1991R2568 — LT — 01.10.2008 — 022.001

Šis dokumentas yra skirtas tik informacijai, ir institucijos nėra teisiškai atsakingos už jo turinį

iš dalies keičiamas:







(*) Šis aktas nebuvo skelbtas lietuvių kalba.









▼B

KOMISIJOS REGLAMENTAS (EEB) Nr. 2568/91

1991 m. liepos 11 d.

dėl maišyto alyvuogių aliejaus ir maišyto alyvuogių išspaudų aliejaus savybių ir dėl atitinkamų analizės metodų







EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA, atsižvelgdama į Europos ekonominės bendrijos steigimo sutartį, atsižvelgdama į 1966 m. rugsėjo 22 d. Tarybos reglamentą (EEB) Nr. 136/66/EEB dėl bendro aliejų ir riebalų rinkos organizavimo ( 1 ) su paskutiniais pakeitimais, padarytais Reglamentu (EEB) Nr. 3577/90 ( 2 ), ypač į jo 35a straipsnį, kadangi Reglamento Nr. 136/66/EEB priede pateikiami alyvuogių aliejaus ir alyvuogių išspaudų aliejaus, parduodamo kiekvienoje valstybėje narėje, Bendrijos vidaus rinkoje ir prekyboje su trečiomis šalimis, aprašymai ir apibrėžimai; kadangi siekiant diferencijuoti aliejus pagal įvairias rūšis, turi būti apibrėžtos kiekvienos jų fizikinės ir cheminės savybės bei organoleptinės pirmo spaudimo aliejaus savybės, kad būtų garantuotas nagrinėjamo produkto grynumas ir kokybė, nepažeidžiant kitų esančių nuostatų; kadangi skirtingų rūšių aliejaus savybės turi būti nustatomos vienodai visoje Bendrijoje; kadangi tuo tikslu turi būti sukurti Bendrijos cheminės analizės ir organoleptinio vertinimo metodai; kadangi pereinamajam laikotarpiui turi būti leista naudoti kitus metodus, taikomus valstybėse narėse, su sąlyga, kad gavus skirtingus rezultatus lems rezultatai, gauti taikant bendrą metodą; kadangi alyvuogių aliejaus fizikinių ir cheminių savybių ir analizės metodų apibrėžimas reikalauja iš dalies pakeisti Kombinuotosios nomenklatūros 15 skyriaus papildomas pastabas; kadangi pirmo spaudimo aliejaus organoleptinių savybių vertinimo metodas numato parinktų ir paruoštų degustatorių grupių sudarymą; kadangi dėl to turi būti nustatyta tokios struktūros sukūrimo trukmė; kadangi atsižvelgiant į sunkumus, su kuriais susidurs kai kurios valstybės narės sudarydamos degustatorių grupes, turi būti leista grupes naudoti kitose valstybėse narėse; kadangi, siekiant užtikrinti alyvuogių išspaudų importui taikomos rinkliavų sistemos teisingą funkcionavimą, turi būti patvirtintas vienas metodas aliejaus kiekiui šiuose produktuose nustatyti; kadangi, siekiant nepakenkti prekybai, turi būti priimta nuostata dėl iki šio reglamento įsigaliojimo įpakuoto aliejaus realizavimo per ribotą laiką; kadangi būtina panaikinti Komisijos reglamentą (EEB) Nr. 1058/77 ( 3 ) su paskutiniais pakeitimais, padarytais Reglamentu (EEB) Nr. 1858/88 ( 4 ); kadangi Aliejaus ir riebalų vadybos komitetas nepateikė savo nuomonės per pirmininko nustatytą laiką, PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENTĄ:







▼M20

1 straipsnis

1. Aliejai, kurių charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 1, 2 punktuose nustatytas charakteristikas, laikomi pirmojo spaudimo alyvuogių aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 1 punkto a ir b papunkčiuose.

2. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 3 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas pirmojo spaudimo klasikiniu alyvuogių aliejumi lampante, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 1 punkto c papunktyje.

3. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 4 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas rafinuotu alyvuogių aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 2 punkte.

4. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 5 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas alyvuogių aliejumi, sudarytu iš rafinuotų ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejų, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 3 punkte.

5. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 6 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas neapdorotu alyvų išspaudų aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 4 punkte.

6. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 7 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas rafinuotu alyvų išspaudų aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 5 punkte.

7. Aliejus, kurio charakteristikos atitinka šio reglamento I priedo 8 punkte nustatytas charakteristikas, laikomas alyvų išspaudų aliejumi, kaip apibrėžta Reglamento (EEB) Nr. 136/66 priedo 6 punkte.

▼B

2 straipsnis

1. Aliejų savybės, nurodytos I priede, nustatomos taikant toliau pateiktus analizės metodus:

— laisvosioms riebiosioms rūgštims, skaičiuojant oleino rūgšties procentiniu kiekiu, nustatyti – II priede nurodytą metodą,

— peroksidų skaičiui nustatyti – III priede nurodytą metodą,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— sterolių kiekiui nustatyti – V priede nurodytą metodą,

— eritrodiolio ir uvaolio kiekiui nustatyti – VI priede nurodytą metodą,

▼M21

— procentiniam 2-glicerilo monopalmitato kiekiui nustatyti – VII priede nurodytą metodą,

▼M20 —————

▼B

— spektrofotometrinei analizei – IX priede nurodytą metodą,

— riebiųjų rūgščių sudėčiai nustatyti – X A ir X B prieduose nurodytą metodą,

— lakiųjų halogenintų tirpiklių kiekiui nustatyti – XI priede nurodytą metodą,

— organoleptinėms pirmo spaudimo alyvuogių aliejaus savybėms įvertinti – XII priede nurodytą metodą,

▼M20 —————

▼M11

— stigmastadienų kiekiui nustatyti – XVII priede nurodytą metodą,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Tikrinant 3 dalyje nustatyta tvarka, analizės, nurodytos II, III, IX, X ir XII prieduose, ir, jei daromos, bet kokios nacionaliniuose įstatymuose numatytos kontraanalizės atliekamos prieš pasibaigiant minimaliam bandinių galiojimo laikui. Jei bandiniai paimami daugiau nei prieš keturis mėnesius iki pasibaigiant minimaliam galiojimo laikui, jie turi būti analizuojami ne vėliau kaip ketvirtąjį mėnesį po bandinių paėmimo. Kitoms šiame reglamente numatytoms analizėms jokie laiko apribojimai netaikomi. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

2a straipsnis

Patikrinti, ar bandinys atitinka deklaruotą kategoriją, nacionalinės valdžios institucijos arba jų atstovai gali šiais būdais:

a) atlikdami bet kuria eilės tvarka I priede nurodytas analizes, arba

b) laikydamiesi Ib priedo schemoje sprendimams priimti nustatytos eilės tvarkos, kol gaunamas vienas šioje schemoje įrašytų atsakymų.

▼M19 —————

▼M5

►M19 3 ◄ straipsnis

Jei nustatoma, kad aliejaus organoleptinės savybės neatitinka jo aprašymo, suinteresuota valstybė narė, nespręsdama iš anksto apie bet kokias kitas bausmes, taiko administracines finansines baudas, atsižvelgdama į nustatyto pažeidimo sunkumą.

Įvertinant pažeidimą ypatingai turi būti kreipiamas dėmesys į savaime suprantamus įprastomis sąlygomis laikomo aliejaus savybių pakitimus.

Kiekvieno pusmečio pradžioje valstybės narės informuoja Komisiją apie nustatytų pažeidimų skaičių bei pobūdį ir apie per praėjusį pusmetį pritaikytas bausmes.

▼M5

4 straipsnis

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Jei valstybės narės jos teritorijoje kuriant degustatorių grupes susiduria su sunkumais, jos gali pasikviesti kitoje valstybėje narėje patvirtintą degustatorių grupę.

3. Kiekviena valstybė narį pateikia degustatorių grupių, sukurtų profesinių arba tarpšakinių organizacijų pagal šio straipsnio 1 dalyje nustatytas sąlygas, sąrašą ir užtikrina, kad tų sąlygų būtų laikomasi.

▼M19 —————

▼B

6 straipsnis

1. Aliejaus kiekis aliejaus išspaudose ir kitose alyvuogių aliejaus ekstrahavimo atliekose (KN kodai 2306 90 11 ir 2306 90 19) nustatomas, taikant XV priede nurodytą metodą.

2. Straipsnio 1 dalyje minimas aliejaus kiekis skaičiuojamas aliejaus masės procentais sausos medžiagos masei.

▼M20

7 straipsnis

Taikomos Bendrijos nuostatos dėl nepageidaujamų medžiagų.

Tirpikliams, kurių sudėtyje yra halogenų, visų kategorijų alyvuogių aliejams nustatytos šios ribinės vertės:

— maksimalus bet kurio aptikto tirpiklio, kurio sudėtyje yra halogenų, kiekis: 0,1 mg/kg,

— maksimalus bendras visų tirpiklių, kurių sudėtyje yra halogenų, kiekis: 0,2 mg/kg.

▼B

8 straipsnis

1. Valstybės narės praneša Komisijai apie priemones, kurių buvo imtasi reglamentui įgyvendinti.

2. Valstybės narės kiekvieno pusmečio pradžioje siunčia Komisijai per praėjusį pusmetį atliktų tikrinimų analizės duomenų oficialią suvestinę.

Rezultatus nagrinėja Aliejaus ir riebalų vadybos komitetas, laikydamasis Reglamento Nr. 136/66/EEB 39 straipsnyje nustatytos tvarkos.

9 straipsnis

Šiuo dokumentu Reglamentas (EEB) Nr. 1058/77 yra panaikinamas.

10 straipsnis

1. Šis reglamentas įsigalioja trečią dieną po jo paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje.

Tačiau XII priede nurodytas metodas taikomas nuo ►M1 1992 m. lapkričio 1 d. ◄ , išskyrus atvejus, susijusius su intervencinės sistemos operacijomis.

▼M5

Tas metodas netaikomas pirmo spaudimo alyvuogių aliejui, paruoštam parduoti iki 1992 m. lapkričio 1 d.

▼B

2. Šis reglamentas netaikomas alyvuogių aliejui ir alyvuogių išspaudų aliejui, įpakuotam iki šio reglamento įsigaliojimo ir parduotam iki 1992 m. spalio 31 d.

Šis reglamentas yra privalomas visas ir tiesiogiai taikomas visose valstybėse narėse.









PRIEDAI

Turinys







I priedas Alyvuogių aliejaus savybės ▼M17 Ia priedas Alyvuogių aliejaus arba alyvų išspaudų aliejaus bandinių, pristatytų ne didesnėse kaip 100 litrų pakuotėse, paėmimas ▼M20 Ib priedas Schema sprendimams priimti ▼B II priedas ►M21 Laisvųjų riebalų rūgščių kiekio nustatymas, naudojant šaltąjį metodą ◄ III priedas Peroksidų skaičiaus nustatymas IV priedas ►M6 Vaško kiekio nustatymas dujų ir skysčių kapiliarinių stulpelių chromatografijos metodu ◄ V priedas Sterolių sudėties ir kiekio nustatymas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu VI priedas Eritrodiolio ir uvaolio nustatymas VII priedas ►M21 2-glicerilo monopalmitato procentinio kiekio nustatymas ◄ ▼M20 ————— ▼B ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B ▼M11 XVII priedas Stigmastadienų nustatymas augaliniuose aliejuose ▼M13 Annex XVIII Method for determining the content of triglycerides with ECN42 ▼M19 Annex XIX Method for determining aliphatic alcohol content

▼M21









I PRIEDAS

ALYVUOGIŲ ALIEJAUS SAVYBĖS







Kategorija Rūgštingumas (%) (*) Peroksidų skaičius, mEq O2/kg (*) Vaškai mg/kg (**) 2-glicerilo monopalmitatas (%) Stigmastadienai mg/kg (1) Skirtumas tarp HPLC ECN42 ir teorinio ECN42 K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Organoleptinis trūkumų vidurkio įvertinimas (Md) (*) Organoleptinis vaisių likučių vidurkio įvertinimas (Mf) (*) 1. Aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,0, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,0, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ ►M22 3,5 ◄ Mf > 0 3. Pirmojo spaudimo klasikinis alyvuogių aliejus lampante > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,1, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > ►M22 3,5 ◄ (2) — 4. Rafinuotas alyvuogių aliejus ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,1, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — 5. Maišytas rafinuoto ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9, jei bendras palmitino rūgšties % ≤ 14 % ≤ 1,0, jei bendras palmitino rūgšties % > 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 6. Neapdorotas alyvuogių išspaudų aliejus — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinuotas alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Kategorija Rūgščių sudėtis (1) Transoleinių izomerų suma (%) Transoleinių ir translinoleninių izomerų suma (%) Sterolių sudėtis Bendras sterolių kiekis (mg/kg) Eritrodiolis ir uvaolis (%) (**) Miristo (%) Linoleno (%) Eikozano (%) Eikozeno (%) Beheno (%) Lignocero (%) Cholesterolis (%) Brasikasterolis (%) Kampesteroli (%) Stigmasterolis (%) ß-sterolis (%) (2) Δ-7 stigma stenolis (%) 1. Aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Pirmojo spaudimo klasikinis alyvuogių aliejus lampante ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Rafinuotas alyvuogių aliejus ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Maišytas rafinuoto ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejus ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Neapdorotas alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Rafinuotas alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Alyvuogių išspaudų aliejus ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









Ia PRIEDAS

ALYVUOGIŲ ALIEJAUS ARBA ALYVŲ IŠSPAUDŲ ALIEJAUS BANDINIŲ, PRISTATYTŲ NE DIDESNĖSE KAIP 100 LITRŲ PAKUOTĖSE, PAĖMIMAS

Šis bandinių paėmimo būdas taikomas alyvuogių aliejaus arba alyvų išspaudų aliejaus 125 000 litrų neviršijančioms siuntoms, pristatytoms ne didesnėse kaip 100 litrų pakuotėse.

Jei siunta viršija 125 000 litrų, ji turi būti padalinta į kelias 125 000 litrų arba mažesnes partijas. Jei siunta mažesnė nei 125 000 litrų, ji laikoma viena partija. Tiriama atskirai kiekviena partija.

Priklausomai nuo partijos dydžio, pagal 1 punkte pateiktą lentelę nustatomas reikalingų priminių bandinių skaičius.

Bandinio dydis pagal 2.1 punkte pateiktą lentelę nustatomas atsižvelgiant į pakuotės talpą.

Sąvokos „siunta“, „pirminis bandinys“ ir „laboratorijos bandinys“ apibrėžti standarte EN ISO 5555.

„Partija“ susideda iš daugelio prekės vienetų, kurie buvo pagaminti ir supakuoti tokiomis aplinkybėmis, kad kiekviename prekės vienete esantis aliejus pagal visas analitines charakteristikas gali būti laikomas homogenišku.

1. REIKALINGŲ PIRMINIŲ BANDINIŲ SKAIČIUS

Pagal šią lentelę, priklausomai nuo partijos dydžio, nustatomas reikalingų priminių bandinių skaičius:







Partijos dydis (litrais), mažesnis nei Reikalingų priminių bandinių skaičius 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Pirminiams bandiniams paimti turi būti pasirenkamos šalia viena kitos esančios tos partijos pakuotės.

Iškilus abejonėms, valstybė narė padidina reikalingų priminių bandinių skaičių.

2. PIRMINIŲ BANDINIŲ SUDĖTIS

2.1 Kiekvieną pirminį bandinį sudaro:



Jei pakuotės talpa: Pirminį bandinį sudarys aliejus iš: a) 5 litrai ir daugiau a) 3 pakuočių b) ne mažiau nei 3, bet ne daugiau nei 5 litrai b) 3 pakuočių c) ne mažiau nei 2, bet ne daugiau nei 3 litrai c) 3 pakuočių d) ne mažiau nei 1, bet ne daugiau nei 2 litrai d) 6 pakuočių e) ne mažiau nei 0,75, bet ne daugiau nei 1 litras e) 6 pakuočių f) mažiau nei 0,75 litro f) trigubo aliejaus kiekio iš minimalaus pakuočių, kurių bendras tūris didesnis nei 5 litrai, skaičiaus

2.2 Pirminiai bandiniai iki jų analizės turi būti laikomi pakuotėse. Po to pirminiai bandiniai nustatyta tvarka suskirstomi į tris laboratorinius bandinius, norint atlikti: a) analizes, nurodytas II, III, IX ir X prieduose, b) analizes, nurodytas XII priede, c) kitas analizes.

2.3 Pakuotės, sudarančios pirminį mėginį, suskirstomos nacionaliniuose įstatymuose patikrinimo procedūrai nustatytos tvarkos.

3. ANALIZĖS IR REZULTATAI

a) Kiekvienas 1 punkte apibrėžtas pirminis bandinys suskirstomas į tris laboratorinius bandinius standarto EN ISO 5555 2.5 punkte nustatyta tvarka ir analizuojamas taip: — remiantis 2 straipsnio 1 dalies pirma įtrauka nustatomos laisvosios riebiosios rūgštys, — remiantis 2 straipsnio 1 dalies antra įtrauka nustatomas peroksido skaičius, — remiantis 2 straipsnio 1 dalies aštunta įtrauka atliekama spektrofotometrinė analizė, — remiantis 2 straipsnio 1 dalies devinta įtrauka nustatoma riebiųjų rūgščių sudėtis.

b) Jei bent vieno tos pačios partijos pirminio bandinio analizių, išvardytų a dalyje, rezultatai neatitinka deklaruotos alyvuogių aliejaus kategorijos charakteristikų, laikoma, kad visa partija neatitinka šių charakteristikų. Jei visų tos pačios partijos pirminių bandinių analizių, išvardytų a dalyje, rezultatai, esant pasikartojančioms naudotų metodų savybėms, yra skirtingi, visa partija laikoma nehomogeniška, ir kiekvienas pirminis bandinys turi būti analizuojamas visais likusiais nurodytais analizės būdais. Kitu atveju likusiais nurodytais analizės būdais turi būti analizuojamas tik vienas tos partijos pirminis bandinys.

c) Jei bent vieno tos pačios partijos pirminio bandinio analizių, išvardytų antros straipsnio dalies b dalyje, rezultatai neatitinka deklaruotos alyvuogių aliejaus kategorijos charakteristikų, laikoma, kad visa partija neatitinka šių charakteristikų. Jei visi tos pačios partijos pirminio bandinio analizių, išvardytų antros straipsnio dalies b dalyje, rezultatai atitinka deklaruotos alyvuogių aliejaus kategorijos charakteristikas, laikoma, kad visa partija atitinka šias charakteristikas.

▼M20









Ib PRIEDAS

SCHEMA SPRENDIMAMS PRIIMTI, SIEKIANT NUSTATYTI, AR ALYVUOGIŲ ALIEJAUS BANDINYS ATITINKA DEKLARUOTĄ KATEGORIJĄ

Analizė siekiant nustatyti, ar alyvuogių aliejus arba alyvų išspaudų aliejus atitinka deklaruotą kategoriją, gali būti atlikta taip:

a) bet kuria eilės tvarka atliekant I priede nurodytas aliejaus atitikimo deklaruotai kategorijai analizes; arba

b) laikantis schemoje sprendimams priimti nustatytos tvarkos, kol gaunamas vienas šioje schemoje įrašytų atsakymų.

Taip pat, atsižvelgiant į Bendrijos nuostatas, turi būti atlikta papildoma analizė nepageidaujamoms medžiagoms nustatyti.

Schema sprendimams priimti taikoma visoms alyvuogių aliejaus ir alyvų išspaudų aliejaus kategorijoms. Ją sudaro nuo 1 iki 11 numeruotos lentelės, kurios taikomos atsižvelgiant į deklaruotą aliejaus kategoriją bendrojoje lentelėje nustatyta eilės tvarka.

Bendrosios lentelės ir lentelių nuo 1 iki 11 paaiškinimai:

— dviguba linija (=) nurodo sekantį žingsnį sprendimo link, jei buvo patenkintos sąlygos, nurodytos prieš tai buvusiame stačiakampyje (teigiamas atsakymas). Punktyrinė linija (…) nurodo sekantį žingsnį neigiamo atsakymo atveju,

— Remiantis šio priedo 1 priedėlyje pateikta atitikmenų lentele, 1–11 schemose esančių stačiakampių laukelių pavadinimais nurodomos analizės, numatytos šiame reglamente.

— 1–11 schemose esančiomis raidėmis skliausteliuose (neigiamas atsakymas) nurodomos pastabos, pateiktos šio priedo 2 priedėlyje. Pačios raidės nereiškia būtinybės atlikti kitas analizes.









1 priedėlis

Šio reglamento priedų ir schemos sprendimams priimti laukelių atitikmenų lentelė







▼M21 – Rūgštingumas II priedas Laisvųjų riebalų rūgščių kiekio nustatymas, naudojant šaltąjį metodą ▼M20 – Peroksido skaičius III priedas Peroksidų skaičiaus nustatymas – UV spektrometrija IX priedas Spektrofotometrinis tyrimas – Organoleptinis įvertinimas XII priedas Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus organoleptinių charakteristikų vertinimas – 3,5-Stigmastadijos XVII priedas Stigmastadijų nustatymo augaliniame aliejuje metodai – Transizomerinės riebiosios rūgštys X.a ir Riebalų rūgščių metilesterių analizė dujų chromatografijos metodu X.b priedas Riebalų rūgščių metilesterių ruošimas – Riebiųjų rūgščių sudėtis X.a ir Riebalų rūgščių metilesterių analizė dujų chromatografijos metodu X.b priedas Riebalų rūgščių metilesterių ruošimas – AECN42 XVIII priedas Trigliceridų sudėties nustatymas su ECN42 (skirtumas tarp HPLC duomenų ir teorinės sudėties) – Sterolių sudėtis ir bendras kiekis V priedas Sterolių sudėties ir kiekio nustatymas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu – Eritrodiolis ir uvaolis VI priedas Eritrodiolio ir uvaolio nustatymas – Vaškai IV priedas Vaškų kiekio nustatymas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu – Alifatiniai alkoholiai XIX priedas Alifatinių alkoholių kiekio nustatymas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu ▼M21 – 2 pozicijoje prisotintos riebiosios rūgštys VII priedas 2-glicerilo monopalmitato procentinio kiekio nustatymas ▼M20









2 priedėlis

1 lentelė

a) Žiūrėti pirmojo spaudimo arba lampante alyvuogių aliejų (Kokybės kriterijai – 2 lentelė, arba Kokybės ir grynumo kriterijai – 4 lentelė)

b) Žiūrėti lampante alyvuogių aliejų (Kokybės ir grynumo kriterijai – 4 lentelė)

2 lentelė

a) Žiūrėti lampante alyvuogių aliejų (Kokybės ir grynumo kriterijai – 4 lentelė)

b) Žiūrėti aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo alyvuogių aliejų (Kokybės kriterijai – 1 lentelė)

3 lentelė

a) Sudėtyje yra rafinuoto aliejaus (alyvuogių ar kito)

b) Sudėtyje yra alyvų išspaudų aliejaus

4 lentelė

a) Žiūrėti Aukščiausios kokybės pirmojo spaudimo ir pirmojo spaudimo alyvuogių aliejų (Kokybės kriterijai – 1 ir 2 lentelė)

b) Sudėtyje yra rafinuoto aliejaus (alyvuogių ar kito)

c) Sudėtyje yra alyvų išspaudų aliejaus

d) Sudėtyje yra esterifikuotų aliejų

7 lentelė

a) Sudėtyje yra alyvų išspaudų aliejaus

b) Sudėtyje yra esterifikuotų aliejų

8 lentelė

a) Sudėtyje yra rafinuoto aliejaus (alyvuogių ar kito)

b) Žiūrėti lampante alyvuogių aliejų (Kokybės ir grynumo kriterijai – 4 lentelė)

c) Sudėtyje yra esterifikuotų aliejų

11 lentelė

a) Sudėtyje yra esterifikuotų aliejų

▼B









II PRIEDAS

▼M21

LAISVŲJŲ RIEBALŲ RŪGŠČIŲ KIEKIO NUSTATYMAS, NAUDOJANT ŠALTĄJĮ METODĄ

▼B

1. RŪGŠTINGUMO NUSTATYMAS

Laisvųjų riebiųjų rūgščių nustatymas alyvuogių aliejuose. Laisvųjų rūgščių kiekis išreiškiamas sutartu būdų skaičiuojamu rūgštingumu.

1.1. Metodo esmė

Bandinys ištirpinamas tirpiklių mišinyje ir esančios laisvosios riebiųjų rūgštys titruojamos kalio hidroksido tirpalu etanolyje.

1.2. Reagentai

Visi reagentai turi būti pripažintos analiziškai grynų reagentų kokybės, naudojamas distiliuotas arba atitinkamo grynumo vanduo.

1.2.1. Dietileterio ir 95 % (v/v) etanolio lygių tūrio dalių mišinys. Pastaba. Dietileteris yra labai degus ir gali sudaryti sprogius peroksidus. Jį naudojant, turi būti imamasi ypatingų atsargumo priemonių . Visiškai prieš pat naudojimą mišinys neutralizuojamas kalio hidroksido tirpalu (1.2.2), 100 ml mišinio įpilant 0,3 ml fenolftaleino tirpalo (1.2.3). Pastaba. Jei negalima naudoti dietiletrio, gali būti naudojamas tirpiklių mišinys, kurį sudaro etanolis ir toluenas. Prireikus etanolį galima pakeisti 2-propanoliu.

1.2.2. Kalio hidroksido titruotas tirpalas etanolyje, c(KOH) apie 0,1 mol//l arba, jei tai būtina, c(KOH) apie 0,5 mol/l. Turi būti žinoma kalio hidroksido tirpalo etanolyje tiksli koncentracija, ji tikrinama prieš pat naudojimą. Reikia turėti paruoštą tirpalą bent penkios dienos prieš naudojimą, jį dekantavus į butelį iš rudo stiklo su guminiu kamščiu. Tirpalas turi būti bespalvis arba šviesiai geltonos spalvos. Pastaba. Patvarus bespalvis kalio hidroksido tirpalas gali būti paruoštas taip. 1 000 ml etanolio, įdėjus 8 g kalio hidroksido ir 0,5 g aliuminio drožlių, užvirinama ir vieną valandą verdama su grįžtamuoju kondensatoriumi. Tuojau pat distiliuojama. Distiliate ištirpinamas reikiamas kiekis kalio hidroksido. Paliekama kelias dienas stovėti, paskui skaidrus virš kalio karbonato nuosėdų esantis tirpalas dekantuojamas. Tirpalą galima paruošti ir be distiliacijos: į 1 000 ml etanolio įpilama 4 ml aliuminio butilato, mišinys paliekamas kelias dienas stovėti. Virš nuosėdų esantis skystis dekantuojamas ir jame ištirpinamas reikiamas kiekis kalio hidroksido. Tirpalas paruoštas naudoti.

1.2.3. Fenolftaleino 10 g/l tirpalas 95–96 % (v/v) etanolyje arba šarminio žydriojo (ypač žymiai spalvotų riebalų atveju) 20 g/l tirpalas 95–96 % (v/v) etanolyje.

1.3. Aparatūra

Įprasta laboratorinė įranga, tarp kitų įrenginių:

1.3.1. analizinės svarstyklės;

1.3.2. 250 ml talpos kūginė kolba;

1.3.3. 10 ml biuretė, sugraduota 0,05 ml padalomis.

1.4. Darbo eiga

1.4.1. Bandinio ruošimas analizei (Atliekama filtruoto bandinio analizė. Jei drėgmė ir priemaišos kartu sudaro mažiau kaip 1 %, bandinys analizuojamas be tolesnio apdorojimo; jei jų yra daugiau kaip 1 %, bandinį reikia filtruoti.)

1.4.2. Bandinio ėmimas Bandinio imama, atsižvelgiant į numatomą rūgščių skaičių, pagal tokią lentelę:



Laukiamas rūgščių skaičius Bandinio masė (g) Svėrimo tikslumas (g) < 1 20 0,05 1–4 10 0,02 4–15 2,5 0,01 15–75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Bandinys sveriamas kūginėje kolboje (1.3.2).

1.4.3. Nustatymas Bandinys (1.4.2) ištirpinamas 50–150 ml prieš tai neutralizuoto dietileterio ir etanolio mišinio (1.2.1). Titruojama 0,1 mol/l koncentracijos kalio hidroksido tirpalu (1.2.2) (žr. 2 pastabą) maišant, kol pasikeičia indikatoriaus spalva (rožinė fenolftaleino spalva nepranyksta bent 10 sekundžių). 1 pastaba. Titruotas kalio hidroksido tirpalas etanolyje (1.2.2) gali būti pakeistas vandeniniu kalio arba natrio hidroksido tirpalu, jei titravimo metu įpilamas vanduo nesukelia išsisluoksniavimo. 2 pastaba. Jei 0,1 mol/l kalio hidroksido tirpalo reikia daugiau kaip 10 ml, naudojamas 0,5 mol/l tirpalas. 3 pastaba. Jei titruojant tirpalas susidrumsčia, įpilama tiek tirpiklių mišinio (1.2.1), kad tirpalas pasidarytu skaidrus.

1.5. Rūgštingumas: skaičiuojamas oleino rūgšties procentiniu kiekiu

Rūgštingumas masės procentais skaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

V = titravimui sunaudoto kalio hidroksido tirpalo tūris, mililitrais;

c = tiksli naudoto kalio hidroksido titruoto tirpalo koncentracija, moliais litre;

M = molinė masė rūgšties, pagal kurią skaičiuojamas rezultatas (= 282);

m = bandinio masė, gramais.

Rezultatas skaičiuojamas ►M6 dviejų apskaičiavimų ◄ aritmetinis vidurkis.









III PRIEDAS

PEROKSIDŲ SKAIČIAUS NUSTATYMAS

1. TIKSLAS

Šiame standarte aprašytas aliejų ir riebalų peroksidų skaičiaus nustatymo metodas.

2. TAIKYMOSRITIS

Šis standartas taikytinas gyvuliniams ir augaliniams aliejams ir riebalams.

3. APIBRĖŽIMAS

Medžiagų, kurios aprašytomis bandymo sąlygomis oksiduoja kalio jodidą, kiekis, skaičiuojamas aktyvaus deguonies miliekvivalentais kilogramui bandinio, vadinamas peroksidų skaičiumi.

4. METODOESMĖ

Acto rūgšties ir chloroformo mišinyje ištirpinta analizuojamo bandinio dalis veikiama kalio jodido tirpalu. Išsiskyręs jodas titruojamas etaloniniu natrio tiosulfato tirpalu.

5. APARATŪRA

Visoje naudojamoje įrangoje neturi būti oksiduojančių arba redukuojančių medžiagų.

Pastaba. Šlifo sujungimai netepami.

5.1. 3 ml talpos stiklinė bertuvėlė.

5.2. Maždaug 250 ml talpos kolbos su šlifo kaklais ir kamščiais iš anksto išdžiovintos ir užpildytos švariomis, sausomis inertinėmis dujomis (azotu arba geriau anglies dioksidu).

5.3. 25 arba 50 ml biuretė, sugraduota 0,1 ml padalomis.

6. REAGENTAI

6.1. Chloroformas, analiziškai grynas, išvalytas nuo deguonies, barbotuojant per jį švarių ir sausų inertinių dujų srovę.

6.2. Ledinė (atšaldyta) acto rūgštis, analiziškai gryna, išvalyta nuo deguonies, barbotuojant per ją švarių ir sausų inertinių dujų srovę.

6.3. Kalio jodidas, neseniai paruoštas prisotintas vandeninis tirpalas, be jodo ir jodatų.

6.4. Natrio tiosulfatas, tiksliai etalonuotas 0,01 arba 0,002 mol/l vandeninis tirpalas. Titras nustatomas prieš pat naudojimą.

6.5. Krakmolo tirpalas, 10 g/l dispersija vandenyje, neseniai paruoštas iš natūralaus tirpaus krakmolo.

7. BANDINYS

Reikia žiūrėti, kad bandinys būtų imamas ir laikomas neapšviestoje šaltoje vietoje, visiškai užpildytame stikliniame inde, hermetiškai užkimštame šlifo arba kamščiamedžio kamščiais.

8. DARBO EIGA

Analizė turi būti atliekama išsklaidytoje dienos šviesoje arba esant dirbtiniam apšvietimui. Stiklinėje bertuvėlėje (5.1) arba, jos neturint, kolboje (5.2) 0,001 g tikslumu pasveriama bandinio masė, kuri pasirenkama iš lentelės duomenų, atsižvelgiant į numatomą peroksidų skaičių:







Laukiamas peroksidų skaičius (mekv.) Analizuojamos bandinio dalies masė (g) 0–12 5,0–2,0 12–20 2,0–1,2 20–30 1,2–0,8 30–50 0,8–0,5 50–90 0,5–0,3

Kolba (5.2) atkemšama ir į ją įdedama stiklinė bertuvėlė su bandiniu. Įpilama 10 ml chloroformo (6.1). Bandinys greitai ištirpinamas maišant. Įpilama 15 ml ledinės acto rūgšties (6.2) ir paskui 1 ml kalio jodido tirpalo (6.3). Kolba greitai užkemšama, kratoma vieną minutę ir lygiai penkias minutes paliekama stovėti neapšviestoje vietoje, 15–25 °C temperatūroje.

Įpilama maždaug 75 ml distiliuoto vandens. Išsiskyręs jodas titruojamas natrio tiosulfato tirpalu (6.4) (0,002 mol/l, jei manoma, kad peroksidų skaičius yra mažesnis kaip 12, ir 0,01 mol/l, jei numatomos vertės yra didesnės kaip 12), stipriai kratant. Indikatoriumi naudojamas krakmolo tirpalas (6.5).

Tam pačiam analizuojamam bandiniui atliekami du nustatymai.

Tuo pačiu metu atliekamas tuščiasis bandymas. Jei tuščiojo bandymo rezultatas didesnis kaip 0,05 ml 0,01 mol/l natrio tiosulfato tirpalo (6.4), negryni reagentai pakeičiami.

9. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

Peroksidų skaičius (PS), skaičiuojant aktyvaus deguonies miliekvivalentais kilogramui, nustatomas pagal formulę:

kurioje:

V = nustatymui sunaudoto etaloninio natrio tiosulfato tirpalo (6.4) tūris, pataisytas pagal tuščiojo bandymo rezultatą, ml;

T = tiksli naudoto natrio tiosulfato tirpalo (6.4) molinė koncentracija;

m = analizuojamos bandinio dalies masė, g.

Rezultatas skaičiuojamas kaip dviejų nustatymų aritmetinis vidurkis.

▼M21









IV PRIEDAS

VAŠKŲ KIEKIO NUSTATYMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU KAPILIARINĖJE KOLONĖLĖJE

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Šiuo metodu nustatomi vaškų kiekiai alyvuogių aliejuje. Vaškai identifikuojami pagal anglies atomų skaičių. Metodas taikomas atskirti spaudimo būdu gautą alyvuogių aliejų nuo alyvuogių aliejaus, gauto ekstrahavimo būdu (maišytas alyvuogių išspaudų aliejus).

2. METODO ESMĖ

Į riebalus arba aliejų pridedama atitinkamo vidinio etalono ir chromatografiškai frakcionuojama kolonėlėje, užpildytoje hidratuotu silikageliu. Frakcija, kuri bandymo sąlygomis išplaunama pirmoji (jos poliškumas yra mažesnis kaip trigliceridų), tiesiogiai tiriama dujų chromatografijos metodu kapiliarinėje kolonėlėje.

3. ĮRANGA

3.1. 25 ml Erlenmejerio kolba.

3.2. Stiklinė dujų chromatografijos kolonėlė su čiaupu, kurios vidinis skersmuo 15 mm, ilgis 30–40 cm.

3.3. Tinkamas dujų chromatografas su kapiliarine kolonėle ir mėginio tiesioginio įpurškimo įtaisu. Chromatografą sudaro: 3.3.1. Kolonėlių termostatas su temperatūros programavimo įrenginiu. 3.3.2. Šaltas inžektorius mėginiui tiesiogiai į kolonėlę įpurkšti. 3.3.3. Liepsnos jonizacinis detektorius ir konverteris stiprintuvas. 3.3.4. Kintamo popieriaus tiekimo greičio savirašis integratorius, dirbantis su konverteriu stiprintuvu (3.3.3), kurio atsako sparta ne didesnė kaip viena sekundė. (Taip pat galima naudoti kompiuterizuotas sistemas, leidžiančias kompiuteriu gauti dujų chromatografijos duomenis.). 3.3.5. 8–12 m ilgio ir 0,25–0,32 mm vidinio skersmens stiklinė arba kvarcinio stiklo kapiliarinė kolonėlė, iš vidaus padengta lygia 0,10–0,30 μm storio stacionarios fazės plėvele. (Naudoti paruoštos plėvelės parduodamos kaip SE-52 arba SE-54.).

3.4. 10 μl mikrošvirkštas su kietinta adata, pritaikytas mėginiui tiesiogiai įpurkšti į kolonėlę.

3.5. Elektrinė purtyklė.

3.6. Sukamasis garintuvas.

3.7. Mufelinė krosnis.

3.8. Analizinės svarstyklės, kurių svėrimo tikslumas ± 0,1 mg.

3.9. Įprasti laboratoriniai stikliniai indai.

4. REAGENTAI

4.1. Silikagelis, kurio granulių dydis 60–200 μm. Jis paruošiamas taip: silikagelis dedamas į krosnį ir ne trumpiau kaip keturias valandas kaitinamas 500 °C temperatūroje. Leidžiama atvėsti ir įpilama 2 % (silikagelio masės) vandens. Gauta suspensija homogenizuojama gerai sumaišant. Prieš naudojimą laikoma tamsoje ne mažiau kaip 12 valandų.

4.2. n-heksanas, tinkamas chromatografijai.

4.3. Etileteris, tinkamas chromatografijai.

4.4. n-heptanas, tinkamas chromatografijai.

4.5. Etaloninis 0,1 % (m/v) laurileikozanato tirpalas heksane (vidinis etalonas). (Taip pat galima naudoti palmitilo palmitatą arba miristilstearatą). 4.5.1. Sudanas I (1-fenilazo-2-naftolis).

4.6. Nešančiosios dujos: vandenilis arba helis, kurių grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus.

4.7. Pagalbinės dujos: — grynas vandenilis, tinkamas dujų chromatografijai, — grynas oras, tinkamas dujų chromatografijai.

5. DARBO EIGA

5.1. Chromatografinės kolonėlės paruošimas.

15 g silikagelio (4.1.) suspenduojama n-heksane (4.2.) ir supilama į kolonėlę (3.2.). Silikageliui leidžiama savaime nusėsti. Kad chromatografinis sluoksnis būtų homogeniškesnis, nusodinimas baigiamas, naudojant elektrinę purtyklę (3.5.). Priemaišos pašalinamos per silikagelį praleidžiant 30 ml n-heksano. Į 25 ml talpos Erlenmejerio kolbą (3.1) svarstyklėmis (3.8) tiksliai pasveriama 500 mg mėginio ir pridedamas reikiamas vidinio etalono (4.5) kiekis, atsižvelgiant į numatomą vaško kiekį mėginyje. Pvz.: analizuojant alyvuogių aliejų įdedama 0,1 mg laurileikozanato, analizuojant maišytą alyvuogių išspaudų aliejų – 0,25–0,5 mg. Paruoštas mėginys dviem 2 ml n-heksano (4.2.) porcijomis supilamas į chromatografijos kolonėlę.

Tirpikliui leidžiama ištekėti iki 1 mm lygio virš absorbento viršutinio paviršiaus, tuomet per silikagelį praleidžiama 70 ml n-heksano natūraliai tirpaluose esantiems n-alkanams pašalinti. Chromatografinis išplovimas pradedamas palaikant 15 lašų per 10 sekundžių srauto greitį, surenkama 180 ml n-heksano/etileterio mišinio, paruošto santykiu 99:1. Mėginio išplovimas turi būti atliekamas kambario, t. y. 22 ± 4 °C, temperatūroje.

Pastabos:

— n-heksano/etileterio mišinys (99:1) turi būti ruošiamas kasdien.

— Siekiant vizualiai sekti, ar vaškai tinkamai išplaunami, į skystą mėginio išplovimo mišinį galima įpilti 100 μl 1 % sudano tirpalo. Kadangi dažiklio sulaikymo trukmė yra tarpinė, lyginant su vaškų ir trigliceridų sulaikymo trukme, todėl dažikliui pasiekus chromatografinės kolonėlės dugną, išplovimo procesas nutraukiamas, nes visi vaškai jau būna išplauti.

Gauta frakcija džiovinama sukamajame garintuve (3.6.), kol išgarinamas beveik visas tirpiklis. Paskutinieji 2 ml tirpiklio pašalinami silpna azoto srove; tuomet įpilama 2–4 ml n-heptano.

5.2. Dujų chromatografinė analizė

5.2.1. Paruošiamieji darbai

Kolonėlė prijungiama prie dujų chromatografo (3.3), kolonėlės pradžią sujungiant su tiesioginio įpurškimo įtaisu, galą – su detektoriumi. Patikrinamas dujų chromatografijos įrenginys (dujų kilpų, detektoriaus, ir savirašio veikimas ir t. t.).

Jei kolonėlė naudojama pirmą kartą, patartina ją kondicionuoti. Per kolonėlę paleidžiama nestipri dujų srovė, tuomet įjungiamas dujų chromatografas. Palaipsniui kaitinama, kol temperatūra per apytiksliai 4 valandas pakyla iki 350 °C. Ši temperatūra palaikoma ne mažiau kaip 2 valandas, po to nustatomos įrenginio darbo sąlygos (sureguliuojamas dujų srauto greitis, uždegama liepsna, prijungiamas elektroninis savirašis (3.3.4.), nustatoma termostato kameros temperatūra, sureguliuojamas detektorius ir t. t.) ir esant bent du kartus didesniam jautriui nei tas, kuris reikalingas analizei atlikti, užrašomas signalas. Bazinė linija turi būti tiesi, be jokių smailių ir nukrypimų.

Neigiamas tiesinis nuokrypis rodo, kad nesandarūs kolonėlės sujungimai; teigiamas nuokrypis – kad kolonėlė nepakankamai kondicionuota.

5.2.2. Darbo sąlygų parinkimas

Paprastai turi būti laikomasi tokių darbo sąlygų:

— kolonėlės temperatūra: —



20 °C/minutę 5 °C/minutę 20 °C/minutę pradinė temperatūra 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— detektoriaus temperatūra: 350 °C,

— įpurkštas medžiagos kiekis: 1 μl (2–4 ml) n-heptano tirpalo,

— nešančiosios dujos: helis arba vandenilis, naudojamas pasirinktoms dujoms optimalus linijinis greitis (žr. priedėlį),

— prietaiso jautris: atitinkantis toliau nurodytas sąlygas:

šios sąlygos gali būti keičiamos, atsižvelgiant į kolonėlės bei dujų chromatografo savybes, kad būtų pasiektas visų vaškų atskyrimas, pakankama smailių skiriamoji geba (žr. paveikslą). Vidinio etalono C32 sulaikymo trukmė turi būti 18 ± 3 minutės. Būdingiausios vaškų smailės aukštis turi sudaryti ne mažiau kaip 60 % visos skalės aukščio.

Smailių integravimo parametrai nustatomi taip, kad būtų gautas teisingas nagrinėjamų smailių plotų įvertinimas.

Pastaba. Kadangi galutinė temperatūra aukšta yra leidžiamas teigiamas nuokrypis, neviršijantis 10 % visos skalės aukščio.

5.3. Analizė

10 μl mikrošvirkštu įsiurbiama 1μl mėginio tirpalo; stūmoklis traukiamas, kol adata ištuštėja. Adata įkišama į įpurškimo įtaisą ir po vienos-dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas. Maždaug po penkių sekundžių adata lėtai ištraukiama.

Užrašinėjama, kol vaškai visiškai išplaunami.

Bazinė linija turi visuomet atitikti nustatytas sąlygas.

5.4. Smailių identifikavimas

Smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmes, lyginant jas su žinomas sulaikymo trukmes turinčiais vaškų mišiniais, analizuotais tomis pačiomis sąlygomis.

Gryno alyvuogių aliejaus vaškų chromatograma parodyta paveiksle.

5.5. Kiekybinis vertinimas

Integratoriumi išmatuojami vidinio etalono ir C40–C46 alifatiniių esterių smailių plotai.

Kiekvieno vašką sudarančio esterio kiekis mg/kg riebalų, apskaičiuojamas pagal formulę:

kurioje:

Ax = kiekvieno esterio smailės plotas, kvadratiniais milimetrais

As = kiekvieno vidinio etalono esterio smailės plotas, kvadratiniais milimetrais

ms = pridėto vidinio etalono masė, miligramais

m = tyrimui paimto mėginio masė, gramais.

6. REZULTATŲ PATEIKIMAS

Pateikiami atskirų C40–C46 vaškų kiekiai ir šių kiekių suma, mg/kg riebalų (ppm).

Pastaba. Vaškų sudedamųjų dalių kiekiai nustatomi remiantis alyvuogių aliejaus chromatogramos esterių porinių anglies skaičiaus smailių C40–C46 pavyzdžiu, pateiktu paveiksle. Jei C46 esteris matomas du kartus, jam identifikuoti rekomenduojama analizuoti maišytą alyvuogių išspaudų aliejų, kuriame C46 lengvai nustatomas, nes šiame aliejuje jo yra daugiausia.

Rezultatai pateikiami vieno ženklo po kablelio (dešimtųjų) tikslumu.

Paveikslas

Alyvuogių aliejaus vaškų chromatograma ( 5 )

Paaiškinimas:

I.S. = Laurileikozanatas

1. = Diterpeniniai esteriai

2 + 2’ = Esteris C40

3 + 3’ = Esteris C42

4 + 4’ = Esteris C44

5. = Esteris C46

6. = Steroliniai esteriai ir triterpeninis alkoholis









Priedėlis

Dujų linijinio greičio nustatymas

Į dujų chromatografą, nustatytą normalioms darbo sąlygoms, įpurškiama 1–3 μl metano arba propano ir matuojamas laikas, kurį dujos užtruks tekėdamos per kolonėlę nuo įpurškimo momento iki smailės iškilimo momento (tM).

Linijinis greitis, cm/s, gaunamas pagal formulę L/tM, kurioje L yra kolonėlės ilgis, centimetrais, tM yra išmatuotas laikas sekundėmis.

▼B









V PRIEDAS

STEROLIŲ SUDĖTIES IR KIEKIO NUSTATYMAS KAPILIARINĖS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1. TIKSLAS

Šiame metode aprašytas atskirų sterolių ir jų bendro kiekio nustatymo riebalinėse medžiagose būdas.

2. METODO ESMĖ

Riebalinė medžiaga, įdėjus β-cholestanolio kaip vidinio etalono, muilinama kalio hidroksido tirpalu etanolyje ir nemuilinama dalis ekstrahuojama dietileteriu.

Sterolių frakcija iš nemuilinamų medžiagų ekstrakto išskiriama chromatografiškai ant šarmu impregnuotų silikagelio plokštelių. Iš silikagelio regeneruoti steroliai paverčiami trimetilsilileteriais ir analizuojami kapiliarinės dujų chromatografijos metodu.

3. APARATŪRA

3.1. 250 ml tūrio kolba ir grįžtamasis kondensatorius, turintys šlifo sujungimus.

3.2. 500 ml talpos dalijamieji piltuvai.

3.3. 250 ml talpos kolbos.

3.4. Visa įranga plonasluoksnei chromatografinei (PSC) analizei atlikti, pritaikyta stiklinėms plokštelėms, kurių matmenys 20 x 20 cm.

3.5. UV 366 arba 254 nm ilgio šviesos bangų lempa.

3.6. Mikrošvirkštai 100 ir 500 μl tūriams imti.

3.7. G3 akytumo stiklinis filtras (15–40 μm akytumas) maždaug 2 cm skersmens ir 5 cm aukščio, tinkamas vakuuminiam filtravimui, su 12/21 šlifo mova.

3.8. 50 ml talpos vakuuminė kolba su 12/21 šlifo įmova filtrui (3.7) prijungti.

3.9. 10 ml talpos mėgintuvėlis su kūginiu dugnu ir kamščiu.

3.10. Darbui su kapiliarine kolonėle naudojamas ir bandinio dozatorių turintis dujų chromatografas, kurį sudaro: 3.10.1 termostatuojama kamera norimai temperatūrai kolonėlėje palaikyti ± 1 °C tikslumu; 3.10.2. reguliuojamos temperatūros garinimo įrenginys su polisiloksanu dengtu garinimo elementu; 3.10.3. liepsnos jonizacinis detektorius ir konverteris stiprintuvas; 3.10.4. darbui kartu su konverteriu-stiprintuvu (3.10.3) pritaikytas kintamo popieriaus tiekimo greičio savirašis-integratorius, kurio inertiškumas ne didesnis kaip viena sekundė.

3.11. Stiklinė arba lydyto kvarco 20–30 m ilgio kapiliarinė kolonėlė, kurios vidinis skersmuo 0,25–0,32 mm, padengta 0,10–0,30 μm storio skystos fazės SE-52 arba SE-54 plėvele arba ją atitinkančia plėvele.

3.12. 10 μl talpos mikrošvirkštas dujų chromatografijai su kietinta adata.

4. REAGENTAI

4.1. Kalio hidroksido maždaug 2 mol/l tirpalas etanolyje: 130 g kalio hidroksido (mažiausia koncentracija 85 %) ištirpinama šaldant 200 ml distiliuoto vandens ir praskiedžiama etanoliu iki 1 litro. Tirpalas turi būti laikomas gerai užkimštame tamsaus stiklo butelyje.

4.2. Dietileteris, analiziškai grynas.

4.3. Bevandenis natrio sulfatas, analiziškai grynas.

4.4. Fluorescencijos indikatoriumi neužteršto silikagelio 0,25 mm sluoksniu dengtos stiklinės PSC plokštelės (gali būti naudojamos gatavos pramonės gaminamos plokštelės).

4.5. Kalio hidroksido 0,2 mol/l tirpalas etanolyje: 13 g kalio hidroksido ištirpinama 20 ml distiliuoto vandens ir praskiedžiama etanoliu iki 1 litro.

4.6. Benzenas, tinkamas chromatografijai (žr. 5.2.2).

4.7. Acetonas, tinkamas chromatografijai (žr. 5.2.2).

4.8. Heksanas, tinkamas chromatografijai (žr. 5.2.2).

4.9. Dietileteris, tinkamas chromatografijai (žr. 5.2.2).

4.10. Chloroformas, tinkamas chromatografijai (žr. 5.2.2).

4.11. Etaloninis tirpalas plonasluoksnei chromatografijai: cholesterolis arba fitosteroliai, ►M6 2 % ◄ tirpalas chloroforme.

4.12. 0,2 % 2',7'-dichlorfluoresceino tirpalas etanolyje. Jis truputį pašarminamas, įlašinant kelis lašus 2 mol/l kalio hidroksido tirpalo.

4.13. Bevandenis piridinas, tinkamas chromatografijai.

4.14. Heksametildisilazanas.

4.15. Trimetilchlorsilanas.

4.16. Etaloniniai sterolių trimetilsilileterių tirpalai. Ruošiami prieš pat juos naudojant iš grynų sterolių arba jų mišinių, gautų iš juos turinčių aliejų.

4.17. 0,2 % (m/v) β-cholestanolio tirpalas chloroforme (vidinis etalonas).

4.18. Dujos nešikliai: vandenilis arba helis, grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus.

4.19. Pagalbinės dujos: — vandenilis, kurio grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus, — oras, kurio grynumas atitinka dujų chromatografijos reikalavimus.

5. DARBO EIGA

5.1. Nemuilinamų medžiagų gavimas 5.1.1. Į 250 ml talpos kolbą 500 μl mikrošvirkštu įšvirkščiamas toks 0,2 % β-cholestanolio tirpalo tūris, kuriame cholestanolio kiekis būtų lygus maždaug 10 % sterolių kiekio analizei paimto bandinio alikvotinėje dalyje. Pavyzdžiui, į 5 g alyvuogių aliejaus bandinį įpilama 500 μl 0,2 % β-cholestanolio tirpalo, 1 500 μl – į ►M6 ————— ◄ aliejaus iš alyvuogių išspaudų bandinį. Vidinio etalono tirpalas N2 srovėje išgarinamas iki sauso likučio, paskui į tą pačią kolbą tiksliai pasveriama 5 g sauso, filtruoto bandinio. ►M6 Aliejai ◄ , kuriuose yra nemaži kiekiai cholesterolio, chromatogramoje gali turėti smailę, kurios sulaikymo trukmė tokia pati kaip ir cholestanolio. Tokiu atveju sterolių frakcija turi būti analizuojama du kartus, su vidiniu etalonu ir be jo ►M6 arba vietoje cholestanolio turi būti naudojamas betulinolis ◄ . 5.1.2. Į kolbą įpilama 50 ml 2 mol/l kalio hidroksido tirpalo alkoholyje, prijungiamas grįžtamasis kondensatorius ir kolba ant vandens vonios šildoma iki nestipraus virimo, nuolat stipriai maišant, kol įvyksta muilinimas (tirpalas pasidaro skaidrus). Šildymas tęsiamas dar 20 minučių, paskui per kondensatoriaus viršų įpilama 50 ml distiliuoto vandens, kondensatorius atjungiamas ir kolba ataušinama maždaug iki 30 °C. 5.1.3. Kolbos turinys kiekybiškai supilamas į 500 ml talpos dalijamąjį piltuvą, nuplovimui per kelis kartus sunaudojant maždaug 50 ml distiliuoto vandens. Įpilama maždaug 80 ml dietileterio, turinys stipriai plakamas 30 sekundžių, paskui leidžiama išsisluoksniuoti (1 pastaba). Apatinis vandeninis sluoksnis išleidžiamas į antrąjį dalijamąjį piltuvą. Vandeninis sluoksnis ekstrahuojamas tuo pačiu būdu dar du kartus, kiekvieną kartą sunaudojant 60–70 ml dietileterio. 1 pastaba. Bet kokia susidariusi emulsija gali būti panaikinta, įpurškiant nedidelį kiekį etanolio arba metanolio. 5.1.4. Eteriniai ekstraktai supilami į vieną dalijamąjį piltuvą ir plaunami distiliuotu vandeniu (50 ml vienu kartu), kol plovimo vanduo rodo neutralią reakciją. Atskyrus plovimo vandenis, eterinis ekstraktas džiovinamas virš bevandenio natrio sulfato ir filtruojamas per bevandenį natrio sulfatą į 250 ml talpos kolbą, kuri buvo prieš tai pasverta, dalijamąjį piltuvą ir filtrą nuplaunant nedideliu kiekiu dietileterio. 5.1.5. Eteris garinamas, kol tūris sumažėja iki kelių mililitrų, paskui likutis džiovinamas nedideliame vakuume arba azoto srovėje. Džiovinimas užbaigiamas, laikant maždaug ketvirtį valandos džiovinimo spintoje 100 °C temperatūroje, paskui ataušintas eksikatoriuje likutis pasveriamas.

5.2. Sterolių frakcijos atskyrimas 5.2.1. Ruošiamos bazinės PSC plokštelės. Silikageliu dengtos plokštelės (4.4) 10 sekundžių visiškai įmerkiamos į 0,2 mol/l kalio hidroksido tirpalą (4.5), pakui paliekamos dvi valandas džiūti traukos spintoje ir vėliau vieną valandą laikomos 100 °C temperatūroje džiovinimo spintoje. Plokštelės išimamos iš džiovinimo spintos ir laikomos eksikatoriuje su kalcio chloridu, kol jų prireikia. (Taip apdorotos plokštelės turi būti panaudotos per 15 dienų.) 2 pastaba. Kai sterolių frakcijai atskirti naudojamos bazinės silikagelio plokštelės, nemuilinamų medžiagų nebūtina apdoroti Al2O3, nes visi rūgštinės prigimties junginiai (riebiosios rūgštys ir kiti) sulaikomi užlašinimo linijoje, ir sterolių juosta aiškiai atsiskiria nuo alifatinių ir terpenų alkoholių juostos. 5.2.2. Į ryškinimo indą maždaug 1 cm storio sluoksniu įpilama benzeno ir acetono mišinio, kurio tūrių santykis 95:5. Vietoj šio mišinio gali būti naudojamas heksano ir dietileterio mišinys, kurio tūrių santykis 65:35. Indas uždaromas ir paliekamas ne mažiau kaip pusei valandos pusiausvyrai tarp garų ir skysčio nusistovėti. Ant vidinių indo sienelių gali būti uždedamos filtro popieriaus juostelės. Tai maždaug trečdaliu sutrumpina ryškinimo trukmę ir komponentų išplovimas būna vienodesnis bei pastovesnis. 3 pastaba. Visiškai pakartojamoms ryškinimo sąlygoms užtikrinti, ryškinimo tirpalas turi būti pakeičiamas kiekvienai analizei. 5.2.3. Ruošiamas maždaug 5 % nemuilinamų medžiagų (5.1.5) tirpalas chloroforme, 300 μl šio tirpalo 100 μl talpos mikrošvirkštu užlašinama vienodo ir kuo mažesnio storio juostele ant PSC plokštelės (5.2.1), maždaug per 2 cm nuo jos apačios. Vienoje linijoje su šia juostele užlašinama 2–3 μl sterolių etaloninio tirpalo (4.11) jų juostai identifikuoti ryškinimą užbaigus. 5.2.4. Plokštelė dedama į ryškinimo indą, paruoštą kaip nurodyta 5.2.2 punkte. Palaikoma 15–20 °C aplinkos temperatūra. Indas iš karto uždengiamas ir plaunama, kol tirpiklio frontas atsiduria 1 cm atstumu nuo plokštelės viršaus. Plokštelė išimama iš ryškinimo indo, tirpiklis išgarinamas karšto oro srovėje arba plokštelė trumpam paliekama traukos spintoje. 5.2.5. Plokštelė plonai ir vienodai apipurškiama 2',7'-dichlorfloresceino tirpalu. Žiūrint ultravioletinėje šviesoje, sterolių juosta gali būti atpažinta pagal buvimą viename lygyje su etaloninio tirpalo dėme. Juostos ribos pagal fluorescuojančius kraštus pažymimos juodu pieštuku. 5.2.6. Silikagelis pažymėtame plote nugrandomas metaline mentele. Gerai susmulkinta medžiaga supilama į stiklinį filtrą (3.7). Įpilama 10 ml karšto chloroformo, mišinys kruopščiai sumaišomas metaline mentele ir vakuumu filtruojamas į prie filtro prijungtą kūginę kolbą (3.8). Likutis ant filtro tris kartus plaunamas dietileteriu (maždaug po 10 ml kiekvieną kartą), filtruojant į tą pačia prie filtro prijungtą kolbą. Filtratas nugarinamas maždaug iki 4–5 ml tūrio, likęs tirpalas supilamas į 10 ml talpos mėgintuvėlį (3.9), kuris prieš tai pasveriamas. Mėgintuvėlio turinys džiovinamas nestipriai kaitinant nedidelėje azoto srovėje, iš naujo tirpinamas keliuose acetono lašuose, vėl sausinamas, paskui mėgintuvėlis su likučiu maždaug 10 minučių dedamas į 105 °C temperatūros džiovinimo spintą, išimtas aušinamas eksikatoriuje ir pasveriamas. Likutį mėgintuvėlyje sudaro sterolių frakcija.

5.3. Trimetilsilileterių ruošimas 5.3.1. Į mėgintuvėlį su steroliu frakcija, vengiant bet kokio drėgmės patekimo (5 pastaba), įpilama sililinimo reagento, kurį sudaro piridino, heksametildisilazano ir trimetilchlorsilano mišinys tūrių santykiu 9:3:1 (4 pastaba), vienam sterolių miligramui imant 50 μl mišinio. 4 pastaba. Galima pirkti paruoštų naudoti tirpalų. Yra pirkti kitų sililinimo reagentų, pvz., N,O-bi(trimetilsilil)trifluoracetamido + 1 % trimetilchlorsilano mišinys, kuris turi būti praskiestas tuo pačiu sauso piridino tūriu. 5.3.2. Mėgintuvėlis užkemšamas ir atsargiai kratomas (neapverčiant), kol steroliai visiškai ištirpsta. Po to jis 15 minučių paliekamas stovėti kambario temperatūroje, paskui kelias minutes centrifuguojamas. Skaidrus tirpalas paruoštas dujų chromatografinei analizei. 5 pastaba. Nedidelė opalescencija yra įprastas reiškinys ir nesukelia trukdymų. Baltų dribsnių susidarymas ir rožinė spalva yra drėgmės patekimo arba reagento sugedimo požymiai. Šiuo atveju bandymas pakartojamas.

5.4. Dujų chromatografinė analizė 5.4.1. Paruošiamieji darbai, kolonėlės užpildymas. 5.4.1.1. Kapiliarinė kolonėlė prijungiama prie dujų chromatografo, kolonėlės įėjimą sujungiant per garintuvą su bandinio dozatoriumi, išėjimą – su detektoriumi. Atliekamas bendras dujų chromatografavimo įrenginio patikrinimas (nutekėjimai dujų sistemoje, detektoriaus, dozatoriaus įtaiso ir savirašio veikimas, t. t.). 5.4.1.2. Pirmą kartą naudojamą kapiliarinę kolonėlę rekomenduojama kondicionuoti. Per kolonėlę paleidžiama nestipri dujų nešiklio srovė, paskui įjungiamas chromatografas ir atliekamas laipsniškas kaitinimas, kol temperatūra nepakyla bent 20 °C aukščiau nei naudojama darbe (6 pastabą). Šioje temperatūroje kolonėlė laikoma ne mažiau kaip dvi valandas, vėliau įrenginys nustatomas darbo režimu (reguliuojamas dujų srautas, uždegama ugnis, prijungiamas elektroninis savirašis, nustatoma kapiliarinės kolonėlės krosnies, detektoriaus ir inžektoriaus temperatūra ir t. t.) ir užrašomas signalas bent du kartus didesniu jautrumu, nei bus naudojamas analizei atlikti. Pagrindo linija turi būti brėžiama tiesi, be bet kokio pobūdžio smailių ir dreifo požymių. Neigiamas tiesinis dreifas yra kolonėlės sujungimų nesandarumo požymis, tuo tarpu teigiamas dreifas rodo nepakankamą kolonėlės kondicionavimą. 6 pastaba. Kondicionavimo temperatūra visuomet turi būti bent 20 °C mažesnė, nei naudojamai stacionariai fazei nustatyta didžiausia temperatūra. 5.4.2. Darbo sąlygų parinkimas 5.4.2.1. Orientacinės darbo sąlygos yra tokios: — kolonėlės temperatūra: 260 °C ± 5 oC, — garintuvo temperatūra: 280 °C, — detektoriaus temperatūra: 290 °C, — dujų nešiklio linijinis greitis: helio 20–35 cm/s, vandenilio 30–50 cm/s, — padalinimo santykis nuo 1:50 iki 1:100, — prietaiso jautrumas: 4–16 kartų didesnis nei minimalus silpninimas, — užrašymo jautrumas: 1–2 mV per visą skalę, — popieriaus slinkimo greitis: 30–60 cm/val, — įpurkštos medžiagos kiekis: 0,5–1 μl TMSE tirpalo. Nurodytos sąlygos gali būti keičiamos pagal kolonėlės ir dujų chromatografo savybes, kad būtų gautos chromatogramos, atitinkančios tokias sąlygas: — β-sitosterolio sulaikymo trukmė turi būti 20 ± 5 minutės, — kampesterolio smailės aukštis turi būti: alyvuogių aliejui (vidutinis kiekis 3 %) 15 ± 5 % visos skalės aukščio; sojos aliejui (vidutinis kiekis 20 %) 80 ± 10 % visos skalės aukščio, — visi esantys steroliai turi būti atskirti. Be to, jų smailės turi būti visiškai atsiskyrusios, t. y. smailės trajektorija turi sugrįžti iki pagrindo linijos, kol prasideda kilimas atsiradus naujai smailei. Tačiau nevisiškas atsiskyrimas leidžiamas, jei smailės su santykine sulaikymo trukme 1,02 plotas gali būti apskaičiuotas naudojant statmenį. 5.4.3. Analizė 5.4.3.1. 10 μl talpos mikrošvirkštu įsiurbiama 1μl heksano, paskui 0,5 μl oro ir 0,5–1 μl bandinio tirpalo. Mikrošvirkšto plunžeris pakeliamas aukštyn, kad adata ištuštėtų. Adata įkišama per įpurškimo įtaiso membraną ir po vienos dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas, paskui po kokių penkių sekundžių adata lėtai ištraukiama. 5.4.3.2. Užrašymas atliekamas, kol bus visiškai išplauti esančių sterolių TMSE. Pagrindo linija turi visą laiką atitikti reikalavimus (5.4.1.2). 5.4.4. Smailių identifikavimas Atskirų smailių identifikavimas atliekamas pagal sulaikymo trukmes ir lyginant su etaloniniu TMSE mišiniu, analizuojamu tomis pačiomis sąlygomis. Steroliai išplaunami tokia eilės tvarka: cholesterolis, brasikasterolis, 24-metilencholesterolis, kampesterolis, kampestanolis, stigmasterolis, Δ-7-kampesterolis, Δ-5,23-stigmastadienolis, klerosterolis, β-sitosterolis, sitostanolis, Δ-5-avenasterolis, Δ-5,24-stigmastadienolis, Δ-7-stigmastenolis, Δ-7-avenasterolis. Sitosterolio sulaikymo trukmės kolonėlėje su SE-52 ir SE-54 yra parodytos I lentelėje. 1 ir 2 brėžiniuose vaizduojamos tipiškos kai kurių aliejų chromatogramos. 5.4.5. Kiekybinis vertinimas 5.4.5.1. Naudojant integratorių, apskaičiuojamas β-cholestanolio ir sterolių smailių plotas. Neatsižvelgiama į I lentelėje nenurodytų junginių smailes. β-cholestanolio kalibravimo koeficientas turi būti lygus 1. 5.4.5.2. Kiekvieno sterolio kiekis, skaičiuojant miligramais 100 g riebalinės medžiagos, nustatomas pagal formulę: kurioje: Ax = x sterolio smailės plotas ►M6 ————— ◄ ; As = β -cholestanolio smailės plotas ►M6 ————— ◄ ; ms = įdėto β -cholestanolio masė, miligramais; m = nustatymui paimto bandinio masė, gramais.

6. REZULTATŲ PATEIKIMAS

6.1. Užrašomos atskirų sterolių koncentracijos, miligramais 100 g riebalinės medžiagos, ir jų „bendro kiekio“ vertė.

6.2. Pagal atskiro sterolio smailės ploto santykį su visų sterolių smailių plotu apskaičiuojamas procentinis kiekvieno sterolio kiekis. kurioje: Ax = x sterolio smailės plotas; ΣA = visų sterolių smailių plotas.









PRIEDĖLIS

Dujų linijinio greičio nustatymas

Į normalioms darbo sąlygoms sureguliuotą dujų chromatografą įpurškiama 1–3 μl metano (arba propano) ir matuojamas laikas, kurį dujos užtruks tekėdamos per kolonėlę nuo įpurškimo momento iki smailės išplovimo momento (tM).

Linijinis greitis, cm/s, gaunamas pagal formulę L/tM, kurioje L yra kolonėlės ilgis centimetrais, tM yra sekundėmis išmatuotas laikas.







I lentelė Santykinė sterolių sulaikymo trukmė Smailė Pavadinimas Santykinė sulaikymo trukmė SE 54 kolonėlė SE 52 kolonėlė 1 cholesterolis Δ-5-cholesten-3β-olis 0,67 0,63 2 cholestanolis 5α-cholestan-3β-olis 0,68 0,64 3 brasikasterolis [24S]-24-metil-Δ-5,22-cholestadien-3β-olis 0,73 0,71 4 24-metilencholesterolis 24-metilen-Δ-5,24-cholestadien-3β-olis 0,82 0,80 5 kampesterolis [24R]-24-metil-Δ-5-cholesten-3β-olis 0,83 0,81 6 kampestanolis [24R]-24-metilcholestan-3β-olis 0,85 0,82 7 stigmasterolis [24R]-24-etil-Δ-5,22-cholestadien-3β-olis 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterolis [24R]-24-metil-Δ-7-cholesten-3β-olis 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienolis [24R,S]-24-etil-Δ-5,23-cholestadien-3β-olis 0,95 0,95 10 klerosterolis [24S]-24-etil-Δ-5,25-cholestadien-3β-olis 0,96 0,96 11 β-sitosterolis [24R]-24-etil-Δ-5-cholesten-3β-olis 1,00 1,00 12 sitostanolis 24-etilcholestan-3β-olis 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterolis [24Z]-24-etiliden-5-cholesten-3β-olis 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienolis [24R,S]-24-etil-Δ-5,24-cholestadien-3β-olis 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenolis [24R,S]-24-etil-Δ-7,24-cholestadien-3β-olis 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterolis [24Z]-24-etiliden-Δ-7-cholesten-3β-olis 1,16 1,16

1 brėžinys

Negryninto alyvuogių aliejaus sterolių frakcijos chromatograma

2 brėžinys

Gryninto alyvuogių aliejaus sterolių frakcijos chromatograma









VI PRIEDAS

ERITRODIOLIO IR UVAOLIO NUSTATYMAS

ĮVADAS

Eritrodiolis (paprastai suprantamas kaip du glikoliai, eritrodiolis ir uvaolis, kartu) yra kai kurių rūšių riebalinėms medžiagoms būdingos nemuilinamos frakcijos sudedamoji dalis. Jo ženkliai didesnių koncentracijų randama tirpikliais ekstrahuojamose aliejuose, nei kituose aliejuose, pvz., spaudimo būdu gautame alyvuogių aliejuje ir vynuogių kauliukų aliejuje, kuriuose jo taip pat yra. Taigi eritrodiolio buvimas gali rodyti, kad yra tirpikliais ekstrahuoto aliejaus.

1. TIKSLAS

Šiame metode aprašytas eritrodiolio nustatymo riebalinėse medžiagose būdas.

2. METODO ESMĖ

Riebalinė medžiaga muilinama kalio hidroksido tirpalu etanolyje. Nemuilinama dalis ekstrahuojama dietileteriu ir gryninama leidžiant per kolonėlę su aliuminio oksidu.

Nemuilinamos medžiagos chromatografuojamos plonasluoksnės chromatografijos metodu ant silikagelio plokštelių, kol atskiriamos sterolių ir eritrodiolio frakcijas atitinkančios juostos. Nuo plokštelės regeneruoti steroliai ir eritrodiolis paverčiami trimetilsilileteriais ir mišinys analizuojamas dujų chromatografijos metodu.

Rezultatas apskaičiuojamas eritrodiolio procentiniu kiekiu eritrodiolio ir sterolių mišinyje.

3. APARATŪRA

3.1. V priede aprašyta aparatūra (sterolių kiekio nustatymas).

4. REAGENTAI

4.1. V priede aprašyti reagentai (sterolių kiekio nustatymas).

4.2. Etaloninis 0,5 % eritrodiolio tirpalas chloroforme.

5. DARBO EIGA

5.1. Nemuilinamų medžiagų paruošimas

Kaip aprašyta V priedo 5.1.2 skirsnyje.

5.2. Eritrodiolio ir sterolių frakcijos atskyrimas

5.2.1. Žr. V priedo 5.2.1 skirsnį.

5.2.2. Žr. V priedo 5.2.2 skirsnį.

5.2.3. Ruošiamas maždaug 5 % nemuilinamų medžiagų tirpalas chloroforme. 0,1 ml talpos mikrošvirkštu 0,3 ml šio tirpalo vienodo ir kuo mažesnio storio juostele užlašinama ant chromatografinės plokštelės, maždaug per 1,5 cm nuo jos apačios. Viename plokštelės gale užlašinama keli mikrolitrai etaloninių cholesterolio ir eritrodiolio tirpalų.

5.2.4. Plokštelė dedama į ryškinimo indą, paruoštą kaip nurodyta 5.2.1 punkte. Palaikoma maždaug 20 °C aplinkos temperatūra. Indas iš karto uždengiamas ir plaunama, kol tirpiklio frontas atsiduria 1 cm atstumu nuo plokštelės viršaus. Plokštelė išimama iš ryškinimo indo, tirpiklis išgarinamas karšto oro srovėje.

5.2.5. Plokštelė plonai ir vienodai apipurškiama 2',7'-dichlorfloresceino tirpalu alkoholyje. Žiūrint ultravioletinėje šviesoje, sterolių ir eritrodiolio juostos gali būti atpažintos pagal buvimą viename lygyje su etaloninių tirpalų dėmėmis. Fluorescuojančios vietos pažymimos išilgai kraštų.

5.2.6. Silikagelis pažymėtame plote nugrandomas metaline mentele. Medžiaga nuo plokštelės supilama į 50 ml kolbą. Įpilama 15 ml karšto chloroformo, gerai sumaišoma ir filtruojama per stiklinį filtrą, silikagelį supilant ant filtro. Filtras tris kartus plaunamas chloroformu (maždaug po 10 ml kiekvieną kartą), filtratas kaupiamas 100 ml kolboje. Filtratas nugarinamas iki 4–5 ml tūrio, tirpalas supilamas į 10 ml talpos graduotą centrifugavimo mėgintuvėlį su kūginės formos dugnu. Mėgintuvėlio turinys džiovinamas nestipriai kaitinant azoto srovėje ir pasveriamas.

5.3. Trimetilsilileterių ruošimas

Kaip aprašyta V priedo 5.3 skirsnyje.

5.4. Dujų chromatografinė analizė

Kaip aprašyta anksčiau minėto metodo aprašymo 5.4 skirsnyje. Analizuojant chromatografo darbo sąlygos turi būti tokios, kad būtų galima atlikti sterolių analizę ir atskirti jų TMSE (trimetilsilileterius) nuo eritrodiolio ir uvaolio.

Įšvirkštus bandinį, užrašymas tęsiamas, kol, išplovus sterolius, išplaunami eritrodiolis ir uvaolis. Tuomet identifikuojamos smailės (santykinės eritrodiolio ir uvaolio sulaikymo trukmės pagal β-sitosterolį yra atitinkamai apie 1,45 ir 1,55) ir nustatomas jų plotas, kaip tai daroma sterolių atveju.

6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

kurioje:

A1 = eritrodiolio smailės plotas ►M6 ————— ◄ ;

A2 = uvaolio smailės plotas ►M6 ————— ◄ ;

ΣAsterolių = visų sterolių smailių plotas ►M6 ————— ◄ .

Rezultatas pateikiamas vieno ženklo po kablelio tikslumu.

▼M21









VII PRIEDAS

2-GLICERIL MONOPALMITATO PROCENTINIO KIEKIO NUSTATYMAS

1. TIKSLAS IR TAIKYMO SRITIS

Aprašyti analitinę procedūrą 2-oje triglicerido padėtyje esančios palmitino rūgšties procentinei daliai apskaičiuoti, nustatant 2-glicerilo monopalmitato kiekį.

Šis metodas taikomas aplinkos temperatūros (20 °C) skystiems augaliniams aliejams.

2. METODO ESMĖ

Paruoštas aliejaus mėginys veikiamas kasos lipaze: dėl dalinės ir specifinės 1 bei 3 padėties triglicerido molekulės hidrolizės monogliceridai atsiranda 2-oje padėtyje. Procentinis 2-glicerilo monopalmitato kiekis monoglicerido frakcijoje nustatomas kapiliarinės dujų chromatografijos metodu, prieš tai atlikus sililinimą.

3. ĮRANGA IR MEDŽIAGOS

3.1. 25 ml Erlenmejerio kolba

3.2. 100, 250 ir 300 ml cheminės stiklinės

3.3. Stiklinė chromatografijos kolonėlė su deginto stiklo disku ir čiaupu, kurios vidinis skersmuo 21–23 mm, ilgis 400 mm.

3.4. 10, 50, 100 ir 200 ml matavimo cilindrai

3.5. 100 ir 250 ml kolbos

3.6. Sukamasis garintuvas

3.7. 10 ml centrifugavimo mėgintuvėliai su kūginės formos dugnu, uždaromi matinio stiklo kamščiu

3.8. Centrifuga 10 ir 100 ml mėgintuvėliams

3.9. Termostatas, kuriame galima palaikyti 40 + 0,5 °C temperatūrą

3.10. 1 ir 2 ml graduotos pipetės

3.11. 1 ml poodinis švirkštas

3.12. 100 μl mikrošvirkštas

3.13. 1 000 ml talpos piltuvas

3.14. Kapiliarinis dujų chromatografas su šalto tiesioginio įpurškimo įtaisu mėginiui tiesiogiai į kolonėlę patalpinti, ir krosnis, kurioje norimą temperatūrą galima palaikyti apytiksliai 1 °C tikslumu

3.15. Šalto tiesioginio įpurškimo įtaisas mėginiui tiesiogiai į kolonėlę patalpinti

3.16. Liepsnos jonizacinis detektorius ir elektrometras

3.17. Kintamo popieriaus tiekimo greičio savirašis integratorius, dirbantis su elektrometru, kurio atsako sparta ne didesnė kaip viena sekundė

3.18. 8–12 m ilgio ir 0,25–0,32 mm vidinio skersmens stiklinė arba kvarcinio stiklo kapiliarinė kolonėlė, padengta 0,10–0,30 μm storio metilpolisiloksano arba 5 % fenil metilpolisiloksano plėvele. Kolonėlė gali būti naudojama 370 °C temperatūroje.

3.19. 10 μl mikrošvirkštas su ne trumpesne kaip 7,5 cm kietinta adata, pritaikytas mėginiui tiesiogiai įšvirkšti į kolonėlę.

4. REAGENTAI

4.1. Silikagelis, kurio granulių dydis 0,063–0,200 mm (70/280 mešų), paruoštas taip: silikagelis dedamas į porcelianinį indą, 4 valandas džiovinamas 160 °C džiovinimo spintoje, po to eksikatoriuje vėsinamas iki kambario temperatūros. Įpilama 5 % (silikagelio masės) vandens: Erlenmejerio kolboje pasveriama 152 g silikagelio ir įpilama 8 g distiliuoto vandens, kolba užkemšama ir atsargiai pakratoma, kad vanduo tolygiai pasiskirstytų. Prieš naudojant paliekama nusistovėti ne mažiau kaip 12 valandų.

4.2. n-heksanas, tinkamas chromatografijai

4.3. Izopropanolis

4.4. Izopropanolis, 1/1 vandeninis tirpalas (v/v)

4.5. Kasos lipazė. Naudojamos lipazės aktyvumas turi būti nuo 2,0 iki 10 lipazės vienetų/mg (Rinkoje prekiaujama kasos lipaze, kurios aktyvumas nuo 2 iki 10 vienetų 1 mg fermento).

4.6. Buferinis tri(hidroksimetil)aminometano tirpalas: 1 M vandeninis tirpalas parūgštinamas iki pH 8 (potenciometrinis patikrinimas) koncentruotu HCl (1:1 v/v)

4.7. Natrio choliato (fermentų kokybės) 0,1 % vandeninis tirpalas (šis tirpalas turi būti sunaudotas per 15 dienų nuo jo paruošimo)

4.8. Kalcio chlorido 22 % vandeninis tirpalas

4.9. Dietileteris, tinkamas chromatografijai

4.10. Judančioji fazė: n-heksano ir dietileterio (87/13) (v/v) mišinys

4.11. Natrio hidroksido 12 % (svorio procentais) tirpalas

4.12. Fenolftaleino 1 % tirpalas etanolyje

4.13. Nešančiosios dujos: helis arba vandenilis, tinkamas dujų chromatografijai

4.14. Pagalbinės dujos: ne mažesnio kaip 99 % grynumo vandenilis, išvalytas nuo drėgmės ir organinių medžiagų, ir tokio pat grynumo oras, tinkamas dujų chromatografijai.

4.15. Sililinizavimo reagentas: piridino, heksametildisilazano ir trimetilchlorsilano mišinys santykiu 9:3:1 (v/v/v). (Rinkoje prekiaujama naudoti paruoštais tirpalais. Gali būti naudojami kiti sililinimo reagentai, pvz., N,O-bi(trimetilsilil)trifluoracetamido + 1 % trimetilchlorsilano mišinys, praskiestas tuo pačiu sauso piridino tūriu).

4.16. Etaloniniai tirpalai: grynieji monogliceridai arba monogliceridų mišiniai, kurių procentinė sudėtis yra artima tiriamų mėginių sudėčiai.

5. DARBO EIGA

5.1. Mėginio paruošimas

5.1.1. Taikant silikagelio kolonėlinę chromatografiją aliejams, kuriuose laisvųjų rūgščių kiekis mažesnis kaip 3 %, jų neutralizuoti nereikia. Aliejai, kuriuose laisvųjų rūgščių kiekis didesnis kaip 3 %, turi būti neutralizuojami pagal 5.1.1.1. punktą. 5.1.1.1. Į 1 000 ml talpos piltuvą (3.13) įpilama 50 g aliejaus ir 200 ml n-heksano. Įpilama 100 ml izopropanolio ir 12 % natrio hidroksido tirpalo (4.11). Įpilamas natrio hidroksido tirpalo kiekis, atitinka aliejaus laisvųjų rūgščių kiekį, padidintą 5 %. Vieną minutę stipriai kratoma. Įpilama 100 ml distiliuoto vandens, vėl kratoma ir paliekama nusistovėti. Atlikus dekantavimą, apatinis muilo sluoksnis pašalinamas. Išleidžiamas tarpinis sluoksnis (gleivės, netirpios medžiagos). Neutralizuoto aliejaus tirpalas heksane plaunamas izopropanolio ir vandens tirpalo (1:1 (v/v)) (4.4) 50–60 ml porcijomis, kol pranyksta rožinė fenolftaleino spalva. Didesnioji heksano dalis pašalinama distiliuojant vakuume (pvz., naudojant sukamąjį garintuvą) ir aliejus perpilamas į 100 ml kolbą (3.5). Aliejus džiovinamas vakuume, kol tirpiklio visiškai nebelieka. Baigus šią procedūrą, aliejaus rūgštingumas turi būti ne didesnis kaip 0,5 %.

5.1.2. Į 25 ml talpos Erlenmejerio kolbą (3.1) įpilama 1,0 g aliejaus, paruošto anksčiau minėtu būdu, ir ištirpinama 10 ml judančiosios fazės (4.10) mišinio. Tirpalas, prieš atliekant silikagelio kolonėlinę chromatografiją, paliekamas nusistovėti ne trumpiau kaip 15 minučių. Jei tirpalas drumstas, jis centrifuguojamas, siekiant sudaryti optimalias sąlygas chromatografijai. (Gali būti naudojama 500 mg naudoti paruoštų SPE silikagelio kapsulių).

5.1.3. Chromatografinės kolonėlės paruošimas Į kolonėlę (3.3) įpilama apie 30 ml judančiosios fazės (4.10), stikline lazdele į kolonėlės apačią įkišamas ir paspaudžiamas gabalėlis vatos, kad išeitų oras. Cheminėje stiklinėje paruošiama 80 g judančiosios fazės ir 25 g silikagelio (4.1) suspensija ir naudojant piltuvą supilama į kolonėlę. Patikrinama, ar į kolonėlę supiltas visas silikagelio kiekis; išplaunama judančiąja faze (4.10), atsukamas čiaupas ir skystis turi pasiekti 2 mm lygį virš silikagelio.

5.1.4. Kolonėlinė chromatografija 25 ml talpos Erlenmejerio kolboje (3.1.) tiksliai pasveriama 1,0 g pagal 5.1 punktą paruošto mėginio. Mėginys ištirpinamas 10 ml judančiosios fazės (4.10). Tirpalas supilamas į chromatografinę kolonėlę, paruoštą pagal 5.1.3 punktą. Kolonėles paviršiaus stengiamasi nejudinti. Atsukamas čiaupas ir mėginio tirpalui leidžiama tekėti, kol jis pasiekia silikagelio lygį. Procesas tęsiamas, naudojant 150 ml judančiosios fazės. Nustatomas 2 ml/min tekėjimo greitis (taip, kad 150 ml iš kolonėlės ištekėtų per 60–70 min). Į iš anksto pasvertą 250 ml talpos kolbą surenkamas eliuatas. Tirpiklis išgarinamas vakuume ir jo likučiai pašalinami azoto srove. Kolba pasveriama ir apskaičiuojamas išgautas ekstrakto kiekis. Jei naudojamos naudoti paruoštos SPE silikagelio kapsulės, į iš anksto su 3 ml n-heksano paruoštas kapsules įpilama 1 ml tirpalo (5.1.2.). Tirpalas filtruojamas ir veikiamas 4 ml n-heksano ir dietileterio (9/1) (v/v) mišiniu. Eliuatas surenkamas į 10 ml talpos mėgintuvėlį ir išdžiovinamas azoto srovėje. Sausas likutis apdorojamas kasos lipaze (5.2). Prieš ir po SPE kapsulių naudojimo labai svarbu patikrinti riebiųjų rūgščių sudėtį.).

5.2. Hidrolizė kasos lipaze

5.2.1. Centrifugavimo mėgintuvėlyje pasveriama 0,1 g pagal 5.1. punktą paruošto aliejaus. Įpilama 2 ml buferinio tirpalo (4.6), 0,5 ml natrio choliato tirpalo ir 0,2 ml kalcio chlorido tirpalo (4.7), įpylus kiekvieną iš šių tirpalų, gerai išmaišoma. Mėgintuvėlis uždaromas matinio stiklo kamščiu ir dedamas į termostatą, kuriame palaikoma 40 ± 0,5 °C temperatūra.

5.2.2. Įdedama 20 mg lipazės, atsargiai pakratoma (taip, kad nesudrėktų kamštis) ir mėgintuvėlis įdedamas į termostatą lygiai 2 min, po to iš jo išimamas, stipriai kratomas lygiai 1 min ir paliekamas atvėsti.

5.2.3. Įpilama 1 ml dietileterio, užkemšama ir smarkiai kratoma, po to centrifuguojama ir eterio tirpalas mikrošvirkštu perpilamas į švarų ir sausą mėgintuvėlį.

5.3. Sililinizuotų darinių ir dujų chromatografijos paruošimas

5.3.1. Į 10 ml talpos mėgintuvėlį su kūginės formos dugnu mikrošvirkštu įšvirkščiama 100 μl tirpalo (5.2.3).

5.3.2. Tirpiklis pašalinamas nestipria azoto srove, įpilama 200 μl sililinizavimo reagento (4.15), mėgintuvėlis užkemšamas ir 20 minučių paliekamas nusistovėti.

5.3.3. Po 20 minučių, įpilama 1–5ml n-heksano (atsižvelgiant į chromatografines sąlygas): gautas tirpalas yra paruoštas dujų chromatografinei analizei.

5.4. Dujų chromatografija

Darbo sąlygos:

— inžektoriaus (tiesioginio įpurškimo įtaiso) temperatūra žemesnė nei tirpiklio virimo temperatūra (68 °C),

— detektoriaus temperatūra: 350 °C,

— kolonėlės temperatūra: krosnies temperatūros nustatymas: 60 °C 1 minutę, po to kas minutę didinama po 15 °C, kol pasiekiama 180 °C, po to kas minutę didinama po 5 °C, kol pasiekiama 340 °C, tuomet 340 °C temperatūra palaikoma 13 minučių,

— nešančiosios dujos: vandenilis arba helis, naudojami nustačius atitinkamą linijinį greitį, kad būtų pasiekta 1 paveiksle pavaizduota skiriamoji geba. Triglicerido C54 sulaikymo trukmė turi būti 40 ± 5 minutės (žr. 2 paveikslą). (Nurodytos sąlygos yra orientacinės. Operatoriai turi jas optimizuoti, kad būtų pasiekta pakankama skiriamoji geba. Glicerino monopalmitatą atitinkančios smailės minimalus aukštis turi būti ne mažesnis kaip 10 % savirašio skalės),

— įpurkštas medžiagos kiekis: 0,5–1 μl (5 ml) n-heptano tirpalo (5.3.3.).

5.4.1. Smailių identifikavimas

Monogliceridai identifikuojami pagal sulaikymo trukmes ir šias trukmes lyginant su standartinių monogliceridų mišinių sulaikymo trukmėmis, analizuojamomis tomis pačiomis sąlygomis.

5.4.2. Kiekybinis vertinimas

Kiekvienos smailės plotas apskaičiuojamas elektroniniu integratoriumi.

6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

Procentinis glicerilo monopalmitato kiekis apskaičiuojamas pagal atitinkamos smailės ploto santykį su visų monogliceridų smailių plotu (žr. 2 paveikslą), taikant tokią formulę:

kurioje:

Ax = Glicerino monopalmitatą atitinkančios smailės plotas

ΣA = visų monoglicerido smailių plotų suma.

Rezultatai pateikiami vieno ženklo po kablelio (dešimtųjų) tikslumu.

7. ANALIZĖS ATASKAITA

Analizės ataskaitoje pateikiama:

— nuoroda į šį metodą,

— išsami pilnam mėginio identifikavimui reikalinga informacija,

— analizės rezultatas,

— bet kokie nukrypimai nuo metodo, padaryti atitinkamoms šalims nusprendus ar dėl kitų priežasčių,

— laboratorijos identifikavimo duomenys, analizės atlikimo data ir už analizę atsakingo asmens parašas.

1 paveikslas

Sililinizavimo reakcijos produktų, gautų rafinuotą alyvuogių aliejų su 20 % esterifikuoto aliejaus (100 %) priedu, paveikus lipaze, chromatograma

Paaiškinimas: Acides gras libres – Laisvosios riebalų rūgštys; Huile d’olives raffinée + 20 % huile estérifiée – Rafinuotas alyvuogių aliejus + 20 % esterifikuoto aliejaus; 1–2 monopalmitoléine – 1–2 monopalmitoleinas; 1–2 monopalmitine – 1–2 monopalmitinas; 1–2 mono C18 insat. – 1–2 mono C18 neprisot; Squalene – Skvalenas.

2 paveikslas

Chromatograma:

A) neesterifikuotas alyvuogių aliejus po poveikimo lipaze; po sililinizavimo; tokiomis sąlygomis (8–12 m ilgio kapiliarinė kolonėlė) vaškų frakcija išplaunama tuo pačiu metu arba truputį vėliau nei digliceridų frakcija. Paveikus lipaze trigliceridų kiekis neturėtų viršyti 15 % Paaiškinimas: 1 = Laisvosios riebalų rūgštys 2 = Monogliceridai 3 = Digliceridai 4 = Trigliceridai * = 2-monopalmitinas ** = Trigliceridas C54

Chromatograma:

B) esterifikuotas aliejus po poveikio lipaze; po sililinizavimo; tokiomis sąlygomis (8–12 m ilgio kapiliarinė kolonėlė) vaškų frakcija išplaunama tuo pačiu metu arba truputį vėliau nei digliceridų frakcija. Paveikus lipaze trigliceridų kiekis neturėtų viršyti 15 % Paaiškinimas: 1 = Laisvosios riebalų rūgštys 2 = Monogliceridai 3 = Digliceridai 4 = Trigliceridai * = 2-monopalmitinas ** = Trigliceridas C54

8. PASTABOS

Rinkoje prekiaujama naudoti paruošta pakankamo aktyvumo lipaze. Lipazę taip pat galima paruošti laboratorijoje:

0 °C temperatūroje atšaldoma 5 kg šviežios kiaulių kasos. Pašalinami aplinkui esantys kieti riebalai bei apie juos esantis jungiamasis audinys, sumalama, kad susidarytų pastos pavidalo skysta masė. Ši pasta keturias-šešias valandas kratoma su 2,5 l absoliučiojo acetono ir centrifuguojama. Likutis dar tris kartus ekstrahuojamas tuo pačiu acetono tūriu, paskui du kartus 1:1 (v/v) acetono ir dietileterio mišiniu ir du kartus dietileteriu.

Likutis 48 valandas džiovinamas vakuume, tam kad gauti milteliai būtų patvarūs. Tokie milteliai, apsaugant juos nuo drėgmės, gali būti laikomi ilgą laiką šaldytuve.

Alyvuogių aliejaus emulsija ruošiama taip:

Maišytuve 10 minučių plakamas mišinys, sudarytas iš 165 ml gumiarabiko tirpalo (100 g/l), 15 g smulkinto ledo ir 20 ml neutralizuoto alyvuogių aliejaus.

Į 50 ml talpos cheminę stiklinę įpilama 10 ml šios emulsijos, po to 0,3 ml natrio choliato tirpalo (0,2 g/ml) ir 20 ml distiliuoto vandens.

Cheminė stiklinė dedama į termostatą, kuriame palaikoma 37 °C temperatūra; įstatomi pH matuoklio elektrodai ir sraigtinis maišiklis.

Biurete lašinamas natrio hidroksido tirpalas, kol pH pasiekia 8,3.

Į vandenį įpilama lipazės miltelių suspensijos (0,1 g/ml lipazės). Kai tik pH matuoklis parodo 8,3, paleidžiamas chronometras ir natrio hidroksido tirpalas lašinamas tokiu greičiu, kad pH visą laiką būtų 8,3. Kas minutę pasižymimas sunaudoto tirpalo tūris.

Matavimai pavaizduojami x/y koordinačių sistemoje, abscisėje nurodant laiką, o ordinatėje – sunaudoto 0,1 N natrio hidroksido tūrį (mililitrais), kuris sunaudotas pastoviam pH išlaikyti. Turi būti gaunamas linijinis grafikas.

Lipazės aktyvumas, matuojamas lipazės vienetais/mg, apskaičiuojamas pagal tokią formulę:

kurioje:

A aktyvumas, išreikštas lipazės vienetais/mg

V 0,1 N natrio hidroksido tirpalo mililitrų skaičius per minutę (apskaičiuotas pagal grafiką)

N natrio hidroksido tirpalo molinė ekvivalentų koncentracija

m analizuojamos lipazės mėginio masė, mg.

Lipazės vienetas yra apibrėžiamas kaip fermento kiekis, kuris išskiria 10 mikroekvivalentų rūgšties per minutę.

▼M20 —————

▼B









IX PRIEDAS

SPEKTROFOTOMETRINIS TYRIMAS ULTAVIOLETINĖJE SPEKTRO DALYJE

ĮŽANGA

Spektrofotometrinis tyrimas ultravioletinėje spektro dalyje gali suteikti informacijos apie riebalų kokybę, jų išsilaikymo būklę ir technologinių procesų metu įvykusius pasikeitimus.

Absorbcija metode nurodytų bangų ilgių srityje vyksta dėl konjuguotų dienų ir trienų sistemų buvimo. Ši absorbcija reiškiama savitosios ekstinkcijos E1 % 1 cm pavidalu (1 cm sluoksnio storio 1 % riebalų tirpalo tam tikrame tirpiklyje ekstinkcija), pagal susitarimą žymimos K raide (taip pat vadinamos „ekstinkcijos koeficientu“).

1. TIKSLAS

Metode aprašyta riebalų tyrimo ultravioletinėje spektro dalyje atlikimo metodika.

2. METODO ESMĖ

Analizuojami riebalai ištirpinami reikiamame tirpiklyje, paskui, esant nustatytam bangos ilgiui, matuojama šio tirpalo ekstinkcija, lyginant su grynu tirpikliu. Pagal spektrofotometrinius duomenis skaičiuojamos savitosios ekstinkcijos vertės.

3. APARATŪRA

3.1. Spektrofotometras ekstinkcijai ultravioletinėje spektro dalyje tarp 220 ir 360 nm matuoti su galimybe turėti nanometro eilės rodmenis.

3.2. Stačiakampės 1 cm storio kiuvetės iš kvarcinio stiklo, su dangčiais. Ekstinkcijos skirtumas tarp vandeniu arba kitu tinkamu tirpikliu užpildytų kiuvečių neturi būti didesnis kaip 0,01 ekstinkcijos vieneto.

3.3. 25 ml talpos matavimo kolbos.

▼M6

3.4. Chromatografinė kolonėlė, kurios viršutinės dalies ilgis 270 mm, skersmuo 35 mm, apatinės dalies ilgis 270 mm, skersmuo maždaug 10 mm.

▼B

4. REAGENTAI

4.1. Spektrofotometriškai grynas izooktanas (2,2,4-trimetilpentanas). Pagal distiliuotą vandenį jo pralaidumas turi būti ne mažesnis kaip 60 %, esant 220 nm, ir ne mažesnis kaip 95 %, esant 250 nm, arba — spektrofotometriškai grynas cikloheksanas: pagal distiliuotą vandenį jo pralaidumas turi būti ne mažesnis kaip 40 %, esant 220 nm, ir ne mažesnis kaip 95 %, esant 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Bazinis aliuminio oksidas kolonėlinei chromatografijai, paruoštas ir tikrinamas kaip aprašyta I priedėlyje.

4.3. Chromatografijai tinkamas n-heksanas.

5. DARBO EIGA

5.1. Analizuojamas bandinys turi būti visiškai vienalytis ir be įtartinų priemaišų. Kambario temperatūroje skystas aliejus turi būti nufiltruotas per filtro popierių, esant maždaug 30 °C temperatūrai. Kieti riebalai turi būti homogenizuoti ir nufiltruoti, esant temperatūrai ne aukštesnei kaip 10 °C virš lydymosi temperatūros.

5.2. Apie 0,25 g taip paruošto bandinio tiksliai pasveriama 25 ml matavimo kolboje, praskiedžiama iki žymės nurodytu tirpikliu ir sumaišoma. Gautas tirpalas turi būti visiškai skaidrus. Jei atsiranda opalescencija arba drumstumas, reikia greitai nufiltruoti per filtro popierių.

5.3. Kiuvetė užpildoma gautu tirpalu ir, esant reikiamam bangos ilgiui tarp 232 ir 276 nm, matuojama tirpalo ekstinkcija, palyginimui naudojant tirpiklį. Gaunamos ekstinkcijos vertės turi būti 0,1–0,8 dydžių intervale. Jei taip nėra, matavimai turi būti pakartoti, naudojant kur reikia labiau praskiestus arba labiau koncentruotus tirpalus.

5.4. Kai reikia nustatyti savitąją ekstinkciją po apdorojimo aliuminio oksidu, daroma taip: 30 g bazinio aliuminio oksido suspensijos heksane supilama į chromatografinę kolonėlę. Absorbentui nusėdus, heksano perteklius išleidžiamas maždaug iki 1 cm lygio virš aliuminio oksido sluoksnio viršaus. 10 g riebalų, homogenizuotų ir nufiltruotų kaip aprašyta 5.1 punkte, tirpinama 100 ml heksano ir tirpalas supilamas į kolonėlę. Eliuatas surenkamas, visas tirpiklis išgarinamas vakuume, esant žemesnei kaip 25 °C temperatūrai. Su taip gautais riebalais iš karto daroma kaip nurodyta 5.2 punkte.

6. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

6.1. Užrašomos savitųjų ekstinkcijų (ekstinkcijos koeficientų) vertės, kurios įvairiems bangų ilgiams apskaičiuojamos pagal formulę: kurioje: Kλ = savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui λ; Eλ = ekstinkcija, išmatuota esant bangos ilgiui λ; c = tirpalo koncentracija g/100 ml; s = kiuvetės storis, cm. Rezultatai turi būti pateikiami dviejų ženklų po kablelio tikslumu.

6.2. Atliekant spektrofotometrinę alyvuogių aliejaus analizę pagal oficialų metodą, aprašytą EEB reglamentuose, savitąją ekstinkciją nurodyta matuoti izooktano tirpale, esant 232 ir 270 nm bangos ilgiams, ir nustatyti ΔK, kuris apibrėžiamas lygtimi: kurioje Km yra savitoji ekstinkcija esant bangos ilgiui m. Tai didžiausios absorbcijos 270 nm srityje bangos ilgis.









I PRIEDĖLIS

Aliuminio oksido ruošimas ir jo aktyvumo tikrinimas

A.1.1. Aliuminio oksido ruošimas

Aliuminio oksidas, prieš tai krosnyje džiovintas tris valandas 380–400 °C temperatūroje, supilamas į hermetiškai uždaromą indą, įpilama distiliuoto vandens, santykiu 5 ml vandens 100 g aliuminio oksido, indas tuojau pat uždaromas, kelis kartus pakratomas ir prieš naudojant paliekamas stovėti mažiausiai 12 valandų.

A.1.2. Aliuminio oksido aktyvumo tikrinimas

Paruošiama chromatografinė kolonėlė su 30 g aliuminio oksido. Pagal 5.4 punkte pateiktą aprašymą, per kolonėlę leidžiamas mišinys, sudarytas iš:

— 95 % pirmo spaudimo alyvuogių aliejaus, kurio savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui 268 nm, mažesnė kaip 0,18,

— 5 % gryninimo procese diatomitu apdoroto žemės riešutų aliejaus, kurio savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui 268 nm,

ne mažesnė kaip 4.

Jei, mišiniui praėjus per kolonėlę, jo savitoji ekstinkcija, esant bangos ilgiui 268 nm, yra didesnė kaip 0,11, aliuminio oksidas tinkamas naudoti, jei ne – jame reikia sumažinti vandens kiekį.









II PRIEDĖLIS

Spektrofotometro kalibravimas

A.2. Po tam tikro laiko tarpo (ne rečiau kaip kas šeši mėnesiai) turi būti tikrinamos prietaiso bangos ilgio ir tikslumo savybės.

A.2.1. Bangos ilgis gali būti tikrinamas, naudojant gyvsidabrio garų lempą arba atitinkamus filtrus.

A.2.2. Norint patikrinti fotocelės ir fotodaugintuvo veikimą, daroma taip: pasveriama 0,2000 g spektrofotometriškai gryno kalio chromato, ištirpinama 1 000 ml talpos matavimo kolboje 0,05 N kaliohidroksido tirpale ir praskiedžiama iki žymės. Paimama lygiai 25 ml gauto tirpalo ir tuo pačiu kalio hidroksido tirpalu 500 ml talpos matavimo kolboje praskiedžiama iki žymės. Esant bangos ilgiui 275 nm, matuojama tokiu būdu gauto tirpalo ekstinkcija, palyginamuoju tirpalu naudojant kalio hidroksido tirpalą. 1 cm storio kiuvetėje išmatuota ekstinkcijos vertė turi būti 0,200 ± 0,005.









X A PRIEDAS

RIEBIŲJŲ RŪGŠČIŲ METILESTERIŲ ANALIZĖ DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1. TIKSLAS

Šiame metode aprašyti bendri nurodymai, kaip taikyti dujų chromatografiją su užpildomomis arba kapiliarinėmis kolonėlėmis, nustatant pagal X B priede nurodytą metodą gautų riebiųjų rūgščių metilesterių kokybinę ir kiekybinę sudėtį.

Metodas netinka polimerizuotoms riebiosioms rūgštims.

2. REAGENTAI

2.1. Dujos nešiklis

Inertinės dujos (azotas, helis, argonas, vandenilis ir t. t), visiškai išdžiovintos, turinčios mažiau kaip 10 mg/kg deguonies.

1 pastaba.

Vandenilis, kuris kaip dujos nešiklis naudojamas tik kapiliarinėse kolonėlėse, gali du kartus padidinti analizės greitį, tačiau yra pavojingas. Galima pirkti saugių įtaisų.

2.2. Pagalbinės dujos

2.2.1. Vandenilis (grynumas ≥ 99,9 %), neturintis organinių priemaišų.

2.2.2. Oras arba deguonis, neturintys organinių priemaišų.

2.3. Palyginamasis etalonas

Grynų riebiųjų rūgščių metilesterių mišinys arba žinomos sudėties riebalų, geriausiai tokių, kurie yra panašūs į analizuojamą riebalinę medžiagą, metilesteriai.

Reikia imtis atsargumo priemonių, kad būtų išvengta nesočiųjų riebiųjų rūgščių su dideliu dvigubų jungčių skaičiumi oksidacijos.

3. APARATŪRA

Pateikiamuose nurodymuose kalbama apie įprastą įrangą, kuri naudojama dujų chromatografijoje, turinčią užpildomas ir (arba) kapiliarines kolonėles ir dujų jonizacinį detektorių. Tinka bet koks prietaisas, kuriuo gaunamas 4.1.2 punkte nurodytas efektyvumas ir atskiriamoji galia.

3.1. Dujų chromatografas

Dujų chromatografą sudaro:

3.1.1. Įpurškimo įtaisas

Įpurškimo įtaisas naudojamas:

a) su užpildytomis kolonėlėmis, turinčiomis kuo mažesnį nenaudingą tūrį (šiuo atveju įpurškimo įtaisą būtų galima kaitinti iki temperatūros, 20–50 °C aukštesnės nei kolonėlės temperatūra); arba

b) su kapiliarinėmis kolonėlėmis, kurių atveju įpurškimo įtaisas kuriamas specialiai darbui su jomis. Jis gali būti su bandinio dozatoriumi arba tiesioginio kolonėlės inžektoriaus tipo be bandinio padalinimo.

2 pastaba. Kai nėra mažiau kaip 16 atomų turinčių riebiųjų rūgščių, galima naudoti išimamą adatinį inžektorių.

3.1.2. Krosnis

Krosnis turi įkaitinti kolonėlę bent iki 260 °C ir pasirinktą temperatūrą užpildomose kolonėlėse palaikyti 1 °C tikslumu, kapiliarinėse kolonėlėse – 0,1 °C tikslumu. Pastarasis reikalavimas ypač svarbus, kai naudojamas lydyto kvarco vamzdis.

Visais atvejais rekomenduojamas programuotos temperatūros kaitinimo režimas, ypač kai analizuojamos rūgštys, turinčios mažiau kaip 16 anglies atomų.

3.1.3. Užpildoma kolonėlė

3.1.3.1. Kolonėlė pagaminta iš medžiagų, inertiškų analizuojamiems junginiams (t. y. iš stiklo arba nerūdijančio plieno), kurios matmenys tokie: a) ilgis: 1–3 m. Kai yra riebiųjų rūgščių su ilga anglies atomų grandine (ilgesne nei C20), turi būti naudojama palyginus trumpa kolonėlė. Kai analizuojamos rūgštys su 4–6 anglies atomais, rekomenduojama naudoti 2 m ilgio kolonėlę; b) vidinis skersmuo: 2–4 mm. 3 pastaba. Jei yra nesočiųjų junginių su daugiau kaip trimis dvigubomis jungtimis, jie kolonėlėje iš nerūdijančio plieno gali suskilti. 4 pastaba. Gali būti naudojama sistema su dviem užpildomomis kolonėlėmis.

3.1.3.2. Užpildymas, susidedantis iš tokių elementų: a) kieto nešiklio: rūgštyje plauto ir silanizuoto diatomito arba kito tinkamo inertiško kieto nešiklio su siauru grūdėtumo intervalu (25 μm intervalas 125–200 μm dalelių dydžio ribose), vidutiniam grūdelių dydžiui esant susietam su kolonėlės vidiniu skersmeniu ir ilgiu; a) nejudančiosios fazės: poliško poliesterių tipo skysčio (pvz., dietilenglikolio polisukcinato, butandiolio polisukcinato, etilenglikolio poliadipato ir t. t.), cianpolisiloksanų arba kurio nors kito skysčio, užtikrinančio reikiamą chromatografinį atskyrimą (žr. 4 punktą). Nejudančioji fazė turi sudaryti 5–20 % (m/m) užpildymo masės. Kai kuriems atskyrimams galima naudoti nepolišką nejudančiąją fazę.

3.1.3.3. Kolonėlės kondicionavimas Kolonėlei esant atjungtai, jei tai įmanoma, nuo detektoriaus, krosnis laipsniškai kaitinama iki 185 °C ir, esant šiai temperatūrai, per iš naujo užpildytą kolonėlę bent 16 valandų 20–60 ml/min. greičiu leidžiama inertinių dujų srovė, vėliau dar dvi valandas, temperatūrą pakėlus iki 195 °C.

3.1.4. Kapiliarinė kolonėlė

3.1.4.1. Vamzdis pagamintas iš medžiagos, inertiškos analizuojamoms medžiagoms (paprastai stiklinio arba lydyto kvarco). Vidinis skersmuo yra 0,2–0,8 mm. Prieš padengiant nejudančiąja faze, vidinis paviršius atitinkamai apdorojamas (pvz., paviršius paruošiamas, inaktyvinamas). Daugeliu atvejų užtenka 25 mm ilgio vamzdžio.

3.1.4.2. Nejudančioji fazė paprastai yra poliglikolių tipo (polietilenglikolis 20 000), poliesteris (butandiolio polisukcinatas) arba poliškas polisiloksanas (ciansiloksanai). Tinka kolonėlės su susiūtos struktūros (erdvinės struktūros) faze. 5 pastaba. Poliškų polisiloksanų atvejų gali būti sunkiau identifikuoti ir atskirti linoleno rūgštį bei C20 rūgštis. Dangos turi būti plonos, t. y. 0,1–0,2 μm.

3.1.4.3. Kolonėlės surinkimas ir kondicionavimas Surenkant kapiliarines kolonėles, laikomasi įprastų atsargumo priemonių, t. y. kolonėlės įstatymas į krosnį (tvirtinimas), sujungimų pasirinkimas ir darymas (sandarumas), kolonėlės galų jungimas su inžektoriumi ir detektoriumi (nenaudingų tūrių sumažinimas). Prie kolonėlės prijungiamos dujos nešiklis (pvz., 0,3 barų (30 kPa) slėgio, kai naudojama 25 mm ilgio ir 0,3 mm vidinio skersmens kolonėlė). Kolonėlė kondicionuojama programuojant krosnies temperatūros kilimą 3 °C/min. greičiu nuo kambario temperatūros iki 10 °C mažesnės už nejudančiosios fazės skilimo temperatūrą. Krosnis šioje temperatūroje laikoma vieną valandą, kol nusistovi pagrindo linija. Paskui temperatūra darbui izoterminėmis sąlygomis sumažinama iki 180 °C. 6 pastaba. Tinkamai iš anksto kondicionuotų kolonėlių galima pirkti.

3.1.5. Detektorius, geriausiai toks, kurį galima būtų kaitinti iki temperatūros, aukštesnės nei kolonėlės temperatūra.

3.2. Švirkštas

Didžiausia švirkšto talpa turi būti 10 μl, sugraduotas 0,1 μl padalomis.

3.3. Savirašis

Jei savirašio brėžiama kreivė bus naudojama analizuojamo mišinio sudėčiai apskaičiuoti, reikalingas elektroninis didelio tikslumo savirašis, suderinamas su naudojamu prietaisu. Savirašio savybės turi būti tokios:

a) inertiškumas turi būti mažesnis kaip 1,5 s, geriausiai 1 s (inertiškumas matuojamas laiku, kurį rašanti plunksna sugaišta pakildama nuo 0 iki 90 %, kai staigiai paduodamas 100 % signalas);

b) popieriaus plotis ne mažesnis kaip 20 cm;

c) popieriaus greitis reguliuojamas 0,4–2,5 cm/min intervale.

3.4. Integratorius

Greitai ir tiksliai apskaičiuoti galima elektroniniu integratoriumi. Jis turi reikiamo jautrumo linijinį atsaką, bei turi patenkinamai atlikti korekciją dėl pagrindo linijos dreifo.

4. DARBO EIGA

4.1–4.3 punktuose aprašytuose veiksmuose naudojama įranga su liepsnos jonizaciniu detektoriumi.

Kaip alternatyva gali būti naudojamas dujų chromatografas su katarometru (veikiančiu šilumos laidumo pokyčio matavimo principu). Tuo atveju darbo sąlygos keičiasi, kaip tai aprašyta 6 punkte.

4.1. Analizės sąlygos

4.1.1. Optimalių darbo sąlygų pasirinkimas 4.1.1.1. Užpildoma kolonėlė Renkantis analizės sąlygas, atsižvelgiama į šiuos kintamus parametrus: a) kolonėlės ilgis ir skersmuo; b) nejudančiosios fazės pobūdis ir kiekis; c) kolonėlės temperatūra; d) dujų nešiklio srauto greitis; e) reikalinga atskiriamoji galia; f) analizuojamos bandinio dalies dydis, parinktas taip, kad detektoriaus ir elektrometro derinio atsakas būtų tiesinis; g) analizės trukmė. Dažniausiai 1 ir 2 lentelėje pateiktos vertės duoda norimus rezultatus, t. y. ne mažiau kaip 2 000 teorinių lėkščių vienam kolonėlės ilgio metrui metilstearato atveju ir jo išplovimas įvyksta maždaug per 15 minučių. Kai aparatūra tai leidžia, inžektoriaus temperatūra turi būti apie 200 °C, o detektoriaus temperatūra lygi kolonėlės temperatūrai arba didesnė. Paprastai liepsnos jonizaciniam detektoriui tiekiamo vandenilio ir dujų nešiklio srauto greičių santykis yra nuo 1:2 iki 1:1, priklausomai nuo kolonėlės skersmens. Deguonies srauto greitis maždaug 5–10 kartų didesnis už vandenilio.



1 lentelė Kolonėlės vidinis skersmuo, mm Dujų nešiklio srauto greitis, ml/min. 2 15–25 3 20–40 4 40–60



2 lentelė Nejudančiosios fazės koncentracija, % (m/m) Kolonėlės temperatūra, oC 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapiliarinė kolonėlė Kapiliarinių kolonėlių efektyvumo ir pralaidumo savybės reiškia, kad komponentų atskyrimas ir analizės trukmė labai priklauso nuo dujų nešiklio srauto kolonėlėje greičio. Todėl, optimizuojant darbo sąlygas, būtina veikti šį parametrą (arba,paprasčiau, slėgio kritimą kolonėlėje), priklausomai nuo to, ar norima pagerinti atskyrimą, ar pagreitinti analizę.

4.1.2. Teorinių lėkščių (efektyvumo) ir atskiriamosios galios nustatymas (žr. 1 brėžinį) Atliekama maždaug lygiais kiekiais paimtų metilstearato ir metiloleato mišinio analizė (pvz., kakao aliejaus metilesterių analizė). Kolonėlės temperatūra ir dujų nešiklio srauto greitis pasirenkami tokie, kad metilstearato smailė užrašoma praėjus maždaug 15 minučių po tirpiklio smailės užrašymo. Naudojamas pakankamas metilesterių kiekis, kad metilstrearato smailė būtų per tris ketvirčius visos skalės aukščio. Teorinių lėkščių skaičius n (efektyvumas) apskaičiuojamas pagal formulę: ir atskiriamoji galia, R, apskaičiuojama pagal formulę: kuriose: dr1 yra sulaikymo atstumas nuo chromatogramos pradžios iki metilstearato smailės viršūnės, milimetrais; ω1 ir ω2 yra atitinkamai metilstearato ir metiloleato smailių pločiai, išmatuoti tarp kreivių perlinkio liečiamųjų susikirtimo su pagrindo linija taškų, milimetrais; Δ yra atstumas tarp metilstearato ir metiloleato smailių viršūnių, milimetrais; ▼M2 ir atskiriamosios galios koeficientas lr, taikant formulę kurioje: a = nuo pagrindo linijos išmatuotos žemiausios smailės aukštis; b = žemiausio taško tarp dviejų gretimų smailių atstumas išmatuotas nuo pagrindo linijos. ▼B 1 brėžinys Chromatograma teoriniam lėkščių skaičiui (efektyvumui) ir atskiriamajai galiai nustatyti Reikia pasirinkti tokias darbo sąlygas, kurios leistų analizuojant metilstearatą turėti bent 2 000 teorinių lėkščių vienam kolonėlės ilgio metrui ir ne mažesnę kaip 1,25 atskiriamąja galią.

4.2. Analizei imama bandinio dalis

Mikrošvirkštu (3.2) paimama 0,1–2 μl pagal X B priedą paruoštų metilesterių ir įšvirkščiama į kolonėlę.

Kai esteriai neištirpinti, ruošiamas jų maždaug 100 mg/ml koncentracijos tirpalas chromatografiškai gryname heptane, ir įšvirkščiama 0,1–1 ml šio tirpalo.

Jei analizuojamų komponentų yra tik pėdsakai, analizuojama bandinio dalis gali būti padidinta (iki 10 kartų).

4.3. Analizė

Paprastai naudojamos 4.1.1 punkte apibrėžtos darbo sąlygos.

Tačiau kolonėlė gali dirbti žemesnėje temperatūroje, kai reikia analizuoti riebiąsias rūgštis su mažiau kaip 12 anglies atomų, arba aukštesnėje temperatūroje, kai analizuojamos riebiosios rūgštys su daugiau kaip 20 anglies atomų. Kartais abiem šiais atvejais galima naudoti temperatūros programavimą. Pavyzdžiui, jei bandinį sudaro mažiau nei 12 anglies atomų turinčių riebiųjų rūgščių metilesteriai, bandinys įšvirkščiamas 100 °C temperatūroje (arba 50–60 °C, jei yra sviesto rūgšties) ir iš karto temperatūra 4–8 oC/min. greičiu keliama iki optimalios. Kai kuriais atvejais abi metodikos gali būti naudojamos kartu.

Po programuojamo temperatūros pakėlimo, išplovimas tęsiamas pastovioje temperatūroje, kol išplaunami visi komponentai. Jei prietaisas neturi programuoto kaitinimo, jis naudojamas esant dviems fiksuotoms temperatūroms tarp 100 ir 195 °C.

Prireikus patikrinti, ar nėra paslėptų smailių, pvz., kartu esant konjuguotiems

C18:3 ir C20:0 arba C18:3 ir C18:2 junginiams, rekomenduojama analizę atlikti su dviem nejudančiomis fazėmis, turinčiomis skirtingą poliškumą.

4.4. Etaloninės chromatogramos ir etaloninių grafikų ruošimas

Tomis pačiomis sąlygomis, kurios naudojamos bandiniui analizuoti, analizuojamas etaloninis mišinys (2.3), išmatuojamos mišinį sudarančių riebiųjų rūgščių sulaikymo trukmės arba sulaikymo atstumai. Kiekvienam nesotumo laipsniui pusiau logaritminiame popieriuje braižomas sulaikymo trukmės arba atstumo logaritmo priklausomybės nuo anglies atomų skaičiaus grafikas. Pastovios temperatūros sąlygomis linijinės grandinės rūgščių su tuo pačiu nesotumo laipsniu grafikai turi būti tiesės. Šios tiesės turi būti daugiau arba mažiau lygiagrečios.

Būtina išvengti sąlygų, kuriomis galėtų atsirasti „paslėptų smailių“, t. y. kai atskiriamoji galia yra nepakankama dviems komponentams atskirti.

5. REZULTATŲ APSKAIČIAVIMAS

5.1. Kokybinė analizė

Iš grafikų, gautų pagal 4.4 punktą, identifikuojamos bandinio metilesterių smailės, prireikus taikant interpoliaciją.

5.2. Kiekybinė analizė

5.2.1. Sudėties nustatymas

Išskyrus ypatingus atvejus, naudojamas vidinio normalizavimo metodas, t. y. daroma prielaida, kad chromatogramoje yra visi bandinio komponentai, todėl bendras smailių plotas atstovauja 100 % visų išplautų komponentų.

Jei įranga turi integratorių, naudojami juo gauti skaičiai. Jei integratoriaus nėra, kiekvienos smailės plotas apskaičiuojamas, padauginant jos aukštį iš pusaukščio pločio, kur reikia atsižvelgiant į užrašymo metu naudotus skirtingus signalo silpninimo laipsnius.

5.2.2. Apskaičiavimo metodas

5.2.2.1. Bendras atvejis Duoto komponento i kiekis, reiškiamas metilesterių masės procentine dalimi, apskaičiuojamas nustatant procentinę atitinkamos smailės ploto dalį visų smailių plote pagal formulę: kurioje: Ai yra i komponentą atitinkančios smailės plotas; ΣA yra visų smailių plotų suma. Rezultatas pateikiamas vieno ženklo po kablelio tikslumu. 7 pastaba. Šiuo bendru atveju laikoma, kad apskaičiavimų, kurie remiasi santykiniais plotais, rezultatas reiškia masės procentinę dalį. Apie atvejus, kuriems ši prielaida netaikytina, žr. 5.2.2.2 punkte.

5.2.2.2. Korekcijos koeficientų naudojimas Kai kuriais atvejais, pvz., esant riebiosioms rūgštims, turinčioms mažiau kaip aštuonis anglies atomus, arba rūgštims su kitomis funkcinėmis grupėmis, kai naudojami šilumos laidumo detektoriai arba kai yra svarbu didesnis tikslumas, procentinei smailių ploto daliai paversti masės procentine dalimi turi būti naudojami korekcijos koeficientai. Korekcijos koeficientai nustatomi pasinaudojant chromatogramomis, gautomis analizuojant žinomos sudėties metilesterių etaloninį mišinį sąlygomis, atitinkančiomis bandinio analizės sąlygas. Šiam etaloniniam mišiniui i komponento masės dalis apskaičiuojama pagal formulę: kurioje: mi yra etaloninio mišinio i komponento masė; Σm yra įvairių etaloninio mišinio komponentų masių suma. Pagal etaloninio mišinio chromatogramą (4.4) i komponento ploto procentinė dalis apskaičiuojama taikant formulę: kurioje: Ai yra i komponentą atitinkančios smailės plotas; ΣA yra visų smailių plotų suma. Tokiu būdu korekcijos koeficientas apskaičiuojamas pagal formulę: Paprastai skaičiuojamas korekcijos koeficientų santykis su KC16, todėl santykiniai koeficientai atrodo taip: Bandiniui kiekvienos i sudėtinės dalies kiekis, skaičiuojant metilesterių masės procentais, yra lygus: Rezultatai pateikiami vieno ženklo po kablelio tikslumu.

5.2.2.3. Vidinio etalono naudojimas Kai kurių analizių atvejų (pvz., kai skaičiavimuose naudojamos ne visos rūgštys, pvz., kai neskaičiuojamos kartu su 16 ir 18 anglies atomų turinčiomis rūgštimis esančios keturis ir šešis anglies atomus turinčios rūgštys, arba kai būtina nustaty