6.

VII priedas pakeičiamas taip: „VII PRIEDAS 2-GLICERIL MONOPALMITATO PROCENTINIO KIEKIO NUSTATYMAS 1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS Aprašyti analitinę procedūrą 2-oje triglicerido padėtyje esančios palmitino rūgšties procentinei daliai apskaičiuoti, nustatant 2-glicerilo monopalmitato kiekį. Šis metodas taikomas aplinkos temperatūros (20 °C) skystiems augaliniams aliejams. 2. METODO ESMĖ Paruoštas aliejaus mėginys veikiamas kasos lipaze: dėl dalinės ir specifinės 1 bei 3 padėties triglicerido molekulės hidrolizės monogliceridai atsiranda 2-oje padėtyje. Procentinis 2-glicerilo monopalmitato kiekis monoglicerido frakcijoje nustatomas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu, prieš tai atlikus sililinimą. 3. ĮRANGA IR MEDŽIAGOS 3.1. 25 ml Erlenmejerio kolba 3.2. 100, 250 ir 300 ml cheminės stiklinės 3.3. Stiklinė chromatografijos kolonėlė su deginto stiklo disku ir čiaupu, kurios vidinis skersmuo 21–23 mm, ilgis 400 mm. 3.4. 10, 50, 100 ir 200 ml matavimo cilindrai 3.5. 100 ir 250 ml kolbos 3.6. Sukamasis garintuvas 3.7. 10 ml centrifugavimo mėgintuvėliai su kūginės formos dugnu, uždaromi matinio stiklo kamščiu 3.8. Centrifuga 10 ir 100 ml mėgintuvėliams 3.9. Termostatas, kuriame galima palaikyti 40 + 0,5 °C temperatūrą 3.10. 1 ir 2 ml graduotos pipetės 3.11. 1 ml poodinis švirkštas 3.12. 100 μl mikrošvirkštas 3.13. 1 000 ml talpos piltuvas 3.14. Kapiliarinis dujų chromatografas su šalto tiesioginio įpurškimo įtaisu mėginiui tiesiogiai į kolonėlę patalpinti, ir krosnis, kurioje norimą temperatūrą galima palaikyti apytiksliai 1 °C tikslumu 3.15. Šalto tiesioginio įpurškimo įtaisas mėginiui tiesiogiai į kolonėlę patalpinti 3.16. Liepsnos jonizacinis detektorius ir elektrometras 3.17. Kintamo popieriaus tiekimo greičio savirašis integratorius, dirbantis su elektrometru, kurio atsako sparta ne didesnė kaip viena sekundė 3.18. 8–12 m ilgio ir 0,25–0,32 mm vidinio skersmens stiklinė arba kvarcinio stiklo kapiliarinė kolonėlė, padengta 0,10–0,30 μm storio metilpolisiloksano arba 5 % fenil metilpolisiloksano plėvele. Kolonėlė gali būti naudojama 370 °C temperatūroje. 3.19. 10 μl mikrošvirkštas su ne trumpesne kaip 7,5 cm kietinta adata, pritaikytas mėginiui tiesiogiai įšvirkšti į kolonėlę. 4. REAGENTAI 4.1. Silikagelis, kurio granulių dydis 0,063–0,200 mm (70/280 mešų), paruoštas taip: silikagelis dedamas į porcelianinį indą, 4 valandas džiovinamas 160 °C džiovinimo spintoje, po to eksikatoriuje vėsinamas iki kambario temperatūros. Įpilama 5 % (silikagelio masės) vandens: Erlenmejerio kolboje pasveriama 152 g silikagelio ir įpilama 8 g distiliuoto vandens, kolba užkemšama ir atsargiai pakratoma, kad vanduo tolygiai pasiskirstytų. Prieš naudojant paliekama nusistovėti ne mažiau kaip 12 valandų. 4.2. n-heksanas, tinkamas chromatografijai 4.3. Izopropanolis 4.4. Izopropanolis, 1/1 vandeninis tirpalas (v/v) 4.5. Kasos lipazė. Naudojamos lipazės aktyvumas turi būti nuo 2,0 iki 10 lipazės vienetų/mg (Rinkoje prekiaujama kasos lipaze, kurios aktyvumas nuo 2 iki 10 vienetų 1 mg fermento). 4.6. Buferinis tri(hidroksimetil)aminometano tirpalas: 1 M vandeninis tirpalas parūgštinamas iki pH 8 (potenciometrinis patikrinimas) koncentruotu HCl (1:1 v/v) 4.7. Natrio choliato (fermentų kokybės) 0,1 % vandeninis tirpalas (šis tirpalas turi būti sunaudotas per 15 dienų nuo jo paruošimo) 4.8. Kalcio chlorido 22 % vandeninis tirpalas 4.9. Dietileteris, tinkamas chromatografijai 4.10. Judančioji fazė: n-heksano ir dietileterio (87/13) (v/v) mišinys 4.11. Natrio hidroksido 12 % (svorio procentais) tirpalas 4.12. Fenolftaleino 1 % tirpalas etanolyje 4.13. Nešančiosios dujos: helis arba vandenilis, tinkamas dujų chromatografijai 4.14. Pagalbinės dujos: ne mažesnio kaip 99 % grynumo vandenilis, išvalytas nuo drėgmės ir organinių medžiagų, ir tokio pat grynumo oras, tinkamas dujų chromatografijai. 4.15. Sililinizavimo reagentas: piridino, heksametildisilazano ir trimetilchlorsilano mišinys santykiu 9:3:1 (v/v/v). (Rinkoje prekiaujama naudoti paruoštais tirpalais. Gali būti naudojami kiti sililinimo reagentai, pvz., N,O-bi(trimetilsilil)trifluoracetamido + 1 % trimetilchlorsilano mišinys, praskiestas tuo pačiu sauso piridino tūriu). 4.16. Etaloniniai tirpalai: grynieji monogliceridai arba monogliceridų mišiniai, kurių procentinė sudėtis yra artima tiriamų mėginių sudėčiai. 5. DARBO EIGA 5.1. Mėginio paruošimas 5.1.1. Taikant silikagelio kolonėlinę chromatografiją aliejams, kuriuose laisvųjų rūgščių kiekis mažesnis kaip 3 %, jų neutralizuoti nereikia. Aliejai, kuriuose laisvųjų rūgščių kiekis didesnis kaip 3 %, turi būti neutralizuojami pagal 5.1.1.1. punktą. 5.1.1.1. Į 1 000 ml talpos piltuvą (3.13) įpilama 50 g aliejaus ir 200 ml n-heksano. Įpilama 100 ml izopropanolio ir 12 % natrio hidroksido tirpalo (4.11). Įpilamas natrio hidroksido tirpalo kiekis, atitinka aliejaus laisvųjų rūgščių kiekį, padidintą 5 %. Vieną minutę stipriai kratoma. Įpilama 100 ml distiliuoto vandens, vėl kratoma ir paliekama nusistovėti. Atlikus dekantavimą, apatinis muilo sluoksnis pašalinamas. Išleidžiamas tarpinis sluoksnis (gleivės, netirpios medžiagos). Neutralizuoto aliejaus tirpalas heksane plaunamas izopropanolio ir vandens tirpalo (1:1 (v/v)) (4.4) 50–60 ml porcijomis, kol pranyksta rožinė fenolftaleino spalva. Didesnioji heksano dalis pašalinama distiliuojant vakuume (pvz., naudojant sukamąjį garintuvą) ir aliejus perpilamas į 100 ml kolbą (3.5). Aliejus džiovinamas vakuume, kol tirpiklio visiškai nebelieka. Baigus šią procedūrą, aliejaus rūgštingumas turi būti ne didesnis kaip 0,5 %. 5.1.2. Į 25 ml talpos Erlenmejerio kolbą (3.1) įpilama 1,0 g aliejaus, paruošto anksčiau minėtu būdu, ir ištirpinama 10 ml judančiosios fazės (4.10) mišinio. Tirpalas, prieš atliekant silikagelio kolonėlinę chromatografiją, paliekamas nusistovėti ne trumpiau kaip 15 minučių. Jei tirpalas drumstas, jis centrifuguojamas, siekiant sudaryti optimalias sąlygas chromatografijai. (Gali būti naudojama 500 mg naudoti paruoštų SPE silikagelio kapsulių). 5.1.3. Chromatografinės kolonėlės paruošimas Į kolonėlę (3.3) įpilama apie 30 ml judančiosios fazės (4.10), stikline lazdele į kolonėlės apačią įkišamas ir paspaudžiamas gabalėlis vatos, kad išeitų oras. Cheminėje stiklinėje paruošiama 80 g judančiosios fazės ir 25 g silikagelio (4.1) suspensija ir naudojant piltuvą supilama į kolonėlę. Patikrinama, ar į kolonėlę supiltas visas silikagelio kiekis; išplaunama judančiąja faze (4.10), atsukamas čiaupas ir skystis turi pasiekti 2 mm lygį virš silikagelio. 5.1.4. Kolonėlinė chromatografija 25 ml talpos Erlenmejerio kolboje (3.1.) tiksliai pasveriama 1,0 g pagal 5.1 punktą paruošto mėginio. Mėginys ištirpinamas 10 ml judančiosios fazės (4.10). Tirpalas supilamas į chromatografinę kolonėlę, paruoštą pagal 5.1.3 punktą. Kolonėles paviršiaus stengiamasi nejudinti. Atsukamas čiaupas ir mėginio tirpalui leidžiama tekėti, kol jis pasiekia silikagelio lygį. Procesas tęsiamas, naudojant 150 ml judančiosios fazės. Nustatomas 2 ml/min tekėjimo greitis (taip, kad 150 ml iš kolonėlės ištekėtų per 60–70 min). Į iš anksto pasvertą 250 ml talpos kolbą surenkamas eliuatas. Tirpiklis išgarinamas vakuume ir jo likučiai pašalinami azoto srove. Kolba pasveriama ir apskaičiuojamas išgautas ekstrakto kiekis. Jei naudojamos naudoti paruoštos SPE silikagelio kapsulės, į iš anksto su 3 ml n-heksano paruoštas kapsules įpilama 1 ml tirpalo (5.1.2.). Tirpalas filtruojamas ir veikiamas 4 ml n-heksano ir dietileterio (9/1) (v/v) mišiniu. Eliuatas surenkamas į 10 ml talpos mėgintuvėlį ir išdžiovinamas azoto srovėje. Sausas likutis apdorojamas kasos lipaze (5.2). Prieš ir po SPE kapsulių naudojimo labai svarbu patikrinti riebiųjų rūgščių sudėtį.). 5.2. Hidrolizė kasos lipaze 5.2.1. Centrifugavimo mėgintuvėlyje pasveriama 0,1 g pagal 5.1. punktą paruošto aliejaus. Įpilama 2 ml buferinio tirpalo (4.6), 0,5 ml natrio choliato tirpalo ir 0,2 ml kalcio chlorido tirpalo (4.7), įpylus kiekvieną iš šių tirpalų, gerai išmaišoma. Mėgintuvėlis uždaromas matinio stiklo kamščiu ir dedamas į termostatą, kuriame palaikoma 40 ± 0,5 °C temperatūra. 5.2.2. Įdedama 20 mg lipazės, atsargiai pakratoma (taip, kad nesudrėktų kamštis) ir mėgintuvėlis įdedamas į termostatą lygiai 2 min, po to iš jo išimamas, stipriai kratomas lygiai 1 min ir paliekamas atvėsti. 5.2.3. Įpilama 1 ml dietileterio, užkemšama ir smarkiai kratoma, po to centrifuguojama ir eterio tirpalas mikrošvirkštu perpilamas į švarų ir sausą mėgintuvėlį. 5.3. Sililinizuotų darinių ir dujų chromatografijos paruošimas 5.3.1. Į 10 ml talpos mėgintuvėlį su kūginės formos dugnu mikrošvirkštu įšvirkščiama 100 μl tirpalo (5.2.3). 5.3.2. Tirpiklis pašalinamas nestipria azoto srove, įpilama 200 μl sililinizavimo reagento (4.15), mėgintuvėlis užkemšamas ir 20 minučių paliekamas nusistovėti. 5.3.3. Po 20 minučių, įpilama 1–5ml n-heksano (atsižvelgiant į chromatografines sąlygas): gautas tirpalas yra paruoštas dujų chromatografinei analizei. 5.4. Dujų chromatografija Darbo sąlygos: — inžektoriaus (tiesioginio įpurškimo įtaiso) temperatūra žemesnė nei tirpiklio virimo temperatūra (68 °C), — detektoriaus temperatūra: 350 °C, — kolonėlės temperatūra: krosnies temperatūros nustatymas: 60 °C 1 minutę, po to kas minutę didinama po 15 °C, kol pasiekiama 180 °C, po to kas minutę didinama po 5 °C, kol pasiekiama 340 °C, tuomet 340 °C temperatūra palaikoma 13 minučių, — nešančiosios dujos: vandenilis arba helis, naudojami nustačius atitinkamą linijinį greitį, kad būtų pasiekta 1 paveiksle pavaizduota skiriamoji geba. Triglicerido C54 sulaikymo trukmė turi būti 40 ± 5 minutės (žr. 2 paveikslą). (Nurodytos sąlygos yra orientacinės. Operatoriai turi jas optimizuoti, kad būtų pasiekta pakankama skiriamoji geba. Glicerino monopalmitatą atitinkančios smailės minimalus aukštis turi būti ne mažesnis kaip 10 % savirašio skalės), — įpurkštas medžiagos kiekis: 0,5–1 μl (5 ml) n-heptano tirpalo (5.3.3.). 5.4.1. Smailių identifikavimas Monogliceridai identifikuojami pagal sulaikymo trukmes ir šias trukmes lyginant su standartinių monogliceridų mišinių sulaikymo trukmėmis, analizuojamomis tomis pačiomis sąlygomis. 5.4.2. Kiekybinis vertinimas Kiekvienos smailės plotas apskaičiuojamas elektroniniu integratoriumi. 6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS Procentinis glicerilo monopalmitato kiekis apskaičiuojamas pagal atitinkamos smailės ploto santykį su visų monogliceridų smailių plotu (žr. 2 paveikslą), taikant tokią formulę: glicerilo monopalmitatas (%): kurioje: Ax = Glicerino monopalmitatą atitinkančios smailės plotas ΣA = visų monoglicerido smailių plotų suma. Rezultatai pateikiami vieno ženklo po kablelio (dešimtųjų) tikslumu. 7. ANALIZĖS ATASKAITA Analizės ataskaitoje pateikiama: — nuoroda į šį metodą, — išsami pilnam mėginio identifikavimui reikalinga informacija, — analizės rezultatas, — bet kokie nukrypimai nuo metodo, padaryti atitinkamoms šalims nusprendus ar dėl kitų priežasčių, — laboratorijos identifikavimo duomenys, analizės atlikimo data ir už analizę atsakingo asmens parašas. 1 paveikslas Sililinizavimo reakcijos produktų, gautų rafinuotą alyvuogių aliejų su 20 % esterifikuoto aliejaus (100 %) priedu, paveikus lipaze, chromatograma 2 paveikslas Chromatograma: A) neesterifikuotas alyvuogių aliejus po poveikimo lipaze; po sililinizavimo; tokiomis sąlygomis (8–12 m ilgio kapiliarinė kolonėlė) vaškų frakcija išplaunama tuo pačiu metu arba truputį vėliau nei digliceridų frakcija. Paveikus lipaze trigliceridų kiekis neturėtų viršyti 15 % Chromatograma: B) esterifikuotas aliejus po poveikio lipaze; po sililinizavimo; tokiomis sąlygomis (8–12 m ilgio kapiliarinė kolonėlė) vaškų frakcija išplaunama tuo pačiu metu arba truputį vėliau nei digliceridų frakcija. Paveikus lipaze trigliceridų kiekis neturėtų viršyti 15 % 8. PASTABOS 1 pastaba. LIPAZĖS RUOŠIMAS Rinkoje prekiaujama naudoti paruošta pakankamo aktyvumo lipaze. Lipazę taip pat galima paruošti laboratorijoje: 0 °C temperatūroje atšaldoma 5 kg šviežios kiaulių kasos. Pašalinami aplinkui esantys kieti riebalai bei apie juos esantis jungiamasis audinys, sumalama, kad susidarytų pastos pavidalo skysta masė. Ši pasta keturias-šešias valandas kratoma su 2,5 l absoliučiojo acetono ir centrifuguojama. Likutis dar tris kartus ekstrahuojamas tuo pačiu acetono tūriu, paskui du kartus 1:1 (v/v) acetono ir dietileterio mišiniu ir du kartus dietileteriu. Likutis 48 valandas džiovinamas vakuume, tam kad gauti milteliai būtų patvarūs. Tokie milteliai, apsaugant juos nuo drėgmės, gali būti laikomi ilgą laiką šaldytuve. 2 pastaba. LIPAZĖS AKTYVUMO TIKRINIMAS Alyvuogių aliejaus emulsija ruošiama taip: Maišytuve 10 minučių plakamas mišinys, sudarytas iš 165 ml gumiarabiko tirpalo (100 g/l), 15 g smulkinto ledo ir 20 ml neutralizuoto alyvuogių aliejaus. Į 50 ml talpos cheminę stiklinę įpilama 10 ml šios emulsijos, po to 0,3 ml natrio choliato tirpalo (0,2 g/ml) ir 20 ml distiliuoto vandens. Cheminė stiklinė dedama į termostatą, kuriame palaikoma 37 °C temperatūra; įstatomi pH matuoklio elektrodai ir sraigtinis maišiklis. Biurete lašinamas natrio hidroksido tirpalas, kol pH pasiekia 8,3. Į vandenį įpilama lipazės miltelių suspensijos (0,1 g/ml lipazės). Kai tik pH matuoklis parodo 8,3, paleidžiamas chronometras ir natrio hidroksido tirpalas lašinamas tokiu greičiu, kad pH visą laiką būtų 8,3. Kas minutę pasižymimas sunaudoto tirpalo tūris. Matavimai pavaizduojami x/y koordinačių sistemoje, abscisėje nurodant laiką, o ordinatėje – sunaudoto 0,1 N natrio hidroksido tūrį (mililitrais), kuris sunaudotas pastoviam pH išlaikyti. Turi būti gaunamas linijinis grafikas. Lipazės aktyvumas, matuojamas lipazės vienetais/mg, apskaičiuojamas pagal tokią formulę: kurioje: A aktyvumas, išreikštas lipazės vienetais/mg V 0,1 N natrio hidroksido tirpalo mililitrų skaičius per minutę (apskaičiuotas pagal grafiką) N natrio hidroksido tirpalo molinė ekvivalentų koncentracija m analizuojamos lipazės mėginio masė, mg. Lipazės vienetas yra apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris išskiria 10 mikroekvivalentų rūgšties per minutę.“