1992 m. lapkričio 9 d. Komisijos direktyva 92/95/EEB, iš dalies keičianti Septintosios direktyvos 76/372/EEB, nustatančios oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus, priedą



Oficialusis leidinys L 327 , 13/11/1992 p. 0054 - 0062

specialusis leidimas suomių kalba: skyrius 3 tomas 45 p. 0182

specialusis leidimas švedų kalba: skyrius 3 tomas 45 p. 0182

CS.ES skyrius 3 tomas 46 p. 3 - 11

ET.ES skyrius 3 tomas 46 p. 3 - 11

HU.ES skyrius 3 tomas 46 p. 3 - 11

LT.ES skyrius 3 tomas 46 p. 3 - 11

LV.ES skyrius 3 tomas 46 p. 3 - 11

MT.ES skyrius 3 tomas 46 p. 3 - 11

PL.ES skyrius 3 tomas 46 p. 3 - 11

SK.ES skyrius 3 tomas 46 p. 3 - 11

SL.ES skyrius 3 tomas 46 p. 3 - 11



Komisijos direktyva 92/95/EEB 1992 m. lapkričio 9 d. iš dalies keičianti Septintosios direktyvos 76/372/EEB, nustatančios oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus, priedą EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, atsižvelgdama į Europos ekonominės bendrijos steigimo sutartį, atsižvelgdama į 1970 m. liepos 20 d. Tarybos direktyvą 70/373/EEB dėl Bendrijos mėginių paėmimo ir analizės metodų, taikomų valstybinei pašarų kontrolei, įvedimo [1] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Ispanijos ir Portugalijos Stojimo aktais, ypač į jos 2 straipsnį, kadangi 1976 m. kovo 1 d. Septintoji Komisijos direktyva 76/372/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus [2], su pakeitimais, padarytais Direktyva 81/680/EEB [3], nurodo metodus, naudotinus nustatant aflatoksiną B1; kadangi, atsižvelgiant į mokslo ir technikos žinių pažangą, šių metodų taikymas yra pagrįstas; kadangi ypač patartina turėti metodą, kuriuo būtų įmanoma kontroliuoti labai mažas aflatoksino ribas, nustatytas 1973 m. gruodžio 17 d. Tarybos direktyva 74/63/EEB dėl nepageidaujamų medžiagų ir produktų didžiausių leistinų kiekių pašaruose nustatymo [4] su paskutiniais pakeitimas, padarytais Direktyva 91/132/EEB [5]; kadangi dar patartina turėti metodą, kuriuo būtų įmanoma nustatyti aflatoksiną B1, kai yra trukdančių medžiagų, pvz., citrusų išspaudose; kadangi šioje direktyvoje numatytos priemonės atitinka Pašarų nuolatinio komiteto nuomonę, PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ: 1 straipsnis Direktyvos 76/372/EEB priedas iš dalies keičiamas šios direktyvos priedu. 2 straipsnis Valstybės narės ne vėliau kaip iki 1993 m. spalio 1 d. priima įstatymus ir kitus teisės aktus, būtinus, kad būtų laikomasi šios direktyvos. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai. Valstybės narės, tvirtindamos šias priemones, daro jose nuorodą į šią direktyvą arba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nustato valstybės narės. 3 straipsnis Ši direktyva skirta valstybėms narėms. Priimta Briuselyje, 1992 m. lapkričio 9 d. Komisijos vardu Ray Mac Sharry Komisijos narys [1] OL L 170, 1970 3 8, p. 2. [2] OL L 102, 1976 4 15, p. 8. [3] OL L 246, 1981 8 29, p. 32. [4] OL L 38, 1974 2 11, p. 31. [5] OL L 66, 1991 3 13, p. 16. -------------------------------------------------- PRIEDAS I. A dalies "Vienmatės plonasluoksnės chromatografijos metodas" 1 punkto "Tikslas ir taikymo sritis" tekstas keičiamas šiuo tekstu: "1. Tikslas ir taikymo sritis Šiuo metodu nustatomas aflatoksino B1 kiekis žaliavose ir paprastuosiuose pašaruose. Šio metodo negalima taikyti, kai yra citrusų išspaudų. Apatinė nustatymo riba yra 0,01 mg/kg (10 ppb). Jei yra trukdančių medžiagų, analizę būtina pakartoti, taikant B metodą (efektyviąją skysčių chromatografiją)." II. B dalies "Dvimatės plonasluoksnės chromatografijos metodas" tekstas keičiamas taip: "B. AFLATOKSINO B1 NUSTATYMAS. EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAS 1. Tikslas ir taikymo sritis Šiuo metodu nustatomas aflatoksino B1 kiekis gyvūnų pašaruose, įskaitant pašarus, turinčius citrusų išspaudų. Apatinė nustatymo riba yra 0,001 mg/kg (1 ppb). 2. Metodo esmė Ėminys ekstrahuojamas chloroformu. Ekstraktas filtruojamas ir alikvotinė filtrato dalis gryninama, naudojant Florisil kasetę ir vėliau C18 kasetę. Galutinis atskyrimas ir nustatymas atliekamas efektyviosios skysčių chromatografijos (HPLC) metodu, naudojant atvirkštinių fazių C18 kolonėlę, iš kurios išleidžiamas tirpalas veikiamas jodo vandeniniu tirpalu jodo dariniui gauti ir jo fluorescencinei analizei atlikti. Pastaba. Mikotoksinai yra labai toksiškos medžiagos. Veiksmai su jomis turėtų būti atliekami tam skirtoje traukos spintoje. Dėl toksinų elektrostatinės prigimties, taigi dėl jų polinkio disperguotis darbo aplinkoje, reikėtų imtis specialių atsargumo priemonių, kai jie yra sausu pavidalu. 3. Reagentai 3.1. Chloroformas, stabilizuotas 0,5–1,0 % masės etanolio tirpalu. Žr. 10.2. 3.2. HPLC grynumo metanolis, skirtas ruošti 3.6. 3.3. Acetonas. 3.4. HPLC grynumo acetonitrilas. 3.5. Eliuentai: reikia ruošti dieną iki naudojimo arba ultragarsu šalinti iš jų orą. 3.5.1. Acetono (3.3) ir vandens mišinys, 98 + 2 (V + V). 3.5.2. Vandens ir metanolio (3.2) mišinys, 80 + 20 (V + V). 3.5.3. Vandens ir acetono (3.3) mišinys, 85 + 15 (V + V). 3.6. HPLC judančioji fazė: Vandens, metanolio (3.2) ir acetonitrilo (3.4) mišinys, 130 + 70 + 40 (V + V + V). N.B. Judančiosios fazės tirpiklių sudėtį gali tekti keisti, atsižvelgiant į naudojamos HPLC kolonėlės charakteristikas. 3.7. Sotusis jodo tirpalas: į 400 ml vandens įdedama 2 g jodo. Maišoma mažiausiai 90 min ir filtruojama per membraninį filtrą (4.15). Sotųjį tirpalą reikia saugoti nuo šviesos, kad nevyktų fotoskaidymas. 3.8. Rūgštimi plautas Celite 545 arba jo atitikmuo. 3.9. Florisil kasetė (Waters SEP-PAK) arba jos atitikmuo. 3.10. C18 kasetė (Waters SEP-PAK) arba jos atitikmuo. 3.11. Inertinės dujos, pvz., azotas. 3.12. Etaloninis 10 μg/ml koncentracijos aflatoksino B1 tirpalas chloroforme. Tirpalo koncentracija tikrinama taip: spektrofotometru matuojamas tirpalo sugerties spektras 330–370 nm bangų ilgių srityje (4.23). Optinis tankis (A) matuojamas arti didžiausios sugerties bangos ilgio — 363 nm. Aflatoksino B1 koncentracija mikrogramais viename tirpalo ml apskaičiuojama pagal formulę: Koncentracija (μg/ml) = = 13,991 × A 3.12.1. Aflatoksino B1 pradinis etaloninis tirpalas chloroforme. 2,5 ml aflatoksino B1 etaloninio tirpalo (3.12) kiekybiškai įpilama į 50 ml matavimo kolbą ir skiedžiama iki žymės chloroformu (3.1). Šis tirpalas laikomas vėsioje vietoje (4 °C) tamsoje, sandariai uždarytas ir įvyniotas į aliuminio foliją. 3.13. Aflatoksino B1 HPLC kalibravimo tirpalai. N.B. Šiems tirpalams ruošti naudojami rūgštimi išplauti stikliniai indai (žr. 4 skyrių "Aparatūra"). 3.13.1. Kalibravimo tirpalas, 4 ng/ml. Į aliuminio foliją įvyniota matavimo kolba su pradiniu etaloniniu tirpalu (3.12.1) paliekama sušilti iki kambario temperatūros (keletą valandų). 400 μl pradinio etaloninio tirpalo (200 ng aflatoksino B1) įpilama į 50 ml matavimo kolbą ir tirpalas išgarinamas iki sauso likučio inertinių dujų (3.11) srovėje. Gautas likutis ištirpinamas maždaug 20 ml vandens/acetono mišinyje (3.5.3), skiedžiama iki žymės vandens/acetono mišiniu (3.5.3) ir gerai sumaišoma. 3.13.2. Kalibravimo tirpalas, 3 ng/ml. 7,5 ml kalibravimo tirpalo (3.13.1) kiekybiškai įpilama į 10 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės vandens/acetono mišiniu (3.5.3) ir gerai sumaišoma. 3.13.3. Kalibravimo tirpalas, 2 ng/ml. 25 ml kalibravimo tirpalo (3.13.1) įpilama į 50 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės vandens/acetono mišiniu (3.5.3) ir gerai sumaišoma. Be to, šis tirpalas vadinamas pamatiniu etalonu, skirtas kartotiniam įpurškimui, kai atliekama HPLC analizė (5.5). 3.13.4. Kalibravimo tirpalas, 1 ng/ml. 2,5 ml kalibravimo tirpalo (3.13.1) įpilama į 10 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės vandens/acetono mišiniu (3.5.3) ir gerai sumaišoma. 3.14. Ampulė su aflatoksinų B1, B2, G1 ir G2 mišiniu 1 ml chloroformo, kurių koncentracija yra maždaug 1, 0,5, 1 ir 0,5 μg/ml. 3.14.1. Chromatografinio atskyrimo tikrinimo tirpalas. Ampulės (3.14) turinys supilamas į mėgintuvėlį su šlifo kamščiu arba į užsukamu kamščiu uždaromą buteliuką. 40 μl šio tirpalo įpilama į mėgintuvėlį su šlifo kamščiu (išplautą rūgštimi) (4.22). Chloroformas išgarinamas inertinių dujų srovėje (3.11) ir vėl ištirpinamas 10 ml vandens/acetono mišinio (3.5.3). 3.15. Reagentai patvirtinančiajam tyrimui (6). 3.15.1. Sotusis natrio chlorido tirpalas. 3.15.2. Natrio sulfatas, bevandenis, granuliuotas. 4. Aparatūra Įspėjimas: vandeniniams aflatoksino tirpalams naudojant rūgštimi neišplautus stiklinius indus galima patirti nuostolių. Ypač atsargiai reikėtų elgtis su naujais stikliniais indais ir vienkartiniais stikliniais indais, pvz., automatinių ėmiklių buteliukais ir Pasteur pipetėmis. Todėl laboratoriniai stikliniai indai, kurie liečiasi su vandeniniais aflatoksinų tirpalais kelias valandas turėtų būti laikomi praskiestoje rūgštyje (pvz., 2 mol/l sieros rūgštyje), vėliau gerai išplaunami distiliuotu vandeniu, kad neliktų jokių rūgšties pėdsakų (pvz., tris kartus, tikrinama naudojant pH indikatorinį popierių). Praktiškai toks apdorojimas yra būtinas apvaliadugnėms kolboms (4.4), matavimo kolboms, matavimo cilindrams, buteliukams arba mėgintuvėliams, naudojamiems kalibravimo tirpalams arba gautiems ekstraktams (ypač automatinių ėmiklių buteliukams) ir Pasteur pipetėms, jei šie indai naudojami kalibravimo tirpalams arba ekstraktams įpilti. 4.1. Laboratorinis malūnas. 4.2. Sietas, kurio akučių dydis 1,0 mm (ISO R 565). 4.3. Mechaninė purtyklė. 4.4. Sukamasis vakuuminis garintuvas ir 150–250 ml apvaliadugnė kolba. 4.5. Chromatografas efektyviajai skysčių chromatografijai, inžektorius su kilpa, kuriuo galima įpurkšti 250 μl. Kaip iš dalies arba visiškai užpildyti kilpą, žr. gamintojų instrukcijas. 4.6. HPLC analizės kolonėlė: 3 μm arba 5 μm C18 užpildas. 4.7. Nepulsuojantis siurblys jodo reagentui į tirpalą po kolonėlės tiekti. 4.8. Nulinio neveikiojo tūrio Valco trišakis iš nerūdijančiojo plieno (1/16” × 0,75 mm). 4.9. Reakcijos kapiliarinis gyvatukas iš teflono arba iš nerūdijančiojo plieno. Nustatyta, kad 5 μm arba 3 μm HPLC kolonėlėms tinka gyvatuko matmenys 3000 × 0,5 mm — 5000 × 0,5 mm. 4.10. Reguliuojamos temperatūros vandens vonia, nustatyta 60 °C, kurios temperatūrą būtų galima reguliuoti tiksliau kaip 0,1 °C. 4.11. Fluorescencinis detektorius, kurio sužadinimo bangos ilgis 365 nm, emisijos — 435 nm. (aparatams su filtru: emisijos bangos ilgis > 400 nm). Apatinė radimo riba — bent 0,05 ng aflatoksino B1. Rekomenduojama detektoriaus išėjime sukurti nedidelį priešslėgį (pvz., naudojant slėgio ribotuvą, gyvatuką iš teflono arba nerūdijančiojo plieno), kad būtų galima slopinti oro burbuliukų susidarymą matavimo kameroje. 4.12. Savirašis. 4.13. Elektroninis integratorius (neprivalomas). 4.14. Rievėtas filtravimo popierius: 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 arba atitikmuo. 4.15. Membraninis filtras, porų dydis 0,45 μm, Millipore HAWP 04700 arba atitikmuo. 4.16. 500 ml kūginė kolba su šlifo kamščiu. 4.17. Stiklo kolonėlė (vidinis skersmuo maždaug 1 cm, ilgis maždaug 30 cm), su Luer antgaliu. 4.18. Chloroformui atsparus Luer čiaupas (pvz., Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 arba atitikmuo). 4.19. Chemiškai atsparus 10 ml švirkštas su Luer antgaliu. 4.20. Švirkštas 250 μl įpurkšti, vykdant HPLC analizę (žr. 4.5). 4.21. 100 μl mikrošvirkštas kalibravimo tirpalams ruošti (svėrimo būdu tikrinama, ar jo tikslumas lygus 2 %). 4.22. 10 ml kalibravimo tirpalų mėgintuvėliai su šlifo kamščiu. 4.23. Spektrofotometras, tinkamas matuoti spektro UV srityje. 4.24. Patvirtinamojo tyrimo įranga (6). 4.24.1. Rūgštimi išplautas 100 ml dalijamasis piltuvas su čiaupu iš teflono. 4.24.2. Kaitinimo blokas, 40–50 °C. 5. Darbo eiga 5.1. Ėminio ruošimas Ėminys malamas, kad jį būtų galima nusijoti per sietą (4.2). 5.2. Mėginys Pasveriama 50 g paruošto ėminio ir supilama į kūginę kolbą (4.16). 5.3. Ekstrahavimas Į mėginį įpilama 25 g Celite (3.8), 250 ml chloroformo (3.1) ir 25 ml vandens (5.2). Kolba užkemšama ir 30 min purtoma mechanine purtykle (4.3). Filtruojama per rievėtą filtravimo popierių (4.14). Surenkama 50 ml filtrato. Prireikus imama alikvotinė dalis filtrato ir chloroformu skiedžiama iki 50 ml, kad aflatoksino B1 koncentracija būtų ne didesnė kaip 4 ng/ml. 5.4. Gryninimas (procedūra turi būti atliekama be ilgesnių pertraukų). Įspėjimas: - bandymų laboratorija turi būti tinkamai apsaugota nuo dienos šviesos. Efektyviai tai galima pasiekti taip: i) UV spindulius sugerianti folija ant langų, derinant su šviesos slopinimu (neturi būti tiesioginės saulės šviesos); ii) užuolaidos arba žaliuzės ir dirbtinis apšvietimas (tinka fluorescencinė lempa); - aflatoksino turintys tirpalai turi būti kiek įmanoma apsaugoti nuo šviesos (laikomi tamsoje, naudojama aliuminio foliją). 5.4.1. Florisil SEP-PAK gryninimas 5.4.1.1. Kolonėlės ir kasetės sąrankos ruošimas Prie trumpesnio Florisil kasetės galo (3.9) prijungiamas čiaupas (4.18) (žr. 1 paveikslą). Kasetė išplaunama ir pašalinamas oras, švirkštu (4.19) paimant 10 ml chloroformo (3.1), kurio 8 ml čiaupu greitai leidžiami per kasetę. Ilgesnis kasetės galas jungiamas prie stiklinės kolonėlės (4.17) ir likę 2 ml chloroformo per kasetę leidžiami į kolonėlę. Čiaupas uždaromas. Švirkštas išimamas. 5.4.1.2. Gryninimas Pagal 5.3 surinktas filtratas supilamas į kolonėlės ir kasetės sąranką, iš kurios jis išteka, veikiamas sunkio jėgos. Plaunama 5 ml chloroformo (3.1), vėliau — 20 ml metanolio (3.2). Eliuatai išpilami. Atliekant šiuos veiksmus reikia užtikrinti, kad kolonėlės ir kasetės sąranka neliktų sausa. Aflatoksinas B1 išplaunamas 40 ml acetono ir vandens mišinio (3.5.1) ir visas eliuatas surenkamas į sukamojo garintuvo apvaliadugnę kolbą (4.4). Esant 40–50 °C, eliuatas koncentruojamas sukamajame garintuve tol, kol baigiamas distiliuoti acetonas. (N.B. Tuo momentu kolboje lieka maždaug 0,5 ml skysčio. Bandymai parodė, kad tolesnis garinimas nekenkia ir kad 0,5 ml skysčio likutyje acetono nėra daug. Dėl acetono likučio galimi aflatoksino B1 nuostoliai C18 kasetėje). Įpilama 1 ml metanolio (3.2), kolba sukiojama, kad ištirptų ant kolbos sienelių esantis aflatoksinas B1, įpilama 4 ml vandens ir sumaišoma. Kasetė atjungiama ir išmetama. Stiklinė kolonėlė skalaujama vandeniu ir paliekama C18 gryninimo pakopai. 5.4.2. C18SEP-PAK gryninimas 5.4.2.1. Kolonėlės ir kasetės sąrankos ruošimas Čiaupas (4.18) jungiamas prie trumpesnio C18 kasetės galo (3.10) (žr. 1 pav). Kasetė užpildoma ir visas oras pašalinamas, naudojant švirkštą (4.19), iš kurio per čiaupą į kasetę greitai įleidžiama 10 ml metanolio (3.2) (oro burbuliukai kasetėje matomi kaip šviesios dėmelės pilkame fone). Imama 10 ml vandens ir 8 ml leidžiama per kasetę (reikia stengtis, kad į kasetę nepatektų oro, kai metanolis keičiamas vandeniu). Ilgesnis kasetės galas jungiamas prie stiklinės kolonėlės (4.17) ir likę 2 ml vandens leidžiami per kasetę, prijungtą prie kolonėlės. Čiaupas uždaromas. Švirkštas išimamas. 5.4.2.2. Gryninimas Surinktas ekstraktas (5.4.1.2) kiekybiškai supilamas į stiklinę kolonėlę (4.17), kolba du kartus skalaujama 5 ml vandens/metanolio mišinio (3.5.2), ir ekstraktas išteka, veikiamas sunkio jėgos. Atliekant šiuos veiksmus reikia užtikrinti, kad kolonėlės ir kasetės sąranka neveiktų sausa. (Kai susiaurėjime prie kasetės susidaro oro burbuliukai, jiems pašalinti reikia sustabdyti srautą ir patapšnoti per stiklinės kolonėlės viršų. Tęsiama toliau). Plaunama 25 ml vandens/metanolio tirpalu. Eliuatas išpilamas. Aflatoksinas B1 išplaunamas 50 ml vandens/acetono mišinio (3.5.3) ir visas eliuatas surenkamas į 50 ml matavimo kolbą. Skiedžiama vandeniu iki žymės ir sumaišoma: gautas tirpalas naudojamas chromatografijai (5.5). Įspėjimas. Paprastai prieš atliekant HPLC galutinį ekstraktą filtruoti nebūtina. Jei manoma, kad filtravimas reikalaingas, celiuliozės filtrai neturi būti naudojami, kadangi gali būti aflatoksino B1 nuostolių. Galima naudoti teflono filtrus. 5.5. Efektyvioji skysčių chromatografija (HPLC) (Apie įrangos surinkimą žr. 2 paveikslą). Reikia skirti pakankamai laiko prietaisams kondicionuoti ir stabilizuoti. 1 pastaba. Nurodyti judančiosios fazės ir po kolonėlės naudojamo reagento srautai yra tik orientaciniai. Juos reikia reguliuoti, atsižvelgiant į HPLC kolonėlės charakteristikas. 2 pastaba. Detektoriaus atsakas į aflatoksiną B1 priklauso nuo temperatūros, todėl būtina kompensuoti slinkį (dreifą) (žr. 3 pav). Reguliariais tarpais (pvz. kas trečią įpuškimą) įpurškiant nustatytą aflatoksino B1 pamatinio etalono (3.13.3) kiekį, pagal vidutinį jo atsaką galima daryti aflatoksino B1 smailės, esančios tarp šių pamatinių etalonų, vertės pataisą, jei gretimų pamatinių etalonų atsako skirtumas nėra didelis. Todėl įpurkšti reikia nepertraukiamai. Jei būtina nutraukti, paskutinį kartą prieš nutraukimą ir pirmą kartą po nutraukimo įpurškiama pamatinio etalono. Kadangi kalibravimo kreivė yra tiesinė ir eina per koordinačių pradžią, aflatoksino B1 kiekiai mėginio ekstraktuose nustatomi tiesiogiai pagal gretimus etalonus. 5.5.1. HPLC siurblio parametrai Naudojant judančiąją fazę (3.6), HPLC siurblys (4.5) nustatomas taip, kad srautas būtų 0,5 arba 0,3 ml/min atitinkamai 5 μm arba 3 μm HPLC kolonėlei (4.6). 5.5.2. Po kolonėlės naudojamo reagento siurblio parametrai Siurblys (4.7) nustatomas taip, kad sočiojo vandeninio jodo tirpalo (3.7) srautas būtų 0,2–0,4 ml/min. Apytikriai nurodymai: patartina maždaug 0,4 arba 0,2 ml/min srautus derinti atitinkamai su judančiosios fazės (3.6) 0,5 ir 0,3 ml/min srautais. 5.5.3. Fluorescencinis detektorius Fluorescencinis detektorius (4.11) nustatomas taip, kad sužadinimas vyktų esant 365 nm, o emisija — 435 nm (prietaisas su filtru: > 400 nm). Detektoriaus silpnintuvas nustatomas taip, kad esant 1 ng aflatoksino B1 savirašio plunksna pajudėtų maždaug 80 % viso skalės aukščio. 5.5.4. Inžektorius Laikantis inžektoriaus gamintojo instrukcijų, visų tirpalų įpurškiama po 250 μl. 5.5.5. Chromatografinio atskyrimo patikrinimas Įpurškiama chromatografinio atskyrimo tikrinimo tirpalo (3.14.1). Slėniai turėtų būti mažesni kaip 5 % gretimų smailių aukščių sumos. 5.5.6. Sistemos stabilumo patikrinimas Prieš kiekvieną tyrimų seriją pamatinis etalonas (3.13.3) įpurškiamas tol, kol gaunamas pastovus smailės plotas (N.B. Aflatoksino B1 atveju nuoseklių įpurškimų smailės neturėtų skirtis daugiau kaip 6 %). Toliau nedelsiant tikrinamas tiesiškumas (5.5.7). 5.5.7. Tiesiškumo tikrinimas Įpurškiama aflatoksino B1 kalibravimo tirpalų (3.13.1.–3.13.4). Atsako slinkio pataisai daryti kas trečią kartą įpurškiamas pamatinis etalonas (3.13.3) (N.B. Per 90 min šio pamatinio etalono smailės neturi skirtis daugiau kaip 10 %). Slinkio pataisa daroma pagal 7 skyriaus formulę. Kalibravimo kreivė turi būti tiesinė ir eiti per koordinačių pradžią, esant paklaidai mažesnei už dvigubą Y įverčio standartinį nuokrypį. Gauti dydžiai neturi skirtis daugiau kaip 3 % nuo vardinių dydžių. Jei šie reikalavimai vykdomi, nedelsiant tęsiama toliau. Jei ne, prieš dirbant toliau randamos ir pašalinamos problemos priežastys. 5.5.8. Mėginių ekstraktų įpurškimas Įpurškiami išgryninti mėginių ekstraktai (5.4.2.2). Po dviejų mėginių ekstraktų įpurškiamas pamatinis etalonas (3.13.3) tokia seka: pamatinis etalonas, ekstraktas, ekstraktas, pamatinis etalonas, ekstraktas, ekstraktas, pamatinis etalonas ir t. t. 6. Patvirtinamasis tyrimas 6.1. Tolesnis ekstrakto apdorojimas (5.4.2.2) Į galutinį ekstraktą, gautą 5.4.2.2, įpilama 5 ml natrio chlorido tirpalo (3.15.1). Ekstrahuojama dalijamajame piltuve (4.24.1) po vieną minutę tris kartus su 2 ml chloroformo (3.1). Sujungti chloroformo ekstraktai supilami į 10 ml mėgintuvėlį per maždaug 1 g natrio sulfato (3.15.2) sluoksnį. Galima naudoti mažą piltuvėlį (4 cm skersmens) su gabalėliu vatos susiaurėjimo vietoje, padengtu maždaug 1 g natrio sulfato. Natrio sulfato sluoksnis plaunamas keliais ml chloroformo, o plovimo skystis surenkamas į tą patį mėgintuvėlį. Naudojant kaitinimo bloką (4.24.2), chloroformo ekstraktas garinamas iki sausojo likučio tame pačiame mėgintuvėlyje ir vėl tirpinamas 1 ml chloroformo. 6.2. Darinio ruošimas ir plonasluoksnė chromatografija Žr. Tarybos direktyvos 76/372/EEB priedo A metodo 5.6.2. punktą. 7. Rezultatų apskaičiavimas Mėginyje esančio aflatoksino B1 kiekis (μg/kg) apskaičiuojamas pagal formulę: aflatoksino B1 kiekis (μg/kg) = m × V V × M × VfVc kurioje: m m = P + P × 2 r st P(mėginio) = mėginio aflatoksino B1 smailės plotas; P(st1) = aflatoksino B1 smailės plotas, gautas pirmiau įpurkštam pamatiniam etalonui (3.13.3); P(st2) = aflatoksino B1 smailės plotas, gautas vėliau įpurkštam pamatiniam etalonui (3.13.3); r(st) = įpurkštas pamatinio etalono aflatoksino B1 kiekis (3.13.3) ng; Vm = purškiamo mėginio ekstrakto tūris ml; Vext = galutinis mėginio ekstrakto tūris, atsižvelgiant į pirmiau atliktą skiedimą (5.3), ml; M = mėginio masė g Vf = iš Florisil kasetės (5.4.1.2) pernešto filtrato, tūris ml; Vc = chloroformo, naudojamo mėginiui ekstrahuoti, tūris ml. Jei dirbama pagal šiame protokole nurodytą metodiką, formulė supaprastėja iki: aflatoksino B1 kiekis μg/kg = 20 × m. 7.1. Rezultatus taip pat galima apskaičiuoti matuojant smailės aukštį. 8. Pakartojamumas Žr. 10.1. 9. Atkuriamumas Žr. 10.1. 10. Pastabos 10.1. Preciziškumas Tarplaboratoriniame tyrime [1], atliktame tarptautiniu lygiu su pašarų mišiniais, buvo gauti 1 lentelėje pateikti pakartojamumo ir atkuriamumo rezultatai. Vartojama sąvoka "pakartojamumas" (r) apibrėžiamas kaip didžiausias santykis, kuris, esant 95 % tikimybės lygiui, nebėra reikšmingas lyginant du to paties mėginio rezultatus, gautus panašiomis sąlygomis vienoje laboratorijoje. Sąvoka atkuriamumas (R) apibrėžiama panašiai, lyginant dvi skirtingas laboratorijas. Be to, pagal ISO 3534:1977, 2.35 [2] ir Komisijos sprendimą 89/610/EEB [3], 1 lentelėje be r ir R pateikti jų variacijos koeficientai. 1 lentelė Pakartojamumas (r) ir atkuriamumas (R), išreikšti kaip santykiai ir atitinkami variacijos koeficientai (15 laboratorijų) Koncentracija | r | R | CVr [4] | CVR | (µg/kg) | | | (%) | (%) | 8 ir 14 | 1,4 | 1,7 | 11 | 18 | "CV 10.2. Chloroformo stabilizavimas (3.1) Florisil kasetės sugerties charakteristikos gali būti pakeistos, jei naudojamas ne etanolis, bet kiti stabilizatoriai. Tai reikia patikrinti pagal 10.3, kai neturima aprašytojo chloroformo. 10.3. Tikslumas Teisingas šio metodo taikymas patvirtinamas, atliekant kartotinus sertifikuotųjų pamatinių medžiagų matavimus. Jei jų neturima, metodo tinkamumas turėtų būti patikrinamas regeneravimo bandymais, daromais su sodrintais tuščiaisiais mėginiais. Vidurkio nuokrypis nuo tikrosios vertės, išreikštas tikrosios vertės procentine dalimi, turi atitikti ribines vertes nuo — 20 iki + 10 %. +++++ TIFF +++++ 1 paveikslas. Kolonėlės ir kasetės sąranka +++++ TIFF +++++ 2 paveikslas. HPLC sistemos ir jodo darinio gamybos sistemos schema +++++ TIFF +++++ 3 paveikslas. Aflatoksino B1 atsako slinkio kompensavimas, reguliariais intervalais įpurškiant pamatinio etalono (3.13.3)" [1] Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17–29. [2] ISO 3534:1977. [3] OL L 351, 1989 12 2, p. 39. [4] "variacijos koeficientas. --------------------------------------------------