1978L0633 — LT — 20.12.1983 — 002.001

Šis dokumentas yra skirtas tik informacijai, ir institucijos nėra teisiškai atsakingos už jo turinį

iš dalies keičiamas:

▼B

AŠTUNTOJI KOMISIJOS DIREKTYVA

1978 m. birželio 15 d.

nustatanti oficialiai pašarų kontrolei taikytinus Bendrijos analizės metodus

(78/633/EEB)

1 straipsnis

1. Valstybės narės reikalauja, kad, oficialiai tikrinant pašarus cinko bacitracino, flavofosfolipolio, geležies, vario, mangano ir cinko kiekiams nustatyti būtų taikomi šios direktyvos priede aprašyti analizės metodai.

▼M1 —————

▼B

2 straipsnis

Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie įsigalioję 1979 m. sausio 1 d., įgyvendina šią direktyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai.

3 straipsnis

Ši direktyva skirta valstybėms narėms.

PRIEDAS

▼M2

1. CINKO BACITRACINO NUSTATYMAS

— matuojant difuziją agaro terpėje —

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomas cinko bacitracino kiekis pašaruose ir premiksuose. Radimo riba 5 mg/kg (5 ppm) ( 9 ).

2. METODO ESMĖ

Esant pH 2 mėginys ekstrahuojamas metanolio, vandens bei vandenilio chlorido rūgšties mišiniu ir natrio sulfido tirpalu. Pridedamas natrio sulfidas skirtas visų tirpių vario druskų, galinčių trukdyti nustatymui, nusodinimui. Ekstrakto pH padidinamas iki 6,5, tirpalas koncentruojamas (jei būtina) ir skiedžiamas. Jo antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant cinko bacitracino difuziją agaro terpėje, kurioje pasėtas Micrococcus luteus (flavus). Difuzija matoma pagal mikroorganizmo inhibavimo zonų susidarymą. Laikoma, kad naudojamų antibiotiko koncentracijos verčių intervale šių zonų skersmuo yra proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui.

3. MIKROORGANIZMAS: MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS) ATCC 10240

3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas

Mėgintuvėlyje su gulsčiąja mitybine terpe (4.1) pasėjama Micrococcus luteus (flavus) ir inkubuojama 24 valandas esant 30 oC. Kultūra laikoma šaldytuve esant 4 oC. Naujai sėjama kas dvi savaites.

3.2. Bakterijų suspensijos ruošimas ( 10 )

Bakterijos iš mėgintuvėlio su neseniai paruoštu gulsčiuoju agaru (3.1) surenkamos panaudojant 2–3 ml natrio chlorido tirpalo (4.3). Ši suspensija naudojama 250 ml mitybinės terpės (4.1), esančios Roux kolboje, apsėjimui, ir inkubuojama 18–20 valandų esant 30 oC. Kultūra surenkama su 25 ml natrio chlorido tirpalo (4.3) ir sumaišoma. Suspensija praskiedžiama natrio chlorido tirpalu (4.3) santykiu 1/10. Šios suspensijos šviesos pralaidumo koeficientas, matuojamas 1 cm storio kiuvetėje, esant 650 nm bangos ilgiui, kai palyginamuoju tirpalu naudojamas natrio chlorido tirpalas (4.3), turi būti apie 75 %. Esant 4 oC šią suspensiją galima laikyti vieną savaitę.

4. MITYBINĖS TERPĖS IR REAGENTAI

4.1. Mitybinė terpė ( 11 )

4.2. Bandymo terpė (11)

5. STANDARTINIAI TIRPALAI

Pasveriama cinko bacitracino (4.10) kiekis, atitinkantis 1 050 T. V. (pagal nurodytą aktyvumą). Įpilama 5 ml 0,1 M vandenilio chlorido rūgšties (4.7) ir paliekama stovėti 15 minučių. Įpilama 30 ml vandens, fosfatiniu buferiu (4.5) nustatoma pH vertė 4,5 (apie 4 ml), praskiedžiama iki 50 ml vandeniu ir gerai sumaišoma (1 ml = 21 T. V.).

Šį pradinį tirpalą nuosekliai skiedžiant fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5) paruošiami tokių koncentracijų tirpalai:

6. EKSTRAKTO IR BANDOMŲJŲ TIRPALŲ RUOŠIMAS

6.1. Ekstrahavimas

6.1.1. Premiksai ir mineraliniai pašarai

Pasveriama 2,0–5,0 g mėginio, įpilama 29 ml mišinio (4.4), 1 ml natrio sulfido tirpalo (4.9) ir trumpai pakratoma. Patikrinama, ar pH vertė yra apie 2. Kratoma 10 minučių, įpilama 30 ml fosfatinio buferinio tirpalo (4.5), kratoma 15 minučių ir centrifuguojama. Paimama reikiama centrifugato alikvotinė dalis ir, naudodami pH-metrą arba violetinio bromkrezolio tirpalą (4.10) kaip indikatorių, 1 M natrio hidroksido tirpalu (4.8) nustatoma pH 6,5 vertė. Praskiedžiama fosfatiniu buferiu (4.5) numatomai cinko bacitracino koncentracijai 0,42 T. V. /ml (= u8) gauti.

6.1.2. Baltymų koncentratai

Pasveriama 10 g mėginio, įpilama 49 ml mišinio (4.4), 1 ml natrio sulfido tirpalo (4.9) ir trumpai pakratoma. Patikrinama, ar pH vertė yra apie 2. Kratoma 10 minučių, įpilama 30 ml fosfatinio buferinio tirpalo (4.5), kratoma 15 minučių ir centrifuguojama. Paimamas reikiamas centrifugato tūris ir, naudojant pH-metrą arba violetinio bromkrezolio tirpalą (4.10) kaip indikatorių, 1 M natrio hidroksido tirpalu (4.8) nustatoma pH 6,5 vertė. Esant ne aukštesnei kaip 35 oC temperatūrai, sukamajame garintuve tirpalas nugarinamas maždaug iki pusės tūrio.

Praskiedžiama fosfatiniu buferiu (4.5) numatomai cinko bacitracino koncentracijai 0,42 T. V. /ml (= u8) gauti.

6.1.3. Kiti pašarai

Pasveriama 10 g mėginio (20,0 g, jei numatoma cinko bacitracino koncentracija 5 mg/kg). Įpilama 24 ml mišinio (4.4), 1 ml natrio sulfido tirpalo (4.9) ir 10 minučių homogenizuojama. Įpilama 25 ml fosfatinio buferinio tirpalo (4.5), kratoma 15 minučių ir centrifuguojama. Paimama 20 ml centrifugato ir, naudojant pH-metrą arba violetinio bromkrezolio tirpalą (4.10) kaip indikatorių, 1 M natrio hidroksido tirpalu (4.8) nustatoma pH 6,5 vertė. Esant ne aukštesnei kaip 35 oC temperatūrai, sukamajame garintuve tirpalas nugarinamas maždaug iki 4 ml. Praskiedžiama fosfatiniu buferiu (4.5) numatomai cinko bacitracino koncentracijai 0,42 T. V./ml (= u8) gauti.

6.2. Bandomieji tirpalai

Iš u8 tirpalo nuosekliai skiedžiant (1:1) fosfatiniu buferiniu tirpalu (4.5) paruošiami tirpalai u4 (numatomas kiekis 0,21 T. V./ml), u2 (numatomas kiekis 0,105 T. V./ml) ir u1 (numatomas kiekis: 0,0525 T. V./ml).

7. BANDYMŲ EIGA

7.1. Sėjimas į bandymų terpę

Į bandymo mitybinę terpę (4.2), esant maždaug 50 oC, pasėjama bakterijų suspensija (3.2). Atliekant išankstinius bandymus ant lėkštelių su terpe (4.2), nustatomas bakterijų suspensijos kiekis, reikalingas didžiausioms ir aiškiausioms inhibavimo zonoms gauti, esant įvairioms cinko bacitracino koncentracijos vertėms.

7.2. Lėkštelių paruošimas

Difuzija ant agaro atliekama lėkštelėse, naudojant keturių koncentracijų standartinius tirpalus (s8, s4, s2 ir s1) ir keturių koncentracijų bandymo tirpalus (u8, u4, u2 ir u1). Kiekvienoje lėkštelėje būtinai turi būti keturių koncentracijos verčių ekstrakto ir standartiniai tirpalai. Paimamos gana didelės lėkštelės, kad agaro terpėje galima būtų padaryti bent aštuonias 10-13 mm skersmens skyles, kurių centrai būtų nutolę ne mažiau kaip 30 mm. Bandymą galima atlikti lėkštelėse, padarytose iš stiklo plokštelės, iš viršaus padengtos 200 mm skersmens ir 20 mm aukščio aliuminio ar plastiko žiedu.

Į lėkšteles įpilama terpės (4.2), apsėtos kaip 7.1 punkte, kad susidarytų maždaug 2 mm storio sluoksnis (60 ml į 200 mm skersmens lėkštelę). Paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje, išgręžiamos skylės ir į jas įlašinami tiksliai išmatuoti bandomųjų ir standartinių tirpalų kiekių tūriai (0,10-0,15 ml į kiekvieną skylę, atsižvelgiant į skersmenį). Kiekvienos koncentracijos tirpalas panaudojamas bent keturis kartus, taigi darant kiekvieną nustatymą įvertinamos 32 inhibavimo zonos.

7.3. Inkubavimas

Lėkštelės inkubuojamos 16–18 valandų esant 30 ± 2 oC.

8. ĮVERTINIMAS

Inhibavimo zonų skersmuo išmatuojamas 0,1 mm tikslumu. Matavimų vidurkio vertės kiekvienai koncentracijos vertei pažymimos pusiau logaritminiame grafike, kuriame inhibavimo zonų skersmuo būtų pavaizduotas kaip koncentracijos logaritmo funkcija. Nubrėžiamos standartinį tirpalą ir ekstraktą atitinkančios tiesės, kaip parodyta žemiau esančiame pavyzdyje.

Taikant formulę, nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL):

Taikant formulę nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH):

Panašiai apskaičiuojami taškai, geriausiai atitinkantys mažiausią UL ir didžiausią UH koncentracijas ekstrakte, pakeisdami aukščiau pateiktose formulėse S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8.

Apskaičiuotos SL ir SH vertės pažymimos tame pačiame grafike ir taškai sujungiami, taip gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiu būdu pažymimos UL ir UH vertės, kurių taškai taip pat sujungiami, gaunant geriausiai ekstraktą atitinkančią tiesę.

Jei nėra jokių trukdžių, tiesės turi būti lygiagrečios. Praktiniame darbe tiesės gali būti laikomos lygiagrečiomis, jei (SH — SL) ir (UH — UL) vertės ir jų vidutinė vertė skiriasi ne daugiau kaip 10 %.

Jei nustatoma, kad tiesės nėra lygiagrečios, u1 ir s1 ar u8 ir s8 vertės gali būti atmestos, o SL, SH, UL ir UH apskaičiuojamos pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses:

ir panašiai skaičiuojamos UL ir UH vertės. Turi būti vykdomi tie patys lygiagretumo kriterijai. Galutinėje ataskaitoje turi būti nurodyta, kad rezultatas buvo apskaičiuojamas pagal tris koncentracijas.

Jei manoma, kad tiesės yra lygiagrečios, pagal vieną iš formulių apskaičiuojamas santykinio aktyvumo logaritmą (log A), atsižvelgiant į tai, ar lygiagretumui įvertinti buvo naudojamos trys ar keturios koncentracijos.

Keturios koncentracijos:

Trys koncentracijos:

arba

Mėginio ekstrakto aktyvumas = atitinkamo standarto aktyvumas × A

(u8 = s8 × A)

Jei nustatoma, kad santykinis aktyvumas yra už 0,5-2,0 intervalo ribų, bandymas kartojamas, atitinkamai keičiant ekstrakto koncentracijos vertes arba, jei tai neįmanoma, standartinio tirpalo koncentracijos vertes. Kai santykinio aktyvumo neįmanoma gauti reikiamame intervale, visi gauti rezultatai turi būti laikomi tik apytikriais, ir tai turi būti nurodyta galutinėje ataskaitoje.

Kai manoma, kad tiesės nėra lygiagrečios, nustatymas pakartojamas. Jei lygiagretumas vis tiek nepasiekiamas, nustatymas laikomas nepatenkinamu.

Rezultatas išreiškiamas mg cinko bacitracino vienam kilogramui pašaro.

9. PAKARTOJAMUMAS

Rezultatų skirtumas tarp dviejų lygiagrečių to paties mėginio matavimų, atliktų to paties analitiko, neturi viršyti:

▼B

2. FLAVOFOSFOLIPOLIO NUSTATYMAS, MATUOJANT DIFUZIJĄ AGARO TERPĖJE

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomas flavofosfolipolio kiekis pašaruose, koncentratuose ir premiksuose. Radimo riba – 1 mg/kg (1 milijonoji dalis).

2. METODO ESMĖ

Mėginys ekstrahuojamas praskiestu metanoliu, šildant su grįžtamuoju kondensatoriumi. Po centrifugavimo ekstraktas, jei reikia, gryninamas, apdorojant jonitinėmis dervomis ir praskiedžiamas. Jo antibiotinis aktyvumas nustatomas matuojant flavofosfolipolio difuziją agaro terpėje, kurioje pasėtas Staphylococcus aureus. Difuzija matoma pagal mikroorganizmo inhibavimo zonų susidarymą. Laikoma, kad šių zonų skersmuo naudojamų koncentracijų intervale yra tiesiai proporcingas antibiotiko koncentracijos logaritmui.

3. MIKROORGANIZMAS: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1. Pradinės bakterijų kultūros laikymas

Mėgintuvėliuose su gulsčiuoju mitybinės terpės agaru (4.1) pasėjamas Staphylococcus aureus. Inkubuojama 24 valandas 37 °C temperatūroje, laikoma šaldytuve maždaug 4 °C temperatūroje ir kiekvieną mėnesį persėjama į gulsčiąjį agarą.

3.2. Bakterijų suspensijos ruošimas ( 12 )

Atskirai paimami du mėgintuvėliai su pradine kultūra (3.1) ir persėjami kas savaitę. Inkubuojami 24 valandoms 37 °C temperatūroje ir laikomi šaldytuve maždaug 4 °C temperatūroje.

24 valandas prieš bandymą šia kultūra apsėjami du – keturi mėgintuvėliai su mitybine terpe (4.1). Inkubuojama 16–18 valandų 37 °C temperatūroje. Bakterijų suspensija surenkama natrio chlorido tirpalu (4.3). Suspensijos šviesos pralaidumo koeficientas pagal natrio chlorido tirpalą (4.3) matuojant 1 cm storio kiuvetėje turi būti apie 40 %, esant bangos ilgiui 578 nm.

4. MITYBINĖS TERPĖS IR REAGENTAI

4.1. Mitybinė terpė ( 13 )

4.2. Bandymo terpė

4.2.1. Pagrindo sluoksnio terpė ( 14 )

4.2.2. Apsėjamo sluoksnio terpė

Kaip nurodyta 4.1 punkte, papildomai pridedama 2,0 g silikoninės emulsijos priešpučio ( 15 ).

5. ĮRANGA

6. STANDARTINIAI TIRPALAI

Tiksliai pasvertas standartinės medžiagos (4.14) kiekis ištirpinamas 50 % metanolyje (4.5) ir praskiedžiamas tiek, kad būtų gautas pradinis tirpalas, turintis 100 μg/ml flavofosfolipolio. Tirpalas, laikomas 4 °C temperatūroje užkimštose kolbose, patvarus iki 2 mėnesių.

Nuosekliai šį pradinį tirpalą praskiedžiant 50 % metanolio tirpalu (4.5), paruošiami tokių koncentracijų tirpalai:

7. EKSTRAKTO RUOŠIMAS

7.1. Ekstrahavimas

7.1.1. Koncentratai, premiksai ir mineraliniai pašarų priedai

Pasveriama 2,0–5,0 g mėginio, įdedama apie 150 mg askorbo rūgšties (4.13). Konusinėje kolboje (5.3) mėginys sumaišomas su 150 ml 50 % metanolio tirpalo (4.5) ir, pridėjus maždaug 400 mg tris(hidroksimetil)aminometano (4.7), nustatoma pH vertė 8,1–8,2. Nustatyta pH vertė tikrinama indikatoriniu popieriumi (4.12). Palaukiama 15 minučių, toliau su tris(hidroksimetil)aminometanu (4.7) vėl nustatoma pH vertė 8,1–8,2 ir, nuolat maišant, virinama 10 minučių su grįžtamuoju kondensatoriumi (5.4). Tirpalas ataušinamas, mišinys centrifuguojamas ir ekstraktas nupilamas.

7.1.2. Kiti pašarai

Pasveriama 5,0–30,0 g mėginio, kuriame yra ne mažiau kaip 30 μg flavofosfolipolio. Konusinėje kolboje (5.3) mėginys sumaišomas su 150 ml 50 % metanolio tirpalo (4.5) ir, pridėjus maždaug 400 mg tris(hidroksimetil)aminometano (4.7), nustatoma pH vertė 8,1–8,2. Nustatyta pH vertė tikrinama indikatoriniu popieriumi (4.12). Palaukiama 15 minučių, toliau su tris(hidroksimetil)aminometanu (4.7) vėl nustatoma pH vertė 8,1–8,2 ir, nuolat maišant, virinama 10 minučių su grįžtamuoju kondensatoriumi (5.4). Tirpalas ataušinamas, mišinys centrifuguojamas ir ekstraktas nupilamas.

7.2. Gryninimas (šios pakopos galima netaikyti koncentratams, premiksams ir mineraliniams priedams)

110 ml ekstrakto sumaišoma su 11 g katijonitinės dervos (4.9), vieną minutę virinama su grįžtamuoju kondensatoriumi (5.4), mišinį visą laiką maišant. Katijonitinė derva atskiriama centrifuguojant arba filtruojant. 100 ml ekstrakto sumaišoma su 150 ml metanolio (4.4) ir tirpalas 4 °C temperatūroje laikomas 12–15 valandų. Susidariusi dribsnių pavidalo masė nufiltruojama kol šalta.

Apatinis stiklinio vamzdžio (5.1) galas užkemšamas stiklo vatos kamščiu (4.11), į vamzdį įpilama 5 ml anijonitinės dervos (4.10) ir kolonėlė plaunama 100 ml 80 % metanolio tirpalu (4.6). Naudojant piltuvą (5.2) į kolonėlę supilama ne mažiau kaip 100 ml filtrato, kuriame turėtų būti 16 μg flavofosfolipolio (200 ml, jei imamas 30 g pašaro mėginys, kuriame yra 1 milijonoji dalis antibiotiko). Jei reikia, prieš supilant į kolonėlę filtratas praskiedžiamas 80 % metanolio tirpalu (4.6), kad flavofosfolipolio koncentracija būtų 16 μg/100 ml. Nustatomas maždaug 2 ml per minutę debitas. Ištekėjęs tirpalas išpilamas. Toliau kolonėlė plaunama 50 ml 80 % metanolio tirpalu (4.6), ištekėjęs tirpalas išpilamas.

Flavofosfolipolis išplaunamas kalio chlorido tirpalu metanolyje (4.8), debitas išlaikomas maždaug 2 ml per minutę. 50 ml eliuato surenkama į matavimo kolbą, įpilama 30 ml vandens ir sumaišoma. Šiame tirpale flavofosfolipolio koncentracija turi būti 0,2 μg/ml (= U8).

7.3. Bandymo tirpalai

Kai būtina (t. y., jei buvo praleista gryninimo pakopa), pagal 7.1.1 punktą gautas eksraktas praskiedžiamas 50 % metanoliu (4.5), kad būtų gauta numatoma 0,2 μg/ml flavofosfolipolio koncentracija (= U8).

Iš tirpalo U8, nuosekliai praskiedžiant (1:1) 50 % metanolio tirpalu (4.5), ruošiami tirpalai U4 (numatomas kiekis 0,1 μg/ml), U2 (numatomas kiekis 0,05 μg/ml) ir U1 (numatomas kiekis 0,025 μg/ml).

8. BANDYMO PROCEDŪRA

8.1. Sėjimas bandymo į mitybinę terpę

Bandymo terpėje (4.2.2) maždaug 50 °C temperatūroje sėjama bakterijų suspensija (3.2). Išankstiniais bandymais lėkštelėse su bandymo terpe (4.2.2) nustatomas bakterijų suspensijos kiekis, kurio, esant įvairioms flavofosfolipolio koncentracijoms, reikia didžiausioms ir aiškiausiai matomoms inhibavimo zonoms susidaryti (apie 30 ml/litre).

8.2. Lėkštelių paruošimas

Difuzija agare atliekama lėkštelėse, naudojant keturių koncentracijų standartinius tirpalus (S8, S4, S2 ir S1) ir keturių koncentracijų bandymo tirpalus(U8, U4, U2 ir U1). Kiekvienoje lėkštelėje būtinai turi būti visų keturių koncentracijų standartiniai ir ekstrakto tirpalai. Šiam tikslui pasirenkamos gana didelės lėkštelės, kad agare būtų galima padaryti bent aštuonias 10–13 mm skersmens skyles, tarp kurių centrų būtų ne mažesnis kaip 30 mm atstumas. Bandymas gali būti atliekamas ant stiklo plokštelės su uždėtu aplygintu aliuminio ar plastiko žiedu, kurio skersmuo 200 mm ir aukštis 20 mm.

Į lėkšteles įpilamas toks terpės (4.2.1) kiekis, kad susidarytų 1,5 mm storio sluoksnis (45 ml 200 mm skersmens lėkštelėje). Paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje ir tuomet ant viršaus užpilama tiek pagal 8.1 punktą apsėtos terpės (4.2.2), kad susidarytų 1 mm storio sluoksnis (30 ml 200 mm skersmens lėkštelėje). Vėl paliekama sutirštėti horizontalioje padėtyje, gręžiamos skylės, į kurias įpilami tiksliai išmatuoti tiriamo ir etaloninio tirpalo tūriai (0,10–0,15 ml į kiekvieną skylę atsižvelgiant į skersmenį).

Kiekvienos koncentracijos tirpalas panaudojamas bent keturis kartus, todėl kiekvieno nustatymo metu įvertinamos 32 inhibavimo zonos.

8.3. Inkubavimas

Lėkštelės inkubuojamos 16–18 valandų 28–30 °C temperatūroje.

9. ĮVERTINIMAS

Inhibavimo zonų skersmuo išmatuojamas 0,1 mm tikslumu. Matavimų vidurkio vertė kiekvienai koncentracijai pažymima pusiau logaritminiame popieriuje, kuriame inhibavimo zonų skersmuo vaizduojamas kaip koncentracijos logaritmo funkcija. Standartiniam tirpalui ir ekstraktui brėžiamos geriausiai atitinkančios tiesės, pvz., kaip parodyta toliau.

Taikant formulę nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis mažiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SL). Nustatomas taškas, geriausiai atitinkantis didžiausią standartinio tirpalo koncentraciją (SH), taikant formulę:

Panašiai skaičiuojami taškai geriausiai atitinkantys mažiausią (UL) ir didžiausią (UH) koncentraciją ekstrakte, pakeičiant nurodytose formulėse S1, S2, S4 ir S8 į U1, U2, U4 ir U8.

Apskaičiuotos SL ir SH vertės pažymimos tame pačiame grafike ir sujungiamos – taip gaunama geriausiai standartinį tirpalą atitinkanti tiesė. Panašiu būdu pažymimos ir sujungiamos UL ir UH vertės, gaunant geriausiai ekstraktą atitinkančią tiesę.

Jei nėra jokių trukdžių, tiesės turi būti lygiagrečios. Praktiniame darbe tiesės gali būti laikomos lygiagrečiomis, jei (SH-SL) ir (UH-UL) vertės nuo jų vidutinės vertės nesiskiria daugiau kaip 10 %.

Jei nustatoma, kad tiesės nėra lygiagrečios, gali būti atmetamos U1 ir S1 arba U8 ir S8 vertės, o SL, SH, UL ir UH apskaičiuojami pagal alternatyvias formules, gaunant alternatyvias geriausiai atitinkančias tieses:

Panašiai apskaičiuojamos UL ir UH vertės. Kaip ir anksčiau turi būti patikrinama, ar alternatyvios geriausio atitikimo tiesės yra lygiagrečios. Jei rezultatas buvo apskaičiuojamas pagal tris lygius, tai turi būti pažymėta galutinėje ataskaitoje.

Kai laikoma, kad tiesės lygiagrečios, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal vieną iš šių formulių:

keturiems lygiams:

trims lygiams:

arba:

Tikrasis aktyvumas = numatomas aktyvumas × santykinis aktyvumas.

Kai laikoma, kad tiesės nėra lygiagrečios, nustatymas pakartojamas. Jei lygiagretumo vis tiek nepasiekiama, santykinio aktyvumo logaritmas (log A) skaičiuojamas pagal formulę (c). Tačiau gautas rezultatas turi būti laikomas tik apytikriu, ir tai turi būti nurodyta galutinėje ataskaitoje.

10. PAKARTOJAMUMAS

Skirtumas tarp dviejų rezultatų, gautų tam pačiam analitikui atliekant du lygiagrečius matavimus su tuo pačiu bandiniu, neturi viršyti:

0,5 mg/kg absoliučiu dydžiu, kai flavofosfolipolio kiekis 1–2 mg/kg,

25 % didžiausios vertės, kai flavofosfolipolio kiekis 2–10 mg/kg,

20 % didžiausios vertės, kai flavofosfolipolio kiekis 10–25 mg/kg,

5 mg/kg, absoliučiu dydžiu, kai flavofosfolipolio kiekis 25–50 mg/kg,

10 % didžiausios vertės, kai flavofosfolipolio kiekis didesnis kaip 50 mg/kg.

3. GELEŽIES, VARIO, MANGANO IR CINKO MIKROELEMENTŲ NUSTATYMAS

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomas geležies, vario, mangano ir cinko mikroelementų kiekis pašaruose. Apatinė nustatymo riba:

2. METODO ESMĖ

Mėginys po organinės medžiagos (jei ji buvo) sudeginimo ištirpinamas druskos rūgštyje. Po atitinkamo praskiedimo geležis, varis, manganas ir cinkas nustatomi atominės absorbcijos analizės metodu.

3. REAGENTAI

Įvadinės pastabos

Reagentams ir analizei skirtiems tirpalams ruošti reikia naudoti vandenį, kuriame nebūtų nustatomų katijonų, todėl vanduo du kartus distiliuojamas distiliatoriuje iš borosilikatinio ar kvarcinio stiklo arba du kartus apdorojamas jonitine derva.

Reagentai turėtų būti bent analiziškai gryni (a. g.). Nustatomų elementų nebuvimas turi būti tikrinamas tuščiuoju bandymu. Prireikus reagentai turi būti papildomai gryninami.

Vietoje žemiau aprašomų standartinių tirpalų galima naudoti prekyboje esančius standartinius tirpalus, jei tik jie turi garantiją ir buvo prieš naudojimą patikrinti.

4. ĮRANGA

5. DARBO PROCEDŪRA

5.1. Organinės medžiagos mėginiai

5.1.1. Mėginio sudeginimas ir analizei skirto tirpalo ruošimas ( 16 )

i) 5–10 g mėginio, pasverto 0,2 mg tikslumu, įdedama į platininį arba kvarcinį tiglį (4.3) (žr. (b) pastabą), džiovinama 105 °C temperatūroje džiovinimo spintoje, po to tiglis dedamas į šaltą mufelinę krosnį (4.1). Krosnis uždaroma (žr. (c) pastabą) ir temperatūra joje per maždaug 90 minučių laipsniškai pakeliama iki 450–475 °C. Tokioje temperatūroje tiglis laikomas 4–16 valandų (pvz., per naktį), kad sudegtų visos organinės medžiagos, po to krosnis atidaroma ir leidžiama jai ataušti (žr. (d) pastabą).

Tiglio turinys išplaunamas į cheminę stiklinę, tam sunaudojant maždaug 5 ml druskos rūgšties (3.1), kuri pilama lėtai ir atsargiai (dėl CO2 skyrimosi gali vykti audringa reakcija). Druskos rūgštis (3.1) į stiklinę lašinama maišant tirpalą tol, kol nustoja skirtis dujų burbuliukai. Išgarinama iki sauso likučio, kartais pamaišant stikline lazdele.

Toliau į likutį įpilama 15 ml 6 N druskos rūgšties (3.2) ir apie 120 ml vandens. Maišoma stikline lazdele, kuri turi būti palikta cheminėje stiklinėje, stiklinė uždengiama laikrodžio stiklu. Stiklinės turinys lėtai užverdamas ir virinamas tol, kol matosi, kad daugiau pelenų nebeištirpsta. Filtruojama per bepelenį filtrą ir filtratas supilamas į 250 ml matavimo kolbą. Cheminė stiklinė ir filtras plaunami 5 ml karšto 6 N druskos rūgšties tirpalo (3.2) ir du kartus verdančiu vandeniu. Matavimo kolbos turinys praskiedžiamas vandeniu iki žymės (HCl koncentracija maždaug 0,5 N).