II PRIEDAS

RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOZAVIMO, APTIKIMO IR IDENTIFIKAVIMO PLANAS

TYRIMŲ PLANO TAIKYMO SRITIS

Pateiktame plane apibūdinamos įvairios procedūros, atliekamos:

i) diagnozuojant bulvių stiebagumbių rudąjį puvinį ir bulvių, pomidorų bei kitų augalų šeimininkų bakterinį vytulį;

ii) aptinkant Ralstonia solanacearum bulvių stiebagumbių, bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų bandiniuose, vandenyje ir dirvožemyje;

iii) identifikuojant Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

TURINYS

Puslapis Bendrieji principai 40 I SKIRSNIS. Tyrimų plano taikymas 40 1. Nustatymo, kuriuo siekiama diagnozuoti R. solanacearum sukeliamą bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų, turinčių rudojo puvinio ir bakterinio vytulio simptomų, rudąjį puvinį ir bakterinį vytulį, planas 40 2. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo besimptomių bulvių stiebagumbių bandiniuose planas 43 3. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo besimptomėse bulvėse, pomidoruose ar kituose augaluose šeimininkuose planas 46 II SKIRSNIS. R. solanacearum aptikimo bulvių stiebagumbiuose ir bulvių, pomidorų ar kitų augalų šeimininkų, turinčių rudojo puvinio ar bakterinio vytulio simptomų, išsamūs metodai 48 1. Simptomai 48 2. Greitosios atrankos testai 48 3. Išskyrimas 49 4. R. solanacearum identifikavimo testai 49 III SKIRSNIS. 1. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo besimptominių bulvių stiebagumbių bandiniuose išsamūs metodai 49 1.1. Bandinio paruošimas 51 1.2. Tyrimas 51 2. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo besimptominių bulvių, pomidorų ar kitų augalų bandiniuose išsamūs metodai 51 2.1. Bandinio paruošimas 52 2.2. Tyrimas 53 IV SKIRSNIS. 1. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo vandenyje planas 55 2. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo vandenyje metodai 55 2.1. Bandinio paruošimas 55 2.2. Tyrimas 56 V SKIRSNIS. 1. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo dirvožemyje planas 58 2. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo dirvožemyje metodai 58 2.1. Bandinio paruošimas 58 2.2. Tyrimas 58 VI SKIRSNIS. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo optimizuotos metodikos 58 A. Diagnostiniai ir aptikimo testai 58 1. Stiebo apytakinio audinio gleivių siūlų susidarymo testas 58 2. Polibetahidroksibutirato granulių aptikimas 58 3. Serologinės agliutinacijos testas 59 4. Selektyvus išskyrimas 60 4.1. Selektyvus pasėjimas ir auginimas terpėje lėkštelėse 60 4.2. Terpės praturtinimas 60 5. Imunofluorescencinis testas (IF) 61 6. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) 64 6.1. DNR išskyrimo ir gryninimo metodai 65 a) Pastrik (2000) metodas 65 b) Kiti metodai 65 6.2. PGR 66 6.3. PGR produkto analizė 66 7. Fluorescencinė hibridizacija in situ (FISH testas) 67 8. Tyrimai imunofermentinės analizės metodu (ELISA testas) 69 a) Netiesioginė ELISA analizė 69 b) Dviejų antikūnų sluoksnių netiesioginė imunofermentinė analizė (DASI ELISA) 70 9. Biotestas 71 B. Identifikavimo testai 72 1. Mitybiniai ir fermentiniai identifikavimo testai 72 2. IF testas 72 3. Imunofermentinė analizė (ELISA testas) 73 4. Polimerazės grandininė reakcija (PGR testas) 73 5. Fluorescencinė hibridizacija in situ (FISH testas) 73 6. Riebiųjų rūgščių tipo nustatymas 73 7. Štamo nustatymo metodai 73 7.1. Biovarieteto nustatymas 73 7.2. Genominis „pirštų antspaudų“ metodas 74 7.3. PGR metodai 74 C. Patvirtinimo testas 74 1 priedėlis Metodikas optimizuojančios ir patvirtinančios laboratorijos 76 2 priedėlis R. solanacearum išskyrimo ir kultūrų auginimo terpė 77 3 priedėlis A) Parduodama standartizuota kontrolinė medžiaga 79 B) Kontrolinių medžiagų paruošimas 80 4 priedėlis Tyrimams skirti buferiniai tirpalai 82 5 priedėlis Užkrėtimo masto nustatymas IF ir FISH testais 85 6 priedėlis Patvirtintos PGR metodikos ir reagentai 86 7 priedėlis Patvirtinti FISH reagentai 91 8 priedėlis Pomidorų ir baklažanų auginimo sąlygos 93 Nuorodos 94

BENDRIEJI PRINCIPAI

Įvairios optimizuotos metodikos, patvirtinti reagentai ir duomenys apie pasiruošimą testui bei kontrolines medžiagas pateikiami priedėliuose. Laboratorijų, dalyvavusių optimizuojant ir tvirtinant darbo taisykles, sąrašas pateikiamas 1 priedėlyje.

Kadangi metodikose numatytas karantino sąlygomis esančio organizmo aptikimas ir gyvybingos R. solanacearum kultūros bus naudojama kaip kontrolinė medžiaga, procedūras reikės atlikti karantino sąlygomis, naudojantis atitinkamais atliekų pašalinimo įrenginiais ir sąlygomis, kurias licencijavo oficialios augalų karantino institucijos.

Testavimo parametrai privalo užtikrinti nuolatinį ir atkartojamą R. solanacearum nustatymo lygmenį esant nustatytoms pasirinktų metodų nustatymo jautrumo slenkstinėms riboms.

Privaloma tiksliai paruošti teigiamas kontrolines medžiagas.

Atliekant testą, atsižvelgus į reikalaujamas metodo jautrumo slenkstines ribas taip pat padaroma prielaida, kad reikia pasirinkti teisingus nustatymus, atlikti įrangos kalibravimą ir techninę priežiūrą, rūpestingai tvarkyti ir saugoti reagentus ir imtis visų priemonių, kad būtų išvengta kryžminės taršos tarp bandinių, t. y. teigiamus kontrolinius bandinius atskiriant nuo tiriamųjų bandinių. Siekiant išvengti administracinių ir kitokių klaidų, ypač susijusių su ženklinimu etiketėmis ir dokumentų tvarkymu, privaloma taikyti kokybės kontrolės standartus.

Įtarus organizmo buvimą, kaip nurodyta Direktyvos 98/57/EB 4 straipsnio 2 dalyje, daroma prielaida, kad atliekant bandinio diagnostinį arba atrankos testą gaunamas teigiamas rezultatas, kaip nurodyta vaizduojamose diagramose. Jei pirmojo atrankos testo (IF arba PGR/FISH) rezultatas teigiamas, jį privaloma patikrinti atliekant antrąjį atrankos testą, pagrįstą kitokiu biologiniu principu.

Jei pirmojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtariamas užkrėtimas R. solanacearum ir privaloma atlikti antrąjį atrankos testą. Jei antrojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtarimas (įtariamas buvimas) patvirtinamas ir būtina toliau atlikti plane nurodytą bandymą. Jei antrojo atrankos testo rezultatas neigiamas, tada bandinys nėra laikomas užkrėstu R. solanacearum.

Jei yra patvirtintas buvimas, kaip nurodyta Direktyvos 98/57/EB 5 straipsnio 1 dalyje, daroma prielaida, kad buvo išskirta ir identifikuota grynoji patogeninė R. solanacearum kultūra.

I SKIRSNIS

TYRIMŲ PLANO TAIKYMAS

1. Nustatymo, kuriuo siekiama diagnozuoti R. solanacearum sukeliamą bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų, turinčių rudojo puvinio ir bakterinio vytulio simptomų, rudąjį puvinį ir bakterinį vytulį, planas.

Šis tyrimas yra taikomas tiriant bulvių stiebagumbius ir bulvinių šeimos augalus, turinčius arba įtariamus turint tipinių žiedinio puvinio simptomų. Jį sudaro greitos atrankos testas ir patogeno išskyrimas iš užkrėsto vaskuliarinio audinio, pasėjimas į (selektyvią) kultūrinę terpę ir, gavus teigiamą rezultatą, Ralstonia solanacearum kultūros identifikavimas.

2. Ralstonia solanacearum aptikimo ir identifikavimo besimptominių bulvių stiebagumbių bandiniuose planas

Principas:

Tyrimo procedūra skirta bulvių stiebagumbių latentinėms infekcijoms nustatyti. Išskiriant patogeninį organizmą, ypač tipiškų kolonijų atveju, o vėliau patvirtinant jo kolonijų grynumą, kaip R. solanacearum atveju, privaloma papildomai atlikti du atrankos testus3, paremtus skirtingais biologijos principais, ir gauti teigiamą rezultatą. Tik vieno atrankos testo teigiamo rezultato nepakanka bandiniui įtarti.

Atrankos testų ir išskyrimo testų nustatymo jautrumo slenkstinė riba turėtų siekti 103-104 ląstelių/ml pakartotinai suspenduotose nuosėdose, naudojamose kaip teigiama kontrolė atliekant kiekvieną testų seriją.

3. Ralstonia solanacearum aptikimo ir identifikavimo bulvių, pomidorų ar kitų augalų šeimininkų besimptominiuose bandiniuose planas

II SKIRSNIS

RALSTONIA SOLANACEARUM NUSTATYMO BULVIŲ STIEBAGUMBIUOSE IR BULVIŲ, POMIDORŲ IR KITUOSE AUGALUOSE ŠEIMININKUOSE, TURINČIUOSE RUDOJO PUVINIO ARBA BAKTERINIO VYTULIO POŽYMIŲ, IŠSAMŪS METODAI

1. Simptomai (žr. svetainę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Bulvių simptomai

Bulvės augalas. Pirmoji užkrėtimo stadija – viršutinių augalo lapų vytimas esant aukštai dienos temperatūrai ir atsigavimas naktį. Ankstyvojo užkrėtimo metu vystantys lapai išlieka žali, tačiau vėliau pageltonuoja ir vystosi rudoji nekrozė. Gali pasitaikyti ir epinastijų. Tačiau labai greitai lapai negrįžtamai nuvysta ir augalas žūva. Skersai nupjautų nuvytusių augalų stiebų apytakinis audinys gali paruduoti, ir iš nupjauto paviršiaus išsiskiria arba gali būti lengvai išspaudžiamos į pieną panašios išskyros. Nupjautą stiebą vertikaliai panardinus į vandenį, iš apytakinių pluoštų nusidriekia gleivių siūlai.

Bulvės stiebagumbis. Bulvės stiebagumbis turi būti perpjaunamas skersai arti stolonų prisisegimo vietos. Ankstyvajai užkrėtimo stadijai būdingas apytakinio žiedo išblukimas, spalva keičiasi nuo blizgančios geltonos iki šviesiai rudos spalvos. Iš apytakinio žiedo po kelių minučių spontaniškai išsiveržia šviesiai kreminės spalvos išskyros. Vėliau apytakinis išblukimas paruduoja, ir nekrozė gali išsiplėsti iki parenchimos. Progresuojančios ligos stadijose užkrečiančios bakterijos išsiveržia iš stolonų prisisegimo vietų ir akučių, dėl to žievėje gali susidaryti truputį pažeistos duobelės, iš kurių gali sunktis bakterijos, prie kurių prilimpa dirvos dalelės. Dėl vidinių vaskuliarinių audinių suirimo odelėje gali atsirasti raudonai rudų pažeidimų, iš kurių išsiskiria šiek tiek išskyrų. Paskesnėms ligos stadijoms būdingas grybų ir bakterijų sukeliamo šlapiojo puvinio susidarymas.

1.2. Pomidorų simptomai

Pomidoro augalas. Pirmasis pastebimas požymis – tai labai silpni jauniausi augalo lapeliai. Palankiomis patogenui aplinkos sąlygomis (dirvos temperatūra apie 25 °C, dirva prisotinta drėgmės) po keleto dienų vyksta epinastija ir vienos augalo pusės arba viso augalo vytimas, ir galiausiai augalas žūva. Mažiau palankiomis sąlygomis (dirvos temperatūra mažesnė nei 21 °C) ant stiebo gali išsivystyti daug papildomų šaknų. Tuomet ant stiebo atsiranda pastebima gliti juosta, kuri įrodo apytakinės sistemos nekrozę. Perpjovus stiebą, iš išblukusių rudų apytakinių stiebo audinių išsiskiria balti arba gelsvi bakterinio skysčio lašeliai.

1.3. Kitų augalų šeimininkų simptomai

Solanum dulcamara ir S. nigrum augalai. Natūraliomis sąlygomis vytimo simptomai retai stebimi šiuose piktžoliniuose augaluose šeimininkuose, nebent dirvos temperatūra viršija 25 °C arba inokuliavimo laipsnis yra pernelyg didelis (pvz., S. nigrum auga šalia sergančių bulvių ar pomidorų augalų). Vytulio atveju simptomai panašūs į pomidorų simptomus. Nevystančiuose S. dulcamara augaluose, kurių stiebai ir šaknys auga vandenyje, galima pastebėti neryškų išblukimą stiebo pagrindo arba povandeninių augalo dalių vaskuliariniuose audiniuose, atlikus skersinį pjūvį. Bakterijos gali sunktis iš prapjautų vaskuliarinių audinių arba sudaryti gleivėtus siūlus, jei prapjautas stiebas įkišamas į vandenį vertikaliai, netgi nesant vytulio simptomų.

2. Greitieji atrankos testai

Greitieji atrankos testai palengvina spėjamos diagnozės nustatymą, bet jie nėra būtini. Taikykite vieną ar kelis iš šių testų:

2.1. Stiebo gleivių siūlų susidarymo testas

(žr. VI skirsnio A dalies 1 punktą.)

2.2. Poli-β-hidroksibutirato (PHB) granulių aptikimas

Būdingos PHB granulės stebimos R. solanacearum ląstelėse, kai iš užkrėsto audinio gautų bakterinių išskyrų karščiu fiksuoti tepinėliai stebimi mikroskopu, prieš stebėjimą tepinėlį nudažius Nile Blue A arba Sudan Black dažu (žr. VI skirsnio A dalies 2 punkte).

2.3. Serologinės agliutinacijos testai

(žr. VI skirsnio A dalies 3 punktą)

2.4. Kiti testai

Kiti atitinkami greitieji atrankos testai yra šie: IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą), FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą), imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą) ir PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą).

3. Išskyrimo tvarka

a) Pašalinti iš bulvių stiebagumbio apytakinio žiedo arba bulvių, pomidorų ar kitų vystančių augalų šeimininkų stiebo apytakinio audinio išskyras arba pašviesėjusį audinį. Suspenduoti nedideliame sterilaus distiliuoto vandens kiekyje arba 50 mM fosfatinio buferinio tirpalo (4 priedėlis) ir palikti 5–10 minučių ant stalo.

b) Paruošti keletą suspensijos dešimtainių tirpalų.

c) Lašinti standartinį 50-100 μl suspensijos ir tirpalų kiekį į pagrindinę mitybinę terpę (NA, YPGA ir SPA, 2 priedėlis) ir (arba) ant Kelmano tetrazolio terpės (2 priedėlis) ir (arba) į selektyvią SMSA terpę (2 priedėlis). Paskleisti arba ruožuoti taikant tinkamą pasėjimo į terpę metodą. Jei reikia, paruošti atskiras lėkšteles kaip teigiamą kontrolę naudojant Ralstonia solanacearum 2 biotipo ląstelių atskiestą suspensiją.

d) Lėkšteles inkubuoti 2–6 dienas 28 °C temperatūroje. — Pagrindinėje mitybinėje terpėje virulentiški R. solanacearum izoliatai sudaro gelsvai baltas, plokščias, netaisyklingas ir takias kolonijas, dažnai su būdingais menturiais centre. Nevirulentinės R. solanacearum formos sudaro mažas, apskritas, netakias, riebias kolonijas, kurios yra ryškiai baltos spalvos. — Kelmano tetrazolio arba SMSA terpėje menturiai yra ryškiai raudonos spalvos. Nevirulentinės Ralstonia solanacearum formos sudaro mažas, apskritas, netakias, riebias tamsiai raudonas kolonijas.

4. R. solanacearum identifikavimo testai

Spėjamų R. solanacearum izoliatų tapatybės patvirtinimo testai aprašyti VI skirsnio B dalyje.

III SKIRSNIS

1. Ralstonia solanacearum aptikimo ir identifikavimo besimptominių bulvių stiebagumbių bandiniuose išsamūs metodai

1.1. Bandinio paruošimas

Pastaba.

— Standartinis vienam testui skirto bandinio dydis - 200 stiebagumbių. Intensyvesnės imties atveju reikia atlikti daugiau šio dydžio bandinio testų. Dėl didesnio stiebagumbių skaičiaus viename bandinyje neįmanoma arba sunku aiškinti rezultatus. Tačiau turint vos keletą stiebagumbių, šią procedūrą galima taikyti mažiau nei 200 stiebagumbių bandiniams.

— Visų toliau aprašytų aptikimo metodų patvirtinimas pagrįstas 200 stiebagumbių bandinių tyrimu.

— Toliau aprašytą bulvių ekstraktą taip pat galima naudoti aptinkant bulvių žiedinio puvinio sukėlėją - bakteriją Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Prieš bandinio paruošimą galima atlikti išankstinį apdorojimą:

a) 2 savaites prieš tyrimą bandinius inkubuoti 25–30 °C temperatūroje, kad būtų paskatintas R. solanacearum kolonijų dauginimasis.

b) Nuplauti stiebagumbius. Naudoti atitinkamus dezinfektantus (chloro junginius, kai PGR naudojama visiškai pašalinti patogeno DNR) ir detergentus, skirtus kiekvienam bandiniui. Stiebagumbiai išdžiovinami oru. Ši plovimo tvarka ypač naudinga (bet kurio naudoti nereikalaujama), kai naudojami bandiniai, turintys dirvožemio perteklių ir kai būtina atlikti PGR testą arba taikyti kitą tiesioginį DNR išskyrimo metodą.

1.1.1. Kiekvieno stiebagumbio viršūnės oda pašalinama švariu ir dezinfekuotu skalpeliu arba daržovėms pjaustyti skirtu peiliu taip, kad vaskuliarinis audinys taptų matomas. Kruopščiai išpjaunamaa stiebagumbio viršūnės vaskuliarinio audinio šerdis, kad nevaskuliarinio audinio būtų kuo mažiau (žr. Komisijos svetainę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Pastaba. Atskirti bet kurį pūvantį stiebagumbį: stiebagumbius su įtariamais rudojo puvinio simptomais ištirti atskirai.

Jei šalinant stiebagumbio viršūnę yra stebimi įtariami rudojo puvinio simptomai, tai reikia apžiūrėti šio stiebagumbio dalį prie viršūnės. Bet kurį perpjautą stiebagumbį reikia mažiausiai dvi dienas laikyti kambario temperatūroje, kad šis sukamštėtų, ir paskiau stiebagumbį atitinkamomis karantino sąlygomis laikyti atšaldytą (4–10 °C temperatūroje). Visus stiebagumbius, įskaitant ir stiebagumbius su įtariamais simptomais, reikėtų laikyti, atsižvelgiant į III priedą.

1.1.2. Stiebagumbių viršūnių gabaliukai surenkami į nepanaudotas vienkartines talpyklas, kurias galima uždaryti ir (arba) užplombuoti. Jau panaudotas talpyklas reikėtų kruopščiai išvalyti ir dezinfekuoti chloro junginiais. Pirmiausia stiebagumbių viršūnių gabaliukus reikėtų apdoroti nedelsiant. Jei tai padaryti neįmanoma, jie, nepridedant buferio, šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas yra saugomi talpykloje.

Stiebagumbio viršūnės gabaliukai apdorojami pagal vieną iš šių procedūrų:

a) gabaliukai pamerkiami į pakankamą (apie 40 ml) išskyrimo buferinio tirpalo tūrį (4 priedėlis) ir 4 valandas žemesnėje nei 24 °C temperatūroje kratomi rotorine kratykle (50–100 rpm), arba 16–24 valandas šaldytuve, arba

b) gabaliukai homogenizuojami pakankame (apie 40 ml) išskyrimo buferinio tirpalo tūryje (4 priedėlis) arba naudojant maišyklę (pvz., Waring arba Ultra Thurax), arba užplombuotame vienkartiniame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher ar Bioreba tvirto polietileno maišelyje, 150 mm x 250 mm; sterilizuotame apšvita) juos sutraiškant guma apkaltu mediniu plaktuku arba atitinkamu malimo prietaisu (pvz., Homex).

Pastaba. Bandinių kryžminės taršos rizika yra ypač didelė, kai bandiniai homogenizuojami naudojant maišyklę. Stengiantis išvengti aerozolio susidarymo arba nuotėkio išskyrimo metu yra imamasi atsargumo priemonių. Užtikrinama, kad kiekvienam bandiniui būtų naudojami atskiri ką tik sterilizuoti maišyklės peiliai ir indai. Jei atliekamas PGR testas, stengiamasi išvengti dauginamosios medžiagos pernešimo per talpyklas ar malimo aparatą. Atliekant PGR testą malimą rekomenduojama atlikti vienkartiniuose maišeliuose ir vienkartiniuose vamzdeliuose.

1.1.3. Viršnuosėdinis skystis nupilamas. Jei jis pernelyg drumstas, skaidrinamas lėtai centrifuguojant (10 minučių ne didesniu kaip 180 g greičiu 4–10 °C temperatūroje) arba filtravimu vakuume (40–100 µm), perplaunant filtrą papildomu (~10 ml) išskyrimo buferiniu tirpalu.

1.1.4. Bakterijos frakcija koncentruojama 15 minučių centrifuguojant 7 000 g greičiu (arba 10 minučių – 10 000 g greičiu) 4–10 °C temperatūroje, ir viršnuosėdinis skystis nupilamas nepažeidžiant nuosėdų.

1.1.5. Nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 1,5 ml nuosėdoms skirtame buferiniame tirpale (4 priedėlis). Naudojama 500 µl C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ir 500 µl etaloninės kultūros tyrimui. Įpilama sterilaus glicerino, kad etaloninės alikvotinės dalies ir tiriamosios alikvotinės dalies 500 µl galutinė koncentracija siektų 10–25 % (tūris/tūris), sumaišoma ir saugoma temperatūroje nuo -16 iki –24 °C (savaites) arba nuo –68 iki –86 °C (mėnesius). Tyrimo metu tiriamosios alikvotinės dalys saugomos 4–10 °C temperatūroje.

Kartotinis sušaldymas ir atitirpdinimas nerekomenduotini.

Jei ekstraktą reikia vežti, jis šaldomoje dėžėje pristatomas per 24 valandas.

1.1.6. Siekiant išvengti užkrėtimo, visus R. solanacearum teigiamus kontrolinius bandinius ir tiriamuosius bandinius būtina laikyti atskirai. Šitaip daroma paruošiant IF plokšteles ir atliekant visus testus.

1.2. Tyrimas

Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų bei optimizuotų metodikų aprašymą, pateikiamą atitinkamuose prieduose:

Selektyvus išskyrimas (žr. VI skirsnio A dalies 4 punktą)

IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą)

PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą)

FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą)

Imunofermentinė analizė(ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą)

Biotestas (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą)

2. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo besimptominių bulvių, pomidorų ir kitų augalų šeimininkų bandiniuose išsamūs metodai

2.1. Bandinio paruošimas

Pastaba. Siekiant aptikti latentines R. solanacearum populiacijas, rekomenduojama tirti sudėtinius bandinius. Ši tvarka gali būti sėkmingai taikoma tiriant 200 stiebų dalių sudėtinius bandinius. Atliekant apžiūras, rekomenduojama naudoti statistiškai patikimą tiriamąjį augalo populiacijos bandinį.

2.1.1. Nuo kiekvieno stiebo antžeminės dalies švariu dezinfekuotu peiliu arba genėjimui skirtu sekatoriumi atpjaunamas 1–2 cm segmentas:

Jauni pomidorų daigai: švariu dezinfekuotu peiliu nuo kiekvieno stiebo pagrindo dalies, esančios šiek tiek aukščiau dirvos paviršiaus, atpjaunamas 1 cm segmentas.

Lauke arba šiltnamyje auginami pomidorų augalai: švariu dezinfekuotu peiliu nuo pagrindinio kiekvieno augalo stiebo atpjaunama žemiausiai esanti šakelė. Nuo kiekvienoje pusėje esančios šakelės žemiausios dalies atpjaunamas 1 cm segmentas.

Kiti augalai šeimininkai: švariu dezinfekuotu peiliu arba sekatoriumi nuo kiekvieno stiebo pagrindo dalies, esančios šiek tiek aukščiau dirvos paviršiaus, atpjaunamas 1 cm segmentas. S. dulcamara ar kitų vandenyje auginamų augalų šeimininkų atveju nuo povandeninių stiebo dalių ar stolonų, turinčių vandenyje esančias šaknis, atpjaunami 1–2 cm segmentai.

Kai imtis atliekama konkrečioje vietoje, rekomenduojama tirti statistiškai reprezentatyvių 10 augalų imtį, paimtą kiekvienoje galimų piktžolinių augalų šeimininkų bandinių paėmimo vietoje. Patogeninio organizmo aptikimą patikimiausiai galima atlikti pavasario pabaigoje, vasarą ir rudenį, nors gamtoje vykstančius užkrėtimus ištisus metus galima nustatyti tarp daugiamečių Solanum dulcamara augalų, augančių vandentakiuose. Žinomiems augalams šeimininkams priklauso savaime įsisėjantys augalai (dirvožemio tvarkytojai) Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium ir kiti bulvinių šeimos augalai. Kiti šeimininkai yra Pelargonium spp. ir Portulaca oleracea. Prie kai kurių augalų šeimininkų, augančių Europoje ir tam tikromis aplinkos sąlygomis savo šaknyse ir (arba) rizosferoje galinčių turėti 2 biovarieteto 3 rasės R. solanacearum populiacijų, galima priskirti šiuos augalus: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra ir Urtica dioica.

Pastaba. Vidinių simptomų (vaskuliarinio audinio dažymasis arba bakterijų išskyros) vizualinį įvertinimą reikia atlikti šio tyrimo etape. Bet kurie simptomų turintys stiebo segmentai atskiriami vieni nuo kitų ir išanalizuojami (žr. II skirsnį).

2.1.2. Stiebo segmentai trumpai dezinfekuojami 70 % etilo alkoholiu ir nedelsiant išdžiovinami sugeriamuoju popieriumi. Po to stiebo segmentai apdorojami taikant vieną iš šių procedūrų:

a) segmentai pamerkiami į pakankamo tūrio (apytiksliai 40 ml) išskyrimo buferinį tirpalą (4 priedėlis) ir 4 valandas maišomi besisukančia kratykle (50–100 rpm greičiu) mažesnėje nei 24 °C temperatūroje arba 16–24 valandas šaldomi, arba

b) apdorojami nedelsiant, guma apkaltu plaktuku arba atitinkamu malimo aparatu (pvz., Homex) segmentus sumalant tvirtame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher arba Bioreba), įpylus atitinkamą išskyrimo buferinio tirpalo kiekį (4 priedėlis). Jei šito padaryti neįmanoma, tai stiebo segmentai saugomi šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas.

2.1.3. 15 minučių leidus susidaryti nuosėdoms, viršnuosėdinis skystis nupilamas.

2.1.4. Paprastai paskiau nereikalaujama skaidrinti ekstrakto arba koncentruoti bakterinės frakcijos, tačiau tai galima atlikti filtruojant ir (arba) centrifuguojant, kaip aprašyta III.1.1.3–1.1.5 skirsniuose.

2.1.5. Neskiestas arba koncentruotas bandinio ekstraktas padalijamas į dvi lygias dalis. Viena dalis tiriama ir saugoma 4–10 °C temperatūroje, o kita saugoma 10–25 % (tūris/tūris) steriliame glicerine temperatūroje nuo –16 iki –24 °C (savaites) arba nuo –68 iki –86 °C (mėnesį) tuo atveju, jeigu bus reikalingi tolesni bandymai.

2.2. Tyrimas

Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų bei optimizuotų metodikų aprašymą, pateikiamą atitinkamuose prieduose:

Selektyvus išskyrimas (žr. VI skirsnio A dalies 4 punktą)

IF testas (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą)

PGR (žr. VI skirsnio A dalies 6 punktą)

FISH (žr. VI skirsnio A dalies 7 punktą)

Imunofermentinė analizė (ELISA) (žr. VI skirsnio A dalies 8 punktą)

Biotestas (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą)

IV SKIRSNIS

1. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo vandenyje planas

2. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo vandenyje metodai

Principas

Pagal šiame skirsnyje aprašytą aptikimo planą ligos sukėlėjas aptinkamas paviršiniame vandenyje ir taip pat bulvių perdirbimo atliekose arba nuotekų vandenyse. Tačiau reikia pabrėžti, kad aptikimo skirtingame substrate jautrumas kinta. Išskyrimo testo nustatymo jautrumui didelės įtakos turi konkuruojančios saprofitinės bakterijos, kurių skaičius bulvių perdirbimo atliekose ir nuotekų vandenyse yra gerokai didesnis nei paviršiniame vandenyje. Kadangi pagal paskesnį planą 1 litre paviršinio vandens tikimasi aptikti ne mažiau kaip 103 ląstelių, tai atrodo, kad organizmo aptikimo bulvių perdirbimo atliekose ar nuotekų vandenyse jautrumas bus gerokai mažesnis. Atsižvelgiant į tai, nuotekų vandenis siūloma tirti baigus visas gryninimo operacijas (pvz., nusodinimą arba filtravimą), kurių metu sumažinamas saprofitinių bakterijų kolonijų skaičius. Aptikimo pagal šį tyrimo planą jautrumo apribojimus reikia apsvarstyti atlikus gautų neigiamų rezultatų patikimumo įvertinimą. Kadangi pagal šį tyrimo planą atlikti patogeninio organizmo buvimo ar nebuvimo paviršiniame vandenyje tyrimai buvo sėkmingi, reikia atsižvelgti į šio plano trūkumus, kai atliekamas patogeninio organizmo buvimo bulvių perdirbimo atliekose ir nuotekų vandenyse tyrimas.

2.1. Bandinio paruošimas

Pastaba.

— R. solanacearum aptikimą paviršiniame vandenyje geriausia atlikti pavasario pabaigoje, vasarą ir rudenį, kai vandens temperatūra viršija 15 °C.

— Dėl pakartotinio bandinių ėmimo skirtingu laiku pirmiau nurodytu laikotarpiu nustatytose imties vietose padidės aptikimo patikimumas, kartu sumažinant klimato kaitos sukeltą poveikį.

— Siekiant išvengti praskiedimų, užmaskuojančių patogeną, reikia atsižvelgti į liūčių laikotarpį ir vandentakio geografinę padėtį.

— Paimti paviršinio vandens, esančio netoli augalų šeimininkų, jei šie šeimininkai tebeegzistuoja, bandinius, jei šis vanduo yra netoliese augalų šeimininkų.

2.1.1. Pasirinktose imties vietose paimti vandens bandinius, pripildant vienkartinius mėgintuvėlius ar butelius vandens, paimto iš 30 cm gylio ir nedaugiau kaip 2 m nuo kranto. Jei bus tiriama perdirbimo atliekos arba nuotekų vandenys, bandinius paimti nuotekų išmetimo vietoje. Rekomenduojama imties vietoje paimti iki 500 ml tūrio bandinius. Jei paimami mažesnio tūrio bandiniai, rekomenduojama paimti bandinius imties vietoje mažiausiai tris kartus, kiekvieno bandinio atlikti du poėmių pakartojimus, kurių kiekvieno tūris yra mažiausiai 30 ml. Atliekant intensyvesnį tyrimą, pasirinkti mažiausiai tris imties vietas 3 km ilgio vandentakyje ir užtikrinti, kad bandiniai taip pat bus paimami iš intakų, įtekančių į vandentakį.

2.1.2. Bandiniai vežami vėsiai (4–10 °C) tamsoje ir ištiriami per 24 valandas.

2.1.3. Jei reikia, bakterijų frakcija gali būti koncentruojama šiais metodais:

a) 30–50 ml tūrio bandiniai centrifuguojami 10 000 g greičiu 10 minučių (arba 7 000 g greičiu 15 minučių) 4–10 °C temperatūroje, viršnuosėdinį skystį nupilant ir nuosėdas pakartotinai suspenduojant 1 ml nuosėdų buferiniame tirpale (4 priedėlis).

b) Atliekamas filtravimas per membraną (mažiausiam skylučių dydžiui esant 0,45 µm), paskiau atliekamas filtro perplovimas 5–10 ml nuosėdų buferiniu tirpalu ir nuoplovų išsaugojimas. Šis metodas tinkamas atlikti naudojant vandenį, kuriame yra nedaug saprofitinių bakterijų.

Tiriant bulvių perdirbimo arba nuotekų vandenų bandinius koncentravimas paprastai nerekomenduojamas, nes dėl padidėjusių saprofitinių bakterijų skaičiaus yra slopinamas Ralstonia solanacearum nustatymas.

2.2. Testavimas

Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų aprašymą atitinkamuose priedėliuose.

V SKIRSNIS

1. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo dirvožemyje planas

2. R. solanacearum aptikimo ir identifikavimo dirvožemyje metodai

Principai

Pagal šiame skirsnyje aprašytą patvirtintą aptikimo planą dirvožemio bandiniuose yra aptinkamas ligos sukėlėjas ir taip pat tiriami bulvių perdirbimo atliekų ir nuotekų dumblo bandiniai. Tačiau reikia pažymėti, kad taikant šiuos metodus nustatymo jautrumas nėra pakankamas, kad būtų galima garantuoti nedidelio skaičiaus ir (arba) nevienodai išplitusių Ralstonia solanacearum populiacijų, randamų šiuose natūraliai užkrėstuose substratuose, aptikimą.

Aptikimo jautrumo apribojimus, susijusius su šiuo tyrimo planu, reikėtų apsvarstyti, kai yra vertinamas bet kokių gautų neigiamų rezultatų patikimumas ir taip pat kai yra atliekami patikrinimai, siekiant nustatyti patogeno buvimą arba nebuvimą dirvožemyje ir dumble. Patikimiausias patogeninio organizmo buvimo lauko dirvožemyje tyrimas yra jautraus užkrėtimui augalo šeimininko pasodinimas ir jo užkrėtimo stebėsena, tačiau ir šio metodo nustatymo jautrumas nėra pakankamas nedideliam užkrėtimo laipsniui nustatyti.

2.1. Bandinio paruošimas

2.1.1. Imant lauko dirvožemio bandinius, reikia laikytis nematodų imčiai taikomų standartinių principų. Kiekvienam bandiniui reikia surinkti 0,5–1 kg dirvožemio 60 imties vietų 0,3 ha ploto lauke 10-20 cm gylyje (arba iš 7 × 7 m žemės ploto). Įtarus patogeninio organizmo buvimą, bandinių imties vietų skaičių 0,3 ha plote reikia padidinti iki 120. Iki tyrimo bandiniai laikomi 12–15 °C temperatūroje. Bulvių perdirbimo atliekų ir nuotekų dumblo bandinių bendras svoris siekia 1 kg ir jie imami tiek imties vietų, kad būtų atitinkamas viso reikiamo ištirti dumblo tūris. Prieš tiriant kiekvienas bandinys sumaišomas.

2.1.2. 10–25 g dirvožemio arba dumblo poėmių dispergavimas 2 valandas atliekamas rotorine kratykle 250 rpm greičiu 60–150 ml išskyrimo buferiniame tirpale (4 priedėlis). Jei dispergavimą reikia pagreitinti, galima pripilti 0,02 % sterilaus Tween- 20 ir įberti 10–20 g sterilaus žvirždo.

2.1.3. Tyrimo metu suspensiją laikyti 4 °C temperatūroje.

2.2. Tyrimas

Žr. vaizduojamąją diagramą ir testų aprašymą atitinkamuose priedėliuose.

VI SKIRSNIS

R. SOLANACEARUM APTIKIMO IR IDENTIFIKAVIMO OPTIMIZUOTOS METODIKOS

A. DIAGNOSTINIAI IR APTIKIMO TESTAI

1. Stiebo gleivių siūlų susidarymo testas

Ralstonia solanacearum bakterijos buvimą vystančiuose bulvių pomidorų ir kitų augalų šeimininkų stiebuose galima įvertinti atlikus šį paprastą spėjamąjį bandymą: nupjauti stiebą truputį virš dirvos paviršiaus. Įmerkti nupjautą stiebą į menzūrą su vandeniu. Po kelių minučių stebėti būdingą spontaninį bakterijų gleivių siūlų tekėjimą iš apytakinių pluoštų.

2. Poli-β-hidroksibutirato granulių aptikimas

1. Ant mikroskopo objektinio stiklelio paruošti išskyrų arba suspenduoto audinio tepinėlį, arba 48 valandas YPGA ar SPA terpėje augintos kultūros tepinėlį (2 priedėlis).

2. Paruošti 2 štamo R. solanacearum teigiamų kontrolinių bandinių tepinėlius ir, jei manoma, kad tai naudinga, paruošti heterologiško biovarieteto neigiamo kontrolinio bandinio kontrolės tepinėlį.

3. Leisti išdžiūti ore ir keletą kartų greitai perleisti apatinį stiklelio paviršių per liepsną, kol tepinėlis užsifiksuos.

4. Preparatą dažyti arba Nile Blue arba Sudan Black dažu ir stebėti mikroskopu, kaip aprašyta toliau:

Nile Blue dažo testas:

a) Fiksuotą tepinėlį pamerkti į 1 % vandeninį Nile Blue A tirpalą. 10 minučių laikyti 55 °C temperatūroje.

b) Nupilti dažantį tirpalą. Nuplauti, trumpai palaikant po silpna vandens srovele ir filtriniu popieriumi pašalinti vandens perteklių.

c) Užpilti tepinėlį 8 % acto rūgštimi ir 1 minutę laikyti kambario temperatūroje.

d) Nuplauti silpna vandens srovele ir nusausinti tepinėlį sugeriamuoju popieriumi.

e) Pakartotinai sudrėkinti lašu vandens ir uždengti dengiamuoju stikleliu.

f) Nudažytą tepinėlį stebėti epifluorescenciniu mikroskopu, šviesos bangos ilgiui siekiant 450 nm po aliejine imersija, padidinus 600–1 000 kartų ir naudojant imersinį aliejaus ar vandens objektyvą.

g) Stebėti ryškiai oranžinį polibetahidroksibutirato granulių švytėjimą. Taip pat stebėti įprastinėje šviesoje, kad būtų įsitikinta, jog nuosėdos yra ląstelės viduje ir ląstelių morfologija yra būdinga R. solanacearum.

Sudan Black dažo testas:

a) Kiekvieną fiksuotą tepinėlį pamerkti į 0,3 % Sudan Black B tirpalą 70 % etanolyje ir 10 minučių palaikyti kambario temperatūroje.

b) Nupilti dažantį tirpalą, trumpai palaikyti po vandeniu iš čiaupo ir filtriniu popieriumi pašalinti vandens perteklių.

c) Tepinėlį trumpam panardinti į ksilolą ir nusausinti filtravimo popieriumi. Atsargiai! Ksilolas yra kenksmingas sveikatai. Imtis visų atsargumo priemonių ir dirbti traukos spintoje.

d) Užpilti tepinėlį 0,5 % (g/ml) vandeniniu safranino tirpalu ir 10 minučių palikti kambario temperatūroje. Atsargiai! Safraninas yra kenksmingas sveikatai. Imtis visų atsargumo priemonių ir dirbti traukos spintoje.

e) Nuplauti silpna vandens srovele. Nusausinti tepinėlį filtravimo popieriumi ir uždengti dengiamuoju stikleliu.

f) Šviesos mikroskopu stebėti nudažytą tepinėlį, naudojant išsklaidytą šviesą, imersinį aliejų ir 1 000 kartų didinantį imersinį aliejaus objektyvą.

g) Stebėti polibetahidroksibutirato granulių Ralstonia solanacearum bakterijos ląstelėje dažymąsi mėlynai juoda spalva. Ląstelės sienelė nusidažo rausva spalva.

3. Serologinės agliutinacijos testai

R. solanacearum ląstelių bakterinėse išskyrose arba simptominių audinių ekstraktuose serologinė agliutinacija geriausiai stebima naudojant patvirtintus antikūnus (žr. 3 priedėlį), žymėtus atitinkamomis spalvinėmis žymėmis, tokiomis kaip raudonos Staphylococcus aureus ląstelės arba dažyto latekso dalelės. Jei naudojamasi nusipirktu rinkiniu (žr. 3 priedėlį), vadovaujamasi gamintojo instrukcijomis. Kitais atvejais operacija atliekama šia tvarka:

a) Žymėtų antikūnų suspensijos ir bakterinių išskyrų lašai (kiekvieno apytiksliai po 5 µl) sumaišomi mikrotitravimo plokštelių duobutėse.

b) Naudojant R. solanacearum 2 biovarieteto ir heterologinio štamo suspensijas, paruošiami teigiami ir neigiami kontroliniai bandiniai.

c) Agliutinacija teigiamuose bandiniuose stebima po 15 sekundžių trukmės švelnaus maišymo.

4. Selektyvus pasėjimas

4.1. Selektyvus pasėjimas

Pastaba. Prieš pradedant taikyti šį metodą pirmąkart, atliekami išankstiniai testai, užtikrinant atkartojamą 103-104 R. solanacearum kolonijas sudarančių vienetų, pridėtų prie bandinių, kurie pirmiau buvo įvertinti kaip neigiami, nustatymą viename mililitre.

Naudojamasi atitinkama patvirtinta selektyvią terpe, tokia kaip SMSA (kaip modifikuota Elphinstone et al., 1996; žr. 2 priedėlį).

Reikia rūpestingai atlikti R. solanacearum atskyrimą nuo kitų bakterijų, nes terpėje gali augti ir kitų rūšių bakterijos. Be to gali išaugti netipiškos morfologijos R. solanacearum kolonijos dėl peraugimo ar bakterijų antagonistų. Įtarus konkurencijos ar antagonizmo atvejus, bandinys pakartotinai tiriamas kitu metodu.

Didžiausio nustatymo jautrumo galima tikėtis, kai naudojamas šviežiai paruoštas bandinio ekstraktas ir laikomasi optimalių augimo sąlygų. Tačiau šį metodą galima sėkmingai taikyti, tiriant ekstraktus, laikytus glicerine temperatūroje nuo –68 iki –86 °C.

Kaip teigiamą kontrolinį bandinį paruošti R. solanacearum virulentiško biovarieteto 2 štamo (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) 106 kolonijų sudarančių vienetų viename mililitre suspensijos praskiedimus santykiu 1:10. Siekiant išvengti taršos, paruošiami teigiami kontroliniai bandiniai atskirai nuo tiriamųjų bandinių.

Kiekvienos selektyvios terpės partija patikrinama pagal patogeno sugebėjimą augti joje prieš pradedant įprastinių bandinių tyrimą.

Kontrolinė medžiaga tiriama taip pat, kaip ir bandinys.

4.1.1. Atlikti atitinkamą pasėjimo praskiedžiant operaciją, siekiant užtikrinti bet kokių pašalinių saprofitinių bakterijų populiacijų praskiedimą. Į kiekvieną lėkštelę pasėti po 50–100 µl kiekvieno praskiedimo bandinio.

4.1.2. Lėkštelės inkubuojamos 28 °C temperatūroje. Plokštelės analizuojamos po 48 valandų ir po to kasdieną 6 dienas. Tipiškos R. solanacearum kolonijos SMSA terpėje būna pieno baltumo, lygios, netaisyklingos formos bei takios ir po 3 inkubacijos dienų kolonijų centre atsiranda nuo rausvos iki kraujo spalvos centrinis vidinis ruožuotumas arba menturiai. (žr. svetainę http://forum.europa.eu.int/MembersPublic/irc/sanco/sanco_europhyt/libraryHome/main).

Pastaba. Kartais šioje terpėje išauga netipiškos R. solanacearum kolonijos. Jos gali būti mažos, apvalios, visiškai raudonos ir netakios arba iš dalies takios, todėl jas būna sunku atskirti nuo saprofitinių kolonijas sudarančių bakterijų.

4.1.3. R. solanacearum spėjamos kolonijos išgryninamos po pasėjimo į pagrindinę mitybinę terpę brėžimo arba praskiedimo būdu atskiroms kolonijoms gauti (žr. 2 priedėlį).

4.1.4. Kolonijos trumpai laikomos tamsoje steriliame kambario temperatūros vandenyje (pH 6–8, neturinčiame chloro) arba ilgą laiką – kriogeninėje apsauginėje terpėje esant temperatūrai nuo –68 iki –86 °C arba liofilizuojamos.

4.1.5. Spėjamos kultūros identifikuojamos (žr. VI skirsnio B dalį) ir atliekamas patogeniškumo testas (žr. VI skirsnio C dalį).

Selektyvaus pasėjimo rezultatų aiškinimas

Selektyvaus pasėjimo testo rezultatai laikomi neigiamais, jei po 6 dienų auginimo bakterijų kultūros nestebimos arba tipiškų R. solanacearum kolonijų nėra, laikantis nuostatos, kad slopinimas nevyko dėl kitų bakterijų konkurencijos ar antagonizmo ir kad tipiškos R. solanacearum kolonijos aptinkamos tik teigiamuose bandiniuose.

Selektyvaus pasėjimo testas teigiamas, jei išskiriamos spėjamos R. solanacearum kolonijos.

4.2. Terpės praturtinimo procedūra

Naudoti tokią patvirtintą terpę, kaip modifikuotas Wilbrink buljonas (žr. 2 priedėlį).

Ši procedūra gali būti taikoma R. solanacearum populiacijų bandinyje atrankai pagerinti ir aptikimo jautrumui padidinti. Šios procedūros metu PGR reakcijos inhibitoriai tinkamai praskiedžiami (1:100). Tačiau reikėtų pažymėti, kad R. solanacearum praturtinimas gali nepasisekti dėl saprofitinių bakterijų, praturtinamų tuo pačiu metu, konkurencijos ar antagonizmo. Dėl šios priežasties R. solanacearum išskyrimas iš praturtintų buljono terpėje auginamų kultūrų gali būti problemiškas. Be to, kadangi serologiškai giminingų saprofitų populiacijos gali padidėti, rekomenduojama imunofermentinei analizei atlikti vietoj specifinių monokloninių antikūnų naudoti polikloninius antikūnus.

4.2.1. Praturtinant PGR, 100 µl bandinio ekstrakto įpilama į 10 ml praturtinamojo sultinio (2 priedėlis), prieš tai išpilstyto alikvotinėmis dalimis į mėgintuvėlius ar kolbutes, į kurias nepripilta DNR. Praturtinant imunofermentinę analizę, į praturtinamąjį sultinį galima įpilti didesnio tūrio tiriamųjų bandinių (pvz., 100 µl į 1,0 ml praturtinamojo sultinio).

4.2.2. Kultūros 72 valandas inkubuojamos 27-30 °C ant kratyklės arba nekratant kolbose, neužkimštose aklinai tam, kad šios vėdintųsi.

4.2.3. Prieš atliekant imunofermentinę analizę ar PGR gerai sumaišyti.

4.2.4. Atliekant abu testus, praturtinamasis sultinys paveikiamas lygiai taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys.

Pastaba. Jei R. solanacearum praturtinimas slopinamas dėl didelio konkuruojančių saprofitinių bakterijų populiacijų skaičiaus, bandinių ekstraktų praturtinimą geriau atlikti prieš centrifugavimo ar koncentravimo kitu būdu operaciją.

5. Imunofluorescencinės analizės (IF) Testas

Principas

Imunofluorescencinės analizės testas kaip pagrindinis atrankos testas rekomenduojamas taikyti dėl to, kad jį atliekant yra pasiekiamos reikalaujamos slenkstinės vertės.

Kai IF testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, PGR ir FISH testą reikia atlikti kaip antrąjį atrankos testą. Kai IF testas atliekamas kaip antrasis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, reikia atlikti paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad analizė būtų baigta.

Pastaba. Naudojami patvirtinti antikūnai, specifiški R. solanacearum (žr. svetainę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Rekomenduojama nustatyti kiekvienos naujos antikūnų partijos titrą. Titras apibrėžiamas kaip didžiausias praskiedimas, kuriam esant vyksta reakcija, tiriant homologinio R. solanacearum štamo 105-106 ląstelių/ml ląstelių suspensiją ir naudojant atitinkamą gamintojo rekomenduojamą fluoresceino izotiocianato (FITC) konjugatą. Neišgrynintų polikloninių arba monokloninių antikūnų titras turėtų būti ne mažesnis kaip 1:2 000. Tyrimo metu antikūnus reikėtų praskiesti iki darbinio praskiedimo (DP), artimo ar lygaus jų titrui.

Reikėtų tirti tik šviežiai pagamintus ekstraktus. Jei būtina, galima tirti glicerine temperatūroje nuo –68 iki –86 °C laikomus ekstraktus. Gliceriną iš bandinio galima pašalinti, įpylus 1 ml nuosėdų buferinio tirpalo (4 priedėlis), pakartotinai 15 minučių centrifuguoti 7 000 g greičiu ir pakartotinai suspenduoti, pripylus nuosėdų buferinio tirpalo lygų tūrį. Dažnai šitai atlikti nebūtina, ypač jei bandiniai fiksuojami ant plokštelės liepsna.

Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles, į kurių duobutes bus pripilta homologinio arba bet kurio nors etaloninio C. m. subsp. sepedonicus štamo, suspenduoto bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 3 priedėlio B dalyje, ir pirmiausia buferiniame tirpale.

Jei įmanoma, į tos pačios plokštelės duobutes turėtų būti pripilama natūraliai užkrėsto audinio preparato (palaikomo liofilizacijos arba šaldymo nuo –16 iki –24 °C temperatūroje būdu) kaip panašaus kontrolinio bandinio.

Anksčiau nustatytų kaip neigiamų bandinių ekstraktų alikvotinės dalys galėtų būti naudojamos kaip neigiamos kontrolės.

Prieinamos standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos išvardytos 3 priedėlyje.

Naudoti daug duobučių turinčias mikroskopines plokšteles, mažiausiai 6 mm storio ir geriausia turinčias 10 langelių.

Kontrolinis bandinys tiriamas taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys.

5.1. Tyrimui skirtos plokštelės paruošiamos taikant vieną iš šių procedūrų:

i) Nuosėdos, turinčios palyginti nedaug krakmolo: Standartinis tūris (15 µl tinka dirbti, kai naudojamos 6 mm storio plokštelės, o jei langeliai didesni, tūris padidinamas) 1:100 praskiestų pakartotinai suspenduotų bulvių nuosėdų lašinamas į pirmąjį langelį. Paskiau nepraskiestų (1/1) pakartotinai suspenduotų nuosėdų panašus tūris lašinamas į vienos tos pačios eilės langelius. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 1 pav.

ii) Esant kitoms nuosėdoms: Pakartotinai suspenduotos nuosėdos praskiedžiamos santykiu 1:10 ir 1:100 nuosėdų buferiniame tirpale. Standartinis pakartotinai suspenduotų nuosėdų tūris (15 µl tinka dirbti, kai naudojamos 6 mm storio plokštelės, o jei langeliai didesni, tūris padidinamas) lašinamas į langelį ir vienoje langelių eilutėje atliekamas praskiedimas. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 2 pav.

5.2. Lašeliai išdžiovinami kambario temperatūroje arba kaitinami 40-45 °C temperatūroje. Bakterinės ląstelės fiksuojamas prie plokštelės arba kaitinant (15 minučių 60 °C temperatūroje), arba liepsna, 95 % etilo alkoholiu arba bet kuria kita antikūnų tiekėjų nurodyta tvarka.

Jei būtina, fiksuotos plokštelės paskiau iki tyrimo gali būti kiek galima trumpiau (ilgiausiai 3 mėnesius) saugomos šaltai sausoje dėžėje.

5.3. IF tvarka

i) Plokštelė, paruošta kaip nurodyta 5.1 skirsnio i punkte: Paruošiamas antikūnų, dukart praskiestų IF buferiniu tirpalu, rinkinys. Į pirmąją duobutę įpilama 1/2 titro (T/2), į kitas - 1/4 titro (T/4), 1/2 titro, (T/2), 1 titras (T) ir dukart titro antikūnų (2T).

ii) Plokštelė, paruošta kaip nurodyta 5.1 skirsnio ii punkte: Atliekamas antikūnų darbinis praskiedimas (DP) IF buferiniame tirpale. Praskiedimas turi įtakos antikūnų specifiškumui.

1 pav. Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 5.1 skirsnio i punktą ir 5.3 skirsnio i punktą

Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimai 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimas (T = titras) T/2 T/4 T/2 T 2T  Antiserumų/antikūnių praskiedimas dukart 1 bandinys 1 2 3 4 5 1 bandinio arba 2 bandinio pakartojimas 6 7 8 9 10





2 pav. Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 5.1 skirsnio ii punktą ir 5.3 skirsnio ii punktą

Antiserumo/antikūnų darbinis praskiedimas 1/1 1/10 1/100 tuščia tuščia  Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimas dešimt kartų 1 bandinys 1 2 3 4 5 1 bandinio 2 bandinio pakartojimai 6 7 8 9 10

5.3.1. Plokštelės išdėliojamos ant sudrėkinto sugeriamojo popieriaus. Kiekvienas testuojamasis langelis sklidinai pripildomas praskiestų antikūnų tirpalo. Į kiekvieną langelį įpilamo antikūnų tirpalo tūris turi atitikti bent tiriamojo ekstrakto tūrį.

Antikūnų tiekėjams nepateikus vartojimo instrukcijų, laikomasi šios tvarkos:

5.3.2. Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C).

5.3.3. Kiekvienoje duobutėje lašeliai sukratomi ir kruopščiai sudrėkinami, įpilant IF buferinio tirpalo. Perplaunama įpilant IF buferinio tirpalo, turinčio Tween (4 priedėlis), ir palaikoma 5 minutes, o po to įpilama IF buferinio tirpalo ir laikoma dar 5 minutes. Vengti aerozolio susidarymo arba lašelių pernešimo, dėl kurio gali įvykti kryžminė tarša. Perteklinis vanduo atsargiai pašalinamas nusausinant.

5.3.4. Plokštelės išdėliojamos ant drėgno popieriaus ir į duobutes įpilama praskiesto FITC bei antikūnų konjugato titrui nustatyti. Į duobutes įpilamo konjugato tūris turi atitikti įpilamų antikūnų tirpalo tūrį.

5.3.5. Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C).

5.3.6. Konjugato lašeliai pašalinami iš plokštelės juos nukratant. Plokštelė sudrėkinama ir plaunama, kaip pirmiau aprašyta (5.3.3).

Atsargiai pašalinamas perteklinis vanduo.

5.3.7. Į kiekvieną tiriamąjį langelį pipete įlašinama po 5–10 µl 0,1 M glicerino fosfatinio buferinio tirpalo arba komercinio priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio ryškintojo tirpalo (4 priedėlis) ir plokštelė uždengiama dengiamuoju stikleliu.

5.4. IF testo rezultatai:

5.4.1. Tiriamąsias plokšteles stebėti epifluorescenciniu mikroskopu naudojant filtrus, tinkamus FITC sužadinimui, aliejaus ar vandens imersinius tirpalus bei 500–1 000 kartų padidinus. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuose kampuose ir aplink perimetrą. Bandinių, neturinčių arba turinčių nedaug ląstelių, stebima mažiausiai 40 laukelių.

Pirmiausia stebima teigiama kontrolinė plokštelė. Ląstelės turi šviesiai fluorescuoti ir būti visiškai nusidažiusios esant nustatytam antikūnų titrui ar darbiniam praskiedimui. Jei dažymasis nepavyko, IF testą (žr. VI skirsnio A dalies 5 punktą) reikia pakartoti.

5.4.2. Tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos R. solanacearum ląstelės (žr. žiniatinklio svetainę: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis arba net didesnis už teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumą esant tam pačiam antikūnų praskiedimui Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančios ląsteles nekreipiama dėmesio.

Įtarus bet kokį užkrėtimą, testą privaloma pakartoti. Šitai gali atsitikti tokiu atveju, kai visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės dėl buferinio tirpalo taršos arba dėl to, kad ant plokštelės dangtelio stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės lango ribų).

5.4.3. Yra keletas būdingų IF testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų panašių į R… solanacearum savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, pasitaikančių bulvių stiebagumbių viršūnių gabaliukų segmentų nuosėdose.

5.4.4. Tirti tik tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles esant antikūnų titrui arba darbiniam praskiedimui, kaip nurodyta 5.3 skirsnyje.

5.4.5. IF rezultatų aiškinimas:

i) Jei stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos ląstelės, apskaičiuojamas tipiškų ląstelių viename mikroskopiniame laukelyje vidurkis ir tipiškų ląstelių skaičius pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename mililitre (5 priedėlis). Bandiniai, kurių 1 ml yra mažiausiai 5×103 tipiškų ląstelių, laikomi užkrėstais. Reikalaujama juos tirti toliau.

ii) IF testo rezultatai laikomi neigiamais, kai viename bandinių mililitre yra mažiau nei 5×103 ląstelių, ir toks bandinys laikomas neigiamu. Toliau tirti nereikalaujama.

6. PGR testai

Principas

Kai PGR testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, išskyrimo arba IF testą būtina atlikti kaip antrąjį privalomąjį atrankos testą. Kai PGR testas atliekamas kaip antrasis atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, tai paskesnį testavimą reikia atlikti pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad būtų baigtas diagnozavimas.

Šio metodo kaip pagrindinio atrankos testo visas galimybes rekomenduojama panaudoti tik turint patirties tam tikroje srityje.

Pastaba. Išankstinio testavimo taikant šį metodą nustatymo geba 1 mililitre turėtų siekti 103 -104 R. solanacearum ląstelių bandinio ekstraktų, kurie anksčiau buvo įvertinti kaip neigiami. Kad visose laboratorijose būtų pasiektas didžiausias metodo nustatymo jautrumas ir specifiškumas, gali būti reikalaujama atlikti optimizavimo eksperimentus.

Naudoti patvirtintus PGR reagentus ir metodikas (žr. 6 priedėlį). Pirmiausia pasirinkti metodą, kurį taikant naudojamas vidinis kontrolinis bandinys.

Siekiant išvengti bandinio užteršimo tiriamąja DNR, imtis atitinkamų atsargumo priemonių. Kad būtų sumažinta taršos tiriamąja DNR galimybė, PGR testą turėtų atlikti prityręs molekulinės biologijos srityje dirbančių laboratorijų techninis personalas.

Neigiami kontroliniai bandiniai (DNR išskyrimo ir PGR atlikimo metu) visada turėtų būti laikomi galutiniais bandiniais, kuriais įrodoma, ar įvyko tarša DNR.

Atliekant PGR testą reikėtų taikyti šiuos neigiamus kontrolinius bandinius:

— bandinio ekstraktą, kuris per ankstesnį tyrimą buvo rastas neužkrėstas R. solanacearum,

— buferinius kontrolinius tirpalus, naudojamus išskirti iš bandinio bakterijai ir DNR,

— PGR reakcinį mišinį.

Reikėtų naudoti šiuos teigiamus kontrolinius bandinius:

— pakartotinai suspenduotų nuosėdų, prie kurių pridėta R. solanacearum C. m. subsp. sepedonicus, alikvotines dalis (apie paruošimą žr. 3B priedėlyje),

— virulentiško C. m. subsp. sepedonicus izoliato (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; žr. 3B priedėlyje)106/ml ląstelių vandeninę suspensiją,

— jei įmanoma, atliekant PGR testą reikėtų naudoti teigiamų kontrolinių bandinių DNR.

Siekiant išvengti galimos taršos, tiriamieji teigiami kontroliniai bandiniai paruošiami atskirai nuo tiriamųjų bandinių.

Reikėtų stengtis, kad bandinių ekstraktuose nebūtų dirvožemio. Todėl tam tikrais atvejais rekomenduotina išskyrimą atlikti naudojant plautas bulves, jei dirbama pagal PGR metodikas.

Įsigyjamos standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlyje.

6.1. DNR gryninimo metodai

Naudoti teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, kaip aprašyta pirmiau 3 priedėlyje.

Kontrolinę medžiagą paruošti taip pat, kaip ir bandinį.

Tiriamoji DNR iš sudėtingų bandinių substratų išskiriama įvairiais metodais, taigi PGR ir kitų fermentinių reakcijų inhibitoriai pašalinami ir tiriamoji DNR sukoncentruojama bandinio ekstrakte. Paskesnis metodas buvo optimizuotas tam, kad būtų atliekama patvirtinta PGR, aprašyta 6 priedėlyje.

a) Pastrik (2000) metodas:

1. 220 µl lizės buferinio tirpalo (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) įlašinama į 1,5 ml tūrio Eppendorfo mėgintuvėlį.

2. Įpilti 100 µl bandinio ekstrakto ir mėgintuvėlį 10 minučių laikyti termostate arba vandens vonelėje 95 °C temperatūroje.

3. Mėgintuvėlį 5 minutes palaikyti lede.

4. Įpilti 80 µl lizocimo pradinio tirpalo (50 mg lizocimo/ml 10 mM Tris HCl, pH 8,0 buferiniame tirpale) ir 30 minučių inkubuoti 37 °C temperatūroje.

5. Įpilti 220 µl Easy DNA ® tirpalo A (Invitrogen), gerai sumaišyti kratant ir 30 minučių inkubuoti 65 °C temperatūroje.

6. Įpilti 100 µl Easy DNA ® tirpalo B (Invitrogen), intensyviai kratyti prieš nuosėdų susidarymą mėgintuvėlyje ir bandiniui tampant visiškai klampiam.

7. Įpilti 500 µl chloroformo ir kratyti tol, kol sumažėja klampumas ir mišinys tampa homogeniškas.

8. 20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje, kad būtų atskirtos fazės ir susidarytų interfazė.

9. Perpilti viršutinę fazę į naujai paruoštą Eppendorfo mėgintuvėlį.

10. Įpilti 1 ml 100 % etilo alkoholio (–20 °C), trumpai pakratyti ir 10 minučių inkubuoti lede.

11. 20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje ir pašalinti etilo alkoholį iš nuosėdų.

12. Įpilti 500 µl 80 % etilo alkoholio (–20 °C) ir sumaišyti pavartant mėgintuvėlį.

13. 10 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje ir išsaugoti nuosėdas bei pašalinti etilo alkoholį.

14. Leisti nuosėdoms išdžiūti ore arba greitajame DNR siurblyje.

15. Pakartotinai suspenduoti nuosėdas 100 µl steriliame ypač gryname vandenyje ir mažiausiai 20 minučių palikti kambario temperatūroje.

16. Laikyti –20 °C temperatūroje tol, kol bus atliekama PGR.

17. Centrifuguojant išsodinti bet kurį baltos spalvos precipitatą ir 5 µl supernatanto, turinčio DNR, panaudoti PGR atlikti.

b) Kiti metodai

Kiti DNR išskyrimo metodai (pvz., Qiagen DNeasy Plant Kit) galėtų būti taikomi, jei įrodoma, kad jie tokie pat veiksmingi, išskiriant DNR iš kontrolinių bandinių, kurių 1 ml yra 103-104 patogeno ląstelių.

6.2. PGR

6.2.1. Tiriamosios ir kontrolinės PGR matricos paruošiamos pagal patvirtintą metodiką (VI.A.6 skirsnis). Bandinio DNR ekstraktas praskiedžiamas ypač grynu vandeniu santykiu 1:10.

6.2.2. Pagal paskelbtą metodiką paruošiamas atitinkamas PGR mišinys taršai atsparioje aplinkoje (6 priedėlis). Patvirtinta PGR yra daugybinė reakcija, kurią atliekant taip pat naudojamas vidinis PGR kontrolinis bandinys.

6.2.3. 2–5 µl DNR ekstrakto įpilama į 25 µl PGR reakcinio mišinio, esančio steriliuose PGR skirtuose mėgintuvėliuose (žr. 6 priedėlis).

6.2.4. Naudojamas neigiamas kontrolinis bandinys, sudarytas tik iš PGR reakcinio mišinio, ir vietoj bandinio į jį įpilama ypač gryno vandens.

6.2.5. Mėgintuvėliai įdedami į tą patį PGR reaktorių, kuris buvo naudojamas išankstinio tyrimo metu, ir atliekama atitinkamai optimizuota PGR reakcija (6 priedėlis).

6.3. PGR produkto analizė

6.3.1. Padaugintos matricinės DNR bandiniai analizuojami elektroforezės agarozės gelyje metodu. Kiekvieno bandinio į gelį įnešama mažiausiai po 12 µl padaugintos DNR reakcinio mišinio, sumaišyto su 3 µl įnešimo buferinio tirpalo (6 priedėlis). Naudojami 2,0 % (svoris/tūris) agarozės geliai, pagaminti taikant TRIS-acetato-EDTA (TAE) buferinį tirpalą (6 priedėlis) ir elektroforezė atliekama esant 5–8 V/cm. Naudojama atitinkamo ilgio DNR žymė, pvz., 100bp ilgio fragmentas.

6.3.2. DNR juostelės išryškinamos dažant etidiumo bromido dažu (0,5 mg/l) 30–60 minučių, imantis atsargumo priemonių, dirbant su šiuo mutagenu.

6.3.3. Gelis apžiūrimas, apšviečiant jį trumpųjų UV bangų peršvietėju (pvz., bangos ilgiui siekiant λ = 302 nm), stebimi numatomo ilgio padaugintos DNR fragmentai (6 priedėlis) ir nufotografuojami.

6.3.4. Gavus naujų duomenų arba esant naujiems atvejams, nustatomas padaugintos DNR autentiškumas atliekant likusios padaugintos DNR bandinio analizę restriktaze, jį inkubuojant kambario temperatūroje atitinkamo fermento ir buferinio tirpalo mišinyje (žr. 6 priedėlį). Suskaldyti fragmentai analizuojami agarozės gelio elektroforezės metodu ir stebimas būdingas restrikcijos fragmentas, gelį apšviečiant UV peršvietėju, nudažius etidiumo bromidu ir palyginant su nesuskaldytu ir suskaldytu teigiamu kontroliniu bandiniu.

PGR testo rezultato aiškinimas:

PGR testas neigiamas, jei specifinės padaugintas R. solanacearum DNR fragmentas tiriamajame bandinyje nenustatomas, bet jis nustatomas visuose teigiamuose kontroliniuose bandiniuose (kai daugybinė PGR atliekama naudojant augalo atžvilgiu specifinius vidinius kontrolinius pradmenis, antrąjį numatomą PGR produktą reikia padauginti kartu su tiriamuoju bandiniu).

PGR testas yra teigiamas, jei aptinkama specifinė padaugintos R. solanacearum numatomo dydžio DNR ir jos fragmentas, suskaldytas restriktaze (kai reikalaujama), laikantis nuostatos ir laikomasi nuostatos, kad jis negaunamas iš bet kurio neigiamo kontrolinio bandinio. Patikimas teigiamo rezultato patvirtinimas gali būti gaunamas pakartojant testą ir naudojant antrąjį DNR pradmenų rinkinį (6 priedėlis).

Pastaba. PGR inhibiciją galima įtarti, jei padaugintos matricinės DNR gaunama iš teigiamo kontrolinio bandinio, turinčio R. solanacearum vandenyje, tačiau neigiami rezultatai gaunami naudojant teigiamą kontrolinį bandinį, turintį R. solanacearum bulvių ekstrakte. Daugybinę PGR atliekant naudojant vidinius PGR kontrolinius bandinius, reakcijos inhibicija stebima negavus abiejų padaugintų matricinių DNR.

Taršą galima įtarti, jei numatoma padauginta DNR gaunama iš daugiau nei vieno neigiamo kontrolinio bandinio.

7. Fluorescencinės hibridizacijos in situ (FISH) testas

Principas

Kai FISH testas taikomas kaip pirmasis atrankos testas ir nustatoma, kad jis teigiamas, IF testą reikia atlikti kaip antrąjį privalomąjį atrankos testą. Kai FISH testas taikomas kaip antrasis privalomasis testas ir nustatoma, kad jis teigiamas, tai reikalaujama paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą atlikti tam, kad būtų baigtas diagnozavimas.

Pastaba. Naudoti patvirtintus oligonukleotidų, specifiškų R. solanacearum bandinius (7 priedėlis). Taikant šį metodą, išankstinio testavimo nustatymo geba turėtų siekti 103-104 R. solanacearum ląstelių viename mililitre bandinio ekstraktų, kurie anksčiau buvo įvertinti kaip neigiami.

Ši tvarka pirmiausia turėtų būti taikoma šviežiai paruoštam bandinio ekstraktui, tačiau ją taip pat galima taikyti bandinio ekstraktui, kuris buvo laikomas glicerine nuo –16 iki –24 °C arba nuo –68 iki –86 °C temperatūroje.

Bandinio ekstrakto, nustatyto kaip neturinčio R. solanacearum ląstelių, alikvotines dalis naudoti kaip neigiamus kontrolinius bandinius.

3–5 dienų amžiaus kultūrų suspensijas, turinčias R. solanacearum (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857 štamo) 0,01 M fosfatiniame buferiniame tirpale 105-106 ląstelių/ml, reikėtų naudoti kaip teigiamus kontrolinius bandinius (apie paruošimą žr. 3 priedėlyje). Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles, skirtas homologiniam arba bet kuriam etaloniniam R. solanacearum štamui, suspenduotam bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 3B priedėlyje.

Fluoresceino izotiocianato (FITC) žyme pažymėti oligonukleotidiniai bandiniai, specifiški eubakterijoms, labai naudingi kontroliuojant hibridizavimo procesą, kadangi jais nudažomos visos bandinyje esančios bakterijos.

Įsigyjamos standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, naudojamos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlio A dalyje.

Kontrolinis bandinys tiriamas tokiu pat būdu, kaip ir tiriamasis bandinys.

7.1. Bulvių ekstrakto fiksavimas

Paskesnė metodika pagal Wullings et al. (1998):

7.1.1. Paruošti fiksavimo tirpalą (žr.7 priedėlį).

7.1.2. Į Eppendorf mėgintuvėlį įlašinama po 100 µl kiekvieno bandinio ekstrakto ir mėgintuvėlis 7 minutes centrifuguojamas 7 000 g greičiu.

7.1.3. Nupilamas viršnuosėdinis skystis ir nuosėdos ištirpinamos 200 µl fiksažo, paruošto prieš trumpiau kaip 24 valandas. Mėgintuvėlis sumaišomas ir 1 valandą inkubuojamas šaldytuve.

7.1.4. 7 minutes centrifuguojama 7 000 g, nupilamas viršnuosėdinis skystis ir nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 75 µl 0,01 M fosfatiniame buferiniame tirpale (žr. 7 priedėlį).

7.1.5. Į švarios daug duobučių turinčios plokštelės duobutes įlašinama po 16 µl fiksuotų suspensijų taip, kaip parodyta 3 pav. Kiekviena plokštelė skiriama 2 bandiniams ištirti, įlašinant juos nepraskiestus po 10 µl, ir paskiau padaryti 1:100 praskiedimą (0,01 M fosfatiniu buferiniu tirpalu). Likusį bandinio tirpalą (49 µl) galima saugoti 20 °C temperatūroje, pripylus 1 tūrį 96 % etilo alkoholio. Jei reikia pakartoti FISH testą, etilo alkoholis pašalinamas, centrifuguojant ir pripilant tokį pat tūrį 0,01 M fosfatinio buferinio tirpalo (sumaišoma, pavartant aukštyn ir žemyn).

7.1 pav. FISH testui skirtos plokštelės išklotinė

1 bandinys tuščia tuščia tuščia 2 bandinys 1 duobutė 2 duobutė 3 duobutė 4 duobutė 5 duobutė 1 bandinys tuščia tuščia tuščia 2 bandinys 6 duobutė 7 duobutė 8 duobutė 9 duobutė 10 duobutė 1 dengiančioji juostelė 2 dengiančioji juostelė

7.1.6. Plokštelės džiovinamos ore (arba plokštelių džiovintuve 37 °C temperatūroje) ir fiksuojamos liepsna.

Šiame etape darbą galima nutraukti ir hibridizavimą atlikti kitą dieną. Plokštelės turi būti nedulkėtos ir jas reikia laikyti sausas kambario temperatūroje.

7.2. Hibridizavimas

7.2.1. Vanduo pašalinamas iš ląstelių, kas minutę įpilant laipsniškai didėjančios koncentracijos - 50 %, 80 % ir 96 % - etilo alkoholio. Plokštelės džiovinamos, įdėjus jas į plokštelėms skirtą laikiklį.

7.2.2. Parengiama drėgna inkubavimo kamera, oro nepraleidžiančios dėžės dugną uždengus sugeriamuoju arba filtriniu popieriumi, išmirkytu 1× hybmix (7 priedėlis). Dėžė mažiausiai 10 minučių paliekama hibridizavimui skirtoje krosnelėje 45 °C temperatūroje.

7.2.3. Paruošti hibridizacijos tirpalą (7 priedėlis), į vienos plokštelės 8 duobutes (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9 ir 10 duobutes žr. 7.1 pav.) įpilti 10 μl ir 2 centrines duobutes (3 ir 8) palikti laisvas.

7.2.4. Kiekviena plokštelė uždengiama dviem apsauginėmis juostelėmis (24 x 24 mm), kad neprasiskverbtų oras. Plokštelės sudedamos į pašildytą drėgną kamerą ir 5 valandas krosnelėje 45 °C temperatūroje tamsoje atliekamas hibridizavimas.

7.2.5. Į tris laboratorines kolbas įpilama po 1 l Milli Q (molekulinės biologijos darbams skirto) vandens, po 1 l 1x hybmix tirpalo (334 ml 3x hybmix ir 666 ml Milli Q vandens) ir 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix ir 958 ml Milli Q vandens). Kiekviena kolba pašildoma vandens vonioje 45 °C temperatūroje.

7.2.6. Plokštelės atidengiamos ir įdedamos į plokštelių laikiklį.

7.2.7. Bandinio perteklius pašalinamas 15 minučių inkubuojant plokštelę laboratorinėje kolboje, į ją įpylus 1x hybmix, 45 °C temperatūroje.

7.2.8. Plokštelių laikiklis pamerkiamas į 1/8 hybmix plovimo tirpalą ir inkubuojamas dar 15 minučių.

7.2.9. Plokštelės trumpam pamerkiamos į Milli Q vandenį ir padedamos ant filtrinio popieriaus. Perteklinis vanduo pašalinamas, paviršių padengiant filtriniu popieriumi. Į kiekvieną langelį pipete įlašinama po 5–10 μl priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio ryškintojo tirpalo (pvz., Vectashield, Vecta Laboratories, CA, JAV arba jam lygiaverčio) ir visa plokštelė uždengiama viena (24 × 60 mm) dengiančiąja juostele.

7.3. FISH testo rezultatai

7.3.1. Plokšteles, pamerktas į imersinį aliejų, nedelsiant stebėti mikroskopu, tinkančiu epifluorescencinei mikroskopijai, ir padidinus 630 ir 1 000 kartų. Bandinyje esančias eubakterines ląsteles (įskaitant Gram(-) ląsteles) stebint per filtrą, tinkantį fluoresceino izotiocianatui (FITC), jos atrodo fluorescuojančiai žaliai. Cy3 dažu dažytas R. solanacearum ląsteles stebint per filtrą, skirtą tetrametilrodamino-5-izotiocianatui, jos fluorescuoja raudonai. Palyginti tiriamųjų ir teigiamų kontrolinių ląstelių morfologiją. Ląstelės turi fluorescuoti šviesia spalva ir būti visiškai nusidažiusios. FISH testą (VI.A.7 skirsnis) reikia pakartoti, jei dažymasis nepavyko. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuose kampuose ir aplink perimetrą. bandinių, neturinčių arba turinčių nedaug ląstelių, stebima mažiausiai 40 laukelių.

7.3.2. Stebėti būdingos morfologijos šviesiai fluorescuojančias R… solanacearum ląsteles tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose (žr. svetainę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis arba net didesnis už teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumą. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančias ląsteles nekreipiama dėmesio.

7.3.3. Įtarus bet kokią taršą, testą privaloma pakartoti. Šitai gali atsitikti tokiu atveju, kai dėl buferinio tirpalo taršos visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės, arba dėl to, kad stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės lango ribų) ant plokštelės dangtelio.

7.3.4. Yra keletas būdingų FISH testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų ir į R… solanacearum savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, nors tokie atvejai gerokai retesni nei IF testo atveju tiriant bulvių stiebagumbių viršūnės gabaliukų segmentų nuosėdas.

7.3.5. Tirti tik tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles.

7.3.6. FISH testo rezultatų aiškinimas:

i) Teigiami FISH testo rezultatai gaunami tada, kai per FITC filtrą stebimos tipiško dydžio bei morfologijos šviesiai žaliai fluorescuojančios R. solanacearum ir per rodamino filtrą stebint visas teigiamas kontrolines ląsteles, šios fluorescuoja šviesiai raudona spalva, o tarp neigiamų kontrolinių ląstelių jokios fluorescencijos nėra. Jei randama šviesiai fluorescuojančių būdingos morfologijos ląstelių, apskaičiuojamas tipiškų ląstelių viename mikroskopiniame laukelyje vidurkis ir tipiškų ląstelių skaičius pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename mililitre (4 priedėlis). Bandiniai, kurių 1 ml yra mažiausiai 5 × 103 tipiškų ląstelių, laikomi užkrėstais. Reikalaujama juos tirti toliau. Bandiniai, kurių pakartotinai suspenduotų nuosėdų 1 ml yra mažiau kaip 5 × 103 tipiškų ląstelių, laikomi neigiamais.

ii) FISH testas yra neigiamas tada, kai stebint per rodamino filtrą tipiško dydžio ir morfologijos šviesiai raudonai fluorescuojančios R. solanacearum nėra stebimos, laikantis nuostatos, kad šviesiai raudonai fluorescuojančios ląstelės teigiamuose kontroliniuose bandiniuose stebimos, šiuos stebint per rodamino filtrą.

8. IMUNOFERMENTINĖS ANALIZĖS (ELISA) testai

Principas

Imunofermentinė analizė gali būti taikoma tik kaip papildomas testas atliekant IF, PGR ir FISH testus dėl palyginti mažo nustatymo jautrumo šio testo metu. Kai atliekama dviejų antikūnų sluoksnių netiesioginė imunofermentinė analizė (DASI ELISA), praturtinimo operacija ir monokloninių antikūnų naudojimas yra privalomi (žr. svetainę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Mėginių praturtinimas prieš imunofermentinę analizę gali atnešti naudos, kad nustatymo jautrumas šio testo metu padidėtų, tačiau dėl kitų praturtinamų konkuruojančių bakterijų jis gali ir sumažėti.

Pastaba. Naudoti tik patvirtintus antikūnus, specifiškus R. solanacearum (žr. svetainę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Rekomenduojama nustatyti kiekvienos naujos antikūnų partijos titrą. Titras apibrėžiamas kaip didžiausias praskiedimas, kuriam esant vyksta optimali reakcija, kai tiriama R. solanacearum homologinio štamo 105-106 ląstelių viename mililitre suspensija, naudojant atitinkamus antrinių antikūnų konjugatus, remiantis gamintojo rekomendacijomis. Tyrimo metu antikūnų titras turi būti darbinis ir artimas arba lygus komercinio preparato titrui.

Nustatyti antikūnų, titrą R. solanacearum homologinio štamo suspensijoje, kurios 1 ml yra 105-106 ląstelių.

Bandinio ekstraktą, kuris, kaip anksčiau įrodyta, buvo neigiamas R. solanacearum atžvilgiu, ir kryžmiškai nereaguojančių bakterijų fosfatiniame buferiniame tirpale suspensiją naudoti kaip neigiamus kontrolinius bandinius.

Bandinio ekstrakto alikvotines dalis, kurias sumaišius su 103-104 R. solanacearum 2 biovarieteto (pvz., štamo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, žr. 2A ir B priedus) suspensija ir nustačius, kad jos buvo neigiamos R. solanacearum atžvilgiu, naudoti kaip neigiamą kontrolinį bandinį. Atliekant kiekvienos plokštelės rezultatų palyginimą naudojama standartinė R. solanacearum 105-106 ląstelių fosfatiniame buferiniame tirpale suspensija. Užtikrinti, kad atliekant testą plokštelės duobutėse įpilti teigiami kontroliniai bandiniai būtų tinkamai atskirti nuo tiriamųjų bandinių

Standartizuotos teigiamos ir neigiamos kontrolinės medžiagos, skirtos šiam testui atlikti, išvardytos 3 priedėlio A dalyje.

Testui skirtą kontrolinę medžiagą tirti taip pat, kaip ir bandinį (bandinius).

Patvirtintos dvi imunofermentinės analizės metodikos.

a) Netiesioginė imunofermentinė analizė (Robinson Smith et al., 1995)

1. Naudoti 100–200 µl bandinio ekstrakto alikvotines dalis (4 minutes kaitinant 100 °C temperatūroje vandens vonelėje arba termostate, kai kuriais atvejais galima sumažinti nespecifinių rezultatų skaičių).

2. Įpilti tokio pat tūrio dvigubos joninės jėgos plokštelės padengimo buferinio tirpalo (4 priedėlis) ir sukratyti.

3. 100 µl alikvotinių dalių įpilti mažiausiai į dvi mikrotitravimo plokštelės (pvz., Nunc-Polysorp ar lygiavertės markės) duobutes ir 1 valandą inkubuoti 37 °C temperatūroje arba per naktį 4 °C temperatūroje.

4. Ekstraktus išpilti iš duobučių, šias tris kartus perplauti fosfatiniu buferinio tirpalo ir Tween mišiniu (4 priedėlis), paskutinę plovimo tirpalo porciją mažiausiai 5 minutes paliekant duobutėse.

5. Paruošti atitinkamo praskiedimo antikūnų, specifiškų R. solanacearum, blokavimo buferiniame tirpale bandinį (4 priedėlis). Naudojant patvirtintų antikūnų komercinį preparatą, atlikti rekomenduojamus praskiedimus (paprastai dvigubai didesnius už darbinį titrą).

6. Įpilti 100 µl antikūnų bandinio į kiekvieną duobutę ir 1 valandą inkubuoti 37 °C temperatūroje.

7. Išpilti antikūnų tirpalą iš duobučių ir plokštelę perplauti, kaip nurodyta 4 punkte.

8. Paruošti atitinkamo praskiedimo antrinių antikūnų ir šarminės fosfatazės konjugato blokavimo buferiniame tirpale bandinį. Įpilti jo po 100 µl ir 1 valandą inkubuoti 37 °C temperatūroje.

9. Išpilti antikūnų konjugatą tirpalą iš duobučių ir plokštelę perplauti, kaip nurodyta 4 punkte.

10. Į kiekvieną duobutę įpilti po 100 µl šarminės fosfatazės substrato tirpalo (4 priedėlis). Inkubuoti tamsoje kambario temperatūroje ir atlikti plokštelėje esančių bandinių spektrofotometrinį matavimą, išmatuojant absorbciją, bangos ilgiui siekiant 405 nm, reguliariais intervalais 90 minučių laikotarpiu.

b) DVIEJŲ ANTIKŪNŲ SLUOKSNIŲ NETIESIOGINĖ IMUNOFERMENTINė ANALIZĖ (DASI ELISA)

1. Paruošti atitinkamo praskiedimo polikloninių antikūnų, specifiškų R. solanacearum, plokštelės padengimo buferiniame tirpale pH 9,6 (4 priedėlis) bandinį, po 200 µl įpilti į kiekvieną duobutę ir 4–5 valandas inkubuoti 37 °C temperatūroje arba 16 valandų 4 °C temperatūroje.

2. Duobutes tris kartus perplauti fosfatinio buferinio tirpalo ir Tween mišiniu (4 priedėlis). Į mažiausiai dvi duobutes įpilti po 190 µl bandinio ekstrakto. Į kiekvienos plokštelės dvi duobutes įpilti teigiamų ir neigiamų kontrolinių tirpalų ir 16 valandų inkubuoti 4 °C temperatūroje.

3. Duobutes tris kartus perplauti fosfatinio buferinio tirpalo ir Tween mišiniu (4 priedėlis).

4. Paruošti atitinkamo praskiedimo monokloninių antikūnų, specifiškų R. solanacearum, fosfatiniame buferiniame tirpale, taip pat turinčiame 0,5 % galvijų serumo albumino (4 priedėlis), bandinį, į kiekvieną duobutę įpilti po 190 µl ir 2 valandas inkubuoti 37 °C temperatūroje.

5. Duobutes tris kartus perplauti fosfatinio buferinio tirpalo ir Tween mišiniu (4 priedėlis).

6. Paruošti atitinkamo praskiedimo antikūnų, specifiškų pelių imunoglobulinams, ir šarminės fosfatazės konjugato fosfatiniame buferiniame tirpale bandinį, į kiekvieną duobutę įpilti po 190 µl ir 2 valandas inkubuoti 37 °C temperatūroje.

7. Duobutes tris kartus perplauti fosfatinio buferinio tirpalo ir Tween mišiniu (4 priedėlis).

8. Paruošti šarminės fosfatazės substrato tirpalą, kurio 1 ml yra 1 mg p-nitrofenilfosfato (4 priedėlis). Į kiekvieną duobutę pripilti po 200 µl. Plokštelė inkubuojama tamsoje, kambario temperatūroje, ir po to matuojama absorbcija, bangos ilgiui siekiant 40 nm reguliariais intervalais 90 minučių laikotarpiu.

Imunofermentinės analizės rezultatų aiškinimas

Imunofermentinė analizė laikoma neigiama, jei bandinių, esančių dviejose duobutėse (bandinys ir jo pakartojimas), vidutinis optinis tankis (OT) dukart mažesnis už neigiamo bandinio ekstrakto, esančio 1 duobutėje, optinį tankį, laikantis nuostatos, kad visų teigiamų kontrolinių bandinių optinis tankis didesnis nei 1,0 (pasibaigus 90 minučių trukusiai inkubacijai su substratu) ir dukart didesnis už neigiamų bandinių ekstraktų optinį tankį.

Imunofermentinė analizė laikoma teigiama, jei bandinių, esančių dviejose duobutėse (bandinys ir jo pakartojimas), vidutinis optinis tankis (OT) dukart didesnis už neigiamo bandinio ekstrakto, esančio 1 duobutėje, optinį tankį, laikantis nuostatos, kad visų neigiamų kontrolinių bandinių optinis tankis dukart mažesnis už visų teigiamų kontrolinių bandinių optinį tankį.

Teigiamo kontrolinio bandinio optinio tankio rodmenims esant neigiamiems, įrodoma, kad testas nebuvo tinkamai atliktas arba jo metu įvyko slopinimas. Neigiamų kontrolinių bandinių teigiami optinio tankio rezultatai rodo, kad įvyko kryžminė tarša arba prisijungė nespecifiniai antikūnai.

9. Biotestas

Pastaba. Šiuo metodu atliekant išankstinį tyrimą bandinių ekstraktuose, kurie buvo anksčiau neigiami, 1 ml galima nustatyti 103-104 R. solanacearum kolonijas sudarančių vienetų (apie paruošimą žr. 3 priedėlyje).

Didžiausio nustatymo jautrumo galima tikėtis, kai naudojamas šviežiai paruoštas bandinio ekstraktas ir laikomasi optimalių augimo sąlygų. Tačiau šį metodą galima sėkmingai taikyti tiriant ekstraktus, laikytus glicerine nuo –68 iki –86 °C temperatūroje.

Taikoma Janse metodika (1988):

9.1. Auginti 10 tiriamųjų pažeidžiamojo tipo pomidorų augalų (pvz., veislę „Moneymaker“ arba lygiavertę jautrią užkrėtimui veislę, kaip nustatyta tyrimų laboratorijoje), kiekvienam bandomajam augalui esant trečiojo lapelio stadijoje. Dėl auginimo žr. 8 priedėlį. Panašiai auginti baklažanu (pvz., veislę „Black Beauty“ arba lygiavertę užkrėtimui jautrią veislę). Naudoti tik augalus, esančius 2–3 lapelio stadijoje, sudarant sąlygas visiškai pasiekti trečiojo tikrojo lapelio stadiją. Nustatyta, kad simptomai pasireiškia ne taip ūmiai ir lėčiau pasireiškia baklažanuose. Kai įmanoma, rekomenduojama auginti pomidorų daigus.

100 µl bandinio ekstrakto paskirstoma po lygiai visiems tiriamiesiems augalams.

9.2.1. Inokuliavimas švirkštu

Augalų stiebai virš sėklaskilčių inokuliuojami naudojant švirkštą su hipodermine adata (ne mažiau kaip 23G). Inokuliuojant visus augalus, bandinys padalijamas po lygiai.

9.2.2. Inokuliavimas įpjovos vietoje

Laikant augalą dviem pirštais, suspenduotų nuosėdų lašas (apytiksliai 5–10 µl) užlašinamas ant stiebo tarp sėklaskilčių ir pirmojo lapelio.

Steriliu skalpeliu padaromas įstrižinis 1 cm ilgio ir 2/3 stiebo storio gylio pjūvis nuo tos vietos, kur buvo užlašintas suspenduotų nuosėdų lašas.

Naudojant švirkštą, pjūvis užsandarinamas vazelinu.

9.3. Taikant tą patį inokuliavimo metodą, 5 daigai inokuliuojami R. solanacearum virulentiško biovarieteto 2 štamo kultūros 105-106 ląstelių/ml vandenine suspensija 48 val. kaip teigiamu kontroliniu bandiniu ir nuosėdų buferiniu tirpalu (4 priedėlis) kaip neigiamu kontroliniu bandiniu. Siekiant išvengti kryžminės taršos, teigiami ir neigiami kontroliniai augalai atskiriami nuo kitų augalų.

9.4. Augalai testams karantino sąlygomis 4 savaites laikomi 25–30 °C temperatūroje ir esant didelei santykinei drėgmei, tinkamai drėkinant, kad būtų išvengta vytimo, skurdimo dėl vandens trūkumo. Siekiant išvengti taršos, teigiami kontroliniai ir neigiami kontroliniai augalai auginami aiškiai atskirtuose loveliuose šiltnamyje arba auginimui skirtoje patalpoje, o jei trūksta erdvės, juos paveikiant yra užtikrinama atskirtis. Jei skirtingais bandiniais inokuliuojamus augalus reikia auginti kartu, jie atskiriami skydeliais. Tręšimo, laistymo, tikrinimo ir kitų operacijų metu labai rūpinamasi išvengti kryžminės taršos. Būtina užtikrinti, kad į šiltnamius ir auginimui skirtas patalpas nepatektų jokie vabzdžiai kenkėjai, nes jie gali pernešti bakteriją nuo vieno bandinio prie kito.

Stebėti vytimo, epinastijos, chlorozės ir (arba) žemaūgiškumo simptomus.

9.5. Atskirti užkrėstus augalus (II.3 skirsnis) ir identifikuoti spėjamas R. solanacearum kultūras (VI. B skirsnis).

9.6. Jei simptomų nepastebima, po trijų savaičių atliekamas IF/PGR testas naudojant sudėtinį bandinį, gautą iš kiekvieno tiriamojo augalo aukščiau inokuliavimo vietos paėmus 1 cm dydžio stiebo segmentą. Jei testo rezultatai teigiami, atliekamas selektyvaus pasėjimo į auginimo terpę testas (4.1 skirsnis).

9.7. Identifikuoti bet kurias išgrynintas spėjamas R. solanacearum kultūras (VI. B skirsnis).

Biotesto rezultatų aiškinimas

Biotesto patikimi rezultatai gaunami, kai teigiamuose kontroliniuose augaluose pasireiškia tipiški simptomai, iš šių augalų galima išskirti bakteriją ir neigiamuose kontroliniuose augaluose simptomų pastebėta nebuvo.

Biotestas neigiamas, jei tiriamieji augalai neužkrečiami R. solanacearum, laikantis nuostatos, kad R. solanacearum aptinkama teigiamuose kontroliniuose augaluose.

Biotestas teigiamas, jei tiriamieji augalai užkrečiami R. solanacearum.

B. IDENTIFIKAVIMO TESTAI

Spėjamų R. solanacearum izoliatų grynos kolonijos identifikuojamos taikant bent šiuos du testus, pagrįstus skirtingais biologiniais principais.

Atliekant kiekvieną testą, naudojami atitinkami etaloniniai štamai (žr. 3 priedėlį).

1. Mitybiniai ir fermentiniai identifikavimo testai

Fenotipinės savybės, kurios paprastai stebimos arba nėra stebimos R. solanacearum atveju, nustatomos Lelliott ir Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001) metodais.

Testas Numatomas rezultatas Fluorescuojančio pigmento sintezė – Polibetahidroksibutirato intarpai + Oksidavimo/Fermentacijos (O/F) testas O+/F– Katalazės aktyvumas + Kovac’o oksidazės testas + Nitrato redukavimas + Citrato sunaudojimas + Augimas 40 °C temperatūroje – Augimas esant 1 % NaCl + Augimas esant 2 % NaCl – Arginino dihidrolazės aktyvumas – Želatinos skystėjimas – Krakmolo hidrolizė – Eskulino hidrolizė – Levano sintezė –

2. Imunofluorescencinė analizė (IF)

2.1. Paruošti apytiksliai 106 ląstelių/1 ml IF buferinio tirpalo suspensiją (4 priedėlis).

2.2. Atitinkamą antiserumą dukart praskiesti (žr. svetainę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Taikyti IF procedūrą (VI.A.5 skirsnis).

2.4. Imunofluorescencinės analizės rezultatas laikomas teigiamu, jei jos metu nustatytas kultūros titras yra lygiavertis kontrolinio bandinio titrui.

3. Imunofermentinė analizė (ELISA)

Pastaba. Atliekant du identifikavimo testus, taikyti tik šį metodą.

3.1. Paruošti apytiksliai 108 ląstelių vienąkart koncentruotame fosfatiniame buferiniame tirpale suspensiją (4 priedėlis).

3.2. Atitinkamai atlikti imunofermentinę analizę, naudojant monokloninį antikūną, specifišką R. solanacearum.

3.3. Imunofermentinės analizės rezultatas laikomas teigiamu, jei iš kultūros gauto bandinio optinis tankis yra lygus ne mažiau kaip pusei teigiamo kontrolinio bandinio optinio tankio.

4. PGR

4.1. Paruošti apytiksliai 106 ląstelių/1 ml molekulinės biologijos tyrimams skirto vandens suspensiją.

4.2. 100 µl ląstelių suspensijos 4 minutes pakaitinti uždaruose mėgintuvėliuose termostate arba vandens vonelėje 100 °C temperatūroje. Paskiau bandinius galima saugoti –16 – –24 °C temperatūroje tol, kol jų prireiks.

4.3. Atitinkamomis PGR procedūromis padauginami atitinkami R. solanacearum matricinės DNR fragmentai (pvz., Seal et al. (1993); Pastrik and Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)).

4.4. R. solanacearum identifikuojama, jei padauginti matricinės DNR fragmentai yra to paties dydžio ir pasižymi tuo pačiu restrikcinio fragmento ilgio polimorfizmu, kaip ir teigiamas kontrolinis štamas.

5. FISH testas

5.1. Paruošti apytiksliai 106 ląstelių/1 ml ypač gryno vandens suspensiją.

5.2. Taikyti FISH procedūrą (VI.A.7 skirsnis) naudojant mažiausiai du oligonukleotidinius bandinius, specifiškus R. solanacearum (7 priedėlis).

5.3. FISH testo teigiamas rezultatas gaunamas, jei tiriant kultūrą ir teigiamą kontrolinį bandinį gaunamas tas pats rezultatas.

6. Riebiųjų rūgščių tipo nustatymas

6.1. 48 valandas auginti kultūrą triptikazės sojos agare (Oxoid) 28 °C temperatūroje.

6.2. Riebiųjų rūgščių tipą nustatyti taip, kaip nurodyta (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Riebiųjų rūgščių tipo nustatymo testo teigiamas rezultatas gaunamas, jei spėjamos kultūros riebiųjų rūgščių tipas atitinka teigiamo kontrolinio bandinio riebiųjų rūgščių tipą. Būdingų riebiųjų rūgščių - 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ir 18:1 2OH buvimas ir 16:0 3OH nebuvimas visiškai patvirtina užkrėtimą Ralstonia sp.

7. Štamo apibūdinimo metodai

Kiekvienu nauju R. solanacearum išskyrimo atveju rekomenduojama štamą apibūdinti taikant toliau pateikiamus metodus.

Atliekant kiekvieną testą, prireikus naudojamasi etaloniniais štamais (žr. 3 priedėlį).

7.1. Biovarieteto nustatymas

R. solanacearum skirstoma į biovarietetus pagal sugebėjimą panaudoti ir (arba) oksiduoti tris disacharidus ir tris heksozės alkoholius (Hayward, 1964 ir Hayward et al., 1990). Atliekant biovarieteto nustatymo testą, naudojamasi auginimo terpe, aprašyta 2 priedėlyje. Testas atliekamas sėkmingai, jei terpė inokuliuojama grynomis R. solanacearum izoliatų kultūromis dūrio metodu ir inkubuojama 28 °C temperatūroje. Jei terpė išpilstoma į sterilias 96 duobučių plokšteles (1 duobutės tūriui siekiant 200 µl), tai per 72 valandas galima stebėti spalvos pokytį nuo alyvų žalumo iki geltonumo, įrodantį teigiamą testo rezultatą.

Biovarietetas 1 2 3 4 5 Sugebėjimas sunaudoti: Maltozę – + + – + Laktozę – + + – + D (+) Celiobiozę – + + – + Manitolį – – + + + Sorbitolį – – + + – Dulcitolį – – + + –

Nustatant 2 biovarieteto subfenotipus, atliekami papildomi testai.

Biovarietetas 2A (paplitęs visame pasaulyje) Biovarietetas 2A (aptinkamas Čilėje ir Kolumbijoje) Biovarietetas 2T (aptinkamas tropikuose) Trehalozės sunaudojimas – + + Mezo-inozitolio sunaudojimas + – + D ribozės sunaudojimas – – + Pektino skaldymo aktyvumas (1) mažas mažas didelis

7.2. Genominis „pirštų antspaudų“ metodas

R. solanacearum štamų nustatymas molekulinės biologijos metodais apskritai atliekamas taikant šiuos tris metodus:

7.2.1. Restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo analizė (Cook et al., 1989).

7.2.2. Pakartojamos sekos PGR naudojant pradmenis, specifiškus bakterinėms REP, BOX ir ERIC sekoms (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3. Padauginto fragmento ilgio polimorfizmo analizė (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. PGR metodai

Specifiniai PGR pradmenys (Pastrik et al, 2002; žr. 6 priedėlį) gali būti naudojami nustatant R. solanacearum atskirus štamus, priklausančius 1 skyriui (3, 4 ir 5 biovarietetai) ir 2 skyriui (1, 2A ir 2T biovarietetai), kai anksčiau buvo nustatyta, atlikus restrikcijos fragmentų polimorfizmo analizę (Cook et al., 1989) bei nustatant 16S rDNR nukleotidų seką (Taghavi et al., 1996).

C. patvirtinimo metodai

Patogeniškumo testą privaloma atlikti galiausiai diagnozuojant R. solanacearum ir įvertinant kultūrų, identifikuojamų kaip R. solanacearum, virulentiškumą.

1. Paruošti apytiksliai 106 ląstelių, po 24–48 valandų auginimo paimtų iš tiriamojo izoliato ir atitinkamo teigiamo kontrolinio R. solanacearum (pvz., NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; žr. 3 priedėlį), inokuliatą.

2. Inokuliuoti 5–10 pomidorų arba baklažanų daigų 3 lapelio stadijoje esančius stiebus (žr. VI skirsnio A dalies 9 punktą).

3. 2 savaites inkubuoti 25–28 °C temperatūroje esant pakankamai šviesos ir palyginti daug drėgmės, atitinkamai laistant, stengiantis išvengti permirkimo arba sausros sukeliamo poveikio. Grynų kultūrų atveju tipiškas vytimas turėtų įvykti per 14 dienų. Jei pasibaigus šiam laikotarpiui ir augalus inkubuojant dar 3 savaitėms, simptomai nestebimi, R. solanacearum kultūros negalima laikyti patogenine.

4. Stebėti vytimo ir (arba) epinastijos, chlorozės ir žemaūgiškumo simptomus.