A)

Blokuojamasis arba konkurencinis ELISA tyrimas atliekamas pagal šį protokolą: Konkurenciniu ELISA tyrimu, naudojant monokloninį antikūną 3-17-A3, galima nustatyti visų žinomų mėlynojo liežuvio ligos viruso (MLLV) serotipų antikūnus. Tyrimo principas yra reakcijos tarp MLLV antigeno ir grupei būdingo monokloninių antikūno (3-17-A3) pertraukimas pridedant tiriamojo serumo. MLLV antikūnai tiriamajame serume blokuoja monokloninio antikūno (Mab) reaktyvumą ir susilpnina lauktos spalvos ryškumą, pridėjus pažymėtų fermentų priešpelinio antikūnų ir chromogeno/substrato. Serumas gali būti tiriamas vieną kartą atskiedžiant 1: 5 (lašinė analizė – 1 priedėlis) arba gali būti titruojamas (serumo titravimas – 2 priedėlis) kol pasiekiamas tirpalo ekvivalentinis taškas. Didesnės kaip 50 % nuslopinimo vertės laikomos teigiamomis. Medžiagos ir reagentai 1. Tinkamos ELISA mikrotitro plokštelės. 2. Antigenas: pateikiamas kaip koncentratas, ekstrahuotas iš ląstelių, paruoštas kaip apibūdinta toliau ir laikomas – 20 °C arba – 70 °C. 3. Blokuojamasis buferinis tirpalas: fosfato buferinis fiziologinis tirpalas (PBS), turintis 0,3 % MLLV neigiamo suaugusio galvijo serumo, 0,1 % (V/V) Tween-20 (pateikiamo kaip polioksietileno sorbitono monolaurato sirupas) PBS. 4. Monokloninis antikūnas: 3-17-A3 (pateikiamas kaip hibridomos audinio kultūros paviršinis sluoksnis, nukreiptas prieš grupei būdingą polipeptidą p7, laikomas – 20 °C temperatūroje arba sausai užšaldytas ir prieš naudojimą skiedžiamas 1/100 su blokuojamuoju buferiniu tirpalu. 5. Konjugatas: prieš pelių ląsteles veikiantis triušio globulinas (adsorbuotas ir išplautas), konjuguotas su krieno peroksidaze ir laikomas tamsoje, 4 °C temperatūroje. 6. Chromogenas ir substratas: Ortofenileno diamino (OPD-chromogenas) galutinė koncentracija – 0,4 mg/ml steriliame distiliuotame vandenyje. Vandenilio peroksido (30 % w/v substratas) 0,05 % v/v, pridedama nedelsiant prieš panaudojimą (5μl H2 O2 / 10 ml OPD). (Su OPD elgtis atsargiai, dėvėti gumines pirštines, įtariamas mutagenas.). 7. 1 molio sieros rūgštis: 26,6 ml rūgšties įpilama į 473,4 ml distiliuoto vandens. (Prisiminkite, kad rūgštis visada pilama į vandenį, ne vanduo – į rūgštį.). 8. Sukamoji purtyklė. 9. ELISA plokštelių skaitytuvas (tyrimą galima skaityti vizualiai). Tyrimo formatas Cc: konjugatų kontrolė (be serumo/be monokloninio antikūno); C++: stipri teigiama serumo kontrolė; C+: silpna teigiama serumo kontrolė; C-: neigiama serumo kontrolė; Cm: Cm monokloninio antikūno kontrolė (be serumo).



1 PRIEDĖLIS Lašinis praskiedimas (1:5) formatas (40 serumo/plokštelių) Patikrinimai Tyrimui naudojami serumai 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



2 PRIEDĖLIS Serumo titravimo formatas (10 serumo/plokštelių) Patikrinimai Tyrimui naudojami serumai 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Tyrimų protokolas Konjugatų kontrolė (Cc) : 1A ir 1B duobutės yra kontrolinės duobutės, pripildytos MLLV antigeno ir konjugato. Gali būti naudojama ELISA skaitytuvui išvalyti. Mab kontrolė (Cm) : 1 ir 2 stulpeliuose, G ir H eilutėse atliekama monokloninio antikūno kontrolė; jie pripildyti BTV antigeno, monokloninio antikūno ir konjugato. Šios duobutės rodo intensyviausią spalvą. Šios kontrolės optinio tankio duomenų reikšmė rodo 0 % slopinimo vertę. Teigiama kontrolė (C++, C+) : 1 ir 2 stulpeliai, C-D-E-F eilutės. Šiose duobutėse yra MLLV antigenas, atitinkamai, MLLV stiprus ir silpnas teigiami antiserumai, Mab ir konjugatas. Neigiama kontrolė (C–) : 2A ir 2B duobutėse atliekama neigiama kontrolė, jose yra MLLV antigenas, MLLV neigiamas antiserumas, Mab ir konjugatas. Tyrimui naudojami serumai : didelio masto serologiniams tyrimams ir greitiems patikrinimams serumai gali būti tiriamas skiedžiant vieną kartą – 1:5 (1 priedėlis). Alternatyviai – 10 serumų gali būti tiriami skiedžiant nuo 1:5 iki 1:640 (2 priedėlis). Taip bus gaunamas tam tikras antikūnų titro rodmuo tiriamame serume. Procedūra 1. Atskieskite MLLV antigeną fosfato buferizuotame fiziologiniame tirpale iki iš anksto titruotos koncentracijos, trumpai paveikite garsu išsklaidydami susikaupusį virusą (jei nėra garso prietaiso, stipriai pumpuokite pipete) ir įpilkite 50 μl į visas ELISA plokštelės duobutes. Pabarbenkite plokštelės kraštus, kad antigenas išsisklaidytų. 2. Inkubuokite 60 minučių 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. Išplaukite plokšteles tris kartus užpildami ir ištuštindami duobutes nesteriliu PBS ir nusausinkite sugeriamuoju popieriumi. 3. Kontrolinės duobutės: Į Cc duobutes įpilkite 100 μl blokuojamojo buferinio tirpalo. Įpilkite 50 μl teigiamo ir neigiamo kontrolinio serumo, skiedžiant 1:5 (10 μl serumo + 40 μl blokuojamojo buferinio tirpalo) į atitinkamas duobutes – C–, C+ ir C++. Į Mab kontrolines duobutes įpilkite 50 μl blokuojamojo buferinio tirpalo. Lašinio titravimo metodas: įpilkite praskiesto santykiu 1:5 kiekvieno tiriamojo serumo su blokuojamuoju buferiniu tirpalu į dvigubas 3 ir 12 stulpelių duobutes (10 μl serumo + 40 μl blokuojamojo buferinio tirpalo), arba Serumo titravimo metodas: paruoškite dvigubo skiedimo kiekvieno tyrimo mėginio (nuo 1:5 iki 1:640) blokuojamajame buferiniame tirpale serijas išilgai aštuonių duobučių viengubuose stulpeliuose nuo 3 iki 12. 4. Vos įpylę tiriamuosius serumus, atskieskite Mab 1:100 blokuojamajame buferiniame tirpale ir į visas, išskyrus kontrolines, plokštelės duobutes įpilkite 50 μl. 5. Inkubuokite 60 minučių 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. Išplaukite plokšteles PBS ir nusausinkite sugeriamuoju popieriumi. 6. Prieš pelių ląsteles veikiantį triušių koncentratą atskieskite iki 1/5000 blokuojamajame buferiniame tirpale ir į visas plokštelės duobutes įpilkite 50 μl. 7. Inkubuokite 60 minučių 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. Išplaukite plokšteles PBS ir nusausinkite sugeriamuoju popieriumi. 8. Pašildykite o-fenilenediamino dihidrochloridą (OPD) ir iš karto prieš naudojimą į kiekvieną 10 ml OPD įpilkite 5 μl 30 % vandenilio peroksido. Į visas plokštelės duobutes įpilkite 50 μl. Apie 10 minučių laukite, kol išryškės spalva, ir sustabdykite reakciją 1 moliu sieros rūgšties (50 μl duobutei). Spalva turėtų išryškėti Mab kontrolinėse duobutėse ir serumu be MLLV antikūnų užpildytose duobutėse. 9. Patikrinkite ir užregistruokite plokštelių parodymus vizualiai arba naudodami spektrofotometrinį skaitytuvą. Rezultatų analizė Naudodami programinės įrangos paketą, išspausdinkite tyrimo ir kontroliniam serumų optinio tankio (OD) ir procentinio slopinimo (PI) vertes, pagrįstas vidurkiu, užregistruotu antigeno kontrolinėse duobutėse. Duomenys, gauti kaip OD ir PI vertės, naudojami nustatant, ar tyrimas atliktas tinkamose ribose. Viršutinės kontrolės ribos (UCL) ir apatinės kontrolės ribos (LCL) Mab kontrolei (antigenas ir Mab be tyrimo serumų) yra tarp 0,4 ir 1,4 OD. Bet kokia šių kriterijų neatitinkanti plokštelė turi būti atmesta. Jei nėra programinės įrangos paketo, OD vertes spausdinkite ELISA spausdintuvu. Suskaičiuokite antigeno kontrolinių duobučių OD vertės vidurkį, kuris yra lygus 100 % vertės. Nustatykite 50 % OD vertę ir suskaičiuokite kiekvieno mėginio teigiamumą ir neigiamumą. Procentinio slopinimo (PI) vertė = 100 – (kiekvieno tyrimo kontrolės OD/Cm vidutinis OD) × 100. Dvigubose neigiamo serumo kontrolės duobutėse ir dvigubose kontrolinėse duobutėse PI vertės turi būti tarp + 25 % ir – 25 % ir, atitinkamai, tarp + 95 % ir + 105 %. Jeigu vertės nėra tarp šių ribų, plokštelės nėra negaliojančios, tačiau pagrindo spalva tikriausiai dar kinta. Stiprių ir silpnų teigiamų kontrolinių serumų PI vertės turi būti tarp + 81 % ir + 100 % ir, atitinkamai, tarp + 51 % ir + 80 %. Diagnostinis slenkstis tyrimo serumams yra 50 % (PI 50 % arba OD 50 %). < 50 % PI verčių mėginiai yra neigiami. Mėginiai, kurių dvigubų duobučių PI vertės didesnės ir mažesnės nei slenkstis, laikomi abejotinais; tokius mėginius galima tirti iš naujo taškiniu tyrimu ir (arba) titruojant. Teigiami mėginiai taip pat gali būti titruojami teigiamumo laipsniui nustatyti. Vizualus skaitymas: teigiami ir neigiami mėginiai lengvai atskiriami vizualiai; silpnai teigiamus ar stipriai neigiamus pavyzdžius gali būti sunkiau aiškinti vizualiai. MLLV ELISA antigeno paruošimas 1. Tris kartus išplaukite susiliejančioms BHK-21 ląstelėms skirtų 40–60 Roux indų serumo neturinčia Eagle terpe ir infekuokite mėlynojo liežuvio ligos viruso 1 serotipu, paskleistu serumo neturinčioje Eagle terpėje. 2. Inkubuokite 37 °C temperatūroje ir kasdien tikrinkite, ar nėra citofatinio efekto (CPE). 3. Jei CPE įvyksta nuo 90 % iki 100 % ląstelių lakšto kiekviename Roux inde, surinkite virusą, nukratydami visas prie stiklo prikibusias ląsteles. 4. Centrifuguokite nuo 2 000 iki 3 000 apsisukimų per minutę, kad ląstelės susigranuliuotų. 5. Pašalinkite paviršinį sluoksnį ir ląsteles vėl suspenduokite maždaug 30 ml PBS, kuriame yra 1 % Sarkosyl ir 2 ml fenilmetilsulfonilo fluorido (lizės buferinio tirpalo). Tai gali sukelti ląstelių gelio formavimąsi, todėl šiam efektui sumažinti gali būti pridėta dar lizės buferinio tirpalo. (Pastaba. fenilmetilsulfonilo fluoridas yra kenksmingas – elkitės ypač atsargiai.). 6. Suardykite ląsteles, 60 sekundžių veikdami ultragarso zondu 30 mikronų amplitudėje. 7. Centrifuguokite sukite 10 minučių 10 000 apsisukimų per minutę. 8. Paviršinį sluoksnį laikykite + 4 °C temperatūroje ir likusias ląstelių granules vėl suspenduokite nuo 10 iki 20 ml lizės buferiniame tirpale. 9. Paveikite garsu ir skaidrinkite, iš viso tris kartus, kiekviename etape saugodami paviršinį sluoksnį 10. Kartu supilkite paviršinius sluoksnius ir centrifuguokite 24 000 apsisukimų per minutę (100,000 g) 120 minučių + 4 °C temperatūroje virš 5 ml 40 % saharozės pagalvės (w/v PBS), naudodami 30 ml Bekmano centrifugos mėgintuvėlius ir SW 28 rotorių. 11. Pašalinkite paviršinį sluoksnį, kruopščiai nusausinkite mėgintuvėlius ir veikdami garsu vėl įdėkite granules į PBS. Antigeną laikykite alikvotomis – 20 °C temperatūroje. MLLV ELISA antigeno titravimas Mėlynojo liežuvio ligos ELISA antigenas titruojamas netiesioginiu ELISA. Dvigubi antigeno tirpalai titruojami lyginant su pastoviu monokloninio antikūno 3-17-A3 tirpalu (1/100). Protokolas: 1. Titruokite MLLV antigeno, ištirpinto 1:20 PBS, tirpalą mikrotitro plokštelėje dvigubo skiedimo serijomis (50 μl/duobutė), naudodami daugiakanalę pipetę. 2. Inkubuokite vienai valandai 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. 3. Išplaukite tris kartus plokšteles PBS. 4. Į visas mikrotitro plokštelės duobutes įpilkite 50 μl (atskiesto 1/100) monokloninio antikūno 3-17-A3. 5. Inkubuokite vienai valandai 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. 6. Išplaukite tris kartus plokšteles PBS. 7. Įpilkite 50 μl prieš pelių ląsteles veikiančio triušio globulino, konjuguoto su krieno peroksidaze, atskiesto iki iš anksto titruotos optimalios koncentracijos, į kiekvieną mikrotitro plokštelės duobutę. 8. Inkubuokite vienai valandai 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. 9. Kaip apibūdinta ankščiau, įpilkite chromogeno ir substrato. Po 10 minučių sustabdykite reakciją, pridėdami 1 molio sieros rūgšties (50 μl/duobutė). Atliekant konkurencinę analizę, turi būti monokloninio antikūno perviršis, todėl pasirenkamas tas antigeno skiedinys, kuris atitinka titravimo kreivę (ne plokščiojoje dalyje), kai OD vertė po 10 minučių būna lygi maždaug 0,8.