2002 m. lapkričio 26 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 2091/2002, iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 2870/2000, nustatantį Bendrijos pamatinius spiritinių gėrimų analizės metodus



Oficialusis leidinys L 322 , 27/11/2002 p. 0011 - 0027

CS.ES skyrius 3 tomas 37 p. 395 - 411

ET.ES skyrius 3 tomas 37 p. 395 - 411

HU.ES skyrius 3 tomas 37 p. 395 - 411

LT.ES skyrius 3 tomas 37 p. 395 - 411

LV.ES skyrius 3 tomas 37 p. 395 - 411

MT.ES skyrius 3 tomas 37 p. 395 - 411

PL.ES skyrius 3 tomas 37 p. 395 - 411

SK.ES skyrius 3 tomas 37 p. 395 - 411

SL.ES skyrius 3 tomas 37 p. 395 - 411



Komisijos reglamentas (EB) Nr. 2091/2002 2002 m. lapkričio 26 d. iš dalies keičiantis Reglamentą (EB) Nr. 2870/2000, nustatantį Bendrijos pamatinius spiritinių gėrimų analizės metodus EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį, atsižvelgdama į 1989 m. gegužės 29 d. Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 1576/89, nustatantį bendrąsias spiritinių gėrimų apibrėžimo, apibūdinimo ir pateikimo taisykles [1] su pakeitimais, padarytais Austrijos, Suomijos ir Švedijos Stojimo aktu, ypač į jo 4 straipsnio 8 dalį, kadangi: (1) 2000 m. gruodžio 19 d. Komisijos reglamentas (EB) Nr. 2870/2000, nustatantis spiritinių gėrimų analizės Bendrijos pamatinius metodus [2], šiuos metodus aprašo priede. (2) Vykdant Komisijos remiamo tyrimų projekto dalį, pagal tarptautiniu mastu pripažintas metodikas buvo įteisinti keturi analizės metodai, kuriais nustatomas trans-anetolas anyžių skonio spiritiniuose gėrimuose, glicirizo rūgštis ir chalkonai anyžių likeriuose ir kiaušinio trynys kiaušininiame likeryje ir likeryje su kiaušiniu. (3) Šie keturi metodai gali būti pripažinti kaip Bendrijos pamatiniai metodai ir turi būti įtraukti į Reglamento (EB) Nr. 2870/2000 priedą. (4) Šiame reglamente numatytos priemonės atitinka Spiritinių gėrimų vykdomojo komiteto nuomonę, PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ: 1 straipsnis Reglamento (EB) Nr. 2870/2000 priedas iš dalies keičiamas taip: 1. Priedo turinyje išbraukiamas V, VI, VII ir IX punktų terminas "(p.m.)". 2. Po III skyriaus pridedami šio reglamento priedo V, VI, VII ir IX skyriai. 2 straipsnis Šis reglamentas įsigalioja septintą dieną po jo paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje. Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse. Priimta Briuselyje, 2002 m. lapkričio 26 d. Komisijos vardu Franz Fischler Komisijos narys [1] OL L 160, 1989 6 12, p. 1. [2] OL L 333, 2000 12 29, p. 20. -------------------------------------------------- PRIEDAS V. ANETOLAS. TRANS-ANETOLO NUSTATYMAS SPIRITINIUOSE GĖRIMUOSE DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU 1. Taikymo sritis Šis metodas tinka nustatyti trans-anetolą anyžių skonio spiritiniuose gėrimuose, taikant kapiliarinės dujų chromatografijos metodą. 2. Normatyvinės nuorodos ISO 3696: 1987 Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai. 3. Metodo esmė Trans-anetolo koncentracija spiritiniuose gėrimuose nustatoma dujų chromatografijos (DC) metodu. Į mėginį ir į žinomos koncentracijos trans-anetolo etaloninį tirpalą dedamas vienodas kiekis vidinio standarto, pvz., 4-alilanizolo (estragolo), jei estragolo natūraliai nėra mėginyje, abu tirpalai praskiedžiami 45 % etanolio tirpalu ir tiesiogiai įpurškiami į DC sistemą. Likeriai, turintys didelius cukrų kiekius, prieš mėginio ruošimą ir analizę turi būti ekstrahuojami. 4. Reagentai ir medžiagos Analizei naudojami cheminiai reagentai, kurių grynumas būtų ne mažesnis nei 98 %. Naudojamas vanduo turėtų būti bent 3 kategorijos, kaip apibrėžta ISO 3696. Etaloninės medžiagos turi būti laikomos šaltai (esant 4 °C), apsaugotos nuo šviesos, aliuminio induose arba dažyto stiklo (gintaro spalvos) cheminių reagentų buteliuose. Būtų gerai, jei kamščiai turėtų sandarinantį dangtelį iš aliuminio. Prieš naudojant kristalinis trans-anetolas turi būti "išlydytas", tai darant temperatūra niekuomet neturi būti didesnė kaip 35 °C. 4.1. 96 % tūrio etanolis (CAS 64-17-5) 4.2. 1-metoksi-4-(1-propenil benzenas; (trans-anetolas) (CAS 4180-23-8) 4.3. 4-alilanizolas, (estragolas) (CAS 140-67-0), pasiūlytas vidinis standartas (VS) 4.4. 45 % tūrio etanolis Įpilkite 560 g distiliuoto vandens į 378 g 96 % tūrio etanolio. 4.5. Etaloninių tirpalų ruošimas Visi etaloniniai tirpalai turi būti laikomi esant kambario temperatūrai (15–35 °C), apsaugoti nuo šviesos, aliuminio induose arba dažyto stiklo (gintaro spalvos) cheminių reagentų buteliuose. Būtų gerai, jei kamščiai turėtų sandarinantį dangtelį iš aliuminio. Trans-anetolas ir 4-alilanizolas beveik netirpsta vandenyje, todėl prieš pilant į juos 45 % etanolį (4.4), trans-anetolą ir 4-alilanizolą reikia ištirpinti nedideliame kiekyje 96 % etanolio (4.1). Pradiniai tirpalai turi būti gaminami iš naujo kiekvieną savaitę. 4.5.1. Etaloninis A tirpalas Pradinis trans-anetolo tirpalas (koncentracija: 2 g/l) Į 20 ml matavimo kolbą pasverkite 40 mg trans-anetolo (4.2) (arba 400 mg į 200 ml ir t. t.). Įpilkite nedidelį tūrį 96 % etanolio (4.1) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. 4.5.2. Vidinio standarto B tirpalas Pradinis vidinio standarto, pvz., estragolo, tirpalas (koncentracija: 2 g/l) Į 20 ml matavimo kolbą pasverkite 40 mg estragolo (4.3) (arba 400 mg į 200 ml ir t. t.). Įpilkite nedidelį tūrį 96 % etanolio (4.1) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. 4.5.3. Tirpalai, naudojami liepsnos jonizacinio detektoriaus (FID) atsako tiesiškumui tikrinti Prieš analizę turi būti patikrintas FID atsako tiesiškumas, atsižvelgiant į tai, kad trans-anetolo koncentracijos spiritiniuose gėrimuose verčių intervalas yra 0 g/l–2,5 g/l. Pagal analizės metodiką analizei skirti nežinomi spiritinių gėrimų mėginiai skiedžiami 10 kartų (8.3). Esant metode aprašytoms analizės sąlygoms, pradiniai tirpalai, atitinkantys 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, ir 0,25 g/l trans-anetolo koncentracijos analizuojamame mėginyje vertes, ruošiami taip: pipete paimkite 0,5, 1, 1,5, 2 ir 2,5 ml pradinio A tirpalo (4.5.1) ir supilkite į atskiras 20 ml matavimo kolbas; į kiekvieną kolbą pipete įpilkite 2 ml vidinio standarto B tirpalo (4.5.2) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. Kaip tuščiojo bandymo tirpalas (8.4) naudojamas 0 g/l koncentracijos tirpalas. 4.5.4. Etaloninis C tirpalas Pipete paimkite 2 ml etaloninio A tirpalo (4.5.1) ir supilkite į 20 ml matavimo kolbą, įpilkite 2 ml vidinio standarto B tirpalo (4.5.2) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. 5. Aparatūra ir įranga 5.1. Kapiliarinis dujų chromatografas su liepsnos jonizaciniu detektoriumi (FID) ir integratoriumi arba kita duomenų apdorojimo sistema, galinčia matuoti smailių aukštį arba plotą, ir automatiniu mėginių tiekėju arba su įranga, reikalinga mėginiui įpurkšti rankiniu būdu. 5.2. Dalijantis/nedalijantis inžektorius 5.3. Kapiliarinė kolonėlė, pvz.: ilgis – 50 m, vidinis skersmuo – 0,32 mm, plėvelės storis – 0,2 μm, nejudančioji fazė: FFAP – TPA (tereftalio rūgštimi) modifikuoto polietilenglikolio tinklinės struktūros akytas polimeras. 5.4. Įprasta laboratorijos įranga: A markės tūrio matavimo stikliniai indai, analizinės svarstyklės (preciziškumas: ± 0,1 mg). 6. Chromatografinės analizės sąlygos Kolonėlės tipas bei matmenys ir DC sąlygos turi būti tokios, kad anetolas ir vidinis standartas būtų atskirti vienas nuo kito ir nuo visų trukdančių medžiagų. Tipinės sąlygos, naudojant 5.3 pavyzdžio kolonėlę, yra tokios: 6.1. Nešiklis: analiziškai grynas helis 6.2. Srautas – 2 ml/min 6.3. Inžektoriaus temperatūra – 250 °C 6.4. Detektoriaus temperatūra – 250 °C 6.5. Krosnies temperatūros sąlygos: izoterminės, 180 °C, trukmė 10 min 6.6. Įpurškiamas tūris: 1 μl, srauto dalijimas – 1:40. 7. Mėginiai Mėginiai turi būti laikomi esant kambario temperatūrai, apsaugoti nuo šviesos ir šalčio. 8. Darbo eiga 8.1. Mėginio atranka dėl estragolo Siekiant patikrinti, ar mėginyje nėra natūralios kilmės estragolo, turi būti daroma tuščiojo bandinio analizė, nepridedant jokio vidinio standarto. Jei yra natūralios kilmės estragolo, turi būti pasirinktas kitas vidinis standartas (pvz., mentolis). Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2 ml mėginio ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. 8.2. Nežinomų mėginių ruošimas Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2 ml mėginio, įpilkite 2 ml vidinio standarto B tirpalo (4.5.2) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. 8.3. Tuščiasis bandymas Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2 ml vidinio standarto B tirpalo B (4.5.2) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. 8.4. Tiesiškumo tikrinimas Prieš analizės pradžią turi būti patikrintas FID atsako tiesiškumas, tris kartus paeiliui analizuojant kiekvieną tiesiškumo tikrinimo etalono tirpalą (4.5.3). Pagal smailių ploto arba aukščio vertes, gautas kiekvienam įpurškimui, nubraižykite grafiką, vaizduojantį pradinio tirpalo koncentraciją g/l kaip R santykio funkciją. R – trans-anetolo ir estragolo smailių aukščio arba ploto santykis. Gautas grafikas turi būti tiesė. 8.5. Nustatymas Įšvirkškite tuščiojo bandinio tirpalą (8.3), po jo etaloninį C tirpalą (4.5.4), vieną iš etalonų tiesiškumui nustatyti (4.5.3), kuris būtų kokybės kontrolės mėginys (jis gali būti pasirinktas atsižvelgiant į numanomą trans-anetolo koncentracija nežinomame mėginyje), ir penkis nežinomos koncentracijos tirpalus (8.2); norint užtikrinti analizės stabilumą, po penkių nežinomos koncentracijos mėginių įšvirkškite tiesiškumo (kokybės kontrolės) mėginį. 9. Atsako faktoriaus apskaičiavimas Išmatuokite trans-anetolo ir vidinio standarto smailių plotą (naudodami integratorių arba kitą duomenų apdorojimo sistemą) arba smailių aukštį (rankinis integravimas). 9.1. Atsako faktoriaus (RFi) apskaičiavimas Atsako faktorius apskaičiuojamas taip: RFi = (Ci/plotas arba aukštisi)*(plotas arba aukštisis/Cis) čia: Ci trans-anetolo koncentracija etaloniniame A tirpale (4.5.1) Cis vidinio standarto koncentracija etaloniniame B tirpale (4.5.2) plotasi trans-anetolo smailės plotas (arba aukštis) plotasis vidinio standarto smailės plotas (arba aukštis) RFi apskaičiuojamas pagal penkis C tirpalo mėginius (4.5.4). 9.2. Atsako tiesiškumo tikrinimo tirpalų analizė Įšvirkškite atsako tiesiškumo tikrinimo tirpalus (4.5.3). 9.3. Mėginio analizė Įšvirkškite nežinomo mėginio tirpalą (8.2). 10. Rezultatų apskaičiavimas Trans-anetolo koncentracijai apskaičiuoti naudojama ši formulė: ci = Cis * (plotas arba aukštisi/plotas arba aukštisis)*RFi čia: ci nežinoma trans-anetolo koncentracija Cis vidinio standarto nežinomame tirpale koncentracija (4.5.2) plotas arba aukštisi trans-anetolo smailės plotas arba aukštis plotas arba aukštisis vidinio standarto smailės plotas arba aukštis RFi atsako faktorius (apskaičiuotas kaip 9.1) Trans-anetolo koncentracija išreiškiama gramais litre vieno ženklo po kablelio tikslumu. 11. Kokybės užtikrinimas ir kontrolė Chromatogramos turėtų būti tokios, kad anetolas ir vidinis standartas būtų atskirti vienas nuo kito ir nuo kitų trukdančių medžiagų. RFi vertė apskaičiuojama pagal rezultatus, gautus penkis kartus įpurškiant C tirpalą C (4.5.4). Jei variacijos koeficiento (CV % = (standartinis nuokrypis/vidutinė vertė)*100)) vertė skiriasi ne daugiau kaip ± 1 %, RFi vidutinė vertė yra priimtina. Šis skaičiavimas turi būti naudojamas apskaičiuoti trans-anetolo koncentraciją mėginyje, kuris kokybės kontrolei buvo pasirinktas iš tiesiškumo kontrolės tirpalų (4.5.3). Jei vidutiniai rezultatai, gauti analizuojant tiesiškumo tikrinimo tirpalą, pasirinktą kokybės kontrolės vidiniu standartu, ir jų teorinės vertės skiriasi ne daugiau kaip ± 2,5 %, nežinomiems mėginiams gauti rezultatai gali būti priimti. 12. Spiritinio gėrimo, turinčio didelį cukraus kiekį, ir likerio mėginių apdorojimas prieš DC analizę Alkoholio ekstrahavimas iš spiritinio gėrimo, turinčio didelį cukraus kiekį, kad būtų galima nustatyti trans-anetolo koncentraciją, taikant kapiliarinės dujų chromatografijos metodą. 12.1. Metodo esmė Paimama likerio mėginio alikvotinė dalis ir į ją įdedama vidinio standarto, kurio koncentracija būtų panaši į analitės (trans-anetolo) koncentraciją likeryje. Į šį tirpalą įdedama natrio fosfato dodekahidrato ir amonio sulfato. Gautas mišinys gerai supurtomas ir atšaldomas, susidaro du sluoksniai, viršutinis alkoholinis sluoksnis nupilamas. Paimama alikvotinė šio alkoholinio tirpalo dalis ir praskiedžiama 45 % etanolio tirpalu (4.4). (Pastaba: šioje stadijoje vidinio standarto nededama, nes jis jau yra įdėtas.) Gautas tirpalas analizuojamas dujų chromatografijos metodu. 12.2. Reagentai ir medžiagos Ekstrahuodami naudokite cheminius reagentus, kurių grynumas yra didesnis kaip 99 %. 12.2.1. Amonio sulfatas, bevandenis (CAS 7783-20-2). 12.2.2. Natrio dihidrofosfato dodekahidratas (CAS 10039-32-4). 12.3. Aparatūra ir įranga Kūginės kolbos, šaldytuvas. 12.4. Darbo eiga 12.4.1. Mėginio atranka dėl estragolo Siekiant patikrinti, ar mėginyje nėra natūralios kilmės estragolo, turi būti daromas tuščiojo bandinio ekstrahavimas (12.6.2) ir analizė, nepridedant jokio vidinio standarto. Jei yra natūralios kilmės estragolo, turi būti pasirinktas kitas vidinis standartas. 12.4.2. Ekstrahavimas Į kūginę kolbą pipete įpilkite 5 ml 96 % etanolio (4.1), pasverkite į šią kolbą 50 mg vidinio standarto (4.3), ir įpilkite 50 ml mėginio. Įdėkite 12 g bevandenio amonio sulfato (12.2.1) ir 8.6 g natrio dihidrofosfato dodekahidrato (12.2.2). Kūginę kolbą užkimškite. Purtykite kolbą bent 30 min. Galima naudoti mechaninę purtyklę, bet ne teflonu dengtą magnetinės maišyklės strypą, kadangi teflonas absorbuos tam tikrą analitės dalį. Atkreipkite dėmesį,, kad įdėtos druskos visiškai neištirpsta. Užkimštą kolbą bent dviem valandom padėkite į šaldytuvą (T < 5 °C). Pasibaigus šiam laikui turi būti du atskiri skysčio sluoksniai ir kietos nuosėdos. Alkoholinis sluoksnis turėtų būti skaidrus; jei neskaidrus, padėkite vėl į šaldytuvą tol, kol sluoksniai aiškiai atsiskirs. Kai alkoholinis sluoksnis pasidaro skaidrus, atsargiai paimkite alikvotinę jo dalį (pvz., 10 ml), nepajudindami vandeninio sluoksnio, supilkite ją į gintarinės spalvos buteliuką, kurį gerai užkimškite. 12.4.3. Ekstrahuoto mėginio ruošimas analizei Leiskite ekstraktui (12.4.2) sušilti iki kambario temperatūros. Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2 ml kambario temperatūros ekstrahuoto mėginio alkoholinio sluoksnio tirpalo, praskieskite iki žymės 45 % etanoliu (4.4) ir gerai sumaišykite. 12.5. Nustatymas Darykite pagal metodiką, nurodytą 8.5 punkte. 12.6. Rezultatų apskaičiavimas Rezultatams apskaičiuoti naudokite šią formulę: Ci = (mis/V)* (plotasi/plotasis) *RFi čia: mis paimta vidinio standarto (4.3) masė (miligramais) (12.4.2) V nežinomo mėginio tūris (50 ml) RFi atsako faktorius (9.1) plotasi trans-anetolo smailės plotas plotasis vidinio standarto smailės plotas Rezultatai išreiškiami gramais litre vieno ženklo po kablelio tikslumu. 12.7. Kokybės užtikrinimas ir kontrolė Darykite pagal metodiką, apibrėžta pirmiau 11 punkte. 13. Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas) Statistiniai tarplaboratorinio tyrimo rezultatai: šiose lentelėse pateiktos anetolui gautos vertės. Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas. Tarplaboratorinio tyrimo metai | 1998 | Laboratorijų skaičius | 16 | Mėginių skaičius | 10 | Analitė | anetolas | Pastis (anyžių likeris): Mėginiai | A | B | C | D | E | F | Laboratorijų, atmetus riktus, skaičius | 15 | 15 | 15 | 13 | 16 | 16 | Riktų skaičius (laboratorijų) | 1 | 1 | 1 | 3 | - | - | Priimtų rezultatų skaičius | 30 | 30 | 30 | 26 | 16 | 16 | Vidutinė vertė g/l | 1,477 | 1,955 | 1,940 | 1,833 | 1,741 | 1,754 | Pakartojamumo standartinis nuokrypis (Sr) g/l | 0,022 | 0,033 | 0,034 | 0,017 | - | - | Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDr) % | 1,5 | 1,7 | 1,8 | 0,9 | - | - | Pakartojamumo ribinė vertė (r) g/1 | 0,062 | 0,093 | 0,096 | 0,047 | - | - | Atkuriamumo standartinis nuokrypis (SR) g/1 | 0,034 | 0,045 | 0,063 | 0,037 | 0,058 | 0,042 | Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDR) % | 2,3 | 2,3 | 3,2 | 2,0 | 3,3 | 2,4 | Atkuriamumo ribinė vertė (R) g/1 | 0,094 | 0,125 | 0,176 | 0,103 | 0,163 | 0,119 | Mėginių tipas: A pastis, aklieji (nežinomi) dvigubi mėginiai B pastis, aklieji dvigubi mėginiai C pastis, aklieji dvigubi mėginiai D pastis, aklieji dvigubi mėginiai E pastis, pavienis mėginys F pastis, pavienis mėginys Kiti spiritiniai gėrimai su anyžiumi: Mėginiai | G | H | I | J | Laboratorijų, atmetus riktus, skaičius | 16 | 14 | 14 | 14 | Riktų skaičius (laboratorijų) | - | 2 | 1 | 1 | Priimtų rezultatų skaičius | 32 | 28 | 28 | 28 | Vidutinė vertė g/l | 0,7780,530* | 1,742 | 0,351 | 0,599 | Pakartojamumo standartinis nuokrypis (Sr) g/l | 0,020 | 0,012 | 0,013 | 0,014 | Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDr) % | 3,1 | 0,7 | 3,8 | 2,3 | Pakartojamumo ribinė vertė (r) g/1 | 0,056 | 0,033 | 0,038 | 0,038 | Atkuriamumo standartinis nuokrypis (SR) g/1 | 0,031 | 0,029 | 0,021 | 0,030 | Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDR) % | 4,8 | 1,6 | 5,9 | 5,0 | Atkuriamumo ribinė vertė (R) g/1 | 0,088 | 0,080 | 0,058 | 0,084 | Mėginių tipas: G ouzo (graikų anyžių spiritinis gėrimas), dviejų skirtingų koncentracijų mėginiai (*) H anis (anyžių degtinė), aklieji dvigubi mėginiai I likeris su anyžiaus skoniu, dvigubi mėginiai J likeris su anyžiaus skoniu, dvigubi mėginiai. VI. GLICIRIZO RŪGŠTIS. GLICIRIZO RŪGŠTIES NUSTATYMAS TAIKANT EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODĄ 1. Taikymo sritis Šis metodas tinka nustatyti glicirizo rūgščiai spiritiniuose gėrimuose su anyžiumi, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (HPLC). Reglamentas (EEB) Nr. 1576/89 nustato, kad visuose spiritiniuose gėrimuose su anyžiumi, vadinamuose pastis, turi būti 0,05–0,5 g/l glicirizo rūgšties. 2. Normatyvinės nuorodos ISO 3696: 1987 Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai. 3. Metodo esmė Glicirizo rūgšties koncentracija nustatoma taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (HPLC) ir radimą UV detektoriumi. Etaloninis tirpalas ir mėginys filtruojami ir atskirai įšvirkščiami į HPLC sistemą. 4. Reagentai ir medžiagos Analizei naudokite tik HPLC markės cheminius reagentus, absoliutųjį etanolį ir bent 3 kategorijos vandenį, kaip apibrėžta ISO 3696. 4.1. Etanolis 96 % tūrio (CAS 64-17-5). 4.2. Amonio glicirizatas, C42H62O16.NH3 (glicirizo rūgšties amonio druska) (Mol. masė – 839,98) (CAS 53956-04-0) – grynumas ne mažesnis kaip 90 % (Glicirizo rūgšties mol. masė – 822,94). 4.3. Ledinė acto rūgštis, CH3COOH (CAS 64-19-7). 4.4. Metanolis, CH3OH (CAS 67-56-1). 4.5. 50 % tūrio etanolis Ruošiant 1000 ml esant 20 °C: - 96 % tūrio etanolio (4.1) – 521 ml - vandens (2.0) – 511 ml. 4.6. HPLC eliuavimo tirpalų ruošimas 4.6.1. Eliuavimo tirpiklis A (pavyzdys) 80 dalių (tūrio) vandens (2.0) 20 dalių (tūrio) acto rūgšties (4.3). Nudujinkite eliuavimo tirpiklį bent penkias minutes. Pastaba: Jei naudojamas vanduo nebuvo filtruojamas per mikrofiltrą, patartina paruoštąjį eliuavimo tirpiklį filtruoti per organiniams tirpikliams skirtą filtrą, kurio akučių dydis būtų 0,45 μm arba mažesnis. 4.6.2. Eliuavimo tirpiklis B Metanolis (4.4). 4.7. Etaloninių tirpalų ruošimas Po dviejų mėnesių visi etaloniniai tirpalai turi būti ruošiami iš naujo. 4.7.1. Etaloninis tirpalas C Į 100 ml matavimo kolbą pasverkite 0,1 mg tikslumu 25 mg amonio glicirizato (4.2). Įpilkite truputį 50 % tūrio etanolio (4.5) ir ištirpinkite amonio glicirizatą. Jam ištirpus, praskieskite iki žymės 50 % tūrio etanoliu (4.5). Filtruokite per organiniams tirpikliams skirtą filtrą. 4.7.2. Etaloniniai tirpalai, naudojami prietaisų atsako tiesiškumui tikrinti Paruošiamas 1,0 g/l pradinis tirpalas, į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriant 25 mg amonio glicirizato. Įpilkite truputį 50 % tūrio etanolio (4.5) ir ištirpinkite amonio glicirizatą. Jam ištirpus, praskieskite iki žymės 50 % tūrio etanoliu (4.5). Paruošiami bent keturi kiti tirpalai, atitinkantys 0,05, 0,1, 0,25 ir 0,5 g/l amonio glicirizato, į atskiras 100 ml matavimo kolbas pipete įpilant 5 ml, 10 ml, 25 ml ir 50 ml 1,0 g/l pradinio tirpalo. Praskieskite kolbų turinį iki žymės 50 % tūrio etanoliu (4.5) ir gerai sumaišykite. Visus tirpalus filtruokite per organiniams tirpikliams skirtą filtrą. 5. Aparatūra ir įranga 5.1. Atskyrimo sistema 5.1.1. Efektyvusis skysčių chromatografas. 5.1.2. Pumpavimo sistema, kuri labai preciziškai galėtų užtikrinti nekintamo dydžio arba programuojamą srautą. 5.1.3. UV spektrofotometrinio radimo sistema, nustatyta 254 nm bangos ilgiui. 5.1.4. Tirpiklių nudujinimo sistema. 5.2. Skaičiuojamasis integratorius arba savirašis, kurio veikimas būtų suderintas su likusia sistemos dalimi. 5.3. Kolonėlė (pavyzdys): medžiaga: nerūdijantis plienas arba stiklas, vidinis skersmuo: 4–5 mm, ilgis: 100–250 mm, nejudamoji fazė: tinklinės struktūros silicio dioksido, skiepyto oktadecilo funkcine grupe (C18), dalelės (geriau sferinės), didžiausias dalelių dydis – 5 μm. 5.4. Laboratorijos įranga 5.4.1. Analizinės svarstyklės, preciziškumas – 0,1 mg 5.4.2. A markės tūrio matavimo stikliniai indai 5.4.3. Mažų tūrių filtravimo per mikromembraną įranga. 6. Chromatografinės analizės sąlygos 6.1. Eliuavimo charakteristikos: (pavyzdys) - srautas: 1 ml/min, - A tirpiklis = 30 %, - B tirpiklis = 70 %. 6.2. Radimas: - UV = 254 nm. 7. Darbo eiga 7.1. Spiritinio gėrimo mėginio ruošimas Jei būtina, filtruokite per organiniams tirpikliams skirtą filtrą (akučių skersmuo – 0,45 μm). 7.2. Nustatymas Nusistovėjus chromatografinės analizės sąlygoms: - įšvirkškite 20 μl etaloninio C tirpalo C (4.7.1), - įšvirkškite 20 μl mėginio tirpalo, - palyginkite abi chromatogramas. Identifikuokite glicirizo rūgšties smailes pagal jų sulaikymo trukmę. Išmatuokite jų plotą (arba aukštį) ir koncentraciją g/l, dviejų skaičių po kablelio tikslumu, apskaičiuokite pagal šią formulę: c = c ×h × P × 823H × 100 × 840 čia: c analizuojamo spiritinio gėrimo glicirizo rūgšties koncentracija gramais litre C etaloninio amonio glicirizato tirpalo koncentracija gramais litre h glicirizo rūgšties analizuojamame spiritiniame gėrime smailės plotas (arba aukštis) H glicirizo rūgšties etaloniniame tirpale smailės plotas (arba aukštis) P etaloninio amonio glicirizato grynumas % 823 glicirizo rūgšties molio masė 840 amonio glicirizato molio masė. 8. Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas) Statistiniai tarplaboratorinio tyrimo rezultatai: šioje lentelėje pateiktos glicirizo rūgščiai gautos vertės. Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas. Tarplaboratorinio tyrimo metai | 1998 | Laboratorijų skaičius | 16 | Mėginių skaičius | 5 | Analitė | glicirizo rūgštis | Mėginiai | A | B | C | D | E | Laboratorijų, atmetus riktus, skaičius | 13 | 14 | 15 | 16 | 16 | Riktų skaičius (laboratorijų) | 3 | 2 | 1 | – | – | Priimtų rezultatų skaičius | 26 | 28 | 30 | 32 | 32 | Vidutinė vertė g/l | 0,046 | 0,092*0,099 | 0,089 | 0,249 | 0,493 | Pakartojamumo standartinis nuokrypis (Sr) g/l | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,003 | Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDr) % | 1,5 | 1,3 | 0,7 | 1,0 | 0,6 | Pakartojamumo ribinė vertė (r) g/1 | 0,002 | 0,004 | 0,002 | 0,007 | 0,009 | Atkuriamumo standartinis nuokrypis (SR) g/1 | 0,004 | 0,007 | 0,004 | 0,006 | 0,013 | Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDR) % | 8,6 | 7,2 | 4,0 | 2,5 | 2,7 | Atkuriamumo ribinė vertė (R) g/1 | 0,011 | 0,019 | 0,010 | 0,018 | 0,037 | Mėginių tipas: A pastis, aklieji dvigubi mėginiai B pastis, dviejų skirtingų koncentracijų mėginiai (*) C pastis, aklieji dvigubi mėginiai D pastis, aklieji dvigubi mėginiai E pastis, aklieji dvigubi mėginiai VII. CHALKONAI. EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAS TIKRINANT CHALKONŲ BUVIMĄ ANYŽIŲ LIKERYJE 1. Taikymo sritis Šis metodas tinka nustatyti, ar gėrimuose su anyžiaus skoniu yra chalkonų. Chalkonai –natūralieji flavonoidų šeimos dažikliai, kurių yra saldymedžio šaknyje (Glycyrrhiza glabra). Kad spiritinis gėrimas su anyžiumi galėtų vadintis pastis, jame turi būti chalkonų (Reglamentas (EEB) Nr. 1576/89). 2. Normatyvinės nuorodos ISO 3696: 1987 Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai. 3. Metodo esmė Paruošiamas etaloninis saldymedžio šaknies ekstrakto tirpalas. Chalkonų buvimas arba nebuvimas nustatomas taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (HPLC) ir radimą UV detektoriumi. 4. Reagentai ir medžiagos Analizei naudokite tik HPLC markės cheminius reagentus. Etanolis turi būti 96 % tūrio. Turi būti naudojamas bent 3 kategorijos vanduo, kaip apibrėžta ISO 3696 4.1. Etanolis 96 % tūrio (CAS 64-17-5) 4.2. Acetonitrilas, CH3CN (CAS 75-05-8) 4.3. Etaloninė medžiaga: Glycyrrhiza glabra,"saldymedžio šaknis" Rupiai sumalkite saldymedžio šaknis (Glycyrrhiza glabra). Vidutiniai strypelių pavidalo dalelių matmenys: ilgis: 10–15 mm, storis: 1–3 mm. 4.4. Natrio acetatas, CH3COONa (CAS 127-09-3) 4.5. Ledinė acto rūgštis, CH3COOH (CAS 64-19-7) 4.6. Tirpalų ruošimas 4.6.1. 50 % tūrio etanolis Ruošiant 1000 ml esant 20 °C: - 96 % tūrio etanolio (4.1) – 521 ml, - vandens (2.0) – 511 ml. 4.6.2. A tirpiklis: acetonitrilas HPLC analizinio grynumo acetonitrilas (4.2). Nudujinkite. 4.6.3. B tirpiklis: 0,1 M natrio acetato buferinis tirpalas, pH 4,66 Pasverkite 8,203 g natrio acetato (4.4), įpilkite 6,005 g ledinės acto rūgšties (4.5) ir matavimo kolboje praskieskite vandeniu (2) iki 1000 ml. 5. Etaloninio Glycyrrhiza glabra ekstrakto ruošimas (4.3) 5.1. Pasverkite 10 g sumaltų saldymedžio šaknų (Glycyrrhiza glabra) (4.3) ir supilkite į apvaliadugnę distiliavimo kolbą, - įpilkite 100 ml 50 % tūrio etanolio (4.6.1), - vieną valandą virinkite su grįžtamuoju šaldytuvu, - filtruokite, - – filtratą padėkite į šalį vėlesniam naudojimui. 5.2. Surinkite ekstrahuojamas saldymedžio šaknis nuo filtro, - supilkite jas į apvaliadugnę distiliavimo kolbą, - įpilkite 100 ml 50 % tūrio etanolio (4.6.1), - vieną valandą virinkite su grįžtamuoju šaldytuvu, - filtruokite. Filtratą padėkite į šalį vėlesniam naudojimui. 5.3. Saldymedžio šaknys turi būti ekstrahuojamos tris kartus. 5.4. Sujunkite tris filtratus. 5.5. Išgarinkite tirpiklį (5.4) sukamuoju garintuvu. 5.6. Ekstrakto likutį (5.5) surinkite, sunaudodami 100 ml 50 % tūrio etanolio (4.6.1). 6. Aparatūra ir įranga 6.1. Atskyrimo sistema. 6.1.1. Efektyvusis skysčių chromatografas. 6.1.2. Pumpavimo sistema, kuri galėtų užtikrinti nekintamo dydžio arba programuojamą srautą esant dideliam slėgiui. 6.1.3. UV/regimosios šviesos spektrofotometrinio radimo sistema, kuri gali būti nustatyta 254 ir 370 nm bangos ilgiui. 6.1.4. Tirpiklių nudujinimo sistema. 6.1.5. Kolonėlės krosnis, kuri gali būti nustatyta 40 ± 0,1 °C temperatūrai. 6.2. Skaičiuojamasis integratorius arba savirašis, kurio veikimas būtų suderintas su likusia sistemos dalimi. 6.3. Kolonėlė: medžiaga: nerūdijantis plienas arba stiklas, vidinis skersmuo: 4–5 mm, nejudamoji fazė: tinklinės struktūros silicio dioksido, skiepyto oktadecilo funkcine grupe (C18), dalelės (geriau sferinės), didžiausias dalelių dydis – 5 μm (tinklinės struktūros fazės). 6.4. Įprasta laboratorinė įranga, įskaitant: 6.4.1. analizines svarstykles (preciziškumas: ± 0,1 mg); 6.4.2. distiliavimo aparatą su grįžtamuoju kondensatoriumi, kurį sudaro, pvz.: - 250 ml apvaliadugnė kolba su standartine šlifo jungtimi, - 30 cm ilgio grįžtamasis kondensatorius ir - šilumos šaltinis (naudojant tinkamą įrangą būtina išvengti bet kokios pirogeninės reakcijos, kurioje dalyvautų ekstrahuojama medžiaga). 6.4.3. Sukamąjį garintuvą. 6.4.4. Filtravimo įranga (t. y. Biuchnerio piltuvas). 6.5. Chromatografinės analizės sąlygos (pavyzdys). 6.5.1. A (4.6.2) ir B (4.6.3) tirpiklių eliuavimo charakteristikos: - gradientinis eliuavimas: kitimas nuo 20/80 (V/V) iki 50/50 (V/V) per 15 minučių, - gradientinis eliuavimas: kitimas nuo 50/50 (V/V) iki 75/25 (V/V) per penkias minutes, - eliuavimas esant nekintamai 75/25 (V/V) judančiosios fazės sudėčiai, trukmė penkios minutės, - kolonėlės stabilizavimas tarp mėginių įšvirkštimo, - eliuavimas esant nekintamai 20/80 (V/V) judančiosios fazės sudėčiai, trukmė penkios minutės. 6.5.2. Srautas – 1 ml/min 6.5.3. UV detektoriaus nustatomieji parametrai: chalkonams rasti detektorius turi būti nustatytas 370 nm, vėliau glicirizo rūgščiai nustatomas 254 nm. Pastaba. Bangos ilgis turi būti pakeistas (370 nm į 254 nm) 30 sekundžių prieš glicirizo rūgšties eliuavimo smailės atsiradimą. 7. Darbo eiga 7.1. Spiritinio gėrimo mėginio ruošimas Filtruokite per organiniams tirpikliams skirtą filtrą (akučių skersmuo – 0,45 μm). 7.2. Saldymedžio šaknų ekstrakto likučio (5.6) ruošimas Prieš analizę praskieskite santykiu vienas ir dešimt 50 % tūrio etanoliu (4.6.1). 7.3. Nustatymas 7.3.1. Įšvirkškite 20 μl paruošto saldymedžio ekstrakto (7.2). Analizuokite, naudodami pirmiau aprašytas chromatografinės analizės sąlygas (6.5). 7.3.2. Įšvirkškite 20 μl mėginio (7.1) (spiritinio gėrimo su anyžiaus skoniu mėginys). Analizuokite, naudodami pirmiau aprašytas chromatografinės analizės sąlygas (6.5). 7.3.3. Palyginkite abi chromatogramas. Chromatogramos chalkonų išėjimo srityje turi būti labai panašios (nustatymas esant 370 nm ir pirmiau aprašytoms analizės sąlygoms) (žr. 1 paveikslą). 8. Pastis gėrimui būdinga chromatograma +++++ TIFF +++++ 9. Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas) Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai: šioje lentelėje rodomas chalkonų buvimo arba nebuvimo pastis ir anyžių skonio spiritiniuose gėrimuose nustatymo metodo efektyvumas. Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas. Tarplaboratorinio tyrimo metai | 1998 | Laboratorijų skaičius | 14 | Mėginių skaičius | 11 | Analitė | chalkonai | Mėginiai | A | B | C | D | E | F | Laboratorijų, atmetus riktus, skaičius | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 13 | Riktų skaičius (laboratorijų) | - | - | - | - | - | 1 [1] | Priimtų rezultatų skaičius | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | 26 | Rezultatų, rodančių chalkonų buvimą, skaičius | 28 | 14 | 14 | 0 | 28 | 0 | Rezultatų, rodančių chalkonų nebuvimą, skaičius | 0 | 0 | 0 | 28 | 0 | 26 | Teisingų rezultatų procentinė dalis % | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | Mėginiai | G | H | I | J | K | Laboratorijų, atmetus riktus, skaičius | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | Riktų skaičius (laboratorijų) | - | - | - | - | - | Patvirtintų rezultatų skaičius | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | Rezultatų, rodančių chalkonų buvimą, skaičius | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Rezultatų, rodančių chalkonų nebuvimą, skaičius | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | Teisingų rezultatų procentinė dalis % | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | Mėginių tipas: A pastis, aklieji dvigubi mėginiai B pastis, pavienis mėginys C pastis, pavienis mėginys D pastis (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai E pastis (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai F likeris su anyžiaus skoniu (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai G likeris su anyžiaus skoniu (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai H ouzo (be chalkonų), pavienis mėginys I ouzo (be chalkonų), pavienis mėginys J anis (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai K pastis (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai. IX. KIAUŠINIO TRYNYS. KIAUŠINIO TRYNIO KONCENTRACIJOS SPIRITINIUOSE GĖRIMUOSE NUSTATYMAS – FOTOMETRINIS METODAS 1. Taikymo sritis Šis metodas tinka nustatyti trynio koncentraciją kiaušininiame likeryje ir likeryje su kiaušiniu 40–250 g/l intervale. 2. Normatyvinės nuorodos ISO 3696: 1987 Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai. 3. Metodo esmė Kiaušinio trynyje esantys etanolyje tirpūs fosforo junginiai ekstrahuojami ir analizuojami fotometriškai kaip fosforo molibdatinis kompleksas. 4. Reagentai ir medžiagos 4.1. Du kartus distiliuotas vanduo 4.2. Diatomitas 4.3. 96 % tūrio etanolis (CAS 64-17-5) 4.4. 15 % magnio acetato (CAS 16674-78-5) tirpalas 4.5. 10 % sieros rūgšties (CAS 7664-93-9) tirpalas 4.6. 1 N sieros rūgšties tirpalas 4.7. 0,16 g/l kalio dihidrofosfato (CAS 778-77-0), KH2PO4, tirpalas 4.8. Reagentas fosfatui nustatyti: 20 g amonio molibdato (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24.4H2O, ištirpinkite 400 ml vandens esant 50 °C; kitame inde 1 g amonio vanadato (CAS 7803-55-6), NH4VO3, ištirpinkite 300 ml karšto vandens, duokite tirpalui ataušti ir įpilkite į jį 140 ml koncentruotos azoto rūgšties (CAS 7697-37-2). Supilkite abu ataušintus tirpalus į vieną 1000 ml matavimo kolbą ir praskieskite iki žymės. 5. Aparatūra ir įranga 5.1. 100 ml kūginė kolba 5.2. Ultragarso vonia (arba magnetinė maišyklė) 5.3. 100 ml matavimo kolba 5.4. 20 °C vandens vonia 5.5. Filtras (vatmanas Nr. 4 arba lygiavertis) 5.6. Porcelianinis (arba platininis) tiglis 5.7. Verdančio vandens vonia 5.8. Kaitinamoji plokštė 5.9. Mufelinė krosnis 5.10. 50 ml matavimo kolba 5.11. 20 ml matavimo kolba 5.12. Spektrofotometras, nustatytas 420 nm bangos ilgiui 5.13. 1 cm kiuvetė. 6. Mėginiai Prieš analizę mėginiai laikomi esant kambario temperatūrai. 7. Darbo eiga 7.1. Mėginių ruošimas 7.1.1. 100 ml kūginę kolbą (5.1) pasverkite 10 g mėginio. 7.1.2. Lėtai mažomis porcijomis įpilkite 70 ml etanolio (4.3), po kiekvieno pridėjimo sukiodami kolbą, ir 15 min pastatykite į ultragarso vonią (5.2) (arba 10 min maišykite magnetine maišykle (5.2) esant kambario temperatūrai). 7.1.3. Kūginės kolbos turinį perneškite į 100 ml matavimo kolbą (5.3), plaudami etanoliu (4.3). Praskieskite etanoliu (4.3) iki žymės ir pastatykite kolbas į 20 °C vandens vonią (5.4). Praskieskite iki tūrio kalibravimo žymės esant 20 °C. 7.1.4. Įdėkite truputį diatomito (4.2) ir filtruokite (5.5), išpildami pirmuosius 20 ml. 7.1.5. 25 ml filtrato įpilkite į porcelianinį (arba platininį) tiglį (5.6). Filtratas turi būti koncentruojamas, lėtai garinant verdančio vandens vonioje (5.7), pridėjus 5 ml 15 % magnio acetato tirpalo (4.4). 7.1.6. Pastatykite tiglius ant kaitinamosios plokštės (5.8) ir kaitinkite tol, kol susidaro sausas likutis. 7.1.7. Likutį iškaitinkite mufelinėje krosnyje (5.9) esant 600 °C tol, kol pelenai tampa baltais, bet ne trumpiau kaip pusantros valandos, tačiau galima palikti pernakt. 7.1.8. Pelenus ištirpinkite 10 ml 10 % sieros rūgšties (4.5), tirpalą perneškite į 50 ml matavimo kolbą (5.10), nuplaudami distiliuotu vandeniu (4.1), ir praskieskite distiliuotu vandeniu (4.1) iki žymės esant kambario temperatūrai. Šio pelenų tirpalo 5 ml alikvotinė dalis turi būti naudojama fotometrinei analizei skirto mėginio tirpalui paruošti. 7.2. Fotometrinis fosfato nustatymas 7.2.1. Palyginamasis tirpalas 7.2.1.1. 50 ml matavimo kolbą (5.10) įpilkite 10 ml 10 % sieros rūgšties (4.5) ir distiliuotu vandeniu (4.1) praskieskite iki žymės. 7.2.1.2. 20 ml matavimo kolbą (5.11) įpilkite 5 ml šio tirpalo (7.2.1.1), 1 ml 1 N sieros rūgšties (4.6), 2 ml fosfato reagento (4.8) ir iki 20 ml praskieskite distiliuotu vandeniu (4.1). 7.2.1.3. Užkimškite laisvai įstatytų kamščiu, supurtykite, 10 min šildykite verdančio vandens vonioje (5.7) ir 20 min aušinkite 20 °C vandens vonioje (5.4). 7.2.1.4. Šio palyginamojo tirpalo įpilkite į 1 cm kiuvetę (5.13). 7.2.2. Mėginio tirpalas 7.2.2.1. 20 ml matavimo kolbą (5.11) įpilkite pelenų tirpalo (7.1.8) 5 ml alikvotinę dalį, 1 ml 1 N sieros rūgšties (4.6), 2 ml fosfato reagento (4.8) ir iki 20 ml praskieskite distiliuotu vandeniu (4.1). 7.2.2.2. Užkimškite laisvai įstatytų kamščiu, supurtykite, 10 min šildykite verdančio vandens vonioje (5.7) ir 20 min aušinkite 20 °C vandens vonioje (5.4). 7.2.2.3. Gautą geltonos spalvos tirpalą iš karto analizuokite spektrofotometru (5.12) 1 cm storio kiuvetėje (5.13) esant 420 nm bangos ilgiui, palyginamuoju tirpalu naudodami (7.2.1.4) tirpalą. 7.2.3. Kalibravimo kreivė 7.2.3.1. Kalibravimo kreivei gauti į 20 ml matavimo kolbas (5.11) įpilkite 2 ml alikvotinę fosfato reagento tirpalo (4.8) dalį, į kiekvieną po 1 ml 1 N sieros rūgšties (4.6) ir 0, 2, 4, 6, 8, ir 10 ml kalio dihidrofosfato tirpalo (4.7) ir distiliuotu vandeniu (4.1) praskieskite iki 20 ml žymės. 7.2.3.2. Užkimškite laisvai įstatytų kamščiu, supurtykite, 10 min šildykite verdančio vandens vonioje (5.7), 20 min aušinkite 20 °C vandens vonioje (5.4) ir analizuokite spektrofotometru (5.12) 1 cm storio kiuvetėje (5.13) esant 420 nm bangos ilgiui, ir palyginamuoju tirpalu naudodami (7.2.1.4) tirpalą. 7.2.3.3. Kalibravimo kreivės gavimas: Natrio dihidrofosfato tirpalas (ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | P2O5 (mg) | 0 | 0,167 | 0,334 | 0,501 | 0,668 | 0,835 | 8. Rezultatų apskaičiavimas Kiaušinio trynio kiekis g/l apskaičiuojamas pagal šią formulę: kiaušinio trynio kiekis g/l = mg P O × 110 × densityE/40 čia: 110 suminio P2O5 kiekio g 100 g kiaušinio trynio perskaičiavimo faktorius mg P2O5 vertė, gauta pagal kalibravimo kreivę tankis kiaušininio likerio tūrio vieneto masė (g/ml) esant 20 °C E kiaušininio likerio masė g 40 5 ml pelenų tirpalo alikvotinės dalies praskiedimo faktorius. 9. Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas) Statistiniai tarplaboratorinio tyrimo rezultatai: šioje lentelėje pateiktos kiaušinio tryniui gautos vertės. Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas. Tarplaboratorinio tyrimo metai | 1998 | Laboratorijų skaičius | 24 | Mėginių skaičius | 5 | Analitė | kiaušinio trynys | Mėginiai | A | B | C | D | E | Laboratorijų, atmetus riktus, skaičius | 19 | 20 | 22 | 20 | 22 | Riktų skaičius (laboratorijų) | 3 | 4 | 2 | 4 | 2 | Priimtų rezultatų skaičius | 38 | 40 | 44 | 40 | 44 | Vidutinė vertė | 147,3 | 241,1 | 227,4 | 51,9 (*)72,8 (*) | 191,1 | Pakartojamumo standartinis nuokrypis (Sr) g/l | 2,44 | 4,24 | 3,93 | 1,83 | 3,25 | Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDr) % | 1,7 | 1,8 | 1,8 | 2,9 | 1,7 | Pakartojamumo ribinė vertė (r) g/1 | 6,8 | 11,9 | 11,0 | 5,1 | 9,1 | Atkuriamumo standartinis nuokrypis (SR) g/1 | 5,01 | 6,06 | 6,66 | 3,42 | 6,87 | Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDR) % | 3,4 | 2,5 | 2,9 | 5,5 | 3,6 | Atkuriamumo ribinė vertė (R) g/1 | 14,0 | 17,0 | 18,7 | 9,6 | 19,2 | Mėginių tipai A Advocaat (kiaušininis likeris), aklieji dvigubi mėginiai B Advocaat, aklieji dvigubi mėginiai C Advocaat, aklieji dvigubi mėginiai D Advocaat (praskiestas), dviejų skirtingų koncentracijų mėginiai (*) E Advocaat, aklieji dvigubi mėginiai [1] Prieštaraujantys dvigubo mėginio rezultatai, aiškinami klaida, padaryta imant mėginį. --------------------------------------------------