiteja nav iesniegusi atzinumu tās priekšsēdētāja noteiktajā termiņā, IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.







▼M20

1. pants

1. Eļļas, kuru īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 1. un 2. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par neapstrādātām olīveļļām Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 1. punkta a) un b) apakšpunkta nozīmē.

2. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 3. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par spīdīgo olīveļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 1. punkta c) apakšpunkta nozīmē.

3. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 4. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par rafinētu olīveļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 2. punkta nozīmē.

4. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 5. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par olīveļļu, kas sastāv no rafinētām olīveļļām un neapstrādātām olīveļļām Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 3. punkta nozīmē.

5. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 6. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par neapstrādātu olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 4. punkta nozīmē.

6. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 7. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par rafinētu olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 5. punkta nozīmē.

7. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 8. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 6. punkta nozīmē.

▼M26

2. pants

1. Eļļas īpašības, kas paredzētas I pielikumā, nosaka saskaņā ar šādām analīzes metodēm:

a) brīvās taukskābes, ko izsaka oleīnskābes procentos, nosaka ar II pielikumā izklāstīto metodi;

b) peroksīda skaitli nosaka ar III pielikumā izklāstīto metodi;

c) vaska saturu nosaka ar IV pielikumā izklāstīto metodi;

d) sterīnu un triterpēndiolu sastāvu un saturu nosaka ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju saskaņā ar V pielikumā izklāstīto metodi;

e) 2-glicerilmonopalmitāta saturu nosaka ar VII pielikumā izklāstīto metodi;

f) spektrofotometriskajai analīzei izmanto IX pielikumā izklāstīto metodi;

g) taukskābju sastāvu nosaka ar XA un XB pielikumā izklāstīto metodi;

h) gaistošos halogenētos šķīdinātājus nosaka ar XI pielikumā izklāstīto metodi;

i) neapstrādātas olīveļļas organoleptisko īpašību novērtēšanai izmanto XII pielikumā izklāstīto metodi;

j) stigmastadiēnus nosaka ar XVII pielikumā izklāstīto metodi;

k) triglicerīdu sastāva noteikšanai ar ECN42 izmanto XVIII pielikumā izklāstīto metodi;

l) alifātisko spirtu saturu nosaka ar XIX pielikumā izklāstīto metodi;

m) vasku, taukskābju metilesteru un taukskābju etilesteru saturu nosaka ar XX pielikumā izklāstīto metodi.

Lai noteiktu citu augu eļļu klātbūtni olīveļļā, izmanto XXa pielikumā izklāstīto analīzes metodi.

2. Valstu iestāžu vai to pārstāvju pārbaudes attiecībā uz neapstrādātu eļļu organoleptiskajām īpašībām īsteno dalībvalstu apstiprinātas degustētāju žūrijas.

Pirmajā daļā minētās eļļas organoleptiskās īpašības atzīst par atbilstīgām deklarētajai kategorijai, ja dalībvalsts apstiprinātā žūrija apliecina eļļas šķiru.

Ja žūrija deklarēto kategoriju attiecībā uz organoleptiskajām īpašībām neapliecina, pēc ieinteresētās personas pieprasījuma valsts iestādes vai to pārstāvji nekavējoties veic divus kontrolnovērtējumus, ko īsteno citas apstiprinātas žūrijas, un vismaz vienu kontrolnovērtējumu, kuru īsteno attiecīgās ražotājas dalībvalsts apstiprināta žūrija. Attiecīgās īpašības atzīst par atbilstīgām deklarētajām īpašībām, ja vismaz divi kontrolnovērtējumi apstiprina deklarēto šķiru. Ja tas tā nav, ieinteresētā persona sedz kontrolnovērtējumu izmaksas.

3. Kad valstu iestādes vai to pārstāvji pārbauda eļļas īpašības atbilstīgi 1. punktam, paraugus ņem saskaņā ar starptautisko standartu EN ISO 661 par paraugu sagatavošanu analīzēm un EN ISO 5555 par paraugu ņemšanu. Tomēr neatkarīgi no standarta EN ISO 5555 6.8. punkta, ja šādas eļļu partijas ir tiešajā iepakojumā, paraugu ņem saskaņā ar šīs regulas Ia pielikumu. Nefasētas eļļas gadījumā, kad paraugus nevar noņemt saskaņā ar EN ISO 5555, tos ņem saskaņā ar dalībvalsts kompetentās iestādes norādījumiem.

Neskarot standartu EN ISO 5555 un standarta EN ISO 661 6. nodaļu, noņemtos paraugus pēc iespējas ātrāk novieto tumšā vietā, nepieļaujot spēcīgu karstuma avotu iedarbību, un nosūta uz laboratoriju analīzes veikšanai ne vēlāk kā piektajā darbdienā pēc to noņemšanas, pretējā gadījumā paraugus glabā tā, lai nepazeminātos to kvalitāte vai lai tie netiktu sabojāti transportēšanas vai glabāšanas laikā pirms nosūtīšanas uz laboratoriju.

4. Lai veiktu 3. punktā paredzētās pārbaudes, II, III, IX, XII un XX pielikumā minētās analīzes un, attiecīgā gadījumā, visas kontrolanalīzes, kas nepieciešamas saskaņā ar valsts tiesību aktiem, iepakotu produktu gadījumā veic pirms minimālā derīguma termiņa beigām. Ja paraugus ņem no nefasētas eļļas, šīs analīzes veic ne vēlāk kā sestajā mēnesī pēc mēneša, kurā ņemts paraugs.

Citām šajā regulām paredzētajām analīzēm laika ierobežojumu nepiemēro.

Ja analīžu rezultāti neatbilst olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas deklarētās kategorijas īpašībām, attiecīgajai personai paziņo ne vēlāk kā vienu mēnesi pirms pirmajā daļā noteiktā perioda beigām, ja vien paraugs netika ņemts mazāk nekā divus mēnešus pirms minimālā derīguma termiņa.

5. Lai noteiktu olīveļļu īpašības ar 1. punkta pirmajā daļā paredzētajām metodēm, analīžu rezultātus tieši salīdzina ar šajā regulā noteiktajām robežvērtībām.

▼M25

2.a pants

1. Šajā pantā jēdziens “pārdotā olīveļļa” nozīmē to attiecīgās dalībvalsts olīveļļas un olīvu izspaidu eļļas kopējo daudzumu, kas ir patērēts šajā dalībvalstī vai eksportēts no šīs dalībvalsts.

2. Dalībvalstis nodrošina, ka atbilstības pārbaudes notiek izlases veidā, pamatojoties uz riska analīzi, un pietiekami bieži, lai nodrošinātu, ka pārdotā olīveļļa atbilst deklarētajai kategorijai.

3. Kritēriji riska novērtēšanai var būt šādi:

a) eļļas kategorija, ražošanas periods, eļļas cena salīdzinājumā ar citu augu eļļu cenu, jaukšanas un iepakošanas operācijas, glabātavas un glabāšanas apstākļi, izcelsmes valsts, galamērķa valsts, transporta veids vai partijas apjoms;

b) uzņēmumu pozīcija tirgus ķēdē, uzņēmumu tirgotās produkcijas apjoms un/vai vērtība, tirgoto eļļas kategoriju klāsts, veiktā saimnieciskā darbība, piemēram, malšana, glabāšana, rafinēšana, sajaukšana, iepakošana vai mazumtirdzniecība;

c) iepriekšējo pārbaužu rezultāti, tai skaitā atklāto defektu skaits un veids, pārdotās eļļas parastā kvalitāte, izmantotā tehniskā aprīkojuma līmenis;

d) uzņēmumu kvalitātes nodrošinājuma sistēmu vai pašpārbaudes sistēmu uzticamība attiecībā uz atbilstību tirdzniecības standartiem;

e) pārbaudes norises vieta, jo īpaši, ja tā ir pirmā produkcijas ievešanas vieta Savienībā, pēdējā izvešanas vieta no Savienības vai vieta, kur notiek eļļu ražošana, iepakošana, iekraušana vai pārdošana galapatērētājam;

f) visa citu informācija, kas var liecināt par neatbilstības risku.

4. Dalībvalstis jau iepriekš nosaka:

a) kritērijus partiju neatbilstības riska noteikšanai;

b) pamatojoties uz riska analīzi katrai riska kategorijai, minimālo uzņēmumu skaitu vai partiju skaitu un/vai daudzumu, kam veiks atbilstības pārbaudi.

Gadā veic vismaz vienu atbilstības pārbaudi katrām tūkstoš tonnām olīveļļas, ko pārdod dalībvalstī.

5. Dalībvalstis atbilstību pārbauda:

a) jebkādā kārtībā veicot analīzes, kas paredzētas I pielikumā; vai

b) ievērojot kārtību, kas izklāstīta I.b pielikumā par lēmumu pieņemšanas shēmu, līdz pieņem vienu no lēmumiem, kas iekļauts lēmumu pieņemšanas shēmā.

▼M19 —————

▼M25

3. pants

Ja konstatē, ka kāda eļļa neatbilst tās kategorijas aprakstam, attiecīgā dalībvalsts, neskarot jebkādas citas sankcijas, piemēro efektīvas, samērīgas un preventīvas sankcijas, kas nosakāmas atkarībā no atklātā pārkāpuma smaguma.

Ja pārbaudēs konstatē būtiskus pārkāpumus, dalībvalstis palielina pārbaužu biežumu attiecībā uz pārdošanas posmu, eļļas kategoriju, izcelsmi vai citiem kritērijiem.

▼M5

4. pants

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Ja dalībvalstīm rodas grūtības izveidot savā teritorijā degustēšanas žūrijas, tās var pieaicināt degustēšanas žūriju, kas apstiprināta kādā citā dalībvalstī.

3. Katra dalībvalsts izveido degustētāju žūriju sarakstu, ko veido profesionālās vai starpnozaru organizācijas saskaņā ar 1. punktā izklāstītajiem nosacījumiem, un nodrošina šo nosacījumu izpildi.

▼M19 —————

▼B

6. pants

1. Raušu un citu olīveļļas ieguves izspaidu (KN kodi 2306 90 11 un 2306 90 19) eļļas saturu nosaka ar XV pielikumā izklāstīto metodi.

2. Šā panta 1. punktā minēto eļļas saturu izsaka eļļas svara procentos no sausā materiāla svara.

▼M20

7. pants

Piemēro Kopienas noteikumus, kas attiecas uz piemaisījumu klātbūtni.

Attiecībā uz halogenētiem šķīdinātājiem ierobežojumi visām olīveļļu kategorijām ir šādi:

— katra konstatētā halogenētā šķīdinātāja maksimālais saturs: 0,1 mg/kg,

— konstatēto halogenēto šķīdinātāju kopējais maksimālais saturs: 0,2 mg/kg.

▼M25

7.a pants

Fiziskām vai juridiskām personām vai personu grupām, kas jebkādos profesionālos vai komerciālos nolūkos glabā olīveļļu un olīvu izspaidu eļļu ražošanas posmos no eļļas ekstrakcijas spiestuvē līdz tās iepildīšanai pudelēs (ieskaitot), ir jākārto ievešanas un izvešanas reģistrs par katru šādu eļļas kategoriju.

Dalībvalsts nodrošina, ka pirmajā daļā paredzētais pienākums tiek pienācīgi pildīts.

▼M25

8. pants

1. Dalībvalstis paziņo Komisijai par šīs regulas īstenošanas pasākumiem. Tās informē Komisiju par visiem turpmākajiem grozījumiem.

▼B

2. Dalībvalstis katra pusgada sākumā nosūta Komisijai paziņojumu par analītiskajiem datiem, kas attiecas uz iepriekšējā pusgadā izdarītajām analīzēm.

Rezultātus izskata Eļļas un tauku pārvaldības komiteja saskaņā ar Regulas Nr. 136/66/EEK 39. pantā izklāstīto kārtību.

▼M25

3. Šajā Regulā minētos paziņojumus sniedz saskaņā ar Komisijas Regulu (EK) Nr. 792/2009 ( 5 ).

▼B

9. pants

Ar šo ir atcelta Regula (EEK) Nr. 1058/77.

10. pants

1. Šī regula stājas spēkā trešajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Kopienu Oficiālajā Vēstnesī.

Tomēr XII pielikumā izklāstīto metodi piemēro ►M1 no 1992. gada 1. novembra ◄ , ja vien darbības neattiecas uz intervences sistēmu.

▼M5

Metode neattiecas uz neapstrādātu olīveļļu, kas sagatavota tirgum pirms 1992. gada 1. novembra.

▼B

2. Šo regulu nepiemēro olīveļļai un olīvu izspaidu eļļai, kas ir iepakota pirms šīs regulas stāšanās spēkā un laista tirgū līdz 1992. gada 31. oktobrim.

Šī regula ir saistoša kopumā un tieši piemērojama visās dalībvalstīs.









PIELIKUMI

Kopsavilkums







I pielikums Olīveļļas īpašības Ia pielikums Paraugu ņemšana no olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas, kas piegādāta tiešā iepakojumā Ib pielikums Lēmumu pieņemšanas shēma, lai pārbaudītu to, vai olīveļļas paraugs atbilst deklarētajai kategorijai II pielikums ►M21 Brīvo taukskābju noteikšana pēc aukstās metodes ◄ III pielikums Peroksīda skaitļa noteikšana IV pielikums ►M6 Vasku satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzes - šķidruma hromatogrāfiju ◄ V pielikums Sterīnu un triterpēndiolu sastāva un satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju VII pielikums ►M21 2-glicerilmonopalmitāta satura noteikšana ◄ ▼M20 ————— ▼B ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B ▼M23 XX pielikums: Vasku, taukskābju metilesteru un taukskābju etilesteru satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfijas metodi ▼M26 XXa pielikums: Metode citu eļļu noteikšanai olīveļļās ▼M25 XXI pielikums: Saskaņā ar 8. panta 2. punktu veikto olīveļļas atbilstības pārbaužu rezultāti

▼M26









I PIELIKUMS

OLĪVEĻĻAS ĪPAŠĪBAS







Kategorija Taukskābju etilesteri (FAEE) mg/kg (*) Skābums (%) (*) Peroksīda skaitlis mEq O2/kg (*) Vaski mg/kg (**) 2-glicerilmonopalmitāts (%) Stigmastadiēni mg/kg (1) Starpība: ECN42 (HPLC) un ECN42 (2) (teorētiskais aprēķins) K232 (*) K268 vai K270 (*) Delta-K (*) Organoleptiskais novērtējums Defekta mediāna (Md) (*) Organoleptiskais novērtējums Augļainuma mediāna (Mf) (*) 1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa FAEE ≤ 40 (2013.–2014. ražas gads) (3) FAEE ≤ 35 (2014.–2015. ražas gads) FAEE ≤ 30 (pēc 2015. ražas gada) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 C44 C46150 ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 2. Neapstrādāta olīveļļa — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 C44 C46150 ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 3. Spīdīgā olīveļļa — > 2,0 — C40 C42 C44 C46300 (4) ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (5) — ≤ 1,1 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 4. Rafinēta olīveļļa — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 C42 C44 C46350 ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 5. Rafinētas un neapstrādātas olīveļļas maisījums — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 C42 C44 C46350 ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 6. Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa — — — C40 C42 C44 C46350 (6) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 C42 C44 C46350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olīvu izspaidu eļļa — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 C42 C44 C46350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Kapilārajā kolonnā atdalāmo (vai neatdalāmo) izomēru summa. (2) Olīveļļai ir jāatbilst XXa pielikumā izklāstītajai metodei. (3) Šis limits attiecas uz olīveļļām, kas ražotas, sākot no 2014. gada 1. marta. (4) Eļļas ar vaska saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par spīdīgo olīveļļu, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir mazāks par vai vienāds ar 350 mg/kg vai ja eritrodiola un uvaola saturs ir mazāks par vai vienāds ar 3,5 %. (5) Vai ja defekta mediāna ir lielāka par 3,5, vai arī defekta mediāna ir mazāka par vai vienāda ar 3,5 un augļainuma mediāna ir 0. (6) Eļļas ar vaska saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par neattīrītu olīvu izspaidu eļļu, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir lielāks par 350 mg/kg un ja eritrodiola un uvaola saturs ir lielāks par 3,5 %.







Kategorija Taukskābju sastāvs (1) Kopā transoleīnskābes izomēri (%) Kopā translinolskābes un translinolēnskābes izomēri (%) Sterīnu sastāvs Kopā sterīni (mg/kg) Eritrodiols un uvaols (%) (**) Miristīnskābe (%) Linolēnskābe (%) Arahīnskābe (%) Eikozānskābe (%) Behenskābe (%) Lignocerīnskābe (%) Holesterīns (%) Brasikasterīns (%) Kampesterīns (2) (%) Stigmasterīns (%) Nosac. betasitosterīns (%) (3) Delta-7- stigmastenols (2) (%) 1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Neapstrādāta olīveļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Spīdīgā olīveļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Rafinēta olīveļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Rafinētas un neapstrādātas olīveļļas maisījums ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Pārējo tauksābju saturs (%) – palmitīnskābe: 7,50–20,00; palmitoleīnskābe: 0,30–3,50; heptadekanoinskābe: ≤ 0,30; heptadecēnskābe: ≤ 0,30; stearīnskābe: 0,50–5,00; oleīnskābe: 55,00–83,00; linolskābe: 3,50–21,00. (2) Skatīt šā pielikuma papildinājumu. (3) Nosacītais betasitosterīns: Delta-5,23-stigmastadienols+klerosterīns+betasitosterīns+sitostanols+delta-5-avenasterīns+delta-5,24-stigmastadienols. (4) Eļļas ar vaska saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par spīdīgo olīveļļu, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir mazāks par vai vienāds ar 350 mg/kg vai ja eritrodiola un uvaola saturs ir mazāks par vai vienāds ar 3,5 %. (5) Eļļas ar vaska saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par neattīrītu olīvu izspaidu eļļu, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir lielāks par 350 mg/kg un ja eritrodiola un uvaola saturs ir lielāks par 3,5 %

Piezīmes.

a) Analīžu rezultāti jāuzrāda ar tādu pašu decimālzīmju skaitu aiz komata kā attiecīgās īpašības skaitliskā vērtība. Pēdējais cipars jānoapaļo uz augšu, ja nākamais cipars, kas jāatmet, ir lielāks par 4.

b) Ja kaut viena īpašība neatbilst tai norādītajai vērtībai, šīs regulas piemērošanas vajadzībām var mainīt eļļas kategoriju vai deklarēt to par neattīrītu.

c) Ja īpašība ir atzīmēta ar zvaigznīti (*), tad attiecībā uz eļļas kvalitāti tas nozīmē šo: spīdīgajai olīveļļai ir iespējams, ka abas attiecīgās robežvērtības vienlaikus atšķiras no noteiktajām; neapstrādātajām olīveļļām, ja vismaz viena no šīm robežvērtībām atšķiras no noteiktajām vērtībām, tiks mainīta eļļas kategorija, lai gan tā joprojām jāklasificē vienā no neapstrādātas olīveļļas kategorijām.

d) Ja īpašība ir atzīmēta ar divām zvaigznītēm (**), attiecībā uz eļļas kvalitāti tas nozīmē, ka visu veidu olīvu izspaidu eļļām ir iespējams, ka abas attiecīgās robežvērtības vienlaikus atšķiras no noteiktajām.









Papildinājums

Lēmumu pieņemšanas shēma

Kampesterīna lēmumu pieņemšanas shēma attiecībā uz neapstrādātu olīveļļu un neapstrādātu augstākā labuma olīveļļu.

Pārējie parametri atbilst šajā regulā noteiktajām robežvērtībām.

Delta-7-stigmastenola lēmumu pieņemšanas shēma attiecībā uz:

— neapstrādātu augstākā labuma olīveļļu un neapstrādātu olīveļļu. —

Pārējie parametri atbilst šajā regulā noteiktajām robežvērtībām;

— olīvu izspaidu eļļu (neattīrītu un rafinētu) —









Ia PIELIKUMS

PARAUGU ŅEMŠANA NO OLĪVEĻĻAS VAI OLĪVU IZSPAIDU EĻĻAS, KAS PIEGĀDĀTA TIEŠĀ IEPAKOJUMĀ

Šo paraugu ņemšanas metodi piemēro olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas partijām, kas iesaiņotas tiešā iepakojumā. Atkarībā no tā, vai tiešā iepakojuma tilpums pārsniedz vai nepārsniedz 5 litrus, piemēro atšķirīgas paraugu ņemšanas metodes.

“Partija” ir tādu pārdošanas vienību kopums, kas ražotas, izgatavotas un iepakotas tādos apstākļos, ka eļļu, kuru satur katra pārdošanas vienība, attiecībā uz visām analītiskajām īpašībām uzskata par viendabīgu. Partijas individualizēšana ir jāveic saskaņa ar Eiropas Parlamenta un Padomes Direktīvu 2011/91/ES ( 6 ).

“Parauga vienība” ir eļļas daudzums, ko satur tiešais iepakojums un kas paņemts no nejauši izvēlētas partijas vietas.

1. PRIMĀRO PARAUGU SATURS

1.1. Tiešais iepakojums, kura tilpums nepārsniedz 5 litrus

“Primārais paraugs” no tiešā iepakojuma, kura tilpums nepārsniedz 5 litrus, ir parauga vienības, kas paņemtas no partijas atbilstīgi 1. tabulai.







1. tabula Primārā parauga minimālajam lielumam jāatbilst turpmāk norādītajam Ja tiešā iepakojuma tilpums ir Primārajā paraugā jābūt eļļai no a) 1 litrs vai vairāk a) 1 tiešā iepakojuma b) mazāk par 1 litru b) minimālā skaita iepakojumu ar kopējo tilpumu vismaz 1,0 litrs

Katra dalībvalsts atkarībā no savām vajadzībām (piemēram, organoleptiskajam novērtējumam citā laboratorijā, nevis tajā, kas veica ķīmisko analīzi, kontrolanalīzi utt.) var palielināt 1. tabulā minēto iepakojumu skaitu, kurš veido primāro paraugu.

1.2. Tiešais iepakojums, kura tilpums pārsniedz 5 litrus

“Primārais paraugs” no tiešā iepakojuma, kura tilpums pārsniedz 5 litrus, ir visu parauga vienību reprezentatīva daļa, kas iegūta samazināšanas procesā atbilstīgi 2. tabulai. Primārajā paraugā ir jābūt vairākiem piemēriem.

Primārā parauga “piemērs” ir ikviens iepakojums, kas ietilpst primārajā paraugā.







2. tabula Atlasāmo parauga vienību minimālais skaits Iepakojumu skaits sērijā Atlasāmo parauga vienību minimālais skaits Līdz 10 1 No … 11 līdz 150 2 No … 151 līdz 500 3 No … 501 līdz 1 500 4 No … 1 501 līdz 2 500 5 > 2 500; uz 1 000 iepakojumiem vēl 1 parauga vienība

Lai samazinātu tiešo iepakojumu parauga tilpumu, parauga vienību saturu homogenizē, lai sagatavotu primāro paraugu. Dažādu parauga vienību porcijas, pēc iespējas labāk aizsargājot no gaisa ietekmes, ielej kopīgā tvertnē, kurā tās maisot homogenizē.

Primārā parauga saturs ir jāielej vairākos iepakojumos ar minimālo tilpumu 1,0 litrs, un katrs no tiem ir primārā parauga piemērs.

Katra dalībvalsts atkarībā no savām vajadzībām (piemēram, organoleptiskajam novērtējumam citā laboratorijā, nevis tajā, kas veica ķīmisko analīzi, kontrolanalīzi utt.) var palielināt primāro paraugu skaitu.

Visi iepakojumi ir jāpiepilda tā, lai pēc iespējas samazinātu gaisa virsslāni, un atbilstīgi jānoslēdz un jāaizplombē, lai nodrošinātu produkta aizsardzību pret iejaukšanos.

Šie piemēri ir jāmērķē, lai nodrošinātu pareizu identificēšanu.

2. ANALĪZES UN REZULTĀTI

2.1. Katrs primārais paraugs ir jāsadala laboratorijas paraugos saskaņā ar standarta EN ISO 5555 2.5. punktu un jāanalizē Ib pielikumā izklāstītajā lēmumu pieņemšanas shēmā norādītajā kārtībā vai jebkurā citā izlases veida kārtībā.

2.2. Ja visi analīžu rezultāti atbilst eļļas deklarētās kategorijas īpašībām, visu partiju atzīst par atbilstīgu. Ja kaut viens analīžu rezultāts neatbilst eļļas deklarētās kategorijas īpašībām, visu partiju atzīst par neatbilstīgu.

3. PARTIJAS KATEGORIJAS PĀRBAUDE

3.1. Lai pārbaudītu partijas kategoriju, kompetentā iestāde saskaņā ar turpmāk norādīto tabulu var palielināt primāro paraugu skaitu, ko ņem no dažādām partijas vietām.



3. tabula Primāro paraugu skaits atkarībā no partijas lieluma Partijas lielums (litri) Primāro paraugu skaits Mazāk par 7 500 2 No 7 500 līdz mazāk par 25 000 3 No 25 000 līdz mazāk par 75 000 4 No 75 000 līdz mazāk par 125 000 5 125 000 un vairāk 6 + 1 par katriem nākamajiem 50 000 litriem Katra primārā parauga vienība ir jāņem no turpmākas vietas partijā; ir jāievēro katra primārā parauga vieta, un tā ir skaidri jāidentificē. Visi primārie paraugi ir jāsagatavo saskaņā ar 1.1. un 1.2. punktā minētajām procedūrām. Pēc tam katram primārajam paraugam veic 2. panta 1. punktā minētās analīzes.

3.2. Ja viens no 2. panta 1. punktā minēto analīžu rezultātiem attiecībā uz vismaz vienu primāro paraugu neatbilst eļļas deklarētās kategorijas īpašībām, visu partiju atzīst par neatbilstīgu.









Ib PIELIKUMS

LĒMUMU PIEŅEMŠANAS SHĒMA, LAI PĀRBAUDĪTU TO, VAI OLĪVEĻĻAS PARAUGS ATBILST DEKLARĒTAJAI KATEGORIJAI

1. tabula

2. tabula

3. tabula









1. papildinājums







Šīs regulas pielikumu un lēmumu pieņemšanas shēmā norādīto analīžu atbilstības tabula — Skābums II pielikums Brīvo taukskābju noteikšana pēc aukstās metodes — Peroksīda skaitlis III pielikums Peroksīda skaitļa noteikšana — UV spektrometrija IX pielikums Spektrofotometriskā analīze — Organoleptiskais novērtējums XII pielikums Neapstrādātas olīveļļas organoleptiskā novērtēšana — Etilesteri XX pielikums Vasku, taukskābju metilesteru un taukskābju etilesteru satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfijas metodi — 3,5-stigmastadiēni XVII pielikums Stigmastadiēnu noteikšanas metode augu eļļās — Trans-izomēri taukskābēs XA pielikums un Taukskābju metilesteru analīze ar gāzu hromatogrāfiju XB pielikums Taukskābju metilesteru pagatavošana — Taukskābju saturs XA pielikums un Taukskābju metilesteru analīze ar gāzu hromatogrāfiju XB pielikums Taukskābju metilesteru pagatavošana — ΔECN42 XVIII pielikums Triglicerīdu sastāva noteikšana ar ECN42 (starpība starp HPLC datiem un teorētisko saturu) — Sterīnu sastāvs un kopējais saturs — Eritrodiols un uvaols V pielikums Sterīnu un triterpēndiolu sastāva un satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju — Vaski IV pielikums Vasku satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju — Alifātiskie spirti XIX pielikums Alifātisko spirtu satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju — Piesātinātās taukskābes 2. pozīcijā VII pielikums 2-glicerilmonopalmitāta satura noteikšana

▼B









II PIELIKUMS

▼M21

BRĪVO TAUKSKĀBJU NOTEIKŠANA PĒC AUKSTĀS METODES

▼B

1. SKĀBUMA NOTEIKŠANA

Brīvu taukskābju noteikšana olīveļļās. Brīvu taukskābju saturu izsaka kā skābumu, ko aprēķina parastā veidā.

1.1. Princips

Paraugu izšķīdina šķīdinātāju maisījumā un klātesošās brīvās skābes titrē ar kālija hidroksīda šķīdumu etanolā.

1.2. Reaktīvi

Visiem reaktīviem ir jābūt atzītas analītiskas kvalitātes un izmantojamam ūdenim jābūt divreiz destilētam vai līdzvērtīgas tīrības.

1.2.1. Dietilētera/etanola (95 tilp. %) maisījums vienādās tilpuma daļās. Piezīme: dietilēteris ir viegli uzliesmojošs un var veidot sprādzienbīstamus peroksīdus. To lietojot, ir jābūt īpaši piesardzīgiem. Dietilētera/etanola maisījumu tieši pirms lietošanas neitralizē ar kālija hidroksīda šķīdumu (1.2.2. punkts), pievienojot uz 100 ml maisījuma 0,3 ml fenolftaleīna šķīduma (1.2.3. punkts). Piezīme: ja nav iespējams lietot dietilēteri, var lietot šķīdinātāju maisījumu, kas sastāv no etanola un toluola. Vajadzības gadījumā etanolu var aizstāt ar 2-propanolu.

1.2.2. Kālija hidroksīds, KOH, titrēts etanola šķīdums, kura koncentrācija aptuveni 0,1 M/l vai vajadzības gadījumā 0,5 M/l. Ir jābūt zināmai kālija hidroksīda šķīduma etanolā precīzai koncentrācijai, un tā ir jāpārbauda tieši pirms lietošanas. Lieto šķīdumu, kas ir pagatavots vismaz piecas dienas pirms lietošanas un dekantēts brūna stikla pudelē ar gumijas aizbāzni. Šķīdumam jābūt bezkrāsainam vai iedzeltenam. Piezīme: stabilu bezkrāsainu kālija hidroksīda šķīdumu var pagatavot šādi. Uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai 1 000 ml etanola ar 8 g kālija hidroksīda un 0,5 g alumīnija skaidiņu un vienu stundu vāra ar atteces dzesinātāju. Tūlīt pārdestilē. Destilātā izšķīdina vajadzīgo kālija hidroksīda daudzumu. Atstāj uz dažām dienām un dzidro supernatantu dekantē no kālija karbonāta nogulsnēm. Šķīdumu var pagatavot arī bez destilācijas šādi: 1 000 ml etanola pievieno 4 ml alumīnija butilāta un maisījumu atstāj uz dažām dienām. Dekantē supernantantu un izšķīdina vajadzīgo daudzumu kālija hidroksīda. Šķīdums ir gatavs lietošanai.

1.2.3. Fenolftaleīna 10 g/l šķīdums 95 līdz 96 tilp. % etanolā vai sārmainā zilā 20 g/l šķīdums 95 līdz 96 tilp. % etanolā (stipri krāsotu tauku gadījumā).

1.3. Aparatūra

Parastais laboratoriju aprīkojums, tai skaitā:

1.3.1. Analītiskie svari;

1.3.2. 250 ml koniskā kolba;

1.3.3. 10 ml birete, graduēta pa 0,05 ml.

1.4. Procedūra

1.4.1. Parauga sagatavošana analīzei (Analīzi izdara ar filtrētu paraugu. Ja mitruma un piemaisījumu kopā ir mazāk par 1 %, paraugu lieto bez turpmākas apstrādes; ja to ir vairāk par 1 %, paraugs ir jāfiltrē.)

1.4.2. Parauga ņemšana Paraugu ņem atkarībā no paredzamā brīvo skābju satura saskaņā ar šādu tabulu:



Paredzamais skābju saturs Parauga masa (g) Svēršanas precizitāte (g) < 1 20 0,05 1 līdz 4 10 0,02 4 līdz 15 2,5 0,01 15 līdz 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Paraugu nosver koniskajā kolbā (1.3.2. punkts).

1.4.3. Noteikšana Paraugu (1.4.2. punkts) izšķīdina 50 līdz 150 ml iepriekš neitralizētā dietilētera un etanola maisījumā (1.2.1. punkts). Maisot titrē ar 0,1 M/l kālija hidroksīda šķīdumu (1.2.2. punkts) (sk. 2. piezīmi), līdz indikatora krāsa mainās (fenolftaleīna sārtā krāsa saglabājas vismaz 10 sekundes). 1. piezīme: titrēto kālija hidroksīda šķīdumu etanolā (1.2.2. punkts) var aizstāt ar kālija vai nātrija hidroksīda ūdens šķīdumu, ar noteikumu, ka ievadītā ūdens daudzums neizraisa fāzu atdalīšanos. 2. piezīme:ja vajadzīgais 0,1 M/l kālija hidroksīda daudzums ir lielāks par 10 ml, lieto 0,5 M/l šķīdumu. 3. piezīme: ja šķīdums titrēšanas laikā kļūst duļķains, pievieno pietiekami daudz šķīdinātāju (1.2.1. punkts), lai šķīdums kļūtu dzidrs.

1.5. Skābju saturs: izteikts oleīnskābes procentos

Skābju saturs svara procentos ir vienāds ar:

kur:

V = izlietotā titrētā kālija hidroksīda tilpums mililitros;

C = lietotā titrētā kālija hidroksīda precīzā koncentrācija M/l;

M = molmasa gramos skābei, ko izmanto rezultāta izteikšanai (= 282);

m = parauga masa gramos.

Rezultāts ►M6 divu aprēķinu ◄ aritmētiskais vidējais.









III PIELIKUMS

PEROKSĪDA SKAITĻA NOTEIKŠANA

1. DARBĪBASJOMA

Šis standarts apraksta eļļu un tauku peroksīda skaitļa noteikšanas metodi.

2. IZMANTOŠANASJOMA

Šis standarts ir piemērojams dzīvnieku un augu eļļām un taukiem.

3. DEFINĪCIJA

Peroksīda skaitlis ir to vielu daudzums paraugā, izteikts aktīvā skābekļa miliekvivalentos kilogramā, kuras oksidē kālija jodīdu aprakstītajos eksperimenta apstākļos.

4. PRINCIPS

Analīzes parauga apstrāde ar kālija jodīda šķīdumu etiķskābes un hloroforma šķīdumā. Atbrīvotā joda titrēšana ar standartizētu nātrija tiosulfāta šķīdumu.

5. APARATŪRA

Visam aprīkojumam jābūt brīvam no reducējošām vai oksidējošām vielām.

Piezīme: slīpētās virsmas nav jāeļļo.

5.1. 3 ml stikla svēršanas laiviņa.

5.2. Aptuveni 250 ml kolbas ar pieslīpētiem kakliem un aizbāžņiem, iepriekš izžāvētas un piepildītas ar sausu inertu gāzi (slāpekli vai, labāk, oglekļa dioksīdu).

5.3. 25 vai 50 ml birete, graduēta ik pa 0,1 ml.

6. REAKTĪVI

6.1. Hloroforms, kam ir analītiska reaktīva kvalitāte, atbrīvots no skābekļa, burbuļojot tam cauri tīras inertas gāzes straumīti.

6.2. Ledus etiķskābe, kam ir analītiska reaktīva kvalitāte, atbrīvota no skābekļa, burbuļojot tai cauri tīras, sausas inertas gāzes straumīti.

6.3. Kālija jodīda piesātināts ūdens šķīdums, nesen pagatavots, kas nesatur jodu un jodātus.

6.4. Nātrija tiosulfāta precīzi standartizēts 0,01 vai 0,002 N ūdens šķīdums, standartizēts tieši pirms lietošanas.

6.5. Cietes šķīdums, 10 g/l ūdens dispersija, nesen pagatavota no dabiskās šķīstošās cietes.

7. PARAUGS

Pievērš vērību, lai paraugu paņemtu un glabātu tumsā, turētu aukstumā un pilnīgi piepildītos stikla traukos, kas ir hermētiski noslēgti ar pieslīpētiem stikla vai korķa aizbāžņiem.

8. PROCEDŪRA

Analīzi izdara izkliedētā dienasgaismā vai mākslīgā apgaismojumā. Analizējamo paraugu ar precizitāti līdz tuvākajam 0,001 g nosver svēršanas laiviņā (5.1. punkts) vai, ja tādas nav, kolbā (5.2. punkts) saskaņā ar šādu tabulu atbilstīgi sagaidāmajam peroksīda skaitlim:







Sagaidāmais peroksīda skaitlis (mekv.) Analizējamā parauga masa (g) 0 līdz 12 5,0 līdz 2,0 12 līdz 20 2,0 līdz 1,2 20 līdz 30 1,2 līdz 0,8 30 līdz 50 0,8 līdz 0,5 50 līdz 90 0,5 līdz 0,3

Atver kolbu (5.2. punkts) un tajā ieliek stikla svēršanas laiviņu ar analīzes paraugu. Pievieno 10 ml hloroforma (6.1. punkts). Ātri maisot, analīzes paraugu izšķīdina. Pievieno 15 ml etiķskābes (6.2. punkts), pēc tam pievieno 1 ml kālija jodīda šķīduma (6.3. punkts). Nekavējoties aizkorķē, vienu minūti krata un atstāj tieši piecas minūtes tumšā vietā 15 līdz 25 °C temperatūrā.

Pievieno aptuveni 75 ml destilēta ūdens. Enerģiski kratot, izdalījušos jodu titrē ar nātrija tiosulfāta šķīdumu (6.4. punkts) (0,002 N šķīduma, ja sagaidāmie lielumi ir mazāki par 12, un 0,01 N šķīduma, ja sagaidāmie lielumi ir lielāki par 12), izmantojot par indikatoru cietes šķīdumu (6.5. punkts).

Vienam analizējamam paraugam izdara divas noteikšanas.

Vienlaikus izdara tukšo mēģinājumu. Ja tukšā mēģinājuma rezultāts pārsniedz 0,05 ml 0,01 N nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts), tad nomaina netīros reaktīvus.

9. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Peroksīda skaitli (PV), izteiktu aktīvā skābekļa miliekvivalentos kilogramā, aprēķina pēc formulas:

kur:

V = standartizēta nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts) ml skaits, kas izlietoti analīzē, kas ir koriģēts, lai ņemtu vērā tukšo mēģinājumu;

T = lietotā nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts) precīzā normalitāte;

m = analīzes parauga masa gramos.

Rezultāts ir divu izdarīto noteikšanu aritmētiskais vidējais.

▼M21









IV PIELIKUMS

VASKU SATURA NOTEIKŠANA AR KAPILĀRĀS KOLONNAS GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. IZMANTOŠANAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta vasku satura noteikšana olīveļļās. Vaskus sadala pēc oglekļa atomu skaita molekulā. Šo metodi var jo īpaši izmantot, lai atšķirtu ar spiešanas paņēmienu iegūtu olīveļļu no olīvu izspaidu eļļas, ko iegūst pēc ekstrakcijas paņēmiena.

2. PRINCIPS

Taukiem vai eļļai pievieno piemērotu iekšējo standartu, pēc tam hromatogrāfiski sadala hidrēta silikagela kolonnā. Testēšanas apstākļos iegūst frakciju, kas eluējas vispirms (kas satur savienojumus, kuru polaritāte ir mazāka nekā triglicerīdiem), un to tieši analizē ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA

3.1. 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba

3.2. Stikla kolonna gāzes hromatogrāfijai, iekšējais diametrs 15,0 mm, augstums 30 līdz 40 cm, ar krānu

3.3. Piemērots gāzes hromatogrāfs ar kapilāro kolonnu, kas aprīkots ar tiešās ievadīšanas sistēmu kolonnā, kas sastāv no šādiem mezgliem: 3.3.1. Termostata kamera kolonnām (kolonnu krāsns) ar programmējamu temperatūru 3.3.2. Aukstās inžekcijas iekārta tiešai ievadīšanai kolonnā 3.3.3. Liesmas jonizācijas detektors un pārveidotājs/pastiprinātājs 3.3.4. Reģistrējošā iekārta/integrators ar maināmu papīra ātrumu darbam ar pārveidotāju/pastiprinātāju (3.3.3.), kuras atbildes reakcijas laiks ir ne lielāks par 1 s. (Var izmantot arī datorizētas sistēmas, kas nodrošina gāzes hromatogrāfijas datu iegūšanu, izmantojot personālo datoru.) 3.3.5. Stikla vai kvarca stikla kapilārā kolonna ar iekšējo diametru 0,25 līdz 0,32 mm, kas ir 8 līdz 12 m gara, ar vienādu no 0,10 līdz 0,30 μm šķidrās fāzes slāni. (Šim nolūkam piemērotas gatavas nopērkamās SE-52 un SE-54 tipa šķidrās fāzes.)

3.4. 10 μl tilpuma mikrošļirce ar rūdītu adatu inžekcijai uz kolonnas

3.5. Elektrovibrators

3.6. Rotācijas ietvaicētājs

3.7. Mufeļkrāsns

3.8. Analītiskie svari ar svēršanas precizitāti + 0,1 mg

3.9. Laboratorijas trauki

4. REAKTĪVI

4.1. Silikagels ar daļiņu izmēru no 60 līdz 200 μm Silikagelu uz vismaz 4 h ievieto mufeļkrāsnī 500 °C temperatūrā. Atdzesē un pievieno 2 % ūdens no ņemtā silikagela daudzuma. Lai maisījumu homogenizētu, to rūpīgi sakrata. Pirms lietošanas vismaz 12 h glabā tumšā vietā

4.2. n-heksāns, hromatogrāfijai

4.3. Etilēteris, hromatogrāfijai

4.4. n-heptāns, hromatogrāfijai

4.5. Laurilarahidāta standarta 0,1 % (m/v) šķīdums heksānā (iekšējais standarts). (Var izmantot arī palmitilpalmitātu vai miristilstearātu.) 4.5.1. Sudāns 1 (1-fenil-azo-2-naftols)

4.6. Nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, gāzes hromatogrāfijai

4.7. Palīggāzes: — tīrs ūdeņradis gāzes hromatogrāfijai, — tīrs gaiss gāzes hromatogrāfijai.

5. PROCEDŪRA

5.1. Hromatogrāfijas kolonnas sagatavošana

Suspendē 15 g silikagela (4.1.) n-heksānā (4.2.) un pārnes kolonnā (3.2.). Nostādina. Sablīvē, izmantojot elektrovibratoru (3.5.), lai hromatogrāfijas slānis būtu homogenāks. Perkolē 30 ml n-heksāna attīrīšanai no piemaisījumiem. Ar svariem (3.8.) iesver precīzi 500 mg parauga 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.), un atbilstoši sagaidāmajam vasku saturam pievieno vajadzīgo daudzumu iekšējā standarta (4.5.). Piemēram, pievieno 0,1 mg laurilarahidāta, analizējot olīveļļu, vai 0,25 līdz 0,5 mg, analizējot olīvu izspaidu eļļu. Sagatavoto paraugu pārnes hromatogrāfijas kolonnā, izmantojot divas 2 ml porcijas n-heksāna (4.2.).

Šķīdinātājam ļauj izplūst no kolonnas, līdz tā līmenis pazeminās līdz apmēram 1 mm virs absorbenta, un tad, lai attīrītu no dabīgi saturošajiem n-alkāniem, perkolē vēl 70 ml n-heksāna. Tad sāk eluēšanu hromatogrāfijai, savācot 180 ml n-heksāna/etilētera maisījuma (attiecībā 99:1) ar ātrumu apmēram 15 pilieni desmit sekunžu laikā. Parauga eluēšana jāveic istabas temperatūrā 22 ± 4 °C temperatūrā.

NB!

— n-heksāna/etilētera maisījums (99:1) jāsagatavo tajā pašā dienā.

— Vasku pareizas eluēšanas vizuālai kontrolei maisījumam var pievienot 100 μl Sudānas 1 krāsvielas 1 % šķīdumu tajā. Tā kā krāsvielas aiztures laiks ir lielāks nekā vaskiem un mazāks nekā triglicerīdiem, eluēšana jāpārtrauc tūlīt pēc tam, kad krāsojums sasniedzis kolonnas apakšējo daļu, jo tas liecina, ka visi vaski jau ir eluēti no kolonnas.

Šādi iegūto parauga frakciju ietvaicē rotācijas ietvaicētājā (3.6.) gandrīz sausu. Pēdējos apmēram 2 ml šķīdinātāja iztvaicē ar vāju slāpekļa plūsmu; pievieno 2–4 ml n-heptāna.

5.2. Gāzes hromatogrāfijas analīze

5.2.1. Sagatavošana

Kolonnu uzstāda gāzes hromatogrāfam (3.3.), pievienojot ieeju kolonnā virskolonnas sistēmai, bet kolonnas izeju detektoram. Veic gāzes hromatogrāfijas aparatūras vispārēju pārbaudi (gāzes kontūru, detektora un reģistrācijas ierīces darbību, u. c.).

Ja kolonnu izmanto pirmo reizi, tā vispirms jākondicionē. Nedaudz nesējgāzes izlaiž caur kolonnu, un tad ieslēdz gāzes hromatogrāfu. Pakāpeniski iesilda tā, lai apmēram četru stundu laikā sasniegtu 350 °C temperatūru. Šādu temperatūru uztur vismaz divas stundas, un pēc tam iekārtai noregulē vajadzīgos darba apstākļus (iestata gāzes plūsmu, aizdedz liesmu, pievieno elektroniskajai reģistrācijas iekārtai (3.3.4.), iestata kolonnas krāsns temperatūru, detektoru, u. c.), reģistrē signālu ar jutību, kas ir vismaz divas reizes augstāka par analīzei nepieciešamo jutību. Nulles līnijai jābūt taisnai, bez jebkādiem izsitieniem, un tā nedrīkst novirzīties.

Negatīvas taisnvirziena novirzes liecina par neblīvumiem kolonnas savienojumu vietās; savukārt pozitīvas novirzes liecina, ka kolonna ir nepietiekami kondicionēta.

5.2.2. Darba apstākļu izvēle

Parasti izmanto šādus apstākļus:

— kolonnas temperatūra – —



20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min sākumā 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektora temperatūra – 350 °C;

— ievadītās vielas daudzums: 1 μl no n-heptāna šķīduma (2–4 ml);

— nesējgāze: hēlijs vai ūdeņradis ar attiecīgajai gāzei pareizu lineāro ātrumu (sk. papildinājumā);

— instrumenta jutība: atbilst turpmāk aprakstītajiem nosacījumiem.

Apstākļus var izmainīt atbilstoši kolonnas un hromatogrāfa raksturlielumiem tā, lai tiktu izdalīti visi vaski un panākta pietiekama signālu izšķirtspēja (sk. attēlu); C32 iekšējā standarta aiztures laikam ir jābūt 18 ± 3 min. Visvairāk reprezentatīvā vaska signālam jābūt vismaz 60 % no pilnas skalas.

Signālu integrēšanas parametri jānosaka tā, lai tiktu iegūts attiecīgo signālu laukumu pareizs novērtējums.

NB!Ņemot vērā, ka beigu temperatūra ir augsta, pieļaujama līdz 10 % novirze no pilnas skalas vērtības.

5.3. Analīzes veikšana

Ar 10 μl tilpuma mikrošļirci ņem 1 μl šķīduma paraugu; atvelk šļirces virzuli tā, lai iztukšotu adatu. Adatu ievieto inžektorā un pēc 1–2 sekundēm ātri ievada; pēc apmēram piecām sekundēm adatu lēnām izvelk.

Veic reģistrāciju, līdz visi vaski ir pilnībā eluēti.

Nulles līnijai noteikti jāatbilst nepieciešamajiem nosacījumiem.

5.4. Signālu identifikācija

Signālus identificē pēc aiztures laikiem, tos salīdzinot ar tādos pašos apstākļos analizētiem tādu vasku maisījumiem, kuru aiztures laiki ir zināmi.

Attēlā redzama neapstrādātas augstākā labuma olīveļļas vasku hromatogramma.

5.5. Daudzuma noteikšana

Izmantojot integratoru, nosaka iekšējā standarta un alifātisko esteru C40 līdz C46 signālu laukumu.

Aprēķina katra vaska estera saturu mg/kg eļļas pēc šādas formulas:

kur

Ax = katra estera signāla laukums, kvadrātmilimetros;

As = iekšējā standarta signāla laukums, kvadrātmilimetros;

ms = pievienotā iekšējā standarta masa, miligramos;

m = analīzei ņemtā parauga masa, gramos.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Norāda dažādu C40 līdz C46 vasku kopīgo saturu mg/kg eļļas (ppm).

NB!Kvantitatīvi nosakāmie komponenti saistāmi ar C40 līdz un C46 esteru signāliem, izmantojot par paraugu olīveļļas vasku hromatogrammu turpmāk redzamajā attēlā. Ja esteris C46 parādās divas reizes, tad, lai to identificētu, ieteicams analizēt olīvu izspaidu eļļas vasku frakciju, kur C46 signāls ir viegli identificējams tāpēc, ka tas ir izteiktā pārākumā.

Rezultātus uzdod ar precizitāti līdz vienam ciparam aiz komata.

Attēls.

Olīveļļas vasku hromatogramma ( 7 )

Paskaidrojumi:

I.S. = laurilarahidāts;

1. = diterpēnesteri;

2 + 2′ = C40 esteri

3 + 3′ = C42 esteri

4 + 4′ = C44 esteri;

5. = C46 esteri

6. = sterīna esteri un triterpēnspirts.









Papildinājums

Gāzes lineārā ātruma noteikšana

Pēc noregulēšanas darba normāliem darba apstākļiem gāzes hromatogrāfā ievada 1–3 μl metāna (vai propāna). Uzņem laiku, kādā gāze iziet cauri kolonnai no ievadīšanas mirkļa līdz tā signāla parādīšanās brīdim (tM).

Gāzes lineāro ātrumu aprēķina pēc formulas L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros un tM ir laiks sekundēs.

▼M26









V PIELIKUMS

STERĪNU UN TRITERPĒNDIOLU SASTĀVA UN SATURA NOTEIKŠANA AR KAPILĀRĀS KOLONNAS GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. DARBĪBAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta atsevišķu sterīnu satura un sterīnu kopējā satura, kā arī triterpēndiolu satura noteikšana olīveļļā un olīvu izspaidu eļļā.

2. PRINCIPS

Eļļu, kam kā iekšējais standarts pievienots α-holestanols, pārziepjo ar kālija hidroksīda šķīdumu etanolā, un nepārziepjoto vielu pēc tam ekstrahē ar etilēteri.

Sterīnu un triterpēndiolu frakciju no nepārziepjojamās vielas atdala ar plānslāņa hromatogrāfiju, izmantojot bāziska silikagēla plati. No silikagēla reģenerētās frakcijas pārveido trimetilsililēteros un analizē ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA

Parastais laboratorijas aprīkojums, jo īpaši turpmāk nosauktais.

3.1. 250 ml tilpuma kolba, kas aprīkota ar atteces dzesinātāju ar pieslīpētu savienojumu.

3.2. 500 ml tilpuma dalāmā piltuve.

3.3. 250 ml tilpuma kolbas.

3.4. Komplekts analīzei ar plānslāņa hromatogrāfiju, izmantojot 20 × 20 cm stikla plates.

3.5. Ultravioletā spuldze ar viļņa garumu 366 vai 254 nm.

3.6. 100 μl un 500 μl mikrošļirces.

3.7. Cilindrisks poraina stikla filtrtīģelis G3 (poru lielums 15–40 μm), aptuveni 5 cm augsts un aptuveni ar 2 cm diametru, piemērots filtrēšanai vakuumā, ar ārējo pieslīpējumu.

3.8. Koniska 50 ml tilpuma vakuumkolba ar iekšējo pieslīpējumu izmantošanai kopā ar filtrtīģeli (3.7. punkts).

3.9. 10 ml tilpuma koniskā mēģene ar stikla aizbāzni.

3.10. Ar sadales inžekcijas sistēmu aprīkots kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfs, kura sastāvdaļas ir šādas: 3.10.1. termostatējama kamera kolonnām vēlamās temperatūras uzturēšanai ar precizitāti līdz ± 1 °C; 3.10.2. termostatējama inžekcijas ierīce ar persilanizētu stikla iztvaicētāju un sadales sistēmu; 3.10.3. liesmas jonizācijas detektors (FID); 3.10.4. datu ieguves sistēma, kas piemērota izmantošanai ar FID (3.10.3. punkts) un ko iespējams manuāli integrēt.

3.11. No 20 līdz 30 m gara kvarca kapilārā kolonna ar iekšējo diametru no 0,25 līdz 0,32 mm, pārklāta ar difenilu (5 %) un dimetilpolisiloksānu (95 %) (SE-52 vai SE-54 stacionāro fāzi vai līdzvērtīgu fāzi), kuru slāņa biezums ir 0,10–0,30 μm.

3.12. Mikrošļirce gāzu hromatogrāfijai ar 10 μl tilpumu un rūdītu adatu, kas piemērota ievadīšanai ar plūsmas dalīšanu.

3.13. Kalcija dihlorīda eksikators.

4. REAĢENTI

4.1. Kālija hidroksīds ar 85 % minimālo titru.

4.2. Kālija hidroksīds, aptuveni 2 N etanola šķīduma. 130 g kālija hidroksīda (4.1. punkts) dzesējot izšķīdina 200 ml destilēta ūdens, pēc tam uzpilda ar etanolu līdz vienam litram (4.10. punkts). Šķīdumu glabā cieši noslēgtās tumša stikla pudelēs ne ilgāk kā divas dienas.

4.3. Etilēteris, analīzes kvalitātes.

4.4. Kālija hidroksīds, aptuveni 0,2 N etanola šķīduma. 13 g kālija hidroksīda (4.1. punkts) izšķīdina 20 ml destilēta ūdens un uzpilda ar etanolu līdz vienam litram (4.10. punkts).

4.5. Bezūdens nātrija sulfāts, analīzes kvalitātes.

4.6. Stikla plates (20 × 20 cm) ar silikagēla pārklājumu, bez fluorescences indikatora, 0,25 mm biezas (nopērkamas lietošanai gatavas).

4.7. Toluols, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.8. Acetons, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.9. n-heksāns, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.10. Etilēteris, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.11. Etanols, analītiskas kvalitātes.

4.12. Etilacetāts, analītiskas kvalitātes.

4.13. Standartšķīdums plānslāņa hromatogrāfijai: holesterīns vai fitosterīni un eritrodiola 5 % šķīdums etilacetātā (4.11. punkts).

4.14. 2,7-dihlorfluoresceīna 0,2 % šķīdums etanolā. To padara nedaudz bāzisku, pievienojot dažus pilienus 2 N kālija hidroksīda šķīduma spirtā (4.2. punkts).

4.15. Bezūdens piridīns, hromatogrāfijas kvalitātes (skatīt 5. piezīmi).

4.16. Heksametildisilazāns, analītiskas kvalitātes.

4.17. Trimetilhlorsilāns, analītiskas kvalitātes.

4.18. Sterīnu trimetilsililēteru parauga šķīdumi. Tos pagatavo pirms lietošanas no sterīniem un eritrodiola, kas iegūti no sterīnus un eritrodiolu saturošām eļļām.

4.19. α-holestanols, vairāk nekā 99 % tīrība (tīrība jāpārbauda ar gāzu hromatogrāfijas analīzi).

4.20. α-holestanola iekšējais standartšķīdums, 0,2 % šķīdums (masa/tilp.) etilacetātā (4.11. punkts).

4.21. Fenolftaleīna šķīdums etanolā, 10 g/l (4.10. punkts).

4.22. Nesējgāzes: ūdeņradis vai hēlijs, gāzu hromatogrāfijas tīrības.

4.23. Palīggāzes: ūdeņradis, hēlijs, slāpeklis un gaiss, gāzu hromatogrāfijas tīrības.

4.24. n-heksāna (4.9. punkts)/etilētera (4.10. punkts) maisījums 65:35 (tilpums/tilpums).

4.25. Sililēšanas reaktīvs, kas ir piridīna/heksametildisilazāna/trimetilhlorsilāna maisījums 9:3:1 (tilpums/tilpums/tilpums).

5. PROCEDŪRA

5.1. Nepārziepjojamās vielas pagatavošana. 5.1.1. Ar 500 μl mikrošļirci (3.6. punkts) 250 ml tilpuma kolbā (3.1. punkts) pārnes tādu daudzumu α-holestanola iekšējā standartšķīduma (4.20. punkts), kas satur tādu holestanola daudzumu, kurš atbilst aptuveni 10 % sterīnu satura paraugā. Piemēram, 5 g olīveļļas parauga pievieno 500 μl α-holestanola šķīduma (4.20. punkts), bet 5 g olīvu izspaidu eļļas pievieno 1 500 μl α-holestanola šķīduma. Silta ūdens vannā, mērenā slāpekļa plūsmā ietvaicē sausu un pēc kolbas atdzesēšanas tajā pašā kolbā iesver 5 ± 0,01 g sausā nofiltrētā parauga. 1. piezīme. Dzīvnieku izcelsmes vai augu eļļas un tauki, kas satur lielākus holesterīna daudzumus, var uzrādīt smailes ar aiztures laikiem, kas ir līdzīgi holestanola aiztures laikam. Tādā gadījumā sterīnu frakcija ir jāanalizē divreiz – ar iekšējo standartu un bez tā. 5.1.2. Pievieno 50 ml 2 N kālija hidroksīda šķīduma etanolā (4.2. punkts) un nedaudz pumeka, uzliek atteces dzesinātāju un silda līdz lēnai viršanai, līdz ir notikusi pārziepjošana (šķīdums kļūst dzidrs). Turpina sildīt vēl 20 minūtes, pēc tam caur dzesinātāja augšgalu pievieno 50 ml destilēta ūdens, atvieno dzesinātāju un atdzesē kolbu aptuveni līdz 30 °C. 5.1.3. Kolbas saturu kvantitatīvi pārnes 500 ml dalāmajā piltuvē (3.2. punkts), vairākas reizes skalojot ar destilētu ūdeni, (50 ml). Pievieno aptuveni 80 ml etilētera (4.10. punkts), enerģiski krata aptuveni 60 sekundes, periodiski atbrīvo spiedienu, apgriežot dalāmo piltuvi un atverot krānu. Ļauj nostāvēties, līdz abas fāzes ir pilnīgi nodalījušās (2. piezīme). Pēc tam pēc iespējas pilnīgāk atdala ziepju šķīdumu, savācot to citā dalāmajā piltuvē. Tieši tāpat ūdens-spirta fāzi ekstrahē vēl divas reizes, katrai ekstrakcijai izlietojot no 60 līdz 70 ml etilētera (4.10. punkts). 2. piezīme. Radušos emulsiju var likvidēt, pievienojot nedaudz etanola (4.11. punkts). 5.1.4. Trīs ētera ekstraktus apvieno vienā dalāmajā piltuvē, kurā ir 50 ml ūdens. Turpina mazgāt ar ūdeni (50 ml), līdz mazgājamais ūdens pēc fenolftaleīna šķīduma (4.21. punkts) piliena pievienošanas vairs neiekrāsojas sārts. Kad mazgājamais ūdens ir aizvadīts, filtrē uz bezūdens nātrija sulfāta (4.5. punkts) iepriekš nosvērtā 250 ml tilpuma kolbā, mazgājot piltuvi un filtru ar maziem daudzumiem etilētera (4.10. punkts). 5.1.5. Šķīdinātāju ietvaicē, destilējot rotācijas ietvaicētājā 30 °C vakuumā. Pievieno 5 ml acetona un ar mērenu gaisa plūsmu pilnībā likvidē gaistošo šķīdinātāju. Atlikumu 15 minūtes žāvē žāvēšanas skapī 103 ± 2 °C temperatūrā. Atdzesē eksikatoros un nosver ar 0,1 mg precizitāti.

5.2. Sterīnu un triterpēndiolu frakcijas atdalīšana (eritrodiols + uvaols) 5.2.1. Bāzisko plānslāņa hromatogrāfijas plašu sagatavošana. Silikagēla plates (4.6. punkts), aptuveni 4 cm, uz 10 sekundēm pilnīgi iegremdē 0,2 N kālija hidroksīda šķīdumā etanolā (4.5. punkts), pēc tam divas stundas žāvē velkmē un vienu stundu žāvēšanas skapī 100 °C temperatūrā. Izņem no žāvēšanas skapja un glabā eksikatorā virs kalcija hlorīda (3.13. punkts) līdz lietošanai (šādi apstrādātas plates jāizlieto 15 dienu laikā). 3. piezīme. Ja sterīnu frakcijas atdalīšanai izmanto bāziska silikagēla plates, nepārziepjojamā frakcija nav jāapstrādā ar alumīnija oksīdu. Tādā veidā visi savienojumi ar skābju īpašībām (taukskābes un pārējie) paliek uz starta, un sterīnu josla labi atdalās no alifātisko spirtu un triterpēnspirtu joslas. 5.2.2. Attīstīšanas kamerā pārnes heksāna/etilētera maisījumu (4.24. punkts) (4. piezīme), izveidojot aptuveni 1 cm biezu slāni. Kameru noslēdz ar piemērotu vāku un vismaz pusstundu atstāj vēsā vietā, lai iestātos šķidruma un tvaika līdzsvars. Kameras iekšējām virsmām var piestiprināt filtrpapīra sloksnes, kas iegremdētas eluentā. Tas aptuveni par trešdaļu samazina attīstīšanas laiku, un komponentu eluēšanās notiek vienmērīgāk un pareizāk. 4. piezīme. Lai attīstīšanas apstākļi būtu atkārtojami, attīstīšanas šķīdums katrai analīzei ir jānomaina. Var lietot arī 50:50 (tilpums/tilpums) n-heksāna/etilētera maisījumu. 5.2.3. Sagatavo aptuveni 5 % nepārziepjojamās vielas (5.1.5. punkts) šķīdumu etilacetātā (4.12. punkts) un ar 100 μl mikrošļirci 0,3 ml šā šķīduma tievā un vienādā svītrā uznes uz hromatogrāfijas plates (5.2.1. punkts) apakšējās malas (2 cm attālumā). Vienādā attālumā ar šo svītru uznes no 2 līdz 3 μl materiāla standartšķīduma (4.13. punkts), lai pēc attīstīšanas varētu identificēt sterīnu un triterpēndiolu joslu. 5.2.4. Plati ievieto attīstīšanas kamerā, kas ir sagatavota, kā noteikts 5.2.2. punktā. Apkārtējās vides temperatūrai jābūt no 15 līdz 20 °C (5. piezīme). Kameru tūlīt noslēdz ar vāku un atstāj eluēties, līdz šķīdinātāja fronte sasniedz aptuveni 1 cm no plates augšējās malas. Plati izņem no attīstīšanas kameras un iztvaicē šķīdinātāju, izmantojot karsta gaisa plūsmu vai plati uz neilgu laiku novietojot velkmē. 5. piezīme. Augstāka temperatūra varētu pasliktināt nodalīšanos. 5.2.5. Uz plates vienmērīgi uzsmidzina nedaudz 2,7-dihlorfluoresceīna šķīduma (4.14. punkts) un tad atstāj nožūt. Novērojot plati ultravioleto staru gaismā, sterīnu un triterpēndiolu joslas var identificēt pēc tā, ka tās ir vienādā attālumā ar standartšķīdumam atbilstošajiem plankumiem (4.13. punkts). Joslu robežas apkārt fluorescējošajam plankumam apzīmē ar melnu zīmuli (skatīt plānslāņa hromatogrāfijas plati 3. attēlā). 5.2.6. Ar metāla lāpstiņu no apzīmētā laukuma noņem silikagelu. Sīki sasmalcinātu no plates noņemto materiālu pārvieto uz filtrtīģeli (3.7. punkts). Pievieno 10 ml karsta etilacetāta (4.12. punkts), rūpīgi samaisa ar metāla lāpstiņu un vakuumā filtrē, filtrātu uztver filtrtīģelim pievienotajā koniskajā kolbā (3.8. punkts). Nogulsnes kolbā trīs reizes mazgā ar etilēteri (4.3. punkts) (katru reizi aptuveni 10 ml), filtrātu savācot tajā pašā filtram pievienotajā kolbā. Filtrātu ietvaicē no 4 līdz 5 ml tilpumam, atlikušo šķīdumu pārnes iepriekš nosvērtā 10 ml mēģenē (3.9. punkts), uzmanīgi sildot, lēnā slāpekļa plūsmā ietvaicē sausu, izšķīdina, vēlreiz pievienojot dažus pilienus acetona (4.8. punkts), atkal ietvaicē sausu. Mēģenē iegūtajam atlikumam jāsastāv no sterīnu un triterpēndiolu frakcijām.

5.3. Trimetilsililēteru iegūšana. 5.3.1. Mēģenē, kurā ir sterīnu un triterpēnu frakcija, pievieno sililēšanas reaģentu (4.25. punkts) (6. piezīme) proporcijā 50 μl uz katru miligramu sterīnu un triterpēndiolu, novēršot mitruma absorbciju (7. piezīme). 6. piezīme. Tirdzniecībā ir pieejami lietošanai gatavi šķīdumi. Ir pieejami arī citi sililēšanas reaģenti, piemēram, bis-trimetilsililtrifluoracetamīds ar 1 % trimetilhlorsilānu, kas ir jāatšķaida ar vienādu tilpumu bezūdens piridīna. Piridīnu var aizvietot ar tādu pašu daudzumu acetonitrila. 5.3.2. Mēģeni noslēdz ar aizbāzni, uzmanīgi krata (bez apgriešanas), līdz savienojumi ir pilnībā izšķīduši. Atstāj vismaz 15 minūtes istabas temperatūrā, pēc tam dažas minūtes centrifugē. Dzidrais šķīdums ir gatavs gāzu hromatogrāfiskai analīzei. 7. piezīme. Var veidoties viegla opalescence, kas nerada traucējumus. Baltu pārslu veidošanās vai sārta krāsojuma parādīšanās norāda uz mitruma klātbūtni vai reaģenta bojāšanos. Ja tā notiek, analīze ir jāatkārto (tikai tad, ja izmanto heksametildisilazānu/trimetilhlorsilānu).

5.4. Gāzu hromatogrāfiskā analīze. 5.4.1. Sagatavošanas operācijas, kapilārās kolonnas kondicionēšana. 5.4.1.1. Kolonnu (3.11. punkts) iemontē gāzu hromatogrāfā, ieeju pievienojot plūsmas sadales inžektoram un kolonnas izeju detektoram. Izdara gāzu hromatogrāfijas iekārtas vispārējo pārbaudi (noplūdes no gāzu līnijām, detektora, plūsmas sadales un reģistrējošās sistēmas efektivitāti utt.). 5.4.1.2. Ja kolonnu lieto pirmoreiz, ir ieteicams to kondicionēt. Lēnu gāzes plūsmu laiž cauri kolonnai, pēc tam ieslēdz gāzu hromatogrāfu un pakāpeniski uzsilda līdz temperatūrai, kas ir vismaz 20 °C virs darba temperatūras (8. piezīme). Šo temperatūru uztur vismaz divas stundas, pēc tam iekārtu noregulē darba režīmā (noregulē gāzu plūsmas un sadali, liesmas aizdedzi, savienojumu ar datu apstrādes sistēmu, kā arī noregulē kolonnas, detektora un inžektora temperatūru utt.), pēc tam reģistrē signālu, izvēloties jutību, kas ir vismaz divas reizes augstāka par analīzei paredzēto temperatūru. Nulles līnijai ir jābūt lineārai, bez smailēm, un tā nedrīkst nobīdīties. Negatīva taisna līnija norāda uz noplūdēm kolonnas savienojumu vietās; pozitīva nobīde norāda uz neatbilstīgu kolonnas kondicionēšanu. 8. piezīme. Kondicionēšanas temperatūrai vienmēr jābūt vismaz par 20 °C zemākai nekā lietojamajai stacionārajai fāzei paredzētajai maksimālajai temperatūrai. 5.4.2. Darba apstākļu izvēle. 5.4.2.1. Darba apstākļi ir šādi: — kolonnas temperatūra: 260 ± 5 °C, — inžektora temperatūra: 280–300 °C, — detektora temperatūra: 280–300 °C, — nesējgāzes lineārais ātrums: hēlijam no 20 līdz 35 cm/s, ūdeņradim no 30 līdz 50 cm/s, — dalījuma attiecība: no 1:50 līdz 1:100, — aparāta jutība: 4–16 reižu lielāka par minimālo atenuāciju, — reģistrēšanas jutība: no 1 līdz 2 mV no visas skalas, — ievadāmās vielas daudzums: no 0,5 līdz 1 μl TMSE šķīduma. Atbilstīgi kolonnas un gāzes hromatogrāfa īpašībām norādītos apstākļus var mainīt, lai iegūtu hromatogrammas, kas atbilst šādiem nosacījumiem: — betasitosterīna smailes aiztures laikam jābūt 20 ± 5 minūtēm, — kampesterīna smailei jābūt: olīveļļai (vidējais saturs 3 %) 20 ± 5 % no pilnas skalas; sojas eļļai (vidējais saturs 20 %) 80 ± 10 % no pilnas skalas, — visiem klātesošajiem sterīniem jābūt atdalītiem. Turklāt smailēm jābūt arī pilnībā nošķirtām, t. i., smailes līnijai ir jāatgriežas uz nulles līnijas, pirms sāk veidoties jauna smaile. Tomēr nepilnīga nošķiršana ir pieņemama ar nosacījumu, ka smailes ar relatīvo aiztures laiku RRT 1,02 02 (sitostanols) var kvantitatīvi noteikt, izmantojot perpendikulu. 5.4.3. Analītiskā procedūra. 5.4.3.1. 10 μl tilpuma mikrošļircē vispirms ievelk 1 μl heksāna, tad 0,5 μl gaisa un pēc tam 0,5 –1 μl parauga šķīduma. Paceļ šļirces virzuli, lai iztukšotu adatu. Izdur adatu cauri inžektora membrānai un pēc vienas vai divām sekundēm strauji ievada, tad aptuveni pēc piecām sekundēm lēni izvelk adatu. Var izmantot arī automātisku inžektoru. 5.4.3.2. Turpina reģistrēt, līdz klātesošo triterpēndiolu TMSE ir pilnīgi eluēti. Nulles līnijai visu laiku ir jāatbilst prasībām (5.4.1.2. punkts). 5.4.4. Smaiļu identificēšana. Atsevišķās smailes identificē pēc aiztures laikiem, salīdzinot ar sterīnu un triterpēndiolu TMSE maisījumiem, kas analizēti tādus pašus apstākļos (skatīt papildinājumu). Sterīni un triterpēndioli eluējas šādā secībā: holesterīns, brasikasterīns, ergosterīns, 24-metilēnholesterīns, kampesterīns, kampestanols, stigmasterīns, Δ7-kampesterīns, Δ5,23-stigmastadienols, klerosterīns, betasitosterīns, sitostanols, Δ5-avenasterīns, Δ5,24-stigmastadienols, Δ7-stigmastenols, Δ7-avenasterīns, eritrodiols un uvaols. Betasitosterīna aiztures laiki SE-52 un SE-54 kolonnā ir parādīti 1. tabulā. Turpmāk 1. un 2. attēlā parādītas dažu eļļu raksturīgās hromatogrammas. 5.4.5. Kvantitatīvā novērtēšana. 5.4.5.1. Izmantojot datu apstrādes sistēmu, aprēķina α-holestanola, sterīnu un triterpēndiolu smaiļu laukumus. To savienojumu smailes, kas nav ietverti 1. tabulā, neņem vērā (ergosterīns nav jāaprēķina). Uzskata, ka α-holestanola atbildes signāla koeficients ir vienāds ar 1. 5.4.5.2. Katra atsevišķā sterīna koncentrāciju, kas izteikta mg/kg taukvielas, aprēķina šādi: kur: Ax = sterīna x smailes laukums skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās, As = α-holestanola smailes laukums skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās, ms = pievienotā α-holestanola masa miligramos, m = noteikšanai ņemtā parauga masa gramos.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

6.1. Atsevišķo sterīnu koncentrāciju izsaka mg/kg taukvielas, un to summu norāda kā “kopējos sterīnus”. Katra atsevišķā sterīna, eritrodiola un uvaola sastāvu izsaka ar skaitli līdz vienai zīmei aiz komata. Kopējais sterīnu sastāvs ir jāizsaka veselā skaitlī.

6.2. Katra atsevišķā sterīna procentus aprēķina pēc attiecīgās smailes laukuma attiecības pret sterīnu, eritrodiola un uvaola smaiļu kopējo laukumu. kur: Ax = x smailes laukums, ΣA = sterīnu smaiļu kopējais laukums.

6.3. Nosacītais betasitosterīns: Δ5-23-stigmastadienols + klerosterīns + betasitosterīns+ sitostanols + Δ5-avenasterīns + Δ5-24-stigmastadienols.

6.4. Aprēķina eritrodiola un uvaola procentus: kur: ΣA = sterīna laukumu summa skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās, Er = eritrodiola laukums skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās, Uv = uvaola laukums skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās.









Papildinājums

Gāzes lineārā ātruma noteikšana

Gāzu hromatogrāfā, kas noregulēts atbilstīgi parastajiem darba apstākļiem, ievada no 1 līdz 3 μl metāna (vai propāna) un izmēra laiku, kādā gāze iziet caur kolonnu no ievadīšanas brīža līdz smailes parādīšanās brīdim (tM).

Lineāro ātrumu aprēķina kā L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros un tM ir laiks sekundēs, kas izmērīts ar hronometru.







1. tabula Sterīnu relatīvie aiztures laiki Smaile Identifikācija Relatīvie aiztures laiki SE 54 kolonna SE 52 kolonna 1. Holesterīns Δ-5-holesten-3ß-ols 0,67 0,63 2. Holestanols 5α-holestan-3ß-ols 0,68 0,64 3. Brasikasterīns [24S]-24-metil-Δ-5,22-holestadien-3ß-ols 0,73 0,71 * Ergosterīns [24S] 24 meti Δ5-7-22 holestatrien 3β-ols 0,78 0,76 4. 24-metilēnholesterīns 24-metilēn-Δ-5,24-holestadien-3ß-ols 0,82 0,80 5. Kampesterīns (24R)-24-metil-Δ-5-holesten-3ß-ols 0,83 0,81 6. Kampestanols (24R)-24-metil-holestan-3ß-ols 0,85 0,82 7. Stigmasterīns (24S)-24-etil-Δ-5,22-holestadien-3ß-ols 0,88 0,87 8. Δ-7-kampesterīns (24R)-24-metil-Δ-7-holesten-3ß-ols 0,93 0,92 9. Δ-5,23-stigmastadienols (24R,S)-24-etil-Δ-5,23-holestadien-3ß-ols 0,95 0,95 10. Klerosterīns (24S)-24-etil-Δ-5,25-holestadien-3ß-ols 0,96 0,96 11. Betasitosterīns (24R)-24-etil-Δ-5-holesten-3ß-ols 1,00 1,00 12. Sitostanols 24-etil-holestan-3ß-ols 1,02 1,02 13. Δ-5-avenasterīns (24Z)-24-etiliden-Δ-holesten-3ß-ols 1,03 1,03 14. Δ-5,24-stigmastadienols (24R,S)-24-etil-Δ-5,24-holestadien-3ß-ols 1,08 1,08 15. Δ-7-stigmastenols (24R,S)-24-etil-Δ-7-holesten-3ß-ols 1,12 1,12 16. Δ-7-avenasterīns (24Z)-24-etiliden-Δ-7-holesten-3ß-ols 1,16 1,16 17. Eritrodiols 5α olean-12en-3b28 diols 1,41 1,41 18. Uvaols Δ12-ursen-3β28 diols 1,52 1,52

1. attēls

Spīdīgās olīveļļas (ar iekšējo standartu) sterīnu un triterpēndiolu frakcijas gāzu hromatogramma

2. attēls

Rafinētas olīveļļas (ar iekšējo standartu) sterīnu un triterpēndiolu frakcijas gāzu hromatogramma

3. attēls

Olīvu izspaidu eļļas plānslāņa hromatogrāfijas plate, kura ir jānoskrāpē, lai noteiktu sterīnus un triterpēndiolus

1 – skvalēns

2 – triterpēnspirti un alifātiskie spirti

3 – sterīni un triterpēndioli

4 – sākums un brīvās taukskābes.

▼M26 —————

▼M21









VII PIELIKUMS

2-GLICERILMONOPALMITĀTA SATURA NOTEIKŠANA

1. IZMANTOŠANAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta triglicerīdu molekulā 2. pozīcijā saistītās palmitīnskābes noteikšana pēc 2-glicerilmonopalmitāta.

Šo metodi var izmantot istabas temperatūrā (20 °C) šķidrām augu eļļām.

2. PRINCIPS

Pēc sagatavošanas eļļas paraugu šķeļ ar aizkuņģa dziedzera lipāzi: triglicerīdu daļējā selektīvā hidrolīzē 1. un 3. pozīcijā rodas 2-monoglicerīdi. 2-glicerilmonopalmitāta saturu monoglicerīdu frakcijā pēc sililēšanas nosaka ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA UN MATERIĀLI

3.1. 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba

3.2. 100, 250 un 300 ml tilpuma vārglāzes

3.3. Hromatogrāfijas kolonna no stikla, iekšējais diametrs 21–23 mm, garums 400 mm, ar poraina stikla disku un krānu

3.4. 10, 50, 100 un 200 ml tilpuma mērcilindri

3.5. 100 un 250 ml tilpuma kolbas

3.6. Rotācijas ietvaicētājs

3.7. 10 ml tilpuma centrifūgas mēģenes ar konisku apakšdaļu un slīpēta stikla aizbāzni

3.8. Centrifūga 10 un 100 ml tilpuma mēģenēm

3.9. Termostats, kurā var uzturēt 40 ± 0,5 °C temperatūru

3.10. 1 un 2 ml tilpuma graduētas pipetes

3.11. 1 ml tilpuma šļirce zemādas injekcijām

3.12. 100 μl tilpuma mikrošļirce

3.13. 1 000 ml tilpuma šķirpiltuve

3.14. Kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfs ar virskolonnas auksto inžekciju parauga tiešai ievadīšanai kolonnā un krāsni, kurā var uzturēt vajadzīgo temperatūru ar precizitāti apm. 1 °C

3.15. Virskolonnas aukstais inžektors parauga tiešai ievadīšanai kolonnā

3.16. Liesmas jonizācijas detektors un elektrometrs

3.17. Elektrometram piemērota reģistrējošā iekārta/integrators ar maināmu papīra ātrumu, kuras atbildes reakcijas laiks ir ne lielāks par 1 s

3.18. Stikla vai kvarca stikla kapilārā kolonna, garums 8–12 metri, iekšējais diametrs 0,25–0,32 mm, kas pārklāta ar metilpolisiloksānu vai fenilmetilpolisiloksānu 5 %, 0,10–0,30 μm slānis, izmantojama 370 °C temperatūrā

3.19. 10 μl tilpuma mikrošļirce ar vismaz 7,5 cm garu rūdītu adatu tiešai virskolonnas ievadīšanai

4. REAKTĪVI

4.1. Silikagels ar daļiņu izmēru no 0,063 līdz 0,200 mm (70/280 mesh), kas sagatavots šādi: Silikagelu porcelāna tīģelī žāvskapī 4 stundas žāvē 160 °C temperatūrā, atdzesē eksikatorā istabas temperatūrā. Pievieno ūdeni 5 % no silikagela masas turpmāk aprakstītajā veidā. Erlenmeijera kolbā iesver 152 g silikagela, pievieno 8 g destilēta ūdens, noslēdz ar aizbāzni un uzmanīgi krata, lai ūdens sadalītos masā vienmērīgi. Pirms lietošanas jāiztur vismaz 12 stundas

4.2. n-heksāns (hromatogrāfijai)

4.3. Izopropanols

4.4. Izopropanols, 1/1 (v/v) ūdens šķīdums

4.5. Aizkuņģa dziedzera lipāze. Tās aktivitātei jābūt no 2,0 līdz 10 lipāzes vienībām uz miligramu. (Aizkuņģa dziedzera lipāzes ar aktivitāti no 2 līdz 10 vienībām uz miligramu fermenta ir nopērkamas.)

4.6. Tris-hidroksimetilaminometāna buferšķīdums: 1 M ūdens reakciju ar konc. HCl (1/1 v/v) noregulē līdz pH 8 (nosaka potenciometriski)

4.7. Enzīma kvalitātes nātrija holāts, 0,1 % ūdens šķīdums (šis šķīdums pēc pagatavošanas ir derīgs divas nedēļas)

4.8. Kalcija hlorīds, 22 % ūdens šķīdums

4.9. Dietilēteris, hromatogrāfijai

4.10. Šķīdinātājs attīstīšanai: n-heksāna/dietilētera (87:13 v:v) maisījums

4.11. Nātrija hidroksīds, 12 % šķīdums

4.12. Fenolftaleīns, 1 % šķīdums etanolā

4.13. Nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, gāzes hromatogrāfijai

4.14. Palīggāzes: ūdeņradis, tīrība vismaz 99 %, sauss un attīrīts no organiskajām vielām; un gaiss, gāzes hromatogrāfijai, ar tādu pašu tīrības pakāpi

4.15. Silanizācijas reaģents: piridīna/heksametildisilazāna, trimetilhlorsilāna 9/3/1 (v/v/v) maisījums. (Nopērkami arī lietošanai sagatavoti šķīdumi. Var izmantot citus sililēšanas reaģentus, konkrēti bis-trimetilsililtrifluoracetamīds + 1 % trimetilhlorsilāns, kas atšķaidīts ar tādu pašu tilpumu bezūdens piridīna.)

4.16. Standartparaugi: tīri monoglicerīdi vai monoglicerīdu maisījumi ar zināmu sastāvu, kas ir līdzīgs analizējamo paraugu sastāvam

5. METODE

5.1. Paraugu sagatavošana

5.1.1. Eļļas, kuru brīvais skābums ir mazāks par 3 %, pirms hromatografēšanas silikagela kolonnā nav obligāti jāneitralizē. Eļļas, kuru brīvais skābums ir lielāks par 3 %, jāneitralizē, kā aprakstīts 5.1.1.1. punktā. 5.1.1.1. Pārnes 50 g eļļas un 200 ml n-heksāna 1 000 ml tilpuma šķirpiltuvē (3.13.). Pievieno 100 ml izopropanola un 12 % nātrija hidroksīda (4.11.) daudzumā, kas ir ekvivalents eļļas brīvajam skābumam plus 5 %. Vienu minūti enerģiski krata. Pievieno 100 ml destilēta ūdens, vēlreiz sakrata un nostādina. Pēc dekantēšanas atdala apakšējo ziepes saturošo slāni. Atdala arī visus pārējos starpslāņus (duļķes un nešķīstošās vielas). Neitralizētā eļļas parauga šķīdumu heksānā vairākas reizes mazgā ar 50–60 ml izopropanola/ūdens 1/1 (v/v) šķīdumu (4.4.), līdz izzūd tā sārtais krāsojums ar fenolftaleīnu. Lielāko daļu heksāna atdala ar vakuumdestilāciju (izmantojot, piemēram, rotācijas ietvaicētāju), un eļļu pārnes 100 ml tilpuma kolbā (3.5.). Eļļu vakuumā žāvē, līdz pilnībā atdalīts viss šķīdinātājs. Šīs procedūras beigās eļļas skābumam jābūt mazākam par 0,5 %.

5.1.2. Šādi sagatavotas eļļas 1,0 g lielu iesvaru pārnes 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.), un to izšķīdina 10 ml attīstīšanas maisījumā (4.10.). Pirms hromatogrāfijas silikagela kolonnā šķīdumu nostādina vismaz 15 minūtes. Lai nodrošinātu hromatogrāfijai optimālus apstākļus, ja šķīdums nav dzidrs, to centrifugē (var izmantot lietošanai sagatavotus 500 mg SPE silikagela kartridžus).

5.1.3. Hromatogrāfijas kolonnas sagatavošana Apmēram 30 ml attīstītāja šķīdinātāja (4.10.) pārnes kolonnā (3.3.), izmantojot stikla spieķīti, kolonnas apakšā ievieto kokvilnas auduma gabaliņu; saspiež, lai aizvadītu gaisu. Vārglāzē sagatavo 25 g silikagela (4.1.) suspensiju apmēram 80 ml attīstītāja šķīdinātāja, un pārnes kolonnā, izmantojot piltuvi. Pārbauda, vai viss silikagels pārnests kolonnā; mazgā ar attīstītāja šķīdinātāju (4.10.), atver krānu un šķidruma līmeni pazemina tā, lai tas būtu apmēram 2 mm virs silikagela līmeņa.

5.1.4. Kolonnas hromatogrāfija No parauga, kas sagatavots, kā aprakstīts iepriekš 5.1. punktā, 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.) ņem precīzi 1,0 g lielu iesvaru. Parauga iesvaru izšķīdina 10 ml attīstītāja šķīdinātāja (4.10.). Šķīdumu pārnes hromatogrāfijas kolonnā, kas sagatavota saskaņā ar 5.1.3. punktu. Jāraugās, lai netiktu aizskarta kolonnas virsma. Atver krānu un parauga šķīdumu pārnes kolonnā, līdz tas sasniedz silikagela līmeni. Attīsta ar 150 ml attīstītāja šķīdinātāja. Noregulē plūsmas ātrumu 2 ml/min (tā, lai 150 ml šķīduma tiktu pārnesti kolonnā apmēram 60–70 min laikā). Eluātu savāc iepriekš nosvērtā 250 ml tilpuma kolbā. Šķīdinātāju iztvaicē vakuumā gandrīz sausu, un šķīdinātāja atliekas atdala slāpekļa plūsmā. Kolbu nosver un aprēķina iegūtā ekstrakta masu. (Ja izmanto lietošanai sagatavotus SPE silikagela kartridžus, rīkojas, kā aprakstīts turpmāk. 1 ml šķīduma (5.1.2.) pārnes sagatavotos kartridžos ar 3 ml n-heksāna. Pēc šķīduma perkolēšanas attīsta ar 4 ml n-heksāna/dietilētera 9/1 (v/v) maisījumu. Eluātu savāc 10 ml tilpuma mēģenē un slāpekļa plūsmā ietvaicē sausu. Uz sauso atlikumu iedarbojas ar aizkuņģa dziedzera lipāzi (5.2.). Jāpārbauda taukskābju sastāvs pirms SPE kartridža un pēc tā.)

5.2. Hidrolīze ar aizkuņģa dziedzera lipāzi

5.2.1. Centrifūgas mēģenē iesver 0,1 g eļļas, kas sagatavotas saskaņā ar 5.1. punktu. Pievieno 2 ml buferšķīduma (4.6.), 0,5 ml nātrija holāta šķīduma (4.7.) un 0,2 ml kalcija hlorīda šķīduma, katru reizi šķīdumu rūpīgi samaisot. Mēģeni noslēdz ar pieslīpēta stikla aizbāzni, un ievieto termostatā 40 ± 0,5 °C temperatūrā.

5.2.2. Pievieno 20 mg lipāzes, uzmanīgi sakrata (nesaslapinot aizbāzni), un mēģeni ievieto termostatā precīzi uz 2 min. Pēc tam izņem, enerģiski krata precīzi 1 min un atdzesē.

5.2.3. Pievieno 1 ml dietilētera, noslēdz ar aizbāzni un enerģiski krata, pēc tam centrifugē, un ar mikrošļirci ētera šķīdumu pārnes tīrā sausā mēģenē.

5.3. Silanilatvasinājumu iegūšana un gāzes hromatogrāfija

5.3.1. Ar mikrošļirci 100 μl šķīduma (5.2.3.) pārnes 10 ml tilpuma mēģenē ar konisku apakšdaļu.

5.3.2. Vājā slāpekļa plūsmā atdala šķīdinātāju, pievieno 200 μl silanizācijas reaģenta (4.15.), mēģeni noslēdz ar aizbāzni un 20 min nostādina.

5.3.3. Pēc 20 min pievieno 1 līdz 5 ml n-heksāna (atkarībā no hromatografēšanas apstākļiem): šādi iegūtais šķīdums ir sagatavots gāzes hromatogrāfijai.

5.4. Gāzes hromatogrāfija

Darba apstākļi:

— inžektora temperatūra (virskolonnas inžektors) zem šķīdinātāja viršanas punkta (68 °C);

— detektora temperatūra: 350 °C;

— kolonnas temperatūra: krāsns temperatūras programma: 1 minūti 60 °C, paaugstināšana par 15 °C minūtē līdz 180 °C, tad par 5 °C minūtē līdz 340 °C, tad 13 minūtes 340 °C;

— nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, ar lineāro ātrumu, kas ir pietiekams 1. att. parādītās izšķirtspējas panākšanai. Aiztures laikam C54 triglicerīdam jābūt 40 ± 5 min (sk. 2. att.). (Norādītie darba apstākļi ir orientējoši. Operatoriem tie jāoptimizē, lai panāktu vajadzīgo izšķirtspēju. Tā signāla augstumam, kas atbilst 2-glicerilmonopalmitātam, jābūt vismaz 10 % no reģistrācijas iekārtas skalas.)

— ievadītās vielas daudzums: 0,5–1 μl n-heksāna šķīduma (5 ml) (5.3.3.).

5.4.1. Signālu identifikācija

Atsevišķos monoglicerīdus identificē pēc aiztures laikiem, tos salīdzinot ar monoglicerīdu standartmaisījumiem tādos pašos apstākļos noteiktajiem aiztures laikiem.

5.4.2. Kvantitatīva noteikšana

Katra signāla laukumu aprēķina, izmantojot elektronisko integratoru.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Glicerilmonopalmitāta saturu aprēķina pēc attiecīgā signāla laukuma attiecības pret visu monoglicerīdu signālu laukumu kopējo summu (sk. 2. att.), izmantojot šādu formulu:

glicerilmonopalmitāts (%)

kur:

Ax = glicerilmonopalmitāta signāla laukums;

ΣA = visu monoglicerīdu signālu laukumu summa.

Rezultātus uzdod ar precizitāti līdz vienam decimālciparam aiz komata.

7. ANALĪZES REZULTĀTU PĀRSKATS

Pārskatā par analīzes rezultātiem jānorāda:

— atsauce uz šo metodi,

— visa informācija, kas vajadzīga parauga pilnīgai identifikācijai,

— analīzes rezultāts,

— ziņas par atkāpēm no šīs metodes, pamatojoties uz ieinteresēto pušu vienošanos, vai kāda cita iemesla dēļ,

— laboratorijas identifikācijas dati, analīzes dienas datums un par analīzes veikšanu atbildīgo personu paraksti.

1. attēls

To silanizēšanas reakcijas produktu hromatogramma, kas iegūti, ar lipāzi iedarbojoties uz rafinētu olīveļļu, kurai pievienoti 20 % esterificētas eļļas (100 %).

Paskaidrojumi: Acides gras libres = brīvās tauksābes; Huile d’olive rafinée = rafinēta olīveļļa; 20 % Huile estérifiée = 20 % esterificēta eļļa; 1-2 monopalmitoléine = 1-2 monopalmitoleīns; 1-2 monopalmitine = 1-2 monopalmitīns; 1-2 mono C18 insat. = 1-2 mono- C18 nepiesāt.; Squalene = skvalēns.

2. attēls

Hromatogrammas:

A) neesterificēta olīveļļa, pēc iedarbības ar lipāzi; pēc silanizēšanas; šādos apstākļos (8–12 m kapilārā kolonna) vasku frakcija eluējas vienlaicīgi ar digicerīdu frakciju vai pavisam nedaudz vēlāk. Pēc iedarbības ar lipāzi triglicerīdu saturs nedrīkst būt augstāks par 15 %. Paskaidrojumi: 1 = Brīvās taukskābes 2 = Monoglicerīdi 3 = Diglicerīdi 4 = Triglicerīdi * = 2-monopalmitīns ** = C54 triglicerīds

Hromatogrammas:

B) esterificēta eļļa pēc iedarbības ar lipāzi; pēc silanizēšanas; šādos apstākļos (8–12 m kapilārā kolonna) vasku frakcija eluējas vienlaicīgi ar digicerīdu frakciju vai pavisam nedaudz vēlāk. Pēc iedarbības ar lipāzi triglicerīdu saturs nedrīkst būt augstāks par 15 %. Paskaidrojumi: 1 = Brīvās taukskābes 2 = Monoglicerīdi 3 = Diglicerīdi 4 = Triglicerīdi * = 2-monopalmitīns ** = C54 triglicerīds

8. PIEZĪMES

LIPĀZES SAGATAVOŠANA

Ir nopērkamas lipāzes ar pietiekamu aktivitāti. Tās var sagatavot arī laboratorijā šādi.

Atdzesē līdz 0 °C temperatūrai 5 kg svaigu cūkas aizkuņģa dziedzeru. Atdala apkārtējos cietos taukus un saistaudus, un pēc tam blenderī sasmalcina šķidras pastas veidā. Pastai pievieno 2,5 l bezūdens acetona, 4–6 stundas maisa, pēc tam centrifugē. Atlikumu vēl trīs reizes ekstrahē ar tādu pašu daudzumu bezūdens acetona, pēc tam divas reizes ar acetona/dietilētera (1/1 v/v) maisījumu, un divas reizes ar dietilēteri.

Atlikumu 48 h žāvē vakuumā, lai iegūtu stabilu pulveri, ko var ilgstoši glabāt ledusskapī, sargājot no mitruma iedarbības.

LIPĀZES AKTIVITĀTES KONTROLE

Sagatavo olīveļļas emulsiju šādā veidā.

Mikserī 10 min maisa maisījumu, kas sastāv no 165 ml gumiarabika 100 g/l šķīduma, 15 g sasmalcināta ledus un 20 ml iepriekš neitralizētas olīveļļas.

Pārnes 10 ml šīs emulsijas 50 ml tilpuma vārlāzē, pievieno 0,3 ml nātrija holāta 0,2 g/ml šķīdumu, un pēc tam 20 ml destilēta ūdens.

Vārglāzi novieto termostatā 37 °C temperatūrā; ievieto pH-metra elektrodus un spirāles maisītāju.

Ar bireti pa pilienam pievieno 0,1 N nātrija hidroksīda šķīdumu līdz pH 8,3.

Pievieno alikvotu lipāzes pulvera suspensijas ūdenī (0,1 g/ml lipāzes). Tiklīdz pH-metrs rāda 8,3, palaiž hronometru un pa pilienam pievieno nātrija hidroksīdu ar tādu ātrumu, lai reakcija nemainītos, un visu laiku būtu pH 8,3. Ik pēc minūtes atzīmē patērētā sārma daudzumu.

Iegūtos datus attēlo x/y grafikā, kurā uz abscisu ass atliek laiku, bet uz ordinātu ass – 0,1 N sārma šķīduma tilpumu mililitros, kas patērēts nemainīga pH saglabāšanai. Iegūtajai sakarībai jābūt lineārai.

Lipāzes aktivitāti, kas izteikta lipāzes vienībās vienā miligramā, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

A aktivitāte lipāzes vienības/mg;

V mililitri 0,1 N nātrija hidroksīda šķīduma minūtē (aprēķina pēc grafika);

N nātrija hidroksīda šķīduma titrs;

m testējamās lipāzes parauga masa miligramos.

Lipāzes vienība ir fermenta daudzums, kāds fermentatīvās šķelšanas reakcijās vienā minūtē izdala 10 mikroekvivalentus skābes.

▼M20 —————

▼M25









IX PIELIKUMS

SPEKTROFOTOMETRISKĀ ANALĪZE UV SPEKTRĀ

IEVADS

Spektrofotometriskā analīze UV spektrā var dot informāciju par tauku kvalitāti, to saglabāšanas stāvokli un tehnoloģisko procesu izraisītajām pārmaiņām tajos.

Absorbcija pie metodē noteiktajiem viļņa garumiem notiek konjugētu diēnu un triēnu sistēmu klātbūtnes dēļ. Šo absorbciju izsaka kā īpatnējo ekstinkciju E 1 % 1 cm (1 % tauku šķīduma ekstinkcija attiecīgā šķīdinātājā pie slāņa biezuma 1 cm), ko parasti apzīmē ar K (sauc arī par “ekstinkcijas koeficientu”).

1. PIEMĒROŠANAS JOMA

Metode apraksta procedūru olīveļļas spektrofotometriskai analīzei (aprakstīta papildinājumā) ultravioletajā spektrā.

2. METODES PRINCIPS

Attiecīgos taukus šķīdina vajadzīgajā šķīdinātājā un pie noteiktiem viļņa garumiem nosaka ekstinkciju šķīdumam attiecībā pret tīru šķīdinātāju. Īpatnējās ekstinkcijas aprēķina pēc spektrofotometra nolasījumiem. Vielas koncentrācijai 1 g uz 100 ml 10 mm kivetē aprēķina īpatnējo absorbciju pie 232 nm un 268 nm izooktānā vai 232 nm un 270 nm cikloheksānā.

3. IEKĀRTA

3.1. Spektrofotometrs ekstinkcijas mērījumiem ultravioletajā spektra daļā starp 220 un 360 nm ar iespēju nolasīt atsevišķas nanometru vienības. Pirms izmantošanas ieteicams pārbaudīt spektrometra viļņa garuma un absorbcijas skalas. 3.1.1. Viļņa garuma skala. To var pārbaudīt, izmantojot references materiālu – optiskā stikla filtru, kas satur holmija oksīdu, kam ir izteiktas absorbcijas joslas. References materiāls ir paredzēts, lai verificētu un kalibrētu viļņa garuma skalas spektrofotometriem, kas darbojas redzamajā un ultravioletajā starojuma apgabalā un kā nominālais spektrālās joslas platums ir ne vairāk par 5 nm. Holmija stikla filtru absorbcijas režīmā salīdzina ar gaisa tukšo paraugu 640–240 nm viļņa garuma diapazonā. Katram spektrālās joslas platumam ((0,10 – 0,25 – 0,50 – 1,00 – 1,50 – 2,00 un 3,00) izdara bāzes līnijas korekciju ar tukšu kivešu turētāju. Spektrālās joslas platuma viļņa garumi ir uzskaitīti ISO 3656 references materiāla sertifikātā. 3.1.2. Absorbcijas skala. To var pārbaudīt, izmantojot references materiālu: 4 kālija dihromāta šķīdumi perhlorskābē, kas hermētiski ievietoti četrās UV paredzētās kvarca kivetēs, lai noteiktu linearitātes un fotometriskās pareizības referenci UV. Ar kālija dihromātu piepildītās kivetes ((40 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml un 100 mg/ml) salīdzina ar perhloskābes tukšo paraugu. Neto absorbcijas vērtības ir uzskaitītas ISO 3656 references materiāla sertifikātā.

3.2. Taisnstūra kvarca kivetes ar vāciņiem, optiskais ceļa garums 1 cm. Ja kivetes piepildītas ar ūdeni vai citu piemērotu šķīdinātāju, tās savā starpā nedrīkst atšķirties par vairāk nekā 0,01 ekstinkcijas vienību.

3.3. 25 ml mērkolbas.

3.4. Analītiskie svari ar nolasījuma precizitāti līdz 0,0001 g.

4. REAĢENTI

Jāizmanto tikai atzītas analītiskas tīrības pakāpes reaģenti, ja vien nav norādīts citādi.

Šķīdinātājs: izooktāns (2,2,4-trimetilpentāns) mērījumiem pie 232 nm un 268 nm vai cikloheksāns mērījumiem pie 232 nm un 270 nm, ar absorbciju mazāk par 0,12 pie 232 nm un mazāk par 0,05 pie 250 nm salīdzinājumā ar destilētu ūdeni, mērot 10 mm kivetē.

5. PROCEDŪRA

5.1. Attiecīgajam paraugam jābūt pilnīgi homogēnam un bez suspendētiem piemaisījumiem. Eļļas, kas istabas temperatūrā ir šķidras, ir jāfiltrē caur filtrpapīru aptuveni 30 °C temperatūrā, cieti tauki ir jāhomogenizē un jāfiltrē temperatūrā, kas nav augstāka par 10 °C virs kušanas punkta.

5.2. Precīzi nosver 0,25 g (ar precizitāti līdz 1 mg) tā sagatavota parauga 25 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar norādīto šķīdinātāju un homogenizē. Iegūtajam šķīdumam ir jābūt pilnīgi dzidram. Ja novērojama opalescence jeb duļķainība, ātri izfiltrē caur filtrpapīru.

5.3. Ar iegūto šķīdumu piepilda kvarca kiveti un izmēra ekstinkciju pie attiecīga viļņa garuma starp 232 un 276 nm, šķīdinātāju izmantojot kā standartšķīdumu. Izmērītajām ekstinkcijas vērtībām jābūt starp 0,1 un 0,8. Ja tā nav, mērījumi ir jāatkārto, lietojot pēc vajadzības koncentrētākus vai atšķaidītākus šķīdumus. PIEZĪME. Var nebūt vajadzības mērīt absorbciju pie visa viļņa garumu diapazona.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

6.1. Pieraksta pie dažādiem viļņa garumiem iegūtās īpatnējās ekstinkcijas (ekstinkcijas koeficientus), ko aprēķina šādi: kur: Κλ = īpatnējā ekstinkcija pie viļņa garuma λ; Ελ = ekstinkcija, kas izmērīta pie viļņa garuma λ; c = šķīduma koncentrācija g/100 ml; s = kvarca kivešu biezums cm. Rezultātus izsaka ar divām zīmēm aiz komata.

6.2. Īpatnējās ekstinkcijas variācija (ΔΚ) Olīveļļas spektrofotometriskajā analīzē, ko veic saskaņā ar Savienības tiesību aktos paredzēto oficiālo metodi, nosaka arī īpatnējās ekstinkcijas absolūtās vērtības variāciju (ΔΚ) pēc šādas formulas kur Km ir īpatnējā ekstinkcija pie viļņa garuma m, maksimālās absorbcijas viļņa garums ir atkarīgs no izmantotā šķīdinātāja – 270 ciklohekāsanam un 268 izooktānam.









Papildinājums







OLĪVEĻĻAS ĪPAŠĪBAS Kategorija Taukskābju metilesteri (FAME) un taukskābju etilesteri (FAEE) Skābums (%) (*) Peroksīda skaitlis mEq 02/kg (*) Vaski mg/kg (**) 2-glicerilmonopalmitāts (%) Stigmasta- diēns mg/kg (1) Starpība: ECN42 (HPLC) un ECN42 (teorētiskais aprēķins) K232 (*) K270 (*) “K 270 vai K 268 (5)” Delta-K (*) (5) Organoleptiskais novērtējums Defekta mediāna (Md) (*) Organoleptiskais novērtējums Augļainuma mediāna (Mf) (*) 1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa Σ FAME + FAEE ≤75 mg/kg vai 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤150 mg/kg un (FAEE/FAME) ≤1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14% 2. Neapstrādāta olīveļļa — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14% ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14% 3. Spīdīgā olīveļļa — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14% 4. Rafinēta olīveļļa — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14% 5. Rafinētas un neapstrādātas olīveļļas maisījums — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14% 6. Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olīvu izspaidu eļļa ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Kapilārajā kolonnā atdalāmo (vai neatdalāmo) izomēru summa (2) Vai ja defektu mediāna ir mazāka par vai vienāda ar 3,5 un augļainuma mediāna ir vienāda ar 0. (3) Eļļas ar vaska saturu no 300mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par spīdīgo olīveļļu, ja kopējais alifātisko spirtu saturs ir mazāks par vai vienāds ar 350 mg/kg vai ja eritrodiola un uvaola saturs ir mazāks par vai vienāds ar 3,5%. (4) Eļļas ar vaska saturu no 300mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par neapstrādātu olīvu izspaidu eļļu, ja kopējais alifātisko spirtu saturs ir lielāks par 350 mg/kg un ja eritrodiola un uvaola saturs ir lielāks par 3,5%. (5) K 270 ja šķīdinātājs ir cikloheksāns, K 268 ja šķīdinātājs ir izooktāns.

▼B









X A PIELIKUMS

TAUKSKĀBJU METILESTERU ANALĪZE AR GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. DARBĪBAS JOMA

Šī metode dod vispārīgus norādījumus par gāzu hromatogrāfijas pielietošanu, izmantojot pakotās vai kapilārās kolonnas, lai noteiktu taukskābju metilesteru, kas iegūti saskaņā ar X B pielikumā norādīto metodi, maisījuma kvalitatīvo un kvantitatīvo sastāvu.

Šī metode nav lietojama polimerizētām taukskābēm.

2. REAKTĪVI

2.1. Nesējgāze

Inerta gāze (slāpeklis, hēlijs, argons, ūdeņradis utt.), kas ir rūpīgi izžāvēta un kas satur mazāk par 10 mg/kg skābekļa.

1. piezīme:

ūdeņradis, ko izmanto par nesējgāzi tikai ar kapilārām kolonnām, var divreiz palielināt analīzes ātrumu, bet tas ir bīstams. Ir pieejamas drošības ierīces.

2.2. Palīggāzes

2.2.1. Ūdeņradis (tīrība 99,9 %), bez organiskiem piemaisījumiem.

2.2.2. Gaiss vai skābeklis, bez organiskiem piemaisījumiem.

2.3. Salīdzināšanas standarts

Tīru taukskābju metilesteru maisījums vai zināma sastāva tauku metilesteri, vēlams, līdzīgi analizējamās taukainās vielas sastāvam.

Ir jārūpējas par polinepiesātināto taukskābju oksidācijas novēršanu.

3. APARATŪRA

Dotie norādījumi attiecas uz parasto gāzu hromatogrāfijas aprīkojumu, kurā izmanto pakotās un/vai kapilārās kolonnas un liesmas jonizācijas detektoru. Jebkura aparatūra, kuras efektivitāte un izšķirtspēja atbilst 4.1.2. punktā noteiktajai, ir piemērota.

3.1. Gāzu hromatogrāfs

Gāzu hromatogrāfā ir šādas sastāvdaļas.

3.1.1. Iešļircināšanas sistēma

Izmanto iešļircināšanas sistēmu vai nu ar:

a) pakotām kolonnām ar vismazāko iespējamo nelietderīgo tilpumu (šajā gadījumā iešļircināšanas sistēmai jābūt sildāmai līdz temperatūrai, kas ir par 20 līdz 50 °C augstāka nekā kolonnas temperatūra), vai ar

b) kapilārām kolonnām, šajā gadījumā iešļircināšanas sistēma ir īpaši izveidota izmantošanai ar šādām kolonnām. Iešļircināšanas sistēma var būt ar plūsmas dalīšanu, vai tā var būt “on column” veida, bez plūsmas dalīšanas.

2. piezīme: ja taukskābju, kurās ir mazāk par 16 oglekļa atomiem, nav klāt, var izmantot kustīgās adatas inžektoru.

3.1.2. Krāsns

Krāsnij jāspēj sildīt kolonnu vismaz līdz 260 °C un uzturēt vēlamo temperatūru 1 °C robežās ar pakoto kolonnu un 0,1 °C robežās ar kapilāro kolonnu. Pēdējā prasība ir īpaši svarīga, ja lieto kvarca kolonnu.

Visos gadījumos ir ieteicams izmantot sildīšanu ar temperatūras programmēšanu, jo īpaši taukskābēm, kurās ir mazāk par 16 oglekļa atomiem.

3.1.3. Pakotā kolonna

3.1.3.1. Kolonna, kas izgatavota no materiāla, kurš ir inerts pret analizējamām vielām (t.i., stikls vai nerūsējošais tērauds), kolonnai ir šādi izmēri: a) garums: 1 līdz 3 m. Relatīvi īsa kolonna būtu jālieto, analizējot garas virknes taukskābes (vairāk par C20). Analizējot skābes ar 4 vai 6 oglekļa atomiem, ir ieteicams izmantot 2 m garu kolonnu; b) iekšējais diametrs: 2 līdz 4 mm. 3. piezīme: ja ir klāt polinepiesātināti komponenti ar vairāk par trim dubultsaitēm, tie nerūsējošā tērauda kolonnā var sadalīties. 4. piezīme:var izmantot sistēmu ar pakotām dubultkolonnām.

3.1.3.2. Pakojums ietver šādas sastāvdaļas: a) nesēju: skābē mazgātu un silanizētu diatomītu vai citu piemērotu inertu nesēju ar šauru graudiņu lieluma diapazonu (25 μm diapazons robežās starp 125 un 200 μm) graudiņu vidējais lielums ir saistīts ar kolonnas iekšējo diametru un garumu; b) stacionārā fāze: poliesteru tipa polārs šķidrums (piem., dietilēnglikola polisukcināts, butāndiola polisukcināts, etilēnglikola poliadepāts u. c.), ciānsilikoni vai cits šķidrums, kas ļauj izdarīt vajadzīgo hromatogrāfisko sadalīšanu (sk. 4. punktu). Stacionārās fāzes daudzums ir 5 līdz 20 % (masa/masa) no pakojuma. Dažu veidu sadalīšanām var izmantot nepolāru stacionāro fāzi.

3.1.3.3. Kolonnas kondicionēšana Kolonnu, ja iespējams, atvieno no detektora, pakāpeniski uzsilda krāsni līdz 185 °C un caur tikko sagatavotu kolonnu laiž inertu gāzi ar ātrumu 20 līdz 60 ml/min. vismaz 16 stundas šajā temperatūrā un vēl divas stundas 195 °C temperatūrā.

3.1.4. Kapilārā kolonna

3.1.4.1. Caurule, izgatavota no materiāla, kas ir inerts pret analizējamām vielām (parastais stikls vai kvarcs). Iekšējais diametrs ir starp 0,2 un 0,8 mm. Iekšējo virsmu pirms pārklāšanas ar stacionāro fāzi attiecīgi apstrādā (piem., sagatavo virsmu, inaktivē). Vairumā gadījumu 25 m ir pietiekami.

3.1.4.2. Stacionārā fāze, parasti poliglikolu tipa (polietilenglikols 20 000), poliesteris (butāndiola polisukcināts) vai polārais polisiloksāns (ciānsilikoni). Ir piemērotas kolonnas ar ķīmiski piesaistītu stacionāro fāzi. 5. piezīme: pastāv iespējamība, ka polārie polisiloksāni varētu radīt grūtības linolēnskābes un skābju ar C20 identificēšanā un atdalīšanā. Pārklājums ir plāns, t. i., 0,1 līdz 0,2 μm.

3.1.4.3. Kolonnas montēšana un kondicionēšana Kapilāro kolonnu montēšanā, t. i., kolonnas ievietošanā krāsnī (atbalsts), pievienojumu montēšanā (hermētiskums), kolonnas galu ievietošanā inžektorā un detektorā (nelietderīgo tilpumu samazināšana) jāievēro parastā piesardzība. Kolonnu pievieno nesējgāzes plūsmai (piem., 0,3 bar (30 kPa) 25 m garai kolonnai ar iekšējo diametru 0,3 mm). Kolonnu kondicionē, programmējot krāsns temperatūru 3 °C/min. no apkārtējās vides temperatūras līdz temperatūrai, kas ir par 10 °C zemāka nekā stacionārās fāzes sadalīšanās temperatūras robeža. Krāsni uztur šajā temperatūrā vienu stundu, līdz stabilizējas nulles līnija. Pēc tam atgriežas pie 180 °C un turpina darbu izotermiskos apstākļos. 6. piezīme:piemērotas, iepriekš kondicionētas, kolonnas ir pieejamas pārdošanā.

3.1.5. Detektors, vēlams tāds, ko var karsēt līdz temperatūrai, kas ir lielāka par kolonnas temperatūru.

3.2. Šļirce

Šļirces maksimālā ietilpība ir 10 μl, un tā ir graduēta 0,1 μl iedaļās.

3.3. Reģistrējošā iekārta

Ja reģistrējošās iekārtas līkne ir jāizmanto, lai aprēķinātu analizējamā maisījuma sastāvu, ir vajadzīga augstas precizitātes elektroniskā reģistrēšanas iekārta, kas ir saderīga ar izmantojamo aparatūru. Reģistrējošajai iekārtai ir šādas īpašības:

a) atbildes ātrums mazāks par 1,5 sek., vēlams 1 sek. (atbildes ātrums ir laiks, kas vajadzīgs pašrakstītāja spalvai, lai pārvietotos no 0 līdz 90 % pēc pēkšņas 100 % signāla izraisīšanas);

b) papīra platums vismaz 20 cm;

c) papīra ātrums regulējams starp 0,4 un 2,5 cm/min.

3.4. Integrators

Ātrus un precīzus aprēķinus var izdarīt ar elektronisko integratoru. Tam ir jādod lineāra atbilde ar pietiekamu jutību, un nulles līnijas noviržu korekcijai ir jābūt apmierinošai.

4. PROCEDŪRA

Darbības, kas aprakstītas no 4.1. LĪDZ 4.3. punktam, attiecas uz liesmas jonizācijas detektora lietošanu.

Alternatīvi var izmantot gāzu hromatogrāfu ar katarometra detektoru (darbojas, pamatojoties uz vadītspējas izmaiņām atkarībā no temperatūras). Darba apstākļus tad maina, kā norādīts 6. punktā.

4.1. Analīzes apstākļi

4.1.1. Darba apstākļu izvēle 4.1.1.1. Pakotā kolonna Izvēloties analīzes apstākļus, jāņem vērā šādi mainīgie lielumi: a) kolonnas garums un diametrs; b) stacionārās fāzes īpašības un daudzums; c) kolonnas temperatūra; d) nesējgāzes plūsma; e) vajadzīgā izšķirtspēja; f) analīzes parauga lielums, ko izvēlas tā, lai detektora un elektrometra iekārta dotu lineāru atbildes reakciju; g) analīzes ilgums. Parasti 1. un 2. tabulā norādītie lielumi dod vēlamos rezultātus, t. i., vismaz 2 000 teorētisko šķīvju uz kolonnas garuma metru metilstearātam un tā eluēšana apmēram 15 minūtēs. Ja aparatūra ļauj, inžektora temperatūrai jābūt apmēram 200 °C un detektora temperatūrai — vienādai vai augstākai par kolonnas temperatūru. Parasti liesmas jonizācijas detektorā padodamā ūdeņraža plūsmas ātrums pret nesējgāzes ātrumu attiecas kā 1:2 līdz 1:1 atkarībā no kolonnas diametra. Skābekļa plūsma ir aptuveni 5 līdz 10 reižu lielāka par ūdeņraža plūsmu.



1. tabula Kolonnas iekšējais diametrs mm Nesējgāzes plūsmas ātrums ml/min. 2 15 līdz 25 3 20 līdz 40 4 40 līdz 60



2. tabula Stacionārās fāzes koncentrācija % (masa/masa) Kolonnas temperatūra °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapilārā kolonna Kapilārās kolonnas efektivitāte un caurlaidība nozīmē, ka sastāvdaļu atdalīšana un analīzes ilgums lielā mērā ir atkarīgs no nesējgāzes plūsmas ātruma kolonnā. Tādēļ ir jāoptimizē darba apstākļi, iedarbojoties uz šo parametru (vai, vienkāršāk sakot, uz kolonnas spiediena kritumu) atbilstoši tam, vai vēlas uzlabot sadalīšanu, vai ātri izdarīt analīzi.

4.1.2. Teorētisko šķīvju skaita (efektivitātes) un izšķirtspējas noteikšana (sk. 1. zīmējumu). Izdara analīzi metilstearāta un metiloleāta maisījumam aptuveni vienādās daļās (piemēram, kakao sviesta metilesteriem). Kolonnas temperatūru un nesējgāzes plūsmas ātrumu izvēlas tā, lai metilstearāta pīķa maksimumu reģistrētu aptuveni 15 minūtes pēc šķīdinātāja pīķa. Izlieto pietiekamu metilesteru maisījuma daudzumu, lai metilstearāta pīķis aizņemtu apmēram trīs ceturtdaļas no visas skalas. Teorētisko šķīvju skaitu n (efektivitāti) aprēķina pēc formulas: un izšķirtspēju R aprēķina pēc formulas: kur: dr1 ir aiztures attālums milimetros no hromatogrammas sākuma līdz metilstearāta pīķa maksimumam; ω1un ω2 ir attiecīgi metilstearāta un metiloleāta pīķu platums milimetros, kas mērīts starp līknes pārliekuma punktos novilkto tangenšu krustošanās punktiem ar nulles līniju; Δ ir attalums milimetros starp metilstearāta un metiloleāta pīķu maksimumiem; ▼M2 un izšķirtspējas indekss lr, aprēķinot pēc formulas: , kur: a = mazākā pīķa augstums, mērot no nulles līnijas; b = zemākā punkta augstums minimumā starp diviem blakusesošiem pīķiem, mērot no nulles līnijas. ▼B 1. zīmējums Hromatogramma teorētisko šķīvju skaita (efektivitātes) un izšķirtspējas noteikšanai Ir jāizvēlas tādi darba apstākļi, kas metilstearātam dod vismaz 2 000 teorētiskos šķīvjus uz kolonnas garuma metru un izšķirtspēju vismaz 1,25.

4.2. Analīzes paraugs

Ar šļirci (3.2. punkts) ņem 0,1 līdz 2 μl metilesteru šķīduma, kas sagatavots saskaņā ar X B pielikumu un iešļircina to kolonnā.

Ja esteri nav šķīdumā, sagatavo 100 mg/ml šķīduma heptānā, kas ir hromatogrāfijas kvalitātes, un iešļircina 0,1 līdz 1 μl šā šķīduma.

Ja analizē sastāvdaļas, kas ir klāt tikai zīmju daudzumos, analīzes paraugu var palielināt (līdz 10 reizēm).

4.3. Analīze

Parasti darba apstākļi ir tādi, kā definēts 4.1.1. punktā.

Tomēr ir iespējams strādāt zemākā kolonnas temperatūrā, ja ir jānosaka taukskābes ar mazāk nekā 12 oglekļa atomiem, vai augstākā temperatūrā, ja nosaka taukskābes ar vairāk nekā 20 oglekļa atomiem. Abos šajos gadījumos ir iespējams izmantot temperatūras programmēšanu. Piemēram, ja paraugs satur taukskābju metilesterus ar mazāk nekā 12 oglekļa atomiem, paraugu iešļircina 100 °C temperatūrā (vai 50 līdz 60 °C temperatūrā, ja klāt ir sviestskābe) un nekavējoties paaugstina temperatūru ar ātrumu 4 līdz 8 °C/min. līdz optimālajai. Dažos gadījumos var apvienot abas procedūras.

Pēc programmētās sildīšanas turpina eluēšanu nemainīgā temperatūrā, līdz ir eluēti visi komponenti. Ja aparātam nav programmētas sildīšanas, to izmanto divās nemainīgās temperatūrās starp 100 un 195 °C.

Ir ieteicams vajadzības gadījumā izdarīt analīzi uz divām nekustīgajām fāzēm ar dažādu polaritāti, lai pārbaudītu, vai nav klāt maskēti pīķi, piemēram, ja vienā paraugā ir klāt konjugēti C18:3 un C20:0, vai C18:3 un C18:2.

4.4. Standarthromatogrammas un standartdiagrammu pagatavošana

Analizē salīdzināšanas standartmaisījumu (2.3. punkts) tajos pašos darba apstākļos kā tie, kas izmantoti paraugam, un izmēra sastāvdaļu taukskābju aiztures laikus vai aiztures attālumus. Uz puslogaritmiskā diagrammu papīra katrai nepiesātinātības pakāpei izveido diagrammu, kas rāda aiztures laika vai attāluma logaritmu kā oglekļa atomu skaita funkciju. Izotermiskos apstākļos diagrammām par taisnas virknes skābēm ar vienu un to pašu nepiesātinātības pakāpi jābūt ar taisnām līnijām. Šīm līnijām jābūt aptuveni paralēlām.

Ir noteikti jāizvairās no analīzes apstākļiem, kuros pastāv “maskētie pīķi”, t.i., kuros izšķirtspēja nav pietiekama, lai sadalītu divas sastāvdaļas.

5. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

5.1. Kvalitatīvā analīze

Metilesteru pīķus paraugā identificē no 4.4. punktā pagatavotās diagrammas, vajadzības gadījumā interpolējot.

5.2. Kvantitatīvā analīze

5.2.1. Sastāva noteikšana

Izņemot īpašus gadījumus, izmanto iekšējās normalizācijas metodi, t. i., pieņem, ka visu parauga komponentu kopums ir pārstāvēts hromatogrammā tā, ka zem pīķiem esošo laukumu kopsumma ir 100 % no sastāvdaļām (pilnīga eluēšana).

Ja iekārtai ir integrators, izmanto skaitļus, kas iegūti no tā. Ja integratora nav, nosaka zem katra pīķa esošo laukumu, reizinot pīķa augstumu ar tā platumu, kāds ir pusē no augstuma, un vajadzības gadījumā ņem vērā dažādas jutības pārslēgšanas reģistrēšanas laikā.

5.2.2. Aprēķinu metode

5.2.2.1. Vispārējs gadījums Aprēķina dotā komponenta i saturu, izteiktu metilesteru masas procentos, nosakot attiecīgā pīķa laukumu procentos attiecībā pret visu pīķu laukumu summu, izmantojot šādu formulu: kur: Ai ir pīķa laukums, kas atbilst komponentam i; A = visu piķu laukumu summa. Rezultātu nosaka līdz vienai zīmei aiz komata. 7. piezīme: šajā vispārējā gadījumā uzskata, ka uz relatīvajiem laukumiem pamatoto aprēķinu rezultāts pārstāv masas procentus. Ja šis pieņēmums nav pieļaujams, sk. 5.2.2.2. punktu.

5.2.2.2. Korekcijas koeficientu lietošana Dažos gadījumos, piemēram, tādu taukskābju klātbūtnē, kas satur mazāk par astoņiem oglekļa atomiem, vai tādu skābju klātbūtnē, kam ir otrējās grupas, ja izmanto siltumvadītspējas detektorus vai ja ir īpaši prasīta augstākā precizitātes pakāpe, ir jālieto korekcijas koeficienti, lai pīķu laukumu procentus pārvērstu komponentu masas procentos. Korekcijas koeficientus nosaka, izmantojot hromatogrammu, kas iegūta, analizējot zināma sastāva metilesteru standartmaisījumu darba apstākļos, identiskos ar parauga analīzes apstākļiem. Šim standartmaisījumam komponenta i masas procentus apraksta formula: kur: mi ir komponenta i masa standartmaisījumā; m ir dazādo komponentu masu summa standartmaisījumā. No standartmaisījuma (4.4. punkts) hromatogrammas šādi aprēķina komponenta i procentus (laukums/laukums): kur: Ai ir komponentam i atbilstošā pīķa laukums, A ir visu pīķu laukumu summa. Korekcijas koeficientu aprēķina šādi: Parasti korekcijas koeficientus izsaka attiecībā pret KC16, tātad relatīvie koeficienti kļūst Paraugā katra komponenta i saturs, izteikts metilesteru masas procentos, ir: Rezultātu nosaka līdz vienai zīmei aiz komata.

5.2.2.3. Iekšējā standarta lietošana Dažās analīzēs (piemēram, ja visas taukskābes nav kvantitatīvi jānosaka, kā tas ir gadījumā, ja skābes ar četriem vai sešiem oglekļa atomiem ir kopā ar skābēm, kurās ir 16 un 18 oglekļa atomi, vai ja ir jānosaka taukskābes absolūtais daudzums paraugā) ir jālieto iekšējais standarts. Bieži lieto taukskābes ar pieciem, 15 vai 17 oglekļa atomiem. Būtu jānosaka korekcijas koeficients (ja tāds ir) iekšējam standartam. Komponenta i masas procentus, izteiktus kā metilesterus, iegūst pēc formulas: kur: Ai ir komponentam i atbilstīgā pīķa laukums; As ir iekšējam standartam atbilstīgā pīķa laukums; K′i ir komponenta i korekcijas koeficients (attiecībā pret KC1); K′s ir iekšējā standarta korekcijas koeficients (attiecībā pret KC16); m ir noteikšanai ņemtā parauga masa miligramos; ms ir iekšējā standarta masa miligramos. Rezultātu nosaka līdz vienai zīmei aiz komata.

▼M2

6. ĪPAŠS GADĪJUMS — TAUKSKĀBJU TRANS — IZOMĒRU NOTEIKŠANA.

Ir iespējams noteikt trans — izomēru saturu taukskābēs ar oglekļa atomu skaitu no 10 līdz 24, atdalot metilesterus, izmantojot gāzu hromatogrāfijas kapilārās kolonnas ar īpatnējo polaritāti.

6.1. Kvarca kapilārā kolonna ar iekšējo diametru no 0,25 mm līdz 0,32 mm un garumu 50 m, pārklāta ar ciānpropisilikonu, pārklājuma kārtas biezums no 0,1 līdz 0,3 μm (veids SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 un līdzīga veida).

▼M21

6.2. Metilesterus sagatavo saskaņā ar XB pielikumā noteikto B procedūru. Taukvielas, kuru brīvais skābums ir lielāks par 3 %, vispirms jāneitralizē saskaņā ar VII pielikuma 5.1.1. punktu.

▼M2

6.3. Kopumā gāzu hromatogrāfiju veic šādos apstākļos: — kolonnas temperatūra noregulēta no 150 °C līdz 230 °C (piemēram, 165 °C uz 1