1991R2568 — LV — 01.10.2008 — 022.001

Šis dokuments ir izveidots vienīgi dokumentācijas nolūkos, un iestādes neuzņemas nekādu atbildību par tā saturu

Grozīta ar:







(*) Šis tiesību akts nekad nav publicēts latviešu valodā.









▼B

KOMISIJAS REGULA (EEK) Nr. 2568/91

(1991. gada 11. jūlijs)

par olīveļļas un olīvu izspaidu eļļas īpašībām un attiecīgajām analīzes metodēm







EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Ekonomikas kopienas dibināšanas līgumu, ņemot vērā Padomes 1966. gada 22. septembra Regulu Nr. 136/66/EEK par eļļas un tauku tirgus kopīgo organizāciju ( 1 ), kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EEK) Nr. 3577/90 ( 2 ) un jo īpaši tās 35.a pantu, tā kā Regulas Nr. 136/66/EEK pielikumā ir aprakstīta un definēta olīveļļa un olīvu izspaidu eļļa, ko tirgo katrā dalībvalstī, Kopienas iekšējā tirgū un tirdzniecībā ar trešām valstīm; tā kā, lai atšķirtu dažādu veidu eļļas, būtu jādefinē katras eļļas fizikālās un ķīmiskās īpašības un neapstrādātas olīveļļas organoleptiskās īpašības, lai garantētu attiecīgo produktu tīrību un kvalitāti, neskarot citus pastāvošos noteikumus; tā kā dažādu veidu eļļas īpašības būtu jānosaka vienveidīgi visā Kopienā; tā kā šajā nolūkā būtu jāizstrādā Kopienas metodes ķīmiskai analīzei un organoleptiskai novērtēšanai; tā kā būtu jāatļauj pārejas posmā izmantot citas dalībvalstīs piemērojamās analīzes metodes ar nosacījumu, ka, pastāvot rezultātu atšķirībai, kopējā metode ir izšķirošā; tā kā olīveļļas fizikālo un ķīmisko īpašību un analīzes metožu definīcija ir saistīta ar kombinētās nomenklatūras 15. nodaļas papildu piezīmju grozījumiem; tā kā neapstrādātas eļļas organoleptisko īpašību novērtēšana ietver atlasītu un apmācītu degustētāju žūriju izveidi; tā kā tādēļ būtu jānosaka šādu struktūru izveidei vajadzīgais laika posms; tā kā, ņemot vērā grūtības, ar ko dažas dalībvalstis sastapsies, izveidojot degustētāju žūrijas, būtu jāatļauj izmantot citu dalībvalstu žūrijas; tā kā, lai nodrošinātu olīvu izspaidu importam piemērojamās maksājumu sistēmas pareizu darbību, būtu jānosaka vienota metode eļļas satura noteikšanai šajos produktos; tā kā, lai nekaitētu tirdzniecībai, ir jāparedz, ka ierobežotu laika posmu drīkst tirgot eļļu, kas ir iepakota pirms šīs regulas stāšanās spēkā; tā kā ir jāatceļ Komisijas Regula (EEK) Nr. 1058/77 ( 3 ), kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Regulu (EEK) Nr. 1858/88 ( 4 ); tā kā Eļļas un tauku pārvaldības komiteja nav iesniegusi atzinumu tās priekšsēdētāja noteiktajā termiņā, IR PIEŅĒMUSI ŠO REGULU.







▼M20

1. pants

1. Eļļas, kuru īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 1. un 2. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par neapstrādātām olīveļļām Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 1. punkta a) un b) apakšpunkta nozīmē.

2. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 3. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par spīdīgo olīveļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 1. punkta c) apakšpunkta nozīmē.

3. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 4. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par rafinētu olīveļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 2. punkta nozīmē.

4. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 5. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par olīveļļu, kas sastāv no rafinētām olīveļļām un neapstrādātām olīveļļām Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 3. punkta nozīmē.

5. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 6. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par neapstrādātu olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 4. punkta nozīmē.

6. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 7. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par rafinētu olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 5. punkta nozīmē.

7. Eļļu, kuras īpašības atbilst šīs regulas I pielikuma 8. punktā noteiktajām īpašībām, uzskata par olīvu izspaidu eļļu Regulas Nr. 136/66/EEK pielikuma 6. punkta nozīmē.

▼B

2. pants

1. Eļļas īpašības, kas paredzētas I pielikumā, nosaka saskaņā ar turpmāk izklāstītajām analīzes metodēm:

— brīvas taukskābes, ko izsaka kā oleīnskābes procentus, nosaka ar II pielikumā izklāstīto metodi,

— peroksīda skaitli nosaka ar III pielikumā izklāstīto metodi,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— sterīnu saturu nosaka ar V pielikumā izklāstīto metodi,

— eritrodiolu un uvaolu nosaka ar VI pielikumā izklāstīto metodi,

▼M21

— 2-glicerilmonopalmitāta saturu nosaka pēc VII pielikumā aprakstītās metodes,

▼M20 —————

▼B

— spektrofotometriskajai analīzei izmanto IX pielikumā izklāstīto metodi,

— taukskābju sastāvu nosaka ar X A un X B pielikumā izklāstīto metodi,

— gaistošos halogenētos šķīdinātājus nosaka ar XI pielikumā izklāstīto metodi,

— neapstrādātas olīveļļas organoleptisko īpašību novērtēšanai izmanto XII pielikumā izklāstīto metodi,

▼M20 —————

▼M11

— stigmastadiēnus nosaka ar XVII pielikumā izklāstīto metodi,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Lai veiktu pārbaudes, kas paredzētas 3. punktā, analīzes, kuras minētas II, III, IX, X un XII pielikumā, un, ja vajadzīgs, visas kontrolanalīzes, kas nepieciešamas saskaņā ar valsts tiesību aktiem, veic pirms minimālā derīguma termiņa beigām. Ja paraugus ņem vairāk nekā četrus mēnešus pirms minimālā derīguma termiņa beigām, analīzes veic ne vēlāk kā ceturtajā mēnesī pēc tā mēneša, kad tika ņemts paraugs. Uz citām analīzēm, kas paredzētas minētajā regulā, neattiecas nekāds laika ierobežojums. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

2.a pants

Valsts iestādes vai to pārstāvji var pārbaudīt, vai paraugs atbilst deklarētajai kategorijai:

a) jebkādā kārtībā veicot analīzes, kas paredzētas I pielikumā;

b) vai ievērojot kārtību, kas izklāstīta I.b pielikumā par lēmumu pieņemšanas shēmu, līdz pieņem vienu no lēmumiem, kas iekļauts lēmumu pieņemšanas shēmā.

▼M19 —————

▼M5

►M19 3. ◄ pants

Ja konstatē, ka kādas eļļas organoleptiskās īpašības neatbilst tās aprakstam, attiecīgā dalībvalsts, neskarot jebkādas citas sankcijas, piemēro administratīvas finanšu sankcijas, kas nosakāmas atkarībā no atklātā pārkāpuma smaguma.

Novērtējot pārkāpumu, īpašu uzmanību velta normālos apstākļos uzglabātas eļļas īpašību dabiskajām izmaiņām.

Dalībvalstis katra pusgada sākumā informē Komisiju par atklāto pārkāpumu skaitu un veidu un par iepriekšējā pusgadā piemērotajām sankcijām.

▼M5

4. pants

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Ja dalībvalstīm rodas grūtības izveidot savā teritorijā degustēšanas žūrijas, tās var pieaicināt degustēšanas žūriju, kas apstiprināta kādā citā dalībvalstī.

3. Katra dalībvalsts izveido degustētāju žūriju sarakstu, ko veido profesionālās vai starpnozaru organizācijas saskaņā ar 1. punktā izklāstītajiem nosacījumiem, un nodrošina šo nosacījumu izpildi.

▼M19 —————

▼B

6. pants

1. Raušu un citu olīveļļas ieguves izspaidu (KN kodi 2306 90 11 un 2306 90 19) eļļas saturu nosaka ar XV pielikumā izklāstīto metodi.

2. Šā panta 1. punktā minēto eļļas saturu izsaka eļļas svara procentos no sausā materiāla svara.

▼M20

7. pants

Piemēro Kopienas noteikumus, kas attiecas uz piemaisījumu klātbūtni.

Attiecībā uz halogenētiem šķīdinātājiem ierobežojumi visām olīveļļu kategorijām ir šādi:

— katra konstatētā halogenētā šķīdinātāja maksimālais saturs: 0,1 mg/kg,

— konstatēto halogenēto šķīdinātāju kopējais maksimālais saturs: 0,2 mg/kg.

▼B

8. pants

1. Dalībvalstis paziņo Komisijai par pasākumiem, kas veikti, lai īstenotu šo regulu.

2. Dalībvalstis katra pusgada sākumā nosūta Komisijai paziņojumu par analītiskajiem datiem, kas attiecas uz iepriekšējā pusgadā izdarītajām analīzēm.

Rezultātus izskata Eļļas un tauku pārvaldības komiteja saskaņā ar Regulas Nr. 136/66/EEK 39. pantā izklāstīto kārtību.

9. pants

Ar šo ir atcelta Regula (EEK) Nr. 1058/77.

10. pants

1. Šī regula stājas spēkā trešajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Kopienu Oficiālajā Vēstnesī.

Tomēr XII pielikumā izklāstīto metodi piemēro ►M1 no 1992. gada 1. novembra ◄ , ja vien darbības neattiecas uz intervences sistēmu.

▼M5

Metode neattiecas uz neapstrādātu olīveļļu, kas sagatavota tirgum pirms 1992. gada 1. novembra.

▼B

2. Šo regulu nepiemēro olīveļļai un olīvu izspaidu eļļai, kas ir iepakota pirms šīs regulas stāšanās spēkā un laista tirgū līdz 1992. gada 31. oktobrim.

Šī regula ir saistoša kopumā un tieši piemērojama visās dalībvalstīs.









PIELIKUMI

Kopsavilkums







I pielikums Olīveļļas īpašības ▼M17 Ia pielikums Paraugu ņemšana no olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas, kas piegādāta tiešā iesaiņojumā, nepārsniedzot 100 litrus ▼M20 Ib pielikums Lēmumu pieņemšanas shēma ▼B II pielikums ►M21 Brīvo taukskābju noteikšana pēc aukstās metodes ◄ III pielikums Peroksīda skaitļa noteikšana IV pielikums ►M6 Vasku satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzes - šķidruma hromatogrāfiju ◄ V pielikums Sterīnu sastāva un satura noteikšana, izmantojot gāzu hromatogrāfiju ar kapilāro kolonnu VI pielikums Eritrodiola un uvaola noteikšana VII pielikums ►M21 2-glicerilmonopalmitāta satura noteikšana ◄ ▼M20 ————— ▼B IX pielikums Spektrofotometriskie pētījumi ultravioletajā spektrā XA pielikums Taukskābju metilesteru analīze ar gāzu hromatogrāfiju Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil XI pielikums Gaistošo halogenēto šķīdinātāju noteikšana olīveļļā Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B XV pielikums Eļļas saturs olīvu izspaidās XVI pielikums Joda skaitļa noteikšana ▼M11 XVII pielikums: Stigmastadiēnu noteikšana augu eļļās ▼M13 Annex XVIII: Method for determining the content of triglycerides with ECN ▼M19 Annex XIX: Method for determining aliphatic alcohol content

▼M21









I PIELIKUMS

OLĪVEĻĻAS ĪPAŠĪBAS







Veids Skābums (%) (*) Peroksīda skaitlis mEq O2/kg (*) Vaski mg/kg (**) 2 glicerilmonopalmitāts (%) Stigmastadiēns mg/kg (1) Starpība ECN42 HPLC – un ECN42 teorētiski aprēķinātā K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Organoleptiskais novērtējums Defekta mediāna (Md) (*) Organoleptiskais novērtējums Augļu piegaršas mediāna (Mf) (*) 1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,0 ja kop. palmitīnskābe % > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Neapstrādāta olīveļļa ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,0 ja kop. palmitīnskābe % > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ ►M22 3,5 ◄ Mf > 0 3. Spīdīgā olīveļļa > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,1 ja kop. palmitīnskābe % > 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > ►M22 3,5 ◄ (2) — 4. Rafinēta olīveļļa ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,1 ja kop. palmitīnskābe % > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 5. Olīeļļas maisījums, kas sastāv norafinētas un neaptrādātas olīveļļas ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,0 ja kop. palmitīnskābe % > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 6. Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Olīvu izspaidu eļļa ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Veids Skābju saturs (1) Kopā transoleīnskābes izomēri (%) Kopā translinolskābes + translinolēnskābes izomēri (%) Sterīna sastāvs Kopā sterīni (mg/kg) Eritrodiols un uvaols (%) (**) Miristīnskābe (%) Linolēnskābe (%) Arahīnskābe (%) Eikozānskābe (%) Behenskābe (%) Lignocerīnskābe (%) Holesterīns (%) Brasikasterīns (%) Kampesterīns (%) Stigmapesterīns (%) Betasitosterīns (%) (2) Delta-7-stigmastenols (%) 1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Neapstrādāta olīveļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Spīdīgā olīveļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Rafinēta olīveļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Olīeļļas maisījums ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Olīvu izspaidu eļļa ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









Ia PIELIKUMS

PARAUGU ŅEMŠANA NO OLĪVEĻĻAS VAI OLĪVU IZSPAIDU EĻĻAS, KAS PIEGĀDĀTA TIEŠĀ IESAIŅOJUMĀ, NEPĀRSNIEDZOT 100 LITRUS

Šo paraugu ņemšanas metodi piemēro olīveļļas vai olīvu izspaidu eļļas piegādēm, kas nepārsniedz 125 000 litrus un iesaiņotas tiešā iesaiņojumā, nepārsniedzot 100 litrus.

Ja piegāde pārsniedz 125 000 litrus, tā jāsadala 125 000 litru lielās vai mazākās partijās. Ja piegāde ir mazāka par 125 000 litriem, tā veido vienu partiju. Tad metodi piemēro katrai partijai.

Primāro paraugu minimālo paraugu skaitu nosaka pēc partijas lieluma saskaņā ar 1. punktā ievietoto tabulu.

Primārā parauga lielumu nosaka, pamatojoties uz tiešā iesaiņojuma tilpību saskaņā ar 2.1. punktā ievietoto tabulu.

Definīcijas, kas sniegtas standartā EN ISO 5555 piemēro terminiem “piegāde”, “primārais paraugs” un “laboratorijas paraugs”.

“Partija” ir tādu pārdošanas vienību komplekts, kas ražotas, izgatavotas un iepakotas tādos apstākļos, ka eļļu, kuru satur katra pārdošanas vienība, uzskata par homogēnu attiecībā uz visām analītiskajām īpašībām.

1. PRIMĀRO PARAUGU SKAITS

Primāro paraugu minimālo skaitu nosaka pēc partijas lieluma saskaņā ar šo tabulu:







Partijas lielums (litros) ir mazāks par Primāro paraugu minimālais skaits 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Tiešajiem iesaiņojumiem, kas izraudzīti, lai veidotu primāro paraugu, partijā jāatrodas līdzās.

Šaubu gadījumā dalībvalstis palielina primāro paraugu skaitu.

2. PRIMĀRO PARAUGU SATURS

2.1. Primārajiem paraugiem jāietver:



Ja tiešā iesaiņojuma tilpība ir Primārajā paraugā ietver eļļu no a) 5 litri vai vairāk a) 3 tiešiem iesaiņojumiem b) 3 litri vai vairāk, bet mazāk nekā 5 litri b) 3 tiešiem iesaiņojumiem b) 2 litri vai vairāk, bet mazāk nekā 3 litri c) 3 tiešiem iesaiņojumiem d) 1 litrs vai vairāk, bet mazāk nekā 2 litri d) 6 tiešiem iesaiņojumiem e) 0,75 litri vai vairāk, bet mazāk nekā 1 litrs e) 6 tiešiem iesaiņojumiem f) mazāk nekā 0,75 litri f) trīskāršs eļļas daudzums no minimālā iesaiņojumu skaita, lai kopējā tilpība būtu vairāk par 1,5 litriem

2.2. Primāros paraugus uzglabā tiešajā iesaiņojumā līdz pat analīzes veikšanas brīdim. Tad eļļu primārajos paraugos attiecīgā gadījumā sadala 3 laboratorijas paraugos, lai veiktu: a) II, III, IX un X pielikumā minētās analīzes; b) XII pielikumā minēto analīzi; c) citas analīzes.

2.3. Iesaiņojumus, kas veido primāro paraugu, sadala saskaņā ar kontroles procedūrām, kuras paredzētas valsts tiesību aktos.

3. ANALĪZES UN REZULTĀTI

a) Katru 1. punktā minēto primāro paraugu sadala laboratorijas paraugos saskaņā ar standarta EN ISO 5555 2.5. punktu, un analizē šādi: — brīvo taukskābju noteikšana, kā minēts 2. panta 1. punkta pirmajā ievilkumā, — peroksīda skaitļa noteikšana, kā minēts 2. panta 1. punkta otrajā ievilkumā, — spektrofotometriskā analīze, kā minēts 2. panta 1. punkta astotajā ievilkumā, — taukskābju sastāva noteikšana, kā minēts 2. panta 1. punkta devītajā ievilkumā.

b) Ja viens no a) apakšpunktā minēto analīžu rezultātiem vismaz vienam no primārajiem paraugiem, kas ņemti no tās pašas partijas, neatbilst deklarētās eļļas kategorijas īpašībām, visu attiecīgo partiju deklarē par neatbilstošu. Ja a) apakšpunktā minēto analīžu rezultāti katram primārajam paraugam, kas ņemts no tās pašas partijas, nav vienādi, ņemot vērā attiecīgo metožu atkārtojamības īpašības, visu partiju deklarē kā nevienveidīgu partiju, un katram primārajam paraugam veic citas vajadzīgās analīzes. Pretējā gadījumā citas vajadzīgās analīzes veic vienam primārajam paraugam no minētās partijas.

b) Ja viens no b) apakšpunkta otrajā daļā minēto analīžu rezultātiem neatbilst deklarētās eļļas kategorijas īpašībām, visu attiecīgo partiju deklarē par neatbilstošu. Ja visi b) apakšpunkta otrajā daļā minēto analīžu rezultāti atbilst deklarētās eļļas kategorijas īpašībām, visu attiecīgo partiju deklarē par atbilstošu.

▼M20









Ib PIELIKUMS

LĒMUMU PIEŅEMŠANAS SHĒMA, LAI PĀRBAUDĪTU TO, VAI OLĪVEĻĻAS PARAUGS ATBILST DEKLARĒTAJAI KATEGORIJAI

Analīzi, kas vajadzīga, lai pārbaudītu to, vai olīveļļa vai olīvu izspaidu eļļa atbilst deklarētajai kategorijai, var veikt:

a) jebkādā izvēles secībā veicot analīzes, kas paredzētas, lai pārbaudītu atbilstību īpašībām, kuras precizētas I pielikumā, vai

b) lēmumu pieņemšanas shēmā norādītajā secībā veicot analīzes, kas precizētas lēmumu pieņemšanas shēmā, līdz pieņem vienu no lēmumiem, kurš iekļauts lēmumu pieņemšanas shēmā.

Analīzes, kas attiecas uz piemaisījumiem un kas vajadzīgas, lai pārbaudītu atbilstību Eiropas Kopienas standartiem, veic atsevišķi.

Lēmumu pieņemšanas shēma attiecas uz visām olīveļļas un olīvu izspaidu eļļas kategorijām. To veido tabulas, kuras numurētas no 1 līdz 11 un kuras izmanto, pamatojoties uz attiecīgās eļļas deklarēto kategoriju un tādā kārtībā, kā noteikts vispārīgajā tabulā.

Vispārīgās tabulas un 1. līdz 11. tabulas atšifrējums:

— dubulta līnija (=) norāda virzienu, kuram jāseko, ja ir atbilstība (pozitīva atbilde) kritērijiem, kas precizēti iepriekšējā lodziņā. Punktota līnija (…) norāda citu virzienu, kuram jāseko neatbilstības gadījumā,

— virsraksti lodziņos, kas iekļauti 1. līdz 11. tabulā, attiecas uz analīzēm, kuras paredzētas šajā regulā, pamatojoties uz atbilstības tabulu, kas dota šā pielikuma 1. papildinājumā,

— burti iekavās, kas norādīti negatīva lēmuma apļos 1. līdz 11. tabulā, savstarpēji norāda uz indikatīvo informāciju, kas sniegta šā pielikuma 2. papildinājumā. Burti paši par sevi nenozīmē to, ka jāveic analīzes vai ka norādītie pieņēmumi ir patiesi.









1. papildinājums

Atbilstības tabula starp šīs regulas pielikumiem un lēmumu pieņemšanas shēmā precizētajām analīzēm







▼M21 – Skābums II pielikums Brīvo taukskābju noteikšana pēc aukstās metodes ▼M20 – Peroksīda skaitlis III pielikums Peroksīda skaitļa noteikšana – UV spektrometrija IX pielikums Spektrofotometriskā analīze – Organoleptiskais novērtējums XII pielikums Neapstrādātas olīveļļas organoleptiskā novērtēšana – 3,5-stigmastadiēni XVII pielikums Stigmastadiēnu noteikšanas metode augu eļļās – Trans-izomēri taukskābēs X.a un Taukskābju metilesteru analīze ar gāzu hromatogrāfiju X.b pielikums Taukskābju metilesteru pagatavošana – Taukskābju saturs X.a un Taukskābju metilesteru analīze ar gāzu hromatogrāfiju X.b pielikums Taukskābju metilesteru pagatavošana – ΔECN42 XVIII pielikums Triglicerīdu sastāva noteikšana ar ECN42 (starpība starp HPLC datiem un teorētisko saturu) – Sterīnu sastāvs un kopējais saturs V pielikums Sterīnu sastāva un satura noteikšana, izmantojot gāzu hromatogrāfiju ar kapilāro kolonnu – Eritrodiols un uvaols VI pielikums Eritrodiola un uvaola noteikšana – Vaski IV pielikums Vasku satura noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzes hromatogrāfiju – Alifātiskie spirti XIX pielikums Alifātisko spirtu noteikšana ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju ▼M21 – Piesātinātās taukskābes 2. pozīcijā VII pielikums 2-glicerilmonopalmitāta satura noteikšana ▼M20









2. papildinājums

1. tabula

a) Sk. neapstrādātu olīveļļu vai spīdīgo olīveļļu (Kvalitātes kritēriji – 2. tabula vai Kvalitātes un tīrības kritēriji – 4. tabula)

b) Sk. spīdīgo olīveļļu (Kvalitātes un tīrības kritēriji – 4. tabula)

2. tabula

a) Sk. spīdīgo olīveļļu (Kvalitātes un tīrības kritēriji – 4. tabula)

b) Sk. neapstrādātu augstākā labuma olīveļļu (Kvalitātes kritēriji – 1. tabula)

3. tabula

a) Rafinētas eļļas (olīvu vai citas) klātbūtne

b) Olīvu izspaidu eļļas klātbūtne

4. tabula

a) Sk. neapstrādātu augstākā labuma olīveļļu un neapstrādātu olīveļļu (Kvalitātes kritēriji – 1. tabula un 2. tabula)

b) Rafinētas eļļas (olīvu vai citas) klātbūtne

c) Olīvu izspaidu eļļas klātbūtne

d) Esterificētu eļļu klātbūtne

7. tabula

a) Olīvu izspaidu eļļas klātbūtne

b) Esterificētu eļļu klātbūtne

8. tabula

a) Rafinētas eļļas (olīvu vai citas) klātbūtne

b) Sk. spīdīgo olīveļļu (Kvalitātes un tīrības kritēriji – 4. tabula)

c) Esterificētu eļļu klātbūtne

11. tabula

(a) Esterificētu eļļu klātbūtne

▼B









II PIELIKUMS

▼M21

BRĪVO TAUKSKĀBJU NOTEIKŠANA PĒC AUKSTĀS METODES

▼B

1. SKĀBUMA NOTEIKŠANA

Brīvu taukskābju noteikšana olīveļļās. Brīvu taukskābju saturu izsaka kā skābumu, ko aprēķina parastā veidā.

1.1. Princips

Paraugu izšķīdina šķīdinātāju maisījumā un klātesošās brīvās skābes titrē ar kālija hidroksīda šķīdumu etanolā.

1.2. Reaktīvi

Visiem reaktīviem ir jābūt atzītas analītiskas kvalitātes un izmantojamam ūdenim jābūt divreiz destilētam vai līdzvērtīgas tīrības.

1.2.1. Dietilētera/etanola (95 tilp. %) maisījums vienādās tilpuma daļās. Piezīme: dietilēteris ir viegli uzliesmojošs un var veidot sprādzienbīstamus peroksīdus. To lietojot, ir jābūt īpaši piesardzīgiem. Dietilētera/etanola maisījumu tieši pirms lietošanas neitralizē ar kālija hidroksīda šķīdumu (1.2.2. punkts), pievienojot uz 100 ml maisījuma 0,3 ml fenolftaleīna šķīduma (1.2.3. punkts). Piezīme: ja nav iespējams lietot dietilēteri, var lietot šķīdinātāju maisījumu, kas sastāv no etanola un toluola. Vajadzības gadījumā etanolu var aizstāt ar 2-propanolu.

1.2.2. Kālija hidroksīds, KOH, titrēts etanola šķīdums, kura koncentrācija aptuveni 0,1 M/l vai vajadzības gadījumā 0,5 M/l. Ir jābūt zināmai kālija hidroksīda šķīduma etanolā precīzai koncentrācijai, un tā ir jāpārbauda tieši pirms lietošanas. Lieto šķīdumu, kas ir pagatavots vismaz piecas dienas pirms lietošanas un dekantēts brūna stikla pudelē ar gumijas aizbāzni. Šķīdumam jābūt bezkrāsainam vai iedzeltenam. Piezīme: stabilu bezkrāsainu kālija hidroksīda šķīdumu var pagatavot šādi. Uzkarsē līdz vārīšanās temperatūrai 1 000 ml etanola ar 8 g kālija hidroksīda un 0,5 g alumīnija skaidiņu un vienu stundu vāra ar atteces dzesinātāju. Tūlīt pārdestilē. Destilātā izšķīdina vajadzīgo kālija hidroksīda daudzumu. Atstāj uz dažām dienām un dzidro supernatantu dekantē no kālija karbonāta nogulsnēm. Šķīdumu var pagatavot arī bez destilācijas šādi: 1 000 ml etanola pievieno 4 ml alumīnija butilāta un maisījumu atstāj uz dažām dienām. Dekantē supernantantu un izšķīdina vajadzīgo daudzumu kālija hidroksīda. Šķīdums ir gatavs lietošanai.

1.2.3. Fenolftaleīna 10 g/l šķīdums 95 līdz 96 tilp. % etanolā vai sārmainā zilā 20 g/l šķīdums 95 līdz 96 tilp. % etanolā (stipri krāsotu tauku gadījumā).

1.3. Aparatūra

Parastais laboratoriju aprīkojums, tai skaitā:

1.3.1. Analītiskie svari;

1.3.2. 250 ml koniskā kolba;

1.3.3. 10 ml birete, graduēta pa 0,05 ml.

1.4. Procedūra

1.4.1. Parauga sagatavošana analīzei (Analīzi izdara ar filtrētu paraugu. Ja mitruma un piemaisījumu kopā ir mazāk par 1 %, paraugu lieto bez turpmākas apstrādes; ja to ir vairāk par 1 %, paraugs ir jāfiltrē.)

1.4.2. Parauga ņemšana Paraugu ņem atkarībā no paredzamā brīvo skābju satura saskaņā ar šādu tabulu:



Paredzamais skābju saturs Parauga masa (g) Svēršanas precizitāte (g) < 1 20 0,05 1 līdz 4 10 0,02 4 līdz 15 2,5 0,01 15 līdz 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Paraugu nosver koniskajā kolbā (1.3.2. punkts).

1.4.3. Noteikšana Paraugu (1.4.2. punkts) izšķīdina 50 līdz 150 ml iepriekš neitralizētā dietilētera un etanola maisījumā (1.2.1. punkts). Maisot titrē ar 0,1 M/l kālija hidroksīda šķīdumu (1.2.2. punkts) (sk. 2. piezīmi), līdz indikatora krāsa mainās (fenolftaleīna sārtā krāsa saglabājas vismaz 10 sekundes). 1. piezīme: titrēto kālija hidroksīda šķīdumu etanolā (1.2.2. punkts) var aizstāt ar kālija vai nātrija hidroksīda ūdens šķīdumu, ar noteikumu, ka ievadītā ūdens daudzums neizraisa fāzu atdalīšanos. 2. piezīme: ja vajadzīgais 0,1 M/l kālija hidroksīda daudzums ir lielāks par 10 ml, lieto 0,5 M/l šķīdumu. 3. piezīme: ja šķīdums titrēšanas laikā kļūst duļķains, pievieno pietiekami daudz šķīdinātāju (1.2.1. punkts), lai šķīdums kļūtu dzidrs.

1.5. Skābju saturs: izteikts oleīnskābes procentos

Skābju saturs svara procentos ir vienāds ar:

kur:

V = izlietotā titrētā kālija hidroksīda tilpums mililitros;

C = lietotā titrētā kālija hidroksīda precīzā koncentrācija M/l;

M = molmasa gramos skābei, ko izmanto rezultāta izteikšanai (= 282);

m = parauga masa gramos.

Rezultāts ►M6 divu aprēķinu ◄ aritmētiskais vidējais.









III PIELIKUMS

PEROKSĪDA SKAITĻA NOTEIKŠANA

1. DARBĪBASJOMA

Šis standarts apraksta eļļu un tauku peroksīda skaitļa noteikšanas metodi.

2. IZMANTOŠANASJOMA

Šis standarts ir piemērojams dzīvnieku un augu eļļām un taukiem.

3. DEFINĪCIJA

Peroksīda skaitlis ir to vielu daudzums paraugā, izteikts aktīvā skābekļa miliekvivalentos kilogramā, kuras oksidē kālija jodīdu aprakstītajos eksperimenta apstākļos.

4. PRINCIPS

Analīzes parauga apstrāde ar kālija jodīda šķīdumu etiķskābes un hloroforma šķīdumā. Atbrīvotā joda titrēšana ar standartizētu nātrija tiosulfāta šķīdumu.

5. APARATŪRA

Visam aprīkojumam jābūt brīvam no reducējošām vai oksidējošām vielām.

Piezīme: slīpētās virsmas nav jāeļļo.

5.1. 3 ml stikla svēršanas laiviņa.

5.2. Aptuveni 250 ml kolbas ar pieslīpētiem kakliem un aizbāžņiem, iepriekš izžāvētas un piepildītas ar sausu inertu gāzi (slāpekli vai, labāk, oglekļa dioksīdu).

5.3. 25 vai 50 ml birete, graduēta ik pa 0,1 ml.

6. REAKTĪVI

6.1. Hloroforms, kam ir analītiska reaktīva kvalitāte, atbrīvots no skābekļa, burbuļojot tam cauri tīras inertas gāzes straumīti.

6.2. Ledus etiķskābe, kam ir analītiska reaktīva kvalitāte, atbrīvota no skābekļa, burbuļojot tai cauri tīras, sausas inertas gāzes straumīti.

6.3. Kālija jodīda piesātināts ūdens šķīdums, nesen pagatavots, kas nesatur jodu un jodātus.

6.4. Nātrija tiosulfāta precīzi standartizēts 0,01 vai 0,002 N ūdens šķīdums, standartizēts tieši pirms lietošanas.

6.5. Cietes šķīdums, 10 g/l ūdens dispersija, nesen pagatavota no dabiskās šķīstošās cietes.

7. PARAUGS

Pievērš vērību, lai paraugu paņemtu un glabātu tumsā, turētu aukstumā un pilnīgi piepildītos stikla traukos, kas ir hermētiski noslēgti ar pieslīpētiem stikla vai korķa aizbāžņiem.

8. PROCEDŪRA

Analīzi izdara izkliedētā dienasgaismā vai mākslīgā apgaismojumā. Analizējamo paraugu ar precizitāti līdz tuvākajam 0,001 g nosver svēršanas laiviņā (5.1. punkts) vai, ja tādas nav, kolbā (5.2. punkts) saskaņā ar šādu tabulu atbilstīgi sagaidāmajam peroksīda skaitlim:







Sagaidāmais peroksīda skaitlis (mekv.) Analizējamā parauga masa (g) 0 līdz 12 5,0 līdz 2,0 12 līdz 20 2,0 līdz 1,2 20 līdz 30 1,2 līdz 0,8 30 līdz 50 0,8 līdz 0,5 50 līdz 90 0,5 līdz 0,3

Atver kolbu (5.2. punkts) un tajā ieliek stikla svēršanas laiviņu ar analīzes paraugu. Pievieno 10 ml hloroforma (6.1. punkts). Ātri maisot, analīzes paraugu izšķīdina. Pievieno 15 ml etiķskābes (6.2. punkts), pēc tam pievieno 1 ml kālija jodīda šķīduma (6.3. punkts). Nekavējoties aizkorķē, vienu minūti krata un atstāj tieši piecas minūtes tumšā vietā 15 līdz 25 °C temperatūrā.

Pievieno aptuveni 75 ml destilēta ūdens. Enerģiski kratot, izdalījušos jodu titrē ar nātrija tiosulfāta šķīdumu (6.4. punkts) (0,002 N šķīduma, ja sagaidāmie lielumi ir mazāki par 12, un 0,01 N šķīduma, ja sagaidāmie lielumi ir lielāki par 12), izmantojot par indikatoru cietes šķīdumu (6.5. punkts).

Vienam analizējamam paraugam izdara divas noteikšanas.

Vienlaikus izdara tukšo mēģinājumu. Ja tukšā mēģinājuma rezultāts pārsniedz 0,05 ml 0,01 N nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts), tad nomaina netīros reaktīvus.

9. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Peroksīda skaitli (PV), izteiktu aktīvā skābekļa miliekvivalentos kilogramā, aprēķina pēc formulas:

kur:

V = standartizēta nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts) ml skaits, kas izlietoti analīzē, kas ir koriģēts, lai ņemtu vērā tukšo mēģinājumu;

T = lietotā nātrija tiosulfāta šķīduma (6.4. punkts) precīzā normalitāte;

m = analīzes parauga masa gramos.

Rezultāts ir divu izdarīto noteikšanu aritmētiskais vidējais.

▼M21









IV PIELIKUMS

VASKU SATURA NOTEIKŠANA AR KAPILĀRĀS KOLONNAS GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. IZMANTOŠANAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta vasku satura noteikšana olīveļļās. Vaskus sadala pēc oglekļa atomu skaita molekulā. Šo metodi var jo īpaši izmantot, lai atšķirtu ar spiešanas paņēmienu iegūtu olīveļļu no olīvu izspaidu eļļas, ko iegūst pēc ekstrakcijas paņēmiena.

2. PRINCIPS

Taukiem vai eļļai pievieno piemērotu iekšējo standartu, pēc tam hromatogrāfiski sadala hidrēta silikagela kolonnā. Testēšanas apstākļos iegūst frakciju, kas eluējas vispirms (kas satur savienojumus, kuru polaritāte ir mazāka nekā triglicerīdiem), un to tieši analizē ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA

3.1. 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba

3.2. Stikla kolonna gāzes hromatogrāfijai, iekšējais diametrs 15,0 mm, augstums 30 līdz 40 cm, ar krānu

3.3. Piemērots gāzes hromatogrāfs ar kapilāro kolonnu, kas aprīkots ar tiešās ievadīšanas sistēmu kolonnā, kas sastāv no šādiem mezgliem: 3.3.1. Termostata kamera kolonnām (kolonnu krāsns) ar programmējamu temperatūru 3.3.2. Aukstās inžekcijas iekārta tiešai ievadīšanai kolonnā 3.3.3. Liesmas jonizācijas detektors un pārveidotājs/pastiprinātājs 3.3.4. Reģistrējošā iekārta/integrators ar maināmu papīra ātrumu darbam ar pārveidotāju/pastiprinātāju (3.3.3.), kuras atbildes reakcijas laiks ir ne lielāks par 1 s. (Var izmantot arī datorizētas sistēmas, kas nodrošina gāzes hromatogrāfijas datu iegūšanu, izmantojot personālo datoru.) 3.3.5. Stikla vai kvarca stikla kapilārā kolonna ar iekšējo diametru 0,25 līdz 0,32 mm, kas ir 8 līdz 12 m gara, ar vienādu no 0,10 līdz 0,30 μm šķidrās fāzes slāni. (Šim nolūkam piemērotas gatavas nopērkamās SE-52 un SE-54 tipa šķidrās fāzes.)

3.4. 10 μl tilpuma mikrošļirce ar rūdītu adatu inžekcijai uz kolonnas

3.5. Elektrovibrators

3.6. Rotācijas ietvaicētājs

3.7. Mufeļkrāsns

3.8. Analītiskie svari ar svēršanas precizitāti + 0,1 mg

3.9. Laboratorijas trauki

4. REAKTĪVI

4.1. Silikagels ar daļiņu izmēru no 60 līdz 200 μm Silikagelu uz vismaz 4 h ievieto mufeļkrāsnī 500 °C temperatūrā. Atdzesē un pievieno 2 % ūdens no ņemtā silikagela daudzuma. Lai maisījumu homogenizētu, to rūpīgi sakrata. Pirms lietošanas vismaz 12 h glabā tumšā vietā

4.2. n-heksāns, hromatogrāfijai

4.3. Etilēteris, hromatogrāfijai

4.4. n-heptāns, hromatogrāfijai

4.5. Laurilarahidāta standarta 0,1 % (m/v) šķīdums heksānā (iekšējais standarts). (Var izmantot arī palmitilpalmitātu vai miristilstearātu.) 4.5.1. Sudāns 1 (1-fenil-azo-2-naftols)

4.6. Nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, gāzes hromatogrāfijai

4.7. Palīggāzes: — tīrs ūdeņradis gāzes hromatogrāfijai, — tīrs gaiss gāzes hromatogrāfijai.

5. PROCEDŪRA

5.1. Hromatogrāfijas kolonnas sagatavošana

Suspendē 15 g silikagela (4.1.) n-heksānā (4.2.) un pārnes kolonnā (3.2.). Nostādina. Sablīvē, izmantojot elektrovibratoru (3.5.), lai hromatogrāfijas slānis būtu homogenāks. Perkolē 30 ml n-heksāna attīrīšanai no piemaisījumiem. Ar svariem (3.8.) iesver precīzi 500 mg parauga 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.), un atbilstoši sagaidāmajam vasku saturam pievieno vajadzīgo daudzumu iekšējā standarta (4.5.). Piemēram, pievieno 0,1 mg laurilarahidāta, analizējot olīveļļu, vai 0,25 līdz 0,5 mg, analizējot olīvu izspaidu eļļu. Sagatavoto paraugu pārnes hromatogrāfijas kolonnā, izmantojot divas 2 ml porcijas n-heksāna (4.2.).

Šķīdinātājam ļauj izplūst no kolonnas, līdz tā līmenis pazeminās līdz apmēram 1 mm virs absorbenta, un tad, lai attīrītu no dabīgi saturošajiem n-alkāniem, perkolē vēl 70 ml n-heksāna. Tad sāk eluēšanu hromatogrāfijai, savācot 180 ml n-heksāna/etilētera maisījuma (attiecībā 99:1) ar ātrumu apmēram 15 pilieni desmit sekunžu laikā. Parauga eluēšana jāveic istabas temperatūrā 22 ± 4 °C temperatūrā.

NB!

— n-heksāna/etilētera maisījums (99:1) jāsagatavo tajā pašā dienā.

— Vasku pareizas eluēšanas vizuālai kontrolei maisījumam var pievienot 100 μl Sudānas 1 krāsvielas 1 % šķīdumu tajā. Tā kā krāsvielas aiztures laiks ir lielāks nekā vaskiem un mazāks nekā triglicerīdiem, eluēšana jāpārtrauc tūlīt pēc tam, kad krāsojums sasniedzis kolonnas apakšējo daļu, jo tas liecina, ka visi vaski jau ir eluēti no kolonnas.

Šādi iegūto parauga frakciju ietvaicē rotācijas ietvaicētājā (3.6.) gandrīz sausu. Pēdējos apmēram 2 ml šķīdinātāja iztvaicē ar vāju slāpekļa plūsmu; pievieno 2–4 ml n-heptāna.

5.2. Gāzes hromatogrāfijas analīze

5.2.1. Sagatavošana

Kolonnu uzstāda gāzes hromatogrāfam (3.3.), pievienojot ieeju kolonnā virskolonnas sistēmai, bet kolonnas izeju detektoram. Veic gāzes hromatogrāfijas aparatūras vispārēju pārbaudi (gāzes kontūru, detektora un reģistrācijas ierīces darbību, u. c.).

Ja kolonnu izmanto pirmo reizi, tā vispirms jākondicionē. Nedaudz nesējgāzes izlaiž caur kolonnu, un tad ieslēdz gāzes hromatogrāfu. Pakāpeniski iesilda tā, lai apmēram četru stundu laikā sasniegtu 350 °C temperatūru. Šādu temperatūru uztur vismaz divas stundas, un pēc tam iekārtai noregulē vajadzīgos darba apstākļus (iestata gāzes plūsmu, aizdedz liesmu, pievieno elektroniskajai reģistrācijas iekārtai (3.3.4.), iestata kolonnas krāsns temperatūru, detektoru, u. c.), reģistrē signālu ar jutību, kas ir vismaz divas reizes augstāka par analīzei nepieciešamo jutību. Nulles līnijai jābūt taisnai, bez jebkādiem izsitieniem, un tā nedrīkst novirzīties.

Negatīvas taisnvirziena novirzes liecina par neblīvumiem kolonnas savienojumu vietās; savukārt pozitīvas novirzes liecina, ka kolonna ir nepietiekami kondicionēta.

5.2.2. Darba apstākļu izvēle

Parasti izmanto šādus apstākļus:

— kolonnas temperatūra – —



20 °C/min 5 °C/min 20 °C/min sākumā 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektora temperatūra – 350 °C;

— ievadītās vielas daudzums: 1 μl no n-heptāna šķīduma (2–4 ml);

— nesējgāze: hēlijs vai ūdeņradis ar attiecīgajai gāzei pareizu lineāro ātrumu (sk. papildinājumā);

— instrumenta jutība: atbilst turpmāk aprakstītajiem nosacījumiem.

Apstākļus var izmainīt atbilstoši kolonnas un hromatogrāfa raksturlielumiem tā, lai tiktu izdalīti visi vaski un panākta pietiekama signālu izšķirtspēja (sk. attēlu); C32 iekšējā standarta aiztures laikam ir jābūt 18 ± 3 min. Visvairāk reprezentatīvā vaska signālam jābūt vismaz 60 % no pilnas skalas.

Signālu integrēšanas parametri jānosaka tā, lai tiktu iegūts attiecīgo signālu laukumu pareizs novērtējums.

NB! Ņemot vērā, ka beigu temperatūra ir augsta, pieļaujama līdz 10 % novirze no pilnas skalas vērtības.

5.3. Analīzes veikšana

Ar 10 μl tilpuma mikrošļirci ņem 1 μl šķīduma paraugu; atvelk šļirces virzuli tā, lai iztukšotu adatu. Adatu ievieto inžektorā un pēc 1–2 sekundēm ātri ievada; pēc apmēram piecām sekundēm adatu lēnām izvelk.

Veic reģistrāciju, līdz visi vaski ir pilnībā eluēti.

Nulles līnijai noteikti jāatbilst nepieciešamajiem nosacījumiem.

5.4. Signālu identifikācija

Signālus identificē pēc aiztures laikiem, tos salīdzinot ar tādos pašos apstākļos analizētiem tādu vasku maisījumiem, kuru aiztures laiki ir zināmi.

Attēlā redzama neapstrādātas augstākā labuma olīveļļas vasku hromatogramma.

5.5. Daudzuma noteikšana

Izmantojot integratoru, nosaka iekšējā standarta un alifātisko esteru C40 līdz C46 signālu laukumu.

Aprēķina katra vaska estera saturu mg/kg eļļas pēc šādas formulas:

kur

Ax = katra estera signāla laukums, kvadrātmilimetros;

As = iekšējā standarta signāla laukums, kvadrātmilimetros;

ms = pievienotā iekšējā standarta masa, miligramos;

m = analīzei ņemtā parauga masa, gramos.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Norāda dažādu C40 līdz C46 vasku kopīgo saturu mg/kg eļļas (ppm).

NB! Kvantitatīvi nosakāmie komponenti saistāmi ar C40 līdz un C46 esteru signāliem, izmantojot par paraugu olīveļļas vasku hromatogrammu turpmāk redzamajā attēlā. Ja esteris C46 parādās divas reizes, tad, lai to identificētu, ieteicams analizēt olīvu izspaidu eļļas vasku frakciju, kur C46 signāls ir viegli identificējams tāpēc, ka tas ir izteiktā pārākumā.

Rezultātus uzdod ar precizitāti līdz vienam ciparam aiz komata.

Attēls.

Olīveļļas vasku hromatogramma ( 5 )

Paskaidrojumi:

I.S. = laurilarahidāts;

1. = diterpēnesteri;

2 + 2′ = C40 esteri

3 + 3′ = C42 esteri

4 + 4′ = C44 esteri;

5. = C46 esteri

6. = sterīna esteri un triterpēnspirts.









Papildinājums

Gāzes lineārā ātruma noteikšana

Pēc noregulēšanas darba normāliem darba apstākļiem gāzes hromatogrāfā ievada 1–3 μl metāna (vai propāna). Uzņem laiku, kādā gāze iziet cauri kolonnai no ievadīšanas mirkļa līdz tā signāla parādīšanās brīdim (tM).

Gāzes lineāro ātrumu aprēķina pēc formulas L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros un tM ir laiks sekundēs.

▼B









V PIELIKUMS

STERĪNU SASTĀVA UN KONCENTRĀCIJAS NOTEIKŠANA, IZMANTOJOT GĀZU HROMATOGRĀFIJU AR KAPILĀRO KOLONNU

1. DARBĪBAS JOMA

Metode apraksta individuālo un kopējo sterīnu satura noteikšanu taukus saturošās vielās.

2. METODES PRINCIPS

Taukus saturoso vielu, pieliekot a-holestanolu kā iekšējo standartu, pārziepjo ar kālija hidroksīda šķīdumu etanolā un pēc tam nepārziepjoto daļu ekstrahē ar dietilēteri.

Sterīnu frakciju atdala no nepārziepjojamā ekstrakta ar hromatogrāfiju uz bāziska silikagēla plāksnes. No silikagēla reģenerētos sterīnus pārveido trimetilsililēteros un analizē ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA

3.1. 250 ml kolba ar pieslīpētu savienojumu, aprīkota ar atteces dzesinātāju.

3.2. 500 ml dalāmās piltuves.

3.3. 250 ml kolbas.

3.4. Komplekts analīzei ar plānslāņa hromatogrāfiju, izmantojot 20 × 20 cm stikla plāksnes.

3.5. Ultravioletā spuldze ar viļņa garumu 366 vai 254 nm.

3.6. 100 μl un 500 μl mikrošļirces.

3.7. Cilindrisks poraina stikla filtrs G 3 (porainība 15 līdz 40 μm), aptuveni 5 cm augsts un aptuveni ar 2 cm diametru, piemērots filtrēšanai pazeminātā spiedienā, ar 12/21 ārējo pieslīpējumu.

3.8. 50 ml vakuumpudele ar 12/21 iekšējo pieslīpējumu aprīkošanai ar stikla filtru (3.7. punkts).

3.9. 10 ml mēģene ar konisku apakšu un aizbāzni.

3.10. Ar sadales sistēmu aprīkots gāzu hromatogrāfs ar kapilāro kolonnu, kura sastāvdaļas ir šādas: 3.10.1. termostatējama kamera kolonnu vēlamās temperatūras uzturēšanai ar precizitāti līdz ± 1 °C; 3.10.2. termostatējama iztvaicēšanas iekārta (inžektors) ar silanizētu stikla iztvaicētāju; 3.10.3. liesmas jonizācijas detektors un pārveidotājs/pastiprinātājs; 3.10.4. reģistrējošā iekārta/integrators ar atbildes laiku ne lielāku par vienu sekundi un ar maināmu papīra ātrumu darbam ar pārveidotāju/pastiprinātāju (3.10.3. punkts).

3.11. 20 līdz 30 m gara stikla vai kvarca kapilārā kolonna ar iekšējo diametru 0,25 līdz 0,32 mm, pilnīgi pārklāta ar vienāda biezuma SE-52 vai SE-54 vai ar līdzvērtīgu šķidro fāzi, kuras slāņa biezums ir starp 0,10 un 0,30 μm.

3.12. Mikrošļirce gāzu hromatogrāfijai ar 10 μl tilpumu un rūdītu adatu.

4. REAKTĪVI

4.1. Kālija hidroksīds, aptuveni 2 N etanola šķīduma. 130 g kālija hidroksīda (minimālā koncentrācija 85 %) dzesējot izšķīdina 200 ml destilēta ūdens, pēc tam uzpilda ar etanolu līdz vienam litram. Šķīdumu glabā cieši noslēgtās tumša stikla pudelēs.

4.2. Dietilēteris, analītiskas tīrības.

4.3. Bezūdens nātrija sulfāts, analītiskas tīrības.

4.4. Stikla plāksnes, pārklātas ar silikagēlu, bez fluorescences indikatora, 0,25 mm biezas (var iegādāties tirdzniecībā, lietošanai gatavas).

4.5. Kālija hidroksīds, 0,2 N etanola šķīduma. 13 g kālija hidroksīda izšķīdina 20 ml destilēta ūdens un uzpilda ar etanolu līdz vienam litram.

4.6. Benzols, hromatogrāfijas kvalitātes. (sk. 5.2.2. punktu).

4.7. Acetons, hromatogrāfijas kvalitātes. (sk. 5.2.2. punktu).

4.8. Heksāns, hromatogrāfijas kvalitātes. (sk. 5.2.2. punktu).

4.9. Dietilēteris, hromatogrāfijas kvalitātes. (sk. 5.2.2. punktu).

4.10. Hloroforms, analītiskas tīrības. (sk. 5.2.2. punktu).

4.11. Standartšķīdums plānslāņa hromatogrāfijai: holesterīns vai fitosterīni, ►M6 2 % ◄ šķīdums hloroformā.

4.12. 2,7-dihlorfluoresceīna 0,2 % šķīdums etanolā. To padara nedaudz bāzisku, pievienojot dažus pilienus 2 N kālija hidroksīda šķīduma spirtā.

4.13. Bezūdens piridīns, hromatogrāfijas kvalitātes.

4.14. Heksametildisilazāns.

4.15. Trimetilhlorsilāns.

4.16. Sterīnu trimetilsililēteru standartšķīdumi. Tos pagatavo pirms lietošanas no tīriem sterīniem vai sterīnu maisījumiem, kas iegūti no sterīnus saturošām eļļām.

4.17. α-holestanols, 0,2 % sķīdums (masa/tilp.) hloroformā (iekšējais standarts).

4.18. Nesējgāzes: ūdeņradis vai hēlijs, gāzu hromatogrāfijas tīrības.

4.19. Palīggāzes: — ūdeņradis, gāzu hromatogrāfijas tīrības, — gaiss, gāzu hromatogrāfijas tīrības.

5. PROCEDŪRA

5.1. Nepārziepjojamās vielas pagatavošana. 5.1.1. Ar 500 μl mikrosļirci 250 ml kolbā ievada tādu daudzumu 0,2 % α-holestanola šķīduma hloroformā (4.17), kas satur holestanola daudzumu, kurš atbilst aptuveni 10 % no noteikšanai ņemtā parauga alikvotās daļas. Piemēram, olīveļļas gadījumā uz 5 g parauga pievieno 500 μl 0,2 % α- holestanola sķīduma un ►M6 ————— ◄ olīvu izspaidu eļļas gadījumā pievieno 1 500 μl. Slāpekļa straumē iztvaicē sausu un pēc tam tajā pašā kolbā precīzi nosver 5 g sausa nofiltrēta parauga. ►M6 Eļļas ◄ , kas satur nozīmīgus holesterīna daudzumus, var uzrādīt pīķus ar aiztures laikiem, kas ir identiski holestanola aiztures laikam. Tādā gadījumā sterīnu frakcija ir jāanalizē divreiz — ar iekšējo standartu un bez tā ►M6 vai holestanola vietā izmanto betulinolu ◄ . 5.1.2. Pievieno 50 ml 2 N kālija hidroksīda šķīduma etanolā, uzliek atteces dzesinātāju un silda līdz lēnai viršanai uz ūdens vannas, visu laiku enerģiski maisot, līdz ir notikusi pārziepjošana (šķīdums kļūst dzidrs). Turpina sildīt 20 minūtes, pēc tam caur dzesinātāja augšgalu pievieno 50 ml destilēta ūdens, atvieno dzesinātāju un atdzesē kolbu aptuveni līdz 30 °C. 5.1.3. Kolbas saturu kvantitatīvi pārnes 500 ml dalāmajā piltuvē, vairākas reizes apskalojot ar destilētu ūdeni, kura kopējais daudzums ir aptuveni 50 ml. Pievieno aptuveni 80 ml dietilētera, enerģiski krata aptuveni 30 sekundes un ļauj noslāņoties (1. piezīme). Atdala apakšējo ūdens fāzi, savācot to citā dalāmajā piltuvē. Tieši tāpat ūdens fāzi ekstrahē vēl divas reizes, katrai ekstrakcijai izlietojot 60 līdz 70 ml dietilētera. 1. piezīme: radušos emulsiju var likvidēt, pievienojot nedaudz etilspirta vai metilspirta ar pulverizatoru. 5.1.4. Dietilētera ekstraktus apvieno dalāmajā piltuvē un mazgā ar destilētu ūdeni (50 ml katru reizi), līdz mazgājamam ūdenim ir neitrāla reakcija. Kad mazgājamais ūdens ir aizvadīts, ētera fāzi žāvē ar bezūdens nātrija sulfātu un nofiltrē uz bezūdens nātrija sulfāta iepriekš nosvērtā 250 ml kolbā, mazgājot dalāmo piltuvi un filtru ar mazu daudzumu dietilētera. 5.1.5. Ēteri destilē līdz dažiem ml, tad nelielā vakuumā vai slāpekļa straumē izžāvē sausu, žāvēšanu veic aptuveni 15 minūtes žāvēšanas skapī 100 °C temperatūrā, atdzesē eksikatorā un pēc tam nosver.

5.2. Sterīnu frakcijas atdalīšana. 5.2.1. Bāzisko plākšņu sagatavošana. Silikagēla plāksnes (4.4) uz 10 sekundēm pilnīgi iegremdē 0,2 N kālija hidroksīda šķīdumā etanolā (4.5. punkts), pēc tam divas stundas atstāj izžūt velkmē un beidzot uz vienu stundu ieliek žāvēšanas skapī 100 °C temperatūrā. Izņem no žāvēšanas skapja un glabā eksikatorā uz kalcija hlorīda līdz lietošanai (šādi apstrādātas plāksnes ir jāizlieto 15 dienu laikā). 2. piezīme: ja sterīnu frakcijas atdalīšanai izmanto bāziskā silikagēla plāksnes, nepārziepjojamās vielas nav jāapstrādā ar alumīnija oksīdu. Visi savienojumi ar skābju īpašībām (taukskābes un pārējie) tādā veidā paliek uz starta līnijas un sterīnu josla labi atdalās no alifātisko un triterpēnu spirtu joslas. 5.2.2. Plākšņu attīstīšanas kamerā ielej benzola/acetona maisījumu, kuru tilpumu attiecība ir 95:5, aptuveni 1 cm biezā slānī. Var lietot arī heksāna/dietilētera maisījumu, kuru tilpumu attiecība ir 65:35. Noslēdz kameru ar piemērotu vāku un atstāj aptuveni pusstundu, lai iestātos šķidruma/tvaiku līdzsvars. Kameras iekšējām virsmām var piestiprināt filtrpapīra sloksnes, kas iemērktas eluentā. Tas aptuveni par trešo daļu samazina attīstīšanas laiku un izraisa komponentu vienmērīgāku eluēšanu. 3. piezīme: lai sasniegtu pilnīgi atkārtojamus eluēšanas apstākļus, attīstīšanas maisījums katrai analīzei ir jānomaina. 5.2.3. Pagatavo aptuveni 5 % nepārziepjojamo vielu (5.1.5. punkts) šķīdumu hloroformā un ar 100 μl mikrošļirci uzvelk uz hromatogrāfijas plāksnes (5.2.1. punkts) iespējami tievu un vienādu svītru, aptuveni 2 cm atstatumā no viena gala, izlietojot 0,3 ml. Vienā līnijā ar šo svītru uzliek 2 līdz 3 ml sterīnu standartšķīduma (4.11. punkts) vienā plāksnes galā tā, lai sterīnu joslu varētu pēc attīstīšanas identificēt. 5.2.4. Plāksni ievieto attīstīšanas kamerā, kas ir sagatavota, kā noteikts 5.2.2. punktā. Vides temperatūrai jābūt starp 15 un 20 °C. Kameru tūlīt noslēdz ar vāku un atstāj eluēties, līdz šķīdinātāja līnija sasniedz aptuveni 1 cm no plāksnes augšējās malas. Plāksni izņem no attīstīšanas kameras un iztvaicē šķīdinātāju karsta gaisa plūsmā vai neilgu laiku atstāj plāksni velkmē. 5.2.5. Plāksni viegli un vienmērīgi apsmidzina ar 2,7-dihlorfluoresceīna šķīdumu. Aplūkojot plāksni ultravioletajā apgaismojumā, sterīnu joslu var identificēt pēc tā, ka tā ir vienā līnijā ar plankumu, kas ir iegūts no standartšķīduma. Joslas robežas apkārt fluorescējošajam plankumam apzīmē ar melnu zīmuli. 5.2.6. Ar metāla lāpstiņu noskrāpē silikagēlu apzīmētajā laukumiņā. Smalki sadrupināto noņemto materiālu novieto uz stikla filtra (3.7. punkts). Pievieno 10 ml karsta hloroforma, rūpīgi samaisa ar metāla lāpstiņu un vakuumā nofiltrē, savācot filtrātu stikla filtram pievienotajā vakuumpudelē (3.8. punkts). Nogulsnes trīs reizes uz filtra mazgā ar dietilēteri (katru reizi aptuveni 10 ml), filtrātu savācot tajā pašā filtram pievienotajā vakuumpudelē. Filtrātu ietvaicē līdz 4 līdz 5 ml tilpumam, atlikušo šķīdumu pārnes iepriekš nosvērtā 10 ml mēģenē (3.9. punkts), viegli sildot lēnā slāpekļa straumē, to iztvaicē sausu, vēlreiz uzpilina dažus pilienus acetona, atkal izžāvē sausu, ievieto žāvēšanas skapī 105 °C temperatūrā aptuveni uz 10 minūtēm, pēc tam ļauj eksikatorā atdzist un nosver. Mēģenē esošās nogulsnes sastāv no sterīnu frakcijas.

5.3. Trimetilsililēteru pagatavošana. 5.3.1. Mēģenes saturam, kas ir sterīnu frakcija, pievieno sililēšanas reaktīvu, kas sastāv no piridīna/heksametildisilazāna/trimetilhlorsilāna maisījuma, kuru tilpumu attiecība ir 9:3:1 (4. piezīme), pa 50 μl uz katru miligramu sterīnu. 4. piezīme: lietošanai gatavi šķīdumi ir pieejami tirdzniecībā. Ir pieejami arī citi silanizēšanas reaktīvi, tādi kā, piemēram, 0-bis-trimetilsililtrifluoracetamīds ar 1 % trimetilhlorsilānu, kas ir jāatšķaida ar vienādu tilpumu bezūdens piridīna. 5.3.2. Mēģeni aizkorķē, rūpīgi krata (bez apgriešanas), līdz sterīni ir pilnīgi izšķīduši. Atstāj vismaz 15 minūtes istabas temperatūrā, pēc tam dažas minūtes centrifugē. Dzidrais šķīdums ir gatavs gāzu hromatogrāfiskai analīzei. 5. piezīme: viegla opalescence, kas var veidoties, ir parasta un nerada traucējumus. Baltu pārslu veidošanās vai sārta krāsojuma parādīšanās norāda uz mitruma klātbūtni vai reaktīva sabojāšanos. Ja tā notiek, analīze ir jāatkārto.

5.4. Gāzu hromatogrāfiskā analīze. 5.4.1. Iepriekšējas darbības, kolonnas pakošana. 5.4.1.1. Kolonnu iemontē gāzu hromatogrāfā, pievienojot ieejas galu iztvaicētājam, kas ir pievienots plūsmas sadales sistēmai, un pievienojot izejas galu detektoram. Izdara vispārējās gāzu hromatogrāfa iekārtas pārbaudes (noplūdes no gāzu līnijām, detektora efektivitāti, plūsmas dalīšanas sistēmas un reģistrējošās sistēmas efektivitāti utt.). 5.4.1.2. Ja kolonnu lieto pirmoreiz, ir ieteicams to kondicionēt. Laiž lēnu gāzes plūsmu cauri kolonnai, pēc tam ieslēdz gāzu hromatogrāfu un pakāpeniski uzsilda līdz temperatūrai, kas ir vismaz 20 °C virs darba temperatūras (6. piezīme). Saglabā šo temperatūru vismaz divas stundas, pēc tam visu iekārtu noregulē darba režīmā (noregulē gāzu plūsmas un dalīšanu, liesmas degšanu, savienojumu ar elektronisko reģistrācijas iekārtu, kolonnas kameras temperatūru, detektoru un inžektoru), pēc tam reģistrē signālu, ņemot vērā jutību, kas ir vismaz divas reizes lielāka par analīzei paredzēto temperatūru. Nulles līnijai ir jābūt lineārai, bez jebkādiem pīķiem, un tā nedrīkst nobīdīties. Negatīva taisna līnija norāda uz noplūdēm kolonnas pievienojumu vietās; pozitīva nobīde norāda uz neatbilstīgu kolonnas kondicionēšanu. 6. piezīme: kondicionēšanas temperatūrai jābūt vismaz par 20 °C zemākai nekā lietojamai stacionārai fāzei paredzētajai maksimālajai temperatūrai. 5.4.2. Darba apstākļu izvēle. 5.4.2.1. Norādījumi par darba apstākļiem ir šādi: — kolonnas temperatūra: 260 ± 5 °C, — iztvaicētāja temperatūra: 280 °C, — detektora temperatūra: 290 °C, — nesējgāzes lineārais ātrums: hēlijam 20 līdz 35 cm/s, ūdeņradim 30 līdz 50 cm/s, — dalījuma attiecība: 1:50 līdz 1:100, — iekārtas jutība: 4 līdz 16 reižu lielāka par mazāko pārslēdzamo jutību, — reģistrēšanas jutība: 1 līdz 2 mV f.s., — papīra ātrums: 30 līdz 60 cm/h, — iešļircinātās vielas daudzums: 0,5 līdz 1 μl TMSE šķīduma. Šie apstākļi var mainīties atkarībā no kolonnas un gāzu hromatogrāfa īpašībām tā, lai iegūtu hromatogrammas, kas atbilst šādām prasībām: — β-sitosterīna aiztures laikam jābūt 20 ± 5 minūtes, — kampesterīna pīķim jābūt: olīveļļai (vidējais saturs 3 %) 15 ± 5 % no visas skalas; sojas eļļai (vidējais saturs 20 %) 80 ± 10 % no visas skalas, — visiem klātesošiem sterīniem jābūt atdalītiem. Turklāt vienlaikus, pīķiem esot atdalītiem, tiem ir jābūt izšķirtiem, t.i., pīķa līnijai ir jāatgriežas uz nulles līnijas, pirms sāk veidoties jauns pīķis. Nepilnīgu izšķiršanu tomēr var pieciest ar nosacījumu, ka pīķi ar relatīvo aiztures laiku TRR 1,02 var kvantitatīvi noteikt, izmantojot perpendikulu. 5.4.3. Analītiskā procedūra. 5.4.3.1. 10 ml mikrosļircē ievelk 1μl heksāna, pēc tam ievelk 0,5 μl gaisa un beidzot 0,5 lidz 1 μl parauga sķīduma. Paceļ šļirces virzuli, lai iztukšotu adatu. Izdur adatu cauri iešļircināšanas iekārtas membrānai un pēc vienas vai divām sekundēm strauji iešļircina, pēc apmēram piecām sekundēm lēni izvelk adatu. 5.4.3.2. Turpina reģistrēt, līdz klātesošie sterīnu TMSE ir pilnīgi eluēti. Nulles līnijai visu laiku ir jāatbilst prasībām (5.4.1.2. punkts). 5.4.4. Pīķu identificēšana. Individuālos pīķus identificē, pamatojoties uz aiztures laikiem un salīdzinot ar sterīnu TMSE maisījumiem, kas analizēti, ņemot vērā tādus pašus nosacījumus. Sterīni eluējas šādā secībā: holesterīns, brasikasterīns, 24-metilenholesterīns, kampesterīns, kampestanols, stigmasterīns, Δ7-kampesterīns, Δ5,23-stigmastadienols, klerosterīns, b-sitosterīns, sitostanols, Δ5-avenasterīns, Δ5,24-stigmastadienols, Δ7-sigmastenols, Δ7-avenasterīns. Sitosterīna aiztures laiki SE-52 un SE-54 kolonnās ir parādīti 1. tabulā. 1. un 2. zīmējumā parādītas dažu eļļu raksturīgas hromatogrammas. 5.4.5. Kvantitatīvā novērtēšana. 5.4.5.1. Izmantojot integratoru, aprēķina α-holestanola un sterīnu pīķu laukumus. Savienojumu pīķus, kas nav ietverti 1. tabulā, neņem vērā. Atbildes signāla koeficientam α-holestanolam ir jābūt vienādam ar 1. 5.4.5.2. Katra individuālā sterīna koncentrāciju mg/100 g taukus saturošās vielas aprēķina šādi: kur: Ax = sterīna x pīķa laukums ►M6 ————— ◄ ; As = α-holestanola piķa laukums ►M6 ————— ◄ ; ms = pievienotā α-holestanola masa miligramos; m = noteikšanai ņemtā parauga masa gramos.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

6.1. Individuālo sterīnu koncentrācijas uzdod kā mg/100 g taukus saturošās vielas un to summu — kā “kopējos sterīnus”.

6.2. Katra individuālā sterīna procentus aprēķina pēc attiecīgā pīķa laukuma attiecības pret sterīnu kopējo pīķu laukumu. kur: Ax = sterīna x pīķa laukums; ΣA = kopejais sterīnu pīķu laukums.









PIELIKUMA PAPILDINĀJUMS

Gāzes lineārā ātruma noteikšana

Gāzu hromatogrāfā, kas noregulēts atbilstīgi parastajiem darba apstākļiem, iešļircina 1 līdz 3 ml metāna (vai propāna) un izmēra laiku, kādā gāze iziet caur kolonnu no iešļircināšanas mirkļa līdz pīķa parādīšanās mirklim (tM).

Lineāro ātrumu izrēķina kā L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros un tM ir laiks sekundēs, kas izmērīts ar hronometru.







1. tabula Sterīnu relatīvie aiztures laiki Pīķis Identifikācija Relatīvie aiztures laiki SE 54 kolonna SE 52 kolonna 1. holesterīns Δ-5-holesten-3β-ols 0,67 0,63 2. holestanols 5α-holestan-3β-ols 0,68 0,64 3. brasikasterīns [24S]-24-metil-Δ-5,22-holestadien-3β-ols 0,73 0,71 4. 24-metilēnholesterīns 24-metilen-Δ-5,24-holesten-3β-ols 0,82 0,80 5. kampesterīns [24R]-24-metil-Δ-5-holesten-3β-ols 0,83 0,81 6. kampestanols [24R]-24-metil-holestan-3β-ols 0,85 0,82 7. stigmasterīns [24R]-24-etil-Δ-5,22-holestadien-3β-ols 0,88 0,87 8. Δ-7-kampesterins [24R]-24-metil-Δ-7-holesten-3β-ols 0,93 0,92 9. Δ-5,23-stigmastadienols [24R, S]-24-etil-Δ-5,23-holestadien-3β-ols 0,95 0,95 10. klerosterīns [24S]-24-etil-Δ-5,25-holastadien-3β-ols 0,96 0,96 11. β-sitosterins [24R]-24-etil-Δ-5-holestan-3β-ols 1,00 1,00 12. sitostanols 24-etil-holestan-3β-ols 1,02 1,02 13. Δ-5-avenasterīns [24Z]-24-etiliden-5-holesten-3β-ols 1,03 1,03 14. Δ-5,24-stigmastadienols [24R, S]-24-etil-Δ-5,24-holestadien-3β-ols 1,08 1,08 15. Δ-7-stigmastenols [24R, S]-24-etil-Δ-7,24-holestadien-3β-ols 1,12 1,12 16. Δ-7-avenasterins [24Z]-24-etiliden-Δ-7-holesten-3β-ols 1,16 1,16

1. zīmējums

Nerafinētas olīveļļas sterīnu frakcijas gāzu hromatogramma

2. zīmējums

Rafinētas olīveļļas sterīnu frakcijas gāzu hromatogramma









VI PIELIKUMS

ERITRODIOLA UN UVAOLA NOTEIKŠANA

IEVADS

Eritrodiols (parasti ar to saprot abus glikolus — eritrodiolu un uvaolu — kopā) ir nepārziepjojamās frakcijas sastāvdaļa, kas raksturīga dažu veidu taukus saturošām vielām. To ievērojami lielākās koncentrācijās atrod ar šķīdinātājiem ekstrahētā olīveļļā nekā citās eļļās, tādās kā spiestā olīveļļā un vīnogu kauliņu eļļā, kas arī to satur, un tādējādi eritrodiola klātbūtne var uzrādīt ar šķīdinātājiem ekstrahētas olīveļļas klātbūtni.

1. DARBĪBAS JOMA

Metode apraksta procedūru eritrodiola noteikšanai taukus saturošās vielās.

2. METODES PRINCIPS

Taukus saturošo vielu pārziepjo ar kālija hidroksīdu etanola šķīdumā. Nepārziepjojamo frakciju pēc tam ekstrahē ar dietilēteri un tīra, laižot caur alumīnija oksīda kolonnu.

Nepārziepjojamām vielām izdara plānslāņa hromatogrāfiju uz silikagēla plāksnes, līdz atdalās joslas, kas atbilst sterīnu un eritrodiola frakcijām. No plāksnes atpakaļiegūtos sterīnus un eritrodiolu pārvērš trimetilsililēteros un maisījumu analizē ar gāzu hromatogrāfiju.

Rezultātus izsaka eritrodiola procentos eritrodiola un sterīnu maisījumā.

3. APARATŪRA

3.1. V pielikumā (sterīnu satura noteikšana) aprakstītā aparatūra.

4. REAKTĪVI

4.1. V pielikumā (sterīnu satura noteikšana) aprakstītie reaktīvi.

4.2. Eritrodiola standartšķīdums, 0,5 % šķīdums hloroformā.

5. PROCEDŪRA

5.1. Nepārziepjojamās vielas pagatavošana

Kā aprakstīts V pielikuma 5.1.2. punktā.

5.2. Eritrodiola un sterīnu atdalīšana

5.2.1. Sk. V pielikuma 5.2.1. punktu.

5.2.2. Sk. V pielikuma 5.2.2. punktu.

5.2.3. Pagatavo nepārziepjojamo vielu 5 % šķīdumu hloroformā. Ar 0,1 ml mikrošļirci uzvelk uz hromatogrāfijas plates iespējami tievu un vienādu svītru, izlietojot aptuveni 0,3 ml šķīduma, aptuveni 1,5 cm no apakšējās malas. Vienā plāksnes galā uzliek dažus mikrolitrus holesterīna un eritrodiola šķīduma izmantošanai par standartu.

5.2.4. Plāksni ievieto attīstīšanas kamerā, kas ir sagatavota, kā noteikts 5.2.1. punktā. Vides temperatūrai būtu jābūt ap 20 °C. Kameru tūlīt noslēdz ar vāku un atstāj eluēties, līdz šķīdinātāja līnija sasniedz aptuveni 1 cm no plāksnes augšējās malas. Plāksni izņem no attīstīšanas kameras un iztvaicē šķīdinātāju karsta gaisa plūsmā.

5.2.5. Plāksni viegli un vienmērīgi apsmidzina ar 2,7-dihlorfluoresceīna šķīdumu spirtā. Plāksni apskatot ultravioletajā apgaismojumā, sterīna un eritrodiola joslas var identificēt pēc tā, ka tās ir vienā līnijā ar standartvielām. Iezīmē tieši aiz fluorescējošās joslas malas.

5.2.6. Ar metāla lāpstiņu noskrāpē silikagēlu iezīmētajos laukumiņos. Noskrāpēto materiālu no plāksnes pārnes 50 ml kolbā. Pievieno 15 ml karsta hloroforma, labi sakrata un caur stikla filtru nofiltrē tā, lai silikagēls tiktu pārnests uz filtra. Trīs reizes mazgā ar karstu hloroformu (katru reizi 10 ml), savācot filtrātu 100 ml kolbā. Filtrātu ietvaicē līdz 4-5 ml tilpumam, pārnes iepriekš nosvērtā 10 ml centrifūgas stobriņā ar konisku dibenu, izžāvē, maigi sildot slāpekļa straumē, un nosver.

5.3. Trimetilsililesteru pagatavošana

Kā aprakstīts V pielikuma 5.3. punktā.

5.4. Gāzu hromatogrāfiskā analīze

Kā aprakstīts iepriekš minētās metodes 5.4. punktā. Gāzu hromatogrāfa darba apstākļiem analizējot jābūt tādiem, lai izdarītu sterīnu analīzi un atdalītu TMSE no eritrodiola un uvaola.

Kad paraugs ir iešļircināts, turpina reģistrēšanu, līdz ir eluēti klātesošie sterīni, eritrodiols un uvaols. Pēc tam identificē pīķus (eritrodiola un uvaola aiztures laiki attiecībā pret β-sitosterīnu attiecīgi ir aptuveni 1,45 un 1,55) un aprēķina sterīnu pīķu laukumus.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

kur:

A1 = eritrodiola pīķa laukums ►M6 ————— ◄ ;

A2 = uvaola pīķa laukums ►M6 ————— ◄ ;

ΣAsterīnu = kopējais sterīnu pīķu laukums ►M6 ————— ◄ .

Rezultātus izsaka līdz vienai zīmei aiz komata.

▼M21









VII PIELIKUMS

2-GLICERILMONOPALMITĀTA SATURA NOTEIKŠANA

1. IZMANTOŠANAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta triglicerīdu molekulā 2. pozīcijā saistītās palmitīnskābes noteikšana pēc 2-glicerilmonopalmitāta.

Šo metodi var izmantot istabas temperatūrā (20 °C) šķidrām augu eļļām.

2. PRINCIPS

Pēc sagatavošanas eļļas paraugu šķeļ ar aizkuņģa dziedzera lipāzi: triglicerīdu daļējā selektīvā hidrolīzē 1. un 3. pozīcijā rodas 2-monoglicerīdi. 2-glicerilmonopalmitāta saturu monoglicerīdu frakcijā pēc sililēšanas nosaka ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3. APARATŪRA UN MATERIĀLI

3.1. 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba

3.2. 100, 250 un 300 ml tilpuma vārglāzes

3.3. Hromatogrāfijas kolonna no stikla, iekšējais diametrs 21–23 mm, garums 400 mm, ar poraina stikla disku un krānu

3.4. 10, 50, 100 un 200 ml tilpuma mērcilindri

3.5. 100 un 250 ml tilpuma kolbas

3.6. Rotācijas ietvaicētājs

3.7. 10 ml tilpuma centrifūgas mēģenes ar konisku apakšdaļu un slīpēta stikla aizbāzni

3.8. Centrifūga 10 un 100 ml tilpuma mēģenēm

3.9. Termostats, kurā var uzturēt 40 ± 0,5 °C temperatūru

3.10. 1 un 2 ml tilpuma graduētas pipetes

3.11. 1 ml tilpuma šļirce zemādas injekcijām

3.12. 100 μl tilpuma mikrošļirce

3.13. 1 000 ml tilpuma šķirpiltuve

3.14. Kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfs ar virskolonnas auksto inžekciju parauga tiešai ievadīšanai kolonnā un krāsni, kurā var uzturēt vajadzīgo temperatūru ar precizitāti apm. 1 °C

3.15. Virskolonnas aukstais inžektors parauga tiešai ievadīšanai kolonnā

3.16. Liesmas jonizācijas detektors un elektrometrs

3.17. Elektrometram piemērota reģistrējošā iekārta/integrators ar maināmu papīra ātrumu, kuras atbildes reakcijas laiks ir ne lielāks par 1 s

3.18. Stikla vai kvarca stikla kapilārā kolonna, garums 8–12 metri, iekšējais diametrs 0,25–0,32 mm, kas pārklāta ar metilpolisiloksānu vai fenilmetilpolisiloksānu 5 %, 0,10–0,30 μm slānis, izmantojama 370 °C temperatūrā

3.19. 10 μl tilpuma mikrošļirce ar vismaz 7,5 cm garu rūdītu adatu tiešai virskolonnas ievadīšanai

4. REAKTĪVI

4.1. Silikagels ar daļiņu izmēru no 0,063 līdz 0,200 mm (70/280 mesh), kas sagatavots šādi: Silikagelu porcelāna tīģelī žāvskapī 4 stundas žāvē 160 °C temperatūrā, atdzesē eksikatorā istabas temperatūrā. Pievieno ūdeni 5 % no silikagela masas turpmāk aprakstītajā veidā. Erlenmeijera kolbā iesver 152 g silikagela, pievieno 8 g destilēta ūdens, noslēdz ar aizbāzni un uzmanīgi krata, lai ūdens sadalītos masā vienmērīgi. Pirms lietošanas jāiztur vismaz 12 stundas

4.2. n-heksāns (hromatogrāfijai)

4.3. Izopropanols

4.4. Izopropanols, 1/1 (v/v) ūdens šķīdums

4.5. Aizkuņģa dziedzera lipāze. Tās aktivitātei jābūt no 2,0 līdz 10 lipāzes vienībām uz miligramu. (Aizkuņģa dziedzera lipāzes ar aktivitāti no 2 līdz 10 vienībām uz miligramu fermenta ir nopērkamas.)

4.6. Tris-hidroksimetilaminometāna buferšķīdums: 1 M ūdens reakciju ar konc. HCl (1/1 v/v) noregulē līdz pH 8 (nosaka potenciometriski)

4.7. Enzīma kvalitātes nātrija holāts, 0,1 % ūdens šķīdums (šis šķīdums pēc pagatavošanas ir derīgs divas nedēļas)

4.8. Kalcija hlorīds, 22 % ūdens šķīdums

4.9. Dietilēteris, hromatogrāfijai

4.10. Šķīdinātājs attīstīšanai: n-heksāna/dietilētera (87:13 v:v) maisījums

4.11. Nātrija hidroksīds, 12 % šķīdums

4.12. Fenolftaleīns, 1 % šķīdums etanolā

4.13. Nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, gāzes hromatogrāfijai

4.14. Palīggāzes: ūdeņradis, tīrība vismaz 99 %, sauss un attīrīts no organiskajām vielām; un gaiss, gāzes hromatogrāfijai, ar tādu pašu tīrības pakāpi

4.15. Silanizācijas reaģents: piridīna/heksametildisilazāna, trimetilhlorsilāna 9/3/1 (v/v/v) maisījums. (Nopērkami arī lietošanai sagatavoti šķīdumi. Var izmantot citus sililēšanas reaģentus, konkrēti bis-trimetilsililtrifluoracetamīds + 1 % trimetilhlorsilāns, kas atšķaidīts ar tādu pašu tilpumu bezūdens piridīna.)

4.16. Standartparaugi: tīri monoglicerīdi vai monoglicerīdu maisījumi ar zināmu sastāvu, kas ir līdzīgs analizējamo paraugu sastāvam

5. METODE

5.1. Paraugu sagatavošana

5.1.1. Eļļas, kuru brīvais skābums ir mazāks par 3 %, pirms hromatografēšanas silikagela kolonnā nav obligāti jāneitralizē. Eļļas, kuru brīvais skābums ir lielāks par 3 %, jāneitralizē, kā aprakstīts 5.1.1.1. punktā. 5.1.1.1. Pārnes 50 g eļļas un 200 ml n-heksāna 1 000 ml tilpuma šķirpiltuvē (3.13.). Pievieno 100 ml izopropanola un 12 % nātrija hidroksīda (4.11.) daudzumā, kas ir ekvivalents eļļas brīvajam skābumam plus 5 %. Vienu minūti enerģiski krata. Pievieno 100 ml destilēta ūdens, vēlreiz sakrata un nostādina. Pēc dekantēšanas atdala apakšējo ziepes saturošo slāni. Atdala arī visus pārējos starpslāņus (duļķes un nešķīstošās vielas). Neitralizētā eļļas parauga šķīdumu heksānā vairākas reizes mazgā ar 50–60 ml izopropanola/ūdens 1/1 (v/v) šķīdumu (4.4.), līdz izzūd tā sārtais krāsojums ar fenolftaleīnu. Lielāko daļu heksāna atdala ar vakuumdestilāciju (izmantojot, piemēram, rotācijas ietvaicētāju), un eļļu pārnes 100 ml tilpuma kolbā (3.5.). Eļļu vakuumā žāvē, līdz pilnībā atdalīts viss šķīdinātājs. Šīs procedūras beigās eļļas skābumam jābūt mazākam par 0,5 %.

5.1.2. Šādi sagatavotas eļļas 1,0 g lielu iesvaru pārnes 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.), un to izšķīdina 10 ml attīstīšanas maisījumā (4.10.). Pirms hromatogrāfijas silikagela kolonnā šķīdumu nostādina vismaz 15 minūtes. Lai nodrošinātu hromatogrāfijai optimālus apstākļus, ja šķīdums nav dzidrs, to centrifugē (var izmantot lietošanai sagatavotus 500 mg SPE silikagela kartridžus).

5.1.3. Hromatogrāfijas kolonnas sagatavošana Apmēram 30 ml attīstītāja šķīdinātāja (4.10.) pārnes kolonnā (3.3.), izmantojot stikla spieķīti, kolonnas apakšā ievieto kokvilnas auduma gabaliņu; saspiež, lai aizvadītu gaisu. Vārglāzē sagatavo 25 g silikagela (4.1.) suspensiju apmēram 80 ml attīstītāja šķīdinātāja, un pārnes kolonnā, izmantojot piltuvi. Pārbauda, vai viss silikagels pārnests kolonnā; mazgā ar attīstītāja šķīdinātāju (4.10.), atver krānu un šķidruma līmeni pazemina tā, lai tas būtu apmēram 2 mm virs silikagela līmeņa.

5.1.4. Kolonnas hromatogrāfija No parauga, kas sagatavots, kā aprakstīts iepriekš 5.1. punktā, 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.) ņem precīzi 1,0 g lielu iesvaru. Parauga iesvaru izšķīdina 10 ml attīstītāja šķīdinātāja (4.10.). Šķīdumu pārnes hromatogrāfijas kolonnā, kas sagatavota saskaņā ar 5.1.3. punktu. Jāraugās, lai netiktu aizskarta kolonnas virsma. Atver krānu un parauga šķīdumu pārnes kolonnā, līdz tas sasniedz silikagela līmeni. Attīsta ar 150 ml attīstītāja šķīdinātāja. Noregulē plūsmas ātrumu 2 ml/min (tā, lai 150 ml šķīduma tiktu pārnesti kolonnā apmēram 60–70 min laikā). Eluātu savāc iepriekš nosvērtā 250 ml tilpuma kolbā. Šķīdinātāju iztvaicē vakuumā gandrīz sausu, un šķīdinātāja atliekas atdala slāpekļa plūsmā. Kolbu nosver un aprēķina iegūtā ekstrakta masu. (Ja izmanto lietošanai sagatavotus SPE silikagela kartridžus, rīkojas, kā aprakstīts turpmāk. 1 ml šķīduma (5.1.2.) pārnes sagatavotos kartridžos ar 3 ml n-heksāna. Pēc šķīduma perkolēšanas attīsta ar 4 ml n-heksāna/dietilētera 9/1 (v/v) maisījumu. Eluātu savāc 10 ml tilpuma mēģenē un slāpekļa plūsmā ietvaicē sausu. Uz sauso atlikumu iedarbojas ar aizkuņģa dziedzera lipāzi (5.2.). Jāpārbauda taukskābju sastāvs pirms SPE kartridža un pēc tā.)

5.2. Hidrolīze ar aizkuņģa dziedzera lipāzi

5.2.1. Centrifūgas mēģenē iesver 0,1 g eļļas, kas sagatavotas saskaņā ar 5.1. punktu. Pievieno 2 ml buferšķīduma (4.6.), 0,5 ml nātrija holāta šķīduma (4.7.) un 0,2 ml kalcija hlorīda šķīduma, katru reizi šķīdumu rūpīgi samaisot. Mēģeni noslēdz ar pieslīpēta stikla aizbāzni, un ievieto termostatā 40 ± 0,5 °C temperatūrā.

5.2.2. Pievieno 20 mg lipāzes, uzmanīgi sakrata (nesaslapinot aizbāzni), un mēģeni ievieto termostatā precīzi uz 2 min. Pēc tam izņem, enerģiski krata precīzi 1 min un atdzesē.

5.2.3. Pievieno 1 ml dietilētera, noslēdz ar aizbāzni un enerģiski krata, pēc tam centrifugē, un ar mikrošļirci ētera šķīdumu pārnes tīrā sausā mēģenē.

5.3. Silanilatvasinājumu iegūšana un gāzes hromatogrāfija

5.3.1. Ar mikrošļirci 100 μl šķīduma (5.2.3.) pārnes 10 ml tilpuma mēģenē ar konisku apakšdaļu.

5.3.2. Vājā slāpekļa plūsmā atdala šķīdinātāju, pievieno 200 μl silanizācijas reaģenta (4.15.), mēģeni noslēdz ar aizbāzni un 20 min nostādina.

5.3.3. Pēc 20 min pievieno 1 līdz 5 ml n-heksāna (atkarībā no hromatografēšanas apstākļiem): šādi iegūtais šķīdums ir sagatavots gāzes hromatogrāfijai.

5.4. Gāzes hromatogrāfija

Darba apstākļi:

— inžektora temperatūra (virskolonnas inžektors) zem šķīdinātāja viršanas punkta (68 °C);

— detektora temperatūra: 350 °C;

— kolonnas temperatūra: krāsns temperatūras programma: 1 minūti 60 °C, paaugstināšana par 15 °C minūtē līdz 180 °C, tad par 5 °C minūtē līdz 340 °C, tad 13 minūtes 340 °C;

— nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, ar lineāro ātrumu, kas ir pietiekams 1. att. parādītās izšķirtspējas panākšanai. Aiztures laikam C54 triglicerīdam jābūt 40 ± 5 min (sk. 2. att.). (Norādītie darba apstākļi ir orientējoši. Operatoriem tie jāoptimizē, lai panāktu vajadzīgo izšķirtspēju. Tā signāla augstumam, kas atbilst 2-glicerilmonopalmitātam, jābūt vismaz 10 % no reģistrācijas iekārtas skalas.)

— ievadītās vielas daudzums: 0,5–1 μl n-heksāna šķīduma (5 ml) (5.3.3.).

5.4.1. Signālu identifikācija

Atsevišķos monoglicerīdus identificē pēc aiztures laikiem, tos salīdzinot ar monoglicerīdu standartmaisījumiem tādos pašos apstākļos noteiktajiem aiztures laikiem.

5.4.2. Kvantitatīva noteikšana

Katra signāla laukumu aprēķina, izmantojot elektronisko integratoru.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Glicerilmonopalmitāta saturu aprēķina pēc attiecīgā signāla laukuma attiecības pret visu monoglicerīdu signālu laukumu kopējo summu (sk. 2. att.), izmantojot šādu formulu:

glicerilmonopalmitāts (%)

kur:

Ax = glicerilmonopalmitāta signāla laukums;

ΣA = visu monoglicerīdu signālu laukumu summa.

Rezultātus uzdod ar precizitāti līdz vienam decimālciparam aiz komata.

7. ANALĪZES REZULTĀTU PĀRSKATS

Pārskatā par analīzes rezultātiem jānorāda:

— atsauce uz šo metodi,

— visa informācija, kas vajadzīga parauga pilnīgai identifikācijai,

— analīzes rezultāts,

— ziņas par atkāpēm no šīs metodes, pamatojoties uz ieinteresēto pušu vienošanos, vai kāda cita iemesla dēļ,

— laboratorijas identifikācijas dati, analīzes dienas datums un par analīzes veikšanu atbildīgo personu paraksti.

1. attēls

To silanizēšanas reakcijas produktu hromatogramma, kas iegūti, ar lipāzi iedarbojoties uz rafinētu olīveļļu, kurai pievienoti 20 % esterificētas eļļas (100 %).

Paskaidrojumi: Acides gras libres = brīvās tauksābes; Huile d’olive rafinée = rafinēta olīveļļa; 20 % Huile estérifiée = 20 % esterificēta eļļa; 1-2 monopalmitoléine = 1-2 monopalmitoleīns; 1-2 monopalmitine = 1-2 monopalmitīns; 1-2 mono C18 insat. = 1-2 mono- C18 nepiesāt.; Squalene = skvalēns.

2. attēls

Hromatogrammas:

A) neesterificēta olīveļļa, pēc iedarbības ar lipāzi; pēc silanizēšanas; šādos apstākļos (8–12 m kapilārā kolonna) vasku frakcija eluējas vienlaicīgi ar digicerīdu frakciju vai pavisam nedaudz vēlāk. Pēc iedarbības ar lipāzi triglicerīdu saturs nedrīkst būt augstāks par 15 %. Paskaidrojumi: 1 = Brīvās taukskābes 2 = Monoglicerīdi 3 = Diglicerīdi 4 = Triglicerīdi * = 2-monopalmitīns ** = C54 triglicerīds

Hromatogrammas:

B) esterificēta eļļa pēc iedarbības ar lipāzi; pēc silanizēšanas; šādos apstākļos (8–12 m kapilārā kolonna) vasku frakcija eluējas vienlaicīgi ar digicerīdu frakciju vai pavisam nedaudz vēlāk. Pēc iedarbības ar lipāzi triglicerīdu saturs nedrīkst būt augstāks par 15 %. Paskaidrojumi: 1 = Brīvās taukskābes 2 = Monoglicerīdi 3 = Diglicerīdi 4 = Triglicerīdi * = 2-monopalmitīns ** = C54 triglicerīds

8. PIEZĪMES

LIPĀZES SAGATAVOŠANA

Ir nopērkamas lipāzes ar pietiekamu aktivitāti. Tās var sagatavot arī laboratorijā šādi.

Atdzesē līdz 0 °C temperatūrai 5 kg svaigu cūkas aizkuņģa dziedzeru. Atdala apkārtējos cietos taukus un saistaudus, un pēc tam blenderī sasmalcina šķidras pastas veidā. Pastai pievieno 2,5 l bezūdens acetona, 4–6 stundas maisa, pēc tam centrifugē. Atlikumu vēl trīs reizes ekstrahē ar tādu pašu daudzumu bezūdens acetona, pēc tam divas reizes ar acetona/dietilētera (1/1 v/v) maisījumu, un divas reizes ar dietilēteri.

Atlikumu 48 h žāvē vakuumā, lai iegūtu stabilu pulveri, ko var ilgstoši glabāt ledusskapī, sargājot no mitruma iedarbības.

LIPĀZES AKTIVITĀTES KONTROLE

Sagatavo olīveļļas emulsiju šādā veidā.

Mikserī 10 min maisa maisījumu, kas sastāv no 165 ml gumiarabika 100 g/l šķīduma, 15 g sasmalcināta ledus un 20 ml iepriekš neitralizētas olīveļļas.

Pārnes 10 ml šīs emulsijas 50 ml tilpuma vārlāzē, pievieno 0,3 ml nātrija holāta 0,2 g/ml šķīdumu, un pēc tam 20 ml destilēta ūdens.

Vārglāzi novieto termostatā 37 °C temperatūrā; ievieto pH-metra elektrodus un spirāles maisītāju.

Ar bireti pa pilienam pievieno 0,1 N nātrija hidroksīda šķīdumu līdz pH 8,3.

Pievieno alikvotu lipāzes pulvera suspensijas ūdenī (0,1 g/ml lipāzes). Tiklīdz pH-metrs rāda 8,3, palaiž hronometru un pa pilienam pievieno nātrija hidroksīdu ar tādu ātrumu, lai reakcija nemainītos, un visu laiku būtu pH 8,3. Ik pēc minūtes atzīmē patērētā sārma daudzumu.

Iegūtos datus attēlo x/y grafikā, kurā uz abscisu ass atliek laiku, bet uz ordinātu ass – 0,1 N sārma šķīduma tilpumu mililitros, kas patērēts nemainīga pH saglabāšanai. Iegūtajai sakarībai jābūt lineārai.

Lipāzes aktivitāti, kas izteikta lipāzes vienībās vienā miligramā, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

A aktivitāte lipāzes vienības/mg;

V mililitri 0,1 N nātrija hidroksīda šķīduma minūtē (aprēķina pēc grafika);

N nātrija hidroksīda šķīduma titrs;

m testējamās lipāzes parauga masa miligramos.

Lipāzes vienība ir fermenta daudzums, kāds fermentatīvās šķelšanas reakcijās vienā minūtē izdala 10 mikroekvivalentus skābes.

▼M20 —————

▼B









IX PIELIKUMS

SPEKTROFOTOMETRISKIE PĒTĪJUMI UV SPEKTRĀ

IEVADS

UV spektrofotometriskā analĪze var dot informāciju par tauku kvalitāti, to saglabāšanas stāvokli un tehnoloģisko procesu izraisītajām pārmaiņām tajos.

Absorbcija pie metodē noteiktajiem viļņu garumiem notiek konjugētu diēnu un triēnu sistēmu klātbūtnes dēļ. Šo absorbciju izsaka kā īpatnējo ekstinkciju E1 % 1cm (1 % tauku šķīduma ekstinkcija attiecīgā šķīdinātājā pie slāņa biezuma 1 cm), ko parasti apzīmē ar K (sauc arī par “ekstinkcijas koeficientu”).

1. DARBĪBAS JOMA

Metode apraksta tauku UV spektrofotom etriskās analīzes procedūru.

2. METODES PRINCIPS

Attiecīgos taukus šķīdina vajadzīgajā šķīdinātājā un pie noteiktiem viļņu garumiem nosaka ekstinkciju šķīdumam attiecībā pret tīru šķīdinātāju. Īpatnējās ekstinkcijas aprēķina pēc spektrofotometra nolasījumiem.

3. APRĪKOJUMS

3.1. Spektrofotometrs ekstinkcijas mērījumiem ultravioletajā spektra daļā starp 220 un 360 nm ar iespēju nolasīt atsevišķas nanometru vienības.

3.2. Taisnstūra kvarca kivetes ar vāciņiem, optiskais ceļš 1 cm. Ja kivetes piepildītas ar ūdeni vai citu piemērotu šķīdinātāju, tām savā starpā nav jāatšķiras vairāk par 0,01 ekstinkcijas vienību.

3.3. 25 ml mērkolbas.

▼M6

3.4. Hromatogrāfijas kolonna ar augšdaļas garumu 270 mm un diametru 35 mm un apakšējās daļas garumu 270 mm un diametru apmēram 10 mm.

▼B

4. REAKTĪVI

4.1. Spektrofotometriski tīrs izooktāns (2,2,4-trimetilpentāns). Attiecībā pret destilētu ūdeni tā caurlaidībai jābūt ne mazākai par 60 % pie 220 nm un ne mazākai par 95 % pie 250 nm vai: — spektrofotometriski tīrs cikloheksāns: attiecībā pret destilētu ūdeni tā caurlaidībai jābūt ne mazākai par 40 % pie 220 nm un ne mazākai par 95 % pie 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Bāzisks alumīnija oksīds hromatogrāfijai caur kolonnu, sagatavots un pārbaudīts, kā aprakstīts I pielikumā.

4.3. n-heksāns, hromatogrāfijas kvalitātes.

5. PROCEDŪRA

5.1. Attiecīgajam paraugam jābūt pilnīgi homogēnam un bez suspendētiem piemaisījumiem. Eļļas, kas istabas apkārtējās vides temperatūrā ir šķidras, ir jāfiltrē caur filtrpapīru aptuveni 30 °C temperatūrā, cieti tauki ir jāhomogenizē un jāfiltrē temperatūrā, kas nav augstāka par 10 °C virs kušanas punkta.

5.2. Precīzi nosver 0,25 g tā sagatavota parauga 25 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar noteikto šķīdinātāju un homogenizē. Iegūtajam šķīdumam ir jābūt pilnīgi dzidram. Ja novērojama opalescence vai duļķainība, ātri filtrē caur filtrpapīru.

5.3. Ar iegūto šķīdumu piepilda kiveti un izmēra ekstinkciju pie piemērota viļņu garuma starp 232 un 276 nm, salīdzināšanai izmantojot šķīdinātāju. Izmērītajiem ekstinkcijas lielumiem jābūt starp 0,1 un 0,8. Ja tā nav, mērījumi ir jāatkārto, lietojot pēc vajadzības koncentrētākus vai atšķaidītākus šķīdumus.

5.4. Ja ir jānosaka īpatnējā ekstinkcija pēc laišanas pāri alumīnija oksīdam, rīkojas šādi: 30 g bāziskā alumīnija oksīda suspensijas heksānā ievieto hromatogrāfijas kolonnā. Pēc adsorbenta nogulsnēšanās izvada heksāna pārākumu līdz līmenim aptuveni 1 cm virs alumīnija oksīda augšējās malas. Izšķīdina 10 g tauku, homogenizētu un nofiltrētu, kā aprakstīts 5.1. punktā, 100 ml heksāna un ielej šķīdumu kolonnā. Savāc eluātu un vakuumā iztvaicē visu šķīdinātāju temperatūrā zem 25 °C. Ar tā iegūtajiem taukiem tūlīt rīkojas tālāk, kā noteikts 5.2. punktā.

6. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

6.1. Pieraksta pie dažādiem viļņu garumiem iegūtās īpatnējās ekstinkcijas (ekstinkcijas koeficientus), ko aprēķina šādi: kur: Kλ = īpatnējā ekstinkcija pie viļņa garuma λ; Eλ = ekstinkcija, kas izmērīta pie viļņa garuma λ; c = šķīduma koncentrācija g/100 ml; s = kivetes biezums cm. Rezultātus izsaka līdz divām zīmēm aiz komata.

6.2. Olīveļļas spektrofotometriskā analīze saskaņā ar EEK regulu oficiālo metodi paredz noteikt īpatnējo ekstinkciju izooktāna šķīdumā pie viļņu garumiem 232 un 270 nm un noteikt K, ko aprēķina šādi: kur Km ir īpatnējā ekstinkcija pie viļņu garuma m, maksimālās absorbcijas viļņu garums ir aptuveni 270 nm.









I PIELIKUMA PAPILDINĀJUMS

Alumīnija oksīda sagatavošana un tā aktivitātes pārbaude

A.1.1. Alumīnija oksīda sagatavošana

Alumīnija oksīdu, kas iepriekš trīs stundas žāvēts krāsnī 380 līdz 400 °C temperatūrā, ievieto hermētiski noslēdzamā traukā, pielej destilētu ūdeni attiecībā 5 ml uz 100 g alumīnija oksīda, tūlīt noslēdz trauku, atkārtoti sakrata, pēc tam pirms lietošanas ļauj nostāvēties vismaz 12 stundas.

A.1.2. Alumīnija oksīda aktivitātes pārbaude

Sagatavo hromatogrāfijas kolonnu ar 30 g alumīnija oksīda. Darbojoties, kā aprakstīts 5.4. punktā, maisījumu, kas sastāv no:

— 95 % neapstrādātas olīveļļas, kuras īpatnējā ekstinkcija pie 268 nm ir mazāka par 0,18,

— 5 % zemesriekstu eļļas, kas rafinēšanas procesā apstrādāta ar balināšanas zemi un kam īpatnējā ekstinkcija pie 268 nm nav mazāka par 4,

izlaiž caur kolonnu.

Ja pēc izlaišanas caur kolonnu maisījuma īpatnējā ekstinkcija pie 268 nm ir lielāka par 0,11, alumīnija oksīds ir pieņemams, pretējā gadījumā ir jāpalielina dehidratēšanas līmenis.









II PIELIKUMA PAPILDINĀJUMS

Spektrofotometra kalibrēšana

A.2. Iekārta ir periodiski jāpārbauda (vismaz reizi sešos mēnešos) attiecībā uz viļņu garumu atbilstību un uz signāla precizitāti.

A.2.1. Viļņu garumu var pārbaudīt, izmantojot dzīvsudraba tvaiku spuldzi vai piemērotus filtrus.

A.2.2. Lai pārbaudītu fotošūnas un fotopavairotāja signālu, rīkojas šādi: spektrofotometrijas veikšanai nosver 0,2000 g kālija hromāta un 1 000 ml mērkolbā izšķīdina 0,05 N kālija hidroksīda šķīdumā, un uzpilda līdz zīmei. Ņem precīzi 25 ml iegūtā šķīduma, pārnes 500 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar to pašu kālija hidroksīda šķīdumu. Izmēra tā iegūtā šķīduma ekstinkciju pie 275 nm, lietojot kālija hidroksīda šķīdumu kā salīdzināšanas šķīdumu. Lietojot 1 cm kiveti, izmērītajai ekstinkcijai jābūt 0,200 ± 0, 005.









X A PIELIKUMS

TAUKSKĀBJU METILESTERU ANALĪZE AR GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1. DARBĪBAS JOMA

Šī metode dod vispārīgus norādījumus par gāzu hromatogrāfijas pielietošanu, izmantojot pakotās vai kapilārās kolonnas, lai noteiktu taukskābju metilesteru, kas iegūti saskaņā ar X B pielikumā norādīto metodi, maisījuma kvalitatīvo un kvantitatīvo sastāvu.

Šī metode nav lietojama polimerizētām taukskābēm.

2. REAKTĪVI

2.1. Nesējgāze

Inerta gāze (slāpeklis, hēlijs, argons, ūdeņradis utt.), kas ir rūpīgi izžāvēta un kas satur mazāk par 10 mg/kg skābekļa.

1. piezīme:

ūdeņradis, ko izmanto par nesējgāzi tikai ar kapilārām kolonnām, var divreiz palielināt analīzes ātrumu, bet tas ir bīstams. Ir pieejamas drošības ierīces.

2.2. Palīggāzes

2.2.1. Ūdeņradis (tīrība 99,9 %), bez organiskiem piemaisījumiem.

2.2.2. Gaiss vai skābeklis, bez organiskiem piemaisījumiem.

2.3. Salīdzināšanas standarts

Tīru taukskābju metilesteru maisījums vai zināma sastāva tauku metilesteri, vēlams, līdzīgi analizējamās taukainās vielas sastāvam.

Ir jārūpējas par polinepiesātināto taukskābju oksidācijas novēršanu.

3. APARATŪRA

Dotie norādījumi attiecas uz parasto gāzu hromatogrāfijas aprīkojumu, kurā izmanto pakotās un/vai kapilārās kolonnas un liesmas jonizācijas detektoru. Jebkura aparatūra, kuras efektivitāte un izšķirtspēja atbilst 4.1.2. punktā noteiktajai, ir piemērota.

3.1. Gāzu hromatogrāfs

Gāzu hromatogrāfā ir šādas sastāvdaļas.

3.1.1. Iešļircināšanas sistēma

Izmanto iešļircināšanas sistēmu vai nu ar:

a) pakotām kolonnām ar vismazāko iespējamo nelietderīgo tilpumu (šajā gadījumā iešļircināšanas sistēmai jābūt sildāmai līdz temperatūrai, kas ir par 20 līdz 50 °C augstāka nekā kolonnas temperatūra), vai ar

b) kapilārām kolonnām, šajā gadījumā iešļircināšanas sistēma ir īpaši izveidota izmantošanai ar šādām kolonnām. Iešļircināšanas sistēma var būt ar plūsmas dalīšanu, vai tā var būt “on column” veida, bez plūsmas dalīšanas.

2. piezīme: ja taukskābju, kurās ir mazāk par 16 oglekļa atomiem, nav klāt, var izmantot kustīgās adatas inžektoru.

3.1.2. Krāsns

Krāsnij jāspēj sildīt kolonnu vismaz līdz 260 °C un uzturēt vēlamo temperatūru 1 °C robežās ar pakoto kolonnu un 0,1 °C robežās ar kapilāro kolonnu. Pēdējā prasība ir īpaši svarīga, ja lieto kvarca kolonnu.

Visos gadījumos ir ieteicams izmantot sildīšanu ar temperatūras programmēšanu, jo īpaši taukskābēm, kurās ir mazāk par 16 oglekļa atomiem.

3.1.3. Pakotā kolonna

3.1.3.1. Kolonna, kas izgatavota no materiāla, kurš ir inerts pret analizējamām vielām (t.i., stikls vai nerūsējošais tērauds), kolonnai ir šādi izmēri: a) garums: 1 līdz 3 m. Relatīvi īsa kolonna būtu jālieto, analizējot garas virknes taukskābes (vairāk par C20). Analizējot skābes ar 4 vai 6 oglekļa atomiem, ir ieteicams izmantot 2 m garu kolonnu; b) iekšējais diametrs: 2 līdz 4 mm. 3. piezīme: ja ir klāt polinepiesātināti komponenti ar vairāk par trim dubultsaitēm, tie nerūsējošā tērauda kolonnā var sadalīties. 4. piezīme: var izmantot sistēmu ar pakotām dubultkolonnām.

3.1.3.2. Pakojums ietver šādas sastāvdaļas: a) nesēju: skābē mazgātu un silanizētu diatomītu vai citu piemērotu inertu nesēju ar šauru graudiņu lieluma diapazonu (25 μm diapazons robežās starp 125 un 200 μm) graudiņu vidējais lielums ir saistīts ar kolonnas iekšējo diametru un garumu; b) stacionārā fāze: poliesteru tipa polārs šķidrums (piem., dietilēnglikola polisukcināts, butāndiola polisukcināts, etilēnglikola poliadepāts u. c.), ciānsilikoni vai cits šķidrums, kas ļauj izdarīt vajadzīgo hromatogrāfisko sadalīšanu (sk. 4. punktu). Stacionārās fāzes daudzums ir 5 līdz 20 % (masa/masa) no pakojuma. Dažu veidu sadalīšanām var izmantot nepolāru stacionāro fāzi.

3.1.3.3. Kolonnas kondicionēšana Kolonnu, ja iespējams, atvieno no detektora, pakāpeniski uzsilda krāsni līdz 185 °C un caur tikko sagatavotu kolonnu laiž inertu gāzi ar ātrumu 20 līdz 60 ml/min. vismaz 16 stundas šajā temperatūrā un vēl divas stundas 195 °C temperatūrā.

3.1.4. Kapilārā kolonna

3.1.4.1. Caurule, izgatavota no materiāla, kas ir inerts pret analizējamām vielām (parastais stikls vai kvarcs). Iekšējais diametrs ir starp 0,2 un 0,8 mm. Iekšējo virsmu pirms pārklāšanas ar stacionāro fāzi attiecīgi apstrādā (piem., sagatavo virsmu, inaktivē). Vairumā gadījumu 25 m ir pietiekami.

3.1.4.2. Stacionārā fāze, parasti poliglikolu tipa (polietilenglikols 20 000), poliesteris (butāndiola polisukcināts) vai polārais polisiloksāns (ciānsilikoni). Ir piemērotas kolonnas ar ķīmiski piesaistītu stacionāro fāzi. 5. piezīme: pastāv iespējamība, ka polārie polisiloksāni varētu radīt grūtības linolēnskābes un skābju ar C20 identificēšanā un atdalīšanā. Pārklājums ir plāns, t. i., 0,1 līdz 0,2 μm.

3.1.4.3. Kolonnas montēšana un kondicionēšana Kapilāro kolonnu montēšanā, t. i., kolonnas ievietošanā krāsnī (atbalsts), pievienojumu montēšanā (hermētiskums), kolonnas galu ievietošanā inžektorā un detektorā (nelietderīgo tilpumu samazināšana) jāievēro parastā piesardzība. Kolonnu pievieno nesējgāzes plūsmai (piem., 0,3 bar (30 kPa) 25 m garai kolonnai ar iekšējo diametru 0,3 mm). Kolonnu kondicionē, programmējot krāsns temperatūru 3 °C/min. no apkārtējās vides temperatūras līdz temperatūrai, kas ir par 10 °C zemāka nekā stacionārās fāzes sadalīšanās temperatūras robeža. Krāsni uztur šajā temperatūrā vienu stundu, līdz stabilizējas nulles līnija. Pēc tam atgriežas pie 180 °C un turpina darbu izotermiskos apstākļos. 6. piezīme: piemērotas, iepriekš kondicionētas, kolonnas ir pieejamas pārdošanā.

3.1.5. Detektors, vēlams tāds, ko var karsēt līdz temperatūrai, kas ir lielāka par kolonnas temperatūru.

3.2. Šļirce

Šļirces maksimālā ietilpība ir 10 μl, un tā ir graduēta 0,1 μl iedaļās.

3.3. Reģistrējošā iekārta

Ja reģistrējošās iekārtas līkne ir jāizmanto, lai aprēķinātu analizējamā maisījuma sastāvu, ir vajadzīga augstas precizitātes elektroniskā reģistrēšanas iekārta, kas ir saderīga ar izmantojamo aparatūru. Reģistrējošajai iekārtai ir šādas īpašības:

a) atbildes ātrums mazāks par 1,5 sek., vēlams 1 sek. (atbildes ātrums ir laiks, kas vajadzīgs pašrakstītāja spalvai, lai pārvietotos no 0 līdz 90 % pēc pēkšņas 100 % signāla izraisīšanas);

b) papīra platums vismaz 20 cm;

c) papīra ātrums regulējams starp 0,4 un 2,5 cm/min.

3.4. Integrators

Ātrus un precīzus aprēķinus var izdarīt ar elektronisko integratoru. Tam ir jādod lineāra atbilde ar pietiekamu jutību, un nulles līnijas noviržu korekcijai ir jābūt apmierinošai.

4. PROCEDŪRA

Darbības, kas aprakstītas no 4.1. LĪDZ 4.3. punktam, attiecas uz liesmas jonizācijas detektora lietošanu.

Alternatīvi var izmantot gāzu hromatogrāfu ar katarometra detektoru (darbojas, pamatojoties uz vadītspējas izmaiņām atkarībā no temperatūras). Darba apstākļus tad maina, kā norādīts 6. punktā.

4.1. Analīzes apstākļi

4.1.1. Darba apstākļu izvēle 4.1.1.1. Pakotā kolonna Izvēloties analīzes apstākļus, jāņem vērā šādi mainīgie lielumi: a) kolonnas garums un diametrs; b) stacionārās fāzes īpašības un daudzums; c) kolonnas temperatūra; d) nesējgāzes plūsma; e) vajadzīgā izšķirtspēja; f) analīzes parauga lielums, ko izvēlas tā, lai detektora un elektrometra iekārta dotu lineāru atbildes reakciju; g) analīzes ilgums. Parasti 1. un 2. tabulā norādītie lielumi dod vēlamos rezultātus, t. i., vismaz 2 000 teorētisko šķīvju uz kolonnas garuma metru metilstearātam un tā eluēšana apmēram 15 minūtēs. Ja aparatūra ļauj, inžektora temperatūrai jābūt apmēram 200 °C un detektora temperatūrai — vienādai vai augstākai par kolonnas temperatūru. Parasti liesmas jonizācijas detektorā padodamā ūdeņraža plūsmas ātrums pret nesējgāzes ātrumu attiecas kā 1:2 līdz 1:1 atkarībā no kolonnas diametra. Skābekļa plūsma ir aptuveni 5 līdz 10 reižu lielāka par ūdeņraža plūsmu.



1. tabula Kolonnas iekšējais diametrs mm Nesējgāzes plūsmas ātrums ml/min. 2 15 līdz 25 3 20 līdz 40 4 40 līdz 60



2. tabula Stacionārās fāzes koncentrācija % (masa/masa) Kolonnas temperatūra °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapilārā kolonna Kapilārās kolonnas efektivitāte un caurlaidība nozīmē, ka sastāvdaļu atdalīšana un analīzes ilgums lielā mērā ir atkarīgs no nesējgāzes plūsmas ātruma kolonnā. Tādēļ ir jāoptimizē darba apstākļi, iedarbojoties uz šo parametru (vai, vienkāršāk sakot, uz kolonnas spiediena kritumu) atbilstoši tam, vai vēlas uzlabot sadalīšanu, vai ātri izdarīt analīzi.

4.1.2. Teorētisko šķīvju skaita (efektivitātes) un izšķirtspējas noteikšana (sk. 1. zīmējumu). Izdara analīzi metilstearāta un metiloleāta maisījumam aptuveni vienādās daļās (piemēram, kakao sviesta metilesteriem). Kolonnas temperatūru un nesējgāzes plūsmas ātrumu izvēlas tā, lai metilstearāta pīķa maksimumu reģistrētu aptuveni 15 minūtes pēc šķīdinātāja pīķa. Izlieto pietiekamu metilesteru maisījuma daudzumu, lai metilstearāta pīķis aizņemtu apmēram trīs ceturtdaļas no visas skalas. Teorētisko šķīvju skaitu n (efektivitāti) aprēķina pēc formulas: un izšķirtspēju R aprēķina pēc formulas: kur: dr1 ir aiztures attālums milimetros no hromatogrammas sākuma līdz metilstearāta pīķa maksimumam; ω1un ω2 ir attiecīgi metilstearāta un metiloleāta pīķu platums milimetros, kas mērīts starp līknes pārliekuma punktos novilkto tangenšu krustošanās punktiem ar nulles līniju; Δ ir attalums milimetros starp metilstearāta un metiloleāta pīķu maksimumiem; ▼M2 un izšķirtspējas indekss lr, aprēķinot pēc formulas: kur: a = mazākā pīķa augstums, mērot no nulles līnijas; b = zemākā punkta augstums minimumā starp diviem blakusesošiem pīķiem, mērot no nulles līnijas. ▼B 1. zīmējums Hromatogramma teorētisko šķīvju skaita (efektivitātes) un izšķirtspējas noteikšanai Ir jāizvēlas tādi darba apstākļi, kas metilstearātam dod vismaz 2 000 teorētiskos šķīvjus uz kolonnas garuma metru un izšķirtspēju vismaz 1,25.

4.2. Analīzes paraugs

Ar šļirci (3.2. punkts) ņem 0,1 līdz 2 μl metilesteru šķīduma, kas sagatavots saskaņā ar X B pielikumu un iešļircina to kolonnā.

Ja esteri nav šķīdumā, sagatavo 100 mg/ml šķīduma heptānā, kas ir hromatogrāfijas kvalitātes, un iešļircina 0,1 līdz 1 μl šā šķīduma.

Ja analizē sastāvdaļas, kas ir klāt tikai zīmju daudzumos, analīzes paraugu var palielināt (līdz 10 reizēm).

4.3. Analīze

Parasti darba apstākļi ir tādi, kā definēts 4.1.1. punktā.

Tomēr ir iespējams strādāt zemākā kolonnas temperatūrā, ja ir jānosaka taukskābes ar mazāk nekā 12 oglekļa atomiem, vai augstākā temperatūrā, ja nosaka taukskābes ar vairāk nekā 20 oglekļa atomiem. Abos šajos gadījumos ir iespējams izmantot temperatūras programmēšanu. Piemēram, ja paraugs satur taukskābju metilesterus ar mazāk nekā 12 oglekļa atomiem, paraugu iešļircina 100 °C temperatūrā (vai 50 līdz 60 °C temperatūrā, ja klāt ir sviestskābe) un nekavējoties paaugstina temperatūru ar ātrumu 4 līdz 8 °C/min. līdz optimālajai. Dažos gadījumos var apvienot abas procedūras.

Pēc programmētās sildīšanas turpina eluēšanu nemainīgā temperatūrā, līdz ir eluēti visi komponenti. Ja aparātam nav programmētas sildīšanas, to izmanto divās nemainīgās temperatūrās starp 100 un 195 °C.

Ir ieteicams vajadzības gadījumā izdarīt analīzi uz divām nekustīgajām fāzēm ar dažādu polaritāti, lai pārbaudītu, vai nav klāt maskēti pīķi, piemēram, ja vienā paraugā ir klāt konjugēti C18:3 un C20:0, vai C18:3 un C18:2.

4.4. Standarthromatogrammas un standartdiagrammu pagatavošana

Analizē salīdzināšanas standartmaisījumu (2.3. punkts) tajos pašos darba apstākļos kā tie, kas izmantoti paraugam, un izmēra sastāvdaļu taukskābju aiztures laikus vai aiztures attālumus. Uz puslogaritmiskā diagrammu papīra katrai nepiesātinātības pakāpei izveido diagrammu, kas rāda aiztures laika vai attāluma logaritmu kā oglekļa atomu skaita funkciju. Izotermiskos apstākļos diagrammām par taisnas virknes skābēm ar vienu un to pašu nepiesātinātības pakāpi jābūt ar taisnām līnijām. Šīm līnijām jābūt aptuveni paralēlām.

Ir noteikti jāizvairās no analīzes apstākļiem, kuros pastāv “maskētie pīķi”, t.i., kuros izšķirtspēja nav pietiekama, lai sadalītu divas sastāvdaļas.

5. REZULTĀTU IZTEIKŠANA

5.1. Kvalitatīvā analīze

Metilesteru pīķus paraugā identificē no 4.4. punktā pagatavotās diagrammas, vajadzības gadījumā interpolējot.

5.2. Kvantitatīvā analīze

5.2.1. Sastāva noteikšana

Izņemot īpašus gadījumus, izmanto iekšējās normalizācijas metodi, t. i., pieņem, ka visu parauga komponentu kopums ir pārstāvēts hromatogrammā tā, ka zem pīķiem esošo laukumu kopsumma ir 100 % no sastāvdaļām (pilnīga eluēšana).

Ja iekārtai ir integrators, izmanto skaitļus, kas iegūti no tā. Ja integratora nav, nosaka zem katra pīķa esošo laukumu, reizinot pīķa augstumu ar tā platumu, kāds ir pusē no augstuma, un vajadzības gadījumā ņem vērā dažādas jutības pārslēgšanas reģistrēšanas laikā.

5.2.2. Aprēķinu metode

5.2.2.1. Vispārējs gadījums Aprēķina dotā komponenta i saturu, izteiktu metilesteru masas procentos, nosakot attiecīgā pīķa laukumu procentos attiecībā pret visu pīķu laukumu summu, izmantojot šādu formulu: kur: Ai ir pīķa laukums, kas atbilst komponentam i; A = visu piķu laukumu summa. Rezultātu nosaka līdz vienai zīmei aiz komata. 7. piezīme: šajā vispārējā gadījumā uzskata, ka uz relatīvajiem laukumiem pamatoto aprēķinu rezultāts pārstāv masas procentus. Ja šis pieņēmums nav pieļaujams, sk. 5.2.2.2. punktu.

5.2.2.2. Korekcijas koeficientu lietošana Dažos gadījumos, piemēram, tādu taukskābju klātbūtnē, kas satur mazāk par astoņiem oglekļa atomiem, vai tādu skābju klātbūtnē, kam ir otrējās grupas, ja izmanto siltumvadītspējas detektorus vai ja ir īpaši prasīta augstākā precizitātes pakāpe, ir jālieto korekcijas koeficienti, lai pīķu laukumu procentus pārvērstu komponentu masas procentos. Korekcijas koeficientus nosaka, izmantojot hromatogrammu, kas iegūta, analizējot zināma sastāva metilesteru standartmaisījumu darba apstākļos, identiskos ar parauga analīzes apstākļiem. Šim standartmaisījumam komponenta i masas procentus apraksta formula: kur: mi ir komponenta i masa standartmaisījumā; m ir dazādo komponentu masu summa standartmaisījumā. No standartmaisījuma (4.4. punkts) hromatogrammas šādi aprēķina komponenta i procentus (laukums/laukums): kur: Ai ir komponentam i atbilstošā pīķa laukums, A ir visu pīķu laukumu summa. Korekcijas koeficientu aprēķina šādi: Parasti korekcijas koeficientus izsaka attiecībā pret KC16, tātad relatīvie koeficienti kļūst Paraugā katra komponenta i saturs, izteikts metilesteru masas procentos, ir: Rezultātu nosaka līdz vienai zīmei aiz komata.

5.2.2.3. Iekšējā standarta lietošana Dažās analīzēs (piemēram, ja visas taukskābes nav kvantitatīvi jānosaka, kā tas ir gadījumā, ja skābes ar četriem vai sešiem oglekļa atomiem ir kopā ar skābēm, kurās ir 16 un 18 oglekļa atomi, vai ja ir jānosaka taukskābes absolūtais daudzums paraugā) ir jālieto iekšējais standarts. Bieži lieto taukskābes ar pieciem, 15 vai 17 oglekļa atomiem. Būtu jānosaka korekcijas koeficients (ja tāds ir) iekšējam standartam. Komponenta i masas procentus, izteiktus kā metilesterus, iegūst pēc formulas: kur: Ai ir komponentam i atbilstīgā pīķa laukums; As ir iekšējam standartam atbilstīgā pīķa laukums; K′i ir komponenta i korekcijas koeficients (attiecībā pret KC1); K′s ir iekšējā standarta korekcijas koeficients (attiecībā pret KC16); m ir noteikšanai ņemtā parauga masa miligramos; ms ir iekšējā standarta masa miligramos. Rezultātu nosaka līdz vienai zīmei aiz komata.

▼M2

6. ĪPAŠS GADĪJUMS — TAUKSKĀBJU TRANS — IZOMĒRU NOTEIKŠANA.

Ir iespējams noteikt trans — izomēru saturu taukskābēs ar oglekļa atomu skaitu no 10 līdz 24, atdalot metilesterus, izmantojot gāzu hromatogrāfijas kapilārās kolonnas ar īpatnējo polaritāti.

6.1. Kvarca kapilārā kolonna ar iekšējo diametru no 0,25 mm līdz 0,32 mm un garumu 50 m, pārklāta ar ciānpropisilikonu, pārklājuma kārtas biezums no 0,1 līdz 0,3 μm (veids SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 un līdzīga veida).

▼M21

6.2. Metilesterus sagatavo saskaņā ar XB pielikumā noteikto B procedūru. Taukvielas, kuru brīvais skābums ir lielāks par 3 %, vispirms jāneitralizē saskaņā ar VII pielikuma 5.1.1. punktu.

▼M2

6.3. Kopumā gāzu hromatogrāfiju veic šādos apstākļos: — kolonnas temperatūra noregulēta no 150 °C līdz 230 °C (piemēram, 165 °C uz 15 minūtēm, tad, pieaugot par 5 °C minūtē, sasniedz 200 °C), — inžektora temperatūra: 250 °C, ja lieto sadales sistēmu, vai sākotnējā temperatūra, ja lieto “virs kolonnas” sistēmu, — detektora temperatūra: 260 °C, — nesējgāzes (hēlijs un ūdeņradis) plūsmas ātrums: 1,2 ml minūtē. Ievadītajam daudzumam jābūt tādam, lai izmantotajos jutīguma apstākļos tā pīķa augstums, kas atbilst arahīnskābes metilesteram, būtu vienāds ar 20 % no skalas apakšas vai lielāks.

6.4. Dažādo metilesteru identifikāciju veic, salīdzinot izdalīšanās laikus ar standarta maisījumu izdalīšanās laikiem (kā norādīts 2.3. punktā). Trans taukskābju esterus eluē pirms atbilstošajiem cis — izomēriem. Hromatogrammas piemērs ir sniegts 2. attēlā. 2.attēls Taukskābes trans – izomēru gāzu hromatogramma, izmantojot kapilāro kolonnu

6.5. Kolonnas efektivitātei, kas noteikta saskaņā ar 4.1.2. punktu, jābūt tādai, lai varētu atdalīt noteiktus kritiskos pārus, piemēram, pāri, ko veido trans — oleīnskābju masīvs un oleīnskābes pīķis, trans C18:1/cis C18:1, ar izšķirtspējas indeksu lielāku par 2.

6.6. Dažādo trans taukskābju procentuālo samēru aprēķina, ņemot vērā attiecību starp konkrētā pīķa virsmu un visu esošo pīķu virsmu summu. Ņem vērā: — trans oktadeci- skābju (T 18: 1), kas norādītas šīs regulas I pielikumā, kā transoleīnskābes izomēru summu, — cis–trans un trans–cis oktadekadiēn-skābju ((CT/TC) 18: 2), kas norādītas šīs regulas I pielikumā, kā translinolskābes izomēru summu, — trans–cis–trans, cis–cis–trans, cis–trans–cis, trans–cis–cis oktadekatriēn-skābju ((TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3), kas norādītas šīs regulas I pielikumā, kā translinolēnskābes izomēru summu procentuālo daudzumu. 8. piezīme: Ņemot vērā šīs metodes raksturīgās īpatnības, vēlams izteikt rezultātus ar 2 decimālzīmēm aiz komata.

▼B

7. ĪPAŠS GADĪJUMS — KATAROMETRA DETEKTORA IZMANTOŠANA (DETEKTORS DARBOJAS PĒC SILTUMA VADĪTSPĒJAS IZMAIŅU PRINCIPA)

Taukskābju metilesteru maisījuma kvalitatīvā un kvantitatīvā sastāva noteikšanai var izmantot arī gāzu hromatogrāfu ar detektoru, kura darbības pamatā ir siltuma vadītspējas izmaiņas (katarometrs). Ja to izmanto, 3. un 4. punktā norādītos nosacījumus ir jāmaina, kā parādīts 3. tabulā.

Kvantitatīvajā analīzē izmanto korekcijas koeficientus, kas norādīti 5.2.2.2. punktā.







3. tabula Mainīgais Lielumu nosacījumi Kolonna Garums: 2 līdz 4 m Iekšējais diametrs: 4 mm Nesējs Graudiņu lielums starp 160 un 200 μm stacionārās fāzes koncentrācija 15 līdz 25 % (masa/masa) Nesējgāze hēlijs vai, ja tā nav, ūdeņradis ar iespējami mazu skābekļa saturu Palīggāze nav vajadzīga inžektora temperatūra no 40 līdz 60 °C virs kolonnas temperatūras kolonnas temperatūra 180 līdz 200 °C nesējgāzes plūsma parasti starp 60 un 80 ml/min. iešļircinātā analīzes parauga lielums parasti starp 0,5 un 2 μl

8. ANALĪZES PROTOKOLS

Analīzes protokolā norāda metilesteru pagatavošanai un hromatogrāfijai lietotās metodes un iegūtos rezultātus. Tur norāda arī visus datus par darbu, kas nav norādīti šajā starptautiskajā standartā vai tiek uzskatīti par neobligātiem, kā arī datus par nejaušībām, kas varētu būt ietekmējušas rezultātus.

Analīzes protokols ietver visu informāciju, kas vajadzīga parauga pilnīgai identificēšanai.

▼M19









X B PIELIKUMS

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A : Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B : Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical par