02009R0152 — LT — 26.04.2017 — 005.001

Šis tekstas yra skirtas tik informacijai ir teisinės galios neturi. Europos Sąjungos institucijos nėra teisiškai atsakingos už jo turinį. Autentiškos atitinkamų teisės aktų, įskaitant jų preambules, versijos skelbiamos Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje ir pateikiamos svetainėje „EUR-Lex“. Oficialūs tekstai tiesiogiai prieinami naudojantis šiame dokumente pateikiamomis nuorodomis

►B KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) Nr. 152/2009 2009 m. sausio 27 d. nustatantis oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos ėminių ėmimo ir analizės metodus (Tekstas svarbus EEE) (OL L 054 2009.2.26, p. 1)

iš dalies keičiamas:









▼B

KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) Nr. 152/2009

2009 m. sausio 27 d.

nustatantis oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos ėminių ėmimo ir analizės metodus

(Tekstas svarbus EEE)







▼M3

1 straipsnis

Ėminių ėmimas oficialiai pašarų kontrolei, visų pirma susijusiai su sudedamųjų dalių, įskaitant medžiagą, kurios sudėtyje yra genetiškai modifikuotų organizmų (toliau – GMO) arba kuri yra iš jų sudaryta arba iš jų pagaminta, pašarų priedų, kaip apibrėžta Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 1831/2003 ( 1 ), nepageidaujamų medžiagų, kaip apibrėžta Europos Parlamento ir Tarybos direktyvoje 2002/32/EB ( 2 ), nustatymu, atliekamas laikantis I priede nurodytų metodų.

I priede nurodytas ėminių ėmimo metodas taikomas pašarų kontrolei, susijusiai su pesticidų likučių nustatymu, kaip apibrėžta 2005 m. vasario 23 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 396/2005 ( 3 ), ir atitikties kontrolei pagal Reglamentą (ES) Nr. 619/2011.

▼B

2 straipsnis

Ėminiai analizei ruošiami ir rezultatų išraiška pateikiama pagal II priede aprašytus metodus.

3 straipsnis

Oficialiai pašarų kontrolei skirta analizė atliekama, taikant metodus, aprašytus III priede (Analizės metodai, taikomi pašarinių medžiagų ir kombinuotųjų pašarų sudėčiai kontroliuoti), IV priede (Analizės metodai leidžiamų pašarų priedų koncentracijai kontroliuoti), V priede (Analizės metodai nepageidaujamoms medžiagoms pašaruose kontroliuoti) ir VI priede (Analizės metodai gyvūninės kilmės sudedamosioms dalims nustatyti atliekant oficialiąją pašarų kontrolę).

4 straipsnis

Paukščių kombinuotųjų pašarų energinė vertė apskaičiuojama pagal VII priedą.

5 straipsnis

VIII priede aprašyti analizės metodai, skirti daugiau neleidžiamų naudoti pašarų priedų neteisėtam buvimui kontroliuoti, taikomi patvirtinimo tikslais.

6 straipsnis

Direktyvos 71/250/EEB, 71/393/EEB, 72/199/EEB, 73/46/EEB, 76/371/EEB, 76/372/EEB, 78/633/EEB, 81/715/EEB, 84/425/EEB, 86/174/EEB, 93/70/EEB, 93/117/EB, 98/64/EB, 1999/27/EB, 1999/76/EB, 2000/45/EB, 2002/70/EB ir 2003/126/EB panaikinamos.

Nuorodos į panaikintas direktyvas laikomos nuorodomis į šį reglamentą ir aiškinamos pagal IX priede pateiktas atitikčių lenteles.

7 straipsnis

Šis reglamentas įsigalioja dvidešimtą dieną nuo jo paskelbimo Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje.

Jis taikomas nuo 2009 m. rugpjūčio 26 d.

Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.

▼M3









I PRIEDAS

ĖMINIŲ ĖMIMO METODAI

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Ėminiai, skirti oficialiai pašarų kontrolei, imami pagal toliau aprašytus metodus. Taip gauti ėminiai laikomi reprezentatyviosiomis atrinktosiomis dalimis.

Reprezentatyviojo ėminių ėmimo tikslas yra gauti mažą dalį iš partijos tokiu būdu, kad nustatytos šiai daliai būdingos savybės rodytų visos partijos vidutines savybes. Partijos ėminiai sudaromi pakartotinai imant atskiruosius ėminius skirtingose partijos vietose. Atskirieji ėminiai sudedami ir sumaišomi, kad sudarytų jungtinį ėminį, iš kurio dalijant į visumos savybes rodančias dalis paruošiami reprezentatyvieji galutiniai ėminiai.

Jei atliekant regimąjį patikrinimą nustatoma, kad pašarų partijų, iš kurių turi būti paimti mėginiai, kokybė skiriasi nuo kitų tos pačios partijos pašarų, tokios partijos atskiriamos nuo likusių pašarų ir traktuojamos kaip atskira partijos dalies dalis. Jei pašarų neįmanoma padalyti į atskiras partijos dalis, pašarai laikomi viena partija. Tokiais atvejais šis faktas paminimas ėminių ėmimo ataskaitoje.

Jei nustatoma, kad pašarai, iš kurių ėminiai paimti laikantis šio reglamento nuostatų, neatitinka ES reikalavimų, yra tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalis, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

2. APIBRĖŽTYS

— Partija – nustatytas pašarų kiekis, kuriam būdingos vienodos savybės, pavyzdžiui, kilmė, rūšis, pakuotės tipas, pakuotojas, siuntėjas arba ženklinimas, o gamybos proceso atveju – vienos gamybos įmonės produkcijos vienetas, pagamintas naudojant vienodus gamybos parametrus, arba keletas tokių vienetų, pagamintų vienas po kito ir laikomų kartu.

— Atrinktoji dalis (Reglamente 152/2009 – partija) – partija arba nustatyta partijos dalis, arba partijos dalies dalis.

— Užplombuotas ėminys – ėminys, užplombuotas taip, kad prie jo nebūtų galima prieiti nepažeidus arba nenuėmus plombos.

— Atskirasis ėminys – kiekis, paimtas iš vienos atrinktosios dalies vietos.

— Jungtinis ėminys – atskirųjų ėminių, paimtų iš vienos atrinktosios dalies, visuma.

— Sumažintasis ėminys – jungtinio ėminio dalis, atspindinti jo visumą, gauta reprezentatyviosios redukcijos metodu.

— Galutinis ėminys – sumažintojo arba homogenizuoto jungtinio ėminio dalis.

— Laboratorinis ėminys – laboratorijai skirtas ėminys (kaip gauta laboratorijos), kuris gali būti galutinis, sumažintasis arba jungtinis ėminys.

3. BENDROSIOS NUOSTATOS

— Ėminius imantys pareigūnai: ėminius ima pareigūnai, kuriuos tam įgalioja kompetentinga institucija.

— Ėminys turi būti užplombuotas taip, kad jo negalima būtų atidaryti nepažeidus arba nenuėmus plombos. Plombos žymuo turi būti aiškus ir gerai matomas. Ėminys taip pat gali būti dedamas į talpyklą ar konteinerį, kuris uždaromas taip, kad jo negalima atidaryti nepataisomai nepažeidus talpyklos arba konteinerio, taip išvengiant talpyklos ar konteinerio panaudojimo antrą kartą.

— Ėminio identifikavimas: ėminys turi būti pažymėtas nenuplaunamomis priemonėmis ir privalo būti identifikuojamas tokiu būdu, kad jį būtų galima vienareikšmiai susieti su ėminių ėmimo ataskaita.

— Iš kiekvieno jungtinio ėminio imama bent po du galutinius ėminius: bent vienas ėminys kontrolei atlikti (vykdymo užtikrinimo tikslais) ir bent vienas ėminys – pašarų ūkio subjektui (teisių gynimo tikslais). Galiausiai, vienas galutinis ėminys gali būti laikomas kontroliniu ėminiu. Jei visas jungtinis ėminys yra homogenizuotas, galutiniai ėminiai imami iš homogenizuoto jungtinio ėminio, išskyrus atvejus, kai tokia procedūra prieštarauja valstybių narių taisyklėms dėl pašarų ūkio subjekto teisių.

4. APARATAS

4.1. Ėminių ėmimo aparatas turi būti pagamintas iš medžiagų, negalinčių užteršti produktų, iš kurių imami ėminiai. Daugkartinio naudojimo aparatas turi būti lengvai valomas, kad būtų išvengiama bet kokio užteršimo.

4.2. Aparatas, rekomenduojamas kietųjų pašarų ėminiams imti 4.2.1. Ėminių ėmimas rankiniu būdu 4.2.1.1. Plokščiadugnė bertuvė vertikaliais kraštais. 4.2.1.2. Ėminių ėmimo zondas su ilgu plyšiu arba pertvaromis. Zondo matmenys turi atitikti atrinktosios dalies ypatybes (konteinerio gylį, maišo matmenis ir pan.) ir pašarų dalelių dydį. Jei ėminių ėmimo zondas turi keletą angų, siekiant užtikrinti, kad ėminiai būtų imami iš skirtingų vietų išilgai zondo, tarpai tarp angų turėtų būti vienodi arba angos turėtų būti atskirtos pertvaromis. 4.2.2. Ėminių ėmimas mechaniniu būdu Judančių pašarų ėminiams imti gali būti naudojamas tinkamas mechaninis aparatas. Tinkamas reiškia, kad ėminiai imami mažiausiai iš visos srauto sekcijos. Judančių pašarų (greito srauto) ėminiams imti gali būti naudojami automatiniai ėmikliai. 4.2.3. Dalytuvas Jei įmanoma ir taikoma, aparatas, skirtas padalyti ėminį į maždaug vienodo dydžio dalis, turėtų būti naudojamas sumažintiesiems ėminiams ruošti reprezentatyviuoju būdu.

5. KIEKYBINIAI REIKALAVIMAI DĖL ATSKIRŲJŲ ĖMINIŲ SKAIČIAUS

— Kiekybiniai 5.1 ir 5.2 punktų reikalavimai dėl atskirųjų ėminių skaičiaus taikomi atrinktosioms dalims, kurios yra ne didesnės kaip 500 tonų ir iš kurių galima paimti ėminius, atspindinčius jų visumą. Aprašyta ėmimo procedūra taip pat taikoma kiekiams, didesniems nei nurodytas didžiausias atrinktosios dalies dydis, jei neatsižvelgiama į toliau pateiktose lentelėse nurodytą didžiausią atskirųjų ėminių skaičių, atskirųjų ėminių skaičius nustatomas pagal procedūros atitinkamoje dalyje (žr. 5.3 punktą) pateiktą kvadratinės šaknies formulę, o mažiausias jungtinio ėminio dydis proporcingai padidinamas. Tai nereiškia, kad didelės partijos dėl to negalima padalyti į mažesnes partijos dalis ir imti ėminių iš partijos kiekvienos dalies laikantis 5.1 ir 5.2 punktuose aprašytos procedūros.

— Atrinktoji dalis turi būti tokia, kad iš jos būtų galima paimti kiekvienos jos sudedamosios dalies ėminį.

— Jei partijos arba partijų dalys yra labai didelės (> 500 tonų) ir jei partijos gabenamos arba laikomos taip, kad ėminių negalima imti pagal šio skyriaus 5.1 ir 5.2 punktuose nurodytą ėmimo procedūrą, taikoma 5.3 punkte nurodyta ėmimo procedūra.

— Jei pašarų ūkio subjektui teisės aktais nustatytas reikalavimas šio reglamento laikytis pagal privalomos stebėsenos sistemą, pašarų ūkio subjektas, siekdamas atsižvelgti į eksploatavimo savybes, nuo šiame skyriuje nustatytų kiekybinių reikalavimų gali nukrypti tik kompetentingai institucijai įtikinamai įrodęs, kad ėminių ėmimo procedūra lygiavertė reprezentatyvumo atžvilgiu, ir tik gavęs kompetentingos institucijos leidimą.

— Išimtiniais atvejais, jeigu nustatyto ėminių ėmimo metodo neįmanoma taikyti kiekybinių reikalavimų atžvilgiu dėl nepriimtinos komercinės žalos partijai (dėl įpakavimo būdų, gabenimo priemonių, laikymo būdo ir t. t.), galima taikyti kitokį ėminių ėmimo metodą, jei jis yra kuo reprezentatyvesnis ir yra išsamiai aprašytas bei patvirtintas dokumentais.

5.1. Kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai kontroliuojant pašaruose vienodai pasiskirsčiusias medžiagas arba produktus

5.1.1. Piltiniai kietieji pašarai







Atrinktosios dalies dydis Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius ≤ 2,5 tonos 7 > 2,5 tonos kvadratinė šaknis iš 20 kartų atrinktąją dalį sudarančių tonų skaičiaus (1), bet ne daugiau kaip 40 atskirųjų ėminių (*1) Jei gautas skaičius yra trupmena, ji turėtų būti suapvalinama iki didesnio sveiko skaičiaus.

5.1.2. Piltiniai skystieji pašarai







Atrinktosios dalies dydis Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius ≤ 2,5 tonos arba ≤ 2 500 litrų 4 (1) > 2,5 tonos arba > 2 500 litrų 7 (1) (*1) Jei neįmanoma padaryti, kad skystis būtų homogeninis, reikia padidinti atskirųjų ėminių skaičių.

5.1.3. Supakuoti pašarai

Pašarai (kietieji ir skystieji) gali būti supilti į maišelius, maišus, dėžes, statines ir kt., nurodytus lentelėje kaip pakavimo vienetai. Iš didelių vienetų (≥ 500 kg arba litrų) ėminiai turi būti imami laikantis piltiniams pašarams nustatytų nuostatų (žr. 5.1.1 ir 5.1.2 punktus).







Atrinktosios dalies dydis Mažiausias skaičius vienetų, iš kurių reikia paimti (mažiausiai) vieną atskirąjį ėminį (1) 1–20 vienetų 1 vienetas (2) 21–150 vienetų 3 vienetai (2) 151–400 vienetų 5 vienetai (2) > 400 vienetų ¼ atrinktąją dalį sudarančių vienetų skaičiaus kvadratinės šaknies (3), bet ne daugiau kaip 40 vienetų (*1) Jei atidarius vienetą galima padaryti poveikį analizei (pvz., greitai gendantys drėgni pašarai), atskirasis ėminys yra neatidarytas vienetas. (*2) Vienetų, kurių turinio masė yra ne didesnė kaip 1 kg arba vienas litras, atskirasis ėminys yra pradinio vieneto turinys. (*3) Jei gautas skaičius yra trupmena, ji turėtų būti suapvalinama iki didesnio sveiko skaičiaus.

5.1.4. Pašarų briketai ir mineralų laižalai

Mažiausiai vienas briketas arba laižalas, iš kurio imamas ėminys, 25 vienetų atrinktajai daliai, bet ne daugiau kaip keturi briketai arba laižalai.

Jei briketai arba laižalai sveria ne daugiau kaip po 1 kg, atskirasis ėminys yra vieno briketo arba vieno laižalo turinys.

5.1.5. Stambieji pašarai/pašariniai augalai







Atrinktosios dalies dydis Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius (1) ≤ 5 tonos 5 > 5 tonos kvadratinė šaknis iš 5 kartus atrinktąją dalį sudarančių tonų skaičiaus (2), bet ne daugiau kaip 40 atskirųjų ėminių (*1) Pripažįstama, kad tam tikrais atvejais (pvz., jei tai yra silosas) neįmanoma paimti reikalingų atskirųjų ėminių nepadarant nepriimtinos žalos partijai. Tokiais atvejais galima taikyti alternatyvų ėminių ėmimo metodą, o ėminių iš tokių partijų ėmimo gairės bus parengtos iki pradedant taikyti šį reglamentą. (*2) Jei gautas skaičius yra trupmena, ji turėtų būti suapvalinama iki didesnio sveiko skaičiaus.

5.2. Kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai kontroliuojant pašaruose tikėtinai nevienodai pasiskirsčiusias sudedamąsias dalis ar medžiagas

Šie kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai taikytini tokiomis aplinkybėmis:

— kontroliuojant aflatoksinus, rugių skalsę, kitus mikotoksinus ir kenksmingas botanines priemaišas pašarinėse žaliavose;

— kontroliuojant kryžminę taršą sudedamąja dalimi, įskaitant genetiškai modifikuotą medžiagą arba medžiagą, kuri, manoma, nevienodai pasiskirsčiusi pašarinėse žaliavose.

Jei kompetentinga kontrolės institucija pagrįstai įtaria, kad toks nevienodas pasiskirstymas taip pat galimas kryžminės taršos sudedamąja dalimi arba kombinuotųjų pašarų medžiaga atveju, gali būti taikomi lentelėje toliau nurodyti kiekybiniai reikalavimai.







Atrinktosios dalies dydis Mažiausias atskirųjų ėminių skaičius < 80 tonų Žr. kiekybinius reikalavimus pagal 5.1 punktą. Imtinų atskirųjų ėminių skaičių reikia padauginti iš 2,5. ≥ 80 tonų 100

5.3. Labai didelėms partijoms taikomi kiekybiniai atskirųjų ėminių reikalavimai

Jei atrinktosios dalys yra didelės (> 500 tonų), imtinų atskirųjų ėminių skaičius = 40 atskirųjų ėminių + tonų skaičiaus kvadratinė šaknis, kai atliekama vienodai pašaruose pasiskirsčiusių medžiagų arba produktų kontrolė, arba 100 atskirųjų ėminių + tonų skaičiaus kvadratinė šaknis, kai atliekama greičiausiai nevienodai pasiskirsčiusių sudedamųjų dalių ar medžiagų kontrolė.

6. KIEKYBINIAI JUNGTINIO ĖMINIO REIKALAVIMAI







Reikia paruošti vieną jungtinį vienos atrinktosios dalies ėminį. Pašarų pobūdis Mažiausias jungtinio ėminio kiekis (1) (2) 6.1. Piltiniai pašarai 4 kg 6.2. Supakuoti pašarai: 4 kg (3) 6.3. Skystieji arba pusiau skysti pašarai: 4 litrai 6.4. Pašarų briketai arba laižalai: 6.4.1. kiekvieno masė didesnė kaip 1 kg 4 kg 6.4.2. kiekvieno masė ne didesnė kaip 1 kg keturių pirminių briketų arba laižalų masė 6.5. Stambieji pašarai / pašariniai augalai 4 kg (4) (*1) Jei pašarų ėminio vertė yra didelė, galima imti mažesnį jungtinio ėminio kiekį, jei tai yra aprašyta ir pagrįsta dokumentais ėminių ėmimo ataskaitoje. (*2) Pagal 2011 m. birželio 24 d. Komisijos reglamento (ES) 619/2011, kuriuo nustatomi oficialios kontrolės, kuria siekiama nustatyti, ar pašaruose nėra genetiškai modifikuotų medžiagų, dėl kurių atliekama leidimo suteikimo procedūra arba kurių leidimas baigė galioti, ėminių ėmimo ir analizės metodai (OL L 166, 2011 6 25, p. 9) nuostatas, jungtinio ėminio, skirto patikrinti, ar pašaruose nėra genetiškai modifikuotų medžiagų, masė turi būti ne mažesnė nei 35 000 sėklų ir (arba) grūdų masė. Tai reiškia, kad jei tai yra kukurūzai – jungtinio ėminio masė privalo būti ne mažiau kaip 10,5 kg, o jei tai sojos pupelės – 7 kg. Jei tai kitos sėklos ir grūdai, pavyzdžiui, miežiai, sorgas, avižos, ryžiai, rugiai, kviečiai ir rapsai – jungtinis 4 kg ėminys atitinka daugiau nei 35 000 sėklų masę. (*3) Jei pašarai yra supakuoti, taip gali būti neįmanoma pasiekti 4 kg jungtinio ėminio dydį, nes jis priklauso nuo atskirų vienetų dydžio. (*4) Jei tai yra stambieji pašarai arba pašariniai augalai, kurių yra mažas savitasis svoris (pvz., šienas, šiaudai), jungtinio ėminio kiekis turėtų būti mažiausiai 1 kg.

7. KIEKYBINIAI GALUTINIŲ ĖMINIŲ REIKALAVIMAI

Galutiniai ėminiai

Reikia atlikti bent vieno galutinio ėminio analizę. Analizuojamo galutinio ėminio kiekis turi būti ne mažesnis kaip:







Kietieji pašarai 500 g (1) (2) (3) Skystieji arba pusiau skysti pašarai 500 ml (1) (*1) Pagal reglamento (ES) 619/2011 nuostatas galutinio ėminio, skirto patikrinti, ar pašaruose nėra genetiškai modifikuotos medžiagos, masė privalo būti ne mažesnė nei 10 000 sėklų ir (arba) grūdų masė. Tai reiškia, kad jei tai yra kukurūzai – galutinio ėminio masė privalo būti ne mažiau kaip 3 000 g, o jei tai sojos pupelės – 2 000 g. Jei tai kitos sėklos ir grūdai, pavyzdžiui, miežiai, sorgas, avižos, ryžiai, rugiai, kviečiai ir rapsai – galutinis 500 g ėminys atitinka daugiau nei 10 000 sėklų masę. (*2) Jei jungtinis ėminys yra gerokai mažesnis nei 4 kg arba litrai (žr. 6 punkto išnašas), galima imti mažesnį kiekį galutinio ėminio, jei tai yra aprašyta patvirtinta dokumentais ėminių ėmimo ataskaitoje. (*3) Jei imami ankštinių augalų, javų grūdų ir medžių riešutų ėminiai pesticidų likučiams juose nustatyti, mažiausias galutinio ėminio dydis yra 1 kg, laikantis Komisijos direktyvos 2002/63/EB (OL L 187, 2002 7 16, p. 30) nuostatų.

8. ĖMINIŲ ĖMIMO IŠ LABAI DIDELIŲ PARTIJŲ ARBA IŠ PARTIJŲ, KURIOS LAIKOMOS ARBA GABENAMOS TAIP, KAD ĖMINIŲ ĖMIMAS IŠ VISOS PARTIJOS NĖRA ĮMANOMAS, METODAS

8.1. Bendrieji principai

Jei dėl partijos gabenimo arba laikymo būdo neįmanoma paimti atskirųjų ėminių iš visos partijos, tokių partijų ėminius reikėtų imti tuomet, kai partija juda srautu.

Didelių sandėlių, skirtų laikyti pašarus, atveju, juos eksploatuojančius subjektus reikėtų paskatinti sandėlyje sumontuoti įrangą, kad būtų galima (automatiškai) imti ėminius iš visos sandėlyje laikomos partijos.

Taikant ėminių ėmimo procedūrą, kaip nurodyta 8 skyriuje, pašarų ūkio subjektui arba jo atstovui pranešama apie ėminių ėmimo procedūrą. Jei pašarų ūkio subjektui arba jo atstovui kyla abejonių dėl šios ėmimo procedūros, pašarų ūkio subjektas arba jo atstovas leidžia kompetentingai institucijai imti ėminius iš visos partijos ir padengia su tuo susijusias išlaidas.

8.2. Laivu gabenamos didelės partijos

8.2.1. Dinaminis ėmimas iš didelių laivu gabenamų partijų

Ėminius iš didelių partijų laivuose geriausia imti tuo metu, kai produktas juda srautu (dinaminis ėmimas).

Ėminiai imami talpų vienetais, kuriuos galima fiziškai atskirti. Vis dėlto talpos viena po kitos iš dalies ištuštinamos, kad po perkėlimo į saugyklas nebeliktų pradinio fizinio atskyrimo. Todėl ėminiai gali būti imami juos fiziškai atskiriant pačioje pradžioje arba jau perkėlus pašarus į saugyklą.

Partijai iškrauti iš laivo gali prireikti kelių dienų. Paprastai ėminiai turi būti imami reguliariu intervalu visą partijos iškrovimo laiką. Vis dėlto, tai ne visada įmanoma ar tinkama, nes valstybinis inspektorius negali būti toje vietoje visą partijos iškrovimo laiką. Todėl ėminius leidžiama imti iš partijos dalies (atrinktosios dalies). Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį.

Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

Net jei oficialus ėminys imamas automatiškai, inspektoriui dalyvauti būtina. Vis dėlto, jei automatinis ėmimas atliekamas vadovaujantis iš anksto nustatytais parametrais, kurių negalima keisti imant ėminius, o atskirieji ėminiai surenkami į talpyklą, kuri užplombuojama apsaugant nuo bet kokių pažeidimų, tuomet inspektoriui būtina dalyvauti tik ėminių ėmimo pradžioje, kiekvieną kartą, kai reikia pakeisti ėminių talpyklą, ir ėminių ėmimo pabaigoje.

8.2.2. Statinis ėmimas iš laivu gabenamų partijų

Jei ėminiai imami statiniu būdu, turi būti taikoma tokia pati procedūra, kokia numatyta iš viršaus pasiekiamoms laikymo patalpoms (silosinėms) (žr. 8.4.1).

Ėmimas turi būti atliekamas (iš viršaus) pasiekiamoje partijos dalyje. Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.3. Ėminių ėmimas iš didelių sandėliuose laikomų partijų

Ėminiai turi būti imami pasiekiamoje partijos dalyje. Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.4. Ėminių ėmimas iš laikymo patalpų (silosinių)

8.4.1. Ėminių ėmimas iš silosinių, (lengvai) pasiekiamų iš viršaus

Ėminiai turi būti imami pasiekiamoje partijos dalyje. Atskirųjų ėminių skaičius nustatomas atsižvelgiant į atrinktosios dalies dydį. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.4.2. Ėminių ėmimas iš silosinių, nepasiekiamų iš viršaus (uždaros silosinės)

8.4.2.1. Didesnės nei 100 tonų silosinės, kurios yra nepasiekiamos iš viršaus (uždaros silosinės)

Tokiose silosinėse laikomų pašarų ėminių negalima imti statiniu būdu. Jei reikia imti ėminį iš silosinėje laikomų pašarų ir nėra galimybės partijos pajudinti, su silosinę eksploatuojančiu subjektu susitariama, kad jis inspektoriui praneš, kada silosinės turinys bus iškraunamas, kad būtų galima paimti ėminius pašarams judant srautu.

8.4.2.2. Mažesnės kaip 100 tonų silosinės, kurios yra nepasiekiamos iš viršaus (uždaros silosinės)

Ėmimo procedūros metu į talpyklą paimamas 50–100 kg pašarų kiekis ir iš jo imami ėminiai. Jungtinio ėminio dydis priklauso nuo visos partijos dydžio, o atskirųjų ėminių skaičius yra susijęs su siloso, paimto į talpyklą ėminiams, kiekiu. Jei ėminiai imami iš tos pačios klasės arba to paties aprašymo pašarų partijos dalies ir jei nustatyta, kad partijos dalis neatitinka ES reikalavimų, daroma prielaida, kad tas pat būdinga visiems tos partijos pašarams, išskyrus atvejus, kai išsamiai įvertinus nerasta įrodymų, kad likusi partijos dalis neatitinka ES reikalavimų.

8.5. Piltinių pašarų dideliuose uždaruose konteineriuose ėminių ėmimas

Ėminius iš tokių partijų dažnai galima imti tik tuomet, kai partijos yra iškrautos. Tam tikrais atvejais konteinerių neįmanoma iškrauti importo ar kontrolės punkte, todėl ėminiai turėtų būti imami iškrovus konteinerius.

9. ĖMINIŲ ĖMIMO, RUOŠIMO IR PAKAVIMO INSTRUKCIJOS

9.1. Bendrosios aplinkybės

Ėminiai turi būti imami ir ruošiami nedelsiant, laikantis atsargumo priemonių, kurios yra būtinos siekiant užtikrinti, kad produktas nepakistų ir nebūtų užterštas. Įrankiai ėminiams imti ir konteinerių, kuriuose jie laikomi, paviršiai turi būti švarūs ir sausi.

9.2. Atskirieji ėminiai

Atskirieji ėminiai turi būti imami atsitiktinai iš visos atrinktosios dalies ir jie turi būti maždaug vienodo dydžio.

Atskirojo ėminio dydis yra ne mažiau nei 100 g arba 25 g, jei tai yra stambieji pašarai arba pašariniai augalai, kurių yra mažas savitasis svoris.

Jei laikantis 8 punkte nurodytų ėmimo procedūros taisyklių būtina imti mažiau nei 40 atskirųjų ėminių, atskirųjų ėminių dydis nustatomas atsižvelgiant į nustatytą jungtinio ėminio dydį (žr. 6 punktą).

Ėminių ėmimo iš supakuotų pašarų mažų partijų atveju, kai, laikantis kiekybinių reikalavimų, būtina imti ribotą atskirųjų ėminių skaičių, atskirasis ėminys yra vieno pradinio vieneto, kurio turinys yra ne didesnis kaip 1 kg ar 1 litras, turinys.

Jei imami į mažus vienetus (pvz., < 250 g) supakuotų pašarų ėminiai, atskirojo ėminio dydis priklauso nuo vieneto dydžio.

9.2.1. Piltiniai pašarai

Jei tinka, ėminius galima imti keičiant atrinktosios dalies vietą (kraunant arba iškraunant).

9.2.2. Supakuoti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių vienetų ėminiams imti, kaip nurodyta 5 skyriuje, kiekvieno vieneto dalis paimama bertuve arba zondu. Prireikus ėminiai imami atskirai ištuštinus vienetus.

9.2.3. Homogeniniai arba homogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių vienetų ėminiams imti, kaip nurodyta 5 skyriuje, jų turinys prireikus homogenizuojamas ir iš kiekvieno vieneto paimamas tam tikras kiekis.

Atskiruosius ėminius galima imti išpilant talpyklos turinį.

9.2.4. Nehomogenizuojami skystieji arba pusiau skysti pašarai

Atrinkus reikiamą skaičių vienetų ėminiams imti, kaip nurodyta 5 skyriuje, ėminiai imami iš skirtingų lygių.

Be to, ėminius galima imti išpilant turinį, tačiau pirmosios dalys turėtų būti išpiltos kaip netinkamos.

Abiem atvejais visas paimto ėminio tūris neturi būti mažesnis kaip 10 litrų.

9.2.5. Pašarų briketai ir mineralų laižalai

Atrinkus ėminiams imti reikalingą skaičių pašarų briketų arba laižalų, kaip nurodyta 5 skyriuje, galima imti kiekvieno briketo arba laižalo dalį. Jei įtariama, kad briketas arba laižalas yra nehomogeninis, kaip ėminį galima imti visą briketą arba laižalą.

Jei briketai arba laižalai sveria ne daugiau kaip po 1 kg, atskirasis ėminys yra vieno briketo arba vieno laižalo turinys.

9.3. Jungtinių ėminių ruošimas

Atskirieji ėminiai sumaišomi, kad būtų gautas vienas jungtinis ėminys.

9.4. Galutinių ėminių ruošimas

Bendrojo ėminio medžiaga kruopščiai sumaišoma ( 4 ).

— Kiekvienas ėminys sudedamas į atitinkamą konteinerį / talpyklą. Imamasi visų reikalingų atsargumo priemonių, kad gabenant arba saugant negalėtų pasikeisti ėminio sudėtis, jis nebūtų užterštas arba sufalsifikuotas.

— Jei tikrinamos sudedamosios dalys arba vienodai pašaruose pasiskirsčiusios medžiagos, jungtinis ėminys gali būti reprezentatyviai sumažinamas bent iki 2,0 kg arba 2,0 litro (sumažintasis ėminys) ( 5 ), geriausia naudojant mechaninį arba automatinį dalytuvą. Jei atliekama pesticidų likučių ankštiniuose augaluose, javų grūduose ir medžių riešutuose kontrolė, mažiausias sumažintojo ėminio kiekis yra 3 kg. Jei dėl pašarų pobūdžio neįmanoma naudoti dalytuvo arba dalytuvo nėra, ėminį galima sumažinti taikant ketvirčiavimo metodą. Iš sumažintųjų ėminių paruošiamas maždaug toks pats kiekis galutinių ėminių (kontrolės, teisių gynimo tikslais ir kontroliniam ėminiui) laikantis 7 skyriuje nurodytų kiekybinių reikalavimų. Atliekant sudedamųjų dalių, įskaitant genetiškai modifikuotas medžiagas, arba medžiagų, kurios, tikėtina, yra nevienodai pasiskirsčiusios pašarinėse žaliavose, kontrolę, jungtinis ėminys yra: — — visiškai homogenizuojamas ir po to paskirstomas į galutinius ėminius arba — sumažinamas iki mažiausiai 2 kg arba 2 litrų ( 6 ) naudojant mechaninį arba automatinį dalytuvą. Tik tuo atveju, jei dėl pašarų pobūdžio negalima naudoti dalytuvo, ėminį, jei reikia, galima sumažinti taikant ketvirčiavimo metodą. Siekiant nustatyti, ar pašaruose nėra genetiškai modifikuotų medžiagų, pagal Reglamentą (ES) Nr. 619/2011 sumažintasis ėminys turi būti sudarytas iš mažiausiai 35 000 sėklų ir (arba) grūdų masės, kad būtų galima gauti galutinius ėminius vykdymo užtikrinimo, teisių gynimo tikslais ir kontroliniam ėmimui, kurie būtų sudaryti iš mažiausiai 10 000 sėklų ir (arba) grūdų (žr. (**) išnašą 6 skyriuje ir (*) išnašą 7 skyriuje).

9.5. Ėminių pakavimas

Konteineriai arba pakuotės plombuojami ir ženklinami taip, kad jų nebūtų galima atidaryti, nepažeidus plombos. Visa etiketė turi būti po plomba.

9.6. Ėminių siuntimas į laboratoriją

Ėminys nedelsiant siunčiamas į paskirtąją kontrolės laboratoriją kartu su analizę atliekančiam asmeniui būtina informacija.

10. ĮRAŠAI APIE ĖMINIUS

Turi būti daromi įrašai apie visus ėminius, kad vienareikšmiškai būtų galima nustatyti kiekvieną atrinktąją dalį ir jos dydį.

Darant įrašą taip pat nurodomas bet koks nukrypimas nuo šiame reglamente nustatytos ėmimo procedūros.

Su padarytu įrašu gali susipažinti oficiali kontrolės laboratorija, įrašas taip pat pateikiamas pašarų ūkio subjektui ir (arba) pašarų ūkio subjektui paskirtai laboratorijai.









II PRIEDAS

BENDROSIOS NUOSTATOS DĖL PAŠARŲ ANALIZĖS METODŲ

A. ĖMINIŲ RUOŠIMAS ANALIZEI

1. Tikslas

Toliau aprašytos procedūros taikomos analizei ruošiant į kontrolės laboratorijas atsiųstus ėminius, paimtus pagal I priede pateiktas nuostatas.

Šie laboratoriniai ėminiai turi būti ruošiami taip, kad pagal analizės metodą sverti numatyto kiekio ėminiai būtų homogeniniai ir atitiktų galutinius ėminius.

2. Taikytinos atsargumo priemonės

Ėminių ruošimo procedūra, kurios reikia laikytis, priklauso nuo taikomo analizės metodo ir nuo tikrintinų sudedamųjų dalių ir medžiagų. Todėl labai svarbu užtikrinti, kad ėminių ruošimo procedūra atitiktų taikomą analizės metodą ir tikrintinas sudedamąsias dalis ar medžiagas.

Visi būtini veiksmai turi būti atlikti taip, kad kiek įmanoma būtų išvengta ėminio užteršimo ir jo sudėties pokyčių.

Malama, maišoma ir sijojama nedelsiant, kad ėminį kuo mažiau veiktų oras ir šviesa. Nenaudojami malūnėliai ir smulkintuvai, kurie gali gerokai įkaitinti ėminį.

Šilumai ypač jautrių pašarų ėminius rekomenduojama malti rankiniu būdu. Be to, užtikrinama, kad pati aparatūra nebūtų užteršimo šaltiniu.

Jei ruošiant ėminį neįmanoma užtikrinti, kad gerokai nepakistų jo drėgmės kiekis, jis nustatomas prieš ėminio ruošimą ir jį paruošus pagal III priedo A dalyje nurodytą metodą.

3. Procedūra

3.1. Bendroji procedūra

Tiriamoji alikvotinė dalis paimama iš galutinio ėminio. Kūgio supylimo ir ketvirčiavimo metodas nerekomenduojamas, nes gali būti gautos alikvotinės dalys su didele dalijimo paklaida.

3.1.1. Pašarai, kuriuos galima malti be paruošimo

— Sijotas galutinis ėminys sumaišomas ir sudedamas į tinkamą švarų ir sausą, sandariai užkemšamą konteinerį. Prieš sveriant analizei reikiamas ėminio kiekis (tiriamoji alikvotinė dalis) dar kartą sumaišomas, siekiant užtikrinti visišką vientisumą.

3.1.2. Pašarai, kurie prieš malant džiovinami

— Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, galutinis ėminys džiovinamas drėgmės kiekiui sumažinti iki 8–12 % taikant pradinio džiovinimo procedūrą, aprašytą III priedo A dalyje pateikto drėgmės nustatymo metodo 4.3 punkte. Tada tęsiama, kaip nurodyta 3.1.1. skirsnyje.

3.1.3. Skystieji arba pusiau skysti pašarai

— Galutinis ėminys supilamas į tinkamą švarų ir sausą, sandariai užkemšamą konteinerį. Prieš sveriant analizei reikiamas ėminio kiekis (tiriamoji alikvotinė dalis) dar kartą kruopščiai sumaišomas, siekiant užtikrinti visišką vientisumą.

3.1.4. Kiti pašarai

— Galutiniai ėminiai, kurių neįmanoma paruošti pagal kurią nors pirmiau pateiktą procedūrą, apdorojami taikant bet kurią kitą procedūrą, kuria būtų užtikrinta, kad analizei pasverti ėminiai (tiriamoji alikvotinė dalis) būtų homogeniniai ir reprezentuotų galutinius ėminius.

3.2. Speciali procedūra atliekant regimąjį patikrinimą, tiriant mikroskopu arba tais atvejais, kai visas jungtinis ėminys yra homogenizuotas

— Atliekant regimąjį patikrinimą (nenaudojant mikroskopo), patikrinimui naudojamas visas laboratorinis ėminys.

— Jei tikrinimas atliekant naudojant mikroskopą, laboratorija gali sumažinti jungtinį ėminį arba dar labiau sumažinti sumažintąjį ėminį. Galutiniai ėminiai teisių gynimo tikslais ir tam tikrais atvejais kontroliniam ėminiui imami laikantis tokios pačios procedūros kaip galutinio ėminio reikalavimų vykdymo procedūra.

— Jei homogenizuotas visas jungtinis ėminys, galutiniai ėminiai imami iš homogenizuoto jungtinio ėminio.

4. Ėminių laikymas

Ėminiai turi būti laikomi temperatūroje, kurioje nekistų jų sudėtis. Vitaminų analizei skirti ėminiai arba šviesai ypač jautrūs ėminiai laikomi tokiomis sąlygomis, kad ėminio neigiamai nepaveiktų šviesa.

B. NUOSTATOS DĖL ANALIZĖS METODAMS NAUDOJAMŲ REAGENTŲ IR APARATŪROS

1. Jei analizės metoduose nenurodyta kitaip, visi analiziniai reagentai turi būti analitiškai gryni (a. g.). Atliekant pėdsakų analizę, reagentų grynumas turi būti patikrintas atliekant tuščiąjį bandymą. Atsižvelgiant į gautą rezultatą, gali tekti papildomai gryninti reagentus.

2. Visoms tirpalų ruošimo, skiedimo, skalavimo arba plovimo operacijoms, minimoms analizės metoduose, nenurodant naudojamo tirpiklio arba skiediklio tipo, turi būti naudojamas vanduo. Paprastai vanduo demineralizuojamas arba distiliuojamas. Konkrečiais atvejais, nurodytais analizės metode, jam turi būti taikomos specialios gryninimo procedūros.

3. Atsižvelgiant į paprastai kontrolės laboratorijų turimą įrangą, analizės metoduose nurodomi tik specialios paskirties arba tam tikru būdu naudojami prietaisai ir aparatūra. Jie turi būti švarūs, ypač kai reikia nustatyti labai mažus cheminių medžiagų kiekius.

C. ANALIZĖS METODŲ TAIKYMAS IR REZULTATŲ IŠRAIŠKA

1. Ekstrahavimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra ekstrahavimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta ekstrahavimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gautas ekstrahavimo veiksmingumas atitinka metodu nustatytos procedūros veiksmingumą.

2. Gryninimo procedūra

Keliems metodams yra nustatyta tam tikra gryninimo procedūra. Paprastai galima taikyti kitas nei metodui nustatyta gryninimo procedūras, jei įrodoma, kad analizuojamai matricai taikant tą kitą procedūrą gauti analizės rezultatai atitinka rezultatus, gautus taikant metodu nustatytą procedūrą.

3. Nustatymų skaičius

Jei analizuojant nepageidaujamas medžiagas, pirmojo nustatymo rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros. Kitais atvejais kartotinė analizė (antrasis nustatymas) yra būtina tam, kad būtų pašalinta ėminių vidinio tarpusavio užteršimo arba atsitiktinio sumaišymo galimybė. Du nustatymai, atsižvelgus į matavimo neapibrėžtį, yra naudojami atitikčiai patikrinti.

Jei atliekant nurodyto medžiagos arba sudedamosios dalies kiekio kontrolę, pirmojo nustatymo rezultatas patvirtina nurodytą kiekį, t. y. analizės rezultatas atitinka priimtiną nurodyto kiekio kitimo intervalą, papildomas nustatymas nebūtinas, jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros. Kitais atvejais kartotinė analizė (antrasis nustatymas) yra būtina tam, kad būtų pašalinta ėminių vidinio tarpusavio užteršimo arba atsitiktinio sumaišymo galimybė. Du nustatymai, atsižvelgus į matavimo neapibrėžtį, yra naudojami atitikčiai patikrinti.

Kai kuriais atvejais priimtinas nuokrypis yra nustatytas teisės aktuose, kaip antai 2009 m. liepos 13 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 767/2009 dėl pašarų tiekimo rinkai ir naudojimo, iš dalies keičiančiame Reglamentą (EB) Nr. 1831/2003 ir panaikinančiame Direktyvas 79/373/EEB, 80/511/EEB, 82/471/EEB, 83/228/EEB, 93/74/EEB, 93/113/EEB, 96/25/EB bei Komisijos sprendimą 2004/217/EB ( 7 ).

4. Taikyto analizės metodo pateikimas ataskaitoje

Analizės ataskaitoje nurodomas taikytas analizės metodas.

5. Analizės rezultato pateikimas ataskaitoje

Analizės rezultatas turi būti išreikštas analizės metode nustatytu būdu; nurodant atitinkamą reikšminių skaitmenų skaičių ir prireikus darant pataisą dėl drėgmės kiekio galutiniame ėminyje prieš ruošimą.

6. Matavimo neapibrėžtis ir išgavos dydis atliekant nepageidaujamų medžiagų analizę

Dėl nepageidaujamų medžiagų, kaip apibrėžta Direktyvoje 2002/32/EB, laikoma, kad gyvūnų pašarams skirtas produktas neatitinka nustatyto didžiausio kiekio, jei manoma, kad su pašaru, kurio drėgmės kiekis yra 12 %, susijęs analizės rezultatas viršija didžiausią kiekį, įskaitant išplėstinę matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą. Atitikčiai įvertinti naudojama analizuojant gauta koncentracija, atlikus išgavos dydžio pataisą ir atėmus išplėstinę matavimo neapibrėžtį. Ši procedūra taikoma tais atvejais, kai galima įvertinti analizės metodo matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydžio pataisą (tai, pvz., neįmanoma, kai atliekama mikroskopinė analizė).

Analizės rezultatas užrašomas taip (jei taikant analizės metodą galima įvertinti matavimo neapibrėžtį ir išgavos dydį):

a) su pataisa dėl išgavos dydžio, nurodant išgavos dydį. Pataisa dėl išgavos dydžio nebūtina, jei jis yra 90–110 %;

b) kaip „x +/– U“, čia x – analizės rezultatas, U – išplėstinė matavimo neapibrėžtis, taikant aprėpties faktorių 2, kuris užtikrina maždaug 95 % patikimumo lygį.

Tačiau jei analizės rezultatas yra gerokai (> 50 %) mažesnis nei kontroliuojama specifikacijos vertė ir jei taikomos atitinkamos kokybės procedūros, o analizės tikslas yra tik patikrinti atitiktį teisinėms nuostatoms, analizės rezultatą būtų galima pateikti ataskaitoje be išgavos dydžio pataisos ir išgavos dydžio bei matavimo neapibrėžties tais atvejais galima nenurodyti.

▼B









III PRIEDAS

ANALIZĖS METODAI, TAIKOMI PAŠARINIŲ MEDŽIAGŲ IR KOMBINUOTŲJŲ PAŠARŲ SUDĖČIAI KONTROLIUOTI

A. DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašarų drėgmės kiekį. Jei pašarai turi lakiųjų medžiagų, pvz., organinių rūgščių, reikia turėti omenyje, kad nustatant drėgmės kiekį nustatomas didelis kiekis lakiųjų medžiagų.

Jis netaikomas analizuojant pieno produktus kaip pašarus, mineralines medžiagas ir mišinius, kuriuos iš esmės sudaro mineralinės medžiagos, gyvūninius ir augalinius riebalus bei aliejus arba aliejingąsias sėklas ir vaisius.

2. Metodas

Ėminys džiovinamas nurodytomis sąlygomis, kurios priklauso nuo pašarų tipo. Masės sumažėjimas nustatomas sveriant. Tiriant kietuosius pašarus, kurių drėgmės kiekis didelis, būtina atlikti pradinį džiovinimą.

3. Aparatūra

3.1 Smulkintuvas, pagamintas iš drėgmės nesugeriančių medžiagų, kuris būtų lengvai valomas, kuriuo būtų galima greitai ir vienodai susmulkinti ėminį, per daug jam neįkaistant, ir kuris kiek įmanoma apsaugotų ėminį nuo sąlyčio su išorės oru ir atitiktų 4.1.1 ir 4.1.2 nustatytus reikalavimus (pvz., plaktukiniai ar vandeniu aušinami mikrosmulkintuvai, sudedamieji kūginiai malūnėliai, mažo apsisukimų dažnio arba krumpliaratiniai smulkintuvai).

3.2 Analizinės svarstyklės, tikslumas 1 mg.

3.3 Sausi korozijai atsparaus metalo arba stikliniai indai su sandariai uždengiamais dangčiais; darbinis paviršius ėminiui paskleisti maždaug 0,3 g/cm2 tankiu.

3.4 Elektrinė pastovios temperatūros džiovinimo spinta (± 2 oC), tinkamai ventiliuojama ir užtikrinanti greitą temperatūros reguliavimą ( 8 ).

3.5 Reguliuojama elektrinė vakuuminė džiovinimo spinta, turinti alyvos siurblį ir mechanizmą, kuriuo galima įleisti karšto sauso oro, arba naudojanti džioviklį (pvz., kalcio oksidą).

3.6 Eksikatorius su stora perforuota metalo arba porceliano plokšte ir veiksmingu džiovikliu.

4. Procedūra

N.B Šiame skirsnyje aprašyti veiksmai turi būti atliekami iškart po ėminių pakuočių atidarymo. Analizė turi būti atliekama bent du kartus.

4.1 Ėminių ruošimas

4.1.1 Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.1.2 ir 4.1.3

Paimama bent 50 g ėminio. Prireikus ėminys susmulkinamas arba sumalamas taip, kad būtų išvengta drėgmės kiekio pokyčio (žr. 6).

4.1.2 Javai ir kruopos

Paimama bent 50 g ėminio. Susmulkinama į daleles, kurių bent 50 % išbyra per 0,5 mm akučių sietą ir ant 1 mm skersmens apvalių akučių sieto lieka ne daugiau kaip 10 %.

4.1.3 Skysti ar pastų tipo pašarai, kuriuos daugiausia sudaro aliejai ir riebalai

Maždaug 25 g ėminio pasveriama 10 mg tikslumu, įdedamas reikiamas kiekis sauso smėlio, pasverto 10 mg tikslumu, ir maišoma tol, kol gaunamas vienalytis produktas.

4.2 Džiovinimas

4.2.1 Pašarai, išskyrus pašarus pagal 4.2.2 ir 4.2.3

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 1 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 103 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama keturias valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 103 oC. Indas uždengiamas dangčiu, išimamas iš džiovinimo spintos, 30–45 min laikomas eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

Jei pašarus daugiausia sudaro aliejai ir riebalai, džiovinama spintoje dar 30 min 130 oC temperatūroje. Dviejų svėrimo rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1 % drėgmės kiekio.

4.2.2 Javai, miltai, kruopos ir rupūs miltai

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į džiovinimo spintą, įkaitintą iki 130 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje. Džiovinama dvi valandas, skaičiuojant nuo to momento, kai spintos temperatūra vėl pasiekia 130 oC. Indas uždengiamas dangčiu, išimamas iš džiovinimo spintos, 30–45 min laikomas eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu.

4.2.3 Kombinuotieji pašarai, kurie turi daugiau nei 4 % sacharozės arba laktozės: pašarinės žaliavos, pvz., saldžiosios ceratonijos ankštys, hidrolizuotieji javų produktai, salyklas, džiovinti runkelių griežiniai, žuvų hidrolizatai ir cukraus žlaugtai; kombinuotieji pašarai, turintys daugiau nei 25 % mineralinių druskų, įskaitant kristalizacinį vandenį.

Indas su dangčiu (3.3) pasveriamas 0,5 mg tikslumu. Maždaug 5 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu, ėminys supilamas į pasvertą indą ir lygiai paskleidžiamas. Neuždengtas indas dedamas į vakuuminę džiovinimo spintą (3.5), įkaitintą iki 80–85 oC. Indą reikia įdėti kiek įmanoma greičiau, kad per daug nenukristų temperatūra spintoje.

Slėgis sumažinamas iki 100 mm Hg stulpelio ir tokiame slėgyje keturias valandas džiovinama karšto sauso oro srove arba džiovikliu (20 ėminių reikia apie 300 g). Pastaruoju atveju, pasiekus nurodytą slėgį, vakuuminis siurblys išjungiamas. Džiovinimo trukmė skaičiuojama nuo to momento, kai džiovinimo spintos temperatūra vėl pakyla iki 80–85 oC. Džiovinimo spintos slėgis atsargiai padidinamas iki atmosferos slėgio. Spinta atidaroma, indas nedelsiant uždengiamas dangčiu, išimamas iš spintos, laikomas 30–45 min eksikatoriuje (3.6), kad atvėstų, ir pasveriamas 1 mg tikslumu. Džiovinama dar 30 min vakuuminėje džiovinimo spintoje 80–85 oC temperatūroje ir dar kartą pasveriama. Šių dviejų svėrimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,1 % drėgmės kiekio.

4.3 Pradinis džiovinimas

4.3.1 Pašarai, išskyrus išvardytus 4.3.2

Kietieji labai drėgni pašarai, kuriuos sunku susmulkinti, turi būti iš anksto džiovinami taip:

Į tinkamą indą (pvz., ant 20 × 12 cm aliuminio plokštės su 0,5 cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkinto ėminio 10 mg tikslumu (prireikus presuotus arba į gabalus sulipusius pašarus galima kažkiek sutrupinti). Džiovinama džiovinimo spintoje 60–70 oC temperatūroje tol, kol drėgmės kiekis nesumažėja iki 8–12 %. Ėminys išimamas iš džiovinimo spintos, neuždengtas valandą vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumu. Nedelsiant susmulkinamas, kaip nurodyta 4.1.1, ir džiovinamas, kaip nurodyta 4.2.1 arba 4.2.3, atsižvelgiant į pašarų tipą.

4.3.2 Javai

Javai, kurių drėgmės kiekis didesnis nei 17 % turi būti iš anksto džiovinami taip:

Į tinkamą indą (pvz., ant 20 × 12 cm aliuminio plokštės su 0,5 cm kraštu) pasveriama 50 g nesusmulkinto ėminio 10 mg tikslumu. 5–7 min džiovinama džiovinimo spintoje 130 oC temperatūroje. Ėminys išimamas iš džiovinimo spintos, neuždengtas dvi valandas vėsinamas laboratorijoje ir pasveriamas 10 mg tikslumu. Nedelsiant susmulkinamas, kaip nurodyta 4.1.2, ir džiovinamas, kaip nurodyta 4.2.2.

5. Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio masės procentais (X) apskaičiuojamas pagal šias formules:

5.1 Džiovinimas, kai netaikomas pradinis džiovinimas

kurioje:

m = tiriamojo ėminio pradinis svoris gramais;

m0 = išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais.

5.2 Džiovinimas, kai taikomas pradinis džiovinimas

kurioje:

m = tiriamojo ėminio pradinis svoris gramais,

m1 = tiriamojo ėminio svoris po pradinio džiovinimo gramais,

m2 = tiriamojo ėminio svoris po smulkinimo arba malimo gramais,

m0 = išdžiovinto tiriamojo ėminio svoris gramais.

5.3 Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečių matavimų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 0,2 % drėgmės kiekio absoliučiosios vertės.

6. Pastaba

Jei paaiškėja, kad ėminį būtina susmulkinti, ir pastebima, kad produkto drėgmės kiekis pakito, pašarų komponentų analizės rezultatus reikia perskaičiuoti pagal pradinės būklės ėminio drėgmės kiekį.

B. GYVŪNINIŲ IR AUGALINIŲ RIEBALŲ BEI ALIEJŲ DRĖGMĖS KIEKIO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti vandens ir lakiųjų medžiagų kiekį gyvūninės ir augalinės kilmės riebaluose bei aliejuose.

2. Metodas

Ėminys džiovinamas 103 oC temperatūroje iki pastoviosios masės (masės sumažėjimas tarp dviejų paeiliui atliekamų svėrimų turi būti mažesnis arba lygus 1 mg). Nuodžiūvis nustatomas sveriant.

3. Aparatūra

3.1 Indas plokščiu dugnu iš korozijai atsparios medžiagos, skersmuo 8–9 cm, aukštis – 3 cm.

3.2 Maždaug 10 cm ilgio gyvsidabrio termometras, su padalomis nuo 80 oC iki bent 110 oC, su pastorintu burbuliuku ir plėtimosi vamzdžiu viršutiniame gale.

3.3 Smėlio vonia arba elektrinė kaitlentė.

3.4 Eksikatorius su veiksmingu džiovikliu.

3.5 Analizinės svarstyklės.

4. Procedūra

Į sausą pasvertą indą (3.1), į kurį įdėtas termometras (3.2), 1 mg tikslumu pasveriama apie 20 g homogenizuoto ėminio. Nuolat maišant termometru, kaitinama ant smėlio vonios arba kaitlentės (3.3) taip, kad maždaug per 7 min temperatūra pasiektų 90 oC.

Kaitinimas sumažinamas, stebint, kaip dažnai nuo indo dugno kyla burbuliukai. Temperatūra turi būti ne aukštesnė kaip 105 oC. Maišoma toliau, braukiant per indo dugną tol, kol nebesusidaro burbuliukų.

Siekiant užtikrinti visišką drėgmės pašalinimą, dar keletą kartų kaitinama iki 103 oC ± 2 oC, kaskart tarp kaitinimų atvėsinant ėminį iki 93 oC. Tada paliekama eksikatoriuje (3.4) atvėsti iki kambario temperatūros ir pasveriama. Šis veiksmas kartojamas tol, kol ėminio svoris tarp iš eilės atliekamų kaitinimo veiksmų sumažėja ne daugiau kaip 2 mg.

N.B Ėminio svorio padidėjimas po kartotinių kaitinimo veiksmų rodo, kad oksiduojasi riebalai, todėl šiuo atveju rezultatai skaičiuojami pagal svėrimo duomenis, gautus prieš tai, kai svoris pradėjo didėti.

5. Rezultatų apskaičiavimas

Drėgmės kiekis ėminio procentine dalimi (X) apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m = tiriamojo ėminio svoris gramais;

m1 = indo su turiniu svoris prieš kaitinimą gramais;

m2 = indo du turiniu svoris po kaitinimo gramais.

Mažesni nei 0,05 % rezultatai turi būti užrašomi kaip „mažiau nei 0,05 %“.

Pakartojamumas

Dviejų to paties ėminio lygiagrečiai atliktos drėgmės kiekio analizės rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 0,05 % absoliučiąja verte.

C. ŽALIŲ BALTYMŲ KIEKIO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti žalių baltymų kiekį pašaruose pagal Kjeldalio metodu nustatomą azoto kiekį.

2. Metodas

Ėminys skaidomas sieros rūgštimi esant katalizatoriui. Rūgštus tirpalas šarminamas natrio hidroksido tirpalu. Gautas amoniakas distiliuojamas ir surenkamas žinomame kiekyje sieros rūgšties, kurios perteklius titruojamas natrio hidroksido standartiniu tirpalu.

Pagal kitą metodą išsiskyręs amoniakas distiliuojamas į tirpalą su boro rūgšties pertekliumi, tada titruojama vandenilio chlorido rūgšties arba sieros rūgšties tirpalu.

3. Reagentai

3.1 Kalio sulfatas

3.2 Katalizatorius: vario (II) oksidas CuO arba vario (II) sulfato pentahidratas CuSO4 5H2O

3.3 Cinko granulės

3.4 Sieros rūgštis, ρ 20 = 1,84 g/ml

3.5 Sieros rūgštis, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(H2SO4) = 0,25 mol/l

3.6 Sieros rūgštis, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(H2SO4) = 0,10 mol/l

3.7 Sieros rūgštis, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(H2SO4) = 0,05 mol/l

3.8 Indikatorius metilraudonasis: 300 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio, σ = 95–96 % (V/V)

3.9 Natrio hidroksido tirpalas (galima naudoti techninį hidroksidą) β = 40 g/100 ml (m/V: 40 %)

3.10 Natrio hidroksidas, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(NaOH) = 0,25 mol/l

3.11 Natrio hidroksidas, standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas, c(NaOH) = 0,10 mol/l

3.12 Pemzos granulės, išplautos vandenilio chlorido rūgštyje ir iškaitintos

3.13 Acetanilidas (lyd. temp. = 114 oC, N kiekis = 10,36 %)

3.14 Sacharozė (neturinti azoto)

3.15 Boro rūgštis (H3BO3)

3.16 Indikatoriaus metilraudonojo tirpalas: 100 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio

3.17 Bromkrezolio žaliojo tirpalas: 100 mg bromkrezolio žaliojo ištirpinama 100 ml etanolio arba metanolio

3.18 Boro rūgšties tirpalas (10 g/l–40 g/l atsižvelgiant į naudojamą aparatūrą)

Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, į boro rūgšties tirpalus turi būti įdėta metilraudonojo ir bromkrezolio žaliojo indikatorių. Jei ruošiamas 1 litras boro rūgšties tirpalo, prieš skiedžiant iki žymės įpilama 7 ml metilraudonojo indikatoriaus tirpalo (3.16) ir 10 ml bromkrezolio žaliojo tirpalo (3.17).

Priklausomai nuo naudojamo vandens, skirtingų partijų boro rūgšties tirpalų pH vertė gali skirtis. Dažnai būtina koreguoti nedideliu šarmo tirpalo tūriu, kad būtų gautas teigiamas tuščiasis ėminys.

Pastaba. Paprastai tinkamai korekcijai pakanka maždaug 3 ml–4 ml NaOH (3.11) 1 litrui 10 g/l boro rūgšties. Tirpalas laikomas kambario temperatūroje, apsaugotas nuo šviesos ir amoniako garų šaltinių.

3.19 Vandenilio chlorido rūgšties standartinis tūrinės titrimetrijos tirpalas c(HCl) = 0,10 mol/l

Pastaba. Galima naudoti kitokios koncentracijos tūrinės titrimetrijos tirpalus (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ir 3.19), jei apskaičiuojant būtų daroma korekcija dėl koncentracijos. Koncentracijos vertės visuomet išreiškiamos keturiais skaičiais po kablelio.

4. Aparatūra

Aparatūra, tinkama skaidyti, distiliuoti ir titruoti pagal Kjeldalio procedūrą.

5. Procedūra

5.1 Skaidymas

1 g ėminio pasveriama 0,001 g tikslumu ir ėminys supilamas į skaidymo aparato kolbą. Įdedama 15 g kalio sulfato (3.1) ir atitinkamas kiekis katalizatoriaus (3.2) (0,3 –0,4 g vario oksido arba 0,9 –1,2 g vario (II) sulfato pentahidrato), įpilama 25 ml sieros rūgšties (3.4, prireikus įmetamos kelios pemzos granulės (3.12) ir sumaišoma.

Kolba iš pradžių šildoma, kartkartėmis ją sukiojant, ant nestiprios ugnies tol, kol masė suanglėja ir nelieka putų; tada šildoma stipriau tol, kol tirpalas pradeda nuolat virti. Kaitinimas yra pakankamas, jei verdanti rūgštis kondensuojasi ant kolbos sienelių. Reikia žiūrėti, kad neperkaistų šoninės kolbos sienelės ir prie jų nepriliptų organinių medžiagų dalelių.

Kai tirpalas tampa skaidrus ir šviesiai žalias, virinama dar dvi valandas, vėliau paliekama atvėsti.

5.2 Distiliavimas

Atsargiai įpilama pakankamai vandens, kad visiškai ištirptų sulfatai. Paliekama atvėsti ir įdedamos kelios cinko granulės (3.3). Tęsiama pagal 5.2.1 arba 5.2.2.

5.2.1 Distiliavimas į sieros rūgštį

Į distiliavimo aparato surinkimo kolbą įpilama lygiai 25 ml sieros rūgšties (3.5) arba (3.7) tirpalo, atsižvelgiant į tai, kiek ėminyje galėtų būti azoto. Įlašinami keli lašai metilraudonojo indikatoriaus (3.8).

Skaidymo aparato kolba prijungiama prie distiliavimo aparato kondensatoriaus, kurio antgalis ne mažiau kaip per centimetrą įmerkiamas į surinkimo kolboje esantį skystį (žr. 8.3 pastabą). Neleidžiant amoniakui garuoti (žr. 8.1 pastabą), į kolbą lėtai įpilama 100 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9). Kolba kaitinama tol, kol amoniakas baigiamas distiliuoti.

5.2.2 Distiliavimas į boro rūgštį

Jei amoniakas distiliate titruojamas rankiniu būdu, taikoma toliau nurodyta procedūra. Jei distiliavimo įrenginys yra visiškai automatizuotas, įskaitant amoniako distiliate titravimą, laikomasi gamintojo instrukcijų dėl distiliavimo įrenginio naudojimo.

Surinkimo kolba su 25 ml–30 ml boro rūgšties tirpalo (3.18) statoma po kondensatoriaus išleidžiamuoju antgaliu taip, kad tiekimo vamzdis būtų žemiau boro rūgšties perteklių turinčio tirpalo paviršiaus. Distiliavimo įrenginys nustatomas dozuoti 50 ml natrio hidroksido tirpalo (3.9). Distiliavimo įrenginys naudojamas pagal gamintojo instrukcijas ir amoniakas distiliuojamas įpilant natrio hidroksido tirpalo. Distiliatas surenkamas į boro rūgšties tirpalą. Distiliato kiekis (distiliavimo garais trukmė) priklauso nuo azoto kiekio ėminyje. Laikomasi gamintojo instrukcijų.

Pastaba. Pusiau automatizuotame distiliavimo įrenginyje natrio hidroksido pertekliaus įpylimas ir distiliavimas garais atliekamas automatiškai.

5.3 Titravimas

Tęsiama pagal 5.3.1 arba 5.3.2.

5.3.1 Sieros rūgštis

Atsižvelgiant į naudotos sieros rūgšties koncentraciją, sieros rūgšties perteklius surinkimo kolboje titruojamas natrio šarmo (3.10 arba 3.11) tirpalu tol, kol pasiekiamas ekvivalentinis taškas.

5.3.2 Boro rūgštis

Surinkimo kolbos turinys titruojamas iš biuretės vandenilio chlorido rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijos tirpalu (3.19) arba sieros rūgšties standartiniu tūrinės titrimetrijos tirpalu (3.6) ir užrašomas sunaudoto titranto tūris.

Kai ekvivalentinis taškas nustatomas kolorimetriškai, ekvivalentinis taškas pasiekiamas, pirmą kartą atsiradus tirpalo rožinei spalvai. Biuretės rodmuo įvertinamas 0,05 ml tikslumu. Apšviesta magnetinė maišyklė arba fotometrinis detektorius gali padėti lengviau pamatyti ekvivalentinį tašką.

Tai galima atlikti automatiškai, naudojant distiliavimo garais įrenginį su automatiniu titravimu.

Konkretus distiliatorius (titratorius) naudojamas pagal gamintojo instrukcijas.

Pastaba. Naudojant automatizuotą titravimo sistemą, titruoti pradedama iškart, kai prasideda distiliavimas ir sunaudojama 1 % boro rūgšties tirpalo (3.18). Jei naudojamas visiškai automatizuotas distiliavimo įrenginys, amoniako automatinį titravimą galima atlikti naudojant potenciometrinę pH sistemą ekvivalentiniam taškui nustatyti. Šiuo atveju naudojamas automatinis titratorius su pH-metru. pH-metras tinkamai sukalibruotas pH 4–pH 7 intervale pagal įprastas laboratorines pH-metro kalibravimo procedūras. Titravimo ekvivalentinis taškas pagal pH atitinka pH vertę 4,6 , šis taškas yra stačiausias titravimo kreivės taškas (perlinkio taškas).

5.4 Tuščiasis bandymas

Siekiant patvirtinti, kad reagentai neturi azoto, atliekamas tuščiasis bandymas (skaidymas, distiliavimas ir titravimas), vietoj ėminio naudojant 1 g sacharozės (3.14).

6. Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojama pagal 6.1 arba 6.2.

6.1 Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.1

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

V0 = NaOH (3.10 arba 3.11) tūris, sunaudotas tuščiajam bandymui, ml;

V1 = NaOH (3.10 arba 3.11) tūris, sunaudotas ėminiui titruoti, ml;

c = natrio hidroksido (3.10 arba 3.11) koncentracija, mol/l;

m = ėminio svoris, g.

6.2 Apskaičiavimas titruojant pagal 5.3.2

6.2.1 Titravimas vandenilio chlorido rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m = tiriamosios dalies svoris, g;

c = vandenilio chlorido rūgšties standartinio tūrinės titrimetrijos tirpalo (3.19) koncentracija, mol/l;

V0 = tuščiajam bandymui sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris, ml;

V1 = tiriamajai daliai sunaudotas vandenilio chlorido rūgšties tūris, ml.

6.2.2 Titravimas sieros rūgštimi

Žalių baltymų kiekis, išreikštas svorio procentais, apskaičiuojamas pagal šią formulę:

kurioje:

m = tiriamosios dalies svoris, g;

c = sieros rūgšties standartinio tūrinės titrimetrijos tirpalo (3.6) koncentracija, mol/l;

V0 = tuščiajam bandymui sunaudotas sieros rūgšties (3.6) tūris, ml;

V1 = tiriamajai daliai sunaudotas sieros rūgšties (3.6) tūris, ml.

7. Metodo tikrinimas

7.1 Pakartojamumas

Dviejų rezultatų, gautų atliekant du lygiagrečius to paties ėminio matavimus, skirtumas neturi būti didesnis nei:

— 0,2 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis mažesnis nei 20 %,

— 1,0 % didžiausios vertės, kai žalių baltymų kiekis 20–40 %,

— 0,4 % absoliučiąja verte, kai žalių baltymų kiekis didesnis nei 40 %.

7.2 Tikslumas

Atliekama 1,5 –2,0 g acetanilido (3.13) analizė (skaidymas, distiliavimas ir titravimas), įdėjus 1 g sacharozės (3.14). 1 g acetilanilido sunaudoja 14,80 ml sieros rūgšties (3.5). Išgavos dydis turi būti ne mažesnis nei 99 %.

8. Pastabos

8.1 Aparatūra gali būti rankinio, pusiau automatinio arba automatinio tipo. Jei naudojama aparatūra, kai ėminį po skaidymo reikia supilti į distiliavimo įrenginį, turi būti supilama be nuostolių. Jei distiliavimo aparato kolba neturi lašinamojo piltuvo, natrio šarmo tirpalas įpilamas prieš pat kolbą prijungiant prie kondensatoriaus, skystį iš lėto pilant kolbos sienele.

8.2 Jei skaidymo produktas sukietėja, analizė pradedama iš naujo su didesniu nei pirmiau nurodyta sieros rūgšties tirpalo (3.4) kiekiu.

8.3 Produktams, kuriuose azoto kiekis nedidelis, į surinkimo kolbą įpilamo sieros rūgšties tirpalo (3.7) tūris prireikus gali būti sumažintas iki 10 arba 15 ml, skiedžiant vandeniu iki 25 ml.

8.4 Atliekant įprastą analizę, galima taikyti alternatyviuosius metodus žalių baltymų kiekiui nustatyti, bet šioje C dalyje aprašytas Kjeldalio metodas yra pamatinis metodas. Rezultatų gautų alternatyviaisiais metodais (pvz., DUMAS) lygiavertiškumas palyginti su pamatiniu metodu turi būti įrodytas kiekvienai matricai atskirai. Kadangi alternatyviuoju metodu gauti rezultatai ir pamatiniu metodu gauti rezultatai gali šiek tiek skirtis, netgi patikrinus lygiavertiškumą, analizės ataskaitoje būtina nurodyti žalių baltymų kiekiui nustatyti taikytą analizės metodą.

D. KARBAMIDO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti karbamido kiekį pašaruose.

2. Metodas

Ėminys suspenduojamas vandenyje kartu su skaidrinančiąja medžiaga. Suspensija filtruojama. Dedama 4-dimetilaminobenzaldehido (4-DMAB) ir karbamido kiekis filtrate nustatomas matuojant optinį tankį, esant bangos ilgiui 420 nm.

3. Reagentai

3.1 4-dimetilaminobenzaldehido tirpalas: 1,6 g 4-DMAB ištirpinama 100 ml 96 % etanolio ir įpilama 10 ml vandenilio chlorido rūgšties (ρ20 = 1,19 g/ml). Šį reagentą galima laikyti ne ilgiau kaip dvi savaitės.

3.2 Carrez I tirpalas: vandenyje ištirpinama 21,9 g cinko acetato, Zn(CH3COO)2·2H2O ir 3 g ledinės acto rūgšties. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.3 Carrez II tirpalas: vandenyje ištirpinama 10,6 g kalio heksacianoferato (II), K4Fe(CN)6 3H2O. Skiedžiama vandeniu iki 100 ml.

3.4 Aktyvintosios anglys, kurios nesugeria karbamido (turi būti patikrinta).

3.5 Karbamido 0,1 % (m/V) tirpalas.

4. Aparatūra

4.1 Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

4.2 Mėgintuvėliai: 160 × 16 mm su šlifo kamščiais.

4.3 Spektrofotometras.

5. Procedūra

5.1 Ėminio analizė

1 mg tikslumu pasveriama 2 g ėminio, kuris kartu su 1 g aktyvintų anglių (3.4) supilamas į 500 ml matavimo kolbą. Įpilama 400 ml vandens ir 5 ml Carrez I (3.2) tirpalo, maždaug 30 s maišoma ir įpilama 5 ml Carrez II (3.3) tirpalo. Trisdešimt minučių tirpalas maišomas vartytuve. Tirpalas skiedžiamas vandeniu iki žymės, sumaišomas ir filtruojamas.

Į mėgintuvėlius su šlifo kamščiais įpilama 5 ml skaidraus bespalvio filtrato, 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1) ir sumaišoma. Mėgintuvėliai statomi į vandens vonią 20 oC (+/- 4 oC) temperatūroje. Po penkiolikos minučių spektrofotometru matuojamas ėminio tirpalo optinis tankis, esant 420 nm bangos ilgiui. Palyginamuoju tirpalu naudojamas tuščiam ėminiui ruošti naudojamų reagentų tirpalas.

5.2 Kalibravimo kreivė

Į 100 ml matavimo kolbas įpilama 1, 2, 4, 5 ir 10 ml karbamido tirpalo (3.5) ir skiedžiama vandeniu iki žymės. Paimama po 5 ml kiekvieno tirpalo, į kiekvieną iš jų įpilama 5 ml 4-DMAB tirpalo (3.1), sumaišoma ir, kaip nurodyta anksčiau, matuojamas jų optinis tankis, lyginant su kontroliniu tirpalu, turinčiu 5 ml 4-DMAB ir 5 ml vandens, neturinčio karbamido. Brėžiama kalibravimo kreivė.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Pagal kalibravimo kreivę nustatomas karbamido kiekis ėminyje.

Rezultatas išreiškiamas ėminio masės procentais.

7. Pastabos

7.1 Tais atvejais, kai karbamido kiekis yra didesnis nei 3 %, imama 1 g ėminio arba pradinis tirpalas skiedžiamas tiek, kad jo 500 ml būtų ne daugiau nei 50 mg karbamido.

7.2 Tuo atveju, kai karbamido yra mažai, ėminio kiekis padidinamas tiek, kad filtratas dar liktų skaidrus ir bespalvis.

7.3 Jei ėminyje yra nesudėtingų azoto junginių, pvz., aminorūgščių, optinis tankis matuojamas esant 435 nm bangos ilgiui.

E. LAKIŲJŲ AZOTO BAZIŲ NUSTATYMAS

I. MIKRODIFUZIJOS METODAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančių lakiųjų azoto bazių kiekį, išreikštą amoniaku.

2. Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu, tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas. Lakiosios azoto bazės išstumiamos mikrodifuzijos būdu, naudojant kalio karbonato tirpalą, surenkamos boro rūgšties tirpale ir titruojamos sieros rūgštimi.

3. Reagentai

3.1 Trichloracto rūgšties tirpalas, 20 % (m/V).

3.2 Indikatorius: 33 mg bromkrezolio žaliojo ir 65 mg metilraudonojo ištirpinama 100 ml 95–96 % (V/V) etanolio.

3.3 Boro rūgšties tirpalas: 1 l matavimo kolboje ištirpinama 10 g boro rūgšties, 200 ml 95–96 % (V/V) etanolio ir 700 ml vandens. Įpilama 10 ml indikatoriaus (3.2). Sumaišoma ir, jei reikia, gaunama šviesiai raudona tirpalo spalva, įpilant natrio hidroksido tirpalo. 1 ml šio tirpalo suriša ne daugiau nei 300 μg NH3.

3.4 Sotusis kalio karbonato tirpalas: 100 ml verdančio vandens ištirpinama 100 g kalio karbonato. Atvėsinama ir filtruojama.

3.5 Sieros rūgštis 0,01 mol/l.

4. Aparatūra

4.1 Maišiklis (vartytuvas), apsisukimų dažnis maždaug 35–40 min-1.

4.2 Stiklinės arba plastikinės Conway kiuvetės (žr. schemą).

4.3 Mikrobiuretės, graduotos 1/100 ml padalomis.

5. Procedūra

10 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir naudojant 100 ml vandens supilama į 200 ml matavimo kolbą. 30 min maišoma maišymo būgne. Įpilama 50 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.1), skiedžiama vandeniu iki žymės, stipriai supurtoma ir filtruojama per gofruotąjį filtrą.

Pipete įlašinama 1 ml boro rūgšties tirpalo (3.3) į Conway kiuvetės centrinę dalį ir 1 ml ėminio filtrato į kiuvetės išorinį žiedą. Iš dalies uždengiama tepalu suteptu dangčiu. Į išorinį žiedą greitai įlašinama 1 ml sočiojo kalio karbonato tirpalo (3.4) ir uždengiama taip, kad į kiuvetę nepatektų oro. Kiuvetė atsargiai sukiojama apie ašį horizontalioje plokštumoje taip, kad abu reagentai susimaišytų. Inkubuojama kambario temperatūroje bent keturias valandas arba 40 oC temperatūroje vieną valandą.

Lakiosios bazės boro rūgšties tirpale iš mikrobiuretės (4.3) titruojamos 0,01 mol/l sieros rūgštimi (3.5).

Pagal tą pačią procedūrą atliekamas tuščiasis bandymas, bet be analizuojamo ėminio.

6. Rezultatų apskaičiavimas

1 ml 0,01 mol/l H2SO4 atitinka 0,34 mg amoniako.

Rezultatai išreiškiami ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei:

— 10 % santykinės vertės, kai amoniako kiekis mažesnis nei 1,0 %;

— 0,1 % absoliučiąja verte, kai amoniako kiekis 1,0 % arba didesnis.

7. Pastaba

Jei amoniako kiekis ėminyje didesnis nei 0,6 %, pradinis filtratas skiedžiamas.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II DISTILIAVIMO METODAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti lakiųjų azoto bazių kiekį, išreikštą amoniaku, žuvies miltuose, kuriuose beveik nėra karbamido. Jį galima taikyti tik mažesniam nei 0,25 % amoniako kiekiui.

2. Metodas

Ėminys ekstrahuojamas vandeniu, tirpalas skaidrinamas ir filtruojamas. Lakiosios azoto bazės išstumiamos virimo temperatūroje, pridedant magnio oksido, ir surenkamos tam tikrame kiekyje sieros rūgšties, kurios perteklius atvirkščiai titruojamas natrio hidroksido tirpalu.

3. Reagentai

3.1 Trichloracto rūgšties tirpalas, 20 % (m/V).

3.2 Magnio oksidas.

3.3 Priešpučio emulsija (pvz., siloksanas).

3.4 Sieros rūgšties 0,05 mol/l tirpalas.

3.5 Natrio hidroksido 0,1 mol/l tirpalas.

3.6 Metilraudonojo tirpalas, 0,3 % tirpalas 95–96 % (V/V) etanolyje.

4. Aparatūra

4.1 Maišiklis (vartytuvas), dažnis maždaug 35–40 sūk./min.

4.2 Distiliavimo aparatas, Kjeldalio tipo.

5. Procedūra

10 g ėminio pasveriama 1 mg tikslumu ir naudojant 100 ml vandens supilama į 200 ml matavimo kolbą. 30 min maišoma maišymo būgne. Įpilama 50 ml trichloracto rūgšties tirpalo (3.1), skiedžiama vandeniu iki žymės, stipriai supurtoma ir filtruojama per gofruotąjį filtrą.

Paimamas skaidraus filtrato kiekis, atitinkantis numatomą lakiųjų azoto bazių kiekį (paprastai reikia 100 ml). Skiedžiama iki 200 ml, įdedama 2 g magnio oksido (3.2) ir įlašinami keli lašai priešpučio emulsijos (3.3). Tirpalas turi būti šarminis pagal lakmusą; priešingu atveju įdedama dar šiek tiek magnio oksido (3.2). Tęsiama pagal analizės metodo, taikomo žalių baltymų kiekiui nustatyti (šio priedo C dalis), 5.2 ir 5.3 punktus.

Pagal tą pačią procedūrą atliekamas tuščiasis bandymas, bet be analizuojamo ėminio.

6. Rezultatų apskaičiavimas

1 ml 0,05 mol/l H2SO4 atitinka 1,7 mg amoniako.

Rezultatai išreiškiami ėminio masės procentais.

Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio nustatymų rezultatų skirtumas ne didesnis nei 10 % amoniako santykinės vertės.

F. AMINO RŪGŠČIŲ (IŠSKYRUS TRIPTOFANĄ) NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Naudojant aminorūgščių analizatorių, šiuo metodu galima nustatyti laisvųjų (sintetinių ir gamtinių) amino rūgščių ir suminį (peptidų ir laisvųjų) aminorūgščių kiekį pašaruose. Šis metodas tinka šioms aminorūgštims: cisteinui (cistinui), metioninui, lizinui, treoninui, alaninui, argininui, asparto ir glutamino rūgštims, glicinui, histidinui, izoleucinui, leucinui, fenilalaninui, prolinui, serinui, tirozinui ir valinui.

Šiuo metodu negalima atskirti aminorūgščių druskų ir negalima atskirti aminorūgščių D-ir L-formų. Metodas netinka triptofano arba hidroksigrupę turintiems aminorūgščių analogams nustatyti.

2. Metodas

2.1 Laisvosios aminorūgštys

Laisvosios aminorūgštys ekstrahuojamos praskiesta vandenilio chlorido rūgštimi. Kartu ekstrahuojamos azoto turinčios makromolekulės nusodinamos sulfosalicilo rūgštimi ir atskiriamos filtruojant. Nustatoma filtruoto tirpalo pH vertė 2,20 . Aminorūgštys atskiriamos jonų mainų chromatografija ir nustatomos fotometriškai vykdant reakciją su ninhidrinu, kai bangos ilgis 570 nm.

2.2 Suminis aminorūgščių kiekis

Pasirinkta procedūra priklauso nuo tiriamų aminorūgščių. Cisteinas (cistinas) ir metioninas prieš hidrolizę turi būti oksiduojami iki cistino rūgšties ir metionino sulfono. Tirozinas turi būti nustatomas neoksiduotų ėminių hidrolizatuose. Visos kitos 1 skirsnyje išvardytos aminorūgštys gali būti nustatomos arba oksiduotuose, arba neoksiduotuose ėminiuose.

Oksidacija atliekama peroksiskruzdžių rūgšties ir fenolio mišiniu 0 oC temperatūroje. Oksidacijos reagento perteklius skaidomas natrio disulfitu. Oksiduoti ar neoksiduoti ėminiai 23 valandas hidrolizuojami vandenilio chlorido rūgštimi (3.20). Nustatoma hidrolizatų pH vertė 2,20 . Aminorūgštys atskiriamos taikant jonų mainų chromatografiją ir nustatomos fotometriniu metodu vykdant reakciją su ninhidrinu, esant 570 nm (prolinui – 440 nm).

3. Reagentai

Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba atitinkamos kokybės (elektrinis laidis < 10 μS) vanduo.

3.1 Vandenilio peroksidas, w (w/w) = 30 %.

3.2 Skruzdžių rūgštis, w (w/w) = 98–100 %.

3.3 Fenolis.

3.4 Natrio disulfitas.

3.5 Natrio hidroksidas.

3.6 5-sulfosalicilo rūgšties dihidratas.

3.7 Vandenilio chlorido rūgštis, tankis maždaug 1,18 g/ml.

3.8 trinatrio citrato dihidratas.

3.9 2,2 '-tiodietanolis (tiodiglikolis).

3.10 Natrio chloridas.

3.11 Ninhidrinas.

3.12 Petroleteris, virimo temperatūros intervalas 40–60 oC.

3.13 Norleucinas arba kitas junginys, kurį galima naudoti kaip vidinį etaloną.

3.14 Azoto dujos (< 10 ppm deguonies).

3.15 1-oktanolis.

3.16 Aminorūgštys.

3.16.1 1 skirsnyje išvardytų medžiagų etalonai. Grynieji junginiai, neturintys kristalizacinio vandens. Džiovinami vakuume virš P2O5 arba H2SO4 likus savaitei iki naudojimo.

3.16.2 Cistino rūgštis.

3.16.3 Metionino sulfonas.

3.17 Natrio hidroksido tirpalas, c = 7,5 mol/l:

300 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

3.18 Natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l:

40 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 litro.

3.19 Skruzdžių rūgšties ir fenolio tirpalas:

889 g skruzdžių rūgšties (3.2) sumaišoma su 111 g vandens ir įdedama 4,73 g fenolio (3.3).

3.20 Hidrolizės mišinys, c = 6 mol/l HCl tirpalas, turintis 1 g/l fenolio:

įdedama 1 g fenolio (3.3) į 492 ml HCl (3.7) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.21 Ekstrahavimo mišinys, c = 0,1 mol/l HCl tirpalas, turintis 2 % tiodiglikolio: paimama 8,2 ml HCl (3.7), skiedžiama maždaug 900 ml vandens, įpilama 20 ml tiodiglikolio (3.9) ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro (tiesiogiai nemaišyti 3.7 ir 3.9).

3.22 5-sulfosalicilo rūgštis, ß = 6 %:

60 g 5-sulfosalicilo rūgšties (3.6) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.23 Oksidavimo mišinys (peroksiskruzdžių rūgštis ir fenolis):

Mažoje stiklinėje sumaišoma 0,5 ml vandenilio peroksido (3.1) ir 4,5 ml skruzdžių rūgšties bei fenolio tirpalo (3.19). Laikoma 1 val. 20–30 oC temperatūroje, kad susidarytų peroksiskruzdžių rūgštis, ir prieš supilant į ėminį šaldoma ledo ir vandens vonioje (15 min).

Įspėjimas. Vengiama patekimo ant odos ir dėvimi apsauginiai drabužiai.

3.24 Citratinis buferinis tirpalas, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20 :

maždaug 800 ml vandens ištirpinama 19,61 g natrio citrato (3.8), 5 ml tiodiglikolio (3.9), 1 g fenolio (3.3) ir 16,50 ml HCl (3.7). Nustatoma pH vertė 2,20 . Skiedžiama vandeniu iki 1 litro.

3.25 Plovimo buferiniai tirpalai, paruošti pagal naudojamo analizatoriaus (4.9) sąlygas.

3.26 Ninhidrino reagentas ruošiamas pagal analizatoriaus (4.9) sąlygas.

3.27 Aminorūgščių etaloniniai tirpalai. Šie tirpalai laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

3.27.1 Aminorūgščių pradiniai etaloniniai tirpalai (3.16.1).

c = 2,5 μmol/ml kiekvienos rūgšties tirpalas vandenilio chlorido rūgštyje.

Galima naudoti esančius prekyboje.

3.27.2 Cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinis etaloninis tirpalas, c = 1,25 μmol/ml.

0,2115 g cistino rūgšties (3.16.2) ir 0,2265 g metionino sulfono (3.16.3) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24) 1 litro matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 12 mėnesių. Šis tirpalas nenaudojamas, jei pradiniame etaloniniame tirpale (3.27.1) yra cistino rūgšties ir metionino sulfono.

3.27.3 Pradinis vidinio etalono, pvz.: norleucino, tirpalas, c = 20 μmol/ml.

0,6560 g norleucino (3.13) ištirpinama citratiniame buferiniame tirpale (3.24) 250 ml matavimo kolboje, iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu. Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 6 mėnesius.

3.27.4 Etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalas, naudojamas hidrolizatams, c = 5 nmol/50 μl cistino rūgšties ir metionino sulfono ir c = 10 nmol/50 μl kitų aminorūgščių. 2,2 g natrio chlorido (3.10) ištirpinama 30 ml citratinio buferinio tirpalo (3.24) 100 ml stiklinėje. Įpilama 4,00 ml aminorūgščių pradinio etaloninio tirpalo (3.27.1), 4,00 ml cistino rūgšties ir metionino sulfono pradinio etaloninio tirpalo (3.27.2) ir 0,50 ml pradinio vidinio etalono tirpalo (3.27.3), jei naudojamas. Natrio hidroksidu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20 .

Kiekybiškai supilama į 50 ml matavimo kolbą, skiedžiama iki žymės citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) ir sumaišoma.

Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius.

Žr. dar 9.1 pastabą.

3.27.5 Etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalas, naudojamas hidrolizatams, paruoštiems pagal 5.3.3.1 punktą, ir ekstraktams (5.2). Kalibravimo tirpalas ruošiamas pagal 3.27.4, bet nededama natrio chlorido.

Laikoma žemesnėje nei 5 oC temperatūroje ne ilgiau kaip 3 mėnesius.

4. Aparatūra

4.1 100 arba 250 ml apvaliadugnė kolba su grįžtamuoju kondensatoriumi.

4.2 100 ml borosilikatinio stiklo butelis su užsukamu kamščiu ir guminiu ar tefloniniu tarpikliu (pvz.: Duran, Schott), tinkamas naudoti krosnyje.

4.3 Ventiliuojama krosnis su temperatūros reguliatoriumi, kurio tikslumas geresnis nei ± 2 oC.

4.4 pH-metras (trys skaičiai po kablelio).

4.5 Membraninis filtras (0,22 μm).

4.6 Centrifuga.

4.7 Sukamasis vakuuminis garintuvas.

4.8 Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė.

4.9 Aminorūgščių analizatorius arba HPLC įranga su jonų mainų kolonėle, reakcijos su ninhidrinu įtaisu, darinių gavimo įtaisu ir fotometriniu detektoriumi.

Kolonėlės įkrova – sulfoninto polistireno dervos, galinčios atskirti aminorūgštis vieną nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių medžiagų. Srautas buferinio tirpalo ir ninhidrino sistemose reguliuojamas siurbliais, srauto stabilumas – ±0,5 % kalibravimo tirpalo ir ėminio analizės metu.

Su kai kuriais aminorūgščių analizatoriais galima naudoti hidrolizės procedūras, kai hidrolizato natrio jonų koncentracija c = 0,8 mol/l ir jame yra visas po oksidacijos likęs skruzdžių rūgšties perteklius. Kitais analizatoriais negalima tinkamai atskirti tam tikras aminorūgštis, jei hidrolizate yra skruzdžių rūgšties perteklius ir (arba) didelė natrio jonų koncentracija. Tokiu atveju po hidrolizės ir prieš pH nustatymą, rūgšties tūris sumažinamas maždaug iki 5 ml ją garinant. Garinama vakuume ne aukštesnėje nei 40 oC temperatūroje.

5. Procedūra

5.1 Ėminio ruošimas

Ėminys sumalamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5 mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimą turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 oC temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (3.12).

5.2 Laisvųjų amino rūgščių nustatymas pašaruose ir premiksuose

Į kūginę kolbą 0,2 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas paruošto ėminio (5.1) kiekis (1–5 g) ir įpilama 100,0 ml ekstrahavimo mišinio (3.21). Mišinys maišomas 60 min mechanine purtykle arba magnetine maišykle (4.8). Nuosėdoms leidžiama nusėsti ir 10,0 ml tirpalo virš nuosėdų paimama pipete į 100 ml stiklinę.

Maišant įpilama 5,0 ml sulfosalicilo rūgšties tirpalo (3.22) ir maišoma magnetine maišykle 5 min. Tirpalas virš nuosėdų filtruojamas arba centrifuguojamas visoms nuosėdoms pašalinti. 10,0 ml gauto tirpalo įpilama į 100 ml stiklinę, natrio hidroksido tirpalu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20 , plaunant citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) supilama į tinkamo tūrio matavimo kolbą ir citratiniu buferiniu tirpalu (3.24) skiedžiama iki žymės.

Jei naudojamas vidinis etalonas, įpilama 1,00 ml vidinio etalono (3.27.3) kiekvienam 100 ml gauto tirpalo ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24).

Atliekama chromatografinė analizė pagal 5.4 punktą.

Jei ekstraktai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

5.3 Suminio aminorūgščių kiekio nustatymas

5.3.1 Oksidavimas

0,1 –1 g paruošto ėminio (5.1) 0,2 mg tikslumu pasveriama:

— į 100 ml apvaliadugnę kolbą (4.1) hidrolizei atvirame inde (5.3.23), arba

— į 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1), jei turi būti maža natrio koncentracija (5.3.3.1), arba,

— į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (4.2) hidrolizei uždarytame inde (5.3.2.4).

Pasvertojoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg, o drėgmės ne daugiau nei 100 mg.

Kolba (butelis) dedama į ledo ir vandens vonią, atšaldoma iki 0 oC, įpilama 5 ml oksidavimo mišinio (3.23) ir maišoma stikline mentele su lenktu galu. Kolba (butelis) kartu su viduje esančia mentele uždengiama orui nepralaidžia plėvele, ledo ir vandens vonia su taip uždarytu indu dedama į šaldytuvą, kuriame temperatūra 0 oC, ir laikoma jame 16 valandų. Po 16 valandų indas išimamas iš šaldytuvo ir oksidavimo reagento perteklius suskaidomas, pridedant 0,84 g natrio disulfito (3.4).

Tęsiama pagal 5.3.2.1.

5.3.2 Hidrolizė

5.3.2.1 Oksiduotų ėminių hidrolizė

Į oksiduotą ėminį, paruoštą pagal 5.3.1, įpilama 25 ml hidrolizavimo mišinio (3.20), nuplaunant prie indo sienelių ir mentelės prilipusius ėminio likučius.

Atsižvelgiant į taikomą procedūrą, tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4.

5.3.2.2 Neoksiduotų ėminių hidrolizė

Į 100 ml ar 250 ml apvaliadugnę kolbą (4.1) ar į 100 ml butelį su užsukamu kamščiu (4.2) 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1 –1 g paruošto ėminio (5.1). Pasvertoje ėminio dalyje azoto turi būti apie 10 mg. Atsargiai įpilama hidrolizavimo mišinio (3.20) ir sumaišoma su ėminiu. Tęsiama pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4.

5.3.2.3 Hidrolizė atvirame inde

Į kolbą su mišiniu (paruoštu pagal 5.3.2.1 ar 5.3.2.2) įdedami 3 stikliniai rutuliukai ir 23 valandas virinama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Hidrolizei pasibaigus, kondensatorius išplaunamas 5 ml citratinio buferinio tirpalo (3.24). Kolba nuimama ir atšaldoma ledo vonioje.

Tęsiama pagal 5.3.3.

5.3.2.4 Hidrolizė uždarame inde

Butelis su mišiniu, paruoštu pagal 5.3.2.1 arba 5.3.2.2, dedamas į krosnį (4.3) 110 oC temperatūroje. Kad slėgis nedidėtų (dėl dujinių medžiagų susidarymo) ir būtų išvengta sprogimo, pirmąją hidrolizės valandą užsukamas kamštis dedamas ant indo viršaus. Kamštis neužsukamas. Po valandos kamštis užsukamas ir indas laikomas krosnyje 23 valandas. Hidrolizei pasibaigus, indas išimamas iš krosnies, kamštis atsargiai atsukamas ir butelis statomas į ledo ir vandens vonią. Paliekama atvėsti.

Atsižvelgiant į pH reguliavimo procedūrą (5.3.3), butelio turinys kiekybiškai supilamas į 250 ml stiklinę arba 250 ml apvaliadugnę kolbą, naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24).

Tęsiama pagal 5.3.3.

5.3.3 pH reguliavimas

Atsižvelgiant į aminorūgščių analizatoriaus (4.9) jautrumą natriui, pH reguliavimas tęsiamas pagal 5.3.3.1 arba 5.3.3.2.

5.3.3.1 Chromatografinės analizės sistemos (4.9), kurioms reikia mažos natrio koncentracijos

Kai naudojami aminorūgščių analizatoriai, kuriems reikia mažos natrio jonų koncentracijos (kai turi būti sumažintas rūgšties tūris), patariama naudoti pradinį vidinio etalono tirpalą (3.27.3).

Šiuo atveju prieš garinimą į hidrolizatą įpilama 2,00 ml pradinio vidinio etalono tirpalo (3.27.3).

Į hidrolizatus, gautus pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4, įlašinami 2 lašai 1-oktanolio.

Sukamajame garintuve (4.7) garinant vakuume ir 40 oC temperatūroje, tūris sumažinamas iki 5–10 ml. Jei netyčia tūris sumažėja iki mažesnio nei 5 ml tūrio, hidrolizatas turi būti išpiltas ir analizė atliekama iš naujo.

Natrio hidroksido tirpalu (3.18) nustatoma pH vertė 2,20 ir toliau tęsiama pagal 5.3.4.

5.3.3.2 Visiems kitiems aminorūgščių analizatoriams (4.9)

Hidrolizatai, gauti pagal 5.3.2.3 arba 5.3.2.4, iš dalies neutralizuojami atsargiai įpilant 17 ml natrio hidroksido tirpalo (3.17), tirpalą visą laiką maišant ir žiūrint, kad temperatūra būtų žemesnė nei 40 oC.

Kambario temperatūroje nustatoma pH vertė 2,20 , naudojant natrio hidroksido tirpalą (3.17) ir vėliau natrio hidroksido tirpalą (3.18). Tęsiama pagal 5.3.4.

5.3.4 Ėminio tirpalas chromatografijai

Hidrolizatas, kurio pH vertė nustatyta (5.3.3.1 arba 5.3.3.2), kiekybiškai supilamas į 200 ml matavimo kolbą naudojant citratinį buferinį tirpalą (3.24), ir skiedžiama iki žymės buferiniu tirpalu (3.24).

Jei vidinis etalonas dar nebuvo naudotas, įpilama 2,00 ml vidinio etalono (3.27.3) ir iki žymės skiedžiama citratiniu buferiniu tirpalu (3.24). Gerai sumaišoma.

Atliekama chromatografinė analizė (5.4).

Jei ėminių tirpalai netiriami tą pačią dieną, jie turi būti laikomi žemesnėje nei 5 oC temperatūroje.

5.4 Chromatografija

Prieš atliekant chromatografinę analizę ekstraktui (5.2) arba hidrolizatui (5.3.4) leidžiama pasiekti kambario temperatūrą. Mišinys kratomas ir filtruojamas per 0,22 μm membraninį filtrą (4.5). Aminorūgščių analizatoriumi (4.9) atliekama gauto skaidraus tirpalo jonų mainų chromatografija.

Įpurkšti galima rankiniu būdu arba automatiškai. Svarbu, kad matuojant etalonus ir ėminius į kolonėlę ± 0,5 % tikslumu būtų įpurškiamas vienodas tirpalo tūris, išskyrus atvejus, kai naudojamas vidinis etalonas, ir kad natrio bei aminorūgščių santykis etalone ir ėminio tirpale būtų kiek įmanoma vienodesnis.

Paprastai kalibravimo dažnis priklauso nuo ninhidrino reagento stabilumo ir analizinės sistemos. Etalonas arba ėminys skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu (3.24), kad etalono smailės plotas sudarytų 30–200 % ėminio aminorūgšties smailės ploto.

Priklausomai nuo naudojamo analizatoriaus ir dervos tipo, aminorūgščių chromatografija šiek tiek skirsis. Pasirinkta sistema turi atskirti vieną aminorūgštį nuo kitos ir nuo kitų su ninhidrinu reaguojančių junginių. Atsakas į kolonėlėje analizuojamų aminorūgščių kiekio pokyčius turi būti tiesinis chromatografinės sistemos naudojimo intervale.

Atliekant chromatografinę analizę, taikomi toliau nurodyti įdubos ir viršūnės aukščių santykiai, kai analizuojamas (nustatomų aminorūgščių) ekvimolinis tirpalas. Šis ekvimolinis tirpalas turi turėti mažiausiai 30 % kiekvienos aminorūgšties, kurią galima tiksliai išmatuoti aminorūgščių analizatoriaus sistema (4.9), įkrovos didžiausio kiekio.

Norint atskirti treoniną ir seriną, žemesnės iš dviejų persiklojančių aminorūgščių smailių įdubos ir viršūnės aukščių santykis chromatogramoje neturi būti didesnis nei 2:10 (jei nustatomas tik cisteinas (cistinas), metioninas, treoninas ir lizinas, nepakankamas gretimų smailių atsiskyrimas neigiamai veiktų nustatymui). Visoms kitoms aminorūgštims atskyrimas turi būti geresnis nei 1: 10.

Sistema turi užtikrinti, kad lizinas būtų atskirtas nuo „lizino darinių“ ir ornitino.

6. Rezultatų apskaičiavimas

Matuojamas ėminio ir etalono kiekvienos aminorūgšties smailės plotas ir apskaičiuojamas kiekis (X) aminorūgšties gramais kg ėminio:

Jei naudojamas vidinis etalonas, dauginama iš:

A = hidrolizato arba ekstrakto smailės plotas

B = kalibravimo etaloninio tirpalo smailės plotas

C = vidinio etalono hidrolizate arba ekstrakte smailės plotas

D = vidinio etalono, kalibravimo etaloninio tirpalo smailės plotas

M = nustatomos aminorūgšties molinė masė

c = etalono koncentracija μmol/ml

m = ėminio masė (g) (su pataisa pradinei masei, jei ėminys buvo džiovinamas ar iš jo šalinami riebalai)

V = visas hidrolizato tūris (5.3.4) arba apskaičiuotas visas praskiesto ekstrakto tūris (6.1) ml

Oksiduotų ėminių hidrolizatuose cistinas ir cisteinas nustatomi kaip cistino rūgštis, bet apskaičiuojami kaip cistinas (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol), naudojant M = 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 ).

Metioninas nustatomas kaip metionino sulfonas oksiduoto ėminio hidrolizatuose, bet apskaičiuojamas kaip metioninas, naudojant metionino M = 149,21 g/mol.

Įdėtas laisvasis metioninas nustatomas po ekstrakcijos kaip metioninas, apskaičiavimui naudojant tą pačią molinę masę.

6.1 Visas praskiesto ekstrakto tūris (F) laisvosioms aminorūgštims (5.2) nustatyti apskaičiuojamas taip:

V = galutinio ekstrakto tūris

7. Metodo įvertinimas

Metodas buvo patikrintas 1990 m. atliekant palyginimą tarptautiniu lygiu, naudojant keturis skirtingus pašarus (mišriuosius kiaulių pašarus, broilerių kombinuotuosius pašarus, baltymų koncentratą, premiksus). Vidurkio ir standartinio nuokrypio rezultatai, gauti atmetus riktus, pateikiami šio punkto lentelėse:







Vidurkiai g/kg Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Baltymų koncentratas 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premiksas 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

7.1 Pakartojamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo pakartojamumas, išreikštas kaip laboratorijos standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:







Laboratorijos standartinis nuokrypis (Sr) g/kg Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Baltymų koncentratas 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premiksas 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.







Laboratorijos standartinio nuokrypio (Sr) variacijos koeficientas (%) Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Baltymų koncentratas 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premiksas 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

7.2 Atkuriamumas

Pirmiau nurodyto tarplaboratorinio palyginimo atkuriamumas, išreikštas kaip tarplaboratorinis standartinis nuokrypis, pateiktas šiose lentelėse:







Tarplaboratorinis standartinis nuokrypis (SR) g/kg Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Baltymų koncentratas 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premiksas 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.







Tarplaboratorinis standartinio nuokrypio (SR) variacijos koeficientas (%) Pamatinė medžiaga Aminorūgštis Treoninas Cisteinas (cistinas) Metioninas Lizinas Mišrieji kiaulių pašarai 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Broilerių kombinuotieji pašarai 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Baltymų koncentratas 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premiksas 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = dalyvavusių laboratorijų skaičius.

8. Pamatinių medžiagų naudojimas

Tinkamas šio metodo taikymas turi būti patikrintas atliekant kartotinius sertifikuotųjų pamatinių medžiagų matavimus, jei jos yra. Rekomenduojama kalibruoti sertifikuotaisiais aminorūgščių kalibravimo tirpalais.

9. Pastabos

9.1 Dėl aminorūgščių analizatorių skirtumų tikrinama pagal galutinę etaloninių aminorūgščių kalibravimo tirpalų (žr. 5.27.4 ir 5.27.5) ir hidrolizatų (žr. 5.3.4) koncentraciją.

Prietaiso tiesinio atsako intervalas turi būti tikrinamas visoms aminorūgštims.

Etaloninis tirpalas skiedžiamas citratiniu buferiniu tirpalu, kad smailių plotai būtų intervalo viduryje.

9.2 Jei hidrolizatams analizuoti naudojama efektyviosios skysčių chromatografijos įranga, bandymų sąlygas reikia optimizuoti pagal gamintojo rekomendacijas.

9.3 Taikant metodą pašarams, kuriuose yra daugiau nei 1 % chloridų (koncentratai, mineraliniai pašarai, papildai), gali būti gauti sumažinti metionino rezultatai, todėl reikia numatyti specialų apdorojimą.

G. TRIPTOFANO NUSTATYMAS

1. Tikslas ir taikymo sritis

Šiuo metodu galima nustatyti pašaruose esančio triptofano suminį kiekį ir laisvąjį triptofaną. Šiuo metodu D- ir L-formos neatskiriamos.

2. Metodas

Suminiam triptofanui nustatyti ėminys 20 valandų hidrolizuojamas šarminėje terpėje sočiuoju bario hidroksido tirpalu 110 oC temperatūroje. Po hidrolizės įpilama vidinio etalono.

Laisvajam triptofanui nustatyti ėminys ekstrahuojamas silpnai rūgštinėje terpėje esant vidiniam etalonui.

Triptofanas ir vidinis etalonas hidrolizate ar ekstrakte nustatomi HPLC metodu naudojant fluorescencinį detektorių.

3. Reagentai

3.1 Turi būti naudojamas du kartus distiliuotas arba tokios pat kokybės vanduo (laidis < 10 μS/cm).

3.2 Etaloninė medžiaga: triptofanas (grynumas/kiekis ≥ 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido.

3.3 Vidinio etalono medžiaga: α-metiltriptofanas (grynumas/kiekis ≥ 99 %), išdžiovintas vakuume virš fosforo pentoksido.

3.4 Bario hidroksido oktahidratas (siekiant išvengti BaCO3 susidarymo, kuris galėtų trukdyti nustatymui, užtikrinama, kad Ba(OH)2 8H2O visiškai nesiliestų su oru) (žr. 9.3 pastabą).

3.5 Natrio hidroksidas.

3.6 Ortofosforo rūgštis, w = 85 %.

3.7 Vandenilio chlorido rūgštis, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8 Metanolis, HPLC grynumo.

3.9 Petroleteris, virimo temperatūros intervalas – 40–60 oC.

3.10 Natrio hidroksido tirpalas, c = 1 mol/l:

40,0 g NaOH (3.5) ištirpinama vandenyje ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (3.1).

3.11 Vandenilio chlorido rūgštis, c = 6 mol/l:

paimama 492 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

3.12 Vandenilio chlorido rūgštis, c = 1 mol/l:

paimama 82 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

3.13 Vandenilio chlorido rūgštis, c= 0,1 mol/l:

paimama 8,2 ml HCl (3.7) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu.

3.14 Orto fosforo rūgštis, c = 0,5 mol/l:

paimama 34 ml ortofosforo rūgšties (3.6) ir skiedžiama iki 1 l vandeniu (3.1).

3.15 Koncentruotas triptofano tirpalas (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2553 g triptofano (3.2), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13). Laikoma –18 oC ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.16 Koncentruotas vidinio etalono tirpalas, c = 2,50 μmol/ml:

į 500 ml matavimo kolbą įdedama 0,2728 g α-metiltriptofano (3.3), ištirpinama vandenilio chlorido rūgštyje (3.13) ir skiedžiama iki žymės vandenilio chlorido rūgštimi (3.13). Laikoma –18 oC ne ilgiau kaip keturias savaites.

3.17 Triptofano kalibravimo etaloninis tirpalas ir vidinis etalonas:

paimama 2,00 ml koncentruoto triptofano tirpalo (3.15) ir 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Skiedžiama vandeniu (3.1) ir metanoliu (3.8) iki maždaug tokio pat tūrio ir maždaug iki tokios pat metanolio koncentracijos (10–30 %) kaip galutinio hidrolizato tūris ir koncentracija.

Šis tirpalas turi būti ruošiamas iš naujo prieš naudojimą.

Ruošiamas tirpalas saugomas nuo tiesioginių saulės spindulių.

3.18 Acto rūgštis

3.19 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolis.

3.20 Etanolaminas, w (w/w) > 98 %.

3.21 1 g 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalas 100 ml metanolio (3.8).

3.22 HPLC judančioji fazė: 3,00 g acto rūgšties (3.18) + 900 ml vandens (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalo (3.21) metanolyje (3.8) (1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20) nustatoma pH vertė 5,00 . Vandeniu (3.1) skiedžiama iki 1 000 ml.

4. Aparatūra

4.1 HPLC įranga ir fluorescencinis detektorius.

4.2 Skysčių chromatografijos kolonėlė, 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė.

4.3 pH-metras.

4.4 Kolba iš polipropileno, talpa 125 ml, su plačiu kaklu ir užsukamu dangčiu.

4.5 Membraninis filtras, 0,45 μm.

4.6 Autoklavas, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1 ) bar.

4.7 Mechaninė purtyklė arba magnetinė maišyklė.

4.8 Sūkurinė maišyklė.

5. Procedūra

5.1 Ėminių ruošimas

Ėminys sumalamas taip, kad jį būtų galima sijoti per 0,5 mm sietą. Daug drėgmės turintys ėminiai prieš malimą turi būti džiovinami ore ne didesnėje nei 50 C temperatūroje arba liofilizuojami. Daug riebalų turintys ėminiai prieš malimą ekstrahuojami petroleteriu (3.9).

5.2 Laisvojo triptofano nustatymas (ekstraktas)

Į kūginę kolbą 1 mg tikslumu pasveriamas atitinkamas kiekis (1–5 g) paruošto ėminio (5.1). Įpilama 100,0 ml vandenilio chlorido rūgšties, c = 0,1 mol/l (3.13) ir 5,00 ml koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16). 60 min purtoma mechanine purtykle arba maišoma magnetine maišykle (4.7). Nuosėdoms leidžiama nusėsti, pipete paimama į cheminę stiklinę 10,0 ml tirpalo virš nuosėdų. Įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14). Natrio hidroksido tirpalu, c = 1,0 mol/l, (3.10) nustatoma pH vertė 3,0 . Įpilamas pakankamas kiekis metanolio (3.8), kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei tinkamo tūrio (maždaug iki to paties tūrio, kaip kalibravimo etaloninio tirpalo tūris (3.17)).

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5). Atliekama chromatografinė analizė pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninis tirpalas ir ekstraktai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 C temperatūroje.

5.3 Suminio triptofano kiekio nustatymas (hidrolizatas)

Į kolbą iš polipropileno (4.4) 0,2 mg tikslumu pasveriama 0,1 –1 g paruošto ėminio (5.1). Pasvertojoje ėminio dalyje yra apie 10 mg azoto. Įpilama 8,4 g bario hidroksido oktahidrato (3.4) ir 10 ml vandens. Sumaišoma sūkurine maišykle (4.8) arba magnetine maišykle (4.7). Teflonu padengtas magnetas paliekamas mišinyje. Indo sienelės nuplaunamos 4 ml vandens. Kolba uždengiama užsukamuoju dangčiu jo neužveržiant. Kolba įdedama į autoklavą (4.6) su verdančiu vandeniu ir garais ir laikoma 30–60 min. Autoklavas uždaromas ir 20 valandų kaitinama 110 (± 2) C temperatūroje.

Prieš atidarant autoklavą temperatūra sumažinama iki šiek tiek žemesnės nei 100 oC. Siekiant išvengti Ba(OH)2 × 8H2O išsikristalizavimo, į šiltą mišinį įpilama 30 ml kambario temperatūros vandens. Švelniai purtoma arba maišoma. Įpilama 2,00 ml koncentruoto vidinio etalono (α-metiltriptofano) tirpalo (3.16). Indai 15 min aušinami ant vandens arba ledo vonios.

Tada įpilama 5 ml ortofosforo rūgšties, c = 0,5 mol/l (3.14). Indą laikant ant aušinamosios vonios ir maišant, turinys neutralizuojama HCl, c = 6 mol/l (3.11), ir HCl, c = 1 mol/l (3.12) nustatoma pH vertė 3,0 . Įpilamas pakankamas kiekis metanolio, kad galutinio tirpalo metanolio koncentracija būtų 10–30 %. Supilama į atitinkamo tūrio matavimo kolbą ir skiedžiama vandeniu iki chromatografinei analizei reikiamo tūrio (pvz., 100 ml). Įpylus metanolio, nuosėdos nesusidaro.

Prieš įpurškiant į HPLC kolonėlę keli ml tirpalo filtruojami per 0,45 μm membraninį filtrą (4.5). Chromatografinė analizė atliekama pagal 5.4 skirsnį.

Etaloninis tirpalas ir hidrolizatai saugomi nuo tiesioginių saulės spindulių. Jei ekstraktų neįmanoma analizuoti tą pačią dieną, ekstraktus ne ilgiau kaip tris paras galima laikyti 5 oC temperatūroje.

5.4 HPLC nustatymas

Rekomenduojamos šios izokratinio eliuavimo sąlygos; gali būti taikomos kitos sąlygos, jei gaunami lygiaverčiai rezultatai (žr. dar 9.1 ir 9.2 pastabas):







Skysčių chromatografijos kolonėlė (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, 3 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė Kolonėlės temperatūra: kambario temperatūra Judančioji fazė (3.22): 3,00 g acto rūgšties (3.18) + 900 ml vandens (3.1) +50,0 ml 1,1,1-trichlor-2-metil-2-propanolio (3.19) tirpalo (3.21) metanolyje (3.8) (1 g/100 ml). Etanolaminu (3.20) nustatoma pH vertė 5,00 . Skiedžiama iki 1 000 ml vandeniu (3.1) Srautas: 1 ml/min Visa eliuavimo trukmė: maždaug 34 min Detektoriaus bangos ilgis: sužadinimas: 280 nm, emisija: 356 nm. Įpurškiamas tūris 20 μl

6. Rezultatų apskaičiavimas

Apskaičiuojamas triptofano kiekis (X) g 100 g ėminio.

A = vidinio etalono smailės plotas, kalibravimo etaloninis tirpalas (3.17)

B = triptofano ekstrakte (5.2) ar hidrolizate (5.3) smailės plotas

V1 = koncentruoto triptofano tirpalo (3.15), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17), tūris ml (2 ml)

c = koncentruoto triptofano tirpalo (3.15), įpilamo į kalibravimo tirpalą (3.17), koncentracija μmol/ml (= 2,50 )

V2 = koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16), įpilamo į ekstraktą (5.2) (= 5,00 ml) arba į hidrolizatą (5.3) (= 2,00 ml), tūris

C = ekstrakto (5.2) arba hidrolizato (5.3) vidinio etalono smailės plotas

D = triptofano kalibravimo etaloninio tirpalo (3.17) smailės plotas

V3 = koncentruoto vidinio etalono tirpalo (3.16), įpilamo į kalibravimo etaloninį tirpalą (3.17), tūris ml (= 2,00 ml)

m = ėminio masė g (su pataisa pradinei masei, jei jis buvo išdžiovintas arba iš jo buvo pašalinti riebalai)

M = triptofano molekulinė masė (= 204,23 g/mol)

7. Pakartojamumas

Dviejų lygiagrečiai atliktų to paties ėminio matavimų rezultatų skirtumas neturi būti didesnis nei 10 % didesniojo rezultato vertės.

8. Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai

Hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (4-asis tarplaboratorinis palyginimas), kurį vykdant ne daugiau kaip 12 laboratorijų analizavo tris ėminius. Buvo atliekamos lygiagrečios (5) kiekvieno ėminio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:







1 ėminys Kiaulių pašaras 2 ėminys Kiaulių pašaras su L-triptofanu 3 ėminys Kiaulių pašaro koncentratas L 12 12 12 n 50 55 50 Vidurkis [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2

L = rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius

n = atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius

sr = pakartojamumo standartinis nuokrypis

SR = atkuriamumo standartinis nuokrypis

r = pakartojamumas

R = atkuriamumas

CVr = pakartojamumo variacijos koeficientas, %

CVR = atkuriamumo variacijos koeficientas, %

Laisvojo triptofano ekstrahavimo metodui sertifikuoti buvo parengtas kitas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas (3–asis tarplaboratorinis palyginimas), kurį vykdant ne daugiau kaip 13 laboratorijų analizavo du ėminius. Buvo atliekamos lygiagrečios (5) kiekvieno ėminio analizės. Rezultatai pateikti šioje lentelėje:







4 ėminys Kviečių ir sojų mišinys 5 ėminys Kviečių ir sojų mišinys (4 ėminys) su triptofanu (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Vidurkis [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11

L = rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius

n = atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius

sr = pakartojamumo standartinis nuokrypis

SR = atkuriamumo standartinis nuokrypis

r = pakartojamumas

R = atkuriamumas

CVr = pakartojamumo variacijos koeficientas, %

CVR = atkuriamumo variacijos koeficientas, %

Triptofano hidrolizės metodui sertifikuoti buvo parengtas dar vienas Bendrijos tarplaboratorinis tyrimas, kurį atliekant ne daugiau kaip 7 laboratorijos analizavo keturis ėminius. Rezultatai pateikti toliau. Kiekvienas ėminys buvo analizuojamas penkis kartus.







1 ėminys Kiaulių pašaro mišinys (CRM 117) 2 ėminys Žuvų miltai su mažu riebalų kiekiu (CRM 118) 3 ėminys Sojų miltai (CRM 119) 4 ėminys Nugriebto pieno milteliai (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Vidurkis [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22

L = rezultatus pateikusių laboratorijų skaičius

n = atskirų rezultatų, paliekamų po riktų (identifikuotų pagal Cochran, Dixon riktų kriterijų) pašalinimo, skaičius

sr = pakartojamumo standartinis nuokrypis

SR = atkuriamumo standartinis nuokrypis

r = pakartojamumas

R = atkuriamumas

CVr = pakartojamumo variacijos koeficientas, %

CVR = atkuriamumo variacijos koeficientas, %

9. Pastabos

9.1 Šios specialios chromatografavimo sąlygos gali pagerinti triptofano ir α-metiltriptofano atskyrimą.

Izokratinis eliuavimas, po kurio kolonėlė plaunama taikant gradientinį eliuavimą:







Skysčių chromatografijos kolonėlė: 125 mm × 4 mm, C18, 5 μm įkrova, arba lygiavertė kolonėlė Kolonėlės temperatūra: 32 oC Judančioji fazė: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanolis, 95 + 5 (V + V). B: Metanolis Gradiento programa: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Srautas: 1,2 ml/min. Visa eliuavimo trukmė: maždaug 33 min.

9.2 Chromatografinė analizė bus nevienoda atsižvelgiant į HPLC tipą ir naudojamą kolonėlės įkrovos med