1991R2568 — LV — 04.08.2016 — 029.001

Šis dokuments ir tikai informatīvs, un tam nav juridiska spēka. Eiropas Savienības iestādes neatbild par tā saturu. Attiecīgo tiesību aktu un to preambulu autentiskās versijas ir publicētas Eiropas Savienības “Oficiālajā Vēstnesī” un ir pieejamas datubāzē “Eur-Lex”. Šie oficiāli spēkā esošie dokumenti ir tieši pieejami, noklikšķinot uz šajā dokumentā iegultajām saitēm

Grozīta ar:







(*) Šis tiesību akts nekad nav publicēts latviešu valodā.









▼B

KOMISIJAS REGULA (EEK) Nr. 2568/91

(1991. gada 11. jūlijs)

par olīveļļas un olīvu izspaidu eļļas īpašībām un attiecīgajām analīzes metodēm







▼M20

1. pants

1. Eļļas, kuru īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 1. un 2. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par neapstrādātām olīveļļām Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 1. punkta a) un b) apakšpunkta nozīmē.

2. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 3. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par spīdīgo olīveļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 1. punkta c) apakšpunkta nozīmē.

3. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 4. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par rafinētu olīveļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 2. punkta nozīmē.

4. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 5. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par olīveļļu, kas sastāv no rafinētām olīveļļām un neapstrādātām olīveļļām Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 3. punkta nozīmē.

5. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 6. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par neapstrādātu olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 4. punkta nozīmē.

6. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 7. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par rafinētu olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 5. punkta nozīmē.

7. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 8. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 6. punkta nozīmē.

▼M26

2. pants

1. Eļļas īpašības, kas paredzētas I pielikumā, nosaka saskaņā ar šādām analīzes metodēm:

a) brīvās taukskābes, ko izsaka oleīnskābes procentos, nosaka ar II pielikumā izklāstīto metodi;

b) peroksīda skaitli nosaka ar III pielikumā izklāstīto metodi;

c) vaska saturu nosaka ar IV pielikumā izklāstīto metodi;

d) sterīnu un triterpēndiolu sastāvu un saturu nosaka ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju saskaņā ar V pielikumā izklāstīto metodi;

e) 2-glicerilmonopalmitāta saturu nosaka ar VII pielikumā izklāstīto metodi;

f) spektrofotometriskajai analīzei izmanto IX pielikumā izklāstīto metodi;

▼M28

g) taukskābju sastāvu nosaka ar X pielikumā izklāstīto metodi;

▼M26

h) gaistošos halogenētos šķīdinātājus nosaka ar XI pielikumā izklāstīto metodi;

i) neapstrādātas olīveļļas organoleptisko īpašību novērtēšanai izmanto XII pielikumā izklāstīto metodi;

j) stigmastadiēnus nosaka ar XVII pielikumā izklāstīto metodi;

k) triglicerīdu sastāva noteikšanai ar ECN42 izmanto XVIII pielikumā izklāstīto metodi;

▼M28

l) alifātisko spirtu un triterpēnspirtu saturu nosaka ar XIX pielikumā izklāstīto metodi;

▼M26

m) vasku, taukskābju metilesteru un taukskābju etilesteru saturu nosaka ar XX pielikumā izklāstīto metodi.

▼M28 —————

▼M26

2. Valstu iestāžu vai to pārstāvju pārbaudes attiecībā uz neapstrādātu eļļu organoleptiskajām īpašībām īsteno dalībvalstu apstiprinātas degustētāju žūrijas.

Pirmajā daļā minētās eļļas organoleptiskās īpašības atzīst par atbilstīgām deklarētajai kategorijai, ja dalībvalsts apstiprinātā žūrija apliecina eļļas šķiru.

Ja žūrija deklarēto kategoriju attiecībā uz organoleptiskajām īpašībām neapliecina, pēc ieinteresētās personas pieprasījuma valsts iestādes vai to pārstāvji nekavējoties veic divus kontrolnovērtējumus, ko īsteno citas apstiprinātas žūrijas, un vismaz vienu kontrolnovērtējumu, kuru īsteno attiecīgās ražotājas dalībvalsts apstiprināta žūrija. Attiecīgās īpašības atzīst par atbilstīgām deklarētajām īpašībām, ja vismaz divi kontrolnovērtējumi apstiprina deklarēto šķiru. Ja tas tā nav, ieinteresētā persona sedz kontrolnovērtējumu izmaksas.

3. Kad valstu iestādes vai to pārstāvji pārbauda eļļas īpašības atbilstīgi 1. punktam, paraugus ņem saskaņā ar starptautisko standartu EN ISO 661 par paraugu sagatavošanu analīzēm un EN ISO 5555 par paraugu ņemšanu. Tomēr neatkarīgi no standarta EN ISO 5555 6.8. punkta, ja šādas eļļu partijas ir tiešajā iepakojumā, paraugu ņem saskaņā ar šīs regulas Ia pielikumu. Nefasētas eļļas gadījumā, kad paraugus nevar noņemt saskaņā ar EN ISO 5555, tos ņem saskaņā ar dalībvalsts kompetentās iestādes norādījumiem.

Neskarot standartu EN ISO 5555 un standarta EN ISO 661 6. nodaļu, noņemtos paraugus pēc iespējas ātrāk novieto tumšā vietā, nepieļaujot spēcīgu karstuma avotu iedarbību, un nosūta uz laboratoriju analīzes veikšanai ne vēlāk kā piektajā darbdienā pēc to noņemšanas, pretējā gadījumā paraugus glabā tā, lai nepazeminātos to kvalitāte vai lai tie netiktu sabojāti transportēšanas vai glabāšanas laikā pirms nosūtīšanas uz laboratoriju.

4. Lai veiktu 3. punktā paredzētās pārbaudes, II, III, IX, XII un XX pielikumā minētās analīzes un, attiecīgā gadījumā, visas kontrolanalīzes, kas nepieciešamas saskaņā ar valsts tiesību aktiem, iepakotu produktu gadījumā veic pirms minimālā derīguma termiņa beigām. Ja paraugus ņem no nefasētas eļļas, šīs analīzes veic ne vēlāk kā sestajā mēnesī pēc mēneša, kurā ņemts paraugs.

Citām šajā regulām paredzētajām analīzēm laika ierobežojumu nepiemēro.

Ja analīžu rezultāti neatbilst olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas deklarētās kategorijas īpašībām, attiecīgajai personai paziņo ne vēlāk kā vienu mēnesi pirms pirmajā daļā noteiktā perioda beigām, ja vien paraugs netika ņemts mazāk nekā divus mēnešus pirms minimālā derīguma termiņa.

5. Lai noteiktu olīveļļu īpašības ar 1. punkta pirmajā daļā paredzētajām metodēm, analīžu rezultātus tieši salīdzina ar šajā regulā noteiktajām robežvērtībām.

▼M25

2.a pants

1. Šajā pantā jēdziens “pārdotā olīveļļa” nozīmē to attiecīgās dalībvalsts olīveļļas un olīvu izspaidu eļļas kopējo daudzumu, kas ir patērēts šajā dalībvalstī vai eksportēts no šīs dalībvalsts.

2. Dalībvalstis nodrošina, ka atbilstības pārbaudes notiek izlases veidā, pamatojoties uz riska analīzi, un pietiekami bieži, lai nodrošinātu, ka pārdotā olīveļļa atbilst deklarētajai kategorijai.

3. Kritēriji riska novērtēšanai var būt šādi:

a) eļļas kategorija, ražošanas periods, eļļas cena salīdzinājumā ar citu augu eļļu cenu, jaukšanas un iepakošanas operācijas, glabātavas un glabāšanas apstākļi, izcelsmes valsts, galamērķa valsts, transporta veids vai partijas apjoms;

b) uzņēmumu pozīcija tirgus ķēdē, uzņēmumu tirgotās produkcijas apjoms un/vai vērtība, tirgoto eļļas kategoriju klāsts, veiktā saimnieciskā darbība, piemēram, malšana, glabāšana, rafinēšana, sajaukšana, iepakošana vai mazumtirdzniecība;

c) iepriekšējo pārbaužu rezultāti, tai skaitā atklāto defektu skaits un veids, pārdotās eļļas parastā kvalitāte, izmantotā tehniskā aprīkojuma līmenis;

d) uzņēmumu kvalitātes nodrošinājuma sistēmu vai pašpārbaudes sistēmu uzticamība attiecībā uz atbilstību tirdzniecības standartiem;

e) pārbaudes norises vieta, jo īpaši, ja tā ir pirmā produkcijas ievešanas vieta Savienībā, pēdējā izvešanas vieta no Savienības vai vieta, kur notiek eļļu ražošana, iepakošana, iekraušana vai pārdošana galapatērētājam;

f) visa citu informācija, kas var liecināt par neatbilstības risku.

4. Dalībvalstis jau iepriekš nosaka:

a) kritērijus partiju neatbilstības riska noteikšanai;

b) pamatojoties uz riska analīzi katrai riska kategorijai, minimālo uzņēmumu skaitu vai partiju skaitu un/vai daudzumu, kam veiks atbilstības pārbaudi.

Gadā veic vismaz vienu atbilstības pārbaudi katrām tūkstoš tonnām olīveļļas, ko pārdod dalībvalstī.

5. Dalībvalstis atbilstību pārbauda:

a) jebkādā kārtībā veicot analīzes, kas paredzētas I pielikumā; vai

b) ievērojot kārtību, kas izklāstīta I.b pielikumā par lēmumu pieņemšanas shēmu, līdz pieņem vienu no lēmumiem, kas iekļauts lēmumu pieņemšanas shēmā.

▼M19 —————

▼M25

3. pants

Ja konstatē, ka kāda eļļa neatbilst tās kategorijas aprakstam, attiecīgā dalībvalsts, neskarot jebkādas citas sankcijas, piemēro efektīvas, samērīgas un preventīvas sankcijas, kas nosakāmas atkarībā no atklātā pārkāpuma smaguma.

Ja pārbaudēs konstatē būtiskus pārkāpumus, dalībvalstis palielina pārbaužu biežumu attiecībā uz pārdošanas posmu, eļļas kategoriju, izcelsmi vai citiem kritērijiem.

▼M5

4. pants

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Ja dalībvalstīm rodas grūtības izveidot savā teritorijā degustēšanas žūrijas, tās var pieaicināt degustēšanas žūriju, kas apstiprināta kādā citā dalībvalstī.

3. Katra dalībvalsts izveido degustētāju žūriju sarakstu, ko veido profesionālās vai starpnozaru organizācijas saskaņā ar 1. punktā izklāstītajiem nosacījumiem, un nodrošina šo nosacījumu izpildi.

▼M19 —————

▼B

6. pants

1. Raušu un citu olīveļļas ieguves izspaidu (KN kodi 2306 90 11 un 2306 90 19 ) eļļas saturu nosaka ar XV pielikumā izklāstīto metodi.

2. Šā panta 1. punktā minēto eļļas saturu izsaka eļļas svara procentos no sausā materiāla svara.

▼M20

7. pants

Piemēro Kopienas noteikumus, kas attiecas uz piemaisījumu klātbūtni.

Attiecībā uz halogenētiem šķīdinātājiem ierobežojumi visām olīveļļu kategorijām ir šādi:

— katra konstatētā halogenētā šķīdinātāja maksimālais saturs: 0,1 mg/kg,

— konstatēto halogenēto šķīdinātāju kopējais maksimālais saturs: 0,2 mg/kg.

▼M25

7.a pants

Fiziskām vai juridiskām personām vai personu grupām, kas jebkādos profesionālos vai komerciālos nolūkos glabā olīveļļu un olīvu izspaidu eļļu ražošanas posmos no eļļas ekstrakcijas spiestuvē līdz tās iepildīšanai pudelēs (ieskaitot), ir jākārto ievešanas un izvešanas reģistrs par katru šādu eļļas kategoriju.

Dalībvalsts nodrošina, ka pirmajā daļā paredzētais pienākums tiek pienācīgi pildīts.

▼M25

8. pants

1. Dalībvalstis paziņo Komisijai par šīs regulas īstenošanas pasākumiem. Tās informē Komisiju par visiem turpmākajiem grozījumiem.

2. Ne vēlāk kā katra gada 31. maijā dalībvalstis nosūta Komisijai ziņojumu par šīs regulas piemērošanu iepriekšējā kalendāra gada laikā. Ziņojumā iekļauj vismaz olīveļļas atbilstības pārbaužu rezultātus saskaņā ar XXI pielikumā ietverto paraugu.

3. Šajā Regulā minētos paziņojumus sniedz saskaņā ar Komisijas Regulu (EK) Nr. 792/2009 ( 1 ).

▼B

9. pants

Ar šo ir atcelta Regula (EEK) Nr. 1058/77.

10. pants

1. Šī regula stājas spēkā trešajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Kopienu Oficiālajā Vēstnesī.

Tomēr XII pielikumā izklāstīto metodi piemēro ►M1 no 1992. gada 1. novembra ◄ , ja vien darbības neattiecas uz intervences sistēmu.

▼M5

Metode neattiecas uz neapstrādātu olīveļļu, kas sagatavota tirgum pirms 1992. gada 1. novembra.

▼B

2. Šo regulu nepiemēro olīveļļai un olīvu izspaidu eļļai, kas ir iepakota pirms šīs regulas stāšanās spēkā un laista tirgū līdz 1992. gada 31. oktobrim.

Šī regula ir saistoša kopumā un tieši piemērojama visās dalībvalstīs.









PIELIKUMI

Kopsavilkums







I pielikums Olīveļļas īpašības Ia pielikums Paraugu ņemšana no olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas, kas piegādāta tiešā iepakojumā Ib pielikums Lēmumu pieņemšanas shēma, lai pārbaudītu to, vai olīveļļas paraugs atbilst deklarētajai kategorijai II pielikums Brīvo taukskābju noteikšana pēc aukstās metodes III pielikums Peroksīda skaitļa noteikšana IV pielikums Vasku satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju V pielikums Sterīnu un triterpēndiolu sastāva un satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju VII pielikums ►M21 2-glicerilmonopalmitāta satura noteikšana ◄ ▼M20 ————— ▼B IX pielikums Spektrofotometriskā analīze uv spektrā ▼M28 X pielikums Taukskābju metilesteru noteikšana ar gāzu hromatogrāfiju ▼B XI pielikums Gaistošo halogenēto šķīdinātāju noteikšana olīveļļā XII pielikums Starptautiskās olīvu padomes metode, ko piemēro neapstrādātas olīveļļas organoleptiskajai novērtēšanai ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B XV pielikums Eļļas saturs olīvu izspaidās XVI pielikums Joda skaitļa noteikšana XVII pielikums Stigmastadiēnu noteikšanas metode augu eļļās XVIII pielikums Faktiskā un teorētiskā triglicerīdu ar ECN 42 satura starpības noteikšana XIX pielikums ►M28 Alifātisko spirtu un triterpēnspirtu satura noteikšana, izmantojot gāzu hromatogrāfiju ar kapilāro kolonnu ◄ ▼M23 XX pielikums Vasku, taukskābju metilesteru un taukskābju etilesteru satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfijas metodi ▼M28 ————— ▼M25 XXI pielikums Saskaņā ar 8. panta 2. punktu veikto olīveļļas atbilstības pārbaužu rezultāti

▼M27









I PIELIKUMS

OLĪVEĻĻAS ĪPAŠĪBAS







Kategorija Taukskābju etilesteri (FAEE) (*) Skābums (%) (*) Peroksīda skaitlis mEq O2/kg (*) Vaski mg/kg (**) 2-glicerilmonopalmitāts (%) Stigmastadiēni mg/kg (1) Starpība: ECN42 (HPLC) un ECN42 (teorētiski aprēķinātā) K232 (*) K268 vai K270 (*) Delta-K (*) Organoleptiskais novērtējums Defektu mediāna (Md) (*) Organoleptiskais novērtējums Augļainuma mediāna (Mf) (*) 1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa FAEE ≤ 40 mg/kg (2013.–2014. ražas gads) (2) FAEE ≤ 35 mg/kg (2014.–2016. ražas gads) FAEE ≤ 30 mg/kg (pēc 2016. ražas gada) ≤ 0,8 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9, ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0, ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 2. Neapstrādāta olīveļļa — ≤ 2,0 ≤ 20 C42 + C44 + C46 ≤ 150 ≤ 0,9, ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % ≤ 0,05 ≤ |0,2| ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0, ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 3. Spīdīgā olīveļļa — > 2,0 — C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (3) ≤ 0,9, ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ |0,3| — — — Md > 3,5 (4) — ≤ 1,1, ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 4. Rafinēta olīveļļa — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9, ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1, ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 5. Rafinētas un neapstrādātas olīveļļas maisījums — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 ≤ 0,9, ja palmitīnskābes kop. saturs % ≤ 14 % — ≤ |0,3| — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0, ja palmitīnskābes kop. saturs % > 14 % 6. Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa — — — C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (5) ≤ 1,4 — ≤ |0,6| — — — — — 7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa — ≤ 0,3 ≤ 5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,4 — ≤ |0,5| — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olīvu izspaidu eļļa — ≤ 1,0 ≤ 15 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 ≤ 1,2 — ≤ |0,5| — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Kapilārajā kolonnā atdalāmo (vai neatdalāmo) izomēru summa. (2) Robežvērtība attiecas uz olīveļļām, kas ražotas no 2014. gada 1. marta. (3) Eļļas ar vasku saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg tiek uzskatītas par spīdīgajām olīveļļām, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir mazāks par vai vienāds ar 350 mg/kg vai ja eritrodiola un uvaola saturs ir mazāks vai vienāds ar 3,5 %. (4) Defektu mediāna var būt mazāka par vai vienāda ar 3,5 un augļainuma mediāna ir vienāda ar 0. (5) Eļļas ar vaska saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par neattīrītu olīvu izspaidu eļļām, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir lielāks par 350 mg/kg un ja eritrodiola un uvaola saturs ir lielāks par 3,5 %.







Kategorija Taukskābju sastāvs (1) Kopā transoleīnskābes izomēri (%) Kopā translinolskābes un translinolēnskābes izomēri (%) Sterīnu sastāvs Kopā sterīni (mg/kg) Eritrodiols un uvaols (%) (**) Miristīnskābe (%) Linolēnskābe (%) Arahīnskābe (%) Eikozānskābe (%) Behenskābe (%) Lignocerīnskābe (%) Holesterīns (%) Brasikasterīns (%) Kampesterīns (2) (%) Stigmasterīns (%) Nosac. βbetasitosterīns (3) (%) (**) Delta-7- stigmastenols (2) (%) 1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Neapstrādāta olīveļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Spīdīgā olīveļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (4) 4. Rafinēta olīveļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Rafinētas un neapstrādātas olīveļļas maisījums ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (5) 7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,40 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Pārējo tauksābju saturs (%) palmitīnskābe: 7,50–20,00; palmitoleīnskābe: 0,30–3,50; heptadekanoinskābe: ≤ 0,30; heptadecēnskābe: ≤ 0,30; stearīnskābe: 0,50–5,00; oleīnskābe: 55,00–83,00; linolēnskābe: 2,50–21,00. (2) Skatīt šā pielikuma papildinājumu. (3) Nosac. β-sitosterīns: delta-5,23-stigmastadienols + klerosterīns + beta-sitosterīns + sitostanols + delta-5-avenasterīns + delta-5,24-stigmastadienols. (4) Eļļas ar vasku saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg tiek uzskatītas par spīdīgajām olīveļļām, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir mazāks par vai vienāds ar 350 mg/kg vai ja eritrodiola un uvaola saturs ir mazāks vai vienāds ar 3,5 %. (5) Eļļas ar vaska saturu no 300 mg/kg līdz 350 mg/kg uzskata par neattīrītu olīvu izspaidu eļļām, ja alifātisko spirtu kopējais saturs ir lielāks par 350 mg/kg vai ja eritrodiola un uvaola saturs ir lielāks par 3,5 %

Piezīmes

(a) Analīžu rezultāti jāuzrāda ar tādu pašu decimālzīmju skaitu aiz komata kā attiecīgās īpašības skaitliskā vērtība. Pēdējais cipars jānoapaļo uz augšu, ja nākamais cipars, kas jāatmet, ir lielāks par 4.

(b) Ja kaut viena īpašība neatbilst tai norādītajai vērtībai, šīs regulas piemērošanas vajadzībām var mainīt eļļas kategoriju vai deklarēt to par neattīrītu.

(c) Ja īpašība ir atzīmēta ar zvaigznīti (*), tad attiecībā uz eļļas kvalitāti tas nozīmē šo: spīdīgajai olīveļļai ir iespējams, ka abas attiecīgās robežvērtības vienlaikus atšķiras no noteiktajām; neapstrādātajām olīveļļām, ja vismaz viena no šīm robežvērtībām atšķiras no noteiktajām vērtībām, tiks mainīta eļļas kategorija, lai gan tā joprojām jāklasificē vienā no neapstrādātas olīveļļas kategorijām.

(d) Ja īpašība ir atzīmēta ar divām zvaigznītēm (**), attiecībā uz eļļas kvalitāti tas nozīmē, ka visu veidu olīvu izspaidu eļļām ir iespējams, ka abas attiecīgās robežvērtības vienlaikus atšķiras no noteiktajām.









Papildinājums

LĒMUMU PIEŅEMŠANAS SHĒMA

Kampesterīna lēmumu pieņemšanas shēma attiecībā uz neapstrādātu olīveļļu un neapstrādātu augstākā labuma olīveļļu.

Pārējie parametri atbilst šajā regulā noteiktajām robežvērtībām.

Delta-7-stigmastenola lēmumu pieņemšanas shēma attiecībā uz:

— neapstrādātu augstākā labuma olīveļļu un neapstrādātu olīveļļu —

Pārējie parametri atbilst šajā regulā noteiktajām robežvērtībām.

— olīvu izspaidu eļļu (neattīrītu un rafinētu) —

▼M26









Ia PIELIKUMS

PARAUGU ŅEMŠANA NO OLĪVEĻĻAS VAI OLĪVU IZSPAIDU EĻĻAS, KAS PIEGĀDĀTA TIEŠĀ IEPAKOJUMĀ

Šo paraugu ņemšanas metodi piemēro olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas partijām, kas iesaiņotas tiešā iepakojumā. Atkarībā no tā, vai tiešā iepakojuma tilpums pārsniedz vai nepārsniedz 5 litrus, piemēro atšķirīgas paraugu ņemšanas metodes.

“Partija” ir tādu pārdošanas vienību kopums, kas ražotas, izgatavotas un iepakotas tādos apstākļos, ka eļļu, kuru satur katra pārdošanas vienība, attiecībā uz visām analītiskajām īpašībām uzskata par viendabīgu. Partijas individualizēšana ir jāveic saskaņa ar Eiropas Parlamenta un Padomes Direktīvu 2011/91/ES ( 2 ).

“Parauga vienība” ir eļļas daudzums, ko satur tiešais iepakojums un kas paņemts no nejauši izvēlētas partijas vietas.

1. PRIMĀRO PARAUGU SATURS

1.1. Tiešais iepakojums, kura tilpums nepārsniedz 5 litrus

“Primārais paraugs” no tiešā iepakojuma, kura tilpums nepārsniedz 5 litrus, ir parauga vienības, kas paņemtas no partijas atbilstīgi 1. tabulai.







1. tabula Primārā parauga minimālajam lielumam jāatbilst turpmāk norādītajam Ja tiešā iepakojuma tilpums ir Primārajā paraugā jābūt eļļai no a) 1 litrs vai vairāk a) 1 tiešā iepakojuma b) mazāk par 1 litru b) minimālā skaita iepakojumu ar kopējo tilpumu vismaz 1,0 litrs

Katra dalībvalsts atkarībā no savām vajadzībām (piemēram, organoleptiskajam novērtējumam citā laboratorijā, nevis tajā, kas veica ķīmisko analīzi, kontrolanalīzi utt.) var palielināt 1. tabulā minēto iepakojumu skaitu, kurš veido primāro paraugu.

1.2. Tiešais iepakojums, kura tilpums pārsniedz 5 litrus

“Primārais paraugs” no tiešā iepakojuma, kura tilpums pārsniedz 5 litrus, ir visu parauga vienību reprezentatīva daļa, kas iegūta samazināšanas procesā atbilstīgi 2. tabulai. Primārajā paraugā ir jābūt vairākiem piemēriem.

Primārā parauga “piemērs” ir ikviens iepakojums, kas ietilpst primārajā paraugā.







2. tabula Atlasāmo parauga vienību minimālais skaits Iepakojumu skaits sērijā Atlasāmo parauga vienību minimālais skaits Līdz 10 1 No … 11 līdz 150 2 No … 151 līdz 500 3 No … 501 līdz 1 500 4 No … 1 501 līdz 2 500 5 > 2 500 ; uz 1 000 iepakojumiem vēl 1 parauga vienība

Lai samazinātu tiešo iepakojumu parauga tilpumu, parauga vienību saturu homogenizē, lai sagatavotu primāro paraugu. Dažādu parauga vienību porcijas, pēc iespējas labāk aizsargājot no gaisa ietekmes, ielej kopīgā tvertnē, kurā tās maisot homogenizē.

Primārā parauga saturs ir jāielej vairākos iepakojumos ar minimālo tilpumu 1,0 litrs, un katrs no tiem ir primārā parauga piemērs.

Katra dalībvalsts atkarībā no savām vajadzībām (piemēram, organoleptiskajam novērtējumam citā laboratorijā, nevis tajā, kas veica ķīmisko analīzi, kontrolanalīzi utt.) var palielināt primāro paraugu skaitu.

Visi iepakojumi ir jāpiepilda tā, lai pēc iespējas samazinātu gaisa virsslāni, un atbilstīgi jānoslēdz un jāaizplombē, lai nodrošinātu produkta aizsardzību pret iejaukšanos.

Šie piemēri ir jāmērķē, lai nodrošinātu pareizu identificēšanu.

2. ANALĪZES UN REZULTĀTI

2.1. Katrs primārais paraugs ir jāsadala laboratorijas paraugos saskaņā ar standarta EN ISO 5555 2.5. punktu un jāanalizē Ib pielikumā izklāstītajā lēmumu pieņemšanas shēmā norādītajā kārtībā vai jebkurā citā izlases veida kārtībā.

2.2. Ja visi analīžu rezultāti atbilst eļļas deklarētās kategorijas īpašībām, visu partiju atzīst par atbilstīgu. Ja kaut viens analīžu rezultāts neatbilst eļļas deklarētās kategorijas īpašībām, visu partiju atzīst par neatbilstīgu.

3. PARTIJAS KATEGORIJAS PĀRBAUDE

3.1. Lai pārbaudītu partijas kategoriju, kompetentā iestāde saskaņā ar turpmāk norādīto tabulu var palielināt primāro paraugu skaitu, ko ņem no dažādām partijas vietām.



3. tabula Primāro paraugu skaits atkarībā no partijas lieluma Partijas lielums (litri) Primāro paraugu skaits Mazāk par 7 500 2 No 7 500 līdz mazāk par 25 000 3 No 25 000 līdz mazāk par 75 000 4 No 75 000 līdz mazāk par 125 000 5 125 000 un vairāk 6 + 1 par katriem nākamajiem 50 000 litriem Katra primārā parauga vienība ir jāņem no turpmākas vietas partijā; ir jāievēro katra primārā parauga vieta, un tā ir skaidri jāidentificē. Visi primārie paraugi ir jāsagatavo saskaņā ar 1.1. un 1.2. punktā minētajām procedūrām. Pēc tam katram primārajam paraugam veic 2. panta 1. punktā minētās analīzes.

3.2. Ja viens no 2. panta 1. punktā minēto analīžu rezultātiem attiecībā uz vismaz vienu primāro paraugu neatbilst eļļas deklarētās kategorijas īpašībām, visu partiju atzīst par neatbilstīgu.









Ib PIELIKUMS

LĒMUMU PIEŅEMŠANAS SHĒMA, LAI PĀRBAUDĪTU TO, VAI OLĪVEĻĻAS PARAUGS ATBILST DEKLARĒTAJAI KATEGORIJAI

1. tabula

2. tabula

3. tabula









1. papildinājums







Šīs regulas pielikumu un lēmumu pieņemšanas shēmā norādīto analīžu atbilstības tabula — Skābums II pielikums Brīvo taukskābju noteikšana pēc aukstās metodes — Peroksīda skaitlis III pielikums Peroksīda skaitļa noteikšana — UV spektrometrija IX pielikums Spektrofotometriskā analīze — Organoleptiskais novērtējums XII pielikums Neapstrādātas olīveļļas organoleptiskā novērtēšana — Etilesteri XX pielikums Vasku, taukskābju metilesteru un taukskābju etilesteru satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfijas metodi — 3,5-stigmastadiēni XVII pielikums Stigmastadiēnu noteikšanas metode augu eļļās ▼M28 — Trans-izomēri taukskābēs X pielikums Taukskābju metilesteru noteikšana ar gāzu hromatogrāfiju — Taukskābju saturs X pielikums Taukskābju metilesteru noteikšana ar gāzu hromatogrāfiju ▼M26 — ΔECN42 XVIII pielikums Triglicerīdu sastāva noteikšana ar ECN42 (starpība starp HPLC datiem un teorētisko saturu) — Sterīnu sastāvs un kopējais saturs — Eritrodiols un uvaols V pielikums Sterīnu un triterpēndiolu sastāva un satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju — Vaski IV pielikums Vasku satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju ▼M28 — Alifātiskie spirti un triterpēnspirti XIX pielikums Alifātisko spirtu un triterpēnspirtu satura noteikšana, izmantojot gāzu hromatogrāfiju ar kapilāro kolonnu ▼M26 — Piesātinātās taukskābes 2. pozīcijā VII pielikums 2-glicerilmonopalmitāta satura noteikšana

▼M29









II PIELIKUMS

BRĪVO TAUKSKĀBJU NOTEIKŠANA PĒC AUKSTĀS METODES

1. MĒRĶIS UN PIEMĒROŠANAS JOMA

Ar šo metodi nosaka brīvās taukskābes olīveļļā un olīvu izspaidu eļļā. Brīvo taukskābju saturu izsaka kā skābumu, ko aprēķina oleīnskābes procentuālā satura veidā.

2. PRINCIPS

Paraugu izšķīdina šķīdinātāju maisījumā, un paraugā ietilpstošās brīvās skābes titrē ar kālija hidroksīda vai nātrija hidroksīda šķīdumu etanolā.

3. REAKTĪVI

Visiem reaktīviem ir jābūt atzītā analītiskā kvalitātē, bet izmantojamajam ūdenim jābūt vai nu destilētam, vai ūdenim ar līdzvērtīgu tīrības pakāpi.

3.1. Dietilēteris; etanols (95 tilp. %), maisījums vienādās tilpuma daļās. Maisījumu tieši pirms lietošanas neitralizēt ar kālija hidroksīda šķīdumu (3.2.), pievienojot uz 100 ml maisījuma 0,3 ml fenolftaleīna šķīduma (3.3.). 1. piezīme. Dietilēteris ir viegli uzliesmojošs un var veidot sprādzienbīstamus peroksīdus. To lietojot, ir jābūt īpaši piesardzīgiem. 2. piezīme. Ja nav iespējams lietot dietilēteri, var lietot šķīdinātāju maisījumu, kas sastāv no etanola un toluola. Vajadzības gadījumā etanolu var aizstāt ar 2-propanolu.

3.2. Kālija hidroksīds vai nātrija hidroksīds, titrēts etanola šķīdums vai ūdensšķīdums, c(KOH) [vai c(NaOH)] (aptuveni 0,1 mol/l) vai, ja vajadzīgs, c(KOH) [vai c(NaOH)] (aptuveni 0,5 mol/l). Tirdzniecībā pieejami lietošanai gatavi šķīdumi. Ir jābūt zināmai kālija hidroksīda šķīduma (vai nātrija hidroksīda šķīduma) etanolā precīzai koncentrācijai, un tā ir jāpārbauda tieši pirms lietošanas. Lietot šķīdumu, kas ir pagatavots vismaz piecas dienas pirms lietošanas un dekantēts brūna stikla pudelē ar gumijas aizbāzni. Šķīdumam jābūt bezkrāsainam vai iedzeltenam. Ja, izmantojot kālija hidroksīda vai nātrija hidroksīda ūdensšķīdumu, novērojama fāzu atdalīšanās, tad ūdensšķīdumu aizstāj ar etanola šķīdumu. 3. piezīme. Stabilu bezkrāsainu kālija hidroksīda (vai nātrija hidroksīda) šķīdumu var pagatavot šādi. Uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai 1 000 ml etanola vai ūdens ar 8 g kālija hidroksīda (vai nātrija hidroksīda) un 0,5 g alumīnija skaidiņu un vienu stundu vāra ar atteces dzesinātāju. Tūlīt pārdestilē. Destilātā izšķīdina vajadzīgo kālija hidroksīda (vai nātrija hidroksīda) daudzumu. Atstāj uz dažām dienām un dzidro supernatantu dekantē no kālija karbonāta (vai nātrija karbonāta) nogulsnēm. Šķīdumu var pagatavot arī bez destilācijas šādi: 1 000 ml etanola (vai ūdens) pievieno 4 ml alumīnija butilāta un maisījumu atstāj uz dažām dienām. Dekantē supernatantu un izšķīdina vajadzīgo daudzumu kālija hidroksīda (vai nātrija hidroksīda). Šķīdums ir gatavs lietošanai.

3.3. Fenolftaleīns, 10 g/l šķīdums 95–96 tilp. % etanolā, vai sārmainais zilais 6B vai timolftaleīns, 20 g/l šķīdums 95–96 tilp. % etanolā. Ja eļļa ir stipri krāsota, izmanto sārmaini zilo vai timolftaleīnu.

4. APARATŪRA

Parastais laboratoriju aprīkojums, tai skaitā:

4.1. analītiskie svari;

4.2. 250 ml koniskā kolba;

4.3. A klases 10 ml birete ar iedaļām līdz 0,05 ml vai līdzvērtīga automātiskā birete.

5. PROCEDŪRA

5.1. Analizējamā parauga sagatavošana

Ja paraugs ir duļķains, tas ir jāfiltrē.

5.2. Analīzes paraugs

Paraugu ņem atkarībā no paredzamā skābuma saskaņā ar šādu tabulu:







Paredzamais skābums (oleīnskābes saturs (g/100g)) Parauga masa (g) Svēršanas precizitāte (g) 0–2 10 0,02 > 2–7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Paraugu nosver koniskajā kolbā (4.2.).

5.3. Noteikšana

Paraugu (5.2. punkts) izšķīdina 50–100 ml iepriekš neitralizētā dietilētera un etanola maisījumā (3.1.).

Maisot titrē ar 0,1 mol/l kālija hidroksīda (vai nātrija hidroksīda) šķīdumu (3.2. punkts) (sk. 4. piezīmi), līdz indikatora krāsa mainās (iekrāsotā indikatora krāsa saglabājas vismaz 10 sekundes).

4. piezīme. Ja vajadzīgā 0,1 mol/l kālija hidroksīda (vai nātrija hidroksīda) šķīduma daudzums ir lielāks par 10 ml, lietot 0,5 mol/l šķīdumu vai mainīt parauga masu atkarībā no paredzamā brīvā skābuma un ierosinātās tabulas.

5. piezīme. Ja šķīdums titrēšanas laikā kļūst duļķains, pievienot pietiekami daudz šķīdinātāju maisījuma (3.1. punkts), lai šķīdums kļūtu dzidrs.

Otro noteikšanu veikt tikai tad, ja pirmais rezultāts ir lielāks nekā attiecīgajai eļļas kategorijai noteiktais ierobežojums.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Skābums, kas izteikts oleīnskābes masas procentos, ir vienāds ar:

kur:

V = izlietotā titrētā kālija hidroksīda (vai nātrija hidroksīda) tilpums mililitros;

c = izlietotā titrētā kālija hidroksīda (vai nātrija hidroksīda) precīzā koncentrācija molos litrā;

M = 282 g/mol, oleīnskābes molmasa gramos molā;

m = analīzes parauga masa gramos.

Oleīnskābes saturs tiek norādīts, kā minēts turpmāk:

a) ar precizitāti līdz divām zīmēm aiz komata, vērtības no 0 līdz 1 ieskaitot;

b) ar precizitāti līdz vienai zīmei aiz komata, vērtības no 1 līdz 100 ieskaitot.

▼B









III PIELIKUMS

PEROKSĪDA SKAITĻA NOTEIKŠANA

1. DARBĪBASJOMA

Šis standarts apraksta eļļu un tauku peroksīda skaitļa noteikšanas metodi.

2. IZMANTOŠANASJOMA

Šis standarts ir piemērojams dzīvnieku un augu eļļām un taukiem.

3. DEFINĪCIJA

Peroksīda skaitlis ir to vielu daudzums paraugā, izteikts aktīvā skābekļa miliekvivalentos kilogramā, kuras oksidē kālija jodīdu aprakstītajos eksperimenta apstākļos.

4. PRINCIPS

Analīzes parauga apstrāde ar kālija jodīda šķīdumu etiķskābes un hloroforma šķīdumā. Atbrīvotā joda titrēšana ar standartizētu nātrija tiosulfāta šķīdumu.

5. APARATŪRA

Visam aprīkojumam jābūt brīvam no reducējošām vai oksidējošām vielām.

Piezīme: slīpētās virsmas nav jāeļļo.

5.1. 3 ml stikla svēršanas laiviņa.

5.2. Aptuveni 250 ml kolbas ar pieslīpētiem kakliem un aizbāžņiem, iepriekš izžāvētas un piepildītas ar sausu inertu gāzi (slāpekli vai, labāk, oglekļa dioksīdu).

5.3. 25 vai 50 ml birete, graduēta ik pa 0,1 ml.

6. REAKTĪVI

6.1. Hloroforms, kam ir analītiska reaktīva kvalitāte, atbrīvots no skābekļa, burbuļojot tam cauri tīras inertas gāzes straumīti.

6.2. Ledus etiķskābe, kam ir analītiska reaktīva kvalitāte, atbrīvota no skābekļa, burbuļojot tai cauri tīras, sausas inertas gāzes straumīti.

6.3. Kālija jodīda piesātināts ūdens šķīdums, nesen pagatavots, kas nesatur jodu un jodātus.

6.4. Nātrija tiosulfāta precīzi standartizēts 0,01 vai 0,002 N ūdens šķīdums, standartizēts tieši pirms lietošanas.

6.5. Cietes šķīdums, 10 g/l ūdens dispersija, nesen pagatavota no dabiskās šķīstošās cietes.

7. PARAUGS

Pievērš vērību, lai paraugu paņemtu un glabātu tumsā, turētu aukstumā un pilnīgi piepildītos stikla traukos, kas ir hermētiski noslēgti ar pieslīpētiem stikla vai korķa aizbāžņiem.

8. PROCEDŪRA

Analīzi izdara izkliedētā dienasgaismā vai mākslīgā apgaismojumā. Analizējamo paraugu ar precizitāti līdz tuvākajam 0,001 g nosver svēršanas laiviņā (5.1. punkts) vai, ja tādas nav, kolbā (5.2. punkts) saskaņā ar šādu tabulu atbilstīgi sagaidāmajam peroksīda skaitlim:







Sagaidāmais peroksīda skaitlis (mekv.) Analizējamā parauga masa (g) 0 līdz 12 5,0 līdz 2,0 12 līdz 20 2,0 līdz 1,2 20 līdz 30 1,2 līdz 0,8 30 līdz 50 0,8 līdz 0,5 50 līdz 90 0,5 līdz 0,3

Atver kolbu (5.2. punkts) un tajā ieliek stikla svēršanas laiviņu ar analīzes paraugu. Pievieno 10 ml hloroforma (6.1. punkts). Ātri maisot, analīzes paraugu izšķīdina. Pievieno 15 ml etiķskābes (6.2. punkts), pēc tam pievieno 1 ml kālija jodīda šķīduma (6.3. punkts). Nekavējoties aizkorķē, vienu minūti krata un atstāj tieši piecas minūtes tumšā vietā 15 līdz 25 °C temperatūrā.

Pievieno aptuveni 75 ml destilēta ūdens. Enerģiski kratot, izdalījušos jodu titrē ar nātrija tiosulfāta šķīdumu (6.4. punkts) (0,002 N šķīduma, ja sagaidāmie lielumi ir mazāki par 12, un 0,01 N šķīduma, ja sagaidāmie lielumi ir lielāki par 12), izmantojot par indikatoru cietes šķīdumu (6.5. punkts).

Vienam analizējamam paraugam izdara divas noteikšanas.

Vienlaikus izdara tukšo mēģinājumu. Ja tukšā mēģinājuma rezultāts pārsniedz 0,05 ml 0,01 N nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts), tad nomaina netīros reaktīvus.

9. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Peroksīda skaitli (PV), izteiktu aktīvā skābekļa miliekvivalentos kilogramā, aprēķina pēc formulas:

kur:

V = standartizēta nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts) ml skaits, kas izlietoti analīzē, kas ir koriģēts, lai ņemtu vērā tukšo mēģinājumu;

T = lietotā nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts) precīzā normalitāte;

m = analīzes parauga masa gramos.

Rezultāts ir divu izdarīto noteikšanu aritmētiskais vidējais.

▼M21









IV PIELIKUMS

VASKU SATURA NOTEIKŠANA AR KAPILĀRĀS KOLONNAS GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. IZMANTOŠANAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta vasku satura noteikšana olīveļļās. Vaskus sadala pēc oglekļa atomu skaita molekulā. Šo metodi var jo īpaši izmantot, lai atšķirtu ar spiešanas paņēmienu iegūtu olīveļļu no olīvu izspaidu eļļas, ko iegūst pēc ekstrakcijas paņēmiena.

2. PRINCIPS

Taukiem vai eļļai pievieno piemērotu iekšējo standartu, pēc tam hromatogrāfiski sadala hidrēta silikagela kolonnā. Testēšanas apstākļos iegūst frakciju, kas eluējas vispirms (kas satur savienojumus, kuru polaritāte ir mazāka nekā triglicerīdiem), un to tieši analizē ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA

3.1. 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba

3.2. Stikla kolonna gāzes hromatogrāfijai, iekšējais diametrs 15,0 mm, augstums 30 līdz 40 cm, ar krānu

3.3. Piemērots gāzes hromatogrāfs ar kapilāro kolonnu, kas aprīkots ar tiešās ievadīšanas sistēmu kolonnā, kas sastāv no šādiem mezgliem: 3.3.1. Termostata kamera kolonnām (kolonnu krāsns) ar programmējamu temperatūru 3.3.2. Aukstās inžekcijas iekārta tiešai ievadīšanai kolonnā 3.3.3. Liesmas jonizācijas detektors un pārveidotājs/pastiprinātājs 3.3.4. Reģistrējošā iekārta/integrators ar maināmu papīra ātrumu darbam ar pārveidotāju/pastiprinātāju (3.3.3.), kuras atbildes reakcijas laiks ir ne lielāks par 1 s. (Var izmantot arī datorizētas sistēmas, kas nodrošina gāzes hromatogrāfijas datu iegūšanu, izmantojot personālo datoru.) 3.3.5. Stikla vai kvarca stikla kapilārā kolonna ar iekšējo diametru 0,25 līdz 0,32 mm, kas ir 8 līdz 12 m gara, ar vienādu no 0,10 līdz 0,30 μm šķidrās fāzes slāni. (Šim nolūkam piemērotas gatavas nopērkamās SE-52 un SE-54 tipa šķidrās fāzes.)

3.4. 10 μl tilpuma mikrošļirce ar rūdītu adatu inžekcijai uz kolonnas

3.5. Elektrovibrators

3.6. Rotācijas ietvaicētājs

3.7. Mufeļkrāsns

3.8. Analītiskie svari ar svēršanas precizitāti + 0,1 mg

3.9. Laboratorijas trauki

4. REAKTĪVI

4.1. Silikagels ar daļiņu izmēru no 60 līdz 200 μm Silikagelu uz vismaz 4 h ievieto mufeļkrāsnī 500 °C temperatūrā. Atdzesē un pievieno 2 % ūdens no ņemtā silikagela daudzuma. Lai maisījumu homogenizētu, to rūpīgi sakrata. Pirms lietošanas vismaz 12 h glabā tumšā vietā

4.2. n-heksāns, hromatogrāfijai

4.3. Etilēteris, hromatogrāfijai

4.4. n-heptāns, hromatogrāfijai

4.5. Laurilarahidāta standarta 0,1 % (m/v) šķīdums heksānā (iekšējais standarts). (Var izmantot arī palmitilpalmitātu vai miristilstearātu.) 4.5.1. Sudāns 1 (1-fenil-azo-2-naftols)

4.6. Nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, gāzes hromatogrāfijai

4.7. Palīggāzes: — tīrs ūdeņradis gāzes hromatogrāfijai, — tīrs gaiss gāzes hromatogrāfijai.

5. PROCEDŪRA

5.1. Hromatogrāfijas kolonnas sagatavošana

Suspendē 15 g silikagela (4.1.) n-heksānā (4.2.) un pārnes kolonnā (3.2.). Nostādina. Sablīvē, izmantojot elektrovibratoru (3.5.), lai hromatogrāfijas slānis būtu homogenāks. Perkolē 30 ml n-heksāna attīrīšanai no piemaisījumiem. Ar svariem (3.8.) iesver precīzi 500 mg parauga 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.), un atbilstoši sagaidāmajam vasku saturam pievieno vajadzīgo daudzumu iekšējā standarta (4.5.). Piemēram, pievieno 0,1 mg laurilarahidāta, analizējot olīveļļu, vai 0,25 līdz 0,5 mg, analizējot olīvu izspaidu eļļu. Sagatavoto paraugu pārnes hromatogrāfijas kolonnā, izmantojot divas 2 ml porcijas n-heksāna (4.2.).

Šķīdinātājam ļauj izplūst no kolonnas, līdz tā līmenis pazeminās līdz apmēram 1 mm virs absorbenta, un tad, lai attīrītu no dabīgi saturošajiem n-alkāniem, perkolē vēl 70 ml n-heksāna. Tad sāk eluēšanu hromatogrāfijai, savācot 180 ml n-heksāna/etilētera maisījuma (attiecībā 99:1) ar ātrumu apmēram 15 pilieni desmit sekunžu laikā. Parauga eluēšana jāveic istabas temperatūrā 22 ± 4 °C temperatūrā.

NB!

— n-heksāna/etilētera maisījums (99:1) jāsagatavo tajā pašā dienā.

— Vasku pareizas eluēšanas vizuālai kontrolei maisījumam var pievienot 100 μl Sudānas 1 krāsvielas 1 % šķīdumu tajā. Tā kā krāsvielas aiztures laiks ir lielāks nekā vaskiem un mazāks nekā triglicerīdiem, eluēšana jāpārtrauc tūlīt pēc tam, kad krāsojums sasniedzis kolonnas apakšējo daļu, jo tas liecina, ka visi vaski jau ir eluēti no kolonnas.

Šādi iegūto parauga frakciju ietvaicē rotācijas ietvaicētājā (3.6.) gandrīz sausu. Pēdējos apmēram 2 ml šķīdinātāja iztvaicē ar vāju slāpekļa plūsmu; pievieno 2–4 ml n-heptāna.

5.2. Gāzes hromatogrāfijas analīze

5.2.1. Sagatavošana

Kolonnu uzstāda gāzes hromatogrāfam (3.3.), pievienojot ieeju kolonnā virskolonnas sistēmai, bet kolonnas izeju detektoram. Veic gāzes hromatogrāfijas aparatūras vispārēju pārbaudi (gāzes kontūru, detektora un reģistrācijas ierīces darbību, u. c.).

Ja kolonnu izmanto pirmo reizi, tā vispirms jākondicionē. Nedaudz nesējgāzes izlaiž caur kolonnu, un tad ieslēdz gāzes hromatogrāfu. Pakāpeniski iesilda tā, lai apmēram četru stundu laikā sasniegtu 350 °C temperatūru. Šādu temperatūru uztur vismaz divas stundas, un pēc tam iekārtai noregulē vajadzīgos darba apstākļus (iestata gāzes plūsmu, aizdedz liesmu, pievieno elektroniskajai reģistrācijas iekārtai (3.3.4.), iestata kolonnas krāsns temperatūru, detektoru, u. c.), reģistrē signālu ar jutību, kas ir vismaz divas reizes augstāka par analīzei nepieciešamo jutību. Nulles līnijai jābūt taisnai, bez jebkādiem izsitieniem, un tā nedrīkst novirzīties.

Negatīvas taisnvirziena novirzes liecina par neblīvumiem kolonnas savienojumu vietās; savukārt pozitīvas novirzes liecina, ka kolonna ir nepietiekami kondicionēta.

5.2.2. Darba apstākļu izvēle

Parasti izmanto šādus apstākļus:

— kolonnas temperatūra – —



20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min sākumā 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektora temperatūra – 350 °C;

— ievadītās vielas daudzums: 1 μl no n-heptāna šķīduma (2–4 ml);

— nesējgāze: hēlijs vai ūdeņradis ar attiecīgajai gāzei pareizu lineāro ātrumu (sk. papildinājumā);

— instrumenta jutība: atbilst turpmāk aprakstītajiem nosacījumiem.

Apstākļus var izmainīt atbilstoši kolonnas un hromatogrāfa raksturlielumiem tā, lai tiktu izdalīti visi vaski un panākta pietiekama signālu izšķirtspēja (sk. attēlu); C32 iekšējā standarta aiztures laikam ir jābūt 18 ± 3 min. Visvairāk reprezentatīvā vaska signālam jābūt vismaz 60 % no pilnas skalas.

Signālu integrēšanas parametri jānosaka tā, lai tiktu iegūts attiecīgo signālu laukumu pareizs novērtējums.

NB!Ņemot vērā, ka beigu temperatūra ir augsta, pieļaujama līdz 10 % novirze no pilnas skalas vērtības.

5.3. Analīzes veikšana

Ar 10 μl tilpuma mikrošļirci ņem 1 μl šķīduma paraugu; atvelk šļirces virzuli tā, lai iztukšotu adatu. Adatu ievieto inžektorā un pēc 1–2 sekundēm ātri ievada; pēc apmēram piecām sekundēm adatu lēnām izvelk.

Veic reģistrāciju, līdz visi vaski ir pilnībā eluēti.

Nulles līnijai noteikti jāatbilst nepieciešamajiem nosacījumiem.

5.4. Signālu identifikācija

Signālus identificē pēc aiztures laikiem, tos salīdzinot ar tādos pašos apstākļos analizētiem tādu vasku maisījumiem, kuru aiztures laiki ir zināmi.

Attēlā redzama neapstrādātas augstākā labuma olīveļļas vasku hromatogramma.

5.5. Daudzuma noteikšana

Izmantojot integratoru, nosaka iekšējā standarta un alifātisko esteru C40 līdz C46 signālu laukumu.

Aprēķina katra vaska estera saturu mg/kg eļļas pēc šādas formulas:

kur

Ax = katra estera signāla laukums, kvadrātmilimetros;

As = iekšējā standarta signāla laukums, kvadrātmilimetros;

ms = pievienotā iekšējā standarta masa, miligramos;

m = analīzei ņemtā parauga masa, gramos.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Norāda dažādu C40 līdz C46 vasku kopīgo saturu mg/kg eļļas (ppm).

NB!Kvantitatīvi nosakāmie komponenti saistāmi ar C40 līdz un C46 esteru signāliem, izmantojot par paraugu olīveļļas vasku hromatogrammu turpmāk redzamajā attēlā. Ja esteris C46 parādās divas reizes, tad, lai to identificētu, ieteicams analizēt olīvu izspaidu eļļas vasku frakciju, kur C46 signāls ir viegli identificējams tāpēc, ka tas ir izteiktā pārākumā.

Rezultātus uzdod ar precizitāti līdz vienam ciparam aiz komata.

Attēls.

Olīveļļas vasku hromatogramma ( 3 )

Paskaidrojumi:

I.S. = laurilarahidāts;

1. = diterpēnesteri;

2 + 2′ = C40 esteri

3 + 3′ = C42 esteri

4 + 4′ = C44 esteri;

5. = C46 esteri

6. = sterīna esteri un triterpēnspirts.









Papildinājums

Gāzes lineārā ātruma noteikšana

Pēc noregulēšanas darba normāliem darba apstākļiem gāzes hromatogrāfā ievada 1–3 μl metāna (vai propāna). Uzņem laiku, kādā gāze iziet cauri kolonnai no ievadīšanas mirkļa līdz tā signāla parādīšanās brīdim (tM).

Gāzes lineāro ātrumu aprēķina pēc formulas L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros un tM ir laiks sekundēs.

▼M26









V PIELIKUMS

STERĪNU UN TRITERPĒNDIOLU SASTĀVA UN SATURA NOTEIKŠANA AR KAPILĀRĀS KOLONNAS GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. DARBĪBAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta atsevišķu sterīnu satura un sterīnu kopējā satura, kā arī triterpēndiolu satura noteikšana olīveļļā un olīvu izspaidu eļļā.

2. PRINCIPS

Eļļu, kam kā iekšējais standarts pievienots α-holestanols, pārziepjo ar kālija hidroksīda šķīdumu etanolā, un nepārziepjoto vielu pēc tam ekstrahē ar etilēteri.

Sterīnu un triterpēndiolu frakciju no nepārziepjojamās vielas atdala ar plānslāņa hromatogrāfiju, izmantojot bāziska silikagēla plati. No silikagēla reģenerētās frakcijas pārveido trimetilsililēteros un analizē ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA

Parastais laboratorijas aprīkojums, jo īpaši turpmāk nosauktais.

3.1. 250 ml tilpuma kolba, kas aprīkota ar atteces dzesinātāju ar pieslīpētu savienojumu.

3.2. 500 ml tilpuma dalāmā piltuve.

3.3. 250 ml tilpuma kolbas.

3.4. Komplekts analīzei ar plānslāņa hromatogrāfiju, izmantojot 20 × 20 cm stikla plates.

3.5. Ultravioletā spuldze ar viļņa garumu 366 vai 254 nm.

3.6. 100 μl un 500 μl mikrošļirces.

3.7. Cilindrisks poraina stikla filtrtīģelis G3 (poru lielums 15–40 μm), aptuveni 5 cm augsts un aptuveni ar 2 cm diametru, piemērots filtrēšanai vakuumā, ar ārējo pieslīpējumu.

3.8. Koniska 50 ml tilpuma vakuumkolba ar iekšējo pieslīpējumu izmantošanai kopā ar filtrtīģeli (3.7. punkts).

3.9. 10 ml tilpuma koniskā mēģene ar stikla aizbāzni.

3.10. Ar sadales inžekcijas sistēmu aprīkots kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfs, kura sastāvdaļas ir šādas: 3.10.1. termostatējama kamera kolonnām vēlamās temperatūras uzturēšanai ar precizitāti līdz ± 1 °C; 3.10.2. termostatējama inžekcijas ierīce ar persilanizētu stikla iztvaicētāju un sadales sistēmu; 3.10.3. liesmas jonizācijas detektors (FID); 3.10.4. datu ieguves sistēma, kas piemērota izmantošanai ar FID (3.10.3. punkts) un ko iespējams manuāli integrēt.

3.11. No 20 līdz 30 m gara kvarca kapilārā kolonna ar iekšējo diametru no 0,25 līdz 0,32 mm, pārklāta ar difenilu (5 %) un dimetilpolisiloksānu (95 %) (SE-52 vai SE-54 stacionāro fāzi vai līdzvērtīgu fāzi), kuru slāņa biezums ir 0,10–0,30 μm.

3.12. Mikrošļirce gāzu hromatogrāfijai ar 10 μl tilpumu un rūdītu adatu, kas piemērota ievadīšanai ar plūsmas dalīšanu.

3.13. Kalcija dihlorīda eksikators.

4. REAĢENTI

4.1. Kālija hidroksīds ar 85 % minimālo titru.

4.2. Kālija hidroksīds, aptuveni 2 N etanola šķīduma. 130 g kālija hidroksīda (4.1. punkts) dzesējot izšķīdina 200 ml destilēta ūdens, pēc tam uzpilda ar etanolu līdz vienam litram (4.10. punkts). Šķīdumu glabā cieši noslēgtās tumša stikla pudelēs ne ilgāk kā divas dienas.

4.3. Etilēteris, analīzes kvalitātes.

4.4. Kālija hidroksīds, aptuveni 0,2 N etanola šķīduma. 13 g kālija hidroksīda (4.1. punkts) izšķīdina 20 ml destilēta ūdens un uzpilda ar etanolu līdz vienam litram (4.10. punkts).

4.5. Bezūdens nātrija sulfāts, analīzes kvalitātes.

4.6. Stikla plates (20 × 20 cm) ar silikagēla pārklājumu, bez fluorescences indikatora, 0,25 mm biezas (nopērkamas lietošanai gatavas).

4.7. Toluols, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.8. Acetons, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.9. n-heksāns, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.10. Etilēteris, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.11. Etanols, analītiskas kvalitātes.

4.12. Etilacetāts, analītiskas kvalitātes.

4.13. Standartšķīdums plānslāņa hromatogrāfijai: holesterīns vai fitosterīni un eritrodiola 5 % šķīdums etilacetātā (4.11. punkts).

4.14. 2,7-dihlorfluoresceīna 0,2 % šķīdums etanolā. To padara nedaudz bāzisku, pievienojot dažus pilienus 2 N kālija hidroksīda šķīduma spirtā (4.2. punkts).

4.15. Bezūdens piridīns, hromatogrāfijas kvalitātes (skatīt 5. piezīmi).

4.16. Heksametildisilazāns, analītiskas kvalitātes.

4.17. Trimetilhlorsilāns, analītiskas kvalitātes.

4.18. Sterīnu trimetilsililēteru parauga šķīdumi. Tos pagatavo pirms lietošanas no sterīniem un eritrodiola, kas iegūti no sterīnus un eritrodiolu saturošām eļļām.

4.19. α-holestanols, vairāk nekā 99 % tīrība (tīrība jāpārbauda ar gāzu hromatogrāfijas analīzi).

4.20. α-holestanola iekšējais standartšķīdums, 0,2 % šķīdums (masa/tilp.) etilacetātā (4.11. punkts).

4.21. Fenolftaleīna šķīdums etanolā, 10 g/l (4.10. punkts).

4.22. Nesējgāzes: ūdeņradis vai hēlijs, gāzu hromatogrāfijas tīrības.

4.23. Palīggāzes: ūdeņradis, hēlijs, slāpeklis un gaiss, gāzu hromatogrāfijas tīrības.

4.24. n-heksāna (4.9. punkts)/etilētera (4.10. punkts) maisījums 65:35 (tilpums/tilpums).

4.25. Sililēšanas reaktīvs, kas ir piridīna/heksametildisilazāna/trimetilhlorsilāna maisījums 9:3:1 (tilpums/tilpums/tilpums).

5. PROCEDŪRA

5.1. Nepārziepjojamās vielas pagatavošana. 5.1.1. Ar 500 μl mikrošļirci (3.6. punkts) 250 ml tilpuma kolbā (3.1. punkts) pārnes tādu daudzumu α-holestanola iekšējā standartšķīduma (4.20. punkts), kas satur tādu holestanola daudzumu, kurš atbilst aptuveni 10 % sterīnu satura paraugā. Piemēram, 5 g olīveļļas parauga pievieno 500 μl α-holestanola šķīduma (4.20. punkts), bet 5 g olīvu izspaidu eļļas pievieno 1 500 μl α-holestanola šķīduma. Silta ūdens vannā, mērenā slāpekļa plūsmā ietvaicē sausu un pēc kolbas atdzesēšanas tajā pašā kolbā iesver 5 ± 0,01 g sausā nofiltrētā parauga. 1. piezīme. Dzīvnieku izcelsmes vai augu eļļas un tauki, kas satur lielākus holesterīna daudzumus, var uzrādīt smailes ar aiztures laikiem, kas ir līdzīgi holestanola aiztures laikam. Tādā gadījumā sterīnu frakcija ir jāanalizē divreiz – ar iekšējo standartu un bez tā. 5.1.2. Pievieno 50 ml 2 N kālija hidroksīda šķīduma etanolā (4.2. punkts) un nedaudz pumeka, uzliek atteces dzesinātāju un silda līdz lēnai viršanai, līdz ir notikusi pārziepjošana (šķīdums kļūst dzidrs). Turpina sildīt vēl 20 minūtes, pēc tam caur dzesinātāja augšgalu pievieno 50 ml destilēta ūdens, atvieno dzesinātāju un atdzesē kolbu aptuveni līdz 30 °C. 5.1.3. Kolbas saturu kvantitatīvi pārnes 500 ml dalāmajā piltuvē (3.2. punkts), vairākas reizes skalojot ar destilētu ūdeni, (50 ml). Pievieno aptuveni 80 ml etilētera (4.10. punkts), enerģiski krata aptuveni 60 sekundes, periodiski atbrīvo spiedienu, apgriežot dalāmo piltuvi un atverot krānu. Ļauj nostāvēties, līdz abas fāzes ir pilnīgi nodalījušās (2. piezīme). Pēc tam pēc iespējas pilnīgāk atdala ziepju šķīdumu, savācot to citā dalāmajā piltuvē. Tieši tāpat ūdens-spirta fāzi ekstrahē vēl divas reizes, katrai ekstrakcijai izlietojot no 60 līdz 70 ml etilētera (4.10. punkts). 2. piezīme. Radušos emulsiju var likvidēt, pievienojot nedaudz etanola (4.11. punkts). 5.1.4. Trīs ētera ekstraktus apvieno vienā dalāmajā piltuvē, kurā ir 50 ml ūdens. Turpina mazgāt ar ūdeni (50 ml), līdz mazgājamais ūdens pēc fenolftaleīna šķīduma (4.21. punkts) piliena pievienošanas vairs neiekrāsojas sārts. Kad mazgājamais ūdens ir aizvadīts, filtrē uz bezūdens nātrija sulfāta (4.5. punkts) iepriekš nosvērtā 250 ml tilpuma kolbā, mazgājot piltuvi un filtru ar maziem daudzumiem etilētera (4.10. punkts). 5.1.5. Šķīdinātāju ietvaicē, destilējot rotācijas ietvaicētājā 30 °C vakuumā. Pievieno 5 ml acetona un ar mērenu gaisa plūsmu pilnībā likvidē gaistošo šķīdinātāju. Atlikumu 15 minūtes žāvē žāvēšanas skapī 103 ± 2 °C temperatūrā. Atdzesē eksikatoros un nosver ar 0,1 mg precizitāti.

5.2. Sterīnu un triterpēndiolu frakcijas atdalīšana (eritrodiols + uvaols) 5.2.1. Bāzisko plānslāņa hromatogrāfijas plašu sagatavošana. Silikagēla plates (4.6. punkts), aptuveni 4 cm, uz 10 sekundēm pilnīgi iegremdē 0,2 N kālija hidroksīda šķīdumā etanolā (4.5. punkts), pēc tam divas stundas žāvē velkmē un vienu stundu žāvēšanas skapī 100 °C temperatūrā. Izņem no žāvēšanas skapja un glabā eksikatorā virs kalcija hlorīda (3.13. punkts) līdz lietošanai (šādi apstrādātas plates jāizlieto 15 dienu laikā). 3. piezīme. Ja sterīnu frakcijas atdalīšanai izmanto bāziska silikagēla plates, nepārziepjojamā frakcija nav jāapstrādā ar alumīnija oksīdu. Tādā veidā visi savienojumi ar skābju īpašībām (taukskābes un pārējie) paliek uz starta, un sterīnu josla labi atdalās no alifātisko spirtu un triterpēnspirtu joslas. 5.2.2. Attīstīšanas kamerā pārnes heksāna/etilētera maisījumu (4.24. punkts) (4. piezīme), izveidojot aptuveni 1 cm biezu slāni. Kameru noslēdz ar piemērotu vāku un vismaz pusstundu atstāj vēsā vietā, lai iestātos šķidruma un tvaika līdzsvars. Kameras iekšējām virsmām var piestiprināt filtrpapīra sloksnes, kas iegremdētas eluentā. Tas aptuveni par trešdaļu samazina attīstīšanas laiku, un komponentu eluēšanās notiek vienmērīgāk un pareizāk. 4. piezīme. Lai attīstīšanas apstākļi būtu atkārtojami, attīstīšanas šķīdums katrai analīzei ir jānomaina. Var lietot arī 50:50 (tilpums/tilpums) n-heksāna/etilētera maisījumu. 5.2.3. Sagatavo aptuveni 5 % nepārziepjojamās vielas (5.1.5. punkts) šķīdumu etilacetātā (4.12. punkts) un ar 100 μl mikrošļirci 0,3 ml šā šķīduma tievā un vienādā svītrā uznes uz hromatogrāfijas plates (5.2.1. punkts) apakšējās malas (2 cm attālumā). Vienādā attālumā ar šo svītru uznes no 2 līdz 3 μl materiāla standartšķīduma (4.13. punkts), lai pēc attīstīšanas varētu identificēt sterīnu un triterpēndiolu joslu. 5.2.4. Plati ievieto attīstīšanas kamerā, kas ir sagatavota, kā noteikts 5.2.2. punktā. Apkārtējās vides temperatūrai jābūt no 15 līdz 20 °C (5. piezīme). Kameru tūlīt noslēdz ar vāku un atstāj eluēties, līdz šķīdinātāja fronte sasniedz aptuveni 1 cm no plates augšējās malas. Plati izņem no attīstīšanas kameras un iztvaicē šķīdinātāju, izmantojot karsta gaisa plūsmu vai plati uz neilgu laiku novietojot velkmē. 5. piezīme. Augstāka temperatūra varētu pasliktināt nodalīšanos. 5.2.5. Uz plates vienmērīgi uzsmidzina nedaudz 2,7-dihlorfluoresceīna šķīduma (4.14. punkts) un tad atstāj nožūt. Novērojot plati ultravioleto staru gaismā, sterīnu un triterpēndiolu joslas var identificēt pēc tā, ka tās ir vienādā attālumā ar standartšķīdumam atbilstošajiem plankumiem (4.13. punkts). Joslu robežas apkārt fluorescējošajam plankumam apzīmē ar melnu zīmuli (skatīt plānslāņa hromatogrāfijas plati 3. attēlā). 5.2.6. Ar metāla lāpstiņu no apzīmētā laukuma noņem silikagelu. Sīki sasmalcinātu no plates noņemto materiālu pārvieto uz filtrtīģeli (3.7. punkts). Pievieno 10 ml karsta etilacetāta (4.12. punkts), rūpīgi samaisa ar metāla lāpstiņu un vakuumā filtrē, filtrātu uztver filtrtīģelim pievienotajā koniskajā kolbā (3.8. punkts). Nogulsnes kolbā trīs reizes mazgā ar etilēteri (4.3. punkts) (katru reizi aptuveni 10 ml), filtrātu savācot tajā pašā filtram pievienotajā kolbā. Filtrātu ietvaicē no 4 līdz 5 ml tilpumam, atlikušo šķīdumu pārnes iepriekš nosvērtā 10 ml mēģenē (3.9. punkts), uzmanīgi sildot, lēnā slāpekļa plūsmā ietvaicē sausu, izšķīdina, vēlreiz pievienojot dažus pilienus acetona (4.8. punkts), atkal ietvaicē sausu. Mēģenē iegūtajam atlikumam jāsastāv no sterīnu un triterpēndiolu frakcijām.

5.3. Trimetilsililēteru iegūšana. 5.3.1. Mēģenē, kurā ir sterīnu un triterpēnu frakcija, pievieno sililēšanas reaģentu (4.25. punkts) (6. piezīme) proporcijā 50 μl uz katru miligramu sterīnu un triterpēndiolu, novēršot mitruma absorbciju (7. piezīme). 6. piezīme. Tirdzniecībā ir pieejami lietošanai gatavi šķīdumi. Ir pieejami arī citi sililēšanas reaģenti, piemēram, bis-trimetilsililtrifluoracetamīds ar 1 % trimetilhlorsilānu, kas ir jāatšķaida ar vienādu tilpumu bezūdens piridīna. Piridīnu var aizvietot ar tādu pašu daudzumu acetonitrila. 5.3.2. Mēģeni noslēdz ar aizbāzni, uzmanīgi krata (bez apgriešanas), līdz savienojumi ir pilnībā izšķīduši. Atstāj vismaz 15 minūtes istabas temperatūrā, pēc tam dažas minūtes centrifugē. Dzidrais šķīdums ir gatavs gāzu hromatogrāfiskai analīzei. 7. piezīme. Var veidoties viegla opalescence, kas nerada traucējumus. Baltu pārslu veidošanās vai sārta krāsojuma parādīšanās norāda uz mitruma klātbūtni vai reaģenta bojāšanos. Ja tā notiek, analīze ir jāatkārto (tikai tad, ja izmanto heksametildisilazānu/trimetilhlorsilānu).

5.4. Gāzu hromatogrāfiskā analīze. 5.4.1. Sagatavošanas operācijas, kapilārās kolonnas kondicionēšana. 5.4.1.1. Kolonnu (3.11. punkts) iemontē gāzu hromatogrāfā, ieeju pievienojot plūsmas sadales inžektoram un kolonnas izeju detektoram. Izdara gāzu hromatogrāfijas iekārtas vispārējo pārbaudi (noplūdes no gāzu līnijām, detektora, plūsmas sadales un reģistrējošās sistēmas efektivitāti utt.). 5.4.1.2. Ja kolonnu lieto pirmoreiz, ir ieteicams to kondicionēt. Lēnu gāzes plūsmu laiž cauri kolonnai, pēc tam ieslēdz gāzu hromatogrāfu un pakāpeniski uzsilda līdz temperatūrai, kas ir vismaz 20 °C virs darba temperatūras (8. piezīme). Šo temperatūru uztur vismaz divas stundas, pēc tam iekārtu noregulē darba režīmā (noregulē gāzu plūsmas un sadali, liesmas aizdedzi, savienojumu ar datu apstrādes sistēmu, kā arī noregulē kolonnas, detektora un inžektora temperatūru utt.), pēc tam reģistrē signālu, izvēloties jutību, kas ir vismaz divas reizes augstāka par analīzei paredzēto temperatūru. Nulles līnijai ir jābūt lineārai, bez smailēm, un tā nedrīkst nobīdīties. Negatīva taisna līnija norāda uz noplūdēm kolonnas savienojumu vietās; pozitīva nobīde norāda uz neatbilstīgu kolonnas kondicionēšanu. 8. piezīme. Kondicionēšanas temperatūrai vienmēr jābūt vismaz par 20 °C zemākai nekā lietojamajai stacionārajai fāzei paredzētajai maksimālajai temperatūrai. 5.4.2. Darba apstākļu izvēle. 5.4.2.1. Darba apstākļi ir šādi: — kolonnas temperatūra: 260 ± 5 °C, — inžektora temperatūra: 280–300 °C, — detektora temperatūra: 280–300 °C, — nesējgāzes lineārais ātrums: hēlijam no 20 līdz 35 cm/s, ūdeņradim no 30 līdz 50 cm/s, — dalījuma attiecība: no 1:50 līdz 1:100, — aparāta jutība: 4–16 reižu lielāka par minimālo atenuāciju, — reģistrēšanas jutība: no 1 līdz 2 mV no visas skalas, — ievadāmās vielas daudzums: no 0,5 līdz 1 μl TMSE šķīduma. Atbilstīgi kolonnas un gāzes hromatogrāfa īpašībām norādītos apstākļus var mainīt, lai iegūtu hromatogrammas, kas atbilst šādiem nosacījumiem: — betasitosterīna smailes aiztures laikam jābūt 20 ± 5 minūtēm, — kampesterīna smailei jābūt: olīveļļai (vidējais saturs 3 %) 20 ± 5 % no pilnas skalas; sojas eļļai (vidējais saturs 20 %) 80 ± 10 % no pilnas skalas, — visiem klātesošajiem sterīniem jābūt atdalītiem. Turklāt smailēm jābūt arī pilnībā nošķirtām, t. i., smailes līnijai ir jāatgriežas uz nulles līnijas, pirms sāk veidoties jauna smaile. Tomēr nepilnīga nošķiršana ir pieņemama ar nosacījumu, ka smailes ar relatīvo aiztures laiku RRT 1,02 02 (sitostanols) var kvantitatīvi noteikt, izmantojot perpendikulu. 5.4.3. Analītiskā procedūra. 5.4.3.1. 10 μl tilpuma mikrošļircē vispirms ievelk 1 μl heksāna, tad 0,5 μl gaisa un pēc tam 0,5 –1 μl parauga šķīduma. Paceļ šļirces virzuli, lai iztukšotu adatu. Izdur adatu cauri inžektora membrānai un pēc vienas vai divām sekundēm strauji ievada, tad aptuveni pēc piecām sekundēm lēni izvelk adatu. Var izmantot arī automātisku inžektoru. 5.4.3.2. Turpina reģistrēt, līdz klātesošo triterpēndiolu TMSE ir pilnīgi eluēti. Nulles līnijai visu laiku ir jāatbilst prasībām (5.4.1.2. punkts). 5.4.4. Smaiļu identificēšana. Atsevišķās smailes identificē pēc aiztures laikiem, salīdzinot ar sterīnu un triterpēndiolu TMSE maisījumiem, kas analizēti tādus pašus apstākļos (skatīt papildinājumu). Sterīni un triterpēndioli eluējas šādā secībā: holesterīns, brasikasterīns, ergosterīns, 24-metilēnholesterīns, kampesterīns, kampestanols, stigmasterīns, Δ7-kampesterīns, Δ5,23-stigmastadienols, klerosterīns, betasitosterīns, sitostanols, Δ5-avenasterīns, Δ5,24-stigmastadienols, Δ7-stigmastenols, Δ7-avenasterīns, eritrodiols un uvaols. Betasitosterīna aiztures laiki SE-52 un SE-54 kolonnā ir parādīti 1. tabulā. Turpmāk 1. un 2. attēlā parādītas dažu eļļu raksturīgās hromatogrammas. 5.4.5. Kvantitatīvā novērtēšana. 5.4.5.1. Izmantojot datu apstrādes sistēmu, aprēķina α-holestanola, sterīnu un triterpēndiolu smaiļu laukumus. To savienojumu smailes, kas nav ietverti 1. tabulā, neņem vērā (ergosterīns nav jāaprēķina). Uzskata, ka α-holestanola atbildes signāla koeficients ir vienāds ar 1. 5.4.5.2. Katra atsevišķā sterīna koncentrāciju, kas izteikta mg/kg taukvielas, aprēķina šādi: kur: Ax = sterīna x smailes laukums skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās, As = α-holestanola smailes laukums skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās, ms = pievienotā α-holestanola masa miligramos, m = noteikšanai ņemtā parauga masa gramos.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

6.1. Atsevišķo sterīnu koncentrāciju izsaka mg/kg taukvielas, un to summu norāda kā “kopējos sterīnus”. Katra atsevišķā sterīna, eritrodiola un uvaola sastāvu izsaka ar skaitli līdz vienai zīmei aiz komata. Kopējais sterīnu sastāvs ir jāizsaka veselā skaitlī.

▼M28

6.2. Katra atsevišķā sterīna procentus aprēķina pēc attiecīgā smailes laukuma attiecības pret sterīnu smaiļu kopējo laukumu: kur: Ax = x smailes laukums, ΣA = sterīnu smaiļu kopējais laukums.

▼M26

6.3. Nosacītais betasitosterīns: Δ5-23-stigmastadienols + klerosterīns + betasitosterīns+ sitostanols + Δ5-avenasterīns + Δ5-24-stigmastadienols.

6.4. Aprēķina eritrodiola un uvaola procentus: kur: ΣA = sterīna laukumu summa skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās, Er = eritrodiola laukums skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās, Uv = uvaola laukums skaitļošanas sistēmas uzskaites vienībās.









Papildinājums

Gāzes lineārā ātruma noteikšana

Gāzu hromatogrāfā, kas noregulēts atbilstīgi parastajiem darba apstākļiem, ievada no 1 līdz 3 μl metāna (vai propāna) un izmēra laiku, kādā gāze iziet caur kolonnu no ievadīšanas brīža līdz smailes parādīšanās brīdim (tM).

Lineāro ātrumu aprēķina kā L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros un tM ir laiks sekundēs, kas izmērīts ar hronometru.







1. tabula Sterīnu relatīvie aiztures laiki Smaile Identifikācija Relatīvie aiztures laiki SE 54 kolonna SE 52 kolonna 1. Holesterīns Δ-5-holesten-3ß-ols 0,67 0,63 2. Holestanols 5α-holestan-3ß-ols 0,68 0,64 3. Brasikasterīns [24S]-24-metil-Δ-5,22-holestadien-3ß-ols 0,73 0,71 * Ergosterīns [24S] 24 meti Δ5-7-22 holestatrien 3β-ols 0,78 0,76 4. 24-metilēnholesterīns 24-metilēn-Δ-5,24-holestadien-3ß-ols 0,82 0,80 5. Kampesterīns (24R)-24-metil-Δ-5-holesten-3ß-ols 0,83 0,81 6. Kampestanols (24R)-24-metil-holestan-3ß-ols 0,85 0,82 7. Stigmasterīns (24S)-24-etil-Δ-5,22-holestadien-3ß-ols 0,88 0,87 8. Δ-7-kampesterīns (24R)-24-metil-Δ-7-holesten-3ß-ols 0,93 0,92 9. Δ-5,23-stigmastadienols (24R,S)-24-etil-Δ-5,23-holestadien-3ß-ols 0,95 0,95 10. Klerosterīns (24S)-24-etil-Δ-5,25-holestadien-3ß-ols 0,96 0,96 11. Betasitosterīns (24R)-24-etil-Δ-5-holesten-3ß-ols 1,00 1,00 12. Sitostanols 24-etil-holestan-3ß-ols 1,02 1,02 13. Δ-5-avenasterīns (24Z)-24-etiliden-Δ-holesten-3ß-ols 1,03 1,03 14. Δ-5,24-stigmastadienols (24R,S)-24-etil-Δ-5,24-holestadien-3ß-ols 1,08 1,08 15. Δ-7-stigmastenols (24R,S)-24-etil-Δ-7-holesten-3ß-ols 1,12 1,12 16. Δ-7-avenasterīns (24Z)-24-etiliden-Δ-7-holesten-3ß-ols 1,16 1,16 17. Eritrodiols 5α olean-12en-3b28 diols 1,41 1,41 18. Uvaols Δ12-ursen-3β28 diols 1,52 1,52

1. attēls

Spīdīgās olīveļļas (ar iekšējo standartu) sterīnu un triterpēndiolu frakcijas gāzu hromatogramma

2. attēls

Rafinētas olīveļļas (ar iekšējo standartu) sterīnu un triterpēndiolu frakcijas gāzu hromatogramma

3. attēls

Olīvu izspaidu eļļas plānslāņa hromatogrāfijas plate, kura ir jānoskrāpē, lai noteiktu sterīnus un triterpēndiolus

1 – skvalēns

2 – triterpēnspirti un alifātiskie spirti

3 – sterīni un triterpēndioli

4 – sākums un brīvās taukskābes.

▼M26 —————

▼M21









VII PIELIKUMS

2-GLICERILMONOPALMITĀTA SATURA NOTEIKŠANA

1. IZMANTOŠANAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta triglicerīdu molekulā 2. pozīcijā saistītās palmitīnskābes noteikšana pēc 2-glicerilmonopalmitāta.

Šo metodi var izmantot istabas temperatūrā (20 °C) šķidrām augu eļļām.

2. PRINCIPS

Pēc sagatavošanas eļļas paraugu šķeļ ar aizkuņģa dziedzera lipāzi: triglicerīdu daļējā selektīvā hidrolīzē 1. un 3. pozīcijā rodas 2-monoglicerīdi. 2-glicerilmonopalmitāta saturu monoglicerīdu frakcijā pēc sililēšanas nosaka ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA UN MATERIĀLI

3.1. 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba

3.2. 100, 250 un 300 ml tilpuma vārglāzes

3.3. Hromatogrāfijas kolonna no stikla, iekšējais diametrs 21–23 mm, garums 400 mm, ar poraina stikla disku un krānu

3.4. 10, 50, 100 un 200 ml tilpuma mērcilindri

3.5. 100 un 250 ml tilpuma kolbas

3.6. Rotācijas ietvaicētājs

3.7. 10 ml tilpuma centrifūgas mēģenes ar konisku apakšdaļu un slīpēta stikla aizbāzni

3.8. Centrifūga 10 un 100 ml tilpuma mēģenēm

3.9. Termostats, kurā var uzturēt 40 ± 0,5 °C temperatūru

3.10. 1 un 2 ml tilpuma graduētas pipetes

3.11. 1 ml tilpuma šļirce zemādas injekcijām

3.12. 100 μl tilpuma mikrošļirce

3.13. 1 000 ml tilpuma šķirpiltuve

3.14. Kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfs ar virskolonnas auksto inžekciju parauga tiešai ievadīšanai kolonnā un krāsni, kurā var uzturēt vajadzīgo temperatūru ar precizitāti apm. 1 °C

3.15. Virskolonnas aukstais inžektors parauga tiešai ievadīšanai kolonnā

3.16. Liesmas jonizācijas detektors un elektrometrs

3.17. Elektrometram piemērota reģistrējošā iekārta/integrators ar maināmu papīra ātrumu, kuras atbildes reakcijas laiks ir ne lielāks par 1 s

3.18. Stikla vai kvarca stikla kapilārā kolonna, garums 8–12 metri, iekšējais diametrs 0,25–0,32 mm, kas pārklāta ar metilpolisiloksānu vai fenilmetilpolisiloksānu 5 %, 0,10–0,30 μm slānis, izmantojama 370 °C temperatūrā

3.19. 10 μl tilpuma mikrošļirce ar vismaz 7,5 cm garu rūdītu adatu tiešai virskolonnas ievadīšanai

4. REAKTĪVI

4.1. Silikagels ar daļiņu izmēru no 0,063 līdz 0,200 mm (70/280 mesh), kas sagatavots šādi: Silikagelu porcelāna tīģelī žāvskapī 4 stundas žāvē 160 °C temperatūrā, atdzesē eksikatorā istabas temperatūrā. Pievieno ūdeni 5 % no silikagela masas turpmāk aprakstītajā veidā. Erlenmeijera kolbā iesver 152 g silikagela, pievieno 8 g destilēta ūdens, noslēdz ar aizbāzni un uzmanīgi krata, lai ūdens sadalītos masā vienmērīgi. Pirms lietošanas jāiztur vismaz 12 stundas

4.2. n-heksāns (hromatogrāfijai)

4.3. Izopropanols

4.4. Izopropanols, 1/1 (v/v) ūdens šķīdums

4.5. Aizkuņģa dziedzera lipāze. Tās aktivitātei jābūt no 2,0 līdz 10 lipāzes vienībām uz miligramu. (Aizkuņģa dziedzera lipāzes ar aktivitāti no 2 līdz 10 vienībām uz miligramu fermenta ir nopērkamas.)

4.6. Tris-hidroksimetilaminometāna buferšķīdums: 1 M ūdens reakciju ar konc. HCl (1/1 v/v) noregulē līdz pH 8 (nosaka potenciometriski)

4.7. Enzīma kvalitātes nātrija holāts, 0,1 % ūdens šķīdums (šis šķīdums pēc pagatavošanas ir derīgs divas nedēļas)

4.8. Kalcija hlorīds, 22 % ūdens šķīdums

4.9. Dietilēteris, hromatogrāfijai

4.10. Šķīdinātājs attīstīšanai: n-heksāna/dietilētera (87:13 v:v) maisījums

4.11. Nātrija hidroksīds, 12 % šķīdums

4.12. Fenolftaleīns, 1 % šķīdums etanolā

4.13. Nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, gāzes hromatogrāfijai

4.14. Palīggāzes: ūdeņradis, tīrība vismaz 99 %, sauss un attīrīts no organiskajām vielām; un gaiss, gāzes hromatogrāfijai, ar tādu pašu tīrības pakāpi

4.15. Silanizācijas reaģents: piridīna/heksametildisilazāna, trimetilhlorsilāna 9/3/1 (v/v/v) maisījums. (Nopērkami arī lietošanai sagatavoti šķīdumi. Var izmantot citus sililēšanas reaģentus, konkrēti bis-trimetilsililtrifluoracetamīds + 1 % trimetilhlorsilāns, kas atšķaidīts ar tādu pašu tilpumu bezūdens piridīna.)

4.16. Standartparaugi: tīri monoglicerīdi vai monoglicerīdu maisījumi ar zināmu sastāvu, kas ir līdzīgs analizējamo paraugu sastāvam

5. METODE

5.1. Paraugu sagatavošana

5.1.1. Eļļas, kuru brīvais skābums ir mazāks par 3 %, pirms hromatografēšanas silikagela kolonnā nav obligāti jāneitralizē. Eļļas, kuru brīvais skābums ir lielāks par 3 %, jāneitralizē, kā aprakstīts 5.1.1.1. punktā. 5.1.1.1. Pārnes 50 g eļļas un 200 ml n-heksāna 1 000 ml tilpuma šķirpiltuvē (3.13.). Pievieno 100 ml izopropanola un 12 % nātrija hidroksīda (4.11.) daudzumā, kas ir ekvivalents eļļas brīvajam skābumam plus 5 %. Vienu minūti enerģiski krata. Pievieno 100 ml destilēta ūdens, vēlreiz sakrata un nostādina. Pēc dekantēšanas atdala apakšējo ziepes saturošo slāni. Atdala arī visus pārējos starpslāņus (duļķes un nešķīstošās vielas). Neitralizētā eļļas parauga šķīdumu heksānā vairākas reizes mazgā ar 50–60 ml izopropanola/ūdens 1/1 (v/v) šķīdumu (4.4.), līdz izzūd tā sārtais krāsojums ar fenolftaleīnu. Lielāko daļu heksāna atdala ar vakuumdestilāciju (izmantojot, piemēram, rotācijas ietvaicētāju), un eļļu pārnes 100 ml tilpuma kolbā (3.5.). Eļļu vakuumā žāvē, līdz pilnībā atdalīts viss šķīdinātājs. Šīs procedūras beigās eļļas skābumam jābūt mazākam par 0,5 %.

5.1.2. Šādi sagatavotas eļļas 1,0 g lielu iesvaru pārnes 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.), un to izšķīdina 10 ml attīstīšanas maisījumā (4.10.). Pirms hromatogrāfijas silikagela kolonnā šķīdumu nostādina vismaz 15 minūtes. Lai nodrošinātu hromatogrāfijai optimālus apstākļus, ja šķīdums nav dzidrs, to centrifugē (var izmantot lietošanai sagatavotus 500 mg SPE silikagela kartridžus).

5.1.3. Hromatogrāfijas kolonnas sagatavošana Apmēram 30 ml attīstītāja šķīdinātāja (4.10.) pārnes kolonnā (3.3.), izmantojot stikla spieķīti, kolonnas apakšā ievieto kokvilnas auduma gabaliņu; saspiež, lai aizvadītu gaisu. Vārglāzē sagatavo 25 g silikagela (4.1.) suspensiju apmēram 80 ml attīstītāja šķīdinātāja, un pārnes kolonnā, izmantojot piltuvi. Pārbauda, vai viss silikagels pārnests kolonnā; mazgā ar attīstītāja šķīdinātāju (4.10.), atver krānu un šķidruma līmeni pazemina tā, lai tas būtu apmēram 2 mm virs silikagela līmeņa.

5.1.4. Kolonnas hromatogrāfija No parauga, kas sagatavots, kā aprakstīts iepriekš 5.1. punktā, 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.) ņem precīzi 1,0 g lielu iesvaru. Parauga iesvaru izšķīdina 10 ml attīstītāja šķīdinātāja (4.10.). Šķīdumu pārnes hromatogrāfijas kolonnā, kas sagatavota saskaņā ar 5.1.3. punktu. Jāraugās, lai netiktu aizskarta kolonnas virsma. Atver krānu un parauga šķīdumu pārnes kolonnā, līdz tas sasniedz silikagela līmeni. Attīsta ar 150 ml attīstītāja šķīdinātāja. Noregulē plūsmas ātrumu 2 ml/min (tā, lai 150 ml šķīduma tiktu pārnesti kolonnā apmēram 60–70 min laikā). Eluātu savāc iepriekš nosvērtā 250 ml tilpuma kolbā. Šķīdinātāju iztvaicē vakuumā gandrīz sausu, un šķīdinātāja atliekas atdala slāpekļa plūsmā. Kolbu nosver un aprēķina iegūtā ekstrakta masu. (Ja izmanto lietošanai sagatavotus SPE silikagela kartridžus, rīkojas, kā aprakstīts turpmāk. 1 ml šķīduma (5.1.2.) pārnes sagatavotos kartridžos ar 3 ml n-heksāna. Pēc šķīduma perkolēšanas attīsta ar 4 ml n-heksāna/dietilētera 9/1 (v/v) maisījumu. Eluātu savāc 10 ml tilpuma mēģenē un slāpekļa plūsmā ietvaicē sausu. Uz sauso atlikumu iedarbojas ar aizkuņģa dziedzera lipāzi (5.2.). Jāpārbauda taukskābju sastāvs pirms SPE kartridža un pēc tā.)

5.2. Hidrolīze ar aizkuņģa dziedzera lipāzi

5.2.1. Centrifūgas mēģenē iesver 0,1 g eļļas, kas sagatavotas saskaņā ar 5.1. punktu. Pievieno 2 ml buferšķīduma (4.6.), 0,5 ml nātrija holāta šķīduma (4.7.) un 0,2 ml kalcija hlorīda šķīduma, katru reizi šķīdumu rūpīgi samaisot. Mēģeni noslēdz ar pieslīpēta stikla aizbāzni, un ievieto termostatā 40 ± 0,5 °C temperatūrā.

5.2.2. Pievieno 20 mg lipāzes, uzmanīgi sakrata (nesaslapinot aizbāzni), un mēģeni ievieto termostatā precīzi uz 2 min. Pēc tam izņem, enerģiski krata precīzi 1 min un atdzesē.

5.2.3. Pievieno 1 ml dietilētera, noslēdz ar aizbāzni un enerģiski krata, pēc tam centrifugē, un ar mikrošļirci ētera šķīdumu pārnes tīrā sausā mēģenē.

5.3. Silanilatvasinājumu iegūšana un gāzes hromatogrāfija

5.3.1. Ar mikrošļirci 100 μl šķīduma (5.2.3.) pārnes 10 ml tilpuma mēģenē ar konisku apakšdaļu.

5.3.2. Vājā slāpekļa plūsmā atdala šķīdinātāju, pievieno 200 μl silanizācijas reaģenta (4.15.), mēģeni noslēdz ar aizbāzni un 20 min nostādina.

5.3.3. Pēc 20 min pievieno 1 līdz 5 ml n-heksāna (atkarībā no hromatografēšanas apstākļiem): šādi iegūtais šķīdums ir sagatavots gāzes hromatogrāfijai.

5.4. Gāzes hromatogrāfija

Darba apstākļi:

— inžektora temperatūra (virskolonnas inžektors) zem šķīdinātāja viršanas punkta (68 °C);

— detektora temperatūra: 350 °C;

— kolonnas temperatūra: krāsns temperatūras programma: 1 minūti 60 °C, paaugstināšana par 15 °C minūtē līdz 180 °C, tad par 5 °C minūtē līdz 340 °C, tad 13 minūtes 340 °C;

— nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, ar lineāro ātrumu, kas ir pietiekams 1. att. parādītās izšķirtspējas panākšanai. Aiztures laikam C54 triglicerīdam jābūt 40 ± 5 min (sk. 2. att.). (Norādītie darba apstākļi ir orientējoši. Operatoriem tie jāoptimizē, lai panāktu vajadzīgo izšķirtspēju. Tā signāla augstumam, kas atbilst 2-glicerilmonopalmitātam, jābūt vismaz 10 % no reģistrācijas iekārtas skalas.)

— ievadītās vielas daudzums: 0,5–1 μl n-heksāna šķīduma (5 ml) (5.3.3.).

5.4.1. Signālu identifikācija

Atsevišķos monoglicerīdus identificē pēc aiztures laikiem, tos salīdzinot ar monoglicerīdu standartmaisījumiem tādos pašos apstākļos noteiktajiem aiztures laikiem.

5.4.2. Kvantitatīva noteikšana

Katra signāla laukumu aprēķina, izmantojot elektronisko integratoru.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Glicerilmonopalmitāta saturu aprēķina pēc attiecīgā signāla laukuma attiecības pret visu monoglicerīdu signālu laukumu kopējo summu (sk. 2. att.), izmantojot šādu formulu:

glicerilmonopalmitāts (%)

kur:

Ax = glicerilmonopalmitāta signāla laukums;

ΣA = visu monoglicerīdu signālu laukumu summa.

Rezultātus uzdod ar precizitāti līdz vienam decimālciparam aiz komata.

7. ANALĪZES REZULTĀTU PĀRSKATS

Pārskatā par analīzes rezultātiem jānorāda:

— atsauce uz šo metodi,

— visa informācija, kas vajadzīga parauga pilnīgai identifikācijai,

— analīzes rezultāts,

— ziņas par atkāpēm no šīs metodes, pamatojoties uz ieinteresēto pušu vienošanos, vai kāda cita iemesla dēļ,

— laboratorijas identifikācijas dati, analīzes dienas datums un par analīzes veikšanu atbildīgo personu paraksti.

1. attēls

To silanizēšanas reakcijas produktu hromatogramma, kas iegūti, ar lipāzi iedarbojoties uz rafinētu olīveļļu, kurai pievienoti 20 % esterificētas eļļas (100 %).

Paskaidrojumi: Acides gras libres = brīvās tauksābes; Huile d’olive rafinée = rafinēta olīveļļa; 20 % Huile estérifiée = 20 % esterificēta eļļa; 1-2 monopalmitoléine = 1-2 monopalmitoleīns; 1-2 monopalmitine = 1-2 monopalmitīns; 1-2 mono C18 insat. = 1-2 mono- C18 nepiesāt.; Squalene = skvalēns.

2. attēls

Hromatogrammas:

A) neesterificēta olīveļļa, pēc iedarbības ar lipāzi; pēc silanizēšanas; šādos apstākļos (8–12 m kapilārā kolonna) vasku frakcija eluējas vienlaicīgi ar digicerīdu frakciju vai pavisam nedaudz vēlāk. Pēc iedarbības ar lipāzi triglicerīdu saturs nedrīkst būt augstāks par 15 %. Paskaidrojumi: 1 = Brīvās taukskābes 2 = Monoglicerīdi 3 = Diglicerīdi 4 = Triglicerīdi * = 2-monopalmitīns ** = C54 triglicerīds

Hromatogrammas:

B) esterificēta eļļa pēc iedarbības ar lipāzi; pēc silanizēšanas; šādos apstākļos (8–12 m kapilārā kolonna) vasku frakcija eluējas vienlaicīgi ar digicerīdu frakciju vai pavisam nedaudz vēlāk. Pēc iedarbības ar lipāzi triglicerīdu saturs nedrīkst būt augstāks par 15 %. Paskaidrojumi: 1 = Brīvās taukskābes 2 = Monoglicerīdi 3 = Diglicerīdi 4 = Triglicerīdi * = 2-monopalmitīns ** = C54 triglicerīds

8. PIEZĪMES

LIPĀZES SAGATAVOŠANA

Ir nopērkamas lipāzes ar pietiekamu aktivitāti. Tās var sagatavot arī laboratorijā šādi.

Atdzesē līdz 0 °C temperatūrai 5 kg svaigu cūkas aizkuņģa dziedzeru. Atdala apkārtējos cietos taukus un saistaudus, un pēc tam blenderī sasmalcina šķidras pastas veidā. Pastai pievieno 2,5 l bezūdens acetona, 4–6 stundas maisa, pēc tam centrifugē. Atlikumu vēl trīs reizes ekstrahē ar tādu pašu daudzumu bezūdens acetona, pēc tam divas reizes ar acetona/dietilētera (1/1 v/v) maisījumu, un divas reizes ar dietilēteri.

Atlikumu 48 h žāvē vakuumā, lai iegūtu stabilu pulveri, ko var ilgstoši glabāt ledusskapī, sargājot no mitruma iedarbības.

LIPĀZES AKTIVITĀTES KONTROLE

Sagatavo olīveļļas emulsiju šādā veidā.

Mikserī 10 min maisa maisījumu, kas sastāv no 165 ml gumiarabika 100 g/l šķīduma, 15 g sasmalcināta ledus un 20 ml iepriekš neitralizētas olīveļļas.

Pārnes 10 ml šīs emulsijas 50 ml tilpuma vārlāzē, pievieno 0,3 ml nātrija holāta 0,2 g/ml šķīdumu, un pēc tam 20 ml destilēta ūdens.

Vārglāzi novieto termostatā 37 °C temperatūrā; ievieto pH-metra elektrodus un spirāles maisītāju.

Ar bireti pa pilienam pievieno 0,1 N nātrija hidroksīda šķīdumu līdz pH 8,3.

Pievieno alikvotu lipāzes pulvera suspensijas ūdenī (0,1 g/ml lipāzes). Tiklīdz pH-metrs rāda 8,3, palaiž hronometru un pa pilienam pievieno nātrija hidroksīdu ar tādu ātrumu, lai reakcija nemainītos, un visu laiku būtu pH 8,3. Ik pēc minūtes atzīmē patērētā sārma daudzumu.

Iegūtos datus attēlo x/y grafikā, kurā uz abscisu ass atliek laiku, bet uz ordinātu ass – 0,1 N sārma šķīduma tilpumu mililitros, kas patērēts nemainīga pH saglabāšanai. Iegūtajai sakarībai jābūt lineārai.

Lipāzes aktivitāti, kas izteikta lipāzes vienībās vienā miligramā, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

A aktivitāte lipāzes vienības/mg;

V mililitri 0,1 N nātrija hidroksīda šķīduma minūtē (aprēķina pēc grafika);

N nātrija hidroksīda šķīduma titrs;

m testējamās lipāzes parauga masa miligramos.

Lipāzes vienība ir fermenta daudzums, kāds fermentatīvās šķelšanas reakcijās vienā minūtē izdala 10 mikroekvivalentus skābes.

▼M20 —————

▼M28









IX PIELIKUMS

SPEKTROFOTOMETRISKĀ ANALĪZE UV SPEKTRĀ

IEVADS

Spektrofotometriskā analīze UV spektrā var dot informāciju par tauku kvalitāti, to saglabāšanas stāvokli un tehnoloģisko procesu izraisītajām pārmaiņām tajos. Absorbcija pie metodē noteiktajiem viļņa garumiem notiek oksidēšanās un/vai rafinēšanas procesā konjugētu diēnu un triēnu sistēmu klātbūtnes dēļ. Šo absorbciju izsaka kā īpatnējo ekstinkciju

(1 % (masas) tauku šķīduma ekstinkcija attiecīgā šķīdinātājā 10 mm kivetē), ko parasti apzīmē ar K (sauc arī par “ekstinkcijas koeficientu”).

1. DARBĪBAS JOMA

Šajā pielikumā aprakstīta procedūra olīveļļas spektrofotometriskajai analīzei UV spektrā.

2. METODES PRINCIPS

Paraugu šķīdina vajadzīgajā šķīdinātājā un pie noteiktiem viļņa garumiem izmēra šķīduma absorbciju attiecībā pret tīru šķīdinātāju.

Vielas koncentrācijai 1 % (masas) 10 mm kivetē aprēķina īpatnējo ekstinkciju pie 232 nm un 268 nm izooktānā vai 232 nm un 270 nm cikloheksānā.

3. IEKĀRTA

3.1. Spektrofotometrs mērījumiem ultravioletajā spektra daļā (starp 220 un 360 nm) ar iespēju nolasīt atsevišķas nanometru vienības. Ieteicams regulāri pārbaudīt spektrometra viļņa garuma un absorbcijas skalu precizitāti un reproducējamību, kā arī izkliedēto gaismu. 3.1.1. Viļņa garuma skala. To var pārbaudīt, izmantojot references materiālu – optiskā stikla filtru, kas satur holmija oksīdu vai holmija oksīda šķīdumu (var būt hermētisks), kam ir izteiktas absorbcijas joslas. References materiāli ir paredzēti, lai verificētu un kalibrētu viļņa garuma skalas spektrofotometriem, kuri darbojas redzamajā un ultravioletajā starojuma apgabalā un kuriem nominālais spektrālās joslas platums ir ne vairāk par 5 nm. Mērījumus salīdzina ar gaisa tukšo paraugu 640–240 nm viļņa garuma diapazonā, ievērojot references materiāliem pievienotās instrukcijas. Ikreiz, kad maina spraugas platumu, izdara bāzes līnijas korekciju ar baltas gaismas kūli. Attiecīgie viļņa garumi ir uzskaitīti standarta references materiāla sertifikātā. 3.1.2. Absorbcijas skala. To var pārbaudīt, izmantojot komerciāli pieejamus hermētiskus references materiālus – paskābinātus kālija dihromāta šķīdumus noteiktās koncentrācijās un ar sertificētām absorbcijas vērtībām pie λmax (4 kālija dihromāta šķīdumi perhlorskābē, kas hermētiski ievietoti četrās UV paredzētās kvarca kivetēs, lai noteiktu linearitātes un fotometriskās pareizības referenci UV). Pēc bāzes līnijas korekcijas kālija dihromāta šķīdumus salīdzina ar tukšo izmantotās skābes paraugu, ievērojot references materiālam pievienotās instrukcijas. Attiecīgās absorbcijas vērtības ir uzskaitītas references materiāla sertifikātā. Alternatīvs veids, kādā pārbaudīt fotoelementa un fotomultiplikatora signālu, ir šāds: spektrofotometrijas veikšanai iesver 0,2000 g kālija hromāta un 1 000 ml mērkolbā to izšķīdina 0,05 N kālija hidroksīda šķīdumā, un uzpilda līdz zīmei. Ņem precīzi 25 ml iegūtā šķīduma, pārnes 500 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar to pašu kālija hidroksīda šķīdumu. Izmēra šādi iegūtā šķīduma ekstinkciju pie 275 nm, lietojot kālija hidroksīda šķīdumu kā references šķīdumu. Lietojot 1 cm kiveti, izmērītajai ekstinkcijai jābūt 0,200 ± 0,005.

3.2. Spektra UV daļas (220 līdz 360 nm) mērījumiem piemērotas taisnstūra kvarca kivetes ar vāciņiem, optiskais ceļa garums 10 mm. Ja kivetes piepildītas ar ūdeni vai citu piemērotu šķīdinātāju, tās savā starpā nedrīkst atšķirties par vairāk nekā 0,01 ekstinkcijas vienību.

3.3. Mērkolbas ar vienu zīmi, tilpums 25 ml, A klase.

3.4. Analītiskie svari ar nolasījuma precizitāti līdz 0,0001 g.

4. REAKTĪVI

Ja nav noteikts citādi, veicot analīzi, lieto vienīgi atzītas analītiskas tīrības pakāpes reaktīvus un destilētu vai demineralizētu ūdeni vai vismaz līdzvērtīgas tīrības pakāpes ūdeni.

Šķīdinātājs: izooktāns (2,2,4-trimetilpentāns) mērījumiem pie 232 nm un 268 nm un cikloheksāns mērījumiem pie 232 nm un 270 nm, ar absorbciju mazāk par 0,12 pie 232 nm un mazāk par 0,05 pie 270 nm salīdzinājumā ar destilētu ūdeni, mērot 10 mm kivetē.

5. PROCEDŪRA

5.1. Paraugam jābūt pilnīgi homogēnam un bez suspendētiem piemaisījumiem. Pretējā gadījumā tas jāfiltrē caur filtrpapīru aptuveni 30 °C temperatūrā.

5.2. Rūpīgi iesver 0,25 g (ar precizitāti līdz 1 mg) šādi sagatavota parauga 25 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar norādīto šķīdinātāju un homogenizē. Iegūtajam šķīdumam ir jābūt pilnīgi dzidram. Ja novērojama opalescence jeb duļķainība, ātri izfiltrē caur filtrpapīru. PIEZĪME. Neapstrādātu olīveļļu un neapstrādātu augstākā labuma olīveļļu absorbcijas mērīšanai pie 268 nm un 270 nm parasti pietiek ar 0,25–0,30 g materiāla. Mērījumiem pie 232 nm parasti ir vajadzīgs 0,05 g parauga, un visbiežāk gatavo divus atsevišķus šķīdumus. Olīvu izspaidu eļļu, rafinētu olīveļļu un eļļu, kam piejaukta olīveļļa, absorbcijas mērīšanai parasti vajadzīgs mazāks paraugs, piemēram, 0,1 g, jo šo eļļu absorbētspēja ir lielāka.

5.3. Ja vajadzīgs, abās kvarca kivetēs (parauga un standartšķīduma kivetē) bāzes līniju (220–290 nm) koriģē ar šķīdinātāju, tad piepilda parauga kvarca kiveti ar testa šķīdumu un izmēra ekstinkciju pie 232, 268 un 270 nm, šķīdinātāju izmantojot par standartšķīdumu. Izmērītajām ekstinkcijas vērtībām jābūt starp 0,1 un 0,8 vai verificētā spektrofotometra linearitātes diapazonā. Ja tā nav, mērījumi jāatkārto, lietojot pēc vajadzības koncentrētākus vai atšķaidītākus šķīdumus.

5.4. Kad izmērīta absorbcija pie 268 vai 270 nm, mēra absorbciju pie λmax, λmax + 4 un λmax – 4. Šīs absorbcijas vērtības izmanto, lai noteiktu īpatnējās ekstinkcijas variāciju (ΔΚ). PIEZĪME. Uzskata, ka λmax izooktānam, ko izmanto par šķīdinātāju, ir 268 nm un ka cikloheksānam tas ir 270 nm.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

6.1. Pieraksta pie dažādiem viļņa garumiem iegūtās īpatnējās ekstinkcijas (ekstinkcijas koeficientus), ko aprēķina šādi: kur: Kλ = īpatnējā ekstinkcija pie viļņa garuma λ; Eλ = ekstinkcija, kas izmērīta pie viļņa garuma λ; c = šķīduma koncentrācija g/100 ml; s = kvarca kivetes ceļa garums centimetros; rezultātus izsaka ar precizitāti līdz divām zīmēm aiz komata.

6.2. Īpatnējās ekstinkcijas variācija (ΔΚ) Ekstinkcijas absolūtās vērtības variāciju (ΔΚ) nosaka pēc šādas formulas: kur Km ir īpatnējā ekstinkcija pie maksimālajai absorbcijai atbilstošā viļņa garuma – 270 nm vai 268 nm atkarībā no izmantotā šķīdinātāja; rezultātus izsaka ar precizitāti līdz divām zīmēm aiz komata.









X PIELIKUMS

TAUKSKĀBJU METILESTERU NOTEIKŠANA AR GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. DARBĪBAS JOMA

Šajā pielikumā sniegti norādījumi par to, kā ar gāzu hromatogrāfiju noteikt brīvās un saistītās taukskābes augu taukos un eļļās pēc tam, kad šīs taukskābes pārvērstas taukskābju metilesteros (FAME).

Saistītās taukskābes no triacilglicerīdiem (TAG) un – atkarībā no esterifikācijas metodes – brīvās taukskābes (FFA) tiek pārvērstas taukskābju metilesteros (FAME), kurus nosaka ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

Šajā pielikumā aprakstītā metode ļauj kvantitatīvi noteikt FAME ar oglekļa atomu virknes garumu C12-C24, ieskaitot piesātināto, cis- un trans-mononepiesātināto un cis- un trans-polinepiesātināto taukskābju metilesterus.

2. PRINCIPS

FAME kvantitatīvajai analīzei izmanto gāzu hromatogrāfiju (GH). FAME sagatavo saskaņā ar A daļu. Pēc tam tos ievada un iztvaicē inžektorā. FAME izdalīšana notiek noteiktas polaritātes un garuma analītiskajās kolonnās. FAME noteikšanai izmanto liesmas jonizācijas detektoru (LJD). Analīzes nosacījumi ir izklāstīti B daļā.

FAME gāzu hromatogrāfijā, kuru veic ar LJD, par nesējgāzi var izmantot ūdeņradi vai hēliju (mobilā fāze). Ūdeņradis palielina izdalīšanas ātrumu un dod izteiktākas smailes. Stacionārā fāze ir mikroskopiski plāns šķidruma slānis uz inertas cietas virsmas, kas izgatavota no kausēta kvarca.

Kad iztvaicētie savienojumi šķērso kapilāro kolonnu, analīzes procesā tie mijiedarbojas ar stacionāro fāzi, kura klāj kapilārās kolonnas iekšējo virsmu. Tā kā dažādiem savienojumiem šī mijiedarbība ir atšķirīga, tie eluējas atšķirīgā laikā, un to sauc par savienojuma aiztures laiku pie konkrētajiem analīzes parametriem. Dažādos savienojumus ir iespējams identificēt, salīdzinot to aiztures laikus.

A DAĻA

TAUKSKĀBJU METILESTERU SAGATAVOŠANA NO OLĪVEĻĻAS UN OLĪVU IZSPAIDU EĻĻAS

1. DARBĪBAS JOMA

Šajā daļā aprakstīta taukskābju metilesteru sagatavošana. Tā aptver metodes taukskābju metilesteru sagatavošanai no olīveļļām un olīvu izspaidu eļļām.

2. PIEMĒROŠANAS JOMA

Taukskābju metilesteru sagatavošanu no olīveļļām un olīvu izspaidu eļļām veic, kālija hidroksīdu istabas temperatūrā transesterificējot ar metanola šķīdumu. Tas, vai paraugu pirms transesterifikācijas nepieciešams attīrīt, ir atkarīgs no brīvo taukskābju satura paraugā un no analītiskā rādītāja, kas jānosaka. Var izmantot šādu tabulu:







Eļļas kategorija Metode Neapstrādāta olīveļļa ar skābes saturu ≤ 2,0 % 1. Taukskābes 2. trans-taukskābes 3. ΔECN42 (pēc attīrīšanas ar silikagelu SPE) Rafinēta olīveļļa Olīveļļa, kas sastāv no rafinētas olīveļļas un neapstrādātām olīveļļām Rafinēta olīvu izspaidu eļļa Olīvu izspaidu eļļa Neapstrādāta olīveļļa ar skābes saturu > 2,0 % Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa 1. Taukskābes (pēc attīrīšanas ar silikagelu SPE) 2. trans-taukskābes (pēc attīrīšanas ar silikagelu SPE) 3. ΔECN42 (pēc attīrīšanas ar silikagelu SPE)

3. METODIKA

3.1. Kālija hidroksīda transesterifikācija istabas temperatūrā ar metanola šķīdumu

3.1.1. Princips

Metilesteri veidojas kā starpposma produkts kālija hidroksīda transesterifikācijā ar metanola šķīdumu, pirms sākas pārziepjošanās.

3.1.2. Reaktīvi

3.1.2.1. Metanols, kas satur ne vairāk kā 0,5 % (masas daļa %) ūdens.

3.1.2.2. Heksāns, hromatogrāfijas kvalitātes.

3.1.2.3. Heptāns, hromatogrāfijas kvalitātes.

3.1.2.4. Dietilēteris, stabilizēts analīzes vajadzībām.

3.1.2.5. Acetons, hromatogrāfijas kvalitātes.

3.1.2.6. Eluēšanas šķīdinātājs eļļas attīrīšanai kolonnas/SPE hromatogrāfijā: heksāna/dietilētera maisījums 87/13 (tilpuma daļa %).

3.1.2.7. Kālija hidroksīds, aptuveni 2M šķīdums metanolā: 11,2 g kālija hidroksīda izšķīdina 100 mililitros metanola.

3.1.2.8. Silikagela kasetnes, 1 g (6 ml), cietās fāzes ekstrakcijai.

3.1.3. Aparatūra

3.1.3.1. 5 ml tilpuma mēģenes ar aizskrūvējamu aizbāzni, kuram ir politetrafluoretilēna apmale.

3.1.3.2. Mērpipetes vai automātiskās pipetes, 2 ml un 0,2 ml.

3.1.4. Eļļas paraugu attīrīšana

Ja vajadzīgs, paraugus attīra, laižot eļļu caur silikagela cietās fāzes ekstrakcijas kasetni. Silikagela kasetni (3.1.2.8.) ievieto vakuuma eluēšanas iekārtā un mazgā ar 6 ml heksāna (3.1.2.2.); mazgāšana tiek veikta bez vakuuma. Pēc tam kolonnā ievada eļļas (aptuveni 0,12 g) šķīdumu 0,5 ml heksānā (3.1.2.2.). Šķīdumu izvelk tai cauri un pēc tam eluē ar 10 ml heksāna/dietilētera (87:13, tilpuma daļa %) (3.1.2.6.). Apvienotus eluātus homogenizē un sadala divos aptuveni vienādos tilpumos. Vienu alikvotu ietvaicē sausu rotācijas ietvaicētājā pie samazināta spiediena un istabas temperatūrā. Atlikumu izšķīdina 1 mililitrā heptāna, un šķīdums ir gatavs taukskābju analizēšanai ar gāzu hromatogrāfiju. Otru alikvotu ietvaicē un atlikumu izšķīdina 1 mililitrā acetona, lai vajadzības gadījumā veiktu triglicerīdu analīzi ar HPLC.

3.1.5. Procedūra

5 ml tilpuma stikla mēģenē ar aizskrūvējamu aizbāzni (3.1.3.1.) iesver aptuveni 0,1 g eļļas parauga. Pievieno 2 ml heptāna (3.1.2.2.) un sakrata. Pievieno 0,2 ml kālija hidroksīda šķīduma metanolā (3.1.2.7.), aizdara ar aizbāzni, kuram ir politetrafluoretilēna apmale, stingri aizskrūvē un 30 sekundes enerģiski krata. Atstāj noslāņoties, līdz augšējais slānis kļūst dzidrs. Dekantē augšējo slāni, kurš satur metilesterus. Heptāna šķīdums ir gatavs ievadīšanai gāzu hromatogrāfā. Līdz gāzu hromatogrāfiskās analīzes uzsākšanai šķīdumu ieteicams glabāt ledusskapī. Šķīdumu nav ieteicams glabāt ilgāk par 12 stundām.

B DAĻA

TAUKSKĀBJU METILESTERU ANALIZĒŠANA AR GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. DARBĪBAS JOMA

Šī daļa ietver vispārīgus norādījumus par gāzu hromatogrāfijas pielietošanu, izmantojot kapilāro kolonnu, lai noteiktu tāda taukskābju metilesteru maisījuma kvalitatīvo un kvantitatīvo sastāvu, kas iegūts saskaņā ar A daļā norādīto metodi.

Šī daļa nav piemērojama polimerizētām taukskābēm.

2. REAKTĪVI

2.1. Nesējgāze

Inerta gāze (hēlijs vai ūdeņradis), kas ir rūpīgi izžāvēta un kas satur mazāk par 10 mg/kg skābekļa.

1. piezīme. Ūdeņradis var divkārt palielināt analīzes ātrumu, bet tas ir bīstams. Ir pieejamas drošības ierīces.

2.2. Palīggāze

2.2.1. Ūdeņradis (tīrība ≥ 99,9 %), bez organiskiem piemaisījumiem.

2.2.2. Gaiss vai skābeklis, bez organiskiem piemaisījumiem.

2.2.3. Slāpeklis: (tīrība > 99 %).

2.3. Salīdzināšanas standarts

Tīru taukskābju metilesteru maisījums vai zināma sastāva tauku metilesteri, vēlams, līdzīgi analizējamās taukainās vielas sastāvam. Nepiesātināto skābju transizomēru noteikšanā noderīgi ir oktadecēn-, oktadekadiēn- un oktadekatriēnskābes metilesteru cis- un trans- izomēri.

Jāparūpējas par to, lai polinepiesātinātās taukskābes neoksidētos.

3. APARATŪRA

Šie norādījumi ir par parasto gāzu hromatogrāfijas aprīkojumu, kurā izmanto kapilārās kolonnas un liesmas jonizācijas detektoru.

3.1. Gāzu hromatogrāfs

Gāzu hromatogrāfa sastāvdaļas ir šādas.

3.1.1. Inžekcijas sistēma

Izmanto inžekcijas sistēmu ar kapilārajām kolonnām; šādā gadījumā inžekcijas sistēmai vajadzētu būt īpaši veidotai izmantošanai kopā ar šādām kolonnām. Inžekcijas sistēma var būt ar plūsmas dalīšanu vai ar virskolonnas inžekciju, bez plūsmas dalīšanas.

3.1.2. Krāsns

Krāsnij jāspēj sildīt kapilāro kolonnu vismaz līdz 260 °C un uzturēt vēlamo temperatūru 0,1 °C robežās. Pēdējā prasība ir īpaši svarīga, ja lieto kvarca kolonnu.

Visos gadījumos ir ieteicams izmantot sildīšanu ar temperatūras programmēšanu, jo īpaši taukskābēm, kurās ir mazāk par 16 oglekļa atomiem.

3.1.3. Kapilārā kolonna

3.1.3.1. Caurule, izgatavota no materiāla, kas ir inerts pret analizējamām vielām (parasti stikls vai kvarcs). Iekšējais diametrs ir starp 0,20 un 0,32 mm. Iekšējo virsmu pirms pārklāšanas ar stacionāro fāzi attiecīgi apstrādā (piemēram, sagatavo virsmu, inaktivē). Taukskābju un taukskābju cis- un trans-izomēru gadījumā pietiekams garums ir 60 m.

3.1.3.2. Stacionārā fāze, piemērotas ir polāra polisiloksāna (ciānpropilsilikona) kolonnas ar ķīmiski piesaistītu stacionāro fāzi. 2. piezīme. Pastāv risks, ka polārie polisiloksāni varētu radīt grūtības ar linolēnskābes un skābju ar C20 identificēšanu un izdalīšanu. Pārklājums ir plāns, t. i., 0,1 līdz 0,2 μm.

3.1.3.3. Kolonnas montēšana un kondicionēšana Kapilāro kolonnu montēšanā, t. i., kolonnas ievietošanā krāsnī (atbalsts), pievienojumu montēšanā (hermētiskums), kolonnas galu ievietošanā inžektorā un detektorā (nelietderīgo tilpumu samazināšana) jāievēro parastā piesardzība. Kolonnu pievieno nesējgāzes plūsmai (piemēram, 0,3 bar (30 kPa) 25 m garai kolonnai ar iekšējo diametru 0,3 mm). Kolonnu kondicionē, programmējot krāsns temperatūru 3 °C/min. no apkārtējās vides temperatūras līdz temperatūrai, kas ir par 10 °C zemāka nekā stacionārās fāzes sadalīšanās temperatūras robeža. Krāsni uztur šajā temperatūrā vienu stundu, līdz stabilizējas nulles līnija. Pēc tam atgriežas pie 180 °C un turpina darbu izotermiskos apstākļos. 3. piezīme. Pārdošanā ir pieejamas piemērotas iepriekš kondicionētas kolonnas.

3.1.4. Liesmas jonizācijas detektors un pārveidotājs-pastiprinātājs

3.2. Šļirce

Šļirces maksimālā ietilpība ir 10 μl, un tā ir graduēta 0,1 μl iedaļās.

3.3. Datu ieguves sistēma

Datu ieguves sistēma, kas tiešsaistē savienota ar detektoriem un tiek lietota kopā ar datorprogrammu, kura ir piemērota smaiļu integrēšanai un normalizēšanai.

4. PROCEDŪRA

Darbības, kas aprakstītas 4.1.–4.3. punktā, attiecas uz liesmas jonizācijas detektora lietošanu.

4.1. Testēšanas apstākļi

4.1.1. Optimālu kapilārās kolonnas darbības apstākļu izraudzīšanās

Kapilārās kolonnas efektivitāte un caurlaidība ir tāda, ka sastāvdaļu izdalīšana un analīzes ilgums lielā mērā ir atkarīgs no nesējgāzes plūsmas ātruma kolonnā. Tāpēc ir jāoptimizē darbības apstākļi, pielāgojot šo parametru (vai vienkārši kolonnas priekšgala zudumus) atkarībā no tā, vai mērķis ir uzlabot izdalīšanu vai paātrināt analīzi.

Turpmāk minētie apstākļi ir izrādījušies palīdzīgi FAME (C4–C26) izdalīšanā. Hromatogrammu piemēri ir doti B papildinājumā.







Inžektora temperatūra: 250 °C Detektora temperatūra: 250 °C Krāsns temperatūra: 165 °C (8 min) līdz 210 °C, uzsilšanas ātrums 2 °C/min Nesējgāze-ūdeņradis: kolonnas priekšgala spiediens, 179 kPa Kopējā plūsma: 154,0 ml/min Dalīšanas attiecība: 1:100 Inžekcijas tilpums: 1 μl

4.1.2. Izšķirtspējas noteikšana (sk. A papildinājumu)

Izšķirtspēju R aprēķina no divām blakusesošām smailēm I un II pēc šādas formulas:

R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) vai R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia)

vai

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), (BP (British Pharmacopeia)),

kur:

d r(I) ir I smailes aiztures attālums;

d r(II) ir II smailes aiztures attālums;

t r(I) ir I smailes aiztures laiks;

t r(II) ir II smailes aiztures laiks;

ω(I) ir I smailes pamatnes platums;

ω(II) ir II smailes pamatnes platums;

ω0,5 ir konkrētā savienojuma smailes platums, kuru mēra smailes augstuma pusceļā.

Ja ω(I) ≈ ω(II), R aprēķina pēc šādas formulas:

R = (dr ( II ) – d r(I))/ω = (dr ( II ) – d r(I))/4σ,

kur:

σ ir standartnovirze (sk. A papildinājuma 1. attēlu).

Ja attālums dr starp abām smailēm d r(II) – d r(I) ir vienāds ar 4σ, izšķirtspējas koeficients R = 1,

Ja divas smailes ir nodalītas nepilnīgi, abu smaiļu pārliekuma punktos novilktās tangentes krustojas punktā C. Lai abas smailes atdalītu pilnībā, attālumam starp tām jābūt vienādam ar:

d r(II) – d r(I) = 6 σ, attiecīgi R = 1,5 (sk. A papildinājuma 3. attēlu).

5. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

5.1. Kvalitatīvā analīze

Pēc B papildinājuma 1. attēla hromatogrammas paraugā identificē metilesteru smailes, vajadzības gadījumā interpolējot vai salīdzinot ar metilesteru standartmaisījumu (kā norādīts 2.3. punktā).

5.2. Kvantitatīvā analīze

5.2.1. Sastāva noteikšana

Aprēķina masas frakciju, wi atsevišķajiem taukskābju metilesteriem, izsaka metilesteru masas procentos, un to dara šādi.

5.2.2. Aprēķina metode

5.2.2.1. Vispārīgs gadījums

Aprēķina un metilesteru masas procentos izsaka dotā komponenta i saturu, nosakot attiecīgās smailes laukumu procentos attiecībā pret visu smaiļu laukumu summu pēc šādas formulas:

wi = (Ai/ΣA) × 100,

kur:

Ai ir laukums zem individuālas taukskābes metilestera i smailes;

ΣA ir visu laukumu summa zem visu individuālo taukskābju metilesteru smailēm.

Rezultātus izsaka ar divām zīmēm aiz komata.

4. piezīme. Taukiem un eļļām taukskābju metilesteru masas frakcija ir vienāda ar triacilglicerīnu masas frakciju, izsakot gramos uz 100 g. Ja šis pieņēmums nav pieļaujams, sk. 5.2.2.2. punktu.

5.2.2.2. Korekcijas koeficientu lietošana

Dažos gadījumos, piemēram, tādu taukskābju klātbūtnē, kas satur mazāk par astoņiem oglekļa atomiem, vai tādu skābju klātbūtnē, kam ir otrējās grupas, laukumus koriģē ar īpašiem korekcijas koeficientiem (Fci). Šos koeficientus nosaka katram instrumentam atsevišķi. Šim nolūkam izmanto piemērotus references materiālus, kuriem ir sertificēts taukskābju sastāvs attiecīgajā spektrā.

5. piezīme. Šie korekcijas koeficienti atšķiras no teorētiskajiem FID korekcijas koeficientiem, kas norādīti A papildinājumā, jo tie aptver arī inžekcijas sistēmas darbību u. c. Tomēr lielāku atšķirību gadījumā būtu jāpārbauda visas sistēmas darbība.

Šim standartmaisījumam taukskābes metilestera i masas procentus apraksta formula:

wi = (mi /Σm) × 100,

kur:

mi ir taukskābes metilestera i masa standartmaisījumā;

Σm ir dažādo komponentu, izteiktu kā taukskābes metilesteri, masas summa standartmaisījumā.

No standartmaisījuma hromatogrammas aprēķina taukskābes metilestera i procentuālo laukumu:

wi = (Ai/ΣA) × 100,

kur:

Ai ir taukskābes metilestera i laukums standartmaisījumā;

ΣA ir visu taukskābes metilesteru laukumu summa standartmaisījumā.

Tad korekcijas koeficients Fc ir:

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Paraugā masas procenti katram taukskābes metilesterim i ir:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Rezultātus izsaka ar divām zīmēm aiz komata.

6. piezīme. Aprēķinātā vērtība atbilst tādas individuālas taukskābes masas procentiem, kas aprēķināta kā triacilglicerīni uz 100 g tauku.

5.2.2.3. Iekšējā standarta lietošana

Dažās analīzēs (piemēram, ja visas taukskābes nav kvantitatīvi jānosaka, kā tas ir gadījumā, ja skābes ar četriem vai sešiem oglekļa atomiem ir kopā ar skābēm, kurās ir 16 un 18 oglekļa atomi, vai ja ir jānosaka taukskābes absolūtais daudzums paraugā) ir jālieto iekšējais standarts. Bieži lieto taukskābes ar 5, 15 vai 17 oglekļa atomiem. Būtu jānosaka iekšējā standarta korekcijas koeficients (ja tāds ir vajadzīgs).

Komponenta i masas procentus, izteiktus kā metilesterus, iegūst pēc formulas:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS),

kur:

Ai ir taukskābes metilestera i laukums;

A IS ir iekšējā standarta laukums;

F i ir taukskābes i, kas izteikta kā taukskābes metilesteris, korekcijas koeficients;

F IS ir iekšējā standarta korekcijas koeficients;

m ir analizējamā parauga masa miligramos;

m IS ir iekšējā standarta masa miligramos.

Rezultātus izsaka ar divām zīmēm aiz komata.

6. TESTĒŠANAS PĀRSKATS

Testēšanas pārskatā norāda metilesteru sagatavošanā un gāzu hromatogrāfijā lietotās metodes. Tajā norāda arī visus datus par darbu, kas nav norādīti šajā standartmetodē vai tiek uzskatīti par neobligātiem, kā arī datus par incidentiem, kuri varētu būt ietekmējuši rezultātus.

Testēšanas pārskatā iekļauj visu informāciju, kas vajadzīga, lai pilnībā identificētu paraugu.

7. PRECIZITĀTE

7.1. Starplaboratoriju salīdzinošās testēšanas rezultāti

Sīkāka informācija par starplaboratoriju salīdzinošo testēšanu, kurā testēta metodes precizitāte, ir izklāstīta standartā IOC/T.20/Doc. Nr. 33 un konkrēti tā C pielikumā. Vērtības, kas iegūtas šajā starplaboratoriju salīdzinošajā testēšanā, drīkst piemērot tikai šeit minētajiem analizējamo vielu koncentrācijas diapazoniem un matricēm.

7.2. Atkārtojamība

Absolūtā starpība starp diviem neatkarīgiem viena testa rezultātiem, kas iegūti, izmantojot to pašu metodi un identisku testa materiālu, tajā pašā laboratorijā, tam pašam operatoram izmantojot to pašu iekārtu neilgā laika posmā, ne vairāk kā 5 % gadījumu drīkst pārsniegt r vērtību, kas norādīta standartā IOC/T.20/Doc. Nr. 33 un konkrēti tā C pielikuma 1.–14. tabulā.

7.3. Reproducējamība

Absolūtā starpība starp diviem viena testa rezultātiem, kas iegūti, izmantojot to pašu metodi un identisku testa materiālu, dažādās laboratorijās, dažādiem operatoriem izmantojot dažādas iekārtas, ne vairāk kā 5 % gadījumu drīkst pārsniegt R vērtību, kas norādīta standartā IOC/T.20/Doc. Nr. 33 un konkrēti tā C pielikuma 1.–14. tabulā.









A pielikums

1. attēls

ω0,5 platums trijstūra ABC augstuma pusceļā un b platums trijstūra NPM augstuma pusceļā.







2. attēls 3. attēls









B papildinājums

1. attēls

Gāzu hromatogrāfijas profils, kas ar auksto metilationa metodi iegūts no olīvu izspaidu eļļas parauga

Ja nav norādīts citādi, hromatogrāfiskās smailes atbilst metilesterim un etilesterim.

▼B









XI PIELIKUMS

GAISTOŠO HALOGENĒTO ŠĶĪDINĀTĀJU SATURA NOTEIKŠANA OLĪVEĻĻĀ

1. METODE

Gāzu hromatogrāfiskā analīze, ņemot paraugu gāzes fāzē (head space paņēmiens).

2. APRĪKOJUMS

2.1. Gāzu hromatogrāfs ar elektronu satveres detektoru (ECD).

2.2. Head space iekārta.

2.3. Gāzu hromatogrāfijas kolonna, 2 m gara un ar 2 mm iekšējo diametru. Nekustīgā fāze: OV101 10 % vai līdzvērtīga, ar ko piesūcināts izkarsēts diatomīts ar daļiņu lielumu 80 līdz 100 mesh, kas mazgāts ar skābi un silanizēts.

2.4. Nesējgāze un palīggāze: slāpeklis gāzu hromatogrāfijai, piemērots detektēšanai ar elektronu satveri.

2.5. 10 līdz 15 ml stikla pudelītes ar teflona pārklājumu un alumīnija aizbāzni, caur ko var ievadīt