01991R2568 — LT — 04.12.2016 — 031.005

Šis tekstas yra skirtas tik informacijai ir teisinės galios neturi. Europos Sąjungos institucijos nėra teisiškai atsakingos už jo turinį. Autentiškos atitinkamų teisės aktų, įskaitant jų preambules, versijos skelbiamos Europos Sąjungos oficialiajame leidinyje ir pateikiamos svetainėje „EUR-Lex“. Oficialūs tekstai tiesiogiai prieinami naudojantis šiame dokumente pateikiamomis nuorodomis

iš dalies keičiamas:





pataisytas:







(*) Šis aktas nebuvo skelbtas lietuvių kalba.









▼B

KOMISIJOS REGLAMENTAS (EEB) Nr. 2568/91

1991 m. liepos 11 d.

dėl maišyto alyvuogių aliejaus ir maišyto alyvuogių išspaudų aliejaus savybių ir dėl atitinkamų analizės metodų







▼M20

1 straipsnis

1. Aliejai, kurių charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 1, 2 punktuose nustatytas charakteristikas, laikomi pirmojo spaudimo alyvuogių aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 1 punkto a ir b papunkčiuose.

2. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 3 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas pirmojo spaudimo klasikiniu alyvuogių aliejumi lampante, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 1 punkto c papunktyje.

3. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 4 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas rafinuotu alyvuogių aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 2 punkte.

4. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 5 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas alyvuogių aliejumi, sudarytu iš rafinuotų ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejų, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 3 punkte.

5. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 6 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas neapdorotu alyvų išspaudų aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 4 punkte.

6. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 7 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas rafinuotu alyvų išspaudų aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 5 punkte.

7. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 8 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas alyvų išspaudų aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 6 punkte.

▼M26

2 straipsnis

1. I priede nustatytos aliejų savybės nustatomos šiais analizės metodais:

a) laisvosioms riebalų rūgštims, išreiškiamoms oleino rūgšties procentine dalimi, nustatyti – II priede nustatytu metodu;

b) peroksidų skaičiui nustatyti – III priede nustatytu metodu;

c) vaškų kiekiui nustatyti – IV priede nustatytu metodu;

d) sterolių ir triterpeno dialkoholių sudėčiai ir kiekiui kapiliarinės dujų chromatografijos metodu nustatyti – V priede nustatytu metodu;

e) procentinei 2-glicerilo monopalmitato daliai nustatyti – VII priede nustatytu metodu;

f) spektrofotometrinei analizei atlikti – IX priede nustatytu metodu;

▼M28

g) riebalų rūgščių sudėčiai nustatyti – X priede nustatytu metodu;

▼M26

h) lakiųjų halogenintų tirpiklių kiekiui nustatyti – XI priede nustatytu metodu;

i) organoleptinėms pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus savybėms įvertinti – XII priede nustatytu metodu;

j) stigmastadienų kiekiui nustatyti – XVII priede nustatytu metodu;

k) trigliceridų su ECN42 kiekiui nustatyti – XVIII priede nustatytu metodu;

▼M28

l) alifatinių ir triterpeno alkoholių kiekiui nustatyti – XIX priede nustatytu metodu;

▼M26

m) vaškų, riebalų rūgščių metilesterių ir riebalų rūgščių etilo esterių kiekiui nustatyti – XX priede nustatytu metodu.

▼M28 —————

▼M26

2. Organoleptinių pirmojo spaudimo alyvuogių aliejų savybių tikrinimą, pavestą nacionalinėms institucijoms ar jų atstovams, atlieka valstybių narių patvirtintos degustuotojų grupės.

Pirmoje pastraipoje nurodytos organoleptinės aliejaus savybės laikomos derančiomis su deklaruota kategorija, jeigu valstybės narės patvirtinta degustuotojų grupė patvirtina nustatytą rūšį.

Jeigu degustuotojų grupė, įvertinusi organoleptines savybes, nepatvirtina deklaruotos kategorijos, suinteresuotosios šalies prašymu nacionalinės institucijos arba jų atstovai nedelsdami organizuoja du priešpriešinius vertinimus, kuriuos atliktų kitos patvirtintos degustuotojų grupės, įskaitant bent vieną vertinimą, kurį atliktų susijusios valstybės narės gamintojos patvirtinta degustuotojų grupė. Atitinkamos savybės laikomos derančiomis su deklaruotomis savybėmis, jeigu deklaruota rūšis patvirtinama atlikus bent du iš šių priešpriešinių vertinimų. Priešingu atveju priešpriešinių vertinimų išlaidas padengia suinteresuotoji šalis.

3. Nacionalinėms institucijoms arba jų atstovams tikrinant aliejaus savybes, kaip nustatyta 1 dalyje, mėginiai imami pagal tarptautinius standartus EN ISO 661 dėl tiriamųjų mėginių paruošimo ir EN ISO 5555 dėl mėginių ėmimo. Tačiau, neatsižvelgiant į standarto EN ISO 5555 6.8 punktą, jeigu tokių aliejų partijos tikrinamos pirminėje pakuotėje, mėginys imamas pagal šio reglamento Ia priedą. Jeigu tikrinami neišpilstyti aliejai, kurių mėginių pagal EN ISO 5555 negalima paimti, mėginiai imami pagal valstybės narės kompetentingos institucijos pateiktus nurodymus.

Nepažeidžiant standarto EN ISO 5555 ir standarto EN ISO 661 6 skyriaus, paimti mėginiai kuo greičiau perkeliami į tamsią vietą atokiau nuo didelio karščio šaltinių ir ne vėliau kaip penktą darbo dieną nuo jų paėmimo nusiunčiami į laboratoriją analizei, priešingu atveju mėginiai saugomi taip, kad juos vežant ar saugant prieš išsiunčiant į laboratoriją nesuprastėtų jų kokybė arba jie nebūtų pažeisti.

4. Atliekant 3 dalyje nustatytą tikrinimą, analizės, nurodytos II, III, IX, XII ir XX prieduose, ir, jei daromos, bet kokios pagal nacionalinės teisės aktus reikalaujamos kontraanalizės atliekamos prieš pasibaigiant minimaliam supakuotų produktų galiojimo laikui. Jeigu imami neišpilstyto aliejaus mėginiai, tos analizės atliekamos ne vėliau kaip šeštąjį mėnesį nuo atitinkamo mėginio paėmimo mėnesio.

Kitoms šiame reglamente numatytoms analizėms netaikomi jokie laiko apribojimai.

Išskyrus atvejus, kai mėginys buvo paimtas likus mažiau nei dviem mėnesiams iki minimalaus galiojimo laiko pabaigos, jeigu analizių rezultatai neatitinka deklaruotos alyvuogių ar alyvuogių išspaudų aliejaus kategorijos savybių, susijusiai šaliai apie tai pranešama ne vėliau kaip likus mėnesiui iki pirmoje pastraipoje nurodyto laikotarpio pabaigos.

5. Alyvuogių aliejų savybes nustatant 1 dalies pirmoje pastraipoje nurodytais metodais, analizės rezultatai tiesiogiai lyginami su šiame reglamente nustatytomis ribomis.

▼M25

2a straipsnis

1. Šiame straipsnyje „parduodamas alyvuogių aliejus“ – visas atitinkamos valstybės narės alyvuogių aliejaus ir alyvuogių išspaudų aliejaus kiekis, suvartojamas toje valstybėje narėje arba eksportuojamas iš tos valstybės narės.

2. Valstybės narės užtikrina, kad atitikties patikros būtų atliekamos atrankiai, remiantis rizikos analize, ir tinkamu dažnumu, taip užtikrinant, kad parduodamas alyvuogių aliejus atitiktų deklaruojamą kategoriją.

3. Rizikos vertinimo kriterijai gali būti šie:

a) aliejaus kategorija, gamybos laikotarpis, aliejaus kaina palyginti su kitokio aliejaus kaina, maišymo ir pakavimo veiksmai, laikymo įrenginiai ir sąlygos, kilmės šalis, paskirties šalis, gabenimo būdas arba partijos apimtis;

b) veiklos vykdytojų padėtis prekybos grandinėje, jų parduodamo aliejaus kiekis ir (arba) vertė, jų parduodamo aliejaus kategorijų įvairovė, vykdomo verslo rūšis, pvz., malimas, laikymas, rafinavimas, maišymas, pakavimas arba mažmeninė prekyba;

c) anksčiau atliktų patikrų rezultatai, įskaitant nustatytų defektų skaičių ir pobūdį, įprastą parduodamo aliejaus kokybę, naudojamos techninės įrangos darbinius parametrus;

d) veiklos vykdytojų taikomų kokybės užtikrinimo sistemų arba savikontrolės sistemų, susijusių su atitiktimi prekybos standartams, patikimumas;

e) vieta, kurioje atliekama patikra, ypač jei tai pirmasis patekimo į Sąjungą taškas, paskutinis taškas prieš išgabenant iš Sąjungos arba vieta, kurioje aliejus gaminamas, pakuojamas, kraunamas arba parduodamas galutiniam vartotojui;

f) bet kokia kita informacija, iš kurios būtų galima įžvelgti neatitikties riziką.

4. Valstybės narės iš anksto nustato:

a) partijų neatitikties reikalavimams rizikos vertinimo kriterijus;

b) remdamosi rizikos analize pagal kiekvieną rizikos kategoriją – mažiausią veiklos vykdytojų arba partijų ir (arba) kiekio, kurių atitikties patikra bus atliekama, kiekį.

Per metus atliekama bent viena kiekvieno tūstančio tonų alyvuogių aliejaus, parduodamo valstybėje narėje, atitikties patikra.

5. Valstybės narės atitiktį tikrina:

a) bet kokia eilės tvarka atlikdamos I priede nurodytas analizes arba

b) laikydamosi Ib priedo schemoje sprendimams priimti nustatytos eilės tvarkos, kol gaunamas vienas šioje schemoje įrašytų atsakymų.

▼M19 —————

▼M25

3 straipsnis

Jei nustatoma, kad aliejus neatitinka jo kategorijos aprašymo, suinteresuota valstybė narė, nedarydama poveikio bet kokioms kitoms bausmėms, taiko veiksmingas, proporcingas ir atgrasias bausmes, atsižvelgdama į nustatyto pažeidimo sunkumą.

Jei atlikus patikras nustatoma didelių pažeidimų, valstybės narės padidina patikrų, susijusių su prekybos etapu, aliejaus kategorija, kilme ar kitais kriterijais, dažnumą.

▼M5

4 straipsnis

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Jei valstybės narės jos teritorijoje kuriant degustatorių grupes susiduria su sunkumais, jos gali pasikviesti kitoje valstybėje narėje patvirtintą degustatorių grupę.

3. Kiekviena valstybė narį pateikia degustatorių grupių, sukurtų profesinių arba tarpšakinių organizacijų pagal šio straipsnio 1 dalyje nustatytas sąlygas, sąrašą ir užtikrina, kad tų sąlygų būtų laikomasi.

▼M19 —————

▼B

6 straipsnis

1. Aliejaus kiekis aliejaus išspaudose ir kitose alyvuogių aliejaus ekstrahavimo atliekose (KN kodai 2306 90 11 ir 2306 90 19 ) nustatomas, taikant XV priede nurodytą metodą.

2. Straipsnio 1 dalyje minimas aliejaus kiekis skaičiuojamas aliejaus masės procentais sausos medžiagos masei.

▼M20

7 straipsnis

Taikomos Bendrijos nuostatos dėl nepageidaujamų medžiagų.

Tirpikliams, kurių sudėtyje yra halogenų, visų kategorijų alyvuogių aliejams nustatytos šios ribinės vertės:

— maksimalus bet kurio aptikto tirpiklio, kurio sudėtyje yra halogenų, kiekis: 0,1 mg/kg,

— maksimalus bendras visų tirpiklių, kurių sudėtyje yra halogenų, kiekis: 0,2 mg/kg.

▼M25

7a straipsnis

Fiziniai arba juridiniai asmenys ir asmenų grupės, laikantys alyvuogių aliejų ir alyvuogių išspaudų aliejų nuo ekstrahavimo malūne iki išpilstymo į butelius (imtinai), nesvarbu, kokiais profesiniais ar komerciniais tikslais, turi registruoti kiekvienos tokio kategorijos aliejaus priėmimą ir išdavimą.

Valstybė narė užtikrina, kad būtų tinkamai laikomasi pirmojoje pastraipoje nustatyto įpareigojimo.

▼M25

8 straipsnis

1. Valstybės narės praneša Komisijai apie priemones, kuriomis įgyvendinamas šis reglamentas. Jos praneša Komisijai apie visus vėlesnius jų pakeitimus.

2. Ne vėliau kaip iki kiekvienų metų gegužės 31 d. valstybės narės perduoda Komisijai šio reglamento įgyvendinimo praėjusiais kalendoriniais metais ataskaitą. Ataskaitoje pateikiami bent jau atliktų alyvuogių aliejaus atitikties patikrų rezultatai, kaip nurodyta XXI priede pateiktuose šablonuose.

3. Šiame reglamente nurodyti pranešimai teikiami remiantis Komisijos reglamentu (EB) Nr. 792/2009 ( 1 ).

▼B

9 straipsnis

Šiuo dokumentu Reglamentas (EEB) Nr. 1058/77 yra panaikinamas.

10 straipsnis

1. Šis reglamentas įsigalioja trečią dieną po jo paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje.

Tačiau XII priede nurodytas metodas taikomas nuo ►M1 1992 m. lapkričio 1 d. ◄ , išskyrus atvejus, susijusius su intervencinės sistemos operacijomis.

▼M5

Tas metodas netaikomas pirmo spaudimo alyvuogių aliejui, paruoštam parduoti iki 1992 m. lapkričio 1 d.

▼B

2. Šis reglamentas netaikomas alyvuogių aliejui ir alyvuogių išspaudų aliejui, įpakuotam iki šio reglamento įsigaliojimo ir parduotam iki 1992 m. spalio 31 d.

Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.









PRIEDAI

Turinys







I priedas Alyvuogių aliejaus savybės Ia priedas Alyvuogių aliejaus arba alyvuogių išspaudų aliejaus, pristatyto pirminėje pakuotėje, mėginių ėmimas Ib priedas Sprendimų schema siekiant patikrinti, ar alyvuogių aliejaus mėginys atitinka deklaruotą kategoriją II priedas Laisvųjų riebalų rūgščių kiekio nustatymas šaltuoju metodu III priedas Peroksidų skaičiaus nustatymas IV priedas Vaškų kiekio nustatymas dujų chromatografijos metodu kapiliarinėje kolonėlėje V priedas Sterolių ir triterpeno dialkoholių sudėties ir kiekio nustatymas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu VII priedas ►M21 2-glicerilo monopalmitato procentinio kiekio nustatymas ◄ ▼M20 ————— ▼B IX priedas Spektrofotometrinis tyrimas ultravioletinėje spektro dalyje ▼M28 X priedas Riebalų rūgščių metilesterių nustatymas dujų chromatografijos metodu ▼B XI priedas Lakiųjų halogenintų tirpiklių kiekio alyvuogių aliejuje nustatymas XII priedas Tarptautinės alyvuogių aliejaus tarybos pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus organoleptinio vertinimo metodas ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B XV priedas Aliejaus kiekio alyvuogių atliekose nustatymas XVI priedas Jodo skaičiaus nustatymas XVII priedas Augaliniuose aliejuose esančių stigmastadienų nustatymo metodas XVIII priedas Skirtumo tarp faktinio ir teorinio triacilglicerolių kiekio su ECN 42 nustatymas Annex XIX ►M28 Alifatinių ir triterpeno alkoholių kiekio nustatymas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu ◄ ▼M23 XX priedas vaškų, riebiųjų rūgščių metilo esterių ir riebiųjų rūgščių etilo esterių kiekio nustatymo kapiliarinės dujų chromatografijos būdu metodika ▼M28 ————— ▼M25 XXI priedas 8 straipsnio 2 dalyje nurodytų alyvuogių aliejaus atitikties patikrų rezultatai

▼M31









I PRIEDAS

ALYVUOGIŲ ALIEJAUS SAVYBĖS

Kokybės rodikliai







Kategorija Rūgštingumas (%) (*) Peroksidų skaičius mekv. O2/kg (*) K232 (*) K268 arba K270 (*) Delta-K (*) Organoleptinis vertinimas Riebalų rūgščių etilo esteriai mg/kg (*) Trūkumų mediana (Md) (*) Vaisių skonio mediana (Mf) (*) 1. Aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 35 2. Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 — 3. Klasikinis alyvuogių aliejus („lampante“) > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Rafinuotas alyvuogių aliejus ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — — 5. Maišytas rafinuoto ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — — 6. Neapdorotas alyvuogių išspaudų aliejus — — — — — — — — 7. Rafinuotas alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — — 8. Alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — — (1) Trūkumų mediana gali būti mažesnė arba lygi 3,5, jei vaisių skonio mediana lygi 0.

Grynumo rodikliai







Kategorija Riebalų rūgščių sudėtis (1) Transoleino izomerų suminis kiekis (%) Translinolo ir translinoleno suminis kiekis (%) Stigmastadienai mg/kg (2) ►C2 Skirtumas: ECN42 (HPLC) ir ECN42 (teorinis apskaičiavimas) ◄ 2-glicerilo monopalmitatas (%) Miristo (%) Linoleno (%) Eikozano (%) Eikozeno (%) Beheno (%) Lignocero (%) 1. Aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C2 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,0, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % 2. Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C2 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,0, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % 3. Klasikinis alyvuogių aliejus („lampante“) ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,1, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % 4. Rafinuotas alyvuogių aliejus ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,1, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % 5. Maišytas rafinuoto ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C2 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,0, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % 6. Neapdorotas alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ►C2 ≤ |0,6| ◄ ≤ 1,4 7. Rafinuotas alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C2 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,4 8. Alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C2 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,2







Kategorija Sterolių sudėtis Bendras sterolių kiekis (mg/kg) Eritrodiolis ir uvaolis (%) (**) Vaškai, mg/kg (**) Cholesterolis (%) Brasikasterolis (%) Kampesterolis (3) (%) Stigmasterolis (%) Tariamasis β-sitosterolis (%) (4) Delta-7-stigmastenolis (3) (%) 1. Aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 3. Klasikinis alyvuogių aliejus („lampante“) ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (5) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (5) 4. Rafinuotas alyvuogių aliejus ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 5. Maišytas rafinuoto ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Neapdorotas alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (6) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (6) 7. Rafinuotas alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < kamp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350

Pastabos:

a) Analizės rezultatai turi būti pateikti tokiu pat tikslumu po kablelio, kaip nustatyta kiekvienai savybei. Apvalinant rezultatą nustatytu tikslumu, paskutinis skaitmuo yra didinamas vienetu, jei po jo einantis skaitmuo didesnis už 4.

b) Aliejus gali būti priskirtas kitai kategorijai arba paskelbtas neatitinkančiu šiame reglamente jam keliamų grynumo kriterijų net ir tuo atveju, jei nustatytų verčių neatitinka tik viena savybė.

c) Žvaigždute (*) pažymėtos aliejaus kokybės savybės reiškia: – klasikinis alyvuogių aliejus „lampante“ nebūtinai vienu metu turi atitikti visas nustatytas ribines vertes; – pirmojo spaudimo alyvuogių aliejai net ir tuo atveju, jei su nustatyta ribine verte nesutampa bent viena savybė, yra priskiriami kitai aliejaus kategorijai, nors vis tiek klasifikuojami kaip pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus.

d) Dviem žvaigždutėmis (**) pažymėta savybė reiškia, kad visų rūšių alyvuogių išspaudų aliejus nebūtinai vienu metu turi atitikti visas nustatytas ribines vertes.









Priedėlis

SPRENDIMŲ MEDIS

Kampesterolis. Sprendimų medis. Pirmojo spaudimo ir aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo alyvuogių aliejai:

Kiti parametrai turi atitikti šiame reglamente nustatytas ribines vertes.

Delta—7—stigmastenolis. Sprendimų medis.

— Aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejai —

Kiti parametrai turi atitikti šiame reglamente nustatytas ribines vertes.

— Alyvuogių išspaudų aliejai (neapdoroti ir rafinuoti) —

▼M26









Ia PRIEDAS

ALYVUOGIŲ ALIEJAUS ARBA ALYVUOGIŲ IŠSPAUDŲ ALIEJAUS, PRISTATYTO PIRMINĖJE PAKUOTĖJE, MĖGINIŲ ĖMIMAS

Šis mėginių ėmimo metodas taikomas alyvuogių arba alyvuogių išspaudų aliejaus, pristatyto pirminėje pakuotėje, partijoms. Atsižvelgiant į tai, ar pirminės pakuotės tūris yra didesnis nei 5 litrai, ar ne, taikomi įvairūs mėginių ėmimo metodai.

Partija – prekės vienetų, kurie buvo pagaminti ir supakuoti tokiomis aplinkybėmis, kad kiekviename prekės vienete esantis aliejus pagal visas analitines savybes yra laikomas homogenišku, rinkinys. Partija turi būti individualiai pažymėta pagal Europos Parlamento ir Tarybos direktyvą 2011/91/ES ( 8 ).

Ėminys – pirminėje pakuotėje esančio aliejaus kiekis, paimtas iš atsitiktine tvarka parinktos partijos vietos.

1. PIRMINIO MĖGINIO SUDĖTIS

1.1. Ne didesnė nei 5 litrų pirminė pakuotė

Pirminis mėginys, kai pirminė pakuotė yra ne didesnė nei 5 litrų, – keletas ėminių, paimtų iš partijos vadovaujantis 1 lentele.







1 lentelė Būtiniausias pirminio mėginio dydis Jeigu pirminės pakuotės tūris Pirminį mėginį turi sudaryti aliejus iš a) 1 litras ar daugiau a) vienos pirminės pakuotės; b) mažiau nei 1 litras b) minimalaus pakuočių, kurių bendras tūris yra bent 1,0 litras, skaičiaus

Kiekviena valstybė narė, atsižvelgdama į savo poreikius (pavyzdžiui, jeigu organoleptinį vertinimą atlieka kita nei atlikusioji cheminę analizę, kontraanalizę ir t. t. laboratorija), gali padidinti 1 lentelėje nurodytą pakuočių skaičių, iš kurio būtų sudarytas pirminis mėginys.

1.2. Didesnė nei 5 litrų pirminė pakuotė

Pirminis mėginys, kai pirminė pakuotė yra didesnė nei 5 litrų, – visų ėminių dalis, atspindinti jų visumą, gauta juos redukuojant ir vadovaujantis 2 lentele. Pirminį mėginį turi sudaryti įvairūs pavyzdžiai.

Pirminio mėginio „pavyzdys“ – kiekviena iš pirminį mėginį sudarančių pakuočių.







2 lentelė Būtiniausias ėminių skaičius Pakuočių partijoje skaičius Būtiniausias ėminių skaičius Iki 10 1 Nuo … 11 iki 150 2 Nuo … 151 iki 500 3 Nuo … 501 iki 1 500 4 Nuo … 1 501 iki 2 500 5 Daugiau kaip 2 500 kiekvienam 1 000 pakuočių 1 papildomas ėminys

Siekiant sumažinti iš pirminių pakuočių paimtų mėginių tūrį, pirminiam mėginiui parengti paimtų ėminių turinys homogenizuojamas. Įvairių ėminių dalys supilamos į bendrą talpyklą, kurioje sumaišomos, kad būtų homogenizuotos, užtikrinant kuo geriausią apsaugą nuo oro.

Pirminio mėginio turinys turi būti išpilstytas į keletą bent 1,0 litro tūrio pakuočių, kurių kiekviena sudaro pirminio mėginio pavyzdį.

Kiekviena valstybė narė, atsižvelgdama į savo poreikius (pavyzdžiui, jeigu organoleptinį vertinimą atlieka kita nei atlikusioji cheminę analizę, kontraanalizę ir t. t. laboratorija), gali padidinti pirminių mėginių skaičių.

Kiekviena pakuotė turi būti užpildyta taip, kad oro sluoksnis viršuje būtų kuo mažesnis, ir paskui tinkamai uždaryta ir užsandarinta, kad produktas nebūtų sugadintas.

Šie pavyzdžiai turi būti paženklinti etiketėmis, kad juos būtų galima teisingai identifikuoti.

2. ANALIZĖS IR REZULTATAI

2.1. Kiekvienas pirminis mėginys pagal standarto EN ISO 5555 2.5 punktą turi būti padalytas į laboratorinius mėginius ir išanalizuotas Ib priede pateikiamoje sprendimų schemoje nurodyta tvarka arba bet kokia kita atsitiktine tvarka.

2.2. Jeigu deklaruotos aliejaus kategorijos savybes atitinka visi analizės rezultatai, derančia turi būti pripažinta visa partija.

Jeigu bent vienas analizės rezultatas neatitinka deklaruotos aliejaus kategorijos savybių, visa partija turi būti pripažinta nederančia.

3. PARTIJOS KATEGORIJOS TIKRINIMAS

3.1. Partijos kategorijai patikrinti kompetentinga institucija gali padidinti įvairiose partijos vietose imamų pirminių mėginių skaičių pagal šią lentelę:







3 lentelė Pirminių mėginių skaičius, nustatomas pagal partijos dydį Partijos dydis (litrais) Pirminių mėginių skaičius Mažiau nei 7 500 2 Nuo 7 500 iki mažiau nei 25 000 3 Nuo 25 000 iki mažiau nei 75 000 4 Nuo 75 000 iki mažiau nei 125 000 5 125 000 arba daugiau 6 + 1 kiekvienam papildomam 50 000 litrų kiekiui

Kiekvienas į pirminį mėginį įtraukiamas ėminys turi būti imamas šalia tos partijos vietos, kurioje paimtas ankstesnis ėminys; būtina įsidėmėti vietą, iš kurios paimtas kiekvienas pirminis mėginys, ir aiškiai ją pažymėti.

Kiekvienas pirminis mėginys turi būti formuojamas 1.1 ir 1.2 punktuose nurodyta tvarka.

Paskui atliekamos kiekvieno pirminio mėginio analizės, nurodytos 2 straipsnio 1 dalyje.

3.2. Jeigu vienas iš bent vieno pirminio mėginio analizių, nurodytų 2 straipsnio 1 dalyje, rezultatų neatitinka deklaruotos aliejaus kategorijos savybių, nederančia pripažįstama visa partija, iš kurios paimti tie mėginiai.









Ib PRIEDAS

SPRENDIMŲ SCHEMA SIEKIANT PATIKRINTI, AR ALYVUOGIŲ ALIEJAUS MĖGINYS ATITINKA DEKLARUOTĄ KATEGORIJĄ

1 lentelė

2 lentelė

3 lentelė









1 priedėlis







Šio reglamento priedų ir sprendimų schemoje nurodytų analizių atitikmenų lentelė — Rūgštingumas II priedas Laisvųjų riebalų rūgščių kiekio nustatymas šaltuoju metodu — Peroksidų skaičius III priedas Peroksidų skaičiaus nustatymas — UV spektrometrija IX priedas Spektrofotometrinis tyrimas — Organoleptinis vertinimas XII priedas Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus organoleptinių savybių vertinimas — Etilo esteriai XX priedas Vaškų, riebalų rūgščių metilesterių ir riebalų rūgščių etilo esterių kiekio nustatymo kapiliarinės dujų chromatografijos būdu metodas — 3,5-stigmastadienai XVII priedas Augaliniuose aliejuose esančių stigmastadienų nustatymo metodas ▼M28 — Riebalų rūgščių trans-izomerai X priedas Riebalų rūgščių metilesterių nustatymas dujų chromatografijos metodu — Riebalų rūgščių sudėtis X priedas Riebalų rūgščių metilesterių nustatymas dujų chromatografijos metodu ▼M26 — ΔECN42 XVIII priedas Trigliceridų sudėties nustatymas su ECN42 (HPLC duomenų ir teorinės sudėties skirtumas) — Sterolių sudėtis ir bendras kiekis — Eritrodiolis ir uvaolis V priedas Sterolių ir triterpeno dialkoholių sudėties ir kiekio nustatymas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu — Vaškai IV priedas Vaškų kiekio nustatymas dujų chromatografijos metodu kapiliarinėje kolonėlėje ▼M28 — Alifatiniai ir triterpenų alkoholiai XIX priedas Alifatinių ir triterpenų alkoholių kiekio nustatymas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu ▼M26 — 2 padėtyje prisotintos riebalų rūgštys VII priedas 2-glicerilo monopalmitato procentinės dalies nustatymas

▼M29









II PRIEDAS

LAISVŲJŲ RIEBALŲ RŪGŠČIŲ KIEKIO NUSTATYMAS ŠALTUOJU METODU

1. TAIKYMO SRITIS

Šio metodo apraše nurodoma, kaip nustatomas laisvųjų riebalų rūgščių kiekis alyvuogių aliejuje ir alyvuogių išspaudų aliejuje. Laisvųjų rūgščių kiekis išreiškiamas rūgštingumu, apskaičiuojamu kaip oleino rūgšties procentinė dalis.

2. METODO ESMĖ

Ėminys ištirpinamas tirpiklių mišinyje ir esančios laisvosios riebalų rūgštys titruojamos naudojant kalio hidroksido arba natrio hidroksido tirpalą.

3. REAGENTAI

Visi reagentai turi būti pripažintos analiziškai grynų reagentų kokybės, o naudojamas vanduo turi būti distiliuotas arba lygiaverčio grynumo.

3.1. Dietileterio ir 95 % (v/v) etanolio lygių tūrio dalių mišinys. Prieš pat naudojimą mišinys neutralizuojamas kalio hidroksido tirpalu (3.2) kiekvienam 100 ml mišinio pilant 0,3 ml fenolftaleino tirpalo (3.3). 1 pastaba. Dietileteris yra labai degus ir gali sudaryti sprogius peroksidus. Jį naudojant turi būti imamasi ypatingų atsargumo priemonių. 2 pastaba. Jei negalima naudoti dietiletrio, gali būti naudojamas tirpiklių mišinys, kurio sudėtyje yra etanolio ir tolueno. Prireikus etanolį galima pakeisti 2-propanoliu.

3.2 Kalio hidroksido arba natrio hidroksido titruotas tirpalas etanolyje arba vandenyje, c(KOH) [arba c(NaOH)] apytikriai 0,1 mol/l arba, jei būtina, c(KOH) [arba c(NaOH)] apytikriai 0,5 mol/l. Tirpalų galima ir nusipirkti. Turi būti žinoma tiksli kalio hidroksido tirpalo (arba natrio hidroksido tirpalo) koncentracija; prieš naudojimą ji patikrinama. Naudokite bent prieš penkias dienas paruoštą ir į rudo stiklo butelį su guminiu kamščiu dekantuotą tirpalą. Tirpalas turi būti bespalvis arba šiaudų spalvos. Jei naudojant kalio hidroksido (arba natrio hidroksido) vandeninį tirpalą stebimas fazių atsiskyrimas, vandeninį tirpalą pakeiskite etanolio tirpalu. 3 pastaba. Stabilų bespalvį kalio hidroksido (arba natrio hidroksido) tirpalą galima paruošti taip: į 1 000 ml etanolio arba vandens įdedama 8 g kalio hidroksido (arba natrio hidroksido) ir 0,5 g aliuminio drožlių, užvirinama ir vieną valandą verdama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Nedelsiant distiliuojama. Distiliate ištirpinamas reikiamas kiekis kalio hidroksido (arba natrio hidroksido). Paliekama kelias dienas stovėti, paskui skaidrus virš kalio karbonato (arba natrio karbonato) nuosėdų esantis tirpalas dekantuojamas. Tirpalą galima paruošti ir be distiliacijos: į 1 000 ml etanolio (arba vandens) įpilama 4 ml aliuminio butilato ir mišinys paliekamas kelias dienas stovėti. Virš nuosėdų esantis skystis dekantuojamas ir jame ištirpinamas reikiamas kiekis kalio hidroksido (arba natrio hidroksido). Tirpalas paruoštas naudoti.

3.3. Fenolftaleino 10 g/l tirpalas 95–96 % (v/v) etanolyje arba šarminio žydriojo 6B ar timolftaleino 20 g/l tirpalas 95–96 % (v/v) etanolyje. Stiprios spalvos aliejams naudojamas šarminis žydrasis arba timolftaleinas.

4. APARATŪRA

Įprasta laboratorinė įranga, įskaitant:

4.1. Analizines svarstykles;

4.2. 250 ml talpos kūginę kolbą;

4.3. 10 ml A klasės biuretę, sugraduotą po 0,05 ml, arba lygiavertę automatinę biuretę.

5. PROCEDŪRA

5.1. Analizuojamo ėminio ruošimas

Jei ėminys yra drumstas, jį reikėtų filtruoti.

5.2. Analizuojamo ėminio dalis

Ėminio imama, atsižvelgiant į numatomą rūgštingumą, pagal tokią lentelę:







Numatomas rūgštingumas (oleino rūgšties kiekis g/100g) Ėminio masė (g) Svėrimo tikslumas (g) 0–2 10 0,02 > 2–7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Ėminys sveriamas kūginėje kolboje (4.2).

5.3. Nustatymas

Ėminys (5.2) ištirpinamas 50–100 ml prieš tai neutralizuoto dietileterio ir etanolio mišinio (3.1).

Titruojama 0,1 mol/l koncentracijos kalio hidroksido (arba natrio hidroksido) tirpalu (3.2) (žr. 4 pastabą) maišant, kol pasikeičia indikatoriaus spalva (spalvoto indikatoriaus spalva nepranyksta bent 10 sekundžių).

4 pastaba. Jei reikiamo kalio hidroksido (arba natrio hidroksido) 0,1 mol/l tirpalo kiekis yra didesnis nei 10 ml, naudojamas 0,5 mol/l tirpalas arba pagal siūlomą lentelę pasirenkama kita ėminio masė atsižvelgiant į numatomą rūgštingumą.

5 pastaba. Jei titruojant tirpalas susidrumsčia, įpilama tiek tirpiklių (3.1), kad tirpalas pasidarytų skaidrus.

Antras nustatymas atliekamas tik jei gautas pirmas rezultatas viršija aliejaus kategorijai nustatytą ribą.

6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

Rūgštingumas oleino rūgšties masės procentais apskaičiuojamas pagal formulę:

čia:

V = titruoti naudoto kalio hidroksido (arba natrio hidroksido) tirpalo tūris mililitrais;

c = tiksli titruoti naudoto kalio hidroksido (arba natrio hidroksido) tirpalo koncentracija moliais litre;

M = 282 g/mol, molinė masė gramais vienam oleino rūgšties moliui;

m = ėminio masė gramais.

Oleino rūgšties kiekis nurodomas taip:

a) nuo 0 iki 1 imtinai – šimtųjų tikslumu;

b) nuo 1 iki 100 imtinai – dešimtųjų tikslumu.

▼M30









III PRIEDAS

PEROKSIDŲ SKAIČIAUS NUSTATYMAS

1. Taikymo sritis

Šiame priede aprašomas gyvulinių ir augalinių aliejų ir riebalų peroksidų skaičiaus nustatymo metodas.

2. Apibrėžtis

Peroksidų skaičius – medžiagų, kurios aprašytomis bandymo sąlygomis oksiduoja kalio jodidą, kiekis, skaičiuojamas aktyvaus deguonies miliekvivalentais kilogramui mėginio.

3. Principas

Acto rūgšties ir chloroformo mišinyje ištirpinta analizuojamo mėginio dalis veikiama kalio jodido tirpalu. Išsiskyręs laisvas jodas titruojamas etaloniniu natrio tiosulfato tirpalu.

4. Aparatūra

Naudojamoje įrangoje turi nebūti jokių oksiduojančiųjų arba redukuojančiųjų medžiagų.

1 pastaba. Šlifo jungtys netepamos.

4.1. 3 ml talpos stiklinė bertuvėlė.

4.2. Maždaug 250 ml talpos kolbos su šlifo kaklais ir kamščiais, iš anksto išdžiovintos ir užpildytos grynomis, sausomis inertinėmis dujomis be priemaišų (azotu arba geriau anglies dioksidu).

4.3. Bent kas 0,05 ml sugraduota 5, 10 arba 25 ml talpos biuretė, geriausia su automatine nulio nustatymo funkcija, arba atitinkama automatinė biuretė.

4.4. Analizinės svarstyklės.

5. Reagentai

5.1. Chloroformas, analiziškai grynas, išvalytas nuo deguonies barbotuojant per jį grynų ir sausų inertinių dujų srovę.

5.2. Ledinė acto rūgštis, analiziškai gryna, išvalyta nuo deguonies barbotuojant per ją grynų ir sausų inertinių dujų srovę.

5.3. Kalio jodidas – neseniai paruoštas prisotintas vandeninis tirpalas, be jodo ir jodatų. Ištirpinkite apie 14 g kalio jodido maždaug 10 ml kambario temperatūros vandens.

5.4. Natrio tiosulfatas – 0,01 mol/l (atitinka 0,01 N) tiksliai paruoštas etaloninis vandeninis tirpalas, ruošiamas prieš pat naudojimą.

Kasdien prieš naudojimą iš naujo paruoškite 0,01 mol/l natrio sulfato tirpalą iš 0,1 mol/l etaloninio natrio tiosulfato tirpalo arba nustatykite tikslią molinę koncentraciją. Iš patirties žinoma, kad tirpalas nėra labai stabilus, – stabilumas priklauso nuo pH vertės ir nuo laisvo anglies dioksido kiekio. Skieskite tik šviežiai virintu vandeniu, jei galima – prapūstu azotu.

Tiksliai natrio tiosulfato tirpalo molinei koncentracijai nustatyti rekomenduojama taikyti šią procedūrą:

250 ml arba 500 ml matavimo kolboje 0,001 g tikslumu pasverkite 0,27–0,33 g kalio jodato (mKIO3) ir skieskite šviežiai virintu iki kambario temperatūros atvėsintu vandeniu iki žymos (V2). Pipete perkelkite 5 arba 10 ml gauto kalio jodato tirpalo (V1) į 250 ml Erlenmejerio kolbą. Įpilkite 60 ml šviežiai virinto vandens, 5 ml 4 mol/l druskos rūgšties ir 25–50 mg kalio jodido arba 0,5 ml prisotinto kalio jodido tirpalo. Šį tirpalą titruokite natrio tiosulfato tirpalu (V3) ir taip nustatykite tikslią molinę natrio tiosulfato tirpalo koncentraciją.

Čia:

mKIO3 – kalio jodato masė gramais,

V1 – kalio jodato tirpalo tūris mililitrais (5 ml arba 10 ml),

V2 – viso kalio jodato tirpalo tūris mililitrais (250 ml arba 500 ml),

V3 – natrio tiosulfato tirpalo tūris mililitrais,

wKIO3 – kalio jodato grynumas, g/100 g,

MKIO3 – kalio jodato molekulinė masė (214 g/mol),

T – tiksli natrio tiosulfato tirpalo molinė koncentracija (mol/l).

5.5. Krakmolo tirpalas, 10 g/l dispersija vandenyje, neseniai paruoštas iš natūralaus tirpaus krakmolo. Galima naudoti ir lygiaverčius reagentus.

6. Mėginys

Reikia žiūrėti, kad mėginys būtų imamas ir laikomas neapšviestoje šaltoje vietoje, visiškai užpildytame stikliniame inde, hermetiškai užkimštame šlifo arba kamščiamedžio kamščiais.

7. Procedūra

Analizė turi būti atliekama išsklaidytoje dienos šviesoje arba esant dirbtiniam apšvietimui. Stiklinėje bertuvėlėje (4.1) arba, jos neturint, kolboje (4.2) 0,001 g tikslumu pasveriama mėginio masė, kuri pasirenkama iš toliau pateiktos lentelės duomenų, atsižvelgiant į numatomą peroksidų skaičių:







Numatomas peroksidų skaičius (mekv.) Analizuojamos mėginio dalies masė (g) 0–12 5,0–2,0 12–20 2,0–1,2 20–30 1,2–0,8 30–50 0,8–0,5 50–90 0,5–0,3

Kolba (4.2) atkemšama ir į ją įdedama stiklinė bertuvėlė su bandiniu. Įpilama 10 ml chloroformo (5.1). Mėginys greitai ištirpinamas maišant. Įpilama 15 ml acto rūgšties (5.2) ir paskui 1 ml kalio jodido tirpalo (5.3). Kolba greitai užkemšama, kratoma vieną minutę ir lygiai penkias minutes paliekama stovėti neapšviestoje vietoje, 15–25 °C temperatūroje.

Įpilama maždaug 75 ml distiliuoto vandens. Išsiskyręs laisvas jodas stipriai kratant titruojamas natrio tiosulfato tirpalu (5.4), kaip indikatorių naudojant krakmolo tirpalą (5.5).

To paties mėginio analizė atliekama du kartus.

Tuo pat metu atliekamas tuščiasis bandymas. Jei tuščiojo bandymo rezultatas didesnis kaip 0,05 ml 0,01 N natrio tiosulfato tirpalo (5.4), negryni reagentai pakeičiami.

8. Rezultatų pateikimas

Peroksidų skaičius (PS), skaičiuojant aktyvaus deguonies miliekvivalentais kilogramui, nustatomas pagal formulę:

čia:

V – analizei sunaudoto etaloninio natrio tiosulfato tirpalo (5.4) tūris, pataisytas pagal tuščiojo bandymo rezultatą, ml,

T – tiksli naudoto natrio tiosulfato tirpalo (5.4) molinė koncentracija, mol/l,

m – analizuojamos bandinio dalies masė, g.

Rezultatu laikomas dviejų matavimų rezultatų aritmetinis vidurkis.

Nustatytą rezultatą pateikite dešimtųjų tikslumu.

▼M21









IV PRIEDAS

VAŠKŲ KIEKIO NUSTATYMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU KAPILIARINĖJE KOLONĖLĖJE

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomi vaškų kiekiai alyvuogių aliejuje. Vaškai identifikuojami pagal anglies atomų skaičių. Metodas taikomas atskirti spaudimo būdu gautą alyvuogių aliejų nuo alyvuogių aliejaus, gauto ekstrahavimo būdu (maišytas alyvuogių išspaudų aliejus).

2. METODO ESMĖ

Į riebalus arba aliejų pridedama atitinkamo vidinio etalono ir chromatografiškai frakcionuojama kolonėlėje, užpildytoje hidratuotu silikageliu. Frakcija, kuri bandymo sąlygomis išplaunama pirmoji (jos poliškumas yra mažesnis kaip trigliceridų), tiesiogiai tiriama dujų chromatografijos metodu kapiliarinėje kolonėlėje.

3. ĮRANGA

3.1. 25 ml Erlenmejerio kolba.

3.2. Stiklinė dujų chromatografijos kolonėlė su čiaupu, kurios vidinis skersmuo 15 mm, ilgis 30–40 cm.

3.3. Tinkamas dujų chromatografas su kapiliarine kolonėle ir mėginio tiesioginio įpurškimo įtaisu. Chromatografą sudaro: 3.3.1. Kolonėlių termostatas su temperatūros programavimo įrenginiu. 3.3.2. Šaltas inžektorius mėginiui tiesiogiai į kolonėlę įpurkšti. 3.3.3. Liepsnos jonizacinis detektorius ir konverteris stiprintuvas. 3.3.4. Kintamo popieriaus tiekimo greičio savirašis integratorius, dirbantis su konverteriu stiprintuvu (3.3.3), kurio atsako sparta ne didesnė kaip viena sekundė. (Taip pat galima naudoti kompiuterizuotas sistemas, leidžiančias kompiuteriu gauti dujų chromatografijos duomenis.). 3.3.5. 8–12 m ilgio ir 0,25–0,32 mm vidinio skersmens stiklinė arba kvarcinio stiklo kapiliarinė kolonėlė, iš vidaus padengta lygia 0,10–0,30 μm storio stacionarios fazės plėvele. (Naudoti paruoštos plėvelės parduodamos kaip SE-52 arba SE-54.).

3.4. 10 μl mikrošvirkštas su kietinta adata, pritaikytas mėginiui tiesiogiai įpurkšti į kolonėlę.

3.5. Elektrinė purtyklė.

3.6. Sukamasis garintuvas.

3.7. Mufelinė krosnis.

3.8. Analizinės svarstyklės, kurių svėrimo tikslumas ± 0,1 mg.

3.9. Įprasti laboratoriniai stikliniai indai.

4. REAGENTAI

4.1. Silikagelis, kurio granulių dydis 60–200 μm. Jis paruošiamas taip: silikagelis dedamas į krosnį ir ne trumpiau kaip keturias valandas kaitinamas 500 °C temperatūroje. Leidžiama atvėsti ir įpilama 2 % (silikagelio masės) vandens. Gauta suspensija homogenizuojama gerai sumaišant. Prieš naudojimą laikoma tamsoje ne mažiau kaip 12 valandų.

4.2. n-heksanas, tinkamas chromatografijai.

4.3. Etileteris, tinkamas chromatografijai.

4.4. n-heptanas, tinkamas chromatografijai.

4.5. Etaloninis 0,1 % (m/v) laurileikozanato tirpalas heksane (vidinis etalonas). (Taip pat galima naudoti palmitilo palmitatą arba miristilstearatą). 4.5.1. Sudanas I (1-fenilazo-2-naftolis).

4.6. Nešančiosios dujos: vandenilis arba helis, kurių grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus.

4.7. Pagalbinės dujos: — grynas vandenilis, tinkamas dujų chromatografijai, — grynas oras, tinkamas dujų chromatografijai.

5. DARBO EIGA

5.1. Chromatografinės kolonėlės paruošimas.

15 g silikagelio (4.1.) suspenduojama n-heksane (4.2.) ir supilama į kolonėlę (3.2.). Silikageliui leidžiama savaime nusėsti. Kad chromatografinis sluoksnis būtų homogeniškesnis, nusodinimas baigiamas, naudojant elektrinę purtyklę (3.5.). Priemaišos pašalinamos per silikagelį praleidžiant 30 ml n-heksano. Į 25 ml talpos Erlenmejerio kolbą (3.1) svarstyklėmis (3.8) tiksliai pasveriama 500 mg mėginio ir pridedamas reikiamas vidinio etalono (4.5) kiekis, atsižvelgiant į numatomą vaško kiekį mėginyje. Pvz.: analizuojant alyvuogių aliejų įdedama 0,1 mg laurileikozanato, analizuojant maišytą alyvuogių išspaudų aliejų – 0,25–0,5 mg. Paruoštas mėginys dviem 2 ml n-heksano (4.2.) porcijomis supilamas į chromatografijos kolonėlę.

Tirpikliui leidžiama ištekėti iki 1 mm lygio virš absorbento viršutinio paviršiaus, tuomet per silikagelį praleidžiama 70 ml n-heksano natūraliai tirpaluose esantiems n-alkanams pašalinti. Chromatografinis išplovimas pradedamas palaikant 15 lašų per 10 sekundžių srauto greitį, surenkama 180 ml n-heksano/etileterio mišinio, paruošto santykiu 99:1. Mėginio išplovimas turi būti atliekamas kambario, t. y. 22 ± 4 °C, temperatūroje.

Pastabos:

— n-heksano/etileterio mišinys (99:1) turi būti ruošiamas kasdien.

— Siekiant vizualiai sekti, ar vaškai tinkamai išplaunami, į skystą mėginio išplovimo mišinį galima įpilti 100 μl 1 % sudano tirpalo. Kadangi dažiklio sulaikymo trukmė yra tarpinė, lyginant su vaškų ir trigliceridų sulaikymo trukme, todėl dažikliui pasiekus chromatografinės kolonėlės dugną, išplovimo procesas nutraukiamas, nes visi vaškai jau būna išplauti.

Gauta frakcija džiovinama sukamajame garintuve (3.6.), kol išgarinamas beveik visas tirpiklis. Paskutinieji 2 ml tirpiklio pašalinami silpna azoto srove; tuomet įpilama 2–4 ml n-heptano.

5.2. Dujų chromatografinė analizė

5.2.1. Paruošiamieji darbai

Kolonėlė prijungiama prie dujų chromatografo (3.3), kolonėlės pradžią sujungiant su tiesioginio įpurškimo įtaisu, galą – su detektoriumi. Patikrinamas dujų chromatografijos įrenginys (dujų kilpų, detektoriaus, ir savirašio veikimas ir t. t.).

Jei kolonėlė naudojama pirmą kartą, patartina ją kondicionuoti. Per kolonėlę paleidžiama nestipri dujų srovė, tuomet įjungiamas dujų chromatografas. Palaipsniui kaitinama, kol temperatūra per apytiksliai 4 valandas pakyla iki 350 °C. Ši temperatūra palaikoma ne mažiau kaip 2 valandas, po to nustatomos įrenginio darbo sąlygos (sureguliuojamas dujų srauto greitis, uždegama liepsna, prijungiamas elektroninis savirašis (3.3.4.), nustatoma termostato kameros temperatūra, sureguliuojamas detektorius ir t. t.) ir esant bent du kartus didesniam jautriui nei tas, kuris reikalingas analizei atlikti, užrašomas signalas. Bazinė linija turi būti tiesi, be jokių smailių ir nukrypimų.

Neigiamas tiesinis nuokrypis rodo, kad nesandarūs kolonėlės sujungimai; teigiamas nuokrypis – kad kolonėlė nepakankamai kondicionuota.

5.2.2. Darbo sąlygų parinkimas

Paprastai turi būti laikomasi tokių darbo sąlygų:

— kolonėlės temperatūra: —



20 °C/minutę 5 °C/minutę 20 °C/minutę pradinė temperatūra 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektoriaus temperatūra: 350 °C,

— įpurkštas medžiagos kiekis: 1 μl (2–4 ml) n-heptano tirpalo,

— nešančiosios dujos: helis arba vandenilis, naudojamas pasirinktoms dujoms optimalus linijinis greitis (žr. priedėlį),

— prietaiso jautris: atitinkantis toliau nurodytas sąlygas:

šios sąlygos gali būti keičiamos, atsižvelgiant į kolonėlės bei dujų chromatografo savybes, kad būtų pasiektas visų vaškų atskyrimas, pakankama smailių skiriamoji geba (žr. paveikslą). Vidinio etalono C32 sulaikymo trukmė turi būti 18 ± 3 minutės. Būdingiausios vaškų smailės aukštis turi sudaryti ne mažiau kaip 60 % visos skalės aukščio.

Smailių integravimo parametrai nustatomi taip, kad būtų gautas teisingas nagrinėjamų smailių plotų įvertinimas.

Pastaba.Kadangi galutinė temperatūra aukšta yra leidžiamas teigiamas nuokrypis, neviršijantis 10 % visos skalės aukščio.

5.3. Analizė

10 μl mikrošvirkštu įsiurbiama 1μl mėginio tirpalo; stūmoklis traukiamas, kol adata ištuštėja. Adata įkišama į įpurškimo įtaisą ir po vienos-dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas. Maždaug po penkių sekundžių adata lėtai ištraukiama.

Užrašinėjama, kol vaškai visiškai išplaunami.

Bazinė linija turi visuomet atitikti nustatytas sąlygas.

5.4. Smailių identifikavimas

Smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmes, lyginant jas su žinomas sulaikymo trukmes turinčiais vaškų mišiniais, analizuotais tomis pačiomis sąlygomis.

Gryno alyvuogių aliejaus vaškų chromatograma parodyta paveiksle.

5.5. Kiekybinis vertinimas

Integratoriumi išmatuojami vidinio etalono ir C40–C46 alifatiniių esterių smailių plotai.

Kiekvieno vašką sudarančio esterio kiekis mg/kg riebalų, apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

Ax = kiekvieno esterio smailės plotas, kvadratiniais milimetrais

As = kiekvieno vidinio etalono esterio smailės plotas, kvadratiniais milimetrais

ms = pridėto vidinio etalono masė, miligramais

m = tyrimui paimto mėginio masė, gramais.

6. REZULTATŲ PATEIKIMAS

Pateikiami atskirų C40–C46 vaškų kiekiai ir šių kiekių suma, mg/kg riebalų (ppm).

Pastaba.Vaškų sudedamųjų dalių kiekiai nustatomi remiantis alyvuogių aliejaus chromatogramos esterių porinių anglies skaičiaus smailių C40–C46 pavyzdžiu, pateiktu paveiksle. Jei C46 esteris matomas du kartus, jam identifikuoti rekomenduojama analizuoti maišytą alyvuogių išspaudų aliejų, kuriame C46 lengvai nustatomas, nes šiame aliejuje jo yra daugiausia.

Rezultatai pateikiami vieno ženklo po kablelio (dešimtųjų) tikslumu.

Paveikslas

Alyvuogių aliejaus vaškų chromatograma ( 9 )

Paaiškinimas:

I.S. = Laurileikozanatas

1. = Diterpeniniai esteriai

2 + 2’ = Esteris C40

3 + 3’ = Esteris C42

4 + 4’ = Esteris C44

5. = Esteris C46

6. = Steroliniai esteriai ir triterpeninis alkoholis









Priedėlis

Dujų linijinio greičio nustatymas

Į dujų chromatografą, nustatytą normalioms darbo sąlygoms, įpurškiama 1–3 μl metano arba propano ir matuojamas laikas, kurį dujos užtruks tekėdamos per kolonėlę nuo įpurškimo momento iki smailės iškilimo momento (tM).

Linijinis greitis, cm/s, gaunamas pagal formulę L/tM, kurioje L yra kolonėlės ilgis, centimetrais, tM yra išmatuotas laikas sekundėmis.

▼M26









V PRIEDAS

STEROLIŲ IR TRITERPENO DIALKOHOLIŲ SUDĖTIES IR KIEKIO NUSTATYMAS KAPILIARINĖS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1. TAIKYMO SRITIS

Šiame metode aprašomas atskirų sterolių ir triterpeno dialkoholių ir bendro jų kiekio alyvuogių ir alyvuogių išspaudų aliejuose nustatymo būdas.

2. METODO ESMĖ

Aliejus, įdėjus α-cholestanolio kaip vidinio etalono, muilinamas kalio hidroksido tirpalu etanolyje, o nemuilinama medžiaga ekstrahuojama etileteriu.

Sterolių ir triterpeno dialkoholių frakcija išskiriama iš nemuilinamos medžiagos ant šarmu impregnuotos silikagelio plokštelės plonasluoksnės chromatografijos būdu. Iš silikagelio regeneruotos frakcijos paverčiamos trimetilsilileteriais ir analizuojamos kapiliarinės dujų chromatografijos metodu.

3. ĮRANGA

Įprasta laboratorinė įranga, visų pirma:

3.1. 250 ml talpos kolba su grįžtamuoju kondensatoriumi, turinčiu šlifo sujungimus.

3.2. 500 ml talpos dalijamasis piltuvas.

3.3. 250 ml talpos kolbos.

3.4. Visa įranga plonasluoksnei chromatografinei analizei atlikti naudojant 20 × 20 cm matmenų stiklines plokšteles.

3.5. Ultravioletinė 254 arba 366 nm ilgio šviesos bangų lempa.

3.6. Mikrošvirkštai 100 μl ir 500 μl tūriams imti.

3.7. G3 akytumo cilindro formos filtras (15–40 μm akytumas), maždaug 2 cm skersmens ir 5 cm aukščio, tinkamas vakuuminiam filtravimui su šlifo mova.

3.8. 50 ml talpos vakuuminė kūgio formos kolba su šlifo įmova filtrui (3.7 punktas) prijungti.

3.9. 10 ml talpos mėgintuvėlis su kūginiu dugnu ir stiklo kamščiu.

3.10. Darbui su kapiliarine kolonėle tinkamas dujų chromatografas su dozuojamojo mėginio įpurškimo sistema, kurį sudaro:

3.10.1. termostatuojama kamera norimai temperatūrai kolonėlėse palaikyti ± 1 °C tikslumu;

3.10.2. reguliuojamos temperatūros įpurškimo įrenginys su polisiloksanu dengtu garinimo elementu ir dozavimo sistema;

3.10.3. liepsnos jonizacinis detektorius (FID);

3.10.4. duomenų rinkimo sistema, tinkama naudoti su FID detektoriumi (3.10.3 punktas) ir pritaikyta rankiniam integravimui.

3.11. Lydyto kvarco 20–30 m ilgio kapiliarinė kolonėlė, kurios vidinis skersmuo 0,25–0,32 mm, padengta vienodo 0,10–0,30 μm storio 5 % difenilo – 95 % dimetilpolisiloksano (SE-52 arba SE-54 nejudančiosios fazės arba ją atitinkančia plėvele) sluoksniu.

3.12. 10 μl talpos mikrošvirkštas dujų chromatografijai su kietinta adata, tinkama dozuojamajam įpurškimui.

3.13. Kalcio dichlorido eksikatorius.

4. REAGENTAI

4.1. Kalio hidroksidas, mažiausias titras – 85 %.

4.2. Kalio hidroksido tirpalas etanolyje, maždaug 2 N.

130 g kalio hidroksido (4.1 punktas) ištirpinama šaldant 200 ml distiliuoto vandens ir paskui praskiedžiama etanoliu (4.10 punktas) iki 1 litro. Tirpalas turi būti laikomas gerai užkimštuose tamsaus stiklo buteliuose ir saugomas ne ilgiau kaip dvi dienas.

4.3. Etileteris, analizei tinkamos kokybės.

4.4. Kalio hidroksido tirpalas etanolyje, maždaug 0,2 N.

13 g kalio hidroksido (4.1 punktas) ištirpinama 20 ml distiliuoto vandens ir praskiedžiama etanoliu (4.10 punktas) iki 1 litro.

4.5. Bevandenis natrio sulfatas, analizei tinkamos kokybės.

4.6. Fluorescencijos indikatoriumi neužteršto silikagelio 0,25 mm sluoksniu dengtos stiklinės plokštelės (20 × 20 cm) (galima pirkti paruoštų naudoti plokštelių).

4.7. Toluenas, chromatografijai tinkamos kokybės.

4.8. Acetonas, chromatografijai tinkamos kokybės.

4.9. n-heksanas, chromatografijai tinkamos kokybės.

4.10. Etileteris, chromatografijai tinkamos kokybės.

4.11. Analizei tinkamos kokybės etanolis.

4.12. Analizei tinkamos kokybės etilacetatas.

4.13. Etaloninis tirpalas plonasluoksnei chromatografijai: cholesterolis arba fitosteroliai, taip pat eritrodiolio 5 % tirpalas etilacetate (4.11 punktas).

4.14. 0,2 % 2,7-dichlorfluoresceino tirpalas etanolyje. Jis truputį pašarminamas įlašinant kelis lašus 2 N kalio hidroksido tirpalo alkoholyje (4.2 punktas).

4.15. Bevandenis piridinas, chromatografijai tinkamos kokybės (žr. 5 pastabą).

4.16. Analizei tinkamos kokybės heksametildisilazanas.

4.17. Analizei tinkamos kokybės trimetilchlorsilanas.

4.18. Sterolių trimetilsilileterių mėginio tirpalai.

Ruošiami prieš pat juos naudojant iš sterolių ir eritrodiolio, gauto iš šių medžiagų turinčių aliejų.

4.19. α-cholestanolis, didesnio nei 99 % grynumo (grynumas turi būti patikrintas dujų chromatografijos analizės būdu).

4.20. α-cholestanolio vidinio etalono tirpalas, 0,2 % tirpalas (m/V) etilacetate (4.11 punktas).

4.21. Fenolftaleino tirpalas, 10 g/l etanolyje (4.10 punktas).

4.22. Dujos nešikliai: vandenilis arba helis, dujų chromatografijai tinkamo grynumo.

4.23. Pagalbinės dujos: vandenilis, helis, azotas ir oras, dujų chromatografijai tinkamo grynumo.

4.24. n-heksano (4.9 punktas) ir etileterio (4.10 punktas) mišinys santykiu 65:35 (V/V).

4.25. Sililinimo reagentas, kurį sudaro piridino, heksametildisilazano ir trimetilchlorsilano mišinys santykiu 9:3:1 (V/V/V).

5. DARBO EIGA

5.1. Nemuilinamų medžiagų gavimas. 5.1.1. Į 250 ml talpos kolbą (3.1 punktas) 500 μl mikrošvirkštu (3.6 punktas) įšvirkščiamas toks α-cholestanolio vidinio etalono tirpalo (4.20 punktas) kiekis, kuriame cholestanolio kiekis atitiktų maždaug 10 % mėginio sterolių kiekio. Pavyzdžiui, į 5 g alyvuogių aliejaus mėginį įpilama 500 μl α-cholestanolio tirpalo (4.20 punktas), o į alyvuogių išspaudų aliejaus mėginį – 1 500 μl. Tirpalas naudojant silpną azoto srovę šilto vandens vonelėje išgarinamas iki sauso likučio, atvėsinus kolbą, į tą pačią kolbą pasveriama 5 ± 0,01 g sauso filtruoto mėginio. 1 pastaba. Gyvulinės kilmės arba augaliniai aliejai ir riebalai, kuriuose yra nemaži kiekiai cholesterolio, chromatogramoje gali turėti smailę, kurios sulaikymo trukmė panaši į cholestanolio. Tokiu atveju sterolių frakcija turi būti analizuojama du kartus – su vidiniu etalonu ir be jo. 5.1.2. Į kolbą įpilama 50 ml 2 N kalio hidroksido tirpalo etanolyje (4.2 punktas) ir įdedama šiek tiek pemzos, prijungiamas grįžtamasis kondensatorius ir kolba šildoma iki nestipraus virimo, kol įvyksta muilinimas (tirpalas pasidaro skaidrus). Šildoma dar 20 minučių, paskui per kondensatoriaus viršų įpilama 50 ml distiliuoto vandens, kondensatorius atjungiamas ir kolba ataušinama iki maždaug 30 °C. 5.1.3. Kolbos turinys naudojant kelias distiliuoto vandens porcijas (50 ml) kiekybiškai supilamas į 500 ml dalijamąjį piltuvą (3.2 punktas). Įpilama maždaug 80 ml etileterio (4.10 punktas), turinys stipriai plakamas maždaug 60 sekundžių periodiškai sumažinant slėgį apverčiant dalijamąjį piltuvą ir atidarant čiaupą. Paskui kolba paliekama stovėti, kol turinys visiškai išsisluoksniuoja į dvi fazes (2 pastaba). Paskui kuo didesnis muilo tirpalo kiekis išleidžiamas į antrąjį dalijamąjį piltuvą. Vandens ir alkoholio fazė tuo pačiu būdu ekstrahuojama dar du kartus, kiekvieną kartą sunaudojant 60–70 ml etileterio (4.10 punktas). 2 pastaba. Bet kokia susidariusi emulsija gali būti panaikinta įpilant nedidelį kiekį etanolio (4.11 punktas). 5.1.4. Trys eteriniai ekstraktai supilami į vieną dalijamąjį piltuvą, kuriame yra 50 ml vandens. Mišinys plaunamas vandeniu (50 ml), kol plovimo vanduo, įlašinus fenolftaleino tirpalo (4.21 punktas) lašą, nebenusidažo rožine spalva. Atskyrus plovimo vandenis, ekstraktas per bevandenį natrio sulfatą (4.5 punktas) filtruojamas į prieš tai pasvertą 250 ml kolbą, piltuvą ir filtrą nuplaunant nedideliu kiekiu etileterio (4.10 punktas). 5.1.5. Tirpiklis distiliuojant vakuume išgarinamas sukamuoju garintuvu 30 °C temperatūroje. Įpilama 5 ml acetono ir lakus tirpiklis visiškai pašalinamas silpnoje oro srovėje. Likutis 15 minučių džiovinamas krosnyje 103 ± 2 °C temperatūroje. Paskui likutis ataušinamas eksikatoriuose ir pasveriamas 0,1 mg tikslumu.

5.2. Sterolių ir triterpeno dialkoholių frakcijos (eritrodiolis + uvaolis) atskyrimas 5.2.1. Ruošiamos bazinės plonasluoksnės chromatografijos plokštelės. Silikageliu dengtos plokštelės (4.6 punktas) 10 sekundžių maždaug 4 cm įmerkiamos į 0,2 N kalio hidroksido tirpalą etanolyje (4.5 punktas), paskui paliekamos dvi valandas džiūti traukos spintoje ir galiausiai vieną valandą laikomos krosnyje 100 °C temperatūroje. Plokštelės išimamos iš krosnies ir laikomos eksikatoriuje su kalcio chloridu (3.13 punktas), kol jų prireikia (taip apdorotos plokštelės turi būti panaudotos per 15 dienų). 3 pastaba. Kai sterolių frakcijai atskirti naudojamos bazinės silikagelio plokštelės, nemuilinamos frakcijos nebūtina apdoroti aliuminio oksidu. Taip visi rūgštinio pobūdžio junginiai (riebalų rūgštys ir kiti) sulaikomi užlašinimo linijoje ir sterolių juosta aiškiai atsiskiria nuo alifatinių ir triterpeno alkoholių juostos. 5.2.2. Į ryškinimo indą maždaug 1 cm storio sluoksniu įpilama heksano ir etileterio mišinio (4.24 punktas) (4 pastaba). Indas uždaromas tinkamu dangčiu ir paliekamas vėsioje vietoje ne mažiau kaip pusvalandžiui, kad nusistovėtų garų ir skysčio pusiausvyra. Ant vidinių indo sienelių gali būti uždedamos filtro popieriaus juostelės, įmerktos į eliuentą. Taip maždaug trečdaliu sutrumpinama ryškinimo trukmė, o komponentai išplaunami vienodžiau ir pastoviau. 4 pastaba. Visiškai pakartojamoms išplovimo sąlygoms užtikrinti ryškinimo tirpalą reikia pakeisti kiekvienai analizei; kaip alternatyvus tirpiklis gali būti naudojamas n-heksano ir etileterio mišinys, kurio tūrių santykis 50:50. 5.2.3. Ruošiamas maždaug 5 % nemuilinamų medžiagų (5.1.5 punktas) tirpalas etilacetate (4.12 punktas) ir 0,3 ml šio tirpalo 100 μl talpos mikrošvirkštu vienoda siaura juostele užlašinama ant apatinio chromatografinės plokštelės (5.2.1 punktas) galo (2 cm nuo apačios). Vienoje linijoje su šia juostele užlašinama 2–3 μl medžiagos etaloninio tirpalo (4.13 punktas) sterolių ir triterpeno dialkoholių juostai identifikuoti užbaigus ryškinimą. 5.2.4. Plokštelė dedama į ryškinimo indą, paruoštą kaip nurodyta 5.2.2 punkte. Turėtų būti palaikoma 15–20 °C aplinkos temperatūra (5 pastaba). Indas iš karto uždengiamas ir plaunama, kol tirpiklio frontas atsiduria maždaug 1 cm atstumu nuo plokštelės viršutinio krašto. Plokštelė išimama iš ryškinimo indo ir tirpiklis išgarinamas karšto oro srovėje arba plokštelė trumpam paliekama traukos spintoje. 5 pastaba. Aukštesnė temperatūra gali pasunkinti atskyrimą. 5.2.5. Plokštelė plonai ir vienodai apipurškiama 2,7-dichlorfluoresceino tirpalu (4.14 punktas) ir paliekama išdžiūti. Žiūrint į plokštelę ultravioletinėje šviesoje, sterolių ir triterpeno dialkoholių juostos gali būti atpažintos pagal buvimą viename lygyje su etaloninio tirpalo (4.13 punktas) dėmėmis. Juostų ribos pagal fluorescuojančius kraštus pažymimos juodu pieštuku (žr. 3 brėžinį, kuriame vaizduojama plonasluoksnės chromatografijos plokštelė). 5.2.6. Silikagelis pažymėtame plote nugrandomas metaline mentele. Gerai susmulkinta medžiaga nuo plokštelės supilama į filtrą (3.7 punktas). Įpilama 10 ml karšto etilacetato (4.12 punktas), gerai sumaišoma metaline mentele ir vakuume filtruojama į kūgio formos kolbą (3.8 punktas), prijungtą prie filtro. Likutis kolboje tris kartus plaunamas etileteriu (4.3 punktas) (maždaug po 10 ml kiekvieną kartą), filtruojant į tą pačią prie filtro prijungtą kolbą; filtratas nugarinamas iki maždaug 4–5 ml tūrio, likęs tirpalas supilamas į 10 ml talpos mėgintuvėlį (3.9 punktas), kuris prieš tai pasveriamas; mėgintuvėlio turinys džiovinamas nestipriai kaitinant nedidelėje azoto srovėje, iš naujo tirpinamas keliuose acetono (4.8 punktas) lašuose ir vėl džiovinamas. Likutį mėgintuvėlyje turi sudaryti sterolių ir triterpeno dialkoholių frakcijos.

5.3. Trimetilsilileterių ruošimas 5.3.1. Į mėgintuvėlį su sterolių ir triterpenų frakcija, vengiant bet kokio drėgmės patekimo (7 pastaba), įpilama sililinimo reagento (4.25 punktas) (6 pastaba), kurio imama po 50 μl vienam sterolių ir triterpeno dialkoholių miligramui. 6 pastaba. Galima pirkti paruoštų naudoti tirpalų. Be to, galima pirkti ir kitų sililinimo reagentų, pvz., N,O-bi(trimetilsilil)trifluoracetamido + 1 % trimetilchlorsilano mišinį, kuris turi būti praskiestas tokio pat tūrio sausu piridinu. Piridiną galima pakeisti tokiu pat acetonitrilo kiekiu. 5.3.2. Mėgintuvėlis užkemšamas ir atsargiai kratomas (neapverčiant), kol junginiai visiškai ištirpsta. Po to jis bent 15 minučių paliekamas stovėti aplinkos temperatūroje ir paskui kelias minutes centrifuguojamas. Skaidrus tirpalas paruoštas dujų chromatografinei analizei. 7 pastaba. Nedidelė opalescencija yra įprastas reiškinys ir nesukelia jokių anomalijų. Baltų dribsnių susidarymas ar rožinė spalva yra drėgmės patekimo arba reagento sugedimo požymiai. Šiuo atveju bandymas turi būti pakartotas (tik jei naudojamas heksametildisilazano ir trimetilchlorsilano mišinys).

5.4. Dujų chromatografinė analizė. 5.4.1. Parengiamieji darbai ir kapiliarinės kolonėlės kondicionavimas. 5.4.1.1. Kolonėlė (3.11 punktas) prijungiama prie dujų chromatografo, kolonėlės įėjimą sujungiant su dozuojamuoju injektoriumi, o išėjimą – su detektoriumi. Atliekamas bendras dujų chromatografavimo įrenginio patikrinimas (nutekėjimai dujų sistemoje, detektoriaus, dozavimo sistemos ir savirašio veikimas ir t. t.). 5.4.1.2. Pirmą kartą naudojamą kapiliarinę kolonėlę rekomenduojama kondicionuoti: per kolonėlę paleidžiama nestipri dujų srovė, paskui įjungiamas chromatografas ir pradedamas laipsniškas kaitinimas, kol temperatūra pakyla bent 20°C aukščiau, nei naudojama darbe (8 pastaba). Šioje temperatūroje kolonėlė laikoma ne mažiau kaip dvi valandas, vėliau visas įrenginys nustatomas darbo režimu (reguliuojamas dujų srautas ir dozavimas, uždegama ugnis, prijungiama skaičiavimo sistema, reguliuojama kolonėlės, detektoriaus ir injektoriaus temperatūra ir t. t.) ir užrašomas signalas bent du kartus didesniu jautrumu, nei bus naudojamas analizei atlikti. Pagrindo linija turi būti brėžiama tiesi, be jokių smailių ir dreifo požymių. Neigiamas tiesinis dreifas yra kolonėlės sujungimų nesandarumo požymis, o teigiamas dreifas rodo nepakankamą kolonėlės kondicionavimą. 8 pastaba. Kondicionavimo temperatūra visuomet turi būti bent 20 °C mažesnė, nei naudojamai nejudančiajai fazei nustatyta didžiausia temperatūra. 5.4.2. Darbo sąlygų parinkimas 5.4.2.1. Darbo sąlygos: — kolonėlės temperatūra: 260 ± 5 °C; — injektoriaus temperatūra: 280–300 °C; — detektoriaus temperatūra: 280–300 °C; — dujų nešiklio linijinis greitis: helio – 20–35 cm/s; vandenilio – 30–50 cm/s; — padalijimo santykis: nuo 1:50 iki 1:100; — prietaiso jautrumas: 4–16 kartų didesnis nei minimalus silpninimas; — užrašymo jautrumas: 1–2 mV per visą skalę; — įpurkštos medžiagos kiekis: 0,5–1 μl TMSE tirpalo. Šios sąlygos gali būti keičiamos pagal kolonėlės ir dujų chromatografo savybes, kad būtų gautos chromatogramos, atitinkančios tokias sąlygas: — ß-sitosterolio smailės sulaikymo trukmė turėtų būti 20 ± 5 minutės; — kampesterolio smailės aukštis turėtų būti: alyvuogių aliejui (vidutinis kiekis 3 %) 20 ± 5 % visos skalės aukščio; sojos pupelių aliejui (vidutinis kiekis 20 %) 80 ± 10 % visos skalės aukščio; — visi esantys steroliai turi būti atskirti. Be to, smailės turi būti visiškai atsiskyrusios, t. y. smailės trajektorija turėtų sugrįžti iki pagrindo linijos, kol prasideda kilimas atsiradus naujai smailei. Tačiau nevisiškas atsiskyrimas leidžiamas, jei smailės su santykine sulaikymo trukme 1,02 plotas (sitostanolis) gali būti apskaičiuotas naudojant statmenį. 5.4.3. Analizė 5.4.3.1. 10 μl talpos mikrošvirkštu įsiurbiama 1 μl heksano, paskui įtraukiama 0,5 μl oro ir 0,5–1 μl mėginio tirpalo. Mikrošvirkšto plunžeris pakeliamas aukštyn, kad adata ištuštėtų. Adata įkišama per injektoriaus membraną ir po vienos dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas, paskui po kokių penkių sekundžių adata lėtai ištraukiama. Taip pat gali būti naudojamas automatinis injektorius. 5.4.3.2. Užrašymas atliekamas, kol bus visiškai išplauti esančių triterpeno dialkoholių TMSE. Pagrindo linija turi visą laiką atitikti reikalavimus (5.4.1.2 punktas). 5.4.4. Smailių identifikavimas Atskiros smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmes ir lyginant su sterolių ir triterpeno dialkoholių TMSE mišiniu, analizuojamu tokiomis pat sąlygomis (žr. priedėlį). Steroliai ir triterpeno dialkoholiai išplaunami tokia eilės tvarka: cholesterolis, brasikasterolis, ergosterolis, 24-metilencholesterolis, kampesterolis, kampestanolis, stigmasterolis, Δ7-kampesterolis, Δ5,23-stigmastadienolis, klerosterolis, ß-sitosterolis, sitostanolis, Δ5-avenasterolis, Δ5,24-stigmastadienolis, Δ7-stigmastenolis, Δ7-avenasterolis, eritrodiolis ir uvaolis. ß-sitosterolio sulaikymo trukmės SE-52 ir SE-54 kolonėlėse parodytos 1 lentelėje. 1 ir 2 brėžiniuose vaizduojamos tipiškos kai kurių aliejų chromatogramos. 5.4.5. Kiekybinis vertinimas 5.4.5.1. Naudojant skaičiavimo sistemą apskaičiuojami α-cholestanolio ir sterolių bei triterpeno dialkoholių smailių plotai. Į 1 lentelėje nenurodytų junginių smailes neatsižvelgiama (ergosterolio smailės plotas neturi būti skaičiuojamas). α-cholestanolio kalibravimo koeficientas turėtų būti laikomas lygiu 1. 5.4.5.2. Kiekvieno atskiro sterolio kiekis, skaičiuojant miligramais 1 kg riebalinės medžiagos, nustatomas pagal tokią formulę: čia: Ax = x sterolio smailės plotas kompiuterinėje sistemoje naudojamais vienetais; As = α-cholestanolio smailės plotas kompiuterinėje sistemoje naudojamais vienetais; ms = įdėto α-cholestanolio masė miligramais; m = nustatymui paimto mėginio masė gramais.

6. REZULTATŲ PATEIKIMAS

6.1. Užrašomos atskirų sterolių koncentracijos miligramais 1 kg riebalinės medžiagos ir jų bendro kiekio vertė.

Kiekvieno atskiro sterolio, eritrodiolio ir uvaolio kiekis turėtų būti nurodomas vienos dešimtosios tikslumu.

Bendras sterolių kiekis turi būti išreiškiamas nenurodant jokių ženklų po kablelio.

▼M28

6.2. Kiekvieno atskiro sterolio procentinė dalis apskaičiuojama pagal atitinkamo sterolio smailės ploto ir visų sterolių smailių plotų sumos santykį:

čia:

A x – x smailės plotas;

ΣA – visų sterolių smailių plotų suma.

▼M26

6.3. Tariamasis β-sitosterolis: Δ5-23-stigmastadienolis + klerosterolis + β-sitosterolis + sitostanolis + Δ5-avenasterolis + Δ5-24-stigmastadienolis.

6.4. Eritrodiolio ir uvaolio procentinė dalis apskaičiuojama taip:

čia:

ΣA = bendras sterolių plotas kompiuterinėje sistemoje naudojamais vienetais;

Er = eritrodiolio plotas kompiuterinėje sistemoje naudojamais vienetais;

Uv = uvaolio plotas kompiuterinėje sistemoje naudojamais vienetais.









Priedėlis

Dujų linijinio greičio nustatymas

Į normalioms darbo sąlygoms sureguliuotą dujų chromatografą įpurškiama 1–3 μl metano (arba propano) ir matuojamas laikas, kurį dujos tekės per kolonėlę nuo įpurškimo momento iki smailės išplovimo momento (tM).

Linijinis greitis (cm/s) apskaičiuojamas pagal formulę L/tM; čia L yra kolonėlės ilgis centimetrais, o tM – sekundėmis išmatuotas laikas.







1 lentelė Santykinė sterolių sulaikymo trukmė Smailė Pavadinimas Santykinė sulaikymo trukmė SE 54 kolonėlė SE 52 kolonėlė 1. Cholesterolis Δ-5-cholesten-3ß-olis 0,67 0,63 2. Cholestanolis 5α-cholestan-3ß-olis 0,68 0,64 3. Brasikasterolis [24S]-24-metil-Δ-5,22-cholestadien-3ß-olis 0,73 0,71 * Ergosterolis [24S] 24-metil-Δ5-7-22-cholestatrien-3β-olis 0,78 0,76 4. 24-metilencholesterolis 24-metilen-Δ-5,24-cholestadien-3ß-olis 0,82 0,80 5. Kampesterolis (24R)-24-metil-Δ-5-cholesten-3ß-olis 0,83 0,81 6. Kampestanolis (24R)-24-metilcholestan-3ß-olis 0,85 0,82 7. Stigmasterolis (24S)-24-etil-Δ-5,22-cholestadien-3ß-olis 0,88 0,87 8. Δ-7-kampesterolis (24R)-24-metil-Δ-7-cholesten-3ß-olis 0,93 0,92 9. Δ-5,23-stigmastadienolis (24R,S)-24-etil-Δ-5,23-cholestadien-3ß-olis 0,95 0,95 10. Klerosterolis (24S)-24-etil-Δ-5,25-cholestadien-3ß-olis 0,96 0,96 11. ß-sitosterolis (24R)-24-etil-Δ-5-cholesten-3ß-olis 1,00 1,00 12. Sitostanolis 24-etilcholestan-3ß-olis 1,02 1,02 13. Δ-5-avenasterolis (24Z)-24-etiliden-Δ-cholesten-3ß-olis 1,03 1,03 14. Δ-5-24-stigmastadienolis (24R,S)-24-etil-Δ-5,24-cholestadien-3ß-olis 1,08 1,08 15. Δ-7-stigmastenolis (24R,S)-24-etil-Δ-7-cholesten-3ß-olis 1,12 1,12 16. Δ-7-avenasterolis (24Z)-24-etiliden-Δ-7-cholesten-3ß-olis 1,16 1,16 17. Eritrodiolis 5-α-olean-12-en-3β-28-diolis 1,41 1,41 18. Uvaolis Δ-12-ursen-3β-28-diolis 1,52 1,52

1 brėžinys

Pirmojo spaudimo klasikinio alyvuogių aliejaus lampante (sodrinto vidiniu etalonu) sterolių ir triterpeno dialkoholių frakcijos dujų chromatograma

2 brėžinys

Rafinuoto alyvuogių aliejaus (sodrinto vidiniu etalonu) sterolių ir triterpeno dialkoholių frakcijos dujų chromatograma

3 brėžinys

Alyvuogių išspaudų aliejaus plonasluoksnės chromatografijos plokštelė su plotu, kuris turi būti nugrandytas steroliams ir triterpeno dialkoholiams nustatyti

1 – skvalenas

2 – triterpeno ir alifatiniai alkoholiai

3 – steroliai ir triterpeno dialkoholiai

4 – pradžia ir laisvosios riebalų rūgštys

▼M26 —————

▼M21









VII PRIEDAS

2-GLICERIL MONOPALMITATO PROCENTINIO KIEKIO NUSTATYMAS

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Aprašyti analitinę procedūrą 2-oje triglicerido padėtyje esančios palmitino rūgšties procentinei daliai apskaičiuoti, nustatant 2-glicerilo monopalmitato kiekį.

Šis metodas taikomas aplinkos temperatūros (20 °C) skystiems augaliniams aliejams.

2. METODO ESMĖ

Paruoštas aliejaus mėginys veikiamas kasos lipaze: dėl dalinės ir specifinės 1 bei 3 padėties triglicerido molekulės hidrolizės monogliceridai atsiranda 2-oje padėtyje. Procentinis 2-glicerilo monopalmitato kiekis monoglicerido frakcijoje nustatomas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu, prieš tai atlikus sililinimą.

3. ĮRANGA IR MEDŽIAGOS

3.1. 25 ml Erlenmejerio kolba

3.2. 100, 250 ir 300 ml cheminės stiklinės

3.3. Stiklinė chromatografijos kolonėlė su deginto stiklo disku ir čiaupu, kurios vidinis skersmuo 21–23 mm, ilgis 400 mm.

3.4. 10, 50, 100 ir 200 ml matavimo cilindrai

3.5. 100 ir 250 ml kolbos

3.6. Sukamasis garintuvas

3.7. 10 ml centrifugavimo mėgintuvėliai su kūginės formos dugnu, uždaromi matinio stiklo kamščiu

3.8. Centrifuga 10 ir 100 ml mėgintuvėliams

3.9. Termostatas, kuriame galima palaikyti 40 + 0,5 °C temperatūrą

3.10. 1 ir 2 ml graduotos pipetės

3.11. 1 ml poodinis švirkštas

3.12. 100 μl mikrošvirkštas

3.13. 1 000 ml talpos piltuvas

3.14. Kapiliarinis dujų chromatografas su šalto tiesioginio įpurškimo įtaisu mėginiui tiesiogiai į kolonėlę patalpinti, ir krosnis, kurioje norimą temperatūrą galima palaikyti apytiksliai 1 °C tikslumu

3.15. Šalto tiesioginio įpurškimo įtaisas mėginiui tiesiogiai į kolonėlę patalpinti

3.16. Liepsnos jonizacinis detektorius ir elektrometras

3.17. Kintamo popieriaus tiekimo greičio savirašis integratorius, dirbantis su elektrometru, kurio atsako sparta ne didesnė kaip viena sekundė

3.18. 8–12 m ilgio ir 0,25–0,32 mm vidinio skersmens stiklinė arba kvarcinio stiklo kapiliarinė kolonėlė, padengta 0,10–0,30 μm storio metilpolisiloksano arba 5 % fenil metilpolisiloksano plėvele. Kolonėlė gali būti naudojama 370 °C temperatūroje.

3.19. 10 μl mikrošvirkštas su ne trumpesne kaip 7,5 cm kietinta adata, pritaikytas mėginiui tiesiogiai įšvirkšti į kolonėlę.

4. REAGENTAI

4.1. Silikagelis, kurio granulių dydis 0,063–0,200 mm (70/280 mešų), paruoštas taip: silikagelis dedamas į porcelianinį indą, 4 valandas džiovinamas 160 °C džiovinimo spintoje, po to eksikatoriuje vėsinamas iki kambario temperatūros. Įpilama 5 % (silikagelio masės) vandens: Erlenmejerio kolboje pasveriama 152 g silikagelio ir įpilama 8 g distiliuoto vandens, kolba užkemšama ir atsargiai pakratoma, kad vanduo tolygiai pasiskirstytų. Prieš naudojant paliekama nusistovėti ne mažiau kaip 12 valandų.

4.2. n-heksanas, tinkamas chromatografijai

4.3. Izopropanolis

4.4. Izopropanolis, 1/1 vandeninis tirpalas (v/v)

4.5. Kasos lipazė. Naudojamos lipazės aktyvumas turi būti nuo 2,0 iki 10 lipazės vienetų/mg (Rinkoje prekiaujama kasos lipaze, kurios aktyvumas nuo 2 iki 10 vienetų 1 mg fermento).

4.6. Buferinis tri(hidroksimetil)aminometano tirpalas: 1 M vandeninis tirpalas parūgštinamas iki pH 8 (potenciometrinis patikrinimas) koncentruotu HCl (1:1 v/v)

4.7. Natrio choliato (fermentų kokybės) 0,1 % vandeninis tirpalas (šis tirpalas turi būti sunaudotas per 15 dienų nuo jo paruošimo)

4.8. Kalcio chlorido 22 % vandeninis tirpalas

4.9. Dietileteris, tinkamas chromatografijai

4.10. Judančioji fazė: n-heksano ir dietileterio (87/13) (v/v) mišinys

4.11. Natrio hidroksido 12 % (svorio procentais) tirpalas

4.12. Fenolftaleino 1 % tirpalas etanolyje

4.13. Nešančiosios dujos: helis arba vandenilis, tinkamas dujų chromatografijai

4.14. Pagalbinės dujos: ne mažesnio kaip 99 % grynumo vandenilis, išvalytas nuo drėgmės ir organinių medžiagų, ir tokio pat grynumo oras, tinkamas dujų chromatografijai.

4.15. Sililinizavimo reagentas: piridino, heksametildisilazano ir trimetilchlorsilano mišinys santykiu 9:3:1 (v/v/v). (Rinkoje prekiaujama naudoti paruoštais tirpalais. Gali būti naudojami kiti sililinimo reagentai, pvz., N,O-bi(trimetilsilil)trifluoracetamido + 1 % trimetilchlorsilano mišinys, praskiestas tuo pačiu sauso piridino tūriu).

4.16. Etaloniniai tirpalai: grynieji monogliceridai arba monogliceridų mišiniai, kurių procentinė sudėtis yra artima tiriamų mėginių sudėčiai.

5. DARBO EIGA

5.1. Mėginio paruošimas

5.1.1. Taikant silikagelio kolonėlinę chromatografiją aliejams, kuriuose laisvųjų rūgščių kiekis mažesnis kaip 3 %, jų neutralizuoti nereikia. Aliejai, kuriuose laisvųjų rūgščių kiekis didesnis kaip 3 %, turi būti neutralizuojami pagal 5.1.1.1. punktą. 5.1.1.1. Į 1 000 ml talpos piltuvą (3.13) įpilama 50 g aliejaus ir 200 ml n-heksano. Įpilama 100 ml izopropanolio ir 12 % natrio hidroksido tirpalo (4.11). Įpilamas natrio hidroksido tirpalo kiekis, atitinka aliejaus laisvųjų rūgščių kiekį, padidintą 5 %. Vieną minutę stipriai kratoma. Įpilama 100 ml distiliuoto vandens, vėl kratoma ir paliekama nusistovėti. Atlikus dekantavimą, apatinis muilo sluoksnis pašalinamas. Išleidžiamas tarpinis sluoksnis (gleivės, netirpios medžiagos). Neutralizuoto aliejaus tirpalas heksane plaunamas izopropanolio ir vandens tirpalo (1:1 (v/v)) (4.4) 50–60 ml porcijomis, kol pranyksta rožinė fenolftaleino spalva. Didesnioji heksano dalis pašalinama distiliuojant vakuume (pvz., naudojant sukamąjį garintuvą) ir aliejus perpilamas į 100 ml kolbą (3.5). Aliejus džiovinamas vakuume, kol tirpiklio visiškai nebelieka. Baigus šią procedūrą, aliejaus rūgštingumas turi būti ne didesnis kaip 0,5 %.

5.1.2. Į 25 ml talpos Erlenmejerio kolbą (3.1) įpilama 1,0 g aliejaus, paruošto anksčiau minėtu būdu, ir ištirpinama 10 ml judančiosios fazės (4.10) mišinio. Tirpalas, prieš atliekant silikagelio kolonėlinę chromatografiją, paliekamas nusistovėti ne trumpiau kaip 15 minučių. Jei tirpalas drumstas, jis centrifuguojamas, siekiant sudaryti optimalias sąlygas chromatografijai. (Gali būti naudojama 500 mg naudoti paruoštų SPE silikagelio kapsulių).

5.1.3. Chromatografinės kolonėlės paruošimas Į kolonėlę (3.3) įpilama apie 30 ml judančiosios fazės (4.10), stikline lazdele į kolonėlės apačią įkišamas ir paspaudžiamas gabalėlis vatos, kad išeitų oras. Cheminėje stiklinėje paruošiama 80 g judančiosios fazės ir 25 g silikagelio (4.1) suspensija ir naudojant piltuvą supilama į kolonėlę. Patikrinama, ar į kolonėlę supiltas visas silikagelio kiekis; išplaunama judančiąja faze (4.10), atsukamas čiaupas ir skystis turi pasiekti 2 mm lygį virš silikagelio.

5.1.4. Kolonėlinė chromatografija 25 ml talpos Erlenmejerio kolboje (3.1.) tiksliai pasveriama 1,0 g pagal 5.1 punktą paruošto mėginio. Mėginys ištirpinamas 10 ml judančiosios fazės (4.10). Tirpalas supilamas į chromatografinę kolonėlę, paruoštą pagal 5.1.3 punktą. Kolonėles paviršiaus stengiamasi nejudinti. Atsukamas čiaupas ir mėginio tirpalui leidžiama tekėti, kol jis pasiekia silikagelio lygį. Procesas tęsiamas, naudojant 150 ml judančiosios fazės. Nustatomas 2 ml/min tekėjimo greitis (taip, kad 150 ml iš kolonėlės ištekėtų per 60–70 min). Į iš anksto pasvertą 250 ml talpos kolbą surenkamas eliuatas. Tirpiklis išgarinamas vakuume ir jo likučiai pašalinami azoto srove. Kolba pasveriama ir apskaičiuojamas išgautas ekstrakto kiekis. Jei naudojamos naudoti paruoštos SPE silikagelio kapsulės, į iš anksto su 3 ml n-heksano paruoštas kapsules įpilama 1 ml tirpalo (5.1.2.). Tirpalas filtruojamas ir veikiamas 4 ml n-heksano ir dietileterio (9/1) (v/v) mišiniu. Eliuatas surenkamas į 10 ml talpos mėgintuvėlį ir išdžiovinamas azoto srovėje. Sausas likutis apdorojamas kasos lipaze (5.2). Prieš ir po SPE kapsulių naudojimo labai svarbu patikrinti riebiųjų rūgščių sudėtį.).

5.2. Hidrolizė kasos lipaze

5.2.1. Centrifugavimo mėgintuvėlyje pasveriama 0,1 g pagal 5.1. punktą paruošto aliejaus. Įpilama 2 ml buferinio tirpalo (4.6), 0,5 ml natrio choliato tirpalo ir 0,2 ml kalcio chlorido tirpalo (4.7), įpylus kiekvieną iš šių tirpalų, gerai išmaišoma. Mėgintuvėlis uždaromas matinio stiklo kamščiu ir dedamas į termostatą, kuriame palaikoma 40 ± 0,5 °C temperatūra.

5.2.2. Įdedama 20 mg lipazės, atsargiai pakratoma (taip, kad nesudrėktų kamštis) ir mėgintuvėlis įdedamas į termostatą lygiai 2 min, po to iš jo išimamas, stipriai kratomas lygiai 1 min ir paliekamas atvėsti.

5.2.3. Įpilama 1 ml dietileterio, užkemšama ir smarkiai kratoma, po to centrifuguojama ir eterio tirpalas mikrošvirkštu perpilamas į švarų ir sausą mėgintuvėlį.

5.3. Sililinizuotų darinių ir dujų chromatografijos paruošimas

5.3.1. Į 10 ml talpos mėgintuvėlį su kūginės formos dugnu mikrošvirkštu įšvirkščiama 100 μl tirpalo (5.2.3).

5.3.2. Tirpiklis pašalinamas nestipria azoto srove, įpilama 200 μl sililinizavimo reagento (4.15), mėgintuvėlis užkemšamas ir 20 minučių paliekamas nusistovėti.

5.3.3. Po 20 minučių, įpilama 1–5ml n-heksano (atsižvelgiant į chromatografines sąlygas): gautas tirpalas yra paruoštas dujų chromatografinei analizei.

5.4. Dujų chromatografija

Darbo sąlygos:

— inžektoriaus (tiesioginio įpurškimo įtaiso) temperatūra žemesnė nei tirpiklio virimo temperatūra (68 °C),

— detektoriaus temperatūra: 350 °C,

— kolonėlės temperatūra: krosnies temperatūros nustatymas: 60 °C 1 minutę, po to kas minutę didinama po 15 °C, kol pasiekiama 180 °C, po to kas minutę didinama po 5 °C, kol pasiekiama 340 °C, tuomet 340 °C temperatūra palaikoma 13 minučių,

— nešančiosios dujos: vandenilis arba helis, naudojami nustačius atitinkamą linijinį greitį, kad būtų pasiekta 1 paveiksle pavaizduota skiriamoji geba. Triglicerido C54 sulaikymo trukmė turi būti 40 ± 5 minutės (žr. 2 paveikslą). (Nurodytos sąlygos yra orientacinės. Operatoriai turi jas optimizuoti, kad būtų pasiekta pakankama skiriamoji geba. Glicerino monopalmitatą atitinkančios smailės minimalus aukštis turi būti ne mažesnis kaip 10 % savirašio skalės),

— įpurkštas medžiagos kiekis: 0,5–1 μl (5 ml) n-heptano tirpalo (5.3.3.).

5.4.1. Smailių identifikavimas

Monogliceridai identifikuojami pagal sulaikymo trukmes ir šias trukmes lyginant su standartinių monogliceridų mišinių sulaikymo trukmėmis, analizuojamomis tomis pačiomis sąlygomis.

5.4.2. Kiekybinis vertinimas

Kiekvienos smailės plotas apskaičiuojamas elektroniniu integratoriumi.

6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

Procentinis glicerilo monopalmitato kiekis apskaičiuojamas pagal atitinkamos smailės ploto santykį su visų monogliceridų smailių plotu (žr. 2 paveikslą), taikant tokią formulę:

glicerilo monopalmitatas (%):

kurioje:

Ax = Glicerino monopalmitatą atitinkančios smailės plotas

ΣA = visų monoglicerido smailių plotų suma.

Rezultatai pateikiami vieno ženklo po kablelio (dešimtųjų) tikslumu.

7. ANALIZĖS ATASKAITA

Analizės ataskaitoje pateikiama:

— nuoroda į šį metodą,

— išsami pilnam mėginio identifikavimui reikalinga informacija,

— analizės rezultatas,

— bet kokie nukrypimai nuo metodo, padaryti atitinkamoms šalims nusprendus ar dėl kitų priežasčių,

— laboratorijos identifikavimo duomenys, analizės atlikimo data ir už analizę atsakingo asmens parašas.

1 paveikslas

Sililinizavimo reakcijos produktų, gautų rafinuotą alyvuogių aliejų su 20 % esterifikuoto aliejaus (100 %) priedu, paveikus lipaze, chromatograma

Paaiškinimas: Acides gras libres – Laisvosios riebalų rūgštys; Huile d’olives raffinée + 20 % huile estérifiée – Rafinuotas alyvuogių aliejus + 20 % esterifikuoto aliejaus; 1–2 monopalmitoléine – 1–2 monopalmitoleinas; 1–2 monopalmitine – 1–2 monopalmitinas; 1–2 mono C18 insat. – 1–2 mono C18 neprisot; Squalene – Skvalenas.

2 paveikslas

Chromatograma:

A) neesterifikuotas alyvuogių aliejus po poveikimo lipaze; po sililinizavimo; tokiomis sąlygomis (8–12 m ilgio kapiliarinė kolonėlė) vaškų frakcija išplaunama tuo pačiu metu arba truputį vėliau nei digliceridų frakcija. Paveikus lipaze trigliceridų kiekis neturėtų viršyti 15 % Paaiškinimas: 1 = Laisvosios riebalų rūgštys 2 = Monogliceridai 3 = Digliceridai 4 = Trigliceridai * = 2-monopalmitinas ** = Trigliceridas C54

Chromatograma:

B) esterifikuotas aliejus po poveikio lipaze; po sililinizavimo; tokiomis sąlygomis (8–12 m ilgio kapiliarinė kolonėlė) vaškų frakcija išplaunama tuo pačiu metu arba truputį vėliau nei digliceridų frakcija. Paveikus lipaze trigliceridų kiekis neturėtų viršyti 15 % Paaiškinimas: 1 = Laisvosios riebalų rūgštys 2 = Monogliceridai 3 = Digliceridai 4 = Trigliceridai * = 2-monopalmitinas ** = Trigliceridas C54

8. PASTABOS

LIPAZĖS RUOŠIMAS

Rinkoje prekiaujama naudoti paruošta pakankamo aktyvumo lipaze. Lipazę taip pat galima paruošti laboratorijoje:

0 °C temperatūroje atšaldoma 5 kg šviežios kiaulių kasos. Pašalinami aplinkui esantys kieti riebalai bei apie juos esantis jungiamasis audinys, sumalama, kad susidarytų pastos pavidalo skysta masė. Ši pasta keturias-šešias valandas kratoma su 2,5 l absoliučiojo acetono ir centrifuguojama. Likutis dar tris kartus ekstrahuojamas tuo pačiu acetono tūriu, paskui du kartus 1:1 (v/v) acetono ir dietileterio mišiniu ir du kartus dietileteriu.

Likutis 48 valandas džiovinamas vakuume, tam kad gauti milteliai būtų patvarūs. Tokie milteliai, apsaugant juos nuo drėgmės, gali būti laikomi ilgą laiką šaldytuve.

LIPAZĖS AKTYVUMO TIKRINIMAS

Alyvuogių aliejaus emulsija ruošiama taip:

Maišytuve 10 minučių plakamas mišinys, sudarytas iš 165 ml gumiarabiko tirpalo (100 g/l), 15 g smulkinto ledo ir 20 ml neutralizuoto alyvuogių aliejaus.

Į 50 ml talpos cheminę stiklinę įpilama 10 ml šios emulsijos, po to 0,3 ml natrio choliato tirpalo (0,2 g/ml) ir 20 ml distiliuoto vandens.

Cheminė stiklinė dedama į termostatą, kuriame palaikoma 37 °C temperatūra; įstatomi pH matuoklio elektrodai ir sraigtinis maišiklis.

Biurete lašinamas natrio hidroksido tirpalas, kol pH pasiekia 8,3.

Į vandenį įpilama lipazės miltelių suspensijos (0,1 g/ml lipazės). Kai tik pH matuoklis parodo 8,3, paleidžiamas chronometras ir natrio hidroksido tirpalas lašinamas tokiu greičiu, kad pH visą laiką būtų 8,3. Kas minutę pasižymimas sunaudoto tirpalo tūris.

Matavimai pavaizduojami x/y koordinačių sistemoje, abscisėje nurodant laiką, o ordinatėje – sunaudoto 0,1 N natrio hidroksido tūrį (mililitrais), kuris sunaudotas pastoviam pH išlaikyti. Turi būti gaunamas linijinis grafikas.

Lipazės aktyvumas, matuojamas lipazės vienetais/mg, apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

A aktyvumas, išreikštas lipazės vienetais/mg

V 0,1 N natrio hidroksido tirpalo mililitrų skaičius per minutę (apskaičiuotas pagal grafiką)

N natrio hidroksido tirpalo molinė ekvivalentų koncentracija

m analizuojamos lipazės mėginio masė, mg.

Lipazės vienetas yra apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris išskiria 10 mikroekvivalentų rūgšties per minutę.

▼M20 —————

▼M28









IX PRIEDAS

SPEKTROFOTOMETRINIS TYRIMAS ULTRAVIOLETINĖJE SPEKTRO DALYJE

ĮŽANGA

Spektrofotometrinis tyrimas ultravioletinėje spektro dalyje gali suteikti informacijos apie riebalų kokybę, jų išsilaikymo būklę ir technologinių procesų metu įvykusius pasikeitimus. Absorbcija metode nurodytų bangų ilgių srityje vyksta dėl konjuguotų dienų ir trienų sistemų, atsiradusių vykstant oksidacijos procesams ir (arba) dėl taikomų rafinavimo metodų. Ši absorbcija išreiškiama kaip savitoji ekstinkcija

(riebalų 1 % masės tirpalo tam tikrame tirpiklyje ekstinkcija 10 mm storio kiuvetėje), pagal susitarimą žymima K raide (taip pat vadinama „ekstinkcijos koeficientu“).

1. TAIKYMO SRITIS

Šiame priede aprašyta riebalų spektrofotometrinio tyrimo ultravioletinėje spektro dalyje procedūra.

2. METODO ESMĖ

Ėminys ištirpinamas reikiamame tirpiklyje ir šio tirpalo optinis tankis matuojamas gryno tirpiklio atžvilgiu, esant nustatytam bangos ilgiui.

Apskaičiuojama 1 % (m/V) tirpalo izooktane, esant 232 nm ir 268 nm bangos ilgiui, arba tirpalo cikloheksane, esant 232 nm ir 270 nm bangos ilgiui, savitoji ekstinkcija, kai naudojama 10 mm kiuvetė.

3. ĮRANGA

3.1. Spektrofotometras, tinkamas matuoti ultravioletinėje spektro dalyje (nuo 220 nm iki 360 nm), kurio rodmenis galima nuskaityti vieno nanometro tikslumu. Rekomenduojama reguliariai tikrinti optinio tankio ir bangų ilgio skalių tikslumą ir atkuriamumą, taip pat išsklaidytosios šviesos buvimą. 3.1.1. Bangų ilgio skalė. Ją galima patikrinti naudojant etaloninę medžiagą, kurią sudaro holmio oksido turinčio optinio stiklo filtras arba holmio oksido tirpalas (sandariai uždarytas arba neuždarytas), turintis ryškias absorbcijos juostas. Etaloninės medžiagos skirtos matomos ir ultravioletinės spektro dalies spektrofotometrų, kurių nominalusis spektrinis juostos plotis yra 5 nm arba mažesnis, bangos ilgio skalėms tikrinti ir kalibruoti. Matuojama oro atžvilgiu nuo 640 iki 240 nm bangų ilgio intervale pagal instrukcijas, pridedamas prie etaloninių medžiagų. Kiekvieną kartą keičiant plyšio plotį, atliekama atskaitos linijos korekcija, esant tuščiam pluošto keliui. Etalono bangų ilgiai nurodyti etaloninės medžiagos sertifikate. 3.1.2. Optinio tankio skalė. Ją galima patikrinti, naudojant prekyboje esančias etalonines medžiagas, kurias sudaro tam tikros koncentracijos parūgštinti kalio dichromato tirpalai, turintys jų λmax atitinkantį sertifikuotą optinį tankį (4 kalio dichromato tirpalai perchlorato rūgštyje, sandariai uždaryti keturiose UV kvarcinio stiklio kiuvetėse, skirtose tiesiškumui ir optinio tankio atskaitos taškui matuoti UV spektro dalyje). Kalio dichromato tirpalai matuojami naudojamos rūgšties tirpalo atžvilgiu po atskaitos linijos korekcijos pagal instrukcijas, pridedamas prie etaloninės medžiagos. Optinio tankio vertės nurodytos etaloninės medžiagos sertifikate. Fotoelemento atsaką ir fotodaugintuvą galima patikrinti kitu būdu, darant taip: į 1 000 ml matavimo kolbą pasveriama 0,2000 g spektrofotometriškai gryno kalio chromato, ištirpinama 0,05 mol/l kalio hidroksido tirpale ir skiedžiama iki žymės. Paimama lygiai 25 ml gauto tirpalo ir tuo pačiu kalio hidroksido tirpalu 500 ml talpos matavimo kolboje skiedžiama iki žymės. Matuojama tokiu būdu gauto tirpalo ekstinkcija, esant bangos ilgiui 275 nm, o palyginamuoju tirpalu naudojant kalio hidroksido tirpalą. 1 cm storio kiuvetėje išmatuota ekstinkcijos vertė turi būti 0,200 ± 0,005.

3.2. Stačiakampės kvarcinės kiuvetės su dangčiais, kurios tinka matuoti ultravioletinės spektro dalies bangų ilgių intervale (nuo 220 iki 360 nm) ir kurių optinio kelio ilgis – 10 mm. Vandens arba kito tinkamo tirpiklio pripildytų kiuvečių ekstinkcijos vertė neturėtų skirtis daugiau kaip 0,01 ekstinkcijos vieneto.

3.3. Vienos žymės 25 ml matavimo kolbos, A klasės.

3.4. Analizinės svarstyklės, kuriomis galima pasverti 0,0001 g tikslumu.

4. REAGENTAI

Jei nenurodyta kitaip, naudojami tik analiziškai gryni reagentai ir distiliuotas, demineralizuotas arba lygiaverčio grynumo vanduo.

Tirpiklis: izooktanas (2,2,4-trimetilpentanas) matavimams esant 232 nm ir 268 nm bangos ilgiui arba cikloheksanas matavimams esant 232 nm ir 270 nm bangos ilgiui, kurio optinis tankis esant 232 nm bangos ilgiui yra mažesnis nei 0,12, o esant 270 nm bangos ilgiui mažesnis nei 0,05, palyginamuoju tirpalu naudojant distiliuotą vandenį ir matuojant 10 mm kiuvetėje.

5. PROCEDŪRA

5.1. Ėminys turi būti visiškai vienalytis ir be suspenduotų priemaišų. Jei jų yra, tirpalą būtina filtruoti per filtravimo popierių maždaug 30 °C temperatūroje.

5.2. Apie 0,25 g taip paruošto ėminio tiksliai pasveriama (1 mg tikslumu) į 25 ml matavimo kolbą, skiedžiama nurodytu tirpikliu iki žymės ir sumaišoma. Gautas tirpalas turi būti visiškai skaidrus. Jei yra opalescencija arba drumstumas, greitai filtruojama per filtravimo popierių. PASTABA. Optiniam tankiui matuoti, esant 268 nm ir 270 nm, paprastai pakanka 0,25–0,30 g aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo ir pirmojo spaudimo aliejaus. Kai matuojama esant 232 nm bangos ilgiui, paprastai reikia turėti 0,05 g ėminio, todėl dažniausiai ruošiami du skirtingi tirpalai. Matuojant alyvuogių išspaudų aliejų, rafinuotų alyvuogių aliejų ir falsifikuotų alyvuogių aliejų optinį tankį, ėminio masė dėl didesnio optinio tankio paprastai gali būti mažesnė, pvz., 0,1 g.

5.3. Prireikus atliekama atskaitos linijos (220–290 nm) korekcija, į abi kvarcines kiuvetes (ėminio ir lyginamojo tirpalo) įpilant tirpiklio, vėliau į ėminio kiuvetę įpilama bandomojo tirpalo ir naudojamo tirpiklio atžvilgiu matuojami ekstinkcijos koeficientai, esant 232, 268 ar 270 nm. Gautos ekstinkcijos vertės turi būti 0,1–0,8 intervale arba spektrofotometro tiesiškumo intervale, kuris turėtų būti patikrintas. Jei taip nėra, matavimai turi būti pakartoti, atitinkamai naudojant labiau praskiestus arba labiau koncentruotus tirpalus.

5.4. Išmatavus optinį tankį, esant 268 ar 270 nm, matuojamas optinis tankis, esant λ max, λmax + 4 ir λmax – 4. Šios optinio tankio vertės naudojamos savitosios ekstinkcijos pokyčiui (ΔΚ) nustatyti. PASTABA. Laikoma, kad izooktano kaip tirpiklio λmax yra 268 nm, o cikloheksano – 270 nm.

6. REZULTATŲ IŠRAIŠKA

6.1. Užrašomos savitosios ekstinkcijos (ekstinkcijos koeficientų) vertės, kurios įvairiems bangų ilgiams apskaičiuojamos pagal formulę: čia: K λ – savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui λ; E λ – ekstinkcija, išmatuota esant bangos ilgiui λ; c – tirpalo koncentracija g/100 ml; s – kvarcinės kiuvetės optinio kelio ilgis, cm; išreikšti šimtųjų tikslumu.

6.2. Savitosios ekstinkcijos pokytis (ΔΚ) Ekstinkcijos absoliučiosios vertės pokytis (ΔΚ) apskaičiuojamas pagal formulę: kurioje K m – savitoji ekstinkcija, esant maksimalios absorbcijos bangos ilgiui, kuris priklausomai nuo naudojamo tirpiklio yra 270 nm ar 268 nm. Rezultatai turėtų būti išreikšti šimtųjų tikslumu.









X PRIEDAS

RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ NUSTATYMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1. TAIKYMO SRITIS

Šiame priede pateikti nurodymai dėl augalinių riebalų ir aliejų laisvųjų ir sujungtųjų rūgščių nustatymo dujų chromatografijos metodu, jas prieš tai pavertus riebalų rūgščių metilesteriais (FAME).

Sujungtosios triacilglicerolių (TAG) riebalų rūgštys ir priklausomai nuo esterinimo metodo gautos laisvosios riebalų rūgštys (FFA) paverčiamos riebalų rūgščių meetilesteriais (FAME), kurie nustatomi kapiliarinės dujų chromatografijos metodu.

Šiame priede aprašytu metodu galima nustatyti FAME nuo C12 iki C24, įskaitant sočiųjų, cis- ir trans-mononesočiųjų bei cis- ir trans-polinesočiųjų riebalų rūgščių metilesterius.

2. METODO ESMĖ

Dujų chromatografija (GC) taikoma kiekybinei FAME analizei. FAME paruošiami pagal A dalį. Paskui jie įpurškiami ir išgarinami injektoriaus viduje. FAME atskiriami nustatyto poliškumo ir ilgio analizės kolonėlėse. FAME aptinkami liepsnos jonizaciniu detektoriumi (FID). Analizės sąlygos pateiktos B dalyje.

Atliekant FAME dujų chromatografiją su FID, kaip nešančiąsias dujas galima naudoti vandenilį arba helį (judančioji fazė). Vandenilis paspartina atskyrimą ir gaunamos aštresnės smailės. Nejudamoji fazė – mikroskopinis plonos skysčio plėvelės sluoksnis ant inertinio kieto lydyto kvarco paviršiaus.

Dujoms judant kapiliarine kolonėle, vyksta išgarintų analizuojamų junginių sąveika su nejudamąja faze, dengiančia vidinį kolonėlės paviršių. Dėl nevienodos skirtingų junginių sąveikos jie išplaunami skirtingu laiku, kuris vadinamas junginio sulaikymo trukme esant tam tikram analizės parametrų rinkiniui. Sulaikymo trukmės verčių palyginimas naudojamas skirtingiems junginiams identifikuoti.

A DALIS.

ALYVUOGIŲ ALIEJAUS IR ALYVUOGIŲ IŠSPAUDŲ ALIEJAUS RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ PARUOŠIMAS

1. APRĖPTIS

Šioje dalyje aprašytas riebalų rūgščių metilesterių paruošimas. Ją sudaro alyvuogių aliejų ir alyvuogių išspaudų aliejų riebalų rūgščių metilesterių paruošimo metodai.

2. TAIKYMO SRITIS

Alyvuogių aliejų ir alyvuogių išspaudų aliejų riebalų rūgščių metilesteriai ruošiami atliekant peresterinimą kalio hidroksido metanoliniu tirpalu kambario temperatūroje. Ėminio gryninimo prieš peresterinimą būtinybė priklauso nuo ėminio laisvųjų riebalų rūgščių kiekio bei nustatomo analizės parametro ir metodą galima pasirinkti pagal šią lentelę:







Aliejaus rūšis Metodas Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus, kurio rūgštingumas ≤ 2,0 % 1. Riebalų rūgštys 2. Riebalų rūgščių trans-izomerai 3. ΔECN42 (išgryninus silikageliu ekstrakcijos kietąja faze (SPE) metodu) Rafinuotas alyvuogių aliejus Alyvuogių aliejus, sudarytas iš rafinuoto alyvuogių aliejaus ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejų: Rafinuotas alyvuogių išspaudų aliejus Alyvuogių išspaudų aliejus Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus, kurio rūgštingumas > 2,0 % Neapdorotas alyvuogių išspaudų aliejus 1. Riebalų rūgštys (išgryninus silikageliu SPE metodu) 2. Riebalų rūgščių trans-izomerai (išgryninus silikageliu SPE metodu) 3. ΔECN42 (išgryninus silikageliu SPE metodu)

3. METODIKA

3.1. Peresterinimas kalio hidroksido metanoliniu tirpalu kambario temperatūroje.

3.1.1. Principas

Metilesteriai susidaro atliekant peresterinimą metanoliniu kalio hidroksido tirpalu, kaip tarpinė stadija prieš įvykstant muilinimui.

3.1.2. Reagentai

3.1.2.1. Metanolis, turintis ne daugiau kaip 0,5 % (masės) vandens.

3.1.2.2. Heksanas, tinkamas chromatografijai.

3.1.2.3. Heptanas, tinkamas chromatografijai.

3.1.2.4. Dietileteris, stabilizuotas prieš analizę.

3.1.2.5. Acetonas, tinkamas chromatografijai.

3.1.2.6. Išplovimo tirpiklis aliejui gryninti kolonėlinės chromatografijos arba ekstrakcijos kietąja faze būdu: heksano ir dietileterio mišinys 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Kalio hidroksidas, maždaug 2 mol/l metanolinis tirpalas: 11,2 g kalio hidroksido ištirpinama 100 ml metanolio.

3.1.2.8. Silikagelio kasetės, 1 g (6 ml), ekstrakcijai kietąja faze atlikti.

3.1.3. Aparatūra

3.1.3.1. Mėgintuvėliai su užsukamais dangteliais (5 ml tūrio), dangtelis su PTFE jungtimi.

3.1.3.2. Graduotos arba automatinės pipetės, 2 ml ir 0,2 ml.

3.1.4. Aliejaus ėminių gryninimas

Jei būtina, ėminiai gryninami aliejų leidžiant per ekstrakcijos kietąja faze silikagelio kasetę. Silikagelio kasetė (3.1.2.8) dedama į išplovimo vakuume aparatą ir plaunama 6 ml heksano (3.1.2.2); plaunama ne vakuume. Paskui aliejaus (maždaug 0,12 g) tirpalas, esantis 0,5 ml heksano (3.1.2.2) supilamas į kolonėlę. Tirpalas leidžiamas žemyn ir išplaunamas 10 ml heksano ir dietileterio (87:13 v/v) mišiniu (3.1.2.6). Sujungti eliuatai sumaišomi ir padalijami į du maždaug vienodus tūrius. Alikvotinė dalis išgarinama sukamajame garintuve iki sauso likučio, esant sumažintam slėgiui ir kambario temperatūroje. Likutis ištirpinamas 1 ml heptano ir gautą tirpalą galima naudoti riebalų rūgščių analizei GC metodu. Antroji alikvotinė dalis išgarinama, o likutis ištirpinamas 1 ml acetono, kad prireikus būtų galima atlikti trigliceridų analizę HPLC metodu.

3.1.5. Procedūra

Į 5 ml mėgintuvėlį su užsukamu dangteliu (3.1.3.1) pasveriama maždaug 0,1 g aliejaus ėminio. Įpilama 2 ml heptano (3.1.2.2) ir supurtoma. Įpilama 0,2 ml metanolinio kalio hidroksido tirpalo (3.1.2.7), uždedamas dangtelis su PTFE jungtimi, dangtelis užsukamas ir mėgintuvėlis stipriai purtomas 30 sekundžių. Paliekama išsisluoksniuoti tol, kol viršutinis tirpalo sluoksnis tampa skaidrus. Viršutinis sluoksnis su metilesteriais dekantuojamas. Tirpalas heptane yra paruoštas įpurkšti į dujų chromatografą. Patartina tirpalą laikyti šaldytuve iki bus atliekama jo dujų chromatografinė analizė. Nerekomenduojama tirpalo laikyti ilgiau kaip 12 h.

B DALIS.

RIEBALŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ ANALIZĖ DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1. TAIKYMO SRITIS

Šioje dalyje aprašyti bendri nurodymai, kaip taikyti kapiliarinę dujų chromatografiją, nustatant pagal A dalyje nurodytą metodą gauto riebalų rūgščių metilesterių mišinio kokybinę ir kiekybinę sudėtį.

Ši dalis netaikoma polimerizuotoms riebalų rūgštims.

2. REAGENTAI

2.1. Nešančiosios dujos

Inertinės dujos (vandenilis ar helis), visiškai išdžiovintos, turinčios mažiau kaip 10 mg/kg deguonies.

1 pastaba. Vandenilis gali dvigubai pagreitinti analizę, bet yra pavojingas. Galima įsigyti saugių įtaisų.

2.2. Pagalbinės dujos

2.2.1. Vandenilis (grynumas ≥ 99,9 %), neturintis organinių priemaišų.

2.2.2. Oras arba deguonis, neturintys organinių priemaišų.

2.2.3. Azotas (grynumas > 99 %).

2.3. Pamatinis etalonas

Grynų riebalų rūgščių metilesterių arba žinomos sudėties riebalų, geriausiai tokių, kurie yra panašūs į analizuojamą riebalinę medžiagą, metilesterių mišinys. Nesočiųjų rūgščių trans-izomerams identifikuoti tinka oktadeceno, oktadekadieno ir oktadekatrieno rūgščių metilesterių cis- ir trans-izomerai.

Reikėtų imtis atsargumo priemonių, kad būtų išvengta polinesočiųjų riebalų rūgščių oksidacijos.

3. APARATŪRA

Pateikiamos instrukcijos tinka įprastai dujų chromatografijos įrangai, kai naudojamos kapiliarinės kolonėlės ir dujų jonizacinis detektorius.

3.1. Dujų chromatografas

Dujų chromatografą sudaro šie elementai:

3.1.1. Įpurškimo sistema

Naudojama įpurškimo sistema su kapiliarinėmis kolonėlėmis, ir šiuo atveju ji turėtų būti specialiai suprojektuota darbui su tokiomis kolonėlėmis. Tai gali būti dalijamo ar nedalijamo srauto tiesioginio įpurškimo į kolonėlę injektorius.

3.1.2. Krosnis

Krosnis turi įkaitinti kapiliarinę kolonėlę bent iki 260°C ir pasirinktą temperatūrą palaikyti 0,1°C tikslumu. Pastarasis reikalavimas yra ypač svarbus, kai naudojamas lydyto kvarco vamzdelis.

Visais atvejais rekomenduojamas programuojamos temperatūros kaitinimo režimas, ypač kai analizuojamos riebalų rūgštys, turinčios mažiau kaip 16 anglies atomų.

3.1.3. Kapiliarinė kolonėlė

3.1.3.1. Vamzdelis pagamintas iš medžiagos, inertiškos analizuojamoms medžiagoms (paprastai stiklinis arba lydyto kvarco). Vidinis skersmuo turi būti nuo 0,20 iki 0,32 mm. Prieš padengiant nejudamąja faze, vidinį paviršių reikia tinkamai apdoroti (pvz., paruošti paviršių ir padaryti jį inertišku). Riebalų rūgštims ir jų cis- bei trans-izomerams pakanka 60 m ilgio.

3.1.3.2. Kaip kolonėlių nejudamoji fazė tinka tinklinės struktūros polinis polisiloksanas (cianpropilpolisiloksanas). 2 pastaba. Yra rizika, kad naudojant polinius polisiloksanus gali būti sunkiau identifikuoti ir atskirti linoleno rūgštį bei C20 rūgštis. Dangos turi būti plonos, t. y. nuo 0,1 iki 0,2 μm.

3.1.3.3. Kolonėlės surinkimas ir kondicionavimas Surenkant kapiliarines kolonėles, laikomasi įprastų atsargumo priemonių, t. y. kolonėlės įstatymas į krosnį (tvirtinimas), jungčių pasirinkimas ir sujungimas (sandarumas), kolonėlės galų jungimas su injektoriumi ir detektoriumi (neveikos tūrių sumažinimas). Į kolonėlę tiekiamos nešančiosios dujos (pvz., 0,3 bar (30 kPa) slėgio, kai naudojama 25 m ilgio ir 0,3 mm vidinio skersmens kolonėlė). Kolonėlė kondicionuojama, programuojant krosnies temperatūros kitimą 3 °C/min sparta nuo kambario temperatūros iki 10 °C mažesnės už nejudamosios fazės skilimo temperatūrą. Krosnis šioje temperatūroje laikoma vieną valandą, kol nusistovi atskaitos linija. Temperatūra darbui izoterminėmis sąlygomis sumažinama iki 180°C. 3 pastaba. Tinkamai iš anksto kondicionuotų kolonėlių galima nusipirkti.

3.1.4. Liepsnos jonizacinis detektorius ir konverteris-stiprintuvas

3.2. Švirkštas

Didžiausia švirkšto talpa turi būti 10 μl, sugraduotas 0,1 μl padalomis.

3.3. Duomenų rinkimo sistema

Duomenų rinkimo sistema tiesiogiai sujungiama su detektoriais ir yra naudojama su programine įranga, kuri galėtų integruoti ir normalizuoti smailes.

4. PROCEDŪRA

Nuo 4.1 iki 4.3 skirsniuose aprašyti veiksmai tinka naudojant liepsnos jonizacinį detektorių.

4.1. Bandymo sąlygos

4.1.1. Kapiliarinių kolonėlių optimalių veikimo sąlygų parinkimas

Dėl kapiliarinių kolonėlių efektyvumo ir pralaidumo komponentų atskyrimas ir analizės trukmė labai priklauso nuo nešančiųjų dujų srauto kolonėlėje. Todėl būtina optimizuoti veikimo sąlygas, reguliuojant šį parametrą (arba tiesiog kolonėlės slėgio sumažėjimą), priklausomai nuo to, ar siekiama pagerinti atskyrimą ar paspartinti analizę.

Paaiškėjo, kad FAME (nuo C4 iki C26) atskirti tinka tokios sąlygos. Chromatogramų pavyzdžiai pateikti B priedėlyje:







injektoriaus temperatūra: 250 °C detektoriaus temperatūra: 250 °C krosnies temperatūra: nuo 165 °C (8 min) iki 210 °C 2 °C/min sparta nešančiosios dujos: vandenilis, dujų tiekimo į kolonėlę slėgis: 179 kPa suminis srautas: 154,0 ml/min; padalijimo santykis: 1:100 įpurškiamas tūris: 1 μl

4.1.2. Skyros nustatymas (žr. A priedėlį)

Dviejų gretimų smailių I ir II skyra R apskaičiuojama pagal formulę:

R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) or R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (JAV farmakopėja),

arba

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japonijos farmakopėja), EP (Europos farmakopėja), (BP (Britų farmakopėja)),

čia:

d r(I) – I smailės sulaikymo atstumas;

d r(II) – II smailės sulaikymo atstumas;

t r(I) – I smailės sulaikymo trukmė;

t r(II) – II smailės sulaikymo trukmė;

ω(I) – I smailės pagrindo plotis;

ω(II) – II smailės pagrindo plotis;

ω0,5 – tam tikro junginio smailės pusaukščio plotis;

If ω(I) ≈ ω(II), R skaičiuojama pagal šias formules:

R = (d r(II) – d r(I))/ω = (d r(II) – d r(I))/4σ

čia:

σ – standartinis nuokrypis (žr. A priedėlio 1 paveikslą).

Jei atstumas d r tarp dviejų smailių d r(II) – d r(I) lygus 4σ, skyros faktorius R = 1.

Jei dvi smailės atsiskiria nevisiškai, dviejų smailių perlinkio taškų liestinės susikerta C taške. Kad dvi smailės visiškai atsiskirtų, atstumas tarp jų turi būti lygus:

d r(II) – d r(I) = 6 σ, todėl R = 1,5 (žr. A priedėlio 3 paveikslą).

5. REZULTATŲ IŠRAIŠKA

5.1. Kokybinė analizė

Pagal B priedėlio 1 paveikslo chromatogramą identifikuojamos ėminio metilesterių smailės, prireikus atliekant interpoliaciją arba lygindami su metiesterių etaloninių mišinių smeilėmis (kaip nurodyta 2.3 punkte).