(6)

Įtraukiami šie C.31–C.46 skyriai: „ C.31. BANDYMAS SU SAUSUMOS AUGALAIS. DAIGŲ PASIRODYMO IR DAIGŲ AUGIMO BANDYMAS ĮVADAS 1. Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) Nr. 208 (2006). Bandymų metodai reguliariai persvarstomi atsižvelgiant į mokslo pažangą ir į jų tinkamumą reglamentavimo reikmėms. Šis atnaujintas bandymo metodas skirtas galimam cheminių medžiagų poveikiui augalų daigų pasirodymui ir augimui vertinti. Pagal šį metodą neatsižvelgiama į lėtinį poveikį ar poveikį reprodukcijai (t. y. sėklų užmezgimui, žiedų formavimuisi, vaisių brendimui). Siekiant užtikrinti, kad būtų taikomi tinkami bandymo metodai, būtina atsižvelgti į bandomosios cheminės medžiagos poveikio sąlygas ir savybes (pvz., atliekant metalų ir metalų junginių bandymus, reikėtų atsižvelgti į pH ir susijusių priešjonių poveikį) (1). Pagal šį bandymo metodą netiriamas cheminių medžiagų garų poveikis augalams. Pagal jį atliekami bendrosios paskirties cheminių medžiagų, biocidų ir augalų apsaugos produktų (taip pat vadinamų pesticidais) bandymai. Šis metodas parengtas remiantis esamais metodais (2), (3), (4), (5), (6), (7), atsižvelgiant ir į kitus augalų bandymams svarbius šaltinius (8), (9), (10). Taikant šį metodą vartojamos sąvokos apibrėžtos 1 priedėlyje. BANDYMO PRINCIPAS 2. Atliekant šį bandymą vertinamas dirvožemyje (ar kitoje tinkamoje dirvožemio terpėje) esančios bandomosios cheminės medžiagos poveikis aukštesniųjų augalų daigų pasirodymui ir pradiniam augimui. Sėklos įterpiamos į bandomąja chemine medžiaga apdorotą dirvožemį ir poveikis paprastai vertinamas praėjus 14–21 dienai po 50 % kontrolinės grupės daigų pasirodymo. Vertinamoji baigtis – pasirodžiusių daigų išvaizdos vertinimas, sausos daigų medžiagos masės (arba šviežios daigų medžiagos masės) masės ir, kai kuriais atvejais, daigų aukščio nustatymas, taip pat pastebimo kenksmingo poveikio įvairioms augalo dalims vertinimas. Šių vertinimų ir stebėjimų duomenys palyginami su atitinkamais kontrolinės neapdorotos grupės augalų duomenimis. 3. Priklausomai nuo numatomo poveikio būdo, bandomoji cheminė medžiaga įterpiama į dirvožemį (arba galbūt į dirbtinio dirvožemio terpę) arba ja padengiamas dirvožemio paviršius (jei tai atitinka galimą tos cheminės medžiagos poveikio būdą). Į dirvožemį bandomoji medžiaga įterpiama bendrai apdorojant visą bandymui naudojamo dirvožemio kiekį, taip apdorotas dirvožemis paskirstomas į augalams auginti skirtus indus ir jame pasėjamos atitinkamos rūšies augalų sėklos. Kai bandomąja medžiaga reikia padengti dirvožemio paviršių, tai daroma jau pasėjus sėklas į indus su dirvožemiu. Po to bandymo vienetai (kontroliniai ir apdoroto dirvožemio bandiniai su pasėtomis sėklomis) laikomi sėklų dygimui ir augalų augimui palankiomis sąlygomis. 4. Priklausomai nuo tyrimo tikslo, šis bandymas gali būti atliekamas siekiant nubrėžti bandomosios medžiagos dozės ir atsako kreivę arba, pasirinkus vieną koncentracijos vertę (normą), kaip ribų nustatymo bandymas. Jeigu vienos koncentracijos (normos) bandymo rezultatas viršija tam tikrą toksiškumo lygį (pvz., jeigu pastebimas didesnis negu x % poveikis), atliekamas intervalo nustatymo bandymas, siekiant nustatyti viršutinę ir žemutinę toksiškumo ribas, o tada – kelių koncentracijų (normų) bandymas siekiant nubrėžti dozės ir atsako kreivę. Siekiant nustatyti efektyviąją koncentraciją ECx arba efektyviąją naudojimo normą ERx (pvz., EC25, ER25, EC50, ER50) tiriamam didžiausio jautrio parametrui arba parametrams, atliekama tinkama statistinė analizė. Be to, atliekant šį bandymą galima apskaičiuoti nepastebėto poveikio koncentraciją (NOEC) ir mažiausią pastebėto poveikio koncentraciją (LOEC). INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ 5. Nustatant tikėtiną cheminės medžiagos poveikio būdą ir planuojant bandymą naudinga žinoti šią informaciją: cheminės medžiagos struktūrinę formulę, grynumą, tirpumą vandenyje, tirpumą organiniuose tirpikliuose, 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientą, gerties į dirvožemį savybes, garų slėgį, cheminį stabilumą veikiant vandeniui bei šviesai ir biologinį skaidumą. BANDYMO TINKAMUMAS 6. Bandymas pripažįstamas tinkamu, jei kontrolinės grupės bandiniai atitinka šiuos veiksmingumo kriterijus: — daigų pasirodymas siekia bent 70 %; — daigai nėra patyrę pastebimo fitotoksinio poveikio (pvz., chlorozės, nekrozės, vytimo, lapų ir stiebų deformacijos) ir augalams yra būdingas tik tai konkrečiai rūšiai įprastas augimo ir sandaros (morfologinis) kintamumas; — per visą tyrimo trukmę išgyvena vidutiniškai bent 90 % pasirodžiusių kontrolinės grupės daigų; — konkrečios rūšies augalai laikomi vienodomis aplinkos sąlygomis ir jų auginimo terpių sudėtyje yra vienodi iš to paties šaltinio gautos dirvožemio terpės, atraminių medžiagų arba substrato kiekiai. ETALONINĖ CHEMINĖ MEDŽIAGA 7. Siekiant įsitikinti, kad laikui bėgant per daug nesikeičia bandymo eiga, konkrečių bandomųjų augalų atsakas į poveikį ir bandymo sąlygos, galima reguliariai atlikti bandymus su etalonine chemine medžiaga. Kita vertus, kai kuriose laboratorijose bandymo sistemos veikimui vertinti gali būti naudojami ankstesnių kontrolinių augalų biomasės ar augimo matavimų duomenys; tai galėtų būti ir tarplaboratorinės kokybės kontrolės priemonė. METODO APRAŠYMAS Natūralus dirvožemis arba dirbtinis substratas 8. Augalai gali būti auginami induose, pripildytuose priesmėlio arba smėlingo priemolio, kurio sudėtyje turi būti iki 1,5 % organinės anglies (apie 3 % organinės medžiagos). Taip pat galima naudoti rinkoje parduodamą vazoniniams augalams skirtą dirvožemį arba sintetinį dirvožemio mišinį, kurio sudėtyje yra iki 1,5 % organinės anglies. Molingo dirvožemio naudoti nepatartina, jeigu yra žinoma, kad bandomajai cheminei medžiagai būdingas didelis junglumas su moliu. Iš lauko paimtą dirvožemį reikėtų išsijoti, kad jame liktų ne didesnės kaip 2 mm dalelės, taip jį suvienodinant ir pašalinant stambias daleles. Bandymo ataskaitoje reikėtų nurodyti galutinio paruošto dirvožemio rūšį ir struktūrą, organinės anglies kiekį ( %), pH ir druskų kiekį, nuo kurio priklauso elektroninis laidumas. Turėtų būti nurodyta dirvožemio kategorija pagal standartinę klasifikavimo schemą (11). Dirvožemį galima pasterizuoti arba iškaitinti, kad sumažėtų jame esančių patogeninių mikroorganizmų poveikis. 9. Naudojant natūralų dirvožemį gali būti sudėtingiau aiškinti bandymo rezultatus ir jų kintamumas gali būti didesnis dėl dirvožemio fizikinių ar cheminių savybių ir mikroorganizmų populiacijų skirtumų, o šie kintamieji savo ruožtu gali pakeisti dirvožemio drėgmės imlumą, cheminių medžiagų surišimo gebą, aeraciją ir mitybinių medžiagų bei mikroelementų sudėtį. Kinta ne tik šie fiziniai parametrai, bet ir cheminės dirvožemio savybės, kaip antai pH ir oksidacijos-redukcijos potencialas, ir nuo to gali priklausyti bandomosios cheminės medžiagos biologinis įsisavinamumas (12), (13), (14). 10. Dirbtiniai substratai paprastai nenaudojami augalų apsaugos produktų bandymams, tačiau galima juos naudoti bandant bendrosios paskirties chemines medžiagas arba siekiant kuo labiau sumažinti natūraliam dirvožemiui būdingą kintamumą ir padidinti bandymų rezultatų palyginamumą. Naudojami substratai turėtų būti sudaryti iš inertinių medžiagų, kurios kuo mažiau sąveikautų su bandomąja chemine medžiaga, jos nešikliu-tirpikliu arba abiem šiomis medžiagomis. Nustatyta, kad rūgštimi išplautas kvarcinis smėlis, mineralinė vata ir stikliniai (pvz., 0,35–0,85 mm skersmens) rutuliukai yra tinkamos inertinės medžiagos, beveik nesugeriančios bandomosios cheminės medžiagos (15), taip užtikrinant, kad kuo didesnis jos kiekis per šaknis pasiektų daigus. Vermikulitas, perlitas ar kitos medžiagos, kurioms būdinga didelė sugerties geba, yra netinkami substratai. Turėtų pakakti augalams augti reikalingų mitybinių medžiagų, kad augalai nepatirtų streso dėl mitybinių medžiagų trūkumo; kai įmanoma, šių medžiagų pakankamumą reikėtų įvertinti atliekant cheminę analizę arba apžiūrint kontrolinius augalus. Bandomųjų rūšių atrankos kriterijai 11. Siekiant tirti įvairius augalų atsakus į poveikį, reikėtų bandymui rinktis pakankamai įvairias rūšis, pvz., atsižvelgiant į jų taksonominę įvairovę augalų karalystėje, paplitimą, gausą, rūšiai būdingus gyvenimo ciklo ypatumus ir paplitimo gamtoje teritoriją (8), (10), (16), (17), (18), (19), (20). Renkantis iš bandymams galimų naudoti rūšių, reikėtų atsižvelgti į šiuos aspektus: — ar tos rūšies augalai subrandina vienodas sėklas, kurias lengva gauti iš patikimo standartinių sėklų šaltinio arba šaltinių ir kurios vienodai, patikimai ir tolygiai dygsta, o daigai tolygiai auga; — ar tie augalai yra tinkami laboratoriniams bandymams ir ar juos naudojant galima gauti patikimus ir atkuriamus rezultatus tiek toje pačioje bandymo vietoje, tiek įvairiose laboratorijose; — bandymui naudojamos rūšies jautris turėtų atitikti natūralioje aplinkoje augančių augalų reakcijas į atitinkamos cheminės medžiagos poveikį; — ar tos rūšys jau pirmiau kiek nors naudotos toksiškumo bandymams ir jas naudojant, pvz., herbicidų bioanalizei, sunkiųjų metalų tyrimams, druskingumo ar mineralinių medžiagų sukelto streso bandymams arba alelopatiniams tyrimams, nustatyta, kad jos yra jautrios labai įvairiems stresą sukeliantiems veiksniams; — ar joms tinka auginimo sąlygos pagal šį bandymo metodą; — ar jos atitinka bandymo tinkamumo kriterijus. Kai kurios bandymams iki šiol daugiausia naudotos rūšys išvardytos 2 priedėlyje, o galimos naudoti nekultūrinių augalų rūšys – 3 priedėlyje. 12. Kiek augalų rūšių reikia naudoti per bandymą, priklauso nuo galiojančių norminių reikalavimų, todėl šio bandymo metodo aprašyme tai nenurodyta. Bandomosios cheminės medžiagos naudojimas 13. Cheminę medžiagą reikėtų naudoti įterptą į tinkamą nešiklį (pvz., vandenį, acetoną, etanolį, polietilenglikolį, gumiarabiką, smėlį). Galima atlikti ir mišinių (apibrėžtos sudėties produktų arba preparatų), susidedančių iš veikliųjų medžiagų ir įvairių priedų, bandymus. Įterpimas į dirvožemį arba dirbtinį substratą 14. Vandenyje tirpias arba vandenyje suspenduojamas chemines medžiagas galima įmaišyti į vandenį ir gautą tirpalą sumaišyti su dirvožemiu naudojant tinkamą maišytuvą. Bandymą šiuo būdu gali būti tinkama atlikti tada, kai cheminės medžiagos poveikis patiriamas per dirvožemį arba dirvožemio porų vandenį ir reikia tirti jos įsisavinimą per augalų šaknis. Dedant bandomąją cheminę medžiagą į dirvožemį, neturėtų būti viršytas jo drėgmės imlumas. Į kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos indą įpilamo vandens tūris turėtų būti vienodas, tačiau vandens kiekį reikėtų riboti, kad dirvožemis nesukibtų į gumulėlius. 15. Vandenyje mažai tirpias chemines medžiagas reikėtų ištirpinti tinkamame lakiame tirpiklyje (pvz., acetone, etanolyje) ir sumaišyti su smėliu, tada tirpiklį iš smėlio galima pašalinti leidžiant oro srautą ir smėlį nepaliaujamai maišant. Taip apdorotas smėlis sumaišomas su bandymui naudojamu dirvožemiu. Paruošiamas antras kontrolinis bandinys, į kurį dedama tik smėlio ir tirpiklio. Į visų koncentracijų bandinius ir antrąjį kontrolinį bandinį dedama po vienodą smėlio, į kurį įmaišyta tirpiklio (kuris vėliau pašalintas), kiekį. Atliekant kietų, netirpių cheminių medžiagų bandymus, cheminė medžiaga sumaišoma su sausu dirvožemiu naudojant tinkamą maišytuvą, tada dirvožemis sudedamas į augalams auginti skirtus indus, į kuriuos iškart pasėjamos sėklos. 16. Kai vietoj dirvožemio naudojamas dirbtinis substratas, vandenyje tirpias chemines medžiagas galima ištirpinti mitybinių medžiagų tirpale prieš pat pradedant bandymą. Vandenyje netirpias chemines medžiagas, kurias galima suspenduoti vandenyje naudojant tirpiklį-nešiklį, reikėtų kartu su nešikliu įmaišyti į mitybinių medžiagų tirpalą. Vandenyje netirpias chemines medžiagas, kurioms tinkamų netoksiškų vandenyje tirpių nešiklių nėra, reikėtų ištirpinti tinkamame lakiajame tirpiklyje. Gautas tirpalas sumaišomas su smėliu arba stikliniais rutuliukais, mišinys įdedamas į būgninį vakuuminį aparatą ir išgarinamas. Lieka chemine medžiaga tolygiai padengtos smėlio dalelės arba stikliniai rutuliukai. Tam tikrą pasvertą rutuliukų dalį reikėtų paveikti tuo pačiu organiniu tirpikliu, ekstrahuojant bandomąją cheminę medžiagą ir ją išanalizuojant; tai reikėtų padaryti prieš pripildant indus, kuriuose bus auginami augalai. Dirvožemio paviršiaus apdorojimas bandomąja medžiaga 17. Atliekant augalų apsaugos produktų bandymus, bandomoji cheminė medžiaga dažnai naudojama apipurškiant bandomuoju tirpalu dirvožemio paviršių. Visa bandymams naudojama įranga, įskaitant bandomosios cheminės medžiagos ruošimo ir dozavimo įrangą, turėtų būti tokio modelio ir gebos, kad, naudojant tą įrangą, bandymus būtų galima atlikti tiksliai ir prireikus pakartoti. Bandomąja medžiaga turėtų būti vienodai padengiamas visų bandinių dirvožemio paviršius. Reikėtų stengtis apsisaugoti nuo galimos cheminės medžiagos įgerties į naudojamą įrangą ar reakcijų su šia įranga (pvz., plastikiniais vamzdeliais ir lipofilinėmis medžiagomis arba plieninėmis dalimis ir elementais). Bandomoji cheminė medžiaga užpurškiama ant dirvožemio paviršiaus imituojant įprastą purškimą žemės ūkyje naudojamais purkštuvais. Paprastai užpurškiamas toks medžiagos kiekis, koks naudojamas pagal įprastą žemės ūkio praktiką; atitinkami (vandens ir kt.) kiekiai turėtų būti nurodyti ataskaitoje. Reikėtų rinktis tokį purkštuvo antgalį, kad būtų tolygiai padengiamas visas dirvožemio paviršius. Jeigu naudojami tirpikliai ir nešikliai, reikėtų paruošti antrą kontrolinių augalų, į kurių indus bus dedama tik tirpiklio arba nešiklio, grupę. To daryti nereikia, kai augalų apsaugos produktai bandomi kaip preparatai. Bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos (normos) patikrinimas 18. Bandymui pasirinktas cheminės medžiagos koncentracijas (naudojimo normas) būtina patikrinti atliekant tinkamą patvirtinamąją analizę. Visas tirpių cheminių medžiagų bandymo koncentracijas (normas) galima patvirtinti išanalizuojant bandymui naudojamą didžiausios koncentracijos bandomąjį tirpalą, jo vėlesnį skiedimą aprašant bandymo dokumentuose ir naudojant tinkamą kalibruotą įrangą (pvz., kalibruotus analizei skirtus stiklinius indus, kalibruotą purškimo įrangą). Atliekant netirpių cheminių medžiagų bandymus, gautą sudėtinę medžiagą būtina patikrinti pagal bandomosios cheminės medžiagos, dedamos į dirvožemį, masę. Jei būtina įrodyti dirvožemio vienalytiškumą, gali reikėti jį išanalizuoti. PROCEDŪRA Bandymo planas 19. Į indus pasėjamos tos pačios rūšies augalų sėklos. Į vieną indą sėjamų sėklų kiekis priklauso nuo augalų rūšies, indo dydžio ir bandymo trukmės. Viename inde turėtų būti tiek augalų, kad jie per visą bandymo trukmę galėtų augti tinkamomis sąlygomis ir jiems nebūtų per ankšta. Augalai turėtų būti sėjami ne tankiau kaip maždaug 3–10 sėklų 100 cm2 plote (priklausomai nuo sėklų dydžio). Pavyzdžiui, 15 cm skersmens inde patartina auginti 1–2 kukurūzų, sojų, pomidorų, agurkų ar cukrinių runkelių daigus, tris rapsų ar žirnių daigus arba 5–10 svogūnų, kviečių ar kitų smulkiasėklių augalų daigų. Sėklų ir kartotinių indų (kartotiniais bandiniais laikomi indai, todėl atskiri tame pačiame inde augantys augalai nėra kartotiniai bandiniai) skaičius turėtų būti tinkamas statistinei analizei efektyviai atlikti (21). Pažymėtina, kad rezultatų kintamumas yra didesnis tada, kai į vieną (kartotinį) indą pasėjama mažiau, tačiau didesnių bandomosios rūšies augalų sėklų, negu tada, kai į indą galima pasėti daugiau smulkių sėklų. Šį kintamumą galima sumažinti į kiekvieną indą sėjant po vienodą augalų skaičių. 20. Siekiant užtikrinti, kad per bandymą būtų stebimas tik bandomosios cheminės medžiagos sukeltas ar su ja susijęs poveikis, naudojamos kontrolinės grupės. Tinkama kontrolinė grupė turėtų būti visais atžvilgiais tapati bandomajai grupei, išskyrus tai, kad ji nepatiria bandomosios cheminės medžiagos poveikio. Visi per vieną bandymą naudojami augalai, įskaitant kontrolinius augalus, turėtų būti gauti iš to paties šaltinio. Kad būtų išvengta vertinimo klaidų, būtina atsitiktine tvarka paskirstyti bandymo ir kontrolinius indus. 21. Reikėtų stengtis nenaudoti insekticidais ar fungicidais padengtų (t. y. beicuotų) sėklų, tačiau kai kurios reguliavimo institucijos leidžia naudoti tam tikrus nesisteminius kontaktinius fungicidus (pvz., kaptaną, tiramą) (22). Jeigu esama susirūpinimo dėl per sėklas platinamų patogeninių organizmų, galima trumpai pamirkyti sėklas silpname 5 % hipochlorito tirpale, tada kruopščiai perplauti tekančiu vandeniu ir išdžiovinti. Sėklų negalima papildomai apdoroti kitu augalų apsaugos produktu. Bandymo sąlygos 22. Bandymo sąlygos turėtų būti artimos normaliam bandomųjų rūšių ir veislių augalų augimui reikalingoms sąlygoms (tinkamų bandymo sąlygų pavyzdžių pateikta 4 priedėlyje). Sudygę augalai turėtų būti pagal gerąją daržininkystės praktiką prižiūrimi reguliuojamo klimato kamerose, fitotronuose arba šiltnamiuose. Naudojant specialias augalams auginti skirtas patalpas, jose paprastai turėtų būti kontroliuojama ir pakankamai dažnai (pvz., kartą per dieną) užrašoma temperatūra, drėgnis, anglies dioksido koncentracija, šviesos (stiprio, bangų ilgio, fotosintezei tinkamos apšvietos) ir apšvietimo trukmės duomenys, laistymo būdas ir t. t., siekiant užtikrinti, kad augalai gerai augtų, palyginti su kontroliniais tos rūšies augalais. Temperatūra šiltnamyje turėtų būti reguliuojama vėdinimo, šildymo ir (arba) vėsinimo sistemomis. Apskritai bandymus šiltnamyje rekomenduojama atlikti tokiomis sąlygomis: — 22 ± 10 °C temperatūra; — 70 ± 25 % drėgnis; — apšvietimo trukmė – ne mažiau kaip 16 šviesos valandų per parą; — 350 ± 50 μ E/m2/s šviesos stipris. Jeigu šviesos stipris yra mažesnis nei 200 μE/m2/s, o bangų ilgis nesiekia 400–700 nm intervalo, gali reikėti papildomo apšvietimo, išskyrus tuos atvejus, kai naudojamoms rūšims reikia mažiau šviesos. Aplinkos sąlygos turėtų būti stebimos ir užrašomos per visą tyrimo trukmę. Augalai turėtų būti auginami neakytuose plastikiniuose ar glazūruotuose induose, po kuriais padėti padėklai arba lėkštelės. Indus galima reguliariai perstatyti siekiant, kad augalai augtų vienodai (taip sumažinant kintamumą dėl auginimo patalpose esamų nevienodų bandymo sąlygų). Indai turi būti pakankamai dideli, kad augalai juose galėtų normaliai augti. 23. Dirvožemio mitybines medžiagas galima papildyti, kai to reikia augalų gyvybingumui palaikyti. Ar reikia papildomų mitybinių medžiagų, ir kada jų dėti, galima sužinoti stebint kontrolinius augalus. Bandymo indus patartina drėkinti iš apačios (pvz., naudojant stiklo pluošto vamzdelius), tačiau iš pradžių galima laistyti iš viršaus, nes taip skatinamas sėklų dygimas ir, jeigu bandomąja medžiaga padengtas dirvožemio paviršius, palengvinama jos skverbtis į dirvožemį. 24. Konkrečios auginimo sąlygos turėtų būti tinkamos bandomajai augalų rūšiai ir tiriamai cheminei medžiagai. Kontrolinių ir bandomųjų grupių augalai turi būti laikomi vienodomis aplinkos sąlygomis, tačiau reikėtų imtis tinkamų priemonių, kad (pvz., lakiosios) bandomosios cheminės medžiagos neprasiskverbtų iš vienos bandomosios grupės į kitą ir nepaveiktų kontrolinės grupės augalų. Vienos koncentracijos (normos) bandymas 25. Siekiant nustatyti tinkamą cheminės medžiagos koncentraciją arba normą, kad būtų galima atlikti vienos (poveikio / ribinės) koncentracijos arba normos bandymą, būtina atsižvelgti į kelis veiksnius. Per bendrosios paskirties cheminių medžiagų bandymus tie veiksniai yra cheminės medžiagos fizikinės ir cheminės savybės. Per augalų apsaugos produktų bandymus būtina atsižvelgti į bandomosios cheminės medžiagos fizikines ir chemines savybes, naudojimo pobūdį, jos didžiausią koncentraciją arba naudojimo normą, kiek kartų ji naudojama per sezoną, ir (arba) jos patvarumą. Siekiant nustatyti, ar bendrosios paskirties cheminė medžiaga turi fitotoksinių savybių, gali reikėti bandymui naudoti didžiausią jos kiekį – 1 000 mg vienam sausos dirvožemio masės kilogramui. Intervalo nustatymo bandymas 26. Kai reikia, galima atlikti intervalo nustatymo bandymą siekiant sužinoti, kokias bandomosios medžiagos koncentracijas ar normas tinka naudoti per nustatomąjį dozės ir atsako tyrimą. Atliekant intervalo nustatymo bandymą, bandymui turėtų būti pasirinktas pakankamai platus koncentracijų (normų) intervalas (pvz., 0,1, 1,0, 10, 100 ir 1 000 mg medžiagos vienam sausos dirvožemio masės kilogramui). Per augalų apsaugos produktų bandymus reikiamas koncentracijas (normas) galima pasirinkti pagal rekomenduojamą arba didžiausią koncentraciją ar naudojimo normą, pvz., 1/100, 1/10 ar 1/1 rekomenduojamos arba didžiausios koncentracijos ar naudojimo normos. Kelių koncentracijų (normų) bandymai 27. Bandymo, kuriam pasirenkamos kelios bandomosios medžiagos koncentracijos (normos), tikslas yra nustatyti jos dozės ir atsako santykį, taip pat nustatyti poveikio daigų pasirodymui, biomasei ir (arba) išvaizdai, palyginti su tos medžiagos poveikio nepatiriančiais kontroliniais bandiniais, ECx arba ERx vertę pagal reguliavimo institucijų reikalavimus. 28. Pasirinktų koncentracijos verčių arba normų skaičius ir intervalas turėtų būti pakankami, kad būtų galima gauti patikimą dozės ir atsako santykį bei regresijos lygtį ir ECx. arba ERx. įvertį. Pasirinktų koncentracijų (normų) intervalas turėtų apimti nustatomas ECx arba ERx vertes. Pavyzdžiui, jeigu reikia nustatyti EC50 vertę, bandymui patartina rinktis tokias bandomosios medžiagos normas, kad poveikis būtų 20–80 %. Šiuo tikslu rekomenduojama rinktis ne mažiau kaip penkias bandymo koncentracijos vertes (normas), išdėstytas geometrine progresija, kurios daugiklis neviršytų 3, kartu su kontroline neapdorota grupe. Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolinėje grupėje turėtų būti mažiausiai 4 kartotiniai bandiniai, o sėklų iš viso turi būti ne mažiau kaip 20. Bandymui naudojant kai kuriuos augalus, kuriems būdingas mažas daigumas arba netolygus augimas, siekiant atlikti statistiškai patikimesnį bandymą, gali reikėti naudoti daugiau kartotinių bandinių. Jeigu bandymui pasirenkama daugiau koncentracijos verčių (normų), kartotinių bandinių gali būti mažiau. Jeigu reikia įvertinti NOEC, siekiant reikiamo statistinio patikimumo, gali reikėti naudoti daugiau kartotinių bandinių (23). Stebėjimai 29. Stebėjimo laikotarpiu, t. y. 14–21 dieną po 50 % kontrolinių augalų (ir, kai tinka, tirpiklio kontrolinių bandinių augalų) sudygimo, augalai dažnai apžiūrimi (bent kartą per savaitę, jeigu įmanoma – kasdien) ir įvertinamas daigų pasirodymas, pastebimi fitotoksiškumo požymiai bei mirtingumas. Baigiant bandymą reikėtų užrašyti išmatuotą likusių gyvų augalų daigų pasirodymo procentinį lygį ir biomasę ir aprašyti pastebėtą kenksmingą poveikį įvairioms augalo dalims. Tai gali būti pakitusi pasirodžiusių daigų išvaizda, sulėtėjęs augimas, chlorozė, spalvos pakitimas, žūstamumas ir poveikis augalo vystymuisi. Galutinę biomasę galima išmatuoti pagal galutinę vidutinę likusių gyvų daigų sausosios medžiagos masę, nupjovus daigus ties dirvožemio paviršiumi ir išdžiovinus 60° C temperatūroje iki pastovios masės. Galutinę biomasę galima išmatuoti ir kitu būdu pagal šviežios daigų medžiagos masę. Dar viena vertinamoji baigtis gali būti daigo aukštis, jei to reikalauja reguliavimo institucijos. Vertinant pastebimą toksinį atsaką, pastebėtiems pažeidimams apibūdinti reikėtų naudoti vienodą vertinimo balais sistemą. Pavyzdžių, kaip galima atlikti kokybinius ir kiekybinius augalų vertinimus juos apžiūrint, pateikta nurodytoje literatūroje (23), (24). DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS Statistinė analizė Vienos koncentracijos (normos) bandymas 30. Kiekvienos rūšies augalų duomenis reikėtų išanalizuoti taikant tinkamą statistinį metodą (21). Ataskaitoje reikėtų nurodyti pasirinktos bandomosios medžiagos koncentracijos (normos) poveikio lygį arba nurodyti, kad esant tai koncentracijai (normai), tokio poveikio nepatirta (pvz., esant y koncentracijai arba normai, pastebėtas < x % poveikis). Kelių koncentracijų (normų) bandymas 31. Dozės ir atsako santykis nustatomas pagal regresijos lygtį. Galima naudoti įvairius modelius: pvz., vertinant ECx arba ERx (kaip antai EC25, ER25, EC50, ER50) ir šių verčių pasikliovimo ribas, daigų pasirodymą išreiškiant dvireikšmiais kintamaisiais, gali būti tinkama naudoti logito, probito, Weibull, Spearman-Karber, sutrumpintą Spearman-Karber ar kitus metodus. Nustatant daigų augimą (masę ir aukštį) kaip tolydžias vertinamąsias baigtis, ECx arba ERx ir šių verčių pasikliovimo ribas galima įvertinti atliekant tinkamą regresinę analizę (pvz., netiesinės regresijos analizę pagal Bruce ir Versteeg (25)). Kai įmanoma, jautriausių rūšių R2 vertė turėtų būti 0,7 arba didesnė, o bandymui pasirinktos koncentracijos (normos) turėtų apimti 20–80 % poveikį. Jei reikia įvertinti NOEC, patartina taikyti patikimus statistinius kriterijus, kuriuos reikėtų pasirinkti remiantis duomenų paskirstymu (21), (26). Bandymo ataskaita 32. Bandymo ataskaitoje turėtų būti pateikti atliktų tyrimų rezultatai ir išsamiai aprašytos bandymo sąlygos, pateiktas išsamus rezultatų aptarimas, duomenų analizė ir šios analizės išvados. Reikėtų pateikti suvestinę rezultatų lentelę ir santrauką. Ataskaitoje turi būti pateikta toliau nurodyta informacija: Bandomoji cheminė medžiaga — Cheminės medžiagos atpažinties duomenys, svarbios bandomosios cheminės medžiagos savybės (pvz., log Pow, tirpumas vandenyje, garų slėgis, jei žinoma – informacija apie išliekamumą ir elgseną aplinkoje). — Išsami informacija apie bandymo tirpalo ruošimą ir bandymui pasirinktų koncentracijų patikrinimą, kaip nurodyta 18 skirsnyje. Bandomosios rūšys — Informacija apie bandomuosius organizmus: rūšis (veislė), augalų šeimos, moksliniai ir bendriniai pavadinimai, gavimo šaltinis; kuo išsamiau aprašyta sėklų kilmė (t. y. tiekėjo pavadinimas, procentinis daigumas, sėklų dydžio kategorija, siuntos arba partijos numeris, kuriais metais arba per kurį augimo sezoną surinktos sėklos, daigumo nustatymo data), gyvybingumas ir t. t. — Bandymui naudotų vienaskilčių ir dviskilčių augalų rūšių skaičius. — Naudotų rūšių pasirinkimo priežastys. — Sėklų laikymo, tvarkymo ir priežiūros aprašymas. Bandymo sąlygos — Bandymo patalpa (pvz., auginimo kamera, fitotronas ir šiltnamis). — Bandymo sistemos aprašymas (pvz., augalams auginti skirtų indų matmenys, iš kokios medžiagos pagaminti tie indai, naudojami dirvožemio kiekiai). — Dirvožemio savybės (dirvožemio struktūra arba rūšis: dirvožemio granuliometrinė sudėtis ir klasifikacija, fizikinės ir cheminės savybės, įskaitant organinės medžiagos kiekį ( %), organinės anglies kiekį ( %) ir pH vertę). — Dirvožemio arba substrato (pvz., dirvožemio, dirbtinio dirvožemio, smėlio ar kt.) paruošimas prieš bandymą. — Mitybinės terpės (jei naudojama) aprašymas. — Bandomosios cheminės medžiagos naudojimas: naudojimo būdo aprašymas, naudojamos įrangos aprašymas, tos medžiagos poveikio lygiai ir kiekiai, be kita ko, patikrinti cheminės analizės būdu, taikyto kalibravimo metodo aprašymas ir aplinkos sąlygų, buvusių naudojant bandomąją medžiagą, aprašymas. — Augalų auginimo sąlygos: šviesos stipris (pvz., fotosintezei tinkama apšvieta), apšvietimo trukmė, aukščiausia ir žemiausia temperatūros, laistymo grafikas ir būdas, tręšimas. — Sėklų skaičius viename inde, vieną bandomosios medžiagos dozę gavusių augalų skaičius, kiekvieno poveikio lygio kartotinių bandinių (indų) skaičius. — Kontrolinių bandinių (neigiamų ir (arba) teigiamų kontrolinių bandinių, tirpiklio, jei naudojamas, kontrolinių bandinių) rūšis ir skaičius. — Bandymo trukmė. Rezultatai — Visų kiekvieno kartotinio bandinio, bandymui pasirinktos koncentracijos (normos) ir bandomosios rūšies vertinamųjų baigčių lentelė. — Bandomosios grupės sėklų daigumas (išreikštas skaičiumi ir procentais), palygintas su kontrolinės grupės sėklų daigumu. — Biomasės (sausos arba šviežios daigų medžiagos masės) matavimai, išreikšti kontrolinės grupės biomasės procentine dalimi. — Augalų daigų aukštis, išreikštas kontrolinės grupės daigų aukščio procentine dalimi (jeigu matuojamas). — Pastebėti dėl bandomosios cheminės medžiagos poveikio atsiradę daigų pažeidimai, išreikšti procentiniu dydžiu, ir tų pastebėtų pažeidimų (chlorozės, nekrozės, vytimo, lapų ir stiebų deformacijos arba jokio poveikio, jei jo nepastebėta) kokybinis bei kiekybinis apibūdinimas, palyginant su kontroliniais augalais. — Jei pastebėti pažeidimai vertinami balais – naudojamos balų sistemos aprašymas. — Jei tyrimui pasirinkta tik viena bandomosios medžiagos norma, reikėtų nurodyti pažeidimų dydį, išreikštą procentais. — ECx arba ERx (pvz., EC50, ER50, EC25, ER25) vertės ir atitinkamos pasikliovimo ribos. Jei atliekama regresinė analizė, pateikite regresinės lygties standartinę paklaidą ir atskirų parametrų įverčio (pvz., nuolydžio, atkarpos) standartinę paklaidą. — Jeigu apskaičiuotos – NOEC (ir LOEC) vertės. — Taikytų statistinių procedūrų ir padarytų prielaidų aprašymas. — Šių duomenų grafinė schema ir bandomosios rūšies dozės bei atsako santykis. Ataskaitoje taip pat turėtų būti aprašyti bet kokie nukrypimai nuo nustatytų pagal šį bandymo metodą atliekamų procedūrų ir bet kokie per bandymą pastebėti neįprasti reiškiniai. NUORODOS (1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora – Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background – Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms – A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistryof Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. (13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlorfrom soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides – An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. (19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OECD (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (22) Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. (26) Šio priedo C.33 skyrius. Sliekų (Eisenia fetida / Eisenia andrei) reprodukcijos bandymas. 1 priedėlis Sąvokų apibrėžtys Veiklioji medžiaga (arba aktyvioji medžiaga) – medžiaga, naudojama siekiant sukelti tam tikrą biologinį poveikį (pvz., skirta vabzdžių kontrolei, augalų ligų kontrolei, piktžolių kontrolei ta medžiaga apdorojamame plote), taip pat vadinama techniškai gryna veikliąja medžiaga ar aktyviąja medžiaga. Cheminė medžiaga – medžiaga arba mišinys. Augalų apsaugos produktai (AAP) arba pesticidai – specifinio biologinio aktyvumo medžiagos, tikslingai naudojamos kultūriniams augalams nuo kenkėjų (pvz., grybelinių ligų, vabzdžių ir kitų konkuruojančių augalų) apsaugoti. ECx · x % poveikio koncentracija arba ERx · x % poveikio lygis – bandomosios medžiagos koncentracija arba lygis, kuriam esant pasireiškia x % nepageidaujamas pokytis arba nuokrypis nuo bandymo vertinamosios baigties, palyginti su kontroline grupe (pvz., 25 arba 50 % mažesnis pasirodžiusių daigų skaičius, daigų aukštis, galutinis gyvų augalų skaičius arba pastebėtų pažeidimų dydis reikštų atitinkamai EC25 / ER25 arba EC50 / ER50). Daigo pasirodymas – augalo diegamakštės arba sėklaskiltės pasirodymas virš dirvožemio paviršiaus. Preparatas – apibrėžtos sudėties komercinis produktas, kurio sudėtyje yra veikliosios medžiagos (aktyviosios medžiagos), taip pat vadinamas galutiniu preparatu (8) arba įprastu galutinio naudojimo produktu (angl. typical end-use product, TEP). Mažiausia pastebėto poveikio koncentracija (LOEC) – mažiausia bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant pastebėtas jos poveikis. Atliekant šį bandymą, LOEC atitinkanti koncentracija per nustatytą veikimo laikotarpį padaro statistiškai reikšmingą poveikį (p < 0,05), palyginti su kontroline grupe, ir yra didesnė nei NOEC vertė. Netiksliniai augalai – augalai, augantys už tikslinių augalų ploto ribų. Naudojant augalų apsaugos produktus, netiksliniais augalais paprastai vadinami už tais produktais apdorojamo ploto ribų esantys augalai. Nepastebėto poveikio koncentracija (NOEC) – didžiausia bandomosios cheminės medžiagos koncentracija, kuriai esant jokio poveikio nepastebėta. Atliekant šį bandymą, NOEC atitinkanti koncentracija per nustatytą veikimo laikotarpį nepadaro statistiškai reikšmingo poveikio (p < 0,05), palyginti su kontroline grupe. Fitotoksiškumas – neigiami įprastos augalų išvaizdos ir augimo pakitimai (nustatomi atliekant matavimus ir apžiūrint augalus) dėl atsako į konkrečios cheminės medžiagos poveikį. Kartotinis bandinys – kontrolinėje grupėje ir (arba) bandomojoje grupėje esantis reprezentatyvus bandymo vienetas. Per šiuos tyrimus kartotinis bandinys yra indas, kuriame auginami augalai. Išvaizdos vertinimas – pastebimos augalams padarytos žalos vertinimas balais apžiūrint sudygusius augalus, jų gyvybingumą, deformacijas, chlorozę, nekrozę ir bendrą išvaizdą, palyginti su kontroline grupe. Bandomoji cheminė medžiaga – naudojant šį bandymo metodą tiriama cheminė medžiaga arba mišinys. 2 priedėlis Bandymams iki šiol naudotų augalų rūšių sąrašas Šeima Rūšis Bendriniai pavadinimai DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Paprastoji morka Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Paprastoji saulėgrąža Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa Sėjamoji salota Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Baltoji garstyčia Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Kininis kopūstas Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Sėjamasis rapsas Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Gūžinis kopūstas Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Ropė Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Sėjamoji pipirnė Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Valgomasis ridikas Chenopodiaceae Beta vulgaris Paprastasis runkelis Cucurbitaceae Cucumis sativus Paprastasis agurkas Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Gauruotoji soja Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Spindulinė pupuolė Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Daržinė pupelė, šparaginė pupelė Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Sėjamasis žirnis Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Vaistinė ožragė Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Paprastasis garždenis Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Raudonasis dobilas Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Sėjamasis vikis Linaceae Linum usitatissimum Sėjamasis linas Polygonaceae Fagopyrum esculentum Sėjamasis grikis Solanaceae Solanum lycopersicon Pomidoras MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Valgomasis svogūnas Poaceae (Gramineae) Avena sativa Sėjamoji aviža Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Paprastasis miežis Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Daugiametė svidrė Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Sėjamasis ryžis Poaceae (Gramineae) Secale cereale Sėjamasis rugys Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Sorgas Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Paprastasis kvietys Poaceae (Gramineae) Zea mays Paprastasis kukurūzas 3 priedėlis Galimų naudoti nekultūrinių augalų rūšių sąrašas Toksiškumo augalams bandymams galimos naudoti rūšys pagal EBPO Pastaba. Tolesnėje lentelėje pateikiama informacija apie 52 nekultūrinių augalų rūšis (skliausteliuose pateiktos kiekvienai rūšiai svarbios literatūros nuorodos). Lentelėje pateikiami daigų pasirodymo duomenys yra paimti iš publikuotos literatūros ir skirti tik susipažinti; reali padėtis gali priklausyti nuo to, iš kokio šaltinio gautos sėklos, ir nuo kitų veiksnių. ŠEIMA Botaninis rūšies pavadinimas (lietuviškas bendrinis pavadinimas) Gyvenimo trukmė ir augimvietė (9) Sėklos masė (mg) Sudygimui arba augimui reikalinga apšvietimo trukmė (10) Sėjimo gylis (mm) (11) Per kiek laiko (parų) sudygsta sėklos (12) Specialus paruošimas (13) Toksiškumo bandymas (14) Sėklų tiekėjai (15) Kitos nuorodos (16) APIACEAE Torilis japónica (Builinė dygūnė) V arba Dv Auga žmogaus veiklos paliestose vietose, gyvatvorėse, ganyklose (16, 19) 1,7–1,9 (14, 19) Š = T (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) stratifikavimas šaltyje (7, 14, 18, 19), sėklas gali reikėti subrandinti (19), tamsa stabdo dygimą (1, 19), nereikia specialaus paruošimo (5) PO (5) ASTERACEAE Bellis perennis (Daugiametė saulutė) D Auga pievose, ariamuose laukuose, vejose (16, 19) 0,09–0,17 (4, 19) Š = T (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) dygimas nepriklauso nuo apšvietos (18, 19), nereikia specialaus paruošimo (4, 14) PO (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (Rugiagėlė) V Auga laukuose, pakelėse, atvirose augimvietėse (16) 4,1–4.9 (4, 14) Š = T (14) 0–3 (2, 4, 14) 14–21 (100 %) (14) nereikia specialaus paruošimo (2, 4) PO (2, 4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (Juodoji bajorė) D Auga laukuose, pakelėse, atvirose augimvietėse (16, 19) 2,4–2,6 (14, 19) Š = T (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) sėklas gali reikėti subrandinti (18, 19), tamsa stabdo dygimą (19), nereikia specialaus paruošimo (5, 14, 26) PO (5, 22, 26) A Inula helenium (Didysis debesylas) D Auga drėgnose, žmogaus veiklos paliestose vietose (16) 1–1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) nereikia specialaus paruošimo (4) PO (4) A, F Leontodon hispidus (Vienagraižė snaudalė) D Auga laukuose, pakelėse, žmogaus veiklos paliestose vietose (16, 19) 0,85–1,2 (14, 19) Š = T (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) tamsa stabdo dygimą (17, 18, 19), nereikia specialaus paruošimo (5, 23) PO (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (Plaukuotoji rudbekija) D, Dv Auga žmogaus veiklos paliestose vietose (16) 0,3 (4, 14) Š = T (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) nereikia specialaus paruošimo (4, 14, 33) PO (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis (Kanadinė rykštenė) D Auga ganyklose, atvirose vietose (16) 0,06–0,08 (4, 14) Š = T (11) 0 (4) 14–21 (11) sumaišyti su tokiu pačiu smėlio kiekiu ir 24 val. mirkyti 500 ppm giberelino (GA) tirpale (11), nereikia specialaus paruošimo (4) PO (4) E, F Xanthium pensylvanicum (Pensilvaninis dagišius) V Auga laukuose, atvirose augimvietėse (16) 25–61 (14, 29) 0(1) 5(29) tamsa gali stabdyti dygimą (1), 12 val. mirkyti šiltame vandenyje (29) PRIEŠ IR PO (31) A Xanthium spinosum (Dygliuotasis dagišius) V Auga atvirose augimvietėse (16) 200 (14) Š = T (14) Š > T (6) 10 (6) skarifikavimas (14), nereikia specialaus paruošimo (6) PRIEŠ IR PO (6) A Xanthium strumarium (Paprastasis dagišius) V Auga laukuose, atvirose augimvietėse (16) 67,4 (14) Š = T (14) 10–20 (6, 21) nereikia specialaus paruošimo (6, 14, 21) PRIEŠ IR PO (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (Pievinė kartenė) D Auga laukuose, pakelėse, vejose (16, 19) 0,6 (14, 19) Š = T (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) tamsa stabdo dygimą (18, 19), nereikia specialaus paruošimo (5, 14, 22) PO (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (Šilkažiedė gaisrena) D (16) 0,21 (14) Š = T (14) < 14 (100 %) (14, 25) sėklas gali reikėti subrandinti (18), nereikia specialaus paruošimo (5, 14, 15, 22–26) PO (5, 15, 22–26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (Baltoji balanda) V Auga laukų pakraščiuose, žmogaus veiklos paliestose vietose (16, 19) 0,7–1,5 (14, 19, 34) Š = T (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) apdorojimas priklauso nuo sėklų spalvos (19), per ramybės periodą sėklos laikomos sausai (19), tamsa stabdo dygimą (1, 18, 19), stratifikavimas šaltyje (18), nereikia specialaus apdorojimo (14, 34) PRIEŠ IR PO (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (Paprastoji jonažolė) D Auga laukuose, ariamose dirvose, atvirose augimvietėse (16, 19) 0,1–0,23 (14, 19) Š= T (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) tamsa stabdo dygimą (1, 18, 19) nereikia specialaus apdorojimo (5, 14, 15, 25, 27) PO (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea (Gebenlapis sukutis) V Auga pakelėse, atvirose augimvietėse, javų laukuose (16) 28,2 (14) Š > T (6, 10) 10–20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) dygimas nepriklauso nuo apšvietos (1) nereikia specialaus apdorojimo (6, 21) PRIEŠ IR PO (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus (Riešutinė viksvuolė) D Auga ariamose dirvose, ganyklose, pakelėse (16, 30) 0,2 (14) Š= T (14) 0 (1) 10–20 (6, 10) 12 (91 %) (10) tamsa stabdo dygimą (1) nereikia specialaus apdorojimo (6, 10, 14) PRIEŠ IR PO (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (Paprastasis garždenis) D Auga pievose, pakelėse, atvirose augimvietėse (16, 19) 1–1,67 (14, 19) Š = T (14) 1 (50 %) (19) skarifikavimas (14, 19) dygimas nepriklauso nuo apšvietos (18, 19), nereikia specialaus apdorojimo (23, 25) PO (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia (Bukalapė velniapupė) V Auga drėgnuose miškuose(16) 23–28 (9) Š = T (14) Š > T (9) 10–20 (6, 9) sėklas 24 val. mirkyti vandenyje (9) skarifikavimas (14), sėklų gyvybingumas priklauso nuo spalvos (1), nereikia specialaus apdorojimo (6) PO (6, 9) A Sesbania exaltata (Agatpupė) V Auga aliuviniuose dirvožemiuose (16) 11–13 (9, 14) Š > T (9) 10–20 (9, 21) sėklas 24 val. mirkyti vandenyje (9) dygimas nepriklauso nuo apšvietos (1), nereikia specialaus apdorojimo (21) PRIEŠ IR PO (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (Raudonasis dobilas) D Auga laukuose, pakelėse, ariamose dirvose (16, 19) 1,4–1,7 (14, 19) Š = T (14) 1 (50 %) (19) skarifikavimas (14, 18) sėklas gali reikėti subrandinti (19), dygimas nepriklauso nuo apšvietos (1, 19), nereikia specialaus apdorojimo (5) PO (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (Paprastoji sukatžolė) D Atvirose vietose (16) 0,75–1,0 (4, 14) Š = T (14) 0 (4) nereikia specialaus apdorojimo (4, 14) PO (4) F Mentha spicata (Šaltmėtė) D Auga drėgnose vietose (16) 2,21 (4) 0 (4) nereikia specialaus apdorojimo (4) PO (4) F Nepeta cataria (Paprastoji katžolė) D Auga žmogaus veiklos paliestose vietose (16) 0,54 (4, 14) Š = T (14) 0 (4) nereikia specialaus apdorojimo (2, 4, 14) PO (2,4) F Prunella vulgaris (Paprastoji juodgalvė) D Auga ariamose dirvose, pievose, žmogaus veiklos paliestose vietose (16, 19) 0,58–1,2 (4, 14, 19) Š= T (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) tamsa stabdo dygimą (18, 19) didesnės sėklos geriau sudygsta (1), nereikia specialaus apdorojimo (4, 14, 22) PO (4, 22) A, F Stachys officinalis (Vaistinė notra) D Auga pievose, laukų pakraščiuose (19) 14–18 (14, 19) Š = T (14) 7 (50 %) (19) nereikia specialaus apdorojimo (5, 14, 22) PO (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (Pluoštinis galenis) V Auga laukuose, atvirose augimvietėse (16) 8,8 (14) Š = T (14) 10–20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) skarifikavimas (14) nereikia specialaus apdorojimo (5, 10, 21) PRIEŠ IR PO (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa (Dygioji sida) V Auga laukuose, pakelėse (16) 3,8 (14) Š = T (14) 10–20 (6, 21) skarifikavimas (14) dygimas nepriklauso nuo apšvietos (1), nereikia specialaus apdorojimo (6, 21 ) PRIEŠ IR PO (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (Aguona birulė) V Auga laukuose, ariamose dirvose, žmogaus veiklos paliestose vietose (16, 19) 0,1–0,3 (4, 14, 19, 29) Š = T (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) stratifikavimas šaltyje ir skarifikavimas (1, 19, 32) nereikia specialaus apdorojimo (4, 14, 29) PO (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (Paprastoji smilga) Auga vejose, ganyklose (16) 0,07 (14) Š > T (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) tamsa stabdo dygimą (1, 17–19), nereikia specialaus apdorojimo (10) PO (10) A, E Alopecurus myosuroides (Pelinis pašiaušėlis) V Auga pievose, atvirose augimvietėse (16) 0,9-1,6 (29, 34) Š = T (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) skarifikavimas (14), apdorojimas 101 mg/L KNO3 (14), stratifikavimas šiltai (1), tamsa stabdo dygimą (1), nereikia specialaus apdorojimo (34) PRIEŠ IR PO (28, 34) A 32 Avena fatua (Tuščioji aviža) V Auga dirbamoje žemėje, atvirose augimvietėse (16) 7–37,5 (14, 30) Š = T (14) Š > T (6) 10–20 (6, 10) 3 (70 %) (18) skarifikavimas (7, 32), tamsa stabdo dygimą (1) stratifikavimas šaltyje (1, 18), nereikia specialaus apdorojimo (6, 10, 14) PRIEŠ IR PO (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (Smiltyninė dirsė) V Auga laukuose, pakelėse, ariamose dirvose (16) 0,45–2,28 (14, 29) Š = T (14) 3 (29) brandinimo periodas (1, 7, 32), šviesa stabdo dygimą (1), nereikia specialaus apdorojimo (14) PRIEŠ IR PO (28, 31) A Cynosurus cristatus (Paprastoji kietavarpė) D Auga laukuose, pakelėse, atvirose augimvietėse (16, 19) 0,5–0,7 (14, 19, 29) Š = T (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) dygimas nepriklauso nuo apšvietos (19), nereikia specialaus apdorojimo (14, 29) PO (5) A Digitaria sanguinalis (Raudonoji pirštuotė) V Auga laukuose, vejose, atvirose augimvietėse (16) 0,52–0,6 (14, 30) Š = T (14) 10–20 (21) 7 (75 %) 14 (94 %) (7) skarifikavimas, stratifikavimas šaltyje ir brandinimas (1, 7, 14, 32), apdorojimas 101 mg/L KNO3 (14), tamsa stabdo dygimą (1), nereikia specialaus apdorojimo (21) PRIEŠ IR PO (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (Paprastoji rietmenė) V (16) 1,5 (14) Š = T (14) Š > T (3) 10–20 (7, 21) skarifikavimas (7, 32), dygimas nepriklauso nuo apšvietos (1), nereikia specialaus apdorojimo (3, 14, 21) PRIEŠ IR PO (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis (Kanadinis elimas) D Auga pakrantėse, žmogaus veiklos paliestose vietose (16) 4–5 (14, 30) Š = T (11) 1 (11) 14–28 (11) nereikia specialaus apdorojimo (2, 11) PO (2) C, D, E Festuca pratensis (Tikrasis eraičinas) D Auga laukuose, drėgnose vietose (16, 19) 1,53–2,2 (16, 19) Š = T (14) Š > T (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) nereikia specialaus apdorojimo (10, 19) PO (10) A 7 Hordeum pusillum (Žemasis miežis) V Auga ganyklose, pakelėse, atvirose augimvietėse (16) 3,28 (14) stratifikavimas šiltai (1), dygimas nepriklauso nuo apšvietos (1) PRIEŠ (31) 7 Phleum pratense (Pašarinis motiejukas) D Auga ganyklose, ariamuose laukuose, žmogaus veiklos paliestose vietose (16, 19) 0,45 (14, 19) Š > T (10, 14) 0–10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) tamsa stabdo dygimą (19), dygimas nepriklauso nuo apšvietos (17), nereikia specialaus apdorojimo (10, 14, 17, 19) PO (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (Vijoklinis rūgtis) V Auga atvirose augimvietėse, pakelėse (16) 5–8 (4, 14, 29) Š = T (20) 0–2 (4, 29) stratifikavimas šaltyje 4–8 savaites (1, 2, 4, 20, 29), dygimas nepriklauso nuo apšvietos (1) PRIEŠ IR PO 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (Trumpamakštis rūgtis) V Auga drėgnuose dirvožemiuose (16) 1,8–2,5 (14) Š > T (6) 5 (94 %) (18) dygimas nepriklauso nuo apšvietos (1), tamsa stabdo dygimą (18), stratifikavimas šaltyje (1), nereikia specialaus apdorojimo (5) PRIEŠ IR PO (6) A, E Polygonum pennsylvanicum (Pensilvaninis rūgtis) V Auga laukuose, atvirose augimvietėse (16) 3,6–7 (14, 29) 2 (29) stratifikavimas šaltyje 4 savaites, esant 0–5 °C temperatūrai (1, 29), tamsa stabdo dygimą (1) PRIEŠ (31) A, E Polygonum periscaria (Dėmėtasis rūgtis) V Auga žmogaus veiklos paliestose vietose, ariamose dirvose (16, 19) 2,1–2,3 (14, 19) Š > T (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) skarifikavimas, stratifikavimas šaltyje, apdorojimas giberelinu (14), stratifikavimas šaltyje, brandinimas (17–19), tamsa stabdo dygimą (19), nereikia specialaus apdorojimo (13) PO (13) A 32 Rumex crispus (Rauktalapė rūgštynė) D Auga ariamuose laukuose, pakelėse, atvirose vietose (16, 19) 1,3–1,5 (4, 14, 19) Š = T (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) tamsa stabdo dygimą (18, 19), sėklas gali reikėti subrandinti (18), nereikia specialaus apdorojimo (4, 14, 33) PO (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis (Raudonžiedis progailis) V Auga ariamuose laukuose, atvirose ir žmogaus veiklos paliestose vietose (16, 19) 0,4–0,5 (4, 14, 19) Š = T (14) 1 (50 %) (19) stratifikavimas šaltyje, apdorojimas giberelinu (1,14, 18, 19, 32), dygimui reikia šviesos (1), nereikia specialaus apdorojimo (2, 4) PO (2, 4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (Aitrusis vėdrynas) D Auga ariamuose laukuose, pakelėse, atvirose vietose (16, 19) 1,5–2 (14, 19, 29) Š = T (14) 1 (29) 41–56 (19, 29) nereikia specialaus apdorojimo (5, 14, 22, 24–26) PO (5, 22, 24–26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (Geltonoji žiognagė) D Auga gyvatvorėse, drėgnose vietose (16, 19) 0,8–1,5 (14, 19) Š = T (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) tamsa stabdo dygimą (18, 19), stratifikavimas šiltai (1), nereikia specialaus apdorojimo (5, 14, 22, 25, 26) PO (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (Kibusis lipikas) V Auga ariamuose laukuose, drėgnose ir žmogaus veiklos paliestose vietose (16, 19) 7–9 (14, 19) Š = T (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) stratifikavimas šaltyje (1, 18, 19), dygimas nepriklauso nuo apšvietos (18, 19), šviesa stabdo dygimą (1), nereikia specialaus apdorojimo (6, 14) PRIEŠ IR PO (6, 28) A 32 Galium mollugo (Paprastasis lipikas) D Auga gyvatvorėse, atvirose vietose (8) 7 (29) Š = T (14) 2 (29) nereikia specialaus apdorojimo (5, 14, 22, 24, 26, 29) PO (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (Paprastoji rusmenė) Dv, D Auga gyvatvorėse, atvirose vietose (16, 19) 0,1–0,6 (4, 14, 19) Š = T (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) tamsa stabdo dygimą (1, 17–19), nereikia specialaus apdorojimo (4, 22–26) PO (4, 22–26) D, G, F Veronica persica (Persinė veronika) V Auga ariamuose laukuose, atvirose ir žmogaus veiklos paliestose vietose (16, 19) 0,5–0,6 (14, 19) Š = T (14) 0 (19) 3(19) 5 (96 %) (18) tamsa stabdo dygimą (18, 19), stratifikavimas šaltyje (18), nereikia specialaus apdorojimo (14) PRIEŠ IR PO (28) A 32 Nurodyti sėklų tiekėjai Tiekėjo nuoroda Informacija apie tiekėją A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ ENGLAND +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 USA (727) 344 – 4050 www.tropilab.com C Pterophylla – Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 – 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 – 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 USA (800) 873 – 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB ENGLAND +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 – 7333 www.thompson-morgan.com CITUOTOS NUORODOS (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. (6) Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. pp 197 – 208. (7) Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. (10) Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC – Weeds. pp. 151 – 156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Personal communication. (www.ernstseed.com). (12) Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. (13) Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. (14) Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. (16) Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. (18) Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. (19) Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London (20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. (21) Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. (22) Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. (23) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. (24) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. (25) Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. (26) Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. (27) Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC – Weeds. pp. 1021-1028. (28) McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Personal communication. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Personal communication. (34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. 4 priedėlis Kai kurių rūšių kultūriniams augalams tinkamų auginimo sąlygų pavyzdžiai Toliau aprašytos sąlygos, kaip nustatyta, tinkamos dešimties rūšių kultūriniams augalams auginti; šiomis gairėmis galima remtis auginimo kamerose bandymams naudojant ir kai kurių kitų rūšių augalus: anglies dioksido koncentracija: 350 ± 50 ppm; santykinis drėgnis: 70 ± 5 % šviesos periodais, 90 ± 5 % tamsos periodais; temperatūra: 25 ± 3 °C dienomis, 20 ± 3 °C naktimis; apšvietimo trukmė: 16 šviesos ir 8 tamsos valandos, kai vidutinis šviesos bangų ilgis 400–700 nm; apšvietimas: 350 ± 50 μE/m2/s skaisčio šviesa, matuojant augalinės dangos paviršiuje. Šios kultūrinių augalų rūšys yra: — pomidoras (Solanum lycopersicon); — paprastasis agurkas (Cucumis sativus); — sėjamoji salota (Lactuca sativa); — gauruotoji soja (Glycine max); — gūžinis kopūstas (Brassica oleracea var. capitata); — paprastoji morka (Daucus carota); — sėjamoji aviža (Avena sativa); — daugiametė svidrė (Lolium perenne); — paprastasis kukurūzas (Zea mays); — valgomasis svogūnas (Allium cepa). C.32. ENCHITRĖJŲ REPRODUKCIJOS BANDYMAS ĮVADAS 1. Šis bandymo metodas atitinka EBPO bandymo gaires (TG) Nr. 220 (2004). Jis skirtas cheminių medžiagų poveikiui kirmėlių enchitrėjų Enchytraeus albidus (Henle, 1873) reprodukcijos našumui dirvožemyje vertinti. Jis daugiausia pagrįstas Vokietijos aplinkos apsaugos agentūros Umweltbundesamt sukurtu metodu (1), kuriam patikrinti atliktas tarplaboratorinis bandymas (2). Svarstomos galimybės cheminių medžiagų toksiškumą Enchytraeidae šeimos kirmėlėms ir sliekams tikrinti ir kitais metodais (3), (4), (5), (6), (7), (8). ĮŽANGINĖS PASTABOS 2. Dirvožemyje gyvenančios Enchytraeus genties žieduotosios kirmėlės yra ekotoksikologiniams bandymams ekologiškai svarbios rūšys. Nors enchitrėjai dažnai aptinkami tuose pačiuose dirvožemiuose, kuriuose gyvena sliekai, jų taip pat dažnai gausu ir tokių rūšių dirvožemyje, kuriame sliekų nėra. Enchitrėjus galima naudoti tiek bandymams laboratorijoje, tiek bandymams pusiau lauko arba lauko sąlygomis. Daugelio Enchytraeus rūšių kirmėles praktiškai nesunku prižiūrėti ir veisti, o jų generacijos laikas kur kas trumpesnis negu sliekų. Todėl reprodukcijos bandymas naudojant enchitrėjus trunka tik 4–6 savaites, o naudojant sliekus (Eisenia fetida) – 8 savaites. 3. Svarbiausia informacija apie sausumos enchitrėjų ekologiją ir ekotoksikologiją pateikta literatūroje (9), (10), (11), (12). BANDYMO PRINCIPAS 4. Suaugę enchitrėjai patiria įvairių bandomosios cheminės medžiagos, kurios įmaišyta į dirbtinį dirvožemį, koncentracijų poveikį. Galima skirti du šio bandymo etapus: a) intervalo nustatymo bandymą, atliekamą tada, kai trūksta informacijos – tokiu atveju po dviejų bandomosios medžiagos poveikio savaičių pagrindinė vertinamoji baigtis yra organizmų gaištamumas; ir b) nustatomąjį reprodukcijos bandymą, per kurį vertinamas bendras vieno motininio gyvūno atsivestų jauniklių skaičius ir motininių gyvūnų išgyvenamumas. Nustatomasis bandymas trunka šešias savaites. Po pirmųjų trijų savaičių suaugusios kirmėlės išimamos ir aprašomi jų sandaros (morfologiniai) pakitimai. Dar po trijų savaičių suskaičiuojami iš suaugusių kirmėlių padėtų kokonų išsiritę palikuonys. Bandomosios cheminės medžiagos paveiktų gyvūnų reprodukcijos našumas palyginamas su kontrolinės grupės arba grupių gyvūnų reprodukcijos našumu siekiant nustatyti: i) nepastebėto poveikio koncentraciją (NOEC) ir (arba) ii) ECx (pvz., EC10, EC50), pagal regresijos modelį vertinant koncentraciją, kuriai esant reprodukcijos našumas sumažėtų x %. ECx (pvz., EC10, EC50) vertė turėtų patekti į bandymui pasirinktų koncentracijos verčių intervalą, kad ECx būtų galima nustatyti interpoliacijos, o ne ekstrapoliacijos būdu. INFORMACIJA APIE BANDOMĄJĄ CHEMINĘ MEDŽIAGĄ 5. Pageidautina žinoti bandomosios cheminės medžiagos tirpumą vandenyje, log Kow, dirvožemio ir vandens pasiskirstymo koeficientą (žr. šio priedo C.18 arba C.19 skyrių) ir garų slėgį. Patartina turėti papildomos informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos išliekamumą dirvožemyje, kaip antai jos fotolizės ir hidrolizės lygius. 6. Šį bandymo metodą galima taikyti vandenyje tirpioms arba netirpioms cheminėms medžiagoms, tačiau nuo tirpumo vandenyje priklauso bandomosios cheminės medžiagos naudojimo būdas. Šis bandymo metodas netinka lakiosioms cheminėms medžiagoms, pvz., tokioms, kurių Henrio dėsnio konstanta arba oro ir vandens pasiskirstymo koeficientas viršija vienetą, arba cheminėms medžiagoms, kurių garų slėgis 25 °C temperatūroje viršija 0,0133 Pa. BANDYMO TINKAMUMAS 7. Bandymas pripažįstamas tinkamu, jeigu kontrolinės grupės bandiniai atitinka šiuos veiksmingumo kriterijus: — suaugusių gyvūnų gaištamumas, nustatytas baigus intervalo nustatymo bandymą ir po pirmų trijų reprodukcijos bandymo savaičių, neturėtų viršyti 20 %; — jeigu, pradedant bandymą, į kiekvieną indą įleista po 10 suaugusių kirmėlių, bandymo pabaigoje kiekviename inde turėtų būti vidutiniškai bent 25 jaunikliai; — vidutinio jauniklių skaičiaus variacijos koeficientas reprodukcijos bandymo pabaigoje neturėtų viršyti 50 %. Jeigu bandymas neatitinka šių tinkamumo kriterijų, jį reikėtų nutraukti, nebent įmanoma pagrįstai įrodyti, kodėl verta jį tęsti. Šį pagrindimą reikėtų pateikti bandymo ataskaitoje. ETALONINĖ CHEMINĖ MEDŽIAGA 8. Bandymai su etalonine chemine medžiaga turėtų būti atliekami reguliariais intervalais arba galbūt per kiekvieną bandymą, siekiant įsitikinti, kad bandomųjų organizmų atsakas laikui bėgant reikšmingai nesikeičia. Tinkama etaloninė cheminė medžiaga yra karbendazimas, kurio poveikis enchitrėjų išgyvenimui ir reprodukcijai įrodytas (13), (14); galima naudoti ir kitas chemines medžiagas, kurių toksiškumo duomenys yra gerai žinomi. Per tarplaboratorinį bandymą naudotas karbendazimo preparatas (prekės pavadinimas – Derosal™), kurį tiekia Frankfurte (Vokietija) įsikūrusi įmonė „AgrEvo“ ir kuriame yra 360 g/l (32,18 %) veikliosios medžiagos (2). Per tarplaboratorinį bandymą nustatyta šios medžiagos poveikio reprodukcijai EC50 vertė yra 1,2 ± 0,8 mg veikliosios medžiagos vienam sausosios medžiagos masės kilogramui (2). Jei per bandymų seriją naudojamas teigiamas toksiškumo etalonas, pasirenkama viena koncentracija, o kartotinių bandinių turėtų būti tiek pat, kiek ir kontrolinėse grupėse. Kaip etaloninę medžiagą pasirinkus karbendazimą, patartina bandymui naudoti 1,2 mg veikliosios medžiagos vienam sausosios medžiagos masės kilogramui (kai bandymas atliekamas su skystu preparatu). BANDYMO APRAŠYMAS Įranga 9. Bandymui naudojami indai turėtų būti pagaminti iš stiklo ar kitos chemiškai inertinės medžiagos. Tinka stiklainiai (pvz., 0,20–0,25 l tūrio ir ≈ 6 cm skersmens). Indų dangčiai turėtų būti perregimi (pvz., iš stiklo ar polietileno) ir tokie, kad per juos kuo mažiau garuotų vanduo, tačiau vyktų pakankama dujų apykaita tarp dirvožemio ir atmosferos oro. Dangčiai turėtų būti skaidrūs ir praleisti šviesą. 10. Bandymui reikalinga įprasta laboratorinė įranga, visų pirma: — džiovinimo spinta; — stereomikroskopas; — pH matuoklis ir fotometras; — tinkamos tikslios svarstyklės; — tinkama temperatūros kontrolės įranga; — tinkama drėgmės kontrolės įranga (nebūtinai, jeigu bandomosios medžiagos poveikis tiriamas induose su dangčiais); — inkubatorius arba maža patalpa su oro kondicionieriumi; — pincetai, vąšeliai arba instrumentai su kilpelėmis gale; — fotografijų ryškinimo vonelė. Dirbtinio dirvožemio paruošimas 11. Šiam bandymui naudojamas dirbtinis dirvožemis (5), (7), kurio sudėtis yra tokia (nurodyta sausosios medžiagos, išdžiovintos iki pastovios masės 105 °C temperatūroje, mase): — 10 % kiminų durpių, ore išdžiovintų ir smulkiai sumaltų (tinkamas dalelių dydis yra 2 ± 1 mm); prieš naudojant bandymui dirvožemį, į kurį dėta durpių iš naujo paketo, patartina įsitikinti, kad jis tinka kirmėlėms auginti; — 20 % kaolino molio (patartina, kad kaolinito jame būtų daugiau kaip 30 %); — apie 0,3–1,0 % kalcio karbonato (analiziškai grynų CaCO3 miltelių), kad būtų gautas 6,0 ± 0,5 pH; dedamo kalcio karbonato kiekis gali daugiausia priklausyti nuo durpių kokybės ir (arba) rūšies; — apie 70 % ore išdžiovinto kvarcinio smėlio (priklausomai nuo reikiamo CaCO3 kiekio), daugiausia smulkaus, kad daugiau kaip 50 % dalelių jame būtų 50–200 μm dydžio. Prieš naudojant dirvožemį nustatomajam bandymui, patartina įsitikinti, kad dirbtinis dirvožemis yra tinkamas kirmėlėms auginti ir atitinka bandymo tinkamumo kriterijus. Ypač patartina įsitikinti, kad bandymo eiga nebūtų sutrikdyta sumažinus organinės anglies kiekį dirbtiniame dirvožemyje, pvz., iki 4–5 % sumažinus durpių kiekį ir atitinkamai padidinus smėlio kiekį. Taip mažinant organinės anglies kiekį, galima sumažinti tikimybę, kad bandomoji cheminė medžiaga įsigers į dirvožemį (dėl jame esančios organinės anglies), ir padidinti kirmėlėms prieinamą bandomosios cheminės medžiagos kiekį. Įrodyta, kad Enchytraeus albidus gali atitikti reprodukcijai taikomus bandymo tinkamumo kriterijus, bandymui naudojant iš lauko paimtą dirvožemį su mažesniu, negu nurodyta, organinės anglies kiekiu, pvz., 2,7 % (15), taip pat yra (nors ir ribotos) patirties, kad tai įmanoma pasiekti ir naudojant dirbtinį dirvožemį su 5 % durpių. Pastaba. Naudojant natūralų dirvožemį papildomiems (pvz., aukštesnės pakopos) bandymams, taip pat reikėtų įrodyti tokio dirvožemio tinkamumą ir atitiktį bandymo tinkamumo kriterijams. 12. Sausos dirvožemio sudedamosios dalys kruopščiai sumaišomos (pvz., dideliame laboratoriniame maišytuve). Reikėtų tai padaryti likus bent savaitei iki bandymo pradžios. Sumaišytą dirvožemį reikėtų palaikyti dvi dienas, kad nusistovėtų (stabilizuotųsi) rūgštingumas; tinkamai pH vertei nustatyti naudojamas dirvožemio ir 1 M kalio chlorido (KCl) arba 0,01 M kalcio chlorido (CaCl2) tirpalas (santykiu 1:5), žr. (16) ir 3 priedėlį. Jeigu dirvožemio rūgštumas viršija tinkamą intervalą (žr. 11 skirsnį), jį galima pakoreguoti įdedant reikiamą CaCO3 kiekį. Jeigu dirvožemis yra pernelyg kalkingas, jį galima pataisyti įdedant daugiau 11 skirsnyje nurodyto mišinio, tačiau nededant CaCO3. 13. Dirbtinio dirvožemio didžiausias vandens įmirkis nustatomas pagal 2 priedėlyje aprašytas procedūras. Iki bandymo pradžios likus vienai ar dviem dienoms, sausas dirbtinis dirvožemis iš pradžių sudrėkinamas įpilant pakankamai dejonizuoto vandens, kad jame būtų maždaug pusė galutinio vandens kiekio (40–60 % didžiausio vandens įmirkio). Taip iš anksto sudrėkintas dirvožemis pradedant bandymą išskirstomas į tiek dalių, kiek koncentracijų pasirinkta (įskaitant, kai tinka, etaloninę cheminę medžiagą) ir kiek kontrolinių bandinių naudojama bandymui. Dirvožemio drėgnis patikslinamas iki 40–60 % didžiausio vandens įmirkio, įpilant bandomosios cheminės medžiagos tirpalo ir (arba) papildomai įpilant distiliuoto ar dejonizuoto vandens (žr. 19–21 skirsnius). Drėgnis nustatomas pradedant ir baigiant bandymą (išdžiovinant dirvožemį iki pastovios masės 105 °C temperatūroje) ir turėtų būti optimalus, kad jame išgyventų kirmėlės. Dirvožemio drėgnį galima apytikriai nustatyti nestipriai suspaudus saujoje šiek tiek dirvožemio – jei drėgnis yra tinkamas, tarp pirštų turėtų pasirodyti smulkių vandens lašelių. Bandomųjų gyvūnų atranka ir paruošimas 14. Bandymams rekomenduojama naudoti rūšis yra Enchytraeus albidus (Henle, 1837) – baltasis enchitrėjas, priklausantis Enchytraeidae šeimai (Oligochaeta būrys, Annelida tipas). E. albidus rūšies enchitrėjai yra vieni stambiausių – yra rašytinių duomenų apie iki 35 mm ilgio užaugančius egzempliorius (17), (18). E. albidus yra paplitę visame pasaulyje, gyvena jūrų, gėlo vandens ir sausumos buveinėse, daugiausia pūvančiose organinėse medžiagose (jūrų dumbliuose, komposte), taip pat (retai) pievose (9). Šios kirmėlės pakenčia labai įvairias ekologines sąlygas ir iš tam tikrų jų sandaros (morfologinių) pakitimų galima spręsti, kad esama kelių šios rūšies porūšių. 15. E. albidus kirmėlėmis prekiaujama rinkoje kaip žuvų pašaru. Reikėtų patikrinti, ar jų kultūra nėra užkrėsta kitų, paprastai smulkesnių, rūšių organizmais (1), (19). Aptikus užkratą, visas kirmėles reikėtų nuplauti vandeniu Petri lėkštelėje. Tada (naudojant stereomikroskopą) reikėtų išrinkti didelius suaugusius E. albidus individus, kurie bus naudojami naujai kultūrai pradėti, o visas likusias kirmėles pašalinti. E. albidus galima lengvai veisti naudojant labai įvairias organines medžiagas (žr. 4 priedėlį). E. albidus gyvenimo ciklas yra trumpas, nes šios kirmėlės subręsta per laiko tarpą nuo 33 dienų (18 °C temperatūroje) iki 74 dienų (12 °C temperatūroje) (1). Bandymui naudojamos tik tokios kultūros, kurios be jokių problemų laikytos laboratorijoje bent 5 savaites (vieną generacijos ciklą). 16. Tinka ir kitos Enchytraeus genties rūšys, pvz., E. buchholzi (Vejdovsky, 1879) arba E. crypticus (Westheide ir Graefe, 1992) (žr. 5 priedėlį). Jeigu naudojamos kitos Enchytraeus rūšys, būtina aiškiai jas identifikuoti ir ataskaitoje nurodyti jų pasirinkimo priežastį. 17. Bandymams naudojamos suaugusios kirmėlės. Jų kliteliumo vietoje turėtų būti kiaušinėlių (baltų taškų) ir jos visos turėtų būti maždaug vienodo dydžio (apie 1 cm ilgio). Jų veisimo kultūros sinchronizuoti nebūtina. 18. Jeigu enchitrėjai nėra auginami tos pačios rūšies dirvožemyje ir tokiomis pačiomis (be kita ko, šėrimo) sąlygomis, kokiomis jie bus naudojami galutiniam bandymui, juos būtina aklimatizuoti bent 24 valandas, o ilgiausiai iki trijų dienų. Iš pradžių reikėtų aklimatizuoti daugiau suaugusių kirmėlių, negu reikia bandymui atlikti, kad būtų galima pašalinti pažeistus ar dėl kitų priežasčių bandymui netinkamus individus. Po aklimatizacijos periodo bandymui atrenkamos tik tos kirmėlės, kurios turi kiaušinėlių ir elgiasi įprastai (pvz., nebando išlįsti iš dirvožemio). Kirmėlės atsargiai išimamos naudojant juvelyrinį pincetą, vąšelį arba instrumentą su kilpelėmis gale ir įdedamos į Petri lėkštelę, kurioje yra įpilta truputį gėlo vandens. Geriausia naudoti regeneruotą gėlą vandenį, kaip pasiūlyta šio priedo C.20 skyriuje (Daphnia magna reprodukcijos bandymas), nes kirmėlėms gali pakenkti dejonizuotas, demineralizuotas ar vandentiekio vanduo. Kirmėlės patikrinamos apžiūrint per stereomikroskopą, neturinčios kiaušinėlių pašalinamos. Kruopščiai išimamos ir pašalinamos bet kokios erkės ar kolembolos, kuriomis gali būti užkrėstos auginamos kultūros. Sveikos kirmėlės, kurios nebus naudojamos bandymui, grąžinamos į pradinę kultūrą. Bandymui pasirinktų koncentracijų terpių ruošimas Vandenyje tirpi bandomoji cheminė medžiaga 19. Bandomosios cheminės medžiagos tirpalo dejonizuotame vandenyje paruošiama tiek, kad jo pakaktų visiems vienos bandymui pasirinktos koncentracijos kartotiniams bandiniams. Patartina naudoti tinkamą vandens kiekį reikiamam drėgniui, t. y. 40–60 % didžiausio vandens įmirkio, pasiekti (žr. 13 skirsnį). Kiekvienas bandomosios cheminės medžiagos tirpalas prieš dedant į bandymo indą gerai sumaišomas su viena iš anksto sudrėkinto dirvožemio porcija. Vandenyje netirpi bandomoji cheminė medžiaga 20. Bandomąsias chemines medžiagas, kurios yra netirpios vandenyje, tačiau tirpios organiniuose tirpikliuose, galima ištirpinti minimaliame tinkamo nešiklio (pvz., acetono) kiekyje. Reikėtų naudoti tik lakiuosius tirpiklius. Nešiklis užpurškiamas ant nedidelio smulkaus kvarcinio smėlio kiekio, pvz., 2,5 g, arba su juo sumaišomas, tada pašalinamas bent vieną valandą garinant po traukos gaubtu. Taip gautas kvarcinio smėlio ir bandomosios cheminės medžiagos mišinys įberiamas į iš anksto sudrėkintą dirvožemį ir kruopščiai su juo sumaišomas įpylus reikiamą dejonizuoto vandens kiekį, kad dirvožemio drėgnis būtų tinkamas. Gautas mišinys sudedamas į bandymo indus. 21. Kai cheminės medžiagos yra mažai tirpios vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, kiekvienam bandymo indui imama po 2,5 g smulkiai sumalto kvarcinio smėlio, kuris sumaišomas su tinkamu bandomosios cheminės medžiagos kiekiu, kad būtų gauta bandymui reikiama jos koncentracija. Šis kvarcinio smėlio ir bandomosios cheminės medžiagos mišinys įberiamas į iš anksto sudrėkintą dirvožemį ir kruopščiai su juo sumaišomas įpylus reikiamą dejonizuoto vandens kiekį, kad dirvožemio drėgnis būtų tinkamas. Gautas mišinys išskirstomas į bandymo indus. Ta pati procedūra kartojama ruošiant kiekvienos koncentracijos bandinius, taip pat paruošiama tinkama kontrolinių bandinių grupė. 22. Bandomųjų cheminių medžiagų koncentracijos paprastai neturėtų viršyti 1 000 mg vienam sausosios dirvožemio medžiagos masės kilogramui, tačiau konkretaus bandymo tikslais gali reikėti rinktis ir didesnes koncentracijos vertes. BANDYMŲ EIGA Bandomosios ir kontrolinės grupės 23. Į kiekvienos bandomosios koncentracijos indus dedamas bandymui paruošto dirvožemio kiekis, atitinkantis 20 g sausosios medžiagos masės (žr. 19–21 skirsnius). Taip pat paruošiami kontroliniai bandiniai be bandomosios cheminės medžiagos. Į kiekvieną indą įdedama pašaro 29 skirsnyje aprašyta tvarka. Tada į kiekvieną bandymo indą įdedama po dešimt atsitiktine tvarka atrinktų kirmėlių. Kirmėlės atsargiai perkeliamos į kiekvieną bandymo indą ir padedamos dirvožemio paviršiuje naudojant, pvz., juvelyrinį pincetą, vąšelį arba instrumentą su kilpelėmis gale. Kartotinių kiekvienos bandymo koncentracijos ir kontrolinės grupės bandinių kiekis priklauso nuo pasirinkto bandymo plano (žr. 34 skirsnį). Bandymo indai atsitiktine tvarka sustatomi į bandymui skirtą inkubatorių ir kas savaitę, taip pat atsitiktine tvarka, sukeičiami vietomis. 24. Jeigu bandomoji cheminė medžiaga dedama į bandinius naudojant nešiklį, kartu su bandymo indų serija reikėtų paruošti vieną kontrolinių bandinių seriją su kvarciniu smėliu, kuris būtų apipurkštas tirpikliu arba su juo sumaišytas. Naudojamo tirpiklio arba dispergento koncentracija turėtų būti tokia pati, kaip ir bandymo induose, į kuriuos dėta bandomosios cheminės medžiagos. Kontrolinių bandinių, į kuriuos papildomai dedama kvarcinio smėlio (po 2,5 g į kiekvieną indą), seriją reikėtų paruošti tais atvejais, kai bandomosios cheminės medžiagos turi būti naudojamos 21 skirsnyje aprašyta tvarka. Bandymo sąlygos 25. Bandymas atliekamas 20 ± 2 °C temperatūroje. Kad kirmėlės nebandytų iššliaužti iš dirvožemio, atliekant bandymą reguliuojamas šviesos ir tamsos ciklas (geriausia, kad būtų 16 val. šviesos ir 8 val. tamsos) ir palaikomas bandymo indų apšvietimas 400–800 lx šviesa. 26. Siekiant patikrinti dirvožemio drėgnį, indai pasveriami bandymo pradžioje ir vėliau sveriami kartą per savaitę. Trūkstama masė papildoma įpilant reikiamą dejonizuoto vandens kiekį. Pažymėtina, kad vandens netekimą galima sulėtinti palaikant didelį oro drėgnį (> 80 %) bandymo inkubatoriuje. 27. Drėgnį ir pH reikėtų išmatuoti pradedant ir baigiant tiek intervalo nustatymo bandymą, tiek nustatomąjį bandymą. Matavimus reikėtų atlikti kontroliniuose ir apdorotuose bandomąja medžiaga (visų koncentracijų) dirvožemio ėminiuose, paruoštuose ir prižiūrimuose taip pat, kaip ir bandomųjų kultūrų indai, tik be kirmėlių. Į šiuos dirvožemio ėminius pašaro reikėtų dėti tik bandymo pradžioje, siekiant paskatinti mikroorganizmų aktyvumą. Pašaro turėtų būti dedama tiek pat, kiek jo reikia bandomųjų kultūrų kirmėlėms šerti, tačiau per bandymą papildomo pašaro į šiuos indus dėti nereikia. Šėrimas 28. Galima naudoti enchitrėjų populiacijai palaikyti tinkamą pašarą. Nustatyta, kad pašarui tinka avižiniai dribsniai; prieš naudojant patartina juos apdoroti autoklave, kad būtų išvengta užkrėtimo mikroorganizmais (taip pat galima juos pakaitinti). 29. Pašaro dedant pirmą kartą, 50 mg sumaltų avižinių dribsnių sumaišoma su dirvožemiu kiekviename inde, prieš įleidžiant kirmėles. Vėliau pašaro papildomai dedama kas savaitę iki 21 bandymo dienos. 28 bandymo dieną pašaro nededama, nes tuo metu reikia išimti suaugusius individus, o jauniklėms kirmėlėms papildomo pašaro vėliau reikia gana nedaug. Šeriant kirmėles bandymo metu, po 25 mg sumaltų avižinių dribsnių įdedama į kiekvieną indą ir atsargiai paberiama dirvožemio paviršiuje, stengiantis nesužeisti kirmėlių. Kad mažiau augtų grybeliai, avižinius dribsnius reikėtų įmaišyti į dirvožemį, ant jų užberiant nedidelį dirvožemio kiekį. Jei lieka nesuvartoto pašaro, jo davinį reikėtų sumažinti. Intervalo nustatymo bandymo planas 30. Kai reikia, atliekamas intervalo nustatymo bandymas pasirinkus, pvz., penkias bandomosios cheminės medžiagos koncentracijas – 0,1, 1,0, 10, 100 ir 1 000 mg vienam sausosios dirvožemio medžiagos masės kilogramui. Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolinėje grupėje pakanka paruošti po vieną kartotinį bandinį. 31. Intervalo nustatymo bandymas trunka dvi savaites. Baigiant bandymą įvertinamas kirmėlių gaištamumas. Kirmėlė registruojama kaip negyva, jeigu nereaguoja į mechaninį dirgiklį priekinėje kūno dalyje. Sprendžiant, koks turėtų būti nustatomojo bandymo koncentracijos verčių intervalas, gali būti naudinga remtis ir papildoma informacija apie gaištamumą. Todėl taip pat reikėtų aprašyti suaugusių kirmėlių elgsenos pokyčius (pvz., jeigu kirmėlės nesugeba įsirausti į dirvožemį arba nejudėdamos guli prisišliejusios prie stiklinės bandymo indo sienos), morfologinius pokyčius (pvz., ar nėra atvirų žaizdų) ir ar yra jauniklių. Jauniklių buvimą galima nustatyti taikant 6 priedėlyje aprašytą dažymo metodą. 32. LC50 galima apytikriai nustatyti apskaičiuojant gaištamumo duomenų geometrinį vidurkį. Parenkant koncentracijos verčių intervalą nustatomajam bandymui, poveikis reprodukcijai laikomas iki 10 kartų mažesniu negu LC50. Tačiau tai empirinis santykis, kuris kiekvienu konkrečiu atveju gali būti skirtingas. Per intervalo nustatymo bandymą užrašytos papildomos pastabos, kaip antai dėl jauniklių buvimo, gali padėti patikslinti bandomosios cheminės medžiagos koncentracijų intervalą, kuris bus naudojamas per nustatomąjį bandymą. 33. Siekiant tiksliai nustatyti LC50, rekomenduojama atliekant bandymą naudoti bent po keturis kiekvienos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos kartotinius bandinius ir parinkti tinkamą koncentracijų skaičių, kad būtų gauti mažiausiai keturi statistiškai pakankamai skirtingi vidutiniai atsakai į tų koncentracijų poveikį. Kai tinka, tiek pat koncentracijos verčių ir kartotinių bandinių naudojama kontrolinėse grupėse. Nustatomojo reprodukcijos bandymo planas 34. Remiantis rekomendacijomis, pateiktomis atlikus tarplaboratorinį bandymą, siūlomi trys bandymo planai (2): — nustatant NOEC, reikėtų bandymui rinktis bent penkias koncentracijos vertes, išdėstytas geometrine progresija. Rekomenduojama paruošti po keturis kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos kartotinius bandinius ir dar aštuonis kontrolinius bandinius. Koncentracijos vertės turėtų skirtis pastoviu santykiu, neviršijančiu 1,8; — nustatant ECx (pvz., EC10, EC50), reikėtų bandymui rinktis mažiausiai penkias koncentracijas ir ECx turėtų patekti į tų koncentracijų intervalą, kad ECx vertę būtų galima nustatyti interpoliacijos, o ne ekstrapoliacijos būdu. Rekomenduojama paruošti bent po keturis kiekvienos bandymui pasirinktos koncentracijos kartotinius bandinius ir keturis kontrolinius kartotinius bandinius. Koncentracijos gali skirtis įvairiu santykiu, kuris, pvz., gali būti mažesnis ar lygus 1,8 tikėtino poveikio intervale arba viršyti 1,8, esant didesnėms arba mažesnėms koncentracijoms; — NOEC ir ECx galima kartu nustatyti pagal kombinuotą metodą. Pagal jį turėtų būti aštuonios bandomosios medžiagos koncentracijos, išdėstytos geometrine progresija. Rekomenduojama paruošti po keturis kiekvienos koncentracijos kartotinius bandinius, taip pat aštuonis kontrolinius bandinius. Pasirinktos koncentracijos vertės turėtų skirtis pastoviu santykiu, neviršijančiu 1,8. 35. Kiekviename bandymo inde turėtų būti dešimt suaugusių kirmėlių (žr. 23 skirsnį). Į bandymo indus dedama pašaro pradedant bandymą ir vėliau kartą per savaitę (žr. 29 skirsnį) iki 21 bandymo dienos imtinai. 21 dieną dirvožemio ėminiai kruopščiai apieškomi rankomis, gyvos suaugusios kirmėlės apžiūrimos ir suskaičiuojamos, aprašomi jų elgsenos pokyčiai (pvz., kirmėlės neįstengia įsirausti į dirvožemį ar nejudėdamos guli prisišliejusios prie stiklinės bandymo indo sienos) ir morfologiniai pokyčiai (pvz., ar yra atvirų žaizdų). Tada visos suaugusios kirmėlės išimamos iš bandymo indų ir bandymui naudoto dirvožemio. Bandymui naudotas dirvožemis su visais kirmėlių padėtais kokonais dar tris savaites inkubuojamas tomis pačiomis bandymo sąlygomis, tačiau pašaro dedama tik 35 bandymo dieną (t. y. į kiekvieną indą įdedama po 25 mg maltų avižinių dribsnių). 36. Po šešių savaičių suskaičiuojamos iš kiaušinėlių naujai išsiritusios kirmėlės. Rekomenduojama rinktis dažymo Bengalijos rožiniu (žr. 6 priedėlį) dažikliu pagrįstą metodą, nors įrodyta, kad tinka ir kiti surinkimo šlapiuoju būdu (bet nekaitinant) ir flotacijos (išplukdymo) metodai (4), (10), (11), (20). Dažymo Bengalijos rožiniu dažikliu metodą patartina rinktis todėl, kad kirmėlių surinkimą iš dirvožemio substrato šlapiuoju būdu gali apsunkinti drumstumas dėl suspenduotų molio dalelių. Ribų nustatymo bandymas 37. Jeigu per intervalo nustatymo bandymą nenustatoma jokio bandomosios medžiagos poveikio esant didžiausiai jos koncentracijai (t. y. 1 000 mg/kg), reprodukcijos bandymą galima atlikti kaip ribinį (ribų nustatymo bandymą, naudojant 1 000 mg/kg koncentraciją, siekiant įrodyti, kad poveikio reprodukcijai NOEC viršija šią vertę. Bandymo santrauka ir tvarkaraštis 38. Bandymo etapus galima apibendrinti taip: Laikas Intervalo nustatymo bandymas Nustatomasis bandymas Likus 7 ar daugiau dienų iki bandymo — Paruoškite dirbtinį dirvožemį (sumaišykite sausas sudedamąsias dalis) — Paruoškite dirbtinį dirvožemį (sumaišykite sausas sudedamąsias dalis) Likus 5 dienoms iki bandymo — Patikrinkite dirbtinio dirvožemio pH — Išmatuokite didžiausią dirvožemio vandens įmirkį — Patikrinkite dirbtinio dirvožemio pH — Išmatuokite didžiausią dirvožemio vandens įmirkį Likus 5–3 dienoms iki bandymo — Atrinkite kirmėles aklimatizacijos periodui — Atrinkite kirmėles aklimatizacijos periodui 3–0 dienos iki bandymo — Aklimatizuokite kirmėles bent 24 valandas — Aklimatizuokite kirmėles bent 24 valandas 1 diena iki bandymo — Dirbtinį dirvožemį iš anksto sudrėkinkite ir padalykite į porcijas — Dirbtinį dirvožemį iš anksto sudrėkinkite ir padalykite į porcijas 0 diena — Paruoškite pradinius tirpalus — Apdorokite bandomąja chemine medžiaga — Sudėkite bandymo substratą į bandymo indus ir juose pasverkite — Įmaišykite pašaro — Įleiskite kirmėles — Išmatuokite dirvožemio pH ir drėgnį — Paruoškite pradinius tirpalus — Apdorokite bandomąja chemine medžiaga — Sudėkite bandymo substratą į bandymo indus ir juose pasverkite — Įmaišykite pašaro — Įleiskite kirmėles — Išmatuokite dirvožemio pH ir drėgnį 7 diena — Patikrinkite dirvožemio drėgnį — Patikrinkite dirvožemio drėgnį — Įdėkite pašaro 14 diena — Nustatykite suaugusių kirmėlių gaištamumą — Įvertinkite jauniklių skaičių — Išmatuokite dirvožemio pH ir drėgnį — Patikrinkite dirvožemio drėgnį — Įdėkite pašaro 21 diena — Stebėkite suaugusių kirmėlių elgesį — Išimkite suaugusias kirmėles — Nustatykite suaugusių kirmėlių gaištamumą — Patikrinkite dirvožemio drėgnį — Įdėkite pašaro 28 diena — Patikrinkite dirvožemio drėgnį — Pašaro nedėkite 35 diena — Patikrinkite dirvožemio drėgnį — Įdėkite pašaro 42 diena — Suskaičiuokite jaunikles kirmėles — Išmatuokite dirvožemio pH ir drėgnį DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS Rezultatų tvarkymas 39. Neskaitant 7 priedėlyje pateiktos apžvalgos, pagal šį bandymo metodą konkrečiai nenurodoma, kaip reikėtų atlikti statistinę bandymo rezultatų analizę. 40. Intervalo nustatymo bandymo pagrindinė vertinamoji baigtis yra bandomųjų gyvūnų gaištamumas. Tačiau taip pat reikėtų aprašyti suaugusių kirmėlių elgesio pokyčius (pvz., kirmėlės neįstengia įsirausti į dirvožemį arba nejudėdamos guli prisišliejusios prie stiklinės bandymo indo sienos), morfologinius pokyčius (pvz., atviras žaizdas) ir ar yra jauniklių. Nustatant LC50 paprastai reikėtų atlikti probito analizę (21) arba logistinę regresinę analizę. Tačiau tais atvejais, kai šis analizės metodas netinka (pvz., jeigu yra mažiau nei trys koncentracijos, kurioms esant dalis gyvūnų žūsta), galima taikyti alternatyvius metodus: tai gali būti slankiųjų vidurkių metodas (22), sutrumpintas Spearman-Karber metodas (23) arba paprastoji interpoliacija (pvz., LC0 ir LC100 geometrinis vidurkis apskaičiuojamas LC0 kvadratinę šaknį dauginant iš LC100). 41. Nustatomojo bandymo vertinamoji baigtis yra kirmėlių vislumas (t. y. atvestų jauniklių skaičius), tačiau šio bandymo, kaip ir intervalo nustatymo bandymo, galutinėje ataskaitoje reikėtų aprašyti ir visus kitus kenksmingo poveikio kirmėlėms požymius. Atliekant statistinę analizę būtina apskaičiuoti kiekvienos bandomosios ir kontrolinės grupės reprodukcijos aritmetinį vidurkį ir standartinį nuokrypį. 42. Atlikus dispersinę analizę, standartinį nuokrypį s ir laisvės laipsnius df galima pakeisti suminiu dispersijos įverčiu, gautu taikant ANOVA metodą, ir, atitinkamai, jo laisvės laipsnius, jeigu dispersija nepriklauso nuo koncentracijos. Tokiu atveju naudokite bendras kontrolinių ir bandomųjų grupių dispersijos vertes. Šios vertės paprastai apskaičiuojamos naudojant komercinę statistikos programinę įrangą, kiekvieno indo rezultatus naudojant kaip kartotinio bandinio rezultatus. Jeigu atrodo, kad galima pagrįstai sujungti neigiamų ir tirpiklio kontrolinių bandinių duomenis, užuot testams naudojus tik kuriuos nors iš jų, reikėtų testais nustatyti, kad tarp jų nėra reikšmingo skirtumo (dėl tinkamų testų žr. 45 skirsnį ir 7 priedėlį). 43. Tolesni statistiniai testai ir išvados priklauso nuo to, ar kartotinių bandinių vertės sudaro normalųjį skirstinį ir ar jų dispersija yra vienalytė. NOEC vertinimas 44. Turėtų būti taikomi patikimi statistiniai kriterijai. Reikėtų naudoti, pvz., iš ankstesnės tarplaboratorinių bandymų patirties arba kitų ankstesnių duomenų gautą informaciją apie tai, ar duomenys maždaug sudaro normalųjį skirstinį. Labiau lemiamą reikšmę turi dispersijos vienalytiškumas (homoskedastija). Iš patirties žinoma, kad dispersija dažnai didėja, didėjant vidurkiui. Šiais atvejais duomenų transformavimas gali lemti homoskedastiją. Tačiau toks transformavimas turėtų būti pagrįstas ankstesnių duomenų tvarkymo patirtimi, o ne tiriamais duomenimis. Turint vienalyčius duomenis, reikėtų taikyti kelis t kriterijus, kaip antai Williams kriterijų (α = 0,05, vienpusis) (24), (25) arba, kai kuriais atvejais, Dunnett kriterijų (26), (27). Pažymėtina, kad netolygios replikacijos atveju lentelėje nurodytas t vertes būtina pataisyti, kaip tai siūlo Dunnett ir Williams. Kartais dėl didelės variacijos atsakai didėja arba mažėja netolygiai. Šiuo atveju, jeigu labai nukrypta nuo monotoniškumo, labiau tinka taikyti Dunnett kriterijų. Jeigu nukrypstama nuo homoskedastijos, gali būti pagrįsta atidžiau ištirti galimą poveikį dispersijoms siekiant nuspręsti, ar taikant t kriterijus per daug nesumažėtų patikimumas (28). Kitu atveju galima taikyti daugybinį U kriterijų, pvz., Bonferroni U kriterijų pagal Holm (29), arba, kai šiems duomenims būdinga heteroskedastija, tačiau kitais atžvilgiais jie atitinka esamą monotonišką dozės ir atsako santykį, – bet kokį kitą neparametrinį kriterijų [pvz., Jonckheere-Terpstra (30), (31) arba Shirley (32), (33)], ir apskritai jam teiktina pirmenybė prieš nelygios dispersijos t kriterijus (taip pat žr. 7 priedėlyje pateiktą schemą). 45. Jeigu atliktas ribų nustatymo bandymas ir tenkinamos parametrinio kriterijaus procedūrų taikymo (normalumo, vienalytiškumo) sąlygos, galima taikyti porinį Student t kriterijų arba, kitu atveju, U kriterijaus procedūrą pagal Mann ir Whitney (29). ECx vertinimas 46. Apskaičiuojant bet kokią ECx vertę, kiekvienos bandomosios grupės vidurkiai naudojami atliekant (tiesinės arba netiesinės) regresijos analizę po to, kai gaunama tinkama dozės ir atsako santykio funkcija. Siekiant gauti kirmėlių augimą kaip nenutrūkstamą atsaką, ECx- vertes galima nustatyti atliekant tinkamą regresinę analizę (35). Tarp dvireikšmiams kintamiesiems (gaištamumas arba išgyvenimas ir atsivestų jauniklių skaičius) tinkamų funkcijų yra įprastos sigmoidinės, logistinės arba Weibull funkcijos su dviem ar keturiais parametrais, iš kurių kai kurie gali taip pat sudaryti hormetinius atsakus. Jeigu dozės ir atsako funkcija buvo pritaikyta atlikus tiesinės regresijos analizę, prieš vertinant ECx, kartu su regresine analize turėtų būti nustatytas reikšmingas r2 (determinacijos koeficiento) dydis ir (arba) nuolydis, įrašant x % atitinkančią kontrolinės grupės vidurkio vertę į lygtį, sudarytą atlikus regresinę analizę. 95 % pasikliovimo ribos apskaičiuojamos pagal Fieller (cituojama Finney (21)) arba kitais tinkamais šiuolaikiniais metodais. 47. Kitu atveju atsakas modeliuojamas kaip pavyzdinio parametro procentinis dydis arba proporcija, aiškinama kaip vidutinis kontrolinės grupės atsakas. Šiais atvejais įprastą (logistinę, Weibull) sigmoidinę kreivę dažnai galima lengvai pritaikyti rezultatams pagal probito regresijos procedūrą (21). Tokiais atvejais svorinė funkcija turi būti pritaikyta metriniams atsakams, kaip nurodo Christensen (36). Tačiau pastebėjus hormezę, probito analizę reikėtų pakeisti keturių parametrų logistine arba Weibull funkcija, pritaikyta pagal netiesinės regresijos procedūrą (36). Jeigu duomenims neįmanoma pritaikyti tinkamos dozės ir atsako funkcijos, galima rinktis alternatyvius ECx ir jos pasikliovimo ribų vertinimo metodus, kaip antai slankiųjų vidurkių metodą pagal Thompson (22) ir sutrumpintą Spearman-Karber procedūrą (23). BANDYMO ATASKAITA 48. Bandymo ataskaitoje turi būti pateikta toliau nurodyta informacija: Bandomoji cheminė medžiaga — Medžiagos fizikinė prigimtis ir svarbios fizikinės bei cheminės savybės (pvz., tirpumas vandenyje, garų slėgis). — Bandomosios cheminės medžiagos cheminės atpažinties duomenys pagal IUPAC nomenklatūrą, CAS numeris, partijos ir siuntos numeriai, struktūrinė formulė ir grynumas. — Iki kokios datos tinka naudoti ėminį. Bandomosios rūšys — Naudojami bandomieji gyvūnai: rūšis, mokslinis pavadinimas, šaltinis, iš kurio gauti organizmai, ir jų veisimo sąlygos. Bandymo sąlygos — Dirbtinio dirvožemio sudedamosios dalys ir paruošimas. — Bandomosios cheminės medžiagos naudojimo bandymui metodas. — Bandymo sąlygų aprašymas, įskaitant temperatūrą, drėgnį, pH ir t. t. — Išsamus bandymo plano ir procedūrų aprašymas. Bandymo rezultatai — Suaugusių kirmėlių gaištamumas po dviejų savaičių ir jauniklių skaičius intervalo nustatymo bandymo pabaigoje. — Suaugusių kirmėlių gaištamumas po trijų poveikio savaičių ir išsamus jauniklių aprašas nustatomojo bandymo pabaigoje. — Bet kokie pastebėti fiziniai ar patologiniai simptomai ir bandomųjų organizmų elgesio pokyčiai. — Poveikio reprodukcijai LC50, NOEC ir (arba) ECx (pvz., EC50, EC10), jeigu nustatytos kurios nors iš šių verčių, kartu su pasikliautinaisiais intervalais, ir grafikas su pritaikytu modeliu, naudotu joms apskaičiuoti, taip pat visa informacija bei pastabos, galinčios padėti aiškinti gautus rezultatus. Ataskaitoje taip pat turėtų būti aprašyti bet kokie nukrypimai nuo nustatytų pagal šį bandymo metodą atliekamų procedūrų ir bet kokie per bandymą pastebėti nenumatyti reiškiniai. NUORODOS (1) Römbke, J. (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen – Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. and Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 pp. (3) Westheide, W. and Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Ed. by Esser, G. and Overdieck, D. pp 497-508. Elsevier, Amsterdam, (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. and Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. (5) Šio priedo C.8 skyrius. Toksiškumas sliekams. (6) ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. (7) ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. (8) Rundgren, S. and A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H. and C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. (10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. (11) Dunger, W. and Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen – Prüfungskategorien der Forschung. UWSF – Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. (14) Römbke, J. and Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. (15) Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. (16) ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality – Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. (17) Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. (18) Nielsen, C.O. and Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. (19) Bouguenec, V. and Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. (20) Korinkova, J. and Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. (21) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), pp. 19-76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. – Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M.A., R.C. Russo and R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correction Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. (24) Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. (25) Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. (26) Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. (27) Dunnett, C.W., (1964) New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. (28) Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361 (29) Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. (30) Jonckheere, A. R. (1954); A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives, Biometrika 41, 133-145. (31) Terpstra, T. J. (1952); The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking, In