Oficialusis leidinys L 259 , 18/10/1993 p. 0001 - 0025

specialusis leidimas suomių kalba: skyrius 3 tomas 53 p. 0036

specialusis leidimas švedų kalba: skyrius 3 tomas 53 p. 0036



Tarybos direktyva 93/85/EEB 1993 m. spalio 4 d. dėl bulvių žiedinio puvinio kontrolės EUROPOS BENDRIJŲ TARYBA, atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį, ypač į jos 43 straipsnį, atsižvelgdama į Komisijos pasiūlymą [1], atsižvelgdama į Europos Parlamento nuomonę [2], atsižvelgdama į Ekonomikos ir socialinių reikalų komiteto nuomonę [3], kadangi bulvių auginimas užima svarbią vietą Bendrijos žemės ūkyje; kadangi bulvių derliui grėsmę nuolat kelia kenksmingi organizmai; kadangi, apsaugant bulvių augalus nuo tokių kenksmingų organizmų, ne tik bus išlaikytas gamybinis našumas, bet ir padidės žemės ūkio produktyvumas; kadangi apsaugos priemonės, kuriomis siekiama, kad kenksmingi organizmai nepatektų į valstybės narės teritoriją, turės tiktai ribotą poveikį, jeigu tokie kenksmingi organizmai tuo patmetu ir metodiškai nebus kontroliuojami visoje Bendrijoje ir nebus užkirstas kelias jiems išplisti; kadangi vienas iš kenksmingų organizmų bulvėse yra Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp.sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., patogeninis bulvių žiedinio puvinio ligos sukėlėjas; kadangi ši liga buvo užregistruota kai kuriose Bendrijos vietose ir tam tikrų ribotų ligos židinių vis dar esama; kadangi visoje Bendrijoje išlieka gana didelis pavojus bulvių pasėliams, jeigu nebus imtasi veiksmingų priemonių aptikti šią ligą ir nustatyti jos išplitimą, užkirsti kelią jai atsirasti ir išplisti, o ją aptikus – užkirsti kelią jos plitimui ir kontroliuoti, siekiant ją išnaikinti; kadangi, to siekiant, Bendrijoje reikia imtis tam tikrų priemonių; kadangi be to, jeigu reikia, valstybės narės privalo imtis papildomų arba griežtesnių priemonių, su sąlyga, kad nebus trukdoma bulvių siuntų judėjimui Bendrijoje, išskyrus atvejus, numatytus 1976 m. gruodžio 21 d. Tarybos direktyvoje 77/93/EEB dėl apsaugos priemonių, skirtų apsisaugoti nuo augalams arba augaliniams produktams kenksmingų organizmų įvežimo į valstybes nares [4]; kadangi tokios priemonės turi būti praneštos kitoms valstybėms narėms ir Komisijai; kadangi 1980 m. birželio 24 d. Tarybos direktyvoje 80/665/EEB dėl bulvių žiedinio puvinio kontrolės [5] nustatytos būtiniausios priemonės, kurių valstybės narės turi imtis nuo bulvių žiedinio puvinio; kadangi nuo to laiko supratimas apie bulvių žiedinio puvinio ligą ir bulvių žiedinio puvinio patogeno nustatymas iš esmės pasikeitė; kadangi Bendrijos augalų sveikatos priežiūros režimo taikymas Bendrijai kaip teritorijai be vidaus sienų lėmė būtinybę dar kartą išnagrinėti ir persvarstyti kai kurias Direktyvos 80/665/EEB nuostatas; kadangi, atlikus tokį pakartotinį nagrinėjimą, nustatyta, kad Direktyvos 80/665/EEB nuostatos yra nepakankamos ir dėl to reikia tiksliau apibrėžti priemones; kadangi, esant tokiai padėčiai, Direktyva 80/665/EEB turėtų būti panaikinta ir patvirtintos reikiamos priemonės; kadangi tokiose priemonėse turi būti atsižvelgta, pirma, kad liga gali būti latentinė ir nepastebėta augančiuose pasėliuose bei sandėliuojamuose stiebagumbiuose ir todėl efektyviai jai užkirsti kelią galima tik auginant ir vartojant sėklines neužkrėstas bulves, ir, antra, kad norint aptikti ligą reikalingi sistemingi oficialūs tyrimai; kadangi patogeno išplitimas augančiuose pasėliuose nėra svarbiausias veiksnys, tačiau kadangi patogenas gali išlikti per žiemą savaime sudygusiuose bulvių augaluose, tai yra pagrindinis infekcijos šaltinis, plintantis sezonas po sezono; kadangi patogenas daugiausiai plinta bulvėms liečiantis su apkrėstomis bulvėmis bei su sodinimo, kasimo ir apdorojimo įrenginiais arba vežimo bei sandėliavimo talpyklomis, kurie buvo organizmo apkrėsti jų ankstesnio sąlyčio metu su apkrėstomis bulvėmis; kadangi tokie užkrėsti objektai po tokio užkrėtimo gali kurį laiką išlikti užkrečiančiais; kadangi patogeno plitimą galima sumažinti arba sustabdyti tokius objektus dezinfekuojant; kadangi bet koks panašus sėklinių bulvių užkrėtimas kelia didžiulį patogeno išplitimo pavojų; kadangi, valstybėms narėms nustatant tokių bendrųjų priemonių detales, taip pat ir tvirtinant griežtesnes ar papildomas priemones, skirtas apsisaugoti nuo patogeno įvežimo į jų teritoriją, pageidautina, kad valstybės narės glaudžiai bendradarbiautų su Komisija Augalų sveikatos nuolatiniame komitete (toliau Komitetas), PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ: 1 straipsnis Šia direktyva numatomos priemonės, kurių turi imtis valstybės narės nuo Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., bulvių žiedinio puvinio sukėlėjo (toliau bakterija) norint: a) ją aptikti ir nustatyti jos išplitimą; b) užkirsti kelią jai atsirasti ir išplisti ir c) aptikus ją, užkirsti kelią jai plisti ir kontroliuoti, stengiantis ją išnaikinti. 2 straipsnis 1. Valstybės narės atlieka sistemingus oficialius tyrimus, ieškant bakterijos stiebagumbiuose ir, kur tikslinga, bulvių augaluose (Solanum tuberosum L.), auginamuose jų teritorijoje, norėdamos įsitikinti, ar tokios bakterijos nėra. Šiems tyrimams, imant stiebagumbių mėginius oficialiam ar oficialiai prižiūrimam laboratoriniam tyrimui, tikrinamos sėklinės ir kitos bulvės, pageidautina iš sandėliuojamų partijų, taikant metodą bakterijai aptikti ir diagnozuoti, apibūdintą I priede. Be to, kur tikslinga, galima atlikti oficialų arba oficialiai prižiūrimą vizualinį kitų mėginių patikrinimą perpjaunant stiebagumbius. Su augalais šiuos tyrimus reikia atlikti taikant tam tikrus metodus ir mėginiai tiriami atitinkamais oficialiais arba oficialiai prižiūrimais tyrimais. Mėginių skaičių, kilmę, stratifikaciją ir jų ėmimo laiką nustato atsakingosios oficialios įstaigos, kaip apibrėžta Direktyvoje 77/93/EEB, remdamosi pagrįstais moksliniais ir statistiniais principais bei bakterijos biologija ir atsižvelgdamos į konkrečių valstybių narių bulvių auginimo tradicijas. Todėl tyrimų detalės kasmet pateikiamos kitoms valstybėms narėms ir Komisijai, norint užtikrinti panašų valstybių narių gebėjimo užtikrinti, kad bakterija neaptikta, lygį. 2. Oficialių tyrimų, numatytų 1 dalyje, rezultatai mažiausiai kartą per metus pranešami kitoms valstybėms narėms ir Komisijai. Šio pranešimo detalės yra konfidencialios. Jos gali būti pateikiamos Komitetui Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka. 3. Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka gali būti priimtos tokios nuostatos: - tyrimų, nurodytų anksčiau pateiktoje 1 dalyje, detalės nustatomos remiantis tvirtais moksliniais ir statistiniais principais, - pranešimo, nurodyto anksčiau pateiktoje 2 dalyje, detalės. 4. Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka priimamos tokios nuostatos: - reikiamas tyrimų ir patikrinimų, nurodytų anksčiau pateiktos 1 dalies trečioje pastraipoje, metodas. 3 straipsnis Valstybės narės užtikrina, kad apie įtariamą ar patvirtintą bakterijos buvimą bulvių augaluose ir stiebagumbiuose, arba nukastuose, laikomuose ar parduotuose jų teritorijoje stiebagumbiuose būtų pranešama jų pačių atsakingosioms oficialioms įstaigoms. 4 straipsnis 1. Įtariamo buvimo atvejais atsakingosios oficialios valstybės narės, kurioje apie tokius atvejus buvo informuota, įstaigos užtikrina oficialų arba oficialiai prižiūrimą laboratorinį tyrimą, taikant metodą, nustatytą I priede, ir pagal sąlygas, nurodytas II priedo 1 punkte, norint patvirtinti arba paneigti įtariamą buvimą. Pirmuoju atveju taikomi reikalavimai, nustatyti II priedo 2 punkte. 2. Laukiant, kol bus patvirtintas arba paneigtas įtariamas paplitimas pagal 1 dalį, tais atvejais, kai paplitimas įtariamas ir kai: i) įtariami diagnozuojami vizualiniai ligos simptomai pamatomi arba ii) gauti teigiami imunofluorescencinio tyrimo, kaip aprašyta I priede, arba kito tinkamo tyrimo rezultatai, atsakingosios valstybių narių institucijos: a) uždraudžia visų partijų ar siuntų, iš kurių buvo paimti mėginiai, judėjimą, išskyrus atvejus, kai tai yra jų kontroliuojama ir su sąlyga, kad buvo imtasi priemonių, jog nėra pavojaus bakterijai išplisti; b) imasi priemonių nustatyti pirminį paplitimo šaltinį; c) pagal įvertinto pavojaus lygį taiko reikiamas papildomas atsargumo priemones, siekiant užkirsti kelią bakterijai išplisti. Šioms priemonėms gali būti priskiriama oficiali visų kitų stiebagumbių arba augalų, esančių patalpose ar už patalpų ribų, kur buvo įtariama liga, judėjimo kontrolė. 3. Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka gali būti patvirtinta: - priemonės, minimos anksčiau minimos 2 dalies c punkte. 4. Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka gali būti patvirtinta: - kitas tinkamas tyrimas, nurodytas anksčiau minimos 2 dalies ii punkte. 5 straipsnis 1. Jeigu oficialiu ar oficialiai prižiūrimu laboratorijos patikrinimu, taikant metodą, nurodytą I priede, patvirtinamas bakterijos buvimas stiebagumbių, augalų ar augalų dalių mėginiuose, valstybės narės atsakingosios institucijos, atsižvelgdamos į pagrįstus mokslinius principus, bakterijos biologiją ir konkrečias gamybos, prekybos ir perdirbimo sistemas toje valstybėje narėje: a) laiko užkrėstais stiebagumbius ar augalus, siuntą ir (arba) partiją, įrenginį, transporto priemonę, laivą, sandėlį ar jo dalis ir bet kokius kitus objektus, įskaitant pakuotę, iš kur buvo paimtas mėginys ir, kur tikslinga, auginimo vietą (-as) bei lauką (-us), kur tie stiebagumbiai ar augalai buvo nukasti; b) atsižvelgdamos į III priedo 1 punkto nuostatas, nustato galimo užkrėtimo mastą per užkrėstos produkcijos sąlytį su gamybos linija iki derliaus nuėmimo arba po jo; c) remdamosi nustatytu užkrėtimu pagal a punktą, galimu užkrėtimo masto nustatymu pagal b punktą, ir galimu bakterijos išplitimu, atsižvelgiant į III priedo 2 punkto nuostatas, paženklina teritorijos ribas. 2. Pagal III priedo 3 punkto nuostatas valstybės narės nedelsdamos praneša kitoms valstybėms narėms ir Komisijai apie bet kokį užkrėtimą, nustatytą pagal 1 dalies a punktą ir teritorijos ribų paženklinimo detales pagal 1 dalies c punktą. Šio pranešimo detalės yra konfidencialios. Jas galima pateikti Komitetui Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka. 3. Po šio pranešimo pagal 2 dalį ir minėtas jos sudėtines dalis, kitos valstybės narės, išvardytos pranešime, prireikus nustato užkrėtimą, galimo užkrėtimo mastą ir paženklina teritorijos ribas atitinkamai pagal 1 dalies a, b ir c punktus. 6 straipsnis Valstybės narės nurodo, kad nustačius, jog stiebagumbiai arba augalai buvo užkrėsti pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, bulvių, kurios klonavimu susiję su užkrėstomis bulvėmis, atsargos būtų patikrintos pagal 4 straipsnio 1 dalį. Patikrinamas toks stiebagumbių ar augalų kiekis, kokio reikia pirminiam infekcijos šaltiniui ir galimo užkrėtimo mastui nustatyti, pageidautina, pagal rizikos laipsnį. Po šio patikrinimo, prireikus nustatomas užkrėtimas, galimo užkrėtimo mastas ir paženklinama užkrėsta teritorija atitinkamai pagal 5 straipsnio 1 dalies a, b ir c punktus. 7 straipsnis 1. Valstybės narės nurodo, kad stiebagumbiai ar augalai, nustatyti užkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, negali būti sodinami ir, kad atsakingosioms institucijoms kontroliuojant: - jie būtų sunaikinami arba - jie būtų šalinami kitais būdais, naudojantis oficialiai prižiūrima priemone (-ėmis) pagal IV priedo 1 punkto nuostatas, su sąlyga, kad yra užtikrinama, jog nebus didelio pavojaus bakterijai išplisti. 2. Valstybės narės nurodo, kad stiebagumbiai ar augalai, nustatyti galį būti užkrėsti pagal 5 straipsnio 1 dalies b punktą, negali būti sodinami ir, nepažeidžiant patikrinimo, minimo 6 straipsnyje dėl su klonavimu susijusių atsargų, rezultatų, kontroliuojant atsakingosioms oficialioms įstaigoms būtų atitinkamai panaudojami arba šalinami kaip nurodyta IV priedo 2 punkte, tokiu būdu, kad nekiltų rimto pavojus bakterijai išplisti. 3. Valstybės narės nurodo, kad bet koks įrenginys, transporto priemonė, laivas, sandėlis ar jo dalys ir bet kokie kiti objektai, įskaitant pakuotę, nustatyti užkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, arba nustatyti galintys būti užkrėsti pagal 5 straipsnio 1 dalies b punktą, būtų sunaikinami arba valomi ir dezinfekuojami, taikant reikiamus metodus, nurodytus IV priedo 3 punkte. Atlikus dezinfekciją, bet kurie iš šių objektų daugiau nėra laikomi užkrėstais. 4. Nepažeidžiant priemonių, įgyvendintų pagal 1, 2 ir 3 dalis, valstybės narės nurodo, kad teritorijoje, paženklintoje pagal 5 straipsnio 1 dalies c punktą, būtų įgyvendintos priemonės, kaip numatyta IV priedo 4 punkte. 8 straipsnis 1. Valstybės narės nurodo, kad sėklinės bulvės atitiktų Direktyvos 77/93/EEB reikalavimus ir būtų tiesiogiai išvestos iš gautos pagal oficialiai patvirtintą programą medžiagos, kurioje bakterija nebuvo aptikta, atlikus oficialų arba oficialiai prižiūrimą patikrinimą, taikant metodą, nustatytą I priede. Anksčiau minimas patikrinimas atliekamas: - tais atvejais, kai užkrėtimas paveikia sėklinių bulvių auginimą, pradinio klonavimo selekcijos augaluose, - kitais atvejais, pradinio klonavimo selekcijos augaluose arba tipiniuose elitinių sėklinių bulvių arba ankstesnių dauginimų mėginiuose. 2. Direktyvos 77/93/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka gali būti patvirtinama: - išsamios šio straipsnio 1 dalies antrosios pastraipos pirmosios įtraukos taikymo taisyklės, - taisyklės, skirtos tipiniams mėginiams, numatytiems šio straipsnio 1 dalies antrosios pastraipos antroje įtraukoje. 9 straipsnis Valstybės narės uždraudžia laikyti ir naudoti bakteriją. 10 straipsnis Nepažeisdamos Direktyvos 77/93/EEB nuostatų, valstybės narės gali leisti eksperimentiniais ar moksliniais tikslais ir veislių selekcijos darbui nukrypti nuo priemonių, minimų šios Direktyvos 6, 7 ir 9 straipsniuose, jei tokios nukrypti leidžiančios nuostatos nepažeidžia bakterijos kontrolės ir nekyla pavojaus bakterijai išplisti. 11 straipsnis Valstybės narės gali patvirtinti tokias papildomas arba griežtesnes priemones, kurių gali prireikti kovai su bakterija arba užkirsti kelią jai plisti, jeigu jos atitinka Direktyvos 77/93/EEB nuostatas. Papildomos priemonės, minimos pirmoje pastraipoje, gali apimti nurodymą sodinti tik tas sėklines bulves, kurios yra oficialiai sertifikuotos arba oficialiai patikrintos tam, kad atitiktų reikalaujamus augalų sveikatos standartus. Pastarieji visų pirma gali būti taikomas tada, kai ūkininkams leidžiama jų pačių ūkiuose sodinti sėklines bulves, kurias jie patys nukasė arba išaugino. Išsami informacija apie tokias priemones pateikiama kitoms valstybėms narėms ir Komisijai. 12 straipsnis Šios direktyvos priedų pakeitimai, kurie bus atlikti plėtojantis mokslinėms ir techninėms žinioms, priimami Direktyvos 77/97/EEB 16a straipsnyje nustatyta tvarka. 13 straipsnis 1. Valstybės narės priima ir paskelbia nuostatas, kurios, įsigaliojusios iki 1993 m. lapkričio 15 d., įgyvendina šią direktyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai. Valstybės narės, tvirtindamos šias nuostatas, daro jose nuorodą į šią direktyvą arba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nustato valstybės narės. Valstybės narės šias nuostatas taiko nuo 1993 m. lapkričio 16 d. 2. Valstybės narės pateikia Komisijai šios direktyvos taikymo srityje priimtų nacionalinės teisės aktų pagrindinių nuostatų tekstus. Apie tai Komisija praneša kitoms valstybėms narėms. 14 straipsnis Direktyva 80/665/EEB panaikinama nuo 1993 m. lapkričio 16 d. 15 straipsnis Ši direktyva skirta valstybėms narėms. Priimta Liuksemburge, 1993 m. spalio 4 d. Tarybos vardu Pirmininkas W. Claes [1] OL C 93, 1993 4 2, p. 12. [2] OL C 176, 1993 6 28, p. 210. [3] OL C 161, 1993 6 14, p. 18. [4] OL L 26, 1977 1 31, p. 20. Direktyva su paskutiniais pakeitimais, padarytais Komisijos direktyva 92/103/EEB (OL L 363, 1992 12 11, p. 1). [5] OL L 180, 1980 7 14, p. 30. -------------------------------------------------- I PRIEDAS BAKTERINIO ŽIEDINIO PUVINIO SUKĖLĖJO CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthof) Davis et al. NUSTATYMO IR DIAGNOZAVIMO BULVIŲ STIEBAGUMBIŲ PARTIJOSE METODIKA 1. Kūgio formos audinių gabaliukų išėmimas 1.1. Nuplaunama 200 stiebagumbių po tekančiu vandeniu ir pašalinamas epidermis, esantis apie kiekvieno stiebagumbio viršūnę, naudojant nuolat dezinfekuojamą skalpelį arba bulvių skutimo peilį; dezinfekuoti galima pamerkus peilį į 70 % etanolį ir uždegus. 1.2. Atsargiai skalpeliu arba bulvių skutimo peiliu išpjaunami kūgio formos audinio gabaliukai iš stiebagumbio viršūnės. Nevaskuliarinio audinio turi būti kiek galima mažiau. Atskirti mėginiai turi būti apdoroti per 24 valandas (žr. 3 dalį) arba laikomi –20 °C temperatūroje ne ilgiau kaip dvi savaites. 2. Vizualinė apžiūra ieškant žiedinio puvinio simptomų Atskyrus mėginius, kiekvienas stiebagumbis perpjaunamas skersai ir apžiūrima, ar nėra žiedinio puvinio simptomų. Stiebagumbis suspaudžiamas ir apžiūrima, kaip atrodo išsiskiriančios iš vaskuliarinio audinio sultys. Pirminiai simptomai yra tam tikras audinio skaidrumas arba peršviečiamumas, neminkštėjimas aplink vaskuliarinę sistemą, ypač prie viršūnės. Vaskuliarinis žiedas prie viršūnės gali būti šiek tiek tamsesnės spalvos negu paprastai. Pirmasis lengvai nustatomas simptomas – vaskuliarinis žiedas yra gelsvas, o švelniai paspaudus gumbą iš indų pradeda sunktis į sūrio konsistenciją panaši medžiaga. Šioje besisunkiančioje medžiagoje yra milijonai bakterijų. Šioje stadijoje vaskuliarinis audinys gali paruduoti. Iš pradžių šie simptomai gali būti matomi tik vienoje žiedo dalyje, nebūtinai prie viršūnės, ir palaipsniui gali išplisti visame žiede. Užkratui plintant, žūva vaskuliarinis audinys; išorinė žievės dalis gali atsiskirti nuo vidinės žievės. Vėlesnėse infekcijos stadijose stiebagumbio paviršiuje atsiranda įtrūkimų, kurių pakraščiai dažnai būna raudonai rudi. Antrinė grybinė arba bakterinė invazija gali užmaskuoti simptomus ir gali būti sunku, netgi neįmanoma, atskirti vėlyvuosius žiedinio puvinio simptomus nuo kitų stiebagumbių puvinių. 3. Mėginių paruošimas dažyti Gramo būdu, imunofluorescenciniam (IF) dažymui ir baklažano testui 3.1. Mėginiai homogenizuojami iki visiško maceravimo tirpiklyje, kuris nebūtų toksiškas Corynebacterium sepedonicum (pavyzdžiui, 0,05 M fosfatiniame buferiniame valgomosios druskos tirpale (PBS) pH 7,0) mažesnėje negu 30 °C temperatūroje; rekomenduojama taip pat įpilti netoksiško deflokulianto, taip pat gali prireikti netoksiško priešpučio (1 ir 2 priedėliai). Reikėtų vengti per ilgo maceravimo. 3.2. Bakterijos iš homogenizuoto tirpalo išskiriamos vienu iš nurodytų būdų [1]: A. a) Centrifuguojama10 minučių, esant 180 g. b) Gautas centrifugatas 10 minučių centrifuguojamas esant ne mažiau kaip 4000 g. Dekantuojama, centrifugatas išpilamas. B. a) Leidžiama maceratui pastovėti 30 minučių, kol audinių dalelės nusėda. Skystis dekantuojamas nesudrumstus nuosėdų. b) Skystis filtruojamas perliejant per filtravimo popierių (Whatman Nr. 1), įdėtą į stiklo filtrą (Nr. 2 = 40–100μm), naudojant vakuuminį vandens siurblį. Filtratas surenkamas į centrifugos vamzdį. Filtras išplaunamas steriliu PBS, kol susidarys ne daugiau kaip 35 ml filtrato. c) Filtratas centrifuguojamas 20 minučių, esant ne mažiau kaip 4000 g. 3.3. Granulė suspenduojama steriliame 0,01 M fosfato buferiniame tirpale pH 7,2 (2 priedėlis), kad visas kiekis sudarytų maždaug 1 ml. Padalijama į dvi lygias dalis, viena dalis atidedama kaip pamatinė – užšaldoma iki -20 °C [2] arba panaudojant liofilizaciją. Likusioji dalis padalijama pusiau – viena pusė IF testui ir Gramo dažymui, kita – baklažano testui. 3.4. Siekiant išvengti užkrėtimo, visi teigiami C. sepedonicus mėginiai ir bandymai turi būti tiriami atskirai. Tai taikoma IF skaidrėms ir baklažano testams. 4. Dažymas pagal Gramą 4.1. Mėginiai iš stiebagumbių (2), kuriuose matyti skaidrumas, puvimas ar koks nors kitas įtartinas simptomas, bei jų skiedinių (5.2.1) paruošiami dažyti pagal Gramą. Mėginius reikia imti nuo apkrėstų audinių pakraščių. 4.2. Iš žinomos C. sepedonicum kultūros ir, jeigu įmanoma, natūraliai apkrėsto audinio (5.1) paruošiami tepinėliai dažyti pagal Gramą. 4.3. Nustatoma, kuriuose mėginiuose yra būdingų gramteigiamų coryneform ląstelių. Paprastai C. sepedonicum ląstelės būna 0,8–1,2μm ilgio ir 0,4–0,60μm pločio. Teisinga spalvinimo tvarka yra pateikiama 3 priedėlyje. Natūralios infekcijos arba neseniai išskirtų kultūrų preparatuose dažnai vyrauja kokinės ląstelių grandinės, kurios paprastai yra šiek tiek mažesnės, negu ląstelės iš kitų agaro kultūrų. Daugumoje kultūrų terpių C. sepedonicum ląstelės būna pleomorfinės coryneform lazdelės ir gali nulemti skirtingą Gramo reakciją. Ląstelės yra pavienės, poromis su būdingomis "alkūnėmis", tipiškomis lenkiamajam dalijimuisi, o kartais netaisyklingomis grupėmis, dažnai vadinamomis tvorelėmis arba kinų hieroglifais. 5. IF tyrimo schema 5.1. Naudojamas antiserumas C. sepedonicum padermei – ATCC 33113 (NCPPB 2137), arba NCPPB 2140. Jis turi turėti IF titrą, didesnį kaip 1:600. Atliekamas vienas kontrolinės skaidrės PBS tyrimas, norint nustatyti, ar fluoresceino izotiocianato anti-rabbit imunoglobulininis junginys (FITC) nesijunia su bakterijų ląstelėmis. Corynebacterium sepedonicum (ATCC 33113 (NCPPB 2137), NCPPB 2140) reikia atlikti kontrolinį homologinį antigeno tyrimą naudojant atskirą skaidrę. Natūraliai užkrėstas audinys (palaikomas liofilizacijos būdu arba užšaldytas iki -20 °C) turi būti naudojamas, kai įmanoma, kaip panašus kontrolinis tos pačios skaidrės tyrimas (2 pav.). 5.2. Darbo eiga 5.2.1. Galutinė granulė nuosekliai 3 kartus dešimteriopai (101, 102, 103) praskiedžiama distiliuotame vandenyje (1 pav.). 5.2.2. Pipete užlašinamas išmatuoto standartinio kiekvienos granulės tirpalo arba C. sepedonicum suspensijos (maždaug 106 ląsteles/ml) kiekis, kurio pakanka uždengti langelį (maždaug 25 μl) į daugiataškės skaidrės langelius kaip parodyta 1 pav. +++++ TIFF +++++ +++++ TIFF +++++ 5.2.4. Atitinkami langeliai padengiami C. sepedonicum antiserumu rekomenduojamais skiediniais, 0,01 M PBS pH 7,2 (2 priedėlis) kaip parodyta 1 paveikslėlyje. (Naudojamas PBS FITC kontrolei.) Darbinis serumo skiedinys turi sudaryti maždaug pusę IF titro. Jeigu norima naudoti kitus antiserumo skiedinius, reikia paruošti atskiras skaidres kiekvienam naudojamam skiediniui. 5.2.5. Inkubuojama drėgnoje kameroje aplinkos temperatūroje 30 minučių. 5.2.6. Gerai praskalaujama 0,01 M PBS pH 7,2. Plaunama penkias minutes tris kartus vis nauju kiekiu 0,01 M PBS pH 7,2. 5.2.7. Kruopščiai pašalinamas drėgmės perteklius. 5.2.8. Kiekvienas langelis padengiamas FITC junginiu tame pačiame skiedinyje, naudojamame nustatyti titrą ir inkubuojama 30 minučių tamsioje drėgnoje kameroje aplinkos temperatūroje. 5.2.9. Praskalaujama ir išplaunama kaip anksčiau. 5.2.10. Į kiekvieną langelį įlašinama maždaug 5–10 μl 0,1 M fosfatų buferuoto glicerino pH 7,6 (arba panašaus tirpalo, kurio pH ne mažesnis kaip 7,6) ir uždengiama dengiamuoju stiklu (2 priedėlis). 5.2.11. Apžiūrima mikroskopu su epifluorescenciniu šviesos šaltiniu ir filtrais, tinkamais darbui su FITC. Tinkamas didinimas yra 400–1000 kartų. Replikuoti langeliai Nuskaitomi dviem diametrais stačiais kampais ir aplink langelio perimetrus. Ieškoma fluorescuojančių ląstelių teigiamuose kontroliniuose mėginiuose ir nustatomas titras. Ieškoma fluorescuojančių ląstelių FITC/PBS kontroliniame langelyje ir, jeigu ten jų nėra, pereinama prie tiriamųjų langelių. Mažiausiai dešimtyje mikroskopo laukų nustatomas vidutinis morfologiškai tipiškų fluorescuojančių ląstelių skaičius viename lauke ir apskaičiuojamas jų skaičius vienam ml nepraskiestos granulės (4 priedėlis). Yra keletas problemų, būdingų imunofluorescenciniam tyrimui. - Bulvių granulėse gali atsirasti foninių fluorescuojančių ląstelių populiacijų, turinčių netipišką morfologiją, ir susikryžminančių saprofitinių bakterijų, kurių dydis ir morfologija yra panašūs į Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Atkreipiamas dėmesys tik į tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles. Dėl sukryžminimo reakcijos galimybės mėginius, kurių imunofluorescencinis tyrimas yra teigiamas, reikia dar kartą ištirti, naudojant kitą antiserumą. - Šio metodo techninė aptikimo riba yra nuo 103 iki 104 ląstelių vienam ml nepraskiestos granulės. Mėginiai su IF tipiškais ląstelių skaičiais, esant aptikimo ribai, paprastai yra neigiami C. m. ssp. sepedonicus, tačiau juos galima ištirti baklažano testu. Neigiamas imunofluorescencinis tyrimas yra nustatomas bet kuriam mėginiui, kuriame neaptiktos morfologiškai tipiškos fluorescuojančios ląstelės. Mėginiai laikomi neužkrėsti Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Baklažano testo atlikti nereikia. Teigiamas imunofluorescencinis tyrimas yra nustatomas bet kuriam mėginiui, kuriame aptiktos morfologiškai tipiškos fluorescuojančios ląstelės. Mėginiai, kuriems nustatomas teigiamas imunofluorescencinis tyrimas, naudojant abu antiserumus, laikomi potencialiai užkrėsti Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Baklažano testą reikia atlikti visiems mėginiams, kurie laikomi potencialiai užkrėsti. 6. Baklažano testas Išsamiau apie kultūras, žiūrėkite 5 priedėlį. 6.1. Granulė padalijama, kaip aprašyta 3.3 punkte, mažiausiai 25 baklažanams, kai yra trečio lapelio stadija (5 priedėlis), taikant vieną toliau pateiktų metodų (6.2, 6.3 arba 6.4). 6.2. Inokuliavimas į įpjovą (I) 6.2.1. Kiekvienas vazonėlis pastatomas horizontaliai (išplėsto polistirolo blokas, iš kurio vieno paviršiaus pašalintas 5 cm gylio, 10 cm pločio ir 15 cm ilgio gabalas (3 pav.) atitinka 10 cm vazonėlį (3 pav.). Kiekvienam tiriamam mėginiui tarp stiebo ir bloko turi būti įstatyta sterilaus aliuminio folijos juostelė. Augalą galima prilaikyti gumine juosta apjuosus bloką. 6.2.2. Skalpeliu padaroma išilginė arba šiek tiek įstriža 0,5–1,0 cm ilgio ir maždaug trijų ketvirčių stiebo skersmens gylio įpjova tarp sėklaskilčių ir pirmojo lapelio. 6.2.3. Įpjova praplečiama skalpelio geležtės smaigaliu, nuo granulės inokuliantas imamas ir tepamas kosmetiniu pieštuku arba plonu dailininko teptuku. Likusi granulė paskirstoma ant visų baklažanų. 6.2.4. Naudojant 2 ml švirkštą, įpjova užtepama steriliu vazelinu. +++++ TIFF +++++ 6.3. Inokuliavimas į įpjovą (II) 6.3.1. Laikant augalą tarp dviejų pirštų, granulės suspensijos lašas (maždaug 5–10 μl) pipete užlašinamas ant stiebo tarp sėklaskilčių ir pirmojo lapelio. 6.3.2. Steriliu skalpeliu padaroma išilginė (maždaug 5° kampu) 1,0 cm ilgio ir maždaug 2/3 stiebo storio gylio įpjova, pradedant įpjovą nuo granulės suspensijos lašo. 6.3.3. Naudojantis švirkštu įpjova užtepama steriliu vazelinu. 6.4. Inokuliavimas švirkštu 6.4.1. Nelaistyti baklažanų vieną dieną prieš inokuliaciją, kad būtų sumažintas turgoro spaudimas. 6.4.2. Baklažanų augalai inokuliuojami tiesiai virš sėklaskilčių švirkštu su poodine adata (ne mažesne kaip 23G). Granulė paskirstoma baklažanams. 6.5. Žinoma C. sepedonicum kultūra ir, kur įmanoma, natūraliai užkrėstas stiebagumbių audinys (5.1) įterpiamas į 25 augalus, taikant tą patį inokuliacijos metodą (6.2, 6.3 arba 6.4). 6.6. Sterilus 0,05 M PBS įterpiamas į 25 augalus, taikant tą patį inokuliacijos metodą (6.2, 6.3 arba 6.4). 6.7. Augalai tinkamomis sąlygomis (5 priedėlis) inkubuojami 40 dienų. Kas aštuonias dienas reguliariai tikrinama, ar neišryškės simptomų. Suskaičiuojamas augalų, kuriuose atsirado simptomų, skaičius. C. sepedonicum baklažanams sukelia lapų vytimą – iš pradžių kraštuose ir tarp gyslų. Suvytęs audinys iš pradžių gali būti tamsiai žalias arba margas, tačiau prieš nekrozuodamas pašviesėja. Vytimo vietos tarp gyslų dažnai atrodo tarsi būtų šlapios riebaus skysčio dėmės. Nekrotinio audinio pakraščiai dažnai būna ryškiai geltoni. Augalai nebūtinai žūva; kuo ilgesnis laikotarpis iki pasirodant pirmiesiems simptomams, tuo didesnė galimybė, kad augalas išgyvens. Augalai gali įveikti infekciją. Jauni baklažanų augalai daug jautresni mažoms C. sepedonicum populiacijoms negu vyresni augalai, todėl reikia naudoti augalus, kai yra trečio lapelio stadija arba prieš pat ją. Vytimą taip pat gali sukelti kitų bakterijų arba grybų populiacijos stiebagumbio audinio granulėje. Tai gali būti Erwinia carotovora subsp. carotovora ir E. carotovora subsp. atroseptica, Phoma exigua var. foveata, o taip pat ir didelės saprofitinių bakterijų populiacijos. Tokį apvytimą galima atskirti nuo C. sepedonicum sukelto vytimo, kadangi visi lapai arba visi augalai greitai vysta. 6.8. Paruošiami Gramo mėginiai (4) visoms baklažanų, kuriuose atsirado simptomų, partijoms, panaudojant suvytusių lapų audinių ir stiebų audinių dalis ir išskiriami tinkamoje maistinių medžiagų terpėje (7). Baklažanų lapų ir stiebų paviršius dezinfekuojamas, nušluostant 70 % etanoliu. 6.9. Esant tam tikroms aplinkybėms, ypač kai augimo sąlygos nėra pačios geriausios, gali būti, kad C. sepedonicum įgis latentinės infekcijos formą baklažanuose net po 40 dienų inkubacijos. Dėl tokios infekcijos inokuliuoti augalai gali nustoti augti ir prarasti energiją. Jeigu IF testas laikomas teigiamu, galima nuspręsti tirti toliau. Todėl labai svarbu palyginti visų tiriamų baklažanų augalų augimo tempus sterilaus 0,05 M PBS kontroline inokuliacija ir stebėti šiltnamio aplinkos sąlygas. Tolesnio tyrimo rekomendacijos yra tokios: 6.9.1. Stiebai virš inokuliuotos vietos nupjaunami, lapai pašalinami. 6.9.2. Stiebai maceruojami 0,05 M PBS pH 7,0, kaip aprašyta 3.1–3.2 punktuose. 6.9.3. Dažyti Gramo būdu (4) ir IF testui (5) panaudojama pusė granulės. 6.9.4. Likusi pusė panaudojama kitam baklažano testui (6), jeigu dažymo Gramo būdu ir (arba) IF testai teigiami. Panaudojama žinoma C. sepedonicum kultūra ir sterili 0,05 M PBS kontrolė. Jeigu kitame teste simptomai nepastebimi, mėginys turi būti laikomas neigiamu. 7. C. sepedonicum išskyrimas Diagnozę galima patvirtinti tiktai tada, jeigu C. sepedonicum yra išskiriama ir nustatoma (8). Nors C. sepedonicum yra sudėtinga bakterija, ją galima išskirti nuo simptominio audinio. Nepaisant to, ją gali užgožti greitai augančios saprofitinės bakterijos ir todėl išskyrimas tiesiai nuo stiebagumbio audinio granulės (3.3.) nerekomenduojamas. Baklažanai yra puiki selektyvi mitybinė terpė C. sepedonicum augti ir taip pat su jais galima puikiai atlikti patvirtinamąjį (bakterijos) šeimininko testą. Išskirti reikia nuo visų, turinčių būdingus simptomus, bulvių stiebagumbių ir baklažanų (4, 6). Kai reikia, atliekamas baklažanų stiebų maceravimas, kaip nurodyta 3 ir 6.9 punktuose. 7.1. Suspensijos sėjamos ant vienos iš išvardytų terpių: (formulės pateiktos 6 priedėlyje: maistingo dekstrozės agaro (tik subkultūrai), mielių peptono gliukozės agaro, maistinio mielių dekstrozės agaro, mielių ekstrakto mineralinių druskų agaro. Inkubuojama 21 °C temperatūroje iki 20 dienų. C. sepedonicum auga lėtai, paprastai išauga į segtuko smaigalio, kremines, skliautines kolonijas per 10 dienų. Dar kartą sėjama, stengiantis gauti gryną kultūrą. Subkultūroje augimo tempai spartesni. Tipiškos kolonijos būna kreminės baltos arba dramblio kaulo spalvos, apskritos, lygios, iškilios, išgaubtos skliautinės, gleivių skystumo, lygiais kraštais ir paprastai 1–3 mm skersmens. Identifikavimas Iš sveikų arba užkrėstų bulvių ir baklažanų galima išskirti daugelį gramteigiamų coryneform bakterijų, kurių kolonijiniai tipai panašūs į C. sepedonicum. Todėl C. sepedonicum reikia nustatyti tokiais testais: IF testas (5.1), baklažano testas, maistinių medžiagų ir fiziologiniai testai (7 priedėlis), - oksidacijos/fermentacijos testas (O/F), - oksidazės testas, - augimas 37 °C temperatūroje, - ureazės gamyba, - eskulino hidrolizė, - krakmolo hidrolizė, - pakantumas 7 % natrio chlorido tirpalui, - indolo testas, - katalazės testas, - H2S gamyba, - citrato įsisavinimas, - želatinos hidrolizė, - rūgštis iš: glicerino, laktozės, ramnozės ir salicino, - dažymas pagal Gramą. Visi testai apima žinomą C. sepedonicum kontrolę. Maistinių medžiagų ir fiziologinius testus reikia atlikti naudojantis inokuliantais iš maistinių agaro subkultūrų. Morfologinius palyginimus reikia atlikti iš maistinių dekstrozės agaro kultūrų. IF testui ląstelių populiacijos turi būti sureguliuotos iki 106 ląstelių/ml. IF titras turi būti panašus į žinomą C. sepedonicum kultūrą. Baklažano testui ląstelių populiacijos turi būti sureguliuotos iki 107 ląstelių/ml. Baklažano testus reikia atlikti su 10 augalų kiekvienam iš testuojamų organizmų vėl naudojant žinomą C. sepedonicum kultūrą ir sterilaus vandens kontrolę; su grynomis kultūromis paprastai turi nuvysti per 20 dienų, tačiau augalai, kuriuose simptomų neaptinkama praėjus šiam laikui, turi būti inkubuojami iš viso 30 dienų temperatūroje, sudarančioje sąlygas baklažanams augti, tačiau neviršijančioje 30 °C (5 priedėlis). Jeigu po 30 dienų simptomų nėra, negali būti patvirtinta, kad kultūra yra patogeninė Corynebacterium sepedonicum forma. Bandymas | C. sepedonicum | O/F | inertiška arba silpnai oksidacinė | Oksidazė | – | Katalazė | + | Nitratų redukcija | – | Ureazės veikla | – | H2S gamyba | – | Indolo gamyba | – | Citrato įsisavinimas | – | Krakmolo hidrolizė | –arba silpna | Augimas esant 37° | – | Augimas 7 % NaCl | – | Želatinos hidrolizė | – | Eskulino hidrolizė | + | Rūgštis iš: | | –Glicerolio | – | –Laktozės | –arba silpna | –Ramnozės | – | –Salicino | – | [1] Alternatyvų išskyrimo metodą 1984 m. pateikė Dinesen. [2] Įrodyta (Jane ir Van Vaerenberg, 1987), kad šaldant mažėja Corynebacterium sepedonicum gyvybingumas. Kad to neatsitiktų, granulė laikoma 10 % glicerolio tirpale. -------------------------------------------------- II PRIEDAS 1. Kiekvienu įtariamu atveju, kai buvo užfiksuotas teigiamas imunofluorescencinis testas, taikomas metodas, nurodytas I priede ir laukiama patvirtinimo arba paneigimo, užbaigus minėtą tyrimą, reikia atskirti ir tinkamai užkonservuoti: - visus tirtus stiebagumbius ir augalus, jeigu įmanoma, ir - visus likusius ekstraktus ir papildomai paruoštas imunofluorescencines skaidres, kol tyrimas minimu metodu bus baigtas. 2. Jeigu bakterijos buvimas patvirtinamas, reikia atskirti ir tinkamai užkonservuoti: - visą medžiagą, minėtą 1 dalyje, ir - užkrėstos baklažanų medžiagos mėginį, kuris buvo inokuliuotas stiebagumbio arba augalo ekstraktu, ir - išskirtą bakterijos kultūrą, trumpiausiai vieną mėnesį po pranešimo procedūros pagal 5 straipsnio 2 dalį. -------------------------------------------------- III PRIEDAS 1. Nustatant galimo užkrėtimo mastą pagal 5 straipsnio 1 dalies b punktą, reikia atsižvelgti į: - stiebagumbius ir augalus, auginamus vietoje, kuri nustatyta užkrėsta pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, - auginimo vietą (-as) arba patalpas, kuriose yra gamybos grandis, susijusi su stiebagumbiais ir augalais, kuri nustatyta užkrėsta pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, įskaitant tas, kur dalijamasi gamybos įranga ir priemonėmis tiesiogiai ar per tą patį rangovą, - stiebagumbius arba augalus, auginamus auginimo vietoje (-se), kuri (-os) minima (-os) ankstesnėje įtraukoje, arba esančius tokioje (-se) auginimo vietoje (-se), laikotarpiu, kai stiebagumbiai ir augalai, nustatyti apkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, buvo auginimo vietose arba gamybiniuose pastatuose, kaip minima pirmojoje įtraukoje, - centrinius sandėlius, kuriuose laikomos bulvės iš anksčiau minėtų auginimo vietų, - bet kokią techniką, transporto priemonę, laivą, saugyklą arba jo dalis ir kitus objektus, įskaitant pakuotę, kurie galėjo turėti sąlytį su stiebagumbiais arba augalais, nustatytais apkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą per praėjusį 12 mėnesių laikotarpį arba kur taikytina, - bet kokius stiebagumbius arba augalus, laikomus arba turėjusius sąlytį su bet kokiomis struktūromis ar objektais, minėtais ankstesniojoje įtraukoje, iki tokių struktūrų ar objektų dezinfekavimo, ir - taip pat, atlikus tyrimą pagal 6 straipsnį, stiebagumbius arba augalus, kurių klonavimo kilmė tokia pati kaip ir stiebagumbių arba augalų, nustatytų apkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą ir kurių užkrėtimo galimybę nurodo atlikti tyrimai. 2. Nustatant galimą išplitimą pagal 5 straipsnio 1 dalies c punktą pat reikia atsižvelgti į: - tai, ar arti yra kitos vietos, kuriose auginamos bulvės arba kitos perdirbimo įmonės, - sėklinių bulvių kilmę. 3. Informavimo smulkmenoms, minimoms 5 straipsnio 2 dalies pirmojoje pastraipoje, priskiriama: - kiekvienai bulvių siuntai ar partijai, kuri laikoma užkrėsta – pažymėjimai, nurodyti Direktyvos 77/93/EEB 7 ir 8 straipsniuose, pasas ar registracijos numeris, kaip priimta, - sėklinių bulvių atsargų veislių pavadinimai ir, jeigu įmanoma, visi kiti atvejai, - nustatyto užkrėtimo objektų apibūdinimas ir teritorijų ribų paženklinimas, - galimybė gauti ekstraktą, paruoštas imunofluorescencines skaidres, apkrėstą baklažanų medžiagą ir išskirtą bakterijos kultūrą iš testo, kurio metu nustatytas ir patvirtintas bakterijos buvimas. -------------------------------------------------- IV PRIEDAS 1. Oficialiai prižiūrimos priemonės, minimos 7 straipsnio 1 dalyje, stiebagumbiams ar augalams, kurie nustatyti apkrėstais remiantis 5 straipsnio 1 dalies a punktu, sunaikinti, yra tokios: - panaudojimas pramoniniam perdirbimui tiesiai ir skubiai pristatant į perdirbimo cechą, kuriame yra atliekų sunaikinimo įrenginiai, nustačius, kad nėra bakterijos išplitimo pavojaus ir kur yra sandėliavimo zonų bei išvykstančių transporto priemonių dezinfekavimo sistema, arba - kitos priemonės, jeigu užtikrinama, kad nėra bakterijos išplitimo pavojaus; apie tokias priemones turi būti pranešta Komisijai ir kitoms valstybėms narėms. 2. Tinkamas stiebagumbių arba augalų, kurie nustatyti galimai apkrėstais remiantis 5 straipsnio 1 dalies b punktu, kaip minėta 7 straipsnio 2 dalyje, panaudojimas arba sunaikinimas, kontroliuojant atsakingosioms oficialioms valstybių narių įstaigoms, yra: - jų naudojimas kaip prekinių, žmonėms vartoti skirtų bulvių, supakuotų tiesioginiam pristatymui ir naudojimui neperpakuojant ir skirtų tiesiogiai pristatyti ir suvartoti, - jų naudojimas kaip prekinių, pramoniniam perdirbimui skirtų bulvių ir skirtų tiesiogiai ir neatidėliotinai pristatyti į perdirbimo įmonę, kurioje yra tinkami atliekų šalinimo ir dezinfekavimo įrenginiai, arba - kitas tinkamas panaudojimas ar sunaikinimas, nustačius, kad nėra bakterijos išplitimo pavojaus. 3. Tinkamais objektų, minimų 7 straipsnio 3 dalyje, valymo ir dezinfekavimo metodais laikomi tie, kurie nekelia bakterijos išplitimo pavojaus ir taikomi prižiūrint atsakingoms oficialioms valstybių narių įstaigoms. 4. Priemones, kurias valstybės narės įgyvendina pažymėtoje teritorijoje, nustatytoje pagal 5 straipsnio 1 dalies c punktą ir minimoje 7 straipsnio 4 dalyje, sudaro: 4.1. Auginimo vietose, kurios laikomos užkrėstomis, remiantis 5 straipsnio 1 dalies a punktu: a) lauke, kuris laikomas užkrėstu pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, arba i) - mažiausiai trejus auginimo metus, einančius po tų, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas, - Imamasi priemonių, stengiantis išnaikinti savaime augančius bulvių augalus ir kitus natūraliai aptiktus bakterijos šeimininkus, ir - jokie stiebagumbiai, augalai, sėklos ar kiti natūraliai aptikti bakterijos šeimininkai ar kiti augalai, keliantys bakterijos išlikimo ar išplitimo pavojų, negali būti sodinami, kol lauke bus aptinkami savaime augantys bulvių augalai mažiausiai dvejus auginimo metus paeiliui, - pirmąjį bulvių auginimo sezoną, einantį po ankstesnėje įtraukoje apibūdinto laikotarpio, oficialiai sertifikuotos sėklinės bulvės sodinamos tiktai prekybai, be to, atliekamas oficialus tyrimas, kaip apibūdinta 2 straipsnio 1 dalyje, - bulvių auginimo sezoną, einantį po ankstesnėje įtraukoje minimo sezono ir pasibaigus atitinkamam sėjomainos ciklui, oficialiai sertifikuotos sėklinės bulvės sodinamos sėkloms arba prekybai, taip pat atliekamas oficialus tyrimas, kaip apibūdinta 2 straipsnio 1 dalyje, arba ii) - ketverius auginimo metus po tų, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas, - imamasi priemonių, stengiantis išnaikinti savaime sudygstančius bulvių augalus ir kitus natūraliai aptiktus bakterijos šeimininkus, ir - laukas paliekamas pūdymui arba daugiametei ganyklai, kuri dažnai visiškai nupjaunama arba intensyviai ganoma, - pirmąjį bulvių auginimo sezoną, einantį po ankstesnėje įtraukoje apibūdinto laikotarpio, oficialiai sertifikuotos sėklinės bulvės sodinamos sėklai arba prekybai, be to, atliekamas oficialus tyrimas, kaip apibūdinta 2 straipsnio 1 dalyje; b) kituose laukuose: - auginimo metais, einančiais po tų metų, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas: - jokie stiebagumbiai, augalai, tikrosios sėklos ar kiti natūraliai aptikti bakterijos šeimininkai negali būti sodinami ir imamasi priemonių, stengiantis išnaikinti savaime augančius bulvių augalus, kaip tinkama, arba - oficialiai sertifikuotos sėklinės bulvės gali būti sodinamos tiktai prekybai, su sąlyga, kad atsakingosioms oficialioms įstaigoms įrodoma, kad savaime sudygstančių bulvių augalų ir kitų natūraliai aptiktų bakterijos šeimininkų pavojus pašalintas, - mažiausiai dvejus auginimo metus po tų, kurie apibūdinti ankstesnėje įtraukoje, tiktai oficialiai sertifikuotos sėklinės bulvės sodinamos sėklai arba prekybai, - kiekvienais auginimo metais, minėtais ankstesnėse įtraukose, imamasi priemonių, stengiantis išnaikinti savaime sudygstančius bulvių augalus ir kitus natūraliai aptiktus bakterijos šeimininkus, be to, atliekamas oficialus tyrimas, kaip apibūdinta 2 straipsnio 1 dalyje, - tais atvejais, jei oficialiai sertifikuotos sėklinės bulvės sodinamos prekybai, augimo metais, einančiais po tų, kuriais buvo aptiktas užkrėtimas, augančios bulvės tikrinamos nustatytais laiko tarpais, o savaime sudygstantys bulvių augalai tikrinami, ar jie neužkrėsti bakterija; c) nustačius užkrėtimą pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą ir kiekvienais po to einančiais auginimo metais įskaitant pirmąjį leistiną bulvių derliaus sezoną, lauke (-uose), kuris (-ie) buvo nustatytas (-i) užkrėstu (-ais), kaip apibūdinta a punkte, visi mechanizmai ir sandėliavimo įranga auginimo vietoje ir susijusi su bulvių produkcija, yra tinkamai valoma ir dezinfekuojama atitinkamais metodais, kaip nurodyta 3 dalyje; d) tose gamybos sistemose, kur galima visiškai pakeisti auginimo terpę, - jokie stiebagumbiai, augalai ar tikrosios sėklos nesodinami, kol gamybos įmonėje nebus imtasi oficialiai prižiūrimų priemonių, skirtų išnaikinti bakteriją ir pašalinti visą bulvių ar kitą bulvinių šeimos medžiagą, tarp jų bent jau visiškai pakeisti auginamąją terpę, išvalyti ir dezinfekuoti gamybos įmonę bei visą įrangą ir paskui iš atsakingųjų oficialių įstaigų gauti leidimą bulvių produkcijai, ir - bulvės auginamos iš oficialiai sertifikuotų sėklinių bulvių arba iš mikrogumbų ar augalų, gautų pradinio dauginimo būdu. 4.2. Pažymėtoje teritorijoje, nepažeisdamos priemonių, apibūdintų 4.1 dalyje, valstybės narės: a) nedelsdamos ir mažiausiai tris auginimo sezonus po nustatyto užkrėtimo: - užtikrina, kad jų atsakingosios oficialios įstaigos prižiūrėtų vietas ir patalpas, kur auginami, laikomi ir apdorojami bulvių stiebagumbiai, taip pat patalpas, kur bulvių apdorojimo mašinomis dirbama pagal sutartį, - reikalauja tokiose vietose esančias mašinas ir sandėlius valyti ir dezinfekuoti, kaip nustatyta ir taikant atitinkamus metodus, kaip nurodyta 3 dalyje, - reikalauja sodinti tik sertifikuotą sėklą auginant visas bulves toje teritorijoje, - reikalauja, kad būtų atskirai apdorojamas nukastų bulvių derlius ir tos bulvės, kurios buvo laikomos visuose toje teritorijoje esančiuose sandėliuose, - atlieka oficialų tyrimą, kaip nustatyta 2 straipsnio 1 dalyje; b) prireikus sudaro visų sėklinių bulvių atsargų pakeitimo programą per reikiamą laikotarpį. Apie priemones, įgyvendintas pagal 4.2 dalį, taip pat augintojų, bendrų saugyklų ir paskirstymo centrų pažymėtoje teritorijoje registracijos numerius, kasmet pranešti kitoms valstybėms narėms ir Komisijai. --------------------------------------------------