8)

B dalis papildoma šiais skyriais: „B.63 TOKSIŠKUMO REPRODUKCIJAI IR (ARBA) VYSTYMUISI ATRANKOS BANDYMAS ĮVADAS 1. Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) 421 (2016). EBPO cheminėms medžiagoms bandyti skirtos gairės periodiškai peržiūrimos, atsižvelgiant į mokslo pažangą. Pradinės atrankinio tyrimo bandymo gairės 421 buvo priimtos 1995 m. atsižvelgiant į „Parengiamojo toksiškumo reprodukcijai atrankos bandymo“ protokolą, aptartą dviejuose ekspertų pasitarimuose Londone 1990 m. (1) ir Tokijuje 1992 m. (2). 2. Šis bandymo metodas yra atnaujintas įtraukiant vertinamąsias baigtis, susijusias su endokrininę sistemą ardančiomis medžiagomis, ir jis yra tąsa 1998 m. EBPO iniciatyva pradėto didelės svarbos darbo, skirto peržiūrėti esamas gaires ir parengti naujas endokrininę sistemą galimai ardančių medžiagų atrankos ir bandymo gaires (3). Pavyzdžiui, EBPO TG 407 (28 dienų graužikų kartotinės dozės toksiškumas per virškinamąjį traktą, šio priedo B.7 skyrius) buvo išplėstos 2008 m., įtraukiant parametrus, tinkamus bandomųjų cheminių medžiagų endokrininiam aktyvumui aptikti. TG 421 atnaujinimo tikslas buvo įtraukti kai kurias vertinamąsias baigtis, susijusias su endokrininę sistemą ardančiomis medžiagomis, į atrankai skirtas bandymo gaires, kai ekspozicijos laikotarpiai aprėpia kai kuriuos jautrius vystymosi laikotarpius (prenatalinius ar ankstyvuosius postnatalinius laikotarpius). 3. Į TG 421 buvo įtrauktos pasirinktos papildomos vertinamosios baigtys, susijusios su endokrininę sistemą ardančiomis medžiagomis, taip pat TG 443 (Išplėstinis toksiškumo vienos kartos dauginimuisi bandymas, šio priedo B.56 skyrius) dalis, atsižvelgiant į galimybių studiją, susijusią su baigčių įtraukimo moksliniais ir techniniais klausimais, taip pat su jų įtraukimo į tyrimą bandymų schemos reikiamais pakeitimais (4). 4. Šis bandymo metodas skirtas gauti ribotai informacijai apie bandomosios cheminės medžiagos poveikį patinų ir patelių reprodukcijos charakteristikoms, pvz., lytinių liaukų funkcijai, poravimosi elgesiui, apvaisinimui, vystymuisi ir palikuonių atsivedimui. Jis nėra esamų B.31, B.34, B.35 arba B.56 bandymo metodų alternatyva arba pakeitimas. PRADINIAI ASPEKTAI 5. Šis atrankos bandymo metodas gali būti taikomas, jei reikia gauti pradinę informaciją apie galimą poveikį reprodukcijai ir (arba) vystymuisi pradiniame cheminių medžiagų toksikologinių savybių vertinimo etape arba apie susirūpinimą keliančias chemines medžiagas. Jis taip pat gali būti taikomas kaip esamų cheminių medžiagų, apie kurias yra labai mažai toksikologinės informacijos arba jos nėra, pradinių atrankos bandymų rinkinio dalis, kaip dozės intervalo nustatymo tyrimas, atliekant išsamesnius reprodukcijos ir (arba) vystymosi tyrimus, arba jei laikoma, kad jis galėtų tikti. Atliekant tyrimą reikėtų vadovautis pagrindiniais principais ir aspektais, pateiktais EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 19 dėl saugos įvertinimui naudojamų bandymo gyvūnų klinikinių požymių, kaip humaniško poveikio vertinamųjų baigčių, atpažinimo, vertinimo ir naudojimo (5). 6. Taikant šį bandymo metodą negaunama išsamios informacijos apie visus reprodukcijos ir vystymosi aspektus. Visų pirma, jis suteikia tik ribotas prenatalinės ekspozicijos postnatalinių reiškinių arba postnatalinės ekspozicijos metu galimai sukelto poveikio aptikimo priemones. Dėl (be kitų priežasčių) palyginti nedidelio gyvūnų skaičiaus dozių grupėse, vertinamųjų baigčių atrankumo ir trumpos tyrimo trukmės šiuo metodu nebus gauta įrodymų, kad būtų galima tvirtai pareikšti apie poveikio nebuvimą. Be to, nesant kitų toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vystymuisi bandymų duomenų, teigiami rezultatai yra naudingi pradiniam pavojingumo vertinimui ir padeda priimti sprendimus dėl papildomų bandymų būtinumo ir trukmės. 7. Rezultatus, gautus taikant su endokrinine sistema susijusius parametrus, reikėtų vertinti atsižvelgiant į EBPO konceptualią endokrininę sistemą ardančių cheminių medžiagų bandymo ir vertinimo sistemą (6). Patobulintos EBPO TG 421 pagal šią konceptualią sistemą yra 4 lygmens in vivo bandymas, kuriuo gaunami duomenys apie neigiamą poveikį su endokrinine sistema susijusioms vertinamosioms baigtims. Tačiau vien tik pats endokrininės sistemos signalas negali būti laikomas pakankamu įrodymu, kad bandomoji cheminė medžiaga yra endokrininę sistemą ardanti medžiaga. 8. Taikant šį bandymo metodą, bandomoji cheminė medžiaga duodama per burną. Gali prireikti pakeitimų, jei naudojami kiti ekspozicijos būdai. 9. Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį. 10. Vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje. BANDYMO PRINCIPAS 11. Kelioms patinų ir patelių grupėms duodamos skirtingos bandomosios cheminės medžiagos dozės. Patinai turėtų gauti dozę ne trumpiau kaip keturias savaites, iki pat numarinimo, įskaitant dieną prieš numatytą numarinimą (tai sudaro ne mažiau kaip dvi savaitės iki poravimosi, poravimosi laikotarpis ir maždaug dvi savaitės po poravimosi). Atsižvelgiant į ribotą dozės davimo patinams laikotarpį, vaisingumas gali ir nebūti tam tikras jautrus toksiškumo sėklidėms rodiklis. Todėl svarbu atlikti išsamų histologinį sėklidžių tyrimą. Manoma, kad dviejų savaičių prieš poravimąsi dozės davimo laikotarpio ir vėlesnių poravimosi ir (arba) vaisingumo stebėjimo rezultatų derinio, esant ne trumpesniam kaip keturių savaičių bendrajam dozės davimo laikotarpiui, ir toliau atlikto išsamaus patinų lytinių liaukų histopatologijos tyrimo pakanka, kad būtų galima aptikti daugumą patinų vaisingumui ir spermatogenezei įtaką darančių veiksnių. 12. Patelės turėtų gauti dozę visą tyrimo laikotarpį. Jį sudaro dvi savaitės iki poravimosi (turint tikslą aprėpti bent du pilnus rujos ciklus), skirtingas laikas iki apvaisinimo, vaikingumo trukmė ir mažiausiai trylika dienų po atsivedimo, iki pat numarinimo, įskaitant dieną prieš numatytą numarinimą. 13. Tyrimo trukmė po aklimatizavimo ir rujos ciklo įvertinimo prieš dozės davimą, priklauso nuo patelių vaisingumo ir yra maždaug 63 dienos (mažiausiai 14 dienų prieš poravimąsi (iki) 14 dienų poravimasis, 22 dienų vaikingumas, 13 dienų žindymas). 14. Dozės davimo laikotarpiu gyvūnai atidžiai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Bandymo metu nugaišę arba numarinti gyvūnai skrodžiami, o baigus bandymą numarinami ir skrodžiami išgyvenę gyvūnai. METODO APRAŠYMAS Gyvūnų rūšies parinkimas 15. Taikant šį bandymo metodą numatyta naudoti žiurkes. Jei šiam bandymo metodui nurodyti parametrai tiriami naudojant kitą graužikų rūšį, turėtų būti pateiktas išsamus pagrindimas. Vykdant tarptautinę patvirtinimo programą endokrininę sistemą ardančioms medžiagoms aptikti pagal EBPO TG 407 (atitinka šio priedo B.7 skyrių), vienintelė naudota rūšis buvo žiurkės. Neturėtų būti naudojamos mažo vaisingumo veislės arba veislės, kurioms dažnai pasireiškia vystymosi defektai. Reikėtų naudoti sveikus neapvaisintus gyvūnus, kurie nebuvo naudojami anksčiau atliekant bandymo procedūras. Reikėtų apibūdinti bandymo gyvūnų rūšį, veislę, lytį, masę ir amžių. Tyrimo pradžioje naudojamų gyvūnų masės skirtumas turėtų būti kuo mažesnis ir ne didesnis kaip 20 % kiekvienos lyties gyvūno vidutinės masės. Jei tyrimas atliekamas kaip ilgalaikio ar visos kartos tyrimo parengiamasis tyrimas, būtų gerai abiems tyrimams naudoti tos pačios veislės ir šaltinio gyvūnus. Laikymas ir šėrimas 16. Visos procedūros turėtų atitikti vietinius laboratorinės gyvūnų priežiūros reikalavimus. Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turėtų būti 22 °C (± 3 °). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti ne mažesnė kaip 30 % ir pageidautina, kad būtų ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų stengtis, kad ji būtų 50–60 %. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, 12 h dienos šviesos ir 12 h tamsos. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė tinkamai įmaišyti bandomąją cheminę medžiagą, duodamą pagal šį metodą. 17. Gyvūnai turėtų būti apgyvendinti nedidelėmis tos pačios lyties grupėmis; gyvūnus galima laikyti atskirai, jei tai būtų moksliškai pagrįsta. Laikant grupėmis, viename narvelyje turėtų būti ne daugiau kaip penki gyvūnai. Poravimo procedūros turėtų būti atliekamos šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Vaikingos patelės turėtų būti laikomos atskiruose narveliuose ir turėti gūžtai įsirengti būtinų medžiagų. Žindančios patelės laikomos atskiruose narveliuose su savo palikuoniais. 18. Pašarus reikėtų nuolat analizuoti dėl teršalų buvimo. Pašaro ėminys turėtų būti saugomas, kol bus parengta ataskaita. Gyvūnų ruošimas 19. Sveiki jauni suaugę gyvūnai atsitiktinės atrankos būdu suskirstomi į kontrolines ir apdorojamas grupes. Narvelius reikėtų išdėstyti taip, kad narvelio vietos įtaka būtų kiek įmanoma mažesnė. Gyvūnai unikaliai identifikuojami ir ne mažiau kaip penkias paras iki tyrimo pradžios laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų. Dozių ruošimas 20. Bandomąją cheminę medžiagą rekomenduojama duoti per burną, nebent būtų laikoma, kad labiau tinka kiti davimo būdai. Jei pasirenkamas davimo per burną būdas, bandomoji cheminė medžiaga paprastai duodama per zondą, tačiau bandomąsias chemines medžiagas galima duoti su pašaru arba geriamuoju vandeniu. 21. Jei būtina, bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama tinkamame nešiklyje arba ruošiama jos suspensija. Rekomenduojama pirmenybę teikti vandeniniam tirpalui arba suspensijai, jei įmanoma, vėliau svarstyti galimybę naudoti tirpalą arba emulsiją aliejuje (pvz., kukurūzų) ir tik tada naudoti tirpalus kituose nešikliuose. Jei nešiklis yra ne vanduo, turėtų būti žinomos jo toksiškumo charakteristikos. Reikėtų nustatyti bandomosios cheminės medžiagos stabilumą ir vienalytiškumą nešiklyje. PROCEDŪRA Gyvūnų skaičius ir lytis 22. Rekomenduojama kiekvienos grupės bandymą pradėti turint ne mažiau kaip 10 patinų ir 12–13 patelių. Prieš ekspozicijos pradžią įvertinamas patelių rujos cikliškumas, ir gyvūnai, kurių ciklas nėra 4–5 dienos, neįtraukiami į tyrimą, todėl rekomenduojama turėti papildomų patelių, kad kiekvienoje grupėje liktų 10 patelių. Manoma, kad, išskyrus aiškaus toksinio poveikio atvejį, kiekvienoje grupėje bus mažiausiai 8 vaikingos patelės, ir tai paprastai yra mažiausias priimtinas vaikingų patelių skaičius kiekvienoje grupėje. Tikslas yra gauti pakankamą vaikingų patelių ir palikuonių skaičių, kad būtų galima pagrįstai įvertinti bandomosios cheminės medžiagos gebėjimą daryti poveikį vaisingumui, vaikingumui, patelės ir žindomo palikuonio elgesiui bei F 1 kartos palikuonių augimui ir vystymuisi nuo apvaisinimo iki 13 paros po atsivedimo. Dozavimas 23. Paprastai turėtų būti ne mažiau kaip trys bandymo grupės ir viena kontrolinė grupė. Dozių dydžiai gali būti pagrįsti informacija, gauta atliekant ūmaus toksiškumo bandymus, arba kartotinės dozės tyrimų rezultatais. Išskyrus apdorojimą bandomąja chemine medžiaga, su kontrolinių grupių gyvūnais turėtų būti elgiamasi taip pat, kaip su apdorojimo grupių gyvūnais. Jeigu duodant bandomąją cheminę medžiagą naudojamas nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti didžiausią naudotą nešiklio kiekį. 24. Dozių dydžiai turėtų būti pasirinkti atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo ir (toksiko)kinetinius duomenis. Taip pat reikėtų atsižvelgti į tai, kad vaikingų ir neapvaisintų gyvūnų jautrumas gali skirtis. Didžiausiąją dozę reikėtų pasirinkti turint tikslą sukelti toksinį poveikį, bet ne gyvūno žūtį ar stiprias kančias. Toliau reikėtų pasirinkti mažėjančių dozės dydžių seką, siekiant parodyti su dozavimu susijusį atsaką ir nepastebėto neigiamo poveikio ribą (NOAEL), esant mažiausiai dozei. Mažėjančių dozių dydžiams nustatyti paprastai yra optimalūs dozių skirtumo intervalai nuo dviejų iki keturių kartų, ir dažnai vietoj didelių intervalų tarp dozavimų (pvz., daugiau kaip 10 kartų) geriau naudoti papildomą ketvirtą bandymo grupę. 25. Jei stebimas bendrasis toksiškumas (pvz., mažesnė kūno masė, poveikis kepenims, širdžiai, plaučiams arba inkstams ir kt.) arba kiti pakitimai, kurie gali nebūti toksiškumo atsakais (pvz., mažesnis pašaro vartojimas, kepenų padidėjimas), stebimas poveikis jautrioms endokrininės sistemos vertinamosioms baigtims turėtų būti aiškinamas atsargiai. Ribinis bandymas 26. Jei atliekant per burną duodamos vieno dydžio dozės tyrimą pagal šiam tyrimui aprašytas procedūras, duodama ne mažesnė kaip 1 000 mg/kg kūno masės per parą dozė arba, jei duodama su pašaru ar geriamuoju vandeniu, atitinkamą pašaro ar geriamo vandens procentinę dalį sudaranti dozė nesukelia pastebimo toksinio poveikio ir jei toksinio poveikio nesitikima, atsižvelgiant į giminingos struktūros medžiagoms gautus duomenis, visas bandymas naudojant kelių dydžių dozes gali būti nebūtinas. Ribinis bandymas atliekamas, išskyrus atvejus, kai žmonių ekspozicijos būdas rodo, kad per burną duodamos dozės turi būti didesnės. Jei duodama kitais būdais, pvz., įkvepiama arba dedama ant odos, didžiausią galimą koncentraciją dažnai gali lemti bandomųjų cheminių medžiagų fizikinės ir cheminės savybės. Dozių davimas 27. Gyvūnai gauna bandomosios cheminės medžiagos dozę kasdien 7 dienas per savaitę. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama per zondą, gyvūnams turėtų būti duodama viena dozė per skrandžio zondą arba per tinkamą intubacinį vamzdelį. Didžiausiasis gyvūnui duodamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandymo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti po 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ėsdinančias bandomąsias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukelia sunkesnį poveikį, bandymo tūrio kintamumas turėtų būti kiek įmanoma mažesnis keičiant koncentraciją taip, kad visų dydžių dozių tūris būtų vienodas. 28. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru ar geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios cheminės medžiagos kiekiai nekeltų trukdžių normaliai mitybai arba vandens pusiausvyrai. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru, galima naudoti pastovią koncentraciją pašaruose (ppm) arba pastovaus dydžio dozę pagal gyvūno kūno masę; pasirinktą variantą reikėtų nurodyti. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama per zondą, dozė turėtų būti duodama kiekvieną dieną panašiu laiku ir koreguojama mažiausiai kartą per savaitę pastoviam dozės ir gyvūno kūno masės santykiui užtikrinti. Bandymo tvarkaraštis 29. Dozes reikėtų pradėti duoti abiejų lyčių gyvūnams ne vėliau kaip 2 savaites prieš poravimąsi, po to, kai jie buvo aklimatizuojami ne trumpiau kaip penkias dienas, ir patelės atrinktos pagal normalius rujos ciklus (2 savaičių laikotarpiu prieš apdorojimą). Tyrimo tvarkaraštis turėtų būti sudarytas taip, kad rujos ciklo įvertinimas prasidėtų netrukus po to, kai gyvūnai pasiekia visišką lytinę brandą. Jos laikas gali šiek tiek skirtis skirtingoms žiurkių veislėms skirtingose laboratorijose, pvz., Sprague Dawley žiurkės subręsta 10 savaičių amžiaus, Wistar žiurkės – maždaug 12 savaičių amžiaus. Pateles su palikuoniais reikėtų numarinti 13 dieną po atsivedimo arba šiek tiek vėliau. Gimimo diena (t. y., kai baigiama atsivesti) nustatoma kaip 0 diena po atsivedimo. Patelės, kurios nerodo poravimosi požymių, numarinamos po 24–26 dienų nuo paskutinės poravimosi laikotarpio dienos. Dozės toliau duodamos abiejų lyčių gyvūnams visą poravimosi laikotarpį. Patinams reikėtų duoti dozę po poravimosi laikotarpio ne trumpiau kaip iki viso 28 dienų dozavimo laikotarpio pabaigos. Patinai numarinami arba, jei manoma, kad juos galima poruoti dar kartą, paliekami ir jiems toliau duodama dozė. 30. Dozės turėtų būti duodamos motininėms patelėms kasdien visą vaikingumo laikotarpį ir ne trumpiau kaip iki 13 dienos po atsivedimo, įskaitant ir tą dieną, arba likus dienai iki numarinimo. Jei tyrimai atliekami bandomąją cheminę medžiagą duodant įkvėpti arba ją dedant ant odos, dozė turėtų būti duodama ne trumpiau kaip iki 19 dienos nuo vaikingumo pradžios, įskaitant ją, ir davimą reikėtų atnaujinti kiek įmanoma greičiau, bet ne vėliau kaip 4 dieną po atsivedimo (PND). 31. Bandymo tvarkaraščio schema pateikta 2 priedėlyje. Poravimo procedūra 32. Atliekant šį tyrimą paprastai reikėtų poruoti 1:1 (vienas patinas ir viena patelė). Išimčių gali būti dėl atsitiktinai žuvusių patinų. Patelė turėtų būti laikoma su tuo pačiu patinu tol, kol atsiranda poravimosi požymiai, arba praeina dvi savaitės. Kiekvieną rytą patelės turėtų būti tiriamos, ieškant spermos arba makšties kamščio. 0 vaikingumo diena apibrėžiama kaip diena, kurią patvirtinamas poravimosi faktas (randamas makšties kamštis arba spermos). Jei poravimas nesėkmingas, galima būtų spręsti dėl pakartotino patelių poravimo su patikrintais tos pačios grupės patinais. Vados dydis 33. 4 dieną po atsivedimo kiekvienos vados dydį galima koreguoti, šalinant perteklinius jauniklius atsitiktinės atrankos būdu, kad būtų gautas kiek įmanoma vienodesnis keturių ar penkių vienos lyties jauniklių vienai vadai skaičius, priklausomai nuo normalaus naudotos žiurkių veislės vados dydžio. Reikėtų paimti dviejų perteklinių jauniklių kraujo ėminius, juos sujungti ir naudoti serumo T4 koncentracijos nustatymui. Atrankusis jauniklių šalinimas, pvz., pagal kūno masę arba anogenitalinį atstumą (AGD), netinka. Jei neįmanoma vienoje vadoje turėti po keturis ar penkis kiekvienos lyties jauniklius, priimtinas dalinis jauniklių skaičiaus koregavimas (pvz., šeši patinai ir keturios patelės). Jaunikliai nešalinami, kai vados dydis yra mažesnis nei brokavimo tikslinė vertė (8 ar 10 jauniklių vienai vadai). Jei vadoje tik vienu jaunikliu daugiau nei brokavimo tikslinė vertė, jis šalinamas ir naudojamas kraujui paimti, kad būtų galima atlikti serumo T4 vertinimą. 34. Jei vados dydis nekoreguojamas, du jaunikliai vienai vadai numarinami 4 dieną po gimimo ir imami jų kraujo ėminiai serumo skydliaukės hormono koncentracijai matuoti. Jei įmanoma, šie du žiurkiukai vienai vadai turėtų būti patelės, kad žiurkiukus patinus būtų galima pasilikti spenelių išsaugojimo įvertinimui, išskyrus atvejus, kai pašalinus šias pateles jų nelieka vertinimui tyrimo pabaigoje. Jaunikliai nešalinami, jei vados dydis būtų mažesnis kaip 8 ar 10 jauniklių vienai vadai (priklausomai nuo normalaus naudotos žiurkių veislės vados dydžio). Jei vadoje tik vienu jaunikliu daugiau nei normalioje vadoje, jis šalinamas ir naudojamas kraujui paimti, kad būtų galima atlikti serumo T4 vertinimą. Gyvų gyvūnų stebėjimo rezultatai Klinikiniai stebėjimai 35. Visą bandymo laikotarpį reikėtų atlikti bendruosius klinikinius stebėjimus bent kartą per dieną ir dažniau, jei stebimi toksiškumo požymiai. Juos pageidautina atlikti kartą ar kelis kartus kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio numatomo poveikio laiką po dozės davimo. Reikėtų registruoti atitinkamus elgesio pokyčius, komplikuoto arba užsitęsusio atsivedimo požymius ir visus toksiškumo požymius, įskaitant gaištamumą. Į šiuos registruojamus duomenis reikėtų įtraukti toksiškumo požymių pradžios laiką, laipsnį ir trukmę. Kūno masė ir pašaro bei vandens suvartojimas 36. Patinus ir pateles reikėtų sverti pirmąją dozės davimo dieną, ne rečiau kaip kas savaitę vėliau ir tyrimo pabaigoje. Vaikingumo laikotarpiu pateles reikėtų sverti 0, 7, 14 ir 20 dieną ir per 24 valandas po atsivedimo (0 arba 1 diena po atsivedimo) ir bent 4 ir 13 dieną po atsivedimo. Šie rezultatai turėtų būti pateikiami ataskaitoje atskirai apie kiekvieną suaugusį gyvūną. 37. Pašaro suvartojimą prieš poravimąsi, vaikingumo ir žindymo metu reikėtų matuoti mažiausiai kartą per savaitę. Pašaro suvartojimo poravimosi metu matuoti nebūtina. Vandens suvartojimas šiais laikotarpiais taip pat turėtų būti matuojamas, kai bandomoji cheminė medžiaga yra duodama su geriamuoju vandeniu. Rujos ciklai 38. Rujos ciklus reikėtų stebėti prieš apdorojimo pradžią, kad tyrimui būtų atrinktos patelės, turinčios reguliarų cikliškumą (žr. 22 pastraipą). Makšties tepinėlius taip pat reikėtų stebėti kasdien nuo apdorojimo laikotarpio pradžios iki poravimosi įrodymų gavimo. Jei yra susirūpinimas dėl ūminio streso poveikio, kuris galėtų pakeisti rujos ciklus pradėjus duoti dozes, laboratorijos gali veikti bandymo gyvūnus medžiaga 2 savaites, tada kasdien imti makšties tepinėlius, kad rujos ciklas būtų stebimas mažiausiai dvi savaites prieš poravimosi laikotarpį ir stebėjimas tęsiamas poravimosi laikotarpiu iki poravimosi įrodymų gavimo. Makšties ar gimdos kaklelio ląsteles reikėtų imti atsargiai, kad nebūtų pažeista gleivinė ir tokiu būdu nebūtų sukeltas netikras vaikingumas (7) (8). Palikuonių parametrai 39. Gestacijos trukmė turėtų būti registruojama ir pradedama skaičiuoti nuo 0 vaikingumo dienos. Kiekviena vada turėtų būti apžiūrėta kiek įmanoma greičiau po atsivedimo siekiant nustatyti jauniklių skaičių ir lytį, gimusių negyvų ir gimusių gyvų jauniklių skaičių, silpnuosius jauniklius (jauniklius, kurie yra gerokai mažesni už atitinkamus kontrolinius jauniklius) ir dideles anomalijas. 40. Gyvi jaunikliai turėtų būti suskaičiuojami ir jų lytis nustatoma per 24 h nuo atsivedimo (0 dieną arba 1 dieną po atsivedimo) ir bent 4 ir 13 dieną po atsivedimo. Be 35 pastraipoje aprašytų stebėjimų, reikėtų registruoti visus jauniklių nenormalaus elgesio pasireiškimus. 41. Kiekvieno jauniklio anogenitalinis atstumas (AGD) turėtų būti matuojamas tą pačią dieną po gimimo tarp PND 0 ir PND 4. Jauniklio kūno masės duomenis reikėtų gauti tą pačią dieną, kurią matuojamas AGD, ir AGD turėtų būti norminamas pagal jauniklio dydį, ir būtų gerai, kad AGD būtų lygus kubinei šakniai iš kūno masės (9). Jauniklių patinų spenelius ir (arba) areoles reikėtų suskaičiuoti PND 12 arba 13 dieną, kaip rekomenduojama EBPO GD 151 (10). Klinikinė biochemija 42. Kraujo ėminiai iš nustatytos vietos imami pagal tokį tvarkaraštį: — ne mažiau kaip dviejų jauniklių vienai vadai 4 dieną po gimimo, jei pakanka jauniklių skaičiaus (žr. 33–34 pastraipas) — visų patelių, ne mažiau kaip dviejų jauniklių vienai vadai 13 dieną tyrimo pabaigoje, ir — visų suaugusių patinų tyrimo pabaigoje. Visi kraujo ėminiai laikomi tinkamomis sąlygomis. 13 dienų jauniklių ir suaugusių patinų kraujo ėminiai vertinami dėl skydliaukės hormonų (T4) koncentracijos serume. Papildomai nustatomas T4 kiekis patelių ir 4 dienų jauniklių kraujo ėminiuose, jei reikia. Be to, galima pasirinkti matuoti kitus hormonus, jei tinka. Vienos vados jauniklių kraujo ėminius galima sujungti atliekant skydliaukės hormonų analizę. Skydliaukės hormonus (T4 ir TSH) reikėtų matuoti kaip „suminį kiekį“. 43. Hormonų nustatymo rezultatų kintamumui ir absoliučiajai koncentracijai gali turėti įtakos šie veiksniai: — numarinimo laikas – dėl hormonų koncentracijos kitimo paros metu; — numarinimo būdas, siekiant išvengti per didelio streso, galinčio turėti įtakos hormonų koncentracijai, — hormonų nustatymui skirti bandymo rinkiniai, kuriais gautos kalibravimo kreivės gali skirtis. 44. Hormonų nustatymui specialiai skirti plazmos ėminiai turėtų būti imami panašiu dienos metu. Naudojant įvairius prekyboje esančius bandymo rinkinius, skiriasi gautos analizuojamų hormonų koncentracijos skaitinės vertės. Patologija Bendroji nekroskopija 45. Reikėtų atlikti numarintų arba tyrimo metu nugaišusių suaugusiųjų gyvūnų makroskopinį tyrimą anomalijoms arba patologiniams pakitimams nustatyti. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas reprodukcijos sistemos organams. Reikėtų registruoti implantacijos vietų skaičių. Makšties tepinėliai turėtų būti tiriami skrodimo dienos ryte, kad būtų galima nustatyti rujos ciklo stadiją ir koreliaciją su kiaušidžių histopatologija. 46. Nuo visų suaugusiųjų patinų sėklidžių, sėklidžių prielipų, taip pat prostatos ir sėklinių pūslelių su koaguliatorių liaukomis, kaip visumos, reikėtų pašalinti visus priaugusius audinius, jei yra, ir po skrodimo kuo greičiau pasverti drėgnos būsenos, kad būtų išvengta džiūvimo. Be to, papildomai galėtų būti nustatoma patinų išangės pakeliamojo ir stormeninio akytkūnio raumens, abiejų Kuperio liaukų ir varpos galvos masė, patelių – porinių kiaušidžių (drėgno organo masė) ir gimdos (įskaitant gimdos kaklelį) masė; jei šios masės įtraukiamos, jos turėtų būti nustatytos kuo greičiau po skrodimo. 47. Negyvi jaunikliai ir 13 dieną po atsivedimo arba šiek tiek vėliau numarinti jaunikliai turėtų būti bent kruopščiai apžiūrėti išoriškai dėl didelių anomalijų. Ypatingą dėmesį reikėtų atkreipti į išorinius lytinio dauginimosi organus, kuriuos reikėtų ištirti dėl pakitusio vystymosi požymių. 13 dieną reikėtų konservuoti iš 1 patino ir 1 patelės vienai jauniklių vadai paimtą skydliaukę. 48. Reikėtų konservuoti visų suaugusiųjų gyvūnų kiaušides, sėklides, papildomus lytinius organus (gimdą ir gimdos kaklelį, sėklidžių prielipus, prostatą ir sėklines pūsleles, plius koaguliatorių liaukas), skydliaukę ir visus organus, turinčius makroskopinių pažeidimų. Atliekant įprastinį sėklidžių ir sėklidžių prielipų tyrimą, nerekomenduojama fiksuoti formaline. Šiems audiniams priimtinas fiksavimo metodas yra Bouino arba modifikuotojo Davidsono fiksatyvo naudojimas (11). Abu tunica albuginea galus galima atsargiai ir negiliai pradurti adata, kad fiksatyvas galėtų greitai prasiskverbti. Histopatologija 49. Reikėtų atlikti didžiausiąją dozę gavusios ir kontrolinės grupės gyvūnų kiaušidžių, sėklidžių ir sėklidžių prielipų išsamų histologinį tyrimą (ypač kreipiant dėmesį į spermatogenezės stadijas ir sėklidžių intersticinių ląstelių struktūros histopatologiją). Jei būtina, galima tirti kitus konservuotus audinius, įskaitant jauniklių ir suaugusiųjų gyvūnų skydliaukę. Atlikus fiksavimą, galėtų būti nustatyta skydliaukės masė. Valyti (apipjaustyti) taip pat reikėtų labai atsargiai ir tik atlikus fiksavimą, kad nebūtų pažeistas audinys. Pažeidus audinį gali būti gauti netikslūs histopatologinės analizės rezultatai. Jei pakitimai nustatomi didžiausiąją dozę gavusioje grupėje, tyrimus reikėtų išplėsti kitų dozavimo grupių gyvūnams. Histopatologinių tyrimų gairėse (11) pateikta išsamios papildomos informacijos apie skrodimą, fiksavimą, pjaustymą ir endokrininių audinių histopatologiją. DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS Duomenys 50. Turėtų būti pateikiami atskirų gyvūnų duomenys. Be to, papildomai visus duomenis reikėtų suvesti į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, darant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų nugaišimo arba humaniško numarinimo laikas, vaisingų gyvūnų skaičius, vaikingų patelių skaičius, toksinio poveikio požymių turinčių gyvūnų skaičius, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant pradžios laiką, trukmę ir toksinio poveikio rimtumą, histopatologinių pakitimų tipai ir visi atitinkami vados duomenys. Lentelės pavidalo suvestinės formatas, kuris pasirodė labai naudingas, kai reikia įvertinti poveikį reprodukcijai ir (arba) vystymuisi, pateiktas 3 priedėlyje. 51. Atsižvelgiant į nedidelę tyrimo apimtį, statistinės analizės kaip reikšmingumo kriterijų nustatymo vertė yra ribota daugeliui vertinamųjų baigčių, ypač reprodukcijos vertinamųjų baigčių. Jei statistiniai tyrimai atliekami, pasirinktas metodas turėtų atitikti tiriamo kintamojo pasiskirstymą ir metodą reikėtų pasirinkti prieš tyrimo pradžią. AGD ir spenelių išlikimo statistinė analizė turėtų būti pagrįsta atskirų jauniklių duomenimis, atsižvelgiant į vados veiksnius. Jei tinka, statistinės analizės vienetas yra vada. Jauniklių kūno masės statistinė analizė turėtų būti pagrįsta atskirų jauniklių duomenimis, atsižvelgiant į vados dydį. Dėl mažo grupės dydžio istorinių kontrolinių ėminių duomenų (pvz., vados dydžio), jei yra, naudojimas taip pat gali būti naudingas kaip pagalbinė priemonė aiškinant tyrimą. Rezultatų įvertinimas 52. Šio toksiškumo tyrimo rezultatai turėtų būti vertinami atsižvelgiant į stebimą poveikį, nekroskopijos ir mikroskopinio tyrimo rezultatus. Įvertinimas aprėpia ryšį tarp bandomosios cheminės medžiagos dozės ir anomalijų buvimo ar nebuvimo, dažnumo ir sunkumo, įskaitant makroskopinius pažeidimus, nustatytus tikslinius organus, nevaisingumą, klinikines anomalijas, paveiktą reprodukavimo gebą ir vados charakteristikas, kūno masės pokyčius, poveikį gaištamumui ir visus kitus toksiškumo reiškinius. 53. Dėl trumpo patinų apdorojimo laikotarpio, vertinant poveikį patinų reprodukcijai, sėklidžių ir sėklidžių prielipų histopatologiją reikėtų nagrinėti kartu su vaisingumo duomenimis. Reprodukcijos ir (arba) vystymosi istorinių kontrolinių ėminių duomenų (pvz., vados dydis, AGD, spenelių išlikimas, T4 koncentracija serume), jei yra, naudojimas taip pat gali būti naudingas kaip pagalbinė priemonė aiškinant tyrimą. 54. Siekiant užtikrinti kokybės kontrolę, siūloma rinkti istorinių kontrolinių ėminių duomenis ir apskaičiuoti skaitinių duomenų variacijos koeficientus, ypač parametrų, susijusių su endokrininę sistemą ardančių medžiagų aptikimu. Šie duomenys gali būti naudojami palyginimo tikslais, kai vertinami atliekami tyrimai. Bandymo ataskaita 55. Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija: Bandomoji cheminė medžiaga: — šaltinis, partijos numeris, naudojimo pabaigos data, jei yra; — bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas. Vienkomponentė medžiaga: — fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės; — cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt.; Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai: — kuo išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, nurodant cheminį pavadinimą (žr. pirmiau), kiekybinį paplitimą ir būdingas fizikines ir chemines savybes. Nešiklis (jei naudojamas): — nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei nešiklis ne vanduo. Bandymo gyvūnai: — naudota rūšis ir (arba) veislė, — gyvūnų skaičius, amžius ir lytis, — šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir kt., — kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje. — rūšies, jei tai ne žiurkės, pasirinkimo pagrindimas. Bandymo sąlygos: — dozės dydžio pasirinkimo pagrindimas; — duomenys apie bandomosios cheminės medžiagos preparato ruošimą ir (arba) jos dėjimą į pašarą, gautą preparato koncentraciją, stabilumą ir vienalytiškumą; — išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimo būdą; — bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos (ppm) pašare arba geriamajame vandenyje perskaičiavimas į faktinę dozę (mg/kg kūno masės per parą), jei taikoma, — išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę. — išsamus randomizavimo procedūros brokuojamiems jaunikliams atrinkti procedūros aprašymas, jei brokuojami. Rezultatai: — kūno masė ir (arba) kūno masės pokyčiai, — Pašaro ir vandens suvartojimo duomenys, jei yra; — toksinio atsako duomenys pagal lytį ir dozę, įskaitant vaisingumą, nėštumą, ir kitus toksiškumo požymius; — gestacijos trukmė; — toksiškas arba kitoks poveikis reprodukcijai, palikuonims, postnataliniam augimui ir kt.; — klinikinių požymių pobūdis, sunkumas ir trukmė (grįžtami ar negrįžtami); — suaugusiųjų patelių, kurių rujos ciklas yra normalus arba nenormalus, skaičius ir ciklo trukmė; — gimusių gyvų jauniklių skaičius ir poimplantaciniai nuostoliai; — jauniklio kūno masės duomenys; — visų jauniklių AGD (ir kūno masė AGD matavimo dieną); — spenelių išlikimas pas jauniklius patinus; — 13 dienų jauniklių ir suaugusiųjų patinų skydliaukės hormonų koncentracija (ir patelių bei 4 dienos jauniklių, jei matuojama); — jauniklių su aiškiai matomais išsigimimais skaičius, išorinių lyties organų bendrasis įvertinimas, silpniausių jauniklių skaičius; — nugaišimo laikas tyrimo metu arba nurodymas, kad gyvūnas išgyveno iki pabaigos; — implantacijų skaičius, vados dydis ir vados masė registravimo metu; — tėvų kartos kūno masės numarinant ir organų masės duomenys; — nekroskopijos duomenys; — išsamus histopatologinių rezultatų aprašymas; — absorbcijos duomenys (jei yra); — statistinis rezultatų apdorojimas, jei reikia. Rezultatų aptarimas. Išvados. Rezultatų aiškinimas 56. Atliekant tyrimą gaunami su kartotinėmis dozėmis susijusio toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vystymuisi vertinimo rezultatai (žr. 5 ir 6 pastraipas). Jis galėtų parodyti, ar būtina atlikti tolesnius tyrimus, ir būti naudojamas kaip gairės rengiant jų schemas. Reikėtų ieškoti informacijos EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 43, kuri padėtų paaiškinti reprodukcijos ir vystymosi rezultatus (12). EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 106 dėl graužikų endokrininių ir reprodukcijos bandymų histologinio įvertinimo (11) pateikiama informacija apie (endokrininių) organų bei makšties tepinėlių paruošimą ir įvertinimą, kuri gali būti naudinga šiam bandymo metodui. LITERATŪRA (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Galima gauti iš Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos Paryžiuje. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Galima gauti iš Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos Paryžiuje. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Galima gauti iš Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos Paryžiuje. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development,.Paris. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment(No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. 1 priedėlis APIBRĖŽTYS (TAIP PAT ŽR. EBPO REKOMENDACINĮ DOKUMENTĄ 150 (6)) Androgeniškumas - cheminės medžiagos geba veikti žinduolio organizme kaip natūralus androgeninis hormonas (pvz., testosteronas). Antiandrogeniškumas - cheminės medžiagos geba slopinti natūralaus androgeninio hormono (pvz., testosterono) veikimą žinduolio organizme. Antiestrogeniškumas - cheminės medžiagos geba slopinti natūralaus estrogeninio hormono (pvz., 17β-estradiolio) veikimą žinduolio organizme. Antitiroidinis aktyvumas - cheminės medžiagos gebėjimas slopinti natūralaus skydliaukės hormono (pvz., T3) veikimą žinduolio organizme. Cheminė medžiaga- medžiaga arba mišinys. Toksiškumas vystymuisi - toksiškumas reprodukcijai, kuris pasireiškia kaip palikuonių pre-, peri-, postnataliniai, struktūriniai ar funkciniai sutrikimai. Dozavimas - bendrasis terminas, aprėpiantis dozės dydį, jos davimo dažnumą ir trukmę. Dozė - duodamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios cheminės medžiagos mase, per parą tenkančia vienam bandomojo gyvūno kūno masės vienetui (pvz., mg/kg kūno masės per parą), arba pastovia koncentracija pašare. Akivaizdus toksiškumas- bendrasis terminas, apibūdinantis aiškius toksiškumo požymius, pastebimus davus bandomosios cheminės medžiagos. Šių požymių turėtų pakakti pavojui įvertinti ir jie turėtų būti tokie, kad padidinus duodamą dozę būtų galima tikėtis sunkių toksiškumo požymių stiprėjimo ir galbūt gyvūnų gaišimo. Vaisingumo sumažėjimas - rodo patelių ar patinų reprodukcijos funkcijų arba gebos sutrikimus. Toksinis poveikis patelei - neigiamas poveikis vaikingoms patelėms, kuris pasireiškia būdingai (tiesioginis poveikis) arba nebūdingai (netiesioginis poveikis). NOAEL - termino nepastebėto neigiamo poveikio riba santrumpa. Tai didžiausioji dozė, kurią duodant nepastebima su apdorojimu susijusių neigiamų rezultatų. Estrogeniškumas - cheminės medžiagos gebėjimas veikti žinduolio organizme kaip natūralus estrogeninis hormonas (pvz., 17β-estradiolis). Toksiškumas reprodukcijai - rodo neigiamą poveikį palikuoniams ir (arba) patelių ar patinų reprodukcijos funkcijų arba gebos sumažėjimą. Bandomoji cheminė medžiaga - medžiaga arba mišinys, bandyti pagal šį bandymo metodą. Tiroidinis aktyvumas - cheminės medžiagos gebėjimas veikti žinduolio organizme kaip natūralus skydliaukės hormonas (pvz., T3). Tinkamumo patvirtinimas - mokslinis procesas, skirtas apibūdinti bandymo metodo taikymo charakteristikoms keliamus reikalavimus ir apribojimus bei įrodyti jo patikimumą ir tinkamumą konkrečiam tikslui. 2 priedėlis BANDYMO TVARKARAŠČIO SCHEMA, RODANTI DIDŽIAUSIĄJĄ TYRIMO TRUKMĘ, PAGRĮSTĄ VISU 14 DIENŲ PORAVIMOSI LAIKOTARPIU ﻿3 priedėlis POVEIKIO REPRODUKCIJAI IR (ARBA) VYSTYMUISI ĮVERTINIMO LENTELĖS FORMOS SUVESTINĖ ATASKAITA STEBĖJIMŲ REZULTATAI VERTĖS Dozavimas (vienetai) 0 (kontrolinis) … … … … Porų skaičius pradžioje (skaičius) Rujos ciklas (bent vidutinė nereguliariųjų ciklų vidutinė trukmė ir dažnis) Patelės, rodančios poravimosi požymius (skaičius) Vaikingos patelės (skaičius) Apvaisinimo dienos 1–5 (skaičius) Apvaisinimo dienos 6–...( (21) ) (skaičius) Vaikingumas ≤ 21 diena (skaičius) Vaikingumas = 22 dienos (skaičius) Vaikingumas ≥ 23 dienos (skaičius) Patelės, turinčios gyvų jauniklių (skaičius) Patelės, turinčios gyvų jauniklių 4 dieną po atsivedimo (skaičius) Implantai/patelei (vidurkis) Gyvi jaunikliai/patelei po atsivedimo (vidurkis) Gyvi jaunikliai/patelei 4 dieną po atsivedimo (vidurkis) Lyčių santykis (v/m) po atsivedimo (vidurkis) Lyčių santykis (v/m) 4 dieną po atsivedimo (vidurkis) Vados masė po atsivedimo (vidurkis) Vados masė 4 dieną po atsivedimo (vidurkis) Jauniklių masė po atsivedimo (vidurkis) Jauniklių masė AGD matavimo metu (vidutinė patinų, vidutinė patelių) Jauniklių AGD, matuotas tą pačia dieną – nuo atsivedimo dienos iki 4 dienos (vidutinis patinų, vidutinis patelių, pažymėti dieną po atsivedimo (PND)) Jauniklių masė 4 dieną (vidurkis) Spenelių išlikimas pas jauniklius patinus 13 dieną (vidurkis) Jauniklių masė 13 dieną (vidurkis) JAUNIKLIAI SU ANOMALIJOMIS Patelių su 0 Patelių su 1 Patelių su ≥ 2 PALIKUONIŲ NUOSTOLIAI Prenataliniai (implantacijos minus gyvų jauniklių skaičius) Patelių su 0 Patelių su 1 Patelių su 2 Patelių su ≥ 3 Postnataliniai (gyvų atsivedimo metu skaičius minus gyvų 13 dieną po atsivedimo skaičius) Patelių su 0 Patelių su 1 Patelių su 2 Patelių su ≥ 3 B.64 JUNGTINIS KARTOTINĖS DOZĖS TOKSIŠKUMO BANDYMO IR TOKSIŠKUMO REPRODUKCIJAI IR (ARBA) VYSTYMUISI ATRANKOS BANDYMO TYRIMAS ĮVADAS 1. Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) 422 (2016). EBPO cheminėms medžiagoms bandyti skirtos gairės periodiškai peržiūrimos, atsižvelgiant į mokslo pažangą. Pradinės atrankinio tyrimo bandymo gairės 422 buvo priimtos 1996 m. atsižvelgiant į „Jungtinio kartotinės dozės ir reprodukcijos ir (arba) vystymosi atrankos bandymo“ protokolą, aptartą dviejuose ekspertų pasitarimuose Londone 1990 m. (1) ir Tokijuje 1992 m. (2). 2. Šiame bandymo metode sujungta toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vystymuisi atrankos dalis, pagrįsta valstybių narių įgyta patirtimi, pradinį metodą taikant didelių gamybos apimčių cheminėms medžiagoms ir atliekant teigiamų kontrolinių medžiagų tiriamuosius darbus (3) (4), ir kartotinės dozės toksiškumo dalis pagal EBPO bandymo gaires 407 (28 dienų graužikų kartotinės dozės toksiškumas per virškinamąjį traktą, atitinka šio priedo B.7 skyrių). 3. Šis bandymo metodas yra atnaujintas įtraukiant vertinamąsias baigtis, susijusias su endokrininę sistemą ardančiomis medžiagomis, ir jis yra tąsa 1998 m. EBPO iniciatyva pradėto didelės svarbos darbo, skirto peržiūrėti esamas gaires ir parengti naujas endokrininę sistemą galimai ardančių medžiagų atrankos ir bandymo gaires (5). Atsižvelgiant į tai TG 407 (atitinka šio priedo B.7 skyrių) buvo išplėstos 2008 m., įtraukiant parametrus, tinkamus bandomųjų cheminių medžiagų endokrininiam aktyvumui aptikti. TG 422 atnaujinimo tikslas buvo įtraukti kai kurias vertinamąsias baigtis, susijusias su endokrininę sistemą ardančiomis medžiagomis, į atrankai skirtas bandymo gaires, kai ekspozicijos laikotarpiai aprėpia kai kuriuos jautrius vystymosi laikotarpius (prenatalinius ar ankstyvuosius postnatalinius laikotarpius). 4. Į TG 422 buvo įtrauktos pasirinktos papildomos vertinamosios baigtys, susijusios su endokrininę sistemą ardančiomis medžiagomis, taip pat TG 443 dalis (Išplėstinis toksiškumo vienos kartos dauginimuisi bandymas, atitinkantis šio priedo B.56 skyrių), atsižvelgiant į galimybių studiją, susijusią su baigčių įtraukimo moksliniais ir techniniais klausimais, taip pat su jų įtraukimo į tyrimą bandymų schemos reikiamais pakeitimais (6). 5. Šis bandymo metodas skirtas gauti ribotai informacijai apie bandomosios cheminės medžiagos poveikį patinų ir patelių reprodukcijos charakteristikoms, pvz., lytinių liaukų funkcijai, poravimosi elgesiui, apvaisinimui, vystymuisi ir palikuonių atsivedimui. Jis nėra esamų B.31, B.34, B.35 arba B.56 bandymo metodų alternatyva arba pakeitimas. PRADINIAI ASPEKTAI 6. Vertinant ir nustatant bandomosios cheminės medžiagos toksiškumo charakteristikas, kartotinės dozės toksiškumas per virškinamąjį traktą gali būti nustatomas po to, kai ūmaus toksiškumo bandymais gaunama pradinė informacija. Atliekant šį tyrimą gaunama informacijos apie galimus pavojus sveikatai dėl kartotinės ekspozicijos per palyginti ribotos trukmės laikotarpį. Metodą sudaro pamatinis kartotinės dozės toksiškumo tyrimas, kuris gali būti taikomas cheminėms medžiagoms, kurioms nebūtinas 90 dienų tyrimas (pvz., kai gamybos apimtis neviršija tam tikrų ribų), arba kaip parengiamasis tyrimas prieš ilgalaikį tyrimą. Atliekant tyrimą reikėtų vadovautis pagrindiniais principais ir aspektais, pateiktais EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 19 dėl saugos įvertinimui naudojamų bandymo gyvūnų klinikinių požymių, kaip humaniško poveikio vertinamųjų baigčių, atpažinimo, vertinimo ir naudojimo (7). 7. Be to, jį sudaro toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vaisingumui atrankos bandymas, todėl taip pat gali būti taikomas gauti pradinei informacijai apie galimą poveikį vyriškos ir moteriškos lyties reprodukcijos charakteristikoms, pvz., lytinių liaukų funkcijai, poravimosi elgesiui, apvaisinimui, vystymuisi ir palikuonių atsivedimui, arba kaip pradinė bandomųjų cheminių medžiagų toksikologinių savybių vertinimo pakopa, arba apie susirūpinimą keliančias chemines medžiagas. Taikant šį bandymo metodą negaunama išsamios informacijos apie visus reprodukcijos ir vystymosi aspektus. Visų pirma, jis suteikia tik ribotas prenatalinės ekspozicijos postnatalinių reiškinių arba postnatalinės ekspozicijos metu galimai sukelto poveikio aptikimo priemones. Dėl (be kitų priežasčių) vertinamųjų baigčių atrankumo ir trumpos tyrimo trukmės šiuo metodu nebus gauta įrodymų, kad būtų galima tvirtai pareikšti apie poveikio reprodukcijai ir (arba) vystymuisi nebuvimą. Be to, nesant kitų toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vystymuisi bandymų duomenų, teigiami rezultatai yra naudingi pradiniam pavojingumo vertinimui ir padeda priimti sprendimus dėl papildomų bandymų būtinumo ir trukmės. 8. Rezultatus, gautus taikant su endokrinine sistema susijusius parametrus, reikėtų vertinti atsižvelgiant į EBPO konceptualią endokrininę sistemą ardančių cheminių medžiagų bandymo ir vertinimo sistemą (8). Patobulintos EBPO TG 422 pagal šią konceptualią sistemą yra 4 lygmens in vivo bandymas, kuriuo gaunami duomenys apie neigiamą poveikį su endokrinine sistema susijusioms vertinamosioms baigtims. Tačiau vien tik pats endokrininės sistemos signalas negali būti laikomas pakankamu įrodymu, kad bandomoji cheminė medžiaga yra endokrininę sistemą ardanti medžiaga. 9. Taip pat šiame metode atskirai pažymimas neurologinis poveikis, kaip specifinė vertinamoji baigtis, ir būtinumas atlikti kruopščius gyvūnų klinikinius tyrimus, kad būtų galima gauti kiek įmanoma daugiau informacijos. Šiuo metodų turėtų būti įmanoma identifikuoti neurotoksinį potencialą turinčias chemines medžiagas, ir dėl to gali prireikti papildomai giliau tirti šį aspektą. Be to, metodas gali rodyti imunologinio poveikio pagrindinius požymius. 10. Nesant kitų sisteminio toksiškumo, toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vystymuisi, neurotoksiškumo ir (arba) imunotoksiškumo tyrimų duomenų, teigiami rezultatai yra naudingi pradiniam pavojingumo vertinimui ir padeda priimti sprendimus dėl papildomų bandymų būtinumo ir trukmės. Bandymas gali būti ypač naudingas kaip EBPO Patikrinimo informacijos duomenų rinkinio (SIDS), skirto įvertinti esamas chemines medžiagas, apie kurias yra labai mažas toksikologinės informacijos kiekis arba jos nėra, dalis ir gali būti dviejų atskirų kartotinės dozės toksiškumo bandymo (EBPO TG 407, atitinka šio priedo B.7 skyrių) ir toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vystymuisi bandymo (EBPO TG 421, atitinka šio priedo B.63 skyrių) atlikimo alternatyva. Jis taip pat gali būti taikomas kaip dozės intervalo nustatymo tyrimas, atliekant išsamesnius reprodukcijos ir (arba) vystymosi tyrimus, arba jei laikoma, kad jis galėtų tikti. 11. Paprastai daroma prielaida, kad skiriasi vaikingų ir neapvaisintų gyvūnų jautrumas. Todėl atliekant šį sudėtinį tyrimą, kuris tinka įvertinti bendrąjį sisteminį toksiškumą ir specifinį toksiškumą reprodukcijai ir (arba) vystymuisi, gali būti sudėtingiau nustatyti dozės lygius nei šiuos bandymus atliekant atskirai. Be to, bendrojo sisteminio toksiškumo bandymų rezultatų aiškinimas gali būti sunkesnis nei atliekant atskirą kartotinės dozės tyrimą, ypač tuo atveju, kai atliekant tyrimą serumo ir histopatologijos parametrai neįvertinami vienu metu. Dėl šių techninių sunkumų reikia turėti didelę toksiškumo bandymų atlikimo patirtį atliekant šį jungtinį atrankos bandymą. Kita vertus, be to, kad naudojama mažiau gyvūnų, sudėtinis bandymas gali būti geresnis būdas atskirti tiesioginį poveikį reprodukcijai ir (arba) vystymuisi nuo poveikių, kurie yra antriniai kitų (sisteminių) poveikių atžvilgiu. 12. Šiame bandyme dozavimo laikotarpis yra ilgesnis nei įprastinis 28 dienų kartotinės dozės tyrimo laikotarpis. Tačiau jį atliekant naudojama mažiau kiekvienos lyties vienos grupės gyvūnų palyginti su situacija, kai įprastinis 28 dienų kartotinės dozės tyrimas atliekamas papildant toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vystymuisi atrankos bandymą. 13. Taikant šį bandymo metodą, bandomoji cheminė medžiaga duodama per burną. Gali prireikti pakeitimų, jei naudojami kiti ekspozicijos būdai. 14. Prieš taikant bandymų metodą mišiniui, kad būtų gauti numatomo reglamentavimo tikslui skirti duomenys, reikėtų panagrinėti, ar metodu galima pasiekti tą tikslą atitinkančius rezultatus ir, jei taip, dėl kokios priežasties. Tokie svarstymai nereikalingi, kai yra reglamentavimo reikalavimas bandyti mišinį. 15. Vartojamos apibrėžtys pateiktos 1 priedėlyje. BANDYMO PRINCIPAS 16. Kelioms patinų ir patelių grupėms duodamos skirtingos bandomosios cheminės medžiagos dozės. Patinai turėtų gauti dozę ne trumpiau kaip keturias savaites, iki pat numarinimo, įskaitant dieną prieš numatytą numarinimą (tai sudaro ne mažiau kaip dvi savaitės iki poravimosi, poravimosi laikotarpis ir maždaug dvi savaitės po poravimosi). Atsižvelgiant į ribotą dozės davimo patinams laikotarpį, vaisingumas gali ir nebūti tam tikras jautrus toksiškumo sėklidėms rodiklis. Todėl svarbu atlikti išsamų histologinį sėklidžių tyrimą. Manoma, kad dviejų savaičių prieš poravimąsi dozės davimo laikotarpio ir vėlesnių poravimosi ir (arba) vaisingumo stebėjimo rezultatų derinio, esant ne trumpesniam kaip keturių savaičių bendrajam dozės davimo laikotarpiui, ir toliau atlikto išsamaus patinų lytinių liaukų histopatologijos tyrimo pakanka, kad būtų galima aptikti daugumą patinų vaisingumui ir spermatogenezei įtaką darančių veiksnių. 17. Patelės turėtų gauti dozę visą tyrimo laikotarpį. Jį sudaro dvi savaitės iki poravimosi (turint tikslą aprėpti bent du pilnus rujos ciklus), skirtingas laikas iki apvaisinimo, vaikingumo trukmė ir mažiausiai trylika dienų po atsivedimo, iki pat numarinimo, įskaitant dieną prieš numatytą numarinimą. 18. Tyrimo trukmė po aklimatizavimo ir rujos ciklo įvertinimo prieš dozės davimą, priklauso nuo patelių vaisingumo ir yra maždaug 63 dienos (mažiausiai 14 dienų prieš poravimąsi (iki 14 dienų) poravimasis, 22 dienų vaikingumas, 13 dienų žindymas). 19. Dozės davimo laikotarpiu gyvūnai atidžiai stebimi kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Bandymo metu nugaišę arba numarinti gyvūnai skrodžiami, o baigus bandymą numarinami ir skrodžiami išgyvenę gyvūnai. METODO APRAŠYMAS Gyvūnų rūšies parinkimas 20. Taikant šį bandymo metodą numatyta naudoti žiurkes. Jei TG 422 nurodyti parametrai tiriami naudojant kitą graužikų rūšį, turėtų būti pateiktas išsamus pagrindimas. Vykdant tarptautinę patvirtinimo programą endokrininę sistemą ardančioms medžiagoms aptikti pagal TG 407, vienintelė naudota rūšis buvo žiurkės. Neturėtų būti naudojamos mažo vaisingumo veislės arba veislės, kurioms dažnai pasireiškia vystymosi defektai. Reikėtų naudoti sveikus neapvaisintus gyvūnus, kurie nebuvo naudojami anksčiau atliekant bandymo procedūras. Reikėtų apibūdinti bandymo gyvūnų rūšį, veislę, lytį, masę ir amžių. Tyrimo pradžioje naudojamų gyvūnų masės skirtumas turėtų būti kuo mažesnis ir būti ne didesnis kaip ± 20 % kiekvienos lyties gyvūno vidutinės masės. Jei tyrimas atliekamas kaip ilgalaikio ar visos kartos tyrimo parengiamasis tyrimas, būtų gerai abiems tyrimams naudoti tos pačios veislės ir šaltinio gyvūnus. Laikymas ir šėrimas 21. Visos procedūros turėtų atitikti vietinius laboratorinės gyvūnų priežiūros reikalavimus. Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turėtų būti 22 °C (± 3 °). Santykinė oro drėgmė turėtų būti ne mažesnė kaip 30 % ir pageidautina, kad būtų ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, 12 h dienos šviesos ir 12 h tamsos. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Pašaro pasirinkimui gali turėti įtakos būtinybė tinkamai įmaišyti bandomąją cheminę medžiagą, duodamą pagal šį metodą. 22. Gyvūnai turėtų būti apgyvendinti nedidelėmis tos pačios lyties grupėmis; gyvūnus galima laikyti atskirai, jei tai būtų moksliškai pagrįsta. Laikant grupėmis, viename narvelyje turėtų būti ne daugiau kaip penki gyvūnai. Poravimo procedūros turėtų būti atliekamos šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Vaikingos patelės turėtų būti laikomos atskiruose narveliuose ir turėti gūžtai įsirengti būtinų medžiagų. Žindančios patelės laikomos atskiruose narveliuose su savo palikuoniais. 23. Pašarus reikėtų nuolat analizuoti dėl teršalų buvimo. Pašaro ėminys turėtų būti saugomas, kol bus parengta ataskaita. Gyvūnų ruošimas 24. Sveiki jauni suaugę gyvūnai atsitiktinai paskirstomi ir priskiriami apdorojimo grupėms ir narveliams. Narvelius reikėtų išdėstyti taip, kad narvelio vietos įtaka būtų kiek įmanoma mažesnė. Gyvūnai unikaliai identifikuojami ir ne mažiau kaip penkias paras iki tyrimo pradžios laikomi savo narveliuose, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų. Dozių ruošimas 25. Bandomąją cheminę medžiagą rekomenduojama duoti per burną, nebent būtų laikoma, kad labiau tinka kiti davimo būdai. Jei pasirenkamas davimo per burną būdas, bandomoji cheminė medžiaga paprastai duodama per zondą, tačiau bandomąsias chemines medžiagas taip pat galima duoti su pašaru arba geriamuoju vandeniu. 26. Jei būtina, bandomoji cheminė medžiaga ištirpinama tinkamame nešiklyje arba ruošiama jos suspensija. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirmenybę teikti vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimybę naudoti aliejaus (pvz., kukurūzų) tirpalą arba suspensiją ir tik po to – galimybę naudoti tirpalus kituose nešikliuose. Jei nešiklis yra ne vanduo, turėtų būti žinomos jo toksiškumo charakteristikos. Reikėtų nustatyti bandomosios cheminės medžiagos stabilumą ir vienalytiškumą nešiklyje. PROCEDŪRA Gyvūnų skaičius ir lytis 27. Rekomenduojama kiekvienos grupės bandymą pradėti turint ne mažiau kaip 10 patinų ir 12–13 patelių. Prieš ekspozicijos pradžią įvertinamas patelių rujos cikliškumas, ir gyvūnai, kurių ciklas nėra 4–5 dienos, neįtraukiami į tyrimą, todėl rekomenduojama turėti papildomų patelių, kad kiekvienoje grupėje liktų 10 patelių. Manoma, kad, išskyrus aiškaus toksinio poveikio atvejį, kiekvienoje grupėje bus mažiausiai 8 vaikingos patelės, ir tai paprastai yra mažiausias priimtinas vaikingų patelių skaičius kiekvienoje grupėje. Tikslas yra gauti pakankamą vaikingų patelių ir palikuonių skaičių, kad būtų galima pagrįstai įvertinti bandomosios cheminės medžiagos gebėjimą daryti poveikį vaisingumui, vaikingumui, patelės ir žindomo palikuonio elgesiui bei F 1 kartos palikuonių augimui ir vystymuisi nuo apvaisinimo iki 13 paros po atsivedimo. Jei planuojami tarpiniai skrodimai, gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas tiek, kiek numatyta numarinti gyvūnų iki tyrimo pabaigos. Turėtų būti apsvarstyta galimybė į kontrolinę grupę ir didžiausiajai dozei skirtą grupę įtraukti po vieną papildomą pagalbinę penkių kiekvienos lyties gyvūnų grupę, kad ne mažiau kaip 14 dienų po apdorojimo būtų galima stebėti sisteminio toksinio poveikio grįžtamumą, tvarumą arba vėlavimą. Pagalbinės grupės gyvūnai nebūtų poruojami, todėl nenaudojami vertinant toksiškumą reprodukcijai ir (arba) vystymuisi. Dozavimas 28. Paprastai turėtų būti ne mažiau kaip trys bandymo grupės ir viena kontrolinė grupė. Jei nėra tinkamų bendrojo toksiškumo duomenų, gali būti atliktas intervalo nustatymo tyrimas (naudojant tos pačios veislės ir iš to paties šaltinio gautus gyvūnus), kuris padėtų nustatyti naudotinas dozes. Išskyrus apdorojimą bandomąja chemine medžiaga, su kontrolinių grupių gyvūnais turėtų būti elgiamasi taip pat, kaip su apdorojimo grupių gyvūnais. Jeigu duodant bandomąją cheminę medžiagą naudojamas nešiklis, kontrolinė grupė turėtų gauti didžiausią naudotą nešiklio kiekį. 29. Dozių dydžiai turėtų būti pasirinkti atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo ir (toksiko)kinetinius duomenis. Taip pat reikėtų atsižvelgti į tai, kad vaikingų ir neapvaisintų gyvūnų jautrumas gali skirtis. Didžiausiąją dozę reikėtų pasirinkti turint tikslą sukelti toksinį poveikį, bet ne gyvūno žūtį ar akivaizdžias kančias. Toliau reikėtų pasirinkti mažėjančių dozės dydžių seką, siekiant parodyti su dozavimu susijusį atsaką ir nepastebėto neigiamo poveikio ribą (NOAEL), esant mažiausiai dozei. Paprastai optimalūs dozių skirtumo intervalai yra nuo dviejų iki keturių kartų, ir dažnai vietoj didelių intervalų tarp dozių (pvz., daugiau kaip 10 kartų) geriau naudoti papildomą ketvirtą bandymo grupę. 30. Jei stebimas bendrasis toksiškumas (pvz., mažesnė kūno masė, poveikis kepenims, širdžiai, plaučiams arba inkstams ir kt.) arba kiti pakitimai, kurie gali nebūti toksiškumo atsakais (pvz., mažesnis pašaro vartojimas, kepenų padidėjimas), stebimas poveikis jautrioms endokrininės sistemos vertinamosioms baigtims turėtų būti aiškinamas atsargiai. Ribinis bandymas 31. Jei atliekant per burną duodamos vieno dydžio dozės tyrimą pagal šiam tyrimui aprašytas procedūras, duodama ne mažesnė kaip 1 000 mg/kg kūno masės per parą dozė arba, jei duodama su pašaru, atitinkamą pašaro ar geriamo vandens procentinę dalį sudaranti dozė (pagal nustatytą kūno masę) nesukelia pastebimo toksinio poveikio ir jei toksinio poveikio nesitikima, atsižvelgiant į giminingos struktūros medžiagoms gautus duomenis, visas bandymas naudojant kelių dydžių dozes gali būti nebūtinas. Ribinis bandymas atliekamas, išskyrus atvejus, kai žmonių ekspozicijos būdas rodo, kad duodamos dozės turi būti didesnės. Jei duodama kitais būdais, pvz., įkvepiama arba dedama ant odos, didžiausią galimą ekspozicijos koncentraciją dažnai gali lemti bandomųjų cheminių medžiagų fizikinės ir cheminės savybės. Dozių davimas 32. Gyvūnai gauna bandomosios cheminės medžiagos dozę kasdien 7 dienas per savaitę. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama per zondą, gyvūnams turėtų būti duodama viena dozė per skrandžio zondą arba per tinkamą intubacinį vamzdelį. Didžiausiasis gyvūnui duodamas vienkartinis skysčio tūris priklauso nuo bandymo gyvūno dydžio. Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kurių galima duoti po 2 ml/100 g kūno masės. Išskyrus dirginančias arba ėsdinančias bandomąsias chemines medžiagas, kurios, būdamos didesnės koncentracijos, paprastai sukelia sunkesnį poveikį, bandymo tūrio kintamumas turėtų būti kiek įmanoma mažesnis keičiant koncentraciją taip, kad visų dydžių dozių tūris būtų vienodas. 33. Jei bandomosios cheminės medžiagos duodamos su pašaru ar geriamuoju vandeniu, svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios cheminės medžiagos kiekiai nekeltų trukdžių normaliai mitybai arba vandens pusiausvyrai. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama su pašaru, galima naudoti pastovią koncentraciją pašaruose (ppm) arba pastovaus dydžio dozę pagal gyvūno kūno masę; pasirinktą variantą reikėtų nurodyti. Jei bandomoji cheminė medžiaga duodama per zondą, dozė turėtų būti duodama kiekvieną dieną panašiu laiku ir koreguojama mažiausiai kartą per savaitę pastoviam dozės ir gyvūno kūno masės santykiui užtikrinti. Jei jungtinis tyrimas naudojamas kaip ilgalaikio ar išsamaus toksiškumo reprodukcijai tyrimo parengiamasis tyrimas, abiem tyrimams reikėtų naudoti panašų pašarą. Bandymo tvarkaraštis 34. Dozes reikėtų pradėti duoti abiejų lyčių gyvūnams 2 savaites prieš poravimąsi, po to, kai jie buvo aklimatizuojami ne trumpiau kaip penkias dienas, ir patelės atrinktos pagal normalius rujos ciklus (2 savaičių laikotarpiu prieš apdorojimą). Tyrimo tvarkaraštis turėtų būti sudarytas taip, kad rujos ciklo įvertinimas prasidėtų netrukus po to, kai gyvūnai pasiekia visišką lytinę brandą. Jos laikas gali šiek tiek skirtis skirtingoms žiurkių veislėms skirtingose laboratorijose, pvz., Sprague Dawley žiurkės subręsta 10 savaičių amžiaus, Wistar žiurkės – maždaug 12 savaičių amžiaus. Pateles su palikuoniais reikėtų numarinti 13 dieną po atsivedimo arba šiek tiek vėliau. Jei patelės turėtų negauti pašaro per naktį prieš kraujo ėminių ėmimą (pasirinkus tokį variantą), patelės ir jų palikuoniai nebūtinai turi būti numarinami tą pačią dieną. Gimimo diena (t. y., kai baigiama atsivesti) nustatoma kaip 0 diena po atsivedimo. Patelės, kurios nerodo poravimosi požymių, numarinamos po 24–26 dienų nuo paskutinės poravimosi laikotarpio dienos. Dozės toliau duodamos abiejų lyčių gyvūnams visą poravimosi laikotarpį. Patinams reikėtų duoti dozę po poravimosi laikotarpio ne trumpiau kaip iki viso 28 dienų dozavimo laikotarpio pabaigos. Patinai numarinami arba, jei manoma, kad juos galima poruoti dar kartą, paliekami ir jiems toliau duodama dozė. 35. Dozės turėtų būti duodamos motininėms patelėms kasdien visą vaikingumo laikotarpį ir ne trumpiau kaip iki 13 dienos po atsivedimo, įskaitant ir tą dieną, arba likus dienai iki numarinimo. Jei tyrimai atliekami bandomąją cheminę medžiagą duodant įkvėpti arba ją dedant ant odos, dozė turėtų būti duodama ne trumpiau kaip iki 19 dienos nuo vaikingumo pradžios, įskaitant ją, ir davimą reikėtų atnaujinti kiek įmanoma greičiau, bet ne vėliau kaip 4 dieną po atsivedimo (PND). 36. Jei įtraukta pagalbinė grupė, jos gyvūnai, numatyti vėlesniems stebėjimams, neporuojami. Jie turėtų būti laikomi be apdorojimo dar ne trumpiau kaip 14 dienų po pirmojo patelių numatyto numarinimo, kad būtų galima aptikti toksinio poveikio vėlavimą, tvarumą arba atsigavimą nuo jo. 37. Bandymo tvarkaraščio schema pateikta 2 priedėlyje. Rujos ciklai 38. Rujos ciklus reikėtų stebėti prieš apdorojimo pradžią, kad tyrimui būtų atrinktos patelės, turinčios reguliarų cikliškumą (žr. 27 pastraipą). Makšties tepinėlius taip pat reikėtų stebėti kasdien nuo apdorojimo laikotarpio pradžios iki poravimosi įrodymų gavimo. Jei yra susirūpinimas dėl ūminio streso poveikio, kuris galėtų pakeisti rujos ciklus, pradėjus duoti dozes, laboratorijos gali veikti bandymo gyvūnus medžiaga 2 savaites, tada kasdien imti makšties tepinėlius, kad rujos ciklas būtų stebimas mažiausiai dvi savaites prieš poravimosi laikotarpį ir stebėjimas tęsiamas poravimosi laikotarpiu iki poravimosi įrodymų gavimo. Makšties ar gimdos kaklelio ląsteles reikėtų imti atsargiai, kad nebūtų pažeista gleivinė ir tokiu būdu nebūtų sukeltas netikras vaikingumas (8) (9). Poravimo procedūra 39. Atliekant šį tyrimą paprastai reikėtų poruoti 1: 1 (vienas patinas ir viena patelė). Išimčių gali būti dėl atsitiktinai žuvusių patinų. Patelė turėtų būti laikoma su tuo pačiu patinu tol, kol atsiranda poravimosi požymiai, arba praeina dvi savaitės. Kiekvieną rytą patelės turėtų būti tiriamos, ieškant spermos arba makšties kamščio. 0 vaikingumo diena apibrėžiama kaip diena, kurią patvirtinamas poravimosi faktas (randamas makšties kamštis arba spermos). Jei poravimas buvo nesėkmingas, galima būtų spręsti dėl pakartotino patelių poravimo su patikrintais tos pačios grupės patinais. Vados dydis 40. 4 dieną po atsivedimo kiekvienos vados dydį galima koreguoti, šalinant perteklinius jauniklius atsitiktinės atrankos būdu, kad būtų gautas kiek įmanoma vienodesnis keturių ar penkių vienos lyties jauniklių vienai vadai skaičius, priklausomai nuo normalaus naudotos žiurkių veislės vados dydžio. Reikėtų paimti dviejų perteklinių jauniklių kraujo ėminius, juos sujungti ir naudoti serumo T4 koncentracijos nustatymui. Atrankusis jauniklių šalinimas, pvz., pagal kūno masę arba anogenitalinį atstumą (AGD), netinka. Jei neįmanoma vienoje vadoje turėti po keturis ar penkis kiekvienos lyties jauniklius, priimtinas dalinis jauniklių skaičiaus koregavimas (pvz., šeši patinai ir keturios patelės). Jaunikliai nešalinami, kai vados dydis yra mažesnis nei brokavimo tikslinė vertė (8 ar 10 jauniklių vienai vadai). Jei vadoje tik vienu jaunikliu daugiau nei brokavimo tikslinė vertė, jis šalinamas ir naudojamas kraujui paimti, kad būtų galima atlikti serumo T4 vertinimą. 41. Jei vados dydis nekoreguojamas, du jaunikliai vienai vadai numarinami 4 dieną po gimimo ir imami jų kraujo ėminiai serumo skydliaukės hormono koncentracijai matuoti. Jei įmanoma, šie du jaunikliai vienai vadai turėtų būti patelės, kad jauniklius patinus būtų galima pasilikti spenelių išlikimo įvertinimui, išskyrus atvejus, kai pašalinus šias pateles jų nelieka vertinimui tyrimo pabaigoje. Jaunikliai nešalinami, jei vados dydis būtų mažesnis kaip 8 ar 10 jauniklių vienai vadai (priklausomai nuo normalaus naudotos žiurkių veislės vados dydžio). Jei vadoje tik vienu jaunikliu daugiau nei normalioje vadoje, jis šalinamas ir naudojamas kraujui paimti, kad būtų galima atlikti serumo T4 vertinimą. Stebėjimų rezultatai 42. Bendrus klinikinius stebėjimus reikia atlikti mažiausiai kartą per dieną, pageidautina kartą ar kelis kartus kasdien tuo pačiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio numatomo poveikio laiką po dozės davimo. Gyvūnų sveikatos būklė turėtų būti registruojama. Bent du kartus per dieną visi gyvūnai turėtų būti patikrinami, ar jie sveiki ir nenugaišę. 43. Kartą prieš pirmosios ekspozicijos pradžią (kad būtų galima palyginti tą patį gyvūną) ir bent kartą per savaitę po dozės davimo turėtų būti atliekami išsamūs visų tėvų kartos gyvūnų klinikiniai stebėjimai. Kiekvieną dieną šiuos stebėjimus reikėtų atlikti tuo pačiu metu, perkėlus gyvūną iš narvo į tam skirtą vietą. Jų rezultatai turėtų būti kruopščiai registruojami, pageidautina naudojant įvertinimo balais sistemas, aiškiai apibrėžtas bandymų laboratorijos. Turėtų būti dedamos pastangos, kad bandymo sąlygų kaita būtų kuo mažesnė, ir pageidautina, kad šiuos stebėjimus atliktų stebėtojai, kurie nežinotų, ar buvo apdorojama. Registruojami požymiai turėtų aprėpti odos, kailio, akių, gleivinės pakitimus, išskyrų, išmatų, autonominio aktyvumo (pvz., ašarojimo, plaukų pašiaušimo, vyzdžio dydžio, neįprasto kvėpavimo) buvimą ir kitus dalykus. Taip pat turėtų būti registruojami eisenos, pozos, atsako į tvarkymo veiksmus pakitimai, traukulių arba toninių judesių atsiradimas, stereotipijos požymiai (pvz., besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu), sunkus arba ilgalaikis atsivedimas arba keistas elgesys (pvz., savęs luošinimas, ėjimas atbulomis) (10). 44. Vieną kartą tyrimo metu reikėtų atlikti penkių patinų ir penkių patelių, atsitiktinai atrinktų iš kiekvienos grupės, jutiminės reakcijos į skirtingų rūšių dirgiklius (pvz., klausos, regos ir proprioceptorių dirgiklius) (8) (9) (11), sugriebimo stiprumo (12) ir judėjimo aktyvumo (13) vertinimą. Išsamesnės informacijos apie procedūras, kurios galėtų būti taikomos, pateikta atitinkamuose literatūros šaltiniuose. Tačiau taip pat galėtų būti taikomos čia nurodytoms procedūroms alternatyvios procedūros. Šie funkciniai patinų stebėjimai turėtų būti atliekami baigiantis dozės davimo jiems laikotarpiui, prieš pat numatytą numarinimą, bet prieš hematologijai ar klinikinei chemijai skirtų kraujo ėminių ėmimą (žr. 53–56 pastraipas, įskaitant 1 išnašą). Šių funkcinių bandymų metu patelės turėti būti fiziologiškai panašios būsenos ir jų funkcinius bandymus reikėtų vieną kartą atlikti paskutinę žindymo savaitę (pvz., 6–13 žindymo dieną), netrukus prieš numatytą numarinimą. Kiek įmanoma reikėtų mažinti patelių ir jauniklių atskyrimo trukmę. 45. Vieną kartą prieš tyrimų pabaigą atliekami funkciniai stebėjimai nebūtini, kai tyrimas atliekamas kaip vėlesnio pusiau lėtinio (90 dienų) arba ilgalaikio toksiškumo tyrimo parengiamasis tyrimas. Tokiu atveju funkciniai stebėjimai turėtų būti įtraukiami į šį tolesnį tyrimą. Kita vertus, tokie funkciniai stebėjimai atliekant kartotinės dozės tyrimą suteikia didesnę galimybę geriau parinkti dozių dydžius tolesniam pusiau lėtinio arba ilgalaikio toksiškumo tyrimui. 46. Išimtiniais atvejais funkcinių stebėjimų galima neatlikti ir su tomis grupėmis, kurių toksiškumo požymiai tokio laipsnio, kad jie labai trukdytų atlikti funkcinius bandymus. 47. Gestacijos trukmė turėtų būti registruojama ir pradedama skaičiuoti nuo 0 nėštumo dienos. Kiekviena vada turėtų būti apžiūrėta kiek įmanoma greičiau po atsivedimo siekiant nustatyti jauniklių skaičių ir lytį, gimusių negyvų ir gimusių gyvų jauniklių skaičių, silpnuosius jauniklius (jauniklius, kurie yra gerokai mažesni už atitinkamus kontrolinius jauniklius) ir dideles anomalijas. 48. Gyvi jaunikliai turėtų būti suskaičiuojami ir jų lytis nustatoma per 24 h nuo atsivedimo (0 dieną arba 1 dieną po atsivedimo) ir bent 4 ir 13 dieną po atsivedimo. Be tėvų kartos gyvūnų stebėjimų (žr. 43 ir 44 pastraipas), reikėtų registruoti visus jauniklių nenormalaus elgesio pasireiškimus. 49. Kiekvieno jauniklio anogenitalinis atstumas (AGD) turėtų būti matuojamas tą pačią dieną po gimimo tarp PND 0 ir PND 4. Jauniklio kūno masės duomenis reikėtų gauti tą pačią dieną, kurią matuojamas AGD, ir AGD turėtų būti norminamas pagal jauniklio dydį, ir būtų gerai, kad AGD būtų lygus kubinei šakniai iš kūno masės (14). Jauniklių patinų spenelius ir (arba) areoles reikėtų suskaičiuoti PND 12 arba 13 dieną, kaip rekomenduojama EBPO GD 151 (15). Kūno masė ir pašaro bei vandens suvartojimas 50. Patinus ir pateles reikėtų sverti pirmąją dozės davimo dieną, ne rečiau kaip kas savaitę vėliau ir tyrimo pabaigoje. Vaikingumo laikotarpiu pateles reikėtų sverti 0, 7, 14 ir 20 dieną ir per 24 valandas po atsivedimo (0 arba 1 diena po atsivedimo) ir bent 4 ir 13 dieną po atsivedimo. Šie rezultatai turėtų būti pateikiami ataskaitoje atskirai apie kiekvieną suaugusį gyvūną. 51. Pašaro suvartojimą prieš poravimąsi, vaikingumo ir žindymo metu reikėtų matuoti mažiausiai kartą per savaitę. Pašaro suvartojimą poravimosi metu matuoti nebūtina. Vandens suvartojimas šiais laikotarpiais taip pat turėtų būti matuojamas, kai bandomoji cheminė medžiaga yra duodama su šia terpe. Hematologija 52. Vieną kartą tyrimo metu reikėtų atlikti tokius penkių patinų ir penkių patelių, atsitiktinai atrinktų iš kiekvienos grupės, hematologinius tyrimus: hematokrito, hemoglobino koncentracijos, eritrocitų kiekio, retikolucitų, bendrojo leukocitų kiekio ir leukocitų formulės, trombocitų kiekio ir kraujo krešėjimo trukmės ir aktyvumo. Jei įtariama, kad bandomoji cheminė medžiaga arba jos numanomi metabolitai turi oksidacinių savybių, turėtų būti nustatyti ir kiti rodikliai, įskaitant metemoglobino koncentraciją ir Heinco kūnelius. 53. Kraujo ėminiai turėtų būti imami iš nurodytos vietos. Ėminių ėmimo metu patelės turėti būti fiziologiškai panašios būsenos. Siekiant išvengti praktinių sunkumų, susijusių su gestacijos pradžios kintamumu, vietoj patelių kraujo ėminių ėmimo prieš pat gyvūnų numarinimą arba numarinimo procedūros metu, juos būtų galima imti baigiantis laikotarpiui prieš poravimąsi. Patinų kraujo ėminius geriausia būtų imti prieš pat gyvūnų numarinimą arba numarinimo procedūros metu. Arba patinų kraujo ėminius taip pat būtų galima imti baigiantis laikotarpiui prieš poravimąsi, jei šis laiko momentas laikomas tinkamiausiu patelėms. 54. Kraujo ėminius reikėtų laikyti tinkamomis sąlygomis. Klinikinė biochemija 55. Klinikiniai biocheminiai nustatymai tiriant pagrindinius toksinius poveikius audiniams, ypač inkstams bei kepenims, turėtų būti atliekami imant kiekvienos grupės penkių patinų ir penkių patelių kraują. Rekomenduojama prieš kraujo ėmimą gyvūnų per naktį nešerti ( 22 ) . Atliekant plazmos arba serumo tyrimus turėtų būtų nustatomas: natris, kalis, gliukozė, suminis cholesterolis, karbamidas, kreatininas, suminis baltymų kiekis ir albuminas, mažiausiai du fermentai, rodantys poveikį kepenų ląstelėms (pvz., alaninaminotransferazė, aspartataminotransferazė ir sorbitoldehidrogenazė) ir tulžies rūgštys. Tam tikromis aplinkybėmis naudingos informacijos gali suteikti papildomi fermentų (kepenų arba kitokios kilmės) ir bilirubino tyrimai. 56. Kraujo ėminiai iš nustatytos vietos imami pagal tokį tvarkaraštį: — ne mažiau kaip dviejų jauniklių iš kiekvienos vados 4 dieną po gimimo, jei pakanka jauniklių skaičiaus (žr. 40–41 pastraipas) — visų patelių, ne mažiau kaip dviejų jauniklių iį kiekvienos vados 13 dieną tyrimo pabaigoje, ir — visų suaugusių patinų tyrimo pabaigoje. Visi kraujo ėminiai laikomi tinkamomis sąlygomis. 13 dienų jauniklių ir suaugusių patinų kraujo ėminiai vertinami dėl skydliaukės hormonų (T4) koncentracijos serume. Papildomai nustatomas T4 kiekis patelių ir 4 dienų jauniklių kraujo ėminiuose, jei reikia. Be to, galima pasirinkti matuoti kitus hormonus, jei tinka. Vienos vados jauniklių kraujo ėminius galima sujungti atliekant skydliaukės hormonų analizę. Skydliaukės hormonus (T4 ir TSH) reikėtų matuoti kaip „suminį kiekį“. 57. Paskutinę tyrimo savaitę (neprivalomai) gali būti atliekami kiekvienos grupės penkių atsitiktinai atrinktų patinų šlapimo tyrimai, nustatytu laiku imant tam tikrą šlapimo tūrį ir tiriant: išvaizdą, kvapą, tūrį, osmolialumą arba savitąjį tankį, pH, baltymus, gliukozę ir kraują (kraujo kūnelius). 58. Be to, būtų galima numatyti tyrimus bendrų audinių pažeidimų serumo rodikliams nustatyti. Jei žinomos ar įtariamos bandomosios cheminės medžiagos savybės gali daryti įtaką susijusiems medžiagų apykaitos eigai, galima atlikti kalcio, fosfato, trigliceridų ir gliukozės nešėrus, specifinių hormonų, metemoglobino bei cholinesterazės analizę. Būtinumas tai atlikti turi būti nustatomas kiekvieną kartą atskirai. 59. Hormonų nustatymo rezultatų kintamumui ir absoliučiajai koncentracijai gali turėti įtakos šie veiksniai: — numarinimo laikas – dėl hormonų koncentracijos kitimo paros metu; — numarinimo būdas, siekiant išvengti per didelio streso, galinčio turėti įtakos hormonų koncentracijai, — hormonų nustatymui skirti bandymo rinkiniai, kuriais gautos kalibravimo kreivės gali skirtis. 60. Hormonų nustatymui specialiai skirti plazmos ėminiai turėtų būti imami panašiu dienos metu. Naudojant įvairius prekyboje esančius bandymo rinkinius, skiriasi gautos analizuojamų hormonų koncentracijos skaitinės vertės. 61. Jei pamatinių istorinių duomenų nepakanka, turėtų būti apsvarstyta galimybė nustatyti hematologinius ir klinikinius biocheminius kintamuosius prieš pradedant duoti dozes arba, tai geriau atlikti naudojant gyvūnų grupę, neįtrauktą į bandymo grupes. Patelių atvejų tyrimui imami žindančių gyvūnų duomenys. PATOLOGIJA Bendroji nekroskopija 62. Turėtų būti atliekamas išsamus visų bandomųjų gyvūnų bendrasis skrodimas, atidžiai ištiriant kūno paviršių ir visas jo angas, kaukolės, krūtinės ląstos, pilvo ertmes ir jų turinį. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas reprodukcijos sistemos organams. Reikėtų registruoti implantacijos vietų skaičių. Makšties tepinėliai turėtų būti tiriami skrodimo dienos ryte, kad būtų galima nustatyti rujos ciklo stadiją ir koreliaciją su patelės reprodukcijos organų histopatologija. 63. Nuo visų suaugusiųjų patinų sėklidžių, sėklidžių prielipų, taip pat prostatos ir sėklinių pūslelių su koaguliatorių liaukomis, kaip visumos, reikėtų pašalinti visus priaugusius audinius, jei yra, ir po skrodimo kuo greičiau pasverti drėgnos būsenos, kad būtų išvengta džiūvimo. Be to, papildomai galėtų būti nustatoma patinų išangės pakeliamojo ir stormeninio akytkūnio raumens, abiejų Kuperio liaukų ir varpos galvos masė, patelių – porinių kiaušidžių (drėgno organo masė) ir gimdos (įskaitant gimdos kaklelį) masė; jei šios masės įtraukiamos, jos turėtų būti nustatytos kuo greičiau po skrodimo. Reikėtų konservuoti visų suaugusiųjų gyvūnų kiaušides, sėklides, papildomus lytinius organus ir visus organus, turinčius makroskopinių pažeidimų. 64. Visų suaugusiųjų patinų ir patelių bei kiekvienos vados vieno 13 dienos jauniklio patino ir patelės skydliaukės turėtų būt konservuojamos tinkamiausioje fiksavimo terpėje, kad vėliau būtų galima atlikti numatytą histopatologinį tyrimą. Skydliaukės masę galima nustatyti atlikus fiksavimą. Valyti (apipjaustyti) taip pat reikėtų labai atsargiai ir tik atlikus fiksavimą, kad nebūtų pažeistas audinys. Pažeidus audinį gali būti gauti netikslūs histopatologinės analizės rezultatai. Kraujo ėminiai turėtų būti imami iš nurodytos vietos prieš pat gyvūnų numarinimą arba numarinimo procedūros metu ir saugomi tinkamomis sąlygomis (žr. 56 pastraipą). 65. Be to, atsitiktinai iš kiekvienos grupės atrinktų penkių suaugusiųjų patinų ir patelių (neskaitant gaištančių ir (arba) numarintų iki tyrimo pabaigos) kepenys, inkstai, antinksčiai, užkrūčio liauka, blužnis, smegenys ir širdis turėtų būti nuvalyti pašalinant priaugusius audinius, jei yra, ir kuo greičiau pasverti drėgnos būsenos, kad būtų išvengta džiūvimo. Naudojant audiniui ir vėlesniam histopatologiniam tyrimui tinkamiausią fiksavimo terpę, reikėtų konservuoti šiuos audinius: visus labai pažeistus audinius, smegenis (jų būdingiausias dalis – didžiąsias smegenis, smegenėles ir smegenų tiltą), nugaros smegenis, akis, skrandį, mažąsias ir didžiąsias žarnas (taip pat Peyerio plokšteles), kepenis, inkstus, antinksčius, blužnį, širdį, užkrūčio liauką, trachėją ir plaučius (įleidžiant fiksatyvo ir tada panardinant), lytines liaukas (sėklides ir kiaušides), papildomus lytinius organus (gimdą, gimdos kaklelį, sėklidžių prielipus, prostatą ir sėklines pūsleles su koaguliatorių liaukomis), makštį, šlapimo pūslę, limfinius mazgus (be artimiausio drenažinio mazgo, remiantis geriausią laboratorine patirtimi paimamas dar vienas mazgas (16)), periferinį nervą (sėdimąjį arba blauzdikaulio), pageidautina, esantį arti raumens, skeleto raumenis ir kaulus su kaulų čiulpais (išpjovą arba šviežiai paruoštą kaulų čiulpų punkciją). Rekomenduojama atlikti sėklidžių fiksavimą jas panardinant į Bouino arba modifikuotąjį Davidsono fiksatyvą (16) (17) (18). Šių audinių nerekomenduojama fiksuoti formaline. Abu tunica albuginea galus galima atsargiai ir negiliai pradurti adata, kad fiksatyvas galėtų greitai prasiskverbti. Atsižvelgiant į gautus klinikinių tyrimų ir kitus rezultatus, gali tekti tirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomosios cheminės medžiagos savybes, turėtų būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai. 66. Vertingos informacijos apie poveikį endokrininei sistemai galima gauti tiriant šiuos audinius: lytines liaukas (kiaušides ir sėklides), papildomus lytinius organus (gimdą ir gimdos kaklelį, sėklidžių prielipus, sėklines pūsleles su koaguliatorių liaukomis, dorsolateralinę ir pilvinę prostatą), makštį, hipofizį, patinų pieno liauką ir antinksčių liauką. Patinų pieno liaukų pakitimai nėra pakankamai dokumentuoti, bet šis parametras gali būti labai jautrus estrogeniškai veikiančioms medžiagoms. Į 65 pastraipą neįtrauktų organų ir (arba) audinių stebėjimas nėra būtinas. 67. Negyvi jaunikliai ir 13 dieną po atsivedimo arba šiek tiek vėliau numarinti jaunikliai turėtų būti bent kruopščiai apžiūrėti išoriškai dėl didelių anomalijų. Ypatingą dėmesį reikėtų atkreipti į išorinius lytinio dauginimosi organus, kuriuos reikėtų ištirti dėl pakitusio vystymosi požymių. Histopatologija 68. Turėtų būti atliekami išsamūs histopatologiniai kontrolinių ir didelės dozės grupių pasirinktų gyvūnų užkonservuotų organų ir audinių tyrimai (ypač kreipiant dėmesį į patinų lytinių liaukų spermatogenezės stadijas ir sėklidžių intersticinių ląstelių struktūros histopatologiją). Jei būtina, galima ištirti jauniklių ir likusių suaugusiųjų gyvūnų skydliaukę. Jei su ekspozicija susijusių pakitimų nustatoma didžiausiąją dozę gavusioje grupėje, reikėtų išanalizuoti ir kitas dozes gavusių gyvūnų grupes. Histopatologinių tyrimų gairėse (10) pateikta išsamios papildomos informacijos apie skrodimą, fiksavimą, pjaustymą ir endokrininių audinių histopatologiją. 69. Turėtų būti ištirti visi makroskopiniai pažeidimai. Siekiant padėti nustatyti NOAEL, reikėtų tirti kitų dozių grupių tikslinius organus, ypač tų grupių, kurios nurodomos kaip rodančios NOAEL. 70. Jei naudojama pagalbinė grupė, reikėtų atlikti audinių ir organų, poveikis kuriems buvo nustatytas tiriant apdorotas grupes, histopatologinį tyrimą. DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS Duomenys 71. Turėtų būti pateikiami atskirų gyvūnų duomenys. Be to, papildomai visus duomenis reikėtų suvesti į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, darant bandymą nugaišusių arba dėl humaniškų priežasčių numarintų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų nugaišimo arba humaniško numarinimo laikas, vaisingų gyvūnų skaičius, vaikingų patelių skaičius, toksinio poveikio požymių turinčių gyvūnų skaičius, pastebėtų toksiškumo požymių aprašymas, įskaitant pradžios laiką, trukmę ir toksinio poveikio rimtumą, histopatologinių pakitimų tipai ir visi atitinkami vados duomenys. Lentelės pavidalo suvestinės formatas, kuris pasirodė labai naudingas, kai reikia įvertinti poveikį reprodukcijai ir (arba) vystymuisi, pateiktas 3 priedėlyje. 72. Jei įmanoma, kiekybiniai rezultatai turėtų būti įvertinti taikant tinkamą visuotinai pripažintą statistinį metodą. Lyginant poveikį pagal dozių intervalą turėtų būti vengiama taikyti įvairius t kriterijus. Statistiniai metodai turėtų būti parenkami rengiant tyrimo planą. AGD ir spenelių išlikimo statistinė analizė turėtų būti pagrįsta atskirų jauniklių duomenimis, atsižvelgiant į vados veiksnius. Jei tinka, statistinės analizės vienetas yra vada. Jauniklių kūno masės statistinė analizė turėtų būti pagrįsta atskirų jauniklių duomenimis, atsižvelgiant į vados dydį. Atsižvelgiant į nedidelę tyrimo apimtį, statistinės analizės kaip reikšmingumo kriterijų nustatymo vertė yra ribota daugeliui vertinamųjų baigčių, ypač reprodukcijos vertinamųjų baigčių. Kai kurie plačiausiai taikomi metodai, ypač skirstinio vidutinės vertės mato parametriniai kriterijai, netinka. Jei statistiniai tyrimai atliekami, pasirinktas metodas turėtų atitikti tiriamo kintamojo pasiskirstymą ir metodą reikėtų pasirinkti prieš tyrimo pradžią. Rezultatų įvertinimas 73. Šio toksiškumo tyrimo rezultatai turėtų būti vertinami atsižvelgiant į stebimą poveikį, nekroskopijos ir mikroskopinio tyrimo rezultatus. Įvertinimas aprėpia ryšį tarp bandomosios cheminės medžiagos dozės ir anomalijų buvimo ar nebuvimo, dažnumo ir sunkumo, įskaitant makroskopinius pažeidimus, nustatytus tikslinius organus, nevaisingumą, klinikines anomalijas, paveiktą reprodukavimo gebą ir vados charakteristikas, kūno masės pokyčius, poveikį gaištamumui ir visus kitus toksiškumo reiškinius. 74. Dėl trumpo patinų apdorojimo laikotarpio, vertinant poveikį patinų reprodukcijai, sėklidžių ir sėklidžių prielipų histopatologiją reikėtų nagrinėti kartu su vaisingumo duomenimis. Reprodukcijos ir (arba) vystymosi istorinių kontrolinių ėminių duomenų (pvz., vados dydis, AGD, spenelių išlikimas, T4 koncentracija serume), jei yra, naudojimas taip pat gali būti naudingas kaip pagalbinė priemonė aiškinant tyrimą. 75. Siekiant užtikrinti kokybės kontrolę, siūloma rinkti istorinių kontrolinių ėminių duomenis ir apskaičiuoti skaitinių duomenų variacijos koeficientus, ypač parametrų, susijusių su endokrininę sistemą ardančių medžiagų aptikimu. Šie duomenys gali būti naudojami palyginimo tikslais, kai vertinami atliekami tyrimai. Bandymo ataskaita 76. Į bandymo ataskaitą turėtų būti įtraukta ši informacija: Bandomoji cheminė medžiaga: — šaltinis, partijos numeris, naudojimo pabaigos data, jei yra; — bandomosios cheminės medžiagos stabilumas, jei žinomas. Vienkomponentė medžiaga: — fizinė išvaizda, tirpumas vandenyje ir papildomos būdingos fizikinės ir cheminės savybės; — cheminio identifikavimo duomenys, pvz., IUPAC ar CAS pavadinimas, CAS numeris, SMILES žymėjimas ar InChI kodas, struktūrinė formulė, grynumas, cheminis priemaišų pavadinimas, jei tinka bei praktiškai įmanoma ir kt.; Daugiakomponentė medžiaga, UVCB ir mišiniai: — kuo išsamesnis sudedamųjų dalių apibūdinimas, nurodant cheminį pavadinimą (žr. pirmiau), kiekybinį paplitimą ir būdingas fizikines ir chemines savybes . Nešiklis (jei naudojamas): — nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei nešiklis ne vanduo. Bandymo gyvūnai: — naudota rūšis ir (arba) padermė, — gyvūnų skaičius, amžius ir lytis, — šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir kt., — kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje. — rūšies, jei tai ne žiurkės, pasirinkimo pagrindimas. Bandymo sąlygos: — dozės dydžio pasirinkimo pagrindimas; — duomenys apie bandomosios cheminės medžiagos preparato ruošimą ir (arba) jos dėjimą į pašarą, gautą preparato koncentraciją, stabilumą ir vienalytiškumą; — išsami informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimo būdą; — bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos (ppm) pašare arba geriamajame vandenyje perskaičiavimas į faktinę dozę (mg/kg kūno masės per parą), jei taikoma; — išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę; — išsamus randomizavimo procedūros brokuojamiems jaunikliams atrinkti procedūros aprašymas, jei brokuojami. Rezultatai: — kūno masė ir (arba) kūno masės pokyčiai; — pašaro ir vandens suvartojimo duomenys, jei taikoma; — toksinio atsako duomenys pagal lytį ir dozę, įskaitant vaisingumą, nėštumą, ir kitus toksiškumo požymius; — gestacijos trukmė; — toksiškas arba kitoks poveikis reprodukcijai, palikuonims, postnataliniam augimui ir kt.; — klinikinių požymių pobūdis, sunkumas ir trukmė (grįžtami ar negrįžtami); — jutimo organų aktyvumo, sugriebimo stiprumo ir judėjimo aktyvumo vertinimo duomenys; — hematologiniai tyrimai, remiantis atitinkamomis pamatinėmis vertėmis; — klinikiniai biocheminiai tyrimai, remiantis atitinkamomis pamatinėmis vertėmis; — suaugusiųjų patelių, kurių rujos ciklas yra normalus arba nenormalus, skaičius ir ciklo trukmė; — gimusių gyvų jauniklių skaičius ir poimplantaciniai nuostoliai; — jauniklių su aiškiai matomais išsigimimais skaičius, išorinių lyties organų bendrasis įvertinimas, silpniausių jauniklių skaičius; — nugaišimo laikas tyrimo metu arba nurodymas, kad gyvūnas išgyveno iki pabaigos; — implantacijų skaičius, vados dydis ir vados masė registravimo metu; — jauniklio kūno masės duomenys; — visų jauniklių AGD (ir kūno masė AGD matavimo dieną); — spenelių išlikimas pas jauniklius patinus; — 13 dienų jauniklių ir suaugusiųjų patinų skydliaukės hormonų koncentracija (ir patelių bei 4 dienos jauniklių, jei matuojama); — tėvų kartos kūno masės numarinant ir organų masės duomenys; — nekroskopijos duomenys; — išsamus histopatologinių rezultatų aprašymas; — absorbcijos duomenys (jei yra); — statistinis rezultatų apdorojimas, jei reikia. Rezultatų aptarimas Išvados. Rezultatų aiškinimas 77. Tyrime būtų pateikiami su kartotinių dozių vartojimu susijusio toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vystymuisi vertinimo rezultatai. Visų pirma, kadangi daugiausia dėmesio skiriama bendrojo toksiškumo ir toksiškumo reprodukcijai ir (arba) vystymuisi vertinamosioms baigtims, pagal tyrimo rezultatus bus galima atskirti poveikį reprodukcijai ir (arba) vystymuisi, kai bendrojo toksiškumo nėra, ir poveikį, kuris pasireiškia tik esant koncentracijoms, kurios taip pat sukelia toksiškumą tėvų kartos gyvūnams (žr. 7–11 pastraipas). Jis galėtų parodyti tolesnių tyrimų atlikimo būtinybę ir pateikti jų rengimo schemų rekomendacijas. Reikėtų ieškoti informacijos EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 43, kuri padėtų paaiškinti reprodukcijos ir vystymosi rezultatus (19). EBPO rekomendaciniame dokumente Nr. 106 dėl graužikų endokrininių ir reprodukcijos bandymų histologinio įvertinimo (16) pateikiama informacija apie (endokrininių) organų bei makšties tepinėlių paruošimą ir įvertinimą, kuri gali būti naudinga šiam bandymo metodui. LITERATŪRA (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Galima gauti iš Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos Paryžiuje. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Galima gauti iš Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos Paryžiuje. (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci., 19, 141-149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol ., 18, 89-95. (5) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Galima gauti iš Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos Paryžiuje. (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research , Part B, 80 (2), 84-97. (9) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document (No 60). (11) Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, 267-283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, 233-236. (13) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609. (14) Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds. (1999). „Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights“, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (16) OECD (2009).Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 106) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (17) Hess RA and Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. (18) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson’s Fluid: Comparison with Bouin’s Fluid and Conventional Davidson’s fluid. Toxicol . Pathol . 30, 524-533. (19) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. (20) OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. 1 priedėlis APIBRĖŽTYS (TAIP PAT ŽR. EBPO REKOMENDACINĮ DOKUMENTĄ NR. 150 (20)) Androgeniškumas - cheminės medžiagos geba veikti žinduolio organizme kaip natūralus androgeninis hormonas (pvz., testosteronas). Antiandrogeniškumas - cheminės medžiagos geba slopinti natūralaus androgeninio hormono (pvz., testosterono) veikimą žinduolio organizme. Antiestrogeniškumas - cheminės medžiagos geba slopinti natūralaus estrogeninio hormono (pvz., 17β-estradiolio) veikimą žinduolio organizme. Antitiroidinis aktyvumas - cheminės medžiagos gebėjimas slopinti natūralaus skydliaukės hormono (pvz., T3) veikimą žinduolio organizme. Cheminė medžiaga - atskira cheminė medžiaga arba mišinys. Toksiškumas vystymuisi - toksiškumas reprodukcijai, kuris pasireiškia kaip palikuonių pre-, peri-, postnataliniai, struktūriniai ar funkciniai sutrikimai. Dozė - duodamas bandomosios cheminės medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios cheminės medžiagos mase, per parą tenkančia vienam bandomojo gyvūno kūno masės vienetui (pvz., mg/kg kūno masės per parą), arba pastovia koncentracija pašare. Dozavimas - bendrasis terminas, aprėpiantis dozės dydį, jos davimo dažnumą ir trukmę. Akivaizdus toksiškumas - bendrasis terminas, apibūdinantis aiškius toksiškumo požymius, pastebimus davus bandomosios cheminės medžiagos. Šių požymių turėtų pakakti pavojui įvertinti ir jie turėtų būti tokie, kad padidinus duodamą dozę būtų galima tikėtis sunkių toksiškumo požymių stiprėjimo ir galbūt gyvūnų gaišimo. Vaisingumo sumažėjimas - rodo patelių ar patinų reprodukcijos funkcijų arba gebos sutrikimus. Toksinis poveikis patelei - neigiamas poveikis vaikingoms patelėms, kuris pasireiškia būdingai (tiesioginis poveikis) arba nebūdingai (netiesioginis poveikis), ir yra susijęs su vaikingumo būsena. NOAEL - termino nepastebėto neigiamo poveikio riba santrumpa. Tai didžiausioji dozė, kurią duodant nepastebima su apdorojimu susijusių neigiamų rezultatų. Estrogeniškumas - cheminės medžiagos gebėjimas veikti žinduolio organizme kaip natūralus estrogeninis hormonas (pvz., 17β-estradiolis). Toksiškumas reprodukcijai - rodo neigiamą poveikį palikuoniams ir (arba) patelių ar patinų reprodukcijos funkcijų arba gebos sumažėjimą. Bandomoji cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys, bandyti pagal šį bandymo metodą. Tiroidinis aktyvumas - cheminės medžiagos gebėjimas veikti žinduolio organizme kaip natūralus skydliaukės hormonas (pvz., T3). Tinkamumo patvirtinimas - mokslinis procesas, skirtas apibūdinti bandymo metodo taikymo charakteristikoms keliamus reikalavimus ir apribojimus bei įrodyti jo patikimumą ir tinkamumą konkrečiam tikslui. 2 priedėlis BANDYMO TVARKARAŠČIO SCHEMA, RODANTI DIDŽIAUSIĄJĄ TYRIMO TRUKMĘ, PAGRĮSTĄ VISU 14 DIENŲ PORAVIMOSI LAIKOTARPIU 3 priedėlis POVEIKIO REPRODUKCIJAI IR (ARBA) VYSTYMUISI ĮVERTINIMO LENTELĖS FORMOS SUVESTINĖ ATASKAITA STEBĖJIMŲ REZULTATAI VERTĖS Dozavimas (vienetai) 0 (kontrolinis) … … … … Porų skaičius pradžioje (skaičius) Rujos ciklas (bent vidutinė nereguliariųjų ciklų vidutinė trukmė ir dažnis) Patelės, rodančios poravimosi požymius (skaičius) Vaikingos patelės (skaičius) Apvaisinimo dienos 1–5 (skaičius) Apvaisinimo dienos 6–...() (skaičius).([1] (23) ) (skaičius) Vaikingumas ≤ 21 diena (skaičius) Vaikingumas = 22 dienos (skaičius) Vaikingumas ≥ 23 dienos (skaičius) Patelės, turinčios gyvų jauniklių (skaičius) Patelės, turinčios gyvų jauniklių 4 dieną po atsivedimo (skaičius) Implantai/patelei (vidurkis) Gyvi jaunikliai/patelei po atsivedimo (vidurkis) Gyvi jaunikliai/patelei 4 dieną po atsivedimo (vidurkis) Lyčių santykis (v/m) po atsivedimo (vidurkis) Lyčių santykis (v/m) 4 dieną po atsivedimo (vidurkis) Vados masė po atsivedimo (vidurkis) Vados masė 4 dieną po atsivedimo (vidurkis) Jauniklių masė po atsivedimo (vidurkis) Jauniklių masė AGD matavimo metu (vidutinė patinų, vidutinė patelių) Jauniklių AGD, matuotas tą pačia dieną – nuo atsivedimo dienos iki 4 dienos (vidutinis patinų, vidutinis patelių, pažymėti dieną po atsivedimo (PND)) Jauniklių masė 4 dieną (vidurkis) Jauniklių masė 13 dieną (vidurkis) Spenelių išlikimas pas jauniklius patinus 13 dieną (vidurkis) JAUNIKLIAI SU ANOMALIJOMIS Patelių su 0 Patelių su 1 Patelių su ≥ 2 PALIKUONIŲ NUOSTOLIAI Prenataliniai (implantacijos minus gyvų jauniklių skaičius) Patelių su 0 Patelių su 1 Patelių su 2 Patelių su ≥ 3 Postnataliniai (gyvų jauniklių skaičius atsivedimo metu minus gyvų jauniklių skaičius 13 dieną po atsivedimo) Patelių su 0 Patelių su 1 Patelių su 2 Patelių su ≥ 3 B.65 ODOS ĖSDINIMO IN VITRO NAUDOJANT MEMBRANINĘ PERTVARĄ METODAS ĮVADAS 1. in vitro membraninės pertvaros bandymo metodas, kuris gali būti taikomas ėsdinančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti. Bandymo metode naudojama dirbtinė membrana, skirta rodyti atsaką ėsdinančioms cheminėms medžiagoms panašiai kaip gyvūnų oda in situ . Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) 435 (2015). Odos ėsdinimu vadinamas negrįžtamasis odos pažeidimas, kuris pasireiškia kaip matoma nekrozė per epidermį į dermį, po bandomosios cheminės medžiagos uždėjimo, kaip apibrėžta Jungtinių Tautų (JT) visuotinai suderintoje cheminių medžiagų klasifikavimo ir ženklinimo sistemoje (GHS) (1) ir Europos Sąjungos (ES) Reglamente Nr. 1272/2008 dėl cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (CLP) ( 24 ) ). Šis bandymo metodas, atitinkantis atnaujintas EBPO bandymo gaires 435, yramembraninės pertvaros bandymo metodas, kuris gali būti taikomas ėsdinančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti. Bandymo metode naudojama dirbtinė membrana, skirta rodyti atsaką ėsdinančioms cheminėms medžiagoms panašiai kaip gyvūnų oda 2. Įprastai odos ėsdinimas buvo vertinamas uždedant bandomąją cheminę medžiagą ant gyvo gyvūno odos ir vertinant audinio pažeidimo laipsnį po tam tikro nustatyto laiko tarpo (2). Be šio bandymo metodo, yra priimti keli kiti in vitro bandymo metodai kaip alternatyva (3) (4) standartinei in vivo triušio odos procedūrai (šio priedo B.4 skyrius, atitinka EBPO TG 404), naudojamai ėsdinančioms cheminėms medžiagoms identifikuoti (2). Pagal JT GHS odos ėsdinimo vertinimo ir klasifikavimo nuosekliųjų bandymų ir įvertinimo strategiją ir EBPO rekomendaciniame dokumente dėl odos dirginimo ar ėsdinimo integruotųjų bandymo ir vertinimo metodų (IATA) rekomenduojama taikyti patvirtintus ir priimtus in vitro 3 ir 4 modulių bandymo metodus (1) (5). IATA aprašomi keli moduliai, kuriuose grupuojami informacijos šaltiniai ir analizės priemonės bei (i) pateikiami nurodymai, kaip integruoti ir naudoti esamus bandymų ir ne bandymų duomenis, skirtus cheminių medžiagų odos dirginimo ir odos ėsdinimo potencialui įvertinti, ir (ii) siūlomas metodas, jei būtini papildomi bandymai, įskaitant, kai nustatomi neigiami rezultatai (5). Pagal šį modulinį metodą gauti teigiami in vitro bandymo metodų rezultatai gali būti naudojami cheminei medžiagai priskirti ėsdinančioms, neatliekant bandymų su gyvūnais, ir taip mažinti bei tikslinti gyvūnų naudojimą ir išvengti skausmo bei kančių, kurių galėtų būti, jei šiam tikslui būtų naudojami gyvūnai. 3. Atlikti in vitro membraninės pertvaros modelio, parduodamo Corrositex ® pavadinimu (6) (7) (8), patvirtinimo tyrimai, pagal kuriuos gautas bendrasis odos ėsdinimo prognozavimo tikslumas – 79 % (128/163), jautris – 85 % (76/89) ir specifiškumas – 70 % (52/74), kai duomenų bazę sudarė 163 medžiagos ir mišiniai (7). Atsižvelgiant į jo pripažintą tinkamumą, šį patvirtintą pamatinį metodą (PPM) rekomenduojama taikyti kaip nuosekliųjų bandymų strategijos dalį, vertinant cheminių medžiagų odos ėsdinimo pavojingumą (5) (7). Prieš in vitro odos ėsdinimo membraninės pertvaros modelį naudojant reglamentavimo tikslais, reikėtų nustatyti jo patikimumą, tinkamumą (tikslumą) ir siūlomo naudojimo apribojimus, kad būtų užtikrintas jo panašumas į PPM (9) pagal naudojimo charakteristikų standartų reikalavimus (10). EBPO abipusis duomenų pripažinimas būtų užtikrintas tik po to, kai pagal PS pasiūlytas naujas arba atnaujintas metodas būtų peržiūrėtas ir įtrauktas į atitinkamas EBPO bandymo gaires. Šiuo metu į EBPO bandymo gaires 435 yra įtrauktas tik vienas in vitro metodas, ir šis bandymo metodas – prekyboje esantis Cor