I PRIEDAS

Tyrimų, kurie turi būti atliekami pagal 3, 4, 5, 7 ir 8 straipsnius, planas

1. SU NURODYTOJO KENKĖJO BUVIMU SUSIJĘ BENDRIEJI PRINCIPAI

1.1. Nurodytojo kenkėjo buvimas įtariamas, jeigu atlikus pirmąjį aptikimo tyrimą su nurodytuoju augalu gaunamas teigiamas rezultatas. Užkrėtimo požymių turinčios augalinės medžiagos atveju pirmasis aptikimo tyrimas gali būti atrankusis išskyrimas.

1.2. Nurodytojo kenkėjo buvimas užkrėtimo požymių turinčiuose nurodytųjų augalų ėminiuose patvirtinamas šiais atvejais: a) kai pirmasis aptikimo tyrimas yra atrankusis išskyrimas, kurį atlikus nustatomos tipines morfologines savybes turinčios kolonijos: gaunami teigiami dviejų identifikavimo tyrimų rezultatai; b) kai pirmasis aptikimo tyrimas yra ne atrankusis išskyrimas, o kitas tyrimas: i) po atrankiojo išskyrimo iš ėminio atlikus du identifikavimo tyrimus gaunami teigiami rezultatai; ii) atlikus antrąjį tyrimą, kuris nėra atrankusis išskyrimas, gaunami teigiami rezultatai.

1.3. Nurodytojo kenkėjo buvimas užkrėtimo požymių neturinčiuose nurodytųjų augalų ėminiuose patvirtinamas šiais atvejais: a) kai atlikus antrąjį aptikimo tyrimą gaunamas teigiamas rezultatas, su sąlyga, kad pirmasis arba antrasis aptikimo tyrimas yra molekulinis (DNR grindžiamas) tyrimas (TaqMan® tikralaikės PGR arba įprastinės PGR tyrimas); b) jei ėminiai paimti valstybėje narėje arba valstybės narės zonoje, kurioje nurodytasis kenkėjas neaptinkamas, ir jei ėminiai yra kilę iš kitos valstybės narės: kai pagal a punktą atlikus antrąjį aptikimo tyrimą gaunamas teigiamas rezultatas ir kai po atrankiojo išskyrimo iš ėminio atlikus du identifikavimo tyrimus gaunami teigiami rezultatai.

2. TYRIMAI

2.1. Aptikimo tyrimai

Atliekami tokie aptikimo tyrimai, kuriais būtų galima nuosekliai aptikti ne mažiau kaip 104 ląstelių viename mililitre pakartotinai suspenduotų nuosėdų.

Antrasis aptikimo tyrimas grindžiamas kitokiais biologiniais principais arba kitokiomis nukleotidų sritimis nei pirmasis aptikimo tyrimas.

Aptikimo tyrimai yra šie:

a) imunofluorescencinė analizė, kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose;

b) FISH tyrimas (van Beuningen et al. (1995) (1)), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose;

c) išskyrimas, kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose. Atliekamas vienas iš šių dviejų tyrimų: i) tiesioginis išskyrimas pusiau atrankioje (arba neatrankiojoje) auginimo terpėje, kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose; ii) po įsotinimo naudojant biologinį tyrimą – išskyrimas, kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose;

d) įprastinės PGR tyrimas naudojant Pastrik (2000) (2) pradmenis, kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose;

e) TaqMan® tikralaikės PGR tyrimai naudojant šiuos pradmenis ir zondus: i) Schaad et al. (1999) (3), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (vadinamasis NYtor tyrimas), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose; iii) Gudmestad et al. (2009), pritaikytą pagal Vreeburg et al. (2018)4, kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose; iv) Massart et al. (2014)) (5), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose.

2.2. Identifikavimo tyrimai

Identifikavimo tyrimai yra šie:

a) imunofluorescencinė analizė, kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose;

b) įprastinės PGR tyrimas (Pastrik (2000)), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose;

c) TaqMan® tikralaikės PGR tyrimai naudojant šiuos pradmenis ir zondus: i) Schaad et al. (1999), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose; ii) Vreeburg et al. (2018) (vadinamasis NYtor tyrimas), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose; iii) Gudmestad et al. (2009), pritaikytą pagal Vreeburg et al. (2018), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose; iv) Massart et al. (2014), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose;

d) DNR brūkšninis kodavimas, kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose;

e) MALDI-TOF masių spektrometrija (Zaluga et al. (2011) (6)), kaip aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose.

3. PROCEDŪRŲ STRUKTŪRINĖS SCHEMOS

1 struktūrinė schema. Nurodytojo kenkėjo buvimo užkrėtimo požymių turinčiuose nurodytojo augalo ėminiuose diagnostikos procedūra.

a Išskyrimas gali būti atliekamas kaip pirmasis arba antrasis aptikimo tyrimas. Įtarus nurodytojo kenkėjo buvimą auginimo terpėje, kolonijos išgryninamos siekiant gauti grynas kultūras, su kuriomis atliekami du identifikavimo tyrimai. Kenkėjo buvimui patvirtinti reikalingi teigiami dviejų identifikavimo tyrimų rezultatai.

b Trečiasis aptikimo tyrimas grindžiamas kitokiais biologiniais principais arba kitokiomis nukleotidų sritimis.

2 struktūrinė schema. Nurodytojo kenkėjo buvimo užkrėtimo požymių neturinčiuose nurodytojo augalo ėminiuose diagnostikos procedūra.

a Išskyrimas neatliekamas.

b Trečiasis aptikimo tyrimas grindžiamas kitokiais biologiniais principais arba kitokiomis nukleotidų sritimis. Išskyrimas neatliekamas.

c 1.3 punkto b papunktyje nurodytų ėminių atveju, siekiant patvirtinti nurodytojo kenkėjo buvimą po antrojo teigiamo aptikimo tyrimo, nurodytąjį kenkėją reikia išskirti iš ėminio, o po to atlikti du identifikavimo tyrimus, kurių rezultatai būtų teigiami.

4. ĖMINIO RUOŠIMAS

4.1. Užkrėtimo požymių neturinčių gumbų ėminiai

Standartinį ėminį sudaro 200 gumbų vienam tyrimui. Atitinkama laboratorinė gumbo dalių prie viršūnės apdorojimo procedūra, atliekama siekiant gauti ekstraktą, kuris naudojamas nurodytajam kenkėjui aptikti, aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose.

4.2. Užkrėtimo požymių neturinčios augalinės medžiagos, išskyrus gumbus, ėminiai

Tyrimas latentinėms infekcijoms aptikti atliekamas naudojant jungtinius stiebo segmentų ėminius. Procedūra gali būti taikoma iki 200 stiebo dalių, paimtų iš vieną ėminį sudarančių skirtingų augalų. Atitinkama laboratorinė stiebo segmentų dezinfekavimo ir apdorojimo procedūra, atliekama siekiant gauti ekstraktą, kuris naudojamas nurodytajam kenkėjui aptikti, aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose.

4.3. Užkrėtimo požymių turinčių nurodytųjų augalų ėminiai

Aseptinėmis sąlygomis iš gumbo apytakinio žiedo arba iš nurodytųjų augalų, ant kurių matomi vytimo simptomai, stiebo apytakinio audinio paimamos audinio dalys. Atitinkama laboratorinė šių audinių apdorojimo procedūra, atliekama siekiant gauti ekstraktą, kuris naudojamas nurodytajam kenkėjui aptikti, išsamiai aprašyta tarptautiniuose diagnostikos standartuose.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155–165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400–7. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.