1988 m. lapkričio 18 d. Komisijos direktyva, devintąjį kartą su technikos pažanga derinanti Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo



Oficialusis leidinys L 133 , 30/05/1988 p. 0001 - 0127

specialusis leidimas suomių kalba: skyrius 15 tomas 14 p. 0003

specialusis leidimas švedų kalba: skyrius 15 tomas 14 p. 0003

CS.ES skyrius 13 tomas 009 p. 90 - 216

ET.ES skyrius 13 tomas 009 p. 90 - 216

HU.ES skyrius 13 tomas 009 p. 90 - 216

LT.ES skyrius 13 tomas 009 p. 90 - 216

LV.ES skyrius 13 tomas 009 p. 90 - 216

MT.ES skyrius 13 tomas 009 p. 90 - 216

PL.ES skyrius 13 tomas 009 p. 90 - 216

SK.ES skyrius 13 tomas 009 p. 90 - 216

SL.ES skyrius 13 tomas 009 p. 90 - 216



Komisijos direktyva 1988 m. lapkričio 18 d. devintąjį kartą su technikos pažanga derinanti Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo (88/302/EEB) EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, atsižvelgdama į Europos ekonominės bendrijos steigimo sutartį, atsižvelgdama į 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo [1] su pakeitimais, padarytais šeštąjį kartą Direktyva 79/831/EEB [2], ypač į jos 19 straipsnį, kadangi Direktyvos 67/548/EEB 3 straipsnio 1 dalyje numatyta, kad medžiagų ir preparatų fizikinės bei cheminės savybės, toksiškumas bei ekotoksiškumas nustatomi V priede nurodytais metodais; kadangi Direktyvos 67/548/EEB 3 straipsnio 2 dalyje numatyta, kad medžiagos arba preparato keliamas tikrasis arba galimas pavojus aplinkai įvertinamas pagal VII ir VIII prieduose išdėstytus rodiklius; kadangi Komisijos Direktyva 84/449/EEB [3] priimtos redakcijos V priede šiuo metu yra išdėstyti tik tie bandymų metodai, kurie atitinka VII priede smulkiai išdėstytus rodiklius, todėl reikėtų apibrėžti bandymų metodus, atitinkančius VIII priede smulkiai išdėstytus rodiklius; kadangi šios direktyvos nuostatos atitinka Direktyvų dėl techninių kliūčių panaikinimo pavojingų medžiagų ir preparatų prekybos srityje derinimo su technikos pažanga komiteto nuomonę, PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ: 1 straipsnis Šios direktyvos priedo tekstas įrašomas į Direktyvos 67/548/EEB V priedą. 2 straipsnis Iki 1988 m. gruodžio 31 d. valstybės narės priima ir paskelbia priemones, būtinas, kad būtų laikomasi šios direktyvos, ir apie tai nedelsdamos praneša Komisijai. Šias priemones jos pradeda taikyti ne vėliau kaip nuo 1989 m. birželio 30 d. 3 straipsnis Ši direktyva skirta valstybėms narėms. Priimta Briuselyje, 1987 m. lapkričio 18 d. Komisijos vardu Stanley clinton davis Komisijos narys [1] OL 196, 1967 8 16, p. 1/67. [2] OL L 259, 1979 10 15, p. 10. [3] OL L 251, 1984 9 19, p. 1. -------------------------------------------------- PRIEDAS Šiame priede aprašyti bandymų metodai yra skirti kai kurioms Tarybos direktyvos 79/831/EEB VIII išvardytoms toksikologinėms ir ekotoksikologinėms savybėms nustatyti. Pateikiami VIII priedo 1 bei 2 lygiams tinkantys bandymų metodai, tačiau šie bandymai neskirstomi pagal skirtingų lygių funkcijas. TURINYS | Puslapis | B DALIS. Toksiškumo nustatymo metodai … | 93 | Bendrasis įvadas: B dalis … | 93 | Pusiau chroninis oralinio toksiškumo tyrimas. 90 dienų trunkantis kartotinės dozės davimo graužikams per os tyrimas … | 97 | Pusiau chroninis oralinio toksiškumo tyrimas. 90 dienų trunkantis kartotinės dozės davimo ne graužikams per os tyrimas … | 101 | Pusiau chroninis oralinio toksiškumo tyrimas. 90 dienų trunkantis kartotinės dozės davimo graužikams per odą tyrimas … | 105 | Pusiau chroninis įkvėpimo toksiškumo tyrimas. 90 dienų trunkantis kartotinės įkvepiamos dozės tyrimas graužikų rūšyse … | 109 | Teratogeniškumo tyrimas – graužikai ir negraužikai … | 113 | Chroninis toksiškumo testas … | 116 | Karcinogeniškumo testas … | 121 | Kombinuotas chroninio toksiškumo/karcinogeniškumo testas … | 126 | Vienos kartos dauginimosi toksiškumo testas … | 132 | Dviejų kartų dauginimosi toksiškumo testas … | 136 | Toksikokinetika … | 140 | Mutageniškumo tyrimas ir atranka pagal karcinogeniškumą: … | 144 | —Genų mutacijos – Saccaromyces cerevisiae… | 144 | —Mitozinė rekombinacija – Saccharomyces cerevisiae… | 147 | —Žinduolių ląstelių genų mutacijų tyrimas in vitro… | 150 | —DNR pažaidos ir jų reparacija – neplanuota DNR sintezė – žinduolių ląstelėse in vitro… | 153 | —Apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis tyrimas in vitro… | 157 | —Su lytimi susijęs recesyvinis letalus testas Drosophila melanogaster tarpe … | 160 | —Žinduolių ląstelių transformacijos testai in vitro… | 162 | —Graužikų dominantinis letalinis testas … | 165 | —Žinduolių embrioninės ląstelės citogenetinis tyrimas in vivo… | 168 | —Pelių taškinis testas … | 171 | —Pelių paveldėta translokacija … | 174 | C DALIS. Ekotoksiškumo nustatymo metodai … | 177 | Bendrasis įvadas. C dalis … | 177 | Dumblių inhibavimo bandymas … | 178 | Toksiškumo sliekams matavimas. Dirbtinio dirvožemio bandymas … | 184 | Biologinis skaidymas. Zahn-Wellens bandymas … | 188 | Biologinis skaidymas. Aktyviojo dumblo modeliavimo bandymas … | 195 | Biologinis skaidymas. Aktyviojo dumblo kvėpavimo inhibavimo bandymas … | 207 | Biologinis skaidymas. Modifikuotas SCAS bandymas … | 212 | B DALIS: TOKSIŠKUMO NUSTATYMO METODAI BENDRASIS ĮVADAS: B DALIS ILGALAIKIAI TYRIMAI Pusiau chroniniai, chroniniai ir ilgalaikiai tyrimai Tiriamosios medžiagos ir mišinio, kuriuo veikiama, apibūdinimas Prieš pradedant bet kokius toksiškumo tyrimus, reikėtų žinoti tiriamosios medžiagos sudėtį, įskaitant pagrindines priemaišas bei jos esmines fizines ir chemines savybes, įskaitant stabilumą. Tiriamosios medžiagos fizinės ir cheminės savybės pateikia svarbią informaciją, pagal kurią pasirenkamas medžiagos davimo būdas, suplanuojami pusiau chroniniai, chroniniai ir karcinogeniškumo tyrimai bei kuria remiantis, medžiaga naudojama ir saugoma. Informacija apie cheminę struktūrą ir fizines bei chemines savybes taipogi gali suteikti žinių bei nurodyti požymius, pagal kuriuos sprendžiama apie absorbcijos charakteristikas, naudojant pasirinktą davimo būdą ir apie metabolitines bei pasiskirstymo audiniuose galimybes. Taipogi gali būti pateikiama informacija apie anksčiau atliktų toksiškumo bei toksikokinetinių tyrimų metu nustatytus toksikokinetinius parametrus. Prieš pradedant tyrimą reikia sukurti analitinį metodą, skirtą tiriamosios medžiagos, esančios dozuojamoje terpėje bei biologinėje medžiagoje, kiekybinėms bei kokybinėms savybėms (įskaitant, jei įmanoma ir pagrindines priemaišas) nustatyti. Eksperimentiniai gyvūnai: rūšies ir kamieno pasirinkimas Kadangi yra svarbu gyvūnus veikti tiriamąja medžiaga didžiąją jų gyvenimo dalį, todėl tyrimuose turėtų būti naudojamos lengvai palaikomos ir trumpai gyvenančios gyvūnų rūšys. Labai pageidaujama, kad būtų žinoma apie spontaninių ligų bei navikų pasireiškimo laipsnį naudojamo kamieno gyvūnų, laikomų tomis pačiomis sąlygomis, tarpe. Kamienai turėtų būti detaliai apibūdinti ir neturėti jokių trukdančių įgimtų sutrikimų. Naudojant inbredinius kamienus, pirmosios palikuonių kartos (F1) hibridai yra pranašesni šiuo aspektu, tačiau jei yra pakankamai sukaupta anksčiau gautų duomenų apie autbredinius gyvūnų, gautų iš uždarų grupių, kamienus, tai tokie kamienai yra tinkami. Gyvūnų priežiūra, vandens ir pašaro tiekimas Gyvūnų tyrimai ir patikrinimai turėtų būti atliekami, atsižvelgiant į nacionalines nuostatas, o taipogi į humaniškumo principus bei pasiekimus gyvūnų gerovės srityje pasauliniu mastu. Tam, kad būtų gauti reikšmingi rezultatai, būtina griežtai kontroliuoti aplinkos sąlygas bei laikytis tinkamų gyvūnų priežiūros priemonių. Tokie faktoriai, kaip laikymo sąlygos, atsitiktinės ligos, gydymas vaistais, priemaišos pašaruose, vandenyje, ore ir kraike bei bendrosios patalpos, skirtos gyvūnų priežiūrai, gali labai įtakoti kartotinės dozės tyrimų išeigą. Apskritai, atliekant tyrimą, reikėtų žinoti apie cheminių sterilizuojančių medžiagų sukeliamus efektus. Pašaras tirėtų atitikti tiriamos rūšies gyvūnų šėrimui keliamus reikalavimus, be to jame neturėtų būti jokių priemaišų, galinčių turėti įtakos tyrimo metu gaunamiems rezultatams. Graužikai turėtų būti šeriami bei girdomi ad libitum, pašarą keičiant mažiausiai kas savaitę. Šiuo metu naudojami 3 šėrimo būdai: šėrimas įprastiniais, sintetiniais bei įvairiausios cheminės sudėties pašarais. Nekreipiant dėmesio į tai, koks šėrimo būdas buvo pasirinktas, tiekėjai periodiškai privalo įsitikinti, nustatinėdami pagrindinio pašaro mitybinę vertę bei užteršimo lygį bei pateikti šią informaciją laboratorijai apie kiekvieną pašaro partiją. Ypač pageidaujama, kad būtų žinoma šėrimo režimo įtaka metabolizmui, navikų vystymuisi bei gyvūnų amžiaus trukmei. Be to,, tiriančioji laboratorija galėtų atlikti tiek pašaro sudedamųjų komponentų, tiek ir nenumatytų teršalų, įskaitant karcinogenus, patikrą. Jeigu šitai yra padaryta, tai analizių rezultatai yra išsaugojami ir pateikiami galutiniame pranešime apie tiriamąją medžiagą. Įprastinės pašarų sudedamosios dalys, kurios, kaip yra žinoma, įtakoja karcinogenezę (pvz., antioksidantai, neprisotintos riebiosios rūgštys, selenas), neturėtų viršyti nustatytų koncentracijų. Atliekant karcinogeniškumo tyrimus, reikia ypač atkreipti dėmesį į keleto įprastinių pašarų teršalų galimą poveikį, pašaruose esant pesticidų liekanoms, organochlorino junginiams, policikliniams aromatiniams angliavandeniliams, estrogenams, sunkiesiems metalams, nitrozaminams ir mikotoksinams. Jei tiriamoji medžiaga duodama su pašaru ir vandeniu, tai būtina atlikti stabilumo tyrimus. Tinkamai vykdomi stabilumo ir homogeniškumo tyrimai turėtų būti panaudoti nustatant kaip dažnai reikia ruošti pašarą bei atlikti reikalingą priežiūrą. Kai pašarai yra sterilizuojami, tai reikia žinoti apie tokių veiksmų įtaką tiriamajai medžiagai bei pašaro sudedamosioms dalims. Reikia atlikti bet kokius būtinus koregavimus. Atlikdami kancerogeniškumo tyrimus, tyrėjai turi būti informuoti apie galimus teršalus, esančius naudojamame vandenyje. Turi būti galimybė gauti informaciją apie vandenį, naudojamą žmonių reikmėms apskritai. Gyvūnams augant, pašare esančios tiriamosios medžiagos koncentracija sureguliuojama taip, kad pastoviai būtų įsisavinamas palyginus vienodas tiriamosios medžiagos kiekis kūno masės atžvilgiu. Tiriamojo ir kontrolinio pašarų mitybinės vertės turi kaip galima labiau atitikti viena kitą. Todėl reikia apsvarstyti tiriamosios medžiagos, sumaišytos su pašaru, mitybinę vertę. Patirtis rodo, kad pašaruose esančių iki 5 % ne mitybai skirtų tiriamųjų medžiagų neturi didesnės įtakos pašaro mitybinei vertei. 1. Įkvėpimo tyrimai Joks ribų paieškos tyrimas nėra nurodomas, kadangi buvo nustatyta, jog neįmanoma nustatyti pavienio įkvėpimo ekspozicijos ribinės vertės. 2. Teratogeniškumo tyrimas Tyrimo metodas pirmiausia skirtas medžiagos davimui per os. Medžiagą galima duoti ir kitais būdais, priklausomai nuo tiriamosios medžiagos fizinių savybių bei nuo žmonių ekspozicijos su tiriamąja medžiaga būdo. Tokiais atvejais, tyrimo metodas turėtų būti tinkamai pritaikomas, atsižvelgiant į atitinkamus metodų, trunkančių 28 dienas, elementus. 3. Toksikokinetika Toksikokinetiniai tyrimai padeda aiškinti bei vertinti duomenis, gautus toksiškumo tyrimo metu. Šie tyrimai yra skirti įvertinti konkrečius tiriamosios cheminės medžiagos toksiškumo aspektus ir gauti rezultatai gali padėti planuojant vėlesnius toksiškumo tyrimus. Nėra numatyta, kad visus parametrus reikia nustatinėti kiekvienu atveju. Tiktai retais atvejais reikia atlikti visą eilę toksikokinetinių (absorbcijos, ekskrecijos, pasiskirstymo bei metabolizmo) tyrimų. Konkrečių junginių atveju gali būti rekomenduojama pakeisti šią tyrimų eilę arba pakanka atlikti pavienės dozės tyrimą. Apibrėžimai Toksikokinetika: | tiriamųjų medžiagų absorbcijos, pasiskirstymo, metabolizmo ir ekskrecijos tyrimas; | Absorbcija: | procesas (-ai), kurio (-ių) pagalba duota medžiaga patenka į organizmą; | Ekskrecija: | procesas (-ai), kurio (-ių) pagalba duota medžiaga ir (ar) jos skilimo produktai pasišalina iš organizmo; | Pasiskirstymas: | procesas (-ai), kurio (-ių) pagalba absorbuota medžiaga ir (ar) jos skilimo produktai pasiskirsto organizme; | Metabolizmas: | procesas (-ai), kurio (-ių) pagalba organizme esančių duotų medžiagų struktūra pakinta dėl fermentinių ar nefermentinių reakcijų. | 4. Ūmus ir pusiau ūmus antrinių rūšių tyrimas Antrinių rūšių tyrimo tikslas papildyti išvadas gautas anksčiau atlikto tyrimo metu. Tiriant antrines rūšis, aukščiau aprašytas tyrimo metodas gali būti panaudotas arba pritaikytas mažesniam gyvūnų skaičiui tirti. 5. Vaisingumo tyrimai Jei reikia atlikti trečiosios kartos dauginimosi tyrimą, tai aprašytas metodas skirtas antrosios kartos dauginimuisi tirti gali būti išplėstas, kad apimtų ir trečiąją kartą. 6. Mutageniškumo tyrimas Papildomi mutageniškumo tyrimai įskaitant atrankos pagal kancerogeniškumą tyrimus Direktyvos VIII priede yra minimi papildomi tyrimai, siekiant detaliau ištirti mutageniškumą arba karcinogeniškumui iš anksto numatyti. Apskritai šiame skirsnyje minimi tyrimai galėtų būti naudojami bet kokiems aspektams tirti. Įvadas Atliekant pradinį medžiagos mutageninio aktyvumo įvertinimą, tiriamos bakterijų genų (taškinės) mutacijos bei citogenetiniai žinduolių ląstelių pažeidimai (in vitro ir in vivo); metodai, tinkami šiam "bazinio rinkinio" tyrimams atlikti buvo aprašyti anksčiau. Šiame skirsnyje aprašomi papildomi tyrimai, kurie tinka bazinio rinkinio tyrimų metu gautų rezultatų patvirtinimui bei praplėtimui atlikti ir kurie gali būti naudojami daugeliui tikslų pasiekti: 1) bazinio rinkinio tyrimų metu gautiems rezultatams patvirtinti; 2) bazinio rinkinio tyrimų metu nenustatytiems galutiniams parametrams tirti; 3) tyrimams in vivo pradėti ar išplėsti. Šiems tikslams pasiekti aprašytų tyrimų metu naudojamos eukariotų sistemos tiek in vitro, tiek ir vivo bei išplėstos galutinių parametrų ribos. Tyrimų metu gaunama informacija apie organizmų, sudėtingesnių nei bazinio rinkinio tyrimuose naudojamos bakterijos, taškines mutacijas bei pateikia papildomos informacijos apie medžiagos gebą sukelti chromosomines aberacijas. Taipogi aprašyti tyrimai, kurių metu skirtingai nei taškinės mutacijos ar chromosominės aberacijos nustatomi ir kiti galutiniai parametrai. Šie parametrai suteikia papildomos informacijos ir jei yra tinkami, gali būti naudojami planuojant tyrimus. Reikėtų laikytis principo: aptariant tolimesnių mutageniškumo tyrimų programą, ji turi būti sudaryta taip, kad būtų pateikta svarbi papildoma informacija apie medžiagos mutageninę ir (ar) karcinogeninę gebą. Šiuo metu atliekami tyrimai, kurie gali tikti konkrečiu atveju, priklausys nuo daugelio faktorių, tokių kaip medžiagos cheminių bei fizinių savybių, pradinių bandymų, kai buvo tiriamos bakterijos ir citogenetiniai pažeidimai, metu gautų rezultatų, medžiagos metabolizmo ypatumų, kitų toksiškumo tyrimų rezultatų ir žinomų medžiagos panaudojimo sričių. Griežta tyrimų parinkimo tvarka netinka dėl įvairių faktorių, kuriuos reikėtų apsvarstyti. Tačiau galima vadovautis keliais bendrais principais. Jei tyrimo, priklausančio baziniam rinkiniui, metu buvo gauti teigiami rezultatai, tai papildomų tyrimų metu reikia parinkti mažiausiai bent vieną tyrimą, kurio metu būtų galima nustatyti galutinius genetinius parametrus. Jei abiejų tyrimų, priklausančių baziniam rinkiniui, metu buvo gauti neigiami rezultatai, tai papildomų tyrimų laikotarpiu, kaip įprasta, reikėtų ištirti genų mutacijas bei chromosomų aberacijas. Taipogi galima gauti papildomus duomenis, atliekant toliau pateiktus indikatorinius bandymus. Toliau pateikiami tokių tyrimų metodai, sugrupuoti remiantis jų metu gaunamais esminiais galutiniais genetiniais parametrais. Genų (taškinių) mutacijų tyrimai Tam, kad toliau tirti medžiagos gebą sukelti taškines (genų) mutacijas, reikėtų panaudoti vieną arba kitą tyrimą, pateikiamą žemiau: a) tiesioginių arba grįžtamųjų mutacijų (reversijų) tyrimai, panaudojant eukariotinius mikroorganizmus (Saccharomyces cerevisiae); b) tiesioginių mutacijų žinduolių ląstelėse tyrimai in vitro; c) su Drosophila melanogaster lytimi sukibusio recesyvinio letalaus geno alelio analizė; d) somatinių ląstelių mutacijų analizė in vivo: pelių taškinių mutacijų tyrimas. Chromosominių aberacijų tyrimai Tam, kad būtų galima tirti medžiagos gebą sukelti chromosomines mutacijas, galima atlikti vieną ar kitą tyrimą: a) žinduolių citogenetiniai tyrimai in vivo; Reikėtų apsvarstyti kaulų čiulpų ląstelių metafazinių chromosomų analizę, jei ši nebuvo atliekama pradinio įvertinimo metu ("bazinio rinkinio tyrimuose"). Papildomai galima tirti embrioninių ląstelių citogenetinius aspektus; b) žinduolių ląstelių citogenetiniai tyrimai in vitro, jei šie nebuvo atliekami pradinio įvertinimo metu; c) graužikų dominantinių letalių genų alelių tyrimai; d) pelių paveldimų chromosomų translokacijų tyrimas. Indikatoriniai efektų DNR atžvilgiu tyrimai Galima taikyti metodus, kuriais nustatomi tam tikri efektai nesukeliantys mutacijų kaip "genetiniai parametrai" DNR atžvilgiu. Šių tyrimų metu galima gauti informaciją, papildančią gaunamą, tiriant mutageniškumą ir kuri gali būti naudinga aiškinant tokių tyrimų rezultatus. Kai yra būtina atlikti tokius tyrimus, tai galima pasirinkti tokius metodus, kurių metu naudojami eukariotiniai mikroorganizmai arba žinduolių ląstelės: a) Saccharomyces cerevisiae ląstelėse vykstančios mitozės rekombinacija; b) DNR pažeidimai ir jų reparacija – nenumatyta DNR sintezė – žinduolių ląstelės (in vitro); c) apsikeitimo seserinėmis chromatidėmis žinduolių ląstelėse tyrimas (in vitro). Kiti karcinogeninės gebos indikatoriniai tyrimai Galima atlikti žinduolių ląstelių transformacijos analizę, kurios metu įvertinama medžiagos geba sukelti morfologinius bei elgesio pokyčius ląstelių kultūroje, kurie, kaip manoma yra susiję su ląstelių piktybine transformacija in vivo. Galima panaudoti daug skirtingų ląstelių tipų bei kriterijų transformacijai įvertinti. Rizikos susijusios su paveldimais efektais žinduoliuose įvertinimas Paveldimi efektai visuose žinduoliuose atsiradę dėl genų (taškinių) mutacijų ar chromosomų aberacijų nustatomi, tiriant pelių specifinį lokusą (4) arba pelių paveldimą chromosomų translokaciją. Tokie metodai gali būti naudojami tada, kai įvertinama galima medžiagos poveikio žmogui genetinė rizika. Prieš pradedant šiuos tyrimus, dėl jų tyrimų sudėtingumo bei labai didelio būtino eksperimentinių gyvūnų skaičiaus, ypač reikalingo, tiriant specifinį lokusą, reikia pateikti labai įtikinamus argumentus šiems tyrimams pagrįsti [1]. PUSIAU CHRONINIS ORALINIO TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS DOZĖS DAVIMO GRAUŽIKAMS PER OS TYRIMAS 1. METODAS 1.1. Įvadas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.2. Apibrėžimai Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.3. Etaloninės medžiagos Nėra. 1.4. Tyrimo metodo principas Tiriamoji medžiaga duodama nustatytomis dozėmis keleto eksperimentinių grupių gyvūnams kiekvieną dieną per os, vieną dozę duodant vienos grupės gyvūnams 90 dienų. Duodant medžiagą, gyvūnai stebimi kiekvieną dieną tam, kad būtų nustatomi toksiškumo požymiai. Gyvūnai, kurie nugaišta tyrimo metu, skrodžiami, o atlikus tyrimą, skrodžiami visi kiti gyvūnai, likę gyvi. 1.5. Kokybės kriterijai Nėra. 1.6. Tyrimo metodo apibūdinimas Pasiruošimas tyrimui Prieš tyrimą gyvūnai yra laikomi mažiausiai 5 dienas eksperimentinėje fermoje, kur jie šeriami. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Tiriamoji medžiaga gali būti duodama su pašaru, per zondą, su kapsulėmis ar geriamuoju vandeniu. Visu eksperimento metu visiems gyvūnams medžiagos dozės duodamos tokiu pačiu būdu. Jei, siekiant palengvinti dozės davimą, naudojama įranga arba priedai, tai turi būti žinoma, kad jie nesukelia toksinių efektų. Galima panaudoti anksčiau atliktų eksperimentų duomenis, jei jie tinka. Tyrimo sąlygos Eksperimentiniai gyvūnai Išskyrus kontraindikacijas, labiausiai naudojama gyvūnų rūšis yra žiurkės. Reikėtų naudoti įprastinius jaunų sveikų gyvūnų laboratorinius kamienus ir geriausia pradėti duoti medžiagą dozėmis, kai bet kuriuo atveju žiurkės yra šešių ir ne daugiau kaip aštuonerių savaičių amžiaus. Naudojamų gyvūnų kūno masės nukrypimas tyrimo pradžioje neturėtų būti didesnis nei ± 20 % vidutinės kūno masės. Jei pusiau chroninis dozės, duodamos per os, tyrimas atliekamas taip pat kaip ir išankstinis ilgalaikis tyrimas, tai abiejų tyrimų metu naudojami tos pačios rūšies bei kamieno gyvūnai. Skaičius ir lytis Duodant medžiagą skirtinga doze, reikėtų naudoti mažiausiai 20 gyvūnų (10 patelių ir 10 patinėlių). Patelės turėtų būti dar negimdžiusios ir ne nėščios. Jeigu numatoma atlikti gyvūnų, esančių grupėje, numarinimą, tai tiriamų gyvūnų skaičius turi būti padidintas tiek, kiek gyvūnų planuojama numarinti prieš pasibaigiant tyrimui. Be to,, 90 dienų laikotarpiu papildomai 20 (po 10 kiekvienos lyties) gyvūnų grupei gali būti duodama ypatingai didelė tiriamosios medžiagos dozė tam, kad praėjus mėnesiui po veikimo būtų stebimas toksinių efektų grįžtamumas, išlikimo pastovumas bei pavėluotas pasireiškimas. Dozė Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios bei kontrolinė dozės. Išskyrus tą laikotarpį, kai tiriamoji medžiaga yra duodama, kontrolinės grupės gyvūnai turėtų būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip kontrolinės grupės individai. Jeigu dozavimui naudojamas įrenginys, tai kontrolinei grupei dozės šiuo įrenginiu turi būti duodamos tokiu pačiu būdu kaip ir tiriamosioms grupėms ir kontrolinė grupė turi gauti tą pačią įrenginiu duotą dozę, kurią gavo tiriamoji grupė, kuriai, panaudojus įrenginį, buvo duota didžiausia dozė. Davus didžiausią medžiagos dozę, turėtų pasireikšti toksiniai efektai, tačiau ši dozė neturi būti mirtina arba jei mirtina, tai tik keletas individų turi mirti. Mažiausia duota dozė neturėtų sukelti jokio toksiškumo. Ši dozė turėtų būti mažesnė nei toji, kuri vartojama praktiškai įvertinant poveikį žmogui. Geriausia būtų, kad vidutinė dozė sukeltų minimalaus toksiškumo požymius. Jeigu naudojama daugiau nei viena vidutinė dozė, tai dozės turi būti padalijamos taip, kad sukeltų toksiškumą palaipsniui. Kontrolinės grupės ir grupių, kurioms duodamos mažiausios bei vidutinės dozės, gyvūnų mirtingumas turėtų būti toks, kad būtų galima įvertinti rezultatų reikšmingumą. Kai tiriamoji medžiaga duodama su pašaru arba esant jos pastoviai koncentracijai pašare (ppm arba mg/pašaro kg) arba gali būti panaudota pastovi dozė gyvūno kūno masės atžvilgiu; jei tiriamoji medžiaga vartojama kitaip nei nurodyta čia, tai nurodomas jos vartojimo būdas. Medžiagos, duodamos per zondą, dozė turėtų būti duodama kiekvieną dieną keletą kartų panašiu metu. Duodama dozė turėtų būti taip nustatoma laiko intervalais (kiekvieną savaitę ar kas dvi savaites), kad būtų išlaikoma pastovi dozė gyvūno kūno masės atžvilgiu. Ribų tyrimas Jei pagal žemiau aprašytą metodą atliekamas 90 dienų trunkantis tyrimas, kai naudojant vieną dozę –– 1000 mg kūno masės kilogramui per dieną arba didesnę dozę, su kuria susiduria žmogus, ir jei žinoma, kad tokia dozė nesukelia toksinių efektų, tai tolimesnis tyrimas laikomas nebūtinu. Svarbu užtikrinti, kad nedidelį toksiškumą sukeliančių medžiagų, duodamų su pašaru, savybės bei kiekiai netrukdų normaliems mitybiniams komponentams. Stebėjimų laikotarpis Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną, ir toksiškumo požymiai registruojami, nurodant jų pasireiškimo pradžią, laipsnį ir trukmę. Reikėtų užregistruoti mirties laiką ir tą momentą, kai toksiškumo požymiai pasireiškia bei išnyksta. Procedūra Geriausia, kad tiriamosios medžiagos dozė gyvūnams būtų duodama septynis kartus per savaitę 90 dienų laikotarpiu. Bet kokios kitos pagalbinės grupės gyvūnai turi būti laikomi dar mėnesiui ir neduodant jiems medžiagos tam, kad būtų stebimas jų organizmo atsistatymas po toksinio poveikio arba toksinių efektų pasireiškimo pastovumas. Stebint narveliuose laikomus gyvūnus, reikia registruoti odos bei kailio, o taip pat akių ir gleivinių membranas bei kvėpavimo, apytakos, autonominės bei centrinės nervų sistemos pokyčius, somatomotorinį aktyvumą ir elgseną. Kiekvieną savaitę reikėtų įvertinti pašaro suvartojimą (ir vandens suvartojimą kai tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamu vandeniu) bei pasverti gyvūnus. Reikėtų kiek įmanoma pastoviau stebėti gyvūnus tam, kad būtų galima užtikrinti, jog šie nebūtų prarandami tyrimo metu dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audinių autolizė bei laikymo vietos praradimas. Baigiantis tyrimui, visi likę gyvi nepagalbinės grupės gyvūnai, nepaveikti tiriamąja medžiaga, skrodžiami. Nugaišę gyvūnai turėtų būti pašalinami ir, kai nurodoma, skrodžiami. Įprastiniu atveju visi gyvūnai, įskaitant ir kontrolinius individus yra tiriami šitaip: a) Prieš pradedant duoti tiriamąją medžiagą bei pasibaigus tyrimui, panaudojant oftalmoskopą ar jam ekvivalentišką tinkamą prietaisą, turėtų būti ištiriamos visų, bet pirmiausia gavusių didžiausią dozę ir priklausančių kontrolinei grupei, gyvūnų akys. Jeigu nustatomi pokyčiai akyse, reikėtų ištirti visus gyvūnus. b) Baigiantis tyrimui, reikėtų įvertinti tokius hematologinius rodiklius kaip hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų skaičius, absoliutus bei skirtingų populiacijų leukocitų skaičius bei, remiantis krešėjimo trukme, protrombino ir tromboplastino susidarymo trukme arba kraujo plokštelių (trombocitų) skaičiumi, nustatyti krešėjimo potencialą. c) Baigiantis tyrimui reikėtų atlikti kraujo biocheminius tyrimus. Atliekant šiuos tyrimus, reikėtų, jei laikoma reikalinga, nustatyti elektrolitų balansą, angliavandenių metabolizmą bei įvertinti kepenų ir inkstų veiklą. Parenkant specifinius tyrimus, reikėtų atsižvelgti į tiriamosios cheminės medžiagos veikimo būdo tyrimo metu gautus duomenis. Siūloma nustatyti kalcį, fosforą, chlorą, natrį, kalį, badavimo metu susidarančią gliukozę (atsižvelgiant į konkrečiai gyvūnų rūšiai galimą badavimo laikotarpį), serumo glutamato piruvato transaminazę [2], serumo glutamato oksalacetato transaminazę [3], ornitino dekarboksilazę, γ glutamino transpeptidazę, šlapale esantį azotą, albuminą, bendrą bilirubino, esančio kraujo kreatinine, kiekį bei atlikti serumo baltymų bendro kiekio nustatymą. Kitiems tyrimams, kurie gali būti reikalingi tam, kad būtų atliktas pakankamas toksikologinis įvertinimas, priklauso lipidų, hormonų rūgščių/šarmų balanso, methemoglobino ir cholinesterazės aktyvumo nustatymas. Papildomi biocheminiai tyrimai gali būti atliekami tuo atveju, kai būtina detaliau išnagrinėti nustatytus reiškinius. d) Nereikalaujama, kad šlapimo analizė būtų atliekama pagal nusistovėjusią tvarką, išskyrus tuos atvejus, kai remiantis duomenimis, numatomas arba nustatomas toksiškumas. Jeigu anksčiau atliktų pagrindinių tyrimų duomenys laikomi nepakankamais, tai prieš pradedant duoti dozes reikia apsvarstyti hematologinių ir klinikinių biocheminių parametrų nustatymą. Pagrindinis skrodimas Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, kurio metu tiriamas kūno išorinis paviršius, visos angos, kiaušo, krūtinės ir pilvo ertmės bei jų turinys. Po skrodimo kuo skubiau pasveriamos kepenys, inkstai, antinksčiai ir kiaušinėliai tam, kad būtų išvengta jų džiūties. Vėlesniems histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi tokie audiniai ir organai, laikomi tinkamoje terpėje: visi esminiai pažeidimai, smegenys – įskaitant pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūvius, smegenėlių ir smegenų žievę, hipofizė, tiroidinė/paratiroidinė liauka, bet koks užkrūčio liaukos audinys, trachėja ir plaučiai, širdis, aorta, (seilių liaukos), kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, kasa, lytinės liaukos, gimda (pagalbiniai lytiniai organai), (oda), stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, šlapimo pūslė, pagrindinis (didysis) limfmazgis, (moterų pieno liauka), (šlaunies raumenynas), periferinis nervas, krūtinkaulis su kaulų čiulpais, (akys), (šlaunikaulis, įskaitant ir segmentinį paviršių), (stuburo smegenys trimis lygiais – sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), ir (eksorbitalinės ašarų liaukos). Audinius, paminėtus skliausteliuose, reikia tirti tik tada, kai nustatomas toksiškumas arba tiriamas medžiagos poveikis į organą-taikinį. Histopatologinis tyrimas a) Reikėtų visapusiškai histopatologiškai ištirti kontrolinės grupės ir tos grupės, kuriai duodama didelė medžiagos dozė, gyvūnus. b) Reikėtų ištirti visus esminius pažeidimus. c) Reikėtų ištirti grupių, kurioms duodamos kitos medžiagos dozės, gyvūnų organus-taikinius. d) Reikėtų histopatologiškai ištirti grupės, kuriai buvo duodama nedidelė ir vidutinė medžiagos dozė, gyvūnų plaučius, kad nustatyti infekciją, kadangi šis tyrimas tinka įvertinti gyvūnų sveikatą. Reikėtų taipogi apsvarstyti šių grupių gyvūnų kepenų bei inkstų histopatologinę analizę. Nėra reikalaujama, kad pagal nusistovėjusią tvarką šių grupių gyvūnai būtų toliau histopatologiškai tiriami, tačiau, kai gyvūnų, priklausančių grupei, kuriai buvo duota didelė medžiagos dozė, organizme nustatomi pažeidimai, tai gyvūnų organai 'turėtų būti visada ištirti. e) Kai naudojama pagalbinė grupė, tai reikėtų atlikti tų audinių ir organų histopatologinę analizę, kuriuose buvo nustatyti reiškiniai ir kurie gauti iš gyvūnų, paveiktų tiriamąja chemine medžiaga. 2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose pasireiškė sutrikimai, skaičius bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo sutrikimai, skaičius, išreikštas procentais. Rezultatai turėtų būti vertinami atitinkamu statistiniu metodu. Galima panaudoti bet kokį visuotinai pripažintą statistinį metodą. 3. ATASKAITA 3.1. Tyrimo ataskaita Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija: - rūšis, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras, - tyrimo sąlygos, - dozės lygiai (įskaitant įrangą, jei ši buvo panaudota) ir koncentracijos, - duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę, - jei įmanoma, dozės lygis, kuriam esant jokių efektų nebuvo pastebėta, - mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo, - toksinių ir kitų efektų apibūdinimas, - kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių stebėjimo laikas, - duomenys apie pašarą bei kūno masę, - oftalmologinių stebėjimų rezultatai, - naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai, - naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) duomenys, - skrodimo metu gauti duomenys, - histopatologinių tyrimų metu gautų visų duomenų detalus apibūdinimas, - rezultatų statistinė analizė, jei įmanoma tai padaryti, - rezultatų aptarimas, - rezultatų aiškinimas. 3.2 Įvertinimas ir aiškinimas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį. PUSIAU CHRONINIS ORALINIO TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS DOZĖS DAVIMO NE GRAUŽIKAMS PER OS TYRIMAS 1. METODAS 1.1. Įvadas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.2. Apibrėžimai Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.3. Etaloninės medžiagos Nėra. 1.4. Tyrimo metodo principas Tiriamoji medžiaga duodama nustatytomis dozėmis keleto eksperimentinių grupių gyvūnams (ne graužikams) kiekvieną dieną per os, vieną dozę duodant vienos grupės gyvūnams 90 dienų. Duodant medžiagą, gyvūnai stebimi kiekvieną dieną tam, kad būtų nustatomi toksiškumo požymiai. Gyvūnai, kurie miršta tyrimo metu, yra skrodžiami, o likę gyvi gyvūnai skrodžiami tyrimo pabaigoje. 1.5. Kokybės kriterijai Nėra. 1.6. Tyrimo metodo apibūdinimas Pasiruošimas tyrimui Prieš tyrimą gyvūnai yra laikomi mažiausiai 5 dienas eksperimentinėje fermoje, kur jie šeriami. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Tiriamoji medžiaga gali būti duodama su pašaru, per zondą, arba geriau su kapsulėmis. Galima naudoti ir kitus per os davimo būdus. Eksperimento metu medžiagos dozės visiems gyvūnams duodamos tokiu pačiu būdu. Jei, siekiant palengvinti dozės davimą, naudojama įranga arba priedai, tai turi būti žinoma, kad jie nesukelia toksinių efektų. Galima panaudoti anksčiau atliktų eksperimentų duomenis, jei jie tinka. Tyrimo sąlygos Eksperimentiniai gyvūnai Dažniausiai naudojama ne graužikų rūšis yra konkrečios veislės šuo. Gali būti naudojami ir kitos ne graužikų rūšys. Reikėtų naudoti jaunus sveikus gyvūnus ir šunims geriausia pradėti duoti medžiagą dozėmis, kai jie yra 4–6 mėnesių ir ne daugiau kaip 9 mėnesių amžiaus. Jei pusiau chroninis dozės, duodamos per os, tyrimas atliekamas taip pat kaip ir išankstinis ilgalaikis tyrimas, tai abiejų tyrimų metu turėtų būti naudojami tos pačios rūšies bei kamieno gyvūnai. Skaičius ir lytis Duodant medžiagą skirtinga doze, reikėtų naudoti mažiausiai 8 gyvūnus (4 pateles ir 4 patinėlius). Tyrimo pabaigoje gyvūnų skaičius turi būti pakankamas, kad būtų galima atlikti svarbų toksinių reiškinių įvertinimą. Dozė Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios bei viena kontrolinė dozės. Išskyrus tą laikotarpį, kai duodama tiriamoji medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turėtų būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip kontrolinės grupės individai. Davus didžiausią medžiagos dozę, turėtų pasireikšti toksiniai efektai, tačiau ši dozė neturi būti mirtina. Mažiausia duota dozė neturėtų sukelti jokio toksiškumo. Ši dozė turėtų būti mažesnė nei toji, kuri vartojama praktiškai įvertinant poveikį žmogui. Geriausia, kad tarpinė dozė sukeltų minimalaus toksiškumo požymius. Jeigu naudojama daugiau nei viena tarpinė dozė, tai dozės turi būti padalijamos taip, kad sukeltų toksiškumą palaipsniui. Kontrolinėje bei tiriamosiose grupėse, kurioms duodamos mažiausios ir vidutinės dozės, neturi pasitaikyti mirties atvejų. Svarbu užtikrinti, kad kai su pašaru yra duodamos mažo toksiškumo medžiagos, tiriamosios medžiagos kiekiai nepakenktų įprastinei mitybai. Kai tiriamoji medžiaga duodama su pašaru arba esant jos pastoviai koncentracijai pašare (ppm arba mg/pašaro kg) arba gali būti panaudota pastovi dozė gyvūno kūno masės atžvilgiu; jei tiriamoji medžiaga vartojama kitaip nei nurodyta čia, tai nurodomas jos vartojimo būdas. Kai dozė duodama tiesiogiai, pvz., su kapsule, tai jinai turėtų būti duodama kiekvieną dieną keletą kartų panašiu metu ir nustatoma laiko intervalais taip (kiekvieną savaitę ar kas dvi savaites), kad būtų išlaikoma pastovi dozė gyvūno kūno masės atžvilgiu. Tuo atveju, kai iš pradžių atliekamas pusiau chroninis tyrimas, o vėliau ilgalaikis tyrimas, tai abiejų tyrimų metu turėtų būti paprastai naudojamas tas pats pašaras. Ribų tyrimas Jei pagal žemiau aprašytą metodą atliekamas 90 dienų trunkantis tyrimas, kai naudojant vieną dozę – 1000 mg kūno masės kilogramui per dieną arba didesnę dozę, su kuria susiduria žmogus ir jei žinoma, kad tokia dozė nesukelia toksinių efektų, tai tolimesnis tyrimas laikomas nebūtinu. Svarbu užtikrinti, kad nedidelį toksiškumą sukeliančios medžiagos, kai jos duodamos su pašaru, tai tiriamosios medžiagos esamos savybės bei kiekiai netrukdo normaliems mitybiniams komponentams. Stebėjimų laikotarpis Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną ir registruojami toksiškumo požymiai, nurodant jų pasireiškimo pradžią, laipsnį ir trukmę. Reikėtų užregistruoti mirties laiką ir tą momentą, kai toksiškumo požymiai pasireiškia bei išnyksta. Procedūra Geriausia, kad gyvūnams duodama tiriamosios medžiagos dozė septynis kartus per savaitę 90 dienų laikotarpiu. Tačiau, pirmiausia remiantis praktiniais sumetimais, kai medžiaga yra duodama kitaip nei su pašaru, tai priimtina, kad ji būtų duodama dozėmis penkiskart per savaitę. Stebint nereikia apsiriboti vien tik odos bei kailio, o taip pat akių ir gleivinių membranas bei kvėpavimo, apytakos, autonominės bei centrinės nervų sistemos pokyčių bei somatomotorinio aktyvumo ir elgsenos registravimu. Kiekvieną savaitę reikėtų įvertinti pašaro suvartojimą (ir vandens suvartojimą kai tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamu vandeniu) bei pasverti gyvūnus. Reikėtų kiekvieną dieną detaliai tirti gyvūnus klinikiniu aspektu bei imtis atitinkamų priemonių, kad būtų galima sumažinti gyvūnų mirtingumą tyrimo metu. Baigiantis tyrimui, visi likę gyvi nepagalbinės grupės gyvūnai, nepaveikti tiriamąja medžiaga, skrodžiami. Nugaišę gyvūnai turėtų būti pašalinami ir, kai nurodoma, skrodžiami. Įprastiniu atveju visi gyvūnai, įskaitant ir kontrolinius individus yra tiriami šitaip: a) Prieš pradedant duoti tiriamąją medžiagą bei pasibaigus tyrimui, panaudojant oftalmoskopą ar jam ekvivalentišką tinkamą prietaisą, turėtų būti ištiriamos visų, bet pirmiausia gavusių didžiausią dozę ir priklausančių kontrolinei grupei, gyvūnų akys. Jeigu nustatomi pokyčiai akyse, reikėtų ištirti visus gyvūnus. b) Prieš prasidedant tyrimui, vėliau kas mėnesį arba tyrimo viduryje ir galiausiai tyrimo pabaigoje reikėtų įvertinti tokius hematologinius rodiklius kaip hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų skaičius, absoliutus bei skirtingų populiacijų leukocitų skaičius bei, remiantis krešėjimo trukme, protrombino ir tromboplastino susidarymo trukme arba kraujo plokštelių (trombocitų) skaičiumi, nustatyti krešėjimo potencialą. c) Prieš prasidedant tyrimui, vėliau kas mėnesį arba tyrimo viduryje ir galiausiai tyrimo pabaigoje reikėtų atlikti kraujo biocheminius tyrimus. Atliekant šiuos tyrimus, jei būtina, reikėtų nustatyti elektrolitų balansą, angliavandenių metabolizmą bei įvertinti kepenų ir inkstų veiklą. Parenkant specifinius tyrimus, reikėtų atsižvelgti į tiriamosios cheminės medžiagos veikimo būdo tyrimo metu gautus duomenis. Siūloma nustatyti kalcį fosforą, chlorą, natrį, kalį, badavimo metu susidarančią gliukozę (atsižvelgiant į konkrečiai gyvūnų rūšiai/veislei galimą badavimo laikotarpį), serumo glutamato piruvato transaminazę [4], serumo glutamato oksalacetato transaminazę [5], ornitino dekarboksilazę, γ glutamilo transpeptidazę, šlapale esantį azotą, albuminą, bendrą bilirubino, esančio kraujo kreatinine, kiekį bei atlikti serumo baltymų bendro kiekio nustatymą. Kitiems tyrimams, kurie gali būti reikalingi tam, kad būtų atliktas pakankamas toksikologinis įvertinimas, priklauso lipidų, hormonų rūgščių/šarmų balanso, methemoglobino ir cholinesterazės aktyvumo nustatymas. Papildomi biocheminiai tyrimai gali būti atliekami tuo atveju, kai būtina detaliau išnagrinėti nustatytus reiškinius. Prieš imant kraujo mėginius iš ne graužikų, šie turėtų badauti kurį laiką (ne ilgiau kaip 24 valandas). d) Nėra reikalaujama, kad pagal nusistovėjusią tvarką būtų atliekama šlapimo analizė, išskyrus tuos atvejus, kai remiantis duomenimis, numatomas arba nustatomas toksiškumas. Pagrindinis skrodimas Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, kurio metu tiriamas kūno išorinis paviršius, visos angos, kiaušo, krūtinės ir pilvo ertmės bei jų turinys. Po skrodimo kuo skubiau pasveriamos kepenys, inkstai, antinksčiai, tiroidinė liauka (kartu su paratireoidiniais dariniais) ir kiaušinėliai tam, kad būtų išvengta jų džiūties. Vėlesniems histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi tokie audiniai ir organai, laikomi tinkamoje terpėje: visi esminiai pažeidimai, smegenys – įskaitant pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūvius, smegenėlių ir smegenų žievę, hipofizė, tiroidinė/paratiroidinė liauka, bet koks užkrūčio liaukos audinys, (trachėja), plaučiai, širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, kasa, lytinės liaukos, gimda (pagalbiniai lytiniai organai), (oda), tulžies pūslė, stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, šlapimo pūslė, pagrindinis (didysis) limfmazgis, (moterų pieno liauka), (šlaunies raumenynas), periferinis nervas, krūtinkaulis su kaulų čiulpais, (akys), (šlaunikaulis, įskaitant ir segmentinį paviršių), (stuburo smegenys trimis lygiais – sprando, krūtinės ląstos ir juosmens). Audinius, paminėtus skliausteliuose, reikia tirti tik tada, kai nustatomas toksiškumas arba tiriamas medžiagos poveikis į organą-taikinį. Histopatologinis tyrimas Reikėtų visapusiškai histopatologiškai ištirti kontrolinės grupės ir tos grupės, kuriai duodama didelė medžiagos dozė, gyvūnus. Tolimesnis grupių, kurioms duodamos kitos dozės, tolimesnis histopatologinis tyrimas turėtų būti atliekamas, panaudojant organus, kuriuose pastebėti pažeidimai, davus didžiausią dozę arba tuos organus, kuriuos reikėtų tirti, remiantis klinikiniais stebėjimais. 2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose pasireiškė sutrikimai, skaičius, pažeidimų tipai bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo sutrikimai, skaičius, išreikštas procentais. Rezultatai turėtų būti vertinami atitinkamu statistiniu metodu. Galima panaudoti bet kokį visuotinai pripažintą statistinį metodą. 3. ATASKAITA 3.1. Tyrimo ataskaita Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija: - rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras, - tyrimo sąlygos, - dozės lygiai (įskaitant prietaisą, jei šis buvo naudotas) ir koncentracijos, - duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę, - jei įmanoma, dozės lygis, kuriam esant jokių efektų nebuvo pastebėta, - mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo, - toksinių ir kitų efektų apibūdinimas (ypač atkreipiant dėmesį į klinikinių tyrimų duomenis), - kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių stebėjimo laikas, - duomenys apie pašarą bei kūno masę, - oftalmologinių stebėjimų rezultatai, - naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai; - naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) duomenys, - skrodimo metu gauti duomenys, - histopatologinių tyrimų metu gautų visų duomenų detalus apibūdinimas, - rezultatų statistinė analizė, jei įmanoma tai padaryti, - rezultatų aptarimas, - rezultatų aiškinimas. 3.2 Įvertinimas ir aiškinimas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį. PUSIAU CHRONINIS ODOS TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS DOZĖS DAVIMO GRAUŽIKAMS PER ODĄ TYRIMAS 1. METODAS 1.1. Įvadas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.2. Apibrėžimai Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.3. Etaloninės medžiagos Nėra. 1.4. Tyrimo metodo principas Tiriamoji medžiaga uždedama nustatytomis dozėmis ant keleto eksperimentinių grupių gyvūnų odos paviršiaus, vieną dozę duodant vienos grupės gyvūnams 90 dienų. Uždedant medžiagą, gyvūnai stebimi kiekvieną dieną tam, kad būtų nustatomi toksiškumo požymiai. Gyvūnai, kurie miršta tyrimo metu, yra skrodžiami, o likę gyvi gyvūnai skrodžiami tyrimo pabaigoje. 1.5. Kokybės kriterijai Nėra. 1.6. Tyrimo metodo apibūdinimas Pasiruošimas tyrimui Prieš tyrimą gyvūnai mažiausiai 5 dienas yra laikomi ir šeriami eksperimentinėje fermoje. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Visai prieš pat tyrimą nuo tiriamųjų gyvūnų nugaros nukerpamas kailis. Kailį galima ir nuskusti, tačiau tai reikėtų atlikti likus vienai parai iki tyrimo pradžios. Paprastai kartotinis nukirpimas ar nuskutimas atliekamas kas savaitę. Kai kailis kerpamas arba skutamas, reikia stengtis nenubrūžinti odos. Uždedant tiriamąją medžiagą reikia stengtis, kad būtų nuvalyta ne mažiau kaip 10 % viso kūno paviršiaus. Sprendžiant, kuri kūno paviršiaus dalis bus nuvalyta ir kiek bus uždedama tiriamosios medžiagos, reikia atsižvelgti į gyvūno kūno masę. Tiriant kietąsias medžiagas, jei reikia, jos gali būti sutrinamos į miltelius, tiriamąją medžiagą reikėtų pakankamai sudrėkinti vandeniu arba, jei būtina, panaudoti tinkamą įrenginį tam, kad būtų galima užtikrinti gerą tiriamosios medžiagos ir odos sąlytį. Skystosios tiriamosios medžiagos paprastai vartojamos nepraskiestos. Medžiagos paprastai uždedamos 5–7 dienas per savaitę. Tyrimo sąlygos Eksperimentiniai gyvūnai Gali būti naudojama suaugusi žiurkė, triušis ar jūrų kiaulytė. Gali būti naudojamos ir kitos rūšys, tačiau reikia apsvarstyti jų panaudojimą. Tyrimo pradžioje kūno masės variacijos ribos turėtų siekti ± 20 % kūno masės vidurkio. Jei prieš ilgalaikį tyrimą yra atliekamas pusiau chroninis odos tyrimas, tai abiejų tyrimų metu reikėtų naudoti tos pačios rūšies ar kamieno gyvūnus. Skaičius ir lytis Duodant medžiagą skirtinga doze, reikėtų naudoti mažiausiai 20 gyvūnų (10 patelių ir 10 patinėlių), turinčių sveiką odą. Patelės turi būti negimdžiusios ir ne nėščios. Jei numarinimai numatomi iš anksto, tai tiriamų gyvūnų skaičius padidinamas padidinant gyvūnų, kuriuos numatoma numarinti prieš užbaigiant tyrimą, skaičių. Be to, 90 dienų bėgyje papildoma 20 gyvūnų (po 10 kiekvienos lyties) grupė veikiama didele medžiagos doze ir praėjus mėnesiui po veikimo, stebimas toksinių efektų grįžtamumas, nepertraukiamumas ar sulėtintas pasireiškimas. Dozė Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios dozės naudojant kontrolinę dozę arba kontrolinį prietaisą, jei toks yra naudojamas. Dozės poveikis turėtų išlikti mažiausiai 6 valandas per dieną. Tiriamoji medžiaga turėtų būti duodama kiekvieną dieną tuo pačiu metu ir medžiaga, kuria veikiama, turi būti duodama tokiu kiekiu su pertraukomis (kas savaitę ar kas dvi savaites), kad būtų palaikoma ta pati medžiagos dozė gyvūno kūno masės atžvilgiu. Išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turėtų būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamosios grupės individai. Jei prietaisas naudojamas dozavimui, tai medžiaga, duodama kontrolinės grupės gyvūnams, naudojant prietaisą, turi būti dozuojama tokiu pat būdu kaip ir medžiaga, duodama tiriamosios grupės gyvūnams bei turi būti gaunamas toks kiekis, koks buvo gautas, davus didžiausią medžiagos dozę tiriamajai grupei. Davus didžiausią medžiagos dozę, turėtų pasireikšti toksiniai efektai, tačiau ši dozė neturi būti mirtina arba gali sukelti tik pavienių gyvūnų mirtį. Mažiausia duota dozė neturėtų sukelti jokio toksiškumo. Ši dozė turėtų būti mažesnė nei toji, kuri vartojama praktiškai įvertinant poveikį žmogui. Geriausia, jog tarpinė dozė sukeltų minimalaus toksiškumo požymius. Jeigu naudojama daugiau nei viena tarpinė dozė, tai dozės turi būti padalijamos taip, kad sukeltų toksiškumą palaipsniui. Mirtingumo laipsnis mažos ir tarpinės dozės grupėse, o taipogi kontrolinėje grupėje turi būti žemas tam, kad būtų galima įvertinti rezultatų reikšmingumą. Jeigu tiriamoji medžiaga, kuria veikiama, ypač suerzina odą, tai reikėtų sumažinti jos koncentracijas ir šitai galbūt susilpnintų medžiagos, duodamos didele doze, sukeliamus toksinius efektus arba šie visai išnyktų. Jei oda buvo ypač pažeista, tai reikia tučtuojau nutraukti tyrimą ir pradėti naują, naudojant mažesnes tiriamosios medžiagos koncentracijas. Ribų tyrimas Jei atliekamas išankstinis tyrimas, naudojant 1000 mg kilogramui arba didesnę dozę, kuri, kaip nustatoma, nesukelia jokių toksinių efektų žmogui, tai laikomasi nuostatos, jog tolimesnis tyrimas nėra būtinas. Stebėjimų laikotarpis Tiriamieji gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną, registruojant toksiškumo požymius. Reikia nurodyti mirties bei toksiškumo požymių pasireiškimo ir išnykimo laiką. Procedūra Gyvūnai turėtų būti laikomi atskirai. Geriausiu atveju gyvūnai turėtų būti veikiami duodama tiriamąja medžiaga septynis kartus per savaitę 90 dienų laikotarpiu. Gyvūnai, esantys bet kurioje pagalbinėje grupėje ir skirti vėlesniems stebėjimams, turėtų būti laikomi dar mėnesį, neveikiant juos medžiaga tam, kad būtų galima jų atsistatymą po toksinių efektų poveikio ar pačių toksinių efektų pasireiškimo nepertraukiamumą. Veikimas medžiaga turėtų trukti šešias valandas per dieną. Tiriamoji medžiaga turėtų būti tvarkingai uždedama ant odos paviršiaus, sudarančio apie 10 % viso kūno paviršiaus ploto. Jei naudojamos ypač toksiškos medžiagos, tai odos paviršiaus, ant kurio uždedamos medžiagos, plotas gali būti mažesnis, tačiau reikėtų kaip galima daugiau šio ploto tvarkingai padengti plona ir tikslia kaip fotojuosta, plėvele. Veikimo metu tiriamoji medžiaga kontaktuoja su oda, padengus pastarąją poringa marle ar odos neerzinančia juostele. Vėliau tiriamoji odos vieta yra taip padengiama, kad išliktų poringa marlė bei tiriamoji medžiaga ir kad būtų užtikrinta, jog gyvūnai nepraris tiriamosios medžiagos. Tam, kad būtų išvengta prarijimo, galima naudoti ribojančias priemones, tačiau visiška imobilizacija nėra rekomenduojama. Veikimo pabaigoje nuo odos, ją plaunant vandeniu ar kokiu kitu atitinkamu valymo būdu turėtų būt pašalintas tiriamosios medžiagos likutis. Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną ir registruojami toksiškumo požymiai, įskaitant jų pasireiškimo pradžią, laipsnį bei trukmę. Stebint narveliuose laikomus gyvūnus, reikia registruoti odos bei kailio, o taip pat akių ir gleivinių membranas bei kvėpavimo, apytakos, autonominės bei centrinės nervų sistemos pokyčius, somatomotorinį aktyvumą ir elgseną. Kiekvieną savaitę reikėtų įvertinti pašaro suvartojimą (ir vandens suvartojimą kai tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamu vandeniu) bei pasverti gyvūnus. Reikėtų kiek įmanoma pastoviau stebėti gyvūnus tam, kad užtikrinti, jog šie nebūtų prarandami tyrimo metu dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audinių autolizė bei laikymo vietos praradimas. Baigiantis tyrimui, visi likę gyvi nepagalbinės grupės gyvūnai, nepaveikti tiriamąja medžiaga, skrodžiami. Nugaišę gyvūnai turėtų būti pašalinami ir, kai nurodoma, skrodžiami. Įprastiniu atveju visi gyvūnai, įskaitant ir kontrolinius individus yra tiriami šitaip: a) Prieš pradedant duoti tiriamąją medžiagą bei pasibaigus tyrimui, panaudojant oftalmoskopą ar jam ekvivalentišką tinkamą prietaisą, turėtų būti ištiriamos visų, bet pirmiausia gavusių didžiausią dozę ir priklausančių kontrolinei grupei, gyvūnų akys. Jeigu nustatomi pokyčiai akyse, reikėtų ištirti visus gyvūnus. b) Prieš pasibaigiant tyrimui, reikėtų įvertinti tokius hematologinius rodiklius kaip hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų skaičius, absoliutus bei skirtingų populiacijų leukocitų skaičius ir įvertinti krešėjimo potencialą, remiantis tokiais kriterijais, kaip krešėjimo trukme, protrombino ir tromboplastino susidarymo trukmė arba kraujo plokštelių (trombocitų) skaičius. c) Prieš pasibaigiant tyrimui, reikėtų atlikti kraujo biocheminius tyrimus. Atliekant šiuos tyrimus, reikėtų, jei reikalinga, nustatyti elektrolitų balansą, angliavandenių metabolizmą bei įvertinti kepenų ir inkstų veiklą. Parenkant specifinius tyrimus, reikėtų atsižvelgti į tiriamosios medžiagos veikimo būdo tyrimo duomenis. Siūloma nustatyti kalcį, fosforą, chlorą, natrį, kalį, badavimo metu susidarančią gliukozę (atsižvelgiant į konkrečiai gyvūnų rūšiai/veislei galimą badavimo laikotarpį), serumo glutamato piruvato transaminazę [6], serumo glutamato oksalacetato transaminazę [7], ornitino dekarboksilazę, γ glutamilo transpeptidazę, šlapale esantį azotą, albuminą, bendrą bilirubino, esančio kraujo kreatinine, kiekį bei atlikti serumo baltymų bendro kiekio nustatymą. Kitiems tyrimams, kurie gali būti reikalingi pakankamam toksikologiniam įvertinimui, priklauso lipidų, hormonų rūgščių/šarmų balanso, methemoglobino ir cholinesterazės aktyvumo nustatymas. Papildomi biocheminiai tyrimai gali būti atliekami tuo atveju, kai būtina detaliau išnagrinėti nustatytus reiškinius. d) Nereikalaujama, kad pagal nusistovėjusią tvarką būtų atliekama šlapimo analizė, išskyrus tuos atvejus, kai remiantis duomenimis, numatomas arba nustatomas toksiškumas. Jeigu neįmanoma gauti anksčiau atliktų tyrimų pagrindinių duomenų, tai, prieš pradedant medžiagos davimą dozėmis, reikėtų apsvarstyti hematologinius ir klinikinius biocheminius parametrus. Pagrindinis skrodimas Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, kurio metu tiriamas kūno išorinis paviršius, visos angos, kiaušo, krūtinės ir pilvo ertmės bei jų turinys. Po skrodimo kuo skubiau pasveriamos kepenys, inkstai, antinksčiai, tiroidinė liauka (kartu su paratireoidiniais dariniais) ir kiaušinėliai tam, kad būtų išvengta jų džiūties. Vėlesniems histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi tokie audiniai ir organai, laikomi tinkamoje terpėje: visi esminiai pažeidimai, smegenys – įskaitant pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūvius, smegenėlių ir smegenų žievę, hipofizė, tiroidinė/paratiroidinė liauka, bet koks užkrūčio liaukos audinys, (trachėja), plaučiai, širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, kasa, lytinės liaukos, gimda (pagalbiniai lytiniai organai), tulžies pūslė, stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, šlapimo pūslė, pagrindinis (didysis) limfmazgis, (moterų pieno liauka), (šlaunies raumenynas), periferinis nervas, (akys), (šlaunikaulis, įskaitant ir segmentinį paviršių), (stuburo smegenys trimis lygiais – sprando, krūtinės ląstos ir juosmens) ir (ašarų liaukos). Audinius, paminėtus skliausteliuose, reikia tirti tik tada, kai nustatomas toksiškumas arba tiriamas medžiagos poveikis organui). Histpatologinis tyrimas a) Reikėtų visapusiškai histopatologiškai ištirti kontrolinės grupės ir tos grupės, kuriai duodama didelė medžiagos dozė, gyvūnus. b) Reikėtų ištirti visus pagrindinius pažeidimus. c) Reikėtų ištirti gyvūnų, kurie veikiami kitomis medžiagos dozėmis, organus, paveikiamus medžiaga. d) Jei naudojamos žiurkės, reikėtų histopatologiniu aspektu ištirti gyvūnų, kurie veikiami mažomis ir tarpinėmis medžiagos dozėmis, plaučius tam, kad įsitikinti, jog jie nėra užkrėsti, nes šituo remiantis nesunkiai galima įvertinti gyvūnų sveikatos būklę. Vėliau šių gyvūnų nebereikia tirti histopatopatologiniu aspektu, tačiau būtina atlikti gyvūnų, kurie veikiami didele medžiagos doze, histopatologinę analizę. e) Kai naudojama pagalbinė grupė, tai reikia atlikti audinių ir organų, kuriuose, tiriant kitas gyvūnų grupes, paveiktas tiriamąja medžiaga, buvo pastebėti medžiagos sukelti efektai, histopatologinę analizę. 2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti pažeidimai, skaičius, pažeidimų tipai bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pažeidimai, skaičius, išreikštas procentais. Rezultatus reikėtų vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kokį statistinį metodą, vartojamą visuotinu mastu. 3. ATASKAITA 3.1. Tyrimo ataskaita Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija: - rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras, - tyrimo sąlygos, - dozės lygiai (įskaitant prietaisą, jei šis buvo naudojamas) ir koncentracijos, - duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę, - jei įmanoma, dozės lygis, kuriam esant jokių efektų nebuvo pastebėta, - mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo, - toksinių ir kitų efektų apibūdinimas (ypač atkreipiant dėmesį į klinikinių tyrimų duomenis), - kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių, pastebėjimo momentas, - duomenys apie pašarą bei kūno masę, - oftalmologinių stebėjimų rezultatai, - naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai, - naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) duomenys, - skrodimo metu gauti duomenys, - visų histopatologinių tyrimų metu gautų duomenų detalus apibūdinimas, - rezultatų statistinė analizė, jei įmanoma, - rezultatų aptarimas, - rezultatų aiškinimas. 3.2 Įvertinimas ir aiškinimas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį. PUSIAU CHRONINIS ĮKVĖPIMO TOKSIŠKUMO TYRIMAS 90 DIENŲ TRUNKANTIS KARTOTINĖS ĮKVEPIAMOS DOZĖS TYRIMAS GRAUŽIKŲ RŪŠYSE 1. METODAS 1.1. Įvadas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.2. Apibrėžimai Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.3. Etaloninės medžiagos Nėra. 1.4. Tyrimo metodo principas Tiriamąja medžiaga laipsniškomis koncentracijomis veikiama keletas eksperimentinių gyvūnų grupių kiekvieną dieną apibrėžtą laikotarpį, vienos grupės gyvūnus veikiant vienos koncentracijos medžiaga 90 dienų laikotarpiu. Kai naudojamas prietaisas, norint pasiekti atitinkamą tiriamosios medžiagos koncentraciją atmosferoje, turėtų būti naudojama kontrolinė grupė, kurios gyvūnai veikiami medžiaga to prietaiso pagalba. Veikimo metu gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną tam, kad būtų registruojami toksinių efektų pasireiškimo požymiai. Gyvūnai, kurie nugaišta tyrimo metu, skrodžiami, o atlikus tyrimą visi tie gyvūnai, kurie liko gyvi. 1.5. Kokybės kriterijai Nėra. 1.6. Tyrimo metodo apibūdinimas Pasiruošimas tyrimui Prieš tyrimą gyvūnai mažiausiai 5 dienas yra laikomi eksperimentinėje fermoje, kur jie šeriami. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Jei būtina, kartu su tiriamąja medžiaga, kuria veikiama, naudojamas atitinkamas prietaisas, kuris sukuria atitinkamą tiriamosios medžiagos koncentraciją atmosferoje. Jei dozavimui naudojamas prietaisas ar kiti priedai, tai jie neturėtų sukelti toksinių efektų. Jei yra reikalinga, tai galima naudotis anksčiau vykdytų tyrimų duomenimis. Tyrimo sąlygos Eksperimentiniai gyvūnai Tinkamiausia naudoti gyvūnų rūšis – žiurkės, nebent yra kontraindikacijų. Reikėtų naudoti įprastinius jaunų sveikų gyvūnų laboratorinius kamienus ir geriausia pradėti duoti medžiagą dozėmis, kai bet kuriuo atveju žiurkės yra šešių ir ne daugiau kaip aštuonerių savaičių amžiaus. Naudojamų gyvūnų kūno masės nukrypimas tyrimo pradžioje neturėtų būti didesnis nei ± 20 % vidutinės kūno masės. Jei prieš pradedant ilgalaikį tyrimą, yra atliekamas pusiau chroninis įkvėpimo tyrimas, tai abiejų tyrimų metu yra naudojamos tos pačios rūšys ir kamienai. Skaičius ir lytis Esant kiekvienai medžiagos, kuria veikiama, koncentracijai, reikėtų naudoti mažiausiai 20 gyvūnų (10 patelių ir 10 patinėlių). Patelės turėtų būti dar negimdžiusios ir ne nėščios. Jeigu numatoma atlikti gyvūnų, esančių grupėje, numarinimą, tiriamų gyvūnų skaičius turi būti padidintas tiek, kiek gyvūnų planuojama numarinti prieš pasibaigiant tyrimui. Be to, 90 dienų laikotarpiu papildoma 20 (po 10 kiekvienos lyties) gyvūnų grupė gali būti veikiama didele tiriamosios medžiagos koncentracija, kad praėjus mėnesiui po veikimo būtų stebimas toksinių efektų grįžtamumas, išlikimo pastovumas bei pavėluotas pasireiškimas. Medžiagos, kuria veikiama, koncentracijos Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios bei viena kontrolinė koncentracijos. Išskyrus tą laikotarpį, kai veikiama tiriamąja medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turėtų būti laikomi tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamosios grupės individai. Esant didžiausiai koncentracijai, turėtų pasireikšti toksiniai efektai, tačiau ši koncentracija neturėtų būti mirtina arba jei mirtina, tai tik keletas individų turi nugaišti. Mažiausia koncentracija neturėtų sukelti jokio toksiškumo. Ši koncentracija turėtų būti mažesnė nei toji, kuri vartojama praktiškai įvertinant poveikį žmogui. Geriausia būtų, kad vidutinė koncentracija sukeltų minimalius toksiškumo požymius. Jeigu naudojama daugiau nei viena vidutinė koncentracija, tai koncentracijos turi būti padalijamos taip, kad toksiškumo požymiai pasireikštų laipsniškai. Kontrolinės grupės ir grupių, kurios veikiamos mažomis bei tarpinėmis koncentracijomis, gyvūnų mirtingumas turėtų būti toks, kad būtų galima įvertinti rezultatų reikšmingumą. Veikimo trukmė Tyrimų kameroje suvienodinus esančios ore medžiagos koncentracijas, kasdien atliekamas veikimas turėtų trukti šešias valandas. Prietaisas Gyvūnai turėtų būti tiriami įkvėpimo tyrimui skirtu prietaisu, suprojektuotu taip, kad palaikytų pastovų dinaminį oro srautą vykstant mažiausiai 12 oro pasikeitimų per valandą tam, kad užtikrintų tinkamą deguonies koncentraciją anksčiau pasiskirsčiusiame ore, kuriuo veikiama. Jei naudojama kamera, ji turėtų būti sukonstruota taip, kad gyvūnai joje būtų kuo mažiau susigrūdę, o tiriamoji medžiaga kuo geriau patektų į gyvūnų kvėpuojamąjį traktą. Tam, kad būtų užtikrintas kameroje esančio oro pastovumas, tūris, kurį užima tiriamieji gyvūnai, neturėtų viršyti 5 % tyrimui naudojamos kameros tūrio. Kameroje esančius gyvūnus galima veikti tiriamąja medžiaga, šiai patenkant į gyvūnų organizmą per burną ir nosį arba per visą kūno paviršių; pirmieji du medžiagos patekimo būdai labai sumažina medžiagos patekimą į organizmą kitais būdais. Stebėjimų laikotarpis Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvieną dieną ir registruojami toksiškumo požymiai, nurodant jų pasireiškimo pradžią, laipsnį ir trukmę. Reikėtų užregistruoti mirties laiką ir tą momentą, kai toksiškumo požymiai pasireiškia bei išnyksta. Procedūra Geriausia, kad tiriamosios medžiagos dozė gyvūnams būtų duodama septynis kartus per savaitę 90 dienų laikotarpiu. Bet kokios kitos pagalbinės grupės gyvūnai turi būti laikomi dar mėnesiui ir neduodant jiems medžiagos tam, kad būtų stebimas jų organizmo atsistatymas po toksinio poveikio arba toksinių efektų pasireiškimo pastovumas. Tyrimo metu turėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperatūra. Optimali santykinė drėgmė turėtų būti 30–70 %, tačiau kai kuriais atvejais (pvz., tiriant aerozolius) tai nebūtina. Veikimo metu pašaras ir girdymas turėtų išlikti nepakitę. Reikėtų naudoti dinaminę įkvėpimo sistemą kartu su atitinkama analitine koncentracijos kontrolės sistema. Atitinkamos medžiagos, kuria veikiama, koncentracijoms nustatyti reikėtų atlikti bandomąjį tyrimą. Oro srautą reikėtų sureguliuoti taip, kad būtų užtikrintos homogeniškos sąlygos kameroje, kurioje veikiama tiriamąja medžiaga. Sistema turėtų užtikrinti, kad veikimo sąlygų pastovumas būtų pasiekiamas kaip galima greičiau. Matavimai ar stebėjimas turėtų būti grindžiamas: a) oro srauto intensyvumu (pastoviai); b) tikrąja tiriamosios medžiagos, esančios kvėpuojamojoje zonoje, koncentracija. Atliekant veikimą kasdien, tiriamosios medžiagos koncentracija neturėtų keistis ± 15 % vidutinės vertės. Tačiau dulkių ir aerozolių atveju toks kontrolės lygis nebūtinas ir priimtinos platesnės ribos. Kasdieninės koncentracijos turėtų būti palaikomos kuo pastovesnės. Kuriant palaikančiąją sistemą, reikėtų atlikti dalelių dydžio analizę tam, kad būtų užtikrintas aerozolių koncentracijų pastovumas. Veikimo metu reikėtų kaip galima dažniau atlikti analizę tam, kad būtų nustatomas dalelių pasiskirstymo pastovumas; c) temperatūra ir drėgmė; d) atliekamo ir po jo sekančio veikimo metu užregistruojami ir sistemingai protokoluojami stebėjimai; reikėtų atskirai registruoti kiekvieną gyvūną. Visus gyvūnus reikėtų stebėti kasdien ir registruoti toksiškumo požymius, įskaitant požymių pasireiškimo laiką, laipsnį bei trukmę. Stebint narveliuose laikomus gyvūnus, reikia registruoti odos bei kailio, o taip pat akių ir gleivinių membranas bei kvėpavimo, apytakos, autonominės bei centrinės nervų sistemos pokyčius, somatomotorinį aktyvumą ir elgseną. Kiekvieną savaitę reikėtų įvertinti pašaro suvartojimą (ir vandens suvartojimą kai tiriamoji medžiaga yra duodama su geriamu vandeniu) bei pasverti gyvūnus. Reikėtų kiek įmanoma pastoviau stebėti gyvūnus tam, kad užtikrinti, jog šie nebūtų prarandami tyrimo metu dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audinių autolizė bei laikymo vietos praradimas. Baigiantis tyrimui, visi likę gyvi nepagalbinės grupės gyvūnai, nepaveikti tiriamąja medžiaga yra skrodžiami. Nugaišę gyvūnai turėtų būti pašalinami ir, kai nurodyta, skrodžiami. Įprastai visi gyvūnai, įskaitant ir kontrolinius individus, tiriami taip: a) Prieš pradedant duoti tiriamąją medžiagą bei pasibaigus tyrimui, panaudojant oftalmoskopą ar jam ekvivalentišką tinkamą prietaisą, turėtų būti ištiriamos visų, bet pirmiausia gavusių didžiausią dozę ir priklausančių kontrolinei grupei, gyvūnų akys. Jeigu nustatomi pokyčiai akyse, reikėtų ištirti visus gyvūnus. b) Baigiantis tyrimui reikėtų įvertinti tokius hematologinius rodiklius kaip hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocitų skaičius, absoliutus bei skirtingų populiacijų leukocitų skaičius bei nustatyti krešėjimo potencialą, remiantis tokiais rodikliais, kaip krešėjimo trukme, protrombino ir tromboplastino susidarymo trukme arba kraujo plokštelių (trombocitų) skaičiumi. c) Baigiantis tyrimui reikėtų atlikti kraujo biocheminius tyrimus. Atliekant šiuos tyrimus, reikėtų, jei reikalinga, nustatyti elektrolitų balansą, angliavandenių metabolizmą bei įvertinti kepenų ir inkstų veiklą. Parenkant specifinius tyrimus, reikėtų atsižvelgti į tiriamosios cheminės medžiagos veikimo būdo tyrimo metu gautus duomenis. Siūloma nustatyti kalcį, fosforą, chlorą, natrį, kalį, badavimo metu susidarančią gliukozę (atsižvelgiant į konkrečiai gyvūnų rūšiai galimą badavimo laikotarpį), serumo glutamato piruvato transaminazę [8], serumo glutamato oksalacetato transaminazę [9], ornitino dekarboksilazę, γ glutamino transpeptidazę, šlapale esantį azotą, albuminą, bendrą bilirubino, esančio kraujo kreatinine, kiekį bei atlikti serumo baltymų bendro kiekio nustatymą. Kitiems tyrimams, kurie gali būti reikalingi tam, kad būtų atliktas pakankamas toksikologinis įvertinimas, priklauso lipidų, hormonų rūgščių/šarmų balanso, methemoglobino ir cholinesterazės aktyvumo nustatymas. Papildomi biocheminiai tyrimai gali būti atliekami tuo atveju, kai būtina detaliau išnagrinėti nustatytus reiškinius. d) Nereikalaujama, kad šlapimo analizė būtų atliekama pagal nusistovėjusią tvarką, išskyrus tuos atvejus, kai remiantis duomenimis, numatomas arba nustatomas toksiškumas. Jeigu anksčiau atliktų pagrindinių tyrimų duomenys laikomi nepakankamais, prieš pradedant duoti dozes reikia apsvarstyti hematologinių ir klinikinių biocheminių parametrų nustatymą. Pagrindinis skrodimas Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, kurio metu tiriamas kūno išorinis paviršius, visos angos, kiaušo, krūtinės ir pilvo ertmės bei jų turinys. Po skrodimo kuo skubiau pasveriamos inkstai, kepenys, antinksčiai ir kiaušinėliai tam, kad būtų išvengta jų džiūties. Vėlesniems histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi tokie audiniai ir organai, laikomi tinkamoje terpėje: visi esminiai pažeidimai, plaučiai, kurie turėtų būti išimti nepažeisti, pasverti ir apdoroti tinkamu fiksatyvu tam, kad būtų išlaikyta plaučių struktūra (efektyvi procedūra – perfuzija fiksatyvu), smegenys – įskaitant pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūvius, smegenėlių ir smegenų žievę, hipofizė, tiroidinė/paratiroidinė liauka, bet koks užkrūčio liaukos audinys, trachėja ir plaučiai, širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys, blužnis, inkstai, antinksčiai, kasa, lytinės liaukos, gimda (pagalbiniai lytiniai organai), (oda), tulžis (jei yra duomenys), stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, šlapimo pūslė, pagrindinis (didysis) limfmazgis, (moterų pieno liauka), (šlaunies raumenynas), periferinis nervas, krūtinkaulis su kaulų čiulpais, (akys), (šlaunikaulis, įskaitant ir segmentinį paviršių), (stuburo smegenys trimis lygiais – sprando, krūtinės ląstos ir juosmens). Audinius, paminėtus skliausteliuose, reikia tirti tik tada, kai nustatomas toksiškumas arba tiriamas medžiagos poveikis į organą-taikinį. Histopatologinis tyrimas a) Reikėtų visapusiškai histopatologiškai ištirti kontrolinės grupės ir tos grupės, kuriai duodama didelė medžiagos dozė, gyvūnus. b) Reikėtų ištirti visus pagrindinius pažeidimus. c) Reikėtų ištirti gyvūnų, kurie veikiami kitomis medžiagos dozėmis, organus, paveikiamus medžiaga. d) Mažų ir vidutinių dozių grupių gyvūnų plaučiai taip pat turėtų būti ištirti histopatologiškai, kadangi tai gali padėti lengviau įvertinti gyvūnų sveikatos būklę. Tolesnė šių grupių gyvūnų histopatologinė analizė neprivaloma. Tačiau visada būtina ištirti didelių dozių grupės gyvūnų organus, turinčius pažeidimo požymių. e) Kai naudojama pagalbinė grupė, tai reikia atlikti audinių ir organų, kuriuose, tiriant kitas gyvūnų grupes, paveiktas tiriamąja medžiaga, buvo pastebėti medžiagos sukelti efektai, histopatologinę analizę. 2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti pažeidimai, skaičius, pažeidimų tipai bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pažeidimai, skaičius, išreikštas procentais. Rezultatus reikėtų vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kokį visuotinai vartojamą statistinį metodą. 3. ATASKAITA 3.1. Tyrimo ataskaita Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija: - rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras, - tyrimo sąlygos: Aparato, kuris naudojamas veikimui medžiaga, aprašymas: įskaitant konstrukciją, tipą, išmatavimus, oro šaltinį, dalelių ir aerozolių sukūrimo sistemą, vėdinimo metodą, veikimą iškvėptu oru ir gyvūnų laikymo kameroje, kai ji naudojama, metodą. Reikėtų aprašyti matuojamą temperatūrą, drėgmę ir, jei reikia, aerozolių koncentracijų arba dalelių dydžio stabilumą. Veikimo metu gauti duomenys: duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant vidurkius ir variacijos dydį (pvz., standartinį nukrypimą) ir pateikiant: a) oro srauto, pereinančio per įkvėpimo įrangą, greičius; b) oro temperatūrą ir drėgmę; c) nominalias koncentracijas (absoliutus įkvėpimo įrangoje esantis tiriamosios medžiagos kiekis, padalytas iš oro tūrio); d) prietaiso, jei jis naudojamas, pobūdį; e) tikrąsias koncentracijas, esančias tiriamoje kvėpuojamoje zonoje; f) vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma nurodyti): - duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę, - jei įmanoma, duomenų lygis, kuriam esant, jokių efektų nebuvo pastebėta, - mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo, - toksinių ir kitų efektų apibūdinimas, - kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių pastebėjimo momentas, - duomenys apie pašarą bei kūno masę, - oftalmologinių stebėjimų rezultatai, - naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai, - naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) duomenys, - skrodimo metu gauti duomenys, - visų histopatologinių tyrimų metu gautų duomenų detalus apibūdinimas, - rezultatų statistinė analizė (jei įmanoma), - rezultatų aptarimas, - rezultatų aiškinimas. 3.2 Įvertinimas ir aiškinimas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį. TERATOGENIŠKUMO TYRIMAS – GRAUŽIKAI IR NEGRAUŽIKAI 1. METODAS 1.1. Įvadas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.2. Apibrėžimai Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.3. Etaloninės medžiagos Nėra. 1.4. Tyrimo metodo principas Tiriamoji medžiaga duodama laipsniškomis dozėmis arba koncentracijomis keleto eksperimentinių grupių gyvūnų nėščioms patelėms tuo nėštumo periodo metu, kai vyksta organogenezė, vieną dozę duodant vienos grupės gyvūnams. Prieš pat numatomą medžiagos pasisavinimą veislinės patelės numarinamos, pašalinama gimda ir tiriamas jos turinys. Tyrimo metu įvertinamas embriono ir gemalo toksiškumas. 1.5. Kokybės kriterijai Nėra. 1.6. Tyrimo metodo apibūdinimas Pasiruošimas tyrimui Likus mažiausiai 5 dienoms prieš prasidedant tyrimui, sveikos jaunos subrendusios ir nekaltos panašaus amžiaus ir dydžio gyvūnų patelės aklimatizuojamos laboratorijos sąlygomis ir po to suporuojamos su žinomu vaisingumu pasižyminčiais patinais. Apvaisintos patelės atsitiktinai atrenkamos ir suskirstomos į grupes, kurios bus veikiamos medžiaga. Suporavimas gali būti atliekamas natūraliai arba dirbtinai apsėklinant. Tiriamoji medžiaga duodama patelėms kiekvieną dieną iškart po implantavimo ir visu organogenezės periodu. Likus vienai dienai iki tyrimo pabaigos, histerektomijos būdu pašalinami gemalai ir tiriamos jų visceralinės (snukio) bei skeleto anomalijos, įskaitant sulėtėjusį augimą, sulėtėjusį sukaulėjimą ar plonųjų žarnų hemoragijas. Tyrimo sąlygos Eksperimentiniai gyvūnai Paprastai naudojamos žiurkės, pelės, žiurkėnai ir triušiai. Labiausiai – žiurkės ir triušiai. Reikėtų naudoti įprastinius laboratorinius kamienus. Kamienas neturėtų pasižymėti mažu vaisingumu ir turėtų būti apibūdintas jo sukuriamas atsakas į teratogenus. Gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose, atskirai. Skaičius ir lytis Duodant medžiagą skirtingomis dozėmis, reikėtų naudoti mažiausiai 20 nėščių žiurkių, pelių bei žiurkėnų patelių arba 12 nėščių triušių patelių. Tikslas yra užtikrinti, jog būtų pakankamas vadų ir jose esančių jauniklių skaičius tam, kad būtų galima įvertinti medžiagos teratogeninį aktyvumą. Dozė Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios bei viena kontrolinė dozės. Jeigu tiriamoji medžiaga duodama naudojant prietaisą, kontrolinei grupei medžiaga turi būti duodama taip pat naudojant tą prietaisą. Jeigu naudojamas prietaisas, turėtų būti suprantamos jo toksikologinės ypatybės, jis neturi būti teratogeniškas ar daryti įtaką dauginimuisi. Išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga, kontrolinės grupės gyvūnai turėtų būti laikomi tokiomis pat sąlygomis kaip ir tiriamosios grupės individai. Nepaisant ribotumo, susijusio su tiriamosios medžiagos fizikine/chemine prigimtimi ar biologinėmis savybėmis, geriausiu atveju didžiausia jos dozė turėtų sukelti aiškiai išreikštą motininį toksiškumą, pasireiškiantį nedideliu svorio sumažėjimu, tačiau ne daugiau kaip 10 % patelių turi mirti. Mažiausia duota tiriamosios medžiagos dozė neturėtų sukelti jokių akivaizdžių toksiškumo požymių. Tarpinė dozė tirėtų būti geometriškai išdėstyta tarp didelės ir mažos dozių. Ribų tyrimas Kai medžiagos pasižymi nedideliu toksiškumu, ir jei dozei siekiant mažiausiai 1000 mg kūno masės kilogramui, nepasireiškia embriono toksiškumas ar teratogeniškumas, laikomasi nuostatos, kad tyrimai, naudojant kitas medžiagos dozes, nėra reikalingi. Veikimo laikas Nulinė tyrimo diena yra ta, kurios metu stebima makšties kamštis ir (arba) sperma (jei įmanoma). Dozę reikėtų duoti pagrindinės organogenezės metu. Šitai galėtų būti atliekama 6–15 dieną pelėse ir žiurkėse, 6–14 dieną žiurkėnuose arba 6–18 dieną triušiuose. Jei nulinę dieną stebimas suporavimas arba dirbtinis apsėklinimas, tai aukščiau minimas laikas turi būti pratęstas viena diena. Kitaip sakant, dozė gali būti papildomai duodama dar vieną dieną, likusią iki numatomo medžiagos pasisavinimo laiko. Stebėjimų laikotarpis Mažiausiai vieną kartą kasdien reikėtų atlikti išsamų klinikinį tyrimą. Kiekvieną dieną reikėtų atlikti papildomus stebėjimus ir imtis atitinkamų priemonių, kad tiriamų gyvūnų gaišimas būtų sumažintas. Procedūra Tiriamoji medžiaga duodama per burną, su kapsule. Tiriamoji medžiaga turėtų būti duodama kasdien, tuo pačiu metu. Tiriamųjų gyvūnų patelės veikiamos tiriamąja medžiaga kasdien visu atitinkamu veikimo periodu. Dozė gali būti parenkama, remiantis patelių svoriu prieš duodant medžiagą arba pagal greitą svorio priaugimą nėštumo metu, gyvūnai gali būti periodiškai sveriami ir dozė gali būti parenkama, remiantis pačiais naujausiais duomenimis apie kūno masę. Toksiškumo požymiai turėtų būti registruojami, vos tik jie pastebimi, įskaitant pasireiškimo laiką, laipsnį ir trukmę. Patelės, kurios prieš subrendimą pasisavino medžiagą arba kurioms įvyko persileidimas, numarinamos ir tiriamos makroskopiškai. Pasibaigus veikimui, stebėjimo periodas turi trukti tol, kol liks viena diena iki nustatyto laiko; tai daroma tam, kad būtų atliekamas stebėjimas visu nėštumo periodu ir išvengta klaidingo rezultatų aiškinimo, atsirandančio dėl po to sekančio natūralaus gimimo. Gyvūnų stebėjimas narveliuose neturėtų apsiriboti odos ir kailio pakitimų, akių ir gleivinių membranų stebėjimais, taipogi reikėtų stebėti kvėpavimą, apytaką, autonominę bei centrinę nervų sistemas, somatomotorinį aktyvumą ir elgseną. Kiekvieną savaitę reikėtų atlikti maisto įsisavinimo matavimus. Gyvūnai turėtų būti sveriami kas savaitę. Skrodimas Ir tyrimo metu nugaišę, ir išlikę išlikę gyvos veislinės patelės tyrimo pabaigoje turėtų būti ištiriamos makroskopiškai, siekiant rasti bet kokias struktūrines anomalijas arba patologinius pokyčius, kurie galėjo atsirasti dėl nėštumo. Iškart po nugaišimo pašalinama gimda ir tiriamas jos turinys, siekiant nustatyti embriono arba gemalo mirtį bei gyvų embrionų skaičių. Paprastai įmanoma nustatyti mirties laiką gimdoje, jei tai įvyko. Žiurkių bei triušių atveju galima nustatyti corpora lutea skaičių. Turėtų būti nustatyta gemalų lytis ir jie turėtų būti atskirai pasveriami, svoriai užrašomi ir apskaičiuotas vidutinis gemalo svoris. Po pašalinimo kiekvienas gemalas turėtų būti apžiūrimas iš išorės. Žiurkių, pelių ir žiurkėnų atveju 1/3–1/2 kiekvienos vados dalis turėtų būti paruošta ir ištirtos skeleto anomalijos bei likusi kiekvienos vados dalis turėtų būti paruošta ir, panaudojant atitinkamus metodus, turėtų būti ištirtos minkštojo audinio anomalijos. Triušių atveju, kiekvieno gemalo visceralinės (snukio) bei skeleto anomalijos turėtų būti kruopščiai ištirtos. 2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, patelių, kurios pastojo, skaičius, gyvų gemalų skaičius bei gemalų, turinčių minkštojo ar skeleto anomalijas, skaičius bei jų sąsajos su konkrečia vada. Rezultatai turėtų būti vertinami atitinkamu statistiniu metodu. Galima panaudoti bet kokį visuotinai pripažintą statistinį metodą. 3. ATASKAITA 3.1. Tyrimo ataskaita Jei įmanoma, tai tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija: - rūšis, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras, - tyrimo sąlygos, - dozės lygiai (įskaitant įrangą, jei ji naudota) ir koncentracijos, - duomenys apie toksinį atsaką pagal duotą dozę, - tai dozės lygis, kuriam esant jokių efektų nepastebėta (jei įmanoma), - mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo, - toksinių ir kitų efektų apibūdinimas, - kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių stebėjimo laikas, - duomenys apie pašarą bei kūno masę, - nėštumo trukmė ir duomenys apie vadą (įskaitant ankstesnius duomenis), - duomenys apie gemalus (gyvas/miręs, lytis, minkštojo audinio ir skeleto defektai), - duomenys apie vadą (gyvi/mirę jaunikliai, jų lytis, kiekvienos vados minkštojo audinio ir skeleto defektai), - rezultatų statistinė analizė (jei įmanoma), - rezultatų aptarimas, - rezultatų aiškinimas. 3.2 Įvertinimas ir aiškinimas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį. CHRONINIS TOKSIŠKUMO TESTAS 1. METODAS 1.1. Įvadas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.2. Apibrėžimai Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.3. Etaloninės medžiagos Nėra. 1.4. Tyrimo metodo principas Tiriamoji medžiaga paprastai duodama septynis kartus per savaitę atitinkamu būdu keletui eksperimentinių gyvūnų grupių, vieną dozę duodant vienai grupei didžiąją gyvūnų gyvenimo dalį. Veikimo tiriamąja medžiaga ir jam pasibaigus eksperimentiniai gyvūnai stebimi kasdien, siekiant nustatyti toksiškumo požymius. 1.5. Kokybės kriterijai Nėra. 1.6. Tyrimo metodo apibūdinimas Pasiruošimas tyrimui Prieš tyrimą mažiausiai 5 dienas gyvūnai yra laikomi ir šeriami eksperimentinėje fermoje. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Tyrimo sąlygos Eksperimentiniai gyvūnai Labiausiai naudojama rūšis yra žiurkės. Remiantis anksčiau atliktų tyrimų duomenimis, gali būti naudojamos ir kitos (graužikų arba negraužikų) rūšys. Reikėtų naudoti įprastinių laboratorinių kamienų gyvūnų sveikus jauniklius ir medžiagos davimas doze turėtų prasidėti iškart po atjunkymo. Tyrimo pradžioje kūno masės variacijos ribos turėtų neviršyti ± 20 % kūno masės vidurkio. Jei prieš ilgalaikį tyrimą yra atliekamas pusiau chroninis oralinis tyrimas, tai abiejų tyrimų metu reikėtų naudoti tos pačios rūšies ar kamieno gyvūnus. Skaičius ir lytis Duodant medžiagą skirtinga doze graužikams ir kartu naudojant kontrolinę grupę, reikėtų naudoti mažiausiai 40 gyvūnų (20 patelių ir 20 patinėlių). Patelės turi būti negimdžiusios ir ne nėščios. Jei numarinimai numatomi iš anksto, tai tiriamų gyvūnų skaičius padidinamas padidinant gyvūnų, kuriuos numatoma numarinti prieš užbaigiant tyrimą, skaičių. Negraužikų atveju priimtina, kad būtų naudojamas mažesnis gyvūnų skaičius, tačiau kiekvienoje grupėje turi būti mažiausiai po 4 kiekvienos lyties gyvūnus. Dozė ir veikimo dažnumas Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios dozės naudojant kontrolinę grupę. Didžiausia dozė turėtų sukelti aiškiai pasireiškiantį toksiškumą, nesukeliant perteklinio mirtingumo. Mažiausia dozė neturėtų sukelti akivaizdaus toksiškumo. Tarpinė dozė turėtų būti išdėstyta tarp aukščiausios ir žemiausios dozių. Pasirenkant dozes reikėtų remtis anksčiau atliktų toksiškumo tyrimų ir testų duomenimis. Veikimas turėtų būti atliekamas kasdien. Jei cheminė medžiaga duodama sumaišius ją su vandeniu ar pašaru, ji turėtų būti pastoviai prieinama. Kontrolė Kartu reikėtų naudoti kontrolinę grupę, identišką grupėms, kurios veikiamos, bet kuriuo aspektu, išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga. Ypatingais atvejais, tokiais kaip įkvėpimo tyrimai naudojant aerozolius arba oraliniai tyrimai naudojant nežinomo biologinio aktyvumo emulsiklius, reikėtų taipogi naudoti ir neigiamą kontrolinę grupę. Neigiama kontrolinė grupė veikiama tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės, išskyrus tai, kad gyvūnai neveikiami jokia tiriamąja medžiaga nei prietaisu. Davimo būdas Duodama paprastai dviem būdais – per burną ir kvėpuojamąjį traktą. Davimo būdo pasirinkimas priklauso nuo tiriamosios medžiagos fizikinių ir cheminių ypatybių ir panašaus veikimo būdo žmonių tarpe. Duodant per odą susiduriama su didelėmis praktinio pobūdžio problemomis. Chroninis sisteminis toksiškumas, atsirandantis dėl poodinės absorbcijos, įprastiniu atveju gali įtakoti kito oralinio testo metu gaunamus duomenis ir gaunama daug informacijos apie poodinės absorbcijos, įvertintos, anksčiau atlikus poodinio toksiškumo testus, perteklių. Oraliniai tyrimai Jei tiriamoji medžiaga absorbuojama iš virškinamojo trakto ir jei šis įsisavinimo būdas yra vienas iš būdų, kuriuo žmonės susiduria su tiriamąja medžiaga, tai pasirenkamas davimo per burną būdas, nebent nustatomos kontraindikacijos. Gyvūnai gali gauti tiriamąją medžiagą su maistu, ištirpintą vandenyje arba su kapsule. Geriausia, kad dozavimas būtų atliekamas septynis kartus per savaitę kasdien, nes dozuojant penkis kartus per savaitę gali paskatinti atsistatymą bei pašalinti toksiškumą tuo metu, kai nėra dozuojama ir šitai gali turėti įtakos gaunamiems rezultatams bei vėliau atliekamam jų įvertinimui. Tačiau pirmiausia, remiantis praktiniu patyrimu, rekomenduojama vykdyti dozavimą penkis kartus per savaitę. Įkvėpimo tyrimai Dėl to, kad įkvėpimo tyrimuose susiduriama su didesnėmis techninėmis problemomis nei duodant tiriamąją medžiagą kitais būdais, čia pateikiamas detalus vadovas, nurodantis kaip duoti medžiagą šiuo būdu. Reikėtų pažymėti, kad ypatingų situacijų atveju lašinimas į trachėją yra alternatyvus problemos sprendimo būdas. Atliekant ilgalaikius veikimus, paprastai remiamasi veikimu žmonių atžvilgiu, veikiant gyvūnus kasdien šešias valandas po to, kai suvienodinamos koncentracijos kameros viduje, penkiskart per savaitę (protarpinis veikimas) arba, atsižvelgiant į galimą aplinkos veikimą, veikiama 22–24 valandas per dieną septynis kartus per savaitę (pastovus veikimas), vieną valandą per dieną šeriant kameroje laikomus gyvūnus tuo pačiu metu. Abiem atvejais gyvūnai pastoviai veikiami nustatytomis tiriamosios medžiagos koncentracijomis. Pagrindinis protarpinio ir pastoviojo veikimų skirtumas yra tai, kad protarpinis veikimas užtrunka 17–18 valandų, per kurias gyvūnai atsigauna po efektų, atsiradusių dėl kasdieninio veikimo, o šitai užtrunka žymiai ilgiau savaitgaliais. Protarpinio ar pastoviojo veikimo pasirinkimas priklauso nuo tyrimo tikslų bei nuo žmogaus veikimo, kuris turi būti imituojamas. Tačiau reikia apsvarstyti ir konkrečius techninius sunkumus. Pavyzdžiui, pastoviojo veikimo teikiamų privalumų, imituojant aplinkos sąlygas, reikia atsisakyti, nes veikimo metu gyvūnus reikia šerti ir girdyti ir dėl to, kad reikia sukurti žymiai sudėtingesnį (bei labiau patikimesnį) aerozolį ir garus bei imtis priežiūros. Veikimo kamera Gyvūnai turėtų būti tiriami įkvėpimo tyrimui skirta įranga, suprojektuota taip, kad palaikytų pastovų dinaminį oro srautą vykstant mažiausiai 12 oro pasikeitimų per valandą tam, kad užtikrintų tinkamą deguonies koncentraciją anksčiau pasiskirsčiusiame ore, kuriuo veikiama. Kontrolinė kamera bei toji, kurioje atliekamas veikimas turėtų būti identiškos pagal konstrukciją ir modelį tam, kad veikimo sąlygos visais aspektais būtų užtikrintos, išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga. Nežymus neigiamas slėgis kameros viduje paprastai palaikomas tam, kad tiriamoji medžiaga nepatektų į supančią aplinką. Tiriami gyvūnai kamerose turėtų būti nesusigrūdę. Siekiant užtikrinti kameros oro stabilumą, tūris, kurį užima tiriamieji gyvūnai, neturėtų viršyti 5 % tyrimui naudojamos kameros tūrio. Reikėtų atlikti tokius matavimus arba priežiūrą: i) oro srautas: oro srauto, patenkančio per kamerą, greitis turi būti pastoviai prižiūrimas; ii) koncentracija: kasdieninio veikimo metu tiriamosios medžiagos koncentracija neturėtų peržengti ± 15 % vidutinės vertės; iii) temperatūra ir drėgmė: graužikų atveju temperatūra turėtų būti palaikoma 22 ± 2 °C ir drėgmė kameroje turėtų siekti nuo 30 % iki 70 %, išskyrus tą atvejį, kai naudojamas vanduo tam, kad tiriamoji medžiaga virstų suspensija kameros atmosferoje. Reikėtų pastoviai stebėti temperatūrą bei drėgmę; iv) dalelių dydžio matavimai: reikėtų nustatyti kameros atmosferoje esančių dalelių, įskaitant skysčius ar kietuosius aerozolius, dydžius. Aerozolių dalelės turėtų būti tokio dydžio, kad naudojamas tiriamasis gyvūnas jas galėtų įkvėpti. Kameros atmosferos mėginiai turėtų būti įnešami į gyvūnų kvėpuojamąją zoną. Oro mėginys, remiantis gravimetrine analize, turėtų atspindėti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą ir visus aerozolius, esančius suspensijoje, netgi jei didžioji aerozolio dalis nėra įkvepiama. Dalelių dydį reikėtų nustatinėti kaip galima dažniau, kuriant sistemą tam, kad būtų užtikrintas aerozolio stabilumas ir po to kuo dažniau veikimų metu tam, kad būtų galima tinkamai nustatyti dalelių, kuriomis gyvūnai veikiami, pasiskirstymą. Tyrimo trukmė Davimas turėtų trukti mažiausiai 12 mėnesių. Procedūra Stebėjimai Detalus klinikinis tyrimas turėtų būti atliekamas vienąkart per dieną. Kasdien reikėtų atlikti papildomus stebėjimus ir imtis atitinkamų veiksmų sumažinti gyvūnų gaišimą tyrimo metu, pavyzdžiui, skrosti ar užšaldyti tuos gyvūnus, kurie buvo rasti nugaišę ir izoliuoti ar numarinti silpnus bei mirštančius gyvūnus. Reikėtų kruopščiai nustatyti toksinių efektų pasireiškimo laiką bei eigą, o taip pat sumažinti gyvūnų gaišimą dėl ligos, autolizės ar kanibalizmo. Turėtų būti registruojami visų gyvūnų klinikiniai požymiai, įskaitant regos bei neurologinius pokyčius, o taip pat mirtingumas. Reikėtų registruoti ir toksinių sąlygų, įskaitant ir įtariamus auglius, pasireiškimo laiką bei eigą. Pirmųjų trylikos tyrimo savaičių bėgyje kartą per savaitę reikėtų registruoti visų gyvūnų kūno masę ir po to vienąkart per savaitę kas mėnesį. Pirmųjų 13 tyrimo savaičių bėgyje kas savaitę reikėtų įvertinti pašaro įsisavinimą ir vėliau kas trys mėnesiai, nebent sveikatos būklė ar svoris verčia elgtis kitaip. Hematologinis tyrimas Reikėtų atlikti hematologinį tyrimą (pvz., nustatant hemoglobino kiekį, eritrocitų užimamą tūrį kraujyje absoliutų eritrocitų, leukocitų ir trombocitų skaičių arba kitus rodiklius kraujo krešėjimo aktyvumui įvertinti) praėjus trims, šešiems mėnesiams, o paskui kas pusę metų, surenkant kraujo mėginius iš visų negraužimų ir iš 10 kiekvienos lyties ir visų grupių žiurkių. Jei įmanoma, kraujo mėginiai imami iš tų pačių žiurkių tokiu pačiu laiko intervalu. Be to, iš negraužikų reikėtų paimti išankstinius mėginius tyrimui. Jei, remiantis klinikiniais stebėjimais, spėjama, kad tyrimo metu sutriko gyvūnų sveikata, paveiktų gyvūnų kraujo analizė turėtų būti atliekama kitaip. Gyvūnų, kuriems buvo duota didžiausia medžiagos dozė bei kontrolinės grupės individų kraujo mėginių analizė atliekama kitu būdu. Kitos grupės (ar grupių), kuriai (-ioms) buvo duota mažesnė dozė, kraujo analizė atliekama kitaip, jei tarp didžiausią dozę gavusios ir kontrolinės grupės egzistuoja pagrindinis skirtumas arba tai buvo nustatyta patologinių tyrimų metu. Šlapimo analizė Šlapimo mėginiai, turėtų būti paimti iš visų negraužimų ir iš 10 kiekvienos lyties ir visų grupių graužikų, jei įmanoma, tų pačių kaip ir hematologiniam tyrimui. Mėginiai, paimti arba iš atskirų gyvūnų, arba mėginių rinkinys, paimtas iš vienos lyties ar graužikų grupės, turėtų būti ištirti taip: - išorė: individualaus gyvūno šlapimo tūris bei tankis, - baltymų, gliukozės, ketonų, paslėpto kraujo kiekis (pusiau kiekybiškai), - nuosėdų mikroskopinis vaizdas (pusiau kiekybiškai). Klinikinė chemija Maždaug kas šešis mėnesius ir tyrimo pabaigoje iš visų negraužikų bei 10 kiekvienos lyties ir visų grupių žiurkių, jei įmanoma, iš tų pačių žiurkių esant tam pačiam laiko tarpui, turėtų būti surenkami kraujo mėginiai, kad vėliau būtų ištirti klinikinės chemijos aspektu. Be to,, iš visų negraužikų turėtų būti paimami išankstiniai mėginiai. Paėmus mėginius, paruošiama plazma ir atliekami tokie matavimai: - absoliuti baltymo koncentracija, - albumino koncentracija, - kepenų funkciniai testai (tokie kaip šarminės fosfatazės aktyvumo nustatymo testas, glutamino piruvato transaminazės [10] aktyvumo nustatymo testas ir glutamato oksal acetato transaminazės [11] aktyvumo nustatymo testas), γ glutamiltranspeptidazė, ornitino dekarboksilazė, - angliavandenių metabolizmas, įvertinant gliukozės kraujyje trūkumą, - inkstų funkciniai testai, tokie kaip šlapalo nustatymas kraujyje. Pagrindinis skrodimas Turėtų būti atliktas visapusiškas bendras visų gyvūnų skrodimas, įskaitant tuos kurie nugaišo eksperimentų metu arba buvo numarinti tada, kai buvo nustatyta, jog jie miršta. Prieš numarinimą turėtų būti paimti visų gyvūnų kraujo mėginiai tam, kad būtų atlikta diferencinė kraujo analizė. Visi akivaizdžiai matomi sutrikimai, augliai ar sutrikimai, kurie, kaip įtariama, gali būti augliai, turėtų būti užkonservuoti. Reikėtų stengtis rasti sąsajas tarp pagrindinių stebėjimų ir mikroskopinių analizių. Histopatologiniams tyrimams turėtų būti išsaugomi tokie audiniai ir organai: smegenys [12] (pailgųjų smegenų/smegenų tilto pjūviai, smegenėlių ir smegenų žievės), hipofizė, tiroidinė liauka (įskaitant paratiroidinę liauką), užkrūčio liauka, plaučiai (įskaitant trachėją), širdis, aorta, seilių liaukos, kepenys [13], blužnis, inkstai [14], antinksčiai [15], stemplė, skrandis, dvylikapirštė žarna, tuščioji žarna, klubinė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, riestoji žarna, gimda, šlapimo pūslė, limfmazgiai, kasa, lytinės liaukos [16], pagalbiniai lytiniai organai, moterų pieno liauka, oda, raumenynas, periferinis nervas, stuburo smegenys (sprando, krūtinės ląstos ir juosmens), krūtinkaulis su kaulų čiulpais, šlaunikaulis (įskaitant ir segmentinį paviršių) bei akys. Plaučių ir šlapimo pūslės pripildymas fiksuojančiąja medžiaga yra optimalus būdas išsaugoti šiuos audinius; plaučių pripildymas įkvėpimo tyrimuose yra svarbus atitinkamų histopatologinių tyrimų aspektu. Ypatingų tyrimų, tokių, kaip įkvėpimo tyrimai, atveju, reikėtų tirti visą kvėpuojamąjį traktą, įskaitant nosies ertmę, gerklas ir ryklę. Jei atliekami kiti klinikiniai tyrimai, tai šių procedūrų metu gauta informacija turėtų būti prieinama, atliekant mikroskopinę analizę, nes ta informacija yra pagrindinė patologo darbo gairė. Histopatologinis tyrimas Visi akivaizdūs pokyčiai, ypač bet kurio organo augliai ir kiti sutrikimai, turėtų būti tiriami mikroskopiškai. Be to, rekomenduojama atlikti tokias procedūras: a) visų užkonservuotų organų ir audinių mikroskopinę analizę, visapusiškai apibūdinant sutrikimus, rastus: 1) visuose gyvūnuose, kurie nugaišo arba buvo numarinti tyrimo metu; 2) visuose tiriamosios grupės, kuriai buvo duota didelė medžiagos dozė, bei kontrolinės grupės gyvūnuose; b) organai arba audiniai, kurių anomalijas sukėlė arba galėjo sukelti tiriamoji medžiaga, taipogi tiriami grupės, gavusios mažą dozę, gyvūnuose; c) jei tyrimo metu gautas rezultatas įrodo, kad gyvūnų gyvenimo normali trukmė ypač sutrumpėjo arba atsirado efektai, galintys turėti įtakos toksiniam atsakui, tai sekanti dozė turėtų būti tiriama taip, kaip aprašyta aukščiau; d) manoma, kad informacija apie sutrikimų, įprastiniu atveju pasitaikančių tiriamųjų gyvūnų kamiene, dažnumą laboratorinėmis sąlygomis (pvz., remiantis anksčiau atliktų tyrimų duomenimis) yra būtina teisingai įvertinant pokyčių gyvūnuose, paveiktuose tiriamąja medžiaga, reikšmę. 2. DUOMENYS Duomenys turėtų būti apibendrinti pasitelkiant lenteles, kuriose nurodomas kiekvienos tiriamosios grupės gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje, gyvūnų, kuriuose buvo pastebėti pakitimai, skaičius, pakitimų tipai bei gyvūnų, kuriuose pasireiškė kiekvieno tipo pakitimai, skaičius, išreikštas procentais. Rezultatus reikėtų vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kokį visuotinai vartojamą statistinį metodą. 3. ATASKAITA 3.1. Tyrimo ataskaita Jei įmanoma, tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateikiama tokia informacija: - rūšis, veislė, kamienas, šaltinis, aplinkos sąlygos, pašaras, - tyrimo sąlygos: Aparato, kuris naudojamas veikimui medžiaga, aprašymas: įskaitant konstrukciją, tipą, išmatavimus, oro šaltinį, dalelių ir aerozolių sukūrimo sistemą, vėdinimo metodą, veikimą iškvėptu oru ir gyvūnų laikymo kameroje, kai ji naudojama, metodą. Reikėtų aprašyti matuojamą temperatūrą, drėgmę ir, jei reikia, aerozolių koncentracijų arba dalelių dydžio stabilumą. Veikimo metu gauti duomenys: duomenys turėtų būti pateikiami lentelėse, nurodant vidurkius ir variacijos dydį (pvz., standartinį nukrypimą) ir pateikiant: a) oro srauto, pereinančio per įkvėpimo įrangą, greitį; b) oro temperatūrą ir drėgmę; c) nominalias koncentracijas (absoliutus įkvėpimo įrangoje esančios tiriamosios medžiagos kiekis, padalytas iš oro tūrio); d) tirpiklio, jei jis naudojamas, tipą; e) tikrąsias koncentracijas, esančias tiriamoje kvėpuojamoje zonoje; f) vidutinius dalelių dydžius (jei įmanoma nurodyti), - dozių dydžiai (įskaitant tirpiklį, jei naudojamas) ir koncentracijos vertės, - duomenys apie toksinį atsaką pagal tirtą lytį ir duotą dozę, - nestebimo poveikio dozės dydis, - mirties laikas arba tyrimo metu, arba jei gyvūnai išliko iki numarinimo, - toksinių ir kitų efektų apibūdinimas, - kiekvieno nenormalaus požymio ir iš jo išplaukiančių pasekmių, pastebėjimo momentas, - duomenys apie pašarą bei kūno masę, - oftalmologinių stebėjimų rezultatai, - naudoti hematologiniai tyrimai ir jų metu gauti rezultatai, - naudoti klinikinės biochemijos tyrimai ir jų metu gauti visi (įskaitant bet kurios šlapimo analizės) duomenys, - skrodimo metu gauti duomenys, - visų histopatologinių tyrimų metu gautų duomenų detalus apibūdinimas, - rezultatų statistinė analizė, jei įmanoma, - rezultatų aptarimas, - rezultatų aiškinimas. 3.2. Įvertinimas ir aiškinimas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 4. NUORODOS Žr. Bendrojo įvado B dalį. KARCINOGENIŠKUMO TESTAS 1. METODAS 1.1. Įvadas Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.2. Apibrėžimai Žr. Bendrojo įvado B dalį. 1.3. Etaloninės medžiagos Nėra. 1.4. Tyrimo metodo principas Tiriamoji medžiaga paprastai duodama septynis kartus per savaitę atitinkamu būdu keletui eksperimentinių gyvūnų grupių, vieną dozę duodant vienai grupei didžiąją gyvūnų gyvenimo dalį. Veikimo tiriamąja medžiaga metu ir jam pasibaigus eksperimentiniai gyvūnai stebimi kasdien, siekiant nustatyti toksiškumo požymius, ypač auglių vystymąsi. 1.5. Kokybės kriterijai Nėra. 1.6. Tyrimo metodo apibūdinimas Prieš tyrimą gyvūnai mažiausiai 5 dienas yra laikomi ir šeriami eksperimentinėje fermoje. Prieš pradedant tyrimą sveiki gyvūnų jaunikliai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į tiriamąją bei kontrolinę grupes. Eksperimentiniai gyvūnai Remiantis anksčiau atliktų tyrimų rezultatais, gali būti naudojamos kitos (graužikų arba negraužikų) rūšys. Reikėtų naudoti įprastinių laboratorinių kamienų gyvūnų sveikus jauniklius, medžiagos davimas doze turėtų prasidėti iškart po atjunkymo. Tyrimo pradžioje kūno masės variacijos ribos turėtų siekti ± 20 % kūno masės vidurkio. Jei prieš ilgalaikį tyrimą yra atliekamas pusiau chroninis oralinis tyrimas, tai abiejų tyrimų metu reikėtų naudoti tos pačios rūšies ar kamieno gyvūnus. Skaičius ir lytis Duodant medžiagą skirtinga doze graužikams ir kartu naudojant kontrolinę grupę, reikėtų naudoti mažiausiai 100 gyvūnų (50 patelių ir 50 patinėlių). Patelės turi būti negimdžiusios ir ne nėščios. Jei numarinimai numatomi iš anksto, tiriamų gyvūnų skaičius padidinamas padidinant gyvūnų, kuriuos numatoma numarinti prieš užbaigiant tyrimą, skaičių. Dozė ir veikimo dažnumas Turėtų būti naudojamos mažiausiai 3 tiriamosios dozės naudojant kontrolinę grupę. Didžiausia dozė turėtų sukelti minimalų toksiškumą, pasireiškiantį nežymiu kūno masės priaugimo sumažėjimu (mažesniu nei 10 %), iš esmės nepakeičiant įprastinės gyvenimo trukmės dėl efektų, kurie skiriasi nuo auglių atsiradimo. Mažiausia dozė neturėtų trikdyti gyvūno normalaus augimo, vystymosi bei gyvenimo trukmės ar sukelti toksiškumo. Apskritai, ši dozė neturėtų būti mažesnė nei didelės dozės dešimtoji dalis (10 %). Tarpinė dozė turėtų būti išdėstyta tarp aukščiausios ir žemiausios dozių. Pasirenkant dozes reikėtų remtis anksčiau atliktų toksiškumo testų ir tyrimų duomenimis. Veikimas turėtų būti atliekamas kasdien. Jei cheminė medžiaga duodama sumaišius ją su vandeniu ar pašaru, ji turėtų būti pastoviai prieinama. Kontrolė Kartu reikėtų naudoti kontrolinę grupę, identišką grupėms, kurios veikiamos, bet kuriuo aspektu, išskyrus veikimą tiriamąja medžiaga. Ypatingais atvejais, tokiais kaip įkvėpimo tyrimai naudojant aerozolius arba oraliniai tyrimai naudojant nežinomo biologinio aktyvumo emulsiklius, reikėtų taipogi naudoti ir neigiamą kontrolinę grupę. Neigiama kontrolinė grupė veikiama tuo pačiu būdu kaip ir tiriamosios grupės, išskyrus tai, kad gyvūnai neveikiami jokia tiriamąja medžiaga nei prietaisu. Davimo būdas Duodama paprastai trimis būdais – per burną, odą ir kvėpuojamąjį traktą. Davimo būdo pasirinkimas priklauso nuo tiriamosios medžiagos fizikinių ir cheminių ypatybių ir panašaus veikimo būdo žmonių tarpe. Oraliniai tyrimai Jei tiriamoji medžiaga absorbuojama iš virškinamojo trakto ir jei šis įsisavinimo būdas yra vienas iš būdų, kuriuo žmonės susiduria su tiriamąja medžiaga, tai pasirenkamas davimo per burną būdas, nebent nustatomos kontraindikacijos. Gyvūnai gali gauti tiriamąją medžiagą su maistu, ištirpintą vandenyje arba su kapsule. Geriausia, kad dozavimas būtų atliekamas septynis kartus per savaitę kasdien, nes dozavimas penkis kartus per savaitę gali paskatinti atsistatymą bei pašalinti toksiškumą tuo metu, kai nėra dozuojama ir šitai gali turėti įtakos gaunamiems rezultatams bei vėliau atliekamam jų įvertinimui. Tačiau pirmiausia remiantis praktiniu patyrimu, rekomenduojama vykdyti dozavimą penkis kartus per savaitę. Odos tyrimai Odos veikimas jos nudažymu gali būti pasirinktas kaip pagrindinio būdo, kuriuo veikiami žmonės imitacija bei kaip odos sutrikimų sukėlimo modelinė sistema. Įkvėpimo tyrimai Dėl to, kad įkvėpimo tyrimuose susiduriam su didesnėmis techninėmis problemomis, nei duodant tiriamąją medžiagą kitais būdais, čia pateikiamas detalus vadovas, nurodantis, kaip duoti medžiagą šiuo būdu. Reikėtų pažymėti, kad ypatingų