Official Journal L 093 , 13/04/1991 P. 0001 - 0048

Finnish special edition: Chapter 3 Volume 37 P. 0012

Swedish special edition: Chapter 3 Volume 37 P. 0012



KOMISIJOS SPRENDIMAS 1991 m. vasario 14 d. nustatantis tam tikrus žalio ir termiškai apdoroto pieno tyrimų ir analizės metodus (91/180/EEB) EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, atsižvelgdama į Europos ekonominės bendrijos steigimo sutartį, atsižvelgdama į 1985 m. rugpjūčio 5 d. Tarybos Direktyvą 85/397/EEB dėl žmonių ir gyvūnų sveikatos įtakos prekybai termiškai apdorotu pienu Bendrijoje([1]) su paskutiniais pakeitimais, padarytais Direktyva 89/662/EEB([2]), ir ypač į jos 10 (2) straipsnį, kadangi 10 (2) straipsnis numato, jog Komisija turi išdėstyti tyrimų ir analizės metodus, naudojamus kontroliuoti atitiktį žalio ir termiškai apdoroto pieno standartams; kadangi yra būtina pateikti metodus, taikomus nustatyti žaliame piene mikroorganizmų skaičių lėkštelėje, ląstelių skaičių, užšalimo temperatūrą ir antibiotikus; kadangi yra būtina pateikti metodus, taikomus nustatyti pasterizuotame piene patogeninius mikroorganizmus, koliforminių bakterijų skaičių, mikroorganizmų skaičių lėkštelėje, fosfatazę, peroksidazę, antibiotikus ir užšalimo temperatūrą; kadangi yra būtina sterilizuotam ir ultraaukštoje temperatūroje apdorotam pienui pateikti metodus ir ypač nustatyti mikroorganizmų skaičių lėkštelėje ir antibiotikus; kadangi dėl techninių priežasčių yra galimybė pirmiausia pateikti tyrimų ir analizės pamatinius metodus, užtikrinančius atitiktį tam tikriems standartams, kadangi yra ypač svarbu toliau tirti sąlygas, kuriose turi būti taikomi įprastiniai analitiniai tyrimų metodai; kadangi laukiant šio tyrimo rezultatų, valstybės narės privalo naudoti atitinkamus įprastinius metodus, užtikrinančius atitiktį Direktyvoje 85/397/EEB nurodytiems standartams; kadangi tyrimų ir analizės pamatinių metodų nustatymas apima ir analitinių procedūrų, kurių būtina laikytis, nustatymą bei tikslumo kriterijų išdėstymą, užtikrinančių vienodą rezultatų aiškinimą; kadangi šiame sprendime numatytos priemonės atitinka Nuolatinio veterinarijos komiteto nuomonę, PRIĖMĖ ŠĮ SPRENDIMĄ: 1 straipsnis Žaliam pienui taikomi šie tyrimų ir analizės pamatiniai metodai: - užšalimo temperatūros nustatymas, - mikroorganizmų skaičiaus nustatymas pagal skaičiuojamas kolonijas lėkštelėje 30 °C temperatūroje, - somatinių ląstelių skaičiaus nustatymas, - antibiotikų ir sulfamidų nustatymas. 2 straipsnis Pasterizuotam pienui taikomi šie tyrimų ir analizės pamatiniai metodai: - užšalimo temperatūros nustatymas, - fosfatazės aktyvumo nustatymas, - peroksidazės aktyvumo nustatymas, - mikroorganizmų skaičiaus nustatymas pagal skaičiuojamas kolonijas lėkštelėje 30 °C temperatūroje, - mikroorganizmų skaičiaus nustatymas pagal skaičiuojamas kolonijas lėkštelėje 21 °C temperatūroje, - koliforminių bakterijų skaičiaus nustatymas pagal skaičiuojamas kolonijas lėkštelėje 30 °C temperatūroje, - antibiotikų ir sulfamidų nustatymas, - patogeninių mikroorganizmų nustatymas. 3 straipsnis Sterilizuotam ir ultraaukštoje temperatūroje apdorotam pienui taikomi šie tyrimų ir analizės pamatiniai metodai: - mikroorganizmų skaičiaus nustatymas pagal skaičiuojamas kolonijas lėkštelėje 30 °C temperatūroje, - užšalimo temperatūros nustatymas, - antibiotikų ir sulfamidų nustatymas. 4 straipsnis Šių pamatinių tyrimų analizės ir metodų tikslumo kriterijai, tyrimų protokolo bendrieji reikalavimai ir mėginių surinkimas atliekamas pagal 1 priede nustatytas taisykles. 5 straipsnis Tyrimų ir analizės pamatiniai metodai, nurodyti 1, 2 ir 3 straipsniuose, yra išdėstyti 2 priede. 6 straipsnis Šis sprendimas turi būti persvarstytas iki 1992 m. gruodžio 31 d., siekiant atsižvelgti į mokslo ir techninę pažangą. 7 straipsnis Šis sprendimas skirtas valstybėms narėms. Priimta Briuselyje, 1991 m. vasario 14 d. Tarybos vardu Ray MAC SHARRY Komisijos narys I PRIEDAS TURINYS Psl. I. Bendrosios nuostatos II. Žalio ir termiškai apdoroto pieno mėginių ėmimas I. BENDROSIOS NUOSTATOS 1. Įvadas. Aprašytos reagentų, įrangos, rezultatų išraiškos, tikslumo ir tyrimų protokolų bendrosios nuostatos. Valstybių narių kompetentingos institucijos ir vykdančiosios laboratorijos, atsakingos už pieno mėginių ėmimą ir tyrimus, privalo laikytis bendrųjų nuostatų. 2. Reagentai 2.1. Vanduo 2.1.1. Kuomet yra minimas vanduo, skirtas tirpinimo, skiedimo ar plovimo tikslams, nesant kitų nurodymų, turi būti vartojamas distiliuotas, dejonizuotas arba bent jau demineralizuotas arba ekvivalentiško grynumo vanduo. Mikrobiologiniams tikslams jis turi būti be medžiagų, kurios galėtų paveikti arba turėti įtakos mikroorganizmų augimui tyrimo sąlygomis. 2.1.2. Kuomet yra nuoroda į "tirpinimą" ar "skiedimą", nesant kokių kitų nurodymų, turima omeny "tirpinimas vandenyje" ar "praskiedimas vandeniu". 2.2. Reagentai. Nesant kitų nurodymų, visi naudojami reagentai turi būti analizinio grynumo. 3. Įranga 3.1. Įrangos sąrašai Skirtinguose pamatiniuose metoduose pateiktuose įrangos sąrašuose yra tik specialios paskirties ir konkretiems techniniams reikalavimams skirta įranga. 3.2. Analizinės svarstyklės Analizinės svarstyklės yra svarstyklės, galinčios sverti 0,1 mg tikslumu. 4. Rezultatų išraiška 4.1. Rezultatai Nesant kitokių nurodymų, analitinis rezultatas protokole turi būti pateikiamas kaip aritmetinis vidurkis, gautas iš dviejų tyrimų, kurie atitinka rezultatų pakartojamumo kriterijų. Jeigu rezultatų pakartojamumo kriterijus nėra įvykdytas, tuomet tyrimas turi būti pakartotas arba rezultatai paskelbti negaliojančiais. 4.2. Procentų skaičiavimas Jeigu kitaip nenurodyta, rezultatas turi būti paskaičiuotas kaip mėginio masės procentas. 5. Tikslumo kriterijai: rezultatų pakartojamumas ir rezultatų atkuriamumas. 5.1. Kiekvieno metodo tikslumo kriterijai apibūdinami tokiu būdu: 5.1.1. Rezultatų pakartojamumas (r) yra vertė, žemiau kurios yra dviejų atskirų tyrimų, gautų naudojant tą patį mėginį, tą patį metodą, tomis pačioms sąlygomis (tas pats analitikas, ta pati įranga, ta pati laboratorija ir trumpas laiko tarpas tarp tyrimų) absoliutus rezultatų skirtumas. 5.1.2. Rezultatų atkuriamumas (R) yra vertė, žemiau kurios yra dviejų atskirų tyrimų, gautų naudojant tą patį mėginį, tą patį metodą ir skirtingomis sąlygomis (skirtingas analitikas, skirtinga įranga, skirtingos laboratorijos ir (arba) skirtingas laiko tarpas tarp tyrimų) absoliutus rezultatų skirtumas. 5.1.3. Nesant kitų nurodymų, kiekvienam metodui atitinkamuose punktuose nurodytos pakartojamumo ir atkuriamumo kriterijų vertės išreiškia 95 % tikimybės lygio intervalus, apibrėžtus ISO 5725 1986 m. antrajame leidinyje. Jos yra skaičiuojamos iš pripažintų tarplaboratorinių tyrimų rezultatų, panaudotų įvertinti metodą. Tačiau kai kuriems metodams bendri bandymai nebuvo atlikti. Šiuo atveju pakartojamumo ir atkuriamumo vertės yra paskaičiuojamos. 5.1.4. 5.1.3. punkte nurodyti tarplaboratoriniai tyrimai ir studijos turi būti planuojami ir atliekami pagal tarptautinius nurodymus. 6. Bandymo protokolas Bandymo protokole smulkiai aprašomi taikyti analizės metodai ir gauti rezultatai. Be to, jame pateikiamos visos procedūros detalės, kurios nėra aprašytos analizės metode arba yra pasirinktinos, taip pat ir visos kitos aplinkybės, kurios gali turėti įtakos gautiems rezultatams. Bandymo protokole pateikiama visa visiškam mėginio identifikavimui būtina informacija. II. ŽALIO IR TERMIŠKAI APDOROTO PIENO MĖGINIŲ ĖMIMAS 1. Taikymo sritis Šis pamatinis metodas taikomas žalio ir termiškai apdoroto pieno mėginių ėmimui. Mėginių ėmimo, saugojimo ir transportavimo procedūros yra taikomos gamintojo pristatytam žaliam pienui, taip pat žaliam ir termiškai apdorotam pienui, esančiam saugojimo ir transportavimo cisternose. 2, 4.4, 5 ir 6 punktuose pateiktos procedūros yra taikomos termiškai apdoroto tiesioginiam vartojimui skirto pieno mėginių ėmimui. 2. Bendrieji reikalavimai Žalio ir termiškai apdoroto pieno, esančio bidonuose, cisternose ir kt., mėginius turi paimti įgudęs, prieš tai tinkamai apmokytas darbuotojas. Esant reikalui, įgaliotos valstybės institucijos arba bandymų laboratorija turi instruktuoti mėginius imantį personalą dėl mėginių ėmimo metodų, siekiant užtikrinti, kad mėginys atstovautų visą siuntą ir atitiktų ją. Jei būtina, įgaliota valstybės institucija arba bandymų laboratorija turi instruktuoti mėginius imantį personalą apie mėginio ženklinimą, siekiant užtikrinti nedviprasmišką mėginio identifikavimą. 3. Mėginių ėmimo įranga 3.1. Bendrieji klausimai Mėginių ėmimo įranga turi būti pagaminta iš nerūdijančio plieno arba kitos reikiamo stiprumo medžiagos, jos konstrukcija turi atitikti numatytą paskirtį (maišymui, mėginių ėmimui ir kt.). Nardinamosios maišyklės ir maišytuvai, skirti maišyti skysčiams induose, privalo turėti pakankamą plotą, kad tolygiai sumaišytų visą pieną, bet nesukeltų gaižaus kvapo. Samtis privalo turėti tvirtą pakankamo ilgio rankeną, kad būtų galima paimti mėginį iš bet kokio gylio indo. Samčio talpa neturi būti mažesnė nei 50 ml. Mėginių indai ir dangčiai turi būti stikliniai arba pagaminti iš tinkamo metalo ar plastiko. Medžiagos, iš kurių yra pagaminta mėginių ėmimo įranga, įskaitant indus ir dangčius, neturi sukelti bet kokių mėginio pokyčių, kurie galėtų paveikti tyrimų rezultatus. Visi mėginių ėmimo įrangos ir taros paviršiai turi būti švarūs, sausi, lygūs, be įtrūkimų, su užapvalintais kampais. 3.2. Mėginių ėmimo įranga mikrobiologiniams tyrimams. Mėginių ėmimo įranga, įskaitant ir indus, išskyrus 3.1 punkte pateiktus reikalavimus, turi būti ir sterili. Jeigu ta pati mėginių ėmimo įranga yra naudojama ir kitam mėginių ėmimui, po kiekvieno mėginio paėmimo ji turi būti nuplauta ir sterilizuojama pagal tyrimų laboratorijos ar įgaliotos valstybės institucijos nurodymus ar reikalavimus, kad būtų išsaugotas vienas po kito imamų mėginių švarumas. 4. Mėginių ėmimo metodika 4.1. Bendrieji reikalavimai Nežiūrint į tai, kokie bus atliekami tyrimai, pienas prieš mėginių ėmimą turi būti kruopščiai sumaišytas rankiniu ar mechaniniu būdu. Mėginys turi būti paimtas tuoj pat po sumaišymo, pienui dar tebesant sumaišytam. Kai iš cisternos tuo pačiu metu imama keletas pieno mėginių, pirmiausia turi būti paimtas mėginys mikrobiologiniam tyrimui. Mėginio dydis turi atitikti tyrimo reikalavimus. Mėginiams naudojamo indo talpa turi būti tokia, kad mėginys beveik ją pilnai užpildytų, tuo būdu sudarant galimybę tinkamai susimaišyti turiniui prieš tyrimą ir vengti sviesto grūdelių susidarymo pervežant. 4.2. Rankinis mėginių paėmimas 4.2.1. Mėginių paėmimas iš pieno kibirų ir bidonų Norint greitai sumaišyti pieną kibire ar bidone, nardinamoji maišyklė judinama aukštyn ir žemyn, užtikrinant, kad pienas, reikiamai susimaišytų ir kad grietinė nepriliptų prie bidono kaklo. Visą siuntą atstovaujantis mėginys turi būti paimtas kaip nurodyta 4.2.4 punkte. 4.2.2. Mėginių paėmimas iš fermos atšaldyto pieno cisternų ar statinių Pienas maišomas mechaniniu ar rankiniu būdu, kol jis tampa pakankamai homogeniškas. Jeigu pieno tūris yra toks, kad mechaninis maišytuvas negali išmaišyti pieno, pienas sumaišomas rankiniu būdu. 4.2.3. Mėginių ėmimas iš svėrimo indo Labai svarbu, kad supiltas į svėrimo indą pienas būtų reikiamai sumaišytas. Siekiant užtikrinti tolygų riebalų pasiskirstymą gali prireikti panaudoti papildomą rankinį ar mechaninį maišymą. Kada pieno siuntos, iš kurios reikia paimti mėginį tūris viršija svėrimo indo talpą, visos siuntos reprezentatyvusis mėginys turi būti paimtas, kaip nurodyta 4.2.4 punkte. 4.2.4. Mėginių paėmimas iš pieno tūrio, esančio keliuose induose Kada pieno kiekis, iš kurio reikia paimti mėginius, yra ne viename inde, reprezentatyvusis kiekis paimamas iš kiekvieno indo ir pažymimas pieno kiekis, kuriam priklauso kiekvienas mėginys. Jeigu mėginių, paimtų iš kiekvieno indo, nereikia tirti atskirai, šių reprezentatyviųjų kiekių porcijos sumaišomos tokiais kiekiais, kurie yra proporcingi kiekiui pieno inde, iš kurio buvo paimtas kiekvienas mėginys. Sumaišius mėginys (- iai) paimami iš šių proporcingų kiekių. 4.2.5. Mėginių paėmimas iš didelių talpų - saugyklų, geležinkelio ir automobilių cisternų 4.2.5.1. Prieš paimant mėginius, pienas tinkamai sumaišomas. Dideliuose induose, saugyklose, geležinkelio ar automobilių cisternose esančiam pienui sumaišyti yra rekomenduojama naudoti mechaninį sumaišymo būdą (4.2.5.2). Sumaišymo laipsnis turi atitikti laiko tarpą, kurio metu pienas buvo ramybės būklėje. Kiekvienu konkrečiu atveju turi būti pademonstruojama, kad sumaišymo efektyvumas yra tinkamas numatytai analizei atlikti; sumaišymo efektyvumo kriterijus turi ypač didelę įtaką analitinių rezultatų, gautų iš mėginių, paimtų iš skirtingų siuntos vietų, arba iš cisternos išpylimo angos, tam tikrais intervalais išpilant pieną, panašumui. Pieno sumaišymo būdas yra laikomas efektyviu, jei dviejų šiomis sąlygomis paimtų mėginių riebalų kiekio skirtumas yra mažesnis kaip 0,1 %. Dideliame inde su dugne esančia išleidimo anga išleidimo vietoje gali būti mažas pieno kiekis, kuris netgi po sumaišymo negali būti laikomas reprezentatyviuoju viso kiekio mėginiu. Todėl mėginius geriau imti per apžiūros angą. Jeigu mėginiai yra imami per išleidimo angą, norint užtikrinti, kad tie mėginiai reprezentuotų visą kiekį, turi būti leidžiama nubėgti pakankamam pieno kiekiui. 4.2.5.2. Didelių kiekių, saugyklų, geležinkelio ar automobilių cisternų turinį galima sumaišyti: - cisternose įmontuotu mechaniniu maišytuvu su elektros variklio pavara, - maišyklėmis su propeleriu, varomomis elektriniu motoru ir uždėtomis ant apžiūros angos taip, kad maišyklė būtų panardinta piene, - pieno recirkuliacijos būdu (geležinkelio ir automobilių cisternų atveju) per perpylimo žarną, pritvirtintą prie cisternos iškrovos siurblių ir įleistą per apžiūros angą, - švariu filtruotu suspaustu oru. Šiuo atveju siekiant išvengti kartaus skonio, turi būti naudojamas minimalus oro slėgis ir tūris. 4.3. Automatinis ar pusiau automatinis mėginių ėmimas Automatiniai ar pusiau automatiniai įtaisai mėginiams paimti iš gamintojo pristatyto šviežio pieno turi būti naudojami pagal bandymų laboratorijos ar kitos įgaliotos valstybės institucijos pateiktus nurodymus. Ši įranga turi būti atitinkamai bandoma prieš pradedant ją naudoti, taip pat reguliariai bandoma, kuomet ji yra naudojama pagal įgaliotos valstybės institucijos nurodymus. Mėginio ėmimo procedūros tinkamumas turi būti tikrinamas siekiant nustatyti: - minimalų surinkto pieno tūrį, iš kurio galima tinkamai paimti mėginį, - bet kurio likučio proporciją, kuri yra susijusi su minimaliu mėginio tūriu, - galimybę paimti visos masės reprezentatyvųjį mėginį po tinkamo sumaišymo. Kada yra naudojama automatinė ar pusiau automatinė mėginių ėmimo įranga, įgaliota valstybės institucija gali nurodyti: - minimalų pieno tūrį, iš kurio turi būti paimti mėginiai, - minimalų mėginio tūrį, - maksimalų likutį, - kokia analizė gali būti atlikta ir kokių reikia imtis atsargos priemonių. 4.4. Termiškai apdoroto pieno, skirto tiesioginiam naudojimui ir esančio mažmeninės prekybos įpakavime, mėginių paėmimas Termiškai apdoroto, skirto tiesioginiam naudojimui ir esančio prekinėje taroje pieno mėginį turi sudaryti nepažeista pakuotė. Esant galimybei, mėginiai turi būti paimti iš įpakavimo mašinos ar įmonės šalto kambario kiek galint greičiau po perdirbimo. Pasterizuotam pienui tai turi būti atlikta apdorojimą dieną. Bet kurio termiškai apdoroto pieno tipo (pasterizuoto, ultraaukštoje temperatūroje apdoroto ir sterilizuoto) imamų mėginių skaičius atitinka tyrimų, kurie bus atliekami pagal tyrimų laboratorijos ar įgaliotos valstybės institucijos, nurodymus. 5. Mėginio identifikavimas Mėginys turi būti paženklintas identifikavimo numeriu, tokiu būdu, kad naudojantis tyrimų laboratorijos ar įgaliotos valstybės institucijos nurodymais, jį būtų galima lengvai atpažinti (žr. 2). 6. Mėginių pervežimas ir laikymas Tyrimų laboratorija pagal pieno tipą ir naudojamą analizės metodą turi parengti nurodymus dėl pieno pervežimo sąlygų, laikymo, periodo tarp mėginių ėmimo ir analizės. Nurodymai turi būti išdėstyti pagal įgaliotos valstybės institucijos reikalavimus. Nurodymuose turi būti pateikti šie reikalavimai: - pervežimo ir laikymo metu turi būti imamasi apsaugos priemonių, siekiant išvengti užteršimo kvapais ir tiesioginės saulės šviesos poveikio. Jei indas, kuriame yra laikomi mėginiai, yra persišviečiantis, jis turi būti laikomas tamsioje vietoje, - žalio pieno mėginiai, skirti mikrobiologinei analizei, turi būti pervežami ir laikomi esant temperatūrai nuo 0 °C iki 4 °C. Laiko tarpas tarp mėginių ėmimo ir analizės turi būti kiek galint trumpesnis ir jokiu būdu ne ilgesnis kaip 36 valandos. Įgaliota valstybės institucija gali priimti laikymo temperatūrą tarp 0 °C ir 6 °C, jeigu laiko tarpas tarp mėginio ėmimo ir analizės ne ilgesnis kaip 24 valandos, - mikrobiologinei analizei skirti pasterizuoto pieno mėginiai turi būti pervežami ir laikomi esant temperatūrai tarp 0 °C ir 4 °C. Laiko tarpas tarp mėginių ėmimo ir analizės turi būti kiek galint trumpesnis ir jokiu būdu neviršijantis 24 valandų, - kiti nei pasterizuoto žalio pieno mėginiai, skirti mikrobiologinei analizei, turi būti laikomi laboratorijoje atšaldyti, ir laiko tarpas tarp mėginio ėmimo ir analizės turi būti kiek galint trumpesnis. Pagal įvairias procedūras kai kurioms analizėms yra taikomos specialios apsaugos priemonės. II. PRIEDAS TURINYS Psl. I. Užšalimo temperatūros nustatymas. II. Fosfatazės aktyvumo nustatymas. III. Peroksidazės aktyvumo nustatymas. IV. Mikroorganizmų skaičiaus nustatymas pagal skaičiuojamas kolonijas 30 °C temperatūroje. V. Mikroorganizmų skaičiaus nustatymas pagal skaičiuojamas kolonijas 21 °C temperatūroje. VI. Koliforminių bakterijų skaičiaus nustatymas pagal skaičiuojamas kolonijas 30 °C temperatūroje. VII. Somatinių ląstelių skaičiaus nustatymas. VIII. Antibiotikų ir sulfamidų nustatymas. IX. Patogeninių mikroorganizmų nustatymas. I. UŽŠALIMO TEMPERATŪROS NUSTATYMAS 1. Taikymo sritis Ši procedūra yra žalio, pasterizuoto, ultraaukštoje temperatūroje apdoroto ir sterilizuoto nenugriebto, pusriebio ir nugriebto pieno užšalimo temperatūros nustatymo pamatinis metodas, naudojant aparatą (termistorinį krioskopą), kuriame termostatiškai valdoma vonia yra atšaldoma elektriniu būdu ir termistorinis zondas pakeičia gyvsidabrio termometrą. Yra dviejų tipų prietaisai. Pirmasis prietaisas rodo aukščiausią užšalimo temperatūrą ant užšalimo kreivės plokščiojoje dalyje, tuo tarpu kitas prietaisas komerciniais tikslais yra sureguliuotas teikti parodymus nustatytu laiku prasidėjus užšalimui. Kadangi užšalimo temperatūros kreivės skirtingam pieno tipui arba pienui ir etaloniniam skiediniui, naudojamam kalibravimui, gali skirtis, šiame pamatiniame metode reikalaujama naudoti kreives rodančius prietaisus. Prietaisai su nustatytu laiku gali būti naudojami įprastiniams analitiniams matavimams. Užšalimo temperatūra naudojama nustatyti pašalinio vandens proporciją piene, su sąlyga, kad mėginio rūgštingumas neviršija 0,18 g pieno rūgšties 100 ml (žr. 7.4) pieno. 2. Apibrėžimas Pieno užšalimo temperatūra - vertė, gauta matuojant pagal aprašytą metodą, išreikšta Celsijaus laipsniais (°C). 3. Principas Pieno mėginys yra smarkiai ataušinamas iki atitinkamos temperatūros priklausomai nuo prietaiso, ir mechaninių vibracijų būdu yra sukeliama kristalizacija, kuri iššaukia greitą temperatūros pakilimą iki kreivės plokščiosios srities, ir tai atitinka mėginio užšalimą. Prietaisas yra kalibruojamas reguliuojant, kad jis turėtų teisingus parodymus dviems etaloniniams skiediniams, naudojant tą pačią procedūrą kaip, ir pieno mėginiams. Esant šioms sąlygoms, kreivės plokščioji sritis rodo pieno užšalimo temperatūrą Celsijaus laipsniais. 4. Prietaisai ir stikliniai indai. Paprastai naudojama ši laboratorinė įranga: 4.1. Krioskopas Krioskopas susideda iš termostatu valdomos aušinimo vonios, termistorinio zondo (puslaidininkinio varžos termometro) su jo grandine ir galvanometro ar automatinio atskaitos įtaiso, mėginių maišytuvo bei prietaiso šaldymui pradėti kartu su mėgintuvėliais. 4.1.1. Aušinimo vonia Gali būti naudojami du aušinimo vonių tipai. 4.1.1.1. Panardinamasis tipas Gerai izoliuota vonia su atitinkamu aušinimo skysčiu, kuris yra taip sumaišytas, kad temperatūros skirtumas tarp dviejų skirtingų temperatūrų skystyje neviršija 0,2 °C. Skysčio temperatūra neturi svyruoti daugiau nei 0,5 °C nuo gamintojo nustatytos vertės. Svarbu palaikyti skystį aušinimo vonioje pastoviame lygyje. Visas mėgintuvėlio paviršius žemiau tūrio ženklo turi būti panardintas į aušinimo skystį. 4.1.1.2. Cirkuliacinis tipas Nenutrūkstama atitinkamo aušinimo skysčio srovė cirkuliuoja aplink mėgintuvėlį. Skysčio temperatūra neturi svyruoti daugiau kaip 0,5 °C gamintojo nurodytos vertės atžvilgiu. Tinkamas aušinimo skystis yra 33 % (pagal tūrį) etano 1,2 diolio (etileno glikolio) vandeninis tirpalas. 4.1.2. Termistorius ir jo grandinė Termistorius turi būti stiklinio zondo tipo, kurio skersmuo neviršija 1,80 0,2 mm ir pagrindinis skersmuo neviršija 0,31 mm. Termistoriaus laiko konstanta turi būti mažesnė kaip dvi sekundės ir vertė (žr. pastabą) turi būti aukšta. Darbo įtampa, srovė ir sklaidos konstanta turi būti tokie, kad termistoriaus temperatūra nepakiltų daugiau nei 0,0005 °C virš jo supančios aplinkos esant -0,512 °C. Maksimali varžos paklaida turi būti 5 %. Kai zondas yra darbo padėtyje krioskope, stiklinio korpuso galas turi būti mėgintuvėlio ašyje ir 44,6 0,1 mm žemiau mėgintuvėlio viršaus (žr. 15 psl.). Reikalingas šablonas vartotojui padedantis įstatyti zondą į šią padėtį. Pastaba apibūdina termistoriaus varžos temperatūrinę charakteristiką pagal formulę: [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] čia: T - temperatūra Kelvinais, R - varža omais, kai temperatūra yra T, [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] - temperatūrinis varžos koeficientas; - konstanta, priklausanti nuo termistoriaus medžiagos. Šiuolaikinėje praktikoje rekomenduojama, kad dydis būtų didesnis kaip 3000. 4.1.3. Matavimo įtaisas ir automatinis atskaitos įtaisas 4.1.3.1. Matavimo principas Naudojamas prietaisas turi užregistruoti pirmąją plokščiąją sritį užšalimo temperatūros kreivėje. Plokščioji sritis yra kreivės dalis, kurioje temperatūra išlieka pastovi 0,002 °C ribose ne mažiau kaip 20 sekundžių. 4.1.3.2. Rankinis atskaitos įtaisas Termistoriaus varža turi būti išlyginama Wheatstone tiltu ar panašiu prietaisu, panaudojant aukščiausios kokybės stabilius rezistorius, kurių paklaida nedidesnė nei 10 % ir kurių temperatūros koeficientas neviršija 2 x 10 -5 °C. Kintamasis (svyruojantis) rezistorius neturi nukrypti nuo tiesiškumo visame jo ruože daugiau nei 0,3 % nuo jo maksimalios vertės. Turi būti rezistorių reguliavimo priemonės skirtos kalibravimo tikslams. Matavimo skalė turi būti suskirstyta intervalais ne didesniais kaip 0,001 °C. 4.1.3.3. Automatinis atskaitos įtaisas Automatinio atskaitos įtaiso skiriamoji galia temperatūros diapazone nuo 0 iki - 1 °C turi būti ne mažesnė kaip 0,001 °C. Automatinio atskaitos įtaiso ir jo grandinės stabilumas turi būti toks, kad tos pačios temperatūros vienas po kito einančios nuorodos nesiskirtų daugiau kaip 0,001 °C. Grandinės tiesiškumas turi būti toks, kad prietaisui teisingai dirbant, nebūtų įvesta jokia paklaida didesnė kaip 0,001 °C bet kuriame diapazono taške nuo - 0,400 °C iki - 0 600 °C. 4.1.4. Maišymo viela Mėginiui maišyti yra naudojama pienui inertiška 1-1,5 mm skersmens metalinė viela. Maišymo viela turi būti pakoreguota pagal amplitudę ir turi būti įmontuota vertikaliai esant jos apatiniam galui lygiai su termistoriaus zondo viršūne. Leidžiama 1,5 mm paklaida aukščiau ar žemiau šios padėties. Maišymo viela turi vibruoti į šonus su pakankama gamintojo nustatyta amplitude (bet ne mažesne kaip 1,5 mm), siekiant užtikrinti tolygią mėginio temperatūrą rezultato nustatymo metu. Normaliai maišant maišymo viela niekada neturi liesti termistoriaus zondą arba mėgintuvėlio sienelę. 4.1.5. Įtaisas užšaldymui pradėti Tai gali būti bet koks įtaisas, kurį paleidus į darbą iš karto prasideda mėginio užšaldymas ir mėginio temperatūra kyla link užšalimo temperatūros. Šiam tikslui gali būti panaudota maišymo viela; vienas būdas yra padidinti vibravimo amplitudę nuo vienos iki dviejų sekundžių, tokiu būdu, kad maišymo viela atsitrenktų į mėgintuvėlio sienelę. 4.1.6. Mėgintuvėliai Mėgintuvėliai (žr. 1 pav.) turi būti stikliniai, jų ilgis turi būti 50,8 0,1 mm; išorinis skersmuo - 16,0 0,1 mm, o vidinis skersmuo 13,5 0,1 mm. Sienelės storis per visą mėgintuvėlį neturi skirtis daugiau kaip 0,1 mm. 29,8 mm nuo mėgintuvėlio viršaus (21 mm virš mėgintuvėlio dugno) turi būti tūrio ženklas, rodantis mėginio tūrį 2,5 0,1 ml. 4.1.7. Elektrinis maitinimas Maitinimo įtampa turi būti stabilizuota aparato viduje arba išorėje, tokiu būdu, kad esant tinklo įtampos 6 % svyravimui, maitinimo įtampos svyravimai nebūtų didesni kaip 1 % įvardintos vertės. 4.2. Analizinės svarstyklės 4.3. 1 000 ml talpos vienaženklės tūrio matavimo kolbos, A klasės. 4.4. Gerai ventiliuojama džiovinimo krosnis, palaikanti 130 1 °C temperatūrą arba ventiliuojama elektrinė krosnis, palaikanti 300 25 °C temperatūrą. 4.5. Džiovintuvas 5. Reagentai 5.1. Boro silikatinio stiklo inde distiliuotas vanduo, užvirintas ir atšaldytas iki 20 2 °C kolboje, kurioje yra anglies dvideginį absorbuojantis vamzdelis. 5.2. Natrio chloridas, analizinio grynumo, smulkiai sumaltas, džiovintas penkias valandas krosnyje 300 25 °C temperatūroje arba alternatyviu būdu išdžiovintas krosnyje 130 1 °C temperatūroje mažiausiai 24 valandas ir atšaldytas iki kambario temperatūros eksikatoriuje. 5.3. Etaloninių tirpalų paruošimas Svėrimo indelyje pasveriamas atitinkamas kiekis (žr. 1 lentelę) sauso natrio chlorido (5.2). Ištirpinama distiliuotame vandenyje (5.1), perpilama į 1 000 ml vienaženklę matavimo kolbą ir praskiedžiama iki žymės 20 2 °C temperatūros vandeniu. Laikoma 5 °C temperatūroje gerai užkimštuose polietileniniuose buteliuose, kurių talpa neviršija 250 ml, ne ilgiau kaip 2 mėnesius. Natrio chlorido tirpalų užšalimo temperatūros 20 °C temperatūroje Na Cl, g/l oC 6,859 - 0,408 7,818 - 0,464 8,149 - 0,483 8,314 - 0,492 8,480 - 0,502 8,646 - 0,512 8,811 - 0,521 8,977 - 0,531 9,143 - 0,541 10,155 - 0,600 Prieš naudojant etaloninį tirpalą, butelis iš lėto apverčiamas ir sukamas keletą kartų, kad gerai susimaišytų jo turinys. Etaloninis tirpalas niekada neturi būti smarkiai maišomas, kad nepatektų į jį oras. Etaloninio tirpalo mėginiai išpilami iš butelio, supilant šį tirpalą į švarią sausą stiklinę, jokiu būdu šiam tikslui negalima naudoti pipečių. Neturi būti naudojami tirpalai, paimti iš butelių, kuriuose yra mažiau nei ketvirtadalis kiekio ir jeigu nėra konservuoti fungicidu (pvz. tiomersalo tirpalu, 10 g/l), jie neturi būti naudojami ilgiau kaip du mėnesius. 6. Termistorinio krioskopo kalibravimas Krioskopas turi būti įrengtas tokiu būdu, kad aplinkos oro temperatūra nepakistų daugiau nei 1 °C nuo tos temperatūros, kurioje yra atliekamas kalibravimas. Krioskopas neturi būti veikiamas saulės spindulių arba skersvėjų ir aukštesnės kaip 26-27 °C kambario temperatūros. Užtikrinama, kad krioskopas būtų gerame darbiniame stovyje pagal gamintojo nurodymus ir būtų įjungtas mažiausiai 12 valandų prieš kalibravimą. Patikrinama zondo padėtis, maišymo vielos vibravimo amplitudę ir aušinančių skysčių temperatūrą. Parenkami du etaloniniai tirpalai (žr. 1 lentelę viršuje), kurie būtų artimi tiriamų pieno mėginių numatomai užšalimo temperatūrai. Pageidautina, kad skirtumas tarp dviejų tirpalų užšalimo temperatūrų būtų ne mažesnis kaip - 0,100 °C. Kai kurių šiuo metu naudojamų krioskopų konstrukcijoje termistoriaus grandinė yra sukonstruota tokiu būdu, kad ji yra išlyginama esant konkrečiai užšalimo temperatūros vertei prietaiso matavimo diapazone. Šiais atvejais etaloninio tirpalo su šia užšalimo temperatūra, kaip vieno iš kalibruojančių tirpalų, naudojimas palengvina kalibravimo procedūrą, ir gamintojas nurodo šią vertę. Pipete įpilama 2,5 0,1 ml vieno etaloninio tirpalo į švarų sausą mėgintuvėlį ir įjungiamas krioskopas. Pastaba Kalibravimui naudojami mėgintuvėliai turi būti pagaminti iš to paties tipo stiklo ir turi būti išplauti ir praskalauti demineralizuotu vandeniu tuo pat metu, kaip ir mėgintuvėliai, naudojami pieno mėginių tyrimui. Etaloninių tirpalų temperatūra turi būti analogiška pieno mėginių temperatūrai. Kalibravimo valdymo rankenėlės reguliuojamos kaip nurodyta gamintojo, kol krioskopo parodymai taps lygūs etaloninio tirpalo užšalimo temperatūrai. Ši procedūra pakartojama su kitu etaloniniu tirpalu ir šiuo būdu toliau kaitaliojama, kol kiekvieno tirpalo vienas po kito einantys parodymai, nereguliuojant kalibravimo valdymo rankenėlių, pateiks kiekvieną teisingą užšalimo temperatūros vertę. Tada krioskopas bus parengtas naudojimui ir tiesiogiai be jokių koregavimų parodys pieno mėginio užšalimo temperatūrą. 7. Mėginio paruošimas 7.1. Jei būtina, mėginiai laikomi nuo 0 iki 5 °C temperatūroje. 7.2. Iš mėginio pašalinami visi matomi svetimkūniai arba kieti sviesto riebalų grūdeliai, jei būtina filtruojama į švarų sausą indą, ir mėginys atsargiai išmaišomas. Jeigu naudojamas filtras, jis turi nereaguoti su pienu ir būti efektyvus naudojant laboratorijos temperatūroje. 7.3. Tyrimai gali būti atliekami tada, kai pienas yra jo laikymo temperatūros (tarp 0° ir 5 °C) arba galima leisti jam pasiekti laboratorijos temperatūrą prieš pat pradedant tyrimą. Tačiau būtina, kad pieno mėginiai ir etaloninis tirpalas, kada jis yra naudojamas, būtų tos pačios temperatūros. 7.4. Titruojant nustatomas pieno rūgštingumas kiek galima tuo pačiu laiku, kada atliekamas užšalimo temperatūros nustatymas. Mėginiai su pieno rūgštingumu, didesniu kaip 0,18 g pieno rūgšties 100 ml pieno, negali būti tiriami. 7.5. Sterilizuotas ir ultraaukštoje temperatūroje apdorotas pienas prieš tyrimą mažiausiai 20 minučių turi būti palaikomas atvirame inde. 8. Procedūra 8.1. Išankstinė kontrolė Patikrinama, kad aušinančiojo skysčio temperatūra ir lygis atitiktų gamintojo nurodymus ir jeigu yra naudojamas termistoriaus zondas, patikrinama jo padėtis tuščiame mėgintuvėlyje.Įjungiamas krioskopas ir užtikrinama, kad aušinantysis skystis būtų tinkamai maišomas ar atitinkamai cirkuliuojamas. Kada krioskopas jau buvo įjungtas mažiausiai 12 valandų, patikrinama aušinančiojo skysčio temperatūra, taip pat maišymo vielos padėtis ir vibravimo amplitudė. 8.2. Įprastinis kalibravimo patikrinimas Prieš atliekant tyrimą, tikrinama natrio chlorido tirpalo užšalimo temperatūra (pvz. tirpalo, kurio užšalimo temperatūra - 0,512 °C), kol du, vienas po kito einantys, parodymai nesiskirs daugiau nei 0,001 °C. Jeigu šių verčių vidurkis skiriasi nuo etaloninio tirpalo užšalimo temperatūros daugiau nei 0,002 °C, iš naujo atliekamas krioskopo kalibravimas, kaip aprašyta 6 punkte. Jeigu krioskopas yra pastoviai naudojamas, įprastinis kalibravimo patikrinimas atliekamas bent jau kas valandą. Būtina atsižvelgti į gamintojo nurodymus. 8.3. Pieno užšalimo temperatūros nustatymas Atsargiai apverčiamas ir keletą kartų sukamas pieno mėginio butelis, kad susimaišytų jo turinys. Mėginys niekada neturi būti labai stipriai maišomas, kad jame neprisirinktų oro. Pipete įpilama 2,5 0,1 ml pieno į švarų, sausą mėgintuvėlį ir pipete pašalinamas jo perteklius. Užtikrinama, kad zondas ir maišymo viela būtų sausi ir švarūs, reikalui esant, atsargiai nuvaloma minkštu, švariu be plaušelių audiniu, traukiant iš apačios į viršų. Mėgintuvėlis įstatomas pagal gamintojo nurodymus į kalibruotą krioskopą. Pienas bus atšaldytas ir užšaldymas prasidės esant gamintojo nurodytai temperatūrai 0,1 °C ribose. (Kai kuriuose automatiniuose prietaisuose šią temperatūrą galima stebėti skaitmeniniais parodymais; mechaniniuose prietaisuose būtinas tikslumas yra pasiekiamas užtikrinant, kad užšalimas prasidėtų, kai galvametro rodyklė arba plona linija sutaps su atitinkamu paženklinimu). Jeigu dėl kokios nors priežasties užšaldymas prasideda prieš arba po nurodyto temperatūros diapazono, tyrimas nutraukiamas ir pakartojamas su kita pieno mėginio porcija. Jeigu pakartotinas mėginys taip pat užšąla anksčiau už nurodytą temperatūrą, kita mėginio dalis pašildoma iki 45 °C ir laikoma 5 minutes, leidžiant ištirpti susikristalizavusiems riebalams. Tada vėl atšaldoma iki tyrimo temperatūros ir iš karto atliekamas nustatymas. Pieno temperatūra prasidėjus šaldymui, gretai kils iki vertės, kuri faktiškai pasiliks pastovi tam tikrą laiko tarpą prieš pradedant vėl kristi. Užšalimo temperatūra atitinka aukščiausią šio periodo metu pasiektą temperatūrą, ir ši vertė užregistruojama protokole. Pastaba Laikotarpis, kai temperatūra lieka pastovi, ir intervalas tarp šaldymo pradžios ir aukščiausios temperatūros pasiekimo skiriasi įvairiuose mėginiuose ir yra žymiai trumpesni vandeniui ir etaloniniams natrio chlorido tirpalams negu pienui. Labai svarbu, kad būtų užregistruota pati aukščiausia temperatūra. Tyrimą patenkinamai užbaigus, mėgintuvėlis nuimamas, praskalaujamas vandeniu, po to išdžiovinamas termistoriaus zondas ir nuvalomas minkštu, švariu, be plaušelių audiniu, vedant iš apačios į viršų, ir analogiškai nustatomai kito pieno mėginio užšalimo temperatūrą. Jeigu skirtumas tarp gautų užšalimo temperatūrų yra didesnis už pakartojamumo vertę (0,004 °C), pakartotinai analogiškai nustatoma b kito mėginio užšalimo temperatūra. Jeigu dvi nustatytos vertės sutampa 0,004 °C ribose, šios vertės užregistruojamos ir panaudojamos galutiniam rezultatui skaičiuoti. 8.4. Zondo aušinimas Panaudojus prietaisą, įdedamas tuščias mėgintuvėlis į naudoto mėgintuvėlio vietą įdedamas tuščias mėgintuvėlis ir nuleidžiama darbinė galvutė, kad zondas būtų šaltas. (Kai kurių konstrukcijų krioskopuose to padaryti negalima; tais atvejais užtikrinama, kad zondas būtų reikiamai ataušintas prieš matuojant, pavyzdžiui, atliekant keletą kontrolinių tyrimų, kol yra gaunami nuoseklūs parodymai). 9. Rezultatų išraiška 9.1. Skaičiavimas Jeigu po įprastinio kalibravimo patikrinimo kalibravimas yra patvirtinamas, suskaičiuojamas pakartotinai gautų užšalimo temperatūros priimtinų verčių vidurkis, suapvalinant iki trečio dešimtainio skaitmens. Jeigu dviejų priimtinų pakartotinų verčių suma yra nelyginis skaičius, vidurkis suapvalinamas iki artimiausios lyginės vertės, kaip parodyta pavyzdyje: Užšalimo temperatūra, °C Tyrimų dvejeto rezultatai Aritmetinis vidurkis - 0,544 - 0,545 - 0,544 - 0,545 - 0,546 - 0,546 9.2. Tikslumas: 9.2.1. Duomenų pakartojamumas (r): 0,004 °C. 9.2.2. Duomenų atkuriamumas (R): 0,006 °C. 1 paveikslas. Termistorinio krioskopo pjūvis (termistoriaus galvutės ir vielinės maišyklės padėtis mėgintuvėlyje) [pic] visi matmenys nurodyti mm II. FOSFATAZĖS AKTYVUMO NUSTATYMAS 1. Taikymo sritis Ši procedūra yra fosfatazės aktyvumo pasterizuotame piene nustatymo pamatinis metodas. 2. Apibrėžimas 2.1. Fosfatazės aktyvumas yra produkte esantis aktyvios šarminės fosfatazės kiekis, išreikštas fenolio kiekiu mikrogramais, metode aprašytomis sąlygomis išskiriamas iš 1 ml pasterizuoto pieno. 2.2. Bet koks pienas, kurio fosfatazės aktyvumas yra mažesnis už 4 g/ml, yra laikomas fosfatazei neigiamu pienu. 3. Principas Fosfatazės aktyvumas yra įvertinamas pagal fenolo kiekį, kuris išsiskiria, į mėginį pridėjus dinatrio fenilfosfato. Išskirtas fenolis reaguoja su dibromoksinochlorimidu, sudarydamas dibromoindofenolą (melsvos spalvos), kuris yra matuojamas kolorimetriniu būdu esant bangos ilgiui 610 nm. Atliekamas sulyginimas su mėginiu, kur fosfatazės fermentas buvo suardytas. 4. Reagentai 4.1. Bario borato - hidroksido buferinis tirpalas 4.1.1. Ištirpinama 50,0 g bario hidroksido (Ba(OH)2 8H2O) vandenyje ir praskiedžiamas iki 1 000 ml. 4.1.2. Ištirpinama 22,0 g boro rūgšties (H3BO3) vandenyje ir praskiedžiama iki 1 000 ml. 4.1.3. Pašildoma 500 ml kiekvieno tirpalo iki 50 °C, jie sumaišomi, greitai atšaldomi iki 20 °C, jeigu reikalinga, pakoreguojamas pH iki 10,6 0,1 pridedant 4.1.1 arba 4.1.2. punktuose nurodyto tirpalo. Nufiltruojama. Tirpalas laikomas sandariai užkimštame inde. 4.1.4. Prieš panaudojant tirpalas atskiedžiamas vienodu vandens tūriu. 4.2. Nuspalvinimo buferinis tirpalas 6,0 g natrio metaborato (NaBO2) arba 12,6 g (NaBO2 4H2O) ir 20 g natrio chlorido (NaCl) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 000 ml. 4.3. Spalvos skiedinio buferinis tirpalas 10 ml nuspalvinimo buferinio tirpalo (4.2) praskiedžiama vandeniu iki 100 ml. 4.4. Buferis substrato tirpalas 0,1 g bevandenio, neturinčio fenolo, dinatriofenilfosfato ištirpinama 100 ml buferinio tirpalo (4.1.3) arba 0,5 g dinatrio fenilfosfato ištirpinama 4,5 ml nuspalvinimo buferiniame tirpale (4.2), įlašinami du lašai BQC tirpalo (4.6) ir paliekama 30 minučių kambario temperatūroje. Susidariusi spalva ekstrahuojama, naudojant 2,5 ml 1-butanolio ir paliekama stovėti, kol 1-butanolis atsiskirs. 1-butanolis nupilamas. Esant reikalui, ši ekstrakcija pakartojama. Tirpalas gali būti laikomas šaldytuve keletą dienų; prieš vartojimą spalva išryškinama ir iš naujo ekstrahuojama. Buferinio substrato tirpalas paruošiamas prieš pat vartojimą, praskiedžiant šio tirpalo 1 ml iki 100 ml bario borato hidroksido buferiniu tirpalu (4.1.3). 4.5. Cinko ir vario nusodiklis 3,0 g cinko sulfato (ZnSO4 7H2O) ir 0,6 g vario (II) sulfato (CuSO4 5H2O) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 100 ml. 4.6. 2.6-dibromoksinonchlorimido tirpalas (BQC tirpalas) 40 1 mg 2,6-dibromoksinonchlorimido (C6H2Br2CINO6) ištirpinama 10 ml 96 % (pagal tūrį) etilo spirito. Laikoma tamsios spalvos butelyje šaldytuve. Jei jis praranda spalvą arba yra laikomas ilgiau kaip vieną mėnesį, išmetamas. 4.7. Vario (II) sulfato tirpalas 0,05 g vario (II) sulfato (CuSO4 5H2O) ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 100 ml. 4.8. Fenolio etaloniniai tirpalai 4.8.1. Pasveriam 200 2 mg gryno bevandenio fenolio, jis supilamas į 100 ml matavimo kolbą, praskiedžiama vandeniu iki žymės ir sumaišoma. Šis pagrindinis tirpalas keletą mėnesių laikomas šaldytuve lieka stabilus. 4.8.2. 10 ml šio pagrindinio tirpalo atskiedžiama vandeniu iki 100 ml ir sumaišoma. 1 ml yra 200 g fenolio. 5. Prietaisai ir stikliniai indai Pastabos: a) Visi stikliniai indai, kamščiai ir mėginių ėmimo priemonės turi būti kruopščiai išvalomi. Rekomenduojama praskalauti juos šviežiai užvirintu distiliuotu vandeniu arba palaikyti garuose. b) Kai kurie plastikinių kamščių tipai gali sukelti užteršimą fenoliu ir todėl jų negalima leisti vartoti. Įprasta laboratorinė įranga: 5.1. Analizinės svarstyklės 5.2. Vandens vonia, palaikanti 37 1 °C temperatūrą. 5.3. Spektrofotometras, tinkantis matuoti esant 610 nm bangos ilgiui. 5.4. Mėgintuvėliai 16 arba 18 mm x 150 mm pageidautinai su 5 arba 10 ml padalomis. 5.5. Pipetės 5.6. Tinkamo dydžio, pvz., 5 cm skersmens stikliniai piltuvėliai. 5.7. Mažiausiai 9 cm skersmens daugiasluoksniai filtrai, skirti filtruoti vidutiniu greičiu. 5.8. Matavimo kolbos etaloniniams tirpalams paruošti. 6. Procedūra Pastabos: a) Rezultato nustatymo metu vengiama tiesioginių saulės spindulių. b) Užteršimas seilių ar prakaito pėdsakais gali duoti neteisingus teigiamus rezultatus, todėl turi būti vengtinas. Šiuo atžvilgiu ypatingas dėmesys skiriamas darbui su pipete. 6.1. Mėginio paruošimas 6.1.1. Analizė atliekama iš karto po mėginio paėmimo. Priešingu atveju mėginiai laikomi šaldytuve, bet ne ilgiau kaip dvi dienas. 6.2. Mėginys Į kiekvieną iš dviejų mėgintuvėlių (5.4) pipete įpilama po 1 ml mėginio, naudojant vieną mėgintuvėlį kaip kontrolinį. 6.3. Rezultato nustatymas 6.3.1. Kontrolinis mėgintuvėlis pakaitinamas dvi minutes verdančiame vandenyje; bandymo mėgintuvėlis ir laboratorinė verdančio vandens stiklinė apdengiami aliumine folija siekiant užtikrinti, kad bus kaitinamas visas mėgintuvėlis. Greitai atšaldoma iki kambario temperatūros. 6.3.2. Likusią procedūros dalį su kontroliniu mėginiu elgiamasi vienodai. Pripilama 10 ml buferinio substrato (4.4) ir sumaišoma. 6.3.3. Iš karto mėgintuvėliai įstatomi į vandens vonią (5.2) 60 minučių, kartais pamaišant (mažiausiai 4 kartus). 6.3.4. Kaitinama verdančiame vandenyje 2 minutes, kaip nurodyta 6.3.1 punkte. Greitai atšaldoma iki kambario temperatūros. 6.3.5. Įpilama po 1 ml cinko ir vario nusodiklio (4.5) į kiekvieną mėgintuvėlį ir kruopščiai išmaišoma. 6.3.6. Nufiltruojama naudojant sausą filtrinį popierių, išpilami pirmieji 2 ml, pakartotinai nufiltruojama, jeigu būtina, kol filtratas bus visiškai skaidrus, ir surinkama į mėgintuvėlį 5 ml filtrato. 6.3.7. Įpilama 5 ml nuspalvinimo buferinio tirpalo (4.2). 6.3.8. Įpilama 0,1 ml BQC tirpalo (4.6), sumaišoma ir leidžiama per 30 minučių kambario temperatūroje išryškėti spalvai. 6.3.9. Spektrofotometru pamatuojama absorbcija, lyginant su kontroliniu, esant 610 nm bangos ilgiui. 6.3.10. Jeigu pagal 6.3.9 punktą pamatuota absorbcija viršija etaloninio tirpalo, kuriame yra 20 g fenolio, absorbciją, pamatuotą pagal 6.4.4 punktą, analizė pakartojama atitinkamai atskiedus mėginį. Skiedžiama sumaišant vieną mėginio tūrio dalį su atitinkamu to paties mėginio tūriu, atsargiai pakaitintu iki virimo, kad būtų inaktyvuojama fosfatazė. 6.4. Kalibravimo kreivės paruošimas 6.4.1. Parengiamas tinkamas etaloninio fenolio tirpalas (4.8.2), turintis 0 (kontroliniame), 2, 5, 10 ir 20 g fenolio 1 mililitre ir pipete atitinkamai prilašinama po 1 ml vandens ir po 1 ml keturių etaloninių fenolio tirpalų į kiekvieną iš penkių mėgintuvėlių. 6.4.2. Į kiekvieną mėgintuvėlį pripilama po 1 ml vario (II) sulfato tirpalo (4.7), 5 ml praskiesto spalvos išryškinimo buferinio tirpalo (4.3), 3 ml vandens ir 0,1 ml BQC tirpalo (4.6), sumaišoma. 6.4.3. Leidžiama spalvai išryškėti per 30 minučių, esant kambario temperatūrai. 6.4.4. Absorbcija išmatuojama spektrofotometru, esant 610 nm bangos ilgiui (5.3).lyginant su kontroliniu mėginiu. 6.4.5. Iš absorbcijos verčių (6.4.4), gautų pagal pridėto fenolio kiekį (6.4.1), naudojant mažiausių kvadratų metodą, apskaičiuojama regresijos tiesė. 7. Rezultatų išraiška 7.1. Skaičiavimas ir formulė 7.1.1. Naudojant gautą regresijos tiesę (6.4.5), iš absorbcijos verčių (6.3.9) paskaičiuojamas fenolio kiekis. 7.1.2. Paskaičiuojamas fosfatazės aktyvumas, išreikštas fenolio mikrogramais viename pasterizuoto pieno mililitre, pagal formulę: Fosfatazės aktyvumas = 2,4 x A x D kur: A - fenolio kiekis mikrogramais, gautas pagal 7.1.1 punktą D - skiedimo koeficientas pagal 6.3.10 punktą (jei nebuvo skiedžiama, D = 1) 2,4 yra skiedimo koeficientas (5/12 viename ml mėginio). Žr. 6.2. punktą kartu su 6.3.2, 6.3.5 ir 6.3.6 punktais. 7.2. Tikslumas 7.2.1. Rezultatų pakartojamumas (r) - 2 g fenolio/ml. 7.2.2. Rezultatų atkuriamumas (R): 3 (preliminariai) g fenolio/ml. 7.2.3. Jeigu skiedimas yra taikomas pagal 6.3.10, 7.2.1 ir 7.2.2 punktuose paminėtas ribas, tikslumas taikomas praskiesto mėginio rezultatams. III. PEROKSIDAZĖS AKTYVUMO NUSTATYMAS 1. Taikymo sritis Ši procedūra yra pamatinis metodas peroksidazės fermento piene, atliekant pasterizavimo kontrolę, nustatymui. 2. Apibrėžimas Peroksidazės teigiama reakcija: Jeigu pienas yra tinkamai pasterizuotas, per 30 sekundžių po sumaišymo su reagentais nusidažo mėlyna spalva. Peroksidazės neigiama reakcija: Praėjus 30 sekundžių po sumaišymo su reagentais, spalva nepasikeičia. 3. Principas Peroksidazės fermentas ardo vandenilio peroksidą. Išskirtas atominis vandenilis oksiduoja bespalvį 1,4 - fenilendiaminą į purpurinį indofenolą (Storch bandymas). Spalvos intensyvumas yra proporcingas fermento koncentracijai. 4. Reagentai 4.1. 1,4 - fenilendiamino tirpalas 2 g 1,4 fenilendiamino (C6H8N2) ištirpinama šiltame (50 °C) vandenyje ir praskiedžiama iki 100 ml. Tirpalas laikomas tamsiame rudo stiklo butelyje su stikliniu kamščiu, vėsioje ir tamsioje vietoje. Jei per 1-2 dienas po paruošimo 1,4-fenilendiamino tirpalas išskiria nuosėdas, jis išpilamas. 4.2. Vandenilio peroksido tirpalas 9 ml 30 % vandenilio peroksido atskiedžiama vandeniu iki 100 ml. Stabilizavimui 1 ml koncentruotos sieros rūgšties pripilama į 1 l tirpalo. Vandenilio peroksido tirpalas yra stabilus vieną mėnesį, jeigu jis yra laikomas vėsioje tamsioje vietoje butelyje su stikliniu kamščiu, apsaugant nuo bet kokio sąlyčio su organiniais junginiais. 5. Procedūra 5.1 5 ml pieno mėginio įpilama į švarų mėgintuvėlį su tinkamu kamščiu. 5.2. Pripilama 5 ml 1,4-fenilendiamino tirpalo (4.1). 5.3. Įlašinami 2 lašai vandenilio peroksido tirpalo (4.2). 5.4. Spalvos susidarymas stebimas 30 sekundžių po sumaišymo. Jeigu mėlyna spalva atsiranda vėliau, praėjus 30 sekundžių po sumaišymo, reakcija yra nespecifinė. IV. MIKROORGANIZMŲ SKAIČIAUS NUSTATYMAS PAGAL SKAIČIUOJAMAS KOLONIJAS LĖKŠTELĖJE 30 °C TEMPERATŪROJE 1. Taikymo sritis Ši procedūra yra pamatinis metodas mikroorganizmų skaičiaus, naudojant kolonijų suskaičiavimo metodą 30 °C temperatūroje, nustatymui. Metodas yra taikomas žaliam, pasterizuotam pienui, taip pat sterilizuotam ir ultraaukštoje temperatūroje apdorotam pienui, prieš tai 15 dienų išlaikytam 30 °C temperatūroje. 2. Apibrėžimas "Mikroorganizmai" reiškia organizmus, formuojančius suskaičiuojamas kolonijas, kai jie laikomi aprašytomis aerobinėmis s sąlygomis. 3. Principas Tam tikras pieno mėginio tūris yra sumaišomas Petri lėkštelėse su mitybine terpe ir laikomas 72 valandas 30 °C temperatūroje. Kolonijos yra suskaičiuojamos ir paskaičiuojamas mikroorganizmų skaičius, esantis 1 ml žalio ar pasterizuoto pieno arba 0,1 ml sterilizuoto ar ultraaukštoje temperatūroje apdoroto pieno su pradiniu išlaikymu. 4. Prietaisai ir stikliniai indai Paprastai naudojama laboratorinė įranga: 4.1. Prietaisai 4.1.1. Sterilizavimo krosnis, kurioje palaikoma (170-175) °C temperatūra. 4.1.2. Autoklavas, kuriame palaikoma 121 1 °C temperatūra. 4.1.3. Termostatas, galintis palaikyti visoje erdvėje 30 1 °C temperatūrą. 4.1.4. PH-metras su temperatūros reguliatoriumi, veikiantis 0,1 pH vieneto tikslumu. 4.1.5. Vandens vonia, palaikanti 45 1 °C temperatūrą. 4.1.6. Lupa, galinti padidinti 2-4 kartus. 4.1.7. Lupa, galinti padidinti 8-10 kartus. 4.1.8. Skaitiklis. 4.1.9. Maišytuvas, galintis sumaišyti 1 ml pieno mėginio arba atlikti dešimtkartį atskiedimą su 9 ml skiediklio ir dirbantis ekscentriniu rotaciniu tiriamųjų mėgintuvėlių skysčių judesiu. 4.2. Stikliniai indai 4.2.1. Tinkamai uždaromi pakankamos talpos mėgintuvėliai, turintys viršuje pakankamai erdvės sumaišyti 10 ml pirminio skiedinio ar tolimesnius dešimtkarčius skiedinius. 4.2.2. Nuo 150 iki 250 ml talpos kolbos arba apie 20 ml talpos mėgintuvėliai mitybinei terpei laikyti. 4.2.3. Pipetės (su vatos kamščiais), pagamintos iš stiklo ar sterilios sintetinės medžiagos su nenudaužtu galu, 1 ml talpos žyme, kurių ištekėjimo angos skersmuo nuo 1,75 iki 3 mm. 4.2.4. Petri lėkštelės, pagamintos iš skaidraus nespalvoto stiklo ar sterilios sintetinės medžiagos, kurių indo dugnas turi apie 90-100 mm vidinį skersmenį. Vidaus gylis turi būti ne mažiau kaip 10 mm. Dugnas turi būti be nelygumų, trukdančių skaičiuoti kolonijas. 4.2.5. Stiklinių indų sterilizavimas. Stikliniai indai turi būti sterilizuojami, naudojant vieną iš šių procedūrų: a) laikant juos ne trumpiau kaip vieną valandą sterilizavimo krosnyje, temperatūroje nuo 170° iki 175 °C (4.1.1); b) laikant juos ne trumpiau kaip 20 minučių autoklave, 121 1 °C temperatūroje (4.1.2). Autoklave būtinai užtikrinamas pakankamas garų prasiskverbimas - t. y., jeigu įranga yra sterilizuojama induose, jie neturi būti aklinai uždaryti, kolbų kamščiai turi būti atlaisvinti. Autoklave sterilizuoti stikliniai indai išdžiovinami išleidus garą. Pipetės sterilizuojamos sterilizavimo krosnyje (4.1.1). 5. Pieno agaro mitybinė terpė. 5.1 Sudėtis: Mielių ekstrakto 2,5 g Triptono 5,0 g Gliukozės D (+) arba dekstrozės 1,0 g Nugriebto pieno miltelių 1,0 g Agaro nuo 10 iki 15 g, priklausomai nuo naudojamo agaro sudaromo gelio tvirtumo Vandens 1 000 ml Nugriebto pieno milteliai turi būti be inhibitorinių medžiagų. Tai tikrinama naudojant lyginamuosius tyrimus su nugriebto pieno milteliais, kurie neturi inhibitorinių medžiagų. Paruošimas: Sudėtinės dalys pasveriamos ir ištirpinamos vandenyje šia tvarka: mielių ekstraktas, triptonas, gliukozė ir galiausiai nugriebto pieno milteliai. Kaitinimas pagreitina suspensijos tirpimą. Pridedama agaro ir kaitinama iki virimo, kol agaras pilnai ištirpsta, arba tirpinama garuose apie 30 minučių. Jeigu būtina, filtruojama per filtrinį popierių. Patikrinamas pH su pH-metru (4.1.4) ir, jeigu būtina, naudojant natrio hidroksido ar druskos rūgšties tirpalą (mažiausiai 0,1 mol/l koncentracijos), pakoreguojamas pH tokiu būdu, kad po sterilizacijos jis būtų 6,9 0,1, matuojant 25 °C temperatūroje. 5.2. Mitybinės terpės išpilstymas, sterilizacija ir laikymas. Terpė (5.1) išpilstoma į kolbas po 100-150 ml arba į mėgintuvėlius (4.2.2) po 12-15 ml. Kolbos ir mėgintuvėliai užkemšami. Sterilizuojama 15 minučių autoklave (4.1.2) 121 1 °C temperatūroje. Patikrinama terpės pH. Jeigu terpė iš karto nenaudojama, laikoma tamsoje nuo 1 iki 5 °C temperatūroje ne ilgiau kaip vieną mėnesį po paruošimo. 5.3. Komercinė sausoji mitybinė terpė. Mitybinė terpė (5.1) paruošiama iš komercinės sausosios terpės. Laikomasi gamintojo nurodymų, bet prieš ištirpinant pridedama nugriebto pieno miltelių, jeigu jų nėra tarp sudėtinių dalių. Pakoreguojamas pH iki 6,9 0,1, 25 °C temperatūroje, kaip aprašyta 5.1 punkte, ir išpilstoma; terpė sterilizuojama ir laikoma, kaip nurodyta 5.2 punkte. 6. Skiedikliai 6.1. Peptono fiziologinis tirpalas Sudėtis Peptono 1,0 g Natrio chlorido (Na Cl) 8,5 g Vandens 1 000 ml. Paruošimas: Sudedamosios dalys ištirpinamos vandenyje, jeigu būtina, pakaitinama. Patikrinamas pH su pH-metru (4.1.4) ir, jeigu būtina, naudojant natrio hidroksido ar druskos rūgšties tirpalą (mažiausia 0,1 mol/l koncentracijos), pH pakoreguojamas tokiu būdu, kad po sterilizacijos jis būtų 7,0 0,1, 25 °C temperatūroje. 6.2. Skiediklio išpilstymas, sterilizavimas ir laikymas Skiediklis (6.1) išpilstomas į mėgintuvėlius (4.2.1) tokiais kiekiais, kad po sterilizacijos kiekviename mėgintuvėlyje būtų 9,0 0,2 ml skiediklio. Mėgintuvėliai užkemšami. Sterilizuojama autoklave (4.1.2) 121 1 °C temperatūroje 15 minučių. Patikrinama skiediklio pH. Jeigu skiediklis iš karto nenaudojamas, laikomas tamsoje, nuo 1° iki 5 °C temperatūroje, ne ilgiau kaip vieną mėnesį po paruošimo. 6.3. Komerciniai sausieji skiedikliai Skiediklis (6.1) gali būti paruoštas iš komercinių sausųjų tablečių ar miltelių. Ruošiama pagal gamintojo nurodymus. Pakoreguojama, kaip aprašyta 6.1 punkte, ir ištirpinama, tirpikliai sterilizuojami ir laikomi kaip nurodyta 6.2 punkte. 7. Procedūra 7.1. Terpės ištirpinimas Prieš pradedant mikrobiologinį tyrimą, greitai ištirpinamas reikiamas terpės kiekis ir terpė kaitinama iki 45 1 °C vandens vonioje (4.1.5). 7.2. Pieno mėginio paruošimas Pieno mėginys kruopščiai išmaišomas, greitai vartant indą su pieno mėginiu 25 kartus, tokiu būdu kad mikroorganizmai pasiskirstytų kiek galima tolygiau. Vengiama putojimo arba leidžiama putoms pasiskirstyti. Laikotarpis tarp sumaišymo ir pieno mėginio paėmimo neturi viršyti trijų minučių. 7.3. Pirmojo skiedinio paruošimas (10-1) (žaliam ir pasterizuotam pienui). 1 ml žalio ar pasterizuoto pieno mėginio (4.2.3) sterilia pipete (4.2.3) įpilama į 9 ml skiediklio (6.1), vengiant pipetės ir skiediklio sąlyčio. Skiediklio temperatūra turi būti apytikriai tokia pati, kaip ir pieno mėginio. Šis pirminis skiedinys atsargiai maišomas 5-10 sekundžių maišytuve. Tokiu būdu yra gaunamas pirminis skiedinys 10-1. 7.4. Tolimesnių dešimtkarčių skiedinių (žaliam ir pasterizuotam pienui) paruošimas. 1 ml pirmojo skiedinio (7.3) įpilama sterilia pipete (4.2.3) į 9 ml skiediklio (6.1) pagal 7.3 punkte pateiktas instrukcijas. Tokiu būdu gaunamas 10-2 skiedinys. Šie veiksmai pakartojami siekiant gauti tolimesnius dešimtkarčius skiedinius, kol gaunamas atitinkamas mikroorganizmų skaičius (8.1.1). 7.5. Sėjimas į Petri lėkšteles. 7.5.1. Žalias pienas. Į Petri lėkštelę (4.2.4) sterilia pipete (4.2.3) įpilama 1 ml mėginio ir (arba) atitinkamas dešimtkartis skiedinys. Turi būti ištirti mažiausiai du skiediniai. Paruošiamas vienas indelis iš kiekvieno pasirinkto tinkamo skiedinio (8.1.1). 7.5.2. Pasterizuotas pienas: įpilama sterilia pipete (4.2.3) 1 ml mėginio ir (arba) atitinkamo dešimtkarčio skiedinio į lėkštelę (4.2.4). Turi būti ištirti mažiausiai du skiediniai. Kiekvienam pasirinktam skiediniui (8.1.1) paruošiama po dvi Petri lėkšteles. 7.5.3. Sterilizuotas ir ultra aukštoje temperatūroje apdorotas pienas (tiriamas po 15 dienų išlaikymo 30 °C temperatūroje - Direktyvos A priedas, VII skyrius, 5 punktas): Į Petri lėkštelę (4.2.4) sterilia pipete (4.2.3) įpilama 0,1 ml pieno mėginio (7.2). Paruošiamos dvi lėkšteles. 7.6. Terpės supylimas. Į kiekvieną sėjamą lėkštelę įpilama apytikriai nuo 15 iki 18 ml terpės (7.1). Iš karto po išpilstymo maišoma Petri lėkštelė pakankamai sukant, kad kolonijos po išlaikymo tolygiai išsiskaidytų. Laikotarpis tarp pieno mėginio paruošimo ir sumaišymo su terpe, priklausomai nuo pieno, mėginio ar skiedinio rūšies, neturi būti ilgesnis kaip 15 minučių. Leidžiama sustingti ant švaraus, vėsaus, horizontalaus paviršiaus. 7.7. Petri lėkštelių inkubavimas Lėkštelės sudedamos į termostatą (4.1.3). Lėkštelės laikomos apverstos. Jos sudedamos viena ant kitos, ne daugiau kaip šešios. Sudėtų lėkštelių krūvos turi būti atskirtos viena nuo kitos, taip pat ir nuo termostato sienelių ir viršaus. Inkubuojama 72 2 valandas 30 1 °C temperatūroje. 7.8. Kolonijų skaičiavimas Kolonijos skaičiuojamos Petri lėkštelėse, turinčiose ne daugiau kaip 300 kolonijų. Lėkštelės apžiūrimos neryškioje šviesoje. Kad palengvintų skaičiavimą, gali būti naudojamos tinkamos lupos (4.1.6) ir (arba) skaitiklis (4.1.8). Skaičiuojant labai mažas kolonijas, vengiama klaidinančių medžiagos nuosėdų dalelių. Naudojant didesnio padidinimo lupas (4.1.7), atsargiai ištiriami abejotini objektai, siekiant atskirti kolonijas nuo pašalinių medžiagų. Išsiplėtusios kolonijos yra laikomos atskiromis kolonijomis. Jeigu išsiplėtusių kolonijų yra priaugę mažiau nei vienas ketvirtadalis, suskaičiuojamos būtinai kolonijos likusioje lėkštelės dalyje ir paskaičiuojamas atitinkamas visos lėkštelės mikroorganizmų skaičius. Jeigu daugiau nei vienas ketvirtadalis lėkštelės yra priaugęs išsiplėtusių kolonijų, lėkštelė išmetama. 8. Rezultatų apskaičiavimas ir išraiška. 8.1. Žalias ir pasterizuotas pienas 8.1.1. Panaudoti visų lėkštelių, turinčių nuo 10 iki 300 kolonijų, suskaičiuotą rezultatą. (žr. 8.1.3 ir 8.1.4) 8.1.2. Mikroorganizmų, esančių 1 ml žalio pasterizuoto pieno, skaičius yra išreiškiamas pagal formulę: [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL], čia: [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] suma kolonijų, suskaičiuotų kaip nurodyta 8.1.1, (n1 + 0,1n2) d atitinka mėginio, įpilto į lėkštelę, tūrį, kur: n1 pirmojo skiedinio lėkštelių skaičius, n2 antrojo skiedinio lėkštelių skaičius, d skiedimo koeficientas, atitinkantis pirmąjį skiedinį, kurio lėkštelės buvo atrinktos kolonijų skaičiavimui. Skaičiavimo rezultatas suapvalinamas iki dviejų reikšminių skaičių. Kai apvalinamas skaičius yra 5, suapvalinama į kairę taip, kad būtų gautas lyginis skaičius. Pavyzdys (pasterizuotas pienas): Skiedinio 10 -2 rezultatai 278 ir 290 kolonijų Skiedinio 10 -3 rezultatai 33 ir 28 kolonijos [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] 8.1.3. Jeigu yra tik lėkštelės, kuriose išaugo mažiau nei 10 kolonijų, mikroorganizmų skaičius 1 mililitre išreiškiamas kaip "mažesnis už 10 x d viename ml"; d - yra žemiausio skiedinio laipsnį atitinkantis atvirkštinis dydis. 8.1.4. Jeigu yra tik lėkštelės, kuriose išaugo daugiau kaip 300 kolonijų, bet įmanoma suskaičiuoti, tuomet kolonijų skaičių padauginti iš skiedimo laipsnį atitinkančio atvirkštinio dydžio. Rezultatas užrašomas kaip "paskaičiuotas mikroorganizmų skaičius viename ml." 8.2. Sterilizuotas ir ultraaukštoje temperatūroje apdorotas pienas Jeigu 0,1 ml yra daugiau nei 10 kolonijas sudarančių vienetų, šie skaičiai turi būti laikomi nebeatitinkančiais Direktyvos 85/397/EEB reikalavimų. 9. Tikslumas Tarptautiniu būdu pripažintų tarplaboratorinių tyrimų rezultatų dar nėra. V. MIKROORGANIZMŲ SKAIČIAUS NUSTATYMAS PAGAL SKAIČIUOJAMAS KOLONIJAS 21 °C TEMPERATŪROJE 1. Taikymo sritis Ši procedūra yra mikroorganizmų, esančių pasterizuotame piene, po jo 5 dienų išlaikymo 6 °C temperatūroje, skaičiaus nustatymo pamatinis metodas, atliekamas naudojant kolonijų suskaičiavimo metodą 21 °C temperatūroje, siekiant nustatyti pasterizuoto pieno užterštumą psichotropiniais mikroorganizmais, galinčiais daugintis piene 6 °C temperatūroje. 2. Apibrėžimas "Mikroorganizmai" reiškia organizmus, sudarančius suskaičiuojamas kolonijas, laikant aerobinėmis nurodytomis sąlygomis. 3. Principas Pasterizuotas pienas išlaikomas 5 dienas 6 °C temperatūroje. Tam tikras pieno mėginio kiekis sumaišomas Petri lėkštelėse su mitybine terpe ir inkubuojamas 25 valandas 21 °C temperatūroje. Kolonijos yra suskaičiuojamos, taip pat paskaičiuojamas mikroorganizmų skaičius, esantis 1 ml pasterizuoto pieno. 4. Prietaisai ir stikliniai indai Įprasta laboratorinė įranga 4.1. Prietaisai 4.1.1. Sterilizavimo krosnis, kurioje palaikoma 170 -175 °C temperatūra. 4.1.2. Autoklavas, kuriame palaikoma 121 1 °C temperatūra. 4.1.3. Termostatai, galintys palaikyti visoje erdvėje temperatūrą: a) 6 0,2 °C b) 21 1 °C 4.1.4. PH-metras su temperatūros reguliatoriumi, dirbantis 0,1 pH vieneto tikslumu. 4.1.5. Vandens vonia, palaikanti 45 1 °C temperatūrą. 4.1.6. Lupa, galinti padidinti 2-4 kartus. 4.1.7. Lupa, galinti padidinti 8-10 kartus. 4.1.8. Skaitiklis 4.1.9. Maišytuvas, galintis sumaišyti 1 ml pieno mėginio arba atlikti dešimtkartį atskiedimą su 9 ml skiediklio ir dirbantis ekscentriniu rotaciniu tiriamųjų mėgintuvėlių skysčių judesiu. 4.2. Stikliniai indai 4.2.1. Tinkamai uždaryti ir pakankamos talpos mėgintuvėliai, turintys viršuje pakankamai erdvės sumaišyti 10 ml pirmojo skiedinio ar tolimesnius dešimtkarčius skiedinius. 4.2.2. Nuo 150 iki 250 ml talpos kolbos arba apie 20 ml talpos mėgintuvėliai mitybinei terpei laikyti. 4.2.3. Pipetės (su vatos kamščiais) pagamintos iš stiklo ar sterilios sintetinės medžiagos su nenudaužtu galu ir 1 ml talpos žyme, kurių ištekėjimo angos skersmuo nuo 1,75 iki 3 mm. 4.2.4. Petri lėkštelės, pagamintos iš skaidraus nespalvoto stiklo ar sterilios sintetinės medžiagos, kurių indo dugnas turi apie (90-100) mm vidinį skersmenį. Vidaus gylis turi būti ne mažesnis kaip 10 mm. Dugnas turi būti be nelygumų, trukdančių skaičiuoti kolonijas. 4.2.5. Stiklinių indų sterilizavimas Stikliniai indai sterilizuojami, naudojant vieną iš šių procedūrų: a) laikant juos ne trumpiau kaip vieną valandą sterilizavimo krosnyje 170-175 °C temperatūroje (4.1.1); b) laikant juos ne trumpiau kaip 20 minučių autoklave 121 1 °C temperatūroje (4.1.2). Būtina autoklave užtikrinti pakankamą garų prasiskverbimą - t. y. jeigu įranga yra sterilizuojama induose, jie neturi būti aklinai uždaryti, kolbos turi būti su atlaisvintais kamščiais. Autoklave sterilizuoti stikliniai indai turi būti išdžiovinti išleidus garą. Pipetės turi būti sterilizuotos sterilizavimo krosnyje (4.1.1). 5. Pieno agaro mitybinė terpė kolonijoms skaičiuoti. 5.1. Sudėtis: Mielių ekstrakto 2,5 g Triptono 5,0 g Gliukozės D(+) arba dekstrozės 1,0 g Nugriebto pieno miltelių 1,0 g Agaro nuo 10 iki 15 g, priklausomai nuo naudojamo agaro sudarančių gelį savybių Vandens 1 000 ml. Nugriebto pieno milteliai turi būti be inhibitorinių medžiagų. Tai turi būti patikrinta naudojant sulyginamuosius tyrimus su nugriebto pieno milteliais, kuriuose nėra inhibitorinių medžiagų. Paruošimas: Sudėtinės dalys atsveriamos ir ištirpinamos vandenyje šia tvarka: mielių ekstraktas, triptonas, gliukozė ir galiausiai nugriebto pieno milteliai. Suspensijos kaitinimas pagreitins tirpinimą. Pridedama agaro ir kaitinama iki virimo, kol agaras pilnai ištirps, arba apie 30 minučių tirpinama garuose. Jeigu būtina, filtruojama per filtrinį popierių. Patikrinama pH su pH-metru (4.1.4) ir, jei būtina, naudojant natrio hidroksido ar druskos rūgšties tirpalą (mažiausiai 0,1 mol/l koncentracijos), pH pakoreguojamas tokiu būdu, kad po sterilizacijos jis būtų 6,9 0,1 25 °C temperatūroje. 5.2. Mitybinės terpės išpilstymas, sterilizacija ir laikymas. Terpė (5.1) išpilstoma į kolbas po 100-150 ml arba į mėgintuvėlius (4.2.2). po 12-15 ml. Kolbos ir mėgintuvėliai užkemšami. Sterilizuojama autoklave (4.1.2) 121 1 °C temperatūroje 15 minučių. Patikrinama terpės pH. Jeigu terpė iš karto nenaudojama, laikoma tamsoje, nuo 1 iki 5 °C temperatūroje ne ilgiau kaip vieną mėnesį po paruošimo. 5.3. Komercinė sausoji mitybinė terpė. Mitybinė terpė (5.1) gali būti paruošta iš komercinės sausosios terpės. Laikomasi gamintojo nurodymų, bet prieš ištirpinant pridėti nugriebto pieno miltelių, jeigu jų nėra tarp sudėtinių dalių. Pakoreguojamas pH iki 6,9 0,1 25 °C temperatūroje, kaip aprašyta 5.1 punkte ir ištirpinama; terpė sterilizuojama ir laikoma, kaip nurodyta 5.2 punkte. 6. Skiedikliai 6.1. Peptono fiziologinis tirpalas Sudėtis: Peptono 1,0 g Natrio chlorido (Na Cl) 8,5 g Vandens 1 000 ml. Paruošimas: Sudedamosios dalys ištirpinamos vandenyje, pakaitinamos, jeigu būtina. Patikrinamas pH su pH-metru (4.1.4) ir, jeigu būtina, naudojant natrio hidroksido ar druskos rūgšties tirpalą (mažiausia 0,1 mol/l koncentracijos), pH pakoreguojamas tokiu būdu, kad po sterilizacijos jis būtų 7,0 0,1 25 °C temperatūroje. 6.2. Skiediklio išpilstymas, sterilizavimas ir laikymas Skiediklis (6.1) išpilstomas į mėgintuvėlius (4.2.1) tokiais kiekiais, kad po sterilizacijos kiekviename mėgintuvėlyje būtų 9,0 0,2 ml skiediklio. Mėgintuvėliai užkemšami. Sterilizuojama autoklave (4.1.2) 121 1 °C temperatūroje 15 minučių. Patikrinamas skiediklio pH. Jeigu skiediklis iš karto nenaudojamas, laikoma tamsoje, nuo 1 iki 5 °C temperatūroje ne ilgiau kaip vieną mėnesį po paruošimo. 6.3. Komerciniai sausieji skiedikliai Skiediklis (6.1) gali būti paruoštas iš komercinių sausųjų tablečių ar miltelių. Ruošiama pagal gamintojo nurodymus. Pakoreguojama, kaip aprašyta 6.1 punkte ir ištirpinama, tirpikliai sterilizuojami ir laikomi kaip nurodyta 6.2 punkte. 7. Procedūra 7.1. Terpės ištirpinimas Prieš pradedant mikrobiologinį tyrimą, greitai ištirpinamas reikiamas terpės kiekis ir terpė pakaitinama iki 45 1 °C vandens vonioje (4.1.5). 7.2. Pieno mėginio paruošimas 7.2.1. Neatidarytą pasterizuoto pieno pakelį arba jeigu tai yra neįmanoma, ne mažiau kaip 100 ml reprezentatyviojo mėginio išlaikyti 120 2 valandas termostate (4.1.3 a), kurio temperatūra 6 0,5 °C.mėginys. 7.2.2. Po išlaikymo kruopščiai sumaišyti pieno mėginį tokiu būdu, kad mikroorganizmai pasiskirstytų kiek galima tolygiau, greitai apverčiant indą su pieno mėginiu 25 kartus. Vengti putojimo arba leisti putoms išsisklaidyti. Laikotarpis tarp maišymo ir pieno mėginio paėmimo neturi būti ilgesnis kaip trys minutės. 7.3. Pirmojo skiedinio paruošimas (10 - 1) Sterilia pipete (4.2.3) įpilama 1 ml žalio ar pasterizuoto pieno mėginio (7.2.2) į 9 ml skiediklio (6.1), vengiant pipetės ir skiediklio sąlyčio. Skiediklio temperatūra turi būti apytikriai tokia pati, kaip ir pieno mėginio. Šis pirmasis skiedinys atsargiai maišomas 5-10 sekundžių maišytuve (4.1.9). Tokiu būdu gaunamas pirmasis skiedinys 10-1. 7.4. Kitų dešimtkarčių skiedinių paruošimas. 1 ml pirmojo skiedinio (7.3) įpilama sterilia pipete (4.2.3) į 9 ml skiediklio (6.1) pagal 7.3. punkte pateiktus nurodymus. Tokiu būdu yra gaunamas 10-2 skiedinys. Šie veiksmai pakartojami siekiant, gauti tolimesnius dešimtkarčius skiedinius, kol tikimasi gauti atitinkamą mikroorganizmų skaičių (8.1). 7.5. Sėjimas į Petri lėkšteles Į Petri lėkštelę (4.2.4) sterilia pipete (4.2.3) įpilama 1 ml mėginio ir (arba) atitinkamo dešimtkarčio skiedinio. Turi būti ištirti mažiausiai du skiediniai. Kiekvienam pasirinktam skiediniui (8.1) imama po dvi Petri lėkšteles. 7.6. Terpės supylimas Į kiekvieną lėkštelę įpilama apytikriai nuo 15 iki 18 ml terpės (7.1). Iš karto po pasėjimo gerai sumaišomas Petri lėkštelės turinys, kad po išlaikymo kolonijos tolygiai išsisklaidytų. Pieno mėginys paruošiamas ir sumaišomas su terpe ne ilgiau kaip per 15 minučių. Leidžiama sustingti ant švaraus, vėsaus, horizontalaus paviršiaus. 7.7. Petri lėkštelių inkubacija Lėkštelės sudedamos į termostatą (4.1.3 b). Lėkštelės laikomos apverstos. Jos sudedamos viena ant kitos, ne daugiau kaip šešios. Sudėtų lėkštelių krūvos atskiriamos viena nuo kitos, taip pat nuo termostato sienelių ir viršaus. Inkubuojama 25 valandas 21 1 °C temperatūroje. 7.8. Kolonijų skaičiavimas Kolonijos skaičiuojamos Petri lėkštelėse, kuriose išaugo ne daugiau nei 300 kolonijų. Lėkštelės apžiūrimos neryškioje šviesoje. Kad būtų lengviau skaičiuoti, gali būti naudojamos tinkamos lupos (4.1.6) ir (arba) skaitiklis (4.1.8). Vengiama klaidinančių medžiagos nuosėdų dalelių skaičiuojant labai mažas kolonijas. Atsargiai ištiriami abejotini objektai, naudojant didesnio padidinimo lupas (4.1.7); ten, kur reikia, kolonijos atskiriamos nuo pašalinių medžiagų. Išsiplėtusios kolonijos laikomos pavienėmis kolonijomis. Jeigu mažiau nei vienas ketvirtadalis lėkštelės yra priaugęs išsiplėtusių kolonijų, būtina suskaičiuoti kolonijas likusioje lėkštelės dalyje ir paskaičiuoti atitinkamą visos lėkštelės mikroorganizmų skaičių. Jeigu daugiau nei vienas ketvirtadalis lėkštelės yra priaugę išsiplėtusių kolonijų, lėkštelė išmetama. 8. Rezultatų skaičiavimas ir išraiška. 8.1. Naudojamas visų lėkštelių, kuriose išaugo nuo 10 iki 300 kolonijų, skaičius (žr. 8.3 ir 8.4 punktus). 8.2. Mikroorganizmų, esančių 1 ml pasterizuoto pieno, skaičius yra išreiškiamas formule: [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL], čia: [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] suma kolonijų, suskaičiuotų kaip nurodyta 8.1.1, (n1 + 0,1n2) d atitinka mėginio, įpilto į lėkštelę, tūrį, kur: n1 pirmojo skiedinio lėkštelių skaičius, n2 antrojo skiedinio lėkštelių skaičius, d skiedimo koeficientas, atitinkantis pirmąjį skiedinį, kurio lėkštelės buvo atrinktos kolonijų skaičiavimui. Skaičiavimo rezultatas suapvalinamas iki dviejų reikšminių skaičių. Kai apvalinamas skaičius yra 5, suapvalinama į kairę taip, kad būtų gautas lyginis skaičius. Pavyzdys Skiedinio 10 -2 rezultatai 278 ir 290 kolonijų, Skiedinio 10 -3 rezultatai 33 ir 28 kolonijos [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] 8.3. Jeigu yra tik lėkštelės, kuriose išaugo mažiau kaip 10 kolonijų, mikroorganizmų skaičius 1 mililitre išreiškiamas kaip "mažesnis už 10xd viename ml"; "d" yra žemiausio skiedinio laipsnį atitinkantis atvirkštinis dydis. 8.4. Jeigu yra tik lėkštelės, kuriose išaugo daugiau kaip 300 kolonijų, bet įmanoma suskaičiuoti, kolonijų skaičius padauginamas iš skiedinio laipsnį atitinkančio atvirkštinio dydžio. Užrašyti rezultatą kaip "paskaičiuotas mikroorganizmų skaičius viename ml". 9. Tikslumas Tarptautiniu būdu pripažintų tarplaboratorinių tyrimų rezultatų dar nėra. VI. KOLIFORMINIŲ BAKTERIJŲ SKAIČIAUS NUSTATYMAS PAGAL SKAIČIUOJAMAS KOLONIJAS 30 °C TEMPERATŪROJE 1. Taikymo sritis Ši procedūra yra koliforminių bakterijų, esančių pasterizuotame piene, skaičiaus nustatymo pamatinis metodas, naudojant kolonijų skaičiavimo metodą 30 °C temperatūroje. 2. Apibrėžimas "Koliforminės bakterijos" yra bakterijos, kurios 30 °C temperatūroje formuoja būdingas arba nebūdingas kolonijas, kurios aprašytose sąlygose fermentuoja laktozę, išskirdamos dujas. 3. Principas Tam tikras pieno mėginio kiekis yra sumaišomas Petri lėkštelėse su mitybine terpe ir inkubuojamas 24 valandas 30 °C temperatūroje. Yra suskaičiuojamos būdingosios kolonijos ir, jeigu būtina, yra patvirtinamas nebūdingųjų kolonijų tapatumas, nustatant jų pajėgumą fermentuoti laktozę. Po to yra paskaičiuojamas koliforminių bakterijų skaičius, esantis 1 ml pasterizuoto pieno. 4. Prietaisai ir stikliniai indai. Įprasta laboratorinė įranga: 4.1. Prietaisai 4.1.1. Sterilizavimo krosnis, kurioje palaikoma 170-175 oC temperatūra. 4.1.2. Autoklavas, kuriame palaikoma 121 1 oC temperatūra. 4.1.3. Termostatas, kurio temperatūra visoje erdvėje yra 30 1 oC. 4.1.4. PH-metras su temperatūros reguliavimu, graduotas 0,1 pH vieneto tikslumu. 4.1.5. Vandens vonia, palaikanti 45 1 oC temperatūrą. 4.1.6. Metalinė kilpelė, pagaminta iš platinos ir iridžio ar nikelio ir chromo. 4.2. Stikliniai indai 4.2.1. 20 ml talpos tinkamai uždaryti mėgintuvėliai patikrinimo testo terpei (5.2) laikyti ir atitinkamų matmenų Durham vamzdeliai, naudojami su mėgintuvėliais. 4.2.2. Nuo 150 iki 250 ml talpos kolbos sausai mitybinei terpei (5.1) laikyti. 4.2.3. Pipetės (su vatos kamščiais), pagamintos iš stiklo ar sterilios sintetinės medžiagos su nenulaužtu galu ir (1-10) ml talpos žyme, kurių ištekėjimo angos skersmuo nuo 1,75 iki 3 mm. 4.2.4. Petri lėkštelės, pagamintos iš skaidraus nespalvoto stiklo ar sterilios sintetinės medžiagos, kurių indo dugnas turi apie 90-100 mm vidinį skersmenį. Vidaus gylis turi būti ne mažesnis kaip 10 mm. Dugnas turi būti be nelygumų, trukdančių suskaičiuoti kolonijas. 4.2.5. Stiklinių indų sterilizavimas Stikliniai indai turi būti sterilizuojami naudojant vieną iš šių būdų: a) laikant juos ne trumpiau kaip vieną valandą sterilizavimo krosnyje, nuo 170° iki 175 °C (4.1.1) temperatūroje. b) laikant juos ne trumpiau kaip 20 minučių autoklave, 121 1 oC temperatūroje (4.1.2) Būtina autoklave užtikrinti pakankamą garų prasiskverbimą - t. y., jeigu įranga yra sterilizuojama induose, jie neturi būti aklinai uždaryti, kolbos turi būti su atlaisvintais kamščiais. Autoklave sterilizuoti stikliniai indai turi būti išdžiovinti išleidus garą. Pipetės turi būti sterilizuotos sterilizavimo krosnyje (4.1.1). 5. Mitybinė terpė 5.1 Violetiniai raudonas tulžies, laktozės agaras (VRBL agaras). Sausa selektyvinė terpė. Sudėtis: Peptono 7 g Mielių ekstrakto 3 g Laktozės (C12H22O11. H2O) 10 g Natrio chlorido (NaCl) 5 g Tulžies rūgšties druskos 1,5 g Neutralaus raudonojo indikatoriaus 0,03 g Kristalinio violetinio indikatoriaus 0,002 g Agaro nuo 10 iki 15 g (priklausomai nuo naudojamo agaro sudaromo gelio tvirtumo) Vandens 1 000 ml. Paruošimas: Sudedamosios dalys pasveriamos ir ištirpinamos vandenyje, paliekamos stovėti keletą minučių, po to energingai išmaišoma. Su pH-metru (4.1.4) patikrinama pH ir, jei būtina, naudojant natrio hidroksido ar druskos rūgšties tirpalą (mažiausia 0,1 mol/l koncentracijos), pH pakoreguojama tokiu būdu, kad po sterilizavimo jis būtų 7,4 0,1, 25 °C temperatūroje. Greitai užvirinama, kartais pamaišant ir tuoj pat išpilstoma į sterilias 100-150 ml talpos kolbas (4.2.2).Terpė pakaitinama vandens vonioje (4.1.5) 45 1 oC temperatūroje. Terpės sterilumas turi būti patikrintas naudojimo metu (6.4). Terpė naudojama trijų valandų laikotarpyje nuo jos paruošimo. 5.2. Briliantinės žalumos laktozės jaučio tulžies buljonas. Patikrinimo testo terpė Sudėtis: Peptono 10 g Laktozės (C12H22O11. H2O) - 10 g Bevandenės jaučių tulžies 20 g Briliantinės žalumos 0,0133 g Vandens 1 000 ml Paruošimas: Sudedamosios dalys ištirpinamos vandenyje užverdant. Su pH-metru (4.1.4) patikrinama pH ir, jei būtina, naudojant (mažiausiai 0,1 mol/l) natrio šarmo ar druskos rūgšties tirpalą, pH sureguliuojamas tokiu būdu, kad po sterilizacijos jis būtų 7,2 0,1 25 °C temperatūroje. Terpė išpilstoma po 10 ml į mėgintuvėlius (4.2.1), kuriuose yra Durham vamzdeliai. Mėgintuvėliai užkemšami. Sterilizuojama autoklave (4.1.2) 121 1 oC temperatūroje 15 minučių. Durham vamzdeliuose po sterilizavimo neturi likti oro burbulų. Patikrinama terpės pH. Jeigu terpė nėra iš karto sunaudojama, ji laikoma tamsoje, nuo 0 iki 5 °C temperatūroje ne ilgiau kaip vieną mėnesį nuo paruošimo. 5.3. Komercinė sausoji mitybinė terpė. Mitybinė terpė (5.1, 5.2) gali būti paruošta iš komercinės sausosios terpės. Laikomasi gamintojo nurodymų. Sureguliuojama pH ir išpilstoma, virinama arba sterilizuojama ir terpė laikoma, kaip aprašyta 5.1 ir 5.2 punktuose. 6. Procedūra 6.1. Terpė Terpė (VRBL agaras) naudojama kaip nurodyta 5.1 punkte. 6.2. Pieno mėginio paruošimas Pieno mėginys kruopščiai išmaišomas greitai vartant indą su pieno mėginiu 25 kartus tokiu būdu, kad mikroorganizmai pasiskirstytų kiek galima tolygiau. Vengiama putojimo arba neleidžiama putoms pasklisti. Laiko tarpas tarp sumaišymo ir pieno mėginio paėmimo neturi būti ilgesnis kaip trys minutės. 6.3. Sėjimas į Petri lėkšteles 3 ml pieno mėginio (6.2) sterilia pipete (4.2.3) supilstomi po 1 ml pieno mėginio į kiekvieną iš trijų lėkštelių (4.2.4). 6.4. Išpilstymas Išpilstoma maždaug apie 12 ml gryno VRBL agaro (6.1) į kiekvieną lėkštelę ant pieno mėginio. Iš karto po išpilstymo, Petri lėkštelė maišoma sukant taip, kad kolonijos tolygiai išsisklaidytų po inkubacijos. Laikas tarp pieno mėginio paruošimo ir mėginio sumaišymo su terpe neturi būti ilgesnis kaip 15 minučių. Paruošiama kontrolinė lėkštelė su 12 ml VRBL agaro jo sterilumui patvirtinti. Leidžiama sustingti ant švaraus vėsaus horizontalaus paviršiaus. Kai terpė visai sustingsta, užsėtos tepės paviršiaus užpilama mažiausiai 4 ml VRBL agaro (6.1). Leidžiama sustigti. 6.5. Petri lėkštelių inkubacija Lėkštelės sudedamos į termostatą (4.1.3). Lėkštelės laikomos apverstos. Jas sudedame vieną ant kitos, ne daugiau kaip šešias. Sudėtų lėkštelių krūvos turi būti atskirtos viena nuo kitos, taip pat nuo termostato sienelių ir viršaus. Inkubuojama 24 2 valandas 30 1 oC temperatūroje. 6.6. Kolonijų skaičiavimas 6.6.1. Kolonijos suskaičiuojamos Petri lėkštelėse, turinčiose ne daugiau kaip 150 kolonijų. Suskaičiuojamos tamsiai raudonos spalvos kolonijos, mažiausiai 0,5 mm skersmens, kurios yra arba nėra apsuptos nuosėdomis, būdingomis koliforminėms bakterijoms. 6.6.2. Jeigu visos arba kelios kolonijos turi nebūdingus aspektus (pvz., nuo tipiškų kolonijų skiriasi spalva, dydžiu ar nuosėdų formavimu), reikia atlikti patikrinimo testą (6.7). 6.7. Patikrinimo testas Pagal 6.6.2 punktą nurodytus požymius atlikamas patikrinimo testas, pasirenkant tinkamą skaičių (pvz., nuo trijų iki penkių) nebūdingų kolonijų ir pasėjant jas briliantinės žalumos laktozės jaučio tulžies buljone (5.2), naudojant metalinę kilpelę (4.1.6). Mėgintuvėliai inkubuojami 30 1 oC temperatūroje 24 2 valandas. Kolonijas, kurios sudaro dujas Durham vamzdeliuose, laikyti koliforminėmis bakterijomis. 7. Rezultatų paskaičiavimas ir išraiška 7.1. Rezultatų skaičiavimui (žr. 7.4) naudojamos tos lėkštelės, kuriose yra ne daugiau kaip 150 kolonijų. 7.2. Jeigu yra atliekamas patikrinimo testas, paskaičiuojamas koliforminių bakterijų kolonijų skaičius iš patikrinto koliforminių bakterijų kolonijų procento. 1) 1 ml pasterizuoto pieno esantis koliforminių bakterijų skaičius yra išreiškiamas pagal formulę: [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] kurioje: [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] bendras koliforminių bakterijų kolonijų skaičius (7.1 kartu su 7.2), nustatytas tiriant pieno mėginį (3 ml), n ištirto mėginio (6.3) mililitrų skaičius (3 ml). Jeigu yra daugiau kaip 100 kolonijų, skaičiavimo rezultatas yra pateikiamas iki dviejų reikšminių skaičių. Jei skaičius, kurį reikia suapvalinti, yra penki, suapvalinti tokiu būdu, kad pirmasis skaičius kairėje būtų lyginis. Jeigu yra tik tokie skaičiavimo rezultatai, kurie viršija 150 kolonijų, rezultatas užrašomas kaip "paskaičiuotų koliforminių bakterijų skaičius 1 ml". 8. Tikslumas Tarptautiniu būdu pripažintų tarplaboratorinių tyrimų rezultatų nėra. VII. SOMATINIŲ LĄSTELIŲ SKAIČIAUS NUSTATYMAS Ši procedūra apima dvi procedūras, kurios yra pamatiniai metodai somatinių ląstelių skaičiui nustatyti. Tai: A. Mikroskopinis metodas B. Fluoro optoelektroninis metodas A. Mikroskopinis metodas 1. Taikymo sritis Ši procedūra yra pamatinis metodas somatinių ląstelių žaliame piene skaičiui nustatyti. Ši procedūra apibrėžia ląstelių skaičiaus pieno mėginyje nustatymo metodą, skirtą kalibruoti ir patikrinti fluoro optoelektroninio metodo tikslumą (žr. B. 1). 2. Apibrėžimas Šiame metode somatinės ląstelės yra tos ląstelės, kurių branduolys gali būti aiškiai nudažytas, naudojant metileno mėlį, pvz., leukocitai ir epitelinės ląstelės. 3. Principas 0,01 ml pieno paskleidžiama ant 1 cm2 mikroskopinio stiklo plokštelės. Susidariusi plėvelė yra išdžiovinama ir nudažoma. Skaičiuojant naudojamasi mikroskopu. Norint gauti 1 ml esančių ląstelių skaičių, somatinių ląstelių skaičius, suskaičiuotas konkrečiame plote, yra padauginamas iš darbinio koeficiento. 4. Reagentai Turi būti naudojami analizinio grynumo reagentai. Dažų tirpalas: Sudėtis: Metileno mėlio 0,6 g Etanolio-99 % 54 ml 1,1,1-trichloretano arba tetrachloretano 40 ml Ledinės acto rūgšties 6 ml Įspėjimas Tetrachloretanas yra nuodingas. Jo tirpalai ruošiami ir jais naudojamasi traukos spintoje. P a r u oš i m a s: Etanolis ir 1,1,1-trichloretanas arba tetrachloretanas išmaišomi butelyje ir kaitinami vandens vonioje iki 60-70 oC. Pridedama metileno mėlio, atsargiai išmaišoma, atšaldoma šaldytuve iki 4 °C per 12-24 valandas ir įpilama ledinės acto rūgšties. Nufiltruojama per filtrą, kurio porų dydis nuo 10 iki 12 mikronų ar mažesnis, ir dažų tirpalas laikomas hermetiškame butelyje. Jeigu susidaro dalelės arba nuosėdos, prieš naudojant nufiltruojama dar kartą. 5. Prietaisai ir stikliniai indai 5.1. Mikroskopas, padidinantis nuo 500 iki 1000 kartų. 5.2. 0,01 ml mikrošvirkštas, 2 % ar didesnio tikslumo. 5.3. Mikroskopo stiklai, turintys pažymėtą 20 mm x 5 mm būsimos plėvelės kontūrą arba etaloninis mikroskopo stiklas, kurio matmenys 20 mm x 5 mm. 5.4. Horizontali plytelė su nustatyta (30-50) oC temperatūra mikroskopo stiklams džiovinti. 5.5. Džiovintuvas (plaukų džiovintuvas) plėvelei džiovinti. 5.6. Vandens vonia, palaikanti (30-40) oC temperatūrą, skirta pieno mėginiui kaitinti. 5.7. Mikrometro stiklas su 0,01 mm padalomis. 6. Procedūra 6.1. Pieno mėginys Pieno mėginys turi būti ištirtas per šešias valandas nuo mėginio paėmimo. Laikymo metu mėginio temperatūra neturi viršyti 6 °C. Reikia vengti užšalimo. 6.2. Mėginio paruošimas laboratorijoje Mėginys pakaitinamas vandens vonioje (5.6) iki 30-40 °C temperatūros. Po to atsargiai išmaišoma. Atšaldoma iki mikrošvirkšto kalibravimo temperatūros (5.2), pvz., iki 20 °C. 6.3. Išankstinis stiklo plokštelių paruošimas Stiklinės plokštelės nuvalomos, pvz., etilo spiritu, nusausinamos nedulkančiu popieriumi, palaikomos liepsnoje ir atvėsinamos. Laikoma dėžutėje, kad nepridulkėtų. 6.4. Plėvelės paruošimas Iš paruošto, kaip aukščiau nurodyta, pieno mėginio mikrošvirkštu (5.2) paimama 0,01 ml pieno. Švirkšto išorinė dalis, kuri liečiasi su pienu, kruopščiai nuvaloma. Švirkštas padedamas ant stiklinės plokštelės (5.3), iš pradžių nubrėžiant (20 mm x 5 mm) formos kontūrą. Po to kiek galima lygiau užpildomas plotas.Visiškai išdžiovinama plėvelė ant horizontalios plytelės (5.4). Iš kiekvieno pieno mėginio turi būti paruošta ir ištirta mažiausia dvi plėvelės. 6.5. Plėvelių dažymas 10 minučių panardinamos į dažų tirpalą (4). Jeigu reikalinga, džiovinimas užbaigiamas džiovintuvu (5.5). Plėvelės padedamos po bėgančiu iš čiaupo vandeniu, kol nusiplaus visas dažų perteklius. Tada vėl išdžiovinti ir laikyti saugant nuo dulkių. 6.6. Mikroskopo lauko kalibravimas Priklausomai nuo pasirinkto padidinimo (x 500 iki x 1000), mikrometro stiklu (5.7) nustatomas mikroskopo lauko skersmuo. 7. Suskaičiavimas ir paskaičiavimas 7.1. Ląstelių suskaičiavimas ir paskaičiavimas Naudojamas mikroskopas (5.1). Vietoj ląstelių yra suskaičiuojami tik ląstelių branduoliai. Jie turi būti aiškiai atpažįstami ir ne mažiau kaip pusė branduolių turi būti matomi mikroskopo lauke. Branduoliai skaičiuojami plėvelės viduriniame trečdalyje vertikaliomis juostelėmis; neskaičiuojama pasirenkant tik pakraštines plėvelės juosteles. Plėvelių paruošimo tinkamumas ir rezultatų patikimumas turi būti tikrinami ne rečiau kaip vieną kartą per mėnesį, suskaičiuojant branduolius skirtinguose plėvelės plotuose. Branduolius galima suskaičiuoti, paskirsčiusius sistemoje mikroskopo laukus tokiu būdu, kad visos plėvelės dalys būtų reprezentuojamos vienodai 7.2. Minimalus suskaičiuotinas ląstelių skaičius Kadangi mikroskopinis somatinių ląstelių suskaičiavimas taip pat gali būti naudojamas automatinių ir mechanizuotų suskaičiavimo procedūrų standartizavimui, identiškų mėginių suskaičiavimo rezultatų variacijos koeficientas neturi būti didesnis už šį elektroninių prietaisų koeficientą. Pieno mėginio, kuriame yra nuo 400 000 iki 600 000 ląstelių/ml, variacijos koeficientas neturi viršyti 5 %. Norint įvykdyti rezultatų pakartojamumo reikalavimą, somatinių ląstelių skaičius, kuris turi būti suskaičiuotas kiekviename mėginyje pagal Puasono pasiskirstymo charakteristikas turi būti ne mažiau kaip 400. Puasono pasiskirstymo būdinga prielaida,kad M = V = s2, čia: M - vidurkis, V - variantiškumas S - standartinis nuokrypis. Variacijos koeficientas yra: [INSERT IMAGE FROM ORIGINAL] čia M - vidurkis, rodantis suskaičiuotų dalelių (ląstelių) skaičių (t. y. 400, kai CV = 5 %); 7.3. Darbinio koeficiento paskaičiavimas Naudojant 0,01 ml pieno, koeficientas yra paskaičiuojamas pagal 7.3.1 arba 7.3.2. 7.3.1. Plėvelės juostelių suskaičiavimas Kiekvienos iš suskaičiuojamų juostelių ilgis turi būti 5 mm. Juostelės plotis atitinka mikroskopo lauko skersmenį, nustatomą mikrometro stiklo plokštele (5.7). Darbinis koeficientas: [pic] čia: d - mikroskopo lauko skersmuo, nustatytas mikrometro stiklo plokštelės (5.7) b - visiškai suskaičiuotų juostelių skaičius. 7.3.2. Skaičiuojant mikroskopo laukų plėvelės viduriniame trečdalyje arba su tinkleliu, darbinis koeficientas apskaičiuojamas pagal formulę: [pic] čia: d - mikroskopo lauko skersmuo, nustatytas mikrometro stiklu (6.7), mm; s - suskaičiuotų laukų skaičius. 7.4. Ląstelių kiekio paskaičiavimas Norint nustatyti ląstelių skaičių, esantį 1 ml pieno, suskaičiuotų somatinių ląstelių skaičius (7.1 ir 7.2) yra padauginamas iš darbinio koeficiento. 7.5. Tikslumas Variacijos koeficientas (žr. 7.2) neturi viršyti 5 %. Tarptautiniu mastu pripažintų tarplaboratorinių tyrimų rezultatų nėra. B. Fluoro optoelektroninis metodas 1. Taikymo sritis Ši procedūra yra pamatinis metodas, kuriuo, atlikus tinkamą kalibravimą (žr. A.1), gali būti suskaičiuotos somatinės ląstelės žaliame piene - su cheminiais konservantais ar be jų. 2. Apibrėžimas Šiame metode somatinės ląstelės yra dalelės, kurios turi minimalų fluorescencinį intensyvumą, susijusį su DNR nudažymu somatinių ląstelių branduoliuose. 3. Principas Pieno mėginys (pvz., 0,2 ml) yra kruopščiai sumaišomas su buferiniu tirpalu ir fluorescenciniu tirpalu. Po to dalis šio mišinio yra paskleidžiama plonu sluoksneliu ant besisukančio disko, kuris yra mikroskopo objektinis stiklelis. Kiekviena ląstelė sukuria elektroninį impulsą, kuris yra sustiprinamas ir užrašomas. Somatinių ląstelių skaičius yra atspausdinamas tūkstančiais į ml. 4. Reagentai Nesant kitų nurodymų, turi būti naudojami analiziškai gryni reagentai. Turi būti naudojamas distiliuotas, dejonizuotas ar analogiško grynumo vanduo. 4.1. Buferinis tirpalas Sudėtis: Natrio vandenilio ftalato 51,0 g Kalio hidroksido 13,75 g 1 % (pagal tūrį) polietilenglikolio-mono-p (1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenilo eterio (pvz., trinitrotoluolas X-100) 10 ml pH nuo 5,7 iki 5,9. Praskiedžiama vandeniu iki 10 000 ml. Paruošimas: Sumaišomos atskiros sudėtinės dalys. Jos turi būti laikomos hermetiškoje aplinkoje ne ilgiau kaip 7 dienas. 4.2. Fluorescencinis tirpalas (pagrindinis tirpalas) Sudėtis: Etidžio bromido 1,0 g Praskiedžiama vandeniu iki 1 000 ml. Paruošimas: Etidžio bromidas ištirpinamas vandenyje. Laikoma šviesos ir oro nepraleidžiančiuose buteliuose ne ilgiau kaip 2 mėnesius. 4.3. Fluorescencinis tirpalas (darbinis tirpalas) Norint gauti 1 000 ml tirpalo, 20 ml pagrindinio tirpalo (4.2) sumaišoma su buferiniu tirpalu (4.1). Darbinis tirpalas neturi būti naudojamas ilgiau kaip 7 dienas. 4.4. Skaidrinantis tirpalas Sudėtis: Buferinio tirpalo (4.1) 10 ml 1 % (pagal tūrį) polietilenglikolio-mono-p (1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenilo eterio (pvz., trinitrotoluolo X-100) 10 ml 25 % (pagal tūrį) amoniako 25 ml. Praskiedžiama vandeniu iki 10 000 ml. Paruošimas: Sumaišomos atskiros sudėtinės dalys. Laikoma ne ilgiau kaip 30 dienų. 5. Prietaisai ir stikliniai indai 5.1. Suskaičiavimo prietaisas, dirbantis pagal fluorescencinį optinį principą. Pastaba Prieš naudojant turi būti atliktas prietaiso kalibravimas. Tokiu būdu yra nustatomas ryšys tarp suskaičiuotinų dalelių tūrio ir slenkstinio lygio, virš kurio yra atliekamas suskaičiavimas. Prietaiso kalibravimas yra atliekamas pagal gamintojo nurodymus, naudojant mėginius, kurių ląstelių kiekis buvo nustatytas naudojant (A) mikroskopinį metodą. 5.2. Cirkuliacinė vandens vonia, palaikanti 40 1 oC temperatūrą. 5.3. Mėgintuvėlis, sandariai uždarytas apie 15 ml tūrio. 6. Pieno mėginys 6.1. Mėginys turi būti laikomas mėgintuvėlyje (5.3) žemoje temperatūroje. Jeigu mėginys yra be cheminių konservantų, suskaičiavimas neturi būti atliekamas per pirmąsias 24 val. po pamelžimo, kadangi suskaičiavimo rezultatas bus per mažas. Laikymo temperatūra neturi būti aukštesnė kaip 6 °C. 6.2. Konservavimas Cheminis konservavimas turi būti atliekamas per 24 valandas. Konservavimas turi būti atliekamas kiek galima greičiau po mėginių paėmimo. 6.2.1. Cheminis mėginio konservavimas gali būti atliekamas pridėjus vieną iš šių konservantų: - borato rūgštį: galutinė borato rūgšties koncentracija mėginyje neturi viršyti 0,6 g/100 ml. Tokiu būdu konservuotas mėginys gali būti laikomas ne ilgiau kaip 24 valandas 6-12 oC temperatūroje; -kalio dichromatą: galutinė kalio dichromato koncentracija neturi būti didesnė kaip 0,2 g/100 ml. Tokiu būdu konservuoti mėginiai gali būti laikomi iki 72 valandų 6-12 oC temperatūroje; - natrio azidą: mėginiai gali būti konservuojami su natrio azidu, kurio galutinė koncentracija 0,024 g/100 ml su sąlyga, jei mėginys tuojau pat po jo paėmimo yra atšaldomas iki 6-12 oC temperatūros ir suskaičiavimas atliekamas per 48 valandas po mėginio paėmimo; - bronopolą: mėginys gali būti konservuojamas bronopolu naudojant galutinę koncentraciją 0,05 g/100 ml, su sąlyga, kad iš karto po paėmimo mėginys yra atšaldomas iki 6-12 oC ir suskaičiavimas atliekamas per 72 valandas po paėmimo. 6.2.2. Borato rūgštimi konservuotas mėginys gali būti toliau konservuojamas 48 valandoms naudojant kalio dichromatą. Pastaba Mėginius konservuojant kalio dichromatu turi būti prisilaikoma vietinių reikalavimų, susijusių su nutekamuoju vandeniu. 7. Procedūra 7.1. Išankstinis mėginio apdorojimas Tiriamasis pienas po pamelžimo turi būti laikomas 2-6 oC temperatūroje ne trumpiau kaip 24 valandas. Pamelžimo dieną nepatartina tirti nekonservuotus mėginius, nes rezultatai gali būti per maži. Jeigu tokį mėginį yra būtina tirti, jis turi būti iš anksto apdorojamas mažiausiai tris valandas kalio dichromatu (žr. 6.2.1). 7.2. Paruošimas Iš anksto apdorotas mėginys (žr. 7.1) arba neapdorotas mėginys, kuris yra mažiausia vienos dienos senumo, yra kaitinamas vandens vonioje (5.2) iki apytikriai 40 °C. Po to iki tyrimo mėginys yra laikomas kambario temperatūroje. 7.3. Ląstelių suskaičiavimas Suskaičiavimas gali būti atliktas naudojant suskaičiavimo prietaisą (5.1) per 15 minučių po kaitinimo pabaigos (žr. 7.2). Iš karto prieš suskaičiuojant, mėginys turi būti kruopščiai išmaišytas, kad būtų pasiektas kiek galima homogeniškesnis somatinių ląstelių pasiskirstymas. Tolimesnis mėginio praskiedimas ir paruošimas atliekamas prietaise automatiškai. 8. Tikslumas Nėra tarptautiniu mastu pripažintų tarplaboratorinių tyrimų rezultatų pakartojamumo (r) ir atkuriamumo (R) skaičių. Tikslumo duomenys bus pateikti ateityje. Nacionaliniame lygmenyje turimi duomenys leidžia atlikti šiuos paskaičiavimus: 1) Suskaičiuotų ląstelių skaičius nuo 400 000 iki 500 000/ml - standartinis rezultatų pakartojamumo nuokrypis: sr = 20 000 ląstelių/ml (lygiavertis 5-4 % variacijos koeficientui) - standartinis atkuriamumo nuokrypis: sr = 40 000 ląstelių/ml (lygiavertis 10-8 % variacijos koeficientui). 9. Tikslumo kontrolė Tikslumo kontrolė yra atliekama naudojant mėginius su žinomu ląstelių kiekiu, kuris yra nustatytas suskaičiavus ląsteles mikroskopu nacionalinėje akredituotoje tyrimų laboratorijoje. VIII. ANTIBIOTIKŲ IR SULFAMIDŲ NUSTATYMAS TAIKYMO SRITIS Ši procedūra yra pamatinis antibiotikų ir sulfamidų nustatymo žaliame ir termiškai apdorotame piene metodas. Pamatinis metodas apima: A. Kokybinį metodą Tai yra pirminis metodas, kurio metu yra atrenkami antibiotikus ir sulfamidus turintys pieno mėginiai. Aprašytame metode kaip testavimo kultūra naudojamas Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, ATTC 10149. Ši procedūra buvo pasirinkta kaip atstovaujanti šiuos tyrimus; B. Penicilino patvirtinimo ir identifikavimo metodas. Šis metodas turi būti naudojamas patvirtinti kokybinio metodo rezultatus, identifikuoti peniciliną ir nustatyti penicilino koncentraciją. A. Kokybinis metodas 1. Taikymo sritis Tai kokybinio antibiotikų ir sulfamidų nustatymo žaliame ir termiškai apdorotame piene metodas, kuomet jie aukštesni nei lentelėje nurodytos ribos: Įvairių antibiotikų ir sulfamidų koncentracijos, kurias galima nustatyti (1). Tyrimo jautrumas Visi neigiami Visi teigiami Benzilpenicilinas 0,002 0,006 Ampicilinas 0,002 0,005 Kloksacilinas 0,015 0,035 Nafcilinas 0,006 0,011 Tetraciklinas 0,10 0,40 Oksitetraciklinas 0,20 0,45 Chlortetraciklinas 0,15 0,50 Chloramfenikolis 7,0 15,0 Dihidrostreptomicinas 4,0 13,0 Neomicinas 1,0 22,0 Kanamicinas 9,0 28,0 Bacitracinas 0,06 0,14 Eritromicinas 1,0 2,25 Rifamicinas 0,01 0,14 Diafenilsulfonas 0,01 0,1 Sulfametazinas (Sulfadimidinas) 0,5 1,0 (1) Benzilpenicilinas ir bacitracinas yra išreikšti kaip TV/ml, visi kiti antibiotikai kaip g/ml. 2. Apibrėžimas Piene yra antibiotikai arba sulfamidai, kada terpės spalva nepasikeičia (žr. 7.1). 3. Principas Pieno mėginys kartu su mitybinėmis medžiagomis yra įpilamas į agaro gelį, kuriame yra pH indikatorius ir Bacillus stearothermophilus, var. calidolactis ATCC 10149 sporos (žr. 5.4.1), kurios turi gerą bendrą jautrumą ir yra ypač jautrios užterštumui penicilinu. Inkubacija, kurios pasekoje vyksta normalus mikroorganizmo augimas ir rūgšties gaminimas, yra pH indikatoriaus spalvos pasikeitimo iš purpurinės į geltoną priežastis. Kada piene yra medžiagos, trukdančios mikroorganizmo augimui, pH indikatoriaus spalva lieka purpurinė. 4. Prietaisai ir stikliniai indai. Paprastai yra naudojama ši laboratorinė įranga: 4.1. Prietaisai 4.1.1. Termostatas, palaikantis 64 1 °C temperatūrą. 4.1.2. Vandens vonia, palaikanti 64 1 °C temperatūrą. 4.1.3. Stovelis mėgintuvėliams arba ampulėms. 4.1.4. Pipetė, vienkartinio naudojimo antgaliukai, tinkamai paimti ir išpilti po 0,1 ml mėginio. 4.1.5. Pincetai ar žnyplelės. 4.1.6. Sterilizavimo krosnis, palaikanti 170-175 °C temperatūrą. 4.1.7. Autoklavas, palaikantis 121 + 1 °C temperatūrą. 4.1.8. PH -metras. 4.2. Stikliniai indai 4.2.1. Mėginių buteliai su tinkamais kamščiais. Pastaba Kai kurie guminiai kamščiai gali nusėsdinti inhibitorines medžiagas ant butelio kaklelio. 4.2.2. Petri lėkštelės, pagamintos iš skaidraus nespalvoto stiklo ar sterilios sintetinės medžiagos su vienodo storio plokščiais dugnais, kurių minimalus vidinis skersmuo yra apie 140 mm. 4.2.3. 250 ml talpos buteliai. 4.2.4. Stiklinės arba sterilios sintetinės medžiagos užkemšamos vata pipetės, kurių talpa 1 ml ir 10 ml. 4.2.5. Stiklinės mentelės. 4.2.6. Mėgintuvėliai arba ampulės, kurių vidinis skersmuo apie 8 mm su užmovomis arba kamščiais. 4.2.7. Stiklinių indų sterilizavimas. Stikliniai indai turi būti sterilizuojami naudojant vieną iš šių procedūrų: a) laikant juos ne trumpiau nei vieną valandą sterilizavimo krosnyje 170-175 °C temperatūroje (4.1.6); b) laikant juos ne trumpiau kaip 20 minučių autoklave 121 1 °C temperatūroje (4.1.7). Būtina užtikrinti autoklave pakankamą garų prasiskverbimą, pav., jeigu įranga yra sterilizuojama induose, jie neturi būti aklinai uždaryti, kolbų kamščiai turi būti atlaisvinti. Autoklave sterilizuoti stikliniai indai turi būti išdžiovinti išleidus garą. Pipetės turi būti sterilizuojamos karšto oro krosnyje. 5. Terpė, tirpalai, testavimo mikroorganizmas Terpės sudėtinės dalys turi būti tinkamos bakteriologiniams tikslams. Turi būti naudojamas distiliuotas arba demineralizuotas bent jau analogiško grynumo vanduo. Jame neturi būti medžiagų, trukdančių testavimo mikroorganizmui augti. 5.1. Terpė 5.1.1. Mitybinis agaras Sudėtis: Mielių ekstrakto 2 g Peptono 5 g Mėsos ekstrakto 1 g Natrio chlorido 5 g Agaro 10-15 g Vandens 1 000 ml Paruošimas Sudedamosios dalys ištirpinamos vandenyje. Užvirinamos, kartas nuo karto pamaišant. pH sureguliuojamas tokiu būdu, kad po sterilizacijos 25 °C temperatūroje jis būtų 7,4 + 0,1. Išpilstoma 10 ml kiekiais į mėgintuvėlius, kad agaras sustingtų nuožulniai arba po 100 ml į butelius. Sterilizuojama 15 minučių 121 1 °C temperatūroje. 5.1.2. Agaro terpė Sudėtis Natrio chlorido 2 g Agaro 15 g Vandens 1 000 ml Trimetoprimo ar tetroksoprimo tirpalo (žr. 5.1.3) (1) 10 ml Paruošimas Vandenyje ištirpinamos sudėtinės dalys, išskyrus trimetoprimą ar tetroksoprimą. Užvirinamos kartas nuo karto pamaišant. Pridedama trimetoprimo ar tetroksoprimo ir 15 min. sterilizuojama 121 1 °C temperatūroje, pH sureguliuojamas tokiu būdu, kad po sterilizavimo 25 °C temperatūroje jis būtų 7,0 0,1. 5.1.3. Trimetoprimo ar tetroksoprimo tirpalas Sudėtis Trimetoprimo 5 mg arba tetroksoprimo 30 mg 96 % etilo spirito 5 ml/30 ml Vandens iki 1 000 ml Paruošimas Trimetoprimas ar tetroksoprimas ištirpinamas etilo spirite (5 ar 30 ml) ir atskiedžiama vandeniu. 5.1.4. Mitybinė terpė Sudėt Mielių ekstrakto 0,75 mg Gliukozės 5,0 mg Tirpaus krakmolo 8,0 mg Bromkrezolo purpurinio indikatoriaus 0,025 g Vandens iki 50 ml Paruošimas Mitybinės medžiagos ir indikatorius ištirpinami vandenyje, jeigu būtina, pakaitinama, filtruojama ir sterilizuojama. Komercinės mitybinės medžiagos yra gaunamos tablečių forma. 5.2. Etaloniniai penicilino tirpalai 5.2.1. Paruošiama 60 g/ml = (100 TV/ml) penicilino tirpalo, ištirpinant kristalinį natrio arba kalio benzilpeniciliną steriliame distiliuotame vandenyje tinkamai užkimštame steriliame butelyje. 5.2.2. Paruošiamas penicilino darbinis tirpalas, atskiedžiant 1,25 ml penicilino tirpalo (5.2.1) iki 1 000 ml steriliu distiliuotu vandeniu. Šiame darbiniame tirpale yra 0,075 g (= 0,125 TV/ml) penicilino. 5.2.3. Paruošiama 75 ml etaloninio penicilino tirpalo, kuriame yra 0,004 g ml (= 0,0067 TV/ml) penicilino, pridedama 71 ml pieno be inhibitorių (5.3) į 4 ml darbinio penicilino tirpalo (5.2.2) ir išmaišoma. 5.2.4. 5.2.1-5.2.3 punktuose nurodyti penicilino tirpalai turi būti paruošti tą dieną, kada atliekamas tyrimas. 5.3. Pienas be inhibitorių Kontrolei naudojamas pienas be inhibitorių, gaunamas ištirpinant steriliame distiliuotame vandenyje nugriebto pieno miltelius (10 % pagal masę tūryje), kurie buvo prieš tai ištirti ir nustatyta, kad jie neturi inhibitorinių medžiagų. Arba pakankamas žalio pieno kiekis, kuris buvo ištirtas ir nustatyta kaip neturintis inhibitorinių medžiagų, gali būti išpilstytas į butelius, kaitinamas vieną valandą 100 °C temperatūroje ir po to laikomas šaldytuve (0-6) °C temperatūroje ne ilgiau kaip vieną savaitę. 5.4. Testavimo mikroorganizmas 5.4.1. Bacillus stearothermophilus var. calidolactus padermė ATCC 10149 yra naudojama kaip testavimo mikroorganizmas. Padermė yra identiška C 953. 5.4.2. Testavimo kultūros palaikymui paruošiama kolekcinė kultūra. Testavimo kultūra yra laikoma ant nuožulniai sustingdinto agaro (5.1.1). Testavimo kultūra kilpa pasėjama ant nuožulniai sustigdinto agaro paviršiaus ir inkubuojama aerobinėmis sąlygomis 48 valandas 63 + 1 °C temperatūroje. Po inkubavimo mėgintuvėlis yra užkemšamas naudojant sterilų guminį kamštį. Tokiu būdu gauta pagrindinė kultūra gali būti keletą mėnesių laikoma šaldytuve nuo 0 iki 5 °C temperatūroje. 5.5. Testavimo kultūra (sporų suspensija) 5.5.1. 20 ml mitybinio agaro (5.1.1) steriliai įpilama į sterilią Petri lėkštelę (4.2.2) ir atšaldoma iki kambario temperatūros. 5.5.2 Sterilia pipete (4.2.4) įpilama 5 ml sterilaus distiliuoto vandens į mėgintuvėlį su pagrindine kultūra ir sporos nuplaunamos nuo nuožulniai sustingdinto agaro naudojantis sterilia kilpa. Ši sporų suspensija turi būti laikoma nuo 0° iki 5 °C temperatūroje ir turi būti naudojama neilgiau kaip 36 valandas. 5.5.3. Steriliai pipete (4.2.4) įpilama 0,5 ml sporų suspensijos (5.5.2) į lėkštelę su mitybine kultūra (5.5.1) ir pasėta kultūra kruopščiai išsklaidoma per visą paviršių su išlenkta stikline lazdele. Inkubuoti 63 1 °C (4.1.1) temperatūroje nuo 16 iki 18 valandų. Naudojant pagrindinę kultūrą (5.4.2) arba senesnę kaip 36 valandų kultūrą, dukterinės kultūros gavimo procedūra turi būti atlikta mažiausiai du kartus, esant ne ilgesniam kaip 36 valandų laikotarpiui tarp dukterinių kultūrų gavimo. 5.5.4. Sterilia pipete (4.2.4) įpilama 10 ml distiliuoto vandens į lėkštelę su kultūra (5.5.3) ir naudojant išlenktą stiklinę lazdelę sporos pašalinamos nuo paviršiaus į suspensiją. Sporų suspensija supilama į butelį (4.2.3), kuriame yra 250 ml sterilaus distiliuoto vandens. Butelys uždaromas ir kruopščiai suplakamas. Kultūros, kurios nebus tuoj pat persėjamos, turi būti laikomos šaldytuve (0-6) °C temperatūroje. 5.5.5. Sporų suspensijoje gyvybingų kolonijų skaičius turi būti nuo 5 iki 10 milijonų 1 ml lėkštelėje esančio skaičiuojamo agaro terpės, kuri buvo inkubuota 63 1 °C temperatūroje 16-18 valandų. Sporų suspensija turi būti vienodai drumsta, ir jeigu joje yra nuosėdos, ji turi būti išmesta ir turi būti paruošta nauja suspensija iš pagrindinės kultūros. 5.6. Mėgintuvėlių arba ampulių paruošimas 5.6.1. Agaro terpė (5.1.2) ištirpinama ir atšaldoma iki 55 °C temperatūros. 5.6.2. Viena dalis šviežios sporų suspensijos (5.5.4) sumaišoma su penkiomis agaro terpės dalimis, esančiomis mėgintuvėlyje ar butelyje (5.6.1), ir kruopščiai išmaišoma. 5.6.3. 0,3 ml terpės su sporomis (5.6.2), apskaičiavus, kad bus gautas 5 mm storio sluoksnis, įpilama į sterilų mėgintuvėlį ar ampulę (4.2.6) ir uždaroma kamščiu arba dangteliu, arba užlydant viršūnę. Mėgintuvėliams ar ampulėms leidžiama atvėsti vertikalioje padėtyje, terpei leidžiama sukietėti ir tada paliekama stovėti ne trumpiau kaip 12 valandų. 5.6.4. Mėgintuvėliai ar ampulės gali būti naudojami tą pačią dieną, bet jie gali būti laikomi ir keletą mėnesių, su sąlyga, kad jie nuo paruošimo yra iš karto atšaldomi ir laikomi 0-6 °C temperatūroje. 6. Procedūra 6.1. Mėginiai turi būti tiriami kaip galima greičiau ir pageidautina per 24 valandas nuo mėginių paėmimo laikant, mėginius tuo metu nuo 0 iki 5 °C temperatūroje. Jei negalima mėginių ištirti per 24 valandas, jie turi būti laikomi giliai užšaldyti (-30 iki - 15 °C), siekiant iki minimumo sumažinti penicilino inaktyvaciją. 6.2. Kiekvienas mėgintuvėlis ar ampulė (5.6) pažymimi įskaitomai ir neištrinamai. Nuimamas dangtelis ar kamštis. Į tinkamą stovelį (4.1.3) sudedamas tyrimui reikalingas skaičius tiriamųjų ir kontrolinių mėginių mėgintuvėlių. 6.3. Į kiekvieną mėgintuvėlį ar ampulę įpilama 50 mikrolitrų 5.1.4 punkte nurodytų mitybinių medžiagų. 6.4. Pieno mėginys kruopščiai išmaišomas ir 0,1 ml įpilama švirkštu (4.1.4) į atitinkamai pažymėtą mėgintuvėlį ar ampulę. Kiekvienam mėginiui naudojamas švarus vienkartinio naudojimo antgaliukas. 6.5. 6.4 punkte aprašytas veiksmas pakartojamas du kartus, naudojant etaloninį penicilino tirpalą, kuriame vietoje pieno mėginio (5.2.3) yra naudojama 0,004 g/ml (= 0,0067 TVml penicilino). 6.6. 6.4 punkte aprašytas veiksmas kartojamas du kartus, kontrolei panaudojant vietoje pieno mėginio inhibitorių neturintį pieną (5.3). 6.7. Mėgintuvėliai ar ampulės užkemšami ir stovelis, kuriame laikomi mėgintuvėliai ar ampulės, įdedamas į vandens vonią, kurios temperatūra yra 63 1 °C, (4.1.2) ir laikomas ne trumpiau kaip 2 val. arba nuo 2 iki 4 valandų. 6.8. Stovelis su mėgintuvėliais ar ampulėmis išimamas iš vandens vonios. 6.9. Stebima terpės spalva (žr. 7). 7. Rezultatų aiškinimas 7.1. Jeigu visuose tiriamųjų ir kontrolinių mėginių mėgintuvėliuose ar ampulėse terpė nusidažo violetine spalva, tai rodo, kad mėginiuose yra antibiotikų arba sulfamidų ir jų kiekis yra toks, koks nurodytas lentelės 58 p. skiltyje "visi teigiami". Mėgintuvėlių ar ampulių su etaloniniu penicilino tirpalu (6.5) spalva turi būti violetinė, kad parodytų pakankamą tyrimų terpės ja