Pridedami šie priedai:

„

Priedėlis

KARVIŲ PIENO IR KAZEINATO APTIKIMO SŪRIUOSE, PAGAMINTUOSE IŠ AVIŲ, OŽKŲ ARBA BUIVOLIŲ PIENO ARBA AVIŲ, OŽKŲ IR BUIVOLIŲ PIENO MIŠINIŲ, METODAS

1. ESMĖ

Karvių pieno ir kazeinato aptikimas sūriuose, pagamintuose iš avių pieno, ožkų pieno ir buivolių pieno arba avių, ožkų ir buivolių pieno mišinių, taikant izoelektrinį γ-kazeinų fokusavimą po skaidymo plazminu.

2. TAIKYMO SRITIS

Metodas tinka, kai reikia jautraus ir specifinio metodo natūraliam ir termiškai apdorotam karvių pienui ir kazeinatui aptikti šviežiuose ir brandintuose sūriuose, pagamintuose iš avių, ožkų ir buivolių pieno arba avių, ožkų ir buivolių pieno mišinių. Jis netinka norint nustatyti, ar falsifikuojant į pieną ir sūrį yra pridėta termiškai apdorotų karvių pieno išrūgų baltymų koncentratų.

3. METODO ESMĖ

3.1. Kazeinų išskyrimas iš sūrio ir pamatinių etalonų

3.2. Gautų kazeinų tirpinimas ir skaidymas plazminu (EC.3.4.21.7)

3.3. Plazminu apdorotų kazeinų izoelektrinis fokusavimas karbamido aplinkoje ir baltymų dažymas

3.4. Nudažytų γ3 ir γ2 kazeinų frakcijų elektroforegramų įvertinimas (karvių pieno buvimo mėginyje įrodymas), lyginant tame pačiame gelyje gautas tiriamojo mėginio ir pamatinių etalonų, kuriuose yra 0 % ir 1 % karvių pieno, elektroforegramas.

4. REAGENTAI

Jei nenurodyta kitaip, naudojamos analiziškai grynos cheminės medžiagos. Vanduo turi būti du kartus distiliuotas arba tokio paties grynumo.

Pastaba. Šie duomenys taikomi laboratorijoje pagamintiems poliakrilamido geliams su karbamidu, kurių matmenys 265 × 125 × 0,25 mm. Jei naudojamas kito tipo ir dydžio gelis, atskyrimo sąlygas gali tekti reguliuoti.

Izoelektrinis fokusavimas

4.1. Reagentai poliakrilamido geliams su karbamidu gaminti

4.1.1. Pradinis gelio tirpalas

Vandenyje ištirpinama

4,85 g akrilamido,

0,15 g N,N′-metilen-bis-akrilamido (BIS),

48,05 g karbamido,

15,00 g glicerolio (87 % masės)

skiedžiama iki 100 ml ir laikoma tamsaus stiklo butelyje šaldytuve.

Pastaba. Vietoje nurodytos masės neurotoksinių akrilamidų galima naudoti iš anksto sumaišytą akrilamido (BIS) tirpalą, kurio galima nusipirkti. Vietoj nurodytos masės akrilamido galima naudoti 16,2 ml jo tirpalo, jei jame yra 30 % (masės pagal tūrį) akrilamido ir 0,8 % (masės pagal tūrį) BIS. Pradinio tirpalo galiojimo trukmė – ne daugiau kaip10 dienų; jeigu jo laidumas didesnis nei 5 μS, tirpalą reikia naujai dejonizuoti 30 min. maišant su 2 g Amberlite MB-3, po to filtruojant per 0,45 μm membraną.

4.1.2. Gelio tirpalas

Gelio tirpalas ruošiamas pradinį gelio tirpalą (žr. 4.1.1) maišant su priedais ir amfolitais (*).

9,0 ml pradinio tirpalo

24 mg β-alanino

500 μl amfolito, pH 3,5–9,5

250 μl amfolito, pH 5–7

250 μl amfolito, pH 6–8

Gelio tirpalas sumaišomas ir dvi tris minutes ultragarso vonelėje arba vakuume iš jo šalinamos dujos.

Pastaba. Gelio tirpalas ruošiamas prieš pat jį liejant (žr. 6.2 punktą).

4.1.3. Katalizatorių tirpalai

4.1.3.1. N,N,N′,N′-tetrametiletilendiaminas (Temed)

4.1.3.2. 40 % (masės pagal tūrį) amonio peroksosulfatas (PER):

800 mg PER ištirpinama vandenyje ir atskiedžiama iki 2 ml.

Pastaba. Visada naudojamas ką tik pagamintas PER tirpalas.

4.2. Kontaktinis skystis

Žibalas arba skystas parafinas

4.3. Anodo tirpalas

5,77 g fosforo rūgšties (85 % masės) ištirpinama vandenyje ir atskiedžiama iki 100 ml.

4.4. Katodo tirpalas

2,00 g natrio hidroksido ištirpinama vandenyje ir atskiedžiama vandeniu iki 100 ml.

Mėginio ruošimas

4.5. Reagentai baltymams išskirti

4.5.1. Praskiesta acto rūgštis (25,0 ml ledinės acto rūgšties atskiedžiama vandeniu iki 100 ml).

4.5.2. Dichlormetanas

4.5.3. Acetonas

4.6. Buferinis tirpalas baltymams tirpinti

Vandenyje ištirpinama

5,75 g glicerolio (87 % masės),

24,03 g karbamido,

250 mg ditiotreitolio

ir atskiedžiama iki 50 ml.

Pastaba. Laikoma šaldytuve, maksimali laikymo trukmė – 1 savaitė.

4.7. Reagentai kazeinui skaidyti plazminu

4.7.1. Buferinis amonio karbonato tirpalas

0,2 mol/l amonio hidrokarbonato tirpalas (1,58 g/100 ml vandens), kuriame yra 0,05 mol/l etilendiamintetraacto rūgšties (EDTA, 1,46 g/100 ml), titruojamas 0,2 mol/l amonio karbonato tirpalu (1,92 g/100 ml vandens), kuriame yra 0,05 mol/l EDTA, kol jo pH pasiekia 8.

4.7.2. Galvijų plazminas (E.C.3.4.21.7), kurio aktyvumas ne mažesnis kaip 5 U/ml

4.7.3. ε-aminoheksano rūgšties tirpalas fermentams slopinti

2,624 g ε-aminoheksano rūgšties (6 amino-n-heksano rūgšties) ištirpinama 100 ml 40 % (tūrio) etanolio.

4.8. Etalonai

4.8.1. Sertifikuotus pamatinius sutraukto nugriebto avių ir ožkų pieno mišinių, kuriuose yra 0 % ir 1 % karvių pieno, etalonus galima gauti Komisijos etaloninių medžiagų ir matavimų institute (Commission's Institute for Reference Materials and Measurements, B-2440, Geel, Belgija).

4.8.2. Laboratorinių etaloninių traukinto buivolių pieno tirpalų, kuriuose yra 0 % ir 1 % karvių pieno, paruošimas

Nugriebtam pienui gauti žalias surinktinis buivolių arba karvių pienas 20 min., esant 2 500 g išscentrinei jėgai, centrifuguojamas 37 °C temperatūroje. Greitai atšaldžius mėgintuvėlį su jo turiniu iki 6–8 °C temperatūros, visiškai nuimamas viršutinis riebalų sluoksnis. 1 % etaloniniam tirpalui paruošti į 1 l talpos cheminę stiklinę įpilama 5,00 ml nugriebto karvių pieno, 495 ml nugriebto buivolių pieno ir praskiesta pieno rūgštimi (10 % masės) parūgštinama iki pH 6,4. Mišinys šildomas iki 35 °C, įpilama 100 μl šliužo fermento (fermento aktyvumas 1:10 000, koncentracija 3 000 U/ml), maišoma 1 min. ir aliuminio folija uždengta stiklinė paliekama stovėti 35 °C temperatūroje vieną valandą, kad pienas susitrauktų. Susidarius varškei, visas sutrauktas pienas liofilizuojamas prieš tai jo nesumaišant ir nenupilant išrūgų. Po liofilizacijos produktas sumalamas į homogeniškus miltelius. 0 % etaloninis tirpalas ruošiamas atliekant tą pačią procedūrą su grynu nugriebtu buivolių pienu. Etaloniniai tirpalai laikomi – 20 °C temperatūroje.

Pastaba. Prieš gaminant etaloninius tirpalus patartina patikrinti buivolių pieno grynumą, izoelektriškai fokusuojant plazminu suskaldytus kazeinus.

Reagentai baltymams dažyti

4.9. Fiksavimo tirpalas

150 g trichloracto rūgšties ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 000 ml.

4.10. Blukinimo tirpalas

500 ml metanolio ir 200 ml ledinės acto rūgšties atskiedžiama distiliuotu vandeniu iki 2 000 ml.

Pastaba. Kiekvieną dieną gaminamas šviežias blukinimo tirpalas; jį galima gaminti lygiomis dalimis sumaišant pradinius 50 % (tūrio) metanolio ir 20 % (tūrio) ledinės acto rūgšties tirpalus.

4.11. Dažymo tirpalai

4.11.1. Dažymo tirpalas (1-asis pradinis tirpalas)

3,0 g dažo Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) ištirpinama 1 000 ml 90 % (tūrio) metanolio, naudojant magnetinę maišyklę (apie 45 min.), ir išfiltruojama per du vidutinio tankumo sulankstytus filtrus.

4.11.2. Dažymo tirpalas (2-asis pradinis tirpalas)

5,0 g vario sulfato pentahidrato ištirpinama 1 000 ml 20 % (tūrio) acto rūgšties.

4.11.3. Dažymo tirpalas (darbinis tirpalas)

Prieš pat dažymą sumaišoma po 125 ml abiejų pradinių tirpalų (4.11.1, 4.11.2).

Pastaba. Dažymo tirpalus reikėtų ruošti naudojimo dieną.

5. ĮRANGA

5.1. Stiklinės plokštelės (265 × 125 × 4 mm); guminis volelis (15 cm pločio); lyginamasis stalas.

5.2. Gelio nešiklio lapas (265 × 125 mm)

5.3. Dengiamasis lapas (280 × 125 mm). Ant kiekvieno išilginio lapo krašto priklijuojama lipni juostelė (280 × 6 × 0,25 mm) (žr. 1 paveikslą)

5.4. Elektrofokusavimo kamera su šaldomąja plokšte (pvz., 265 × 125 mm) ir tinkamas maitinimo šaltinis (≥ 2,5 kV) arba automatinis elektroforezės prietaisas

5.5. Reguliuojamos temperatūros cirkuliacinis kriostatas, nustatytas 12 ± 0,5 °C temperatūrai palaikyti

5.6. Centrifuga, reguliuojama iki 3 000 g

5.7. Elektrodų juostos (≥ 265 mm ilgio)

5.8. Plastikiniai anodo ir katodo tirpalų lašintuvai

5.9. Mėginių aplikatoriai (10 × 5 mm, viskozė arba filtravimo popierius, mažai adsorbuojantis baltymus)

5.10. Nerūdijančiojo plieno arba stikliniai dažymo ir blukinimo indai (pvz., 280 × 150 mm įrankių padėklai)

5.12. Reguliuojamas rotacinis maišiklis (veleno skersmuo – 10 mm), kurio greičių intervalas – 8 000–20 000 aps./min.

5.13. Magnetinė maišyklė

5.14. Ultragarsinė vonelė

5.15. Plėvelės sulydymo įtaisas

5.16. 25 μl mikropipetės

5.17. Vakuuminis koncentratorius arba sublimacinė džiovykla

5.18. Termostatinė vandens vonelė, kurioje galima nustatyti 35 ir 40 ± 1 °C temperatūrą, su purtytuvu

5.19. Densitometras, rodmenų skaitymo bangos ilgis λ = 634 nm

6. PROCEDŪRA

6.1. Mėginių ruošimas

6.1.1. Kazeinų išskyrimas

Į 100 ml talpos centrifugavimo mėgintuvėlį pasveriamas 5 g sausos masės atitinkantis sūrio arba pamatinio etalono kiekis, įpilama 60 ml distiliuoto vandens ir homogenizuojama rotaciniu maišikliu (8 000–10 000 aps./min.). Praskiesta acto rūgštimi (4.5.1) parūgštinama iki pH 4,6 ir centrifuguojama (5 min., 3 000 g). Riebalai ir išrūgos dekantuojami, likutis homogenizuojamas (20 000 aps./min.) su 40 ml distiliuoto vandens, parūgštinto praskiesta acto rūgštimi (4.5.1) iki pH 4,5, įpilama 20 ml dichlormetano (4.5.2), dar kartą homogenizuojama ir centrifuguojama (5 min, 3 000 g). Tarp vandens ir organinio tirpiklio fazių susidaręs kazeino sluoksnis (žr. 2 paveikslą) nuimamas mentele, abi fazės dekantuojamos. Kazeinas vėl homogenizuojamas su 40 ml distiliuoto vandens (žr. pirmiau) ir 20 ml dichlormetano (4.5.2), vėl centrifuguojama. Ši procedūra kartojama tol, kol abi ekstrakto fazės tampa bespalvės (2–3 kartus). Baltymų likutis homogenizuojamas su 50 ml acetono (4.5.3) ir filtruojamas per sulankstytą vidutinio tankumo filtravimo popierių. Likutis du kartus, naudojant po 25 ml acetono, plaunamas ant filtro, paliekamas džiūti ore arba išdžiovinamas azoto srove ir sumalamas į miltelius grūstuvėje.

Pastaba. Išdžiovinti kazeino izoliatai turėtų būti laikomi – 20 °C temperatūroje.

6.1.2. β-kazeinų skaidymas plazminu γ-kazeinų intensyvumui padidinti

25 mg išskirtų kazeinų (6.1.1) ištirpinami 0,5 ml buferinio amonio karbonato tirpalo (4.7.1) ir homogenizuojami 20 min., pvz., ultragarsu. Gautas tirpalas pašildomas iki 40 °C temperatūros ir į jį pridedama 10 ml plazmino (4.7.2), sumaišoma ir laikoma 1 valandą 40 °C temperatūroje nuolat purtant. Fermentui slopinti įpilama 20 μl ε-aminokaprono rūgšties tirpalo (4.7.3), tada dedama 200 ml kieto karbamido ir 2 mg ditiotreitolio.

Pastaba. Norint gauti simetriškesnes fokusuoto kazeino juosteles, patartina, pridėjus ε-aminokaprono rūgšties, tirpalą liofilizuoti ir gautus likučius ištirpinti 0,5 ml baltymų tirpinimo buferio (4.6).

6.2. Poliakrilamido gelių su karbamidu ruošimas

Keliais vandens lašais suvilgytas gelio nešiklio lapas (5.2) išlyginamas ant stiklinės plokštės (5.1), visą perteklinį vandenį pašalinant popieriniu rankšluosčiu arba servetėle. Tokiu pačiu būdu ant kitos stiklinės plokštės dedamas dengiamasis lapas (5.3) su tarpikliais (0,25 mm). Plokštė dedama horizontaliai ant lyginamojo stalo.

Į paruoštą gelio tirpalą (4.1.2), iš kurio pašalintos dujos, įpilama 10 μl Temed (4.1.3.1), maišoma ir įpilama 10 μl PER tirpalo (4.1.3.2), gerai sumaišoma ir iš karto išpilama tolygiai dengiamojo lapo viduryje. Plokštė su gelio nešiklio lapu vienu kraštu (lapu į apačią) padedama ant plokštės su dengiamuoju lapu ir lėtai nuleidžiama taip, kad tarp lapų susidarytų vienodai pasklidusi gelio plėvelė be oro burbuliukų (3 paveikslas). Naudojant ploną mentelę, plokštė su gelio nešiklio lapu iš lėto visiškai nuleidžiama ir prispaudžiama ant jos viršaus uždedant dar tris stiklines plokštes. Pasibaigus polimerizacijai (po maždaug 60 min.) ant gelio nešiklio lapo susipolimerizavęs gelis nuimamas kartu su dengiančiu lapu, paverčiant stiklines plokšteles. Nuo gelio nešiklio lapo išorinės pusės gelio ir karbamido likučiai gerai nuvalomi. Daugiasluoksnis gelis sulydomas į plėvelės vamzdį ir laikomas šaldytuve (ne ilgiau kaip šešias savaites).

Pastaba. Dengiantysis lapas su tarpikliais gali būti naudojamas dar kartą. Poliakrilamido gelį galima supjaustyti į mažesnius gabaliukus ir taip daryti rekomenduojama, jei yra keli mėginiai arba jei naudojamas automatinis elektroforezės įrenginys (du geliai, kurių dydis 4,5 × 5 cm).

6.3. Izoelektrinis fokusavimas

Šaldymo termostate nustatoma 12 °C temperatūra. Gelio nešiklio lapo išorinė pusė nuvaloma žibalu, keli žibalo lašai (4.2) užlašinami ant šaldymo bloko vidurio. Ant jo išvyniojamas gelis (gelio nešiklio puse žemyn), saugant, kad nesusidarytų oro burbuliukų. Žibalo perteklius nuvalomas ir nuimamas dengiamasis lapas. Elektrodo juostelės suvilgomos anodo ir katodo tirpalais (4.3, 4.4), juostelės atpjaunamos pagal gelio ilgį ir dedamos į numatytas vietas (atstumas tarp elektrodų 9,5 cm).

Izoelektrinio fokusavimo sąlygos:

6.3.1. Gelio matmenys 265 × 125 × 0,25 mm

Veiksmas Trukmė (min.) Įtampa (V) Srovė (mA) Galia (W) Voltvalandės (Vh) 1. Parengiamasis fokusavimas 30 maks. 2 500 maks. 15 pastovi 4 apie 300 2. Mėginio fokusavimas (7) 60 maks. 2 500 maks. 15 pastovi 4 apie 1 000 3. Galutinis fokusavimas 60 maks. 2 500 maks. 5 maks. 20 apie 3 000 40 maks. 2 500 maks. 6 maks. 20 apie 3 000 30 maks. 2 500 maks. 7 maks. 25 apie 3 000

Pastaba. Jei keičiamas gelių storis arba plotis, reikia tinkamai pakoreguoti srovės ir galios reikšmes (pvz., jei naudojamas 265 × 125 × 0,5 mm matmenų gelis, elektros srovės ir galios vertės dvigubinamos).

6.3.2. Automatinio elektroforezės įtaiso įtampos programos pavyzdys (2 geliai, kurių dydžiai 5,0 × 4,5 cm), elektrodai be juostų dedami tiesiai ant gelio.

Veiksmas Įtampa Srovė Galia Temp. Voltvalandės 1. Parengiamasis fokusavimas 1 000 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 85 Vh 2. Mėginio fokusavimas 250 V 5,0 mA 2,5 W 8 °C 30 Vh 3. Fokusavimas 1 200 V 10,0 mA 3,5 W 8 °C 80 Vh 4. Fokusavimas 1 500 V 5,0 mA 7,0 W 8 °C 570 Vh

Atliekant 2 veiksmąį, mėginio aplikatorius uždedamas esant 0 Vh.

Atliekant 2 veiksmą, mėginio aplikatorius nuimamas esant 30 Vh.

6.4. Baltymų dažymas

6.4.1. Baltymų fiksavimas

Išjungus elektros srovę, elektrodo juostelės tuoj pat nuimamos ir gelis greitai įdedamas į dažymo / blukinimo indą, į kurį įpilta 200 ml fiksatyvo (4.9); laikoma 15 min., nuolat purtant.

6.4.2. Gelio plokštelės plovimas ir dažymas

Fiksavimo tirpalas gerai nusausinamas ir gelio plokštelė plaunama du kartus kiekvieną kartą po 30 sekundžių su 100 ml blukinimo tirpalo (4.10). Blukinimo tirpalas išpilamas ir į indą pripilama 250 ml dažymo tirpalo (4.11.3); dažoma 45 min., švelniai pakratant.

6.4.3. Gelio plokštelės blukinimas

Dažymo tirpalas išpilamas, gelio plokštelė plaunama du kartus, kiekvieną kartą sunaudojant po 100 ml blukinimo tirpalo (4.10), paskui gelio plokštelė 15 min. purtoma su 200 ml blukinimo tirpalo; ši procedūra kartojama mažiausiai du tris kartus tol, kol pagrindas tampa švarus ir bespalvis. Po to plokštelė nuplaunama distiliuotu vandeniu (du kartus po 2 min.) ir džiovinama ore (2–3 val.) arba plaukų džiovintuvu (10–15 min.).

1 pastaba. Fiksuojama, plaunama, dažoma ir blukinama 20 °C temperatūroje. Aukštesnėje temperatūroje nedirbama.

2 pastaba. Jeigu naudojamas jautresnis dažymo tirpalas (pvz., Siver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code No.17-1150-01), plazminu apdoroti kazeino mėginiai turi būti atskiesti iki 5 mg/ml.

7. VERTINIMAS

Vertinama lyginant nežinimo mėginio ir pamatinio etalono baltymų elektroforegramas tame pačiame gelyje. Sūriuose iš avių, ožkų ir buivolių pieno ir iš avių, buivolių ir ožkų pieno mišinių esantis karvių pienas aptinkamas pagal γ3 ir γ2 kazeinus, kurių izoelektrinis taškas yra intervale nuo pH 6,5 iki pH 7,5 (4 a, b paveikslai ir 5 paveikslas). Aptikimo riba yra mažesnė kaip 0,5 %.

7.1. Vizualinis įvertinimas

Vizualiai įvertinant karvių pieno kiekį rekomenduojama pasirinkti tokias mėginių ir etaloninių tirpalų koncentracijas, kad avių, ožkų ir (arba) buivolių γ2 ir γ3 kazeinų frakcijų išsidėstymo juostelės būtų vienodo intensyvumo (žr. „γ2 E,G,B“ ir „γ3 E,G,B“ 4 a, b pav. ir 5 pav.). Tada karvių pieno kiekį (mažesnį ar didesnį už 1 % arba lygų 1 %) nežinomame mėginyje galima nustatyti iš karto, palyginant karvių pieno γ3 ir γ2 kazeinų juostelių intensyvumą (žr. „γ3 C“ ir „γ2 C“ 4 a, b pav. ir 5 pav.) su tų pačių kazeinų intensyvumu pamatiniuose etalonuose (avių, ožkų pieno) arba laikinuosiuose laboratoriniuose etaloniniuose tirpaluose (buivolių pieno), kuriuose yra 0 % ir 1 % karvių pieno.

7.2. Densitometrinis įvertinimas

Karvių pieno γ2 ir γ3 kazeinų smailės ploto santykį su ožkų, avių ir (arba) buivolių pieno γ2 ir γ3 kazeinų smailių plotais galima nustatyti densitometrijos būdu (5.19) (žr. 5 pav.). Gauta vertė palyginama su 1 % pamatiniu etalonu (ožkų, avių pieno) arba laikinuoju laboratoriniu etaloniniu tirpalu (buivolių pieno), analizuotų ant to paties gelio, γ2 ir γ3 kazeinų smailių ploto santykiu.

Pastaba. Šis metodas yra pakankamai tikslus, jeigu karvių pieno γ2 ir γ3 kazeinų signalas yra aiškiai teigiamas matavimą atliekant su 1 % pamatiniu etalonu, bet toks nėra matuojant su 0 % pamatiniu etalonu. Jei taip nėra, procedūra optimizuojama tiksliai laikantis metodo nurodymų.

Vertinama, kad mėginyje karvių pieno yra, jeigu abiejų karvių pieno γ2 ir γ3 kazeinų frakcijų juostelių intensyvumas arba atitinkami smailių plotų santykiai yra lygūs1 % pamatinio etalono vertei arba už ją didesni.

8. NUORODOS

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carrier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

1 paveikslas

Scheminis dengiamojo lapo vaizdas

2 paveikslas

Kazeino sluoksnis, kuris plūduriuoja tarp vandeninės ir organinės fazių po centrifugavimo

3 paveikslas

Labai plono poliakrilamido gelio sluoksnio liejimo prispaudimu būdas

a – tarpiklio juostelė (0,25 mm); b – dengiamasis lapas (5.3); c, e – stiklinės plokštelės (5.1); d – gelio tirpalas (4.1.2); f – gelio nešiklio lapas (5.2)

4a paveikslas

Plazminu apdorotų kazeinų, gautų iš avių ir ožkų pieno sūrių, kuriuose yra skirtingas karvių pieno kiekis, izoelektrinis fokusavimas

% CM – procentinis karvių pieno kiekis, C – karvių pienas, E – avių pienas, G – ožkų pienas

Pavaizduota viršutinė IEF gelio dalis.

4b paveikslas

Plazminu apdorotų kazeinų, gautų iš sūrių, pagamintų iš avių, ožkų ir buivolių pieno mišinių, kuriuose yra skirtingas karvių pieno kiekis, izoelektrinis fokusavimas

% CM – procentinis karvių pieno kiekis, 1+ – mėginys, kuriame yra 1 % karvių pieno ir kuris frakcijos juostelės viduryje pažymėtas grynu karvių kazeinu. C – karvių pienas, E – avių pienas, G – ožkų pienas, B – buivolių pienas.

Pavaizduotas visas atskyrimo ant IEF gelio atstumas.

5 paveikslas

Etaloninių tirpalų ir sūrio, pagaminto iš avių ir ožkų pieno mišinio, mėginių densitogramų po izoelektrinio fokusavimo sanklota

a, b – etaloniniai tirpalai, kuriuose yra 0 ir 1 % karvių pieno; c–g – sūrio mėginiai, kuriuose yra 0, 1, 2, 3 ir 7 % karvių pieno;, C – karvių pienas, E – avių pienas; G – ožkų pienas.

Viršutinė IEF gelio dalis buvo skenuojama esant λ = 634 nm bangos ilgiui.