2009R0152 — LT — 18.04.2012 — 001.001

Šis dokumentas yra skirtas tik informacijai, ir institucijos nėra teisiškai atsakingos už jo turinį

►B KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) Nr. 152/2009 2009 m. sausio 27 d. nustatantis oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos ėminių ėmimo ir analizės metodus (Tekstas svarbus EEE) (OL L 054, 26.2.2009, p.1)

iš dalies keičiamas:









▼B

KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) Nr. 152/2009

2009 m. sausio 27 d.

nustatantis oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos ėminių ėmimo ir analizės metodus

(Tekstas svarbus EEE)







EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį, atsižvelgdama į 2004 m. balandžio 29 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentą (EB) Nr. 882/2004 dėl oficialios kontrolės, kuri atliekama siekiant užtikrinti, kad būtų įvertinama, ar laikomasi pašarus ir maistą reglamentuojančių teisės aktų, gyvūnų sveikatos ir gerovės taisyklių ( 1 ), ypač į jo 11 straipsnio 4 dalies a, b ir c punktus, kadangi: (1) Šie aktai buvo priimti Direktyvai 70/373/EEB įgyvendinti ir vis dar galioja pagal Reglamento (EB) Nr. 882/2004 61 straipsnio 2 dalį: — 1971 m. birželio 15 d. pirmoji Komisijos direktyva 71/250/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 2 ); — 1971 m. lapkričio 18 d. antroji Komisijos direktyva 71/393/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 3 ); — 1972 m. balandžio 27 d. trečioji Komisijos direktyva 72/199/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 4 ); — 1972 m. gruodžio 5 d. ketvirtoji Komisijos direktyva 73/46/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 5 ); — 1976 m. kovo 1 d. pirmoji Komisijos direktyva 76/371/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 6 ); — 1976 m. kovo 1 d. septintoji Komisijos direktyva 76/372/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 7 ); — 1978 m. birželio 15 d. aštuntoji Komisijos direktyva 78/633/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 8 ); — 1981 m. liepos 31 d. devintoji Komisijos direktyva 81/715/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 9 ); — 1984 m. liepos 25 d. dešimtoji Komisijos direktyva 84/425/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 10 ); — 1986 m. balandžio 9 d. Komisijos direktyva 86/174/EEB, nustatanti paukščių kombinuotųjų pašarų energetinės vertės apskaičiavimo metodus ( 11 ); — 1993 m. liepos 28 d. vienuoliktoji Komisijos direktyva 93/70/EEB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 12 ); — 1993 m. gruodžio 17 d. dvyliktoji Komisijos direktyva 93/117/EB, nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus ( 13 ); — 1998 m. rugsėjo 3 d. Komisijos direktyva 98/64/EB, nustatanti Bendrijos analizės metodus pašaruose esančioms aminorūgštims, žaliems aliejams ir riebalams bei olakvindoksui nustatyti ir iš dalies pakeičianti Direktyvą 71/393/EEB ( 14 ); — 1999 m. balandžio 20 d. Komisijos direktyva 1999/27/EB, nustatanti Bendrijos analizės metodus amproliumui, diklazurilui ir karbadoksui pašaruose nustatyti, iš dalies keičianti Direktyvas 71/250/EEB bei 73/46/EEB ir panaikinanti Direktyvą 74/203/EEB ( 15 ); — 1999 m. liepos 23 d. Komisijos direktyva 1999/76/EB, nustatanti Bendrijos analizės metodą, kuriuo nustatoma lasalocido natrio druska pašaruose ( 16 ); — 2000 m. liepos 6 d. Komisijos direktyva 2000/45/EB, nustatanti Bendrijos analizės metodus pašaruose esantiems A vitaminui, E vitaminui ir triptofanui nustatyti ( 17 ); — 2002 m. liepos 26 d. Komisijos direktyva 2002/70/EB, nustatanti dioksinų ir dioksinų tipo PCB koncentracijos pašaruose nustatymo reikalavimus ( 18 ); — 2003 m. gruodžio 23 d. Komisijos direktyva 2003/126/EB dėl gyvūninės kilmės sudedamųjų dalių nustatymo analizės metodo, taikomo valstybinei pašarų kontrolei ( 19 ). (2) Kadangi Direktyva 70/373/EEB buvo pakeista Reglamentu (EB) Nr. 882/2004, reikėtų tos direktyvos įgyvendinimo aktus pakeisti vienu reglamentu. Tuo pačiu metu metodai turėtų būti suderinti su mokslo ir technikos žinių raida. Metodai, kurie nebeatitinka numatytos paskirties, turėtų būti panaikinti. Numatyta tinkamu metu atnaujinti ėminių ėmimo nuostatas, kad būtų galima atsižvelgti į naujausius pašarų gamybos, laikymo, vežimo ir pateikimo į rinką pasiekimus, tačiau tam tikrą laiką reikia palikti galiojančias ėminių ėmimo nuostatas. (3) Todėl Direktyvos 71/250/EEB, 71/393/EEB, 72/199/EEB, 73/46/EEB, 76/371/EEB, 76/372/EEB, 78/633/EEB, 81/715/EEB, 84/425/EEB, 86/174/EEB, 93/70/EEB, 93/117/EB, 98/64/EB, 1999/27/EB, 1999/76/EB, 2000/45/EB, 2002/70/EB ir 2003/126/EB turėtų būti panaikintos. (4) Šiame reglamente numatytos priemonės atitinka Maisto grandinės ir gyvūnų sveikatos nuolatinio komiteto nuomonę, kadangi: PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:







1 straipsnis

Ėminių ėmimas oficialiai pašarų kontrolei, susijusiai su sudedamųjų dalių, priedų ir nepageidaujamų medžiagų nustatymu, išskyrus pesticidų likučius ir mikroorganizmus, atliekamas pagal I priede aprašytus metodus.

2 straipsnis

Ėminiai analizei ruošiami ir rezultatų išraiška pateikiama pagal II priede aprašytus metodus.

3 straipsnis

Oficialiai pašarų kontrolei skirta analizė atliekama, taikant metodus, aprašytus III priede (Analizės metodai, taikomi pašarinių medžiagų ir kombinuotųjų pašarų sudėčiai kontroliuoti), IV priede (Analizės metodai leidžiamų pašarų priedų koncentracijai kontroliuoti), V priede (Analizės metodai nepageidaujamoms medžiagoms pašaruose kontroliuoti) ir VI priede (Analizės metodai gyvūninės kilmės sudedamosioms dalims nustatyti atliekant oficialiąją pašarų kontrolę).

4 straipsnis

Paukščių kombinuotųjų pašarų energinė vertė apskaičiuojama pagal VII priedą.

5 straipsnis

VIII priede aprašyti analizės metodai, skirti daugiau neleidžiamų naudoti pašarų priedų neteisėtam buvimui kontroliuoti, taikomi patvirtinimo tikslais.

6 straipsnis

Direktyvos 71/250/EEB, 71/393/EEB, 72/199/EEB, 73/46/EEB, 76/371/EEB, 76/372/EEB, 78/633/EEB, 81/715/EEB, 84/425/EEB, 86/174/EEB, 93/70/EEB, 93/117/EB, 98/64/EB, 1999/27/EB, 1999/76/EB, 2000/45/EB, 2002/70/EB ir 2003/126/EB panaikinamos.

Nuorodos į panaikintas direktyvas laikomos nuorodomis į šį reglamentą ir aiškinamos pagal IX priede pateiktas atitikčių lenteles.

7 straipsnis

Šis reglamentas įsigalioja dvidešimtą dieną nuo jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.

Jis taikomas nuo 2009 m. rugpjūčio 26 d.

Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.









I PRIEDAS

ĖMINIŲ ĖMIMO METODAI

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Ėminiai, skirti oficialiai pašarų kontrolei, imami pagal toliau aprašytus metodus. Taip gauti ėminiai laikomi reprezentatyviaisiais partijos ėminiais.

2. ĖMINIUS IMANTYS PAREIGŪNAI

Ėminius ima pareigūnai, kuriuos tam įgalioja valstybės narės.

3. APIBRĖŽTYS

Partija: produkto kiekis, sudarantis tyrimo vienetą ir pasižymintis savybėmis, kurios laikomos tolygiomis.

Atskirasis ėminys: kiekis, paimtas iš vienos partijos vietos.

Jungtinis ėminys: jungtinių ėminių, paimtų iš vienos ėminio partijos, visuma.

Sumažintasis ėminys: jungtinio ėminio dalis, atspindinti jo visumą, gauta jį redukuojant.

Galutinis ėminys: sumažintojo arba homogenizuoto jungtinio ėminio dalis.

4. APARATAS

4.1 Ėminių ėmimo aparatas turi būti pagamintas iš medžiagų, negalinčių užteršti produktų, iš kurių imami ėminiai. Toks aparatas gali būti oficialiai patvirtintas valstybių narių.

4.2 Aparatas, rekomenduojamas kietųjų pašarų ėminiams imti

4.2.1 Ėminių ėmimas rankiniu būdu

4.2.1.1 Plokščiadugnė bertuvė vertikaliais kraštais.

4.2.1.2 Ėminių ėmimo zondas su ilgu plyšiu arba pertvaromis. Zondo matmenys turi atitikti ėminio tiriamosios dalies ypatybes (talpyklos gylį, maišo matmenis ir pan.) ir pašarų dalelių dydį.

4.2.2 Ėminių ėmimas mechaniniu būdu

Judančių pašarų ėminiams imti gali būti naudojamas patvirtintas mechaninis aparatas.

4.2.3 Dalytuvas

Aparatas, skirtas padalyti ėminį į maždaug vienodo dydžio dalis, gali būti naudojamas atskiriesiems ėminiams imti bei sumažintiesiems ir galutiniams ėminiams ruošti.

5. KIEKYBINIAI REIKALAVIMAI







5.A. Tikrinant vienodai pašaruose pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus 5.A.1. Partija Partija turi būti tokia, kad iš jos būtų galima paimti kiekvienos jos sudedamosios dalies ėminį. 5.A.2. Atskirieji ėminiai 5.A.2.1. Piltiniai pašarai: Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius: 5.A.2.1.1. Partija ne didesnė kaip 2,5 metrinės tonos septyni 5.A.2.1.2. Partija didesnė kaip 2,5 metrinės tonos kvadratinė šaknis iš 20 kartų partiją sudarančių metrinių tonų skaičiaus (1), bet ne daugiau kaip 40 atskirųjų ėminių 5.A.2.2. Supakuoti pašarai: Mažiausias pakuočių, iš kurių imami ėminiai, skaičius (2): 5.A.2.2.1. Pakuotės, kurių masė didesnė kaip 1 kg: 5.A.2.2.1.1. Partiją sudaro nuo vienos iki keturių pakuočių visos pakuotės 5.A.2.2.1.2. Partiją sudaro nuo penkių iki 16 pakuočių keturios pakuotės 5.A.2.2.1.3. Partiją sudaro daugiau kaip 16 pakuočių kvadratinė šaknis iš partiją sudarančių pakuočių skaičiaus (1), be ne daugiau kaip 20 pakuočių 5.A.2.2.2. Pakuotės, kurių masė ne didesnė kaip 1 kg: keturios 5.A.2.3. Skystieji arba pusiau skysti pašarai: Mažiausias talpyklų, iš kurių imami ėminiai, skaičius (2): 5.A.2.3.1. Talpyklų tūris didesnis kaip 1 l: 5.A.2.3.1.1. Partiją sudaro nuo vienos iki keturių talpyklų visos talpyklos 5.A.2.3.1.2. Partiją sudaro nuo penkių iki 16 talpyklų keturios 5.A.2.3.1.3. Partiją sudaro daugiau kaip 16 talpyklų kvadratinė šaknis iš partiją sudarančių talpyklų skaičiaus (1), be ne daugiau kaip 20 talpyklų 5.A.2.3.2. Talpyklų tūris ne didesnis kaip 1 l keturios 5.A.2.4. Pašarų briketai ir mineralų laižalai Mažiausias briketų arba laižalų, iš kurių imami ėminiai, skaičius (2): vienas pašarų briketas arba laižalas 25 vienetų partijai, bet ne daugiau kaip keturi briketai arba laižalai 5.A.3. Jungtinis ėminys Reikia paruošti vieną jungtinį vienos tiriamosios ėminio dalies ėminį. Jungtinį ėminį sudarančių atskirųjų ėminių suminis kiekis turi būti ne mažesnis kaip: 5.A.3.1. Piltiniai pašarai: 4 kg 5.A.3.2. Supakuoti pašarai: 5.A.3.2.1. pakuotės, kurių masė didesnė kaip 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. pakuotės, kurių masė ne didesnė kaip 1 kg keturių pirminių pakuočių turinio masė 5.A.3.3. Skystieji arba pusiau skysti pašarai: 5.A.3.3.1. talpyklų tūris didesnis kaip 1 l: keturi litrai 5.A.3.3.2. talpyklų tūris ne didesnis kaip 1 l: keturių pirminių talpyklų turinio tūris 5.A.3.4. Pašarų briketai arba laižalai: 5.A.3.4.1. kiekvieno masė didesnė kaip 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. kiekvieno masė ne didesnė kaip 1 kg keturių pirminių briketų arba laižalų masė 5.A.4. Galutiniai ėminiai Prireikus iš jungtinio ėminio jį mažinant ruošiami galutiniai ėminiai. Reikia atlikti bent vieno galutinio ėminio analizę. Analizuojamo galutinio ėminio kiekis turi būti ne mažesnis kaip: Kietieji pašarai 500 g Skystieji arba pusiau skysti pašarai: 500 ml 5.B. Kontroliuojant nepageidaujamas medžiagas arba produktus, kurie gali netolygiai pasiskirstyti pašaruose, pvz., aflatoksinus, rugių skalsę, ricinžolę ir crotalaria (3) 5.B.1. Partija: žr. 5.A.1. 5.B.2. Atskirieji ėminiai 5.B.2.1. Piltiniai pašarai: žr. 5.A.2.1. 5.B.2.2. Supakuoti pašarai: Mažiausias pakuočių, iš kurių imami ėminiai, skaičius: 5.B.2.2.1. partiją sudaro nuo vienos iki keturių pakuočių visos pakuotės 5.B.2.2.2. partiją sudaro nuo penkių iki 16 pakuočių keturios 5.B.2.2.3. partiją sudaro daugiau kaip 16 pakuočių kvadratinė šaknis iš partiją sudarančių pakuočių skaičiaus (1), be ne daugiau kaip 40 pakuočių 5.B.3. Jungtiniai ėminiai Jungtinių ėminių skaičius skirsis atsižvelgiant į partijos dydį. Toliau nurodomas mažiausias iš vienos partijos paimtų jungtinių ėminių skaičius. Kiekvieną jungtinį ėminį sudarančių atskirųjų ėminių suminė masė turi būti ne mažesnė kaip 4 kg 5.B.3.1. Piltiniai pašarai Partijos svoris metrinėmis tonomis: Mažiausias partijos jungtinių ėminių skaičius: iki 1 1 nuo daugiau kaip 1 iki 10 2 nuo daugiau kaip 10 iki 40 3 daugiau kaip 40 4 5.B.3.2. Supakuoti pašarai Supakuotų pašarų partijos pakuočių skaičius Mažiausias partijos jungtinių ėminių skaičius: nuo 1 iki 16 1 nuo 17 iki 200 2 nuo 201 iki 800 3 daugiau kaip 800 4 5.B.4. Galutiniai ėminiai Iš jungtinio ėminio jį mažinant gaunami galutiniai ėminiai. Reikia atlikti bent vieno galutinio ėminio vienam jungtiniam ėminiui analizę. Analizei paimto galutinio ėminio masė negali būti mažesnė kaip 500 g. (1) Jei gautas skaičius yra trupmena, ji turėtų būti suapvalinama iki sveiko skaičiaus. (2) Jei pakuotės arba talpyklos turinio masė ne didesnė kaip 1 kg arba tūris ne didesnis kaip 1 l ir pašarų briketų arba laižalų masė ne didesnė kaip 1 kg, atskirasis ėminys yra vienos pirminės pakuotės arba talpyklos, vieno briketo arba laižalo turinys. (3) Metodai, numatyti 5.A, taikomi aflatoksinams, rugių skalsei, ricinžolei ir crotalaria kontroliuoti visaverčiuose pašaruose ir pašarų papilduose.

6. ĖMINIŲ ĖMIMO, RUOŠIMO IR PAKAVIMO INSTRUKCIJOS

6.1 Bendrosios nuostatos

Ėminiai turi būti imami ir ruošiami kiek įmanoma greičiau, turint omenyje atsargumo priemones, kurios yra būtinos siekiant užtikrinti, kad produktas nepakistų ir nebūtų užterštas. Įrankiai ėminiams imti ir talpyklų, kuriose jie laikomi, paviršiai turi būti švarūs ir sausi.

6.2 Atskirieji ėminiai

6.2.A Kontroliuojant vienodai pašaruose pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus

Atskirieji ėminiai turi būti imami atsitiktinai iš visos partijos ir jie turi būti maždaug vienodo dydžio.

6.2.A.1 Piltiniai pašarai

Partija vizualiai dalijama į tam tikrą skaičių maždaug vienodų dalių. Atsitiktinai pasirenkamas dalių skaičius, atitinkantis pagal 5.A.2 punktą reikalaujamą atskirųjų ėminių skaičių, ir iš kiekvienos dalies paimama bent po vieną ėminį.

Jei tinka, ėminius galima imti keičiant partijos vietą (kraunant arba iškraunant).

6.2.A.2 Supakuoti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių pakuočių ėminiams imti, kaip nurodyta 5.A.2. punkte, dalis kiekvienos pakuotės turinio paimama bertuve arba zondu. Prireikus ėminiai imami, atskirai ištuštinus pakuotes. Prireikus atskirai kiekvieno jungtinio ėminio gabalai turi būti sutrupinti juos atskiriant nuo ėminio ir grąžinti atgal.

6.2.A.3 Homogeniniai arba homogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių talpyklų ėminiams imti, kaip nurodyta 5.A.2 punkte, jų turinys prireikus homogenizuojamas ir iš kiekvienos talpyklos paimamas tam tikras kiekis.

Atskiruosius ėminius galima imti išpilant talpyklos turinį.

6.2.A.4 Nehomogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių talpyklų ėminiams imti, kaip nurodyta 5.A.2 punkte, ėminiai imami iš skirtingų lygių.

Be to, ėminius galima imti išpilant talpyklos turinį, tačiau pirmosios frakcijos turėtų būti išpiltos lauk.

Abiem atvejais visas paimto ėminio tūris neturi būti mažesnis kaip 10 l.

6.2.A.5 Pašarų briketai ir mineralų laižalai

Atrinkus ėminiams imti reikalingą kiekį pašarų briketų arba laižalų, kaip nurodyta 5.A.2.punkte, imama kiekvieno briketo arba laižalo dalis.

6.2.B. Kontroliuojant nepageidaujamas medžiagas arba produktus, kurie gali netolygiai pasiskirstyti pašaruose, pvz., aflatoksinus, rugių skalsę, ricinžolę ir crotalaria

Partija vizualiai dalijama į tam tikrą skaičių maždaug vienodų dalių, atitinkančių 5.B.3 punkte numatytą jungtinių ėminių skaičių. Jeigu šis skaičius didesnis už 1,5.B.2 punkte numatytas suminis atskirųjų ėminių skaičius paskirstomas maždaug vienodai skirtingoms dalims. Tada imami maždaug tokie vienodo dydžio ėminiai ( 20 ), kad suminis ėminių kiekis iš kiekvienos dalies būtų ne mažesnis kaip kiekvienam jungtiniam ėminiui gauti būtinas 4 kg kiekis. Iš skirtingų dalių paimti atskirieji ėminiai neturi būti sujungiami.

6.3 Jungtinių ėminių ruošimas

6.3.A. Kontroliuojant vienodai pašaruose pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus

Atskirieji ėminiai sumaišomi, kad būtų gautas vienas jungtinis ėminys.

6.3.B. Kontroliuojant nepageidaujamas medžiagas arba produktus, kurie gali netolygiai pasiskirstyti pašaruose, pvz., aflatoksinus, rugių skalsę, ricinžolę ir crotalaria

Atskirieji ėminiai iš kiekvienos partijos dalies sumaišomi ir gaunamas 5.B.3 punkte nurodytas jungtinių ėminių skaičius, imantis priemonių užrašyti kiekvieno jungtinio ėminio kilmę.

6.4 Galutinių ėminių ruošimas

Kiekvieno jungtinio ėminio medžiaga gerai sumaišoma, kad būtų gautas homogenizuotas ėminys ( 21 ) Prireikus jungtinis ėminys iš pradžių sumažinamas bent iki 2 kg arba dviejų litrų (sumažintasis ėminys) mechaniniu arba automatiniu dalytuvu arba taikant ketvirčiavimo metodą.

Tada ruošiami bent trys maždaug vienodo kiekio galutiniai ėminiai, atitinkantys 5.A.4 arba 5.B.4 punktų kiekybinius reikalavimus. Kiekvienas ėminys sudedamas į atitinkamą talpyklą. Imamasi visų reikalingų atsargumo priemonių, kad gabenant arba saugant negalėtų pasikeisti ėminio sudėtis, jis nebūtų užterštas arba sufalsifikuotas.

6.5 Galutinių ėminių pakavimas

Talpyklos arba pakuotės plombuojamos ir ženklinamos (visa etiketė turi būti po plomba) taip, kad jų nebūtų galima atidaryti, nepažeidus plombos.

7. ĮRAŠAI APIE ĖMINIUS

Turi būti daromi įrašai apie visus ėminius, kad vienareikšmiškai būtų galima nustatyti kiekvieną partiją.

8. ĖMINIŲ PASKIRTIES VIETA

Bent vienas kiekvieno jungtinio ėminio galutinis ėminys kuo skubiau siunčiamas į įgaliotąją kontrolės laboratoriją kartu su analizę atliekančiam asmeniui būtina informacija.









II PRIEDAS

BENDROSIOS NUOSTATOS DĖL PAŠARŲ ANALIZĖS METODŲ

A. ĖMINIŲ RUOŠIMAS ANALIZEI

1. Tikslas

Toliau aprašytos procedūros taikomos analizei ruošiant į kontrolės laboratorijas atsiųstus galutinius ėminius, paimtus pagal I priede pateiktas nuostatas.

Šie ėminiai turi būti ruošiami taip, kad pagal analizės metodą sverti numatyto kiekio ėminiai būtų vienalyčiai ir atitiktų galutinius ėminius.

2. Taikytinos atsargumo priemonės

Ėminių ruošimo procedūra, kurios reikia laikytis, priklauso nuo taikomo analizės metodo. Todėl labai svarbu užtikrinti, kad ėminių ruošimo procedūra atitiktų taikomą analizės metodą.

Visi būtinosios operacijos turi būti atliktos taip, kad kiek įmanoma būtų išvengta ėminio užteršimo ir jo sudėties pokyčių.

Malama, maišoma ir sijojama kiek įmanoma greičiau, kad ėminį kuo mažiau veiktų oras ir šviesa. Nenaudojami malūnėliai ir smulkintuvai, kurie gali gerokai įkaitinti ėminį.

Šilumai ypač jautrių pašarų ėminius rekomenduojama malti rankiniu būdu. Be to, užtikrinama, kad pati aparatūra nebūtų užteršimo mikroelementais šaltiniu.

Jei ėminio paruošti neįmanoma gerokai nepakintant jo drėgmės kiekiui, jis nustatomas prieš ėminio ruošimą ir jį paruošus pagal III priedo A dalyje pateiktą metodą.

3. Procedūra

Ėminys dalijamas į analizei ir palyginimui skirtus atitinkamus poėminius, taikant reikiamus dalijimo būdus, pvz., pakaitinį perkasimą, stacionarųjį arba sukamąjį latakinį dalytuvą. Kūgio supylimo ir ketvirčiavimo metodas nerekomenduojamas, nes gali būti gauti poėminiai su didele dalijimo paklaida. Palyginamasis ėminys laikomas tinkamame švariame ir sausame, sandariai uždaromame inde, ir bent 100 g poėminiai ruošiami analizei kaip nurodyta toliau.

3.1 Pašarai, kuriuos galima malti be paruošimo

Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, prireikus visas sumaltas ėminys sijojamas per sietą su kvadratinėmis 1 mm dydžio akutėmis (pagal ISO R565 rekomendaciją). Vengiama malti labai smulkiai.

Sijotas ėminys sumaišomas ir sudedamas į tinkamą švarų ir sausą, sandariai užkemšamą indą. Dar kartą sumaišoma prieš sveriant analizei reikiamą ėminio kiekį.

3.2 Pašarai, kurie prieš malant džiovinami

Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, ėminys džiovinamas drėgmės kiekiui sumažinti iki 8–12 % taikant pradinio džiovinimo procedūrą, aprašytą III priedo A dalyje pateikto drėgmės nustatymo metodo 4.3 punkte. Tada tęsiama, kaip nurodyta 3.1 skirsnyje.

3.3 Skystieji arba pusiau skysti pašarai

Ėminys supilamas į tinkamą švarų ir sausą, sandariai užkemšamą indą. Dar kartą sumaišoma prieš sveriant analizei reikiamą ėminio kiekį.

3.4 Kiti pašarai

Ėminiai, kurių neįmanoma paruošti pagal kurią nors pirmiau pateiktą procedūrą, apdorojami taikant bet kurią kitą procedūrą, kuri užtikrintų, kad analizei pasverti ėminiai būtų vienalyčiai ir atitiktų galutinius ėminius.

4. Ėminių laikymas

Ėminiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Vitaminų analizei skirti ėminiai arba šviesai ypač jautrūs ėminiai laikomi rudo stiklo induose.

B. NUOSTATOS DĖL ANALIZĖS METODAMS NAUDOJAMŲ REAGENTŲ IR APARATŪROS

1. Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, visi analiziniai reagentai turi būti analiziškai gryni (a. g.). Atliekant pėdsakų analizę, reagentų grynumas turi būti patikrintas atliekant tuščiąjį bandymą. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali tekti papildomai gryninti reagentus.

2. Visoms tirpalų ruošimo, skiedimo, skalavimo arba plovimo operacijoms, apie kurias kalbama analizės metoduose, nenurodant naudojamo tirpiklio arba skiediklio tipo, turi būti naudojamas vanduo. Paprastai vanduo demineralizuojamas arba distiliuojamas. Konkrečiais atvejais, nurodytais analizės metode, jam turi būti taikomos specialios gryninimo procedūros.

3. Atsižvelgiant į paprastai kontrolės laboratorijų turimą įrangą, analizės metoduose nurodomi tik specialios paskirties arba tam tikru būdu naudojami prietaisai ir aparatūra. Jie turi būti švarūs, ypač kai reikia nustatyti mažus cheminių medžiagų kiekius.

C. ANALIZĖS METODŲ TAIKYMAS IR REZULTATŲ IŠRAIŠKA

1. Ekstrahavimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra ekstrahavimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta ekstrahavimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gautas ekstrahavimo veiksmingumas atitinka metodu nustatytos procedūros veiksmingumą.

2. Gryninimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra gryninimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta gryninimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gauti analizės rezultatai atitinka rezultatus, gautus taikant metodu nustatytą procedūrą.

3. Taikyto analizės metodo pateikimas ataskaitoje

Paprastai kiekvienai pašaruose esančiai cheminei medžiagai nustatyti pateikiamas vienas analizės metodas. Jei pateikiami keli metodai, kontrolės laboratorijos taikomas konkretus metodas turi būti nurodytas analizės ataskaitoje.

4. Nustatymų skaičius

Analizės ataskaitoje pateikiamas rezultatas turi būti tinkamo pakartojamumo vidutinė vertė, gauta atliekant mažiausiai du atskirų ėminio dalių nustatymus.

Tačiau, jei analizuojant nepageidaujamas medžiagas, pirmojo nustatymo rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros.

Jei atliekant nurodyto medžiagos arba sudedamosios dalies kiekio kontrolę, pirmojo nustatymo rezultatas patvirtina nurodytą kiekį, t. y. analizės rezultatas atitinka priimtiną nurodyto kiekio kitimo intervalą, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros.

Kai kuriais atvejais priimtinas kitimo intervalas yra apibrėžtas teisės aktuose, pvz., Tarybos direktyvoje 79/373/EEB ( 22 ).

5. Analizės rezultato pateikimas ataskaitoje

Analizės rezultatas turi būti išreikštas analizės metode nustatytu būdu; nurodant atitinkamą reikšminių skaitmenų skaičių ir prireikus darant pataisą dėl drėgmės kiekio galutiniame ėminyje prieš ruošimą.

6. Matavimo neapibrėžtis ir išgavos dydis atliekant nepageidaujamų medžiagų analizę

Dėl nepageidaujamų medžiagų, kaip apibrėžta Direktyvoje 2002/32/EB, įskaitant dioksinus ir dioksinų tipo PCB, laikoma, kad gyvūnų pašarams skirtas produktas neatitinka nustatyto didžiausio kiekio, jei manoma, kad analizės rezultatas viršija didžiausią kiekį, įskaitant išplėstinę matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą. Atitikčiai įvertinti naudojama analizuojant gauta koncentracija, atlikus išgavos dydžio pataisą ir ir atėmus išplėstinę matavimo neapibrėžtį. Ši procedūra taikoma tais atvejais, kai galima įvertinti analizės metodo matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą (tai, pvz., neįmanoma, kai atliekama mikroskopinė analizė).

Analizės rezultatas užrašomas taip (jei taikant analizės metodą galima įvertinti matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydį):

a) su pataisa dėl išgavos dydžio, nurodant išgavos dydį. Pataisa dėl išgavos dydžio nebūtina, jei jis yra 90–110 %;

b) kaip „x +/- U“, čia x – analizės rezultatas, U – išplėstinė matavimo neapibrėžtis, taikant aprėpties faktorių 2, kuris užtikrina maždaug 95 % patikimumo lygį.

Tačiau jei analizės rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė, ir su ta sąlyga, kad taikomos atitinkamos kokybės procedūros, o analizės tikslas yra tik patikrinti atitiktį teisinėms nuostatoms, analizės rezultatą būtų galima pateikti ataskaitoje be išgavos dydžio pataisos ir išgavos dydžio bei matavimo neapibrėžties tais atvejais galima nenurodyti.









III PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI, TAIKOMI PAŠARINIŲ MEDŽIAGŲ IR KOMBINUOTŲJŲ PAŠARŲ SUDĖČIAI KONTROLIUOTI

A. DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų drėgmės kiekį. Jei pašarai turi lakiųjų medžiagų, pvz., organinių rūgščių, reikia turėti omenyje, kad nustatant drėgmės kiekį nustatomas didelis kiekis lakiųjų medžiagų.

Jis netaikomas analizuojant pieno produktus kaip pašarus, mineralines medžiagas ir mišinius, kuriuos iš esmės sudaro mineralinės medžiagos, gyvūninius ir augalinius riebalus bei aliejus arba aliejingąsias sėklas ir vaisius.

2. Metodas

Ėminys džiovinamas nurodytomis sąlygomis, kurios priklauso nuo pašarų tipo. Masės sumažėjimas nustatomas sveriant. Tiriant kietuosius pašarus, kurių drėgmės kiekis didelis, būtina atlikti pradinį džiovinimą.

3. Aparatūra

3.1 Smulkintuvas, pagamintas iš drėgmės nesugeriančių medžiagų, kuris būtų lengvai valomas, kuriuo būtų galima greitai ir vienodai susmulkinti ėminį, per daug jam neįkaistant, ir kuris kiek įmanoma apsaugotų ėminį nuo sąlyčio su išorės oru ir atitiktų 4.1.1 ir 4.1.2 nustatytus reikalavimus (pvz., plaktukiniai ar vandeniu aušinami mikrosmulkintuvai, sudedamieji kūginiai malūnėliai, mažo apsisukimų dažnio arba krumpliaratiniai smulkintuvai).

3.2 Analizinės svarstyklės, tikslumas 1 mg.

3.3 Sausi korozijai atsparaus metalo arba stikliniai indai su sandariai uždengiamais dangčiais; darbinis paviršius ėminiui paskleisti maždaug 0,3 g/cm2 tankiu.

3.4 Elektrinė pastovios temperatūros džiovinimo spinta (± 2 oC), tinkamai ventiliuojama ir užtikrinanti greitą temperatūros reguliavimą ( 23 ).

3.5 Reguliuojama elektrinė vakuuminė džiovinimo spinta, turinti alyvos siurblį ir mechanizmą, kuriuo galima įleisti karšto sauso oro, arba naudojanti džioviklį (pvz., kalcio oksidą).

3.6 Eksikatorius su stora perforuota metalo arba porceliano plokšte ir veiksmingu džiovikliu.

4. Procedūra

N.B Šiame skirsnyje aprašyti veiksmai turi būti atliekami iškart po ėminių pakuočių atidarymo. Analizė turi būti atliekama bent du kartus.

4.1 Ėminių ruošimas

4.1.1 Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.1.2 ir 4.1.3

Paimama bent 50 g ėminio. Prireikus ėminys susmulkinamas arba sumalamas taip, kad būtų išvengta drėgmės kiekio pokyčio (žr. 6).

4.1.2 Javai ir kruopos

Paimama bent 50 g ėminio. Susmulkinama į daleles, kurių bent 50 % išbyra per 0,5 mm akučių sietą ir ant 1 mm skersmens apvalių akučių sieto lieka ne daugiau kaip 10 %.

4.1.3 Skysti ar pastų tipo pašarai, kuriuos daugiausia sudaro aliejai ir riebalai

Maždaug 25 g ėminio pasveriama 10 mg tikslumu, įdedamas reikiamas kiekis sauso smėlio, pasverto 10 mg tikslumu, ir maišoma tol, kol gaunamas vienalytis produktas.

4.2 Džiovinimas

4.2.1 Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.2.2 ir 4.2.3

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 1 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 103 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama keturias valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 103 oC. Indas uždengiamas dangčiu, išimamas iš džiovinimo spintos, 30–45 min laikomas eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

Jei pašarus daugiausia sudaro aliejai ir riebalai, džiovinama spintoje dar 30 min 130 oC temperatūroje. Dviejų svėrimo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1 % drėgmės kiekio.

4.2.2 Javai, miltai, kruopos ir rupūs miltai

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 130 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama dvi valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 130 oC. Indas uždengiamas dangčiu, išimamas iš džiovinimo spintos, 30–45 min laikomas eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

4.2.3 Kombinuotieji pašarai, kurie turi daugiau nei 4 % sacharozės arba laktozės: pašarinės žaliavos, pvz., saldžiosios ceratonijos ankštys, hidrolizuotieji javų produktai, salyklas, džiovinti runkelių griežiniai, žuvų hidrolizatai ir cukraus žlaugtai; kombinuotieji pašarai, turintys daugiau nei 25 % mineralinių druskų, įskaitant kristalizacinį vandenį. Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į vakuuminę džiovinimo spintą (3.5), įkaitintą iki 80–85 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Slėgis sumažinamas iki 100 mm Hg stulpelio ir tokiame slėgyje keturias valandas džiovinama karšto sauso oro srove arba džiovikliu (20 ėminių reikia apie 300 g). Pastaruoju atveju, pasiekus nurodytą slėgį, vakuuminis siurblys išjungiamas. Džiovinimo trukmė skaičiuojama nuo to momento, kai džiovinimo spintos temperatūra vėl pakyla iki 80–85 oC. Džiovinimo spintos slėgis atsargiai padidinamas iki atmosferos slėgio. Spinta atidaroma, indas nedelsiant uždengiamas dangčiu, išimamas iš spintos, laikomas 30–45 min eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu. Džiovinama dar 30 min vakuuminėje džiovinimo spintoje 80–85 oC temperatūroje ir dar kartą pasveriama. Šių dviejų svėrimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1 % drėgmės kiekio.

4.3 Pradinis džiovinimas

4.3.1 Pašarai, išskyrus išvardytus 4.3.2

Kietieji labai drėgni pašarai, kuriuos sunku susmulkinti, turi būti iš anksto džiovinami taip:

Į tinkamą indą (pvz., ant 20 × 12 cm aliuminio plokštės su 0,5 cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkinto ėminio 10 mg tikslumu (prireikus presuotus arba į gabalus sulipusius pašarus galima kažkiek sutrupinti). Džiovinama džiovinimo spintoje 60–70 oC temperatūroje tol, kol drėgmės kiekis nesumažėja iki 8–12 %. Ėminys išimamas iš džiovinimo spintos, neuždengtas valandą vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumu. Nedelsiant susmulkinamas, kaip nurodyta 4.1.1, ir džiovinamas, kaip nurodyta 4.2.1 arba 4.2.3, atsižvelgiant į pašarų tipą.

4.3.2 Javai

Javai, kurių drėgmės kiekis didesnis nei 17 % turi būti iš anksto džiovinami taip:

Į tinkamą indą (pvz., ant 20 × 12 cm aliuminio plokštės su 0,5 cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkinto ėminio 10 mg tikslumu. 5–7 min džiovinama džiovinimo spintoje 130 oC temperatūroje. Ėminys išimamas iš džiovinimo spintos, neuždengtas dvi valandas vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumu. Nedelsiant susmulkinamas, kaip nurodyta 4.1.2, ir džiovinamas, kaip nurodyta 4.2.2.

5. Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio masės procentais (X) apskaičiuojamas pagal šias formules:

5.1 Džiovinimas, kai netaikomas pradinis džiovinimas

kurioje:

m = tiriamojo ėminio pradinis svoris gramais;

m0 = išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais.

5.2 Džiovinimas, kai taikomas pradinis džiovinimas

kurioje:

m = tiriamojo ėminio pradinis svoris gramais,

m1 = tiriamojo ėminio svoris po pradinio džiovinimo gramais,

m2 = tiriamojo ėminio svoris po smulkinimo arba malimo gramais,

m0 = išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais.

5.3 Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečių matavimų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 0,2 % drėgmės kiekio absoliučiosios vertės.

6. Pastaba

Jei paaiškėja, kad ėminį būtina susmulkinti, ir pastebima, kad produkto drėgmės kiekis pakito, pašarų komponentų analizės rezultatus reikia perskaičiuoti pagal pradinės būklės ėminio drėgmės kiekį.

B. GYVŪNINIŲ IR AUGALINIŲ RIEBALŲ BEI ALIEJŲ DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti vandens ir lakiųjų medžiagų kiekį gyvūninės ir augalinės kilmės riebaluose bei aliejuose.

2. Metodas

Ėminys džiovinamas 103 oC temperatūroje iki pastoviosios masės (masės sumažėjimas tarp dviejų paeiliui atliekamų svėrimų turi būti mažesnis arba lygus 1 mg). Nuodžiūvis nustatomas sveriant.

3. Aparatūra

3.1 Indas plokščiu dugnu iš korozijai atsparios medžiagos, skersmuo 8–9 cm, aukštis – 3 cm.

3.2 Maždaug 10 cm ilgio gyvsidabrio termometras, su padalomis nuo 80 oC iki bent 110 oC, su pastorintu burbuliuku ir plėtimosi vamzdžiu viršutiniame gale.

3.3 Smėlio vonia arba elektrinė kaitlentė.

3.4 Eksikatorius su veiksmingu džiovikliu.

3.5 Analizinės svarstyklės.

4. Procedūra

Į sausą pasvertą indą (3.1), į kurį įdėtas termometras (3.2), 1 mg tikslumu pasveriama apie 20 g homogenizuoto ėminio. Nuolat maišant termometru, kaitinama ant smėlio vonios arba kaitlentės (3.3) taip, kad maždaug per 7 min temperatūra pasiektų 90 oC.

Kaitinimas sumažinamas, stebint, kaip dažnai nuo indo dugno kyla burbuliukai. Temperatūra turi būti ne aukštesnė kaip 105 oC. Maišoma toliau, braukiant per indo dugną tol, kol nebesusidaro burbuliukų.

Siekiant užtikrinti visišką drėgmės pašalinimą, dar keletą kartų kaitinama iki 103 oC ± 2 oC, kaskart tarp kaitinimų atvėsinant ėminį iki 93 oC. Tada paliekama eksikatoriuje (3.4) atvėsti iki kambario temperatūros ir pasveriama. Šis veiksmas kartojamas tol, kol ėminio svoris tarp iš eilės atliekamų kaitinimo veiksmų sumažėja ne daugiau kaip 2 mg.

N.B Ėminio svorio padidėjimas po kartotinių kaitinimo veiksmų rodo, kad oksiduojasi riebalai, todėl šiuo atveju rezultatai skaičiuojami pagal svėrimo duomenis, gautus prieš tai, kai svoris pradėjo didėti.

5. Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio procentine dalimi (X) apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m = tiriamojo ėminio svoris gramais;

m1 = indo su turiniu svoris prieš kaitinimą gramais;

m2 = indo du turiniu svoris po kaitinimo gramais.

Mažesni nei 0,05 % rezultatai turi būti užrašomi kaip „mažiau nei 0,05 %“.

Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečiai atliktos drėgmės kiekio analizės rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,05 % absoliučiąja verte.

C. ŽALIŲ BALTYMŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti žalių baltymų kiekį pašaruose pagal Kjeldalio metodu nustatomą azoto kiekį.

2. Metodas

Ėminys skaidomas sieros rūgštimi esant katalizatoriui. Rūgštus tirpalas šarminamas natrio hidroksido tirpalu. Gautas amoniakas distiliuojamas ir surenkamas žinomame kiekyje sieros rūgšties, kurios perteklius titruojamas natrio hidroksido standartiniu tirpalu.

Pagal kitą metodą išsiskyręs amoniakas distiliuojamas į tirpalą su boro rūgšties pertekliumi, tada titruojama vandenilio chlorido rūgšties arba sieros rūgšties tirpalu.

3. Reagentai

3.1 Kalio sulfatas

3.2 Katalizatorius: vario (II) oksidas CuO arba vario (II) sulfato pentahidratas CuSO4 5H2O

3.3 Cinko granulės

3.4 Sieros rūgštis, ρ 20 = 1,84 g/ml

3.5 Sieros rūgštis, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6 Sieros rūgštis, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7 Sieros rūgštis, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8 Indikatorius metilraudonasis: 300 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio, σ = 95–96 % (V/V)

3.9 Natrio hidroksido tirpalas (galima naudoti techninį hidroksidą) β = 40 g/100 ml (m/V: 40 %)

3.10 Natrio hidroksidas, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11 Natrio hidroksidas, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12 Pemzos granulės, išplautos vandenilio chlorido rūgštyje ir iškaitintos

3.13 Acetanilidas (lyd. temp. = 114 oC, N kiekis = 10,36 %)

3.14 Sacharozė (neturinti azoto)

3.15 Boro rūgštis (H3BO3)

3.16 Indikatoriaus metilraudonojo tirpalas: 100 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio

3.17 Bromkrezolio žaliojo tirpalas: 100 mg bromkrezolio žaliojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio

3.18 Boro rūgšties tirpalas (10 g/l–40 g/l atsižvelgiant į naudojamą aparatūrą) Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, į boro rūgšties tirpalus turi būti įdėta metilraudonojo ir bromkrezolio žaliojo indikatorių. Jei ruošiamas 1 litras boro rūgšties tirpalo, prieš skiedžiant iki žymės įpilama 7 ml metilraudonojo indikatoriaus tirpalo (3.16) ir 10 ml bromkrezolio žaliojo tirpalo (3.17). Priklausomai nuo naudojamo vandens, skirtingų partijų boro rūgšties tirpalų pH vertė gali skirtis. Dažnai būtina koreguoti nedideliu šarmo tirpalo tūriu, kad būtų gautas teigiamas tuščiasis ėminys. Pastaba. Paprastai tinkamai korekcijai pakanka maždaug 3 ml–4 ml NaOH (3.11) 1 litrui 10 g/l boro rūgšties. Tirpalas laikomas kambario temperatūroje, apsaugotas nuo šviesos ir amoniako garų šaltinių.

3.19 Vandenilio chlorido rūgšties standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas c(HCl) = 0,10 mol/l Pastaba. Galima naudoti kitokios koncentracijos tūrinės titrimetrijos tirpalus (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ir 3.19), jei apskaičiuojant būtų daroma korekcija dėl koncentracijos. Koncentracijos vertės visuomet išreiškiamos keturiais skaičiais po kablelio.

4. Aparatūra

Aparatūra, tinkama skaidyti, distiliuoti ir titruoti pagal Kjeldalio procedūrą.

5. Procedūra

5.1 Skaidymas

1 g ėminio pasveriama 0,001 g tikslumu ir ėminys supilamas į skaidymo aparato kolbą. Įdedama 15 g kalio sulfato (3.1) ir atitinkamas kiekis katalizatoriaus (3.2) (0,3–0,4 g vario oksido arba 0,9–1,2 g vario (II) sulfato pentahidrato), įpilama 25 ml sieros rūgšties (3.4, prireikus įmetamos kelios pemzos granulės (3.12) ir sumaišoma.

Kolba iš pradžių šildoma, kartkartėmis ją sukiojant, ant nestiprios ugnies tol, kol masė suanglėja ir nelieka putų; tada šildoma stipriau tol, kol tirpalas pradeda nuolat virti. Kaitinimas yra pakankamas, jei verdanti rūgštis kondensuojasi ant kolbos sienelių. Reikia žiūrėti, kad neperkaistų šoninės kolbos sienelės ir prie jų nepriliptų organinių medžiagų dalelių.

Kai tirpalas tampa skaidrus ir šviesiai žalias, virinama dar dvi valandas, vėliau paliekama atvėsti.

5.2 Distiliavimas

Atsargiai įpilama pakankamai vandens, kad visiškai ištirptų sulfatai. Paliekama atvėsti ir įdedamos kelios cinko granulės (3.3). Tęsiama pagal 5.2.1 arba 5.2.2.

5.2.1 Distiliavimas į sieros rūgštį

Į distiliavimo aparato surinkimo kolbą įpilama lygiai 25 ml sieros rūgšties (3.5) arba (3.7) tirpalo, atsižvelgiant į tai, kiek ėminyje galėtų būti azoto. Įlašinami keli lašai metilraudonojo indikatoriaus (3.8).

Skaidymo aparato kolba prijungiama prie distiliavimo aparato kondensatoriaus, kurio antgalis ne mažiau kaip per centimetrą įmerkiamas į surinkimo kolboje esantį skystį (žr. 8.3 pastabą). Neleidžiant amoniakui garuoti (žr. 8.1 pastabą), į kolbą lėtai įpilama 100 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9). Kolba kaitinama tol, kol amoniakas baigiamas distiliuoti.

5.2.2 Distiliavimas į boro rūgštį

Jei amoniakas distiliate titruojamas rankiniu būdu, taikoma toliau nurodyta procedūra. Jei distiliavimo įrenginys yra visiškai automatizuotas, įskaitant amoniako distiliate titravimą, laikomasi gamintojo instrukcijų dėl distiliavimo įrenginio naudojimo.

Surinkimo kolba su 25 ml–30 ml boro rūgšties tirpalo (3.18) statoma po kondensatoriaus išleidžiamuoju antgaliu taip, kad tiekimo vamzdis būtų žemiau boro rūgšties perteklių turinčio tirpalo paviršiaus. Distiliavimo įrenginys nustatomas dozuoti 50 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9). Distiliavimo įrenginys naudojamas pagal gamintojo instrukcijas ir amoniakas distiliuojamas įpilant natrio hidroksido tirpalo. Distiliatas surenkamas į boro rūgšties tirpalą. Distiliato kiekis (distiliavimo garais trukmė) priklauso nuo azoto kiekio ėminyje. Laikomasi gamintojo instrukcijų.

Pastaba. Pusiau automatizuotame distiliavimo įrenginyje natrio hidroksido pertekliaus įpylimas ir distiliavimas garais atliekamas automatiškai.

5.3 Titravimas

Tęsiama pagal 5.3.1 arba 5.3.2.

5.3.1 Sieros rūgštis

Atsižvelgiant į naudotos sieros rūgšties koncentraciją, sieros rūgšties perteklius surinkimo kolboje titruojamas natrio šarmo (3.10 arba 3.11) tirpalu tol, kol pasiekiamas ekvivalentinis taškas.

5.3.2 Boro rūgštis

Surinkimo kolbos turinys titruojamas iš biuretės vandenilio chlorido rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijos tirpalu (3.19) arba sieros rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijos tirpalu (3.6) ir užrašomas sunaudoto titranto tūris.

Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, ekvivalentinis taškas pasiekiamas, pirmą kartą atsiradus tirpalo rožinei spalvai. Biuretės rodmuo įvertinamas 0,05 ml tikslumu. Apšviesta magnetinė maišyklė arba fotometrinis detektorius gali padėti lengviau pamatyti ekvivalentinį tašką.

Tai galima atlikti automatiškai, naudojant distiliavimo garais įrenginį su automatiniu titravimu.

Konkretus distiliatorius (titratorius) naudojamas pagal gamintojo instrukcijas.

Pastaba. Naudojant automatizuotą titravimo sistemą, titruoti pradedama iškart, kai prasideda distiliavimas ir sunaudojama 1 % boro rūgšties tirpalo (3.18). Jei naudojamas visiškai automatizuotas distiliavimo įrenginys, amoniako automatinį titravimą galima atlikti naudojant potenciometrinę pH sistemą ekvivalentiniam taškui nustatyti. Šiuo atveju naudojamas automatinis titratorius su pH-metru. pH-metras tinkamai sukalibruotas pH 4–pH 7 intervale pagal įprastas laboratorines pH-metro kalibravimo procedūras. Titravimo ekvivalentinis taškas pagal pH atitinka pH vertę 4,6, šis taškas yra stačiausias titravimo kreivės taškas (perlinkio taškas).

5.4 Tuščiasis bandymas

Siekiant patvirtinti, kad reagentai neturi azoto, atliekamas tuščiasis bandymas (skaidymas, distiliavimas ir titravimas), vietoj ėminio naudojant 1 g sacharozės (3.14).

6. Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojama pagal 6.1 arba 6.2.

6.1 Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.1

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

V0 = NaOH (3.10 arba 3.11) tūris, sunaudotas tuščiajam bandymui, ml;

V1 = NaOH (3.10 arba 3.11) tūris, sunaudotas ėminiui titruoti, ml;

c = natrio hidroksido (3.10 arba 3.11) koncentracija, mol/l;

m = ėminio svoris, g.

6.2 Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.2

6.2.1 Titravimas vandenilio chlorido rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m = tiriamosios dalies svoris, g;

c = vandenilio chlorido rūgšties standartinio tūrinės titrimetrijos tirpalo (3.19) koncentracija, mol/l;

V0 = tuščiajam bandymui sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris, ml;

V1 = tiriamajai daliai sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris, ml.

6.2.2 Titravimas sieros rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m = tiriamosios dalies svoris, g;

c = sieros rūgšties standartinio tūrinės titrimetrijos tirpalo (3.6) koncentracija, mol/l;

V0 = tuščiajam bandymui sunaudotas sieros rūgšties (3.6) tūris, ml;

V1 = tiriamajai daliai sunaudotas sieros rūgšties (3.6) tūris, ml.

7. Metodo tikrinimas

7.1 Pakartojamumas

Dviejų rezultatų, gautų atliekant du lygiagrečius to paties ėminio matavimus, skirtumas neturi būti didesnis nei:

— 0,2 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis mažesnis nei 20 %,

— 1,0 % didžiausios vertės, kai žalių baltymų kiekis 20–40 %,

— 0,4 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis didesnis nei 40 %.

7.2 Tikslumas

Atliekama 1,5–2,0 g acetanilido (3.13) analizė (skaidymas, distiliavimas ir titravimas), įdėjus 1 g sacharozės (3.14). 1 g acetilanilido sunaudoja 14,80 ml sieros rūgšties (3.5). Išgavos dydis turi būti ne mažesnis nei 99 %.

8. Pastabos

8.1 Aparatūra gali būti rankinio, pusiau automatinio arba automatinio tipo. Jei naudojama aparatūra, kai ėminį po skaidymo reikia supilti į distiliavimo įrenginį, turi būti supilama be nuostolių. Jei distiliavimo aparato kolba neturi lašinamojo piltuvo, natrio šarmo tirpalas įpilamas prieš pat kolbą prijungiant prie kondensatoriaus, skystį iš lėto pilant kolbos sienele.

8.2 Jei skaidymo produktas sukietėja, analizė pradedama iš naujo su didesniu nei pirmiau nurodyta sieros rūgšties tirpalo (3.4) kiekiu.

8.3 Produktams, kuriuose azoto kiekis nedidelis, į surinkimo kolbą įpilamo sieros rūgšties tirpalo (3.7) tūris prireikus gali būti sumažintas iki 10 arba 15 ml, skiedžiant vandeniu iki 25 ml.

8.4 Atliekant įprastą analizę, galima taikyti alternatyviuosius metodus žalių baltymų kiekiui nustatyti, bet šioje C dalyje aprašytas Kjeldalio metodas yra pamatinis metodas. Rezultatų gautų alternatyviaisiais metodais (pvz., DUMAS) lygiavertiškumas palyginti su pamatiniu metodu turi būti įrodytas kiekvienai matricai atskirai. Kadangi alternatyviuoju metodu gauti rezultatai ir pamatiniu metodu gauti rezultatai gali šiek tiek skirtis, netgi patikrinus lygiavertiškumą, analizės ataskaitoje būtina nurodyti žalių baltymų kiekiui nustatyti taikytą analizės metodą.

D. KARBAMIDO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti karbamido kiekį pašaruose.

2. Metodas

Ėminys suspenduojamas vandenyje kartu su skaidrinančiąja medžiaga. Suspensija filtruojama. Dedama 4-dimetilaminobenzaldehido (4-DMAB) ir karbamido kiekis filtrate nustatomas matuojant optinį tankį, esant bangos ilgiui 420 nm.

3. Reagentai

3.1 4-dimetilaminobenzaldehido tirpalas: 1,6 g 4-DMAB ištirpinama 100 ml 96 % etanolio ir įpilama 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (ρ20 = 1,19 g/ml). Šį reagentą galima laikyti ne ilgiau kaip dvi savaitės.

3.2 Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato, Zn(CH3COO)2·2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.3 Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II), K4Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4 Aktyvintosios anglys, kurios nesugeria karbamido (turi būti patikrinta).

3.5 Karbamido 0,1 % (m/V) tirpalas.

4. Aparatūra

4.1 Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

4.2 Mėgintuvėliai: 160 × 16 mm su šlifo kamščiais.

4.3 Spektrofotometras.

5. Procedūra

5.1 Ėminio analizė

1 mg tikslumu pasveriama 2 g ėminio, kuris kartu su 1 g aktyvintų anglių (3.4) supilamas į 500 ml matavimo kolbą. Įpilama 400 ml vandens ir 5 ml Carrez I (3.2) tirpalo, maždaug 30 s maišoma ir įpilama 5 ml Carrez II (3.3) tirpalo. Trisdešimt minučių tirpalas maišomas vartytuve. Tirpalas skiedžiamas vandeniu iki žymės, sumaišomas ir filtruojamas.

Į mėgintuvėlius su šlifo kamščiais įpilama 5 ml skaidraus bespalvio filtrato, 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1) ir sumaišoma. Mėgintuvėliai statomi į vandens vonią 20 oC (+/- 4 oC) temperatūroje. Po penkiolikos minučių spektrofotometru matuojamas ėminio tirpalo optinis tankis, esant 420 nm bangos ilgiui. Palyginamuoju tirpalu naudojamas tuščiam ėminiui ruošti naudojamų reagentų tirpalas.

5.2 Kalibravimo kreivė

Į 100 ml matavimo kolbas įpilama 1, 2, 4, 5 ir 10 ml karbamido tirpalo (3.5) ir skiedžiama vandeniu iki žymės. Paimama po 5 ml kiekvieno tirpalo, į kiekvieną iš jų įpilama 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1), sumaišoma ir, kaip nurodyta anksčiau, matuojamas jų optinis tankis, lyginant su kontroliniu tirpalu, turinčiu 5 ml 4-DMAB ir 5 ml vandens, neturinčio karbamido. Brėžiama kalibravimo kreivė.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Pagal kalibravimo kreivę nustatomas karbamido kiekis ėminyje.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7. Pastabos

7.1 Tais atvejais, kai karbamido kiekis yra didesnis nei 3 %, imama 1 g ėminio arba pradinis tirpalas skiedžiamas tiek, kad jo 500 ml būtų ne daugiau nei 50 mg karbamido.

7.2 Tuo atveju, kai karbamido yra mažai, ėminio kiekis padidinamas tiek, kad filtratas dar liktų skaidrus ir bespalvis.

7.3 Jei ėminyje yra nesudėtingų azoto junginių, pvz., aminorūgščių, optinis tankis matuojamas esant 435 nm bangos ilgiui.

E. LAKIŲJŲ AZOTO BAZIŲ NUSTATYMAS

I. MIKRODIFUZIJOS METODAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančių lakiųjų azoto bazių kiekį, išreikštą amoniaku.

2. Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu, tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas. Lakiosios azoto bazės išstumiamos mikrodifuzijos būdu, naudojant kalio karbonato tirpalą, surenkamos boro rūgšties tirpale ir titruojamos sieros rūgštimi.

3. Reagentai

3.1 Trichloracto rūgšties tirpalas, 20 % (m/V).

3.2 Indikatorius: 33 mg bromkrezolio žaliojo ir 65 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml 95–96 % (V/V) etanolio.

3.3 Boro rūgšties tirpalas: 1 l matavimo kolboje ištirpinama 10 g boro rūgšties, 200 ml 95–96 % (V/V) etanolio ir 700 ml vandens. Įpilama 10 ml indikatoriaus (3.2). Sumaišoma ir, jei reikia, gaunama šviesiai raudona tirpalo spalva, įpilant natrio hidroksido tirpalo. 1 ml šio tirpalo suriša ne daugiau nei 300 μg NH3.

3.4 Sotusis kalio karbonato tirpalas: 100 ml verdančio vandens ištirpinama 100 g kalio karbonato. Atvėsinama ir filtruojama.

3.5 Sieros rūgštis 0,01 mol/l.

4. Aparatūra

4.1 Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

4.2 Stiklinės arba plastikinės Conway kiuvetės (žr. schemą).

4.3 Mikrobiuretės, graduotos 1/100 ml padalomis.

5. Procedūra

10 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir naudojant 100 ml vandens supilama į 200 ml matavimo kolbą. 30 min maišoma maišymo būgne. Įpilama 50 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.1), skiedžiama vandeniu iki žymės, stipriai supurtoma ir filtruojama per gofruotąjį filtrą.

Pipete įlašinama 1 ml boro rūgšties tirpalo (3.3) į Conway kiuvetės centrinę dalį ir 1 ml ėminio filtrato į kiuvetės išorinį žiedą. Iš dalies uždengiama tepalu suteptu dangčiu. Į išorinį žiedą greitai įlašinama 1 ml sočiojo kalio karbonato tirpalo (3.4) ir uždengiama taip, kad į kiuvetę nepatektų oro. Kiuvetė atsargiai sukiojama apie ašį horizontalioje plokštumoje taip, kad abu reagentai susimaišytų. Inkubuojama kambario temperatūroje bent keturias valandas arba 40 oC temperatūroje vieną valandą.

Lakiosios bazės boro rūgšties tirpale iš mikrobiuretės (4.3) titruojamos 0,01 mol/l sieros rūgštimi (3.5).

Pagal tą pačią procedūrą atliekamas tuščiasis bandymas, bet be analizuojamo ėminio.

6. Rezultatų apskaičiavimas

1 ml 0,01 mol/l H2SO4 atitinka 0,34 mg amoniako.

Rezultatai išreiškiami ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

— 10 % santykinės vertės, kai amoniako kiekis mažesnis nei 1,0 %;

— 0,1 % absoliučiąja verte, kai amoniako kiekis 1,0 % arba didesnis.

7. Pastaba

Jei amoniako kiekis ėminyje didesnis nei 0,6 %, pradinis filtratas skiedžiamas.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II DISTILIAVIMO METODAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti lakiųjų azoto bazių kiekį, išreikštą amoniaku, žuvies miltuose, kuriuose beveik nėra karbamido. Jį galima taikyti tik mažesniam nei 0,25 % amoniako kiekiui.

2. Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu, tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas. Lakiosios azoto bazės išstumiamos virimo temperatūroje, pridedant magnio oksido, ir surenkamos tam tikrame kiekyje sieros rūgšties, kurios perteklius atvirkščiai titruojamas natrio hidroksido tirpalu.

3. Reagentai

3.1 Trichloracto rūgšties tirpalas, 20 % (m/V).

3.2 Magnio oksidas.

3.3 Priešpučio emulsija (pvz., siloksanas).

3.4 Sieros rūgšties 0,05 mol/l tirpalas.

3.5 Natrio hidroksido 0,1 mol/l tirpalas.

3.6 Metilraudonojo tirpalas, 0,3 % tirpalas 95–96 % (V/V) etanolyje.

4. Aparatūra

4.1 Maišiklis (vartytuvas), dažnis maždaug 35–40 sūk./min.

4.2 Distiliavimo aparatas, Kjeldalio tipo.

5. Procedūra

10 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir naudojant 100 ml vandens supilama į 200 ml matavimo kolbą. 30 min maišoma maišymo būgne. Įpilama 50 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.1), skiedžiama vandeniu iki žymės, stipriai supurtoma ir filtruojama per gofruotąjį filtrą.

Paimamas skaidraus filtrato kiekis, atitinkantis numatomą lakiųjų azoto bazių kiekį (paprastai reikia 100 ml). Skiedžiama iki 200 ml, įdedama 2 g magnio oksido (3.2) ir įlašinami keli lašai priešpučio emulsijos (3.3). Tirpalas turi būti šarminis pagal lakmusą; priešingu atveju įdedama dar šiek tiek magnio oksido (3.2). Tęsiama pagal analizės metodo, taikomo žalių baltymų kiekiui nustatyti (šio priedo C dalis), 5.2 ir 5.3 punktus.

Pagal tą pačią procedūrą atliekamas tuščiasis bandymas, bet be analizuojamo ėminio.

6. Rezultatų apskaičiavimas

1 ml 0,05 mol/l H2SO4 atitinka 1,7 mg amoniako.

Rezultatai išreiškiami ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 10 % amoniako santykinės vertės.

F. AMINO RŪGŠČIŲ (IŠSKYRUS TRIPTOFANĄ) NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Naudojant aminorūgščių analizatorių, šiuo metodu galima nustatyti laisvųjų (sintetinių ir gamtinių) amino rūgščių ir suminį (peptidų ir laisvųjų) aminorūgščių kiekį pašaruose. Šis metodas tinka šioms aminorūgštims: cisteinui (cistinui), metioninui, lizinui, treoninui, alaninui, argininui, asparto ir glutamino rūgštims, glicinui, histidinui, izoleucinui, leucinui, fenilalaninui, prolinui, serinui, tirozinui ir valinui.

Šiuo metodu negalima atskirti aminorūgščių druskų ir negalima atskirti aminorūgščių D-ir L-formų. Metodas netinka triptofano arba hidroksigrupę turintiems aminorūgščių analogams nustatyti.

2. Metodas

2.1 Laisvosios aminorūgštys

Laisvosios aminorūgštys ekstrahuojamos praskiesta vandenilio chlorido rūgštimi. Kartu ekstrahuojamos azoto turinčios makromolekulės nusodinamos sulfosalicilo rūgštimi ir atskiriamos filtruojant. Nustatoma filtruoto tirpalo pH vertė 2,20. Aminorūgštys atskiriamos jonų mainų chromatografija ir nustatomos fotometriškai vykdant reakciją su ninhidrinu, kai bangos ilgis 570 nm.

2.2 Suminis aminorūgščių kiekis

Pasirinkta procedūra priklauso nuo tiriamų aminorūgščių. Cisteinas (cistinas) ir metioninas prieš hidrolizę turi būti oksiduojami iki cistino rūgšties ir metionino sulfono. Tirozinas turi būti nustatomas neoksiduotų ėminių hidrolizatuose. Visos kitos 1 skirsnyje išvardytos aminorūgštys gali būti nustatomos arba oksiduotuose, arba neoksiduotuose ėminiuose.

Oksidacija atliekama peroksiskruzdžių rūgšties ir fenolio mišiniu 0 oC temperatūroje. Oksidacijos reagento perteklius skaidomas natrio disulfitu. Oksiduoti ar neoksiduoti ėminiai 23 valandas hidrolizuojami vandenilio chlorido rūgštimi (3.20). Nustatoma hidrolizatų pH vertė 2,20. Aminorūgštys atskiriamos taikant jonų mainų chromatografiją ir nustatomos fotometriniu metodu vykdant reakciją su ninhidrinu, esant 570 nm (prolinui – 440 nm).

3. Reagentai

Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba atitinkamos kokybės (elektrinis laidis < 10 μS) vanduo.

3.1 Vandenilio peroksidas, w (w/w) = 30 %.

3.2 Skruzdžių rūgštis, w (w/w) = 98–100 %.

3.3 Fenolis.

3.4 Natrio disulfitas.

3.5 Natrio hidroksidas.

3.6 5-sulfosalicilo rūgšties dihidratas.

3.7 Vandenilio chlorido rūgštis, tankis maždaug 1,18 g/ml.

3.8 trinatrio citrato dihidratas.

3.9 2,2'-tiodietanolis (tiodiglikolis).

3.10 Natrio chloridas.

3.11 Ninhidrinas.

3.12 Petroleteris, virimo temperatūros intervalas 40–60 oC.

3.13 Norleucinas arba kitas junginys, kurį galima naudoti kaip vidinį etaloną.

3.14 Azoto dujos (< 10 ppm deguonies).

3.15 1-oktanolis.

3.16 Aminorūgštys.

3.16.1 1 skirsnyje išvardytų medžiagų etalonai. Grynieji junginiai, neturintys kristalizacinio vandens. Džiovinami vakuume virš P2O5 arba H2SO4 likus savaitei iki naudojimo.

3.16.2 Cistino rūgštis.

3.16.3 Metionino sulfonas.

3.17 Natrio hidroksido tirpalas, c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

3.18 Natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

3.19 Skruzdžių rūgšties ir fenolio tirpalas: 889 g skruzdžių rūgšties (3.2) sumaišoma su 111 g vandens ir įdedama 4,73 g fenolio (3.3).

3.20 Hidrolizės mišinys, c = 6 mol/l HCl tirpalas, turintis 1 g/l fenolio: įdedama 1 g fenolio (3.3) į 492 ml HCl (3.7) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.21 Ekstrahavimo mišinys, c = 0,1 mol/l HCl tirpalas, turintis 2 % tiodiglikolio: paimama 8,2 ml HCl (3.7), skiedžiama maždaug 900 ml vandens, įpilama 20 ml tiodiglikolio (3.9) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro (tiesiogiai nemaišyti 3.7 ir 3.9).

3.22 5-sulfosalicilo rūgštis, ß = 6 %: 60 g 5-sulfosalicilo rūgšties (3.6) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.23 Oksidavimo mišinys (peroksiskruzdžių rūgštis ir fenolis): Mažoje stiklinėje sumaišoma 0,5 ml vandenilio peroksido (3.1) ir 4,5 ml skruzdžių rūgšties bei fenolio tirpalo (3.19). Laikoma 1 val. 20–30 oC temperatūroje, kad susidarytų peroksiskruzdžių rūgštis, ir prieš supilant į ėminį šaldoma ledo ir vandens vonioje (15 min). Įspėjimas. Vengiama patekimo ant odos ir dėvimi apsauginiai drabužiai.

3.24 Citratinis buferinis tirpalas, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: maždaug 800 ml vandens ištirpinama 19,61 g natrio citrato (3.8), 5 ml tiodiglikolio (3.9), 1 g fenolio (3.3) ir 16,50 ml HCl (3.7). Nustatoma pH vertė 2,20. Skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.25 Plovimo buferiniai tirpalai, paruošti pagal naudojamo analizatoriaus (4.9) sąlygas.

3.26 Ninhidrino reagentas ruošiamas pagal analizatoriaus (4.9) sąlygas.

3.27 Aminorūgščių etaloniniai tirpalai. Šie tirpalai laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

3.27.1 Aminorūgščių pradiniai etaloniniai tirpalai (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml kiekvienos rūgšties tirpalas vandenilio chlorido rūgštyje. Galima naudoti esančius prekyboje.

3.27.2 Cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinis etaloninis tirpalas, c = 1,25 μmol/ml. 0,2115 g cistino rūgšties (3.16.2) ir 0,2265 g metionino sulfono (3.16.3) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24) 1 litro matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 12 mėnesių. Šis tirpalas nenaudojamas, jei pradiniame etaloniniame tirpale (3.27.1) yra cistino rūgšties ir metionino sulfono.

3.27.3 Pradinis vidinio etalono, pvz.: norleucino, tirpalas, c = 20 μmol/ml. 0,6560 g norleucino (3.13) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24) 250 ml matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 6 mėnesius.

3.27.4 Etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalas, naudojamas hidrolizatams, c = 5 nmol/50 μl cistino rūgšties ir metionino sulfono ir c = 10 nmol/50 μl kitų aminorūgščių. 2,2 g natrio chlorido (3.10) ištirpinama 30 ml citratinio buferinio tirpalo (3.24) 100 ml stiklinėje. Įpilama 4,00 ml aminorūgščių pradinio etaloninio tirpalo (3.27.1), 4,00 ml cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinio etaloninio tirpalo (3.27.2) ir 0,50 ml pradinio vidinio etalono tirpalo (3.27.3), jei naudojamas. Natrio hidroksidu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20. Kiekybiškai supilama į 50 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) ir sumaišoma. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius. Žr. dar 9.1 pastabą.

3.27.5 Etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalas, naudojamas hidrolizatams, paruoštiems pagal 5.3.3.1 punktą, ir ekstraktams (5.2). Kalibravimo tirpalas ruošiamas pagal 3.27.4, bet nededama natrio chlorido. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius.

4. Aparatūra

4.1 100 arba 250 ml apvaliadugnė kolba su grįžtamuoju kondensatoriumi.

4.2 100 ml borosilikatinio stiklo butelis su užsukamu kamščiu ir guminiu ar tefloniniu tarpikliu (pvz.: Duran, Schott), tinkamas naudoti krosnyje.

4.3 Ventiliuojama krosnis su temperatūros reguliatoriumi, kurio tikslumas geresnis nei ± 2 oC.

4.4 pH-metras (trys skaičiai po kablelio).

4.5 Membraninis filtras (0,22 μm).

4.6 Centrifuga.

4.7 Sukamasis vakuuminis garintuvas.

4.8 Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė.

4.9 Aminorūgščių analizatorius arba HPLC įranga su jonų mainų kolonėle, reakcijos su ninhidrinu įtaisu, darinių gavimo įtaisu ir fotometriniu detektoriumi. Kolonėlės įkrova – sulfoninto polistireno dervos, galinčios atskirti aminorūgštis vieną nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių medžiagų. Srautas buferinio tirpalo ir ninhidrino sistemose reguliuojamas siurbliais, srauto stabilumas – ±0,5 % kalibravimo tirpalo ir ėminio analizės metu. Su kai kuriais aminorūgščių analizatoriais galima naudoti hidrolizės procedūras, kai hidrolizato natrio jonų koncentracija c = 0,8 mol/l ir jame yra visas po oksidacijos likęs skruzdžių rūgšties perteklius. Kitais analizatoriais negalima tinkamai atskirti tam tikras aminorūgštis, jei hidrolizate yra skruzdžių rūgšties perteklius ir (arba) didelė natrio jonų koncentracija. Tokiu atveju po hidrolizės ir prieš pH nustatymą, rūgšties tūris sumažinamas maždaug iki 5 ml ją garinant. Garinama vakuume ne aukštesnėje nei 40 oC temperatūroje.

5. Procedūra

5.1 Ėminio ruošimas

Ėminys sumalamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5 mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimą turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 oC temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (3.12).

5.2 Laisvųjų amino rūgščių nustatymas pašaruose ir premiksuose

Į kūginę kolbą 0,2 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas paruošto ėminio (5.1) kiekis (1–5 g) ir įpilama 100,0 ml ekstrahavimo mišinio (3.21). Mišinys maišomas 60 min mechanine purtykle arba magnetine maišykle (4.8). Nuosėdoms leidžiama nusėsti ir 10,0 ml tirpalo virš nuosėdų paimama pipete į 100 ml stiklinę.

Maišant įpilama 5,0 ml sulfosalicilo rūgšties tirpalo (3.22) ir maišoma magnetine maišykle 5 min. Tirpalas virš nuosėdų filtruojamas arba centrifuguojamas visoms nuosėdoms pašalinti. 10,0 ml gauto tirpalo įpilama į 100 ml stiklinę, natrio hidroksido tirpalu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20, plaunant citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) supilama į tinkamo tūrio matavimo kolbą ir citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) skiedžiama iki žymės.

Jei naudojamas vidinis etalonas, įpilama 1,00 ml vidinio etalono (3.27.3) kiekvienam 100 ml gauto tirpalo ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24).

Atliekama chromatografinė analizė pagal 5.4 punktą.

Jei ekstraktai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

5.3 Suminio aminorūgščių kiekio nustatymas

5.3.1 Oksidavimas

0,1–1 g paruošto ėminio (5.1) 0,2 mg tikslumu pasveriama:

— į 100 ml apvaliadugnę kolbą (4.1) hidrolizei atvirame inde (5.3.23), arba

— į 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1), jei turi būti maža natrio koncentracija (5.3.3.1), arba,

— į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (4.2) hidrolizei uždarytame inde (5.3.2.4).

Pasvertojoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg, o drėgmės ne daugiau nei 100 mg.

Kolba (butelis) dedama į ledo ir vandens vonią, atšaldoma iki 0 oC, įpilama 5 ml oksidavimo mišinio (3.23) ir maišoma stikline mentele su lenktu galu. Kolba (butelis) kartu su viduje esančia mentele uždengiama orui nepralaidžia plėvele, ledo ir vandens vonia su taip uždarytu indu dedama į šaldytuvą, kuriame temperatūra 0 oC, ir laikoma jame 16 valandų. Po 16 valandų indas išimamas iš šaldytuvo ir oksidavimo reagento perteklius suskaidomas, pridedant 0,84 g natrio disulfito (3.4).

Tęsiama pagal 5.3.2.1.

5.3.2 Hidrolizė

5.3.2.1 Oksiduotų ėminių hidrolizė

Į oksiduotą ėminį, paruoštą pagal 5.3.1, įpilama 25 ml hidrolizavimo mišinio (3.20), nuplaunant prie indo sienelių ir mentelės prilipusius ėminio likučius.

Atsižvelgiant į taikomą procedūrą, tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4.

5.3.2.2 Neoksiduotų ėminių hidrolizė

Į 100 ml ar 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1) ar į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (4.2) 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1–1 g paruošto ėminio (5.1). Pasvertoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg. Atsargiai įpilama hidrolizavimo mišinio (3.20) ir sumaišoma su ėminiu. Tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4.

5.3.2.3 Hidrolizė atvirame inde

Į kolbą su mišiniu (paruoštu pagal 5.3.2.1 ar 5.3.2.2) įdedami 3 stikliniai rutuliukai ir 23 valandas virinama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Hidrolizei pasibaigus, kondensatorius išplaunamas 5 ml citratinio buferinio tirpalo (3.24). Kolba nuimama ir atšaldoma ledo vonioje.

Tęsiama pagal 5.3.3.

5.3.2.4 Hidrolizė uždarame inde

Butelis su mišiniu, paruoštu pagal 5.3.2.1 arba 5.3.2.2, dedamas į krosnį (4.3) 110 oC temperatūroje. Kad slėgis nedidėtų (dėl dujinių medžiagų susidarymo) ir būtų išvengta sprogimo, pirmąją hidrolizės valandą užsukamas kamštis dedamas ant indo viršaus. Kamštis neužsukamas. Po valandos kamštis užsukamas ir indas laikomas krosnyje 23 valandas. Hidrolizei pasibaigus, indas išimamas iš krosnies, kamštis atsargiai atsukamas ir butelis statomas į ledo ir vandens vonią. Paliekama atvėsti.

Atsižvelgiant į pH reguliavimo procedūrą (5.3.3), butelio turinys kiekybiškai supilamas į 250 ml stiklinę arba 250 ml apvaliadugnę kolbą, naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24).

Tęsiama pagal 5.3.3.

5.3.3 pH reguliavimas

Atsižvelgiant į aminorūgščių analizatoriaus (4.9) jautrumą natriui, pH reguliavimas tęsiamas pagal 5.3.3.1 arba 5.3.3.2.

5.3.3.1 Chromatografinės analizės sistemos (4.9), kurioms reikia mažos natrio koncentracijos

Kai naudojami aminorūgščių analizatoriai, kuriems reikia mažos natrio jonų koncentracijos (kai turi būti sumažintas rūgšties tūris), patariama naudoti pradinį vidinio etalono tirpalą (3.27.3).

Šiuo atveju prieš garinimą į hidrolizatą įpilama 2,00 ml pradinio vidinio etalono tirpalo (3.27.3).

Į hidrolizatus, gautus pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4, įlašinami 2 lašai 1-oktanolio.

Sukamajame garintuve (4.7) garinant vakuume ir 40 oC temperatūroje, tūris sumažinamas iki 5–10 ml. Jei netyčia tūris sumažėja iki mažesnio nei 5 ml tūrio, hidrolizatas turi būti išpiltas ir analizė atliekama iš naujo.

Natrio hidroksido tirpalu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20 ir toliau tęsiama pagal 5.3.4.

5.3.3.2 Visiems kitiems aminorūgščių analizatoriams (4.9)

Hidrolizatai, gauti pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4, iš dalies neutralizuojami atsargiai įpilant 17 ml natrio hidroksido tirpalo (3.17), tirpalą visą laiką maišant ir žiūrint, kad temperatūra būtų žemesnė nei 40 oC.

Kambario temperatūroje nustatoma pH vertė 2,20, naudojant natrio hidroksido tirpalą (3.17) ir vėliau natrio hidroksido tirpalą (3.18). Tęsiama pagal 5.3.4.

5.3.4 Ėminio tirpalas chromatografijai

Hidrolizatas, kurio pH vertė nustatyta (5.3.3.1 arba 5.3.3.2), kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbą naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24), ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24).

Jei vidinis etalonas dar nebuvo naudotas, įpilama 2,00 ml vidinio etalono (3.27.3) ir iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu (3.24). Gerai sumaišoma.

Atliekama chromatografinė analizė (5.4).

Jei ėminių tirpalai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

5.4 Chromatografija

Prieš atliekant chromatografinę analizę ekstraktui (5.2) arba hidrolizatui (5.3.4) leidžiama pasiekti kambario temperatūrą. Mišinys kratomas ir filtruojamas per 0,22 μm membraninį filtrą (4.5). Aminorūgščių analizatoriumi (4.9) atliekama gauto skaidraus tirpalo jonų mainų chromatografija.

Įpurkšti galima rankiniu būdu arba automatiškai. Svarbu, kad matuojant etalonus ir ėminius į kolonėlę ± 0,5 % tikslumu būtų įpurškiamas vienodas tirpalo tūris, išskyrus atvejus, kai naudojamas vidinis etalonas, ir kad natrio bei aminorūgščių santykis etalone ir ėminio tirpale būtų kiek įmanoma vienodesnis.

Paprastai kalibravimo dažnis priklauso nuo ninhidrino reagento stabilumo ir analizinės sistemos. Etalonas arba ėminys skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu (3.24), kad etalono smailės plotas sudarytų 30–200 % ėminio aminorūgšties smailės ploto.

Priklausomai nuo naudojamo analizatoriaus ir dervos tipo, aminorūgščių chromatografija šiek tiek skirsis. Pasirinkta sistema turi atskirti vieną aminorūgštį nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių junginių. Atsakas į kolonėlėje analizuojamų aminorūgščių kiekio pokyčius turi būti tiesinis chromatografinės sistemos naudojimo intervale.

Atliekant chromatografinę analizę, taikomi toliau nurodyti įdubos ir viršūnės aukščių santykiai, kai analizuojamas (nustatomų aminorūgščių) ekvimolinis tirpalas. Šis ekvimolinis tirpalas turi turėti mažiausiai 30 % kiekvienos aminorūgšties, kurią galima tiksliai išmatuoti aminorūgščių analizatoriaus sistema (4.9), įkrovos didžiausio kiekio.

Norint atskirti treoniną ir seriną, žemesnės iš dviejų persiklojančių aminorūgščių smailių įdubos ir viršūnės aukščių santykis chromatogramoje neturi būti didesnis nei 2:10 (jei nustatomas tik cisteinas (cistinas), metioninas, treoninas ir lizinas, nepakankamas gretimų smailių atsiskyrimas neigiamai veiktų nustatymui). Visoms kitoms aminorūgštims atskyrimas turi būti geresnis nei 1: 10.

Sistema turi užtikrinti, kad lizinas būtų atskirtas nuo „lizino darinių“ ir ornitino.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Matuojamas ėminio ir etalono kiekvienos aminorūgšties smailės plotas ir apskaičiuojamas kiekis (X) aminorūgšties gramais kg ėminio:

Jei naudojamas vidinis etalonas, dauginama iš:

A = hidrolizato arba ekstrakto smailės plotas

B = kalibravimo etaloninio tirpalo smailės plotas

C = vidinio etalono hidrolizate arba ekstrakte smailės plotas

D = vidinio etalono, kalibravimo etaloninio tirpalo smailės plotas

M = nustatomos aminorūgšties molinė masė

c = etalono koncentracija μmol/ml

m = ėminio masė (g) (su pataisa pradinei masei, jei ėminys buvo džiovinamas ar iš jo šalinami riebalai)

V = visas hidrolizato tūris (5.3.4) arba apskaičiuotas visas praskiesto ekstrakto tūris (6.1) ml

Oksiduotų ėminių hidrolizatuose cistinas ir cisteinas nustatomi kaip cistino rūgštis, bet apskaičiuojami kaip cistinas (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol), naudojant M = 120,15 g/mol (0,5 × 240,30).

Metioninas nustatomas kaip metionino sulfonas oksiduoto ėminio hidrolizatuose, bet apskaičiuojamas kaip metioninas, naudojant metionino M = 149,21 g/mol.

Įdėtas laisvasis metioninas nustatomas po ekstrakcijos kaip metioninas, apskaičiavimui naudojant tą pačią molinę masę.

6.1 Visas praskiesto ekstrakto tūris (F) laisvosioms aminorūgštims (5.2) nustatyti apskaičiuojamas taip: V = galutinio ekstrakto tūris

7. Metodo įvertinimas

Metodas buvo patikrintas 1990 m. atliekant palyginimą tarptautiniu lygiu, naudojant keturis skirtingus pašarus (mišriuosius kiaulių pašarus, broilerių kombinuotuosius pašarus, baltymų koncentratą, premiksus). Vidurkio ir standartinio nuokrypio rezultatai, gauti atmetus riktus, pateikiami šio punkto lentelėse:







Vidurkiai g/kg Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Baltymų koncentratas 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premiksas 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

7.1 Pakartojamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo pakartojamumas, išreikštas kaip laboratorijos standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:







Laboratorijos standartinis nuokrypis (Sr) g/kg Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Baltymų koncentratas 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premiksas 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.







Laboratorijos standartinio nuokrypio (Sr) variacijos koeficientas (%) Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Baltymų koncentratas 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premiksas 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

7.2 Atkuriamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo atkuriamumas, išreikštas kaip tarplaboratorinis standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:







Tarplaboratorinis standartinis nuokrypis (SR) g/kg Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Baltymų koncentratas 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premiksas 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.







Tarplaboratorinis standartinio nuokrypio (SR) variacijos koeficientas (%) Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Baltymų koncentratas 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premiksas 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

8. Pamatinių medžiagų naudojimas

Tinkamas šio metodo taikymas turi būti patikrintas atliekant kartotinius sertifikuotųjų pamatinių medžiagų matavimus, jei jos yra. Rekomenduojama kalibruoti sertifikuotaisiais aminorūgščių kalibravimo tirpalais.

9. Pastabos

9.1 Dėl aminorūgščių analizatorių skirtumų tikrinama pagal galutinę etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalų (žr. 5.27.4 ir 5.27.5) ir hidrolizatų (žr. 5.3.4) koncentraciją. Prietaiso tiesinio atsako intervalas turi būti tikrinamas visoms aminorūgštims. Etaloninis tirpalas skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu, kad smailių plotai būtų intervalo viduryje.

9.2 Jei hidrolizatams analizuoti naudojama efektyviosios skysčių chromatografijos įranga, bandymų sąlygas reikia optimizuoti pagal gamintojo rekomendacijas.

9.3 Taikant metodą pašarams, kuriuose yra daugiau nei 1 % chloridų (koncentratai, mineraliniai pašarai, papildai), gali būti gauti sumažinti metionino rezultatai, todėl reikia numatyti specialų apdorojimą.

G. TRIPTOFANO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančio triptofano suminį kiekį ir laisvąjį triptofaną. Šiuo metodu D- ir L-formos neatskiriamos.

2. Metodas

Suminiam triptofanui nustatyti ėminys 20 valandų hidrolizuojamas šarminėje terpėje sočiuoju bario hidroksido tirpalu 110 oC temperatūroje. Po hidrolizės įpilama vidinio etalono.

Laisvajam triptofanui nustatyti ėminys ekstrahuojamas silpnai rūgštinėje terpėje esant vidiniam etalonui.

Triptofanas ir vidinis etalonas hidrolizate ar ekstrakte nustatomi HPLC metodu naudojant fluorescencinį detektorių.

3. Reagentai

3.1 Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba tokios pat kokybės vanduo (laidis < 10 μS/cm).

3.2 Etaloninė medžiaga: triptofanas (grynumas/kiekis ≥ 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido.

3.3 Vidinio etalono medžiaga: α-metiltriptofanas (grynumas/kiekis ≥ 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido.

3.4 Bario hidroksido oktahidratas (siekiant išvengti BaCO3 susidarymo, kuris galėtų trukdyti nustatymui, užtikrinama, kad Ba(OH)2 8H2O visiškai nesiliestų su oru) (žr. 9.3 pastabą).

3.5 Natrio hidroksidas.

3.6 Ortofosforo rūgštis, w = 85 %.

3.7 Vandenilio chlorido rūgštis, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8 Metanolis, HPLC grynumo.

3.9 Petroleteris, virimo temperatūros intervalas – 40–60 oC.

3.10 Natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l: 40,0 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (3.1).

3.11 Vandenilio chlorido rūgštis, c = 6 mol/l: paimama 492 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

3.12 Vandenilio chlorido rūgštis, c = 1 mol/l: paimama 82 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

3.13 Vandenilio chlorido rūgštis, c= 0,1 mol/l: paimama 8,2 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

3.14 Orto fosforo rūgštis, c = 0,5 mol/l: paimama 34 ml ortofosforo rūgšties (3.6) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (3.1).

3.15 Koncentruotas triptofano tirpalas (3.2), c = 2,50 μmol/ml: į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2553 g triptofano (3.2), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13). Laikoma –18 oC ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.16 Koncentruotas vidinio etalono tirpalas, c = 2,50 μmol/ml: į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2728 g α-metiltriptofano (3.3), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13). Laikoma –18 oC ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.17 Triptofano kalibravimo etaloninis tirpalas ir vidinis etalonas: paimama 2,00 ml koncentruoto triptofano tirpalo (3.15) ir 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Skiedžiama vandeniu (3.1) ir metanoliu (3.8) iki maždaug tokio pat tūrio ir maždaug iki tokios pat metanolio koncentracijos (10–30 %) kaip galutinio hidrolizato tūris ir koncentracija. Šis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą. Ruošiamas tirpalas saugomas nuo tiesioginių saulės spindulių.

3.18 Acto rūgštis

3.19 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolis.

3.20 Etanolaminas, w (w/w) > 98 %.

3.21 1 g 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalas 100 ml metanolio (3.8).

3.22 HPLC judančioji fazė: 3,00 g acto rūgšties (3.18) + 900 ml vandens (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalo (3.21) metanolyje (3.8) (1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20) nustatoma pH vertė 5,00. Vandeniu (3.1) skiedžiama iki 1 000 ml.

4. Aparatūra

4.1 HPLC įranga ir fluorescencinis detektorius.

4.2 Skysčių chromatografijos kolonėlė, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė.

4.3 pH-metras.

4.4 Kolba iš polipropileno, talpa 125 ml, su plačiu kaklu ir užsukamu dangčiu.

4.5 Membraninis filtras, 0,45 μm.

4.6 Autoklavas, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7 Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė.

4.8 Sūkurinė maišyklė.

5. Procedūra

5.1 Ėminių ruošimas

Ėminys sumalamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5 mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimą turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 C temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (3.9).

5.2 Laisvojo triptofano nustatymas (ekstraktas)

Į kūginę kolbą 1 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas kiekis (1–5 g) paruošto ėminio (5.1). Įpilama 100,0 ml vandenilio chlorido rūgšties, c = 0,1 mol/l (3.13) ir 5,00 ml koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16). 60 min purtoma mechanine purtykle arba maišoma magnetine maišykle (4.7). Nuosėdoms leidžiama nusėsti, pipete paimama į cheminę stiklinę 10,0 ml tirpalo virš nuosėdų. Įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14). Natrio hidroksido tirpalu, c = 1,0 mol/l, (3.10) nustatoma pH vertė 3,0. Įpilamas pakankamas kiekis metanolio (3.8), kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei tinkamo tūrio (maždaug iki to paties tūrio, kaip kalibravimo etaloninio tirpalo tūris (3.17)).

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5). Atliekama chromatografinė analizė pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninis tirpalas ir ekstraktai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 C temperatūroje.

5.3 Suminio triptofano kiekio nustatymas (hidrolizatas)

Į kolbą iš polipropileno (4.4) 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1–1 g paruošto ėminio (5.1). Pasvertojoje ėminio dalyje yra apie 10 mg azoto. Įpilama 8,4 g bario hidroksido oktahidrato (3.4) ir 10 ml vandens. Sumaišoma sūkurine maišykle (4.8) arba magnetine maišykle (4.7). Teflonu padengtas magnetas paliekamas mišinyje. Indo sienelės nuplaunamos 4 ml vandens. Kolba uždengiama užsukamuoju dangčiu jo neužveržiant. Kolba įdedama į autoklavą (4.6) su verdančiu vandeniu ir garais ir laikoma 30–60 min. Autoklavas uždaromas ir 20 valandų kaitinama 110 (± 2) C temperatūroje.

Prieš atidarant autoklavą temperatūra sumažinama iki šiek tiek žemesnės nei 100 oC. Siekiant išvengti Ba(OH)2 × 8H2O išsikristalizavimo, į šiltą mišinį įpilama 30 ml kambario temperatūros vandens. Švelniai purtoma arba maišoma. Įpilama 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Indai 15 min aušinami ant vandens arba ledo vonios.

Tada įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14). Indą laikant ant aušinamosios vonios ir maišant, turinys neutralizuojama HCl, c = 6 mol/l (3.11), ir HCl, c = 1 mol/l (3.12) nustatoma pH vertė 3,0. Įpilamas pakankamas kiekis metanolio, kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei reikiamo tūrio (pvz., 100 ml). Įpylus metanolio, nuosėdos nesusidaro.

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5). Chromatografinė analizė atliekama pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninis tirpalas ir hidrolizatai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 oC temperatūroje.

5.4 HPLC nustatymas

Rekomenduojamos šios izokratinio eliuavimo sąlygos; gali būti taikomos kitos sąlygos, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai (žr. dar 9.1 ir 9.2 pastabas):







Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė Kolonėlės temperatūra: kambario temperatūra Judančioji fazė (3.22): 3,00 g acto rūgšties (3.18) + 900 ml vandens (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalo (3.21) metanolyje (3.8) (1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20) nustatoma pH vertė 5,00. Skiedžiama iki 1 000 ml vandeniu (3.1) Srautas: 1 ml/min Visa eliuavimo trukmė: maždaug 34 min Detektoriaus bangos ilgis: sužadinimas: 280 nm, emisija: 356 nm. Įpurškiamas tūris 20 μl

6. Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojamas triptofano kiekis (X) g 100 g ėminio.

A = vidinio etalono smailės plotas, kalibravimo etaloninis tirpalas (3.17)

B = triptofano ekstrakte (5.2) ar hidrolizate (5.3) smailės plotas

V1 = koncentruoto triptofano tirpalo (3.15), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17), tūris ml (2 ml)

c = koncentruoto triptofano tirpalo (3.15), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17), koncentracija μmol/ml (= 2,50)

V2 = koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16), įpilamo į ekstraktą (5.2) (= 5,00 ml) arba į hidrolizatą (5.3) (= 2,00 ml), tūris

C = ekstrakto (5.2) arba hidrolizato (5.3) vidinio etalono smailės plotas

D = triptofano kalibravimo etaloninio tirpalo (3.17) smailės plotas

V3 = koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16), įpilamo į kalibravimo etaloninį tirpalą (3.17), tūris ml (= 2,00 ml)

m = ėminio masė g (su pataisa pradinei masei, jei jis buvo išdžiovintas arba iš jo buvo pašalinti riebalai)

M = triptofano molekulinė masė (= 204,23 g/mol)

7. Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 10 % didesniojo rezultato vertės.

8. Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai

Hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (4-asis tarplaboratorinis palyginimas), kurį vykdant ne daugiau kaip 12 laboratorijų analizavo tris ėminius. Buvo atliekamos lygiagrečios (5) kiekvieno ėminio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:







1 ėminys Kiaulių pašaras 2 ėminys Kiaulių pašaras su L-triptofanu 3 ėminys Kiaulių pašaro koncentratas L 12 12 12 n 50 55 50 Vidurkis [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2

L = rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius

n = atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius

sr = pakartojamumo standartinis nuokrypis

SR = atkuriamumo standartinis nuokrypis

r = pakartojamumas

R = atkuriamumas

CVr = pakartojamumo variacijos koeficientas, %

CVR = atkuriamumo variacijos koeficientas, %

Laisvojo triptofano ekstrahavimo metodui sertifikuoti buvo parengtas kitas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (3–asis tarplaboratorinis palyginimas), kurį vykdant ne daugiau kaip 13 laboratorijų analizavo du ėminius. Buvo atliekamos lygiagrečios (5) kiekvieno ėminio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:







4 ėminys Kviečių ir sojų mišinys 5 ėminys Kviečių ir sojų mišinys (4 ėminys) su triptofanu (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Vidurkis [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11

L = rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius

n = atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius

sr = pakartojamumo standartinis nuokrypis

SR = atkuriamumo standartinis nuokrypis

r = pakartojamumas

R = atkuriamumas

CVr = pakartojamumo variacijos koeficientas, %

CVR = atkuriamumo variacijos koeficientas, %

Triptofano hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas dar vienas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas, kurį atliekant ne daugiau kaip 7 laboratorijos analizavo keturis ėminius. Rezultatai pateikti toliau. Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas penkis kartus.







1 ėminys Kiaulių pašaro mišinys (CRM 117) 2 ėminys Žuvų miltai su mažu riebalų kiekiu (CRM 118) 3 ėminys Sojų miltai (CRM 119) 4 ėminys Nugriebto pieno milteliai (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Vidurkis [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22

L = rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius

n = atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius

sr = pakartojamumo standartinis nuokrypis

SR = atkuriamumo standartinis nuokrypis

r = pakartojamumas

R = atkuriamumas

CVr = pakartojamumo variacijos koeficientas, %

CVR = atkuriamumo variacijos koeficientas, %

9. Pastabos

9.1 Šios specialios chromatografavimo sąlygos gali pagerinti triptofano ir α-metiltriptofano atskyrimą. Izokratinis eliuavimas, po kurio kolonėlė plaunama taikant gradientinį eliuavimą:



Skysčių chromatografijos kolonėlė: 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė Kolonėlės temperatūra: 32 oC Judančioji fazė: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanolis, 95 + 5 (V + V). B: Metanolis Gradiento programa: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Srautas: 1,2 ml/min. Visa eliuavimo trukmė: maždaug 33 min.

9.2 Chromatografinė analizė bus nevienoda atsižvelgiant į HPLC tipą ir naudojamą kolonėlės įkrovos medžiagą. Pasirinkta sistema turi užtikrinti triptofano ir vidinio etalono smailių atsiskyrimą iki pat bazinės linijos. Be to, svarbu, kad irimo produktai būtų gerai atskirti nuo triptofano ir vidinio etalono. Siekiant patikrinti, ar bazinėje linijoje, kur turi būti vidinio etalono smailė, nėra priemaišų, analizuojami hidrolizatai be vidinio etalono. Svarbu, kad eliuavimo trukmė būtų pakankamai ilga visiems irimo produktams išplauti, antraip pavėlavusios eliuavimo smailės gali trukdyti vėliau atliekamoms chromatografavimo procedūroms. Chromatografavimo sistemos atsakas darbinių koncentracijos verčių intervale yra tiesinis. Atsako tiesiškumas nustatomas naudojant vieną (normalią) vidinio etalono koncentraciją ir keičiant triptofano koncentraciją. Svarbu, kad triptofano ir vidinio etalono smailės būtų HPLC ir fluorescencinio detektoriaus sistemos tiesinėje dalyje. Jei triptofano ir (arba) vidinio etalono smailė (-s) yra per žemos ar per aukštos, analizė kartojama imant kito dydžio ėminį ir (arba) kitą galutinį tūrį.

9.3 Bario hidroksidas Sendamas bario hidroksidas vis blogiau tirpsta. Dėl šios priežasties tirpalas, naudojamas nustatymui HPLC metodu, darosi neskaidrus ir dėl to gali būti gauti mažesni triptofano kiekio rezultatai.

H. ŽALIŲ ALIEJŲ IR RIEBALŲ NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šis metodas taikomas žalių aliejų ir riebalų kiekiui pašaruose nustatyti. Metodas netaikomas aliejingosioms sėkloms ir aliejiniams vaisiams.

Atsižvelgiant į pašarų tipą bei sudėtį ir į analizės atlikimo priežastį taikoma viena iš dviejų aprašytų procedūrų.

1.1 A procedūra. Tiesiogiai ekstrahuojami žali aliejai ir riebalai

Šis metodas taikomas augalinės kilmės pašarams, išskyrus pašarus, įtrauktus į B procedūros taikymo sritį.

1.2 B procedūra. Suminis žalių aliejų ir riebalų kiekis

Šis metodas taikomas gyvūninės kilmės pašarams ir visiems kombinuotiesiems pašarams. Šis metodas turi būti taikomas visoms medžiagoms, iš kurių žali aliejai ir riebalai negali būti visiškai ekstrahuoti prieš tai neatlikus jų hidrolizės (pvz., grūdų glitimas, mielės, bulvių baltymai ir produktai, kurie apdorojami taikant procesus, pvz., išspaudimo, dribsnių gamybos ir kaitinimo procesus).

1.3 Rezultatų aiškinimas

Visais atvejais, kai rezultatas, gautas taikant B procedūrą, yra didesnis nei rezultatas gautas pagal A procedūrą, teisingu turi būti laikomas rezultatas, gautas taikant B procedūrą.

2. Metodas

2.1 A procedūra

Ėminys ekstrahuojamas petroleteriu. Tirpiklis išgarinamas, o likutis džiovinamas ir sveriamas.

2.2 B procedūra

Ėminys apdorojamas vandenilio chlorido rūgštimi kaitinant. Mišinys atvėsinamas ir filtruojamas. Likutis plaunamas, džiovinamas ir ekstrahuojamas pagal A procedūrą.

3. Reagentai

3.1 Petroleteris: virimo temperatūros intervalas – 40–60 oC, bromo skaičius turi būti mažesnis kaip 1, likutis po išgarinimo mažesnis nei 2 mg/100 ml.

3.2 Natrio sulfatas, bevandenis.

3.3 Vandenilio chlorido rūgštis, c = 3 mol/l

3.4 Pagalbinė filtravimo priemonė, pvz., diatomitas, Hyflo-supercel.

4. Aparatūra

4.1 Ekstrahavimo aparatas. Jei naudojamas sifonas (Soksleto aparatas), grąžinamo skysčio srautas yra toks, kad per valandą būtų 10 ciklų; jei sifonas nenaudojamas, grąžinamo skysčio srautas yra apie 10 ml/min.

4.2 Ekstrahavimo tūtos, kurios neturėtų petroleteryje tirpių medžiagų ir kurių akytumas atitiktų 4.1 punkto reikalavimus.

4.3 Džiovinimo spinta, vakuuminė spinta, nustatyta 75 ± 3 oC, arba spinta su oro cirkuliacija, nustatyta 100 ± 3 oC.

5. Procedūra

5.1 A procedūra (žr. 8.1 punktą)

5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, supilama į ekstrahavimo tūtą (4.2) ir užkemšama riebalų neturinčios vatos kamščiu.

Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (4.1) ir ekstrahuojama šešias valandas petroleteriu (3.1). Petroleterio ekstraktas surenkamas į pasvertą sausą kolbą su pemzos gabaliukais ( 24 ).

Tirpiklis distiliuojamas. Likutis džiovinamas kolbą laikant džiovinimo spintoje (4.3) pusantros valandos. Kolba atvėsinama eksikatoriuje ir pasveriama. Džiovinama dar 30 min, siekiant patikrinti, ar nekinta riebalų ir aliejų masė (paeiliui sveriant du kartus, masės skirtumas turi būti mažesnis arba lygus 1 mg).

5.2 B procedūra

2,5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu (žr. 8.2 punktą), supilama į 400 ml stiklinę arba 300 ml kūginę kolbą, įpilama 100 ml vandenilio chlorido rūgšties (3.3) ir įmetami keli pemzos gabaliukai. Stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu arba kūginė kolba sujungiama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Mišinys atsargiai užverdamas virš mažos liepsnos arba ant kaitlentės ir vieną valandą virinamas. Reikia žiūrėti, kad produktas nepriliptų prie indo sienelių.

Atvėsinama ir pridedama pakankamai pagalbinės filtravimo priemonės (3.4), kad būtų išvengta aliejaus ir riebalų nuostolių filtruojant. Filtruojama per sudrėkintą, dvigubą riebalų neturintį filtravimo popierių. Likutis plaunamas šaltu vandeniu tol, kol gaunamas neutralios reakcijos filtratas. Patikrinama, ar filtrate nėra riebalų. Jų buvimas filtrate rodo, kad prieš hidrolizę ėminys turi būti ekstrahuojamas petroleteriu pagal A procedūrą.

Dvigubas filtravimo popierius su likučiu dedamas ant laikrodžio stiklo ir 100 ± 3 oC temperatūroje džiovinamas pusantros valandos džiovinimo spintoje su oro cirkuliacija (4.3).

Dvigubas filtravimo popierius su sausu likučiu įdedamas į ekstrahavimo tūtą (4.2), kuri užkemšama riebalų neturinčios vatos kamščiu. Tūta dedama į ekstrahavimo aparatą (4.1) ir tęsiama, kaip nurodyta 5.1 punkto antroje ir trečioje pastraipose.

6. Rezultato išraiška

Likučio masė išreiškiama ėminio masės procentais.

7. Pakartojamumas

To paties tyrėjo atliekamų dviejų lygiagrečių to paties ėminio analizės rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

— 0,2 %, absoliučiąja verte, kai žalių aliejų ir riebalų kiekis yra mažesnis nei 5 %,

— 4,0 % didžiausio rezultato vertės, kai kiekis 5–10 %,

— 0,4 % absoliučiąja verte, kai kiekis didesnis nei 10 %.

8. Pastabos

8.1 Jei produktus, turinčius didelį aliejų ir riebalų kiekį, sunku susmulkinti arba jie yra netinkami sumažintajam vienalyčiam tiriamajam ėminiui paimti, daroma taip. 20 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir sumaišoma su 10 g ar didesniu kiekiu bevandenio natrio sulfato (3.2). Ekstrahuojama petroleteriu (3.1), kaip nurodyta 5.1. Gautas ekstraktas skiedžiamas iki 500 ml petroleteriu (3.1) ir tirpalas sumaišomas. 50 ml tirpalo supilama į prieš tai pasvertą nedidelę sausą kolbą su pemzos gabalėliais. Tirpiklis distiliuojamas, likutis džiovinamas ir tęsiama, kaip nurodyta 5.1 punkto paskutinėje pastraipoje. Pašalinamas tirpiklis iš tūtoje likusio ekstrahavimo likučio, likutis susmulkinamas ne didesnėmis nei 1 mm dydžio dalelėmis, sudedamas atgal į ekstrahavimo tūtą (natrio sulfato nededama) ir atliekamos 5.1 punkto antroje ir trečioje pastraipose nurodytos procedūros. Aliejų ir riebalų kiekis ėminio masės procentais apskaičiuojamas pagal šią formulę: (10 m1 + m2) × 5 kurioje: m1 = likučio po pirmojo ekstrahavimo (alikvotinės ekstrakto dalies) svoris gramais, m2 = likučio po antrojo ekstrahavimo svoris gramais.

8.2 Jei produkte yra nedaug aliejų arba riebalų, tiriamojo ėminio masė gali būti padidinta iki 5 g.

8.3 Naminių gyvūnėlių ėdalą, turintį daug vandens, prieš hidrolizę ir ekstrahavimą gali tekti maišyti su bevandeniu natrio sulfatu, kaip tai daroma taikant B procedūrą.

8.4 Atliekant 5.2 punkte aprašytas procedūras, veiksmingiau būtų naudoti ne šaltą, bet karštą vandenį likučiui po filtravimo plauti.

8.5 Kai kurių pašarų atveju 1,5 val. džiovinimo trukmę gali tekti padidinti. Per ilgo džiovinimo vengiama, nes dėl to gali būti gauti mažesni rezultatai. Gali būti naudojama mikrobangų krosnį.

8.6 Pradinis ekstrahavimas pagal A procedūrą prieš hidrolizę ir pakartotinis ekstrahavimas pagal B procedūrą rekomenduojamas tuo atveju, jei žalių aliejų ir riebalų kiekis yra didesnis nei 15 %. Ekstrahavimo trukmė kažkiek priklauso nuo pašarų ir nuo juose esančių aliejų arba riebalų tipo.

I. ŽALIOS LĄSTELIENOS NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų neriebalines organines medžiagas, netirpias rūgštinėje ir šarminėje terpėje, kurios paprastai apibūdinamos kaip žalia ląsteliena.

2. Metodas

Ėminys, iš kurio prireikus pašalinami riebalai, veikiamas tam tikros koncentracijos sieros rūgšties ir kalio hidroksido tirpalais virimo temperatūroje. Likutis atskiriamas filtruojant, plaunamas, džiovinamas, sveriamas ir sudeginamas 475–500 oC temperatūros intervale. Žalios ląstelienos kiekis tiriamajame ėminyje atitinka masės sumažėjimą po sudeginimo.

3. Reagentai

3.1 Sieros rūgštis, c = 0,13 mol/l.

3.2 Priešputis (pvz., n-oktanolis).

3.3 Pagalbinė filtravimo priemonė (Celite 545 arba lygiavertė), iškaitinta 500 oC temperatūroje keturias valandas (8.6).

3.4 Acetonas.

3.5 Petroleteris, kurio virimo temperatūros intervalas 40–60 oC.

3.6 Vandenilio chlorido rūgštis, c = 0,5 mol/l.

3.7 Kalio hidroksido tirpalas, c = 0,23 mol/l.

4. Aparatūra

4.1 Kaitinimo įrenginys skaidymui sieros rūgštimi arba kalio hidroksido tirpalu, turintis filtravimo tiglio (4.2) laikiklį, išleidimo vamzdį su čiaupu skysčiui išleisti ir vakuuminį siurblį, gali būti suslėgtojo oro. Kiekvieną dieną prieš naudojimą blokas penkias minutes šildomas verdančiu vandeniu.

4.2 Stiklinis filtravimo tiglis su sukepinto stiklo filtro plokšte, kurios akučių dydis 40–90 μm. Prieš naudojant pirmą kartą, tiglis kelias minutes kaitinamas iki 500 oC ir atvėsinamas (8.6).

4.3 Ne mažesnės nei 270 ml talpos cilindras su grįžtamuoju kondensatoriumi, tinkamas virinimui.

4.4 Džiovinimo spinta su šilumine rele.

4.5 Mufelinė krosnis su šilumine rele.

4.6 Ekstrahavimo įrenginys, kurį sudaro filtravimo tiglio (4.2) laikiklio plokštė ir išleidimo vamzdis su čiaupu vakuumui prijungti ir skysčiui išleisti.

4.7 Jungiamieji žiedai kaitinimo įrenginiui (4.1), tigliui (4.2) ir cilindrui (4.3) sujungti ir šaltojo ekstrahavimo įrenginiui (4.6) bei tigliui prijungti.

5. Procedūra

1 mg tikslumu pasveriama 1 g paruošto ėminio, ėminys dedamas į tiglį (4.2) (žr. 8.1, 8.2 ir 8.3 pastabas) ir pridedama 1 g pagalbinės filtravimo priemonės.

Surenkamas kaitinimo įrenginys (4.1) ir filtravimo tiglis (4.2), tada prie tiglio prijungiamas cilindras (4.3). Į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančios sieros rūgšties (3.1) ir prireikus įlašinami keli lašai priešpučio (3.2).

Užvirinama per 5 ± 2 min ir stipriai virinama lygiai 30 min.

Atsukamas čiaupas į išleidimo vamzdį (4.1), sieros rūgštis filtruojama vakuumu per filtravimo tiglį ir likutis tris kartus paeiliui plaunamas 30 ml verdančio vandens, užtikrinant, kad po kiekvieno plovimo likutis būtų filtruojamas sausai.

Išleidžiamasis čiaupas užsukamas, į cilindro ir tiglio sąranką įpilama 150 ml verdančio kalio hidroksido tirpalo (3.7) ir įlašinami keli lašai priešpučio (3.2). Užvirinama per 5 ± 2 min ir stipriai virinama lygiai 30 min. Filtruojama ir kartojama plovimo procedūra, taikyta sieros rūgščiai.

Po paskutinio plovimo ir džiovinimo tiglis su jame esančia medžiaga atjungiamas ir sujungiamas su šaltojo ekstrahavimo įrenginiu (4.6). Prijungiamas vakuumas ir likutis tiglyje tris kartus iš eilės plaunamas 25 ml acetono porcijomis (3.4) užtikrinant, kad po kiekvieno plovimo likutis būtų filtruojamas sausai.

Tiglis džiovinamas džiovinimo spintoje iki pastoviosios masės 130 oC temperatūroje. Po kiekvieno džiovinimo tiglis atvėsinamas eksikatoriuje ir greitai pasveriamas. Tiglis dedamas į mufelinę krosnį ir ne mažiau nei 30 min iškaitinamas 475–500 oC temperatūroje iki pastoviosios masės.

Po kiekvieno iškaitinimo iš pradžių atvėsinama krosnyje, vėliau eksikatoriuje, ir pasveriama.

Atliekamas tuščiasis bandymas be ėminio. Masės sumažėjimas dėl iškaitinimo neturi būti didesnis nei 4 mg.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Žalios ląstelienos kiekis ėminio masės procentais gaunamas pagal lygtį:

kurioje:

m = ėminio svoris g;

m0 = ėminio svorio sumažėjimas po iškaitinimo, g;

m1 = svorio sumažėjimas po iškaitinimo, atliekant tuščiąjį bandymą, g.

7. Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečių to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei:

— 0,6 % absoliučiąja verte, kai ž