3.

Įterpiamas šis VIII skyrius: „VIII. SUMINIS CUKRŲ KIEKIS 1. Taikymo sritis Efektyviosios skysčių chromatografijos ir lūžio rodiklio matavimo (HPLC–RI) metodas taikomas spiritinių gėrimų suminiam cukrų kiekiui nustatyti (jį išreiškiant invertuotojo cukraus kiekiu), išskyrus likerius, kurių sudėtyje yra kiaušinių ir pieno produktų. Metodas buvo patvirtintas atliekant tarplaboratorinį anyžių likerio (pastis), graikiško anyžių likerio, vyšnių likerio, kremo likerio (nurodant vaisiaus arba naudotos žaliavos pavadinimą) ir juodųjų serbentų kremo likerio tyrimą, esant nuo 10,86 g/l iki 509,7 g/l koncentracijai. Tačiau prietaiso atsako tiesiškumas buvo patvirtintas koncentracijai nuo 2,5 g/l iki 20,0 g/l. Šis metodas nėra skirtas mažoms cukrų koncentracijos vertėms nustatyti. 2. Norminės nuorodos ISO 3696:1987. Analizės vanduo. Apibūdinimas ir bandymo metodai. 3. Principas Cukrų tirpalų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, kad būtų nustatyta juose esančios gliukozės, fruktozės, sacharozės, maltozės ir laktozės koncentracija. Taikant šį metodą, kaip pavyzdys naudojama alkilaminų nejudančioji fazė ir aptikimas diferencinės refraktometrijos metodu. Taip pat kaip nejudančiąją fazę būtų galima naudoti anijonitines dervas. 4. Reagentai ir medžiagos 4.1. Gliukozė (CAS 50–99–7), ne mažesnio kaip 99 % grynumo. 4.2. Fruktozė (CAS 57–48–7), ne mažesnio kaip 99 % grynumo. 4.3. Sacharozė (CAS 57–50–1), ne mažesnio kaip 99 % grynumo. 4.4. Laktozė (CAS 5965–66–2), ne mažesnio kaip 99 % grynumo. 4.5. Maltozės monohidratas (CAS 6363–53–7), ne mažesnio kaip 99 % grynumo. 4.6. Grynas acetonitrilas (CAS 75–05–8) HPLC analizei. 4.7. Distiliuotas ar demineralizuotas vanduo, pageidautina filtruotas per mikrofiltrą. 4.8. Tirpikliai (pavyzdys) Eliuavimo tirpiklį sudaro: 75 tūrio dalys acetonitrilo (4.6), 25 tūrio dalys distiliuoto vandens (4.7). Degazuojama 5–10 minučių leidžiant nestiprią helio srovę. Jei naudojamas vanduo nebuvo filtruotas per mikrofiltrą, tirpiklis turi būti filtruojamas per organiniams tirpikliams skirtą filtrą, kurio akučių dydis lygus 0,45 μm arba mažesnis. 4.9. Absoliutusis etanolis (CAS 64–17–5). 4.10. Etanolio tirpalas (5 % tūrio). 4.11. Pradinio etaloninio tirpalo (20 g/l) paruošimas Pasveriama po 2 g kiekvieno analizuojamo cukraus (4.1–4.5) ir visi svėriniai be nuostolių suberiami į 100 ml matavimo kolbą. (NB. 2,11 g maltozės monohidrato atitinka 2 g maltozės). Skiedžiama iki 100 ml 5 % tūrio etanolio tirpalu (4.10), tirpalas supurtomas ir laikomas maždaug + 4 °C temperatūroje. Naujas pradinis tirpalas ruošiamas kartą per savaitę. 4.12. Darbinių etaloninių tirpalų paruošimas (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 ir 20,0 g/l) Pradinis etaloninis tirpalas 20 g/l (4.11) atitinkamai skiedžiamas 5 % tūrio etanolio tirpalu (4.10), kad būtų gauti penki darbiniai 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 ir 20,0 g/l etaloniniai tirpalai. Filtruojami per filtrą, kurio akučių dydis lygus 0,45 μm arba mažesnis (5.3.). 5. Aparatūra ir įranga 5.1. HPLC sistema, kuri visų cukrų smailes galėtų atskirti iki bazinės linijos. 5.1.1. Efektyvusis skysčių chromatografas su šešių padėčių įpurškimo vožtuvu, turinčiu 10 μl kilpą, arba koks nors kitas automatinis ar rankinis įtaisas mažiems tūriams patikimai įpurkšti. 5.1.2. Siurbimo sistema, kuria būtų galima labai preciziškai gauti ir užtikrinti pastovų arba programuojamą srautą. 5.1.3. Diferencinis refraktometras. 5.1.4. Skaičiuojamasis integratorius arba savirašis, kurio veikimas būtų suderintas su likusia įranga. 5.1.5. Prieškolonėlė: prie analizės kolonėlės rekomenduojama prijungti tinkamą prieškolonėlę. 5.1.6. Kolonėlė (pavyzdys): Medžiaga: nerūdijantysis plienas arba stiklas. Vidinis skersmuo: 2–5 mm. Ilgis: 100–250 mm (atsižvelgiant į įkrovos dalelių dydį, pavyzdžiui, 250 mm, jei dalelių skersmuo 5 μm. Nejudančioji fazė: su silicio dioksidu sujungtos alkilamino funkcinės grupės, maksimalus dalelių dydis – 5 μm. 5.1.7. Chromatografinės analizės sąlygos (pavyzdys). Eliuavimo tirpiklis (4.8.), srautas: 1 ml/min. Aptikimas: diferencinė refraktometrija. Siekiant užtikrinti visišką detektoriaus stabilumą, jį reikėtų įjungti kelias valandas prieš naudojimą. Į palyginamąją kiuvetę turi būti įpilta eliuavimo tirpiklio. 5.2. Analizinės svarstyklės, kurių tikslumas – 0,1 mg. 5.3. Mažų tūrių filtravimo įranga, naudojant 0,45 μm mikromembraną. 6. Ėminių laikymas Gauti ėminiai prieš analizę laikomi kambario temperatūroje. 7. Procedūra 7.1. A DALIS. Ėminių ruošimas 7.1.1. Ėminys purtomas. 7.1.2. Ėminys filtruojamas per filtrą, kurio akučių dydis 0,45 μm arba mažesnis (5.3). 7.2. B DALIS. HPLC 7.2.1. Nustatymas Įpurškiama po 10 μl etaloninių tirpalų (4.12) ir ėminių (7.1.2). Analizė atliekama tinkamomis chromatografinės analizės sąlygomis, pavyzdžiui, tokiomis, kurios aprašytos pirmiau. 7.2.2. Jei kuri nors ėminio smailė būtų didesnio ploto (ar aukščio) nei atitinkama didžiausios koncentracijos etalono smailė, ėminį reikėtų praskiesti distiliuotu vandeniu ir analizuoti iš naujo. 8. Skaičiavimas Palyginamos dvi – etaloninio tirpalo ir spiritinio gėrimo – chromatogramos. Smailės nustatomos pagal sulaikymo trukmės vertes. Matuojamas smailių plotas (ar aukštis), kad, taikant išorinio etalono metodą, būtų galima apskaičiuoti koncentracijos vertes. Atsižvelgiama į visus ėminio skiedimo veiksmus. Galutinis rezultatas yra sacharozės, maltozės, laktozės, gliukozės ir fruktozės kiekio suma, išreikšta invertuotojo cukraus kiekiu (g/l). Invertuotojo cukraus kiekis apskaičiuojamas kaip visų esamų monosacharidų ir redukuojančiųjų disacharidų suminis kiekis, pridedant stechiometrinį gliukozės ir fruktozės kiekį, apskaičiuotą pagal esamą sacharozės kiekį. Invertuotasis cukrus (g/l) = gliukozė (g/l) + fruktozė (g/l) + maltozė (g/l) + laktozė (g/l) + (sacharozė (g/l) × 1,05) 1,05 = (fruktozės molekulinė masė + gliukozės molekulinė masė)/sacharozės molekulinė masė 9. Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas) 9.1. Tarplaboratorinio tyrimo statistiniai rezultatai Šie duomenys buvo gauti atliekant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas [1] [2]. Tarplaboratorinio tyrimo metai 2000 Laboratorijų skaičius 24 Ėminių skaičius 8 [1] Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method – Performance Studies, Horwitz, W. (1995) Pure and Applied Chemistry 67, 332–343. [2] Horwitz, W. (1982) Analytical Chemistry 54, 67A–76A. 1 lentelė Fruktozė, gliukozė, maltozė Analitė Fruktozė Gliukozė Maltozė Ėminiai (× 2) Juodųjų serbentų kremo likeris Etalonas (50 g/l) Anyžių skonio spiritinis gėrimas Juodųjų serbentų kremo likeris Etalonas (50 g/l) Anyžių skonio spiritinis gėrimas Etalonas (10 g/l) Vidutinė vertė [g/l] 92,78 50,61 15,62 93,16 50,06 15,81 9,32 Laboratorijų skaičius, atmetus riktus 21 22 21 23 19 21 22 Pakartojamumo standartinis nuokrypis sr, [g/l] 2,34 2,12 0,43 3,47 1,01 0,48 0,54 Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDr [%] 2,53 4,2 2,76 3,72 2,03 3,02 5,77 Pakartojamumo riba r [g/l] (r = 2,8 × sr) 6,56 5,95 1,21 9,71 2,84 1,34 1,51 Atkuriamumo standartinis nuokrypis sR [g/l] 7,72 3,13 0,84 9,99 2,7 0,88 1,4 Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDR [%] 8,32 6,18 5,37 10,72 5,4 5,54 15,06 Atkuriamumo riba R [g/l] (R = 2,8 × sR) 21,62 8,76 2,35 27,97 7,57 2,45 3,93

2 lentelė Sacharozė Analitė Sacharozė Ėminiai Anyžių likeris (pastis) Ouzo (graikiškas anyžių likeris) Vyšnių likeris Mėtinis kremo likeris Juodųjų serbentų kremo likeris Etalonas (100 g/l) Vidutinė vertė [g/l] 10,83 29,2 19,7 (*) 103,33 349,96 319,84 99,83 Laboratorijų skaičius, atmetus riktus 19 19 20 18 18 18 Pakartojamumo standartinis nuokrypis sr [g/l] 0,09 0,75 2,17 5,99 4,31 1,25 Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDr [%] 0,81 3,07 2,1 1,71 1,35 1,25 Pakartojamumo riba R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,25 2,1 6,07 16,76 12,06 3,49 Atkuriamumo standartinis nuokrypis sR [g/l] 0,79 0,92 4,18 9,94 16,11 4,63 Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDR [%] 7,31 3,76 4,05 2,84 5,04 4,64 Atkuriamumo riba R [g/l] (R = 2,8 × sR) 2,22 2,57 11,7 27,84 45,12 12,97

3 lentelė Suminis cukrų kiekis (Pastaba. Šie duomenys buvo apskaičiuoti kaip suminis cukrų kiekis, o ne invertuotojo cukraus kiekis, apibrėžtas pirmiau 8 skirsnyje.)

Ėminiai Anyžių likeris (pastis) Ouzo (graikiškas anyžių likeris) Anyžių skonio spiritinis gėrimas Vyšnių likeris Mėtinis kremo likeris Juodųjų serbentų kremo likeris Etalonas (220 g/l) Vidutinė vertė [g/l] 10,86 29,2 19,7 (**) 31,59 103,33 349,73 509,69 218,78 Laboratorijų skaičius, atmetus riktus 20 19 20 20 18 18 19 Pakartojamumo standartinis nuokrypis sr [g/l] 0,13 0,75 0,77 2,17 5,89 5,59 2,71 Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDr [%] 1,16 3,07 2,45 2,1 1,69 1,1 1,24 Pakartojamumo riba R [g/l] (R = 2,8 × sR) 0,35 2,1 2,17 6,07 16,5 15,65 7,59 Atkuriamumo standartinis nuokrypis sR [g/l] 0,79 0,92 1,51 4,18 9,98 14,81 8,53 Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis RSDR [%] 7,25 3,76 4,79 4,04 2,85 2,91 3,9 Atkuriamumo riba R [g/l] (R = 2,8 × sR) 2,21 2,57 4,24 11,7 27,94 41,48 23,89