Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

Kartais medžiagos gali sukelti slėgio didėjimą (per didelį arba per mažą), kurio priežastis cheminės reakcijos, neapibūdinančios medžiagos oksiduojamųjų savybių. Tokiais atvejais norint nustatyti reakcijos tipą, bandymą gali tekti kartoti, vietoj celiuliozės naudojant inertinę medžiagą, pvz., diatomitą.

Slėgio keitliu gautas signalas užrašomas tinkama sistema, kuri leistų gauti nepertraukiamą slėgio kitimo laike kreivę ir kartu ją analizuoti (pvz., pereinamųjų vyksmų sąvirašis, sujungtas su diagramų sąvirašiu). Mišinys kaitinamas tol, kol plyšta trūkioji membrana, arba bent 60 s. Jei trūkioji membrana neplyšta, mišinys paliekamas aušti prieš tai jį atsargiai atidarant, imantis atsargumo priemonių, jei slėginiame inde dar būtų per didelis slėgis. Medžiaga ir kiekviena etaloninė medžiaga bandoma penkis kartus. Užrašomas laikas, per kurį slėgis padidėja nuo 690 kPa iki 2 070 kPa virš atmosferos slėgio. Apskaičiuojama vidutinė slėgio didėjimo trukmė.

Aparatas su slėgio keitliu ir kaitinimo sistema, bet be trūkiosios membranos, tvirtinamas stove uždegimo žvake žemyn. Cheminėje stiklinėje stikline lazdele (18) sumaišoma 2,5 g bandomojo skysčio ir 2,5 g išdžiovintos celiuliozės. Saugai užtikrinti, maišant tarp operatoriaus ir mišinio turi būti saugos skydas. Jei mišinys užsidega maišant arba pilant į indą, toliau bandyti nereikia. Mišinį reikia dėti į slėginį indą mažomis dalimis tapšnojant ir užtikrinti, kad jis būtų dedamas apie uždegimo apviją ir gerai su ja liestųsi. Svarbu kad dedant mišinį apvija nebūtų deformuota, kadangi dėl to gali būti gauti klaidingi rezultatai (19) . Trūkioji membrana dedama į vietą ir gerai užsukamas tvirtinimo kamštis. Indas su įkrova trūkiąja membrana į viršų įstatomas į laikantįjį stovą, kuris turi būti statomas tinkamoje šarvuotoje traukos spintoje arba deginimo kameroje. Prie uždegimo žvakės kontaktų jungiamas maitinimo šaltinis ir įjungiama 10 A srovė. Laikas nuo maišymo pradžios iki maitinimo įjungimo turi būti ne didesnis kaip 10 min.

Be to, jei bandytojas numato, kad šio bandymo rezultatai gali būti naudojami kitais tikslais (11) , pasirinktinai gali būti tikslinga naudoti papildomas etalonines medžiagas (13) .

Atsižvelgiant į taikomą analizės metodą turi būti atliekami vienas arba du bandymai. Kai yra specifiniai tiesioginės polimerų komponentų analizės vandeninėje terpėje metodai, turėtų pakakti vieno anksčiau aprašyto bandymo. Tačiau kai tokių metodų nėra, o polimero tirpumo (ekstrahavimosi) nustatymas apribotas tik netiesiogine analize, vandeniniame ekstrakte nustatant tik bendrosios organinės anglies kiekį (BOA), turi būti atliktas papildomas bandymas. Be to, šis papildomas bandymas turi būti atliekamas tris kartus, naudojant 10 kartų mažesnius polimero bandinius ir tuos pačius vandens kiekius, kurie buvo naudojami pirmajame bandyme.

ASTM D 5296–92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536–91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto stūmoklio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.

Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139–2146.

Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

ASTM 3592–77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, p. 25–52.

ASTM D 3750–79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.

remiasi osmoso principu, t. y. tirpiklio molekulių savaiminiu perėjimu per puslaidę membraną iš praskiesto tirpalo į koncentruotą tirpalą. Bandyme praskiesto tirpalo koncentracija yra nulinė, o koncentruotame tirpale yra polimero. Dėl tirpiklio siurbimo per membraną susidaro slėgių skirtumas, kurio dydis priklauso nuo polimero koncentracijos ir molekulinės masės (1) (3) (4).

ASTM D 5296–92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536–91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto stūmoklio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.

NF T 20–035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

Jei kyla įtarimas, kad rezultatas yra klaidingai teigiamas, bandymas turi būti pakartotas vietoje celiuliozės naudojant inertišką medžiagą, kurios dalelių dydis būtų panašus, pvz., diatomitą. Be to, bandomosios medžiagos ir celiuliozės mišinys, kurio degimo greitis yra didžiausias, turi būti pakartotinai išbandytas inertiškoje atmosferoje (deguonies < 2 % pagal tūrį).

Jei išankstiniam bandymui naudojami medienos miltai, ruošiami spygliuočių medienos miltai, surinkus tą dalį, kuri nusisijoja per 1,6 mm dydžio akučių sietą, ji gerai sumaišoma, po to ne didesnis kaip 25 mm storio sluoksnis keturias valandas džiovinamas 105 °C temperatūroje. Atšaldoma ir laikoma sandariame inde, jį pripildžius kuo pilniau iki naudojimo, sunaudoti geriausiai per 24 valandas po džiovinimo.

NF T 20–036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

NF T 20–038 (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

Kaitinama propano dujomis iš pramoninio baliono, turinčio reduktorių (60–70 mbar), leidžiamomis per debitmatį ir tolygiai vamzdynu paskirstomomis (kaip rodo degiklių liepsnos stebėjimas) keturiems degikliams. Degikliai išdėstyti apie bandymo kamerą, kaip parodyta 1 paveiksle. Keturi degikliai bendrai suvartoja 3,2 litro propano per minutę. Galima deginti kitokias dujas ir naudoti kitokius degiklius, tačiau kaitinimo sparta turi būti tokia, kokia nurodyta 3 paveiksle. Visuose aparatuose kaitinimo sparta turi būti periodiškai tikrinama, naudojant dietilftalatu pripildytus vamzdžius, kaip parodyta 3 paveiksle.

Jei bandomos kietosios medžiagos, kiekvienam bandymui reikalingos medžiagos masė nustatoma atliekant dviejų pakopų tuščiąjį bandymą. Pasvertas vamzdis pripildomas 9 cm3 medžiagos, toliau medžiaga plūkiama 80 N jėga, tenkančia visam vamzdžio skerspjūviui. Kad būtų saugu arba tais atvejais, kai bandinio fizinė forma dėl spaudimo gali pasikeisti, gali būti taikomos kitos pripildymo metodikos; pvz., jei medžiaga yra labai jautri trinčiai, plūkimas netinka. Jei medžiaga yra spūdi, jos dedama daugiau ir ji plūkiama, kol vamzdis pripildomas tiek, kad iki viršaus lieka 55 mm. Nustatoma bendra masė, kurios reikia pripildyti iki 55 mm lygio, ir dedamos dar dvi tokios dalys, kiekvieną kartą plūkiant 80 N jėga. Po to plūkiant arba išimant medžiagos dedama tiek, kad iki vamzdžio viršaus liktų 15 mm. Atliekamas antras tuščiasis bandymas, iš pradžių su suplūktu kiekiu, kuris sudarytų vieną trečdalį pirmame tuščiajame bandyme nustatytos masės. Įdedamos dar dvi tokios dalys plūkiant 80 N jėga, po to, prireikus, įdedant arba išimant dalį medžiagos nustatomas jos 15 mm lygis iki viršaus. Kietosios medžiagos kiekis, nustatytas antrame tuščiajame bandyme, naudojamas kiekvienam bandymui, pripildant tris kartus vienodais kiekiais, kiekvieną suspaudžiant iki 9 cm3 reikalinga tam jėga. (Tai galima palengvinti naudojant tarpinius žiedus).

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20–039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

Jei su inertišku nešikliu sumaišyta ir ore padėta medžiaga užsidega per penkias minutes arba jei skystoji medžiaga per penkias minutes apdegina arba uždega joje suvilgytą ir ore padėtą filtravimo popierių, ji laikoma piroforine medžiaga.

NF T 20–040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

Į aparato lašinamąjį piltuvą įpilama 10–20 ml vandens, o į kūginę kolbą įdedama 10 g bandomosios medžiagos. Išsiskyrusių dujų tūris gali būti išmatuotas bet kuriuo tinkamu būdu. Atidaromas lašinamojo piltuvo čiaupas, kad vanduo galėtų tekėti į kūginę kolbą, ir paleidžiamas sekundmatis. Išsiskyrusių dujų kiekis septynias valandas matuojamas kas valandą. Jei per šį laiką išsiskyrusių dujų kiekis svyruoja arba jei šio laikotarpio pabaigoje išsiskyrusių dujų kiekis didėja, matavimai turi būti tęsiami ne ilgiau kaip penkias paras. Jei kuriuo nors matavimo momentu dujų išsiskyrimo sparta yra didesnė kaip 1 litras/kg per valandą, bandymą galima nutraukti. Šis bandymas turi būti pakartotas tris kartus.

NF T 20–041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

NF T 20–042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

Miltelių, granulių ir pastos pavidalo medžiagos turi būti laikomos labai degiomis, jei degimo trukmė bet kuriame bandyme, atliktame pagal 1.6.2 aprašytą metodiką, yra mažesnė kaip 45 sekundės. Metalų arba metalų lydinių milteliai laikomi labai degiais, jei jie gali būti padegti ir liepsna arba reakcijos zona išplinta per visą bandinį ne ilgiau kaip per 10 min.

R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977, vol.1.

T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.

C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525

NF T 20–043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.

O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, p. 223–339.

J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675

W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.

H. Ellgehausen, C. D’Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219.

Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.

Po to sudaromas log k verčių ir log P santykio koreliacijos grafikas atitinkamiems etaloniniams junginiams. Praktiškai vienu metu įšvirkščiama nuo 5 iki 10 standartinių etaloninių junginių, kurių log P maždaug atitinka tikėtiną intervalą, ir nustatomos sulaikymo trukmės, geriau ant įrašančiojo integratoriaus, sujungto su aptikimo sistema. Apskaičiuojami atitinkami talpos koeficiento logaritmai log k ir brėžiamas log P, nustatyto kratomos kolbos metodu, funkcijos grafikas. Kalibruojama reguliariais intervalais, ne rečiau kaip kartą per dieną, kad būtų galima atlikti galimus pakitimus kolonėlės darbe.

čia (nc – anglies atomų skaičius). Po to nulinis laikas to apskaičiuojamas pagal: t0 = a / (1 – b)

Nulinį laiką to galima nustatyti naudojant homologinę eilę (pvz., n-alkilmetilketonus) arba nepasiskirsčiusius organinius junginius (pvz., tiokarbamidas arba formamidas). Apskaičiuojant nulinį laiką to naudojant homologinę eilę, įšvirkščiami ne mažiau kaip septyni homologinės eilės nariai ir nustatomos atitinkamos sulaikymo trukmės. Neapdorotos sulaikymo trukmės tr(nc + 1)

Medžiagos, kurių tirpumas n-oktanolyje yra mažas, turi polinkį mažoms log Pow vertėms, kai naudojamas HPLC metodas; tokių junginių smailės kartais atsiranda įvykus tirpiklio frontui. Tai tikriausiai vyksta dėl to, kad pasiskirstymo procesas yra per lėtas pusiausvyrai pasiekti per normalų HPLC atskyrimo laiką. Tada debito mažinimas ir (arba) metanolio/vandens santykio mažinimas gali būti veiksminga priemonė patikimai vertei gauti.

n-oktanolio fazės turėtų būti matuojamos pagal tūrį. Bandymo indai turėtų būti dedami arba į tinkamą purtyklę arba kratomi ranka. Jeigu naudojamas centrifugos vamzdelis, rekomenduojama greitai sukti vamzdelį 180o apie jo skersinę ašį taip, kad bet koks pagautas oro kiekis iškiltų per tas dvi fazes. Patirtis parodė, kad pasiskirstymo pusiausvyrai nusistovėti paprastai pakanka 50 tokių apsukų. Kad nekiltų abejonių, rekomenduojama 100 apsukų per penkias minutes.

kai tR – bandomosios medžiagos sulaikymo trukmė, o to – vidutinis laikas, reikalingas tirpiklio molekulei pereiti per kolonėlę (pradinis laikas).

NF T 20–046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

NF T 20–045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.

Medžiagos kiekis, reikalingas norimam vandens tūriui įsotinti, yra apskaičiuojamas išankstiniu bandymu. Reikalingas vandens tūris priklauso nuo analizės metodo ir tirpumo intervalo. Apytikriai penki anksčiau nustatyti medžiagos kiekiai pasveriami į kiekvieną iš trijų stiklinių indų su stikliniais kamščiais (pvz., centrifugos mėgintuvėliai, kolbos). Pasirinktas vandens kiekis pilamas į kiekvieną indą, kiekvienas indas sandariai užkemšamas. Užkimšti indai purtomi 30 °C temperatūroje. (Turėtų būti naudojamas purtyklė arba maišytuvas, galintys dirbti pastovioje temperatūroje, pvz., magnetinis maišymas termostatu kontroliuojamoje vandens vonioje). Po paros vienas indas išimamas ir pakartotinai nustatoma pusiausvyra per 24 valandas bandymo temperatūroje retsykiais papurtant. Inde esantis turinys centrifuguojamas bandymo temperatūroje, mėginio koncentracija skaidrioje vandeninėje fazėje nustatoma atitinkamu analizės metodu. Su kitomis dviem kolbomis elgiamasi taip pat, prieš tai nustatant pradinę pusiausvyrą 30 °C temperatūroje atitinkamai per dvi ir tris dienas. Jeigu duomenys apie koncentraciją, gauti ne mažiau kaip iš paskutiniųjų dviejų indų, atitinka reikalavimus, bandymas yra patenkinamas. Visas bandymas turėtų būti pakartojamas naudojant ilgesnius pusiausvyros nustatymo laikus, jeigu 1, 2 ir 3 indo rezultatai krypsta į didesnes vertes.

Srautas leidžiamas per kolonėlę. Rekomenduojama, kad būtų naudojamas apytikriai 25 ml/val. debitas (apibūdintai kolonėlei tai – 10 sluoksnio tūrių/val.). Pirmieji penki sluoksnio tūriai (mažiausiai) yra išpilami, kad būtų pašalinamos vandenyje tirpios priemaišos. Po to recirkuliacinis siurblys dirba tol, kol pasiekiama pusiausvyra, kaip nustatyta penkiais vienas po kito dedamais bandiniais, kurių koncentracijos skiriasi ne daugiau kaip ± 30 % juos atsitiktinai parenkant. Šie bandiniai turėtų būti vienas nuo kito atskiriami laiko intervalais, kurio metu pasikeičia ne mažiau kaip 10 eliuato sluoksnio tūrių.

Pakrauta pagalbinė medžiaga paliekama įmirkti apie dvi valandas apytikriai 5 ml vandens, po to suspensija dedama į mikrokolonėlę. Kitais atvejais pakraunama sausa pagalbinė medžiaga gali būti supilama į vandens pripildytą mikrokolonėlę, po to apie dvi valandas leidžiama nusistovėti pusiausvyrai.

Šiuo metodu medžiaga (kietosios medžiagos turi būti susmulkintos) ištirpinama vandenyje, kurio temperatūra šiek tiek aukštesnė negu bandymo temperatūra. Pasiekus sotį, mišinys ataušinamas ir laikomas bandymo temperatūroje, maišant tiek, kiek to reikia pusiausvyrai pasiekti. Matavimas gali būti atliekamas ir tiesiogiai bandymo temperatūroje, jeigu tinkamu bandinių parinkimu užtikrinama, kad bus pasiekta soties pusiausvyra. Po to medžiagos masės koncentracija vandeniniame tirpale, kuriame neturi būti jokių neištirpusių dalelių, yra nustatoma atitinkamu analitiniu metodu.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

Matuojami tirpalai perpilami į kruopščiai išvalytą matavimo indą, stengiantis, kad nesusidarytų putų, po to matavimo indas dedamas ant bandymo aparato stalelio. Stalelio viršus su matavimo indu keliamas aukštyn, kol žiedas panyra žemiau matuojamo tirpalo paviršiaus. Po to stalelio viršus pamažu ir tolydžiai nuleidžiamas (apie 0,5 cm/min. greičiu), atskiriant žiedą nuo paviršiaus, kol bus pasiekta maksimali jėga. Skysčio sluoksnis, besiliečiantis su žiedu, neturi atsiskirti nuo žiedo. Užbaigus matavimus, žiedas vėl iškeliamas į paviršių, matavimai kartojami tol, kol bus gauta pastovi paviršiaus įtempties vertė. Kiekvienam nustatymui užrašomas tirpalo perpylimo į matavimo indą laikas. Matavimai užrašomi esant maksimaliai jėgai, reikalingai atskirti žiedą nuo skysčio paviršiaus.

Stikliniai indai turi būti kruopščiai išvalomi. Jeigu reikia, jie išplaunami karšta chromo-sieros rūgštimi, o po to sirupo tirštumo fosforo rūgštimi (83–98 % H3PO4 svorio) kruopščiai nuskalaujami vandeniu iš čiaupo ir galiausiai perskalaujami du kartus distiliuotu vandeniu, kol bus pasiekta neutrali reakcija, po to išdžiovinama arba nuskalaujama dalimi bandinio tirpalo, kurį reikia išmatuoti.

ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

NF T 20–047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.

NF T 20–048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa – Static method.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.

Kaip garų sugaudymo ir po to atliekamos analizės alternatyva gali būti naudojama betarpiška tyrimų technika, pavyzdžiui, chromatografas, gali būti naudojama kiekybiškai nustatyti kiekį medžiagos, perneštos žinomu kiekiu nešančiųjų dujų. Be to, galima išmatuoti mėginio masės nuostolius.

Kai pasiekiamas reikalingas vakuumo lygis, pradedama kalibravimo serija žemiausioje reikalaujamoje temperatūroje. Nustatoma atitinkama anga dangtelyje, garų srovė teka per gaubtą tiesiai virš angos, į ataušintą svarstyklių lėkštę. Svarstyklių lėkštė turi būti pakankamai didelė, kad visa per gaubtą nukreipta srovė patektų į ją. Garų srovės judesio kiekis veikia kaip jėga į svarstyklių lėkštę, ir molekulės kondensuojasi ant vėsaus paviršiaus.

jeigu varinės krosnies dangtelyje yra trys skirtingo skersmens angos, viena nuo kitos esančios 90o kampu, galima apimti įvairius garų slėgio intervalus per visą matavimų intervalą (angų skersmuo apytikriai 0,30–4,50 mm). Didelės angos naudojamos mažam garų slėgiui ir atvirkščiai. Sukant krosnį galima nustatyti norimą angą arba tarpinę padėtį garų srovėje (krosnies skylė – skydas – svarstyklių lėkštė), išskirti molekulių srautą arba nukreipti jį per krosnies angą į svarstyklių lėkštę. Kad būtų išmatuota medžiagos temperatūra, termoelementas arba varžinis termometras dedamas tinkamoje vietoje,

Pusiausvyra pasiekiama, kai esant pastoviam slėgiui užregistruojama pastovi temperatūra. Reikia būti ypač atsargiems ir virinimo metu vengti kunkuliavimo. Be to, ant aušintuvo turi įvykti visiška kondensacija. Nustatant lengvai besilydančių kietųjų medžiagų garų slėgį, reikia stebėti, kad neužsikimštų kondensatorius.

Metodas pagrįstas tiriamos medžiagos, garų pavidalu išlekiančios iš Knudsen’o kameros (4) per laiko vienetą per angą ultravakuumo sąlygomis, masės apskaičiavimu. Pasišalinusių garų masę galima gauti nustatant kameros sumažėjusią masę arba kondensuojant garus žemoje temperatūroje ir nustatant išgarintos medžiagos kiekį chromatografinės analizės būdu. Garų slėgis apskaičiuojamas naudojant Hertz-Knudsen’o priklausomybę.

Medžiagos kiekis, išeinantis iš elemento per laiko vienetą per žinomo dydžio angą yra nustatomas vakuume taip, kad medžiagos sugrįžimas į kamerą būtų nereikšmingas (pvz., matuojant impulsą, generuotą jautrioje pusiausvyroje garų čiurkšle arba matuojant prarastą svorį).

IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.

R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.

R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.

Ypatingas dėmesys atkreiptinas į tuos metodus, kuriuose naudojama detekcija fotoelementu ir terminė analizė, kadangi šiais metodais galima nustatyti tiek lydymosi, tiek virimo temperatūrą. Be to, matavimus galima atlikti automatiškai.

IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505–515.

R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 (final).

Metodo parinkimas priklauso nuo to, ar medžiaga gali būti lengvai susmulkinama, ar sunkiai smulkinama, ar jos susmulkinti neįmanoma. Todėl ribinis koeficientas priklausys nuo to, ar galima, ar negalima tą medžiagą lengvai ar sunkiai susmulkinti, ar visai neįmanoma.

B DALIS. TOKSIŠKUMO IR KITO POVEIKIO SVEIKATAI NUSTATYMO METODAI

TURINYS

BENDRASIS ĮVADAS 144

B.1 bis. ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ. FIKSUOTŲJŲ DOZIŲ METODAS 146

B.1 tris. ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASĖS METODAS 159

B.2. ŪMUS TOKSIŠKUMAS (PER KVĖPAVIMO TAKUS) 175

B.3. ŪMUS TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ) 179

B.4. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. ODOS DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS 183

B.5. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. AKIŲ DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS 192

B.6. ODOS JAUTRINIMAS 203

B.7. KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENŲ) TOKSIŠKUMAS (PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ) 211

B.8. KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENŲ) TOKSIŠKUMAS (PER KVĖPAVIMO TAKUS) 217

B.9. KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENŲ) TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ) 222

B.10. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ BANDYMAS IN VITRO 226

B.11. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ KAULŲ ČIULPŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS BANDYMAS IN VIVO 234

B.12. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ ERITROCITŲ MAŽŲJŲ BRANDUOLIŲ BANDYMAS IN VIVO 241

B.13/14. MUTAGENIŠKUMAS – BAKTERIJŲ GRĮŽTAMŲJŲ MUTACIJŲ BANDYMAS 249

B.15. MUTAGENIŠKUMO BANDYMAS IR ATRANKA PAGAL KANCEROGENIŠKUMĄ. SACCAROMYCES CEREVISIAE GENŲ MUTACIJOS 257

B.16. MITOZINĖ REKOMBINACIJA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE 260

B.17. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ GENŲ MUTACIJŲ BANDYMAS IN VITRO 263

B.18. DNR PAŽAIDOS IR JŲ REPARACIJA – NETAISYKLINGA DNR SINTEZĖ – ŽINDUOLIŲ LĄSTELĖSE IN VITRO 272

B.19. APSIKEITIMO SESERINĖMIS CHROMATIDĖMIS BANDYMAS IN VITRO 276

B.20. DROSOPHILA MELANOGASTER NUO LYTIES PRIKLAUSOMO RECESYVINIO LETALIŠKUMO BANDYMAS 280

B.21. ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ TRANSFORMACIJOS BANDYMAI IN VITRO 283

B.22. GRAUŽIKŲ DOMINANTINIS LETALIŠKUMO BANDYMAS 286

B.23. ŽINDUOLIŲ SPERMATOGONIJŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS BANDYMAS 289

B.24. PELIŲ TAŠKINIS BANDYMAS 296

B.25. PELIŲ PAVELDĖTA TRANSLOKACIJA 299

B.26. POŪMIS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ. 90 DIENŲ KARTOTINIŲ DOZIŲ TOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS BANDYMAS 303

B.27. POŪMIS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ. 90 DIENŲ KARTOTINIŲ DOZIŲ TOKSIŠKUMO NE GRAUŽIKAMS BANDYMAS 309

B.28. POŪMIS TOKSIŠKUMAS PER ODĄ. 90 DIENŲ KARTOTINIŲ DOZIŲ TOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS BANDYMAS 315

B.29. POŪMIS TOKSIŠKUMAS PER KVĖPAVIMO TAKUS. 90 DIENŲ KARTOTINIŲ DOZIŲ TOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS BANDYMAS 319

B.30. LĖTINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS 324

B.31. TOKSIŠKUMO PRENATALINIAM VYSTYMUISI BANDYMAS 330

B.32. KANCEROGENIŠKUMO BANDYMAS 339

B.33. KOMBINUOTAS LĖTINIO TOKSIŠKUMO IR KANCEROGENIŠKUMO BANDYMAS 345

B.34. TOKSIŠKUMO VIENOS KARTOS DAUGINIMUISI BANDYMAS 352

B.35. TOKSIŠKUMO DVIEJŲ KARTŲ DAUGINIMUISI BANDYMAS 356

B.36. TOKSIKOKINETIKA 366

B.37. ORGANINIŲ FOSFORO JUNGINIŲ SUKELTO UŽDELSTO NEUROTOKSIŠKUMO PO ŪMAUS VEIKIMO MEDŽIAGA BANDYMAS 370

B.38. ORGANINIŲ FOSFORO JUNGINIŲ SUKELTO UŽDELSTO NEUROTOKSIŠKUMO 28 DIENŲ BANDYMAS 375

B.39. NENUMATYTOS DNR SINTEZĖS (NDS) ŽINDUOLIŲ KEPENŲ LĄSTELĖSE BANDYMAS IN VIVO 379

B.40. ODOS SUARDYMAS IN VITRO . ODOS SLUOKSNIO ELEKTRINĖS VARŽOS (OSEV) BANDYMAS 385

B.40 bis. ODOS SUARDYMAS IN VITRO . ŽMOGAUS ODOS MODELIO BANDYMAS 395

B.41. 3T3 NRU FOTOTOKSIŠKUMO IN VITRO BANDYMAS 401

B.42. ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO BANDYMAS 415

B.43. NEUROTOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS BANDYMAS 421

B.44. SUGERTIS PER ODĄ. IN VIVO METODAS 433

B.45. SUGERTIS PER ODĄ. IN VITRO METODAS 439

BENDRASIS ĮVADAS

A. BANDOMOSIOS MEDŽIAGOS APIBŪDINIMAS

Bandomosios medžiagos sudėtį, taip pat ir pagrindines priemaišas, bei jos svarbiausias fizikines ir chemines savybes, tarp jų stabilumą, reikėtų žinoti dar prieš bet kokio toksikologinio bandymo planavimą.

Bandomosios medžiagos fizikinės ir cheminės savybės yra svarbi informacija renkantis veikimo medžiaga būdą, planuojant kiekvieną konkretų bandymą ir elgimąsi su medžiaga bei jos laikymą.

Bandomosios medžiagos (jeigu įmanoma ir pagrindinių priemaišų) dozuojamoje terpėje ar biologinėje medžiagoje nustatymo kokybinius ir kiekybinius analitinius metodus reikėtų parengti dar prieš bandymą.

Visą informaciją, susijusią su medžiagos nustatymu, fizikinėmis ir cheminėmis jos savybėmis, grynumu, bandomosios medžiagos elgsena, reikėtų įtraukti į bandymo ataskaitą.

B. GYVŪNŲ PRIEŽIŪRA

Atliekant toksikologinį bandymą, būtina griežta aplinkos sąlygų kontrolė ir tinkama gyvūnų priežiūra.

i) Laikymo sąlygos

Eksperimentinių gyvūnų patalpų ar aptvarų aplinkos sąlygos turėtų būti tinkamos bandomosioms rūšims. Žiurkėms, pelėms ir jūrų kiaulytėms kambario temperatūra turėtų būti 22 °C ± 3 °C, santykinis oro drėgnis nuo 30 iki 70 %; triušiams temperatūra turėtų būti 20 ± 3 °C, santykinis oro drėgnis nuo 30 iki 70 %.

Tam tikrų eksperimentinių metodų atveju labai svarbi temperatūra, todėl tokiais atvejais bandymo metodo aprašyme nurodomos tinkamos sąlygos. Visuose toksiškumo bandymuose temperatūra ir drėgnis turėtų būti stebimi, registruojami ir įtraukiami į baigiamąją bandymo ataskaitą.

Apšvietimas turi būti dirbtinis, šviesos režimas – 12 valandų šviesos ir 12 valandų tamsos. Apšvietimo duomenys turėtų būti registruojami ir įtraukiami į baigiamąją bandymo ataskaitą.

Jei metode kitaip nenurodoma, gyvūnai gali būti laikomi po vieną arba tos pačios lyties individų grupėmis, tačiau viename narve neturėtų būti daugiau negu penki gyvūnai.

Eksperimentų su gyvūnais ataskaitose svarbu nurodyti gyvūnų laikymo būdą bei jų skaičių viename narve medžiagos eksperimento bei vėlesniu stebėjimo periodu.

ii) Šėrimas

Bandymo metu gyvūnams duodami pašarai turi atitikti visus tos gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus. Tais atvejais, kai bandomoji medžiaga dedama į pašarus, jų maistinė vertė gali sumažėti dėl bandomosios medžiagos sąveikos su pašaru. Į tokios sąveikos galimybę turėtų būti atsižvelgiama aiškinant bandymo rezultatus. Standartiniai laboratorinių gyvūnų pašarai gali būti naudojami neribojant geriamo vandens kiekio. Jei bandomoji medžiaga duodama su pašarais, juos renkantis turi būti užtikrinama, kad bandomąją medžiagą būtų galima tinkamai su jais sumaišyti. Maisto teršalai, kurie turi įtakos toksiniam poveikiui, neturėtų viršyti koncentracijų, dėl kurių rezultatai gali būti iškreipti.

C. ALTERNATYVUS BANDYMAS

Europos Sąjunga siekia vystyti ir tvirtinti alternatyvius metodus, kuriais galima gauti panašią informaciją kaip ir įprastais bandymais su gyvūnais, tačiau kuriems būtų naudojama mažiau gyvūnų, jiems būtų sukeliama mažiau skausmo arba būtų galima visiškai jų nenaudoti.

Kai tik tokie metodai įsigalioja, būtina apsvarstyti jų taikymą siekiant nustatyti medžiagų pavojingumą, jas vėliau klasifikuojant bei ženklinant ir vertinant medžiagos cheminę saugą.

D. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS

Vertinant ir aiškinant gyvūnų ir in vitro bandymų rezultatus, reikia atsižvelgti į jų tiesioginės ekstrapoliacijos žmogui ribotumą, todėl gavus įrodymą apie medžiagos neigiamą poveikį žmonėms, jo turėtų pakakti bandymų su gyvūnais rezultatams patvirtinti.

E. LITERATŪROS ŠALTINIAI

Dauguma šių metodų sukurti vykdant OECD bandymų gairių programą ir turėtų būti atliekami pagal Geros laboratorinės praktikos principus, kad būtų užtikrintas kuo didesnis abipusis duomenų pripažinimas.

Papildomos informacijos galima rasti OECD gairėse nurodytuose šaltiniuose ir kitoje publikuotoje literatūroje.

B.1 bis. ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ. FIKSUOTŲJŲ DOZIŲ METODAS

1. METODAS

Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 420 (2001).

1.1. ĮVADAS

Taikant tradicinius metodus ūmus toksiškumas įvertinamas pagal gyvūno žūtį. Britų toksikologų draugija (British Toxicology Society) 1984 m. pasiūlė naują ūmaus toksiškumo bandymo būdą, pagrįstą kelių fiksuoto dydžio dozių davimu (1). Taikant šį būdą poveikio įrodymas nebėra tik gyvūnų žūtis; metodas pagrįstas aiškių toksiškumo požymių, kurie pasireiškia nuo kurios nors fiksuoto dydžio dozės iš dozių serijos, stebėjimu. Pasibaigus JK (2) ir tarptautinio (3) tinkamumo patvirtinimo bandymui in vivo, 1992 m. ši procedūra buvo patvirtinta kaip bandymo metodas. Vėliau, taikant matematinius modelius, daugelyje bandymų buvo įvertintos statistinės fiksuotų dozių metodikos savybės (4)(5)(6). Be to, atlikti in vivo ir modeliavimo bandymai įrodė metodikos atkuriamumą ir kad ją taikant naudojama mažiau gyvūnų, jiems sukeliamos mažesnės kančios nei taikant tradicinius metodus ir pagal ją galima suklasifikuoti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus.

Rekomendacijas dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinamąjį traktą bandymo rekomendaciniame dokumente (7). Be to, šiame rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie B.1 bis bandymo metodo taikymą ir aiškinimą.

Metodo esmę sudaro tai, kad atliekant pagrindinį bandymą skiriamos vidutinio toksiškumo dozės ir išvengiama dozių, kurios sukeltų žūtį. Be to, nereikia skirti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai numarinami ir interpretuojant bandymo rezultatus laikomi atliekant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro rekomendacinio dokumento objektas (8).

Taikant metodą gaunama informacijos apie medžiagos pavojingas savybes, todėl ją galima įvertinti ir klasifikuoti pagal Visuotinai suderintą ūmų toksinį poveikį sukeliančių cheminių medžiagų klasifikavimo sistemą (Globally Harmonised System (GHS) for the classification of chemicals which cause acute toxicity) (9).

Prieš bandymo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudaro medžiagos tapatumas ir cheminė struktūra, jos fizikinės ir cheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo būdas (-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.

1.2. APIBRĖŽTYS

Ūmus toksiškumas per virškinamąjį traktą – neigiamas poveikis, kuris atsiranda gavus per virškinamąjį traktą vieną medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h.

Uždelsta žūtis – kai gyvūnas nenugaišta arba nepradeda gaišti per 48 h, bet nugaišta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį.

Dozė – gyvūnui duotas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandomojo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg).

Akivaizdus toksiškumas – bendrasis terminas, kuriuo apibūdinami tokie aiškūs toksiškumo požymiai, atsiradę gyvūnui (-ams) davus bandomosios medžiagos (pavyzdžiai pateikti (3)), kad galima numatyti, jog gyvūnui (-ams) davus kitą didžiausią fiksuotą dozę didesnei daliai gyvūnų pasireikš didelio skausmo ir ilgalaikių didelių kančių požymiai, gaišimo būsenos požymiai (kriterijai pateikti rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)), arba tikėtina, kad jie nugaiš.

GHS – visuotinai suderinta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (OECD) (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių gabenimo ekspertų komiteto (fizikinės ir cheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (ILO) (pranešimas apie pavojus) bendra veikla, koordinuojama pagal Bendrą organizacijų tinkamo cheminių medžiagų valdymo programą (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)).

Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsena arba žūtis numatoma anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Graužikams šios būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).

LD50 (vidutinė mirtina dozė) – statistiškai apskaičiuota per virškinamąjį traktą duodama medžiagos dozė, nuo kurios tikėtinai gali žūti 50 % gyvūnų. LD50 vertė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandomojo gyvūno masės vienetui (mg/kg).

Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2 000 arba 5 000 mg/kg).

Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba neišvengiamos žūties, net jei gyvūnas gydomas, būsena. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).

Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį žinomu ateities momentu prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandens arba pašaro, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).

1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS

Vienos lyties gyvūnų grupėms nuosekliai duodamos fiksuotos 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg dozės (išskirtiniu atveju galima apsvarstyti galimybę duoti papildomą fiksuotą 5 000 mg/kg dozę, žr. 1.6.2 skirsnį). Atsižvelgiant į orientacinį bandymą pasirenkama tokia pradinė dozė, kuri galėtų sukelti kai kuriuos toksiškumo požymius, bet kuri nebūtų sunkaus toksinio poveikio arba žūties priežastimi. Klinikiniai požymiai ir sąlygos, susijusios su skausmu, kančia ir neišvengiama žūtimi, išsamiai aprašytos atskirame OECD rekomendaciniame dokumente (8). Kitoms gyvūnų grupėms gali būti duodamos didesnės arba mažesnės fiksuotos dozės, atsižvelgiant į toksiškumo arba gaištamumo požymių buvimą arba nebuvimą. Ši procedūra tęsiama tol, kol nustatoma dozė, sukelianti akivaizdų toksiškumą arba ne daugiau kaip vieno gyvūno žūtį, arba kol nustatoma, kad net didžiausia dozė nesukelia jokio poveikio arba gyvūnai žūsta net nuo mažiausios dozės.

1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.4.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas

Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (7). Taip yra todėl, kad literatūros apie tipinius LD50 bandymus analizė rodo, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie yra, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (10). Tačiau, jei giminingos struktūros cheminių junginių toksikologinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad jautresni gali būti patinai, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai daromi su patinais, pateikiamas tinkamas pagrindimas.

Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti dar neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš duodant dozę turi būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.

1.4.2. Laikymo ir šėrimo sąlygos

Bandomų gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 °C (±3 °C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų siekti, kad ji būtų 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis ir jo seka: 12 h šviesos ir 12 h tamsos. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorinių gyvūnų pašaras, geriamojo vandens kiekis neribojamas. Gyvūnai gali būti laikomi grupėmis narveliuose, į grupes skirstant pagal jų gaunamą dozę, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti aiškiai stebėti kiekvieną gyvūną.

1.4.3. Gyvūnų ruošimas

Gyvūnai atrenkami atsitiktinai, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių davimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad galėtų priprasti prie laboratorijos sąlygų.

1.4.4. Dozių ruošimas

Paprastai bandomoji medžiaga duodama tokio paties tūrio dozėmis, keičiama tik dozės preparato koncentracija. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias duodamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai turi būti ne didesnis kaip 1ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima duoti 2 ml/100g kūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama aliejiniam tirpalui (emulsijai, suspensijai) (pvz., kukurūzų aliejaus) ir tik po jų galimi kitų nešiklių tirpalai. Jei nešiklis ne vanduo, turi būti žinomos jo toksikologinės charakteristikos. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.

1.5. BANDYMO EIGA

1.5.1. Dozavimas

Bandomoji medžiaga duodama kaip vienetinė dozė per skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma duoti vienetinės dozės, ji gali būti duodama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.

Prieš duodant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės negauna pašaro, išskyrus vandenį, per naktį; pelės negauna pašaro, išskyrus vandenį, 3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė duodama dalimis tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.

1.5.2. Orientacinis bandymas

Orientacinio bandymo tikslas – nustatyti tinkamą pradinę pagrindinio bandymo dozę. Bandomoji medžiaga nuosekliai duodama atskiriems gyvūnams pagal 1 priedėlio diagramą. Orientacinis bandymas baigiamas, kai galima priimti sprendimą dėl pagrindinio bandymo pradinės dozės (arba jei gyvūnas žūsta esant mažiausiai fiksuotai dozei).

Orientacinio bandymo pradinė dozė pasirenkama iš 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg dozių kaip dozė, nuo kurios turėtų pasireikšti akivaizdus toksiškumas. Ji turi būti pagrįsta, jei įmanoma, in vivo ir in vitro duomenimis apie tą pačią cheminę medžiagą ir struktūriniu požiūriu giminingas chemines medžiagas. Neturint tokios informacijos, pradinė dozė yra 300 mg/kg.

Kiekvienam gyvūnui dozės duodamos ne dažniau kaip kas 24 h. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi mažiausiai 14 parų.

Išimtiniais atvejais ir tik jei tai pagrįsta tam tikrais reguliavimo sumetimais, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5 000 mg/kg dydžio dozę (žr. 3 priedėlį). Dėl gyvūnų gerovės priežasčių neskatinama daryti bandymo taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2 000–5 000 mg/kg) ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių ar gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsauga.

Tais atvejais, kai darant orientacinį bandymą žūsta gyvūnas, gavęs mažiausią fiksuotą dozę (5 mg/kg), įprasta bandymą nutraukti ir medžiagą priskirti GHS 1 kategorijai (kaip nurodyta 1 priedėlyje). Tačiau jei reikalingas tolesnis klasifikavimo patvirtinimas, gali būti atliekama tokia neprivaloma papildoma procedūra: 5 mg/kg dozė duodama antram gyvūnui. Jei šis antras gyvūnas žūsta, GHS 1 kategorija patvirtinama ir bandymas iš karto nutraukiamas. Jei antras gyvūnas išgyvena, 5 mg/kg dozę gauna ne daugiau kaip trys papildomi gyvūnai. Kadangi yra didelė žūties rizika, gyvūnų gerovei apsaugoti jie turi gauti šią dozę paeiliui. Laiko tarpo tarp dozės davimo kiekvienam gyvūnui turi pakakti nustatyti, ar pirmiau dozę gavęs gyvūnas turi galimybę išgyventi. Jei žūsta antras gyvūnas, dozių davimas iš karto nutraukiamas ir nei vienas papildomas gyvūnas dozės nebegauna. Kadangi žuvus antram gyvūnui (neatsižvelgiant į bandymo nutraukimo momentu panaudotų gyvūnų skaičių) rezultatas yra A (2 arba daugiau žūčių), taikoma 2 priedėlio klasifikavimo taisyklė esant 5 mg/kg fiksuotai dozei (1 kategorija, jei žuvo 2 arba daugiau gyvūnų, 2 kategorija, jei žuvo ne daugiau kaip 1 gyvūnas). Be to, 4 priedėlyje pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, taikytinas iki bus įgyvendinta nauja GHS.

1.5.3. Pagrindinis bandymas

1.5.3.1. Gyvūnų skaičius ir dozių dydis

Veiksmai, kurių turi būti imamasi po bandymo su pradine doze, nurodyti 2 priedėlyje pateiktose schemose. Yra trys būdai: nutraukti bandymą ir priskirti medžiagą atitinkamai pavojaus klasei, bandyti esant didesnei fiksuotai dozei arba bandyti esant mažesnei fiksuotai dozei. Tačiau siekiant apsaugoti gyvūnus, darant pagrindinį bandymą nebus kartojama dozė, sukėlusi žūtį darant orientacinį bandymą (žr. 2 priedėlį). Patirtis rodo, kad labiausiai tikėtina, jog davus pradinę dozę medžiagą galima suklasifikuoti ir tolesnio bandymo nebereikia.

Kiekvienai bandomai dozei paprastai bus naudojama iš viso po penkis vienos lyties gyvūnus. Penkis gyvūnus sudaro vienas gyvūnas iš orientacinio bandymo, gavusio pasirinktą dozę, ir keturi papildomi gyvūnai (išskyrus neįprastus atvejus, kai pagrindinio bandymo dozė nebuvo įtraukta į orientacinį bandymą).

Laiko tarpą tarp kiekvieno dydžio dozių skyrimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės davimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. Rekomenduojamas 3 arba 4 parų laikotarpis tarp kiekvieno dydžio dozės, jei prireikia, uždelstam toksiniam poveikiui stebėti. Laiko tarpas prireikus gali būti keičiamas, pvz., jei gaunama reakcija, dėl kurios sunku priimti sprendimą.

Kai sprendžiama, ar skirti didžiausią fiksuotą 5 000 mg/kg dozę, reikėtų laikytis 3 priedėlyje aprašyto metodo (taip pat žr. 1.6.2 skirsnį).

1.5.3.2. Ribinis bandymas

Ribinis bandymas visų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y. toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Informacijos apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima gauti pasinaudojus žiniomis apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius arba produktus, atsižvelgiant į toksikologiškai reikšmingų komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra, arba kai ta informacija leidžia manyti, kad bandomoji medžiaga yra toksiška, turi būti atliekamas pagrindinis bandymas.

Paprastai šioje rekomendacijoje ribiniu bandymu laikomas orientacinis bandymas esant 2 000 mg/kg (arba išimtinais atvejais 5 000 mg/kg), po kurio keturiems papildomiems gyvūnams būtų skirta tokio pat dydžio dozė.

1.6. STEBĖJIMAI

Kiekvienas dozę gavęs gyvūnas stebimas bent vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, skiriant ypatingą dėmesį pirmosioms keturioms valandoms, o vėliau kartą per dieną visas 14 parų, išskyrus atvejus, kai gyvūnams reikia nutraukti bandymą ir humaniškai numarinti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksines reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei uždelsto toksiškumo požymių atsiradimo tendencija (11). Visi stebėjimai sistemingai užrašomi, apie kiekvieną gyvūną atskirai.

Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinio aktyvumo ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai numarinti. Kai gyvūnai numarinami dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kuo tiksliau.

1.6.1. Kūno masė

Kiekvieno gyvūno masė nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos davimą ir vėliau – mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.

1.6.2. Patologija

Visiems bandomiesiems gyvūnams (įskaitant nugaišusius per bandymą arba pašalintus iš bandymo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) daroma bendroji nekroskopija. Aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. Gyvūnams, kurie po dozės gavimo išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų daryti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.

2. DUOMENYS

Turi būti pateikiami atskiri duomenys apie kiekvieną gyvūną. Be to, visi duomenys apibendrinami lentelėse, kuriose nurodomas kiekvienos bandymo grupės gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, darant bandymą žuvusių arba dėl gyvūnų gerovės priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, atskirų gyvūnų žūties laikas, toksinio poveikio aprašymas ir eiga, grįžtamumas, nekroskopijos duomenys.

3. ATASKAITOS RENGIMAS

3.1. BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei taikoma:

Bandomoji medžiaga:

— fizinė būsena, grynumas ir, jei svarbu, fizikinės ir cheminės savybės (įskaitant izomerizavimą),

— tapatumas, įskaitant CAS numerį.

Nešiklis (jei taikoma):

— nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

Bandomieji gyvūnai:

— naudota rūšis ir veislė,

— mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma,

— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei taikoma, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą),

— šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.

Bandymo sąlygos:

— išsami informacija apie bandomosios medžiagos sudėtį, įskaitant duodamos medžiagos fizikinį pavidalą,

— išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimą, įskaitant dozės tūrį ir davimo laiką,

— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (šaltinį), vandens šaltinį),

— pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.

Rezultatai:

— kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir dozės dydžio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant nugaišimą, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę),

— kūno masės ir jos kitimo lentelės,

— kiekvieno gyvūno masė dozės davimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba numarinimo dieną,

— žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį numarinimą,

— toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir jų eiga, taip pat grįžtamumas kiekvieno gyvūno atveju,

— kiekvieno gyvūno nekroskopijos ir histopatologiniai duomenys, jei yra.

Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.

Išvados.

4. NUORODOS

1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85–92.

2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D.and Shillaker, R.O., (1987) Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279–291.

3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P., (1990) The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469–482.

4) Whitehead, A. and Curnow, R.N., (1992) Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313–324.

5) Stallard, N. and Whitehead, A., (1995) Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, p. 315–323.

6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P., (2002) Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183–196.

7) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris.

8) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assesment No 19.

9) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521–14-no-24-no-0,FF.html].

10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C., (1995) Comparison of the Up-and- Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223–231.

11) Chan, P.K and Hayes, A.W., (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, USA.

1 PRIEDĖLIS ORIENTACINIO BANDYMO SCHEMA

2 PRIEDĖLIS PAGRINDINIO BANDYMO SCHEMA

3 PRIEDĖLIS BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2 000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEDARANT BANDYMO 5 pavojaus kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per virškinimo traktą arba odą yra 2 000–5 000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais: a) jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 2 priedėlio bandymo schemų, remiantis gaištamumo dažnumu; b) jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti bandymai su gyvūnais arba toksinis poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai; c) gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir — yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksinį poveikį žmonėms, arba — pastebimas tam tikras gaištamumas, kai bandymas atliekamas duodant dozes per virškinimo traktą, siekiančias 4 kategorijos vertes, arba — jei tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių, ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba — jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį darant kitus bandymus su gyvūnais. BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS NEGU 2 000 MG/KG DOZĖMS Išimtiniais atvejais, ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5 000 mg/kg dydžio dozę. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas skiriant 5 000 mg/kg neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (9). Orientacinis bandymas Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 1 priedėlyje pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5 000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama orientacinio bandymo pradinė 5 000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (žūtis), reikės daryti bandymą su antru gyvūnu, jam skiriant 2 000 mg/kg; gavus B ir C rezultatus (akivaizdus toksiškumas arba jokio toksiškumo), pradinė pagrindinio bandymo dozė gali būti 5 000 mg/kg. Panašiai, jei skiriama kita nei 5 000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5 000 mg/kg, jei esant 2 000 mg/kg dozei gaunti B arba C rezultatai; jei esant 5 000 mg/kg gautas A rezultatas, pagrindinio bandymo pradinė dozė yra 2 000 mg/kg, o gavus B ir C rezultatus, pagrindinio bandymo pradinė dozė yra 5 000 mg/kg. Pagrindinis bandymas Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 2 priedėlyje pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5 000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama pagrindinio bandymo pradinė 5 000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (≥ 2 žūtys) reikės daryti 2 grupės bandymą, jai skiriant 2 000 mg/kg; gavus B rezultatą (akivaizdus toksiškumas ir (arba) ≤ 1 žūtis) arba C (jokio toksiškumo), medžiaga nebus klasifikuojama pagal GHS. Panašiai, jei naudojama kita nei 5 000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5 000 mg/kg, jei esant 2 000 mg/kg dozei gaunamas C rezultatas; jei esant 5 000 mg/kg dozei gaunamas A rezultatas, medžiaga priskiriama GHS 5 kategorijai, o gavus B arba C rezultatus, medžiaga pagal GHS neklasifikuojama.

4 PRIEDĖLIS BANDYMŲ METODAS B.1 bis. Klasifikavimo pagal ES schemą rekomendacijos, taikomos pareinamajam laikotarpiui iki visiško visuotinai suderintos klasifikavimo sistemos (GHS) įgyvendinimo (paimta iš (8) nuorodos)

B.1 tris. ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASĖS METODAS

1. METODAS

Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 423 (2001)

1.1. ĮVADAS

Šiame bandyme taikomas ūmaus toksiškumo klasės metodas (1) – tai nuosekli procedūra, pagal kurią vienai pakopai naudojami 3 vienos lyties gyvūnai. Atsižvelgiant į gaištamumą ir (arba) gyvūno gaišimo būseną, vidutiniškai gali prireikti 2–4 pakopų, kad būtų galima spręsti apie bandomosios medžiagos ūmų toksiškumą. Ši metodika yra atkuriama, ją taikant naudojama daug mažiau gyvūnų ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. Ūmaus toksiškumo klasės metodas pagrįstas biometriniais įvertinimais (2) (3) (4) (5), naudojant fiksuotas dozes, kurios pakankamai skiriasi, kad medžiagą būtų galima suklasifikuoti ir įvertinti jos pavojingumą. 1996 m. priimto metodo tinkamumas buvo plačiai patvirtintas nacionaliniu (6) ir tarptautiniu mastu (7) darant in vivo bandymus ir lyginant su literatūroje pateiktais LD50 duomenimis.

Rekomendacijas dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinamąjį traktą bandymo rekomendaciniame dokumente (8). Be to, šiame rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie B.l tris bandymo metodo taikymą ir aiškinimą.

Nereikia duoti dozių, jei žinoma, kad jos sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai numarinami ir interpretuojant bandymo rezultatus laikomi darant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo numarinti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro rekomendacinio dokumento objektas (9).

Metode naudojamos iš anksto nustatyto dydžio dozės, o rezultatai leidžia medžiagą įvertinti ir ją suklasifikuoti pagal Visuotinai suderintą ūmų toksinį poveikį sukeliančių cheminių medžiagų klasifikavimo sistemą (Globally Harmonised System (GHS) for the classification of chemicals which cause acute toxicity) (10).

Iš esmės šis metodas nėra skirtas tikslioms LD50 vertėms apskaičiuoti, bet juo galima nustatyti apibrėžtus žūtį sukeliančių dozių intervalus, kadangi tokio bandymo tikslas ir yra nustatyti, ar dalis gyvūnų žūsta. Šiuo metodu galima nustatyti LD50 vertę tik tais atvejais, kai mažiausiai dviejų dozių sukeliamas gaištamumas yra didesnis kaip 0 % ir mažesnis kaip 100 %. Kai skiriamos iš anksto pasirinkto dydžio dozės neatsižvelgiant į bandomąją medžiagą, o klasifikavimas tiesiogiai siejamas su stebimų skirtingos būsenos gyvūnų skaičiumi, laboratorijoms didėja galimybė pasiekti suderinamų ir atkartojamų rezultatų.

Prieš bandymo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudaro medžiagos tapatumas ir cheminė struktūra, jos fizikinės ir cheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo būdas (-ai). Ši informacija yra būtina siekiant įsitikinti, kad bandymas reikalingas žmonių sveikatos apsaugos tikslais, ir padeda pasirinkti tinkamą pradinę dozę.

1.2. APIBRĖŽTYS

Ūmus TOKSIŠKUMAS PER virškinamąjį traktą – neigiamas poveikis, kuris atsiranda gavus per virškinamąjį traktą vieną medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h.

Uždelsta žūtis – kai gyvūnas nenugaišta arba nepradeda gaišti per 48 h, bet nugaišta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį.

Dozė – gyvūnui duotas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandomojo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg)

GHS – visuotinai suderinta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (OECD) (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių gabenimo ekspertų komiteto (fizikinės ir cheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (ILO) (pranešimas apie pavojus) bendra veikla, koordinuojama pagal Bendrą organizacijų tinkamo cheminių medžiagų valdymo programą (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC))

Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsena arba žūtis numatoma anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Graužikams šios būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9)).

LD50 (vidutinė mirtina dozė) – statistiškai apskaičiuota per virškinamąjį traktą duodama medžiagos dozė, nuo kurios tikėtinai gali žūti 50 % gyvūnų. LD50 vertė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandomojo gyvūno masės vienetui (mg/kg).

Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2 000 arba 5 000 mg/kg).

Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba neišvengiamos žūties, net jei gyvūnas gydomas, būsena. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9)).

Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį žinomu ateities momentu prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandens arba pašaro, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9)).

1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS

Šio bandymo esmę sudaro nuoseklusis metodas, pagal kurį vienai pakopai naudojant mažiausią įmanomą gyvūnų skaičių gaunama pakankamai informacijos apie bandomosios medžiagos ūmų toksiškumą, kad būtų galimą ją klasifikuoti. Bandymo gyvūnų grupė per virškinamąjį traktą gauna vieną iš nustatytų bandomosios medžiagos dozių. Medžiaga bandoma taikant nuoseklųjį metodą, kiekvienai pakopai naudojant po tris vienos lyties gyvūnus (paprastai pateles). Tai, ar junginio dozę gavę gyvūnai nugaišta per vieną pakopą, lemia, kokia yra tolesnė pakopa, t. y.:

— toliau bandyti nereikia,

— duoti tokią pat dozę dar trims gyvūnams,

— trims papildomiems gyvūnams duoti kitą didesnę arba mažesnę dozę.

Bandymo metodika išsamiai aprašyta 1 priedėlyje. Metodas leidžia spręsti, ar bandomąją medžiagą priskirti vienai iš toksiškumo klasių, apibrėžtų fiksuotomis LD50 intervalo ribinėmis vertėmis.

1.4. METODO APRAŠYMAS

1.4.1. Gyvūnų rūšies pasirinkimas

Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (9). Taip yra todėl, kad literatūros apie tipinius LD50 bandymus analizė rodo, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie yra, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (11). Tačiau jei giminingos struktūros cheminių junginių toksikologinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad jautresni gali būti patinai, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai daromi su patinais, turėtų būti pateiktas atitinkamas pagrindimas.

Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš skiriant dozę turėtų būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.

1.4.2. Laikymo ir šėrimo sąlygos

Bandomų gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 °C (±3 °C). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų siekti, kad ji būtų 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis ir jo seka: 12 h šviesos ir 12 h tamsos. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorinių gyvūnų pašaras, geriamojo vandens kiekis neribojamas. Gyvūnai gali būti laikomi grupėmis narveliuose, į grupes skirstant pagal jų gaunamą dozę, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti aiškiai stebėti kiekvieną gyvūną.

1.4.3. Gyvūnų ruošimas

Gyvūnai atrenkami atsitiktinai, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių davimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad priprastų prie laboratorijos sąlygų.

1.4.4. Dozių ruošimas

Paprastai bandomoji medžiaga duodama tokio paties tūrio dozėmis, keičiama tik preparato koncentracija. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias skiriamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai turi būti ne didesnis kaip 1ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima duoti 2 ml/100g kūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama aliejiniam tirpalui (emulsijai, suspensijai) (pvz., kukurūzų aliejaus) ir tik po jų galimi kitų nešiklių tirpalai. Jei nešiklis yra ne vanduo, turi būti žinomos jo toksikologinės charakteristikos. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.

1.5. BANDYMO EIGA

1.5.1. Dozavimas

Bandomoji medžiaga duodama kaip vienetinė dozė per skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma duoti vienetinės dozės, ji gali būti duodama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.

Prieš duodant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės negauna pašaro, išskyrus vandenį, per naktį; pelės negauna pašaro, išskyrus vandenį, 3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė duodama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.

1.5.2. Gyvūnų skaičius ir dozių dydis

Kiekvienai pakopai naudojami trys gyvūnai. Dozė, kuri turi būti naudojama kaip pradinė dozė, pasirenkama iš keturių fiksuotų dydžių: 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg kūno masės. Kaip pradinė turėtų būti pasirinkta tokia dozė, nuo kurios tikrai nugaištų kai kurie dozę gavę gyvūnai. Schemose, pateiktose 1 priedėlyje, aprašyta procedūra, kurią reikėtų taikyti kiekvienai pradinei dozei. Be to, 4 priedėlyje pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, taikytinas iki bus įgyvendinta nauja GHS.

Kai turima informacija leidžia manyti, kad gyvūnai neturėtų nugaišti nuo didžiausios pradinės dozės (2 000 mg/kg kūno masės), reikėtų daryti ribinį bandymą. Jei informacijos apie bandomąją medžiagą nėra, dėl gyvūnų gerovės priežasčių pradine doze reikėtų pasirinkti 300 mg/kg kūno masės.

Laiko tarpą tarp kiekvieno dydžio dozių davimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės davimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai.

Išimtiniais atvejais ir tik jei tai pagrįsta tam tikrais reguliavimo sumetimais, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5 000 mg/kg dydžio dozę (žr. 2 priedėlį). Dėl gyvūnų gerovės priežasčių neskatinama atlikti bandymo taikant GHS 5 kategorijos intervalą (2 000–5 000 mg/kg) ir apie tokio bandymo reikalingumą turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsauga.

1.5.3. Ribinis bandymas

Ribinis bandymas visų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y. toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima sužinoti remiantis informacija apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius ar produktus, atsižvelgiant į toksikologiškai reikšmingų komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra, arba kai ta informacija leidžia manyti, kad bandomoji medžiaga yra toksiška, turi būti atliekamas pagrindinis bandymas.

Kai skiriama viena 2 000 mg/kg kūno masės dozė, ribiniam bandymui galima imti šešis gyvūnus (po tris vienai pakopai). Išimtiniais atvejais, kai skiriama viena 5 000 mg/kg dozė, ribiniam bandymui galima naudoti tris gyvūnus (žr. 2 priedėlį). Jei pastebimas su medžiaga siejamas gaišimas, gali tekti daryti bandymą esant gretimai mažesnei dozei.

1.6. STEBĖJIMAI

Kiekvienas dozę gavęs gyvūnas stebimas bent vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, skiriant ypatingą dėmesį pirmosioms keturioms valandoms, o vėliau kartą per dieną visas 14 parų, išskyrus atvejus, kai gyvūnams reikia nutraukti bandymą ir humaniškai numarinti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksines reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei yra uždelsto toksiškumo tendencija (12). Visi stebėjimai sistemingai užrašomi, apie kiekvieną gyvūną atskirai.

Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinio aktyvumo ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai numarinami. Kai gyvūnai numarinami dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kuo tiksliau.

1.6.1. Kūno masė

Kiekvieno gyvūno masė turi būti nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos davimą ir vėliau mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.

1.6.2. Patologija

Visiems bandomiesiems gyvūnams (įskaitant nugaišusius per bandymą arba pašalintus iš bandymo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) daroma bendroji nekroskopija. Turėtų būti aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. Gyvūnams, kurie išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.

2. DUOMENYS

Turėtų būti pateikiami atskiri duomenys apie kiekvieną gyvūną. Be to, visi duomenys apibendrinami lentelėse, kuriose nurodomas kiekvienos bandymo grupės gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, darant bandymą žuvusių arba dėl gyvūnų gerovės priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, atskirų gyvūnų žūties laikas, toksinio poveikio aprašymas ir eiga, grįžtamumas, nekroskopijos duomenys.

3. ATASKAITOS RENGIMAS

3.1. BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei taikoma:

Bandomoji medžiaga:

— fizikinė būsena, grynumas ir, jei svarbu, fizikinės ir cheminės savybės (įskaitant izomerizavimą),

— tapatumas, įskaitant CAS numerį.

Nešiklis (jei taikoma):

— nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

Bandomieji gyvūnai:

— naudota rūšis ir veislė,

— mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma,

— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei taikoma, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą),

— šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.

Bandymo sąlygos:

— išsami informacija apie bandomosios medžiagos sudėtį, įskaitant duodamos medžiagos fizikinį pavidalą,

— išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimą, įskaitant dozės tūrį ir davimo laiką,

— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (šaltinį), vandens šaltinį),

— pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.

Rezultatai:

— kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir dozės dydžio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant nugaišimą, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę),

— kūno masės ir jos kitimo lentelės,

— kiekvieno gyvūno masė dozės davimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba numarinimo dieną,

— žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį numarinimą,

— toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir jų eiga, taip pat grįžtamumas kiekvieno gyvūno atveju,

— kiekvieno gyvūno nekroskopijos ir histopatologiniai duomenys, jei yra.

Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.

Išvados.

4. NUORODOS

1) Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86

2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336–341.

3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559–610

4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729–734.

5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, p. 129–134

6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455–470.

7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659–670.

8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521–14-no-24-no-0,FF.html].

11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223–231.

12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

1 PRIEDĖLIS PROCEDŪRA, TAIKOMA NAUDOJANT KIEKVIENĄ PRADINĘ DOZĘ BENDROSIOS PASTABOS Į šį priedą įtrauktose atitinkamose bandymo schemose aprašoma kiekvienos pradinės dozės procedūra, kurios reikia laikytis. — 1 A priedėlis: pradinė dozė 5 mg/kg kūno masės — 1 B priedėlis: pradinė dozė 50 mg/kg kūno masės — 1 C priedėlis: pradinė dozė 300 mg/kg kūno masės — 1 D priedėlis: pradinė dozė 2 000 mg/kg kūno masės Atsižvelgiant į humaniškai numarintų arba nugaišusių gyvūnų skaičių, bandymo eiga žymima rodyklėmis. 1 A PRIEDĖLIS BANDYMO PROCEDŪRA, KAI PRADINĖ DOZĖ YRA 5 MG/KG KŪNO MASĖS 1 B PRIEDĖLIS BANDYMO PROCEDŪRA, KAI PRADINĖ DOZĖ YRA 50 MG/KG KŪNO MASĖS 1 C PRIEDĖLIS BANDYMO PROCEDŪRA, KAI PRADINĖ DOZĖ YRA 300 MG/KG KŪNO MASĖS 1 D PRIEDĖLIS BANDYMO PROCEDŪRA, KAI PRADINĖ DOZĖ YRA 2 000 MG/KG KŪNO MASĖS

2 PRIEDĖLIS BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2 000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEDARANT BANDYMO 5 pavojaus kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima nustatyti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per virškinamąjį traktą arba odą yra 2 000–5 000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais: a) jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 1a-1d schemų, remiantis gaištamumo dažnumu; b) jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti bandymai su gyvūnais arba toksinis poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai; c) gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir — yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksinį poveikį žmonėms, arba — pastebimas tam tikras gaištamumas, kai bandymas atliekamas per virškinamąjį traktą duodant dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, arba — jei tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba — jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima darant kitus bandymus su gyvūnais gauta informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį. BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS KAIP 2 000 MG/KG DOZĖMS Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas su gyvūnais skiriant 5 kategorijos intervalo dozes (5 000 mg/kg) neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (10). Neturi būti daromas joks bandymas esant didesnėms dozėms. Kai reikia bandyti naudojant 5 000 mg/kg dozę, reikalinga tik viena pakopa (t. y. trys gyvūnai). Jei žūsta pirmas dozę gavęs gyvūnas, dozavimas tęsiamas skiriant 2 000 mg/kg dozę pagal 1 priedėlyje pateiktas schemas. Jei pirmas gyvūnas lieka gyvas, dozę gauna kiti du gyvūnai. Jei žūsta tik vienas iš trijų gyvūnų, daroma prielaida, kad LD50 vertė yra didesnė negu 5 000 mg/kg. Jei žūsta abu gyvūnai, dozavimas tęsiamas skiriant 2 000 mg/kg dozę.

3 PRIEDĖLIS BANDYMŲ METODAS B.1 tris. Klasifikavimo pagal ES schemą rekomendacijos, taikomos pereinamajam laikotarpiui iki visiško visuotinai suderintos klasifikavimo sistemos (GHS) įgyvendinimo (paimta iš 8 nuorodos)

B.2. ŪMUS TOKSIŠKUMAS (PER KVĖPAVIMO TAKUS)

1. METODAS

1.1. ĮVADAS

Naudinga turėti išankstinės informacijos apie medžiagos dalelių dydžio pasiskirstymą, garų slėgį, lydymosi temperatūrą, virimo temperatūrą, pliūpsnio temperatūrą ir sprogumą (jeigu tinka).

Taip pat žr. Bendrojo įvado B dalies A skirsnį.

1.2. APIBRĖŽTYS

Žr. Bendrojo įvado B dalies B skirsnį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Nėra.

1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS

Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės apibrėžtą laikotarpį veikiamos tam tikros skirtingos koncentracijos bandomąja medžiaga; vieno dydžio koncentracija naudojama vienai grupei. Po to atliekami poveikio ir žūties atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama nekroskopija, o užbaigus bandymą nekroskopija atliekama jį išgyvenusiems gyvūnams.

Gyvūnus, kurie turi aiškių ir ilgalaikių kančios ir skausmo požymių, gali tekti humaniškai numarinti. Bandomosios medžiagos nereikėtų duoti tokiomis dozėmis, kurios neabejotinai sukeltų skausmo ir kančių dėl ardančių (ėsdinančių) arba dirginančių savybių.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Nėra.

1.6. BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6.1. Pasiruošimas

Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai yra atrenkami atsitiktinai ir suskirstomi į reikalingą grupių skaičių. Jie neturi patirti dirbtinai sukurto poveikio, išskyrus atvejus, jei tai daryti rekomenduojama dėl tam tikro veikimo aparato tipo.

Kietąsias bandomas medžiagas gali tekti mikronizuoti, kad būtų gaunamos atitinkamo dydžio dalelės.

Prireikus į bandomąją medžiagą gali būti dedama atitinkamo tirpiklio, kad būtų gaunama atitinkama bandomosios medžiagos koncentracija atmosferoje; tokiu atveju naudojama kontrolinė tirpiklio grupė. Jeigu tirpiklis ar kiti priedai yra naudojami dozavimui palengvinti, turėtų būti žinoma, kad jie nesukels toksinio poveikio. Gali būti naudojamasi ankstesniais duomenimis, jei jų yra.

1.6.2. Bandymo sąlygos

1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai

Jeigu nėra kontraindikacijų, pirmenybė teikiama žiurkėms. Turėtų būti panaudojamos plačiai naudojamos laboratorinės veislės. Bandymo pradžioje abiejų lyčių gyvūnų svoris turėtų būti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.

1.6.2.2. Skaičius ir lytis

Kiekviena koncentracija bandoma su ne mažiau kaip dešimčia graužikų (penki patinėliai ir penkios patelės). Patelės turėtų būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos.

Pastaba: Atliekant ūmaus toksiškumo bandymus su aukštesniaisiais gyvūnais nei graužikai, turi būti apsvarstoma galimybė naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turėtų būti atidžiai parenkamos ir turėtų būti dedamos visos pastangos neviršyti vidutinio toksiškumo dozių. Tokiuose bandymuose turėtų būti vengiama mirtinų bandomosios medžiagos dozių.

1.6.2.3. Poveikio koncentracijos

Koncentracijų skaičius turėtų būti pakankamas, ne mažiau trys. Jos turėtų pakankamai skirtis, kad bandomiesiems gyvūnams pasireikštų įvairus toksinis poveikis ir skirtingo dydžio gaištamumo procentas. Duomenų turi būti tiek, kad pakaktų sudaryti mirtinų koncentracijų kreivę ir, jei įmanoma, tinkamai nustatyti LC50.

1.6.2.4. Ribinis bandymas

Jeigu penkis bandomus patinėlius ir penkias bandomas pateles paveikus 20 mg bandomosios medžiagos litre dujų arba 5 mg bandomosios medžiagos litre aerozolio arba dalelių (arba, jeigu tai neįmanoma dėl bandomosios medžiagos fizikinių arba cheminių, taip pat ir sprogumo savybių, tuomet didžiausia įmanoma koncentracija) keturias valandas, per 14 dienų nebūna su tuo cheminiu junginiu susijusių nugaišimo atvejų, laikoma, kad tolesnis bandymas yra nebūtinas. (18-ta ATP, dir. 93/21/EEB, L1 10/93).

1.6.2.5. Poveikio trukmė

Poveikio trukmė turėtų būti keturios valandos.

1.6.2.6. Įranga

Gyvūnai turėtų būti bandomi inhaliaciniais įrenginiais, skirtais išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą, kad būtų užtikrintas pakankamas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirstytų veikiamoji atmosfera. Jeigu naudojama kamera, ji turėtų būti tokios konstrukcijos, kad gyvūnai kuo mažiau susigrūstų ir kad jie įkvėptų kuo daugiau bandomosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti kameros atmosferos pastovumą, visas bandomų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 % bandymo kameros tūrio. Atskiroje kameroje gali būti paveikiama burna ir nosis, tik galva arba visas kūnas; du pirmieji būdai padeda sumažinti bandomosios medžiagos patekimą kitais keliais.

1.6.2.7. Stebėjimo laikotarpis

Stebėjimo laikotarpis turėtų būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimo trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo laikotarpio trukmę; todėl, jeigu laikoma reikalinga, ji gali būti pailginama. Labai svarbu, kada toksiškumo požymiai atsiranda ir išnyksta, bei nugaišimo laikas, ypač jeigu yra tendencija, kad žūtis pasireiškia vėliau.

1.6.3. Bandymo eiga

Prieš pat poveikį gyvūnai pasveriami ir po to paveikiami bandomąja koncentracija tam skirtame aparate keturias valandas po to, kai kameroje nusistovi koncentracijos pusiausvyra. Pusiausvyros nusistovėjimo trukmė turi būti trumpa. Temperatūra, kurioje vykdomas bandymas, turėtų būti išlaikoma 22 ± 3 °C. Tinkamiausias santykinis drėgnumas yra tarp 30 % ir 70 %, bet tam tikrais atvejais (pvz., atliekant tam tikrus aerozolių bandymus), tai gali būti neįgyvendinama. Išlaikant nedidelį neigiamą slėgį kameros viduje (≥ 5 mm vandens) užkertamas kelias bandomajai medžiagai patekti į aplinką. Veikimo laikotarpiu neturėtų būti duodama pašaro ir vandens. Turėtų būti naudojamos atitinkamos bandymo atmosferos generavimo ir stebėsenos sistemos, kuriomis būtų galima kuo greičiau užtikrinti vienodą poveikį. Kamera turėtų būti tokios konstrukcijos ir taip veikti, kad jos viduje bandymo atmosfera pasiskirstytų vienodai.

Turėtų būti atliekami šie matavimai arba stebėsena:

a) oro srauto greičio (visą laiką);

b) tikrosios bandomosios medžiagos koncentracijos, matuojamos kvėpavimo zonoje ne mažiau kaip tris kartus veikimo laikotarpiu (esant tam tikrai atmosferai, pvz., naudojant didelės koncentracijos aerozolius, gali tekti vykdyti dažnesnę stebėseną). Veikimo laikotarpiu koncentracija neturėtų keistis daugiau negu ± 15 % vidutinės vertės. Tačiau naudojant tam tikrus aerozolius, šio kontrolės lygio gali būti neįmanoma pasiekti, tokiu atveju būtų priimtinas platesnis intervalas. Aerozolių dalelių dydžio analizė turėtų būti atliekama reikiamu dažnumu (ne rečiau kaip vieną kartą vienai bandomajai grupei);

c) temperatūros ir drėgnumo, jei įmanoma, visą laiką.

Veikimo laikotarpiu ir po jo atliekami stebėjimai, kurie sistemingai užrašomi; apie kiekvieną gyvūną turėtų būti daromi atskiri įrašai. Pirmą dieną stebėjimai turėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis ištyrimas turėtų būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti vykdomi kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų iki minimumo sumažinti bandymo metu prarandamų gyvūnų skaičių, pvz., rastų negyvų gyvūnų nekroskopija arba užšaldymas ir nusilpusių arba gaištančių gyvūnų izoliavimas arba numarinimas.

Stebimi odos ir kailio, akių, gleivinės pasikeitimai, taip pat respiratorinės, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinio aktyvumo ir elgsenos pasikeitimai. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas kvėpavimo, drebulių, konvulsijų, seilėjimosi, viduriavimo, letargo, miego ir komos stebėjimams. Nugaišimo laikas turėtų būti užrašomas kaip galima tiksliau. Kiekvieno gyvūno svoris turėtų būti nustatomas kiekvieną savaitę po poveikio ir šiam nugaišus.

Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, ir tiems, kurie išlieka gyvi pabaigus bandymą, atliekama nekroskopija, ypač atkreipiant dėmesį į visus viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų pokyčius. Turėtų būti užregistruojami visi dideli patologiniai pokyčiai. Jeigu reikalaujama, turėtų būti paimami audiniai histopatologiniam tyrimui.

2. DUOMENYS

Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, nurodant kiekvienos bandomos grupės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyvūno nugaišimo laiką, gyvūnų, turinčių kitokių toksiškumo požymių, skaičių, pateikiant toksinio poveikio ir nekroskopijos duomenų aprašymą. Turėtų būti apskaičiuojami ir registruojami svorio pasikeitimai, jeigu išgyvenama ilgiau negu vieną dieną. Gyvūnai, kurie humaniškai numarinami dėl cheminio junginio sukeliamų kančių ir skausmo, užregistruojami kaip nugaišimo atvejai, kurių priežastis – cheminis junginys. LD50 turėtų būti nustatoma pripažintu metodu. Duomenų vertinime reikėtų nurodyti sąryšį, jeigu toks yra, tarp gyvūnų poveikio bandomąja medžiaga ir visų anomalijų atsiradimo ir stiprumo, įskaitant elgsenos ir klinikines anomalijas, didesnių audinių pakitimų, kūno svorio pasikeitimų, gaištamumo ir kito toksinio poveikio.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3.1. BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:

— rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašarai ir pan.,

— bandymo sąlygos: veikimo aparato apibūdinimas, taip pat aparato konstrukcija, tipas, dydžiai, oro šaltinis, aerozolių generavimo sistema, oro kondicionavimo metodas ir gyvūnų laikymo bandymo kameroje, jeigu tokia naudojama, būdas. Turėtų būti apibūdinama temperatūros, drėgnumo, aerozolio koncentracijos ir dalelių dydžio pasiskirstymo matavimo įranga.

Duomenys apie poveikį

Jie turėtų būti pateikiami lentelėse vidutinėmis vertėmis ir kintamumo vienetais (pvz., standartinis nuokrypis) ir, jeigu įmanoma, į juos turėtų būti įtraukti:

a) oro srauto, tekančio inhaliacijos įrenginiu, greitis;

b) oro temperatūra ir drėgnumas;

c) nominalios koncentracijos (visas bandomos medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos įrenginį, padalytas iš oro tūrio);

d) nešiklio, jeigu naudotas, rūšis;

e) faktinės koncentracijos kvėpavimo bandymo zonoje;

f) masės vidutinis aerodinaminis skersmuo (MMAD) ir geometrinis standartinis nuokrypis (GSD);

g) pusiausvyros nustatymo laikotarpis;

h) veikimo laikotarpis; — duomenų apie reakciją pagal lytį ir poveikį surašymas į lenteles (pvz., gyvūnų, kurie nugaišo arba buvo numarinti bandymo metu, skaičius; toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius; paveiktų gyvūnų skaičius), — nugaišimo laikas veikimo metu arba po jo, priežastys ir kriterijai, kuriais naudotasi humaniškai numarinant gyvūnus, — visi pastebėjimai, — kiekvienos lyties LC50 vertė, nustatyta stebėjimo laikotarpio pabaigoje (nurodant apskaičiavimo metodą), — LC50 95 % pasikliautinasis intervalas (tais atvejais, kai gali būti pateikta), — dozės ir gaištamumo kreivė ir statumas (jeigu įmanoma pagal nustatymo metodą), — nekroskopijos duomenys, — visi histopatologiniai duomenys, — rezultatų aptarimas (ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kokį poveikį humaniškas gyvūnų numarinimas bandymo metu galėtų turėti apskaičiuojamai LC50 vertei), — rezultatų aiškinimas.

3.2. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS

Žr. Bendrojo įvado B dalies D skirsnį.

4. NUORODOS

Žr. Bendrojo įvado B dalies E skirsnį.

B.3. ŪMUS TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)

1. METODAS

1.1. ĮVADAS

Žr. Bendrojo įvado B dalies A skirsnį.

1.2. APIBRĖŽTYS

Žr. Bendrojo įvado B dalies B skirsnį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Nėra.

1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS

Bandomoji medžiaga dedama ant odos skirtingomis dozėmis kelioms eksperimentinių gyvūnų grupėms, viena dozė – vienai grupei. Po to atliekami poveikio ir nugaišimo atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama nekroskopija, ir, užbaigus bandymą, atliekama bandymą išgyvenusių gyvūnų nekroskopija.

Gyvūnus, kurie turi aiškių ir ilgalaikių kančios ir skausmo požymių, reikia humaniškai numarinti. Jeigu žinoma, kad dėl medžiagų, naudojamų dozavimo bandymuose, gali kilti skausmas ir kančia dėl jų ardančių (ėsdinančių) arba dirginančių savybių, tokie bandymai neturėtų būti atliekami.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Nėra.

1.6. BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6.1. Pasirengimas

Gyvūnai laikomi eksperimentiniuose narveliuose eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni suaugę gyvūnai atsitiktinai atrenkami ir paskiriami į bandomąsias grupes. Apytikriai 24 valandas iki bandymo nuo gyvūno kūno sprando srityje pašalinamas kailis, jį nukerpant arba nuskutant. Jeigu kailis kerpamas arba skutamas, reikia stengtis nenutrinti odos, tai gali pakeisti pralaidumą. Bandomajai medžiagai uždėti turėtų būti nukirpta ar nuskusta ne mažiau kaip 10 % kūno paviršiaus. Jeigu bandomos kietosios medžiagos, kurios atitinkamais atvejais gali būti pulverizuojamos, bandomoji medžiaga turėtų būti pakankamai sudrėkinama vandeniu arba, jeigu reikia, atitinkamu nešikliu, kad būtų užtikrinamas geras sąlytis su oda. Jeigu naudojamas nešiklis, turėtų būti atsižvelgiama į jo poveikį bandomosios medžiagos įsiskverbimui į odą. Skystos bandomosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos.

1.6.2. Bandymo sąlygos

1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai

Gali būti naudojamos suaugusios žiurkės arba triušiai. Gali būti naudojamos ir kitos rūšys, bet jų naudojimas turėtų būti pagrindžiamas. Turėtų būti panaudojamos įprastos laboratorinės veislės. Bandymo pradžioje abiejų lyčių gyvūnų svoris turėtų būti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.

1.6.2.2. Skaičius ir lytis

Kiekvienai dozei naudojama ne mažiau kaip 5 gyvūnai. Jie visi turėtų būti vienos lyties. Jeigu naudojamos patelės, jos turėtų būti neturėjusios palikuonių ir neapvaisintos. Jeigu galima gauti informacijos, įrodančios, kad kuri nors lytis yra daug jautresnė, dozė taikoma tai lyčiai.

Pastaba. Atliekant ūmaus toksiškumo bandymus su aukštesniaisiais gyvūnais nei graužikai, turi būti apsvarstoma galimybė naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turėtų būti atidžiai parenkamos ir turėtų būti dedamos visos pastangos neviršyti vidutinio toksiškumo dozių. Tokiuose bandymuose turėtų būti vengiama mirtinų bandomosios medžiagos dozių.

1.6.2.3. Dozės

Dozių skaičius turėtų būti pakankamas, ne mažiau kaip trys. Jos turėtų pakankamai skirtis, kad bandomiesiems gyvūnams pasireikštų įvairus toksinis poveikis ir skirtingo dydžio gaištamumo procentas. Parenkant dozės dydį reikia atsižvelgti į jautrinimo ar ėsdinimo poveikį. Duomenų turėtų būti tiek, kad būtų galima sudaryti dozės ir reakcijos kreivę ir, jeigu įmanoma, būtų galima nustatyti LD50.

1.6.2.4. Ribinis bandymas

Galima atlikti ribinį bandymą su penkiais patinėliais ir penkiomis patelėmis, jiems skiriant vienetinę 2 000 mg/kg kūno masės dozę pagal pirmiau aprašytą darbo eigą. Jeigu cheminis junginys tampa nugaišimo priežastimi, reikėtų apsvarstyti, ar nereikėtų atlikti išsamų tyrimą.

1.6.2.5. Stebėjimo laikotarpis

Stebėjimo laikotarpis turėtų būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimo trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo laikotarpio trukmę; todėl, jeigu laikoma reikalinga, ji gali būti pailginama. Labai svarbu, kada toksiškumo požymiai atsiranda ir išnyksta, bei nugaišimo laikas, ypač jeigu yra tendencija, kad žūtis pasireiškia vėliau.

1.6.3. Bandymo eiga

Gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose narveliuose. Bandomoji medžiaga turėtų būti tolygiai uždedama ant plotelio, kurio dydis sudaro apie 10 % viso kūno paviršiaus. Jeigu medžiagos labai toksiškos, paveikiamas paviršius gali būti mažesnis, bet kaip galima didesnis plotas turėtų būti padengiamas kuo plonesniu ir lygesniu sluoksniu.

Bandomoji medžiaga turėtų liestis su oda akytu marlės tvarsčiu ir nedirginančia lipnia juostele per visą 24 valandų veikimo laiką. Bandomoji vieta turėtų būti papildomai tinkamai uždengta, kad marlės tvarstis ir bandomoji medžiaga laikytųsi bei būtų užtikrinama, kad gyvūnai nepraris bandomosios medžiagos. Gali būti naudojami ribotuvai, kad bandomoji medžiaga nebūtų praryjama, bet visiško imobilizavimo metodas nerekomenduojamas.

Veikimo laikotarpio pabaigoje bandomosios medžiagos likutis turėtų būti nuimamas, paprastai naudojant vandenį ar kokį kitą atitinkamą odos valymo būdą.

Veikimo metu atliekami stebėjimai, kurie sistemingai užrašomi. Apie kiekvieną gyvūną turėtų būti daromi atskiri įrašai. Pirmą dieną stebėjimai turėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis ištyrimas turėtų būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti vykdomi kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų kuo labiau sumažinti bandymo metu prarandamų gyvūnų skaičių, pvz., rastų negyvų gyvūnų nekroskopija arba užšaldymas ir nusilpusių arba gaištančių gyvūnų izoliavimas arba numarinimas.

Turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimai, taip pat respiratorinės, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinio aktyvumo ir elgsenos pasikeitimai. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas drebulių, konvulsijų, seilėjimosi, viduriavimo, letargo, miego ir komos stebėjimams. Nugaišimo laikas turėtų būti užrašomas kuo tiksliau. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, ir tiems, kurie išlieka gyvi pabaigus bandymą, atliekama nekroskopija. Visi dideli patologiniai pokyčiai turėtų būti registruojami. Jeigu nurodyta, turėtų būti paimami audiniai histopatologiniam tyrimui.

Toksiškumo priešingai lyčiai įvertinimas

Užbaigus bandymą su viena lytimi, dozė skiriama ne mažiau kaip vienai grupei, susidedančiai iš 5 priešingos lyties gyvūnų, kad būtų nustatyta, ar šios lyties gyvūnai nėra jautresni bandomajai medžiagai. Atskirais atvejais pateisinamas mažesnio gyvūnų skaičiaus naudojimas. Jeigu galima gauti pakankamai informacijos, įrodančios, kad bandomos lyties gyvūnai yra daug jautresni, galima apsieiti be priešingos lyties gyvūnų bandymo.

2. DUOMENYS

Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, nurodant kiekvienos grupės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyvūno nugaišimo laiką, gyvūnų, turinčių kitokių toksiškumo požymių, skaičių, pateikiant toksinio poveikio ir nekroskopijos duomenų aprašymą. Kiekvieno gyvūno svoris turėtų būti nustatomas ir užrašomas prieš pat uždedant bandomosios medžiagos, po to kartą per savaitę ir nugaišimo metu; svorio pasikeitimai turėtų būti apskaičiuojami ir užrašomi, jeigu išgyvenama ilgiau negu vieną dieną. Gyvūnai, kurie humaniškai numarinami dėl cheminio junginio sukeliamų kančių ir skausmo, yra užregistruojami kaip žūties atvejai, kurių priežastis – cheminis junginys. LD50 turėtų būti nustatoma pripažintu metodu.

Vertinant duomenis reikėtų įvertinti sąryšį, jeigu toks yra, tarp gyvūnų, paveiktų bandomąja medžiaga, ir visų anomalijų atsiradimo ir stiprumo, įskaitant elgsenos ir klinikines anomalijas, didesnių audinių pakitimų, kūno svorio pasikeitimų, nugaišimo ir kito toksikologinio poveikio.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3.1. BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, turėtų būti pateikiama tokia informacija:

— rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašaras ir pan.,

— bandymo sąlygos (taip pat odos nuvalymo metodas ir tvarstymo būdas: pralaidus arba nepralaidus),

— dozės (nurodant nešiklį, jeigu naudojamas, ir koncentracijas),

— gyvūnų, kuriems įvestos dozės, lytis,

— duome