19)

C dalis papildoma šiais skyriais: „C.47 Toksiškumo ankstyvųjų gyvenimo stadijų žuvims bandymas ĮVADAS 1. Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 210 (2013). Bandymų, naudojant ankstyvųjų gyvenimo stadijų žuvis, tikslas – nustatyti cheminių medžiagų letalų ir subletalų poveikį bandytų stadijų ir bandytų rūšių žuvims. Jie suteikia vertingos informacijos, pagal kurią galima įvertinti cheminės medžiagos lėtinį letalų ir subletalų poveikį kitų rūšių žuvims. 2. Bandymų gairės 210 yra pagrįstos Jungtinės Karalystės pasiūlymu, aptartu EBPO ekspertų susitikime, sušauktame Medmenhame (Jungtinė Karalystė) 1988 m. lapkričio mėn., ir atnaujintu 2013 m., atsižvelgiant į bandymo taikymo patirtį ir į rekomendacijas, pateiktas 2010 m. rugsėjo mėn. vykusiame EBPO seminare dėl toksiškumo žuvims bandymų (1). BANDYMO PRINCIPAS 3. Ankstyvųjų gyvenimo stadijų žuvys veikiamos vandenyje ištirpinta kelių koncentracijos verčių bandomąja chemine medžiaga. Pirmenybė teikiama dinaminėms sąlygoms, tačiau, jei jų neįmanoma įgyvendinti, priimtinos pusiau statinės sąlygos. Išsamesnės informacijos reikėtų ieškoti EBPO rekomendaciniame dokumente apie probleminių cheminių medžiagų ir mišinių toksiškumo vandens organizmams bandymus (2). Bandymo pradžioje apvaisinti ikrai dedami į bandymų kameras ir bandymas tęsiamas rūšiai būdingą laikotarpį, kuris yra būtinas kontrolinių ėminių žuvims pasiekti mailiaus stadiją. Letalus ir subletalus poveikis vertinamas ir lyginamas su kontrolinėmis vertėmis siekiant nustatyti mažiausiai stebimo poveikio koncentraciją (LOEC) tam, kad būtų galima nustatyti i) nestebimo poveikio koncentraciją (NOEC) ir (arba) ii) ECx (pvz., EC10, EC20) pritaikant regresijos modelį, norint įvertinti koncentraciją, kuri sukelia matuojamo poveikio x % pokytį. Ataskaitoje pateikiamos poveikio koncentracijos vertės ir parametrai gali priklausyti nuo reglamentavimo sistemos. Reikėtų, kad bandymų koncentracijos vertės aprėptų ECx, tam, kad ECx būtų apskaičiuojama interpoliavimo, o ne ekstrapoliavimo būdu (apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje). INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ 4. Bandomoji cheminė medžiaga reiškia tai, kas yra bandoma. Turėtų būti žinomas bandomosios cheminės medžiagos tirpumas vandenyje (žr. šio priedo A.6 skyrių) ir garų slėgis (žr. šio priedo A.4 skyrių), be to, reikėtų turėti patikimą analizės metodą medžiagos kiekiui bandymo tirpaluose nustatyti, kurio tikslumas ir kiekybinio nustatymo riba būtų žinomi ir pateikiami ataskaitoje. Nors ūmaus toksiškumo bandymas nėra būtinas, jo rezultatai (žr. šio priedo skyrių C.1 ar C.49), pageidautina gauti būtent šiam bandymui pasirinktoms rūšims, galėtų suteikti naudingos informacijos. 5. Jei šiuo metodu bandomas mišinys, jis turėtų būti kuo išsamiau apibūdintas, pvz., nurodant jo sudedamųjų dalių cheminius pavadinimus, jų kiekius ir toms cheminėms medžiagoms būdingas savybes (tokias kaip nurodytos pirmiau). Prieš taikant bandymų metodą mišiniui reglamentavimo tikslais, reikėtų atsižvelgti į tai, ar jį atlikus bus galima gauti reglamentavimo tikslu priimtinus rezultatus. 6. Naudingą informaciją sudaro struktūrinė formulė, cheminės medžiagos grynumas, tirpumas vandenyje, stabilumas vandenyje ir veikiant šviesai, pKa, Pow ir lengvo biologinio skaidumo bandymo rezultatai (pvz., šio priedo C.4 ar C.29 skyriai). BANDYMO TINKAMUMAS 7. Taikomos šios bandymo tinkamumo sąlygos: — ištirpusio deguonies koncentracija turi būti > 60 % oro prisotinimo vertės per visą poveikio laikotarpį; — kiekvienu bandymo momentu vandens temperatūra bandymo kamerose ar kiekvieną bandymų parą neturėtų skirtis daugiau kaip ± 1,5 °C ir turėtų atitikti bandymų rūšiai nurodytą temperatūros intervalą (2 priedėlis); — privalomas bandymo koncentracijos verčių analizės matas; — bendras apvaisintų ikrų ir išsiritusių lervų išgyvenamumas kontroliniuose ir, jei reikia, tirpiklio kontroliniuose induose turėtų būti lygus arba didesnis nei 2 priedėlyje nurodytos ribos; 8. Jei stebimas nedidelis nukrypimas nuo bandymo tinkamumo kriterijų, į padarinius reikėtų atsižvelgti įvertinant bandymo duomenų patikimumą ir šie aspektai turėtų būti įtraukti į ataskaitą. Ataskaitoje turėtų būti pateiktas poveikis išgyvenamumui, išsiritimui ar augimui tirpiklio kontroliniame ėminyje, palyginti su neigiamu kontroliniu ėminiu, ir jį reikėtų aptarti vertinant bandymų duomenų patikimumą. METODO APRAŠYMAS Bandymų kameros 9. Galima naudoti stiklo, nerūdijančiojo plieno ar kitos chemiškai inertinės medžiagos kameras. Kadangi yra žinoma, kad polisiloksanas pasižymi didele geba absorbuoti lipofilines medžiagas, reikėtų kiek įmanoma riboti polisiloksano vamzdelių naudojimą atliekant dinaminius tyrimus ir polisiloksano sandariklių naudojimą sąlyčio su vandeniu vietose, pvz., naudojant vientisus stiklinius akvariumus. Indų matmenys turėtų būti pakankamai dideli, tam, kad būtų galima užtikrinti tinkamas augimo sąlygas, išlaikant ištirpusio deguonies koncentraciją kontrolinių ėminių induose (pvz., mažų žuvų rūšims pakaktų 7 l indo talpos šioms sąlygoms užtikrinti) ir atitikti įkrovos dydžio kriterijus, nurodytus 19 pastraipoje. Bandymo kameras pageidautina išdėstyti bandymo plote atsitiktinai. Palyginti su visiško atsitiktinio išdėstymo schema, geriau rinktis atsitiktinai išdėstytų blokų schemą, pagal kurią kiekviename bloke yra kiekvienos dozės ėminys. Bandymo kameros turėtų būti apsaugotos nuo nepageidaujamų trikdžių. Prieš dedant bandymų organizmus, bandymų sistemą pageidautina pakankamai ilgai kondicionuoti esant naudojamoms bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertėms, kad būtų įrodytas koncentracijos stabilumas veikimo sąlygomis. Rūšių parinkimas 10. Rekomenduotos žuvų rūšys nurodytos 1 lentelėje. Tai netrukdo naudoti kitas rūšis, tačiau tinkamoms bandymo sąlygoms užtikrinti gali tekti keisti bandymų procedūrą. Šiuo atveju ataskaitoje reikėtų pagrįsti rūšies pasirinkimą ir bandymo metodą. Veislinių žuvų laikymas 11. Išsamius duomenis apie veislinių žuvų laikymą patenkinamomis sąlygomis galima rasti 3 priedėlyje ir nuorodose (3) (4) (5). Apvaisintų ikrų, embrionų ir lervų veikimas bandomąją medžiaga 12. Iš pradžių apvaisinti ikrai, embrionai ir lervos gali būti veikiami į pagrindinę kamerą įdėtuose mažesniuose stikliniuose ar nerūdijančiojo plieno induose, kurių šoninės ar galinės sienelės pakeistos tinklu, kad bandymo tirpalas galėtų tekėti per indą. Per mažus indus tekantį srautą be sūkurių galima gauti indus pakabinant ant svirties, kuri juos pakeltų ir nuleistų taip, kad visą laiką organizmai būtų po vandeniu. Apvaisintus lašišinių žuvų ikrus galima laikyti ant padėklų ar tinklų su pakankamai didelėmis angomis, kad išsiritusios lervos galėtų per jas iškristi. 13. Jei ikrų talpyklos, grotelės ar tinkleliai buvo naudojami ikrams pagrindiniame bandymų inde laikyti, išsiritus lervoms šias sulaikymo priemones reikėtų pašalinti pagal 3 priedėlio rekomendacijas, tačiau reikia palikti tinklelius, kad lervos negalėtų ištrūkti. Jei lervas reikia pernešti, jų neturėtų veikti oras, o lervoms iš ikrų talpyklų išleisti neturėtų būti naudojami tinklai. Šio pernešimo laikas įvairioms rūšims skirtingas ir jis turėtų būti nurodytas ataskaitoje. Tačiau ne visuomet pernešti yra būtina. Vanduo 14. Kaip bandymo vandenį galima naudoti bet kokį vandenį, kuriame bandymo rūšis galėtų ilgai gyventi ir augti (žr. 4 priedėlį). Jo kokybė turėtų būti pastovi visą bandymo trukmę. Siekiant užtikrinti, kad skiedimo vanduo neturėtų per daug įtakos bandymo rezultatui (pvz., sudarydamas kompleksus su bandomąja medžiaga) ar nedarytų neigiamo poveikio neršiančių žuvų elgesiui, kartkarčiais reikėtų imti vandens ėminius ir juos analizuoti. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl–, SO4 2-), amoniako, bendro liekamųjų chloro pesticidų kiekio, bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizę reikėtų atlikti, pvz., du kartus per metus, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei žinoma, kad vandens kokybė nėra pastovi, jos matavimus reikia atlikti dažniau; dažnumas priklauso nuo kokybės kintamumo. Kai kurios skiedimui tinkamo vandens charakteristikos yra pateiktos 4 priedėlyje. Bandymo tirpalai 15. Atliekant dinaminius bandymus reikia turėti sistemą, kuri visą laiką dozuotų ir skiestų bandomosios cheminės medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozuojamąjį siurblį, proporcingojo skiedimo sistemą, sotintuvo sistemą), kad į bandymo kameras būtų galima tiekti kelių bandymo koncentracijos verčių tirpalus. Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautą reikėtų tikrinti tam tikrais laiko tarpais ir per visą bandymą jis neturėtų kisti daugiau kaip 10 %. Nustatyta, kad tinkamas srautas – toks, kuris atitinka bent penkis bandymo kameros tūrius per 24 h (3). Tačiau jei laikomasi 19 pastraipoje nurodyto įkrovos dydžio, galimas mažesnis srautas, pvz., 2–3 bandymų kameros tūriai, kad maistas nebūtų šalinamas per greitai. 16. Pasirinktos koncentracijos bandymo tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinį tirpalą geriau ruošti tiesiog maišant ar plakant bandomąją cheminę medžiagą skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ir (arba) ultragarsu). Gana koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles) ar pasyvaus dozavimo metodus (6). Nerekomenduojama naudoti tirpiklinio nešiklio. Tačiau jei tirpiklis yra būtinas, lygiagrečiai reikėtų bandyti kontrolinį tirpiklio ėminį, kurio koncentracija atitiktų ėminių su chemine medžiaga tirpiklio koncentraciją; t. y. tirpiklio kiekis turėtų būti vienodas visų koncentracijų tirpaluose, taip pat ir kontroliniame ėminyje. Naudojant kai kurias skiedimo sistemas, tai galėtų būti techniškai sunku įgyvendinti; šiuo atveju tirpiklio koncentracija jo kontroliniame ėminyje turėtų būti lygi didžiausiai tirpiklio koncentracijai apdorotos grupės ėminyje. Informacijos apie sunkiai bandomas chemines medžiagas reikėtų ieškoti EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 23 apie sunkiai apdorojamų cheminių medžiagų ir mišinių toksiškumo vandens organizmams bandymus (2). Jei naudojamas tirpiklis, jo pasirinkimą lems medžiagos cheminės savybės. EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 23 rekomenduojama ne didesnė kaip 100 μl/l koncentracija. Siekiant išvengti galimo tirpiklio poveikio išmatuotoms vertinamosioms baigtims (7), rekomenduojama naudoti kuo mažesnę tirpiklio koncentraciją. 17. Pusiau statinio bandymo atveju galima taikyti dvi skirtingas atnaujinimo procedūras. Nauji bandymo tirpalai ruošiami švariuose induose ir į juos atsargiai pernešami išgyvenę ikrai ir lervos arba bandymo organizmai paliekami bandymo induose, bet dalis (ne mažiau kaip du trečdaliai) bandymo tirpalo ir kontrolinio ėminio tūrio pakeičiama. PROCEDŪRA Veikimo sąlygos Trukmė 18. Bandymą reikėtų pradėti kuo greičiau po ikrų apvaisinimo, pageidautina, kad jie būtų panardinti į bandymo tirpalus prieš blastodisko dalijimosi pradžią arba kuo arčiau šios stadijos pradžios. Bandymo trukmė priklauso nuo naudotos rūšies. Kai kurios rekomenduojamos trukmės vertės pateiktos 2 priedėlyje. Įkrova 19. Bandymo pradžioje turimų apvaisintų ikrų skaičiaus turėtų pakakti, kad būtų užtikrinta atitiktis statistikos reikalavimams. Jie turėtų būti atsitiktinai paskirstyti tarp apdorotų ėminių ir vienai koncentracijai turėtų tekti ne mažiau kaip 80 ikrų, vienodai padalytų tarp ne mažiau kaip keturių kartotinių ėminių bandymo kamerų. Įkrovos dydis (biomasės kiekis bandymo tirpalo tūriui) turėtų būti pakankamai mažas, kad ikrų ir lervų stadijų metu be aeravimo būtų galima užtikrinti ištirpusio deguonies koncentraciją ne mažesnę kaip 60 % prisotinto oro prisotinimo vertės. Atliekant dinaminius bandymus, rekomenduojama, kad drėgnų ikrų masės įkrova per 24 h būtų ne didesnė kaip 0,5 g/l ir bet kuriuo momentu ne didesnė kaip 5 g/l tirpalo (3). Šviesa ir temperatūra 20. Šviesiojo laikotarpio trukmė ir vandens temperatūra turėtų būti tinkama bandymo rūšiai (žr. 2priedėlį). Maitinimas 21. Maistas ir maitinimas yra kritiniai veiksniai, todėl yra svarbu, kad nuo reikiamo momento, atsižvelgiant į kiekvieną gyvenimo stadiją, būtų duodamas tinkamas maistas ir jo kiekio turėtų pakakti normaliam augimui užtikrinti. Maitinimas turėtų būti maždaug vienodas visuose kartotinių ėminių induose, nebent būtų koreguojama atsižvelgiant į gaištamumą. Maisto perteklių ir išmatas prireikus reikėtų pašalinti, kad nesikauptų atliekos. Maitinimo režimai išsamiai aprašyti 3 priedėlyje, bet įgijus patirties, maistas ir maitinimo režimai nuolat tobulinami, kad būtų pagerintas išgyvenamumas ir optimizuotas augimas. Gyvas maistas pagerina aplinką, todėl turėtų būti naudojamas vietoj sauso ar šaldyto maisto arba jį papildyti, jei tai tinka atsižvelgiant į rūšį ir gyvenimo stadiją. Bandymo koncentracijos vertės 22. Paprastai reikia naudoti ne mažiau kaip penkias bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertes, kurių skirtumo pastovus faktorius būtų ne didesnis kaip 3,2, ir keturis kartotinius vienos koncentracijos ėminius. Nustatant bandymų koncentracijos verčių intervalą, reikėtų atsižvelgti į ūmaus toksiškumo bandymų, jei yra, pageidautina naudojant tą pačią rūšį, ir (arba) intervalo nustatymo bandymo informaciją (1). Tačiau nustatant bandymų koncentracijos verčių intervalą reikėtų atsižvelgti į visus informacijos šaltinius, įskaitant, pvz., kryžmines nuorodas, žuvų embrionų ūmaus toksiškumo duomenis. Jei reikia nustatyti tik empirines NOEC vertes, ribinis bandymas arba išplėstinis ribinis bandymas naudojant mažiau kaip penkias koncentracijos vertes gali būti priimtini kaip galutiniai bandymai. Reikėtų pagrįsti mažesnio nei penkių koncentracijos verčių skaičiaus naudojimą. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos verčių, didesnių kaip 96 h LC50 ar 10 mg/l, jei ši mažesnė, bandyti nebūtina. Kontroliniai ėminiai 23. Be bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos verčių serijos reikėtų bandyti tik skiedimo vandens kontrolinius ėminius ir, jei reikia, tirpiklio kontrolinius ėminius su tirpikliniu nešikliu (žr. 16 pastraipą). Analizinių nustatymų ir matavimų dažnumas 24. Prieš pradedant veikimo laikotarpį, reikėtų patikrinti, ar cheminės medžiagos tiekimo į visus kartotinius ėminius sistema tinkamai veikia (pvz., matuojant bandymų koncentracijos vertes). Reikėtų nustatyti reikiamus analizės metodus, įskaitant reikiamą kiekybinio nustatymo ribą (LOQ) ir pakankamus duomenis apie cheminės medžiagos stabilumą bandymų sistemoje. Atliekant bandymą bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertės nustatomos reguliariais laiko tarpais, kad būtų galima apibūdinti veikimą ja. Koncentracija turi būti nustatoma ne mažiau kaip penkis kartus. Naudojant dinamines sistemas, kiekvienos koncentracijos bandomosios cheminės medžiagos vieno kartotinio ėminio analizė turėtų būti atliekama bent kartą per savaitę, sistemingai pasirenkant kitus kartotinius ėminius. Papildomi analiziniai matavimai dažnai pagerintų bandymų rezultatų kokybę. Siekiant užtikrinti tikrojo tirpalo cheminę analizę, ėminius gali tekti filtruoti (pvz., per 0,45 μm akučių filtrą) arba centrifuguoti, kad būtų pašalintos visos kietosios dalelės. Prieš naudojant, filtrus reikėtų prisotinti, kad būtų mažesnė bandomosios cheminės medžiagos adsorbcija. Kai išmatuotos koncentracijos vertės nepatenka į 80–120 % nominalios koncentracijos intervalą, reikėtų nustatyti poveikio koncentracijos vertes ir dinaminių bandymų atveju jas išreikšti koncentracijos aritmetinio vidurkio atžvilgiu (žr. C.20 bandymų metodo 6 priedėlį dėl aritmetinio vidurkio skaičiavimo (8)), o pusiau statinių bandymų – išmatuotų koncentracijų geometrinio vidurkio atžvilgiu (žr. EBPO rekomendacinio dokumento Nr. 23 apie sunkiai apdorojamų cheminių medžiagų ir mišinių toksiškumo vandens organizmams bandymus (2) 5 skyrių). 25. Ištirpusio deguonies koncentraciją, pH ir temperatūrą reikėtų matuoti visuose induose bent kartą per savaitę visą bandymo trukmę, o druskingumą ir kietumą, jei reikia, – bandymo pradžioje ir pabaigoje. Bent viename bandymų inde temperatūrą reikėtų kontroliuoti nuolat. Stebėjimai 26. Embrioninio vystymosi stadija : prieš veikimo bandomąja chemine medžiaga pradžią reikėtų kuo tiksliau patikrinti embrioninio vystymosi stadiją. Tai galima padaryti naudojant tinkamai konservuotų ir nuvalytų ikrų reprezentatyvų ėminį. 27. Išsiritimas ir išgyvenamumas : išsiritimą ir išgyvenamumą reikėtų stebėti bent kartą kasdien, o gautus skaičius registruoti. Jei ankstyvoje embriono vystymosi stadijoje (pvz., pirmąją ar antrąją bandymo parą) ant ikrų pastebimas grybelis, tuos ikrus reikėtų suskaičiuoti ir pašalinti. Negyvus embrionus, lervas ir mailių reikėtų pašalinti iš karto, kai tik pastebimi, nes jie greitai suyra ir gali būti sudraskyti kitų žuvų. Negyvus individus reikėtų šalinti ypač atsargiai, kad nebūtų fiziškai sužaloti šalia esantys ikrai ir (arba) lervos. Žūties požymiai skiriasi atsižvelgiant į rūšį ir gyvenimo stadiją. Pavyzdžiui: — apvaisintų ikrų: ypač ankstyvosiomis stadijomis stipriai sumažėja permatomumas ir pakinta spalva dėl baltymo koaguliacijos ir (arba) nusėdimo, todėl atsiranda baltas matinis atspalvis; — embrionų, lervų ir mailiaus: nejudrumas ir (arba) kvėpavimo judesių, ir (arba) širdies plakimo nebuvimas ir (arba) reakcijos į mechaninius dirgiklius nebuvimas. 28. Nenormali išvaizda : kūno formos anomalijų turinčių lervų arba mailiaus skaičių reikėtų registruoti atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę, ir aprašyti anomalijų požymius. Reikėtų pažymėti, kad nenormalios lervos ir mailius pasitaiko natūraliai ir kai kurių rūšių gali būti kelių kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) procentų eilės. Jei laikoma, kad išsigimimo požymiai ir susijęs nenormalus elgesys yra toks ryškus, kad organizmas patiria dideles kančias ir nėra galimybės atsigauti, jis gali būti pašalintas iš bandymo. Tokius gyvūnus reikėtų numarinti ir vėliau atliekant duomenų analizę priskirti prie nugaišusių. Daugumos šiam bandymų metodui rekomenduotų rūšių normalus embrioninis vystymasis yra aprašytas (9) (10) (11) (12). 29. Nenormalus elgesys : anomalijas, pvz., hiperventiliaciją, nekoordinuotą plaukimą, netipišką nejudrumą ir elgesį maitinant reikėtų registruoti atitinkamais laiko tarpais, atsižvelgiant į bandymo trukmę (pvz., šiltųjų vandenų žuvų – kartą per parą). Nors šie reiškiniai yra sunkiai kiekybiškai įvertinami, kartą pastebėti jie gali padėti aiškinti gaištamumo duomenis. 30. Masė : pasibaigus bandymui, reikėtų pasverti visas išgyvenusias žuvis bent kartotinio ėminio (ataskaitoje pateikiant kartotinio ėminio gyvūnų skaičių ir vieno gyvūno vidutinę masę); pageidautina nurodyti drėgno kūno (nušluostyto filtravimo popieriumi) masę, tačiau ataskaitoje galima pateikti sauso kūno masės duomenis (13). 31. Ilgis : pasibaigus bandymui matuojamas atskirų žuvų ilgis. Rekomenduojama matuoti visą ilgį, tačiau jei supuvo uodegos pelekas ar jis yra išėstas, galima matuoti standartinį ilgį. Visas vieno bandymo žuvis reikėtų matuoti tuo pačiu būdu. Atskirų žuvų ilgį galima matuoti, pvz., slankmačiu, skaitmeniniu fotoaparatu arba kalibruotu okuliaro mikrometru. Tipinis mažiausias ilgis nurodytas 2 priedėlyje. DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS Rezultatų apdorojimas 32. Rekomenduojama, kad bandymo schema ir pasirinktas statistinis kriterijus užtikrintų pakankamą galią (80 % ar didesnę) vertinamųjų baigčių biologinės svarbos pokyčiams aptikti, jei ataskaitoje reikia pateikti NOEC. Ataskaitoje pateikiamos poveikio koncentracijos vertės ir parametrai gali priklausyti nuo reglamentavimo sistemos. Jei ataskaitoje reikia pateikti ECx, bandymo schema ir pasirinktas regresijos modelis turėtų užtikrinti galimybę gauti tokį ECx įvertį, kad i) ataskaitoje pateiktame ECx 95 % pasikliovimo intervale nebūtų nulio ir jis nebūtų per platus, ii) prognozuojamo ECx vidurkio pasikliovimo intervale nebūtų kontrolinio ėminio vidurkio ir iii) nebūtų reikšmingo regresijos modelio nesuderinamumo su duomenimis. Pagal kiekvieną iš metodų reikia nustatyti kiekvienos vertinamosios baigties, kurią svarbu aptikti ar įvertinti, procentinį pokytį. Bandymo schema turėtų būti pritaikyta tokiai galimybei užtikrinti. Kai pirmiau nurodytos ECx nustatymo sąlygos neįvykdytos, reikėtų taikyti NOEC metodą. Maža tikimybė, kad toks pats procentinis pokytis tiktų visoms vertinamosioms baigtims, taip pat mažai tikėtina, kad galima sukurti įgyvendinamą bandymą, kuris atitiktų šiuos kriterijus visoms vertinamosioms baigtims, todėl kuriant tinkamą bandymo schemą yra svarbu sutelkti dėmesį į jam svarbias vertinamąsias baigtis. 5 ir 6 priedėliuose pateiktos statistinės struktūrinės diagramos bei kiekvieno metodo rekomendacijos, kurios padėtų apdoroti duomenis ir pasirinkti tinkamiausią statistinį kriterijų ar modelį. Galima taikyti kitus statistinius metodus, jei jie yra moksliškai pagrįsti. 33. Reikės analizuoti kiekvieno kartotinių ėminių rinkinio kitimus atliekant dispersinės analizės ar faktorinės analizės lentelės procedūras ir šia analize pagrįstus reikiamus statistinės analizės metodus. Rekomenduojamas daugybinio palyginimo mažėjimo tvarka Jonckheere-Terpstra ar Williams kriterijus, kad būtų galima palyginti atskirų koncentracijų ir kontrolinių ėminių rezultatus, jei atsakas yra tolydusis, ir lyginimo mažėjimo tvarka Cochran-Armitage kriterijus, jei atsakai yra dvireikšmiai ir atitinka monotonišką koncentracijos bei atsako priklausomybę, nesant didesnės nei binominio skirstinio dispersijos įrodymų (14). Kai yra didesnės nei binominio skirstinio dispersijos įrodymų, rekomenduojama Cochran-Armitage kriterijaus Rao-Scott modifikacija (15) (16) arba Williams ar Dunnett (po kvadratinės šaknies arksinuso transformacijos) ar Jonckheere-Terpstra kriterijus, taikomas kartotinių ėminių dalims. Jei duomenys neatitinka monotoniškos koncentracijos ir atsako priklausomybės, gali būti naudingas Dunnett ar Dunn arba Mann-Whitney metodas, jei atsakai tolydieji, ir Fisher tikslusis kriterijus, jei atsakai dvireikšmiai (14) (17) (18). Taikant statistinį metodą ar modelį, reikėtų imtis priemonių užtikrinti, kad būtų atitiktis metodo ar modelio reikalavimams (pvz., bandymo schemoje ir naudojant kriterijų ar modelį turi būti atsižvelgta į įvertintą kintamumą tarp kamerų). Reikėtų įvertinti duomenų normalumą, o 5 priedėlyje nurodyta, ką reikėtų daryti su ANOVA liekanomis. 6 priedėlyje aptariami papildomi regresijos metodo taikymo aspektai. Reikėtų atsižvelgti į transformacijas, kad būtų įvykdyti statistinio kriterijaus reikalavimai. Tačiau transformacijas regresijos modeliui priderinti reikia daryti atsargiai, pvz., žinant, kad 25 % netransformuoto atsako pokytis neatitinka 25 % transformuoto atsako pokyčio. Tiek hipotezės tikrinimo kriterijuose, tiek regresijos modelyje reikėtų atsižvelgti į tai, kad, atliekant visas analizes, analizės ir bandymų vienetas yra bandymo kamera, o ne atskira žuvis (3) (14) (19) (20). Bandymo ataskaita 34. Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija: Bandomoji cheminė medžiaga: Vienakomponentė cheminė medžiaga: — fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizinės ir cheminės savybės; — cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, priemaišų cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt. (įskaitant organinės anglies kiekį, jei jos yra). Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai: — kuo išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, nurodant cheminio identifikavimo duomenis (žr. pirmiau), kiekybinį paplitimą ir būdingas fizikines ir chemines savybes. Bandymo gyvūnų rūšys: — mokslinis pavadinimas, veislė, šaltinis, apvaisintų ikrų surinkimo metodas ir vėlesnis tvarkymas. Bandymo sąlygos: — taikyta bandymų procedūra (pusiau statinis ar dinaminis, įkrova), — šviesiojo laikotarpio trukmė (-ės); — bandymų schema (pvz., bandymų kamerų ir kartotinių ėminių skaičius, vieno kartotinio ėminio ikrų skaičius, bandymų kameros medžiaga ir matmenys (aukštis, plotis, tūris), vienos kameros vandens tūris); — pradinių tirpalų paruošimo metodas ir atnaujinimo dažnumas (reikėtų nurodyti tirpumo agentą, jei naudojamas, ir jo koncentraciją); — bandomosios cheminės medžiagos dozavimo metodas (pvz., siurbliai, skiedimo sistemos); — metodo atgavimo efektyvumas ir nominalios bandymų koncentracijos vertės, kiekybinio nustatymo riba, išmatuotų verčių vidurkiai bandymo indui ir jų standartiniai nuokrypiai, šių verčių gavimo metodas ir įrodymas, kad matavimai susiję su bandomosios cheminės medžiagos tikrojo tirpalo koncentracija; — skiedimo vandens charakteristikos: pH, kietumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro koncentracija (jei matuojama), bendroji organinė anglis (jei matuojama), suspenduotos kietosios dalelės (jei matuojamos), bandymo terpės druskingumas (jei matuojamas) ir visi kiti atlikti matavimai, — bandymų indų vandens kokybė, pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija; — išsami informacija apie maitinimą (pvz., maisto rūšis (-ys), šaltinis, duodamas kiekis ir maitinimo dažnumas). Šių vertinamųjų baigčių rezultatai, kurie ataskaitoje pateikiami atskirai (arba kaip kartotinių ėminių rezultatai), jų vidurkis ir variacijos koeficientas, jei reikia: — įrodymai, kad kontroliniai ėminiai atitinka bandymų rūšies išgyvenamumo priimtinumo standartą (2 priedėlis); — gaištamumo kiekvienoje stadijoje (embrionas, lervos ir mailius) ir bendri gaištamumo duomenys; — paros iki išsiritimo, kiekvieną parą išsiritusių lervų skaičius ir išsiritimo pabaiga; — sveikų žuvų skaičius bandymo pabaigoje; — išgyvenusių gyvūnų ilgio (nurodyti standartinio ar viso) ir masės duomenys; — morfologinių anomalijų, jei yra, dažnumas, aprašymas ir skaičius; — neįprasto elgesio reiškinių, jei pasireiškė, dažnumas, aprašymas ir skaičius; — statistinės analizės metodas (regresinė analizė ar dispersinė analizė) ir duomenų apdorojimas (taikytas statistinis kriterijus ar modelis); — kiekvieno vertinto atsako nestebimo poveikio koncentracija (NOEC); — kiekvieno vertinto atsako mažiausia stebimo poveikio koncentracija (kai p = 0,05) (LOEC); — kiekvieno vertinto atsako ECx, jei taikoma, ir pasikliovimo intervalai (pvz., 90 % ar 95 %); skaičiavimams naudoto priderinto modelio grafikas, koncentracijos ir atsako priklausomybės kreivės krypties koeficientas, regresijos modelio formulė, įvertinti modelio parametrai ir jų standartinės paklaidos. Visi nukrypimai nuo bandymų metodo. Rezultatų aptarimas, įskaitant nukrypimų nuo šio bandymų metodo įtaką bandymų rezultatams. 1 lentelė Bandyti rekomenduojamų žuvų rūšys GĖLAVANDENĖS UPIŲ ŽIOČIŲ ir JŪRŲ Oncorhynchus mykiss Vaivorykštinis upėtakis Cyprinodon variegatus Margasis dančiakarpis Pimephales promelas Juodoji drūtagalvė rainė Menidia sp. Priekrančių menidija Danio rerio Zebrinė danija Oryzias latipes Japoninė medaka LITERATŪRA (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.171, OECD, Paris. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment. No. 23, OECD Paris. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 pp. (4) Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. (8) Šio priedo C.20 skyrius. Daphnia magna reprodukcijos bandymas. (9) Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 – 376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54, OECD, Paris. (15) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. (16) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. (17) Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121. (18) Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. (19) Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. 1 priedėlis APIBRĖŽTYS Ilgis iki šakutės (FL)– ilgis nuo snukio galo iki uodeginio peleko vidurinių spindulių galo ir naudojamas toms žuvims, kurioms sunku nustatyti stuburo pabaigą (www.fishbase.org). Standartinis ilgis (SL) – žuvies ilgis, išmatuotas nuo snukio galo iki paskutiniojo slankstelio užpakalinio galo arba iki stuburo plokštės mediolateralinės dalies užpakalinio galo. Kitaip tariant, į šį matmenį neįtrauktas uodeginio peleko ilgis. (www.fishbase.org). Visas ilgis (TL) – ilgis nuo snukio galo iki uodeginio peleko ilgesnės mentės galo, paprastai matuojamas mentes prispaudus išilgai vidurio linijos. Tai yra tiesinis matmuo, o ne matuojamas pagal kūno išlinkimą (www.fishbase.org). 1 paveikslas Įvairių naudojamų ilgių apibūdinimas Standartinis ilgis Ilgis iki šakutės Visas ilgis Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys. ECx – (x % poveikio koncentracija) – koncentracija, kuriai esant daromas poveikis x % bandymo organizmų, palyginti su kontroliniu ėminiu per tam tikrą veikimo laikotarpį. Pvz., EC50 yra įvertinta koncentracija, kuri daro poveikį 50 % veikiamos populiacijos bandymo vertinamajai baigčiai per tam tikrą veikimo laikotarpį. Mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC) – mažiausia bandymo koncentracija, kuriai esant stebimas cheminės medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas, palyginti su kontroliniu ėminiu (p < 0,05). Tačiau esant visoms didesnėms nei LOEC bandymo koncentracijos vertėms, kenksmingas poveikis turėtų būti lygus arba didesnis nei poveikis, kuris būtų esant LOEC. Kai negalima įvykdyti šių dviejų sąlygų, turėtų būti pateiktas išsamus paaiškinimas, kaip buvo pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC) vertė. Nurodymai pateikti 5 ir 6 priedėliuose. Nestebimo poveikio koncentracija (NOEC) – vos mažesnė nei LOEC bandymo koncentracija, kuri per nurodytą veikimo laikotarpį nedaro statistiškai reikšmingo poveikio (p < 0,05), palyginti su kontroliniu ėminiu. UVCB – nežinomos ar kintamos sudėties medžiagos, sudėtingųjų reakcijų produktai ar biologinės medžiagos. IUPAC – Tarptautinė teorinės ir taikomosios chemijos sąjunga. SMILES – supaprastinto molekulių pateikimo linijine forma specifikacija. 2 priedėlis REKOMENDUOJAMŲ RŪŠIŲ BANDYMŲ SĄLYGOS, TRUKMĖ IR IŠGYVENAMUMO KRITERIJAI RŪŠIS BANDYMŲ SĄLYGOS REKOMENDUOJAMA BANDYMŲ TRUKMĖ Tipinis mažiausias kontrolinių žuvų visas vidutinis ilgis tyrimo pabaigoje (mm) (98) KONTROLINIŲ ĖMINIŲ ŽUVŲ IŠGYVENAMUMAS (ne mažesnis) Temperatūra (°C) Druskingumas (0/00) Šviesiojo laikotarpio trukmė (h) Išsiritimo procentinė dalis Išsiritusių lervų išgyvenamumas Gėlasis vanduo Oncorhynchus mykiss Vaivorykštinis upėtakis 10 ± 1,5 (99) 12–16 (100) 2 savaitės po kontrolinių ėminių žuvų maitinimo iki soties pradžios (arba 60 parų po išsiritimo) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Juodoji drūtagalvė rainė 25 ± 1,5 16 32 paros nuo bandymo pradžios (arba 28 paros po išsiritimo) 18 70 % 75 % Danio rerio Zebrinė danija 26 ± 1,5 12–16 (101) 30 parų po išsiritimo 11 70 % 75 % Oryzias latipes Japoninė medaka 25 ± 2 12–16 (101) 30 parų po išsiritimo 17 80 % 80 % Upių žiočių ir jūrų: Cyprinodon variegatus Margasis dančiakarpis 25 ± 1,5 15–35 (102) 12–16 (101) 32 paros nuo bandymo pradžios (arba 28 paros po išsiritimo) 17 75 % 80 % Menidia sp. Priekrančių menidija 22–25 15–35 (102) 13 28 paros 20 80 % 60 % 3 priedėlis REKOMENDUOJAMŲ RŪŠIŲ NERŠIANČIŲ IR BANDYMŲ GYVŪNŲ MAITINIMO BEI PRIEŽIŪROS REKOMENDACIJOS RŪŠIS MAISTAS (*9) PERNEŠIMO PO IŠSIRITIMO LAIKAS PIRMOJO MAITINIMO LAIKAS Neršianti žuvis Tik ką išsiritusios lervos Mailius Tipas Dažnumas Gėlasis vanduo Oncorhynchus mykiss Vaivorykštinis upėtakis upėtakių maistas Jokio (1) upėtakių mailiaus maistas BSN 2–4 kartus per parą 14–16 parų po išsiritimo ar nuo plaukimo pradžios (pasirinktinai) 19 parų po išsiritimo ar nuo plaukimo pradžios Pimephales promelas Juodoji drūtagalvė rainė BSN, maisto dribsniai FBS BSN BSN 48, maisto dribsniai 2–3 kartus per parą kai išsirita 90 % 2 paros po išsiritimo Danio rerio Zebrinė danija BSN, maisto dribsniai Pirktinis lervų maistas, pirmuonys (2), baltymai (3) BSN48, maisto dribsniai, BSN kartą per parą; maisto dribsniai du kartus per parą kai išsirita 90 % 2 paros po išsiritimo Oryzias latipes Japoninė medaka maisto dribsniai BSN, maisto dribsniai (arba pirmuonys ar verpetės) BSN48, maisto dribsniai (arba verpetės) BSN kartą per parą; maisto dribsniai du kartus per parą arba maisto dribsniai ir verpetės kartą per parą Netaikoma 6–7 paros po neršto Upių žiočių ir jūrų: Cyprinodon varieqatus Margasis dančiakarpis BSN, maisto dribsniai, FBS BSN BSN48 2–3 kartus per parą Netaikoma 1 para po išsiritimo ar nuo plaukimo pradžios Menidia sp. Priekrančių menidija BSN 48, maisto dribsniai BSN BSN48 2–3 kartus per parą Netaikoma 1 para po išsiritimo ar nuo plaukimo pradžios 4 priedėlis KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMINĖS CHARAKTERISTIKOS Komponentas Ribinė koncentracija Kietosios dalelės 5 mg/l Bendroji organinė anglis 2 mg/l Nejonizuotas amoniakas 1 μg/l Liekamasis chloras 10 μg/l Bendras fosforo organinių pesticidų kiekis 50 ng/l Bendras chloro organinių pesticidų ir polichlorintųjų bifenilų kiekis 50 ng/l Bendras organinio chloro kiekis 25 ng/l Aliuminis 1 μg/l Arsenas 1 μg/l Chromas 1 μg/l Kobaltas 1 μg/l Varis 1 μg/l Geležis 1 μg/l Švinas 1 μg/l Nikelis 1 μg/l Cinkas 1 μg/l Kadmis 100 ng/l Gyvsidabris 100 ng/l Sidabras 100 ng/l 5 priedėlis NOEC NUSTATYMO STATISTINĖS ANALIZĖS REKOMENDACIJOS Bendrosios nuostatos Analizės vienetas yra kartotinio ėminio indas. Todėl, atliekant nuolatinius matavimus, pvz., dydžio, reikėtų apskaičiuoti kartotinio ėminio vidurkį arba medianą ir šios kartotinio ėminio vertės yra analizės duomenys. Reikėtų įrodyti taikomų kriterijų galią, pageidautina pagrįstą atitinkama kiekvienos laboratorijos istorinių duomenų baze. Kiekvienai vertinamajai baigčiai reikėtų gauti poveikio dydį, kuris, taikant statistinius kriterijus, gali būti aptiktas esant 75–80 % galiai. Šio bandymų metodo kūrimo metu turimos duomenų bazės nustato galią, kuri yra įmanoma taikant rekomenduojamas statistines procedūras. Atskira laboratorija turėtų įrodyti savo sugebėjimą atitikti šį galios reikalavimą, atlikdama savo galios analizę arba įrodydama, kad kiekvieno atsako variacijos koeficientas (VK) nėra didesnis nei rengiant šias bandymo gaires naudoto VK 90-oji procentilė. Šios VK vertės pateiktos 1 lentelėje. Jei yra tik kartotinių ėminių vidurkiai ar medianos, į kartotinių ėminių VK galima neatsižvelgti. 1 lentelė 90-osios procentilės VK vertės, gautos pasirinktoms gėlavandenėms rūšims Rūšis Atsakas VK tarp kartotinių ėminių Kartotinių ėminių VK Vaivorykštinis upėtakis Ilgis 17,4 9,8 Masė 10,1 28 Juodoji drūtagalvė rainė Ilgis 16,9 13,5 Masė 11,7 38,7 Zebrinė danija Ilgis 43,7 11,7 Masė 11,9 32,8 Beveik visi statistiniai kriterijai, taikyti įvertinant laboratorijos toksikologinius tyrimus, yra skirti apdorotos grupės ir kontrolinių ėminių tiriamiems palyginimams. Dėl šios priežasties negalima reikalauti tikrinti pagal reikšmingą ANOVA F kriterijų prieš taikant Dunnett ar Williams kriterijų arba pagal reikšmingą Kruskal-Wallis kriterijų prieš taikant Jonckheere-Terpstra, Mann-Whitney ar Dunn kriterijų (Hochberg and Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). Taikant Dunnett kriterijų, galima atlikti daugybines korekcijas, todėl jo klaidingi teigiami ir klaidingi neigiami rodikliai yra netinkami F kriterijaus reikšmingumui nustayti. Panašiai, mažėjimo tvarka taikomi Williams ir Jonckheere-Terpstra kriterijai, naudojant 0,05 reikšmingumo lygį, kiekvienoje pakopoje užtikrina visuminę 5 % klaidingai teigiamų rodiklių dalį, ir ši dalis bei kriterijų galia yra netinkami nustatant pagal F ar Kruskal-Wallis kriterijų reikšmingumą. Todėl reikia daryti Mann-Whitney ir Dunn kriterijų pataisą dėl daugybinių korekcijų ir tam rekomenduojama Bonferroni-Holm pataisa. Daugumą rekomendacijų dėl hipotezių tikrinimo ir šiems kriterijams pagrįsti naudojamų prielaidų tikrinimo išsamiai aptariama EBPO (2006 m.) dokumente, kuriame taip pat pateikiama daug bibliografijos šaltinių. Kontrolinių ėminių apdorojimas, kai naudojamas tirpiklis Jei naudojamas tirpiklis, reikėtų įtraukti skiedimo vandens kontrolinį ėminį ir tirpiklio kontrolinį ėminį. Jei tarp kontrolinių ėminių nenustatoma reikšmingo skirtumo, abu kontrolinius ėminius reikėtų palyginti dėl kiekvieno atsako ir sujungti atliekant statistinę analizę. Priešingu atveju tirpiklio kontrolinį ėminį reikėtų naudoti nustatant NOEC ar įvertinant ECx, o vandens kontrolinio ėminio nenaudoti. Žr. tinkamumo kriterijų apribojimus (7 pastraipa) Ilgiui, masei, išsiritusių ikrų arba nugaišusių ar nenormalių lervų daliai ir pirmajai ar paskutinei išsiritimo parai ar plaukimo pradžiai reikėtų taikyti T kriterijų arba Mann-Whitney kriterijų skiedimo vandens ir tirpiklio kontroliniams ėminiams palyginti esant 0,05 reikšmingumo lygiui, nekreipiant dėmesio į apdorotas grupes. Tikrinimo pagal šiuos kriterijus rezultatai turėtų būti pateikti ataskaitoje. Dydžio matavimai (ilgio ir masės) Atskirų žuvų ilgio ir masės verčių pasiskirstymas gali būti normalusis ar lognormalusis. Bet kuriuo atveju kartotinių ėminių vidutinės vertės linkusios į normalųjį pasiskirstymą, atsižvelgiant į centrinę ribinę teoremą, ir tai patvirtina daugiau kaip šimtas trijų gėlavandenių žuvų rūšių ankstyvųjų gyvenimo stadijų toksiškumo tyrimų. Be to, jei duomenys ar istorinės duomenų bazės rodo atskirų žuvų dydžio verčių lognormalųjį pasiskirstymą, galima apskaičiuoti atskirų žuvų verčių kartotinio ėminio vidurkio logaritmą ir tada analizės duomenys gali būti šių kartotinių ėminių vidurkių logaritmų antilogaritmai. Duomenis reikėtų patikrinti dėl atitikties normaliajam pasiskirstymui ir dispersijos vienalytiškumui. Šiam tikslu reikėtų naudoti ANOVA modelio liekanas ir koncentraciją kaip vienintelį nepriklausomą kintamąjį. Galima naudoti vizualinį nustatymą pagal sklaidos diagramas ir histogramas arba kamieninę-lapinę diagramą. Arba galima taikyti formalųjį kriterijų, pvz., Shapiro-Wilk ar Anderson-Darling. Atitiktis dispersijos vienalytiškumui gali būti įvertinta vizualiai tiriant tą pačią sklaidos diagramą arba formaliai pagal Levene kriterijų. Įvertinamas tik parametrinių kriterijų (pvz., Williams, Dunnett) normalumas ar dispersijos vienalytiškumas. Reikėtų atkreipti dėmesį į galimus riktus ir jų įtaką analizei. Galima taikyti Tukey riktų kriterijų ir vizualiai patikrinti pirmiau aprašytus liekanų grafikus. Reikėtų priminti, kad stebėjimo vienetas yra visas kartotinis ėminys, todėl riktus iš analizės reikėtų šalinti tik po kruopštaus tyrimo. Statistiniai kriterijai, kurie yra naudojami bandymų schemų ir biologinės tikimybės charakteristikoms yra tendencijos mažėjimo kriterijai, tokie kaip pvz., Williams ir Jonckheere-Terpstra. Tokiems kriterijams taikoma prielaida dėl koncentracijos ir atsako priklausomybės monotoniškumo, todėl duomenys turėtų būti vertinami siekiant nuoseklaus atitikimo tokiai prielaidai. Tai galima atlikti vizualiai, pagal kartotinių ėminių vidurkių sklaidos diagramą palyginant su bandymo koncentracijom. Būtų naudinga perdengti sklaidos diagramą tiesinio grafiko dalimis, kurios sujungtų koncentracijos vidurkius kaip kartotinio ėminio imties dydžio svertinius vidurkius. Didelis tokio tiesinio grafiko dalių nukrypimas nuo monotoniškumo rodytų, kad galbūt reikėtų naudoti ne tendencijos mažėjimo kriterijus. Arba galima taikyti formalius kriterijus. Paprastas formalus kriterijus yra apskaičiuoti koncentracijos vidurkių tiesinius ir kvadratinius kontrastus. Jei kvadratinis kontrastas yra reikšmingas, o tiesinis – ne, tai rodo, kad gali būti monotoniškumo problema, kurią reikėtų įvertinti pagal grafikus. Jei problema – normalumas ar dispersijos vienalytiškumas, šiuos kontrastus galima gauti pagal rangų transformacijos duomenis. Galima taikyti alternatyvias procedūras, pvz., Bartholomew monotoniškumo kriterijų, bet ši procedūra sudėtingesnė. 2 paveikslas Struktūrinė diagrama NOEC gauti pagal dydžio (ilgio ir masės) matavimus Tais atvejais, kai duomenys neatitinka šių kriterijų reikalavimų, NOEC nustatoma mažėjimo tvarka taikant Williams ar Jonckheere-Terpstra kriterijus. Šios procedūros pateiktos EBPO (2006 m.). Jei duomenys neatitinka mažėjimo tvarka taikomo tendencijos kriterijaus, galima taikyti Dunnett kriterijų ar Tamhane-Dunnett (T3) kriterijų, kurie abu turi pataisas dėl daugybinių korekcijų. Taikant šiuos kriterijus daroma prielaida dėl normalumo, o Dunnett kriterijaus atveju – dėl dispersijos vienalytiškumo. Jei duomenys šių sąlygų neatitinka, galima taikyti Dunn neparametrinį kriterijų. Išsami informacija apie šiuos kriterijus pateikta EBPO (2006 m.). 2 paveiksle pateikta tinkamų kriterijų pasirinkimo apžvalga. Išsiritimas iš ikrų ir lervų išgyvenamumas Duomenys yra išsiritimo iš ikrų ar išgyvenusių lervų dalis atskirame kartotiniame ėminyje. Šias dalis reikėtų įvertinti dėl didesnės nei binominio skirstinio dispersijos, kuri yra įprastinė, bet ne visuotinė tokių matavimų dispersija. 3 paveiksle pateiktoje struktūrinėje diagramoje pateiktos rekomendacijos dėl tinkamo kriterijaus pasirinkimo; išsamus aprašymas pateiktas tekste. Dažniausiai taikomi du kriterijai. Tai yra Tarone C(α) kriterijus (Tarone, 1979 m.) ir chi kvadratu kriterijus, kurių kiekvienas taikomas atskirai kiekvienai bandymo koncentracijai. Jei didesnė nei binominio skirstinio dispersija nustatoma nors vienai bandymo koncentracijai, reikėtų taikyti metodus, kurie su tokia sąlyga būtų suderinami. 1 formulė. Tarone C (α) kriterijus (Tarone 1979 m.) čia: ̂ – vidutinė dalis esant tam tikrai koncentracijai, m – kartotinių ėminių indų skaičius, nj – subjektų skaičius kartotiniame ėminyje j, ir xj – reaguojančių subjektų tame kartotiniame ėminyje skaičius, pvz., neišsiritusių ar žuvusių. Šis kriterijus taikomas kiekvienai koncentracija atskirai. Į šį kriterijų galima žiūrėti kaip į pataisytą chi kvadratu kriterijų, bet Tarone atliktas ribotos galios modeliavimas parodė, kad jis yra didesnės galios nei chi kvadratu kriterijus. 3 paveikslas. Struktūrinė diagrama NOEC gauti pagal išsiritimą iš ikrų ir lervų gaištamumą Jei nėra reikšmingų didesnės nei binominio skirstinio dispersijos įrodymų, galima taikyti Cochran-Armitage kriterijų mažėjimo tvarka. Šis kriterijus neatsižvelgia į kartotinius ėminius, todėl, jei yra tokių įrodymų, reikėtų taikyti Cochran-Armitage kriterijų su Rao-Scott pataisa (RSCA), kuri atsižvelgia į kartotinius ėminius, kartotinių ėminių dydį ir į didesnę nei binominio skirstinio dispersiją, todėl ir yra rekomenduojama. Alternatyvūs kriterijai yra Williams ir Jonckheere-Terpstra kriterijai mažėjimo tvarka ir Dunnett kriterijus, aprašyti dydžio matavimams. Šie kriterijai taikomi, kai yra didesnė nei binominio skirstinio dispersija ar kai jos nėra, bet jų galia yra kažkiek mažesnė (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). Pirmoji arba paskutinė išsiritimo arba plaukimo para Atsakas yra sveikas skaičius, rodantis bandymo dieną, kurią yra stebimas nurodytas parametras tam tikrame kartotinio ėminio inde. Verčių intervalas paprastai yra labai ribotas ir dažnai esama didelės susijusių verčių dalies, pvz., ta pati pirmoji išsiritimo para stebima visuose kontroliniuose kartotiniuose ėminiuose ir galbūt vienos ar dviejų mažos koncentracijos verčių ėminiuose. Tokiems duomenims netinka parametriniai kriterijai, pvz., Williams ir Dunnett kriterijai. Jei nėra didelio nemonotoniškumo įrodymų, Jonckheere-Terpstra kriterijus mažėjimo tvarka turi didelę galią bandomosios cheminės medžiagos poveikiui aptikti. Priešingu atveju galima taikyti Dunn kriterijų. Lervų anomalijos Atsakas yra kokių nors anomalijų turinčių lervų skaičius. Šis atsakas labai dažnai yra mažo dažnumo ir turi kai kurių panašių pirmosios išsiritimo dienos problemų, taip pat kartais pastebima nepastovi koncentracijos ir atsako priklausomybė. Jei duomenys bent apytikriai atitinka monotonišką priklausomybės nuo koncentracijos formą, Jonckheere-Terpstra kriterijus mažėjimo tvarka turi didelę galią poveikiui aptikti. Priešingu atveju galima taikyti Dunn kriterijų. NUORODOS Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, No. 54. Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris.. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952. Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. 6 priedėlis STATISTINĖS ANALIZĖS REKOMENDACIJOS ĮVERČIAMS GAUTI REGRESIJOS METODU Bendrosios nuostatos Modeliui priderinti naudoti stebėjimų duomenys yra kartotinių ėminių vidurkiai (ilgio ir masės) arba kartotinių ėminių dalys (išsiritimo iš ikrų ir lervų gaištamumo) (EBPO, 2006 m.). Paprastai patariama svertinė regresija pagal kartotinio ėminio imties dydį. Galima taikyti kitas svertinio įvertinimo schemas, pvz., svertinį įvertinimą pagal prognozuojamą vidutinį atsaką arba jo ir kartotinio ėminio imties dydžio derinį. Svertinis įvertinimas pagal vienos koncentracijos ėminių atvirkštinę dispersiją nerekomenduojamas (Bunke et al. 1999, Seber and Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). Transformuojant atsakus prieš analizę, reikėtų išsaugoti stebėjimo duomenų nepriklausomybę, ir ECx, o jos pasikliovimo ribos turėtų būti išreikštos pradiniais matavimo vienetais, o ne transformuotais vienetais. Pvz., ilgio logaritmo 20 % pokytis nėra lygiavertis ilgio 20 % pokyčiui (Lyles et.al 2008, Draper and Smith 1999). 4 paveiksle pateikta struktūrinė diagrama ECx įverčiams gauti. Išsamesnis paaiškinimas pateiktas tolesniame tekste. 4 paveikslas ECx įvertinimo pagal kartotinių ėminių vidutinį ilgį, masę arba išsiritimo iš ikrų ar lervų gaištamumo dalį struktūrinė diagrama, išsamesnis paaiškinimas pateiktas tekste Išsiritimo iš ikrų ir lervų gaištamumo aspektai Jei imamas išsiritimas iš ikrų ir lervų gaištamumas, paprastai būtų geriau priderinti mažėjimo modelį, nebent būtų priderinamas probit regresijos modelis, kaip aprašyta toliau. T. y reikėtų modeliuoti pagal neišsiritusių ikrų ar žuvusių lervų dalį. To priežastis – ECx atitinka koncentraciją, kuriai esant pokytis yra lygus x % kontrolinio ėminio vidutinio atsako. Jei neišsirita 5 % kontrolinio ėminio ikrų ir modeliuojama pagal neišsiritusių ikrų skaičių, EC20 rodytų koncentraciją, kuriai esant yra 20 % pokytis, palyginti su 5 % kontrolinio ėminio neišsiritusių ikrų, t. y. pokytis yra 0,2 × 0,05 = 0,01 arba 1 procentinis punktas ir iš viso neišsirito 6 %. Toks nedidelis pokytis negali būti kaip nors prasmingai įvertintas pagal turimus duomenis ir nėra biologiškai svarbus. Tačiau, jei modeliuojama pagal išsiritusių ikrų kiekį, kontrolinio ėminio dalis šiame pavyzdyje būtų 95 %, o 20 % sumažėjimas, palyginti su kontrolinio ėminio vidurkiu, sudarytų pokytį 0,95 × 0,2 = 0,18, taigi nuo 95 % iki 77 % (= 95 – 18) išsiritusių ikrų procentinės dalies, todėl poveikio koncentracija gali būti įvertinta ir ji turbūt daug svarbesnė. Taip nėra matuojant dydį, nors neigiamas poveikis dydžiui paprastai reiškia dydžio sumažėjimą. Dydžio (ilgio arba masės) ir išsiritimo iš ikrų ar lervų išgyvenamumo dalies modeliai Išskyrus Brain-Cousens hormezės modelį, visi šie modeliai yra aprašyti ir rekomenduojami EBPO (2006 m.). Tai, kas vadinama EBPO 2-5, taip pat yra aptarta dėl ekotoksiškumo bandymų, Slob (2002). Aišku, kad yra daug kitų modelių, kurie galėtų būti naudingi. Bunke et al. (1999) išvardyta daug į šį dokumentą neįtrauktų modelių ir yra labai daug nuorodų į kitus modelius. Toliau išvardyti metodai yra siūlomi kaip ypač tinkami ekotoksiškumo bandymams ir yra plačiai taikomi. Penkios bandymo koncentracijos vertės ir kontrolinis ėminys: — Bruce-Versteeg; — paprastasis eksponentinis (EBPO 2); — eksponentinis su formos parametru (EBPO 3); — paprastasis eksponentinis su apatine riba (EBPO 4). Daugiau kaip šešios bandymo koncentracijos vertės ir kontrolinis ėminys: — eksponentinis su formos parametru ir apatine riba (EBPO 5); — Michaelis-Menten; — Hill. Jei yra vizualūs hormezės įrodymai (maža jos tikimybė išsiritimo iš ikrų ar lervų išgyvenamumo daliai, bet kartais stebima dydžio duomenims): — Brain-Cousens Hormetic; Brain and Cousens (1989 m.) Alternatyvūs išsiritimo iš ikrų ar lervų išgyvenamumo dalies modeliai — Šių atsakų didėjimo modeliai gali būti priderinti pagal probit (ar logistinio skirstinio) modelį, jei nėra didesnės nei binominio skirstinio dispersijos įrodymų, o priderinant modelį įvertinamas kontrolinio ėminio incidentiškumas. Šis metodas nėra tinkamiausias, nes kaip analizės vienetas imamas pavienis, o ne kartotinis ėminys (Morgan 1992, O'Hara Hines and Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Atskiro modelio suderintumas — Vizualiai lyginamas stebimas ir prognozuojamas procentinis sumažėjimas kiekvienai bandymo koncentracijai (Motulsky and Christopoulos 2004, Draper and Smith 1999). — Taikant F kriterijų lyginama regresijos vidutinė kvadratinė paklaida ir grynoji vidutinė kvadratinė paklaida (Draper and Smith 1999). — tikrinama, ar kad kiekvienas modelio narys gerokai skiriasi nuo nulio (pvz., nustatoma, ar visi modelio nariai yra svarbūs), (Motulsky and Christopoulos 2004). — Gaunamas regresijos liekanų kaip bandymų koncentracijos funkcijos grafikas, galbūt log (koncentracijos) skalėje. Neturėtų būti jokio šio grafiko modelio; taškai turėtų būti atsitiktinai išsisklaidę apie horizontalią liniją nulio aukštyje. — Duomenys turėtų būti įvertinami dėl normalumo ir dispersijos vienalytiškumo 5 priedėlyje nurodytu būdu. — Be to, liekanų apie regresijos modelį normalumas turėtų būti vertinamas taikant metodus, kurie 5 priedėlyje yra nurodyti ANOVA liekanoms. Modelių palyginimas — Taikomi Akiake informacijos kriterijai (AICc). Mažesnės AIC vertės žymi geresnius suderintumus ir, jei AICc(B)-AICc(A) ≥ 10, A modelis beveik neabejotinai yra geresnis nei B modelis (Motulsky and Christopoulos (2004). — Du modeliai lyginami vizualiai pagal tai, kaip gerai jie atitinka pirmiau nurodytus vieno modelio kriterijus. — Siūlomas paprastumo principas, kai taikomas paprasčiausias duomenis atitinkantis modelis (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008). ECx įverčio kokybė ECx pasikliovimo intervalas (PI) neturėtų būti labai platus. Statistiškai reikėtų pagrįsti sprendimą dėl pasikliovimo intervalo pločio ir dėl vis dar tinkamo ECx naudingumo. Išsiritimo iš ikrų ir dydžių duomenų regresijos modelių priderinimo tikrinimas rodo, kad maždaug 75 % ECx (x = 10, 20 ar 30) pasikliovimo intervalų aprėpia ne daugiau kaip dvi koncentracijos vertes. Taip gaunamos bendrosios priimtinumo rekomendacijos ir praktinės pasiekiamumo rekomendacijos. Daug autorių teigia, kad ataskaitoje reikia pateikti visų modelio parametrų pasikliovimo intervalus, o platus modelio parametrų pasikliovimo intervalas rodo nepriimtiną modelį (Ott and Longnecker 2008, Alvord and Rossio 1993, Motulsky and Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber and Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005). ECx pasikliovimo intervale (ar kitame modelio parametre) neturėtų būti nulio (Motulsky and Christopoulos 2004). Tai yra tas pat, kaip regresijai būtų minimalus reikšmingas skirtumas, kuris dažnai nurodomas taikant hipotezių tikrinimo metodus (pvz., Wang et al 2000). Tai taip pat atitinka LOEC atsakų vidurkių pasikliovimo intervalą, į kurį nepatenka kontrolinio ėminio vidurkis. Reikėtų įsitikinti, kad parametrų įverčiai yra moksliškai patikimi. Pvz., jei y0 pasikliovimo intervalas yra ± 20 %, joks EC10 įvertis nėra patikimas. Jei koncentracijai C pagal modelį prognozuojamas 20 % poveikis, o didžiausias stebimas poveikis esant C ir mažesnei koncentracijai yra 10 %, EC20 nėra patikima (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005). ECx neturėtų prireikti ekstrapoliacijos toliau nei teigiamų koncentracijos verčių intervalas (Draper and Smith 1999, EBPO 2006). Pvz., bendroji rekomendacija galėtų būti tokia, kad ECx turi būti ne daugiau kaip 25 % mažesnė nei mažiausia bandyta koncentracija ir ne daugiau kaip 25 % didesnė nei didžiausia bandyta koncentracija. NUORODOS Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96. Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, pp. 107-121 OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, No. 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD, Paris. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, pp. 113–117, 2000. C.48 Trumpalaikis žuvų reprodukcijos tyrimas ĮVADAS 1. Šis bandymų metodas atitinka EBPO bandymų gaires (TG) 229 (2012). Poreikis parengti ir patvirtinti žuvų bandymą, kuriuo galima nustatyti endokrininę sistemą veikiančias chemines medžiagas, atsirado susirūpinus, kad aplinkos užterštumas cheminėmis medžiagomis gali kelti neigiamą poveikį ir žmonėms, ir laukinei gyvūnijai dėl šių cheminių medžiagų sąveikos su endokrinine sistema. 1998 m. EBPO iniciatyva pradėtas didelės svarbos darbas – peržiūrėti esamas gaires ir parengti naujas endokrininę sistemą galimai ardančių medžiagų atrankos ir bandymų gaires. Viena iš šio darbo dalių – parengti žuvų endokrininę sistemą veikiančių cheminių medžiagų atrankos bandymų gaires. Kad būtų įrodyta tyrimo svarba ir patikimumas, buvo atlikta trumpalaikio žuvų reprodukcijos tyrimo plataus masto patvirtinimo programa, kurią sudaro pasirinktų cheminių medžiagų tarplaboratoriniai tyrimai, siekiant aptikti chemines medžiagas, kurios pagal įvairius mechanizmus veikia žuvų reprodukciją, įskaitant poveikį endokrininei sistemai (1, 2, 3, 4, 5). Buvo patvirtintos visos EBPO juodosios drūtagalvės rainės bandymų gairių vertinamosios baigtys ir japoninės medakos (t. y. vitelogeninas ir antriniai lytiniai požymiai) bei zebrinės danijos (t. y. vitelogenino) vertinamųjų baigčių rinkinio dalis. Tinkamumo patvirtinimo darbus iš dalies peržiūrėjo ekspertų grupė, kurią paskyrė nacionaliniai EBPO bandymų gairių programos koordinatoriai (6), ir nepriklausoma ekspertų grupė, kurią įgaliojo Jungtinių Amerikos Valstijų Aplinkos apsaugos agentūra (29). Bandymas nėra skirtas specifiniams hormonų veiklos sutrikimo mechanizmams nustatyti, nes bandymo gyvūnai vis dar turi sveiką pagumburio, hipofizės ir lytinių liaukų (PHL) ašį, galinčią reaguoti į ją veikiančias chemines medžiagas, joms esant skirtingos koncentracijos. 2. Šiame bandymų metode aprašomas in vivo atrankos tyrimas, kai lytiškai subrendęs žuvies patinas ir neršianti patelė ribotą jų gyvavimo ciklo dalį (21 parą) laikomi kartu ir veikiami tam tikra chemine medžiaga. Pasibaigus 21 paros veikimo laikotarpiui, matuojamos dvi bandomosios cheminės medžiagos endokrininio aktyvumo biologinių žymenų vertinamosios baigtys; šios vertinamosios baigtys yra vitelogeninas ir antriniai lytiniai požymiai. Vitelogeninas matuojamas juodosios drūtagalvės rainės, japoninės medakos ir zebrinės danijos, o antriniai lytiniai požymiai – juodosios drūtagalvės rainės ir japoninės medakos organizme. Be to, kasdien visą bandymo laiką stebimas kiekybinis veislumas. Siekiant įvertinti bandymų gyvūnų reprodukcinį tinkamumą ir į įrodomosios vertės analizę įtraukti kitas vertinamąsias baigtis, lytinės liaukos konservuojamos ir gali būti įvertinta jų histopatologija. 3. Ši biologinis tyrimas yra in vivo poveikio reprodukcijai atrankos tyrimas ir jo taikymą reikėtų vertinti pagal EBPO endokrininę sistemą ardančių cheminių medžiagų bandymo ir vertinimo konceptualiąją sistemą (angl. Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) (30). Pagal šią konceptualiąją sistemą trumpalaikis žuvų reprodukcijos bandymas pasiūlytas 3 lygiu kaip in vivo bandymas, kurį atliekant gaunami duomenys apie pasirinktą (-us) endokrininį (-ius) mechanizmą (-us) ar kelią (-ius). PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI 4. Vitelogeniną (VTG) paprastai gamina kiaušinius dedančių moteriškos lyties stuburinių gyvūnų kepenys, kaip atsaką į cirkuliuojantį endogeninį estrogeną. Jis yra kiaušinio trynio baltymų pirmtakas ir, pagamintas kepenyse, keliauja krauju į kiaušidę, kurioje jį įsisavina ir modifikuoja besivystantys kiaušinėliai. Nesubrendusių žuvų patelių ir patinų plazmoje vitelogenino beveik neįmanoma aptikti, nes jų organizme nepakanka cirkuliuojančio estrogeno, tačiau kepenys gali sintetinti ir išskirti VTG, kaip atsaką į išorinį dirginimą estrogenais. 5. Matuojant vitelogenino kiekį, galima nustatyti įvairias chemines medžiagas, turinčias įvairaus pobūdžio estrogeninį poveikį. Estrogenines chemines medžiagas galima aptikti matuojant vitelogenino indukciją žuvies patino organizme – tai išsamiai aprašyta ekspertų įvertintoje literatūroje (pvz. (7)). Taip pat nustatyta, kad vitelogenino indukciją sukelia aromatizuotų androgenų poveikis (8, 9). Sumažėjus patelių organizme cirkuliuojančiam estrogenų kiekiui, pvz., jei slopinama aromatazė, kuri endogeninį androgeną paverčia natūraliu estrogenu 17β-estradioliu, mažėja VTG koncentracija, naudojama aromatazės slopinimo savybių turinčioms cheminėms medžiagoms (10, 11). Yra nustatyta ir plačiai dokumentuota VTG atsako po estrogenų ar aromatazės slopinimo biologinė svarba. Tačiau įmanoma, kad VTG gamybai patelėse įtaką taip pat daro bendrasis toksiškumas ir neendokrininio toksinio veikimo būdai, pvz., toksinis poveikis kepenims. 6. Įprastam naudojimui sėkmingai sukurti ir standartizuoti keli matavimo metodai. Toks yra rūšių specifinės imunofermentinės analizės metodas (IFA), kurį taikant imunocheminiu būdu kiekybiškai nustatomas VTG, gautas mažuose iš atskirų žuvų paimtuose kraujo ar kepenų ėminiuose (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). VTG kiekiui išmatuoti imami juodosios drūtagalvės rainės kraujo, zebrinės danijos kraujo arba galvos ir uodegos homogenato bei medakos kepenų ėminiai. Tarp VTG kiekio, išmatuoto medakos kraujyje ir kepenyse, esama geros koreliacijos (19). 6 priedėlyje pateiktos rekomenduojamos VGT analizei skirtų ėminių ėmimo procedūros. VTG matavimo rinkiniai yra plačiai prieinami; tokie rinkiniai turėtų būti pagrįsti patvirtintu rūšims specifiniu IFA metodu. 7. Tam tikrų rūšių žuvų patinų antriniai lytiniai požymiai yra išoriškai matomi, kiekybiškai įvertinami ir reaguoja į cirkuliuojančius endogeninių androgenų kiekius; tai taikytina juodajai drūtagalvei rainei ir medakai, bet ne zebrinei danijai, kuri neturi kiekybiškai įvertinamų antrinių lytinių požymių. Patelės išlaiko gebėjimą išvystyti vyriškuosius antrinius lytinius požymius, kai yra paveikiamos androgeninėmis cheminėmis medžiagomis vandenyje. Mokslinėje literatūroje pateikiami keli tyrimai tokio tipo juodosios drūtagalvės rainės (20) ir medakos (21) organizmo reakcijai pagrįsti dokumentais. Patinų antrinių lytinių požymių sumažėjimą reikėtų vertinti atsargiai dėl mažos statistinės galios, be to, jis turėtų būti pagrįstas ekspertų vertinimais ir įrodomosios vertės analize. Kadangi zebrinė danija neturi kiekybiškai įvertinamų antrinių lytinių požymių, kurie reaguotų į androgeninio poveikio chemines medžiagas, jos naudojimas šiame tyrime yra ribotas. 8. Kalbant apie juodąją drūtagalvę rainę, pagrindinis išorinio androgeninio veikimo rodiklis yra poravimosi gumburėlių skaičius priekinėje patelės galvos dalyje. Kalbant apie medaką, pagrindinis išorinio veikimo androgeninėms cheminėms medžiagoms požymis yra patelės spenelinių ataugų skaičius. 5A ir 5B priedėliuose nurodytos rekomenduojamos procedūros, skirtos juodosios drūtagalvės rainės ir medakos lyties požymiams įvertinti. 9. 21 paros žuvų tyrimas aprėpia kiekybinį ikrų gamybos įvertinimą ir lytinių liaukų konservavimą, kad būtų galima atlikti neprivalomą histopatologinį tyrimą. Kad būtų galima išsamiau įvertinti bandymų gyvūnų reprodukcinį tinkamumą, arba tais atvejais, kai veikiant cheminei medžiagai nebuvo vitelogenino ir antrinių lytinių požymių atsako, kai kurios priežiūros institucijos gali pareikalauti papildomų vertinamųjų baigčių. Nors kai kurios vertinamosios baigtys gali ypač tikti diagnostikai (pvz., VTG indukcija patinuose ir gumburėlių susidarymas patelėse), ne visos tyrimo vertinamosios baigtys (pvz., vislumas ir lytinių liaukų histopatologija) yra skirtos vienareikšmiškai nustatyti specifinius ląstelių veikimo mechanizmus. Atvirkščiai, vertinamųjų baigčių seka, kaip visuma, leidžia daryti išvadas dėl galimų endokrininių sutrikimų ir tokiu būdu užtikrinti tolesnių bandymų gaires. Nors vislumas endokrininiu požiūriu nėra specifinis veiksnys, jis dėl įrodyto jautrio žinomoms endokrininę sistemą veikiančioms cheminėms medžiagoms (5) yra svarbi vertinamoji baigtis, kurią reikią įtraukti, nes kai ji ir kitos vertinamosios baigtys nėra paveiktos, yra didesnė tikimybė, kad junginys nerodo endokrininio aktyvumo. Tačiau jei paveikiamas vislumas, labai padidėja įrodomoji duomenų galia išvadoms padaryti. Rekomendacijos dėl duomenų aiškinimo ir bandymų rezultatų priimtinumo pateikiamos toliau šio bandymų metodo aprašyme. 10. Šiame bandymų metode vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje. BANDYMO PRINCIPAS 11. Atliekant tyrimą, chemine medžiaga veikiami kartu į bandymo indus patalpinti reprodukcinio amžiaus žuvų patinai ir patelės. Tyrime naudojamos suaugusios reprodukcinio amžiaus žuvys, todėl jas galima aiškiai atskirti pagal lytį, taigi ir atlikti su lytimi susijusią kiekvienos vertinamosios baigties analizę, be to, taip užtikrinamas jų jautrumas išorinėms cheminėms medžiagoms. Baigus bandymą, lytis patvirtinama makroskopiniu lytinių liaukų tyrimu atvėrus pilvo ertmę žirklėmis. Atitinkamų biologinio tyrimo sąlygų apžvalga pateikta 2 priedėlyje. Tyrimas paprastai pradedamas atrenkant žuvis iš neršiančių žuvų populiacijos; tyrime neturėtų būti naudojami senstantys gyvūnai. Rekomendacijos dėl žuvų amžiaus ir reprodukcinės būklės pateiktos skirsnyje Žuvų atranka. Tyrimas atliekamas naudojant trijų koncentracijos verčių cheminę medžiagą, taip pat vandens kontrolinį ėminį ir, jei reikia, tirpiklio kontrolinį ėminį. Tiriant zebrinę daniją, vienai bandomosios medžiagos dozei naudojami du indai arba du kartotiniai ėminiai (kiekviename inde yra po penkis patinus ir penkias pateles). Tiriant juodąją drūtagalvę rainę, vienai bandomosios medžiagos dozei naudojami keturi indai arba keturi kartotiniai ėminiai (kiekviename inde yra po du patinus ir keturias pateles). Taip daroma siekiant atsižvelgti į teritorinį juodosios drūtagalvės rainės patino elgesį, tačiau užtikrinant pakankamą tyrimo statistinę galią. Tiriant medaką, vienai bandomosios medžiagos dozei naudojami keturi indai arba keturi kartotiniai ėminiai (kiekviename inde yra po tris patinus ir tris pateles). Žuvys veikiamos 21 parą, o žuvų ėminiai imami 21-ą parą. Kiekybinių vislumo duomenų kontrolė atliekama kasdien. 12. Imant ėminius 21-ą parą visi gyvūnai humaniškai numarinami. Įvertinami juodosios drūtagalvės rainės ir medakos antriniai lytiniai požymiai (žr. 5A ir 5B priedėlius); iš zebrinės danijos ir juodosios drūtagalvės rainės paimami kraujo ėminiai VTG kiekiui nustatyti, arba jam nustatyti vietoj zebrinės danijos kraujo galima paimti jų galvą ir uodegą (6 priedėlis); iš medakos VTG analizei atlikti paimamos kepenys (6 priedėlis); lytinės liaukos fiksuojamos su visu kūnu arba išpjautos, kad būtų galima atlikti histopatologinį įvertinimą (22). BANDYMO PRIIMTINUMO KRITERIJAI 13. Taikomos šios sąlygos, kad bandymo rezultatai būtų priimtini: — gaištamumas vandens (arba tirpiklio) kontrolinių ėminių induose veikimo laikotarpio pabaigoje neturėtų būti didesnis kaip 10 %; — ištirpusio deguonies koncentracija visą veikimo laikotarpį turėtų būti ne mažesnė kaip 60 % oro soties vertės (OSV); — kiekvienu veikimo laikotarpio momentu bandymo indų vandens temperatūra neturėtų skirtis daugiau kaip ± 1,5 °C ir turėtų būti bandymų rūšiai nurodytame intervale 2 °C tikslumu (2 priedėlis); — turėtų būti įrodymų, kad bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tirpale yra išmatuotų vidutinių verčių ± 20 % intervale; — turėtų būti įrodymų, kad žuvys aktyviai neršia visuose kartotinių ėminių induose prieš pradedant jas veikti chemine medžiaga ir visą bandymo trukmę kontrolinių ėminių induose. METODO APRAŠYMAS Aparatūra 14. Įprasta laboratorinė įranga ir ši speciali įranga: a. deguonies ir pH matuokliai, b. įranga vandens kietumui ir šarmingumui nustatyti, c. atitinkama aparatūra temperatūrai kontroliuoti, geriau nuolatinės kontrolės aparatūra, d. indai, pagaminti iš chemiškai inertiškos medžiagos, kurių talpa atitinka rekomenduojamą įkrovą bei žuvų tankį (žr. 2 priedėlį); e. neršto substratas juodajai drūtagalvei rainei ir zebrinei danijai, reikiama išsami informacija pateikta 4 priedėlyje; f. reikiamo tikslumo svarstyklės (t. y. ± 0,5 mg tikslumo). Vanduo 15. Galima naudoti bet kokį vandenį, kuriame bandomoji rūšis gali ilgai gyventi ir augti. Jo kokybė turėtų būti pastovi visą bandymų trukmę. Vandens pH vertė turėtų būti 6,5–8,5, tačiau, atliekant konkretų bandymą, pH vertė neturėtų pakisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Siekiant užtikrinti, kad skiedimo vanduo netinkamai nepaveiktų bandymo rezultatų (pvz., sudarydamas kompleksus su bandomąja chemine medžiaga), tam tikrais intervalais turėtų būti imami mėginiai analizei atlikti. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd ir Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl– ir SO4 2-), pesticidų (pvz., fosforo organinių ir chloro organinių pesticidų bendrojo kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turėtų būti atliekama, pvz., kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei būtų įrodyta, kad vandens kokybė išlieka pastovi bent metus, analizė gali būti atliekama ne taip dažnai, o intervalai – padidinti (pvz., kas šešis mėnesius). Kai kurios skiedimui tinkamo vandens cheminės savybės pateiktos 3 priedėlyje. Bandymų tirpalai 16. Pasirinktos koncentracijos bandymo tirpalai ruošiami skiedžiant pradinį tirpalą. Pradinį tirpalą geriau ruošti tiesiog maišant ar plakant bandomąją cheminę medžiagą skiedimo vandenyje mechaninėmis priemonėmis (pvz., maišykle ar ultragarsu). Pakankamai koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti galima naudoti prisotinimo kolonėles (tirpumo kolonėles). Nerekomenduojama naudoti tirpiklinio nešiklio. Tačiau jei tirpiklis yra būtinas, lygiagrečiai reikėtų bandyti kontrolinį tirpiklio ėminį, kurio koncentracija atitinka ėminių su chemine medžiaga tirpiklio koncentraciją. Sunkiai bandomoms cheminėms medžiagoms tirpiklis gali būti geriausias techninis sprendimas; informacijos reikėtų ieškoti EBPO rekomendaciniame dokumente apie sunkiai apdorojamų cheminių medžiagų ir mišinių toksiškumo vandens organizmams bandymus (23). Tirpiklis bus pasirinktas pagal cheminės medžiagos ar mišinio chemines savybes. EBPO rekomendaciniame dokumente rekomenduojama ne didesnė kaip 100 μl/l koncentracija ir šios rekomendacijos reikėtų laikytis. Tačiau neseniai pateiktoje apžvalgoje (24) atkreiptas dėmesys į papildomas problemas, kai tiriant endokrininį aktyvumą naudojami tirpikliai. Todėl prireikus naudoti tirpiklį rekomenduojama kiek įmanoma mažinti jo koncentraciją, jei tai techniškai įmanoma (atsižvelgiant į bandomosios cheminės medžiagos fizines ir chemines savybes). 17. Bus naudojama dinaminė bandymų sistema. Naudojant tokią sistemą (pvz., dozavimo siurblį, proporcingojo skiedimo sistemą, prisotinimo sistemą), pradinis bandomosios cheminės medžiagos tirpalas visą laiką dozuojamas ir skiedžiamas, kad bandymo kamerose būtų reikiamos koncentracijos verčių serijos tirpalai. Pradinių tirpalų ir skiedimo vandens srautai turėtų būti tikrinami tam tikrais laiko tarpais, pageidautina kasdien, ir per visą bandymą neturėtų skirtis daugiau kaip 10 %. Reikėtų vengti naudoti nekokybiškus plastmasinius vamzdelius ar kitas medžiagas, kurios gali turėti biologiškai veiklių cheminių medžiagų. Renkantis dinaminei bandymų sistemai tinkamą medžiagą, reikėtų atsižvelgti į galimą bandomosios cheminės medžiagos adsorbciją ant šios medžiagos. Žuvų laikymas 18. Pasirenkamos vienos laboratorinės populiacijos ir geriau to paties neršto žuvys, kurios bent dvi savaites prieš bandymą būtų aklimatizuojamos į bandymo sąlygas panašiomis vandens kokybės ir apšvietimo sąlygomis. Svarbu, kad įkrova ir žuvų tankis (apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje) atitiktų naudojamą bandymų rūšį (žr. 2 priedėlį). 19. Po 48 h stabilizacijos laikotarpio, registruojamas gaištamumas ir taikomi tokie kriterijai: — populiacijos gaištamumas per septynias paras yra didesnis kaip 10 % – visa partija atmetama; — jei populiacijos gaištamumas per septynias paras 5–10 %, aklimatizuojama dar septynias paras ir, jei gaištamumas per kitas septynias paras didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama; — populiacijos gaištamumas per septynias paras yra mažesnis kaip 5 % – partija priimama. 20. Aklimatizacijos, parengiamuoju arba veikimo chemine medžiaga laikotarpiais žuvys neturėtų būti gydomos nuo ligų. Parengiamasis laikotarpis ir žuvų atranka 21. Rekomenduojama parengiamojo laikotarpio trukmė – viena ar dvi savaitės, jo metu gyvūnai laikomi induose, kurie būtų panašūs į naudojamus atliekant patį bandymą. Visą laikymo laikotarpį ir veikimo chemine medžiaga tarpsniu žuvys turėtų būti maitinamos iki soties. Veikimo tarpsnis pradedamas iš laboratorijos turimų poravimuisi subrendusių gyvūnų atsargų atrenkant lytiškai dimorfiškas (pvz., turinčias aiškius antrinius lytinius požymius, kurie juodosios drūtagalvės rainės ir medakos atveju yra matomi) ir aktyviai neršiančias suaugusias žuvis. Tik dėl bendrosios orientacijos (nevertinant atskirai nuo stebimos konkrečios žuvų partijos tikrosios reprodukcinės būklės) juodosios drūtagalvės rainės turėtų būti maždaug 20 (± 2) savaičių amžiaus, darant prielaidą, kad visą savo gyvavimo laikotarpį jos augo 25 ± 2 °C temperatūroje. Japoninės medakos turėtų būti maždaug 16 (± 2) savaičių amžiaus, darant prielaidą, kad visą savo gyvavimo laikotarpį jos augo 25 ± 2 °C temperatūroje. Zebrinės danijos turėtų būti maždaug 16 (± 2) savaičių amžiaus, darant prielaidą, kad visą savo gyvavimo laikotarpį jos buvo auginamos 26 ± 2 °C temperatūroje. Parengiamuoju veikimo tarpsniu ikrų gamyba turėtų būti vertinama kasdien. Nerštą rekomenduojama stebėti visuose kartotinių ėminių induose prieš pradedant veikimo bandomąja medžiaga tarpsnį. Šioje stadijoje negalima pateikti pageidautinų kiekybinių kasdienio neršto duomenų, tačiau yra įprasta stebėti, kad kiekvienos rūšies vidutinis nerštas yra > 10 ikrų/patelei/per parą. Reikėtų naudoti atsitiktinio išdėstymo blokinę schemą, kai kartotiniai ėminiai atsitiktinai priskiriami įvairioms bandymų dozėms pagal ikrų gamybos išeigą, kad būtų užtikrintas subalansuotas kartotinių ėminių paskirstymas. BANDYMO SCHEMA 22. Naudojami trijų bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos verčių ėminiai, taip pat vienas (vandens) kontrolinis ėminys ir, jei reikia, vienas tirpiklio kontrolinis ėminys. Duomenys gali būti analizuojami, kad būtų nustatyti statistiškai reikšmingi chemine medžiaga apdorotų ir kontrolinių ėminių atsako skirtumai. Šie analizės duomenys suteikia informacijos apie tai, ar reikia atlikti papildomus ilgesnės trukmės cheminės medžiagos bandymus, siekiant nustatyti nepageidaujamą poveikį (t. y. išgyvenamumui, vystymuisi, augimui ir reprodukcijai), o ne tik naudoti šiuos duomenis rizikai vertinti (25). 23. 21-ą bandymų parą imami kiekvienos bandomosios medžiagos dozės (penki patinai ir penkios patelės dviejuose kartotinių ėminių induose) ir kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) zebrinės danijos patinų ir patelių ėminiai vitelogenino kiekiui nustatyti. 21-ą bandymų parą imami kiekvienos bandomosios medžiagos dozės (trys patinai ir trys patelės keturiuose kartotinių ėminių induose) ir kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) medakos patinų ir patelių ėminiai vitelogenino kiekiui ir antriniams lytiniams požymiams nustatyti. 21-ą parą imami kiekvienos bandomosios medžiagos dozės (du patinai ir keturios patelės keturiuose kartotinių ėminių induose) ir kontrolinio (-ių) ėminio (-ių) juodosios drūtagalvės rainės patinų ir patelių ėminiai vitelogenino kiekiui ir antriniams lytiniams požymiams nustatyti. Būtina kiekybiškai nustatyti vislumą, o lytinės liaukos fiksuojamos su visu kūnu arba išpjautos, kad, jei reikia, būtų galima atlikti histopatologinį įvertinimą. Bandymų koncentracijos verčių parinkimas 24. Šiame bandyme didžiausia bandymo koncentracija turėtų atitikti didžiausią toleruojamą koncentraciją (DTK), nustatytą atliekant ribinį bandymą arba pagal kitus toksiškumo duomenis, arba 10 mg/l ar didžiausio tirpumo vandenyje koncentracija, jei ji mažesnė. DTK apibrėžiama kaip cheminės medžiagos didžiausia bandymo koncentracija, kuriai esant žuvų gaištamumas yra mažesnis nei 10 %. Taikant tokį metodą, daroma prielaida, kad yra empiriniai ūmaus toksiškumo ar kiti toksiškumo duomenys, pagal kuriuos galima apskaičiuoti DTK. DTK gali būti sunku tiksliai nustatyti, todėl paprastai reikia profesinio sprendimo. 25. Reikia naudoti ne mažiau kaip tris bandymų koncentracijos vertes, kurių skirtumo pastovus faktorius būtų ne didesnis kaip 10, ir skiedimo vandens kontrolinį ėminį. Rekomenduojamas faktorių intervalas yra nuo 3,2 iki 10. PROCEDŪRA Bandymų žuvų atranka ir svėrimas 26. Svarbu, kad žuvų masės skirtumas bandymų pradžioje būtų kuo mažesnis. Šiam bandymui atlikti rekomenduojamų įvairių žuvų rūšių tinkamo dydžio ribos pateiktos 2 priedėlyje. Bandymams naudotos visos žuvų partijos patinų ir patelių atskiro gyvūno masė bandymo pradžioje, jei įmanoma, neturėtų skirtis nuo tos pačios lyties masės aritmetinio vidurkio daugiau kaip ± 20 %. Vidutinei masei nustatyti rekomenduojama prieš bandymą pasverti žuvų populiacijos poėminį. Veikimo sąlygos Trukmė 27. Bandymo trukmė po parengiamojo laikotarpio – 21 para. Rekomenduojama parengiamojo laikotarpio trukmė – viena arba dvi savaitės. Maitinimas 28. Siekiant palaikyti gerą kūno būklę, žuvis reikėtų maitinti tinkamu maistu iki soties (2 priedėlis) ir pakankamai dažnai. Reikėtų imtis priemonių išvengti mikrobų dauginimosi ir vandens drumstumo. Apskritai rekomenduojama paros davinį padalyti į dvi ar tris lygias dalis, kad žuvys maisto davinį gautų kelis kartus per parą, bet ne dažniau kaip kas tris valandas. Priimtinas vienas didesnis davinys – ypač savaitgaliais. Žuvų nereikėtų maitinti 12 h prieš ėminių ėmimą ar skrodimą. 29. Reikėtų patikrinti, ar žuvų pašare nėra teršalų, pvz., chloro organinių pesticidų, policiklinių aromatinių angliavandenilių (PAA) ar polichlorintųjų bifenilų (PCB). Reikėtų vengti maisto, kuriame būtų didesnis fitoestrogenų kiekis, nes taip būtų iškreiptas tyrimo atsakas į žinomą estrogenų agonistą (pvz., 17-beta estradiolį). 30. Nesuėstą maistą ir išmatas iš bandymo indų reikėtų šalinti bent du kartus per savaitę, pvz., kruopščiai valant kiekvienos talpyklos dugną siurbliu. Šviesa ir temperatūra 31. Šviesiojo laikotarpio trukmė ir vandens temperatūra turėtų atitikti bandymo rūšį (žr. 2 priedėlį). Analizinių nustatymų ir matavimų dažnumas 32. Prieš veikimo bandomąja medžiaga laikotarpio pradžią reikėtų įsitikinti, ar cheminės medžiagos tiekimo sistema veikia tinkamai. Reikėtų turėti visus reikiamus analizės metodus, taip pat turėti pakankamai duomenų apie cheminės medžiagos stabilumą bandymų sistemoje. Atliekant bandymą, bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vertės reguliariais intervalais nustatomos taip: skiediklio ir toksinės cheminės medžiagos srautą pageidautina tikrinti kasdien, bet ne rečiau kaip du kartus per savaitę, ir visą bandymų laiką neturėtų skirtis daugiau kaip 10 %. Faktinę bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją visuose induose rekomenduojama matuoti bandymo pradžioje, o vėliau – kas savaitę. 33. Rekomenduojama rezultatus pagrįsti išmatuotomis koncentracijos vertėmis. Tačiau, jei bandomosios cheminės medžiagos koncentracija tirpale per visą bandymą buvo tinkamai užtikrinama ± 20 % tikslumu, rezultatus galima pagrįsti nominaliosiomis arba išmatuotomis vertėmis. 34. Ėminius gali tekti filtruoti (pvz., per 0,45 μm akučių filtrą) ar centrifuguoti. Jei reikia atskirti, rekomenduojama procedūra yra centrifugavimas. Tačiau, jei filtras bandomosios medžiagos neadsorbuoja, priimtinas būtų ir filtravimas. 35. Atliekant bandymą, visuose bandymo induose bent kartą per savaitę reikėtų matuoti ištirpusį deguonį, temperatūrą ir pH. Bendras kietumas ir šarmingumas kontrolinių ėminių induose ir viename inde su didžiausia koncentracija turėtų būti matuojami bent kartą per savaitę. Bent viename bandymų inde temperatūrą reikėtų kontroliuoti nuolat. Stebėjimai 36. Tyrimo laikotarpiu arba jam pasibaigus vertinami tam tikri bendrieji (pvz., išgyvenamumo) ir pagrindiniai biologiniai atsakai (pvz., vitelogenino koncentracija). Kasdien reikia atlikti kiekybinę vislumo stebėseną. Šių vertinamųjų baigčių matavimas ir įvertinimas bei jų naudingumas aprašyti toliau. Išgyvenamumas 37. Bandymo laikotarpiu žuvis reikėtų tirti ir jų gaištamumą registruoti kasdien, o nugaišusias žuvis reikėtų kuo greičiau pašalinti. Kontrolinių ar apdorojamų ėminių induose nugaišusių žuvų nereikėtų pakeisti kitomis. Bandymų metu nugaišusių žuvų lytis turėtų būti nustatyta atliekant makroskopinį lytinių liaukų patikrinimą. Elgesys ir išvaizda 38. Reikėtų atkreipti dėmesį į visas elgesio anomalijas (palyginti su kontrolinių ėminių gyvūnais); tai galėtų būti bendrojo toksiškumo požymiai, įskaitant hiperventiliaciją, nekoordinuotą plaukimą, pusiausvyros praradimą ir netipišką nejudamumą ar mitybą. Taip pat reikėtų atkreipti dėmesį į papildomas išorines anomalijas (pvz., kraujavimą, spalvos pakeitimą). Atliekant duomenų vertinimą, į tokius toksiškumo požymius reikėtų ypač atkreipti dėmesį, nes jie gali rodyti tokias koncentracijos vertes, kurioms esant biologiniai endokrininio aktyvumo žymenys nėra patikimi. Atliekant tokius elgesio stebėjimus, taip pat galima gauti naudingos kokybinės informacijos, pagal kurią ateityje būtų galima nustatyti galimus žuvų bandymų reikalavimus. Pvz., stebint juodąsias drūtagalves raines, pastebėta, kad androgenų veikiamiems normaliems patinams arba patino požymių įgijusioms patelėms pasireiškia teritorinė agresija; stebint zebrines danijas, nustatyta, kad jas veikiant estrogenais arba antiandrogenais sumažėja arba sutrinka joms būdingo su pirmais saulės spinduliais prasidedančio poravimosi ir neršto aktyvumas. 39. Dėl to, kad kai kurie išvaizdos aspektai (visų pirma, spalva) apdorojant žuvis gali greitai pasikeisti, prieš išimant žuvis iš bandymo sistemos svarbu atlikti kokybinius stebėjimus. Ligšiolinė juodosios drūtagalvės rainės stebėjimo patirtis rodo, kad kai kurios endokrininę sistemą veikiančios cheminės medžiagos iš pradžių gali sukelti šių išorės savybių pokyčius: kūno spalvos (šviesios ar tamsios), spalvų rašto (t. y. vertikalių dryžių atsiradimą) ir kūno formos (t. y. galvos ir krūtinės srities formos). Todėl žuvų fizinę išvaizdą reikia stebėti viso bandymo metu ir jo pabaigoje. Vislumas 40. Kasdienius kiekybinius neršto duomenis reikėtų registruoti pagal kartotinius ėminius. Ikrų gamybą reikėtų registruoti kaip ikrų skaičių vienai išgyvenusiai patelei per parą pagal kartotinius ėminius. Ikrai iš bandymų kamerų pašalinami kasdien. Neršto substratus reikėtų dėti į juodosios drūtagalvės rainės ir zebrinės danijos bandymų kamerą, kad žuvys galėtų neršti normaliomis sąlygomis. 4 priedėlyje pateikta papildoma informacija apie rekomenduojamus zebrinės danijos (4A priedėlis) ir juodosios drūtagalvės rainės (4B priedėlis) neršto substratus. Nemanoma, kad neršto substratas yra būtinas medakai. Humaniškas žuvų numarinimas 41. 21 parą, t. y. pasibaigus veikimo laikotarpiui, žuvį reikėtų numarinti atitinkamu kiekiu 100–500 mg/l trikaino (trikaino metansulfonato, metakaino, MS-222 (CAS 886-86-2)) tirpalu 300 mg/l NaHCO3 (natrio hidrokarbonato, CAS 144-55-8) buferiniame tirpale, skirtu gleivinės dirginimui sumažinti; vitelogenino kiekiui nustatyti imami kraujo ar audinių ėminiai, kaip paaiškinta skirsnyje Vitelogeninas. Antrinių lytinių požymių stebėjimas 42. Kai kurios endokrininę sistemą veikiančios cheminės medžiagos gali sukelti rūšims būdingų antrinių lytinių požymių (juodosios drūtagalvės rainės patino poravimosi gumburėlių, medakos patino spenelinių ataugų skaičiaus) pokyčius. Visų pirma, dėl pagal tam tikrus mechanizmus veikiančių cheminių medžiagų priešingos lyties gyvūnams gali atsirasti anomalūs antriniai lytiniai požymiai; pvz., veikiant androgenų receptorių agonistams, tokiems kaip trenbolonas, metiltestosteronas ir dihidrotestosteronas, juodosios drūtagalvės rainės patelėms gali išsivystyti aiškiai išreikšti poravimosi gumburėliai, o medakos patelėms – spenelinės ataugos (11, 20, 21). Taip pat buvo pranešimų, kad estrogenų receptorių agonistai gali sumažinti juodosios drūtagalvės rainės suaugusių patinų poravimosi gumburėlių skaičių ir sprando pagalvėlės dydį (26, 27). Atliekant tokius makroskopinius morfologinius stebėjimus, galima gauti naudingos kokybinės ir kiekybinės informacijos, pagal kurią ateityje būtų galima nustatyti galimus žuvų bandymų reikalavimus. Juodosios drūtagalvės rainės poravimosi gumburėlių ir medakos spenelinių ataugų skaičių ir dydį galima nustatyti tiesiogiai, atliekant bandymą, arba tikslesniu būdu – iš išsaugotų bandinių. Rekomenduojamos juodosios drūtagalvės rainės ir medakos antrinių lytinių požymių vertinimo procedūros pateiktos 5A ir 5B priedėliuose. Vitelogeninas (VTG) 43. Kraujas paimamas iš uodegos arterijos ar venos, naudojant heparinizuotą kapiliarinį mikrohematokrito vamzdelį, arba švirkštu atliekant širdies punkciją. Atsižvelgiant į žuvies dydį, iš kiekvienos juodosios drūtagalvės rainės paprastai paimama po 5–60 μl, o iš kiekvienos zebrinės danijos – po 5–15 μl kraujo. Plazma nuo kraujo atskiriama centrifugavimu ir iki vitelogenino nustatymo analizės kartu su proteazės inhibitoriais laikoma – 80 °C temperatūroje. Arba kaip audinių šaltinis medakos VTG kiekiui nustatyti naudojamos kepenys, o zebrinės danijos atveju gali būti naudojamas galvos ir (arba) uodegos homogenatas (6 priedėlis). VTG reikėtų matuoti taikant patvirtintą homologinį IFA metodą, naudojant homologinį VTG standartą ir homologinius antikūnus. Rekomenduojama taikyti metodą, kuriuo VTG kiekį plazmoje galima aptikti ng/ml eilės (arba audiniuose – ng/mg eilės), nes tai yra foninė koncentracija chemine medžiaga neapdoroto žuvies patino organizme. 44. Vitelogenino analizės kokybės kontrolė atliekama naudojant cheminių medžiagų etalonus ir atliekant tuščiųjų ėminių bei ne mažiau kaip dviejų kartotinių ėminių analizę. Kiekvienam IFA metodui reikėtų atlikti matricos efekto (ėminio skiedimo efekto) bandymą mažiausiam ėminio skiedimo faktoriui nustatyti. Kiekvienoje VTG tyrimams naudojamoje IFA plokštelėje turėtų būti šie kokybės kontrolės ėminiai: bent šeši kalibravimo etalonai, kurie aprėptų numatomų vitelogenino koncentracijos verčių diapazoną, ir bent vienas tuščiasis nespecifinio surišimo ėminys (analizuojami du kartotiniai ėminiai). Šių tuščiųjų ėminių optinis tankis turėtų būti mažesnis nei 5 % didžiausios koncentracijos kalibravimo etalono optinio tankio. Analizuojamos bent dvi alikvotinės kiekvienos skiedimo koncentracijos ėminio (kartotiniai duobučių ėminiai). Jei kartotinių duobučių ėminių koncentracija skiriasi daugiau kaip 20 %, analizę reikėtų pakartoti. 45. Kalibravimo kreivių koreliacijos koeficientas (R2) turėtų būti didesnis kaip 0,99. Tačiau didelės koreliacijos nepakanka tiksliai visų intervalų koncentracijos prognozei užtikrinti. Reikėtų užtikrinti ne tik pakankamai didelę kalibravimo kreivės verčių koreliaciją, bet ir pagal kalibravimo kreivę apskaičiuota kiekvieno etalono koncentracija turėtų būti 70–120 % jo nominaliosios koncentracijos vertės. Jei nominaliosios koncentracijos vertės tolsta nuo kalibravimo kreivės regresijos linijos (pvz., esant mažesnei koncentracijai), gali tekti kalibravimo kreivę padalyti į mažų ir didelių verčių intervalus arba taikyti netiesinį modelį, kad būtų galima tinkamai priderinti optinio tankio duomenis. Jei kreivė padalijama, abiejų tiesiųjų atkarpų R2 > 0,99. 46. Aptikimo riba apibrėžiama kaip mažiausios koncentracijos analizės etalono koncentracija, o kiekybinio nustatymo riba – kaip mažiausios koncentracijos analizės etalono koncentracija, padauginta iš mažiausio skiedimo faktoriaus. 47. Kiekvieną dieną atliekant VTG tyrimus analizuojamas sodrintas ėminys, paruoštas naudojant tyrimų serijos pamatinį etaloną (7 priedėlis). Numatomos ir išmatuotos koncentracijos verčių santykis pateikiamas ataskaitoje kartu su kiekvienos tą dieną atliktų tyrimų grupės rezultatais. Lytinių liaukų histopatologijos įvertinimas 48. Priežiūros institucijos gali pareikalauti atlikti lytinių liaukų histopatologijos įvertinimą, kad būtų ištirtas PHL ašies tikslinis organas, jį paveikus chemine medžiaga. Šiuo tikslu lytines liaukos fiksuojamos su visu kūnu arba išpjautos. Kai reikalaujama atlikti histopatologiją, vertinant bandomosios cheminės medžiagos endokrininį aktyvumą bus ieškoma su endokrinine sistema susijusių specifinių lytinių liaukų atsakų. Šiuos diagnostinius atsakus dažniausiai sudaro sėklidžių oocitų buvimas, Leidigo ląstelių hiperplazija, trynio susidarymo sulėtėjimas, padidėjusi spermatogonija ir perifolikulinė hiperplazija. Kitų lytinių liaukų pažeidimų, pvz., oocitų atrezijos, sėklidžių išsigimimo ir stadijos pasikeitimų priežastys gali būti įvairios. Rekomendaciniame dokumente apie žuvų lytinių liaukų histopatologiją nurodytos procedūros, kurios būtų taikomos atliekant lytinių liaukų preparavimą, fiksavimą, pjūvių gamybą ir histopatologinį įvertinimą (22). DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS Biologinių žymenų atsako vertinimas taikant dispersinės analizės (ANOVA) metodą 49. Nustatant galimą cheminės medžiagos aktyvumą endokrininės sistemos atžvilgiu lyginami apdorotų ir kontrolinių grupių atsakai taikant dispersinės analizės (ANOVA) metodą. Jei naudojamas tirpiklio kontrolinis ėminys, reikėtų atlikti tinkamą statistinę skiedimo vandens ir tirpiklio kontrolinių ėminių skirtumo analizę atsižvelgiant į visas vertinamąsias baigtis. Rekomendacijas dėl praskiesto vandens ir tirpiklio kontrolinių ėminių duomenų apdorojimo atliekant paskesnę statistinę analizę, galima rasti EBPO dokumente (2006c) (28). Visi biologinio atsako duomenys turėtų būti analizuojami ir pateikiami atskirai pagal lytį. Jei parametriniams metodams taikyti reikiamos prielaidos nepasitvirtina, t. y. nenormalus pasiskirstymas (pvz., Shapiro-Wilk kriterijus) ar nevienalytė dispersija (Bartlett kriterijus arba Levene kriterijus), reikėtų atsižvelgti į galimybę transformuoti duomenis dispersijoms homogenizuoti prieš atliekant ANOVA arba svertinę ANOVA. Jei dozės ir atsako priklausomybė yra nemonotoniška, daugybiniam lyginimui paporiui gali būti taikomas Dunnett kriterijus (parametrinis) arba Mann-Whitney kriterijus su Bonferroni pataisa (neparametrinis). Galima taikyti kitus kriterijus (pvz., Jonckheere-Terpstra kriterijų arba Williams kriterijų), jei dozės ir atsako priklausomybė yra maždaug monotoniška. Siekiant padėti apsispręsti, kurį statistinį kriterijų geriausia taikyti, 8 priedėlyje pateikta statistinė struktūrinė diagrama. Papildomos informacijos taip pat galima gauti iš OECD dokumento Dabartiniai ekotoksiškumo duomenų statistinės analizės metodai (28). Rezultatų ataskaita 50. Tyrimo duomenis turėtų sudaryti ši informacija: Bandymus atliekanti įstaiga: — atsakingi darbuotojai ir jų pareigos atliekant tyrimą; — kiekviena laboratorija turėtų įrodyti savo kvalifikaciją, naudodama reprezentatyviųjų cheminių medžiagų grupę. Bandomoji cheminė medžiaga: — bandomosios cheminės medžiagos apibūdinimas; — fizinė būsena ir atitinkamos fizikinės ir cheminės savybės; — bandymų koncentracijos verčių tirpalų paruošimo metodas ir dažnumas; — informacija apie stabilumą ir biologinį skaidumą. Tirpiklis: — tirpiklio apibūdinimas (tipas, naudojama koncentracija); — tirpiklio pasirinkimo pagrindimas (jei ne vanduo). Bandymų gyvūnai: — rūšis ir veislė; — tiekėjas ir speciali tiekėjo įranga; — žuvų amžius bandymų pradžioje ir reprodukcinė ar neršto būklė; — išsamūs duomenys apie gyvūnų aklimatizavimo procedūrą; — žuvų (iš veislinių žuvų poėminio) kūno masė veikimo pradžioje. Bandymų sąlygos — taikyta bandymų procedūra (bandymų tipas, įkrova, įkrovos tankis ir kt.); — pradinių tirpalų paruošimo metodas ir srautas; — nominaliosios bandymo koncentracijos vertės, kas savaitę matuojamos bandymo tirpalų koncentracijos vertės, taikomas analizės metodas, bandymų indams gauti išmatuotų verčių vidurkiai bei standartiniai nuokrypiai ir įrodymai, kad matavimai atitinka bandomosios cheminės medžiagos koncentraciją tikrajame tirpale; — skiedimo vandens savybės (įskaitant pH, kietumą, šarmingumą, temperatūrą, ištirpusio deguonies koncentraciją, liekamojo chloro kiekį, bendrąją organinę anglį, suspenduotų kietųjų dalelių kiekį ir visus kitus atliktus matavimus); — bandymų indų vandens kokybė, pH, kietumas, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija; — išsami informacija apie maitinimą (pvz., maisto (-ų) rūšis, šaltinis, duodamas kiekis, maitinimo dažnumas ir, jei yra, atitinkamų teršalų (polichlorintųjų bifenilų, policiklinių aromatinių angliavandenilių ir chloro organinių pesticidų) analizės rezultatai. Rezultatai: — įrodymai, kad kontroliniai ėminiai atitiko bandymo priimtinumo kriterijus; — duomenys apie gaištamumą induose su kuria nors bandymo koncentracija ir kontroliniame inde; — taikyti statistiniai analizės metodai, duomenų apdorojimas ir taikomų metodų pagrindimas; — bendrųjų morfologinių stebėjimų duomenys, įskaitant apie antrinius lytinius požymius, ikrų gamybą ir VTG; — duomenų analizių rezultatai, pageidautina – lentelių ir grafikų forma; — neįprastų žuvų reakcijų dažnumas ir bandomosios cheminės medžiagos sukeltas matomas poveikis. BANDYMŲ REZULTATŲ AIŠKINIMO IR PRIĖMIMO REKOMENDACIJOS 51. Šiame skirsnyje pateikti keli aspektai, į kuriuos reikia atsižvelgti aiškinant įvairių vertinamųjų baigčių matavimo atliekant bandymą rezultatus. Rezultatus reikėtų vertinti atsargiai, jei atrodo, kad bandomoji cheminė medžiaga sukėlė akivaizdų toksiškumą arba paveikė bendrąją bandymo gyvūno būklę. 52. Nustatant bandymo koncentracijos verčių intervalą, reikėtų stengtis neviršyti didžiausios toleruojamos koncentracijos, kad duomenų aiškinimas būtų prasmingas. Svarbu naudoti bent vieną cheminės medžiagos koncentraciją, dėl kurios neatsiranda toksinio poveikio požymių. Ligos ir toksinio poveikio požymius reikėtų atidžiai vertinti ir pateikti ataskaitoje. Pvz., gali būti taip, kad VTG gamybai patelių organizme įtakos taip pat gali turėti bendrasis toksiškumas, o ne endokrininio toksinio poveikio mechanizmai (pvz., toksinis poveikis kepenims). Tačiau poveikio aiškinimas gali tapti patikimesnis naudojant kitas cheminės medžiagos dozes, kurios nėra susijusios su sisteminiu toksiškumu. 53. Yra keli aspektai, kuriuos reikia apsvarstyti prieš priimant bandymų rezultatus. Reikėtų orientuotis pagal aiškų VTG koncentracijos kontrolinėse patinų ir patelių grupėse skirtumą, kuris juodosios drūtagalvės rainės bei zebrinės danijos atveju turėtų būti maždaug trijų eilių, o medakos – maždaug vienos eilės. Verčių, kurios pasitaiko kontrolinėse ir doze veikiamose grupėse, intervalo pavyzdžiai pateikti tinkamumo patvirtinimo ataskaitose (1, 2, 3, 4). Esant dideliems VTG kiekiams kontrolinių patinų organizme, galėtų sumažėti bandymo jautris ir gebėjimas aptikti silpnus estrogenų agonistus. Esant mažiems VTG kiekiams kontrolinių patelių organizme, galėtų sumažėti bandymo jautris ir gebėjimas aptikti aromatazės inhibitorius ir estrogenų antagonistus. Šioms rekomendacijoms parengti buvo atlikti tinkamumo patvirtinimo tyrimai. 54. Kalbant apie ikrų gamybos kiekybinį įvertinimą, jų kiekis gali labai stipriai skirtis (variacijos koeficientas (VK) gali būti 20–60 %), ir tai gali mažinti bandymo gebėjimą aptikti reikšmingą ikrų gamybos sumažėjimą, jei jis yra mažesnis kaip 70 %, VK artėjant prie 50 % ar didesnės vertės. Kai VK yra mažesnių verčių (apie 20–30 %), bandymo galia (80 %) bus pakankama 40–50 % ikrų gamybos sumažėjimui aptikti. Bandymų su juodąja drūtagalve raine schema, naudojant keturis kartotinius vienos bandomosios medžiagos dozės ėminius užtikrintų didesnę galią vislumo vertinamajai baigčiai palyginti su bandymų schema naudojant tik du kartotinius ėminius. 55. Jei laboratorija anksčiau nė karto nebuvo atlikusi tokio bandymo arba buvo padaryti reikšmingi pakeitimai (pvz., pakeista žuvų veislė ar tiekėjas), patartina atlikti techninės kvalifikacijos tyrimą. Rekomenduojama naudoti chemines medžiagas, kurios veiktų keliais būdais arba turėtų poveikį kelioms bandymo vertinamosioms baigtims. Praktiniu požiūriu kiekvienai laboratorijai rekomenduojama kurti savo istorinių kontrolinių ėminių duomenų patinams ir patelėms bazę ir atlikti estrogeninio aktyvumo bandymus su teigiama kontroline chemine medžiaga (pvz., 17β-estradioliu, 100 ng/l, arba žinomu silpnu agonistu), dėl kurios padidėja VTG kiekis žuvų patinų organizme, su aromatazę slopinančia teigiama kontroline chemine medžiaga (pvz., fadrozolu arba prochlorazu, 300 μg/l), dėl kurios sumažėja VTG kiekis žuvų patelių organizme, ir su androgeninio aktyvumo teigiama kontroline chemine medžiaga (pvz., 17β-trenbolonu, 5 ng/l), dėl kurios juodosios drūtagalvės rainės ir medakos patelės įgauna antrinių lytinių požymių. Visus šiuos duomenis galima palyginti su turimais tinkamumo patvirtinimo tyrimų (1, 2, 3) duomenimis, kad būtų užtikrinta laboratorijos kvalifikacija. 56. Apskritai VTG matavimus reikėtų laikyti teigiamais, jei VTG kiekis statistiškai reikšmingai padidėja patinų organizme (p < 0,05) arba statistiškai reikšmingai sumažėja patelių organizme (p < 0,05) bent didžiausiai bandytai dozei, palyginti su kontroline grupe, ir nėra bendrojo toksiškumo požymių. Teigiamas rezu