PRIEDAS

Reglamento (EB) Nr. 440/2008 priedas iš dalies keičiamas taip:

Įterpiami B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 ir B.58 skyriai:

„B.53. TOKSINIO POVEIKIO NERVŲ SISTEMOS VYSTYMUISI TYRIMAS

ĮŽANGA

1. Šis bandymų metodas atitinka EBPO Bandymų gaires (angl. OECD Test Guideline (TG)) Nr. 426 (2007). 1995 m. birželio mėn. Kopenhagoje EBPO Toksinio poveikio dauginimuisi ir vystymuisi tyrimo darbo grupė aptarė poreikį atnaujinti esamas EBPO toksinio poveikio dauginimuisi ir vystymuisi bandymų gaires ir parengti naujas dar neaptartų vertinamųjų baigčių bandymų gaires (1). Darbo grupė rekomendavo toksinio poveikio nervų sistemos vystymuisi bandymų gaires rengti remiantis JAV aplinkos apsaugos agentūros (angl. US EPA) gairėmis; šios gairės nuo to laiko buvo pakeistos (2). 1996 m. birželio mėn. Kopenhagoje įvyko antras konsultacinis posėdis, surengtas siekiant padėti Sekretoriatui rengti naujų toksinio poveikio nervų sistemos vystymuisi bandymo gairių projektą, taip pat patarti dėl pagrindinių šių gairių punktų, pavyzdžiui, dėl dalykų, susijusių su gyvūnų rūšių pasirinkimu, dozių davimo laikotarpiu, bandymo laikotarpiu, vertinamosiomis baigtimis ir rezultatų vertinimo kriterijais. JAV toksinio poveikio nervų sistemai rizikos vertinimo gairės paskelbtos 1998 m. (3). EBPO ekspertų konsultacinis posėdis ir Tarptautinio gyvybės mokslų instituto (angl. ILSI) Rizikos mokslų instituto seminaras surengtas 2000 m. spalio mėn., ekspertų konsultacinis posėdis įvyko 2005 m. Tokijuje. Šie posėdžiai surengti moksliniams ir techniniams klausimams, susijusiems su esamomis bandymų gairėmis, aptarti; rengiant šį bandymų metodą atsižvelgta į per posėdžius pateiktas rekomendacijas (4) (5) (6) (7). Papildoma informacija apie šio bandymų metodo taikymą, aiškinimą ir terminus pateikiama EBPO Rekomendaciniame dokumente (angl. OECD Guidance Document) Nr. 43 „Reproductive Toxicity Testing and Assesment“ (8) ir Nr. 20 „Neurotoxicity Testing“ (9).

PRADINIAI ASPEKTAI

2. Yra žinoma, kad kai kurios cheminės medžiagos daro toksinį poveikį žmonių ir kitų rūšių gyvūnų nervų sistemos vystymuisi (10) (11) (12) (13). Galimą cheminės medžiagos toksinį poveikį nervų sistemos vystymuisi gali prireikti nustatyti tam, kad būtų galima nustatyti ir įvertinti cheminės medžiagos toksines savybes. Toksinio poveikio nervų sistemos vystymuisi tyrimų tikslas – surinkti duomenis, įskaitant duomenis apie dozių ir atsako ryšio ypatumus, apie galimą funkcinį ir morfologinį poveikį palikuonių nervų sistemos vystymuisi, galintį atsirasti toms medžiagoms palikuonis veikiant gimdoje ir gyvenimo pradžioje.

3. Toksinio poveikio nervų sistemos vystymuisi tyrimą galima atlikti kaip atskirą tyrimą, įtraukti į toksinio poveikio dauginimuisi ir (arba) toksinio poveikio suaugusių gyvūnų nervų sistemai tyrimą (pvz., B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16) bandymų metodai) arba sujungti su toksinio poveikio prenataliniam vystymuisi tyrimu (pvz., B.31 bandymų metodas (17)). Jeigu toksinio poveikio nervų sistemos vystymuisi tyrimas įtraukiamas į kitą tyrimą arba sujungiamas su kitu tyrimu, būtina išlaikyti abiejų rūšių tyrimų vientisumą. Visi bandymai turėtų atitikti taikomus teisės aktus, valdžios institucijų ir įstaigų gaires dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams tyrimams (pvz., 18).

4. Bandymų laboratorijos darbuotojai, prieš atlikdami tyrimą, turėtų susipažinti su visa turima informacija apie bandomąją cheminę medžiagą. Ši informacija – tai cheminės medžiagos tapatumas ir struktūra, jos fizikinės ir cheminės savybės, visų kitų cheminės medžiagos in vitro arba in vivo toksinio poveikio bandymų rezultatai, giminingos struktūros cheminių medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo būdas (-ai). Ši informacija yra reikalinga, kad visiems suinteresuotiesiems asmenims būtų įrodyta, jog bandymas yra svarbus žmonių sveikatai saugoti ir padės pasirinkti tinkamą pradinę dozę.

BANDYMŲ METODO PRINCIPAS

5. Bandomoji cheminė medžiaga duodama gyvūnams gestacijos ir laktacijos laikotarpiu. Bandymai su motininėmis patelėmis atliekami siekiant įvertinti poveikį vaikingoms ir žindančioms patelėms, jie taip pat gali suteikti palyginamosios informacijos (motininės patelės versus palikuonys). Palikuonys toksiniam poveikiui nervų sistemos vystymuisi įvertinti atrenkami iš vadų atsitiktine tvarka. Vertinimą sudaro stebėjimai, kuriais siekiama nustatyti bendras neurologines ir elgsenos anomalijas, įskaitant fizinį vystymąsi, elgsenos ontogenezę, motorinį aktyvumą, motorinę ir jutiminę funkcijas, mokymąsi ir atmintį; jį taip pat sudaro galvos smegenų masės ir neuropatologinis vertinimas postnatalinio vystymosi ir brandos laikotarpiais.

6. Kai bandymų metodas yra taikomas kaip atskiras tyrimas, papildomai turimi kiekvienos grupės gyvūnai gali būti panaudoti konkretiems neurobihevioristiniams, neuropatologiniams, neurocheminiams arba elektrofiziologiniams bandymams, kurių rezultatais galima papildyti duomenis, gautus atliekant pagal šį bandymų metodą rekomenduojamus tyrimus (16) (19) (20) (21). Papildomi bandymai gali būti ypač naudingi, kai praktiniai stebėjimai, numatomas poveikis arba veikimo mechanizmo/būdo duomenys atskleidžia, kad neurotoksiškumas yra specifinio pobūdžio. Šie papildomi bandymai gali būti taikomi ir motininėms patelėms, ir jaunikliams. Be to, dar galima atlikti ex vivo arba in vitro bandymus, jei jais nekeičiamas in vivo bandymų vientisumas.

PASIRENGIMAS BANDYMUI

Gyvūnų rūšies parinkimas

7. Tinkamiausia bandomųjų gyvūnų rūšis yra žiurkės; jei reikia, galima naudoti kitas gyvūnų rūšis. Tačiau reikėtų atkreipti dėmesį, kad pagal šį bandymų metodą nurodytas gestacinio ir postnatalinio laikotarpių dienų skaičius yra būdingas būtent dažniausiai naudojamų veislių žiurkėms; jeigu pasirenkama kita gyvūnų rūšis arba ne dažniausiai naudojama veislė, reikėtų atitinkamai pakoreguoti dienų skaičių. Kitos rūšies naudojimas turėtų būti pagrįstas toksikologiniais, farmakokinetikos ir (arba) kitais duomenimis. Į pagrindimą reikėtų įtraukti informaciją apie tai, ar yra atlikti tos rūšies postnatalinis neurobihevioristinis ir neuropatologinis vertinimai. Jeigu anksčiau buvo atliktas bandymas, per kurį kilo rūpestį keliančių klausimų, reikėtų atkreipti dėmesį į rūšis/veislę, dėl kurios kilo rūpestį keliantis klausimas. Dėl skirtingų veislių žiurkėms būdingų skirtingų elgsenos savybių reikėtų surinkti įrodymus, kad pasirinktos veislės žiurkės yra pakankamai vaisingos ir pakankamai jautrios. Kitų rūšių patikimumą ir jautrumą tiriant toksinį poveikį nervų sistemos vystymuisi reikėtų pagrįsti dokumentais.

Laikymo ir šėrimo sąlygos

8. Bandomųjų gyvūnų patalpos temperatūra turėtų būti 22 ± 3 °C. Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų siekti, kad ji būtų 50–60 %. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis, jo seka: 12 h šviesos ir 12 h tamsos. Apšvietimo ciklą taip pat galima keisti prieš poravimąsi ir per tyrimą, siekiant įvertinti funkcines ir elgsenos tamsoje (šviečiant raudonai šviesai), t. y. laikotarpiu, kada gyvūnai paprastai būna aktyvūs, vertinamąsias baigtis (22). Darant bet kokius šviesos ir tamsos ciklo pakeitimus, reikėtų numatyti pakankamai laiko aklimatizavimuisi, kad gyvūnai galėtų prisitaikyti prie naujo ciklo. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, o geriamojo vandens kiekis neribojamas. Pašaro ir vandens pobūdį reikėtų aprašyti, abu reikėtų ištirti, ar juose nėra teršalų.

9. Gyvūnai narveliuose gali būti laikomi atskirai arba mažomis tos pačios lyties grupėmis. Poruojama turėtų būti šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Pasitvirtinus susiporavimui arba ne vėliau kaip 15 gestacijos dieną suporuoti gyvūnai turėtų būti atskiriami ir laikomi po vieną atsivedimo arba veisimo narveliuose. Narveliai išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio buvimo vietos. Artėjant atsivedimui, suporuotos patelės turėtų būti aprūpinamos tinkamomis ir nustatytomis gūžtos sukimo medžiagomis. Gerai žinoma, kad netinkamas elgesys su gyvūnais arba stresas gestacijos metu gali turėti neigiamų padarinių, tarp jų – būti prenatalinio vados netekimo, vaisiaus arba postnatalinio vystymosi pakitimų priežastimi. Siekiant apsisaugoti nuo vaisiaus praradimo dėl veiksnių, nesusijusių su bandomosios cheminės medžiagos davimu, su gyvūnais gestacijos laikotarpiu reikėtų elgtis atsargiai ir vengti išorės veiksnių, pavyzdžiui, pernelyg didelio išorės triukšmo, keliamo streso.

Gyvūnų paruošimas

10. Reikėtų naudoti sveikus dar bandymams nenaudotus ir prie laboratorijos sąlygų pripratintus gyvūnus, nebent tyrimas yra įtrauktas į kitą tyrimą (žr. 3 punktą). Bandomieji gyvūnai turėtų būti aprašomi nurodant jų rūšį, veislę, šaltinį, lytį, masę ir amžių. Kiekvienam gyvūnui reikėtų priskirti unikalų identifikavimo numerį ir kiekvieną gyvūną juo pažymėti. Kiek įmanoma, visų bandymo grupių gyvūnai turėtų būti vienodos masės ir amžiaus ir atitikti normalias tiriamos rūšies ir veislės savybes. Kiekvienu dozės lygmeniu turėtų būti naudojamos jaunos, suaugusios, palikuonių neturėjusios patelės. Reikėtų vengti vienų tėvų palikuonių poravimo ir pasirūpinti, kad taip nenutiktų. 0 gestacijos diena (GD) yra vaginalinio kamščio ir (arba) spermos atsiradimo diena. Jeigu iš tiekėjo įsigyjamos jau vaikingos patelės, reikėtų joms leisti kurį laiką aklimatizuotis (pvz., 2–3 dienas). Apvaisintos patelės atsitiktinės atrankos būdu suskirstomos į kontrolinę ir bandomąją grupes ir kuo tolygiau paskirstomos po visas grupes (pvz., norint užtikrinti vienodą paskirstymą po visas grupes, rekomenduojama taikyti stratifikuotą atsitiktinę atranką, pavyzdžiui, pagal kūno masę). Grupėse turėtų būti po vienodą skaičių to paties patino apvaisintų patelių.

BANDYMO PROCEDŪRA

Gyvūnų skaičius ir lytis

11. Kiekvienoje bandymo ir kontrolinėje grupėje turėtų būti pakankamas vaikingų patelių, kurios bus veikiamos bandomąja chemine medžiaga, skaičius tam, kad būtų gauta pakankamai palikuonių neurotoksiškumui vertinti. Kiekvienu dozės lygmeniu iš viso rekomenduojama naudoti po 20 vadų. Grupėms galima taikyti kartotinio arba šachmatinio dozavimo modelį, jeigu kiekvienoje grupėje užtikrinamas reikiamas bendras vadų skaičius ir taikomi tinkami statistiniai modeliai kartotinio dozavimo rezultatams apskaityti.

12. 4 postnatalinę dieną (PND) arba prieš tai (atsivedimo diena yra 0 PND) kiekvienos vados jauniklių skaičius pakoreguojamas išimant atsitiktine tvarka atrinktus perteklinius jauniklius, kad visos vados būtų vienodo dydžio (23). Vados dydis neturėtų viršyti naudojamos veislės graužikų vidutinio vados dydžio (8–12). Vadoje turėtų būti, jeigu tik tai įmanoma, po vienodą skaičių vyriškos ir moteriškos lyties jauniklių. Selektyvus jauniklių eliminavimas, pvz., pagal kūno masę, nepriimtinas. Vadas standartizavus (atlikus brokavimą) prieš atliekant tolesnį funkcinių vertinamųjų baigčių bandymą, tie konkretūs jaunikliai, kuriuos ketinama tirti prieš nujunkymą, ir tie, kuriuos ketinama tirti po nujunkymo, turėtų būti pažymėti unikalia žyma, naudojant bet kurį tinkamą humanišką jauniklių ženklinimo metodą (pvz., 24).

Gyvūnų suskirstymas funkciniams ir elgsenos bandymams, galvos smegenų masės ir neuropatologiniam įvertinimui

13. Pagal šį bandymų metodą galima taikyti įvairius būdus gyvūnams, kuriems in utero ir laktacijos laikotarpiu bus atliekami funkciniai ir elgsenos bandymai, vertinamas lytinis subrendimas, nustatoma galvos smegenų masė ir atliekamas neuropatologinis vertinimas, suskirstyti (25). Tam tikrais atvejais papildomai galima atlikti ir kitus neurobihevioristinės funkcijos (pvz., socialinės elgsenos), neurocheminius arba neuropatologinius bandymus, jeigu dėl to nebus pažeistas pagrindinių reikalingų bandymų vientisumas.

14. Jaunikliai atrenkami iš kiekvienos dozės grupės ir paskirstomi vertinamosioms baigtims vertinti 4 PND arba vėliau. Jauniklius reikėtų atrinkti taip, kad per kiekvieną bandymą kiekvienos dozės grupėje iš kiekvienos vados būtų, kiek tai yra įmanoma, paimta po lygiai abiejų lyčių gyvūnų. Atliekant motorinio aktyvumo bandymą, bandymai visais amžiaus etapais iki nujunkymo atliekami su ta pačia vyriškos ir moteriškos lyties jauniklių pora (žr. 35 punktą). Atliekant visus kitus elgsenos bandymus, galima imti tas pačias arba skirtingas vyriškos ir moteriškos lyties gyvūnų poras. Atliekant nujunkytų jauniklių versus suaugusių gyvūnų kognityvinės funkcijos bandymus, gali tekti paskirti skirtingus jauniklius, taip siekiant išvengti rezultatų iškraipymo dėl amžiaus ir dėl išsidresavimo per ankstesnius tų rodiklių matavimus (26) (27). Pradėjus nujunkymą (21 PND) bandymams neatrinktus jauniklius galima humaniškai numarinti. Visus jauniklių suskirstymo pakeitimus reikėtų nurodyti. Statistinis mato vienetas turėtų būti vada (arba motininė patelė), ne jauniklis.

15. Tyrimams iki ir po nujunkymo, kognityviniams bandymams, patologiniams tyrimams ir t. t. jauniklius galima suskirstyti įvairiais būdais (1 pvz., parodyta bendra struktūra, 1 priedėlyje pateikti paskirstymo pavyzdžiai). Rekomenduojamas minimalus gyvūnų skaičius kiekvienos dozės grupėje atliekant tyrimus iki ir po nujunkymo yra toks:

Klinikiniai stebėjimai ir kūno masė Visi gyvūnai Išsamūs klinikiniai stebėjimai Po 20 kiekvienos lyties (po 1 kiekvienos lyties iš vados) Galvos smegenų masė (po fiksavimo) 11–22 PND Po 10 kiekvienos lyties (po 1 iš vados) Galvos smegenų (nefiksuotų) masė ~70 PND Po 10 kiekvienos lyties (po 1 iš vados) Neuropatologija (panardinimas arba perfuzinė fiksacija) 11–22 PND Po 10 kiekvienos lyties (po 1 iš vados) Neuropatologija (perfuzinė fiksacija) ~70 PND Po 10 kiekvienos lyties (po 1 iš vados) Lytinis subrendimas Po 20 kiekvienos lyties (po 1 kiek vienos lyties iš vados) Kiti vystymosi parametrai (pasirinktinai) Visi gyvūnai Elgsenos ontogenezė Po 20 vienos lyties (po 1 kiekvienos lyties iš vados) Motorinis aktyvumas Po 20 vienos lyties (po 1 kiekvienos lyties iš vados) Motorinė ir jutiminė funkcijos Po 20 vienos lyties (po 1 kiekvienos lyties iš vados) Mokymasis ir atmintis Po 10 kiekvienos lyties (1) (po 1 iš vados)

Dozavimas

16. Turėtų būti naudojamos mažiausiai trijų dydžių dozės ir lygiagrečiai naudojama viena kontrolinė grupė. Dozės turėtų būti išskirstomos intervalais taip, kad toksinis poveikis būtų laipsniškas. Jei nėra apribojimų dėl fizikinio ir cheminio cheminės medžiagos pobūdžio arba biologinių jos savybių, turi būti pasirenkama tokia didžiausia dozė, kuri sukeltų tam tikrą toksinį poveikį motininei patelei (pvz., klinikinius požymius, kūno masės augimo sumažėjimą (ne daugiau kaip 10 %) ir (arba) būtų gauta duomenų apie dozės apribojimus dėl jos toksiškumo tiksliniam organui). Didelės dozės riba pagal kūno masę gali būti 1 000 mg vienam kūno masės kg per dieną su tam tikromis išimtimis. Pavyzdžiui, jei numatomas žmonių sąlytis su bandomąja chemine medžiaga, gali paaiškėti, kad reikia naudoti didesnio dydžio dozę. Taip pat reikėtų atlikti parengtinius tyrimus arba preliminarius dozės dydžio intervalo nustatymo tyrimus ir jais nustatyti, iki kokio dydžio dozė motininei patelei yra minimaliai toksiška. Jeigu atlikus standartinį toksiškumo vystymuisi tyrimą arba parengtinį tyrimą yra nustatoma, kad bandomoji cheminė medžiaga yra toksiška vystymuisi, didžiausia dozė turėtų būti maksimali dozė, kuri nesukelia pernelyg didelio toksinio poveikio palikuonims, mirties in utero ir ką tik gimusių jauniklių mirties arba išsigimimų, pakankamų, kad kliudytų atlikti prasmingą toksinio poveikio nervų sistemai vertinimą. Reikėtų stengtis, kad mažiausia dozė būtų tokia, kuri nesukeltų jokių toksinio poveikio motininei patelei arba vystymuisi, įskaitant nervų sistemos, požymių. Kitus dozės dydžius reikėtų pasirinkti mažėjančia tvarka taip, kad būtų pastebėtas kiekvienas su doze susijęs atsakas ir būtų nustatyta nepastebėto neigiamo poveikio riba (NOAEL) arba aptikimo ribai artimas dozės dydis, kad pagal tai būtų galima nustatyti etaloninę dozę. Nustatant dozės dydį mažėjančia tvarka, intervalas, kai dozės dydis skiriasi 2–4 kartus, dažnai būna optimalus; vietoj didelių intervalų tarp dozių (pvz., kai jų dydis skiriasi daugiau kaip 10 kartų) dažnai geriau naudoti papildomą ketvirtą bandomąją grupę.

17. Dozės dydžiai turėtų būti pasirenkami atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo duomenis ir į papildomą informaciją apie bandomosios cheminės medžiagos arba giminingų medžiagų metabolizmo ir toksikokinetines savybes. Ši informacija taip pat gali padėti pagrįsti dozavimo režimo tinkamumą. Galimybę dozes jaunikliams duoti tiesiogiai reikėtų svarstyti atsižvelgiant į sąlyčio su bandomąja chemine medžiaga ir farmakokinetinę informaciją (28) (29). Prieš pradedant tyrimus, per kuriuos dozės būtų duodamos tiesiogiai, reikėtų atidžiai įvertinti naudą ir trūkumus (30).

18. Lygiagrečiai tiriama kontrolinė grupė turėtų būti medžiagos negaunanti kontrolinė grupė arba nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, jei bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Visiems gyvūnams paprastai turėtų būti duodamas vienodas, matuojant pagal kūno masę, cheminės medžiagos arba nešiklio tūris. Jei dozių ruošimui palengvinti naudojamas nešiklis arba kitas priedas, reikėtų atsižvelgti į tokias jo charakteristikas: poveikį bandomosios cheminės medžiagos absorbcijai, pasiskirstymui, metabolizmui ar sulaikymui; poveikį bandomosios cheminės medžiagos cheminėms savybėms, dėl kurio gali pasikeisti jos toksiškumas; poveikį pašaro ar vandens suvartojimui arba gyvūnų įmitimui. Nešiklis neturėtų kelti poveikio, kuris trukdytų aiškinti tyrimo rezultatus, neurobihevioristiniu požiūriu jis taip pat neturėtų būti toksiškas ir neturėtų veikti dauginimosi ar vystymosi. Jei nešiklis yra naujas, turėtų būti naudojama ne tik nešiklį gaunanti kontrolinė grupė, bet ir nieko negaunanti kontrolinė grupė. Su kontrolinės (-ių) grupės (-ių) gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat, kaip ir su bandymo grupės gyvūnais.

Dozių davimas

19. Bandomoji cheminė medžiaga arba nešiklis turėtų būti duodamas tokiu būdu, kuris yra artimiausias galimo žmogaus sąlyčio su ta medžiaga būdui, remiantis turima metabolizmo ir pasiskirstymo bandomųjų gyvūnų organizme informacija. Dažniausiai duodama per virškinamąjį traktą (pvz., per zondą, kartu su pašaru, geriamuoju vandeniu), bet kiti būdai (pvz., per odą, kvėpavimo takus) taip pat gali būti taikomi atsižvelgiant į tai, kokie yra žmogaus sąlyčio su ta medžiaga ypatumai, tikėtinas arba žinomas būdas (išsamesni paaiškinimai pateikti Rekomendaciniame dokumente Nr. 43(8)). Pasirinktą davimo būdą reikėtų pagrįsti. Bandomoji cheminė medžiaga turėtų būti duodama kiekvieną dieną maždaug tuo pačiu laiku.

20. Dozė kiekvienam gyvūnui paprastai turėtų būti nustatoma atsižvelgiant į patį paskutinį jo svėrimą. Tačiau reguliuojant dozės dydį paskutinį gestacijos trimestrą reikia imtis atsargumo priemonių. Jei pastebima, kad toksinis poveikis motininėms patelėms yra per didelis, jos turėtų būti humaniškai numarinamos.

21. Bandomoji cheminė medžiaga arba nešiklis suporuotoms patelėms turėtų būti duodamas ne rečiau kaip kartą per dieną nuo implantacijos dienos (6 GD) iki laktacijos laikotarpio pabaigos (21 PND), kad jaunikliai būtų bandomosios cheminės medžiagos veikiami prenatalinio ir postnatalinio nervų sistemos vystymosi laikotarpiais. Amžius, nuo kurio pradedama duoti dozes, ir dozių davimo trukmė bei dažnumas gali būti koreguojami, jeigu pagal turimus duomenis tokia bandymo struktūra yra artimesnė žmogaus patiriamam poveikiui. Dozių davimo kitų rūšių gyvūnams trukmę reikėtų pakoreguoti taip, kad būtų užtikrinta, kad gyvūnai gautų bandomosios medžiagos visais ankstyvaisiais smegenų vystymosi etapais (t. y. prenatalinį ir ankstyvąjį postnatalinį žmogaus galvos smegenų augimą atitinkančiais laikotarpiais). Dozes galima pradėti duoti nuo gestacijos pradžios (0 GD), tačiau reikėtų atsižvelgti į tai, kad bandomoji cheminė medžiaga gali sukelti priešimplantacinius nuostolius. Jei dozes būtų pradedama duoti 6 GD, šios rizikos būtų išvengiama, bet tada vystymosi etapais nuo 0 iki 6 GD bandymas nevyktų. Jeigu laboratorija įsigyja jau suporuotus gyvūnus, dozes duoti nuo 0 GD yra neįmanoma, taigi 6 GD būtų tinkama pradinė diena. Bandymų laboratorija turėtų nustatyti dozavimo režimą, remdamasi atitinkama informacija apie bandomosios cheminės medžiagos poveikį, ankstesnę patirtį ir logistikos aspektus; be kitų dalykų ji gali pratęsti dozių davimą ir po nujunkymo. Jauniklių atsivedimo dieną gyvūnams dozių reikėtų neduoti, jei jie atsivedė dar ne visus palikuonis. Dažniausiai daroma prielaida, kad jaunikliai bus veikiami per motinos pieną; tačiau, kai neturima pakankamai įrodymų, kad jaunikliai bus veikiami nepertraukiamai, reikėtų svarstyti galimybę dozes duoti jaunikliams tiesiogiai. Nepertraukiamo veikimo įrodymų galima gauti, pvz., iš farmakokinetinės informacijos, toksiškumo palikuonims arba biologinių žymeklių pokyčių (28).

STEBĖJIMAI

Motininių patelių stebėjimas

22. Visas motinines pateles reikėtų bent kartą per dieną apžiūrėti jų sveikatos būklei nustatyti ir patikrinti, ar jos negaišta ir ar nenugaišo.

23. Dozių davimo ir stebėjimo laikotarpiais periodiškai (bent kartą, kai dozės duodamos gestaciniu laikotarpiu, ir dukart, kai dozės duodamos laktaciniu laikotarpiu) reikėtų atlikti išsamesnius klinikinius stebėjimus, stebint bent po dešimt motininių patelių kiekvienu dozės lygmeniu. Gyvūnai turėtų būti stebimi ne narvelyje, kuriame yra laikomi, stebėjimus turi atlikti parengti techniniai darbuotojai, nežinantys apie gyvūnams duodamas dozes, naudodami standartizuotas procedūras, padedančias sumažinti stresą gyvūnams ir stebėtojo šališkumą ir kuo labiau padidinti skirtingų stebėtojų gautų rezultatų patikimumą. Jeigu įmanoma, būtų gerai, jei stebėjimus per vieną tyrimą atliktų tas pats techninis darbuotojas.

24. Pastebėjus požymių, juos reikėtų užrašyti. Jeigu įmanoma, taip pat reikėtų užrašyti stebimų požymių stiprumą. Klinikiniai stebėjimai turėtų apimti odos, kailio, akių, gleivinių, sekrecijų dažnį ir autonominį aktyvumą (pvz., ašarojimą, plaukų pašiaušimą, vyzdžių dydį, neįprastą kvėpavimą ir (arba) kvėpavimą per burną, visus neįprastus šlapinimosi arba tuštinimosi požymius), tačiau neapsiriboti vien tuo.

25. Taip pat turėtų būti pažymėta bet kokia neįprasta reakcija, susijusi su kūno padėtimi, aktyvumo lygiu (pvz., naudojimosi tipiniu plotu sumažėjimas arba padidėjimas) ir judesių koordinacija. Turėtų būti užrašomi eisenos (pvz., krypuojanti eisena, ataksija), laikysenos (pvz., kuprojimasis), reakcijos į elgesį su gyvūnu, vietą arba kitus aplinkos dirgiklius pakitimai, taip pat kloninių arba toninių judesių, traukulių arba drebulio buvimas, stereotipinis elgesys (pvz., besaikis valymasis, neįprasti galvos judesiai, nuolatinis sukimasis ratu), keistas elgesys (pvz., kandžiojimasis arba per didelis laižymasis, žalojimasis, vaikščiojimas atbulomis, vokalizacija) arba agresija.

26. Toksinio poveikio požymius, įskaitant jų atsiradimo pradžią, paros metą, laipsnį ir trukmę, reikėtų užrašyti.

27. Gyvūnus reikėtų sverti, kai jiems duodamos dozės, per visą tyrimą: bent kartą per savaitę, jauniklių atsivedimo arba artimą jam dieną ir 21 PND (nujunkymo dieną). Jeigu tyrime naudojamas zondas, motininės patelės turėtų būti sveriamos bent dukart per savaitę. Prireikus po kiekvieno kūno masės matavimo dozes reikėtų koreguoti. Pašaro suvartojimą gestacijos ir laktacijos laikotarpiais reikėtų matuoti bent kartą per savaitę. Vandens suvartojimą reikėtų matuoti bent kartą per savaitę, jeigu gyvūnas yra veikiamas per vandenį.

Palikuonių stebėjimas

28. Visus palikuonis reikėtų bent kartą per dieną atidžiai apžiūrėti, ar nepasireiškia toksinio poveikio požymiai, ar jie negaišta ir ar nenugaišo.

29. Dozių davimo ir stebėjimo laikotarpiais reikėtų atlikti išsamesnius palikuonių klinikinius tyrimus. Palikuonius (bent po vieną kiekvienos lyties jauniklį iš vados) turėtų stebėti parengti techniniai darbuotojai, nežinantys apie gyvūnams duodamas dozes, naudodami standartizuotas procedūras, padedančias sumažinti šališkumą ir kuo labiau padidinti skirtingų stebėtojų gautų rezultatų patikimumą. Jeigu įmanoma, būtų gerai, jei stebėjimus atliktų tas pats techninis darbuotojas. Reikėtų stebėti bent 24 ir 25 punktuose aptartas stebimu vystymosi laikotarpiu aktualias vertinamąsias baigtis.

30. Visus toksinio poveikio palikuonims požymius, įskaitant jų atsiradimo pradžią, paros metą, laipsnį ir trukmę, reikėtų užrašyti.

Fiziniai ir vystymosi parametrai

31. Vystymosi parametrų iki nujunkymo pokyčiai (pvz., ausies kaušelio išsilyginimas, akių atsivėrimas, kandžių prasikalimas) yra glaudžiai susiję su kūno mase (30) (31). Kūno masė gali būti geriausias fizinio vystymosi rodiklis. Todėl atlikti vystymosi parametrų matavimus yra rekomenduojama tik tada, kai turima įrodymų, kad iš šių vertinamųjų baigčių bus gauta papildomos informacijos. Šių parametrų vertinimo laikas nurodytas 1 lentelėje. Pagal tai, kokio poveikio tikimasi, ir tai, kokie yra pradiniai matavimo rezultatai, gali būti tikslinga numatyti papildomus laiko momentus arba matavimus atlikti kitais vystymosi etapais.

32. Vertinant fizinį vystymąsi, rekomenduotina tyrimą atlikti postkoitaliniu, o ne postnatalinio amžiaus etapu (33). Jeigu bandymai su jaunikliais atliekami nujunkymo dieną, šiuos bandymus rekomenduojama atlikti iki faktinio nujunkymo, kad dėl patiriamo su nujunkymu susijusio streso rezultatai nebūtų iškreipiami. Be to, dvi dienas po nujunkymo nereikėtų atlikti jokių jauniklių bandymų, atliktinų po nujunkymo.

1 lentelė

Fizinių ir vystymosi parametrų bei funkcinių/elgsenos vertinamųjų baigčių vertinimo laikas (2)

Amžiaus tarpsniai Vertinamosios baigtys Iki nujunkymo (3) Paaugę jaunikliai (3) Jauni suaugę gyvūnai (3) Fiziniai ir vystymosi parametrai Kūno masė ir klinikiniai stebėjimai Kas savaitę (4) Ne rečiau kaip kas dvi savaites Ne rečiau kaip kas dvi savaites Galvos smegenų masė 22 PND (5) Bandymo pabaigoje Neuropatologija 22 PND (5) Bandymo pabaigoje Lytinis subrendimas — Pagal poreikį — Kiti vystymosi parametrai (6) Pagal poreikį — — Funkcinės/elgsenos vertinamosios baigtys Elgsenos ontogenezė Ne mažiau kaip du matavimai Motorinis aktyvumas (įskaitant įpročių formavimąsi) 1–3 kartus (7) — Vieną kartą Motorinė ir jutiminė funkcijos — Vieną kartą Vieną kartą Mokymasis ir atmintis — Vieną kartą Vieną kartą

33. Reikėtų suskaičiuoti gyvus jauniklius ir nustatyti jų lytį, pvz., vizualiai įvertinti arba išmatuoti anogenitalinį atstumą (34) (35), kiekvieną vados jauniklį reikėtų atskirai pasverti vos atsivestą ar netrukus po atsivedimo, bent kartą per savaitę laktacijos laikotarpiu, o vėliau – bent kartą per dvi savaites. Vertinant lytinį subrendimą, reikėtų nustatyti bent vieno kiekvienos vados patinėlio ir vienos patelės amžių ir kūno masę, kada susiformuoja makštis (35) arba atsiskiria apyvarpė (37).

Elgsenos ontogenezė

34. Tiriant pasirinktų elgsenos rodiklių ontogenezę, bent po vieną kiekvienos lyties jauniklį iš vados reikėtų vertinti atitinkamu amžiaus laikotarpiu, visas bandymo dienas visiems elgsenos rodikliams vertinti naudojant tuos pačius jauniklius. Matavimo dienos turėtų būti tolygiai paskirstytos per tą laikotarpį; turėtų būti aprašomi įprasti arba su dozės davimu susiję tos elgsenos ontogenezės pokyčiai (38). Štai keletas elgsenos rodiklių, kurių ontogenezę būtų galima vertinti, pavyzdžių: išsitiesimo refleksas, neigiamas geotaksis (angl. negative geotaxis), motorinis aktyvumas (38) (39) (40).

Motorinis aktyvumas

35. Motorinį aktyvumą reikėtų stebėti (41) (42) (43) (44) (45) laikotarpiu iki nujunkymo ir gyvūnui suaugus. Dėl bandymų nujunkymo laikotarpiu žr. 32 punktą. Bandymo sesija turėtų trukti pakankamai ilgai, kad būtų galima matyti, jog dozių negaunantys kontrolinės grupės gyvūnai priprato prie bandymo sesijos sąlygų. Motorinį aktyvumą itin rekomenduojama naudoti elgsenos ontogenezei vertinti. Kai jis naudojamas kaip elgsenos ontogenezės kriterijus, visose bandymo iki nujunkymo sesijose reikėtų naudoti tuos pačius gyvūnus. Bandymas turėtų būti atliekamas pakankamai dažnai, kad būtų galima įvertinti pripratimo prie sesijos sąlygų ontogenezę (44). Tam iki nujunkymo dienos įskaitytinai gali prireikti įvertinti tris arba daugiau laikotarpių (pvz., 13, 17, 21 PND). Bandymus su tais pačiais arba tos pačios vados gyvūnais dar reikėtų atlikti gyvūnams suaugus, artėjant tyrimo pabaigai (pvz., 60–70 PND). Bandymus kitomis dienomis galima atlikti papildomai pagal poreikį. Motoriniam aktyvumui stebėti reikėtų naudoti automatizuotą aktyvumo fiksavimo prietaisą, kuriuo būtų galima nustatyti aktyvumo didėjimą ir mažėjimą (t. y. pradinė prietaisu išmatuoto aktyvumo reikšmė neturėtų būti nei tokia maža, kad nebūtų galima nustatyti jo sumažėjimo, nei tokia didelė, kad nebūtų galima nustatyti aktyvumo padidėjimo). Kiekvieną prietaisą reikėtų patikrinti pagal standartines procedūras, siekiant, kiek įmanoma, užtikrinti patikimą skirtingų prietaisų veikimą visomis dienomis. Prietaisus bandomosioms grupėms reikėtų paskirstyti kuo proporcingiau. Bandymą reikėtų atlikti atskirai su kiekvienu gyvūnu. Bandymų laiką bandomosioms grupėms reikėtų proporcingai paskirstyti, kad būtų išvengta rezultatų iškraipymo dėl cirkadinio aktyvumo ritmo. Reikėtų stengtis užtikrinti, kad bandymo sąlygos kuo mažiau skirtųsi ir nebūtų sistemiškai susietos su dozių davimu. Tarp kintamųjų, kurie gali paveikti daugelį elgsenos matų, įskaitant motorinį aktyvumą, yra: bandymo narvelio triukšmo izoliacija, dydis ir forma, temperatūra, santykinė drėgmė, apšvietimo sąlygos, kvapai, narvelio, kuriame gyvūnas laikomas nuolat, arba naujo bandymų narvelio naudojimas ir aplinkos dirgikliai.

Motorinė ir jutiminė funkcijos

36. Motorinę ir jutiminę funkcijas reikėtų nuodugniai ištirti bent vieną kartą per paaugusio jauniklio amžiaus laikotarpį ir vieną kartą per jauno suaugusio gyvūno amžiaus laikotarpį (pvz., 60–70 PND). Dėl bandymų nujunkymo laikotarpiu žr. 32 punktą. Bandymų reikėtų atlikti pakankamai – tiek, kad būtų gautas reikiamas skaičius kiekybinių jutiminio modalumo (pvz., somatosensorinio, vestibuliarinio) ir motorinių funkcijų (pvz., jėgos, koordinacijos) pavyzdžių. Keletas motorinės ir jutiminės funkcijų pavyzdžių: ekstenzoriaus ištiesimo reakcija (46), išsitiesimo refleksas (47) (48), pripratimas prie garsinio dirgiklio (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54), sukeltasis potencialas (55).

Mokymosi ir atminties bandymai

37. Asociatyvaus mokymosi ir atminties bandymą reikėtų atlikti po nujunkymo (pvz., 25 ± 2 dieną) ir tam naudoti jaunus suaugusius gyvūnus (60 PND amžiaus ir vyresnius). Dėl bandymų nujunkymo laikotarpiu žr. 32 punktą. Šiais dviem vystymosi etapais galima atlikti tą patį arba kitą (-us) bandymą (-us). Pasirenkant bandymą (-us) nujunkytų ir suaugusių žiurkių mokymuisi ir atminčiai tirti, leidžiamas tam tikras lankstumas. Tačiau bandymas (-ai) turėtų būti parengtas (-i) taip, kad atitiktų du kriterijus. Pirma, mokymasis turėtų būti vertinamas kaip pokytis, kuris įvyksta per keletą kartojamų bandymų arba sesijų arba, kai bandymas yra vienas, kaip būsenos pokytis dėl neasociatyvaus mokymosi patirties poveikio. Antra, per bandymą (-us) reikėtų tirti ne tik pradinį mokymąsi (įgūdžių įgijimą), bet ir tam tikrą atminties matą (trumpalaikę arba ilgalaikę atmintį), tačiau šio atminties mato negalima aprašyti tol, kol per tą patį bandymą nebus įvertintas įgūdžių įgijimas. Jeigu mokymosi ir atminties bandymas (-ai) atskleidžia bandomosios cheminės medžiagos poveikį, galima apsvarstyti galimybę atlikti papildomą (-us) bandymą (-us), kad remiantis jutiminių, motyvacijos ir (arba) motorinių gebėjimų pokyčiais būtų galima atmesti alternatyvius aiškinimus. Mokymosi ir atminties bandymų metodą, be paminėtų dviejų kriterijų, dar rekomenduojama pasirinkti pagal jo jautrumą tiriamosios cheminės medžiagos klasės medžiagoms, jeigu literatūroje esama tokios informacijos. Jeigu tokios informacijos nėra, tai bandymai, kuriuos būtų galima atlikti laikantis nurodytųjų kriterijų, pavyzdžiui, yra šie: pasyvaus vengimo (angl. passive avoidance) (43) (56) (57), gebėjimo prisiminti tam tikrą padėtį po pertraukos (angl. delayed-matching-to-position), kai tiriamos suaugusios žiurkės (58) ir žiurkių jaunikliai (59), poveikio per uoslę (angl. olfactory conditioning) (43) (60), Morris vandens labirinto (angl. Morris water maze) (61) (62) (63), Biel arba Sinsinačio labirinto (angl. Biel or Cincinnati maze) (64) (65), radialinių atšakų labirinto (angl. radial arm maze) (66), T labirinto (angl. T-maze) (43), nuo režimo priklausančios elgsenos susiformavimo ir išlikimo (angl. acquisition and retention of schedule-controlled behaviour) (26) (67) (68). Literatūroje aptariami ir kiti bandymai, skirti nujunkytoms (26) (27) ir suaugusioms žiurkėms (19) (20).

Nekroskopija

38. Po palikuonių nujunkymo galima atlikti motininių gyvūnų eutanaziją.

39. Neuropatologinis palikuonių vertinimas bus atliekamas naudojant 22 PND arba anksčiau, 11–22 PND, ir tyrimo pabaigoje humaniškai numarintų gyvūnų audinius. Tiriant 22 PND numarintus palikuonis, reikėtų vertinti jų galvos smegenų audinius; tiriant tyrimo pabaigoje numarintus gyvūnus – ir centrinės nervų sistemos (CNS), ir periferinės nervų sistemos (PNS) audinius. 22 PND arba anksčiau numarinti gyvūnai gali būti fiksuojami panardinant į fiksatyvą arba perfuzinės fiksacijos būdu. Tyrimo pabaigoje numarinti gyvūnai turėtų būti fiksuojami perfuzinės fiksacijos būdu. Visi audinių mėginių paruošimo aspektai nuo gyvūnų perfuzijos iki audinių mėginių išpjovimo, audinių paruošimo ir objektinių stiklelių dažymo turėtų būti tarpusavyje taip suderinti, kad kiekvienoje partijoje būtų reprezentatyvių mėginių iš kiekvienos dozės grupės. Išsamesnės neuropatologinių tyrimų gairės išdėstytos EBPO Rekomendaciniame dokumente Nr. 20 (9), taip pat žr. (103).

Audinių mėginių paruošimas

40. Visas pagrindines per nekroskopiją pastebėtas anomalijas reikėtų registruoti. Paimti audinių mėginiai turėtų atspindėti visas pagrindines nervų sistemos sritis. Audinių mėginius reikėtų laikyti tinkamame fiksatyve ir tirti pagal standartizuotus paskelbtus histologinių tyrimų protokolus (69) (70) (71) (103). CNS ir PNS audinius galima įterpti į parafiną, tačiau kai reikalinga didesnė rezoliucija (pvz., tiriant periferinius nervus, kai įtariama periferinė neuropatija ir (arba) kai atliekama morfometrinė periferinių nervų analizė), po fiksavimo gali būti tikslinga naudoti osmį ir įterpti į epoksidinę dervą. Morfometrinei analizei atlikti visais dozės lygmenimis paimti galvos smegenų audiniai turėtų būti įterpti į tinkamą terpę tuo pačiu metu, siekiant išvengti artefaktų susitraukimo dėl pernelyg ilgo laikymo fiksatyve (6).

Neuropatologinis tyrimas

41. Šio kokybinio tyrimo paskirtis:

i) nustatyti nervų sistemos sritis, kuriose yra neuropatologinių pokyčių požymių;

ii) nustatyti neuropatologinių pokyčių, kurie atsirado dėl veikimo bandomąja chemine medžiaga, pobūdį; ir

iii) nustatyti neuropatologinių pokyčių sunkumo intervalą.

Reprezentatyvius histologiniam tyrimui skirtus audinių mėginių mikroskopu turėtų ištirti tinkamai parengtas patologas, kuris nustatytų, ar esama neuropatologinių pokyčių požymių. Visus neuropatologinius pokyčius reikėtų įvertinti subjektyviu balu, žyminčiu pokyčio dydį. 22 PND arba anksčiau humaniškai numarintų gyvūnų galvos smegenų dalims įvertinti gali pakakti hematoksilino ir eozino dažų. Tačiau tyrimo pabaigoje numarintų gyvūnų CNS ir PNS audinių dalims tirti rekomenduojama naudoti mielino dažus (pvz., luxol fast blue/cresyl violet) ir sidabravimo dažus (pvz., Bielschowsky arba Bodian). Remiantis profesionalia patologo nuomone ir pagal tai, kokio pobūdžio pakitimų pastebėta, galima apsvarstyti galimybę naudoti kitus dažus, skirtus konkretiems pakitimams nustatyti ir apibūdinti (pvz., glialinio fibrilinės rūgšties baltymo (GFAP) arba lektino histocheminį dažymą glialiniams ir mikroglialiniams pokyčiams įvertinti (72), Fluoro-Jade dažus nekrozei nustatyti (73) (74) arba sidabravimo dažus, skirtus neuronų degeneracijai nustatyti (75)).

42. Reikėtų atlikti morfometrinį (kiekybinį) vertinimą, nes jo duomenys gali padėti nustatyti su dozės davimu susijusį poveikį ir yra vertingi aiškinant su dozės davimu susijusius galvos smegenų masės arba morfologijos skirtumus (76) (77). Kad būtų galima atlikti morfometrinį vertinimą, reikėtų paimti ir paruošti nervų audinio mėginį. Morfometrinį vertinimą gali sudaryti, pvz., konkrečių smegenų sričių tiesiniai arba zoniniai matavimai (78). Tiesiniams arba zoniniams matavimams atlikti reikia naudoti homologiškus kruopščiai pagal patikimus mikroskopinius parametrus pasirinktus pjūvius (6). Stereologiją galima naudoti, kai norima nustatyti su dozės davimu susijusį poveikį tokiems parametrams kaip konkrečių neuroanatominių sričių dydis ar ląstelių skaičius (79) (80) (81) (82) (83) (84).

43. Smegenis reikėtų ištirti, ar nėra su dozės davimu susijusių neuropatologinių pokyčių; norint užtikrinti, kad tyrimas būtų nuodugnus, iš visų svarbiausių smegenų sričių (pvz., uoslės svogūnėlių, smegenų žievės, hipokampo, bazalinių ganglijų, gumburo, pogumburio, vidurinių smegenų (keturkalnio, smegenų dangčio ir smegenų kojyčių), tilto, pailgųjų smegenų, smegenėlių) reikėtų paimti pakankamai mėginių. Svarbu, kad tiriant visus gyvūnus būtų imami tos pačios plokštumos pjūviai. Iš tyrimo pabaigoje humaniškai numarintų gyvūnų reikėtų paimti reprezentatyvius nugaros smegenų ir PNS pavyzdžius. Tarp tiriamų sričių turėtų būti akis su regos nervu ir tinklaine, nugaros smegenys kaklo ir juosmens sustorėjimų vietose, užpakalinės ir priekinės nugaros smegenų šaknelės pluoštai, proksimalinis sėdmens nervas, proksimalinis blauzdikaulio nervas (prie kelio) ir blauzdikaulio nervo šakos į blauzdos raumenį. Nugaros smegenų ir periferinės nervų sistemos pjūviai turėtų būti ir kryžminiai arba skersiniai, ir išilginiai.

44. Atliekant neuropatologinį vertinimą reikėtų tirti ne tik ląstelių pokyčius (pvz., neuronų vakuolizaciją, degeneraciją, nekrozę) ir audinių pokyčius (pvz., gliozę, leukocitinę infiltraciją, cistų susiformavimą), bet ir tai, ar nėra nervų sistemos vystymosi pažeidimų požymių (6) (85) (86) (87) (88) (89). Šiuo požiūriu svarbu, kad su dozės davimu susijęs poveikis būtų atskirtas nuo normalaus vystymosi požymių, kurie atsiranda numarinimo laiką atitinkančiame vystymosi etape (90). Reikšmingų pokyčių, rodančių vystymosi sutrikimus, pavyzdžiai (sąrašas nėra baigtinis):

— uoslės svogūnėlių, didžiųjų galvos smegenų arba smegenėlių bendro dydžio arba formos pokyčiai;

— įvairių galvos smegenų sričių (pvz., smegenėlių išorinio užuomazginio sluoksnio, didžiosios smegenų jungties) santykinio dydžio pokyčiai, įskaitant jų sumažėjimą arba padidėjimą dėl ląstelių populiacijų, kurios paprastai būna kintančios, mažėjimo ir ilgesnio nei įprastai gyvavimo, taip pat dėl aksonų projekcijų;

— proliferacijos, migracijos ir diferenciacijos pokyčiai, kuriuos atspindi pernelyg didelės apoptozės arba nekrozės plotai, ektopinių, sutrikdytos orientacijos arba pakitusios sandaros neuronų populiacijų grupės arba išsklaidytos populiacijos, santykinio įvairių žievės sluoksnių struktūrų dydžio pokyčiai;

— mielino kaupimosi pokyčiai, įskaitant bendrą struktūrų, kuriose kaupiasi mielinas, dydžio sumažėjimą arba pokyčius;

— hidrocefalijos požymiai, ypač skilvelių padidėjimas, smegenų vandentiekio stenozė ir smegenų pusrutulių suplonėjimas.

Dozės ir atsako tarpusavio ryšys neuropatologinių pokyčių atveju

45. Kokybinei ir kiekybinei neuropatologinei analizei atlikti rekomenduojama taikyti toliau aptartą nuoseklųjį metodą. Iš pradžių lyginami didelės dozės ir kontrolinės grupės gyvūnų audinių dalys. Jeigu didelės dozės grupės gyvūnams neuropatologinių pakitimų nenustatoma, toliau analizuoti nereikia. Jeigu didelės dozės gyvūnų grupėje nustatomi neuropatologiniai pokyčiai, tada tiriami vidutinės ir mažos dozės grupių gyvūnai. Jeigu didelės dozės grupė nebetiriama dėl nugaišimo arba kito rezultatus iškreipiančio toksiškumo, reikėtų tirti, ar neuropatologinių pokyčių nėra didelės ir vidutinės dozės grupėse. Jeigu mažesnių dozių grupėse pastebima toksinio poveikio nervų sistemai požymių, atliekama šių grupių gyvūnų neuropatologinė analizė. Jeigu atliekant kokybinius arba kiekybinius tyrimus yra nustatomi su dozės davimu susiję neuropatologiniai pokyčiai, reikėtų, remiantis visų dozių grupių gyvūnų vertinimu, nustatyti pažeidimų arba morfometrinių pokyčių pasireiškimo, dažnumo ir laipsnio priklausomybę nuo dozės. Per šį vertinimą reikėtų vertinti visas galvos smegenų sritis, kuriose pastebėta neuropatologinių pokyčių požymių. Apibūdinant kiekvieno pobūdžio pažeidimą reikėtų apibrėžti kriterijus, pagal kuriuos yra nustatomas kiekvienas pažeidimo laipsnis, ir nurodyti požymius, pagal kuriuos kiekvienas laipsnis yra atskiriamas. Kiekvieno pobūdžio pažeidimo dažnumą ir sunkumo laipsnį reikėtų užrašyti, paskui atlikti statistinę analizę ir įvertinti dozės ir atsako tarpusavio ryšio pobūdį. Rekomenduojama naudoti koduotus objektinius stiklelius (91).

DUOMENYS IR ATASKAITA

Duomenys

46. Duomenys pateikiami atskirai ir apibendrinami lentelėse, nurodant kiekvienos bandymo grupės pakitimų pobūdį, motininių patelių skaičių, palikuonių skaičių pagal lytis ir vadas, kuriose atsirado kiekvienos rūšies pakitimų. Jeigu palikuonys buvo tiesiogiai veikiami postnataliniu laikotarpiu, reikėtų nurodyti veikimo būdą, trukmę ir laikotarpį.

Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas

47. Neurotoksiškumo vystymuisi tyrimas suteiks informacijos apie kartotinio sąlyčio su chemine medžiaga poveikį in utero ir ankstyvuoju postnatalinio vystymosi laikotarpiu. Kadangi akcentuojamos ir bendrojo toksiškumo, ir toksiškumo vystymuisi vertinamosios baigtys, tyrimo rezultatai leis atskirti poveikį nervų sistemos vystymuisi, kai nėra bendrojo motininės patelės toksiškumo, ir poveikį, kuris sukeliamas tik esant koncentracijai, kuri toksiška ir motininiam gyvūnui (27). Kadangi tyrimo struktūra, statistinė analizė ir biologinis duomenų reikšmingumas yra susiję sudėtingais ryšiais, norint tinkamai interpretuoti neurotoksiškumo vystymuisi duomenis, reikės remtis ekspertų vertinimu (107) (109). Bandymo rezultatams aiškinti reikėtų taikyti įrodomosios vertės analizę (20) (92) (93) (94). Reikėtų aptarti elgsenos arba morfologinių duomenų, jei tokių gauta, modelius, taip pat duomenis apie dozės ir atsako ryšį. Į šį apibūdinimą reikėtų įtraukti duomenis visų tų tyrimų, kurie būtų svarbūs vertinant neurotoksiškumą vystymuisi, įskaitant žmonių epidemiologinius tyrimus arba konkrečių atvejų ataskaitas, tyrimus su bandomaisiais gyvūnais (pvz., toksikokinetinius duomenis, informaciją apie struktūrą ir aktyvumą, kitų toksiškumo tyrimų duomenis). Taip pat reikėtų įtraukti duomenis apie bandomosios cheminės medžiagos dozės ir neurotoksiškumo kiekvienos lyties gyvūnams tarpusavio ryšio buvimą arba nebuvimą, dažnumą ir mastą (20) (95).

48. Vertinant duomenis reikėtų aptarti ir biologinį, ir statistinį reikšmingumą. Į statistinę analizę reikėtų žvelgti kaip į priemonę, kuri duomenis padeda aiškinti, o ne nulemia jų aiškinimą. Tai, kad statistinio reikšmingumo nepakanka, negali būti vienintelis kriterijus padaryti išvadai, kad su dozių davimu susijusio poveikio nėra, kaip ir statistinio reikšmingumo buvimas neturėtų būti vienintelis kriterijus padaryti išvadai, kad su dozių davimu susijusio poveikio esama. Siekiant išvengti galimų klaidingų neigiamų išvadų ir sunkumų, kurių kyla, kai reikia įrodyti nesamą dalyką, reikėtų aptarti turimus teigiamus ir ankstesnius kontrolinius duomenis, ypač tais atvejais, kai su dozių davimu susijusio poveikio nėra (102) (106). Klaidingų teigiamų duomenų tikimybę reikėtų aptarti atsižvelgiant į bendrą statistinį duomenų įvertinimą (96). Be kitų dalykų, taip pat reikėtų įvertinti neuropatologinių ir elgsenos pakitimų tarpusavio ryšį, jei jis pastebėtas.

49. Visus rezultatus reikėtų analizuoti naudojant pagal bandymo struktūrą tinkamus statistinius modelius (108). Parametrinės arba neparametrinės analizės metodus reikėtų rinktis atsižvelgiant į tokius veiksnius kaip duomenų pobūdis (transformuoti ar ne), jų pasiskirstymas, santykinis pasirinktos statistinės analizės patikimumas. Statistinę analizę reikėtų pasirinkti pagal tyrimo tikslą ir struktūrą, siekiant minimizuoti I tipo (klaidingi teigiami rezultatai) ir II tipo (klaidingi neigiami rezultatai) klaidų kiekį (96) (97) (104) (105). Kai vystymosi tyrimams yra naudojamos po keletą palikuonių vienu metu atsivedančių gyvūnų rūšys ir tiriama po keletą vienos vados jauniklių, į statistinį modelį reikėtų įtraukti ir vadą ir taip apsisaugoti nuo pernelyg didelių I tipo klaidų (98) (99) (100) (101). Statistinis mato vienetas turėtų būti vada, ne jauniklis. Bandymus reikėtų suplanuoti taip, kad tos pačios vados gyvūnai nebūtų laikomi nepriklausomais stebėjimo objektais. Visos pakartotinai vertinamos to paties subjekto vertinamosios baigtys turėtų būti analizuojamos taikant tokius statistinius modelius, kuriuose atsižvelgiama į tai, kad šie matai nėra savarankiški.

Bandymo ataskaita

50. Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikta ši informacija:

Bandomoji cheminė medžiaga:

— fizikinė būsena ir, jei reikia, fizikinės ir cheminės savybės;

— tapatumo duomenys, įskaitant šaltinį;

— preparato grynumas ir žinomos ir (arba) numanomos priemaišos.

Nešiklis (jei naudojamas):

— nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo ir ne fiziologinis tirpalas.

Bandomieji gyvūnai:

— naudojamos rūšys ir veislės ir pagrindimas, jei pasirinktos ne žiurkės;

— bandomųjų gyvūnų tiekėjas;

— gyvūnų skaičius, amžius bandymo pradžioje ir lytis;

— šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras, vanduo ir t. t.;

— kiekvieno gyvūno masė bandymo pradžioje.

Bandymo sąlygos:

— pagrindinė priežastis, nulėmusi dozės dydžio pasirinkimą;

— pagrindinė priežastis, nulėmusi dozės davimo būdo ir laikotarpio pasirinkimą;

— duodamos dozės specifikacija, įskaitant išsamią informaciją apie nešiklį, duodamos medžiagos tūrį ir fizikinį pavidalą;

— duomenys apie bandomosios cheminės medžiagos preparato ruošimą ir (arba) jos dėjimą į pašarą, gautą preparato koncentraciją, stabilumą ir vienalytiškumą;

— metodas, taikytas motininėms patelėms ir jaunikliams paženklinti unikalia žyma;

— atsitiktinės atrankos, taikytos motininėms patelėms suskirstyti į dozes gaunančias grupes, jaunikliams brokuoti ir suskirstyti į bandymo grupes, išsamus aprašas;

— informacija apie bandomosios cheminės medžiagos davimo būdą;

— bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos pašaruose, geriamajame vandenyje arba įkvepiamos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos (ppm) perskaičiavimas į tikrąją dozę (mg/kg kūno masės per parą), jei reikia;

— aplinkos sąlygos;

— duomenys apie pašaro ir vandens (pvz., vandentiekio, distiliuotas) kokybę;

— tyrimo pradžios ir pabaigos datos.

Stebėjimo ir bandymo procedūros:

— išsamus stebėjimų ir procedūrų standartizavimo aprašas ir naudotos apibrėžtys stebėjimų rezultatams įvertinti balais;

— taikytų bandymo procedūrų sąrašas ir jų taikymo pagrindimas;

— duomenys apie taikytas elgsenos/funkcinių, patologinių, neurocheminių arba elektropsichologinių bandymų procedūras, taip pat informacija ir išsamūs duomenys apie automatizuotus prietaisus;

— prietaisų kalibravimo procedūros ir procedūros, skirtos užtikrinti, kad prietaisų parodymai būtų lygiaverčiai ir kad bandymai su dozes gaunančiomis grupėmis būtų atliekami proporcingai;

— glaustas pagrindimas paaiškinant sprendimus, kuriuos priimant remtasi profesionaliu vertinimu.

Rezultatai (pavieniai ir suvestiniai, jei reikia, nurodant vidurkį ir dispersiją):

— gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje ir tyrimo pabaigoje;

— gyvūnų ir vadų skaičius, naudotas bandymui pagal kiekvieną metodą;

— kiekvieno gyvūno ir vados, iš kurios jis kilęs, identifikavimo numeris;

— vados dydis ir vidutinė atsivestų jauniklių masė pagal lytį;

— kūno masė ir duomenys apie kūno masės pokyčius, įskaitant motininių patelių ir jauniklių kūno masę numarinimo etapu;

— duomenys apie pašaro ir vandens, jei reikia (pvz., jeigu bandomoji cheminė medžiaga yra duodama su vandeniu), suvartojimą;

— duomenys apie toksinį atsaką pagal lytį ir dozės dydį, taip pat apie toksiškumo požymius arba nugaišusius gyvūnus, įskaitant, jei reikia, nugaišimo laiką ir priežastį;

— išsamių pastebėtų klinikinių požymių tipas, sunkumas, trukmė, pradžios data, paros laikas, tolesnė eiga;

— kiekvieno vystymosi parametro (masės, lytinio subrendimo ir elgsenos ontogenezės) balas kiekvienu stebėjimo momentu;

— išsamus nustatytų elgsenos, funkcinių, neuropatologinių, neurocheminių, elektropsichologinių požymių aprašas pagal lytį, įskaitant padidėjimą ir sumažėjimą dėl kontrolės;

— nekroskopijos duomenys;

— smegenų masė;

— visos diagnozės pagal neurologinius požymius ir pažeidimus, įskaitant natūraliai atsirandančias ligas arba būsenas;

— požymių pavyzdžių nuotraukos;

— mažo padidinimo mikroskopinės nuotraukos morfometrijai naudotų pjūvių homologijai įvertinti;

— absorbcijos ir metabolizmo duomenys, taip pat papildomi duomenys iš atskirų toksikokinetinių tyrimų, jei turimi;

— statistinis rezultatų apdorojimas, įskaitant duomenims ir rezultatams, nepaisant to, ar jie buvo reikšmingi, ar ne, analizuoti taikytus statistinius modelius;

— tyrimo grupės narių sąrašas, įskaitant profesinį parengimą.

Rezultatų aptarimas:

— informacija apie dozės ir atsako santykį pagal lytį ir grupę;

— tai, kiek visas kitas toksinis poveikis turėjo įtakos išvadai dėl bandomosios cheminės medžiagos galimo neurotoksiškumo, pagal lytį ir grupę;

— tai, kiek toksikokinetiniai duomenys turėjo įtakos išvadai;

— panašumas į kitų žinomų neurotoksiškų medžiagų poveikį;

— duomenys, kuriais pagrindžiamas bandymų metodo patikimumas ir jautrumas (t. y. teigiami ir ankstesni kontroliniai duomenys);

— neuropatologinio ir funkcinio poveikio ryšys, jei yra;

— NOAEL arba etaloninė dozė motininėms patelėms ir jaunikliams pagal lytį ir grupę.

Išvados:

— bendras duomenų aiškinimas remiantis rezultatais, įskaitant išvadą, ar bandomoji cheminė medžiaga sukėlė neurotoksinį poveikį vystymuisi, ir NOAEL.

LITERATŪROS ŠALTINIAI

(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13–14 June 1995.

(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98–239. Paskelbta: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Paskelbta: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79–91.

(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101–111.

(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93–100.

(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23–25 October 2000.

(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and SAFEty Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008. Paskelbta: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and SAFEty Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Paskelbta: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173–292.

(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188–197.

(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1 st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14) Šio priedo B.34 skyrius „Toksiškumo vienos kartos dauginimuisi bandymas“.

(15) Šio priedo B.35 skyrius „Toksiškumo dviejų kartų dauginimuisi bandymas“.

(16) Šio priedo B.43 skyrius „Neurotoksiškumo graužikams bandymas“.

(17) Šio priedo B.31 skyrius „Toksiškumo prenataliniam vystymuisi bandymas“.

(18) 2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos. OL L 276, 2010 10 20, p. 33.

(19) WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Paskelbta: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20) WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Paskelbta: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1 st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499–509.

(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2–6.

(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110–112.

(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118–136.

(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87–94.

(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4.

(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433–439.

(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449–457.

(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383–390.

(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350–365.

(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579–586.

(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298–303.

(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489–95.

(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896–920.

(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67–100.

(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53–66.

(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) „Plenum Press“, New York, pp. 37–82.

(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3′-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117–129.

(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247–260.

(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599–609.

(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405–411.

(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661–669.

(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589–591.

(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), „Plenum Press“, New York, pp. 287–351.

(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107–128.

(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). „Raven Press“, New York, pp. 181–211.

(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199–211.

(53) Crofton, K.M., Lassiter, T.L., Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25–30.

(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437–445.

(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), „Raven Press“, New York. pp. 125–145.

(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3′-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321–332.

(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247–296.

(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237–244.

(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98–105.

(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465–479.

(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47–60.

(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29–69.

(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60–90.

(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235–241.

(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387–399.

(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327–332.

(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342–352.

(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338–341.

(69) Fix, A.S., Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122–131.

(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, pp. 84–107.

(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, „Churchill Livingstone“, London.

(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291–304.

(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123–130.

(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365–372.

(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561.

(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745–755.

(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417–432.

(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129–135.

(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305–310.

(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262–268.

(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707–710.

(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51–61.

(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113–121.

(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294–298.

(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3–41.

(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. „Science“, 283:70–74.

(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. „Science“, 287:1056–1060.

(90) Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. „Springer-Verlag“, Berlin.

(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127–133.

(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401–405.

(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274–56322.

(95) Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113–126.

(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21–27.

(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329–335.

(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165–172.

(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221–228.

(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587–90.

(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345–352.

(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A 'best practices' approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 34:296–313.

(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205–210.

(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295–301.

(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266–287.

(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288–325.

(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326–348.

(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349–381.

1 pvz.

Bendra funkcinių ir (arba) elgsenos bandymų, neuropatologinio vertinimo ir galvos smegenų masės tyrimo schema. Ši diagrama parengta pagal 13–15 punktuose pateiktą aprašą (PND = postnatalinė diena). Gyvūnų suskirstymo pavyzdžiai pateikti 1 priedėlyje.

1 priedėlis 1. Galimo suskirstymo pavyzdžiai aptarti ir išdėstyti lentelėje toliau. Šie pavyzdžiai pateikti norint parodyti, kad tiriamuosius gyvūnus pagal įvairias bandymų paradigmas galima suskirstyti įvairiais būdais. 1 pavyzdys 2. Elgsenos ontogenezės bandymams iki nujunkymo naudojama viena grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jauniklių (po 1 patiną ir 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui. Iš šių gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir dozės lygmens jauniklių (t. y. po 1 patinėlį arba 1 patelę iš vados) yra humaniškai numarinami 22 PND. Galvos smegenys išimamos, pasveriamos ir parengiamos histopatologiniam vertinimui. Galvos smegenų masės duomenys taip pat yra renkami naudojant likusių to paties dozės lygmens 10 patinėlių ir 10 patelių nefiksuotas galvos smegenis. 3. Kita grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jauniklių (po 1 patinėlį ir 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui, yra naudojama funkciniams ir (arba) elgsenos bandymams po nujunkymo (atliekami išsamūs klinikiniai stebėjimai, vertinamas motorinis aktyvumas, paaugusių jauniklių reakcija į garsinius dirgiklius ir atliekamas kognityvinės funkcijos bandymas). Iš šių gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir dozės lygmens jauniklių (t. y. po 1 patinėlį arba 1 patelę iš vados) tyrimo pabaigoje (apie 70 PND) duodama anestetiko, jie fiksuojami perfuzijos būdu. Po papildomo fiksavimo in situ galvos smegenys išimamos ir parengiamos neuropatologiniam vertinimui. 4. Jaunų suaugusių gyvūnų (pvz., 60–70 PND amžiaus) kognityvinės funkcijos bandymams naudojama trečia grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jauniklių (t. y. po 1 patinėlį ir 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui. Iš šių gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir dozės lygmens gyvūnų (t. y. po 1 patinėlį arba 1 patelę iš vados) tyrimo pabaigoje humaniškai numarinami, jų galvos smegenys išimamos ir pasveriamos. 5. 20 likusių kiekvienos lyties iš grupės gyvūnų yra paliekami galimiems papildomiems bandymams atlikti. 1 lentelė Jauniklio nr. (8) Bandymui paskirtų jauniklių skaičius Tyrimas/Bandymas V M 1 5 20 V + 20 M Elgsenos ontogenezė 10 V + 10 M 22 PND galvos smegenų masė/neuropatologinė morfometrija 10 V + 10 M 22 PND galvos smegenų masė 2 6 20 V + 20 M Išsamūs klinikiniai stebėjimai 20 V + 20 M Motorinis aktyvumas 20 V+ 20 M Lytinis subrendimas 20 V + 20 M Motorinė ir jutiminė funkcijos 20 V + 20 M Mokymasis ir atmintis (25 PND) 10 V + 10 M Jaunų suaugusių gyvūnų galvos smegenų masė/neuropatologinė morfometrija ~ 70 PND 3 7 20 V + 20 M Mokymasis ir atmintis (jauni suaugę gyvūnai) 10 V + 10 M Jaunų suaugusių gyvūnų galvos smegenų masė ~ 70 PND 4 8 — Rezerviniai gyvūnai kitiems gyvūnams pakeisti arba papildomiems bandymams atlikti 2 pavyzdys 6. Elgsenos ontogenezės bandymams iki nujunkymo naudojama viena grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jauniklių (po 1 patinėlį ir 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui. Iš šių gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir dozės lygmens jauniklių (t. y. po 1 patinėlį arba 1 patelę iš vados) yra humaniškai numarinami 11-ą PND. Galvos smegenys išimamos, pasveriamos ir parengiamos histopatologiniam vertinimui. 7. Kita grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jauniklių (po 1 patinėlį ir 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui, yra naudojama bandymams po nujunkymo (atliekami išsamūs klinikiniai stebėjimai, vertinamas motorinis aktyvumas, lytinio subrendimo amžius, motorinė ir jutiminė funkcijos). Iš šių gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir dozės lygmens jauniklių (t. y. po 1 patinėlį arba 1 patelę iš vados) tyrimo pabaigoje (apie 70 PND) duodama anestetiko, jie fiksuojami perfuzijos būdu. Po papildomo fiksavimo in situ galvos smegenys išimamos, pasveriamos ir parengiamos neuropatologiniam vertinimui. 8. Paaugusių jauniklių ir jaunų suaugusių gyvūnų kognityvinės funkcijos bandymams naudojama grupė, kurią sudaro po 10 kiekvienos lyties jauniklių (t. y. po 1 patinėlį arba 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui. 23 PND amžiaus gyvūnų ir jaunų suaugusių gyvūnų kognityvinei funkcijai bandyti yra naudojami skirtingi gyvūnai. Tyrimo pabaigoje po 10 kiekvienos lyties iš grupės gyvūnų, su kuriais atlikti suaugusiems gyvūnams skirti bandymai, yra numarinami, jų galvos smegenys išimamos ir pasveriamos. 9. 20 likusių kiekvienos lyties iš grupės gyvūnų, kurie nebuvo pasirinkti bandymams, yra numarinami ir sunaikinami po nujunkymo. 2 lentelė Jauniklio nr. (9) Bandymui paskirtų jauniklių skaičius Tyrimas/bandymas V M 1 5 20 V + 20 M Elgsenos ontogenezė 10 V + 10 M 11 PND galvos smegenų masė/neuropatologinė morfometrija 2 6 20 V + 20 M Išsamūs klinikiniai stebėjimai 20 V + 20 M Motorinis aktyvumas 20 V + 20 M Lytinis subrendimas 20 V + 20 M Motorinė ir jutiminė funkcijos 10 V + 10 M Jaunų suaugusių gyvūnų galvos smegenų masė/neuropatologinė morfometrija ~ 70 PND 3 7 10 V + 10 M (10) Mokymasis ir atmintis (23 PND) 3 7 10 V + 10 M (10) Mokymasis ir atmintis (jauni suaugę gyvūnai) Jaunų suaugusių gyvūnų galvos smegenų masė 4 8 — Gyvūnai numarinami ir sunaikinami 21 PND 3 pavyzdys 10. Smegenų masės ir neuropatologiniam vertinimui 11 PND naudojama viena grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jauniklių (po 1 patinėlį ir 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui. Iš šių gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir dozės lygmens jauniklių (t. y. po 1 patinėlį arba 1 patelę iš vados) yra humaniškai numarinami 11 PND. Jų galvos smegenys išimamos, pasveriamos ir parengiamos histopatologiniam vertinimui. Galvos smegenų masės duomenys taip pat yra renkami naudojant likusių to paties dozės lygmens 10 patinėlių ir 10 patelių nefiksuotas galvos smegenis. 11. Kita grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jauniklių (po 1 patinėlį ir 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui, yra naudojama elgsenos ontogenezės (motorinio aktyvumo) tyrimams, tyrimams po nujunkymo (motoriniam aktyvumui ir lytinio subrendimo amžiui vertinti), paaugusių jauniklių kognityvinei funkcijai bandyti. 12. Motorinės ir jutiminės funkcijų (reakcijos į garsinius dirgiklius) bandymams ir išsamiems klinikiniams stebėjimams atlikti naudojama viena grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jauniklių (po 1 patinėlį ir 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui. Iš šių gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir dozės lygmens jauniklių (t. y. po 1 patinėlį arba 1 patelę iš vados) tyrimo pabaigoje (apie 70 PND) duodama anestetiko, jie fiksuojami perfuzijos būdu. Po papildomo fiksavimo in situ galvos smegenys išimamos, pasveriamos ir parengiamos neuropatologiniam vertinimui. 13. Jaunų suaugusių gyvūnų kognityvinės funkcijos bandymams yra naudojama grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jauniklių (t. y. po 1 patinėlį ir 1 patelę iš vados) vienam dozės lygmeniui. Iš šių gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir dozės lygmens gyvūnų (t. y. po 1 patinėlį arba 1 patelę iš vados) tyrimo pabaigoje humaniškai numarinami, jų galvos smegenys išimamos ir pasveriamos. 3 lentelė Jauniklio nr. (11) Bandymui paskirtų jauniklių skaičius Tyrimas/bandymas V M 1 5 10 V + 10 M 11 PND galvos smegenų masė/neuropatologinė morfometrija 10 V + 10 M 11 PND galvos smegenų masė 2 6 20 V + 20 M Elgsenos ontogenezė (motorinis aktyvumas) 20 V + 20 M Motorinis aktyvumas 20 V + 20 M Lytinis subrendimas 20 V + 20 M Mokymasis ir atmintis (27-ą PND) 3 7 20 V + 20 M Reakcija į garsinį dirgiklį (paaugusiems jaunikliams ir jauniems suaugusiems gyvūnams) 20 V + 20 M Išsamūs klinikiniai stebėjimai 10 V + 10 M Jaunų suaugusių gyvūnų galvos smegenų masė/neuropatologija 70 PND morfometrija 4 8 20 V + 20 M Mokymasis ir atmintis (jauni suaugę gyvūnai) 10 V + 10 M Jaunų suaugusių gyvūnų smegenų masė

2 priedėlis Sąvokos Cheminė medžiaga: medžiaga arba mišinys. Bandomoji cheminė medžiaga: bet kuri pagal šį bandymų metodą bandoma medžiaga arba mišinys.

B.54. POVEIKIU GRAUŽIKŲ GIMDAI PAGRĮSTA BIOANALIZĖ. TRUMPALAIKIS ESTROGENINIŲ SAVYBIŲ ATRANKOS BANDYMAS

ĮVADAS

1. Šis bandymų metodas atitinka EBPO Bandymų gaires (angl. OECD Test Guideline (TG)) Nr. 440 (2007). 1998 m. EBPO iniciatyva pradėtas didelės svarbos darbas – peržiūrėti esamas gaires ir parengti naujas galimai endokrininę sistemą ardančių medžiagų atrankos ir bandymo gaires. Viena iš šio darbo dalių – parengti poveikiu graužikų gimdai pagrįstos bioanalizės gaires. Paskui buvo įgyvendinta plati poveikiu graužikų gimdai pagrįstos bioanalizės tinkamumo patvirtinimo programa, be kita ko, buvo parengtas dokumentas su išsamia įvadine informacija (2) (3), atlikti platūs tyrimai vienoje laboratorijoje ir skirtingose laboratorijose siekiant parodyti bioanalizės su stipriu etaloniniu estrogenu, silpnais estrogenų receptorių agonistais, stipriu estrogenų receptorių antagonistu ir neigiama etalonine chemine medžiaga aktualumą ir atkuriamumą (4) (5) (6) (7) (8) (9). Šis bandymų metodas B.54 yra paremtas patirtimi, įgyta įgyvendinant tinkamumo patvirtinimo bandymo programą, ir per šią programą gautais estrogenų agonistų tyrimo rezultatais.

2. Poveikiu gimdai pagrįsta bioanalizė yra trumpalaikis atrankos bandymas, sukurtas 4-ajame dešimtmetyje (27) (28), pirmą kartą ekspertų komitetas jį standartizavo atrankai atlikti 1962 m. (32) (35). Jis pagrįstas gimdos masės didėjimu arba poveikį gimdai turinčiu atsaku (jei norite susipažinti išsamiau, žr. 29). Jį atliekant vertinama, ar cheminė medžiaga gali paskatinti biologinį aktyvumą, atitinkantį natūralių estrogenų (pvz., 17ß-estradiolio) agonistų arba antagonistų veikimą, tačiau šis bandymas antagonistams nustatyti taikomas daug rečiau negu agonistams. Gimda į estrogenus reaguoja dvejopai. Pirminis atsakas yra masės padidėjimas dėl vandens sugėrimo. Paskui audiniui augant ima didėti masė (30). Žiurkių ir pelių gimdos atsakas kokybiniu požiūriu yra panašus.

3. Ši bioanalizė yra in vivo atrankos analizė, jos taikymą reikėtų vertinti pagal EBPO Konceptualią endokrininę sistemą ardančių cheminių medžiagų bandymo ir vertinimo sistemą (angl. Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) (2 priedėlis). Pagal šią konceptualią sistemą poveikiu gimdai pagrįsta bioanalizė yra 3 lygmens in vivo analizė, kurią atliekant gaunama duomenų apie vieną endokrininės sistemos mechanizmą, t. y. estrogeninį poveikį.

4. Poveikiu gimdai pagrįsta bioanalizė yra sukurta kaip in vitro ir in vivo bandymų serijos dalis, ji yra skirta cheminėms medžiagoms, kurios gali sąveikauti su endokrinine sistema, nustatyti ir taip padėti atlikti rizikos žmogaus sveikatai ir aplinkai vertinimą. EBPO tinkamumo patvirtinimo programoje buvo naudojami ir stiprūs, ir silpni estrogenų agonistai siekiant įvertinti, kaip analizė padeda nustatyti estrogenines chemines medžiagas (4) (5) (6) (7) (8). Šia programa buvo aiškiai parodytas bandymų metodo jautrumas estrogenų agonistams nustatyti ir gauti geri atkuriamumo toje pačioje laboratorijoje ir skirtingose laboratorijose rezultatai.

5. Kalbant apie neigiamas chemines medžiagas, į tinkamumo patvirtinimo programą įtraukta tik viena etaloninė cheminė medžiaga, poveikiu gimdai pagrįsta analize ir in vitro rišimosi prie receptorių bei receptorių analize patvirtinta kaip „neigiama“; taip pat buvo įvertinti papildomi bandymų duomenys, nesusiję su EBPO tinkamumo patvirtinimo programa, kuriais dar išsamiau patvirtintas poveikiu gimdai pagrįstos bioanalizės tinkamumas estrogenų agonistų atrankai atlikti (16).

PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI

6. Estrogenų agonistai ir antagonistai veikia kaip estrogenų receptorių a ir b ligandai ir gali atitinkamai skatinti arba slopinti transkripcinę receptorių veiklą. Dėl to gali kilti pavojus sveikatai, įskaitant poveikį dauginimuisi ir vystymuisi. Dėl to cheminę medžiagą reikia greitai įvertinti ir nustatyti, ar ji gali veikti kaip estrogeno agonistas arba antagonistas. Nors ligandų rišimosi prie estrogenų receptorių afiniškumas arba reporterinių genų transkripcijos aktyvinimas in vitro yra informatyvus veiksnys, jis yra tik vienas iš keleto galimo pavojaus determinantų. Kiti galimi determinantai – tai metabolinis aktyvavimas ir deaktyvavimas patekus į organizmą, pasiskirstymas tiksliniuose audiniuose, pašalinimas iš organizmo, priklausantis, bent jau iš dalies, nuo bandomosios cheminės medžiagos ir jos davimo būdo. Dėl to reikia atlikti galimo cheminės medžiagos veikimo in vivo atitinkamomis sąlygomis atrankos bandymą, išskyrus tuos atvejus, kai reikiama informacija jau būna turima iš cheminės medžiagos absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo, pašalinimo (ADME) charakteristikos. Gimdos audiniai, ypač laboratorinių graužikų, kurių rujos ciklas trunka apie 4 dienas, reaguoja į stimuliavimą estrogenais sparčiai ir energingai augdami. Įvairių rūšių graužikai, ypač žiurkės, taip pat plačiai naudojami toksiškumo tyrimuose pavojingumui apibūdinti. Todėl graužiko gimda yra tinkamas tikslinis organas estrogenų agonistų ir antagonistų in vivo atrankos bandymui atlikti.

7. Šis bandymų metodas yra pagrįstas tais EBPO tinkamumo patvirtinimo tyrime naudotais protokolais, kurie ir vienos laboratorijos, ir skirtingų laboratorijų tyrimuose patvirtinti kaip patikimi ir atkartojami (5) (7). Šiuo metu galima taikyti du metodus, tai yra: suaugusių patelių, kurioms atlikta ovariektomija, t. y. OVX suaugusių patelių metodą ir nesubrendusių patelių, kurioms neatlikta ovariektomija, t. y. nesubrendusių patelių metodą. Per EBPO tinkamumo patvirtinimo bandymo programą buvo įrodyta, kad abiejų metodų jautrumas ir atkuriamumas yra panašūs. Tačiau, kadangi nesubrendusio gyvūno pogumburio–hipofizės–lytinių liaukų (angl. HPG) ašis dar neaktyvi, šis metodas yra ne toks specifiškas, bet apima platesnį tyrimą negu tada, kai naudojamas gyvūnas, kuriam atlikta ovariektomija, nes nesubrendęs gyvūnas gali reaguoti į chemines medžiagas, kurios sąveikauja su pogumburio–hipofizės–lytinių liaukų ašimi, ne tik su estrogeno receptoriumi. Žiurkių pogumburio–hipofizės–lytinių liaukų ašis ima funkcionuoti maždaug 15 dieną po atsivedimo. Iki tol paspartinti subrendimo duodant, pavyzdžiui, GnRH, negalima. Artėjant patelių lytinio subrendimo laikui, iki makšties atsivėrimo patelei įvyksta keli tušti ciklai, per kuriuos makštis neatsiveria ir ovuliacija neįvyksta, tačiau būna tam tikrų hormoninių svyravimų. Jeigu chemine medžiaga pogumburio–hipofizės–lytinių liaukų ašis yra tiesiogiai arba netiesiogiai stimuliuojama, patelė anksti subręsta, anksti vyksta ovuliacija, spartėja makšties atsivėrimo procesas. Tokį poveikį daro ne tik cheminės medžiagos, kurios veikia pogumburio–hipofizės–lytinių liaukų ašį, – kai kurie pašarai, kurių metabolizuojančios energijos lygis yra didesnis, skatina augimą ir spartina makšties atsivėrimą, nors nėra estrogeniniai. Tokios cheminės medžiagos OVX suaugusiems gyvūnams nesukels poveikį gimdai turinčio atsako, nes jų pogumburio–hipofizės–lytinių liaukų ašis nefunkcionuoja.

8. Rūpinantis gyvūnų gerove reikėtų taikyti tą metodą, pagal kurį naudojamos nesubrendusios žiurkės, vengti chirurginio gyvūnų paruošimo, stengtis, jei galima, nenaudoti tų gyvūnų, kurie turi kokių nors rujos pradžios požymių (žr. 30 punktą).

9. Poveikį gimdai turintis atsakas būna ne vien estrogeninės kilmės, t. y. atsaką gali sukelti ir kitos cheminės medžiagos, ne vien estrogenų agonistai arba antagonistai. Pavyzdžiui, santykinai didelės progesterono, testosterono arba įvairių sintetinių progestinų dozės gali daryti stimuliuojamąjį poveikį (30). Bet kurį atsaką galima ištirti histologiškai ir patikrinti, ar makščiai daromas keratinizavimo ir ragėjimo poveikis (30). Kad ir kokios kilmės būtų galimas atsakas, teigiami poveikiu gimdai pagrįstos bioanalizės rezultatai paprastai turėtų paskatinti imtis tolesnių aiškinimosi tyrimų. Papildomų duomenų apie estrogeninį poveikį galima gauti atliekant in vitro analizę, pavyzdžiui, rišimosi prie ER, transkripcijos aktyvinimo analizę, arba in vivo analizę, pavyzdžiui, patelių lytinio subrendimo analizę.

10. Atsižvelgiant į tai, kad poveikiu gimdai pagrįsta bioanalizė yra in vivo atrankos analizė, pasirinktas tinkamumo patvirtinimo metodas padėjo ir atsižvelgti į gyvūnų gerovę, ir laikytis daugiapakopių bandymų strategijos. Todėl atliekant analizę buvo stengiamasi tiksliai patvirtinti estrogeninio poveikio – tai svarbiausias rūpestis, kylantis dėl daugelio cheminių medžiagų, – rezultatų atkuriamumą ir jautrumą, bet mažai dėmesio skirta antiestrogeninio poveikio aspektams. Buvo išbandytas tik vienas stipriai veikiantis antiestrogenas, nes akivaizdžiai antiestrogeninio pobūdžio (kurio nenustelbia tam tikras estrogeninis poveikis) cheminių medžiagų yra labai nedaug. Šis bandymų metodas taikomas pagal estrogeninio poveikio protokolą, o protokolas, kuriame aptariamas antagonistų analizės būdas, yra pateiktas Rekomendaciniame dokumente (37). Cheminių medžiagų, darančių grynai antiestrogeninį poveikį, analizės atkuriamumas ir jautrumas bus išsamiau apibrėžtas vėliau, bandymų metodikai tapus įprasta, kurį laiką ją panaudojus ir nustačius daugiau tokio pobūdžio poveikį turinčių cheminių medžiagų.

11. Pripažįstama, kad visos procedūros, kurioms naudojami gyvūnai, turi atitikti gyvūnų priežiūros vietinius reikalavimus; toliau nurodyti gyvūnų priežiūros ir elgesio su gyvūnais reikalavimai yra būtiniausi veiklos reikalavimai ir už juos viršesni yra vietiniai reikalavimai, pavyzdžiui, 2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos (38). Daugiau humaniško elgesio su gyvūnais gaires galima rasti EBPO (25).

12. Kaip ir prieš bet kurią kitą analizę, kuriai atlikti naudojami gyvi gyvūnai, prieš pradedant šią analizę itin svarbu įsitikinti, kad duomenys tikrai reikalingi. Pavyzdžiui, dvi sąlygos, kada duomenys gali būti reikalingi, yra tokios:

— yra didelė sąlyčio tikimybė (konceptualios sistemos (2 priedėlis) 1 lygmuo) arba estrogeninio poveikio požymiai (2 lygmuo) ir siekiama nustatyti, ar toks poveikis gali pasireikšti in vivo;

— atliekant 4 arba 5 lygmens in vivo bandymus nustatoma estrogeninio poveikio požymių ir yra siekiama pagrįsti, kad šis poveikis yra susijęs su estrogenų mechanizmu, kurio in vitro bandymu išsiaiškinti neįmanoma.

13. Sąvokos, vartojamos šiame bandymų metodo aprašyme, pateiktos 1 priedėlyje.

BANDYMŲ METODO PRINCIPAS

14. Poveikiu gimdai pagrįstos bioanalizės jautrumas paremtas bandymų su gyvūnais sistema, pagal kurią pogumburio–hipofizės–kiaušidžių ašis nefunkcionuoja, dėl to endogeninis cirkuliuojančių estrogenų lygis yra žemas. Taip užtikrinama maža pradinė gimdos masė ir didžiausias galimas atsako į duodamus estrogenus spektras. Yra dvi šį reikalavimą atitinkančios graužikų patelių būsenos, kada jos yra jautrios estrogenams:

i) kol patelės yra nesubrendusios, po nujunkymo iki lytinio subrendimo, ir

ii) jaunos suaugusios patelės, kurioms atlikta ovariektomija, praėjus pakankamai laiko, kad gimdos audiniai galėtų regresuoti.

15. Bandomoji cheminė medžiaga duodama kasdien per virškinamąjį traktą, naudojant zondą, arba poodinėmis injekcijomis. Skirtingos bandomosios cheminės medžiagos dozės duodamos ne mažiau kaip dviem dozes gaunančioms bandomųjų gyvūnų grupėms (paaiškinimai pateikti 33 punkte), kiekvienai grupei duodant po vieno dydžio dozę: pagal nesubrendusių gyvūnų metodą – tris dienas iš eilės, pagal OVX suaugusių gyvūnų metodą – ne trumpiau kaip tris dienas iš eilės. Gyvūnų nekroskopija atliekama praėjus maždaug 24 valandoms po paskutinės dozės davimo. Tiriant estrogenų agonistus vertinama, ar dozes gaunančių grupių gyvūnų gimdos masės padidėjimo vidurkis yra statistiškai reikšmingas, palyginti su nešiklio grupe. Statistiškai reikšmingas dozes gaunančios grupės gyvūnų gimdos masės vidurkio padidėjimas rodo, kad per šią bioanalizę gautas teigiamas atsakas.

METODO APRAŠYMAS

Gyvūnų rūšies parinkimas

16. Galima naudoti dažniausiai naudojamų veislių laboratorinius graužikus. Pavyzdžiui, tinkamumo patvirtinimo tikslais naudotos Sprague-Dawley ir Wistar veislių žiurkės. Jei žinoma arba įtariama, kad kai kurių veislių gyvūnų gimda reaguoja ne taip jautriai, tokių gyvūnų naudoti nereikėtų. Laboratorija turėtų įrodyti naudojamos veislės gyvūnų jautrumą taip, kaip aptarta 26 ir 27 punktuose.

17. Poveikiu gimdai pagrįstai bioanalizei atlikti nuo 4-ojo dešimtmečio dažniausiai buvo naudojamos žiurkės ir pelės. EBPO tinkamumo patvirtinimo tyrimai buvo atliekami tik su žiurkėmis, laikantis nuomonės, kad abi rūšys turėtų būti lygiavertės ir kad, siekiant saugoti išteklius ir gyvūnus, tinkamumui visame pasaulyje patvirtinti turėtų pakakti vienos rūšies. Toksiškumo dauginimuisi ir vystymuisi tyrimuose dažniausiai pasirenkama rūšis yra žiurkės. Kadangi jau anksčiau sukaupta plati duomenų apie peles bazė, siekiant poveikiu graužikų gimdai pagrįstą bioanalizės metodą išplėsti pritaikant jį pelėms, kaip bandomųjų gyvūnų rūšiai, su pelėmis atliktas riboto masto kontrolinis tinkamumo patvirtinimo tyrimas. Laikantis pradinio siekio saugoti išteklius ir gyvūnus, pasirinktas tarpinis metodas, pagal kurį buvo panaudota nedaug bandomųjų cheminių medžiagų, dalyvavo nedaug laboratorijų ir nebuvo naudoti koduotų mėginių bandymai. Iš šio tarpinio tinkamumo patvirtinimo tyrimo matyti, kad poveikiu jaunų suaugusių pelių, kurioms atlikta ovariektomija, gimdai pagrįsta bioanalizė ir kokybiniu, ir kiekybiniu požiūriu tiksliai atitinka žiurkių tyrimo duomenis. Jei poveikiu gimdai pagrįsta bioanalizė yra pradinė, atliekama prieš ilgalaikį tyrimą, abiem tyrimams galima naudoti tos pačios veislės ir to paties šaltinio gyvūnus. Pagal tarpinį metodą naudotos tik OVX pelės ir ataskaitoje nėra pateikiama pakankamai tvirtų duomenų nesubrendusių pelių modelio tinkamumui patvirtinti, todėl šiame bandymų metode į nesubrendusių pelių modelį nebuvo atsižvelgta.

18. Taigi kai kuriais atvejais vietoj žiurkių galima naudoti peles. Jeigu pasirenkama ši gyvūnų rūšis, pasirinkimą reikėtų pagrįsti pagal toksikologinius, farmakokinetinius ir (arba) kitus kriterijus. Jei naudojamos pelės, protokolą gali tekti pakeisti. Pavyzdžiui, pelių pašaro suvartojimas pagal kūno masę yra didesnis už žiurkių, todėl fitoestrogeno kiekis pelėms duodamuose pašaruose turėtų būti mažesnis negu žiurkėms duodamuose pašaruose (9) (20) (22).

Laikymo ir šėrimo sąlygos

19. Visos procedūros turėti atitikti vietos laboratorinių gyvūnų priežiūros standartus. Šiose nuostatose pateikti būtiniausi gyvūnų priežiūros ir elgesio su gyvūnais reikalavimai, vietos taisyklės, pavyzdžiui, 2010 m. rugsėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES dėl mokslo tikslais naudojamų gyvūnų apsaugos, yra už juos viršesnės. Bandomųjų gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 °C (gali svyruoti ± 3 °C). Santykinė drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką. Reikėtų siekti, kad santykinė drėgmė būtų 50–60 %. Apšvietimas turėtų būti dirbtinis. Per parą apšvietimo seka turėtų būti 12 h šviesos ir 12 h tamsos.

20. Laboratorinis pašaras ir vanduo turėtų būti duodami ad libitum. Jauni suaugę gyvūnai narveliuose gali būti laikomi atskirai arba tos pačios lyties grupėmis po tris. Dėl jauno nesubrendusių gyvūnų amžiaus juos laikyti rekomenduojama socialinėmis grupėmis.

21. Yra žinoma, kad didelis fitoestrogenų kiekis laboratoriniuose pašaruose pakankamai smarkiai skatina graužikų gimdos masę didėti – tiek, kad tai gali trukdyti atlikti poveikiu gimdai pagrįstą bioanalizę (13) (14) (15). Kai naudojami nesubrendę gyvūnai, didelis fitoestrogenų kiekis laboratoriniuose pašaruose ir jų metabolizuojanti energija taip pat gali paskatinti ankstyvą lytinį subrendimą. Fitoestrogenų pašaruose visų pirma atsiranda dėl to, kad į juos dedama sojos ir alfalfa produktų, ištirta, kad fitoestrogenų kiekis įvairiose laboratorinių pašarų partijose būna skirtingas (23). Kūno masė yra svarbus kintamasis, nes vartojamo pašaro kokybė yra susijusi su kūno mase. Todėl su tokiais pačiais pašarais faktiškai suvartojamas fitoestrogenų kiekis, lyginant skirtingų rūšių ir amžiaus gyvūnus, gali skirtis (9). Nesubrendusios žiurkių patelės pašaro pagal kūno masę gali suvartoti maždaug dukart daugiau negu jaunos suaugusios patelės, kurioms atlikta ovariektomija. Jaunos suaugusios pelės pašaro pagal kūno masę gali suvartoti maždaug keturiskart daugiau negu jaunos suaugusios žiurkių patelės, kurioms atlikta ovariektomija.

22. Tačiau poveikiu gimdai pagrįstos bioanalizės rezultatai (9) (17) (18) (19) rodo, kad nedidelis fitoestrogenų kiekis pašaruose yra priimtinas ir nemažina bioanalizės jautrumo. Rekomenduojama, kad fitoestrogenų kiekis jaunoms Sprague Dawley ir Wistar veislių žiurkėms duodamuose pašaruose sudarytų ne daugiau kaip 350 μg genisteino ekvivalentų vienam laboratorinio pašaro gramų (6) (9). Tokį pašarą taip pat tiktų naudoti, kai bandymas atliekamas su jaunomis suaugusiomis žiurkių patelėmis, kurioms atlikta ovariektomija, nes jauni gyvūnai, palyginti su nesubrendusiais gyvūnais, pašaro pagal kūno masę suvartoja mažiau. Jeigu reikia naudoti peles, kurioms atlikta ovariektomija, arba fitoestrogenams jautresnes žiurkes, reikėtų apsvarstyti galimybę proporcingai sumažinti fitoestrogenų kiekį pašaruose (20). Be to, dėl skirtingos įvairių pašarų metabolinės energijos gali keistis lytinio brendimo pradžios laikas (21) (22).

23. Prieš tyrimą reikėtų kruopščiai pasirinkti pašarus, kad jų fitoestrogenų (paaiškinimai pateikti (6) (9)) arba metabolizuojančios energijos kiekis nebūtų padidintas, nes tai gali iškreipti rezultatus (15) (17) (19) (22) (36). Tam, kad laboratorijos taikoma bandymo sistema veiktų tinkamai, taip, kaip nurodyta 26 ir 27 punktuose, svarbu patikrinti abu šiuos veiksnius. Kaip gerą laboratorijos praktiką (GLP) atitinkanti apsauginė priemonė turėtų būti paimtas reprezentatyvus kiekvienos pašarų, duodamų per tyrimą, partijos mėginys, kad būtų galima ištirti juose esančių fitoestrogenų kiekį (pvz., kai gimdos kontrolinis svoris, palyginti su ankstesniais kontroliniais duomenimis, yra didelis arba kai atsakas į etaloninį estrogeną, 17 alfa-etinilestradiolį, yra neadekvatus). Alikvotines dalis reikėtų išanalizuoti per tyrimą arba užšaldyti – 20 °C temperatūroje ar taip, kad mėginys iki analizės nesuirtų.

24. Kai kurio kraiko sudėtyje gali būti natūraliai susidariusių estrogeninių arba antiestrogeninių cheminių medžiagų (pvz., yra žinoma, kad kukurūzų burbuolės kotai veikia žiurkių rujos cikliškumą ir yra antiestrogeniniai). Pasirinktame kraike turėtų būti kuo mažesnis fitoestrogenų kiekis.

Gyvūnų paruošimas

25. Bandomieji gyvūnai, neturintys ligos arba fizinių anomalijų požymių, yra atsitiktine tvarka suskirstomi į kontrolinę ir dozes gaunančias grupes. Narveliai turėtų būti išdėstomi taip, kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis dėl narvelio vietos. Gyvūnus reikėtų paženklinti unikaliomis žymomis. Nesubrendusius gyvūnus aklimatizacijos laikotarpiu iki nujunkymo geriau laikyti viename narvelyje su motininėmis arba kitomis žindančiomis patelėmis. Jaunų suaugusių gyvūnų ir nesubrendusių gyvūnų, kurie pristatyti kartu su motininėmis patelėmis arba kitomis žindančiomis patelėmis, aklimatizacijos laikotarpis iki tyrimo pradžios turėtų trukti apie 5 dienas. Jeigu nesubrendę gyvūnai yra įsigyti jau nujunkyti ir be motininių patelių, aklimatizacijos laikotarpį gali tekti sutrumpinti, nes dozes reikėtų pradėti duoti iškart po nujunkymo (žr. 29 punktą).

BANDYMO PROCEDŪRA

Laboratorijos kompetencijos patikrinimas

26. Laboratorijos kompetenciją patikrinti galima dvejopai:

— periodiškai tikrinti pagal pradinio bazinio teigiamo kontrolinio tyrimo rezultatus (žr. 27 punktą). Ne rečiau kaip kas 6 mėnesius ir kaskart, kai atsiranda pokytis, galintis paveikti analizės eigą (pvz., nauji pašarai, skrodimus atliekančio personalo pasikeitimas, gyvūnų veislės arba tiekėjo pasikeitimas ir t. t.), reikėtų patikrinti bandymo sistemos (gyvūnų modelio) jautrumą, tam panaudojant atitinkamą etaloninio estrogeno 17a-etinilestradiolio (CAS Nr. 57–63–6) (EE) dozę (remiantis 27 punkte nurodyto bazinio teigiamo kontrolinio tyrimo rezultatais);

— vykdyti lygiagrečią kontrolę, į kiekvieną analizę įtraukiant grupę, kuriai duodama atitinkama etaloninio estrogeno dozė.

Jeigu sistema reaguoja ne taip, kaip tikėtasi, bandymo sąlygas reikėtų išnagrinėti ir atitinkamai pakeisti. Rekomenduojama etaloninio estrogeno dozė, kuri būtų naudojama pagal bet kurį iš būdų, sudarytų ED70–80.

27. Bazinis teigiamas kontrolinis tyrimas – laboratorija prieš pirmą kartą atlikdama tyrimą pagal šį bandymų metodą turėtų patikrinti savo kompetenciją, t. y. išbandyti gyvūnų modelio jautrumą nustatydama atsaką į etaloninio estrogeno 17a-etinilestradiolio (CAS Nr. 57–63–6) (EE) dozę, kai skiriamos ne mažiau kaip keturios dozės. Gimdos masės atsakas bus palygintas su turimais ankstesniais duomenimis (žr. literatūros sąrašo 5 punktą). Jeigu šis bazinis teigiamas kontrolinis tyrimas neduoda lauktų rezultatų, bandymo sąlygas reikėtų išnagrinėti ir atitinkamai pakeisti.

Gyvūnų skaičius ir būklė

28. Kiekvienoje dozes gaunančioje ir kontrolinėje grupėje turėtų būti mažiausiai 6 gyvūnai (ir pagal nesubrendusių gyvūnų, ir pagal OVX suaugusių gyvūnų metodo protokolus).

Nesubrendusių gyvūnų amžius

29. Kai poveikiu gimdai pagrįstai bioanalizei