1972 m. gruodžio 5 d. Ketvirtoji Komisijos Direktyva nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus



Oficialusis leidinys L 083 , 30/03/1973 p. 0021 - 0034

specialusis leidimas suomių kalba: skyrius 3 tomas 5 p. 0115

specialusis leidimas graikų k.: skyrius 03 tomas 9 p. 0114

specialusis leidimas švedų kalba: skyrius 3 tomas 5 p. 0115

specialusis leidimas ispanų kalba: skyrius 03 tomas 6 p. 0230

specialusis leidimas portugalų kalba skyrius 03 tomas 6 p. 0230

CS.ES skyrius 03 tomas 02 p. 12 - 25

ET.ES skyrius 03 tomas 02 p. 12 - 25

HU.ES skyrius 03 tomas 02 p. 12 - 25

LT.ES skyrius 03 tomas 02 p. 12 - 25

LV.ES skyrius 03 tomas 02 p. 12 - 25

MT.ES skyrius 03 tomas 02 p. 12 - 25

PL.ES skyrius 03 tomas 02 p. 12 - 25

SK.ES skyrius 03 tomas 02 p. 12 - 25

SL.ES skyrius 03 tomas 02 p. 12 - 25



Ketvirtoji Komisijos Direktyva 1972 m. gruodžio 5 d. nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus (73/46/EEB) EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, atsižvelgdama į Europos ekonominės bendrijos steigimo sutartį, atsižvelgdama į 1970 m. liepos 20 d. Tarybos direktyvą dėl Bendrijos mėginių paėmimo ir analizės metodų, taikomų oficialiai pašarų kontrolei, įvedimo [1] su pakeitimais, padarytais 1972 m. liepos 20 d. Direktyva Nr. 72/275/EEB [2], ypač į jos 2 straipsnį; kadangi ta direktyva reikalauja, kad, siekiant patikrinti, kaip laikomasi įstatymais ir kitais teisės aktais patvirtintų nuostatų dėl pašarų kokybės ir sudėties reikalavimų, oficialios pašarų kontrolės atlikimui būtų taikoma Bendrijos mėginių paėmimo ir analizės metodai; kadangi 1971 m. birželio 15 d. Direktyvoje Nr. 71/250/EEB [3], 1971 m. lapkričio 18 d. Direktyvoje Nr. 71/393/EEB [4] ir 1972 m. balandžio 27 d. Direktyvoje Nr. 72/199/EEB [5] jau nustatyta keletas Bendrijos analizės metodų; kadangi dėl vėliau pasiektos darbo pažangos tikslinga priimti ketvirtąjį metodų rinkinį; kadangi šioje direktyvoje numatytos priemonės atitinka Pašarų vadybos komiteto nuomonę; PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ: 1 straipsnis Valstybės narės reikalauja, kad gyvulinių bei augalinių riebalų ir aliejų drėgmės kiekio bei magnio ir neapdorotos ląstelienos kiekio pašaruose analizės, reikalingos oficialiai pašarų kontrolei, būtų atliekamos taikant metodus, nustatytus šios direktyvos I priede. Šios direktyvos I priede apibūdintiems metodams taikomos 1971 m. birželio 15 d. Pirmosios Komisijos direktyvos Nr. 71/250/EEB priedo 1 dalyje (Įžangoje) numatytos bendrosios nuostatos. 2 straipsnis Valstybės narės reikalauja, kad oficialiai pašarų kontrolei reikalingos retinolio (vitamino A), tiamino (aneurino, vitamino B1), askorbino ir dehidroskorbo rūgščių (vitamino C) kiekio pašaruose analizės būtų atliekamos taikant šios direktyvos II priede nustatytus metodus. 1971 m. birželio 15 d. Pirmosios Komisijos direktyvos Nr. 71/250/EEB priedo 1 dalyje (Įžangoje), išskyrus dalį, kurioje kalbama apie analizės mėginio paruošimą, numatytos bendrosios nuostatos taikomos šios direktyvos II priede nustatytiems metodams. 3 straipsnis Valstybės narės ne vėliau kaip iki 1974 m. sausio 1 d. priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie įgyvendina šią direktyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai. 4 straipsnis Ši direktyva skirta valstybėms narėms. Priimta Briuselyje, 1972 m. gruodžio 5 d. Komisijos vardu Pirmininkas S. L. Mansholt [1] OL L 170, 1970 8 3, p. 2. [2] OL L 171, 1972 7 29, p. 39. [3] OL L 155, 1971 7 12, p. 13. [4] OL L 279, 1971 12 20, p. 7. [5] OL L 123, 1972 5 29, p. 6. -------------------------------------------------- I PRIEDAS 1. DRĖGNIO GYVULINIUOSE IR AUGALINIUOSE RIEBALUOSE BEI ALIEJUOSE NUSTATYMAS 1. Tikslas ir taikymo sritis Taikant šį metodą, galima nustatyti vandens ir lakiųjų medžiagų kiekį gyvulinės ir augalinės kilmės riebaluose bei aliejuose. 2. Metodo esmė Mėginys džiovinamas 103 °C temperatūroje iki pastovios masės. Nuodžiūvis nustatoma pasvėrus. 3. Prietaisai 3.1. Nerūdijančios medžiagos indas plokščiu dugnu, 8-9 cm skersmens ir apie 3 cm aukščio. 3.2. Maždaug nuo 80 °C iki bent 110 °C sugraduotas apie 10 cm ilgio gyvsidabrio termometras su pastorintu burbuliuku ir plėtimosi vamzdeliu viršutiniame gale. 3.3. Smėlio vonia arba elektrinė plytelė. 3.4. Eksikatorius su veiksmingu džiovikliu. 3.5. Analizinės svarstyklės. 4. Darbo procedūra 1 mg tikslumu pasveriama apie 20 g homogenizuoto mėginio sausame žinomos masės inde (3.1), į kurį įdėtas termometras (3.2). Nuolat maišant termometru, kaitinama ant smėlio vonios ar karštos plytelės (3.3), kad maždaug per 7 minutes temperatūra pakiltų iki 90 °C. Kaitinimas sumažinamas, stebima, kaip dažnai nuo indo dugno kyla burbuliukai. Temperatūra negali pakilti daugiau nei 105 °C. Braukiant per indo dugną, kol nebesusidarys burbuliukų, maišoma toliau. Kad galima būtų užtikrinti, jog drėgmės visiškai nebėra, kaitinama dar keletą kartų iki 103 °C ± 2 °C, kaskart prieš kaitinimą ataušinant mėginį iki 93 °C. Tada paliekama eksikatoriuje (3.4) atvėsti iki kambario temperatūros ir pasveriama. Šis veiksmas kartojamas tol, kol mėginio masė, palyginti su mase po ankstesnio kaitinimo, sumažės ne daugiau kaip 2 mg. NB. Jei pakartotinai pakaitinus padidėja mėginio masė, vadinasi, riebalai oksidavosi. Tuo atveju rezultatai skaičiuojami pagal pasvėrimo duomenis iš karto po to, kai masė pradėjo didėti. 5. Rezultatų apskaičiavimas Drėgnis mėginio procentais pateikiamas pagal šią formulę: · 100Mo kurioje: mo = mėginio masė, g;. m1 = indo su turiniu masė prieš kaitinimą, g; m2 = indo du turiniu masė po kaitinimo, g. Mažesni negu 0,05 % rezultatai turi būti užrašomi kaip "mažesnis negu 0,05 %". Pakartojamumas Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio drėgnio analizių rezultatų skirtumas turi neviršyti 0,05 % absoliučia verte. 2. MAGNIO NUSTATYMAS atominės absorbcijos spektrometrijos būdu 1. Tikslas ir taikymo sritis Taikant šį metodą, galima nustatyti magnio kiekį pašaruose. Jis ypač tinka tuomet, kai magnio kiekiai neviršija 5 %. 2. Metodo esmė Mėginys paverčiamas pelenais ir ištirpinamas praskiestoje druskos rūgštyje. Jei organinių medžiagų mėginyje nėra, tirpinama iš karto praskiestoje druskos rūgštyje. Tirpalas praskiedžiamas, o magnio kiekis nustatomas atominės absorbcinės spektrometrijos analizės metodu, bangos ilgiui esant 285,2 nm, lyginant su standartiniais tirpalais. 3. Reagentai 3.1. Druskos rūgštis a.g. ρ = 1,16 g/ml. 3.2. Koncentruota druskos rūgštis a.g. ρ = 1,19 g/ml. 3.3. Magnio juosta ar viela arba kambario temperatūroje išdžiovintas magnio sulfato heptahidratas. 3.4. Stroncio druskos tirpalas (chloridas arba nitratas) 2,5 % (m/v) stroncio (= 76,08 g SrCl2. 6H2O a.g., arba 60,38 g Sr (NO3)2 a.g.). 3.5. Standartinis magnio tirpalas: 1 mg tikslumu pasveriamas 1 g magnio (3.3), prieš tai nuo jo atsargiai nuvalius oksido plėvelę, arba atitinkamą magnio sulfato heptahidrato (3.3) kiekį (10,143 g). Supilama į 1000 ml matavimo kolbą, įpilama 80 ml druskos rūgšties (3.1), ištirpinama ir praskiedžiama vandeniu iki 1000 ml. 1 ml šio tirpalo yra 1,000 mg magnio. 4. Prietaisai 4.1. Platininiai, kvarciniai ar porcelianiniai tigliai mėginiui sudeginti. 4.2. Mufelinė krosnis su termorele. 4.3. Atominės absorbcijos spektrometras. 5. Darbo procedūra 5.1. Mėginio tirpalo paruošimas 5.1.1. Pašarai, kuriuos sudaro tik mineralinės medžiagos 1 mg tikslumu pasveriama 5 g mėginio 500 ml matavimo kolboje ir ištirpinama 250-300 ml vandens. Įpilama 40 ml druskos rūgšties (3.1), užvirinama ir ant silpnos ugnies skystis pavirinamas 30 minučių. Paliekama atvėsti, praskiedžiama iki žymės vandeniu, išmaišoma ir filtruojama į sausą cheminę stiklinę per sausą klostuotą filtrą. Pirmieji 30 ml filtrato išpilami. Esant silicio diksidui, 5 g mėginio paveikiami reikalingu kiekiu (15-30 ml) druskos rūgšties (3.2), sausai išgarinama ant vandens vonios ir įdedama valandai į 105 °C temperatūros džiovinimo spintą. Toliau bandymas atliekamas laikantis darbo procedūros, nurodytos nuo 5.1.2 trečio sakinio. 5.1.2. Pašarai, susidedantys daugiausia iš mineralinių medžiagų 1 mg tikslumu pasveriama 5 g mėginio tiglyje, sudeginama 550 °C temperatūroje mufelinėje krosnyje, kol gaunami pelenai be anglinių dalelių, ir paliekama atvėsti. Kad būtų pašalintas silicio dioksidas, įpilama į pelenus reikiamas kiekis (15-30 ml) druskos rūgšties (3.2), sausai išgarinama ant vandens vonios ir įdedama valandai į 105 °C temperatūros džiovinimo spintą. Likutis paveikiamas 10 ml druskos rūgšties (3.1) ir supilama į 500 ml matavimo kolbą naudojant šiltą vandenį. Paliekama atvėsti ir praskiedžiama iki žymės vandeniu. Išmaišoma ir filtruojama į sausą cheminę stiklinę per sausą klostuotą filtrą. Pirmieji 30 ml filtrato išpilami. 5.1.3. Pašarai, susidedantys daugiausia iš organinių medžiagų 1 mg tikslumu pasveriama 5 g mėginio tiglyje ir sudeginama 550 °C temperatūroje mufelinėje krosnyje, kol gaunami pelenai be anglinių dalelių. Pelenai paveikiami 5 ml druskos rūgšties (3.2), sausai išgarinami ant vandens vonios ir džiovinama valandą džiovinimo spintoje 105 °C temperatūroje, kad susidarytų netirpus silicio dioksidas. Pelenai paveikiami 5 ml druskos rūgšties (3.1), supilami į 250 ml matavimo kolbą naudojant šiltą vandenį, užvirinama, paliekama atvėsti ir praskiedžiama iki žymės vandeniu. Išmaišoma ir filtruojama į sausą cheminę stiklinę per sausą klostuotą filtrą. Pirmieji 30 ml filtrato išpilami. 5.2. Atominė absorbcinė analizė Skiedžiant standartinį tirpalą (3.5) vandeniu, paruošiami bent 5 didėjančios koncentracijos standartiniai tirpalai, atitinkantys optimalų spektrofotometro matavimo diapazoną. Į kiekvieną tirpalą įpilama 10 ml stroncio druskos tirpalo (3.4) ir praskiedžiama vandeniu iki 100 ml. Vandeniu alikvotinė filtrato, gauto pagal 5.1.1, 5.1.2 arba 5.1.3, dalis praskiedžiama taip, kad susidarytų magnio koncentracija, neviršijanti standartinių tirpalų koncentracijų. Druskos rūgšties koncentracija šiame tirpale turi būti ne didesnė kaip 0.4 N. Įpilama 10 ml stroncio druskos tirpalo (3.4) ir praskiedžiama vandeniu iki 100 ml. Išmatuojama analizuojamo tirpalo ir etaloninių tirpalų absorbcija, esant 285,2 nm bangos ilgiui. 6. Rezultatų apskaičiavimas Magnio kiekis mėginyje apskaičiuojamas pagal standartinius tirpalus. Rezultatas išreiškiamas mėginio masės procentais. Pakartojamumas Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties mėginio analizių rezultatų skirtumas turi neviršyti 5 % santykinės vertės. 3. ŽALIOS LĄSTELIENOS NUSTATYMAS 1. Tikslas ir taikymo sritis Taikant šį metodą, nustatomas rūgštyse ir šarmuose netirpių organinių medžiagų, iš kurių pašalinti riebalai ir kurios apibrėžiamos kaip žalia ląsteliena, kiekis. 2. Metodo esmė Iš mėginio, jei reikia, pašalinami riebalai, jis paveikiamas verdančiais nurodytos koncentracijos sieros rūgšties ir kalio hidroksido tirpalais paeiliui. Likutis atskiriamas filtravimu, esant asbestui, išplaunamas, išdžiovinamas, pasveriamas ir sudeginamas iki pelenų 900 °C temperatūroje. Mėginyje ląstelienos yra tiek, kiek sumažėja masė mėginį paverčiant į pelenus. 3. Reagentai 3.1. Sieros rūgštis 0,26 N. 3.2. Apdorotas asbestas: Gučo tiglyje ant asbesto užpilama 5 kartus didesnės masės praskiestos druskos rūgšties (1 tūris druskos rūgšties, ρ = 1.19 + 3 tūriai vandens). Mišinys verdamas apie 45 minutes, paliekamas atvėsti ir filtruojamas per Biuchnerio piltuvą. Likutis išplaunamas pirma vandeniu, kol plovimo vandenyje nebeliks druskos rūgšties, o paskui acetonu (3.6). Asbestas išdžiovinamas džiovinimo spintoje ir dvi valandas kaitinama 900 °C temperatūroje. Paliekama atvėsti ir laikoma užkimštoje kolboje. Taip apdorotas asbestas gali būti naudojamas keletą kartų. Jis turi atitikti 5 punkte nustatytus tuščiojo bandymo reikalavimus. 3.3. Priešpučio emulsija (pvz., silikonas). 3.4. Kalio hidroksido tirpalas 0,23 N. 3.5. Druskos rūgštis 0,5 N. 3.6. Acetonas. 3.7. Dietileteris. 4. Prietaisai 4.1. Mažiausiai 600 ml talpos cheminė stiklinė su 200 ml tūrio atžymomis. 4.2. Apie 80 mm skersmens ir 4 mm storio porcelianiniai diskai su maždaug 32 apie 4 mm skersmens skylėmis. 4.3. Apie 2 l talpos vakuuminės kolbos su guminiais kamščiais ir 800 ml tūrio atžymomis, kuriose įtaisytas 120 mm skersmens stiklinis piltuvas. 4.4. Apie 40 mm skersmens ir apie 4 mm storio piltuvo (4.3) kūgiui tinkančios filtravimo plokštės nuožulniais kraštais su maždaug 16 apie 4 mm skersmens skylių, uždengtos vielos tinklu, kurio akutės dydis apie 1 mm. Ir plokštės, ir vieliniai tinklai turi būti atsparūs rūgštims ir šarmams. 4.5. Platininiai arba kvarciniai tigliai mėginiui sudeginti. 4.6. Elektrinė mufelinė krosnis su termorele. 4.7. Eksikatorius. 4.8. Asbesto filtras: suspenduojama 2,0 g asbesto (3.2) 100 ml vandens. Filtruojama vakuume per filtro plokštę, padengtą vieliniu tinklu (4.4), kurie įdėti į vakuuminės kolbos piltuvą (4.3). Surenkamas filtratas ir dar kartą filtruojama per tą patį filtrą. Filtratas išpilamas. 5. Darbo procedūra 1 mg tikslumu pasveriama 3 g mėginio ir 2 g apdoroto asbesto (3.2) į cheminę stiklinę (4.1), įpilama 200 ml sieros rūgšties (3.1) ir keletą lašų priešpučio emulsijos (3.3). Greitai užvirinama ir virinama lygiai 30 minučių. Kad nesikeistų tūris, stiklinė uždengiama aušinimo įtaisu, pvz., 500 ml apvaliadugne kolba, kurioje cirkuliuoja šaltas vanduo. Įpilama apie 50 ml šalto vandens, kad tirpalas nebevirtų, ir nedelsiant filtruojama vakuumu per iš anksto pagal 4.8 paruoštą asbesto filtrą. Likutis išplaunamas 5 kartus su maždaug 100 ml labai karšto vandens, kad galiausiai filtrato tūris būtų 800 ml. Likutis kokybiškai supilamas į stiklinę (4.1) su įtaisytu porcelianiniu disku (4.2) virimo reguliavimui. Įpilama 200 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4). Greitai užvirinama ir virinama lygiai 30 minučių. Įpilama maždaug 50 ml šalto vandens ir nedelsiant filtruojama vakuumu per naują pagal 4.8 iš anksto paruoštą asbesto filtrą. Likutis plaunamas labai karštu vandeniu, kol plovimo vanduo taps neutralus (patikrinama lakmuso popierėliu), po to 3 minutes acetonu (3.6) (iš viso apie 100 ml acetono). Likutis kokybiškai supilamas į tiglį (4.5), jei reikia, prieš tai susmulkinamas ir išdžiovinamas 130 °C temperatūros džiovinimo spintoje, kol nebekis masė. Paliekama atvėsti eksikatoriuje (4.7) ir greitai pasveriama. Tiglis padedamas į mufelinę krosnį (4.6) ir paliekama 30 minučių sudegti iki pelenų 900 °C temperatūroje. Paliekama atvėsti eksikatoriuje (4.7) ir greitai pasveriama. Laikydamiesi tos pačios darbo tvarkos su apdorotu asbestu (3.2), tik be mėginio, atliekamas tuščiasis bandymas. Iškaitinus 6 g asbesto, masės sumažėjimas turi neviršyti 10 mg. 6. Rezultatų apskaičiavimas Ląstelienos kiekis mėginio procentais pateikiamas santykiu: · 100 3 kuriame: a = masės sumažėjimas, pavertus asbestą pelenais, per bandymą; b = masės sumažėjimas, pavertus asbestą pelenais, per tuščiąjį bandymą. Pakartojamumas Dviejų lygiagrečių to paties mėginio analizių rezultatų skirtumas turi neviršyti: 0,3 absoliučia verte, kai ląstelienos kiekis mažesnis negu 10 %; 3 % santykine verte, kai ląstelienos kiekis lygus ar didesnis negu 10 % 7. Pastabos 7.1. Iš pašarų, kuriuos sudaro daugiau negu 10 % aliejų ir riebalų, prieš analizę reikia dietileteriu pašalinti riebalus (3.7). Tam mėginys (3 g, pasvertus 1 mg tikslumu) padedamas ant asbesto filtro (4.8). 3 kartus užpilama maždaug 50 ml dietileterio (3.7) ir kiekvieną kartą kruopščiai nusiurbiama vakuumu. Visas nuriebalintas mėginys ir asbestas įdedamas į cheminę stiklinę (4.1) ir analizė tęsiama, kaip nurodyta 5 punkte. 7.2. Iš pašarų, kuriuose yra aliejų ir riebalų ir kurių negalima ekstrahuoti iš karto, riebalus reikia pašalinti kaip nurodyta 7.1. Po to, išplovus likutį po veikimo rūgštimi, iš jo dar kartą reikia pašalinti riebalus. Virinami rūgštimi, plaunami ir dar kartą šalinami riebalai tokiu būdu: rūgštis nuo likučio nuplaunama tris kartus acetonu (3.6) (iš viso 100 ml), po to 3 kartus 50 ml dietileteriu (3.7). Tada likutis kiekybiškai (be nuostolių) supilamas į cheminę stiklinę (4.1) ir analizė tęsiama, kaip nurodyta 5 punkto antrame paragrafe (veikimas kalio hidroksido tirpalu). 7.3. Jei pašaruose yra daug kalcio (daugiau negu 2 % kalcio), mėginys (3 g pasverti 1 mg tikslumu) įdedamas į cheminę stiklinę (4.1) su 100 ml druskos rūgšties 0.5 N (3.5) ir paliekama 5 minutėms žemoje temperatūroje. Nedelsiant išfiltruojama ir išplaunama šaltu vandeniu. Filtruojama per 2,0 g asbesto, pritaikyto virti su sieros rūgštimi. Jei filtruoti sunku, suspensija praskiedžiama acetonu (3.6). Toliau analizė atliekama kaip nurodyta 5 punkte. -------------------------------------------------- II PRIEDAS 1. RETINOLIO (VITAMINO A) NUSTATYMAS 1. Tikslas ir taikymo sritis Taikant šį metodą, galima nustatyti retinolio (vitamino A) kiekį pašaruose, koncentratuose ir premiksuose. Nustatymo riba yra 10000 T. V./kg intensyvios spalvos pašarams ir 4000 T. V./kg kitiems [1]. Produktai klasifikuojami į dvi grupes pagal numanomą retinolio kiekį juose: A grupė: mažiau negu 200000 T. V./kg retinolio; B grupė: 200000 T. V./kg ir daugiau retinolio. 2. Metodo esmė Karštas mėginys hidrolizuojamas kalio hidroksido tirpalu etanolyje, esant antioksidantui arba azoto atmosferoje. Mišinys ekstrahuojamas 1,2-dichloretanu. Ekstraktas sausai išgarinamas ir paveikiamas petroleteriu. Tirpalas chromatografuojamas aliuminio oksido kolonėlėje (B grupės produktams chromatografuoti reikia tik tam tikrais atvejais). A grupės produktuose retinolis po Carr-Price reakcijos, kurios metu gaunamas spalvotas kompleksas, nustatomas spektrofotometriškai, esant 610 nm bangos ilgiui; B grupės produktuose retinolis nustatomas spektrofotometrijos būdu ultravioletinėje spektro dalyje, esant 325 nm bangos ilgiui. 3. Reagentai a) Naudojami A ir B grupių produktų analizei 3.1. 96 % (v/v) etanolis. 3.2. 10 % (m/v) natrio askorbato tirpalas a.g., arba 3.3. Išvalytas azotas. 3.4. 50 % (m/v) kalio hidroksido tirpalo a.g. 3.5. Kalio hidroksido 1 N tirpalas a.g. 3.6. Kalio hidroksido 0,5 N tirpalas a.g. 3.7. 1,2-dichloretanas a.g. 3.8. Petroleteris, virimo temperatūra 30-50 oC. Jei reikia, išgryninama tokiu būdu: 1000 ml petroleterio kratoma su 20 ml koncentruotos sieros rūgšties porcijomis, kol rūgštis nebenusidažys. Rūgštis nupilama ir petroleteris plaunamas paeiliui vieną kartą su 500 ml vandens, du kartus su 250 ml 10 % (m/v) natrio hidroksido tirpalo ir tris kartus su 500 ml vandens. Vandeninis sluoksnis išpilamas, valandą petroleteris džiovinamas virš aktyviųjų anglių ir bevandenio natrio sulfato, filtruojama ir distiliuojama. 3.9. Aliuminio oksidas, standartizuotas pagal Brokmaną: 8 valandas kaitinama 750 °C temperatūroje, atvėsinama eksikatoriuje ir laikoma rudo stiklo butelyje, užkimštame šlifo kamščiu. Prieš naudodami chromatografijai, sudrėkinama tokiu būdu: į rudo stiklo butelį įpilama 10 g aliuminio oksido ir 0,7 ml vandens, užkemšama kamščiu, maišant dar kartą 5 minutes pakaitinama verdančio vandens vonioje. Paliekama atvėsti. Patikrinamas taip paruošto aliuminio oksido aktyvumas, žinomą kiekį retinolio (3.17) (apie 500 T. V.) apdorojant pagal 5.3 ir 5.4 punktuose pateiktą metodiką ir patikrinant išgavą. 3.10. Bazinis aliuminio oksidas, 1 aktyvumo laipsnio (Woelm, Merck ar panašus). 3.11. Grynas dietileteris. Chromatografijos būdu kolonėlėje (3.10) su baziniu aliuminio oksidu pašalinami peroksidai ir vandens pėdsakai (250 ml dietilo eterio 25 g aliuminio oksido). 3.12. 4, 8, 12, 16 ir 20 % (v/v) dietileterio (3.11) tirpalai petroleteryje (3.8). 3.13. Natrio sulfido 0.5 mol/l tirpalas 70 % (v/v) glicerolyje; ruošiamas iš natrio sulfido a.g. b) Naudojami tik A grupės produktų analizei 3.14. Kristalinis benzenas a.g. 3.15. Chloroformas a.g. Chromatografijos būdu pašalinamas etanolis, fosgenas ir vandens pėdsakai kolonėlėje (3.10) su baziniu aliuminio oksidu (200 ml chloroformo 50 g aliuminio oksido; pirmuosius 50 ml eliuato patartina chromatografuoti antrą kartą). 3.16. Carr-Price reagentas: sumaišoma apie 25 g stibio trichlorido a.g. (laikomo eksikatoriuje) su 100 ml chloroformo (3.15), kol tirpalas pasidarys sotus. Nedidelis kiekis stibio trichlorido nuosėdų neturi jokios įtakos. Pridedama 2 ml acto rūgšties anhidrido a.g. Laikoma šaldytuve rudo stiklo butelyje su šlifo kamščiu. Tirpalą galima naudoti keletą savaičių. 3.17. Retinolis, spektrofotometriškai standartizuotas. c) Naudojami tik B grupės produktų analizei 3.18. Izopropanolis chromatografijai. 4. Įranga 4.1. Vandens vonia. 4.2. Vakuuminis garintuvas su įvairių dydžių apvaliadugnėmis kolbomis. 4.3. Stikliniai chromatografijos vamzdžiai (300 mm ilgio, apie 13 mm vidinio skersmens). 4.4. Spektrofotometras su 10 mm storio kiuvetėmis. Matavimams UV srityje reikia kvarcinių kiuvečių. 4.5. UV lempos, spinduliuojančios 365 nm bangos ilgio diapazone. 5. Darbo procedūra NB. Visos operacijos turi būti atliekamos darbo vietose, kuriose nėra tiesioginės šviesos, jei reikia, rudo stiklo prietaisuose. 5.1. Mėginys Iš smulkiai sutrupinto mėginio paimama porcija, atsižvelgiant į numanomą retinolio kiekį, taigi: 0,1-1,0 g koncentratų (kai kiekis didesnis negu 20000 T. V./g); 3,0-5,0 g premiksų (kiekis nuo 400 iki 20000 T. V./g); 10-20 g mineralinių mišinių; 30 g A grupės produktų. Nedelsiant mėginys įdedamas į 500 ml kolbą su šlifo kamščiu. 5.2. Hidrolizė ir ekstrahavimas [2] Ant mėginio paeiliui užpilama 40 ml etanolio (3.1), 2 ml natrio askorbato tirpalo (3.2) [3], 10 ml kalio hidroksido tirpalo (3.4) ir 2 ml natrio sulfido tirpalo (3.13). 30 minučių pakaitinus 70-80oC temperatūroje su grįžtamuoju kondensatoriumi, pakišama po tekančiu vandeniu atvėsti. Įpilama 50 ml etanolio (3.1) ir 100 ml 1,2-dichloretano (3.7) (su pipete). Energingai suplakama ir nupilamas viršutinis sluoksnis į dekantavimo indą. Į indą įpilama 150 ml kalio hidroksido tirpalo (3.5), 30 sekundžių plakama ir paliekama pastovėti, kol atsiskirs sluoksniai. Dichloretaninį sluoksnis (apatinis sluoksnis) atskiriamas į dekantavimo indą, įpilama 40 ml kalio hidroksido tirpalo (3.6), 10 sekundžių plakama ir paliekama pastovėti, kol atsiskirs sluoksniai. Dichloretaninis sluoksnis atskiriamas į dekantavimo indą ir plaunama 6-8 kartus vandeniu po 40 ml, kol neliks šarmų (patikrinama su fenolftaleinu). Surenkamas dichloretaninis sluoksnis ir filtravimo popieriaus juostelėmis pašalinamas vandens likutis. Tirpalo alikvotinė dalis sausai išgarinama vakuumu ant vandens vonios 40 °C temperatūroje. Likutis greitai ištirpinamas 5 ml petroleterio (3.8). Analizuodami A grupės produktus, chromatografuokite kaip nurodyta 5.3.1. Analizuojant B grupės produktus, tirpalas perpilamas į 50 ml matavimo kolbą, praskiedžiama iki reikiamo tūrio petroleteriu (3.8), sumaišoma ir išmatuojamas optinis tankis, kaip nurodyta 5.4.2. 5.3. Chromatografija 5.3.1. A grupės produktai Chromatografavimo vamzdis iki (4.3) 200 mm padalos užpildomas 10 g aliuminio oksido (3.9) iš anksto paruošta suspensija petroleteryje (3.8). Supilama į kolonėlę pagal 5.2 gautą tirpalą ir nedelsiant įpilama 20 ml petroleterio (3.8). Po slėgiu arba daliniame vakuume nuosekliai išplaunama 4, 8, 12, 16 ir 20 % dietileterio tirpalo (3.12) petroleteryje (3.8) 10 ml tūrio porcijomis, esant 2-3 lašų per sekundę debitui. Pirmasis eliuojamas karotinas [4] Paprastai retinolis eliuojamas 20 % dietileterio tirpalu (3.12) petroleteryje. Toliau išplaunama UV šviesoje (kolonėlė trumpai apšvitinama gyvsidabrio lempa). Retinolio fluorescenuojanti zona aiškiai atsiskiria nuo po jos einančios geltonos ksantofilų zonos. Eliuato dalis su retinoliu surenkama į Erlenmejerio kolbą. 5.3.2. B grupės produktai Chromatografija turi būti atliekama tik tuo atveju, kai optinio tankio matavimai, gauti pagal 5.4.2, neatitinka 5.4.2 pateikiamų reikalavimų. Jei pasirodo, kad chromatografiją atlikti būtina, į chromatografinę kolonėlę įpilama alikvotinė tirpalo petroleteryje, gauto pagal 5.2 punktą, turinčio apie 500 T. V. retinolio, dalis ir chromatografuojama pagal 5.3.1. 5.4. Optinio tankio matavimas 5.4.1. A grupės produktai. Vakuume sausai išgarinamas eliuatas, kuriame yra pagal 5.3.1 gauto retinolio. Likutis paveikiamas 2 ml benzeno (3.14). Imama 0,3 ml šio tirpalo ir įpilama 3 ml Carr-Price reagento (3.16). Susidaro mėlyna spalva. Spektrofotometru išmatuojamas optinis tankis esant 610 nm bangos ilgiui, praėjus lygiai 30 sekundžių nuo reakcijos pradžios. Pagal kalibracinę kreivę, kuri gaunama didėjančios koncentracijos retinolio standarto tirpalus benzene apdorojant Carr-Price reagentu (2-16 T. V. retinolio standarto (3.17) 0,3 ml benzeno (3.14) + 3 ml Carr-Price reagento (3.16)), nustatomas retinolio kiekis. Kalibracinė kreivė turi būti nuolat ir dažnai tikrinama, naudojant standartą ir ką tik paruoštą Carr-Price reagento tirpalą. 5.4.2. B grupės produktai Paimama alikvotinė tirpalo petroleteryje, gauto pagal 5.2., kuriame yra apie 200 T. V. retinolio, dalis. Vakuume sausai išgarinamas, o likutis ištirpinamas 25 ml izopropanolio (3.15). Optinis tankis išmatuojamas spektrofotometru, esant 325, 310 ir 334 nm bangos ilgiui. Absorbcijos maksimumas yra esant 325 nm. Retinolio kiekis tirpaluose skaičiuojamas taip: E325 · 18,30 = T. V. retinolio/ml; Tačiau optinių tankių santykis E310 : E325 ir E334 : E325 ; turi būti 6: 7 = 0,857. Jei vienas šių santykių labai skiriasi nuo šios vertės (mažiau nei 0,830 arba daugiau nei 0,880), prieš matuojant optinius tankius, reikia atlikti chromatografiją, taikant 5.3.2 nurodytą metodą. Jei po chromatografijos išmatavus optinius tankius gauti rezultatai rodo, kad minėtieji santykiai vis tiek akivaizdžiai skiriasi nuo 0,857 vertės nei 0,830 arba daugiau nei 0,880), nustatymas turi būti atliekamas pagal A grupės produktams taikomą metodą. 6. Rezultatų apskaičiavimas Retinolio kiekis mėginyje, apskaičiuojamas atsižvelgiant į mėginio masę ir atskiedimus per analizę. Rezultatai išreiškiami retinolio T. V. 1 kg pašarų, 1 kg koncentrato arba premikso. Pakartojamumas Dviejų to paties mėginio lygiagrečiai atliktų analizių rezultatai turi nesiskirti daugiau kaip: - 20 % santykine verte, kai retinolio mažiau negu 75000 T. V./kg, - 15000 T. V, kai retinolio kiekis yra nuo 75000 iki 150000 T. V/kg, - 10 % santykine verte, kai kiekis nuo 150000 iki 250000 T. V/kg, - 25000 T. V, kai retinolio kiekis nuo 25000 iki 500000 T. V/kg, - 5 % santykine verte, kai retinolio daugiau negu 500000 T. V/kg. 2. TIAMINO (VITAMINO B1, ANEURINO) NUSTATYMAS 1. Tikslas ir taikymo sritis Taikant šį metodą, galima nustatyti tiamino (aneurino, vitamino B1) kiekį pašaruose, koncentratuose ir premiksuose. Nustatymo riba – 5 milijonosios dalys. 2. Metodo esmė Karštas tirpalas paveikiamas praskiesta sieros rūgštimi ir hidrolizuojamas fermentais. Gautas tirpalas oksiduojamas šarminėje terpėje. Susidaręs tiochromas ekstrahuojamas izobutanoliu ir nustatomas fluorimetrijos būdu. 3. Reagentai 3.1. 100 μg/ml standartinis tiamino tirpalas: vakuume ištirpinama išdžiovinto iki pastovaus svorio 112,3 mg tiamino vandenilio chlorido, 1000 ml 0,2 N sieros rūgšties (3.2). Laikant vėsioje, tamsioje vietoje, tirpalą galima naudoti vieną mėnesį. 3.2. Sieros rūgštis 0,2 N. 3.3. Grynas natrio rūgštusis sulfitas. 3.4. 20 % (m/v) kalio heksacionoferato (4-) a.g. tirpalas. 3.5. 25 % (m/v) kalio hidroksido a.g. tirpalas. 3.6. Oksidavimo mišinys: 2 ml kalio heksacianoferato (4-) tirpalo (3.4) sumaišoma su 48 ml kalio hidroksido tirpalo (3.5). Šio tirpalo negalima laikyti ilgiau kaip 4 valandas. 3.7. Metilpropanolis a.g. 3.8. Natrio acetato 2.5 N tirpalas. 3.9. Multifermentinis preparatas, kuriame yra proteazės, fosfatazės ir amilazės (pvz., Clarose). 3.10. 96 % (v/v) etanolio tirpalas. 4. Įranga 4.1. Vandens vonia. 4.2. Centrifuga (3500 apsisukimų per minutę) su 30-50 ml mėgintuvėliais su šlifo kamščiais. 4.3. Fluorimetras. 5. Darbo tvarka 5.1. Hidrolizė fermentais Į dvi 250 ml matavimo kolbas, A ir B, įpilama po vienodą kiekį smulkiai sutrupinto mėginio, kuriame yra apie 100 μg tiamino, ir 125 ml sieros rūgšties (3.2). Į A kolbą įpilama ir 1,0 ml etaloninio tirpalo (3.1) (vidinis standartas). Kolbos energingai suplakamos, padedama ant verdančios vandens vonios ir palaikoma 15 minučių kartais suplakant. Paliekama atvėsti iki maždaug 45 °C. Į kiekvieną kolbą įpilama 20 ml natrio acetato tirpalo (3.8) ir 0,5 g multifermentinio preparato (3.9) ir paliekama pastovėti 20 minučių kambario temperatūroje. Įpilama 20 ml natrio acetato tirpalo (3.8), praskiedžiama iki žymės vandeniu, sumaišoma ir filtruojama. Surenkami A ir B filtratai, prieš tai išpylus pirmuosius 15 ml. Paruošiami tokie tirpalai: 5.1.1. Palyginamasis tirpalas T Į centrifugos mėgintuvėlį (4.2) įpilama 5 ml filtrato A ir apie 10 ml natrio rūgščiojo sulfito (3.3). Mėgintuvėlis panardinamas į verdančio vandens vonią, palaikoma 15 minučių ir paliekama atvėsti iki kambario temperatūros. 5.1.2. Tirpalai A (vidinis standartas) ir B (mėginys) Į vieną centrifugos mėgintuvėlį (4.2) įpilama 5 ml A filtrato, o į kitą 5 ml B filtrato. 5.2. Oksidavimas Į T, A ir B tirpalus įpilama 5 ml oksidavimo mišinio (3.6), o praėjus vienai minutei, 10 ml metilpropanolio (3.7). Užkimšus mėgintuvėlius, 5 sekundes energingai plakama. Paliekama pastovėti vieną minutę ir centrifuguojama, kad susidarytų sluoksniai. Iš kiekvieno mėgintuvėlio paimama 5 ml viršutinio metilpropanolio sluoksnio ir supilama į atskiras 25 ml matavimo kolbas, praskiedžiama iki žymės etanoliu (3.10) ir sumaišoma (T, A ir B ekstraktai). 5.3. Fluorescencijos matavimas Matuojama esant tokiam bangų ilgiui, kuriame fluorimetras optimaliai reaguoja į tiochromo fluorescenciją. Apšvitinama apie 365 nm ilgio banga. Naudojant T ekstraktą, prietaisas nustatomas nuliui. Išmatuojamas A ir B ekstraktų fluorescencijos intensyvumas. 6. Rezultatų apskaičiavimas Tiamino kiekis mėginyje mg/kg apskaičiuojamas pagal: c kurioje: a = A ekstrakto (vidinis etalonas) fluorescencijos intensyvumas; b = B ekstrakto (mėginio) fluorescencijos intensyvumas; c = mėginio masė g; d = tiamino kiekis μg, pridėtas prie mėginio (vidinis etalonas). Pakartojamumas Dviejų to paties mėginio lygiagrečiai atliktų analizių rezultatai turi nesiskirti daugiau kaip: 10 % santykine verte, kai kiekis mažesnis negu 500 mg/kg, ir 5 % santykine verte, kai kiekis lygus arba didesnis negu 500 mg/kg. 3. ASKORBO RŪGŠTIES IR DEHIDROASKORBO RŪGŠTIES (VITAMINO C) NUSTATYMAS 1. Tikslas ir taikymo sritis Taikant šį metodą, galima nustatyti visas askorbo ir dehidroaskorbo rūgštis (vitamino C) pašaruose, koncentratuose ir premiksuose. Nustatymo riba – 5 ppm. Produktai klasifikuojami į dvi grupes pagal numanomą vitamino C kiekį juose: A grupė: mažiau negu 10 g/kg; B grupė: 10 g/kg arba daugiau. 2. Metodo esmė Mėginys suspenduojamas praskiestame metafosforo rūgšties tirpale ir ekstrahuojamas chloroformu. Vandeninis sluoksnis paveikiamas 2,6-dichlorfenolio-indofenolio tirpalu, kad askorbo rūgštis virstų dehidroaskorbo rūgštimi, ir po to paveikiama 2,4-dinitrofenilhidrazino tirpalu. Susidaręs hidrazonas ekstrahuojamas etilacetato, ledinės acto rūgšties ir acetono mišiniu. Tirpalas chromatografuojamas kolonėlėje su silikageliu, eliuatas išgarinamas sausai ir likutis ištirpinamas praskiestoje sieros rūgštyje. Tirpalo optinis tankis išmatuojamas spektrofotometru esant 509 nm bangos ilgiui. Analizuojant A grupės produktus, su eliuatu, gautu chromatografijos kolonėlėje, toliau atliekama plonasluoksnė chromatografija, kad būtų atskirtas hidrazonas. 3. Reagentai 3.1. 0,05 % L-askorbo rūgšties standartinis tirpalas: ištirpinama 50 ml L-askorbo rūgšties a.g. maždaug 20 ml metafosforo rūgšties tirpale (3.2) ir praskiedžiama vandeniu iki 100 ml. Ruošiama prieš pat naudojimą. 3.2. 10 % (m/v) metafosforo rūgšties tirpalas: susmulkinama grūstuvėje, ištirpinama vandenyje 200 g metafosforo rūgšties a.g. ir praskiedžiama vandeniu iki 200 ml. Laikoma 4 °C temperatūroje. Tirpalas patvarus vieną savaitę. 3.3. Chloroformas a.g. 3.4. 0,5 % (m/v) 2,6-dichlorfenolio-indofenolio a.g. tirpalas. Ruošiama prieš pat naudojimą. 3.5. Filtravimą greitinančios priemonės (S. ir S. Nr. 121 arba panašus). 3.6. 2 % (m/v) 2,4-dinitrofenilhidrazino tirpalas rūgštyje: 2 g 2,4-dinitrofenilhidrazino ištirpinama 100 ml praskiestos sieros rūgšties (25 ml sieros rūgšties a.g., ρ = 1,84 g/ml, praskiedžiama vandeniu iki 100 ml). Laikant žemoje temperatūroje, šio tirpalo savybės nekinta vieną savaitę. 3.7. Azotas arba 3.8. Anglies dioksidas. 3.9. Etilacetato a.g., ledinės acto rūgšties ir acetono a.g. mišinys: 96/2/2 tūrio vienetais. 3.10. Dichlormetano a.g. ir ledinės acto rūgšties mišinys: 97/3 tūrio vienetais. 3.11. Silikagelis, dalelių dydis nuo 0,05 iki 0,2 mm. 3.12. Stahl rūšies silikagelis H plonasluoksnei chromatografijai. 3.13. Praskiesta sieros rūgštis: įpilama105 ml vandens į 200 ml matavimo kolbą, sumaišoma iki reikiamo tūrio su sieros rūgštimi a.g., ρ = 1,84 g/ml. 3.14. Eliuentas plonasluoksnei chromatografijai: sumaišoma 75 ml dietileterio a.g., 25 ml etilacetato a.g. ir 4,0 ml 96 % (m/v) acto rūgšties a.g. Pakeičiama po 2-3 chromatografijų. 4. Įranga 4.1. 20 °C vandens vonia su termorele. 4.2. Centrifuga (3500 apsisukimų per minutę) su 40-50 ml mėgintuvėliais su šlifo kamščiais. 4.3. Sukamasis vakuuminis garintuvas su 250 ml kolbomis. 4.4. Stikliniai chromatografiniai vamzdžiai (ilgis: 100 mm, vidinis skersmuo: 20 mm) su sukepintu disku (pvz., Allihn vamzdžiai). 4.5. Spektrofotometras arba kolorimetras su 10 mm storio kiuvetėmis. 4.6. Įtaisas plonasluoksnei chromatografijai su silikageliu (3.12), padengtomis iki 0,5-0,6 mm storio sluoksniu plokštelėmis (tinka gatavos plokštelės). Plokštelės džiovinamos 2,5-3 valandas džiovinimo spintoje 120-130 oC temperatūroje. Paliekama atvėsti ir palaikoma eksikatoriuje bent 24 valandas prieš naudojimą. 4.7. Džiovinimo spinta, nustatyta 120-130 oC temperatūrai. 5. Darbo procedūra 5.1. Ekstrahavimas Į kiekvieną A ir B 250 ml matavimo kolbą (su šlifo kamščiais) įdedama po vienodą kiekį smulkiai sutrupinto mėginio, kuriame yra apie 200 μg vitamino C. Tik į A kolbą įpilama 0,4 ml standartinio tirpalo (3.1) ir lengvai plakant išmaišoma (vidinis standartas). Į kiekvieną kolbą, esant 4 °C temperatūrai, įdedama po 30 ml chloroformo (3.3) ir 25 ml metafosforo rūgšties tirpalo (3.2). Šiek tiek suplakama ir paliekama 10-15 minučių pastovėti. Įpilama 25 ml vandens, užkemšamos kolbos, 10 sekundžių energingai plakama ir paliekama pastovėti 10-15 minučių vandens vonioje (4.1). Centrifuguojama, kad vandeninis sluoksnis atsiskirtų nuo chloroforminio sluoksnio. Toliau tekste aprašytos operacijos su vandeniniais ekstraktais A (vidinis standartas) ir B atliekamos vienu metu. 5.2. Oksidacija Su pipete į reakcijos mėgintuvėlį su šlifo kamščiu įpilama 40 ml pagal 5.1 gauto viršutinio vandeninio tirpalo (šiek tiek drumzlino), įpilama 0,5-1 ml 2,6-dichlorofenolio-indofenolio tirpalo (3.4) ir išmaišoma. Susidaro raudona spalva, kuri turėtų išlikti bent 15 minučių. Po to įpilama apie 300 ml filtravimą greitinančių priemonių (3.5), suplakama ir filtruojama per sausą klostuotą filtrą. Filtratas nebūtinai turi būti skaidrus. 5.3. Reakcija su 2,4-dinitrofenilhidrazino ir hidrazono ekstraktu Su pipete įpilama 10 ml pagal 5.2 gauto filtrato į centrifugos mėgintuvėlį (4.2), įpilama 2 ml 2,4-dinitrofenilhidrazino tirpalo (3.6) ir išmaišoma. Per mėgintuvėlį greitai praleidžiama azoto (3.7) arba anglies dioksido (3.8) srovė, užkemšama ir panardinama maždaug 15 valandų (per naktį) į vandens vonią (4.1). Po to įpilama 3 ml vandens, 20 ml etilacetato, ledinės acto rūgšties ir acetono mišinio (3.9) ir apie 800 mg filtravimą greitinančių priemonių (3.5). Mėgintuvėlis užkemšamas, 30 sekundžių energingai plakamas ir centrifuguojamas. Į garinimo kolbą įpilama 15 ml viršutinio sluoksnio tirpalo ir garinama sumažintame slėgyje sukamajame garintuve (4.3), kol gaunamas aliejingas likutis. Likutis ištirpinamas 2 ml etilacetato, ledinės acto rūgšties ir acetono mišinio (3.9), dar kartą pakaitinus iki 50 °C, paliekama atvėsti, įpilama 10 ml dichlormetano ir ledinės acto rūgšties mišinio (3.10) ir sumaišoma. 5.4. Chromatografija kolonėlėje Chromatografijos vamzdis (4.4) pripildomas iki 30 mm padalos dichlormetano ir ledinės acto rūgšties mišinio (3.10). Suspenduojama (energingai plakant) 5 g silikagelio (3.11) 30 ml dichlormetano ir ledinės acto rūgšties mišinio (3.10); suspensija supilama į vamzdį. Kiek pastovėjus, suspaudžiama azotu (3.7) naudojant nedidelį slėgį. Į kolonėlę įpilama pagal 5.3 gautas tirpalas, kolba išskalaujama nedideliu kiekiu dichlormetano ir ledinės acto rūgšties mišinio (3.10), jis supilamas į kolonėlę, pripildoma pastarojo mišinio (3.10) ir toliau ji plaunama tuo pačiu mišiniu (3-4 kartus po maždaug 5 ml), kol gaunamas bespalvis eliuatas. Geltonai nusidažiusio eliuato dalis išpilama. Rausvoji zona eliuojama kolonėlės viršuje etilacetato, ledinės acto rūgšties ir acetono mišiniu (3.9), eliuatas surenkamas ir sausai išgarinamas. 5.4.1. Analizuojant A grupės produktus (vitamino C kiekis mažesnis negu 10 g/kg), likutis ištirpinamas 2,0 ml etilacetato, ledinės acto rūgšties ir acetono mišinio (3.9) ir nedelsiant chromatografuojama ploname sluoksnyje, kaip nurodyta 5.5 punkte. 5.4.2. Analizuojant B grupės produktus (vitamino C kiekis 10 g/kg ar daugiau), aliejingas likutis paveikiamas 4,0 ml praskiestos sieros rūgšties (3.13), energingai suplakama, kad likutis visiškai ištirptų, ir išmatuojamas optinis tankis, kaip nurodyta 5.6. 5.5. Plonasluoksnė chromatografija Toliau aprašomos operacijos atliekamos du kartus. Ant plokštelės (4.6) užpilama siaura juostele 0,5 ml tirpalo, gauto pagal 5.4.1. Naudojant plovimo tirpiklį (3.14), bent 20 minučių chromatografuojama kameroje, prisotintoje tirpiklio garų, kol aiškiai atsiskiria rausvos spalvos hidrazono sritis. Paliekama džiūti ore. Pasižymimos rausvos srities ribos, nugramdoma ta vieta mentele ir visi milteliai pernešami į chromatografijos kolonėlę (4.4). Plaunama vieną kartą 2 ml ir du kartus po 1,5 ml etilacetato, ledinės acto rūgšties ir acetono mišiniu (3.9) paeiliui. Eliuatas surenkamas į nedidelę kolbą (paskutinė dalis turi būti bespalvė). Sausai išgarinama, aliejingas likutis paveikiamas 4,0 ml praskiestos sieros rūgšties (3.13), energingai suplakama, kad likutis visiškai ištirptų ir išmatuojamas optinis tankis. 5.6. Optinio tankio matavimas Optinis tankis matuojamas spektrofotometru esant 509 nm bangos ilgiui, praėjus 20-30 minučių po nuosėdų ištirpimo sieros rūgštyje. Palyginamajam tirpalui naudojamas praskiestos sieros rūgšties tirpalas (3.13). 5.7. Tuščiasis bandymas Tuščiasis bandymas atliekamas laikantis tos pačios darbo procedūros, tik be mėginio. 6. Rezultatų apskaičiavimas Vitamino C kiekis mėginyje g vienam kg apskaičiuojamas pagal formulę: · 2 · 10d kurioje: a = tuščiojo mėginio optinis tankis; b = vidinio standarto tirpalo optinis tankis; c = mėginio tirpalo optinis tankis; d = mėginio masė gramais. Pakartojamumas Dviejų to paties mėginio lygiagrečiai atliktų analizių rezultatų skirtumas turi neviršyti: 10 % santykine verte, kai vitamino C kiekis mažesnis negu 10 g/kg, ir 5 % santykine verte, kai kiekis 10 g/kg ir daugiau. [1] 1 T. V. = 0,3 μg retinolio. [2] Pieno ir jo produktams skirtų pašarams, linkusiems aglomeruotis ar brinkti, 5.2 pirmame ir antrame paragrafuose nurodytas reagentų kiekis padvigubinamas. [3] Kai hidrolizė atliekama azoto aplinkoje, natrio askorbato pridėti nereikia. [4] Karotino kiekis gali būti nustatytas matuojant optinį tankį esant 450 nm bangos ilgiui;E 1 % 1 cm = 2600 --------------------------------------------------