I PRIEDAS

3 straipsnio 2 dalyje nurodytojo kenkėjo aptikimo ir identifikavimo tyrimų metodai

1. Tyrimai naudojant sporas

Nurodytajam kenkėjui aptikti ir identifikuoti naudojamos vasarinės sporangės ir ramybės būsenos sporos, kurios gaunamos išsijojant dirvožemį arba tiesiogiai iš augalinės medžiagos.

2. Aptikimo metodai

Nurodytojo kenkėjo sporoms išgauti iš dirvožemio taikomas vienas iš šių metodų:

a) dirvožemio sijojimo metodas, kaip aprašyta Pratt (1976) (1);

b) dirvožemio sijojimo metodas, kaip aprašyta van Leeuwen et al.(2005) (2);

c) zoninio centrifugavimo metodas dideliam ėminių apdorojimo našumui užtikrinti, kaip aprašyta Wander et al. (2007) (3).

3. Identifikavimo metodai

Išgavus nurodytojo kenkėjo sporas, jos identifikuojamos taikant vieną iš šių metodų:

a) morfologinį identifikavimą, naudojant šviesos mikroskopą, kurio didinamoji galia – 100–400 kartų;

b) paprastą polimerazės grandininę reakciją (PGR), naudojant pradmenis, remiantis Lévesque et al (2001) (4) ir van den Boogert et al (2005) (5);

c) tikralaikę PGR, naudojant pradmenis ir zondus, pagal van Gent-Pelzer et al (2010) (6);

d) tikralaikę PGR, naudojant pradmenis ir zondus, pagal Smith et al (2014) (7).

4. Ramybės būsenos sporų gyvybingumas

Ramybės būsenos sporų gyvybingumą galima nustatyti atliekant mikroskopinę analizę arba biologinį tyrimą. Sporangių gyvybingumą galima nustatyti atliekant laktofenolyje arba vandenyje fiksuotų sporangių mikroskopinę analizę (Przetakiewicz, 2015) (8). Sporanges, kurių turinys grūdėtas arba protoplazmos masė šiek tiek suapvalėjusi, galima laikyti gyvybingomis. Ilgą laiką plazmolizuotos sporangės arba sporangės, kurių turinio nesimato, laikomos žuvusiomis.

Kaip alternatyvų tyrimą arba kilus abejonėms, galima atlikti biologinį tyrimą, kaip aprašyta IV priedo 3 punkte.

5. Patotipų nustatymas

Patotipams nustatyti reikalingos šviežios išaugos.

Tyrimui skirtas inokuliatas ruošiamas taikant vieną iš šių metodų:

a) Škotijos žemės ūkio ministerijos Mokslo ir konsultacijų skyriaus (angl. Science and Advice for Scottish Agriculture, SASA) apibrėžtą metodą, kuris apima toliau nurodytus du etapus: i) inokuliato ruošimas Senas (parudavęs) išaugos audinys susmulkinamas ir džiovinamas kambario temperatūroje, kol sukietėja. Sukietėjęs audinys sumalamas rankiniu arba mechaniniu būdu. Sumalta medžiaga sausai išsijojama, surenkant 25–75 μm dydžio frakcijas, tada ruošiamas ekstraktas taikant Pratt (1976)1 chloroformo metodą; ii) šviežių išaugų ruošimas Maždaug 10 mg išgautų ramybės būsenos sporų užbarstoma ant 10 ml sterilaus distiliuoto vandens mažoje plastikinėje Petri lėkštelėje ir inkubuojama tamsoje 20 °C temperatūroje, kol sporos pradeda dygti. Bulvių gumbai, kurių daigai yra maždaug 1–2 mm ilgio, pažymėtais daigais į viršų dedami į skaidrias plastiko dėžes, išklotas drėgnu minkštuoju popieriumi. Naudojant švirkštą, išlydytu vazelinu aplink daigus formuojamas žiedas. Vazelino žiedas yra vientisas ir pakankamai aukštas, kad iš jo neištekėtų sporų suspensija. 10 ml dygstančių ramybės būsenos sporų dar praskiedžiama steriliu vandeniu iki 20 ml ir suspensija pipete arba spaudžiamu buteliu lašinama į tuos žiedus, kol daigas visiškai panardinamas sporų suspensijoje. Plastiko dėžės uždengiamos dangčiais ir 4 paras inkubuojamos 10 °C temperatūroje, tada dėžės atidaromos, pašalinamas inokuliatas ir vazelino žiedai, o dėžės perkeliamos į dulksna drėkinamą šiltnamį, kuriame palaikoma 15–18 °C temperatūra (16 h šviesos);

b) Spiekermann & Kothoff (1924) (9) metodą;

c) Potoček et al (1991) (10) metodą;

d) Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble ir Glynne 1970 (13)) metodą.

Siekiant nustatyti visus patotipus, kurie aktualūs Sąjungai (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) ir 38(Nevşehir), atliekamas diferencinis užkrėtimo tyrimas su įvairių veislių nurodytuoju augalu, kaip nurodyta lentelėje. Užkrėtimo tyrimas atliekamas pagal d punkte nurodytą protokolą (Glynne-Lemmerzahl metodas).

Selektyvus bulvių veislių imlumas S. endobioticum patotipams nustatyti

Veislė S. endobioticum patotipai 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa / Evora / Deodara I I I I I Irga / Producent A I I I I Talent A A* A* I I Saphir A I A A I Ikar / Gawin / Karolin / Belita A A A A A „I“ – imli. „A“ – atspari. *: reiškia mažą veislės imlumą S. endobioticum (nenekrozuojantys audiniai su sorų telkiniais (angl. sorus field), bet išaugos nesusiformavusios).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: p. 21–29.

(2) van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: p. 25–31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: p. 165–174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: p. 200–201.

(5) van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: p. 47–57.

(6) van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: p. 129–133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: p. 422–432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92: p. 704–708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: p. 114–115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: p. 191–205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: p. 34–60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: p. 288–297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: p. 125–135.