10)

Įterpiami C.27, C.28, C.29 ir C.30 skyriai: „C.27. TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOSĖDOSE IR VANDENYJE, NAUDOJANT NUOSĖDAS SU ĮTERPTA BANDOMĄJA CHEMINE MEDŽIAGA ĮVADAS 2. Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 218 (2004). Šiuo bandymo metodu siekiama įvertinti ilgalaikį cheminių medžiagų poveikį nuosėdose gyvenančioms gėlųjų vandenų dvisparnio vabzdžio Chironomus sp. lervoms. Šis bandymas grindžiamas turimais toksiškumo bandymo su Chironomus riparius ir Chironomus tentans protokolais, kurie parengti Europoje (1) (2) (3) ir Šiaurės Amerikoje (4) (5) (6) (7) (8) ir patikrinti tarplaboratorinio lyginimo bandymais (1) (6) (9). Taip pat leidžiama naudoti kitas dvisparnių vabzdžių rūšis, pvz., Chironomus yoshimatsui (10) (11), kurios tinkamai pagrįstos dokumentais. 2. Pasirinkus šiame bandymo metode naudojamą poveikio metodą į nuosėdas įterpiama bandomoji cheminė medžiaga. Atitinkamo poveikio scenarijaus pasirinkimas priklauso nuo numatomo bandymo taikymo. Pasirinkus bandomosios cheminės medžiagos įterpimo į nuosėdas scenarijų turi būti modeliuojami nuosėdose paprastai susikaupiantys cheminių medžiagų lygiai. Į šią poveikio sistemą įtrauktas bandomosios cheminės medžiagos įtepimas į nuosėdų—vandens bandymo sistemos nuosėdas. 3. Cheminės medžiagos, kurias būtina ištirti siekiant nustatyti jų poveikį nuosėdose gyvenantiems organizmams, paprastai šiame skyriuje išlieka ilgą laikotarpį. Nuosėdose gyvenančius organizmus galima veikti keliais būdais. Kiekvieno poveikio būdo santykinė svarba ir laikas, sugaištamas, kol taikant kiekvieną būdą užtikrinamas bendrasis toksiškas poveikis, priklauso nuo atitinkamos cheminės medžiagos fizinių ir cheminių savybių. Jei tai lengvai absorbuojamos cheminės medžiagos (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusios cheminės medžiagos, užteršto maisto nurijimas galėtų būti tinkamas poveikio būdas. Siekiant, kad stipriomis lipofilinėmis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų toksiškumas būtų vertinamas tinkamai, galima svarstyti galimybę, ar nereikėtų į nuosėdas įterpti maisto prieš taikant bandomąją cheminę medžiagą. Norint atsižvelgti į visus galimus poveikio būdus pagrindinis dėmesys taikant šį bandymo metodą skiriamas ilgalaikiui poveikiui. Bandymo trukmė naudojant C. Riparius ir C. Yoshimatsui yra 20–28 dienos ir 28–65 dienos, jeigu pasirenkama C. tentans. Jeigu konkrečiam tikslui, pvz., tiriant nestabilių cheminių medžiagų poveikį, būtini trumpalaikiai duomenys, papildomus kartotinius ėminius galima paimti po dešimties parų laikotarpio. 4. Išmatuotas poveikis yra bendras išsiritusių suaugusiųjų skaičius ir išsiritimo trukmė. Rekomenduojama, kad lervų išgyvenimo ir augimo rodikliai būtų matuojami tik po dešimties parų laikotarpio, jeigu būtini papildomi trumpalaikiai duomenys, ir šiuo atveju, jeigu reikia, naudojant papildomus pakartotinius ėminius. 5. Rekomenduojama naudoti sintetines nuosėdas. Sintetinės nuosėdos keliais atžvilgiais yra tinkamesnės negu natūralios nuosėdos: — darant bandymą kintamumas yra sumažinamas, nes kintamumas sudaro atkuriamą „standartinę matricą“ ir nėra būtina nustatyti neužterštą ir švarų nuosėdų šaltinį, — bandymus galima pradėti bet kuriuo metu ir nepaisyti bandomųjų nuosėdų sezoninio kintamumo bei šiuo atveju nebūtina iš anksto apdoroti nuosėdų, kad iš jų būtų pašalinta būdingoji fauna; naudojant sintetines nuosėdas taip pat sumažinamos išlaidos, išleidžiamos lauke renkant įprastiems bandymams reikalingą nuosėdų kiekį, — naudojant sintetines nuosėdas galima lyginti toksiškumą ir atitinkamai klasifikuoti chemines medžiagas. 6. Taikomų sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje. BANDYMO METODO ESMĖ 7. Pirmos stadijos chironomidų lervos veikiamos tam tikros koncentracijos bandomąja chemine medžiaga nuosėdų–vandens sistemose. Bandomoji cheminė medžiaga įterpiama į nuosėdas ir pirmos stadijos lervos sudedamos į bandymo laboratorines stiklines, kuriose nuosėdų ir vandens koncentracijos yra stabilizuotos. Bandymo pabaigoje matuojama chironomidų išsinėrimo ir augimo sparta. Taip pat galima matuoti lervų išgyvenimą ir masę po 10 parų, jeigu reikia (naudojant kartotinius ėminius, kai būtina). Šie duomenys analizuojami taikant regresijos modelį siekiant įvertinti koncentraciją, kuri būtų x % sumažinusi lervų išsinėrimą, arba lervų išgyvenimą ar augimą (pvz., EC15, EC50 ir t. t.) arba hipotezę tikrinant statistiniais kriterijais siekiant nustatyti NOEC/LOEC (stebimo poveikio nedarančią koncentraciją ir (arba) mažiausią stebimo poveikio koncentraciją). Pastaruoju atveju pasitelkus statistinius kriterijus poveikio vertes būtina lyginti su kontrolinėmis vertėmis. INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ 8. Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje, jos garų slėgis, išmatuotas ar apskaičiuotas nuosėdų susidarymas ir stabilumas vandenyje bei nuosėdose. Turėtų būti prieinamas analizės metodas kiekybiniam bandomosios cheminės medžiagos kiekiui nustatyti paviršiniame vandenyje, porų vandenyje ir nuosėdose su žinomu ir praneštu tikslumu bei aptikimo riba. Naudinga informacija laikytina bandomosios cheminės medžiagos struktūrinė formulė ir grynumas. Bandomosios cheminės medžiagos cheminis išliekamumas (pvz., išsklaidymas, abiotinis ir biotinis suirimas ir t. t.) taip pat laikytinas naudinga informacija. Išsamios bandomųjų cheminių medžiagų, kurios dėl jų fizinių ir cheminių savybių sunkiai pritaikomos bandymams atlikti, gairės pateiktos (12). ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS 9. Bandymus su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis galima atlikti periodiškai ir juos darant būtų užtikrinama, kad bandymo protokolas ir bandymo sąlygos būtų patikimos. Etaloninės toksiškos medžiagos, tinkamos naudoti atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymus ir patvirtinimo tyrimus: lindanas, trifluralinas, pentachlorfenolis, kadmio chloridas ir kalio chloridas (1) (2) (5) (6) (13). BANDYMO VALIDUMAS 10. Bandymas laikomas validuotu, jeigu taikomos šios sąlygos: — bandymo pabaigoje lervų išsinėrimas kontroliniuose bandiniuose turi būti ne mažesnis negu 70 %; (1) (6), — C. riparius ir C. yoshimatsui iš kontrolinių indų suaugėliais turėtų tapti 12–23 dienomis po lervų įleidimo į indus; C. tentans, šis laikotarpis turi būti 20–65 dienos, — bandymo pabaigoje pH vertė ir ištirpusio deguonies koncentracija turėtų būti matuojama kiekviename inde; deguonies koncentracijos vertė esant naudojamai temperatūrai turėtų būti bent 60 % soties ore vertės ir paviršinio vandens pH vertė visuose bandymo induose turėtų atitikti 6–9 intervalą, — vandens temperatūra neturėtų skirtis daugiau negu ± 1,0 °C. Vandens temperatūrą galima reguliuoti naudojant izoterminę patalpą ir šiuo atveju patalpos temperatūra turėtų būti patvirtinama atitinkamu laiko intervalu. BANDYMO METODO APRAŠYMAS Bandymo indai 11. Tyrimas atliekamas naudojant 600 ml laboratorines stiklines (skersmuo 8 cm). Leidžiama rinktis kitus indus, tačiau juos naudojant turėtų būti užtikrinamas tinkamas paviršinio vandens ir nuosėdų storis. Nuosėdų paviršiaus plotas turėtų būti toks, kad vienai lervai tektų 2–3 cm2. Nuosėdų storio ir paviršinio vandens sluoksnio storio santykis turėtų būti 1:4. Bandymo indai ir kiti įrenginiai, kurie liesis su bandymo sistema, turėtų būti vien iš stiklo ar kitos cheminiu atžvilgiu neutralios medžiagos (pvz., teflono). Rūšių pasirinkimas 12. Renkantis atliekant bandymą naudojamą rūšį pirmenybė teikiama Chironomus riparius. Taip pat leidžiama naudoti Chironomus tentans, tačiau juos sunkiau prižiūrėti ir jiems būtinas ilgesnis bandymo laikotarpis. Be to, leidžiama naudoti Chironomus yohimatsui. Su Chironomus riparius susiję kultūrų auginimo metodai aprašyti 2 priedėlyje. Taip pat pateikiama informacija apie kitų rūšių, t. y. Chironomus tentans (4) ir Chironomus yoshimatsui (11), kultūrų auginimo sąlygas. Rūšies tapatybės nustatymas turi būti patvirtinamas prieš bandymą, tačiau patvirtinimas nėra būtinas prieš kiekvieną bandymą, jeigu organizmas paimtas iš vietoje išaugintos kultūros. Nuosėdos 13. Pirmenybė teikiama pasiruoštoms nuosėdoms (jos dar vadinamos pertvarkytomis, dirbtinėmis ar sintetinėmis nuosėdomis). Tačiau jeigu naudojamos natūralios nuosėdos, turėtų būti nurodomos jų charakteristikos (bent pH, organinės anglies kiekis, kitų parametrų apibrėžtis, pvz., C/N santykis, ir taip pat rekomenduojama pateikti granuliometrinę sudėtį) ir nuosėdose neturi būti jokių teršalų bei kitų organizmų, kurie galėtų konkuruoti su chironomidais ar juos vartoti. Taip pat rekomenduojama, kad prieš nuosėdas pradedant naudoti toksiškumo bandymui su chironomidais, natūralios nuosėdos kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui. Atliekant šį bandymą (1) (15) (16) rekomenduojama naudoti iš dirbtinio dirvožemio, kuris naudojamas taikant bandymo metodą C.8 (14), pasiruoštas sintetines nuosėdas: a) 4–5 % durpių (sausoji masė): pH vertė kiek įmanoma turi būti 5,5–6,0; privaloma naudoti smulkiai sumaltus (dalelių dydis ≤ 1 mm) durpių miltelius; jos turi būti džiovintos tik ore; b) 20 % (sausoji masė) kaolino molio (pageidautina, kad kaolinito jame būtų daugiau negu 30 %); c) 75–76 % (sausoji masė) kvarcinio smėlio (smulkusis smėlis turėtų sudaryti didžiausią dalį, daugiau negu 50 % dalelių dydis 50–200 μm); d) įpilama dejonizuoto vandens, kad galutinio mišinio drėgnumas būtų 30—50 %; e) įdedama chemijos požiūriu gryno kalcio karbonato (CaCO3), kad galutinio nuosėdų mišinio pH vertė būtų 7,0 ± 0,5; galutinio mišinio sudėtyje turėtų būti 2 % (± 0,5 %) organinės anglies ir jos kiekis koreguojamas atitinkamais durpių ir smėlio kiekiais atsižvelgiant į a–c. 14. Turėtų būti žinomas durpių, kaolino molio ir smėlio gavimo šaltinis. Nuosėdų sudedamosios dalys turėtų būti patikrinamos, ar jose nėra cheminės taršos pėdsakų (pvz., sunkiųjų metalų, chlororganinių komponentų, fosfororganinių komponentų ir t. t.). Sintetinių nuosėdų pasiruošimo pavyzdys aprašytas 3 priedėlyje. Taip pat leidžiama maišyti sausąsias sudedamąsias dalis, jeigu įmanoma įrodyti, kad užpylus paviršinio vandens nėra atskiriamos nuosėdų sudedamosios dalys (pvz., neima plūduriuoti kietosios durpių dalelės) ir kad durpės ar nuosėdos yra kondicionuotos pagal reikalavimus. Vanduo 15. Kaip bandymo vandenį leidžiama rinktis bet kokį vandenį, atitinkantį 2 ir 4 priedėliuose išvardytas skiedimui tinkamo vandens chemines savybes. Bet kokį tinkamą vandenį, natūralų vandenį (paviršinį ar gruntinį), regeneruotą vandenį (žr. 2 priedėlį) arba vandentiekio vandenį, iš kurio pašalintas chloras, leidžiama rinktis kaip kultūros auginimo vandenį ir bandymo vandenį, jeigu chironomidai jame be streso požymių išgyvena kultūros veisimo ir bandymo laikotarpiu. Bandymo vandens pH vertė pradedant bandymą turėtų būti 6–9, o bendrasis kietumas ne didesnis negu 400 mg/l kaip CaCO3. Tačiau jeigu galima daryti prielaidą, kad vandens kietumo jonai gali sąveikauti su bandomąja chemine medžiaga, turėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4). Atliekant tyrimą turėtų būti naudojamas to paties tipo vanduo. 4 priedėlyje išvardytų vandens kokybės charakteristikų vertės turėtų būti matuojamos ne rečiau negu du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad šios charakteristikos yra gerokai pakitusios. Pradiniai tirpalai. Nuosėdos su įterpta bandomąja chemine medžiaga 16. Pasirinktos koncentracijos nuosėdos su įterpta bandomąja chemine medžiaga paprastai pasiruošiamos bandomosios cheminės medžiagos tirpalo įpilant tiesiogiai į nuosėdas. Bandomosios cheminės medžiagos pradinis tirpalas ištirpinamas dejonizuotame vandenyje ir maišymo įtaisu, tiekimo maišikliu ar rankomis maišomas su sintetinėmis nuosėdomis. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga sunkiai tirpsta vandenyje, ją galima ištirpinti kuo mažesniame tinkamo organinio tirpiklio kiekyje (pvz., heksane, acetone arba chloroforme). Šis tirpalas maišomas su 10 g smulkaus kvarco smėlio vienam bandymo indui. Palaukiama, kol tirpiklis išgaruoja ir jis turi būti visiškai pašalinamas iš smėlio; tada bandymo laboratorinėje stiklinėje smėlis maišomas su reikiamu nuosėdų kiekiu. Norint bandomąją cheminę medžiagą soliubilizuoti, disperguoti ar emulguoti leidžiama naudoti tik lengvai garuojančias medžiagas. Atkreiptinas dėmesys, kad ruošiantis nuosėdas turi būti atsižvelgiama į bandomoje cheminėje medžiagoje ir smėlio mišinyje esantį smėlį (t. y. nuosėdos turėtų būti pasiruošiamos naudojant mažiau smėlio). Privaloma pasirūpinti, kad į nuosėdas įterpiama bandomoji cheminė medžiaga būtų kruopščiai ir tolygiai paskirstoma nuosėdose. Jeigu būtina, galima analizuoti ėminio dalį siekiant nustatyti vienalytiškumą. BANDYMO PLANAS 17. Sudarant bandymo planą pasirenkamos bandymo koncentracijos ir jų paskirstymas, kiekvienos koncentracijos indų skaičius ir lervų skaičius inde. Pateikiamas EC taško nustatymo, NOEC nustatymo ir ribos bandymo atlikimo aprašymas. Regresinės analizės planas 18. Bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC15, EC50) ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Apskritai tikslumo ir ypač validumo vertes, kurias naudojant galima įvertinti poveikio koncentracijas (ECx), įmanoma patikslinti, jeigu poveikio koncentracijos vertės atitinka bandomųjų koncentracijų intervalą. Nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai mažesnių negu mažiausioji teigiamoji koncentracija arba didesnių negu didžiausioji koncentracija verčių. Pradinis intervalo nustatymo bandymas praverčia renkantis naudotinų koncentracijų intervalą (žr. 27 pastraipą). 19. Jeigu turi būti nustatomos poveikio koncentracijos (ECx), turėtų būti atliekami bent penki bandymai naudojant kiekvieną koncentracijos vertę ir trys kartotiniai bandymai. Bet kuriuo atveju rekomenduojama naudoti pakankamą bandomųjų koncentracijų skaičių, kad modelis būtų reikiamai įvertinamas. Koncentracijų koeficiento vertė neturėtų būti didesnė negu 2 (išimtį leidžiama taikyti tais atvejais, jeigu dozės ir reakcijos santykio kreivė turi nuolaidų statumą). Kartotinių ėminių skaičių atliekant kiekvieną apdorojimą galima mažinti, jeigu padidėja skirtingą atsaką sukeliančių bandomųjų koncentracijų skaičius. Didinant kartotinių ėminių skaičių arba mažinant bandomųjų koncentracijų intervalo ribas būtų taikomi siauresni bandymo pasikliovimo intervalai. Papildomi kartotiniai ėminiai būtini tuo atveju, jeigu reikia įvertinti 10 parų lervų išgyvenimą ir augimą. NOEC/LOEC įvertinimo planas 20. Jeigu reikia įvertinti LOEC arba NOEC, turėtų būti naudojamos ne mažiau negu keturių kartotinių bandymų penkios bandomosios koncentracijos ir koncentracijų koeficiento vertė ne turėtų viršyti 2. Kartotinių bandymų skaičius turėtų būti pakankamas siekiant užtikrinti reikiamą statistinę galią, kad būtų aptinkamas 20 % skirtumas nuo kontrolinio 5 % reikšmingumo lygmens (p = 0,05). Nustatant vystymosi greitį paprastai naudojama dispersinė analizė (ANOVA), pvz., Dunnett bandymas ir Williams bandymas (17) (18) (19) (20). Nustatant išskridimo normą galima naudoti Cochran-Armitage, Fisher (su Bonferroni pataisa) arba Mantel-Haentzal bandymus. Ribinis bandymas 21. Ribinį bandymą galima atlikti (viena bandomoji koncentracija ir kontrolinis ėminys), jeigu darant pradinį intervalo nustatymo bandymą nebuvo nustatyta jokių poveikių. Ribinio bandymo tikslas – atlikti bandymą naudojant ganėtinai didelę koncentraciją, kad sprendimą priimantys asmenys galėtų išskirti galimą toksinį bandomosios cheminės medžiagos poveikį ir kad būtų nustatyta ribinė koncentracijos vertė, kuri jokiu būdu neturi būti naudojama. Rekomenduojama 1 000 mg/kg (sausoji masė). Paprastai poveikiui bandomąja medžiaga ir kontroliniam ėminiui būtini ne mažiau negu šeši pakartotiniai bandymai. Turi būti įrodoma pakankama statistinė galia aptikti 20 % skirtumą nuo kontrolinės vertės esant 5 % reikšmingumo lygiui (p = 0,05). Jeigu atsakas nurodomas metriniais vienetais (vystymosi greitis ir masė), t-bandymas yra tinkamas statistinis metodas, jeigu duomenys atitinka šio bandymo reikalavimus (atitiktis, vienalytės dispersijos). Jeigu šių reikalavimų nesilaikoma, leidžiama naudoti nelygiavertės dispersijos t-bandymą arba neparametrinį bandymą, pvz., Wilcoxon-Mann-Whithey bandymą. Nustatant išsiritimo normą atliktinas Fisher bandymas. PROCEDŪRA Poveikio sąlygos Nuosėdų su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir vandens sistemos pasiruošimas 22. Bandomosios cheminės medžiagos įtepimo procedūra aprašyta bandymo metode C.8: Nustatant toksiškumą sliekams rekomenduojama taikyti bandomąją medžiagą (14). Nuosėdos su įterpta bandomąja medžiaga dedamos į indus ir užpilamos paviršiniu vandeniu, kad būtų užtikrintas nuosėdų ir vandens santykis 1:4 (žr. 11 ir 15 pastraipas). Nuosėdų sluoksnio storis turėtų būti 1,5—3 cm. Kad į vandens tūrį pilant bandymo vandenį nuosėdų sudedamosios dalys neatsiskirtų ir kietosios dalelės vėl nebūtų suspenduojamos skystyje, nuosėdas leidžiama uždengti plastiko disku, kol vanduo pilamas ant nuosėdų, ir vėliau diskas nedelsiant nuimamas. Taip pat leidžiama naudoti kitus įtaisus. 23. Bandymo indai turėtų būti uždengiami (pvz., stiklo plokštėmis) Jeigu būtina, atliekant tyrimą leidžiama įpilti vandens, kad būtų užtikrinamas pradinis vandens tūris ir kompensuojama išgaruojanti vandens dalis. Papildomai turėtų būti pilamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo, kad nesusidarytų druskos. Stabilizavimas 24. Pasiruošus nuosėdas su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir paviršiniu vandeniu rekomenduojama palaukti, kol bandomoji cheminė medžiaga iš hidratuotos fazės pereis į nuosėdas (3) (4) (6) (13). Šis procesas turėtų būti visų pirma atliekamas laikantis darant bandymą taikomų temperatūros ir aeracijos sąlygų. Nuosėdoms ir cheminei medžiagai būdinga tam tikra pusiausvyros nusistovėjimo trukmė bei ji gali aprėpti kelias valandas ar dienas ir retais atvejais ne daugiau negu kelias savaites (4–5 savaites). Šiuo atveju būtų pakankamai laiko biologiškai suskaidyti daugelį cheminių medžiagų ir pusiausvyra nenusistovėtų, tačiau rekomenduojama rinktis 48 val. pusiausvyros nusistovėjimo laikotarpį. Kito šio pusiausvyros nusistovėjimo laikotarpio pabaigoje turėtų būti matuojama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija paviršiniame vandenyje, porų vandenyje ir nuosėdose, bent jau didžiausios koncentracijos ir mažiausios koncentracijos (žr. 38 pastraipą). Naudojantis šiais bandomosios cheminės medžiagos analiziniais nustatymais galima apskaičiuoti masės balansą ir išreikšti rezultatus atsižvelgiant į išmatuotas koncentracijas. Bandomųjų organizmų pridėjimas 25. Keturias ar penkias dienas prieš bandomųjų organizmų įdėjimą į bandymo indus, kiaušinėlių masė turėtų būti paimama iš sėjimo kultūrų ir sudedama į mažus indus auginimo terpėje. Leidžiama naudoti iš kamieninės kultūros gautą terpę arba šviežią pasiruoštą terpę. Jeigu naudojama pastaroji, į auginimo terpę turėtų būti įdedamas mažas kiekis pašaro, pvz., žaliųjų dumblių ir (arba) įlašinami keli lašeliai smulkiai sumaltų žuvų maisto gabalėlių suspensijos filtrato (žr. 2 priedėlį). Turėtų būti naudojamos tik neseniai padėtų kiaušinėlių masės. Paprastai lervos ima ristis po kelių dienų nuo kiaušinėlių padėjimo (Chironomus riparius 20 °C temperatūroje išsirita per 2–3 dienas, Chironomus tentans 23 °C temperatūroje išsirita per 1–4 dienas ir Chironomus yoshimatui 25 °C temperatūroje) ir lervos augdamos pereina keturias stadijas, iš kurių kiekviena trunka 4–8 dienas. Atliekant bandymą turėtų būti naudojamos pirmosios stadijos lervos (2–3 arba 1–4 dienų po išsiritimo). Mašalų stadiją įmanoma nustatyti pagal galvutės apvalkalo plotį (6). 26. Pirmos stadijos dvidešimt lervų buka pipete atsitiktinai paskirstoma kiekvienam bandymo indui, kuriame yra nuosėdų su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir vandens. Vandens aeravimas turi būti nutraukiamas, kol lervos dedamos į bandymo indą, ir ši būsena išlaikoma dar 24 valandas po lervų įdėjimo (žr. 25 ir 32 pastraipas). Pagal taikomą bandymo planą (žr. 19 ir 20 pastraipas) kiekviena koncentracija veikiama ne mažiau negu 60 lervų, jeigu nustatomas ES taškas, arba 80 lervų, jeigu apibrėžiama NOEC. Bandomosios koncentracijos 27. Intervalo nustatymo bandymas gali būti naudingas siekiant apibrėžti darant galutinį bandymą pasirinktinų koncentracijų intervalą. Šiuo tikslu naudojamos labai besiskiriančių bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų serijos. Siekiant užtikrinti galutiniam bandymui naudojamų chironomidų vienodą paviršiaus tankumą, jie veikiami kiekviena bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tol, kol įvertinamos atitinkamos bandomosios koncentracijos ir kartotiniai ėminiai nėra reikalingi. 28. Atliekant galutinį bandymą naudojamos bandomosios koncentracijos pasirenkamos atsižvelgiant į intervalo nustatymo bandymo rezultatą. Turėtų būti naudojamos ne mažiau negu penkios koncentracijos kaip aprašyta 18–20 pastraipose. Kontroliniai ėminiai 29. Kontrolinių ėminių indai be jokios bandomosios cheminės medžiagos, tačiau su nuosėdomis, turėtų būti naudojami atliekant bandymą su atitinkamu skaičiumi kartotinių ėminių (žr. 19–20 pastraipą). Jeigu taikant bandomąją cheminę medžiagą naudotas tirpiklis (žr. 16 pastraipą), turėtų būti įdedamas tirpiklio kontrolinis ėminys. Bandymo sistema 30. Naudojamos statinės sistemos. Išskirtiniais atvejais leidžiama naudoti pusiau statines ar dinamines sistemas su trūkiuoju ar tolygiu paviršinio vandens atnaujinimu, pvz., jeigu vandens kokybės reikalavimai neatitinka taikomų bandomajam organizmui ar daro poveikį cheminei pusiausvyrai (pvz., ištirpusio deguonies lygiai pernelyg sumažėja, labai padidėja šalinimo produktų koncentracija arba iš nuosėdų ima sunktis mineralų skystis ir daro poveikį pH ir (arba) vandens kietumo vertėms). Tačiau paprastai pakanka kitų paviršinio vandens kokybės gerinimo metodų, pvz., aeracijos, ir jiems teiktina pirmenybė. Pašaras 31. Lervas būtina maitinti; pageidautina kiekvieną dieną ar bent tris kartus per savaitę. Per pirmąsias 10 parų jaunoms lervoms per dieną turėtų pakakti 0,25–0,5 mg (C. yoshimatui lervoms 0,35–0,5 mg) žuvų maisto (vandens suspensija arba smulkiai sumaltas maistas, pvz., Tetra-Min arba Tetra-Phyll, išsami informacija pateikta 2 priedėlyje). Senesnėms lervoms pašaro reikia šiek tiek daugiau: likusiai bandymo daliai kiekvieną dieną lervoms turėtų pakakti 0,5–1 mg. Pašaro kiekis turėtų būti mažinamas visų apdorojimų atvejais ir kontrolinėje grupėje, jeigu nustatomas grybelio atsiradimas arba jeigu aptinkama, kad kontrolinės grupės gyvūnai gaišta. Jeigu grybelio augimo nepavyksta sustabdyti, bandymas turi būti pakartotas. Jeigu bandymai atliekami su lengvai absorbuojamomis cheminėmis medžiagomis (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusiomis cheminėmis medžiagomis, išgyvenimui ir natūraliam augimui būtiną pašaro kiekį galima įterpti į sintetines nuosėdas prieš stabilizavimo laikotarpį. Šiuo tikslu turi būti naudojamas ne žuvų maistas, o augalinis pašaras, pvz., pridedama 0,5 % (sausoji masė) smulkiai sumaltų lapų, pvz., didžiosios dilgėlės (Urtica dioeca), baltojo šilkmedžio (Morus alba), persinio dobilo (Trifolium repens), daržinio špinato (Spinacia oleracea) arba galima naudoti kitą augalinę medžiagą (Cerophyl arba alfa celiuliozę). Inkubacijos sąlygos 32. Rekomenduojama visų pirma 24 valandas po lervų įdėjimo nestipriai aeruoti bandymo indų paviršinį vandenį ir vėliau aeruojama per visą bandymo atlikimo trukmę (privaloma stebėti, ar ištirpusio deguonies koncentracijos vertė nėra mažesnė negu 60 % soties ore vertės (ASV)). Aeruojant naudojama stiklinė Pastero pipetė, pritvirtinta 2–3 cm virš nuosėdų sluoksnio (t. y. vienas ar keli burbulai per sek.). Darant bandymus su lakiosiomis cheminėmis medžiagomis galima nuspręsti nuosėdų–vandens sistemos neaeruoti. 33. Atliekant bandymą išlaikoma pastovi 20 °C (± 2 °C) temperatūra. Atliekant bandymą su C. tentans ir C. yoshimatui atitinkamai rekomenduojama pasirinkti 25 °C (± 2 °C) temperatūrą. Naudojamas 16 val. apšvietimo laikotarpis; šviesos intensyvumo vertės turėtų būti 500–1 000 liuksų. Poveikio trukmė 34. Poveikis prasideda lervas įdėjus į indus su bandomąją chemine medžiaga ir kontrolinių ėminių indus. Jeigu naudojami C. riparius ir C. yoshimatsui, poveikio trukmė yra 28 dienos, o kai pasirenkama C. tentans – 65 dienos. Jeigu mašalai atsiranda anksčiau, bandymą galima nutraukti ne anksčiau negu po penkių dienų atsiradus paskutiniam kontrolinės grupės suaugusiajam. Stebėjimai Lervų išsinėrimas 35. Nustatoma vystymosi trukmė ir bendras visų iki galo išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius. 36. Bandymo indai turėtų būti stebimi bent tris kartus per savaitę siekiant nustatyti bet kokią neįprastą veikseną (pvz., nuosėdų susidarymą, neįprastą plūduriavimą) palyginti su kontroliniai indais. Numatomo lervų išsinėrimo laikotarpiu būtina skaičiuoti kasdieną atsirandančius mašalus. Kiekvieną dieną registruojami visi atsiradę mašalai ir nurodoma jų lytis. Nustačius tapatybę mašalai pašalinami iš indų. Turėtų būti registruojamos visos prie užbaigiant bandymą padėtos kiaušinėlių masės ir po to pašalinamos, kad lervos pakartotinai nebūtų įdėtos į nuosėdas. Taip pat registruojamas matomų lėliukų skaičius, kurios nėra išsiritusios. Išsineriančių lervų skaičiavimo gairės pateiktos 5 priedėlyje. Augimas ir išgyvenimas 37. Jeigu privaloma pateikti duomenis apie 10 parų lervų išgyvenimą ir augimą, iš pradžių turi būti įtraukiami papildomi bandymo indai, kad juos būtų galima naudoti vėliau. Šių papildomų indų nuosėdos sijojamos 250 μm sietu siekiant surinkti lervas. Nejudumas ar nepakankamas atsakas į mechaninius dirgiklius yra gaišimo kriterijai. Neatsigavusios lervos taip pat turėtų būti laikomos nugaišusiomis (bandymo pradžioje nugaišusios lervos galėjo būti žuvusios nuo mikrobų). Nustatoma bandymo inde išgyvenusių lervų sausoji masė (be pelenų) ir apskaičiuojama vidutinė pavienė indo sausoji masė. Tikslinga nustatyti, kurios stadijos yra išgyvenusi lerva; šiuo tikslu galima matuoti kiekvieno individo galvos apvalkalo plotį. Analiziniai matavimai Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija 38. Prieš pradedant bandymą (t. y. prieš įdedant lervas) bent iš kiekvieno apdorojimo indo imami biriųjų nuosėdų ėminiai ir į juos atsižvelgiant bei naudojant analizinį nustatymą įvertinama bandomosios cheminės medžiagos koncentracija nuosėdose. Bandymo pradžioje ir pabaigoje rekomenduojama analizuoti bent paviršinio vandens, porų vandens ir nuosėdų ėminius (žr. 24 pastraipą) esant didžiausiai koncentracijai ir mažesnei koncentracijai. Nustačius bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją gaunama informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos elgseną ir (arba) pasiskirstymą vandens–nuosėdų sistemoje. 39. Jeigu atliekami tarpiniai matavimai (pvz., 7 dieną) ir jeigu analizei atlikti reikalingi dideli ėminiai, kuriuos paėmus bandymo sistemai būtų padarytas poveikis, analiziniai nustatymai turėtų būti atliekami naudojant iš panašiai apdorotų papildomų bandymo indų paimtus ėminius (įskaitant bandomųjų organizmų buvimą), tačiau biologiniam stebėjimui nenaudotų indų. 40. Siekiant izoliuoti laisvąjį vandenį rekomenduojama naudoti 30 min. trukmės centrifugavimo procedūrą, pvz., 10 000 g ir 4 °C. Tačiau jeigu įrodoma, kad bandomosios cheminės medžiagos filtrai neadsorbuoja, taip pat galima rinktis filtravimą. Tam tikrais atvejais gali nebūti įmanoma analizuoti porų vandens koncentracijų, nes ėminys yra pernelyg mažas. Fiziniai ir cheminiai parametrai 41. Tinkamu būdu turėtų būti matuojama bandymo indų pH ir temperatūros vertės (žr. 10 pastraipą). Bandymo pradžioje ir jo pabaigoje turėtų būti matuojama kontrolinių ėminių ir vieno bandymo indo kietumo ir amoniako vertės esant didžiausiai koncentracijai. DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS Rezultatų apdorojimas 42. Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį mašalų patelių ir patinėlių vystymosi greičiui ir bendram jų skaičiui, arba, jeigu atliekamas 10 parų bandymas, poveikį lervų išgyvenimui ir jų masei. Jeigu neturima duomenų apie statistiniu požiūriu skirtingą lyčių jautrumą, atliekant statistinę analizę patinėlių ir patelių rezultatus galima sujungti. Apie lyčių jautrumo skirtumus galima spręsti naudojant statistines priemones, pvz., atliekant χ2-r × 2 lentelės bandymą. Jeigu reikia, po 10 parų turi būti nustatomas lervų išgyvenimas ir vidutinė kiekvieno indo sausoji masė. 43. Visų pirmiausiai remiantis bandymo pradžioje (žr. 38 pastraipą) išmatuotomis nuosėdų koncentracijomis apskaičiuojamos sausąja mase pagrįstos ir išreikštos poveikio koncentracijos. 44. Indo statistinius duomenis, norint apskaičiuoti EC50 arba bet kokio kito ECx taškinį įvertį, leidžiama naudoti kaip patikimus kartotinius duomenis. Apskaičiuojant kiekvieno ECx pasikliovimo intervalą turėtų būti atsižvelgiama į kiekvieno indo skirtingumą arba būti įrodoma, kad šis kintamumas yra toks mažas ir kad jo galima nepaisyti. Jeigu modeliui taikomas mažiausiųjų kvadratų metodas, kiekvieno indo statistikos duomenims taikoma transformacija siekiant pagerinti dispersijos vienalytiškumą. Tačiau ECx vertės turėtų būti apskaičiuojamos atsaką transformavus į pradinę vertę. 45. Jeigu taikant statistinę analizę siekiama apibrėžti NOEC/LOEC ir šiuo tikslu tikrinama hipotezė, turi būti atsižvelgiama į su indais susijusį skirtingumą, pvz., įterpiant ANOVA. Antraip jeigu susiklosto situacijos, kad įprastos ANOVA prielaidos gali būti pažeidžiamos, galima naudoti išsamesnius bandymus (21). Išsinėrimo santykis 46. Išsinėrimo santykiai yra kiekybiniai duomenys ir juos galima analizuoti atliekant Cochran-Armitage bandymą, taikomą mažėjimo tvarka, jeigu laikoma, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir šie duomenys atitinka minėtą prielaidą. Jeigu ne, šiuo atveju leidžiama rinktis Fisher arba Mantel-Haentzal bandymą su pakoreguotomis pagal Bonferroni-Holm p vertėmis. Jeigu turima įrodymų, kad naudojant tą pačią koncentraciją kartotinių ėminių kintamumas yra didesnis negu būtų galima nustatyti atsižvelgiant į binominį skirstinį (dažnai vadinamą „pertekline dispersija“), šiuo atveju turėtų būti pasirenkamas (21) pasiūlytas išsamus Cochran-Armitage arba Fisher bandymas. Nustatoma inde išsiritusių mašalų suma ne ir dalinama iš įdėtų lervų skaičiaus na: kur: ER = išsinėrimo santykis ne = iš indo išsinėrusių mašalų skaičius na = į indą įdėtų lervų skaičius 47. Jeigu ėminiai yra dideli ir jeigu nustatoma perteklinė dispersija, šiuo atveju galima rinktis kitą alternatyvą, t. y. išsinėrimo santykį laikyti nenutrūkstamuoju atsaku ir rinktis Williamso bandymą, jeigu daroma prielaida, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir atitiksiąs šiuos ER duomenis. Jeigu monotoniškumas nėra užtikrinamas, pirmenybė teiktina Duneto bandymui. Didelio ėminio dydis šiuo atveju apibrėžiamas išsinėrusių mašalų ir neišsinėrusių mašalų skaičiumi, kuris abiem atvejais viršija penkis, atsižvelgiant į kartotinį ėminį (indą). 48. Norint taikyti ANOVA metodų vertes, ER vertės pirmiausiai turėtų būti transformuojamos naudojant arksinuso kvadratinės šaknies transformaciją arba Tukey-Freeman transformaciją siekiant gauti apytikslį įprastą skirstinį ir suvienodinti dispersijas. Leidžiama naudoti Cochran-Armitage, Fisherio (Bonferroni) arba Mantel-Haentzal bandymus, jeigu taikomi absoliutieji dažniai. Arcsin-sqrt transformacija taikoma pasirenkant ER vertės kvadratinės šaknies arksinusą (sin–1). 49. Išsinėrimo santykių ECx vertės apskaičiuojamos naudojant regresijos analizę (arba, pvz., probit (22), logit, Weitbull, atitinkamą komercinę programinę įrangą ir t. t.). Jeigu regresijos analizė nepavyksta (pvz., jeigu tėra mažiau negu du daliniai atsakai), naudojami kiti neparametriniai metodai, pvz., slankiojo vidurkio metodas ar interpoliacijos metodas. Vystymosi greitis 50. Vidutinė vystymosi trukmė yra vidutinis laikotarpis nuo lervų įdėjimo (nulinė bandymo diena) ir iki eksperimentinės mašalų kohortos išsinėrimo. (Apskaičiuojant tikrąją vystymosi trukmę turėtų būti atsižvelgiama į lervų amžių, kai jos buvo įdedamos). Vystymosi greitis yra atvirkštinis dydis vystymosi trukmės atžvilgiu (vienetas: 1/diena) ir atitinka tą lervos vystymosi atkarpą, kuris vyksta per vieną dieną. Vystymosi greičiui, palyginti su šių nuosėdų toksiškumo tyrimų įvertinimu, teikiama pirmenybė, nes jo dispersija yra mažesnė, ir jis vienalytiškesnis bei glaudžiau atitinka įprastą pasiskirstymą, jeigu lyginama su vystymosi trukme. Vadinasi, leidžiama veikiau rinktis patikimą parametrinį bandymą su vystymosi greičiu negu su vystymosi trukme. Vystymosi greičio kaip nenutrūkstamo atsako ECx vertes galima įvertinti naudojant regresijos analizę (pvz., (23), (24)). 51. Atliekant šiuos statistinius tyrimus laikoma, kad tikrinimo x dieną pastebėtas mašalų skaičius išsinėrė per vidutinį laiko intervalą nuo x dienos iki x-1 dienos (l = tikrinimo intervalo trukmė (paprastai viena diena)). Vienam indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė (x) apskaičiuojama pagal šią lygtį: kur: : indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė i : tikrinimo intervalo indeksas m : didžiausias tikrinimo intervalų skaičius : per tikrinimo intervalą i išsinėrusių mašalų skaičius ne : bendras eksperimento pabaigoje išsinėrusių mašalų skaičius (= xi : per intervalą i išsinėrusių mašalų vystymosi greitis kur: dienai : tikrinimo diena (diena po poveikio) li : tikrinimo intervalo i trukmė (dienos, paprastai 1 diena) Bandymo ataskaita 52. Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukiama bent ši informacija: Bandomoji cheminė medžiaga: — fizinis pobūdis ir, jeigu reikia, fizinės bei cheminės savybės (tirpumas vandenyje, garų slėgis, pasiskirstymo dirvoje koeficientas (ar nuosėdose, jeigu žinomas), stabilumas vandenyje ir t. t.), — cheminės tapatybės nustatymo duomenys (bendrinis pavadinimas, cheminis pavadinimas, struktūrinė formulė, CAS numeris ir t. t.), įskaitant grynumą ir analinės metodas atliekant bandomosios cheminės medžiagos kiekybinį nustatymą. Bandomosios rūšys: — naudojami bandomieji gyvūnai: rūšis, mokslinis pavadinimas, organizmo gavimo šaltinis ir veisimo sąlygos, — informacija apie kiaušinėlių masės ir lervų tvarkymą, — gyvūnų amžius, kai jie buvo įdėti į bandymo indus. Bandymo sąlygos: — naudotos nuosėdos, t. y. natūralios ar sintetinės nuosėdos, — jei naudojamos natūralios nuosėdos, nuosėdų ėminių ėmimo vieta ir jos aprašymas, įskaitant, jeigu įmanoma, taršos aprašas; charakteristikos: pH, organinės anglies kiekis, C/N santykis ir granuliometrinė analizė (jeigu reikia), — sintetinių nuosėdų pasiruošimas: sudedamosios dalys ir charakteristikos (organinės anglies kiekis, pH, drėgmė ir t. t. bandymo pradžioje), — bandymo vandens pasiruošimas (jeigu naudojamas regeneruotas vanduo) ir charakteristikos (deguonies koncentracija, pH. Laidumas, kietumas ir t. t. bandymo pradžioje), — nuosėdų ir vandens sluoksnių storis, — paviršinio vandens ir porų vandens tūris; drėgnųjų nuosėdų masė su porų vandeniu ir be jo, — bandymo indai (medžiaga ir dydis), — bandomosios cheminės medžiagos įterpimo į nuosėdas metodas: naudotos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kartotinių ėminių skaičius ir naudoti tirpikliai, jeigu buvo naudoti, — nuosėdų—vandens sistemos, į kurią įterpta bandomosios cheminės medžiagos, stabilizavimo pusiausvyros fazė: trukmė ir sąlygos, — inkubacijos sąlygos: temperatūra, šviesos ciklas ir intensyvumas, aeracija (dažnumas ir intensyvumas), — išsami informacija apie maistą, įskaitant jo tipą, paruošiamą, kiekį ir maitinimo tvarką. Rezultatai: — nominaliosios bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandomosios koncentracijos ir visų analizių rezultatai siekiant bandymo inde nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją, — vandens kokybė bandymo induose, t. y. pH, temperatūra, ištirpęs deguonis, kietumas ir amoniako kiekis, — išgaruojančio bandymo vandens papildymas, jeigu taikoma, — iš kiekvieno indo per dieną išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius, — lervų, kurios inde neišsinėrė kaip mašalai, skaičius, — vidutinė pavienė lervų sausoji masė inde ir tam tikros stadijos lervų sausoji masė inde, jeigu reikia, — išsinėrusių mašalų skaičius atliekant tapatų bandymą ir bandomoji koncentracija (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas), — atliekant tapatų bandymą išsinėrusių mašalų vidutinis vystymosi greitis ir apdorojimo norma (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas), — toksinio poveikio įvertinimai, pvz., ECx (ir susiję pasikliovimo intervalai), NOEC ir (arba) LOEC bei jiems nustatyti naudoti statistikos metodai, — rezultatų aptarimas, įskaitant bet kokį poveikį bandymo rezultatams, kuris būtų padarytas nukrypus nuo šio bandymo metodo. LITERATŪRA 1. BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. 2. Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. 3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. 4. ASTM International/E1706–00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. 5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. 7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. 8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 9. Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. 10. Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. 11. Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. 12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and SAFEty Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 14. Šio priedo bandymo metodas C.8. Toksiškumas sliekams. 15. Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. 16. Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. 17. Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121. 18. Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491. 19. Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117. 20. Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531. 21. Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. 22. Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. 23. Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. 24. Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. 1 priedėlis SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS Šiame bandymo metode vartojamų terminų apibrėžtys: Pasiruoštosios nuosėdos ar regeneruotos, dirbtinės arba sintetinės nuosėdos yra natūralių nuosėdų fizines sudedamąsias dalis atitinkančių medžiagų mišinys. Paviršinis vanduo – bandymo inde ant nuosėdų užpiltas vanduo. Laisvasis vanduo ar porų vanduo – ertmes tarp nuosėdų ir dirvožemio kietųjų dalelių užpildantis vanduo. Nuosėdos su įterpta bandomąja chemine medžiaga – nuosėdos, į kurias prileista bandomosios cheminės medžiagos. Bandomoji cheminė medžiaga – bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys. 2 priedėlis Rekomendacijos dėl Chironomus riparius auginimo 1. Chironomus lervas galima auginti kristalizatoriuose ar didelėse talpyklose. Ant talpyklos dugno plonu sluoksniu (5–10 mm storio) paskleidžiamas smulkus kvarco smėlis. Taip pat įrodyta (pvz., Merck, Art 8117), kad diatomitas yra tinkamas substratas (pakanka plonesnio sluoksnio, vos kelių mm storio). Po to užpilamas kelių centimetrų storio vandens sluoksnis. Jeigu reikia, įpilama papildomo vandens, kad būtų atkuriamas išgaravęs kiekis ir sustabdomas džiūvimas. Jeigu reikia, vandenį leidžiama pakeisti. Turėtų būti užtikrinamas nuosaikus aeravimas. Lervų auginimo indai turėtų būti laikomi tinkamuose narvuose, kad išsinėrę suaugusieji vabzdžiai nepajėgtų pasprukti. Narvas turėtų būti ganėtinai erdvus, kad galėtų spiestis išsinėrę suaugusieji vabzdžiai; antraip populiacija gali nesusiformuoti (mažiausi matmenys yra 30 × 30 × 30 cm). 2. Narvai turėtų būti laikomi kambario temperatūroje arba pastovių aplinkos sąlygų patalpoje 20 ± 2 °C temperatūroje; šviesiojo laikotarpio trukmė 16 val. (šviesos intensyvumas apie 1 000 liuksų), 8 val. tamsos. Parengta ataskaitų, kuriose nurodoma, kad jeigu oro drėgnumas yra mažesnis negu 60 % RH, gali sumažėti reprodukcija). Skiedimo vanduo 3. Leidžiama naudoti bet kokį tinkamą natūralų ar sintetinį vandenį. Paprastai naudojamas šulinio vanduo, vanduo, iš kurio pašalintas chloras, ir dirbtinės terpės (pvz., Elendt „M4“ arba „M7“ priemonė, žr. toliau). Prieš naudojimą vanduo turi būti aeruojamas. Jeigu būtina, kultūrų auginimo vandenį leidžiama atnaujinti pilant panaudotą vandenį iš kultūrų auginimo indų ar jį leidžiant per sifoną; būtina stengtis nepažeisti lervų vamzdžių. Lervų šėrimas 4. Chironomus lervos turėtų būti šeriamos žuvų maisto dribsniais (Tetra Min®, Tetra Phyll® arba kita panašia patentuota žuvų maisto rūšimi); vienam indui per dieną skiriama apie 250 mg pašaro. Pašarą galima pateikti sausą, sumaltą milteliais arba kaip vandens suspensiją: 1,0 g maisto dribsnių įdedama į 20 ml skiedimo vandens ir išmaišoma, kol gaunamas vienalytis mišinys. Šio ruošinio apie 5 ml per dieną leidžiama įdėti į kiekvieną indą (prieš naudojant būtina pakratyti). Vyresnėms lervoms duodama daugiau pašaro. 5. Šėrimas koreguojamas atsižvelgiant į vandens kokybę. Jeigu auginimo terpė „susidrumsčia“, duodamo pašaro kiekis turėtų būti sumažinamas. Duodamo pašaro kiekiai turi būti kruopščiai stebimi. Jeigu duodamas per mažas pašaro kiekis, lervos persikelia į vandens storymę, o skiriant per daug pašaro suintensyvėja mikroorganizmų veikla ir sumažėja deguonies koncentracija. Abiem minėtomis sąlygomis sumažėja augimo greitis. 6. Ruošiant naujus kultūrų auginimo indus į juos taip pat galima šiek tiek įdėti žaliųjų dumblių (pvz., Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). Išsinėrusių suaugusiųjų mašalų šėrimas 7. Kai kurie tyrinėtojai pasiūlė, kad išsinėrusius suaugusius mašalus būtų galima šerti naudojant prisotintame sacharozė tirpale išmirkytus vilnos tamponus. Lervų išsinėrimas 8. Suaugę mašalai ima rastis iš lervų auginimo indų po 13–15 dienų 20 ± 2 °C temperatūroje. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius. Kiaušinėlių masė 9. Kol suaugę mašalai būna veisimo narve, visi lervų auginimo indai turėtų būti tikrinami tris kartus per savaitę, ar juose nėra drebučių pavidalo kiaušinėlių masės. Jeigu randama šios kiaušinėlių masės, ji turėtų būti atsargiai pašalinama. Kiaušinėliai turėtų būti sudedami į mažą indelį su veisimo vandens ėminiu. Kiaušinėlių masė naudojama pradedant inde auginti naują kultūrą (pvz., 2–4 kiaušinėlių masė viename inde) arba atliekant toksiškumo bandymus. 10. Pirmos stadijos lervos turėtų išsiristi po 2–3 dienų. Naujų kultūrų auginimo indų ruošimas 11. Išauginus kultūras turėtų būti įmanoma kiekvieną savaitę ar rečiau paruošti naują lervų kultūros auginimo indą atsižvelgiant į bandymo atlikimo reikalavimus ir pašalinant senesnius indus, kai išsineria suaugę mašalai. Taikant šią sistemą mažomis pastangomis reguliariai tiekiami suaugę mašalai. Bandymo tirpalų „M4“ ir „M7“ ruošimas 12. Elendtas (1990) aprašė „M4“ terpę. „M7“ terpė ruošiama kaip „M4“ terpė, išskyrus 1 lentelėje išvardytas chemines medžiagas, kurių koncentracijos „M7“, palyginti su „M4“, yra keturis kartus mažesnės. Leidinys apie „M7“ terpę yra rengiamas (Elendto pateiktas pranešimas). Bandomasis tirpalas neturėtų būti ruošiamas pagal Elendtą ir Bias (1990), jeigu norima gauti NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 ir K2HPO4 koncentracijas, nes pradinių tirpalų ruošimas nėra tapati veikla. „M7“ terpės ruošimas 13. Kiekvienas pradinis tirpalas (I) paruošiamas atskirai ir iš šių pradinių tirpalų (I) paruošiamas kombinuotasis pradinis tirpalas (II) (žr. 1 lentelę). 50 ml kombinuotojo pradinio tirpalo (II) ir 2 lentelėje nurodyti kiekvieno makroelementų pradinio tirpalo kiekiai praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens, kad taip būtų pasiruošta „M7“ terpė. Vitaminų pradinis tirpalas pasiruošiamas į dejonizuotą vandenį įmaišius tris vitaminus kaip nurodyta 3 lentelėje ir 0,1 ml kombinuotojo vitaminų pradinio tirpalo įmaišoma į galutinę „M7“ terpę prieš pat naudojimo pradžią. (Vitaminų pradinis tirpalas laikomas sušaldytas mažomis alikvotinėmis dalimis.) Terpė aeruojama ir stabilizuojama. LITERATŪRA BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. 1 lentelė „M4“ ir „M7“ terpei skirtų mikroelementų pradiniai tirpalai Pradiniai tirpalai (I) Kiekis (mg), praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens Ruošiant kombinuotą pradinį tirpalą (II): maišomi nurodyti pradinių tirpalų (I) kiekiai (mg) ir praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens Galutinės bandomųjų tirpalų koncentracijos (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

2 lentelė M4 ir M7 terpėms skirti makroelementų pradiniai tirpalai Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens (mg) Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas makroelementų pradinių tirpalų kiekis (ml/l) Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

3 lentelė M4 ir M7 terpei skirtas vitaminų pradinis tirpalas. Visi trys vitaminų tirpalai maišomi siekiant paruošti vieną vitaminų pradinį tirpalą Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens (mg) Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas vitaminų pradinio tirpalo kiekis (ml/l) Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos (mg/l) Tiamino hidrochloridas 750 0,1 0,075 Ciankobalaminas (B12) 10 0,1 0,0010 Biotinas 7,5 0,1 0,00075 LITERATŪRA Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. 3 priedėlis SINTETINIŲ NUOSĖDŲ RUOŠIMAS Nuosėdų sudėtis Sintetinės nuosėdos turėtų būti sudarytos iš šių sudedamųjų dalių: Sudedamoji dalis Charakteristikos Nuosėdų sausosios procentinė dalis) Durpės Naujosios Zelandijos kiminų durpės, jų pH kiek įmanoma atitinka 5,5–6,0, jokių augalų matomų liekanų, smulkiai sumaltos (kietųjų dalelių dydis ≤ 1 mm), džiovintos ore 4–5 Kvarcinis smėlis Grūdelių dydis: > 50 % dalelių dydžio vertės intervalas turėtų būti 0–200 μm 75–76 Kaolito molis Kaolinito kiekis ≥ 30 % 20 Organinė anglis Pakoreguota pridedant durpių ir smėlio 2 (± 0,5) Kalcio karbonatas CaCO3, milteliai, cheminiu atžvilgiu grynas 0,05–0,1 Vanduo Laidumas ≤ 10 μS/cm 30–50 Pasiruošimas Durpės džiovinamos ore ir malamos tol, kol gaunami smulkūs milteliai. Suspensija iš nustatyto durpių miltelių kiekio ir dejonizuoto vandens pasiruošiama didelio našumo homogenizavimo įrenginiu. Naudojant CaCO3 koreguojama, kad šios suspensijos pH vertė būtų 5,5 ± 0,5. Švelniai maišant suspensija kondicionuojama ne trumpiau negu dvi dienas 20 ± 2 °C temperatūroje siekiant stabilizuoti pH ir paruošti stabilią mikroorganizmų populiaciją. pH matuojama dar kartą ir jo vertė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Tada durpių suspensija maišoma su kitomis sudedamosiomis dalimis (smėliu ir kaolino moliu) ir dejonizuotu vandeniu siekiant gauti vienalytes nuosėdas, kuriose vandens kiekis sudaro 30—50 % sausosios masės. Dar kartą matuojama galutinio mišinio pH vertė ir, jeigu reikia, naudojant CaCO3 koreguojama, kol pH vertė ima atitikti 6,5–7,5 vertę. Imami nuosėdų ėminiai siekiant nustatyti sausąją masę ir organinės anglies kiekį. Taip pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuosėdas naudoti chironomidų toksiškumo bandymui, sintetinės nuosėdos būtų kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui. Sandėliavimas Sintetinių nuosėdų ruošimo visas sudedamąsias sausas dalis galima laikyti sausoje ir vėsioje vietoje kambario temperatūroje. Sintetinės (drėgnos) nuosėdos neturėtų būti sandėliuojamos prieš jas imant naudoti atliekamam bandymui. Jos turėtų būti naudojamos iš karto po 7 dienas trukusio kondicionavimo laikotarpio, kuriuo baigiamas ruošimo etapas. LITERATŪRA Chapter C.8 of this Annex. Toxicity for Earthworms. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. SAFEty 39: 10–20. 4 priedėlis Tinkamo skiedimo vandens cheminės charakteristikos Cheminė medžiaga Koncentracijos Kietosios dalelės < 20 mg/l Bendroji organinė anglis < 2 mg/l Nejonizuotas amoniakas < 1 mg/l Kietumas (kaip CaCO3) < 400 mg/l (17) Liekamasis chloras < 10 mg/l Suminis organinių fosforo pesticidų kiekis < 50 ng/l Suminis organinių chloro pesticidų ir polichlorintų bifenilų kiekis < 50 ng/l Suminis organinio chloro kiekis < 25 ng/l 5 priedėlis Chironomidų lervų išsiritimo stebėjimo gairės Į bandymo stiklines įdedamos išsiritimo gaudyklės. Gaudyklės reikalingos nuo 20 dienos iki bandymo pabaigos. Gaudyklės brėžinio pavyzdys pateiktas toliau: A: nailono ekranas B: apversti plastiko gaubtai C: bebriaunė laboratorinė poveikio stiklinė D: vandens keitimo ekrano angos E: vanduo F: nuosėdos C.28. TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOSĖDOSE IR VANDENYJE, NAUDOJANT VANDENĮ SU ĮTERPTA BANDOMĄJA CHEMINE MEDŽIAGA ĮVADAS 1. Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires Nr. 219 (2004). Šiuo bandymo metodu siekiama įvertinti ilgalaikį cheminių medžiagų poveikį nuosėdose gyvenančioms gėlųjų vandenų dvisparnio vabzdžio Chironomus sp. lervoms. Šis metodas iš esmės pagrįstas BBA gairėmis; šiuo atveju naudojama nuosėdų—vandens sistema su dirbtiniu dirvožemiu ir vandens storymės poveikio scenarijumi (1). Atliekant šį bandymą taip pat atsižvelgiama į turimus toksiškumo bandymo su Chironomus riparius ir Chironomus tentans protokolus, kurie parengti Europoje (1) (2) (3) ir Šiaurės Amerikoje (4) (5) (6) (7) (8) ir patikrinti tarplaboratorinio lyginimo bandymais (1) (6) (9). Taip pat leidžiama naudoti kitas dvisparnių vabzdžių rūšis, pvz., Chironomus yoshimatsui (10) (11), kurios tinkamai pagrįstos dokumentais. 2. Taikant šį bandymo metodą kaip poveikio scenarijus pasirenkamas bandomosios cheminės medžiagos įterpimas į vandenį. Atitinkamo poveikio scenarijaus pasirinkimas priklauso nuo numatomo bandymo taikymo. Vandens poveikio scenarijumi, kai, be kita ko, į vandens storymę įterpiama bandomoji cheminė medžiaga, ketinama modeliuoti pesticidų sklidimą ir scenarijus apima pradines didžiausias koncentracijas porų vandenyje. Šis scenarijus taip pat taikytinas kitų poveikio tipų atvejais (įskaitant cheminių medžiagų išsiliejimą), išskyrus ilgiau negu bandymo laikotarpis trunkančius kaupimosi procesus. 3. Cheminės medžiagos, kurias būtina ištirti siekiant nustatyti jų poveikį nuosėdose gyvenantiems organizmams, paprastai šiame skyriuje išlieka ilgą laikotarpį. Nuosėdose gyvenančius organizmus galima veikti keliais būdais. Kiekvieno poveikio būdo santykinė svarba ir laikas, sugaištamas, kol taikant kiekvieną būdą užtikrinamas bendrasis toksiškas poveikis, priklauso nuo atitinkamos cheminės medžiagos fizinių ir cheminių savybių. Jei tai lengvai absorbuojamos cheminės medžiagos (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusios cheminės medžiagos, užteršto maisto nurijimas galėtų būti tinkamas poveikio būdas. Siekiant, kad stipriomis lipofilinėmis savybėmis pasižyminčių cheminių medžiagų toksiškus būtų reikiamai vertinamas, galima svarstyti galimybę, ar nereikėtų į nuosėdas įterpti pašaro prieš taikant bandomąją cheminę medžiagą. Norint atsižvelgti į visus galimus poveikio būdus pagrindinis dėmesys taikant šį bandymo metodą skiriamas ilgalaikiam poveikiui. Bandymo trukmė naudojant C. Riparius ir C. Yoshimatsui yra 20–28 dienos ir 28–65 dienos, jeigu pasirenkama C. tentans. Jeigu konkrečiam tikslui, pvz., tiriant nestabilių cheminių medžiagų poveikį, būtini trumpalaikiai duomenys, papildomus kartotinius ėminius galima paimti po dešimties parų laikotarpio. 4. Išmatuotas poveikis yra bendras išsiritusių suaugusiųjų skaičius ir išsiritimo trukmė. Rekomenduojama, kad lervų išgyvenimo ir augimo rodikliai būtų matuojami tik po dešimties parų laikotarpio, jeigu būtini papildomi trumpalaikiai duomenys ir jeigu reikia naudoti papildomus pakartotinius ėminius. 5. Rekomenduojama naudoti sintetines nuosėdas. Sintetinės nuosėdos keliais atžvilgiais yra tinkamesnės negu natūralios nuosėdos: — kintamumas darant bandymą yra sumažinamas, nes kintamumas sudaro atkuriamą „standartinę matricą“ ir nėra būtina nustatyti neužterštą ir švarų nuosėdų šaltinį, — bandymus galima pradėti bet kuriuo metu ir nepaisyti bandomųjų nuosėdų sezoninio kintamumo bei šiuo atveju nebūtina iš anksto apdoroti nuosėdų, kad iš jų būtų pašalinta būdingoji fauna; naudojant sintetines nuosėdas taip pat sumažinamos išlaidos, išleidžiamos lauke renkant įprastiems bandymams reikalingą nuosėdų kiekį, — naudojant sintetines nuosėdas galima lyginti toksiškumą ir atitinkamai klasifikuoti chemines medžiagas: toksiškumo bandymų, kuriems naudotos natūralios ir dirbtinės nuosėdos, duomenys buvo lyginami atsižvelgiant į kelias chemines medžiagas (2). 6. Taikomų sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje. BANDYMO METODO ESMĖ 7. Pirmos stadijos chironomidų lervos veikiamos tam tikros koncentracijos bandomąja chemine medžiaga nuosėdų-vandens sistemose. Pradėjus bandymą viena pirmosios stadijos lerva įdedama į bandymo stiklinę, kurioje yra nuosėdų–vandens sistema ir į kurios vandenį vėliau įleidžiama bandomosios cheminės medžiagos. Bandymo pabaigoje matuojama chironomidų išsinėrimo ir augimo sparta. Taip pat galima matuoti lervų išgyvenimą ir masę po 10 parų, jeigu reikia (naudojant kartotinius ėminius, kai būtina). Šie duomenys analizuojami taikant regresijos modelį ir siekiant įvertinti koncentraciją, kuri būtų x % sumažinusi lervų išsinėrimą, arba lervų išgyvenimą ar augimą (pvz., EC15, EC50 ir t. t.) arba hipotezę tikrinant statistiniais kriterijais siekiant nustatyti NOEC/LOEC (stebimo poveikio nedarančią koncentraciją ir (arba) mažiausią stebimo poveikio koncentraciją). Pastaruoju atveju pasitelkus statistinius kriterijus poveikio vertes būtina lyginti su kontrolinėmis vertėmis. INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ 8. Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje, jos garų slėgis, išmatuotas ar apskaičiuotas nuosėdų susidarymas ir stabilumas vandenyje bei nuosėdose. Turėtų būti prieinamas analizės metodas kiekybiniam bandomosios cheminės medžiagos kiekiui nustatyti paviršiniame vandenyje, porų vandenyje ir nuosėdose su žinomu ir praneštu tikslumu bei aptikimo riba. Naudinga informacija laikytina bandomosios cheminės medžiagos struktūrinė formulė ir grynumas. Bandomosios cheminės medžiagos cheminis išliekamumas (pvz., išsklaidymas, abiotinis ir biotinis suirimas ir t. t.) taip pat laikytinas naudinga informacija. Išsamios bandomųjų cheminių medžiagų, su kurioms dėl jų fizinių ir cheminių savybių sunku daryti bandymą, gairės pateiktos (12). ETALONINĖS CHEMINĖS MEDŽIAGOS 9. Bandymus su etaloninėmis cheminėmis medžiagomis galima atlikti periodiškai ir juos darant būtų užtikrinama, kad bandymo protokolas ir bandymo sąlygos būtų patikimos. Etaloninės toksiškos medžiagos, tinkamos naudoti atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymus ir patvirtinimo tyrimus: lindanas, trifluralinas, pentachlorfenolis, kadmio chloridas ir kalio chloridas (1) (2) (5) (6) (13). BANDYMO VALIDUMAS 10. Bandymas laikomas validuotu, jeigu taikomos šios sąlygos: — lervų išsinėrimas kontroliniuose ėminiuose bandymo pabaigoje turi būti ne mažesnis negu 70 %; (1) (6), — C. riparius ir C. yoshimatsui iš kontrolinių indų suaugėliais turėtų tapti 12–23 dienomis po lervų įleidimo į indus; C. tentans, šis laikotarpis turi būti 20–65 dienos, — bandymo pabaigoje pH vertė ir ištirpusio deguonies koncentracija turėtų būti matuojama kiekviename inde; deguonies koncentracijos vertė esant naudojamai temperatūrai turėtų būti bent 60 % soties ore vertės ir paviršinio vandens pH vertė visuose bandymo induose turėtų atitikti 6–9 intervalą, — vandens temperatūra neturėtų skirtis daugiau negu ± 1,0 °C. Vandens temperatūrą galima reguliuoti naudojant izoterminę patalpą ir šiuo atveju patalpos temperatūra turėtų būti patvirtinama atitinkamais laiko intervalais. BANDYMO METODO APRAŠYMAS Bandymo indai 11. Tyrimas atliekamas naudojant 600 ml laboratorines stiklines (skersmuo 8 cm). Leidžiama rinktis kitus indus, tačiau juos naudojant turėtų būti užtikrinamas tinkamas paviršinio vandens ir nuosėdų storis. Nuosėdų paviršiaus plotas turėtų būti toks, kad vienai lervai tektų 2–3 cm2. Nuosėdų storio ir paviršinio vandens sluoksnio storio santykis turėtų būti 1:4. Bandymo indai ir kiti įrenginiai, kurie liesis su bandymo sistema, turėtų būti vien iš stiklo ar kitos cheminiu atžvilgiu neutralios medžiagos (pvz., teflono). Rūšių pasirinkimas 12. Renkantis atliekant bandymą naudojamą rūšį pirmenybė teikiama Chironomus riparius. Taip pat leidžiama naudoti Chironomus tentans, tačiau juos sunkiau prižiūrėti ir jiems būtinas ilgesnis bandymo laikotarpis. Be to, leidžiama naudoti Chironomus yohimatsui. Su Chironomus riparius susiję kultūrų auginimo metodai aprašyti 2 priedėlyje. Taip pat pateikiama informacija apie kitų rūšių, t. y. Chironomus tentans (4) ir Chironomus yoshimatsui (11), kultūrų auginimo sąlygos. Rūšies tapatybės nustatymas turi būti patvirtinamas prieš bandymą, tačiau patvirtinimas nėra būtinas prieš kiekvieną bandymą, jeigu organizmas paimtas iš vietoje išaugintos kultūros. Nuosėdos 13. Pirmenybė teikiama pasiruoštoms nuosėdoms (jos dar vadinamos pertvarkytomis, dirbtinėmis ar sintetinėmis nuosėdomis). Tačiau jeigu naudojamos natūralios nuosėdos, turėtų būti nurodomos jų charakteristikos (bent pH, organinės anglies kiekis, kitų parametrų apibrėžtis, pvz., C/N santykis, ir taip pat rekomenduojama pateikti granuliometrinę sudėtį) ir nuosėdose neturi būti jokių teršalų ir kitų organizmų, kurie galėtų konkuruoti su chironomidais ar juos vartoti. Taip pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuosėdas naudoti toksiškumo bandymui su chironomidais, natūralios nuosėdos kondicionuojamos septynias dienas tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui. Atliekant šį bandymą (1) (15) (16) rekomenduojama naudoti iš dirbtinio dirvožemio, kuris naudojamas taikant bandymo metodą C.8 (14), pasiruoštas sintetines nuosėdas: a) 4–5 % durpių (sausoji masė): pH vertė kiek įmanoma turi būti 5,5–6,0; privaloma naudoti smulkiai sumaltus (dalelių dydis ≤ 1 mm) durpių miltelius; jos turi būti džiovintos tik ore; b) 20 % (sausoji masė) kaolino molio (pageidautina, kad kaolinito jame būtų daugiau kaip 30 %); c) 75–76 % (sausoji masė) kvarcinio smėlio (smulkusis smėlis turėtų sudaryti didžiausią dalį, daugiau negu 50 % dalelių dydis 50–200 μm); d) įpilama dejonizuoto vandens, kad galutiniame mišinyje drėgnumas sudarytų 30–50 %; e) įdedama chemijos požiūriu gryno kalcio karbonato (CaCO3), kad galutinio nuosėdų mišinio pH vertė būtų 7,0 ± 0,5; f) galutinio mišinio sudėtyje turėtų būti be 2 % (± 0,5 %) organinės anglies ir jos kiekis turi būti koreguojamas atitinkamais durpių ir smėlio kiekiais atsižvelgiant į a–c. 14. Turėtų būti žinomas durpių, kaolino molio ir smėlio gavimo šaltinis. Nuosėdų sudedamosios dalys turėtų būti patikrinamos, ar jose nėra cheminės taršos pėdsakų (pvz., sunkiųjų metalų, chlororganinių komponentų, fosfororganinių komponentų ir t. t.). Sintetinių nuosėdų pasiruošimo pavyzdys aprašytas 3 priedėlyje. Taip pat leidžiama maišyti sausąsias sudedamąsias dalis, jeigu įmanoma įrodyti, kad užpylus paviršinio vandens nėra atskiriamos nuosėdų sudedamosios dalys (pvz., neima plūduriuoti kietosios durpių dalelės) ir kad durpės ar nuosėdos yra kondicionuotos pagal reikalavimus. Vanduo 15. Kaip bandymo vandenį leidžiama rinktis bet kokį vandenį, atitinkantį 2 ir 4 priedėliuose išvardytas skiedimui tinkamo vandens chemines savybes. Bet kokį tinkamą vandenį, natūralų vandenį (paviršinį ar gruntinį), regeneruotą vandenį (žr. 2 priedėlį) arba vandentiekio vandenį, iš kurio pašalintas chloras, leidžiama rinktis kaip kultūros auginimo vandenį ir bandymo vandenį, jeigu chironomidai jame be streso požymių išgyvena kultūros veisimo ir bandymo laikotarpiu. Bandymo vandens pH vertė pradedant bandymą turėtų būti 6–9, o bendrasis kietumas ne didesnis negu 400 mg/l kaip CaCO3. Tačiau jeigu galima daryti prielaidą, kad vandens kietumo jonai gali sąveikauti su bandomąja chemine medžiaga, turėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4). Atliekant tyrimą turėtų būti naudojamas to paties tipo vanduo. 4 priedėlyje išvardytų vandens kokybės charakteristikų vertės turėtų būti matuojamos ne rečiau negu du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad šios charakteristikos yra gerokai pakitusios. Pradiniai tirpalai. Vanduo su įterpta bandomąja chemine medžiaga 16. Bandymo koncentracijos apskaičiuojamos remiantis vandens storymės koncentracijomis, t. y. paviršiniu nuosėdų vandeniu. Pasirinktų koncentracijų bandomieji tirpalai paprastai pasiruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradiniai tirpalai visų pirmiausiai turėtų būti ruošiami bandomąją cheminę medžiagą tirpinant bandymo terpėje. Norint pasiruošti tinkamos koncentracijos pradinio tirpalo tam tikrais atvejais gali tekti naudoti tirpiklius ar dispergatorius. Tinkami tirpikliai – acetonas, etanolis, metanolis, metoksietanolis, etilenglikolio dimetileteris, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Naudotini dispergatoriai – „Cremophor RH40“, „Tween 80“, metilceliuliozė 0,01 % ir HCO-40. Soliubilizavimo priemonės koncentracija galutinėje bandymo terpėje turėtų būti kuo mažesnė (t. y. ≤ 0,1 ml/l) ir vienoda kiekvieną kartą veikiant bandomąja chemine medžiaga. Jeigu naudojama soliubilizavimo priemonė, ji neturi daryti jokio didesnio poveikio chironomidų lervų išgyvenimui arba akivaizdaus neigiamo poveikio šioms lervoms, kaip kad nustatoma darant kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu. Tačiau turėtų būti imamasi visų priemonių, kad šios medžiagos nebūtų naudojamos. BANDYMO PLANAS 17. Sudarant bandymo planą pasirenkamos bandymo koncentracijos ir jų paskirstymas, kiekvienos koncentracijos indų skaičius ir lervų skaičius inde. Pateikiamas EC taško nustatymo, NOEC nustatymo ir ribos bandymo atlikimo aprašymas. Pirmenybė teikiama regresinei analizei, o ne hipotezės tikrinimo metodui. Regresinės analizės planas 18. Bandymui naudotos koncentracijos būtinai turi aprėpti poveikio koncentraciją (pvz., EC15, EC50) ir dominančio medžiagos poveikio koncentracijos verčių diapazoną. Apskritai tikslumo ir ypač validumo vertes, kurias naudojant galima įvertinti poveikio koncentracijas (ECx), įmanoma patikslinti, jeigu poveikio koncentracijos vertės atitinka bandymo koncentracijų intervalą. Nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai mažesnių negu mažiausioji teigiamoji koncentracija arba didesnių negu didžiausioji koncentracija verčių. Pradinis intervalo nustatymo bandymas praverčia renkantis naudotinų koncentracijų intervalą (žr. 27 pastraipą). 19. Jeigu turi būti nustatomos poveikio koncentracijos (ECx), turėtų būti atliekami bent penki bandymai naudojant kiekvieną koncentracijos vertę ir trys kartotiniai bandymai. Bet kuriuo atveju rekomenduojama naudoti pakankamą bandymo koncentracijų skaičių, kad būtų užtikrinamas reikiamas modelio įvertinimas. Koncentracijų koeficiento vertė neturėtų būti didesnė negu 2 (išimtį leidžiama taikyti tais atvejais, jeigu dozės ir reakcijos santykio kreivė turi nuolaidų statumą). Kartotinių ėminių skaičių atliekant kiekvieną apdorojimą galima mažinti, jeigu padidėja skirtingą atsaką sukeliančių bandymo koncentracijų skaičius. Didinant kartotinių ėminių skaičių arba mažinant bandymo koncentracijų intervalo ribas būtų taikomi siauresni bandymo pasikliovimo intervalai. Papildomi kartotiniai ėminiai būtini tuo atveju, jeigu būtina įvertinti 10 parų lervų išlikimą ir augimą. NOEC/LOEC įvertinimo planas 20. Jeigu turi būti vertinama LOEC arba NOEC, turėtų būti naudojamos ne mažiau negu keturių kartotinių bandymų penkios bandomosios koncentracijos ir koncentracijų koeficiento vertė neturėtų viršyti 2. Kartotinių bandymų skaičius turėtų būti pakankamas siekiant užtikrinti reikiamą statistinę galią, kad būtų aptinkamas 20 % skirtumas nuo kontrolinio 5 % reikšmingumo lygmens (p = 0,05). Nustatant vystymosi greitį paprastai naudojama dispersinė analizė (ANOVA), pvz., Dunnett bandymas ir Williams bandymas (17) (18) (19) (20). Nustatant išskridimo normą galima naudoti Cochran-Armitage, Fisher (su Bonferroni pataisa) arba Mantel-Haentzal bandymus. Ribinis bandymas 21. Ribinį bandymą galima atlikti (viena bandomoji koncentracija ir kontrolinis ėminys), jeigu darant pradinį intervalo nustatymo bandymą nebuvo nustatyta jokių poveikių. Atliekant ribinį bandymą siekiama nurodyti, kad toksinė bandomosios cheminės medžiagos vertė yra didesnė negu darant bandymą nustatyta ribinė koncentracija. Naudojant šį bandymo metodą negalima pateikti jokių pasiūlymų dėl rekomenduojamos koncentracijos; ši teisė suteikta pareigūnui. Paprastai būtini ne mažiau negu šeši pakartotiniai bandymai poveikiui bandomąja medžiaga ir kontroliniai bandymai. Turėtų būti įrodoma pakankama statistinė galia aptikti 20 % skirtumą nuo kontrolinės vertės esant 5 % reikšmingumo lygiui (p = 0,05). Jeigu atsakas nurodomas metriniais vienetais (vystymosi greitis ir masė), t-bandymas yra tinkamas statistinis metodas, jeigu duomenys atitinka šio bandymo reikalavimus (atitiktis, vienalytės dispersijos). Jeigu šių reikalavimų nesilaikoma, leidžiama naudoti nelygiavertės dispersijos t-bandymą arba ne parametrinį bandymą, pvz., Wilcoxon-Mann-Whithey bandymą. Nustatant išsinėrimo normą atliktinas Fisher bandymas. PROCEDŪRA Poveikio sąlygos Vandens–nuosėdų sistemos su įterpta bandomąja chemine medžiaga paruošimas 22. Į bandymo indus įdedami atitinkami sintetinių nuosėdų kiekiai (žr. 13–14 dalis ir 3 priedėlį), kad būtų paruoštas ne plonesnis negu 1,5 cm sluoksnis. Vandens pilama tiek, kol nusistovi 6 cm vandens storymė (žr. 15 pastraipą). Nuosėdų sluoksnio ir vandens storymės santykis neturėtų viršyti 1:4 bei nuosėdų sluoksnio storis neturėtų būti didesnis negu 3 cm. Nuosėdų–vandens sistema prieš įdedant į ją bandomuosius gyvūnus turėtų būti švelniai aeruojama septynias dienas (žr. 14 pastraipą ir 3 priedėlį). Kad į vandens storymę pilant bandymo vandenį nuosėdų sudedamosios dalys neatsiskirtų ir kietosios dalelės vėl nebūtų suspenduojamos skystyje, nuosėdas leidžiama uždengti plastiko disku, kol vanduo pilamas ant nuosėdų, ir vėliau diskas nedelsiant nuimamas. Taip pat leidžiama naudoti kitus įtaisus. 23. Bandymo indai turėtų būti uždengiami (pvz., stiklo plokštėmis) Jeigu būtina, atliekant tyrimą leidžiama įpilti vandens, kad būtų užtikrinamas pradinis vandens tūris ir kompensuojama išgaruojanti vandens dalis. Papildomai turėtų būti pilamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo siekiant užkirsti kelią, kad nesusidarytų druskos. Bandomųjų organizmų įdėjimas 24. Keturias ar penkias dienas prieš bandomuosius organizmus įdedant į bandymo indus, kiaušinėlių masė turėtų būti paimama iš sėjimo kultūrų ir sudedama į mažus indus auginimo terpėje. Leidžiama naudoti iš kamieninės kultūros gautą terpę arba šviežią pasiruoštą terpę. Jeigu naudojama pastaroji, į auginimo terpę turėtų būti įdedamas mažas kiekis pašaro, pvz., žaliųjų dumblių ir (arba) įlašinami keli lašeliai smulkiai sumaltų žuvų maisto gabalėlių suspensijos filtrato (žr. 2 priedėlį). Turėtų būti naudojamos tik neseniai padėtų kiaušinėlių masės. Paprastai lervos ima ristis po kelių dienų nuo kiaušinėlių padėjimo (Chironomus riparius 20 °C temperatūroje išsirita per 2–3 dienas, Chironomus tentans 23 °C temperatūroje išsirita per 1–4 dienas ir Chironomus yoshimatui 25 °C temperatūroje) ir lervos augdamos pereina keturias stadijas, iš kurių kiekviena trunka 4–8 dienas. Atliekant bandymą turėtų būti naudojamos pirmosios stadijos lervos (2–3 arba 1–4 dienų po išsiritimo). Mašalų stadiją įmanoma nustatyti pagal galvutės apvalkalo plotį (6). 25. Pirmos stadijos dvidešimt lervų buka pipete atsitiktinai paskirstoma kiekvienam bandymo indui, kuriame yra nuosėdų su įterpta bandomąja chemine medžiaga ir vandens. Vandens aeravimas turi būti nutraukiamas, kol lervos dedamos į bandymo indą, ir ši būsena išlaikoma dar 24 valandas po lervų įdėjimo (žr. 24 ir 32 pastraipas). Pagal taikomą bandymo planą (žr. 19 ir 20 pastraipas) kiekviena koncentracija veikiama ne mažiau negu 60 lervų, jeigu nustatomas ES taškas, arba 80 lervų, jeigu apibrėžiama NOEC. 26. Po dvidešimt keturių valandų nuo lervų įdėjimo, į paviršinio vandens storymę įleidžiama bandomoji cheminė medžiaga ir vanduo vėl imamas šiek tiek aeruoti. Maži bandomosios cheminės medžiagos tirpalų kiekiai pipete įterpiami po vandens paviršiumi. Tada paviršinis vanduo turėtų būti išmaišomas (stengiamasi nesukelti nuosėdų). Bandomosios koncentracijos 27. Intervalo nustatymo bandymas gali būti naudingas siekiant apibrėžti darant galutinį bandymą pasirinktinų koncentracijų intervalą. Šiuo tikslu naudojamos labai besiskiriančių bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų serijos. Siekiant užtikrinti galutiniam bandymui naudojamų chironomidų vienodą paviršiaus tankumą, jie veikiami kiekviena bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tol, kol įvertinamos atitinkamos bandomosios koncentracijos ir kartotiniai ėminiai nėra reikalingi. 28. Atliekant galutinį bandymą naudojamos bandomosios koncentracijos pasirenkamos atsižvelgiant į intervalo nustatymo bandymo rezultatą. Turėtų būti naudojamos ne mažiau negu penkios koncentracijos kaip aprašyta 18–20 pastraipose. Kontroliniai ėminiai 29. Kontrolinių ėminių indai be jokios bandomosios cheminės medžiagos, tačiau su nuosėdomis, turėtų būti naudojami atliekant bandymą su atitinkamu skaičiumi kartotinių ėminių (žr. 19–20 pastraipą) Jeigu taikant bandomąją cheminę medžiagą naudotas tirpiklis (žr. 16 pastraipą), turėtų būti įdedama tirpiklio kontrolinis ėminys. Bandymo sistema 30. Naudojama statinė sistema. Išskirtiniais atvejais leidžiama naudoti pusiau statines ar dinamines sistemas su trūkiuoju ar tolygiu paviršinio vandens atnaujinimu, pvz., jeigu vandens kokybės reikalavimai neatitinka taikomų bandomajam organizmui ar daro poveikį cheminei pusiausvyrai (pvz., ištirpusio deguonies lygiai pernelyg sumažėja, labai padidėja šalinimo produktų koncentracija arba iš nuosėdų ima sunktis mineralų skystis ir daro poveikį pH ir (arba) vandens kietumo vertėms. Tačiau paprastai pakanka kitų paviršinio vandens kokybės gerinimo metodų, pvz., aeracijos, ir jiems teiktina pirmenybė. Pašaras 31. Lervas būtina šert; pageidautina kiekvieną dieną ar bent tris kartus per savaitę. Per pirmąsias 10 parų jaunoms lervoms per dieną turėtų pakakti 0,25–0,5 mg (C. yoshimatui lervoms 0,35–0,5 mg) žuvų maisto (vandens suspensija arba smulkiai sumaltas maistas, pvz., Tetra-Min arba Tetra-Phyll, išsami informacija pateikta 2 priedėlyje). Senesnėms lervoms reikia šiek tiek daugiau pašaro: likusiai bandymo daliai kiekvieną dieną lervoms turėtų pakakti 0,5–1 mg. Pašaro kiekis turėtų būti mažinamas visų poveikių bandomąja chemine medžiaga atvejais ir kontroliuojamas, jeigu nustatomas grybelio atsiradimas arba jeigu aptinkama, kad gaišta kontrolinės grupės gyvūnai. Jeigu grybelio augimo nepavyksta sustabdyti, bandymas turi būti pakartotas. Jeigu bandymai atliekami su lengvai absorbuojamomis cheminėmis medžiagomis (pvz., kai Kow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuosėdomis susijusiomis cheminėmis medžiagomis, išgyvenimui ir natūraliam augimui būtiną pašaro kiekį galima įterpti į sintetines nuosėdas prieš stabilizavimo laikotarpį. Šiuo tikslu turi būti naudojamas ne žuvų maistas, o augalinis pašaras, pvz., pridedama 0,5 % (sausoji masė) smulkiai sumaltų lapų, pvz., didžiosios dilgėlės (Urtica dioeca), baltojo šilkmedžio (Morus alba), persinio dobilo (Trifolium repens), daržinio špinato (Spinacia oleracea) arba galima naudoti kitą augalinę medžiagą (Cerophyl arba alfa celiuliozę). Inkubacijos sąlygos 32. Rekomenduojama visų pirma 24 valandas po lervų įdėjimo nestipriai aeruoti bandymo indų paviršinį vandenį ir vėliau aeruojama per visą bandymo atlikimo trukmę (privaloma stebėti, ar ištirpusio deguonies koncentracijos vertė nėra mažesnė negu 60 % soties ore vertės (ASV)). Aeruojant naudojama stiklinė Pastero pipetė, pritvirtinta 2–3 cm virš nuosėdų sluoksnio (t. y. vienas ar keli burbulai per sek.). Darant bandymus su lakiosiomis cheminėmis medžiagomis galima apsispręsti ir neaeruoti nuosėdų–vandens sistemos. 33. Atliekant bandymą išlaikoma pastovi 20 °C (± 2 °C) temperatūra. Atliekant bandymą su C. tentans ir C. yoshimatui atitinkamai rekomenduojama pasirinkti 23 °C(± 2 °C) temperatūrą. Naudojamas 16 val. apšvietimo laikotarpis; šviesos intensyvumo vertės turėtų būti 500–1 000 liuksų. Poveikio trukmė 34. Poveikis prasideda lervas įdėjus į indus su bandomąją chemine medžiaga ir kontrolinių ėminių indus. Jeigu naudojami C. riparius ir C. yoshimatsui, poveikio trukmė yra 28 dienos, o kai pasirenkama C. tentans – 65 dienos. Jeigu mašalai atsiranda anksčiau, bandymą galima nutraukti ne anksčiau negu po penkių dienų atsiradus paskutiniam kontrolinės grupės suaugusiajam. STEBĖJIMAI Lervų išsinėrimas 35. Nustatoma vystymosi trukmė ir bendras visų iki galo išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius. 36. Bandymo indai turėtų būti stebimi bent tris kartus per savaitę siekiant nustatyti bet kokią neįprastą veikseną (pvz., nuosėdų susidarymą, neįprastą plūduriavimą) palyginti su kontroliniais indais. Numatomo lervų išsinėrimo laikotarpiu būtina skaičiuoti kasdieną atsirandančius mašalus. Kiekvieną dieną registruojami visi atsiradę mašalai ir nurodoma jų lytis. Nustačius tapatybę mašalai pašalinami iš indų. Turėtų būti registruojamos visos prieš užbaigiant bandymą padėtos kiaušinėlių masės ir po to pašalinamos, kad lervos pakartotinai nebūtų įdėtos į nuosėdas. Taip pat registruojamas matomų lėliukų skaičius, kurios nėra išsiritusios. Išsineriančių lervų skaičiavimo gairės pateiktos 5 priedėlyje. Augimas ir išgyvenimas 37. Jeigu privaloma pateikti duomenis apie 10 parų lervų išlikimą ir augimą, iš pradžių turi būti įtraukiami papildomi bandymo indai, kad juos būtų galima naudoti vėliau. Šių papildomų indų nuosėdos sijojamos 250 μm sietu siekiant surinkti lervas. Gaišimo kriterijai yra nejudumas ar nepakankamas atsakas į mechaninius dirgiklius. Neatsigavusios lervos taip pat turėtų būti laikomos nugaišusiomis (bandymo pradžioje nugaišusios lervos galėjo būti žuvusios nuo mikrobų). Nustatoma bandymo inde išgyvenusių lervų sausoji masė (be pelenų) ir apskaičiuojama vidutinė pavienio indo sausoji masė. Tikslinga nustatyti, kurios stadijos yra išgyvenusi lerva; šiuo tikslu galima matuoti kiekvieno individo galvos apvalkalo plotį. Analiziniai matavimai Bandomosios cheminės medžiagos koncentracija 38. Bandymo pradžioje (geriausiai būtų vieną valandą po bandomosios cheminės medžiagos įterpimo) ir jo pabaigoje rekomenduojama analizuoti bent paviršinio vandens, porų vandens ir nuosėdų ėminius esant didžiausiai koncentracijai ir mažesnei koncentracijai. Nustačius bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją gaunama informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos elgseną ir (arba) pasiskirstymą vandens–nuosėdų sistemoje. Bandymo pradžioje imant nuosėdų ėminius gali būti padarytas poveikis bandymo sistemai (pvz., pašalinamos bandomosios lervos); vadinasi, turėtų būti naudojami papildomi bandymo indai siekiant bandymo pradžioje ir jį atliekant, jeigu reikia, atlikti analizinius nustatymus (žr. 39 pastraipą). Nuosėdų matavimų gali nereikėti atlikti, jeigu bandomosios cheminės medžiagos pasiskirstymas tarp vandens ir nuosėdų buvo aiškiai apibrėžtas atlikus vandens ir (arba) nuosėdų tyrimą palyginamomis sąlygomis (pvz., nuosėdų ir vandens santykis, poveikio tipas, organinės anglies kiekis nuosėdose). 39. Jeigu atliekami tarpiniai matavimai (pvz., 7 dieną) ir jeigu analizei atlikti reikalingi dideli ėminiai, kuriuos paėmus bandymo sistemai būtų padarytas poveikis, analiziniai nustatymai turėtų būti atliekami naudojant iš panašiai apdorotų papildomų bandymo indų paimtus ėminius (įskaitant bandomųjų organizmų buvimą), tačiau biologiniam stebėjimui nenaudotų indų. 40. Siekiant izoliuoti laisvąjį vandenį rekomenduojama 30 min. taikyti centrifugavimą, pvz., 10 000 g ir 4 °C. Tačiau jeigu įrodoma, kad bandomosios cheminės medžiagos filtrai neadsorbuoja, taip pat galima rinktis filtravimą. Tam tikrais atvejais gali nebūti įmanoma analizuoti porų vandens koncentracijų, nes ėminys yra pernelyg mažas. Fiziniai ir cheminiai parametrai 41. Tinkamu būdu turėtų būti matuojama bandymo induose esančio bandymo vandens pH, ištirpusio deguonies ir temperatūros vertės (žr. 10 pastraipą). Bandymo pradžioje ir jo pabaigoje turėtų būti matuojama kontrolinių ėminių ir vieno bandymo indo kietumo ir amoniako vertės esant didžiausiai koncentracijai. DUOMENYS IR ATASKAITŲ TEIKIMAS Rezultatų apdorojimas 42. Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios cheminės medžiagos poveikį mašalų patelių ir patinėlių vystymosi greičiui ir bendram jų skaičiui, arba, jeigu atliekamas 10 parų bandymas, poveikį lervų išgyvenimui ir jų masei. Jeigu neturima duomenų apie statistiniu požiūriu skirtingą lyčių jautrumą, atliekant statistinę analizę patinėlių ir patelių rezultatus galima sujungti. Apie lyčių jautrumo skirtumus galima spręsti naudojant statistines priemones, pvz., atliekant χ2-r × 2 lentelės bandymą. Jeigu reikia, po 10 parų turi būti nustatomas lervų išgyvenimas ir vidutinė kiekvieno indo sausoji masė. 43. Paviršinio vandens koncentracijomis išreikštos poveikio koncentracijos visų pirmiausiai apskaičiuojamos remiantis bandymo pradžioje išmatuotomis koncentracijomis (žr. 38 pastraipą). 44. Norint apskaičiuoti EC50 arba bet kokio kito ECx taškinį įvertį indo statistinius duomenis leidžiama naudoti kaip patikimus kartotinius duomenis. Apskaičiuojant kiekvieno ECx pasikliovimo intervalą turėtų būti atsižvelgiama į kiekvieno indo skirtingumą arba būti įrodoma, kad šis kintamumas yra toks mažas, kad jo galima nepaisyti. Jeigu modeliui taikomas mažiausiųjų kvadratų metodas, kiekvieno indo statistikos duomenims taikoma transformacija siekiant pagerinti dispersijos vienalytiškumą. Tačiau ECx vertės turėtų būti apskaičiuojamos atsaką transformavus į pradinę vertę. 45. Jeigu taikant statistinę analizę siekiama apibrėžti NOEC/LOEC ir šiuo tikslu tikrinama hipotezė, turi būti atsižvelgiama į su indais susijusį skirtingumą, pvz., įterpiant ANOVA. Antraip jeigu susiklosto situacijos, kad įprastos ANOVA prielaidos gali būti pažeidžiamos, galima naudoti išsamesnius bandymus (21). Išsinėrimo santykis 46. Išsinėrimo santykiai yra kiekybiniai duomenys ir juos galima analizuoti atliekant Cochran-Armitage bandymą, taikomą mažėjimo tvarka, jeigu laikoma, kad dozės ir atsakos santykis būsiąs monotoniškas ir šie duomenys atitinka minėtą prielaidą. Jeigu ne, šiuo atveju leidžiama rinktis Fisher arba Mantel-Haentzal bandymą su pakoreguotomis pagal Bonferroni-Holm p vertėmis. Jeigu turima įrodymų, kad naudojant tą pačią koncentraciją kartotinių ėminių kintamumas yra didesnis negu būtų galima nustatyti atsižvelgiant į binominį skirstinį (dažnai vadinamą „pertekline dispersija“), šiuo atveju turėtų būti pasirenkamas (21) pasiūlytas išsamus Cochran-Armitage arba Fisher bandymas. 47. Viename inde išsiritusių mašalų skaičius ne nustatomas ir dalinamas iš įdėtų lervų skaičiaus na: kur: ER = išsinėrimo santykis ne = viename inde išsinėrusių mašalų skaičius na = į indą įdėtų lervų skaičius 48. Jeigu ėminiai yra dideli ir jeigu nustatoma perteklinė dispersija, šiuo atveju galima rinktis kitą alternatyvą, t. y. išsinėrimo santykį laikyti nenutrūkstamuoju atsaku ir rinktis Williamso bandymą, jeigu daroma prielaida, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir atitiksiąs šiuos ER duomenis. Jeigu monotoniškumas nėra užtikrinamas, pirmenybė teiktina Duneto bandymui. Didelio ėminio dydis šiuo atveju apibrėžiamas išsinėrusių mašalų ir neišsinėrusių mašalų skaičiumi, kuris abiem atvejais viršija penkis, atsižvelgiant į kartotinį ėminį (indą). 49. Norint taikyti ANOVA metodų vertes, ER vertės pirmiausiai turėtų būti transformuojamos naudojant arksinuso kvadratinės šaknies transformaciją arba Tukey-Freeman transformaciją siekiant gauti apytikslį įprastą skirstinį ir suvienodinti dispersijas. Leidžiama naudoti Cochran-Armitage, Fisherio (Bonferroni) arba Mantel-Haentzal bandymus, jeigu taikomi absoliutieji dažniai. Arksinuso kvadratinės šaknies transformacija taikoma pasirenkant ER vertės kvadratinės šaknies arksinusą (sin–1). 50. Išsinėrimo santykių ECx vertės apskaičiuojamos naudojant regresijos analizę (arba, pvz., probit (22), logit, Weitbull, atitinkamą komercinę programinę įrangą ir t. t.). Jeigu regresijos analizė nepavyksta (pvz., jeigu tėra mažiau negu du daliniai atsakai), naudojami kiti ne parametriniai metodai, pvz., slankiojo vidurkio metodas ar interpoliacijos metodas. Vystymosi greitis 51. Vidutinė vystymosi trukmė yra vidutinis laikotarpis nuo lervų įdėjimo (nulinė bandymo diena) ir iki eksperimentinės mašalų kohortos išsinėrimo. (Apskaičiuojant tikrąją vystymosi trukmę turėtų būti atsižvelgiama į lervų amžių, kai jos buvo įdedamos). Vystymosi greitis yra atvirkštinis dydis vystymosi trukmės atžvilgiu (vienetas: 1/diena) ir atitinka tą lervos vystymosi atkarpą, kuris vyksta per vieną dieną. Vystymosi greičiui, palyginti su šių nuosėdų toksiškumo tyrimų įvertinimu, teikiama pirmenybė, nes jo dispersija yra mažesnė, ir jis vienalytiškesnis bei glaudžiau atitinka įprastą pasiskirstymą, jeigu lyginama su vystymosi trukme. Vadinasi, leidžiama veikiau rinktis patikimą parametrinį bandymą su vystymosi greičiu negu su vystymosi trukme. Vystymosi greičio kaip nenutrūkstamo atsako ECx vertes galima įvertinti naudojant regresijos analizę (pvz., (23), (24)). 52. Atliekant šiuos statistinius tyrimus laikoma, kad tikrinimo x dieną pastebėtas mašalų skaičius išsinėrė per vidutinį laiko intervalą nuo x dienos iki x-1 dienos (l = tikrinimo intervalo trukmė (paprastai viena diena)). Vienam indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė (x) apskaičiuojama pagal šią lygtį: kur: : indui taikoma vidutinė vystymosi greičio vertė i : tikrinimo intervalo indeksas m : didžiausias tikrinimo intervalų skaičius : per tikrinimo intervalą i išsinėrusių mašalų skaičius ne : bendras eksperimento pabaigoje išsinėrusių mašalų skaičius (= ) xi : per intervalą i išsinėrusių mašalų vystymosi greitis kur: dienai : tikrinimo diena (diena po poveikio) li : tikrinimo intervalo i trukmė (dienos, paprastai 1 diena) Bandymo ataskaita 53. Į bandymo ataskaitą turi būti įtraukiama bent ši informacija: Bandomoji cheminė medžiaga: — fizinis pobūdis ir, jeigu reikia, fizinės bei cheminės savybės (tirpumas vandenyje, garų slėgis, pasiskirstymo dirvoje koeficientas (ar nuosėdose, jeigu žinomas), stabilumas vandenyje ir t. t.), — cheminės tapatybės nustatymo duomenys (bendrinis pavadinimas, cheminis pavadinimas, struktūrinė formulė, CAS numeris ir t. t.), įskaitant grynumą ir analinės metodas atliekant bandomosios cheminės medžiagos kiekybinį nustatymą. Bandomosios rūšys: — naudojami bandomieji gyvūnai: rūšis, mokslinis pavadinimas, organizmo gavimo šaltinis ir veisimo sąlygos, — informacija apie kiaušinėlių masės ir lervų tvarkymą, — gyvūnų amžius, kai jie buvo įdėti į bandymo indus. Bandymo sąlygos: — naudotos nuosėdos, t. y. natūralios ar sintetinės nuosėdos, — jei naudojamos natūralios nuosėdos, nuosėdų ėminių ėmimo vieta ir jos aprašymas, įskaitant, jeigu įmanoma, taršos aprašas; charakteristikos: pH, organinės anglies kiekis, C/N santykis ir granuliometrinė analizė (jeigu reikia), — sintetinių nuosėdų pasiruošimas: sudedamosios dalys ir charakteristikos (organinės anglies kiekis, pH, drėgmė ir t. t. bandymo pradžioje), — bandymo vandens pasiruošimas (jeigu naudojamas regeneruotas vanduo) ir charakteristikos (deguonies koncentracija, pH. Laidumas, kietumas ir t. t. bandymo pradžioje), — nuosėdų ir vandens sluoksnių storis, — paviršinio vandens ir porų vandens tūris; drėgnųjų nuosėdų masė su porų vandeniu ir be jo, — bandymo indai (medžiaga ir dydis), — pradinių tirpalų ruošimo metodai ir bandomosios koncentracijos, — bandomosios cheminės medžiagos taikymas: naudotos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos, kartotinių ėminių skaičius ir naudoti tirpikliai, jeigu buvo naudoti, — inkubacijos sąlygos: temperatūra, šviesos ciklas ir intensyvumas, aeracija (dažnumas ir intensyvumas), — išsami informacija apie pašarą, įskaitant jo tipą, paruošimą, kiekį ir maitinimo tvarką. Rezultatai: — nominaliosios bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandomosios koncentracijos ir visų analizių rezultatai siekiant bandymo inde nustatyti bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją, — vandens kokybė bandymo induose, t. y. pH, temperatūra, ištirpęs deguonis, kietumas ir amoniako kiekis, — išgaruojančio bandymo vandens papildymas, jeigu taikoma, — iš kiekvieno indo per dieną išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius, — lervų, kurios iš indo neišsinėrė kaip mašalai, skaičius, — vidutinė pavienė lervų sausoji masė inde ir tam tikros stadijos lervų sausoji masė inde, jeigu reikia, — išsinėrusių mašalų skaičius atliekant tapatų bandymą ir bandomoji koncentracija (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas), — atliekant tapatų bandymą išsinėrusių mašalų vidutinis vystymosi greitis ir apdorojimo norma (mašalų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas), — toksinio poveikio įvertinimai, pvz., ECx (ir susiję pasikliovimo intervalai), NOEC ir (arba) LOEC bei jiems nustatyti naudoti statistikos metodai, — rezultatų aptarimas, įskaitant bet kokį poveikį bandymo rezultatams, kuris būtų padarytas nukrypus nuo šio bandymo metodo. LITERATŪRA 1. BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. 2. Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. 3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. 4. ASTM International/E1706–00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. 5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. 6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. 7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. 8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. 9. Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. 10. Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. 11. Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. 12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and SAFEty Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. 13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. 14. Šio priedo C.8 skyrius. Toksiškumas sliekams. 15. Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. 16. Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. 17. Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121. 18. Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491. 19. Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117. 20. Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531. 21. Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577–585. 22. Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. 23. Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494. 24. Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. 1 priedėlis SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS Šiame metode vartojamų terminų apibrėžtys: Pasiruoštosios nuosėdos ar regeneruotos, dirbtinės arba sintetinės nuosėdos yra natūralių nuosėdų fizines sudedamąsias dalis atitinkančių medžiagų mišinys. Paviršinis vanduo – bandymo inde ant nuosėdų užpiltas vanduo. Laisvasis vanduo ar porų vanduo – ertmes tarp nuosėdų ir dirvožemio kietųjų dalelių užpildantis vanduo. Vanduo su įterpta bandomąja chemine medžiaga – bandymo vanduo, į kurias prileista bandomosios cheminės medžiagos. Bandomoji cheminė medžiaga – bet kokia naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga ar mišinys. 2 priedėlis Rekomendacijos dėl Chironomus riparius auginimo 1. Chironomus lervas galima auginti kristalizatoriuose ar didelėse talpyklose. Ant talpyklos dugno plonu sluoksniu (5–10 mm storio) paskleidžiamas smulkus kvarco smėlis. Taip pat įrodyta (pvz., Merck, Art 8117), kad diatomitas yra tinkamas substratas (pakanka plonesnio sluoksnio, vos kelių mm storio). Po to įpilamas kelių centimetrų storio vandens sluoksnis. Jeigu reikia, įpilama papildomo vandens, kad būtų atkuriamas išgaravęs kiekis ir užkertamas kelias džiuvimui. Jeigu reikia, vandenį leidžiama pakeisti. Turėtų būti užtikrinamas nuosaikus aeravimas. Lervų auginimo indai turėtų būti laikomi tinkamuose narvuose, kad išsinėrę suaugusieji vabzdžiai nepajėgtų pasprukti. Narvas turėtų būti ganėtinai erdvus, kad galėtų spiestis išsinėrę suaugusieji vabzdžiai; antraip populiacija gali nesusiformuoti (mažiausi matmenys yra 30 × 30 × 30 cm). 2. Narvai turėtų būti laikomi kambario temperatūroje arba pastovių aplinkos sąlygų patalpoje 20 ± 2 °C temperatūroje; šviesiojo laikotarpio trukmė 16 val. (šviesos intensyvumas apie 1 000 liuksų), 8 val. tamsos. Parengta ataskaitų, kuriose nurodoma, kad jeigu oro drėgnumas yra mažesnis negu 60 % RH, gali sumažėti reprodukcija). Skiedimo vanduo 3. Leidžiama naudoti bet kokį tinkamą natūralų ar sintetinį vandenį. Paprastai naudojamas šulinio vanduo, vanduo, iš kurio pašalintas chloras, ir dirbtinės terpės (pvz., Elendt „M4“ arba „M7“ priemonė, žr. toliau). Prieš naudojant vanduo turi būti aeruojamas. Jeigu būtina, kultūrų auginimo vandenį leidžiama atnaujinti pilant panaudotą vandenį iš kultūrų auginimo indų ar jį leidžiant per sifoną; būtina stengtis nepažeisti lervų vamzdžių. Lervų šėrimas 4. Chironomus lervos turėtų būti šeriamos žuvų maisto dribsniais (Tetra Min®, Tetra Phyll® arba kita panašia patentuota žuvų maisto rūšimi); vienam indui per dieną skiriama apie 250 mg pašaro. Maistą galima pateikti sausą, sumaltą milteliais arba kaip vandens suspensiją: 1,0 g maisto dribsnių įdedama į 20 ml skiedimo vandens ir išmaišoma, kol gaunamas vienalytis mišinys. Šio ruošinio apie 5 ml per dieną leidžiama įdėti į kiekvieną indą (prieš naudojant būtina pakratyti). Vyresnėms lervoms būtina duoti daugiau pašaro. 5. Šėrimas koreguojamas atsižvelgiant į vandens kokybę. Jeigu auginimo terpė „susidrumsčia“, duodamo pašaro kiekis turėtų būti sumažinamas. Duodamo pašaro kiekiai turi būti kruopščiai stebimi. Jeigu duodamas per mažas pašaro kiekis, lervos persikelia į vandens storymę, o skiriant per daug pašaro suintensyvėja mikroorganizmų veikla ir sumažėja deguonies koncentracija. Abiejų tipų sąlygomis gali sumažėti augimo greitis. 6. Ruošiant naujus kultūrų auginimo indus į juos taip pat galima šiek tiek įdėti žaliųjų dumblių (pvz., Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). Išsinėrusių suaugusiųjų mašalų šėrimas 7. Kai kurie tyrinėtojai pasiūlė, kad išsinėrusius suaugusius mašalus būtų galima šerti naudojant prisotintame sacharozė tirpale išmirkytus vilnos tamponus. Lervų išsinėrimas 8. Suaugę mašalai ima rastis iš lervų auginimo indų po 13–15 dienų 20 ± 2 °C temperatūroje. Patinėliai lengviau atpažįstami žiūrint į jų plunksniškus čiuptuvėlius. Kiaušinėlių masė 9. Kol suaugę mašalai būna veisimo narve, visi lervų auginimo indai turėtų būti tikrinami tris kartus per savaitę, ar juose nėra drebučių pavidalo kiaušinėlių masės. Jeigu randama šios kiaušinėlių masės, ji turėtų būti atsargiai pašalinta. Kiaušinėliai turėtų būti sudedami į mažą indelį su veisimo vandens ėminiu. Kiaušinėlių masė naudojama pradedant inde auginti naują kultūrą (pvz., 2–4 kiaušinėlių masė viename inde) arba atliekant toksiškumo bandymus. 10. Pirmos stadijos lervos turėtų išsiristi po 2–3 dienų. Naujų kultūrų auginimo indų ruošimas 11. Išauginus kultūras turėtų būti įmanoma kiekvieną savaitę ar rečiau paruošti naują lervų kultūros auginimo indą atsižvelgiant į bandymo atlikimo reikalavimus ir pašalinant senesnius indus, kai išsineria suaugę mašalai. Taikant šią sistemą mažomis pastangomis reguliariai tiekiami suaugę mašalai. Bandymo tirpalų „M4“ ir „M7“ ruošimas 12. Elendtas (1990) aprašė „M4“ terpę. „M7“ terpė ruošiama kaip „M4“ terpė, išskyrus 1 lentelėje išvardytas chemines medžiagas, kurių koncentracijos „M7“, palyginti su „M4“, yra keturis kartus mažesnės. Leidinys apie „M7“ terpę yra rengiamas (Elendto pateiktas pranešimas). Bandomasis tirpalas neturėtų būti ruošiamas pagal Elendtą ir Bias (1990), jeigu norima gauti NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 ir K2HPO4 koncentracijas, nes pradinių tirpalų ruošimas nėra tapati veikla. Terpės „M7“ ruošimas 13. Kiekvienas pradinis tirpalas (I) paruošiamas atskirai ir iš šių pradinių tirpalų (I) paruošiamas kombinuotasis pradinis tirpalas (II) (žr. 1 lentelę). 50 ml kombinuotojo pradinio tirpalo (II) ir 2 lentelėje nurodyti kiekvieno makroelementų pradinio tirpalo kiekiai skiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens, kad taip būtų pasiruošta „M7“ terpė. Vitaminų pradinis tirpalas pasiruošiamas į dejonizuotą vandenį įmaišius tris vitaminus kaip nurodyta 3 lentelėje ir 0,1 ml kombinuotojo vitaminų pradinio tirpalo įmaišoma į galutinę „M7“ terpę prieš pat naudojimo pradžią. (Vitaminų pradinis tirpalas laikomas sušaldytas mažomis alikvotinėmis dalimis). Terpė aeruojama ir stabilizuojama. 1 lentelė M4 ir M7 terpei skirtų mikroelementų pradiniai tirpalai Pradiniai tirpalai (I) Kiekis (mg), praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens Ruošiant kombinuotą pradinį tirpalą (II): maišomi nurodyti pradinių tirpalų (I) kiekiai (mg) ir praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto vandens Galutinės bandomųjų tirpalų koncentracijos (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (18) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 • 4 H2O (18) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (18) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (18) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 • 6 H2O (18) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (18) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 • 2 H2O (18) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 • 2 H2O (18) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 • 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA • 2 H2O (18) (19) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 • 7 H2O (18) (19) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249 2 lentelė M4 ir M7 terpėms skirti makroelementų pradiniai tirpalai Kiekis praskiedžiamas iki 1 litro dejonizuoto vandens (mg) Ruošiant M4 ir M7 terpę įdedamas makroelementų pradinių tirpalų kiekis (ml/l) Galutinės bandomųjų tirpalų M4 ir M7 koncentracijos (mg/l) CaCl2 • 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 • 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 • 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184 3 lentelė M4 ir M7 terpei skirtas vitaminų pradinis tirpalas Visi trys vitaminų ti