KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) NR. 440/2008

2008 m. gegužės 30 d.

nustatantis bandymų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH)

(Tekstas svarbus EEE)

EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,

atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį,

atsižvelgdama į 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 dėl cheminių medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojimų (REACH), įsteigiantį Europos cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies keičiantį Direktyvą 1999/45/EB bei panaikinantį Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglamentą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB (1), ypač į jo 13 straipsnio 3 dalį,

kadangi:

PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:

1 straipsnis

Įgyvendinant Reglamentą (EB) Nr. 1907/2006 taikomi bandymų metodai nustatyti šio reglamento priede.

2 straipsnis

Siekdama pakeisti, patobulinti bandymus su stuburiniais gyvūnais arba sumažinti jų skaičių, Komisija prireikus persvarsto šiame reglamente nurodytus bandymų metodus.

3 straipsnis

Nuorodos į Direktyvos 67/548/EEB V priedą laikomos nuorodomis į šį reglamentą.

4 straipsnis

Šis reglamentas įsigalioja kitą dieną po jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.

(1) OL L 396, 2006 12 30, p. 1, pataisyta OL L 136, 2007 5 29, p. 3.

(2) OL L 196, 1967 8 16, p. 1. Direktyva su paskutiniais pakeitimais, padarytais Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2006/121/EB (OL L 396, 2006 12 30, p. 850, pataisyta OL L 136, 2007 5 29, p. 281) – įrašyti atitinkamas nuorodas, kai bus paskelbtas 30-asis derinimas su technine pažanga.

(14) Be to, tokį drėgmės kiekį galima pasiekti kitu metodu, pvz., 24 h kaitinant vakuume esant 105 oC.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidizing liquids.

Kartais medžiagos gali sukelti slėgio didėjimą (per didelį arba per mažą), kurio priežastis cheminės reakcijos, neapibūdinančios medžiagos oksiduojamųjų savybių. Tokiais atvejais norint nustatyti reakcijos tipą, bandymą gali tekti kartoti, vietoj celiuliozės naudojant inertinę medžiagą, pvz., diatomitą.

Slėgio keitliu gautas signalas užrašomas tinkama sistema, kuri leistų gauti nepertraukiamą laiko slėgio kitimo laike kreivę ir kartu ją analizuoti (pvz., pereinamųjų vyksmų sąvirašis, sujungtas su diagramų sąvirašiu). Mišinys kaitinamas tol, kol plyšta trūkioji membrana, arba bent 60 s. Jei trūkioji membrana neplyšta, mišinys paliekamas aušti prieš jį atsargiai atidarant, imantis atsargumo priemonių, jei slėginiame inde dar būtų per didelis slėgis. Medžiaga ir kiekviena etaloninė medžiaga bandoma penkis kartus. Užrašomas laikas, per kurį slėgis padidėja nuo 690 kPa iki 2 070 kPa virš atmosferos slėgio. Apskaičiuojama vidutinė slėgio didėjimo trukmė.

Aparatas su slėgio keitliu ir kaitinimo sistema, bet be trūkiosios membranos, tvirtinamas stove uždegimo žvake žemyn. Cheminėje stiklinėje stikline lazdele (16) sumaišoma 2,5 g bandomojo skysčio ir 2,5 g išdžiovintos celiuliozės. Saugai užtikrinti, maišant tarp operatoriaus ir mišinio turi būti saugos skydas. Jei mišinys užsidega maišant arba pilant į indą, toliau bandyti nereikia. Mišinį reikia dėti į slėginį indą mažomis dalimis tapšnojant ir užtikrinti, kad jis būtų dedamas apie uždegimo apviją ir gerai su ja liestųsi. Svarbu kad dedant mišinį apvija nebūtų deformuota, kadangi dėl to gali būti gauti klaidingi rezultatai (17) . Trūkioji membrana dedama į vietą ir gerai užsukamas tvirtinimo kamštis. Indas su įkrova trūkiąja membrana į viršų įstatomas į laikantįjį stovą, kuris turi būti statomas tinkamoje šarvuotoje traukos spintoje arba deginimo kameroje. Prie uždegimo žvakės kontaktų jungiamas maitinimo šaltinis ir įjungiama 10 A srovė. Laikas nuo maišymo pradžios iki maitinimo įjungimo turi būti ne didesnis kaip 10 min.

Be to, jei bandytojas numato, kad šio bandymo rezultatai gali būti naudojami kitais tikslais (9) , pasirinktinai gali būti tikslinga naudoti papildomas etalonines medžiagas (11) .

Atsižvelgiant į taikomą analizės metodą turi būti atliekami vienas arba du bandymai. Kai yra pakankamai specifiniai tiesioginės polimerų komponentų analizės vandeninėje terpėje metodai, turėtų pakakti vieno anksčiau aprašyto bandymo. Tačiau kai tokių metodų nėra, o polimero tirpimo (ekstrahavimo) nustatymas apribotas tik netiesiogine analize, vandeniniame ekstrakte nustatant tik bendrosios organinės anglies kiekį (BOA), turi būti atliktas papildomas bandymas. Be to, šis papildomas bandymas turi būti atliekamas tris kartus, naudojant 10 kartų mažesnius polimero bandinius ir tuos pačius vandens kiekius, kurie buvo naudojami pirmajame bandyme.

ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto plunžerio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.

Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139–2146.

Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, p. 25–52.

ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.

remiasi osmoso principu, t. y. tirpiklio molekulių savaiminiu perėjimu per puslaidę membraną iš praskiesto tirpalo į koncentruotą tirpalą. Bandyme praskiesto tirpalo koncentracija yra nulinė, o koncentruotame tirpale yra polimero. Dėl tirpiklio siurbimo per membraną susidaro slėgių skirtumas, kurio dydis priklauso nuo polimero koncentracijos ir molekulinės masės (1) (3) (4).

ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto plunžerio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.

NF T 20-035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the oxidizing properties of solids.

Jei kyla įtarimas, kad rezultatas yra klaidingai teigiamas, bandymas turi būti pakartotas vietoje celiuliozės naudojant inertišką medžiagą, kurios dalelių dydis būtų panašus, pvz., diatomitą. Be to, bandomosios medžiagos ir celiuliozės mišinys, kurio degimo greitis yra didžiausias, turi būti pakartotinai išbandytas inertiškoje atmosferoje (deguonies < 2 % pagal tūrį).

Jei išankstiniam bandymui naudojami medienos miltai, ruošiami spygliuočių medienos miltai, surinkus tą dalį, kuri nusisijoja per 1,6 mm dydžio akučių sietą, ji gerai sumaišoma, po to ne didesnis kaip 25 mm storio sluoksnis keturias valandas džiovinamas 105 oC temperatūroje. Atšaldoma ir laikoma sandariame inde, jį pripildžius kuo pilniau, kol reikės naudoti, geriausiai per 24 valandas po džiovinimo.

NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the relative temperature of the spontaneous flammability of solids.

NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use – Determination of explosion risk.

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.

Kaitinama propano dujomis iš pramoninio baliono, turinčio reduktorių (60-70 mbar), leidžiamomis per debitmatį ir tolygiai vamzdynu paskirstomomis (kaip rodo degiklių liepsnos stebėjimas) keturiems degikliams. Degikliai išdėstyti apie bandymo kamerą, kaip parodyta 1 paveiksle. Keturi degikliai bendrai suvartoja 3,2 litro propano per minutę. Galima deginti kitokias dujas ir naudoti kitokius degiklius, tačiau kaitinimo sparta turi būti tokia, kokia nurodyta 3 paveiksle. Visuose aparatuose kaitinimo sparta turi būti periodiškai tikrinama, naudojant dietilftalatu pripildytus vamzdžius, kaip parodyta 3 paveiksle.

Jei bandomos kietosios medžiagos, kiekvienam bandymui reikalingos medžiagos masė nustatoma atliekant dviejų pakopų tuščiąjį bandymą. Pasvertas vamzdis pripildomas 9 cm3 medžiagos, toliau medžiaga plūkama 80 N jėga, tenkančia visam vamzdžio skerspjūviui. Kad būtų saugu arba tais atvejais, kai bandinio fizinė forma dėl spaudimo gali pasikeisti, gali būti taikomos kitos pripildymo metodikos; pvz., jei medžiaga yra labai jautri trinčiai, plūkimas netinka. Jei medžiaga yra spūdi, jos dedama daugiau ir ji plūkama, kol vamzdis pripildomas tiek, kad iki viršaus lieka 55 mm. Nustatoma bendra masė, kurios reikia pripildyti iki 55 mm lygio, ir dedamos dar dvi tokios dalys, kiekvieną kartą plukant 80 N jėga. Po to plukant arba išimant medžiagos dedama tiek, kad iki vamzdžio viršaus liktų 15 mm. Atliekamas antras tuščiasis bandymas, iš pradžių su suplūktu kiekiu, kuris sudarytų vieną trečdalį pirmame tuščiajame bandyme nustatytos masės. Įdedamos dar dvi tokios dalys plukant 80 N jėga, po to, prireikus, įdedant arba išimant dalį medžiagos nustatomas jos 15 mm lygis iki viršaus. Kietosios medžiagos kiekis, nustatytas antrame tuščiajame bandyme, naudojamas kiekvienam bandymui, pripildant tris kartus vienodais kiekiais, kiekvieną kartą suspaudžiant iki 9 cm3 reikalinga tam jėga. (Tai galima palengvinti naudojant tarpinius žiedus).

Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.

NF T 20-039 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.

Jei su inertišku nešikliu sumaišyta ir ore padėta medžiaga užsidega per penkias minutes arba jei skystoji medžiaga per penkias minutes apdegina arba uždega joje suvilgytą ir ore padėtą filtravimo popierių, ji laikoma piroforine medžiaga.

NF T 20-040 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.

Recommendations on the transport of dangerous goods, test and criteria, 1990, United Nations, New York.

Į aparato lašinamąjį piltuvą įpilama 10-20 ml vandens, o į kūginę kolbą įdedama 10 g bandomosios medžiagos. Išsiskyrusių dujų tūris gali būti išmatuotas bet kuriuo tinkamu būdu. Atidaromas lašinamojo piltuvo čiaupas, kad vanduo galėtų tekėti į kūginę kolbą, ir paleidžiamas sekundmatis. Išsiskyrusių dujų kiekis kas valandą matuojamas septynias valandas. Jei per šį laiką išsiskyrusių dujų kiekis svyruoja arba jei šio laikotarpio pabaigoje išsiskyrusių dujų kiekis didėja, matavimai turi būti tęsiami ne ilgiau kaip penkias paras. Jei kuriuo nors matavimo momentu dujų išsiskyrimo sparta yra didesnė kaip 1 litras/kg per valandą, bandymą galima nutraukti. Šis bandymas turi būti pakartotas tris kartus.

NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of gases.

NF T 20-042 (September 85). Chemical products for industrial use. Determination of the flammability of solids.

R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, Elsevier, New York, 1977,vol.1.

T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.

C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.

J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biologische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, New York 1979.

C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525

NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.

A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.

O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laboratoriumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1958, Band I/1, p. 223–339.

J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 675

W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.

H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, vol. 12, p. 219.

Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.

C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Council C(81) 30 final.

Po to sudaromas log k verčių ir log P santykio koreliacijos grafikas atitinkamiems etaloniniams junginiams. Praktiškai vienu metu įšvirkščiama nuo 5 iki 10 standartinių etaloninių junginių, kurių log P maždaug atitinka tikėtiną intervalą, ir nustatomos sulaikymo trukmės, geriau ant įrašančiojo integratoriaus, sujungto su aptikimo sistema. Apskaičiuojami atitinkami talpos koeficiento logaritmai log k ir brėžiamas log P, nustatyto kratomos kolbos metodu, funkcijos grafikas. Kalibruojama reguliariais intervalais, ne rečiau kaip kartą per dieną, kad būtų galima atlikti galimus pakitimus kolonėlės darbe.

(nc – anglies atomų skaičius). Po to gaunamas nulinis laikas to pagal:

tr (n c + 1) = a + b tr (n c)

Nulinį laiką to galima nustatyti naudojant homologinę eilę (pvz., n-alkilmetilketonus) arba nepasiskirsčiusius organinius junginius (pvz., tiokarbamidas arba formamidas). Apskaičiuojant nulinį laiką to naudojant homologinę eilę, įšvirkščiami ne mažiau kaip septyni homologinės eilės nariai ir nustatomos atitinkamos sulaikymo trukmės. Neapdorotos sulaikymo trukmės tr(nc + 1)

Medžiagos, kurių tirpumas n-oktanolyje yra mažas, turi polinkį mažoms log Pow vertėms, kai naudojamas HPLC metodas; tokių junginių smailės kartais atsiranda įvykus tirpiklio frontui. Tai tikriausiai vyksta dėl to, kad pasiskirstymo procesas yra per lėtas pusiausvyrai pasiekti per normalų atskyrimo HPLC laiką. Tada debito mažinimas ir/arba metanolio/vandens santykio mažinimas gali būti veiksminga priemonė patikimai vertei gauti.

n-oktanolio fazės turėtų būti matuojamos pagal tūrį. Bandymo indai turėtų būti dedami arba į tinkamą purtyklę arba kratomi ranka. Jeigu naudojamas centrifugos vamzdis, rekomenduojama greitai sukti vamzdį 180 o apie jo skersinę ašį taip, kad bet koks pagautas oro kiekis iškiltų per tas dvi fazes. Patirtis parodė, kad pasiskirstymo pusiausvyrai nustatyti paprastai pakanka 50 tokių apsukų. Kad nekiltų abejonių, rekomenduojama 100 apsukų per penkias minutes.

kai tR – bandomosios medžiagos sulaikymo trukmė, o to – vidutinis laikas, reikalingas tirpiklio molekulei pereiti per kolonėlę (pradinis laikas).

NF T 20-046 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.

NF T 20-045 (AFNOR) (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 105, Decision of the Council C(81) 30 final.

Medžiagos kiekis, reikalingas norimam vandens tūriui įsotinti, yra apskaičiuojamas išankstiniu bandymu. Reikalingas vandens tūris priklauso nuo analizės metodo ir tirpumo intervalo. Apytikriai penki anksčiau nustatyti medžiagos kiekiai pasveriami į kiekvieną iš trijų stiklinių indų su stikliniais kamščiais (pvz., centrifugos vamzdžiai, kolbos). Pasirinktas vandens kiekis pilamas į kiekvieną indą, kiekvienas indas sandariai užkemšamas. Užkimšti indai kratomi 30 oC temperatūroje. (Turėtų būti naudojamas kratytuvas arba maišytuvas, galintys dirbti pastovioje temperatūroje, pvz., magnetinis maišymas termostatu kontroliuojamoje vandens vonioje). Po paros vienas indas išimamas ir pakartotinai nustatoma pusiausvyra per 24 valandas bandymo temperatūroje retsykiais pakratant. Inde esantis turinys centrifuguojamas bandymo temperatūroje, mėginio aiškioje hidratuotoje fazėje koncentracija nustatoma atitinkamu analiziniu metodu. Su kitomis dviem kolbomis elgiamasi taip pat, prieš tai nustatant pradinę pusiausvyrą 30 oC temperatūroje atitinkamai per dvi ir tris paras. Jeigu duomenys apie koncentraciją, gauti ne mažiau kaip iš paskutiniųjų dviejų indų, atitinka reikalavimus, bandymas yra patenkinamas. Visas bandymas turėtų būti pakartojamas naudojant ilgesnius pusiausvyros nustatymo laikus, jeigu 1, 2 ir 3 indo rezultatai krypsta į didesnes vertes.

Srautas leidžiamas per kolonėlę. Rekomenduojama, kad būtų naudojamas apytikriai 25 ml/val. debitas (apibūdintai kolonėlei tai – 10 sluoksnio tūrių/val.). Pirmieji penki sluoksnio tūriai (mažiausiai) yra išpilami, kad būtų pašalinamos vandenyje tirpios priemaišos. Po to recirkuliacinis siurblys dirba tol, kol pasiekiama pusiausvyra, kaip nustatyta penkiais vienas po kito dedamais mėginiais, kurių koncentracijos skiriasi ne daugiau kaip ± 30 % juos atsitiktinai parenkant. Šie mėginiai turėtų būti vienas nuo kito atskiriami laiko intervalais, kurio metu pasikeičia ne mažiau kaip 10 eliuato sluoksnio tūrių.

Pakrauta pagalbinė medžiaga paliekama įmirkti apie dvi valandas apytikriai 5 ml vandens, po to suspensija dedama į mikrokolonėlę. Kitais atvejais pakraunama sausa pagalbinė medžiaga gali būti supilama į vandens pripildytą mikrokolonėlę, po to apie dvi valandas leidžiama nusistovėti pusiausvyrai.

Šiuo metodu medžiaga (kietosios medžiagos turi būti pulverizuojamos) ištirpinama vandenyje, kurio temperatūra šiek tiek aukštesnė negu bandymo temperatūra. Pasiekus sotį, mišinys ataušinamas ir laikomas bandymo temperatūroje, maišant tiek, kiek to reikia pusiausvyrai pasiekti. Matavimas gali būti atliekamas ir tiesiogiai bandymo temperatūroje, jeigu tinkamu bandinių parinkimu užtikrinama, kad bus pasiekta soties pusiausvyra. Po to medžiagos masės koncentracija vandeniniame tirpale, kuriame neturi būti jokių neištirpusių dalelių, yra nustatoma atitinkamu analitiniu metodu.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.

Matuojami tirpalai perpilami į kruopščiai išvalytą matavimo indą stengiantis, kad nesusidarytų putų, po to matavimo indas dedamas ant bandymo aparato stalelio. Stalelio viršus su matavimo indu keliamas aukštyn, kol žiedas panyra žemiau matuojamo tirpalo paviršiaus. Po to stalelio viršus pamažu ir tolydžiai nuleidžiamas (apie 0,5 cm/min. greičiu), atskiriant žiedą nuo paviršiaus, kol bus pasiekta maksimali jėga. Skysčio sluoksnis, besiliečiantis su žiedu, neturi atsiskirti nuo žiedo. Užbaigus matavimus, žiedas vėl iškeliamas į paviršių, matavimai kartojami tol, kol bus gauta pastovi paviršiaus įtempties vertė. Kiekvienam nustatymui užrašomas tirpalo perpylimo į matavimo indą laikas. Matavimai užrašomi esant maksimaliai jėgai, reikalingai atskirti žiedą nuo skysčio paviršiaus.

Stikliniai indai turi būti kruopščiai išvalomi. Jeigu reikia, jie išplaunami karšta chromo sieros rūgštimi, o po to sirupo tirštumo sieros rūgštimi (83–98 % H3PO4 svorio) kruopščiai nuskalaujami vandeniu iš čiaupo ir galiausiai nuplaunami du kartus distiliuotu vandeniu, kol bus gaunama neutrali reakcija, po to išdžiovinama arba nuskalaujama dalimi mėginio tirpalo, kurį reikia išmatuoti.

ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure- temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope.

NF T 20-047 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-3 to 1 Pa – Vapour pressure balance method.

NF T 20-048 AFNOR (Sept. 85). Chemical products for industrial use – Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10-1 to 105 Pa – Static method.

R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed. Chapter IX, Interscience Publ., New York, 1959, Vol. I, Part I.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 104, Decision of the Council C(81) 30 final.

Kaip garų sugaudymo ir po to atliekamos analizės alternatyva gali būti naudojama betarpiška tyrimų technika, pavyzdžiui, chromatografas, gali būti naudojama kiekybiškai nustatyti kiekį medžiagos, perneštos žinomu kiekiu nešančiųjų dujų. Be to, galima išmatuoti mėginio masės nuostolius.

Kai pasiekiamas reikalingas vakuumo lygis, pradedama kalibravimo serija žemiausioje reikalaujamoje temperatūroje. Nustatoma atitinkama anga dangtelyje, garų srovė teka per gaubtą tiesiai virš angos, į ataušintą svarstyklių lėkštę. Svarstyklių lėkštė turi būti pakankamai didelė, kad visa per gaubtą nukreipta srovė patektų į ją. Garų srovės savo jėga veikia į svarstyklių lėkštę, ir molekulės kondensuojasi ant vėsaus paviršiaus.

jeigu varinės krosnies dangtelyje yra trys skirtingo skersmens angos, viena nuo kitos esančios 90o kampu, galima apimti įvairius garų slėgio intervalus per visą matavimų intervalą (angų skersmuo apytikriai 0,30–4,50 mm). Didelės angos naudojamos mažam garų slėgiui ir atvirkščiai. Sukant krosnį galima nustatyti norimą angą arba tarpinę padėtį garų srovėje (krosnies skylė – skydas – svarstyklių lėkštė), išsiskiria molekulių srautas arba jis nukreipiamas per krosnies angą į svarstyklių lėkštę. Kad būtų išmatuota medžiagos temperatūra, termoelementas arba varžinis termometras dedamas tinkamoje vietoje,

Jeigu tai skystieji kūnai, pati medžiaga naudojama kaip skystis pagalbiniame manometre. Į izoteniskopą dedamas toks kiekis skysčio, kurio pakanka kolbai užpildyti, ir prie izoteniskopo pritaisoma trumpoji manometro kojelė. Izoteniskopas pritaisomas prie vakuuminės sistemos, iš jos išsiurbiamas oras, po to užpildoma azotu. Sistemos išsiurbimas ir išvalymas kartojamas du kartus, kad būtų pašalinamas liekamasis deguonis. Užpildytas izoteniskopas dedamas horizontaliai, kad mėginys mėginio kolboje ir manometro sekcijoje (U dalis) pasklistų plonu sluoksniu. Slėgis sistemoje sumažinamas iki 133 Pa, o mėginys yra iš lengvo šildomas, kol ima virti (ištirpusių sujungtųjų dujų pašalinimas). Tada izoteniskopas dedamas taip, kad mėginys vėl atsirastų kolboje ir trumpojoje manometro kojelėje ir abu būtų pilni skysčio. Palaikomas toks pat slėgis kaip degazuojant; išsikišęs mėginio kolbos galiukas šildomas nedidelėje liepsnoje, kol išsiskyrę mėginio garai gerai pasklis ir išstums dalį mėginio iš viršutinės kolbos dalies ir manometro kojelės į izoteniskopo manometro sekciją, sudarydami garų pripildytą be azoto erdvę.

Pusiausvyra pasiekiama, kai esant pastoviam slėgiui užregistruojama pastovi temperatūra. Reikia būti ypač atsargiems ir virinimo metu vengti kunkuliavimo. Be to, ant aušintuvo turi vykti kondensacija. Nustatant blogai besilydančių medžiagų garų slėgį, stebėti, kad neužsikimštų kondensatorius.

Metodas pagrįstas tiriamos medžiagos, garų pavidalu išlekiančios iš Knudsen elemento (4) per laiko vienetą per angą ultravakuumo sąlygomis, masės apskaičiavimui. Ištekėjusių garų masę galima gauti nustatant elemento prarastą masę arba kondensuojant garus žemoje temperatūroje ir nustatant išgarintos medžiagos kiekį chromatografinės analizės būdu. Garų slėgis apskaičiuojamas naudojant Hertz-Knudsen priklausomybę.

Medžiagos kiekis, išeinantis iš elemento per laiko vienetą per žinomo dydžio apertūrą yra nustatomas vakuume taip, kad medžiagos sugrįžimas į elementą būtų nedidelis (pvz., matuojant impulsą, generuotą jautrioje pusiausvyroje garų čiurkšle arba matuojant prarastą svorį).

IUPAC, Recommended reference materials for realization of physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.

R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council C(81) 30 final.

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal

Method for determination of distillation characteristics

Method for determination of distillation of petroleum products

Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)

Standard test method for boiling point of engine anti-freezes

R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.

Ypatingas dėmesys atkreiptinas į tuos metodus, kuriuose naudojama detekcija fotoelementu ir terminė analizė, kadangi šiais metodais galima nustatyti tiek lydimosi, tiek virimo temperatūrą. Be to, matavimus galima atlikti automatiškai.

Standard tes methos for pour point of petroleum oils

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differencial thermal analysis

Standard definitions of terms relating to thermal analysis

Standard method for assessing the thermal

Method for the determination of the freezing point

Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)

Method for determination of crystallizing point

Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials

Testing methods for melting point of chemical products.

Method for the determination of melting point and/or melting range

Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals

IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 505–515.

R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.

OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 (final).

B DALIS. TOKSIŠKUMO IR KITO POVEIKIO SVEIKATAI NUSTATYMO METODAI

TURINYS

BENDRASIS ĮVADAS

B.1 bis. ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. FIKSUOTŲJŲ DOZIŲ METODAS

B.1 tris. ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASĖS METODAS

B.2. ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (INHALIACINIS)

B.3. ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)

B.4. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. ODOS DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS

B.5. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. AKIŲ DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS

B.6. ODOS SENSIBILIZACIJA

B.7. PAKARTOTINOS DOZĖS (28 DIENO) TOKSIŠKUMAS (PER VIRŠKINAMĄJĮ TRAKTĄ)

B.8. KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENOS) TOKSIŠKUMAS (INHALIACINIS)

B.9. KARTOTINIŲ DOZIŲ (28 DIENOS) TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)

B.10. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJŲ TYRIMAS IN VITRO

B.11. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ KAULŲ ČIULPŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS TYRIMAS IN VIVO

B.12. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ ERITROCITŲ MAŽŲJŲ BRANDUOLIŲ TYRIMAS IN VIVO

B.13/14. MUTAGENIŠKUMAS – GRĮŽTAMŲJŲ MUTACIJŲ BAKTERIJOSE TYRIMAS

B.15. MUTAGENIŠKUMO TYRIMAS IR ATRANKA PAGAL KARCINOGENIŠKUMĄ GENŲ MUTACIJOS – SACCAROMYCES CEREVISIAE

B.16. MITOZINĖ REKOMBINACIJA – SACCHAROMYCES CEREVISIAE

B.17. MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ GENŲ MUTACIJŲ TYRIMAS IN VITRO

B.18. DNR PAŽAIDOS IR JŲ REPARACIJA – NEPLANUOTA DNR SINTEZĖ – ŽINDUOLIŲ LĄSTELĖSE IN VITRO

B.19. APSIKEITIMO SESERINĖMIS CHROMATIDĖMIS TYRIMAS IN VITRO

B.20. SU LYTIMI SUSIJĘS RECESYVINIS LETALUS TESTAS DROSOPHILA MELANOGASTER TARPE

B.21. ŽINDUOLIŲ LĄSTELIŲ TRANSFORMACIJOS TESTAI IN VITRO

B.22. GRAUŽIKŲ DOMINANTINIS LETALINIS TESTAS

B.23. ŽINDUOLIŲ SPERMATOGONIJŲ CHROMOSOMŲ ABERACIJOS TYRIMAS

B.24. PELIŲ TAŠKINIS TESTAS

B.25. PELIŲ PAVELDĖTA TRANSLOKACIJA

B.26. SUBCHRONIŠKO ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS 90 PARŲ KARTOTINĖS DOZĖS TYRIMAS SU GRAUŽIKAIS ORALINIAM TOKSIŠKUMUI NUSTATYTI

B.27. SUBCHRONIŠKO ORALINIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS 90 PARŲ KARTOTINĖS DOZĖS TYRIMAS NE SU GRAUŽIKAIS ORALINIAM TOKSIŠKUMUI NUSTATYTI

B.28. PUSIAU CHRONINIS ODOS TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS DOZĖS DAVIMO GRAUŽIKAMS PER ODĄ TYRIMAS

B.29. PUSIAU CHRONINIS ĮKVĖPIMO TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS ĮKVEPIAMOS DOZĖS TYRIMAS GRAUŽIKŲ RŪŠYSE

B.30. CHRONINIS TOKSIŠKUMO TESTAS

B.31. TOKSIŠKO POVEIKIO PRENATALINIAM VYSTYMUISI TYRIMAS

B.32. KARCINOGENIŠKUMO TESTAS

B.33. KOMBINUOTAS CHRONINIO TOKSIŠKUMO/KARCINOGENIŠKUMO TESTAS

B.34. VIENOS KARTOS DAUGINIMOSI TOKSIŠKUMO TESTAS

B.35. TOKSIŠKO POVEIKIO DVIEJŲ KARTŲ REPRODUKCIJAI TYRIMAS

B.36. TOKSIKOKINETIKA

B.37. FOSFOROORGANINIŲ MEDŽIAGŲ ŪMAUS POVEIKIO SUKELTAS UŽDELSTAS NEUROTOKSIŠKUMAS

B.38. FOSFOROORGANINIŲ MEDŽIAGŲ 28 DIENŲ PAKARTOTINOS DOZĖS SUKELTO UŽDELSTO NEUROTOKSIŠKUMO TYRIMAS

B.39. NENUMATYTOS DNR SINTEZĖS (NDS) TYRIMAS ŽINDUOLIŲ KEPENŲ LĄSTELĖSE IN VIVO

B.40. ODOS SUARDYMAS IN VITRO. ODOS SLUOKSNIO ELEKTRINĖS VARŽOS (OSEV) BANDYMAS)

B.40BIS. ODOS SUARDYMAS IN VITRO. ŽMOGAUS ODOS MODELIO BANDYMAS

B.41. 3T3 NRU FOTOTOKSIŠKUMO BANDYMAS IN VITRO

B.42. ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO TYRIMAS

B.43. NEUROTOKSIŠKO POVEIKIO GRAUŽIKAMS TYRIMAS

B.44. SUGERTIS PER ODĄ. IN VIVO METODAS

B.45. SUGERTIS PER ODĄ. IN VITRO METODAS

BENDRASIS ĮVADAS

A. TIRIAMOSIOS MEDŽIAGOS APIBŪDINIMAS

Tiriamosios medžiagos sudėtį, taip pat ir pagrindines priemaišas, bei jos svarbiausias fizines ir chemines savybes, tarp jų pastovumą, reikėtų žinoti dar prieš bet kokio toksikologinio tyrimo planavimą.

Tiriamosios medžiagos fizinės ir cheminės savybės nulemia medžiagos patekimo kelio pasirinkimą, kai kurių tyrimo detalių planavimą, elgimąsi su medžiaga bei jos laikymą.

Tiriamosios medžiagos (jeigu įmanoma ir pagrindinių priemaišų) dozuojamoje terpėje ar biologinėje medžiagoje nustatymo kokybinius ir kiekybinius analitinius metodus reikėtų parengti dar prieš tyrimą.

Visa informacija susijusi su medžiagos nustatymu, fizikinėmis ir cheminėmis jos savybėmis, grynumu, tiriamosios medžiagos elgesiu reikėtų įtraukti į tyrimo ataskaitą.

B. GYVŪNŲ PRIEŽIŪRA

Giežta aplinkos sąlygų kontrolė ir tinkama gyvūnų priežiūra yra būtini toksikologiniame tyrime.

i) Laikymo sąlygos

Eksperimentinių gyvūnų kambarių ar aptvarų aplinkos sąlygos turėtų būti tinkamos tiriamosioms rūšims. Žiurkėms, pelėms ir jūrų kiaulytėms kambario temperatūra turėtų būti 22 oC ± 3 oC, santykinis drėgnis nuo 30 iki 70 %; triušiams temperatūra turėtų būti 20 ± 3 oC, santykinis drėgnis nuo 30 iki 70 %.

Kai eksperimentinė įranga yra ypač jautri temperatūros poveikiui, tiriamajame metode reikėtų aprašyti jai tinkamas sąlygas. Visuose toksinių poveikių tyrimuose temperatūra ir drėgnis turėtų būti stebimi, registruojami ir įtraukiami į tyrimo baigiamąją ataskaitą.

Apšvietimas turi būti dirbtinis, šviesos režimas – 12 valandų šviesos/12 valandų tamsos. Apšvietimo detalės turėtų būti registruojamos ir įtraukiamos į baigiamąją tyrimo ataskaitą.

Jei metode kitaip nenurodoma, gyvūnai gali būti laikomi po vieną arba tos pačios lyties individų grupėmis, tačiau viename narve neturėtų būti daugiau negu penki gyvūnai.

Eksperimentų su gyvūnais ataskaitose svarbu nurodyti gyvūnų laikymo būdą bei jų skaičių viename narve medžiagos poveikio bei vėlesniu stebėjimo periodu.

ii) Šėrimas

Tyrimo metu gyvūnams duodami pašarai turi atitikti visus tos gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus. Tais atvejais, kai tiriamoji medžiaga dedama į pašarus, jų galiojimo laikas turėtų būti sutrumpinamas dėl tiriamosios medžiagos sąveikos su pašaro sudedamosiomis dalimis. Į tokios reakcijos galimybę turėtų būti atsižvelgiama interpretuojant tyrimų rezultatus. Standartiniai laboratorinių gyvūnų pašarai turėtų būti duodami neribojant geriamo vandens kiekio. Pasirenkant minėtą poveikio metodą, pašaro turėtų būti duodama tiek, kad tai užtikrintų reikiamą tiriamosios medžiagos gaunamą kiekį.

Maisto teršalai, kurie yra toksiški, neturėtų viršyti interferuojančių koncentracijų.

C. ALTERNATYVUS TYRIMAS

Europos Sąjunga siekia vystyti ir tvirtinti alternatyvius metodus, kurie teiktų panašią informaciją kaip ir įprasti gyvūnų tyrimai, tačiau naudotų mažiau gyvūnų, sukeltų jiems mažiau skausmo arba visiškai išvengtų jų panaudojimo.

Kai tik tokie metodai įsigalioja, juos privaloma taikyti rizikos įvertinimui, vėlesniam klasifikavimui ir kenksmingumo ženklinimui.

D. ĮVERTINIMAS IR INTERPRETACIJA

Vertinant ir interpretuojant gyvūnų ir in vitro tyrimų rezultatus, reikia atsižvelgti į jų tiesioginės ekstrapoliacijos žmogui ribotumą, todėl gavus įrodymą apie medžiagos neigiamą poveikį žmonėms, tai turėtų patvirtinti gyvūnų tyrimų rezultatus.

E. LITERATŪROS ŠALTINIAI

Dauguma šių metodų remiasi EBPO programos tyrimo Gairėmis ir turėtų būti atliekami pagal Geros laboratorinės praktikos principus, tam kad užtikrinti kuo didesnį duomenų pripažinimą.

Papildomą informaciją galima būtų rasti EBPO gairėse ir bet kurioje tinkamoje spausdintoje literatūroje.

B.1 BIS. ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. FIKSUOTŲJŲ DOZIŲ METODAS

1. METODAS

Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 420 (2001)

1.1 ĮVADAS

Taikant tradicinius metodus ūmaus toksiškumo poveikis įvertinamas pagal gyvūno žūtį. Britų toksikologų draugija (British Toxicology Society) 1984 m. pasiūlė naują ūmaus toksiškumo bandymo būdą, pagrįstą kelių fiksuoto dydžio dozių davimu (1). Taikant šį būdą išvengiama gyvūnų žūties, kuri būtų poveikio įrodymas; jis pagrįstas aiškių toksiškumo požymių pasireiškimu, kai iš dozių serijos duodama viena fiksuoto dydžio dozė. Pasibaigus JK (2) ir tarptautinio (3) tinkamumo patvirtinimo tyrimui in vivo, 1992 m. ši procedūra buvo patvirtinta kaip bandymo metodas. Vėliau, taikant matematinius modelius, daugelyje tyrimų buvo įvertintos statistinės fiksuotų dozių metodikos savybės (4)(5)(6). Kartu daromi in vivo ir modeliavimo tyrimai įrodė metodikos atkuriamumą; ją taikant naudojama mažiau gyvūnų, jiems sukeliamos mažesnės kančios nei taikant tradicinius metodus ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus.

Rekomendacijas dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Rekomendaciniame ūmaus oralinio toksiškumo bandymo dokumente (7). Be to, šiame rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie B.1 bis bandymo metodo taikymą ir aiškinimą.

Metodo esmę sudaro tai, kad darant pagrindinį tyrimą skiriamos vidutinio toksiškumo dozės ir išvengiama dozių, kurios sukeltų žūtį. Be to, nereikia skirti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai nužudomi ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi darant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo nužudyti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro rekomendacinio dokumento objektas (8).

Taikant metodą gaunama informacijos apie medžiagos pavojingas savybes, todėl ją galima įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai suderintą sistemą (Globally Harmonised System (GHS), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (9).

Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikocheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo būdas (-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.

1.2 SĄVOKOS

Ūmus oralinis toksiškumas – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda davus per burną vieną medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h.

Uždelsta mirtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį.

Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg).

Akivaizdus toksiškumas – bendrasis terminas, aprašantis aiškius toksiškumo požymius, atsiradusius davus bandomosios medžiagos (pavyzdžiai pateikti (3), kai davus kitą didžiausią fiksuotą dozę, galima laukti, kad didelio skausmo ir ilgalaikių didelių kančių požymiai, gaišimo būsenos požymiai (kriterijai pateikti rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8) pasireikš arba galima žūtis ištiks didesnę dalį gyvūnų.

GHS – visuotinai suderinta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema (Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). Ekonominio bendradarbiavimo ir plėtros organizacijos (OECD) (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių gabenimo ekspertų komiteto (fizikocheminės savybės) ir Tarptautinės darbo organizacijos (ILO) (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)).

Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau detalių pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).

LD50 (medianinė mirtina dozė) – statistiškai apskaičiuojama viena medžiagos dozė, nuo kurios yra tikimybė žūti 50 % gyvūnų, gavusių dozę per burną. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (mg/kg).

Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2 000 arba 5 000 mg/kg).

Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).

Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (8)).

1.3 BANDYMO METODO ESMĖ

Vienos lyties gyvūnų grupėms nuosekliai duodamos fiksuotos 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg dozės (išimtiniais atvejais galima spręsti apie papildomos fiksuotos 5 000 mg/kg dozės davimą, žr. 1.6.2 skirsnį). Pradinė dozė pasirenkama atsižvelgiant į orientacinį tyrimą, kaip dozė, kuri galėtų sukelti kai kuriuos toksiškumo požymius, bet kuri nebūtų sunkaus toksiško poveikio arba žūties priežastimi. Klinikiniai požymiai ir sąlygos, susijusios su skausmu, kančia ir neišvengiama žūtimi, išsamiai aprašytos atskirame OECD rekomendaciniame dokumente (8). Kitoms gyvūnų grupėms gali būti duodamos didesnės arba mažesnės fiksuotos dozės, atsižvelgiant į toksiškumo arba gaištamumo požymių buvimą arba nebuvimą. Ši procedūra tęsiama tol, tol identifikuojama dozė, sukelianti akivaizdų toksiškumą arba ne daugiau kaip vieno gyvūno žūtį, arba kai nėra jokio poveikio esant didžiausiai dozei ar kai gyvūnai žūsta esant mažiausiai dozei.

1.4 BANDYMO METODO APRAŠYMAS

1.4.1 Gyvūnų rūšies pasirinkimas

Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (7). Pasirinkimą lėmė tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos, kurios parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (10). Tačiau, jei giminingos struktūros cheminių junginių toksikologinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai daromi su patinais, pateikiami atitinkami tai patvirtinantys duomenys.

Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti dar be vados ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš duodant dozę turi būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.

1.4.2 Laikymo ir šėrimo sąlygos

Bandomų gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti laikomi narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti aiškiai matyti kiekvieną gyvūną.

1.4.3 Gyvūnų ruošimas

Gyvūnai atrenkami atsitiktinai, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių davimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad galėtų priprasti prie laboratorinių sąlygų.

1.4.4 Dozių ruošimas

Apskritai visų dydžių bandomosios medžiagos dozės skiriamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui, galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias duodamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturi būti didesnis kaip 1ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100g kūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis ne vanduo, turi būti žinomos jo toksikologinės charakteristikos. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.

1.5 DARBO EIGA

1.5.1 Dozių davimas

Bandomoji medžiaga duodama kaip viena dozė per skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma duoti vienos dozės, ji gali būti duodama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.

Prieš duodant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės negauna pašaro, išskyrus vandenį, per naktį; pelės gauna vandens, bet negauna pašaro 3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė duodama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.

1.5.2 Orientacinis tyrimas

Orientacinio tyrimo tikslas – leisti pasirinkti atitinkamą pradinę pagrindinio tyrimo dozę. Bandomoji medžiaga nuosekliai duodama atskiriems gyvūnams pagal 1 priedo diagramą. Orientacinis tyrimas baigiamas, kai galima priimti sprendimą dėl pagrindinio tyrimo pradinės dozės (arba jei gyvūnai žūsta esant mažiausiai fiksuotai dozei).

Orientacinio tyrimo pradinė dozė pasirenkama iš 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg dozių, kaip dozė, kuri galėtų parodyti akivaizdų toksiškumą, pagrįstą, jei įmanoma, in vivo ir in vitro duomenimis apie tą pačią cheminę medžiagą ir struktūriniu požiūriu giminingas chemines medžiagas. Neturint tokios informacijos, pradinė dozė būtų 300 mg/kg.

Tarp dozių davimo kiekvienam gyvūnui turi būti mažiausiai 24 h laiko tarpas. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi mažiausiai 14 parų.

Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5 000 mg/kg dydžio dozę (žr. 3 priedą). Dėl priežasčių, susijusių su gyvūnų gerove, neskatinama daryti bandymo taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2 000–5 000 mg/kg) ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga.

Tais atvejais, kai darant orientacinį tyrimą žūsta gyvūnas, gavęs mažiausią fiksuotą dozę (5 mg/kg), taikant įprastą procedūrą tyrimą reikia nutraukti ir medžiagą priskirti GHS 1 kategorijai (kaip nurodyta 1 priede). Tačiau jei reikalingas tolesnis klasifikavimo patvirtinimas, gali būti atliekama ši neprivaloma papildoma procedūra. 5 mg/kg dozė duodama antram gyvūnui. Jei šis antras gyvūnas žūsta, GHS 1 kategorija patvirtinama ir tyrimas iš karto nutraukiamas. Jei antras gyvūnas išgyvena, 5 mg/kg dozę gauna ne daugiau kaip trys papildomi gyvūnai. Kadangi yra didelė žūties rizika, gyvūnų gerovei apsaugoti jie turi gauti šią dozę paeiliui. Laiko tarpo tarp dozės davimo kiekvienam gyvūnui turi pakakti nustatyti, ar pirmiau dozę gavęs gyvūnas turi galimybę išgyventi. Jei žūsta antras gyvūnas, dozių davimas iš karto nutraukiamas ir nei vienas papildomas gyvūnas dozės nebegauna. Kadangi žuvus antram gyvūnui (neatsižvelgiant į bandymo nutraukimo momentu panaudotų gyvūnų skaičių) rezultatas yra A (2 arba daugiau žūčių), taikoma 2 priedo klasifikavimo taisyklė esant 5 mg/kg fiksuotai dozei (1 kategorija, jei žuvo 2 arba daugiau gyvūnų, 2 kategorija, jei žuvo ne daugiau kaip 1 gyvūnas). Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo.

1.5.3 Pagrindinis tyrimas

1.5.3.1 Gyvūnų skaičius ir dozių dydis

Veiksmai, kurių turi būti imamasi po bandymo su pradine doze, nurodyti 2 priede pateiktose schemose. Yra trys būdai: nutraukti bandymą ir priskirti medžiagą atitinkamai pavojaus klasei, bandyti esant didesnei fiksuotai dozei arba bandyti esant mažesnei fiksuotai dozei. Tačiau siekiant apsaugoti gyvūnus, darant pagrindinį tyrimą nebus kartojama dozė, sukėlusi žūtį darant orientacinį tyrimą (žr. 2 priedą). Patyrimas rodo, kad labiausiai tikėtinas pradinės dozės davimo rezultatas pasireikš tuo, kad medžiaga galės būti klasifikuota ir tolesnis bandymas nebus būtinas.

Kiekvienai tiriamai dozei paprastai bus naudojama iš viso po penkis vienos lyties gyvūnus. Penkis gyvūnus sudarys vienas gyvūnas iš orientacinio tyrimo, gavusio pasirinktą dozę, ir keturi papildomi gyvūnai (išskyrus neįprastus atvejus, kai pagrindinio tyrimo dozė nebuvo įtraukta į orientacinį tyrimą).

Laiko tarpą tarp kiekvieno dydžio dozių skyrimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės davimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai. Rekomenduojamas 3 arba 4 parų laikotarpis tarp kiekvieno dydžio dozės, jei prireikia, uždelstam toksiškumui stebėti. Laiko tarpas prireikus gali būti reguliuojamas, pvz., reakcijos be traukulių atveju.

Kai sprendžiama, ar skirti didžiausią fiksuotą 5 000 mg/kg dozę, reikėtų laikytis 3 priede aprašytos metodikos (dar žr. 1.6.2 skirsnį).

1.5.3.2 Ribinis bandymas

Ribinis bandymas visų pirma daromas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t.y., toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Informacijos apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima gauti pasinaudojus žiniomis apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius arba produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos išvis nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti daromas pagrindinis bandymas.

Taikant įprastą procedūrą, šioje rekomendacijoje ribiniu bandymu būtų orientacinis tyrimas esant 2 000 mg/kg (arba išimtinais atvejais 5 000 mg/kg), po kurio keturiems papildomiems gyvūnams būtų skirta tokio pat dydžio dozė.

1.6 STEBĖJIMAI

Gavę dozę gyvūnai atskirai mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimi visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai nužudyti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (11). Visi stebėjimai yra sistemingai užrašomi atskirai apie kiekvieną gyvūną.

Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai nužudyti. Kai gyvūnai nužudomi dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.

1.6.1 Kūno masė

Atskira gyvūnų masė nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos davimą ir vėliau – mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai sveriami ir humaniškai nužudomi.

1.6.2 Patologija

Visiems bandymo gyvūnams (įskaitant nugaišusius darant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) daromas bendrasis skrodimas. Aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. Gyvūnams, kurie po dozės gavimo išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų daryti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.

2. DUOMENYS

Turi būti pateikiami atskirų gyvūnų duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius, darant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius, atskirų gyvūnų žūties laikas, toksiško poveikio aprašymas, to poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys.

3. ATASKAITOS RENGIMAS

3.1 BANDYMŲ ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka:

Bandomoji medžiaga: — fizinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikocheminės savybės (įskaitant izomerizavimą), — identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį.

Nešiklis (jei tinka): — nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

Bandymo gyvūnai: — naudota rūšis ir veislė, — mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma, — gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą), — šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.

Bandymo sąlygos: — išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant duodamos medžiagos fizikinį pavidalą, — išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimą, įskaitant dozavimo tūrį ir davimo laiką, — išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (šaltinį), vandens šaltinį), — pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.

Rezultatai: — kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir dozės dydžio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant gaištamumą, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę), — kūno masės ir jos kitimo lentelės, — atskirų gyvūnų masė dozės davimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba nužudymo dieną, — žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį nužudymą, — toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas, — kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra.

Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.

Išvados.

4. NUORODOS

1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, p. 85–92.

2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O., (1987) Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279–291.

3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P., (1990) The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, p. 469–482.

4) Whitehead, A. and Curnow, R.N., (1992) Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313–324.

5) Stallard, N. and Whitehead, A., (1995) Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, p. 315–323.

6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P., (2002) Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183–196.

7) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris.

8) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment No 19.

9) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C., (1995) Comparison of the Up-and- Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223–231.

11) Chan, P.K and Hayes, A.W., (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, USA.

1 PRIEDAS ORIENTACINIO TYRIMO SCHEMA

2 PRIEDAS PAGRINDINIO TYRIMO SCHEMA

3 PRIEDAS BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2 000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEDARANT BANDYMO Pavojaus 5 kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per burną arba odą yra 2 000-5 000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2 000 mg/kg < LD550 < 5 000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais: a) jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 2 priedo bandymo schemų, pagrįstų gaištamumo dažnumu; b) Jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti tyrimai su gyvūnais arba toksiškas poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai; c) gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir — yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms, arba — pastebimas tam tikras gaištamumas, kai bandymas atliekamas duodant per burną dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, arba — jei tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba — jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį darant kitus tyrimus su gyvūnais. BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS NEGU 2 000 MG/KG DOZĖMS Išimtiniais atvejais, ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotą 5 000 mg/kg dydžio dozę. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas skiriant 5 000 mg/kg neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiamą kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (9). Orientacinis tyrimas Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 1 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5 000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama orientacinio tyrimo pradinė 5 000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (žūtis) reikės daryti bandymą su antru gyvūnu, skiriant 2 000 mg/kg; gavus B ir C rezultatus (akivaizdus toksiškumas arba jokio toksiškumo) pradinė pagrindinio tyrimo dozė gali būti 5 000 mg/kg. Panašiai, jei skiriama kita nei 5 000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5 000 mg/kg, jei esant 2 000 mg/kg dozei gaunami B arba C rezultatai; gavus A rezultatą, esant 5 000 mg/kg, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 2 000 mg/kg, o gavus B ir C rezultatus, pagrindinio tyrimo pradinė dozė yra 5 000 mg/kg. Pagrindinis tyrimas Sprendimo priėmimo taisyklės, taikomos 2 priede pateiktai nuosekliai procedūrai, išplečiamos, kad būtų galima įtraukti 5 000 mg/kg dozę. Taigi kai skiriama pagrindinio tyrimo pradinė 5 000 mg/kg dozė, gavus A rezultatą (≥ 2 žūtys) reikės daryti 2 grupės bandymą, skiriant 2 000 mg/kg; gavus B rezultatą (akivaizdus toksiškumas ir (arba) ≤1 žūtis) arba C (jokio toksiškumo), medžiaga nebus klasifikuojama pagal GHS. Panašiai, jei naudojama kita nei 5 000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus tęsiamas iki 5 000 mg/kg, jei esant 2 000 mg/kg dozei gaunamas C rezultatas; gavus A rezultatą esant 5 000 mg/kg, medžiaga priskiriama GHS 5 kategorijai, o gavus B arba C rezultatus, medžiaga pagal GHS neklasifikuojama.

4 PRIEDAS BANDYMŲ METODAS B.1 bis. Klasifikavimo pagal ES schemą rekomendacijos, taikomos pareinamajam laikotarpiui iki visiškai visuotinai suderintos klasifikavimo sistemos (GHS) įgyvendinimo (paimta iš (8) nuorodos)

B.1 TRIS. ŪMUS ORALINIS TOKSIŠKUMAS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLASĖS METODAS

1. METODAS

Šis bandymų metodas atitinka OECD TG 423 (2001)

1.1 ĮVADAS

Šiame bandyme taikomas ūmaus toksiškumo klasės metodas (1) – tai nuosekli procedūra, pagal kurią vienai pakopai naudojami 3 vienos lyties gyvūnai. Atsižvelgiant į gaištamumą ir (arba) gyvūno gaišimo būseną, vidutiniškai gali prireikti 2-4 pakopų, kad būtų galima spręsti apie bandomosios medžiagos toksiškumą. Ši metodika yra atkuriama, ją taikant naudojama daug mažiau gyvūnų ir ji leidžia suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai būtų padaryta taikant kitus ūmaus toksiškumo bandymo metodus. Ūmaus toksiškumo klasės metodas pagrįstas biometriniais įvertinimais (2) (3) (4) (5), naudojant fiksuotas dozes, kurios pakankamai skiriasi, kad medžiagą būtų galima klasifikuoti ir įvertinti jos pavojų. 1996 m. priimto metodo tinkamumas buvo plačiai patvirtintas nacionaliniu (6) ir tarptautiniu mastu (7) darant in vivo bandymus ir lyginant su literatūroje pateiktais LD50 duomenimis.

Rekomendacijas dėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandymų metodo pasirinkimo galima rasti Rekomendaciniame ūmaus oralinio toksiškumo bandymo dokumente (8). Be to, šiame Rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie B.l tris bandymo metodo taikymą ir aiškinimą.

Nereikia duoti dozių, kurios, kaip žinoma, sukelia didelį skausmą ir kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginančio poveikio. Gaištantys gyvūnai arba gyvūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausmą arba kuriems pasireiškia didelės ir ilgalaikės kančios požymiai, turi būti humaniškai nužudomi ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi darant bandymą žuvusiais gyvūnais. Sprendimo nužudyti gaištantį arba stipriai kenčiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos žūties nustatymo rekomendacijos yra atskiro rekomendacinio dokumento objektas (9).

Metode naudojamos iš anksto nustatyto dydžio dozės, o rezultatai leidžia medžiagą įvertinti ir klasifikuoti pagal visuotinai suderintą sistemą {Globally Harmonised System (GHS)), skirtą ūmų toksiškumą sukeliančioms cheminėms medžiagoms klasifikuoti (10).

Iš esmės šis metodas nėra skirtas tikslioms LD50 vertėms apskaičiuoti, bet juo galima nustatyti apibrėžtus žūtį sukeliančių dozių intervalus, kadangi tokio bandymo tikslas ir yra nustatyti, ar dalis gyvūnų žūsta. Šiuo metodu galima nustatyti LD50 vertę tik tais atvejais, kai mažiausiai dviejų dozių sukeliamas gaištamumas yra didesnis kaip 0 % ir mažesnis kaip 100 %. Kai skiriamos iš anksto pasirinktos dozės neatsižvelgiant į bandomąją medžiagą, o klasifikavimas tiesiogiai siejamas su stebimų skirtingos būsenos gyvūnų skaičiumi, laboratorijoms didėja galimybė pasiekti suderinamų ir atkartojamų rezultatų.

Prieš tyrimo pradžią bandymų laboratorija išnagrinėja visą turimą informaciją apie bandomąją medžiagą. Tokią informaciją sudarytų medžiagos identiškumas ir cheminė struktūra, jos fizikocheminės savybės, visų kitų in vitro arba in vivo medžiagos toksiškumo bandymų rezultatai, giminingos struktūros medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo būdas (-ai). Ši informacija yra būtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus dėl bandymo reikalingumo žmonių sveikatai apsaugoti, ir padėti pasirinkti tinkamą pradinę dozę.

1.2 SĄVOKOS

Ūmus oralinis toksiškumas – taikomas tam neigiamam poveikiui, kuris atsiranda davus per burną vieną medžiagos dozę arba kelias dozes per 24 h.

Uždelsta mirtis – kai gyvūnas nežūsta arba nepanašus į gaištantį per 48 h, bet žūsta vėliau per 14 parų stebėjimo laikotarpį.

Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Dozė išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (pvz., mg/kg).

GHS – visuotinai suderinta cheminių medžiagų ir mišinių klasifikavimo sistema {Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures). OECD (žmonių sveikata ir aplinka), JT pavojingų prekių pervežimo ekspertų komiteto (fizikocheminės savybės) ir ILO (pavojų pranešimas) bendroji veikla, koordinuojama Tarporganizacinės cheminių medžiagų tinkamos vadybos programos {Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)).

Neišvengiama žūtis – kai gaišimo būsenos arba žūties reikia laukti anksčiau negu nustatytas kito planinio stebėjimo momentas. Šios graužikų būsenos požymiai galėtų būti traukuliai, gulėjimas ant šono, gulėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9).).

LD 50 (medianinė mirtina dozė) – tai statistiškai apskaičiuojama viena medžiagos dozė, nuo kurios yra tikimybė žūti 50 % gyvūnų, gavusių dozę per burną. LD50 vertė yra išreiškiama bandomosios medžiagos mase bandymo gyvūno masės vienetui (mg/kg).

Ribinė dozė –dozė, atitinkanti viršutinę bandymo dozės ribą (2 000 arba 5 000 mg/kg).

Gaišimo būsena – būsena prieš žūtį arba kai neišgyvena net gydomas gyvūnas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9)).

Numatoma žūtis – klinikinių požymių, rodančių žūtį tam tikru momentu ateityje prieš eksperimento pabaigą, pvz., nesugebėjimas pasiekti vandenį arba pašarą, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9)).

1. 3 BANDYMO METODO ESMĖ

Šio bandymo esmę sudaro nuosekli metodika, pagal kurią vienai pakopai naudojant mažiausią įmanomą gyvūnų skaičių gaunama pakankamai informacijos apie bandomosios medžiagos ūmų toksiškumą, kad būtų galimą ją klasifikuoti. Grupė bandymo gyvūnų per burną gauna viena iš nustatytų bandomosios medžiagos dozių. Medžiaga bandoma taikant nuoseklią metodiką, kiekvienai pakopai naudojami trys vienos lyties gyvūnai (paprastai patelės). Su junginiu siejamas dozę gavusių gyvūnų gaišimas arba negaišimas per vieną iš pakopų lemia kitą pakopą, t. y.:

— toliau bandyti nereikia,

— duoti tokią pat dozę dar trims gyvūnams,

— trims papildomiems gyvūnams duoti kitą didesnę arba mažesnę dozę.

Bandymo metodika išsamiai aprašyta 1 priede. Metodas leidžia spręsti, ar bandomąją medžiagą priskirti vienai iš toksiškumo klasių, apibrėžtų fiksuotomis LD50 intervalo ribinėmis vertėmis.

1.4 METODO APRAŠYMAS

1.4.1 Gyvūnų rūšies pasirinkimas

Tinkamiausia graužikų rūšis yra žiurkės, nors galima naudoti ir kitus graužikus. Paprastai naudojamos patelės (9). Pasirinkimą lėmė tipinių LD50 bandymų informacinės apžvalgos, kurios parodė, kad jautrumo skirtumai tarp lyčių yra maži, bet tais atvejais, kai jie pastebimi, patelės dažniausiai yra šiek tiek jautresnės (11). Tačiau jei giminingos struktūros cheminių junginių toksikologinės arba toksikokinetinės savybės rodo, kad patinai gali būti jautresni, turėtų būti naudojama ši lytis. Kai bandymai daromi su patinais, turėtų būti pateikti atitinkami tai patvirtinantys duomenys.

Bandomi sveiki, jauni, bet suaugę plačiai naudojamų laboratorinių rūšių gyvūnai. Patelės turi būti dar be vados ir neapvaisintos. Kiekvieno gyvūno amžius prieš skiriant dozę turėtų būti nuo 8 iki 12 savaičių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anksčiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę masę.

1.4.2 Laikymo ir šėrimo sąlygos

Bandymo gyvūnų patalpos temperatūra turi būti 22 oC (± 3 oC). Nors santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laiką, reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi būti dirbtinis, esant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sekai. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Gyvūnai gali būti laikomi narveliuose pagal dozes, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi trukdyti aiškiai matyti kiekvieną gyvūną.

1.4.3 Gyvūnų ruošimas

Gyvūnai atrenkami atsitiktinai, ženklinami, kad būtų įmanoma identifikuoti kiekvieną gyvūną, ir prieš dozių davimo pradžią laikomi narveliuose mažiausiai 5 paras, kad priprastų prie laboratorinių sąlygų.

1.4.4 Dozių ruošimas

Apskritai visų dydžių bandomosios medžiagos dozės duodamos kaip pastovaus tūrio dozės, keičiant ruošiamos dozės koncentraciją. Tačiau jei reikia bandyti skystą galutinį produktą arba mišinį, paskesniam šios bandomosios medžiagos rizikos įvertinimui galbūt labiau tiktų neskiesta, t. y. pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojančios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias skiriamos dozės tūris neturi būti viršytas. Didžiausias skysčio tūris, kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyvūno dydžio. Graužikams šis tūris paprastai neturėtų būti didesnis negu 1 ml/100g kūno masės, tačiau vandeninių tirpalų atveju galima naudoti 2 ml/100g kūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandeninį tirpalą (suspensiją, emulsiją), toliau pirmenybė teikiama tirpalui (emulsijai, suspensijai) aliejuje (pvz., kukurūzų aliejuje) ir tik tuomet naudojami tirpalai kituose nešikliuose. Jei nešiklis yra ne vanduo, turi būti žinomos jo toksikologinės charakteristikos. Dozės turi būti ruošiamos prieš pat davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra žinomas ir laikomas priimtinu.

1.5 DARBO EIGA

1.5.1 Dozių davimas

Bandomoji medžiaga duodama kaip viena dozė per skrandžio zondą arba tinkamą intubacinį vamzdelį. Esant neįprastoms aplinkybėms, kai neįmanoma duoti vieną dozę, ji gali būti duodama mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.

Prieš duodant dozę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurkės negauna pašaro, išskyrus vandenį, per naktį; pelės gauna vandens, bet negauna pašaro 3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyvūnai pasveriami ir duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pelės nešeriamos 1–2 h. Jei dozė duodama dalimis per tam tikrą laikotarpį, gyvūnus gali tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukmę.

1.5.2 Gyvūnų skaičius ir dozių dydis

Kiekvienai pakopai imami trys gyvūnai. Dozė, kuri turi būti naudojama kaip pradinė dozė, pasirenkama iš keturių fiksuotų dydžių: 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg kūno masės. Kaip pradinė turėtų būti pasirinkta dozė, kuriai esant tikrai nugaištų kai kurie iš dozę gavusių gyvūnų. Schemose, pateiktose 1 priede, aprašyta procedūra, kurios reikėtų laikytis kiekvienai pradinei dozei. Be to, 4 priede pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistemą, laukiant naujos GHS įgyvendinimo.

Kai turimoje informacijoje nurodoma, kad gyvūnai neturėtų gaišti esant didžiausiai pradinei dozei (2 000 mg/kg kūno masės), reikėtų daryti ribinį bandymą. Neturint informacijos apie bandomąją medžiagą, bet rūpinantis gyvūnų gerove, pradine doze reikėtų pasirinkti 300 mg/kg kūno masės.

Laiko tarpą tarp kiekvieno dydžio dozių davimo lemia toksiškumo požymių atsiradimo pradžia, trukmė ir sunkumas. Kitos dozės davimas gyvūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno anksčiau dozę gavę gyvūnai.

Išimtiniais atvejais ir tik norint įvykdyti konkrečius kontrolės institucijų reikalavimus, galima spręsti, ar skirti papildomą viršutinės ribos fiksuotos 5 000 mg/kg dydžio dozę (žr. 2 priedą). Dėl su gyvūnų gerove susijusių priežasčių, neskatinama daryti bandymą taikant GHS 5 kategorijos intervalus (2 000–5 000 mg/kg) ir apie tokio bandymo reikalingumą turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsauga.

1.5.3 Ribinis bandymas

Ribinis bandymas visų pirma daromas tais atvejais, kai bandytojas turi informacijos, rodančios, kad bandomoji medžiaga greičiausiai yra netoksiška, t. y., toksiškumas pasireiškia esant didesnėms nei reglamentuojamos ribinėms dozėms. Apie bandomosios medžiagos toksiškumą galima sužinoti remiantis informacija apie panašius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius ar produktus, atsižvelgiant į toksikologinį reikšmingumą turinčių komponentų tapatumą ir procentinę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškumą yra mažai arba jos visai nėra arba kai pagal tą informaciją bandomoji medžiaga gali būti toksiška, turi būti daromas pagrindinis bandymas.

Kai skiriama viena 2 000 mg/kg kūno masės dozė, ribiniam bandymui galima imti šešis gyvūnus (po tris vienai pakopai). Išimtiniais atvejais, kai skiriama viena 5 000 mg/kg dozė, ribiniam bandymui galima naudoti tris gyvūnus (žr. 2 priedą). Jei pastebimas su medžiaga siejamas gaišimas, gali tekti daryti bandymą esant gretimai mažesnei dozei.

1.6 STEBĖJIMAI

Gavę dozę gyvūnai atskirai mažiausiai vieną kartą per pirmąsias 30 min. ir periodiškai per pirmąsias 24 h, ypač per pirmąsias 4 h, ir toliau kasdien stebimi visas 14 parų, išskyrus kai gyvūnams reikia nutraukti tyrimą ir humaniškai nužudyti dėl gyvūnų gerovės priežasčių arba kai jie nugaišta. Tačiau stebėjimo trukmė neturi būti griežtai fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksiškumo reakcijas, sveikimo laikotarpio pradžią ir trukmę, taigi prireikus ji gali būti pratęsta. Svarbus yra toksiškumo požymių atsiradimo ir išnykimo momentas, ypač jei jie vėluoja atsirasti (12). Visi stebėjimai yra sistemingai užrašomi atskirai apie kiekvieną gyvūną.

Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia stebėti papildomai. Reikia stebėti odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimus, be to kvėpavimo, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų, somatomotorinės veiklos ir elgesio pasikeitimus. Ypač reikia stebėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos būsenos, ar neteka seilės. Reikėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente dėl poveikio žmonėms (9). Gaištantys gyvūnai ir gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia ilgalaikiai sunkių kančių požymiai, turėtų būti humaniškai nužudyti. Kai gyvūnai nužudomi dėl humaniškų priežasčių arba randami negyvi, žūties laikas užrašomas kiek įmanoma tiksliau.

1.6.1 Kūno masė

Atskira gyvūnų masė turi būti nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos davimą ir vėliau mažiausiai kas savaitę. Turi būti apskaičiuotas ir užrašytas masės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlikę gyvūnai pasveriami ir humaniškai nužudomi.

1.6.2 Patologija

Visiems bandomiesiems gyvūnams (įskaitant nugaišusius darant bandymą arba pašalintus iš tyrimo dėl gyvūnų gerovės priežasčių) daromas bendrasis skrodimas. Turėtų būti aprašomi visi dideli kiekvieno gyvūno patologiniai pokyčiai. Gyvūnams, kurie išgyveno 24 h arba ilgiau, galima būtų atlikti mikroskopinį organų, turinčių akivaizdžių patologinių pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos informacijos.

2. DUOMENYS

Turėtų būti pateikiami atskirų gyvūnų duomenys. Be to, visi duomenys suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo grupei nurodomas naudotų gyvūnų skaičius, gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, skaičius, darant bandymą žuvusių arba dėl humaniškų priežasčių nužudytų gyvūnų skaičius, atskirų gyvūnų žūties laikas, toksiškumo poveikio aprašymas, tokio poveikio kitimas laike ir grįžtamumas, skrodimo duomenys.

3. ATASKAITOS RENGIMAS

3.1 BANDYMŲ ATASKAITA

Bandymų ataskaitoje turi būti pateikta ši informacija, jei tinka:

Bandomoji medžiaga: — fizikinė būsena, grynumas ir, jei tinka, fizikocheminės savybės (įskaitant izomerizavimą), — identifikavimo duomenys, įskaitant CAS numerį.

Nešiklis (jei tinka): — nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.

Bandymo gyvūnai: — naudota rūšis ir veislė, — mikrobiologinė gyvūno būsena, jei žinoma, — gyvūnų skaičius, amžius ir lytis (įskaitant, jei tinka, patinų vietoj patelių naudojimo pagrindimą), — šaltinis, laikymo sąlygos, pašaras ir t. t.

Bandymo sąlygos: — išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparatą, įskaitant duodamos medžiagos fizikinį pavidalą, — išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimą, įskaitant dozavimo tūrį ir davimo laiką, — išsami informacija apie pašaro ir vandens kokybę (įskaitant pašaro tipą (šaltinį), vandens šaltinį), — pradinės dozės pasirinkimo pagrindimas.

Rezultatai: — kiekvieno gyvūno reakcijos duomenų ir dozės dydžio lentelės (t. y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant gaištamumą, poveikio tipą, sunkumą ir trukmę), — kūno masės ir jos kitimo lentelės, — atskirų gyvūnų masė dozės davimo dieną, vėliau kas savaitę ir žūties arba nužudymo dieną, — žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planinį nužudymą, — toksiškumo požymių kiekvienam gyvūnui atsiradimas ir vystymasis, jų galimas grįžtamumas, — kiekvieno gyvūno skrodimo ir histopatologiniai duomenys, jei yra.

Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.

Išvados.

4. NUORODOS

1) Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86

2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336–341.

3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559–610

4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729–734.

5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX 16, p. 129–134

6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method – An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455–470.

7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659–670.

8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF .html].

11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223–231.

12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.

1 PRIEDAS PROCEDŪRA, TAIKOMA NAUDOJANT KIEKVIENĄ PRADINĘ DOZĘ BENDROSIOS PASTABOS Į šį priedą įtrauktose atitinkamose bandymo schemose aprašoma kiekvienos pradinės dozės procedūra, kurios reikia laikytis. — 1 a priedas: pradinė dozė 5 mg/kg kūno masės — 1 b priedas: pradinė dozė 50 mg/kg kūno masės — 1 c priedas: pradinė dozė 300 mg/kg kūno masės — 1 d priedas: pradinė dozė 2 000 mg/kg kūno masės Atsižvelgiant į humaniškai nužudytų arba žuvusių gyvūnų skaičių, bandymo eiga žymima rodyklėmis. 1 A PRIEDAS PROCEDŪRA ESANT 5 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI 1 B PRIEDAS PROCEDŪRA ESANT 50 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI 1 C PRIEDAS PROCEDŪRA ESANT 300 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI 1 D PRIEDAS PROCEDŪRA ESANT 2 000 MG/KG KŪNO MASĖS PRADINEI DOZEI

2 PRIEDAS BANDOMŲJŲ MEDŽIAGŲ, KURIŲ TIKĖTINOS LD50 VERTĖS YRA DIDESNĖS NEGU 2 000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI NEDARANT BANDYMO Pavojaus 5 kategorijos kriterijai yra apibrėžti, kad būtų galima identifikuoti bandomąsias medžiagas, kurių ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, tačiau kurios esant tam tikroms aplinkybėms gali būti pavojingos pažeidžiamoms populiacijoms. Tikėtina, kad šių medžiagų LD50 per burną arba odą yra 2 000–5 000 mg/kg arba ekvivalentinė dozė, kai medžiagos patenka kitais būdais. Bandomosios medžiagos galėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibrėžtai 2 000 mg/kg < LD50 < 5 000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais: a) jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kurią nors iš 2 priedo bandymo schemų, pagrįstų gaištamumo dažnumu; b) jei jau yra patikimų duomenų, rodančių, kad LD50 yra 5 kategorijos verčių intervale, arba kiti tyrimai su gyvūnais arba toksiškas poveikis žmonėms rodo ūmaus tipo poveikį žmonių sveikatai; c) gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo būdu, jei priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagrįstas ir — yra patikimos informacijos, rodančios didelį toksišką poveikį žmonėms, arba — pastebimas tam tikras gaištamumas, kai bandymas atliekamas duodant per burną dozes, siekiančias 4 kategorijos vertes, arba — jei tęsiant bandymus iki 4 kategorijos verčių ekspertų sprendimu patvirtinami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavimą, pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyvūno išvaizdą, arba — jei ekspertų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galimą reikšmingą ūmų poveikį darant kitus tyrimus su gyvūnais. BANDYMAS ESANT DIDESNĖMS KAIP 2 000 MG/KG DOZĖMS Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyvūnų gerovę, bandymas su gyvūnais skiriant 5 kategorijos intervalo dozes (5 000 mg/kg) neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didelė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmonių arba gyvūnų sveikatos apsauga (10). Neturi būti daromas joks bandymas esant didesnėms dozėms. Kai reikia bandyti naudojant 5 000 mg/kg dozę, reikalinga tik viena pakopa (t. y. trys gyvūnai). Jei žūsta pirmas dozę gavęs gyvūnas, dozavimas tęsiamas skiriant 2 000 mg/kg dozę pagal 1 priede pateiktas schemas. Jei pirmas gyvūnas lieka gyvas, dozę gauna kiti du gyvūnai. Jei žūsta tik vienas iš trijų gyvūnų, daroma prielaidą kad LD50 vertė yra didesnė negu 5 000 mg/kg. Jei žūsta abu gyvūnai, dozavimas tęsiamas skiriant 2 000 mg/kg dozę.

3 PRIEDAS BANDYMŲ METODAS B.1 tris. Klasifikavimo pagal ES schemą rekomendacijos, taikomos pereinamajam laikotarpiui iki visiško visuotinai suderintos klasifikavimo sistemos (GHS) įgyvendinimo (paimta iš 8 nuorodos)

B.2. ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (INHALIACINIS)

1. METODAS

1.1. ĮVADAS

Naudinga turėti išankstinę informaciją apie medžiagos dalelių dydžio pasiskirstymą, garų slėgį, lydymosi temperatūrą, virimo temperatūrą, pliūpsnio temperatūrą ir sprogumą (jeigu tinka).

Taip pat žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.

1.2. SĄVOKOS

Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Nėra.

1.4. BANDYMO METODO ESMĖ

Kelios eksperimentinių gyvūnų grupės yra veikiamos tiriamąja medžiaga apibrėžtą laikotarpį tam tikra tvarka suskirstytomis koncentracijomis, viena koncentracija naudojama vienai grupei. Po to atliekami poveikio ir žūties atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, o užbaigus bandymą – likusiems gyviems gyvūnams atliekama autopsija.

Gyvūnus, kurie turi aiškių ir ilgalaikių kančios ir skausmo požymių, reikia humaniškai nužudyti. Jeigu žinoma, kad dėl medžiagų, naudojamų dozavimo bandymuose, gali kilti skausmas ir kančia dėl jų ardančių (ėsdinančių) arba dirginančių savybių, tokie bandymai neturėtų būti atliekami.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Nėra.

1.6. BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6.1. Pasirengimas

Gyvūnai laikomi eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento. Prieš bandymą sveiki jauni gyvūnai yra randomizuojami ir suskirstomi į reikalingą grupių skaičių. Jie neturi patirti dirbtinai sukurto poveikio, išskyrus atvejus, jei tai daryti rekomenduojama dėl tam tikro poveikio aparato tipo.

Kietąsias tiriamas medžiagas gali tekti mikronizuoti, kad būtų gaunamos atitinkamo dydžio dalelės.

Prireikus į tiriamąją medžiagą gali būti dedama atitinkamo tirpiklio, kad būtų gaunama atitinkama tiriamos medžiagos koncentracija atmosferoje, po to turėtų būti naudojama kontrolinė tirpiklių grupė. Jeigu tirpiklis ar kiti priedai yra naudojami dozavimui palengvinti, turėtų būti žinoma, kad jie nesukels toksiško poveikio. Atitinkamais atvejais gali būti naudojamasi ankstesniais duomenimis.

1.6.2. Bandymo sąlygos

1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai

Jeigu nėra kontraindikacijų, pirmenybė atiduodama žiurkėm s. Turėtų būti panaudojamos plačiai naudojamos laboratorinės veislės. Kiekvienai lyčiai bandymo pradžioje naudojamų gyvūnų svorio įvairavimas neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.

1.6.2.2. Skaičius ir lytis

Ne mažiau kaip dešimt graužikų (penki patinėliai ir penkios patelės) yra naudojami kiekvienai koncentracijai. Patelės turėtų būti neturėjusios jauniklių ir nevaikingos.

Pastaba: Atliekant ūminio toksiškumo bandymus su aukštesniaisiais negu graužikai gyvūnais turi būti apsvarstoma galimybė naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turėtų būti atidžiai parenkamos ir turėtų būti dedamos visos pastangos neviršyti vidutiniškai toksiškų dozių. Tokiuose bandymuose turėtų būti vengiama įvesti mirtinas tiriamosios medžiagos dozes.

1.6.2.3. Poveikio koncentracijos

Koncentracijų skaičius turėtų būti pakankamas, ne mažiau trijų, ir taip paskirstytų, kad susidarytų bandymo grupės, turinčios tam tikrą toksiško poveikio intervalą ir mirštamumo procentą. Duomenų turi būti tiek, kad pakaktų sudaryti mirtinų koncentracijų kreivę ir atitinkamais atvejais būtų galima tinkamai nustatyti LC50.

1.6.2.4. Ribinis bandymas

Jeigu penkis bandomus patinėlius ir penkias bandomas pateles paveikus 5 mg skystos arba kietos medžiagos viename litre dujų arba aerozolio (arba, jeigu tai neįmanoma dėl tiriamos medžiagos fizikinių arba cheminių, taip pat ir sprogumo savybių – maksimalia pasiekiama koncentracija) keturias valandas, per 14 dienų nebūna su tuo cheminiu junginiu susijusių nugaišimo atvejų, laikoma, kad tolesnis bandymas yra nereikalingas. (18th ATP, dir. 93/21/EEC, L1 10/93)

1.6.2.5. Poveikio trukmė

Poveikio trukmė turėtų būti lygi keturioms valandoms.

1.6.2.6. Įrenginiai

Gyvūnai turėtų būti bandomi inhaliaciniais įrenginiais, skirtais išlaikyti dinaminį oro srautą ne mažiau kaip 12 oro pasikeitimų per valandą, kad būtų užtikrintas pakankamas deguonies kiekis ir vienodai pasiskirstytų poveikio atmosfera. Jeigu naudojama kamera, ji turėtų būti tokios konstrukcijos, kad kaip galima būtų sumažinamas gyvūnų susigrūdimas ir kad jie įkvėptų kaip galima daugiau tiriamosios medžiagos. Paprastai, norint užtikrinti kameros atmosferos pastovumą, visas bandomų gyvūnų „tūris“ neturėtų viršyti 5 % bandymo kameros tūrio. Atskiroje kameroje gali būti paveikiama burna ir nosis, tik galva arba visas kūnas; du pirmieji būdai padeda sumažinti tiriamos medžiagos patekimą kitais keliais.

1.6.2.7. Stebėjimo laikotarpis

Stebėjimo laikotarpis turėtų būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimo trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo laikotarpio trukmę; todėl, jeigu laikoma reikalinga, jis gali būti pailginamas. Labai svarbus yra laikas, kada toksiškumo požymiai atsiranda ir išnyksta, bei nugaišimo laikas, ypač jeigu yra tendencija, kad žūtis pasireiškia vėliau.

1.6.3. Darbo eiga

Prieš pat poveikį gyvūnai yra sveriami ir po to paveikiami tiriama koncentracija tam skirtame aparate keturias valandas po to, kai kameroje nustatoma koncentracijos pusiausvyra. Pusiausvyros nustatymo trukmė turi būti trumpa. Temperatūra, kurioje vykdomas bandymas, turėtų būti išlaikoma 22 ± 3 oC. Tinkamiausias santykinis drėgnumas yra tarp 30 % ir 70 %, bet tam tikrais atvejais (pvz., atliekant tam tikrus aerozolių bandymus), tai gali būti neįgyvendinama. Išlaikant nedidelį neigiamą slėgį kameros viduje (≥ 5 mm vandens) užkertamas kelias tiriamajai medžiagai patekti į aplinką. Poveikio metu turėtų būti duodama pašaro ir vandens. Turėtų būti naudojamos atitinkamos bandymo atmosferos generavimo ir stebėsenos sistemos. Tokia sistema turėtų užtikrinti, kad kaip galima greičiau bus pasiektos pastovios poveikio sąlygos. Kamera turėtų būti tokios konstrukcijos ir taip veikti, kad kameros viduje būtų palaikomas vienodas bandymo atmosferos pasiskirstymas.

Turėtų būti atliekami šie matavimai arba stebėsena:

a) oro srauto greičio (visą laiką),

b) tikrosios tiriamos medžiagos koncentracijos, matuojamos kvėpavimo zonoje ne mažiau kaip tris kartus poveikio metu (esant tam tikrai atmosferai, pvz., naudojant didelės koncentracijos aerozolius, gali tekti vykdyti dažnesnį monitoringą). Poveikio metu koncentracija neturėtų keistis daugiau negu ± 15 % vidutinės vertės. Tačiau naudojant tam tikrus aerozolius, šio kontrolės lygio gali būti neįmanoma pasiekti, tokiu atveju būtų priimtinas platesnis intervalas. Aerozolių dalelių dydžio analizė turėtų būti atliekama reikiamu dažnumu (ne rečiau kaip vieną kartą vienai bandomajai grupei),

c) temperatūros ir drėgnumo, j eigų įmanoma, visą laiką.

Poveikio metu ir po jo atliekami stebėjimai, kurie sistemingai užrašomi; apie kiekvieną gyvūną turėtų būti daromi atskiri įrašai. Pirmą dieną stebėjimai turėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis ištyrimas turėtų būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti vykdomi kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų iki minimumo sumažinti bandymo metu prarandamų gyvūnų skaičių, pvz., rastų negyvų gyvūnų autopsija arba užšaldymas ir nusilpusių arba gaištančių gyvūnų izoliavimas arba nužudymas.

Stebimi odos ir kailio, akių, gleivinės pasikeitimai, taip pat respiratorinės, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos ir elgsenos pasikeitimai. Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tremorų, konvulsijų, salivacijos, diarėjos, letargo, miego ir komos stebėjimams. Nugaišimo laikas turėtų būti užrašomas kaip galima tiksliau. Kiekvieno gyvūno svoris turėtų būti nustatomas kiekvieną savaitę po poveikio ir šiam nugaišus.

Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, ir tiems, kurie išlieka gyvi bandymą sustabdžius, atliekama autopsija, ypač atkreipiant dėmesį į visus viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų pokyčius. Turėtų būti užregistruojami visi dideli patologiniai pokyčiai. Jeigu reikalaujama, turėtų būti paimami audiniai histopatologiniam tyrimui.

2. DUOMENYS

Duomenys turėtų būti apibendrinami lentelėse, nurodant kiekvienos bandomos grupės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyvūno nugaišimo laiką, gyvūnų, turinčių kitokius toksiškumo požymius, skaičių, pateikiant toksiškų poveikių ir autopsijos duomenų aprašymą. Turėtų būti apskaičiuojami ir registruojami svorio pasikeitimai, jeigu išgyvenama ilgiau negu vieną dieną. Gyvūnai, kurie humaniškai nužudomi dėl cheminio junginio sukeliamų kančių ir skausmo, yra užregistruojami kaip nugaišimo atvejai, kurių priežastis – cheminis junginys. LD50 gali būti nustatomas pripažintu metodu. Į duomenų vertinimą turėtų įeiti sąryšis, jeigu toks yra, tarp gyvūnų poveikio tiriamąja medžiaga ir visų specifinių rodiklių dažnumo ir stiprumo, taip pat ir elgsenos ir klinikinių parodymų, didesnių audinių pakitimų, kūno svorio pasikeitimų, mirštamumo ir kitų toksikologinių poveikių.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

3.1. BANDYMO ATASKAITA

Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:

— rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos sąlygos, pašarai ir pan.;

— bandymo sąlygos: poveikio aparato apibūdinimas, taip pat aparato konstrukcija, tipas, dydžiai, oro šaltinis, aerozolių generavimo sistema, oro kondicionavimo metodas ir gyvūnų laikymo bandymo kameroje, jeigu tokia naudojama, būdas. Turėtų būti apibūdinama temperatūros, drėgnumo matavimo įranga, aerozolio koncentracijos ir dalelių dydžio pasiskirstymas.

Duomenys apie poveikį

Jie turėtų būti pateikiami lentelėse vidutinėmis vertėmis ir kintamumo vienetais (pvz., standartinis nuokrypis) ir, jeigu įmanoma, į juos turėtų būti įtraukti:

a) oro srauto, tekančio inhaliacijos įrenginiu, greitis;

b) oro temperatūra ir drėgnumas;

c) nominalios koncentracijos (visas tiriamos medžiagos kiekis, įdėtas į inhaliacijos įrenginį, padalytas iš oro tūrio);

d) tirpiklio, jeigu naudotas, rūšis;

e) faktinės koncentracij os kvėpavimo bandymo zonoj e;

f) masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAD) ir geometrinis standartinis nuokrypis (GSD);

g) pusiausvyros nustatymo periodas;

h) poveikio periodas; — duomenų apie reakciją pagal lytį ir poveikį surašymas į lenteles (pvz., gyvūnų, kurie nugaišo arba buvo nužudyti bandymo metu, skaičius; toksiškumo požymių turinčių gyvūnų skaičius; paveiktų gyvūnų skaičius), — nugaišimo laikas poveikio metu arba po jo, priežastys ir kriterijai, kuriais naudotasi humaniškai nužudant gyvūnus, — visi pastebėjimai, — LC50 vertė kiekvienai lyčiai, nustatyta stebėjimo laikotarpio pabaigoje (nurodant apskaičiavimo metodą), — LC50 95 % pasikliautinasis intervalas (tais atvejais, kai gali būti pateikta), — dozės ir mirštamumo kreivė ir statumas (jeigu įmanoma pagal nustatymo metodą), — autopsijos duomenys, — visi histopatologiniai duomenys, — rezultatų aptarimas (ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas tam, kokį poveikį humaniškas gyvūnų nužudymas bandymo metu galėtų turėti apskaičiuojamai LC50 vertei), — rezultatų aiškinimas.

3.2. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS IR AIŠKINIMAS

Žr. bendrąją įvadinę B(D) dalį.

4. LITERATŪRA

Žr. bendrąją įvadinę B(E) dalį.

B.3. ŪMINIS TOKSIŠKUMAS (PER ODĄ)

1. METODAS

1.1. ĮVADAS

Žr. bendrąją įvadinę B(A) dalį.

1.2. SĄVOKOS

Žr. bendrąją įvadinę B(B) dalį.

1.3. ETALONINĖS MEDŽIAGOS

Nėra.

1.4. BANDYMO METODO ESMĖ

Tiriamoji medžiaga dedama ant odos suskirstytomis dozėmis kelioms eksperimentinių gyvūnų grupėms, viena dozė – vienai grupei. Po to atliekami poveikio ir nugaišimo atvejų stebėjimai. Gyvūnams, kurie nugaišta bandymo metu, atliekama autopsija, ir, užbaigus bandymą, autopsija daroma išlikusiems gyviems gyvūnams.

Gyvūnus, kurie turi aiškių ir ilgalaikių kančios ir skausmo požymių, reikia humaniškai nužudyti. Jeigu žinoma, kad dėl medžiagų, naudojamų dozavimo bandymuose, gali kilti skausmas ir kančia dėl jų ardančių (ėsdinančių) arba dirginančių savybių, tokie bandymai neturėtų būti atliekami.

1.5. KOKYBĖS KRITERIJAI

Nėra.

1.6. BANDYMO METODO APIBŪDINIMAS

1.6.1. Pasirengimas

Gyvūnai laikomi eksperimentiniuose narveliuose eksperimentinėmis laikymo ir šėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni suaugę gyvūnai randomizuojami ir paskiriami į apdorojimo grupes. Apytikriai 24 valandas iki bandymo nuo gyvūno kūno sprando srityje pašalinamas kailis, jį nukerpant arba nuskutant. Jeigu kailis kerpamas arba skutamas, reikia stengtis nenubrūžinti odos, tai gali pakeisti pralaidumą. Tiriamajai medžiagai uždėti turėtų būti nukirpta ar nuskusta ne mažiau kaip 10 % kūno paviršiaus. Jeigu bandomos kietosios medžiagos, kurios atitinkamais atvejais gali būti pulverizuojamos, tiriamoji medžiaga turėtų būti pakankamai sudrėkinama vandeniu arba, jeigu reikia, atitinkamu tirpikliu, kad būtų užtikrinamas geras sąlytis su oda. Jeigu naudojamas tirpiklis, turėtų būti atsižvelgiama į tirpiklio poveikį tiriamosios medžiagos įsiskverbimui į odą. Skystos tiriamosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos.

1.6.2. Bandymo sąlygos

1.6.2.1. Eksperimentiniai gyvūnai

Gali būti naudojamos suaugusios žiurkės arba triušiai. Gali būti naudojamos kitos rūšys, bet jų naudojimas turėtų būti pagrindžiamas. Turėtų būti panaudojamos plačiai naudojamos veislės. Kiekvienai lyčiai bandymo pradžioje naudojamų gyvūnų svorio įvairavimo intervalas neturėtų viršyti ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.

1.6.2.2. Skaičius ir lytis

Kiekvienai dozei naudojama ne mažiau 5 gyvūnų. Jie visi turėtų būti vienos lyties. Jeigu naudojamos patelės, jos turėtų būti neturėjusios jauniklių ir būti nevaikingos. Jeigu galima gauti informacijos, parodančios, kad kuri nors lytis yra daug jautresnė, dozė taikoma tai lyčiai.

Pastaba. Atliekant ūminio toksiškumo bandymus su aukštesniaisiais negu graužikai gyvūnais reikėtų išnagrinėti galimybę naudoti mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turėtų būti kruopščiai parenkamos, ir stengiamasi neviršyti vidutinio toksiškumo dozių. Tokių bandymų metu turėtų būti vengiama įvesti mirtinas tiriamosios medžiagos dozes.

1.6.2.3. Dozės

Jų turėtų būti pakankamas skaičius, ne mažiau kaip trys, ir atitinkamai paskirstytų, kad susidarytų tiriamosios grupės, turinčios atitinkamą toksiško poveikio intervalą ir mirštamumo procentą. Duomenų turėtų būti tiek, kad būtų galima sudaryti dozės ir reakcijos kreivę ir, jeigu įmanoma, būtų galima nustatyti LD50.

1.6.2.4. Ribinis bandymas

Jeigu naudojami graužikai, ribinis bandymas suleidžiant vieną dozę, ne mažesnę kaip 2 000 mg/kg kūno svorio, gali būti atliekamas su penkių patinėlių ir penkių patelių grupe, naudojant aukščiau apibūdintą darbo eigą. Jeigu cheminis junginys tampa nugaišimo priežastimi, reikėtų apsvarstyti, ar nereikėtų atlikti išsamų tyrimą.

1.6.2.5. Stebėjimo laikotarpis

Stebėjimo laikotarpis turėtų būti ne trumpesnis kaip 14 dienų. Tačiau stebėjimų trukmė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji turėtų būti nustatoma pagal toksines reakcijas, jų pasireiškimo dažnumą ir sveikimo laikotarpio trukmę; todėl jis gali būti pailginamas, jeigu laikoma, kad to reikia. Svarbus yra laikas, per kurį toksiškumo požymių atsiranda ir išnyksta, taip pat nugaišimo laikas, ypač jeigu yra tendencija, kad žūtis pasireiškia vėliau.

1.6.3. Darbo eiga

Gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose narveliuose. Tiriamoji medžiaga turėtų būti tolygiai uždedama ant plotelio, kurio dydis sudaro apie 10 % viso kūno paviršiaus. Jeigu medžiagos labai toksiškos, paveikiamas paviršius gali būti mažesnis, bet kaip galima didesnis plotas turėtų būti padengiamas kiek įmanoma plonesnių ir lygesniu sluoksniu.

Tiriamoji medžiaga turėtų liestis su oda akytu marlės tvarsčiu ir nedirginančia lipnia juostele per visą 24 valandų poveikio laiką. Tiriamoji vieta ir toliau turėtų būti atitinkamai padengta, kad būtų išsaugotas marlės tvarstis ir tiriamoji medžiaga bei užtikrinama, kad gyvūnai nepraris tiriamosios medžiagos. Gali būti naudojami ribotuvai, kad tiriamoji medžiaga nebūtų praryjama, bet visiško imobilizavimo metodas nerekomenduojamas.

Poveikio laikotarpio pabaigoje tiriamosios medžiagos likutis turėtų būti nuimamas, paprastai naudojant vandenį ar kokį kitą atitinkamą odos valymo būdą.

Poveikio metu atliekami stebėjimai, kurie sistemingai užrašomi. Apie kiekvieną gyvūną turėtų būti daromi atskiri įrašai. Pirmą dieną stebėjimai turėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis ištyrimas turėtų būti atliekamas ne rečiau kaip vieną kartą kiekvieną darbo dieną, kiti stebėjimai turėtų būti vykdomi kiekvieną dieną, imantis atitinkamų veiksmų iki minimumo sumažinti bandymo metu prarandamų gyvūnų skaičių, pvz., rastų negyvų gyvūnų autopsija arba užšaldymas ir nusilpusių arba gaištančių gyvūnų izoliavimas arba nužudymas.

Turėtų būti stebimi odos ir kailio, akių ir gleivinės pasikeitimai, taip pat respiratorinės, kraujo, autonominės ir centrinės nervų sistemų ir somatomotorinės veiklos ir elgsenos pasikeitimai. Ypatingas dėmesys turėtų būti ski