KOMISIJOS ĮGYVENDINIMO SPRENDIMAS (ES) 2015/1554

2015 m. rugsėjo 11 d.

kuriuo nustatomos Direktyvos 2006/88/EB taikymo taisyklės dėl priežiūros ir diagnostinių metodų taikymo reikalavimų

(pranešta dokumentu Nr. C(2015) 6188)

(Tekstas svarbus EEE)

EUROPOS KOMISIJA,

atsižvelgdama į Sutartį dėl Europos Sąjungos veikimo,

atsižvelgdama į 2006 m. spalio 24 d. Tarybos direktyvą 2006/88/EB dėl gyvūnų sveikatos reikalavimų, taikomų akvakultūros gyvūnams ir jų produktams, ir dėl tam tikrų vandens gyvūnų ligų prevencijos ir kontrolės (1), ypač į jos 49 straipsnio 3 dalį, 50 straipsnio 4 dalį, 57 straipsnio b punktą ir 61 straipsnio 3 dalį,

kadangi:

PRIĖMĖ ŠĮ SPRENDIMĄ:

1 straipsnis

Dalykas

Šiame sprendime nustatytos taisyklės dėl:

2 straipsnis

Sąvokų apibrėžtys

Šiame sprendime vartojamų terminų apibrėžtys:

a) virusinė hemoraginė septicemija (VHS)– liga, kurią sukelia virusinės hemoraginės septicemijos virusas (VHSV), taip pat vadinamas Egtvedo virusu, priklausantis Rhabdoviridae šeimos Novirhabdovirus genčiai;

b) infekcinė hematopoetinė nekrozė (IHN)– liga, kurią sukelia infekcinės hematopoetinės nekrozės virusas (IHNV), priklausantis Rhabdoviridae šeimos Novirhabdovirus genčiai;

c) koi herpeso virusinė (KHV) infekcija– liga, kurią sukelia koi herpeso virusas (KHV), priklausantis Alloherpesviridae šeimai. Jo mokslinis pavadinimas – karpinių žuvų 3 herpeso virusas (CyHV-3);

d) infekcinė lašišų anemija (ILA)– liga, kuria susergama užsikrėtus HPR genotipo su iškrita labai polimorfinėje srityje lašišų anemijos virusu (ILAV), priklausančiu Orthomyxoviridae šeimos Isavirus genčiai;

e) Marteilia refringens sukelta infekcija– liga, kurią sukelia užkrėtimas Paramyxea pirmuonimis Marteilia refringens;

f) Bonamia ostreae sukelta infekcija– liga, kurią sukelia užkrėtimas Haplosporea pirmuonimis Bonamia ostreae;

g) baltmė (vitiligo)– liga, sukeliama baltmės sindromo viruso, kuris yra dvigrandės spiralės struktūros DNR virusas, priklausantis Nimaviridae šeimos Whispovirus genčiai.

3 straipsnis

Minimalūs reikalavimai dėl likvidavimo ir priežiūros programų

Valstybės narės užtikrina, kad I priede nustatytų taisyklių dėl ligų priežiūros ir likvidavimo programų, apsaugos zonų, mėginių ėmimo ir diagnostinių metodų ir II priede nustatytų konkrečių metodų bei išsamių procedūrų būtų laikomasi suteikiant, panaikinant arba grąžinant ligos neapimtos teritorijos statusą valstybei narei ar tam tikrai jos zonai arba teritoriniam vienetui dėl vienos arba daugiau išvardytų ligų.

4 straipsnis

Minimalūs reikalavimai dėl diagnostinių metodų ir konkrečių procedūrų

Valstybės narės užtikrina, kad I priede nustatytų kontrolės metodų ir II priede nustatytų konkrečių diagnostinių metodų bei išsamių procedūrų būtų laikomasi atliekant laboratorinius tyrimus siekiant patvirtinti arba paneigti kurios nors iš išvardytų ligų buvimą.

5 straipsnis

Minimalios kontrolės priemonės, taikomos izoliuojant išvardytomis ligomis užkrėstas teritorijas, ir minimalūs reikalavimai dėl izoliavimo priemonių panaikinimo valstybėse narėse, zonose arba teritoriniuose vienetuose, kurie nėra paskelbti išvardytų ligų neapimtomis teritorijomis

Valstybės narės užtikrina, kad I priede nustatytų minimalių kontrolės priemonių ir minimalių reikalavimų dėl izoliavimo priemonių panaikinimo būtų laikomasi taikant kontrolės priemones ir panaikinant taikytas izoliavimo priemones dėl vienos arba daugiau išvardytų ligų valstybėje narėje ar tam tikroje jos zonoje arba teritoriniame vienete, kuris nėra paskelbtas tų ligų neapimta teritorija.

6 straipsnis

Panaikinimas

Sprendimai 2001/183/EB, 2002/878/EB ir 2003/466/EB yra panaikinami.

7 straipsnis

Taikymo pradžios data

Šis sprendimas taikomas nuo 2016 m. balandžio 1 d.

8 straipsnis

Adresatai

Šis sprendimas skirtas valstybėms narėms.

(1) OL L 328, 2006 11 24, p. 14.

(2) 2001 m. vasario 22 d. Komisijos sprendimas 2001/183/EB, nustatantis mėginių ėmimo planus ir diagnostinius metodus, taikomus diagnozuoti ir patvirtinti tam tikras žuvų ligas, ir panaikinantis Sprendimą 92/532/EEB (OL L 67, 2001 3 9, p. 65).

(3) 2003 m. birželio 13 d. Komisijos sprendimas 2003/466/EB dėl zonavimo ir savanoriškos priežiūros, vykdomos, įtarus arba patvirtinus infekcinės lašišų anemijos (ILA) buvimą, kriterijų nustatymo (OL L 156, 2003 6 25, p. 61).

(4) 2002 m. lapkričio 6 d. Komisijos sprendimas 2002/878/EB, nustatantis mėginių ėmimo planus ir diagnostinius metodus moliuskų ligoms bonamiozei (Bonamia ostreae) ir marteiliozei (Marteilia refringens) aptikti ir patvirtinti (OL L 305, 2002 11 7, p. 57).

Ūkių ištekliai atkuriami tik po to, kai visi oficialiai paskelbti baltme (vitiligo) užkrėsti ūkiai ištuštinami, išvalomi, išdezinfekuojami ir juose paliekamas pūdymas pagal I.2.2.1 punkto c papunktį;

vieną kartą patikrinta vėžiagyvių sveikata; tuose ūkiuose, kuriuose gauti neigiami i papunktyje nurodytų tyrimų rezultatai, sveikata toliau tikrinama kartą per mėnesį tuo metų laiku, kai vandens temperatūra paprastai siekia aukščiausią metų temperatūros lygį, iki apsaugos zonos panaikinimo pagal I.2.2.1 punkto c papunktį.

dvejų metų laikotarpiu po to, kai baigtos taikyti a, b ir c papunkčiuose nurodytos priemonės, nepatvirtinta jokių užkrėtimo Bonamia ostreae atvejų, o tuo laikotarpiu kilę įtarimai dėl šios infekcijos paneigti pagal II.3 punkte nustatytas procedūras.

visų oficialiai paskelbtų užkrėstų ūkių arba moliuskų auginimo plotų ir visų kitų ūkių arba moliuskų auginimo plotų, kuriuose paliktas pūdymas, esančių nustatytose apsaugos ir priežiūros zonose, ištekliai atkuriami tiekiant moliuskus iš valstybių narių, zonų arba teritorinių vienetų, kuriuose nustatyta I kategorijos sveikatos būklė, susijusi su Bonamia ostreae infekcija. Ištekliai atkuriami tik po to, kai visi oficialiai paskelbti užkrėsti ūkiai ištuštinami, išvalomi, išdezinfekuojami ir juose paliekamas pūdymas pagal I.2.2 punkto c papunktį;

dvejų metų laikotarpiu po to, kai baigtos taikyti a, b ir c papunkčiuose nurodytos priemonės, nepatvirtinta jokių užkrėtimo Marteilia refringens atvejų, o tuo laikotarpiu kilę įtarimai dėl šios infekcijos paneigti pagal II.3 punkte nustatytas procedūras.

Ištekliai atkuriami tik po to, kai visi oficialiai paskelbti užkrėsti ūkiai ištuštinami, išvalomi, išdezinfekuojami ir juose paliekamas pūdymas pagal I.2.2 punkto c papunktį;

ILA virusas aptinkamas AT qPGR būdu ir, siekiant patvirtinti HPR genotipo iškritą, nustatoma HE geno seka; ir

ILA virusas aptinkamas AT qPGR būdu ir, siekiant patvirtinti HPR genotipo iškritą, nustatoma HE geno seka, ILA virusas taip pat aptinkamas audinių preparatuose naudojant specifinius antikūnus prieš šį virusą (t. y. taikant IHC metodą užfiksuotiems segmentams arba NFAT metodą audinių atspaudams);

atliekamas mėginių atrankos tyrimas AT qPGR būdu, įskaitant HE geno sekos nustatymą siekiant patvirtinti HPR genotipo iškritą;

dvejų metų laikotarpiu po to, kai baigtos taikyti a, b ir c papunkčiuose nurodytos priemonės, nepatvirtinta jokių užkrėtimo HPR genotipo su iškrita ILA virusu atvejų, o tuo laikotarpiu kilę įtarimai dėl ILA paneigti pagal II.3 punkte nustatytas procedūras.

Ūkių ištekliai atkuriami tik po to, kai visi oficialiai paskelbti užkrėsti ūkiai ištuštinami, išvalomi, išdezinfekuojami ir juose paliekamas pūdymas pagal I.2.2.1 punkto c papunktį;

vieną kartą patikrinta žuvų sveikata; tuose ūkiuose, kuriuose gauti neigiami i papunktyje nurodytų tyrimų rezultatai, sveikata toliau tikrinama kartą per mėnesį iki apsaugos zonos panaikinimo pagal I.2.2.1 punkto c papunktį;

Ūkių ištekliai atkuriami tik po to, kai visi oficialiai paskelbti KHV užkrėsti ūkiai ištuštinami, išvalomi, išdezinfekuojami ir juose paliekamas pūdymas pagal I.2.2.1 punkto c papunktį;

vieną kartą patikrinta žuvų sveikata; tuose ūkiuose, kuriuose gauti neigiami III.2 punkte nurodytų tyrimų rezultatai; sveikata toliau tikrinama kartą per mėnesį tuo metų laiku, kai vandens temperatūra paprastai siekia > 15 °C, iki apsaugos zonos panaikinimo pagal I.2.2.1 punkto c papunktį;

Ūkių ištekliai atkuriami tik po to, kai visi oficialiai paskelbti užkrėsti ūkiai ištuštinami, išvalomi, išdezinfekuojami ir juose paliekamas pūdymas pagal I.2.2.1 punkto c papunktį;

vieną kartą patikrinta žuvų sveikata: tuose ūkiuose, kuriuose gauti neigiami i papunktyje nurodytų tyrimų rezultatai; sveikata toliau tikrinama kartą per mėnesį tuo metų laiku, kai vandens temperatūra nesiekia 14 °C, išskyrus laikotarpį, kuriuo žuvų tvenkiniai ar žuvidės yra padengti ledu, iki apsaugos zonos panaikinimo pagal I.2.2.1 punkto c papunktį;

c) žemyninė zona– aiškiai apibrėžta geografinė teritorija vienos arba kelių valstybių narių teritorijos žemyninėje dalyje su vientisa hidrologine sistema, kurią sudaro vandens baseino dalys nuo jo ištakų iki natūralios arba dirbtinės užtvankos, per kurią vandens gyvūnai iš žemutinės vandens baseino dalies negali migruoti į viršų, visas vandens baseinas nuo ištakų iki žiočių arba keli vandens baseinai, įskaitant jų žiotis, per kurias susidaro vandens baseinų epidemiologinės sąsajos;

II PRIEDAS

IŠSAMŪS DIAGNOSTINIAI METODAI IR PROCEDŪROS

I. Įžanga

Šiame priede nustatytos išsamios diagnostinių metodų taikymo procedūros atliekant laboratorinį tyrimą pagal šio sprendimo I priede nustatytas likvidavimo ir priežiūros programas ir siekiant patvirtinti arba paneigti įtarimą dėl toliau nurodytų neegzotinių ligų, kurios išvardytos Direktyvos 2006/88/EB IV priedo II dalyje (toliau – išvardytos ligos), pagal direktyvos 57 straipsnio b punktą:

1. Virusinė hemoraginė septicemija (VHS) 1 dalis 2. Infekcinė hematopoetinė nekrozė (IHN) 1 dalis 3. Koi herpeso virusinė (KHV) infekcija 2 dalis 4. Infekcinė lašišų anemija (ILA) 3 dalis 5. Marteiliozės (Marteilia refringens) infekcija 4 dalis 6. Bonamiozės (Bonamia ostreae) infekcija 5 dalis 7. Baltmė (vitiligo) 6 dalis

II. Sąvokų apibrėžtys

Šiame priede gabenimo terpe vadinama ląstelių kultūros terpė, į kurios 1 ml dėta 10 % veršelio serumo ir 200 TV penicilino, 200 μg streptomicino ir 200 μg kanamicino arba kitų patvirtinto veiksmingumo antibiotikų.

1 DALIS

INFEKCINĖS HEMATOPOETINĖS NEKROZĖS (IHN) IR VIRUSINĖS HEMORAGINĖS SEPTICEMIJOS (VHS) PRIEŽIŪROS IR BUVIMO PATVIRTINIMO IŠSAMŪS DIAGNOSTINIAI METODAI IR PROCEDŪROS

I. VHS ir IHN priežiūros diagnostiniai metodai ir procedūros

Imant mėginius ir atliekant laboratorinį tyrimą, kai siekiama gauti arba išlaikyti ligos (IHN arba VHS) neapimtos teritorijos statusą, kaip nustatyta I priedo 1 dalies I skirsnyje, to paties priedo 1 dalies II.1 ir II.2 punktuose nustatytais diagnostiniais metodais, taikomi tolesniuose I.1–I.6 punktuose išsamiai aprašyti diagnostiniai metodai ir procedūros.

I.1. Žuvų mėginių paruošimas ir gabenimas

I.1.1. Audiniai virusologiniam ląstelių kultūros tyrimui

Organų, kuriuos reikia ištirti, dalys prieš išgabenant arba perduodant laboratorijai išimamos iš žuvies steriliais skrodimo įrankiais ir įdedamos į sterilius plastikinius mėgintuvėlius, į kuriuos įpilta gabenimo terpės.

Virusologiniam tyrimui ląstelių kultūroje ir AT qPGR metodu tinkamos žuvies medžiagos kiekis priklauso nuo žuvies dydžio. Taigi, mėginiams imami šie audiniai: visa lerva su trynio maišeliu (kūno ilgis < 4 cm), vidaus organai, įskaitant inkstus (kai žuvies kūno ilgis 4–6 cm), o kai žuvys didesnės, imami inkstai, blužnis, širdis ir (arba) galvos smegenys; iš veisimui skirtų žuvų neršto metu paimama kiaušidžių skysčio.

Kiaušidžių ar sėklidžių skystį arba organų gabalėlius, paimtus iš daugiausia 10 žuvų, galima dėti į vieną sterilų mėgintuvėlį, į kurį įpilta bent 4 ml gabenimo terpės ir iš kurių sudaromas vienas bendras mėginys. Kiekvieno mėginio audiniai kartu turi sverti ne mažiau kaip 0,5 g.

Virusologinį ląstelių kultūros tyrimą būtina pradėti kuo greičiau, ne vėliau kaip per 48 valandas po mėginių paėmimo. Išimtiniais atvejais virusologinį tyrimą galima pradėti vėliausiai per 72 valandas po to, kai surinkta medžiaga, su sąlyga, kad tyrimui skirta medžiaga būtų apsaugota naudojant gabenimo terpę ir kad ją gabenant būtų įmanoma laikytis reikalavimų dėl temperatūros.

I. 1.2. Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininės reakcijos (AT PGR arba AT qPGR) analizei imami mėginiai

Žuvų mėginiai I.1.1 punkte aprašyta tvarka paimami steriliu instrumentu ir įdedami į sterilų plastikinį mėgintuvėlį, į kurį įpilta gabenimo terpės. Į vieną mėgintuvėlį galima dėti daugiausia 10 žuvų audinių mėginius, iš kurių bus sudarytas vienas bendras mėginys. Tačiau tuo atveju, kai naudojamas mažas pasėlio kiekis, galima naudoti daugiausia penkių žuvų audinius. Kitu atveju mėginius galima sujungti naudojant RNR stabilizavimo reagentus, kaip antai 0,2 g audinio/ml reagentą pagal gamintojų rekomendacijas, nors kiekviena žuvis turi būti apdorojama atskirai ir mėginiuose jų sujungti negalima, nes RNR išskyrimui naudojamas nedidelis medžiagos kiekis.

Į laboratoriją galima siųsti ir visą žuvį.

I.2. Žuvų mėginių siuntimas

Mėgintuvėliai su ląstelėms auginti arba AT PGR ar AT qPGR analizei skirtais žuvų audiniais gabenimo terpėje sudedami į izoliuotas talpyklas, kaip antai polistireno dėžes storomis sienelėmis, kartu įdedant pakankamai ledo arba kitos panašaus aušinamojo poveikio aušinimo terpės, kad būtų užtikrinta, jog mėginiai į laboratoriją bus gabenami atšaldyti. Tačiau būtina stengtis mėginių neužšaldyti. Mėginio temperatūra gabenimo metu niekada neturi viršyti 10 °C, o gavus gabenimo dėžę joje vis dar turi būti ledo arba vienas ar keli iš dalies arba visiškai užšalę šaldymo blokai.

Į laboratoriją galima siųsti visą žuvį, jei ją gabenant įmanoma laikytis pirmoje pastraipoje nurodytų reikalavimų dėl temperatūros. Visa žuvis suvyniojama į sugeriamąjį popierių ir galiausiai gabenama plastikiniame maiše. Galima gabenti ir gyvas žuvis.

I.3. Papildomos diagnostikai skirtos medžiagos rinkimas

Jei diagnostikos laboratorija sutinka, galima rinkti ir kitus žuvų audinius ir juos ruošti papildomiems tyrimams.

I.4. Mėginių paruošimas ląstelių kultūros tyrimui ir AT qPGR

I.4.1. Užšaldymas išimtiniais atvejais

Jei kyla praktinių sunkumų, dėl kurių mėginių neįmanoma apdoroti per 48 valandas po to, kai surinkti žuvų audiniai, gali būti tinkama užšaldyti audinių pavyzdžius gabenimo terpėje – 20 °C arba žemesnėje temperatūroje ir atlikti virusologinį tyrimą per 14 dienų. Tačiau prieš tyrimą audiniai užšaldomi ir atšildomi tik vieną kartą. Dokumentuose būtina išsamiai užrašyti priežastis, dėl kurių žuvų audinių mėginiai kiekvienu atveju buvo užšaldyti.

I.4.2. Organų homogenizavimas

Laboratorijoje žuvų audiniai mėgintuvėliuose turi būti visiškai homogenizuoti smulkintuvu, maišytuvu arba grūstuvu piestoje su steriliu smėliu ir tada suspenduoti naudotoje gabenimo terpėje.

Jei mėginį sudaro visa žuvis, trumpesnė nei 4 cm, ji susmulkinama steriliomis žirklėmis arba skalpeliu, prieš tai pašalinus kūno dalį, esančią už žarnos angos. Jei mėginį sudaro visa žuvis, kurios kūno ilgis 4–6 cm, surenkami visi vidaus organai, įskaitant inkstus. Jeigu mėginį sudaro visa žuvis, ilgesnė nei 6 cm, audinių pavyzdžiai imami taip, kaip apibūdinta I.1 punkte. Audinių pavyzdžiai susmulkinami steriliomis žirklėmis arba skalpeliu, homogenizuojami šio punkto pirmoje pastraipoje aprašytu būdu ir suspenduojami gabenimo terpėje.

Galutinis audinio medžiagos ir gabenimo terpės santykis laboratorijoje turi būti patikslintas iki 1:10.

I.4.3. Homogenato centrifugavimas

Homogenatas 15 minučių centrifuguojamas 2 000–4 000 × g šaldomoje centrifugoje, 2–5 °C temperatūroje; taip gaunamas supernatantas, kurį galima apdoroti antibiotikais 4 valandas 15 °C temperatūroje arba per naktį 4–8 °C temperatūroje. Jei mėginys atgabentas gabenimo terpėje, supernatanto antibiotikais apdoroti nebūtina.

Jei dėl praktinių sunkumų, pvz., inkubatoriaus gedimo ar dėl ląstelių kultūrų kilusių problemų, ląstelių neįmanoma inokuliuoti per 48 valandas po to, kai surinkti žuvų audinių mėginiai, galima užšaldyti supernatantą – 80 °C temperatūroje; tokiu atveju galima atlikti virusologinį tyrimą per 14 dienų.

Jei gautas supernatantas per 48 valandas po to, kai paimti mėginiai, užšaldomas iki – 80 °C temperatūros, jį virusologiniam tyrimui galima pakartotinai panaudoti tik vieną kartą.

Prieš inokuliuojant ląsteles supernatantas lygiomis dalimis sumaišomas su tinkamai atskiestų imuninių serumų, veikiančių prieš vietinės kilmės serologinių tipų infekcinės kasos nekrozės (IKN) virusus, mišiniu ir inkubuojamas bent vieną valandą 15 °C arba ilgiausiai 18 val. 4 °C temperatūroje. Atliekant 50 % plokštelių neutralizacijos testą imuninio serumo titras turi būti bent 1/2 000.

Visus pasėlius apdorojant IKN viruso imuniniu serumu siekiama išvengti citopatinio efekto (CPE) dėl IKN viruso buvimo inokuliuotose ląstelių kultūrose. Taip sutrumpėja virusologinių tyrimų trukmė ir sumažėja atvejų, kai pastebėtą citopatinį efektą reikėtų laikyti potencialiu VHS arba IHN viruso buvimo požymiu.

Gavus mėginius iš gamybos vienetų, laikomų neužkrėstais IKN, pasėlių imuniniu serumu dėl IKN viruso galima neapdoroti.

I.4.4. Mėginių paruošimas pagal AT PGR ir AT qPGR grindžiamos priežiūros programas

Jei mėginiai sudėti į gabenimo terpę, atliekama I.4.2 ir I.4.3 punktuose nurodyta procedūra. Po centrifugavimo gaunamas supernatantas ir iš jo išskiriama RNR. Jei tolesnio tyrimo iškart po centrifugavimo atlikti nenumatoma, mėginiai iškart užšaldomi – 20 °C ar žemesnėje temperatūroje.

Ruošiant analizei RNR stabilizavimo reagente užkonservuotus žuvų audinius, tolesni darbai atliekami per toliau nurodytus terminus priklausomai nuo to, kokioje temperatūroje laikomi mėginiai:

kai mėginiai laikomi 37 °C temperatūroje – viena diena;

kai mėginiai laikomi 25 °C temperatūroje – viena savaitė;

kai mėginiai laikomi 4 °C temperatūroje – vienas mėnuo;

kai mėginiai laikomi – 20 °C temperatūroje – neribotą laiką.

Sujungti bendri mėginiai RNR stabilizavimo reagente tvarkomi taip pat, kaip ir pavieniai RNR stabilizavimo reagente užkonservuoti mėginiai. Naudojant RNR stabilizavimo reagente sujungtus bendrus mėginius, mėginio kiekis neturi viršyti RNR išskyrimo priemonių rinkinių gamintojo rekomenduojamo kiekio naudojant tokius rinkinius, kaip antai „RneasyMini“ („Qiagen“) ar pan. Jei didesni mėginiai sujungiami, ekstrahavimo rinkinių ar metodai turi atspindėti šį sujungimą.

RNR stabilizavimo reagentuose užkonservuoti mėginiai nenaudojami ląstelėms auginti.

I.4.5. AT qPGR naudojamų mėginių sujungimas

Kadangi AT qPGR metodo pagal nustatytus protokolus jautris yra panašus arba dar didesnis negu ląstelių auginimo metodų, gali būti tinkama naudoti supernatantą iš homogenizuotos žuvų audinių medžiagos, gautos kartu sudėjus daugiausia 10 žuvų organus į PGR skirtą ląstelių kultūros terpę. Tačiau kadangi PGR naudojama kur kas mažiau pasėlio negu auginant ląsteles, prieš sujungiant DNR išskyrimui skirtą medžiagą visi žuvų audiniai turi būti kruopščiai homogenizuoti.

Tas pats principas taikomas ir tada, kai surinkti mėginiai laikomi RNR stabilizavimo reagentuose. Tačiau tokiu atveju dažnai sunku viename mėgintuvėlyje surinkti tipinę medžiagą iš žuvų, kurių gali būti iki 10, todėl žuvų skaičius bendrame mėginyje sumažinamas nuo 5 iki 2.

I.5. Virusologinis ląstelių kultūros tyrimas

I.5.1. Ląstelių kultūros ir terpės

Melsvažiaunių saulešerių mailiaus ląstelių linijos -2 (BF-2) arba vaivorykštinio upėtakio lytinių liaukų ląstelių linijos -2 (RTG-2) ir Epithelioma papulosum cyprini (EPC) arba juodųjų drūtagalvių rainių (FHM) ląstelės auginamos 20–30 °C temperatūroje tinkamoje terpėje, t. y. minimalioje pagrindinėje terpėje Eagle MEM arba modifikuotuose jos variantuose, papildomai įdėjus 10 % galvijų vaisiaus serumo ir standartinės koncentracijos antibiotikų.

Kai ląstelės auginamos uždengtuose indeliuose, į terpę įpilama hidrokarbonato buferinio tirpalo. Auginant ląsteles atviruose induose į terpę galima įpilti tris(hidroksimetil)aminometan-HCl (Tris-HCl) (23 mM) ir natrio hidrokarbonato (6 mM) buferinio tirpalo. Terpės pH turi būti 7,6 ± 0,2.

Žuvų audinių medžiaga inokuliuojamos ląstelių kultūros, kai įmanoma, turėtų būti sudarytos iš jaunų, paprastai vienos dienos ląstelių kultūros monosluoksnių; tačiau gali būti tinkama naudoti 4–48 val. amžiaus ląsteles. Ląstelės inokuliavimo metu turi būti aktyviai augančios.

I.5.2. Ląstelių kultūrų inokuliavimas

Ląstelių kultūros inokuliuojamos antibiotikais apdorota organų suspensija atskiedžiant dviem skirtingais santykiais, t. y. praskiedžiant pirmą kartą ir papildomai iki 1:10; taip, siekiant išvengti homologinės interferencijos, gaunamos galutinės audinio medžiagos koncentracijos ląstelių kultūros terpėje santykiu 1:100 ir 1:1 000. Inokuliuojamos bent dviejų linijų ląstelės, kaip nurodyta I.5.1 punkte. Pasėlio dydžio ir ląstelių kultūros terpės tūrio santykis turi būti apie 1:10.

Kiekvienos koncentracijos atskiestam mėginiui ir kiekvienai ląstelių linijai reikalingas bent apie 2 cm2 dydžio ląstelių plotas (tam tinka viena duobutė 24 duobučių laboratorinėje plokštelėje, skirtoje ląstelių kultūroms auginti). Kai įmanoma, reikia naudoti laboratorines plokšteles.

I.5.3. Ląstelių kultūrų inkubavimas

Inokuliuotos ląstelių kultūros 7–10 dienų inkubuojamos 15 °C temperatūroje. Jeigu ląstelių kultūros terpės spalva pasikeičia iš raudonos į geltoną (tai reiškia, kad terpė parūgštėjo), pH tikslinamas įpilant sterilaus hidrokarbonato tirpalo ar lygiaverčio poveikio medžiagų, kad būtų užtikrintas ląstelių imlumas viruso užkratui.

Bent kas šešis mėnesius arba jei įtariamas ląstelių imlumo užkratui sumažėjimas, atliekamas užšaldytų VHS ir IHN virusų atsargų titravimas tikrinant ląstelių kultūrų imlumą užkratui. Jei įmanoma, atliekama III skirsnyje nurodyta procedūra.

I.5.4. Mikroskopija

Inokuliuotos ląstelių kultūros reguliariai, bent tris kartus per savaitę, apžiūrimos 40–150 kartų didinančiu mikroskopu siekiant pastebėti citopatinį efektą. Pastebėjus citopatinį efektą iškart pradedamos viruso identifikavimo procedūros pagal I.6 punktą.

I.5.5. Persėjimas

Jei citopatinis efektas nepasireiškia po pirmųjų 7–10 inkubavimo dienų, atliekamas persėjimas į naujas ląstelių kultūras, kurių ląstelių užimamas plotas turi būti toks pats kaip ir pradinės kultūros.

Po inokuliavimo praėjus 7–10 dienų sujungiami daliniai terpės (supernatanto) mėginiai iš visų kultūrų arba laboratorinės plokštelės duobučių, kuriose laikoma pradinė kultūra, pagal ląstelių liniją. Tada šiais bendrais mėginiais inokuliuojamos homologinių ląstelių kultūros, neatskiedžiant ir atskiedžiant santykiu 1:10 (galutinis supernatanto atskiedimas atitinkamai turi būti 1:10 ir 1:100), kaip apibūdinta I.5.2 punkte. Kitu atveju daliniais mėginiais, kuriuose yra 10 % pradinės kultūros terpės, tiesiogiai inokuliuojama laboratorinės plokštelės duobutė su naujų ląstelių kultūra (persėjimas iš duobutės į duobutę). Prieš inokuliavimą gali būti atliekamas išankstinis inkubavimas tinkamu santykiu atskiedus tirpalus IKN virusui skirtu imuniniu serumu, kaip apibūdinta I.4.3 punkte.

Tada inokuliuotos kultūros 7–10 dienų inkubuojamos 15 °C temperatūroje ir patikrinamos pagal I.5.4 punktą.

Jei toksinis citopatinis efektas pasireiškia per pirmas tris inkubavimo dienas, persėjimas atliekamas šiame etape, tačiau tokiu atveju ląstelės inkubuojamos septynias dienas, dar kartą persėjamos ir inkubuojamos dar septynias dienas. Jei toksinis citopatinis efektas pasireiškia po trijų dienų, ląstelės persėjamos vieną kartą ir inkubuojamos iš viso 14 dienų po pradinio inokuliavimo. Paskutines septynias inkubavimo dienas neturi būti toksinio poveikio požymių.

Jei užkrėtimas bakterijomis įvyksta nepaisant apdorojimo antibiotikais, prieš persėjimą atliekamas centrifugavimas 15–30 minučių 2 000–4 000 × g 2–5 °C temperatūroje arba supernatantas perkošiamas per 0,45 μm dydžio akučių filtrą, arba atliekamos abi šios procedūros (naudojama nedidelio molekulinio svorio baltymus prijungianti membrana). Be to, persėjimas atliekamas pagal tas pačias procedūras kaip ir toksinio citopatinio efekto atveju, kaip aprašyta šio punkto ketvirtoje pastraipoje.

Jei citopatinio efekto nėra, galima patvirtinti, kad tyrimo rezultatas yra neigiamas.

I.6. Viruso identifikavimas

Nustačius citopatinį efektą ląstelių kultūroje, jos terpė (supernatantas) paimama ir ištiriama taikant vieną arba kelis iš šių metodų: imunofermentinę analizę (IFA), imunofluorescencinį (IF) metodą, neutralizacijos metodą, AT PGR arba AT qPGR. Jei šiais tyrimais nepavyksta patikimai identifikuoti viruso per vieną savaitę, supernatantas siunčiamas nedelsiant identifikuoti į nacionalinę etaloninę laboratoriją arba ES etaloninę laboratoriją, kurioje atliekami žuvų ligų tyrimai, kaip nurodyta Direktyvos 2006/88/EB VI priede.

I.6.1. Imunofermentinė analizė (IFA)

Identifikuojant viruso izoliatą atliekama daugiasluoksnė imunofermentinė analizė (IFA) su dvejopais antikūnais. Mikrotitravimo plokštelės padengiamos į kiekvieną duobutę įpilant po 50 μl (0,9 pg) patvirtintos kokybės A baltymu išgrynintų imunoglobulinų (Ig) iš triušio imuninių serumų, veikiančių prieš INH arba VHS virusą, atskiestų karbonato buferiniu tirpalu (pH – 9,6), į kurį dėta 15 mM natrio azido, ir nuo 18 valandų iki 2 savaičių inkubuojamos 4 °C temperatūroje.

Skiedimo lėkštelėje kiekvienas mėginys, į kurį dėta 1 % „Triton“ X-100, ir teigiami kontroliniai mėginiai atskiedžiami buferiniu tirpalu (t. y. fosfato buferiniu druskų tirpalu (PBS)-T-BSA, 1 % BSA) keturiomis skirtingomis koncentracijomis: neskiestas mėginys, 1:4, 1:16 ir 1:64 santykiu atskiestas mėginys. IFA plokštelės nuplaunamos fosfato buferiniu druskų tirpalu, į kurį dėta 0,05 % „Tween-20“ (PBS-T), ir po 50 μl kiekvienos koncentracijos atskiesto mėginio iš skiedimo lėkštelės paskirstoma ant nuplautos ir, kaip pirmiau aprašyta, padengtos IFA plokštelės.

Tada IFA plokštelės 30 minučių inkubuojamos 37 °C temperatūroje. Po to plokštelės nuplaunamos ir 30 minučių inkubuojamos 37 °C temperatūroje su specifiniais monokloniniais antikūnais (t. y. identifikuojant VHS virusą – Mab IP5B11, identifikuojant IHN virusą – Hyb 136–3). Ant IFA plokštelės paskirstoma po 50 μl triušio antikūnų veikiamų pelės antikūnų krienų peroksidazės (HRP) konjugato, 1:1 000 santykiu praskiesto PBS-T-BSA.

Galiausiai po pakartotinio plovimo, į kiekvieną plokštelės duobutę įpylus po 50 μl orto-fenilendiamino (OPD), vyksta reakcijos. IFA plokštelės 20 minučių inkubuojamos tamsoje, kambario temperatūroje ir reakcija sustabdoma į kiekvieną duobutę įpilant po 100 μl 0,5 M H2SO4.

Sugerties geba stebima IFA analizatoriumi (bangų ilgis 492 ir 620 nm). Mėginiai pripažįstami teigiamais arba neigiamais palyginus tyrimo rezultatus su teigiamų ir neigiamų kontrolinių mėginių sugerties vertėmis. Apskritai neigiamais laikomi tie mėginiai, kurių bendra sugerties geba (A) < 0,5 (neatskiestos medžiagos), įtartinais – mėginiai, kurių A vertės yra nuo 0,5 iki 1,0, o teigiamais – mėginiai, kurių A vertės > 1,0.

Vietoj šiame punkte nurodytų variantų galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo IFA variantus.

I.6.2. Imunofluorescencinis (IF) tyrimas

Į sąrašą įtrauktų VHS ir IHN virusų užkratas identifikuojamas jais užkrečiant ląsteles 96 duobučių „Black“ plokštelėse, įprastose 24 duobučių plokštelėse arba naudojant dengiamąsias stiklo plokšteles su 24 duobučių plokštelėmis. Kai IHN, VHS ar abu virusai identifikuojami jais užkrečiant ląsteles dengiamųjų stiklo plokštelių paviršiuje, taikomas toks protokolas:

a) dengiamosios plokštelės užsėjamos ląstelėmis tokiu tankiu, kad nuo auginimo pradžios praėjus 24 valandoms jos ištisai dengtų 60–90 % ploto. Kai įmanoma, šiam tikslui reikėtų naudoti EPC ląsteles, nes jos tvirtai prikimba prie stiklo paviršiaus, tačiau galima naudoti ir kitas ląstelių linijas, kaip antai BF-2, RTG-2 arba FHM. Naudojant 150 μl ląstelių kultūros supernatanto, atskiesto dviem skirtingais santykiais (1:10 ir 1:1 000), inokuliuojamos vienos dienos monosluoksnio ląstelių kultūros po du porinius mėginius ir 24 valandas inkubuojama 15 °C temperatūroje;

b) po to ląstelių kultūros terpė pašalinama ir užkrėsti ląstelių monosluoksniai užfiksuojami 0,5 ml ledo šaltumo vandeninio acetono tirpalo (80 %, tūrio proc.). Fiksuojama po traukos gaubtu 15 minučių kambario temperatūroje, tada acetono tirpalas pašalinamas ir dengiamieji stikleliai bent 30 minučių džiovinami ore. Šiame etape plokštelės apdorojamos iškart arba laikomos – 20 °C temperatūroje iki tolesnio naudojimo;

c) specifiniai monokloniniai antikūnai (t. y. identifikuojant VHS virusą – MAb IP5B11, identifikuojant IHN virusą – Hyb 136–3) atskiedžiami 0,01 M PBS-T (pH – 7,2) tokiu santykiu, kokį rekomenduoja tų monokloninių antikūnų tiekėjas; po 50–100 μl įpilama į kiekvieną užfiksuotos monokultūros duobutę ir plokštelės vieną valandą inkubuojamos didelio drėgnio kameroje 37 °C temperatūroje;

d) dengiamieji stikleliai atsargiai tris kartus nuplaunami fosfato buferiniu druskų tirpalu, į kurį dėta 0,05 % „Tween-20“ (PBS-T); po paskutinio plovimo buferinis tirpalas turi būti visiškai pašalintas. Po to ląstelės vieną valandą inkubuojamos 37 °C temperatūroje su fluoresceino izotiocianatu (FITC) arba tetrametilrodamin-5-(ir-6-) izotiocianatu (TRITC) konjuguotais antikūnais, kaip pirminį antikūną panaudojus pelių imunoglobuliną, atskiedus pagal gamintojo nurodymus, tada dar kartą nuplaunamos PBS-T ir išdžiovinamos. Nudažytos kultūros uždedamos ant stiklo plokštelių naudojant glicerolio druskos tirpalą ir apžiūrimos ultravioletiniu (UV) mikroskopu. Tam naudojamas 10 ar 12 kartų didinantis okuliaras ir 25 ar 40 kartų didinantis objektyvas, kurio apertūros skaičius atitinkamai > 0,7 ir > 1,3.

Priklausomai nuo naudojamų ląstelių kultūrų, fiksavimo ir kontrolinės kokybės antikūnų galima taikyti ir kitus patvirtinto panašaus efektyvumo IF metodus.

I.6.3. Neutralizacija

Iš surinkto supernatanto ląstelės pašalinamos centrifuguojant (2 000–4 000 × g) arba filtruojant per membraninį (0,45 μm dydžio akučių) filtrą su nedidelio molekulinio svorio baltymus prijungiančia membrana, tada supernatantas 1:100 ir 1:10 000 santykiu praskiedžiamas ląstelių kultūros terpe.

Bent dviem skirtingais santykiais praskiesto supernatanto mėginiai sumaišomi ir inkubuojami 60 minučių 15 °C temperatūroje lygiomis dalimis su šiais reagentais, kiekvienu iš jų atskirai:

a) serumu, kurio sudėtyje yra VHS viruso antikūno, specifinio tam tikrai grupei, praskiedžiama (tūrio) santykiu 1:50;

b) serumu, kurio sudėtyje yra IHN viruso antikūno, specifinio tam tikrai grupei, praskiedžiama (tūrio) santykiu 1:50;

c) vietinės kilmės serologinių tipų IKN viruso imuninių serumų mišiniu, praskiedžiama (tūrio) santykiu 1:50;

d) gryna terpe (teigiamas kontrolinis mėginys).

Mažiausiai dvi ląstelių kultūros inokuliuojamos naudojant po 50 μl kiekvieno viruso supernatanto serumo mišinio kiekvienai ir inkubuojamos 15 °C temperatūroje. Citopatinio efekto pasireiškimas tikrinamas kaip aprašyta I. 5.4 punkte.

VHS viruso padermės ir izoliatai, kurie nereaguoja į neutralizacijos testus, identifikuojami taikant IF arba ELISA (IFA) metodus.

Vietoj šio tyrimo galima atlikti kitokius patvirtinto panašaus efektyvumo neutralizacijos tyrimus.

I.6.4. AT PGR, AT qPGR

I.6.4.1. Viruso RNR paruošimas

Visi darbai su RNR atliekami ant ledo; būtina mūvėti pirštines.

RNR išskiriama taikant fenolio-chloroformo metodą arba naudojant RNR giminingumo sukamąsias kolonėles pagal gamintojo nurodymus. Galima naudoti RNR išskyrimo priemonių rinkinius, kurie parduodami rinkoje ir kuriuos naudojant gaunama aukštos kokybės RNR, tinkama naudoti pagal AT PGR protokolus, kaip aprašyta tolesniuose punktuose.

RNR pakartotinai suspenduojama distiliuotame vandenyje be ribonukleazių (t. y. vandenyje, į kurį dėta 0,1 % dietilpirokarbonato) arba tinkamame eliuavimo buferiniame tirpale.

I.6.4.2. AT PGR

IHN virusui aptikti naudojami šie pradmenys:

tiesioginis pradmuo 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

atvirkštinis pradmuo 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Atliekami tokie ciklai (vieno etapo AT PGR): 1 ciklas: 30 minučių 50 °C temperatūroje; 1 ciklas: 2 minučių 95 °C temperatūroje; 30 ciklų: 30 sekundžių 95 °C temperatūroje, 30 sekundžių 50 °C temperatūroje, 60 sekundžių 72 °C temperatūroje; 1 ciklas: 7 minutės 72 °C temperatūroje; po to palaikoma 4 °C temperatūroje.

VHS virusui aptikti naudojami šie pradmenys:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Atliekami tokie ciklai (vieno etapo AT PGR): 30 minučių 50 °C temperatūroje, 15 minučių 95 °C temperatūroje, 35 ciklai po 30 sekundžių 94 °C temperatūroje, 30 sekundžių 55 °C temperatūroje ir 60 sekundžių 68 °C temperatūroje. Po to reakcijos produktas 7 minutes laikomas 68 °C temperatūroje.

AT PGR reakcijų produktų kiekis ir specifiškumas vertinamas gelio elektroforezės būdu naudojant 1,5 % agarozės gelį, į kurį dėta etidžio bromido, ir apžiūrint peršvietus ultravioletine (UV) šviesa. IHN viruso atveju galima apžiūrėti iki 693 bp PGR būdu gautą amplikoną. VHS viruso amplikono dydis – 505 bp.

PGR rezultatai gali priklausyti nuo to, kokiomis sąlygomis ji vyksta, t. y. atsižvelgiant į tai, koks termocikleris naudojamas, gali reikėti patikslinti šiluminio apdorojimo protokolus. Be to, galima gauti klaidingai teigiamų rezultatų dėl klaidingo pradmenų surišimo arba užteršimo laboratorijoje. Todėl, kad neliktų abejonių, reikia naudoti pakankamai tinkamų teigiamų ir neigiamų kontrolinių mėginių ir padaugintų genų sekų. Su VHS viruso pradmenimis BF-2 ląsteles reikia naudoti ypač atsargiai, nes šie pradmenys gali reaguoti su ląstelių linijos DNR arba RNR ir taip galima gauti klaidingai teigiamus panašaus dydžio rezultatus. Tiriant iš BF-2 ląstelių gautą supernatantą nustatoma bet kokių padaugintų PGR fragmentų genų seka.

I.6.4.3. VHS viruso nustatymas AT qPGR būdu

VHS viruso amplifikacijai naudojami šie pradmenys ir zondas:

Tiesioginis pradmuo: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

atvirkštinis pradmuo: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;

ir zondas: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

Vieno etapo AT qPGR

Kartu su kiekviena tyrimo plokštele reikia naudoti neigiamus šablono kontrolinius mėginius ir teigiamus kontrolinius mėginius. Ciklinio apdorojimo sąlygos: 30 minučių 50 °C temperatūroje, 15 minučių 95 °C temperatūroje, 40 ciklų po 15 sekundžių 94 °C temperatūroje, 40 sekundžių 60 °C temperatūroje, 20 sekundžių 72 °C temperatūroje; prireikus ciklas tikslinamas. Vietoj šio varianto galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo AT PGR arba AT qPGR variantus.

I.6.4.4. IHN viruso nustatymas AT qPGR būdu

IHN viruso amplifikacijai naudojami šie pradmenys ir zondas:

Tiesioginis pradmuo: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

atvirkštinis pradmuo: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;

ir zondas: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

Dviejų etapų AT qPGR

Kadangi tolesnė analizė priklauso nuo dviejų etapų amplifikacijos, reikia ypač atsargiai tvarkyti mėgintuvėlius nuo vienos reakcijos iki kitos, stengiantis jų neužteršti.

Ciklinio apdorojimo sąlygos (po atvirkštinės transkripcijos etapo): 2 minutės 50 °C temperatūroje, 10 minučių 95 °C temperatūroje, po to 40 ciklų po 15 sekundžių 95 °C temperatūroje ir 1 minutę 60 °C temperatūroje; prireikus ciklas tikslinamas.

Vietoj šio varianto galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo AT PGR arba AT qPGR variantus.

II. Išsamūs diagnostiniai metodai ir procedūros siekiant patvirtinti arba paneigti VHS, IHN ar abiejų virusų buvimą įtariamų šių ligų protrūkių atvejais

Kai reikia atlikti laboratorinį tyrimą pagal Direktyvos 2006/88/EB 57 straipsnio b punktą siekiant patvirtinti arba paneigti INH, VHS ar abi ligas I priedo 1 dalies II.3 punkte nustatytais diagnostiniais metodais, taikomi toliau išsamiai aprašyti diagnostiniai metodai ir procedūros:

a) įprastas viruso išskyrimas ir vėlesnė neutralizacija serumu, imunocheminis arba molekulinis viruso identifikavimas;

b) viruso aptikimas AT PGR arba AT qPGR būdu;

c) kiti diagnostiniai metodai, kaip antai netiesiogiai fluorescuojančių antikūnų tyrimas, imunofermentinė analizė, AT PGR, imunohistocheminis tyrimas.

II.1. Viruso išskyrimas įprastu būdu ir vėlesnis viruso identifikavimas

II.1.1. Mėginių atranka

Tyrimui atrenkama bent 10 žuvų, turinčių IHN arba VHS būdingų požymių.

II.1.2. Žuvų mėginių paruošimas ir gabenimas

Mėginiai, iš kurių virusas bus išskiriamas įprastu būdu, ruošiami ir gabenami pagal I.2 punkte aprašytus metodus ir procedūras.

II.1.3. Papildomos diagnostikai skirtos medžiagos rinkimas

Papildoma medžiaga virusui išskirti įprastu būdu renkama pagal I.3 punkte aprašytus metodus ir procedūras.

II.1.4. Mėginių paruošimas ląstelių kultūros tyrimui

Mėginiai ląstelių kultūros tyrimui, siekiant išskirti virusą įprastu būdu, ruošiami pagal I.4 punkte aprašytus metodus ir procedūras.

II.1.5. Virusologinis ląstelių kultūros tyrimas

Virusologinis tyrimas išskiriant virusą įprastu būdu atliekamas pagal I.5 punkte aprašytus metodus ir procedūras.

II.1.6. Viruso identifikavimas

Viruso identifikavimas išskiriant virusą įprastu būdu atliekamas pagal I.6 punkte aprašytus metodus ir procedūras.

II.2. Viruso aptikimas AT qPGR būdu

II.2.1. Mėginių atranka

Siekiant aptikti virusą AT qPGR būdu mėginiai atrenkami pagal I.1.2 punkte aprašytus metodus ir procedūras.

II.2.2. Žuvų mėginių paruošimas ir gabenimas

Siekiant aptikti virusą AT qPGR būdu mėginiai ruošiami ir gabenami pagal I.2 punkte aprašytus metodus ir procedūras.

II.2.3. Papildomos diagnostikai skirtos medžiagos rinkimas

Siekiant aptikti virusą AT qPGR būdu papildoma medžiaga diagnostikai renkama pagal I.3 punkte aprašytus metodus ir procedūras.

II.2.4. Mėginių paruošimas AT qPGR

Siekiant aptikti virusą AT qPGR būdu mėginiai ruošiami pagal I.6.4.1 punkte aprašytus metodus ir procedūras.

II.2.5. AT qPGR

Aptinkant virusą AT qPGR būdu reikia laikytis I.6.4.1, I.6.4.3 ir I.6.4.4 punktuose aprašytų metodų ir procedūrų.

II.3. Kiti diagnostiniai metodai

I.4.3 punkte aprašytu būdu paruoštą supernatantą galima naudoti atliekant imunofermentinę analizę (IFA), netiesiogiai fluorescuojančių antikūnų tyrimą (NFAT) arba AT PGR atitinkamai pagal I.6.1, I.6.2 arba I.6.4 punktą. Audinių medžiagą galima tirti ir kitais diagnostiniais metodais, kaip antai atlikti užšaldytų audinių atpjovų NFAT arba imunohistocheminiu metodu tirti formalinu užfiksuotus audinius. Kartu su šiais greitais tyrimais turi būti atliekamas virusologinis tyrimas pagal II punkto a arba b papunktį per 48 valandas po to, kai paimti mėginiai, jeigu:

a) gaunamas neigiamas rezultatas; arba

b) gaunamas teigiamas rezultatas tiriant medžiagą, kurioje aptinkamas pirmas IHN arba VHS atvejis.

III. Titravimo procedūra tikrinant ląstelių kultūrų imlumą užkratui

Atliekant titravimą siekiant patikrinti ląstelių kultūrų imlumą užkratui, kaip nurodyta I.5.3 punkte, reikia laikytis šio punkto tolesnėse pastraipose nurodytų procedūrų. Naudojami bent du VHS viruso izoliatai ir vienas IHN viruso izoliatas.

Izoliatai imami iš pagrindinių Europos Sąjungoje aptinkamų virusų grupių, t. y. VHS viruso atveju – vienas patogeniškas izoliatas, gautas iš gėlavandenio vaivorykštinio upėtakio, ir vienas jūrinis izoliatas, patogeniškas otui, o IHN viruso atveju – viena vaivorykštiniam upėtakiui Europos Sąjungoje patogeniška padermė. Reikia naudoti gerai žinomus izoliatus, gautus iš ES valstybių narių. Viruso partijos su mažu ląstelių kultūrų skaičiumi dauginamos ląstelių kultūrų mėgintuvėliuose; VHS virusui naudojamos BF-2 arba RTG-2 linijos ląstelės, o IHN virusui – EPC arba FHM linijos ląstelės. Naudojamoje ląstelių kultūros terpėje turi būti bent 10 % serumo. Inokuliuojant kultūras infekcijos pasikartojamumo koeficientas turi būti žemas (< 1).

Esant bendram citopatiniam efektui virusas koncentruojamas centrifuguojant ląstelių kultūros supernatantą 2 000 × g 15 minučių, sterilizuotas filtruojamas per 0,45 μm dydžio akučių membraninį filtrą ir išpilstomas į etiketėmis paženklintus kriostatinius mėgintuvėlius. Virusas laikomas – 80 °C temperatūroje.

Praėjus savaitei po užšaldymo, trys kiekvieno viruso kartotiniai buteliukai atitirpinami šaltame vandenyje ir titruojant tiriamos atitinkamos ląstelių linijos. Bent kas šešis mėnesius arba įtarus, kad ląstelių linijos imlumas virusui sumažėjo, reikia atitirpinti ir titruoti kiekvieną viruso izoliatą.

Titravimo procedūros turi būti išsamiai aprašytos ir kiekvieną kartą būtina laikytis tos pačios procedūros.

Titravimui iki galutinio atskiedimo naudojami ne mažiau kaip šeši kartotiniai mėginiai kiekviename skiedimo etape. Gauti titrai palyginami su pirmiau gautais titrais. Jei bet kurio iš trijų virusų izoliatų titras sumažėja 2 log arba daugiau, palyginti su pradiniu titru, ta ląstelių linija kontrolei nebenaudojama.

Jeigu laboratorijoje laikomos įvairios ląstelių linijos, kiekviena iš jų tiriama atskirai.

Užrašyti duomenys saugomi ne trumpiau kaip 10 metų.

2 DALIS

KOI HERPESO VIRUSINĖS (KHV) INFEKCIJOS PRIEŽIŪROS IR PATVIRTINIMO IŠSAMŪS DIAGNOSTINIAI METODAI IR PROCEDŪROS

I. Siekiant patvirtinti KHV infekciją arba paneigti dėl jos kilusius įtarimus taikomi išsamūs diagnostiniai metodai ir procedūros

Kai reikia atlikti laboratorinį tyrimą pagal Direktyvos 2006/88/EB 57 straipsnio b punktą siekiant patvirtinti KHV infekciją arba paneigti dėl jos kilusius įtarimus I priedo 2 dalies III skirsnyje nustatytais diagnostiniais metodais, taikomi šios dalies I.1–I.2 punktuose išsamiai aprašyti diagnostiniai metodai ir procedūros.

I.1. Žuvų mėginių paruošimas

Diagnostikos tikslais žuvis (gyvas arba paskerstas ir atskirai supakuotas sandariose steriliose talpose) arba, kitu atveju, užšaldytus žuvų organus ar organų gabalėlius, užkonservuotus (nuo 80 % stiprumo iki absoliutaus) etanolyje arba virusų mėginių gabenimo terpėje (jie turi būti apdoroti per 48 valandas po surinkimo), galima naudoti tyrimams įprastine PGR arba qPGR pagrįstais metodais.

Siekiant aptikti KHV tyrimams renkamos žuvų žiaunos ir inkstai; kaip papildomą atskirą mėginį galima pridėti žuvies blužnį, galvos smegenis ir žarnyną. Neatidėliotinais atvejais galima į vieną bendrą mėginį sudėti daugiausia penkių žuvų audinius.

Be to, kai kuriais atvejais galima imti ir gyvų žuvų mėginius, kaip antai kraują, žiaunų tepinėlius, mėginius žiaunų biopsijos būdu, gleivių nuograndas (taip galima naudoti labai vertingų žuvų mėginius tais atvejais, kai įtariama KHV infekcija).

I.1.1. DNR išskyrimas

DNR išskiriama pagal standartines procedūras.

Galima naudoti DNR išskyrimo priemonių rinkinius, kurie parduodami rinkoje ir kuriuos naudojant gaunama aukštos kokybės DNR, tinkama naudoti pagal I.2 punkte nurodytus protokolus.

I.2. Užkrato aptikimas ir identifikavimas polimerazės grandinine reakcija (PGR) grindžiamais metodais

I.2.1. KHV aptikimas qPGR būdu

Siekiant aptikti KHV qPGR būdu, naudojamas toks qPGR analizės priemonių rinkinys:

Tiesioginis pradmuo (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

atvirkštinis pradmuo (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

zondas (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Ciklinio apdorojimo sąlygos: 1 ciklas – 15 minučių 95 °C temperatūroje, po to 40 ciklų po 15 sekundžių 94 °C temperatūroje ir 60 sekundžių 60 °C temperatūroje. Kartu su kiekviena tyrimo plokštele reikia naudoti neigiamus šablono kontrolinius mėginius ir teigiamus kontrolinius mėginius. Vis dėlto vietoj šio varianto galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo qPGR variantus.

I.2.2. KHV aptikimas įprastos PGR būdu

Atliekama šiame punkte aprašyta analizė, kuria siekiama aptikti KHV timino kinazės (TK) geną. Tačiau vietoj to galima atlikti ir kitokio pobūdžio PGR analizes, kurios, kaip patvirtinta, specifiškumu ir jautriu prilygsta čia aprašytai analizei.

Tiesioginis pradmuo (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

atvirkštinis pradmuo (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Ciklinio apdorojimo sąlygos: 1 ciklas – 5 minutės 95 °C temperatūroje, po to 35 ciklai po 30 sekundžių 95 °C temperatūroje, 30 sekundžių 52 °C temperatūroje, 1 minutė 72 °C temperatūroje ir 1 ciklas 10 minučių 72 °C temperatūroje. Produkto dydis turėtų būti 409 bazių poros (bp).

PGR rezultatai gali priklausyti nuo to, kokiomis sąlygomis ji vyksta, t. y. atsižvelgiant į tai, koks termocikleris naudojamas, gali reikėti patikslinti šiluminio apdorojimo protokolus. Be to, galima gauti klaidingai teigiamų rezultatų dėl klaidingo pradmenų surišimo arba užteršimo. Kartu su kiekviena tyrimo plokštele reikia naudoti neigiamus šablono kontrolinius mėginius ir teigiamus kontrolinius mėginius. Vis dėlto vietoj šio varianto galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo PGR variantus.

Pirmą kartą aptikus virusą tam tikrame plote, jo aptikimas patvirtinamas nustatant genų seką arba nusiunčiant jo mėginį nedelsiant identifikuoti į nacionalinę etaloninę laboratoriją arba ES etaloninę laboratoriją, kurioje atliekami žuvų ligų tyrimai, kaip nurodyta Direktyvos 2006/88/EB VI priede.

II. KHV infekcijos priežiūrai taikomi išsamūs diagnostiniai metodai ir procedūros

Imant mėginius ir atliekant laboratorinį tyrimą, kai siekiama gauti arba išlaikyti tam tikros žuvų sveikatos būklės, susijusios su KHV infekcija, statusą, kaip nustatyta I priedo 2 dalies I skirsnyje, to paties priedo 2 dalies II arba III skirsnyje nustatytais diagnostiniais metodais, taikomi šios dalies II.1 ir II.2 punktuose išsamiai aprašyti diagnostiniai metodai ir procedūros.

II.1. Žuvų mėginių paruošimas

Kai įmanoma, imami ilgesnį laiką virusui palankioje temperatūroje (t. y. 2–3 savaites 15–26 °C) laikytų žuvų mėginiai. Jei įmanoma, siekiant padidinti tikimybę, kad pavyks aptikti KHV, mėginiai paimami per 24 valandas, bet ne vėliau kaip per 72 valandas po tvarkymo, kaip antai gaudymo tinklais ar pervežimo darbų, dėl kurių virusas gali vėl suaktyvėti žuvyse, tapusiose jo nešiotojomis.

KHV viruso priežiūros tikslais atliekamiems tyrimams galima siųsti gyvas arba paskerstas žuvis, atskirai supakuotas sandariose steriliose talpose, arba, kitu atveju, galima naudoti užšaldytus organus ar organų gabalėlius, užkonservuotus 80–100 % alkoholyje arba virusų mėginių gabenimo terpėje (jie turi būti apdoroti per 48 valandas po surinkimo), tyrimams, kurie atliekami PGR pagrįstais metodais. KHV infekcijos priežiūros reikmėms imami žiaunų ir inkstų audinių mėginiai.

Imant mėginius KHV infekcijos priežiūros tikslais jų sujungimo, kiek tai įmanoma, turi būti vengiama. Jeigu sujungimas būtinas, jungiami ne daugiau kaip dviejų žuvų audinių medžiagos mėginiai. Didesni mėginiai homogenizuojami grūstuvu piestoje arba smulkintuvu ir prieš nuskaidrinant iš jų paimami papildomi mėginiai, iš kurių bus išskirta DNR. Kitu atveju papildomus mėginius galima imti iš kiekvieno į mėginį dedamo audinio ir dėti į lizės mėgintuvėlius.

II.1.1. DNR išskyrimas

DNR išskiriama pagal standartines procedūras. Galima naudoti DNR išskyrimo priemonių rinkinius, kurie parduodami rinkoje ir kuriuos naudojant gaunama aukštos kokybės DNR, tinkama naudoti pagal II.2 punkte nurodytus PGR protokolus.

Tinkamas audinio masės ir terpės tūrio santykis yra 1:9. Tyrimams naudojama 20–25 mg audinio medžiagos.

II.2. KHV infekcijos priežiūra PGR grindžiamais metodais

KHV priežiūros tikslais taikomas qPGR metodas. Jei gaunami teigiami rezultatai ištyrus mėginius iš tam tikro ploto, kurio užkrėtimas KHV iki tol nebuvo patvirtintas, šie tyrimo rezultatai patvirtinami:

a) nustatant mėginių PGR arba lizdinės PGR produkto genų seką. Gauta gryna patvirtinta genų seka turi sutapti (bent 98 %) su šiomis etaloninėmis genų sekomis;

b) arba, kitu atveju, mėginius galima nusiųsti į nacionalinę etaloninę laboratoriją patvirtinti.

II.2.1. KHV aptikimas qPGR būdu

qPGR eiga turi būti tokia, kaip aprašyta toliau.

Tiesioginis pradmuo (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

atvirkštinis pradmuo (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

zondas (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Ciklinio apdorojimo sąlygos: 1 ciklas – 15 minučių 95 °C temperatūroje, po to 50 ciklų po 15 sekundžių 94 °C temperatūroje ir 60 sekundžių 60 °C temperatūroje.

qPGR rezultatai gali priklausyti nuo to, kokiomis sąlygomis ji vyksta, t. y. atsižvelgiant į tai, koks termocikleris naudojamas, gali reikėti patikslinti šiluminio apdorojimo protokolus. Be to, galima gauti klaidingai teigiamų rezultatų dėl klaidingo pradmenų surišimo arba užteršimo laboratorijoje. Kartu su kiekviena tyrimo plokštele reikia naudoti neigiamus šablono kontrolinius mėginius ir teigiamus kontrolinius mėginius. Vis dėlto vietoj šio varianto galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo qPGR variantus.

II.2.2. KHV aptikimo patvirtinimas įprastos PGR būdu

Siekiant patvirtinti KHV infekcijos buvimą atliekama įprasta lizdinė PGR, kaip parodyta 2.1 lentelėje, ir nustatoma jos amplifikacijos produkto genų seka.

2.1 lentelė.

Atliekant lizdinės PGR analizę visų karpinių žuvų herpeso virusų (CyHV-1, CyHV-2 ir CyHV-3) atvejais naudojami pradmenys ir jos atlikimo sąlygos

Pradmens pavadinimas Seka Ciklinio apdorojimo sąlygos Produkto dydis CyHVpol- tiesioginis 5′ -CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ Pirmojo etapo PGR 1 ciklas: 95 °C 2 minutes 40 ciklų: 95 °C 30 sekundes 55 °C 30 sekundes 72 °C 45 sekundes 1 ciklas: 72 °C 10 minučių 362 bp CyHVpol- atvirkštinis 5′ -CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol- vidinis tiesioginis 5′ -CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ Antrojo etapo PGR 1 ciklas: 95 °C 2 minutes, 40 ciklų: 95 °C 30 sekundes 55 °C 30 sekundes 72 °C 45 sekundes 1 ciklas: 72 °C 10 minučių 339 bp CyHVpol- vidinis atvirkštinis 5′ -GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

PGR rezultatai gali priklausyti nuo to, kokiomis sąlygomis ji vyksta, t. y. atsižvelgiant į tai, koks termocikleris naudojamas, gali reikėti patikslinti šiluminio apdorojimo protokolus. Be to, galima gauti klaidingai teigiamų rezultatų dėl klaidingo pradmenų surišimo arba užteršimo laboratorijoje. Kartu su kiekviena tyrimo plokštele reikia naudoti neigiamus šablono kontrolinius mėginius ir teigiamus kontrolinius mėginius. Vietoj šio varianto galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo PGR variantus.

Genų seka gali būti nustatyta laboratorijoje arba nepriklausomų įmonių, kurių specializacija – genų sekos nustatymas. Genų sekos nustatymo rezultatai išanalizuojami gretinant gautas sekas su žinomomis etaloninėmis KHV genų sekomis („Gen Bank“ prieigos numeriai AP008984, DQ657948 ir DQ177346). Gauta gryna patvirtinta genų seka turi bent 98 % sutapti su tomis etaloninėmis sekomis.

3 DALIS

INFEKCINĖS LAŠIŠŲ ANEMIJOS (ILA) PRIEŽIŪROS IR BUVIMO PATVIRTINIMO IŠSAMŪS DIAGNOSTINIAI METODAI IR PROCEDŪROS

I. Mėginių ėmimo procedūros vykdant ILA priežiūrą ir kontrolę

Imant mėginius ir atliekant laboratorinį tyrimą pagal I priedo 3 dalyje nustatytas priežiūros ar likvidavimo programas arba siekiant patvirtinti arba paneigti įtarimą dėl ILA pagal Direktyvos 2006/88/EB 57 straipsnio b punktą, taikomi šio skirsnio I.1, I.2 ir I.3 punktuose išsamiai aprašyti metodai ir procedūros.

I.1. Žuvų mėginių paruošimas

Imant žuvų mėginius laboratoriniams tyrimams dėl ILA jie, kiek tai įmanoma, neturi būti sujungiami. Vis dėlto, imant mėginius ILA priežiūros tikslais, 2–5 žuvų mėginių sujungimas yra priimtinas.

Mėginiai AT PGR analizei paimami iš visų mėginiams atrinktų žuvų. Vidurinės inkstų dalies gabalėlis išimamas iš žuvies steriliu instrumentu ir įdedamas į mikrocentrifuginį mėgintuvėlį, į kurį įpilta 1 ml patvirtinto efektyvumo RNR konservuojančiojo tirpalo. Į vieną mėgintuvėlį, į kurį įpilta mėginiams gabenti skirto tirpalo, galima dėti daugiausia penkių žuvų audinių mėginius, iš kurių bus sudarytas vienas bendras mėginys. Vieno mėginio audinio masė turi būti 0,5 g. Kai žuvys yra per mažos, kad iš jų būtų galima gauti reikiamos masės mėginius, 0,5 g masės mėginį galima surinkti iš inkstų, širdies, blužnies, kepenų arba prievarčio aklųjų žarnų gabalėlių (renkantis organus čia nurodyta pirmumo tvarka).

Histologiniam tyrimui imami ką tik paskerstų normalios būklės žuvų, turinčių ILA būdingų klinikinių arba patanatominių požymių, audiniai. Jei yra kokių nors išorinių ar vidinių pažeidimų, paimami jų mėginiai, taip pat visais atvejais imami inkstų vidurinės dalies, širdies, kepenų, kasos, žarnyno, žiaunų ir blužnies mėginiai, kurie iš kiekvienos žuvies išpjaunami skalpeliu ir įdedami į 8–10 % (tūrio proc.) buferinį formalino druskos tirpalą. Siekiant užtikrinti, kad audiniai būtų patikimai užkonservuoti, fiksavimo tirpalo ir audinio santykis turi būti bent 20:1. Imunohistocheminiam (IHC) tyrimui imami inkstų vidurinės dalies ir širdies mėginiai.

Virusologiniam ląstelių kultūros tyrimui paimama visos mėginiams skirtos žuvies audinių. Kepenų, inkstų priekinės arba vidurinės dalies, širdies ir blužnies gabalėliai išimami iš žuvies steriliu instrumentu ir įdedami į plastikinius mėgintuvėlius, į kuriuos įpilta 9 ml gabenimo terpės. Į vieną mėgintuvėlį, į kurį įpilta audiniams gabenti skirto tirpalo, galima dėti daugiausia penkių žuvų audinius, iš kurių sudaromas vienas bendras mėginys. Vieno mėginio audinio masė turi būti 1,0 ± 0,5 g.

I.2. Žuvų mėginių gabenimas

Į laboratoriją galima gabenti visą žuvį, jei ją gabenant įmanoma laikytis šio punkto 3 pastraipoje nurodytų reikalavimų dėl temperatūros. Visa žuvis suvyniojama į sugeriamąjį popierių ir gabenama plastikiniame maiše atšaldyta, kaip aprašyta toje pastraipoje.

Galima gabenti ir gyvas žuvis, tačiau tik nacionalinei etaloninei žuvų ligų tyrimo laboratorijai prižiūrint ir atsižvelgiant į papildomus su gyvų žuvų gabenimu susijusius dezinfekavimo ir biologinio saugumo aspektus.

Kraujo mėginiai ir mėgintuvėliai su virusologiniam tyrimui arba AT PGR analizei skirtais žuvų audiniais sudedami į izoliuotas talpyklas, kaip antai polistireno dėžes storomis sienelėmis, kartu įdedant pakankamai ledo arba šaldymo blokų, kad būtų užtikrinta, jog mėginiai į laboratoriją bus gabenami atšaldyti. Tačiau reikia stengtis mėginių neužšaldyti, o gavus gabenimo dėžę joje vis dar turėtų būti ledo arba vienas ar keli iš dalies arba visiškai užšalę šaldymo blokai. Išimtiniais atvejais AT PGR ir virusologiniam tyrimui skirtus mėginius galima staigiai užšaldyti ir gabenti į laboratoriją – 20 °C ar žemesnėje temperatūroje.

AT PGR analizei skirtus mėginius užkonservavus RNR stabilizavimo reagente, Ribonucleic acid(RNA)later, RNR išskyrimas turi būti atliktas per toliau nurodytus terminus priklausomai nuo to, kokioje temperatūroje laikomi mėginiai:

kai mėginiai laikomi 37 °C temperatūroje – viena diena;

kai mėginiai laikomi 25 °C temperatūroje – viena savaitė;

kai mėginiai laikomi 4 °C temperatūroje – vienas mėnuo;

kai mėginiai laikomi – 20 °C temperatūroje – neribotą laiką.

Jei histologiniam tyrimui skirti žuvų mėginiai gabenami fiksavimo tirpale, jie sudedami į skysčiui nelaidžius mėgintuvėlius smūgiams atspariose talpyklose. Būtina stengtis tų mėginių neužšaldyti.

Virusologinį ląstelių kultūros tyrimą būtina pradėti kuo greičiau, ne vėliau kaip per 48 valandas po mėginių paėmimo. Išimtiniais atvejais virusologinį tyrimą galima pradėti vėliausiai per 72 valandas po to, kai surinkta medžiaga, su sąlyga, kad tyrimui skirta medžiaga būtų apsaugota naudojant gabenimo terpę ir kad ją gabenant būtų įmanoma laikytis reikalavimų dėl temperatūros.

I.3. Papildomos diagnostikai skirtos medžiagos rinkimas

Jei diagnostikos laboratorija sutinka, galima rinkti ir kitus, ne tik I.1 punkte nurodytus žuvų audinius ir juos ruošti papildomiems tyrimams.

II. Išsamūs diagnostiniai metodai ir procedūros vykdant stebėseną ir siekiant patvirtinti ILA buvimą arba paneigti dėl jos kilusius įtarimus

Atliekant laboratorinį tyrimą, kai siekiama gauti arba išlaikyti tam tikrą žuvų sveikatos būklės, susijusios su ILA, statusą, kaip nustatyta I priedo 3 dalies I skirsnyje, arba pagal Direktyvos 2006/88/EB 57 straipsnio b punktą siekiant patvirtinti arba paneigti įtarimą dėl ILA I priedo 3 dalies II skirsnyje nustatytais diagnostiniais metodais, taikomi tolesniuose II.1–II.5 punktuose išsamiai aprašyti metodai ir procedūros.

II.1. Mėginių tyrimas AT PGR metodu

Atrankinis tyrimas dėl ILAV atliekamas taikant AT qPGR diagnostinį metodą. Kadangi AT qPGR rezultatai gali būti skirtingi priklausomai nuo sąlygų, kuriomis ji atliekama, kad neliktų abejonių, reikėtų naudoti pakankamai tinkamų teigiamų ir neigiamų kontrolinių mėginių ir amplikonų.

II.1.1. Visos RNR išskyrimas

Visi darbai su RNR atliekami ant ledo; būtina mūvėti pirštines.

Visa RNR išskiriama taikant fenolio-chloroformo metodą arba naudojant RNR giminingumo sukamąsias kolonėles pagal gamintojo nurodymus.

Išgryninta RNR resuspenduojama distiliuotame vandenyje be ribonukleazių (t. y. vandenyje, į kurį dėta 0,1 % dietilpirokarbonato).

Ekstrahuotos RNR grynumas ir koncentracija apskaičiuojami matuojant optinį tankį esant 260 nm ir 280 nm bangos ilgiui. Galima taikyti alternatyvų metodą – įtraukti vidaus kontrolę, pagrįstą priešprieša viruso genomui, kaip nurodyta II.1.3 punkte.

II.1.2. ILAV aptikimas AT PGR metodu

ILAV genomo amplifikacija gali būti atliekama keliais AT PGR metodais. Galima rinktis dviejų etapų AT PGR, per kurią AT ir PGR etapų reakcijos vyksta dviejuose atskiruose mėgintuvėliuose. Tačiau galima rinktis ir vieno etapo reakciją, kai abi reakcijos vyksta viename mėgintuvėlyje. Kai tik įmanoma, reikėtų rinktis pastarąjį vieno etapo metodą, nes atliekant analizę viename mėgintuvėlyje, kai jo turinio nereikia perkelti kitur, sumažinama kryžminės taršos rizika, be to, manoma, kad šio metodo jautris yra ne mažesnis negu dviejų etapų metodo.

Pradmenys naudojami ir analizė atliekama taip, kaip aprašyta šiame punkte, t. y. naudojama ILA1 arba ILA2 pradmenų pora, skirta 8 segmentui; nustatyta, kad šie pradmenys tinka ILAV aptikti šios ligos protrūkių metu ir žuvyse, kurios yra šio viruso nešiotojos. Atvirkštinis pradmuo ILA2 netinka izoliatams iš Šiaurės Amerikos; tokiais atvejais reikia naudoti kitokius pradmenis.

Tiesioginis pradmuo (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;

atvirkštinis pradmuo (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Ciklinio apdorojimo sąlygos: vienas ciklas – 30 minučių 50 °C temperatūroje, 1 ciklas – 15 minučių 94 °C temperatūroje, 40 ciklų po 30 sekundžių 94 °C temperatūroje, 30 sekundžių 55 °C temperatūroje, 60 sekundžių 72 °C temperatūroje; vienas ciklas – 5 minutes 72 °C temperatūroje. Produkto dydis 155 bp.

PGR rezultatai gali priklausyti nuo to, kokiomis sąlygomis ji vyksta, t. y. atsižvelgiant į tai, koks termocikleris naudojamas, gali reikėti patikslinti šiluminio apdorojimo protokolus. Be to, galima gauti klaidingai teigiamų rezultatų dėl klaidingo pradmenų surišimo arba užteršimo laboratorijoje. Kartu su kiekviena tyrimo plokštele reikia naudoti neigiamus šablono kontrolinius mėginius ir teigiamus kontrolinius mėginius. Vis dėlto vietoj šio varianto galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo AT PGR variantus.

II.1.3. ILAV aptikimas AT qPGR metodu

Taikant AT qPGR metodą įmanoma padidinti tyrimo specifiškumą ir tikriausiai jautrį. Tyrimas šiuo metodu gali vykti greičiau, nes nereikia atlikti gelio elektroforezės ir, kadangi įmanoma apytikriai nustatyti viruso genominės RNR kiekį mėgintuvėlyje su mėginiu, sumažėja kryžminės taršos rizika. AT qPGR analizės trūkumas yra toks, kad dažnai neįmanoma nustatyti amplifikacijos produktų genų sekos. Tačiau jei abejojama dėl amplifikacijos produkto specifiškumo, gautam rezultatui patvirtinti būtina atlikti dar vieną specialiai ILAV skirtą analizę.

Atliekama šiame punkte aprašyta analizė (speciali 8 segmento analizė). Ši analizė tinka izoliatams iš Europos Sąjungos, Europos laisvosios prekybos asociacijos ir Šiaurės Amerikos. Kai tik įmanoma, reikėtų rinktis vieno etapo metodą, nes atliekant analizę viename mėgintuvėlyje sumažėja kryžminės taršos rizika.

Tiesioginis pradmuo: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;

atvirkštinis pradmuo: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;

ir zondas: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.

Kartu su kiekviena tyrimo plokštele reikia naudoti neigiamus šablono kontrolinius mėginius ir teigiamus kontrolinius mėginius. Ciklinio apdorojimo sąlygos: 1 ciklas 30 minučių 50 °C temperatūroje, vienas ciklas 15 minučių 95 °C temperatūroje, 40 ciklų po 15 sekundžių 94 °C temperatūroje, 60 sekundžių 60 °C temperatūroje; prireikus ciklas tikslinamas. Vietoj šio varianto galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo AT PGR arba AT qPGR variantus.

II.1.4. PGR amplifikacijos produktų genų sekos nustatymas

Tiesioginis pradmuo (ILAs6–3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;

atvirkštinis pradmuo (ILAs6–2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.

Kartu su kiekviena tyrimo plokštele reikia naudoti neigiamus šablono kontrolinius mėginius ir teigiamus kontrolinius mėginius. Ciklinio apdorojimo sąlygos (vieno etapo AT PGR): 1 ciklas 30 minučių 50 °C temperatūroje, 1 ciklas 15 minučių 94 °C temperatūroje, 40 ciklų po 30 sekundžių 94 °C temperatūroje, 30 sekundžių 55 °C temperatūroje, 60 sekundžių 72 °C temperatūroje ir 1 ciklas – 5 minutes 72 °C temperatūroje; prireikus ciklas tikslinamas. Vietoj šio varianto galima rinktis kitus patvirtinto panašaus efektyvumo AT PGR arba AT qPGR variantus.

HPR genotipo genų sekai 6 segmente nustatyti galima rinktis tokį alternatyvų metodą:

Tiesioginis pradmuo: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;

atvirkštinis pradmuo: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′.

Produkto dydis 304 NT, jei HPR 0.

Galima atlikti ir kitokio pobūdžio AT PGR analizes, specifiškumu ir jautriu prilygstančias šiame punkte aprašytoms analizėms.

AT PGR amplifikacijos produkto grynumas prieš nustatant genų seką patikrinamas gelio elektroforezės būdu. Jei nustatomas tik vienas grynas fragmentas, jis išgryninamas tiesiai iš PGR reakcijos produkto. Jei padaugintų fragmentų yra daugiau, reikiamas fragmentas išgryninamas gelio elektroforezės būdu. PGR fragmentai iš tirpalų ar agarozės gelių išgryninami naudojant PGR fragmentų giminingumo sukamąsias kolonėles pagal gamintojo nurodymus.

Genų seka nustatoma naudojant amplifikacijos pradmenis, gautus iš nepriklausomų įmonių, gaminančių specialius genų sekai nustatyti skirtus produktus. Rezultatai turi būti analizuojami naudojant paieškos priemonę BLAST, o sekos lyginamos su kitomis žinomomis sekomis JAV nacionalinio informacijos centro (NCBI) nukleotidų duomenų bazėje.

Nustačius genų seką neturi likti jokių abejonių dėl AT PGR amplifikacijos produkto specifiškumo.

II.2. ILAV išskyrimas ląstelių kultūrose

II.2.1. Mėginių paruošimas

Audinys gali būti laikomas – 80 °C temperatūroje. Audinys turi būti užšaldomas ir atšildomas tik vieną kartą prieš tyrimą. Priežiūros ir kontrolės tikslais tyrimą reikia atlikti kiek įmanoma greičiau.

Kiekvienas mėginys (bendras audinių mėginys gabenimo tirpale) visiškai homogenizuojamas patvirtintu tinkamu homogenizatoriumi, 15 minučių centrifuguojamas 2 000–4 000 × g 0–6 °C temperatūroje, supernatantas perkošiamas (0,45 μm dydžio akučių filtru) ir inkubuojamas įpylus tokį patį kiekį tinkamai atskiesto imuninių serumų, veikiančių prieš vietinės kilmės serologinių tipų infekcinės kasos nekrozės (IKN) virusus, mišinio. Imuninio serumo titras atliekant 50 % plokštelių neutralizacijos testą turi būti bent 1:2 000. Mišinys inkubuojamas 1 valandą 15 °C temperatūroje ir gaunamas pasėlis.

Visus pasėlius apdorojant infekcinės kasos nekrozės viruso (kai kuriuose Europos regionuose šio viruso aptinkama net 50 % žuvų mėginių) imuniniu serumu siekiama išvengti citopatinio efekto (CPE) dėl IKN viruso buvimo pasėtose ląstelių kultūrose. Tokią procedūrą galima atlikti siekiant, kad sutrumpėtų virusologinių tyrimų trukmė ir sumažėtų atvejų, kai pastebėtą citopatinį efektą reikėtų laikyti potencialiu ILAV buvimo požymiu. Imant mėginius iš gamybos vienetų, laikomų neužkrėstais IKN, pasėlių imuniniu serumu dėl IKN viruso galima neapdoroti.

II.2.2. Ląstelių kultūrų inokuliavimas

Pradiniam ILAV išskyrimui naudojamos atlantinių lašišų inkstų (ALI) ląstelės. Galima naudoti ir kitų ląstelių linijas, kurių efektyvumas ir jautris išskiriant ILAV yra patvirtinti, atsižvelgiant į viruso padermių kintamumą ir įvairių padermių gebėjimą daugintis įvairių linijų ląstelėse. Atrodo, kad ALI ląstelės yra tinkamos iki šiol žinomiems viruso izoliatams išskirti ir auginti, jei ribojamas perėjimas iš vienos būsenos į kitą. ALI ląstelėse citopatinis efektas (CPE) gali būti pastebimesnis nei kitose šiam virusui imlių ląstelių linijose, kaip antai SHK-1 (lašišų galva inkstai -1, anglų k. Salmon head kidney-1).

ALI ląstelės (atlikus 65 arba mažiau persėjimų) auginamos duobutinėse plokštelėse L-15 terpėje, kurios sudėtyje yra 10 % galvijų vaisiaus serumo, 2 % (tūrio proc.) 200 mM L-glutamino, ir 0,08 % (tūrio proc.) 50 mM 2-merkaptoetanolio. Jaunų aktyviai augančių ląstelių kultūros inokuliuojamos imuniniu serumu apdorota organų suspensija. Galutinis audinių medžiagos ir kultūros terpės kiekio santykis tirpale turi būti 1:1 000. Kiekvieno organo atveju į kiekvieną plokštelės duobutę, kurioje yra 2 ml kultūros terpės, įlašinama 40 μl pasėlio suspensijos. Kad sumažėtų kryžminės taršos rizika, iš įvairių žuvininkystės ūkio vietų paimtiems mėginiams naudojamos atskiros 12 arba 24 duobučių plokštelės.

Į vienos plokštelės duobutes pasėlio nededama – tai yra neigiamas kontrolinis mėginys. Atskira plokštelė inokuliuojama etaloniniu ILAV izoliatu; tai – teigiamas kontrolinis mėginys, kaip nurodyta toliau. 100 μl paruošto pradinio ILA viruso preparato (minimalus titras 107, audinio kultūros užkrečiamoji dozė – 50 % vertinamosios baigties (TCID50 ml– 1)) pasėjama į pirmąją plokštelės duobutę ir sumaišoma. Dalis šios medžiagos perpilama iš pirmosios į antrąją duobutę, kad būtų gautas 1:10 santykiu praskiestas mišinys, ir sumaišoma. Šis veiksmas kartojamas apdorojant visą plokštelę, šešis kartus praskiedžiant jos turinį po 10 kartų. Pradinį ILAV preparatą galima bent dvejus metus laikyti – 80 °C temperatūroje, tačiau kai jis atitirpinamas, būtina jį panaudoti per tris dienas. Reikia stengtis išvengti kryžminės taršos tarp tiriamųjų plokštelių ir teigiamų kontrolinių mėginių medžiagos. Kad nebūtų tokio užteršimo rizikos, teigiami kontroliniai mėginiai ruošiami ir tvarkomi atskirai nuo tiriamųjų plokštelių. Užuot naudojus teigiamus kontrolinius mėginius su kiekvienu pasėliu, galima kas šešis mėnesius atlikti ALI ląstelių jautrio ILAV izoliatams bandymą.

Mėginiai inkubuojami 15 ± 2 °C temperatūroje ne ilgiau kaip 15 dienų. Ląstelių kultūros du kartus, laikotarpiu nuo 5 iki 7 ir nuo 12 iki 14 tyrimo dienos po inokuliavimo, apžiūrimos mikroskopu siekiant pastebėti citopatinį efektą. Bet kuriame mėginyje pastebėjus citopatinį efektą, iškart pradedamos viruso identifikavimo procedūros pagal II.2.4 punktą. Jeigu jokio citopatinio efekto nepastebima iki 14 dienos, atliekamas netiesiogiai fluorescuojančių antikūnų tyrimas (NFAT), hemadsorbcija arba AT PGR.

II.2.3. Persėjimas

Persėjimas atliekamas 13–15 dieną. Kultūros supernatanto dedama į duobutinių plokštelių duobutes, kuriose yra naujų aktyviai augančių ląstelių, atskiedžiant tinkamu santykiu (1:10), ir inkubuojama iki 18 dienų 14 ± 2 °C temperatūroje. Ląstelių kultūros du kartus, laikotarpiu nuo 5 iki 7 ir nuo 14 iki 18 tyrimo dienos po inokuliavimo, apžiūrimos mikroskopu siekiant pastebėti citopatinį efektą. Bet kuriame mėginyje pastebėjus citopatinį efektą, iškart pradedamos viruso identifikavimo procedūros pagal II.2.4 punktą. Jei citopatinio efekto nepastebima 14–18 dienomis, atliekama hemadsorbcija arba AT PGR tyrimas.

Jei toksinis citopatinis poveikis pasireiškia per pirmas septynias inkubavimo dienas, persėjimas atliekamas šiame etape, ląstelės inkubuojamos 14–18 dienų, dar kartą persėjamos ir inkubuojamos dar 14–18 dienų laikotarpį. Jei po septynių dienų citotoksiškumo reakcija neįvyksta, ląstelės persėjamos vieną kartą ir inkubuojamos, kad nuo pradinio inkubavimo praeitų ne mažiau kaip 28–36 dienos.

Jei pirminė ląstelių kultūra užteršiama bakterijomis, tyrimas atliekamas pakartotinai naudojant audinių homogenatą, laikytą – 80 °C temperatūroje. Prieš inokuliavimą audinių homogenatas centrifuguojamas 4 000 × g 15–30 minučių esant 0–6 °C temperatūroje, o supernatantas perkošiamas naudojant 0,22 μm filtrą. Jei persėjant ląstelių kultūrą, ši užteršiama bakterijomis, viršnuosėdinis skystis filtruojamas per 0,22 μm skersmens filtrą, juo užkrečiamos jaunos ląstelės ir inkubuojamos paskiau 14–18 dienų.

II.2.4. Viruso identifikavimo tyrimai

Bet kuriame etape pastebėjus citopatinio efekto požymių arba gavus teigiamą hemadsorbcijos tyrimo rezultatą reikia identifikuoti virusą. Tinkami ILAV identifikavimo metodai yra AT PGR pagal II.1 punktą ir imunofluorescencinis (IF) metodas pagal II.2.6 punktą. Jei manoma, kad gali būti ir kitų virusų, atliekami papildomi virusų identifikavimo tyrimai. Jei tais tyrimais nepavyksta patikimai identifikuoti viruso per vieną savaitę, supernatantas siunčiamas nedelsiant identifikuoti į:

a) Pasaulinės gyvūnų sveikatos organizacijos (OIE) etaloninę ILA tyrimo laboratoriją arba

b) nacionalinę etaloninę laboratoriją arba ES etaloninę laboratoriją, kurioje tiriamos žuvų ligos, kaip nurodyta Direktyvos 2006/88/EB VI priede.

II.2.5. Hemadsorbcija

Kadangi ILAV dauginantis ląstelių kultūrose ne visada pasireiškia citopatinis efektas, turi būti atliktas kiekvienos duobutės turinio AT PGR ar hemadsorbcijos tyrimas pagal šį punktą arba imunofluorescencinis tyrimas pagal II.2.6 punktą.

Ląstelių kultūros terpė, įskaitant teigiamus ir neigiamus kontrolinius mėginius, išimama iš kiekvienos duobutės ir sudedama į etiketėmis paženklintus sterilius mėgintuvėlius. Į kiekvieną duobutę įpilama 500 μl 0,2 % (tūrio proc.) perplautų triušio arba arklio eritrocitų suspensijos arba 0,05 % (tūrio proc.) perplautų vaivorykštinio upėtakio ar atlantinės lašišos eritrocitų suspensijos ir 45 minutes inkubuojama kambario temperatūroje. Eritrocitai pašalinami ir kiekviena duobutė dukart išplaunama L-15 terpe. Kiekviena duobutė apžiūrima mikroskopu.

Iš eritrocitų sankaupų ALI ląstelių paviršiuje galima numanyti, kad jos yra užkrėstos ortomiksovirusu. Jei gaunamas teigiamas hemadsorbcijos tyrimo rezultatas, iškart atliekamas viruso identifikavimo tyrimas pagal II.2.4 punktą.

II.2.6. Imunofluorescencija (IF)

ALI ląstelės (atlikus 65 arba mažiau persėjimų) auginamos duobutinėse plokštelėse L-15 terpėje, kurios sudėtyje yra 10 % galvijų vaisiaus serumo, 2 % (tūrio proc.) 200 mM L-glutamino ir 0,08 % (tūrio proc.) 50 mM 2-merkaptoetanolio, ir naudojamos ląstelėmis ištisai padengiant daugiau kaip 50 % viso ploto. Galima naudoti ir kitas patvirtinto efektyvumo ląstelių linijas arba auginimo terpes. Į dvi duobutes įpilama po 225 μl ląstelių kultūros, kuri, kaip manoma, yra užkrėsta virusu, supernatanto, sumaišoma ir perpilama į kitas dvi duobutes praskiedžiant santykiu 1:5. Dar dvi papildomos duobutės neinokuliuojamos; tai – kontroliniai mėginiai. Iš įvairių žuvininkystės ūkio vietų paimtiems mėginiams ir viruso kontroliniams mėginiams naudojamos atskiros plokštelės. Viruso kontrolinis mėginys paruošiamas naudojant etaloninį ILAV izoliatą.

Plokštelės inkubuojamos 14 ± 2 °C temperatūroje ir stebimos mikroskopu daugiausia septynias dienas. Anksti pastebėjus citopatinį efektą arba jeigu jokio citopatinio efekto nepastebima per septynias dienas, atliekamas tolesnis veiksmas – fiksavimas. Duobutės išplaunamos fosfato buferiniu druskų tirpalu (FBDT) ir užfiksuojamos 20 minučių inkubuojant kambario temperatūroje įpylus 80 % acetono. Plokštelės išdžiovinamos ore ir iškart nudažomos arba 0–6 °C temperatūroje laikomos ne ilgiau kaip 24 valandas iki dažymo.

Į kartotines duobutes įpilama monokloninių antikūnų (MAb) 3H6F8 ir 1OC9F5, specialiai skirtų ILA virusui, arba kitų MAb antikūnų, kurių veiksmingumas ir specifiškumas patvirtinti, mišinio, atskiesto FBDT, ir 30 minučių inkubuojama 37 ± 4 °C temperatūroje. MAb pašalinami ir plokštelės tris kartus išplaunamos 0,05 % „Tween 20“ FBDT tirpalu. Į kiekvieną duobutę įpilama pelės antikūnų serumo IgG fluoresceino izotiocianato (FITC) konjugato, atskiesto FBDT, ir 30 minučių inkubuojama 37 ± 4 °C temperatūroje. Įvairių MAb ir FITC konjugato partijų skiedimo santykiai tikslinami kiekvienoje laboratorijoje. Antikūnai pašalinami ir plokštelės tris kartus nuplaunamos 0,05 % „Tween 20“ FBDT tirpalu.

Duobutės iškart apžiūrimos fluorescencinei mikroskopijai pritaikytu inversiniu mikroskopu su FITC sužadinti tinkamu filtru. Jei pastebima fluorescuojančių ląstelių, tyrimo rezultatas yra teigiamas. Tyrimas laikomas patikimu, kai teigiamų kontrolinių mėginių tyrimo rezultatai yra teigiami, o neigiamų kontrolinių mėginių rezultatai neigiami.

II.3. Kitų audinių tyrimas

II.2.6 punkte nurodytą metodą galima taikyti tiriant ir kitus žuvų audinius, kaip antai kepenis, blužnį ir širdį, jeigu juose yra pakankamai endotelio ląstelių, leukocitų arba limfocitų, kuriuos galima paskleisti ant mėginio plokštelės. Kiekvieno audinio dažymo procedūra yra tokia pati, nors kai kurių audinių galbūt geriau nedažyti propidiumo jodidu ir nustatyti audinio atspaude esančių ląstelių tipus fazinio kontrastinio apšvietimo būdu.

II.4. Histologinis tyrimas

Parafine esančios atpjovos supjaustomos 5 μm storio gabaliukais ir nudažomos hematoksilinu ir eozinu.

Klinikinių ligos požymių turinčių atlantinių lašišų ląstelių pokyčių būna įvairių; iš jų galima paminėti šiuos:

a) eritrocitų gausa centrinės venos sinuse ir žvyneliniuose kapiliaruose, įskaitant eritrocitų trombų susidarymą žiaunose;

b) daugiataškės arba susiliejančios kraujosrūvos, hepatocitų nekrozė ar abu šie reiškiniai kepenyse, atokiau nuo didesnių kraujagyslių; daugiataškė eritrocitų sankaupa išsiplėtusiose kepenų sinusoidėse;

c) eritrocitų kaupimasis žarnyno lamina propria kraujagyslėse ir galiausiai vidinis lamina propria kraujavimas;

d) dėl eritrocitų kaupimosi išsitempusi blužnies stroma;

e) nedidelis daugiataškis arba išplitęs pasklidasis intersticinis kraujavimas su vamzdelių nekroze kraujavimo vietose, eritrocitų kaupimasis inkstų glomeruluose;

f) eritrofagocitozė blužnyje, antrinis kraujavimas kepenyse ir inkstuose.

II.5. Imunohistocheminis (IHC) tyrimas

ILA viruso branduolio baltymus veikiančiu polikloniniu antikūnu apdorojamos formaline užfiksuoto audinio parafinuotos atpjovos. Taip tiriami organai – inkstų vidurinė dalis ir širdis (vidurio sritis, įskaitant visas tris kameras ir vožtuvus). Dėl patologinių požymių įtariami ligos atvejai patvirtinami gavus teigiamą IHC tyrimo rezultatą. Histologiniai pjūviai atliekami standartiniais metodais.

(1) Audinių atpjovų paruošimas Audiniai bent vieną dieną laikomi užfiksuoti neutraliu 10 % formalino fosfato buferiniu tirpalu, dehidratuojami naudojant etanolio tirpalų seriją, nuskaidrinami ksilenu ir įterpiami į parafiną pagal standartinius protokolus. Maždaug 5 μm storio atpjovos (IHC mėginiams dedamos ant poli-L-lizinu padengtų plokštelių) 20 minučių kaitinamos 56–58 °C (daugiausia 60 °C) temperatūroje, deparafinuojamos ksilenu, rehidratuojamos naudojant etanolio tirpalų seriją ir nudažomos hematoksilinu ir eozinu patomorfologiniam ir IHC tyrimams pagal 2 punktą.

(2) Dažymo procedūra atliekant IHC tyrimą Visos inkubavimo procedūros atliekamos kambario temperatūroje ant supamosios platformos, nebent šiame sprendime būtų nurodyta kitaip: a) antigenai gaunami dukart po 6 minutes verdant audinių atpjovas 0,1 M citrato buferiniame tirpale (pH – 6,0), po to 20 minučių blokuojant 50 mM TBS tirpalo, į kurį dėta 5 % lieso pieno miltelių ir 2 % ožkos serumo (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH – 7,6) 20 minučių; b) tada audinių atpjovos per naktį inkubuojamos su pirminiu antikūnu (ILAV branduolio baltymams skirtas monospecifinis triušio antikūnas), atskiedus TBS tirpalu, į kurį dėta 1 % lieso pieno miltelių, po to tris kartus perplaunamos 0,1 % „Tween 20“ TBS tirpalu; c) siekiant aptikti prijungtus antikūnus audinių atpjovos 60 minučių inkubuojamos su triušio antikūnų IgG konjugato šarmine fosfataze. Paskutinį kartą perplovus įdedama „Fast Red“ (1 mg ml– 1) ir naftolio AS-MX fosfato (0,2 mg ml– 1) su 1 mM levamisolio 0,1 M TBS tirpale (pH – 8,2) ir paliekama 20 minučių. Tada audinių atpjovos nuplaunamos tekančiu vandentiekio vandeniu, perdažomos Harriso hematoksilinu ir uždedamos ant plokštelių naudojant tam skirtą vandeninę terpę. Kartu su kiekviena partija ruošiami kontroliniai mėginiai – ILAV teigiamų ir ILAV neigiamų audinių atpjovos.

(3) IHC tyrimo rezultato aiškinimas IHC tyrimo rezultatas aiškinamas taip, kaip nurodyta a ir b punktuose: a) kontrolinių audinių atpjovų tyrimo rezultatai yra teigiami pastebėjus, kad endokardo kraujagyslių endotelio ląstelių citoplazma ir branduolio vidus yra aiškiai raudonai nudažyti (rausva) spalva. Teigiamas tiriamojo audinio atpjovos mėginio rezultatas patvirtinamas tik aptikus endotelio ląstelių, kurių branduolio vidus nudažytas tokia aiškiai matoma raudona spalva; b) kontrolinių audinių atpjovų tyrimo rezultatai laikomi neigiamais, jei nėra jokios reikšmingos spalvinės reakcijos. Kadangi lokalizacija branduolio viduje yra būdinga ortomiksoviruso branduolio baltymui viruso dauginimosi etape, citoplazmos ir kitokio dažymo reiškiniai, kurie nėra lokalizuoti branduolio viduje, laikomi nespecifiniais arba negalutiniais. Stipriausios teigiamos dažymo reakcijos paprastai pastebimos širdies ir inkstų endotelio ląstelėse. Jei hemoraginiai pažeidimai yra labai išplitę, endotelio dažymo reakcijos gali būti menkos arba jų gali visai nebūti, galbūt dėl užkrėstų endotelio ląstelių irimo (lizės).

4 DALIS

MARTEILIOZĖS (MARTEILIA REFRINGENS INFEKCIJOS) PRIEŽIŪROS IR BUVIMO PATVIRTINIMO IŠSAMŪS DIAGNOSTINIAI METODAI IR PROCEDŪROS

I. Diagnozuojant marteiliozės (Marteilia refringens) infekciją taikomi išsamūs diagnostiniai metodai ir procedūros

Imant mėginius ir atliekant laboratorinį tyrimą, kai siekiama gauti arba išlaikyti tam tikrą gyvūnų sveikatos būklės, susijusios su Marteilia refringens infekcija, statusą, kaip nustatyta I priedo 4 dalies I skirsnyje, arba pagal Direktyvos 2006/88/EB 57 straipsnio b punktą siekiant patvirtinti arba paneigti įtarimą dėl šios vienos iš išvardytų ligų I priedo 4 dalies II skirsnyje nustatytais diagnostiniais metodais, taikomi šios dalies I.1, I.2 ir I.3 punktuose išsamiai aprašyti diagnostiniai metodai ir procedūros.

I.1. Mėginių ėmimo tvarka

Kad būtų didesnė tikimybė aptikti šia liga užkrėstų gyvūnų, imant mėginius pirmiausia renkami pavieniai prasivėrę arba ką tik nugaišę moliuskai.

Mėginiams surinktos austrės arba midijos laikomos 4 °C temperatūroje arba šaldytuve ant ledo ne ilgiau kaip 24 valandas, jei mėginiuose yra prasivėrusių moliuskų, arba ne ilgiau kaip 72 valandas, jei prasivėrusių moliuskų nėra. Moliuskai laikomi plastikiniame maiše su etikete, kurioje turi būti nurodyta, kokios tai austrės arba midijos ir iš kur jos paimtos. Prasivėrę arba ką tik nugaišę moliuskai laikomi atskirai nuo kitų moliuskų.

Histologiniam Marteilia refringens diagnostikos tyrimui naudojamos audinių, įskaitant žiaunas ir širdies audinį, 3–5 mm storio atpjovos. Kai kuriems tyrimams, įskaitant audinių atspaudų tyrimus ir polimerazės grandininę reakciją (PGR), naudojamas virškinamosios liaukos gabalėlis.

I.2. Mikroskopiniai metodai

I.2.1. Citologinis tyrimas (atspaudų citologinis tyrimas)

Nusausinus virškinamosios liaukos audinius sugeriamuoju popieriumi, padaromi keli jų atspaudai stiklo plokštelėje. Plokštelės išdžiovinamos ore, užfiksuojamos metanoliu arba absoliučiuoju etanoliu ir nudažomos naudojant rinkoje parduodamą rinkinį kraujui dažyti, pavyzdžiui, Diff-Quik®/Hemacolor®, pagal gamintojo nurodymus. Vandeniu iš čiaupo nuplautos ir išdžiovintos plokštelės uždengiamos dengiamosiomis plokštelėmis ir užsandarinamos tinkama sintetine derva. Plokštelės pirmiausia apžiūrimos 200 kartų didinančiu, o tada, naudojant imersinį aliejų, 1 000 kartų didinančiu mikroskopu.

Teigiamas šio tyrimo rezultatas gaunamas mėginyje pastebėjus iki 30–40 μm dydžio ląstelių. Nudažyta ląstelių citoplazma yra bazofilinė, o branduolys eozinofilinis. Pastebima blyškių ratilų aplink dideles, ryškiai nudažytas (šviesos spindulius laužiančias) granules, o didesnėse ląstelėse pastebima ir tokių darinių, kai viena ląstelė yra kitos viduje.

Šis tyrimo metodas nėra konkrečiai skirtas šios rūšies parazitams.

I.2.2. Histologinis tyrimas

Audinių, įskaitant žiaunas, virškinamąją liauką, mantiją ir lytinę liauką, atpjovos bent 24 valandas laikomos užfiksuotos Davidsono fiksatoriumi, o tada paruošiamos histologiniam tyrimui, kurio metu naudojamas parafinas, įprastu būdu ir nudažomos, pavyzdžiui, hematoksilinu ir eozinu. Mėginiai apžiūrimi didinant mikroskopu iki 1 000 kartų.

Teigiamas šio tyrimo rezultatas gaunamas mėginyje pastebėjus nuo 4 iki 40 μm dydžio ląstelių. Ankstyvuose etapuose ląstelės turi kelis branduolius ir yra rutulio arba pailgos formos. Jos paprastai aptinkamos stemplės ir skrandžio epitelyje, o kartais lūpų čiuptuvėliuose. Sporogenezė vyksta ląstelėms dalijantis ląstelių viduje virškinamosios liaukos vamzdeliuose ir latakuose. Refrakcinių kūnų (granulių) atsiranda sporogenezės procese, ankstesniuose etapuose jų nepastebima. Vėlyvuose infekcijos etapuose pastebima virškinamojo trakto ertmėje laisvai pasklidusių sporinių. Nudažyta ląstelių citoplazma yra bazofilinė, o branduolys eozinofilinis. Granulės gali būti nuo sodrios oranžinės iki sodrios raudonos spalvos.

Šis tyrimo metodas nėra konkrečiai skirtas šios rūšies parazitams.

I.3. Molekuliniai metodai

I.3.1. DNR išskyrimas

DNR išskiriama pagal standartines procedūras.

Galima naudoti DNR išskyrimo priemonių rinkinius, kurie parduodami rinkoje ir kuriuos naudojant paprastai gaunama aukštos kokybės DNR, tinkama naudoti pagal PGR protokolus, kaip aprašyta I.3.2 punkte.

I.3.2. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

Yra parengti ir paskelbti keli PGR protokolai..

Turi būti naudojami vidinio transkribuojamo regiono (ITS1) sričiai skirti PGR pradmenys, nes jie geba dauginti tik M. refringens.

PGR atliekama 50 μl tūrio mėginyje. Naudojami PGR mišiniai, sudaryti iš buferinio tirpalo (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl [pH – 9,0, 25 °C] ir 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mišinio, 1 μM tiesioginio ir atvirkštinio pradmenų, 0,02 vnt. μl– 1 Taq DNR polimerazės ir 10–100 ng išskirtos DNR. Po penkių minučių DNR denatūravimo 94 °C temperatūroje 30 kartų kartojamas toks ciklas: denatūravimas 94 °C temperatūroje – viena minutė, pradmenų surišimas 55 °C temperatūroje – viena minutė ir elongacija 72 °C temperatūroje – viena minutė kiekvienai kilobazių porai. Galutinis elongacijos etapas trunka 10 minučių 72 °C temperatūroje. M. refringens aptikti PGR naudojami ITS1 sričiai skirti pradmenys (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ ir 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).

Teigiami kontroliniai mėginiai ruošiami iš labai užkrėsto šeimininko genominės DNR arba plazmidžių DNR, įskaitant tikslinę sritį.

Neigiami kontroliniai mėginiai ruošiami iš neužkrėstų šeimininkų genominės DNR ir PGR reagentų be tikslinės DNR.

Teigiamas rezultatas yra teigiama PGR amplifikacija iki numatyto dydžio (412 bp); visų neigiamų kontrolinių mėginių rezultatai turi būti neigiami, o visų teigiamų kontrolinių mėginių rezultatai teigiami.

I.3.3. Hibridizacija in situ (ISH)

Yra parengti ir paskelbti keli ISH protokolai..

Naudojamas rRNR genų komplekso mažajam subvienetui skirtas zondas, nes jo tinkamumas patvirtintas histologiniais tyrimais.

Audinių, įskaitant žiaunas ir virškinamąją liauką, atpjovos bent 24 valandas laikomos užfiksuotos Davidsono fiksatoriumi, o tada paruošiamos histologiniam tyrimui, kurio metu naudojamas parafinas, įprastu būdu. 5 μm storio atpjovos dedamos ant aminoalkilsilanu padengtų plokštelių, kurios per naktį kaitinamos 40 °C temperatūros krosnyje, tada deparafinuojamos 10 minučių panardinant į ksileną. Šis veiksmas atliekamas dar kartą, tada tirpiklis pašalinamas po 10 minučių paeiliui panardinant mėginius į dvi voneles, į kurias įpilta absoliučiojo etanolio. Po to atpjovos dehidratuojamos panardinant į seriją etanolio tirpalų. Tada jos 30 minučių apdorojamos proteinaze K (100 μg ml–1) TE buferiniame tirpale (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]) 37 °C temperatūroje. Plokštelės su atpjovomis dehidratuojamos panardinant į seriją etanolio tirpalų ir išdžiovinamos ore. Atpjovos inkubuojamos 100 μl hibridizacijos buferinio tirpalo (4× SSC [standartinio druskos citrato], 50 % formamido, 1 × Denhardto tirpalo, 250 μg ml–1 mielių tRNR, 10 % dekstrano sulfato), į kurį dėta 10 ng (1 μl PGR reagentų, paruoštų kaip aprašyta I.3.2 punkte, naudojant pradmenis CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG ir TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) digoksigeninu pažymėtą zondą. Atpjovos uždengiamos in situ plastikinėmis dengiamosiomis plokštelėmis ir penkias minutes laikomos padėtos ant kaitinimo įrenginio 95 °C temperatūroje. Plokštelės vieną minutę aušinamos padėtos ant ledo, po to per naktį atliekama hibridizacija didelio drėgnio kameroje 42 °C temperatūroje. Atpjovos dukart po penkias minutes plaunamos 2 × SSC (kambario temperatūros) ir vieną kartą 10 min. 0,4 × SSC (42 °C temperatūroje). Aptikimo veiksmai atliekami laikantis gamintojo nurodymų. Tada plokštelės nuplaunamos steriliu distiliuotu vandeniu (dH2O). Atpjovos perdažomos naudojant dažus „Bismarck Brown Yellow“, nuplaunamos distiliuotu vandeniu ir uždengiamos dengiamosiomis plokštelėmis naudojant tam skirtą vandeninę terpę.

Teigiami ir neigiami kontroliniai mėginiai atitinkamai ruošiami iš žinomų užkrėstų ir neužkrėstų šeimininkų audinių atpjovų.

Teigiamas rezultatas patvirtinamas žinomuose tiksliniuose audiniuose pastebėjus pažymėtų juodai purpurinės spalvos M. refringens ląstelių; visų neigiamų kontrolinių mėginių rezultatai turi būti neigiami, o visų teigiamų kontrolinių mėginių rezultatai teigiami.

I.3.4. Sekos nustatymas

DNR sekos nustatymas atliekamas kaip vienas iš paskutinių patvirtinamosios diagnostinės procedūros etapų. Tikslinės sritys yra mažojo subvieneto rDNR ir ITS1.

II. Išsamūs diagnostiniai metodai ir procedūros, taikomi prižiūrint ir patvirtinant Marteilia refringens infekciją

Įgyvendinant priežiūros programas ir patvirtinant Marteilia refringens infekcijos buvimą arba paneigiant dėl šios vienos iš išvardytų ligų kilusius įtarimus pagal I priedo 4 dalies II skirsnyje nustatytus reikalavimus, taikomi diagnostiniai metodai ir atitinkamos procedūros pagal 4.1 lentelėje pateiktas gaires:

4.1 lentelė.

Gairės dėl diagnostinių metodų taikymo pagal priežiūros programas ir siekiant patvirtinti Marteilia refringens infekciją arba paneigti dėl jos kilusius įtarimus

Metodas Kryptinga priežiūra Pirminė diagnozė Patvirtinamoji diagnozė Virškinamosios liaukos atspaudų tyrimas X X X, arba Histopatologinis tyrimas X X, arba Hibridizacija in situ X, ir PGR X X X, ir Sekos nustatymas X

5 DALIS

BONAMIOZĖS (BONAMIA OSTREAE INFEKCIJOS) PRIEŽIŪROS IR BUVIMO PATVIRTINIMO IŠSAMŪS DIAGNOSTINIAI METODAI IR PROCEDŪROS

I. Bonamiozės (Bonamia ostreae infekcijos) diagnostikos procedūros

Imant mėginius ir atliekant laboratorinį tyrimą. kai siekiama gauti arba išlaikyti tam tikros gyvūnų sveikatos būklės, susijusios su Bonamia ostreae, statusą, kaip nustatyta I priedo 5 dalies I skirsnyje, arba pagal Direktyvos 2006/88/EB 57 straipsnio b punktą siekiant patvirtinti arba paneigti įtarimą dėl šios vienos iš išvardytų ligų I priedo 5 dalies II skirsnyje nustatytais diagnostiniais metodais, taikomi tolesniuose I.1, I.2 ir I.3 punktuose išsamiai aprašyti diagnostiniai metodai ir procedūros.

I.1. Mėginių ėmimo procesas

Kad būtų didesnė tikimybė aptikti šia liga užkrėstų gyvūnų, imant mėginius pirmiausia renkami pavieniai prasivėrę arba ką tik nugaišę moliuskai.

Mėginiams surinktos austrės laikomos 4 °C temperatūroje arba šaldytuve ant ledo ne ilgiau kaip 24 valandas, jei mėginiuose yra prasivėrusių moliuskų, arba 72 valandas, jei prasivėrusių moliuskų nėra. Moliuskai laikomi plastikiniame maiše su etikete, kurioje turi būti nurodyta, kokios tai austrės ir iš kur jos paimtos. Prasivėrę arba ką tik nugaišę moliuskai laikomi atskirai nuo kitų moliuskų.

Histologiniam Bonamia ostreae diagnostikos tyrimui naudojamos audinių, įskaitant žiaunas ir širdies audinį, 3–5 mm storio atpjovos. Kai kuriems tyrimams, įskaitant audinių atspaudų tyrimus ir polimerazės grandininę reakciją (PGR), naudojamas virškinamosios liaukos gabalėlis.

I.2. Mikroskopiniai metodai

I.2.1. Citologinis tyrimas (atspaudų citologinis tyrimas)

Nusausinus žiaunų arba širdies audinius sugeriamuoju popieriumi, padaromi keli jų atspaudai stiklo plokštelėje. Plokštelės išdžiovinamos ore, užfiksuojamos metanoliu arba absoliučiuoju etanoliu ir nudažomos naudojant rinkoje parduodamą rinkinį kraujui dažyti, pavyzdžiui, Diff-Quick®/Hemacolor®, pagal gamintojo nurodymus. Vandeniu iš čiaupo nuplautos ir išdžiovintos plokštelės uždengiamos dengiamosiomis plokštelėmis ir užsandarinamos tinkama sintetine derva. Plokštelės pirmiausia apžiūrimos per 200 kartų didinantį, o tada, naudojant imersinį aliejų, 1 000 kartų didinančiu mikroskopu.

Teigiamu šio tyrimo rezultatu laikomas mažų (2–5 μm skersmens) rutulio arba kiaušinio pavidalo organizmų buvimas hemocituose. Tačiau šių parazitų gali būti ne tik ląstelėse. Šie organizmai sudaryti iš bazofilinės citoplazmos ir eozinofilinio branduolio (kurių spalvos gali priklausyti nuo naudojamų dažų), o paskleisti ant stiklo plokštelės atspauduose gali atrodyti platesni negu histologinio tyrimo metu. Galima pastebėti ląstelių ir su keliais branduoliais. Šis tyrimo metodas nėra konkrečiai skirtas šios rūšies parazitams.

I.2.2. Histologinis tyrimas

Audinių, įskaitant žiaunas ir virškinamąją liauką, atpjovos bent 24 valandas laikomos užfiksuotos Davidsono fiksatoriumi, o tada paruošiamos histologiniam tyrimui, kurio metu naudojamas parafinas, įprastu būdu ir nudažomos, pavyzdžiui, hematoksilinu ir eozinu. Mėginiai apžiūrimi didinant mikroskopu iki 1 000 kartų.

Teigiamu šio tyrimo rezultatu laikomas parazitų, labai mažų 2–5 μm skersmens ląstelių, buvimas hemocituose; jų gali būti ir laisvai pasklidusių jungiamajame audinyje arba žiaunų, virškinamojo trakto ir mantijos epitelio fistulėse, kurios dažnai siejamos su stipria uždegimine reakcija. Kad neliktų abejonių, liga diagnozuojama tik aptikus šių parazitų hemocituose. Šis tyrimo metodas nėra konkrečiai skirtas šios rūšies parazitams.

I.3. Molekuliniai metodai

I.3.1. DNR išskyrimas

DNR išskiriama pagal standartines procedūras.

Galima naudoti DNR išskyrimo priemonių rinkinius, kurie parduodami rinkoje ir kuriuos naudojant paprastai gaunama aukštos kokybės DNR, tinkama naudoti pagal PGR protokolus, kaip aprašyta toliau.

I.3.2. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

Yra parengti ir paskelbti keli PGR protokolai.

Galima taikyti du PGR protokolus, skirtus mažojo subvieneto rRNR:

a) pirmasis yra tradicinė PGR, kai amplifikuojami keli Haplosporidia fragmentai, įskaitant Bonamia spp. Pradmenys, pavadinti Bo and Boas, yra atitinkamai 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ ir 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-CCC-CC-3′, o amplifikuojant gaunamas 300 bp produktas. PGR mišiniai sudaryti iš buferinio tirpalo (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl [pH 9,0, 25 °C] ir 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP mišinio, 1 μM tiesioginio ir atvirkštinio pradmenų, 0,02 vnt. μl–1 Taq DNR polimerazės ir 0,2 ng μl–1 DNR šablono; bendras tūris yra 50 μl. Mėginiai penkias minutes denatūruojami termocikleriu 94 °C temperatūroje, tada 30 kartų kartojamas toks ciklas: viena minutė 94 °C temperatūroje, viena minutė 55 °C temperatūroje ir viena minutė 72 °C temperatūroje, o baigiant mėginys 10 minučių palaikomas 72 °C temperatūroje. Teigiami kontroliniai mėginiai ruošiami iš labai užkrėsto šeimininko genominės DNR arba plazmidžių DNR, įskaitant tikslinę sritį. Neigiami kontroliniai mėginiai ruošiami iš neužkrėstų šeimininkų genominės DNR ir PGR reagentų be tikslinės DNR. Teigiamas rezultatas yra teigiama PGR amplifikacija iki numatyto dydžio (t. y. 300 bp); visų neigiamų kontrolinių mėginių rezultatai turi būti neigiami, o visų teigiamų kontrolinių mėginių rezultatai teigiami;

b) pagal antrąjį PGR protokolą atliekama analizė naudojant priemonę „SYBR® Green Real time PCR assay“. Ji konkrečiai skirta B. ostreae rūšies parazitams aptikti (kaip aprašyta toliau); ją galima naudoti kartu su B. exitiosa aptikti skirta analizės priemone „SYBR® Green Real time PCR assay“ (Ramilo et al., 2013 m.). Naudojant pradmenis BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) ir BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplifikuojamas 208 bp produktas. PGR skirtų mišinių sudėtyje yra „SYBR® Green Master Mix“ (1 vnt.), 0,3 μM tiesioginio ir atvirkštinio pradmenų ir 200 ng išskirtos DNR. Naudojant aptikimo tikruoju laiku sistemą mėginiai 10 minučių denatūruojami 95 °C temperatūroje, o tada 35 kartus kartojamas toks ciklas: 30 sekundžių 95 °C temperatūroje, 45 sekundės 55 °C temperatūroje ir viena minutė 72 °C temperatūroje. Lydymosi temperatūros kreivės analizė atliekama laipsniškai didinant temperatūrą po 0,5 °C per sekundę, pradedant nuo 55 °C ir baigiant ties 95 °C, ir užrašant su kiekvienu temperatūros pokyčiu susijusios fluorescencijos duomenis. Teigiami kontroliniai mėginiai ruošiami iš labai užkrėsto šeimininko genominės DNR arba plazmidžių DNR, įskaitant tikslinę sritį. Neigiami kontroliniai mėginiai ruošiami iš neužkrėstų šeimininkų genominės DNR ir PGR reagentų be tikslinės DNR. Teigiamas rezultatas yra teigiama PGR amplifikacija su unikalia lydymosi temperatūros smaile (78,25 ± 0,25 °C tokiomis sąlygomis, kurios aprašytos Ramilo et al., 2013 m.); visų neigiamų kontrolinių mėginių rezultatai turi būti neigiami, o visų teigiamų kontrolinių mėginių rezultatai teigiami.

I.3.3. Hibridizacija in situ (ISH)

Yra parengti ir paskelbti keli ISH protokolai.

Naudojamas rDNR genų komplekso mažajam subvienetui skirtas zondas, nors ir pastebėta kryžminė jo reakcija su kai kuriais kitais Haplosporidia šeimos organizmais.

Audinių, įskaitant žiaunas ir virškinamąją liauką, atpjovos bent 24 valandas laikomos užfiksuotos Davidsono fiksatoriumi, o tada paruošiamos histologiniam tyrimui, kurio metu naudojamas parafinas, įprastu būdu. 5 μm storio atpjovos dedamos ant aminoalkilsilanu padengtų plokštelių, kurios per naktį kaitinamos 40 °C temperatūros krosnyje, tada deparafinuojamos 10 min. panardinant į ksileną. Šis veiksmas atliekamas dar kartą, tada tirpiklis pašalinamas po 10 minučių paeiliui panardinant mėginius į dvi voneles, į kurias įpilta absoliučiojo etanolio. Po to atpjovos dehidratuojamos panardinant į seriją etanolio tirpalų. Tada atpjovos dehidratuojamos panardinant į seriją etanolio tirpalų ir 30 minučių apdorojamos proteinaze K (100 μg ml– 1) TE buferiniame tirpale (Tris [50 mM], EDTA [10 mM]) 37 °C temperatūroje. Plokštelės su atpjovomis dehidratuojamos panardinant į seriją etanolio tirpalų ir išdžiovinamos ore. Atpjovos inkubuojamos 100 μl hibridizacijos buferinio tirpalo (4× SSC [standartinio druskos citrato], 50 % formamido, 1× Denhardto tirpalo, 250 μg ml– 1 mielių tRNR, 10 % dekstrano sulfato), į kurį dėta 20 ng (2 μl PGR reakcijos mišinio, paruošto kaip aprašyta I.3.2 punkte, naudojant pradmenis Bo ir Boas) digoksigeninu pažymėtą zondą. Atpjovos uždengiamos in situ plastikinėmis dengiamosiomis plokštelėmis ir penkias minutes laikomos padėtos ant kaitinimo įrenginio 95 °C temperatūroje. Plokštelės vieną minutę aušinamos padėtos ant ledo, po to per naktį atliekama hibridizacija didelio drėgnio kameroje 42 °C temperatūroje. Atpjovos dukart po penkias minutes plaunamos 2 × SSC (kambario temperatūros) ir vieną kartą 10 minučių 0,4 × SSC (42 °C temperatūroje). Aptikimo veiksmai atliekami pagal gamintojo nurodymus. Tada plokštelės nuplaunamos steriliu distiliuotu vandeniu (dH2O). Atpjovos perdažomos naudojant dažus „Bismarck Brown Yellow“, nuplaunamos distiliuotu vandeniu ir uždengiamos dengiamosiomis plokštelėmis naudojant tam skirtą vandeninę terpę.

Teigiami ir neigiami kontroliniai mėginiai atitinkamai ruošiami iš žinomų užkrėstų ir neužkrėstų šeimininkų audinių atpjovų.

Teigiamas rezultatas yra pažymėtų parazitų buvimas hemocituose; visų neigiamų kontrolinių mėginių rezultatai turi būti neigiami, o visų teigiamų kontrolinių mėginių rezultatai teigiami.

I.3.4. Sekos nustatymas

DNR sekos nustatymas atliekamas kaip vienas iš paskutinių patvirtinamosios diagnostinės procedūros etapų. Tikslinės sritys yra mažojo subvieneto rDNR ir ITS1.

II. Bonamia ostreae infekcijos priežiūros ir patvirtinimo procedūros

Vykdant Bonamia ostreae infekcijos priežiūrą ir patvirtinant šios infekcijos buvimą arba paneigiant dėl jos kilusius įtarimus pagal I priedo 5 dalies II skirsnyje nustatytus reikalavimus, taikomi diagnostiniai metodai ir atitinkamos procedūros pagal 5.1 lentelėje pateiktas gaires.

5.1 lentelė.

Gairės dėl diagnostinių metodų taikymo pagal priežiūros programas ir siekiant patvirtinti Bonamia ostreae infekciją arba paneigti dėl jos kilusius įtarimus

Metodas Kryptinga priežiūra Pirminė diagnozė Patvirtinamoji diagnozė Širdies arba žiaunų audinių atspaudų tyrimas X X X, arba Histopatologinis tyrimas X X, arba Hibridizacija in situ X, ir PGR X X X, ir Sekos nustatymas X

6 DALIS

BALTMĖS (VITILIGO) PRIEŽIŪROS IR BUVIMO PATVIRTINIMO IŠSAMŪS DIAGNOSTINIAI METODAI IR PROCEDŪROS

1. Diagnostinės procedūros, pagal kurias aptinkamas baltmės (vitiligo) virusas

Imant mėginius ir atliekant laboratorinį tyrimą pagal priežiūros ir likvidavimo programas, nustatytas I priedo 6 dalies I skirsnyje, ir pagal Direktyvos 2006/88/EB 57 straipsnio b punktą siekiant patvirtinti arba paneigti įtarimą dėl baltmės (vitiligo) virusinės infekcijos I priedo 6 dalies II skirsnyje nustatytais diagnostiniais metodais, taikomi šios dalies 2–7 punktuose išsamiai aprašyti diagnostiniai metodai ir procedūros.

Šioje II priedo dalyje aprašyti metodai ir procedūros yra pritaikyti remiantis Europos Sąjungos etaloninėje vėžiagyvių ligų tyrimo laboratorijoje atliekamu tyrimu, akredituotu pagal standartą ISO 17025. Vietoj jų galima taikyti alternatyvius metodus lygiavertėmis sąlygomis arba naudojant kitų gamintojų pagamintus tyrimų rinkinius, jautriu ir specifiškumu prilygstančius šioje dalyje aprašytiems rinkiniams. Siekiant patikimai identifikuoti baltmės (vitiligo) virusą visais atvejais nustatoma PGR amplifikacijos produkto DNR seka.

2. Mėginių ėmimo procesas

Baltmės (vitiligo) virusu užkrėstus vėžiagyvių audinius (pleopodijas ir žiaunas) galima laikyti etanolyje, „RNAlater“ tirpale arba iškart užšaldytus – 80 °C temperatūroje. Nustatant baltmės (vitiligo) virusą audinių mėginiuose privalomi procedūros etapai yra audinio homogenizavimas, DNR išskyrimas, speciali baltmės (vitiligo) viruso DNR amplifikacija PGR būdu, amplifikacijos produkto vizualizacija gelyje, DNR išgryninimas ir sekos nustatymas patikimai identifikuojant užkratą.

3. Audinio homogenizavimas

Audiniai suardomi ir homogenatas tinkamame buferiniame tirpale paruošiamas naudojant audinius ardantį prietaisą „Fast Prep“ ir mėgintuvėlius „Lysing Matrix A“ („MP Biomedicals“). Audinys pasveriamas, įdedamas į mėgintuvėlius „Lysing Matrix A“, atskiedžiamas, kad jo masės ir skiediklio tūrio santykis būtų 1:10, arba pagal gamintojo nurodymus, tinkamu buferiniu tirpalu (G2, į kurį dėta 10 μl proteinazės K, skirtu naudoti su gamintojo „Qiagen“ rinkiniu „DNA Tissue Kit“) ir homogenizuojamas dvi minutes apdorojant homogenizatoriumi „Fast Prep-24“. Homogenizuoti mėginiai bent keturias valandas arba per naktį inkubuojami 56 °C temperatūroje. Mėginiai sumaišomi sūkuriniu maišytuvu, dvi minutes centrifuguojami 9 000 sūkių/min., tada 50 μl supernatanto arba 5 mg audinio (optimali audinio masė naudojant DNR išskyrimo rinkinį) atitinkantis šio skysčio kiekis įpilamas į mėgintuvėlį su mėginiu, iš kurio bus išskiriama DNR, ir papildomas buferiniu tirpalu G2 iki 200 μl tūrio.

4. DNR išskyrimas

Išskiriama visa DNR naudojant DNR išskirti iš audinių skirtą rinkinį ir „EZ1 Advanced XL Biorobot“ („Qiagen“) pagal gamintojo nurodymus. Kartu su kiekviena mėginių partija imama po vieną DNR išskyrimo (veršelio užkrūčio liaukos DNR) kontrolinį mėginį ir neigiamą (buferinio tirpalo G2) kontrolinį mėginį. DNR išskiriama iki 50 μl tūrio. Siekiant įsitikinti, kad DNR išskyrimas atliktas sėkmingai, visuose mėginiuose ir kontro