X PRIEDAS

RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ NUSTATYMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1. TAIKYMO SRITIS

Šiame priede pateikti nurodymai dėl augalinių riebalų ir aliejų laisvųjų ir sujungtųjų rūgščių nustatymo dujų chromatografijos metodu, jas prieš tai pavertus riebalų rūgščių metilesteriais (FAME).

Sujungtosios triacilglicerolių (TAG) riebalų rūgštys ir priklausomai nuo esterinimo metodo gautos laisvosios riebalų rūgštys (FFA) paverčiamos riebalų rūgščių meetilesteriais (FAME), kurie nustatomi kapiliarinės dujų chromatografijos metodu.

Šiame priede aprašytu metodu galima nustatyti FAME nuo C12 iki C24, įskaitant sočiųjų, cis- ir trans-mononesočiųjų bei cis- ir trans-polinesočiųjų riebalų rūgščių metilesterius.

2. METODO ESMĖ

Dujų chromatografija (GC) taikoma kiekybinei FAME analizei. FAME paruošiami pagal A dalį. Paskui jie įpurškiami ir išgarinami injektoriaus viduje. FAME atskiriami nustatyto poliškumo ir ilgio analizės kolonėlėse. FAME aptinkami liepsnos jonizaciniu detektoriumi (FID). Analizės sąlygos pateiktos B dalyje.

Atliekant FAME dujų chromatografiją su FID, kaip nešančiąsias dujas galima naudoti vandenilį arba helį (judančioji fazė). Vandenilis paspartina atskyrimą ir gaunamos aštresnės smailės. Nejudamoji fazė – mikroskopinis plonos skysčio plėvelės sluoksnis ant inertinio kieto lydyto kvarco paviršiaus.

Dujoms judant kapiliarine kolonėle, vyksta išgarintų analizuojamų junginių sąveika su nejudamąja faze, dengiančia vidinį kolonėlės paviršių. Dėl nevienodos skirtingų junginių sąveikos jie išplaunami skirtingu laiku, kuris vadinamas junginio sulaikymo trukme esant tam tikram analizės parametrų rinkiniui. Sulaikymo trukmės verčių palyginimas naudojamas skirtingiems junginiams identifikuoti.

A DALIS.

ALYVUOGIŲ ALIEJAUS IR ALYVUOGIŲ IŠSPAUDŲ ALIEJAUS RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ PARUOŠIMAS

1. APRĖPTIS

Šioje dalyje aprašytas riebalų rūgščių metilesterių paruošimas. Ją sudaro alyvuogių aliejų ir alyvuogių išspaudų aliejų riebalų rūgščių metilesterių paruošimo metodai.

2. TAIKYMO SRITIS

Alyvuogių aliejų ir alyvuogių išspaudų aliejų riebalų rūgščių metilesteriai ruošiami atliekant peresterinimą kalio hidroksido metanoliniu tirpalu kambario temperatūroje. Ėminio gryninimo prieš peresterinimą būtinybė priklauso nuo ėminio laisvųjų riebalų rūgščių kiekio bei nustatomo analizės parametro ir metodą galima pasirinkti pagal šią lentelę:

Aliejaus rūšis Metodas Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus, kurio rūgštingumas ≤ 2,0 % 1. Riebalų rūgštys 2. Riebalų rūgščių trans-izomerai 3. ΔECN42 (išgryninus silikageliu ekstrakcijos kietąja faze (SPE) metodu) Rafinuotas alyvuogių aliejus Alyvuogių aliejus, sudarytas iš rafinuoto alyvuogių aliejaus ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejų: Rafinuotas alyvuogių išspaudų aliejus Alyvuogių išspaudų aliejus Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus, kurio rūgštingumas > 2,0 % Neapdorotas alyvuogių išspaudų aliejus 1. Riebalų rūgštys (išgryninus silikageliu SPE metodu) 2. Riebalų rūgščių trans-izomerai (išgryninus silikageliu SPE metodu) 3. ΔECN42 (išgryninus silikageliu SPE metodu)

3. METODIKA

3.1. Peresterinimas kalio hidroksido metanoliniu tirpalu kambario temperatūroje.

3.1.1. Principas

Metilesteriai susidaro atliekant peresterinimą metanoliniu kalio hidroksido tirpalu, kaip tarpinė stadija prieš įvykstant muilinimui.

3.1.2. Reagentai

3.1.2.1. Metanolis, turintis ne daugiau kaip 0,5 % (masės) vandens.

3.1.2.2. Heksanas, tinkamas chromatografijai.

3.1.2.3. Heptanas, tinkamas chromatografijai.

3.1.2.4. Dietileteris, stabilizuotas prieš analizę.

3.1.2.5. Acetonas, tinkamas chromatografijai.

3.1.2.6. Išplovimo tirpiklis aliejui gryninti kolonėlinės chromatografijos arba ekstrakcijos kietąja faze būdu: heksano ir dietileterio mišinys 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Kalio hidroksidas, maždaug 2 mol/l metanolinis tirpalas: 11,2 g kalio hidroksido ištirpinama 100 ml metanolio.

3.1.2.8. Silikagelio kasetės, 1 g (6 ml), ekstrakcijai kietąja faze atlikti.

3.1.3. Aparatūra

3.1.3.1. Mėgintuvėliai su užsukamais dangteliais (5 ml tūrio), dangtelis su PTFE jungtimi.

3.1.3.2. Graduotos arba automatinės pipetės, 2 ml ir 0,2 ml.

3.1.4. Aliejaus ėminių gryninimas

Jei būtina, ėminiai gryninami aliejų leidžiant per ekstrakcijos kietąja faze silikagelio kasetę. Silikagelio kasetė (3.1.2.8) dedama į išplovimo vakuume aparatą ir plaunama 6 ml heksano (3.1.2.2); plaunama ne vakuume. Paskui aliejaus (maždaug 0,12 g) tirpalas, esantis 0,5 ml heksano (3.1.2.2) supilamas į kolonėlę. Tirpalas leidžiamas žemyn ir išplaunamas 10 ml heksano ir dietileterio (87:13 v/v) mišiniu (3.1.2.6). Sujungti eliuatai sumaišomi ir padalijami į du maždaug vienodus tūrius. Alikvotinė dalis išgarinama sukamajame garintuve iki sauso likučio, esant sumažintam slėgiui ir kambario temperatūroje. Likutis ištirpinamas 1 ml heptano ir gautą tirpalą galima naudoti riebalų rūgščių analizei GC metodu. Antroji alikvotinė dalis išgarinama, o likutis ištirpinamas 1 ml acetono, kad prireikus būtų galima atlikti trigliceridų analizę HPLC metodu.

3.1.5. Procedūra

Į 5 ml mėgintuvėlį su užsukamu dangteliu (3.1.3.1) pasveriama maždaug 0,1 g aliejaus ėminio. Įpilama 2 ml heptano (3.1.2.2) ir supurtoma. Įpilama 0,2 ml metanolinio kalio hidroksido tirpalo (3.1.2.7), uždedamas dangtelis su PTFE jungtimi, dangtelis užsukamas ir mėgintuvėlis stipriai purtomas 30 sekundžių. Paliekama išsisluoksniuoti tol, kol viršutinis tirpalo sluoksnis tampa skaidrus. Viršutinis sluoksnis su metilesteriais dekantuojamas. Tirpalas heptane yra paruoštas įpurkšti į dujų chromatografą. Patartina tirpalą laikyti šaldytuve iki bus atliekama jo dujų chromatografinė analizė. Nerekomenduojama tirpalo laikyti ilgiau kaip 12 h.

B DALIS.

RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ ANALIZĖ DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1. TAIKYMO SRITIS

Šioje dalyje aprašyti bendri nurodymai, kaip taikyti kapiliarinę dujų chromatografiją, nustatant pagal A dalyje nurodytą metodą gauto riebalų rūgščių metilesterių mišinio kokybinę ir kiekybinę sudėtį.

Ši dalis netaikoma polimerizuotoms riebalų rūgštims.

2. REAGENTAI

2.1. Nešančiosios dujos

Inertinės dujos (vandenilis ar helis), visiškai išdžiovintos, turinčios mažiau kaip 10 mg/kg deguonies.

1 pastaba. Vandenilis gali dvigubai pagreitinti analizę, bet yra pavojingas. Galima įsigyti saugių įtaisų.

2.2. Pagalbinės dujos

2.2.1. Vandenilis (grynumas ≥ 99,9 %), neturintis organinių priemaišų.

2.2.2. Oras arba deguonis, neturintys organinių priemaišų.

2.2.3. Azotas (grynumas > 99 %).

2.3. Pamatinis etalonas

Grynų riebalų rūgščių metilesterių arba žinomos sudėties riebalų, geriausiai tokių, kurie yra panašūs į analizuojamą riebalinę medžiagą, metilesterių mišinys. Nesočiųjų rūgščių trans-izomerams identifikuoti tinka oktadeceno, oktadekadieno ir oktadekatrieno rūgščių metilesterių cis- ir trans-izomerai.

Reikėtų imtis atsargumo priemonių, kad būtų išvengta polinesočiųjų riebalų rūgščių oksidacijos.

3. APARATŪRA

Pateikiamos instrukcijos tinka įprastai dujų chromatografijos įrangai, kai naudojamos kapiliarinės kolonėlės ir dujų jonizacinis detektorius.

3.1. Dujų chromatografas

Dujų chromatografą sudaro šie elementai:

3.1.1. Įpurškimo sistema

Naudojama įpurškimo sistema su kapiliarinėmis kolonėlėmis, ir šiuo atveju ji turėtų būti specialiai suprojektuota darbui su tokiomis kolonėlėmis. Tai gali būti dalijamo ar nedalijamo srauto tiesioginio įpurškimo į kolonėlę injektorius.

3.1.2. Krosnis

Krosnis turi įkaitinti kapiliarinę kolonėlę bent iki 260°C ir pasirinktą temperatūrą palaikyti 0,1°C tikslumu. Pastarasis reikalavimas yra ypač svarbus, kai naudojamas lydyto kvarco vamzdelis.

Visais atvejais rekomenduojamas programuojamos temperatūros kaitinimo režimas, ypač kai analizuojamos riebalų rūgštys, turinčios mažiau kaip 16 anglies atomų.

3.1.3. Kapiliarinė kolonėlė

3.1.3.1. Vamzdelis pagamintas iš medžiagos, inertiškos analizuojamoms medžiagoms (paprastai stiklinis arba lydyto kvarco). Vidinis skersmuo turi būti nuo 0,20 iki 0,32 mm. Prieš padengiant nejudamąja faze, vidinį paviršių reikia tinkamai apdoroti (pvz., paruošti paviršių ir padaryti jį inertišku). Riebalų rūgštims ir jų cis- bei trans-izomerams pakanka 60 m ilgio.

3.1.3.2. Kaip kolonėlių nejudamoji fazė tinka tinklinės struktūros polinis polisiloksanas (cianpropilpolisiloksanas).

2 pastaba. Yra rizika, kad naudojant polinius polisiloksanus gali būti sunkiau identifikuoti ir atskirti linoleno rūgštį bei C20 rūgštis.

Dangos turi būti plonos, t. y. nuo 0,1 iki 0,2 μm.

3.1.3.3. Kolonėlės surinkimas ir kondicionavimas

Surenkant kapiliarines kolonėles, laikomasi įprastų atsargumo priemonių, t. y. kolonėlės įstatymas į krosnį (tvirtinimas), jungčių pasirinkimas ir sujungimas (sandarumas), kolonėlės galų jungimas su injektoriumi ir detektoriumi (neveikos tūrių sumažinimas). Į kolonėlę tiekiamos nešančiosios dujos (pvz., 0,3 bar (30 kPa) slėgio, kai naudojama 25 m ilgio ir 0,3 mm vidinio skersmens kolonėlė).

Kolonėlė kondicionuojama, programuojant krosnies temperatūros kitimą 3 °C/min sparta nuo kambario temperatūros iki 10 °C mažesnės už nejudamosios fazės skilimo temperatūrą. Krosnis šioje temperatūroje laikoma vieną valandą, kol nusistovi atskaitos linija. Temperatūra darbui izoterminėmis sąlygomis sumažinama iki 180°C.

3 pastaba. Tinkamai iš anksto kondicionuotų kolonėlių galima nusipirkti.

3.1.4. Liepsnos jonizacinis detektorius ir konverteris-stiprintuvas

3.2. Švirkštas

Didžiausia švirkšto talpa turi būti 10 μl, sugraduotas 0,1 μl padalomis.

3.3. Duomenų rinkimo sistema

Duomenų rinkimo sistema tiesiogiai sujungiama su detektoriais ir yra naudojama su programine įranga, kuri galėtų integruoti ir normalizuoti smailes.

4. PROCEDŪRA

Nuo 4.1 iki 4.3 skirsniuose aprašyti veiksmai tinka naudojant liepsnos jonizacinį detektorių.

4.1. Bandymo sąlygos

4.1.1. Kapiliarinių kolonėlių optimalių veikimo sąlygų parinkimas

Dėl kapiliarinių kolonėlių efektyvumo ir pralaidumo komponentų atskyrimas ir analizės trukmė labai priklauso nuo nešančiųjų dujų srauto kolonėlėje. Todėl būtina optimizuoti veikimo sąlygas, reguliuojant šį parametrą (arba tiesiog kolonėlės slėgio sumažėjimą), priklausomai nuo to, ar siekiama pagerinti atskyrimą ar paspartinti analizę.

Paaiškėjo, kad FAME (nuo C4 iki C26) atskirti tinka tokios sąlygos. Chromatogramų pavyzdžiai pateikti B priedėlyje:

injektoriaus temperatūra: 250 °C detektoriaus temperatūra: 250 °C krosnies temperatūra: nuo 165 °C (8 min) iki 210 °C 2 °C/min sparta nešančiosios dujos: vandenilis, dujų tiekimo į kolonėlę slėgis: 179 kPa suminis srautas: 154,0 ml/min; padalijimo santykis: 1:100 įpurškiamas tūris: 1 μl

4.1.2. Skyros nustatymas (žr. A priedėlį)

Dviejų gretimų smailių I ir II skyra R apskaičiuojama pagal formulę:

R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) or R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (JAV farmakopėja),

arba

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japonijos farmakopėja), EP (Europos farmakopėja), (BP (Britų farmakopėja)),

čia:

d r(I) – I smailės sulaikymo atstumas; d r(II) – II smailės sulaikymo atstumas; t r(I) – I smailės sulaikymo trukmė; t r(II) – II smailės sulaikymo trukmė; ω(I) – I smailės pagrindo plotis; ω(II) – II smailės pagrindo plotis; ω0,5 – tam tikro junginio smailės pusaukščio plotis;

If ω(I) ≈ ω(II), R skaičiuojama pagal šias formules:

R = (d r(II) – d r(I))/ω = (d r(II) – d r(I))/4σ

čia:

σ – standartinis nuokrypis (žr. A priedėlio 1 paveikslą).

Jei atstumas d r tarp dviejų smailių d r(II) – d r(I) lygus 4σ, skyros faktorius R = 1.

Jei dvi smailės atsiskiria nevisiškai, dviejų smailių perlinkio taškų liestinės susikerta C taške. Kad dvi smailės visiškai atsiskirtų, atstumas tarp jų turi būti lygus:

d r(II) – d r(I) = 6 σ, todėl R = 1,5 (žr. A priedėlio 3 paveikslą).

5. REZULTATŲ IŠRAIŠKA

5.1. Kokybinė analizė

Pagal B priedėlio 1 paveikslo chromatogramą identifikuojamos ėminio metilesterių smailės, prireikus atliekant interpoliaciją arba lygindami su metiesterių etaloninių mišinių smeilėmis (kaip nurodyta 2.3 punkte).

5.2. Kiekybinė analizė

5.2.1. Sudėties nustatymas

Atskirų riebalų rūgščių metilesterių masės dalis wi, išreikšta metilesterių masės procentine dalimi, apskaičiuojama taip:

5.2.2. Apskaičiavimo metodas

5.2.2.1. Bendrasis atvejis

Duoto i komponento kiekis, išreikštas metilesterių masės procentine dalimi, apskaičiuojamas nustatant atitinkamos smailės ploto procentinę dalį visų smailių plotų sumos atžvilgiu pagal formulę:

w i = A i/ΣA × 100

čia:

A i – atskiro riebalų rūgšties metilesterio i smailės plotas; ΣA – atskirų riebalų rūgščių metilesterių visų smailių plotų suma.

Rezultatai pateikiami šimtųjų tikslumu.

4 pastaba. Riebalų ir aliejų riebalų rūgščių metilesterių masės dalis yra lygi triacilglicerolių masės daliai, išreikštai gramais 100 g. Tais atvejais, kai ši prielaida negalioja, žr. 5.2.2.2.

5.2.2.2. Korekcijos koeficientų naudojimas

Tam tikrais atvejais, pvz., jei yra riebalų rūgščių, turinčių mažiau kaip aštuonis anglies atomus, arba rūgščių su antrinėmis grupėmis, turi būti atliekama plotų korekcija, taikant specialius korekcijos koeficientus (Fci). Šie koeficientai turi būti nustatyti kiekvienam atskiram prietaisui. Šiuo tikslu turi būti naudojamos atitinkamam intervalui tinkamos etaloninės medžiagos, kurių riebalų rūgščių sudėtis būtų sertifikuota.

5 pastaba. Šie korekcijos koeficientai nėra identiški A priedėlyje pateiktiems teoriniams FID korekcijos koeficientams, nes į juos įtrauktos įpurškimo sistemos veikimo charakteristikos ir kt. Tačiau esant didesniems skirtumams reikėtų patikrinti visos sistemos veikimo charakteristikas.

Šio etaloninio mišinio i metilesterio masės dalis apskaičiuojama pagal formulę:

wi = (m i/Σm) × 100

čia:

m i – etaloninio mišinio i metilesterio masė; Σm – įvairių etaloninio mišinio komponentų, kaip metilesterių, masių suma.

Pagal etaloninio mišinio chromatogramą i metilesterio ploto procentinė dalis apskaičiuojama pagal formulę:

wi = (Ai/ΣA) x 100

čia:

A i – etaloninio mišinio i metilesterio plotas; ΣA – visų etaloninio mišinio metilesterių plotų suma.

Tokiu atveju pataisos koeficientas F c yra lygus:

F c = (m i × ΣA)/(Ai/Σm)

Ėminio kiekvieno i metilesterio masės procentinė dalis yra lygi:

w i = (F i × A i)/Σ(F i × A i)

Rezultatai pateikiami šimtųjų tikslumu.

6 pastaba. Apskaičiuota vertė atitinka atskiros riebalų rūgšties masės procentinę dalį, apskaičiuotą kaip triacilglicerolių masė 100 g riebalų.

5.2.2.3. Vidinio etalono naudojimas

Atliekant tam tikras analizes (pvz., kai kiekybiškai nustatomos ne visos rūgštys, pvz., kai be rūgščių su 16 ir 18 anglies atomų yra keturis ir šešis anglies atomus turinčios rūgštys, arba kai reikia nustatyti absoliutų riebalų rūgšties kiekį ėminyje) būtina naudoti vidinį etaloną. Dažnai naudojamos riebalų rūgštys su 5, 15 arba 17 anglies atomų. Vidiniam etalonui turi būti nustatytas korekcijos koeficientas (jei yra).

Metilesteriu išreikšto i komponento procentinė masės dalis nustatoma pagal formulę:

wi = (m IS × F i × A i)/(m × F IS × A IS)

Čia:

A i – i metilesterio plotas; A IS – vidinio etalono plotas; F i – i riebalų rūgšties, išreikštos metilesteriu, korekcijos koeficientas; F IS – vidinio etalono korekcijos koeficientas; m – tiriamosios dalies masė, miligramais; m IS – vidinio etalono masė, miligramais.

Rezultatai pateikiami šimtųjų tikslumu.

6. BANDYMŲ ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti nurodyti visi metilesterių ruošimo ir dujų chromatografinės analizės metodai ir gauti rezultatai. Joje taip pat nurodoma visa su darbu susijusi informacija, nenurodyta šiame standartiniame metode, arba laikoma neprivaloma, kartu nurodant visų incidentų, galėjusių turėti įtakos rezultatams, aplinkybes.

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ėminiui visiškai identifikuoti būtina informacija.

7. PRECIZIŠKUMAS

7.1. Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai:

Metodo preciziškumo tarplaboratorinio tyrimo duomenys pateikti standarto IOC/T.20/Doc. No 33 C priede. Šiame tarplaboratoriniame tyrime gautos vertės gali netikti kitoms nei nurodytos koncentracijos vertėms ir matricoms.

7.2. Pakartojamumas

Dviejų atskirų bandymo rezultatų, kuriuos per trumpą laiką toje pačioje laboratorijoje ir ta pačia įranga gavo vienas operatorius, tai pačiai tiriamajai medžiagai taikydamas tą patį tyrimo metodą, absoliutusis skirtumas ne daugiau kaip 5 % atvejų gali būti didesnis už r vertes, pateiktas IOC/T.20/Doc No 33 standarto C priedo nuo 1 iki 14 lentelėse.

7.3. Atkuriamumas

Dviejų atskirų bandymo rezultatų, kuriuos skirtingose laboratorijose ir skirtinga įranga gavo skirtingi operatoriai, tai pačiai tiriamajai medžiagai taikydami tą patį tyrimo metodą, absoliutusis skirtumas ne daugiau kaip 5 % atvejų gali būti didesnis už R vertes, pateiktas IOC/T.20/Doc No 33 standarto C priedo nuo 1 iki 14 lentelėse.

A priedėlis 1 paveikslas ω 0,5 – trikampio (ABC) pusaukščio plotis, b – trikampio (NPM) pusaukščio plotis. 2 paveikslas 3 paveikslas