Šis dokumentas yra skirtas tik informacijai, ir institucijos n ėra teisiškai atsakingos už jo turin į 
►B ►C1 KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) Nr. 440/2008  
2008 m. geguž ės 30 d.  
nustatantis bandym ų metodus pagal Europos Parlamento ir Tarybos reglament ą (EB) 
Nr. 1907/2006 d ėl chemini ų medžiag ų registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir 
apribojim ų (REACH)  
(Tekstas svarbus EEE) ◄ 
(OL L 142, 2008 5 31, p. 1)  
iš dalies kei čiamas:  
Oficialusis leidinys  
Nr. puslapis  data  
►M1 2009 m. liepos 23 d. Komisijos Reglamentas (EB) Nr. 761/2009  L 220  1  2009 8 24  
►M2 2010 m. gruodžio 8 d. Komisijos reglamentas (ES) Nr. 1152/2010  L 324  13  2010 12 9  
►M3 2012 m. liepos 6 d. Komisijos reglamentas (ES) Nr. 640/2012  L 193  1  2012 7 20  
►M4 2014 m. sausio 24 d. Komisijos reglamentas (ES) Nr. 260/2014  L 81  1  2014 3 19  
►M5 2014 m. liepos 15 d. Komisijos reglamentas (ES) Nr. 900/2014  L 247  1  2014 8 21  
pataisytas:  
►C1 Klaid ų ištaisymas, OL L 284, 2011 10 31, p. 3 (440/2008)  2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1
▼C1 
KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) Nr. 440/2008  
2008 m. geguž ės 30 d.  
nustatantis bandym ų metodus pagal Europos Parlamento ir 
Tarybos reglament ą (EB) Nr. 1907/2006 d ėl chemini ų medžiag ų 
registracijos, įvertinimo, autorizacijos ir apribojim ų (REACH)  
(Tekstas svarbus EEE)  
EUROPOS BENDRIJ Ų KOMISIJA,  
atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutart į, 
atsižvelgdama į 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos 
reglament ą (EB) Nr. 1907/2006 d ėl chemini ų medžiag ų registracijos, 
įvertinimo, autorizacijos ir apribojim ų (REACH), įsteigiantį Europos 
cheminių medžiag ų agentūrą, iš dalies kei čiantį Direktyv ą 1999/45/EB 
bei panaikinant į Tarybos reglament ą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos 
reglament ą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyv ą 76/769/EEB ir Komi ­
sijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB (
 1 ), ypač į jo 13 straipsnio 3 dal į, 
kadangi:  
(1) Remiantis Reglamentu (EB) Nr. 1907/2006, Bendrijos lygmeniu 
reikia nustatyti bandym ų metodus, kurie b ūtų taikomi tais atve ­
jais, kai norint surinkti informacij ą apie chemini ų medžiag ų 
savybes b ūtina atlikti chemini ų medžiag ų bandymus.  
(2) 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvos 67/548/EEB d ėl įsta­
tymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojan čių pavojing ų medžiag ų 
klasifikavim ą, pakavim ą ir ženklinim ą etiketėmis, suderinimo (  2 ) 
V priede nustatyti chemini ų medžiag ų bei preparat ų fizikinių ir 
cheminių savybių, toksiškumo ir ekotoksiškumo nustatymo 
metodai. Direktyvos 67/548/EEB V priedas išbrauktas Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2006/121/EB, kuri bus taikoma nuo 2008 m. birželio 1 d.
 
(3) Direktyvos 67/548/EEB V priede nurodytus bandym ų metodus 
reikėtų įtraukti į šį reglament ą. 
(4) Šiuo reglamentu neuždraudžiama taikyti ir kit ų bandymų metodų 
su sąlyga, kad jie b ūtų taikomi atsižvelgiant į Reglamento 
1907/2006 13 straipsnio 3 dal į. ▼B 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) OL L 396, 2006 12 30, p. 1, pataisyta OL L 136, 2007 5 29, p. 3. 
( 2 ) OL 196, 1967 8 16, p. 1. Direktyva su paskutiniais pakeitimais, padarytais 
Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2006/121/EB (OL L 396, 
2006 12 30, p. 850, pataisyta OL L 136, 2007 5 29, p. 281) –  įrašyti 
atitinkamas nuorodas, kai bus paskelbtas 30-asis derinimas su technine pažanga .
 (5) Kuriant bandym ų metodus reik ėtų labai gerai atsižvelgti į 
bandymų su gyvūnais pakeitimo, patobulinimo ir j ų skaičiaus 
sumažinimo principus, vis ų pirma tais atvejais, kai tinkamais 
patvirtintais metodais galima pakeisti, patobulinti bandymus su gyvūnais arba sumažinti j ų skaičių.
 
(6) Šio reglamento nuostatos atitinka pagal Reglamento (EB) 
Nr. 1907/2006 133 straipsn į įsteigto komiteto nuomon ę, 
PRIĖMĖ ŠĮ REGLAMENT Ą: 
1 straipsnis  
Įgyvendinant Reglament ą (EB) Nr. 1907/2006 taikomi bandym ų 
metodai nustatyti šio reglamento priede.  
2 straipsnis  
Siekdama pakeisti, patobulinti bandymus su stuburiniais gyv ūnais arba 
sumažinti j ų skaičių, Komisija prireikus persvarsto šiame reglamente 
nurodytus bandym ų metodus.  
3 straipsnis  
Nuorodos į Direktyvos 67/548/EEB V pried ą laikomos nuorodomis į šį 
reglament ą. 
4 straipsnis  
Šis reglamentas įsigalioja kit ą dieną po jo paskelbimo  Europos S ąjungos 
oficialiajame leidinyje . 
Jis taikomas nuo 2008 m. birželio 1 d.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
PRIEDAS  
A DALIS. FIZIKINI Ų IR CHEMINI Ų SAVYBI Ų NUSTATYMO 
METODAI  
TURINYS  
A.1. LYDYMOSI/UŽŠALIMO TEMPERAT ŪRA 
A.2. VIRIMO TEMPERAT ŪRA 
A.3. SANTYKINIS TANKIS  
A.4. GAR Ų SLĖGIS 
A.5. PAVIRŠIAUS ĮTEMPTIS  
A.6. TIRPUMAS VANDENYJE  
A.7. PASISKIRSTYMO KOEFICIENTAS  
A.8. PLI ŪPSNIO TEMPERAT ŪRA 
A.9. DEGUMAS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)  
A.10.  DEGUMAS (DUJOS)  
A.11.  DEGUMAS (S ĄLYTIS SU VANDENIU)  
A.12.  KIET ŲJŲ IR SKYST ŲJŲ MEDŽIAG Ų PIROFORIN ĖS 
SAVYBĖS 
A.13.  SPROGUMAS  
A.14.  SKYS ČIŲ IR DUJ Ų SAVAIMINIO UŽSILIEPSNOJIMO 
TEMPERAT ŪRA 
A.15.  KIET ŲJŲ MEDŽIAG Ų SANTYKIN Ė SAVAIMINIO UŽSI ­
LIEPSNOJIMO TEMPERAT ŪRA 
A.16.  OKSIDACIN ĖS SAVYB ĖS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)  
A.17.  POLIMER Ų SKAITIN ĖS VIDUTIN ĖS MOLEKULIN ĖS 
MASĖS IR MOLEKULIN ĖS MASĖS PASISKIRSTYMAS  
A.18.  MAŽOS MOLEKULIN ĖS MAS ĖS MEDŽIAG Ų KIEKIS 
POLIMERUOSE  
A.19.  POLIMER Ų TIRPUMAS VANDENYJE/EKSTRAHAVIMAS IŠ 
VANDENS  
A.20.  OKSIDACIN ĖS SAVYB ĖS (SKYS ČIAI) 
A.22.  PLAUŠELI Ų SKERSMENS ILGIO SVORINIS GEOMETRINIS 
VIDURKIS  
▼M4 
A.23.  PASISKIRSTYMO KOEFICIENTAS (1-OKTANOLIS / 
VANDUO). L ĖTO MAIŠYMO METODAS  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. LYDYMOSI/UŽŠALIMO TEMPERAT ŪRA 
1. METODAS  
Dauguma apib ūdintų metodų yra pagr įsti OECD bandym ų gairėmis 
(1). Pagrindiniai principai yra pateikti 2 ir 3 nuorodoje.  
1.1. ĮVADAS  
Apibūdintieji metodai ir prietaisai turi b ūti taikomi nustatant 
medžiagų lydymosi temperat ūrą, netaikant joki ų apribojim ų jų 
grynumo laipsniui.  
Metodo parinkimas priklauso nuo to, ar medžiaga gali b ūti lengvai 
susmulkinama, ar sunkiai smulkinama, ar jos susmulkinti ne įma­
noma. Tod ėl ribinis koeficientas priklausys nuo to, ar galima, ar 
negalima t ą medžiagą lengvai ar sunkiai susmulkinti, ar visai ne įma­
noma.  
Kai kurioms medžiagoms labiau tinka nustatyti užšalimo arba kiet ė­
jimo temperat ūrą, jų nustatymo standartai taip pat yra įtraukti į šį 
metodą. 
Jeigu dėl tam tikr ų medžiagos savybi ų minėtų parametr ų neįmanoma 
tinkamai išmatuoti, gali b ūti naudojama takumo temperat ūra. 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Lydymosi temperat ūra – tai temperat ūra, kuriai esant fazinis virsmas 
iš kietosios b ūsenos į skystąją vyksta atmosferos sl ėgyje ir ši tempe ­
ratūra sutampa su užšalimo temperat ūra. 
Kadangi daugumos medžiag ų fazinis virsmas vyksta temperat ūrų 
intervale, jis apib ūdinamas kaip lydymosi temperat ūrų intervalas.  
Vienetų pakeitimas (iš K į °C) 
t = T – 273,15  
t: temperat ūra pagal Celsij ų (°C).  
T: termodinamin ė temperat ūra, kelvinai (K).  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nebūtina naudoti etalonines medžiagas visais tais atvejais, kai 
tiriama nauja medžiaga. Pirmiausia jos tur ėtų būti naudojamos kart ­
kartėmis tikrinant šio metodo veikim ą ir siekiant palyginti gautus 
rezultatus su kit ų metodų rezultatais.  
Kai kurios kalibravimo medžiagos yra pateiktos nuorodose (4).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Nustatoma fazinio virsmo iš kietosios b ūsenos į skystąją arba iš 
skystosios b ūsenos į kietąją temperat ūra (temperat ūrų intervalas). 
Praktikoje šildant/aušinant bandomos medžiagos bandin į atmosferos 
slėgyje, yra nustatoma pradin ė lydymosi/užšalimo temperat ūra ir 
galutinės lydymosi/užšalimo stadijos temperat ūra. Apib ūdinami 
penki metod ų tipai, b ūtent: kapiliarinis metodas, karšt ųjų stadijų 
metodai, užšalimo temperat ūros nustatymas, termin ės analizės 
metodai ir takumo temperat ūros nustatymas (pvz., naftos produk ­
tams).  
Tam tikrais atvejais vietoje lydymosi temperat ūros yra patogu 
matuoti užšalimo temperat ūrą. 
1.4.1.  Kapiliarinis metodas  
1.4.1.1.  Lydymosi temperat ūros matavimo prietaisai su skys čių vonia  
Nedidelis kiekis gerai susmulkintos medžiagos dedamas į kapiliarin į 
vamzdelį ir tvirtai užspaudžiamas. Kapiliarinis vamzdelis šildomas 
kartu su termometru, lydymosi metu temperat ūros pakitimas nusta ­
tomas apie 1 K/min. Nustatoma pradin ė ir galutin ė lydymosi tempe ­
ratūra. 
1.4.1.2.  Lydymosi temperat ūros matavimo prietaisai su metaliniu bloku  
Taip kaip apib ūdinta 1.4.1.1 punkte, išskyrus tai, kad kapiliarinis 
vamzdelis ir termometras dedami į pašildytą metalinį bloką, ir jie 
stebimi per bloke esan čias skylutes.  
1.4.1.3.  Detekcija fotoelementu  
Kapiliariniame vamzdelyje esantis m ėginys yra automatiškai 
šildomas metaliniame cilindre. Šviesos spindulys nukreipiamas pro medžiagą per cilindre esan čią skylutę į tiksliai kalibruot ą fotoele­
mentą. Daugumos medžiag ų, jas lydant, optin ės savybės keičiasi 
nuo matini ų iki skaidri ų. Į fotoelement ą patenkan čios šviesos inten ­
syvumas did ėja ir siun čia sustabdymo signal ą į skaitmenin į indika­
torių, kuris rodo kaitinimo kameroje esan čio platininio varžinio 
termometro temperat ūrą. Šis metodas netinka kai kurioms ryški ą 
spalvą turinčioms medžiagoms.
 
1.4.2.  Karštosios stadijos  
1.4.2.1.  Koflerio karštasis strypas  
Koflerio karštajame strype naudojami du metalo gabalai, turintys 
skirtingą terminį laidumą, šildomi elektra, kur strypas sukonstruo ­
jamas taip, kad temperat ūros gradientas b ūtų beveik linijinis per 
visą jo ilgį. Karštojo strypo temperat ūra gali svyruoti nuo 283 iki 
573 K kartu su specialiu temperat ūros prietaisu, kur į sudaro judantis 
velenėlis su rodykle ir kilpel ė, skirta konkre čiam strypui. Kad b ūtų 
nustatyta lydymosi temperat ūra, labai plonas medžiagos sluoksnis 
dedamas tiesiai ant karšto strypo paviršiaus. Po keli ų sekundži ų 
taip skystosios ir kietosios faz ės pasirodo ryški skiriamoji linija. 
Temperat ūra skiriamojoje linijoje yra užrašoma rodykl ę nustatant 
taip, kad ji b ūtų ant linijos.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Lydymosi temperat ūros mikroskopas  
Keletas mikroskopo karšt ųjų stadijų yra naudojamos nustatant lydy ­
mosi temperat ūrą esant labai mažam medžiagos kiekiui. Daugumoje 
karštųjų stadijų temperat ūra yra matuojama jautriu termoelementu, 
bet kartais naudojami ir gyvsidabrio termometrai. Tipiškame mikro ­
skopiniame karštosios pakopos lydymosi temperat ūros nustatymo 
aparate yra kaitinimo kamera, kuri ą sudaro metalin ė plokštelė, virš 
kurios ant objektinio stiklelio yra dedamas bandinys. Metalin ės 
plokštelės centre yra skyl ė, per kuri ą patenka šviesa nuo mikroskopo 
apšvietimo veidrod ėlio. Naudojimo metu kamera uždengiama stiklo 
plokštele, kad į erdvę, kurioje yra bandinys, nepatekt ų oro.  
Bandinio kaitinim ą reguliuoja reostatas. Atliekant labai tikslius 
optinių anizotropini ų medžiag ų matavimus, gali b ūti naudojama 
poliarizuota šviesa.  
1.4.2.3.  Menisko metodas  
Šis metodas taikomas tiriant poliamidus.  
Temperat ūra, kurioje pasislenka silikonin ės alyvos meniskas, esantis 
taip karštosios pakopos ir uždengian čiojo stiklo, paremto poliami ­
diniu bandiniu, yra nustatoma vizualiai.  
1.4.3.  Užšalimo temperat ūros nustatymo metodas  
Bandinys dedamas į specialų mėgintuvėlį, kuris įdedamas į aparatą 
užšalimo temperat ūrai nustatyti. Aušinimo metu bandinys atsargiai ir 
be perstojo maišomas, o jo temperat ūra yra matuojama atitinkamais 
intervalais. Kai kelis kartus užrašius rodmenis temperat ūra nusistovi, 
ši temperat ūra (su pakoreguota termometro paklaida) yra užrašoma 
kaip užšalimo temperat ūra. 
Peršaldymo turi b ūti vengiama palaikant pusiausvyr ą taip kietosios ir 
skystosios faz ės. 
1.4.4.  Termin ė analizė 
1.4.4.1.  Diferencin ė ir termin ė analizė (DTA)  
Pagal šią metodiką medžiagos ir etalonin ės medžiagos temperat ūrų 
skirtumas yra užrašomas kaip temperat ūros funkcija, kai tai 
medžiagai ir etaloninei medžiagai yra naudojama ta pati kontroliuo ­
jamos temperat ūros programa. Jeigu bandinyje įvyksta virsmas, kurio 
metu pakinta entalpija, tok į pasikeitim ą parodo endoterminis (lydy ­
mosi) arba egzoterminis (užšalimo) nukrypimas nuo užrašytos 
temperatūros pagrindin ės linijos.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2.  Diferencin ė skenuojamoji kalorimetrija (DSK)  
Pagal šią metodiką įvesties energij ų skirtumas medžiagoje ir etaloni ­
nėje medžiagoje užrašomas kaip temperat ūros funkcija, kai tai 
medžiagai ir etaloninei medžiagai yra naudojama ta pati kontroliuo ­
jamos temperat ūros programa. Ši energija – tai energija, reikalinga 
nustatyti medžiagos ir etalonin ės medžiagos nuliniam temperat ūrų 
skirtumui. Jeigu bandinyje įvyksta virsmas, kurio metu pakinta ental ­
pija, tokį pasikeitim ą parodo endoterminis (lydymosi) arba egzoter ­
minis (užšalimo) nukrypimas nuo užrašyto šilumos srauto pagrin ­
dinės linijos.  
1.4.5.  Takumo temperat ūra 
Šis metodas naudojamas tiriant naftos produktus, jis taip pat tinka 
alyvoms, kuri ų lydymosi temperat ūra yra žema.  
Iš anksto pašildytas m ėginys atv ėsinamas ypa č greitai ir yra tikri ­
namas 3 K intervalais srauto charakteristikoms nustatyti. Žemiausia temperatūra, kuriai esant nustatytas medžiagos jud ėjimas, yra užra ­ 
šoma kaip takumo temperat ūra.
 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Įvairių metodų, naudojam ų lydymosi temperat ūrai/lydymosi tempe ­
ratūros intervalui nustatyti, tinkamumas ir tikslumas yra pateikti šioje 
lentelėje: 
LENTEL Ė. METOD Ų TINKAMUMAS  
A. Kapiliariniai metodai  
Matavimo metodas  Medžiagos, 
kurias galima 
susmulkinti  Medžiagos, kuri ų 
negalima 
susmulkinti  Temperat ūrų 
intervalas  Apskaičiuotas 
tikslumas (  1 ) Galiojantis 
standartas  
Lydymosi tempe ­
ratūros prietaisai 
su skysčių vonia  Taip Tik kelios  273–573 K  ± 0,3 K  JIS K 0064  
Lydymosi tempe ­
ratūros prietaisai 
su metaliniu bloku  Taip Tik kelios  293– > 573 K  ± 0,5 K  ISO 1218(E)  
Detekcija foto ­
elementu  Taip Kelios, naudo ­
jant prietaisus  253–573 K  ± 0,5 K  
( 1 ) Priklauso nuo prietaiso r ūšies ir medžiagos grynumo.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Karštosios stadijos ir užšalimo metodai  
Matavimo metodas  Medžiagos, 
kurias galima 
susmulkinti  Medžiagos, kuri ų 
negalima lengvai 
susmulkinti  Temperat ūrų 
intervalas  Apskaičiuotas 
tikslumas (  1 ) Galiojantis 
standartas  
Koflerio karštasis 
strypas  Taip Ne  283–> 573 K  ± 1 K  ANSI/ASTM D 
3451–76  
Lydymosi tempe ­
ratūros mikro ­
skopas  Taip Tik kelios  273–> 573 K  ± 0,5 K  DIN 53736  
Menisko metodas  Ne  Ypa č 
poliamidams  293–> 573 K  ± 0,5 K  ISO 1218(E)  
Užšalimo tempe ­
ratūros nustatymo 
metodai  Taip Taip  223–573 K  ± 0,5 K  Pvz.. BS 4695  
( 1 ) Priklauso nuo prietaiso r ūšies ir medžiagos grynumo.  
C. Termin ė analizė 
Matavimo metodas  Medžiagos, 
kurias galima 
susmulkinti  Medžiagos, kuri ų 
negalima lengvai 
susmulkinti  Temperat ūrų 
intervalas  Apskaičiuotas 
tikslumas (  1 ) Galiojantis 
standartas  
Diferencin ė 
terminė analizė Taip Taip  173–1 273 K  Iki 600 K ± 
0,5 K iki 
1 273 K 
± 2,0 K  ASTM E 537–76  
Diferencin ė 
skenuojamoji 
kalorimetrija  Taip Taip  173–1 273 K  Iki 600 K ± 
0,5 K iki 
1 273 K ± 2,0 
K ASTM E 537–76  
( 1 ) Priklauso nuo prietaiso r ūšies ir medžiagos grynumo.  
D. Takumo temperat ūra 
Matavimo metodas  Medžiagos, 
kurias galima 
susmulkinti  Medžiagos, kuri ų 
negalima lengvai 
susmulkinti  Temperat ūrų 
intervalas  Apskaičiuotas 
tikslumas (  1 ) Galiojantis 
standartas  
Takumo 
temperatūra Naftos 
produktams ir 
alyvoms  Naftos produk ­
tams ir alyvoms  223–323 K  ± 3,0 K  ASTM D 97–66  
( 1 ) Priklauso nuo prietaiso r ūšies ir medžiagos grynumo.  
1.6. METOD Ų APIBŪDINIMAS  
Beveik vis ų bandymo metod ų darbo eiga yra aprašyta tarptautiniuose 
ir nacionaliniuose standartuose (žr. 1 pried ėlį). 
1.6.1.  Kapiliariniai metodai  
Jeigu smulkiai susmulkint ų medžiag ų temperat ūra yra keliama 
pamažu, paprastai jos pereina lydymosi pakopas, kurios parodytos 
1 pav.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
1 paveikslas
  
Lydymosi temperat ūros nustatymo metu temperat ūra yra užrašoma 
lydymosi pradžioje ir baigiamojoje lydymosi stadijoje.  
1.6.1.1.  Lydymosi temperat ūros nustatymo prietaisai su skys čių vonios 
aparatu  
2 pvz., parodytas standartizuotas stiklinis lydymosi temperat ūros 
nustatymo aparatas (JIS K 0064); visos charakteristikos pateiktos 
milimetrais.  
2 paveikslas
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Vonios skystis  
Turi būti parenkamas atitinkamas skystis. Skys čio pasirinkimas 
priklauso nuo lydymosi temperat ūros, kurią reikia nustatyti, pvz., 
skystas parafinas naudojamas nustatant lydymosi temperat ūrą, kuri yra 
ne aukštesn ė kaip 473 K, o silikonin ė alyva naudojama nustatant lydy ­
mosi temperat ūra, kuri yra ne aukštesn ė kaip 573 K.  
Jei lydymosi temperat ūra yra aukštesn ė kaip 523 K, gali b ūti naudo­
jamas mišinys iš trij ų dalių sieros r ūgšties ir dviej ų dalių kalio 
sulfato (pagal masi ų santykį). Jeigu naudojamas toks mišinys, reikia 
imtis atitinkam ų atsargumo priemoni ų. 
Termometras  
Turi būti naudojami tik tokie termometrai, kurie atitinka ši ų arba 
lygiaverčių standartų reikalavimus:  
ASTM E 1–71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Darbo eiga  
Sausa medžiaga gr ūstuvėje sutrinama į smulkius miltelius ir dedama 
į kapiliarin į vamzdelį, kurio vienas galas užlydytas, kad j į užpildžius, 
medžiagos sluoksnis, stipriai j ą suslėgus, būtų 3 mm storio. Norint 
gauti tolygiai susl ėgtą mėginį, kapiliarin į vamzdel į iš apytikriai 700 
mm aukš čio reikėtų vertikalia kryptimi paleisti per stiklin į vamzdel į 
ant laikrodžio stiklo.  
Užpildytas kapiliarinis vamzdelis dedamas į vonią taip, kad vidurin ė 
gyvsidabrio termometro galiuko dalis liest ų vamzdel į toje vietoje, 
kur yra bandinys. Paprastai kapiliarinis vamzdelis dedamas į aparatą, 
kurio temperat ūra yra apie 10 K žemesn ė negu lydymosi tempera ­
tūra. 
Vonios skystis šildomas taip, kad temperat ūra kiltų apie 3 K/min. 
Skystį reikia maišyti. Kai temperat ūra yra 10 K žemesn ė negu 
laukiama lydymosi temperat ūra, temperat ūros didėjimo greitis yra 
nustatomas toks, kad neviršyt ų 1 K/min.  
Apskaičiavimas  
Lydymosi temperat ūra apskaičiuojama taip:  
T = T  D + 0,00016 (T  D - T E ) n 
čia: 
T = koreguota lydymosi temperat ūra, K  
T D = D termometro rodmenys, K  
T E = E termometro rodmenys, K  
n = D termometro gyvsidabrio stulpelio padal ų skaičius ant iški ­
lusios jo dalies.  
1.6.1.2.  Lydymosi temperat ūros nustatymo prietaisai su metaliniu bloku  
Aparatūra 
Ją sudaro:  
— cilindrinis metalinis blokas, kurio viršutin ė dalis yra tuš čia ir 
sudaro ertm ę (žr. 3 pav.),  
— metalinis kaištis su dviem ar keliomis skylut ėmis, per kurias 
kapiliaras įstatomas į metalinį bloką, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— metalinio bloko kaitinimo sistema, kuri, pavyzdžiui, yra tiekiama 
per bloke įtaisytą elektrinę varžą, 
— reostatas energijos padavimui reguliuoti, jeigu kaitinimui naudo ­
jama elektra,  
— keturi langeliai iš šilumai atsparaus stiklo išorin ėse kameros 
sienose, esantys visiškai priešingose pus ėse statmenai vienas 
kitam. Priešais vien ą iš šių langelių yra mikroskopo okuliaras 
kapiliariniam vamzdeliui steb ėti. Kiti trys langeliai naudojami 
aparato vidui apšviesti lempomis,  
— kaitrai atsparaus stiklo kapiliarinis vamzdelis, viename gale užly ­
dytas (žr. 1.6.1.1).  
Termometras  
Žiūrėti 1.6.1.1 punkte nurodytus standartus. Taip pat naudojami 
panašaus tikslumo termoelektriniai matavimo prietaisai.  
3 paveikslas
  
1.6.1.3.  Detekcija fotoelementu  
Aparatūra ir darbo eiga  
Aparatūrą sudaro metalin ė kamera su automatizuota kaitinimo 
sistema. Trys kapiliarai užpildomi pagal 1.6.1.1 ir dedami į krosnį. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Aparatui kalibruoti galima kelis kartus linijiniu b ūdu padidinti 
temperatūrą, o atitinkamai padidinta temperat ūra yra elektriniu 
būdu suderinama pagal iš anksto pasirinkt ą konstantą ir tiesinį koefi­
cientą. Savirašiai aparatai užrašo tikr ąją krosnies temperat ūrą bei 
kapiliaruose esan čios medžiagos temperat ūrą. 
1.6.2.  Karštosios stadijos  
1.6.2.1.  Koflerio karštasis strypas  
Žr. priedėlį. 
1.6.2.2.  Lydymosi temperat ūros mikroskopas  
Žr. priedėlį. 
1.6.2.3.  Menisko metodas (poliamidai)  
Žr. priedėlį. 
Kaitinimo sparta lydymosi temperat ūroje turėtų būti mažesn ė kaip 1 
K/min.  
1.6.3.  Užšalimo temperat ūros nustatymo metodai  
Žr. priedėlį. 
1.6.4.  Termin ė analizė 
1.6.4.1.  Diferencin ė terminė analizė 
Žr. priedėlį. 
1.6.4.2.  Diferencin ė skenuojamoji kalorimetrija  
Žr. priedėlį. 
1.6.5.  Takumo temperat ūros nustatymas  
Žr. priedėlį. 
2. DUOMENYS  
Kai kuriais atvejais reikalinga termometro korekcija.  
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:  
— naudotas metodas,  
— tikslus medžiagos apib ūdinimas (tapatumas ir priemaišos) ir 
preliminarios gryninimo, jeigu toks naudojamas, stadijos,  
— tikslumo apskai čiavimas.  
Ne mažiau kaip dviej ų matavim ų, patenkan čių į apskaičiuotą tiks­
lumo interval ą (žr. lenteles), vidurkis nurodomas kaip lydymosi 
temperatūra. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Jei temperat ūrų skirtumas tarp pradin ės temperat ūros ir temperat ūros 
galutinėje lydymosi faz ėje yra metodo tikslumo ribose, galutin ės 
lydymosi faz ės temperat ūra yra laikoma lydymosi temperat ūra; kitu 
atveju pateikiamos dvi temperat ūros. 
Jei medžiaga suyra ar sublimuojasi prieš pasiekiant lydymosi tempe ­
ratūrą, pateikiama ta temperat ūra, kuriai esant įvyko šis reiškinys.  
Pateikiama visa informacija ir pasteb ėjimai, svarb ūs duomen ų aiški­
nimui, ypa č apie medžiagoje esan čias priemaišas ir jos fizikin ę 
būseną. 
4. NUORODOS  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council 
C (81) 30 (final).  
2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, p. 803–834.  
3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.  
4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, p. 505–515.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Priedėlis 
Papildomos technin ės informacijos, pavyzdžiui, galima ieškoti toliau nurodytuose 
standartuose  
1. Kapiliariniai metodai  
1.1. Lydymosi temperat ūros nustatymo prietaisai su skys čių vonia 
ASM E 324–69  Organini ų chemini ų medžiag ų lydy­
mosi taško ir tirpimo pradžios ir 
pabaigos nustatymo standartinis metodas.
 
BS 46–34  Lydymosi taško ir (arba) tirpimo 
diapazono nustatymo metodas.  
DIN 53181  Smal ų lydymosi intervalo nustatymas 
kapiliarinio proceso metu.  
JIS K 00–64  Chemini ų produkt ų lydymosi taško 
nustatymo metodas.  
1.2. Lydymosi temperat ūros nustatymo prietaisai su metaliniu bloku 
DIN 53736  Dalini ų kristalini ų plastmasi ų vizua­
linis lydymosi temperat ūros 
nustatymas.  
ISO 1218 (E)  Plastmas ės – poliamidai – „lydymosi 
taško“ nustatymas.  
2. Karštosios stadijos  
2.1. Koflerio karštasis strypas 
ANSI/ASTM D 3451–76  Polimerini ų miltelini ų dangų patikri­
nimo standartas.  
2.2. Lydymosi temperat ūros mikroskopas 
DIN 53736  Dalini ų kristalini ų plastmasi ų lydymosi 
temperatūros vizualinis nustatymas.  
2.3. Menisko metodas (poliamidai) 
ISO 1218 (E)  Plastmas ės – poliamidai – „lydymosi 
taško“ nustatymas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133–66  Standartin ė specifikacija acetilintai 
dervai iš medžiag ų formuoti ir 
štampuoti.  
NF T 51–050  Poliamid ų lydymosi taško nustatymas 
menisko metodu.  
3. Užšalimo temperat ūros nustatymo metodai  
BS 4633  Kristalizacijos taško nustatymo 
metodas.  
BS 4695  Naftos vašk ų lydymosi taško nusta ­
tymo metodas. Lydymosi kreiv ė. 
DIN 51421  Laki ųjų medžiag ų, kuro ir benzol ų 
užšalimo taško nustatymas.  
ISO 2207  Naftos vaškai: lydymosi temperat ūros 
nustatymas.  
DIN 53175  Riebal ų sutirštėjimo taško nustatymas.  
NF T 60–114  Parafin ų lydymosi taškas.  
NF T 20–051  Kristalizacijos taško nustatymo 
metodas. Sukiet ėjimo taškas.  
ISO 1392  Užšalimo taško nustatymo metodas.  
4. Termin ė analizė 
4.1. Diferencin ė terminė analizė 
ASTM E 537–76  Standartinis metodas įvertinti chemi ­
kalų šiluminį stabilum ą diferencijuota 
šilumine analize.  
ASTM E 473–85  Standartinis šilumin ės analizės laiko­
tarpių nustatymas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472–86  Standartinis termoanalitini ų duomen ų 
pateikimas praktikoje.  
DIN 51005  Termin ė analizė, supratimas.  
4.2. Diferencin ė skenuojamoji kalorimetrija 
ASTM E 537–76  Standartinis metodas įvertinti chemi ­
kalų šiluminį stabilum ą diferencijuotos 
šiluminės analizės metodais.  
ASTM E 473–85  Šilumin ės analizės standartini ų laiko­
tarpių nustatymas.  
ASTM E 472–86  Standartinis termoanalitini ų duomen ų 
pateikimas praktikoje.  
DIN 51005  Termin ė analizė, supratimas.  
5. Takumo temperat ūros nustatymas  
ASTM D 97–66  Atrinkt ų pavyzdži ų ir naftos produkt ų 
analizė: drumstėjimo ribos nustatymas.  
ASTM D 97–66  Naftos aliej ų drumstimosi taško nusta ­
tymo metodas.  
ISO 3016  Naftos produktai. Takumo tempera ­
tūros nustatymas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. VIRIMO TEMPERAT ŪRA 
1. METODAS  
Dauguma apib ūdintų metodų yra pagr įsti OECD Bandym ų gairėmis 
(1). Pagrindiniai principai pateikti 2 ir 3 nuorodoje.  
1.1. ĮVADAS  
Čia apibūdinti metodai ir prietaisai gali b ūti naudojami skystoms ir 
lengvai besilydan čioms medžiagoms, jei chemini ų reakcijų, kuriose 
jos dalyvauja, temperat ūra nėra žemesn ė nei virimo temperat ūra 
(pvz., autooksidacija, persigrupavimas, skilimas ir pan.). Š į metodą 
galima taikyti grynoms ir priemaiš ų turinčioms skystosioms medžia ­
goms.  
Ypatingas d ėmesys atkreiptinas į tuos metodus, kuriuose naudojama 
detekcija fotoelementu ir termin ė analizė, kadangi šiais metodais 
galima nustatyti tiek lydymosi, tiek virimo temperat ūrą. Be to, mata ­
vimus galima atlikti automatiškai.  
Dinaminis metodas geras tuo, kad j į taip pat galima naudoti nustatant 
garų slėgį ir nebūtina virimo temperat ūrą koreguoti iki normalaus 
slėgio (101,325 kPa), kadangi normalus sl ėgis matavim ų metu gali 
būti nustatomas manostatu.  
Pastabos  
Priemaišų įtaka nustatant virimo temperat ūrą labai priklauso nuo 
priemaišų pobūdžio. Jeigu m ėginyje yra laki ųjų priemaiš ų, kurios 
galėtų turėti įtakos rezultatams, medžiag ą reikia išgryninti.  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Normali virimo temperat ūra yra apib ūdinama kaip temperat ūra, 
kurioje skys čių garų slėgis yra lygus 101,325 kPa.  
Jeigu virimo temperat ūra matuojama ne normaliame atmosferos 
slėgyje, temperat ūros priklausomyb ė nuo garų slėgio gali b ūti apibū­
dinama Klauzijaus-Klapeirono lygtimi:  
log p ¼ Í ðΔ H v Þ 
ð2,3 RTÞ Î 
þ const : 
čia: 
p = medžiagos gar ų slėgis paskaliais  
Δ H v = garavimo šiluma, J mol  -1 
R = universalioji molin ė dujų konstanta = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = termodinamin ė temperat ūra, K  
Virimo temperat ūra yra nustatoma atsižvelgiant į matavimo metu 
esantį aplinkos sl ėgį. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Vienetų perskaičiavimas  
Slėgis (vienetai: kPa)  
100 kPa = 1 baras = 0,1 MPa 
(„baras“ vis dar leistinas, bet nerekomenduojamas)  
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(neleistini vienetai „mm Hg“ ir „Torr“)  
1 atm = standartin ė atmosfera = 101 325 Pa 
(neleistinas vienetas „atm“)  
Temperat ūra (vienetai: K)  
t = T – 273,15  
t: Celsijaus temperat ūra, Celsijaus laipsniai (°C)  
T: termodinamin ė temperat ūra, kelvinai (K)  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nebūtina naudoti etalonines medžiagas visais tais atvejai, jeigu 
tiriama nauja medžiaga. Pirmiausia jos tur ėtų būti naudojamos kart ­
kartėmis tikrinant šio metodo veikim ą ir gautų rezultatų lyginimui su 
kitų metodų rezultatais.  
Kai kurias kalibravimo medžiagas galima rasti priede išvardytuose 
metoduose.  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Penki virimo temperat ūros (virimo intervalo) nustatymo metodai yra 
pagrįsti virimo temperat ūros matavimu, kiti du pagr įsti termine 
analize.  
1.4.1.  Nustatymas ebulioskopu  
Ebulioskopai buvo sukurti molekuliniam svoriui nustatyti keliant 
virimo temperat ūrą, bet jie taip pat tinka tiksliems virimo tempera ­
tūros matavimams atlikti. Labai paprastas aparatas yra apib ūdintas 
ASTM D 1120–72 (žr. pried ėlį). Šiame aparate skystis šildomas 
pusiausvyros s ąlygomis atmosferos sl ėgyje, kol užverda.  
1.4.2.  Dinaminis metodas  
Šis metodas pagr įstas flegmos pakartotinio gar ų suskystinimo tempe ­
ratūros matavimu atitinkamu termometru, jai verdant. Taikant š į 
metodą galima keisti sl ėgį. 
1.4.3.  Distiliacijos metodas virimo temperat ūrai nustatyti  
Šis metodas pagr įstas skysčio distiliavimu, gar ų pakartotinio suskys ­
tinimo temperat ūros matavimu bei distiliato kiekio nustatymu.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  „Siwoloboff’o“ metodas  
Bandinys šildomas m ėgintuvėlyje, panardintame į kaitinimo vonioje 
esantį skystį. Užlydytas kapiliarinis vamzdelis, kurio apatin ėje dalyje 
yra oro burbuliukas, panardinamas į tą patį mėgintuvėlį. 
1.4.5.  Detekcija fotoelementu  
Pagal Siwoloboff’o metod ą atliekamas automatinis fotoelektrinis 
matavimas, naudojant kylan čius burbuliukus.  
1.4.6.  Diferencin ė terminė analizė 
Pagal šią metodiką yra užrašomi medžiagos ir etalonin ės medžiagos 
temperatūrų skirtumai kaip temperat ūros funkcija, kai medžiagai ir 
etaloninei medžiagai yra taikoma ta pati kontroliuojama temperat ūrą 
programa. Jeigu bandinyje įvyksta virsmas, kurio metu pasikei čia 
entalpija, t ą pokytį parodo endoterminis nuokrypis (virimas) nuo 
pagrindin ės užrašytų temperat ūrų linijos.  
1.4.7.  Diferencin ė skenuojamoji kalorimetrija  
Pagal šią metodiką skirtumas tarp energijos įvesties į medžiag ą ir į 
etaloninę medžiag ą yra užrašomas kaip temperat ūros funkcija, kai 
medžiagai ir etaloninei medžiagai yra taikoma ta pati kontroliuojama temperatūrų programa. Ši energija – tai energija, reikalinga nustatyti 
medžiagos ir etalonin ės medžiagos nulin į temperat ūrų skirtumą. 
Jeigu bandinyje įvyksta virsmas, kurio metu pasikei čia entalpija, t ą 
pokytį parodo endoterminis nuokrypis (virimas) nuo pagrindin ės 
užrašyto šilumos srauto linijos.
 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Skirtingų metodų, naudojam ų virimo temperat ūrai/virimo intervalui 
nustatyti, tinkamumas ir tikslumas yra pateikti 1 lentel ėje. 
1 lentelė 
Metodų palyginimas  
Matavimo metodas  Apskai čiuotas tikslumas  Galiojantis standartas  
Ebulioskopas  ± 1,4 K (iki 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (iki 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120–72 (  1 ) 
Dinaminis metodas  ± 0,5 K (iki 600 K) (  2 ) 
Distiliavimo procesas (virimo 
intervalas)  ± 0,5 K (iki 600 K)  ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71  
Pagal Siwoloboff ‘ ą ± 0,2 K (iki 600 K) (  2 ) 
Detekcija fotoelementu  ± 0,3 K (373 K) (  2 ) 
Diferencin ė terminė kalorimetrija  ± 0,5 K (iki 600 K) 
± 0,2 K (iki 1 273 K)  ASTM E 537–76  
Diferencin ė skenuojamoji 
kalorimetrija  ± 0,5 K (iki 600 K) 
± 0,2 K (iki 1 273 K)  ASTM E 537–76  
( 1 ) Šis tikslumas tinka tik labai paprastai priemonei, pavyzdžiui, aprašytai ASTM D 1120–72; ji gali b ūti patobulinta 
sudėtingesniais ebulioskopiniais prietaisais. 
( 2 ) Tinka tik grynoms medžiagoms. Naudojant kitokiomis s ąlygomis, reik ėtų pagrįsti. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. METOD Ų APIBŪDINIMAS  
Kai kurių mėginio metod ų darbo eiga yra apib ūdinta tarptautiniuose 
ir nacionaliniuose standartuose (žr. pried ą). 
1.6.1.  Ebulioskopas  
Žr. priedėlį 
1.6.2.  Dinaminis metodas  
Žr. A.4 bandymo metod ą. Garų slėgio nustatymas.  
Užrašoma steb ėta virimo temperat ūra, kai slėgis 101,325 kPa.  
1.6.3.  Distiliavimo procesas (virimo intervalas)  
Žr. priedėlį. 
1.6.4.  Siwoloboff’o metodas  
Bandinys kaitinamas m ėgintuvėlyje, kurio skersmuo apie 5 mm, 
lydimosi temperat ūros nustatymo aparate (1 pav.).  
1 pvz., pavaizduotas standartizuotas lydymosi ir virimo temperat ūros 
nustatymo aparatas (JIS K 0064) (pagamintas iš stiklo, visi 
duomenys nurodyti milimetrais).  
1 paveikslas
  
Kapiliarinis vamzdelis (virinimo kapiliarinis vamzdelis), kuris užly ­
dytas 1 cm virš apatinio galo, dedamas į mėgintuvėlio vamzdel į. 
Bandinio yra dedama tiek, kad užlydytoji kapiliarinio vamzdelio dalis būtų žemiau skys čio paviršiaus. M ėgintuvėlio vamzdelis su 
virinimo kapiliariniu vamzdeliu yra pritaisomas arba prie termometro 
gumine juostele, arba pritvirtinamas laikikliu iš šono (žr. 2 pav.).
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
2 pav.  
Pagal Siwoloboff’ ą 3 pav.  
Modifikuotas variantas
  
Vonios skystis parenkamas pagal virimo temperat ūrą. Temperat ūrų 
intervale iki 573 K, gali b ūti naudojama silikonin ė alyva. Skystas 
parafinas gali b ūti naudojamas tik iki 473 K. Vonios skystis kaiti ­
namas taip, kad temperat ūra iš pradži ų didėtų 3 K/min. Vonioje 
esantis skystis turi b ūti maišomas. Kai temperat ūra siekia apie 10 
K žemiau laukiamos virimo temperat ūros, kaitinimas sumažinamas 
taip, kad temperat ūros didėjimo greitis b ūtų 1 K/min. Art ėjant prie 
virimo temperat ūros, iš virinimo kapiliarinio vamzdelio greitai 
pradeda kilti burbuliukai.  
Virimo temperat ūra yra ta temperat ūra, kai staiga atv ėsinus burbu ­
liukų nebelieka, o skystis staiga pradeda kilti kapiliariniu vamzdeliu. 
Termometras atitinkamai rodo medžiagos virimo temperat ūrą. 
Modifikuotame variante (3 pav.) virimo temperat ūra nustatoma lydi ­
mosi temperat ūros nustatymo kapiliariniame vamzdelyje. Jis yra 
išploninamas ištempiant apie 2 cm (a), išsiurbiamas nedidelis kiekis bandinio. Atvirasis plonojo kapiliaro galiukas yra užlydomas taip, 
kad jo gale likt ų mažas oro burbuliukas. Kaitinant lydymosi tempe ­
ratūros aparate (b), oro burbuliukas ple čiasi. Virimo temperat ūra 
atitinka temperat ūrą, kurioje medžiagos gumul ėlis pasiekia vonioje 
esančio skysčio pavirši ų (c).
 
1.6.5.  Detekcija fotoelementu  
Kapiliariniame vamzdelyje esantis bandinys šildomas įkaitintame 
metaliniame bloke.  
Šviesos spindulys nukreipiamas pro bloke esan čias tam tinkan čias 
skylutes per medžiag ą į tiksliai kalibruot ą fotoelement ą. 
Didėjant mėginio temperat ūrai virinimo kapiliariniame vamzdelyje 
atsiranda pavieni ų oro burbuliuk ų. Pasiekus virimo temperat ūrą, 
burbuliuk ų labai padaug ėja. Dėl to pasikei čia šviesos intensyvumas, 
kurį užregistruoja fotoelementas, ir paduodamas sustabdymo signalas 
į indikatori ų, parodant į bloke esan čio platininio varžinio termometro 
rodmenis.  
Šis metodas yra ypa č naudingas, kadangi leidžia atlikti nustatymus 
mažesnėje negu kambario temperat ūroje (iki 253,15 K (-20 °C)) 
nedarant joki ų pakeitim ų aparate. Prietaisas papras čiausiai turi b ūti 
dedamas į aušinimo voni ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Termin ė analizė 
1.6.6.1.  Diferencin ė terminė analizė 
Žr. priedėlį. 
1.6.6.2.  Diferencin ė skenuojamoji kalorimetrija  
Žr. priedėlį. 
2. DUOMENYS  
Esant nedideliems nukrypimams nuo normalaus sl ėgio (daugiausiai ± 
5 kPa), virimo temperat ūra normalizuojama iki T  n naudojantis 
tokiomis Sidney Young skaitmenini ų verčių lygtimis:  
T n = T + (f  T x Δp) 
čia: 
Δ p = (101,325 – p) [pastaba]  
P = sl ėgio matavimas, kPa  
f T = virimo temperat ūros pokyčio greitis, sl ėgis K/kPa  
T = išmatuota virimo temperat ūra, K  
T n = virimo temperat ūra, koreguota iki normalaus sl ėgio, K  
Daugelio medžiag ų temperat ūros korekcijos koeficientai f  T ir jų 
aproksimacijos lygtys yra įtrauktos į anksčiau minėtus tarptautinius 
ir nacionalinius standartus.  
Pavyzdžiui, DIN 53171 metodas nurodo tokias apytikres korekcijas 
dažuose esantiems tirpikliams:  
2 lentelė 
Temperat ūra. Korekcijos koeficientai f  T 
Temperat ūra T (K)  Korekcijos koeficientas f  T (K/kPa)  
323,15  0,26  
348,15  0,28  
373,15  0,31  
398,15  0,33  
423,15  0,35  
448,15  0,37  
473,15  0,39  
498,15  0,41  
523,15  0,44  
548,15  0,45  
573,15  0,47  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
Į bandymo ataskait ą, jeigu įmanoma, įtraukiama tokia informacija:  
— naudotas metodas,  
— tikslus medžiagos apib ūdinimas(tapatumas ir priemaišos) ir preli ­
minarios gryninimo, jeigu toks naudojamas, stadijos,  
— tikslumo apskai čiavimas.  
Ne mažiau kaip dviej ų matavim ų, patenkan čių į apskaičiuotą tiks­
lumo interval ą (žr. 1 lentel ę), vidutin ė temperat ūra nurodoma kaip 
virimo temperat ūra. 
Nurodomos išmatuotos virimo temperat ūros ir jų vidurkiai, o sl ėgis 
(iai), kuriame buvo atlikti šie matavimai, nurodomas kPa. Pageidau ­
tina, kad sl ėgis būtų artimas normaliam atmosferos sl ėgiui. 
Pateikiama visa informacija ir pasteb ėjimai, svarb ūs duomen ų aiški­
nimui, ypa č apie medžiagoje esan čias priemaišas ir jos fizikin ę 
būseną. 
4. NUORODOS  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council 
C (81) 30 final.  
2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental ther ­
modynamics, Butterworths, London 1975, volume II.  
3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publi ­
cations, New York, 1959, volume I, Part I, Chapter VIII.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Priedėlis 
Papildomos technin ės informacijos, pavyzdžiui, galima ieškoti toliau nurodytuose 
standartuose  
1. Ebulioskopas  
1.1. Lydymosi temparat ūros nustatymo prietaisai su skys čių vonia 
ASTM D 1120–72  Standartinis automobili ų antifrizo virimo 
taško tyrimo metodas.  
2. Distiliavimo procesas (virimo intervalas)  
ISO/R 918  Distiliacijos tyrimo metodas. Distiliacijos 
eiga ir diapozonas.  
BS 4349/68  Distiliacijos naftos produktuose nustatymo 
metodas.  
BS 4591/71  Distiliacijos charakteristik ų nustatymo 
metodas.  
DIN 53171  Pagrindiniai rodikliai. Virimo nustatymas.  
NF T 20–608  Distiliacija: distiliacijos intervalo 
nustatymas.  
3. Diferencin ė terminė analizė ir diferencin ė skenuojamoji kalori ­
metrija  
ASTM E 537–76  Standartinis metodas chemikal ų įverti­
nimo metodas diferencijuotos šilumin ės 
analizės metodais.  
ASTM E 473–85  Standartinis šilumin ės analiz ės 
nustatymas.  
ASTM E 472–86  Šilumin ės analizės duomen ų panaudojimo 
standartas.  
DIN 51005  Šilumin ė analizė: sąvokos.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. SANTYKINIS TANKIS  
1. METODAS  
Apibūdintieji metodai yra pagr įsti OECD bandym ų gairėmis (1). 
Pagrindiniai principai yra pateikti 2 nuorodoje.  
1.1. ĮVADAS  
Santykinio tankio nustatymo metodai taikomi tiriant skyst ąsias ir 
kietąsias medžiagas nepriklausomai nuo j ų grynumo.. Naudotini 
metodai pateikti 1 lentel ėje. 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Skystųjų ir kietųjų medžiag ų santykinis tankis D 20 
4 yra tam tikro 
tiriamosios medžiagos t ūrio masės, esant 20 °C, ir tokio paties 
tūrio vandens mas ės, esant 4 °C temperat ūrai, santykis. Santykinis 
tankis yra bedimensis dydis.  
Medžiagos tankis ρ yra jos mas ės m ir tūrio v dalmuo.  
Tankis, ρ, SI vienetais nurodomas – kg/m  3 . 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS (1) (3)  
Nebūtina etalonines medžiagas naudoti visais atvejais, kai tiriama 
nauja medžiaga. Pagrindinis etalonini ų medžiag ų naudojimo tikslas 
yra periodiškai patikrinti metodo kokyb ę ir užtikrinti gaut ų rezultatų 
palyginamum ą su kitais metodais gaut ų bandymų duomenimis.  
1.4. METODO PRINCIPAS  
Naudojamos keturios bandym ų metodų klasės. 
1.4.1.  Plūdrumo metodai  
1.4.1.1.  Hidrometras  (skystosioms medžiagoms)  
Tankis gali b ūti pakankamai tiksliai ir greitai nustatomas pl ūdriaisiais 
hidrometrais, kurie leidžia nustatyti skys čio tankį pagal imersijos gyl į 
remiantis graduotos skal ės parodymais.  
1.4.1.2.  Hidrostatinis balansas  (skystosioms ir kietosioms medžiagoms)  
Mėginio, pasverto ore ir atitinkamame skystyje (pvz., vandenyje) 
svorių skirtumas gali b ūti naudojamas tankiui nustatyti.  
Kietiesiems k ūnams nustatytas kiet ųjų medžiagų tankis taikytinas tik 
tirtam bandiniui. Nustatant skys čių tankį, žinomo t ūrio v kūnas yra 
sveriamas iš pradži ų ore, po to – skystyje.  
1.4.1.3.  Panardint ų kūnų metodas  (skystosioms medžiagoms) (4)  
Pagal šį metodą skysčio tankis yra nustatomas pagal duomen ų, gautų 
sveriant skyst į prieš žinomo t ūrio kūno panardinim ą į jį, panardinus į 
jį ir ištraukus iš jo, skirtum ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Piknometrijos metodai  
Kietiesiems k ūnams ir skys čiams gali b ūti naudojami įvairių formų ir 
žinomo tūrio piknometrai. Tankis apskai čiuojamas pa ėmus pilno ir 
tuščio piknometro svorio ir jo žinomo t ūrio skirtum ą. 
1.4.3.  Oro palyginamasis piknometras  (kietiesiems k ūnams)  
Bet kokios formos kietojo k ūno tankį galima išmatuoti kambario 
temperatūroje su duj ų palyginamuoju piknometru. Medžiagos t ūris 
matuojamas įvairaus tūrio graduotais cilindrais ore arba inertin ėse 
dujose. Užbaigus t ūrio matavim ą, tankio apskai čiavimams vien ą 
kartą matuojama mas ė. 
1.4.4.  Osciliacinis densitometras  (5) (6) (7)  
Skysčio tankis gali b ūti matuojamas osciliaciniu densitometru. U 
formos vamzdelio mechaninis osciliatorius vibruojamas osciliatoriaus 
rezonanso dažniu, kuris priklauso nuo jo mas ės. Įdėjus tiriamosios 
medžiagos, pakinta osciliatoriaus rezonansinis dažnis. Aparatas turi 
būti kalibruojamas pagal dvi žinomo tankio skyst ąsias medžiagas. 
Geriau šias medžiagas parinkti taip, kad j ų tankiai apimt ų matuotin ą 
intervalą. 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Skirtingų metodų, naudojam ų santykiniam tankiui nustatyti, pritai ­
kymo galimyb ė pateikta lentel ėje. 
1.6. METODO APIB ŪDINIMAS  
Standartai, kuriuose, pavyzdžiui, reik ėtų ieškoti informacijos apie 
papildomus techninius ypatumus, yra pateikti priede.  
Tyrimai turi vykti 20 °C temperat ūroje, atliekant ne mažiau kaip du 
matavimus.  
2. DUOMENYS  
Žr. standartus.  
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
Ataskaitoje apie tyrim ą, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informa ­
cija: 
— naudotas metodas,  
— tikslus medžiagos apib ūdinimas(tapatumas ir priemaišos) bei 
preliminarios gryninimo, jeigu toks naudojamas, stadijos.  
Santykinis tankis  D 20 
4 pateikiamas kaip apibr ėžta 1.2 punkte, kartu 
pateikiant duomenis apie matuotos medžiagos fizin ę būseną. 
Pateikiama visa informacija ir pasteb ėjimai, svarb ūs duomen ų aiški­
nimui, ypa č apie medžiagoje esan čias priemaišas ir jos fizikin ę 
būseną. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Lentelė 
Metodų tinkamumas  
Matavimo metodas  Tankis  Didžiausia galima 
dinaminė klampa  Galiojantys standartai  
Kietieji k ūnai Skys čiai 
1.4.1.1. Hidrometras  Taip  5 Pa s  ISO 387 
ISO 649–2 
NF T 20–050  
1.4.1.2. Hidrostatinis balansas  
a) kietieji k ūnai Taip  ISO 1183 (A)  
b) skysčiai Taip  5 Pa s  ISO 901 ir 758  
1.4.1.3. Panardint ų kūnų metodas  Taip  20 Pa s  DIN 53217  
1.4.2. Piknometrija  ISO 3507  
a) kietieji k ūnai Taip  ISO 1183(B) 
NF T 20–053  
b) skysčiai Taip  500 Pa s  ISO 758  
1.4.3. Oro palyginamasis 
piknometras  Taip DIN 55990 
Teil 3, DIN 53243  
1.4.4. Osciliacinis densitometras  Taip  5 Pa s  
4. NUORODOS  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Council 
C(81) 30 final.  
2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part 1.
 
3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.
 
4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol.ll, p. 
427–430.  
5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektronik, 
1970, vol. 19, p. 297–302.  
6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen –Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen Produkten 
und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutische Industrie, 
1975, vol. 37, p. 717–726.  
7) Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253–255.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Priedėlis 
Papildomos technin ės informacijos, pavyzdžiui, galima ieškoti toliau nurodytuose 
standartuose  
1. Pl ūdrumo metodai  
1.1. Hidrometras 
DIN 12790, ISO 387  Hidrometras. Bendrosios instrukcijos.  
DIN 12791  I d. Tankio hidrometrai. Konstrukcija, 
pritaikymas ir naudojimas. 
I d. Tankio hidrometrai. Standartiniai 
dydžiai, ženklinimas. 
III d. Naudojimas ir patikra.  
ISO 649–2  Laboratoriniai stikliniai indai. Bendros 
paskirties tankio hidrometrai  
NF T 20–050  Cheminiai produktai pramoniniam naudo ­
jimui. Skys čių tankio Nustatymas. Areo ­
metrinis metodas  
DIN 12793  Laboratoriniai indai. Bendrosios paskirties 
tankio hidrometrai. Hidrometrai interva ­
lams nustatyti.  
1.2. Hidrostatinis balansas  
Kietosioms medžiagoms  
ISO 1183  A metodas. Plastik ų tankio ir santykinio 
tankio nustatymo metodai, išskyrus akytųjų plastikų
 
NF T 20–049  Cheminiai produktai pramoniniam naudo ­
jimui. Kiet ųjų kūnų, išskyrus milteli ų ir 
akytųjų medžiag ų, tankio nustatymas. 
Hidrostatinio balanso metodas  
ASTM-D-792  Plastmasi ų specifinio sunkio ir tankio 
nustatymas išst ūmimu  
DIN 53479  Plastmasi ų ir elastini ų medžiag ų tyrimas; 
tankio nustatymas  
Skystosioms medžiagoms  
ISO 901  ISO 758  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757  Mineralini ų alyvų ir susijusi ų medžiag ų 
tyrimas; tankio nustatymas  
ASTM D 941–55, ASTM D 1296–67 ir ASTM D 1481–62  
ASTM D 1298  Žalios naftos ir skyst ųjų naftos produkt ų 
tankio, specifinio ar API tankio nusta ­
tymas hidrometrijos metodu.  
BS 4714  Žalios naftos ir skyst ųjų naftos produkt ų 
tankio, specifinio ar API tankio nusta ­
tymas hidrometrijos metodu.  
1.3. Panardint ų kūnų metodas 
DIN 53217  Daž ų, lakų ir panaši ų dengian čiųjų 
medžiagų tyrimas; tankio nustatymas; 
panardint ų kūnų metodas  
2. Piknometrijos metodai  
2.1. Skystosioms medžiagoms  
ISO 3507  Piknometrai  
ISO 758  Skystieji cheminiai produktai; tankio 
nustatymas 20 °C temperat ūroje 
DIN 12797  Gay-Lussac  piknometras (nelakiems ir 
mažai klampiems skys čiams skys čiams,)  
DIN 12798  Lipkin  piknometras (skys čiams, kuri ų 
kinematin ė klampa mažesn ė kaip 100 × 
10-6 m  2 s -1 15 °C temperat ūroje)  
DIN 12800  Sprengel  piknometras (skys čiams pagal 
DIN 12798)  
DIN 12801  Reischauer  piknometras (skys čiams, kuri ų 
kinematin ė klampa mažesn ė kaip 100 × 
10-6 m  2 s -1 20 °C temperat ūroje, taip 
pat taikoma angliavandeniams ir vandens 
tirpalams su aukštesniu gar ų slėgiu, 
apytiksliai 1 baras 90 °C temperat ūroje) ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806  Hubbard  piknometras (vis ų rūšių klam­
piems skys čiams, kuri ų slėgis nėra per 
aukštas, ypa č dažams, lakui ir bitumui)  
DIN 12807  Bingham  piknometras (skys čiams, pagal 
DIN 12801)  
DIN 12808  Jaulmes  piknometras (ypa č etanolio - 
vandens mišiniams)  
DIN 12809  Piknometras su pagrindiniu termometru ir 
kapiliariniu vamzdeliu (skys čiams, kurie 
nėra per klamp ūs) 
DIN 53217  Daž ų, lakų ir panaši ų produktų tyrimas; 
tankio nustatymas piknometru  
DIN 51757  7 punktas. Mineralini ų alyvų ir susijusi ų 
medžiagų tyrimas; tankio nustatymas  
ASTM D 297  15 skirsnis. Gumos produktai – chemin ė 
analizė 
ASTM D 2111  C metodas. Halogeninti organiniai 
junginiai  
BS 4699  Naftos produkt ų specifinio sunkio ir 
tankio nustatymo metodas (graduoto 
dviejų kapiliarų piknometro metodas).  
BS 5903  Naftos produkt ų santykinio tankio ir 
tankio nustatymo metodas kapiliariniu – 
užkimštu piknometru  
NF T 20–053  Cheminiai produktai pramoniniam naudo ­
jimui. Milteliuose ir skys čiuose esan čių 
kietųjų dalelių tankio nustatymas. Pikno ­
metrijos metodas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. Kietosioms medžiagoms 
ISO 1183  B metodas. Plastik ų, išskyrus akyt ųjų, 
tankio ir santykinio tankio nustatymo 
metodai  
NF T 20–053  Cheminiai produktai pramoniniam naudo ­
jimui. Milteliuose ir skys čiuose esan čių 
kietųjų dalelių tankio nustatymas. Pikno ­
metrijos metodas  
DIN 19683  Dirvožemi ų tankio nustatymas  
3. Oro palyginamasis piknometras  
DIN 55990  3 dalis: Daž ų ir kitų dangų tyrimas. Lako 
milteliai. Tankio nustatymas.  
DIN 53243  Dažan čios medžiagos. Chlorinti polimerai. 
Nustatymas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. GAR Ų SLĖGIS 
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 104 (2004).  
1.1. ĮVADAS  
Į pataisytąją A.4 metodo (1) versij ą įtrauktas vienas papildomas 
metodas, t.y., efuzijos metodas: izotermin ė termogravimetrija, skirtas 
cheminėms medžiagoms, kuri ų garų slėgis yra labai mažas (iki 10  –10 
Pa). Atsižvelgiant į metodikų poreikį, ypač tokių, kurios tikt ų žemo 
garų slėgio medžiagoms, kitos šio metodo metodikos yra pakartotinai 
įvertintos d ėl jų tinkamumo kitiems sl ėgio intervalams.  
Termodinamin ės pusiausvyros s ąlygomis grynosios medžiagos gar ų 
slėgis yra tik temperat ūros funkcija. Pagrindiniai metodo principai 
aprašyti kitur (2)(3).  
Jokia viena matavimo metodika netinka gar ų slėgiui matuoti inter ­
vale nuo mažiau kaip 10  –10 iki 10  5 Pa. Šį metodą sudaro aštuoni 
garų slėgio matavimo metodai, kurie gali b ūti taikomi skirtingiems 
garų slėgio intervalams. Įvairių metodų taikymo atvejai ir matavimo 
intervalai pateikti 1 lentel ėje. Metodai gali b ūti taikomi tik bandymo 
sąlygomis patvariems junginiams. Jei bandymo metodai negali b ūti 
taikomi d ėl technini ų priežasčių, garų slėgį irgi galima įvertinti, o 
rekomenduojamas įvertinimo metodas aprašytas pried ėlyje. 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Medžiagos gar ų slėgis apibr ėžiamas kaip so čiųjų garų slėgis virš 
kietosios arba skystosios medžiagos.  
Reikėtų naudoti SI sl ėgio vienet ą – Paskal į (Pa). Čia pateikiami 
istoriškai naudoti vienetai ir faktoriai jiems perskai čiuoti: 
1 toras  =  1 mm Hg  =  1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosfera  =  1,013 × 10  5 Pa 
1 baras  =  10  5 Pa 
SI temperat ūros vienetas – kelvinas (K). Temperat ūrai Celsijaus 
laipsniais perskai čiuoti į Kelvino laipsnius taikoma formul ė: 
T = t + 273,15  
čia, T – Kelvino arba termodinamin ė temperat ūra ir  t – Celsijaus 
temperatūra. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
1 lentelė 
Matavimo metodas  Medžiagos  Pakartojamumo 
įvertis  Atkuriamumo 
įvertis  Rekomenduojamas 
intervalas  kietosios  skystosios  
Dinaminis metodas  Žema lyd. 
temp.  Taip iki 25 % 
1–5 %  iki 25 % 
1–5 %  10 3 Pa – 2 × 10  3 
Pa 
2 × 10  3 Pa – 10  5 
Pa 
Statinis metodas  Taip  Taip  5–10 %  5–10 %  10 Pa – 10  5 Pa 
10 –2 Pa – 10  5 
Pa (  1 ) 
Izoteniskopo 
metodas  Taip Taip  5–10 %  5–10 %  10  2 Pa – 10  5 Pa 
Efuzijos metodas: 
garų slėgio pusi­
ausvyra  Taip Taip  5–20 %  iki 50 %  10  –3 – 1 Pa  
Efuzijos metodas:  
Knudseno  kamera  Taip Taip  10–30 %  —  10  –10 – 1 P  
Efuzijos metodas: 
izotermin ė termo­
gravimetrija  Taip Taip  5–30 %  iki 50 %  10  –10 – 1 Pa  
Dujų soties 
metodas  Taip Taip  10–30 %  iki 50 %  10  –10 – 10  3 Pa 
Sukamojo rotoriaus 
metodas  Taip Taip  10–20 %  —  10  –4 -0,5 Pa  
( 1 ) Naudojant talpin į slėgmatį. 
1.3. BANDYMO ESM Ė 
Apskritai, gar ų slėgis nustatomas įvairioje temperat ūroje. Ribotame 
temperatūros intervale grynos medžiagos gar ų slėgio logaritmas yra 
tiesinė atvirkštin ės termodinamin ės temperat ūros funkcija pagal 
supaprastint ą Klapeirono-Klauzijaus lygt į: 
log p ¼ ΔHv 
2,3RT þ constant  
čia: 
p = gar ų slėgis Paskaliais  
ΔHv = garavimo šiluma J mol  –1 
R = universalioji duj ų konstanta, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = temperat ūra K.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Etaloninių medžiag ų naudoti neb ūtina. Visų pirma, jos skirtos kart ­
karčiais patikrinti metodo taikom ąsias savybes ir lyginti skirtingais 
metodais gautus rezultatus.  
1.5. METOD Ų APRAŠYMAS  
1.5.1.  Dinaminis metodas (Cottrell‘o metodas)  
1.5.1.1.  Metodo esm ė 
Garų slėgis nustatomas matuojant medžiagos virimo temperat ūrą 
esant įvairiems apibr ėžtiems slėgiams nuo maždaug 10  3 iki 10  5 Pa. 
Be to, šis metodas rekomenduojamas virimo temperat ūrai nustatyti. 
Šiuo atveju jis tinka iki 600 K. D ėl skysčių stulpelio hidrostatinio 
slėgio jų virimo temperat ūra 3–4 cm gylyje yra maždaug 0,1 °C 
aukštesnė nei paviršiuje. Taikant  Cottrell‘o  metodą (4), termometras 
laikomas garuose virš skys čio paviršiaus, o verdantis skystis vis ą 
laiką siurbiamas virš termometro burbuliuko. Burbuliuk ą dengia 
skysčio, esan čio pusiausvyroje su garais atmosferos sl ėgyje, 
sluoksnis. Taigi termometras rodo tikr ąją virimo temperat ūrą, kai 
nėra paklaidos d ėl perkaitinimo arba hidrostatinio sl ėgio. Siurblys, 
kurį pirmą kartą panaudojo  Cottrell‘as , pavaizduotas 1 paveiksle. 
Verdantis skystis yra A m ėgintuvėlyje. Į jo dugną įlydyta platinos 
viela B užtikrina tolyg ų virimą. Šoninis vamzdelis C sujungtas su 
kondensatoriumi, o apvalkalas D apsaugo termometr ą E nuo šalto 
kondensato. Kai skystis A m ėgintuvėlyje verda, piltuvu sugauti 
burbuliukai ir skystis pilami nuo dviej ų siurblio F atšak ų ant termo ­
metro burbuliuko.  
1 paveikslas
  2 paveikslas
  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Cottrell‘o  siurblys (4)  
A: Termopora  
B: Vakuumo buferinis t ūris 
C: Slėgmatis  
D: Vakuumas  
E: Matavimo taškas  
F: Kaitinimo elementas  c.a. 150 W  
1.5.1.2.  Aparat ūra 
Labai tikslus aparatas, taikantis  Cottrell‘o  principą, pavaizduotas 2 
paveiksle. J į sudaro vamzdis su virintuvo skyriumi apatin ėje dalyje, 
aušintuvu vidurin ėje dalyje ir išleidžiam ąja anga bei junge viršutin ėje 
dalyje.  Cottrell‘o  siurblys įstatomas į virintuvo dal į, kaitinam ą elek­
triniu kaitintuvu. Temperat ūra matuojama dengt ąja termopora arba 
varžiniu termometru, įstatomu per jung ę viršuje. Išleidžiamoji anga 
jungiama su sl ėgio reguliavimo sistema. Pastar ąją sudaro vakuuminis 
siurblys, buferinis t ūris, slėgio stabilizatorius azotui, kuriuo reguliuo ­
jamas slėgis, įleisti ir sl ėgmatis.  
1.5.1.3.  Darbo eiga  
Medžiaga dedama į virintuvo skyri ų. Gali kilti problem ų, jei kieto ­
sios medžiagos ne milteliai, bet jas kartais galima išspr ęsti šildant 
aušinimo gaubt ą. Jungės vietoje aparat ūra sandariai uždaroma ir 
medžiaga nudujinama. Taikant š į metodą, negalima matuoti puto ­
jančių medžiag ų garų slėgio. 
Nustatomas mažiausias reikiamas sl ėgis ir įjungiamas kaitinimas. 
Tuo pat metu prie savirašio prijungiamas temperat ūros jutiklis.  
Pusiausvyra pasiekiama, kai pastoviame sl ėgyje užrašoma pastovi 
virimo temperat ūra. Ypač reikia stengtis išvengti verdan čio skysčio 
šuolių. Be to, ant aušintuvo turi įvykti visiška kondensacija. Nusta ­
tant žemos lydymosi temperat ūros kietųjų medžiag ų garų slėgį, 
reikėtų žiūrėti, kad neužsikimšt ų kondensatorius.  
Užrašius ši ą pusiausvyrin ę temperat ūrą, nustatomas didesnis sl ėgis. 
Procesas t ęsiamas tuo pa čiu būdu tol, kol pasiekiamas 10  5 Pa slėgis 
(viso maždaug nuo 5 iki 10 matavimo tašk ų). Siekiant patikrinti, 
pusiausvyrin ės temperat ūros vertės turi būti nustatytos mažinant 
slėgį. 
1.5.2.  Statinis metodas  
1.5.2.1.  Metodo esm ė 
Taikant statin į metodą (5), tam tikroje temperat ūroje nustatomas 
termodinamin ę pusiausvyr ą atitinkantis gar ų slėgis. Šis metodas 
tinka medžiagoms ir daugiakomponen čiams skys čiams bei kieto ­
sioms medžiagoms intervale nuo 10  –1 iki 10  5 Pa, be to, jei b ūtų 
imtasi atsargumo priemoni ų, intervale nuo 1 iki 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Aparat ūra 
Įrangą sudaro pastovios temperat ūros vonia (preciziškumas ±0,2 K), 
indas medžiagai, prijungtas prie vakuumo, sl ėgmatis ir sistema 
slėgiui reguliuoti. Ėminio kamera (3a paveikslas) prijungiama prie 
vakuumo per vožtuv ą ir diferencin į slėgmatį (U vamzdel į, pripildyt ą 
atitinkamo sl ėgmačio skysčio), kuris naudojamas kaip nulio rody ­
tuvas. Diferenciniam sl ėgmačiui pildyti tinka gyvsidabris, polisilok ­
sanai ir ftalatai, atsižvelgiant į slėgio interval ą ir bandomosios 
medžiagos chemines savybes. Ta čiau, jei įmanoma, d ėl aplinkos 
problemų reikėtų vengti naudoti gyvsidabr į. Bandomoji medžiaga 
neturi pastebimai tirpti U vamzdelio skystyje arba su juo reaguoti. 
Vietoj U vamzdelio galima naudoti sl ėgmatį (3b paveikslas). Sl ėg­
mačiui pildyti tinka gyvsidabris sl ėgio intervale nuo normalaus iki 
10 2 Pa slėgio, o polisiloksaniniai skys čiai ir ftalatai – nuo mažesnio 
kaip 10  2 Pa iki 10 Pa sl ėgio. Yra kiti sl ėgmačiai mažesniam kaip 10  2 
Pa slėgiui matuoti ir kaitinamos membranos talpiniai manometrai 
tinka matuoti net mažesn į kaip 10  –1 Pa slėgį. Matuojama indo su 
ėminiu išorin ės sienelės temperat ūra arba temperat ūra pačiame inde.  
1.5.2.3.  Darbo eiga  
Naudodami 3a paveiksle pavaizduot ą aparatą, pripildykite U vamz ­
delį pasirinktu skys čiu, kuris turi b ūti nudujintas aukštesn ėje tempe­
ratūroje prieš užrašant rodmenis. Bandomoji medžiaga dedama į 
aparatą ir nudujinama žemesn ėje temperat ūroje. Jei ėminys daugia ­
komponentis, temperat ūra turėtų būti pakankamai žema, kad negal ėtų 
pakisti medžiagos sud ėtis. Pusiausvyra grei čiau pasiekiama maišant. 
Ėminį galima atšaldyti skystu azotu arba sausu ledu, ta čiau reikėtų 
imtis priemoni ų išvengti oro dr ėgmės arba siurblio skys čio konden ­
sacijos. Atidarius ėminio indo vožtuv ą, kelias minutes siurbiama orui 
pašalinti. Prireikus nudujinimas kartojamas kelis kartus.  
3a paveikslas
  3b paveikslas
  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Kai uždarius vožtuv ą ėminys kaitinamas, gar ų slėgis didėja. Tai 
keičia skysčio U vamzdelyje pusiausvyr ą. Jai atstatyti į aparatą 
leidžiamas azotas arba oras tol, kol sl ėgio skirtumo rodytuvas v ėl 
rodo nulį. Pusiausvyrai pasiekti b ūtinas slėgis gali b ūti matuojamas 
slėgmačiu arba didesnio preciziškumo prietaisu. Šis sl ėgis atitinka 
medžiagos gar ų slėgį matuojamoje temperat ūroje. Naudojant 3 b 
paveiksle pavaizduot ą aparatą, garų slėgis rodomas tiesiogiai.  
Garų slėgis nustatomas atitinkamai mažiems temperat ūros interva ­
lams (viso maždaug nuo 5 iki 10 matavimo tašk ų) iki reikiamos 
aukščiausios temperat ūros. 
Kaip tikrinimo priemon ė, turi būti pakartotinai gauti rodmenys maži ­
nant temperat ūrą. Jei kartotini ų matavim ų rodmenys neatitinka did ė­
jančios temperat ūros kreivei gaut ų rodmenų, to priežastimi gali b ūti 
šios aplinkyb ės: 
i) ėminyje vis dar yra oro (pvz., labai klampi ų medžiag ų atveju) 
arba žemos virimo temperat ūros medžiag ų, kuri arba kurios išsis ­
kiria kaitinant;  
ii) vyksta medžiagos chemin ė reakcija tiriamame temperat ūros inter­
vale (pvz., skilimas, polimerizacija).  
1.5.3.  Izoteniskopo metodas  
1.5.3.1.  Metodo esm ė 
Izoteniskopas (6) pagr įstas statinio metodo principu. Taikant metod ą, 
ėminys dedamas į pastovios temperat ūros kolbut ę, jungiam ą su slėg­
mačiu ir vakuuminiu siurbliu. Lakesn ės nei medžiaga priemaišos 
šalinamos nudujinant sumažintame sl ėgyje. Ėminio gar ų slėgis pasi­
rinktoje temperat ūroje pusiausvirinamas matuojamu inertiniu duj ų 
slėgiu. Izoteniskopas buvo sukurtas tam tikr ų skystųjų angliavande ­
nilių garų slėgiui matuoti, bet jis tinka ir kietosioms medžiagoms 
tirti. Metodas paprastai netinka daugiakomponent ėms sistemoms. 
Rezultatų paklaidos yra mažos tik tokiu atveju, jei ėminiai turi 
nelakių priemaiš ų. Rekomenduojamas intervalas nuo 10  2 iki 10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Aparat ūra 
Matavimo įtaiso pavyzdys pavaizduotas 4 paveiksle. Vis ą aprašym ą 
galima rasti ASTM D 2879–86 (6).  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Darbo eiga  
Skysčių atveju pati medžiaga naudojama kaip diferencinio sl ėgmačio 
skystis. Į izoteniskop ą įpilama skys čio, kurio kiekio pakanka kolbutei 
ir trumpajai sl ėgmačio atšakai pripildyti. Izoteniskopas jungiamas 
prie vakuumavimo sistemos ir išsiurbus or ą pripildomas azoto. 
Sistemos išsiurbimas ir prap ūtimas kartojamas du kartus deguonies 
likučiui pašalinti. Pripildytas izoteniskopas dedamas į horizontali ą 
padėtį, taigi ėminys plonu sluoksniu pasklinda ėminio kolbut ėje ir 
slėgmatyje. Sistemos sl ėgis sumažinamas iki 133 Pa ir ėminys iš l ėto 
kaitinamas tol, kol pradeda virti (šalinamos ištirpusios dujos). Izote ­
niskopas statomas taip, kad ėminys vėl subėgtų į kolbutę ir užpildyt ų 
trumpąją slėgmačio atšaką. 133 Pa sl ėgis nekei čiamas. Ištemptas 
kolbutės smaigalys kaitinamas silpna liepsna tol, kol susidar ę ėminio 
garai išsiple čia tiek, kad dalis ėminio išstumiama iš viršutin ės 
kolbutės dalies ir sl ėgmačio atšakos į slėgmatį, sudarydami garais 
užpildytą ir azoto neturin čią erdvę. Izoteniskopas dedamas į pasto­
vios temperat ūros vonią ir azoto sl ėgis sulyginamas su ėminio slėgiu. 
Esant pusiausvyrai, azoto sl ėgis atitinka medžiagos gar ų slėgį. 
4 paveikslas
  
Kietųjų medžiag ų atveju naudojami sl ėgmačio skysčiai, pvz., polisi ­
loksaniniai skys čiai arba ftalatai, atsižvelgiant į taikomus sl ėgio ir 
temperatūros intervalus. Nudujintas sl ėgmačio skystis supilamas į 
izoteniskopo ilgosios atšakos pastorint ą vietą. Tiriama kietoji 
medžiaga dedama į ėminio kolbut ę ir nudujinama padidintoje tempe ­
ratūroje. Izoteniskopas palenkiamas, kad sl ėgmačio skystis gal ėtų 
tekėti į U vamzdel į. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Efuzijos metodas: gar ų slėgio pusiausvyra  (7) 
1.5.4.1.  Metodo esm ė 
Bandomosios medžiagos ėminys kaitinamas mažoje krosnyje ir 
dedamas po gaubtu, iš kurio išsiurbiamas oras. Krosnis uždengiama dangčiu, kuriame yra mažos žinomo skersmens skylut ės. Per vien ą iš 
skylučių išeinantys medžiagos garai nukreipiami į svarstykli ų, kurios 
irgi yra po išsiurbtu gaubtu, l ėkštę. Pagal kai kurias schemas svars ­
tyklių lėkštė yra apgaubta šaldymo kamera, kuri sklaido šilum ą į 
išorę tik šiluminio laidumo d ėka, ir aušinama tik spinduliavimu, 
taigi išeinantys garai kondensuojasi ant l ėkštės. Garų srauto kinetin ė 
energija veikia l ėkštę kaip jėga. Garų slėgis gali b ūti gautas dviem 
būdais: tiesiogiai pagal svarstykli ų lėkštę veikiančią jėgą ir dar pagal 
garavimo spart ą, taikant  Hertzo-Knudseno  lygtį (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M r 
čia: 
G = garavimo sparta (kg s  –1 m –2 ) 
M = molin ė masė (g mol  –1 ) 
T = temperat ūra (K)  
R = universalioji duj ų konstanta (J mol  –1 K –1 ) 
P = gar ų slėgis (Pa)  
Rekomenduojamas intervalas yra nuo 10  –3 iki 1 Pa.  
1.5.4.2.  Aparat ūra 
Bendroji aparat ūros schema pavaizduota 5 paveiksle.  
5 paveikslas
  
A: Pagrindo plokšt ė F:  Šaldymo kamera ir šaldymo strypas  
B: Judamosios rit ės prietaisas  G:  Garinimo krosnis  
C: Gaubtas  H:  Diuaro indas su skystu azotu  
D: Svarstykl ės ir jų lėkštė I:  Ėminio temperat ūros matuoklis  
E: Vakuumetras  J:  Bandomoji medžiaga  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Efuzijos metodas: Knudseno kamera  
1.5.5.1.  Metodo esm ė 
Taikant metod ą, įvertinama bandomosios medžiagos mas ė, per laiko 
vienetą ištekanti gar ų pavidalu iš  Knudseno  kameros (8) per maž ą 
angą ypač didelio vakuumo s ąlygomis. Ištekan čių garų masę galima 
nustatyti pagal kameros mas ės mažėjimą arba kondensuojant garus 
žemoje temperat ūroje ir išgaravusios medžiagos kiek į nustatant chro ­
matografijos metodu. Gar ų slėgis apskai čiuojamas, taikant  Hertz- 
Knudsen  lygtį (žr. 1.5.4.1 skirsn į) ir pataisos faktorius, susietus su 
aparatūros parametrais (9). Rekomenduojamas intervalas yra nuo 
10 –10 iki 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Aparat ūra 
Bendroji aparat ūros schema pavaizduota 6 paveiksle.  
6 paveikslas
  
1: Vakuumo jungtis  7:  Užsukamas dangtelis  
2: Lizdai platinos varžiniam termometrui 
arba temperat ūrai matuoti ir reguliuoti  8: Sparnuotosios veržl ės 
3: Vakuuminio indo dangtis  9:  Varžtai  
4: Žiedinis tarpiklis  10:  Efuzijos kameros iš ner ūdijančiojo plieno  
5: Vakuuminis indas iš aliuminio  11:  Kaitinimo elementas  
6: Įtaisas efuzijos kameroms įdėti ir išimti  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Efuzijos metodas: izotermin ė termogravimetrija  
1.5.6.1.  Metodo esm ė 
Metodas pagr įstas bandomosios medžiagos pagreitinto garavimo 
aukštesnėje temperat ūroje ir aplinkos sl ėgyje spartos nustatymu, 
taikant termogravimetrij ą (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Garavimo 
spartos vert ės v  T gaunamos pasirinkt ą junginį veikiant iš l ėto 
tekančių inertinių dujų atmosfera ir nustatant mas ės mažėjimą per 
atitinkam ą laikotarp į, esant apibr ėžtai pastoviai absoliu čiajai tempe ­
ratūrai T. Gar ų slėgio vertės p  T apskaičiuojamos pagal v  T vertes, 
taikant tiesin ę garų slėgio logaritmo ir garavimo spartos logaritmo 
funkciją. Prireikus galima ekstrapoliuoti 20 ir 25 °C temperat ūros 
vertėms, atliekant regresin ę log p  T kaip 1/T funkcijos analiz ę. Šis 
metodas tinka medžiagoms, kuri ų garų slėgio vertės yra 10  –10 Pa 
(10 –12 mbar) ir grynumas kiek įmanoma ar čiau 100 %, kad b ūtų 
išvengta išmatuoto mas ės sumažėjimo neteisingo aiškinimo.  
1.5.6.2.  Aparat ūra 
Bandymo įrangos bendroji schema pavaizduota 7 paveiksle.  
7 paveikslas
  
Ėminio laikiklio plokšt ė, pakabinta ant mikrosvarstykli ų reguliuo ­
jamos temperat ūros kameroje, nupu čiama sauso azoto srove, kuri 
išneša bandom ąją medžiag ą. Iš kameros iš ėjęs dujų srautas valomas 
sorbcijos bloke.  
1.5.6.3.  Darbo eiga  
Šiurkštinto paviršiaus stiklo plokšt ė padengiama vienaly čiu bando­
mosios medžiagos sluoksniu. Jei tiriamos kietosios medžiagos, plokštė tolygiai suvilgoma medžiagos tirpalu atitinkamame tirpiklyje 
ir džiovinama inertini ų dujų atmosferoje. Matavimui atlikti dengtoji 
plokštė kabinama į termogravimetrin į analizatori ų ir nepertraukiamai 
matuojamas jos mas ės mažėjimas kaip laiko funkcija.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Garavimo sparta v  T tam tikroje temperat ūroje apskai čiuojama pagal 
ėminio mas ės sumažėjimą Δm taikant lygt į: 
v T ¼ Δm 
F Ö t ðg cm  –2 h –1 Þ 
čia F – plotas, padengtas bandom ąja medžiaga, paprastai ėminio 
plokštės paviršiaus plotas, ir  t – laikas, per kur į masė sumažėja Δm. 
Garų slėgis p  T apskaičiuojamas kaip garavimo spartos v  T funkcija:  
log p  T = C + D log v  T 
čia C ir D yra konstantos, b ūdingos naudojamai bandymo įrangai, 
susijusios su matavimo kameros skersmeniu ir duj ų srautu. Šios 
konstantos turi b ūti nustatytos vien ą kartą matuojant žinomo gar ų 
slėgio jungini ų rinkinį ir atliekant log p  T kaip log v  T funkcijos 
regresiją (11)(21)(22).  
Santykis tarp gar ų slėgio p  T ir absoliu čiosios temperat ūros T apra ­ 
šomas lygtimi:  
log p  T = A + B 1/T  
čia A ir B yra konstantos, gautos atliekant log p  T pagal 1/T regresij ą. 
Pagal šią lygtį garų slėgis gali b ūti apskaičiuotas ekstrapoliavimo 
būdu bet kuriai kitai temperat ūrai. 
1.5.7.  Duj ų soties metodas  (23)  
1.5.7.1.  Metodo esm ė 
Žinomo t ūrio kambario temperat ūros inertini ų dujų srautas teka per 
bandomosios medžiagos ėminį arba virš jo tokiu grei čiu, kuris užtik ­
rintų dujų prisotinim ą. Labai svarbu pasiekti duj ų fazės sotį. Pernešta 
medžiaga sulaikoma, dažniausiai sorbentu, ir nustatomas jos kiekis. Vietoj gar ų sulaikymo ir v ėlesnės analizės kiekybiniam perneštos 
medžiagos kiekio nustatymui galima taikyti nuosekliai atliekamos 
analizės metodus, pvz., duj ų chromatografij ą. Garų slėgis apskai čiuo­
jamas darant prielaid ą, kad dujoms tinka ideali ųjų dujų dėsnis ir 
visas duj ų mišinio sl ėgis yra lygus mišin į sudarančių komponent ų 
slėgių sumai. Bandomosios medžiagos dalinis sl ėgis, t. y. gar ų slėgis, 
apskaičiuojamas pagal išmatuot ą visą dujų tūr
į ir perneštos 
medžiagos mas ę. 
Dujų soties metodas tinka kietosioms arba skystosioms chemin ėms 
medžiagoms. Jis gali b ūti taikomas gar ų slėgiui iki 10  –10 Pa 
(10)(11)(12)(13)(14). Metodo patikimumas didžiausias, kai gar ų 
slėgis yra mažesnis kaip 10  3 Pa. Kai jis yra didesnis kaip 10  3 Pa, 
paprastai gaunamos padidintos gar ų slėgio vertės, galbūt dėl aero­
zolių susidarymo. Kadangi gar ų slėgio matavimai atliekami kambario 
temperatūroje, nėra būtina ekstrapoliuoti aukštesn ės temperat ūros 
vertėms gautus duomenis, taigi išvengiama aukštai temperat ūrai 
gautų duomen ų ekstrapoliacijos, kuri dažnai gali b ūti didelių 
paklaidų priežastimi.  
1.5.7.2.  Aparat ūra 
Taikant š į metodą būtina naudoti pastovios temperat ūros kamer ą. 8 
paveiksle pateiktame kameros eskize pavaizduota kamera, turinti po tris kietųjų ir skystųjų ėminių talpyklas, tod ėl įmanoma kietojo arba 
skystojo ėminio analiz ę kartoti tris kartus. Temperat ūra reguliuojama 
±0,5 °C arba geresniu tikslumu.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
8 paveikslas
  
Dažniausiai kaip inertinis nešiklis naudojamos azoto dujos, bet 
kartais gali tekti naudoti kitas dujas (24). Nešiklio dujos turi b ūti 
sausos. Duj ų srautas dalijamas į 6 srautus, reguliuojamus adatiniais 
vožtuvais (anga maždaug 0,79 mm), ir teka į kamerą per 3,8 mm v. 
s. varinius vamzdžius. Pasiekus temperat ūros pusiausvyr ą, dujos teka 
per ėminį, gaudykl ę su sorbentu ir išleidžiamos iš kameros.  
Kietėji ėminiai dedami į 5 mm v. s. stiklo vamzdžius tarp stiklo 
vatos kamš čių (žr. 9 paveiksl ą). 10 paveiksle pavaizduota skystojo 
ėminio talpykla ir sorbento sistema. Geriausi atkuriamumo rezultatai 
gaunami taikant skys čių garų slėgio matavimo metod ą, kai stiklo 
arba inertinio sorbento, pvz., kvarco, karoliukai padengiami skys čiu 
ir šiais karoliukais pripildoma talpykl ą. Pagal kit ą būdą nešiklio 
dujos gali b ūti leidžiamos per didelio akytumo sukepint ą stiklą ir 
barbotuojamos per skystos bandomosios medžiagos kolon ėlę. 
9 paveikslas
  10 paveikslas
  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Sorbento sistem ą sudaro priekinis ir atsarginis sorbento skyriai. Kai 
garų slėgis yra labai mažas, sorbentu sulaikomas tik labai mažas 
kiekis ir rimta problema gali b ūti adsorbcija ant stiklo vatos bei 
stiklinių vamzdži ų. 
Kietu CO  2 aušinamos gaudykl ės yra kitas efektyvus b ūdas 
medžiagos garams surinkti. Jos nesudaro jokio priešsl ėgio prisoti ­
nimo kolon ėlėje, be to, labai lengva pašalinti sulaikyt ą medžiag ą. 
1.5.7.3.  Darbo eiga  
Ištekančių nešiklio duj ų srautas matuojamas kambario temperat ūroje. 
Bandymo metu srautas dažnai tikrinamas, siekiant užtikrinti tiksl ų 
visą nešiklio duj ų tūrį. Geriau b ūtų visą laiką jį matuoti mas ės 
srautmačiu. Dujų fazei prisotinti gali b ūti reikalinga gana didel ė 
sąlyčio trukmė, taigi visiškai mažos duj ų srauto vert ės (25).  
Po bandymo priekinis ir atsarginis sorbento skyriai analizuojami 
atskirai. Kiekviename skyriuje esantis junginys desorbuojamas 
tirpikliu. Atliekama gaut ų tirpalų kiekybin ė analizė iš kiekvieno 
skyriaus desorbuotai masei nustatyti. Analiz ės metodo (ir sorbento 
bei desorbcijai naudojamo tirpiklio) pasirinkim ą lemia bandomosios 
medžiagos prigimtis. Desorbcijos efektyvumui nustatyti žinomas 
ėminio kiekis švirkš čiamas ant sorbento, desorbuojamas ir atgautas 
kiekis analizuojamas. Svarbu patikrinti desorbcijos efektyvum ą esant 
koncentracijai, kuri b ūtų lygi arba beveik lygi ėminio koncentracijai 
bandymo s ąlygomis.  
Norint įsitikinti, ar nešiklio dujos yra prisotintos bandom ąja 
medžiaga, naudojami trys skirtingi duj ų srautai. Jei apskai čiuota 
garų slėgio vertė nesikeičia dėl srauto poky čio, daroma prielaida, 
kad dujos yra prisotintos.  
Garų slėgis apskai čiuojamas pagal lygt į: 
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
čia: 
p = gar ų slėgis (Pa)  
W = išgaravusios bandomosios medžiagos mas ė (g) 
V = so čiųjų garų tūris (m  3 ) 
R = universalioji duj ų konstanta 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperat ūra (K)  
M = bandomosios medžiagos molin ė masė (g mol  –1 ) 
Turi būti daroma matuojam ų tūrių pataisa d ėl srautma čio ir prisoti ­
nimo kolon ėlės slėgio ir temperat ūros skirtumo.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Sukamasis rotorius  
1.5.8.1.  Metodo esm ė 
Taikant š į metodą, naudojamas sukamojo rotoriaus klampos 
matuoklis, kurio matavimo elementas yra magnetiniame lauke paka ­
bintas mažas plieninis rutuliukas, sukam ųjų laukų verčiamas suktis 
(26)(27)(28). Apsisukim ų dažnis gali b ūti išmatuotas matavimo 
ritėmis. Kai rutuliukas pasiekia nustatyt ą apsisukim ų dažnį, paprastai 
apie 400 apsisukim ų per sekund ę, žadinimas nutraukiamas ir dažnis 
pradeda maž ėti dėl dujų trinties. Apsisukimo dažnio maž ėjimas 
matuojamas kaip laiko funkcija. Gar ų slėgis nustatomas pagal plie ­
ninio rutuliuko l ėtėjimą, kuris yra sl ėgio funkcija. Rekomenduojamas 
intervalas yra nuo 10  –4 iki 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Aparat ūra 
Bandymo įrenginio schema pavaizduota 11 paveiksle. Matavimo 
galvutė įdedama į gaubtą, kurio pastovi temperat ūra reguliuojama 
0,1 °C tikslumu. Ėminio indas dedamas į atskirą gaubtą, kurio 
temperatūra irgi reguliuojama 0,1 °C tikslumu. Vis ų kitos įrenginio 
dalių temperat ūra yra aukštesn ė, siekiant išvengti kondensacijos. 
Visas aparatas yra prijungtas prie vakuumo sistemos.  
11 paveikslas
  
2. DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS  
2.1. DUOMENYS  
Garų slėgis, gautas taikant bet kur į iš pirmiau pateikt ų metodų, turėtų 
būti nustatytas bent dviem temperat ūros vertėms. Siekiant patikrinti 
garų slėgio kreivės tiesiškum ą, pageidautina sl ėgį nustatyti trims arba 
daugiau ver čių intervale nuo 0 iki 50 °C. Vietoje temperat ūros inter­
valo nuo 0 iki 50 °C efuzijos metodo ( Knudseno  kamera ir izoter ­
minė termogravimetrija) ir duj ų soties metodo atveju rekomenduo ­
jamas matavimo temperat ūros intervalas nuo 120 iki 150 °C.  
2.2. BANDYM Ų ATASKAITA  
Bandymų ataskaitą turi sudaryti ši informacija:  
— taikytas metodas,  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— tiksli medžiagos specifikacija (identifikavimo duomenys ir prie ­
maišos) ir pradinio gryninimo pakopa, jei taikoma,  
— bent dvi b ūtinos garų slėgio ir temperat ūros vertės, geriau trys 
arba daugiau, intervale nuo 0 iki 50 °C (arba nuo 120 iki 150 °C),
 
— bent viena iš temperat ūros verčių turėtų būti lygi 25 °C arba 
žemesnė, jei techniškai įmanoma pagal pasirinkt ą metodą, 
— visi pradiniai duomenys,  
— log p kaip 1/T funkcijos kreiv ė, 
— garų slėgio 20 arba 25 °C įvertis.  
Jei stebimas virsmas (b ūsenos pokytis, skilimas), tur ėtų nūti pažy­
mėta ši informacija:  
— virsmo pob ūdis, 
— virsmo temperat ūra atmosferos sl ėgyje,  
— garų slėgis 10 ir 20 °C žemiau virsmo temperat ūros bei 10 ir 
20 °C aukš čiau šios temperat ūros (išskyrus virsm ą iš kietosios į 
dujinę būseną). 
Ataskaitoje turi b ūti pateikta visa rezultatams interpretuoti b ūtina 
informacija ir pastabos, ypa č apie priemaišas ir medžiagos fizikin ę 
būseną. 
3. LITERAT ŪRA 
(1) Official Journal of the European Communities L 383 A, 26–47 
(1992).  
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., and Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
(3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York.
 
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
(5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use – Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within a range from 10  –1 to 10  5 Pa – Static method.  
(6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure – 
temperature relationship and initial decomposition temperature 
of liquids by isoteniscope.  
(7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use –Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa – Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, 521–532.  
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000)  
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determina ­
tion of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 
(1964), 22–28  
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269–278.  
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122.  
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science
 4 (1973) 137–147.  
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393–400.
 
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Rela ­
tionship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesti ­
cide Science 13 (1982) 161–168.  
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 
(1995) 27–31.
 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase 
MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 
300–310.
 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of 
Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 
87(12) (1998) 1512–20.  
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C.
 
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002)  
(23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal 
Register, Washington DC  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
(25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
(27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. 
Technol. 17(2), 642.  
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Priedėlis 
Apytikrio įvertinimo metodas  
ĮVADAS  
Apytikriai apskai čiuotos vert ės gali būti taikomos:  
— nuspręsti, kuris iš bandymo metod ų tinka;  
— gauti įverčiui arba ribinei vertei tais atvejais, kai bandymo metodas negali 
būti taikomas d ėl technini ų priežasčių. 
APYTIKRIO ĮVERTINIMO METODAS  
Skysčių ir kietųjų medžiag ų garų slėgis gali b ūti apytikriai įvertintas, taikant 
modifikuot ą Watson  koreliacij ą (a). Vieninteliai reikalingi bandym ų duomenys 
– virimo temperat ūra normaliajame sl ėgyje. Metodas tinka sl ėgio intervalui nuo 
10 5 Pa iki 10  –5 Pa. 
Detali informacija apie metod ą yra pateikta „ Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods “ (b). Be to, žr.  OECD Environmental Monograph  No.67 (c).  
APSKAIČIAVIMO METODIKA  
Garų slėgis apskai čiuojamas taip:  
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – Í 
3 – 2  T 
T b Î m 
T 
T b – 2m Í 
3 – 2  T 
T b Î m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 6 6 4 3 
7 7 7 7 5
 
čia: 
T = matavimo temperat ūra, 
T b = virimo temperat ūra normaliajame sl ėgyje,  
P VP = garų slėgis temperat ūroje T,  
ΔH Vb = garavimo šiluma,  
ΔZ b = spūdumo faktorius ( įvertintas 0,97),  
m = empirinis faktorius, susietas su fizikine b ūsena matavimo temperat ū­
roje. 
Toliau,  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8,75 þ R ln T b Þ 
čia, K  F – empirinis faktorius, skirtas atsižvelgti į medžiagos poliškum ą. Kelių 
tipų junginių K F faktoriai yra pateikti (b) nuorodoje.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Duomenys labai dažnai pateikiami, nurodant virimo temperat ūra sumažintame 
slėgyje. Tokiu atveju gar ų slėgis apskai čiuojamas taip:  
ln P vp ≈ ln P  1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – Í 
3 – 2  T 
T 1 Î m 
T 1 
T – 2m Í 
3 – 2  T 
T 1 Î m – 1 
ln T 
T 1 2 
6 4 3 
7 5 
čia, T  1 – virimo temperat ūra sumažintame sl ėgyje P  1 . 
ATASKAITA  
Taikant įvertinimo metod ą, į ataskaitą turi būti įtraukti išsam ūs apskaičiavimo 
dokumentai.  
LITERAT ŪRA 
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assess ­
ment (1993).  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. PAVIRŠIAUS ĮTEMPTIS  
1. METODAS  
Apibūdintieji metodai yra pagr įsti OECD Bandym ų gairėmis (1). 
Pagrindiniai principai pateikti 2 nuorodoje.  
1.1. ĮVADAS  
Apibūdintieji metodai turi b ūti taikomi vandenini ų tirpalų paviršiaus 
įtempties matavimuose.  
Prieš atliekant šiuos bandymus naudinga iš anksto tur ėti informacij ą 
apie medžiagos miceli ų tirpumą vandenyje, strukt ūrą, hidrolizines 
savybes ir kritines koncentracijas.  
Toliau išvardyti metodai yra taikytini daugumai chemini ų medžiag ų, 
netaikant joki ų apribojim ų jų grynumo laipsniui.  
Paviršiaus įtempties matavimuose žiediniu tenzometru apsiribojama 
vandeniniais tirpalais, kuri ų dinaminis klampumas mažesnis negu 
apytikriai 200 mPa s.  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Gibso paviršiaus energija vienam paviršiaus vienetui vadinama pavir ­ 
šiaus įtemptimi.  
Paviršiaus įtemptis nurodoma:  
N/m (SI vienetais) arba  
mN/m (SI pogrupiais)  
1 N/m = 10  3 dinų/cm 
1 mN/m = 1 dina/cm nebevartojamoje cgs sistemoje  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Etaloninių medžiag ų nereikia naudoti visais tais atvejais, kai tiriama 
nauja medžiaga. Jos pirmiausia tur ėtų būti naudojamos kartkart ėmis 
tikrinant metod ų veikimą ir lyginant rezultatus su kitais metodais 
gautais rezultatais.  
Etaloninės medžiagos, kurios apima plat ų spektrą paviršiaus 
įtempčių, pateiktos 1 ir 3 nuorodose.  
1.4. METOD Ų PRINCIPAS  
Šie metodai yra pagr įsti matavimais didžiausios j ėgos, reikalingos 
vertikaliai įtempti ant ąselės arba žiedo, esan čio sąlytyje su matavimo 
stiklinėje esančio tiriamojo skys čio paviršiumi, norint skyst į atskirti 
nuo to paviršiaus arba plokštel ės, kurios kraštas lie čiasi su tuo pavir ­ 
šiumi, kad b ūtų pritraukta susidariusi pl ėvelė. 
Vandenyje tirpios medžiagos, kai j ų koncentracija ne mažesn ė kaip 1 
mg/l, yra tiriamos vandeniniuose tirpaluose esant vienai koncentra ­
cijai.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Šie metodai yra žymiai tikslesni, negu tai gali b ūti reikalinga aplinkai 
įvertinti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. METOD Ų APIBŪDINIMAS  
Medžiagos tirpalas paruošiamas distiliuotame vandenyje. Šio tirpalo 
koncentracija tur ėtų sudaryti 90 % medžiagos soties tirpumo vande ­
nyje; jeigu ši koncentracija viršija 1 g/l, tyrimui naudojama 1 g/l 
koncentracija. Medžiag ų, kurių tirpumas vandenyje mažesnis kaip 
1 mg/l, nereikia tirti.  
1.6.1.  Plokštel ės metodas  
Žr. ISO 304 ir NF T 73–060 (Paviršinio aktyvumo reagentai – 
paviršiaus įtempties nustatymas tempiant skys čio plėveles).  
1.6.2.  Ąselės metodas  
Žr. ISO 304 ir NF T 73–060 (Paviršinio aktyvumo reagentai – 
paviršiaus įtempties nustatymas tempiant skys čio plėveles).  
1.6.3.  Žiedo metodas  
Žr. ISO 304 ir NF T 73–060 (Paviršinio aktyvumo reagentai – 
paviršiaus įtempties nustatymas tempiant skys čio plėveles).  
1.6.4.  OECD suderintas cirkuliarinis metodas  
1.6.4.1.  Aparat ūra 
Komerciškai prieinami tenzometrai tinka šiems matavimams. Juos 
sudaro šie elementai:  
— kilnojamasis m ėginio stalelis,  
— matavimo sistema,  
— matavimo žiedas,  
— matavimo indas.  
1.6.4.1.1. K i l n o j a m a s i s m ė g i n i o s t a l e l i s  
Kilnojamasis m ėginio stalelis naudojamas kaip kontroliuojamos 
temperatūros matavimo indo, kuriame yra tiriamasis skystis, atrama. 
Kartu su j ėgos matavimo sistema jis dedamas ant stovo.  
1.6.4.1.2. J ė g o s m a t a v i m o s i s t e m a  
Jėgos matavimo sistema (žr. paveiksl ą) yra virš bandinio stalelio. 
Jėgos matavimo paklaida neturi viršyti ± 10  -6 N, atitinkan čią 
paklaidos rib ą ± 0,1 mg matuojant mas ę. Daugeliu atvej ų parduo­
damų tenzometr ų matavimo skal ė yra kalibruota mN/m taip, kad 
paviršiaus įtemptis gali b ūti tiesiogiai parodoma mN/m, 0,1 mN/m 
tikslumu.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. M a t a v i m o k ū n a s ( ž i e d a s )  
Paprastai žiedas yra padarytas iš platinos ir iridžio vielos, kurios 
storis 0,4 mm, o perimetras 60 mm. Vielos žiedas pakabinamas 
horizontaliai ant metalin ės ašies ir montažinio laikytuvo, kad b ūtų 
galima sujungti su j ėgos matavimo sistema (žr. paveiksl ą). 
Paveikslas  
Matavimo k ūnas 
(Visi matmenys nurodyti milimetrais)
  
1.6.4.1.4. M a t a v i m o i n d a s  
Matavimo indas su tiriamu tirpalu, kuris turi b ūti išmatuotas – tai 
stiklinis indas su kontroliuojama temperat ūra. Jo konstrukcija turi 
būti tokia, kad matavimo metu tiriamo tirpalo skys čio temperat ūra 
ir dujų fazė virš jo paviršiaus išlikt ų pastovios ir kad bandinys nega ­
ruotų. Tinka cilindriniai stikliniai indai, kuri ų vidinis skersmuo ne 
mažesnis kaip 45 mm.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Aparat ūros paruošimas  
1.6.4.2.1. V a l y m a s  
Stikliniai indai turi b ūti kruopščiai išvalomi. Jeigu reikia, jie išplau ­
nami karšta chromo-sieros r ūgštimi, o po to sirupo tirštumo fosforo 
rūgštimi (83–98 % H  3 PO 4 svorio) kruopš čiai nuskalaujami vandeniu 
iš čiaupo ir galiausiai perskalaujami du kartus distiliuotu vandeniu, 
kol bus pasiekta neutrali reakcija, po to išdžiovinama arba nuskalau ­
jama dalimi bandinio tirpalo, kur į reikia išmatuoti.  
Žiedas pirma turi b ūti gerai nuskalaujamas vandeniu, kad b ūtų paša­
lintos bet kokios vandenyje tirpios medžiagos, trumpam pamer ­
kiamas į chromo-sieros r ūgštį, praskalaujamas du kartus distiliuotu 
vandeniu, kol bus pasiekta neutrali reakcija, ir galiausiai lengvai pašildomas virš metanolio liepsnos.
 
Pastaba  
Tarša medžiagomis, kurios neištirpsta arba nesuyra veikiamos 
chromo-sieros r ūgštimi arba fosforo r ūgštimi, pavyzdžiui, silikonai, 
yra pašalinama atitinkamais organiniais tirpikliais.  
1.6.4.2.2. A p a r a t o k a l i b r a v i m a s  
Aparatas patvirtinamas patikrinant nulin į tašką ir suderinant taip, kad 
prietaiso parodymai leist ų patikimai nustatyti mN/m.  
Montavimas  
Aparatas išlyginamas, pavyzdžiui, pagal tenzometro pagrindo spirito 
lygį, suderinant pagrinde esan čius koreguojan čius varžtus.  
Nulinio taško derinimas  
Įtaisius žied ą ant aparato ir prieš pamerkiant j į į skystį, tenzometro 
parodymai suderinami taip, kad rodyt ų nulį, ir patikrinama, kad 
žiedas kab ėtų lygiagre čiai skysčio paviršiui. Tam tikslui skys čio 
paviršius gali b ūti naudojamas kaip veidrodis.  
Kalibravimas  
Tikrasis bandymo kalibravimas gali b ūti atliekamas dviem b ūdais:  
a) naudojant mas ę: naudojant žinomos mas ės, 0,1–1,0 g svarelius, 
uždedamus ant žiedo. Kalibravimo koeficientas Φ a , iš kurio turi 
būti padauginamas kiekvienas prietaiso parodymas, nustatomas 
pagal šią lygtį (1): 
Φ a ¼ ðσ r Þ 
ðσ a Þ , 
čia: 
σ r ¼ Í ðmgÞ 
ð2bÞ Î 
(mN/m)  
m = svarelio mas ė (g) 
g = laisvojo kritimo pagreitis (981 cm s  -2 jūros lygyje)  
b = vidutinis žiedo perimetras (cm)  
σ a = tenzometro parodymai po to, kai ant žiedo uždedami 
svareliai (mN/m).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) naudojant vanden į: procedūra naudojant gryn ą vandenį, kurio 
paviršiaus įtemptis, kai temperat ūra, pavyzdžiui, lygi 23 °C, yra 
72,3 mN/m. Ši proced ūra greitesn ė negu svorio kalibravimas, bet 
visuomet yra pavojus, kad vandens paviršiaus įtemptį iškreips 
taršos paviršinio aktyvumo medžiagomis p ėdsakai.  
Kalibravimo koeficientas Φ b , iš kurio padauginami visi prietaiso 
parodymai, yra nustatomas pagal lygt į (2): 
Φ b ¼ ðσ o Þ 
ðσ g Þ , 
čia: 
σ o = vandens paviršiaus įtempties vert ė, nurodyta literat ūroje 
(mN/m)  
σ g = išmatuota vandens paviršiaus įtempties vert ė (mN/m), abi 
vienodoje temperat ūroje 
1.6.4.3.  Bandini ų paruošimas  
Vandeniniai tirpalai paruošiami iš tiriam ųjų medžiag ų, naudojant 
reikalingas koncentracijas vandenyje, juose neturi b ūti jokių neištir­
pusių medžiag ų. 
Tirpalas turi b ūti laikomas pastovioje temperat ūroje (± 0,5 °C). 
Kadangi tirpalo, esan čio matavimo inde, paviršiaus įtemptis kinta 
laike, atliekami keli matavimai skirtingu laiku ir br ėžiama kreiv ė, 
parodanti paviršiaus įtemptį kaip laiko funkcij ą. Jeigu niekas toliau 
nesikeičia, tai pusiausvyros b ūsena pasiekta.  
Tarša kitų medžiagų dulkėmis ir dujomis trukdo matavimams. Tod ėl 
darbas turi b ūti atliekamas po apsauginiu gaubtu.  
1.6.5.  Bandymo s ąlygos  
Matavimai atliekami apytikriai 20 °C temperat ūroje ir kontroliuojami 
± 0,5 °C ribose.  
1.6.6.  Darbo eiga  
Matuojami tirpalai perpilami į kruopščiai išvalyt ą matavimo ind ą, 
stengiantis, kad nesusidaryt ų putų, po to matavimo indas dedamas 
ant bandymo aparato stalelio. Stalelio viršus su matavimo indu 
keliamas aukštyn, kol žiedas panyra žemiau matuojamo tirpalo pavir ­ 
šiaus. Po to stalelio viršus pamažu ir tolydžiai nuleidžiamas (apie 0,5 cm/min. grei čiu), atskiriant žied ą nuo paviršiaus, kol bus pasiekta 
maksimali j ėga. Skys čio sluoksnis, besilie čiantis su žiedu, neturi 
atsiskirti nuo žiedo. Užbaigus matavimus, žiedas v ėl iškeliamas į 
paviršių, matavimai kartojami tol, kol bus gauta pastovi paviršiaus 
įtempties vert ė. Kiekvienam nustatymui užrašomas tirpalo perpylimo 
į matavimo ind ą laikas. Matavimai užrašomi esant maksimaliai j ėgai, 
reikalingai atskirti žied ą nuo skys čio paviršiaus.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. DUOMENYS  
Norint apskai čiuoti paviršiaus įtemptį, aparato parodyta vert ė mN/m 
pirma dauginama iš kalibracijos koeficiento Φ a arba Φ b (priklau­
somai nuo naudoto kalibravimo b ūdo). Taip bus gaunama vert ė, 
kuri taikoma tik apytikriai ir tod ėl ją reikia koreguoti.  
Harkins ir Jordan (4) empiriškai nustat ė paviršiaus įtempties ver čių, 
matuotų žiedo metodu, korekcijos koeficientus, kurie priklauso nuo 
žiedo matmen ų, skysčio tankio ir jo paviršiaus įtempties.  
Kadangi korekcijos koeficiento nustatymas kiekvienam atskiram 
matavimui pagal Harkins ir Jordan lenteles yra daug pastang ų reika­
laujantis darbas, vandenini ų tirpalų paviršiaus įtempčiai apskai čiuoti 
gali būti naudojama supaprastinta koreguot ų paviršiaus įtempties 
verčių skaitymo tvarka tiesiogiai iš šios lentel ės. (Interpoliacija turi 
būti naudojama parodymams, svyruojantiems tarp lentel ėje pateikt ų 
verčių). 
Lentelė 
Matuotos paviršiaus įtempties korekcija  
Tik vandeniniams tirpalams, ρ ≡ 1 g/cm  3 
r = 9,55 mm (vidutinis žiedo spindulys)  
r = 0,185 mm (žiedo vielos spindulys)  
Eksperimentin ė vertė (mN/m)  Koreguotoji vert ė (mN/m)  
Kalibravimas pagal svor į (žr. 1.6.4.2.2 
(a)) Kalibravimas pagal vanden į (žr. 
1.6.4.2.2 (b))  
20 16,9  18,1  
22 18,7  20,1  
24 20,6  22,1  
26 22,4  24,1  
28 24,3  26,1  
30 26,2  28,1  
32 28,1  30,1  
34 29,9  32,1  
36 31,8  34,1  
38 33,7  36,1  
40 35,6  38,2  
42 37,6  40,3  
44 39,5  42,3  
46 41,4  44,4  
48 43,4  46,5  
50 45,3  48,6  
52 47,3  50,7  
54 49,3  52,8  
56 51,2  54,9  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Eksperimentin ė vertė (mN/m)  Koreguotoji vert ė (mN/m)  
Kalibravimas pagal svor į (žr. 1.6.4.2.2 
(a)) Kalibravimas pagal vanden į (žr. 
1.6.4.2.2 (b))  
58 53,2  57,0  
60 55,2  59,1  
62 57,2  61,3  
64 59,2  63,4  
66 61,2  65,5  
68 63,2  67,7  
70 65,2  69,9  
72 67,2  72,0  
74 69,2  —  
76 71,2  —  
78 73,2  —  
Ši lentelė buvo sudaryta remiantis Harkins-Jordan korekcijomis. Ji 
panaši į vandens ir vandenini ų tirpalų (tankis p = 1 g/cm) DIN 
standartą (DIN 53914) ir taikoma pardavin ėjamam žiedui, kurio 
dimensijos R = 9,55 mm (vidutinis žiedo spindulys) ir r = 0,185 mm (žiedo vielos spindulys). Lentel ėje yra pateiktos koreguotos 
paviršiaus įtempties matavim ų vertės, paimtos po kalibravimo su 
svareliais arba kalibravimo su vandeniu.
 
Kitaip, be išankstinio kalibravimo, paviršiaus įtemptis gali b ūti 
apskaičiuojama pagal ši ą formulę: 
σ ¼ ðf Ü FÞ 
ð4πRÞ , 
čia: 
F = j ėga, išmatuota dinamometru pl ėvelės nutrūkimo taške  
R = žiedo spindulys  
f = korekcijos koeficientas (1)  
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— naudotas metodas,  
— naudoto vandens arba tirpalo r ūšis, 
— tikslus ir išsamus medžiagos apib ūdinimas (tapatumas ir prie ­
maišos),  
— matavimo rezultatai: paviršiaus įtemptis (parodymai), nurodant 
tiek atskirus parodymus ir j ų aritmetin į vidurkį, tiek koreguot ą 
vidurkį (atsižvelgiant į įrangą ir korekcijos lentel ę), ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— tirpalo koncentracija,  
— bandymo temperat ūra, 
— kiek laiko buvo laikomas naudotas tirpalas; ypa č laikas nuo 
paruošimo iki tirpalo matavimo,  
— paviršiaus įtempties priklausomyb ės nuo laiko, perpylus tirpal ą į 
matavimo ind ą apibūdinimas,  
— turi būti nurodoma visa informacija ir pastabos, svarbios rezultat ų 
aiškinimui, ypa č atsižvelgiant į priemaišas ir medžiagos fizikin ę 
būseną. 
3.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Laikant, kad 20 °C temperat ūroje distiliuoto vandens paviršiaus 
įtemptis lygi 72,75 mN/m, medžiagos, kuri ų paviršiaus įtemptis 
mažesnė kaip 60 mN/m, pagal šio bandymo s ąlygas, tur ėtų būti 
laikomos paviršinio aktyvumo medžiagomis.  
4. NUORODOS  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council 
C(81) 30 final.  
2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New 
York, 1959, Vol. I, Part I, Chapter XIV  
3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511.  
4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 
p. 1751.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. TIRPUMAS VANDENYJE  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 105 (OECD 
bandymo gair ės Nr. 105) (1995). Šis bandymo metodas yra atnaujinta 1981 
m. patvirtinto originalaus bandymo metodo Nr. 105 redakcija. Dabartin ė 
redakcija iš esm ės nesiskiria nuo 1981 m. redakcijos. Daugiausia buvo 
keičiamas formatas. Atnaujinant remtasi ES bandymo metodu „Tirpumas 
vandenyje“ (  1 ). 
PIRMINIAI ASPEKTAI  
2. Chemin ės medžiagos tirpum ą vandenyje gali stipriai paveikti joje esan čios 
priemaišos. Šis bandymo metodas skirtas nustatyti iš esm ės grynų cheminių 
medžiagų, kurios yra stabilios vandenyje ir nelakios, tirpum ą vandenyje. 
Prieš nustatant tirpum ą vandenyje, naudinga gauti išankstin ės informacijos 
apie bandom ąją cheminę medžiag ą, pvz., informacijos apie jos strukt ūrinę 
formulę, garų slėgį, disociacijos konstant ą ir hidroliz ę kaip pH funkcij ą. 
3. Dėstant šį bandymo metod ą aprašomi du metodai – kolon ėlės eliuavimo 
metodas ir kolbos metodas, atitinkamai taikomi, kai tirpumas yra mažesnis 
kaip 10–2 g/l ir kai tirpumas yra didesnis kaip 10–2 g/l. Taip pat aprašomas paprastas išankstinis bandymas. Šiuo bandymu galima nustatyti apytikr į 
ėminio kiek į, naudotin ą per galutin į bandym ą, ir laiką, reikaling ą sočiai 
užtikrinti.
 
APIBRĖŽTYS IR VIENETAI  
4. Chemin ės medžiagos tirpumas vandenyje yra medžiagos soties mas ės 
koncentracija vandenyje esant tam tikrai temperat ūrai. 
5. Tirpumas vandenyje išreiškiamas tirpinio mase tirpalo t ūryje. SI sistemos 
vienetas – kg/m  3 , bet gali b ūti naudojama ir g/l.  
ETALONIN ĖS CHEMIN ĖS MEDŽIAGOS  
6. Tiriant bandom ąją cheminę medžiagą, etalonini ų cheminių medžiagų naudoti 
nereikia.  
METODŲ APRAŠYMAS  
Bandymo s ąlygos  
7. Bandym ą geriausia atlikti 20 ± 0,5 °C temperat ūroje. Pasirinktoji tempera ­
tūra turėtų būti išlaikoma pastovi visose svarbiose įrangos dalyse.  
Išankstinis bandymas  
8. Į apytikriai 0,1 g ėminio (kietosios bandomosios chemin ės medžiagos turi 
būti pulverizuotos), esan čio stikliniu kaiš čiu užkimštame 10 ml talpos mata ­
vimo cilindre, kambario temperat ūroje nuosekliai pilami vis didesni vandens 
kiekiai. Kiekvien ą kartą įpylus tam tikr ą vandens kiek į, mišinys kratomas 10 
minučių ir vizualiai tikrinama, ar n ėra neištirpusi ų ėminio daleli ų. Jeigu 
supylus 10 ml vandens ėminys arba jo dalys neištirpsta, bandymas t ęsiamas 
100 ml talpos matavimo cilindre. Toliau pateiktoje 1 lentel ėje nurodytas 
apytikris tirpumas esant tokiam vandens t ūriui, kuriame ėminys visiškai  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
ištirpsta. Kai tirpumas mažas, bandomajai cheminei medžiagai ištirpinti gali 
reikėti daug laiko; tam tur ėtų būti skiriamos ne mažiau kaip 24 valandos. 
Jeigu per 24 valandas bandomoji chemin ė medžiaga vis tiek neištirpsta, 
turėtų būti skiriama daugiau laiko (bet ne daugiau kaip 96 val.), arba tur ėtų 
būti mėginama dar labiau skiesti, siekiant išsiaiškinti, ar tur ėtų būti taikomas 
kolonėlės eliuavimo arba kolbos metodas.  
1 lentelė 
Vandens t ūris (ml), reika ­
lingas ištirpinti 0,1 g tirpinio  0,1 0,5  1  2  10  100  > 100  
Apytikris tirpumas (g/l)  > 1 000  200–1 0 ­
00 100–200  50–100  10–50  1–10  < 1  
Kolonėlės eliuavimo metodas  
Principas  
9. Šis metodas pagr įstas bandomosios chemin ės medžiagos eliuavimu vandeniu 
iš mikrokolon ėlės, į kurią įdėta inertin ės pagalbin ės medžiagos, pirmiau 
padengtos pertekliniu bandomosios medžiagos kiekiu (2). Tirpumas vande ­
nyje nustatomas pagal eliuato mas ės koncentracij ą, susidariusi ą pasiekus 
laiko funkcijos kreiv ės plokščiąją dalį. 
Aparatūra 
10. Vienas iš prietais ų – mikrokolon ėlė (1 paveikslas), kurioje išlaikoma pastovi 
temperatūra. Ji prijungiama prie recirkuliacinio siurblio (2 paveikslas) arba 
išlyginamojo indo (3 paveikslas). Į mikrokolon ėlę įdedama inertin ės pagal­
binės medžiagos, laikomos vietoje mažu stiklo vatos kamš čiu, kuris kartu 
atlieka daleli ų filtravimo funkcij ą. Kaip pagalbin ės medžiagos gali b ūti 
naudojami stiklo rutuliukai, diatomitas arba kitos inertin ės medžiagos.  
11. 1 paveiksle parodyta mikrokolon ėlė yra tinkama prijungti prie recirkulia ­
cinio siurblio. Kolon ėlės viršutin ėje dalyje yra tiek erdv ės, kad joje tilpt ų 
penki sluoksniai (pradedant bandym ą jie išpilami) ir penki ėminiai (atliekant 
bandymą jie paimami analizei). Arba š į dydį galima sumažinti, jeigu atlie ­
kant bandym ą į sistemą galima įpilti vandens, kuriuo b ūtų pakeisti pradiniai 
penki su priemaišomis pašalinami sluoksniai. Kolon ėlė prijungiama prie 
recirkuliacinio siurblio iš inertin ės medžiagos pagamintais vamzdeliais, 
kuriais galima užtikrinti apie 25 ml/h pralaidum ą. Pvz., recirkuliacinis 
siurblys gali b ūti peristaltinis arba membraninis siurblys. Reikia imtis atsar ­
gumo priemoni ų, kad vamzdelis neužsiteršt ų ir (arba) kad nevykt ų adsorb­
cija į vamzdelio medžiag ą. 
12. 3 paveiksle pateikta montavimo naudojant išlyginam ąjį indą schema. Pagal 
šią montavimo schem ą mikrokolon ėlėje įrengiamas vienšakis čiaupas. Išly ­
ginamasis indas prijungiamas naudojant matinio stiklo jungt į ir vamzdelius, 
pagamintus iš inertin ės medžiagos. Srauto, tekan čio iš išlyginamoji indo, 
greitis tur ėtų būti apie 25 ml/h.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
1 paveikslas
  
Matmenys, mm  
A. Matinio stiklo jungties prijungimas  
B. Viršerdv ė 
C. Vidin ė dalis – 5  
D. Išorin ė dalis – 19  
E. Stiklin ės vatos kamštis  
F. Uždaromasis čiaupas  
2 paveikslas
  
A. Atmosferinis pusiausvirinimas  
B. Srautmatis  
C. Mikrokolon ėlė 
D. Termostatu kontroliuojamas cirkuliacinis siurblys  
E. Recirkuliacinis siurblys  
F. Dvišakis ėminių ėmimo vožtuvas  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
3 paveikslas
  
A. Išlyginamasis indas (pvz., 2,5 l chemin ė kolba)  
B. Kolon ėlė 
C. Frakcijos rinktuvas  
D. Termostatas  
E. Tefloninis vamzdelis  
F. Matinio stiklo jungtis  
G. Vamzdelis vandeniui (tarp termostato ir kolon ėlės, vidinis skersmuo – 
apie 8 mm)  
13. Apie 600 mg pagalbin ės medžiagos perpilama į 50 ml apvaliadugn ę kolbą. 
Tinkamas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis ištirpinamas lakiame 
analizinio reagento kokyb ės tirpiklyje, ir reikiamas šio tirpalo kiekis užpi ­
lamas ant pagalbin ės medžiagos. Tirpiklis visiškai išgarinamas, pavyzdžiui, 
sukamajame garintuve, nes kitaip eliuavimo etapu d ėl paviršinio skaidymosi 
pagalbinė medžiaga nebus įsotinta vandeniu. Įkrauta pagalbin ė medžiaga dvi 
valandas mirkoma apytikriai 5 mililitruose vandens, po to suspensija supi ­
lama į mikrokolon ėlę. Arba dedama sausa pagalbin ė medžiaga gali b ūti 
supilama į vandens pripildyt ą mikrokolon ėlę ir dvi valandas paliekama 
nusistovėti pusiausvyrai.  
14. Dėl pagalbin ės medžiagos įkrovimo gali kilti sunkum ų ir dėl to gali b ūti 
gauti klaidingi rezultatai, pvz., kai bandomoji chemin ė medžiaga nus ėda 
kaip alyva. Šios problemos tur ėtų būti išnagrin ėtos ir apie jas tur ėtų būti 
pateikta išsami informacija ataskaitoje.  
Procedūra, taikoma naudojant recirkuliacin į siurblį 
15. Srautas pradedamas leisti per kolon ėlę. Rekomenduojamas srauto greitis – 
apie 25 ml/val.; aprašytos kolon ėlės atveju tai atitinka 10 sluoksni ų per 
valandą. Ne mažiau kaip penki pirmieji sluoksniai išpilami, kad b ūtų paša­
lintos vandenyje tirpios priemaišos. Tada recirkuliacinis siurblys paliekamas 
veikti tol, kol nusistovi pusiausvyra, kuri laikoma pasiekta tada, kai penki ų 
paeiliui paimt ų ėminių koncentracijos atsitiktine tvarka skiriasi ne daugiau 
kaip ± 30 %. Šie ėminiai tur ėtų būti imami laiko intervalais, per kuriuos 
pasikeičia ne mažiau kaip dešimt eliuato sluoksni ų. Atsižvelgiant į taikomą 
analizės metodą, gali būti naudinga nubr ėžti koncentracijos ir laiko tarpu ­
savio priklausomyb ės kreivę, rodančią, ar jau pasiekta pusiausvyra.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Procedūra, taikoma naudojant išlyginam ąjį indą 
16. Ištisin ės sekos eliuato frakcijos tur ėtų būti surenkamos ir analizuojamos 
pasirinktu metodu. Intervalo vidurio eliuato frakcijos, kuri ų koncentracijos 
yra pastovios (± 30 %) ne mažiau kaip penkiose paeiliui paimtose frakci ­
jose, yra naudojamos nustatyti tirpum ą vandenyje.  
17. Tinkamiausias eliuatas – du kartus distiliuotas vanduo. Taip pat gali b ūti 
naudojamas dejonizuotas vanduo, kurio savitoji varža didesn ė kaip 10 
ΜΩ/cm, o bendras organin ės anglies kiekis mažesnis kaip 0,01 %.  
18. Pagal abi proced ūras atliekamas antrasis matavimas, taikant perpus mažesn į 
srauto greit į nei pirm ąjį kartą. Jeigu abiej ų matavim ų rezultatai sutampa, 
bandymas yra patenkinamas. Jeigu esant mažesniam srauto grei čiui nusta­
tomas didesnis tirpumas, srauto greitis turi b ūti toliau mažinamas perpus tol, 
kol dviem vienas po kito einan čiais matavimais bus gautas toks pat 
tirpumas.  
19. Taikant abi proced ūras turėtų būti patikrinama, ar frakcijose n ėra koloidini ų 
medžiagų, tiriant, ar nepasireiškia Tindalio efektas. Jeigu toki ų dalelių yra, 
bandymo rezultatai negalioja, ir bandymas tur ėtų būti pakartojamas, prieš tai 
pagerinus kolon ėlės filtruojam ąsias savybes.  
20. Turėtų būti išmatuojamas kiekvieno ėminio pH, geriausia – naudojant 
specialias indikacines juosteles.  
Kolbos metodas  
Principas  
21. Bandomoji chemin ė medžiaga (kietosios medžiagos turi b ūti pulverizuo ­
jamos) ištirpinama vandenyje, kurio temperat ūra šiek tiek aukštesn ė už 
bandymo temperat ūrą. Pasiekus sot į, mišinys ataušinamas ir laikomas 
bandymo temperat ūroje. Matavimas gali b ūti atliekamas ir esant tiksliai 
bandymo temperat ūrai, jeigu atitinkama ėminių imtimi užtikrinama, kad 
bus pasiekta soties pusiausvyra. Tada bandomosios chemin ės medžiagos 
masės koncentracija vandeniniame tirpale, kuriame turi neb ūti neištirpusi ų 
dalelių, yra nustatoma atitinkamu analiz ės metodu (3).  
Aparatūra 
22. Reikalingos tokios medžiagos:  
— įprasti laboratoriniai stikliniai indai ir prietaisai,  
— prietaisas, tinkamas tirpalams suplakti kontroliuojamoje pastovioje 
temperatūroje, 
— centrifuga (pageidautina, su reguliuojama temperat ūra), jeigu ji b ūtina 
emulsijoms parengti, ir  
— analiz ės įranga.  
Procedūra 
23. Išankstiniu bandymu apskai čiuojamas bandomosios chemin ės medžiagos 
kiekis, reikalingas pageidaujamam vandens t ūriui įsotinti. Apytikriai penkis 
kartus didesnis kiekis įdedamas į kiekvien ą iš trijų stiklinių indų su stikli­
niais kaiš čiais (pvz., centrifugos vamzdžius, kolbas). Į kiekvien ą indą 
įpilamas vandens kiekis, parinktas atsižvelgiant į analizės metodą ir tirpumo 
intervalą. Indai tvirtai uždaromi ir kratomi 30 °C temperat ūroje. Turėtų būti 
naudojamas kratytuvas arba maišytuvas, galintis dirbti pastovioje tempera ­
tūroje, pvz., gali b ūti taikomas magnetinis maišymas termostatu kontroliuo ­
jamoje vandens vonel ėje. Po paros vienas indas išimamas ir 24 valandoms 
paliekamas bandymo temperat ūroje, kad nusistov ėtų pusiausvyra, retsykiais  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
pakratant. Tada indo turinys centrifuguojamas bandymo temperat ūroje ir 
atitinkamu analiz ės metodu nustatoma bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracija skaidrioje vandenin ėje fazėje. Su kitomis dviem kolbomis 
daroma taip pat, prieš tai atitinkamai per dvi ir tris paras užtikrinus pradin ę 
pusiausvyr ą 30 °C temperat ūroje. Jeigu bent paskutiniuosiuose dviejuose 
induose išmatuota koncentracija nesiskiria daugiau kaip 15 %, bandymas 
yra patenkinamas. Jeigu 1, 2 ir 3 ind ų rezultatai krypsta į didesnes vertes, 
visas bandymas tur ėtų būti pakartojamas taikant ilgesnius pusiausvirinimo 
laikotarpius.  
24. Bandymas gali b ūti atliekamas ir be išankstinio laikymo 30 °C temperat ū­
roje. Kad b ūtų galima apskai čiuoti soties pusiausvirinimo greit į, ėminiai 
imami tol, kol maišymo laikas nebeturi įtakos išmatuotai koncentracijai.  
25. Turėtų būti išmatuojamas kiekvieno ėminio pH, geriausia – naudojant 
specialias indikacines juosteles.  
Analitiniai tyrimai  
26. Turėtų būti taikomas konkre čiai cheminei medžiagai pritaikytas metodas, 
kadangi nedideli priemaiš ų medžiag ų kiekiai gali b ūti didelių matuojamo 
tirpumo paklaid ų priežastis. Toki ų metodų pavyzdžiai: duj ų arba skys čių 
chromatografija, titravimo metodai, fotometriniai metodai, voltamperometri ­
niai metodai.  
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
Duomenys  
Kolonėlės eliuavimo metodas  
27. Per kiekvien ą matavim ą turėtų būti apskaičiuotos ne mažiau kaip penki ų iš 
soties kreiv ės plokščiosios dalies paeiliui paimt ų ėminių vidutinės vertės ir 
standartiniai nuokrypiai. Vidutin ės vertės, gautos per du bandymus taikant 
skirtingus srautus, tur ėtų skirtis ne daugiau kaip 30 %.  
Kolbos metodas  
28. Apskai čiuojamas kiekvienoje iš trij ų kolbų gautų atskirų rezultatų, kurie 
turėtų skirtis ne daugiau kaip 15 %, vidurkis.  
Bandymo ataskaita  
Kolonėlės eliuavimo metodas  
29. Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta tokia informacija:  
— išankstinio bandymo rezultatai,  
— cheminis tapatumas ir priemaišos (išankstinio gryninimo etapas, jeigu 
toks buvo taikomas),  
— kiekvieno ėminio koncentracija, srauto greitis ir pH,  
— ne mažiau kaip penki ų ėminių, paimtų iš kiekvieno matavimo soties 
kreivės plokščiosios dalies, vidutin ės vertės ir standartiniai nuokrypiai,  
— dviejų vienas po kito atlikt ų matavim ų vidurkis,  
— vandens temperat ūra įsotinimo metu,  
— analiz ės metodas,  
— pagalbin ės medžiagos pob ūdis, 
— pagalbin ės medžiagos d ėjimas,  
— naudotas tirpiklis,  
— chemin ės medžiagos cheminio nestabilumo per bandym ą įrodymai,  
— visa informacija, svarbi rezultat ų aiškinimui, ypa č apie priemaišas ir 
bandomosios chemin ės medžiagos fizin ę būseną. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Kolbos metodas  
30. Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta tokia informacija:  
— išankstinio bandymo rezultatai,  
— cheminis tapatumas ir priemaišos (išankstinio gryninimo etapas, jeigu 
toks buvo taikomas),  
— atskiri analitiniai tyrimai ir vidurkis, jeigu kiekvienai kolbai buvo nusta ­
toma daugiau nei viena vert ė, 
— kiekvieno ėminio pH,  
— skirting ų kolbų, kurių duomenys sutampa, ver čių vidurkis,  
— bandymo temperat ūra, 
— analiz ės metodas,  
— chemin ės medžiagos cheminio nestabilumo per bandym ą įrodymai,  
— visa informacija, svarbi rezultat ų aiškinimui, ypa č apie priemaišas ir 
bandomosios chemin ės medžiagos fizin ę būseną. 
LITERAT ŪRA 
1. 1992 m. liepos 31 d. Komisijos direktyva 92/69/EEB, septyniolikt ąjį kartą su 
technikos pažangos derinanti Tarybos direktyv ą 67/548/EEB d ėl įstatymų ir 
kitų teisės aktų, reglamentuojan čių pavojing ų medžiag ų klasifikavim ą, paka­
vimą ir ženklinim ą etiketėmis, suderinimo (OL L 383, 1992 12 29, p. 113).  
2. NF T 20–045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility — Column elution method.  
3. NF T 20–046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.7. PASISKIRSTYMO KOEFICIENTAS  
1. METODAS  
Apibūdintasis „kratomos kolbos“ metodas yra pagr įstas OECD 
Bandymų gairėmis (1).  
1.1. ĮVADAS  
Šiam bandymui naudinga tur ėti išankstin ę informacij ą apie 
medžiagos strukt ūrinę formulę, disociacijos konstant ą, tirpum ą 
vandenyje, hidroliz ę, tirpumą n-oktanolyje ir paviršiaus įtemptį. 
Matavimai tur ėtų būti atliekami su jonizuojamomis medžiagomis, 
esančiomis tik nejonizuotoje formoje (laisvoji r ūgštis arba baz ė) ir 
gaunamomis naudojant atitinkam ą buferinį tirpalą, kurio pH ne 
mažiau kaip vienu vienetu mažesnis (laisvoji r ūgštis) arba didesnis 
(laisvoji baz ė) nei pK.  
Šį bandymo metod ą sudaro du atskiri metodai: kratomos kolbos 
metodas ir efektyvioji skys čių chromatografija (HPLC). Pirmasis 
yra taikomas, kai log P  ow vertė (žr. toliau esan čius apibr ėžimus) 
yra 2–4 ribose, o antrasis – 0–6 ribose. Prieš atliekant bet kur į iš 
šių eksperiment ų, pirma tur ėtų būti iš anksto apskai čiuojamas 
galimas pasiskirstymo koeficientas.  
Kratomos kolbos metodas taikomas tik visiškai grynoms, vandenyje 
ir n-oktanolyje tirpioms medžiagoms. Jis netaikomas paviršinio akty ­
vumo medžiagoms (kurioms tur ėtų būti pateikiama apskai čiuota 
vertė arba apskai čiavimai, pagr įsti individualiu tirpumu 
n-oktanolyje ir vandenyje).  
HPLC metodas neturi b ūti taikomas stiprioms r ūgštims ir baz ėms, 
metalų kompleksiniams junginiams, paviršinio aktyvumo medžia ­
goms arba medžiagoms, reaguojan čioms su eliuatu. Šioms medžia ­
goms turėtų būti pateikiama apskai čiuotoji vert ė arba apskai čiavimas, 
pagrįstas individualiuoju tirpumu n-oktanolyje arba vandenyje.  
HPLC metodas yra mažiau jautrus priemaišoms, esan čioms bando ­
majame junginyje, negu kratomos kolbos metodas. Nepaisant to, d ėl 
priemaišų buvimo kai kuriais atvejais rezultat ų aiškinimas tampa 
sudėtingas, kadangi tampa sunku priskirti smailes. Mišiniams, 
kurių juostos neišskaidytos, tur ėtų būti nustatomos viršutin ė ir 
apatinė log P ribos.  
1.2. APIBR ĖŽTIS IR VIENETAI  
Pasiskirstymo koeficientas (P) yra apibr ėžiamas kaip medžiagos, 
ištirpintos dviej ų fazių sistemoje, sudarytoje iš dviej ų nesimaišan čių 
tirpiklių, pusiausvyros koncentracij ų (c  i ) santykis. Jeigu tai 
n-oktanolis ir vanduo:  
p ow ¼ ðc n – oktanolis Þ 
ðc vanduo Þ 
Todėl pasiskirstymo koeficientas (P) yra dviej ų koncentracij ų dalmuo 
ir paprastai pateikiamas kaip jo dešimtainis logaritmas (log P).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Kratomos kolbos metodas  
Etaloninių medžiag ų nereikia naudoti visais tais atvejais, kai tiriama 
nauja medžiaga. Pirmiausiai jos tur ėtų būti naudojamos kartkart ėmis 
tikrinant metodo veikim ą ir palyginant gautus rezultatus su kitais 
metodais gautais rezultatais.  
HPLC metodas  
Norint išmatuotus HPLC duomenis apie jungin į susieti su jo P verte, 
turi būti brėžiamas kalibravimo log P palyginimo su chromatografi ­
niais duomenimis kreiv ė, panaudojant ne mažiau kaip 6 pamatinius 
taškus. Vartotojas sprendžia, kokias tinkamas etalonines medžiagas naudoti. Jeigu įmanoma, ne mažiau kaip vieno etaloninio junginio 
P
 ow turėtų būti didesnis negu bandomosios medžiagos, o kitas P 
turėtų būti mažesnis negu bandomosios medžiagos. Jeigu log P  ow 
vertės yra mažesn ės nei 4, kalibravimas gali b ūti pagrindžiamas 
duomenimis, gautais kratomos kolbos metodu. Kai log P vert ės 
didesnės nei 4, kalibravimas gali b ūti pagrindžiamas literat ūroje 
patvirtintomis vert ėmis, jeigu jos atitinka apskai čiuotąsias vertes. 
Norint gauti tikslesnes vertes, geriau pasirinkti tuos etaloninius jungi ­
nius, kurie strukt ūros požiūriu yra panaš ūs į bandomąja medžiaga.  
Išsamų daugumos chemini ų medžiag ų log P  ow verčių sąrašą galima 
rasti 2 ir 3 nuorodose. Jeigu duomen ų apie strukt ūriškai susijusi ų 
junginių pasiskirstymo koeficientus ne įmanoma gauti, tada gali b ūti 
naudojamas bendresnio pob ūdžio kalibravimas, nustatytas su kitais 
etaloniniais junginiais.  
Rekomenduojam ų etalonini ų medžiag ų ir jų P ow verčių sąrašas 
pateiktas 2 pried ėlyje. 
1.4. METODO PRINCIPAS  
1.4.1.  Kratomos kolbos metodas  
Pasiskirstymo koeficientui nustatyti turi b ūti pasiekiama pusiausvyra 
tarp visų sąveikaujan čių sistemos sudedam ųjų dalių ir turi būti nusta­
tytos koncentracijos medžiag ų, ištirpintų abiejose faz ėse. Šiam klau ­
simui skirtos literat ūros nagrin ėjimas rodo, kad problemai spr ęsti gali 
būti naudojamos kelios metodikos, pvz., kruopštus dviej ų fazių 
sumaišymas ir po to vykstantis j ų atskyrimas, norint nustatyti tyri ­
nėjamos medžiagos pusiausvyros koncentracij ą. 
1.4.2.  HPLC metodas  
HPLC yra atliekama su analizin ėmis kolon ėlėmis, įkrautomis preky ­
boje esan čiomis kietosiomis faz ėmis su ilgomis angliavandeni ų gran­
dinėmis (pvz., C  8 , C 18 ), chemiškai sujungtomis su kvarcu. Chemi ­
kalai, įšvirkšti į tokią kolonėlę, juda išilgai jos skirtingais grei čiais, 
kadangi pasiskirstymas tarp judan čiosios būsenos ir angliavandenio 
statinės būsenos yra skirtingo laipsnio. Chemikal ų mišiniai d ėl jų 
hidrofobiškumo yra pirma eliuojami vandenyje tirpiais chemikalais, 
po to alyvoje tirpiais chemikalais proporcingai j ų angliavandenio ir 
vandens pasiskirstymo koeficientui. Tai leidžia nustatyti santyk į tarp 
sulaikymo trukm ės tokioje kolon ėlėje (atvirkštin ė fazė) ir 
n-oktanolio/vandens pasiskirstymo koeficient ą. Pasiskirstymo koefi ­
cientas yra nustatomas iš  talpos faktoriaus k , gaunamo iš lygties:  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ Í ðt r – t o Þ 
ðt o Þ Î 
kai t  R – bandomosios medžiagos sulaikymo trukm ė, o t  o – vidutinis 
laikas, reikalingas tirpiklio molekulei pereiti per kolon ėlę (pradinis 
laikas).  
Kiekybiniai analiz ės metodai nereikalingi, reikia tik nustatyti eliua ­
vimo laik ą. 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
1.5.1.  Pakartojamumas  
Kratomos kolbos metodas  
Norint užtikrinti pasiskirstymo koeficiento tikslum ą, bandymas turi 
būti atliekamas du kartus, esant trims skirtingoms bandymo s ąly­
goms, kuriomis apibr ėžtas medžiagos kiekis, taip pat tirpiklio t ūriai 
gali būti keičiami Nustatytos pasiskirstymo koeficiento vert ės, 
išreikštos bendruoju logaritmu, tur ėtų patekti į ± 0,3 log vienet ų 
intervalą. 
HPLC metodas  
Norint padidinti pasikliovim ą matavimais, turi b ūti atliekami karto ­
tiniai bandymai. Log P vert ės, gautos iš pavieni ų matavim ų, turėtų 
patekti į ± 0,1 log vienet ų intervalą. 
1.5.2.  Jautrumas  
Kratomos kolbos metodas  
Metode naudojamas matavim ų intervalas yra nustatomas pagal 
analizės procedūros aptikimo rib ą. Tai turėtų leisti įvertinti log P  ow 
vertes intervale nuo 2 iki 4 (kartais, kai to reikalauja tam tikros 
sąlygos, šis intervalas log P  ow gali būti išplečiamas iki 5), jeigu 
tirpinio koncentracija bet kokioje b ūsenoje nėra didesn ė negu 0,01 
molio viename litre.  
HPLC metodas  
HPLC metodas leidžia įvertinti log P  ow pasiskirstymo koeficientus 
intervale nuo 0 iki 6.  
Paprastai junginio pasiskirstymo koeficientas gali b ūti įvertinamas 
per ± 0,1 log vienet ų nuo kratomos kolbos vert ės. Tipiška koreliacija 
gali būti randama 4, 5, 6, 7, 8 literat ūros nuorodose. Didesn į tiks­
lumą galima pasiekti, jeigu koreliacijos grafikai yra pagrindžiami 
struktūriškai susijusiais etaloniniais junginiais (9).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Specifiškumas  
Kratomos kolbos metodas  
Nernsto pasiskirstymo d ėsnis praskiestiems tirpalams taikomas tik 
esant pastoviai temperat ūrai, slėgiui ir pH. Jis taikomas tiktai grynai 
medžiagai, ištirpintai dviejuose grynuose tirpikliuose. Jeigu tuo pa čiu 
metu keli skirtingi tirpiniai yra vienoje arba abiejose b ūsenose, tai 
gali turėti įtakos rezultatams.  
Dėl ištirpusi ų molekuli ų disociacijos arba asociacijos yra gaunami 
nukrypimai nuo Nersto pasiskirstymo d ėsnio. Tokius nukrypimus 
rodo tai, kad pasiskirstymo koeficientas tampa priklausomu nuo tirpalo koncentracijos.
 
Dėl daugkartin ės pusiausvyros nusistov ėjimo poreikio šis bandymo 
metodas netur ėtų būti naudojamas jonizuojamiems junginiams, jeigu 
nenaudojama korekcija. Tokiems junginiams reik ėtų apsvarstyti gali ­
mybę vietoje vandens naudoti buferinius tirpalus; buferinio tirpalo 
pH turėtų būti ne mažesnis kaip vienas medžiagos pKa vienetas, ir 
reikėtų atsižvelgti į šio pH tinkamum ą bandymo s ąlygoms.  
1.6. METODO APIB ŪDINIMAS  
1.6.1.  Išankstinis pasiskirstymo koeficiento įvertinimas  
Pasiskirstymo koeficient ą geriau vertinti naudojant apskai čiavimo 
metodą (žr. 1 pried ėlį) arba atitinkamais atvejais pagal bandomosios 
medžiagos tirpumo koeficient ą grynuose tirpikliuose (10).  
1.6.2.  Kratomos kolbos metodas  
1.6.2.1.  Pasiruošimas  
n-oktanolis: pasiskirstymo koeficiento nustatymas tur ėtų būti atlie­
kamas su didelio grynumo analiziniais reagentais.  
Vanduo: tur ėtų būti naudojamas distiliuotas arba du kartus disti ­
liuotas vanduo, naudojant stiklin į arba kvarcin į aparatą. Jonizuoja ­
miems junginiams, jeigu tai pagr įsta, vietoje vandens tur ėtų būti 
naudojami buferiniai tirpalai.  
Pastaba  
Vanduo, paimtas tiesiogiai iš jonitinio filtro, netur ėtų būti naudo­
jamas.  
1.6.2.1.1. I š a n k s t i n i s t i r p i k l i ų s o t i n i m a s  
Prieš nustatant pasiskirstymo koeficient ą, tirpiklio sistemos faz ės yra 
abipusiai sotinamos purtant eksperimento temperat ūroje. Kad tai b ūtų 
atlikta, pakanka ant mechanin ės purtykl ės 24 valandas purtyti du 
didelius standartinius butelius, kuriuose yra didelio grynumo anali ­
zinis n-oktanolis arba vanduo su pakankamu kiekiu kito tirpiklio, po 
to leidžiama pakankamai ilgai nusistov ėti, kad atsiskirt ų fazės ir būtų 
pasiekta sotis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. P a s i r u o š i m a s b a n d y m u i  
Visas dviej ų fazių sistemos t ūris turėtų beveik užpildyti bandymo 
indą. Taip bus išvengta medžiagos nuostoli ų dėl lakumo. Naudotini 
tūrio santykiai ir medžiagos kiekiai pasirenkami taip:  
— išankstinis pasiskirstymo koeficiento apskai čiavimas (žr. anks ­
tesnį punktą), 
— mažiausias bandomos medžiagos kiekis, reikalingas analizei 
atlikti, ir  
— didžiausios koncentracijos apribojimas bet kurioje faz ėje 0,01 
molio viename litre.  
Atliekami trys bandymai. Pirmajame naudojamas apskai čiuotas 
n-oktanolio ir vandens t ūrio santykis; antrajame – šis santykis dali ­
namas iš dviej ų; o trečiajame – šis santykis dauginamas iš dviej ų 
(pvz., 1:1; 1:2; 2:1).  
1.6.2.1.3. B a n d o m o j i m e d ž i a g a  
Pagrindinis tirpalas paruošiamas iš anksto vandeniu įsotintame 
n-oktanolyje. Šio pagrindinio tirpalo koncentracija tur ėtų būti tiksliai 
nustatoma prieš j į naudojant pasiskirstymo koeficiento nustatymui. 
Šis tirpalas tur ėtų būti laikomas jo stabilum ą užtikrinan čiomis sąly­
gomis.  
1.6.2.2.  Bandymo s ąlygos  
Turėtų būti išlaikoma pastovi bandymo temperat ūra (± 1 °C), o 
temperatūros intervalas – 20–25 °C.  
1.6.2.3.  Matavimo eiga  
1.6.2.3.1. P a s i s k i r s t y m o p u s i a u s v y r o s n u s t a t y m a s  
Kiekvienai bandymo s ąlygai turėtų būti paruošiami dvigubi bandymo 
indai su reikalingu tiksliai pamatuotu dviej ų tirpiklių kiekiu ir su 
būtinu pagrindinio tirpalo kiekiu.  
n-oktanolio faz ės turėtų būti matuojamos pagal t ūrį. Bandymo indai 
turėtų būti dedami arba į tinkamą purtyklę arba kratomi ranka. Jeigu 
naudojamas centrifugos vamzdelis, rekomenduojama greitai sukti 
vamzdelį 180  o apie jo skersin ę ašį taip, kad bet koks pagautas oro 
kiekis iškilt ų per tas dvi fazes. Patirtis parod ė, kad pasiskirstymo 
pusiausvyrai nusistov ėti paprastai pakanka 50 toki ų apsukų. Kad 
nekiltų abejonių, rekomenduojama 100 apsuk ų per penkias minutes.  
1.6.2.3.2. F a z i ų a t s k y r i m a s  
Jeigu reikia, kad faz ės atsiskirt ų, mišinys centrifuguojamas. Tai 
turėtų būti atliekama laboratorine centrifuga kambario temperat ūroje 
arba, jeigu naudojama centrifuga su nekontroliuojama temperat ūra, 
centrifugos vamzdeliai, siekiant nustatyti pusiausvyr ą, turėtų būti 
laikomi bandymo temperat ūroje ne trumpiau kaip vien ą valandą iki 
analizės. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analiz ė 
Nustatant pasiskirstymo koeficient ą yra būtina nustatyti bandomos 
medžiagos koncentracijas abiejose faz ėse. Tą galima atlikti iš kiek ­
vieno vamzdelio imant kiekvienos iš dviej ų fazių alikvotin ę dalį 
kiekvienai bandymo s ąlygai ir jas analizuoti pagal pasirinkt ą darbo 
eigą. Visas medžiagos, esan čios abiejose faz ėse, kiekis tur ėtų būti 
apskaičiuojamas ir palyginamas su iš įdėtos medžiagos kiekiu.  
Vandens faz ės mėginiai turėtų būti imami tokia tvarka, kad b ūtų kaip 
galima labiau sumažinamas pavojus įtraukti n-oktanolio p ėdsakus: 
vandens faz ės mėginiui paimti gali b ūti naudojamas stiklinis 
švirkštas su nuimama adata. Iš pradži ų švirkštas tur ėtų būti iš dalies 
pripildytas oro. Oras tur ėtų būti švelniai išstumiamas tuo pa čiu metu 
įterpiant adat ą per n-oktanolio sluoksn į. Į švirkštą įtraukiamas pakan ­
kamas tūris vandens faz ės. Švirkštas greitai ištraukiamas iš tirpalo ir 
nuimama adata. Švirkšto turinys gali b ūti naudojamas kaip vande ­
ninis bandinys. Dviej ų atskirtų fazių koncentracij ą geriau nustatyti tai 
medžiagai tinkamu metodu. Analiz ės metodų, kurie gali b ūti tinkami, 
pavyzdžiai:  
— fotometrinis metodas,  
— dujų chromatografija,  
— efektyvioji skys čių chromatografija.  
1.6.3.  HPLC metodas  
1.6.3.1.  Pasiruošimas  
Aparatūra 
Reikalingas skys čių chromatografas su įtaisytu impuls ų nesuke­
liančiu siurbliu ir atitinkamu detektoriumi. Rekomenduojama naudoti 
injekcinį vožtuvą su injekcin ėmis kilpomis. Tai, kad statin ėje fazėje 
yra polin ės grupės, gali smarkiai pakenkti HPLC kolon ėlės darbui. 
Todėl statinėse fazėse turėtų būti mažiausias procentas polini ų grupių 
(11). Gali b ūti naudojamos parduodamos mikrodaleli ų atvirkštini ų 
fazių įkrovos arba jau įkrautos kolon ėlės. Apsaugos kolon ėlė gali 
būti dedama tarp įšvirkštimo sistemos ir analizin ės kolonėlės. 
Judančioji fazė 
HPLC tinkantis metanolis ir HPLC tinkantis vanduo naudojami 
eliuentiniam tirpikliui paruošti, kuris prieš naudojim ą degazuojamas. 
Turėtų būti naudojamas izokratinis eliuavimas. Tur ėtų būti naudo­
jami metanolio/vandens santykiai su mažiausiu 25 % vandens kiekiu. 
Paprastai pakanka 3:1 (v/v) metanolio-vandens mišinio log P 6 jungi ­
niams eliuuoti per vien ą valandą, kai debitas 1 ml/min. Jeigu 
junginių log P didelis, gali reik ėti sutrumpinti eliuavimo laik ą (taip 
pat ir etalonini ų junginių), sumažinant judan čiosios faz ės poliškum ą 
arba kolon ėlės ilgį. 
Medžiagos, kuri ų tirpumas n-oktanolyje yra mažas, turi polink į 
mažoms log P  ow vertėms, kai naudojamas HPLC metodas; toki ų 
junginių smailės kartais atsiranda įvykus tirpiklio frontui. Tai tikriau ­
siai vyksta d ėl to, kad pasiskirstymo procesas yra per l ėtas pusiaus ­
vyrai pasiekti per normal ų HPLC atskyrimo laik ą. Tada debito maži ­
nimas ir (arba) metanolio/vandens santykio mažinimas gali b ūti 
veiksminga priemon ė patikimai vertei gauti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Bandomieji ir etaloniniai junginiai tur ėtų būti tirpūs judančiojoje 
fazėje ir pakankamos koncentracijos, kad juos b ūtų galima aptikti. 
Tik išimtiniais atvejais gali b ūti naudojami priedai su metanolio ir 
vandens mišiniu, kadangi priedai pakei čia kolonėlės savybes. Chro ­
matogramose su priedais yra privaloma naudoti tokios pat r ūšies 
atskirą kolonėlę. Jeigu metanolio ir vandens mišinys netinka, gali 
būti naudojami kiti organiniai vandenyje tirp ūs mišiniai, pvz., 
etanolis ir vanduo arba acetonitrilas ir vanduo.  
Eliuato pH yra ypa č svarbus jonizuojamiems junginiams. Jis tur ėtų 
būti kolonėlės eksploatacijos pH intervalo ribose, kuris paprastai yra 
2–8. Priderinant rekomenduojama naudoti buferinius tirpalus. Reikia 
stengtis išvengti drusk ų nuosėdų ir kolon ėlės gedimų, kurie pasi ­
reiškia dėl tam tikr ų organinės fazės/buferini ų mišinių. Nepatartina 
matuoti HPLC kvarcin ėmis stacionariomis faz ėmis, kai pH didesnis 
negu 8, kadangi d ėl naudojamos šarmin ės judančiosios faz ės gali 
greitai pablog ėti kolonėlės veikimas.  
Tirpiniai  
Etaloniniai junginiai tur ėtų būti kiek įmanoma grynesni. Junginiai, 
kurie turi b ūti naudojami bandyme arba kalibravimui, jeigu 
įmanoma, ištirpinami judan čiojoje faz ėje. 
Bandymo s ąlygos  
Matavimų metu temperat ūra neturėtų svyruoti daugiau negu ± 2 K.  
1.6.3.2.  Matavimas  
Nulinio laiko t  o apskaičiavimas  
Nulinį laiką t o galima nustatyti naudojant homologin ę eilę (pvz., 
n-alkilmetilketonus) arba nepasiskirs čiusius organinius junginius 
(pvz., tiokarbamidas arba formamidas). Apskai čiuojant nulin į laiką 
t o naudojant homologin ę eilę, įšvirkščiami ne mažiau kaip septyni 
homologin ės eilės nariai ir nustatomos atitinkamos sulaikymo 
trukmės. Neapdorotos sulaikymo trukm ės t r(nc + 1)  
brėžiamos kaip t  r(nc + 1)  funkcija, o a ir b regresijos lygties atid ėjimas 
ir pasvirimas::  
t r ( nc + 1  ) = a + b t  r ( nc ) 
čia (n  c – anglies atom ų skaičius). Po to nulinis laikas t  o apskaičiuo­
jamas pagal: t  0 = a / (1 – b)  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Kalibravimo grafikas  
Po to sudaromas log k ver čių ir log P santykio koreliacijos grafikas 
atitinkamiems etaloniniams junginiams. Praktiškai vienu metu įšvirkščiama nuo 5 iki 10 standartini ų etalonini ų junginių, kurių 
log P maždaug atitinka tik ėtiną intervalą, ir nustatomos sulaikymo 
trukmės, geriau ant įrašančiojo integratoriaus, sujungto su aptikimo 
sistema. Apskai čiuojami atitinkami talpos koeficiento logaritmai log 
k ir brėžiamas log P, nustatyto kratomos kolbos metodu, funkcijos 
grafikas. Kalibruojama reguliariais intervalais, ne re čiau kaip kart ą 
per dieną, kad būtų galima atlikti galimus pakitimus kolon ėlės darbe.
 
Bandinio talpos koeficiento nustatymas  
Įšvirkščiamas kiek įmanoma mažesnis bandinio judan čiosios faz ės 
kiekis. Nustatoma tokia sulaikymo trukm ė (dvigubas matavimas), 
kad būtų galima apskai čiuoti talpos koeficient ą k. Iš etalonini ų 
junginių koreliacijos grafiko galima interpoliuoti bandinio pasiskirs ­
tymo koeficient ą. Jeigu pasiskirstymo koeficientas labai mažas arba 
labai didelis, b ūtina ekstrapoliacija. Tokiais atvejais ypa č reikia atsiž ­
velgti į regresijos ties ės pasikliovimo ribas.  
2. DUOMENYS  
Kratomos kolbos metodas  
Nustatytų P verčių patikimumas gali b ūti patikrinamas palyginant 
dviejų bandymų vidurkius su suminiu vidurkiu.  
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:  
— tikslus medžiagos apib ūdinimas(tapatumas ir priemaišos),  
— jeigu metod ų neįmanoma panaudoti (pvz., paviršinio aktyvumo 
medžiaga), tur ėtų būti pateikiama apskai čiuotoji vert ė arba 
duomenys, pagr įsti individualiu tirpumu n-oktanolyje ir vande ­
nyje,  
— visa informacija ir pastabos, svarbios duomen ų aiškinimui, ypa č 
atsižvelgiant į medžiagoje esan čias priemaišas ir jos fizin ę 
būseną. 
Kratomos kolbos metodui:  
— išankstinio įvertinimo, jei toks buvo, rezultatai,  
— bandymo temperat ūra, 
— duomenys apie analiz ės procedūras, naudotas nustatant koncent ­
racijas,  
— centrifugavimo, jei jis buvo naudotas, laikas ir greitis,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— kiekvienam nustatymui matuotos koncentracijos abiejose faz ėse 
(tai reiškia, kad ataskaitoje bus pateikta iš viso 12 koncentracij ų), 
— bandinio svoris, kiekvienos naudotos faz ės tūris kiekviename 
mėgintuvėlyje ir visas apskai čiuotas mėginio kiekvienoje faz ėje 
kiekis nusistov ėjus pusiausvyrai,  
— apskai čiuotos pasiskirstymo koeficiento (P) vert ės ir vidutin ė 
vertė turėtų būti pateikiamos ataskaitoje kiekvienai bandymo 
sąlygų grupei, kaip ir vis ų nustatym ų vidutinės vertės. Jeigu 
galima prielaida, kad koncentracija priklauso nuo pasiskirstymo 
koeficiento, tai tur ėtų būti nurodoma ataskaitoje,  
— turėtų būti pateikiami standartiniai individuali ųjų P verčių 
nuokrypiai nuo vidutin ės vertės, 
— visų nustatym ų vidurkis P tur ėtų būti išreiškiamas logaritmu 
(dešimtainis logaritmas),  
— teoriškai apskai čiuotas P  ow , jei ši vert ė buvo nustatyta arba jeigu 
išmatuotoji vert ė > 10  4 , 
— naudoto vandens ir vandens faz ės pH eksperimento metu,  
— jeigu naudojami buferiniai tirpalai, buferi ų naudojimo vietoje 
vandens pagrindimas, buferini ų tirpalų sudėtis, koncentracija ir 
pH, vandens faz ės pH prieš eksperiment ą ir po jo.  
HPLC metodui:  
— išankstini ų vertinim ų, jeigu tokie buvo, rezultatai,  
— mėginiai ir etalonin ės medžiagos, j ų grynumas,  
— nustatymo temperat ūros intervalas,  
— pH dydis, kuriam esant buvo atliekamas nustatymas,  
— išsami informacija apie analiz ės ir apsaugin ę kolonėlę, judančiąją 
fazę ir nustatymo vidurkius,  
— duomenys apie kalibravimui naudot ų etalonini ų junginių sulai­
kymo trukmes ir literat ūroje randamas log P vertes  
— išsami informacija apie regresijos kreiv ės sudarym ą (log k 
santykis su log P),  
— vidutiniai bandomo junginio duomenys apie sulaikymo trukmes 
ir interpoliuot ą log P vert ę, 
— įrangos ir darbo s ąlygų apibūdinimas,  
— eliuavimo profiliai,  
— į kolonėlę pakrautų mėginių ir etalonini ų medžiag ų kiekiai,  
— nulinis laikas ir kaip jis buvo išmatuotas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. NUORODOS  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
 
3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
4) L. Renberg, G. Sundstr Ėm and K. Sundh-Nygärd, Chemosp ­
here, 1980, vol. 80, p. 683.  
5) H. Ellgehausen, C. D’Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, p. 219.  
6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73.  
7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.  
8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 
p. 675  
9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, p. 787  
10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E. Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/1, p. 223–339.  
11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, p. 479  
12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.  
13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
14) NF T 20–043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial 
use – Determination of partition coefficient – Flask shaking method.
 
15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 
1459  
16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
p. 525  
17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.  
18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. 
Technol., 1974, vol. 8, p. 1113.  
19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
p. 382  
20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York 1979.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam 1984,  
22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Base11978.  
23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, p. 615.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
1 priedėlis 
APSKAI ČIAVIMO / VERTINIMO METODAI  
ĮVADAS  
Apskaičiavimo metod ų, duomen ų ir pavyzdži ų bendrasis įvadas pateiktas „Hand ­
book of Chemical Property Estimation Methods“ (a).  
Apskaičiuotosios P  ow vertės gali būti naudojamos:  
— spręsti apie eksperimentini ų metodų tinkamum ą (kratomos kolbos metodo 
intervalas: log P  ow vertės nuo 2 iki 4, HPLC intervalas: log P  ow : nuo 0 iki 6),  
— bandymo tinkamoms s ąlygoms parinkti (pvz., etalonines medžiagas HPLC 
metodikose, n-oktanolio ir vandens t ūrių santykį kratomos kolbos metode),  
— kaip galim ų eksperimentini ų paklaidų laboratorijos vidin ės kontrol ės prie­
monė, 
— P  ow gauti tais atvejais, kai eksperimentiniai metodai negali b ūti taikomi d ėl 
techninių priežasčių. 
VERTINIMO METODAS  
Išankstinis pasiskirstymo koeficiento įvertis  
Pasiskirstymo koeficientas gali b ūti įvertintas, naudojant bandomosios medžiagos 
tirpumo grynuose tirpikliuose vertes:  
Taigi:  
P įvertis ¼ soties C  nÄoktanolis  
soties C  vanduo  
APSKAI ČIAVIMO METODAI  
Apskaičiavimo metod ų esmė 
Visi apskai čiavimo metodai remiasi formaliuoju molekul ės dalinimu į atitinkamas 
mažesnes strukt ūras, kurių log P  ow tikrieji poky čiai yra žinomi. Tuomet visos 
molekulės log P  ow apskaičiuojamas kaip atitinkam ų dalių verčių suma pridedant 
pataisos d ėl sąveikų molekulės viduje d ėmenų sumą. 
Dalių konstant ų ir pataisos d ėmenų sąrašus galima rasti (b), (c), (d), (e). Kai 
kurie sąrašai yra nuolat atnaujinami (b).  
Kokybės kriterijai  
Paprastai apskai čiavimo metodo patikimumas maž ėja kuo sud ėtingesnė junginio 
sandara. Paprast ų molekuli ų, turinčių mažą molekulin ę masę ir vieną arba dvi 
funkcines grupes, atveju, tarp įvairiais fragmentavimo metodais gaut ų rezultatų ir 
išmatuotos vert ės galima laukti 0,1–0,3 log P  ow vieneto nuokrypio. Sud ėtingesnių 
molekulių atveju paklaidos ribos gali b ūti didesnės. Tai priklauso nuo fragment ų 
konstantų patikimumo ir j ų buvimo, taip pat nuo sugeb ėjimo įvertinti intramole ­
kulines sąveikas (pvz., vandenilio jungtis) ir pataisos d ėmenų teisingo naudojimo 
(mažiau problem ų turint kompiuterin ę programą CLOGP-3) (b). Jonini ų junginių 
atveju svarbu teisingai įvertinti kr ūvį arba jonizacijos laipsn į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Apskaičiavimo proced ūros 
Hansch π-metodas  
Pradinė hidrofobinio pakaito darinio konstanta, π, įvesta  Fujira ir kt . (f) apibr ė­ 
žiama taip:  
π x = log P  ow (PhX) – log P  ow (PhH)  
čia: P  ow (PhX) aromatinio darinio pasiskirstymo koeficientas ir P  ow (PhH) 
pradinio junginio pasiskirstymo koeficientas  
(pvz., π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) - log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 – 2,13 = 0,71).  
Pagal jo apibr ėžimą π metodas labiausiai taikytinas pakait ų aromatiniame žiede 
atveju, π vertės didelei daliai pakait ų yra pateiktos lentel ėse (b), (c), (d). Jos 
taikomos apskai čiuoti aromatini ų molekuli ų arba aromatini ų struktūrinių frag­
mentų log P  ow . 
Rekker metodas  
Pagal Rekker (g) log P  ow vertė apskaičiuojama taip:  
log P  ow ¼ ∑ 
i a i f i þ ∑ 
j ðsąveikos dėmenųÞ 
kai f  i įvairių molekul ės fragment ų konstantos ir a  i – konstant ų pasikartojimo 
dažnis tiriamoje molekul ėje. Pataisos d ėmenys gali b ūti išreikšti kaip vienos 
atskiros C  m , (vadinamosios „magiškosios konstantos“) sveikasis kartotinis. Frag ­
mentų konstantos f  i ir C  m buvo nustatytos iš 1 054 eksperimentini ų P ow verčių 
sąrašo (825 junginiai), naudojant daugianar ę regresinę analizę (c), (h). S ąveikos 
dėmenų nustatymas atliekamas pagal nustatytas taisykles, kurios aprašytos lite ­
ratūroje (e), (h), (i).  
Hansch-Leo metodas  
Pagal Hansch ir Leo (c) log P  ow vertė apskaičiuojama taip:  
log P  ow ¼ Ê 
∑ 
i a i f i þ ∑ 
j b j F j Ì 
kai f  i įvairių molekulės fragment ų konstantos, F – pataisos d ėmenys ir a  i , b j – 
atitinkami pasikartojimo dažniai. Atom ų ir grupių fragmentini ų verčių sąrašas ir 
pataisos d ėmenų f i (vadinam ųjų faktorių) sąrašas buvo nustatyti bandym ų ir 
klaidų metodu, naudojant eksperimentines P  ow vertes. Pataisos d ėmenys buvo 
suskirstyti į keletą skirtingų klasių (a), (c). Atsižvelgti į visas taisykles ir pataisos 
dėmenis yra gana sud ėtinga ir reikalauja daug laiko. Yra sukurti program ų 
paketai (b).  
Kombinuotasis metodas  
Sudėtinių molekuli ų log P  ow apskaičiavimas gali b ūti iš esm ės pagerintas, jei 
molekulė dalinama į didesnes strukt ūrines dalis, kuri ų log P  ow patikimos vert ės 
randamos lentel ėse (b), (c) arba gaunamos naudojant pa čių atliktus matavimus. 
Vėliau tokie fragmentai (pvz., heterociklai, antrachinonas, azobenzenas) gali b ūti 
derinami su Hansch π-vertėmis arba su Rekker arba Leo fragment ų konstantomis.  
Pastabos  
i) Apskai čiavimo metodai gali b ūti taikomi tik iš dalies arba visiškai jonizuo ­
tiems junginiams, jei įmanoma atsižvelgti į būtinuosius pataisos faktorius.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) Jei gali b ūti padaryta prielaida apie tarpmolekulini ų vandenilini ų jungčių 
buvimą, turi būti pridedami atitinkami pataisos d ėmenys (maždaug nuo + 
0,6 iki + 1,0 log P  ow vieneto) (a). Toki ų ryšių buvimo požymiai gali b ūti 
gauti naudojant molekul ės erdvinius modelius arba spektroskopinius 
duomenis.  
iii) Jei galimos kelios tautomerin ės formos, apskai čiavimai turi remtis pa čia pati­
kimiausia forma.  
iv) Būtina kruopš čiai sekti fragment ų konstant ų sąrašų pataisas.  
Ataskaita  
Taikant apskai čiavimo/vertinimo metodus, bandym ų ataskaitoje, jei įmanoma, 
turi būti tokia informacija:  
— medžiagos aprašymas (mišinys, priemaišos ir t. t.),  
— kokio nors galimo intramolekulinio vandenilinio ryšio, disociacijos, kr ūvio ir 
visų kitų neįprastų veiksnių (pvz., tautomerijos) požymiai,  
— apskai čiavimo metodo aprašymas,  
— duomen ų bazės identifikavimas arba šaltinis,  
— ypatumai pasirenkant fragmentus,  
— išsamus apskai čiavimo dokumentavimas.  
NUORODOS  
a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
d) Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 14, 
479. 
f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.  
g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol.1.  
h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12,1459.  
i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
2 Priedėlis 
Etaloninės medžiagos, rekomenduojamos naudoti taikant HPLC (high power liquid chromatography) – 
efektyviąją skysčių chromatografij ą 
Nr. Etalonin ė medžiaga  Log P  ow pKa 
1 2-butanonas  0,3  
2 4-acetilpiridinas  0,5  
3 Anilinas  0,9  
4 N-fenilacetamidas  1,0  
5 Benzilo alkoholis  1,1  
6 p-metoksifenolis  1,3  pKa = 10,26  
7 Feniloksiacto r ūgštis 1,4  pKa = 3,12  
8 Fenolis  1,5  pKa = 9,92  
9 2,4-dinitrofenolis  1,5  pKa = 3,96  
10 Benznitrilas  1,6  
11 Fenilacetonitrilas  1,6  
12 4-metilbenzilo alkoholis  1,6  
13 Acetofenonas  1,7  
14 2-nitrofenolis  1,8  pKa = 7,17  
15 3-nitrobenzenkarbonin ė rūgštis 1,8  pKa = 3,47  
16 4-chloranilinas  1,8  pKa = 4,15  
17 Nitrobenzenas  1,9  
18 3-fenilpropen-2-olis  1,9  
19 Benzenkarbonin ė rūgštis 1,9  pKa = 4,19  
20 p-krezolis  1,9  pKa = 10,17  
21 3-fenilakrilo r ūgštis 2,1  pKa = 3,89 cis 4,44 trans  
22 Anizolas  2,1  
23 Metilbenzoatas  2,1  
24 Benzenas  2,1  
25 3-metilbenzenkarbonin ė rūgštis 2,4  pKa = 4,27  
26 4-chlorfenolis  2,4  pKa = 9,1  
27 Trichloretilenas  2,4  
28 Atrazinas  2,6  
29 Etilbenzoatas  2,6  
30 2,6-dichlorbenznitrilas  2,6  
31 3-chlorbenzenkarbonin ė rūgštis 2,7  pKa = 3,82  
32 Toluenas  2,7  
33 1-naftolis  2,7  pKa = 9,34  
34 2,3-dichloranilinas  2,8  
35 Chlorbenzenas  2,8  
36 Alilfenileteris  2,9  
37 Brombenzenas  3,0  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Nr. Etalonin ė medžiaga  Log P  ow pKa 
38 Etilbenzenas  3,2  
39 Benzofenonas  3,2  
40 4-fenilfenolis  3,2  pKa = 9,54  
41 Timolis  3,3  
42 1,4-dichlorbenzenas  3,4  
43 Difenilaminas  3,4  pKa = 0,79  
44 Naftalinas  3,6  
45 Fenilbenzoatas  3,6  
46 Izopropilbenzenas  3,7  
47 2,4,6-trichlorfenolis  3,7  pKa = 6  
48 Bifenilas  4,0  
49 Benzilbenzoatas  4,0  
50 2,4-dinitro-6-(antr- butil)-fenolis  4,1  
51 1,2,4-trichlorbenzenas  4,2  
52 Dodekankarbonin ė rūgštis 4,2  
53 Difenileteris  4,2  
54 n-butilbenzenas  4,5  
55 Fenantrenas  4,5  
56 Fluorantenas  4,7  
57 Dibenzilas  4,8  
58 2,6-difenilpiridinas  4,9  
59 Trifenilaminas  5,7  
60 DDT [2,2,2-trichlor-1,1-bis-(p-chlorfenil)etanas]  6,2  
Kitos maž ą log P  ow turinčios etalonin ės medžiagos  
1 Nikotino r ūgštis – 0,07  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.8. PLIŪPSNIO TEMPERAT ŪRA 
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Prieš atliekant š į bandym ą, naudinga tur ėti išankstin ę informacij ą 
apie medžiagos degum ą. Bandymo metodika taikytina skystosioms 
medžiagoms, kuri ų garai gali b ūti padegti uždegimo priemon ėmis. 
Šiame tekste pateikti metodai patikimi tiktai tame pli ūpsnio tempe ­
ratūros intervale, kuris yra tam metodui nurodytas.  
Pasirenkant konkret ų metodą, turi būti atsižvelgta į tiriamosios 
medžiagos chemin ės reakcijos su bandymo indu galimyb ę. 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Pliūpsnio temperat ūra – tai mažiausia temperat ūra, perskai čiuota 
101,325 kPa sl ėgiui, kurioje bandymo metodui apibr ėžtomis sąly­
gomis virš skys čio atsiranda tiek gar ų, kad mėginio inde susidaro 
degus gar ų ir oro mišinys.  
Vienetai: °C;  
t = T – 273,15;  
(t nurodoma oC, T nurodoma K).  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Etalonines medžiagas neb ūtina naudoti kiekvienu atveju tiriant nauj ą 
medžiagą. Pagrindinis etalonini ų medžiag ų naudojimo tikslas yra 
periodiškai patikrinti metodo kokyb ę ir užtikrinti gaut ų rezultatų 
palyginamum ą su kitais metodais gautais bandym ų duomenimis.  
1.4. METODO PRINCIPAS  
Medžiaga pilama į mėginio indą ir pagal atskiram bandymo metodui 
naudojam ą metodiką šildoma arba aušinama iki bandymo tempera ­
tūros. Uždegimo bandymai atliekami norint nustatyti, ar m ėginys 
bandymo temperat ūroje užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
1.5.1.  Pakartojamumas  
Pakartojamumas kinta atsižvelgiant į pliūpsnio temperat ūros interval ą 
ir taikom ą bandymo metod ą; didžiausias kintamumas 2 °C.  
1.5.2.  Jautrumas  
Jautrumas priklauso nuo taikyto bandymo metodo.  
1.5.3.  Specifiškumas  
Kai kurių bandymo metod ų specifiškumas apribotas tam tikrais 
pliūpsnio temperat ūros intervalais ir priklauso nuo medžiagai 
būdingų savybių (pvz., didel ės klampos).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Pasiruošimas  
Bandomosios medžiagos ėminys įpilamas į bandymo aparat ą pagal 
1.6.3.1 ir (arba) 1.6.3.2.  
Saugai užtikrinti rekomenduojama, kad intensyviai reaguojan čių ir 
nuodingų medžiag ų bandinys b ūtų mažas, maždaug 2 cm  3 . 
1.6.2.  Bandymo s ąlygos  
Aparatas, kiek tai atitinka saug ą, turi būti dedamas nuo skersv ėjų 
apsaugotoje vietoje.  
1.6.3.  Bandymo eiga  
1.6.3.1.  Pusiausvyrinis metodas  
Žr. ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Nepusiausvyrinis metodas  
Abel aparatas:  
žr. BS 2000 170 dal į, NF M07–011, NF T66–009.  
Abel-Pensky aparatas:  
žr. EN 57, DIN 51755 1 dal į (temperat ūroms nuo 5 iki 65 °C), DIN 
51755 2 dal į (temperat ūroms mažesn ėm nei 5 °C), NF M07–036.  
Tag aparatas:  
žr. ASTM D 56.  
Pensky-Martens aparatas:  
žr. ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000–34, NF 
M07–019.  
Pastabos:  
Kai nepusiausvyriniu metodu pagal 1.6.3.2 nustatoma, kad pli ūpsnio 
temperatūra lygi 0 ± 2 °C, 21 ± 2 °C arba 55 ± 2 °C, jos vert ė turi 
būti patvirtinta pusiausvyriniu metodu, naudojant t ą patį aparatą. 
Skelbti rezultatams gali b ūti taikomi tik tokie metodai, kuriais galima 
nustatyti pli ūpsnio temperat ūrą. 
Klampių skysčių (dažų, dervų ir panaši ų medžiag ų), kurių sudėtyje 
yra tirpikli ų, pliūpsnio temperat ūrai nustatyti gali b ūti taikomas tik 
klampių medžiag ų pliūpsnio temperat ūrai nustatyti tinkamas apara ­
tais ir metodas.  
Žr. ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 1 dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. DUOMENYS  
3. ATASKAITA  
Jei įmanoma, bandymo ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
— tiksli medžiagos specifikacija (tapatumas ir priemaišos),  
— turi b ūti nurodytas taikytas metodas, taip pat visi galimi nukr ­
ypimai,  
— rezultatai ir visos papildomos pastabos, kurios b ūtų svarbios 
aiškinant rezultatus.  
4. NUORODOS  
Nėra ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.9. DEGUMAS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Prieš atliekant š į bandym ą, naudinga tur ėti išankstin ę informacij ą 
apie medžiagos potencialias sprogstam ąsias savybes.  
Šis bandymas turi b ūti taikomas tik medžiagoms, turin čioms milteli ų, 
granulių arba pastos pavidal ą. 
Siekiant, kad neb ūtų apimtos visos medžiagos, kurios gali b ūti 
padegtos, o tik tos, kurios greitai dega arba kuri ų elgsena degant 
bet kuriuo atveju yra ypa č pavojinga, labai degiomis medžiagomis 
laikomos tik tos medžiagos, kuri ų degimo greitis yra didesnis nei 
tam tikra ribin ė vertė. 
Gali būti ypač pavojinga, jei įkaitimo zona plinta metaliniuose milte ­
liuose, kadangi gesinant liepsn ą kyla sunkum ų. Metaliniai milteliai 
turi būti laikomi labai degiomis medžiagomis, jei jie palaiko įkaitimo 
zonos plitim ą miltelių masėje per tam tikr ą laiką. 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Degimo laikas išreiškiamas sekund ėmis. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nenurodytos.  
1.4. METODO PRINCIPAS  
Formuojamas maždaug 250 mm ilgio vientisas medžiagos ruožas 
arba milteli ų juosta ir atliekamas išankstinis atrankos bandymas, 
norint nustatyti, ar padegus dujiniu degikliu vyksta degan čios 
liepsnos plitimas ar rusenimas. Jei plitimas 200 mm juosta įvyksta 
per nustatyt ą laiką, tuomet degimo grei čiui nustatyti bandymas atlie ­
kamas pagal vis ą program ą. 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nenurodyti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Išankstinis atrankos bandymas  
Ant nedegios, neakytos ir šilumai nelaidžios pagrindo plokšt ės 
formuojamas maždaug 250 mm ilgio, 20 mm plo čio ir 10 mm 
aukščio medžiagos ruožas arba milteli ų juosta. Vienas milteli ų 
juostos galas karšta duj ų degiklio liepsna (mažiausias skersmuo 5 
mm) veikiamas tol, kol milteliai užsidega arba ne ilgiau kaip 2 
minutes (metal ų arba metal ų lydinių milteliai veikiami 5 minutes). 
Reikia pasižym ėti, ar degimo zona išilgai 200 mm plinta 4 min. 
bandymo laiko (arba 40 minu čių metalų miltelių atveju). Jei 
medžiaga neužsidega ir degimo zona išilgai 200 mm milteli ų juostos 
plinta su liepsna arba rusenant 4 minutes (arba 40 minu čių) bandymo 
laiko, medžiaga neturi b ūti laikoma labai degia ir toliau jos bandyti 
nereikia. Jei degimo zona 200 mm ilgio medžiagos milteli ų juosta 
plinta mažiau kaip 4 minutes arba mažiau kaip 40 minu čių, jei tai 
metaliniai milteliai, turi b ūti atliekama toliau aprašyta veiksm ų seka 
(1.6.2 punktas ir toliau).  
1.6.2.  Degimo grei čio nustatymo bandymas  
1.6.2.1.  Pasiruošimas  
Medžiagos milteliai arba granul ės suberiamos į 250 mm ilgio form ą, 
turinčią trikampio formos skerspj ūvį, kurio vidinis aukštis 10 mm ir 
plotis 20 mm. Abejose formos pus ėse išilgine kryptimi tvirtinamos 
dvi iš šon ų ribojančios metalin ės plokštės, kurios yra 2 mm aukš ­
tesnės nei viršutinis trikampio skerspj ūvio kraštas (žr. paveiksl ą). 
Forma tris kartus numetama iš 2 cm aukš čio ant kieto paviršiaus. 
Jei reikia, forma v ėl pripildoma. Šonin ės ribojan čios plokšt ės 
nuimamos ir medžiagos perteklius nubraukiamas. Ant formos viršaus 
uždedama nedegi, neakyta ir blogai šilum ą leidžianti pagrindo 
plokštė, įtaisas apver čiamas ir forma nuimama.  
Pastos pavidalo medžiagos dedamos ant nedegios, neakytos ir blogai 
šilumą leidžiančios pagrindo plokšt ės, suformuojant iš j ų 250 mm 
ilgio juostel ę, kurios skerspj ūvio plotas apie 1 cm  2 . 
1.6.2.2.  Bandym ų sąlygos  
Jei bandoma dr ėgmei jautri medžiaga, bandymas, j ą išėmus iš 
pakuotės, turi būti atliekamas kiek įmanoma grei čiau. 
1.6.2.3.  Bandymo eiga  
Bandinys dedamas į traukos spint ą skersai traukos kryp čiai. 
Oro greitis turi b ūti pakankamas, kad d ūmai negal ėtų patekti į labo­
ratoriją, ir bandymo metu turi nesikeisti. Apie įtaisą turi būti įtaisytas 
nuo skersv ėjo saugantis ekranas.  
Bandiniui viename gale padegti naudojama karšta duj ų degiklio 
liepsna (mažiausias skersmuo 5 mm). Nudegus 80 mm bandinio, 
kitoje 100 mm atkarpoje matuojamas degimo greitis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
Bandymas atliekamas šešis kartus, kiekvien ą kartą naudojant švari ą 
šaltą plokštę, nebent teigiamas rezultatas gaunamas anks čiau. 
2. DUOMENYS  
Vertinant rezultatus svarbi degimo trukm ė, nustatyta išankstiniame 
atrankos bandyme (1.6.1.) ir trumpiausia degimo trukm ė, gauta atlie ­
kant ne daugiau kaip šešis bandymus (1.6.2.3.).  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYM Ų ATASKAITA  
Jei įmanoma, bandym ų ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
— tiksli medžiagos specifikacija (tapatumas ir priemaišos),  
— bandomosios medžiagos apib ūdinimas, jos fizin ė būsena, įskai­
tant drėgmės kiekį, 
— išankstini ų atrankos bandym ų ir degimo grei čio bandymo, jei 
buvo atliekamas, rezultatai,  
— visos papildomos pastabos, kurios b ūtų svarbios aiškinant rezul ­
tatus.  
3.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Miltelių, granulių ir pastos pavidalo medžiagos turi b ūti laikomos 
labai degiomis, jei degimo trukm ė bet kuriame bandyme, atliktame 
pagal 1.6.2 aprašyt ą metodik ą, yra mažesn ė kaip 45 sekund ės. 
Metalų arba metal ų lydinių milteliai laikomi labai degiais, jei jie 
gali būti padegti ir liepsna arba reakcijos zona išplinta per vis ą 
bandinį ne ilgiau kaip per 10 min.  
4. NUORODOS  
NF T 20–042 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Priedėlis 
Paveikslas  
Forma ir priedai bandiniui paruošti  
(Visi matmenys milimetrais)
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.10.  DEGUMAS (DUJOS)  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šis metodas leidžia nustatyti, ar dujos, sumaišytos su oru kambario 
temperatūroje (maždaug 20 °C), ir esant atmosferos sl ėgiui yra 
degios, o jei degios, tai koks yra degi ų dujų koncentracijos inter ­
valas. Vis didesn ės koncentracijos bandom ųjų dujų mišiniai su oru 
veikiami elektros kibirkštimi ir stebima, ar mišinys užsidega.  
1.2. APIBR ĖŽTIS IR VIENETAI  
Degumo intervalas yra intervalas tarp mažiausios ir didžiausios spro ­
gumo ribin ės koncentracijos. Mažiausia ir didžiausia sprogumo ribin ė 
koncentracija yra tokia degi ų dujų mišinio su oru ribin ė koncentra ­
cija, kuriai esant liepsnos plitimas nevyksta.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nenurodytos.  
1.4. METODO PRINCIPAS  
Dujų koncentracija ore didinama palaipsniui ir kiekvienu atveju duj ų 
mišinys veikiamas elektros kibirkštimi.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Neapibrėžti. 
1.6. METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Aparat ūra 
Bandymo indas – vertikaliai pastatytas stiklinis cilindras, kurio 
mažiausias vidinis skersmuo 50 mm ir mažiausias aukštis 300 mm. 
Uždegimo elektrodai, tarp kuri ų yra 3–5 mm tarpas, įtaisomi 60 mm 
nuo cilindro dugno. Cilindre turi b ūti įtaisytas sl ėginis vožtuvas. 
Norint apriboti bet kokio sprogimo padaryt ą žalą, aparatas turi b ūti 
apsaugotas skydu.  
Uždegimo šaltiniu naudojama pastovi indukcin ė 0,5 s trukm ės 
kibirkštis, generuojama aukštos įtampos transformatoriaus, kurio 
išėjimo įtampa 10–15 kV (didžiausia galia 300 W). Tinkamos apara ­
tūros pavyzdys aprašytas (2) nuorodoje.  
1.6.2.  Bandymo s ąlygos  
Bandymas turi b ūti atliekamas kambario temperat ūroje (maždaug 
20 °C).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  Bandymo eiga  
Žinomos koncentracijos duj ų mišinys su oru įpučiamas į cilindrą, 
naudojant dozavimo siurblius. Per mišin į leidžiama kibirkštis ir 
stebima, ar liepsna atsiskiria nuo liepsnos šaltinio ir plinta savaime 
ar taip nevyksta. Duj ų koncentracija kei čiama 1 % t ūr. pakopomis 
tol, kol dujos užsidega, kaip tai aprašyta anks čiau. 
Jei chemin ė dujų sandara rodo, kad jos netur ėtų būti degios, ir gali 
būti apskaičiuota jų stechiometrinio mišinio su oru sud ėtis, tai 1 % 
pakopomis reikia tikrinti pradedant mišiniu, kuriame duj ų yra 10 % 
mažiau nei stechiometrin ės sudėties mišinyje, ir baigiant mišiniu, 
kuriame duj ų yra 10 % daugiau nei stechiometrin ės sudėties miši­
nyje.  
2. DUOMENYS  
Šiai savybei nustatyti reikalingi tik duomenys apie liepsnos plitim ą. 
3. ATASKAITA  
Jei įmanoma, bandymo ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
— tiksli medžiagos specifikacija (tapatumas ir priemaišos),  
— naudotos aparat ūros aprašymas, nurodant matmenis,  
— temperat ūra, kurioje bandymas buvo atliekamas,  
— tirtos koncentracijos ir gauti rezultatai,  
— bandymo rezultatas: nedegios dujos ar labai degios dujos,  
— jei padaryta išvada, kad dujos nedegios, tai turi b ūti nurodytas 
koncentracijos intervalas, kuriame tai buvo daroma 1 % pako ­
pomis,  
— turi b ūti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija 
ir pastabos.  
4. NUORODOS  
1) NF T 20–041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse- einer 
Standard-Apparatur zur Messung von Explosionsgrenzen’. 
Chem.-Ing.- Tech. 1984, vol. 56, 2, p. 126–127.Wortmann, T. Redeker und H. Schacke. ’Entwicklung
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.11.  DEGUMAS (S ĄLYTIS SU VANDENIU)  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šis bandymo metodas gali b ūti taikomas norint nustatyti, ar d ėl 
medžiagos reakcijos su vandeniu arba dr ėgme nesusidaro pavojingas 
kiekis vienos arba keleto r ūšių dujų, kurios gal ėtų būti labai degios.  
Bandymo metodas gali b ūti taikomas kietosioms ir skystosioms 
medžiagoms. Šis metodas netaikytinas medžiagoms, kurios užsidega 
nuo sąlyčio su oru.  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Labai degios: medžiagos, kurios s ąlytyje su vandeniu arba dr ėgnu 
oru pavojingais kiekiais ne mažesne kaip 1 litras/kg per valand ą 
sparta išskiria labai degias dujas.  
1.3. METODO PRINCIPAS  
Medžiaga bandoma laikantis toliau aprašytos pakop ų sekos; jei dujos 
kurioje nors pakopoje užsiliepsnoja, toliau bandyti neb ūtina. Jei 
žinoma, kad medžiaga su vandeniu intensyviai nereaguoja, prad ėkite 
nuo 4 pakopos (1.3.4).  
1.3.1.  1 pakopa  
Bandomoji medžiaga dedama į lovelį su distiliuotu vandeniu 20 °C 
temperatūroje ir stebima, ar išsiskirian čios dujos užsiliepsnoja ar 
neužsiliepsnoja.  
1.3.2.  2 pakopa  
Bandomoji medžiaga dedama ant filtravimo popieriaus, pad ėto į 
lėkštelę su distiliuotu vandeniu 20 °C temperat ūroje, ir stebima, ar 
išsiskirian čios dujos užsiliepsnoja ar neužsiliepsnoja. Filtravimo 
popierius skirtas tik tam, kad medžiaga b ūtų vienoje vietoje, kas 
padidintų užsiliepsnojimo galimyb ę. 
1.3.3.  3 pakopa  
Iš bandomosios medžiagos suformuojama kr ūvelė, kurios aukštis 
apie 2 cm ir skersmuo 3 cm. Ant kr ūvelės lašinami keli lašai 
vandens ir stebima, ar išsiskirian čios dujos užsiliepsnoja ar neužsi ­
liepsnoja.  
1.3.4.  4 pakopa  
Bandomoji medžiaga maišoma su distiliuotu vandeniu 20 °C tempe ­
ratūroje ir kas valand ą septynių valandų laikotarpiu matuojama duj ų 
išsiskyrimo sparta. Jei duj ų skyrimosi sparta svyruoja arba septynias 
valandas did ėja, matavimo trukm ė turi būti padidinta ne daugiau kaip 
iki penki ų parų. Bandymas gali b ūti sustabdytas, jei išsiskyrimo 
sparta kuriuo nors momentu yra didesn ė kaip 1 litras/kg per valand ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nenurodytos.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
1.6. METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  1 pakopa  
1.6.1.1.  Bandymo s ąlygos  
Bandymas atliekamas kambario temperat ūroje (maždaug 20 °C).  
1.6.1.2.  Bandymo eiga  
Nedidelis kiekis (skersmuo maždaug 2 mm) bandomosios medžiagos 
turi būti įdėtas į lovelį su distiliuotu vandeniu. Reikia steb ėti, ar i) 
skiriasi kokios nors dujos ir ii) ar jos užsiliepsnoja. Jei dujos užsi ­
liepsnoja, medžiagos toliau bandyti nereikia, nes medžiaga laikoma pavojinga.
 
1.6.2.  2 pakopa  
1.6.2.1.  Aparat ūra 
Filtravimo popierius padedamas distiliuoto vandens, įpilto į bet kokį 
tinkamą indą, pvz., 100 mm skersmens garinimo l ėkštelę, paviršiuje.  
1.6.2.2.  Bandymo s ąlygos  
Bandymas atliekamas kambario temperat ūroje (maždaug 20 °C).  
1.6.2.3.  Bandymo eiga  
Nedidelis kiekis (skersmuo maždaug 2 mm) bandomosios medžiagos 
dedamas filtravimo popieriaus centre. Reikia steb ėti, ar i) skiriasi 
kokios nors dujos ir ii) ar jos užsiliepsnoja. Jei dujos užsiliepsnoja, medžiagos toliau bandyti nereikia, nes medžiaga laikoma pavojinga.
 
1.6.3.  3 pakopa  
1.6.3.1.  Bandymo s ąlygos  
Bandymas atliekamas kambario temperat ūroje (maždaug 20 °C).  
1.6.3.2.  Bandymo eiga  
Iš bandomosios medžiagos suformuojama kr ūvelė, kurios aukštis 
apie 2 cm ir skersmuo 3 cm ir kurios viršuje yra padarytas įdubimas. 
Į įdubimą lašinami keli lašai vandens ir stebima, ar i) skiriasi kokios 
nors dujos ir ii) ar jos užsiliepsnoja. Jei dujos užsiliepsnoja, 
medžiagos toliau bandyti nereikia, nes medžiaga laikoma pavojinga.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  4 pakopa  
1.6.4.1.  Aparat ūra 
Surenkamas paveiksle parodytas aparatas.  
1.6.4.2.  Bandymo s ąlygos  
Patikrinkite, ar tiriamosios medžiagos pakuot ėje yra milteli ų, kurių 
dalelių skersmuo mažesnis kaip 500 μm. Jei milteliai sudaro daugiau 
kaip 1 % visos medžiagos mas ės arba jei medžiaga yra trapi, tai 
norint atsižvelgti į dalelių dydžio maž ėjimą laikymo ir krovimo 
metu, prieš bandymus visa medžiaga turi b ūti sumalta į miltelius; 
kitais atvejais medžiaga turi b ūti bandoma tokia, kokia gauta. 
Bandymas turi b ūti atliekamas kambario temperat ūroje (maždaug 
20 °C) ir atmosferiniame sl ėgyje.  
1.6.4.3.  Bandymo eiga  
Į aparato lašinam ąjį piltuvą įpilama 10–20 ml vandens, o į kūginę 
kolbą įdedama 10 g bandomosios medžiagos. Išsiskyrusi ų dujų tūris 
gali būti išmatuotas bet kuriuo tinkamu b ūdu. Atidaromas lašinamojo 
piltuvo čiaupas, kad vanduo gal ėtų tekėti į kūginę kolbą, ir palei ­
džiamas sekundmatis. Išsiskyrusi ų dujų kiekis septynias valandas 
matuojamas kas valand ą. Jei per š į laiką išsiskyrusi ų dujų kiekis 
svyruoja arba jei šio laikotarpio pabaigoje išsiskyrusi ų dujų kiekis 
didėja, matavimai turi b ūti tęsiami ne ilgiau kaip penkias paras. Jei 
kuriuo nors matavimo momentu duj ų išsiskyrimo sparta yra didesn ė 
kaip 1 litras/kg per valand ą, bandym ą galima nutraukti. Šis 
bandymas turi b ūti pakartotas tris kartus.  
Jei chemin ė dujų sudėtis nežinoma, dujos turi b ūti analizuojamos. Jei 
dujose yra labai degi ų komponent ų ir nėra žinoma, ar visas mišinys 
yra labai degus, turi b ūti paruoštas ir pagal A. 11 metod ą išbandytas 
tokios pa čios sudėties mišinys.  
2. DUOMENYS  
Medžiaga laikoma pavojinga, jei:  
— bet kurioje bandymo pakopoje įvyksta užsidegimas,  
arba 
— degios dujos skiriasi didesne kaip 1 litras/kg bandomosios 
medžiagos per valand ą sparta.  
3. ATASKAITA  
Bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti tokia informacija:  
— tiksli medžiagos specifikacija (tapatumas ir priemaišos),  
— bet kokio bandomosios medžiagos pradinio ruošimo detal ės, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— bandym ų rezultatai (1, 2, 3 ir 4 pakopos),  
— išsiskyrusi ų dujų cheminė sudėtis, 
— dujų išsiskyrimo sparta, jei vykdoma 4 pakopa (1.6.4),  
— visos papildomos pastabos, kurios b ūtų svarbios aiškinant rezul ­
tatus.  
4. NUORODOS  
1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York.  
2) NF T 20–040 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Priedėlis 
Paveikslas  
Aparatas
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.12.  PIROFORIN ĖS KIETŲJŲ MEDŽIAG Ų IR SKYS ČIŲ SAVYB ĖS 
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Bandymo metodikos taikytinos kietosioms ir skystosioms medžia ­
goms, kuri ų maži kiekiai savaime užsidega po trumpalaikio s ąlyčio 
su oru kambario temperat ūroje (maždaug 20 °C).  
Šis bandymo metodas netaikomas medžiagoms, kurios kambario 
temperatūros ore savaime užsidega tik po keli ų valandų arba dien ų 
arba kurioms reikia aukštesn ės temperat ūros. 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Laikoma, kad medžiagos turi piroforini ų savybių, jei 1.6 apibr ėž­
tomis sąlygomis jos užsidega arba apangl ėja. 
Savaimin į skysčių užsiliepsnojim ą gali tekti tirti taikant A.15 metod ą 
„Skysčių ir dujų savaiminio užsiliepsnojimo temperat ūra“. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nenurodytos.  
1.4. METODO PRINCIPAS  
Kieta arba skysta medžiaga maišoma su inertišku nešikliu ir 
kambario temperat ūroje penkias minutes laikoma ore. Jei skystos 
medžiagos neužsidega, jos sugeriamos filtravimo popieriumi ir 
kambario temperat ūroje (maždaug 20 °C) penkias minutes laikomos 
ore. Kieta arba skysta medžiaga laikoma piroforine, jei ji užsidega, arba skystis uždega ar apangl ėja filtravimo popierius.
 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Pakartojamumas: kadangi tai labai svarbu saugos poži ūriu, vienin ­
telio teigiamo rezultato pakanka, kad medžiaga b ūtų laikoma pirofo ­
rine. 
1.6. BANDYM Ų METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Aparat ūra 
Maždaug 10 cm skersmens porcelianin ė lėkštutė kambario tempera ­
tūroje (maždaug 20 °C) apytikriai iki 5 mm aukš čio pripildoma 
diatominio molio.  
Pastaba  
Diatominis molis arba kuri nors kita panaši inertiška medžiaga, kuri ą 
būtų galima visur gauti, turi b ūti imama vietoje grunto, ant kurio 
bandomoji medžiaga gal ėtų būti išpilta avarijos atveju.  
Bandyti skys čiams, kurie neužsidega ore sumaišyti su inertiniu 
nešikliu, reikia tur ėti sausą filtravimo popieri ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  Bandymo eiga  
a) Kietųjų medžiag ų milteliai  
1–2 cm  3 bandomosios kietos medžiagos milteli ų iš maždaug 1 m 
aukščio beriama ant nedegaus paviršiaus ir ži ūrima, ar medžiaga 
užsidega krisdama arba per penkias minutes po nus ėdimo.  
Bandymas kartojamas šešis kartus, jei medžiaga neužsidega anks ­ 
čiau. 
b) Skysčiai 
Maždaug 5 cm  3 bandomojo skys čio supilama į paruoštą porcelianin ę 
lėkštutę ir stebima, ar medžiaga užsidega per penkias minutes.  
Jei per šešis bandymus medžiaga neužsidega, daromi tokie 
bandymai:  
0,5 ml m ėginys švirkštu užpilamas ant akyto filtravimo popieriaus ir 
stebima, ar per penkias minutes po suvilgymo filtravimo popierius 
užsidega ar apangl ėja. Bandymas atliekamas tris kartus, jei popierius 
neužsidega arba neapangl ėja anksčiau. 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Bandymas gali b ūti nutrauktas, gavus pirm ą teigiamą rezultatą. 
2.2. VERTINIMAS  
Jei su inertišku nešikliu sumaišyta ir ore pad ėta medžiaga užsidega 
per penkias minutes arba jei skystoji medžiaga per penkias minutes 
apdegina arba uždega joje suvilgyt ą ir ore pad ėtą filtravimo popieri ų, 
ji laikoma piroforine medžiaga.  
3. ATASKAITA  
Bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti tokia informacija:  
— tiksli medžiagos specifikacija (tapatumas ir priemaišos),  
— bandym ų rezultatai,  
— visos papildomos pastabos, kurios b ūtų svarbios aiškinant rezul ­
tatus.  
4. NUORODOS  
1) NF T 20–039 (September 85). Chemical products for industrial 
use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
 
2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.13.  SPROGUMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šis metodas pateikia bandymo schem ą norint nustatyti, ar kelia spro ­
gimo pavoj ų kieta arba pastos pavidalo medžiaga, veikiant liepsnai 
(terminis jautrumas) arba sm ūgiui ar trin čiai (jautrumas mechani ­
niams veiksniams), ir ar kelia sprogimo pavoj ų skysta medžiaga, 
veikiant liepsnai arba sm ūgiui. 
Metodas susideda iš trij ų dalių: 
a) terminio jautrumo bandymas (1);  
b) mechaninio jautrumo sm ūgiui bandymas (1);  
c) mechaninio jautrumo trin čiai bandymas (1).  
Šiuo metodu gauti duomenys leidžia įvertinti tikimyb ę įvykti spro ­
gimui, jei veikia kai kurie įprasti veiksniai. Metodas neskirtas nusta ­
tyti, ar medžiaga gali sprogti bet kokiomis s ąlygomis.  
Metodas tinka nustatyti, ar tam tikromis direktyvoje apibr ėžtomis 
sąlygomis, medžiaga kelia sprogimo pavoj ų (terminis ir mechaninis 
jautrumas). Jame naudojama keli ų tipų aparatūra, kuri turi plat ų 
pritaikym ą tarptautiniu mastu (1) ir kuri ą naudojant paprastai 
gaunami reikšmingi duomenys. Reikia pripažinti, kad metodas n ėra 
tikslus. Be nurodytos aparat ūros gali b ūti naudojami alternatyv ūs 
aparatai, jei jie turi tarptautin į pripažinim ą o rezultatai gali b ūti 
atitinkamai susieti su rezultatais, gautais naudojant nurodyt ą apara­
tūrą. 
Bandymų atlikti nereikia, kai turima informacija apie medžiagos 
termodinamines savybes (pvz., susidarymo šilum ą skilimo šilum ą) 
ir (arba) kai kuri ų chemiškai aktyvi ų grupių (2) nebuvimas strukt ū­
rinėje formul ėje leidžia pagr įstai neabejoti, kad medžiaga negali 
greitai suirti skiriantis dujoms arba šilumai (t. y. medžiaga nekelia jokio sprogimo pavojaus). Su skys čiais nereikia atlikti mechaninio 
jautrumo trin čiai bandymo.
 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Sprogstamosios medžiagos:  
medžiagos, kurios gali sprogti veikiant liepsnai arba kurios yra 
jautrios sm ūgiui ar trin čiai nurodytame aparate (arba yra jautresn ės 
mechaniniam poveikiui nei 1,3-dinitrobenzenas alternatyviame 
aparate).  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
1,3-dinitrobenzenas, techniškai gryna kristalin ė medžiaga, išsijota per 
0,5 mm aku čių sietą skirta trinties ir sm ūgio metodams.  
Perhidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazinas (RDX, heksogenas, ciklonitas – 
CAS 121–82–4), perkristalintas iš vandeninio cikloheksanono tirpalo, dr ėgnas išsijotas per 250 μm akučių sietą ir išlikęs ant 150 
μm akučių sieto bei išdžiovintas 103 ± 2 °C temperat ūroje (4 
valandas), skirtas antros eil ės trinties ir sm ūgio bandymams.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. METODO PRINCIPAS  
Norint nustatyti trij ų jautrumo bandym ų saugos sąlygas, būtina atlikti 
išankstinius bandymus.  
1.4.1.  Saugaus naudojimo bandymai (3)  
Saugumo sumetimais, prieš atliekant pagrindinius bandymus labai 
maži medžiagos m ėginiai (maždaug 10 mg) atviroje vietoje kaitinami 
dujų liepsnoje, veikiami sm ūgio bet kokiame patogios formos aparate 
ir veikiami trinties, naudojant medin į plaktuką ir priekal ą arba bet 
kokios rūšies trinties aparat ą. Tikslas – nustatyti, ar medžiaga yra 
tiek jautri ir sprogi, kad nurodytieji jautrumo bandymai, ypa č 
terminio jautrumo bandymas, turi b ūti atliekami laikantis speciali ų 
saugos priemoni ų, kad būtų išvengta pavojaus sužeisti operatori ų. 
1.4.2.  Terminis jautrumas  
Norint nustatyti, ar medžiaga gali sprogti intensyvaus kaitinimo ir 
apibrėžto uždaro t ūrio sąlygomis, ji pagal š į metodą kaitinama plie ­
niniame vamzdyje, užkimštame skirting ų angos skersmen ų diafrag­
momis.  
1.4.3.  Mechaninis jautrumas (sm ūgis) 
Taikant š į metodą medžiaga veikiama sm ūgio, kai nustatyto dydžio 
masė metama iš nustatyto aukš čio. 
1.4.4.  Mechaninis jautrumas (trintis)  
Taikant š į metodą kietos arba pastos pavidalo medžiagos veikiamos 
trinties tarp standartini ų paviršių nustatytomis apkrovos ir santykinio 
judėjimo sąlygomis.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nenurodyti.  
1.6. METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Terminis jautrumas (liepsnos poveikis)  
1.6.1.1.  Aparat ūra 
Aparatą sudaro vienkartinio naudojimo plieninis vamzdis su jam 
skirtu daugkartinio naudojimo uždarymo įtaisu (1 paveikslas), įsta­
tytas į kaitinimo ir apsaugin į įtaisą. Kiekvienas vamzdis yra giliojo 
tempimo plonalakš čio plieno vamzdis (žr. pried ėlį), vamzdžio vidinis 
skersmuo 24 mm, ilgis 75 mm, sieneli ų storis 0,5 mm. Atviras 
vamzdžio galas užrie čiamas, kad j į būtų galima uždaryti diafragmos 
bloku. Jį sudaro sl ėgiui atspari diafragma, kurios centre esanti anga 
yra gerai pritvirtinta prie vamzdžio dviej ų dalių sriegine jungtimi 
(veržle ir sandarikliu su sriegiu). Veržl ė ir sandariklis su sriegiu 
pagaminti iš chromo manganinio plieno (žr. pried ėlį), kuris neki ­
birkščiuoja iki 800 °C. Diafragmos yra 6 mm storio, pagamintos iš 
kaitrai atsparaus plieno (žr. pried ėlį), ir turi įvairaus skersmens angas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Bandym ų sąlygos  
Paprastai medžiaga yra bandoma tokia, kokia yra gauta, nors kai 
kuriais atvejais, pvz. jei ji yra presuota, lieta arba kitokiu b ūdu 
tankinta, prieš bandant j ą gali tekti smulkinti.  
Jei bandomos kietosios medžiagos, kiekvienam bandymui reikalingos 
medžiagos mas ė nustatoma atliekant dviej ų pakopų tuščiąjį bandymą. 
Pasvertas vamzdis pripildomas 9 cm  3 medžiagos, toliau medžiaga 
plūkiama 80 N j ėga, tenkan čia visam vamzdžio skerspj ūviui. Kad 
būtų saugu arba tais atvejais, kai bandinio fizin ė forma dėl spaudimo 
gali pasikeisti, gali b ūti taikomos kitos pripildymo metodikos; pvz., 
jei medžiaga yra labai jautri trin čiai, plūkimas netinka. Jei medžiaga 
yra spūdi, jos dedama daugiau ir ji pl ūkiama, kol vamzdis pripil ­
domas tiek, kad iki viršaus lieka 55 mm. Nustatoma bendra mas ė, 
kurios reikia pripildyti iki 55 mm lygio, ir dedamos dar dvi tokios 
dalys, kiekvien ą kartą plūkiant 80 N j ėga. Po to pl ūkiant arba išimant 
medžiagos dedama tiek, kad iki vamzdžio viršaus likt ų 15 mm. 
Atliekamas antras tuš čiasis bandymas, iš pradži ų su suplūktu kiekiu, 
kuris sudaryt ų vieną trečdalį pirmame tuš čiajame bandyme nustatytos 
masės. Įdedamos dar dvi tokios dalys pl ūkiant 80 N j ėga, po to, 
prireikus, įdedant arba išimant dal į medžiagos nustatomas jos 15 
mm lygis iki viršaus. Kietosios medžiagos kiekis, nustatytas antrame tuščiajame bandyme, naudojamas kiekvienam bandymui, pripildant 
tris kartus vienodais kiekiais, kiekvien ą suspaudžiant iki 9 cm
 3 reika­
linga tam j ėga. (Tai galima palengvinti naudojant tarpinius žiedus).  
Skysčių ir gelių dedama į vamzdį iki 60 mm aukš čio, ypating ą 
dėmesį kreipiant į gelių įkrovimą, kad būtų išvengta tuštum ų susi­
darymo. Ant vamzdžio iš apa čios užstumiamas sandariklis su sriegiu, 
įstatoma diafragma su reikiamo skersmens anga ir, šiek tiek sutepus 
molibdeno disulfido pagrindu pagamintu tepalu, užsukama veržl ė. 
Labai svarbu kontroliuoti, kad medžiagos nepatekt ų tarp jung ės ir 
diafragmos arba tarp sriegi ų. 
Kaitinama propano dujomis iš pramoninio baliono, turin čio reduk­
torių (60–70 mbar), leidžiamomis per debitmat į ir tolygiai vamzdynu 
paskirstomomis (kaip rodo degikli ų liepsnos steb ėjimas) keturiems 
degikliams. Degikliai išd ėstyti apie bandymo kamer ą, kaip parodyta 
1 paveiksle. Keturi degikliai bendrai suvartoja 3,2 litro propano per minutę. Galima deginti kitokias dujas ir naudoti kitokius degiklius, 
tačiau kaitinimo sparta turi b ūti tokia, kokia nurodyta 3 paveiksle. 
Visuose aparatuose kaitinimo sparta turi b ūti periodiškai tikrinama, 
naudojant dietilftalatu pripildytus vamzdžius, kaip parodyta 3 paveiksle.
 
1.6.1.3.  Bandym ų eiga  
Kiekvienas bandymas atliekamas tol, kol vamzdis sutr ūkinėja į dalis, 
arba jis kaitinamas penkias minutes. Vertinama, kad bandymo metu 
įvyko sprogimas, jei jis baigiasi vamzdžio sutr ūkimu į tris arba 
daugiau skeveldr ų, kurios kai kuriais atvejais gali jungtis siauromis 
metalo juostomis, kaip parodyta 2 paveiksle. Jei bandymo metu 
susidaro mažiau skeveldr ų arba jų visai nesusidaro, tuomet nelai ­
koma, kad įvyko sprogimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Iš pradži ų atliekama trij ų bandym ų serija su 6,0 mm skersmens 
diafragma, ir jei sprogim ų neįvyksta, atliekama antroji trij ų bandymų 
serija su 2 mm skersmens diafragma. Jei sprogimas įvyksta bet 
kurioje bandym ų serijoje, tolesni bandymai nereikalingi.  
1.6.1.4.  Vertinimas  
Bandymų rezultatas laikomas teigiamu, jei sprogimas įvyksta bet 
kurioje anks čiau nurodyt ų bandymų serijoje.  
1.6.2.  Mechaninis jautrumas (sm ūgis) 
1.6.2.1.  Aparat ūra (4 paveikslas)  
Pagrindin ės tipiško aparato su krintan čiu kūju dalys yra lietas plie ­
ninis blokas su pagrindu, priekalas, kolona, kreipikliai, krintantys 
svarsčiai, paleidžiantysis įtaisas ir m ėginio laikiklis. Plieninis prie ­
kalas, 100 mm (skersmuo) × 70 mm (aukštis), varžtais tvirtinamas ant plieninio bloko, 230 mm (aukštis) × 250 mm (plotis) × 200 mm (aukštis), esan čio ant lieto pagrindo 450 mm (ilgis) × 450 mm 
(plotis) × 60 mm (aukštis). Kolona, pagaminta iš besi ūlio trauktinio 
plieninio vamzdžio, tvirtinama laikiklyje, priveržtame užpakalin ėje 
plieninio bloko sienoje. Keturiais varžtais aparatas tvirtinamas prie vientiso betoninio bloko, 60 × 60 × 60 cm, tokiu b ūdu, kad krei ­
piklių strypai b ūtų vertikalūs ir krintantis svarstis krist ų laisvai. 
Naudojami 5 ir 10 kg svars čiai, pagaminti iš vientiso plieno. Vis ų 
svarsčių smogiamoji galvut ė pagaminta iš gr ūdinto plieno, HRC 
60–63, ir jos mažiausias skersmuo lygus 25 mm.
 
Bandinys dedamas į smūgiavimo įtaisą, kurį sudaro du vienas ant 
kito uždėti koaksial ūs plieniniai cilindrai, esantys tuš čiaviduriame 
cilindro formos plieniniame kreipiamajame žiede. Vientiso plieno 
cilindrai turi b ūti 10 (– 0,003, – 0,005) mm skersmens ir 10 mm 
aukščio, jų paviršius turi b ūti poliruotas, kraštai apvalinti (kreiv ės 
spindulys 0,5 mm) ir HRC 58–65 kietumo. Tuš čiavidurio cilindro 
išorinis skersmuo turi b ūti lygus 16 mm, poliruotos ištekintos angos 
skersmuo 10 (+ 0,005, + 0,010) mm ir aukštis 13 mm. Smogiamasis 
įtaisas surinktas ant tarpinio priekalo (26 mm skersmuo ir 26 mm 
aukštis), pagaminto iš plieno, ir centruotas žiedu su angomis dujoms išleisti.
 
1.6.2.2.  Bandym ų sąlygos  
Bandinio t ūris turi būti lygus 40 mm  3 , arba tūris turi atitikti bet kok į 
alternatyv ųjį aparatą. Kietos medžiagos turi b ūti išbandytos sausos ir 
ruošiamos taip:  
a) milteliai sijojami (sieto aku čių dydis 0,5 mm); bandymui naudo ­
jama visa tai, kas išbyra per siet ą; 
b) presuotos, lietos ar kitu b ūdu tankintos medžiagos smulkinamos į 
mažus gabaliukus ir sijojamos; bandymui naudojamos sijotos 
0,5–1 mm skersmens frakcijos, kurios turi sudaryti reprezenta ­
tyvią pradinės medžiagos dal į. 
Medžiagos, kurios paprastai tiekiamos pastos pavidalo, turi b ūti, jei 
tai įmanoma, bandomos išdžiovintos arba, bet kuriuo atveju, paša ­
linus kuo didesn ę dalį skiediklio. Skys čiai bandomi tarp viršutinio ir 
apatinio plieninio cilindro esant 1 mm tarpui.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  Bandym ų eiga  
Atliekama šeši ų bandymų serija, metant 10 kg mas ės svarstį iš 0,40 
m aukščio (40 J). Jei 40 J atveju šeši ų bandymų metu sprogimas 
įvyksta, turi b ūti atliekama kita 6 bandym ų serija, metant 5 kg mas ės 
svarstį iš 0,15 m aukš čio (7,5 J). Kituose aparatuose bandinys lygi ­
namas su pasirinkt ąja etalonine medžiaga, naudojant nustatyt ą meto­
diką (pvz., kėlimo-metimo metodik ą ir t. t.).  
1.6.2.4.  Vertinimas  
Bandymų rezultatas laikomas teigiamu, jei bent vieno bandymo 
metu, naudojant nurodyt ą smūgiavimo įtaisą, įvyksta sprogimas 
(liepsnos blyksniai ir (arba) garsas, prilygstantis sprogimo garsui) 
arba bandinys yra jautresnis nei 1,3-dinitrobenzenas ar heksogenas 
atliekant alternatyv ų smūgio bandym ą. 
1.6.3.  Mechaninis jautrumas (trintis)  
1.6.3.1.  Aparat ūra (5 paveikslas)  
Trinties aparat ą sudaro lieto plieno pagrindo plokšt ė, ant kurios 
montuojamas trinties įtaisas. Jį sudaro nejudantis porcelianinis kaištis 
ir judanti porcelianin ė plokštė. Porcelianin ė plokštė privirtinta prie 
vežimėlio, kuris juda dviem kreipikliais. Vežim ėlis prijungtas prie 
elektros variklio jungiamuoju strypu, ekscentriniu krumpliara čiu ir 
atitinkama pavara tokiu b ūdu, kad porcelianin ė plokštė po porcelia ­
niniu kaiš čiu pajudinama tik kart ą 10 mm į priekį ir atgal. Porcelia ­
ninį kaištį galima apkrauti, pvz., 120 arba 360 N apkrova.  
Plokščios porcelianin ės plokštės pagamintos iš balto techninio porce ­
liano (šiurkštumas nuo 9 iki 32 μm), jų matmenys: 25 mm (ilgis) × 
25 mm (plotis) × 5 mm (storis). Cilindrinis 15 mm ilgio porcelianinis 
kaištis taip pat pagamintas iš balto techninio porceliano, jo skersmuo lygus 10 mm, ir galai turi šiurkštint ą sferinį paviršių, kurio kreiv ės 
spindulys lygus 10 mm.
 
1.6.3.2.  Bandymo s ąlygos  
Bandinio t ūris turi būti lygus 10 mm  3 arba toks, kad tikt ų bet kuriam 
alternatyviam aparatui.  
Kietos medžiagos išbandomos sausos ir ruošiamos taip:  
a) milteliai sijojami (sieto aku čių dydis 0,5 mm); bandymui naudo ­
jama visa tai, kas iškrenta per siet ą; 
b) presuotos, lietos ar kitu b ūdu sutankintos medžiagos smulki ­
namos į mažus gabalus ir sijojamos; bandymuose naudojama 
sijota frakcija, kurios daleli ų skersmuo < 0,5 mm.  
Medžiagos, kurios paprastai tiekiamos pastos pavidalu, turi b ūti 
bandomos sausos, kur įmanoma. Jei sauso medžiagos pavidalo 
paruošti ne įmanoma, pasta (pašalinus kiek įmanoma didesn į kiekį 
skiediklio) bandoma šablonu pagamint ą 0,5 mm storio, 2 mm plo čio 
ir 10 mm ilgio pl ėvelę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  Bandym ų eiga  
Porcelianinis kaištis uždedamas ant bandomosios medžiagos ir 
veikiamas apkrova. Atliekant bandym ą porceliano plokšt ės akytumo 
žymės turi būti skersai jud ėjimo krypties. Kaištis turi b ūti ant 
bandinio, po kaiš čiu turi būti pakankamas kiekis bandinio medžiagos 
ir plokštė po kaiščiu turi jud ėti teisingai. Plokštel ę padengti pastos 
pavidalo medžiaga naudojamas 0,5 mm storio laikiklis, turintis 2 × 10 mm griovel į. Porcelianin ė plokštelė turi judėti po porcelianiniu 
kaiščiu 10 mm į priekį ir atgal per 0,44 sekund ės. Kiekviena plokš ­
telės ir kaiščio paviršiaus dalis turi b ūti naudojama tik vien ą kartą; 
du kiekvieno kaiš čio galai naudojami dviems bandymams ir kiek ­
vienas iš dviej ų plokštelės paviršių naudojamas trims bandymams.
 
Atliekama šeši ų bandymų serija, naudojant 360 N apkrov ą. Jei šių 
šešių bandymų metu gaunamas teigiamas rezultatas, turi b ūti atlikta 
kita šešių bandym ų serija su 120 N apkrova. Kituose aparatuose 
bandinys lyginamas su pasirinkta etalonine medžiaga, taikant nusta ­
tytą metodiką (pvz., kėlimo-metimo metodik ą ir t. t.).  
1.6.3.4.  Vertinimas  
Bandymų rezultatai laikomi teigiamais, jei kurio nors ši ų bandymų 
metu naudojant nustatyt ą trinties aparat ą įvyksta bent vienas spro ­
gimas (prilygstantis sprogimui traškesys ir (arba) sprogim ą prime­
nantis garsas arba liepsnos blyksnis) arba jei jie atitinka lygiaver čius 
kriterijus vykdant alternatyv ų trinties bandym ą. 
2. DUOMENYS  
Iš esmės medžiaga pagal ši ą direktyv ą laikoma kelianti sprogimo 
pavojų, jei terminio jautrumo, jautrumo sm ūgiui arba trin čiai 
bandymo rezultatas yra teigiamas.  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYM Ų ATASKAITA  
Bandymų ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti tokia informacija:  
— bandomosios medžiagos tapatumas, sud ėtis, grynumas, dr ėgmės 
kiekis ir t. t.,  
— bandinio fizin ė forma ir ar jis buvo smulkinamas, trupinamas ir 
(arba) sijojamas,  
— stebėjimai vykdant terminio jautrumo bandymus (pvz., bandinio 
masė, skeveldr ų skaičius ir t. t.),  
— stebėjimai vykdant mechaninio jautrumo bandymus (pvz., didelio 
dūmų kiekio susidarymas arba visiškas medžiagos irimas be 
garso, liepsnos, kibirkš čių, traškesio ir t. t.),  
— kiekvieno tipo bandym ų rezultatai,  
— jei buvo naudojamas alternatyvus aparatas, turi b ūti pateiktas 
mokslinis pagrindimas, taip pat duomenys apie koreliacij ą tarp 
rezultatų, gautų nustatytu aparatu, ir rezultat ų, gautų lygiaverčiu 
aparatu,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— visi naudingi komentarai, pvz., nuoroda į panašių medžiag ų 
bandymus, kurie galb ūt tiktų tinkamai paaiškinti rezultatus,  
— visos papildomos pastabos, kurios b ūtų svarbios aiškinant rezul ­
tatus.  
3.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS IR VERTINIMAS  
Bandymų ataskaitoje turi b ūti paminėti visi rezultatai, kurie laikomi 
klaidingais, anomaliais arba nereprezentatyviais. Jei kokius nors rezultatus reikia atmesti, turi b ūti pateiktas paaiškinimas ir vis ų alter­
natyvių arba papildom ų bandymų rezultatai. Jei anomalus rezultatas 
negali būti paaiškintas, jis turi b ūti priimtas toks, koks yra, ir turi 
būti naudojamas medžiagai atitinkamai klasifikuoti.
 
4. NUORODOS  
1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0–750–60103–5, 1990.  
3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol.3, p. 6–13 ir 30–42.  
4) NF T 20–038 (September 85). Chemical products for industrial 
use – Determination of explosion risk.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Priedėlis 
Terminio jautrumo bandyme naudojam ų medžiag ų specifikacijos pavyzdys 
(žr. DIN 1623)  
1) Vamzdis: medžiagos specifikacija Nr. 1.0336.505g  
2) Diafragma: medžiagos specifikacija Nr. 1.4873  
3) Sandariklis su sriegiu ir veržl ė: medžiagos specifikacija Nr. 1.3817  
1 paveikslas  
Terminio jautrumo bandymo aparatas  
(visi matmenys milimetrais)
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
2 paveikslas  
Terminio jautrumo bandymas  
(skeveldrų susidarymo pavyzdžiai)
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
3 paveikslas  
Kaitinimo spartos kalibravimas terminio jautrumo bandymui
  
Temperat ūros ir laiko priklausomyb ės kreivė gauta kaitinant dibutilftalat ą (27 cm  3 ) uždarame (1,5 
mm diafragma) vamzdyje, naudojant 3,2 litro per minut ę propano sraut ą. Temperat ūra matuota 1 
mm skersmens chromelio/aliumelio termoelementu, įdėtu į apvalkal ą iš nerūdijančio plieno ir įsta­
tytu vamzdžio viduryje 43 mm žemiau jo briaunos. Kaitinimo sparta 135 °C–285 °C temperat ūroje 
turi būti nuo 185 iki 215 K/minut ę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
4 paveikslas  
Jautrumo sm ūgiui bandymo aparatas  
(visi matmenys milimetrais)
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
4 paveikslo  
tęsinys
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
5 paveikslas  
Jautrumo trin čiai bandymo aparatas
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.14.  SKYS ČIŲ IR DUJ Ų SAVAIMINIO UŽSILIEPSNOJIMO 
TEMPERAT ŪRA 
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šiuo bandymu neturi b ūti tiriamos sprogstamosios medžiagos ir 
medžiagos, kurios užsidega s ąlytyje su oru esant kambario tempera ­
tūrai. Bandymo metodika taikytina dujoms, skys čiams ir garams, 
kurie ore gali užsidegti susiliet ę su karštu paviršiumi.  
Savaiminio užsiliepsnojimo temperat ūra gali žymiai sumaž ėti, jei yra 
katalizatoriaus savybi ų turinčių priemaiš ų, dėl paviršiaus medžiag ų 
savybių arba dėl didesnio bandymui naudojamo indo t ūrio. 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Savaiminio užsiliepsnojimo laipsnis apib ūdinamas savaiminio užsi ­
liepsnojimo temperat ūra. Savaiminio užsiliepsnojimo temperat ūra yra 
mažiausia temperat ūra, kurioje bandomoji medžiaga užsiliepsnoja, 
sumaišyta su oru esant bandymo metode apibr ėžtoms sąlygoms.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Etaloninės medžiagos nurodytos standartuose (žr. 1.6.3). Jos turi b ūti 
visų pirma naudojamos tikrinti metodo veikim ą ir lyginti rezultatus, 
gautus taikant kitus metodus.  
1.4. METODO PRINCIPAS  
Taikant š į metodą nustatoma mažiausia gaubto vidinio paviršiaus 
temperatūra, kurioje savaime užsiliepsnoja po gaubtu įpurkštos 
dujos, garai arba skystis.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Pakartojamumas kinta atsižvelgiant į savaiminio užsiliepsnojimo 
temperatūros interval ą ir taikytą metodą. 
Jautrumas ir specifiškumas priklauso nuo taikyto bandymo metodo.  
1.6. METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Aparat ūra 
Aparatas aprašytas 1.6.3 nurodytame metode.  
1.6.2.  Bandymo s ąlygos  
Tiriamosios medžiagos bandinys yra tiriamas pagal 1.6.3 nurodyt ą 
metodą. 
1.6.3.  Bandymo eiga  
Žr. IEC 79–4, DIN 51794, ASTM-E 659–78, BS 4056, NF T 
20–037.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. DUOMENYS  
Užrašykite bandym ų temperat ūrą, atmosferos sl ėgį, naudotą bandinio 
kiekį ir bandinio savaiminio užsiliepsnojimo v ėlinimosi trukm ę. 
3. ATASKAITA  
Jei įmanoma, bandym ų ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
— tiksli medžiagos specifikacija (tapatumas ir priemaišos),  
— naudotas bandinio kiekis, atmosferos sl ėgis, 
— naudota aparat ūra, 
— matavim ų rezultatai (bandym ų temperat ūra, su savaiminiu užsi ­
liepsnojimu susij ę rezultatai, atitinkam ų vėlinimųsi trukmė), 
— visos papildomos pastabos, kurios b ūtų svarbios aiškinant rezul ­
tatus.  
4. NUORODOS  
Nėra. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.15.  KIET ŲJŲ MEDŽIAG Ų SANTYKIN Ė SAVAIMINIO 
UŽSILIEPSNOJIMO TEMPERAT ŪRA 
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šiuo bandymu neturi b ūti tiriamos sprogiosios medžiagos ir 
medžiagos, kurios s ąlytyje su oru savaime užsiliepsnoja kambario 
temperatūroje. 
Šio bandymo tikslas – gauti išankstin ę informacij ą apie kiet ųjų 
medžiagų savaimin į užsiliepsnojim ą aukštesn ėje temperat ūroje. 
Jei medžiagos reakcijos su deguonimi arba egzoterminio jos skilimo 
metu susidariusi šiluma aplinkoje išsisklaido nepakankamai greitai, dėl savaiminio įkaitimo įvyksta savaiminis užsiliepsnojimas. Taigi 
savaiminis užsiliepsnojimas įvyksta, kai šilumos susidarymo greitis 
yra didesnis nei jos netekimo greitis.
 
Bandymo metodika yra naudinga kaip išankstinis kiet ųjų medžiag ų 
atrankos bandymas. Atsižvelgiant į sudėtingą kietųjų medžiag ų užsi­
degimo ir degimo prigimt į, šiuo metodu nustatyta savaiminio užsi ­
liepsnojimo temperat ūra turi būti taikoma tik palyginimui.  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Pagal šį metodą nustatyta savaiminio užsiliepsnojimo temperat ūra 
yra mažiausia aplinkos temperat ūra, išreikšta °C, kurioje tam tikras 
medžiagos kiekis užsidega apibr ėžtomis sąlygomis.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nenurodytos.  
1.4. METODO PRINCIPAS  
Tam tikras bandomosios medžiagos kiekis kambario temperat ūroje 
dedamas į krosnį; užrašoma bandinio viduje matuojamos tempera ­
tūros kitimo laike kreiv ė, krosnies temperat ūrą 0,5 °C/min sparta 
didinant iki 400 °C arba iki lydymosi temperat ūros, jei ji žemesn ė. 
Šiame bandyme krosnies temperat ūra, kurioje bandinio temperat ūra 
pasiekia 400 °C d ėl savaiminio įkaitimo, vadinama savaiminio užsi ­
liepsnojimo temperat ūra. 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Aparat ūra 
1.6.1.1.  Krosnis  
Laboratorin ė krosnis (t ūris apie 2 litrus), su programuojamu tempe ­
ratūros reguliavimu ir savaimine oro cirkuliacija bei sprogimo sl ėgio 
mažinimo vožtuvu. Siekiant išvengti galimo sprogimo pavojaus, bet 
kokios skilimo metu susidaran čios dujos turi nepatekti ant elektrini ų 
kaitinimo element ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Kubas iš vielos tinklelio  
Iš nerūdijančio plieno pagamintas vielos tinklelis su 0,045 mm 
akutėmis turi b ūti supjaustytas pagal 1 paveiksle pateikt ą pavyzdį. 
Tinklelis turi b ūti sulankstytas kubu su atviru viršumi ir sutvirtintas 
viela.  
1.6.1.3.  Termoelementai  
Tinkami termoelementai.  
1.6.1.4.  Savirašis  
Bet koks dviej ų kanalų savirašis, kalibruotas nuo 0 °C iki 600 °C 
arba pagal atitinkam ą įtampą. 
1.6.2.  Bandymo s ąlygos  
Medžiagos bandomos tokios, kokios yra gaunamos.  
1.6.3.  Bandymo eiga  
Kubas užpildomas bandom ąja medžiaga ir, švelniai tapšnojant, jos 
dedama vis daugiau, kol kubas visiškai prisipildo. Toliau kubas kambario temperat ūroje pakabinamas krosnies viduryje. Vienas 
termoelementas patalpinamas kubo viduje, o temperat ūrai krosnyje 
registruoti kitas termoelementas dedamas tarp kubo ir krosnies sienos.
 
Krosnies ir bandinio temperat ūra nuolat užrašoma, krosnies tempe ­
ratūrą 0,5 °C/min sparta didinant iki 400 °C arba iki lydymosi 
temperatūros, jei ji yra žemesn ė. 
Kai medžiaga užsiliepsnoja, bandinio viduje esantis termoelementas 
rodys labai staig ų temperat ūros didėjimą lyginant su krosnies tempe ­
ratūra. 
2. DUOMENYS  
Norint vertinti, svarbu žinoti krosnies temperat ūrą, kurioje bandinio 
temperatūra dėl jo savaiminio įkaitimo pasiekia 400 °C (žr. 2 
paveikslą). 
3. ATASKAITA  
Jei įmanoma, ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
— tiriamosios medžiagos apib ūdinimas,  
— matavimo rezultatai, įskaitant temperat ūros kitimo laike kreiv ę, 
— visos papildomos pastabos, kurios b ūtų svarbios aiškinant rezul ­
tatus.  
4. NUORODOS  
NF T 20–036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
1 paveikslas  
20 mm bandymo kubo pavyzdys
  
2 paveikslas  
Tipinė temperat ūros kitimo laike kreiv ė
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.16.  OKSIDACIN ĖS SAVYB ĖS (KIETOSIOS MEDŽIAGOS)  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Prieš atliekant š į bandymą naudinga tur ėti išankstin ę informacij ą apie 
bet kurias medžiagos potencialias sprogumo savybes.  
Šis bandymas netaikomas skys čiams, dujoms, sprogstamosioms arba 
labai degioms medžiagoms arba organiniams peroksidams.  
Šio bandymo atlikti nereikia, jei strukt ūrinės formulės analizė leidžia 
pagrįstai neabejoti, kad medžiaga negali egzotermiškai reaguoti su 
degiąja medžiaga.  
Norint išsiaiškinti, ar bandymas turi b ūti atliekamas taikant ypatingas 
saugumo priemones, turi b ūti daromas išankstinis bandymas.  
1.2. APIBR ĖŽTIS IR VIENETAI  
Degimo trukm ė: reakcijos laikas, kur į reakcijos zona sklinda palei 
krūvelę, bandym ą atliekant pagal 1.6 aprašyt ą metodiką. 
Degimo greitis: išreikštas milimetrais per sekund ę. 
Didžiausias degimo greitis: degimo grei čio didžiausia vert ė, gauta 
deginant mišinius, kuriuose oksidatorius sudaro nuo 10 % iki 90 % 
mišinio mas ės. 
1.3. ETALONIN Ė MEDŽIAGA  
Bandyme ir išankstiniame bandyme kaip etalonin ė medžiaga naudo ­
jamas bario nitratas (analiziškai grynas).  
Etaloninis mišinys yra toks bario nitrato ir celiulioz ės miltelių 
mišinys, paruoštas pagal 1.6, kurio degimo greitis yra didžiausias 
(paprastai tai mišinys, kuriame bario nitrato yra 60 % mas ės). 
1.4. METODO PRINCIPAS  
Išankstinis bandymas atliekamas saugos tikslais. Toliau bandyti 
nereikia, jei išankstiniu bandymu nustatoma, kad bandomoji medžiaga turi oksidacini ų savybių. Jei taip n ėra, su medžiaga turi 
būti atliktas visas bandymas.
 
Atliekant vis ą bandymą, bandomoji medžiaga ir atitinkama degioji 
medžiaga maišomos įvairiais santykiais. Iš kiekvieno mišinio paruo ­ 
šiama krūvelė, kuri viename gale padegama. Nustatytas didžiausias 
degimo greitis lyginamas su etaloninio mišinio didžiausiu degimo 
greičiu. 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Jei reikia, tinka bet kuris malimo ir maišymo b ūdas su sąlyga, kad 
šešių atskirų bandym ų didžiausio degimo greitis nuo aritmetinio 
vidurkio vert ės skiriasi ne daugiau kaip 10 %.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Paruošimas  
1.6.1.1.  Bandomoji medžiaga  
Bandinį smulkinkite, kad daleli ų dydis būtų < 0,125 mm pagal toki ą 
metodiką: bandom ąją medžiag ą sijokite, likusi ąją dalį malkite ir v ėl 
sijokite, kol per siet ą išsijojamas visas bandinys.  
Galima taikyti bet kok į malimo ir sijojimo b ūdą, kuris atitikt ų 
kokybės kriterijus.  
Prieš ruošiant mišin į medžiaga išdžiovinama 105 °C temperat ūroje 
iki pastoviosios mas ės. Jei bandomosios medžiagos skilimo tempe ­
ratūra yra mažesn ė kaip 105 °C, medžiaga turi b ūti išdžiovinta atitin ­
kamoje mažesn ėje temperat ūroje. 
1.6.1.2.  Degioji medžiaga  
Degioji medžiaga yra celiulioz ės milteliai. Celiulioz ės rūšis turi 
atitikti plonasluoksn ėje chromatografijoje arba kolon ėlinėje chroma ­
tografijoje naudojam ą celiulioz ę. Nustatyta, kad bandymui tinkama 
celiuliozės rūšis, kurios daugiau kaip 85 % plaušeli ų ilgis yra nuo 
0,020 iki 0,075 mm. Celiulioz ės milteliai sijojami per siet ą, kurio 
akučių dydis 0,125 mm. Vis ą bandymą turi būti naudojama celiu ­
liozė iš tos pa čios partijos.  
Prieš ruošiant mišin į celiulioz ės milteliai džiovinami 105 °C tempe ­
ratūroje iki pastoviosios mas ės. 
Jei išankstiniam bandymui naudojami medienos miltai, ruošiami 
spygliuočių medienos miltai, surinkus t ą dalį, kuri nusisijoja per 
1,6 mm dydžio aku čių sietą, ji gerai sumaišoma, po to ne didesnis 
kaip 25 mm storio sluoksnis keturias valandas džiovinamas 105 °C 
temperatūroje. Atšaldoma ir laikoma sandariame inde, j į pripildžius 
kuo pilniau iki naudojimo, sunaudoti geriausiai per 24 valandas po džiovinimo.
 
1.6.1.3.  Padegimo šaltinis  
Padegimo šaltinis turi b ūti karšta duj ų degiklio (mažiausias skersmuo 
5 mm) liepsna. Jei naudojamas kitas uždegimo šaltinis (pvz., bandant inertinių dujų atmosferoje), b ūtina pateikti aprašym ą ir naudojimo 
pagrindim ą.
 
1.6.2.  Bandymo eiga  
Pastaba  
Oksidatori ų mišiniai su celiulioze arba medienos miltais turi b ūti 
laikomi potencialiai sprogiais mišiniais ir su jais turi b ūti elgiamasi 
kiek galima atsargiau.  
1.6.2.1.  Išankstinis bandymas  
Išdžiovinta medžiaga gerai sumaišoma su išdžiovinta celiulioze arba 
medienos miltais, imant 2 mas ės dalis bandomosios medžiagos ir 1 
masės dalį celiulioz ės arba medienos milt ų ir mišinys, pripildant be 
plūkimo kūgio formos šablon ą (pvz., laboratorin į stiklinį piltuvą, 
užkimšus jo kojel ę), formuojamas į kūgio formos kr ūvelę, kurios 
matmenys 3,5 cm (pagrindo skersmuo) × 2,5 cm (aukštis).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Krūvelė dedama ant šaltos nedegios, neakytos ir blogai šilum ą pralei­
džiančios pagrindo plokšt ės. Bandymas turi b ūti atliktas traukos spin ­
toje, kaip aprašyta 1.6.2.2.  
Padegimo šaltiniu prisilie čiama prie k ūgio. Stebimas ir užrašomas 
vykstančios reakcijos intensyvumas ir trukm ė. 
Jei reakcija vyksta intensyviai, medžiaga turi b ūti laikoma oksiduo ­
jančia. 
Kiekvienu atveju, jei kyla abejoni ų, būtina atlikti toliau aprašyt ą 
bandinių eilės bandym ą. 
1.6.2.2.  Bandini ų eilės bandymas  
Paruoškite oksidatoriaus ir celiulioz ės mišinius, kuriuose oksidato ­
riaus kiekis kinta kas 10 % nuo 10 % iki 90 % mas ės. Norint degimo 
greičio didžiausi ą vertę gauti tiksliau, kraštiniams atvejams turi b ūti 
naudojami tarpin ės sudėties oksidatoriaus ir celiulioz ės mišiniai.  
Krūvelei paruošti naudojama forma. Iš metalo pagaminta forma yra 
250 mm ilgio, o jos skerspj ūvis yra trikampis, kurio vidinis aukštis 
10 mm ir vidinis ilgis 20 mm. Abejose formos pus ėse išilgine kryp ­
timi tvirtinamos dvi šonin ės metalin ės plokštės, kurios yra 2 mm 
aukštesnės nei viršutinis trikampio skerspj ūvio kraštas (žr. 
paveikslą). Šis įtaisas pripildomas mišinio, jo neplakant ir įpilant 
nedidelį perteklių. Forma vien ą kartą numetama iš 2 cm aukš čio 
ant kieto paviršiaus, o medžiagos perteklius nubraukiamas įstrižai 
pasukta plokštele. Šonin ės plokštės nuimamos ir lik ę milteliai lygi ­
nami velen ėliu. Po to, ant formos viršaus uždedama nedegi, neakyta 
ir blogai šilum ą praleidžianti pagrindo plokšt ė, įtaisas apver čiamas ir 
forma nuimama.  
Krūvelė dedama į traukos spint ą skersai traukos kryp čiai. 
Oro greitis turi b ūti pakankamas, kad d ūmai negal ėtų patekti į labo­
ratoriją, ir bandymo metu turi nesikeisti. Apie įtaisą turi būti įtaisytas 
nuo skersv ėjų saugantis ekranas.  
Kadangi celiulioz ė ir kai kurios bandomosios medžiagos yra higro ­
skopiškos, bandymas turi b ūti atliekamas kiek įmanoma grei čiau. 
Vieną krūvelės galą padekite, prikiš ę prie jo liepsn ą. 
Po to, kai reakcijos zona įveikia pradin į 30 mm atstum ą, matuokite 
reakcijos trukm ę 200 mm atstumu.  
Bandymas atliekamas su etalonine medžiaga ir bent vien ą kartą su 
kiekvienu iš bandomosios medžiagos mišini ų su celiulioze.  
Jei nustatoma, kad didžiausias degimo greitis yra žymiai didesnis nei 
etaloninio mišinio didžiausias degimo greitis, bandymas gali b ūti 
nutrauktas; priešingu atveju bandymas turi b ūti pakartotas penkis 
kartus su kiekvienu iš trij ų mišinių, kuriems gautas didžiausias 
degimo greitis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Jei kyla įtarimas, kad rezultatas yra klaidingai teigiamas, bandymas 
turi būti pakartotas vietoje celiulioz ės naudojant inertišk ą medžiag ą, 
kurios daleli ų dydis būtų panašus, pvz., diatomit ą. Be to, bandomo ­
sios medžiagos ir celiulioz ės mišinys, kurio degimo greitis yra 
didžiausias, turi b ūti pakartotinai išbandytas inertiškoje atmosferoje 
(deguonies < 2 % pagal t ūrį). 
2. DUOMENYS  
Saugos tikslais turi b ūti laikoma, kad didžiausias degimo greitis, o ne 
jo vidutin ė vertė yra bandomosios medžiagos oksidacines savybes 
apibūdinantis parametras.  
Vertinant imama didžiausia degimo grei čio vertė, gauta atlikus šešis 
atitinkamo mišinio bandymus.  
Nubrėžkite kiekvieno mišinio didžiausiojo degimo grei čio priklauso ­
mybės nuo oksidatoriaus koncentracijos kreiv ę. Iš kreivės nustatykite 
didžiausiąją degimo grei čio vertę. 
Šešios išmatuotos degimo grei čio vertės, gautos atliekant bandymus 
su mišiniu, kuriam nustatytas didžiausias degimo greitis, turi nesis ­
kirti nuo aritmetinio vidurkio vert ės daugiau kaip 10 %; kitu atveju 
turi būti patobulinti malimo ir maišymo metodai.  
Gautą didžiausi ąjį degimo greit į palyginkite su etaloninio mišinio 
didžiausiuoju degimo grei čiu (žr. 1.3).  
Jei bandymai atliekami inertiškoje atmosferoje, didžiausias reakcijos 
greitis lyginamas su etaloninio mišinio degimo inertiškoje atmosfe ­
roje didžiausiu grei čiu. 
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYM Ų ATASKAITA  
Jei įmanoma, bandym ų ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
— bandomosios medžiagos tapatumas, sud ėtis, grynumas, dr ėgmės 
kiekis ir t. t.,  
— kiekvienas bandinio apdorojimo b ūdas (pvz., malimas, džiovi ­
nimas),  
— bandymuose naudotas uždegimo šaltinis,  
— matavim ų rezultatai,  
— reakcijos pob ūdis (pvz., degimas pli ūpsniais paviršiuje, degimas 
visoje bandinio mas ėje, visa informacija apie degimo produktus 
ir t. t.),  
— visos papildomos pastabos, kurios b ūtų svarbios aiškinant rezul ­
tatus, įskaitant degimo intensyvumo aprašym ą (liepsnojimas, 
kibirkščiavimas, r ūkimas, lėtas rusenimas ir t. t.) ir apytikr ę 
degimo trukm ę, nustatyt ą išankstiniame saugos (atrankos) 
bandyme bandomajai ir etaloninei medžiagoms,  
— bandym ų su inertiška medžiaga rezultatai, jei yra,  
— bandym ų inertiškoje atmosferoje rezultatai, jei yra.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Laikoma, kad medžiaga yra oksiduojanti, jei:  
a) išankstinio bandymo reakcija vyksta intensyviai,  
b) atliekant išsam ų bandymą bandomųjų mišinių degimo greitis yra 
didesnis arba lygus celiulioz ės ir bario nitrato etaloninio mišinio 
didžiausiajam degimo grei čiui. 
Norint išvengti klaidingai teigiam ų rezultatų, juos aiškinant turi b ūti 
atsižvelgta į rezultatus, gautus atliekant medžiagos mišini ų su iner­
tiška medžiaga bandymus ir (arba) inertiškoje atmosferoje atlikt ų 
bandymų rezultatus.  
4. NUORODOS  
NF T 20–035 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Priedėlis 
Paveikslas  
Bandiniui ruošti naudojama forma ir priedai  
(visi matmenys milimetrais)
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.17.  POLIMER Ų SKAITIN ĖS VIDUTIN ĖS MOLEKULIN ĖS MASĖS 
IR MOLEKULIN ĖS MASĖS PASISKIRSTYMAS  
1. METODAS  
Šis gelchromatografijos (Gel Permeation Chromatographic) metodas 
yra OECD TG 118 (1996) kopija. Pagrindiniai principai ir papildoma 
techninė informacija pateikta 1 nuorodoje.  
1.1. ĮVADAS  
Kadangi polimer ų savybės yra labai skirtingos, ne įmanoma aprašyti 
vieną atskirą metodą tiksliai nustatant į atskyrimo ir vertinimo 
sąlygas, kurios apimt ų visas galimybes ir specifinius atvejus, pasitai ­
kančius atskiriant polimerus. Ypa č sudėtingas polimer ų sistemas 
dažnai ne įmanoma paruošti gelchromatografijai (GPC). Kai GPC 
nenaudotina, molekulin ę masę galima nustatyti kit ų metodų pagalba 
(žr. papildym ą). Tokiais atvejais turi b ūti pateiktos visos taikyto 
metodo detal ės ir pagrindimas.  
Aprašytas metodas paruoštas DIN 55672 standarto (1) pagrindu. 
Visa detali informacija apie tai, kaip atlikti bandymus ir kaip vertinti 
duomenis, galima rasti šiame DIN standarte. Tuo atveju, kai b ūtina 
keisti bandymo s ąlygas, šie keitimai turi b ūti pagrįsti. Galima taikyti 
kitus standartus, jei jie yra visiškai aprašyti. Aprašytame metode 
kalibravimui naudojami žinomo polidispersiškumo polistireno bandi ­
niai ir metod ą gali tekti keisti, pritaikant kai kuriems polimerams, 
pvz., vandenyje tirpiems ir ilgos šakotos grandin ės polimerams.  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Skaitinė vidutinė molekulin ė masė M n ir masinė vidutinė molekulin ė 
masė M w nustatomos taikant tokias lygtis: 
M n ¼ X  n 
i¼1 H i 
X  n 
i¼1 H i=M i M w ¼ X  n 
i¼1 H i Ü M  i 
X  n 
i¼1 H i 
čia: 
H i yra nuo pagrindo linijos išmatuotas detektoriaus signalo lygis 
sulaikymo t ūriui V  i , 
M i sulaikymo t ūrį V i atitinkančios polimero frakcijos molekulin ė 
masė ir 
n yra duomen ų taškų skaičius. 
Molekulin ės masės skirstinio plot į, kuris yra sistemos dispersiškumo 
matas, nustato santykis M  w /M n . ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Kadangi GPC yra santykinis metodas, turi b ūti atliekamas kalibra ­
vimas. Paprastai šiam tikslui naudojami siaurame intervale pasiskirst ę 
linijinės sandaros polistireno etalonai, kuri ų vidutinės molekulin ės 
masės M  n ir M  w ir molekulin ės masės pasiskirstymas yra žinomi. 
Kalibravimo kreiv ę nežinomo bandinio molekulinei masei nustatyti 
galima naudoti tik tuomet, jei bandiniui ir etalonams atskirti naudotos s ąlygos buvo parinktos identišku b ūdu.
 
Nustatyta priklausomyb ė tarp molekulin ės masės ir eliuavimo t ūrio 
galioja tik konkretaus bandymo specifin ėmis sąlygomis. Svarbiausios 
sąlygos yra temperat ūra, tirpiklis (arba tirpikli ų mišinys), chromato ­
grafavimo s ąlygos ir atskyrimo kolon ėlė arba kolon ėlių sistema.  
Taip nustatytos bandinio molekulin ės masės yra santykin ės vertės ir 
vadinamos „molekulin ėmis masėmis pagal polistiren ą“. Tai reiškia, 
kad dėl sandaros ir chemini ų skirtumų tarp bandinio ir etalon ų mole­
kulinės masės nuo absoliu čiųjų verčių gali skirtis didesniu arba 
mažesniu laipsniu. Jei naudojami kiti etalonai, pvz., polietilengli ­
kolis, polioksietilenas, polimetilmetakrilatas, poliakrilo r ūgštis, turi 
būti nurodyta priežastis.  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandinio molekulin ės masės skirstinys ir vidutin ės molekulin ės 
masės (M  n , M  w ) gali būti nustatyti taikant GPC. GPC yra specialus 
skysčių chromatografijos metodas, kuriame bandinys atskiriamas 
pagal atskir ų komponent ų hidrodinaminius t ūrius (2).  
Atskyrimas vyksta, kai bandinys praeina per kolon ėlę, užpildyt ą 
poringa medžiaga, dažniausiai organiniu geliu. Mažos molekul ės 
gali įsiskverbti į poras, tuo tarpu didel ės molekul ės ekskliuduojamos. 
Todėl didelių molekuli ų kelias yra trumpesnis ir jos išplaunamos 
pirmos. Vidutinio dydžio molekul ės įsiskverbia į kai kurias poras 
ir išplaunamos v ėliau. Mažiausios molekul ės, kurių vidutinis hidro ­
dinaminis spindulys yra mažesnis nei gelio poros, gali įsiskverbti į 
visas poras. Šios molekul ės išplaunamos paskutin ės. 
Teoriškai atskyrim ą apsprendžia vien tik molekuli ų dydis, ta čiau 
praktikoje sunku išvengti kai kuri ų trukdančių sugerties veiksni ų. 
Netolygus kolon ėlės užpildymas ir nenaudingi t ūriai gali bloginti 
padėtį (2). 
Aptikimas atliekamas, pvz., matuojant l ūžio rodikl į arba UV-sugert į, 
taip gaunama paprasta pasiskirstymo kreiv ė. Tačiau norint kreivei 
priskirti tikr ąsias molekulin ės masės vertes, kolon ėlę reikia kali ­
bruoti, leidžiant per j ą žinomos molekulin ės masės polimerus, geriau ­
siai - panašios sandaros polimerus, pvz., įvairius polistireno etalonus. 
Vertikaliojoje ašyje žymint įvairios molekulin ės masės išplaut ų 
dalelių kiekį, kuris reiškiamas mase, o horizontaliojoje ašyje – mole ­
kulinės masės logaritm ą, dažniausiai gaunama Gauso kreiv ė, kartais 
su iškreipta nedidele uodega mažos molekulin ės masės pusėje. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. KOKYB ĖS KERITERIJAI  
Eliuavimo t ūrio pakartojamumas (variacijos koeficientas) turi b ūti 
geresnis nei 0,3 %. Jei vertinant skirtingu laiku daryt ą chromato ­
gramą, ji neatitinka tik k ą minėto kriterijaus, reikiamas analiz ės 
pakartojamumas turi b ūti užtikrintas atliekant patais ą vidiniu etalonu 
(1). Polidispersiškumas priklauso nuo etalon ų molekulin ės masės. 
Polistireno etalon ų atveju tipiškos vert ės yra tokios: 
M p < 2 000  M  w /M n < 1,20  
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05  
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p yra etalono molekulin ė masė, atitinkanti smail ės viršūnę) 
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Etalonini ų polistireno tirpal ų ruošimas  
Polistireno etalonai ištirpinami juos kruopš čiai sumaišant su pasi ­
rinktu eliuentu. Ruošiant tirpalus turi b ūti atsižvelgta į gamintojo 
rekomendacijas.  
Pasirinktų etalonų koncentracijos priklauso nuo įvairių veiksnių, 
pvz., injekcijos t ūrio, tirpalo klampumo ir analizinio detektoriaus 
jautrumo. Norint išvengti perkrovos, didžiausias injekcijos t ūris turi 
būti pritaikytas kolon ėlės ilgiui. Taikant GPC medžiag ų atskyrimui 
analizėje, tipiški injekcijos t ūriai 30 cm × 7,8 mm kolon ėlei paprastai 
yra 40–100 μ1. Galima naudoti didesn į tūrį, tačiau jis neturi viršyti 
250 μ1. Prieš pradedant tikr ąjį kolonėlės kalibravim ą, turi būti nusta­
tytas optimalus santykis tarp injekcijos t ūrio ir koncentracijos.  
1.6.2.  Bandinio tirpalo ruošimas  
Iš esmės tie patys reikalavimai taikomi ruošiant bandini ų tirpalus. 
Bandinys ištirpinamas tinkamame tirpiklyje, pvz., tetrahidrofurane, 
kruopščiai maišant. Jokiu b ūdu negalima tirpinti naudojant ultragar ­
sinę vonią. Jei būtina, bandinio tirpalas gryninamas, filtruojant per 
membranin į filtrą, kurio por ų dydis 0,2–2 μm. 
Galutinėje ataskaitoje turi b ūti pažymėta, ar buvo neištirpusi ų dalelių, 
nes tai gali b ūti didelės molekulin ės masės medžiag ų dalelės. Ištir­
pusių dalelių procentinei mas ės daliai nustatyti turi b ūti taikomas 
tinkamas metodas. Tirpalai turi b ūti panaudoti per 24 valandas.  
1.6.3.  Aparat ūra 
— rezervuaras tirpikliui,  
— dujų pašalinimo įtaisas (jei reikia),  
— siurblys,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— pulsacij ų slopintuvas (jei reikia),  
— injekcijos sistema,  
— chromatografin ės kolonėlės, 
— detektorius,  
— debitmatis (jei reikia),  
— duomen ų rašiklis-procesorius,  
— atliekų indas.  
Turi būti užtikrinta, kad GPC sistema b ūtų inertiška naudojamiems 
tirpikliams (pvz., naudoti plieninius kapiliarus, jei tirpiklis tertrahi ­
drofuranas).  
1.6.4.  Įšvirkštimas ir tirpiklio tiekimo sistema  
Tam tikras bandinio tirpalo t ūris griežtai nustatytoje zonoje įlei­
džiamas į kolonėlę, naudojant automatin į bandinio tiektuv ą arba 
rankiniu b ūdu. Švirkšto st ūmoklio per greitas ištraukimas arba spau ­
dimas įleidžiant rankiniu b ūdu gali b ūti molekulini ų masių stebimo 
pasiskirstymo poky čių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo 
sistema turi b ūti be pulsacij ų, geriausiu atveju jai reikia pulsacij ų 
slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.  
1.6.5.  Kolon ėlė 
Atsižvelgiant į bandinį, polimeras tiriamas naudojant vien ą paprastą 
kolonėlę arba kelias nuosekliai sujungtas kolon ėles. Prekyboje yra 
keletas kolon ėlėms užpildyti naudojam ų poringų medžiag ų su 
apibrėžtomis savyb ėmis (pvz., por ų dydžiu, ekskliudavimo ribomis). 
Atskyrimui naudojamo gelio arba kolon ėlės aukščio pasirinkimas 
priklauso ir nuo bandinio savybi ų (hidrodinamini ų tūrių, molekulin ės 
masės pasiskirstymo) ir nuo specifini ų atskyrimo s ąlygų, pvz., 
tirpiklio, temperat ūros ir srauto (1) (2) (3).  
1.6.6.  Teorin ės lėkštelės 
Atskyrimui naudojama kolon ėlė arba kolon ėlių sistema turi b ūti 
apibūdinta teorini ų lėkštelių skaičiumi. Tetrahidrofurano kaip 
eliuento atveju reikia į žinomo ilgio kolon ėlę įleisti etilbenzeno 
arba kito tinkamo nepolinio tirpiklio tirpal ą. Teorinių lėkštelių skai­ 
čius apskai čiuojamas pagal toki ą lygtį: 
N ¼ 5,54 Í ðV e Þ 
ðW 1=2 Þ Î 2 
arba N ¼ 16 Í ðV e Þ 
ðWÞ Î 2 
kurioje:  
N = teorini ų lėkštelių skaičius 
V e = smailės viršūnę atitinkantis eliuavimo t ūris ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = smail ės plotis pagrindo linijoje  
W 1/2 = smailės plotis per smail ės aukščio vidurį 
1.6.7.  Atskyrimo efektyvumas  
Be teorini ų lėkštelių skaičiaus, kuris apsprendžia juostos plot į, tam 
tikrą vaidmen į vaidina atskyrimo efektyvumas, kur į apibūdina kali­
bracinės kreivės statumas. Kolon ėlės atskyrimo efektyvumas nusta ­
tomas pagal toki ą priklausomyb ę: 
Í ððV e,M  x Þ – ðV e,ð10M  x Þ ÞÞ 
kolonėlės skerspjūvio plotas Î 
≥ 6,0 " 
ðcm 3 Þ 
ðcm 2 Þ # 
kurioje:  
V e,Mx = polistireno, turin čio molekulin ę masę M  x , eliua­
vimo tūris, 
V e , (10Mx) = polistireno, turin čio 10 kart ų didesnę molekulin ę 
masę, eliuavimo t ūris. 
Sistemos atskiriamoji galia dažniausiai apibr ėžiama taip:  
R 1,2 ¼ 2 Ü Í ðV e1 – V  e2 Þ 
ðW 1 þ W  2 Þ Î 
Ü Í ð1Þ 
ðlog 10 ðM 2=M 1 ÞÞ Î 
čia: 
V e1 , V e2 = dviejų polistireno etalon ų eliuavimo t ūriai, atitinkantys 
smailės viršūnę, 
W 1 , W  2 = smailių pločiai pagrindo linijoje,  
M 1 , M  2 = molekulin ės masės, atitinkan čios smaili ų viršūnes (turi 
skirtis 10 kart ų). 
Kolonėlės sistemai R vert ė turi būti didesnė kaip 1,7 (4).  
1.6.8.  Tirpikliai  
Visi tirpikliai turi b ūti labai gryni (tetrahidrofurano grynumas 
99,5 %). Tirpiklio indas (jei reikia, su inertini ų dujų atmosfera) turi 
būti pakankamai didelis kolon ėlei kalibruoti ir keli ų bandinių analizei 
atlikti. Prieš tirpikl į tiekiant siurbliu į kolonėlę iš jo turi b ūti paša­
lintos dujos.  
1.6.9.  Temperat ūros reguliavimas  
Svarbių vidinių komponent ų (injekcijos kilpos, kolon ėlių, detekto­
riaus ir vamzdži ų) temperat ūra turi būti pastovi ir atitikti pasirinkt ą 
tirpiklį. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detektorius  
Detektoriaus paskirtis – kiekybiškai registruoti iš kolon ėlės išplauto 
bandinio koncentracij ą. Norint, kad smail ės nebūtų labai pla čios, 
detektoriaus kiuvet ės tūris turi b ūti kuo mažesnis. Jis neturi b ūti 
didesnis kaip 10 μl, išskyrus šviesos sklaidos ir klampumo detekto ­
rius. Detektavimui paprastai naudojama diferencin ė refraktometrija. 
Tačiau, jei to reikalauja bandinio specifin ės savybės arba eliuavimo 
tirpiklis, gali b ūti naudojami kit ų tipų detektoriai, pvz., UV/VIS, IR, 
klampumo detektoriai ir t. t.  
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
2.1. DUOMENYS  
Išsamių vertinimo kriterij ų, taip pat duomen ų kaupimui ir apdoro ­
jimui keliam ų reikalavim ų reikia ieškoti DIN standarte (1).  
Kiekvienam bandiniui turi b ūti atlikti du nepriklausomi bandymai. 
Bandiniai turi b ūti analizuojami atskirai.  
Kiekvieną kartą matuojant reikia gauti M  n , M  w , M  w /M n ir M  p vertes. 
Būtina aiškiai nurodyti, kad išmatuotos vert ės yra santykin ės vertės, 
atitinkančios naudojam ų etalonų molekulin ę masę. Po sulaikymo 
tūrio arba sulaikymo trukm ės verčių (galbūt pataisyt ų naudojant 
vidinį etaloną) nustatymo vienam ši ų dydžių atidedamos log M  p 
vertės (M  p yra kalibravimo etalono smail ės viršūnę atitinkanti 
vertė). Kiekvienai molekulin ės masės dešimtainei skil čiai būtina 
turėti bent du kalibravimo taškus, o visai kalibracinei kreivei, kuri 
turi apimti įvertintą bandinio molekulin ę masę, turi būti bent penki 
matavimų taškai. Maž ą molekulin ę masę atitinkantis kalibracin ės 
kreivės galinis taškas nustatomas pagal n – heksilbenzen ą arba kitok į 
tinkamą nepolinį tirpiklį. Skaitinė vidutinė ir masin ė vidutinė mole­
kulinės masės paprastai apskai čiuojamos elektronin ėmis duomen ų 
apdorojimo priemon ėmis, taikant 1.2 skyriaus formules. Atliekant 
apskaičiavimus rankiniu b ūdu, galima pasiži ūrėti į ASTM D 
3536–91 (3).  
Pasiskirstymo kreiv ė turi būti pateikta lentel ės pavidalu arba kaip 
grafikas (diferencinis dažnis arba bendrojo kiekio procentin ės dalys 
pagal log M). Vaizduojant grafiškai viena molekulin ės masės dešim­
tainė skiltis paprastai turi b ūti 4 cm plo čio, o smail ės viršūnės aukštis 
turi būti apie 8 cm. Integralini ų pasiskirstymo kreivi ų atveju atstumas 
ordinatėje tarp tašk ų, atitinkan čių 0 ir 100 %, turi b ūti apie 10 cm.  
2.2. BANDYM Ų ATASKAITA  
Bandymų ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
2.2.1.  Bandomoji medžiaga  
— turima informacija apie bandom ąją medžiagą (tapatumas, priedai, 
priemaišos),  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— bandinio apdorojimo aprašymas, pasteb ėjimai, problemos.  
2.2.2.  Aparat ūra 
— tirpiklio rezervuaras, inertin ės dujos, duj ų pašalinimas iš eliuento, 
eliuento sud ėtis, priemaišos,  
— siurblys, pulsacij ų slopintuvas, injekcijos sistema,  
— atskyrimo kolon ėlės (gamintojas, visa informacija apie kolon ėlių 
charakteristikas, pvz., por ų dydis, atskyrimo medžiagos r ūšis ir t. 
t., naudot ų kolonėlių skaičius, ilgis ir jungimo tvarka),  
— kolon ėlės (arba jų rinkinio) teorini ų lėkštelių skaičius, atskyrimo 
efektyvumas (sistemos atskyrimo galia),  
— informacija apie smaili ų simetriją, 
— kolon ėlės temperat ūra, temperat ūros reguliavimo b ūdas, 
— detektorius (matavimo principas, tipas, kiuvet ės tūris), 
— debitmatis, jei buvo naudotas (gamintojas, matavimo principas),  
— duomen ų registravimo ir apdorojimo sistema (aparatas ir progra ­
minė įranga).  
2.2.3.  Sistemos kalibravimas  
— kalibracin ės kreivės gavimo metodo detalus aprašymas,  
— informacija apie šio metodo kokyb ės kriterijus (pvz., koreliacijos 
koeficient ą, paklaidų kvadratų sumą ir t. t.),  
— informacija apie visas ekstrapoliacijas, prielaidas ir aproksima ­
cijas, darytas bandymo eigoje ir vertinant bei apdorojant 
duomenis,  
— visi matavimai, naudoti kalibracinei kreivei gauti, turi b ūti doku­
mentuoti lentel ėje, kurioje kiekvienam kalibravimo taškui b ūtų 
pateikta tokia informacija:  
— bandinio pavadinimas,  
— bandinio gamintojas,  
— etalon ų būdingosios vert ės M  p , M  n , M  w ir M  w /M n , kokias 
pateikė gamintojas, arba gautos v ėlesniuose matavimuose, 
kartu nurodant nustatymo metodo detales,  
— injekcijos t ūris ir injekcijos koncentracija,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— kalibravimui naudota M  p vertė, 
— išmatuotas eliuavimo t ūris arba pataisyta sulaikymo trukm ė, 
atitinkantys smail ės viršūnę, 
— smailės viršūnę atitinkanti apskai čiuota M  p vertė, 
— apskai čiuotos ir kalibravimui naudotos M  p vertės procentin ė 
paklaida.  
2.2.4.  Vertinimas:  
— vertinimas atsižvelgiant į laiką: metodai taikyti reikiamam pakar ­
tojamumui užtikrinti (patais ų darymo metodas, vidinis standartas 
ir t. t.),  
— informacija apie tai, ar vertinimas buvo atliekamas pagal eliua ­
vimo tūrį ar pagal sulaikymo trukm ę, 
— informacija apie vertinimo ribas, jei smail ė nėra iki galo anali ­
zuota,  
— lyginimo metod ų aprašymas, jei jie buvo taikyti,  
— bandinio ruošimo ir išankstinio apdorojimo metodikos,  
— duomenys apie neištirpusias daleles, jei yra,  
— injekcijos t ūris (μl) ir injekcijos koncentracija (mg/ml)  
— stebėjimų duomenys, nurodantys veiksnius, kurie yra nukrypim ų 
nuo teorinio GPC profilio priežastis,  
— bandymo metodikose daryt ų visų keitimų detalus aprašymas,  
— detalės apie paklaid ų intervalus,  
— bet kokia kita informacija ir steb ėjimų duomenys, reikalingi 
duomenims interpretuoti.  
3. NUORODOS  
1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
3) ASTM D 3536–91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation 
Chromatography-GPC). American Society for Testing and Mate ­
rials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
4) ASTM D 5296–92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Priedėlis 
Kitų polimer ų skaitinės vidutin ės molekulin ės masės nustatymo metod ų 
pavyzdžiai  
Gelchromatografija (GPC) yra labiausiai tinkamas b ūdas M  n nustatyti, ypa č, jei 
yra rinkinys etalon ų, kurių sandara yra panaši į polimero sandar ą. Tačiau, jei 
norint taikyti GPC kyla praktini ų sunkumų arba kai jau iš anksto tikimasi, kad 
medžiaga neatitiks M  n nustatyto kriterijaus (kas turi b ūti patvirtinta), taikytini šie 
alternatyv ūs metodai, pvz.:  
1. Koligatyvi ųjų savybių naudojimas  
1.1. Ebulioskopija arba krioskopija:  
matuojamas tirpiklio virimo temperat ūros didėjimas (ebulioskopija) 
arba užšąlimo temperat ūros mažėjimas (krioskopija), kai jame ištir ­
pinama polimero. Metodas remiasi faktu, kad ištirpinto polimero įtaką virimo (užšalimo) temperat ūros pokyčiui apsprendžia polimero 
molekulin ė masė (1) (2).
 
Taikomumas: M  n < 20 000.  
1.2. Gar ų slėgio mažėjimas:  
matuojamas pasirinkto etaloninio skys čio garų slėgis prieš įdedant 
polimero ir po žinom ų polimero kieki ų pridėjimo (1) (2).  
Taikomumas: M  n < 20 000 (teoriškai; ta čiau praktikoje metodo 
pritaikymas ribotas).  
1.3. Membranin ė osmometrija:  
remiasi osmoso principu, t. y. tirpiklio molekuli ų savaiminiu 
perėjimu per puslaid ę membran ą iš praskiesto tirpalo į koncentruot ą 
tirpalą. Bandyme praskiesto tirpalo koncentracija yra nulin ė, o 
koncentruotame tirpale yra polimero. D ėl tirpiklio siurbimo per 
membran ą susidaro sl ėgių skirtumas, kurio dydis priklauso nuo poli ­
mero koncentracijos ir molekulin ės masės (1) (3) (4).  
Taikomumas: kai M  n yra 20 000–200 000 intervale.  
1.4. Osmometrija gar ų fazėje: 
gryno tirpiklio aerozolio garavimo greitis lyginamas su bent trij ų 
aerozolių, turinčių skirtingos koncentracijos polimero, garavimo 
greičiu (1) (2) (4).  
Taikomumas: M  n < 20 000.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Galini ų grupių analizė 
Norint taikyti š į metodą, reikia žinoti bendr ąją polimero sandar ą ir jo 
galinių grupių (kurias nuo pagrindin ės grandin ės turi būti galima 
atskirti, pvz., taikant branduoli ų magnetinio rezonanso metod ą arba 
titravimo (derivatizavimo) metod ą) prigimtį. Pagal polimere esan čių 
galinių grupių molekulin ę koncentracij ą gali būti nustatyta jo mole ­
kulinės masės vertė (7) (8) (9).  
Taikomumas: M  n iki 50 000 (patikimumui maž ėjant).  
3. Nuorodos  
1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd 
Edn., John Wiley, New York.  
2) Glover, C.A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E Slade, 
Jr. ed., Marcel Dekker, New York.  
3) ASTM D 3750–79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by 
Membrane Osmometry. American Society for Testing and Mate ­
rials, Philadelphia, Pennsylvania.  
4) Coll, H. (1989). membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, p. 25–52.
 
5) ASTM 3592–77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 
6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Deter ­
minationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley 
and Sons.  
7) SchrĖder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: 
Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel 
Dekker, New York.  
9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 
2139–2146.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.18.  MAŽOS MOLEKULIN ĖS MAS ĖS MEDŽIAG Ų KIEKIS 
POLIMERUOSE  
1. METODAS  
Šis gelchromatografijos (Gel Permeation Chromatographic) metodas 
yra OECD TG 119 (1996) kopija. Pagrindiniai principai ir papildoma 
techninė informacija pateikta nuorodose.  
1.1. ĮVADAS  
Kadangi polimer ų savybės yra labai skirtingos, ne įmanoma aprašyti 
vieną atskirą metodą, tiksliai nustatant į atskyrimo ir vertinimo 
sąlygas, kurios apimt ų visas galimybes ir specifinius atvejus, pasitai ­
kančius atskiriant polimerus. Ypa č sudėtingas polimer ų sistemas 
dažnai ne įmanoma paruošti gelchromatografijai (GPC). Kai GPC 
nenaudotina, molekulin ę masę galima nustatyti kit ų metodų pagalba 
(žr. papildym ą). Tokiais atvejais turi b ūti pateiktos visos taikyto 
metodo detal ės ir pagrindimas.  
Aprašytas metodas paruoštas DIN 55672 standarto (1) pagrindu. 
Visa detali informacija apie tai, kaip atlikti bandymus ir kaip vertinti duomenis, galima rasti šiame DIN standarte. Tuo atveju, kai b ūtina 
keisti bandymo s ąlygas, šie keitimai turi b ūti pagrįsti. Galima taikyti 
kitus standartus, jei jie yra visiškai aprašyti. Aprašytame metode kalibravimui naudojami žinomo polidispersiškumo polistireno bandi ­
niai ir metod ą gali tekti keisti, pritaikant kai kuriems polimerams, 
pvz., vandenyje tirpiems ir ilgos šakotos grandin ės polimerams.
 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Mažesnė nei 1 000 dalton ų molekulin ė masė sąlygiškai apibr ėžiama 
kaip maža molekulin ė masė. 
Skaitinė vidutinė molekulin ė masė M n ir masinė vidutinė molekulin ė 
masė M w nustatomos taikant tokias lygtis: 
M n ¼ X  n 
i¼1 H i 
X  n 
i¼1 H i=M i M w ¼ X  n 
i¼1 H i Ü M  i 
X  n 
i¼1 H i 
kuriose:  
H i = yra nuo pagrindo linijos išmatuotas detektoriaus signalo lygis 
sulaikymo t ūriui V  i , 
M i = sulaikymo t ūrį V i atitinkančios polimero frakcijos moleku ­
linė masė ir n yra duomen ų taškų skaičius. 
Molekulin ės masės skirstinio plot į, kuris yra sistemos dispersiškumo 
matas, nusako santykis M  w /M n . ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Kadangi GPC yra santykinis metodas, turi b ūti atliekamas kalibra ­
vimas. Paprastai šiam tikslui naudojami siaurame intervale pasiskirst ę 
linijinės sandaros polistireno etalonai, kuri ų vidutinės molekulin ės 
masės M  n ir M  w ir molekulin ės masės pasiskirstymas yra žinomi. 
Kalibravimo kreiv ę nežinomo bandinio molekulinei masei nustatyti 
galima naudoti tik tuomet, jei bandiniui ir etalonams atskirti naudotos s ąlygos buvo parinktos identišku b ūdu.
 
Nustatyta priklausomyb ė tarp molekulin ės masės ir eliuavimo t ūrio 
galioja tik konkretaus bandymo specifin ėmis sąlygomis. Svarbiausios 
sąlygos yra temperat ūra, tirpiklis (arba tirpikli ų mišinys), chromato ­
grafavimo s ąlygos ir atskyrimo kolon ėlė arba kolon ėlių sistema.  
Taip nustatytos bandinio molekulin ės masės yra santykin ės vertės ir 
vadinamos „molekulin ėmis masėmis pagal polistiren ą“. Tai reiškia, 
kad dėl sandaros ir chemini ų skirtumų tarp bandinio ir etalon ų mole­
kulinės masės nuo absoliu čiųjų verčių gali skirtis didesniu arba 
mažesniu laipsniu. Jei naudojami kiti etalonai, pvz., polietilengli ­
kolis, polioksietilenas, polimetilmetakrilatas, poliakrilo r ūgštis, turi 
būti nurodyta j ų naudojimo priežastis.  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandinio molekulin ės masės skirstinys ir vidutin ės molekulin ės 
masės (M  n , M  w ) gali būti nustatyti taikant GPC. GPC yra specialus 
skysčių chromatografijos metodas, kuriame bandinys atskiriamas 
pagal atskir ų komponent ų hidrodinaminius t ūrius (2).  
Atskyrimas vyksta, kai bandinys praeina per kolon ėlę, užpildyt ą 
poringa medžiaga, dažniausiai organiniu geliu. Mažos molekul ės 
gali įsiskverbti į poras, tuo tarpu didel ės molekul ės ekskliuduojamos. 
Todėl didelių molekuli ų kelias yra trumpesnis ir jos išplaunamos 
pirmos. Vidutinio dydžio molekul ės įsiskverbia į kai kurias poras 
ir išplaunamos v ėliau. Mažiausios molekul ės, kurių vidutinis hidro ­
dinaminis spindulys yra mažesnis nei gelio poros, gali įsiskverbti į 
visas poras. Šios molekul ės išplaunamos paskutin ės. 
Teoriškai atskyrim ą apsprendžia vien tik molekuli ų dydis, ta čiau 
praktikoje sunku išvengti kai kuri ų trukdančių sugerties veiksni ų. 
Netolygus kolon ėlės užpildymas ir nenaudingi t ūriai gali bloginti 
padėtį (2). 
Aptikimas atliekamas, pvz., matuojant l ūžio rodikl į arba UV-sugert į, 
ir gaunama paprasta pasiskirstymo kreiv ė. Tačiau norint kreivei 
priskirti tikr ąsias molekulin ės masės vertes, kolon ėlę reikia kali ­
bruoti, leidžiant per j ą žinomos molekulin ės masės polimerus ir 
geriausiai b ūtų apskritai panašios sandaros polimerus, pvz., įvairius 
polistireno etalonus. Vertikaliojoje ašyje žymint įvairios molekulin ės 
masės išplautų dalelių kiekį, kuris reiškiamas mase, o horizontalio ­
joje ašyje – molekulin ės masės logaritm ą, paprastai gaunama Gauso 
kreivė, kartais iškreipta nedidele uodega mažos molekulin ės masės 
pusėje. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Pagal šią kreivę nustatomas mažos molekulin ės masės medžiag ų 
kiekis. Apskai čiavimas gali b ūti tikslus tik tuo atveju, jei mažos 
molekulin ės masės dalelių atsakas yra ekvivalentiškas j ų masės daliai 
polimere.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Eliuavimo t ūrio pakartojamumas (variacijos koeficientas) turi b ūti 
geresnis nei 0,3 %. Jei vertinant skirtingu laiku daryt ą chromato ­
gramą, ji neatitinka tik k ą minėto kriterijaus, reikiamas analiz ės 
pakartojamumas turi b ūti užtikrintas atliekant korekcij ą vidiniu 
etalonu (1). Polidispersiškumas priklauso nuo etalon ų molekulin ės 
masės. Polistireno etalon ų atveju tipiškos vert ės yra tokios: 
M p < 2 000  M  w /M n < 1,20  
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05  
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p yra etalono molekulin ė masė, atitinkanti smail ės viršūnę). 
1.6. BANDYM ŲO METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Etalonini ų polistireno tirpal ų ruošimas  
Polistireno etalonai ištirpinami juos kruopš čiai sumaišant su pasi ­
rinktu eliuentu. Ruošiant tirpalus turi b ūti atsižvelgta į gamintojo 
rekomendacijas.  
Pasirinktų etalonų koncentracijos priklauso nuo įvairių veiksnių, 
pvz., injekcijos t ūrio, tirpalo klampumo ir analizinio detektoriaus 
jautrumo. Norint išvengti perkrovos, didžiausias injekcijos t ūris turi 
būti pritaikytas kolon ėlės ilgiui. Taikant GPC medžiag ų atskyrimui 
analizėje, tipiški injekcijos t ūriai 30 cm × 7,8 mm kolon ėlei paprastai 
yra 40–100 μ1. Galima naudoti didesn į tūrį, tačiau jis neturi viršyti 
250 μ1. Prieš pradedant tikr ąjį kolonėlės kalibravim ą, turi būti nusta­
tytas optimalus santykis tarp injekcijos t ūrio ir koncentracijos.  
1.6.2.  Bandinio tirpalo ruošimas  
Iš esmės tie patys reikalavimai taikomi ruošiant bandini ų tirpalus. 
Bandinys ištirpinamas tinkamame tirpiklyje, pvz., tetrahidrofurane, kruopščiai maišant. Jokiu b ūdu negalima tirpinti naudojant ultragar ­
sinę vonią. Jei būtina, bandinio tirpalas gryninamas, filtruojant per 
membranin į filtrą, kurio por ų dydis 0,2–2 μm.
 
Galutinėje ataskaitoje turi b ūti pažymėta, ar buvo neištirpusi ų dalelių, 
nes tai gali b ūti didelės molekulin ės masės medžiag ų dalelės. Ištir­
pusių dalelių procentinei mas ės daliai nustatyti turi b ūti taikomas 
tinkamas metodas. Tirpalai turi b ūti panaudoti per 24 valandas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Pataisos atsižvelgiant į priemaiš ų ir pried ų kiekį 
Paprastai b ūtina daryti medžiag ų, kurių molekulin ė masė M < 1 000, 
kiekio pataisas atsižvelgiant į esančių nepolimerini ų medžiag ų (pvz., 
priemaišų ir (arba) pried ų) indėlį, išskyrus kai nustatytas kiekis ir 
taip jau < 1 %. Tai daroma polimero tirpalo arba GPC eliuato tiesio ­
ginės analizės būdu. 
Tais atvejais, kai iš ėjusio iš kolon ėlės eliuato koncentracija tolesnei 
analizei per maža, jis turi b ūti koncentruojamas. Gali prireikti eliuat ą 
išgarinti iki sauso liku čio ir vėl jį ištirpinti. Eliuato koncentravimas 
turi būti atliktas tokiomis s ąlygomis, kurios užtikrint ų, kad eliuatas 
išliks nepakit ęs. Eliuato apdorojimas po GPC pakopos priklauso nuo 
kiekybiniam nustatymui taikomo metodo.  
1.6.4.  Aparat ūra 
GPC aparat ą sudaro šios sudedamosios dalys:  
— rezervuaras tirpikliui,  
— dujų pašalinimo įtaisas (jei reikia),  
— siurblys,  
— pulsacij ų slopintuvas (jei reikia),  
— injekcijos sistema,  
— chromatografin ės kolonėlės, 
— detektorius,  
— debitmatis (jei reikia),  
— duomen ų rašiklis-procesorius,  
— atliekų indas.  
Turi būti užtikrinta, kad GPC sistema b ūtų inertiška naudojamiems 
tirpikliams (pvz., naudojant plieninius kapiliarus, jei tirpiklis tetrahi ­
drofuranas).  
1.6.5.  Įšvirkštimas ir tirpiklio tiekimo sistema  
Tam tikras bandinio tirpalo t ūris griežtai nustatytoje zonoje įlei­
džiamas į kolonėlę, naudojant automatin į bandinio tiektuv ą arba 
rankiniu b ūdu. Švirkšto st ūmoklio per greitas ištraukimas arba spau ­
dimas įleidžiant rankiniu b ūdu gali b ūti molekulini ų masių stebimo 
pasiskirstymo poky čių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo 
sistema turi b ūti be pulsacij ų, geriausiu atveju jai reikia pulsacij ų 
slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.  
1.6.6.  Kolon ėlė 
Atsižvelgiant į bandinį, polimeras tiriamas naudojant vien ą paprastą 
kolonėlę arba kelias nuosekliai sujungtas kolon ėles. Prekyboje yra 
keletas kolon ėlėms užpildyti naudojam ų poringų medžiag ų su 
apibrėžtomis savyb ėmis (pvz., por ų dydžiu, ekskliudavimo ribomis). 
Atskyrimui naudojamo gelio arba kolon ėlės aukščio pasirinkimas 
priklauso ir nuo bandinio savybi ų (hidrodinamini ų tūrių, molekulin ės 
masės pasiskirstymo) ir nuo specifini ų atskyrimo s ąlygų, pvz., 
tirpiklio, temperat ūros ir srauto (1) (2) (3).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Teorin ės lėkštelės 
Atskyrimui naudojama kolon ėlė arba kolon ėlių sistema turi b ūti 
apibūdinta teorini ų lėkštelių skaičiumi. Tetrahidrofurano kaip 
eliuento atveju reikia į žinomo ilgio kolon ėlę įleisti etilbenzeno 
arba kito tinkamo nepolinio tirpiklio tirpal ą. Teorinių lėkštelių skai­ 
čius apskai čiuojamas pagal toki ą lygtį: 
N ¼ 5,54 Í ðV e Þ 
ðW 1=2 Þ Î 2 
arba N ¼ 16 Í ðV e Þ 
ðWÞ Î 2 
kurioje:  
N = teorini ų lėkštelių skaičius 
V e = smailės viršūnę atitinkantis eliuavimo t ūris 
W = smail ės plotis pagrindo linijoje  
W 1/2 = smailės plotis per smail ės aukščio vidurį. 
1.6.8.  Atskyrimo efektyvumas  
Be teorini ų lėkštelių skaičiaus, kuris apsprendžia juostos plot į, tam 
tikrą vaidmen į vaidina atskyrimo efektyvumas, kur į apibūdina kali­
bracinės kreivės statumas. Kolon ėlės atskyrimo efektyvumas nusta ­
tomas pagal toki ą priklausomyb ę: 
Í ððV e,M  x Þ – ðV e,ð10M  x Þ ÞÞ 
kolonėlės skerspjūvio plotas Î 
≥ 6,0 " 
ðcm 3 Þ 
ðcm 2 Þ # 
kurioje:  
V e,Mx = polistireno, turin čio molekulin ę masę M  x , eliuavimo 
tūris 
V e ,( 10Mx ) = polistireno, turin čio 10 kart ų didesnę molekulin ę 
masę, eliuavimo t ūris. 
Sistemos atskiriamoji galia dažniausiai apibr ėžiama taip:  
R 1,2 ¼ 2 Ü Í ðV e1 – V  e2 Þ 
ðW 1 þ W  2 Þ Î 
Ü Í ð1Þ 
ðlog 10 ðM 2=M 1 ÞÞ Î 
čia: 
V e1 , V e2 = dviejų polistireno etalon ų eliuavimo t ūriai, atitinkantys 
smailės viršūnę, 
W 1 , W  2 = smailių pločiai pagrindo linijoje,  
M 1 , M  2 = molekulin ės masės, atitinkan čios smaili ų viršūnes (turi 
skirtis 10 kart ų). 
Kolonėlės sistemai R vert ė turi būti didesnė kaip 1,7 (4).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Tirpikliai  
Visi tirpikliai turi b ūti labai gryni (tetrahidrofurano grynumas 
99,5 %). Tirpiklio indas (jei reikia inertini ų dujų atmosferoje) turi 
būti pakankamai didelis kolon ėlei kalibruoti ir keli ų bandinių analizei 
atlikti. Prieš tirpikl į tiekiant siurbliu į kolonėlę iš jo turi b ūti paša­
lintos dujos.  
1.6.10.  Temperat ūros reguliavimas  
Svarbių vidinių komponent ų (injekcijos kilpos, kolon ėlių, detekto­
riaus ir vamzdži ų) temperat ūra turi būti pastovi ir atitikti pasirinkt ą 
tirpiklį. 
1.6.11.  Detektorius  
Detektoriaus paskirtis – kiekybiškai registruoti iš kolon ėlės išplauto 
bandinio koncentracij ą. Norint, kad smail ės nebūtų labai pla čios, 
detektoriaus kiuvet ės tūris turi b ūti kuo mažesnis. Jis neturi b ūti 
didesnis kaip 10 μl, išskyrus šviesos sklaidos ir klampumo detekto ­
rius. Aptikimui paprastai naudojama diferencin ė refraktometrija. 
Tačiau, jei to reikalauja bandinio specifin ės savybės arba eliuavimo 
tirpiklis, gali b ūti naudojami kit ų tipų detektoriai, pvz., UV/VIS, IR, 
klampumo detektoriai ir t. t.  
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
2.1. DUOMENYS  
Išsamių vertinimo kriterij ų, taip pat duomen ų kaupimui ir apdoro ­
jimui keliam ų reikalavim ų reikia ieškoti DIN standarte (1).  
Kiekvienam bandiniui turi b ūti atlikti du nepriklausomi bandymai. 
Bandiniai turi b ūti analizuojami atskirai. Visais atvejais taip pat yra 
svarbu apskai čiuoti tuš čiųjų bandini ų, apdorojam ų vienodai su 
bandiniu, duomenis.  
Būtina aiškiai nurodyti, kad išmatuotos vert ės yra santykin ės vertės, 
atitinkančios naudojam ų etalonų molekulin ę masę. 
Po sulaikymo t ūrio arba sulaikymo trukm ės verčių (galbūt pataisyt ų 
naudojant vidin į etaloną) nustatymo vienam ši ų dydžių atidedamos 
log M  p vertės (M  p yra kalibravimo etalono smail ės viršūnę atitinkanti 
vertė). Kiekvienai molekulin ės masės dešimtainei skil čiai būtina 
turėti bent du kalibravimo taškus, o visai kalibracinei kreivei, kuri 
turi apimti įvertintą bandinio molekulin ę masę, turi būti bent penki 
matavimų taškai. Maž ą molekulin ę masę atitinkantis kalibracin ės 
kreivės galinis taškas nustatomas pagal n – heksilbenzen ą arba kitok į 
tinkamą nepolinį tirpiklį. Kreivės dalis, atitinkanti mažesn ę nei 1 000 
molekulin ę masę, apskaičiuojama ir prireikus pataisoma atsižvelgiant 
į priemaišas ir priedus. Eliuavimo kreiv ės paprastai vertinamos elek ­
troninio duomen ų apdorojimo b ūdu. Atliekant apskai čiavimus 
rankiniu b ūdu, galima pasiži ūrėti į ASTM D 3536–91 (3).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Jei kolon ėlėje sulaikomas koks nors netirpus polimeras, jo moleku ­
linė masė greičiausiai yra didesn ė nei tirpiosios dalies, ir jei į jo kiekį 
neatsižvelgti, gaunamas mažos molekulin ės masės medžiag ų kiekio 
pervertinimas. Papildyme pateikiamos rekomendacijos, kaip daryti mažos molekulin ės masės medžiag ų kiekio patais ą atsižvelgiant į 
netirpų polimerą.
 
Pasiskirstymo kreiv ė turi būti pateikta lentel ės pavidalu arba kaip 
grafikas (diferencinis dažnis arba bendrojo kiekio procentin ės dalys 
pagal log M). Vaizduojant grafiškai viena molekulin ės masės dešim­
tainė skiltis paprastai turi b ūti 4 cm plo čio, o smail ės viršūnės aukštis 
turi būti apie 8 cm. Integralini ų pasiskirstymo kreivi ų atveju atstumas 
ordinatėje tarp tašk ų, atitinkan čių 0 ir 100 %, turi b ūti apie 10 cm.  
2.2. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymų ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
2.2.1.  Bandomoji medžiaga  
— turima informacija apie bandom ąją medžiagą (tapatumas, priedai, 
priemaišos),  
— bandinio apdorojimo aprašymas, pasteb ėjimai, problemos.  
2.2.2.  Aparat ūra 
— tirpiklio rezervuaras, inertin ės dujos, duj ų pašalinimas iš eliuento, 
eliuento sud ėtis, priemaišos,  
— siurblys, pulsacij ų slopintuvas, injekcijos sistema,  
— atskyrimo kolon ėlės (gamintojas, visa informacija apie kolon ėlių 
charakteristikas, pvz., por ų dydis, atskyrimo medžiagos r ūšis ir t. 
t., naudot ų kolonėlių skaičius, ilgis ir jungimo tvarka),  
— kolon ėlės (arba jų rinkinio) teorini ų lėkštelių skaičius, atskyrimo 
efektyvumas (sistemos atskyrimo galia),  
— informacija apie smaili ų simetriją, 
— kolon ėlės temperat ūra, temperat ūros reguliavimo b ūdas, 
— detektorius (matavimo principas, tipas, kiuvet ės tūris), 
— debitmatis, jei buvo naudotas (gamintojas, matavimo principas),  
— duomen ų registravimo ir apdorojimo sistema (aparat ūra ir progra ­
minė įranga).  
2.2.3.  Sistemos kalibravimas  
— kalibracin ės kreivės gavimo metodo detalus aprašymas,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— informacija apie šio metodo kokyb ės kriterijus (pvz., koreliacijos 
koeficient ą, paklaidų kvadratų sumą ir t. t.),  
— informacija apie visas ekstrapoliacijas, prielaidas ir aproksima ­
cijas, darytas bandymo eigoje ir vertinant bei apdorojant 
duomenis,  
— visi matavimai, naudoti kalibracinei kreivei gauti, turi b ūti doku­
mentuoti lentel ėje, kurioje kiekvienam kalibravimo taškui b ūtų 
pateikta tokia informacija:  
— bandinio pavadinimas,  
— bandinio gamintojas,  
— etalon ų būdingosios vert ės M  p , M  n , M  w ir M  w /M n , kokias 
pateikė gamintojas, arba gautos v ėlesniuose matavimuose, 
kartu nurodant nustatymo metodo detales,  
— injekcijos t ūris ir injekcijos koncentracija,  
— kalibravimui naudota M  p vertė, 
— išmatuotas eliuavimo t ūris arba pataisyta sulaikymo trukm ė, 
atitinkantys smail ės viršūnę, 
— smailės viršūnę atitinkanti apskai čiuota M  p vertė, 
— apskai čiuotos ir kalibravimui naudotos M  p vertės procentin ė 
paklaida.  
2.2.4.  Informacija apie maž ą molekulin ę masę turinčio polimero kiek į 
— analizei taikyt ų metodų aprašymas ir bandym ų atlikimo eiga,  
— informacija apie mažos molekulin ės masės medžiag ų procentin ę 
dalį (m/m), apskai čiuotą viso bandinio masei,  
— informacija apie priemaiš ų, priedų ir kitų nepolimerini ų medžiagų 
masės procentin ę dalį, apskaičiuotą viso bandinio masei.  
2.2.5.  Vertinimas:  
— vertinimas atsižvelgiant į laiką: visi metodai taikyti reikiamam 
pakartojamumui užtikrinti (patais ų darymo metodas, vidinis stan ­
dartas ir t. t.),  
— informacija apie tai, ar vertinimas buvo atliekamas pagal eliua ­
vimo tūrį ar pagal sulaikymo trukm ę, 
— informacija apie vertinimo ribas, jei smail ė nėra iki galo anali ­
zuota,  
— lyginimo metod ų aprašymas, jei jie buvo taikyti,  
— bandinio ruošimo ir išankstinio apdorojimo metodikos,  
— duomenys apie neištirpusias daleles, jei yra,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— injekcijos t ūris (μl) ir injekcijos koncentracija (mg/ml),  
— stebėjimų duomenys, nurodantys veiksnius, kurie yra nukrypim ų 
nuo teorinio GPC profilio priežastis,  
— bandymo metodikose daryt ų visų pakeitim ų detalus aprašymas,  
— detalės apie paklaid ų intervalus,  
— bet kokia kita informacija ir steb ėjimų duomenys, reikalingi 
duomenims interpretuoti.  
3. NUORODOS  
1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
3) ASTM D 3536–91, (1991). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Mate ­
rials, Philadelphia, Pennsylvania.
 
4) ASTM D 5296–92, (1992). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Penn ­
sylvania.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Priedėlis 
Nurodymai, kaip daryti mažos molekulin ės masės medžiagos kiekio pataisas 
dėl netirpaus polimero buvimo  
Kai bandinyje yra netirpaus polimero, GPC analiz ės metu prarandama mas ė. 
Netirpus polimeras negr įžtamai sulaikomas kolon ėlėje arba ant bandinio filtro, 
o tirpioji bandinio dalis praeina per kolon ėlę. Jei galima įvertinti arba išmatuoti 
polimero l ūžio rodiklio pokyt į (dn/dc), tai galima įvertinti kolon ėlėje prarast ą 
masę. Tokiu atveju pataisa daroma naudojant išorin į kalibravim ą žinomos 
koncentracijos etalonin ėmis medžiagomis bei dn/dc refraktometro atsakui kali ­
bruoti. Čia pateiktame pavyzdyje naudojamas polimetilmetakrilato (pMMA) 
etalonas.  
Norint akrilo polimer ų analizėje atlikti išorin į kalibravim ą, GPC metodu anali ­
zuojamas žinomos koncentracijos pMMA tirpalas tetrahidrofurane ir gauti duomenys naudojami refraktometro konstantai nustatyti pagal lygt į:
 
K = R/(C × V × dn/dc),  
čia: 
K = refraktometro konstanta (mikrovoltas iš sekund ės mililitrui),  
R = pMMA etalono atsakas (mikrovoltas iš sekund ės), 
C = pMMA etalono koncentracija (mg/ml),  
V = injekcijos t ūris (ml), ir  
dn/dc = tetrahidrofurane ištirpinto pMMA l ūžio rodiklio pokytis (ml/mg).  
Tipiniai pMMA etalono duomenys:  
R = 2937 891,  
C = 1,07 mg/ml,  
V = 0,1 ml,  
dn/dc = 9 × 10–5 ml/mg.  
Toliau gautoji K vert ė 3,05 × 10  11 naudojama teoriškam detektoriaus atsakui 
apskaičiuoti, jei pro detektori ų butų išplauta 100 % įšvirkšto polimero kiekio.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.19.  POLIMER Ų TIRPUMAS VANDENYJE/EKSTRAHAVIMASIS 
IŠ VANDENS  
1. METODAS  
Aprašytas metodas yra OECD TG 120 (1997) pataisytos versijos 
kopija. Kita technin ė informacija pateikta (1) nuorodoje.  
1.1. ĮVADAS  
Prieš taikant toliau išd ėstytą metodą, kai kuriems polimerams, pvz., 
emulsiniams polimerams, gali b ūti reikalingi paruošiamieji darbai. 
Metodas netaikomas skystiesiems polimerams ir polimerams, kurie 
bandymo s ąlygomis reaguoja su vandeniu.  
Kai metod ą taikyti netikslinga arba ne įmanoma, polimer ų tirpumas 
(ekstrahavimasis) gali b ūti tiriamas kit ų metodų pagalba. Tokiais 
atvejais turi b ūti pateiktos visos metodo detal ės ir pagrindimas.  
1.2. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Polimerų tirpumas (ekstrahavimasis) vandenin ėje terpėje nustatomas 
taikant kolbos metod ą (žr. A.6 tirpumas vandenyje, kolbos metodas), 
kuriame daromi toliau aprašyti pakeitimai.  
1.4. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.5. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.5.1.  Įranga  
Bandant šiuo metodu reikalinga tokia įranga:  
— trupintuvas, pvz., mal ūnas žinomo dydžio dalel ėms gauti,  
— purtykl ė, kurioje b ūtų galima reguliuoti temperat ūrą, 
— membranini ų filtrų sistema,  
— atitinkama analizin ė įranga,  
— standartizuoti sietai.  
1.5.2.  Bandinio ruošimas  
Reprezentatyvus bandinys iš pradži ų turi būti susmulkintas iki 
0,125– 0,25 mm dydžio daleli ų, naudojant atitinkamus sietus. 
Bandinio patvarumui užtikrinti arba malimo procese gali b ūti reika­
lingas aušinimas. Medžiagos gumos pagrindu gali b ūti trupinamos 
skystojo azoto temperat ūroje (1).  
Jei reikiamo dydžio daleli ų frakcijos gauti negalima, turi b ūti imtasi 
veiksmų dalelių dydžiui kiek įmanoma sumažinti, o rezultatas turi 
būti pateiktas ataskaitoje. Ataskaitoje b ūtina nurodyti b ūdą, kaip 
sutrupintas bandinys buvo laikomas prieš bandym ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Bandymo eiga  
Į tris indus su stikliniais kamš čiais atskirai pasveriami trys bando ­
mosios medžiagos 10 g mas ės bandiniai ir į kiekvien ą indą įpilama 
1 000 ml vandens. Jei pasirodo, kad 10 g polimero apdoroti n ėra 
galimybės, turi būti naudojamas kitas gretimas didžiausias kiekis, 
kurį galima apdoroti, o vandens t ūris atitinkamai kei čiamas.  
Indai gerai užkemšami ir purtomi 20 °C temperat ūroje. Turi b ūti 
naudojamas purtymo arba maišymo įtaisas, galintis veikti pastovioje 
temperatūroje. Po 24 valand ų kiekvieno indo turinys centrifuguo ­
jamas arba filtruojamas ir atitinkamu analiz ės metodu skaidrioje 
vandeninėje fazėje nustatoma polimero koncentracija. Jei tinkam ų 
metodų analizuoti vandenin ėje terpėje nėra, bendrasis tirpumas (ekst ­
rahavimasis) gali b ūti nustatytas pagal sauso liku čio ant filtro arba 
sausų centrifugavimo nuos ėdų masę. 
Paprastai b ūtina kiekybiškai atskirti priemaišas ir priedus nuo mažos 
molekulin ės masės medžiag ų. Gravimetrinio nustatymo atveju, norint 
atsižvelgti į likučius, atsirandan čius dėl bandymo metodikos taikymo, 
svarbu atlikti tuš čiąjį bandymą be bandomosios medžiagos.  
Polimerų tirpumas (ekstrahavimasis) vandenyje 37 °C temperat ūroje 
ir esant pH 2 bei pH 9 gali b ūti nustatytas tokiu pat b ūdu, kuris 
aprašytas atliekant bandym ą 20 °C temperat ūroje. pH vert ė gali būti 
reguliuojama pridedant tinkamo buferinio tirpalo arba tinkam ų 
rūgščių ar šarm ų, pvz., druskos r ūgšties, acto r ūgšties, analiziškai 
gryno natrio ar kalio hidroksido, arba NH  3 . 
Atsižvelgiant į taikomą analizės metodą turi būti atliekami vienas 
arba du bandymai. Kai yra specifiniai tiesiogin ės polimer ų kompo­
nentų analizės vandenin ėje terpėje metodai, tur ėtų pakakti vieno 
anksčiau aprašyto bandymo. Ta čiau kai toki ų metodų nėra, o poli ­
mero tirpumo (ekstrahavimosi) nustatymas apribotas tik netiesiogine 
analize, vandeniniame ekstrakte nustatant tik bendrosios organin ės 
anglies kiek į (BOA), turi b ūti atliktas papildomas bandymas. Be 
to, šis papildomas bandymas turi b ūti atliekamas tris kartus, naudo ­
jant 10 kart ų mažesnius polimero bandinius ir tuos pa čius vandens 
kiekius, kurie buvo naudojami pirmajame bandyme.  
1.5.4.  Analiz ė 
1.5.4.1.  Vieno dydžio bandinio analiz ė 
Gali būti naudojami tiesiogin ės polimero komponent ų analizės 
vandeninėje terpėje metodai. Kaip alternatyv ą galima b ūtų svarstyti 
galimybę netiesiogiai analizuoti ištirpint ų/ekstrahuot ų polimer ų 
komponentus, nustatant bendr ąjį tirpiųjų dalių kiekį ir darant pataisas 
dėl polimerams neb ūdingų komponent ų buvimo.  
Analizė vandenin ėje fazėje visų polimerini ų medžiag ų bendrajam 
kiekiui nustatyti galima:  
jei taikomas pakankamai jautrus metodas, pvz.:  
— BOA nustatymas, taikant šlapi ą suardym ą persulfatu arba dichro ­
matu CO  2 gauti, kurio kiekis įvertinamas IR arba chemin ės 
analizės metodu,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— atomin ė absorbcin ė analizė (AAS) arba jos induktyviai suža ­
dintos plazmos (ICP) emisijos atitikmuo silicio arba metal ų turin­
tiems polimerams nustatyti,  
— UV absorbcija arba spektrofluorimetrija polimerams su vienva ­
lente aromatine grupe,  
— LC-MS (skys čių chromatografija – masi ų spektroskopija) mažos 
molekulin ės masės bandiniams,  
arba atliekamas vandeninio ekstrakto garinimas vakuume iki sauso 
likučio ir jo spektrin ė analizė (IR, UV ir t. t.) arba liku čio AAS (ICP) 
analizė. 
Jei pačios vandenin ės fazės analizė neįmanoma, vandeninis ekstra ­
ktas turi b ūti ekstrahuojamas organiniu tirpikliu, kuris nesimaišo su 
vandeniu, pvz., chlorintuoju angliavandeniliu. Tirpiklis v ėliau išgari ­
namas, o likutis analizuojamas, kaip anks čiau nurodyta, polimero 
kiekiui nustatyti. Vis ų šio likučio komponent ų, kurie identifikuojami 
kaip priemaišos arba priedai, kiekis turi b ūti atimtas, kad b ūtų galima 
nustatyti paties polimero tirpumo (ekstrahavimosi) laipsn į. 
Kai tokių medžiag ų kiekis yra gana didelis, likut į gali tekti anali ­
zuoti, pvz., HPLC (didelio efektyvumo skys čių chromatografijos) 
arba GPC (gelchromatografijos) metodais, kuri ų pagalba priemaišos 
būtų atskirtos nuo monomero ir jo darini ų, kad būtų galima nustatyti 
tikrąjį pastarųjų medžiag ų kiekį. 
Kai kuriais atvejais gal b ūt pakaktų tiesiog išgarinti organin į tirpiklį 
iki sauso liku čio ir jį pasverti.  
1.5.4.2.  Bandymas su dviem skirtingo dydžio bandiniais  
Visuose vandeniniuose ekstraktuose atliekama BOA analiz ė. 
Neištirpusi bandinio dalis (likutis po ekstrahavimo) analizuojama 
gravimetriškai. Jei po kiekvieno indo turinio centrifugavimo arba 
filtravimo, polimero liku čiai lieka ant indo sieneli ų, indas turi b ūti 
skalaujamas filtratu tol, kol inde nelieka joki ų matomų likučių. 
Toliau filtratas v ėl centrifuguojamas arba filtruojamas. Ant filtro 
arba centrifugavimo m ėgintuvėlyje esantis likutis džiovinamas 
vakuume 40 °C temperat ūroje ir sveriamas. Džiovinama tol, kol 
gaunama pastovi mas ė. 
2. DUOMENYS  
2.1. BANDYMAS, ATLIKTAS NAUDOJANT VIENO DYDŽIO 
BANDIN Į 
Turi būti pateikti kiekvienai iš trij ų kolbų gauti atskiri rezultatai ir j ų 
vidutinės vertės, išreiškiant mas ės vienetais tirpalo t ūriui (paprastai 
mg/1) arba mas ės vienetais polimero masei (paprastai mg/g). Taip 
pat papildomai turi b ūti pateiktas bandinio mas ės nuostolis (apskai ­ 
čiuotas tirpinio mas ę dalinant iš pradinio bandinio mas ės). Turi b ūti 
apskaičiuoti variacijos koeficientai. Atskiri skai čiai turi būti pateikti 
visai medžiagai (polimeras + pagrindiniai priedai ir t. t.) ir tik poli ­
merui (t. y. atimant toki ų priedų indėlį). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. BANDYMAS, ATLIKTAS NAUDOJANT DU SKIRTINGO 
DYDŽIO BANDINIUS  
Turi būti pateiktos atskiros BOA kiekio vandeniniuose ekstraktuose 
vertės, gautos dviejuose trigubuose bandymuose, ir kiekvieno 
bandymo vidutin ė vertė, išreiškiant mas ės vienetais tirpalo t ūriui 
(paprasta mgC/l), taip pat mas ės vienetais pradinio bandinio masei 
(paprastai mgC/g).  
Jei tarp rezultat ų, gautų dideliam ir mažam bandinio mas ės bei 
vandens santykiui, skirtumo n ėra, tai gal ėtų rodyti, kad visi ekstra ­
huojami komponentai buvo iš tikr ųjų ekstrahuoti. Tokiu atveju, 
tiesioginė analizė paprastai neb ūtina. 
Turi būti pateiktos liku čių atskiros mas ės ir išreikštos pradin ės 
bandinio mas ės procentais. Turi b ūti apskai čiuojamos bandyme 
gautos vidutin ės vertės. Skirtumas tarp 100 ir nustatyto procentinio 
kiekio rodo tirpios ir ekstrahuojamos medžiagos procentin į kiekį 
pradiniame bandinyje.  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
3.1.1.  Bandomoji medžiaga  
— turima informacija apie bandom ąją medžiaga (tapatumas, priedai, 
priemaišos, mažos molekulin ės masės medžiag ų kiekis).  
3.1.2.  Bandym ų sąlygos  
— naudot ų metodikų ir bandym ų sąlygų aprašymas,  
— analiz ės ir aptikimo metod ų aprašymas.  
3.1.3.  Rezultatai  
— tirpumo/ekstrahuojamumo rezultatai, mg/1; atskiros ir vidutin ės 
vertės ekstrahavimo bandymuose įvairiuose tirpaluose, suardyto 
polimero kiekis ir priemaišos, priedai ir t. t.,  
— tirpumo/ekstrahuojamumo rezultatai mg/g polimero,  
— vandenini ų ekstraktų BOA vert ės, tirpalo mas ė ir apskai čiuotas 
kiekis procentais, jei matuotas,  
— kiekvieno bandinio pH,  
— informacija apie tuš čiajame bandyme gautas vertes,  
— jei b ūtina, nuorodos į bandymo medžiagos nepatvarum ą 
bandymo ir analiz ės eigoje,  
— visa informacija, kuri yra svarbi interpretuojant rezultatus.  
4. NUORODOS  
1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für 
Prüfzwecke.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.20.  OKSIDACIN ĖS SAVYB ĖS (SKYS ČIAI) 
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šis bandym ų metodas skirtas matuoti skystosios medžiagos geb ą 
padidinti degiosios medžiagos degimo greit į arba degimo intensy ­
vumą arba sudaryti mišin į su degi ąja medžiaga, kuris užsidega 
savaime, kai dvi medžiagos sumaišomos kartu. Jis yra pagr įstas JT 
bandymu, taikomu oksiduojamiesiems skys čiams (1), ir j į atitinka. 
Tačiau, kadangi šis A.21 metodas vis ų pirma rengiamas siekiant 
atitikti Direktyvos 67/548 reikalavimus, reikia lyginti tik su viena 
etalonine medžiaga. Bandymas ir lyginimas su papildomomis etalo ­
ninėmis medžiagomis gali b ūti reikalingas, kai bandym ų rezultatus 
numatoma naudoti kitais tikslais (  1 ). 
Šio bandymo daryti nereikia, kai tiriant strukt ūrinę formulę neabejo­
tinai nustatoma, kad medžiaga negali egzotermiškai reaguoti su degiąja medžiaga.
 
Prieš darant š į bandymą naudinga tur ėti išankstin ės informacijos apie 
visas galimas medžiagos sprogi ąsias savybes.  
Šis bandymas netaikomas kietosioms medžiagoms, dujoms, sprogio ­
sioms ar labai degioms medžiagoms arba organiniams peroksidams.  
Šio bandymo galima nedaryti, jei bandomosios medžiagos rezultatai 
jau yra gauti darant JT oksiduojam ųjų skysčių bandymą. 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Vidutinė slėgio didėjimo trukm ė – išmatuoto bandomojo mišinio 
slėgio didėjimo, palyginti su atmosferos sl ėgiu, nuo 690 kPa iki 
2 070 kPa trukm ės verčių vidurkis.  
1.3. ETALONIN Ė MEDŽIAGA  
Kaip etalonin ė medžiaga naudojamas 65 % (m/m) vandeninis azoto 
rūgšties (analiziškai grynos) tirpalas (  2 ). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Pvz., JT transporto reglament ų kontekste. 
( 2 ) Prieš bandymus r ūgštis turėtų būti titruojama jos koncentracijai patvirtinti.
 Be to, jei bandytojas numato, kad šio bandymo rezultatai gali b ūti 
naudojami kitais tikslais (  1 ), pasirinktinai gali b ūti tikslinga naudoti 
papildomas etalonines medžiagas (  2 ). 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandomasis skystis maišomas masi ų santykiu 1:1 su pluoštine celiu ­
lioze ir mišinys dedamas į slėginį indą. Jei maišant arba dedant 
įvyksta savaiminis užsidegimas, toliau bandymo daryti nereikia.  
Jei mišinys savaime neužsidega, atliekamas visas bandymas. Mišinys 
kaitinamas sl ėgio inde ir nustatomas vidutinis laikas, per kur į slėgis, 
palyginti su atmosferos sl ėgiu, padid ėja nuo 690 kPa iki 2 070 kPa. 
Šis padid ėjęs slėgis lyginamas su vidutine etalonin ės (-ių) medžiagos 
(-ų) ir celiulioz ės santykio 1:1 mišinio sl ėgio didėjimo trukme.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Darant penkis vienos medžiagos bandymus, aritmetinis vidurkis ir 
atskiri rezultatai turi skirtis ne daugiau kaip 30 %. Rezultatai, kurie palyginti su vidurkiu skiriasi daugiau kaip 30 %, turi b ūti atmesti, 
maišymo ir pripildymo metodika patobulinta ir bandymas pakartotas.
 
1.6. METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Pasiruošimas  
1.6.1.1.  Degioji medžiaga  
Kaip degioji medžiaga naudojama sausa pluoštin ė celiulioz ė, kurios 
plaušelių ilgis 50–250 μm, o vidutinis skersmuo – 25 μm (  3 ). Ne 
didesnio kaip 25 mm storio celiulioz ės sluoksnis 4 h džiovinamas 
iki pastoviosios mas ės esant 105 °C ir aušinamas bei prieš bandym ą 
laikomas desikatoriuje su džiovikliu. Vandens kiekis išdžiovintoje 
celiuliozėje turi b ūti mažesnis kaip 0,5 % sausos medžiagos 
masės ( 4 ). Prireikus džiovinimo trukm ė turi būti padidinta tokiam 
drėgmės kiekiui pasiekti (  5 ). Viso bandymo metu turi b ūti naudojama 
ta pati celiulioz ės siunta.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Pvz., JT transporto reglament ų kontekste. 
( 2 ) Pvz.: 1 nuorodoje naudojama 50 % (m/m) perchlorato r ūgštis ir 40 % (m/m) natrio 
chloratas. 
( 3 ) Pvz., Whatman Column Chromatographic Cellulose Powder CF 11, katalogo Nr. 4021 
050. 
( 4 ) Patvirtinama, pvz., titruojant Karlo Fišerio metodu. 
( 5 ) Be to, tok į drėgmės kiekį galima pasiekti kitu metodu, pvz., 24 h kaitinant vakuume 
esant 105  o C.
 1.6.1.2.  Aparat ūra 
1.6.1.2.1. S l ė g i n i s i n d a s  
Būtina turėti slėginį indą. Slėginį indą sudaro 89 mm ilgio ir 60 mm 
išorinio skersmens plieninis cilindras (žr. 1 paveiksl ą). Staklėmis 
gaminamos dvi plokštel ės priešingiems cilindro galams (sumažinan ­ 
čios skerspj ūvį iki 50 mm), kurios pad ėtų įtvirtinti cilindr ą, įstatant 
uždegimo žvak ę ir ventiliavimo angos aklidangt į. Indas su 20 mm 
skersmens anga iš abiej ų galų viduje platinamas iki 19 mm gylio ir 
sriegiamas 1 „Brit ų standarto vamzdinis sriegis arba jo metrinis 
atitikmuo. Sl ėgio mažinimo atvamzdis įsriegiamas į kreivąjį slėginio 
indo pavirši ų 35 mm nuo vieno galo ir 90  o kampu ištekintoms 
plokštelėms. Gręžiama 12 mm gylio anga, kurioje daromas sriegis 
įsukti atvamzdžiui, turin čiam 1/2“ Brit ų standarto vamzdin į (arba jo 
metrinio atitikmens) srieg į. Prireikus įstatomas inertin ės medžiagos 
sandariklis hermetiškumui užtikrinti. Atvamzdžio ilgis, matuojant nuo slėginio indo korpuso, lygus 55 mm, jame išgr ęžiama 6 mm 
skersmens anga. Atvamzdžio galas platinamas ir įsriegiamas diafrag ­
minio tipo sl ėgio keitliui įsukti. Galima naudoti bet kur į slėgio mata­
vimo įtaisą, kurio neveikt ų karštos dujos arba skilimo produktai ir 
kuris galėtų matuoti sl ėgio didėjimo greit į nuo 690 iki 2 070 kPa ne 
ilgiau kaip per 5 ms.
 
Į tolesnį nuo atvamzdžio sl ėginio indo gal ą įsukama uždegimo 
žvakė, turinti du elektrodus, vien ą izoliuotą nuo korpuso, o kit ą 
įžemintą žvakės korpuse. Į kitą slėginio indo gal ą įstatoma tr ūkioji 
membrana (tr ūkimo slėgis maždaug 2 200 kPa), kuri ą laiko kamštis 
su 20 mm anga. Prireikus uždegimo žvak ė sandarinama inertin ės 
medžiagos sandarikliu hermetiškumui užtikrinti. Vis ą sąranka tvirti ­
nama laikan čiajame stove naudojimui tinkamame aukštyje (2 
paveikslas). Stov ą paprastai sudaro mažaanglio plieno pagrindo 
plokštė, kurios matmenys yra 235 mm × 184 mm × 6 mm, ir 185 
mm ilgio kvadratin ė tuščiavidurė sekcija, kurios matmenys 
– 70 mm × 70 mm × 4 mm.  
Vienas kvadratin ės tuščiavidurės sekcijos galas nupjaunamas iš 
abiejų priešingų šonų dviem plokš čiabriaunėms 86 mm ilgio kojoms 
gauti. Šių plokščiųjų šonų galai nupjaunami 60  o kampu ir privirinami 
prie pagrindo plokšt ės. Viename viršutinio galo šone išpjaunama 22 
mm pločio ir 46 mm gylio anga, į kurią įsistato sl ėginio indo 
atvamzdis, kai visa sl ėginio indo s ąranka uždegimo žvake žemyn 
nuleidžiama į laikantįjį stovą. Prie žemesn ės tuščiavidurės sekcijos 
sienos iš vidaus privirinamas 30 mm plo čio ir 6 mm storio plieninis 
fiksatorius. Priešingoje sienoje įsriegiamos angos dviem 7 mm ilgio 
sparnuotosioms veržl ėms, kurios neleist ų slėginiam indui jud ėti. 
Slėginiam indui laikyti iš apa čios prie šonini ų sienų privirinamos 
dvi 12 mm plo čio ir 6 mm storio plienin ės juostos, įremtos į tuščia­
vidurės sekcijos pagrind ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2. U ž d e g i m o s i s t e m a  
Uždegimo sistem ą sudaro 25 cm ilgio ir 0,6 mm skersmens Ni/Cr 
viela, kurios savitoji varža yra 3,85 Ω/m. Viela susukama į apviją 
naudojant 5 mm skersmens stryp ą ir tvirtinama prie uždegimo žvak ės 
elektrodų. Apvijos konfig ūracija turi atitikti vien ą iš pavaizduot ų 3 
paveiksle. Atstumas nuo sl ėginio indo dugno iki apatin ės uždegimo 
apvijos pus ės turi būti 20 mm. Jei elektrod ų ilgis nereguliuojamas, 
uždegimo vielos galai nuo apvijos iki sl ėginio indo dugno turi b ūti 
izoliuoti keraminiu apvalkalu. Viela kaitinama naudojant stabili ­
zuotos įtampos srov ės šaltinį, kuris gal ėtų tiekti mažiausiai 10 A 
stiprumo srov ę. 
1.6.2.  Bandymo eiga  ( 1 ) 
Aparatas su sl ėgio keitliu ir kaitinimo sistema, bet be tr ūkiosios 
membranos, tvirtinamas stove uždegimo žvake žemyn. Chemin ėje 
stiklinėje stikline lazdele (  2 ) sumaišoma 2,5 g bandomojo skys čio ir 
2,5 g išdžiovintos celiulioz ės. Saugai užtikrinti, maišant tarp opera ­
toriaus ir mišinio turi b ūti saugos skydas. Jei mišinys užsidega 
maišant arba pilant į indą, toliau bandyti nereikia. Mišin į reikia 
dėti į slėginį indą mažomis dalimis tapšnojant ir užtikrinti, kad jis 
būtų dedamas apie uždegimo apvij ą ir gerai su ja liest ųsi. Svarbu kad 
dedant mišin į apvija neb ūtų deformuota, kadangi d ėl to gali b ūti 
gauti klaidingi rezultatai (  3 ). Trūkioji membrana dedama į vietą ir 
gerai užsukamas tvirtinimo kamštis. Indas su įkrova trūkiąja 
membrana į viršų įstatomas į laikantįjį stovą, kuris turi b ūti statomas 
tinkamoje šarvuotoje traukos spintoje arba deginimo kameroje. Prie 
uždegimo žvak ės kontakt ų jungiamas maitinimo šaltinis ir įjungiama 
10 A srov ė. Laikas nuo maišymo pradžios iki maitinimo įjungimo 
turi būti ne didesnis kaip 10 min.  
Slėgio keitliu gautas signalas užrašomas tinkama sistema, kuri leist ų 
gauti nepertraukiam ą slėgio kitimo laike kreiv ę ir kartu j ą analizuoti 
(pvz., pereinam ųjų vyksmų sąvirašis, sujungtas su diagram ų sąvi­
rašiu). Mišinys kaitinamas tol, kol plyšta tr ūkioji membrana, arba 
bent 60 s. Jei tr ūkioji membrana neplyšta, mišinys paliekamas 
aušti prieš tai j į atsargiai atidarant, imantis atsargumo priemoni ų, 
jei slėginiame inde dar b ūtų per didelis sl ėgis. Medžiaga ir kiekviena 
etaloninė medžiaga bandoma penkis kartus. Užrašomas laikas, per 
kurį slėgis padid ėja nuo 690 kPa iki 2 070 kPa virš atmosferos 
slėgio. Apskai čiuojama vidutin ė slėgio didėjimo trukm ė. 
Kartais medžiagos gali sukelti sl ėgio didėjimą (per didel į arba per 
mažą), kurio priežastis chemin ės reakcijos, neapib ūdinančios 
medžiagos oksiduojam ųjų savybių. Tokiais atvejais norint nustatyti 
reakcijos tip ą, bandym ą gali tekti kartoti, vietoj celiulioz ės naudojant 
inertinę medžiag ą, pvz., diatomit ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Oksidatoriaus ir celiulioz ės mišiniai turi b ūti laikomi potencialiai sprogiais mišiniais, 
todėl su jais reikia elgtis atsargiai. 
( 2 ) Praktiškai tai galima padaryti ruošiant didesn į nei bandymui reikia bandomojo skys čio ir 
celiuliozės 1:1 mišinio kiek į ir supilant 5 ± 0,1 g į slėginį indą. Kiekvienam bandymui 
ruošiamas naujas mišinys. 
( 3 ) Visų pirma turi b ūti išvengta gretim ų apvijos vij ų sąlyčio.
 2. DUOMENYS  
Bandomosios medžiagos ir etalonin ės (-ių) medžiagos (- ų) slėgio 
didėjimo trukm ės vertės. Bandym ų su inertine medžiaga sl ėgio didė­
jimo trukm ės vertės, jei tokie bandymai daromi.  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Apskaičiuojamos bandomosios medžiagos ir etalonin ės (-ių) 
medžiagos (- ų) vidutinės slėgio didėjimo trukm ės vertės. 
Apskaičiuojama bandym ų su inertine medžiaga sl ėgio didėjimo 
trukmės vertė, jei tokie bandymai daromi.  
Kai kurie rezultat ų pavyzdžiai pateikti 1 lentel ėje 
1 lentelė 
Rezultatų pavyzdžiai  ( a ) 
Medžiaga (  b ) 1:1 mišinio su celiulioze vidutin ė slėgio didėjimo 
trukmė 
(ms) 
Amonio dichromatas, sotusis vandeninis tirpalas  20 800  
Kalcio nitratas, sotusis vandeninis tirpalas  6 700  
Geležies (III) nitratas, sotusis vandeninis tirpalas  4 133  
Ličio perchloratas, sotusis vandeninis tirpalas  1 686  
Magnio perchloratas, sotusis vandeninis tirpalas  777  
Nikelio nitratas, sotusis vandeninis tirpalas  6 250  
Azoto rūgštis, 65 %  4 767 (  c ) 
Perchlorato r ūgštis, 50 %  121 (  c ) 
Perchlorato r ūgštis, 55 %  59  
Kalio nitratas, 30 % vandeninis tirpalas  26 690  
Sidabro nitratas, sotusis vandeninis tirpalas  (  d ) 
Natrio chloratas, 40 % vandeninis tirpalas  2 555 (  c ) 
Natrio nitratas, 45 % vandeninis tirpalas  4 133  
Inertinė medžiaga  
Vanduo: celiulioz ė (  d ) 
( a ) Žr. 1 nuorod ą dėl klasifikavimo pagal JT transportavimo schem ą. 
( b ) Sotieji tirpalai turi b ūti ruošiami esant 20 °C. 
( c ) Vidutin ė vertė, gauta darant tarplaboratorinius lyginamuosius tyrimus. 
( d ) Didžiausias 2 070 kPa sl ėgis nebuvo pasiektas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymų ataskaitoje pateikiama ši informacija:  
— bandomosios medžiagos tapatumas, sud ėtis, grynumas ir kitos 
savybės, 
— bandomosios medžiagos koncentracija,  
— naudojamos celiulioz ės džiovinimo metodika,  
— drėgmės kiekis naudojamoje celiulioz ėje, 
— matavim ų rezultatai,  
— inertin ės medžiagos bandym ų rezultatai, jei yra,  
— apskai čiuotosios vidutin ės slėgio didėjimo trukm ės vertės, 
— visi nukrypimai nuo šio metodo ir j ų pagrįstumas,  
— visa papildoma informacija arba pastabos rezultatams interpre ­
tuoti.  
3.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS (  1 ) 
Bandymų rezultatai įvertinti:  
a) pagal tai, ar bandomosios medžiagos ir celiulioz ės mišinys užsi ­
dega savaime; ir  
b) lyginant medžiagos ir etalonin ės (-ių) medžiagos (- ų) vidutinę 
slėgio didėjimo nuo 690 kPa iki 2 070 kPa trukm ę. 
Skystoji medžiaga turi b ūti laikoma oksidatoriumi, kai:  
a) medžiagos ir celiulioz ės santykio 1:1 mišinys, mas ės dalimis, 
užsidega savaime; arba  
b) medžiagos ir celiulioz ės santykio 1:1 mišinio, mas ės dalimis, 
vidutinė slėgio didėjimo trukm ė yra mažesn ė arba lygi 65 % 
(m/m) vandeninio azoto r ūgšties tirpalo ir celiulioz ės santykio 
1:1 mišinio, mas ės dalimis, vidutinei sl ėgio didėjimo trukmei.  
Siekiant išvengti klaiding ų teigiamų rezultatų, interpretuojant juos 
reikėtų atsižvelgti į rezultatus, gautus bandant medžiag ą su inertine 
medžiaga.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Žr. 1 nuorod ą dėl rezultat ų pagal JT transportavimo reglamentus interpretavimo, kai 
naudojamos kelios etalonin ės medžiagos.
 4. NUORODOS  
Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of 
Tests and Criteria. 3rd revised edition. UN Publication No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, page 342. Test O.2: Test for oxidi ­
zing liquids.
 
1 paveikslas  
Slėginis indas
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
2 paveikslas  
Laikantysis stovas
  
3 paveikslas  
Uždegimo sistema
  
Pastaba: galima naudoti bet kuri ą iš šių schemų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  PLAUŠELI Ų SKERSMENS ILGIO SVORINIS GEOMETRINIS 
VIDURKIS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šiame metode aprašyta biri ųjų dirbtini ų mineralini ų 
plaušelių (MMMF) skersmens ilgio svorinio geometrinio vidurkio 
(Length Weighted Geometric Mean Diameter  – LWGMD) matavimo 
metodika. Kadangi LWGMD generalin ės aibės vertės turės 95 % 
tikimybę būti tarp imties 95 % pasikliovimo lygmen ų (LWGMD ± 
dviguba standartin ės paklaidos vert ė), ataskaitoje pateikta vert ė 
(bandymo vert ė) bus imties apatinio 95 % pasikliovimo r ėžio vertė 
(t.y. LWGMD – dviguba standartin ės paklaidos vert ė). Metodas 
pagrįstas atnaujintu (1994 m. birželis) Saugos ir sveikatos 
agentūros (HSE) pramonei skirtos metodikos projektu, kuris buvo 
suderintas ECFIA ir HSE pasitarime Chesteryje 1993 m. rugs ėjo 
26 d. ir kuris buvo parengtas pagal antr ąjį tarplaboratorin į tyrimą 
bei jam yra skirtas (1, 2). Šis matavimo metodas gali b ūti taikomas 
MMMF turin čių biriųjų medžiag ų arba produkt ų plaušelių skersme­
niui apibūdinti, įskaitant ugniai atsparios keramikos pluoštus (RCF), 
dirbtinius stiklo pluoštus (MMVF), kristalinius ir polikristalinius 
pluoštus.  
Ilgio svorinis skai čiavimas yra b ūdas kompensuoti skersmens pasis ­
kirstymą dėl ilgų plaušelių trūkinėjimo, imant medžiagos ėminius 
arba ją tvarkant. MMMF skersmens ver čių pasiskirstymui matuoti 
naudojama geometrin ė statistika (geometrinis vidurkis), kadangi ši ų 
skersmens ver čių pasiskirstymui aproksimuoti naudojamas lognorma ­
lusis skirstinys.  
Ilgio ir skersmens matavimas yra varginantis ir daug laiko užimantis 
procesas, ta čiau jei būtų matuojami tik tie plaušeliai, kurie lie čia be 
galo plon ą liniją rastrinio elektroninio mikroskopo (SEM) regos 
lauke, tikimyb ė pasirinkti tam tikr ą plaušelį proporcinga jo ilgiui. 
Kadangi taip atsižvelgiama į ilgį darant ilgio svorinius apskai čia­
vimus, vienintelis reikalingas matmuo yra skersmuo ir LWGMD – 2SE galima apskai čiuoti aprašytu b ūdu.
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Dalelė: objektas, kurio ilgio ir plo čio santykis yra mažesnis kaip 3:1.  
Plaušelis : objektas, kurio ilgio ir plo čio santykis (matmen ų santykis) 
yra ne mažesnis kaip 3:1.  
1.3. TAIKYMO SRITIS IR APRIBOJIMAI  
Metodas skirtas tirti skersmens ver čių pasiskirstym ą, kai vidutinis 
medianinis skersmuo yra nuo 0,5 μm iki 6 μm. Galima matuoti 
didesnes skersmens vertes, jeigu b ūtų naudojamas mažesnis SEM 
didinimas, ta čiau mažesnio skersmens plaušeli ų skirstiniams vis 
labiau pasireikšt ų metodo apribojimai, tod ėl rekomenduojama 
naudoti matavimus TEM (elektroniniu peršvietimo mikroskopu), jei 
skersmens medianin ė vertė yra mažesn ė kaip 0,5 μm. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. BANDYMO METODO ESM Ė 
Imamas tam tikras kiekis tipini ų pluoštini ų audinių arba supilt ų 
biriųjų plaušelių kerno ėminių. Biriųjų plaušelių ilgis mažinamas 
juos sutrupinant b ūdu, ir gautas tipinis antrinis ėminys disperguo ­
jamas vandenyje. Alikvotin ės dalys ekstrahuojamos ir filtruojamos 
per 0,2 μm akutes turint į polikarbonatin į filtrą ir ruošiamos tirti 
rastrinio elektroninio mikroskopo (SEM) metodais. Plaušeli ų 
skersmuo matuojamas esant ×10 000 arba didesniam ekrano didi ­
nimui (  1 ), taikant linij ų susikirtimo metod ą nepaslinktajai skersmens 
medianinei vertei gauti. Apskai čiuojamas apatinis 95 % pasikliovimo 
intervalas (pagal vienpus į kriterijų) medžiagos plaušeli ų skersmens 
geometrinio vidurkio mažiausiai vertei gauti.  
1.5. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.5.1.  Saugos įspėjimai  
Turi būti kiek įmanoma sumažintas ore esan čių plaušelių poveikis 
žmonėms, o su sausais plaušeliais turi b ūti dirbama tik traukos spin ­
toje arba apsaugin ėje kameroje su pirštin ėmis. Turi b ūti vykdomas 
periodinis personalo veikimo monitoringas kontrol ės metodų efekty­
vumui tikrinti. Dirbant su MMMF b ūtina mūvėti vienkartines pirš ­
tines, kad mažiau b ūtų dirginama oda ir b ūtų išvengta kryžminio 
užteršimo.  
1.5.2.  Aparat ūra/įranga  
— Presai ir presformos (kuriose galima gauti 10 MPa);  
— 0,2 μm akučių kapiliarini ų akučių filtrai iš polikarbonato (25 mm 
skersmens);  
— 5 μm akučių membraninis filtras iš celiulioz ės esterių, naudo­
jamas kaip atraminis filtras;  
— stiklinis filtravimo aparatas (arba vienkartin ės filtravimo 
sistemos), pritaikytas 25 mm skersmens filtrams (pvz.,  Millipore  
stiklinis mikroanaliz ės rinkinys, tipas Nr. XX10 025 00);  
— šviežiai distiliuotas vanduo, filtruotas per 0,2 μm akučių filtrą 
mikroorganizmams pašalinti;  
— dulkinamojo dengimo įrenginys su aukso arba aukso/paladžio 
taikiniu;  
— rastrinis elektroninis mikroskopas, kurio skyra b ūtų iki 10 nm ir 
turėtų ×10 000 didinim ą; 
— įvairios priemon ės: mentel ės, 24 tipo skalpelis, pincetas, SEM 
mėgintuvėliai, grafitiniai klijai arba grafitin ė lipnioji juosta, 
sidabriniai klijai;  
— ultragarsinis zondas arba stalin ė ultragarsin ė vonia;  
— kerno ėmiklis arba kamš čių grąžtas, kerno m ėginiams iš MMMF 
audinių lakštų imti.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Šis didinimas nurodomas 3 μm plaušeliams, 6 μm plaušeliams labiau gali tikti × 5 000 
didinimas.
 1.5.3.  Bandymo eiga  
1.5.3.1.  Ėminių ėmimas  
Audiniams ir šilumin ės izoliacijos lakštams naudojamas 25 mm 
kerno ėmiklis arba kamš čių grąžtas skerspj ūvio ėminiams paimti. 
Ėminių ėmimo vietos turi b ūti vienodai išd ėstytos skersai nedidelio 
ilgio lakšt ų arba ėminiai imami iš atsitiktini ų vietų, jei yra didelio 
ilgio lakšt ų atraižos. Tokia pa čia įranga galima imti atsitiktinius 
biriųjų plaušelių ėminius.. Jei įmanoma, turi b ūti imami šeši ėminiai, 
siekiant įvertinti erdvinius biriosios medžiagos nukrypimus.  
Šeši kerno ėminiai trupinami 50 mm skersmens presformoje esant 10 
MPa. Medžiaga sumaišoma mentele ir iš naujo suspaudžiama esant 10 MPa. Medžiaga išimama iš presformos ir laikoma uždarytame stikliniame butelyje.
 
1.5.3.2.  Ėminių ruošimas  
Prireikus organin į rišiklį galima pašalinti, jei plaušeliai maždaug 
vieną valandą kaitinami 450 °C temperat ūros krosnyje.  
Ėminys supilamas į kūgį ir taikomas ketvir čiavimo metodas jam 
toliau padalyti (šis veiksmas turi b ūti daromas traukos spintoje).  
Nedidelis ėminio kiekis (< 0,5 g) mentele įdedamas į 100 ml šviežiai 
distiliuoto vandens, filtruoto per 0,2 μm membranin į filtrą (galima 
naudoti kitus ypa č švaraus vandens šaltinius, jei b ūtų įrodytas j ų 
tinkamumas). Ėminys kruopš čiai disperguojamas ultragarsiniu 
zondu, dirban čiu 100 W galia ir reguliuojamu kavitacijai gauti. (Jei 
zondo nėra, taikomas šis metodas: kelis kartus indas purtomas ir 
apverčiamas 30 s; penkias minutes veikiamas ultragarsu stalin ėje 
ultragarsin ėje vonioje; v ėliau indas kelis kartus purtomas ir apver ­ 
čiamas dar 30 s).  
Iškart po plaušeli ų dispergavimo paimamos kelios alikvotin ės dalys 
(pvz., trys 3, 6 ir 10 ml alikvotin ės dalys) pla čios angos pipete (2–5 
ml tūrio). 
Kiekviena alikvotin ė dalis siurbiama vakuumu per 0,2 μm polikar ­
bonatinį filtrą, uždėtą ant 5 μm akučių MEC atraminio filtro, naudo ­
jant cilindro formos 25 mm stiklinio filtro piltuv ą. Į piltuvą įpilama 
maždaug 5 ml filtruoto distiliuoto vandens ir alikvotin ė ėminio dalis 
lėtai lašinama iš pipet ės į vandenį, pipetės galiuką laikant žemiau 
menisko. Supylus ėminį, pipetė ir filtro indas turi b ūti kruopš čiai 
plaunami, nes ploni plaušeliai paprastai lieka ant paviršiaus.  
Filtras atsargiai išimamas ir, prieš dedant į džiovinimo ind ą, atski­
riamas nuo atsarginio filtro.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Ketvirtadalis arba pus ė filtro su filtruotomis nuos ėdomis pjaunama 
24 tipo skalpeliu, naudojant supimo veiksm ą. Išpjauta dalis kruopš ­ 
čiai tvirtinama prie SEM stovo lipnios grafitin ės juostos gabaliuku 
arba grafitiniais klijais. Elektriniam kontaktui pagerinti bent trijose stovo ir filtro krašt ų vietose užtepama sidabrini ų klijų. Išdžiūvus 
klijams/sidabro klijams, ant nuos ėdų paviršiaus užpurškiamas 
maždaug 50 nm aukso arba aukso/paladžio sluoksnis.
 
1.5.3.3.  SEM kalibravimas ir darbas  
1.5.3.3.1. K a l i b r a v i m a s  
SEM kalibravimas turi b ūti tikrinamas bent kart ą per savait ę (geriau 
būtų kartą per dieną) sertifikuotu kalibravimo tinkleliu. Kalibravimas 
turi būti tikrinamas pagal sertifikuot ą etaloną ir jei išmatuota 
vertė (SEM) neatitinka sertifikuotosios vert ės ±2 % tikslumu, SEM 
reikia kalibruoti ir dar kart ą tikrinti.  
SEM turi b ūti įmanoma skirti bent 0,2 μm mažiausi ą matomą skers­
menį, naudojant tikr ąją ėminio matric ą esant × 2 000 didinimui.  
1.5.3.3.2. D a r b a s  
SEM turi dirbti naudojant 10 000 didinim ą ( 1 ), esant sąlygoms, užtik ­
rinančioms ger ą skyrą ir priimtin ą vaizdą, kai mažas skleidimo 
greitis, pvz., 5 s kadrui. Nors skirting ų SEM veikimo reikalavimai 
gali skirtis, paprastai geriausiam matomumui ir skyrai gauti, kai 
tiriamos palyginti mažos molekulin ės masės medžiagos, greitinimo 
įtampa turi b ūti 5–10 keV, nustatant maž ą dėmės dydį ir trump ą 
darbinį atstumą. Kadangi daromi linij ų kirtimo matavimai, turi b ūti 
naudojamas 0  o polinkis perfokusavimui sumažinti arba, jei SEM turi 
eucentrinį staliuką, turi b ūti naudojamas eucentrinis darbinis 
atstumas. Galima naudoti mažesn į didinimą, jei medžiaga neturi 
mažų (mažo skersmens) plaušeli ų ir jei plaušeli ų skersmens vert ės 
yra didelės (> 5 μm). 
1.5.3.4.  Dydžio nustatymas  
1.5.3.4.1. T y r i m a s ė m i n i u i į v e r t i n t i , e s a n t m a ž a m d i d i ­
n i m u i  
Ėminys iš pradži ų turi būti tiriamas esant mažam didinimui, kad b ūtų 
galima rasti duomen ų apie dideli ų plaušelių susikaupim ą ir įvertinti 
plaušelių tankį. Jei susikaupimas yra per didelis, rekomenduojama 
ruošti nauj ą ėminį. 
Siekiant statistinio tikslumo, b ūtina matuoti tam tikr ą mažiausi ą plau­ 
šelių skaičių, todėl didelis plaušeli ų tankis lyg ir b ūtų pageidautinas, 
kadangi tuštiems laukams tirti reikia daug laiko ir toks tyrimas nepa ­
didina analiz ės duomen ų. Tačiau jei filtras yra perkrautas, tampa 
sunku išmatuoti visus matuotinus plaušelius, ir maži plaušeliai gali 
likti nepasteb ėti, kadangi b ūtų paslėpti po dideliais plaušeliais.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) Apie 3 μm plaušelius žr. pirmiau pateikt ą pastabą.
 Gali būti poslinkis į per dideli ų LWGMD įverčių pusę, jei plaušeli ų 
tankis būtų didesnis kaip 150 plaušeli ų kertamos linijos milimetrui. 
Iš kitos pus ės, dėl mažos plaušeli ų koncentracijos pailg ėja analizės 
laikas ir dažnai labiau apsimoka paruošti ėminį, kurio plaušeli ų 
tankis būtų netoli optimalaus, nei t ęsti plaušeli ų skaičiavimą ant filtrų 
su maža koncentracija. Esant optimaliam plaušeli ų tankiui, skai čiuo­
tinų plaušelių vidurkis tur ėtų būti vienas arba du plaušeliai laukuose 
su 5 000 didinimu. Vis d ėlto optimalus tankis priklausys nuo plau ­ 
šelių dydžio (skersmens), tod ėl būtina, kad operatorius naudot ų 
ekspertų įvertinimą, siekiant nuspr ęsti, ar plaušeli ų tankis yra arti 
optimalaus ar ne.  
1.5.3.4.2. I l g i o s v o r i n i s p l a u š e l i ų s k e r s m e n s v e r č i ų į v e r t i ­
n i m a s  
Skaičiuojami tik tie plaušeliai, kurie lie čia (arba kerta) (be galo) 
ploną liniją SEM ekrane. Šiam tikslui per ekrano vidur į brėžiama 
horizontali (arba vertikali) linija.  
Kitaip galima pažym ėti vieną tašką ekrano centre ir prad ėti neper­
traukiamai jud ėti viena kryptimi skersai filtro. Matuojamas ir užra ­ 
šomas skersmuo vis ų plaušelių, turinčių didesnį kaip 3:1 matmen ų 
santykį ir liečiančių arba kertan čių šį tašką. 
1.5.3.4.3. P l a u š e l i ų d y d ž i o n u s t a t y m a s  
Rekomenduojama matuoti ne mažiau kaip 300 plaušeli ų. Kiekvienas 
plaušelis matuojamas tik kart ą susikirtimo su linija taške arba ekrane 
nupieštame taške (arba arti susikirtimo taško, jei plaušelio krašt ų 
nesimato). Jei pasitaiko nevienodo skerspj ūvio plaušeliai, turi b ūti 
naudojamas matmuo, atitinkantis plaušelio vidutin į skersmen į. Reikia 
kruopščiai nustatyti plaušeli ų kraštą ir matuoti trumpiausi ą atstumą 
tarp plaušelio krašt ų. Dydį galima matuoti ži ūrint, arba ant saugom ų 
vaizdų arba fotografij ų. Rekomenduojama naudoti pusiau automa ­
tines vaizdo matavimo sistemas, kurios tiesiogiai siun čia duomenis 
į elektronin ę lentelę, nes taip taupomas laikas, šalinamos užrašymo 
klaidos ir galima automatizuoti apskai čiavimus.  
Esant mažam didinimui, tikrinami ilg ų plaušelių galai, siekiant įsiti­
kinti, ar jie nesusisuka ir dar kart ą neatsiduria matavimo regos lauke 
ir yra matuojami tik vien ą kartą. 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Plaušelių skersmens vert ės paprastai neatitinka normaliojo skirstinio. 
Tačiau padarius logaritmin ę transformacij ą galima gauti skirstin į, 
kuris aproksimuot ų normalųjį. 
Apskaičiuojamas n plaušeli ų skersmens (D) nat ūraliojo logaritmo 
verčių (lnD) aritmetinis vidurkis (vidutinis lnD) ir standartinis 
nuokrypis (SD  lnD ). 
vidutinis ln D ¼ ΣlnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
ΣðlnD – vidutinis lnD Þ 2 
n – 1 s 
(2) 
Standartin ės paklaidos vertei (SE  lnD ) gauti standartinis nuokrypis 
dalijamas iš matavim ų skaičiaus (n) kvadratin ės šaknies. 
SE lnD ¼ SD ﬃﬃﬃ n p (3) 
Geometrinio vidurkio bei dvigubos geometrin ės standartin ės 
paklaidos skirtumui gauti iš aritmetinio vidurkio vert ės atimama 
dviguba standartin ė paklaida ir apskai čiuojama šios vert ės (vidurkio 
ir dvigubos standartin ės paklaidos skirtumo) eksponent ė. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðvidutinis lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymų ataskaitą turi sudaryti bent ši informacija:  
— LWGMD – 2SE vert ė; 
— visi nukrypimai, ypa č galintys daryti įtaką rezultatų preciziš­
kumui ir tikslumui, ir atitinkami duomenys jiems pagr įsti. 
4. NUORODOS  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999.  
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: 
Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Execu ­
tive. Research and Laboratory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23.  PASISKIRSTYMO KOEFICIENTAS (1-OKTANOLIS / VANDUO). 
LĖTO MAIŠYMO METODAS  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 123 (OECD 
bandymo gair ės Nr. 123) (2006 m.). 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo 
koeficiento (P  OW ) vertės, kai log P  OW neviršija 8,2, tiksliai nustatytos 
taikant lėto maišymo metod ą (1). Todėl Šis bandymo metodas yra tinkamas 
tiesiogiai nustatyti didelio hidrofobiškumo medžiag ų P OW . 
2. Kiti 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficiento (P  OW ) nustatymo 
metodai yra kratomos kolbos metodas (2) ir P  OW nustatymas remiantis 
atvirkštin ės fazės HPLC sulaikymo savyb ėmis (3). Kratomos kolbos 
metodui b ūdingi artefaktai, susidarantys labai mažiems oktanolio lašeliams 
pereinant į vandenin ę fazę. Didėjant P  OW vertėms, dėl šių lašelių buvimo 
vandeninėje fazėje vis labiau pervertinama bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija vandenyje. Tod ėl šis metodas taikytinas tik toms 
cheminėms medžiagoms, kuri ų P OW vertė mažesnė nei 4. Antrasis metodas 
grindžiamas patikimais tiesiogiai nustatyt ų P OW verčių duomenimis, naudo ­
jamais tiksliai nustatyti HPLC sulaikymo savybi ų ir išmatuot ų P OW verčių 
tarpusavio priklausomyb ę. Buvo paskelbtas OECD gairi ų, skirtų nustatyti 
jonizuojam ųjų chemini ų medžiag ų 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo 
koeficientus, projektas (4), ta čiau jis nebenaudotinas.  
3. Šis bandymo metodas parengtas Nyderlanduose. Čia aprašyt ų metodų tiks­
lumas patvirtintas ir pagerintas per tarplaboratorin į patvirtinam ąjį tyrimą, 
kuriame dalyvavo 15 laboratorij ų (5). 
PIRMINIAI ASPEKTAI  
Reikšmė ir taikymas  
4. Nagrin ėjant inertines organines chemines medžiagas, nustatyta labai stipri ų 
priklausomybi ų tarp 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficient ų (P OW ) 
ir tų medžiag ų bioakumuliacijos žuvyse. Be to, įrodyta, kad P  OW susijęs su 
toksiškumu žuvims, taip pat su chemini ų medžiag ų sugertimi į kietąsias 
medžiagas, pvz., dirvožemius ir nuos ėdas. Išsami ši ų priklausomybi ų 
apžvalga pateikta literat ūros šaltinyje (6).  
5. Nustatyta didel ė 1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficiento ir kit ų 
cheminės medžiagos savybi ų, kurios yra svarbios aplinkos toksikologijai ir 
chemijai, tarpusavio priklausomybi ų įvairovė. Todėl 1-oktanolio / vandens 
pasiskirstymo koeficientas ilgainiui tapo pagrindiniu kriterijumi vertinant 
cheminių medžiag ų keliamą pavojų aplinkai, taip pat prognozuojant 
cheminių medžiag ų išliekamum ą aplinkoje.  
Taikymo sritis  
6. Manoma, kad atliekant l ėto maišymo bandym ą sumažinamas labai maž ų 
lašelių susidarymas iš 1-oktanolio lašeli ų vandenin ėje fazėje. Todėl neper­
vertinama koncentracija vandenyje, susidaranti d ėl bandomosios chemin ės 
medžiagos molekuli ų, susijusių su šiais lašeliais. D ėl šios priežasties l ėto 
maišymo metodas yra labai tinkamas nustatyti P  OW , susijusį su chemin ėmis 
medžiagomis, kuri ų numatomos log P  OW vertės yra 5 arba didesn ės ir 
kurioms taikant kratomos kolbos metod ą (2) veikiausiai b ūtų gauti klaidingi 
rezultatai.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
APIBRĖŽTIS IR VIENETAI  
7. Chemin ės medžiagos pasiskirstymo tarp vandens ir lipofilinio tirpiklio 
(1-oktanolio) koeficientas rodo chemin ės medžiagos pusiausvyros pasiskirs ­
tymą dviejose faz ėse. Pasiskirstymo tarp vandens ir 1-oktanolio koeficientas 
(P OW ) apibrėžiamas kaip bandomosios chemin ės medžiagos pusiausvyros 
koncentracij ų 1-oktanolyje, įsotintame vandeniu (C  O ), ir vandenyje, įsotin­
tame 1-oktanoliu (C  W ), santykis.  
P OW ¼ C O=C W 
Koncentracij ų santykis yra bematis. Dažniausiai jis nurodomas kaip loga ­
ritmas pagrindu 10 (log P  OW ). P  OW priklauso nuo temperat ūros, todėl patei­
kiant duomenis tur ėtų būti nurodyta matavimo temperat ūra. 
METODO PRINCIPAS  
8. Norint nustatyti pasiskirstymo koeficient ą, pasiekiama vandens, 1-oktanolio 
ir bandomosios chemin ės medžiagos tarpusavio pusiausvyra esant pastoviai 
temperatūrai. Tada nustatomos bandomosios chemin ės medžiagos koncent ­
racijos abiejose faz ėse. 
9. Bandym ų sunkumus, susijusius su labai maž ų lašelių susidarymu atliekant 
kratomos kolbos bandym ą, galima sumažinti atliekant čia siūlomą lėto 
maišymo bandym ą. Atliekant l ėto maišymo bandym ą, 1-oktanolio ir bando ­
mosios chemin ės medžiagos pusiausvyra pasiekiama termostatu kontroliuo ­
jamame maišomame reaktoriuje. Per ėjimas iš vienos faz ės į kitą pagreiti­
namas maišant. Maišant sukuriamas nedidelis s ūkuriavimas, kuriuo pageri ­
namas per ėjimas iš 1-oktanolio į vandenį (ir atvirkš čiai) be labai maž ų 
lašelių susidarymo (1).  
BANDYMO TINKAMUMAS  
10. Kadangi kit ų chemini ų medžiag ų, be bandomosios, buvimas gali tur ėti 
įtakos bandomosios chemin ės medžiagos aktyvumo koeficientui, bandomoji 
cheminė medžiaga tur ėtų būti bandoma kaip gryna chemin ė medžiaga. Per 
1-oktanolio / vandens pasiskirstymo bandym ą turėtų būti naudojama pati 
gryniausia chemin ė medžiaga, kokios tik galima įsigyti rinkoje.  
11. Šis metodas taikomas grynoms chemin ėms medžiagoms, kurios nesiskaido 
ar nesijungia ir kurioms neb ūdinga aktyvi s ąveika. Jis gali b ūti taikomas 
nustatyti toki ų cheminių medžiag ų ir mišini ų 1-oktanolio / vandens pasis ­
kirstymo koeficient ą. Jeigu metodas taikomas mišiniams, nustatytieji 1-okta ­
nolio / vandens pasiskirstymo koeficientai yra s ąlyginiai ir priklauso nuo 
cheminės bandomojo mišinio sud ėties ir nuo elektrolit ų, kurie naudojami 
kaip vandenin ė fazė, sudėties. Įtraukus papildom ų etapų, šis metodas taip 
pat gali b ūti taikomas besiskaidantiems arba besijungiantiems junginiams 
(12 skirsnis).  
12. Dėl įvairios pusiausvyros vandenyje ir 1-oktanolyje, kurie naudojami per 
besiskaidan čių cheminių medžiag ų, pvz., organini ų rūgščių ir fenolių, orga­
ninių bazių ir organometalini ų cheminių medžiag ų, pasiskirstymo proces ą, 
1-oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficientas yra s ąlyginė konstanta, 
labai priklausoma nuo elektrolit ų sudėties (7) (8). Tod ėl nustatant 1-okta ­
nolio / vandens pasiskirstymo koeficient ą būtina bandymo metu kontroliuoti 
pH ir elektrolit ų sudėtį ir tai nurodyti ataskaitoje. Vertinant šiuos pasiskirs ­
tymo koeficientus, b ūtina atsižvelgti į ekspertų nuomon ę. Taikant disocia ­
cijos konstantos (- ų) vertę (-es), turi b ūti parinktos tinkamos pH vert ės, kad 
pasiskirstymo koeficientas b ūtų nustatytas kiekvienai jonizacijos b ūklei. 
Atliekant bandymus su organometaliniais junginiais, turi b ūti naudojami 
nekompleksodariniai buferiai. Atsižvelgiant į turimas žinias apie vandens 
chemiją (kompleksodaros konstantas, disociacijos konstantas), Bandymo 
sąlygos tur ėtų būti parinktos taip, b ūtų galima įvertinti bandomosios 
cheminės medžiagos atmainavim ą. Per visus bandymus naudojant fonin į 
elektrolitą turėtų būti užtikrinta tokia pat jonin ė jėga. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Atliekant bandym ą gali kilti sunkum ų, kai bandymas atliekamas su chemi ­
nėmis medžiagomis, kurios prastai tirpsta vandenyje arba kuri ų P OW yra 
didelis, nes koncentracijos vandenyje tampa labai mažos ir sunku jas tiksliai nustatyti. Aprašant š į bandymo metod ą patariama, kaip spr ęsti šią problemą.
 
INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ CHEMIN Ę MEDŽIAG Ą 
14. Cheminiai reagentai tur ėtų būti analizinio arba didesnio grynumo. Rekomen ­
duojama naudoti žym ėtąsias bandom ąsias chemines medžiagas, kuri ų 
cheminė sudėtis yra žinoma ir kuri ų grynumas, pageidautina, ne mažesnis 
kaip 99 %, arba radioaktyviu izotopu žym ėtąsias bandom ąsias chemines 
medžiagas, kuri ų cheminė sudėtis ir radiocheminis grynumas yra žinomi. 
Jeigu naudojamos trumpo pusinio gyvavimo atsekamosios medžiagos, tur ėtų 
būti taikomos skilimo pataisos. Jeigu naudojamos radioaktyviu izotopu 
žymėtosios bandomosios chemin ės medžiagos, tur ėtų būti taikomas 
cheminei medžiagai pritaikytas analiz ės metodas, kuriuo b ūtų užtikrinama, 
jog išmatuotasis radioaktyvumas b ūtų tiesiogiai susij ęs su bandom ąja 
chemine medžiaga.  
15. Log P  OW įvertis gali b ūti gaunamas naudojant komercin ę programin ę įrangą, 
skirtą apskaičiuoti log P  OW , arba naudojant tirpumo abiejuose tirpikliuose 
santykį. 
16. Prieš atliekant l ėto maišymo bandym ą, skirtą nustatyti P  OW , reikėtų gauti 
tokią informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiag ą: 
a) struktūrinė formulė; 
b) tinkami analiz ės metodai, skirti nustatyti chemin ės medžiagos koncent ­
raciją vandenyje ir 1-oktanolyje;  
c) jonizuojam ųjų cheminių medžiag ų disociacijos konstanta (-os) (OECD 
Guideline 112 (OECD gair ės Nr. 112) (9));  
d) tirpumas vandenyje (10);  
e) abiotin ė hidrolizė (11);  
f) lengvas biologinis skaidomumas (12);  
g) garų slėgis (13).  
METODO APRAŠYMAS  
Įranga ir aparat ūra 
17. Reikalinga įprasta laboratorin ė įranga, pirmiausia šie dalykai:  
— vandeninei fazei maišyti naudojami magnetiniai maišytuvai ir teflonu 
dengtos maišymo mentel ės, 
— analiz ės prietaisai, tinkami nustatyti bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracij ą atsižvelgiant į numatomas koncentracijas,  
— maišymo indas su čiaupu apa čioje; atsižvelgiant į log P  OW įvertį ir 
bandomojo mišinio aptikimo rib ą (AR), turi b ūti apsvarstyta galimyb ė 
naudoti toki ų pat geometrini ų savybių reaktorių, kurio talpa b ūtų didesnė 
nei vienas litras, kad chemin ės medžiagos ekstrahavimo ir analiz ės tiks­
lais būtų galima paimti pakankam ą kiekį vandens. Taip vandens ekst ­
rakte susidarys didesn ės koncentracijos ir analitinis tyrimas bus patiki ­
mesnis. 1 pried ėlyje pateikta lentel ė, kurioje nurodytas mažiausias 
būtinas kiekis, mišinio AR, jo apskai čiuotasis log P  OW ir jo tirpumas 
vandenyje. Lentel ė sudaryta remiantis log P  OW priklausomybe nuo 
tirpumo oktanolyje ir vandenyje rodikli ų santykio, kaip nurod ė Pinsuwan 
ir kiti (14):  
log P  OW ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
čia: 
SR ¼ S oct=S w (moliais)  
ir Lyman (15) nustatyta priklausomybe, skirta prognozuoti tirpum ą 
vandenyje. Tirpumo vandenyje rodikliai, apskai čiuoti naudojant 1 prie ­
dėlyje pateikt ą lygtį, turi būti laikomi pirmuoju įverčiu. Reikėtų atkreipti 
dėmesį, kad naudotojas gali apskai čiuoti tirpum ą vandenyje ir naudo ­
damas bet koki ą kitą priklausomyb ę, kuri, jo nuomone, geriau apib ūdina 
hidrofobiškumo ir tirpumo s ąryšį. Pvz., prognozuojant kiet ųjų mišinių 
tirpumą, rekomenduojama atsižvelgti į lydymosi temperat ūrą. Jeigu 
naudojama pakeista lygtis, reik ėtų įsitikinti, ar lygtis taip pat tinkama 
skaičiuoti tirpum ą oktanolyje. 2 pried ėlyje pateikta stiklu gaubto 
maišymo indo, kurio talpa apie vien ą litrą, schema. Nustatyta, kad 2 
priedėlyje pavaizduoto indo proporcijos yra tinkamos ir tur ėtų būti išsau­
gotos naudojant kitokio dydžio aparat ą, 
— būtina turėti pastovios temperat ūros išlaikymo per l ėto maišymo 
bandymą priemonę. 
18. Indai tur ėtų būti pagaminti iš inertin ės medžiagos, kad adsorbcija į indo 
paviršių būtų labai maža.  
Bandomųjų tirpalų ruošimas  
19. P  OW turėtų būti nustatomas naudojant pat į gryniausi ą 1-oktanol į, kokio tik 
galima įsigyti rinkoje (ne mažesnio kaip 99 % grynumo). Rekomenduojama 
1-oktanol į gryninti j į ekstrahuojant r ūgštimi, baze ir vandeniu, o tada išdžio ­
vinant. Be to, 1-oktanolis gali b ūti gryninamas distiliavimo b ūdu. Išgry ­
nintas 1-oktanolis bus naudojamas paruošti etaloninius bandom ųjų cheminių 
medžiagų tirpalus. Nustatant P  OW naudojamas vanduo turi b ūti distiliuotas 
stiklu arba kvarcu arba išgautas iš gryninimo sistemos, arba turi b ūti naudo­
jamas HPLC kokyb ės vanduo. Distiliuotas vanduo turi b ūti filtruojamas per 
0,22 μm filtrą; siekiant patikrinti, ar koncentruotuose ekstraktuose n ėra prie­
maišų, kurios gal ėtų susimaišyti su bandom ąja chemine medžiaga, taip pat 
turėtų būti įterpiami tuštieji ėminiai. Jeigu naudojamas stiklo pluošto filtras, 
jis turėtų būti išvalytas ne trumpiau kaip tris valandas kaitinant 400 °C 
temperatūroje. 
20. Prieš bandym ą abu tirpikliai įsotinami vienas kitu pasiekiant j ų pusiausvyr ą 
pakankamai dideliame inde. Tai atliekama dvi paras l ėtai maišant dviej ų 
fazių sistemą. 
21. Parenkama tinkama bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija ir ištir ­
pinama 1-oktanolyje ( įsotintame vandeniu). 1-oktanolio / vandens pasiskirs ­
tymo koeficientas turi b ūti nustatytas atskiestuose tirpaluose, įpiltuose į 1- 
oktanolį ir vanden į. Todėl bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija 
neturėtų viršyti 70 % jos tirpumo, susidarant ne didesnei kaip 0,1 M 
koncentracijai kiekvienoje faz ėje (1). Per bandym ą naudojami 1-oktanolio 
tirpalai turi b ūti be suspenduotos kietosios bandomosios chemin ės 
medžiagos.  
22. Tinkamas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis ištirpinamas 1-oktano ­
lyje (įsotintame vandeniu). Jeigu P  OW įvertis didesnis kaip penki, b ūtina 
imtis atsargumo priemoni ų, kad per bandym ą naudojamuose 1-oktanolio 
tirpaluose neb ūtų suspenduotos kietosios bandomosios chemin ės medžiagos. 
Šiuo tikslu su chemin ėmis medžiagomis, kuri ų apskaičiuotoji log P  OW vertė 
didesnė kaip 5, atliekama tokia proced ūra: 
— bandomoji chemin ė medžiaga ištirpinama 1-oktanolyje ( įsotintame 
vandeniu),  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— pakankamai ilgai palaukiama, kol nus ės tirpale suspenduota kietoji 
cheminė medžiaga. Nus ėdimo laikotarpiu stebima bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracija,  
— kai išmatuotos koncentracijos 1-oktanolio tirpale vert ės tampa pastovios, 
pradinis tirpalas atskiedžiamas tinkamu 1-oktanolio kiekiu,  
— matuojama atskiesto pradinio tirpalo koncentracija. Jeigu išmatuota 
koncentracija atitinka atskiedimo laipsn į, atskiestas pradinis tirpalas 
gali būti naudojamas per l ėto maišymo bandym ą. 
Ėminių ekstrahavimas ir analiz ė 
23. Bandomajai cheminei medžiagai ištirti tur ėtų būti taikomas patvirtintas 
analizės metodas. Tyrin ėtojai turi pateikti įrodymų, kad koncentracijos 
vandeniu įsotintoje 1-oktanolio ir 1-oktanoliu įsotintoje vandenin ėje fazėje 
per bandym ą viršija metodin ę taikomų analizės procedūrų kiekybinio verti ­
nimo ribą. Tais atvejais, kai b ūtina taikyti ekstrahavimo metodus, prieš 
bandymą turi būti nustatytas analizinis bandomosios chemin ės medžiagos 
regeneravimas iš vandenin ės fazės ir iš 1-oktanolio faz ės. Analizinis signalas 
turi būti koreguojamas atsižvelgiant į tuščiuosius ėminius, ir tur ėtų būti 
imtasi atsargumo priemoni ų, kad analit ės nebūtų perkeltos iš vieno ėminio 
į kitą. 
24. Atsižvelgiant į gana mažas hidrofobini ų bandom ųjų chemini ų medžiag ų 
koncentracijas vandenin ėje fazėje, prieš atliekant analiz ę veikiausiai reik ės 
ekstrahuoti vandens faz ę naudojant organin į tirpiklį ir paruošti parengtin ę 
ekstrakto koncentracij ą. Dėl tos pat priežasties b ūtina sumažinti atsitiktines 
tuščiąsias koncentracijas. Šiuo tikslu b ūtina naudoti didelio grynumo tirpik ­
lius, pageidautina – liku čių analizei naudojamus tirpiklius. Be to, naudojant 
iš anksto kruopš čiai išvalytus (pvz., išplautus tirpikliais arba pakaitintus 
aukštoje temperat ūroje) stiklinius indus, galima išvengti kryžmin ės taršos.  
25. Log P  OW įvertį galima gauti naudojant skai čiavimo program ą arba remiantis 
ekspertų nuomone. Jeigu vert ė didesnė už šešis, b ūtina atidžiai steb ėti su 
tuščiaisiais ėminiais susijusias pataisas ir anali čių perkėlimą. Atitinkamai, 
jeigu log P  OW vertė didesnė už šešis, regeneravimo pataisoms privaloma 
taikyti pakaitin į etaloną, kad būtų galima pasiekti didelius parengtin ės 
koncentracijos koeficientus. Rinkoje galima įsigyti įvairios programin ės 
įrangos, skirtos apskai čiuoti log P  OW ( 1 ), pvz., „Clog P“ (16), „KOWWIN“ 
(17), „ProLogP“ (18) ir „ACD log P“ (19). Skai čiavimo princip ų aprašymai 
pateikti literat ūros šaltiniuose (20–22).  
26. Kiekybinio įvertinimo ribos (K ĮR), taikytinos tiriant bandom ąją cheminę 
medžiagą 1-oktanolyje ir vandenyje, nustatomos taikant patvirtintus 
metodus. Metodin ė kiekybinio įvertinimo riba gali b ūti apytikriai nustatyta 
kaip koncentracija vandenyje arba 1-oktanolyje, kuriai esant gaunamas 
signalo ir triukšmo santykis, lygus dešim čiai. Turėtų būti parinktas tinkamas 
ekstrahavimo ir parengtinio koncentravimo metodas; be to, tur ėtų būti 
taikomas analizinis regeneravimas. Norint prieš analitin į tyrimą gauti 
reikiamo dydžio signal ą, būtina parinkti tinkam ą parengtin ės koncentracijos 
koeficient ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Ši informacija pateikiama tik naudotoj ų patogumui. Gali b ūti naudojamos lygiavert ės 
kompiuterin ės programos, jeigu galima įrodyti, kad jas naudojant gaunami tokie pat 
rezultatai.
 27. Remiantis analiz ės metodo parametrais ir numatomomis koncentracijomis, 
nustatomas apytikris imties dydis, reikalingas norint tiksliai nustatyti mišinio 
koncentracij ą. Neturėtų būti naudojami vandens ėminiai, kurie yra per maži, 
kad būtų galima gauti pakankam ą analizinį signalą. Be to, netur ėtų būti 
naudojami pernelyg dideli vandens ėminiai, nes gali likti per mažai vandens 
minimaliam reikiam ų analizių skaičiui (n = 5). 1 pried ėlyje nurodytas 
mažiausias ėminio tūris, kaip indo t ūrio funkcija, bandomosios chemin ės 
medžiagos AR ir bandomosios medžiagos tirpumas.  
28. Bandom ųjų cheminių medžiag ų kiekybinis įvertinimas atliekamas lyginant 
atitinkamo mišinio kalibravimo kreives. Koncentracija analizuojamuose 
ėminiuose turi b ūti sulyginama su etalonin ėmis koncentracijomis.  
29. Jeigu bandomosios chemin ės medžiagos log P  OW įvertis didesnis už šešis, 
prieš ekstrahavim ą vandens ėminiui turi b ūti pritaikytas pakaitinis etalonas, 
kad būtų galima užregistruoti nuostolius, susidaran čius vandens ėminių ekst­
rahavimo ir parengtinio koncentravimo metu. Kad regeneravimo pataisa 
būtų tiksli, pakaital ų savybės turi būti labai panašios į bandomosios 
cheminės medžiagos savybes arba tokios pat. Pageidautina, kad šiuo tikslu 
būtų naudojami (stabil ūs) izotopais žym ėtieji dominan čių chemini ų 
medžiagų analogai (pvz., deuterizuotieji arba žym ėtieji izotopu  13 C). Jeigu 
žymėtųjų stabilių izotopų, pvz.,  13 C arba  2 H, naudoti ne įmanoma, remiantis 
patikimais literat ūroje pateiktais duomenimis tur ėtų būti įrodyta, kad pakai ­
talo fizin ės ir chemin ės savybės labai panašios į bandomosios chemin ės 
medžiagos savybes. Pagal skys čių ekstrahavimo skys čiais princip ą ekstra­
huojant vandenin ę fazę, gali susidaryti emulsijos. J ų susidarym ą galima 
sumažinti įpilant druskos ir paliekant emulsij ą nakčiai nusistov ėti. Ataskai ­
toje turi b ūti nurodyti taikyti ėminių ekstrahavimo ir parengtinio koncentra ­
vimo metodai.  
30. Iš 1-oktanolio faz ės ekstrahuoti ėminiai prieš atliekant analiz ę prireikus gali 
būti atskiedžiami tinkamu tirpikliu. Be to, jeigu per chemini ų medžiag ų 
regeneravimo bandymus pastebimi dideli regeneravimo bandym ų nuokrypiai 
(santykinis standartinis nuokrypis didesnis kaip 10 %), rekomenduojama regeneravimo pataisos tikslais naudoti pakaitinius etalonus.
 
31. Ataskaitoje b ūtina išsamiai aprašyti analiz ės metodą. Turėtų būti nurodytas 
ekstrahavimo metodas, parengtin ės koncentracijos ir skiedimo koeficientai, 
kalibravimo tvarka, kalibravimo intervalas, bandomosios chemin ės 
medžiagos analizinis regeneravimas iš vandens, pakaitini ų etalonų naudo­
jimas regeneravimo pataisos tikslais, tuš čiosios vert ės, aptikimo ribos ir 
kiekybinio įvertinimo ribos.  
Bandymo eiga  
Optimalūs 1-oktanolio / vandens kiekio santykiai  
32. Parenkant vandens ir 1-oktanolio kiekius, reik ėtų atsižvelgti į kiekybinio 
įvertinimo ribas 1-oktanolyje ir vandenyje, vandens ėminiams taikomus 
parengtin ės koncentracijos koeficientus, imamus 1-oktanolio ir vandens 
kiekius ir į numatomas koncentracijas. Bandymo sumetimais 1-oktanolio 
kiekis lėto maišymo sistemoje tur ėtų būti parinktas taip, kad 1-oktanolio 
sluoksnis b ūtų gana storas (> 0,5 cm), jog 1-oktanolio faz ės ėminius būtų 
galima imti nesuardant šio sluoksnio.  
33. Tipiniai fazi ų santykiai, taikomi tiriant mišinius, kuri ų log P  OW vertės yra 
4,5 ir didesn ės, yra 20–50 ml 1-oktanolio ir 950–980 ml vandens vieno litro 
talpos inde.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Bandymo s ąlygos  
34. Atliekant bandym ą reaktorius kontroliuojamas termostatu siekiant sumažinti 
temperatūros kaitą iki mažiau kaip 1 °C. Tyrimas tur ėtų būti atliekamas 
25 °C temperat ūroje. 
35. Bandym ų sistema tur ėtų būti apsaugota nuo dienos šviesos, bandym ą atlie­
kant tamsioje patalpoje arba reaktori ų uždengiant aliuminio folija.  
36. Bandymas tur ėtų būti atliekamas nedulk ėtoje (kiek įmanoma) aplinkoje.  
37. 1-oktanolio ir vandens sistema maišoma, kol pasiekiama pusiausvyra. Per 
bandomąjį eksperiment ą, atliekant l ėto maišymo eksperiment ą ir periodiškai 
imant vandens ir 1-oktanolio ėminius, įvertinamas pusiausvirinimo laiko ­
tarpis. Minimalus ėminių ėmimo laiko intervalas – penkios valandos.  
38. Kiekvienas P  OW turėtų būti nustatomas atliekant ne mažiau kaip tris atskirus 
lėto maišymo bandymus.  
Pusiausvirinimo laikotarpio nustatymas  
39. Daroma prielaida, kad pusiausvyra pasiekiama tada, kai koncentracij ų 1- 
oktanolyje ir vandenyje santykio priklausomyb ės nuo laiko kreiv ės nuolydis 
laikotarpiu, apiman čiu keturis laiko momentus, įgyja beveik nulin ę vertę, kai 
p reikšmė lygi 0,05. Trumpiausias pusiausvirinimo laikotarpis – viena para 
iki galimos ėminių ėmimo pradžios. Ėminių ėmimas iš chemini ų medžiag ų, 
kurių log P  OW įvertis mažesnis nei penki, apytikriai gali b ūti atliekamas 
antrąją ir trečiąją paromis. Kai tiriamos didesnio hidrofobiškumo medžiagos, 
pusiausvirinimo laikotarpis gali b ūti ilgesnis. Jeigu mišinio log P  OW vertė 
lygi 8,23 (dekachlorobifenilas), pusiausvyrai nusistov ėti pakanka 144 
valandų. Pusiausvyra įvertinama pakartotinai imant ėminius iš vieno indo.  
Bandymo pradžia  
40. Pradedant bandym ą reaktorius pripildomas 1-oktanoliu įsotinto vandens. 
Turėtų būti skiriama pakankamai laiko, kol bus pasiekta termostatu regu ­
liuojama temperat ūra. 
41. Pageidaujamas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis (ištirpintas reikia ­
mame vandeniu įsotinto 1-oktanolio kiekyje) atsargiai įdedamas į reaktorių. 
Tai labai svarbus bandymo etapas, nes b ūtina išvengti s ūkurinio dviej ų fazių 
maišymosi. Šiuo tikslu 1-oktanolio faz ė gali būti lėtai lašinama pipete ant 
bandymų indo sienel ės nedideliu atstumu nuo vandens paviršiaus. Tada ji 
nutekės stiklo sienele ir sudarys plon ą sluoksnį virš vandenin ės fazės. 
Visada reik ėtų vengti tiesiogiai filtruoti 1-oktanol į į kolbą; 1-oktanolio laše ­
liams netur ėtų būti leidžiama tiesiogiai kristi į vandenį. 
42. Prad ėjus maišyti, maišymo greitis tur ėtų būti pamažu didinamas. Jeigu 
maišymo grei čio negalima tinkamai sureguliuoti, tur ėtų būti apsvarstyta 
galimybė naudoti transformatori ų. Maišymo greitis tur ėtų būti sureguliuotas 
taip, kad ties vandens ir 1-oktanolio s ąlyčio vieta susidaryt ų 0,5–2,5 cm 
gylio sūkurys. Sūkurio gyliui viršijus 2,5 cm, maišymo greitis tur ėtų būti 
sumažintas; kitaip iš 1-oktanolio lašeli ų vandenin ėje fazėje gali susidaryti 
labai maži lašeliai, o d ėl to gali b ūti pervertinta bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija vandenyje. Ne didesn į kaip 2,5 cm gyl į atitinkantis 
maišymas rekomenduojamas atsižvelgiant į tarplaboratorinio patvirtinamojo 
tyrimo rezultatus (5). Tai greito pusiausvyros pasiekimo ir labai maž ų 
1-oktanolio lašeli ų susidarymo ribojimo kompromisas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Ėminių ėmimas ir apdorojimas  
43. Prieš imant ėminius maišytuvas tur ėtų būti išjungtas, ir reik ėtų palaukti, kol 
skysčiai nustos jud ėti. Baigus imti ėminius, maišytuvas v ėl iš lėto palei­
džiamas, kaip aprašyta pirmiau, ir pamažu didinamas maišymo greitis.  
44. Vandenin ės fazės ėminiai imami iš čiaupo, įrengto reaktoriaus apa čioje. 
Visada atmeskite nenauding ą vandens kiek į, susikaupus į čiaupuose (2 prie ­
dėlyje parodytame inde – apie 5 ml). Čiaupuose susikaup ęs vanduo nemai ­ 
šomas, tod ėl nepasiekiama jo pusiausvyra su pagrindine mase. Užsirašykite 
vandens ėminių tūrį ir pasirūpinkite, kad nustatant masi ų balansą būtų atsiž­
velgta į bandomosios chemin ės medžiagos kiek į atmestame vandenyje. 
Garavimo nuostoliai tur ėtų būti sumažinti leidžiant vandeniui inertiškai 
tekėti į skirstom ąjį piltuvą, kad neb ūtų drumsčiamas vandens ir 1-oktanolio 
sluoksnis.  
45. 1-oktanolio ėminiai gaunami 100 mikrolitr ų švirkštu, pagamintu tik iš stiklo 
ir metalo, paimant maž ą (apie 100 μl) 1-oktanolio sluoksnio alikvotin ę dalį. 
Turėtų būti imamasi atsargumo priemoni ų, kad neb ūtų suardyta riba. Užre ­
gistruojamas paimto skys čio tūris. Pakanka paimti maž ą alikvotin ę 
tirpalo dal į, nes 1-oktanolio ėminys bus atskiestas.  
46. Turėtų būti vengiama neb ūtinų ėminio perk ėlimo veiksm ų. Šiuo tikslu 
ėminio tūris turėtų būti nustatomas gravimetriniu b ūdu. Imant vandens 
ėminius tai galima užtikrinti vandens ėminį imant skirstomajame piltuve, 
kuriame jau yra reikiamas tirpiklio kiekis.  
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
47. Pagal š į bandymo metod ą P OW nustatomas vienodomis s ąlygomis atliekant 
tris lėto maišymo bandymus (tris atskirus bandymus) su tiriamu mišiniu. 
Regresija, naudojama įrodyti pusiausvyros pasiekim ą, turėtų būti grindžiama 
bent keturi ų C O /C W santykių nustatymo nuosekliais laiko momentais rezul ­
tatais. Tai suteikia galimyb ę apskaičiuoti dispersij ą, kuria išreiškiamas per 
kiekvieną atskirą bandymą gautos vidutin ės vertės neapibr ėžtis. 
48. P  OW vertė gali būti apibūdinama duomen ų, gautų per kiekvien ą atskirą 
bandymą, dispersija. Ši informacija naudojama apskai čiuoti P  OW , kaip sver ­
tinį atskirų bandymų rezultatų vidurkį. Šiuo tikslu kaip svoris naudojamas 
atskirų bandym ų rezultatų dispersijai atvirkštinis dydis. Tod ėl duomenys, 
kuriems b ūdingas didelis nuokrypis (išreikštas dispersija) ir atitinkamai 
mažesnis patikimumas, rezultatui tur ės mažiau įtakos nei duomenys, kuriems 
būdinga maža dispersija.  
49. Lygiai taip pat apskai čiuojamas svertinis standartinis nuokrypis. Juo apib ū­
dinamas P  OW matavimų pakartojamumas. Maža svertinio standartinio 
nuokrypio vert ė reiškia, kad toje pa čioje laboratorijoje gautiems P  OW nusta­
tymo rezultatams b ūdingas labai aukštas pakartojamumas. Toliau aprašytas 
formalus statistinis duomen ų apdorojimas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Rezultatų apdorojimas  
Pusiausvyros pasiekimo įrodymas  
50. Kiekvienam ėminių ėmimo laiko momentui apskai čiuojamas bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracij ų 1-oktanolyje ir vandenyje santykio loga ­
ritmas (log (C  O /C w )). Chemin ės pusiausvyros pasiekimas įrodomas nubr ė­ 
žiant šio santykio, kaip laiko funkcijos, kreiv ę. Šios kreiv ės plokščioji dalis, 
pagrįsta ne mažiau kaip keturiais nuosekliais laiko momentais, rodo, kad 
buvo pasiekta pusiausvyra ir kad mišinys iš tikr ųjų ištirpo 1-oktanolyje. 
Priešingu atveju bandymas turi b ūti tęsiamas tol, kol remiantis keturiais 
nuosekliais laiko momentais negaunama kreiv ės nuolydžio, kurio vert ė 
beveik nesiskiria nuo nulio, kai p reikšm ė lygi 0,05, t. y. reiškiantis, kad 
log C  o /C w vertė nepriklauso nuo laiko.  
Log P  OW apskaičiavimas  
51. Atskiro bandymo log P  OW vertė apskaičiuojama kaip svertin ė vidutinė log 
C o /C w vertė, pagrįsta log C  o /C w kreivės, kaip laiko funkcijos, dalimi, kurioje 
įrodytas pusiausvyros susidarymas. Svertinis vidurkis apskai čiuojamas 
duomenims taikant svorius, išreikštus dispersijai atvirkštiniu dydžiu, kad duomenų įtaka galutiniam rezultatui b ūtų atvirkščiai proporcinga duomen ų 
neapibrėžčiai.
 
Log P  OW vidurkis  
52. Vidutin ė atskirų bandym ų log P  OW vertė apskaičiuojama kaip atskir ų 
bandymų rezultatų, kuriems buvo pritaikyti j ų atitinkamomis dispersijomis 
pagrįsti svoriai, vidurkis.  
Skaičiuojama taip:  
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
čia: 
log P  OW,i = atskiro bandymo i log P  OW vertė; 
log P  OW,Av  = atskirų log P  OW įverčių svertinis vidurkis;  
w i = statistinis svoris, priskirtas atskiro bandymo i log P  OW vertei.  
Atvirkštinis log P  OW,i dispersijai dydis yra w  i (w i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 ). 
53. Log P  OW vidurkio paklaida apskai čiuojama kaip log C  o /C w , nustatyto 
atskirų bandym ų pusiausvirinimo etapu, pakartojamumas. Jis išreiškiamas 
kaip log P  OW,Av  (σ log Pow,Av  ) svertinis standartinis nuokrypis, kuris savo 
ruožtu yra log P  OW,Av  paklaidos matas. Svertinis standartinis nuokrypis 
gali būti skaičiuojamas remiantis svertine dispersija (var  log Pow,Av  ): 
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0:5 
Simbolis n reiškia atskir ų bandymų skaičių. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Bandymo ataskaita  
54. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— įprastas pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, strukt ūrinė 
formulė (rodanti žym ėtojo atomo pad ėtį, jeigu naudojama radioaktyviu 
izotopu žym ėtoji chemin ė medžiaga) ir atitinkamos fizin ės bei chemin ės 
savybės (žr. 17 skirsn į), 
— bandomosios chemin ės medžiagos grynumas (priemaišos),  
— radiocheminis žym ėtųjų cheminių medžiag ų grynumas ir molinis akty ­
vumas (jeigu tinka),  
— išankstinis log P  ow įvertis, taip pat vert ės apskaičiavimo metodas.  
Bandymo s ąlygos:  
— tyrimų datos,  
— bandymo temperat ūra, 
— 1-oktanolio ir vandens t ūriai bandymo pradžioje,  
— paimt ų 1-oktanolio ir vandens ėminių tūriai, 
— bandymo induose lik ę 1-oktanolio ir vandens t ūriai, 
— naudot ų bandymo ind ų ir taikyt ų maišymo s ąlygų aprašas (maišymo 
mentelių ir bandymo indo geometrin ės savybės, sūkurio gylis milimet ­
rais, ir, jeigu žinoma, maišymo greitis),  
— analiz ės metodai, taikyti įvertinti bandom ąją cheminę medžiagą ir meto­
dinę kiekybinio įverčio ribą, 
— ėminių ėmimo laikas,  
— vandenin ės fazės pH ir naudoti buferiai, kai pH koreguojamas atsižvel ­
giant į jonizuojam ąsias molekules,  
— kartojim ų skaičius. 
Rezultatai:  
— taikyt ų analizės metodų pakartojamumas ir jautris,  
— nustatytos bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos 1-oktano ­
lyje ir vandenyje, kaip laiko funkcija,  
— masių balanso įrodymas,  
— temperat ūra ir standartinis nuokrypis arba temperat ūros intervalas 
bandymo metu,  
— koncentracij ų santykio regresija, kaip laiko funkcija,  
— vidutin ė log P  ow,Av  vertė ir jos standartin ė paklaida,  
— rezultat ų aptarimas ir paaiškinimas,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— tipinės analizės pirmini ų duomen ų rodiklių pavyzdžiai (visi pirminiai 
duomenys turi b ūti saugomi pagal GLP reikalavimus), nurodant pakai ­
talų regeneravim ą, kalibruojant taikyt ų lygių skaičių (nurodant kalibra ­
vimo kreiv ės koreliacijos koeficiento kriterijus) ir kokyb ės užtikrinimo ir 
(arba) kokyb ės kontrolės (KU/KK) rezultatus,  
— jeigu yra – tyrimo proced ūros patvirtinimo ataskaita (turi b ūti nurodyta 
kaip literat ūros šaltinis).  
LITERAT ŪRA 
1. De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring“ method. Environ. 
Toxicol. Chem. 8: 499–512.  
2. Šio priedo A.8 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas.  
3. Šio priedo A.8 skyrius. Pasiskirstymo koeficientas.  
4. OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
 
5. Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM 
contract-Nrs 602730 M/602700/01.  
6. Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
7. Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, New York, NY.  
8. Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwar ­
zenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of 
tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. Sci. 
Technol.  31: 2596–2602.  
9. OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water. Paris.  
10. Šio priedo A.6 skyrius. Tirpumas vandenyje.  
11. Šio priedo C.7 skyrius. Skaidymas. Abiotinis skaidymas. Hidroliz ė kaip pH 
funkcija.  
12. Šio priedo C.4 skyrius. II–VII dalys (A–F metodai). „Lengvo“ biologinio 
skaidomumo matavimas.  
13. Šio priedo A.4 skyrius. Gar ų slėgis. 
14. Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 623–626.  
15. Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, 
Washington, DC, 2–1 to 2–52.
 
16. Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical 
Information Systems, Irvine, CA.  
17. Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
18. Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest.  
19. ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Canada, 2001.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
20. Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl 
WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , 
American Chemical Society, Washington, D.C.  
21. Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479–488.  
22. Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed,  Methoden der Organischen Chemie : 
386–390.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
1 priedėlis 
Mažiausio vandens t ūrio, reikalingo aptikti bandom ąsias chemines 
medžiagas su įvairiomis log P  OW vertėmis vandenin ėje fazėje, skaičiuoklė 
Prielaidos:  
— mažiausias atskir ų alikvotini ų tirpalo dali ų tūris – 10 % viso t ūrio, penki ų 
alikvotini ų tirpalo dali ų – 50 % viso t ūrio, 
— bandomuju cheminiu medžiagu koncentracija  ¼ 0; 7 Ü tirpumas kiekvienoje  
fazeje. Esant mažesn ėms koncentracijoms, gali reik ėti didesnio t ūrio, 
— tūris, reikalingas norint nustatyti aptikimo rib ą (AR): 100 ml,  
— log P  ow /log S  w ir log P  ow /SR (S  oct /S w ) yra patikimos bandomosioms chemi ­
nėms medžiagoms taikytin ų tarpusavio priklausomybi ų išraiškos.  
S w įvertis  
log P  ow Lygtis  log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496  3,133E+00  
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035  1,084E+00  
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,426  3,750E-01  
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,887  1,297E-01  
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,348  4,487E-02  
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,809  1,552E-02  
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,270  5,370E-03  
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,731  1,858E-03  
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –3,192  6,427E-04  
S okt. įvertis  
log P  ow Lygtis  S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04  
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04  
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04  
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04  
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05  
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05  
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05  
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05  
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Bendra bandomo ­
sios chemin ės 
medžiagos mas ė 
(mg)  Masė okt. /Masė vand. Masė H2O 
(mg)  Konc.  H2O 
(mg/l)  Masė okt. 
(mg)  Konc.  okt. 
(mg/l)  
1 319  526  2,5017  2,6333  1 317  26 333  
1 686  1 664  1,0127  1,0660  1 685  33 709  
2 158  5 263  0,4099  0,4315  2 157  43 149  
2 762  16 644  0,1659  0,1747  2 762  55 230  
3 535  52 632  0,0672  0,0707  3 535  70 691  
4 524  1664 36  0,0272  0,0286  4 524  90 480  
5 790  5263 16  0,0110  0,0116  5 790  115 807  
7 411  1 664 357  0,0045  0,0047  7 411  148 223  
9 486  5 263 158  0,0018  0,0019  9 486  189 713  
Tūrio apskai čiavimas  
Mažiausias t ūris, reikalingas H  2 O fazei pagal kiekvien ą AR koncentracij ą 
log K  ow AR (μg/l)→ 0,001  0,01  0,10  1,00  10  
4 0,04  0,38  3,80  38  380  
4,5 0,09  0,94  9,38  94  938  
5 0,23  2,32  23,18  232  2 318  
5,5 0,57  5,73  57,26  573  5 726  
6 1,41  14,15  141  1 415  14 146  
6,5 3,50  34,95  350  3 495  34 950  
7 8,64  86,35  864  8 635  86 351  
7,5 21,33  213  2 133  21 335  213 346  
8 52,71  527  5 271  52 711  527 111  
Tūris, naudo ­
jamas norint 
nustatyti 
AR (I)  0,1 
Skaičiavimų paaiškinimai:  
Sudaro mažiau kaip 10 % viso vandenin ės fazės tūrio, naudojant 1 litro talpos 
pusiausvirinimo ind ą. 
Sudaro mažiau kaip 10 % viso vandenin ės fazės tūrio, naudojant 2 litr ų talpos 
pusiausvirinimo ind ą. 
Sudaro mažiau kaip 10 % viso vandenin ės fazės tūrio, naudojant 5 litr ų talpos 
pusiausvirinimo ind ą. 
Sudaro mažiau kaip 10 % viso vandenin ės fazės tūrio, naudojant 10 litr ų talpos 
pusiausvirinimo ind ą. 
Daugiau kaip 10 % naudojant net 10 litr ų talpos pusiausvirinimo ind ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Reikaling ų tūrių, kaip tirpumo vandenyje ir log P  OW funkcijos, apžvalga  
Mažiausias t ūris, reikalingas H  2 O fazei pagal kiekvien ą AR koncentracij ą (ml)  
log P  ow S w (mg/l)  AR ( μg/l)→ 0,001  0,01  0,10  1,00  10  
4 10  0,01  0,12  1,19  11,90  118,99  
5 0,02  0,24  2,38  23,80  237,97  
3 0,04  0,40  3,97  39,66  396,62  
1 0,12  1,19  11,90  118,99  1 189,86  
4,5 5  0,02  0,20  2,03  20,34  203,37  
2 0,05  0,51  5,08  50,84  508,42  
1 0,10  1,02  10,17  101,68  1 016,83  
0,5 0,20  2,03  20,34  203,37  2 033,67  
5 1  0,09  0,87  8,69  86,90  869,01  
0,5 0,17  1,74  17,38  173,80  1 738,02  
0,375  0,23  2,32  23,18  231,75  2 317,53  
0,2 0,43  4,35  43,45  434,51  4 345,05  
5,5 0,4  0,19  1,86  18,57  185,68  1 856,79  
0,2 0,37  3,71  37,14  371,36  3 713,59  
0,1 0,74  7,43  74,27  742,72  7 427,17  
0,05 1,49  14,85  148,54  1 485,43  14 854,35  
6 0,1  0,63  6,35  63,48  634,80  6 347,95  
0,05 1,27  12,70  126,96  1 269,59  12 695,91  
0,025  2,54  25,39  253,92  2 539,18  25 391,82  
0,0125  5,08  50,78  507,84  5 078,36  50 783,64  
6,5 0,025  2,17  21,70  217,02  2 170,25  21 702,46  
0,0125  4,34  43,40  434,05  4 340,49  43 404,93  
0,006  9,04  90,43  904,27  9 042,69  90 426,93  
0,003  18,09  180,85  1 808,54  18 085,39  180 853,86  
7 0,006  7,73  77,29  772,89  7 728,85  77 288,50  
0,003  15,46  154,58  1 545,77  15 457,70  154 577,01  
0,0015  23,19  231,87  2 318,66  23 186,55  231 865,51  
0,001  46,37  463,73  4 637,31  46 373,10  463 731,03  
7,5 0,002  19,82  198,18  1 981,77  19 817,73  198 177,33  
0,001  39,64  396,35  3 963,55  39 635,47  396 354,66  
0,0005  79,27  792,71  7 927,09  79 270,93  792 709,32  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l)  AR ( μg/l)→ 0,001  0,01  0,10  1,00  10  
0,00025  158,54  1 585,42  15 854,19  158 541,86  1 585 418,63  
8 0,001  33,88  338,77  3 387,68  33 876,77  338 767,72  
0,0005  67,75  677,54  6 775,35  67 753,54  677 535,44  
0,00025  135,51  1 355,07  13 550,71  135 507,09  1 355 070,89  
0,000125  271,01  2 710,14  27 101,42  271 014,18  2 710 141,77  
Tūris, naudojamas norint 
nustatyti AR (I)  0,1 
2 priedėlis 
Per lėto maišymo bandym ą, skirtą nustatyti P  OW , naudojamo stiklu gaubto 
bandymų indo pavyzdys
  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
B DALIS. TOKSIŠKUMO IR KITO POVEIKIO SVEIKATAI 
NUSTATYMO METODAI  
TURINYS  
BENDRASIS ĮVADAS  
B.1 bis.  ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKT Ą. 
FIKSUOT ŲJŲ DOZIŲ METODAS  
B.1 tris.  ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKT Ą. 
ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLAS ĖS METODAS  
B.2. ŪMUS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS 
B.3. ŪMUS TOKSIŠKUMAS (PER OD Ą) 
B.4. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. ODOS DIRGINIMAS AR 
ĖSDINIMAS  
B.5. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. AKI Ų DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS  
B.6. ODOS JAUTRINIMAS  
B.7. 28 DIEN Ų GRAUŽIK Ų KARTOTIN ĖS DOZĖS TOKSIŠ ­
KUMAS PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKTĄ 
B.8. PO ŪMIS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS. 28 DIEN Ų TYRIMAS  
B.9. KARTOTINI Ų DOZIŲ (28 DIEN Ų) TOKSIŠKUMAS (PER 
ODĄ) 
B.10.  MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLI Ų CHROMOSOM Ų 
ABERACIJ Ų BANDYMAS  IN VITRO  
B.11.  MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLI Ų KAUL Ų ČIULPŲ 
CHROMOSOM Ų ABERACIJOS BANDYMAS  IN VIVO  
B.12.  MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLI Ų ERITROCIT Ų MAŽŲJŲ 
BRANDUOLI Ų BANDYMAS  IN VIVO  
B.13/14.  MUTAGENIŠKUMAS – BAKTERIJ Ų GRĮŽTAMŲJŲ MUTA­
CIJŲ BANDYMAS  
B.15.  MUTAGENIŠKUMO BANDYMAS IR ATRANKA PAGAL 
KANCEROGENIŠKUM Ą. SACCAROMYCES CEREVISIAE  
GENŲ MUTACIJOS  
B.16.  MITOZIN Ė REKOMBINACIJA –  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
B.17.  MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLI Ų LĄSTELIŲ GENŲ 
MUTACIJ Ų BANDYMAS  IN VITRO  
B.18.  DNR PAŽAIDOS IR J Ų REPARACIJA – NETAISYKLINGA 
DNR SINTEZ Ė – ŽINDUOLI Ų LĄSTELĖSE IN VITRO  
B.19.  APSIKEITIMO SESERIN ĖMIS CHROMATID ĖMIS 
BANDYMAS  IN VITRO  
B.20.  DROSOPHILA MELANOGASTER  NUO LYTIES PRIKLAU ­
SOMO RECESYVINIO LETALIŠKUMO BANDYMAS  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21.  ŽINDUOLI Ų LĄSTELIŲ TRANSFORMACIJOS BANDYMAI  
IN VITRO  
B.22.  GRAUŽIK Ų DOMINANTINIS LETALIŠKUMO BANDYMAS  
B.23.  ŽINDUOLI Ų SPERMATOGONIJ Ų CHROMOSOM Ų ABERA ­
CIJOS BANDYMAS  
B.24.  PELI Ų TAŠKINIS BANDYMAS  
B.25.  PELI Ų PAVELD ĖTA TRANSLOKACIJA  
B.26.  PO ŪMIS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKTĄ. 90 
DIENŲ KARTOTINI Ų DOZIŲ TOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS 
BANDYMAS  
B.27.  PO ŪMIS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKTĄ. 90 
DIENŲ KARTOTINI Ų DOZIŲ TOKSIŠKUMO NE GRAUŽI ­
KAMS BANDYMAS  
B.28.  PO ŪMIS TOKSIŠKUMAS PER OD Ą. 90 DIEN Ų KARTO ­
TINIŲ DOZIŲ TOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS BANDYMAS  
B.29.  PUSIAU L ĖTINIS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS. 90 DIEN Ų 
TYRIMAS  
B.30.  L ĖTINIO TOKSIŠKUMO TYRIMAI  
B.31.  TOKSIŠKUMO PRENATALINIAM VYSTYMUISI 
BANDYMAS  
B.32.  KANCEROGENIŠKUMO TYRIMAI  
B.33.  JUNGTINIAI L ĖTINIO TOKSIŠKUMO IR KANCEROGENIŠ ­
KUMO TYRIMAI  
B.34.  TOKSIŠKUMO VIENOS KARTOS DAUGINIMUISI 
BANDYMAS  
B.35.  TOKSIŠKUMO DVIEJ Ų KART Ų DAUGINIMUISI 
BANDYMAS  
B.36.  TOKSIKOKINETIKA  
B.37.  ORGANINI Ų FOSFORO JUNGINI Ų SUKELTO UŽDELSTO 
NEUROTOKSIŠKUMO PO ŪMAUS VEIKIMO MEDŽIAGA 
BANDYMAS  
B.38.  ORGANINI Ų FOSFORO JUNGINI Ų SUKELTO UŽDELSTO 
NEUROTOKSIŠKUMO 28 DIEN Ų BANDYMAS  
B.39.  NENUMATYTOS DNR SINTEZ ĖS (NDS) ŽINDUOLI Ų 
KEPENŲ LĄSTELĖSE BANDYMAS  IN VIVO  
B.40.  ODOS SUARDYMAS  IN VITRO . ODOS SLUOKSNIO ELEK ­
TRINĖS VARŽOS (OSEV) BANDYMAS  
B.40 bis.  ODOS SUARDYMAS  IN VITRO . ŽMOGAUS ODOS MODELIO 
BANDYMAS  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41.  3T3 NRU FOTOTOKSIŠKUMO  IN VITRO  BANDYMAS  
B.42.  ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO 
BANDYMAS  
B.43.  NEUROTOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS BANDYMAS  
B.44.  SUGERTIS PER OD Ą. IN VIVO  METODAS  
B.45.  SUGERTIS PER OD Ą. IN VITRO  METODAS  
B.46.  IN VITRO  ODOS DIRGINIMAS. REKONSTRUOTO 
ŽMOGAUS EPIDERMIO BANDYMO METODAS  
B.47.  GALVIJ Ų RAGENOS PADRUMST ĖJIMO IR PRALAIDUMO 
BANDYMO METODAS AKIS ĖSDINAN ČIOMS IR STIPRIAI 
DIRGINAN ČIOMS MEDŽIAGOMS NUSTATYTI  
B.48.  IZOLIUOTOS VIŠTOS AKIES BANDYMO METODAS AKIS 
ĖSDINAN ČIOMS IR STIPRIAI DIRGINAN ČIOMS MEDŽIA ­
GOMS NUSTATYTI  
B.49.  IN VITRO  ŽINDUOLI Ų LĄSTELĖS MIKROBRANDUOLIO 
BANDYMAS  
B.50.  ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO 
BANDYMAS. DA  
B.51.  ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO 
BANDYMAS. BrdU-ELISA  
▼M4 
B.52.  ŪMUS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO 
KLASĖS NUSTATYMO METODAS  
▼M5 
B.53.  TOKSINIO POVEIKIO NERV Ų SISTEMOS VYSTYMUISI 
TYRIMAS  
B.54.  POVEIKIU GRAUŽIK Ų GIMDAI PAGR ĮSTA BIOANALIZ Ė. 
TRUMPALAIKIS ESTROGENINI Ų SAVYBI Ų ATRANKOS 
BANDYMAS  
B.55.  ŽIURKI Ų HERSHBERGER BIOANALIZ Ė: 
TRUMPALAIK Ė (ANTI)ANDROGENINI Ų SAVYBI Ų 
ATRANKOS ANALIZ Ė 
B.56.  IŠPL ĖSTINIS TOKSIŠKUMO VIENOS KARTOS DAUGINI ­
MUISI BANDYMAS  
B.57.  H295R STEROIDOGENEZ ĖS ANALIZ Ė 
B.58.  GRAUŽIK Ų SOMATINI Ų IR EMBRIONINI Ų LĄSTELIŲ 
TARPGENINI Ų MUTACIJ Ų ANALIZ Ė ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
BENDRASIS ĮVADAS  
A. BANDOMOSIOS MEDŽIAGOS APIB ŪDINIMAS  
Bandomosios medžiagos sud ėtį, taip pat ir pagrindines priemaišas, 
bei jos svarbiausias fizikines ir chemines savybes, tarp j ų stabilum ą, 
reikėtų žinoti dar prieš bet kokio toksikologinio bandymo planavim ą. 
Bandomosios medžiagos fizikin ės ir chemin ės savybės yra svarbi 
informacija renkantis veikimo medžiaga b ūdą, planuojant kiekvien ą 
konkretų bandymą ir elgimąsi su medžiaga bei jos laikym ą. 
Bandomosios medžiagos (jeigu įmanoma ir pagrindini ų priemaiš ų) 
dozuojamoje terp ėje ar biologin ėje medžiagoje nustatymo kokybinius 
ir kiekybinius analitinius metodus reik ėtų parengti dar prieš 
bandymą. 
Visą informacij ą, susijusi ą su medžiagos nustatymu, fizikin ėmis ir 
cheminėmis jos savyb ėmis, grynumu, bandomosios medžiagos 
elgsena, reik ėtų įtraukti į bandymo ataskait ą. 
B. GYV ŪNŲ PRIEŽI ŪRA 
Atliekant toksikologin į bandym ą, būtina griežta aplinkos s ąlygų 
kontrolė ir tinkama gyv ūnų priežiūra. 
i) Laikymo s ąlygos  
Eksperimentini ų gyvūnų patalpų ar aptvar ų aplinkos s ąlygos turėtų 
būti tinkamos bandomosioms r ūšims. Žiurk ėms, pelėms ir jūrų kiau­
lytėms kambario temperat ūra turėtų būti 22 °C ± 3 °C, santykinis oro 
drėgnis nuo 30 iki 70 %; triušiams temperat ūra turėtų būti 20 ± 3 °C, 
santykinis oro dr ėgnis nuo 30 iki 70 %.  
Tam tikrų eksperimentini ų metodų atveju labai svarbi temperat ūra, 
todėl tokiais atvejais bandymo metodo aprašyme nurodomos 
tinkamos s ąlygos. Visuose toksiškumo bandymuose temperat ūra ir 
drėgnis turėtų būti stebimi, registruojami ir įtraukiami į baigiamąją 
bandymo ataskait ą. 
Apšvietimas turi b ūti dirbtinis, šviesos režimas – 12 valand ų šviesos 
ir 12 valand ų tamsos. Apšvietimo duomenys tur ėtų būti registruojami 
ir įtraukiami į baigiamąją bandymo ataskait ą. 
Jei metode kitaip nenurodoma, gyv ūnai gali b ūti laikomi po vien ą 
arba tos pa čios lyties individ ų grupėmis, tačiau viename narve netu ­
rėtų būti daugiau negu penki gyv ūnai. 
Eksperiment ų su gyv ūnais ataskaitose svarbu nurodyti gyv ūnų 
laikymo b ūdą bei jų skaičių viename narve medžiagos eksperimento 
bei vėlesniu steb ėjimo periodu.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Šėrimas  
Bandymo metu gyv ūnams duodami pašarai turi atitikti visus tos 
gyvūnų rūšies mitybos reikalavimus. Tais atvejais, kai bandomoji 
medžiaga dedama į pašarus, j ų maistinė vertė gali sumaž ėti dėl 
bandomosios medžiagos s ąveikos su pašaru. Į tokios sąveikos gali ­
mybę turėtų būti atsižvelgiama aiškinant bandymo rezultatus. Stan ­
dartiniai laboratorini ų gyvūnų pašarai gali b ūti naudojami neribojant 
geriamo vandens kiekio. Jei bandomoji medžiaga duodama su paša ­
rais, juos renkantis turi b ūti užtikrinama, kad bandom ąją medžiag ą 
būtų galima tinkamai su jais sumaišyti. Maisto teršalai, kurie turi 
įtakos toksiniam poveikiui, netur ėtų viršyti koncentracij ų, dėl kurių 
rezultatai gali b ūti iškreipti.  
C. ALTERNATYVUS BANDYMAS  
Europos S ąjunga siekia vystyti ir tvirtinti alternatyvius metodus, 
kuriais galima gauti panaši ą informacij ą kaip ir įprastais bandymais 
su gyvūnais, tačiau kuriems b ūtų naudojama mažiau gyv ūnų, jiems 
būtų sukeliama mažiau skausmo arba b ūtų galima visiškai j ų nenau­
doti. 
Kai tik tokie metodai įsigalioja, b ūtina apsvarstyti j ų taikymą siekiant 
nustatyti medžiag ų pavojingum ą, jas vėliau klasifikuojant bei ženkli ­
nant ir vertinant medžiagos chemin ę saugą. 
D. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Vertinant ir aiškinant gyv ūnų ir in vitro  bandymų rezultatus, reikia 
atsižvelgti į jų tiesiogin ės ekstrapoliacijos žmogui ribotum ą, todėl 
gavus įrodymą apie medžiagos neigiam ą poveikį žmonėms, jo tur ėtų 
pakakti bandym ų su gyvūnais rezultatams patvirtinti.  
E. LITERAT ŪROS ŠALTINIAI  
Dauguma ši ų metodų sukurti vykdant OECD bandym ų gairių 
programą ir turėtų būti atliekami pagal Geros laboratorin ės praktikos 
principus, kad b ūtų užtikrintas kuo didesnis abipusis duomen ų pripa­ 
žinimas.  
Papildomos informacijos galima rasti OECD gair ėse nurodytuose 
šaltiniuose ir kitoje publikuotoje literat ūroje. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1 bis.  ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKT Ą. 
FIKSUOT ŲJŲ DOZIŲ METODAS  
1. METODAS  
Šis bandym ų metodas atitinka OECD TG 420 (2001).  
1.1. ĮVADAS  
Taikant tradicinius metodus ūmus toksiškumas įvertinamas pagal 
gyvūno žūtį. Britų toksikolog ų draugija ( British Toxicology Society ) 
1984 m. pasi ūlė naują ūmaus toksiškumo bandymo b ūdą, pagrįstą 
kelių fiksuoto dydžio dozi ų davimu (1). Taikant š į būdą poveikio 
įrodymas neb ėra tik gyv ūnų žūtis; metodas pagr įstas aiški ų toksiš­
kumo požymi ų, kurie pasireiškia nuo kurios nors fiksuoto dydžio 
dozės iš dozi ų serijos, steb ėjimu. Pasibaigus JK (2) ir tarptautinio 
(3) tinkamumo patvirtinimo bandymui  in vivo , 1992 m. ši proced ūra 
buvo patvirtinta kaip bandymo metodas. V ėliau, taikant matematinius 
modelius, daugelyje bandym ų buvo įvertintos statistin ės fiksuot ų 
dozių metodikos savyb ės (4)(5)(6). Be to, atlikti  in vivo  ir modelia ­
vimo bandymai įrodė metodikos atkuriamum ą ir kad j ą taikant 
naudojama mažiau gyv ūnų, jiems sukeliamos mažesn ės kančios nei 
taikant tradicinius metodus ir pagal j ą galima suklasifikuoti 
medžiagas panašiai, kaip tai b ūtų padaryta taikant kitus ūmaus 
toksiškumo bandymo metodus.  
Rekomendacijas d ėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandym ų 
metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinam ąjį 
traktą bandymo rekomendaciniame dokumente (7). Be to, šiame 
rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie B.1 bis bandymo metodo taikym ą ir aiškinim ą.
 
Metodo esm ę sudaro tai, kad atliekant pagrindin į bandymą skiriamos 
vidutinio toksiškumo doz ės ir išvengiama dozi ų, kurios sukelt ų žūtį. 
Be to, nereikia skirti dozi ų, kurios, kaip žinoma, sukelia didel į 
skausmą ir kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginan čio poveikio. 
Gaištantys gyv ūnai arba gyv ūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausm ą 
arba kuriems pasireiškia didel ės ir ilgalaik ės kančios požymiai, turi 
būti humaniškai numarinami ir interpretuojant bandymo rezultatus 
laikomi atliekant bandym ą žuvusiais gyv ūnais. Sprendimo numarinti 
gaištantį arba stipriai ken čiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numa ­
tomos arba neišvengiamos ž ūties nustatymo rekomendacijos yra 
atskiro rekomendacinio dokumento objektas (8).  
Taikant metod ą gaunama informacijos apie medžiagos pavojingas 
savybes, tod ėl ją galima įvertinti ir klasifikuoti pagal Visuotinai 
suderintą ūmų toksinį poveikį sukeliančių cheminių medžiag ų klasi­
fikavimo sistem ą (Globally Harmonised System (GHS) for the clas ­
sification of chemicals which cause acute toxicity ) (9).  
Prieš bandymo pradži ą bandymų laboratorija išnagrin ėja visą turimą 
informacij ą apie bandom ąją medžiag ą. Tokią informacij ą sudaro 
medžiagos tapatumas ir chemin ė struktūra, jos fizikin ės ir chemin ės 
savybės, visų kitų in vitro  arba  in vivo  medžiagos toksiškumo 
bandymų rezultatai, giminingos strukt ūros medžiag ų toksikologiniai 
duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo b ūdas (-ai). Ši 
informacija yra b ūtina norint įtikinti visus, kurie priima sprendimus 
dėl bandymo reikalingumo žmoni ų sveikatai apsaugoti, ir pad ėti 
pasirinkti tinkam ą pradinę dozę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Ūmus toksiškumas per virškinam ąjį traktą – neigiamas poveikis, 
kuris atsiranda gavus per virškinam ąjį traktą vieną medžiagos doz ę 
arba kelias dozes per 24 h.  
Uždelsta ž ūtis – kai gyv ūnas nenugaišta arba nepradeda gaišti per 
48 h, bet nugaišta v ėliau per 14 par ų stebėjimo laikotarp į. 
Dozė – gyvūnui duotas bandomosios medžiagos kiekis. Doz ė išreiš­
kiama bandomosios medžiagos mase bandomojo gyv ūno masės 
vienetui (pvz., mg/kg).  
Akivaizdus toksiškumas  – bendrasis terminas, kuriuo apib ūdinami 
tokie aišk ūs toksiškumo požymiai, atsirad ę gyvūnui (-ams) davus 
bandomosios medžiagos (pavyzdžiai pateikti (3)), kad galima numa ­
tyti, jog gyv ūnui (-ams) davus kit ą didžiausi ą fiksuotą dozę didesnei 
daliai gyv ūnų pasireikš didelio skausmo ir ilgalaiki ų didelių kančių 
požymiai, gaišimo b ūsenos požymiai (kriterijai pateikti rekomenda ­
ciniame dokumente d ėl poveikio žmon ėms (8)), arba tik ėtina, kad jie 
nugaiš.  
GHS  – visuotinai suderinta chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifika ­
vimo sistema ( Globally Harmonised Classification System for 
Chemical Substances and Mixtures ). Ekonominio bendradarbiavimo 
ir plėtros organizacijos (OECD) (žmoni ų sveikata ir aplinka), JT 
pavojingų prekių gabenimo ekspert ų komiteto (fizikin ės ir chemin ės 
savybės) ir Tarptautin ės darbo organizacijos (ILO) (pranešimas apie 
pavojus) bendra veikla, koordinuojama pagal Bendr ą organizacij ų 
tinkamo chemini ų medžiag ų valdymo program ą (Interorganisation 
Programme for the Sound Management of Chemicals  (IOMC)).  
Neišvengiama ž ūtis – kai gaišimo b ūsena arba ž ūtis numatoma 
anksčiau negu nustatytas kito planinio steb ėjimo momentas. Grauži ­
kams šios b ūsenos požymiai gal ėtų būti traukuliai, gul ėjimas ant 
šono, gul ėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau informacijos 
pateikta rekomendaciniame dokumente d ėl poveikio žmon ėms (8)).  
LD 50 (vidutinė mirtina doz ė) – statistiškai apskai čiuota per virški ­
namąjį traktą duodama medžiagos doz ė, nuo kurios tik ėtinai gali ž ūti 
50 % gyv ūnų. LD  50 vertė išreiškiama bandomosios medžiagos mase 
bandomojo gyv ūno masės vienetui (mg/kg).  
Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutin ę bandymo doz ės ribą (2 000 
arba 5 000 mg/kg).  
Gaišimo b ūsena  – būsena prieš ž ūtį arba neišvengiamos ž ūties, net 
jei gyvūnas gydomas, b ūsena. (Daugiau informacijos pateikta reko ­
mendaciniame dokumente d ėl poveikio žmon ėms (8)).  
Numatoma ž ūtis – klinikini ų požymių, rodančių žūtį žinomu ateities 
momentu prieš eksperimento pabaig ą, pvz., nesugeb ėjimas pasiekti 
vandens arba pašaro, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta reko ­
mendaciniame dokumente d ėl poveikio žmon ėms (8)).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Vienos lyties gyv ūnų grupėms nuosekliai duodamos fiksuotos 5, 50, 
300 ir 2 000 mg/kg doz ės (išskirtiniu atveju galima apsvarstyti gali ­
mybę duoti papildom ą fiksuotą 5 000 mg/kg doz ę, žr. 1.6.2 skirsn į). 
Atsižvelgiant į orientacin į bandymą pasirenkama tokia pradin ė dozė, 
kuri galėtų sukelti kai kuriuos toksiškumo požymius, bet kuri neb ūtų 
sunkaus toksinio poveikio arba ž ūties priežastimi. Klinikiniai požy ­
miai ir s ąlygos, susijusios su skausmu, kan čia ir neišvengiama 
žūtimi, išsamiai aprašytos atskirame OECD rekomendaciniame doku ­
mente (8). Kitoms gyv ūnų grupėms gali b ūti duodamos didesn ės 
arba mažesn ės fiksuotos doz ės, atsižvelgiant į toksiškumo arba gaiš ­
tamumo požymi ų buvimą arba nebuvim ą. Ši proced ūra tęsiama tol, 
kol nustatoma doz ė, sukelianti akivaizd ų toksiškum ą arba ne daugiau 
kaip vieno gyv ūno žūtį, arba kol nustatoma, kad net didžiausia doz ė 
nesukelia jokio poveikio arba gyv ūnai žūsta net nuo mažiausios 
dozės. 
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Gyv ūnų rūšies pasirinkimas  
Tinkamiausia graužik ų rūšis yra žiurk ės, nors galima naudoti ir kitus 
graužikus. Paprastai naudojamos patel ės (7). Taip yra tod ėl, kad 
literatūros apie tipinius LD  50 bandymus analiz ė rodo, kad jautrumo 
skirtumai tarp ly čių yra maži, bet tais atvejais, kai jie yra, patel ės 
dažniausiai yra šiek tiek jautresn ės (10). Ta čiau, jei giminingos struk ­
tūros chemini ų junginių toksikologin ės arba toksikokinetin ės savybės 
rodo, kad jautresni gali b ūti patinai, tur ėtų būti naudojama ši lytis. 
Kai bandymai daromi su patinais, pateikiamas tinkamas pagrindimas.  
Bandomi sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų laboratorini ų 
rūšių gyvūnai. Patel ės turi būti dar netur ėjusios palikuoni ų ir neap­
vaisintos. Kiekvieno gyv ūno amžius prieš duodant doz ę turi būti nuo 
8 iki 12 savai čių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anks čiau dozę 
gavusių gyvūnų vidutinę masę. 
1.4.2.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Bandomų gyvūnų patalpos temperat ūra turi būti 22 °C (± 3 °C). 
Nors santykin ė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidau ­
tina ne didesn ė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikėtų 
siekti, kad ji b ūtų 50–60 %. Apšvietimas turi b ūti dirbtinis ir jo seka: 
12 h šviesos ir 12 h tamsos. Gyv ūnams šerti tinka įprastas labora ­
torinių gyvūnų pašaras, geriamojo vandens kiekis neribojamas. 
Gyvūnai gali b ūti laikomi grup ėmis narveliuose, į grupes skirstant 
pagal jų gaunamą dozę, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi truk ­
dyti aiškiai steb ėti kiekvien ą gyvūną. 
1.4.3.  Gyv ūnų ruošimas  
Gyvūnai atrenkami atsitiktinai, ženklinami, kad b ūtų įmanoma iden ­
tifikuoti kiekvien ą gyvūną, ir prieš dozi ų davimo pradži ą laikomi 
narveliuose mažiausiai 5 paras, kad gal ėtų priprasti prie laboratorijos 
sąlygų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  Dozi ų ruošimas  
Paprastai bandomoji medžiaga duodama tokio paties t ūrio dozėmis, 
keičiama tik doz ės preparato koncentracija. Ta čiau jei reikia bandyti 
skystą galutinį produktą arba mišin į, paskesniam šios bandomosios 
medžiagos rizikos įvertinimui galb ūt labiau tikt ų neskiesta, t. y. 
pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojan čios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias 
duodamos doz ės tūris neturi b ūti viršytas. Didžiausias skys čio tūris, 
kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyv ūno 
dydžio. Graužikams šis t ūris paprastai turi b ūti ne didesnis kaip 
1ml/100g k ūno masės, tačiau vandenini ų tirpalų atveju galima 
duoti 2 ml/100g k ūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato 
sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandenin į tirpalą 
(suspensij ą, emulsiją), toliau pirmenyb ė teikiama aliejiniam tirpalui 
(emulsijai, suspensijai) (pvz., kukur ūzų aliejaus) ir tik po j ų galimi 
kitų nešiklių tirpalai. Jei nešiklis ne vanduo, turi b ūti žinomos jo 
toksikologin ės charakteristikos. Doz ės turi būti ruošiamos prieš pat 
davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra 
žinomas ir laikomas priimtinu.  
1.5. BANDYMO EIGA  
1.5.1.  Dozavimas  
Bandomoji medžiaga duodama kaip vienetin ė dozė per skrandžio 
zondą arba tinkam ą intubacin į vamzdel į. Esant ne įprastoms aplinky ­
bėms, kai ne įmanoma duoti vienetin ės dozės, ji gali b ūti duodama 
mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.  
Prieš duodant doz ę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurk ės negauna pašaro, 
išskyrus vanden į, per nakt į; pelės negauna pašaro, išskyrus vanden į, 
3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyv ūnai pasveriami ir 
duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pel ės nešeriamos 1–2 h. 
Jei dozė duodama dalimis tam tikr ą laikotarp į, gyvūnus gali tekti 
šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukm ę.
 
1.5.2.  Orientacinis bandymas  
Orientacinio bandymo tikslas – nustatyti tinkam ą pradinę pagrindinio 
bandymo doz ę. Bandomoji medžiaga nuosekliai duodama atskiriems 
gyvūnams pagal 1 pried ėlio diagram ą. Orientacinis bandymas 
baigiamas, kai galima priimti sprendim ą dėl pagrindinio bandymo 
pradinės dozės (arba jei gyv ūnas žūsta esant mažiausiai fiksuotai 
dozei).  
Orientacinio bandymo pradin ė dozė pasirenkama iš 5, 50, 300 ir 
2 000 mg/kg dozi ų kaip doz ė, nuo kurios tur ėtų pasireikšti 
akivaizdus toksiškumas. Ji turi b ūti pagrįsta, jei įmanoma,  in vivo  
ir in vitro  duomenimis apie t ą pačią cheminę medžiagą ir struktūriniu 
požiūriu giminingas chemines medžiagas. Neturint tokios informa ­
cijos, pradin ė dozė yra 300 mg/kg.  
Kiekvienam gyv ūnui dozės duodamos ne dažniau kaip kas 24 h. Visi 
gyvūnai turėtų būti stebimi mažiausiai 14 par ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Išimtiniais atvejais ir tik jei tai pagr įsta tam tikrais reguliavimo 
sumetimais, galima spr ęsti, ar skirti papildom ą viršutin ės ribos 
fiksuotą 5 000 mg/kg dydžio doz ę (žr. 3 pried ėlį). Dėl gyvūnų 
gerovės priežasčių neskatinama daryti bandymo taikant GHS 5 kate ­
gorijos intervalus (2 000–5 000 mg/kg) ir apie tokio bandymo b ūti­
nybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didel ė tikimybė, kad jo rezul ­
tatai yra tiesiogiai sietini su žmoni ų ar gyvūnų sveikatos arba 
aplinkos apsauga.  
Tais atvejais, kai darant orientacin į bandymą žūsta gyvūnas, gavęs 
mažiausią fiksuotą dozę (5 mg/kg), įprasta bandym ą nutraukti ir 
medžiagą priskirti GHS 1 kategorijai (kaip nurodyta 1 pried ėlyje). 
Tačiau jei reikalingas tolesnis klasifikavimo patvirtinimas, gali b ūti 
atliekama tokia neprivaloma papildoma proced ūra: 5 mg/kg doz ė 
duodama antram gyv ūnui. Jei šis antras gyv ūnas žūsta, GHS 1 kate ­
gorija patvirtinama ir bandymas iš karto nutraukiamas. Jei antras gyvūnas išgyvena, 5 mg/kg doz ę gauna ne daugiau kaip trys papil ­
domi gyv ūnai. Kadangi yra didel ė žūties rizika, gyv ūnų gerovei 
apsaugoti jie turi gauti ši ą dozę paeiliui. Laiko tarpo tarp doz ės 
davimo kiekvienam gyv ūnui turi pakakti nustatyti, ar pirmiau doz ę 
gavęs gyvūnas turi galimyb ę išgyventi. Jei ž ūsta antras gyv ūnas, 
dozių davimas iš karto nutraukiamas ir nei vienas papildomas 
gyvūnas dozės nebegauna. Kadangi žuvus antram gyv ūnui (neatsiž ­
velgiant į bandymo nutraukimo momentu panaudot ų
 gyvūnų skaičių) 
rezultatas yra A (2 arba daugiau ž ūčių), taikoma 2 pried ėlio klasifi ­
kavimo taisykl ė esant 5 mg/kg fiksuotai dozei (1 kategorija, jei žuvo 
2 arba daugiau gyv ūnų, 2 kategorija, jei žuvo ne daugiau kaip 1 
gyvūnas). Be to, 4 pried ėlyje pateiktas klasifikavimo metodas 
pagal ES sistem ą, taikytinas iki bus įgyvendinta nauja GHS.  
1.5.3.  Pagrindinis bandymas  
1.5.3.1.  Gyvūnų skaičius ir dozi ų dydis  
Veiksmai, kuri ų turi būti imamasi po bandymo su pradine doze, 
nurodyti 2 pried ėlyje pateiktose schemose. Yra trys b ūdai: nutraukti 
bandymą ir priskirti medžiag ą atitinkamai pavojaus klasei, bandyti 
esant didesnei fiksuotai dozei arba bandyti esant mažesnei fiksuotai 
dozei. Ta čiau siekiant apsaugoti gyv ūnus, darant pagrindin į bandymą 
nebus kartojama doz ė, sukėlusi žūtį darant orientacin į bandymą (žr. 2 
priedėlį). Patirtis rodo, kad labiausiai tik ėtina, jog davus pradin ę dozę 
medžiagą galima suklasifikuoti ir tolesnio bandymo nebereikia.  
Kiekvienai bandomai dozei paprastai bus naudojama iš viso po 
penkis vienos lyties gyv ūnus. Penkis gyv ūnus sudaro vienas gyv ūnas 
iš orientacinio bandymo, gavusio pasirinkt ą dozę, ir keturi papildomi 
gyvūnai (išskyrus ne įprastus atvejus, kai pagrindinio bandymo doz ė 
nebuvo įtraukta į orientacin į bandymą). 
Laiko tarp ą tarp kiekvieno dydžio dozi ų skyrimo lemia toksiškumo 
požymių atsiradimo pradžia, trukm ė ir sunkumas. Kitos doz ės 
davimas gyv ūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno 
anksčiau dozę gavę gyvūnai. Rekomenduojamas 3 arba 4 par ų laiko­
tarpis tarp kiekvieno dydžio doz ės, jei prireikia, uždelstam toksiniam 
poveikiui steb ėti. Laiko tarpas prireikus gali b ūti keičiamas, pvz., jei 
gaunama reakcija, d ėl kurios sunku priimti sprendim ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
Kai sprendžiama, ar skirti didžiausi ą fiksuotą 5 000 mg/kg doz ę, 
reikėtų laikytis 3 pried ėlyje aprašyto metodo (taip pat žr. 1.6.2 
skirsnį). 
1.5.3.2.  Ribinis bandymas  
Ribinis bandymas vis ų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas 
turi informacijos, rodan čios, kad bandomoji medžiaga grei čiausiai 
yra netoksiška, t. y. toksiškumas pasireiškia esant didesn ėms nei 
reglamentuojamos ribin ėms dozėms. Informacijos apie bandomosios 
medžiagos toksiškum ą galima gauti pasinaudojus žiniomis apie pana ­ 
šius bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius arba produktus, atsižvelgiant į toksikologiškai reikšming ų komponent ų 
tapatumą ir procentin ę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie 
medžiagos toksiškum ą yra mažai arba jos išvis n ėra, arba kai ta 
informacija leidžia manyti, kad bandomoji medžiaga yra toksiška, turi būti atliekamas pagrindinis bandymas.
 
Paprastai šioje rekomendacijoje ribiniu bandymu laikomas orienta ­
cinis bandymas esant 2 000 mg/kg (arba išimtinais atvejais 5 000 
mg/kg), po kurio keturiems papildomiems gyv ūnams būtų skirta 
tokio pat dydžio doz ė. 
1.6. STEB ĖJIMAI  
Kiekvienas doz ę gavęs gyvūnas stebimas bent vien ą kartą per pirm ą­
sias 30 min. ir periodiškai per pirm ąsias 24 h, skiriant ypating ą 
dėmesį pirmosioms keturioms valandoms, o v ėliau kartą per dien ą 
visas 14 par ų, išskyrus atvejus, kai gyv ūnams reikia nutraukti 
bandymą ir humaniškai numarinti d ėl gyvūnų gerovės priežas čių 
arba kai jie nugaišta. Ta čiau stebėjimo trukm ė neturi b ūti griežtai 
fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksines reakcijas, sveikimo laiko ­
tarpio pradži ą ir trukm ę, taigi prireikus ji gali b ūti pratęsta. Svarbus 
yra toksiškumo požymi ų atsiradimo ir išnykimo momentas, ypa č jei 
uždelsto toksiškumo požymi ų atsiradimo tendencija (11). Visi steb ė­
jimai sistemingai užrašomi, apie kiekvien ą gyvūną atskirai.  
Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia steb ėti 
papildomai. Reikia steb ėti odos ir kailio, aki ų ir gleivin ės pasikei­
timus, be to kv ėpavimo, kraujo, autonomin ės ir centrin ės nervų 
sistemų, somatomotorinio aktyvumo ir elgesio pasikeitimus. Ypa č 
reikia steb ėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, 
mieguistumas, miego ir komos b ūsenos, ar neteka seil ės. Reikėtų 
atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame 
dokumente d ėl poveikio žmon ėms (8). Gaištantys gyv ūnai ir 
gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia 
ilgalaikiai sunki ų kančių požymiai, tur ėtų būti humaniškai numarinti. 
Kai gyv ūnai numarinami d ėl gyvūnų gerovės priežas čių arba 
randami negyvi, ž ūties laikas užrašomas kuo tiksliau.  
1.6.1.  Kūno masė 
Kiekvieno gyv ūno masė nustatoma prieš pat bandomosios medžiagos 
davimą ir vėliau – mažiausiai kas savait ę. Turi būti apskaičiuotas ir 
užrašytas mas ės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlik ę gyvūnai pasve ­
riami ir humaniškai numarinami.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Patologija  
Visiems bandomiesiems gyv ūnams (įskaitant nugaišusius per 
bandymą arba pašalintus iš bandymo d ėl gyvūnų gerovės priežasčių) 
daroma bendroji nekroskopija. Aprašomi visi dideli kiekvieno 
gyvūno patologiniai poky čiai. Gyvūnams, kurie po doz ės gavimo 
išgyveno 24 h arba ilgiau, galima b ūtų daryti mikroskopin į organų, 
turinčių akivaizdži ų patologini ų pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali 
suteikti naudingos informacijos.  
2. DUOMENYS  
Turi būti pateikiami atskiri duomenys apie kiekvien ą gyvūną. Be to, 
visi duomenys apibendrinami lentel ėse, kuriose nurodomas kiek ­
vienos bandymo grup ės gyvūnų skaičius, toksiškumo požymi ų 
turinčių gyvūnų skaičius, darant bandym ą žuvusių arba dėl gyvūnų 
gerovės priežasčių numarint ų gyvūnų skaičius, atskir ų gyvūnų žūties 
laikas, toksinio poveikio aprašymas ir eiga, gr įžtamumas, nekrosko ­
pijos duomenys.  
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija, jei taikoma:  
Bandomoji medžiaga:  
— fizinė būsena, grynumas ir, jei svarbu, fizikin ės ir chemin ės 
savybės (įskaitant izomerizavim ą), 
— tapatumas, įskaitant CAS numer į. 
Nešiklis (jei taikoma):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir veisl ė, 
— mikrobiologin ė gyvūno būsena, jei žinoma,  
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis ( įskaitant, jei taikoma, patin ų 
vietoj pateli ų naudojimo pagrindim ą), 
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.  
Bandymo s ąlygos:  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos sud ėtį, įskaitant 
duodamos medžiagos fizikin į pavidalą, 
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos davim ą, įskaitant 
dozės tūrį ir davimo laik ą, 
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (įskaitant 
pašaro tip ą (šaltinį), vandens šaltin į), 
— pradin ės dozės pasirinkimo pagrindimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Rezultatai:  
— kiekvieno gyv ūno reakcijos duomen ų ir dozės dydžio lentel ės (t. 
y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant 
nugaišimą, poveikio tip ą, sunkum ą ir trukm ę), 
— kūno masės ir jos kitimo lentel ės, 
— kiekvieno gyv ūno masė dozės davimo dien ą, vėliau kas savait ę ir 
žūties arba numarinimo dien ą, 
— žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planin į numarinim ą, 
— toksiškumo požymi ų kiekvienam gyv ūnui atsiradimas ir j ų eiga, 
taip pat gr įžtamumas kiekvieno gyv ūno atveju,  
— kiekvieno gyv ūno nekroskopijos ir histopatologiniai duomenys, 
jei yra.  
Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. 
Human Toxicol., 3, p. 85–92.
 
2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D.and Shillaker, R.O., (1987) 
Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, p. 279–291.
 
3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P., (1990) The international validation of a fixed-dose proce ­
dure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, p. 469–482.  
4) Whitehead, A. and Curnow, R.N., (1992) Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, p. 313–324.
 
5) Stallard, N. and Whitehead, A., (1995) Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 
p. 315–323.  
6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P., (2002) Statistical 
evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183–196.
 
7) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and SAFEty Monograph Series 
on Testing and Assessment No 24. Paris.  
8) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in SAFEty Evaluation. Environmental 
Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Asses ­
ment No 19.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
9) OECD (1998) Harmonised Integrated Hazard Classification for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521–14-no- 
24-no-0,FF.html].
 
10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C., (1995) Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, p. 223–231.  
11) Chan, P.K and Hayes, A.W., (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3
 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd. New York, 
USA.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼C1 
1 PRIED ĖLIS 
ORIENTACINIO BANDYMO SCHEMA

 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼C1

 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼C1 
2 PRIED ĖLIS 
PAGRINDINIO BANDYMO SCHEMA

 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼C1

 
3 PRIED ĖLIS 
BANDOM ŲJŲ MEDŽIAG Ų, KURIŲ TIKĖTINOS LD  50 VERTĖS YRA 
DIDESN ĖS NEGU 2 000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI 
NEDARANT BANDYMO  
5 pavojaus kategorijos kriterijai yra apibr ėžti, kad b ūtų galima identifikuoti 
bandomąsias medžiagas, kuri ų ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, 
tačiau kurios esant tam tikroms aplinkyb ėms gali b ūti pavojingos pažeidžiamoms 
populiacijoms. Tik ėtina, kad ši ų medžiag ų LD  50 per virškinimo trakt ą arba odą 
yra 2 000–5 000 mg/kg arba ekvivalentin ė dozė, kai medžiagos patenka kitais 
būdais. Bandomosios medžiagos gal ėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, 
apibrėžtai 2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais 
atvejais:  
a) jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kuri ą nors iš 2 pried ėlio bandymo 
schemų, remiantis gaištamumo dažnumu;  
b) jei jau yra patikim ų duomenų, rodančių, kad LD  50 yra 5 kategorijos ver čių 
intervale, arba kiti bandymai su gyv ūnais arba toksinis poveikis žmon ėms 
rodo ūmaus tipo poveik į žmonių sveikatai;  
c) gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo b ūdu, jei 
priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagr įstas ir  
— yra patikimos informacijos, rodan čios didelį toksinį poveikį žmonėms, 
arba 
— pastebimas tam tikras gaištamumas, kai bandymas atliekamas duodant 
dozes per virškinimo trakt ą, siekiančias 4 kategorijos vertes, arba  
— jei tęsiant bandymus iki 4 kategorijos ver čių, ekspertų sprendimu patvirti ­
nami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavim ą, 
pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyv ūno išvaizd ą, arba  
— jei ekspert ų sprendimu patvirtinama patikima informacija, rodanti galim ą 
reikšming ą ūmų poveikį darant kitus bandymus su gyv ūnais. 
BANDYMAS ESANT DIDESN ĖMS NEGU 2 000 MG/KG DOZ ĖMS 
Išimtiniais atvejais, ir tik norint įvykdyti konkre čius kontrol ės institucij ų reikala­
vimus, galima spr ęsti, ar skirti papildom ą viršutinės ribos fiksuot ą 5 000 mg/kg 
dydžio doz ę. Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyv ūnų gerovę, bandymas skiriant 
5 000 mg/kg neskatinamas ir apie tokio bandymo b ūtinybę turėtų būti spren­
džiama, kai yra didel ė tikimybė, kad jo rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmoni ų 
arba gyvūnų sveikatos apsauga (9).  
Orientacinis bandymas  
Sprendimo pri ėmimo taisykl ės, taikomos 1 pried ėlyje pateiktai nuosekliai proce ­
dūrai, išplečiamos, kad b ūtų galima įtraukti 5 000 mg/kg doz ę. Taigi kai skiriama 
orientacinio bandymo pradin ė 5 000 mg/kg doz ė, gavus A rezultat ą (žūtis), reikės 
daryti bandym ą su antru gyv ūnu, jam skiriant 2 000 mg/kg; gavus B ir C rezul ­
tatus (akivaizdus toksiškumas arba jokio toksiškumo), pradin ė pagrindinio 
bandymo doz ė gali būti 5 000 mg/kg. Panašiai, jei skiriama kita nei 5 000 
mg/kg pradin ė dozė, bandymas bus t ęsiamas iki 5 000 mg/kg, jei esant 2 000 
mg/kg dozei gaunti B arba C rezultatai; jei esant 5 000 mg/kg gautas A rezul ­
tatas, pagrindinio bandymo pradin ė dozė yra 2 000 mg/kg, o gavus B ir C 
rezultatus, pagrindinio bandymo pradin ė dozė yra 5 000 mg/kg.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Pagrindinis bandymas  
Sprendimo pri ėmimo taisykl ės, taikomos 2 pried ėlyje pateiktai nuosekliai proce ­
dūrai, išplečiamos, kad b ūtų galima įtraukti 5 000 mg/kg doz ę. Taigi kai skiriama 
pagrindinio bandymo pradin ė 5 000 mg/kg doz ė, gavus A rezultat ą (≥ 2 žūtys) 
reikės daryti 2 grup ės bandym ą, jai skiriant 2 000 mg/kg; gavus B rezultat ą 
(akivaizdus toksiškumas ir (arba) ≤ 1 žūtis) arba C (jokio toksiškumo), medžiaga 
nebus klasifikuojama pagal GHS. Panašiai, jei naudojama kita nei 5 000 mg/kg pradinė dozė, bandymas bus t ęsiamas iki 5 000 mg/kg, jei esant 2 000 mg/kg 
dozei gaunamas C rezultatas; jei esant 5 000 mg/kg dozei gaunamas A rezultatas, 
medžiaga priskiriama GHS 5 kategorijai, o gavus B arba C rezultatus, medžiaga pagal GHS neklasifikuojama.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼C1 
4 PRIED ĖLIS 
BANDYM Ų METODAS B.1 bis.  
Klasifikavimo pagal ES schem ą rekomendacijos, taikomos pareinamajam laikotarpiui iki visiško visuotinai suderintos klasifikavimo sistemos (GHS) įgyvendinimo (paimta iš (8) nuorodos)

 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼C1

 
B.1 tris.  ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKT Ą. 
ŪMAUS TOKSIŠKUMO KLAS ĖS METODAS  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 423 (2001)  
1.1. ĮVADAS  
Šiame bandyme taikomas ūmaus toksiškumo klas ės metodas (1) – tai 
nuosekli proced ūra, pagal kuri ą vienai pakopai naudojami 3 vienos 
lyties gyv ūnai. Atsižvelgiant į gaištamum ą ir (arba) gyv ūno gaišimo 
būseną, vidutiniškai gali prireikti 2–4 pakop ų, kad būtų galima 
spręsti apie bandomosios medžiagos ūmų toksiškum ą. Ši metodika 
yra atkuriama, j ą taikant naudojama daug mažiau gyv ūnų ir ji leidžia 
suskirstyti medžiagas panašiai, kaip tai b ūtų padaryta taikant kitus 
ūmaus toksiškumo bandymo metodus. Ūmaus toksiškumo klas ės 
metodas pagr įstas biometriniais įvertinimais (2) (3) (4) (5), naudojant 
fiksuotas dozes, kurios pakankamai skiriasi, kad medžiag ą būtų 
galima suklasifikuoti ir įvertinti jos pavojingum ą. 1996 m. priimto 
metodo tinkamumas buvo pla čiai patvirtintas nacionaliniu (6) ir tarp ­
tautiniu mastu (7) darant  in vivo  bandymus ir lyginant su literat ūroje 
pateiktais LD  50 duomenimis.  
Rekomendacijas d ėl nurodytam tikslui tinkamiausio bandym ų 
metodo pasirinkimo galima rasti Ūmaus toksiškumo per virškinam ąjį 
traktą bandymo rekomendaciniame dokumente (8). Be to, šiame 
rekomendaciniame dokumente yra papildomos informacijos apie 
B.l tris bandymo metodo taikym ą ir aiškinim ą. 
Nereikia duoti dozi ų, jei žinoma, kad jos sukelia didel į skausmą ir 
kančią dėl ėsdinančio arba stipriai dirginan čio poveikio. Gaištantys 
gyvūnai arba gyv ūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausm ą arba 
kuriems pasireiškia didel ės ir ilgalaik ės kančios požymiai, turi b ūti 
humaniškai numarinami ir interpretuojant bandymo rezultatus laikomi darant bandym ą žuvusiais gyv ūnais. Sprendimo numarinti 
gaištantį arba stipriai ken čiantį gyvūną priėmimo kriterijai ir numa ­
tomos arba neišvengiamos ž ūties nustatymo rekomendacijos yra 
atskiro rekomendacinio dokumento objektas (9).
 
Metode naudojamos iš anksto nustatyto dydžio doz ės, o rezultatai 
leidžia medžiag ą įvertinti ir j ą suklasifikuoti pagal Visuotinai sude ­
rintą ūmų toksinį poveikį sukelian čių cheminių medžiag ų klasifika ­
vimo sistem ą (Globally Harmonised System (GHS) for the classifi ­
cation of chemicals which cause acute toxicity ) (10).  
Iš esmės šis metodas n ėra skirtas tikslioms LD  50 vertėms apskai ­ 
čiuoti, bet juo galima nustatyti apibr ėžtus žūtį sukelian čių dozių 
intervalus, kadangi tokio bandymo tikslas ir yra nustatyti, ar dalis gyvūnų žūsta. Šiuo metodu galima nustatyti LD
 50 vertę tik tais atve ­
jais, kai mažiausiai dviej ų dozių sukeliamas gaištamumas yra 
didesnis kaip 0 % ir mažesnis kaip 100 %. Kai skiriamos iš anksto pasirinkto dydžio doz ės neatsižvelgiant į bandom ąją medžiag ą, o 
klasifikavimas tiesiogiai siejamas su stebim ų skirtingos b ūsenos 
gyvūnų skaičiumi, laboratorijoms did ėja galimyb ė pasiekti suderi ­
namų ir atkartojam ų rezultatų.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Prieš bandymo pradži ą bandymų laboratorija išnagrin ėja visą turimą 
informacij ą apie bandom ąją medžiag ą. Tokią informacij ą sudaro 
medžiagos tapatumas ir chemin ė struktūra, jos fizikin ės ir chemin ės 
savybės, visų kitų in vitro  arba  in vivo  medžiagos toksiškumo 
bandymų rezultatai, giminingos strukt ūros medžiag ų toksikologiniai 
duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudojimo b ūdas (-ai). Ši 
informacija yra b ūtina siekiant įsitikinti, kad bandymas reikalingas 
žmonių sveikatos apsaugos tikslais, ir padeda pasirinkti tinkam ą 
pradinę dozę. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Ūmus TOKSIŠKUMAS PER virškinam ąjį traktą – neigiamas 
poveikis, kuris atsiranda gavus per virškinam ąjį traktą vieną 
medžiagos doz ę arba kelias dozes per 24 h.  
Uždelsta ž ūtis – kai gyv ūnas nenugaišta arba nepradeda gaišti per 
48 h, bet nugaišta v ėliau per 14 par ų stebėjimo laikotarp į. 
Dozė – gyvūnui duotas bandomosios medžiagos kiekis. Doz ė išreiš­
kiama bandomosios medžiagos mase bandomojo gyv ūno masės 
vienetui (pvz., mg/kg)  
GHS  – visuotinai suderinta chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifika ­
vimo sistema ( Globally Harmonised Classification System for 
Chemical Substances and Mixtures ). Ekonominio bendradarbiavimo 
ir plėtros organizacijos (OECD) (žmoni ų sveikata ir aplinka), JT 
pavojingų prekių gabenimo ekspert ų komiteto (fizikin ės ir chemin ės 
savybės) ir Tarptautin ės darbo organizacijos (ILO) (pranešimas apie 
pavojus) bendra veikla, koordinuojama pagal Bendr ą organizacij ų 
tinkamo chemini ų medžiag ų valdymo program ą (Interorganisation 
Programme for the Sound Management of Chemicals  (IOMC))  
Neišvengiama ž ūtis – kai gaišimo b ūsena arba ž ūtis numatoma 
anksčiau negu nustatytas kito planinio steb ėjimo momentas. Grauži ­
kams šios b ūsenos požymiai gal ėtų būti traukuliai, gul ėjimas ant 
šono, gul ėjimas horizontaliai ir drebulys. (Daugiau informacijos 
pateikta rekomendaciniame dokumente d ėl poveikio žmon ėms (9)).  
LD 50 (vidutinė mirtina doz ė) – statistiškai apskai čiuota per virški ­
namąjį traktą duodama medžiagos doz ė, nuo kurios tik ėtinai gali ž ūti 
50 % gyv ūnų. LD  50 vertė išreiškiama bandomosios medžiagos mase 
bandomojo gyv ūno masės vienetui (mg/kg).  
Ribinė dozė – dozė, atitinkanti viršutin ę bandymo doz ės ribą (2 000 
arba 5 000 mg/kg).  
Gaišimo b ūsena  – būsena prieš ž ūtį arba neišvengiamos ž ūties, net 
jei gyvūnas gydomas, b ūsena. (Daugiau informacijos pateikta reko ­
mendaciniame dokumente d ėl poveikio žmon ėms (9)).  
Numatoma ž ūtis – klinikini ų požymių, rodančių žūtį žinomu ateities 
momentu prieš eksperimento pabaig ą, pvz., nesugeb ėjimas pasiekti 
vandens arba pašaro, buvimas. (Daugiau informacijos pateikta reko ­
mendaciniame dokumente d ėl poveikio žmon ėms (9)).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Šio bandymo esm ę sudaro nuoseklusis metodas, pagal kur į vienai 
pakopai naudojant mažiausi ą įmanomą gyvūnų skaičių gaunama 
pakankamai informacijos apie bandomosios medžiagos ūmų toksiš­
kumą, kad būtų galimą ją klasifikuoti. Bandymo gyv ūnų grupė per 
virškinam ąjį traktą gauna vien ą iš nustatyt ų bandomosios medžiagos 
dozių. Medžiaga bandoma taikant nuosekl ųjį metodą, kiekvienai 
pakopai naudojant po tris vienos lyties gyv ūnus (paprastai pateles). 
Tai, ar junginio doz ę gavę gyvūnai nugaišta per vien ą pakopą, lemia, 
kokia yra tolesn ė pakopa, t. y.:  
— toliau bandyti nereikia,  
— duoti toki ą pat dozę dar trims gyv ūnams,  
— trims papildomiems gyv ūnams duoti kit ą didesnę arba mažesn ę 
dozę. 
Bandymo metodika išsamiai aprašyta 1 pried ėlyje. Metodas leidžia 
spręsti, ar bandom ąją medžiag ą priskirti vienai iš toksiškumo klasi ų, 
apibrėžtų fiksuotomis LD  50 intervalo ribin ėmis vertėmis. 
1.4. METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Gyv ūnų rūšies pasirinkimas  
Tinkamiausia graužik ų rūšis yra žiurk ės, nors galima naudoti ir kitus 
graužikus. Paprastai naudojamos patel ės (9). Taip yra tod ėl, kad 
literatūros apie tipinius LD  50 bandymus analiz ė rodo, kad jautrumo 
skirtumai tarp ly čių yra maži, bet tais atvejais, kai jie yra, patel ės 
dažniausiai yra šiek tiek jautresn ės (11). Ta čiau jei giminingos struk ­
tūros chemini ų junginių toksikologin ės arba toksikokinetin ės savybės 
rodo, kad jautresni gali b ūti patinai, tur ėtų būti naudojama ši lytis. 
Kai bandymai daromi su patinais, tur ėtų būti pateiktas atitinkamas 
pagrindimas.  
Bandomi sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų laboratorini ų 
rūšių gyvūnai. Patel ės turi būti neturėjusios palikuoni ų ir neapvai ­
sintos. Kiekvieno gyv ūno amžius prieš skiriant doz ę turėtų būti nuo 
8 iki 12 savai čių, o masė ± 20 % tikslumu turi atitikti anks čiau dozę 
gavusių gyvūnų vidutinę masę. 
1.4.2.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Bandomų gyvūnų patalpos temperat ūra turi būti 22 °C (± 3 °C). 
Nors santykin ė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidau ­
tina ne didesn ė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikėtų 
siekti, kad ji b ūtų 50–60 %. Apšvietimas turi b ūti dirbtinis ir jo seka: 
12 h šviesos ir 12 h tamsos. Gyv ūnams šerti tinka įprastas labora ­
torinių gyvūnų pašaras, geriamojo vandens kiekis neribojamas. 
Gyvūnai gali b ūti laikomi grup ėmis narveliuose, į grupes skirstant 
pagal jų gaunamą dozę, tačiau gyvūnų skaičius narvelyje neturi truk ­
dyti aiškiai steb ėti kiekvien ą gyvūną. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Gyv ūnų ruošimas  
Gyvūnai atrenkami atsitiktinai, ženklinami, kad b ūtų įmanoma iden ­
tifikuoti kiekvien ą gyvūną, ir prieš dozi ų davimo pradži ą laikomi 
narveliuose mažiausiai 5 paras, kad priprast ų prie laboratorijos 
sąlygų. 
1.4.4.  Dozi ų ruošimas  
Paprastai bandomoji medžiaga duodama tokio paties t ūrio dozėmis, 
keičiama tik preparato koncentracija. Ta čiau jei reikia bandyti skyst ą 
galutinį produkt ą arba mišin į, paskesniam šios bandomosios 
medžiagos rizikos įvertinimui galb ūt labiau tikt ų neskiesta, t. y. 
pastovios koncentracijos, bandomoji medžiaga, to reikalauja ir kai kurios reglamentuojan čios institucijos. Bet kuriuo atveju didžiausias 
skiriamos doz ės tūris neturi b ūti viršytas. Didžiausias skys čio tūris, 
kurį galima duoti vienu metu, priklauso nuo bandomo gyv ūno 
dydžio. Graužikams šis t ūris paprastai turi b ūti ne didesnis kaip 
1ml/100g k ūno masės, tačiau vandenini ų tirpalų atveju galima 
duoti 2 ml/100g k ūno masės. Kalbant apie dozuojamo preparato 
sudėtį, rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, vandenin į tirpalą 
(suspensij ą, emulsiją), toliau pirmenyb ė teikiama aliejiniam tirpalui 
(emulsijai, suspensijai) (pvz., kukur ūzų aliejaus) ir tik po j ų galimi 
kitų nešiklių tirpalai. Jei nešiklis yra ne vanduo, turi b ūti žinomos jo 
toksikologin ė
s charakteristikos. Doz ės turi būti ruošiamos prieš pat 
davimą, išskyrus kai preparato stabilumas naudojimo laikotarpiu yra 
žinomas ir laikomas priimtinu.  
1.5. BANDYMO EIGA  
1.5.1.  Dozavimas  
Bandomoji medžiaga duodama kaip vienetin ė dozė per skrandžio 
zondą arba tinkam ą intubacin į vamzdel į. Esant ne įprastoms aplinky ­
bėms, kai ne įmanoma duoti vienetin ės dozės, ji gali b ūti duodama 
mažesnėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.  
Prieš duodant doz ę gyvūnai nešeriami (pvz., žiurk ės negauna pašaro, 
išskyrus vanden į, per nakt į; pelės negauna pašaro, išskyrus vanden į, 
3–4 h). Pasibaigus badavimo laikotarpiui, gyv ūnai pasveriami ir 
duodama bandomoji medžiaga. Gavusios bandomosios medžiagos žiurkės gali būti nešeriamos dar 3–4 h, pel ės nešeriamos 1–2 h. 
Jei dozė duodama dalimis per tam tikr ą laikotarp į, gyvūnus gali 
tekti šerti ir girdyti atsižvelgiant į laikotarpio trukm ę.
 
1.5.2.  Gyv ūnų skaičius ir dozi ų dydis  
Kiekvienai pakopai naudojami trys gyv ūnai. Dozė, kuri turi b ūti 
naudojama kaip pradin ė dozė, pasirenkama iš keturi ų fiksuotų 
dydžių: 5, 50, 300 ir 2 000 mg/kg k ūno masės. Kaip pradin ė turėtų 
būti pasirinkta tokia doz ė, nuo kurios tikrai nugaišt ų kai kurie doz ę 
gavę gyvūnai. Schemose, pateiktose 1 pried ėlyje, aprašyta proced ūra, 
kurią reikėtų taikyti kiekvienai pradinei dozei. Be to, 4 pried ėlyje 
pateiktas klasifikavimo metodas pagal ES sistem ą, taikytinas iki bus 
įgyvendinta nauja GHS.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Kai turima informacija leidžia manyti, kad gyv ūnai neturėtų nugaišti 
nuo didžiausios pradin ės dozės (2 000 mg/kg k ūno masės), reikėtų 
daryti ribin į bandym ą. Jei informacijos apie bandom ąją medžiag ą 
nėra, dėl gyvūnų gerovės priežasčių pradine doze reik ėtų pasirinkti 
300 mg/kg k ūno masės. 
Laiko tarp ą tarp kiekvieno dydžio dozi ų davimo lemia toksiškumo 
požymių atsiradimo pradžia, trukm ė ir sunkumas. Kitos doz ės 
davimas gyv ūnams atidedamas tol, kol bus įsitikinta, kad išgyveno 
anksčiau dozę gavę gyvūnai. 
Išimtiniais atvejais ir tik jei tai pagr įsta tam tikrais reguliavimo 
sumetimais, galima spr ęsti, ar skirti papildom ą viršutin ės ribos 
fiksuotą 5 000 mg/kg dydžio doz ę (žr. 2 pried ėlį). Dėl gyvūnų 
gerovės priežasčių neskatinama atlikti bandymo taikant GHS 5 kate ­
gorijos interval ą (2 000–5 000 mg/kg) ir apie tokio bandymo reika ­
lingumą turėtų būti sprendžiama, kai yra didel ė tikimybė, kad jo 
rezultatai yra tiesiogiai sietini su žmoni ų arba gyv ūnų sveikatos 
arba aplinkos apsauga.  
1.5.3.  Ribinis bandymas  
Ribinis bandymas vis ų pirma atliekamas tais atvejais, kai bandytojas 
turi informacijos, rodan čios, kad bandomoji medžiaga grei čiausiai 
yra netoksiška, t. y. toksiškumas pasireiškia esant didesn ėms nei 
reglamentuojamos ribin ėms dozėms. Apie bandomosios medžiagos 
toksiškum ą galima sužinoti remiantis informacija apie panašius 
bandytus junginius arba panašius bandytus mišinius ar produktus, atsižvelgiant į toksikologiškai reikšming ų komponent ų tapatumą ir 
procentin ę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiš ­
kumą yra mažai arba jos išvis n ėra, arba kai ta informacija leidžia 
manyti, kad bandomoji medžiaga yra toksiška, turi b ūti atliekamas 
pagrindinis bandymas.
 
Kai skiriama viena 2 000 mg/kg k ūno masės dozė, ribiniam 
bandymui galima imti šešis gyv ūnus (po tris vienai pakopai). Išimti ­
niais atvejais, kai skiriama viena 5 000 mg/kg doz ė, ribiniam 
bandymui galima naudoti tris gyv ūnus (žr. 2 pried ėlį). Jei pastebimas 
su medžiaga siejamas gaišimas, gali tekti daryti bandym ą esant 
gretimai mažesnei dozei.  
1.6. STEB ĖJIMAI  
Kiekvienas doz ę gavęs gyvūnas stebimas bent vien ą kartą per pirm ą­
sias 30 min. ir periodiškai per pirm ąsias 24 h, skiriant ypating ą 
dėmesį pirmosioms keturioms valandoms, o v ėliau kartą per dien ą 
visas 14 par ų, išskyrus atvejus, kai gyv ūnams reikia nutraukti 
bandymą ir humaniškai numarinti d ėl gyvūnų gerovės priežas čių 
arba kai jie nugaišta. Ta čiau stebėjimo trukm ė neturi b ūti griežtai 
fiksuojama. Ji nustatoma pagal toksines reakcijas, sveikimo laiko ­
tarpio pradži ą ir trukm ę, taigi prireikus ji gali b ūti pratęsta. Svarbus 
yra toksiškumo požymi ų atsiradimo ir išnykimo momentas, ypa č jei 
yra uždelsto toksiškumo tendencija (12). Visi steb ėjimai sistemingai 
užrašomi, apie kiekvien ą gyvūną atskirai.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Jei gyvūnams ir toliau pasireiškia toksiškumo požymiai, reikia steb ėti 
papildomai. Reikia steb ėti odos ir kailio, aki ų ir gleivin ės pasikei­
timus, be to kv ėpavimo, kraujo, autonomin ės ir centrin ės nervų 
sistemų, somatomotorinio aktyvumo ir elgesio pasikeitimus. Ypa č 
reikia steb ėti, ar nepasireiškia drebulys, traukuliai, viduriavimas, 
mieguistumas, miego ir komos b ūsenos, ar neteka seil ės. Reikėtų 
atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Rekomendaciniame 
dokumente d ėl poveikio žmon ėms (9). Gaištantys gyv ūnai ir 
gyvūnai, kurie patiria didelius skausmus arba kuriems pasireiškia 
ilgalaikiai sunki ų kančių požymiai, tur ėtų būti humaniškai numari ­
nami. Kai gyv ūnai numarinami d ėl gyvūnų gerovės priežasčių arba 
randami negyvi, ž ūties laikas užrašomas kuo tiksliau.  
1.6.1.  Kūno masė 
Kiekvieno gyv ūno masė turi būti nustatoma prieš pat bandomosios 
medžiagos davim ą ir vėliau mažiausiai kas savait ę. Turi būti apskai­ 
čiuotas ir užrašytas mas ės pokytis. Pasibaigus bandymui, išlik ę 
gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.  
1.6.2.  Patologija  
Visiems bandomiesiems gyv ūnams (įskaitant nugaišusius per 
bandymą arba pašalintus iš bandymo d ėl gyvūnų gerovės priežasčių) 
daroma bendroji nekroskopija. Tur ėtų būti aprašomi visi dideli kiek ­
vieno gyv ūno patologiniai poky čiai. Gyvūnams, kurie išgyveno 24 h 
arba ilgiau, galima b ūtų atlikti mikroskopin į organų, turinčių akivaiz­
džių patologini ų pokyčių, tyrimą, kadangi jis gali suteikti naudingos 
informacijos.  
2. DUOMENYS  
Turėtų būti pateikiami atskiri duomenys apie kiekvien ą gyvūną. Be 
to, visi duomenys apibendrinami lentel ėse, kuriose nurodomas kiek ­
vienos bandymo grup ės gyvūnų skaičius, toksiškumo požymi ų 
turinčių gyvūnų skaičius, darant bandym ą žuvusių arba dėl gyvūnų 
gerovės priežasčių numarint ų gyvūnų skaičius, atskir ų gyvūnų žūties 
laikas, toksinio poveikio aprašymas ir eiga, gr įžtamumas, nekrosko ­
pijos duomenys.  
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija, jei taikoma:  
Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena, grynumas ir, jei svarbu, fizikin ės ir chemin ės 
savybės (įskaitant izomerizavim ą), 
— tapatumas, įskaitant CAS numer į. 
Nešiklis (jei taikoma):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir veisl ė, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— mikrobiologin ė gyvūno būsena, jei žinoma,  
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis ( įskaitant, jei taikoma, patin ų 
vietoj pateli ų naudojimo pagrindim ą), 
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.  
Bandymo s ąlygos:  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos sud ėtį, įskaitant 
duodamos medžiagos fizikin į pavidalą, 
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos davim ą, įskaitant 
dozės tūrį ir davimo laik ą, 
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (įskaitant 
pašaro tip ą (šaltinį), vandens šaltin į), 
— pradin ės dozės pasirinkimo pagrindimas.  
Rezultatai:  
— kiekvieno gyv ūno reakcijos duomen ų ir dozės dydžio lentel ės (t. 
y. gyvūnų, kuriems pasireiškia toksiškumo požymiai, įskaitant 
nugaišimą, poveikio tip ą, sunkum ą ir trukm ę), 
— kūno masės ir jos kitimo lentel ės, 
— kiekvieno gyv ūno masė dozės davimo dien ą, vėliau kas savait ę ir 
žūties arba numarinimo dien ą, 
— žūties data ir laikas, jei tai įvyksta prieš planin į numarinim ą, 
— toksiškumo požymi ų kiekvienam gyv ūnui atsiradimas ir j ų eiga, 
taip pat gr įžtamumas kiekvieno gyv ūno atveju,  
— kiekvieno gyv ūno nekroskopijos ir histopatologiniai duomenys, 
jei yra.  
Rezultatų aptarimas ir aiškinimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Roll R., Hofer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspec ­
tives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., 
Suppl. 31, p. 86  
2) Roll R., Riebschlager M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizitat von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336–341.  
3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class 
Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559–610  
4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 
729–734.
 
5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class 
Methods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, p. 
129–134  
6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A 
National Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method 
– An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, p. 
455–470.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method 
(Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659–670.  
8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in SAFEty Evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assess ­
ment N 19.
 
10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnetl.oecd.or ­
g/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents- 521–14-no-24-no-0,FF.html].
 
11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, 
Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and 
Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol 33, p. 223–231.  
12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology . Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
1 PRIED ĖLIS 
PROCED ŪRA, TAIKOMA NAUDOJANT KIEKVIEN Ą PRADIN Ę DOZĘ 
BENDROSIOS PASTABOS  
Į šį priedą įtrauktose atitinkamose bandymo schemose aprašoma kiekvienos 
pradinės dozės procedūra, kurios reikia laikytis.  
— 1 A pried ėlis: pradin ė dozė 5 mg/kg k ūno masės 
— 1 B pried ėlis: pradin ė dozė 50 mg/kg k ūno masės 
— 1 C pried ėlis: pradin ė dozė 300 mg/kg k ūno masės 
— 1 D pried ėlis: pradin ė dozė 2 000 mg/kg k ūno masės 
Atsižvelgiant į humaniškai numarint ų arba nugaišusi ų gyvūnų skaičių, bandymo 
eiga žymima rodykl ėmis. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼C1 
1 A PRIED ĖLIS 
BANDYMO PROCED ŪRA, KAI PRADIN Ė DOZĖ YRA 5 MG/KG K ŪNO MAS ĖS

 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼C1 
1 B PRIED ĖLIS 
BANDYMO PROCED ŪRA, KAI PRADIN Ė DOZĖ YRA 50 MG/KG K ŪNO MAS ĖS

 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼C1 
1 C PRIED ĖLIS 
BANDYMO PROCED ŪRA, KAI PRADIN Ė DOZĖ YRA 300 MG/KG K ŪNO MAS ĖS

 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼C1 
1 D PRIED ĖLIS 
BANDYMO PROCED ŪRA, KAI PRADIN Ė DOZĖ YRA 2 000 MG/KG K ŪNO MAS ĖS

 2 PRIED ĖLIS 
BANDOM ŲJŲ MEDŽIAG Ų, KURIŲ TIKĖTINOS LD  50 VERTĖS YRA 
DIDESN ĖS NEGU 2 000 MG/KG, KLASIFIKAVIMO KRITERIJAI 
NEDARANT BANDYMO  
5 pavojaus kategorijos kriterijai yra apibr ėžti, kad b ūtų galima nustatyti bando ­
mąsias medžiagas, kuri ų ūmaus toksiškumo pavojus yra palyginti mažas, ta čiau 
kurios esant tam tikroms aplinkyb ėms gali b ūti pavojingos pažeidžiamoms popu ­
liacijoms. Tik ėtina, kad ši ų medžiag ų LD  50 per virškinam ąjį traktą arba odą yra 
2 000–5 000 mg/kg arba ekvivalentin ė dozė, kai medžiagos patenka kitais b ūdais. 
Bandomosios medžiagos gal ėtų būti priskirtos pavojaus kategorijai, apibr ėžtai 
2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (5 kategorija pagal GHS), šiais atvejais:  
a) jei būtų priskirtos šiai kategorijai pagal kuri ą nors iš 1a-1d schem ų, remiantis 
gaištamumo dažnumu;  
b) jei jau yra patikim ų duomenų, rodančių, kad LD  50 yra 5 kategorijos ver čių 
intervale, arba kiti bandymai su gyv ūnais arba toksinis poveikis žmon ėms 
rodo ūmaus tipo poveik į žmonių sveikatai;  
c) gaunant duomenis ekstrapoliavimo, įvertinimo arba matavimo b ūdu, jei 
priskyrimas didesnio pavojaus klasei nepagr įstas ir  
— yra patikimos informacijos, rodan čios didelį toksinį poveikį žmonėms, 
arba 
— pastebimas tam tikras gaištamumas, kai bandymas atliekamas per virški ­
namąjį traktą duodant dozes, siekian čias 4 kategorijos vertes, arba  
— jei tęsiant bandymus iki 4 kategorijos ver čių ekspertų sprendimu patvirti ­
nami reikšmingi klinikiniai toksiškumo požymiai, išskyrus viduriavim ą, 
pasišiaušusius plaukus arba nesveiko gyv ūno išvaizd ą, arba  
— jei ekspert ų sprendimu patvirtinama patikima darant kitus bandymus su 
gyvūnais gauta informacija, rodanti galim ą reikšming ą ūmų poveikį. 
BANDYMAS ESANT DIDESN ĖMS KAIP 2 000 MG/KG DOZ ĖMS 
Pripažįstant būtinumą apsaugoti gyv ūnų gerovę, bandymas su gyv ūnais skiriant 5 
kategorijos intervalo dozes (5 000 mg/kg) neskatinamas ir apie tokio bandymo būtinybę turėtų būti sprendžiama, kai yra didel ė tikimybė, kad jo rezultatai yra 
tiesiogiai sietini su žmoni ų arba gyv ūnų sveikatos apsauga (10). Neturi b ūti 
daromas joks bandymas esant didesn ėms dozėms.
 
Kai reikia bandyti naudojant 5 000 mg/kg doz ę, reikalinga tik viena pakopa (t. y. 
trys gyvūnai). Jei ž ūsta pirmas doz ę gavęs gyvūnas, dozavimas t ęsiamas skiriant 
2 000 mg/kg doz ę pagal 1 pried ėlyje pateiktas schemas. Jei pirmas gyv ūnas lieka 
gyvas, doz ę gauna kiti du gyv ūnai. Jei ž ūsta tik vienas iš trij ų gyvūnų, daroma 
prielaida, kad LD  50 vertė yra didesn ė negu 5 000 mg/kg. Jei ž ūsta abu gyv ūnai, 
dozavimas t ęsiamas skiriant 2 000 mg/kg doz ę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
3 PRIED ĖLIS 
BANDYM Ų METODAS B.1 tris. Klasifikavimo pagal ES schem ą rekomendacijos, taikomos 
pereinamajam laikotarpiui iki visiško visuotinai suderintos klasifikavimo sistemos (GHS) 
įgyvendinimo (paimta iš 8 nuorodos)
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. ŪMUS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 403 (OECD 
bandymo gair ės Nr. 403) (2009) (1). Pirmosios ūmaus toksiškumo įkvėpus 
bandymų gairės |Nr. 403 (TG 403) priimtos 1981 m. Šis atnaujintas B.2 
bandymo metodas (lygiavertis atnaujintoms TG 403) parengtas siekiant 
užtikrinti didesn į lankstum ą, naudoti mažiau gyv ūnų ir įgyvendinti regla ­
mentavimo reikmes. Atnaujintasis bandymo metodas sudarytas iš dviej ų 
rūšių tyrimų: įprasto LC  50 protokolo ir protokolo „Koncentracija × laikas“ 
(„K × l“). Pagrindin ės šio bandymo metodo savyb ės yra galimyb ė nustatyti 
koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ę remiantis nemirtinomis 
ir mirtinomis pasekm ėmis, siekiant nustatyti medianin ę mirtiną koncentracij ą 
(LC  50 ), nemirtin ą ribinę koncentracij ą (pvz., LC01) ir kreiv ės nuolydį, taip 
pat galim ą jautrumą pagal lyt į. „K × l“ protokolas tur ėtų būti naudojamas 
tada, kai yra speciali ųjų reglamentavimo arba mokslini ų reikmių, dėl kurių 
būtina atlikti įvairios trukm ės bandymus su gyv ūnais, pvz., reagavimo į 
nepaprast ąsias aplinkybes planavimo [pvz., ūmaus poveikio rekomendacini ų 
lygių (ŪPRL) nustatymo, reagavimo į nepaprast ąsias aplinkybes planavimo 
gairių (RNAPG) parengimo arba ūmaus poveikio ribini ų lygių (ŪPRL) 
verčių nustatymo] arba žem ėnaudos planavimo tikslais.  
2. Šio bandymo metodo tyrim ų atlikimo ir aiškinimo gair ės pateiktos rekomenda ­
ciniame dokumente d ėl ūmaus toksiškumo įkvėpus bandymo (RD Nr. 39) (2).  
3. Aprašant š į bandymo metod ą vartojamos apibr ėžtys pateiktos šio skyriaus 
pabaigoje ir RD Nr. 39 (2).  
4. Šiuo bandymo metodu galima nustatyti bandomosios chemin ės medžiagos 
savybes ir atlikti kokybin į rizikos vertinim ą, taip pat įvertinti ir klasifikuoti 
bandomąsias chemines medžiagas pagal Reglament ą (EB) Nr. 1272/2008 
(3). RD Nr. 39 (2) pateikiamos rekomendacijos, kaip pasirinkti tinkam ą 
bandymo metod ą, skirtą ūmaus poveikio tyrimams. Kai reikalinga informa ­
cija tik apie klasifikavim ą ir ženklinim ą, paprastai rekomenduojama remtis 
šio priedo B.52 skyriumi (4) [žr. RD Nr. 39 (2)]. Šis (B.2) bandymo metodas n ėra specialiai skirtas specialiosios paskirties medžiag ų, pvz., 
mažo tirpumo izomerini ų arba pluoštini ų medžiag ų arba dirbtini ų nanome­
džiagų, bandymams.
 
PIRMINIAI ASPEKTAI  
5. Prieš svarstydama galimyb ę atlikti bandymus pagal š į bandymo metod ą, 
bandymų laboratorija, siekdama sumažinti bandym ų su gyvūnais poreik į, 
turėtų peržiūrėti visą turimą informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiagą, 
įskaitant esamus tyrimus (pvz., šio priedo B.52 skyrius (4)), kuri ų duomenys 
leistų neatlikti papildom ų bandym ų. Pasirinkti tinkamiausi ą gyvūnų rūšį, 
padermę, lytį, poveikio b ūdą ir tinkamas bandym ų koncentracijas gali pad ėti 
informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos tapatum ą, chemin ę 
struktūrą, fizines ir chemines savybes, taip pat toksiškumo bandym ų in 
vitro  arba  in vivo  rezultatai, numatomi panaudojimo b ūdai ir galimas 
poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys 
apie panašios strukt ūros chemines medžiagas [žr. RD Nr. 39 (2)].  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Turėtų būti kaip įmanoma vengiama atlikti ėsdinančių ir (arba) dirginan čių 
bandomųjų cheminių medžiag ų bandymus naudojant koncentracijas, kurios, 
tikėtina, sukelt ų didelį skausmą ir (arba) kan čią. Ėsdinimo ir (arba) dirgi ­
nimo galimyb ė turėtų būti vertinama pasitelkiant ekspert ų nuomon ę ir 
remiantis tokiais įrodymais kaip patirtis su žmon ėmis ir gyv ūnais (pvz., 
remiantis kartotini ų dozių tyrimais, atliktais naudojant ne ėsdinančias ir 
(arba) nedirginan čias koncentracijas), turimi  in vitro  duomenys (pvz., 
remiantis šio priedo B.40 (5) ir B.40 bis (6) skyriais arba OECD TG 435 (OECD bandymo gair ės Nr. 425) (7)), pH vert ės, informacija apie panašias 
chemines medžiagas arba kiti tinkami duomenys, pvz., norint ištirti, ar 
galima neatlikti papildom ų bandymų. Jeigu yra speciali ųjų reglamentavimo 
reikmių (pvz., nepaprast ųjų aplinkybi
ų planavimo tikslais), taikant š į 
bandymo metod ą gyvūnai gali b ūti veikiami šiomis medžiagomis, nes 
pagal šį bandymo metod ą tyrimo vadovas arba vyriausiasis tyr ėjas turi 
galimybę kontroliuoti tikslini ų koncentracij ų pasirinkim ą. Tačiau tikslin ės 
koncentracijos netur ėtų sukelti stipraus dirginimo ir (arba) ėsdinimo, bet 
turėtų būti pakankamos, kad b ūtų galima prat ęsti koncentracijos ir reakcijos 
tarpusavio priklausomyb ės kreivę į tokių lygių, kad būtų pasiektas regla ­
mentavimo arba mokslinis tikslas, kurio siekiama bandymu. Šios koncent ­
racijos tur ėtų būti parinktos atsižvelgiant į konkretų atvejį, ir turėtų būti 
pateiktas toki ų koncentracij ų pasirinkimo pagrindimas [žr. RD Nr. 39 (2)].  
BANDYMO PRINCIPAS  
7. Šis atnaujintasis B.2 bandymo metodas skirtas gauti pakankamai informa ­
cijos apie bandomosios chemin ės medžiagos ūmų toksiškum ą, kad ją būtų 
galima klasifikuoti ir pateikti gaištamumo duomenis (pvz., LC  50, LC 01 ir 
kreivės nuolydis), susijusius su viena arba abejomis lytimis ir reikalingus 
kiekybiniams rizikos vertinimams. Pagal š į bandymo metod ą siūlomi du 
metodai. Pirmasis metodas yra įprastas protokolas, pagal kur į gyvūnų grupės 
veikiamos ribine koncentracija (ribinis bandymas) arba iš anksto nustatyt ą 
laiką, paprastai – keturias valandas, veikiamos įvairiomis pamažu didina ­
momis koncentracijomis. Atsižvelgiant į specialius reglamentavimo tikslus, 
gali būti taikomi ir kitokie poveikio laikotarpiai. Antrasis metodas yra 
(„K × l“) protokolas, pagal kur į gyvūnų grupės veikiamos viena (ribine) 
koncentracija arba įvairiais laikotarpiais veikiamos skirtingomis koncentra ­
cijomis.  
8. Gaištantys gyv ūnai arba gyv ūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausm ą arba 
kuriems pasireiškia didel ės ir ilgalaik ės kančios požymi ų, turėtų būti huma­
niškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultat ą laikomi atliekant bandym ą 
nugaišusiais gyv ūnais. Sprendimo numarinti gaištan čius arba sunkiai 
kenčiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišvengiamos 
žūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti OECD rekomendaciniame 
dokumente Nr. 19 d ėl pasekmi ų žmonėms (8).  
METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
9. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų labora­
torinių padermių gyvūnai. Tinkamiausia r ūšis yra žiurk ės; jeigu naudojama 
kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.  
Gyvūnų paruošimas  
10. Patel ės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Poveikio dien ą gyvūnai 
turėtų būti jauni, bet suaug ę, 8–12 savai čių amžiaus, o mas ė pagal kiekvien ą 
lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti anks čiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę 
masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka ir paženklinami, kad b ūtų galima 
identifikuoti kiekvien ą gyvūną. Ne mažiau kaip penkias paras iki bandymo 
pradžios gyv ūnai laikomi savo narveliuose, kad priprast ų prie laboratorini ų 
sąlygų. Prieš bandymus gyv ūnai taip pat tur ėtų būti trumpai papratinami prie 
bandymų aparatūros, nes tai pad ės sumažinti įtampą, kylančią patekus į 
naują aplinką. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Gyvūnų laikymas  
11. Bandom ųjų gyvūnų laikymo patalpos temperat ūra turėtų būti 22 ± 3 °C. 
Tinkamiausias santykinis dr ėgnis – 30–70 %, bet jis gali b ūti nepasiekiamas, 
jeigu naudojamas nešiklis yra vanduo. Prieš doz ės davimą ir davus doz ę 
gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirstyti grup ėmis pagal lyt į ir 
koncentracij ą; narvelyje laikom ų gyvūnų skaičius turėtų būti toks, kad 
būtų galima aiškiai steb ėti kiekvien ą gyvūną ir kad b ūtų patiriama kuo 
mažiau žalos d ėl kanibalizmo ir grumtyni ų. Jeigu doz ė gyvūnams duodama 
tik per nos į, gali reik ėti juos pripratinti prie uždarom ųjų vamzdeli ų. Užda­
romieji vamzdeliai gyv ūnams netur ėtų kelti didel ės fizinės, terminės arba 
suvaržymo įtampos. Varžymas gali tur ėti fiziologini ų pasekmių, pvz., tur ėti 
poveikio k ūno temperat ūrai (hipertermija) ir (arba) per minut ę įkvepiamam 
tūriui. Jeigu yra bendr ųjų duomenų, rodančių, kad toki ų pastebim ų pokyčių 
neįvyksta, pripratinimas prie uždarom ųjų vamzdeli ų nebūtinas. Gyv ūnai, 
kurių visas k ūnas veikiamas aerozoliu, poveikio laikotarpiu tur ėtų būti 
laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis neb ūtų filtruojamas per kit ų 
narvelyje esan čių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laikotarp į, gyvūnams 
šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas pašaras, 
duodant neribot ą geriamo vandens kiek į. Apšvietimas tur ėtų būti dirbtinis, 
taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sek ą. 
Inhaliacin ės kameros  
12. Parenkant inhaliacin ę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios 
cheminės medžiagos pob ūdį ir bandymo tiksl ą. Pirmenyb ė teikiama doz ės 
davimui tik per nos į (ši sąvoka apima s ąvokas „tik per galv ą“, „tik per nos į“ 
ir „tik per šnip ą“). Pirmenyb ė dozės davimui tik per nos į paprastai teikiama 
tiriant skyst ųjų arba kiet ųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali konden ­
suotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali b ūti sėkmingiau 
pasiekti taikant poveikio per vis ą kūną metodą, tačiau tai turi b ūti pagrįsta 
tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovum ą naudojant 
poveikio per vis ą kūną kamerą, visa bandom ųjų gyvūnų užimama erdv ė 
turėtų neviršyti 5 % kameros t ūrio. Poveikio tik per nos į ir poveikio per 
visą kūną metodų principai ir konkret ūs šių metodų privalumai bei tr ūkumai 
aprašyti RD Nr. 39 (2).  
POVEIKIO S ĄLYGOS  
Koncentracij ų taikymas  
13. Poveikio tik per nos į trukmė atliekant bandymus su žiurk ėmis gali b ūti bet 
kokia, ta čiau ne ilgesn ė kaip 6 valandos. Jeigu poveikis tik per nos į 
taikomas pel ėms, poveikio trukm ė paprastai netur ėtų viršyti keturi ų valandų. 
Jeigu reikalingi ilgesn ės trukmės tyrimai, b ūtinas pagrindimas [žr. RD 
Nr. 39 (2)]. Gyv ūnai, kurie veikiami aerozoliais poveikio per vis ą kūną 
kamerose, tur ėtų būti laikomi atskirai, kad kiti viename narvelyje laikomi 
gyvūnai laižydami nenuryt ų bandomosios chemin ės medžiagos. Poveikio 
metu gyv ūnas netur ėtų būti šeriamas. Vandens gali b ūti duodama per vis ą 
laikotarpį, kuriuo gyv ūnas veikiamas per vis ą kūną. 
14. Gyvūnai veikiami bandom ąja medžiaga duj ų, garų, aerozoli ų arba jų mišinių 
pavidalu. Per tyrim ą naudotina fizin ė būsena priklauso nuo fizini ų ir 
cheminių bandomosios chemin ės medžiagos savybi ų, pasirinktos koncentra ­
cijos ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant bandomąją cheminę medžiag ą. Higroskopin ės ir chemiškai reaguojan čios 
bandomosios chemin ės medžiagos tur ėtų būti bandomos sauso oro s ąly­
gomis. Tur ėtų būti imamasi atsargumo priemoni ų, kad būtų išvengta sprogi ų 
koncentracij ų susidarymo.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Dalelių dydžio pasiskirstymas  
15. Daleli ų rūšiavimas pagal dyd į turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir 
garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis b ūtų pada­
rytas visoms svarbioms kv ėpavimo tak ų sritims, rekomenduojama naudoti 
aerozolius, kuri ų masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 
1–4 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis ( σ g ) – 1,5–3,0 (2) (9) (10). 
Nors turėtų būti imamasi pagr įstų priemoni ų, kad šio standarto b ūtų laiko­
masi, jeigu jo įgyvendinti ne įmanoma, tur ėtų būti pateikta ekspert ų 
nuomonė. Pvz., metal ų garai gali b ūti mažesni už š į standartą, o įelektrintos 
dalelės, pluoštai ir higroskopin ės medžiagos (kurios padid ėja drėgnoje 
kvėpavimo tak ų aplinkoje) gali viršyti š į standartą. 
Bandomosios chemin ės medžiagos paruošimas nešiklyje  
16. Siekiant užtikrinti reikiam ą bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą 
ir dalelių dydį atmosferoje, gali b ūti naudojamas nešiklis. Paprastai pirme ­
nybė teikiama vandeniui. Siekiant užtikrinti reikiam ą dalelių dydžio pasis ­
kirstymą, iš daleli ų sudaryta medžiaga gali b ūti apdorojama mechaniškai, 
tačiau turėtų būti imamasi atsargumo priemoni ų, kad bandomoji medžiaga 
nebūtų suskaidyta arba neb ūtų pakeistos jos savyb ės. Kai manoma, kad 
mechaniškai apdorojus bandom ąją cheminę medžiag ą pasikeitė jos chemin ė 
sudėtis (pvz., d ėl labai aukšt ų temperat ūrų, susidariusi ų dėl trinties pernelyg 
stipriai malant), bandomosios chemin ės medžiagos sud ėtis turėtų būti patik­
rinta analiz ės būdu. Turėtų būti imamasi tinkam ų atsargumo priemoni ų, kad 
bandomoji chemin ė medžiaga neb ūtų užteršta. Neb ūtina tikrinti netrapi ų 
granulių pavidalo medžiag ų, kurios specialiai paruoštos taip, kad j ų nebūtų 
galima įkvėpti. Turėtų būti atliekamas trynimo bandymas, skirtas įrodyti, 
kad tvarkant granuli ų pavidalo medžiag ą nesusidaro įkvepiamų dalelių. 
Jeigu atliekant trynimo bandym ą susidaro įkvepiamų cheminių medžiag ų, 
turėtų būti atliekamas toksiškumo įkvėpus bandymas.  
Kontroliniai gyv ūnai 
17. Vienalaik ės neigiamos kontrol ės (naudojant or ą) grupė nebūtina. Jeigu 
bandymo atmosferos suk ūrimo tikslais naudojamas nešiklis n ėra vanduo, 
nešiklio kontrolin ė grupė turėtų būti naudojama tik tuo atveju, jeigu n ėra 
istorinių toksiškumo įkvėpus duomen ų. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos 
bandomosios chemin ės medžiagos toksiškumo tyrim ą nustatoma, kad 
medžiaga n ėra toksiška, vadinasi, ir nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, 
nėra toksiškas; taigi nešiklio kontrol ė nebūtina. 
POVEIKIO S ĄLYGŲ STEBĖJIMAS  
Oro srautas kameroje  
18. Kiekvieno poveikio metu tur ėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas 
ir ne rečiau kaip kart ą per valand ą registruojamas per kamer ą tekantis oro 
srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pasto ­
vumo) steb ėjimas yra vienas iš vis ų dinamini ų parametr ų matavim ų, sutei­
kiantis galimyb ę netiesiogiai kontroliuoti visus svarbius dinaminius atmos ­
feros kūrimo parametrus. Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas tam, kad 
būtų išvengta pakartotinio įkvėpimo doz ės davimo tik per nos į kamerose, 
kai per poveikio sistem ą tekantis oro srautas yra nepakankamas užtikrinti 
dinaminį bandomosios chemin ės medžiagos atmosferos sraut ą. Yra nustatyti 
metodai, kurie gali b ūti taikomi norint įrodyti, kad pasirinktomis poveikio 
sąlygomis ne įvyksta pakartotinio įkvėpimo (2) (11). Deguonies koncentra ­
cija turėtų būti ne mažesn ė kaip 19 %, anglies dioksido – ne didesn ė kaip 
1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad ši ų standartų įgyvendinti ne įmanoma, 
turėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncentracijos.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Kameros temperat ūra ir santykinis dr ėgnis 
19. Kameroje tur ėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperat ūra. Tiek doz ę duodant 
tik per nos į, tiek veikiant vis ą kūną, santykinis dr ėgnis turėtų būti stebimas 
ir registruojamas ne mažiau kaip tris kartus, kai poveikio trukm ė keturios 
valandos, ir kas valand ą, kai poveikio trukm ė mažesnė. Tinkamiausias 
santykinis dr ėgnis – 30–70 %, ta čiau jis gali b ūti nepasiekiamas (pvz., 
bandant vandens pagrindo mišinius) arba neišmatuojamas d ėl trukdžių, atsi­
randančių bandomajai cheminei medžiagai taikant bandymo metod ą. 
Bandomoji chemin ė medžiaga. Vardin ė koncentracija  
20. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardin ė koncentra ­
cija poveikio kameroje. Vardin ė koncentracija yra sukurtos bandomosios 
cheminės medžiagos mas ės ir viso oro srauto, perleisto per kamer ų sistemą, 
tūrio santykis. Vardin ė koncentracija n ėra naudojama apib ūdinti poveik į 
gyvūnui, tačiau, vardin ę koncentracij ą palyginus su faktine, nustatomas 
generavimo, kur į užtikrina bandym ų sistema, efektyvumas, kuriuo remiantis 
galima nustatyti generavimo problemas.  
Bandomoji chemin ė medžiaga. Faktin ė koncentracija  
21. Faktin ė koncentracija yra bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija 
inhaliacin ės kameros gyv ūno kvėpavimo zonoje. Faktines koncentracijas 
galima nustatyti specialiaisiais metodais (pvz., taikant tiesioginio ėminių 
ėmimo, adsorbcijos ar chemini ų reakcijų metodus ir tada atliekant analizin į 
apibūdinimą) arba nespecialiaisiais metodais, pvz., atliekant gravimetrin ę 
analizę naudojant filtrus. Gravimetrin ė analizė gali būti taikoma tik vienos 
sudedamosios dalies milteli ų aerozoliams arba mažo lakumo skyst ųjų dalelių 
aerozoliams ir tur ėtų būti grindžiama tinkamais prieš tyrim ą atliktais bando ­
mosios chemin ės medžiagos savybi ų apibūdinimais. Iš daugiau kaip vienos 
sudedamosios dalies sudaryt ų miltelių aerozolių koncentracijos taip pat gali 
būti nustatomos atliekant gravimetrin ę analizę. Tačiau tam reikalingi anali ­
tiniai duomenys, įrodantys, kad ore esan čios medžiagos sud ėtis panaši į 
pirminės medžiagos sud ėtį. Jeigu tokios informacijos n ėra, tyrimo metu 
gali reikėti vienodais intervalais atlikti pakartotin ę bandomosios chemin ės 
medžiagos (geriausia, kad ji b ūtų ore) analiz ę. Jeigu aerozolin ės medžiagos 
gali garuoti arba sublimuoti, tur ėtų būti įrodyta, kad pasirinktu metodu 
surinktos visos faz ės. Tyrimo ataskaitoje tur ėtų būti nurodytos siekiamos, 
vardinės ir faktin ės koncentracijos, ta čiau atliekant statistin ę analizę, skirtą 
apskaičiuoti mirtinas koncentracijos vertes, naudojamos tik faktin ės koncent ­
racijos.  
22. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti naudojama viena bandomosios chemin ės 
medžiagos partija, o bandomasis ėminys tur ėtų būti laikomas tokiomis s ąly­
gomis, kad b ūtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir stabilumas. 
Prieš pradedant tyrim ą reikėtų apibūdinti bandomosios chemin ės medžiagos 
savybes, įskaitant jos grynum ą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, tapatum ą, 
taip pat nustatyt ų teršalų ir priemaiš ų kiekius. Be kit ų duomenų, tai galima 
pagrįsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiausios 
koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektroskopin ę 
arba dujų chromatografijos analiz ę, arba kitais įverčiais. Nors bandomojo 
ėminio tapatumo nustatymas n ėra bandym ų laboratorijos pareiga, bandym ų 
laboratorijai gali b ūti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateik ėjo nurodytas 
savybes (pvz., spalv ą, fizinę būseną ir t. t.).  
23. Poveikio atmosfera tur ėtų būti kaip įmanoma pastovesn ė ir turėtų būti 
stebima nuolat ir (arba) su pertraukomis, atsižvelgiant į analizės metodą. 
Jeigu ėminiai imami su pertraukomis, per keturi ų valandų tyrimą kameros 
atmosferos ėminiai tur ėtų būti imami ne mažiau kaip du kartus. Jeigu tai 
neįmanoma d ėl nedideli ų oro srauto grei čių arba maž ų koncentracij ų, gali 
būti imamas vienas ėminys per vis ą poveikio laikotarp į. Jeigu ėminiai paste ­
bimai skiriasi, tiriant kitas koncentracijas per poveikio laikotarp į turėtų būti ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
imami keturi ėminiai. Atskiri kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai 
neturėtų nukrypti nuo vidutin ės koncentracijos daugiau kaip ± 10 %, kai 
tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip ± 20 %, kai tiriami skyst ųjų arba 
kietųjų dalelių aerozoliai. Tur ėtų būti apskaičiuotas ir užregistruotas pusiaus ­
vyros nusistov ėjimo kameroje laikotarpis (t  95 ). Į poveikio trukm ę įtrau­
kiamas laikas, per kur į susidaro bandomoji chemin ė medžiaga, ir atsižvel ­
giama į laiką, kurio reikia, kad b ūtų pasiekta t  95 . T 95 apskaičiavimo gair ės 
pateiktos RD Nr. 39 (2).  
24. Jeigu tiriami labai sud ėtingi mišiniai, sudaryti iš duj ų ir (arba) gar ų, ir 
aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios chemin ės medžiagos, 
pučiamos iš specialiai varom ų galutinio naudojimo produkt ų arba prietais ų), 
kiekvienos faz ės veikimas inhaliacin ėje kameroje gali b ūti skirtingas, tod ėl 
iš kiekvienos faz ės (dujų ir (arba) gar ų ir aerozolio) tur ėtų būti parinkta bent 
viena indikacin ė cheminė medžiaga (analit ė); paprastai šiuo tikslu pasiren ­
kama pagrindin ė veiklioji mišinio chemin ė medžiaga. Jeigu bandomoji 
cheminė medžiaga yra mišinys, tur ėtų būti nurodyta mišinio, o ne tik veik ­
liosios chemin ės medžiagos arba sudedamosios dalies (analit ės) analizin ė 
koncentracija. Daugiau informacijos apie faktines koncentracijas pateikta 
RD Nr. 39 (2).  
Bandomoji chemin ė medžiaga. Daleli ų dydžio pasiskirstymas  
25. Aerozoli ų dalelių dydžio pasiskirstymas tur ėtų būti nustatomas bent kart ą 
per kiekvien ą keturių valandų trukmės poveikio laikotarp į naudojant pako ­
pinį ėmiklį arba alternatyv ų prietaisą, pvz., aerodinamin į dalelių rūšiuotuvą. 
Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu arba alternatyviu prietaisu 
gaunami lygiaver čiai rezultatai, atliekant tyrim ą gali būti naudojamas alter ­
natyvus prietaisas. Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju 
veiksmingumu, kartu su pagrindiniu prietaisu tur ėtų būti naudojamas 
antrasis prietaisas, pvz., gravimetrinis filtras, gaudykl ė arba barboteris. 
Atlikus daleli ų dydžio analiz ę nustatyta mas ės koncentracija tur ėtų neviršyti 
priimtinų filtruojamosios analiz ės būdu nustatytos mas ės koncentracijos rib ų 
[žr. RD Nr. 39 (2)]. Jeigu lygiavertiškum ą galima įrodyti pradiniame tyrimo 
etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyv ūnų 
gerovės sumetimais tur ėtų būti imamasi priemoni ų, kad būtų kuo mažiau 
negalutini ų duomen ų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti poveik į. Garuose 
esančios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek tik ėtina, 
kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu gar ų atmosfe­
roje aptinkama daleli ų, dėl kurių gali susidaryti mišri ų fazių (žr. 15 skirsn į). 
PROCED ŪRA 
26. Toliau aprašyti du tyrim ų tipai: įprastas protokolas ir „K × l“ protokolas. 
Pagal abu protokolus gali b ūti atliekamas orientacinis tyrimas, pagrindinis 
tyrimas ir (arba) ribinis bandymas (tradicinis protokolas) arba bandymai 
taikant ribin ę koncentracij ą („K × l“ protokolas). Jeigu žinoma, kad kurios 
nors lyties gyv ūnai yra jautresni, tyrimo vadovas gali nuspr ęsti atlikti šiuos 
tyrimus tik su jautresni ąja lytimi. Jeigu naudojant kitos r ūšies graužikus nei 
žiurkės dozė duodama tik per nos į, ilgiausia poveikio trukm ė gali būti 
pakoreguojama siekiant sumažinti tos r ūšies gyvūnų patiriam ą kančią. 
Prieš pradedant tur ėtų būti atsižvelgta į visus turimus duomenis, kad b ūtų 
kuo labiau sumažintas gyv ūnų naudojimo poreikis. Pvz., naudojant pagal šio 
priedo B.52 skyri ų (4) gautus duomenis galima sumažinti orientacinio 
tyrimo poreik į ir įrodyti, ar kurios nors lyties gyv ūnai yra jautresni [žr. 
RD Nr. 39 (2)].  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
ĮPRASTAS PROTOKOLAS  
Bendrieji aspektai. Įprastas protokolas  
27. Atliekant įprastą tyrimą, gyvūnų grupės nustatyt ą laikotarp į (paprastai – 
keturias valandas) veikiamos bandom ąja chemine medžiaga doz ės davimo 
tik per nos į arba doz ės davimo per vis ą kūną kameroje. Gyv ūnai veikiami 
ribine koncentracija (ribinis bandymas) arba nuosekliai veikiami ne mažiau 
kaip trimis skirtingomis koncentracijomis (pagrindinis tyrimas). Išskyrus 
atvejus, kai apie bandom ąją cheminę medžiag ą jau turima informacijos, 
pvz., gautos remiantis anks čiau atliktu B.52 tyrimu, prieš pagrindin į tyrimą 
gali būti atliekamas orientacinis tyrimas [žr. RD Nr. 39 (2)].  
Orientacinis tyrimas. Įprastas protokolas  
28. Orientacinis tyrimas skirtas įvertinti bandomosios chemin ės medžiagos 
stiprumą, nustatyti ly čių jautrumo skirtumus ir pad ėti pasirinkti poveikio 
koncentracijos lygius, taikytinus per pagrindin į tyrimą arba ribin į bandymą. 
Parenkant per orientacin į tyrimą taikytinus koncentracijos lygius, tur ėtų būti 
naudojama visa turima informacija, įskaitant turimus (Q)SAR duomenis ir 
duomenis apie panašias chemines medžiagas. Taikant kiekvien ą skirtingą 
koncentracij ą, dozė turėtų būti duodama ne daugiau kaip trims patinams ir 
trims patel ėms (trijų kiekvienos lyties gyv ūnų gali reik ėti lyčių skirtumams 
nustatyti). Per orientacin į tyrimą gali būti taikoma tik viena koncentracija, 
tačiau prireikus bandymas gali b ūti atliktas ir taikant kitokias koncentracijas. 
Per orientacin į tyrimą neturėtų būti naudojama tiek gyv ūnų ir taikoma tiek 
skirtingų koncentracij ų, kiek per pagrindin į tyrimą. Vietoje orientacinio 
tyrimo gali b ūti remiamasi anks čiau atliktu B.52 tyrimu [žr. RD Nr. 39 (2)].  
Ribinis bandymas. Įprastas protokolas  
29. Ribinis bandymas atliekamas tada, kai bandomoji chemin ė medžiaga yra 
nežinoma arba kai manoma, kad ji iš esm ės netoksiška, t. y. sukelianti 
toksinį poveikį tik taikant didesn ę nei normin ę ribinę koncentracij ą. Atlie­
kant ribin į bandymą, ribine bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija 
veikiama tik viena trij ų patinų ir trijų patelių grupė. Informacijos apie 
bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą galima gauti remiantis 
žiniomis apie panašias bandytas chemines medžiagas, atsižvelgiant į toksi­
kologinės reikšmės turinčių sudedam ųjų dalių tapatumą ir procentin ę dalį. 
Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškum ą yra mažai arba 
jos išvis n ėra arba kai remiantis ta informacija yra tik ėtina, kad bandomoji 
cheminė medžiaga yra toksiška, tur ėtų būti atliekamas pagrindinis 
bandymas.  
30. Ribin ės koncentracijos paprastai parenkamos atsižvelgiant į norminius reika ­
lavimus. Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams ir aerozoliams taikytinos ribin ės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 
20 mg/l ir 5 mg/l (arba didžiausioji pasiekiama koncentracija) (3). Pasiekti 
kai kurių bandom ųjų cheminių medžiag ų, ypač garų ir aerozoli ų, ribines 
koncentracijas, gali b ūti techniškai sud ėtinga. Atliekant aerozoli ų bandymus, 
pirmiausia tur ėtų būti siekiama užtikrinti įkvepiamą dalelių dydį (MMAS – 
1–4 μm). Daugelio bandom ųjų chemini ų medžiag ų atveju tai įmanoma 
pasiekti, kai koncentracija yra 2 mg/l. Atlikti aerozoli ų bandymus taikant 
didesnę kaip 2 mg/l koncentracij ą turėtų būti mėginama tik tuo atveju, jeigu 
įmanoma pasiekti įkvepiamą dalelių dydį [žr. RD Nr. 39 (2)]. 
Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 gyv ūnų gerovės sumetimais rekomenduo ­
jama neatlikti bandym ų viršijant ribin ę
 koncentracij ą (3). Galimyb ė taikyti 
ribinę koncentracij ą turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu labai tik ėtina, 
kad tokio bandymo rezultatai tur ės tiesiogin ės reikšmės žmonių sveikatos 
apsaugai (3); tokiu atveju tyrimo ataskaitoje pateikiamas pagrindimas. 
Tiriant potencialiai sprogias bandom ąsias chemines medžiagas tur ėtų būti 
imamasi atsargumo priemoni ų, kad nesusidaryt ų sprogimui palanki ų sąlygų. 
Siekiant išvengti neb ūtino gyvūnų naudojimo, prieš ribin į bandymą turėtų 
būti atliktas atskiras bandymas be gyv ūnų, siekiant įsitikinti, ar įmanoma 
pasiekti ribiniam bandymui reikalingas kameros s ąlygas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Jeigu taikant ribin ę koncentracij ą pastebimas gyv ūnų gaišimas arba liguis ­
tumas, ribinio bandymo rezultatai gali b ūti naudojami kaip orientacinis 
tyrimas, kuriuo b ūtų remiamasi per tolesnius bandymus taikant kitokias 
koncentracijas (žr. apie pagrindin į tyrimą). Jeigu d ėl bandomosios chemin ės 
medžiagos fizini ų arba chemini ų savybių neįmanoma pasiekti ribin ės 
koncentracijos, tur ėtų būti bandoma didžiausioji pasiekiama koncentracija. 
Jeigu esant didžiausiajai pasiekiamai koncentracijai pasireiškia mažesnis kaip 50 % gaištamumas, daugiau bandym ų atlikti nereikia. Jeigu ribin ės 
koncentracijos ne įmanoma pasiekti, tyrimo ataskaitoje tur ėtų būti pateiktas 
paaiškinimas ir patvirtinamieji duomenys. Jeigu didžiausioji pasiekiama 
koncentracija nesukelia toksiškumo, gali reik ėti sukurti skystojo aerozolio 
pavidalo bandom ąją cheminę medžiag ą.
 
Pagrindinis tyrimas. Įprastas protokolas  
32. Pagrindinis tyrimas paprastai atliekamas naudojant po penkis patinus ir 
penkias pateles (arba penkis jautresniosios lyties, jeigu ji žinoma, gyv ūnus) 
kiekvienam koncentracijos lygiui ir taikant bent tris koncentracijos lygius. 
Norint gauti patikim ą statistin ę analizę, turėtų būti taikomi pakankami 
koncentracijos lygiai. Laiko tarpas tarp dozi ų davimo grup ėms nustatomas 
atsižvelgiant į toksiškumo požymi ų atsiradimo laik ą, trukmę ir sunkum ą. 
Kito koncentracijos lygio doz ės davimas gyv ūnams nukeliamas iki to 
laiko, kai bus pagr įstai įsitikinta, kad pirmiau bandytieji gyv ūnai išgyveno. 
Tai tyrimo vadovui suteikia galimyb ę pakoreguoti tikslin ę koncentracij ą, 
taikytiną kitai grupei, kuriai duodama doz ė. Atsižvelgiant į technologij ų 
sudėtingumą, atliekant inhaliacinius tyrimus tai gali b ūti ne visada įgyven­
dinama, tod ėl poveikis gyv ūnams taikant kit ą koncentracijos lyg į turėtų būti 
grindžiamas jau įgyta patirtimi ir mokslinu vertinimu. Bandant mišinius, 
turėtų būti remiamasi RD Nr. 39 (2).  
PROTOKOLAS „KONCENTRACIJA × LAIKAS“ („K × L“)  
Bendrieji aspektai. „K × l“ protokolas  
33. Vertinant toksiškum ą įkvėpus, kaip alternatyva įprastam protokolui gali b ūti 
svarstoma galimyb ė atlikti nuosekl ų „K × l“ protokolu pagr įstą tyrimą (12) 
(13) (14). Šiuo metodu suteikiama galimyb ė daryti poveik į gyvūnams 
taikant kelet ą koncentracijos lygi ų ir keletą laikotarpi ų. Visi bandymai atlie ­
kami tik doz ės davimo tik per nos į kameroje (pagal š į protokolą netikslinga 
naudoti poveikio per vis ą kūną kameras). Šis protokolas pavaizduotas 1 
priedėlyje pateiktoje strukt ūrinėje schemoje. Modeliuojamoji analiz ė parodė, 
kad gauti patikimas LC  50 vertes galima ir pagal įprastą protokol ą, ir pagal 
„K × l“ protokol ą, tačiau „K × l“ protokolas paprastai tinkamesnis norint 
gauti patikimas LC  01 ir LC  10 vertes (15).  
34. Modeliuojamoji analiz ė parodė, kad dviej ų gyvūnų naudojimas (kai naudo ­
jama po vien ą skirtingų lyčių gyvūną arba kai naudojami du jautresniosios 
lyties gyv ūnai) kiekvienam koncentracijos ir laiko tarpusavio priklauso ­
mybės kreivės intervalui paprastai yra tinkamas, kai per pagrindin į tyrimą 
bandomos keturios koncentracijas ir taikomi penki poveikio laikotarpiai. Tam tikromis aplinkyb ėmis tyrimo vadovas gali pasirinkti kiekviename 
koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomyb ės kreivės intervale naudoti 
po dvi kiekvienos lyties žiurkes (15). Kiekvienam koncentracijos ir laiko momento deriniui naudojant po du kiekvienos lyties gyv ūnus gali b ūti suma­ 
žintas įverčių poslinkis ir nuokrypis, padidintas vertinimo s ėkmės koefi­
cientas ir pagerinta pasikliautinojo intervalo apr ėptis. Tačiau, jeigu nepasie ­
kiama pakankamai tikslios atitikties skai čiuojant naudotiniems duomenims 
(kai naudojama po vien ą skirtingų lyčių gyvūną arba kai naudojami du 
jautresniosios lyties gyv ūnai), gali pakakti ir penktosios poveikio koncent ­
racijos. Daugiau patarim ų dėl gyvūnų skai
čiaus ir koncentracij ų, taikytin ų 
atliekant „K × l“ protokolu pagr įstą tyrimą, pateikta RD Nr. 39 (2).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Orientacinis tyrimas. „K × l“ protokolas  
35. Orientacinis tyrimas yra skirtas įvertinti bandomosios chemin ės medžiagos 
stiprumą ir padėti pasirinkti poveikio koncentracijos lygius, taikytinus per 
pagrindin į tyrimą. Siekiant parinkti tinkam ą pradinę koncentracij ą, taikytiną 
per pagrindin į tyrimą, ir sumažinti naudojam ų gyvūnų skaičių, gali reik ėti 
atlikti orientacin į tyrimą kiekvienai koncentracijai naudojant ne daugiau kaip 
po tris kiekvienos lyties gyv ūnus [išsamesn ės informacijos pateikta RD 
Nr. 39 (2) III pried ėlyje]. Norint nustatyti ly čių skirtumus, gali reik ėti 
naudoti po tris kiekvienos lyties gyv ūnus. Šiems gyv ūnams tur ėtų būti 
daromas vienkartinis poveikis, paprastai trunkantis 240 minu čių. Galimyb ė 
sukurti tinkamas bandymo atmosferas tur ėtų būti įvertinta per išankstinius 
techninius bandymus, nenaudojant gyv ūnų. Jeigu yra per B.52 (4) tyrim ą 
gautų gaištamumo duomen ų, orientacinis tyrimas paprastai neb ūtinas. 
Parinkdamas pradin ę B.2 tyrimo tikslin ę koncentracij ą, tyrimo vadovas 
turėtų atsižvelgti į gaištamumo pob ūdį, nustatyt ą per B.52 tyrimus (4) 
pagal kiekvien ą lytį ir visas bandytas koncentracijas [žr. RD Nr. 39 (2)].  
Pradinė koncentracija. „K × l“ protokolas  
36. Pradin ė koncentracija (I poveikio seansas) (I pried ėlis) bus ribin ė koncent­
racija arba koncentracija, tyrimo vadovo parinkta remiantis orientaciniu 
tyrimu. Šia koncentracija įvairiais laikotarpiais (pvz., 15, 30, 60, 120 arba 
240 minu čių) veikiamos gyv ūnų grupės, sudarytos iš dviej ų skirtingos lyties 
gyvūnų, t. y. bendras gyv ūnų skaičius yra 10 (vadinamasis I poveikio 
seansas) (I pried ėlis). 
37. Ribin ės koncentracijos paprastai parenkamos atsižvelgiant į norminius reika ­
lavimus. Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams 
ir aerozoliams taikytinos ribin ės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 
20 mg/l ir 5 mg/l (arba didžiausioji pasiekiama koncentracija) (3). Pasiekti kai kurių bandom ųjų cheminių medžiag ų, ypač garų ir aerozoli ų, ribines 
koncentracijas, gali b ūti techniškai sud ėtinga. Atliekant aerozoli ų bandymus, 
turėtų būti siekiama užtikrinti įkvėpiamą dalelių dydį (MMAS – 1–4 μm), 
esant ribinei 2 mg/l koncentracijai. Daugelio bandom ųjų cheminių medžiagų 
atveju tai įmanoma pasiekti. Atlikti aerozoli ų bandymus taikant didesn ę kaip 
2 mg/l koncentracij ą turėtų būti mėginama tik tuo atveju, jeigu įmanoma 
pasiekti įkvepiamą dalelių dydį [žr. RD Nr. 39 (2)]. Reglamente (EB) 
Nr. 1272/2008 gyv ūnų gerovės sumetimais rekomenduojama neatlikti 
bandymų
 viršijant ribin ę koncentracij ą (3). Galimyb ė atlikti bandymus virši ­
jant ribin ę koncentracij ą turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu labai 
tikėtina, kad tokio bandymo rezultatai tur ės tiesiogin ės reikšmės žmonių 
sveikatos apsaugai (3); tokiu atveju tyrimo ataskaitoje tur ėtų būti pateiktas 
pagrindimas. Tiriant potencialiai sprogias bandom ąsias chemines medžiagas 
turėtų būti imamasi atsargumo priemoni ų, kad nesusidaryt ų sprogimui 
palankių sąlygų. Siekiant išvengti neb ūtino gyv ūnų naudojimo, prieš 
bandymą taikant pradin ę koncentracij ą turėtų būti atliktas atskiras bandymas 
be gyvūnų, siekiant įsitikinti, ar įmanoma pasiekti šiai koncentracijai reika ­
lingas kameros s ąlygas.  
38. Jeigu taikant pradin ę koncentracij ą pastebimas gyv ūnų gaišimas arba liguis ­
tumas, tos koncentracijos bandymo rezultatai gali b ūti panaudojami kaip 
pagrindas per tolesnius bandymus taikant kitokias koncentracijas (žr. apie 
pagrindin į tyrimą). Jeigu d ėl bandomosios chemin ės medžiagos fizini ų arba 
cheminių savybių neįmanoma pasiekti ribin ės koncentracijos, tur ėtų būti 
bandoma didžiausia pasiekiama koncentracija. Jeigu esant didžiausiai pasie ­
kiamai koncentracijai pasireiškia mažesnis kaip 50 % gaištamumas, daugiau 
bandymų atlikti nereikia. Jeigu ribin ės koncentracijos ne įmanoma pasiekti, 
tyrimo ataskaitoje tur ėtų būti pateiktas paaiškinimas ir patvirtinamieji 
duomenys. Jeigu didžiausia pasiekiama koncentracija nesukelia toksiškumo, 
gali reik ėti sukurti skystojo aerozolio pavidalo bandom ąją chemin ę 
medžiagą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Pagrindinis tyrimas. „K × l“ protokolas  
39. Per pagrindin į tyrimą bandoma pradin ė koncentracija (I poveikio seansas) (I 
priedėlis) bus ribin ė koncentracija arba koncentracija, tyrimo vadovo 
parinkta remiantis orientaciniu tyrimu. Jeigu per I poveikio seans ą arba po 
jo pastebimas gaištamumas, II poveikio seanso koncentracija ir poveikio 
laikotarpiai bus nustatomi remiantis mažiausiuoju poveikiu („K × l“ proto ­
kolas), dėl kurio nugaištama. Kiekvienas tolesnis seansas priklausys nuo 
ankstesniojo seanso (žr. 1 pried ėlį). 
40. Norint nustatyti „K × l“ protokolu pagr įstą gaištamumo priklausomyb ę, 
daugeliui bandom ųjų cheminių medžiag ų pakanka rezultat ų, gautų taikant 
pradinę koncentracij ą ir per tris papildomus poveikio seansus naudojant 
smulkesn ę laiko matric ą (t. y. poveikio laikotarpi ų geometrinius intervalus, 
apibūdinamus vienas po kito einan čių laikotarpi ų santykiu, kuris paprastai 
yra √2) (15), ta čiau taip pat gali b ūti naudinga taikyti penkt ąją poveikio 
koncentracij ą [žr. 1 pried ėlį ir RD Nr. 39 (2)]. Matematinis pagal „K × l“ 
protokolą gautų rezultatų apdorojimas aprašytas 1 pried ėlyje. 
STEBĖJIMAI  
41. Poveikio laikotarpiu tur ėtų būti dažnai atliekami klinikiniai gyv ūnų stebė­
jimai. Baigus duoti doz ę, dozės davimo dien ą klinikiniai steb ėjimai turėtų 
būti atliekami bent du kartus arba daugiau, atsižvelgiant į gyvūnų reakciją į 
gautą dozę, o vėliau – bent kart ą per parą, iš viso stebint 14 dien ų. Tikslios 
stebėjimų laikotarpio trukm ės nenustatoma; ji tur ėtų būti parenkama atsiž ­
velgiant į klinikini ų požymių atsiradimo laik ą ir gyvūnų atsigavimo laiko ­
tarpio trukm ę. Svarbu atkreipti d ėmesį į toksiškumo požymi ų atsiradimo ir 
išnykimo laik ą, ypač jeigu toksiškumo požymiai pasireiškia tik po kurio 
laiko. Visi steb ėjimai sistemingai registruojami, išsaugant atskirus įrašus 
apie kiekvien ą gyvūną. Gaištantys gyv ūnai ir gyv ūnai, kurie patiria didelius 
skausmus ir (arba) kuriems pasireiškia ilgalaiki ų sunkios kan čios požymi ų, 
gyvūnų gerovės sumetimais tur ėtų būti humaniškai numarinami. Atliekant 
klinikinių toksiškumo požymi ų tyrimus, tur ėtų būti imamasi atsargumo prie ­
monių, kad prasta pradin ė išvaizda ir trumpalaikiai kv ėpavimo tak ų paki­
timai, atsirad ę dėl poveikio proced ūros, nebūtų palaikyti bandomosios 
cheminės medžiagos sukelto toksiškumo požymiais, d ėl kurių reikėtų 
pirmiau laiko numarinti gyv ūnus. Turėtų būti atsižvelgta į principus ir krite ­
rijus, apibendrintus Rekomendaciniame dokumente d ėl pasekmi ų žmonėms 
(RD Nr. 19) (7). Kai gyv ūnai numarinami d ėl humanišk ų priežasčių arba 
randami nugaiš ę, kiek įmanoma tiksliau užregistruojamas ž ūties laikas.  
42. Narveliuose tur ėtų būti stebimi odos ir kailio, aki ų ir gleivin ės pakitimai, 
taip pat kv ėpavimo, kraujo, autonomin ės ir centrin ės nervų sistemų, soma­
tomotorin ės veiklos ir elgsenos pakitimai. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti išskirti 
vietinis ir sisteminis poveikiai. Ypa č reikėtų stebėti, ar nepasireiškia 
drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos b ūsenos, 
ar neteka seil ės. Matuojant temperat ūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti 
patvirtinam ųjų sulėtėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios tempe ­
ratūros įrodymų, susijusių su dozės davimu arba izoliavimu.  
Kūno masė 
43. Kiekvieno gyv ūno masė turėtų būti vieną kartą užregistruojama pratinimo 
laikotarpiu, tada poveikio dien ą dar nedavus doz ės (nulinė diena) ir bent 
pirmąją, trečiąją ir septint ąją dienomis (o v ėliau – kas savait ę), taip pat 
žūties arba numarinimo metu, jeigu tai įvyksta po pirmosios dienos. K ūno 
masė yra labai svarbus toksiškumo gyv ūnams rodiklis, tod ėl gyvūnai, kurių 
masė, palyginti su vert ėmis, gautomis prieš tyrim ą, nukrenta 20 % arba 
daugiau, tur ėtų būti atidžiai stebimi. Pasibaigus poveikio pasekmi ų stebė­
jimo laikotarpiui, išgyven ę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patologija  
44. Visiems bandomiesiems gyv ūnams, įskaitant nugaišusius atliekant bandym ą 
arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyv ūnų gerovės sumetimais, daromas 
bendrasis skrodimas. Jeigu skrodimo negalima atlikti iš karto po to, kai 
aptinkamas nugaiš ęs gyvūnas, gyvūnas turėtų būti laikomas pakankamai 
šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), siekiant kuo labiau pristabdyti autoliz ę. 
Skrodimai tur ėtų būti atliekamai kaip galima anks čiau, paprastai – per dien ą 
arba dvi. Visi dideli patologiniai pakitimai tur ėtų būti užregistruojami pagal 
kiekvieną gyvūną, ypatingą dėmesį skiriant kv ėpavimo tak ų pakitimams.  
45. Norint padidinti tyrimo aiškinam ąją reikšmę, gali būti atliekamos papil ­
domos apži ūros, iš anksto numatytos pagal tyrimo plan ą, pvz., išgyvenusi ų 
žiurkių plaučių svėrimas ir (arba) dirginimo įrodymų gavimas atliekant 
kvėpavimo tak ų apžiūrą mikroskopu. Taip pat gali b ūti tiriami organai, 
turintys didel ės 24 valandas arba ilgiau išgyvenusi ų gyvūnų patologijos 
požymių, arba organai, apie kuriuos žinoma arba d ėl kurių manoma, kad 
jiems buvo pakenkta. Mikroskopu apži ūrėjus visus kv ėpavimo takus, galima 
gauti naudingos informacijos apie bandom ąsias chemines medžiagas, kurios 
reaguoja su vandeniu, pvz., r ūgštis ir higroskopines bandom ąsias chemines 
medžiagas.  
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
Duomenys  
46. Turėtų būti pateikti kiekvieno gyv ūno masės duomenys ir skrodimo išvados. 
Klinikinių stebėjimų duomenys tur ėtų būti apibendrinti lentel ėse, pagal kiek ­
vieną bandomąją grupę nurodant naudot ų gyvūnų skaičių, gyvūnų, kuriems 
pasireiškė toksiškumo požymi ų, skaičių, atliekant bandym ą nugaišusi ų arba 
dėl humanišk ų priežasčių numarint ų gyvūnų skaičių, kiekvieno gyv ūno 
žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašym ą, pasireiškimo 
laiką ir grįžtamumą, skrodimo išvadas.  
Bandymo ataskaita  
47. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):  
Bandomieji gyv ūnai ir jų laikymas  
— Laikymo s ąlygų aprašymas, nurodant gyv ūnų skaičių narvelyje (arba 
skaičiaus pokyt į), kraiko medžiag ą, aplinkos temperat ūrą ir santykin į 
drėgnį, šviesos ir tamsos kait ą paros metu ir š ėrimo režim ą, 
— naudota r ūšis (paderm ė) ir, jeigu tai ne žiurk ės, kitos rūšies naudojimo 
pagrindimas,  
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— atsitiktin ės atrankos metodas,  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (įskaitant pašaro tip ą 
arba šaltin į, vandens šaltin į), 
— prieš bandym ą sudarytų sąlygų aprašymas, nurodant š ėrimo režim ą, 
izoliavimo ir apsaugos nuo lig ų būdą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Bandomoji chemin ė medžiaga  
— Fizinė būsena, grynumas ir, jeigu taikytina, fizin ės ir chemin ės savybės 
(įskaitant izomerij ą), 
— identifikavimo duomenys ir Chemini ų medžiag ų santrump ų tarnybos 
(angl. CAS) registracijos numeris, jeigu jis žinomas.  
Nešiklis  
— Nešiklio naudojimo pagrindimas ir nešiklio parinkimo pagrindimas 
(jeigu tai ne vanduo),  
— istoriniai arba vienalaikiai duomenys, įrodantys, kad nešiklis nedaro 
neigiamo poveikio tyrimo rezultatams.  
Inhaliacin ė kamera  
— Inhaliacin ės kameros aprašas, nurodant matmenis ir t ūrį, 
— įrangos, naudotos darant poveik į gyvūnams ir kuriant atmosfer ą, šaltinis 
ir aprašas,  
— temperat ūros, drėgnio, daleli ų dydžio ir faktin ės koncentracijos mata ­
vimo įranga,  
— oro šaltinis, tiekiamo ir (arba) ištraukiamo oro apdorojimas ir kondicio ­
navimo sistema,  
— įrangos kalibravimo siekiant užtikrinti homogenišk ą bandymo atmosfer ą 
metodai,  
— slėgių skirtumas (teigiamas ar neigiamas),  
— kameroje esan čios dozės davimo angos (jeigu doz ė duodama tik per 
nosį); gyvūnų vieta sistemoje (jeigu doz ė duodama per vis ą kūną), 
— bandymo atmosferos laikinas homogeniškumas ir (arba) pastovumas,  
— temperat ūros ir dr ėgnio jutikli ų vieta ir kameroje sukurtos bandymo 
atmosferos ėminių ėmimas,  
— oro srauto grei čiai, per doz ės davimo ang ą tekančio oro srauto greitis 
(jeigu doz ė duodama tik per nos į) arba gyv ūnų kiekis kameroje (jeigu 
dozė duodama per vis ą kūną), 
— informacija apie deguonies ir anglies dioksido kiekio matavimo įrangą, 
jeigu tokia naudota,  
— inhaliacin ės kameros pusiausvyros pasiekimo laikas (t  95 ), 
— tūrio pokyčių kiekis per valand ą, 
— matavimo prietaisai (jeigu naudojami).  
Poveikio duomenys  
— Tikslin ės koncentracijos parinkimo pagrindiniam tyrimui pagrindimas,  
— vardin ės koncentracijos (inhaliacin ėje kameroje sukurtos bandomosios 
cheminės medžiagos bendrosios mas ės ir viso per kamer ą perleisto oro 
srauto tūrio santykis),  
— faktin ės bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos, nustatytos 
gyvūnų kvėpavimo zonoje; jeigu bandomi mišiniai, įgaunantys įvairias 
fizines būsenas (dujos, garai, aerozoliai), kiekviena iš ši ų būsenų gali 
būti analizuojama atskirai,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— visos koncentracijos ore tur ėtų būti nurodomos mas ės vienetais (pvz., 
mg/l, mg/m  3 ir t. t.); skliaustuose taip pat gali b ūti nurodoma t ūrio 
vienetais (pvz., ppm, ppb ir t. t.),  
— dalelių dydžio pasiskirstymas, mas ės medianinis aerodinaminis 
skersmuo (MMAS) ir geometrinis standartinis nuokrypis ( σg), nurodant 
jų apskaičiavimo metodus. Tur ėtų būti nurodytos atliktos atskiros daleli ų 
dydžio analiz ės. 
Bandymo s ąlygos  
— Išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos paruošim ą, 
nurodant proced ūras, taikytas siekiant sumažinti kiet ųjų medžiagų dalelių 
dydį arba paruošti bandomosios chemin ės medžiagos tirpalus. Jeigu 
mechaniniais procesais gal ėjo būti pakeista bandomosios chemin ės 
medžiagos sud ėtis, pateikite bandomosios chemin ės medžiagos sud ėties 
patikros analizi ų rezultatus,  
— įrangos, naudotos kuriant bandymo atmosfer ą ir veikiant gyv ūnus 
bandymo atmosfera, aprašas (pageidautina, pateikiant diagram ą), 
— išsami informacija apie taikyt ą cheminės analizės metodą ir metodo 
tinkamumo patvirtinim ą (nurodant bandomosios chemin ės medžiagos 
regeneravimo iš ėminių ėmimo terp ės veiksmingum ą), 
— bandom ųjų koncentracij ų parinkimo pagrindimas.  
Rezultatai  
— Kameros temperat ūrų, drėgnio ir oro sraut ų lentelės, 
— kameros vardin ės ir faktin ės koncentracijos duomen ų lentelės, 
— dalelių dydžių lentelės, pateikiant analizini ų ėminių ėmimo duomenis, 
dalelių dydžių pasiskirstym ą ir MMAS bei σ g skaičiavimus,  
— kiekvieno gyv ūno reakcijos duomen ų ir jam taikyto koncentracijos lygio 
lentelės (t. y. gyv ūnų, kuriems pasireišk ė toksiškumo požymi ų, nurodant 
gaištamum ą, poveikio pob ūdį, sunkum ą, pasireiškimo laik ą ir trukm ę), 
— kiekvieno gyv ūno masė, nustatyta atliekant tyrim ą; žūties data ir laikas, 
jeigu gyv ūnas nugaišo dar prieš numatyt ą numarinim ą; toksiškumo 
požymių atsiradimo laikas ir ar ši ų požymių pasireiškimas kiekvieno 
gyvūno atveju buvo gr įžtamasis,  
— kiekvieno gyv ūno skrodimo išvados ir histopatologini ų tyrimų rezultatai, 
jeigu yra,  
— gaištamumo įverčiai (pvz., LC  50 , LD  01 ), taikant 95 % pasikliovimo 
ribas, ir kreiv ės nuolydis (jeigu nustatytas pagal vertinimo metod ą), 
— statistinis ryšys, pateikiant n rodiklio įvertį („K × l“ protokolas). Tur ėtų 
būti nurodytas naudotos statistin ės programin ės įrangos pavadinimas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Rezultatų aptarimas ir aiškinimas  
— Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas metod ų, taikytų siekiant laikytis 
šio bandymo metodo kriterij ų, pvz., susijusi ų su ribine koncentracija 
arba daleli ų dydžiu, aprašymui,  
— atsižvelgiant į bendruosius rezultatus, tur ėtų būti aprašyta daleli ų įkvė­
pimo galimyb ė, ypač jeigu nebuvo įmanoma taikyti daleli ų dydžio krite ­
rijaus,  
— atsižvelgiant į OECD rekomendaciniame dokumente d ėl pasekmi ų 
žmonėms (8) nustatytus kriterijus, tur ėtų būti pateiktas paaiškinimas, ar 
kilo poreikis humaniškai numarinti gyv ūnus, patirian čius skausm ą arba 
sunkią ilgalaikę kančią, 
— jeigu šio priedo B.52 skyriuje (4) nustatyti bandymai buvo nutraukti 
atsižvelgiant š į (B.2) bandymo metod ą, turėtų būti pateiktas pagrindimas,  
— pateikiant bendr ąjį tyrimo vertinim ą, turėtų būti nurodytas metod ų, 
taikytų nustatyti vardines ir faktines koncentracijas, nuoseklumas ir 
faktinės koncentracijos santykis su vardine koncentracija,  
— turėtų būti aprašyta tik ėtina žūties priežastis ir vyraujantis veikimo b ūdas 
(sisteminis ar vietinis).  
LITERAT ŪRA 
1. OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Paris. Available at: [http://www.oec ­
d.org/env/testguidelines]  
2. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ ­
testguidelines]
 
3. 2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) 
Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifikavimo, ženklinimo 
ir pakavimo, iš dalies kei čiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 
1999/45/EB ir iš dalies kei čiantis Reglament ą (EB) Nr. 1907/2006, OL 
L 353, 2008 12 31, p. 1.  
4. Šio priedo B.52 skyrius. Ūmus toksiškumas įkvėpus. Ūmaus toksiškumo 
klasės (ŪTK) metodas.  
5. Šio priedo B.40 skyrius. Odos ėsdinimas  in vitro . Odos sluoksnio elektrin ės 
varžos (OSEV) bandymas.  
6. Šio priedo B.40bis skyrius. Odos ėsdinimas  in vitro . Žmogaus odos modelio 
bandymas.  
7. OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available 
at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
8. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, OECD, Paris. Available at: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
9. SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute 
Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.  
10. Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
11. Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160–167.  
12. Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with 
Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290.
 
13. Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determi ­
nation of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117.
 
14. Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute 
Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71.  
15. OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C x t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
 
16. Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
APIBRĖŽTIS  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  naudojant š į bandymo metod ą tiriama 
cheminė medžiaga arba mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
1 priedėlis 
„K × l“ protokolas  
1. Vertinant toksiškum ą įkvėpus, kaip alternatyva įprastam protokolui gali b ūti 
svarstoma galimyb ė atlikti nuosekl ų „Koncentracija × laiko“ („K × l“) 
protokolu pagr įstą tyrimą (12) (13) (14). Jam tur ėtų būti teikiama pirme ­
nybė, kai yra konkre čių reglamentavimo arba mokslini ų reikmių, dėl kurių 
būtina atlikti įvairios trukm ės bandymus su gyv ūnais, pvz., reagavimo į 
nepaprast ąsias aplinkybes planavimo arba žem ėnaudos planavimo tikslais. 
Pagal šį metodą pirmiausia atliekami bandymai taikant ribin ę koncentracij ą 
(I poveikio seansas), per kuriuos gyv ūnai veikiami chemine medžiaga penkis 
skirtingus laikotarpius (pvz., 15, 30, 60, 120 ir 240 minu čių), siekiant per 
vieną poveikio seans ą padaryti įvairios trukm ės poveikius (žr. 1 paveiksl ą). 
Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams ir aero ­
zoliams taikytinos ribin ės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 20 
mg/l ir 5 mg/l. Šie lygiai gali b ūti viršijami tik tuo atveju, jeigu yra regla ­
mentavimo arba mokslini ų reikmių atlikti bandymus taikant kitokius lygius 
(žr. B.2 skyriaus pagrindinio teksto 37 skirsn į). 
2. Tais atvejais, kai apie bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą turima 
mažai informacijos arba jeigu jos išvis n ėra, turėtų būti atliekamas orienta ­
cinis tyrimas, per kur į gyvūnai (naudojant ne daugiau kaip tris kiekvienos 
lyties gyv ūnus) paprastai 240 minu čių veikiami tyrimo vadovo pasirinkta 
tiksline koncentracija.  
3. Jeigu per I poveikio seans ą bandoma ribin ė koncentracija ir pastebimas 
mažesnis kaip 50 % gaištamumas, daugiau bandym ų atlikti nereikia. Jeigu 
yra reglamentavimo arba mokslini ų reikmių nustatyti koncentracijos, laiko ir 
reakcijos tarpusavio priklausomyb ę taikant aukštesnius lygius nei nurodytoji 
ribinė koncentracija, kitas poveikis tur ėtų būti daromas taikant aukštesn į 
lygį, pvz., du kartus viršijant ribin ę koncentracij ą (1 paveiksle tai nurodyta 
kaip 2L).  
4. Jeigu taikant ribin ę koncentracij ą pastebimas toksiškumas, b ūtina atlikti 
papildomus bandymus (pagrindin į tyrimą). Šie papildomi poveikiai daromi 
taikant mažesnes koncentracijas (1 paveiksle tai nurodyta kaip II, III ir IV poveikio seansai) arba didesnes koncentracijas, ta čiau taikant trumpesnes 
trukmes (1 paveiksle tai nurodyta kaip IV poveikio seansas), parenkant 
pritaikytas trukmes ir jas išd ėstant mažesniais intervalais).
 
5. Bandymas (taikant pradin ę koncentracij ą ir papildomas koncentracijas) atlie ­
kamas kiekvienam koncentracijos lygio ir laiko momento deriniui naudojant po vieną skirtingos lyties gyv ūną arba du jautresniosios lyties gyv ūnus. Tam 
tikromis aplinkyb ėmis tyrimo vadovas gali pasirinkti kiekvienam koncent ­
racijos lygio ir laiko momento deriniui naudoti po dvi kiekvienos lyties 
žiurkes (arba keturis jautresniosios lyties gyv ūnus) (15). Kiekvienam 
koncentracijos ir laiko momento deriniui naudojant po du kiekvienos lyties gyvūnus gali b ūti sumažintas įverčių poslinkis ir nuokrypis, padidintas verti ­
nimo sėkmės koeficientas ir pagerinta pasikliautinojo intervalo apr ėptis, 
susijusi su čia aprašomu protokolu. Išsamesn ės informacijos pateikta RD 
Nr. 39 (2).
 
6. Geriausia, kad visi poveikio seansai b ūtų atlikti tą pačią dieną. Tai suteikt ų 
galimybę atidėti kitą dozės davimą, kol bus pagr įstai įsitikinta išgyvenimu, o 
tyrimo vadovui b ūtų sudaryta galimyb ė pakoreguoti kito poveikio seanso 
tikslinę koncentracij ą ir taikytinas trukmes. Rekomenduojama kiekvien ą 
poveikio seans ą pradėti nuo grup ės, kuriai bus daromas ilgiausias poveikis, 
pvz., nuo grup ės, kuri bus veikiama 240 minu čių, tada pereiti prie grup ės, 
kuri bus veikiama 120 minu čių ir t. t. Pvz., jeigu grup ės, kuri bus veikiama 
240 minu čių, gyvūnai žūna po 90 minu čių arba jiems pasireiškia sunkaus 
toksiškumo požymi ų (pvz., labai pakinta kv ėpavimas, pvz., kv ėpavimas 
pasunkėja), nėra prasm ės duoti doz ę grupei, kuri ą buvo numatyt ą veikti 
120 minu čių, nes tik ėtina, kad gaištamumas b ūtų 100 %. Taigi tyrimo 
vadovas šiai koncentracijai tur ėtų parinkti trumpesnius poveikio laikotarpius 
(pvz., 90, 65, 45, 33 ir 25 minu čių trukmės). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Turėtų būti dažnai matuojama kameroje susidariusi koncentracija, kad kiek ­
vienai poveikio trukmei b ūtų galima nustatyti pagal laik ą apskaičiuojamą 
vidutinę koncentracij ą. Jeigu įmanoma, atliekant statistin ę analizę turėtų būti 
naudojamas kiekvieno gyv ūnų žūties laikas (o ne poveikio trukm ė). 
8. Pirm ųjų keturių poveikio seans ų rezultatai tur ėtų būti išanalizuoti siekiant 
nustatyti koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomyb ės kreivėje susida­
riusias duomen ų spragas (žr. 1 paveiksl ą). Nepakankamos atitikties atveju 
gali būti daromas papildomas poveikis (taikant penkt ąją koncentracij ą). Šio 
penktojo poveikio koncentracija ir poveikio trukm ės turėtų būti tokios, kad 
būtų užpildyta min ėtoji spraga.  
9. Visi poveikio seansai ( įskaitant pirm ąjį) bus naudojami apskai čiuoti 
koncentracijos, laiko ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ę taikant statistin ę 
analizę (16). Jeigu įmanoma, kiekvienam koncentracijos ir laiko priklauso ­
mybės kreivės intervalui tur ėtų būti taikoma pagal laik ą apskaičiuota vidu ­
tinė koncentracija ir poveikio trukm ė iki žūties (jei darant poveik į gyvūnas 
nugaišta).  
1 paveikslas  
Hipotetinis koncentracijos, laiko ir gaištamumo tarpusavio priklausomyb ės 
pavyzdys
  
Nenuspalvinti simboliai – išgyven ę gyvūnai; nuspalvinti simboliai – nugaiš ę 
gyvūnai. 
Trikampiai – patel ės; apskritimai – patinai.  
Ištisinė linija – LC  50 vertės (intervalas – 7,5–240 min.), apskai čiuotos pati ­
nams, kai n = 1.  
Brūkšninė linija – LC  50 vertės (intervalas – 7,5–240 min.), apskai čiuotos 
patelėms, kai n = 1.  
Taškinės linijos – hipotetini ų LC  50 verčių tiesės, nubrėžtos patinams ir 
patelėms, kai n = 2 (12).  
Žodynėlis 
koncentracija  
poveikio trukm ė ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Toliau pateiktas nuoseklios proced ūros pavyzdys.  
I poveikio seansas. Bandymai taikant ribin ę koncentracij ą (žr. 1 
paveikslą) 
— Kiekvienam koncentracijos ir laiko trukm ės deriniui naudojama po vien ą 
skirtingos lyties gyv ūną; iš viso – 10 gyv ūnų ( a ) 
— Tikslin ė koncentracija (  b ) – ribinė koncentracija.  
— Penkios gyv ūnų grupės veikiamos šia tiksline koncentracija atitinkamai 
15, 30, 60, 120 ir 240 minu čių. 
↓ 
II poveikio seansas  ( c ). Pagrindinis tyrimas  
— Kiekvienam koncentracijos ir laiko trukm ės deriniui naudojama po vien ą 
skirtingos lyties gyv ūną; iš viso – 10 gyv ūnų. 
— Penkios gyv ūnų grupės veikiamos mažesne koncentracija (  d ) (1/2L), 
taikant šiek tiek ilgesnes poveikio trukmes (intervalai apskai čiuojami 
taikant koeficient ą √2; žr. 1 paveiksl ą). 
↓ 
III poveikio seansas. Pagrindinis tyrimas  
— Kiekvienam koncentracijos ir laiko trukm ės deriniui naudojama po vien ą 
skirtingos lyties gyv ūną; iš viso – 10 gyv ūnų. 
— Penkios gyv ūnų grupės veikiamos mažesne koncentracija (  d ) (1/4L), 
taikant šiek tiek ilgesnes poveikio trukmes (intervalai apskai čiuojami 
taikant koeficient ą √2; žr. 1 paveiksl ą). 
↓ 
IV’ poveikio seansas. Pagrindinis tyrimas  
— Kiekvienam koncentracijos ir laiko trukm ės deriniui naudojama po vien ą 
skirtingos lyties gyv ūną; iš viso – 10 gyv ūnų. 
— Penkios gyv ūnų grupės veikiamos mažesne koncentracija (  d ) (1/8L), 
taikant šiek tiek ilgesnes poveikio trukmes (intervalai apskai čiuojami 
taikant koeficientu √2; žr. 1 paveiksl ą). 
↓ arba  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Jeigu n ėra informacijos apie ly čių jautrumą, naudojamos abiej ų lyčių žiurkės, t. y. kiek ­
vienai koncentracijai naudojama po vien ą skirtingos lyties gyv ūną. Remiantis turima 
informacija arba per š į poveikio seans ą pastebėjus, kad kurios nors lyties gyv ūnai yra 
jautresni, per tolesnius bandymus kiekvienam koncentracijos lygiui naudojama 10 
jautresniosios lyties gyv ūnų (kiekvienam koncentracijos ir laiko trukm ės deriniui naudo ­
jama po du gyv ūnus). 
( b ) Jeigu taikomas Reglamentas (EB) Nr. 1272/2008, dujoms, garams ir aerozoliams taiky ­
tinos ribin ės koncentracijos atitinkamai yra 20 000 ppm, 20 mg/l ir 5 mg/l. Numatant, 
kad medžiaga yra toksiška, arba atsižvelgiant į orientacinio tyrimo rezultatus, tur ėtų būti 
parinktos mažesn ės pradinės koncentracijos. Jeigu yra reglamentavimo arba mokslini ų 
reikmių, gali būti taikomos didesn ės koncentracijos. 
( c ) Būtų geriausia, jeigu kito koncentracijos lygio doz ės davimas gyv ūnams būtų nukeliamas 
iki to laiko, kai bus pagr įstai įsitikinta, kad pirmiau doz ę gavę gyvūnai išgyveno. Tai 
tyrimo vadovui suteikt ų galimyb ę pakoreguoti tikslin ę koncentracij ą ir trukmes, taiky ­
tinas per kit ą poveikio seans ą. 
( d ) Mažiausioji doz ė (koncentracija × laikas), d ėl kurių gyvūnai nugaišo per bandymus 
taikant pradin ę koncentracij ą (pirmasis poveikio seansas), bus naudojama kaip orientyras, 
nustatant kit ą koncentracijos ir poveikio trukm ės derinį. Paprastai koncentracija maži ­
nama du kartus (1/2L), ir gyv ūnai veikiami naujais laiko intervalais, naudojant smulkesn į 
tinklelį, sudaryt ą taikant geometrin į poveikio laikotarpi ų suskirstym ą remiantis koefi ­
cientu 1,4 ( √2; žr. 11 nuorod ą), ir šiuos laikotarpius išd ėstant apie trukm ę, per kuri ą 
pirmojo poveikio metu pasteb ėtas mažiausiasis mirtinas doz ės dydis (laikas × koncent ­
racija). Šiame paveiksle (1 paveikslas) per I poveikio seans ą gaištamumas pirm ą kartą 
pastebėtas po 15 minu čių; todėl per II seans ą taikytinos trukm ės nustatytos kaip vidurin ę 
trukmę pasirenkant 30 min., t. y. 15, 21, 30, 42 ir 60 minu čių. Po dviej ų poveikio seans ų 
primygtinai rekomenduojama remiantis duomenimis nubraižyti panaš ų grafiką, kaip paro ­
dyta pirmiau, ir patikrinti, ar koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomyb ės tiesė 
sudaro 45 laipsni ų kampą (n = 1) arba ar koncentracijos, laiko ir reakcijos tarpusavio 
priklausomyb ės tiesė yra nelabai nuožulni (pvz., n = 2) ar nuožulnesn ė (pvz., n = 0,8). 
Pastaraisiais atvejais primygtinai rekomenduojama atitinkamai pakoreguoti toliau taiky ­
tinas koncentracijas ir trukmes.
 IV poveikio seansas. Pagrindinis tyrimas  
— Kiekvienai koncentracijai ir laiko trukmei naudojama po vien ą skirtingos 
lyties gyv ūną; iš viso – 10 gyv ūnų. 
— Penkios gyv ūnų grupės veikiamos didesne koncentracija (  e ) (2L), taikant 
šiek tiek trumpesnes poveikio trukmes (intervalus apskai čiuojant 
remiantis koeficientu √2; žr. 1 paveiksl ą). 
Matematinis rezultat ų apdorojimas pagal „K × l“ protokol ą 
11. Pagal „K × l“ proced ūrą taikant keturias arba penkias poveikio koncentra ­
cijas ir penkias trukmes bus atitinkamai bus gauti 20 arba 25 duomen ų 
taškai. Naudojant šiuos duomen ų taškus, koncentracijos ir laiko tarpusavio 
priklausomyb ė gali būti apskaičiuota atliekant statistin ę analizę (16):  
1 lygtis:  
TikimybėðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
čia: C – koncentracija; t – poveikio trukm ė, arba:  
2 lygtis:  
Reakcija ¼ ƒðC n tÞ 
čia: n ¼ b 1=b 2: 
Naudojant 1 lygt į, LC  50 vertė gali būti apskaičiuota tam tikram laikotarpiui 
(pvz., keturi ų valandų, vienos valandos, 30 minu čių arba bet kokiam kitam 
laikotarpiui, patenkan čiam į bandymų laikotarpi ų intervalą), tariant, kad P = 
5 (50 % reakcija). Atkreipkite d ėmesį, kad Haberio taisykl ė taikoma tik 
tada, kai n = 1. LC  01 vertė gali būti apskaičiuota tariant, kad P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) Tam tikrais atvejais gali reik ėti padidinti koncentracij ą (2L), taikytin ą per naujus laiko 
intervalus, nustatytus naudojant dar smulkesn į tinklelį, sudaryt ą taikant geometrin į 
poveikio laikotarpi ų suskirstym ą remiantis koeficientu 1,4 ( √2), ir šiuos laikotarpius 
išdėstant apie trukm ę, per kuri ą pirmojo poveikio metu pasteb ėtas mažiausiasis mirtinas 
koncentracijos lygis. Pageidautina, kad trumpiausia poveikio trukm ė būtų ilgesnė kaip 5 
minutės; ilgiausia trukm ė turėtų neviršyti 8 valand ų.
 B.3. ŪMUS TOKSIŠKUMAS (PER OD Ą) 
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dalies A skirsn į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dalies B skirsn į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandomoji medžiaga dedama ant odos skirtingomis doz ėmis kelioms 
eksperimentini ų gyvūnų grupėms, viena doz ė – vienai grupei. Po to 
atliekami poveikio ir nugaišimo atvej ų stebėjimai. Gyv ūnams, kurie 
nugaišta bandymo metu, atliekama nekroskopija, ir, užbaigus bandymą, atliekama bandym ą išgyvenusi ų gyvūnų nekroskopija.
 
Gyvūnus, kurie turi aiški ų ir ilgalaiki ų kančios ir skausmo požymi ų, 
reikia humaniškai numarinti. Jeigu žinoma, kad d ėl medžiag ų, 
naudojam ų dozavimo bandymuose, gali kilti skausmas ir kan čia 
dėl jų ardančių (ėsdinančių) arba dirginan čių savybių, tokie 
bandymai netur ėtų būti atliekami.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
1.6.1.  Pasirengimas  
Gyvūnai laikomi eksperimentiniuose narveliuose eksperimentin ėmis 
laikymo ir š ėrimo sąlygomis ne trumpiau kaip penkias dienas iki 
eksperimento pradžios. Prieš bandym ą sveiki jauni suaug ę gyvūnai 
atsitiktinai atrenkami ir paskiriami į bandomąsias grupes. Apytikriai 
24 valandas iki bandymo nuo gyv ūno kūno sprando srityje pašali ­
namas kailis, j į nukerpant arba nuskutant. Jeigu kailis kerpamas arba 
skutamas, reikia stengtis nenutrinti odos, tai gali pakeisti pralaidum ą. 
Bandomajai medžiagai užd ėti turėtų būti nukirpta ar nuskusta ne 
mažiau kaip 10 % k ūno paviršiaus. Jeigu bandomos kietosios 
medžiagos, kurios atitinkamais atvejais gali b ūti pulverizuojamos, 
bandomoji medžiaga tur ėtų būti pakankamai sudr ėkinama vandeniu 
arba, jeigu reikia, atitinkamu nešikliu, kad b ūtų užtikrinamas geras 
sąlytis su oda. Jeigu naudojamas nešiklis, tur ėtų būti atsižvelgiama į 
jo poveik į bandomosios medžiagos įsiskverbimui į odą. Skystos 
bandomosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos.  
1.6.2.  Bandymo s ąlygos  
1.6.2.1.  Eksperimentiniai gyv ūnai 
Gali būti naudojamos suaugusios žiurk ės arba triušiai. Gali b ūti 
naudojamos ir kitos r ūšys, bet j ų naudojimas tur ėtų būti pagrin­
džiamas. Tur ėtų būti panaudojamos įprastos laboratorin ės veislės. 
Bandymo pradžioje abiej ų lyčių gyvūnų svoris tur ėtų būti ± 20 % 
atitinkamo vidutinio svorio.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Skai čius ir lytis  
Kiekvienai dozei naudojama ne mažiau kaip 5 gyv ūnai. Jie visi 
turėtų būti vienos lyties. Jeigu naudojamos patel ės, jos tur ėtų būti 
neturėjusios palikuoni ų ir neapvaisintos. Jeigu galima gauti informa ­
cijos, įrodančios, kad kuri nors lytis yra daug jautresn ė, dozė taikoma 
tai lyčiai. 
Pastaba . Atliekant ūmaus toksiškumo bandymus su aukštesniaisiais 
gyvūnais nei graužikai, turi b ūti apsvarstoma galimyb ė naudoti 
mažesnį gyvūnų skaičių. Dozės turėtų būti atidžiai parenkamos ir 
turėtų būti dedamos visos pastangos neviršyti vidutinio toksiškumo 
dozių. Tokiuose bandymuose tur ėtų būti vengiama mirtin ų bandomo ­
sios medžiagos dozi ų. 
1.6.2.3.  Dozės 
Dozių skaičius turėtų būti pakankamas, ne mažiau kaip trys. Jos 
turėtų pakankamai skirtis, kad bandomiesiems gyv ūnams pasireikšt ų 
įvairus toksinis poveikis ir skirtingo dydžio gaištamumo procentas. 
Parenkant doz ės dydį reikia atsižvelgti į jautrinimo ar ėsdinimo 
poveikį. Duomen ų turėtų būti tiek, kad b ūtų galima sudaryti doz ės 
ir reakcijos kreiv ę ir, jeigu įmanoma, b ūtų galima nustatyti LD  50 . 
1.6.2.4.  Ribinis bandymas  
Galima atlikti ribin į bandym ą su penkiais patin ėliais ir penkiomis 
patelėmis, jiems skiriant vienetin ę 2 000 mg/kg k ūno masės dozę 
pagal pirmiau aprašyt ą darbo eig ą. Jeigu cheminis junginys tampa 
nugaišimo priežastimi, reik ėtų apsvarstyti, ar nereik ėtų atlikti išsam ų 
tyrimą. 
1.6.2.5.  Steb ėjimo laikotarpis  
Stebėjimo laikotarpis tur ėtų būti ne trumpesnis kaip 14 dien ų. Tačiau 
stebėjimo trukm ė neturėtų būti griežtai nustatoma. Ji tur ėtų būti 
nustatoma pagal toksines reakcijas, j ų pasireiškimo dažnum ą ir svei­
kimo laikotarpio trukm ę; todėl, jeigu laikoma reikalinga, ji gali b ūti 
pailginama. Labai svarbu, kada toksiškumo požymiai atsiranda ir išnyksta, bei nugaišimo laikas, ypa č jeigu yra tendencija, kad ž ūtis 
pasireiškia v ėliau.
 
1.6.3.  Bandymo eiga  
Gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose narveliuose. Bandomoji 
medžiaga tur ėtų būti tolygiai uždedama ant plotelio, kurio dydis 
sudaro apie 10 % viso k ūno paviršiaus. Jeigu medžiagos labai 
toksiškos, paveikiamas paviršius gali b ūti mažesnis, bet kaip galima 
didesnis plotas tur ėtų būti padengiamas kuo plonesniu ir lygesniu 
sluoksniu.  
Bandomoji medžiaga tur ėtų liestis su oda akytu marl ės tvarsčiu ir 
nedirginan čia lipnia juostele per vis ą 24 valand ų veikimo laik ą. 
Bandomoji vieta tur ėtų būti papildomai tinkamai uždengta, kad 
marlės tvarstis ir bandomoji medžiaga laikyt ųsi bei būtų užtikrinama, 
kad gyvūnai nepraris bandomosios medžiagos. Gali b ūti naudojami 
ribotuvai, kad bandomoji medžiaga neb ūtų praryjama, bet visiško 
imobilizavimo metodas nerekomenduojamas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Veikimo laikotarpio pabaigoje bandomosios medžiagos likutis tur ėtų 
būti nuimamas, paprastai naudojant vanden į ar kokį kitą atitinkam ą 
odos valymo b ūdą. 
Veikimo metu atliekami steb ėjimai, kurie sistemingai užrašomi. Apie 
kiekvieną gyvūną turėtų būti daromi atskiri įrašai. Pirm ą dieną stebė­
jimai tur ėtų būti atliekami dažnai. Kruopštus klinikinis ištyrimas 
turėtų būti atliekamas ne re čiau kaip vien ą kartą kiekvien ą darbo 
dieną, kiti steb ėjimai turėtų būti vykdomi kiekvien ą dieną, imantis 
atitinkam ų veiksmų kuo labiau sumažinti bandymo metu prarandam ų 
gyvūnų skaičių, pvz., rast ų negyvų gyvūnų nekroskopija arba užšal ­
dymas ir nusilpusi ų arba gaištan čių gyvūnų izoliavimas arba numa ­
rinimas.  
Turėtų būti stebimi odos ir kailio, aki ų ir gleivin ės pasikeitimai, taip 
pat respiratorin ės, kraujo, autonomin ės ir centrin ės nervų sistemų ir 
somatomotorinio aktyvumo ir elgsenos pasikeitimai. Ypatingas dėmesys tur ėtų būti skiriamas drebuli ų, konvulsij ų, seilėjimosi, vidu ­
riavimo, letargo, miego ir komos steb ėjimams. Nugaišimo laikas 
turėtų būti užrašomas kuo tiksliau. Gyv ūnams, kurie nugaišta 
bandymo metu, ir tiems, kurie išlieka gyvi pabaigus bandym ą, atlie­
kama nekroskopija. Visi dideli patologiniai poky čiai turėtų būti 
registruojami. Jeigu nurodyta, tur ėtų būti paimami audiniai histopa ­
tologiniam tyrimui.
 
Toksiškumo priešingai ly čiai įvertinimas  
Užbaigus bandym ą su viena lytimi, doz ė skiriama ne mažiau kaip 
vienai grupei, susidedan čiai iš 5 priešingos lyties gyv ūnų, kad būtų 
nustatyta, ar šios lyties gyv ūnai nėra jautresni bandomajai medžiagai. 
Atskirais atvejais pateisinamas mažesnio gyv ūnų skaičiaus naudo ­
jimas. Jeigu galima gauti pakankamai informacijos, įrodančios, kad 
bandomos lyties gyv ūnai yra daug jautresni, galima apsieiti be prie ­ 
šingos lyties gyv ūnų bandymo.  
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti apibendrinami lentel ėse, nurodant kiekvienos 
grupės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, kiekvieno gyv ūno nugai­ 
šimo laik ą, gyvūnų, turinčių kitokių toksiškumo požymi ų, skaičių, 
pateikiant toksinio poveikio ir nekroskopijos duomen ų aprašym ą. 
Kiekvieno gyv ūno svoris tur ėtų būti nustatomas ir užrašomas prieš 
pat uždedant bandomosios medžiagos, po to kart ą per savait ę ir 
nugaišimo metu; svorio pasikeitimai tur ėtų būti apskaičiuojami ir 
užrašomi, jeigu išgyvenama ilgiau negu vien ą dieną. Gyvūnai, 
kurie humaniškai numarinami d ėl cheminio junginio sukeliam ų 
kančių ir skausmo, yra užregistruojami kaip ž ūties atvejai, kuri ų 
priežastis – cheminis junginys. LD  50 turėtų būti nustatoma pripažintu 
metodu.  
Vertinant duomenis reik ėtų įvertinti s ąryšį, jeigu toks yra, tarp 
gyvūnų, paveiktų bandomąja medžiaga, ir vis ų anomalij ų atsiradimo 
ir stiprumo, įskaitant elgsenos ir klinikines anomalijas, didesni ų 
audinių pakitimų, kūno svorio pasikeitim ų, nugaišimo ir kito toksi ­
kologinio poveikio.  
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, tur ėtų būti pateikiama tokia 
informacija:  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— rūšis, veislė, gyvūnų tiekėjas, aplinkos s ąlygos, pašaras ir pan.,  
— bandymo s ąlygos (taip pat odos nuvalymo metodas ir tvarstymo 
būdas: pralaidus arba nepralaidus),  
— dozės (nurodant nešikl į, jeigu naudojamas, ir koncentracijas),  
— gyvūnų, kuriems įvestos doz ės, lytis,  
— duomen ų lentelės pagal lyt į ir dozes (t. y. gyv ūnų, kurie nugaišo 
arba buvo numarinti bandymo metu, skai čius, toksiškumo 
požymių turinčių gyvūnų skaičius, paveikt ų gyvūnų skaičius), 
— nugaišimo laikas davus doz ę, priežastys ir kriterijai, kuriais 
naudotasi humaniškai numarinant gyv ūnus, 
— visi pasteb ėjimai,  
— išsamiame bandyme išbandytos lyties LD  50 vertė, nustatyta per 
14 dienų (nurodant apibr ėžtą nustatymo metod ą), 
— LD  50 95 % pasikliautinasis intervalas (tais atvejais, kai gali b ūti 
pateiktas),  
— dozės ir gaištamumo kreiv ė ir statumas, jeigu įmanoma nustatyti 
pagal nustatymo metod ą, 
— nekroskopijos duomenys,  
— visi histopatologiniai duomenys,  
— bet kurio bandymo su priešinga lytimi rezultatai,  
— rezultat ų aptarimas (ypatingas d ėmesys tur ėtų būti atkreipiamas į 
tai, kokį poveikį apskaičiuojamai LD  50 vertei gali tur ėti huma­
niškas gyv ūnų numarinimas bandymo metu),  
— duomen ų aiškinimas.  
3.2. DUOMEN Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dalies D skirsn į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dalies E skirsn į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. ODOS DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 404 (2002).  
1.1. ĮVADAS  
Rengiant š į atnaujint ą metodą ypatingas d ėmesys buvo kreipiamas į 
galimą gyvūnų gerovės pagerinim ą ir į visos turimos informacijos 
apie bandom ąją medžiag ą įvertinimą, siekiant išvengti neb ūtinų 
bandymų su laboratoriniais gyv ūnais. Pagal š į metodą rekomenduo ­
jama, prieš darant aprašyt ą medžiagos ėsdinimo ar dirginimo  in vivo  
bandymą, daryti turim ų atitinkam ų duomen ų įrodomosios vert ės 
analizę. Jei duomen ų nepakanka, j ų galima gauti darant nuosekl ųjį 
bandymą (1). Į bandymo strategij ą, pateikiam ą kaip šio metodo prie ­
dėlis, įtraukti įteisinti ir priimti  in vitro  bandymai. Be to, jei tinka, 
darant pradin į in vivo  bandymą vietoj vienalaikio rekomenduojamas 
nuoseklusis trij ų bandomųjų tamponų uždėjimo gyv ūnui bandymas.  
Siekiant užtikrinti ir duomen ų mokslin į patikimum ą, ir gyv ūnų 
gerovę, in vivo  bandymai nedaromi tol, kol darant duomen ų įrodo­
mosios vert ės analizę nebus įvertinti visi turimi duomenys, apib ūdi­
nantys galim ą medžiagos ėsdinamąjį ar dirginam ąjį poveikį odai. 
Tokius duomenis sudarys turim ų bandym ų su žmon ėmis ir (arba) 
laboratoriniais gyv ūnais rezultatai, ėsdinimo ar dirginimo duomenys, 
gauti apie vien ą arba kelias medžiagas, turin čias gimining ą struktūrą, 
arba apie j ų mišinius, duomenys, patvirtinantys medžiagos stiprias 
rūgštines arba šarmines savybes (2) (3), be to, įteisintų ir priimt ų in 
vitro  arba  ex vivo  bandymų rezultatai (4) (5) (5a). Ši analiz ė turėtų 
sumažinti poreik į in vivo  bandyti tas medžiagas, apie kuri ų odos 
ėsdinamąjį ar dirginam ąjį poveikį jau turima pakankamai kit ų 
bandymų metu gaut ų duomenų. 
Pirmenyb ė teikiama į šio metodo pried ėlį įtrauktai nuosekli ųjų 
bandymų strategijai, kuri ą sudaro įteisinti ir priimti  in vitro  arba  ex 
vivo ėsdinimo ar dirginimo bandymai. Strategij ą parengė ir vienbal ­
siai rekomendavo OECD seminaro dalyviai (6), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai suderintos chemini ų medžiag ų klasifi­
kavimo sistemos (GHS) bandym ų strategija (7). Rekomenduojama 
laikytis šios bandym ų strategijos prieš pradedant  in vivo  bandymus. 
Tiriant naujas medžiagas, rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagr įstiems duomenims apie medžiagos ėsdinimo 
ar dirginimo savybes gauti. Tiriant esamas medžiagas, apie kuri ų 
odos ėsdinimo ar dirginimo savybes duomen ų nepakanka, ši strate ­
gija turėtų būti taikoma tiek, kiek tr ūksta duomen ų spragoms užpil ­
dyti. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba 
sprendimas netaikyti nuosekli ųjų bandym ų metodo turi b ūti 
pagrįstas.
 
Jei darant duomen ų įrodomosios vert ės analizę ėsdinimo arba dirgi ­
nimo savybi ų negalima nustatyti, pagal nuoseklaus bandymo strate ­
giją reikėtų apsvarstyti  in vivo  bandymo atlikim ą (žr. pried ėlį). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Odos dirginimas  – išnykstantis odos pažeidimas, bandom ąja 
medžiaga veikiant ne ilgiau kaip 4 h.  
Odos ėsdinimas  – neišnykstantis odos pažeidimas; b ūtent, matomoji 
nekrozė per epiderm į ir į dermį, odos nekroz ė po bandomosios 
medžiagos užd ėjimo ne ilgiau kaip keturioms valandoms. Tipiniai 
ėsdinimo požymiai yra opos, kraujavimas, kruvini šašai ir, baigiantis 
14 parų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas d ėl jos išbalimo, 
visiškai nuplikusios vietos ir randai. Neaiškiems pažeidimams nusta ­
tyti galima b ūtų daryti histopatologin į tyrimą. 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Ant bandomo gyv ūno odos dedama viena bandomosios medžiagos 
dozė; nepaveiktos gyv ūno odos vietos naudojamos kontrolei. Nusta ­
tytais laiko tarpais nustatomas ir balais įvertinamas dirginimo ar 
ėsdinimo laipsnis, kuris papildomai aprašomas, siekiant išsamiai 
įvertinti poveik į. Bandymo trukm ė turi būti tokia, kad pakakt ų įver­
tinti, ar stebimas poveikis yra gr įžtamas, ar negr įžtamas.  
Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuola ­
tiniai sunki ų kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi b ūti humaniškai 
numarinami, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal 
kuriuos priimamas sprendimas d ėl humaniško gaištan čių ir labai 
kenčiančių gyvūnų numarinimo, aprašyti (8) nuorodoje.  
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Pasiruošimas  in vivo  bandymui  
1.4.1.1.  Gyvūnų rūšies pasirinkimas  
Tinkamiausias laboratorinis gyv ūnas – baltasis triušis; naudojami 
sveiki, jauni ir suaug ę triušiai. Kit ų rūšių naudojimas turi b ūti 
pagrįstas. 
1.4.1.2.  Gyvūnų ruošimas  
Maždaug 24 h prieš bandym ą nuo gyv ūno reikia pašalinti kail į, jį 
trumpai nukerpant nugaros srityje. Reikia stengtis nenutrinti odos ir 
naudoti tik tuos gyv ūnus, kurių oda yra sveika ir nepažeista.  
Kai kurių veislių triušiai turi tanki ų plaukų vietas, kurios labiau 
matomos tam tikrais met ų laikais. Tokios tanki ų plaukų vietos neturi 
būti naudojamos bandymui.  
1.4.1.3.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Gyvūnai turi b ūti laikomi atskirai. Patalpos, kurioje laikomi bando ­
mieji triušiai, temperat ūra turi būti 20 °C (± 3 °C). Nors santykin ė 
oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesn ė 
kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikėtų siekti, kad ji b ūtų 
50–60 %. Apšvietimas turi b ūti dirbtinis: 12 h šviesos ir 12 h tamsos. 
Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, 
neribojant geriamo vandens kiekio.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2.  Bandymo eiga  
1.4.2.1.  Bandomosios medžiagos užd ėjimas  
Bandomoji medžiaga uždedama ant mažo odos ploto (maždaug 6 
cm 2 ) ir uždengiama marl ės tamponu, kuris tvirtinamas nedirginan čia 
lipnia juosta. Jei tiesiogiai užd ėti neįmanoma (pvz., skys čiai arba kai 
kurios pastos), bandom ąją medžiagą reikėtų dėti ant marl ės tampono, 
kuris būtų dedamas ant odos. Vis ą veikimo laikotarp į tamponas turi 
laisvai liesti od ą, naudojant pusiau pralaid ų tvarstį. Jei bandomoji 
medžiaga dedama ant tampono, jis dedamas ant odos taip, kad medžiaga gerai liest ųsi su oda ir tolygiai pasiskirstyt ų ant jos. 
Gyvūnai neturi pasiekti tampono ir praryti arba įkvėpti bandomosios 
medžiagos.
 
Skystos bandomosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos. 
Bandant kiet ąsias medžiagas (kurios gali b ūti pulverizuojamos, jei 
manoma, kad tai b ūtina), bandom ąją medžiagą reikėtų sudrėkinti kuo 
mažesniu vandens kiekiu (arba prireikus kitu tinkamu nešikliu), kurio pakaktų geram sąlyčiui su oda užtikrinti. Kai nešiklis yra ne vanduo, 
galima nešiklio įtaka bandomosios medžiagos dirginamajam povei ­
kiui turi b ūti kiek įmanoma mažesn ė.
 
Pasibaigus veikimo laikotarpiui, kurio trukm ė paprastai yra 4 h, 
bandomosios medžiagos likutis turi b ūti pašalintas, jei įmanoma, 
vandeniu arba kitu tinkamu tirpikliu, nepakei čiant odos reakcijos 
arba epidermio vientisumo.  
1.4.2.2.  Dozės dydis  
Ant bandymo vietos dedama 0,5 ml skys čio arba 0,5 g kietosios 
medžiagos arba pastos doz ė. 
1.4.2.3.  Pradinis bandymas (in vivo odos dirginimo ar ėsdinimo bandymas 
su vienu gyv ūnu) 
Labai rekomenduojama  in vivo  bandymą iš pradži ų daryti su vienu 
gyvūnu, ypač kai yra įtarimas d ėl ėsdinančiųjų medžiagos savybi ų. 
Tai atitinka nuosekli ųjų bandymų strategiją (žr. 1 pried ėlį). 
Kai po duomen ų įrodomosios vert ės analizės padaroma išvada, kad 
medžiaga yra ėsdinanti, daugiau bandym ų su gyv ūnais daryti 
nereikia. Didesnei daliai medžiag ų, kurios, kaip sp ėjama, yra ėsdi­
nančios, paprastai daugiau  in vivo  bandymų neprireikia. Ta čiau tais 
atvejais, kai turimi duomenys atrodo nepakankamai įrodantys, galima 
daryti ribot ą bandym ą su gyvūnais, taikant š į būdą: ant gyv ūno 
paeiliui dedami ne daugiau kaip trys tamponai. Pirmasis tamponas 
nuimamas po trij ų minučių. Jei jokios sunkios odos reakcijos n ėra, 
dedamas antras tamponas, kuris nuimamas po valandos. Jei šioje stadijoje steb ėjimai rodo, kad veikim ą galima humaniškai prat ęsti 
keturioms valandoms, dedamas tre čias tamponas, kuris nuimamas 
po keturių valandų, ir odos reakcija įvertinama balais.
 
Jei ėsdinantis poveikis pastebimas po bet kurio iš trij ų nuosekli ų 
paveikimų, bandymas nedelsiant baigiamas. Jei ėsdinančio poveikio 
nėra, nuėmus paskutin į tamponą, gyvūnas stebimas 14 par ų, jei ėsdi­
nimo požymi ų neatsiranda anks čiau. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
Tais atvejais, kai nesitikima, kad bandomoji medžiaga sukels ėsdi­
nantį poveikį, o tik dirginant į, vienam gyv ūnui keturioms valandoms 
dedamas vienas tamponas.  
1.4.2.4.  Patvirtinamasis bandymas (in vivo odos dirginimo bandymas su 
papildomais gyv ūnais)  
Jei darant pradin į bandym ą ėsdinančio poveikio n ėra, dirginantis 
poveikis arba neigiama reakcija turi b ūti patvirtinti naudojant ne 
daugiau kaip du papildomus gyv ūnus, kiekvienam iš j ų uždedant 
po vieną tamponą ir laikant j į keturias valandas. Jei dirginantis 
poveikis pastebimas darant pradin į bandymą, patvirtinam ąjį bandymą 
galima daryti nuosekliu b ūdu arba veikiant du papildomus gyv ūnus 
vienu metu. Išimtiniais atvejais, kai pradinis bandymas nedaromas, 
dviem arba trims gyv ūnams gali b ūti dedama po vien ą tamponą 
keturioms valandoms. Kai naudojami du gyv ūnai ir abiej ų reakcija 
vienoda, toliau bandyti nereikia. Priešingu atveju atliekamas 
bandymas su tre čiu gyvūnu. Neaiškias reakcijas gali tekti įvertinti 
naudojant papildom ą gyvūną. 
1.4.2.5.  Steb ėjimo laikotarpis  
Stebėjimo laikotarpio trukm ės turi pakakti pasteb ėto poveikio gr įžta­
mumui visiškai įvertinti. Ta čiau bandymas turi b ūti nutrauktas bet 
kuriuo momentu, kai tik gyv ūnui pasireiškia ilgalaikiai didelio 
skausmo arba kan čios požymiai. Siekiant nustatyti poveikio gr įžta­
mumą, gyvūnai po tampon ų nuėmimo stebimi iki 14 par ų. Jei grįž­
tamumas pastebimas anks čiau kaip po 14 par ų, bandymas nutrau ­
kiamas tuo momentu.  
1.4.2.6.  Klinikiniai steb ėjimai ir odos reakcijos įvertinimas balais  
Patikrinama, ar gyv ūnai turi eritemos ir edemos požymi ų, o reakcija 
įvertinama balais po 60 minu čių nuėmus tampon ą ir vėliau – po 24, 
48 ir 72 valand ų. Darant pradin į bandym ą su vienu gyv ūnu, 
bandymo vieta taip pat tiriama iškart po tampono nu ėmimo. Odos 
reakcija įvertinama balais ir užrašoma pagal lentel ėje pateikt ą grada­
vimo skal ę. Jei odai padarytas pažeidimas po 72 h negali b ūti iden­
tifikuotas kaip dirginimas arba ėsdinimas, poveikio gr įžtamumui 
nustatyti steb ėjimą gali tekti t ęsti iki 14 par ų. Be dirginamojo 
poveikio steb ėjimo, turi b ūti išsamiai apib ūdintas ir užrašytas bet 
koks vietinis toksinis poveikis, pvz., odos dži ūvimas, ir bet koks 
neigiamas somatinis poveikis (pvz., poveikis, pasireiškiantis kaip klinikiniai toksiškumo požymiai, ir poveikis k ūno masei). Neaiš ­
kiems pažeidimams išaiškinti galima b ūtų daryti histopatologin į 
tyrimą.
 
Odos reakcijos įvertinimas balais yra neišvengiamai subjektyvus. 
Siekiant labiau suderinti odos reakcijos įvertinimą balais ir pad ėti 
bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina steb ė­
jimus, juos vykdantis personalas turi b ūti atitinkamai apmokytas 
taikyti įvertinimo balais sistem ą (žr. toliau pateikt ą lentelę). Taip 
pat galėtų būti naudingas iliustruotas odos dirginimo ir kit ų pažei­
dimų vertinimo vadovas (9).  
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų PATEIKIMAS  
Galutinėje ataskaitoje bandymo rezultatai turi b ūti apibendrinti lente ­
lėje, į kurią turėtų būti įtraukti visi 3.1 skirsnio punktai.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS  
Odos sudirginimo rezultatai turi b ūti įvertinti pagal pažeidim ų tipą ir 
sunkumą bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvim ą. Atskiri 
rezultatai n ėra medžiagos dirginam ųjų savybių absoliutusis įvertis, 
kadangi vertinamas ir kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į 
šiuos atskirus rezultatus reik ėtų žiūrėti kaip į pamatines vertes, kurios 
turi būti vertinamos kartu su visais kitais bandymo rezultatais.  
Vertinant dirginam ąsias savybes tur ėtų būti atsižvelgta į odos pažei ­
dimų grįžtamumą. Kai reakcija, pvz., plikimas (ribotame plote), 
hiperkeratoz ė, hiperplazija ir pleiskanojimas, išlieka iki 14 par ų 
stebėjimo laikotarpio pabaigos, bandomoji medžiaga priskiriama 
dirginančioms.  
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
In vivo  bandymo pagrindimas: jau turim ų bandymo duomen ų įrodo­
mosios vert ės analizė, įskaitant nuosekli ųjų bandym ų strategijos 
taikymo rezultatus:  
— ankstesni ų bandymų atitinkam ų duomenų aprašymas,  
— duomenys, gauti kiekvienoje bandym ų strategijos stadijoje,  
— darytų in vitro  bandymų aprašymas, įskaitant išsami ą informacij ą 
apie metodikas, rezultatus, gautus tiriant bandom ąją ir (arba) 
etaloninę medžiag ą, 
— duomen ų įrodomosios vert ės analizė siekiant nustatyti, ar reikia 
atlikti  in vivo  bandymą. 
Bandomoji medžiaga:  
— tapatumas duomenys (pvz., CAS numeris, šaltinis, grynumas, 
žinomos priemaišos, partijos numeris),  
— fizinė būsena ir fizikin ės bei chemin ės savybės (pvz., pH, 
lakumas, tirpumas, stabilumas),  
— sudėtis ir komponent ų procentin ė dalis, jei tai mišinys.  
Nešiklis:  
— tapatumas, koncentracija (jei taikytina), naudojamas t ūris, 
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir veisl ė, kitų nei baltieji triušiai gyv ūnų naudojimo 
pagrindimas,  
— kiekvienos lyties gyv ūnų skaičius, 
— kiekvieno gyv ūno masė bandymo pradžioje ir pabaigoje,  
— amžius bandymo pradžioje,  
— gyvūnų šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Bandymo s ąlygos:  
— tampono d ėjimo vietos ruošimo technika,  
— išsami informacija apie tamponui naudojamas medžiagas ir 
tampono d ėjimo technik ą, 
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošim ą, dėjimą 
ir nuėmimą. 
Rezultatai:  
— kiekvieno gyv ūno dirginimo ar ėsdinimo reakcijos bal ų, gautų 
per kiekvien ą matavim ą, lentelių sudarymas,  
— visų pastebėtų pažeidim ų aprašymas,  
— pasteb ėto dirginimo arba ėsdinimo tipo ir laipsnio pasakojamasis 
aprašymas ir visi histopatologinio tyrimo rezultatai,  
— kito kartu su dirginimu arba ėsdinimų pasireiškian čio neigiamo 
vietinio (pvz., odos dži ūvimo) ir somatinio poveikio aprašymas.  
Rezultatų aptarimas.  
4. NUORODOS  
1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., 
Verhaar, h.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alter ­
native Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410–429.
 
2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, p. 19–26.
 
3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. 
ATLA 26, p. 709–720.
 
4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation“, Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brus ­
sels. 
5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, h.G. and Liebsch, M. 
(1998) The ECVAM international validation study on in vitro 
tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Mana ­
gement Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524.  
5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.  
6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. 
Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www.oecd ­
l.org/ehs/test/background.htm).
 
7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www.oecdl.org/ehs/Class/HCL6. 
htm).
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in SAFEty Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and SAFEty Publications. Series on Testing and Assessment No. 19 (http://www.oecdl.org/ehs/test/monos.htm).
 
9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, ( 20T-2004 ). United States 
Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and 
Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.  
[Paprašius, galima gauti OECD sekretoriate].  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
I lentelė 
ODOS REAKCIJOS VERTINIMO BALAIS SKAL Ė 
Eritemos ir šaš ų atsiradimas  
Eritemos n ėra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  0  
Labai nedidel ė eritema (vos pastebima). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  1  
Aiškiai apibr ėžta eritema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  2  
Nuo vidutin ės iki didel ės eritemos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  3  
Didelė eritema (jautienos raudonumo) arba šaš ų susidarymas, trukdantis 
įvertinti eritem ą . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  4  
Didžiausias įmanomas balas: 4  
Edemos atsiradimas  
Edemos n ėra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  0  
Labai nedidel ė edema (vos pastebima). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  1  
Nedidelė edema (plotelio kraštai aiškiai apibr ėžti dėl iškilimo) . . . . . . . .  2  
Vidutinė edema (iškilusi maždaug 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  3  
Didelė edema (iškilusi daugiau kaip 1 mm ir išplitusi už veikiamo ploto 
ribų) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . 4  
Didžiausias įmanomas balas: 4  
Neaiškiems pažeidimams paaiškinti galima b ūtų daryti histopatologin į tyrimą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
PRIEDĖLIS 
Nuosekliųjų bandym ų strategija odos dirginimui ir ėsdinimui nustatyti  
BENDRIEJI KLAUSIMAI  
Siekiant gauti išsami ų mokslini ų rezultatų ir rūpinantis gyv ūnų gerove, svarbu be 
reikalo nenaudoti gyv ūnų ir, kiek įmanoma, mažinti visus bandymus, kurie gyv ū­
nams gali sukelti sunkias reakcijas. Prieš sprendžiant, ar daryti  in vivo  bandymus, 
turėtų būti įvertinta visa informacija apie medžiagos galim ą ėsdinamąjį ar dirgi­
namąjį poveikį odai. Jei jau yra pakankamai duomen ų galimam bandomosios 
medžiagos ėsdinamajam arba dirginamajam poveikiui odai klasifikuoti, nereikia 
bandymų su laboratoriniais gyv ūnais. Taigi taikant duomen ų įrodomosios vert ės 
analizę ir nuosekli ųjų bandym ų strategij ą sumažėja būtinybė daryti  in vivo  
bandymus, ypa č jei tikėtina, kad medžiaga gali sukelti sunkias reakcijas.  
Turimai informacijai apie medžiag ų dirginam ąjį ir ėsdinamąjį poveikį įvertinti 
rekomenduojama taikyti duomen ų įrodomosios vert ės analizę, kuri leist ų spręsti, 
ar tokio poveikio galimybei apib ūdinti reikia daryti papildomus tyrimus, išskyrus  
in vivo  odos bandymus. Jei reikia papildom ų tyrimų, atitinkamiems eksperimen ­
tiniams duomenims gauti, rekomenduojama taikyti nuosekli ųjų bandymų strate­
giją. Norint gauti duomen ų apie nebandytas medžiagas, reikaling ų jų ėsdina­
majam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reik ėtų taikyti nuosekli ųjų 
bandymų strategij ą. Šiame priede aprašyta bandym ų strategija buvo parengta 
OECD seminare (1) ir v ėliau patvirtinta bei išpl ėsta kaip integruota darnioji 
pavojų dėl chemini ų medžiag ų poveikio žmoni ų sveikatai ir aplinkai klasifika ­
vimo sistema ( Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human 
Health and Environmental Effects of Chemical Substances ), 1998 m. lapkri čio 
mėn. priimta 28-ajame jungtiniame chemini ų medžiag ų komiteto ir chemini ų 
medžiagų darbo grup ės posėdyje (2).  
Nors ši nuosekli ųjų bandymų strategija n ėra sudėtinė B.4 bandymo metodo dalis, 
ji apibūdina rekomenduojam ą būdą odos dirginimo ar ėsdinimo charakteristikoms 
nustatyti. Šis b ūdas atitinka geriausi ą praktiką ir yra odos dirginimo ar ėsdinimo  
in vivo  bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos  in vivo  bandymų 
rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reik ėtų atkreipti d ėmesį 
prieš pradedant tok į bandymą. Strategijoje si ūlomas būdas, kaip įvertinti turimus 
duomenis apie bandom ųjų medžiag ų odos dirginimo ar ėsdinimo savybes, kad 
būtų galima gauti reikiam ų duomenų apie medžiagas, kurioms reikalingi papil ­
domi tyrimai arba kurios nebuvo tirtos. Be to, rekomenduojama daryti įteisintus 
ir priimtus odos ėsdinimo ar dirginimo  in vitro  arba  ex vivo  bandymus esant 
konkrečioms aplinkyb ėms. 
ĮVERTINIMO IR BANDYMO STRATEGIJOS APRAŠYMAS  
Siekiant nustatyti  in vivo  odos bandym ų reikalingum ą, prieš darant bandymus, 
kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), įvertinama visa turima 
informacija. Nors reikšmingos informacijos galima b ūtų gauti vertinant atskirus 
parametrus (pvz., pH ribines vertes), tur ėtų būti nagrinėjama turimos informacijos 
visuma. Sprendimui priimti turi b ūti daroma vis ų atitinkam ų duomen ų apie 
konkrečios medžiagos arba jos analog ų poveikį įrodomosios vert ės analizė, 
kuri pagr įstų priimam ą sprendim ą. Didžiausias d ėmesys tur ėtų būti kreipiamas 
į duomenis apie medžiag ą gautus tiriant žmones ir gyv ūnus, o vėliau tirti  in vitro  
arba ex vivo  bandymų duomenis. Ėsdinančiųjų medžiagų in vivo  bandymų reikėtų 
kiek įmanoma vengti. Toliau pateikiami bandym ų strategijos veiksniai.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Turimų duomenų gautų tiriant žmones ir gyv ūnus, įvertinimas (1 pakopa) . Iš 
pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profe ­
sinių susirgim ų tyrimai ir byl ų ataskaitos, ir (arba) bandym ų su gyv ūnais 
duomenys, pvz., vienkartinio arba kartotinio poveikio odai toksiškumo tyrimai, kadangi jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu odai. 
Medžiagų, kurios yra žinomos kaip dirginan čios arba ėsdinančios, ir medžiag ų, 
kurios akivaizdžiai n ėra ėsdinančios arba dirginan čios, nereikia bandyti darant  in 
vivo tyrimus.
 
Struktūros ir aktyvumo ryši ų (SAR) analiz ė (2 pakopa) . Analizuojami gimining ą 
struktūrą turinčių medžiag ų bandymo rezultatai, jei tokie b ūtų. Kai pakanka 
duomenų apie giminingos strukt ūros medžiag ų arba toki ų medžiag ų mišinių 
poveikį žmonėms ir gyv ūnams, kad b ūtų galima įrodyti medžiag ų gebą ėsdinti 
ar jautrinti od ą, galima daryti prielaid ą kad įvertinimui pateiktos bandomosios 
medžiagos poveikis bus toks pats. Tokiais atvejais bandomosios medžiagos neb ū­
tina bandyti. Pagal nuosekli ųjų bandymų strategiją neigiami duomenys apie gimi ­
ningos strukt ūros medžiag ų arba toki ų medžiag ų mišinių poveikį žmonėms ar 
gyvūnams nėra pakankamas įrodymas, kad medžiaga n ėra ėsdinanti ar jautrinanti. 
Medžiagų geba ėsdinti ir dirginti od ą nustatoma taikant įteisintus ir priimtus SAR 
metodus.  
Fizikinės ir chemin ės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa) . Medžiagos, 
turinčios ribines pH vertes, pvz., ≤ 2,0 ir ≥ 11,5, gali tur ėti didelį vietinį poveikį. 
Jei ribinė pH vertė yra pagrindin ė savybė, pagal kuri ą medžiaga identifikuojama 
kaip odą ėsdinanti medžiag ą galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo atsarg ą (arba 
buferinę talpą) (3) (4). Jei buferin ė talpa leidžia daryti prielaid ą, kad medžiaga 
gali nebūti odą ėsdinanti medžiaga, tai turi b ūti patvirtinta darant papildomus 
bandymus ir geriau b ūtų taikyti įteisintą ir priimtą in vitro  arba  ex vivo  bandymą 
(žr. 5 ir 6 pakopas).  
Toksiškumas per od ą (4 pakopa) . Jei buvo įrodyta, kad chemin ė medžiaga yra 
labai toksiška per od ą, in vivo  odos dirginimo ar ėsdinimo tyrimas gali b ūti 
neįmanomas, nes bandomosios medžiagos kiekis, kuris įprastai dedamas ant 
odos, gali b ūti didesnis už labai didelio toksiškumo doz ę, taigi gyv ūnas gali 
žūti arba sunkiai kent ėti. Be to, jei jau yra padaryti toksiškumo per od ą tyrimai 
su baltaisiais triušiais, naudojant 2 000 mg/kg k ūno masės arba didesn ę ribinę 
dozę, ir nebuvo pasteb ėta odos dirginimo ar ėsdinimo, papildomas odos dirgi ­
nimo ar ėsdinimo bandymas gali b ūti nereikalingas. Vertinant ūmų toksiškum ą 
pirmiau darytuose tyrimuose, reik ėtų atsižvelgti į kelias aplinkybes. Pvz., 
paskelbta informacija apie odos pažeidimus gali b ūti neišsami. Gali b ūti bandomi 
ir stebimi gyv ūnai kitų, ne triuši ų rūšių, o rūšių jautrumas poveikiui gali labai 
skirtis. Be to, bandomosios medžiagos taikymo b ūdas gali netikti odos dirginimui 
ar ėsdinimui įvertinti (pvz., medžiag ų skiedimas bandant toksiškum ą per odą (5). 
Tačiau tais atvejais, kai toksiškumo per od ą tyrimai su triušiais buvo gerai 
suplanuoti ir padaryti, neigiami rezultatai gali b ūti laikomi pakankamu įrodymu, 
kad medžiaga n ėra ėsdinanti arba dirginanti.  
In vitro arba ex vivo bandym ų rezultatai  (5 ir 6 pakopos ). Medžiag ų, kurios, kaip 
įrodyta, veikia kaip ėsdinančios arba labai dirginan čios darant patvirtinto tinka ­
mumo ir priimt ą in vitro  arba  ex vivo  bandymą (6) (7), skirt ą šiam konkre čiam 
poveikiui įvertinti, nereikia bandyti su gyv ūnais. Galima daryti prielaid ą, kad 
tokios medžiagos tur ės panašų sunkų poveikį in vivo . ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
Bandymas su triušiais in vivo  (7 ir 8 pakopos ). Jei atlikus duomen ų įrodomosios 
vertės analizę priimamas sprendimas daryti bandym ą in vivo , jį reikėtų pradėti 
pradiniu bandymu su vienu gyv ūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad 
medžiaga yra od ą ėsdinanti, toliau bandyti nereikia. Jei darant pradin į bandymą 
ėsdinamasis poveikis nepastebimas, dirginimo arba ėsdinimo poveikis patvirti ­
namas naudojant ne daugiau kaip du papildomus gyv ūnus, veikiamus keturias 
valandas. Jei darant pradin į bandymą pastebimas dirginamasis poveikis, patvirti ­
namasis bandymas gali b ūti daromas nuosekliu b ūdu arba tuo pat metu veikiant 
du papildomus gyv ūnus. 
NUORODOS  
1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www1. oecd. org/ehs/test/b ackground. htm).
 
2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as 
endorsed by the 28  l Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://wwwl.oecd.org/ehs/ Class/HCL6.htm).
 
3) Worth, A.P., Fentem J. H, Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdaile D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin prielaid ą ATLA 26, p. 709–720.
 
4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) 
p. 19–26.  
5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and 
Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth 1 1,5, 
1–56032–356–6, Chapter 31, p. 411–436.  
6) Testing Method B.40.  
7) Fentem, J.H., identifikuojama G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation prielaid ą on in vitro tests for skin 
corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology 
in Vitro 12, p. 483–524.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Schema  
ODOS DIRGINIMO AR ĖSDINIMO BANDYMO IR ĮVERTINIMO STRATEGIJA
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. ŪMUS TOKSIŠKUMAS. AKI Ų DIRGINIMAS AR ĖSDINIMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 405 (2002).  
1.1. ĮVADAS  
Rengiant š į atnaujint ą metodą ypatingas d ėmesys buvo kreipiamas į 
galimą gyvūnų gerovės pagerinim ą ir į visos turimos informacijos 
apie bandom ąją medžiag ą įvertinimą, siekiant išvengti neb ūtinų 
bandymų su laboratoriniais gyv ūnais. Pagal š į metodą rekomenduo ­
jama, prieš darant aprašyt ą medžiagos ūmaus akių ėsdinimo ar dirgi ­
nimo bandym ą in vivo , atlikti turim ų atitinkam ų duomenų įrodomo­
sios vertės analizę (1). Jei duomen ų nepakanka, j ų galima gauti 
darant nuosekl ųjį bandymą (2)(3). Į bandymo strategij ą įtraukti šio 
metodo pried ėlyje aprašyti įteisinti ir priimti  in vitro  bandymai. Be 
to, prieš numatant daryti  in vivo  akių bandymą akių ėsdinimui prog ­
nozuoti, rekomenduojama taikyti  in vivo  odos dirginimo ar ėsdinimo 
bandymą. 
Siekiant užtikrinti ir duomen ų mokslin į patikimum ą, ir gyv ūnų 
gerovę, in vivo  bandymai netur ėtų būti svarstomi tol, kol darant 
duomenų įrodomosios vert ės analizę nebus įvertinti visi turimi 
duomenys, apib ūdinantys galim ą medžiagos ėsdinamąjį ar dirgina ­
mąjį poveikį akims. Tokius duomenis sudaro turim ų žmonių tyrimų 
ir (arba) bandym ų su laboratoriniais gyv ūnais rezultatai, ėsdinimo ar 
dirginimo duomenys, gauti apie vien ą arba kelias medžiagas, turin ­ 
čias gimining ą struktūrą, arba jų mišinius, duomenys, patvirtinantys 
medžiagos stiprias r ūgštines arba šarmines savybes (4)(5), be to, 
įteisintų ir priimt ų in vitro  arba  ex vivo  odos ėsdinimo ir dirginimo 
bandymų rezultatai (6)(6a). Tokie tyrimai gali b ūti padaryti prieš 
duomenų įrodomosios vert ės analizę arba kaip jos rezultatas.  
Atlikus toki ą analizę gali paaišk ėti, kad reikia  in vivo  ištirti kai kuri ų 
medžiagų akių ėsdinimo ar dirginimo geb ą. Visais šiais atvejais prieš 
svarstant  in vivo  akių bandymo atlikim ą, pageidautina prieš tai atlikti 
medžiagos poveikio odai  in vivo  bandymą ir ją įvertinti pagal B.4 
bandymo metod ą (7). Duomen ų įrodomosios vert ės analizės ir nuose ­
kliųjų bandymų strategijos taikymas tur ėtų sumažinti poreik į in vivo  
bandyti toki ų medžiag ų, apie kurias jau yra gauta pakankamai 
duomenų darant kitus bandymus, aki ų ėsdinimo ar dirginimo 
poveikį. Jei taikant nuosekli ųjų bandym ų strategiją akių ėsdinimo 
arba dirginimo geba negali b ūti nustatyta net po odos ėsdinimo ir 
dirginimo  in vivo  bandymo, galima daryti  in vivo  akių ėsdinimo ar 
dirginimo bandym ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Pirmenyb ė teikiama į šio metodo pried ėlį įtrauktai nuosekli ųjų 
bandymų strategijai, kuri ą sudaro įteisinti ir priimti  in vitro  arba  ex 
vivo ėsdinimo ar dirginimo bandymai. Strategij ą parengė ir vienbal ­
siai rekomendavo OECD seminaro dalyviai (8), ji buvo priimta ir rekomenduota kaip visuotinai suderintos chemini ų medžiag ų klasifi­
kavimo sistemos (GHS) bandym ų strategija (9). Rekomenduojama 
laikytis šios bandym ų strategijos prieš pradedant  in vivo  bandymus. 
Tiriant naujas medžiagas, rekomenduojamas nuoseklusis bandymo būdas moksliškai pagr įstiems duomenims apie medžiagos ėsdinimo 
ar dirginimo savybes gauti. Tiriant esamas medžiagas, apie kuri ų 
odos ėsdinimo ar dirginimo savybes duomen ų nepakanka, ši strate ­
gija turėtų būti taikoma tiek, kiek tr ūksta duomen ų spragoms užpil ­
dyti. Kitokios bandymo strategijos arba metodikos taikymas arba 
sprendimas netaikyti nuosekli ųjų bandym ų metodo turi b ūti 
pagrįstas.
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Akių dirginimas  – akių pokyčių sukėlimas, paveikus bandom ąja 
medžiaga priekin į akies pavirši ų, jei poky čiai visiškai išnyksta per 
21 parą po veikimo.  
Akių ėsdinimas  – akies audini ų pažeidimas arba sunkus reg ėjimo 
pablogėjimas, paveikus bandom ąja medžiaga priekin į akies pavirši ų, 
jei pažeidimai ne visiškai išnyksta per 21 par ą po veikimo.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Ant bandomo gyv ūno vienos akies dedama viena bandomosios 
medžiagos doz ė; nepaveikta gyv ūno akis naudojama kontrolei. 
Apibrėžtais laiko tarpais nustatomi ir balais įvertinami jungin ės, 
ragenos ir rainel ės pažeidimai. Be to, kad b ūtų išsamiai įvertintas 
poveikis, aprašomas bet koks kitas poveikis ir neigiamas somatinis poveikis. Bandymo trukm ė turi būti pakakama poveikio gr įžtamumui 
arba negr įžtamumui įvertinti.
 
Gyvūnai, kuriems kurioje nors bandymo stadijoje pasireiškia nuola ­
tiniai sunki ų kančių ir (arba) skausmo požymiai, turi b ūti humaniškai 
numarinami, o medžiaga atitinkamai įvertinama. Kriterijai, pagal 
kuriuos priimamas sprendimas d ėl humaniško gaištan čių ir labai 
kenčiančių gyvūnų numarinimo, aprašyti (10) nuorodoje.  
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Pasiruošimas  in vivo  bandymui  
1.4.1.1.  Gyvūnų rūšies pasirinkimas  
Tinkamiausias laboratorinis gyv ūnas – baltasis triušis; naudojami 
sveiki, jauni ir suaug ę triušiai. Kit ų rūšių naudojimas turi b ūti 
pagrįstas. 
1.4.1.2.  Gyvūnų ruošimas  
Abi kiekvieno bandymui numatyto gyv ūno akys patikrinamos per 24 
h iki bandymo pradžios. Gyv ūnai, kuriems nustatoma aki ų sudir­
gimas, aki ų defektai arba jau esamas ragenos pažeidimas, neturi 
būti naudojami.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Gyvūnai turi b ūti laikomi atskiruose narveliuose. Patalpos, kurioje 
laikomi bandymo triušiai, temperat ūra turi būti 20 °C (± 3 °C). Nors 
santykinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne 
didesnė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikėtų siekti, 
kad ji būtų 50–60 %. Apšvietimas turi b ūti dirbtinis ir jo seka: 12 h 
šviesos ir 12 h tamsos. Gyv ūnams šerti tinka įprastas laboratorini ų 
gyvūnų pašaras, geriamojo vandens kiekis neribojamas.  
1.4.2.  Bandymo eiga  
1.4.2.1.  Bandomosios medžiagos d ėjimas  
Bandomoji medžiaga dedama į kiekvieno gyv ūno vienos akies 
junginės maišelį, švelniai atitraukiant apatin į voką nuo akies obuolio. 
Vokai švelniai suspaudžiami maždaug vienai sekundei, kad b ūtų 
išvengta medžiagos nuostoli ų. Kita neapdorota akis naudojama kont ­
rolei.  
1.4.2.2.  Akių plovimas  
Įdėjus bandomosios medžiagos, bandomo gyv ūno akių reikėtų 
neplauti mažiausiai 24 h, išskyrus kiet ąsias medžiagas (žr. 1.4.2.3.2 
skirsnį) ir jei iš karto pasireiškia ėsdinimo arba dirginimo poveikis. 
Po 24 h akis galima plauti, jei manoma, kad tai reikia daryti.  
Nerekomenduojama naudoti pagalbin ės gyvūnų grupės plovimo 
įtakai tirti, nebent tai yra moksliškai pagr įsta. Jei pagalbin ės grupės 
reikia, naudojami du triušiai. Plovimo s ąlygos turi b ūti kruopš čiai 
aprašomos, pvz., plovimo laikas, plovimo tirpalo sud ėtis ir tempera ­
tūra, trukm ė, tūris ir plovimo greitis.  
1.4.2.3.  Dozės dydis  
1.4.2.3.1. S k y s č i ų b a n d y m a s  
Bandant skys čius, naudojama 0,1 ml doz ė. Nereikėtų naudoti purškiklio 
medžiagai tiesiai į akį purkšti. Purškiamasis skystis tur ėtų būti išpurš­
kiamas ir surenkamas į indą, ir tik po to jo 0,1 ml įlašinama į akį. 
1.4.2.3.2. K i e t ų j ų m e d ž i a g ų b a n d y m a s  
Bandant kiet ąsias medžiagas, past ą ir medžiag ą, sudarytą iš dalelių, 
naudojamos medžiagos t ūris turi b ūti 0,1 ml arba ne didesn ė kaip 
100 mg mas ė. Bandomoji medžiaga turi b ūti sumalta į smulkias 
dulkes. Kietosios medžiagos t ūris matuojamas j ą švelniai sutankinus, 
pvz., taukšint matavimo ind ą. Jei stebint pirm ą kartą, praėjus 1 h po 
akies veikimo, kieta bandomoji medžiaga dar yra nepašalinta iš 
bandomo gyv ūno akies veikiant fiziologiniams mechanizmams, ak į 
galima praplauti fiziologiniu tirpalu arba distiliuotu vandeniu.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3. A e r o z o l i ų b a n d y m a s  
Prieš įlašinant į akį rekomenduojama visas purškiam ąsias medžiagas 
ir aerozolius iš pradži ų surinkti į indą. Viena išimtis daroma sl ėgi­
niuose aerozoli ų purkštuvuose esan čioms medžiagoms, kuri ų nega­
lima sukaupti d ėl garavimo. Tokiais atvejais akis atmerkiama ir 
bandomoji medžiaga maždaug vien ą sekundę tiesiog purškiama į 
akį stačiu kampu iš 10 cm atstumo. Šis atstumas gali b ūti kitoks, 
atsižvelgiant į purkštuvo ir jo turinio sl ėgį. Reikia imtis atsargumo 
priemonių, kad akis neb ūtų pažeista d ėl purškimo sl ėgio. Atitinka ­
mais atvejais gali tekti įvertinti mechaninio akies pažeidimo srauto 
jėga galimyb ę. 
Aerozolio dozei įvertinti galima modeliuoti š į įpurškimo bandym ą: 
medžiaga purškiama ant pasverto popieriaus lapo per triušio akies 
dydžio ang ą, esančią tiesiai prieš popieriaus lap ą. Pagal popieriaus 
masės padidėjimą nustatomas apytikris į akį įpurškiamas medžiagos 
kiekis. Laki ųjų medžiag ų dozė gali būti įvertinta pasveriant ind ą, į 
kurį surenkama medžiaga, prieš medžiagos naudojim ą ir po jo.  
1.4.2.4.  Pradinis bandymas (in vivo akies dirginimo ar ėsdinimo bandymas 
su vienu gyv ūnu) 
Kaip aiškiai nurodyta nuosekli ųjų bandymų strategijos aprašyme (žr. 
1 priedėlį), labai rekomenduojama  in vivo  bandymą iš pradži ų daryti 
su vienu gyv ūnu. 
Jei šio bandymo rezultatai rodo, kad taikant aprašyt ąją metodik ą 
medžiaga yra ak į ėsdinanti arba labai j ą dirginanti, kiti akies dirgi ­
nimo bandymai neturi b ūti daromi.  
1.4.2.5.  Vietinis nuskausminimas  
Galima naudoti vietinio nuskausminimo priemones atsižvelgiant į 
kiekvieną atskirą atvejį. Jei duomen ų įrodomosios vert ės analizė 
rodo, kad medžiaga gali sukelti skausm ą arba pradinis bandymas 
rodo skausming ą gyvūno reakcij ą, prieš įlašinant bandom ąją 
medžiagą galima naudoti vietinio nuskausminimo priemon ę. Reikia 
kruopščiai parinkti vietinio nuskausminimo priemon ės tipą, koncent ­
raciją ir dozę, siekiant užtikrinti, kad d ėl jos naudojimo neb ūtų reak­
cijos į bandomosios medžiagos poveik į skirtumų. Kontrolin ė akis 
taip pat nuskausminama.  
1.4.2.6.  Patvirtinamasis bandymas (in vivo akies dirginimo bandymas su 
papildomais gyv ūnais)  
Jei darant pradin į bandymą ėsdinančio poveikio nepastebima, dirgi ­
nantis poveikis arba neigiama reakcija turi b ūti patvirtinta naudojant 
ne daugiau kaip du papildomus gyv ūnus. Jei darant pradin į bandymą 
pastebimas labai didelis dirginantis poveikis, rodantis, kad darant 
patvirtinam ąjį bandym ą gali būti sukeltas stiprus (neišnykstantis) 
poveikis, š į bandymą rekomenduojama daryti nuosekliai – gyv ūnus 
naudoti po vien ą paeiliui, o ne abu iš karto. Jei antrajam gyv ūnui 
pasireiškia ėsdinamasis arba sunkus dirginamasis poveikis, bandymas 
nutraukiamas. Silpnam arba vidutinio dydžio dirginamajam poveikiui 
patvirtinti gali b ūti reikalingi papildomi gyv ūnai. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7.  Steb ėjimo laikotarpis  
Stebėjimo laikotarpio trukm ė turi būti pakankama, kad b ūtų visiškai 
įvertintas stebimo poveikio dydis ir gr įžtamumas. Ta čiau bandymas 
turi būti baigtas bet kuriuo momentu, kai tik gyv ūnui pasireiškia 
ilgalaikiai didelio skausmo arba kan čios požymiai (9). Siekiant 
nustatyti poveikio gr įžtamumą gyvūnai paprastai stebimi 21 par ą 
po bandomosios medžiagos davimo. Jei pastebima, kad poveikis pradeda nykti anks čiau nei baigiantis 21 parai, bandymas nutrau ­
kiamas tuo momentu.
 
1.4.2.7.1. K l i n i k i n i a i s t e b ė j i m a i i r a k i ų r e a k c i j o s į v e r t i ­
n i m a s b a l a i s  
Akys tiriamos pra ėjus 1, 24, 48, ir 72 h po bandomosios medžiagos 
įdėjimo. Gyv ūnai bandomi ne ilgiau, nei b ūtina galutinei informacijai 
gauti. Gyv ūnai, kuriems pasireiškia ilgalaikis didelis skausmas arba 
kančia, turi būti iš karto humaniškai numarinami, o medžiaga atitin ­
kamai įvertinta. Turi b ūti humaniškai numarinami gyv ūnai, kuriems 
po įlašinimo atsiranda šie pažeidimai: ragenos prad ūrimas arba 
didelės ragenos opos, įskaitant stafilom ą; kraujo atsiradimas prieki ­
nėje akies kameroje; 4 bal ų ragenos drumstumas, kuris nepraeina po 
48 h; šviesos reflekso nebuvimas (2 bal ų rainelės reakcija) ilgiau 
kaip 72 h; jungin ės membranos opos; jungin ės arba niktitacin ės 
membranos nekroz ė, arba nekrozinio audinio lupimasis. Numarinti 
reikia tod ėl, kad tokie pažeidimai paprastai yra negr įžtami.  
Gyvūnams, kuri ų akių pažeidim ų nepastebima, bandymas baigiamas 
ne anksčiau kaip po trij ų dienų po įlašinimo. Gyv ūnai su nedideliais 
ir vidutiniais pažeidimais turi b ūti stebimi tol, kol pažeidimai 
pranyksta, arba 21 par ą, o po to bandymas baigiamas. Apži ūrėti 
reikia po 7, 14 ir 21 paros, kad b ūtų galima nustatyti pažeidim ų 
tipą ir jų grįžtamumą arba negr įžtamumą. 
Kiekvienos apži ūros metu užrašomi aki ų (junginės, ragenos ir 
rainelės) pažeidimai balais (1 lentel ė). Be to, nurodomi visi kiti 
akies pažeidimai (pvz., panuso, d ėmių atsiradimas) arba neigiamas 
somatinis poveikis.  
Kad būtų lengviau tikrinti reakcij ą galima naudoti binokulin ę lupą, 
rankinę plyšinę lempą, biologin į mikroskop ą arba kitok į tinkamą 
įtaisą. Užrašius steb ėjimus po 24 h, akys gali b ūti dar ištiriamos 
naudojant fluorescein ą. 
Akių reakcijos įvertinimas balais neišvengiamai yra subjektyvus. 
Siekiant labiau suderinti aki ų reakcijos įvertinimą balais ir pad ėti 
bandymo laboratorijoms ir visiems, kurie vykdo ir aiškina steb ė­
jimus, juos vykdantis personalas turi b ūti atitinkamai mokomas 
taikyti įvertinimo balais sistem ą. 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS  
Akių dirginimo rezultatai įvertinami pagal pažeidim ų tipą ir sunkum ą 
bei atsižvelgiant į grįžtamumą arba į jo nebuvim ą. Atskiri rezultatai 
nėra medžiagos dirginam ųjų savybių absoliutusis įvertis, kadangi dar 
įvertinamas kitas bandomosios medžiagos poveikis. Į šiuos atskirus 
rezultatus reik ėtų žiūrėti kaip į atskaitos vertes, kurios įgauna 
prasmę, kai yra patvirtinamos išsamiais vis ų kitų stebėjimų aprašy­
mais ir įvertinimais.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
In vivo  bandymo pagrindimas: jau turim ų bandymų duomenų įrodo­
mosios vert ės analizė, įskaitant nuosekli ųjų bandym ų strategijos 
taikymo rezultatus:  
— ankstesni ų bandymų atitinkam ų duomenų aprašymas,  
— duomenys, gauti kiekvienoje bandym ų strategijos stadijoje,  
— darytų in vitro  bandymų aprašymas, įskaitant išsami ą informacij ą 
apie proced ūras, rezultatus, gautus tiriant bandom ąją ar etalonin ę 
medžiagas,  
— daryto  in vivo  odos dirginimo ar ėsdinimo bandymo aprašymas, 
įskaitant gautus rezultatus,  
— duomen ų įrodomosios vert ės analizė, kuria pagrindžiamas  in vivo  
bandymas.  
Bandomoji medžiaga:  
— tapatumas (pvz., CAS numeris, šaltinis, grynumas, žinomos prie ­
maišos, siuntos numeris),  
— fizikin ė būsena ir fizikin ės ir chemin ės savybės (pvz., pH, 
lakumas, tirpumas, stabilumas, reagavimas su vandeniu),  
— sudėtis ir komponent ų procentin ė dalis, jei tai mišinys,  
— jei naudojama vietinio nuskausminimo priemon ė: jos tapatumas, 
grynumas, tipas, doz ė ir galima s ąveika su bandom ąja medžiaga.  
Nešiklis:  
— tapatumas, koncentracija (jei tinka), naudojamas t ūris, 
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ar veisl ė, kitų nei baltųjų triušių naudojimo pagrin ­
dimas,  
— kiekvieno gyv ūno amžius bandymo pradžioje,  
— kiekvienos lyties gyv ūnų skaičius bandymo ir kontrolin ėje (jei 
reikia) grup ėje, 
— atskirų gyvūnų masė bandymo pradžioje ir pabaigoje,  
— gyvūnų šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir kt.  
Rezultatai:  
— metodo, taikyto dirginimui kiekvienu steb ėjimo momentu įver­
tinti balais (pvz., rankin ė plyšinė lempa, biologinis mikroskopas, 
fluoresceinas), aprašymas,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— kiekvieno gyv ūno dirginimo ar ėsdinimo reakcijos duomen ų, 
gautų kiekvienu steb ėjimo momentu iki gyv ūno pašalinimo iš 
bandymo, lenteli ų sudarymas,  
— pasteb ėto dirginimo arba ėsdinimo pob ūdžio ir laipsnio pasako ­
jamasis aprašymas,  
— visų kitų akies pažeidim ų aprašymas (pvz., vaskuliarizacija, 
panuso susidarymas, s ąaugų, dėmių atsiradimas),  
— bet kokio ne akims daromo neigiamo vietinio ir somatinio 
poveikio aprašymas, visi histopatologinio tyrimo rezultatai, jei 
yra. 
Rezultatų aptarimas.  
3.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Akių dirginimo rezultatus, gautus tiriant laboratorinius gyv ūnus, 
ekstrapoliuoti žmon ėms galima tik tam tikru mastu. Daugeliu atvej ų 
baltieji triušiai yra jautresni akis dirginan čioms arba ėsdinančioms 
medžiagoms nei žmon ės. 
Reikia stengtis į rezultatų aiškinim ą neįtraukti antrin ės infekcijos 
sukelto dirginimo.  
4. NUORODOS  
1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, h.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410–429.
 
2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C, Dossou, K.G, Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, h., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159–164.
 
3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, p. 161–177  
4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, p. 19–26.
 
5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, p. 227–231.  
6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, h.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by 
the Management Team. Toxicology in Vitro 12, p. 483–524.
 
6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.  
7) Testing method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.  
8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicol ogical Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 
(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6. 
htm).
 
10) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assess ­
ment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Expe ­
rimental Animals Used in SAFEty Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and SAFEty Publications. Series on Testing and 
Assessment No. 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
1 lentelė 
Akių pažeidimo vertinimo balais skal ė 
Ragena  
Drumstis: tankumo laipsnis (duomenys imami iš tankiausios srities) (*) 
Opėjimo arba drumsties n ėra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  0  
Išsibarsčiusios arba išsklaidytos drumsties sritys (išskyrus nedidel į norma­
laus blizgesio sumaž ėjimą), rainelės elementai aiškiai matomi . . . . . . . . .  1  
Lengvai įžiūrima pusskaidr ė sritis, rainel ės elementai šiek 
tiek dulsvi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . 2  
Perlamutrin ės sritys, rainel ės elementai nematomi, vyzdžio dydis vos 
įžiūrimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  3  
Ragena matin ė, dėl drumsties rainel ės nesimato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  4  
Didžiausias įmanomas balas: 4  
PASTABOS  
(*) Turi b ūti nurodyta ragenos drumsties sritis.  
Rainelė 
Normali. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0  
Labai pagil ėjusios raukšl ės, kongestija, pabrinkimas, vidutiniška 
junginės apie ragen ą hiperemija; arba injekcija; rainel ė vis dar reaguoja 
į šviesą (vangi reakcija laikoma poveikiu) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  1  
Kraujavimas, stiprus suardymas arba n ėra reakcijos į šviesą . . . . . . . . . .  2  
Didžiausias įmanomas balas: 2  
Junginė 
Raudonumas (taikoma voko ir obuolio junginei, išskyrus ragen ą ir rainelę) 
Normali. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0  
Kai kurie kraujo indai hiperemiški ( įšvirkšta) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  1  
Išsklaidyta, tamsiai raudonos spalvos, atskiri indai sunkiai įžiūrimi. . . .  2  
Išsklaidyta, jautienos raudonumo spalvos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  3  
Didžiausias įmanomas balas: 3  
Chemozė 
Paburkimas (taikoma vokams ir (arba) niktitacin ėms membranoms) 
Paburkimo n ėra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  0  
Nedidelis paburkimas, didesnis nei normalus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  1  
Akivaizdus paburkimas, vokai iš dalies išvirsta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  2  
Paburkimas, pusiau užmerkti vokai . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  3  
Paburkimas, vokai užmerkti daugiau nei per pus ę . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  4  
Didžiausias įmanomas balas: 4  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
PRIEDĖLIS 
Nuosekliųjų bandym ų strategija aki ų dirginimui ir ėsdinimui nustatyti  
BENDRIEJI KLAUSIMAI  
Siekiant gauti išsami ų mokslini ų rezultatų ir rūpinantis gyv ūnų gerove, svarbu be 
reikalo nenaudoti gyv ūnų ir, kiek įmanoma, mažinti visus bandymus, kurie gyv ū­
nams gali iššaukti sunkias reakcijas. Prieš sprendžiant, ar daryti  in vivo  
bandymus, tur ėtų būti įvertinta visa informacija apie medžiagos galim ą ėsdina­
mąjį ar dirginam ąjį poveikį odai. Jei jau yra pakankamai duomen ų galimam 
bandomosios medžiagos ėsdinamajam arba dirginamajam poveikiui odai klasifi ­
kuoti, nereikia bandym ų su laboratoriniais gyv ūnais Taigi taikant duomen ų įrodo­
mosios vert ės analizę ir nuosekli ųjų bandymų strategiją sumažėja būtinybė daryti  
in vivo  bandymus, ypa č jei tikėtina, kad medžiaga gali iššaukti sunkias reakcijas.  
Turimai informacijai apie medžiag ų dirginam ąjį ir ėsdinamąjį poveikį akims įver­
tinti rekomenduojama taikyti duomen ų įrodomosios vert ės analizę, kuri leist ų 
spręsti, ar tokio poveikio galimybei apib ūdinti reikia daryti papildomus tyrimus, 
išskyrus  in vivo  akių bandymus. Jei reikia papildom ų tyrimų, atitinkamiems ekspe ­
rimentiniams duomenims gauti rekomenduojama taikyti nuosekli ųjų bandymų stra­
tegiją. Norint gauti duomen ų apie nebandytas medžiagas, reikaling ų jų ėsdina­
majam ar dirginamajam poveikiui odai įvertinti, reik ėtų taikyti nuosekli ųjų 
bandymų strategij ą. Šiame priede aprašyta bandym ų strategija buvo parengta 
OECD seminare (1). V ėliau ji buvo patvirtinta bei išpl ėsta kaip integruota darnioji 
pavojų dėl chemini ų medžiagų poveikio žmoni ų sveikatai ir aplinkai klasifikavimo 
sistema, 1998 m. lapkri čio mėn. priimta 28-ajame jungtiniame chemini ų medžiagų 
komiteto ir chemini ų medžiagų darbo grup ės posėdyje (2).  
Nors ši nuosekli ųjų bandymų strategija n ėra sudėtinė B.5 bandymo metodo dalis, 
ji apibūdina rekomenduojam ą būdą akių dirginimo ar ėsdinimo charakteristikoms 
nustatyti. Šis b ūdas atitinka geriausi ą praktiką ir yra aki ų dirginimo ar ėsdinimo  
in vivo  bandymų etikos etalonas. Bandymo metode pateikiamos  in vivo  bandymų 
rekomendacijos ir apibendrinami veiksniai, į kuriuos reik ėtų atkreipti d ėmesį 
prieš pradedant tok į bandym ą. Nuosekli ųjų bandym ų strategijoje si ūlomas 
duomenų įrodomosios vert ės analizės būdas, kuris leist ų įvertinti turimus 
duomenis apie bandom ųjų medžiag ų akių dirginimo ar ėsdinimo savybes, kad 
būtų galima nuosekliai gauti reikiam ų duomenų apie medžiagas, kurioms reika ­
lingi papildomi tyrimai arba kurios nebuvo tirtos. Strategijoje nurodoma iš 
pradžių daryti įteisintus ir priimtus  in vitro  arba  ex vivo  bandymus ir tik po to 
naudoti odos ėsdinimo ar dirginimo bandymo metod ą B.4 konkre čiomis aplinky ­
bėmis (3) (4).  
ĮVERTINIMO IR BANDYMO STRATEGIJOS APRAŠYMAS  
Siekiant nustatyti  in vivo  akių bandymų reikalingum ą, prieš darant bandymus, 
kurie būtų nuosekliųjų bandymų strategijos dalis (schema), įvertinama visa turima 
informacija. Nors reikšmingos informacijos galima b ūtų gauti vertinant atskirus 
parametrus (pvz., pH ribines vertes), tur ėtų būti nagrinėjama turimos informacijos 
visuma. Sprendimui priimti tur ėtų būti daroma vis ų atitinkam ų duomen ų apie 
konkrečios medžiagos arba jos strukt ūrinių analogų poveikį įrodomosios vert ės 
analizė, kuri pagr įstų priimamą sprendim ą. Didžiausias d ėmesys tur ėtų būti krei­
piamas į duomenis apie medžiag ą, gautus tiriant žmones ir gyv ūnus, o vėliau tirti  
in vitro  arba  ex vivo  bandym ų duomenis. Ėsdinančiųjų medžiag ų in vivo  
bandymų reikėtų kiek įmanoma vengti. Toliau pateikiami bandym ų strategijos 
veiksniai.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Turimų duomenų apie poveik į žmonėms ir gyv ūnams, įvertinimas  (1 pakopa ). Iš 
pradžių nagrinėjami tiriant žmones gauti duomenys, pvz., klinikiniai arba profe ­
sinių susirgim ų tyrimai ir byl ų ataskaitos, ir (arba) aki ų tyrimų su gyvūnais 
duomenys, kadangi jie suteikia informacijos, tiesiogiai susijusios su poveikiu akims. Toliau įvertinami turimi odos ėsdinimo ar dirginimo duomenys, gauti 
darant tyrimus su žmon ėmis ir (arba) gyv ūnais. Medžiagos, kurios yra žinomos 
kaip ėsdinančios arba labai dirginan čios akis, netur ėtų būti lašinamos į gyvūnų 
akis, be to, nereik ėtų lašinti medžiag ų, kurios ėsdina arba dirgina od ą; tokios 
medžiagos laikomos ėsdinančiomis ir (arba) dirginan čiomis akis. Medžiagos, apie 
kurias yra pakankamai duomen ų, kad jos n ėra ėsdinančios arba dirginan čios, 
atsižvelgiant į ankstesnius aki ų tyrimus, irgi netur ėt
ų būti bandomos darant  in 
vivo akių tyrimus.  
Struktūros ir aktyvumo ryši ų (SAR) analiz ė (2 pakopa) . Analizuojami gimining ą 
struktūrą turinčių medžiag ų bandymo rezultatai, jei tokie b ūtų. Kai pakanka 
duomenų apie giminingos strukt ūros medžiag ų arba toki ų medžiag ų mišinių 
poveikį žmonėms ir gyv ūnams, kad b ūtų galima įrodyti medžiag ų gebą ėsdinti 
ar jautrinti akis, galima daryti prielaid ą kad įvertinimui pateiktos bandomosios 
medžiagos poveikis bus toks pats. Tokiais atvejais bandomosios medžiagos neb ū­
tina bandyti. Pagal nuosekli ųjų bandymų strategiją neigiami duomenys apie gimi ­
ningos strukt ūros medžiag ų arba toki ų medžiag ų mišinių poveikį žmonėms ar 
gyvūnams nėra pakankamas įrodymas, kad medžiaga n ėra ėsdinanti ar jautrinanti. 
Medžiagų geba ėsdinti ir dirginti od ą bei akis turi b ūti nustatoma taikant įtei­
sintus ir priimtus SAR metodus.  
Fizikinės ir chemin ės savybės ir cheminis reaktyvumas (3 pakopa) . Medžiagos, 
turinčios ribines pH vertes, pvz., ≤ 2,0 arba ≥ 11,5, gali tur ėti didelį vietinį 
poveikį. Jei ribin ė pH vertė yra pagrindin ė savybė, pagal kuria medžiaga identi ­
fikuojama kaip akis ėsdinanti medžiaga, galima atsižvelgti į rūgšties ar šarmo 
atsargą (arba buferin ę talpą) (5)(6). Jei buferin ė talpa leidžia daryti prielaid ą, kad 
medžiaga  gali  nebūti akis ėsdinanti medžiag ą tai turi b ūti patvirtinta darant 
papildomus bandymus ir geriau b ūtų taikyti įteisintą ir priimt ą in vitro  arba  ex 
vivo bandymą (žr. 5 ir 6 pakopas).  
Kitos turimos informacijos nagrin ėjimas (4 pakopa) . Šioje stadijoje įvertinama 
visa turima informacija apie sistemin į toksiškum ą per odą. Nagrinėjamas ūmus 
bandomosios medžiagos toksiškumas per od ą. Jei buvo įrodyta, kad bandomoji 
medžiaga yra labai toksiška per od ą, nebūtina bandyti jos poveikio akims. Nors 
nebūtinai turi b ūti ryšys tarp ūmaus toksiškumo per od ą ir akių dirginimo ar 
ėsdinimo, galima daryti prielaid ą, kad medžiagai esant labai toksiškai per od ą, ji 
taip pat bus labai toksiška jos įlašinus į akis. Be to, tokie duomenys gali b ūti 
nagrinėjami tarp 2 ir 3 pakop ų. 
In vitro arba ex vivo bandym ų rezultatai  (5 ir 6 pakopos ). Medžiag ų, kurios 
pasirodė ėsdinančios arba labai dirginan čios darant patvirtinto tinkamumo ir 
priimtą in vitro  arba  ex vivo  bandymą (7)(8), skirt ą šiam konkre čiam poveikiui 
akims arba odai įvertinti, nereikia bandyti su gyv ūnais. Galima padaryti prielaid ą 
kad tokios medžiagos tur ės panašų sunkų poveikį in vivo . Jei įteisintų ir priimt ų 
in vitro  ar ex vivo  bandym ų nėra, 5 ir 6 pakopos praleidžiamos ir iš karto 
pereinama prie 7 pakopos.  
Medžiagos dirginamojo arba ėsdinamojo poveikio odai įvertinimas in vivo  (7 
pakopa ). Jei pirmiau išvardyt ų tyrimų duomenų nepakanka, norint atlikti įtiki­
namą duomenų įrodomosios vert ės analizę apie medžiagos geb ą dirginti ar ėsdinti 
akis, iš pradži ų įvertinama  in vivo  medžiagos geba dirginti ar ėsdinti odą, taikant 
bandymo metod ą B.4 (4) ir jo pried ą (9). Jei įrodoma, kad medžiaga ėsdina arba 
labai dirgina od ą, ji laikoma akis ėsdinančia ir dirginan čia medžiaga, jei kita 
informacija nepatvirtina priešingos išvados. Taigi  in vivo  akių bandymo daryti 
nereikėtų. Jei medžiaga n ėra ėsdinanti arba labai dirginanti od ą, turėtų būti 
daromas  in vivo  akių bandymas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
Bandymas su triušiais in vivo (8 ir 9 pakopos). In vivo  akių bandymą reikėtų 
pradėti darant pradin į bandymą su vienu gyv ūnu. Jei šio bandymo rezultatai rodo, 
kad medžiaga yra labai dirginanti arba ėsdinanti akis, toliau bandyti nereikia. Jei 
darant pradin į bandymą ėsdinimo arba sunkus dirginantis poveikis nepastebimas, 
daromas patvirtinamasis bandymas, naudojant du papildomus gyv ūnus. 
NUORODOS  
1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria 
for Alternative Toxicol ogical Test Methods. Held in Solna, Sweden, 
22–24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28t Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).
 
3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, p. 161–177.  
4) Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion.  
5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro , 2, p. 19–26.  
6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 
p. 227–231.  
7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 
p. 483–524.
 
8) Testing Method B.40 Skin Corrosion.  
9) Annex to Testing method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin Irri ­
tation and Corrosion.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Schema  
AKIŲ DIRGINIMO AR ĖSDINIMO BANDYMO IR ĮVERTINIMO STRATEGIJA
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. ODOS JAUTRINIMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Pastabos  
Bandymų tikslumas ir geb ėjimas jais aptikti potencialius žmogaus 
odos alergenus laikomi svarbiais klasifikuojant visuomen ės sveikatai 
reikšming ą toksiškum ą. 
Nėra vieno bandym ų metodo, kuriuo b ūtų galima tinkamai nustatyti 
visas odą jautrinti galin čias medžiagas ir kuris tikt ų visoms medžia ­
goms tirti.  
Pasirenkant bandym ą, reikia atsižvelgti į medžiagos fizikines 
savybes, įskaitant jos geb ėjimą prasiskverbti per od ą. 
Naudojant j ūrų kiaulytes sukurti dviej ų tipų bandymai: adjuvantiniai 
bandymai, kuriais alergin ės reakcijos sustiprinamos bandom ąją 
medžiagą ištirpinant (ar padarant suspensij ą) Freundo pilname 
adjuvante (FPA), ir neadjuvantiniai bandymai.  
Tikėtina, kad adjuvantiniais bandymais tiksliau nustatomos žmogaus 
odą jautrinti galin čios medžiagos negu tais bandymais, kuriems 
nenaudojamas Freundo pilnas adjuvantas. Tod ėl šiems bandymams 
teikiama pirmenyb ė. 
Jūrų kiaulytės maksimizacijos bandymas (JKMB) yra pla čiai naudo ­
jamas adjuvantinis bandymas. Nors medžiagos geb ėjimui sukelti 
odos jautrinimo reakcij ą nustatyti gali b ūti naudojami ir kiti metodai, 
JKMB laikomas tinkamiausiu adjuvantiniu bandymu.  
Manoma, kad neadjuvantiniai bandymai (pla čiausiai naudojamas  
Buehlerio  bandymas) daugelio medžiag ų klasių atžvilgiu yra mažiau 
tikslus.  
Kartais gali b ūti svarių priežasčių rinktis  Buehlerio  bandymo metod ą, 
pagal kur į naudojamos antodin ės aplikacijos, o ne įodinės injekcijos, 
kaip yra j ūrų kiaulytės maksimizacijos bandymo atveju. Jei naudo ­
jamas  Buehlerio  bandymas, tai reik ėtų moksliškai pagr įsti. 
Šiame metode aprašyti j ūrų kiaulyt ės maksimizacijos 
bandymas (JKMB) ir  Buehlerio  bandymas. Moksliškai pagrindus, 
galima naudoti ir kitus standartizuotus metodus.  
Jei atlikus pripažint ą atrankos bandym ą gaunamas teigiamas rezul ­
tatas, bandomoji medžiaga gali b ūti apibūdinama kaip potencialus 
alergenas, ir tolesnio j ūrų kiaulytės bandymo gali nereik ėti. Tačiau 
jei atlikus tok į bandym ą gaunamas neigiamas rezultatas, turi b ūti 
atliktas jūrų kiaulytės bandymas, remiantis šiame metode aprašyta 
procedūra. 
Taip pat ži ūrėkite Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Odos jautrinimas  (alerginis kontaktinis dermatitas) – imunin ės 
kilmės odos reakcija į medžiag ą. Žmonėms atsakas gali pasireikšti 
odos niež ėjimu, eritema, edema spuogeliais, p ūslėmis, pūslelėmis ar 
jų deriniu. Gyv ūnų odos reakcijos gali skirtis ir gali pasireikšti tik 
paraudimu ir patinimu.  
Indukcinis poveikis  – eksperimentinis organizmo veikimas bando ­
mąja medžiaga, siekiant sukelti organizmo padid ėjusio jautrumo 
būklę. 
Indukcinis laikotarpis  – bent vienos savait ės laikotarpis po induk ­
cinio poveikio, kurio metu gali išsivystyti organizmo padid ėjusio 
jautrumo b ūklė. 
Provokacinis poveikis  – pakartotinis organizmo veikimas bandom ąja 
medžiaga po indukcinio laikotarpio, siekiant nustatyti, ar organizmo 
reakcija yra jautresn ė. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Bandymams naudojamos įrangos jautrumas ir patikimumas turi b ūti 
įvertinamas kas šešis m ėnesius naudojant žinomas medžiagas, suke ­
liančias silpną arba vidutinio stiprumo odos jautrinimo poveik į. 
Tinkamai atlikus bandym ą su silpna arba vidutinio stiprumo jautri ­
nančia medžiaga (sensibilizatoriumi), reik ėtų tikėtis, kad reakcija 
pasireikš bent 30 % gyv ūnų adjuvantinio bandymo atveju ir bent 
15 % gyv ūnų neadjuvantinio bandymo atveju.  
Pirmenyb ė teikiama šioms medžiagoms:  
CAS Nr.  Einecs Nr.  Einecs pavadinimas  Įprastas pavadinimas  
101–86–0  202–983–3  cinamono r ūgšties 
heksialdehidas  cinamono r ūgšties 
heksialdehidas  
149–30–4  205–736–8  benztiazol-2-tiolis (2- 
merkaptobenztiazolas)  kaptaksas  
94–09–7  202–303–5  benzokainas  norkainas  
Gali būti aplinkybi ų, kai tinkamai pagrindus galima naudoti kitas 
kontrolines medžiagas.  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Iš pradžių bandomieji gyv ūnai paveikiami bandomosios medžiagos 
įodinėmis injekcijomis ir (arba) antodin ėmis aplikacijomis (induk ­
cinis poveikis). Pra ėjus 10–14 dien ų poilsio laikotarpiui (indukci ­
niam laikotarpiui), kurio metu gali pasireikšti imuninis atsakas, gyvūnai paveikiami provokacine doze. Bandom ųjų gyvūnų odos 
reakcijos į provokacin į poveikį apimtis ir laipsnis yra lyginami su 
kontrolini ų gyvūnų, kurie patyr ė imitacin į (nejautrinan čios 
medžiagos) indukcijos ir provokacijos veikim ą.
 
1.5. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Jeigu bandom ąją medžiagą būtina nuplauti, reikia naudoti vanden į ar 
tinkamą tirpiklį, kad nepakist ų gauta reakcija ar neb ūtų pažeistas 
odos vientisumas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Jūrų kiaulytės maksimizacijos bandymas (JKMB)  
1.5.1.1.  P a s i r u o š i m a s  
Sveikos jaunos suaugusios baltosios (albinos ės) jūrų kiaulytės 
mažiausiai 5 dienas prieš bandym ą aklimatizuojamos laboratorijos 
sąlygomis. Gyv ūnai prieš bandym ą atsitiktin ės atrankos b ūdu 
paskirstomi į bandymo grupes. Kailis gali b ūti pašalinamas žirkl ėmis, 
nuskutant ar chemine depiliacija, atsižvelgiant į bandymo metod ą. 
Reikia stengtis nesubraižyti odos. Gyv ūnai pasveriami prieš 
bandymo pradži ą ir jo pabaigoje.  
1.5.1.2.  B a n d y m o s ą l y g o s  
1.5.1.2.1. B a n d o m i e j i g y v ū n a i 
Naudojamos įprastinės laboratorin ės baltųjų jūrų kiaulyčių veislės. 
1.5.1.2.2.  S k a i č i u s i r l y t i s  
Gali būti naudojami patinai ir (arba) patel ės. Patelės turi būti netu­
rėjusios palikuoni ų ir neapvaisintos.  
Bandomojoje grup ėje turi būti mažiausiai 10 gyv ūnų, o kontrolin ėje 
mažiausiai 5. Jeigu ištirta mažiau negu 20 bandom ųjų ir 10 kontro ­
linių jūrų kiaulyčių ir neįmanoma nustatyti, ar bandomoji medžiaga 
yra odą jautrinanti medžiaga, primygtinai rekomenduojama ištirti 
daugiau gyv ūnų, kad iš viso susidaryt ų 20 bandom ųjų ir 10 kontro ­
linių gyvūnų. 
1.5.1.2.3. D o z ė s 
Kiekvienam indukciniam poveikiui sukelti naudojama gerai orga ­
nizmo toleruojama didžiausia bandomosios medžiagos koncentracija, sukelianti nuo silpno iki vidutinio stiprumo odos sudirginim ą. Provo­
kaciniam poveikiui naudojama didžiausia odos nedirginanti bando ­
mosios medžiagos koncentracija. Jeigu b ūtina, tinkamos koncentra ­
cijos nustatomos atliekant parengtin į bandym ą su dviem ar trim 
gyvūnais, jei n ėra kitos informacijos. Šiam tikslui galima b ūtų 
panaudoti ir FPA paveiktus gyv ūnus.
 
1.5.1.3.  B a n d y m o e i g a  
1.5.1.3.1. I n d u k c i j a  
0 diena – bandomoji grup ė 
Menčių srityje, nuo kurios pašalintas kailis, atliekamos 0,1 ml t ūrio 
trys poros įodinių injekcijų taip, kad kiekvienos poros viena injekcija 
būtų kitoje nugaros vidurio pus ėje. 
1 injekcija: FPA/vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1 
(v/v)  
2 injekcija: bandomosios medžiagos, ištirpintos tinkamame tirpiklyje, 
pasirinkta koncentracija  
3 injekcija: bandomosios medžiagos pasirinkta koncentracija, paga ­
minta panaudojant mišin į FPA/vanduo ar fiziologinis tirpalas 
santykiu 1:1 (v/v).  
Ruošiant 3 injekcij ą, vandenyje tirpios medžiagos tirpinamos vande ­
nyje, po to maišomos su FPA. Kai medžiagos tirpios riebaluose ir netirpios, pirmiausia padaroma suspensija su FPA, po to įpilama 
vandens. Bandomosios medžiagos galutin ė koncentracija turi b ūti 
tokia pati, kaip ir antrojoje injekcijoje.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
1 ir 2 injekcijos suleidžiamos ar čiau galvos viena šalia kitos, tuo 
tarpu 3 injekcija suleidžiama ar čiau uodegos esan čiame bandoma ­
jame plote.  
0 diena – kontrolin ė grupė 
Tose pat vietose kaip ir bandomiesiems gyv ūnams atliekamos 0,1 ml 
tūrio trys poros įodinių injekcijų. 
1 injekcija: FPA/vandens ar fiziologinio tirpalo mišinys santykiu 1:1 
(v/v)  
2 injekcija: neskiestas nešiklis  
3 injekcija: nešiklio 50 % tirpalas (v/v), pagamintas panaudojant 
mišinį – FPA/vanduo ar fiziologinis tirpalas santykiu 1:1 (v/v).  
5–7 diena – bandomoji ir kontrolin ės grupės 
Jeigu bandomoji medžiaga nedirgina odos, apytikriai 24 valandas 
prieš antodines indukcines aplikacijas, nuo t ų bandom ųjų odos 
plotelių nukirpus ir (ar) nuskutus kail į, tepamas 0,5 ml 10 % natrio 
laurilo sulfato tirpalas vazeline (siekiant sukelti vietin į dirginim ą). 
6–8 diena – bandomoji grup ė 
Nuo bandomojo ploto v ėl pašalinamas kailis. Filtravimo popierius (2 
× 4 cm) sudr ėkinamas bandomojoje medžiagoje, ištirpintoje tinka ­
mame nešiklyje, uždedamas ant bandomojo ploto ir fiksuojamas 
okliuzine (nepralaidžia) tvarstom ąja medžiaga 48 valandoms. 
Nešiklio pasirinkim ą reikia pagr įsti. Kietosios medžiagos yra susmul ­
kinamos į miltelius ir išmaišomos nešiklyje. Skys čiai gali būti naudo­
jami neskiesti, jei tinkama.  
6–8 diena – kontrolin ė grupė 
Nuo bandomojo ploto v ėl pašalinamas kailis. Viskas atliekama tai 
pat kaip ir bandomojoje grup ėje, vietoj bandomosios medžiagos 
naudojant nešikl į; vėliau viskas fiksuojama okliuzine (nepralaidžia) 
tvarstomąja medžiaga 48 valandoms.  
1.5.1.3.2. P r o v o k a c i j a  
20–22 diena – bandomoji ir kontrolin ė grupės 
Nuo bandom ųjų ir kontrolini ų gyvūnų šonų pašalinamas kailis. 
Bandomąja medžiaga sudr ėkintas tamponas arba gaubtelis, užde ­
damas ant vieno gyv ūnų šono. Jeigu reikia, ant kito šono uždedamas 
nešikliu sudr ėkintas tamponas. Tamponas arba gaubtelis fiksuojami 
nepralaidžiu tvars čiu 24 valandoms.  
1.5.1.3.3. S t e b ė j i m a s i r v e r t i n i m a s : b a n d o m o j i i r k o n t r o ­
l i n ė g r u p ė s 
— praėjus maždaug 21 valandai po tampono nu ėmimo, provokacinis 
plotas nuvalomas, trumpai nukerpamas ir (arba) nuskutamas, o jeigu būtina, depiliuojamas,
 
— maždaug po 3 valand ų (praėjus maždaug 48 valandoms nuo 
provokacijos pradžios) apži ūrima odos reakcija ir įvertinama 
balais taip, kaip paaiškinta pried ėlyje, 
— praėjus maždaug 24 valandoms po šio apži ūrėjimo, odos reakcija 
apžiūrima antrą kartą (72 valandos) ir dar kart ą įvertinama balais.  
Skatinama apži ūrėti bandomuosius ir kontrolinius gyv ūnus aklos 
atrankos b ūdu. 
Jeigu reikia išsiaiškinti per pirm ąją provokacij ą pastebėtus rezultatus, 
praėjus maždaug vienai savaitei svarstytinas antros provokacijos (t. 
y. reprovokacija) atlikimas, jei reikia, su nauja kontroline grupe. 
Reprovokacij ą taip pat galima atlikti su pradine kontroline grupe.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Dėl indukcini ų ir provokacini ų procedūrų kilusios visos odos ir bet 
kokios ne įprastos, taip pat ir somatin ės, reakcijos stebimos ir įverti­
namos pagal Magnussono/Kligmano skal ę (žr. pried ėlį). Kitos proce ­
dūros, pvz., histopatologinis tyrimas, odos raukšl ės storio matavimas, 
gali būti atliekamos siekiant išsiaiškinti neaiškias reakcijas.  
1.5.2.  Buehlerio bandymas  
1.5.2.1.  P a s i r u o š i m a s  
Sveikos jaunos suaugusios baltosios (albinos ės) jūrų kiaulytės 
mažiausiai 5 dienas prieš bandym ą aklimatizuojamos laboratorijos 
sąlygomis. Gyv ūnai prieš bandym ą atsitiktin ės atrankos b ūdu 
paskirstomi į bandymo grupes. Kailis gali b ūti pašalinamas žirkl ėmis, 
nuskutant ar chemine depiliacija, atsižvelgiant į bandymo metod ą. 
Reikia stengtis nesubraižyti odos. Gyv ūnai pasveriami prieš 
bandymo pradži ą ir jo pabaigoje.  
1.5.2.2.  B a n d y m o s ą l y g o s  
1.5.2.2.1. B a n d o m i e j i g y v ū n a i 
Naudojamos įprastinės laboratorin ės baltųjų jūrų kiaulyčių veislės. 
1.5.2.2.2. S k a i č i u s i r l y t i s  
Gali būti naudojami patinai ir (arba) patel ės. Patelės turi būti netu­
rėjusios palikuoni ų ir neapvaisintos.  
Mažiausiai 20 gyv ūnų naudojama bandomojoje ir mažiausiai 10 
gyvūnų kontrolin ėje grupėse. 
1.5.2.2.3. D o z ė s 
Kiekvienam indukciniam poveikiui naudojama didžiausia bandomo ­
sios medžiagos koncentracija, sukelianti silpn ą ne pernelyg didel į 
odos sudirginim ą. Provokaciniam poveikiui naudojama didžiausia 
odos nedirginanti bandomosios medžiagos koncentracija. Jeigu 
būtina, tinkamos koncentracijos nustatomos atliekant parengtin į 
bandymą su dviem ar trim gyv ūnais. 
Vandenyje tirpioms bandomosioms medžiagoms kaip nešiklis naudo ­
jamas vanduo ar atskiesta nedirginanti aktyvioji paviršiaus medžiaga. Kitoms bandomosioms medžiagoms kaip nešiklis indukcijos etape 
naudojamas 80 % etanolis/vanduo, o provokacijos etape – acetonas.
 
1.5.2.3.  B a n d y m o e i g a  
1.5.2.3.1. I n d u k c i j a  
0 diena – bandomoji grup ė 
Nuo vieno gyv ūno šono pašalinamas kailis (trumpai nukerpamas). 
Bandymui naudojamas tamponas turi b ūti prisigėręs bandomosios 
medžiagos, ištirpintos tinkamame nešiklyje (nešiklio pasirinkim ą 
reikia pagr įsti; skystos bandomosios medžiagos gali b ūti neskie­
džiamos, jei tinkama).  
Bandymui naudojamas tamponas (kompresas) pridedamas prie odos 
ir 6 h nepralaidžiu tvars čiu arba gaubteliu ir tinkama tvarstom ąja 
medžiaga laikomas taip, kad liest ųsi su oda.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
Bandymui naudojamas tamponas turi b ūti nepralaidus. Tinka 
maždaug 4–6 cm  2 vatos diskelis ar kvadrat ėlis. Siekiant užtikrinti 
okliuziją, gyvūno judesius geriausia apriboti tinkamomis priemo ­
nėmis. Jei gyv ūnas subintuojamas, gali tekti j į paveikti bandom ąja 
medžiaga papildomai.  
0 diena – kontrolin ė grupė 
Nuo vieno gyv ūno šono pašalinamas kailis (trumpai nukerpamas). 
Viskas atliekama tai pat kaip ir bandomojoje grup ėje, vietoj bando ­
mosios medžiagos naudojant tik nešikl į. Bandymui naudojamas 
tamponas arba gaubtelis fiksuojamas tinkama tvarstom ąja medžiaga 
6 valandoms. Jeigu įrodoma, kad imitacin ė kontrolin ė grupė nebū­
tina, gali b ūti naudojama paprasta kontrolin ė grupė. 
6–8 ir 13–15 diena – bandomoji ir kontrolin ė grupės 
6–8 ir 13–15 dienomis ant to paties šono bandomojo ploto (jei 
būtina, pašalinus kail į) atliekamos tokios pa čios pakartotin ės aplika­
cijos kaip ir 0 dien ą. 
1.5.2.3.2. P r o v o k a c i j a  
27–29 diena – bandomoji ir kontrolin ė grupės 
Nuo netirto bandom ųjų ir kontrolini ų gyvūnų šono pašalinamas 
kailis (trumpai nukerpamas). Ant bandom ųjų ir kontrolini ų gyvūnų 
netirto šono užpakalin ės dalies dedamas nepralaidus tamponas arba 
gaubtelis su reikiamu kiekiu bandomosios medžiagos (didžiausios nedirginan čios koncentracijos).
 
Kada reikia, ant bandom ųjų ir kontrolini ų gyvūnų netirto šono prie ­
kinės dalies taip pat dedamas nepralaidus tamponas arba gaubtelis, 
prisigėręs tik nešiklio. Viskas fiksuojama tinkama tvarstom ąja 
medžiaga 6 valandoms.  
1.5.2.3.3. S t e b ė j i m a s i r v e r t i n i m a s  
— praėjus maždaug 21 valandai po tvars čio nuėmimo, nuo provo ­
kacinio ploto pašalinamas kailis,  
— maždaug po 3 valand ų (praėjus maždaug 30 valand ų nuo provo ­
kacijos pradžios) apži ūrima odos reakcija ir įvertinama balais 
taip, kaip paaiškinta pried ėlyje, 
— praėjus maždaug 24 valandoms po 30 valand ų apžiūrėjimo 
(maždaug 54 valandoms po provokacinio tampono užd ėjimo), 
odos reakcija apži ūrima antr ą kartą ir įvertinama balais.  
Skatinama apži ūrėti bandomuosius ir kontrolinius gyv ūnus aklos 
atrankos b ūdu. 
Jeigu reikia išsiaiškinti per pirm ąją provokacij ą pastebėtus rezultatus, 
praėjus maždaug vienai savaitei svarstomas antros provokacijos (t. y. 
reprovokacijos) atlikimas, jei reikia, su nauja kontroline grupe. 
Reprovokacij ą taip pat galima atlikti su pradine kontroline grupe.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Dėl indukcini ų ir provokacini ų procedūrų kilusios visos odos ir bet 
kokios ne įprastos, taip pat ir somatin ės, reakcijos stebimos ir įverti­
namos pagal Magnussono/Kligmano skal ę (žr. pried ėlį). Kitos proce ­
dūros, pvz., histopatologinis tyrimas, odos raukšl ės storio matavimas, 
gali būti atliekamos siekiant išsiaiškinti neaiškias reakcijas.  
2. DUOMENYS (JKMB ir Buehlerio bandymo)  
Duomenys turi b ūti suvesti į lentelę, kurioje nurodoma kiekvieno 
gyvūno odos reakcija nustatyta per kiekvien ą apžiūrą. 
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS (JKMB ir Buehlerio bandymo)  
Jeigu prieš bandym ą su jūrų kiaulytėmis buvo atliktas atrankos 
bandymas, jo aprašymas arba nuoroda (pvz., vietinio limfinio 
mazgo bandymas, pel ės ausies patinimo bandymas (angl. MEST)), 
įskaitant išsami ą informacij ą apie proced ūrą, turi būti pateikiami 
kartu su gautais rezultatais apie bandom ąsias ir kontrolines 
medžiagas.  
Bandymo ataskaita (JKMB ir Buehlerio)  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, tur ėtų būti pateikiama ši infor ­
macija.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudotos j ūrų kiaulyčių veislės, 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— gyvūnų šaltinis, laikymo s ąlygos, pašarai ir kt.,  
— kiekvieno gyv ūno kūno masė bandymo pradžioje.  
Bandymo s ąlygos:  
— veikiamo plotelio paruošimo b ūdas, 
— informacija apie tamponui naudot ą medžiag ą ir tvirtinimo b ūdą, 
— parengtinio bandymo rezultatai su išvada apie indukcijai ir 
provokacijai naudotinas koncentracijas,  
— informacija apie bandomosios medžiagos paruošim ą, aplikacij ą ir 
nuėmimą, 
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas,  
— nešiklio ir bandomosios medžiagos koncentracijos, naudotos 
indukciniam ir provokaciniam poveikiui sukelti, taip pat bendras indukcijai ir provokacijai sunaudotas medžiagos kiekis.
 
Rezultatai:  
— rezultat ų suvestinė su paskutiniu įrangos jautrumo ir patikimumo 
patikrinimu (žr. 1.3), be to, informacija apie panaudot ą medžiagą, 
koncentracij ą ir nešikl į, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— kiekvieno gyv ūno įvertinimas balais kartu su vertinimo sistema,  
— pasteb ėto poveikio pob ūdžio ir laipsnio pasakojamasis apra ­ 
šymas,  
— histopatologiniai duomenys.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
Šis metodas atitinka OECD TG 406.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Priedėlis 
LENTELĖ 
Magnussono/Kligmano skal ė reakcijai į provokacin į mėginį įvertinti  
0 = nėra matom ų pakitimų 
1 = ribotas arba nevienodo intensyvumo paraudimas  
2 = vidutinis ir susiliejantis paraudimas  
3 = intensyvus paraudimas ir patinimas  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. 28 DIEN Ų GRAUŽIK Ų KARTOTIN ĖS DOZĖS TOKSIŠKUMAS 
PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKT Ą 
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 407 (OECD 
bandymo gair ės Nr. 407) (2008). Originalios bandymo gair ės „Test Guide ­
line“ 407 priimtos 1981 m. Siekiant gauti papildomos informacijos remiantis per tyrim ą naudotais gyv ūnais, pirmiausia informacijos apie neurotoksiš ­
kumą ir imunotoksiškum ą, 1995 m. priimta atnaujinta versija.
 
2. 1998 m. OECD ėmėsi prioritetin ės veiklos, skirtos atnaujinti esamas 
bandymų gaires ir parengti naujas bandym ų gaires, pagal kurias b ūtų atren­
kamos ir bandomos medžiagos, galin čios pakenkti endokrininei sistemai (8). 
Viena iš veiklos kryp čių buvo esam ų OECD gairi ų, susijusių su „28 dien ų 
kartotinės dozės toksiškumo per virškinam ąjį traktą graužikams tyrimu“ (TG 
407), atnaujinimas įtraukiant parametrus, tinkamus nustatyti bandom ųjų 
cheminių medžiag ų poveikį endokrininei sistemai. Rengiant ši ą procedūrą 
įgyvendinta plati tarptautin ė programa, skirta patikrinti papildom ų parametr ų 
reikšmę ir praktin į naudingum ą, jų veiksmingum ą cheminėms medžiagoms, 
turinčioms (anti)estrogeninio, (anti)androgeninio ir (anti)tiroidinio poveikio, 
atkuriamumo vienoje laboratorijoje ir įvairiose laboratorijose galimybes ir 
naujųjų parametr ų nesuderinamum ą su parametrais, kurie buvo privalomi 
prieš priimant TG 407. Pagal ši ą program ą gauti gaus ūs duomenys buvo 
surinkti ir įvertinti išsamioje OECD ataskaitoje (9). Šis atnaujintasis B.7 
metodas (lygiavertis TG 407) yra įgyvendinant ši ą tarptautin ę bandym ų 
programą įgytos patirties ir gaut ų rezultatų išdava. Šis bandymo metodas 
suteikia galimyb ę tam tikrus per endokrinin ę sistemą daromus poveikius 
susieti su kitais toksikologiniais poveikiais.  
PIRMINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI  
3. Vertinant ir nustatant chemini ų medžiagų toksiškumo charakteristikas, karto ­
tinės dozės toksiškumas per virškinam ąjį traktą gali būti nustatomas po to, 
kai ūmaus toksiškumo bandymais gaunama pradin ės informacijos. Šis 
bandymo metodas skirtas nustatyti poveik į, atsižvelgiant į labai didel ę 
galimo toksinio poveikio objekt ų įvairovę. Taikant š į metodą gaunama infor ­
macijos apie galimus pavojus sveikatai, kurie gali gr ėsti dėl gana trump ą 
laiką trunkančio kartotinio poveikio, įskaitant poveik į nervų, imuninei ir 
endokrininei sistemoms. Atsižvelgiant šias konkre čias pasekmes, taikant š į 
metodą turėtų būti nustatytos chemin ės medžiagos, galin čios turėti neuro­
toksinio poveikio, d ėl kurio gali reik ėti atlikti nuodugnesnius šio aspekto 
tyrimus, ir chemin ės medžiagos, kenksmingos skydliauk ės fiziologijai. Be 
to, šiuo metodu galima gauti duomen ų apie chemines medžiagas, kurios 
kenkia jaun ų, bet suaugusi ų patinų ir (arba) pateli ų lytiniams organams, ir 
pastebėti poveikio imuninei sistemai požymi ų. 
4. Šio (B.7) bandymo metodo rezultatai tur ėtų būti naudojami pavoj ų nusta­
tymo ir rizikos vertinimo tikslais. Rezultatai, gauti pagal endokrininei sistemai taikomus parametrus, tur ėtų būti vertinami atsižvelgiant į OECD 
konceptuali ą endokrininei sistemai kenksming ų chemini ų medžiag ų 
bandymų ir vertinimo sistem ą (11). Šis metodas sudarytas iš pamatinio 
kartotinės dozės toksiškumo tyrimo, kuris gali b ūti taikomas chemin ėms 
medžiagoms, d ėl kurių nebūtina atlikti 90 dien ų tyrimo (pvz., kai gamybos 
apimtis neviršija tam tikr ų ribų), arba kaip išankstinis tyrimas prieš ilgalaik į 
tyrimą. Stebėjimų laikotarpio trukm ė turėtų būti 28 dienos.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Tarptautin ė programa, įgyvendinta siekiant patvirtinti parametrus, kurie b ūtų 
tinkami nustatyti galim ą bandomosios chemin ės medžiagos poveik į endokri­
ninei sistemai, parod ė, kad pagal š į (B.7) bandymo metod ą gaunam ų 
duomenų kokybė labai priklauso nuo bandym ų laboratorijos patirties. Tai 
pirmiausia taikytina histopatologiniam ciklini ų patelės lytinių organų paki­
timų tyrimui ir maž ų, nuo hormon ų priklausom ų organų, kuriuos sud ėtinga 
skrosti, mas ės nustatymui. Parengtos histopatologini ų tyrimų gairės (19). Jos 
skelbiamos OECD viešojoje svetain ėje, skirtoje bandym ų gairėms. Jos 
skirtos pad ėti patologams atlikti tyrimus ir užtikrinti didesn į analizės tiks­
lumą. Nustatyta, kad toksiškum ą endokrininei sistemai rodo labai įvairūs 
parametrai; šie parametrai įtraukti į šį bandymo metod ą. Parametrai, d ėl 
kurių negauta pakankamai duomen ų, kad būtų galima įrodyti jų naudin­
gumą, arba dėl kurių per patvirtinimo program ą gauta silpn ų įrodymų, 
kad jie gali pad ėti nustatyti endokrininei sistemai kenksmingas medžiagas, 
siūlomi naudoti kaip neprivalomos pasekm ės (žr. 2 pried ėlį). 
6. Remiantis per patvirtinimo proces ą gautais duomenimis, b ūtina pabrėžti, kad 
šios analiz ės tikslumas n ėra pakankamas, kad b ūtų galima nustatyti visas 
chemines medžiagas, kuri ų veikimo b ūdas yra (anti)androgeninis arba (anti) ­
estrogeninis (9). Šis bandymo metodas netaikomas tam gyvenimo etapui, kuriuo endokrinin ė sistema yra pažeidžiamiausia. Visgi patvirtinimo proceso 
metu taikant š į bandymo metod ą nustatyta chemini ų medžiag ų, kurios 
daugiau ar mažiau kenkia skydliauk ės funkcijai, ir chemini ų medžiag ų, 
stipriai ir vidutiniškai stipriai veikian čių skydliauk ę per estrogeninius arba 
androgeninius receptorius, ta čiau dažniausiai nepavykdavo nustatyti endokri ­
ninę sistemą veikiančių cheminių medžiag ų, kurios silpnai veikia estrogeni ­
nius arba androgeninius receptorius. Taigi jo negalima apib ūdinti kaip atran ­
kinės analizės, skirtos nustatyti poveik į endokrininei sistemai.
 
7. Todėl, nesant su šiais veikimo b ūdais susijusio poveikio, negalima teigti, 
kad nesukeliama poveikio endokrininei sistemai. Nagrin ėjant per endokri ­
ninę sistemą daromus poveikius, chemin ės medžiagos savybi ų apibūdinimas 
neturėtų būti grindžiamas vien tik šio bandymo metodo taikymo rezultatais, 
bet jis tur ėtų būti naudojamas taikant įrodomosios duomen ų galios metod ą, 
apimantį visus turimus chemin ės medžiagos duomenis, skirtus apib ūdinti 
galimą poveikį endokrininei sistemai. D ėl šios priežasties reglamentavimo 
tikslais priimami sprendimai d ėl poveikio endokrininei sistemai (chemin ės 
medžiagos savybi ų apibūdinimas) tur ėtų būti grindžiami platesnio metodo 
taikymu, o ne tik šio bandymo metodo taikymo rezultatais.  
8. Pripažinta, kad visos gyv ūnų naudojimu pagr įstos proced ūros atitiks vieti ­
nius gyvūnų priežiūros reikalavimus; toliau išd ėstyti prieži ūros ir poveikio 
aprašymai yra minimal ūs veiklos reikalavimai, kurie bus pakei čiami vietos 
teisės aktais, jeigu šie bus griežtesni. Daugiau rekomendacij ų dėl humaniško 
elgesio su gyv ūnais pateikia OECD (14).  
9. Vartojamos apibr ėžtys pateiktos 1 pried ėlyje. 
BANDYMO PRINCIPAS  
10. Bandomoji chemin ė medžiaga per burn ą 28 dienas kasdien skirtingomis 
dozėmis duodama kelioms bandom ųjų gyvūnų grupėms – po vieno dydžio 
dozę vienai grupei. Kiekvien ą dozės davimo laikotarpio dien ą gyvūnai 
atidžiai stebimi toksiškumo požymiams nustatyti. Bandymo metu nugaiš ę 
arba numarinti gyv ūnai skrodžiami, o baigus bandym ą numarinami ir skro ­
džiami išgyven ę gyvūnai. Atliekant 28 dien ų tyrimą gaunama informacijos  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
apie kartotin ės oralinės dozės poveikį, iš kurio gali b ūti matoma, ar reikia 
atlikti tolesnius ilgalaikius tyrimus. Be to, taip gali b ūti gauta informacijos 
dėl koncentracij ų parinkimo ilgalaikiams tyrimams. Remiantis šiuo bandymo 
metodu gautais duomenimis tur ėtų būti galima apib ūdinti chemin ės 
medžiagos toksiškum ą, nustatyti doz ės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ę 
ir apibrėžti nepastebimo neigiamo poveikio lyg į (NNPL).  
METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
11. Tinkamiausia graužik ų rūšis yra žiurk ės, bet galima naudoti ir kit ų rūšių 
graužikus. Jeigu pagal š į (B.7) bandymo metod ą nustatyti parametrai tiriami 
naudojant kit ų rūšių graužikus, tur ėtų būti pateiktas išsamus pagrindimas. 
Nors biologiniu poži ūriu tikėtina, kad kitos r ūšis į toksines medžiagas tur ėtų 
reaguoti panašiai kaip žiurk ės, naudojant smulkesnes r ūšis gali atsirasti 
didesnių nuokrypi ų, susijusi ų su techniniais mažesni ų organų skrodimo 
sunkumais. Vienintel ė pagal tarptautin ę patvirtinimo program ą, skirtą nusta­
tyti endokrininei sistemai kenksmingas medžiagas, naudota r ūšis buvo 
žiurkės. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų 
laboratorini ų padermių gyvūnai. Patel ės turėtų būti dar be vados ir neapvai ­
sintos. Doz ė turėtų būti pradedama duoti kaip galima anks čiau, kai tik 
jauniklis atjunkomas, bet ne v ėliau nei gyv ūnams sueina devynios savait ės. 
Pradedant tyrim ą gyvūnų kūno masės skirtumai turi b ūti kuo mažesni ir 
nenukrypti nuo kiekvienos lyties k ūno masės vidurkio daugiau kaip 
± 20 %. Jeigu prieš ilgesnio laikotarpio tyrim ą atliekamas išankstinis karto ­
tinės oralinės dozės tyrimas, pageidautina, kad per abu tyrimus naudojami 
gyvūnai būtų tos pačios paderm ės ir gauti iš to paties šaltinio.  
Laikymas ir š ėrimas  
12. Visos proced ūros turėtų atitikti vietinius laboratorin ės gyvūnų priežiūros 
reikalavimus. Bandom ųjų gyvūnų patalpos temperat ūra turėtų būti 22 °C 
(± 3 °C). Nors santykinis oro dr ėgnis turėtų būti ne mažesnis kaip 30 % 
ir, pageidautina, ne didesnis kaip 70 % (išskyrus patalpos plovimo met ą), 
turėtų būti siekiama užtikrinti 50–60 % santykin į drėgnį. Apšvietimas tur ėtų 
būti dirbtinis, užtikrinant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sek ą. Gyvūnams šerti 
tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo 
vandens kiekio. Pašaro parinkimui gali tur ėti įtakos poreikis tinkamai įmai­ 
šyti bandom ąją cheminę medžiagą, kai ji duodama pagal š į metodą. Gyvūnai 
turėtų būti laikomi mažomis tos pa čios lyties grup ėmis; jeigu tai moksliškai 
pagrįsta, gyvūnai gali b ūti laikomi po vien ą. Jeigu gyv ūnai narveliuose 
laikomi grupel ėmis, viename narvelyje tur ėti būti laikomi ne daugiau kaip 
penki gyv ūnai. 
13. Turėtų būti nuolat analizuojama, ar pašaro sud ėtyje nėra teršalų. Pašaro 
ėminys tur ėtų būti saugomas, kol bus parengta ataskaita.  
Gyvūnų paruošimas  
14. Sveiki jauni suaug ę gyvūnai atsitiktin ės atrankos principu suskirstomi į 
kontrolines ir bandom ąsias grupes. Narveliai tur ėtų būti išdėstyti taip, kad 
galimas narveli ų išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams tur ėtų būtų kuo 
mažesnis. Gyv ūnai paženklinami, kad kiekvien ą iš jų būtų galima identifi ­
kuoti, ir ne mažiau kaip penkias paras iki poveikio tyrimo pradžios laikomi 
savo narveliuose, kad priprast ų prie laboratorini ų sąlygų. 
Dozių ruošimas  
15. Bandomoji chemin ė medžiaga leidžiama zondu arba duodama su pašarais 
arba geriamuoju vandeniu. Oralinis doz ės davimo b ūdas priklauso nuo 
tyrimo tiksl ų ir fizinių, chemini ų bei (arba) toksikokinetini ų bandomosios 
cheminės medžiagos savybi ų. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Prireikus bandomoji chemin ė medžiaga ištirpinama arba pagaminama jos 
suspensija tinkamame nešiklyje. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirme ­
nybę teikti vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimyb ę 
naudoti aliejaus (pvz., kukur ūzų) tirpalą arba suspensij ą ir tik po to – gali ­
mybę naudoti tirpalus kituose nešikliuose. Jeigu naudojamas nešiklis n ėra 
vanduo, turi b ūti žinomos to nešiklio toksin ės savybės. Turėtų būti nusta­
tytas bandomosios chemin ės medžiagos stabilumas nešiklyje.  
PROCED ŪRA 
Gyvūnų skaičius ir lytis  
17. Kiekvieno dydžio doz ė duodama ne mažiau kaip dešim čiai gyvūnų 
(penkiems patinams ir penkioms patel ėms). Jeigu numatoma marinti 
gyvūnus nebaigus bandymo, pradinis gyv ūnų skaičius turėtų būti padidintas 
numatomu iki tyrimo pabaigos numarinti gyv ūnų skaičiumi. Tur ėtų būti 
apsvarstyta galimyb ė į kontrolin ę grupę ir didžiausiajai dozei skirt ą grupę 
įtraukti po vien ą papildom ą pagalbin ę dešimties gyv ūnų grupę (po penkis 
kiekvienos lyties gyv ūnus), kad bent 14 dien ų po dozės davimo b ūtų galima 
stebėti toksinio poveikio gr įžtamumą, tvarumą arba dels ą. 
Dozuotė 
18. Paprastai tur ėtų būti naudojamos ne mažiau kaip trys bandomosios grup ės ir 
viena kontrolin ė grupė, tačiau jeigu įvertinus turimus duomenis nesitikima 
jokio 1 000 mg/kg k ūno masės per parą dozės poveikio, galima atlikti ribin į 
bandymą. Jeigu n ėra tinkam ų duomen ų, gali būti atliktas rib ų nustatymo 
tyrimas (naudojant tos pa čios paderm ės ir iš to paties šaltinio gautus 
gyvūnus), pad ėsiantis nustatyti naudotinas dozes. Kontrolin ės grupės 
gyvūnai turėtų būti prižiūrimi lygiai taip pat kaip ir bandomieji gyv ūnai, 
išskyrus tai, kad jiems neduodama bandomosios chemin ės medžiagos. Jeigu 
duodant bandom ąją cheminę medžiag ą naudojamas nešiklis, kontrolin ė 
grupė turėtų gauti didžiausi ą naudotą nešiklio kiek į. 
19. Dozi ų dydžiai tur ėtų būti parenkami atsižvelgiant į jau turimus bandomosios 
arba į ją panašių chemini ų medžiag ų toksiškumo ir (toksiko)kinetinius 
duomenis. Pasirinkta didžiausioji doz ė turėtų sukelti toksin į poveikį, tačiau 
nenužudyti gyv ūno ir nesukelti sunki ų kančių. Kitos, mažesn ės dozės turėtų 
būti parenkamos taip, kad b ūtų galima nustatyti galimas reakcijas į dozes ir 
nepastebim ą neigiam ą poveikį (NNPL), kai duodama mažiausioji doz ė. 
Dažnai b ūtų geriausia, jeigu maž ėjančia tvarka parenkami dozi ų dydžiai 
vienas nuo kito skirt ųsi du–keturis kartus, ir dažnai patartina ketvirtajai 
papildomai tiriamajai grupei taikyti labai didelius dozi ų dydžių skirtumus 
(pvz., koeficientus, didesnius kaip 10).  
20. Jeigu pastebimas bendras toksinis poveikis (pvz., sumaž ėjusi kūno masė, 
poveikis kepenims, širdžiai, plau čiams arba inkstams ir t. t.) arba nustatoma 
kitų pakitimų, kurie gali b ūti ne toksin ės reakcijos (pvz., sumaž ėjęs pašaro 
vartojimas, kepen ų padidėjimas), pasteb ėtas poveikis imuninio, nervinio arba 
endokrininio pob ūdžio pasekm ėms turėtų būti vertinamas atsargiai.  
Ribinis bandymas  
21. Jeigu vieno dydžio doz ės, ne mažesn ės kaip 1 000 mg/kg k ūno masės per 
parą arba atitinkama procentin ė dalis pašaruose ar geriamame vandenyje 
(nustatant pagal k ūno masę), kai doz ė duodama su pašarais ar geriamu 
vandeniu, bandymas, atliekamas taikant tokiam tyrimui nustatytas proce ­
dūras, nesukelia pastebimo toksinio poveikio ir jeigu toksinio poveikio nesi ­
tikima remiantis turimais duomenimis apie panašios strukt ūros chemines 
medžiagas, išsamus trij ų dydžių dozių tyrimas neb ūtinas. Ribinis bandymas 
neatliekamas tais atvejais, kai nustatant poveik į žmogui, reikia duoti 
didesnes dozes.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Dozių davimas  
22. Bandomosios chemin ės medžiagos doz ė 28 dien ų laikotarpiu gyv ūnams 
duodama kasdien, septynias dienas per savait ę. Jeigu bandomoji chemin ė 
medžiaga leidžiama zondu, ji tur ėtų būti duodama viena doze, naudojant 
skrandžio zond ą arba tinkam ą intubacin į vamzdel į. Didžiausias vienkartinis 
duodamo skys čio kiekis priklauso nuo bandomojo gyv ūno dydžio. Šis kiekis 
neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g k ūno masės, išskyrus vandeninius 
tirpalus, kuri ų galima duoti po 2 ml/100 g k ūno masės. Išskyrus dirginan čias 
arba ėsdinančias chemines medžiagas, kurios, b ūdamos didesn ės koncentra ­
cijos, paprastai sukelia sunkesn į poveikį, bandomojo tirpalo t ūrio nepasto ­
vumas tur ėtų būti kiek įmanoma sumažintas kei čiant koncentracij ą taip, kad 
visų dydžių dozių tūris būtų vienodas.  
23. Jeigu chemin ės medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, 
svarbu užtikrinti, kad įmaišomi bandomosios chemin ės medžiagos kiekiai 
netrikdytų įprasto mitybos režimo arba vandens balanso. Bandom ąją 
cheminę medžiag ą duodant su pašaru, galima taikyti vienod ą koncentracij ą 
pašare (ppm) ar vienod ą dozės dydį pagal gyv ūno kūno masę; turi būti 
nurodytas pasirinktas variantas. Jeigu chemin ė medžiaga leidžiama zondu, 
dozė kasdien tur ėtų būti duodama panašiu metu ir prireikus koreguojama, 
kad būtų palaikomas pastovus doz ės dydis atsižvelgiant į gyvūno kūno 
masę. Jeigu prieš ilgalaik į tyrimą atliekamas išankstinis kartotin ės dozės 
tyrimas, per abu tyrimus gyv ūnams turi b ūti duodami panaš ūs pašarai.  
Stebėjimai  
24. Steb ėjimų laikotarpio trukm ė turėtų būti 28 dienos. Tolesniems steb ėjimams 
numatytos pagalbin ės grupės gyvūnai turėtų būti dar bent 14 dien ų laikomi 
neduodant jokios doz ės, kad būtų galima nustatyti toksinio poveikio dels ą, 
tvarumą arba gyv ūnų atsigavim ą nuo poveikio.  
25. Bent kart ą per parą turėtų būti atliekami bendrieji klinikiniai steb ėjimai; 
geriausia, kad jie b ūtų atliekami tuo pa čiu paros metu, atsižvelgiant į 
stipriausią numatomo poveikio pasireiškim ą po dozės davimo. Tur ėtų būti 
registruojama gyv ūnų sveikatos b ūklė. Bent du kartus per par ą visi gyvūnai 
turėtų būti patikrinami, ar jie sveiki ir nenugaiš ę. 
26. Kartą prieš pirmojo poveikio pradži ą (kad būtų galima palyginti atskirus 
gyvūnus) ir bent kart ą per savait ę po dozės davimo tur ėtų būti atliekami 
išsamūs visų gyvūnų klinikiniai steb ėjimai. Šie steb ėjimai atliekami perk ėlus 
gyvūną iš jo narvo į tam skirt ą įprastą vietą ir, pageidautina, tur ėtų būti 
atliekami tuo pa čiu paros metu. Steb ėjimai turėtų būti kruopščiai registruo ­
jami, pageidautina, pagal toje laboratorijoje aiškiai apibr ėžtą vertinimo 
sistemą. Turėtų būti dedamos pastangos, kad bandymo s ąlygų kaita būtų 
kuo mažesn ė, ir pageidautina, kad šiuos steb ėjimus atlikt ų stebėtojai, neži ­
nantys apie doz ės davimą. Be kitų dalykų, turėtų būti registruojami odos, 
kailio, aki ų, gleivinės pakitimai, išskyr ų atsiradimas ir autonominis akty ­
vumas (pvz., ašarojimas, plauk ų pašiaušimas, vyzdžio dydis, ne įprasti kvėpa­
vimo pakitimai). Taip pat tur ėtų būti registruojami eisenos, pozos, reakcijos į 
paėmimą rankomis pakitimai, traukuli ų arba tonini ų judesių atsiradimas, 
stereotipinis (pvz., besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu) arba 
keistas elgesys (pvz., sav ęs luošinimas, vaikš čiojimas atbulomis) (2).  
27. Ketvirt ą poveikio savait ę turėtų būti tiriamos jutimin ės reakcijos į įvairaus 
pobūdžio dirgiklius (pvz., klausos, regos ir proprioreceptorinius) (3) (4) (5), 
vertinamas spaudimo (j ėgos) stiprumas (6) ir jud ėjimo aktyvumas (7). Išsa ­
mesnės informacijos apie proced ūras, kurios gal ėtų būti taikomos, pateikta 
atitinkamuose literat ūros šaltiniuose. Vietoje nurodyt ųjų gali būti taikomos ir 
alternatyvios proced ūros. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Jeigu kartotin ės dozės tyrimas atliekamas kaip išankstinis tyrimas prieš 
pusiau lėtinio poveikio (90 dien ų) tyrimą, funkciniai steb ėjimai ketvirt ąją 
savaitę gali būti neatliekami. Tokiu atveju funkciniai steb ėjimai turėtų būti 
įtraukiami į šį tolesnį tyrimą. Kita vertus, tokie funkciniai steb ėjimai atlie ­
kant kartotin ės dozės tyrimą suteikia didesn ę galimybę geriau parinkti dozi ų 
dydžius tolesniam pusiau l ėtinio poveikio tyrimui.  
29. Išimtiniais atvejais funkcini ų stebėjimų galima neatlikti ir su tomis 
grupėmis, kurių toksiškumo požymiai tokio laipsnio, kad jie labai trukdyt ų 
atlikti funkcinius bandymus.  
30. Atliekant skrodim ą, (neprivaloma tvarka) gal ėtų būti nustatomas vis ų patelių 
lytinis ciklas, imant makšties tepin ėlius. Šie steb ėjimai suteikt ų informacijos 
apie lytinio ciklo etap ą, buvusį gyvūno numarinimo metu, ir pad ėtų atlikti 
histologinius su estrogenais susijusi ų audinių tyrimus [žr. histopatologini ų 
tyrimų gaires (19)].  
Kūno masė ir pašar ų ir (arba) vandens suvartojimas  
31. Bent kart ą per savait ę visi gyv ūnai turėtų būti pasveriami. Ne re čiau kaip 
kartą per savait ę turėtų būti matuojamas pašar ų suvartojimas. Jeigu bando ­
moji chemin ė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, bent kart ą per 
savaitę turėtų būti matuojamas ir vandens suvartojimas.  
Hematologiniai tyrimai  
32. Pasibaigus bandymo laikotarpiui tur ėtų būti atlikti tokie hematologiniai 
tyrimai: hematokrito, hemoglobino koncentracijos, eritrocit ų kiekio, retiko ­
lucitų, bendro leukocit ų kiekio ir įvairių leukocitų kiekių, trombocit ų kiekio 
ir kraujo kreš ėjimo laiko ir aktyvumo. Jeigu įtariama, kad bandomoji 
cheminė medžiaga arba jos numatomi metabolitai turi oksidacini ų savybių, 
turėtų būti nustatyti ir kiti rodikliai, įskaitant methemoglogino koncentracij ą 
ir Heinco k ūnelius.  
33. Kraujo ėminiai tur ėtų būti imami iš nurodytos vietos prieš pat gyv ūnų 
numarinim ą arba numarinimo proced ūros metu ir saugomi tinkamomis s ąly­
gomis. Nakt į prieš numarinim ą gyvūnams turėtų būti neduodama pašaro (  1 ). 
Klinikinė biochemija  
34. Siekiant ištirti pagrindinius toksinius poveikius audiniams, pirmiausia inks ­
tams ir kepenims, tur ėtų būti atlikti vis ų gyvūnų kraujo ėminių, paimtų prieš 
pat gyvūnų numarinim ą arba numarinimo proced ūros metu, klinikiniai 
biocheminiai tyrimai (atmetus gaištan čius arba nebaigus tyrimo numarintus 
gyvūnus). Kraujo plazmoje arba serume tiriama: natris, kalis, gliukoz ė, 
bendras cholesterolio kiekis, šlapalas, kreatininas, bendras baltym ų ir albu­
mino kiekis, mažiausiai du fermentai, rodantys poveik į kepenų ląstelėms 
(pvz., alaninaminotransferaz ė, aspartataminotransferaz ė, šarminė fosfatazė, 
gamaglutamiltranpeptidaz ė ir glutamato dehidrogenaz ė), ir tulžies r ūgštys. 
Tam tikromis aplinkyb ėmis naudingos informacijos gali suteikti papildomi 
fermentų (kepenų arba kitokios kilm ės) ir bilirubino tyrimai.  
35. Paskutin ę tyrimo savait ę (neprivaloma tvarka) gali b ūti atliekami šlapimo 
tyrimai, per nustatyt ą laiko tarp ą surenkant tam tikr ą šlapimo kiek į ir ištiriant 
šlapimo išvaizd ą, kvapą, tūrį, osmosin į slėgį arba savit ąjį svorį, pH, 
baltymus, gliukoz ę ir kraują (kraujo k ūnelius).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) Atliekant kai kuriuos serumo ir plazmos matavimus, ypa č gliukozės, pageidautina, kad 
gyvūnai naktį negautų pašaro. Pagrindin ė tokio poreikio priežastis yra ta, kad d ėl padi­
dėjusių nuokrypi ų, kurių neišvengiamai atsirast ų, jeigu gyv ūnai būtų šeriami, b ūtų 
paslėpti sunkiau pastebimi padariniai ir b ūtų sunku aiškinti rezultatus. Ta čiau, kita vertus, 
naktį gyvūnams neduodant maisto gali b ūti padaryta neigiamos įtakos bendrajai gyv ūnų 
medžiagų apykaitai ir, ypa č atliekant š ėrimo tyrimus, gali b ūti iškraipytas kasdienis 
bandomosios chemin ės medžiagos poveikis. Jeigu b ūtų nuspręsta nešerti gyv ūnų per 
naktį, klinikiniai biocheminiai tyrimai tur ėtų būti atliekami jau atlikus ketvirtosios tyrimo 
savaitės funkcinius steb ėjimus.
 36. Be to, tur ėtų būti apsvarstyta galimyb ė atlikti plazmos arba serumo rodikli ų, 
rodančių bendruosius audini ų pažeidimus, tyrimus. Jeigu žinomos bandomo ­
sios chemin ės medžiagos savyb ės gali arba, įtariama, gali tur ėti neigiamo 
poveikio susijusioms metabolin ėms savyb ėms, galima atlikti kalcio, fosforo, 
triglicerid ų, specifini ų hormonų ir cholinesteraz ės tyrimus. Šie tyrimai turi 
būti paskiriami tam tikr ų kategorij ų medžiagoms arba atsižvelgiant į 
konkretų atvejį. 
37. Nors atliekant tarptautin į su endokrinine sistema susijusi ų pasekmi ų verti­
nimą ir nepavyko įrodyti aiškios skydliauk ės hormon ų (T3, T4) ir tireotro ­
pinų (angl. TSH) tyrim ų naudos, gali b ūti naudinga išsaugoti plazmos ir 
serumo ėminius, kad b ūtų galima įvertinti T3, T4 ir TSF (neprivaloma), kai 
atsiranda poveikio hipofiz ės-skydliauk ės ašiai požymi ų. Saugotini ėminiai 
gali būti užšaldomi –20 °C temperat ūroje. Hormon ų tyrimų rezultat ų 
nuokrypiams ir absoliutin ėms koncentracijoms gali tur ėti įtakos šie veiks ­
niai: 
— numarinimo laikas – d ėl hormon ų koncentracijos kaitos paros metu,  
— numarinimo b ūdas, taikomas siekiant, kad gyv ūnai nepatirt ų pernelyg 
didelio streso, galin čio turėti įtakos hormon ų koncentracijoms,  
— hormon ų tyrimų įranga, kuri gali skirtis etalonini ų kreivių požiūriu. 
Galutinai nustatyti skydliauk ę veikiančias chemines medžiagas patikimiau 
taikant histopatologin ę analizę, o ne remiantis hormon ų lygiais.  
38. Hormon ų tyrimams specialiai skirti plazmos ėminiai tur ėtų būti imami 
panašiu paros metu. Rekomenduojama apsvarstyti galimyb ę atlikti T3, T4 
ir TSH tyrimus remiantis skydliauk ės histopatologiniais pakitimais. Taikant 
įvairią komercin ę analizės įrangą, skaitinės vertės, gautos analizuojant 
hormonų koncentracijas, skiriasi. Tod ėl gali b ūti neįmanoma parengti 
poveikio vertinimo kriterij ų, pagrįstų vienodais istoriniais duomenimis. 
Arba laboratorijos tur ėtų siekti, kad kontroliniai T3 ir T4 variacijos koefi ­
cientai būtų mažesni kaip 25, o TSH – mažesni kaip 35. Visos koncentra ­
cijos registruojamos ng/ml išraiška.  
39. Jeigu pamatiniai istoriniai duomenys yra netinkami, tur ėtų būti apsvarstyta 
galimybė nustatyti hematologinius ir klinikinius biocheminius kintamuosius 
prieš pradedant duoti dozes arba, pageidautina, naudojant gyv ūnų grupę, 
neįtrauktą į bandomąsias grupes.  
PATOLOGIJA  
Bendrasis skrodimas  
40. Atliekamas išsamus vis ų bandomųjų gyvūnų bendrasis skrodimas, atidžiai 
ištiriant k ūno pavirši ų ir visas jo angas, kaukol ę, krūtinės ląstą, pilvo ertmes 
ir jų turinį. Atlikus skrodim ą, visų gyvūnų (išskyrus gaištan čius ir (arba) 
numarintus nebaigus tyrimo)  kepenys, inkstai, antinks čiai, sėklidės, sėklidžių 
prielipai, prostata ir s ėklinės pūslelės su koaguliatori ų liaukomis (kaip 
kompleksas),  užkrūčio liauka, blužnis, smegenys ir širdis tur ėtų būti nuva­
lyti, jeigu reikia, pašalinant prigludusius audinius, ir po skrodimo kuo grei ­ 
čiau pasverti, kol neišdžiuvo. Valant prostatos kompleks ą, būtina imtis atsar ­
gumo priemoni ų, kad neb ūtų pradurtos s ėklinės pūslelės su skys čiais. Arba 
sėklinės pūslelės ir prostata gali b ūti valomos ir sveriamos atlikus fiksavim ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Be to, kaip galima grei čiau skrodimo, kol neišdžiuvo, gali b ūti pasveriami ir 
kiti du audiniai: kiaušidži ų pora (drėgnų organų masė) ir gimda su gimdos 
kakleliu (patarim ų, kaip pašalinti ir sv ėrimui paruošti gimdos audinius, 
pateikta OECD TG 440 (OECD bandym ų gairės Nr. 440) (18)).  
42. Atlikus fiksavim ą, gali būti (bet neprivaloma) nustatyti skydliauk ės masę. 
Valyti irgi b ūtina labai atsargiai ir tik atlikus fiksavim ą, kad neb ūtų pažeistas 
audinys. Pažeidus audin į gali būti gauti netiksl ūs histopatologin ės analizės 
rezultatai.  
43. Atsižvelgiant į audinio tip ą ir numatom ą vėliau atlikti histopatologin į tyrimą, 
tinkamiausioje fiksavimo terp ėje turėtų būti konservuoti šie audiniai (žr. 47 
skirsnį): visi  labai pakit ę audiniai, smegenys (j ų būdingiausios dalys – 
didžiosios smegenys, smegen ėlės ir smegen ų tiltas),  nugaros smegenys,  
akis, skrandis, mažosios ir didžiosios žarnos (taip pat Peyerio plokštel ės), 
kepenys, inkstai, antinks čiai, blužnis, širdis, užkr ūčio liauka, skydliauk ė, 
trachėja ir plau čiai (prileidžiant fiksatyvo ir tada panardinant),  lytinės 
liaukos (s ėklidės ir kiaušid ės), kiti lytiniai organai (gimda, gimdos kaklelis, 
sėklidžių prielipai, prostata ir s ėklinės pūslelės su koaguliatori ų liaukomis),  
makštis, šlapimo p ūslė, limfiniai mazgai [be artimiausio drenažinio mazgo, 
remiantis geriausi ąja laboratorine patirtimi paimamas dar vienas mazgas 
(15)], periferinis nervas (s ėdimasis arba blauzdikaulio), pageidautina, esantis 
arti raumens,  skeleto raumuo ir kaulas su kaul ų čiulpais (išpjova arba švie ­ 
žiai paruošta kaul ų čiulpų punkcija). Rekomenduojama atlikti s ėklidžių 
fiksavimą jas panardinant į Bouino arba modifikuot ąjį Davidsono fiksatyv ą 
(16) (17). Abu  tunica albuginea  galai turi b ūti atsargiai ir negiliai pradurti 
adata, kad b ūtų galima greitai prileisti fiksatyvo. Atsižvelgiant į gautas 
klinikines ir kitokias išvadas, gali reik ėti ištirti papildomus audinius. Be 
to, atsižvelgiant į žinomas bandomosios chemin ės medžiagos savybes, tur ėtų 
būti konservuojami visi numanomi tiksliniai organai.  
44. Vertingos informacijos apie poveik į endokrininei sistemai galima gauti išti ­
riant šiuos organus: lytines liaukas (kiaušides ir s ėklides), kitus lytinius 
organus (gimd ą su gimdos kakleliu, s ėklidžių prielipus, s ėklines pūsleles 
su koaguliatori ų liaukomis, dorsolateralin ę ir pilvinę prostatas), makšt į, hipo­
fizę, patinų pieno liaukas, skydliauk ę ir antinks čius). Patin ų pieno liauk ų 
pakitimai n ėra pakankamai išsamiai aprašyti, ta čiau šis parametras gali b ūti 
labai svarbus estrogeninio poveikio turin čias chemines medžiagas. 43 skirs ­
nyje nenurodyt ų organų ir (arba) audini ų stebėjimai neprivalomi (žr. 2 prie ­
dėlį). 
45. Histopatologini ų tyrimų gairėse (19) pateikta išsamios papildomos informa ­
cijos apie skrodim ą, fiksavim ą, pjaustym ą ir endokrinini ų audinių histopa­
tologiją. 
46. Įgyvendinant tarptautin ę bandymų program ą gauta šiek tiek įrodymų, kad 
sunkiai pastebimo poveikio endokrininei sistemai turin čios chemin ės 
medžiagos, menkai veikian čios lytinių hormonų homeostaz ę, gali būti nusta­
tomos atsižvelgiant į lytinio ciklo sinchronizavimo trikdym ą įvairiuose audi ­
niuose ir iš dalies – į atvirus histopatologinius pateli ų lytinių organų paki­
timus. Nors galutini ų įrodymų dėl tokio poveikio negauta, rekomenduojama 
aiškinant kiaušidži ų (folikulų, apvalkal ų ir kiaušidži ų grūdėtųjų ląstelių), 
gimdos, gimdos kaklelio ir makšties histopatologini ų tyrimų rezultatus atsiž ­
velgti į galimo lytinio ciklo asinchroniškum ą. Jeigu vertinamas ciklo etapas, 
nustatomas imant makšties tepin ėlius, į jį taip pat galima atsižvelgti atliekant 
šį palyginim ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatologinis tyrimas  
47. Turėtų būti atliktas išsamus histopatologinis vis ų kontrolin ės grupės ir 
didžiausiąją dozę gavusios grup ės gyvūnų konservuot ų organų ir audini ų 
tyrimas. Jeigu nustatoma, kad didžiausi ąją dozę gavusioje grup ėje atsirado 
su dozės davimu susijusi ų pakitimų, turėtų būti atlikti ir vis ų kitų dydžių 
dozes gavusi ų grupių gyvūnų histopatologiniai tyrimai.  
48. Ištiriami visi labai pakit ę audiniai.  
49. Jei naudojama pagalbin ė grupė, turėtų būti atliekamas histopatologinis 
audinių ir organ ų, dėl kurių, ištyrus doz ę gavusias grupes, nustatyta, kad 
jiems buvo padarytas poveikis, tyrimas.  
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
Duomenys  
50. Turėtų būti pateikiami kiekvieno gyv ūno duomenys. Be to, visi duomenys 
turėtų būti apibendrinti lentel ėse, pagal kiekvien ą bandomąją grupę nurodant 
pradedant bandym ą turėtų gyvūnų skaičių, atliekant bandym ą nugaišusi ų 
arba dėl humanišk ų priežasčių numarint ų gyvūnų skaičių ir kiekvienos 
žūties arba numarinimo d ėl humanišk ų priežasčių laiką, gyvūnų su toksiš ­
kumo požymiais skai čių, pastebėtų toksiškumo požymi ų aprašymą, įskaitant 
kiekvieno toksinio poveikio pasireiškimo laik ą, trukmę ir sunkum ą, gyvūnų 
su audini ų pakitimais skai čių, pakitim ų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo 
pakitimais procentin ę dalį. 
51. Jeigu įmanoma, skaitiniai rezultatai tur ėtų būti įvertinti taikant tinkam ą 
visuotinai pripažint ą statistinį metodą. Lyginant poveik į pagal dozi ų inter­
valą turėtų būti vengiama taikyti įvairius t kriterijus. Statistiniai metodai 
turėtų būti parenkami planuojant tyrim ą. 
52. Siekiant užtikrinti kokyb ės kontrolę, siūloma surinkti istorinius kontrolinius 
duomenis ir skaitiniams duomenims apskai čiuoti variacijos koeficientus, 
ypač parametrams, susijusiems su endokrininei sistemai kenksming ų 
medžiagų nustatymu. Šie duomenys gali b ūti naudojami palyginimo tikslais, 
kai vertinami faktiniai tyrimai.  
Bandymo ataskaita  
53. Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
Bandomoji chemin ė medžiaga  
— Fizinė būsena, grynumas, fizin ės ir chemin ės savybės, 
— identifikavimo duomenys.  
Nešiklis (jeigu naudojamas)  
— Nešiklio, jeigu tai ne vanduo, pasirinkimo pagrindimas.  
Bandomieji gyv ūnai 
— Naudota r ūšis ir (arba) paderm ė, 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.,  
— kiekvieno gyv ūno masė pradedant bandym ą, 
— rūšies, jeigu tai ne žiurk ės, pasirinkimo pagrindimas.  
Bandymo s ąlygos  
— Dozės dydžio pasirinkimo pagrindimas,  
— išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos ir (arba) 
pašaro paruošim ą, gautą koncentracij ą, preparato stabilum ą ir homoge ­
niškumą, ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos davimo b ūdą, 
— bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos (ppm) pašare arba 
geriamajame vandenyje perskai čiavimas į faktinę dozę (mg/kg k ūno 
masės per parą), jeigu taikytina,  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę. 
Neprivalomos tirti, bet ištirtos pasekm ės 
— Neprivalom ų tirti, bet ištirt ų pasekmių sąrašas.  
Rezultatai  
— Kūno masė ir (arba) k ūno masės pokyčiai, 
— maisto ir, jeigu taikytina, vandens suvartojimas,  
— toksin ės reakcijos duomenys pagal lyt į ir dozės dydį, nurodant toksiš ­
kumo požymius,  
— klinikini ų požymių pobūdis, sunkumas ir trukm ė (grįžtami ar negr įž­
tami),  
— jutiminio aktyvumo, spaudimo (j ėgos) stiprumo ir jud ėjimo aktyvumo 
įvertinimai,  
— hematologiniai tyrimai remiantis atitinkamomis pamatin ėmis vertėmis, 
— klinikiniai biocheminiai tyrimai remiantis atitinkamomis pamatin ėmis 
vertėmis, 
— kūno masė numarinimo metu ir organ ų masė, 
— skrodimo išvados,  
— išsamus vis ų histopatologinio tyrimo rezultat ų aprašymas,  
— sugerties duomenys, jeigu yra,  
— statistinis rezultat ų apdorojimas, jeigu taikytina.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTYS  
Androgeniškumas –  cheminės medžiagos geba veikti žinduolio organizme kaip 
natūralus androgeninis hormonas (pvz., testosteronas).  
Antiandrogeniškumas –  cheminės medžiagos geba slopinti nat ūralaus androge ­
ninio hormono (pvz., testosterono) veikim ą žinduolio organizme.  
Antiestrogeniškumas –  cheminės medžiagos geba slopinti nat ūralaus estroge ­
ninio hormono (pvz., 17-beta-estradiolio) veikim ą žinduolio organizme.  
Antitiroidinis veiklumas –  cheminės medžiagos geba slopinti nat ūralaus skyd ­
liaukės hormono (pvz., T  3 ) veikimą žinduolio organizme.  
Dozuotė – bendroji s ąvoka, apimanti doz ę, jos davimo dažnum ą ir trukm ę. 
Dozė – duodamas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis. Doz ė išreiškiama 
bandomosios chemin ės medžiagos mase, per par ą tenkančia vienam bandomojo 
gyvūno kūno masės vienetui (pvz., mg/kg k ūno masės per par ą), arba pastovia 
koncentracija pašare.  
Akivaizdus toksiškumas –  bendroji s ąvoka, apib ūdinanti aiškius toksiškumo 
požymius, pastebimus davus bandomosios chemin ės medžiagos. Šie požymiai 
turėtų būti pakankami įvertinti pavoj ų ir turėtų būti tokie, kad padidinus duodam ą 
dozę būtų galima tik ėtis sunkaus toksiškumo požymi ų ir galbūt gyvūnų gaišimo.  
NNPL –  „nepastebimo neigiamo poveikio lygio“ santrumpa. Tai didžiausioji 
dozė, kurią duodant nepastebima neigiam ų rezultatų. 
Estrogeniškumas –  cheminės medžiagos geba veikti žinduolio organizme kaip 
natūralus estrogeninis hormonas (pvz., 17–beta-estradiolis).  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  pagal šį bandymo metod ą bandoma chemin ė 
medžiaga arba mišinys.  
Tiroidinis veiklumas –  cheminės medžiagos geba veikti žinduolio organizme 
kaip natūralus skydliauk ės hormonas (pvz., T  3 ). 
Patikimumo patvirtinimas –  mokslinis procesas, skirtas apib ūdinti bandymo 
metodo proced ūrinius reikalavimus ir apribojimus ir įrodyti bandymo metodo 
patikimum ą bei tinkamum ą tam tikram tikslui.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
2 priedėlis 
Pasekmės, rekomenduojamos taikyti pagal B.7 metod ą nustatant 
endokrininei sistemai kenksmingas medžiagas  
Privalomos pasekm ės Neprivalomos pasekm ės 
Masė 
— Sėklidžių 
— Sėklidžių prielipų 
— Antinks čių 
— Prostatos ir s ėklinių pūslelių su 
koaguliatori ų liaukomis  — Kiaušidži ų 
— Gimdos su gimdos kakleliu 
— Skydliauk ės 
Histopatologinis tyrimas  
— Lytini ų liaukų: 
— Sėklidžių 
— Kiaušidži ų 
— Kitų lytinių organų: 
— Sėklidžių prielipų 
— Prostatos ir s ėklinių pūslelių su 
koaguliatori ų liaukomis 
— Gimdos su gimdos kakleliu 
— Antinks čių 
— Skydliauk ės 
— Makšties  — Makšties tepin ėlių 
— Patin ų pieno liauk ų 
— Hipofiz ės 
Hormonų matavimai  
— Cirkuliaciniai T3, T4 lygiai 
— Cirkuliaciniai TSH lygiai  
LITERAT ŪRA 
1. OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuroto ­
xicity.  
2. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
3. Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
4. Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704.  
5. Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Compa ­
risons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
 
6. Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
7. Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
 
8. OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
9. OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: 
Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
10. OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for 
Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
No 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
11. OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endoc ­
rine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/docu ­
ment/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_ 37407,00.html  
12. OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
13. OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endoc ­
rine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
14. OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/ ­
MONO(2000)7.  
15. Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404–407.  
16. Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52–85.
 
17. Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of 
testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533.
 
18. OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
19. OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endoc ­
rine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. POŪMIS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS. 28 DIEN Ų TYRIMAS  
SANTRAUKA  
Šis atnaujintasis B.8 bandymo metodas parengtas tam, kad b ūtų galima išsamiai 
apibūdinti bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą, pasireiškiant į neilgą 
(28 dienų) laikotarp į duodant kartotin ę dozę per kvėpavimo takus, ir gauti 
duomenų, reikaling ų kiekybiniams inhaliacin ės rizikos vertinimams. Ne mažiau 
kaip penki ų patinų ir penkių patelių grupės 28 dien ų laikotarpiu šešias valandas 
per parą veikiamos a) bandom ąja chemine medžiaga, taikant tris arba daugiau 
koncentracijos lygi ų, b) išvalytu oru (neigiama kontrol ė) ir (arba) c) nešikliu 
(nešiklio kontrol ė). Paprastai gyv ūnai veikiami penkias dienas per savait ę, tačiau 
galima taikyti ir septyni ų dienų per savait ę poveikį. Bandymai visada atliekami ir 
su patinais, ir su patel ėmis, tačiau, jeigu žinoma, kad kurios nors lyties gyv ūnai 
yra jautresni tam tikrai bandomajai cheminei medžiagai, patinams ir patel ėms gali 
būti taikomi skirtingi koncentracijos lygiai. Šis metodas tyrimo vadovui suteikia 
lanksčią galimybę įtraukti pagalbines (gr įžtamumo tyrim ų) grupes, taikyti bron ­
choalveolin į plovimą (BAP), atlikti neurologinius tyrimus ir papildomus kliniki ­
nius patologinius bei histopatologinius tyrimus, kad b ūtų galima geriau apib ūdinti 
bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą. 
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 412 (OECD 
bandymo gair ės Nr. 412) (2009). Originalios po ūmio toksiškumo įkvėpus 
bandymo gair ės „Test Guideline“ 412 (TG 412) priimtos 1981 m. (1). Šis 
(B.8) bandymo metodas (lygiavertis atnaujintosioms TG 412) atnaujintas 
siekiant jį suderinti su mokslo pasiekimais ir patenkinti dabartines ir b ūsimas 
reglamentavimo reikmes.  
2. Šis metodas suteikia galimyb ę apibūdinti neigiam ą poveikį, sukeltą 28 
dienas kasdien per kv ėpavimo takus duodant kartotin ę bandomosios 
cheminės medžiagos doz ę. Atlikus 28 dien ų poūmio toksiškumo įkvėpus 
tyrimus gauti duomenys gali b ūti naudojami kokybiniams rizikos vertini ­
mams [jeigu po to neatliekamas 90 dien ų pusiau lėtinio toksiškumo įkvėpus 
tyrimas (šio priedo B.29 skyrius)]. Šie duomenys taip pat gali suteikti 
informacijos d ėl koncentracij ų parinkimo ilgesnio laikotarpio tyrimams, 
pvz., 90 dien ų pusiau l ėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimui. Šis bandymo 
metodas n ėra specialiai skirtas nanomedžiag ų bandymams. Aprašant š į 
bandymo metod ą vartojamos apibr ėžtys pateiktos šio skyriaus pabaigoje ir 
rekomendaciniame dokumente Nr. 39 (2).  
PIRMINIAI ASPEKTAI  
3. Siekdama užtikrinti aukštesn ę tyrimo kokyb ę ir kaip galima labiau sumažinti 
gyvūnų naudojim ą, bandym ų laboratorija, prieš atlikdama tyrim ą, turėtų 
įvertinti vis ą turimą informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiag ą. Pasi­
rinkti tinkamas bandym ų koncentracijas gali pad ėti informacija apie bando ­
mosios chemin ės medžiagos tapatum ą, chemin ę struktūrą, fizines ir 
chemines savybes, taip pat toksiškumo bandym ų in vitro  arba  in vivo  rezul­
tatai, numatomas (-i) panaudojimo b ūdas (-ai) ir galimas poveikis žmogui, 
turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struk ­
tūros chemines medžiagas, taip pat duomenys, gauti atlikus ūmaus toksiš ­
kumo įkvėpus bandymus. Jeigu yra tik ėtinas arba jeigu atliekant tyrim ą 
pastebimas neurotoksinis poveikis, tyrimo vadovas gali nuspr ęsti įtraukti 
atitinkamus vertinimus, pvz., funkcini ų stebėjimų rinkinį (FSR) ir jud ėjimo 
aktyvumo vertinim ą. Nors gali b ūti labai svarbu užtikrinti tinkam ą su 
konkrečiais tyrimais susijusi ų dozių davimo laik ą, ši papildoma veikla netu ­
rėtų trukdyti įgyvendinti pagrindinio tyrimo plan ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Ėsdinančių arba dirginan čių bandomųjų cheminių medžiagų tirpalai gali b ūti 
bandomi taikant koncentracijas, kurioms esant pasiekiamas reikiamas toksiš ­
kumo lygis [žr. RD Nr. 39 (2)]. Ta čiau veikiant gyv ūnus šiomis medžia ­
gomis taikytinos tikslin ės koncentracijos tur ėtų būti gana mažos, kad nesu ­
keltų ženklaus skausmo ir kan čių, bet pakankamos, kad b ūtų galima prat ęsti 
koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ės kreivę iki tokių lygių, 
kuriems esant b ūtų pasiektas reglamentavimo arba mokslinis tikslas, kurio 
siekiama bandymu. Šios koncentracijos tur ėtų būti parenkamos atsižvelgiant 
į konkretų atvejį ir, pageidautina, remiantis tinkamai suplanuotu rib ų nusta­
tymo tyrimu, suteikian čiu informacijos apie pavojingas pasekmes, dirginimo 
ribinę vertę ir poveikio pasireiškimo laik ą (žr. 11–13 skirsnius). Tur ėtų būti 
pateiktas koncentracijos pasirinkimo pagrindimas.  
5. Gaištantys gyv ūnai arba skausm ą ar sunkias ilgalaikes kan čias akivaizdžiai 
patiriantys gyv ūnai turėtų būti humaniškai numarinami. Gaištantys gyv ūnai 
laikomi atliekant bandym ą nugaišusiais gyv ūnais. Sprendimo numarinti gaiš ­
tančius arba sunkiai ken čiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos 
arba neišvengiamos ž ūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti OECD 
rekomendaciniame dokumente d ėl pasekmi ų žmonėms (3).  
METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
6. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų labora­
torinių padermių graužikai. Tinkamiausia r ūšis yra žiurk ės. Jeigu naudojama 
kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.  
Gyvūnų paruošimas  
7. Patel ės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Atsitiktin ės atrankos dien ą 
gyvūnai turėtų būti jauni, bet suaug ę, 7–9 savai čių amžiaus. K ūno masė 
pagal kiekvien ą lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti vidutin ę tos lyties 
gyvūnų masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka, paženklinami, kad 
būtų įmanoma identifikuoti kiekvien ą gyvūną, ir ne mažiau kaip penkias 
paras iki bandymo pradžios laikomi savo narveliuose, kad priprast ų prie 
laboratorini ų sąlygų. 
Gyvūnų laikymas  
8. Kad b ūtų patogiau steb ėti ir kad b ūtų išvengta painiavos, kiekvienas 
gyvūnas turėtų būti išskirtinai paženklintas, jeigu įmanoma, naudojant 
poodinius atsakiklius. Bandom ųjų gyvūnų laikymo patalpos temperat ūra 
turėtų būti 22 ± 3 °C. Tinkamiausias santykinis dr ėgnis – 30–70 %, bet 
jis gali b ūti nepasiekiamas, jeigu naudojamas nešiklis n ėra vanduo. Prieš 
dozės davimą ir davus doz ę gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirs ­
tyti grupėmis pagal lyt į ir koncentracij ą; narvelyje laikom ų gyvūnų skaičius 
turėtų būti toks, kad b ūtų galima aiškiai steb ėti kiekvien ą gyvūną ir kad būtų 
patiriama kuo mažiau žalos d ėl kanibalizmo ir grumtyni ų. Jeigu doz ė gyvū­
nams duodama tik per nos į, gali reik ėti juos pripratinti prie uždarom ųjų 
vamzdelių. Uždaromieji vamzdeliai gyv ūnams netur ėtų kelti didel ės fizinės, 
terminės arba suvaržymo įtampos. Varžymas gali tur ėti fiziologini ų 
pasekmių, pvz., tur ėti poveikio k ūno temperat ūrai (hipertermija) ir (arba) 
per minut ę įkvepiamam t ūriui. Jeigu yra bendr ųjų duomenų, rodančių, kad 
tokių pastebim ų pokyčių neįvyksta, pripratinimas prie uždarom ųjų vamz­
delių nebūtinas. Gyv ūnai, kurių visas kūnas veikiamas aerozoliu, poveikio 
laikotarpiu tur ėtų būti laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis neb ūtų 
filtruojamas per kit ų narvelyje esan čių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laiko ­
tarpį, gyvūnams šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas 
pašaras, duodant neribot ą geriamo vandens kiek į. Apšvietimas tur ėtų būti 
dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sek ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Inhaliacin ės kameros  
9. Parenkant inhaliacin ę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios 
cheminės medžiagos pob ūdį ir bandymo tiksl ą. Pirmenyb ė teikiama doz ės 
davimui tik per nos į (ši sąvoka apima s ąvokas „tik per galv ą“, „tik per nos į“ 
ir „tik per šnip ą“). Pirmenyb ė dozės davimui tik per nos į paprastai teikiama 
tiriant skyst ųjų arba kiet ųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali konden ­
suotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali b ūti sėkmingiau 
pasiekti taikant poveikio per vis ą kūną metodą, tačiau tai turi b ūti pagrįsta 
tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovum ą naudojant 
poveikio per vis ą kūną kamerą, visa bandom ųjų gyvūnų užimama erdv ė 
turėtų neviršyti 5 % kameros t ūrio. Poveikio tik per nos į ir poveikio per 
visą kūną metodų principai ir konkret ūs šių metodų privalumai bei tr ūkumai 
aprašyti RD Nr. 39 (2).  
TOKSIŠKUMO TYRIMAI  
Ribinės koncentracijos  
10. Kitaip nei ūmaus poveikio tyrimams, 28 dien ų poūmio toksiškumo įkvėpus 
tyrimams ribini ų koncentracij ų nenustatyta. Didžiausioji bandytina koncent ­
racija tur ėtų būti nustatoma atsižvelgiant į šiuos dalykus: 1) didžiausi ąją 
pasiekiam ą koncentracij ą, 2) „blogiausiu atveju“ taikytin ą poveikio 
žmonėms lygį, 3) poreik į užtikrinti tinkam ą deguonies tiekim ą ir (arba) 4) 
gyvūnų gerovės aspektus. Jeigu n ėra duomenimis pagr įstų ribų, gali būti 
taikomos Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 (13) nustatytos ūmaus poveikio 
ribos (t. y. neviršijant 5 mg/l koncentracijos, jeigu tai aerozoliai, 20 mg/l, 
jeigu tai garai, ir 20 000 ppm, jeigu tai dujos); žr. RD Nr. 39 (2). Jeigu 
atliekant duj ų arba labai laki ų bandom ųjų chemini ų medžiag ų (pvz., 
šaldymo medžiag ų) bandymus b ūtina viršyti šias ribas, turi b ūti pateiktas 
pagrindimas. Ribin ė koncentracija tur ėtų sukelti akivaizd ų toksiškum ą nesu­
keldama pernelyg didelio streso gyv ūnams ir netrumpindama j ų gyvenimo 
trukmės (3).  
Ribų nustatymo tyrimas  
11. Prieš pradedant pagrindin į tyrimą, gali reik ėti atlikti rib ų nustatymo tyrim ą. 
Ribų nustatymo tyrimas yra išsamesnis už orientacin į tyrimą, nes jis susij ęs 
ne tik su koncentracij ų parinkimu. Per rib ų nustatymo tyrim ą gautos žinios 
gali padėti sėkmingai atlikti pagrindin į tyrimą. Pvz., rib ų nustatymo tyrimas 
gali suteikti technin ės informacijos apie analiz ės metodus, daleli ų dydžius, 
toksinio poveikio mechanizm ų nustatym ą, klinikin ės patologijos ir histopa ­
tologinių tyrimų duomenis ir apytikrius vertinimus, koks NNPL ir kokia 
didžiausioji leidžiama koncentracija (DLK) gal ėtų būti taikomi atliekant 
pagrindin į tyrimą. Tyrimo vadovas gali nuspr ęsti atlikti rib ų nustatymo 
tyrimą, kad nustatyt ų kvėpavimo tak ų dirginimo ribin ę vertę (pvz., atliekant 
histopatologin į kvėpavimo tak ų tyrimą, plaučių funkcijos tyrimus arba bron ­
choalveolin į plovimą), didžiausi ąją koncentracij ą, kuri būtų leidžiama kaip 
nesukelianti pernelyg didelio streso gyv ūnams, ir parametrus, kuriais b ūtų 
geriausiai apib ūdinamas bandomosios chemin ės medžiagos toksiškumas.  
12. Ribų nustatymo tyrimas gali b ūti atliekamas taikant vien ą arba daugiau 
koncentracijos lygi ų. Kiekvienas koncentracijos lygis tur ėtų būti bandomas 
naudojant ne daugiau kaip tris patinus ir tris pateles. Rib ų nustatymo tyrimas 
turėtų trukti ne mažiau kaip penkias dienas, bet paprastai – ne ilgiau kaip 14 
dienų. Tyrimo ataskaitoje tur ėtų būti pateiktas per pagrindin į tyrimą taiky­
tinų koncentracij ų parinkimo pagrindimas. Pagrindinio tyrimo tikslas – 
įrodyti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ę remiantis numa ­
noma sunkiausia pasekme. Tinkamiausia mažiausioji koncentracija – nepas ­
tebimo neigiamo poveikio lygio koncentracija, didžiausioji – akivaizd ų 
toksiškum ą sukelianti koncentracija, nesukelianti pernelyg didelio streso 
gyvūnams ir netrumpinanti j ų gyvenimo trukm ės (3).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Parenkant per rib ų nustatymo tyrim ą taikytinus koncentracijos lygius, tur ėtų 
būti atsižvelgiama į visą turimą informacij ą, įskaitant strukt ūros ir savybi ų 
ryšius ir duomenis apie panašias chemines medžiagas (žr. 3 skirsn į). Ribų 
nustatymo tyrimu gali b ūti patikrintos ir (arba) atmestos pasekm ės, kurios 
laikomos sunkiausiomis mechaniniu poži ūriu vertinamomis pasekm ėmis, 
pvz., cholinesteraz ės inhibavimas organiniais fosforo junginiais, methemo ­
globino susidarymas veikiant eritrocitotoksin ėms medžiagoms, skydliauk ės 
hormonų (T  3 , T 4 ) reakcija į tirotoksines medžiagas, poveikis baltymams, 
laktatdehidrogenazei arba neutrofilams atliekant bronchoalveolin į plovimą, 
siekiant pašalinti nekenksmingas prastai tirpstan čias daleles arba plau čius 
dirginančius aerozolius.  
Pagrindinis tyrimas  
14. Pagrindinis po ūmio toksiškumo tyrimas paprastai atliekamas taikant tris 
koncentracijos lygius ir prireikus taikant vienalaik ę neigiam ą kontrolę 
(naudojant or ą) ir (arba) nešiklio kontrol ę (žr. 17 skirsn į). Parenkant 
poveikio lygius tur ėtų būti pasitelkiami visi turimi duomenys, įskaitant siste ­
minio toksiškumo tyrim ų rezultatus, metabolizmo ir kinetini ų savybių 
duomenis (labai svarbu užtikrinti, kad neb ūtų taikomos tokios didžiausiosios 
koncentracijos, kuriomis b ūtų įsotinti kinetiniai procesai). Kiekviena bando ­
moji grup ė sudaroma iš ne mažiau kaip dešimties graužik ų (penkių patinų ir 
penkių patelių), kurie keturi ų savaičių laikotarpiu (bendra tyrimo trukm ė – 
28 dienos) penkias dienas per savait ę šešias valandas per par ą veikiami 
bandomąja chemine medžiaga. Gyv ūnai gali b ūti veikiami ir septynias 
dienas per savait ę (pvz., tiriant įkvepiamus vaistus). Jeigu žinoma, kad 
kurios nors lyties gyv ūnai yra jautresni konkre čiai bandomajai cheminei 
medžiagai, siekiant nustatyti kuo tikslesn ę koncentracijos ir reakcijos tarpu ­
savio priklausomyb ę, kaip aprašyta 15 skirsnyje, skirting ų lyčių gyvūnams 
gali būti taikomi skirtingi koncentracijos lygiai. Jeigu naudojant kitos r ūšies 
graužikus nei žiurk ės dozė duodama tik per nos į, ilgiausia poveikio trukm ė 
gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos r ūšies gyvūnų patiriam ą 
kančią. Jeigu taikomas trumpesnis nei šeši ų valandų per par ą poveikis 
arba jeigu b ūtina atlikti ilgalaikio (pvz., 22 valand ų per parą) poveikio per 
visą kūną tyrimą, turėtų būti pateiktas atitinkamas pagrindimas [žr. RD 
Nr. 39 (2)]. Poveikio metu gyv ūnas neturėtų būti šeriamas, išskyrus atvejus, 
kai poveikio trukm ė ilgesnė kaip šešios valandos. Vandens gali b ūti 
duodama per vis ą poveikio per vis ą kūną laikotarp į. 
15. Turėtų būti nurodyta, kokiam organui (-ams) skirtos pasirinktos tikslin ės 
koncentracijos, ir taikant šias koncentracijas tur ėtų būti užtikrinta aiški 
koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ė: 
— taikant didžiausi ąją koncentracij ą turėtų būti padarytas toksinis poveikis, 
tačiau netur ėtų pasireikšti ilgalaiki ų požymių arba gyv ūnai netur ėtų 
nugaišti, nes tokiu atveju neb ūtų galima atlikti prasmingo vertinimo,  
— tarpinis (-iai) koncentracijos lygis (-iai) tur ėtų skirtis tiek, kad b ūtų 
galima nustatyti toksinio poveikio lygius tarp mažiausiosios ir didžiau ­
siosios koncentracijos,  
— taikant mažiausi ąją koncentracij ą neturėtų būti daroma toksinio poveikio 
ir neturėtų būti pastebima jo požymi ų. 
Pagalbinis (gr įžtamumo) tyrimas  
16. Siekiant nustatyti toksinio poveikio gr įžtamumą, tvarum ą arba dels ą, 
reikiamos trukm ės, bet ne ilgesniu kaip 14 dien ų laikotarpiu po doz ės 
davimo gali b ūti atliekamas pagalbinis (gr įžtamumo) tyrimas. Pagalbin ės 
(grįžtamumo tyrim ų) grupės sudaromos iš penki ų patinų ir penkių patelių, 
kurie per pagrindin į tyrimą veikiami kartu su bandomaisiais gyv ūnais. 
Pagalbinės (grįžtamumo) grup ės turėtų būti veikiamos didžiausi ąja bando­
mosios chemin ės medžiagos koncentracija; prireikus tur ėtų būti taikoma 
vienalaikė kontrolė naudojant or ą ir (arba) nešikl į (žr. 17 skirsn į). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Kontroliniai gyv ūnai 
17. Su vienalaik ės neigiamos kontrol ės (naudojant or ą) gyvūnais turėtų būti 
elgiamasi taip pat, kaip su bandomosios grup ės gyvūnais, išskyrus tai, kad 
jie veikiami išvalytu oru, o ne bandom ąja chemine medžiaga. Jeigu siekiant 
palengvinti bandymo atmosferos suk ūrimą naudojamas vanduo arba kita 
cheminė medžiaga, atliekant tyrim ą naudojama nešiklio kontrol ės grupė, o 
ne neigiamos kontrol ės (naudojant or ą) grupė. Jeigu įmanoma, kaip nešiklis 
turėtų būti naudojamas vanduo. Jeigu kaip nešiklis naudojamas vanduo, 
kontroliniai gyv ūnai turėtų būti veikiami oru, kurio dr ėgnis turėtų būti 
toks pat, koks taikomas grup ėms, kurioms duodama doz ė. Tinkamas nešiklis 
turėtų būti parenkamas remiantis tinkamai atliktu išankstiniu tyrimu arba 
istoriniais duomenimis. Jeigu nešiklio toksiškumas n ėra gerai žinomas, 
tyrimo vadovas gali nuspr ęsti taikyti ir neigiam ą kontrolę (naudojant or ą), 
ir nešiklio kontrol ę, tačiau primygtinai rekomenduojama to nedaryti. Jeigu 
istoriniai duomenys rodo, kad nešiklis netoksiškas, neigiamos kontrol ės 
(naudojant or ą) grupės naudoti neb ūtina, turėtų būti taikoma tik nešiklio 
kontrolė. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos bandomosios chemin ės medžiagos 
išankstinį tyrimą nustatoma, kad medžiaga n ėra toksiška, vadinasi, ir 
nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, n ėra toksiškas, tod ėl turėtų būti taikoma 
kontrolė naudojant š į nešiklį. 
POVEIKIO S ĄLYGOS  
Koncentracij ų taikymas  
18. Gyvūnai veikiami bandom ąja medžiaga duj ų, garų, aerozoli ų arba jų mišinių 
pavidalu. Per tyrim ą naudotina fizin ė būsena priklauso nuo fizini ų ir 
cheminių bandomosios chemin ės medžiagos savybi ų, pasirinktos koncentra ­
cijos ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant bandomąją cheminę medžiag ą. Higroskopin ės ir chemiškai reaguojan čios 
bandomosios chemin ės medžiagos tur ėtų būti bandomos sauso oro s ąly­
gomis. Tur ėtų būti imamasi atsargumo priemoni ų, kad būtų išvengta sprogi ų 
koncentracij ų susidarymo. Iš daleli ų sudaryta medžiaga gali b ūti apdorojama 
mechaniškai, siekiant sumažinti daleli ų dydį. Daugiau patarim ų pateikta RD 
Nr. 39 (2).
 
Dalelių dydžio pasiskirstymas  
19. Daleli ų rūšiavimas pagal dyd į turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir 
garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis b ūtų pada­
rytas visoms svarbioms kv ėpavimo tak ų sritims, rekomenduojama naudoti 
aerozolius, kuri ų masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 
1–3 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis ( σ g ) – 1,5–3,0 (4). Nors tur ėtų 
būti imamasi pagr įstų priemoni ų, kad šio standarto b ūtų laikomasi, jeigu jo 
įgyvendinti ne įmanoma, tur ėtų būti pateikta ekspert ų nuomonė. Pvz., metal ų 
garų dalelės gali būti mažesn ės už šį standartą, o įelektrintų dalelių ir 
pluoštų – didesn ės. 
Bandomosios chemin ės medžiagos paruošimas nešiklyje  
20. Geriausia, kad bandomoji chemin ė medžiaga b ūtų bandoma nenaudojant 
nešiklio. Jeigu b ūtina naudoti nešikl į norint pasiekti reikiam ą bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracij ą ir užtikrinti reikiam ą dalelių dydį, pirme­
nybė turėtų būti teikiama vandeniui. Visuomet, kai bandomoji chemin ė 
medžiaga ištirpinama nešiklyje, tur ėtų būti įrodytas jos stabilumas.  
POVEIKIO S ĄLYGŲ STEBĖJIMAS  
Oro srautas kameroje  
21. Kiekvieno poveikio metu tur ėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas 
ir ne rečiau kaip kart ą per valand ą registruojamas per poveikio kamer ą 
tekantis oro srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pastovumo laiko atžvilgiu) steb ėjimas realiuoju laiku yra vienas 
iš visų dinamini ų parametr ų matavim ų, suteikiantis galimyb ę netiesiogiai 
kontroliuoti visus svarbius dinaminius inhaliacinius parametrus. Jeigu
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
koncentracija stebima tiesiogiai, oro sraut ų matavimo dažnumas gali b ūti 
sumažintas iki vieno matavimo kiekvien ą dieną per kiekvien ą poveikio 
seansą. Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas tam, kad b ūtų išvengta 
pakartotinio įkvėpimo doz ės davimo tik per nos į kamerose. Deguonies 
koncentracija tur ėtų būti ne mažesn ė kaip 19 %, anglies dioksido – ne 
didesnė kaip 1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad šio standarto įgyvendinti 
neįmanoma, tur ėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncent ­
racijos. Jeigu pirm ąją poveikio dien ą atlikti matavimai rodo, kad ši ų dujų 
lygiai yra tinkami, daugiau matavim ų atlikti neb ūtina. 
Kameros temperat ūra ir santykinis dr ėgnis 
22. Kameroje tur ėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperat ūra. Ir doz ę duodant tik 
per nosį, ir per vis ą kūną, jeigu įmanoma, per kiekvien ą poveikio seans ą 
turėtų būti nuolat stebimas ir kas valand ą registruojamas santykinis dr ėgnis 
gyvūnų kvėpavimo zonoje. Tinkamiausias santykinis dr ėgnis – 30–70 %, 
tačiau jis gali b ūti nepasiekiamas (pvz., bandant vandens pagrindo mišinius) 
arba neišmatuojamas d ėl trukdži ų, atsirandan čių bandomajai cheminei 
medžiagai taikant bandymo metod ą. 
Bandomoji chemin ė medžiaga. Vardin ė koncentracija  
23. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardin ė koncentra ­
cija poveikio kameroje. Vardin ė koncentracija yra sukurtos bandomosios 
cheminės medžiagos mas ės ir viso oro srauto, perleisto per inhaliacini ų 
kamerų sistemą, tūrio santykis. Vardin ė koncentracija n ėra naudojama 
apibūdinti poveik į gyvūnui, tačiau, vardin ę koncentracij ą palyginus su 
faktine, nustatomas generavimo, kur į užtikrina bandym ų sistema, efekty ­
vumas, kuriuo remiantis galima nustatyti generavimo problemas.  
Bandomoji chemin ė medžiaga. Faktin ė koncentracija  
24. Faktin ė koncentracija yra bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija, 
nustatyta pa ėmus ėminį iš inhaliacin ėje kameroje esan čios gyvūno kvėpa­
vimo zonos. Faktines koncentracijas galima nustatyti specialiaisiais metodais 
(pvz., taikant tiesioginio ėminių ėmimo, adsorbcijos arba chemini ų reakcijų 
metodus ir tada atliekant analizin į apibūdinimą) arba nespecialiaisiais meto ­
dais, pvz., atliekant gravimetrin ę analizę naudojant filtrus. Gravimetrin ė 
analizė gali būti taikoma tik vienos sudedamosios dalies milteli ų aerozo­
liams arba mažo lakumo skyst ųjų dalelių aerozoliams ir tur ėtų būti grin­
džiama tinkamais prieš tyrim ą atliktais bandomosios chemin ės medžiagos 
savybių apibūdinimais. Iš daugiau kaip vienos sudedamosios dalies sudaryt ų 
miltelių aerozoli ų koncentracijos taip pat gali b ūti nustatomos atliekant 
gravimetrin ę analizę. Tačiau tam reikalingi analitiniai duomenys, įrodantys, 
kad ore esan čios medžiagos sud ėtis panaši į pirminės medžiagos sud ėtį. 
Jeigu tokios informacijos n ėra, tyrimo metu gali reik ėti vienodais intervalais 
atlikti pakartotin ę bandomosios chemin ės medžiagos (geriausia, kad ji b ūtų 
ore) analiz ę. Jeigu aerozolin ės medžiagos gali garuoti arba sublimuoti, tur ėtų 
būti įrodyta, kad pasirinktu metodu surinktos visos faz ės. 
25. Jeigu įmanoma, per vis ą tyrimą turėtų būti naudojama viena bandomosios 
cheminės medžiagos partija, o bandomasis ėminys tur ėtų būti laikomas 
tokiomis s ąlygomis, kad b ūtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir 
stabilumas. Prieš pradedant tyrim ą reikėtų apibūdinti bandomosios chemin ės 
medžiagos savybes, įskaitant jos grynum ą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, 
tapatumą, taip pat nustatyt ų teršalų ir priemaiš ų kiekius. Be kit ų duomenų, 
tai galima pagr įsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiau ­
sios koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektrosko ­
pinę arba duj ų chromatografijos analiz ę, arba kitais įverčiais. Nors bando ­
mojo ėminio tapatumo nustatymas n ėra bandym ų laboratorijos pareiga, 
bandymų laboratorijai gali b ūti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateik ėjo 
nurodytas savybes (pvz., spalv ą, fizinę būseną ir t. t.).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti palaikoma pastovi poveikio atmosfera. Poveikio 
sąlygų pastovumui įrodyti gali b ūti naudojamas steb ėjimo realiuoju laiku 
prietaisas, pvz., aerozoliams gali b ūti naudojamas aerozoli ų fotometras, 
garams – bendro angliavandenili ų kiekio analizatorius. Faktin ė kameroje 
susidariusi koncentracija tur ėtų būti matuojama kiekvien ą poveikio dien ą, 
ne mažiau kaip tris kartus pagal kiekvien ą poveikio lyg į. Jeigu tai ne įma­
noma dėl nedideli ų oro srauto grei čių arba maž ų koncentracij ų, gali būti 
imamas vienas ėminys per vien ą poveikio laikotarp į. Būtų geriausia, kad 
tokiu atveju šis ėminys būtų imamas per vis ą poveikio laikotarp į. Atskiri 
kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai netur ėtų nukrypti nuo vidu ­
tinės kameroje susidariusios koncentracijos daugiau kaip ± 10 %, kai 
tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip ± 20 %, kai tiriami skyst ųjų 
arba kietųjų dalelių aerozoliai. Tur ėtų būti apskaičiuotas ir ataskaitoje nuro ­
dytas pusiausvyros nusistov ėjimo kameroje laikotarpis (t  95 ). Poveikio laiko ­
tarpis apima bandomosios chemin ės medžiagos suk ūrimo trukm ę. Į šį laiko­
tarpį įtraukiamas pusiausvyros nusistov ėjimo kameroje laikotarpis (t  95 ) ir 
irimo laikas. t  95 apskaičiavimo gair ės pateiktos RD Nr. 39 (2).  
27. Jeigu tiriami labai sud ėtingi mišiniai, sudaryti iš duj ų ir (arba) gar ų, ir 
aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios chemin ės medžiagos, 
pučiamos iš specialiai varom ų galutinio naudojimo produkt ų arba prietais ų), 
kiekvienos faz ės veikimas inhaliacin ėje kameroje gali b ūti skirtingas. Tod ėl 
iš kiekvienos faz ės (dujų ir (arba) gar ų ir aerozolio) tur ėtų būti parinkta bent 
viena indikacin ė cheminė medžiaga (analit ė); paprastai šiuo tikslu pasiren ­
kama pagrindin ė veiklioji mišinio chemin ė medžiaga. Jeigu bandomoji 
cheminė medžiaga yra mišinys, tur ėtų būti nurodyta viso mišinio, o ne tik 
veikliosios sudedamosios dalies arba indikacin ės chemin ės medžiagos 
(analitės) analizin ė koncentracija. Daugiau informacijos apie faktines 
koncentracijas pateikta RD Nr. 39 (2).  
Bandomoji chemin ė medžiaga. Daleli ų dydžio pasiskirstymas  
28. Aerozoli ų dalelių dydžio pasiskirstymas tur ėtų būti nustatomas bent kart ą 
per savait ę pagal kiekvien ą koncentracijos lyg į, naudojant pakopin į ėmiklį 
arba alternatyv ų prietaisą, pvz., aerodinamin į dalelių rūšiuotuvą (ADR). 
Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu ir alternatyviu prietaisu gaunami 
lygiaverčiai rezultatai, atliekant tyrim ą gali būti naudojamas alternatyvus 
prietaisas.  
29. Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju veiksmingumu, kartu 
su pagrindiniu prietaisu tur ėtų būti naudojamas antrasis prietaisas, pvz., 
gravimetrinis filtras, gaudykl ė arba barboteris. Atlikus daleli ų dydžio analiz ę 
nustatyta mas ės koncentracija tur ėtų neviršyti priimtin ų filtruojamosios 
analizės būdu nustatytos mas ės koncentracijos rib ų [žr. RD Nr. 39 (2)]. 
Jeigu, taikant visas bandomas koncentracijas, lygiavertiškum ą galima įrodyti 
pradiniame tyrimo etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyv ūnų gerovės sumetimais tur ėtų būti imamasi priemoni ų, kad 
būtų kuo mažiau negalutini ų duomen ų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti 
tyrimą.
 
30. Garuose esan čios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek 
tikėtina, kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu gar ų 
atmosferoje aptinkama daleli ų, dėl kurių gali susidaryti mišri ų fazių. 
STEBĖJIMAI  
31. Prieš poveikio laikotarp į, poveikio laikotarpiu ir pasibaigus poveikio laiko ­
tarpiui, tur ėtų būti atliekami klinikiniai gyv ūnų stebėjimai. Atsižvelgiant į 
gyvūnų reakciją poveikio laikotarpiu, steb ėjimus gali reik ėti atlikti dažniau. 
Jeigu gyv ūnų stebėjimą apsunkina gyv ūnų uždarom ųjų vamzdeli ų naudo­
jimas, prastas poveikio per vis ą kūną kamerų apšvietimas arba neskaidrios 
atmosferos, gyv ūnai turėtų būti atidžiai apži ūrimi po doz ės davimo. Steb ė­
jimais prieš kitos dienos poveik į galima įvertinti toksinio poveikio gr įžta­
mumą arba pasunk ėjimą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Visi steb ėjimai registruojami, išsaugant atskirus įrašus apie kiekvien ą 
gyvūną. Kai gyv ūnai numarinami d ėl humanišk ų priežasčių arba randami 
nugaišę, kiek įmanoma tiksliau užregistruojamas ž ūties laikas.  
33. Narveliuose tur ėtų būti stebimi odos ir kailio, aki ų ir gleivin ės, kvėpavimo ir 
kraujotakos sistem ų, centrinės nervų sistemos, somatomotorin ės veiklos ir 
elgsenos pakitimai. Ypa č reikėtų stebėti, ar nepasireiškia drebulys, trauku ­
liai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos b ūsenos, ar neteka seil ės. 
Matuojant temperat ūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti patvirtinam ųjų sulė­
tėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios temperat ūros įrodymų, 
susijusių su dozės davimu arba izoliavimu. Į tyrimo protokol ą gali būti 
įtraukti papildomi vertinimai, pvz., kinetikos, biomonitoringo, plau čių funk­
cijos, plau čių audinyje besikaupian čių mažo tirpumo medžiag ų užsilaikymo 
ir elgsenos poky čių. 
KŪNO MAS Ė 
34. Kiekvieno gyv ūno masė turėtų būti registruojama prieš pat pirm ąjį poveikį 
(nulinę dieną), o vėliau – dukart per savait ę (pvz., pirmadieniais ir penkta ­
dieniais, siekiant įrodyti gyv ūnų atsigavim ą per savaitgal į, kai nedaroma 
poveikio, arba tokiais laiko intervalais, kad b ūtų galima įvertinti sistemin į 
toksiškum ą) ir kai gyv ūnas nugaišta arba yra numarinamas. Jeigu per pirm ą­
sias dvi savaites nepasireiškia jokio poveikio, likusiu tyrimo laikotarpiu 
kūno masė gali būti matuojama kas savait ę. Pagalbiniai (gr įžtamumo tyrim ų) 
gyvūnai (jeigu naudojami) atsigavimo laikotarpiu tur ėtų būti ir toliau 
sveriami kas savait ę. Baigus tyrim ą, visi gyv ūnai turėtų būti pasverti 
netrukus po numarinimo, kad b ūtų galima tiksliai apskai čiuoti organ ų ir 
kūno masių santykius.  
PAŠARŲ IR VANDENS SUVARTOJIMAS  
35. Pašar ų suvartojimas tur ėtų būti matuojamas kas savait ę. Gali būti matuo­
jamas ir vandens suvartojimas.  
KLINIKIN Ė PATOLOGIJA  
36. Klinikin ės patologijos vertinimai tur ėtų būti taikomi visiems gyv ūnams, 
įskaitant kontrolinius ir pagalbinius (gr įžtamumo tyrim ų) gyvūnus, kai jie 
numarinami. Tur ėtų būti užregistruotas laikotarpis nuo poveikio pabaigos iki 
kraujo pa ėmimo, ypa č jeigu tiriama pasekm ė sparčiai nyksta. Ėminių 
ėmimas baigus duoti doz ę būtinas pagal tuos parametrus, kuriems b ūdingas 
trumpas plazmos pusin ės eliminacijos laikas (pvz., COHb, CHE ir MetHb).  
37. 1 lentel ėje nurodyti klinikin ės patologijos parametrai, kurie paprastai priva ­
lomi atliekant visus toksikologinius tyrimus. Nereikalaujama visada atlikti šlapimo analiz ę, tačiau ji gali b ūti atliekama, jeigu manoma, kad tai b ūtų 
naudinga atsižvelgiant į numatom ą arba nustatyt ą toksiškum ą. Kad būtų 
geriau apib ūdintas bandomosios chemin ės medžiagos toksiškumas, tyrimo 
vadovas gali nuspr ęsti įvertinti papildomus parametrus (pvz., cholinesteraz ė, 
lipidai, hormonai, r ūgščių ir bazių balansas, methemoglobinas arba Heinco 
kūneliai, kreatino kinaz ė, mieloidų ir eritroid ų santykis, troponinai, arterinio 
kraujo dujos, laktato dehidrogenaz ė, sorbitolio dehidrogenaz ė, glutamato 
dehidrogenaz ė ir gamaglutamiltranspeptidaz ė.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
1 lentelė 
Įprastiniai klinikin ės patologijos parametrai  
Hematologiniai tyrimai  
Eritrocitų kiekis 
Hematokritas 
Hemoglobino koncentracija 
Vidutinis hemoglobino kiekis eritroci ­
tuose 
Vidutinis eritrocito t ūris 
Vidutinė eritrocit ų hemoglobino 
koncentracija 
Retikulocitai  Bendras leukocit ų kiekis 
Įvairių leukocitų kiekiai 
Trombocit ų kiekis 
Krešėjimo aktyvumas (pasirinkti 
vieną rodiklį): 
— Protrombino laikas 
— Krešėjimo laikas 
— Dalinis tromboplastino laikas  
Klinikinės chemijos tyrimai  
Gliukozė (*) 
Bendras cholesterolio kiekis 
Trigliceridai 
Kraujo šlapalo azoto kiekis Bendras bilirubino kiekis Kreatininas 
Bendras baltym ų kiekis 
Albuminas Globulinas
 Alanino aminotransferaz ė 
Aspartato aminotransferaz ė 
Šarminė fosfatazė 
Kalis Natris Kalcis 
Fosforas 
Chloridas
 
Šlapimo analiz ė (neprivaloma)  
Išvaizda (spalva ir drumstumas) 
Tūris 
Savitasis svoris arba osmosinis sl ėgis 
pH Bendras baltym ų kiekis 
Gliukozė 
Kraujas ir (arba) kraujo k ūneliai  
(*) Kadangi d ėl ilgo neš ėrimo laikotarpio gali atsirasti gliukoz ės kiekio matavimo 
skirtumų, lyginant gavusius doz ę ir kontrolinius gyv ūnus, tyrimo vadovas tur ėtų 
nustatyti, ar reik ėtų nešerti gyv ūnų. Jeigu taikomas neš ėrimo laikotarpis, jis tur ėtų 
būti pritaikytas naudojamai r ūšiai; žiurk ėms turėtų būti taikomas 16 val. laiko ­
tarpis (neš ėrimas per nakt į). Gliukoz ės kiekis nešeriam ų gyvūnų organizme gali 
būti nustatomas po neš ėrimo per nakt į paskutini ąją poveikio savait ę arba po 
nešėrimo per nakt į prieš skrodim ą (pastaruoju atveju – kartu su visais kitais 
patologijos parametrais).  
38. Jeigu yra įrodymų, kad pagrindin ė kaupimosi ir užsilaikymo vieta yra apati ­
niai kvėpavimo takai (t. y. alveol ės), tada, norint kiekybiškai išanalizuoti 
prielaidomis pagr įsto dozės poveikio parametrus, daugiausia d ėmesio 
skiriant alveolitui, plau čių uždegimui ir fosfolipidozei, b ūtų galima rinktis 
bronchoalveolinio plovimo (BAP) metod ą. Šis metodas suteikia galimyb ę 
tinkamai ištirti doz ės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ę ir per tam tikr ą 
laiką įvykusius alveoli ų pažeidim ų pokyčius. BAP skystis gali b ūti anali­
zuojamas siekiant nustatyti įvairių leukocitų kiekius, bendr ą baltymų kiekį ir 
laktato dehidrogenaz ę. Kiti parametrai, į kuriuos b ūtų galima atsižvelgti, yra 
parametrai, rodantys lizosom ų pažeidimus, fosfolipidoz ę, fibrozę ir dirgina ­
mąjį arba alergin į uždegim ą, galbūt įtraukiant uždegim ą sukeliančių citokinų 
ir (arba) chemokin ų tyrimą. BAP matavimais paprastai papildomi histopa ­
tologinių tyrimų rezultatai, ta čiau BAP matavimai negali atstoti ši ų tyrimų 
rezultatų. Plaučių plovimo gair ės pateiktos RD Nr. 39 (2).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
BENDROJI PATOLOGIJA IR ORGAN Ų MASĖ 
39. Turėtų būti visiškai nuleidžiamas vis ų bandomųjų gyvūnų, įskaitant nugai ­ 
šusius atliekant bandym ą arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyv ūnų 
gerovės sumetimais, kraujas (jeigu įmanoma) ir atliekamas ši ų gyvūnų bend­
rasis skrodimas. Tur ėtų būti užregistruotas laikas nuo kiekvieno paskutinio 
dozės davimo kiekvienam gyv ūnui iki to gyv ūno numarinimo. Jeigu skro ­
dimo negalima atlikti iš karto po to, kai aptinkamas nugaiš ęs gyvūnas, 
gyvūnas turėtų būti laikomas pakankamai šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), 
siekiant kuo labiau pristabdyti autoliz ę. Skrodimai tur ėtų būti atliekamai 
kaip galima anks čiau, paprastai – per dien ą arba dvi. Visi dideli patologiniai 
pakitimai tur ėtų būti užregistruojami pagal kiekvien ą gyvūną, ypating ą 
dėmesį skiriant kv ėpavimo tak ų pakitimams.  
40. 2 lentel ėje nurodyti organai ir audiniai, kurie tur ėtų būti užkonservuojami 
atliekant bendr ąjį skrodim ą, naudojant histopatologiniam tyrimui tinkam ą 
fiksavimo terp ę. Skliausteliuose ([…]) nurodyti organai ir audiniai, taip 
pat kai kurie kiti organai ir audiniai, d ėl kurių konservavimo sprendžia 
tyrimo vadovas.  Paryškintuoju  šriftu nurodytieji organai tur ėtų būti nuva­
lyti ir pasverti kaip galima grei čiau po atskyrimo, kol neišdžiuvo. Skyd ­
liaukė ir sėklidžių prielipai tur ėtų būti sveriami tik esant reikalui, nes 
valymo įrankiai gali pakenkti histopatologiniam tyrimui. Audiniai ir organai 
turėtų būti fiksuojami 10 % buferiniame formaline arba kitokiame tinka ­
mame fiksatyve kaip galima grei čiau po skrodimo, ne mažiau kaip 24–48 
valandos iki valymo, atsižvelgiant į ketinamą naudoti fiksatyv ą. 
2 lentelė 
Atliekant bendr ąjį skrodim ą konservuojami organai ir audiniai  
Antinksčiai 
Kaulų čiulpai (ir (arba) šviežiai paruošta 
punkcija)  
Smegenys  (įskaitant didži ųjų smegen ų, 
smegenėlių ir pailg ųjų smegen ų (smegen ų 
tilto) išpjovas)  
[Akys (tinklain ė, regos nervas) ir aki ų vokai]  
Širdis  
Inkstai  
Gerklos (trys lygiai, į vieną lygį įtraukiant 
antgerklio pagrind ą) 
Kepenys  
Plaučiai (visos vieno lygmens skiltys, įskai­
tant pagrindinius bronchus)  
Limfmazgiai, imami iš plau čių vartų srities, 
ypač jeigu tiriamos mažo tirpumo kiet ųjų 
dalelių bandomosios chemin ės medžiagos. 
Atliekant nuodugnesnius tyrimus, per kuriuos 
nagrinėjami imuniniai aspektai, gali b ūti 
imama daugiau mazg ų, pvz., iš tarpuplau čio, 
kaklo, pažandži ų ir (arba) aus ų sričių. 
Nosiarykl ės audiniai (ne mažiau keturi ų 
lygių; į vieną lygį įtraukiant nosiarykl ės 
latakus ir nosies limfinius audinius (NLA))  
Stemplė 
[Uoslės receptoriai]  
Kiaušidės Sėklinės pūslelės 
Stuburo smegenys (sprando, kr ūtinės ląstos 
ir juosmens)  
Blužnis  
Skrandis  
Sėklidės 
Užkrūčio liauka  
Skydliauk ė 
Trachėja (ne mažiau kaip du lygiai, iš kuri ų 
vienas – išilginis keteros pj ūvis ir vienas – 
skersinis pj ūvis 
[Šlapimo p ūslė] 
Gimda  
Visi labai pakit ę audiniai  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Plau čiai turėtų būti išimami sveiki, pasveriami ir apdorojami tinkamu fiksa ­
tyvu užtikrinant 20–30 cm vandens sluoksnio sl ėgį, kad būtų išsaugota 
plaučių struktūra (5). Išpjovos tur ėtų būti imamos iš vis ų vieno lygmens 
skilčių, įskaitant pagrindinius bronchus, bet, jeigu atliekamas plau čių 
plovimas, neišplautos skiltys tur ėtų būti išpjaunamos trimis lygmenimis 
(ne iš eilės). 
42. Tiriami ne mažiau kaip keturi nosiarykl ės audinių lygiai; vienas iš j ų turėtų 
apimti nosin ę ryklės angą (5, 6, 7, 8, 9), kad b ūtų galima tinkamai ištirti 
ragėjantįjį, pereinam ąjį (be blakstien ėlių, kvėpuojamąjį), kvėpuojamąjį (su 
blakstienėlėmis, kvėpuojamąjį) ir uodžiam ąjį epitelius bei limfodrenažin į 
audinį (NALT; 10, 11). Tur ėtų būti ištirti trys gerkl ų lygiai; vienas iš j ų 
turėtų apimti antgerklio pagrind ą. Turėtų būti ištirti ne mažiau kaip du 
trachėjos lygiai; vienas iš j ų turėtų būti išilginis pagrindini ų bronchų išsiša­
kojimo keteros pj ūvis ir vienas – skersinis pj ūvis. 
HISTOPATOLOGINIS TYRIMAS  
43. Turėtų būti atliktas vis ų 2 lentelėje nurodyt ų organų ir audini ų histopatolo ­
ginis tyrimas, apimantis kontrolin ę ir didžiausiosios koncentracijos grupes, 
taip pat visus gyv ūnus, kurie tyrimo metu nugaišo arba buvo numarinti. 
Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas kv ėpavimo takams, tiksliniams 
organams ir labai pakitusiems audiniams. Visose grup ėse turėtų būti tiriami 
didžiausiosios koncentracijos grup ės gyvūnų organai ir audiniai, d ėl kurių 
nustatyta pakitim ų. Norėdamas įrodyti aiški ą reakciją į tam tikrą koncentra ­
ciją, tyrimo vadovas gali nuspr ęsti atlikti papildom ų grupių histopatologinius 
tyrimus. Jeigu naudojama pagalbin ė (grįžtamumo tyrim ų) grupė, atliekant 
histopatologin į tyrimą turėtų būti tiriami visi audiniai ir organai, kuriems 
padarytas poveikis doz ę gavusiose grup ėse. Jeigu didžiausiosios koncentra ­
cijos grup ėje nebaigus bandymo nugaišta labai daug gyv ūnų ar kyla kitoki ų 
problemų, mažinan čių duomenų reikšmingum ą, turėtų būti atliktas kito pagal 
dydį (mažesnio) koncentracijos lygio histopatologinis tyrimas. Reik ėtų 
mėginti rasti s ąsajų tarp bendr ųjų stebėjimų ir mikroskopin ės analizės rezul­
tatų. 
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
Duomenys  
44. Turėtų būti pateikti kiekvieno gyv ūno kūno masės, pašarų suvartojimo, 
klinikinės patologijos tyrim ų, organų masės ir histopatologini ų tyrimų 
duomenys. Klinikini ų stebėjimų duomenys tur ėtų būti apibendrinti lentel ėse, 
pagal kiekvien ą bandom ąją grupę nurodant naudot ų gyvūnų skaičių, 
gyvūnų, kuriems pasireišk ė toksiškumo požymi ų, skaičių, atliekant bandym ą 
nugaišusi ų arba dėl humanišk ų priežasčių numarint ų gyvūnų skaičių, kiek­
vieno gyv ūno žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašym ą, 
pasireiškimo laik ą ir grįžtamumą, skrodimo išvadas. Visi rezultatai – kieky ­
biniai ir papildomi – tur ėtų būti įvertinti taikant tinkam ą statistinį metodą. 
Gali būti taikomas bet kuris visuotinai pripažintas statistinis metodas; statis ­
tiniai metodai tur ėtų būti parenkami planuojant tyrim ą. 
Bandymo ataskaita  
45. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):  
Bandomieji gyv ūnai ir jų laikymas  
— Laikymo s ąlygų aprašymas, nurodant gyv ūnų skaičių narvelyje (arba 
skaičiaus pokyt į), kraiko medžiag ą, aplinkos temperat ūrą ir santykin į 
drėgnį, šviesos ir tamsos kait ą paros metu ir š ėrimo režim ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— Naudota r ūšis (paderm ė) ir, jeigu tai ne žiurk ės, kitos rūšies naudojimo 
pagrindimas. Gali b ūti pateikti pirminiai ir istoriniai duomenys, jeigu jie 
gauti tiriant gyv ūnus, kuriems buvo taikomos panašios poveikio, 
laikymo ir neš ėrimo sąlygos.  
— Gyvūnų skaičius, amžius ir lytis.  
— Atsitiktin ės atrankos metodas.  
— Prieš bandym ą sudarytų sąlygų aprašymas, nurodant š ėrimo režim ą, 
izoliavimo ir apsaugos nuo lig ų būdą. 
Bandomoji chemin ė medžiaga  
— Fizinė būsena, grynumas ir, jeigu taikytina, fizin ės ir chemin ės savybės 
(įskaitant izomerij ą). 
— Identifikavimo duomenys ir Chemini ų medžiag ų santrump ų tarnybos 
(angl. CAS) registracijos numeris, jeigu jis žinomas.  
Nešiklis  
— Nešiklio naudojimo pagrindimas ir nešiklio parinkimo pagrindimas 
(jeigu tai ne vanduo).  
— Istoriniai arba vienalaikiai duomenys, įrodantys, kad nešiklis nedaro 
neigiamo poveikio tyrimo rezultatams.  
Inhaliacin ė kamera  
— Išsamus inhaliacin ės kameros aprašas, nurodant t ūrį ir pateikiant 
diagramą. 
— Įrangos, naudotos darant poveik į gyvūnams ir kuriant atmosfer ą, šaltinis 
ir aprašas.  
— Temperat ūros, drėgnio, daleli ų dydžio ir faktin ės koncentracijos mata ­
vimo įranga.  
— Oro šaltinis ir kondicionavimo sistema.  
— Įrangos kalibravimo siekiant užtikrinti homogenišk ą bandymo atmosfer ą 
metodai.  
— Slėgių skirtumas (teigiamas ar neigiamas).  
— Kameroje esan čios dozės davimo angos (jeigu doz ė duodama tik per 
nosį); gyvūnų vieta kameroje (jeigu doz ė duodama per vis ą kūną). 
— Bandymo atmosferos pastovumas.  
— Temperat ūros ir drėgnio jutikli ų vieta ir kameroje sukurtos bandymo 
atmosferos ėminių ėmimas.  
— Tiekiamo ir (arba) ištraukiamo oro apdorojimas.  
— Oro srauto grei čiai, per doz ės davimo ang ą tekančio oro srauto greitis 
(jeigu doz ė duodama tik per nos į) arba gyv ūnų kiekis kameroje (jeigu 
dozė duodama per vis ą kūną). 
— Inhaliacin ės kameros pusiausvyros pasiekimo laikas (t  95 ). 
— Tūrio pokyčių kiekis per valand ą. 
— Matavimo prietaisai (jeigu naudojami).  
Poveikio duomenys  
— Tikslin ės koncentracijos parinkimo pagrindiniam tyrimui pagrindimas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— Vardin ės koncentracijos (inhaliacin ėje kameroje sukurtos bandomosios 
cheminės medžiagos bendrosios mas ės ir viso per kamer ą perleisto oro 
srauto tūrio santykis).  
— Faktin ės bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos, nustatytos 
gyvūnų kvėpavimo zonoje; jeigu bandomi mišiniai, įgaunantys įvairias 
fizines būsenas (dujos, garai, aerozoliai), kiekviena iš ši ų būsenų gali 
būti analizuojama atskirai.  
— Visos koncentracijos ore tur ėtų būtų nurodomos mas ės vienetais (pvz., 
mg/l, mg/m  3 ir t. t.), o ne t ūrio vienetais (pvz., ppm, ppb ir t. t.).  
— Daleli ų dydžio pasiskirstymas, mas ės medianinis aerodinaminis 
skersmuo (MMAS) ir geometrinis standartinis nuokrypis ( σ g ), nurodant 
jų apskaičiavimo metodus. Tur ėtų būti pateiktos atliktos atskiros daleli ų 
dydžio analiz ės. 
Bandymo s ąlygos  
— Išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos paruošim ą, 
nurodant proced ūras, taikytas siekiant sumažinti kiet ųjų medžiagų dalelių 
dydį arba paruošti bandomosios chemin ės medžiagos tirpalus.  
— Įrangos, naudotos kuriant bandymo atmosfer ą ir veikiant gyv ūnus 
bandymo atmosfera, aprašas (pageidautina, pateikiant diagram ą). 
— Išsami informacija apie įrangą, naudotą stebėti kameros temperat ūrą, 
drėgnį ir oro sraut ą kameroje (t. y. kalibravimo kreiv ės nubrėžimas).  
— Išsami informacija apie įrangą, naudotą imti ėminius, skirtus nustatyti 
kameroje susidariusi ą koncentracij ą ir dalelių dydžio pasiskirstym ą. 
— Išsami informacija apie taikyt ą cheminės analizės metodą ir metodo 
tinkamumo patvirtinim ą (nurodant bandomosios chemin ės medžiagos 
regeneravimo iš ėminių ėmimo terp ės veiksmingum ą). 
— Atsitiktin ės atrankos, taikytos suskirstant gyv ūnus į bandomąją ir kontro ­
linę grupes, metodas.  
— Išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (nurodant pašaro tip ą 
ir (arba) šaltin į, vandens šaltin į). 
— Bandom ųjų koncentracij ų parinkimo pagrindimas.  
Rezultatai  
— Kameros temperat ūrų, drėgnio ir oro sraut ų lentelės. 
— Kameros vardin ės ir faktin ės koncentracijos duomen ų lentelės. 
— Daleli ų dydžių lentelės, pateikiant analizini ų ėminių ėmimo duomenis, 
dalelių dydžių pasiskirstym ą ir MMAS bei σ g skaičiavimus.  
— Kiekvieno gyv ūno reakcijos duomen ų ir koncentracijos lygio lentel ės (t. 
y. gyvūnų, kuriems pasireišk ė toksiškumo požymi ų, įskaitant gaišta ­
mumą, poveikio pob ūdį, sunkum ą, pasireiškimo laik ą ir trukm ę). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— Kiekvieno gyv ūno masės lentelės. 
— Pašaro suvartojimo lentel ės. 
— Klinikin ės patologijos duomen ų lentelės. 
— Kiekvieno gyv ūno skrodimo išvados ir histopatologini ų tyrimų rezul­
tatai, jeigu yra.  
— Visų kitų išmatuot ų parametr ų lentelės. 
Rezultatų aptarimas ir aiškinimas  
— Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas metod ų, taikytų siekiant laikytis 
šio bandymo metodo kriterij ų, pvz., susijusi ų su ribine koncentracija 
arba daleli ų dydžiu, aprašymui.  
— Atsižvelgiant į bendruosius rezultatus, tur ėtų būti aprašyta daleli ų įkvė­
pimo galimyb ė, ypač jeigu nebuvo įmanoma taikyti daleli ų dydžio krite ­
rijaus.  
— Pateikiant bendr ąjį tyrimo vertinim ą, turėtų būti nurodytas metod ų, 
taikytų nustatyti vardines ir faktines koncentracijas, nuoseklumas ir 
faktinės koncentracijos santykis su vardine koncentracija.  
— turėtų būti aprašyta tik ėtina žūties priežastis ir vyraujantis veikimo b ūdas 
(sisteminis ar vietinis).  
— Atsižvelgiant į OECD rekomendaciniame dokumente d ėl pasekmi ų 
žmonėms (3) nustatytus kriterijus, tur ėtų būti pateiktas paaiškinimas, ar 
kilo poreikis humaniškai numarinti gyv ūnus, patirian čius skausm ą arba 
sunkią ilgalaikę kančią. 
— Turėtų būti nurodytas (-i) tikslinis (-iai) organas (-ai).  
— Turėtų būti apibrėžti nepastebimo neigiamo poveikio lygis (NNPL) ir 
mažiausio pastebimo neigiamo poveikio lygis (MPNPL).  
LITERAT ŪRA 
1. OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guide ­
line No 412, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
3. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation, Environmental Health and SAFEty Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4. Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide 
Programs, United States Environmental Protection Agency.  
5. Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229–258.
 
6. Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.  
7. Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labora ­
tory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
8. Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
 
9. Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
 
10. Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal 
lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.  
11. Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.  
12. Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428.  
13. 2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) 
Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifikavimo, ženklinimo 
ir pakavimo, iš dalies kei čiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 
1999/45/EB ir iš dalies kei čiantis Reglament ą (EB) Nr. 1907/2006, OL 
L 353, 2008 12 31, p. 1.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTIS  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  naudojant š į bandymo metod ą tiriama chemin ė 
medžiaga arba mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. KARTOTINI Ų DOZIŲ (28 DIEN Ų) TOKSIŠKUMAS (PER OD Ą) 
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dalies A skirsn į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dalies B skirsn į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandomoji medžiaga 28 dienas kiekvien ą dieną dedama ant odos 
fiksuoto dydžio doz ėmis kelioms eksperimentini ų gyvūnų grupėms, 
viena doz ė – vienai grupei. Veikimo laikotarpiu gyv ūnai stebimi 
kiekvieną dieną toksiškumo požymiams nustatyti. Gyv ūnams, kurie 
nugaišta bandymo metu, atliekama nekroskopija, bandym ą užbaigus 
išlikusiems gyv ūnams taip pat atliekama nekroskopija.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
1.6.1.  Pasirengimas  
Gyvūnai laikomi eksperimentin ėmis laikymo ir š ėrimo sąlygomis ne 
trumpiau kaip penkias dienas iki eksperimento pradžios. Prieš bandymą sveiki jauni gyv ūnai atrenkami „aklos atrinkties“ metodu 
ir paskiriami į poveikio ir kontrolines grupes. Prieš pat bandym ą nuo 
bandomųjų gyvūnų kūno sprando srityje nukerpamas kailis. Galima 
ir skusti, bet tai tur ėtų būti atliekama apytikriai prieš 24 valandas iki 
bandymo. Pakartotinai kirpti arba skusti paprastai reikia apytikriai kas savait ę. Jeigu kailis kerpamas arba skutamas, reikia stengtis 
nesubraižyti odos. Bandomajai medžiagai užd ėti turėtų būti nuker­
pama ne mažiau kaip 10 % k ūno paviršiaus. Sprendžiant, nuo kokio 
dydžio ploto pašalinti kail į, turėtų būti atsižvelgiama į gyvūno kūno 
svorį, ir į apdangalo dyd į. Jeigu bandomos kietosios medžiagos, 
kurios prireikus gali b ūti susmulkinamos į miltelius, bandomoji 
medžiaga tur ėtų būti pakankamai sudr ėkinama vandeniu arba, tam 
tikrais atvejais, atitinkamu nešikliu, kad b ūtų užtikrintas geras s ąlytis 
su oda. Skystos bandomosios medžiagos paprastai naudojamos 
neskiestos. Medžiaga dedama ant odos nuo penki ų iki septyni
ų 
kartų per savait ę. 
1.6.2.  Bandymo s ąlygos  
1.6.2.1.  Bandomieji gyv ūnai 
Gali būti naudojamos suaugusios žiurk ės, triušiai arba j ūrų kiaulytės. 
Gali būti naudojamos kitos r ūšys, bet j ų naudojimas tur ėtų būti 
pagrindžiamas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Bandymo pradžioje naudojam ų gyvūnų svorio intervalas tur ėtų būti 
ne daugiau kaip ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio.  
1.6.2.2.  Skai čius ir lytis  
Kiekvieno dydžio doz ė bandoma su ne mažiau 10 gyv ūnų (penkios 
patelės ir penki patin ėliai), turin čių sveiką odą. Patelės turėtų būti 
neturėjusios palikuoni ų ir neapvaisintos. Jeigu numatoma, kad 
bandymo eigoje dal į gyvūnų teks numarinti, pradinis j ų skaičius 
atitinkamai padidinamas. Be to, papildomai 10 gyv ūnų grupei (po 
penkis kiekvienos lyties gyv ūnus) galima skirti didel ę medžiagos 
dozę 28 dienas ir 14 dien ų po veikimo medžiaga steb ėti toksinio 
poveikio gr įžtamumą, pastovum ą ar uždelstum ą. Taip pat naudojama 
papildoma 10 kontrolini ų gyvūnų grupė (po penkis kiekvienos lyties 
gyvūnus).  
1.6.2.3.  Dozavimas  
Reikalingos ne mažiau kaip trys doz ės, kontrolin ė grupė arba 
nešiklio kontrolin ė grupė, jeigu naudojamas nešiklis. Veikimo laikas 
turėtų būti ne trumpesnis kaip šešios valandos per dien ą. Bandomoji 
medžiaga tur ėt būti uždedama panašiu laiku kiekvien ą dieną ir tam 
tikrais intervalais (kas savait ę arba kas dvi savaites) suderinami taip, 
kad gyvūno kūno svorio atžvilgiu b ūtų išlaikoma pastovi doz ė. Su 
kontrolinės grupės gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su 
bandomaisiais gyv ūnais, išskyrus tai, kad jie negauna bandomosios 
medžiagos. Didžiausia doz ė turėtų būti tokia, kad sukelt ų toksinį 
poveikį, bet nesukelt ų gyvūnų žūties (arba tik nedidel į gaištamum ą). 
Mažiausia doz ė turėtų būti tokia, kad neb ūtų pastebėta jokių toksiš­
kumo požymi ų. Jeigu yra tinkamas poveikio žmogui įvertinimas, 
mažiausia doz ė turėtų būti šiek tiek didesn ė už poveikio žmogui 
dozę. Būtų geriausia, jeigu vidurin ė dozė būtų tokia, kad sukelt ų 
mažiausią pastebim ą toksinį poveikį. Jeigu naudojama daugiau 
tarpinių dozių, jos tur ėtų būti išskirstomos intervalais taip, kad 
toksinis poveikis b ūtų laipsniškas. Maž ų ir tarpini ų dozių bei kontro ­
linėje grupėse gaištamumas tur ėtų būti nedidelis, kad b ūtų galima 
prasmingai įvertinti rezultatus.  
Jeigu užd ėta bandomoji medžiaga sukelia stipr ų odos dirginim ą, 
koncentracijos tur ėtų būti sumažinamos, ir d ėl to gali susilpn ėti 
kitas toksinis poveikis ar jo iš viso gali neb ūti gavus didel ę 
medžiagos doz ę. Be to, jeigu oda labai stipriai pažeidžiama, 
bandymą gali reik ėti nutraukti ir prad ėti naują bandymą naudojant 
mažesnės koncentracijos dozes.  
1.6.2.4.  Ribinis bandymas  
Jeigu preliminarus bandymas naudojant 1 000 mg/kg doz ę arba 
didesnę dozę, susijusi ą su tikėtinu poveikiu žmogui, jeigu toks 
žinomas, nesukelia aiškaus toksinio poveikio, bandymo galima nebe ­
tęsti. 
1.6.2.5.  Steb ėjimo laikotarpis  
Bandomieji gyv ūnai turėtų būti stebimi kiekvien ą dieną, siekiant 
nustatyti toksiškumo požymius. Tur ėtų būti registruojamas nugai ­ 
šimo laikas ir laikas, kada atsirado ir išnyko toksiškumo požymiai.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Bandymo eiga  
Gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose narveliuose. Gyv ūnai 
veikiami bandom ąja medžiaga 28 dienas, geriausiai septynias dienas 
per savait ę. Gyvūnai, esantys papildomoje grup ėje, skirtoje toliau 
stebėti, turėtų būti laikomi dar 14 dien ų jiems neduodant bandomo ­
sios medžiagos, kad b ūtų galima nustatyti atsigavim ą po toksinio 
poveikio arba tokio poveikio užsit ęsimą. Veikimo bandom ąja 
medžiaga trukm ė turi būti ne trumpesn ė kaip šešios valandos per 
dieną. 
Bandomoji medžiaga tur ėtų būti tolygiai uždedama ant plotelio, 
kurio dydis sudaro apie 10 % viso k ūno paviršiaus. Jeigu medžiagos 
labai toksiškos, veikiamas paviršius gali b ūti mažesnis, bet kaip 
galima didesnis plotas tur ėtų būti padengiamas kuo plonesniu ir 
tolygesniu sluoksniu.  
Veikimo laikotarpiu bandomoji medžiaga tur ėtų būti laikoma ant 
odos akytu marl ės tvarsčiu ir nedirginan čia lipnia juostele. Bando ­
moji vieta apdengiama papildomai, kad laikyt ųsi marlės tvarstis su 
bandomąja medžiaga, ir b ūtų užtikrinama, kad gyv ūnai nepraris 
bandomosios medžiagos. Gali b ūti naudojami ribotuvai, kad bando ­
moji medžiaga neb ūtų praryjama, bet visiško imobilizavimo metodas 
nerekomenduojamas. Gali b ūti taikomas ir „apsauginio antkaklio“ 
metodas.  
Pasibaigus veikimo laikotarpiui, bandomosios medžiagos likutis 
turėtų būti pašalinamas, jeigu tinka – naudojant vanden į ar kokį 
kitą tinkamą odos valymo b ūdą. 
Visi gyvūnai turėtų būti stebimi kiekvien ą dieną, o toksiškumo požy ­
miai registruojami nurodant j ų pasireiškimo laik ą, laipsnį ir trukm ę. 
Turėtų būti stebimi odos ir kailio, aki ų ir akies gleivin ės pokyčiai, 
taip pat kv ėpavimo, kraujo apytakos, vegetacin ės ir centrin ės nervų 
sistemų pokyčiai, somatomotorinio aktyvumo ir elgsenos sutrikimai. 
Kiekvieną savaitę turėtų būti nustatomas gyv ūnų svoris. Taip pat 
rekomenduojama kiekvien ą savaitę matuoti suvartoto pašaro kiek į. 
Reguliarus gyv ūnų stebėjimas yra reikalingas tam, kad b ūtų užtikri­
nama, jog bandomieji gyv ūnai nebus prarasti d ėl tokių priežasčių 
kaip kanibalizmas, audini ų autolizė arba narvo pastatymas netinka ­
moje vietoje. Bandymo laikotarpio pabaigoje išlikusiems ne pagal ­
binės grupės gyvūnams atliekama nekroskopija. Gaištantys gyv ūnai 
ir gyvūnai, kenčiantys dideles kan čias ar skausm ą, kai tik pastebima, 
turėtų būti pašalinami iš bandymo, humaniškai numarinami ir atlie ­
kama jų nekroskopija.  
Bandymo pabaigoje visiems gyv ūnams, taip pat ir kontroliniams, 
atliekami tokie tyrimai:  
1) hematologija, taip pat bent jau kraujo k ūnelių, hemoglobino 
koncentracijos, eritrocit ų kiekio apskai čiavimas, visas ir diferen ­
cinis leukocit ų kiekis ir kreš ėjimo matavimas;  
2) klinikin ė kraujo biochemija, įskaitant ne mažiau kaip vien ą 
kepenų ir inkstų funkcijų parametr ą: alanino aminotransferaz ės 
serumas (anks čiau žinomas kaip glutamo piruvo transaminaz ė), 
aspartate aminotransferaz ės serumas (anks čiau žinomas kaip 
glutamo oksalato transminaz ė), šlapimo azotas, albuminas, 
kraujo kreatininas, visas bilirubino kiekis ir visas serumo 
baltymų kiekis.  
Kitus tyrimus, kurie gali b ūti reikalingi kompetentingam toksikolo ­
giniam įvertinimui atlikti, sudaro kalcio, fosforo, chloro, natrio, 
kalio, badavimo gliukoz ės nustatymas, lipid ų, hormon ų, rūgščių/­ 
šarmų pusiausvyros, methemoglobino, cholinesteraz ės aktyvumo 
analizė. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Atitinkamais atvejais gali b ūti atliekami papildomi klinikin ės bioche­
mijos tyrimai siekiant išsamiau ištirti pasteb ėtą toksinį poveikį. 
1.6.4.  Bendroji nekroskopija  
Visiems bandomiesiems gyv ūnams turėtų būti atliekama visa bend ­
roji nekroskopija. Bent jau kepenys, inkstai, antinks čiai ir sėklidės 
turėtų būti pasveriami dr ėgni tuojau pat po nekroskopijos, kad neiš ­
džiūtų. Organai ir audiniai (tai yra tie organai, kurie turi dideli ų 
matomų pakenkim ų arba kuri ų dydis pakit ęs) turėtų būti konservuo ­
jami atitinkamoje terp ėje galimam histopatologiniam ištyrimui atei ­
tyje. 
1.6.5.  Histopatologinis ištyrimas  
Turėtų būti atliekamas didel ės dozės grupės ir kontrolin ės grupės 
gyvūnų užkonservuot ų organų ir audini ų histologinis ištyrimas. 
Bandomosios medžiagos pažeisti didžiausios koncentracijos grup ės 
gyvūnų organai ir audiniai tur ėtų būti ištiriami visose mažesni ų dozių 
grupėse. Visi papildomos grup ės gyvūnai turėtų būti ištiriami histo ­
logiškai, ypating ą dėmesį skiriant tiems organams ir audiniams, kurie 
buvo paveikti bandom ųjų gyvūnų atveju.  
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti apibendrinami lentel ėse, nurodant kiekvienos 
bandomosios grup ės gyvūnų skaičių bandymo pradžioje ir gyv ūnų, 
kuriems pasireišk ė kiekvienos r ūšies pakenkimai, skai čių. 
Visi stebėti rezultatai turi b ūti įvertinami naudojant atitinkam ą statis­
tikos metod ą. Gali būti naudojamas bet kuris pripažintas statistikos 
metodas.  
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jeigu įmanoma, pateikiama tokia informacija:  
— duomenys apie gyv ūnus (rūšis, veislė, šaltinis, aplinkos s ąlygos, 
pašaras ir pan.),  
— bandymo s ąlygos (taip pat tvarstymo b ūdas: nepralaidus ar 
pralaidus),  
— dozės (nurodant nešikl į, jeigu naudotas) ir koncentracijos,  
— poveikio nesukelianti doz ė, jeigu įmanoma,  
— duomenys apie toksines reakcijas pagal lyt į ir dozę, 
— nugaišimo laikas bandymo metu arba nurodant, ar gyv ūnas išgy­
veno iki pabaigos,  
— toksinis arba kitoks poveikis,  
— visų nenormali ų požymių pastebėjimo laikas ir tolesn ė eiga,  
— duomenys apie pašar ą ir kūno svorį, 
— naudoti hematologiniai tyrimai ir j ų rezultatai,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— naudoti klinikiniai biocheminiai tyrimai ir j ų rezultatai,  
— nekroskopijos duomenys,  
— išsamus vis ų histopatologini ų duomenų aprašymas,  
— statistinis duomen ų apdorojimas, jeigu įmanomas,  
— duomen ų aptarimas,  
— duomen ų aiškinimas.  
3.2. DUOMEN Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dalies D skirsn į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dalies E skirsn į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLI Ų CHROMOSOM Ų 
ABERACIJ Ų BANDYMAS  IN VITRO  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 473 – Žinduoli ų chromosom ų abera­
cijos bandym ą in vitro  (1997).  
1.1. ĮVADAS  
Chromosom ų aberacij ų in vitro  bandymo tikslas – identifikuoti 
medžiagas, sukelian čias strukt ūrines auginam ų žinduoli ų ląstelių 
chromosom ų aberacijas (1)(2)(3). Strukt ūrinės aberacijos gali b ūti 
dviejų tipų – chromosomin ės arba chromatidin ės. Nors dauguma 
cheminių mutagen ų sukelia chromatidines aberacijas, ta čiau pasitaiko 
ir chromosomini ų aberacij ų. Poliploidiškumo intensyvumas gali 
reikšti, kad chemin ė medžiaga gali sukelti chromosom ų skaičiaus 
pasikeitimus. Ta čiau šio metodo tikslas n ėra išmatuoti chromosom ų 
skaičiaus poky čius, ir paprastai tam jis n ėra taikomas. Daugelio 
žmonių genetiškai paveldim ų ligų priežastis yra chromosom ų muta­
cijos bei su jomis susij ę įvykiai; esama pakankamai įrodymų, kad 
žmonių ir eksperimentini ų gyvūnų vėžį sukelia somatin ėse ląstelėse 
esančių onkogen ų bei navik ų supresorini ų genų struktūriniai poky ­ 
čiai, atsirad ę dėl chromosom ų mutacijų bei su jomis susijusi ų įvykių. 
Tiriant chromosom ų aberacijas  in vitro  galima naudoti gerai žinom ų 
ląstelių linijų, ląstelių kamienų arba pirmini ų ląstelių kultūras. 
Naudojamos l ąstelės pasirenkamos pagal j ų gebėjimą augti kult ūroje, 
kariotipų stabilum ą, chromosom ų skaičių, chromosom ų įvairovę ir 
spontanin į chromosom ų aberacijų dažnį. 
Atliekant bandymus  in vitro  reikia naudoti egzogenin į metabolin ės 
aktyvacijos šaltin į. Šioje metabolin ės aktyvacijos sistemoje negalima 
visiškai atkartoti žinduoli ų in vivo  sąlygų. Reikia stengtis išvengti 
tokių sąlygų, kurioms esant b ūtų gaunami teigiami rezultatai, neats ­
pindintys tikrojo mutageniškumo ir galintys atsirasti d ėl pH ar osmo ­
sinio slėgio pokyčių arba ypa č padidėjus citotoksiškumui (4)(5).  
Šis bandymas atliekamas galimiems žinduoli ų mutagenams ar kance ­
rogenams aptikti. Daugelis chemini ų junginių, apie kuriuos, atlikus š į 
bandymą, gaunamas teigiamas rezultatas, yra žinduoli ų kancerogenai; 
tačiau nėra šimtaprocentinio ryšio tarp šio bandymo ir kancerogeniš ­
kumo. Ryšys priklauso nuo chemini ų medžiag ų klasės; yra negin či­
jamų įrodymų kad šio bandymo metu negalima nustatyti tam tikr ų 
kancerogen ų, nes pasirodo, jog j ų poveikis yra kitas nei tiesioginis 
DNR suardymas.  
Taip pat žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Chromatidin ė aberacija  – strukt ūrinis chromosomos pakenkimas, 
pasireiškiantis kaip pavieni ų chromatidži ų suardymas arba kaip chro ­
matidžių suardymas ir susijungimas.  
Chromotidin ė aberacija  – strukt ūrinis chromosomos pakenkimas, 
pasireiškiantis kaip abiej ų seserinių chromatidži ų trūkis arba kaip 
jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pa čioje vietoje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplikacija  – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replika ­
cijos S (sintez ės) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitoz ės 
būdu, bet prasideda naujas S (sintez ės) periodas. Šitaip atsiranda 
chromosomos, turin čios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidži ų. 
Plyšys  – achromatin ė, mažesnė nei vienos chromatid ės plotis, spraga, 
kurioje yra mažiausias skai čius klaidingai suporuot ų bazių. 
Mitozinis indeksas  – mitozės metafaz ėje esančių ląstelių santykis, 
padalintas iš viso l ąstelių populiacijos skai čiaus, rodantis tos l ąstelių 
populiacijos proliferacijos laipsn į. 
Chromosom ų skaičiaus aberacija  – ląstelėse esančių chromosom ų 
skaičiaus pokytis, palyginus su normaliu naudojam ų ląstelių skai­ 
čiumi.  
Poliploidiškumas  – haploidinio chromosom ų skaičiaus (n), išskyrus 
diploidinį skaičių (t. y. 3 n, 4n ir t. t.), kartotinis.  
Struktūrinė aberacija  – chromosomos strukt ūros pokytis, kur į 
galima nustatyti dalijimosi ciklo metafaz ėje esančias ląsteles tiriant 
mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, poky čiai 
grandinių viduje ar tarp grandini ų. 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Ląstelių kultūros veikiamos bandom ąja chemine medžiaga esant 
metabolinei aktyvacijai arba jos nesant. L ąstelių kultūras paveikus 
bandomąja medžiaga, tam tikrais laiko tarpais jos yra veikiamos 
ląstelių dalijimąsi metafaz ėje stabdan čia medžiaga (pavyzdžiui 
Kolcemidu arba kolchicinu), surenkamos, dažomos, o metafaz ėje 
esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad b ūtų nustatomos chromo ­
somų aberacijos.  
1.4. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
1.4.1.  Preparatai  
1.4.1.1.  Ląstelės 
Galima naudoti įvairiausias l ąstelių linijas, kamienus arba pirmines 
ląstelių, tarp jų ir žmoni ų ląstelių kultūras (pvz., kiniško žiurk ėno 
fibroblastus, žmogaus ar kit ų žinduolių periferinio kraujo limfocitus).  
1.4.1.2.  Terp ė ir kultivavimo s ąlygos  
Kultūros turėtų būti kultivuojamos reikiamoje terp ėje, esant reikia ­
moms inkubacijos s ąlygoms (kultivavimui skirtuose induose, esant 
reikiamai CO  2 koncentracijai, temperat ūrai ir drėgmei). Reguliariai 
tikrinama, ar pripažintos l ąstelių linijos ir kamienai išlaiko pastov ų 
modalinį chromosom ų skaičių, ar jos neužsikr ėtusios mikoplaz ­
momis, o jei yra užkr ėstos, tai toliau nebenaudojamos. Turi b ūti 
žinoma ląstelių ciklo trukm ė bei taikomos kultivavimo s ąlygos.  
1.4.1.3.  Kult ūrų paruošimas  
Gerai žinomos l ąstelių linijos ir kamienai: l ąstelės yra padauginamos 
iš kamienini ų kultūrų, pasėjamos kult ūrinėje terpėje tokiu tankumu, 
kad prieš l ąsteles surenkant, kult ūros nesusiliet ų, po to jos inkubuo ­
jamos 37 °C temperat ūroje. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Limfocitai: į kultūrinę terpę, turinčią mitogeno (pvz., fitohemagliuti ­
nino), įnešamas sveik ų tiriamųjų kraujo, paveikto antikoaguliantu 
(pvz., heparinu), m ėginys arba iš to kraujo išskirti limfocitai ir inku ­
buojama 37 °C temperat ūroje. 
1.4.1.4.  Metabolin ė aktyvacija  
Ląstelės turėtų būti paveikiamos bandom ąja chemine medžiaga tiek 
esant atitinkamai metabolin ės aktyvacijos sistemai, tiek ir be jos. 
Plačiausiai naudojama sistema yra iš graužik ų kepenų, paveikt ų 
tokiais fermentin į aktyvum ą skatinan čiomis medžiagomis kaip 
AROCLOR 1254 (6) (7) (8) (9) ar fenobarbitono ir ß-naftoflavono 
mišinys (10) (11) (12), postmitochondrin ė frakcija, praturtinta kofak ­
toriumi.  
Post-mitochondrin ė frakcija paprastai naudojama toki ų koncentracij ų, 
kurių intervalas bandymo metu naudojamoje galutin ėje terpėje siekia 
1–10 % (v/v). Metabolin ės aktyvacijos sistema gali priklausyti nuo 
bandomosios chemin ės medžiagos klas ės. Kai kuriais atvejais tiks ­
linga naudoti daugiau nei vien ą post-mitochondrin ės frakcijos 
koncentracij ą. 
Endogenin ę aktyvacij ą gali pagerinti, taikant tokias naujoves kaip 
genetinės inžinerijos pagalba gautas l ąstelių linijas, gaminan čias 
specifinius, aktyvacijoje dalyvaujan čius fermentus. Bandyme naudo ­
jamų ląstelių linijų pasirinkimas tur ėtų būti moksliškai pagr įstas 
(pvz., pagal citochromo P450 izofermento svarb ą bandomos 
cheminės medžiagos metabolizmui).  
1.4.1.5.  Bandoma chemin ė medžiaga (preparatas)  
Kietosios bandomosios medžiagos tur ėtų būti ištirpinamos arba 
suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba tirpinan čiuosiuose 
įrenginiuose, o jeigu reikia, tai prieš paveikiant l ąsteles šia medžiaga, 
ir praskiestos. Prieš bandym ą į bandomąją sistemą gali būti tiesiogiai 
įnešamos ir (arba) praskiedžiamos skystosios bandomosios 
medžiagos. Tur ėtų būti naudojami naujai paruošti bandomosios 
medžiagos preparatai, jeigu ši ų medžiag ų stabilumo tyrimo 
duomenys nerodo, kad juos galima saugoti.  
1.4.2.  Bandymo s ąlygos  
1.4.2.1.  Tirpiklis (nešiklis)  
Tirpiklis (nešiklis) netur ėtų chemiškai reaguoti su bandom ąja 
chemine medžiaga ir tur ėtų būti užtikrinta, kad l ąstelės liks išsau ­
gotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami gerai neži ­
nomi tirpikliai (nešikliai), reikia tur ėti duomen ų, įrodančių jų tinka­
mumą (suderinamum ą su medžiaga). Jei įmanoma, tai pirmiausia 
rekomenduojama naudoti vandenin į tirpiklį (nešiklį). Kai bandomos 
vandenyje nestabilios chemin ės medžiagos, tai naudojamuose orga ­
niniuose tirpikliuose netur ėtų būti vandens. Vanden į galima pašalinti 
molekuliniu filtru.  
1.4.2.2.  Veikimo koncentracijos  
Parenkant pa čią didžiausi ą koncentracij ą, vadovaujamasi tokiais 
kriterijais, kaip citotoksiškumas, tirpumas bandomojoje sistemoje ir 
pH arba osmosinio sl ėgio pokyčiai. 
Citotoksiškumas tur ėtų būti nustatomas pagrindinio eksperimento 
metu, esant metabolinei aktyvacijai, remiantis atitinkamais l ąstelių 
vientisumo ir augimo rodikliais, tokiais kaip l ąstelių kolonijų susilie­
jimo laipsnis, gyv ų ląstelių skaičius arba mitozinis indeksas. Pirminio 
eksperimento metu b ūtų naudinga nustatyti toksiškum ą ir tirpum ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Turėtų būti naudojamos bent trys koncentracijos. Jei nustatomas 
citotoksiškumas, tai šios koncentracijos tur ėtų svyruoti nuo maksi ­
malaus iki minimalaus (arba jokio) citotoksiškumo laipsnio; tai reiškia, kad koncentracijos tur ės būti atskirtos tiktai faktoriumi, 
esančiu tarp 2 ir √10. Ląstelių surinkimo metu inde, kur bandomo ­
sios medžiagos koncentracija didžiausia, tur ėtų būti pastebima, kad 
gerokai sumaž ėjo ląstelių kolonijų susiliejimo laipsnis ir l ąstelių skai­ 
čius arba mitozinis indeksas (visi sumaž ėjo daugiau nei 50 %). Mito ­
zinis indeksas yra tik netiesioginis citotoksini ų/citostatini ų poveikių 
įvertinimo matas ir priklauso nuo laiko pra ėjusio po bandomosios 
medžiagos poveikio. Ta čiau mitozinis indeksas tinka l ąstelių, augi­
namų suspensijoje, kult ūroms, kuriose kiti toksiškumo bandymai gali 
būti sudėtingi ir praktiškai ne įmanomi. Duomenys apie l ąstelių ciklo 
kinetinius parametrus, tokius kaip vidutinis l ąstelių kartos susiforma ­
vimo laikas, gali b ūti panaudoti kaip pagalbin ė
 informacija. Ta čiau 
vidutinis l ąstelių kartos susiformavimo laikas, laikomas bendru 
vidurkiu, ne visada parodo, kad egzistuoja sul ėtinto vystymosi 
subpopuliacijos, ir netgi menkas l ąstelių susiformavimo laiko pailg ė­
jimas gali b ūti susijęs su kur kas ilgesne optimalaus aberacij ų skai­ 
čiaus atsiradimo trukme.  
Kai medžiagos yra pakankamai necitotoksiškos, tai didžiausia bando ­
mosios medžiagos koncentracija tur ėtų būti 5 μl/ml, 5,5 mg/ml arba 
0,01 M, priklausomai nuo to, kuri iš vis ų išvardytų koncentracij ų yra 
pati mažiausia.  
Kai medžiagos yra gana netirpios ir yra netoksiškos tokios koncent ­
racijos, kuri yra mažesn ės už tą koncentracij ą, kuriai esant medžiagos 
netirpsta, tai baigiantis veikimui bandom ąja medžiaga, didžiausios 
naudojamos doz ės koncentracija tur ėtų viršyti tirpumo rib ą paruoš­
toje, kultivavimui skirtoje terp ėje. Kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, 
kai toksiškumas pasireiškia tik tada, kai medžiagos koncentracija yra 
truputį didesnė už pačią mažiausi ą koncentracij ą, kuriai esant 
medžiaga visiškai netirpsta, rekomenduojama patikrinti daugiau nei vieną koncentracij ą, kurioje susiformuoja matomas precipitatas. 
Derėtų įvertinti tirpum ą prieš veikim ą bandomąja chemine medžiaga, 
ir po jo, kadangi veikiant bandom ąja medžiaga, tirpumas gali pakisti 
dėl ląstelių ir S9 serumo, esan čių bandomojoje sistemoje. Netirpum ą 
galima nustatyti plika akimi. Precipitato susidarymas netur ėtų truk­
dyti įvertinti duomenis.
 
1.4.2.3.  Neigiami ir teigiami kontroliniai m ėginiai  
Atliekant kiekvien ą eksperiment ą, esant metabolinei aktyvacijai, arba 
jai nesant, tuo pa čiu metu naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklio 
arba nešiklio) kontroliniai m ėginiai. Kai naudojamasi metaboline 
aktyvacija, tai kartu su teigiamu kontroliniu m ėginiu turi b ūti naudo­
jama aktyvuojanti chemin ė medžiaga tam, kad b ūtų sukuriamas 
atsakas į mutagen ą. 
Teigiamuose kontroliniuose m ėginiuose turi b ūti tokios žinomo elas ­
togeno koncentracijos, kurioms esant bei veikiant bandom ąja 
medžiaga, b ūtų galima nesunkiai sumažinti pašalin į foną pakarto­
tinai, o tai parodo bandomosios sistemos jautrum ą. 
Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolin ės dozės, kad gaunami 
poveikiai b ūtų ryškūs, bet tyr ėjas ne iš karto atpažint ų užkoduot ą 
objektinį stiklelį. Žemiau pateikiami teigiamuose kontroliniuose 
mėginiuose esan čių cheminių medžiag ų pavyzdžiai:  
Metabolin ės aktyvacijos s ąlygos  Medžiaga  CAS Nr.  Einecs Nr.  
Egzogenin ė metabolin ė aktyva­
cija nevyksta  metilmetansulfonatas  66–27–3  200–625–0  
etilmetansulfonatas  62–50–0  200–536–7  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Metabolin ės aktyvacijos s ąlygos  Medžiaga  CAS Nr.  Einecs Nr.  
etilnitrošlapalas  759–73–9  212–072–2  
mitomicinas C  50–07–7  200–008–6  
4-nitrokvinolino-N-oksidas  56–57–5  200–281–1  
Egzogenin ė metabolin ė aktyva­
cija vyksta  benzopirenas  50–32–8  200–028–5  
ciklofosfamidas 
ciklofosfamido-monohidratas  50–18–0 
6055–19–2  200–015–4  
Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines chemines medžiagas. 
Kai įmanoma, tai apsvarstomas teigiam ų kontrolini ų chemini ų 
medžiagų, priklausan čių konkrečiai klasei, panaudojimas.  
Auginant kiekvien ą ląstelių rinkinį, reikia naudoti neigiamus kontro ­
linius mėginius, sudarytus iš terp ėje esančio pavienio tirpiklio ar 
nešiklio ir kurie paveikiami šia terpe lygiai taip pat kaip ir l ąstelių 
kultūros. Taip pat reikia papildomai naudoti ir nepaveiktus kontro ­
linius mėginius, nekreipiant d ėmesio į tai, kad anks čiau atlikt ų 
eksperiment ų aprašuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis nesuk ėlė 
jokio žalingo ar mutageninio poveikio.  
1.4.3.  Bandymo atlikimo metodika  
1.4.3.1.  Veikimas bandom ąja chemine medžiaga  
Proliferuojan čios ląstelės veikiamos bandom ąja medžiaga esant meta ­
bolinės aktyvacijos sistemai arba jai nesant. Limfocitai veikiami 
bandomąja medžiaga, pra ėjus maždaug 48 valandoms po stimulia ­
cijos mitogenu.  
1.4.3.2. Paprastai naudojamos kiekvienos koncentracijos pakartotin ės 
kultūros, ypa č rekomenduojama tai daryti, kai kultivuojamos 
neigiamos kontrolin ės kultūros, terp ėje esant vien tik tirpiklio. 
Jeigu remiantis anks čiau atlikt ų eksperiment ų aprašymais galima 
parodyti, kad tarp kartotinio pas ėjimo kult ūrų egzistuoja minimal ūs 
skirtumai (13), (14), tada pavienes kult ūras bus galima tirti, terp ėje 
esant skirtingoms bandomosios chemin ės medžiagos koncentraci ­
joms.  
Dujinės ir lakiosios medžiagos tiriamos atitinkamais metodais, 
tokiais kaip kultivavimas užsandarintuose induose 15, 16.  
1.4.3.3.  Kult ūrų surinkimo laikas  
Atliekant pirm ąjį eksperiment ą, ląstelės, esant metabolin ės aktyva­
cijos sistemai arba jai nesant bandom ąja chemine medžiaga 
veikiamos 3–6 valandas ir yra surenkamos pra ėjus maždaug kas 
1,5 normalaus l ąstelinio ciklo nuo poveikio pradžios (12). Jeigu 
eksperimentas atliekamas pagal š į protokolą, esant metabolin ės akty­
vacijos sistemai arba jai nesant ir gaunami neigiami rezultatai, tai 
reikia atlikti papildom ą poveikio bandom ąja medžiaga eksperiment ą, 
nesant metabolin ės aktyvacijos sistemos ir l ąstelės surenkamos, 
praėjus laiko tarpui, maždaug lygiam 1,5 l ąstelinio ciklo trukm ės. 
Kai kurios chemin ės medžiagos yra lengviau nustatomos, jei bando ­
mąja medžiaga veikiama ilgiau, o m ėginiai paimami tada, kai praeina 
daugiau nei 1,5 l ąstelinio ciklo. Neigiami duomenys, gauti tuo metu, 
kai buvo naudojama metabolin ė aktyvacija, turi b ūti patvirtinami 
kiekvienu atveju. Jei manoma, kad nereikia patvirtinti neigiam ų 
rezultatų, tai privalo b ūti pagrįsta. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Chromosom ų paruošimas  
Paprastai likus 1–3 valandoms iki surinkimo l ąstelių kultūros yra 
paveikiamos Kolcemidu  ® arba kolchicinu. Kiekviena l ąstelių kultūra 
surenkama ir atskirai apdorojama tam, kad chromosomos b ūtų 
paruoštos. Ruošiant chromosomas, l ąstelės paveikiamos hipotoniniu 
šoku, fiksuojamos ir dažomos.  
1.4.3.5.  Analiz ė 
Prieš pradedant mikroskopin ę analizę, visi objektiniai stikleliai, įskai­
tant teigiamus ir neigiamus kontrolinius m ėginius, yra atskirai 
koduojami. Kadangi fiksavimo metu metafaz ėje esančios ląstelės 
dažnai suyra bei prarandamos chromosomos, tai suskai čiuotos 
ląstelės turės centromeras, kuri ų skaičius bus lygus vis ų tipų ląstelių 
modaliniam skai čiui ≠2. Jei tiriant kartotinio pas ėjimo kult ūras, 
galima naudotis ta pa čia kontrole, tai nustatytas centromer ų skaičius 
bus lygus 200 gerai matom ų metafazi ų. Centromer ų skaičius gali 
sumažėti, kai stebima daug aberacij ų. 
Nors šio bandymo tikslas yra nustatyti chromosom ų struktūrines 
aberacijas, svarbu poliploidij ą bei endoduplikacij ą registruoti tada, 
kai tai yra matoma.  
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Ląstelė yra eksperimentinis vienetas, tod ėl nustatomas l ąstelių, 
turinčių struktūrines aberacijas, išreiškiamas procentais. Reikia išvar ­
dinti chromosom ų struktūrinių aberacijų skirtingus tipus, nurodant j ų 
skaičių bei pasireiškimo dažn į bandomose ir kontrolin ėse ląstelių 
kultūrose. Atskirai registruojami chromosom ų plyšiai, ta čiau į juos 
neatsižvelgiama nustatant absoliut ų aberacijos dažn į. 
Reikia taip pat registruoti tarpusavyje sutampan čias priemones, 
kurios naudojamos citotoksiškumui vertinti visose paveiktose ir 
neigiamose kontrolin ėse kultūrose, kai yra atliekami pagrindiniai 
eksperimentai, kuri ų metu nustatomos aberacijos.  
Reikėtų pateikti ir pavienius duomenis. Be to, visus duomenis 
reikėtų pateikti apibendrintai, lenteli ų forma.  
Nėra reikalaujama, kad aiškus teigiamas atsakas b ūtų patvirtinamas. 
Abejotini rezultatai išsiaiškinami atliekant toliau bandym ą, pageidau ­
tina, pakeistomis eksperimento s ąlygomis. B ūtinybė patvirtinti, kad 
buvo gauti neigiami rezultatai buvo aptarta 1.4.3.3 skyriuje. V ėlesnių 
eksperiment ų metu reikia apsvarstyti tiriam ų parametr ų pakeitimus, 
tam, kad ištirt ų sąlygų spektras b ūtų praplėstas. Tiriamieji para ­
metrai, kuriuos galima keisti – tai intervalai tarp koncentracij ų ir 
metabolin ės aktyvacijos s ąlygos.  
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas 
bei pakartojamas chromosomines aberacijas turin čių ląstelių skai­ 
čiaus padid ėjimas, kuriuo remiantis, nustatoma ar gautas rezultatas 
yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gaut ų rezultatų biologin ę 
reikšmę. Vertinant bandymo rezultatus, galima taikyti statistinius 
metodus (3), (13). Statistinis reikšmingumas netur ėtų būti vienintelis 
faktorius, pagal kur į sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar 
neigiamas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
Poliploidini ų ląstelių skaičiaus padid ėjimas gali rodyti, kad bando ­
moji medžiaga gali slopinti mitoz ę ir sukelti chromosom ų skaičiaus 
ląstelėje pakitimus. L ąstelių, turinčių endoreduplikuotas chromo ­
somas, skai čiaus padid ėjimas gali parodyti, kad bandomoji medžiaga 
gali slopinti l ąstelinį ciklą (17), (18).  
Jei tiriant medžiag ą, buvo gauti rezultatai, neatitinkantys aukš čiau 
išvardintų kriterijų, tai šioje sistemoje medžiaga laikoma nemutage ­
niška.  
Nors atliekant daugel į eksperiment ų, bus gauti aišk ūs teigiami ir 
neigiami rezultatai, ta čiau retais atvejais, remiantis gaut ų duomenų 
visuma, nebus galima padaryti konkre čios išvados apie bandomosios 
medžiagos aktyvum ą. NET ir daug kart ų pakartojus eksperiment ą, 
rezultatai gali likti abejotini ar neaišk ūs. 
Tiriant chromosom ų aberacijas  in vitro , gauti teigiami rezultatai, 
gauti atlikus bandym ą, rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia chro ­
mosomų aberacijas kultivuotose somatin ėse žinduoli ų ląstelėse. 
Neigiami rezultatai rodo, kad esant bandymo s ąlygoms, bandomoji 
medžiaga nesukelia chromosom ų aberacijų kultivuotose somatin ėse 
žinduolių ląstelėse. 
3. ATASKAITA  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta tokia informacija:  
Tirpiklis (nešiklis):  
— priežastys, d ėl kurių buvo pasirinktas nešiklis,  
— bandomosios medžiagos tirpumas ir stabilumas tirpiklyje (nešik ­
lyje), jei žinomas.  
Ląstelės: 
— ląstelių tipas ir šaltinis,  
— panaudoto l ąstelių tipo kariotipo ypatyb ės ir tinkamumas,  
— ar ląstelės neužsikr ėtusios mikoplazmomis, jei taikoma,  
— informacija apie l ąstelinio ciklo trukm ę, 
— kraujo donor ų, iš kurių buvo gauti viso kraujo m ėginiai ar iš 
kurių kraujo buvo išskirti limfocitai, lytis bei panaudotas mito ­
genas,  
— ląstelių persėjimų skaičius, jei taikoma,  
— ląstelių kultivavimo metodai, jei taikoma,  
— modalinis chromosom ų skaičius. 
Bandymo s ąlygos:  
— metafaz ę sustabdan čios chemin ės medžiagos prigimtis, koncent ­
racija bei laiko tarpas, kur į ši medžiaga veik ė ląsteles,  
— pagrindin ė priežastis, d ėl kurios buvo pasirinktos koncentracijos 
ir ląstelių kultūrų kultivavimo skai čius nurodant, jei įmanoma, 
citotoksiškumo tyrimo duomenis ir tirpumo ribas,  
— terpės sudėtis ir CO  2 koncentracija, jei taikoma,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— bandomosios medžiagos koncentracija,  
— nešiklio t ūris ir į jį įneštos bandomosios medžiagos t ūris, 
— inkubacijos temperat ūra, 
— inkubacijos laikas,  
— veikimo bandom ąja medžiaga trukm ė, 
— ląstelių tankis pas ėjimo metu, jei taikoma,  
— metabolin ės aktyvacijos sistemos tipas ir sud ėtis, įskaitant tinka ­
mumo kriterijus,  
— teigiami ir neigiami kontroliniai m ėginiai,  
— objektini ų stiklelių paruošimo b ūdai, 
— aberacij ų vertinimo kriterijai,  
— ištirtų metafazi ų skaičius, 
— toksiškumo įvertinimo metodai,  
— kriterijai, pagal kuriuos sprendžiama, ar bandymo metu gauti 
rezultatai teigiami, neigiami ar abejotini.  
Rezultatai:  
— toksiškumo požymiai, pvz., l ąstelių kultūrų kolonijų susiliejimo 
laipsnis, l ąstelinio ciklo duomenys, l ąstelių skaičius, mitozinis 
indeksas,  
— precipitacijos požymiai,  
— duomenys apie terp ės, kurioje buvo atliekamas veikimas, pH ir 
osmosinį slėgį, jei tai buvo nustatyta,  
— aberacij ų, įskaitant plyšius, apib ūdinimas,  
— ląstelių, esančių bandomąja medžiaga veiktose bei kontrolin ėse 
kolonijose ir turin čių chromosom ų aberacijas, skai čius bei chro ­
mosomų aberacijų tipas,  
— ploidiškumo poky čiai, jei pastebimi,  
— dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma,  
— statistin ės analizės, jei tokios buvo atliktos,  
— vienu metu gauti neigiam ų (tirpiklis/nešiklis) ir teigiam ų kontro­
linių mėginių tyrimų duomenys,  
— ankstesni ų bandymų duomenys apie neigiamus (tirpiklis/nešiklis) 
ir teigiamus kontrolinius m ėginius, kartu nurodant j ų intervalus, 
vidurkius ir standartinius nukrypimus.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Evans, h.J. (1976). Cytological Methods for Detecting Chemical 
Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New 
York and London, p. 1–29.
 
2) Ishidate, MJr. and Sofuni, T. (1985). The  in Vitro  Chromo ­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, 
Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam-New York-Oxford, p. 427–432.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C, Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C, Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Anderson, G. and Zeiger, E. (1978). Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary 
cells: Evaluation of 108 chemicals. Environs. Molec. Mutagen 
10 (suppl.10), p. 1–175.
 
4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, MJr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res,. 257, p. 147–204.
 
5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992). 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells. Mutation Res., 268, p. 297–305.  
6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364.
 
7) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215.  
8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. and 
de Vogei, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcino ­
gens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and 
Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of 
Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, p. 83–90.
 
9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979). Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro . Mutation Res., 66, p. 277–290.
 
10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G, 
Gibson, GG, Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of 
UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, p. 175–177.  
11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A SAFE Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, 
F.J., Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds)  In Vitro  
Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, p. 85–88.
 
12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, MJr., Ivett, J.L., 
Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T. (1994). 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations. Mutation Res., 312, p. 241–261.  
13) Richardson, C, Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., 
Chanter, D.O. and Phillips, B. (1989). Analysis of Data from  
In Vitro  Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Muta ­
genicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University 
Press, Cambridge, p. 141–154.  
14) Soper, K.A. and Galloway, S.M. (1994). replicate Flasks are 
not Necessary for  In Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139–149.  
15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). 
Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 
p. 91–103.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795–801.
 
17) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 
119, p. 403–413.  
18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362–1364.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLI Ų KAUL Ų ČIULPŲ 
CHROMOSOM Ų ABERACIJOS BANDYMAS  IN VIVO  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 475 – Žinduoli ų kaulų čiulpų chro­
mosomų aberacijos bandym ą (1997).  
1.1. ĮVADAS  
Žinduolių chromosom ų aberacij ų bandymas  in vitro  naudojamas 
nustatyti strukt ūrinėms chromosom ų aberacijoms, kurias bandomoji 
cheminė medžiaga sukelia žinduoli ų, paprastai graužik ų, kaulų čiulpų 
ląstelėse (1) (2) (3) (4). Chromosom ų struktūrinės aberacijos gali b ūti 
dviejų tipų – chromosomin ės arba chromatidin ės. Poliploidiškumo 
reiškimosi intensyvumas rodo, kad chemin ė medžiaga gali sukelti 
chromosom ų skaičiaus pasikeitimus. Dauguma chemini ų mutagen ų 
sukelia chromatidines aberacijas, ta čiau pasitaiko ir chromosomini ų 
aberacijų. Daugelio žmoni ų genetiškai paveldim ų ligų priežastis yra 
chromosom ų mutacijos bei su jomis susij ę įvykiai; esama pakan ­
kamai įrodymų, kad žmoni ų ir eksperimentini ų gyvūnų vėžį sukelia 
somatinėse ląstelėse esančių onkogen ų bei navik ų supresorini ų genų 
struktūriniai poky čiai, atsirad ę dėl chromosom ų mutacijų bei su 
jomis susijusi ų įvykių. 
Šiam bandymui paprastai naudojamas graužik ų stuburo skliautas. 
Pagrindinis bandomasis audinys yra kaul ų čiulpai, kadangi jie yra 
išvagoti daugyb ės kraujagysli ų, o be to, kaul ų čiulpuose yra daug 
greitai besidauginan čių ląstelių, kurios yra lengvai išskiriamos ir 
apdorojamos. Šio bandymo metu n ėra bandomi kit ų rūšių žinduoliai 
bei jų audiniai.  
Šis chromosom ų aberacijos bandymas ypa č svarbus, kai įvertinama 
mutagenų daroma žala, nes šio bandymo metu galima ištirti metabo ­
lizmo, farmakokinetikos ir DNR pažaid ų reparacini ų procesų veiks­
nius in vivo , nors jie gali varijuoti tarp skirting ų žinduolių rūšių ir 
skirtingų audinių. Bandymas  in vivo  naudingas ir tuo, kad v ėliau 
galima ištirti mutagenin į poveikį, nustatyt ą in vitro . 
Jeigu yra duomen ų, kad bandomoji chemin ė medžiaga arba reak ­
tyvus metabolitas ne įsiskverbia į tikslinį audinį, šis bandymas 
netinka.  
Taip pat žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Chromatidin ė aberacija  – strukt ūrinis chromosomos pakenkimas, 
pasireiškiantis kaip pavieni ų chromatidži ų suardymas arba kaip chro ­
matidžių suardymas ir susijungimas.  
Chromotidin ė aberacija  – strukt ūrinis chromosomos pakenkimas, 
pasireiškiantis kaip abiej ų seserinių chromatidži ų trūkis arba kaip 
jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pa čioje vietoje.  
Endoreduplikacija  – procesas, kurio metu pasibaigus DNR replika ­
cijos S (sintez ės) periodui, branduolys nepradeda dalytis mitoz ės 
būdu, bet prasideda naujas S (sintez ės) periodas. Šitaip atsiranda 
chromosomos, turin čios 4, 8, 16 ir t. t. chromatidži ų. 
Plyšys  – achromatin ė, mažesnė nei vienos chromatid ės plotis spraga, 
kurioje yra mažiausias skai čius klaidingai suporuot ų bazių. 
Mitozinis indeksas  – mitozės metafaz ėje esančių ląstelių santykis, 
padalintas iš viso l ąstelių populiacijos skai čiaus, rodantis tos l ąstelių 
populiacijos proliferacijos laipsn į. 
Chromosom ų skaičiaus aberacija  – ląstelėse esančių chromosom ų 
skaičiaus pokytis, palyginus su normaliu naudojam ų ląstelių skai­ 
čiumi. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Poliploidiškumas  – haploidinio chromosom ų skaičiaus (n), išskyrus 
diploidinį skaičių (t. y. 3 n, 4n ir t. t.), kartotinis.  
Struktūrinė aberacija  – chromosomos strukt ūros pokytis, kur į 
galima nustatyti dalijimosi ciklo metafaz ėje esančias ląsteles tiriant 
mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, poky čiai 
grandinių viduje ar tarp grandini ų. 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Gyvūnai veikiami bandom ąja chemine medžiaga tinkamu poveikio 
būdu, o po šio veikimo pra ėjus tinkamam laikotarpiui, numarinami. 
Prieš numarinim ą gyvūnai paveikiami medžiaga, sustabdan čia 
ląstelių dalijimąsi metafaz ėje (pvz., Kolcemidu® arba kolchicinu). 
Po to iš kaul ų čiulpų ląstelių išskiriamos chromosomos, jos dažomos, 
ir metafaz ėje esančios ląstelės tiriamos mikroskopu, kad b ūtų nusta­
tytos chromosom ų aberacijos.  
1.4. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
1.4.1.  Preparatai  
1.4.1.1.  Gyvūnų rūšies pasirinkimas  
Paprastai naudojamos žiurk ės, pelės ir kiniški žiurk ėnai, tačiau gali 
būti panaudotos ir kitos atitinkamos žinduoli ų rūšys. Reikia naudoti 
įprastas jaun ų sveikų suaugusi ų gyvūnų laboratorines linijas. 
Bandymo pradžioje gyv ūnų svorio skirtumai turi b ūti kuo mažesni; 
jų svoris turi b ūti ne didesnis kaip ± 20 % atitinkamos lyties gyv ūnų 
vidutinis svoris.  
1.4.1.2.  Laikymo ir maitinimo s ąlygos  
Taikomos Bendrojo įvado B dalyje nurodytos s ąlygos, nors stengia ­
masi, kad dr ėgmė siektų 50–60 %.  
1.4.1.3.  Gyvūnų paruošimas  
Sveiki jauni subrend ę gyvūnai atsitiktin ės atrankos b ūdu suskirstomi 
į kontrolin ę bei bandom ąją (kuriai priskirti individai bus veikiami 
medžiaga) grupes. Narvai pastatomi taip, kad b ūtų kuo labiau suma ­ 
žintas aplinkos poveikis, susij ęs su narv ų išdėstymu. Kiekvienas 
gyvūnas paženklinamas. Gyv ūnams ne mažiau kaip 5 dienas 
leidžiama prisitaikyti prie laboratorini ų sąlygų. 
1.4.1.4.  Dozi ų paruošimas  
Kietosios bandomosios medžiagos tur ėtų būti ištirpinamos arba 
suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose arba nešikliuose, o jeigu reikia, tai prieš paveikiant gyv ūnus šia medžiaga, ir praskiestos. 
Skystosios bandomosios medžiagos į bandomąją sistemą įnešamos 
tiesiogiai arba prieš bandym ą praskiedžiamos. Tur ėtų būti naudojami 
naujai paruošti bandomosios medžiagos preparatai, jeigu ši ų 
medžiagų stabilumo tyrimo duomenys nerodo, kad juos galima 
saugoti.
 
1.4.2.  Bandymo s ąlygos  
1.4.2.1.  Tirpiklis (nešiklis)  
Tirpiklis (nešiklis) netur ėtų chemiškai reaguoti su bandom ąja 
chemine medžiaga ir tur ėtų būti užtikrinta, kad l ąstelės liks išsau ­
gotos bei bus išlaikytas S9 aktyvumas. Jeigu naudojami gerai neži ­
nomi tirpikliai (nešikliai), reikia pateikti j ų tinkamum ą įrodančius 
duomenis. Jei įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti 
vandeninį tirpiklį arba nešikl į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Kontroliniai m ėginiai  
Kiekvieno bandymo metu turi b ūti tiriami iš kiekvienai ly čiai 
priklausan čių gyvūnų paimti bei tuo pa čiu metu naudojami teigiami 
ir neigiami (tirpiklis/nešiklis) kontroliniai m ėginiai. Kontrolin ės 
grupės gyvūnai turi b ūti laikomi tomis pa čiomis sąlygomis kaip ir 
bandomieji gyv ūnai, išskyrus tai, kad jie neveikiami bandom ąja 
medžiaga.  
Teigiamuose kontroliniuose m ėginiuose, paveiktuose tokia pa čia 
bandomosios chemin ės medžiagos doze  in vivo , turi būti aptinkamos 
struktūrinės aberacijos, kurioms esant, bei veikiant bandom ąja 
medžiaga, b ūtų galima nesunkiai sumažinti pašalin į foną pakarto­
tinai, o tai parodo bandomosios sistemos jautrum ą. Pasirenkamos 
tokios teigiamos kontrolin ės dozės, kad gaunami poveikiai b ūtų 
ryškūs, bet tyrėjas ne iš karto atpažint ų užkoduotus objektinius stik ­
lelius. Priimtina, kad teigiami kontroliniai m ėginiai būtų suleisti 
gyvūnams tokiu b ūdu, kuris skiriasi nuo bandomosios chemin ės 
medžiagos suleidimo b ūdo bei būtų tik vienąkart dozuojami. Jeigu 
yra įmanoma, tai galima apsvarstyti teigiam ų kontrolini ų medžiag ų, 
priklausan čių cheminių medžiag ų klase, panaudojim ą. Toliau patei ­
kiami teigiam ų kontrolini ų cheminių medžiag ų pavyzdžiai:  
Medžiaga  CAS Nr.  Einecs Nr.  
etilo metansulfonatas  62–50–0  200–536–7  
etilo nitrošlapalas  759–73–9  212–072–2  
mitomicinas C  50–07–7  200–008–6  
ciklofosfamidas  
ciklofosfamido monohidratas  50–18–0  
6055–19–2  200–015–4  
trietilenmelaminas  51–18–3  200–083–5  
Neigiami kontroliniai m ėginiai, paveikti arba vien tirpikliu arba vien 
tik nešikliu arba kiti m ėginiai paveikti tuo pa čiu būdu kaip ir bando ­
mosios grup ės, turi b ūti paimami kiekvien ą kartą nekreipiant 
dėmesio į anksčiau atlikt ų bandym ų metu gautus kontrolinius 
duomenis, rodan čius, kad variacijos laipsnis tarp gyv ūnų ir ląstelių, 
kuriose stebimos chromosom ų aberacijos, yra tinkamas. Jei neigiami 
kontroliniai m ėginiai paimami tik vien ą kartą, tai pirmojo pa ėmimo 
laikas yra tinkamiausias. Taipogi reikia papildomai naudoti ir nepa ­
veiktus kontrolinius m ėginius, nekreipiant d ėmesio į tai, kad anks ­ 
čiau atliktų eksperiment ų aprašuose nurodyta, jog pasirinktas tirpiklis 
ar nešiklis nesuk ėlė jokio žalingo ar mutageninio poveikio.  
1.5. BANDYMO EIGA  
1.5.1.  Gyv ūnų skaičius ir lytis  
Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolin ėje grupėje turi būti ne mažiau 
kaip po 5 kiekvienos lyties gyv ūnus. Jei bandymo metu galima gauti 
anksčiau atliktų bandymų, kuriems naudota ta pati gyv ūnų rūšis ir tas 
pats veikimo bandom ąja medžiaga b ūdas, duomen ų, kurie rodo, kad 
toksiškumas abiems lytims nelabai skiriasi, užtenka ištirti vienos 
lyties gyv ūnus. Jeigu žmogaus s ąlytis su bandom ąja medžiaga 
priklauso nuo lyties, pvz., kai kuri ų farmakologiškai aktyvi ų 
medžiagų atveju, reikia ištirti atitinkamos lyties gyv ūną. 
1.5.2.  Veikimo tvarkaraštis  
Gyvūnas bandom ąja chemine medžiaga tur ėtų būti paveikiamas per 
vieną kartą. Tačiau galima veikti taikant vadinam ąją išskaidyt ą dozę, 
tai yra medžiaga suduodama per du kartus t ą pačią dieną, padarius ne 
daugiau kaip keleto valand ų pertrauką tam, kad b ūtų galima suduoti 
pakankamai didel į bandomosios medžiagos kiek į. Kita dozavimo 
tvarka turi b ūti moksliškai pagrindžiama.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Jei gyvūnas bandom ąja medžiaga buvo paveiktas per vien ą dieną, 
mėginiai imami du kartus. Tiriant graužikus, pirmasis m ėginys 
paimamas pra ėjus maždaug 1,5 l ąstelinio ciklo (šis normaliai trunka 
12–18 valand ų) po veikimo. Kadangi bandomosios medžiagos įsisk­
verbimas bei metabolizmas ir jos įtaka ląsteliniam ciklui gali paveikti 
optimalų laiką per kurį nustatomos chromosom ų aberacijos, tai reko ­
menduojama, kad antrasis m ėginys būtų paimamas pra ėjus 24 valan ­
doms po veikimo. Jei doz ės duodamos daugiau nei vien ą dieną, 
mėginys paimamas vien ą kartą, praėjus 1,5 ląstelinio ciklo trukm ės 
po paskutinio paveikimo bandom ąja medžiaga.  
Prieš numarinant, gyv ūnams suleidžiama intraperitonin ė injekcija su 
atitinkama doze metafaz ę sustabdan čios veikliosios medžiagos (pvz., 
Kolcemido® ar kolchicino). Po atitinkamo intervalo iš gyv ūnų 
paimami m ėginiai. Pel ėms tas intervalas yra maždaug 3–5 valandos, 
kiniškiems žiurk ėnams – 4–5 valandos. Iš kaul ų čiulpų išskiriamos 
ląstelės ir analizuojamos, siekiant nustatyti chromosom ų aberacijas.  
1.5.3.  Dozi ų dydis  
Jeigu bandymas atliekamas siekiant surasti interval ą, nes nėra apie 
tai duomen ų, tai jis turi b ūti atliekamas to pa čioje laboratorijoje, 
naudojant tos pa čios rūšies, linijos ir lyties gyv ūnus bei veikiant 
juos bandom ąja chemine medžiaga pagal t ą patį tvarkarašt į, kuris 
bus naudojamas pagrindinio bandymo metu (5). Jeigu nustatomas 
toksiškumas, tai pirmam m ėginių ėmimui naudojamos trij ų dydžių 
dozės. Šie dozi ų dydžiai turi apimti vis ą intervalą, pradedant nuo 
maksimumo ir baigiant minimumu (arba tokia doze, kuri visiškai nėra toksiška). V ėlesniu m ėginių paėmimo metu naudojama tik 
pati didžiausia doz ė. Didžiausia doze laikoma tokia doz ė, kuria 
paveikus gyv ūną pasireiškia toksiškumo požymiai ir jei pagal t ą 
pačią seką būtų duota dar didesn ė dozė, spėjama, kad ji b ūtų mirtina. 
Cheminės medžiagos, kurios pasižymi specifiniu biologiniu akty ­
vumu, kai j ų doz
ės būna mažos ir netoksiškos (pavyzdžiui tokios 
kaip hormonai ir mitogenai) gali b ūti laikomos išimtimi ir j ų dozės 
nustatomos kiekvienu atveju atskirai. Didžiausia doze taip pat galima laikyti toki ą dozę, kuria paveikus gyv ūną, kaulų čiulpuose pasireiškia 
kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, mitozinis indeksas 
sumažėja daugiau nei 50 %).
 
1.5.4.  Ribinis bandymas  
Jeigu paveikus gyv ūną bent 2 000 mg/kg k ūno masės doze per vien ą 
kartą arba du kartus per vien ą dieną nepastebima jokio toksiškumo 
požymių ir jei, remiantis strukt ūriškai panaši ų cheminių medžiag ų 
tyrimų duomenimis, nemanoma, kad ji yra genotoksiška, laikoma, 
kad viso bandymo su trij ų dydžių dozėmis atlikti nereikia. Atliekant 
ilgiau trunkan čius bandymus ir bandom ąja medžiaga veikiant iki 14 
dienų, ribinė dozė turi siekti 2 000 mg/kg k ūno masės/dieną, o tuo 
atveju kai bandom ąja medžiaga veikiama ilgiau nei 14 dien ų – 1 000 
mg/kg kūno masės/dieną. Atsižvelgiant į numatom ą žmogaus s ąlytį 
su bandom ąja medžiaga, gali reik ėti išbandyti didesnes dozes.  
1.5.5.  Dozi ų davimas  
Bandomoji medžiaga paprastai yra suduodama per vamzdel į, įvestą į 
skrandį, inkubacine kaniule arba suleidžiant intraperitonin ę injekciją. 
Bandomąją medžiagą galima įterpti ir kitais b ūdais, jei jie yra pagrin ­
džiami. Maksimalus skys čio, priverstinai duodamo per vamzdel į arba 
įšvirkščiamo į pilvą vienu metu, t ūris priklauso nuo bandomojo 
gyvūno dydžio. T ūris neturi viršyti 2 ml/100 g k ūno masės. Didesnio 
nei šis tūrio davimas turi b ūti pagrindžiamas. Išskyrus dirginan čias ar 
ėsdinančias medžiagas, kuri ų didesnės koncentracijos sukelia labai 
sunkų poveikį, bandomosios medžiagos t ūrio kitimas turi b ūti suma­ 
žinamas iki minimumo, koncentracij ą taip sureguliuojant, kad esant 
visiems doz ės lygiams, t ūris būtų pastovus.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Chromosom ų paruošimas  
Kai tik gyv ūnai numarinami, iš j ų iškart išimami kaul ų čiulpai, 
pamerkiami į hipotonin į tirpalą ir fiksuojami. V ėliau kaulų čiulpų 
ląstelės paskleidžiamos ant objektini ų stiklelių ir nudažomos.  
1.5.7.  Analiz ė 
Mitozinis indeksas nustatomas įvertinant citotoksiškum ą mažiausiai 
1 000 ląstelių, gautų iš 1 gyv ūno ir tai atliekama, ištiriant visus 
bandomąja medžiaga veiktus ( įskaitant teigiamus kontrolinius) ir 
neveiktus (neigiamus kontrolinius) gyv ūnus. 
Išanalizuojama mažiausiai 100 l ąstelių, gautų iš 1 gyv ūno. Šis skai ­ 
čius gali b ūti sumažinamas, jei stebima daug chromosom ų aberacijų. 
Visi objektiniai stikleliai ( įskaitant teigiam ų ir neigiam ų kontrolini ų 
mėginių objektinius stiklelius) turi b ūti užkoduojami nepriklausomai 
vienas nuo kito tam, kad juos b ūtų galima ištirti mikroskopu. 
Kadangi ruošiant objektinius stiklelius, dažnai suardoma metafaz ėje 
esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, tai v ėliau suskai ­ 
čiuotos ląstelės turi turėti tokį centromer ų skaičių, kuris būtų lygus 
2n ± 2.  
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Kiekvieno gyv ūno bandym ų rezultatai turi b ūti pateikiami lentel ėse. 
Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Reikia nustatyti kiekvieno 
gyvūno ląstelių, chromosom ų aberacij ų vienoje l ąstelėje skaičius 
bei ląstelių, turinčių chromosomas su strukt ūrinėmis aberacijomis, 
skaičių, išreiškiam ą procentais. Reikia išvardinti skirtingus chromo ­
somų struktūrinių aberacijų tipus, nurodant j ų skaičių bei pasireiš ­
kimo dažn į gyvūnų, paveikt ų ir nepaveikt ų bandom ąja chemine 
medžiaga, grup ėse. Atskirai registruojami plyšiai, ta čiau į juos neat ­
sižvelgiama, nustatant absoliut ų aberacijos dažn į. Jeigu tarp atskir ų 
lyčių nenustatoma joki ų skirtumų pagal atsak ą, tai abiej ų lyčių 
bandymo duomenys sujungiami tam, kad b ūtų galima atlikti statistin ę 
analizę. 
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Egzistuoja keli kriterijai, tokie, kaip nuo koncentracijos priklausomas 
bei pakartojamas chromosomines aberacijas turin čių ląstelių skai­ 
čiaus padid ėjimas, kuriuo remiantis, nustatoma ar gautas rezultatas 
yra teigiamas. Pirmiausia reikia aptarti gaut ų rezultatų biologin ę 
reikšmę. Vertinant bandymo rezultatus, galima taikyti statistinius 
metodus (6). Statistinis reikšmingumas netur ėtų būti vienintelis 
faktorius, pagal kur į sprendžiama, ar gautas atsakas teigiamas ar 
neigiamas. Abejotini rezultatai tur ėtų būti išsiaiškinti tolesniais 
bandymais ir pirmiausia pakei čiant eksperimento s ąlygas.  
Poliploidini ų ląstelių skaičiaus padid ėjimas gali rodyti, kad bando ­
moji medžiaga gali slopinti mitoz ę ir sukelti chromosom ų skaičiaus 
ląstelėje pakitimus. L ąstelių, turinčių endoreduplikuotas chromo ­
somas, skai čiaus padid ėjimas gali parodyti, kad bandomoji medžiaga 
gali slopinti l ąstelinį ciklą (7), (8).  
Jei tiriant medžiag ą buvo gauti rezultatai, neatitinkantys aukš čiau 
išvardytų kriterijų, tai šioje sistemoje medžiaga laikoma nemutage ­
niška.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Nors atliekant daugel į eksperiment ų, bus gauti aišk ūs teigiami ir 
neigiami rezultatai, ta čiau retais atvejais, remiantis gaut ų duomenų 
visuma, nebus galima padaryti konkre čios išvados apie bandomosios 
medžiagos aktyvum ą. NET ir daug kart ų pakartojus eksperiment ą 
rezultatai gali likti abejotini ar neaišk ūs. 
Tiriant chromosom ų aberacijas  in vitro , teigiami rezultatai, gauti 
atlikus bandym ą, rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia chromo ­
somų aberacijas tirtos gyv ūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Neigiami 
rezultatai rodo, kad esant bandymo s ąlygoms, bandomoji medžiaga 
nesukelia chromosom ų aberacijų tirtos gyv ūnų rūšies kaulų čiulpų 
ląstelėse. 
Reikia aptarti t ą galimybę, ar bandomoji medžiaga ar jos metabolitai 
pasieks bendr ąją apytaką ar tik tikslin į audinį (pvz., sisteminio 
toksiškumo atveju).  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikiama tokia informacija:  
Tirpiklis (nešiklis):  
— priežastys, d ėl kurių buvo pasirinktas nešiklis,  
— bandomosios chemin ės medžiagos, esan čios tirpiklyje (nešiklyje), 
tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— panaudota r ūšis ar veisl ė, 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, maitinimas ir pan.,  
— kiekvieno gyv ūno svoris prieš pradedant bandym ą ir kiekvienos 
grupės svorio intervalas, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.  
Bandymo s ąlygos:  
— teigiami ir neigiami (tirpiklis/nešiklis) kontroliniai m ėginiai,  
— intervalo nustatymo bandymo, jei jis buvo vykdomas, duomenys,  
— dozių dydžio pasirinkimo priežastys,  
— bandomosios medžiagos paruošimo apib ūdinimas,  
— bandomosios medžiagos davimo apib ūdinimas,  
— priežastys, nul ėmusios davimo b ūdo pasirinkim ą, 
— metodai, kuriais patvirtinama, kad bandomoji chemin ė medžiaga 
pateko į bendrąją apytaką ar į tikslinį audinį, jei taikoma,  
— bandomosios chemin ės medžiagos, esan čios pašaruose ir geria ­
majame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją 
dozę (mg/kg k ūno masės/dienai), jei taikoma,  
— duomenys apie pašar ų ir geriamojo vandens kokyb ę, 
— išsami informacija apie veikim ą bandomąja medžiaga ir m ėginio 
paėmimo tvarkarašt į, 
— toksiškumo įvertinimo metodai,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— metafaz ę sustabdan čios medžiagos prigimtis, jos koncentracija 
bei veikimo ja trukm ė, 
— objektini ų stiklelių paruošimo b ūdai, 
— aberacij ų įvertinimo kriterijai,  
— ląstelių, kurios buvo išskirtos iš vieno gyv ūno bei išanalizuotos, 
skaičius, 
— teigiam ų, neigiam ų ar abejotin ų rezultatų nustatymo kriterijai.  
Rezultatai:  
— toksiškumo požymiai,  
— mitozinis indeksas,  
— kiekvieno gyv ūno ląstelėse esančių aberacijų tipas ir skai čius, 
— absoliutus aberacij ų vieno grup ės gyvūnų ląstelėse skaičius, kartu 
nurodant vidurkius ir standartinius nukrypimus,  
— ląstelių su aberacijomis skai čius, kartu nurodant vidurkius ir stan ­
dartinius nukrypimus,  
— ploidiškumo pasikeitimai, jei buvo tokie pasteb ėti, 
— dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,  
— statistin ės analizės, jei tokios buvo atliktos,  
— vienu metu gauti neigiami kontroliniai duomenys,  
— anksčiau gauti neigiami kontroliniai duomenys, kartu pateikiant 
jų intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,  
— vienu metu gauti teigiami kontroliniai duomenys.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Adler, ID. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. Parry 
(Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275–306.  
2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, h., McFee, A.F. 
and Shelby, M. (1987). Mammalian  In Vivo  Cytogenetic Assays: 
Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells. Mutation Res., 189, p. 157–165.
 
3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., 
Bootman, J. and Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetic 
Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, 
UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141.
 
4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, 
D.H., Holden, h.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, h., Sutou, S. and Vannier, B. (1994). Report from the Working 
Group on the  in Vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal 
Aberration Test. Mutation Res., 312, p. 305–312.
 
5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G, Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, p. 313–319.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
6) Loveli, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, 
G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, 
J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic 
Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of Mutage ­
nicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge University 
Press, Cambridge. p. 184–232.  
7) Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 119, p. 403–413.
 
8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin – 
induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 
43, p. 1362–1364.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLI Ų ERITROCIT Ų MAŽŲJŲ 
BRANDUOLI Ų BANDYMAS IN VIVO  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 474 – Žinduoli ų eritrocitų mažųjų 
branduoli ų bandymą (1997).  
1.1. ĮVADAS  
Žinduolių mažųjų branduoli ų bandymas  in vivo  atliekamas, kad 
analizuojant gyv ūnų, paprastai graužik ų, kaulų čiulpų eritrocitus ir 
(arba) periferinio kraujo l ąsteles būtų galima nustatyti bandomosios 
cheminės medžiagos sukeltus eritroblast ų chromosom ų arba mito ­
zinio aparato pažeidimus.  
Mažųjų branduoli ų bandymo tikslas – nustatyti chemines medžiagas, 
sukeliančias citogenetinius pažeidimus, d ėl kurių susiformuoja 
mažieji branduoliai, kuriuose yra atsilikusi ų chromosom ų fragmentai 
ar ištisos chromosomos.  
Kai kaulų čiulpų eritroblastas vystydamasis virsta polichromatiniu 
eritrocitu, pagrindinis (didysis) branduolys yra suspaudžiamas ir bet kuris susiformav ęs mažasis branduolys gali likti už citoplazmos, 
neturinčios branduolio, rib ų. Šiose ląstelėse galima pamatyti mažuo ­
sius branduolius, nes l ąstelė yra praradusi savo pagrindin į branduol į. 
Jei gyvūnus, paveikus bandom ąja chemine medžiaga padaug ėja 
polichromatini ų eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, tai rodo, 
kad chromosomos buvo pažeistos.
 
Atliekant š į bandym ą paprastai naudojami graužik ų kaulų čiulpai, 
nes būtent šiame audinyje susiformuoja polichromatiniai eritrocitai. 
Periferinio kraujo polichromatini ų (nesubrendusi ų, turinčių mažuo­
sius branduolius) eritrocit ų bandym ą galima atlikti su bet kurios 
rūšies gyvūnais, jei įrodyta, kad tos r ūšies gyvūnų blužnis nesugeba 
pašalinti eritrocit ų, turinčių mažuosius branduolius, arba kuri yra 
pakankamai jautri, kad b ūtų galima nustatyti medžiagas, sukelian čias 
struktūrines chromosom ų aberacijas ar chromosom ų skaičiaus abera ­
cijas. Mažuosius branduolius galima atskirti pagal daugel į kriterijų. 
Vienas jų – nustatyti, ar mažuosiuose branduoliuose yra kinetochorai 
arba centromerin ė DNR. Bandymo tikslas taip pat gali b ūti nustatyti, 
kiek periferiniame kraujyje yra subrendusi ų (normochromatini ų) 
eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, palyginti su subrendusi ų 
eritrocitų skaičiumi, kai gyv ūnai veikiami bandom ąja chemine 
medžiaga keturias ar daugiau savai čių. 
Šis žinduoli ų mažųjų branduoli ų bandymas  in vivo  yra ypač svarbus 
mutagenų pavojui įvertinti, nes pagal j į galima atsižvelgti į tokius 
veiksnius kaip  in vivo  metabolizmas, farmakokinetika bei DNR 
pažaidų reparacija, nors jie gali skirtis priklausomai nuo gyv ūnų 
rūšies, audinio ir bandomo genetinio poveikio. Bandymas  in vivo  
taip pat naudingas toliau tiriant mutagenin į poveikį, nustatyt ą in 
vitro . 
Jeigu turima duomen ų, kad bandomoji medžiaga ar reaktyvusis meta ­
bolitas ne įsiskverbs į tikslinį audinį, šis bandymas yra netinkamas.  
Taip pat žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Centromera (kinetochoras)  – chromosomos regionas, su kuriuo 
ląstelės dalijimosi metu asocijuojasi verpst ės siūlai ir dėl to dukte ­
rinės chromosomos tvarkingai juda link dukterini ų ląstelių polių. 
Mažieji branduoliai  – maži papildomi ir nuo pagrindinio l ąstelės 
branduolio atskirti branduoliai, susidarantys mitoz ės telofazės metu 
iš atsilikusi ų chromosom ų fragment ų ar ištisų chromosom ų. 
Normochromatinis eritrocitas  – subrend ęs, neturintis ribosom ų 
eritrocitas, kur į nuo nesubrendusio polichromatinio eritrocito galima 
atskirti nudažius ribosomas nudažan čiais dažais.  
Polichromatinis eritrocitas  – nesubrend ęs, tarpinėje vystymosi stadi ­
joje esantis eritrocitas, kuris vis dar tebeturi ribosomas ir gali b ūti 
atskirtas nuo subrendusio normochromatinio eritrocito nudažius ribo ­
somas nudažan čiais dažais.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Gyvūnai veikiami bandom ąja medžiaga tinkamu veikimo b ūdu. Jei 
bandymui naudojami kaul ų čiulpai, gyv ūnai numarinami pra ėjus 
atitinkamiems laiko tarpams po veikimo bandom ąja medžiaga, iš j ų 
išimami kaul ų čiulpai, paruošiami ir nudažomi j ų preparatai 
(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Jei naudojamas periferinis kraujas, jis paimamas 
po veikimo bandom ąja medžiaga pra ėjus atitinkamiems laiko 
tarpams, paruošiami ir nudažomi jo tepin ėliai (4)(8)(9)(10). Tiriant 
periferinį kraują, kaip galima mažiau laiko turi praeiti tarp paskutinio 
veikimo ir l ąstelių surinkimo. Preparatai analizuojami, siekiant nusta ­
tyti, ar yra maž ųjų branduoli ų. 
1.4. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
1.4.1.  Preparatai  
1.4.1.1.  Gyvūnų rūšies pasirinkimas  
Jei naudojami kaul ų čiulpai, rekomenduojama pasirinkti peles ar 
žiurkes, nors galima pasirinkti ir bet kokias kitas žinduoli ų rūšis. 
Jei naudojamas periferinis kraujas, rekomenduojama pasirinkti 
peles. Ta čiau galima naudoti bet kokias kitas žinduoli ų rūšis, jeigu 
žinoma, kad tos r ūšies žinduolio blužnis nesugeba pašalinti eritrocit ų, 
turinčių mažuosius branduolius arba tos r ūšies žinduolis pakankamai 
jautrus, kad b ūtų galima nustatyti medžiagas, sukelian čias strukt ū­
rines chromosom ų aberacijas arba chromosom ų skaičiaus aberacijas. 
Turėtų būti naudojami įprastinių laboratorini ų veislių jauni ir sveiki 
gyvūnai. Bandymo pradžioje gyv ūnų svorio skirtumai turi b ūti kuo 
mažesni; j ų svoris turi b ūti ne didesnis kaip ± 20 % atitinkamos 
lyties gyv ūnų vidutinis svoris.  
1.4.1.2.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Taikomos Bendrojo įvado B dalyje nurodytos s ąlygos, nors stengia ­
masi, kad dr ėgmė siektų 50–60 %.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Gyvūnų paruošimas  
Sveiki jauni subrend ę gyvūnai atsitiktin ės atrankos b ūdu suskirstomi 
į kontrolin ę bei bandom ąją grupes. Gyv ūnams leidžiama aklimati ­
zuotis prie laboratorini ų sąlygų mažiausiai 5 dienas. Narvai pastatomi 
taip, kad b ūtų kuo labiau sumažintas poveikis, susij ęs su narv ų 
išdėstymu.  
1.4.1.4.  Dozi ų paruošimas  
Kietosios bandomosios chemin ės medžiagos ištirpinamos arba 
suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose ir, jei 
reikia, praskiedžiamos prieš duodant jas gyv ūnams. Skyst ųjų bando­
mųjų medžiag ų dozės gali būti ruošiamos iškart arba prieš tai pras ­
kiedžiamos. Prieš kiekvien ą bandym ą bandomosios chemin ės 
medžiagos preparatai tur ėtų būti paruošiami šviežiai, nebent 
duomenys apie medžiag ą stabilum ą rodo, kad j ą galima laikyti.  
1.4.2.  Bandymo s ąlygos  
1.4.2.1.  Tirpiklis arba nešiklis  
Tirpiklis arba nešiklis, naudojamas tokiu kiekiu, kokio reikia doz ėms 
paruošti, tur ėtų nesukelti jokio toksinio poveikio, ir netur ėtų 
chemiškai reaguoti su bandom ąja medžiaga. Gerai nežinomi tirpikliai 
arba nešikliai gali b ūti naudojami tik turint j ų tinkamum ą įrodančių 
duomenų. Jei įmanoma, pirmiausia rekomenduojama naudoti vande ­
ninį tirpiklį arba nešikl į. 
1.4.2.2.  Kontroliniai gyv ūnai 
Atliekant kiekvien ą bandym ą kartu naudojami kiekvienos lyties 
gyvūnų teigiami ir neigiami (tirpiklis/nešiklis) kontroliniai m ėginiai. 
Kontrolin ės grupės gyvūnai laikomi tomis pa čiomis sąlygomis kaip 
ir bandomosios grup ės gyvūnai, išskyrus tai, kad bandom ąja 
medžiaga jie neveikiami.  
Teigiamuose kontroliniuose m ėginiuose  in vivo  sąlygomis turi susi ­
daryti mažieji branduoliai, esant tokiam veikimui, kuris kaip tikimasi, užgoš pašalin į foną. Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolin ės 
grupės dozės, kad būtų gaunamas aiškus poveikis, bet kad tyr ėjas 
ne iškart atpažint ų užkoduotus objektinius stiklelius. Priimtina, kad 
teigiamai kontrolinei grupei bandomoji chemin ė medžiaga b ūtų 
duodama kitu b ūdu negu bandomajai grupei, ir m ėginius galima 
paimti tik vien ą kartą. Be to, jei įmanoma, kontroliniam teigiamam 
mėginiui gauti galima rinktis kit ą tos pačios chemini ų medžiag ų 
klasės medžiag ą. Žemiau pateikiami medžiag ų, tinkamų teigiamiems 
kontroliniams m ėginiams gauti, pavyzdžiai:
 
Medžiaga  CAS Nr.  Einecs Nr.  
etilo metansulfonatas  62–50–0  200–536–7  
N-etil-N-nitrošlapalas  759–73–9  212–072–2  
mitomicinas C  50–07–7  200–008–6  
ciklofosfamidas 
ciklofosfamido monohidratas  50–18–0 
6055–19–2  200–015–4  
trietilenmelaminas  51–18–3  200–083–5  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Kiekvieną kartą, kai imami m ėginiai, iš kontrolini ų gyvūnų, paveiktų 
tik tirpikliu arba tik nešikliu, su kuriais buvo elgiamasi lygiai taip pat 
kaip su bandomaisiais gyv ūnais, turi b ūti paimti neigiami kontroliniai 
mėginiai, nebent turima ankstesni ų bandym ų duomen ų, rodančių 
priimtiną variacijos tarp gyv ūnų laipsnį ir ląstelių, turinčių mažuosius 
branduolius, dažn į. Jei neigiami kontroliniai m ėginiai imami tik 
vieną kartą, geriausia juos imti kartu su pirmuoju m ėginių ėmimu. 
Be to, reikia papildomai panaudoti bandom ąja medžiaga nepaveiktus 
kontrolinius m ėginius, nebent yra anks čiau atlikt ų bandym ų arba 
publikuot ų duomenų, rodančių, kad pasirinktas tirpiklis ar nešiklis 
nesukelia jokio žalingo ar mutageninio poveikio.  
Jei naudojamas periferinis kraujas, tai m ėginys, naudojamas prieš 
veikimą bandomąja medžiaga, gali b ūti naudojamas kaip neigiama 
kontrolė, tačiau tik trumpai trunkan čių periferinio kraujo tyrim ų metu 
(pavyzdžiui, 1–3 kartus veikiant bandom ąja medžiaga), kai gaunami 
duomenys atitinka pageidaujam ą anksčiau naudotos kontrol ės inter­
valą. 
1.5. BANDYMO EIGA  
1.5.1.  Gyv ūnų skaičius ir lytis  
Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolin ėje grupėje turi būti mažiausiai 
po 5 analizei tinkamus kiekvienos lyties gyv ūnus (11). Jei bandymo 
metu galima gauti anks čiau atliktų bandymų, kuriems naudota ta pati 
gyvūnų rūšis ir tas pats veikimo bandom ąja medžiaga b ūdas, 
duomenų, kurie rodo, kad toksiškumas abiems lytims nelabai skiriasi, 
užtenka ištirti vienos lyties gyv ūnus. Jeigu žmogaus s ąlytis su bando ­
mąja medžiaga priklauso nuo lyties, pvz., kai kuri ų farmakologiškai 
aktyvių medžiag ų atveju, reikia ištirti atitinkamos lyties gyv ūną. 
1.5.2.  Veikimo tvarkaraštis  
Nėra standartinio veikimo bandom ąja chemine medžiaga tvarkaraš čio 
(t. y. 1, 2 ar daugiau veikim ų atliekami kas 24 valandos), kur į būtų 
galima rekomenduoti. M ėginių ėmimas esant prailgintam dozavimo 
režimui, yra priimtinas, jei įrodytas teigiamas poveikis, arba 
neigiamo tyrimo atveju, jei buvo nustatytas toksiškumas arba buvo 
panaudota ribin ė dozė ir dozavimas buvo t ęsiamas iki m ėginio 
paėmimo. Jei reikia suduoti didel į bandomosios chemin ės medžiagos 
tūrį, ji gali b ūti duodama per kelis kartus, t. y. per 1 dien ą atliekami 
2 veikimai bandom ąja medžiaga ir abi proced ūras skiria ne ilgesnis 
kaip kelių valandų laikotarpis.  
Bandymas gali b ūti atliekamas 2 b ūdais:  
a) gyvūnai paveikiami bandom ąja chemine medžiaga vien ąkart. 
Kaulų čiulpų mėginiai paimami mažiausiai 2 kartus, pirm ą 
kartą ne anksčiau kaip pra ėjus 24 valandoms po veikimo bando ­
mąja medžiaga, bet ne v ėliau kaip pra ėjus 48 valandoms po 
veikimo tarp m ėginių ėmimo paliekant atitinkam ą laiko interval ą. 
Imti mėginius anks čiau nei pra ėjus 24 valandoms po veikimo 
galima tik pagr įstais atvejais. Periferinio kraujo m ėginiai imami 
mažiausiai 2 kartus, pirm ą kartą – ne anks čiau kaip pra ėjus 36 
valandoms po veikimo, o v ėliau po atitinkamo laiko intervalo, 
bet ne vėliau kaip po 72 valand ų. Jei teigiamas atsakas gaunamas 
paėmus pirm ąjį mėginį, kito mėginio imti neb ūtina; ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) jei per dien ą atliekami du ir daugiau veikim ų (pavyzdžiui, atlie ­
kami du ir daugiau veikim ų kas 24 valandos), kaul ų čiulpų 
mėginiai paimami vien ąkart, praėjus 18–24 valandoms po pasku ­
tinio paveikimo bandom ąja medžiaga, o periferinio kraujo m ėgi­
niai – pra ėjus 36–48 valandoms po paskutinio veikimo bando ­
mąja medžiaga (12).  
Mėginiai gali b ūti papildomai paimami ir kitu laiko metu, jei tai 
svarbu.  
1.5.3.  Doz ės dydis  
Jeigu atliekamas bandymas, siekiant surasti interval ą, nes apie j į nėra 
duomenų, jis turi b ūti atliekamas toje pa čioje laboratorijoje, naudo ­
jant tos pa čios rūšies, veisl ės ir lyties gyv ūnus bei veikiant juos 
bandomąja chemine medžiaga pagal t ą patį tvarkarašt į, kuris bus 
naudojamas pagrindinio bandymo metu (13). Jeigu nustatomas 
toksiškumas, tai pirm ąkart imant m ėginius naudojamos 3 dydži ų 
dozės. Dozių dydžiai turi apimti vis ą intervalą, pradedant nuo 
didžiausio poveikio ir baigiant mažiausiu arba tokia doze, kuri 
visiškai n ėra toksiška. V ėlesniam m ėginių ėmimui naudojama tik 
pati didžiausia doz ė. Didžiausia doze laikoma tokia doz ė, kuria 
paveikus gyv ūną pasireiškia toksiškumo požymiai ir jei pagal t ą 
pačią seką būtų duota dar didesn ė dozė, spėjama, kad ji b ūtų mirtina. 
Cheminės medžiagos, kurios pasižymi specifiniu biologiniu akty ­
vumu, kai j ų dozės būna mažos ir netoksiškos (pavyzdžiui tokios 
kaip hormonai ir mitogenai) gali b ūti laikomos išimtimi ir j ų dozės 
nustatomos kiekvienu atveju atskirai. Didžiausia doze taip pat galima 
laikyti toki ą dozę, kuria paveikus gyv ūną, kaulų čiulpuose pasireiškia 
kai kurie toksiškumo požymiai (pvz., nesubrendusi ų eritrocitų skai­ 
čius, lyginant su absoliu čiu visų eritrocitų, esančių kaulų čiulpuose ir 
periferiniame kraujyje, skai čiumi, sumaž ėja). 
1.5.4.  Ribinis bandymas  
Jeigu paveikus gyv ūną bent 2 000 mg/kg k ūno masės doze per vien ą 
kartą arba du kartus per vien ą dieną nepastebima jokio toksiškumo 
požymių ir jei, remiantis strukt ūriškai panaši ų cheminių medžiag ų 
bandymų duomenimis, nemanoma, kad ji yra genotoksiška, laikoma, 
kad viso bandymo su trij ų dydžių dozėmis atlikti nereikia. Atliekant 
ilgiau trunkan čius bandymus ir bandom ąja medžiaga veikiant iki 14 
dienų, ribinė dozė turi siekti 2 000 mg/kg k ūno masės/dieną, o tuo 
atveju, kai bandom ąja medžiaga veikiama ilgiau nei 14 dien ų – 
1 000 mg/kg k ūno masės/dieną. Atsižvelgiant į numatom ą žmogaus 
sąlytį su bandom ąja medžiaga, gali reik ėti išbandyti didesnes dozes.  
1.5.5.  Dozi ų davimas  
Bandomoji medžiaga paprastai yra suduodama per vamzdel į, įvestą į 
skrandį, inkubacine kaniule arba suleidžiant intraperitonin ę injekciją. 
Bandomąją medžiagą galima įterpti ir kitais b ūdais, jei jie yra pagrin ­
džiami. Maksimalus skys čio, priverstinai duodamo per vamzdel į arba 
įšvirkščiamo į pilvą vienu metu, t ūris priklauso nuo bandomojo 
gyvūno dydžio. T ūris neturi viršyti 2 ml/100 g k ūno masės. Didesnio 
nei šis tūrio davimas turi b ūti pagrindžiamas. Išskyrus dirginan čias ar 
ėsdinančias medžiagas, kuri ų didesnės koncentracijos sukelia labai 
sunkų poveikį, bandomosios medžiagos t ūrio kitimas turi b ūti suma­ 
žinamas iki minimumo, koncentracij ą taip sureguliuojant, kad esant 
visiems doz ės lygiams, t ūris būtų pastovus.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Kaul ų čiulpų/kraujo paruošimas  
Kaulų čiulpų ląstelės paprastai gaunamos iš k ą tik numarint ų gyvūnų 
šlaunikauli ų ir blauzdikauli ų. Bendru atveju iš šlaunikauli ų ir blauz­
dikaulių išskiriamos l ąstelės ir, panaudojant gerai žinomus metodus, 
paruošiami j ų preparatai, kurie po to nudažomi. Periferinis kraujas 
imamas iš uodegin ės venos ar kito atitinkamo kraujo indo. Iš kraujo 
išskirtos l ąstelės arba iškart dažomos supravitaliniais dažais 
(8)(9)(10) arba paruošiami tepin ėliai, kurie v ėliau yra nudažomi. 
DNR atžvilgiu naudojami specifiniai dažai, tokie kaip akridino oran ­ 
žinis 14 arba Hoechst 33258 dažas, turintis pironino-Y 15, gali pašalinti kai kuriuos artefaktus, kurie atsiranda, naudojant DNR 
atžvilgiu nespecifinius dažus. Ta čiau tai, kad yra šis privalumas, 
nereiškia, kad negalima naudoti įprastinių dažų (pavyzdžiui, Giemsa 
dažo). Galima naudoti ir papildomas sistemas, tokias kaip celiulioze užpildytos chromatografin ės kolonėlės, skirtas branduolius turin ­ 
čioms ląstelėms pašalinti (16), jei įrodoma, kad naudojant šias 
sistemas galima tinkamai išskirti mažuosius branduolius laboratori ­
nėmis sąlygomis.
 
1.5.7.  Analiz ė 
Nustatomas kiekvieno gyv ūno nesubrendusi ų ir subrendusi ų eritro­
citų santykis, suskai čiuojant mažiausiai 200 eritrocit ų iš kaulų čiulpų 
ir 1 000 eritrocit ų iš periferinio kraujo (17). Prieš pradedant mikro ­
skopinę analizę, visi objektiniai stikleliai, įskaitant teigiamus ir 
neigiamus kontrolinius m ėginius, užkoduojami nepriklausomai 
vienas nuo kito. Ištiriama bent 2 000 kiekvieno gyv ūno eritrocit ų ir 
suskaičiuojami nesubrend ę, mažųjų branduoli ų turintys eritrocitai. 
Papildomos informacijos gali b ūti gaunama suskai čiuojant subrendu ­
sius eritrocitus, turin čius mažųjų branduoli ų. Analizuojant stiklelius, 
nesubrendusi ų ir subrendusi ų eritrocitų santykis turi b ūti ne mažesnis 
kaip 20 % kontrolin ės vertės. Jei gyv ūnai buvo veikiami bandom ąja 
medžiaga m ėnesį ir ilgiau, reikia suskai čiuoti mažiausiai 2 000 eritro ­
citų ir nustatyti, kiek iš j ų turi mažuosius branduolius. Vietoj 
rankinio įvertinimo galima naudoti automatizuotas analiz ės sistemas 
(vaizdo analiz ės ir ląstelių suspensijos srauto t ėkmės citometrin ės 
analizės sistemas), jeigu jos atitinkamai yra patvirtintos ir pagr įstos. 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Kiekvieno gyv ūno bandym ų rezultatai turi b ūti pateikiami lentel ėse. 
Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Turi b ūti nustatytas kiekvieno 
gyvūno nesubrendusi ų eritrocitų skaičius ir nesubrendusi ų eritrocitų, 
turinčių mažuosius branduolius, skai čius bei nesubrendusi ų ir subren ­
dusių eritrocit ų skaičiaus santykis. Jeigu gyv ūnai be pertraukos 
veikiami bandom ąja medžiaga m ėnesį ar ilgiau, turi b ūti pateikti 
duomenys apie subrendusius eritrocitus, jei tokie duomenys buvo 
renkami. Jeigu įmanoma, tai kiekvieno gyv ūno atveju pateikiamas 
nesubrendusi ų ir subrendusi ų eritrocitų skaičiaus santykis bei eritro ­
citų, turinčių mažuosius branduolius, skai čius, išreikštas procentais 
Jeigu nenustatoma joki ų atsako skirtum ų tarp atskir ų lyčių, tai abiej ų 
lyčių bandymo duomenys sujungiami statistin ės analizės tikslais.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Teigiamą rezultatą galima įvertinti keletu kriterij ų, pavyzdžiui, nuo 
dozės dydžio priklausomas l ąstelių, turinčių mažuosius branduolius, 
skaičiaus padid ėjimas arba akivaizdus l ąstelių, turinčių mažuosius 
branduolius, skai čiaus padid ėjimas, gyv ūnams gavus pavien ę dozę 
ir paėmus vieną mėginį. Pirmiausia reikia apsvarstyti biologin ę rezul­
tatų reikšmę. Įvertinant bandymo metu gautus rezultatus, galima 
pasinaudoti statistiniais metodais (18)(19). Statistinis reikšmingumas 
turėtų būti ne vienintelis veiksnys, pagal kur į sprendžiama, ar atsakas 
teigiamas, ar ne. Abejotini rezultatai tur ėtų būti išaiškinti, toliau 
tęsiant bandym ą ir pirmiausia pakei čiant bandymo s ąlygas.  
Jei bandant medžiag ą gaunami rezultatai, neatitinkantys aukš čiau 
išvardytų kriterijų, laikoma, kad pagal š į bandymą, tokia medžiaga 
yra nemutageniška.  
Nors daugumos eksperiment ų metu bus gaunami aišk ūs teigiami ar 
neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gaut ų rezultatų rinkinys neleis 
padaryti išvados apie bandomosios medžiagos aktyvum ą. Rezultatai 
gali likti abejotini ar neaišk ūs, nepriklausomai nuo atlikt ų eksperi­
mentų skaičiaus. 
Mažųjų branduoli ų bandymo teigiami rezultatai rodo, kad bandomoji 
medžiaga sukelia maž ųjų branduoli ų, kuriuos s ąlygoja bandomosios 
rūšies gyvūnų eritroblast ų chromosom ų ar mitozinio aparato pažei ­
dimai, pasireiškim ą. Neigiami rezultatai rodo, kad bandomoji 
medžiaga nesukelia maž ųjų branduoli ų atsiradimo bandomos r ūšies 
gyvūnų nesubrendusiuose eritrocituose.  
Turi būti aptarta, kokia yra tikimyb ė, kad bandomoji medžiaga arba 
jos metabolitai pateks į bendrąją apytaką ar konkret ų tikslinį audinį 
(pavyzdžiui, somatinio toksiškumo atveju).  
3. ATASKAITA  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikiama tokia informacija:  
Tirpiklis/nešiklis:  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas,  
— bandomosios chemin ės medžiagos tirpumas ir stabilumas tirpik ­
lyje/nešiklyje, jei žinomas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— panaudota r ūšis ar veisl ė, 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir pan.,  
— kiekvieno gyv ūno svoris prieš pradedant bandym ą ir kiekvienos 
grupės svorio intervalas, vidurkiai bei standartinis nuokrypis.  
Bandymo s ąlygos:  
— teigiami ir neigiami (tirpiklis/nešiklis) kontroliniai m ėginiai,  
— ribų paieškos bandymo, jei jis buvo vykdomas, rezultatai,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— dozių dydžių pasirinkimo priežastys,  
— duomenys apie bandomosios medžiagos paruošim ą, 
— duomenys apie veikim ą bandomąja medžiaga,  
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi veikimo b ūdo pasirinkim ą, 
— metodai, kuriais patvirtinama, kad bandomoji chemin ė medžiaga 
pateko į bendrąją apytaką ar tikslin į audinį, jei taikoma,  
— bandomosios chemin ės medžiagos, esan čios pašaruose ir geria ­
majame vandenyje, koncentracijos (pm) pervertimas į tikrąją 
dozę (mg/kg k ūno masės/dienai), jei taikoma,  
— duomenys apie pašar ų ir geriamojo vandens kokyb ę, 
— išsamus veikimo bandom ąja medžiaga ir m ėginio paėmimo tvar ­
karaščio aprašymas,  
— objektini ų stiklelių paruošimo metodai,  
— toksiškumo matavimo metodai,  
— nesubrendusi ų eritrocitų, turinčių mažuosius branduolius, skai čia­
vimo kriterijai,  
— iš vieno gyv ūno išskirt ų bei išanalizuot ų ląstelių skaičius, 
— teigiam ų, neigiam ų ar abejotin ų rezultatų nustatymo kriterijai.  
Rezultatai:  
— toksiškumo požymiai,  
— nesubrendusi ų ir subrendusi ų eritrocitų skaičiaus santykis,  
— kiekvieno gyv ūno nesubrendusi ų eritrocitų, turinčių mažuosius 
branduolius, skai čius, 
— kiekvienos grup ės nesubrendusi ų eritrocitų, turinčių mažuosius 
branduolius, skai čiaus vidurkis ir standartinis nuokrypis,  
— dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,  
— statistin ės analizės ir metodai, jei taikyta,  
— lygiagre čiai gaunam ų ir ankstesni ų neigiamų kontrolini ų mėginių 
duomenys,  
— lygiagre čiai gaunam ų teigiamų kontrolini ų mėginių duomenys.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Heddle, J.A. (1973). A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, p. 187–190.  
2) Schmid, W. (1975). The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
p. 9–15.  
3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., 
Mavournin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W. (1983). The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. 
Mutation Res. 123, p. 61–118.
 
4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, M.F. 
and Heddle, J.A. (1990). The  In Vivo  Micronucleus Assay in 
Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of 
the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, 
Mutation Res., 239, p. 29–80.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
5) MacGregor, J.T., Schlegel, R., Choy, W.N., and Wehr, CM. 
(1983). Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice in: „Developments in Science and Practice of Toxicology“, Ed. A.W. Hayes, R.C. Schnell and T.S. Miya, 
Elsevier, Amsterdam, p. 555–558.
 
6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A., Hite, M., Margolin, G.H., 
Ramel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D. (1987) 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mamma ­
lian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res. 189, p. 103–112.  
7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E. 
(1990). The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measure ­
ment at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits 
Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol, 14, p. 513–522.
 
8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990). The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. 
Mutation Res., 245, p. 245–249.  
9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryth ­
rocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary 
Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. 
MMS. Mutation Res., 278, p. 83–98.  
10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995). 
Protocol recommended for the short-term mouse peripheral 
blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153–159.
 
11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., 
Blackey, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr.F.B., Pacchie ­
rotti, F., Romagna, F., Shimada, h., Sutou, S. and Vannier, B. 
(1994).  In Vivo  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Muta ­
tion Res., 312, p. 293–304.  
12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995). An optimal, generalized 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, 
p. 313–319.
 
13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working Group: Dose Setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, p. 313–319.
 
14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983). An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241–247.  
15) MacGregor, J.T., Wehr, CM. and Langlois, R.G. (1983). A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269–275.
 
16) Romagna, F. and Staniforth, CD. (1989). The automated bone 
marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91–104.  
17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G. (1995). Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 
347, p. 97–99.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D.G. and Henderson, L. (1990).  In Vivo  Cytogenetics Assay. 
In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. 
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141.
 
19) Loveli, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G, Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines 
for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184–232.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGENIŠKUMAS – BAKTERIJ Ų GRĮŽTAMŲJŲ 
MUTACIJ Ų BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 471 – Bakterij ų grįžtamųjų mutacijų 
bandymą (1997).  
1.1. ĮVADAS  
Bakterijų grįžtamųjų mutacij ų bandymui naudojami  Salmonella 
typhimurium  ir Escherichia coli  kamienai, kuriems reikalingos 
aminorūgštys, ir juo siekiama nustatyti taškines mutacijas, kurios 
atsiranda d ėl vienos ar keli ų DNR bazi ų porų pakaitos, intarp ų ar 
delecijos (1)(2)(3). Šio bakterij ų grįžtamųjų mutacijų bandymo esm ė 
ta, kad juo nustatomos mutacijos, d ėl kurių bandom ųjų kamienų 
mutacijos atsistato į pirmykšt ę padėtį ir atsikuria bakterij ų funkcinis 
gebėjimas sintetinti b ūtiną amino rūgštį. Bakterijos-revertantai aptin ­
kamos pagal j ų sugebėjimą augti terp ėje, kurioje n ėra amino r ūgšties, 
reikalingos j ų tėviniam bandomajam kamienui.  
Daugelio žmoni ų genetiškai paveldim ų ligų priežastis yra taškin ės 
mutacijos bei su jomis susij ę įvykiai, ir egzistuoja pakankamai 
įrodymų, kad dėl somatin ėse ląstelėse esančių onkogen ų bei navik ų 
supresorini ų genų taškinių mutacijų formuojasi žmoni ų ir eksperi ­
mentinių gyvūnų navikai. Bakterij ų grįžtamųjų mutacijų bandymas 
yra nebrangus ir greitai bei pakankamai lengvai atliekamas. Dauguma bandom ųjų kamienų pasižymi keletu ypatybi ų, pagal 
kurias lengva nustatyti j ų mutacijas, įskaitant DNR sekose, esan čiose 
grįžtamųjų mutacijų vyksmo vietose bei sukurian čiose atsak ą į 
signalą, padidint ą lą
stelių pralaidum ą didelės molekulin ės masės 
molekulėms ir DNR pažaid ų atstatymo sistem ų sunaikinim ą arba 
pažaidoms atspari ų DNR atk ūrimo proces ų suintensyv ėjimą. Tiriant 
kamienų specifiškum ą gaunama vertingos informacijos apie genotok ­
siškų medžiag ų sukeltų mutacijų tipus. Yra sukaupta labai didel ė 
grįžtamųjų mutacijų bandymų rezultatų duomenų bazė, kurioje yra 
duomenų apie įvairiausias strukt ūras, ir yra sukurta visuotinai pripa ­ 
žintų metodų cheminėms medžiagoms, įskaitant lakiuosius junginius, 
pasižymin čioms skirtingomis fizikin ėmis bei chemin ėmis savyb ėmis, 
tirti. 
Taip pat žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Grįžtamųjų mutacij ų bandymas  – bandymas, kuriuo  Salmonella 
typhimurium  arba  Escherichia coli  kamienuose, kuriems reikalinga 
aminorūgštis (atitinkamai histidinas ar triptofanas), nustatoma muta ­
cija, dėl kurios atsiranda kamienas, kuriam nereikalinga amino ­
rūgštis, tiekiama egzogeniniu b ūdu. 
Mutagenai, sukeliantys bazi ų porų pakaitas  – medžiagos, suke ­
liančios DNR bazi ų porų pakaitas. Atliekant reversijos bandym ą, ši 
pakaita gali vykti pradin ės mutacijos ar kitoje bakterijos genomo 
vietoje.  
Mutagenai, sukeliantys skaitymo r ėmelio poslink į – medžiagos, 
sukeliančios vienos ar keli ų DNR bazi ų porų intarpus ar delecijas, 
dėl kurių pasislenka RNR molekul ėje esantis skaitymo r ėmelis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. PRADINIAI SVARSTYMAI  
Atliekant bakterij ų grįžtamųjų mutacijų bandymą naudojamos proka ­
riotinės ląstelės, kurios skiriasi nuo žinduoli ų ląstelių pagal tokius 
veiksnius kaip medžiag ų transportas į ląstelę, metabolizmas, chromo ­
somų struktūra bei DNR pažaid ų atstatymo procesai. Paprastai atlie ­
kant bandymus  in vitro , reikia naudoti egzogenin į metabolin ės akty­
vacijos šaltin į. Metabolin ės aktyvacijos sistemos  in vitro  negali abso ­
liučiai imituoti žinduoli ų metabolin ės aktyvacijos s ąlygų in vivo . 
Taigi atliekant bandym ą negaunama tiesiogin ės informacijos apie 
cheminių medžiag ų mutageniškum ą ir kancerogeniškum ą žinduo­
liams.  
Bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas paprastai naudojamas kaip 
pirminė atranka siekiant nustatyti genotoksin į aktyvum ą, o ypač 
gebėjimą sukelti taškines mutacijas. Gausi duomen ų bazė parodė, 
kad daugelio chemini ų medžiag ų, su kuriomis atlikus š į bandymą 
gauti teigiami rezultatai, mutagenin ės savybės patvirtinamos ir kitais 
bandymais. Ta čiau šiuo bandymu galima nustatyti ne visus muta ­
genus; priežastys gali b ūti šio bandymo pagrindinio tikslo specifika, 
metabolin ės aktyvacijos skirtumai ar mutagen ų biologinio įsisavina­
mumo skirtumai. Kita vertus, d ėl veiksnių, padidinan čių bakterijų 
grįžtamųjų mutacijų bandymo jautrum ą, mutageninis medžiag ų akty­
vumas gali b ūti pervertintas.  
Bakterijų grįžtamųjų mutacijų bandymas netinka konkre čių cheminių 
medžiagų klasėms, pavyzdžiui junginiams, pasižymintiems pernelyg 
dideliu baktericidiniu aktyvumu (konkret ūs antibiotikai) ir tiems 
junginiams, kurie, kaip manoma, blokuoja žinduoli ų ląstelių DNR 
replikacijos sistem ą (keletas topoizomerazi ų inhibitori ų ir nukleozid ų 
analogų). Tokiais atvejais labiau tinka žinduoli ų mutacijų bandymai.  
Nors cheminiai junginiai, kuriuos tiriant šiuo bandymu gaunamas 
teigiamas rezultatas, yra kancerogeniški žinduoliams, ta čiau šis tarpu ­
savio ryšys n ėra absoliutus. Tai priklauso nuo chemini ų medžiag ų 
klasės ir atliekant š į bandymą neįmanoma nustatyti tam tikr ų kance­
rogenų, kadangi j ų veikimo mechanizmai nepagr įsti genotoksiškumu 
arba nėra būdingi bakterij ų ląstelėms. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bakterijų ląstelių suspensijos veikiamos bandom ąja medžiaga naudo ­
jant egzogenin ę metabolin ės aktyvacijos sistem ą arba jos nenaudo ­
jant. Pagal inkorporacijos į lėkštelę metodą šios suspensijos paden ­
giamos agaru ir užliejamos ant minimalios terp ės. Pagal išankstin ės 
inkubacijos metod ą suspensija iš pradži ų inkubuojama su medžiaga, 
kuria bus veikiamos bakterin ės ląstelės, o vėliau padengiama agaru ir 
po to užpilama ant minimalios terp ės. Panaudojant abu metodus ir 
praėjus 2–3 inkubacijos dienoms, skai čiuojamos revertant ų kolonijos 
ir lyginamos su spontanini ų revertant ų kolonijomis, auginamomis 
kontrolinėse lėkštelėse, tirpiklyje, skai čiumi.  
Aprašytos kelios bakterij ų grįžtamųjų mutacijų bandymo proced ūros. 
Dažniausiai naudojami inkorporacijos į lėkštelę (1)(2)(3)(4), išanks ­
tinės inkubacijos (2)(3)(5)(6)(7)(8), fliuktuacijos (9)(10) ir suspenda ­
vimo metodai. Taipogi buvo aprašytos dujini ų ir lakiųjų medžiag ų 
bandymo modifikacijos (12).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Šiame bandym ų metode aprašytos su inkorporacijos į lėkštelę ir 
išankstinės inkubacijos metodais susijusios proced ūros. Abu šie 
metodai tinka eksperimentams, kuri ų metu naudojama ir kuri ų 
metu nenaudojama metabolin ė aktyvacijos sistema, atlikti. Tam 
tikros medžiagos išankstin ės inkubacijos metodu nustatomos veiks ­
mingiau. Tai medžiagos, priklausan čios tokioms chemini ų medžiag ų 
klasėms kaip alifatiniai aminai, turintys trump ąją grandinę, dvivalen ­ 
čiai metalai, turintys NO grup ę, alkaloidai, turintys pirolizidin ą, alilo 
grupę turintys junginiai bei azoto junginiai (3). Taip pat pripaž įs­
tama, kad naudojant tokius standartinius bandym ų metodus kaip 
inkorporacijos į lėkštelę bei išankstin ės inkubacijos metodai ne 
visada galima nustatyti tam tikr ų klasių mutagenus. Tokie mutagenai 
laikytini „ypatingais atvejais“ ir griežtai rekomenduojama juos nusta ­
tyti pagal kitas metodikas. Nustatyti tokie „ypatingi atvejai“ (kartu 
nurodomi galim ų jų nustatymo metod ų pavyzdžiai): – azodažai ir 
diazo junginiai (3)(5)(6)(13), dujos bei lakiosios chemin ės medžiagos 
(12)(14)(15)(16) ir glikozidai (17) (18). Nukrypimas nuo standartin ės 
bandymo atlikimo metodikos turi b ūti moksliškai pagr įstas. 
1.5. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.5.1.  Preparatai  
1.5.1.1.  Bakterijos  
Grynos bakterij ų kultūros auginamos tol, kol pasiekia v ėlyvąją 
eksponentin ę arba ankstyv ąją stacionarin ę augimo faz ę apie 10  9 
ląstelių/ml). Kult ūros, pasiekusios v ėlyvąją stacionarin ę augimo 
fazę, neturi b ūti naudojamos. Svarbu yra tai, kad bakterij ų kultūrose, 
kurios naudojamos eksperimentams, b ūtų didelis gyv ų bakterijų 
ląstelių titras. Titras nustatomas arba pagal anks čiau gautas augimo 
kreives arba kiekvieno bandymo metu nustatant gyv ų ląstelių skaičių 
pagal jų augimą lėkštelėje. 
Rekomenduojama inkubacijos temperat ūra yra 37 °C  
Turi būti naudojami mažiausiai 5 bakterij ų kamienai. J ų tarpe turi 
būti keturi  Salmonella typhimurium  kamienai (TA 1535, TA 1537 
arba TA 97a arba TA 97; TA 98 ir TA 100), kurie, kaip buvo 
įrodyta daugelyje laboratorij ų, yra patikimi ir atkuria atsak ą. Šių 
keturių Salmonella typhimurium  kamienų pirminės reversijos vietoje 
lokalizuota GC bazi ų pora ir yra žinoma, kad panaudojant šiuos 
kamienus, negalima identifikuoti kryžmiškai rišan čių mutagen ų ir 
hidrazinų. Šios medžiagos nustatomos, panaudojant  Escherichia 
coli WP2 ir  Salmonella typhimurium  TA 102 kamienus (19), kuri ų 
pirminėje reversijos vietoje lokalizuota AT bazi ų pora. Taigi reko ­
menduojamas toks kamien ų derinys:  
— S. typhimurium  TA1535 ir  
— S. typhimurium  TA1537 arba TA97 arba TA97a ir  
— S typhimurium  TA98 ir  
— S. typhimurium  TA100 ir  
— E. coli  WP2 uvrA arba  E. coli  WP2 uvrA (pKM10l) arba  S 
typhimurium  TA102.  
Siekiant nustatyti kryžmiškai surišan čius mutagenus patartina papil ­
domai panaudoti  S. typhimurium  TA 102 arba  E. coli  [pvz.  E. coli 
WP2  arba  E. coli WP2  (pKM101)] kamienus, sugeban čius taisyti 
DNR pažaidas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Reikia naudoti gerai žinomas pagrindin ės kultūros paruošimo, 
žymeklių patvirtinimo bei saugojimo metodikas. Turi b ūti įrodyta, 
kad aminor ūgštis yra b ūtina kiekvieno preparato, paruošto iš užšal ­
dytos pradin ės kultūros, augimui (histidinas –  S. typhimurium  kamie­
nams, o triptofanas –  E. coli  kamienams). Panašiai turi b ūti patik­
rintos kitos fenotipin ės charakteristikos: R-faktori ų turinčių plazmi­
džių buvimas arba nebuvimas, jei tai yra reikalinga [t. y. kamien ų 
TA 98, TA 100 ir TA 97a arba TA 97, WP 2 uvrA ir WP 2 uvrA (pKM 101) atsparumas ampicilinui bei kamieno TA 102 atsparumas 
ampicilinui ir tetraciklinui), taip pat b ūdingų mutacijų buvimas ( S. 
typhimurium  rfa mutacija pagal jautrum ą violetinei šviesai,  E. coli  
uvr A mutacija arba  S. typhimurium  uvr B mutacija pagal jautrum ą 
ultravioletinei šviesai) (2)(3). Kamienai taip pat turi spontaniškai 
sukurti revertant ų kolonijas, kuri ų dažnis atitikt ų ankstesnius labora ­
torijos duomenis ir literat ūroje nurodytas ribas.
 
1.5.1.2.  Terp ė 
Naudojamas atitinkamas minimalus agaras (pavyzdžiui, turintis mini ­
malios Vogel-Bonner terp ės E ir gliukoz ės) ir ant viršaus užliejamas 
agaras, turintis histidino ir biotino arba triptofano tam, kad vykt ų keli 
ląstelių dalijimaisi (1)(2)(9).  
1.5.1.3.  Metabolin ė aktyvacija  
Bakterijos turi b ūti veikiamos bandom ąja medžiaga naudojant atitin ­
kamą metabolin ės aktyvacijos sistem ą ir nenaudojant tokios sistemos. 
Plačiausiai vartojama sistema yra iš graužik ų kepenų, paveikt ų 
tokiomis fermentin į aktyvum ą skatinan čiomis medžiagomis kaip 
AROCLOR 1254 (1)(2) ar fenobarbitono ir P-naftoflavono mišiniu (18)(20)(21), post-mitochondrin ė frakcija, praturtinta kofaktoriumi. 
Post-mitochondrin ė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, 
kurių intervalas S9 mišinyje siekia nuo 5 iki 30 % (v/v). Metabolin ės 
aktyvacijos sistema pasirenkama priklausomai nuo bandomosios cheminės medžiagos klas ės. Kai kuriais atvejais tikslinga naudoti 
daugiau nei vien ą post-mitochondrin ės frakcijos koncentracij ą. 
Tiriant azodažus ir diazo junginius, gali b ūti tikslingiau naudoti 
redukcinę metabolin ę aktyvacijos sistem ą (6)(13).
 
1.5.1.4.  Bandomoji medžiaga/preparatas  
Kietosios bandomosios medžiagos turi b ūti ištirpinamos arba suspen ­
duojamos atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose ir, jei reikia, pras ­
kiedžiamos prieš veikiant jomis bakterijas. Skystosios bandomosios 
medžiagos įnešamos tiesiogiai į bandymo sistemas ir (arba) praskie ­
džiamos prieš veikiant jomis bakterijas. Kiekvieno bandymo metu turi būti paruošiami švieži preparatai, nebent b ūtų stabilumo tyrimo 
duomenų, rodančių, kad bandom ąsias medžiagas galima saugoti.
 
Tirpiklis/nešiklis turi nereaguoti su bandom ąja medžiaga ir nekelti 
pavojaus, kad bakterijos neišgyvens bei b ūti suderinamas su S9 
aktyvumu (22). Jeigu naudojami gerai nežinomi tirpikliai (nešikliai), reikia turėti jų tinkamum ą pagrindžian čių duomenų. Jei įmanoma, tai 
pirmiausia rekomenduojama naudoti vandenin į tirpiklį (nešiklį). Kai 
bandomos vandenyje nestabilios chemin ės medžiagos, naudojamuose 
organiniuose tirpikliuose neturi b ūti vandens.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Bandymo s ąlygos  
1.5.2.1.  Bandomieji kamienai (žr. 1.5.1.1.)  
1.5.2.2.  Veikimo koncentracija  
Kriterijai, į kuriuos reikia atsižvelgti nustatant didžiausi ą bandomo ­
sios medžiagos koncentracij ą, yra medžiagos citotoksiškumas ir 
tirpumas galutiniame veikimo mišinyje.  
Gali būti naudinga toksiškum ą bei netirpum ą nustatyti parengiamojo 
eksperimento metu. Citotoksiškumas gali b ūti nustatomas pagal 
revertantų kolonijų skaičiaus sumaž ėjimą, šalutinės terpės praskaidr ė­
jimą ar sunykim ą arba pagal kult ūrų, paveiktų bandomąja medžiaga, 
išgyvenimo laipsn į. Medžiagos citotoksiškumas gali kisti d ėl meta­
bolinės aktyvacijos sistem ų naudojimo. Netirpumas tur ėtų būti įver­
tinamas plika akimi stebint precipitato susidarym ą eksperimento 
metu galutiniame reakciniame mišinyje.  
Maksimali rekomenduojama bandom ų tirpių, citotoksiškumu nepasi ­ 
žyminčių medžiag ų koncentracija yra 5 mg/l ėkštelėje arba 5 μl/lėkš­
telėje. Citotoksiškumu nepasižymin čių ir netirpi ų (koncentracijai 
esant 5 mg/l ėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje) medžiag ų atveju reikia 
ištirti vien ą ar daugiau koncentracij ų, kurioms esant medžiagos 
netirpsta galutiniame reakciniame mišinyje. Bandomosios medžiagos, kurios yra citotoksiškos, kai j ų koncentracija yra mažesn ė nei 5 
mg/lėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, turi būti bandomos tol, kol nusta ­
toma koncentracija, kuriai esant medžiagos pasižymi citotoksiniu aktyvumu. Precipitato susidarymas neturi trukdyti įvertinti duomenis.
 
Per pirmin į eksperiment ą reikia išbandyti mažiausiai 5 išanalizuo ­
jamas bandomosios medžiagos koncentracijas, kuri ų vertes skirt ų 
intervalai, lyg ūs pusei log ( √10). Mažesni skiriamieji intervalai 
tinka tada, kai bandoma atsako priklausomyb ė nuo koncentracijos. 
Koncentracija, didesn ė už 5 mg/l ėkštelėje arba 5 μl/lėkštelėje, gali 
būti pasirenkama tuo atveju, jei bandomosiose medžiagose yra 
didelis mutagenišk ų priemaiš ų kiekis.  
1.5.2.3.  Neigiami ir teigiami kontroliniai m ėginiai  
Kiekvieno bandymo metu kartu naudojami neigiami (tirpiklis ar 
nešiklis) bei teigiami bakterij ų kamienui b ūdingi kontroliniai m ėgi­
niai taikant metabolin ę aktyvacij ą ir jos netaikant.  
Kai bandym ų metu naudojama metabolin ės aktyvacijos sistema, tai 
teigiama kontrolin ė etalonin ė medžiaga pasirenkama pagal naudo ­
jamą bakterinio kamieno tip ą. 
Toliau pateikiami tinkam ų teigiamų kontrolini ų medžiag ų, naudo­
jamų taikant metabolin ę aktyvacij ą, pavyzdžiai:  
CAS Nr.  Einecs Nr.  Medžiaga  
781–43–1  212–308–4  9,10-dimetilantracenas  
57–97–6  200–359–5  7,12-dimetilbenzaantracenas  
50–32–8  200–028–5  benzpirenas  
613–13–8  210–330–9  2-aminoantracenas  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
CAS Nr.  Einecs Nr.  Medžiaga  
50–18–0  ciklofosfamidas  
6055–19–2  200–015–4  ciklofosfamido monohidratas  
Toliau pateikiama tinkama teigiama kontrolin ė medžiaga, kai naudo ­
jamas redukcin ės metabolin ės aktyvacijos metodas:  
CAS Nr.  Einecs Nr.  Medžiaga  
573–58–0  209–358–4  Kongo raudonasis  
2-aminoantracenas neturi b ūti naudojamas kaip vienintelis S9 mišinio 
efektyvumo indikatorius. Jei 2-aminoantracenas naudojamas, kiek ­
viena S9 mišinio partija išanalizuojama, panaudojant mutagen ą, 
kuriam yra reikalinga metabolin ė aktyvacija mikrosomini ų fermentų 
pagalba, pavyzdžiui, benzpiren ą ar dimetilbenzaantracen ą. 
Toliau pateikiami tinkam ų teigiamų kontrolini ų medžiagų, specifišk ų 
bakterijų kamienui, naudojam ų netaikant egzogenin ės metabolin ės 
aktyvacijos, pavyzdžiai:  
CAS Nr.  Einecs Nr.  Medžiaga  Kamienas  
26628–22–8  247–852–1  Natrio azidas  TA 1535 ir TA 100  
607–57–8  210–138–5  2-nitrofluorenas  TA 98  
90–45–9  201–995–6  9-aminoakridinas  TA 1537, TA 97 ir TA 97a  
17070–45–0  241–129–4  ICD 191  TA 1537, TA 97 ir TA 97a  
80–15–9  201–254–7  kumeno hidroksiperoksidas  TA 102  
50–07–7  200–008–6  mitomicinas C  WP2 uvrA ir TA102  
70–25–7  200–730–1  N-etil-N-nitro-N- 
nitrozoguanidinas  WP2, WP2uvrA ir WP2uv ­
rA(pK M101)  
56–57–5  200–281–1  4-nitrokvinolino-1-oksidas  WP2, WP2uvrA ir WP2uv ­
rA(pK M101)  
3688–53–7  Furilfuramidas (AF2)  kamienai, turintys plazmidži ų 
Kitas atitinkamas etalonines medžiagas irgi galima naudoti kaip 
teigiamus kontrolinius m ėginius. Jei įmanoma, apsvarstomas su 
konkrečios klasės cheminėmis medžiagomis susijusi ų teigiamų kont­
rolinių mėginių naudojimas.  
Taip pat turi b ūti neigiami kontroliniai m ėginiai, sudaryti vien tik iš 
tirpiklio ar nešiklio, be bandomosios medžiagos, su kuriais visais kitais atžvilgiais elgiamasi taip pat kaip su bandomaisiais m ėginiais. 
Be to, reikia naudoti nepaveiktus kontrolinius m ėginius, nebent yra 
ankstesnių duomen ų, rodančių, kad pasirinktas tirpiklis n ėra nei 
žalingas, nei mutageniškas.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Bandymo eiga  
Atliekant bandym ą pagal inkorporacijos į lėkštelę metodą 
(1)(2)(3)(4), kai netaikoma metabolin ė aktyvacija, paprastai 2 ml 
padengian čiojo agaro sumaišoma su 0,05 ml arba 0,1 ml bandomo ­
sios medžiagos tirpalo, 0,1 ml šviežiai išaugintos bakterij ų kultūros 
(turinčios apie 10  8 gyvų ląstelių) ir 0,5 ml sterilaus buferio. Atliekant 
bandymą kai naudojama metabolin ė aktyvacija, paprastai 0,5 ml 
metabolin ės aktyvacijos mišinio, kuriame yra pakankamas 
post-mitochondrin ės frakcijos kiekis (intervalo 5–30 % v/v ribose, 
metabolin ės aktyvacijos mišinyje), sumaišoma su 2 ml padengian ­ 
čiojo agaro, bakterijomis ir bandom ąja medžiaga/bandomuoju tirpalu. 
Kiekvieno m ėgintuvėlio turinys suplakamas ir užpilamas ant mini ­
malaus agaro, esan čio lėkštelėje, paviršiaus. Prieš inkubacij ą paden­
giančiajam agarui leidžiama sukiet ėti. 
Atliekant bandym ą pagal išankstin ės inkubacijos metod ą (2)(3)(5)(6), 
bandomoji medžiaga/bandomasis tirpalas iš anksto inkubuojamas su 
bandomuoju bakteriniu kamienu (turin čiu apie 10  8 gyvų ląstelių) ir 
steriliu buferiu arba metabolin ės aktyvacijos sistema (0,5 ml) ir 
paprastai inkubuojamas 20 ar daugiau minu čių 30–37 °C temperat ū­
roje prieš sumaišant su padengian čiuoju agaru ir užpilant ant mini ­
malaus agaro, esan čio lėkštelėje, paviršiaus. Įprastiniu atveju 2 ml 
padengian čiojo agaro sumaišoma su 0,05 ar 0,1 ml bandomosios 
medžiagos/bandomojo tirpalo, 0,1 ml bakterij ų ir 0,5 ml S9 mišinio 
ar sterilaus buferio. Atliekant išankstin ę inkubacij ą, mėgintuvėliai 
purtomi purtykle, kad j ų turinys prisisotint ų oro.  
Tam, kad tiriant kiekvien ą dozę, būtų gaunamas patenkinamas varia ­
cijos koeficientas, atliekamas bakterij ų išsėjimas į 3 lėkšteles. Jeigu 
atliekamas išs ėjimas tik į 2 lėkšteles, tai jis moksliškai pagrin ­
džiamas. Kartais pasitaikantis l ėkštelės praradimas neb ūtinai reiškia, 
kad bandymas nepavyko.  
Dujinės bei lakios medžiagos turi b ūti bandomos atitinkamais meto ­
dais, jas laikant sandariuose induose (12)(14)(15)(16).  
1.5.4.  Inkubacija  
Per kiekvien ą bandymą visos lėkštelės turi būti inkubuojamos 48–72 
valandas 37 °C temperat ūroje. Po inkubacijos nustatomas revertant ų 
kolonijų, esančių kiekvienoje l ėkštelėje skaičius. 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Pateikiant rezultatus, nurodomas revertant ų kolonijų, esančių vienoje 
lėkštelėje, skaičius. Taip pat reikia nurodyti revertant ų kolonijų, 
esančių tiek teigiamose, tiek ir neigiamose (tirpiklio kontrolinis 
mėginys ir bandom ąja medžiaga neveiktas kontrolinis m ėginys) kont ­
rolinėse lėkštelėse, skaičių. Pateikiant duomenis apie bandom ąją 
medžiagą ir teigiamus bei neigiamus (tirpiklio kontrolinis m ėginys 
ir (ar) bandom ąja medžiaga neveiktas kontrolinis m ėginys) kontro ­
linius mėginius, nurodomas revertant ų kolonijų, esančių kiekvienoje 
lėkštelėje, skaičius, jo vidurkis bei standartinis nukrypimas.  
Kai gaunamas aiškus teigiamas rezultatas, jo nereikia patvirtinti. 
Abejotini rezultatai išaiškinami t ęsiant bandymus, geriausia šiek 
tiek pakeistomis eksperimentin ėmis sąlygomis. Neigiami rezultatai 
patvirtinami kiekvienu atskiru atveju. Tais atvejais, kai manoma, jog nebūtina patvirtinti, kad buvo gauti neigiami rezultatai, šitai 
turi būti pagrįsta. Atliekant tolimesnius eksperimentus apsvarstoma, 
ar reikia modifikuoti tiriamus parametrus tam, kad b ūtų išplėstas 
įvertinamų sąlygų intervalas. Tiriamieji parametrai, kuriuos galima 
modifikuoti, yra ribos, skirian čios koncentracijas, bandymo atlikimo 
metodai (inkorporacijos į lėkštelę bei išankstin ės inkubacijos) bei 
metabolin ės aktyvacijos s ąlygos.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Egzistuoja keletas teigiamo rezultato įvertinimo kriterij ų, tokių kaip 
su koncentracija susij ęs mažiausiai vieno kamieno revertant ų kolo­
nijų, esančių vienoje l ėkštelėje, skaičiaus padid ėjimas virš tiriamos 
ribos, kai naudojama arba nenaudojama metabolin ės aktyvacijos 
sistema ir/ar j į atkartojant, kai naudojama viena ar daugiau koncent ­
racijų (23). Pirmiausia reikia aptarti biologin ę rezultatų reikšmę. Įver­
tinant bandymo rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais metodais 
(24). Tačiau statistin ė svarba netur ėtų tapti vieninteliu faktoriumi, 
apsprendžian čiu teigiam ą atsaką. 
Jei tiriant medžiag ą gaunami rezultatai, neatitinkantys aukš čiau 
minėtų kriterijų, tai medžiaga laikoma nemutageniška.  
Nors daugumos eksperiment ų metu gaunami aiškiai teigiami arba 
neigiami rezultatai, ta čiau išimtiniais atvejais, remiantis visais gautais 
rezultatais, negalima padaryti tinkamos išvados apie bandomos 
medžiagos aktyvum ą. Rezultatai gali likti abejotini ir neaišk ūs, 
nepriklausomai nuo to, kiek kart ų eksperimentas buvo pakartotas.  
Jei tiriant bakterij ų grįžtamąsias mutacijas gautas teigiamas rezul ­
tatas, tai reiškia, kad bandomoji medžiaga sukelia taškines mutacijas 
(bazių pakaitas arba skaitymo r ėmelio pasislinkim ą) Salmonella 
typhimurium  ir (arba)  Escherichia coli  genome. Neigiami rezultatai 
rodo, kad tokiomis bandymo s ąlygoms bandomoji medžiaga nesu ­
kelia mutacij ų bandomose bakterij ų rūšyse.  
3. ATASKAITA  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikiama tokia informacija:  
Tirpiklis/nešiklis:  
— priežastys, d ėl kurių buvo pasirinktas šis nešiklis,  
— bandomosios chemin ės medžiagos, esan čios tirpiklyje/nešiklyje, 
tirpumas ir stabilumas, jei žinomas.  
Kamienai:  
— panaudoti kamienai,  
— ląstelių, esančių vienoje kult ūroje, skai čius, 
— kamieno charakteristikos.  
Bandymo s ąlygos:  
— bandomosios medžiagos kiekis vienoje l ėkštelėje (mg/lėkštelėje 
arba μl/lėkštelėje), nurodant pagrindin ę priežastį dėl kurios tiriant 
vieną koncentracij ą, buvo pasirinkta konkreti doz ė bei lėkštelių 
skaičius, 
— panaudota terp ė, 
— metabolin ės aktyvacijos sistemos tipas ir sud ėtis, įskaitant ir 
sistemos tinkamumo kriterijus,  
— poveikio bandom ąja medžiaga atlikimo metodik ą. 
Rezultatai:  
— toksiškumo požymiai,  
— precipitacijos požymiai,  
— kolonij ų vienoje l ėkštelėje skaičius, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— revertant ų kolonijų vienoje l ėkštelėje skaičiaus vidurkis bei stan ­
dartinis nukrypimas,  
— dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei j į įmanoma nurodyti,  
— statistin ės analizės, jei atliktos,  
— kartu naudot ų neigiamų (tirpiklis/nešiklis) ir teigiam ų kontrolini ų 
mėginių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei 
standartinius nukrypimus,  
— anksčiau gauti neigiam ų (tirpiklis/nešiklis) ir teigiam ų kontrolini ų 
mėginių tyrimo duomenys, nurodant intervalus, vidurkius bei 
standartinius nukrypimus.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975). Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347–364.
 
2) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215.  
3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial 
Mutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217–233.  
4) Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., Brown, 
M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mortelmans, K., 
Prival, M., Rao, T.K. and Ray V. (1986). The  Salmonella 
typhimurium/Mammalian  Microsomal Assay: A Report of the 
U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. 
Mutation Res., 168, p. 69–240.  
5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975). Mutagenicity of 
Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, I, 
p. 91–96.  
6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980). Factors Modulating Mutagenicity 
Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York., p. 273–285.
 
7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. 
and Foster, R. (1980). Bacterial Mutation Assays. In: Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirkland, 
Cambridge University Press, p. 13–61.
 
8) Aeschacher, h.U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987). Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food SAFEty, 8, 
p. 167–177.  
9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A. (1976). Use of 
a simplified fluctuation test to detect low levels of mutagens. Mutation Res., 38, p. 33–42.
 
10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Bridges 
(1984). The Fluctuation Test in Bacteria. In: Handbook of Mutagenicity Test Procedures. 2nd Edition. Ed. Kilbey, B.J., 
Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C, Elsevier, 
Amsterdam-New York-Oxford, p. 141–161.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J. (1981). An Examination of 
the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with Strains 
of Salmonella typhimurium . Environmental Mutagenesis, 3, p. 
453–465.  
12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994). 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, p. 335–344.
 
13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and 
Vaughn, V.L. (1984). Mutagenicity of Benzidine and Benzidine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay. Mutation Res., 136, p. 33–47.
 
14) Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mortel ­
mans, K. (1992). Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 19, p. 2–141.
 
15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G. (1977). Muta ­
genic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. 
Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249–258.
 
16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, L.D. 
(1987). Vaporization Technique to Measure Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay. 
Environmental Mutagenesis, 9, p. 421–441.
 
17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., and 
Sugimura, T. (1979). Mutagenicity of the Naturally Occurring 
Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane 
Conjugates in  Salmonella typhimurium . Cancer Res., 39, p. 
3780–3782.  
18) Tamura, G., Gold, C, Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N. (1980). 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p. 4961–4965.
 
19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G. 
(1990). Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 
285–291.  
20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A SAFE Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer or Metabolic Activation Systems. In: „ In Vitro  meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing“ Eds. F.J. de Serres et 
al. Elsevier, North Holland, p. 85–88.
 
21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G, 
Gibson, GG, Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alternatives 
to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genotoxicity Assays. 
Mutagenesis, 7, p. 175–177.  
22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N. (1981). 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/Micro ­
some Test. Mutation Res., 88, p. 343–350.  
23) Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., 
Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987). Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity. Mutation Res. 189, p. 83–91.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., 
Robinson, W.D. and Tweats, D.J. (1989). Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., 
Cambridge University Press, p. 28–65.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  MUTAGENIŠKUMO BANDYMAS IR ATRANKA PAGAL 
KANCEROGENIŠKUM Ą. SACCAROMYCES CEREVISIAE 
GENŲ MUTACIJOS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Siekiant įvertinti chemini ų medžiag ų (taikant metabolin ę aktyvacij ą 
ir jos netaikant) sukeliamas gen ų mutacijas, gali b ūti naudojami 
įvairiausi haploidiniai ir diploidiniai  Saccaromyces cerevisiae  
kamienai.  
Haploidiniuose kamienuose gali b ūti naudojamos tiesiogin ės muta­
cinės sistemos, tokios kaip mutacinis virsmas iš raudonos spalvos 
mutantų, kurių augimui reikalingas adeninas ( ade-l, ade-2 ) į 
dvigubus baltos spalvos mutantus, kuri ų augimui reikalingas 
adeninas bei atrankos sistemos, tokios kaip atsparumo kanavalinui 
ir cikloheksimidui indukcin ė sistema.  
Plačiausiai naudojam ą grįžtamųjų mutacijų bandymo sistem ą sudaro 
haploidinis kamienas XV 185–14C, kuris turi geno, koduojan čio 
ochros spalv ą, beprasmes mutacijas  ade  2–1,  org  4–17,  lys 1–1,  
trp 5–48, kurios tampa gr įžtamosiomis mutacijomis atlikus bazi ų 
pakeitimą mutagenais, sukelian čiais vietos atžvilgiu specifines muta ­
cijas arba geno, koduojan čio ochros spalv ą, veiklą slopinan čias 
mutacijas. Kamienas XV 185–14C taip pat turi žym ę his 1–7 
–beprasm ę mutaciją, kuri gali virsti gr įžtamąja mutacija, įvykus 
mutacijai antroje vietoje, bei žym ę hom 3–10, kuri tampa gr įžtamąja 
mutacija paveikus j ą mutagenais, sukelian čiais skaitymo r ėmelio 
pasislinkim ą. 
Tarp diploidini ų S. cerevisiae  kamienų plačiausiai naudojamas t ėra 
tik vienas D7 kamienas, kuris yra homozigotiškas pagal  ilv 1–92.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
Pasiruošimas bandymui  
Prieš pradedant bandym ą, panaudojant atitinkam ą prietaisą, reikėtų 
paruošti bandom ųjų ir kontrolini ų medžiag ų tirpalus. Jei bandomi 
organiniai, vandenyje netirp ūs junginiai, tai reik ėtų naudoti ne 
daugiau kaip 2 % organini ų tirpiklių, tokių kaip etanolis, acetonas 
ar dimetilsulfoksidas (DMSO), tirpalus (v/v). Naudojant prietais ą 
galutinė tirpalo koncentracija netur ėtų labai įtakoti ląstelių gyvybin­
gumo bei augimo parametr ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
M e t a b o l i t i n ė a k t y v a c i j a  
Ląstelės turėtų būti veikiamos bandomosiomis medžiagomis, esant 
arba nesant egzogenin ės metabolitin ės aktyvacijos sistemos.  
Graužikų, iš anksto paveikt ų fermentus skatinan čiomis medžiagomis, 
kepenų postmitochondrin ė frakcija, praturtinta kofaktoriumi yra 
plačiausiai naudojama metabolitin ė aktyvacijos sistema. Metaboli ­
tinei aktyvacijai galima naudoti ir kit ų rūšių bei audini ų postmito ­
chondrines frakcijas bei proced ūras. 
Bandymo s ąlygos  
B a n d o m i e j i k a m i e n a i  
Atliekant gen ų mutacijų bandymus labiausiai yra naudojami haploi ­
dinis kamienas XV 185–14C ir diploidinis kamienas D  7 . Galima 
naudoti ir kitus kamienus.  
T e r p ė 
Nustatant kolonij ų, kuriose ne įvyko ir įvyko mutacijos, skai čių, 
naudojama atitinkama kultivavimui skirta terp ė. 
T e i g i a m o s i r n e i g i a m o s k o n t r o l ė s 
Reikėtų vienu metu naudoti teigiamas, nepaveiktas bandom ąja 
medžiaga ir tirpiklio kontroles. Nustatant kiekvien ą specifinę galutinę 
mutaciją, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrol ės. 
V e i k i m o k o n c e n t r a c i j a  
Reikėtų naudoti mažiausiai penkias, pakankamai skirtingas bando ­
mosios medžiagos koncentracijas. Toksišk ų medžiag ų atveju, 
didžiausia bandomoji koncentracija netur ėtų sumažinti kolonij ų išgy­
venimo mažiau nei 5–10 %. Reik ėtų tirti santykinai vandenyje 
netirpstan čių medžiag ų tirpumo rib ą pagal atitinkamas proced ūras. 
Lengvai vandenyje tirpstan čių netoksišk ų medžiag ų didžiausia 
koncentracija tur ėtų būti nustatoma kiekvienu atveju.  
I n k u b a c i j o s s ą l y g o s  
Lėkštelės inkubuojamos 4–7 dienoms 28–30 °C temperat ūroje, 
tamsoje.  
S p o n t a n i n i ų m u t a c i j ų d a ž n i a i  
Reikėtų naudoti subkult ūras, kuriose spontanini ų mutacijų dažniai 
yra normal ūs. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
T i k s l i ų k o p i j ų s k a i č i u s 
Atliekant prototrof ų, atsirandan čių dėl genų mutacijų bei ląstelių 
gyvybingumo bandym ą, reikėtų naudoti mažiausiai tris vienos 
koncentracijos tiksli ų kolonijų kopijų lėkšteles. Jei eksperiment ų 
metu naudojamos tokios žym ės kaip  hom  3–10, pasižymin čios nedi­
deliu mutacij ų dažniu, reik ėtų naudoti daugiau tiksli ų kolonijų kopijų 
lėkštelių tam, kad gaunami duomenys b ūtų statistiškai patikimi.  
Bandymo eiga  
S. cerevisiae  kamienai paprastai veikiami bandom ąja medžiaga, 
ląstelėms esant stacionarin ėje arba augimo stadijoje skystoje terp ėje. 
Iš pradžių eksperimentai atliekami su l ąstelėmis, esan čiomis augimo 
stadijoje; 1 – 5 × 10 l ąstelių/ml veikiamos bandom ąja medžiaga 18 
valandų 28–37 °C temperat ūroje ant kratykl ės; jeigu reikia, veikimo 
metu į terpę įnešamas atitinkamas metabolitin ės aktyvacijos sistemos 
kiekis. Baigiantis veikimui, l ąstelės centrifuguojamos, plaunamos ir 
pasėjamos į atitinkam ą kultivavimui skirt ą terpę. Po inkubacijos 
nustatomas plokštel ėse kolonij ų, kuriose ne įvyko arba įvyko gen ų 
mutacijos, skai čius. Jei pirmojo eksperimento gauti rezultatai yra 
neigiami, tai antrasis eksperimentas atliekamas naudojant l ąsteles, 
esančias stacionarin ėje fazėje. Jeigu pirmojo eksperimento metu 
gauti rezultatai teigiami, jie patvirtinami atlikus atitinkam ą nepriklau ­
somą eksperiment ą. 
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti pateikiami lentel ėse, nurodant kolonij ų skaičių, 
kolonijų, kuriose ne įvyko ir kuriose įvyko mutacijos kiek į bei muta ­
cijos dažn į. Visi rezultatai tur ėtų būti patvirtinti, atlikus nepriklau ­
somą bandymą. Duomenis reik ėtų įvertinti atitinkamais statistiniais 
metodais.  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— panaudotas kamienas,  
— bandymo s ąlygos: ląstelių stacionarioji ar augimo faz ė, terpės 
sudėtis, inkubacijos temperat ūra ir trukm ė, metabolitin ės aktyva­
cijos sistema,  
— veikimo s ąlygos: veikimo laipsnis, veikimo proced ūra ir trukm ė, 
veikimo temperat ūra, teigiamos ir neigiamos kontrol ės, 
— kolonij ų skaičius, kolonij ų, kuriose ne įvyko ir įvyko mutacijos 
bei mutacijos dažnis, doz ės ir atsako s ąsaja, jei įmanoma nuro ­
dyti, statistinis duomen ų įvertinimas,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  MITOZIN Ė REKOMBINACIJA – SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Mitozinė rekombinacija  Saccharomyces cerevisiae  gali būti nusta­
toma tarp gen ų (arba konkre čiau, tarp geno ir jo centromeros) ir 
genų viduje. Ši rekombinacija, vykstanti tarp gen ų, yra vadinama 
mitoziniu per ėjimu, kurio metu susiformuoja atvirkštiniai produktai, 
tuo tarpu, kai rekombinacijos gen ų viduje metu susidaro neatvirkšti ­
niai produktai, vadinami gen ų konversijomis. Apskritai, per ėjimas 
įvertinamas pagal homozigotini ų kolonijų arba sektori ų, turinčių 
recesyvinius gen ų alelius, produkcijos laipsn į heterozigotiniame 
kamiene, tuo tarpu gen ų konversija vertinama pagal prototrofini ų 
revertantų, susiformavusi ų auksotrofiniame heteroaleliniame 
kamiene, turin čiame du neveiklius to paties geno alelius, skai čių. 
Siekiant nustatyti mitozinio geno konversij ą, dažniausiai naudojami 
šie kamienai: D4 (heteroalelinis pagal  ade 2 ir  trp 5), D7 (heteroa ­
lelinis pagal  trp 5), BZ34 (heteroalelinis pagal  org 4) ir JD1 (heroa ­
lelinis pagal  his 4 ir  trp 5). Raudonos ir violetin ės spalvos homozi ­
gotiniai sektoriai, sukuriantys mitozin į krosingover į, gali būti verti­
nami, naudojant D5 arba D7 kamienus (taipogi galima įvertinti mito ­
zinę genų konversij ą ir grįžtamąją mutaciją, vykstan čią ilv 1–92), 
kurie yra heteroaleliški pagal papildan čiuosius geno  ade  2 alelius.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
Pasiruošimas bandymui  
Prieš pradedant bandym ą, panaudojant atitinkam ą prietaisą, reikėtų 
paruošti bandom ųjų ir kontrolini ų medžiag ų tirpalus. Jei bandomi 
organiniai, vandenyje netirp ūs junginiai, reik ėtų naudoti ne daugiau 
kaip 2 % organini ų tirpiklių, tokių kaip etanolis, acetonas ar 
dimetilsulfoksidas (DMSO), tirpalus (v/v). Naudojant prietais ą, galu­
tinė tirpalo koncentracija netur ėtų labai įtakoti ląstelių gyvybingumo 
bei augimo parametr ų. 
M e t a b o l i n ė a k t y v a c i j a  
Ląstelės turėtų būti veikiamos bandomosiomis medžiagomis, esant 
arba nesant egzogenin ės metabolin ės aktyvacijos sistemos. Graužik ų, 
iš anksto paveikt ų fermentus skatinan čiomis medžiagomis, kepen ų 
postmitochondrin ė frakcija praturtinta kofaktoriumi yra pla čiausiai 
naudojama metabolin ė aktyvacijos sistema. Metabolinei aktyvacijai 
galima naudoti ir kit ų rūšių bei audini ų postmitochondrines frakcijas 
bei proced ūras. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Bandymo s ąlygos  
B a n d o m i e j i k a m i e n a i  
Dažniausiai naudojami diploidiniai D  4 , D  5 , D  7 ir JD1. Galima 
naudoti ir kitus kamienus.  
T e r p ė 
Nustatant kolonij ų, kuriose ne įvyko mitozin ė rekombinacija, skai čių 
ir kolonij ų, kuriose įvyko mitozin ė rekombinacija, dažn į, naudojama 
atitinkama terp ė skirta kultivavimui.  
T e i g i a m o s i r n e i g i a m o s k o n t r o l ė s 
Reikėtų vienu metu naudoti teigiamas, nepaveiktas bandom ąja 
medžiaga ir tirpiklio kontroles. Nustatant kiekvien ą specifinę galutinę 
rekombinacij ą, naudojamos atitinkamos teigiamos kontrol ės. 
V e i k i m o k o n c e n t r a c i j o s  
Reikėtų naudoti mažiausiai penkias, tinkamai atskirtas bandomosios 
medžiagos koncentracijas. Reik ėtų apsvarstyti citotoksiškum ą ir 
tirpumą. Mažiausia koncentracija neturi įtakoti ląstelių gyvybingumo. 
Toksiškų medžiag ų atveju, didžiausia bandomoji koncentracija netu ­
rėtų sumažinti kolonij ų išgyvenimo mažiau nei 5–10 %. Reik ėtų tirti 
santykinai vandenyje netirpstan čių medžiag ų tirpumo rib ą pagal 
atitinkamas proced ūras. 
Lengvai vandenyje tirpstan čių netoksišk ų medžiag ų didžiausia 
koncentracija tur ėtų būti nustatoma kiekvienu atveju.  
I n k u b a c i j o s s ą l y g o s  
Lėkštelės inkubuojamos 4–7 dienoms 28–30 °C temperat ūroje, 
tamsoje. Analizei naudojamos plokštel ės, kuriose, d ėka mitozinio 
perėjimo, atsiranda raudonos ir violetin ės spalvos sektoriai, tur ėtų 
būti laikomos šaldytuve (apie 4 °C temperat ūroje) papildomai 
vieną arba dvi dienas prieš nustatant atitinkamai nusidažiusi ų kolo­
nijų skaičių. 
S p o n t a n i n ė s m i t o z i n ė s r e k o m b i n a c i j o s d a ž n i a i  
Reikėtų naudoti subkult ūras, kuriose spontanin ės mitozin ės rekombi ­
nacijos dažniai yra normal ūs. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
T i k s l i ų k o p i j ų s k a i č i u s 
Atliekant prototrof ų, atsirandan čių dėl mitozinio geno konversijos 
bei ląstelių gyvybingumo bandym ą, reikėtų naudoti mažiausiai tris 
vienos koncentracijos tiksli ų kolonijų kopijų lėkšteles. Tiriant rece ­
syvinį homozigotiškum ą, atsirandant į dėl mitozinio krosingoverio, 
reikėtų panaudoti daugiau l ėkštelių, kad būtų galima nustatyti 
tinkamą kolonijų skaičių. 
Bandymo eiga  
S. cerevisiae  kamienai paprastai veikiami bandom ąja medžiaga, 
ląstelėms esant stacionarin ėje arba augimo stadijoje skystoje terp ėje. 
Iš pradžių eksperimentai atliekami su l ąstelėmis, esan čiomis augimo 
stadijoje; 1–5×10  7 ląstelių/ml veikiamos bandom ąja medžiaga 18 
valandų 28–37 °C temperat ūroje ant kratykl ės; jeigu reikia, tai 
veikimo metu į terpę įnešamas atitinkamas metabolitin ės aktyvacijos 
sistemos kiekis.  
Baigiantis veikimui, l ąstelės centrifuguojamos, plaunamos ir pas ė­
jamos į atitinkam ą kultivavimui skirt ą terpę. Po inkubacijos nusta ­
tomas plokštel ėse kolonij ų, kuriose ne įvyko arba įvyko mitozin ė 
rekombinacija, skai čius. 
Jei pirmojo eksperimento gauti rezultatai yra neigiami, tai antrasis 
eksperimentas atliekamas, naudojant l ąsteles, esan čias stacionarin ėje 
fazėje. Jeigu pirmojo eksperimento metu gauti rezultatai teigiami, jie 
patvirtinami atlikus atitinkam ą nepriklausom ą eksperiment ą. 
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti pateikiami lentel ėse, nurodant kolonij ų skaičių, 
kolonijų, kuriose ne įvyko ir kuriose įvyko mitozin ė rekombinacija, 
kiekį bei rekombinacij ų dažnį. 
Visi rezultatai tur ėtų būti patvirtinti atlikus nepriklausom ą bandymą. 
Duomenis reik ėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— panaudotas kamienas,  
— bandymo s ąlygos: ląstelių stacionarioji ar augimo faz ė, terpės 
sudėtis, inkubacijos temperat ūra ir trukm ė, metabolitin ės aktyva­
cijos sistema,  
— veikimo s ąlygos: veikimo laipsnis, veikimo proced ūra ir trukm ė, 
veikimo temperat ūra, teigiamos ir neigiamos kontrol ės, 
— kolonij ų skaičius, kolonij ų, kuriose ne įvyko ir įvyko rekombina ­
cijos bei rekombinacijos dažnis, doz ės ir atsako s ąsaja, jei 
įmanoma nurodyti, statistinis duomen ų įvertinimas,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENIŠKUMAS – ŽINDUOLI Ų LĄSTELIŲ GENŲ 
MUTACIJ Ų BANDYMAS  IN VITRO  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 476 – Žinduoli ų ląstelių genų muta­
cijų bandymą in vitro  (1997).  
1.1. ĮVADAS  
Žinduolių ląstelių genų mutacijų bandymas  in vitro  gali būti naudo­
jamas siekiant aptikti chemini ų medžiag ų sukeltas mutacijas. Tinka ­
moms ląstelių linijoms priklauso peli ų limfomos l ąstelių linija 
L5178Y, kiniškojo žiurk ėno ląstelių linijos CHO, CHO-ASS2 bei 
V79 ir žmogaus limfoblast ų linija TK (1). Naudojant šias linijas, 
dažniausiai įvertinamos timidinkinaz ę (TK) bei 
hipoksantinguaninfosforiboziltransferaz ę (HFRT) koduojan čių genų 
bei ksantinguaninfosforiboziltransferaz ę (KFRT) koduojan čio trans­
geno mutacijos. Atliekant TK, KFRT bei HFRT koduojan čių genų 
mutacijų bandymus, nustatomi ir skirtingi genetini ų įvykių spektrai. 
Dėl to, kad TK ir KFRT koduojantys genai yra lokalizuoti autosomi ­
nėse chromosomose, galima nustatyti genetinius įvykius (pavyzdžiui, 
didelių genų segmentų delecijas), kurie n ėra nustatomi HFRT koduo ­
jančio geno, esan čio X chromosomose, lokuse (2) (3) (4) (5) (6).  
Atliekant žinduoli ų ląstelių genų mutacijų bandymą in vitro , galima 
naudoti gerai žinomas l ąstelių linijas ar kamienus. Bandymo metu 
naudojamos l ąstelės atrenkamos pagal sugeb ėjimą augti kult ūroje bei 
stabilumą spontaniškai vykstan čių mutacijų atžvilgiu.  
Bendru atveju, kai bandymai atliekami  in vitro , reikia naudoti egzo ­
geninį metabolin ės aktyvacijos šaltin į. Ši metabolin ė aktyvacijos 
sistema negali absoliu čiai atitikti žinduoli ų sąlygų in vivo . Reikia 
stengtis vengti toki ų sąlygų, kurioms esant bus gaunami rezultatai, 
neatspindintys vidinio mutageniškumo. Teigiami rezultatai, neatspin ­
dintys vidinio mutageniškumo, gali b ūti gaunami d ėl pH ir osmo ­
sinio slėgio pokyčių bei didelio citotoksiškumo laipsnio (7).  
Šis bandymas naudojamas atrinkti galimus žinduoli ų mutagenus bei 
kancerogenus. Daugelis jungini ų, kurie šio bandymo metu pasirodo 
esą teigiami, yra žinduoli ų kancerogenai, ta čiau nėra aiškaus tarpu ­
savio ryšio tarp šio bandymo ir kancerogeniškumo. Tarpusavio ryšys priklauso nuo chemini ų medžiagų klasės ir vis daug ėja įrodymų, kad 
šio bandymo metu negalima nustatyti kai kuri ų kancerogen ų, galbūt 
dėl to, kad jie nepasižymi genotoksiškumu arba bakterin ėse ląstelėse 
veikia visiškai kitaip (6).
 
Taip pat žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Tiesiogin ės mutacijos  – geno t ėvinio tipo mutantin ės formos muta ­
cija, dėl kurios šio geno koduojamas baltymas praranda fermentin į 
aktyvumą arba šis pakinta.  
Bazių porų pakaitas sukeliantys mutagenai  – medžiagos, sukelian ­ 
čios vienos ar keli ų bazių porų, esančių DNR molekul ėje, pakaitas.  
Skaitymo r ėmelio poslink į sukeliantys mutagenai  – medžiagos, 
sukeliančios vienos ar daugelio bazi ų porų intarpus ar iškritas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Fenotipin ės ekspresijos laikas  – laiko periodas, per kur į nepakitusio 
geno produktai pašalinami iš naujai mutavusi ų ląstelių. 
Mutavimo dažnis  – mutantini ų ir gyvų ląstelių skaičiaus santykis.  
Absoliutus santykinis augimas  – per konkret ų laiko tarp ą ląstelių, 
lyginant su kontroline populiacija, padid ėjęs skaičius, įvertinamas 
kaip suspensijos augimas, lyginant su neigiamos kontrolin ės ląstelių 
grupės kloninio augimo efektyvumu, o pastarasis lyginamas su 
neigiamu kontroliniu m ėginiu.  
Santykinis suspensijos augimas  – fenotipin ės ekspresijos periodu 
padidėjęs ląstelių, lyginant su neigiamu kontroliniu m ėginiu, skai ­ 
čius. 
Gyvybingumas  – ląstelių, paveiktų bandomąja medžiaga, kloninio 
augimo efektyvumas tuo metu, kai, pasibaigus ekspresijai, jos pas ė­
jamos į terpę, esant sąlygoms, naudojamoms atrankai.  
Išgyvenimas  – ląstelių, paveikt ų bandom ąja medžiaga, kloninio 
augimo efektyvumas tuo metu, kai baigiantis veikimui bandom ąja 
medžiaga, jos pas ėjamos į terpę; bendru atveju išgyvenimas lygi ­
namas su kontrolin ės ląstelių populiacijos išgyvenimu.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Ląstelės, nesugeban čios sintetinti timidinkinaz ės (TK) d ėl mutacijos 
TK +/ - -> TK-  / -, yra atsparios pirimidino analogo – 
trifluortimidino (TFT) – sukeliamiems citotoksiniams poveikiams. 
Ląstelės, sugeban čios sintetinti TK, yra jautrios TFT, kuris blokuoja 
ląstelės metabolizm ą bei sustabdo tolimesn į jos dalijim ąsi. Taigi 
mutantinės ląstelės sugeba proliferuoti, esant terp ėje TFT, kai tuo 
tarpu normalios l ąstelės, sintetinan čios TK, šito padaryti negali. 
Ląstelės nesugeban čios sintetinti HFRT ir KFRT yra panašiai atren ­
kamos pagal atsparum ą 6-tioguaninui (TG) arba 8-azaguaninui (AG). 
Jeigu žinduoli ų genų mutacijos yra bandomos, panaudojant medžiag ą, 
kuri yra naudojama l ąstelių atrankai ir yra bazi ų analogas arba 
cheminis junginys, tai reikia ypa č atkreipti d ėmesį į bandomosios 
cheminės medžiagos savybes. Pavyzdžiui, reikia tirti bet kok į įtarimą 
keliantį bandomosios medžiagos toksiškum ą mutantini ų ir normali ų 
ląstelių atžvilgiu. Taigi atrankos sistemos arba atrankos medžiagos 
parinkimas turi b ūti patvirtinamas tada, kai bandomos chemin ės 
medžiagos, savo strukt ūra panašios į atrankos medžiag ą (8). 
Ląstelės, esančios suspensijoje arba vienasluoksn ėje kultūroje, 
veikiamos bandom ąja medžiaga, esant arba nesant metabolin ės akty­
vacijos sistemos ir prieš pradedant bandym ą šiek tiek pakultivuo ­
jamos tam, kad b ūtų nustatytas citotoksiškumas bei vykt ų fenotipo 
ekspresija (9) (10) (11) (12) (13). Įprastiniu atveju citotoksiškumas 
nustatomas pagal santykin į kloninio augimo efektyvum ą ar absoliut ų 
santykinį kultūros augim ą, matuojam ą tada, kai baigiasi l ąstelių 
veikimas bandom ąja medžiaga. Kult ūros, paveiktos bandom ąja 
medžiaga, palaikomos terp ėje tam tikr ą laiką, būdingą kiekvienam 
lokusui bei l ąstelių tipui tam, kad vykt ų beveik optimali atsiradusi ų 
mutacijų fenotipo ekspresija. Mutavimo dažnis nustatomas, pas ėjant 
žinomą ląstelių skaičių į terpę, turinčią atrankai naudojamos 
medžiagos tam, kad, siekiant įvertinti kloninio augimo efektyvum ą, 
būtų identifikuotos mutantin ės ląstelės, esančios terpėje, neturin čioje 
atrankai naudojamos medžiagos. Pasibaigus inkubacijai, suskai čiuo­
jamos kolonijos. Mutavimo dažnis nustatomas, suskai čiavus kolo ­
nijas, kuriose įvyko mutacijos ir kurios buvo auginamos terp ėje, 
turinčioje arba neturin čioje atrankai naudojamos medžiagos.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Preparatai  
1.4.1.1.  Ląstelės 
Šio bandymo metu galima naudoti įvairius ląstelių tipus, įskaitant 
L5171Y, CHO, CHO-AS52, V79 klonus arba TK6 l ąsteles. 
Bandymo metu naudojami l ąstelių tipai turi b ūti jautrūs cheminiams 
mutagenams, j ų kloninio augimo efektyvumas turi b ūti pakankamai 
didelis bei jose vykstan čių spontanini ų mutacijų dažnis turi b ūti 
pakankamai stabilus. L ąstelės turi būti patikrintos, ar neužkr ėstos 
mikoplazmomis, nes priešingu atveju, atliekant š į bandym ą, jos 
nėra naudojamos.  
Bandymas parengiamas taip, kad jis b ūtų atliekamas, esant kuo 
didesniam nustatymo jautrumui bei visapusiškumui. Naudojam ų 
ląstelių bei jų kultūrų skaičius ir bandomosios medžiagos koncentra ­
cijos turi atspind ėti šiuos apibr ėžtus parametrus (14). Minimalus, 
gyvų ląstelių, išlikusių po veikimo bandom ąja medžiaga bei naudo ­
jamų kiekviename bandymo etape, skai čius turi b ūti pagrįstas spon ­
taninių mutacijų dažniu. Rekomenduojama panaudoti mažiausiai 10  6 
ląstelių. Turi būti sudaryta galimyb ė susipažinti su anks čiau gautais 
duomenimis apie l ąstelinę sistemą, rodančiais, kad bandymas atlie ­
kamas nuosekliai.  
1.4.1.2.  Terp ė ir kultivavimo s ąlygos  
Reikia naudoti atitinkam ą terpę, skirtą kultivavimui bei laikytis 
atitinkam ų inkubavimo s ąlygų (kultivavimo indai, temperat ūra, 
CO 2 koncentracija ir dr ėgmė). Terpė turi būti parinkta atsižvelgiant 
į šio bandymo metu naudojamas atrankos sistemas bei l ąstelių tipą. 
Ypač svarbu tai, kad pasirinktos kultivavimo s ąlygos užtikrint ų opti­
malų ląstelių augimą ekspresijos metu bei normali ų ir mutantini ų 
ląstelių sugebėjimą suformuoti kolonijas.  
1.4.1.3.  Kult ūrų paruošimas  
Ląstelės padauginamos iš kamienini ų kultūrų, pasėjamos į terpę, 
skirtą kultivavimui ir inkubuojamos 37 °C temperat ūroje. Prieš 
pradedant š į bandym ą, kultūros turi b ūti išgryninamos, kad b ūtų 
atsikratyta jau anks čiau esančių mutantini ų ląstelių. 
1.4.1.4.  Metabolin ė aktyvacija  
Ląstelės inkubuojamos su bandom ąja chemine medžiaga, tiek esant, 
tiek ir nesant atitinkamos metabolin ės aktyvacijos sistemos. Pla čiau­
siai vartojama sistema yra post-mitochondrin ė frakcija, išskirta iš 
graužikų kepenų, paveiktų tokiomis fermentin į aktyvum ą skatinan ­ 
čiomis medžiagomis kaip AROCLOR 1254 (15) (16) (17) (18) ar 
fenobarbitono ir β-naftoflavono mišiniu (19) (20) bei praturtinta 
kofaktoriumi.  
Post-mitochondrin ė frakcija paprastai vartojama koncentracijomis, 
kurių intervalas bandymo metu naudojamoje galutin ėje terpėje siekia 
nuo 1–10 % (v/v). Metabolin ės aktyvacijos sistema pasirenkama 
priklausomai nuo bandomosios chemin ės medžiagos klas ės. Kai 
kuriais atvejais tikslinga vartoti daugiau nei post-mitochondrin ės 
frakcijos koncentracij ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Endogenin ę aktyvacij ą gali pagerinti daug tuo tikslu padaryt ų pasie­
kimų, įskaitant ir genetin ės inžinerijos pagalba gautos l ąstelių linijas, 
kurios gamina specifinius fermentus, dalyvaujan čius aktyvacijoje. 
Bandyme naudojamos l ąstelių linijos pasirenkamos moksliškai 
pagrįstai (pavyzdžiui pagal citochromo P450 izofermento svarb ą 
bandomos chemin ės medžiagos metabolizmui).  
1.4.1.5.  Bandomosios medžiagos/paruošimas  
Kietosios bandomosios medžiagos turi b ūti ištirpinamos arba suspen ­
duojamos atitinkamuose tirpikliuose arba nešikliuose ir, jeigu reikia, 
tai prieš tai, kai šia medžiaga bus paveiktos l ąstelės, jos yra praskie ­
džiamos. Prieš paveikiant l ąsteles skystosiomis bandomosiomis 
medžiagomis arba po veikimo, šios medžiagos gali b ūti tiesiogiai 
įnešamos į bandom ąsias sistemas ir praskiedžiamos. Bandomosios 
medžiagos preparatai gaminami prieš kiekvien ą bandymą, neatsižvel ­
giant į tai, kad ši ų medžiag ų stabilumo bandymo duomenys tenkina 
saugojimo s ąlygas.  
1.4.2.  Bandymo s ąlygos  
1.4.2.1.  Tirpiklis/nešiklis  
Tikimasi, kad tirpiklis/nešiklis chemiškai nereaguos su bandom ąja 
chemine medžiaga ir atitiks l ąstelių išgyvenim ą bei S9 aktyvum ą. 
Jeigu naudojami kiti, skirtingai nei žinomi, tirpikliai/nešikliai, tai prieš pradedant juos vartoti, reikia pateikti j ų tinkamum ą įrodančius 
duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti 
skystosios faz ės tirpiklį arba nešikl į. Kai bandomos vandenyje netir ­
pios chemin ės medžiagos, tai naudojamuose organiniuose tirpik ­
liuose neturi b ūti vandens. Vanden į galima pašalinti, papildomai 
naudojant molekulin į filtrą.
 
1.4.2.2.  Veikimo koncentracijos  
Kai parenkama pati didžiausia koncentracija, tai vadovaujamasi 
tokiais kriterijais kaip citotoksiškumas, tirpumas bandomojoje siste ­
moje ir pH arba osmosinio sl ėgio pokyčiai. 
Citotoksiškumas turi b ūti nustatomas pagrindinio eksperimento, 
naudojant arba nenaudojant metabolin ės aktyvacijos sistemos, 
metu, remiantis atitinkamais rodikliais, rodan čiais, kad l ąstelės yra 
vientisos ir kad jos auga – santykiniu kloninio augimo efektyvumu 
arba absoliu čiu santykiniu augimu. B ūtų naudinga citotoksiškum ą bei 
tirpumą nustatyti išankstinio eksperimento metu.  
Turi būti naudojamos bent 4 išbandomos koncentracijos. Jei citotok ­
siškumas pasireiškia, tai šios koncentracijos tur ėtų svyruoti nuo 
maksimalaus iki minimalaus citotoksiškumo laipsnio arba jo apskritai neturėtų būti; šitai paprastai reikš, kad koncentracijos tur ės būti 
atskirtos tiktai faktoriumi, esan čiu tarp 2 ir √10. Jei didžiausia 
koncentracija yra pagr įsta citotoksiškumu, tai esant jai, santykinis 
išgyvenimas arba santykinis absoliutus augimas turi sudaryti apie 10–20 % (bet ne mažiau kaip 10 %). Santykinai necitotoksišk ų 
medžiagų atveju maksimali bandomoji koncentracija turi b ūti 5 
mg/ml, 5 μl/ml arba 0,01 M, bet kuriai esant mažiausiai.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Santykinai netirpios medžiagos turi b ūti bandomos kultivavimo s ąly­
gomis, jų tirpumui siekiant rib ą arba esant už jos. Netirpumas turi 
būti nustatomas galutin ėje terpėje, kuria paveikiamos l ąstelės. Prieš 
pradedant ir baigiant veikim ą bandomąja medžiaga, b ūtų naudinga 
nustatyti tirpum ą, kadangi veikimo metu tirpumas gali pakisti d ėl 
bandomojoje sistemoje esan čių ląstelių, S9 mišinio, serumo ir pan. 
netirpumą galima įvertinti plika akimi. Precipitatas neturi trukdyti 
rezultatų vertinimui.  
1.4.2.3.  Kontroliniai m ėginiai  
Atliekant kiekvien ą eksperiment ą, vienu metu reikia naudoti 
teigiamus ir neigiamus (tirpiklis/nešiklis) kontrolinius m ėginius, 
esant arba nesant metabolin ės aktyvacijos sistemos. Kai naudojama 
metabolin ė aktyvacija, tai teigiamas kontrolinis m ėginys turi b ūti 
cheminė medžiaga, kuria reikia aktyvuoti tam, kad ši sukelt ų muta­
geninį atsaką. 
Teigiamų kontrolini ų medžiag ų pavyzdžiai:  
Metabolin ės 
aktyvacijos s ąlygos  Lokusas  Medžiaga  CAS Nr.  Einecs Nr.  
Egzogenin ės 
metabolin ės akty­
vacijos nėra HPRT  Etilmetansulfonatas  62–50–0  200–536–7  
Etilnitrozošlapalas  759–73–9  212–072–2  
TK (mažos ir 
didelės 
kolonijos)  Metilmetansulfonatas  66–27–3  200–625–0  
XPRT  Etilmetansulfonatas  62–50–0  200–536–7  
Etilnitrozošlapalas  759–73–9  212–072–2  
Egzogenin ė meta­
bolinė aktyvacijos 
sistema yra  HPRT  3-Metilcholantrenas  56–49–5  200–276–4  
N-nitrozodietilaminas  62–75–9  200–549–8  
7,12-Dimetilbenzantracenas  57–97–6  200–359–5  
TK (mažos ir 
didelės 
kolonijos)  Ciklofosfamidas  50–18–0  200–015–4  
Ciklofosfamidmonohidratas  6055–19–2  
Benzpirenas  50–32–8  200–028–5  
XPRT  N-nitrozodimetilaminas (esant 
dideliems S9 mišinio kiekiams)  62–75–9  200–549–8  
Benzpirenas  50–32–8  200–028–5  
Galima naudoti ir kitas teigiamas kontrolines etalonines medžiagas, 
pavyzdžiui, jei laboratorijoje buvo anks čiau gauti duomenys apie 5- 
bromo-2’-dezoksiuridin ą (CAS Nr. 59–14–3; Einecs Nr. 200–415–9), 
tai galima naudoti ši ą etalonin ę medžiag ą. Kai yra įmanoma, tai 
reikia apsvarstyti konkre čios klasės chemini ų medžiag ų, kaip 
teigiamų kontrolini ų mėginių, panaudojim ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Reikia panaudoti ir neigiamus kontrolinius m ėginius, sudarytus vien 
tik iš tirpiklio ar nešiklio ir neturin čius bandomosios medžiagos bei 
paveiktus tokiu pat b ūdu kaip ir bandomieji m ėginiai. Be to, reikia 
naudoti ir bandom ąja medžiaga neveiktus neigiamus kontrolinius 
mėginius, nekreipiant d ėmesio į anksčiau gautus kontrolinius 
duomenis, rodan čius, kad pasirinktas tirpiklis n ėra žalingas ir muta ­
geniškas.  
1.4.3.  Bandymo atlikimo metodika  
1.4.3.1.  Veikimas bandom ąja medžiaga  
Proliferuojan čios ląstelės paveikiamos bandom ąja medžiaga, tiek 
esant tiek ir nesant metabolin ės aktyvacijos. Poveikis turi trukti 
atitinkam ą laiką (efektyvus poveikis paprastai užtrunka 3–6 
valandas). Poveikio trukm ė gali būti prailginama vienu ar keliais 
ląstelės ciklais.  
Tiriant kiekvien ą koncentracij ą gali būti atliekami kult ūrų, paveiktų 
bandomąja medžiaga, 1 ar 2 pakartojimai. Kai atliekamas kult ūrų, 
paveiktų bandomąja medžiaga, vienetinis pakartojimas, tai koncent ­
racijų skaičius padidinamas, kad užtikrinti, jog susidarys pakankamas 
analizuojam ų kultūrų skaičius (turi b ūti naudojamos mažiausiai 8 
bandomosios koncentracijos). Reikia mažiausiai dukart panaudoti 
neigiamas (tirpikliu paveiktas) kontrolines kult ūras. 
Dujinės ir lakios medžiagos turi b ūti bandomos atitinkamais meto ­
dais, panaudojant užsandarintus indus (21), (22).  
1.4.3.2.  Išgyvenimo, gyvybingumo bei mutavimo dažnio nustatymas  
Baigiantis veikimui bandom ąja medžiaga, l ąstelės perplaunamos ir 
pakultivuojamos, siekiant nustatyti j ų išgyvenim ą bei užtikrinti 
mutantinio fenotipo ekspresij ą. Pasibaigus veikimui bandom ąja 
medžiaga, iškart nustatomas citotoksiškumas, įvertinant santykin į 
kloninio augimo efektyvum ą (išgyvenim ą) arba absoliut ų santykin į 
augimą. 
Kiekvienas lokusas turi apibr ėžtą mažiausi ą laiko tarp ą, per kurį turi 
įvykti beveik optimali naujai atsiradusio mutantinio fenotip ų ekspre­
sija (HFRT ir KFRT fenotipas turi mažiausiai ekspresuotis 6–8 dienas, o TK fenotipas – mažiausiai 2 dienas). L ąstelės auginamos 
terpėje, turinčioje arba neturin čioje medžiagos, kurios pagalba 
mutantai atrenkami pagal kloninio augimo efektyvum ą bei nusta ­
tomas jų skaičius. Gyvybingumas pradedamas nustatin ėti (tam, kad 
būtų galima apskai čiuoti mutavimo dažn į) baigiantis ekspresijai, kai 
kamienai pas ėjami į lėkštelę su terpe, kuri n ėra skirta atrankai (nes 
neturi atrankai naudojamos medžiagos).
 
Jei L5178Y TK  +/ - bandymo metu nustatoma, kad bandomoji 
medžiaga yra teigiama, tai mažiausiai vien ąkart nustatomas bando ­
mųjų kultūrų (esant pa čiai didžiausiai teigiamai koncentracijai) bei 
teigiamų ir neigiam ų kontrolini ų kultūrų dydis. Jei L5178Y TK  +/ - 
bandymo metu nustatoma, kad bandomoji yra neigiama, tai nusta ­
tomas teigiam ų bei neigiam ų kontrolini ų kolonijų skaičius. Atliekant 
TK6TK  +/ - bandym ą, taipogi galima įvertinti kolonij ų dydį. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Pateikiant duomenis, turi b ūti nurodytas kontrolini ų bei paveikt ų 
bandomąja medžiaga kult ūrų nustatytas citotoksiškumas, gyvybin ­
gumas, kolonij ų skaičius bei mutavimo dažnis. Jei atliekant 
L5178Y TK  +/ - bandym ą buvo gautas teigiamas atsakas, tai kolonijos 
vertinamos, panaudojant kriterijus, skirtus mažiausiai 1 bandomosios 
medžiagos koncentracijai, kuria buvo veikiamos mažos ir didel ės 
kolonijos bei teigiamos ir neigiamos kontrolin ės kolonijos. Didel ėse 
bei mažose kolonijose esan čių mutantų molekulin ė ir citogenetin ė 
prigimtis buvo išsamiai ištirta (23), (24). Atliekant TK  +/ - bandym ą, 
kolonijos buvo vertinamos, panaudojant normalaus augimo (didel ės 
kolonijos) ir sul ėtinto augimo (mažos kolonijos) kriterijus (25). 
Mutantinės ląstelės, kuriose įvyko dideli genetiniai pažeidimai, pasi ­ 
žymi ilgesniu nei paprastai dalijimosi periodu ir tod ėl jos suformuoja 
mažas kolonijas. Šis sutrikimas įprastiniu atveju gali pasireikšti arba 
kaip atskiro geno praradimas arba kariotipiškai įvertinamomis chro ­
mosomų aberacijomis. Chemin ės medžiagos, sukelian čios gigantini ų 
chromosom ų aberacijas, skatina mažas kolonijas sudaran čių mutantų 
susiformavim ą (26). Mažiau pažeistos mutantin ės ląstelės auga pana ­ 
šiai kaip ir t ėvinės ląstelės bei sudaro dideles kolonijas.  
Reikia pateikti išgyvenimo (santykinio kloninio augimo efektyvumo) 
ar absoliutaus santykinio augimo duomenis. Mutavimo dažnis turi 
būti išreiškiamas kaip mutantini ų ir išgyvenusi ų ląstelių skaičiaus 
santykis.  
Kiekvienos kult ūros bandymo duomenys pateikiami atskirai. Be to 
visi duomenys turi b ūti pateikiami apibendrintai, lenteli ų forma.  
Nėra būtina patvirtinti, kad buvo gautas teigiamas atsakas. Abejotini 
rezultatai išaiškinami t ęsiant bandymus, kuri ų metu pirmiausia pakei ­ 
čiamos eksperimentin ės sąlygos. Neigiami rezultatai patvirtinami 
kiekvienu atveju. Jei manoma, jog n ėra reikalo patvirtinti, kad 
buvo gauti neigiami rezultatai, tai reikia pateikti pateisinan čias aplin­
kybes. V ėliau atliekant eksperimentus, reikia apsvarstyti bandom ų 
parametrų pakeitimus tam, kad, analizuojant abejotinus bei 
neigiamus rezultatus, b ūtų išplėstas įvertinamų sąlygų spektras. 
Koncentracijas skirian čiosios ribos bei metabolin ės aktyvacijos 
sąlygos yra bandomieji parametrai, kuriuos galima modifikuoti.  
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Egzistuoja keli teigiamo rezultato įvertinimo kriterijai, tokie kaip nuo 
koncentracijos priklausantis arba atkartojamas mutavimo dažnio padidėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biologin ę rezultatų reikšmę. 
Įvertinant bandymo rezultatus, galima pasinaudoti statistiniais meto ­
dais. Tačiau statistikos svarba netur ėtų tapti vieninteliu faktoriumi, 
apsprendžian čiu teigiam ą atsaką.
 
Jei tiriant medžiag ą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukš čiau 
minėtų kriterijų, tai medžiaga laikoma nemutageniška.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Nors daugumos eksperiment ų metu gaunami aiškiai teigiami arba 
neigiami rezultatai, ta čiau išimtiniais atvejais, remiantis visais gautais 
rezultatais, negalima padaryti tinkamos išvados apie bandomos medžiagos aktyvum ą. Rezultatai gali likti abejotini ir neaišk ūs, 
nepriklausomai nuo to, kiek kart ų eksperimentas buvo pakartotas.
 
Teigiami rezultatai, gauti, tiriant žinduoli ų ląstelių genų mutacijas, 
rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia gen ų mutacijas panaudotose 
žinduolių ląstelėse. Nuo koncentracijos priklausantis teigiamas 
atsakas yra svarbiausias. Neigiami rezultatai rodo, kad, esant 
bandymo s ąlygoms bandomoji medžiaga nesukelia gen ų mutacijų 
panaudotose žinduoli ų ląstelėse. 
3. ATASKAITA  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikiama tokia informacija:  
Tirpiklis/nešiklis įrenginys:  
— priežastys, d ėl kurių buvo pasirinktas šis įrenginys,  
— bandomosios chemin ės medžiagos, esan čios tirpiklyje/nešiklyje, 
tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.  
Ląstelės: 
— ląstelių tipas ir šaltinis,  
— ląstelių kultūrų skaičius, 
— ląstelių persėjimų skaičius (jei jį galima nurodyti),  
— ląstelių kultūros palaikymo metodai (jei juos galima nurodyti),  
— ar neužsikr ėtusios mikoplazmomis.  
Bandymo s ąlygos:  
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi koncentracij ų bei kult ūrų skai­ 
čiaus pasirinkim ą, įskaitant citotoksiškumo nustatymo duomenis 
bei tirpumo apribojimus (jei juos įmanoma nurodyti),  
— terpės sudėtis ir CO  2 koncentracija,  
— bandomosios medžiagos sud ėtis, 
— nešiklio darbin ė talpa bei į jį įdėtos medžiagos t ūris, 
— inkubacijos temperat ūra, 
— inkubacijos trukm ė, 
— veikimo bandom ąja medžiaga trukm ė, 
— ląstelių tankis veikimo metu,  
— metabolin ės aktyvacijos sistemos tipas bei sud ėtis, 
— teigiami bei neigiami kontroliniai m ėginiai, įskaitant j ų tinka­
mumo kriterijus,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— ekspresijos trukm ė (įskaitant pas ėtų ląstelių skaičių, subkultiva ­
vimo bei mitybai skirt ų medžiag ų įnešimo tvarkaraš čiai, jei juos 
įmanoma pateikti),  
— atrankos medžiagos,  
— kriterijai, kuriais vadovaujamasi, sprendžiant, ar bandym ų metu 
gauti rezultatai yra teigiami, neigiami ar abejotini,  
— gyvų bei mutantini ų ląstelių skaičiaus nustatymo metodai,  
— kolonij ų dydis ir tipas ( įskaitant „maž ų“ bei „dideli ų“ kolonij ų 
vertinimo kriterijus, kaip yra numatyta).  
Rezultatai:  
— toksiškumo požymiai,  
— precipitacijos požymiai,  
— duomenys apie pH bei osmosin į slėgį, veikiant bandom ąja 
medžiaga (jei tai buvo bandoma),  
— kolonij ų dydis, jei buvo vertinamos bent neigiamos arba 
teigiamos kontrol ės, 
— laboratorijos kompetentingumas L5178Y TK  +/ - sistemos pagalba 
nustatyti mutantus, sudaran čius mažas kolonijas (jei tai b ūtina 
nurodyti),  
— dozės ir atsako tarpusavio ryšys (jei įmanoma nurodyti),  
— statistin ės analizės (jei bet kokios buvo atliktos),  
— duomenys apie vienu metu naudojamus neigiamus (tirpiklis/ne ­ 
šiklis) ir teigiamus kontrolinius m ėginius,  
— anksčiau gauti duomenys apie neigiamus (tirpiklis/nešiklis) bei 
teigiamus kontrolinius m ėginius, kartu nurodant j ų intervalus, 
vidurkius ir standartinius nukrypimus,  
— mutavimo dažnis.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, 
K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Muta ­
genesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
2) Chu, E.H.Y. and Mailing, h.V. (1968). Mammalian Cell Gene ­
tics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in 
Chinese Hamster Cells  In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 
61, p. 1306–1312.  
3) Liber, h.L. and Thilly, W.G. (1982). Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. Mutation Res., 94, p. 467–485.
 
4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, 
K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse 
Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, 
p. 394–403.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F. (1989). Comparison of the 
AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six 
Drug Candidates. Mutation Res., 223, p. 121–128.  
6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, h.R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group 
Report. Report of the International Workshop on Standardisa ­
tion of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, p. 235–239.
 
7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity 
Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, p. 147–204.
 
8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and 
Mavournin, K.H. (1983). Specific Gene Mutations in L5178Y 
Cells in Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, p. 225–251.
 
9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S. (1988). A 
Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxant ­
hine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. 
Mutation Res., 196, p. 17–36.
 
10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., 
Loveday, K.S., O’Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L. (1987). A Guide for the Performance of the 
Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphori ­
bosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, p. 135–141.
 
11) Liber, h.L., Yandell, D.W and Little, J.B. (1989). A Compa ­
rison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, p. 9–17.
 
12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W. (1986). 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate -and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, p. 133–147.
 
13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D. (1984). Procedures for 
the L5178Y/TK  +/- – TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Mutageni ­
city Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mutage ­
nicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New York, 
p. 239–268.  
14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, 
J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: 
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, 
D.J., Ed., Cambridge University Press, p. 66–101.
 
15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A. (1977). Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by 
Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Muta ­
tion Res., 46, p. 365–373.  
16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975). Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ 
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 
p. 347–364.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and 
Brown M.M.M. (1979). Validation and Characterization of 
the L5178Y/TK  +/ - Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. 
Mutat. Res., 59, p. 61–108.  
18) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983). Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173–215.  
19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Alterna ­
tives to Aroclor 1254-Induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, p. 175–177.  
20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976). A SAFE Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In:  In Vitro  Meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, 
J.R., Bend, J.R. and Philpot, R. M (eds), Elsevier, North-Holland, p. 85–88.
 
21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982). 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). 
Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 
p. 91–103.  
22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 
p. 795–801.
 
23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and 
Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 51–55.
 
24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C, Howard, B.E., Batson, 
A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of 
Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK  +/- 
Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, p. 161–174.  
25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B. (1990). Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous 
Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, 
p. 89–102.  
26) Moore, M.M. and Doerr, C.L. (1990). Comparison of Chromo ­
some Aberration Frequency and Small-Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK
 +/- - 3.7.2C Mouse Lymp ­
homa Cells. Mutagenesis, 5, p. 609–614.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  DNR PAŽAIDOS IR J Ų REPARACIJA – NETAISYKLINGA 
DNR SINTEZ Ė – ŽINDUOLI Ų LĄSTELĖSE IN VITRO  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Neplanuotos DNR sintez ės (NDS) bandymo metu įvertinama DNR 
sintezė reparacijos metu, kai iškerpama bei pašalinama chemin ėmis 
ar fizinėmis medžiagomis pažeista DNR atkarpa. Bandymas paremtas 
tričiu žymėto timidino (  3 H-TdR) įjungimu į žinduoli ų ląstelių, 
nesančių ląstelinio ciklo S (sintez ės) fazėje, DNR.  3 H-TdR įsijun­
gimas į DNR gali b ūti nustatomas atliekant paveikt ų ląstelių DNR 
autoradiografij ą arba registruojant skystosios scintiliacijos įvykius 
(SSĮ). Išskyrus pirminius žiurki ų hepatocitus, naudojamos žinduoli ų 
ląstelės kultivuojamos kartu su bandymo medžiaga, esant arba nesant 
metabolitin ės aktyvacijos sistemos. Taipogi NDS galima įvertinti ir 
sistemose  in vivo . 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
Pasiruošimas bandymui  
Bandomosios, kontrolin ės ar etalonin ės medžiagos tur ėtų būti paruo­ 
šiamos kultivavimui skirtoje terp ėje arba, panaudojant atitinkamus 
prietaisus, ištirpinamos ar suspenduojamos ir v ėliau praskiedžiamos 
kultivavimui skirta terpe, kad bandymo metu b ūtų galima jas 
naudoti. Galutin ė medžiag ų koncentracija, pasiekta naudojant prie ­
taisą, neturėtų įtakoti ląstelių gyvybingumo.  
Bandymo metu galima naudoti žiurki ų hepatocit ų pirmines kult ūras, 
žmogaus limfocitus arba gerai žinomas l ąstelių linijas (pvz., žmogaus 
diploidinius fibroblastus).  
Ląstelės turėtų būti veikiamos bandom ąja medžiaga, esant arba 
nesant metabolitin ės aktyvacijos sistemos.  
Bandymo s ąlygos  
K u l t ū r ų s k a i č i u s 
Atliekant neplanuotos DNR sintez ės bandym ą autoradiografijos 
metodu, reik ėtų naudoti mažiausiai dvi l ąstelių kultūras, o skystosios 
scintiliacijos įvykių registravimo metodu –mažiausiai šešias kult ūras 
(arba mažiau, jei moksliškai pagrindžiama), b ūtinas kiekvienam 
eksperimento etapui.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
T e i g i a m o s i r n e i g i a m o s k o n t r o l ė s 
Atliekant kiekvien ą eksperiment ą, reikėtų vienu metu naudoti 
teigiamas ir neigiamas (neveiktas ir (ar) su prietaisu) kontroles, esant ar nesant metabolitin ės aktyvacijos sistemos.
 
Atliekant bandym ą ir naudojant žiurki ų hepatocit ų pirmines kult ūras, 
naudojamos teigiamos kontrol ės – 7,12-dimetilbenzantracenas (7,12- 
DMBA) arba 2-acetilaminofluorenas (2-AAF). Jei naudojamos gerai 
žinomos l ąstelių linijos ir atliekamas neplanuotos DNR sintez ės 
bandymas tiek autoradiografijos, tiek ir skystosios scintiliacijos įvykių registravimo metodais, nesant metabolitin ės aktyvacijos 
sistemos, 4-nitrokvinolin-N-oksidas naudojamas kaip teigiama kont ­
rolė, o esant metabolitin ės aktyvacijos sistemai – 
N-dimetilnitrozaminas.
 
V e i k i m o k o n c e n t r a c i j o s  
Reikėtų naudoti daug bandomosios medžiagos koncentracij ų, išdės­
tytų dideliame intervale, pakankame atsakui nustatyti. Didžiausios 
koncentracijos bandomoji medžiaga tur ėtų sukelti kelet ą citotoksini ų 
poveikių. Turėtų būti ištirti santykinai vandenyje netirp ūs junginiai, 
kad būtų nustatyta j ų tirpumo riba. Pavienio bandymo metu tur ėtų 
būti nustatyta laisvai vandenyje tirpstan čių netoksini ų junginių 
didžiausia bandomoji koncentracija.  
L ą s t e l ė s 
Kultivuojant kult ūras reikėtų naudoti atitinkam ą terpę ir laikytis 
atitinkamos CO  2 koncentracijos, temperat ūros bei dr ėgmės. Reikėtų 
periodiškai tikrinti gerai žinomas l ąstelių linijas, siekiant nustatyti 
mikoplazm ų sukeliam ą infekciją. 
M e t a b o l i n ė a k t y v a c i j a  
Kai bandomos pirmin ės hepatocit ų kultūros, metabolin ės aktyvacijos 
nenaudojamos. Gerai žinomos l ąstelių linijos bei limfocitai veikiami 
bandomąja medžiaga, esant ar nesant atitinkamai metabolin ės akty­
vacijos sistemai.  
Bandymo eiga  
K u l t ū r ų p a r u o š i m a s  
Gerai žinomos l ąstelių linijos paruošiamos iš kamienini ų kultūrų 
(veikiant tripsinu arba kratymu), pas ėjamos atitinkamu tankumu į 
terpę kultivavimui skirtuose induose ir inkubuojamos 37 °C tempe ­
ratūroje. 
Trumpalaik ės žiurkių hepatocit ų kultūros sukuriamos šviežiai disoci ­
juotus hepatocitus pas ėjant į atitinkam ą terpę ir leidžiant jiems prisit ­
virtinti prie augimo paviršiaus.  
Žmogaus limfocit ų kultūros paruošiamos atitinkamais metodais.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
K u l t ū r ų v e i k i m a s b a n d o m ą j a m e d ž i a g a  
Pirminiai žiurki ų hepatocitai  
Šviežiai išskirti žiurki ų hepatocitai veikiami bandom ąja medžiaga 
terpėje, turin čioje 3H-TdR, atitinkam ą laiko tarp ą. Baigiantis 
veikimui, terp ė atskiriama nuo l ąstelių, kurios v ėliau sudrėkinamos, 
fiksuojamos bei išdžiovinamos. Objektinius stiklelius reik ėtų panar­
dinti į autoradiografin ę emulsiją (galima naudoti ir fotografin ę juos­
telę), eksponuoti, išryškinti nudažyti ir suskai čiuoti ląsteles.  
Gerai žinomos l ąstelių linijos ir limfocitai  
Autoradiografija: L ąstelių kultūros veikiamos bandom ąja medžiaga 
atitinkam ą laiko tarp ą, po to veikiamos  3 H-TdR. Laiko trukm ė paren­
kama atsižvelgiant į bandomosios medžiagos prigimt į, metabolitini ų 
sistemų aktyvumus bei l ąstelių tipą. Tam, kad b ūtų pasiekta pati 
intensyviausia neplanuota DNR sintez ė, 3 H-TdR turi b ūti įnešamas 
arba vienu metu su bandom ąja medžiaga arba pra ėjus kelioms minu ­
tėms po to, kai buvo įnešta bandomoji medžiaga. Kuri proced ūra bus 
pasirinkta, nulems tarpusavio s ąveika tarp bandomosios medžiagos ir  
3 H-TdR. Siekiant atskirti neplanuot ą DNR sintez ę nuo pusiau 
konservatyvios DNR sintez ės, pastaroji turi b ūti blokuojama, pvz., 
panaudojant neturin čią arginino terp ę arba terp ę, turinčią nedaug 
serumo, arba pridedant į terpę hidroksišlapalo.  
Skystosios scintiliacijos įvykių registacija: Prieš veikiant bandom ąja 
medžiaga, l ąstelių perėjimas į S fazę turėtų būti blokuojamas taip, 
kaip aprašyta anks čiau; vėliau ląstelės veikiamos bandom ąja 
medžiaga taip, kaip tai atliekama autoradiografijos metu. Baigiantis inkubacijos periodui, iš l ąstelių išskiriama DNR ir nustatomas abso ­
liutus DNR bei į ją įsijungusio
 3 H-TdR kiekis.  
Reikėtų pabrėžti, kad jei, dirbant remiantis aprašytu metodu, naudo ­
jami žmogaus limfocitai, tai nestimuliuot ų kultūrų atveju pusiau 
konservatyvios DNR sintez ės nėra būtina blokuoti.  
Analizė 
A u t o r a d i o g r a f i n i a i n u s t a t y m a i  
Įvertinant neplanuotos DNR sintez ės intensyvum ą ląstelių kultūroje, 
neskaičiuojami branduoliai, esantys S faz ėje. Reikėtų suskaičiuoti 
mažiausiai 50 l ąstelių, esant vienai koncentracijai. Kiekviename stik ­
lelyje reikia suskai čiuoti kelet ą atsitiktini ų regionų, plačiai atskirt ų 
vienas nuo kito. Į citoplazm ą įsijungusio  3 H-TdR kiekis tur ėtų būti 
nustatomas, suskai čiuojant tris branduolio apribotus laukelius, esan ­ 
čius jau suskai čiuotų ląstelių citoplazmoje.  
S k y s t o s i o s s c i n t i l i a c i j o s į v y k i ų n u s t a t y m a i  
Siekiant įvertinti neplanuotos DNR sintez ės intensyvum ą pagal užre ­
gistruotus skystosios scintiliacijos įvykius, reik ėtų naudoti atitinkam ą 
ląstelių kultūrų kiekį, esant kiekvienai koncentracijai bandomajame 
bei kontroliniame m ėginiuose.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Visi rezultatai tur ėtų būti patvirtinti, atlikus nepriklausom ą bandymą. 
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti pateikiami lentel ėse. 
2.1. AUTORADIOGRAFINIAI NUSTATYMAI  
Reikėtų atskirai registruoti į citoplazm ą įsijungusio  3 H-TdR kiek į bei 
ląstelės branduolyje esan čių granulių skaičių. 
Apibūdinant į citoplazm ą įsijungusio  3 H-TdR kiekio bei l ąstelės 
branduolyje esan čių granulių skaičiaus pasiskirstym ą, galima naudoti 
vidurkį, medianą ir modą. 
2.2. SKYSTOSIOS SCINTILIACIJOS ĮVYKIŲ NUSTATYMAI  
Nustatant skystosios scintiliacijos įvykius,  3 H-TdR įsijungimą 
išreikšti dpm/ μg DNR. Apib ūdinant įsijungimo pasiskirstym ą, galima 
panaudoti dpm/ug DNR vidurk į bei standartin į nukrypim ą. 
Duomenis reik ėtų įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— panaudotos l ąstelės, tankumas ir pers ėjimų skaičius veikimo 
metu, ląstelių kultūrų skaičius, 
— ląstelių kultūrų kultivavimo metodai, įskaitant terp ę, temperat ūrą 
ir CO  2 koncentracij ą, 
— bandomoji medžiaga, priemon ė, koncentracijos ir bandymo metu 
naudojam ų koncentracij ų pasirinkimo kriterijai,  
— metabolitin ės aktyvacijos sistem ų apibūdinimas,  
— veikimo tvarkaraštis,  
— teigiamos ir neigiamos kontrol ės, 
— panaudotas autoradiografinis metodas,  
— ląstelių patekimo į S fazę blokavimo proced ūros, 
— DNR išskyrimo ir absoliutaus kiekio nustatymo proced ūros, atlie­
kant skystosios scintiliacijos įvykių registracij ą, 
— dozės ir atsako s ąsaja, jei įmanoma,  
— statistinis įvertinimas,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  APSIKEITIMO SESERIN ĖMIS CHROMATID ĖMIS 
BANDYMAS  IN VITRO  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Apsikeitimo seserin ėmis chromatid ėmis (ASC) bandymas trunka 
trumpai ir jo metu nustatomi gr įžtamieji apsikeitimai DNR tarp 
dviejų seserinių chromatidži ų, esančių vienoje dvigub ėjančioje chro­
mosomoje. Apsikeitimas seserin ėmis chromatid ėmis pasikeitim ą 
DNR replikacijos produktais iš paži ūros homologiškuose lokusuose. 
Pasikeitimo proceso metu neabejotinai įvyksta DNR tr ūkis ir susiu ­
vimas, ta čiau nedaug žinoma apie šio proceso molekulinius mecha ­
nizmus. Apsikeitimo seserin ėmis chromatid ėmis nustatymui reikia 
skirtingai pažym ėti seserines chromatides ir šitai galima padaryti, 
įjungiant bromdeoksiuridin ą (BrdU) į chromosomin ę DNR dviej ų 
ląstelinių ciklų metu.  
Žinduolių ląstelės veikiamos bandom ąja medžiaga  in vitro , naudojant 
arba nenaudojant žinduoli ų metabolitin ę aktyvacijos sistem ą, jeigu 
reikia, ir kultivuojamos dviej ų replikacijos cikl ų laikotarpiu terp ėje, 
turinčioje bromdeoksiuridino. Paveikus vert ės išsisukimo inhibito ­
riumi (pvz., kolchicinu), l ąstelės surenkamos ir paruošiami chromo ­
somų preparatai.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
Pasiruošimas bandymui  
— Bandymo metu galima naudoti pirmines kult ūras (žmogaus 
limfocitai) arba gerai žinomas l ąstelių linijas (pvz., kiniškojo 
žiurkėno kiaušidži ų ląsteles). Reik ėtų patikrinti, ar l ąstelių linijos 
neužsikrėtusios mikoplazmomis.  
— Reikėtų naudoti atitinkam ą kultivavimui skirt ą terpę bei parinkti 
inkubacijos s ąlygas (pvz., temperat ūra, indai, skirti kultivavimui, 
CO 2 koncentracija bei dr ėgmė). 
— Prieš veikiant l ąsteles bandomosiomis medžiagomis, šios turi b ūti 
paruoštos kultivavimui skirtoje terp ėje arba, panaudojant atitin ­
kamus prietaisus, ištirpintos ar suspenduotos. Panaudojant tirpikl į 
kaip kontrol ę, reikėtų stebėti, kad, naudojant atitinkam ą prietaisą, 
pasiekta bandomosios medžiagos galutin ė koncentracija kultiva ­
vimui skirtoje sistemoje ypatingai ne įtakotų ląstelių gyvybin ­
gumo ar augimo grei čio bei apsikeitimo seserin ėmis chromati ­
dėmis dažnumo.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— Ląstelės turėtų būti veikiamos bandom ąja medžiaga, esant arba 
nesant egzogeninei žinduoli ų metabolitin ės aktyvacijos sistemai. 
Jei naudojami l ąstelių, turinčių metabolitin ę aktyvacijos sistem ą, 
tipai, tai aktyvumo greitis ir prigimtis tur ėtų atitikti bandom ąją 
cheminių junginių klasę. 
Bandymo s ąlygos  
K u l t ū r ų s k a i č i u s 
Kiekvieno eksperimento etapo metu reik ėtų naudoti mažiausiai dvi 
kultūras. 
T e i g i a m o s i r n e i g i a m o s k o n t r o l ė s 
Kiekvieno eksperimento metu reik ėtų naudoti teigiamas kontroles, 
sudarytas tiek iš tiesiogiai veikian čio junginio, tiek junginio, kur į 
reikia metabolitiškai aktyvuoti; taipogi reik ėtų naudoti kontrol ę 
kartu su priemone.  
Toliau pateikiamos medžiagos, kurias galima naudoti kaip teigiamas 
kontroles:  
— tiesiogiai veiki ąs junginys:  
— etilmetansulfonatas,  
— netiesiogiai veiki ąs junginys:  
— ciklofosfamidas.  
Jeigu reikia, galima naudoti ir papildom ą teigiamą kontrolę, priklau­
sančią tai pačiai chemini ų junginių klasei kaip ir bandomoji 
medžiaga.  
V e i k i m o k o n c e n t r a c i j o s  
Reikėtų naudoti mažiausiai tris bandomosios medžiagos koncentra ­
cijas, tinkamai atskirtas vien ą nuo kitos. Didžiausia koncentracija 
turėtų sukelti intensyv ų toksinį poveikį, tačiau nesutrukdyti l ąstelių 
replikacijos ciklui vykti. Panaudojant atitinkamas proced ūras turėtų 
būti bandomi santykinai vandenyje netirp ūs junginiai, kad b ūtų 
nustatyta j ų tirpumo riba. Pavienio bandymo metu tur ėtų būti nusta­
tyta laisvai vandenyje tirpstan čių netoksini ų junginių didžiausia 
bandomoji koncentracija.  
Bandymo eiga  
K u l t ū r ų p a r u o š i m a s  
Gerai žinomos l ąstelių linijos paruošiamos iš kamienini ų kultūrų 
(veikiant tripsinu arba kratymu), pas ėjamos atitinkamu tankumu į 
terpę kultivavimui skirtuose induose ir inkubuojamos 37 °C tempe ­
ratūroje. Vienasluoksni ų kultūrų atveju ląstelių, esančių kultivavimui 
skirtame inde, skai čius turėtų būti sureguliuotas taip, kad l ąstelių 
surinkimo metu kult ūros susimaišymas siekt ų ne daugiau 50 %. 
Ląsteles galima kultivuoti ir suspensijoje. Žmogaus limfocit ų 
kultūros paruošiamos iš heparinizuoto kraujo, panaudojant atitin ­
kamas proced ūras ir inkubuojami 37 °C temperat ūroje. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
V e i k i m a s  
Ląstelės, esančios eksponentin ėje augimo faz ėje, veikiamos bando ­
mąja medžiaga atitinkam ą laiko tarp ą; dažniausiai užtenka 1–2 
valandų, tačiau konkre čiais atvejais veikimas gali b ūti pratęsiamas 
iki dviejų ląstelinių ciklų. Ląstelės, nepasižymin čios pakankamu 
metaboliniu aktyvumu, tur ėtų būti veikiamos bandom ąja medžiaga, 
esant ar nesant atitinkamai metabolin ės aktyvacijos sistemai. 
Baigiantis veikimui, l ąstelės atplaunamos nuo neprisirišusios bando ­
mosios medžiagos ir kultivuojamos du replikacijos periodus terp ėje, 
turinčioje bromdeoksiuridino. L ąsteles galima veikti vienu metu 
bandomąja medžiaga ir bromdeoksiuridinu dviej ų ląstelinių ciklų 
trukmės laiko periodu.  
Žmogaus limfocit ų kultūros veikiamos tuo metu, kai jos yra pusiau 
sinchronin ėje būsenoje.  
Ląstelės analizuojamos tada, kai jos pradeda dalintis antr ą kartą po 
veikimo, užtikrinant, kad bandom ąja medžiaga buvo paveiktos 
ląstelės, esančios pačiuose jautriausiose medžiagos atžvilgiu l ąste­
linio ciklo faz ėse. Visos kult ūros, į kurias buvo įneštas bromdeok ­
siuridinas, laikomos tamsoje arba blankioje dienos šviesos lemp ų 
šviesoje iki tol, kol bus surinktos l ąstelės tam, kad b ūtų sumažinta 
DNR, turin čios bromdeoksiuridino, fotoliz ė. 
L ą s t e l i ų s u r i n k i m a s  
Prieš surenkant l ąsteles, šios veikiamos verpst ės išsisukimo inhibito ­
riumi (pvz., kolchicinu) 1–2 valandas. Kiekviena kult ūra surenkama 
ir apdorojama atskirai, kad chromosomos b ūtų paruoštos.  
C h r o m o s o m ų p a r u o š i m a s i r d a ž y m a s  
Chromosomos paruošiamos standartiniais citogenetiniais metodais. 
Objektiniai stikleliai, skirti apsikeitimo seserin ėmis chromatid ėmis 
demonstravimui, gali b ūti dažomi keliais b ūdais (pvz., panaudojant 
fluorescencinius dažus ir Giemsa dažym ą). 
A n a l i z ė 
Analizuojam ų ląstelių skaičius turėtų būti pagrįstas apsikeitimo sese ­
rinėmis chromatid ėmis spontaniniu kontroliniu dažniu. Įprastiniu 
atveju, tiriant apsikeitim ą seserinėmis chromatid ėmis, mažiausiai 25 
gerai matomos metafaz ės yra analizuojamos. Objektiniai stikleliai 
užkoduojami prieš analiz ę. Žmogaus limfocit ų atveju, analizuojamos 
tik metafaz ėje esančios chromosomos, turin čios 46 chromatides. 
Gerai žinom ų ląstelių linijų atveju analizuojamos tik tos metafazin ės 
chromosomos, kurios turi ± 2 modalin į skaičių centromer ų. Reikėtų 
nurodyti ar, tiriant apsikeitim ą seserinėmis chromatid ėmis, skaičiuo­
jamas žym ės centromerinis perjungimas. Rezultatai turi b ūti patvir­
tinti, atlikus nepriklausom ą eksperiment ą. 
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti pateikti lentel ėse. Atskirai nuo paveikt ų ir 
kontrolini ų kultūrų turėtų būti atskirai pateiktas apsikeitim ų seseri­
nėmis chromosomomis kiekvienoje metafazin ėje ir nemetafazin ėje 
chromosomoje skai čius. 
Rezultatai tur ėtų būti įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. ATASKAITA  
3.1 BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— panaudotos l ąstelės, ląstelių kultūrų kultivavimo metodai,  
— bandymo s ąlygos: terp ės sudėtis, CO  2 koncentracija, bandomo ­
sios medžiagos koncentracija, panaudota priemon ė, inkubacijos 
temperatūra, veikimo laikas, panaudotas verpst ės išsisukimo inhi ­
bitorius, jo koncentracija ir veikimo inhibitoriumi trukm ė, panau­
dotos žinduoli ų metabolitin ės aktyvacijos sistemos tipas, 
teigiamos ir neigiamos kontrol ės, 
— ląstelių kultūrų, naudotų kiekviename eksperimento etape, skai ­ 
čius, 
— objektini ų stiklelių paruošimo metodo aprašymas,  
— išanalizuot ų metafazi ų skaičius (kiekvienos kult ūros bandymo 
duomenys pateikiami atskirai),  
— apsikeitim ų seserinėmis chromatid ėmis vienoje l ąstelėje ir 
vienoje chromosomoje vidurkis (kiekvienos kult ūros bandymo 
duomenys pateikiami atskirai),  
— apsikeitimo seserin ėmis chromatid ėmis vertinimo kriterijai,  
— dozės pasirinkimo kriterijai,  
— dozės ir atsako s ąsaja, jei įmanoma,  
— statistinis įvertinimas,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  DROSOPHILA MELANOGASTER NUO LYTIES 
PRIKLAUSOMO RECESYVINIO LETALIŠKUMO BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Su lytimi susijusio recesyvinio letalaus (LSRL) testo, panaudojant  
Drosophila melanogaster , metu vabzdžio embrionin ės linijos l ąste­
lėse nustatomos mutacijos, tiek taškin ės, tiek ir nedidel ės delecijos. 
Šis bandymas yra skirtas tiesiogin ėms mutacijoms analizuoti ir jo 
metu galima nustatyti mutacijas, lokalizuotas apie 800 lokus ų, suda­
rančių apie 80 % vis ų X-chromosomos lokus ų. X-chromosoma 
sudaro maždaug penktadal į haploidinio  Drosophila  genomo.  
Drosophila melanogaster  X-chromosomoje vykstan čios mutacijos 
pasireiškia fenotipiškai patinuose, turin čiuose mutantin į geną. Kada 
mutacija yra letali hemizigotin ėmis sąlygomis, tai jos egzistavimas 
reiškia, kad viena iš dviej ų patinų grupių neturės palikuoni ų, kuriuos 
normaliomis s ąlygomis atsiveda heterozigotin ės patelės. Atliekant 
LSRL test ą, pasinaudojama šia informacija, specifiškai pažymint 
bei išdėstant chromosomas.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
Pasiruošimas bandymui  
P a d e r m ė s 
Gali būti naudojami gerai žinomos laukin ės paderm ės patinai ir 
padermės Muller-5 patel ės. Taipogi galima naudoti kitas atitinkamai 
pažymėtas pateli ų padermes, turin čias daug invertuot ų 
X-chromosom ų. 
B a n d o m o j i m e d ž i a g a  
Bandomosios medžiagos tur ėtų būti tirpinamos vandenyje. Prieš 
pradedant veikim ą, vandenyje netirpstan čios medžiagos gali b ūti 
ištirpinamos arba suspenduojamos panaudojus atitinkamas priemones (pvz., etanolio ir Tween-60 arba Tween-80 mišin į), o tada praskie ­
džiamos vandeniu ar drusk ų tirpalu. Reik ėtų vengti naudoti 
dimetilsulfoksid ą (DMSO) kaip tirpinimo priemon ę.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
G y v ū n ų s k a i č i u s 
Testą reikėtų taip suplanuoti, kad iš anksto b ūtų numatytas jo 
jautrumas ir skiriamoji geba. Dažnai pasireiškian čios spontanin ės 
mutacijos, stebimos atitinkamose kontrol ėse turės didelės įtakos 
chromosom ų, paveiktų bandomąja medžiaga ir kurios turi b ūti anali­
zuojamos, skai čiui. 
D a v i m o b ū d a s  
Bandomoji medžiaga gali b ūti duodama per virškinam ąjį traktą, ją 
injekuojant arba veikiant dujomis ar garais. Bandom ąją medžiag ą 
galima duoti ir su maistu, ta čiau šitai daroma naudojant cukraus 
tirpalą. Jeigu reikia, medžiagos gali b ūti ištirpinamos 0,7 % NaCl 
tirpale ir injekuojamos į stemplę ar pilvel į. 
T e i g i a m ų i r n e i g i a m ų k o n t r o l i ų n a u d o j i m a s  
Reikėtų naudoti neigiamas (priemon ė) ir teigiamas kontroles. Ta čiau, 
jei galima pasinaudoti anks čiau atlikt ų laboratorini ų bandym ų 
duomenimis, tuo pa čiu metu kontroli ų naudoti nereikia.  
V e i k i m o d o z ė 
Reikėtų naudoti tris veikimo dozes. Atliekant išankstin į bandomosios 
medžiagos įvertinimą, galima naudoti vien ą dozę, kuri yra arba 
didžiausia toleruojamoji koncentracija, arba kuri sukelia kai kuriuos 
toksiškumo požymius. Veikiant netoksiškomis medžiagomis, reik ėtų 
naudoti maksimali ą veikimo koncentracij ą. 
B a n d y m o e i g a  
Laukinio tipo patinai (3–5 dien ų amžiaus) veikiami bandom ąja 
medžiaga ir poruojami individualiai su daugeliu Muller-5 ar kitos atitinkamai pažym ėtos (turin čios daug invertuot ų X-chromosom ų) 
padermės nekaltų patelių. Kiekvien ą 1–3 dien ą apvaisintos patel ės 
keičiamos nekaltomis patel ėmis tam, kad b ūtų panaudotas visas 
embrionini ų ląstelių ciklas. Ši ų patelių palikuonys vertinami pagal 
letalius poveikius subrendusios spermos, vidurin ėje ar vėlyvojoje 
stadijoje esan čių spermatidži ų, spermatocit ų ir spermatogonij ų 
atžvilgiu veikimo metu.
 
Ankstesniuose kryžminimuose naudotoms heterozigotin ėms pirmos 
palikuoni ų kartos (F  1 ) patelėms leidžiama kryžmintis individualiai 
(viena patel ė inde) su j ų broliais. Kiekviena F  2 karta įvertinama 
pagal laukinio tipo patin ų neegzistavim ą. Jei nustatoma, kad kult ūra 
yra paimta iš F  1 patelės, turinčios letalią X-chromosomos mutacij ą 
(pvz., nebuvo pasteb ėta patinų su paveikta chromosoma), tai tur ėtų 
būti bandomos t ą patį genotipą turinčios šios patel ės dukterys tam, 
kad būtų galima įsitikinti jog letalumas pasikartoja kitoje kartoje.  
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti pateikti lentel ėse, nurodant ištirt ų 
X-chromosom ų skaičių, nevaising ų patinų skaičių ir kiekvieno 
paveikto patino kiekvieno poravimosi periodo metu nustatyt ų letalių 
chromosom ų skaičių, esant kiekvienai bandomosios medžiagos 
koncentracijai, reik ėtų registruoti skirting ų dydžių genų klasterių 
kiekvieno patino genome skai čių. Šie rezultatai turi b ūti patvirtinti, 
atlikus atskir ą eksperiment ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Įvertinant su lytimi sukibusi ų recesyvių letalių genų testų rezultatus, 
reikėtų panaudoti atitinkamus statistinius metodus. Remiantis atitin ­
kamais statistiniais metodais, reik ėtų įvertinti ir apsvarstyti vieno 
patino recesyvi ų letalių genų kaupimąsi. 
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— paderm ė: panaudotos  Drosophila  padermės ar kamienai, vabz ­
džių amžius, paveikt ų patinų skaičius, sterili ų patinų skaičius, 
sukurtų F2 kartos kult ūrų skaičius, F2 kult ūrų, neturinčių pali­
kuonių, skaičius, chromosom ų, turinčių letalią mutaciją, nustatytą 
embrionin ės linijos l ąstelėse, skaičius, 
— grupių, kurios veikiamos, dydžio nustatymo kriterijai,  
— bandymo s ąlygos: išsamus veikimo ir m ėginių paėmimo tvarka ­
raštis, veikimo koncentracijos, toksiškumo bandymo duomenys, 
neigiamos (tirpiklis) ir teigiamos kontrol ės, jeigu reikia,  
— letalių mutacijų įvertinimo kriterijai,  
— dozės ir atsako s ąsaja, jei įmanoma,  
— duomen ų įvertinimas,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  ŽINDUOLI Ų LĄSTELIŲ TRANSFORMACIJOS BANDYMAI  IN 
VITRO  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Siekiant nustatyti chemini ų medžiag ų, sukelian čių ląstelių piktybin ę 
transformacij ą in vivo  ir ląstelių fenotipo poky čius in vitro , gali būti 
naudojamos žinduoli ų ląstelių kultūrų sistemos. Pla čiai naudojamoms 
ląstelių linijoms priklauso C3H10T  1/2 , 3T3, SHE bei Fischer žiurki ų 
ląstelės ir testai grindžiami l ąstelių morfologijos poky čiais, ligos 
židinio formavimosi bei prisitvirtinimo prie pusiau kieto agaro pokyčių tyrimais. Mažiau naudojamoms sistemoms priklauso tos, 
kurios naudojamos fiziologiniams bei morfologiniams l ąstelių, 
paveiktų kancerogenin ėmis chemin ėmis medžiagomis, poky čiams 
nustatyti. N ė vieno  in vitro , testų metu nebuvo nustatyta mechanis ­
tinio ryšio tarp v ėžio ir ląstelių pokyčiu. Naudojant kai kurias bando ­
mąsias sistemas, galima nustatyti protoonkogen ų promotorius. Įver­
tinant bandomosios medžiagos įtaką ląstelių kultūrų sugebėjimui 
suformuoti kolonijas (klonavimo efektyvumas) arba augimo grei ­ 
čiams, galima nustatyti citotoksiškum ą. Citotoksiškumo įvertinamas 
tam, kad b ūtų nustatyta, jog bandomoji medžiaga, kuria buvo 
veikiama, sukelia toksikologin į poveikį ir kurios negalima naudoti 
visuose bandymuose, apskai čiuojant transformacijos dažn į, kadangi 
šiuo atveju l ą
stelių inkubacij ą ar persėjimą reikėtų pratęsti. 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
Pasiruošimas bandymui  
L ą s t e l ė s 
Priklausomai nuo naudojamo testo transformacijai įvertinti, galima 
naudoti įvairiausias l ąstelių linijas ar pirmines l ąsteles. Tyr ėjas 
privalo užtikrinti, kad bandom ąsias ląsteles paveikus žinomais kance ­
rogenais, šiose pasireiškia atitinkami fenotipiniai poky čiai ir kad 
įrodyta bei dokumentiškai patvirtinta, jog tyr ėjo laboratorijoje varto ­
jamas bandymas yra oficialiai pripaž įstamas ir patikimas.  
T e r p ė 
Atliekant transformacijos bandym ą, reikėtų naudoti atitinkam ą terpę 
bei parinkti atitinkamas eksperimentines s ąlygas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
B a n d o m o j i m e d ž i a g a  
Prieš veikiant l ąsteles, bandomosios medžiagos gali b ūti paruošiamos 
kultivavimui skirtoje terp ėje arba ištirpinamos ar suspenduojamos 
atitinkamomis priemon ėmis. Tirpinan čiosios priemon ės galutin ė 
koncentracija l ąstelių kultūrų sistemoje netur ėtų įtakoti ląstelių gyvy­
bingumo, augimo grei čio ar pasitaikan čios transformacijos.  
M e t a b o l i n ė a k t y v a c i j a  
Ląstelės turėtų būti veikiamos bandom ąja medžiaga, tiek esant, tiek 
ir nesant metabolin ės aktyvacijos sistemos. Kai naudojami l ąstelių, 
pasižymin čių metaboliniu aktyvumu, tipai, tai aktyvumo prigimtis 
turėtų atitikti t ą klasę, kuriai priklauso naudojamas cheminis 
junginys.  
Bandymo s ąlygos  
T e i g i a m ų i r n e i g i a m ų k o n t r o l i ų n a u d o j i m a s  
Kiekvieno eksperimento metu reik ėtų naudoti teigiamas kontroles, 
sudarytas tiek iš tiesiogiai veikian čio junginio, tiek iš junginio, 
kurį reikia metaboliškai aktyvuoti; taipogi reik ėtų naudoti ir 
neigiamas (priemon ė) kontroles.  
Žemiau pateikiamos medžiagos, kurias galima naudoti kaip teigiamas 
kontroles:  
— tiesiogiai veikiantys junginiai:  
— etilmetansulfonatas,  
— β-propiolaktonas,  
— junginiai, kuriuos reikia aktyvuoti metabolitiškai:  
— 2-acetilaminofluorenas,  
— 4-dimetilaminobenzenas,  
— 7,12-dimetilbenzantracenas.  
Jeigu reikia, galima naudoti ir papildom ą teigiamą kontrolę, priklau­
sančią tai pačiai chemini ų junginių klasei kaip ir bandomoji 
medžiaga.  
V e i k i m o k o n c e n t r a c i j o s  
Bandomąją medžiag ą reikėtų vartoti keliomis koncentracijomis. Šios 
koncentracijos tur ėtų sukelti nuo koncentracijos priklausom ą toksinį 
poveikį, esant didžiausiai koncentracijai, l ąstelių išgyvenimas tur ėtų 
sumažėti, tačiau esant mažiausiai koncentracijai, jis tur ėtų būti toks, 
kaip ir neigiamai kontrolei esant terp ėje. Panaudojant atitinkamas 
procedūras turėtų būti bandomi santykinai vandenyje netirp ūs jungi­
niai, kad b ūtų nustatyta j ų tirpumo riba. Pavienio bandymo metu 
turėtų būti nustatyta laisvai vandenyje tirpstan čių netoksini ų junginių 
didžiausia bandomoji koncentracija.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Bandymo eiga  
Ląstelės turėtų būti veikiamos atitinkam ą laiką, priklausomai nuo 
naudojamos bandymo sistemos ir veikimo metu galima pakartotinai veikti su ta pa čia medžiagos doze, pakei čiant terpę (jei būtina, į terpę 
įnešama šviežiai paruošto metabolin ės aktyvacijos mišinio), jei 
veikimo laikas pailginamas. L ąstelės, nepasižymin čios efektyviai 
veikiančia metaboline aktyvacija, tur ėtų būti veikiamos bandom ąja 
medžiaga, esant arba nesant atitinkamai metabolin ės aktyvacijos 
sistemai. Baigiantis veikimui, l ąstelės atplaunamos nuo neprisirišu ­
sios bandomosios medžiagos ir, kai nustatoma transformacija bei pasirodo transformuotas fenotipas, kultivuojamos atitinkamomis s ąly­
gomis. Visi rezultatai patvirtinami, atlikus nepriklausom ą eksperi­
mentą.
 
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti pateikti lentel ėse įvairiausiomis formomis, 
priklausomai nuo atlikto bandymo, pvz., nurodant l ėkštelių skaičių, 
teigiamas l ėkšteles ar transformuot ų ląstelių skaičių. Jeigu reikia, 
išgyvenimas išreiškiamas procentais kontrol ės laipsnio atžvilgiu ir 
transformacijos dažnis išreiškiamas transformuot ų ląstelių, esančių 
išgyvenusi ų ląstelių tarpe, skai čiumi.  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— panaudot ų ląstelių tipas, ląstelių kultūrų skaičius, ląstelių kultūrų 
kultivavimo metodai,  
— bandymo s ąlygos: bandomosios medžiagos koncentracija, panau ­
dota priemon ė, inkubacijos laikas, veikimo trukm ė ir dažnis, 
ląstelių populiacijos tankis veikimo metu, panaudotos egzoge ­
ninės metabolitin ės aktyvacijos sistemos tipas, teigiamos ir 
neigiamos kontrol ės, stebimo l ąstelių fenotipo ypatumai, panau ­
dota atrankos sistema (jei įmanoma), doz ės pasirinkimo kriterijai,  
— gyvų ir transformuot ų ląstelių skaičiaus nustatymo metodas,  
— statistinis įvertinimas,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  GRAUŽIK Ų DOMINANTINIS LETALIŠKUMO BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Dominantiniai letal ūs poveikiai sukelia embriono arba gemalo ž ūtį. 
Veikiant chemine medžiaga, sukeliami dominantiniai letal ūs povei­
kiai, kurie rodo, kad bandomoji medžiaga paveik ė bandomosios 
rūšies gyvūnų embrionų audinius. Apskritai manoma, kad dominan ­
tiniai letal ūs poveikiai pasireiškia d ėl chromosom ų pažeidim ų (struk­
tūrinės anomalijos arba chromosom ų skaičiaus poky čiai). Jei patel ės 
paveikiamos medžiaga, ir j ų embrionai ž ūsta, tai šitai taip pat įvyksta 
dėl toksinių poveikių. 
Apskritai, gyv ūnų patinai paveikiami bandom ąja medžiaga, o v ėliau 
poruojami su nekaltomis patel ėmis, nepaveiktomis bandom ąja 
medžiaga. Poruojant individus paeiliui, tam tikrais laiko tarpais, 
galima atskirai tirti įvairius embrionin ės ląstelės vystymosi etapus. 
Jei, lyginant su kontrolin ės grupės patelių negyvų implantų skai­ 
čiumi, šių implantų skaičius padaug ėja kiekvienoje paveiktos grup ės 
patelėje, tai rodo, kad implantacija nepavyko. Nes ėkmė, atliekant 
išankstinę implantacij ą, gali būti vertinama pagal  corpora lutea  
kiekį arba lyginant absoliut ų implantų bandomos bei kontrolin ės 
grupės patelėse skaičių. Absoliutus dominantinis letalus poveikis 
apima nes ėkmes, atliekant išankstin ę bei vėlesnę implantacijas. 
Absoliutaus dominantinio letalaus poveikio įvertinimas paremtas 
gyvų implantų, esančių bandomos bei kontrolin ės grupės patelėse, 
kiekio palyginimu. Konkre čiais laiko intervalais d ėl ląstelių (tokių 
kaip spermatocit ų ir (ar) spermatogonij ų) žūties gali sumaž ėti 
implantų skaičius. 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
Pasiruošimas bandymui  
Jei įmanoma, bandomosios medžiagos tur ėtų būti ištirpintos ar 
suspenduotos izotoniniame drusk ų tirpale. Vandenyje netirpios 
cheminės medžiagos turi b ūti ištirpintos ar suspenduotos, panaudojus 
atitinkamus nešiklius. Naudojamas nešiklis neturi interferuoti su bandomąja chemine medžiaga ir neturi b ūti toksiškas. Reik ėtų 
naudoti šviežiai paruoštus bandomosios chemin ės medžiagos prepa ­
ratus.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Bandymo s ąlygos  
D a v i m o b ū d a s  
Paprastai bandomasis junginys tur ėtų būti duodamas vien ąkart. 
Remiantis toksikologine informacija, veikim ą galima pakartoti. 
Paprastai bandomoji medžiaga duodama per į trachėją įvedamą 
vamzdelį arba injekuojant bandom ąją medžiag ą į pilvą. Medžiag ą 
galima duoti ir kitais b ūdais. 
E k s p e r i m e n t i n i a i g y v ū n a i 
Rekomenduojama tirti žiurkes arba peles. Sveiki visiškai lytiškai 
subrendę gyvūnai atsitiktinai pasirenkami ir suskirstomi į bandomąją 
bei kontrolines grupes.  
S k a i č i u s i r l y t i s  
Atsižvelgiant į vertinam ų biologini ų savybių spontanines variacijas, 
reikėtų naudoti pakankam ą skaičių patinų, paveikt ų bandom ąja 
medžiaga. Skai čius turėtų būti pasirenkamas remiantis iš anksto 
nustatytu aptikimo jautrumu bei gaunam ų duomenų svarba. Pavyz ­
džiui, atliekant tipin į testą, patinų, priklausan čių grupėms, kurių kiek­
vienai duodama skirtinga doz ė, turi būti tiek, kad vieno poravimosi 
periodo metu b ūtų apvaisinta 30–50 pateli ų. 
T e i g i a m ų i r n e i g i a m ų k o n t r o l i n i ų b a n d i n i ų 
n a u d o j i m a s  
Atliekant kiekvien ą eksperiment ą, paprastai vienu metu reik ėtų 
naudoti teigim ą bei neigiam ą (nešiklio) kontrolinius bandinius. Kai 
galima susipažinti su toje pa čioje laboratorijoje k ą tik atlikt ų ekspe­
rimentų, naudojant teigiam ą kontrolin į bandinį, gautais patenkina ­
mais rezultatais, tai šiuos rezultatus galima naudoti vietoj teigiamos 
kontrolės, naudojamos tuo pa čiu metu. Teigiamos kontrolin ės 
medžiagos tur ėtų būti naudojamos atitinkamomis mažomis doz ėmis 
(pvz., MMS, injekuojamos į pilvą, dozė turi siekti 10 mg/kg) siekiant 
įrodyti bandymo metodo jautrum ą. 
V e i k i m o d o z ė 
Reikėtų naudoti tris veikimo dozes. Didel ė dozė turėtų sukelti toksiš ­
kumo požymius arba sumažinti gyv ūnų, paveikt ų bandom ąja 
medžiaga, vaisingum ą. Konkre čiais atvejais užtenka ir pavien ės 
didelės dozės. 
R i b i n i s b a n d y m a s  
Duodant netoksines bandom ąsias medžiagas vien ąkart, jų koncentra ­
cija turi siekti 5 g/kg, o duodant pakartotinai – 1 g/kg/dien ą. 
Bandymo eiga  
Bandomąsias medžiagas galima duoti įvairiai. Dažniausiai bandomoji 
medžiaga duodama vien ąkart. 
Pasibaigus veikimui, atitinkamais laiko tarpais pavieniai patinai paei ­
liui poruojami su bandom ąja medžiaga nepaveiktomis n ė karto nesi ­
poravusiomis patel ėmis. Patel ės paliekamos su patinais laiko tarpui, 
lygiam vienai rujai arba tol, kol jie susiporuos, o tai nustatoma pagal 
spermos patekim ą į makštį arba pagal makšties kamš čio susidarym ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Pasibaigus veikimui, atliekama tiek poravim ų, kiek yra numatyta 
veikimo tvarkaraštyje bei tur ėtų būti užtikrinta, kad pasibaigus 
veikimui, m ėginiai paimami atskirais embrionin ės ląstelės vystymosi 
etapais.  
Patelės numarinamos pra ėjus pusei gestacijos periodo ir gimdos 
turinys ištiriamas tam, kad b ūtų nustatytas gyv ų bei žuvusi ų implantų 
skaičius. Reikia ištirti kiaušides, kad b ūtų nustatytas  corpora lutea  
skaičius. 
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti pateikiami lentel ėse, nurodant patin ų ir 
vaikingų bei nevaiking ų patelių skaičių. Reikėtų atskirai registruoti 
kiekvieno suporavimo rezultatus, nurodant kiekvieno patino ir 
patelės tapatybę. Taipogi kiekvienos patel ės atveju reik ėtų registruoti 
suporavimo savait ę, patinų gautą dozę, gyvų bei negyv ų implantų 
egzistavimo dažn į. 
Absoliutus dominantini ų letalių poveikių skaičius nustatomas, lygi ­
nant gyvų implantų skaičių bandomosios bei kontrolin ės grupės pate­
lėse. Bandomosios grup ės patelių gyvų bei negyv ų implantų skai­ 
čiaus santykis palyginamas su tokiu pa čiu kontrolin ės grupės 
implantų skaičiaus santykiu siekiant nustatyti, ar implantacija nepa ­
vyko.  
Jei tarp pateikiam ų duomenų nurodomos ankstyvosios bei v ėlyvosios 
žūtys, tai šitai turi b ūti aiškiai parodyta lentel ėse. Jeigu nustatoma, 
kad išankstin ė implantacija nepavyko, tai ji turi b ūti užregistruota. Ar 
išankstinė implantacija pavyko ar ne, sprendžiama, lyginant pagal  
corpora lutea  ir implant ų skaičiaus skirtumus arba pagal vidutinio 
implantų gimdoje skai čiaus sumaž ėjimą bandomojoje grup ėje, lygi­
nant su poravimais kontrolin ėje grupėje. 
Rezultatai tur ėtų būti įvertinti atitinkamais statistiniais metodais.  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— rūšis, atmaina, panaudot ų gyvūnų amžius bei svoris, eksperimen ­
tinėje bei kontrolin ėse grupėse esančių kiekvienos lyties gyv ūnų 
skaičius, 
— bandomoji medžiaga, priemon ė, dozės, ir dozi ų pasirinkimo 
kriterijai, neigiamos ir teigiamos kontrol ės, toksiškumo 
duomenys,  
— davimo b ūdas ir veikimo tvarkaraštis,  
— suporavimo tvarkaraš čiai, 
— metodas, kuriuo nustatoma, kad suporavimas įvyko,  
— numarinimo laikas,  
— dominantini ų letalių mutacijų įvertinimo kriterijai,  
— dozės ir atsako s ąsaja, jei įmanoma,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— statistinis įvertinimas,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  ŽINDUOLI Ų SPERMATOGONIJ Ų CHROMOSOM Ų 
ABERACIJOS BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 483 – Žinduoli ų spermatogonij ų 
chromosom ų aberacijos bandym ą (1997).  
1.1. ĮVADAS  
Žinduolių spermatogonij ų chromosom ų aberacijos bandymo  in vivo  
tikslas – identifikuoti medžiagas, sukelian čias žinduoli ų spermatogo ­
nijų chromosom ų struktūrines aberacijas (1) (2) (3) (4) (5). Strukt ū­
rinės aberacijos gali b ūti 2 tipų: chromosomin ės ir chromatidin ės. 
Dauguma mutagen ų sukelia chromosomines mutacijas, ta čiau pasi­
taiko ir chromatidini ų aberacijų. Šis metodas n ėra skirtas chromo ­
somų skaičiaus rinkinyje poky čiams įvertinti ir šiam tikslui min ėtasis 
metodas paprastai n ėra naudojamas. Chromosom ų mutacijos bei su 
jomis susij ę įvykiai sukelia daug genetini ų ligų žmonių tarpe.  
Šio bandymo metu nustatomi spermatogenini ų gemalini ų ląstelių 
chromosom ų pokyčiai, kuriais remiantis prognozuojama apie pavel ­
dimų mutacijų atsiradim ą gemalinėse ląstelėse. 
Atliekant š į bandymą paprastai panaudojami graužikai. Šio citogene ­
tinio bandymo metu  in vivo  nustatomos chromosominio tipo abera ­
cijos, atsirandan čios spermatogonij ų mitozin ėse chromosomose. 
Kitos ląstelės nėra naudojamos šiam bandymui atlikti.  
Tam, kad spermatogonijose b ūtų identifikuotos chromatidin ės abera­
cijos, tiriama l ąstelių pirmoji mitoz ė, vykstanti iškart po to, kai 
ląstelės buvo paveiktos bandom ąja medžiaga tam, kad, l ąstelėms 
dalijantis, šie pakitimai neb ūtų prarandami. Papildom ą informacij ą 
apie bandom ąja medžiaga paveiktas spermatogonij ų kamienines 
ląsteles galima gauti, analizuojant mejozines chromosomas bei 
ieškant chromosomini ų aberacijų ląstelių, esančių I diakinez ės meta­
fazės stadijoje, kai šios, paveiktos bandom ąja medžiaga, tampa sper ­
matocitais, chromosomose.  
Šio bandymo, atliekamo  in vivo  sąlygomis, metu siekiama nustatyti, 
ar somatini ų ląstelių mutacijas sukeliantys mutagenai gali jas sukelti 
ir gemalin ėse ląstelėse. Be to, spermatogonij ų bandymas yra svarbus, 
įvertinant mutagen ų padarytą žalą, pagal kuri ą sprendžiama apie 
faktorių, reguliuojan čių metabolizm ą, farmakokinetik ą bei DNR 
pažaidų atstatymo procesus, reikšm ę. 
Sėklidėse yra daug skirtingoms generacijoms priklausan čių sperma­
togonijų, kurios tarpusavyje skiriasi pagal jautrum ą chemini ų 
medžiagų poveikiui. Tod ėl identifikuotos aberacijos parodo sperma ­
togonijų populiacij ų, kurių pagrindin ę dalį sudaro daug diferenci ­
juotų spermatogonij ų, paveikt ų bandom ąja medžiaga, bendr ąjį 
atsaką. Priklausomai nuo j ų lokalizacijos s ėklidėse, skirting ų genera­
cijų spermatogonijos gali arba patekti arba nepatekti į bendrąją cirku­
liaciją, nes egzistuoja fizinis ir fiziologinis (Sertoli l ąstelių bei kraujo 
ir sėklidžių) barjerai.  
Jeigu nustatoma, kad bandomoji medžiaga arba reaktyvusis metabo ­
litas nepasiekia audinio, į kurį buvo nukreiptas, tai šio bandymo 
metu jis daugiau nebenaudojamas.  
Taip pat žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Chromatidin ė aberacija  – strukt ūrinis chromosomos pakenkimas, 
pasireiškiantis kaip pavieni ų chromatidži ų suardymas arba kaip chro ­
matidžių suardymas ir susijungimas.  
Chromotidin ė aberacija  – strukt ūrinis chromosomos pakenkimas, 
pasireiškiantis kaip abiej ų seserinių chromatidži ų trūkis arba kaip 
jų abiejų trūkis ir susijungimas toje pa čioje vietoje.  
Plyšys  – achromatin ė, mažesnė nei vienos chromatid ės plotis, spraga, 
kurioje yra mažiausias skai čius klaidingai suporuot ų bazių. 
Chromosom ų skaičiaus aberacija  – ląstelėse esančių chromosom ų 
skaičiaus pokytis, palyginus su normaliu naudojam ų ląstelių skai­ 
čiumi.  
Poliploidiškumas  – haploidinio chromosom ų skaičiaus (n), išskyrus 
diploidinį skaičių (t. y. 3 n, 4n ir t. t.), kartotinis.  
Struktūrinė aberacija  – chromosomos strukt ūros pokytis, kur į 
galima nustatyti dalijimosi ciklo metafaz ėje esančias ląsteles tiriant 
mikroskopu; jis pasireiškia kaip delecijos ir fragmentai, poky čiai 
grandinių viduje ar tarp grandini ų. 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Gyvūnai veikiami bandom ąja chemine medžiaga pagal atitinkam ą 
veikimo chemine medžiaga metodik ą ir atitinkamais laiko momentais 
po veikimo numarinami. Prieš numarinim ą gyvūnai paveikiami 
medžiaga, sustabdan čia ląstelių dalijimąsi metafaz ėje (pavyzdžiui, 
kolchicinu arba Kolcemidu®). Iš gemalini ų ląstelių išskiriamos chro ­
mosomos, jos dažomos ir metafaz ėje esančios ląstelės tiriamos 
mikroskopu, kad b ūtų nustatytos chromosom ų aberacijos.  
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Paruošimas  
1.4.1.1.  Gyvūnų rūšies pasirinkimas  
Paprastai naudojami kiniško žiurk ėno ir peli ų patinėliai. Tačiau gali 
būti naudojami ir kit ų atitinkam ų žinduoli ų rūšių patinai. Reikia 
naudoti visuotinai naudojam ų laboratorini ų atmainų jaunus sveikus 
subrendusius gyv ūnus. Bandymo pradžioje gyv ūnų svorio variacija 
turi būti minimali ir neviršyti ± 20 % vidutinio svorio.  
1.4.1.2.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Taikomos Bendrojo įvado B dalyje nurodytos s ąlygos, nors stengia ­
masi, kad dr ėgmė siektų 50–60 %.  
1.4.1.3.  Gyvūnų paruošimas  
Sveiki jauni subrend ę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolin ę 
bei bandom ąją (kuriai priskirti individai bus veikiami chemine 
medžiaga) grupes. Narvai pastatomi taip, kad b ūtų kuo labiau suma ­ 
žintas aplinkos poveikis, susij ęs su narv ų išdėstymu. Kiekvienas 
gyvūnas turi savo identifikacijos ženkl ą. Prieš pradedant bandym ą, 
gyvūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorini ų sąlygų mažiau­
siai per 5 dienas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Dozi ų paruošimas  
Kietosios bandomosios chemin ės medžiagos ištirpinamos arba 
suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose ir jei reikia, tai, prieš paruošiant j ų dozes, skirtas gyv ūnams, jos praskiedžiamos. 
Skystųjų bandom ųjų medžiag ų dozės ruošiamos iškart arba prieš 
dozių paruošim ą, jos praskiedžiamos. Prieš kiekvien ą bandymą švie­ 
žiai paruošiami bandomosios chemin ės preparatai ir neatsižvelgiama 
į stabilumo tyrimo metu gautus duomenis, rodan čius, kad medžiaga 
atitinka jos laikymui keliamus reikalavimus.
 
1.4.2.  Bandymo s ąlygos  
1.4.2.1.  Tirpiklis/nešiklis  
Naudojamos tirpiklio ar nešiklio doz ės neturėtų sukelti jokio toksinio 
poveikio ir netur ėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su 
bandomąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti mažiau žinomi tirpikliai/ ­
nešikliai, prieš pradedant juos naudoti, reikia pateikti j ų tinkamum ą 
įrodančius duomenis. Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduo ­
jama naudoti vandenin į tirpiklį arba nešikl į. 
1.4.2.2.  Kontroliniai m ėginiai  
Kiekvieno bandymo metu turi b ūti tiriami iš kiekvienai ly čiai 
priklausan čių gyvūnų paimti vienu metu naudojami teigiami ir 
neigiami (tirpiklis/nešiklis) kontroliniai m ėginiai. Išskyrus veikim ą 
bandomąja medžiaga, kontrolin ės grupės gyvūnai turi b ūti laikomi 
tomis pa čiomis sąlygomis kaip ir gyv ūnai, paveikti bandom ąja 
chemine medžiaga (bandomoji grup ė). 
Spermatogonini ų ląstelių, paveikt ų tokia pa čia bandomosios 
cheminės medžiagos doze  in vivo , teigiamuose kontroliniuose m ėgi­
niuose turi b ūti nustatomos strukt ūrinės aberacijos, kurios, kaip tiki ­
masi, užgoš lengvai nustatom ą pašalinį foną. 
Pasirenkamos tokios teigiamos kontrolin ės dozės, kad gaunami 
poveikiai b ūtų ryškūs, bet kad tyr ėjas ne iškart dešifruot ų užkoduotus 
objektinius stiklelius. Priimtina, kad teigiami kontroliniai m ėginiai 
būtų duodami gyv ūnams kitaip nei bandomoji medžiaga bei b ūtų 
tik vieną kartą paimami. Jeigu yra įmanoma, tai galima pasvarstyti 
apie konkre čiai klasei priklausan čių medžiagų, kaip teigiam ų kontro­
linių mėginių, panaudojim ą. Žemiau pateikiami tokie teigiam ų kont­
rolinių cheminių medžiag ų pavyzdžiai:  
Medžiaga  CAS Nr.  Einecs Nr.  
ciklofosfamidas 
ciklofosfamido monohidratas  50–18–0 
6055–19–2  200–015–4  
cikloheksilaminas  108–91–8  203–629–0  
mitomicinas C  50–07–7  200–008–6  
Monomerinis akrilamidas  79–06–1  201–173–7  
Trietilenmelaminas  51–18–3  200–083–5  
Neigiami kontroliniai m ėginiai, paveikti arba tirpikliu ar tik nešikliu, 
arba paveikti taip pat kaip ir bandomosios grup ės, turi būti kiekvien ą 
kartą paimami, nekreipiant d ėmesio į anksčiau atliktų bandymų metu 
gautus kontrolinius duomenis, rodan čius, kad variacijos laipsnis tarp 
gyvūnų ir ląstelių, kuriose stebimos chromosom ų aberacijos yra 
priimtini. Jei neigiami kontroliniai m ėginiai paimami tik vien ą 
kartą, tai pirmojo pa ėmimo laikas yra pats priimtiniausias. Be to, 
reikia papildomai panaudoti bandom ąja medžiaga neveiktus kontro ­
linius mėginius, nekreipiant d ėmesio į anksčiau atliktų bandymų bei 
publikuotus duomenis, rodan čius, kad pasirinktas tirpiklis ar nešiklis 
nesukėlė jokių žalingų ar mutagenini ų poveikių. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. BANDYMO ATLIKIMO METODIKA  
1.5.1.  Gyv ūnų skaičius 
Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolin ėje grupėse turi būti mažiausiai 
5 bandomieji patin ėliai. 
1.5.2.  Veikimo tvarkaraštis  
Bandomosiomis medžiagomis geriausia veikti vien ąkart arba dukart 
(pavienis veikimas arba 2 veikimai). Bandomosiomis medžiagomis galima veikti taikant vadinam ąją išskaidyt ą dozę, kai tą pačią dieną 
atliekami du veikimai bandom ąja medžiaga ir j ų atlikimo laikas 
skiriasi ne daugiau kaip keletu valand ų tam, kad b ūtų suteiktas 
pakankamai didelis bandomosios medžiagos t ūris. Kita dozavimo 
tvarka turi b ūti moksliškai pagrindžiama.
 
Kai gyvūnų grupei duodama didžiausia koncentracija, tai, pasibaigus 
veikimui, m ėginiai paimami 2 kartus. Kadangi bandomoji medžiaga 
gali turėti įtakos ląstelės ciklo kinetikai, tai, pasibaigus veikimui, 
mėginiai paimami kuo anks čiau ir kuo v ėliau 24–48 valand ų laiko­
tarpiu. Kai bandomos kitos (ne didžiausios) doz ės, tai pasibaigus 
veikimui, m ėginiai paimami 24 valand ų (arba 1,5 l ąstelės ciklo 
trukmės) laikotarpiu, nebent yra žinomas kitas m ėginių paėmimo 
laikas, kuris yra tinkamesnis, tiriant poveikius (6).  
Be to, m ėginius galima paimti ir kitu metu. Pavyzdžiui, tiriant 
chemines medžiagas, sukelian čias chromosom ų pertraukimus arba 
galinčias turėti įtakos nuo S nepriklausantiems efektams, m ėginius 
galima paimti ir kitu tinkamu metu (1).  
Pakartotinio veikimo tvarkaraš čio tinkamumas turi b ūti nustatomas 
kiekvienu atveju. Pagal pakartotinio veikimo tvarkarašt į, gyvūnai 
numarinami 24 valand ų laikotarpiu (1,5 l ąstelės ciklo trukm ės) po 
paskutinio veikimo. Jeigu reikia, tai m ėginiai yra papildomai 
paimami atitinkamu metu.  
Prieš numarinim ą, gyvūnams į pilvo pl ėvę suleidžiama atitinkama 
dozė metafazę sustabdan čios medžiagos (pavyzdžiui, Kolcemido® 
ar kolchicino). Po atitinkamo intervalo iš gyv ūnų paimami m ėginiai, 
pelių atveju tai atliekama po 3–5 valand ų, kiniškų žiurkėnų atveju tai 
atliekama po 4–5 valand ų. 
1.5.3.  Doz ės dydis  
Jeigu atliekamas intervalo, apie kur į nėra duomen ų, paieškos 
bandymas, tai jis turi b ūti atliekamas to pa čioje laboratorijoje, naudo ­
jant tos pa čios rūšies, kamieno ir lyties gyv ūnus bei veikiant juos 
bandomąja chemine medžiaga pagal t ą patį tvarkarašt į, kuris buvo 
naudojamas pagrindinio bandymo metu (7). Jeigu nustatomas toksiš ­
kumas, tai pirm ąkart imant m ėginius, naudojami 3 dozi ų lygiai. Šie 
dozių lygiai turi apimti vis ą intervalą, pradedant nuo maksimumo ir 
baigiant minimumu arba tokia doze, kuri visiškai n ėra toksiška. 
Vėlesniu m ėginių paėmimo metu naudojama tik pati didžiausia 
dozė. Didžiausia doze vadinama tokia doz ė, kuriai esant, išryšk ėja 
toksiškumo, priklausomo nuo doz ės požymiai, tokie, kurie pasirodo, 
kai naudojant tok į pat dozavimo tvarkarašt į, suleidžiama didžiausia 
dozė ir spėjama, kad ji bus mirtina.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Medžiagos pasižymin čios specifiniu biologiniu aktyvumu, kai j ų 
dozės būna mažos ir netoksiškos (pavyzdžiui tokios kaip hormonai 
ir mitogenai) gali b ūti laikomos išimtimi, kai joms taikomi doz ę 
nustatantys kriterijai ir tada jos bandomos kiekvienu atveju. Didžiausia doze vadinama tokia doz ė, kuriai esant, spermatogonijose 
pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyzdžiui, I ir II mejo ­
zinės metafaz ės metu spermatogonij ų mitozių santykis sumaž ėja; šis 
sumažėjimas neviršija 50 %).
 
1.5.4.  Ribinis bandymas  
Jeigu bandymas atliekamas esant vienam doz ės lygiui, kuris, per 
vieną dieną atliekant pavien į arba du poveikius bandom ąja medžiaga, 
mažiausiai sudaro 2 000 mg/kg k ūno masės/dieną ir jei nepastebima 
jokių toksinių poveikių bei, remiantis strukt ūriškai panaši ų cheminių 
medžiagų bandymų duomenimis, nebus tikimasi užregistruoti geno ­
toksiškumo, tai tada laikomasi nuostatos, kad yra tikslinga atlikti vis ą 
bandymą panaudojant 3 dozi ų lygmenis. Numatomas bandomosios 
medžiagos poveikis žmogui gali parodyti, kad, atliekant rib ų 
paieškos bandym ą reikia naudoti aukštesn į dozės lygį. 
1.5.5.  Dozavimas  
Bandomoji medžiaga yra paprastai duodama, priverstinai maitinant 
per vamzdel į, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kaniul ę per vamz ­
delį arba injekcij ą į pilvą. Bandom ąją medžiagą galima įvesti ir kitais 
būdais, jei jie yra pagrindžiami. Maksimalus skys čio, priverstinai 
duodamo per vamzdel į arba injekuojamo į pilvą vienu metu, t ūris 
priklauso nuo bandomojo gyv ūno dydžio. T ūris neturi viršyti 2 
ml/100 g k ūno masės. Didesni ų nei šitų tūrių davimas turi b ūti 
pagrindžiamas. Išskyrus dirginan čias ar ėsdinančias medžiagas, 
kurios, b ūdamos didesn ėmis koncentracijomis, sukelia žalingus 
poveikius, bandomosios medžiagos t ūrio kitimas turi b ūti sumaži ­
namas iki minimumo, koncentracij ą taip sureguliuojant, kad esant 
visiems dozi ų lygiams, t ūris būtų pastovus.  
1.5.6.  Chromosom ų paruošimas  
Iškart po numarinimo, iš gyv ūnų išimami kaul ų čiulpai, pamerkiami į 
hipotonin į tirpalą ir fiksuojami. V ėliau kaulų čiulpų ląstelės išsklai­
domos ant objektini ų stiklelių ir nudažomos.  
1.5.7.  Analiz ė 
Išanalizuojama mažiausiai 100 vieno gyv ūno ląstelių (mažiausiai 500 
vienos grup ės metafazi ų). Šis skai čius gali b ūti sumažinamas, jei 
stebima daug chromosom ų aberacij ų. Visi tepin ėliai (įskaitant 
teigiamus ir neigiamus kontrolinius m ėginius) turi b ūti užkoduojami 
nepriklausomai vienas nuo kito tam, kad b ūtų galima juos ištirti 
mikroskopu. Kadangi dažnai ruošiant objektinius stiklelius, suardoma 
metafazėje esančios ląstelės bei prarandamos chromosomos, tai 
vėliau suskai čiuotos ląstelės turi tur ėti tokį centromer ų skaičių, 
kuris būtų lygus 2 n ± 2.  
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Kiekvieno gyv ūno bandymo rezultatai turi b ūti pateikiami lentel ėse. 
Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Turi b ūti nustatytas kiekvieno 
gyvūno ląstelių, turinčių struktūrines aberacijas ir chromosom ų 
aberacijų vienoje l ąstelėje skaičius. Turi b ūti išvardinti skirtingi chro ­
mosomų struktūrinių aberacijų tipai, nurodant j ų skaičių bei pasireiš ­
kimo dažn į gyvūnų, paveikt ų ir nepaveikt ų bandom ąja chemine 
medžiaga, grup ėse. Atskirai registruojama bei pranešama apie plyši ų 
pasireiškim ą, tačiau bendru atveju jie ne įskaitomi, kai nustatomas 
absoliutinis aberacij ų pasireiškimo dažnis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Jei stebima tiek mitoz ė, tiek ir mejoz ė, tai turi b ūti nustatytas sper ­
matogonij ų mitozių I ir II mejozin ės metafaz ės metu santykis, naudo ­
jamas kaip citotoksiškumo matas paimant bendr ą mėginį (turintį 100 
vieno gyv ūno ląstelių) iš visų tirtų bei neigiam ų kontrolini ų gyvūnų 
tam, kad b ūtų nustatytas galimas citotoksinis poveikis. Jeigu stebima 
tik mitoz ė, tai kiekvieno gyv ūno atveju, imant mažiausiai 1 000 
ląstelių, nustatomas j ų mitozinis indeksas.  
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Teigiamą rezultatą galima įvertinti keletu kriterij ų, tokiais kaip nuo 
dozės priklausomas l ąstelių su chromosomin ėmis aberacijomis skai ­ 
čiaus padid ėjimas arba akivaizdus l ąstelių, turinčių aberacijas ir 
priklausan čių pavienės dozės grupei pagal vienkartin į mėginio 
paėmimo laik ą, skaičiaus padid ėjimas. Pirmiausia reikia aptarti biolo ­
ginę rezultatų reikšmę. Įvertinant bandymo metu gautus rezultatus, 
galima pasinaudoti statistiniais metodais (8). Statistinis reikšmin ­
gumas tur ėtų būti vienintelis faktorius, apsprendžiantis teigiam ą 
atsaką. Abejotini rezultatai tur ėtų būti išaiškinti, toliau t ęsiant 
bandymą ir pirmiausia pakei čiant eksperimentines s ąlygas.  
Jei tiriant medžiag ą, gaunami rezultatai, neatitinkantys aukš čiau 
išvardintų kriterijų, ši bandomoji medžiaga laikoma nemutageniška.  
Nors daugumos eksperiment ų metu buvo gauti aiškiai teigiami ar 
neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gaut ų rezultatų rinkinys neleis 
padaryti teisingos išvados apie bandomosios medžiagos aktyvum ą. 
Rezultatai gali likti abejotini ar neaišk ūs, nepriklausomai nuo atlikt ų 
eksperiment ų skaičiaus. 
Tiriant chromosom ų aberacijas  in vitro , gauti teigiami rezultatai 
rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia chromosom ų aberacijas tirtos 
gyvūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. Neigiami rezultatai rodo, esant 
bandymo s ąlygoms, bandomoji medžiaga nesukelia chromosom ų 
aberacijų tirtos gyv ūnų rūšies kaulų čiulpų ląstelėse. 
Reikia aptarti t ą galimybę, ar bandomoji medžiaga ar jos metabolitai 
pasieks bendr ąją cirkuliacij ą ar specifiniu b ūdu tą audinį, į kurį jie 
yra nukreipti (pavyzdžiui, sisteminio toksiškumo atveju).  
3. ATASKAITA  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikiama tokia informacija:  
Tirpiklis/nešiklis įrenginys:  
— priežastys, d ėl kurių buvo pasirinktas šis nešiklis,  
— bandomosios chemin ės medžiagos, esan čios tirpiklyje/nešiklyje 
įrenginyje, tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— panaudota r ūšis ar kamienas,  
— gyvūnų skaičius ir amžius,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, maitinimas ir pan.,  
— kiekvieno gyv ūno svoris prieš pradedant bandym ą ir kiekvienos 
grupės svorio riba, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Bandymo s ąlygos:  
— ribų paieškos bandymo, jei jis buvo vykdomas, duomenys,  
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi doz ės dydžio pasirinkim ą 
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi davimo b ūdo pasirinkim ą 
— bandomosios medžiagos paruošimo apib ūdinimas,  
— bandomosios medžiagos davimo b ūdo apibūdinimas,  
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi numarinimo laiko pasirinkim ą 
— bandomosios chemin ės medžiagos, esan čios pašaruose ir geria ­
majame vandenyje, koncentracijos (ppm) pervertimas į tikrąją 
dozę (mg/kg k ūno masės/dienai), jei tai įmanoma,  
— duomenys apie pašar ų ir geriamojo vandens kokyb ę, 
— veikimo bandom ąja medžiaga ir m ėginio paėmimo tvarkaraš čio 
išsamus aprašymas,  
— metodai toksiškumui įvertinti,  
— metafaz ę sustabdan čios medžiagos prigimtis, jos koncentracija 
bei veikimo ja trukm ė, 
— objektini ų stiklelių paruošimo metodai,  
— aberacij ų įvertinimo kriterijai,  
— ląstelių, kurios buvo išskirtos iš vieno gyv ūno bei išanalizuotos, 
skaičius, 
— teigiam ų, neigiam ų ar abejotin ų rezultatų nustatymo kriterijai.  
Rezultatai:  
— toksiškumo požymiai,  
— mitozinis indeksas,  
— I ir II mejozin ėse metafaz ėse esančių ląstelių spermatogonini ų 
mitozių santykis,  
— kiekvieno gyv ūno ląstelių chromosom ų aberacijų tipas ir skai ­ 
čius, 
— absoliutus aberacij ų vienoje grup ėje skaičius, 
— vienos grup ės ląstelių, turinčių aberacijas, skai čius, 
— dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,  
— statistin ės analizės, jei bet kokios buvo atliktos,  
— duomenys apie vienu metu naudotas neigiamas kontroles,  
— anksčiau gauti duomenys apie neigiamus kontrolinius m ėginius, 
nurodant intervalus, vidurkius bei standartinius nukrypimus,  
— duomenys apie vienu metu naudotus teigiamus kontrolinius 
mėginius,  
— ploidiškumo pasikeitimai, jei buvo tokie stebimi.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. NUORODOS  
1) Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Speci ­
fications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, 
Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, 
Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, p. 477–484.
 
2) Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutage ­
nicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. 
Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, p. 275–306.  
3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air-Drying 
Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cyto ­
genetics and Cell Genetics, 3, p. 289–294.  
4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and 
Henderson, L (1990).  In Vivo  Cytogenetic Assays, In: D.J. 
Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for 
Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 115–141.
 
5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Muta ­
tion Res., 52, p. 207–209.  
6) Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., 
Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. 
Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ 
Cell Tests. Mutation Res., 312, p. 313–318.
 
7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society 
Working group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, p. 313–319.
 
8) Loveli, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, 
G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytogenetic Assays 
In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity 
Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
p. 184–232.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  PELI Ų TAŠKINIS BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Šis bandymas atliekamas naudojant peles, kuriose besivystantys 
embrionai yra veikiami chemin ėmis medžiagomis. Šios medžiagos 
veikia besivystan čių embrionų ląsteles -melanoblastus, kuriuose loka ­
lizuoti genai, kontroliuojantys kailio plauk ų spalvą. Besivystantys 
embrionai yra heterozigotiški pagal daugel į genų, apsprendžian čių 
kailio spalv ą. Įvykus mutacijai melanoblasto tokio geno dominanti ­
niame alelyje arba š į alelį praradus (d ėl daugelio genetini ų įvykių), iš 
melanoblasto atsirandan čios ląstelės palikuon ės įgyja recesyv ų feno­
tipą ir dėl to pelių palikuoni ų kailyje atsiranda skirtingos spalvos 
taškai. Nustatomas palikuoni ų, turinčių tokius taškus, bei juos suke ­
liančių skaičius bei mutacij ų dažnis ir palyginama su palikuoni ų, 
kilusių iš embrion ų tik tirpikliu, tašk ų bei juos suk ėlusių mutacijų 
skaičiumi ir dažniu. Peli ų taškinio bandymo metu nustatomos 
spėjamos gemalini ų ląstelių somatinės mutacijos.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
Pasiruošimas bandymui  
Jei įmanoma, bandomosios medžiagos tur ėtų būti ištirpintos ar 
suspenduotos izotoniniame drusk ų tirpale. Vandenyje netirpios 
cheminės medžiagos turi b ūti ištirpintos ar suspenduotos panaudojus 
atitinkamas priemones. Naudojama priemon ė neturi trukdyti nei 
bandomajai cheminei medžiagai veikti, nei toksiniams poveikiams pasireikšti. Reik ėtų naudoti šviežiai paruoštus bandomosios chemin ės 
medžiagos preparatus.
 
E k s p e r i m e n t i n i a i g y v ū n a i 
T kamieno ( nonagouti , a/a; šinšilos, rožini ų akių, c ch p/c ch p; rudos, 
b/b; atmieštos spalvos, trump ų ausų, d se/d se; margas taškuotumas, 
s/s) pelės yra poruojamos arba su HT kamieno (blyškios,  nonagouti , 
trumpų kojų, pa a bp/pa a bp; labai tankaus kailio ln fz/ln fz; perl ų 
spalvos pe/pe) arba su C57 BL ( nonagouti , a/a) pel ėmis. Taip pat 
galima poruoti kamien ų NMRI ( nonagouti , a/a; albinosai, c/c) ir 
DBA ( nonagouti , a/a; rudos, b/b; atmieštos spalvos d/d) peles tam, 
kad jų palikuonys tur ėtų nonagouti  tipo mutacij ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
S k a i č i u s i r l y t i s  
Pakankamai vaiking ų patelių veikiamos bandom ąja medžiaga, kad 
kiekvieną dozę gavusios patel ės atsivest ų reikiamą gyvų palikuoni ų 
skaičių. Paimant atitinkamo dydžio m ėginį, atsižvelgiama į pelių, 
paveiktų bandomąja medžiaga, taškuotum ą bei kontrolini ų duomenų 
gausą. Neigiamas rezultatas laikomas priimtinu, jei buvo įvertinta 
mažiausiai 300 palikuoni ų, kuriuos atsived ė patelės, paveiktos 
bandomąja medžiaga.  
T e i g i a m ų i r n e i g i a m ų k o n t r o l i ų n a u d o j i m a s  
Turi būti gaunami kontroliniai duomenys, vienu metu ištyrus peles, 
paveiktas tik nešikliu (neigiamomis kontrol ėmis). Anks čiau toje 
pačioje laboratorijoje atlikt ų bandym ų kontroliniai duomenys irgi 
gali būti surenkami, kad b ūtų užtikrintas duomen ų vientisumas ir 
padidėtų bandymo jautrumas. Jei buvo nustatyta, kad bandomoji 
cheminė medžiaga n ėra mutageniška, toje pa čioje laboratorijoje turi 
būti atliekamas bandymas su mutageniška bandom ąja medžiaga ir 
gaunami teigiam ų kontrolių bandymo duomenys.  
D a v i m o b ū d a s  
Paprastai bandomoji medžiaga duodama vaikingoms patel ėms per 
vamzdelį, įvestą į trachėją arba atliekant injekcij ą į pilvą. 
V e i k i m o d o z ė 
Naudojamos trys veikimo doz ės, iš kuri ų viena sukelia toksiškumo 
požymius arba sumažina vados dyd į. Naudojant netoksines chemines 
medžiagas, reik ėtų duoti pa čią didžiausi ą dozę, kuri praktiškai 
įmanoma.  
Bandymo eiga  
Pavienis veikimas bandom ąja medžiaga įprastai atliekamas 8, 9 ar 10 
gestacijos dien ą, skaičiuojant nuo 1 dienos, kuri laikoma ta diena, kai 
makšties kamštis buvo pasteb ėtas pirmąsyk. Šios dienos atitinka 
7,25, 8,25 ir 9,25 dienas, pra ėjusias nuo apvaisinimo. Tomis 
dienomis galima s ėkmingai atlikti veikimus bandomosiomis medžia ­
gomis.  
A n a l i z ė 
Palikuonys yra užkoduojami ir, pra ėjus 3–4 savait ėms po gimimo, 
įvertinami pagal taškus. Skiriamos trys tašk ų klasės: 
a) baltos spalvos 5 mm diametro taškai, išsid ėstę pilvo dalyje ir 
tikriausiai atsirad ę dėl ląstelių žūties (BVPT);  
b) geltonos spalvos, panaš ūs į agučio (agouti-like ) taškai, stebimi 
krūties, lytini ų liaukų, viršugalvio ašin ėje ir kirkšnin ėje srityse, 
kurie, kaip manoma, atsirado d ėl sutrikusios l ąstelių 
diferenciacijos (SDT);  
c) pigmentuoti ir baltos spalvos taškai, išsim ėtę kailyje ir, manoma, 
kad tai susij ę su somatin ėmis mutacijomis (SMT).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Visos trys tašk ų klasės, išskyrus paskutini ąją, įvertinamos pagal 
genetinę reikšmę. Problemos, atsirandan čios dėl taškų, atsirandan čių 
sutrikus l ąstelių diferenciacijai, ar somatini ų mutacijų, atskyrimo 
išsprendžiamos, atlikus kailio m ėginių fluorescencin ę analizę. 
Reikėtų registruoti akivaizdžias pagrindines morfologines anomalijas, 
pasireiškian čias palikuoni ų tarpe.  
2. DUOMENYS  
Pateikiant duomenis, reik ėtų nurodyti ištirtus palikuonius bei pateikti 
gyvūnų, turinčių vieną ar daugiau sp ėjamų somatini ų mutacijų, 
skaičių. Paveiktų ir neigiam ų kontrolini ų grupių bandymų duomenys 
turėtų būti palyginti atitinkamais metodais. Duomenys pateikiami, 
atsižvelgiant į kiekvien ą vadą. 
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— poravimui panaudoti kamienai,  
— bandomoje bei kontrolin ėse grupėse esančių vaikingų patelių 
skaičius, 
— vidutinis vados dydis bandomojoje bei kontrolin ėje grupėse 
gimimo bei atjunkymo metu,  
— bandomosios chemin ės medžiagos doz ės, 
— metodas, kuriuo nustatoma, kad suporavimas įvyko,  
— panaudotas tirpiklis, – gestacijos diena, kuri ą buvo prad ėtas 
veikimas bandom ąja medžiaga,  
— veikimo b ūdas, 
— absoliutus įvertintų palikuoni ų ir bandomojoje bei kontrolin ėje 
grupėse esančių BVPT, SMT ir SPT skai čius, 
— pagrindin ės morfologin ės anomalijos,  
— jei įmanoma, doz ės ir atsako s ąsaja SPT bandymo atveju,  
— statistinis įvertinimas,  
— rezultat ų aptarimas  
— rezultat ų aiškinimas.  
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  PELI Ų PAVELD ĖTA TRANSLOKACIJA  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Tiriant paveldim ą translokacij ą pelėse, nustatomi žinduoli ų embrio­
ninių ląstelių chromosom ų struktūriniai bei skai čiaus poky čiai, kurie 
išnyksta pirmos kartos palikuonyse. Nustatomi tokie chromosom ų 
pokyčiai: atvirkštin ės translokacijos ir X-chromosomos praradimas 
tuo atveju, jei bandomos palikuoni ų patelės. Gyvūnų, turinčių trans­
lokacijas bei XO-pateli ų vaisingumas yra sumaž ėjęs ir pagal tai 
atrenkami F  1 palikuonys, kurie bus naudojami citogenetinei analizei. 
Visiškas sterilumas stebimas konkre čių translokacij ų atveju (X-auto ­
soma ir c-t tipas). Atliekant citogenetin ę analizę, translokacijos nusta ­
tomos arba F  1 patinuose arba F  1 patelių vyriškos lyties palikuoni ų 
ląstelėse, besidalijan čiose mejoz ės būdu, ląstelėms esant diakinez ės-I 
metafazės stadijoje. Atliekant citogenetin ę analizę, XO-patel ės nusta­
tomos tik pagal kaul ų čiulpų ląsteles, besidalijan čias mitozės būdu ir 
turinčias tik 39 chromosomas.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
Pasiruošimas bandymui  
Bandomosios medžiagos ištirpinamos izotoniniame drusk ų tirpale. 
Vandenyje netirpios chemin ės medžiagos ištirpinamos ar suspenduo ­
jamos, panaudojus atitinkamas priemones. Naudojami šviežiai 
paruošti bandomosios chemin ės medžiagos tirpalai. Jei priemon ė 
duodama kartu su bandomosios medžiagos doze, tai ji neturi trukdyti nei bandomajai cheminei medžiagai veikti, nei toksiniams povei ­
kiams pasireikšti.
 
D a v i m o b ū d a s  
Paprastai bandomoji medžiaga duodama per į trachėją įvedamą 
vamzdelį arba injekuojant bandom ąją medžiag ą į pilvą. Medžiag ą 
galima duoti ir kitais b ūdais. 
E k s p e r i m e n t i n i a i g y v ū n a i 
Tam, kad palengv ėtų kryžminimas bei citologinis patvirtinimas, šie 
eksperimentai atliekami su pel ėmis. Specifinis peli ų kamienas n ėra 
būtinas. Tačiau vienam kamienui priklausan čių gyvūnų vadoje vidu ­
tiniškai bei pastoviai tur ėtų būti daugiau nei aštuoni palikuonys.  
Naudojami sveiki lytiškai subrend ę gyvūnai. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
G y v ū n ų s k a i č i u s 
Gyvūnų, būtinų bandymui atlikti, skai čius priklauso nuo spontanin ės 
translokacijos dažnio bei mažiausio translokacijos suk ėlimo grei čio, 
kuris būtinas tam, kad b ūtų gaunamas teigiamas rezultatas.  
Bandymas paprastai atliekamas analizuojant patin ų F 1 palikuonis. 
Tiriant gyv ūnų, kuriems buvo duota konkreti bandomosios 
medžiagos doz ė, grupę, reikėtų išanalizuoti mažiausiai 500 patin ų 
F 1 palikuonis. Jei bandomi pateli ų F 1 palikuonys, bandymui atlikti 
reikia po 300 patin ų bei pateli ų. 
T e i g i a m ų i r n e i g i a m ų k o n t r o l i ų n a u d o j i m a s  
Reikėtų remtis atitinkamais kontroliniais duomenimis, gautais atlie ­
kant bandym ą ir vienu metu naudojant kontroles bei anks čiau atliktų 
bandymų metu naudotas kontroles. Kai galima susipažinti su toje 
pačioje laboratorijoje k ą tik atlikt ų eksperiment ų, naudojant 
teigiamas kontroles, gautais patenkinamais rezultatais, šiuos rezul ­
tatus galima naudoti vietoj teigiamos kontrol ės, naudojamos tuo 
pačiu metu.  
V e i k i m o d o z ė 
Bandymo metu paprastai naudojama pavien ė ir pati didžiausia doz ė, 
sukelianti silpniausiai pasireiškian čius toksinius poveikius, ta čiau 
neįtakojanti elgsenos dauginimosi metu ar išgyvenimo. Siekiant 
nustatyti doz ės ir atsako s ąsają, reikėtų panaudoti dvi nedideles 
papildomas dozes. Netoksini ų chemini ų medžiag ų atveju reik ėtų 
naudoti pa čią didžiausi ą dozę. 
Bandymo eiga  
V e i k i m a s i r p o r a v i m a s  
Veikti bandom ąja medžiaga galima dvejopai. Dažniausiai bandomoji 
medžiaga duodama vien ąkart. Taipogi medžiag ą galima duoti 35 
dienų laikotarpiu, septynias dienas per savait ę. Pasibaigus veikimui, 
atliekami poravimai pagal tvarkarašt į ir reikėtų užtikrinti, kad buvo 
paimti vis ų brendimo stadij ų paveiktų embrionini ų ląstelių mėginiai. 
Baigiantis poravimui, patinai ir patel ės atskiriami ir patalpinami į 
atskirus narvelius. Kai patel ės atsiveda jauniklius, registruojama pali ­
kuonių gimimo data, vados dydis bei palikuoni ų lytis. Visi vyriškos 
lyties palikuonys atjunkomi, o visi moteriškos lyties palikuonys paša ­
linami, nebent jie b ūtų naudojami eksperimento metu.  
T r a n s l o k a c i j o s h e t e r o z i g o t i š k u m o b a n d y m a s  
Galima naudotis vienu iš dviej ų galimų metodų: 
— F  1 palikuoni ų vaisingumo bandymas ir gyv ūnų, kurie gali tur ėti 
translokacijas, identifikavimas citogenetin ės analizės būdu, 
— visų F 1 vyriškos lyties palikuoni ų citogenetin ė analizė, neatren­
kant jų iš anksto pagal vaisingum ą. 
a) Vaisingumo bandymas  
Sumažėjęs F 1 gyvūno vaisingumas gali b ūti nustatomas, stebint 
vados gaus ą ir (ar) analizuojant pateli ų, kurios buvo naudojamos 
poravimui, gimdos turin į. 
Atsižvelgiant į naudojam ą pelių kamieną, reikia pasirinkti krite ­
rijus, pagal kuriuos bus sprendžiama apie normal ų ir sumaž ėjusį 
vaisingum ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Vados dydžio steb ėjimas: Bandomieji F  1 patinai yra laikomi 
atskirai arba nuo tame pa čiame eksperimente naudojam ų arba 
nuo visos peli ų kolonijos pateli ų. Narvai stebimi kasdien, prade ­
dant nuo 18 dienos, pra ėjusios po suporavimo. Patel ėms atsi­
vedus F  2 palikuonis, užregistruojamas vados dydis bei pali ­
kuonių, kurie po to pašalinami, lytis. Jei bandomi moteriškos 
lyties F  1 palikuonys, tai mažos F  2 vados bus bandomos v ėliau. 
Translokacijas turin čios patelės identifikuojamos, atliekant trans ­
lokacijos citogenetin ę analizę, naudojant bet kur į jų vyriškos 
lyties palikuon į. XO patel ės identifikuojamos pagal ly čių 
santykio j ų palikuoni ų tarpe poky čius – 1:1 (patinai/patel ės) 
— → 1:2 (patinai/patel ės). Vėliau normal ūs F 1 gyvūnai toliau 
nebetiriami, jei F  2 vados dydis pasiekia arba peržengia iš anksto 
nustatytą normalią ribą, priešingu atveju stebimos antroji bei 
trečioji F  2 vados.  
F 1 gyvūnų, kurių negalima laikyti normaliais, baigus net trij ų F 2 
vadų stebėjimus, atveju reikia arba tirti pateli ų, kurios buvo 
poruojamos su patinais, gimdos turin į arba reikia iškart prad ėti 
gyvūnų citogenetin ę analizę. 
Gimdos turinio analiz ė: Translokacijas turin čių gyvūnų vados 
dydis sumaž ėja dėl embrion ų žūties, todėl daug žuvusi ų 
implantų parodo, kad bandomieji gyv ūnai turi translokacijas. 
Kiekvienas F  1 patinas, kuris bus bandomas, suporuojamas su 
2–3 patel ėmis. Apvaisinimas nustatomas kiekvienos dienos 
rytą ieškant makšties kamš čio susidarymo. Pra ėjus 14–16 
dienų po apvaisinimo patel ės numarinamos ir užregistruojami 
gyvi bei žuv ę implantai, esantys gimdoje.  
b) Citogenetin ė analizė 
Sėklidės paruošiamos, išdžiovinant jas ore. Gyv ūnai, turintys 
translokacijas, identifikuojami pagal pirmini ų spermatocit ų, 
esančių mejozės diakinez ės-metafaz ės I stadijoje, multivalentini ų 
chromosom ų konfigūracijas. Nusta čius šiuos multivalentinius 
darinius mažiausiai dviejose l ąstelėse, galima teigti, kad bando ­
masis gyv ūnas turi translokacijas.  
Jei nebuvo vykdoma atranka pagal kryžminimus, tai visi F  1 
patinai tiriami citogenetiniu aspektu. Reikia mikroskopiškai 
ištirti mažiausiai 25 vieno patino l ąsteles, esan čias diakinez ės- 
metafazės I stadijoje. Jei įtariama, kad F  1 patinuose, turin čiuose 
menkas s ėklides bei F  1 XO patel ėse mejozė nutraukiama, prieš 
prasidedant diakinezei, reikia ištirti ši ų patinų spermatogonij ų 
arba kaul ų čiulpų ląstelių bei pateli ų kaulų čiulpų ląstelių mito­
zines metafazines chromosomas. Mažiausiai dešimtyje ištirt ų 
ląstelių nustatytos ne įprastai ilgos ar trumpos chromosomos 
parodo, kad vienas ar kitas patinas yra sterilus pagal chromo ­
somų translokacijas (c-t tipas). Kai kurios X-autosom ų translo­
kacijos, apsprendžian čios patinų sterilumą, gali būti nustatomos 
tiktai atliekant mitozini ų chromosom ų juostų elektroforezin ę 
analizę. Jei tirtos patel ės atveju bent 10 mitoz ės atvejų užregist­
ruojamos 39 chromosomos, tokia patel ė laikoma XO.  
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti pateikiami lentel ėse. 
Atliekant kiekvien ą poravim ą, registruojamas vidutinis vados dydis 
bei lyčių santykis, pradedant nuo t ėvų poravimo ir baigiant pali ­
kuonių gimimu bei j ų atjunkymu.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Įvertinant F  1 gyvūnų vaisingum ą, pateikiamas vidutinis vados dydis 
normalių poravimų atveju bei atskir ų F 1 gyvūnų, turinčių transloka ­
cijas, vad ų dydžiai. Tiriant gimdos turin į, pateikiamas vidutinis gyv ų 
bei žuvusi ų implantų skaičius normali ų poravimų atveju ir atskir ų F 1 
gyvūnų, turinčių translokacijas, gyv ų bei žuvusi ų transplant ų skaičius 
kiekvieno poravimo atveju.  
Atliekant l ąstelių, esančių diakinez ės- metafaz ės I stadijoje, citoge ­
netinę analizę, nurodomas multivalentini ų chromosom ų konfigūracijų 
tipų kiekis bei absoliutus l ąstelių, naudotų, tiriant kiekvien ą trans­
lokacijas turint į gyvūną, absoliut ų skaičių. 
Tiriant sterilius F  1 gyvūnus, pateikiamas absoliutus poravim ų skai­ 
čius bei poravimo periodo trukm ė. Nurodomi s ėklidžių svoriai bei 
citogenetin ės analizės duomenys.  
Tiriant XO pateles, nurodomas vidutinis vados dydis, ly čių santykis 
F 2 palikuoni ų tarpe bei citogenetin ės analizės duomenys.  
Jei numanomi F  1 gyvūnai, turintys translokacijas, tiriami pagal 
vaisingum ą, taip atrenkant juos iš anksto, pateikiamos lentel ės, 
kuriose nurodoma, kiek iš t ų F 1 gyvūnų yra heterozigot ų pagal trans ­
lokacijas.  
Pateikiami eksperiment ų, kurių metu naudojamos teigiamos bei 
neigiamos kontrol ės, duomenys.  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, turi b ūti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— pelių kamienas, gyv ūnų amžius, gyv ūnų, paveikt ų bandom ąja 
medžiaga, k ūno masė, 
— kiekvienos lyties t ėvinių gyvūnų skaičius bandomojoje bei kont ­
rolinėje grupėse, 
— bandymo s ąlygos, išsamus veikimo aprašymas, doz ės, tirpikliai, 
suporavimo tvarkaraštis,  
— kiekvienos patel ės atsivest ų palikuoni ų skaičius bei lytis, pali ­
kuonių, užaugint ų translokacijos bandymams, skai čius bei lytis,  
— translokacijos bandymo laikas bei kriterijai,  
— gyvūnų, turinčių translokacijas, išsamus apib ūdinimas bei j ų skai­ 
čius, įskaitant kryžminimo duomenis bei gimdos turinio analiz ės 
rezultatus, jei reikia,  
— citogenetin ės procedūros ir mikroskopin ės analizės apibūdinimas, 
pageidautina, pateikiant schemas,  
— statistinis įvertinimas,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  POŪMIS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKT Ą. 90 
DIENŲ KARTOTINI Ų DOZIŲ TOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS 
BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis poūmio toksiškumo per virškinam ąjį traktą bandymo metodas yra 
OECD TG 408 (1998) kopija.  
1.1. ĮVADAS  
Vertinant chemini ų medžiag ų toksines savybes, galima atlikti karto ­
tinių dozių poūmio toksiškumo per virškinam ąjį traktą bandym ą, 
prieš tai gavus pradin ę informacij ą apie jos toksiškum ą per ūmaus 
ar 28 par ų kartotinės dozės toksiškumo bandymus. Per 90 dien ų 
bandymą gaunama informacijos apie galimus pavojus sveikatai, 
galinčius kilti po kartotinio veikimo ilg ą laikotarp į, trunkant į nuo 
atjunkymo iki visiško subrendimo. Atlikus š į bandym ą gaunama 
informacijos apie svarbesnius toksinius poveikius, paveiktus organus 
ir kaupimosi galimyb ę, taip pat duomen ų apie nepasteb ėto neigiamo 
poveikio rib ą (NOAEL), kuria galima pasinaudoti parenkant dozes 
lėtinio poveikio bandymui ir nustatant žmoni ų sąlyčio su konkre čia 
chemine medžiaga saugos kriterijus.  
Šiame metode papildomas d ėmesys skiriamas sukeliamiems neurolo ­
giniams pakitimams, taip pat gaunama žini ų, ar paveiktos imunolo ­
ginė ir dauginimosi sistemos. Pabr ėžiamas gyv ūnų kruopščių klini­
kinių stebėjimų būtinumas, kad b ūtų gauta kuo daugiau informacijos. 
Šiuo bandymu tur ėtų būti nustatomos chemin ės medžiagos, galin čios 
sukelti neurotoksin į poveikį, paveikti imunologin ę sistemą ar daugi ­
nimosi organus, o tai b ūtų pagrindas toliau t ęsti išsamius tyrimus.  
Taip pat žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Dozė – gyvūnui duotas bandomosios medžiagos kiekis. Doz ė išreiš­
kiama bandomosios medžiagos mase bandomojo gyv ūno masės 
vienetui (pvz., mg/kg), ar pastovia koncentracija maiste (ppm).  
Dozavimas  –bendras terminas, apimantis doz ės dydį, jos dažn į ir 
dozavimo trukm ę. 
NOAEL  – termino „nepasteb ėto neigiamo poveikio riba“ 
(No observed adverse effect level) santrumpa, tai yra didžiausia 
dozė, kai nepastebimas neigiamas su veikimu chemine medžiaga 
susijęs poveikis.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Kasdien kelioms bandom ųjų gyvūnų grupėms per virškinam ąjį traktą 
duodamos skirtingos bandomosios medžiagos doz ės, vienai grupei 
90 parų laikotarpiu duodama vieno dydžio doz ė. Medžiagos davimo 
laikotarpiu atidžiai stebima, ar gyv ūnams pasireiškia toksiškumo 
požymiai. Darant bandym ą nugaišę ar numarinti gyv ūnai skrodžiami, 
o baigus bandym ą išlikę gyvūnai taip pat numarinami ir skrodžiami.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Gyv ūnų paruošimas  
Turi būti imami sveiki gyv ūnai, bent penkias paras aklimatizuoti 
laboratorijos s ąlygomis ir dar nenaudoti kitiems bandymams. Apra ­ 
šoma bandymo gyv ūnų rūšis, veisl ė, šaltinis, lytis, mas ė ir (ar) 
amžius. Gyv ūnai į kontrolines ir bandom ąsias grupes turi b ūti 
paskirstomi atsitiktinai. Narveliai turi b ūti pastatomi taip, kad kuo 
mažiau pasireikšt ų neigiama j ų išdėstymo įtaka. Kiekvienam gyv ūnui 
turi būti paskirtas unikalus identifikacijos numeris.  
1.4.2.  Dozi ų ruošimas  
Bandomoji medžiaga duodama per zond ą arba su maistu ar geria ­
muoju vandeniu. Doz ės davimo per virškinam ąjį traktą būdas 
priklauso nuo bandymo tikslo ir bandomosios medžiagos fizikini ų 
ir chemini ų savybių. 
Jei būtina, bandomajai medžiagai ištirpdyti arba suspenduoti naudo ­
jamas atitinkamas nešiklis. Rekomenduojama naudoti, jei įmanoma, 
vandeninį tirpalą (suspensij ą, emulsiją), toliau pirmenyb ė teikiama 
aliejiniam tirpalui (emulsijai, suspensijai) (pvz., kukur ūzų aliejaus) 
ir tik po j ų svarstytini kit ų nešiklių tirpalai. Turi b ūti žinomos vis ų 
nešiklių, išskyrus vanden į, toksiškumo charakteristikos. Turi b ūti 
nustatytas bandomosios medžiagos stabilumas doz ės davimo s ąly­
gomis.  
1.4.3.  Bandymo s ąlygos  
1.4.3.1.  Bandomieji gyv ūnai 
Geriau tinka žiurk ės, tačiau galima naudoti ir kitus graužikus, pvz., 
peles. Reik ėtų naudoti gerai žinom ų laboratorini ų veislių jaunus 
suaugusius gyv ūnus. Patel ės turi būti dar netur ėjusios palikuoni ų ir 
neapvaisintos. Dozavimas tur ėtų būti pradėtas kuo anks čiau po atjun ­
kymo, bet kokiu atveju ne v ėliau negu gyv ūnams sukanka devynios 
savaitės. Gyvūnų masės skirtumai prieš bandymo pradži ą turi būti 
kuo mažesni ir neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties vidutin ės masės. 
Jei tai yra pradinis bandymas prieš ilgalaik į lėtinio toksiškumo 
bandymą, abiem bandymams turi b ūti naudojami tos pa čios veislės 
ir to paties šaltinio gyv ūnai. 
1.4.3.2.  Skai čius ir lytis  
Kiekvienai dozei turi b ūti naudojama bent 20 gyv ūnų (10 pateli ų ir 
10 patinų). Jei planuojami tarpiniai skrodimai, gyv ūnų skaičius turi 
būti padidintas tiek, kiek j ų numatyta numarinti iki bandymo 
pabaigos. Remiantis ankstesn ėmis žiniomis apie chemin ę medžiag ą 
ar labai panaši ų savybių medžiagą, galima į kontrolinio bandymo ir į 
didžiausios doz ės grupę papildomai įtraukti pagalbin ę 10 gyvūnų 
grupę (po penkis kiekvienos lyties), kad pasibaigus veikimo laiko ­
tarpiui galima b ūtų stebėti visų toksiškumo požymi ų grįžtamumą ar 
išlikimą. Šio laikotarpio po veikimo trukm ė turėtų būti atitinkamai 
nustatyta atsižvelgiant į stebimus poveikius.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Dozės 
Naudojamos bent trij ų dydžių dozės ir vienas lygiagretus kontrolinis 
bandinys, išskyrus atvejus, kai daromas ribinis bandymas (žr. 1.4.3.4). Dozi ų dydžiai gali b ūti pagrįsti kartotini ų dozių ar diapa ­
zono nustatymo bandym ų rezultatais ir turi b ūti atsižvelgta į visus 
esamus toksikologinius ir toksikokinetinius duomenis apie bando ­
mąją medžiagą ar giminingas medžiagas. Jei bandomosios medžiagos 
fizikinis ir cheminis pob ūdis ar biologinis poveikis doz ės neriboja, 
didžiausia doz ė turi būti pasirinkta tokia, kad gyv ūnui būtų sukeltas 
toksinis poveikis, bet jis než ūtų ar nepatirt ų didelių kančių. Mažė­
jančių dozių seka turi b ūti pasirinkta taip, kad b ūtų pastebėtas bet 
koks doz ės sukeltas atsakas, o esant mažiausiai dozei neb ūtų paste­
bėta jokio neigiamo poveikio (NOAEL). Maž ėjančios dozės turėtų
 
būti du-keturis kartus viena už kit ą mažesnės, ir dažnai vietoj dideli ų 
dozių intervalų (pvz., kai skirtumas tarp j ų yra 6–10 kart ų) geriau 
naudoti papildom ą ketvirtą bandymų grupę. 
Kontrolin ę grupę sudaro neveikiam ų gyvūnų grupė arba nešikl į 
gaunanti kontrolin ė grupė, jei bandomajai medžiagai duoti naudo ­
jamas nešiklis. Išskyrus bandomosios medžiagos davim ą, su kontro ­
linės grupės gyvūnais turi b ūti elgiamasi lygiai taip, kaip su 
bandymo grupi ų gyvūnais. Jei naudojamas nešiklis, kontrolin ės 
grupės gyvūnai gauna didžiausi ą nešiklio t ūrį. Jei bandomoji 
medžiaga duodama su maistu ir d ėl to gyvūnai suvartoja mažiau 
maisto, gali b ūti naudinga tur ėti lygiagre čiai maitinam ą kontrolin ę 
grupę, kad būtų galima nustatyti, ar maisto vartojimo sumaž ėjimas 
yra dėl apetito stokos ar d ėl toksikologini ų pokyčių pagal bandymo 
modelį. 
Reikėtų atkreipti d ėmesį į šias nešiklio ir kit ų priedų charakteristikas: 
poveikį bandomosios medžiagos absorbcijai, pasiskirstymui, metabo ­
lizmui ar sulaikymui; poveik į bandomosios medžiagos chemin ėms 
savybėms, galintiems pakeisti jos toksiškumo charakteristikas; ir 
poveikį maisto ar vandens vartojimui ar gyv ūnų mitybos b ūklei. 
1.4.3.4.  Ribinis bandymas  
Jei, taikant šiam bandymui aprašytas metodikas, vienos doz ės, atitin­
kančios bent 1 000 mg/kg k ūno masės/parai, bandymas nesukelia 
jokio pastebimo neigiamo poveikio ir jei toksiškumas nenumatomas atsižvelgiant į struktūriškai gimining ų medžiagų duomenis, visas trij ų 
dozių bandymas gali b ūti laikomas neb ūtinu. Toks ribinis bandymas 
netaikomas tais atvejais, kai atsižvelgiant į žmonių sąlytį su 
medžiaga reikia naudoti didesnio dydžio doz ę.
 
1.5. BANDYMO EIGA  
1.5.1.  Dozavimas  
Bandomosios medžiagos doz ė 90 par ų laikotarpiu gyv ūnams 
duodama kasdien visas septynias dienas per savait ę. Bet kur į kitą 
režimą, pvz., penki ų dienų per savait ę, reikia pagr įsti. Kai bandomoji 
medžiaga duodama per zond ą, gyvūnams turėtų būti duodama tik 
viena doz ė naudojant skrandžio zond ą ar tinkam ą intubacin į vamz­
delį. Didžiausias gyv ūnui duodamas vienkartinis skys čio tūris 
priklauso nuo bandomojo gyv ūno dydžio. T ūris netur ėtų būti 
didesnis kaip 1 ml/100 g k ūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, 
kurių galima duoti po 2 ml/100 g k ūno masės. Išskyrus dirginan čias 
ar ėsdinančias medžiagas, kuri ų didesnės koncentracijos paprastai 
sukelia dirginant į poveikį, tirpalo t ūrio svyravimai turi b ūti kuo 
mažesni: koncentracija pakoreguojama taip, kad vis ų dozių tūris 
būtų toks pats.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Jei medžiagos duodamos su maistu ar geriamuoju vandeniu, svarbu 
garantuoti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrikdyt ų 
normalaus mitybos režimo ar vandens balanso. Bandom ąją medžiagą 
duodant su maistu, galima naudoti pastovi ą koncentracij ą maiste 
(ppm) ar pastovi ą dozę pagal gyv ūno kūno masę; naudota alterna ­
tyva turi b ūti nurodyta. Medžiag ą įleidžiant per zond ą, dozė turėtų 
būti duodama kasdien panašiu laiku ir prireikus pakoreguojama 
pastoviam doz ės dydžiui pagal gyv ūno kūno masę palaikyti. Jei 90 
parų bandymas daromas kaip pradinis prieš ilgalaik į lėtinio toksiš ­
kumo bandym ą, abiem bandymams turi b ūti naudojamas panašus 
maistas.  
1.5.2.  Steb ėjimai  
Stebėjimo trukm ė turi būti ne mažesn ė kaip 90 par ų. Pagalbin ės 
grupės gyvūnai, skirti paskesniems steb ėjimams, atitinkam ą laiką 
turi būti niekaip neveikiami, kad b ūtų galima konstatuoti toksini ų 
poveikių išlikimą ar atsigavim ą po jų. 
Bendras klinikinis steb ėjimas turi b ūti atliekamas bent kart ą per 
dieną, geriau kasdien tuo pa čiu laiku, atsižvelgiant į intensyviausi ą 
numatomo poveikio pasireiškimo laik ą po medžiagos davimo. Turi 
būti registruojama gyv ūnų klinikinė būsena. Bent du kartus per 
dieną, paprastai kiekvienos dienos ryte ir vakare, visi gyv ūnai apžiū­
rimi siekiant nustatyti liguistumo ir gaištamumo požymius.  
Bent vien ą kartą prieš pirm ąjį veikimą (kad būtų galima palyginti to 
paties gyv ūno duomenis) ir po to kart ą per savait ę visiems gyv ūnams 
turi būti daromi išsam ūs klinikiniai tyrimai. Šie tyrimai turi b ūti 
daromi ne pa čiame gyv ūno narvelyje, o geriau standartiškai įrengtoje 
vietoje ir kiekvien ą kartą panašiu laiku. Jie turi b ūti kruopščiai regist­
ruojami, geriausiai naudojant bandym ų laboratorijos aiškiai nustatyt ą 
vertinimo balais sistem ą. Turi būti imamasi priemoni ų, garantuo ­
jančių kuo mažesn į stebėjimo sąlygų kitimą. Pastebėti simptomai 
turi apimti, jais neapsiribojant, odos, kailio, aki ų, gleivinių, sekrecijų 
ir ekskrecij ų dažnį ir autonomin į aktyvum ą (pvz., ašarojim ą, plaukų 
pašiaušim ą, vyzdžių dydį, neįprastą kvėpavimą). Taip pat turi b ūti 
registruojami eisenos poky čiai, laikysena ir reakcija į elgimąsi su 
gyvūnu (angl.  handling ), kloniniai ar toniniai judesiai, stereotipai 
(pvz., per dažnas k ūno prisiži ūrėjimas, nuolatinis sukimasis ratu) ar 
keistas elgesys (pvz., sav ęs žalojimas, vaikš čiojimas atbulomis) (1).  
Prieš pradedant duoti bandom ąją medžiag ą ir baigiant bandym ą turi 
būti daromas, pageidautina vis ų, bet jei ne įmanoma, tai bent didžiau ­
sios dozės ir kontrolin ės grupių gyvūnų oftalmologinis tyrimas 
naudojant oftalmoskop ą ar lygiavert ę tinkamą įrangą. Jei nustatomi 
akių pakitimai, turi b ūti ištirti visi gyv ūnai. 
Baigiantis veikimo laikui, bet jokiu b ūdu ne anks čiau kaip vienuo ­
liktą savaitę, turi būti tikrinama sensorin ė reakcija į įvairius dirgiklius 
(1) (pvz., klausos, regos ir proprioceptinius dirgiklius) (2), (3), (4), daromas grybšnio j ėgos (5) ir motorinio aktyvumo (6) vertinimas. 
Kita išsami informacija apie tinkamus metodus pateikiama atitinka ­
mose nuorodose. Ta čiau galima taikyti ši ų nuorodų metodams alter ­
natyvius metodus.
 
Bandymo pabaigoje numatyti funkciniai steb ėjimai gali b ūti nevyk­
domi, jei yra kit ų bandym ų funkcini ų stebėjimų duomenys, o 
kasdienių klinikini ų stebėjimų metu nepasteb ėta jokių funkcini ų 
sutrikimų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Išimtiniu atveju funkcini ų stebėjimų galima taip pat nedaryti 
grupėms, kurių toksiškumo požymiai yra tokie ryšk ūs, kad jie 
labai trukdyt ų atlikti funkcinius steb ėjimus.  
1.5.2.1.  Kūno masė ir maisto/vandens suvartojimas  
Visi gyvūnai turi b ūti sveriami bent kart ą per savait ę. Suvartojamo 
maisto kiekis turi b ūti matuojamas bent kas savait ę. Jei bandomoji 
medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, bent kas savait ę turi 
būti nustatomas ir suvartojamo vandens kiekis. Suvartojamo vandens 
kiekį rekomenduojama matuoti ir tuo atveju, kai bandom ąją 
medžiagą duodant su maistu ar per zond ą gali pakisti vandens suvar ­
tojimas.  
1.5.2.2.  Hematologiniai ir klinikiniai biocheminiai tyrimai  
Kraujo bandiniai turi b ūti imami iš nurodytos vietos ir prireikus 
laikomi atitinkamomis s ąlygomis. Baigiantis bandymo laikotarpiui 
kraujas paimamas prieš pat gyv ūnų numarinim ą arba numarinimo 
metu.  
Bandymo laikotarpio pabaigoje arba kai imami tarpiniai kraujo 
bandiniai, turi b ūti daromi šie hematologiniai tyrimai: hematokrito 
vertė, hemoglobino koncentracija, eritrocit ų skaičius, bendras leuko ­
citų skaičius ir leukocit ų formulė, trombocit ų skaičius ir kraujo 
krešėjimo laiko/gebos matavimas.  
Klinikiniai biocheminiai matavimai siekiant nustatyti pagrindinius 
toksinius poveikius audiniams, ypa č inkstams bei kepenims, turi 
būti atliekami pa ėmus krauj ą prieš pat numarinant gyv ūną ar numa ­
rinimo metu (išskyrus gaištan čius ir (ar) numarintus darant 
bandymą). Panašiai kaip hematologiniams tyrimams, galima imti 
tarpinius bandinius klinikiniams biocheminiams bandymams. Reko ­
menduojama prieš kraujo ėmimą gyvūnų per naktį nešerti (  1 ). Anali­
zuojant serum ą ar plazm ą turi būti nustatomi natrio ir kalio jonai, 
gliukozė, bendras cholesterolis, karbamidas, kraujo karbamido 
azotas, kreatininas, bendras baltym ų ir albumino kiekis ir daugiau 
kaip du fermentai, rodantys poveik į kepenų ląstelėms (pvz., alanina ­
minotransferaz ė, aspartataminotransferaz ė, šarminė fosfatazė, gama 
glutamiltranspeptidaz ė ir sorbitoldehidrogenaz ė). Taip pat galima 
įtraukti papildom ų fermentų (kepenų ar kitokios kilm ės) ir tulžies 
rūgščių matavimus, kurie tam tikromis s ąlygomis gali suteikti 
naudingos informacijos.  
Neprivalomai paskutin ę bandymo savait ę gali būti analizuojami šie 
nustatytu laiku paimt ų šlapimo bandini ų parametrai: išvaizda, t ūris, 
osmoliališkumas ar santykinis tankis, pH, baltymai, gliukoz ė ir 
kraujas ar kraujo l ąstelės. 
Be to, galima atlikti tyrimus bendr ų audinių pakitimų serumo rodik ­
liams nustatyti. Jei d ėl žinomų bandomosios medžiagos savybi ų gali 
būti paveiktos susijusios medžiag ų apykaitos kreiv ės arba įtariama, 
kad jos paveiktos, reik ėtų daryti kalcio, fosforo, badavimo triglice ­
ridų, specifini ų hormonų, metemoglobino ir cholinesteraz ės analizes. 
Šios analiz ės turi būti atliekamos tam tikr ų klasių cheminių medžiagų 
atžvilgiu arba d ėl jų atlikimo turi b ūti sprendžiama konkre čiu atveju.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Būtų geriau, jei prieš imant krauj ą kai kuriems serumo ir plazmos parametrams, ypa č 
gliukozei, nustatyti gyv ūnai nebūtų naktį maitinami. Pagrindin ė priežastis – šeriant neiš ­
vengiamai padid ėja rezultat ų sklaida, d ėl to galėtų būti užslėpti mažiau pastebimi povei ­
kiai ir tod ėl pasunkėtų rezultatų aiškinimas. Ta čiau, kita vertus, badavimas per vis ą naktį 
gali turėti įtakos bendrajai gyv ūnų medžiag ų apykaitai ir sutrikdyti, ypa č darant davimo 
su maistu tyrimus, kasdien į veikimą bandom ąja medžiaga. Jei pasirenkamas gyv ūnų 
badavimas per nakt į, klinikiniai biocheminiai nustatymai turi b ūti daromi po tyrimo 
funkcinių stebėjimų.
 Apskritai bandym ą reikia daryti lanks čiai, atsižvelgiant į gyvūnų rūšį 
ir stebimus ar numatomus konkre čios medžiagos poveikius.  
Jei istorini ų pradinių duomen ų nepakanka, reikia apsvarstyti, ar 
hematologinius ir klinikinius parametrus reikia nustatyti prieš prade ­
dant dozavim ą; paprastai prieš veikim ą bandom ąja medžiaga ši ų 
duomenų gauti nepatariama (7).  
1.5.2.3.  Bendroji nekroskopija  
Visiems bandymui naudotiems gyv ūnams turi b ūti daroma visiška ir 
išsami bendroji nekroskopija, kuri ą sudaro kruopštus k ūno išorės 
paviršiaus, vis ų angų, kaukolės, krūtinės ir pilvo ertmi ų bei jų turinio 
tyrimas. Vis ų gyvūnų kepenys, inkstai, antinks čiai, sėklidės, antsė­
klidžiai, gimdos, kiaušid ės, užkrūčio liaukos, blužnis, smegenys ir 
širdis (išskyrus nugaišusi ų ir (ar) numarint ų bandymo metu) atski ­
riami nuo prilipusi ų audinių ir kuo grei čiau sveriami švieži, kad 
neišdžiūtų. 
Naudojant audiniui ir v ėlesniam histopatologiniam tyrimui tinka ­
miausią fiksavimo terp ę turi būti užkonservuojami šie audiniai: visi 
organai su makroskopiniais pakitimais, smegenys (tipiškos sritys, įskaitant didži ąsias smegenis, smegen ėles ir kaul ų čiulpus/Varoli 
tiltą), stuburo smegenys (trij ų lygių: kaklo, vidurinio kr ūtinės ir juos­
mens), hipofiz ė, skydliauk ė, prieskydin ė liauka, užkr ūčio liauka, 
stemplė, seilių liaukos, skrandis, plonosios ir storosios žarnos ( įskai­
tant Peyerio plokšteles), kepenys, kasa, inkstai, antinks čiai, blužnis, 
širdis, trach ėja ir plaučiai (konservuojant pripu čiami fiksavimo terp ės 
ir vėliau panardinami), aorta, lytin ės liaukos, gimda, pagalbiniai 
lyties organai, pateli ų pieno liaukos, prostata, šlapimo p ūslė, tulžies 
pūslė (pelių), limfmazgiai (somatiniams poveikiams nustatyti geriau 
imti vien ą limfmazg į dozės davimo kelyje, o kit ą – toli nuo doz ės 
patekimo kelio), periferiniai nervai (s ėdmens ar blauzdikaulio) geriau 
prie pat raumens, kaul ų čiulp
ų dalis (ir (ar) šviežiai išsiurbti kaul ų 
čiulpai), oda ir akys (jei darant oftalmologinius tyrimus buvo paste ­
bėti pakitimai). Klinikiniai ir kiti duomenys gali parodyti, jog b ūtina 
tirti papildomus audinius. Taip pat konservuojami visi organai, kurie pagal žinomas bandomosios medžiagos savybes gali b ūti jos 
paveikti.
 
1.5.2.4.  Histopatologiniai tyrimai  
Turi būti daromi išsam ūs histopatologiniai kontrolini ų ir didel ės 
dozės grupių gyvūnų užkonservuot ų organų ir audini ų tyrimai. Jei 
didelės dozės grupėje pastebima su veikimu bandom ąja medžiaga 
susijusių pokyčių, ištiriami vis ų kitų dozių grupių gyvūnai. 
Turėtų būti ištirti visi makroskopiniai pakitimai.  
Jei naudojama pagalbin ė grupė, turi būti atliekamas t ų audinių ir 
organų, kurie paveikti medžiag ą gavusiose grup ėse, histopatologinis 
tyrimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
2.1. DUOMENYS  
Turi būti pateikti kiekvieno gyv ūno duomenys. Papildomai visi 
duomenys turi b ūti apibendrinami lentel ėse, kiekvienai bandymo 
grupei nurodomas bandymo pradžioje tur ėtų gyvūnų skaičius, darant 
bandymą rastų nugaišusi ų ar dėl gyvūnų gerovės priežasčių numa­
rintų gyvūnų skaičius ir kiekvienos ž ūties ar numarinimo d ėl gyvūnų 
gerovės priežasčių laikas, gyv ūnų su toksiškumo požymiais skai čius, 
stebimų toksiškumo požymi ų aprašymas, įskaitant kiekvieno toksinio 
poveikio atsiradimo moment ą, trukmę ir sunkum ą, gyvūnų su organ ų 
pakitimais skai čių, pakitimų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakiti ­
mais procentin ę dalį. 
Jei tinka, skaitmeniniai rezultatai turi b ūti įvertinti atitinkamu ir 
plačiai taikomu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei 
skirti duomenys turi b ūti pasirinkti planuojant bandym ą. 
2.2. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
2.2.1.  Bandomoji medžiaga:  
— fizinė būsena, grynumas ir fizikin ės bei chemin ės savybės, 
— tapatumas,  
— nešiklis (jei naudojamas): nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei 
nešiklis ne vanduo.  
2.2.2.  Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir veisl ė, 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, maistas ir t. t.,  
— kiekvieno gyv ūno masė bandymo pradžioje.  
2.2.3.  Bandymo s ąlygos:  
— dozės dydžio parinkimo pagrindimas,  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos/preparato 
ruošimą, jo dėjimą į maistą, gautą koncentracij ą, preparato stabi ­
lumą ir vienalytiškum ą, 
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimo b ūdą, 
— tikrosios doz ės (mg/kg k ūno masės/parai) ir bandomosios 
medžiagos koncentracijos maiste/geriamajame vandenyje (ppm) perskaičiavimo į tikrąją dozę faktorius, jei naudojamas,
 
— išsami informacija apie maisto ir vandens kokyb ę. 
2.2.4.  Rezultatai:  
— kūno masė ir kūno masės pokyčiai, 
— maisto ir vandens suvartojimas, jei aktualu,  
— toksinio atsako duomenys pagal lyt į ir dozę, įskaitant toksiškumo 
požymius,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— atliekant klinikinius steb ėjimus pasteb ėto poveikio pob ūdis, 
sunkumas ir trukm ė (grįžtamojo pob ūdžio ar ne),  
— oftalmologinio tyrimo rezultatai,  
— jutiminio aktyvumo, grybšnio j ėgos ir motorinio aktyvumo verti ­
nimai (jei yra),  
— hematologiniai bandymai su atitinkamomis pamatin ėmis 
vertėmis, 
— klinikiniai biocheminiai bandymai su atitinkamomis pamatin ėmis 
vertėmis, 
— kūno masė bandymo pabaigoje, organ ų masė ir organo/k ūno 
masės santykis,  
— nekroskopijos duomenys,  
— išsamus vis ų histopatologinio tyrimo rezultat ų aprašymas,  
— absorbcijos duomenys, jei yra,  
— statistinis rezultat ų apdorojimas, jei daromas.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
3. NUORODOS  
1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No. 60.  
2) Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, p. 999–1003.  
3) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial 
Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, p. 691–704.  
4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain 
and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 108, p. 267–283.
 
5) Meyer O.A., Tilson h.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A 
Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind- limb 
grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., I, p. 233–236.
 
6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter 
L.W., Tilson h.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, p. 599–609.
 
7) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al . (1996). Harmonisation of 
Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and SAFEty 
Studies, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, p. 198–201.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  POŪMIS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKT Ą. 90 
DIENŲ KARTOTINI Ų DOZI Ų TOKSIŠKUMO NE 
GRAUŽIKAMS BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis poūmio toksiškumo per virškinam ąjį traktą bandymo metodas yra 
OECD TG 409 (1998) kopija.  
1.1. ĮVADAS  
Vertinant chemini ų medžiag ų toksines savybes, galima atlikti karto ­
tinių dozių poūmio toksiškumo per virškinam ąjį traktą bandym ą, 
prieš tai gavus pradin ę informacij ą apie jos toksiškum ą per ūmaus 
ar 28 par ų kartotinės dozės toksiškumo bandymus. Per 90 par ų 
bandymą gaunama informacijos apie galimus pavojus sveikatai, 
galinčius kilti po kartotinio veikimo ilg ą laikotarp į, trunkant į nuo 
atjunkymo iki visiško subrendimo. Atlikus š į bandym ą gaunama 
informacijos apie svarbesnius toksinius poveikius, paveiktus organus ir kaupimosi galimyb ę, taip pat duomen ų apie nepasteb ėto neigiamo 
poveikio rib ą (NOAEL), kuria galima pasinaudoti parenkant dozes 
lėtinio toksiškumo bandymui ir nustatant žmoni ų sąlyčio su 
konkrečia chemine medžiaga saugos kriterijus.
 
Bandymo metodas leidžia identifikuoti chemini ų medžiag ų veikimo 
neigiamus poveikius ne graužik ų rūšims ir turi b ūti taikomas tik:  
— jei kitais bandymais nustatyti poveikiai rodo, kad paaiškinimui/a ­
pibūdinimui reikalinga kita, ne graužik ų rūšis, ar  
— jei toksikokinetiniai tyrimai rodo, kad tinkamiausias laboratorinio 
gyvūno pasirinkimas yra tam tikra ne graužik ų rūšis, ar  
— jei kitos specifin ės priežastys pateisina ne graužik ų naudojim ą. 
Taip pat žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Dozė – gyvūnui duotas bandomosios medžiagos kiekis. Doz ė išreiš­
kiama bandomosios medžiagos mase bandomojo gyv ūno masės 
vienetui (pvz., mg/kg), ar pastovia koncentracija maiste (ppm)..  
Dozavimas  – bendras terminas, apimantis doz ės dydį, jos dažn į ir 
dozavimo trukm ę. 
NOAEL  – termino „nepasteb ėto neigiamo poveikio riba“ 
(No observed adverse effect level) santrumpa, tai yra didžiausia dozė, kai nepastebimas neigiamas su veikimu chemine medžiaga 
susijęs poveikis.
 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Kasdien kelioms bandom ųjų gyvūnų grupėms per virškinam ąjį traktą 
duodamos skirtingos bandomosios medžiagos doz ės, vienai grupei 
90 parų laikotarpiu duodama vieno dydžio doz ė. Medžiagos davimo 
laikotarpiu atidžiai stebima, ar gyv ūnams pasireiškia toksiškumo 
požymiai. Darant bandym ą nugaišę ar numarinti gyv ūnai skrodžiami, 
o baigus bandym ą išlikę gyvūnai taip pat numarinami ir skrodžiami.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Gyv ūnų rūšies parinkimas  
Paprastai naudojama ne graužik ų rūšis yra šuo, jis turi b ūti nustatytos 
veislės; dažnai naudojamas skalikas. Gali b ūti naudojami kiti 
gyvūnai, pvz., kiaul ės, mažosios kiaul ės. Primatai nerekomenduo ­
jami, tad j ų naudojimas turi b ūti pagrįstas. Turi b ūti naudojami 
jauni ir sveiki gyv ūnai. Jei naudojamas šuo, prad ėti dozavim ą geriau 
nuo 4–6 m ėnesių ir ne vyresniam kaip devyni ų mėnesių amžiaus. Jei 
tai yra pradinis bandymas prieš ilgalaik į lėtinio toksiškumo bandym ą, 
abiem bandymams turi b ūti naudojami tos pa čios rūšies/veislės 
gyvūnai. 
1.4.2.  Gyv ūnų paruošimas  
Turi būti imami sveiki, laboratorijos s ąlygomis aklimatizuoti ir 
kitiems bandymams dar nenaudoti gyv ūnai. Aklimatizavimo trukm ė 
priklauso nuo pasirinkt ų rūšių ir jų šaltinio. Šunims ar specialiai šiuo 
tikslu augintoms kiaul ėms iš vietin ės kolonijos rekomenduojama 
penkių parų aklimatizacija, o jei gyv ūnai yra iš išorini ų šaltinių – 
bent dviej ų savaičių aklimatizacija. Aprašoma bandom ųjų gyvūnų 
rūšis, veislė, šaltinis, lytis, mas ė ir (ar) amžius. Gyv ūnai į kontrolines 
ir veikimo medžiaga grupes turi b ūti paskirstomi atsitiktinai. Narve ­
liai turi b ūti išdėstomi taip, kad kuo mažiau pasireikšt ų pastatymo 
vietos įtaka. Kiekvienam gyv ūnui turi b ūti paskirtas tik vienas iden ­
tifikacijos numeris.  
1.4.3.  Dozi ų paruošimas  
Bandomoji medžiaga duodama su maistu ar geriamuoju vandeniu, 
per zond ą arba kapsul ėmis. Doz ės davimo b ūdas priklauso nuo 
bandymo tikslo ir bandomosios medžiagos fizikini ų ir chemini ų 
savybių. 
Jei būtina, bandomajai medžiagai ištirpinti arba suspenduoti naudo ­
jamas atitinkamas nešiklis. Vis ų pirma rekomenduojamas vandeninis 
tirpalas arba suspensija, po jo pirmenyb ė teikiama aliejiniam tirpalui 
arba suspensijai (pvz., kukur ūzų) ir tik po j ų galimi kit ų nešiklių 
tirpalai. Naudojamo kito nešiklio nei vanduo toksin ės savybės turi 
būti žinomos. Tur ėtų būti nustatytas bandomosios medžiagos stabi ­
lumas nešiklyje.  
1.5. BANDYMO EIGA  
1.5.1.  Gyv ūnų skaičius ir lytis  
Kiekvienai dozei turi b ūti naudojami bent aštuoni gyv ūnai (keturios 
patelės ir keturi patinai). Jei planuojami tarpiniai skrodimai, gyv ūnų 
skaičius turi būti padidintas tiek, kiek gyv ūnų numatyta numarinti iki 
bandymo pabaigos. Baigus bandym ą gyvūnų skaičius turi b ūti toks, 
kad būtų galima tinkamai įvertinti medžiagos toksin į poveikį. 
Remiantis ankstesn ėmis žiniomis apie chemin ę medžiag ą ar labai 
panašių savybių medžiag ą, galima b ūtų numatyti į kontrolinio 
bandymo ir į didžiausios doz ės grupę papildomai įtraukti po pagal ­
binę aštuonių gyvūnų grupę (po keturis kiekvienos lyties), kurios 
pasibaigus veikimo medžiaga laikotarpiui b ūtų stebimos siekiant 
nustatyti, ar toksiniai poveikiai yra gr įžtamieji, ar išliekamieji. Šio 
laikotarpio po veikimo medžiaga trukm ė turėtų būti tinkamai nusta ­
tyta atsižvelgiant į stebimus poveikius.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Dozavimas  
Naudojamos bent trij ų dydžių dozės ir viena lygiagreti kontrol ė 
grupė, išskyrus atvejus, kai daromas ribinis bandymas (žr. 1.5.3). 
Dozių dydžiai gali b ūti pagrįsti kartotini ų dozių ar diapazono nusta ­
tymo bandym ų rezultatais, ir turi b ūti atsižvelgta į visus esamus 
toksikologinius ir toksikokinetinius duomenis apie bandom ąjį junginį 
ar giminingas chemines medžiagas. Jei bandomosios medžiagos fizi ­
kinis ir cheminis pob ūdis ar biologinis poveikis doz ės neriboja, 
didžiausia doz ė turi būti pasirinkta tokia, kad gyv ūnui būtų sukeltas 
toksinis poveikis, bet jis než ūtų ar nepatirt ų didelių kančių. Mažė­
jančių dozių seka turi b ūti pasirinkta taip, kad b ūtų pastebėtas bet 
koks doz ės sukeltas atsakas, o esant mažiausiai dozei neb ūtų paste­
bėta jokio neigiamo poveikio (NOAEL). Maž ėjančios dozės turėtų 
būti du-keturis kartus viena už kit ą mažesnės, ir dažnai vietoj dideli ų 
dozių intervalų (pvz., kai skirtumas tarp j ų yra 6–10 kart ų) geriau 
naudoti papildom ą ketvirtą bandymų grupę. 
Kontrolin ę grupę sudaro neveikiam ų gyvūnų grupė arba nešikl į 
gaunanti kontrolin ė grupė, jei bandomajai medžiagai duoti naudo ­
jamas nešiklis. Išskyrus bandomosios medžiagos davim ą, su kontro ­
linės grupės gyvūnais turi b ūti elgiamasi lygiai taip, kaip su 
bandymo grupi ų gyvūnais. Jei naudojamas nešiklis, kontrolin ės 
grupės gyvūnai gauna didžiausi ą nešiklio t ūrį. Jei bandomoji 
medžiaga duodama su maistu ir d ėl to gyvūnai suvartoja mažiau 
maisto, gali b ūti naudinga tur ėti lygiagre čiai maitinam ą kontrolin ę 
grupę, kad būtų galima nustatyti, ar maisto vartojimo sumaž ėjimas 
yra dėl apetito stokos ar d ėl toksikologini ų pokyčių pagal bandymo 
modelį. 
Reikėtų atkreipti d ėmesį į šias nešiklio ir kit ų priedų charakteristikas: 
poveikį bandomosios medžiagos absorbcijai, pasiskirstymui, metabo ­
lizmui ar sulaikymui; poveik į bandomosios medžiagos chemin ėms 
savybėms, galintiems pakeisti jos toksiškumo charakteristikas; ir 
poveikį maisto ar vandens vartojimui ar gyv ūnų mitybos b ūklei. 
1.5.3.  Ribinis bandymas  
Jei, taikant šiam bandymui aprašytas metodikas, vienos doz ės, atitin­
kančios bent 1 000 mg/kg k ūno masės/parai, bandymas nesukelia 
jokio pastebimo neigiamo poveikio ir jei toksiškumas nenumatomas 
atsižvelgiant į struktūriškai gimining ų medžiagų duomenis, visas trij ų 
lygių dozės bandymas gali b ūti laikomas neb ūtinu. Toks ribinis 
bandymas netaikomas tais atvejais, kai atsižvelgiant į žmonių sąlytį 
su medžiaga reikia naudoti didesnio dydžio doz ę. 
1.5.4.  Dozi ų davimas  
Bandomosios medžiagos doz ė 90 par ų laikotarpiu gyv ūnams 
duodama kasdien visas septynias dienas per savait ę. Bet kur į kitą 
režimą, pvz., penki ų dienų per savait ę, reikia pagr įsti. Kai bandomoji 
medžiaga duodama per zond ą, gyvūnams turėtų būti duodama tik 
viena doz ė naudojant skrandžio zond ą ar tinkam ą intubacin į vamz­
delį. Didžiausias gyv ūnui duodamas vienkartinis skys čio tūris 
priklauso nuo bandym ų gyvūno dydžio. Paprastai t ūris turėtų būti 
kuo mažesnis. Išskyrus dirginan čias ar ėsdinančias medžiagas, kuri ų 
didesnės koncentracijos paprastai sukelia dirginant į poveikį, tirpalo 
tūrio svyravimai turi b ūti kuo mažesni: koncentracija pakoreguojama 
taip, kad vis ų dozių tūris būtų toks pats.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Jei medžiagos duodamos su maistu ar geriamuoju vandeniu, svarbu 
garantuoti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai netrikdyt ų 
normalaus mitybos režimo ar vandens balanso. Bandom ąją medžiagą 
duodant su maistu, galima naudoti pastovi ą koncentracij ą maiste 
(ppm) ar pastovi ą dozę pagal gyv ūno kūno masę; naudota alterna ­
tyva turi b ūti nurodyta. Medžiag ą įleidžiant per zond ą ar duodant 
kapsulę, dozė turėtų būti duodama kasdien panašiu laiku ir prireikus 
pakoreguota pastoviam doz ės lygiui pagal gyv ūno kūno masę palai­
kyti. Jei 90 par ų bandymas daromas kaip pradinis bandymas prieš 
ilgalaikį lėtinio toksiškumo bandym ą, abiem bandymams turi b ūti 
naudojamas panašus maistas.  
1.5.5.  Steb ėjimai  
Stebėjimo trukm ė turi būti ne mažesn ė kaip 90 par ų. Pagalbin ės 
grupės gyvūnai, skirti paskesniems steb ėjimams, atitinkam ą laiką 
turi būti niekaip neveikiami, kad b ūtų galima konstatuoti toksini ų 
poveikių išlikimą ar atsigavim ą po jų. 
Bendras klinikinis steb ėjimas turi b ūti atliekamas bent kart ą per 
dieną, geriau kasdien tuo pa čiu laiku, atsižvelgiant į intensyviausi ą 
numatomo poveikio pasireiškimo laik ą po medžiagos davimo. Turi 
būti registruojama gyv ūnų klinikinė būsena. Bent du kartus per 
dieną, paprastai kiekvienos dienos ryte ir vakare, visi gyv ūnai apžiū­
rimi siekiant nustatyti liguistumo ir gaištamumo požymius.  
Bent vien ą kartą prieš pirm ąjį veikimą (kad būtų galima palyginti to 
paties gyv ūno duomenis), ir po to kart ą per savait ę visiems gyv ū­
nams turi b ūti daromi išsam ūs klinikiniai tyrimai. Šie tyrimai turi 
būti daromi ne pa čiame gyv ūno narvelyje, o geriau standartiškai 
įrengtoje vietoje ir kiekvien ą kartą panašiu laiku. Turi b ūti imamasi 
priemonių, garantuojan čių kuo mažesn į stebėjimo sąlygų kitimą. 
Toksiškumo požymiai turi b ūti kruopš čiai registruojami, įskaitant 
jų pradžią, laipsnį ir trukm ę. Stebėjimai turi apimti, jais neapsiribo ­
jant, odos, kailio, aki ų, gleivini ų, sekrecij ų ir ekskrecij ų dažnį ir 
autonomin į aktyvum ą (pvz., ašarojim ą, plaukų pašiaušim ą, vyzdžių 
dydį, neįprastą kvėpavimą). Taip pat turi b ūti registruojami eisenos 
pokyčiai, laikysena ir reakcija į elgesį su gyvūnu (angl.  handling ), 
kloniniai ar toniniai judesiai, stereotipai (pvz., per dažnas k ūno prisi­ 
žiūrėjimas, nuolatinis sukimasis ratu) ar keistas elgesys.  
Prieš pradedant duoti bandom ąją medžiag ą ir baigiant bandym ą turi 
būti daromas, pageidautina vis ų, bet jei ne įmanoma, tai bent didžiau ­
sios dozės ir kontrolin ės grupių gyvūnų oftalmologinis tyrimas 
naudojant oftalmoskop ą ar lygiavert ę tinkamą įrangą. Jei nustatomi 
akių pakitimai, turi b ūti ištirti visi gyv ūnai. 
1.5.5.1.  Kūno masė ir maisto/vandens suvartojimas  
Visi gyvūnai turi b ūti sveriami bent kart ą per savait ę. Suvartojamo 
maisto kiekis turi b ūti matuojamas bent kas savait ę. Jei bandomoji 
medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, bent kas savait ę turi 
būti nustatomas ir suvartojamo vandens kiekis. Suvartojamo vandens 
kiekį rekomenduojama matuoti ir tuo atveju, kai bandom ąją 
medžiagą duodant su maistu ar per zond ą gali pakisti vandens suvar ­
tojimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hematologiniai ir klinikiniai biocheminiai tyrimai  
Kraujo bandiniai turi b ūti imami iš nurodytos vietos ir prireikus 
laikomi atitinkamomis s ąlygomis. Baigiantis bandymo laikotarpiui 
kraujas paimamas prieš pat gyv ūnų numarinim ą arba numarinimo 
metu.  
Bandymo pradžioje, po to arba kas m ėnesį, arba vien ą kartą 
bandymo viduryje ir galiausiai bandymo pabaigoje turi b ūti daroma 
hematologin ė analizė, įskaitant hemoglobino koncentracij ą, eritrocit ų 
skaičių, bendrą leukocit ų skaičių ir leukocit ų formulę, trombocit ų 
skaičių ir kraujo kreš ėjimo gebos, pvz., kreš ėjimo laiko, protrombino 
laiko ar tromboplastino laiko, matavim ą. 
Klinikiniai biocheminiai matavimai tiriant pagrindinius toksinius 
poveikius audiniams, ypa č inkstams bei kepenims, turi b ūti atliekami 
paėmus krauj ą prieš pat numarinant gyv ūną ar numarinimo metu 
(išskyrus gaištan čius ir (ar) numarintus darant bandym ą) pradedant 
bandymą, po to arba kas m ėnesį, arba vien ą kartą bandymo viduryje 
ir galiausiai bandymo pabaigoje. Svarstytinos tyrim ų sritys: elektro ­
litų pusiausvyra, angliavandeni ų apykaita ir kepen ų bei inkst ų funk­
cijos. Konkre čių tyrimų pasirinkimui įtakos tur ės bandomosios 
medžiagos veikimo b ūdų stebėjimas. Prieš kraujo ėmimą gyvūnai 
turi būti nemaitinami gyv ūno rūšį atitinkant į laiką. Rekomenduojama 
nustatyti kalc į, fosforą, chloridus, natr į, kalį, badavimo gliukoz ę, 
alaninaminotransferaz ę, aspartataminotransferaz ę, ornitindekarboksi ­
lazę, gama glutamiltranspeptidaz ę, karbamido azot ą, albumin ą, 
kraujo kreatinin ą, bendrą bilirubin ą ir bendrą serumo baltym ų kiekį. 
Šlapimą reikia tirti bent pradedant bandym ą, per bandymo vidur į ir 
galiausiai bandymo pabaigoje analizuojant nustatytu laiku paimtus 
bandinius. Šlapimo analiz ė apima išvaizd ą, tūrį, osmoliališkum ą ar 
santykinį tankį, pH, baltymus, gliukoz ę ir kraują ar kraujo l ąsteles. 
Galima naudoti papildomus parametrus, jei b ūtina išplėsti stebimo 
(-ų) poveikio (-i ų) tyrimą. 
Be to, svarstytini tyrimai bendr ų audinių pakitimų žymekliams nusta ­
tyti. Kitos analiz ės, kurių gali prireikti norint tinkamai įvertinti 
medžiagos toksiškum ą, apima lipid ų, hormonų, rūgščių ir šarmų pu­
siausvyros, metemoglobino ir cholinesteraz ės inhibavimo analiz ę. 
Galima naudoti papildomus klinikinius biocheminius tyrimus, jei 
būtina išplėsti stebim ų poveikių tyrimą. Šios analiz ės turi būti atlie­
kamos tam tikr ų klasių chemini ų medžiag ų atžvilgiu arba d ėl jų 
atlikimo turi b ūti sprendžiama konkre čiu atveju.  
Apskritai bandym ą reikia daryti lanks čiai, atsižvelgiant į gyvūnų rūšį 
ir stebimus ar numatomus konkre čios medžiagos poveikius.  
1.5.5.3.  Bendroji nekroskopija  
Visiems bandymui naudotiems gyv ūnams daroma visiška ir išsami 
bendroji nekroskopija, kuri ą sudaro kruopštus k ūno išorės paviršiaus, 
visų angų, kaukolės, krūtinės ir pilvo ertmi ų bei jų turinio tyrimas. 
Visų gyvūnų kepenys su tulžies p ūsle, inkstai, antinks čiai, sėklidės, 
antsėklidžiai, kiaušid ės, gimdos, skydliauk ė (su prieskydine liauka), 
užkrūčio liaukos, blužnis, smegenys ir širdis (išskyrus nugaišusi ų ir 
(ar) numarint ų bandymo metu) atskiriami nuo prilipusi ų audinių ir 
kuo greičiau sveriami švieži, kad neišdži ūtų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Naudojant audiniui ir v ėlesniam histopatologiniam tyrimui tinka ­
miausią fiksavimo terp ę, turi būti užkonservuojami šie audiniai: 
visi organai su makroskopiniais pakitimais, smegenys (tipiškos sritys, įskaitant didži ąsias smegenis, smegen ėles ir kaul ų čiulpus/Varoli 
tiltą), stuburo smegenys (trij ų lygių: kaklo, vidurinio kr ūtinės ir juos­
mens), hipofizis, akys, skydliauk ė, prieskydine liauka, užkr ūčio 
liauka, stempl ė, seilių liaukos, skrandis, plonosios ir storosios žarnos 
(įskaitant Peyerio plokšteles), kepenys, tulžies p ūslė, kasa, inkstai, 
antinksčiai, blužnis, širdis, trach ėja ir plau čiai, aorta, lytin ės liaukos, 
gimda, pagalbiniai lyties organai, pateli ų pieno liaukos, prostata, 
šlapimo p ūslė, limfmazgiai (somatiniams poveikiams nustatyti geriau 
imti vien ą limfmazg į dozės davimo kelyje, o kit ą – toli nuo doz ės 
davimo kelio), periferiniai nervai (s ėdmens ar blauzdikaulio) geriau 
prie pat raumens, kaul ų čiulpų dalis (ir (ar) šviežiai išsiurbti kaul ų 
čiulpai) ir oda. Klinikiniai ir kiti duomenys gali parodyti, jog b ūtina 
tirti papildomus audinius. Taip pat konservuojami visi organai, kurie pagal žinomas bandomosios medžiagos savybes gali b ūti jos 
paveikti.
 
1.5.5.4.  Histopatologiniai tyrimai  
Turi būti daromi išsam ūs histopatologiniai kontrolini ų ir didel ės 
dozės grupių gyvūnų užkonservuot ų organų ir audini ų tyrimai. Jei 
didelės dozės grupėje pastebima su veikimu bandom ąja medžiaga 
susijusių pokyčių, ištiriami vis ų kitų dozių grupių gyvūnai. 
Turėtų būti ištirti visi makroskopiniai pakitimai.  
Jei naudojama pagalbin ė grupė, turi būti atliekamas t ų audinių ir 
organų, kurie paveikti medžiag ą gavusiose grup ėse, histopatologinis 
tyrimas.  
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
2.1. DUOMENYS  
Turi būti pateikti kiekvieno gyv ūno duomenys. Papildomai visi 
duomenys turi b ūti apibendrinami lentel ėse, kiekvienai bandymo 
grupei nurodomas bandymo pradžioje tur ėtų gyvūnų skaičius, darant 
bandymą rastų nugaišusi ų ar dėl gyvūnų gerovės priežasčių numa­
rintų gyvūnų skaičius ir kiekvienos ž ūties ar numarinimo d ėl gyvūnų 
gerovės priežasčių laikas, gyv ūnų su toksiškumo požymiais skai čius, 
stebimų toksiškumo požymi ų aprašymas, įskaitant kiekvieno toksiš ­
kumo poveikio atsiradimo moment ą, trukmę ir sunkum ą, gyvūnų su 
organų pakitimais skai čių, pakitimų tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo 
pakitimais procentin ę dalį. 
Jei tinka, skaitmeniniai rezultatai turi b ūti įvertinti atitinkamu ir 
plačiai taikomu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei 
skirti duomenys turi b ūti pasirinkti planuojant bandym ą. 
2.2. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena, grynumas ir fizikin ės ir chemin ės savybės, 
— tapatumas,  
— nešiklis (jei naudojamas): nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei 
nešiklis ne vanduo.  
2.2.2.  Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir veisl ė, 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, maistas ir t. t.,  
— kiekvieno gyv ūno masė bandymo pradžioje.  
2.2.3.  Bandymo s ąlygos:  
— dozės dydžio parinkimo pagrindimas,  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos/preparato 
ruošimą, jo dėjimą į maistą, gautą koncentracij ą, preparato stabi ­
lumą ir vienalytiškum ą, 
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos davimo b ūdą, 
— tikrosios doz ės (mg/kg k ūno masės/parai) ir bandomosios 
medžiagos koncentracijos maiste/geriamajame vandenyje (ppm) 
perskaičiavimo į tikrąją dozę faktorius, jei naudojamas,  
— išsami informacija apie maisto ir vandens kokyb ę. 
2.2.4.  Rezultatai:  
— kūno masė ir kūno masės pokyčiai, 
— maisto ir vandens suvartojimas, jei aktualu,  
— toksinio atsako duomenys pagal lyt į ir dozę, įskaitant toksiškumo 
požymius,  
— atliekant klinikinius steb ėjimus pasteb ėto poveikio pob ūdis, 
sunkumas ir trukm ė (grįžtamojo pob ūdžio ar ne),  
— oftalmologinio tyrimo rezultatai,  
— hematologiniai bandymai su atitinkamomis pamatin ėmis 
vertėmis, 
— klinikiniai biocheminiai bandymai su atitinkamomis pamatin ėmis 
vertėmis, 
— kūno masė numarinant, organ ų masė ir organo/k ūno masės 
santykis,  
— nekroskopijos duomenys,  
— išsamus vis ų histopatologinio tyrimo rezultat ų aprašymas,  
— statistinis rezultat ų apdorojimas, jei daromas.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  POŪMIS TOKSIŠKUMAS PER OD Ą. 90 DIEN Ų KARTOTINI Ų 
DOZIŲ TOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandomoji medžiaga uždedama nustatytomis doz ėmis ant keleto 
eksperimentini ų grupių gyvūnų odos paviršiaus, vien ą dozę duodant 
vienos grup ės gyvūnams 90 dien ų. Uždedant medžiag ą, gyvūnai 
stebimi kiekvien ą dieną tam, kad b ūtų nustatomi toksiškumo požy ­
miai. Darant bandym ą nugaišę ar numarinti gyv ūnai skrodžiami, o 
baigus bandym ą išlikę gyvūnai taip pat numarinami ir skrodžiami.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
1.6.1.  Pasiruošimas bandymui  
Prieš bandym ą gyvūnai mažiausiai 5 dienas yra laikomi ir šeriami 
eksperimentin ėmis sąlygomis. Prieš pradedant bandym ą sveiki jauni 
gyvūnai atsitiktinai atrenkami ir suskirstomi į bandomąją bei kontro ­
linę grupes. Prieš pat bandym ą nuo bandom ųjų gyvūnų nugaros 
nukerpamas kailis. Kail į galima ir nuskusti, ta čiau tai reik ėtų atlikti 
likus vienai parai iki bandymo pradžios. Paprastai kartotinis nukir ­
pimas ar nuskutimas atliekamas kas savait ę. Kai kailis kerpamas arba 
skutamas, reikia stengtis nesubraižyti odos. Bandomajai medžiagai 
uždėti turėtų būti nukerpama ne mažiau kaip 10 % k ūno paviršiaus. 
Sprendžiant, nuo kokio dydžio ploto pašalinti kail į, turėtų būti atsiž­
velgiama į gyvūno kūno svorį, ir į apdangalo dyd į. Tiriant kiet ąsias 
medžiagas, kurios prireikus gali b ūti sutrinamos į miltelius, jos 
sudrėkinamos vandeniu arba, jei b ūtina, kitu tinkamu nešikliu tam, 
kad būtų užtikrintas geras bandomosios medžiagos ir odos s ąlytis. 
Skystosios bandomosios medžiagos paprastai naudojamos neskiestos. 
Medžiagos paprastai dedamos kasdien 5–7 kartus per savait ę. 
1.6.2.  Bandymo s ąlygos  
1.6.2.1.  Eksperimentiniai gyv ūnai 
Gali būti naudojama suaugusi žiurk ė, triušis ar j ūrų kiaulytė. Gali 
būti naudojamos kitos r ūšys, bet j ų naudojimas tur ėtų būti pagrin­
džiamas.. Bandymo pradžioje naudojam ų gyvūnų svorio intervalas 
turėtų būti ne daugiau kaip ± 20 % atitinkamo vidutinio svorio. Jei 
prieš ilgalaik į bandym ą atliekamas pusiau ūmus odos bandymas, 
abiejų bandym ų metu reik ėtų naudoti tos pa čios rūšies ar veisl ės 
gyvūnus. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
1.6.2.2.  Skai čius ir lytis  
Kiekvieno dydžio doz ė bandoma su ne mažiau 10 gyv ūnų (penkios 
patelės ir penki patin ėliai), turin čių sveiką odą. Patelės turėtų būti 
neturėjusios palikuoni ų ir neapvaisintos. Jeigu numatoma, kad 
bandymo eigoje dal į gyvūnų teks numarinti, pradinis j ų skaičius 
atitinkamai padidinamas. Be to, papildomai 20 gyv ūnų grupei (po 
dešimt kiekvienos lyties) galima skirti didel ę medžiagos doz ę 90 
dienų ir 28 dienas po veikimo medžiaga steb ėti toksinio poveikio 
grįžtamumą, pastovum ą ar uždelst ą pasireiškim ą. 
1.6.2.3.  Dozės 
Turėtų būti išbandomos mažiausiai 3 bandomosios medžiagos doz ės, 
ir turi būti kontrolin ė grupė arba nešiklio kontrolin ė grupė, jei naudo ­
jamas nešiklis. Gyv ūnai turi b ūti veikiami medžiaga bent 6 valandas 
per dieną. Bandomoji medžiaga tur ėt būti uždedama panašiu laiku 
kiekvieną dieną ir tam tikrais intervalais (kas savait ę arba kas dvi 
savaites) pakoreguojama taip, kad gyv ūno kūno svorio atžvilgiu b ūtų 
išlaikoma pastovi doz ė. Su kontrolin ės grupės gyvūnais reikia elgtis 
lygiai taip pat kaip ir su bandomaisiais gyv ūnais, išskyrus tai, kad jie 
negauna bandomosios medžiagos. Jei siekiant lengviau dozuoti 
medžiagą naudojamas nešiklis, kontrolin ės grupės gyvūnai veikiami 
nešikliu taip pat kaip bandomieji gyv ūnai; jie turi gauti tok į patį 
nešiklio kiek į, kokį gavo didžiausios doz ės grupės gyvūnai. 
Didžiausia doz ė turėtų būti tokia, kad sukelt ų toksinį poveikį, bet 
nesukeltų gyvūnų žūties (arba tik nedidel į gaištamum ą). Mažiausia 
dozė turėtų būti tokia, kad neb ūtų pastebėta jokių toksiškumo 
požymių. Jeigu yra tinkamas poveikio žmogui įvertinimas, mažiausia 
dozė turėtų būti šiek tiek didesn ė už poveikio žmogui doz ę. Būtų 
geriausia, jeigu vidurin ė dozė būtų tokia, kad sukelt ų mažiausi ą 
pastebimą toksinį poveikį. Jeigu naudojama daugiau tarpini ų dozių, 
jos turėtų būti išskirstomos taip, kad toksinis poveikis b ūtų laips­
niškas. Maž ų ir tarpini ų dozių bei kontrolin ėje grupėse gaištamumas 
turėtų būti nedidelis, kad b ūtų galima prasmingai įvertinti rezultatus.  
Jeigu bandomoji medžiaga, kuria veikiama, ypa č suerzina od ą, tai 
reikėtų sumažinti jos koncentracijas ir šitai galb ūt susilpnint ų 
medžiagos, duodamos didele doze, sukeliamus toksinius poveikius 
arba šie visai išnykt ų. Jei oda buvo ypa č pažeista, tai reikia tu čtuojau 
nutraukti bandym ą ir pradėti naują, naudojant mažesnes bandomosios 
medžiagos koncentracijas.  
1.6.3.  Ribinis bandymas  
Jeigu preliminarus bandymas naudojant 1 000 mg/kg doz ę arba 
didesnę dozę, susijusi ą su tikėtinu žmogaus s ąlyčiu su bandom ąja 
medžiaga, jeigu toks žinomas, nesukelia aiškaus toksinio poveikio, 
tolimesnis bandymas n ėra būtinas.  
1.6.4.  Steb ėjimų laikotarpis  
Bandomieji gyv ūnai turėtų būti stebimi kiekvien ą dieną, registruojant 
toksiškumo požymius. Reikia nurodyti nugaišimo bei toksiškumo 
požymių pasireiškimo ir išnykimo laik ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
1.6.5.  Bandymo eiga  
Gyvūnai turėtų būti laikomi atskiruose narveliuose. Gyv ūnai 
veikiami bandom ąja medžiaga 90 dien ų, geriausia – septynis kartus 
per savait ę. 
Gyvūnai, esantys bet kurioje pagalbin ėje grupėje ir skirti v ėlesniems 
stebėjimams, tur ėtų būti laikomi dar 28 dienas, neveikiant j ų 
medžiaga, kad b ūtų galima nustatyti, ar gyv ūnai atsigauna po 
toksinio poveikio, ar jis išlieka. Veikimas medžiaga tur ėtų trukti 
šešias valandas per dien ą. 
Bandomoji medžiaga tur ėtų būti tvarkingai uždedama ant odos pavir ­ 
šiaus plotelio, sudaran čio apie 10 % viso k ūno paviršiaus ploto. Jei 
bandomos ypa č toksiškos medžiagos, odos plotas, ant kurio dedama 
medžiaga, gali b ūti mažesnis, ta čiau kuo daugiau jo reikia padengti 
kuo plonesniu ir vienodesniu medžiagos sluoksniu.  
Veikimo metu bandomoji medžiaga tur ėtų liestis su oda akytu marl ės 
tvarsčiu ir nedirginan čia lipnia juostele. Bandomoji vieta tur ėtų būti 
papildomai tinkamai uždengta, kad marl ės tvarstis ir bandomoji 
medžiaga laikyt ųsi bei b ūtų užtikrinama, kad gyv ūnai nepraris 
bandomosios medžiagos. Gali b ūti naudojami ribotuvai, kad bando ­
moji medžiaga neb ūtų praryjama, bet visiško imobilizavimo metodas 
nerekomenduojamas.  
Veikimo pabaigoje nuo odos, j ą plaunant vandeniu ar kokiu kitu 
atitinkamu valymo b ūdu, turėtų būt pašalintas bandomosios 
medžiagos likutis.  
Visi gyv ūnai turėtų būti stebimi kiekvien ą dieną ir registruojami 
toksiškumo požymiai, įskaitant j ų pasireiškimo pradži ą, laipsnį bei 
trukmę. Stebint narveliuose laikomus gyv ūnus, reikia registruoti odos 
ir kailio, aki ų ir gleivin ės pasikeitimus, taip pat kv ėpavimo, kraujo, 
autonomin ės ir centrin ės nervų sistemų ir somatomotorinio aktyvumo 
ir elgsenos pasikeitimus. Kiekvien ą savaitę reikėtų įvertinti pašaro 
suvartojim ą bei pasverti gyv ūnus. Reguliarus gyv ūnų stebėjimas 
svarbus siekiant užtikrinti, jog bandymo metu neb ūtų prarandama 
gyvūnų dėl tokių priežasčių kaip kanibalizmas, audini ų autolizė ar 
narvo pastatymas netinkamoje vietoje. Pasibaigus bandymui visi lik ę 
gyvi bandom ųjų grupių gyvūnai, nepriskirti pagalbinei grupei, numa ­
rinami ir skrodžiami. Kai pastebimi gaištantys gyv ūnai, jie pašali ­
nami iš bandymo ir skrodžiami.  
Paprastai visi gyv ūnai, įskaitant ir kontrolin ės grupės gyvūnus, yra 
tiriami šitaip:  
a) prieš pradedant duoti bandom ąją medžiagą ir bandymo pabaigoje 
turi būti daromas, pageidautina vis ų, bet jei ne įmanoma, tai bent 
didžiausios doz ės ir kontrolin ės grupių gyvūnų oftalmologinis 
tyrimas naudojant oftalmoskop ą ar lygiavert ę tinkamą įrangą. 
Jei nustatomi aki ų pakitimai, turi b ūti ištirti visi gyv ūnai. 
b) bandymo pabaigoje, reik ėtų įvertinti tokius hematologinius rodik ­
lius kaip hematokritas, hemoglobino koncentracija, eritrocit ų 
skaičius, absoliutus bei skirting ų populiacij ų leukocitų skaičius 
ir įvertinti kreš ėjimo potencial ą, remiantis tokiais kriterijais, kaip 
krešėjimo trukme, protrombino ir tromboplastino susidarymo 
trukmė arba kraujo plokšteli ų (trombocit ų) skaičius. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) bandymo pabaigoje reik ėtų atlikti klinikinius biocheminius 
tyrimus. Atliekant šiuos tyrimus, reik ėtų, jei reikalinga, nustatyti 
elektrolitų balansą, angliavandeni ų metabolizm ą bei įvertinti 
kepenų ir inkstų veiklą. Parenkant specifinius tyrimus, reik ėtų 
atsižvelgti į pastebėtus bandomosios medžiagos veikimo b ūdus. 
Siūloma nustatyti kalc į, fosforą, chlorą, natrį, kalį, badavimo 
metu susidaran čią gliukozę (atsižvelgiant į konkrečiai gyvūnų 
rūšiai/veislei tinkam ą badavimo laikotarp į), serumo glutamato 
piruvato transaminaz ę ( 1 ), serumo glutamato oksalacetato trans ­
aminazę ( 2 ), ornitino dekarboksilaz ę, gama glutamilo transpepti ­
dazę, šlapale esant į azotą, albumin ą, bendrą bilirubino, esan čio 
kraujo kreatinine, kiek į bei atlikti serumo baltym ų bendro kiekio 
nustatymą. Siekiant tinkamai įvertinti toksin į poveikį, gali reik ėti 
atlikti lipid ų, hormonų rūgščių/šarmų balanso, methemoglobino ir 
cholinesteraz ės aktyvumo tyrimus. Papildomi biocheminiai 
tyrimai gali b ūti atliekami tuo atveju, kai b ūtina išsamiau išna ­
grinėti nustatytus reiškinius.  
d) šlapimo analiz ės paprastai atlikti nereikia, nebent j ą reikia atlikti 
atsižvelgiant į numatom ą ar pasteb ėtą toksinį poveikį. 
Jeigu nėra tinkam ų pamatini ų anksčiau atliktų bandymų duomenų, 
prieš pradedant medžiagos dozavim ą reikėtų apsvarstyti hematologi ­
nius ir klinikinius biocheminius parametrus.  
1.6.6.  Bendroji nekroskopija  
Turėtų būti atlikta visapusiška bendra vis ų gyvūnų nekroskopija, 
kurios metu tiriamas k ūno išorinis paviršius, visos angos, kiaušo, 
krūtinės ir pilvo ertm ės bei jų turinys. Po nekroskopijos kuo skubiau 
(kad neišdži ūtų) pasveriamos dar dr ėgnos kepenys, inkstai, anti ­
nksčiai ir sėklidės. Galimiems v ėlesniems histopatologiniams tyri ­
mams tur ėtų būti tinkamoje terp ėje išsaugomi tokie audiniai ir 
organai: visi esminiai pažeidimai, smegenys – įskaitant pailg ųjų 
smegenų/smegenų tilto pjūvius, smegen ėlių ir smegen ų žievę, hipo­
fizė, tiroidinė/paratiroidin ė liauka, bet koks užkr ūčio liaukos audinys, 
(trachėja), plaučiai, širdis, aorta, seili ų liaukos, kepenys, blužnis, 
inkstai, antinks čiai, kasa, lytin ės liaukos, gimda (pagalbiniai lytiniai 
organai), tulžies p ūslė (jei yra), stempl ė, skrandis, dvylikapiršt ė 
žarna, tuš čioji žarna, klubin ė žarna, akloji žarna, tiesioji žarna, ries ­
toji žarna, šlapimo p ūslė, pagrindinis (didysis) limfmazgis, (pateli ų 
pieno liauka), (šlaunies raumenynas), periferinis nervas, (akys), 
(krūtinkaulis su kaul ų čiulpais), (šlaunikaulis, įskaitant ir segmentin į 
paviršių), (stuburo smegenys trimis lygiais – sprando, kr ūtinės ląstos 
ir juosmens) ir (ašar ų liaukos). Audinius, pamin ėtus skliausteliuose, 
reikia tirti tik jei to reikia atsižvelgiant į nustatytą toksinį poveikį 
arba nustatyt ą toksinį poveikį konkrečiam organui.  
1.6.7.  Histopatologinis tyrimas  
a) reikėtų visapusiškai histopatologiškai ištirti kontrolin ės grupės ir 
tos grupės, kuriai duodama didel ė medžiagos doz ė, gyvūnų odą ir 
organus,  
b) reikėtų ištirti visus pagrindinius pažeidimus,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Dabar žinoma kaip serumo alanino aminotransferaz ė. 
( 2 ) Dabar žinoma kaip serumo aspartato aminotransferaz ė.
 c) reikėtų ištirti tuos kitas dozes gavusi ų gyvūnų organus, kurie 
paveikti medžiagos,  
d) jei naudojamos žiurk ės, reikėtų histopatologiniu aspektu ištirti 
gyvūnų, kurie veikiami mažomis ir tarpin ėmis medžiagos 
dozėmis, plau čius siekiant įsitikinti, jog jie n ėra užkrėsti, nes 
šituo remiantis nesunkiai galima įvertinti gyv ūnų sveikatos 
būklę. Kitų histopatologini ų tyrimų šių grupių gyvūnams atlikti 
nereikia, ta čiau jei didel ę dozę gavusių gyvūnų tam tikri organai 
yra paveikti, tuos pa čius organus reikia ištirti ir šiose grup ėse. 
e) kai naudojama pagalbin ė grupė, reikia atlikti audini ų ir organ ų, 
kuriuose, tiriant kitas gyv ūnų grupes, paveiktas bandom ąja 
medžiaga, buvo pasteb ėti medžiagos sukelti poveikiai, histopato ­
loginę analizę. 
2. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti pateikiami apibendrintai, pasitelkiant lenteles, 
kuriose nurodomas kiekvienos bandomosios grup ės gyvūnų skaičius 
bandymo pradžioje, gyv ūnų, kuriuose buvo pasteb ėti pažeidimai, 
skaičius, pažeidim ų tipai bei gyv ūnų, kuriuose pasireišk ė kiekvieno 
tipo pažeidimai, skai čius, išreikštas procentais. Rezultatus reik ėtų 
vertinti atitinkamu statistiniu metodu. Galima naudoti bet kok į visuo­
tinai pripažint ą statistinį metodą. 
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Jei įmanoma, bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— rūšis, veislė, šaltinis, aplinkos s ąlygos, pašaras,  
— bandymo s ąlygos,  
— dozės dydžiai ( įskaitant nešikl į, jei šis buvo naudojamas) ir 
koncentracijos,  
— duomenys apie toksin į atsaką pagal tirt ą lytį ir duotą dozę, 
— jei įmanoma, doz ės dydis, kuriam esant nepasteb ėta jokio 
neigiamo poveikio,  
— nugaišimo laikas bandymo metu arba informacija, kad gyv ūnai 
išgyveno iki bandymo pabaigos,  
— toksinio ir kitokio poveikio apib ūdinimas (ypa č atkreipiant 
dėmesį į klinikini ų tyrimų duomenis),  
— kiekvienos anomalijos pasteb ėjimo laikas ir tolesn ė eiga,  
— duomenys apie pašar ą bei kūno masę, 
— oftalmologini ų stebėjimų rezultatai,  
— naudoti hematologiniai tyrimai ir j ų metu gauti rezultatai,  
— naudoti klinikin ės biochemijos tyrimai ir j ų metu gauti visi 
(įskaitant bet kurios šlapimo analiz ės) duomenys,  
— nekroskopijos metu gauti duomenys,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— visų histopatologini ų tyrimų metu gaut ų duomenų išsamus apib ū­
dinimas,  
— rezultat ų statistinė analizė, jei įmanoma,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  PUSIAU L ĖTINIS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS. 90 DIEN Ų 
TYRIMAS  
SANTRAUKA  
Šis atnaujintasis B.29 bandymo metodas parengtas tam, kad b ūtų galima išsamiai 
apibūdinti pusiau l ėtinį bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą, pasireiš­
kiantį 90 dienų laikotarpiu duodant doz ę per kvėpavimo takus, ir gauti patikim ų 
duomenų, reikaling ų kiekybiniams inhaliacin ės rizikos vertinimams. 10 patin ų ir 
10 patelių grupės 90 dien ų (13 savai čių) laikotarpiu šešias valandas per par ą 
veikiamos a) bandom ąja chemine medžiaga, taikant tris arba daugiau koncentra ­
cijos lygi ų, b) išvalytu oru (neigiama kontrol ė) ir (arba) c) nešikliu (nešiklio 
kontrolė). Paprastai gyv ūnai veikiami penkias dienas per savait ę, tačiau galima 
taikyti ir septyni ų dienų per savait ę poveikį. Bandymai visada atliekami ir su 
patinais, ir su patel ėmis, tačiau, jeigu žinoma, kad kurios nors lyties gyv ūnai yra 
jautresni tam tikrai bandomajai cheminei medžiagai, patinams ir patel ėms gali 
būti taikomi skirtingi koncentracijos lygiai. Šis metodas tyrimo vadovui suteikia 
lanksčią galimybę įtraukti pagalbines (gr įžtamumo tyrim ų) grupes, taikyti numa ­
rinimą nebaigus bandymo, bronchoalveolin į plovimą (BAP), atlikti neurologinius 
tyrimus ir papildomus klinikinius patologinius bei histopatologinius tyrimus, kad 
būtų galima geriau apib ūdinti bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą. 
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ 413 (OECD 
bandymo gair ės Nr. 413) (2009). Originalios pusiau l ėtinio toksiškumo 
įkvėpus bandym ų gairės „Test Guideline“ 413 (TG 413) priimtos 1981 m. 
(1). Šis (B.29) bandymo metodas (lygiavertis atnaujintosioms TG 413 
(2009)) atnaujintas siekiant j į suderinti su mokslo pasiekimais ir patenkinti 
dabartines ir b ūsimas reglamentavimo reikmes.  
2. Pusiau l ėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimai pirmiausia atliekami siekiant 
nustatyti reglamentavimo tikslais taikytinas koncentracijas, skirtas įvertinti 
darbo aplinkoje darbuotojams gresian čią riziką. Be to, jie atliekami siekiant 
įvertinti žmoni ų gyvenamosiose vietose gresian čią riziką, transportavimo 
riziką ir aplinkosaugin ę riziką. Šis metodas suteikia galimyb ę apibūdinti 
neigiamą poveikį, sukeltą 90 dienų (apie 10 % žiurk ės gyvenimo trukm ės) 
kasdien per kv ėpavimo takus duodant kartotin ę bandomosios chemin ės 
medžiagos doz ę. Atlikus pusiau l ėtinio toksiškumo įkvėpus tyrimus gauti 
duomenys gali b ūti naudojami atliekant kiekybinius rizikos vertinimus ir 
parenkant per l ėtinio poveikio tyrimus taikytinas koncentracijas. Šis 
bandymo metodas n ėra specialiai skirtas nanomedžiag ų bandymams. Apra ­ 
šant šį bandymo metod ą vartojamos apibr ėžtys pateiktos šio skyriaus pabai ­
goje ir rekomendaciniame dokumente (RD) Nr. 39 (2).  
PIRMINIAI ASPEKTAI  
3. Siekdama užtikrinti aukštesn ę tyrimo kokyb ę ir kaip galima labiau sumažinti 
gyvūnų naudojim ą, bandym ų laboratorija, prieš atlikdama tyrim ą, turėtų 
įvertinti vis ą turimą informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiag ą. Pasi­
rinkti tinkamas bandym ų koncentracijas gali pad ėti informacija apie bando ­
mosios chemin ės medžiagos tapatum ą, chemin ę struktūrą, fizines ir 
chemines savybes, taip pat toksiškumo bandym ų in vitro  arba  in vivo  rezul­
tatai, numatomas (-i) panaudojimo b ūdas (-ai) ir galimas poveikis žmogui, 
turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struk ­
tūros chemines medžiagas, taip pat duomenys, gauti atlikus kitus kartotinio 
poveikio tyrimus. Jeigu yra tik ėtinas arba jeigu atliekant tyrim ą pastebimas 
neurotoksinis poveikis, tyrimo vadovas gali nuspr ęsti įtraukti atitinkamus 
vertinimus, pvz., funkcini ų stebėjimų rinkinį (FSR) ir jud ėjimo aktyvumo 
vertinimą. Nors gali b ūti labai svarbu užtikrinti tinkam ą su konkre čiais 
tyrimais susijusi ų dozių davimo laik ą, ši papildoma veikla netur ėtų trukdyti 
įgyvendinti pagrindinio tyrimo plan ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Ėsdinančių arba dirginan čių bandomųjų cheminių medžiagų tirpalai gali b ūti 
bandomi taikant koncentracijas, kurioms esant pasiekiamas reikiamas toksiš ­
kumo lygis. Daugiau informacijos pateikta RD Nr. 39 (2). Ta čiau veikiant 
gyvūnus šiomis medžiagomis taikytinos tikslin ės koncentracijos tur ėtų būti 
gana mažos, kad nesukelt ų ženklaus skausmo ir kan čių, bet pakankamos, 
kad būtų galima prat ęsti koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklauso ­
mybės kreivę iki tokių lygių, kuriems esant b ūtų pasiektas reglamentavimo 
arba mokslinis tikslas, kurio siekiama bandymu. Šios koncentracijos tur ėtų 
būti parenkamos atsižvelgiant į konkretų atvejį ir, pageidautina, remiantis 
tinkamai suplanuotu rib ų nustatymo tyrimu, suteikian čiu informacijos apie 
pavojingas pasekmes, dirginimo ribin ę vertę ir poveikio pasireiškimo laik ą 
(žr. 11–13 skirsnius). Tur ėtų būti pateiktas koncentracijos pasirinkimo 
pagrindimas.  
5. Gaištantys gyv ūnai arba skausm ą ar sunkias ilgalaikes kan čias akivaizdžiai 
patiriantys gyv ūnai turėtų būti humaniškai numarinami. Gaištantys gyv ūnai 
laikomi atliekant bandym ą nugaišusiais gyv ūnais. Sprendimo numarinti gaiš ­
tančius arba sunkiai ken čiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos 
arba neišvengiamos ž ūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti OECD 
rekomendaciniame dokumente d ėl pasekmi ų žmonėms (3).  
METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
6. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų labora­
torinių padermių graužikai. Tinkamiausia r ūšis yra žiurk ės. Jeigu naudojama 
kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.  
Gyvūnų paruošimas  
7. Patel ės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Atsitiktin ės atrankos dien ą 
gyvūnai turėtų būti jauni, bet suaug ę, 7–9 savai čių amžiaus. K ūno masė 
pagal kiekvien ą lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti vidutin ę tos lyties 
gyvūnų masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka, paženklinami, kad 
būtų įmanoma identifikuoti kiekvien ą gyvūną, ir ne mažiau kaip penkias 
paras iki bandymo pradžios laikomi savo narveliuose, kad priprast ų prie 
laboratorini ų sąlygų. 
Gyvūnų laikymas  
8. Kad b ūtų patogiau steb ėti ir kad b ūtų išvengta painiavos, kiekvienas 
gyvūnas turėtų būti išskirtinai paženklintas, pageidautina, naudojant poodi ­
nius atsakiklius. Bandom ųjų gyvūnų laikymo patalpos temperat ūra turėtų 
būti 22 ± 3 °C. Tinkamiausias santykinis dr ėgnis – 30–70 %, bet jis gali 
būti nepasiekiamas, jeigu naudojamas nešiklis yra vanduo. Prieš doz ės 
davimą ir davus doz ę gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirstyti 
grupėmis pagal lyt į ir koncentracij ą; narvelyje laikom ų gyvūnų skaičius 
turėtų būti toks, kad b ūtų galima aiškiai steb ėti kiekvien ą gyvūną ir kad 
būtų patiriama kuo mažiau žalos d ėl kanibalizmo ir grumtyni ų. Jeigu doz ė 
gyvūnams duodama tik per nos į, gali reik ėti juos pripratinti prie uždarom ųjų 
vamzdelių. Uždaromieji vamzdeliai gyv ūnams netur ėtų kelti didel ės fizinės, 
terminės arba suvaržymo įtampos. Varžymas gali tur ėti fiziologini ų 
pasekmių, pvz., tur ėti poveikio k ūno temperat ūrai (hipertermija) ir (arba) 
per minut ę įkvepiamam t ūriui. Jeigu yra bendr ųjų duomenų, rodančių, kad 
tokių pastebim ų pokyčių neįvyksta, pripratinimas prie uždarom ųjų vamz­
delių nebūtinas. Gyv ūnai, kurių visas kūnas veikiamas aerozoliu, poveikio 
laikotarpiu tur ėtų būti laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis neb ūtų 
filtruojamas per kit ų narvelyje esan čių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laiko ­
tarpį, gyvūnams šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas 
pašaras, duodant neribot ą geriamo vandens kiek į. Apšvietimas tur ėtų būti 
dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sek ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Inhaliacin ės kameros  
9. Parenkant inhaliacin ę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios 
cheminės medžiagos pob ūdį ir bandymo tiksl ą. Pirmenyb ė teikiama doz ės 
davimui tik per nos į (ši sąvoka apima s ąvokas „tik per galv ą“, „tik per nos į“ 
ir „tik per šnip ą“). Pirmenyb ė dozės davimui tik per nos į paprastai teikiama 
tiriant skyst ųjų arba kiet ųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali konden ­
suotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali b ūti sėkmingiau 
pasiekti taikant poveikio per vis ą kūną metodą, tačiau tai turi b ūti pagrįsta 
tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovum ą naudojant 
poveikio per vis ą kūną kamerą, visa bandom ųjų gyvūnų užimama erdv ė 
turėtų neviršyti 5 % kameros t ūrio. Poveikio tik per nos į ir poveikio per 
visą kūną metodų principai ir konkret ūs šių metodų privalumai bei tr ūkumai 
aprašyti RD Nr. 39 (2).  
TOKSIŠKUMO TYRIMAI  
Ribinės koncentracijos  
10. Kitaip nei ūmaus poveikio tyrimams, pusiau l ėtinio toksiškumo įkvėpus 
tyrimams ribini ų koncentracij ų nenustatyta. Didžiausioji bandytina koncent ­
racija tur ėtų būti nustatoma atsižvelgiant į šiuos dalykus: 1) didžiausi ąją 
pasiekiam ą koncentracij ą, 2) „blogiausiu atveju“ taikytin ą poveikio 
žmonėms lygį, 3) poreik į užtikrinti tinkam ą deguonies tiekim ą ir (arba) 4) 
gyvūnų gerovės aspektus. Jeigu n ėra duomenimis pagr įstų ribų, gali būti 
taikomos Reglamente (EB) Nr. 1272/2008 (13) nustatytos ūmaus poveikio 
ribos (t. y. neviršijant 5 mg/l koncentracijos, jeigu tai aerozoliai, 20 mg/l, 
jeigu tai garai, ir 20 000 ppm, jeigu tai dujos); žr. RD Nr. 39 (2). Jeigu 
atliekant duj ų arba labai laki ų bandom ųjų chemini ų medžiag ų (pvz., 
šaldymo medžiag ų) bandymus b ūtina viršyti šias ribas, turi b ūti pateiktas 
pagrindimas. Ribin ė koncentracija tur ėtų sukelti akivaizd ų toksiškum ą nesu­
keldama pernelyg didelio streso gyv ūnams ir netrumpindama j ų gyvenimo 
trukmės (3).  
Ribų nustatymo tyrimas  
11. Prieš pradedant pagrindin į tyrimą, dažniausiai gali reik ėti atlikti rib ų nusta­
tymo tyrim ą. Ribų nustatymo tyrimas yra išsamesnis už orientacin į tyrimą, 
nes jis susij ęs ne tik su koncentracij ų parinkimu. Per rib ų nustatymo tyrim ą 
gautos žinios gali pad ėti sėkmingai atlikti pagrindin į tyrimą. Pvz., rib ų 
nustatymo tyrimas gali suteikti technin ės informacijos apie analiz ės 
metodus, daleli ų dydžius, toksinio poveikio mechanizm ų nustatym ą, klini­
kinės patologijos ir histopatologini ų tyrimų duomenis ir apytikrius verti ­
nimus, koks NNPL ir kokia didžiausioji leidžiama koncentracija (DLK) galėtų būti taikomi atliekant pagrindin į tyrimą. Tyrimo vadovas gali 
nuspręsti atlikti rib ų nustatymo tyrim ą, kad nustatyt ų kvėpavimo tak ų dirgi­
nimo ribin ę vertę (pvz., atliekant histopatologin į kvėpavimo tak ų tyrimą, 
plauč
ių funkcijos tyrimus arba bronchoalveolin į plovimą), didžiausi ąją 
koncentracij ą, kuri būtų leidžiama kaip nesukelianti pernelyg didelio streso 
gyvūnams, ir parametrus, kuriais b ūtų geriausiai apib ūdinamas bandomosios 
cheminės medžiagos toksiškumas.  
12. Ribų nustatymo tyrimas gali b ūti atliekamas taikant vien ą arba daugiau 
koncentracijos lygi ų. Atsižvelgiant į pasirinktas pasekmes, kiekvien ą 
koncentracijos lyg į atitinkanti doz ė duodama šešiems patinams ir trims–še ­ 
šioms patel ėms. Ribų nustatymo tyrimas tur ėtų trukti ne mažiau kaip 
penkias dienas, bet paprastai – ne ilgiau kaip 28 dienas. Tyrimo ataskaitoje turėtų būti pateiktas per pagrindin į tyrimą taikytinų koncentracij ų parinkimo 
pagrindimas. Pagrindinio tyrimo tikslas – įrodyti koncentracijos ir reakcijos 
tarpusavio priklausomyb ę remiantis numanoma sunkiausia pasekme. Tinka ­
miausia mažiausioji koncentracija – nepastebimo neigiamo poveikio lygio koncentracija, didžiausioji – akivaizd ų toksiškum ą sukelianti koncentracija, 
nesukelianti pernelyg didelio streso gyv ūnams ir netrumpinanti j ų gyvenimo 
trukmės (3)
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Parenkant per rib ų nustatymo tyrim ą taikytinus koncentracijos lygius, tur ėtų 
būti atsižvelgiama į visą turimą informacij ą, įskaitant strukt ūros ir savybi ų 
ryšius ir duomenis apie panašias chemines medžiagas (žr. 3 skirsn į). Ribų 
nustatymo tyrimu gali b ūti patikrintos ir (arba) atmestos pasekm ės, kurios 
laikomos sunkiausiomis mechaniniu poži ūriu vertinamomis pasekm ėmis, 
pvz., cholinesteraz ės inhibavimas organiniais fosforo junginiais, methemo ­
globino susidarymas veikiant eritrocitotoksin ėms medžiagoms, skydliauk ės 
hormonų (T  3 , T 4 ) reakcija į tirotoksines medžiagas, poveikis baltymams, 
laktatdehidrogenazei arba neutrofilams atliekant bronchoalveolin į plovimą, 
siekiant pašalinti nekenksmingas prastai tirpstan čias daleles arba plau čius 
dirginančius aerozolius.  
Pagrindinis tyrimas  
14. Pagrindinis pusiau l ėtinio toksiškumo tyrimas paprastai atliekamas taikant 
tris koncentracijos lygius ir prireikus taikant vienalaik ę neigiamą kontrolę 
(naudojant or ą) ir (arba) nešiklio kontrol ę (žr. 18 skirsn į). Parenkant 
poveikio lygius tur ėtų būti pasitelkiami visi turimi duomenys, įskaitant siste ­
minio toksiškumo tyrim ų rezultatus, metabolizmo ir kinetini ų savybių 
duomenis (labai svarbu užtikrinti, kad neb ūtų taikomos tokios didžiausiosios 
koncentracijos, kuriomis b ūtų įsotinti kinetiniai procesai). Kiekviena bando ­
moji grup ė sudaroma iš dešimties graužik ų patinų ir dešimties pateli ų, kurie 
13 savaičių laikotarpiu (bendra tyrimo trukm ė ne trumpesn ė kaip 90 dien ų) 
penkias dienas per savait ę šešias valandas per par ą veikiami bandom ąja 
chemine medžiaga. Gyv ūnai gali b ūti veikiami ir septynias dienas per 
savaitę (pvz., tiriant įkvepiamus vaistus). Jeigu žinoma, kad kurios nors 
lyties gyv ūnai yra jautresni konkre čiai bandomajai cheminei medžiagai, 
siekiant nustatyti kuo tikslesn ę koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklau ­
somybę, kaip aprašyta 15 skirsnyje, skirting ų lyčių gyvūnams gali b ūti 
taikomi skirtingi koncentracijos lygiai. Jeigu naudojant kitos r ūšies grau ­ 
žikus nei žiurk ės dozė duodama tik per nos į, ilgiausia poveikio trukm ė 
gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti tos r ūšies gyvūnų patiriam ą 
kančią. Jeigu taikomas trumpesnis nei šeši ų valandų per par ą poveikis 
arba jeigu b ūtina atlikti ilgalaikio (pvz., 22 valand ų per parą) poveikio per 
visą kūną tyrimą, turėtų būti pateiktas atitinkamas pagrindimas (žr. RD 
Nr. 39) (2). Poveikio metu gyv ūnas neturėtų būti šeriamas, išskyrus atvejus, 
kai poveikio trukm ė ilgesnė kaip šešios valandos. Vandens gali b ūti 
duodama per vis ą poveikio per vis ą kūną laikotarp į. 
15. Turėtų būti nurodyta, kokiam organui (-ams) skirtos pasirinktos tikslin ės 
koncentracijos, ir taikant šias koncentracijas tur ėtų būti užtikrinta aiški 
koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ė: 
— taikant didžiausi ąją koncentracij ą turėtų būti padarytas toksinis poveikis, 
tačiau netur ėtų pasireikšti ilgalaiki ų požymių arba gyv ūnai netur ėtų 
nugaišti, nes tokiu atveju neb ūtų galima atlikti prasmingo vertinimo,  
— tarpinis (-iai) koncentracijos lygis (-iai) tur ėtų skirtis tiek, kad b ūtų 
galima nustatyti toksinio poveikio lygius tarp mažiausiosios ir didžiau ­
siosios koncentracijos,  
— taikant mažiausi ąją koncentracij ą neturėtų būti daroma toksinio poveikio 
ir neturėtų būti pastebima jo požymi ų. 
Numarinimas nebaigus bandymo  
16. Jeigu numatoma marinti gyv ūnus nebaigus bandymo, kiekvienam poveikio 
lygiui naudotinas gyv ūnų skaičius turėtų būti padidintas numatomu iki 
tyrimo pabaigos numarinti gyv ūnų skaičiumi. Tur ėtų būti pateiktas mari ­
nimo nebaigus tyrim ų taikymo pagrindimas; atliekant statistin ę analizę, 
turėtų būti tinkamai atsižvelgiama į numarinam ų gyvūnų skaičių. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Pagalbinis (gr įžtamumo) tyrimas  
17. Siekiant nustatyti toksinio poveikio gr įžtamumą, tvarum ą arba dels ą, 
reikiamos trukm ės, bet ne ilgesniu kaip 14 dien ų laikotarpiu po doz ės 
davimo gali b ūti atliekamas pagalbinis (gr įžtamumo) tyrimas. Pagalbin ės 
(grįžtamumo) grup ės sudaromos iš dešimties patin ų ir dešimties pateli ų, 
kurie per pagrindin į tyrimą veikiami kartu su bandomaisiais gyv ūnais. 
Pagalbinės (grįžtamumo) grup ės turėtų būti veikiamos didžiausi ąja bando­
mosios chemin ės medžiagos koncentracija; prireikus tur ėtų būti taikoma 
vienalaikė kontrolė naudojant or ą ir (arba) nešikl į (žr. 18 skirsn į). 
Kontroliniai gyv ūnai 
18. Su vienalaik ės neigiamos kontrol ės (naudojant or ą) gyvūnais turėtų būti 
elgiamasi taip pat, kaip su bandomosios grup ės gyvūnais, išskyrus tai, kad 
jie veikiami išvalytu oru, o ne bandom ąja chemine medžiaga. Jeigu siekiant 
palengvinti bandymo atmosferos suk ūrimą naudojamas vanduo arba kita 
cheminė medžiaga, atliekant tyrim ą naudojama nešiklio kontrol ės grupė, o 
ne neigiamos kontrol ės (naudojant or ą) grupė. Jeigu įmanoma, kaip nešiklis 
turėtų būti naudojamas vanduo. Jeigu kaip nešiklis naudojamas vanduo, 
kontroliniai gyv ūnai turėtų būti veikiami oru, kurio dr ėgnis turėtų būti 
toks pat, koks taikomas grup ėms, kurioms duodama doz ė. Tinkamas nešiklis 
turėtų būti parenkamas remiantis tinkamai atliktu išankstiniu tyrimu arba 
istoriniais duomenimis. Jeigu nešiklio toksiškumas n ėra gerai žinomas, 
tyrimo vadovas gali nuspr ęsti taikyti ir neigiam ą kontrolę (naudojant or ą), 
ir nešiklio kontrol ę, tačiau primygtinai rekomenduojama to nedaryti. Jeigu 
istoriniai duomenys rodo, kad nešiklis netoksiškas, neigiamos kontrol ės 
(naudojant or ą) grupės naudoti neb ūtina, turėtų būti taikoma tik nešiklio 
kontrolė. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos bandomosios chemin ės medžiagos 
išankstinį tyrimą nustatoma, kad medžiaga n ėra toksiška, vadinasi, ir 
nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, n ėra toksiškas, tod ėl turėtų būti taikoma 
kontrolė naudojant š į nešiklį. 
POVEIKIO S ĄLYGOS  
Koncentracij ų taikymas  
19. Gyvūnai veikiami bandom ąja medžiaga duj ų, garų, aerozoli ų arba jų mišinių 
pavidalu. Per tyrim ą naudotina fizin ė būsena priklauso nuo fizini ų ir 
cheminių bandomosios chemin ės medžiagos savybi ų, pasirinkt ų koncentra ­
cijų ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant 
bandomąją cheminę medžiag ą. Higroskopin ės ir chemiškai reaguojan čios 
bandomosios chemin ės medžiagos tur ėtų būti bandomos sauso oro s ąly­
gomis. Tur ėtų būti imamasi atsargumo priemoni ų, kad būtų išvengta sprogi ų 
koncentracij ų susidarymo. Iš daleli ų sudarytos medžiagos gali b ūti apdoro­
jamos mechaniškai, siekiant sumažinti daleli ų dydį. Daugiau patarim ų 
pateikta RD Nr. 39 (2).  
Dalelių dydžio pasiskirstymas  
20. Daleli ų rūšiavimas pagal dyd į turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir 
garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis b ūtų pada­
rytas visoms svarbioms kv ėpavimo tak ų sritims, rekomenduojama naudoti 
aerozolius, kuri ų masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 
1–3 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis ( σ g ) – 1,5–3,0 (4). Nors tur ėtų 
būti imamasi pagr įstų priemoni ų, kad šio standarto b ūtų laikomasi, jeigu jo 
įgyvendinti ne įmanoma, tur ėtų būti pateikta ekspert ų nuomonė. Pvz., metal ų 
garų dalelės bus mažesn ės už šį standartą, o įelektrintų dalelių ir pluošt ų – 
didesnės. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Bandomosios chemin ės medžiagos paruošimas nešiklyje  
21. Geriausia, kad bandomoji chemin ė medžiaga b ūtų bandoma nenaudojant 
nešiklio. Jeigu b ūtina naudoti nešikl į norint pasiekti reikiam ą bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracij ą ir užtikrinti reikiam ą dalelių dydį, pirme­
nybė turėtų būti teikiama vandeniui. Visuomet, kai bandomoji chemin ė 
medžiaga ištirpinama nešiklyje, tur ėtų būti įrodytas jos stabilumas.  
POVEIKIO S ĄLYGŲ STEBĖJIMAS  
Oro srautas kameroje  
22. Kiekvieno poveikio metu tur ėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas 
ir ne rečiau kaip kart ą per valand ą registruojamas per poveikio kamer ą 
tekantis oro srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pastovumo laiko atžvilgiu) steb ėjimas realiuoju laiku yra vienas 
iš visų dinamini ų parametr ų matavim ų, suteikiantis galimyb ę netiesiogiai 
kontroliuoti visus svarbius dinaminius inhaliacinius parametrus. Jeigu koncentracija stebima tiesiogiai, oro sraut ų matavimo dažnumas gali b ūti 
sumažintas iki vieno matavimo kiekvien ą dieną per kiekvien ą poveikio 
seansą. Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas tam, kad b ūtų išvengta 
pakartotinio įkvėpimo doz ės davimo tik per nos į kamerose. Deguonies 
koncentracija tur ėtų būti ne mažesn ė kaip 19 %, anglies dioksido – ne 
didesnė kaip 1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad šio standarto įgyvendinti 
neįmanoma, tur ėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncent ­
racijos. Jeigu pirm ąją poveikio dien ą atlikti matavimai rodo, kad ši ų dujų
 
lygiai yra tinkami, daugiau matavim ų atlikti neb ūtina. 
Kameros temperat ūra ir santykinis dr ėgnis 
23. Kameroje tur ėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperat ūra. Ir doz ę duodant tik 
per nosį, ir per vis ą kūną, jeigu įmanoma, per kiekvien ą poveikio seans ą 
turėtų būti nuolat stebimas ir kas valand ą registruojamas santykinis dr ėgnis 
gyvūnų kvėpavimo zonoje. Tinkamiausias santykinis dr ėgnis – 30–70 %, 
tačiau jis gali b ūti nepasiekiamas (pvz., bandant vandens pagrindo mišinius) 
arba neišmatuojamas d ėl trukdži ų, atsirandan čių bandomajai cheminei 
medžiagai taikant bandymo metod ą. 
Bandomoji chemin ė medžiaga. Vardin ė koncentracija  
24. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardin ė koncentra ­
cija poveikio kameroje. Vardin ė koncentracija yra sukurtos bandomosios 
cheminės medžiagos mas ės ir viso oro srauto, perleisto per inhaliacini ų 
kamerų sistemą, tūrio santykis. Vardin ė koncentracija n ėra naudojama 
apibūdinti poveik į gyvūnui, tačiau, vardin ę koncentracij ą palyginus su 
faktine, nustatomas generavimo, kur į užtikrina bandym ų sistema, efekty ­
vumas, kuriuo remiantis galima nustatyti generavimo problemas.  
Bandomoji chemin ė medžiaga. Faktin ė koncentracija  
25. Faktin ė koncentracija yra bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija, 
nustatyta pa ėmus ėminį iš inhaliacin ėje kameroje esan čios gyvūno kvėpa­
vimo zonos. Faktines koncentracijas galima nustatyti specialiaisiais metodais 
(pvz., taikant tiesioginio ėminių ėmimo, adsorbcijos arba chemini ų reakcijų 
metodus ir tada atliekant analizin į apibūdinimą) arba nespecialiaisiais meto ­
dais, pvz., atliekant gravimetrin ę analizę naudojant filtrus. Gravimetrin ė 
analizė gali būti taikoma tik vienos sudedamosios dalies milteli ų aerozo­
liams arba mažo lakumo skyst ųjų dalelių aerozoliams ir tur ėtų būti grin­
džiama tinkamais prieš tyrim ą atliktais bandomosios chemin ės medžiagos  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
savybių apibūdinimais. Iš daugiau kaip vienos sudedamosios dalies sudaryt ų 
miltelių aerozoli ų koncentracijos taip pat gali b ūti nustatomos atliekant 
gravimetrin ę analizę. Tačiau tam reikalingi analitiniai duomenys, įrodantys, 
kad ore esan čios medžiagos sud ėtis panaši į pirminės medžiagos sud ėtį. 
Jeigu tokios informacijos n ėra, tyrimo metu gali reik ėti vienodais intervalais 
atlikti pakartotin ę bandomosios chemin ės medžiagos (geriausia, kad ji b ūtų 
ore) analiz ę. Jeigu aerozolin ės medžiagos gali garuoti arba sublimuoti, tur ėtų 
būti įrodyta, kad pasirinktu metodu surinktos visos faz ės. 
26. Jeigu įmanoma, per vis ą tyrimą turėtų būti naudojama viena bandomosios 
cheminės medžiagos partija, o bandomasis ėminys tur ėtų būti laikomas 
tokiomis s ąlygomis, kad b ūtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir 
stabilumas. Prieš pradedant tyrim ą reikėtų apibūdinti bandomosios chemin ės 
medžiagos savybes, įskaitant jos grynum ą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, 
tapatumą, taip pat nustatyt ų teršalų ir priemaiš ų kiekius. Be kit ų duomenų, 
tai galima pagr įsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiau ­
sios koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektrosko ­
pinę arba duj ų chromatografijos analiz ę, arba kitais įverčiais. Nors bando ­
mojo ėminio tapatumo nustatymas n ėra bandym ų laboratorijos pareiga, 
bandymų laboratorijai gali b ūti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateik ėjo 
nurodytas savybes (pvz., spalv ą, fizinę būseną ir t. t.).  
27. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti palaikoma pastovi poveikio atmosfera. Poveikio 
sąlygų pastovumui įrodyti gali b ūti naudojamas steb ėjimo realiuoju laiku 
prietaisas, pvz., aerozoliams gali b ūti naudojamas aerozoli ų fotometras, 
garams – bendro angliavandenili ų kiekio analizatorius. Faktin ė kameroje 
susidariusi koncentracija tur ėtų būti matuojama kiekvien ą poveikio dien ą, 
ne mažiau kaip tris kartus pagal kiekvien ą poveikio lyg į. Jeigu tai ne įma­
noma dėl nedideli ų oro srauto grei čių arba maž ų koncentracij ų, gali būti 
imamas vienas ėminys per vien ą poveikio laikotarp į. Būtų geriausia, kad 
tokiu atveju šis ėminys būtų imamas per vis ą poveikio laikotarp į. Atskiri 
kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai netur ėtų nukrypti nuo vidu ­
tinės kameroje susidariusios koncentracijos daugiau kaip ± 10 %, kai 
tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip ± 20 %, kai tiriami skyst ųjų 
arba kietųjų dalelių aerozoliai. Tur ėtų būti apskaičiuotas ir ataskaitoje nuro ­
dytas pusiausvyros nusistov ėjimo kameroje laikotarpis (t  95 ). Poveikio laiko ­
tarpis apima bandomosios chemin ės medžiagos suk ūrimo trukm ę. Į šį laiko­
tarpį įtraukiamas pusiausvyros nusistov ėjimo kameroje laikotarpis (t  95 ) ir 
irimo laikas. t  95 apskaičiavimo gair ės pateiktos RD Nr. 39 (2).  
28. Jeigu tiriami labai sud ėtingi mišiniai, sudaryti iš duj ų ir (arba) gar ų, ir 
aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios chemin ės medžiagos, 
pučiamos iš specialiai varom ų galutinio naudojimo produkt ų arba prietais ų), 
kiekvienos faz ės veikimas inhaliacin ėje kameroje gali b ūti skirtingas. Tod ėl 
iš kiekvienos faz ės (dujų ir (arba) gar ų ir aerozolio) tur ėtų būti parinkta bent 
viena indikacin ė cheminė medžiaga (analit ė); paprastai šiuo tikslu pasiren ­
kama pagrindin ė veiklioji mišinio sudedamoji dalis. Jeigu bandomoji 
cheminė medžiaga yra mišinys, tur ėtų būti nurodyta viso mišinio, o ne tik 
veikliosios sudedamosios dalies arba indikacin ės chemin ės medžiagos 
(analitės) analizin ė koncentracija. Daugiau informacijos apie faktines 
koncentracijas pateikta RD Nr. 39 (2).  
Bandomoji chemin ė medžiaga. Daleli ų dydžio pasiskirstymas  
29. Aerozoli ų dalelių dydžio pasiskirstymas tur ėtų būti nustatomas bent kart ą 
per savait ę pagal kiekvien ą koncentracijos lyg į, naudojant pakopin į ėmiklį 
arba alternatyv ų prietaisą, pvz., aerodinamin į dalelių rūšiuotuvą (ADR). 
Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu ir alternatyviu prietaisu gaunami 
lygiaverčiai rezultatai, atliekant tyrim ą gali būti naudojamas alternatyvus 
prietaisas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju veiksmingumu, kartu 
su pagrindiniu prietaisu tur ėtų būti naudojamas antrasis prietaisas, pvz., 
gravimetrinis filtras, gaudykl ė arba barboteris. Atlikus daleli ų dydžio analiz ę 
nustatyta mas ės koncentracija tur ėtų neviršyti priimtin ų filtruojamosios 
analizės būdu nustatytos mas ės koncentracijos rib ų [žr. RD Nr. 39 (2)]. 
Jeigu, taikant visas bandomas koncentracijas, lygiavertiškum ą galima įrodyti 
pradiniame tyrimo etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyv ūnų gerovės sumetimais tur ėtų būti imamasi priemoni ų, kad 
būtų kuo mažiau negalutini ų duomen ų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti 
tyrimą.
 
31. Garuose esan čios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek 
tikėtina, kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu gar ų 
atmosferoje aptinkama daleli ų, dėl kurių gali susidaryti mišri ų fazių. 
STEBĖJIMAI  
32. Prieš poveikio laikotarp į, poveikio laikotarpiu ir pasibaigus poveikio laiko ­
tarpiui, tur ėtų būti atliekami klinikiniai gyv ūnų stebėjimai. Atsižvelgiant į 
gyvūnų reakciją poveikio laikotarpiu, steb ėjimus gali reik ėti atlikti dažniau. 
Jeigu gyv ūnų stebėjimą apsunkina gyv ūnų uždarom ųjų vamzdeli ų naudo­
jimas, prastas poveikio per vis ą kūną kamerų apšvietimas arba neskaidrios 
atmosferos, gyv ūnai turėtų būti atidžiai apži ūrimi po doz ės davimo. Steb ė­
jimais prieš kitos dienos poveik į galima įvertinti toksinio poveikio gr įžta­
mumą arba pasunk ėjimą. 
33. Visi steb ėjimai registruojami, išsaugant atskirus įrašus apie kiekvien ą 
gyvūną. Kai gyv ūnai numarinami d ėl humanišk ų priežasčių arba randami 
nugaišę, kiek įmanoma tiksliau užregistruojamas ž ūties laikas.  
34. Narveliuose tur ėtų būti stebimi odos ir kailio, aki ų ir gleivin ės, kvėpavimo ir 
kraujotakos sistem ų, centrinės nervų sistemos, somatomotorin ės veiklos ir 
elgsenos pakitimai. Ypa č reikėtų stebėti, ar nepasireiškia drebulys, trauku ­
liai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos b ūsenos, ar neteka seil ės. 
Matuojant temperat ūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti patvirtinam ųjų sulė­
tėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios temperat ūros įrodymų, 
susijusių su dozės davimu arba izoliavimu. Į tyrimo protokol ą gali būti 
įtraukti papildomi vertinimai, pvz., kinetikos, biomonitoringo, plau čių funk­
cijos, plau čių audinyje besikaupian čių mažo tirpumo medžiag ų užsilaikymo 
ir elgsenos poky čių. 
KŪNO MAS Ė 
35. Kiekvieno gyv ūno masė turėtų būti registruojama prieš pat pirm ąjį poveikį 
(nulinę dieną), o vėliau – dukart per savait ę (pvz., pirmadieniais ir penkta ­
dieniais, siekiant įrodyti gyv ūnų atsigavim ą per savaitgal į, kai nedaroma 
poveikio, arba tokiais laiko intervalais, kad b ūtų galima įvertinti sistemin į 
toksiškum ą) ir kai gyv ūnas nugaišta arba yra numarinamas. Jeigu per pirm ą­
sias dvi savaites nepasireiškia jokio poveikio, likusiu tyrimo laikotarpiu kūno masė gali būti matuojama kas savait ę. Pagalbiniai (gr įžtamumo tyrim ų) 
gyvūnai (jeigu naudojami) atsigavimo laikotarpiu tur ėtų būti ir toliau 
sveriami kas savait ę. Baigus tyrim ą, visi gyv ūnai turėtų būti pasverti 
netrukus po numarinimo, kad b ūtų galima tiksliai apskai čiuoti organ ų ir 
kūno masi
ų santykius.  
PAŠARŲ IR VANDENS SUVARTOJIMAS  
36. Pašar ų suvartojimas tur ėtų būti matuojamas kas savait ę. Gali būti matuo­
jamas ir vandens suvartojimas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
KLINIKIN Ė PATOLOGIJA  
37. Klinikin ės patologijos vertinimai tur ėtų būti taikomi visiems gyv ūnams, 
įskaitant kontrolinius ir pagalbinius (gr įžtamumo tyrim ų) gyvūnus, kai jie 
numarinami. Tur ėtų būti užregistruotas laikotarpis nuo poveikio pabaigos iki 
kraujo pa ėmimo, ypa č jeigu tiriama pasekm ė sparčiai nyksta. Ėminių 
ėmimas baigus duoti doz ę būtinas pagal tuos parametrus, kuriems b ūdingas 
trumpas plazmos pusin ės eliminacijos laikas (pvz., COHb, CHE ir MetHb).  
38. 1 lentel ėje nurodyti klinikin ės patologijos parametrai, kurie paprastai priva ­
lomi atliekant visus toksikologinius tyrimus. Nereikalaujama visada atlikti šlapimo analiz ę, tačiau ji gali b ūti atliekama, jeigu manoma, kad tai b ūtų 
naudinga atsižvelgiant į numatom ą arba nustatyt ą toksiškum ą. Kad būtų 
geriau apib ūdintas bandomosios chemin ės medžiagos toksiškumas, tyrimo 
vadovas gali nuspr ęsti įvertinti papildomus parametrus (pvz., cholinesteraz ė, 
lipidai, hormonai, r ūgščių ir bazių balansas, methemoglobinas arba Heinco 
kūneliai, kreatino kinaz ė, mieloidų ir eritroid ų santykis, troponinai, arterinio 
kraujo dujos, laktato dehidrogenaz ė, sorbitolio dehidrogenaz ė, glutamato 
dehidrogenaz ė ir gamaglutamiltranspeptidaz ė.)
 
1 lentelė 
Įprastiniai klinikin ės patologijos parametrai  
Hematologiniai tyrimai  
Eritrocitų kiekis 
Hematokritas Hemoglobino koncentracija 
Vidutinis hemoglobino kiekis eritroci ­
tuose 
Vidutinis eritrocito t ūris 
Vidutinė eritrocit ų hemoglobino 
koncentracija 
Retikulocitai
 Bendras leukocit ų kiekis 
Įvairių leukocitų kiekiai 
Trombocit ų kiekis 
Krešėjimo aktyvumas (pasirinkti 
vieną rodiklį): 
— Protrombino laikas — Krešėjimo laikas 
— Dalinis tromboplastino laikas
 
Klinikinės chemijos tyrimai  
Gliukozė (*) 
Bendras cholesterolio kiekis 
Trigliceridai Kraujo šlapalo azoto kiekis Bendras bilirubino kiekis 
Kreatininas 
Bendras baltym ų kiekis 
Albuminas 
Globulinas
 Alanino aminotransferaz ė 
Aspartato aminotransferaz ė 
Šarminė fosfatazė 
Kalis Natris 
Kalcis 
Fosforas Chloridas
 
Šlapimo analiz ė (neprivaloma)  
Išvaizda (spalva ir drumstumas) 
Tūris 
Savitasis svoris arba osmosinis sl ėgis 
pH Bendras baltym ų kiekis 
Gliukozė 
Kraujas ir (arba) kraujo k ūneliai  
(*) Kadangi d ėl ilgo neš ėrimo laikotarpio gali atsirasti gliukoz ės kiekio matavimo 
skirtumų, lyginant gavusius doz ę ir kontrolinius gyv ūnus, tyrimo vadovas tur ėtų 
nustatyti, ar reik ėtų nešerti gyv ūnų. Jeigu taikomas neš ėrimo laikotarpis, jis tur ėtų 
būti pritaikytas naudojamai r ūšiai; žiurk ėms turėtų būti taikomas 16 val. laiko ­
tarpis (neš ėrimas per nakt į). Gliukoz ės kiekis nešeriam ų gyvūnų organizme gali 
būti nustatomas po neš ėrimo per nakt į paskutini ąją poveikio savait ę arba po 
nešėrimo per nakt į prieš skrodim ą (pastaruoju atveju – kartu su visais kitais 
patologijos parametrais).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Jeigu yra įrodymų, kad pagrindin ė kaupimosi ir užsilaikymo vieta yra apati ­
niai kvėpavimo takai (t. y. alveol ės), tada, norint kiekybiškai išanalizuoti 
prielaidomis pagr įsto dozės poveikio parametrus, daugiausia d ėmesio 
skiriant alveolitui, plau čių uždegimui ir fosfolipidozei, b ūtų galima rinktis 
bronchoalveolinio plovimo (BAP) metod ą. Šis metodas suteikia galimyb ę 
tinkamai ištirti doz ės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ę ir per tam tikr ą 
laiką įvykusius alveoli ų pažeidim ų pokyčius. BAP skystis gali b ūti anali­
zuojamas siekiant nustatyti įvairių leukocitų kiekius, bendr ą baltymų kiekį ir 
laktato dehidrogenaz ę. Kiti parametrai, į kuriuos b ūtų galima atsižvelgti, yra 
parametrai, rodantys lizosom ų pažeidimus, fosfolipidoz ę, fibrozę ir dirgina ­
mąjį arba alergin į uždegim ą, galbūt įtraukiant uždegim ą sukeliančių citokinų 
ir (arba) chemokin ų tyrimą. BAP matavimais paprastai papildomi histopa ­
tologinių tyrimų rezultatai, ta čiau BAP matavimai negali atstoti ši ų tyrimų 
rezultatų. Plaučių plovimo gair ės pateiktos RD Nr. 39 (2).  
OFTALMOLOGINIS TYRIMAS  
40. Naudojant oftalmoskop ą arba lygiavert į įrenginį, prieš duodant bandomosios 
cheminės medžiagos doz ę turėtų būti atliekami vis ų gyvūnų akies dugno, 
laužiamosios terp ės, rainelės ir jungin ės oftalmologiniai tyrimai, o baigus 
duoti doz ę – tokie pat didžiausiosios koncentracijos bei kontrolin ės grupės 
tyrimai. Jeigu nustatoma aki ų pakitimų, turėtų būti tiriami ir visi kit ų grupių, 
įskaitant pagalbin ę (grįžtamumo tyrim ų), gyvūnai. 
BENDROJI PATOLOGIJA IR ORGAN Ų MASĖ 
41. Turėtų būti visiškai nuleidžiamas vis ų bandomųjų gyvūnų, įskaitant nugai ­ 
šusius atliekant bandym ą arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyv ūnų 
gerovės sumetimais, kraujas (jeigu įmanoma) ir atliekamas ši ų gyvūnų bend­
rasis skrodimas. Tur ėtų būti užregistruotas laikas nuo kiekvieno paskutinio 
dozės davimo kiekvienam gyv ūnui iki jo numarinimo. Jeigu skrodimo nega ­
lima atlikti iš karto po to, kai aptinkamas nugaiš ęs gyvūnas, gyvūnas turėtų 
būti laikomas pakankamai šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), siekiant kuo 
labiau pristabdyti autoliz ę. Skrodimai tur ėtų būti atliekamai kaip galima 
anksčiau, paprastai – per dien ą arba dvi. Visi dideli patologiniai pakitimai 
turėtų būti užregistruojami pagal kiekvien ą gyvūną, ypatingą dėmesį skiriant 
kvėpavimo tak ų pakitimams.  
42. 2 lentel ėje nurodyti organai ir audiniai, kurie tur ėtų būti užkonservuojami 
atliekant bendr ąjį skrodim ą, naudojant histopatologiniam tyrimui tinkam ą 
fiksavimo terp ę. Skliausteliuose ([…]) nurodyti organai ir audiniai, taip 
pat kai kurie kiti organai ir audiniai, d ėl kurių konservavimo sprendžia 
tyrimo vadovas.  Paryškintuoju  šriftu nurodytieji organai tur ėtų būti nuva­
lyti ir pasverti kaip galima grei čiau po atskyrimo, kol neišdžiuvo. Skyd ­
liaukė ir sėklidžių prielipai tur ėtų būti sveriami tik esant reikalui, nes 
valymo įrankiai gali pakenkti histopatologiniam tyrimui. Audiniai ir organai 
turėtų būti fiksuojami 10 % buferiniame formaline arba kitokiame tinka ­
mame fiksatyve kaip galima grei čiau po skrodimo, ne mažiau kaip 24–48 
valandos iki valymo, atsižvelgiant į ketinamą naudoti fiksatyv ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 431
2 lentelė 
Atliekant bendr ąjį skrodim ą konservuojami organai ir audiniai  
Antinksčiai 
Aorta  
Kaulų čiulpai (ir (arba) šviežiai paruošta 
punkcija)  
Smegenys  (įskaitant didži ųjų smegen ų, 
smegenėlių ir pailg ųjų smegen ų (smegen ų 
tilto) išpjovas)  
Akloji žarna  
Gaubtinė žarna  
Dvylikapiršt ė žarna  
[Sėklidžių prielipai]  
[Akys (tinklain ė, regos nervas) ir aki ų vokai]  
Šlaunikaulis ir kelio s ąnarys  
Tulžies p ūslė (jeigu yra)  
[Harderio liaukos]  
Širdis  
Klubinė žarna  
Tuščioji žarna  
Inkstai  
[Ašarų liaukos (viršakiduobin ės)] 
Gerklos (trys lygiai, įskaitant antgerklio 
pagrindą) 
Kepenys  
Plaučiai (visos vieno lygmens skiltys, įskai­
tant pagrindinius bronchus)  
Limfmazgiai, imami iš plau čių vartų srities, 
ypač jeigu tiriamos mažo tirpumo kiet ųjų 
dalelių bandomosios chemin ės medžiagos. 
Atliekant nuodugnesnius tyrimus, per kuriuos 
nagrinėjami imuniniai aspektai, gali b ūti 
imama daugiau mazg ų, pvz., iš tarpuplau čio, 
kaklo, pažandži ų ir (arba) aus ų sričių. 
Limfmazgiai (labiausiai nutol ę nuo infekcijos 
vartų) 
Pieno liauka (pateli ų) 
Raumuo (šlaunies)  
Nosiarykl ės audiniai (ne mažiau keturi ų 
lygių; į vieną lygį įtraukiant nosiarykl ės 
latakus ir nosies limfinius audinius (NLA))  Stemplė 
[Uoslės receptoriai]  
Kiaušidės 
Kasa  
Prieskydin ės liaukos  
Periferinis nervas (s ėdimasis arba blauzdi ­
kaulio, pageidautina, arti raumens)  
Hipofizė 
Prostata  
Tiesioji žarna  
Seilių liaukos  
Sėklinės pūslelės 
Oda 
Stuburo smegenys (sprando, kr ūtinės ląstos 
ir juosmens)  
Blužnis  
Krūtinkaulis  
Skrandis  
Dantys  
Sėklidės 
Užkrūčio liauka  
Skydliauk ės 
[Liežuvis]  
Trachėja (ne mažiau kaip du lygiai, iš kuri ų 
vienas – išilginis keteros pj ūvis, ir vienas – 
skersinis pj ūvis 
[Šlapimtakis]  
[Šlaplė] 
Šlapimo p ūslė 
Gimda  
Tiksliniai organai  
Visi labai pakit ę audiniai ir j ų masės ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Plau čiai turėtų būti išimami sveiki, pasveriami ir apdorojami tinkamu fiksa ­
tyvu užtikrinant 20–30 cm vandens sluoksnio sl ėgį, kad būtų išsaugota 
plaučių struktūra (5). Išpjovos tur ėtų būti imamos iš vis ų vieno lygmens 
skilčių, įskaitant pagrindinius bronchus, bet, jeigu atliekamas plau čių 
plovimas, neišplautos skiltys tur ėtų būti išpjaunamos trimis lygmenimis 
(ne iš eilės). 
44. Tiriami ne mažiau kaip keturi ų lygių nosiarykl ės audiniai; vienas iš j ų turėtų 
būti nosinės ryklės angos audinys (5) (6) (7) (8) (9), kad b ūtų galima 
tinkamai ištirti rag ėjantįjį, pereinam ąjį (be blakstien ėlių, kvėpuojamąjį), 
kvėpuojamąjį (su blakstien ėlėmis, kvėpuojamąjį) ir uodžiam ąjį epitelius 
bei limfodrenažin į audinį (NALT) (10) (11). Tur ėtų būti ištirti trys gerkl ų 
lygiai; vienas iš j ų turėtų būti antgerklio pagrindas. Tur ėtų būti ištirti ne 
mažiau kaip du trach ėjos lygiai; vienas iš j ų turėtų būti išilginis pagrindini ų 
bronchų išsišakojimo keteros pj ūvis ir vienas – skersinis pj ūvis. 
HISTOPATOLOGINIS TYRIMAS  
45. Turėtų būti atliktas vis ų 2 lentelėje nurodyt ų organų ir audini ų histopatolo ­
ginis tyrimas, apimantis kontrolin ę ir didžiausiosios koncentracijos grupes, 
taip pat visus gyv ūnus, kurie tyrimo metu nugaišo arba buvo numarinti. 
Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas kv ėpavimo takams, tiksliniams 
organams ir labai pakitusiems audiniams. Visose grup ėse turėtų būti tiriami 
didžiausiosios koncentracijos grup ės gyvūnų organai ir audiniai, d ėl kurių 
nustatyta pakitim ų. Norėdamas įrodyti aiški ą reakciją į tam tikrą koncentra ­
ciją, tyrimo vadovas gali nuspr ęsti atlikti papildom ų grupių histopatologinius 
tyrimus. Jeigu naudojama pagalbin ė (grįžtamumo tyrim ų) grupė, atliekant 
histopatologin į tyrimą turėtų būti tiriami visi audiniai ir organai, kuriems 
padarytas poveikis doz ę gavusiose grup ėse. Jeigu didžiausiosios koncentra ­
cijos grup ėje nebaigus bandymo nugaišta labai daug gyv ūnų ar kyla kitoki ų 
problemų, mažinan čių duomenų reikšmingum ą, turėtų būti atliktas kito pagal 
dydį (mažesnio) koncentracijos lygio histopatologinis tyrimas. Reik ėtų 
mėginti rasti s ąsajų tarp bendr ųjų stebėjimų ir mikroskopin ės analizės rezul­
tatų. 
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
Duomenys  
46. Turėtų būti pateikti kiekvieno gyv ūno kūno masės, pašarų suvartojimo, 
klinikinės patologijos tyrim ų, organų masės ir histopatologini ų tyrimų 
duomenys. Klinikini ų stebėjimų duomenys tur ėtų būti apibendrinti lentel ėse, 
pagal kiekvien ą bandom ąją grupę nurodant naudot ų gyvūnų skaičių, 
gyvūnų, kuriems pasireišk ė toksiškumo požymi ų, skaičių, atliekant bandym ą 
nugaišusi ų arba dėl humanišk ų priežasčių numarint ų gyvūnų skaičių, kiek­
vieno gyv ūno žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašym ą, 
pasireiškimo laik ą ir grįžtamumą, skrodimo išvadas. Visi rezultatai – kieky ­
biniai ir papildomi – tur ėtų būti įvertinti taikant tinkam ą statistinį metodą. 
Gali būti taikomas bet kuris visuotinai pripažintas statistinis metodas; statis ­
tiniai metodai tur ėtų būti parenkami planuojant tyrim ą. 
Bandymo ataskaita  
47. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):  
Bandomieji gyv ūnai ir jų laikymas  
— Laikymo s ąlygų aprašymas, nurodant gyv ūnų skaičių narvelyje (arba 
skaičiaus pokyt į), kraiko medžiag ą, aplinkos temperat ūrą ir santykin į 
drėgnį, šviesos ir tamsos kait ą paros metu ir š ėrimo režim ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— Naudota r ūšis (paderm ė) ir, jeigu tai ne žiurk ės, kitos rūšies naudojimo 
pagrindimas. Gali b ūti pateikti pirminiai ir istoriniai duomenys, jeigu jie 
susiję su gyvūnais, kuriems buvo taikomos panašios poveikio, laikymo ir 
nešėrimo sąlygos.  
— Gyvūnų skaičius, amžius ir lytis.  
— Atsitiktin ės atrankos metodas.  
— Prieš bandym ą sudarytų sąlygų aprašymas, nurodant š ėrimo režim ą, 
izoliavimo ir apsaugos nuo lig ų būdą. 
Bandomoji chemin ė medžiaga  
— Fizinė būsena, grynumas ir, jeigu taikytina, fizin ės ir chemin ės savybės 
(įskaitant izomerij ą). 
— Identifikavimo duomenys ir Chemini ų medžiag ų santrump ų tarnybos 
(angl. CAS) registracijos numeris, jeigu jis žinomas.  
Nešiklis  
— Nešiklio naudojimo pagrindimas ir nešiklio parinkimo pagrindimas 
(jeigu tai ne vanduo).  
— Istoriniai arba vienalaikiai duomenys, įrodantys, kad nešiklis nedaro 
neigiamo poveikio tyrimo rezultatams.  
Inhaliacin ė kamera  
— Išsamus inhaliacin ės kameros aprašas, nurodant t ūrį ir pateikiant 
diagramą. 
— Įrangos, naudotos darant poveik į gyvūnams ir kuriant atmosfer ą, šaltinis 
ir aprašas.  
— Temperat ūros, drėgnio, daleli ų dydžio ir faktin ės koncentracijos mata ­
vimo įranga.  
— Oro šaltinis ir kondicionavimo sistema.  
— Įrangos kalibravimo siekiant užtikrinti homogenišk ą bandymo atmosfer ą 
metodai.  
— Slėgių skirtumas (teigiamas ar neigiamas).  
— Kameroje esan čios dozės davimo angos (jeigu doz ė duodama tik per 
nosį); gyvūnų vieta kameroje (jeigu doz ė duodama per vis ą kūną). 
— Bandymo atmosferos pastovumas.  
— Temperat ūros ir drėgnio jutikli ų vieta ir kameroje sukurtos bandymo 
atmosferos ėminių ėmimas.  
— Tiekiamo ir (arba) ištraukiamo oro apdorojimas.  
— Oro srauto grei čiai, per doz ės davimo ang ą tekančio oro srauto greitis 
(jeigu doz ė duodama tik per nos į) arba gyv ūnų kiekis kameroje (jeigu 
dozė duodama per vis ą kūną). 
— Inhaliacin ės kameros pusiausvyros pasiekimo laikas (t  95 ). 
— Tūrio pokyčių kiekis per valand ą. 
— Matavimo prietaisai (jeigu naudojami).  
Poveikio duomenys  
— Tikslin ės koncentracijos parinkimo pagrindiniam tyrimui pagrindimas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— Vardin ės koncentracijos (inhaliacin ėje kameroje sukurtos bandomosios 
cheminės medžiagos bendrosios mas ės ir viso per kamer ą perleisto oro 
srauto tūrio santykis).  
— Faktin ės bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos, nustatytos 
gyvūnų kvėpavimo zonoje; jeigu bandomi mišiniai, įgaunantys įvairias 
fizines būsenas (dujos, garai, aerozoliai), kiekviena iš ši ų būsenų gali 
būti analizuojama atskirai.  
— Visos koncentracijos ore tur ėtų būtų nurodomos mas ės vienetais (pvz., 
mg/l, mg/m  3 ir t. t.), o ne t ūrio vienetais (pvz., ppm, ppb ir t. t.).  
— Daleli ų dydžio pasiskirstymas, mas ės medianinis aerodinaminis 
skersmuo (MMAS) ir geometrinis standartinis nuokrypis ( σ g ), nurodant 
jų apskaičiavimo metodus. Tur ėtų būti pateiktos atliktos atskiros daleli ų 
dydžio analiz ės. 
Bandymo s ąlygos  
— Išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos paruošim ą, 
nurodant proced ūras, taikytas siekiant sumažinti kiet ųjų medžiagų dalelių 
dydį arba paruošti bandomosios chemin ės medžiagos tirpalus.  
— Įrangos, naudotos kuriant bandymo atmosfer ą ir veikiant gyv ūnus 
bandymo atmosfera, aprašas (pageidautina, pateikiant diagram ą). 
— Išsami informacija apie įrangą, naudotą stebėti kameros temperat ūrą, 
drėgnį ir oro sraut ą kameroje (t. y. kalibravimo kreiv ės nubrėžimas).  
— Išsami informacija apie įrangą, naudotą imti ėminius, skirtus nustatyti 
kameroje susidariusi ą koncentracij ą ir dalelių dydžio pasiskirstym ą. 
— Išsami informacija apie taikyt ą cheminės analizės metodą ir metodo 
tinkamumo patvirtinim ą (nurodant bandomosios chemin ės medžiagos 
regeneravimo iš ėminių ėmimo terp ės veiksmingum ą). 
— Atsitiktin ės atrankos, taikytos suskirstant gyv ūnus į bandomąją ir kontro ­
linę grupes, metodas.  
— Išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (nurodant pašaro tip ą 
ir (arba) šaltin į, vandens šaltin į). 
— Bandom ųjų koncentracij ų parinkimo pagrindimas.  
Rezultatai  
— Kameros temperat ūrų, drėgnio ir oro sraut ų lentelės. 
— Kameros vardin ės ir faktin ės koncentracijos duomen ų lentelės. 
— Daleli ų dydžių lentelės, pateikiant analizini ų ėminių ėmimo duomenis, 
dalelių dydžių pasiskirstym ą ir MMAS bei σ g skaičiavimus.  
— Kiekvieno gyv ūno reakcijos duomen ų ir koncentracijos lygio lentel ės (t. 
y. gyvūnų, kuriems pasireišk ė toksiškumo požymi ų, įskaitant gaišta ­
mumą, poveikio pob ūdį, sunkum ą, pasireiškimo laik ą ir trukm ę). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— Kiekvieno gyv ūno masės lentelės. 
— Pašaro suvartojimo lentel ės. 
— Klinikin ės patologijos duomen ų lentelės. 
— Kiekvieno gyv ūno skrodimo išvados ir histopatologini ų tyrimų rezul­
tatai, jeigu yra.  
Rezultatų aptarimas ir aiškinimas  
— Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas metod ų, taikytų siekiant laikytis 
šio bandymo metodo kriterij ų, pvz., susijusi ų su ribine koncentracija 
arba daleli ų dydžiu, aprašymui.  
— Atsižvelgiant į bendruosius rezultatus, tur ėtų būti aprašyta daleli ų įkvė­
pimo galimyb ė, ypač jeigu nebuvo įmanoma taikyti daleli ų dydžio krite ­
rijaus.  
— Pateikiant bendr ąjį tyrimo vertinim ą, turėtų būti nurodytas metod ų, 
taikytų nustatyti vardines ir faktines koncentracijas, nuoseklumas ir 
faktinės koncentracijos santykis su vardine koncentracija.  
— Turėtų būti aprašyta tik ėtina žūties priežastis ir vyraujantis veikimo 
būdas (sisteminis ar vietinis).  
— Atsižvelgiant į OECD rekomendaciniame dokumente d ėl pasekmi ų 
žmonėms (3) nustatytus kriterijus, tur ėtų būti pateiktas paaiškinimas, ar 
kilo poreikis humaniškai numarinti gyv ūnus, patirian čius skausm ą arba 
sunkią ilgalaikę kančią. 
— Turėtų būti nurodytas (-i) tikslinis (-iai) organas (-ai).  
— Turėtų būti apibrėžti nepastebimo neigiamo poveikio lygis (NNPL) ir 
mažiausio pastebimo neigiamo poveikio lygis (MPNPL).  
LITERAT ŪRA 
1. OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , Original Test Guide ­
line No 413, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2. OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
3. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation, Environmental Health and SAFEty Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
4. Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
 
5. Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in  Toxicology of Inhaled 
Material,  Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, 
pp. 229–258.  
6. Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.  
7. Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labora ­
tory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
8. Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263.
 
9. Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.
 
10. Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn 
AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal 
lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.  
11. Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymp ­
hoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.  
12. Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428.  
13. 2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) 
Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifikavimo, ženklinimo 
ir pakavimo, iš dalies kei čiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 
1999/45/EB ir iš dalies kei čiantis Reglament ą (EB) Nr. 1907/2006, OL 
L 353, 2008 12 31, p. 1.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTIS  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  naudojant š į bandymo metod ą tiriama chemin ė 
medžiaga arba mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  LĖTINIO TOKSIŠKUMO TYRIMAI  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 452 (OECD 
bandymo gair ės Nr. 452) (2009). Originalios bandymo gair ės TG 452 
priimtos 1981 m. Šis atnaujintasis B.30 bandymo metodas parengtas atsiž ­
velgiant į poreikį įvertinti naujausius pasiekimus gyv ūnų gerovės srityje ir 
norminių reikalavim ų pasikeitimus (1) (2) (3) (4). B.30 bandymo metodas 
buvo atnaujinamas kartu su šio priedo B.32 skyriumi „Kancerogeniškumo 
tyrimai“ ir šio priedo B.33 skyriumi „Jungtiniai l ėtinio toksiškumo ir kance ­
rogeniškumo tyrimai“, siekiant gauti papildomos informacijos remiantis per tyrimą naudotais gyv ūnais ir pateikti išsamesni ų rekomendacij ų dėl dozės 
parinkimo. Šis bandymo metodas skirtas taikyti bandant labai įvairias 
chemines medžiagas, įskaitant pesticidus ir pramonines chemines medžiagas.
 
2. Daugelis l ėtinio toksiškumo tyrim ų atliekami naudojant graužik ų rūšis, todėl 
šis metodas pirmiausia taikytinas tyrimams, atliekamiems naudojant šias rūšis. Jeigu tokius tyrimus reik ėtų atlikti naudojant ne graužik ų rūšis, 
jiems taip pat gali b ūti taikomi aprašant š į bandymo metod ą ir šio 
priedo B.27 skyriuje „90 dien ų kartotinės dozės toksiškumo per virškinam ąjį 
traktą ne graužikams tyrimas“ (5) išd ėstyti principai ir proced ūros su atitin ­
kamais pakeitimais, kaip aprašyta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 d ėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ų planavimo ir 
atlikimo.
 
3. Atliekant l ėtinio toksiškumo tyrimus, doz ė paprastai gali b ūti duodama 
trimis būdais – per burn ą, per odą ir per kv ėpavimo takus. Doz ės davimo 
būdas parenkamas atsižvelgiant į bandomosios chemin ės medžiagos fizines 
ir chemines savybes ir labiausiai paplitus į poveikio žmon ėms būdą. Daugiau 
informacijos apie poveikio b ūdo parinkim ą pateikta OECD rekomendaci ­
niame dokumente Nr. 116 (6).  
4. Šis bandymo metodas iš esm ės skirtas poveikio per virškinam ąjį traktą 
būdui, nes šis b ūdas dažniausiai taikomas atliekant l ėtinio toksiškumo 
tyrimus. Norint įvertinti žmoni ų sveikatai gresian čią riziką ir (arba) laikantis 
tam tikros reglamentavimo tvarkos gali reik ėti atlikti ilgalaikio l ėtinio toksiš ­
kumo tyrimus, per kuriuos doz ė būtų duodama per od ą ir kvėpavimo takus, 
tačiau techniniu poži ūriu abu poveikio b ūdai yra gana sud ėtingi. Šie tyrimai 
turės būti planuojami atsižvelgiant į konkretų atvejį, tačiau čia aprašytu 
bandymo metodu, skirtu įvertinti lėtinį toksiškum ą, kai doz ė duodama per 
burną, gali būti remiamasi rengiant inhaliacini ų ir (arba) odini ų tyrimų 
protokolą, atsižvelgiant į rekomendacijas d ėl poveikio laikotarpi ų, klinikini ų 
ir patologini ų parametr ų ir t. t. Yra parengtos OECD rekomendacijos d ėl 
bandomųjų cheminių medžiagų dozių davimo per kv ėpavimo takus (6) (7) ir 
per odą (6). Planuojant ilgesnius tyrimus, per kuriuos doz ės duodamos per 
kvėpavimo takus, pirmiausia tur ėtų būti remiamasi šio priedo B.8 skyriumi 
(8) ir šio priedo B.29 skyriumi (9), taip pat OECD rekomendaciniu doku ­
mentu dėl ūmaus poveikio įkvėpus bandym ų (7). Jeigu bandymai atliekami 
taikant poveikio per od ą būdą, turėtų būti remiamasi šio priedo B.9 skyriumi 
(10). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Atliekant l ėtinio toksiškumo tyrim ą gaunama informacijos apie galimus 
pavojus sveikatai, galin čius kilti d ėl kartotinio poveikio gana ilgu naudo ­
jamos rūšies gyvūnų gyvenimo laikotarpiu. Tyrimas suteikia informacijos 
apie bandomosios chemin ės medžiagos toksin į poveikį, padeda nustatyti 
tikslinius organus ir kaupimosi galimyb ę. Be to, jis gali pad ėti apytiksliai 
nustatyti nepastebimo neigiamo poveikio lyg į, kuris gali b ūti naudojamas 
nustatant saugaus poveikio žmon ėms kriterijus. Taip pat pabr ėžiamas 
gyvūnų kruopščių klinikini ų stebėjimų būtinumas, kad b ūtų gauta kuo 
daugiau informacijos.  
6. Pagal š į bandymo metod ą atliekam ų tyrimų tikslai:  
— bandomosios chemin ės medžiagos l ėtinio toksiškumo nustatymas,  
— tikslini ų organų nustatymas,  
— dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ės apibūdinimas,  
— nepastebimo neigiamo poveikio lygio (NNPL) arba orientacin ės 
dozės (OD) nustatymo pagrindo nustatymas,  
— žmonėms taikom ų poveikio lygi ų lėtinio toksinio poveikio prognoza ­
vimas,  
— duomen ų teikimas rengiant bandym ų hipotezes d ėl veikimo b ūdo (6).  
PIRMINIAI ASPEKTAI  
7. Vertindama bandomosios chemin ės medžiagos toksines savybes, bandym ų 
laboratorija, prieš atlikdama tyrim ą, turėtų apsvarstyti vis ą turimą informa­
ciją apie bandom ąją cheminę medžiag ą, kad planuojant tyrim ą pirmiausia 
būtų siekiama padidinti l ėtinio toksiškumo tyrimo veiksmingum ą ir suma­ 
žinti gyv ūnų naudojim ą. Parengti tyrimo plan ą padės informacija apie 
bandomosios chemin ės medžiagos tapatum ą, cheminę struktūrą, fizines ir 
chemines savybes, veikimo b ūdą, taip pat toksiškumo bandym ų in vitro  
arba in vivo  rezultatai, numatomas (-i) panaudojimo b ūdas (-ai) ir galimas 
poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys 
apie panašios strukt ūros chemines medžiagas, turimi toksikokinetiniai 
duomenys (vienos doz ės ir, jeigu yra, kartotin ės dozės kinetinės savybės) 
ir duomenys, gauti atlikus kitus kartotinio poveikio tyrimus. L ėtinis toksiš ­
kumas tur ėtų būti nustatomas tik gavus pirmin ės informacijos apie toksiš ­
kumą, pagrįstos 28 dien ų ir (arba) 90 dien ų kartotinės dozės toksiškumo 
bandymais. Atliekant bendr ąjį konkrečios bandomosios chemin ės medžiagos 
galimo neigiamo poveikio sveikatai vertinim ą, turėtų būti apsvarstyta gali ­
mybė taikyti etapin į lėtinio toksiškumo bandymo metod ą (11) (12) (13) (14).  
8. Prieš pradedant tyrim ą, atsižvelgiant į bandymo plan ą ir tikslus, tur ėtų būti 
nustatyti tinkamiausi statistiniai rezultat ų analizės metodai. Tur ėtų būti 
apsvarstyta, ar rengiant statistinius duomenis tur ėtų būti atlikta pataisa atsiž ­
velgiant į išgyvenimo rodiklius ir analiz ė pirmalaikio vienos arba daugiau 
grupių pašalinimo atveju. Rekomendacij ų dėl tinkamos statistin ės analizės ir 
pagrindin ės informacijos apie tarptautiniu mastu pripažintus statistinius 
metodus pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6), taip pat reko ­
mendaciniame dokumente Nr. 35 d ėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniš ­
kumo tyrim ų analizės ir vertinimo (15).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Atliekant l ėtinio toksiškumo tyrim ą, visada tur ėtų būti atsižvelgiama į 
pagrindinius principus ir aspektus, išd ėstytus OECD rekomendaciniame 
dokumente Nr. 19 d ėl klinikini ų požymių, kaip pasekmi ų žmonėms, pasi­
reiškimo vertinant saugum ą naudojamiems bandomiesiems gyv ūnams pripa ­ 
žinimo, vertinimo ir taikymo (16), pirmiausia jo 62 skirsnyje. Tame skirs ­
nyje teigiama:  „Jeigu per kartotin ės dozės tyrimus gyv ūnams pasireiškia 
klinikinių požymių, kurie progresuoja ir d ėl kurių toliau prast ėja sveikatos 
būklė, turėtų būti priimtas informacija pagr įstas sprendimas, ar nereik ėtų 
humaniškai numarinti gyv ūno. Priimant sprendim ą turėtų būti atsižvelgiama 
į informacijos, kuri b ūtų gauta tęsiant tyrim ą su šiuo gyv ūnu, vertės ir šio 
gyvūno bendrosios b ūklės santykį. jeigu nusprendžiama t ęsti bandym ą su 
šiuo gyv ūnu, atsižvelgiant į poreikį, turėtų būti padidintas steb ėjimų 
dažnumas. Be to, galb ūt būtų įmanoma labai nepakenkiant bandymo tikslui 
laikinai nutraukti doz ės davimą, jeigu dėl to sumaž ėtų skausmas ar kan čia, 
arba sumažinti bandom ąją dozę.“ 
10. Išsami ų rekomendacij ų dėl dozės parinkimo l ėtinio toksiškumo ir kancero ­
geniškumo tyrimams princip ų ir jų svarstym ų pateikta rekomendaciniame 
dokumente Nr. 116 (6), taip pat Tarptautinio gamtos moksl ų instituto leidi ­
niuose (17) (18). Pagrindin ė dozės parinkimo strategija priklauso nuo tyrimo 
pagrindinio tikslo arba tiksl ų (6 skirsnis). Parenkant tinkamus dozi ų dydžius, 
pavojų atranka tur ėtų būti vykdoma atsižvelgiant į mažų dozių sukeliamas 
reakcijas ir į tų pavojų reikšmę. Tai ypa č svarbu tada, kai ketinama atlikti 
jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ą (šio priedo B.33 
skyrius) (11 skirsnis).  
11. Turėtų būti apsvarstyta galimyb ė atlikti jungtin į lėtinio toksiškumo ir kance ­
rogeniškumo tyrim ą (šio priedo B.33 skyrius), o ne atskirai atlikti l ėtinio 
toksiškumo tyrim ą (B.30 bandymo metodas) ir kancerogeniškumo tyrim ą 
(šio priedo B.32 skyrius). Palyginti su dviem atskirais tyrimais, atliekant bendrą bandym ą užtikrinamas didesnis veiksmingumas laiko ir išlaid ų 
požiūriu, neprarandant duomen ų kokybės nei lėtinio poveikio, nei kancero ­
geniškumo bandymo etapu. Ta čiau, atliekant jungtin į lėtinio toksiškumo ir 
kancerogeniškumo tyrim ą (šio priedo B.33 skyrius), tur ėtų būti kruopščiai 
apsvarstyti doz ės parinkimo principai (9 ir 20–25 skirsniai); be to, pripa ­ 
žinta, kad pagal tam tikras reglamentavimo sistemas gali reik ėti atlikti 
atskirus tyrimus.
 
12. Aprašant š į bandymo metod ą vartojamos apibr ėžtys pateiktos šio skyriaus 
pabaigoje ir rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6).  
BANDYMO PRINCIPAS  
13. Bandomoji chemin ė medžiaga kasdien skirtingomis doz ėmis duodama 
kelioms bandom ųjų gyvūnų grupėms; įprastas doz ės davimo laikotarpis – 
12 mėnesių, tačiau, atsižvelgiant į norminius reikalavimus, gali b ūti 
taikomos ilgesn ės arba trumpesn ės trukmės (žr. 33 skirsn į). Ši trukm ė paren­
kama taip, kad b ūtų pakankamai ilga, jog aiškiai pasireikšt ų kaupiamasis 
toksiškumas, ta čiau jis neb ūtų painiojamas su sen ėjimo pakitimais. Jeigu 
pasirenkama ne 12 m ėnesių trukmė, ji turėtų būti pagrįsta, ypač jeigu ta 
trukmė trumpesn ė nei 12 m ėnesių. Bandomoji chemin ė medžiaga paprastai 
duodama per burn ą, tačiau gali b ūti tinkamas ir doz ės davimas per kv ėpa­
vimo takus arba per od ą. Pagal tyrimo plan ą taip pat gali b ūti numatyta 
vienas arba daugiau kartu marinti gyv ūnus nebaigus bandymo, pvz., po trij ų 
ir šešių mėnesių; šiuo tikslu gali b ūti įtraukiamos papildomos gyv ūnų grupės 
(žr. 19 skirsn į). Dozių davimo laikotarpiu atidžiai stebima, ar gyv ūnams 
nepasireišk ė toksiškumo požymi ų. Bandymo metu nugaiš ę arba numarinti 
gyvūnai skrodžiami, o baigus bandym ą numarinami ir skrodžiami išgyven ę 
gyvūnai. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
14. Šiuo bandymo metodu pirmiausia vertinamas graužikams pasireiškiantis 
lėtinis toksiškumas (žr. 2 skirsn į), tačiau pripaž įstama, kad pagal tam tikras 
reglamentavimo tvarkas gali reik ėti atlikti panašius ne graužik ų tyrimus. 
Gyvūnų rūšies pasirinkimas tur ėtų būti pagrįstas. Ne graužik ų rūšims pasi ­
reiškiančio lėtinio toksiškumo tyrim ų planas ir atlikimas prireikus tur ėtų būti 
grindžiami aprašant š į bandymą ir šio priedo B.27 skyriuje „90 dien ų karto­
tinės dozės toksiškumo per virškinam ąjį traktą ne graužikams tyrimas“ (5) 
išdėstytais principais. Daugiau informacijos apie gyv ūnų rūšies ir paderm ės 
pasirinkim ą pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6).  
15. Pagal š į bandymo metod ą pirmenyb ė teikiama žiurk ėms, tačiau gali b ūti 
naudojami ir kit ų rūšių graužikai, pvz., pel ės. Žiurkės ir pelės yra tinka ­
miausi bandomieji gyv ūnai, nes j ų gyvenimo trukm ė palyginti trumpa, jos 
plačiai naudojamos atliekant farmakologinius ir toksikologinius tyrimus, jos 
jautrios augli ų sukėlimui, yra pakankami gerai aprašyt ų padermių. Atsižvel ­
giant į šias savybes, yra daug informacijos apie j ų fiziologij ą ir patologij ą. 
Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų labora­
torinių padermių gyvūnai. Lėtinio toksiškumo tyrimas tur ėtų būti atliekamas 
naudojant tos pa čios paderm ės ir iš to paties šaltinio gautus gyv ūnus, kaip ir 
naudotieji per trumpesn ės trukmės išankstin į (-ius) toksiškumo tyrim ą (-us). 
Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos.  
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
16. Gyvūnai gali b ūti laikomi po vien ą arba mažomis tos pa čios lyties grup ėmis; 
galimybė laikyti gyv ūnus po vien ą turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu 
tai moksliškai pagr įsta (19) (20) (21). Narveliai tur ėtų būti išdėstyti taip, kad 
galimas narveli ų išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams tur ėtų būtų kuo 
mažesnis. Bandom ųjų gyvūnų laikymo patalpos temperat ūra turėtų būti 
22 °C (± 3 °C). Nors santykinis dr ėgnis turėtų būti ne mažesnis kaip 
30 % ir, pageidautina, ne didesnis kaip 70 % (išskyrus patalp ų valymo 
metą), turėtų būti siekiama palaikyti 50–60 % santykin į drėgnį. Apšvietimas 
turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sek ą. Gyvūnams 
šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo 
vandens kiekio. Š ėrimo režimas tur ėtų atitikti visus bandom ųjų gyvūnų 
rūšies mitybos reikalavimus; pašaro sud ėtyje turėtų būti kuo mažiau teršal ų, 
įskaitant (be kit ų teršalų) pesticid ų likučius, patvariuosius organinius 
teršalus, fitoestrogenus, sunkiuosius metalus ir mikotoksinus. Tur ėtų būti 
periodiškai – bent pradedant tyrim ą ir pasikeitus naudojamai partijai – 
parengiama analitin ė informacija apie pašarines medžiagas ir pašaro sud ėtyje 
esančių teršalų lygius; ši informacija tur ėtų būti pateikta galutin ėje ataskai ­
toje. Turėtų būti rengiama atitinkama analitin ė informacija apie tyrimo metu 
naudojam ą geriamąjį vandenį. Pašaro parinkimui gali tur ėti įtakos poreikis 
tinkamai įmaišyti bandom ąją cheminę medžiag ą ir laikytis gyv ūnų mitybos 
reikalavim ų, kai bandomoji chemin ė medžiaga duodama su pašaru.  
Gyvūnų paruošimas  
17. Turėtų būti naudojami sveiki gyv ūnai, ne trumpiau kaip septynias paras 
pratinti prie laboratorini ų sąlygų ir anksčiau nenaudoti kitiems bandymams. 
Jeigu naudojami graužikai, doz ė gyvūnams turėtų būti pradedama duoti kaip 
galima anks čiau po atjunkymo ir pripratinimo, pageidautina, ne v ėliau nei 
gyvūnams sueina aštuonios savait ės. Gyvūnai turėtų būti apibūdinti nurodant 
rūšį, padermę, šaltinį, lytį, masę ir amžių. Pradedant tyrim ą kiekvienos lyties 
gyvūnų kūno masės skirtumai turi b ūti kuo mažesni ir pagal kiekvien ą lytį ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
nenukrypti nuo vis ų tyrime dalyvaujan čių gyvūnų kūno masės vidurkio 
daugiau kaip ± 20 %. Gyv ūnai turėtų būti atsitiktine tvarka suskirstyti į 
kontrolines ir bandom ąsias grupes. Gyv ūnus suskirs čius atsitiktine tvarka, 
grupių vidutinės kūno masės pagal lyt į neturėtų smarkiai skirtis. Jeigu yra 
statistiniu poži ūriu dideli ų skirtumų, atsitiktinis suskirstymo etapas tur ėtų 
būti pakartotas (jeigu tai įmanoma). Kiekvienam gyv ūnui turėtų būti 
suteiktas unikalus identifikavimo numeris, kuriuo gyv ūnas visam laikui 
pažymimas j į ištatuiruojant, implantuojant mikroschem ą arba kitu tinkamu 
būdu. 
PROCED ŪRA 
Gyvūnų skaičius ir lytis  
18. Turėtų būti naudojami abiej ų lyčių gyvūnai. Turėtų būti naudojama tiek 
gyvūnų, kad baigus tyrim ą kiekvienoje grup ėje liktų pakankamai gyv ūnų 
išsamiai biologinei ir statistinei analizei. Jeigu naudojami graužikai, kiek ­
vieno dydžio dozei skirtos grup ės paprastai sudaromos iš 20 patin ų ir 20 
patelių; jeigu naudojami ne graužikai, rekomenduojama grupes sudaryti iš ne 
mažiau kaip keturi ų patinų ir keturi ų patelių. Jeigu tyrimams naudojamos 
pelės, į kiekvieno dydžio dozei skirt ą grupę gali reik ėti įtraukti daugiau 
gyvūnų, kad būtų galima atlikti visus reikiamus hematologinius tyrimus.  
Rezervo sudarymas atsižvelgiant į gyvūnų marinim ą nebaigus 
bandymo, pagalbini ų grupių sudarymas ir kontrolini ų gyvūnų parūpi­
nimas  
19. Jeigu tai moksliškai pagr įsta, rengiantis tyrimui gali b ūti sudarytas rezervas 
(ne mažiau kaip po 10 kiekvienos lyties gyv ūnų kiekvienoje grup ėje) atsiž­
velgiant į gyvūnų marinimą nebaigus bandymo, pvz., po šeši ų mėnesių, kad 
būtų galima gauti informacijos apie toksikologini ų pakitimų vystymąsi ir 
mechanistin ės informacijos. Jeigu tokios informacijos apie bandom ąją 
cheminę medžiag ą jau turima remiantis anks čiau atliktais kartotin ės dozės 
toksiškumo tyrimais, gyv ūnų marinimo nebaigus bandymo moksliškai 
pagrįsti negalima. Taip pat gali b ūti naudojamos pagalbin ės grupės, skirtos 
stebėti galimų tiriamos bandomosios chemin ės medžiagos sukelt ų toksiko­
loginių pakitimų grįžtamumą; šios grup ės paprastai naudojamos tik didžiau ­
siajai tyrimo dozei ir kontrolei. Be to, gali b ūti numatyta papildoma kontro ­
linių gyvūnų grupė (paprastai – po penkis kiekvienos lyties gyv ūnus), skirta 
prireikus steb ėti ligos b ūklę tyrimo metu (22). Jeigu numatytas gyv ūnų 
marinimas nebaigus bandymo arba pagalbini ų ar kontrolini ų grupių naudo­
jimas, tyrimo plane numatytas gyv ūnų skaičius turėtų būti padidintas numa ­
tytu nebaigus tyrimo numarinti gyv ūnų skaičiumi. Šie gyv ūnai turėtų 
stebimi taip pat, kaip pagrindinio tyrimo l ėtinio toksiškumo etapo gyv ūnai, 
įskaitant k ūno masės stebėjimą, pašarų ir vandens suvartojimo steb ėjimą, 
hematologinius ir klinikin ės biochemijos matavimus ir patologinius tyrimus, 
tačiau taip pat gali b ūti numatyta (grup ėse, kuriose numatytas gyv ūnų mari­
nimas nebaigus bandymo) atlikti tik tokius matavimus, kurie yra susij ę su 
specifiniais, pagrindiniais matais, pvz., neurotoksiškumu arba imunotoksiš ­
kumu.  
Dozių dydžių grupės ir dozuot ė 
20. Rekomendacijos d ėl visų su dozių dydžių parinkimu ir dozi ų dydžių skir­
tumų nustatymu susijusi ų aspektų pateiktos rekomendaciniame dokumente 
Nr. 116 (6). Tur ėtų būti naudojamos bent trij ų dydžių dozės ir taikoma 
vienalaikė kontrolė, išskyrus atvejus, kai atliekamas ribinis bandymas (žr. 
27 skirsnį). Dozių dydžiai paprastai grindžiami trumpesnio laikotarpio karto ­
tinių dozių arba ribų nustatymo tyrim ų rezultatais ir tur ėtų būti nustatomi 
atsižvelgiant į visus turimus toksikologinius ir toksikokinetinius duomenis 
apie bandom ąją medžiag ą arba panašias chemines medžiagas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. Jeigu doz ė neturėtų būti ribojama atsižvelgiant į bandomosios medžiagos 
fizines ir chemines savybes arba biologin į poveikį, didžiausioji doz ė 
paprastai tur ėtų būti parenkama tokia, kad b ūtų galima nustatyti pagrindinius 
tikslinius organus ir toksin į poveikį, nesukeliant kan čios, sunkaus toksiš ­
kumo, liguistumo arba ž ūties. Atsižvelgiant į toliau 22 skirsnyje išd ėstytus 
veiksnius, didžiausioji doz ė turėtų būti parenkama tokia, kad j ą taikant b ūtų 
sukeliami pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., pasireiškiantys k ūno masės 
prieaugio sumaž ėjimu (apie 10 %).  
22. Tačiau, atsižvelgiant į tyrimo tikslus (žr. 6 skirsn į), didžiausioji doz ė gali 
būti parinkta mažesn ė už dozę, kurią taikant b ūtų pastebimi toksiškumo 
požymiai, pvz., jeigu taikant doz ę sukeliamas dominantis neigiamas 
poveikis, turintis nedidel ės įtakos gyvenimo trukmei arba k ūno masei. 
Didžiausioji doz ė neturėtų viršyti 1 000 mg/kg k ūno masės per parą (ribinė 
dozė, žr. 27 skirsn į). 
23. Dozi ų dydžiai ir dozi ų dydžių skirtumai gali b ūti parinkti tokie, kad b ūtų 
galima nustatyti doz ės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ę ir NNPL arba 
gauti kitok į siekiamą tyrimo rezultat ą, pvz., nustatyti orientacin ę dozę (OD) 
(žr. 25 skirsn į) taikant mažiausi ąją dozę. Nustatant mažesni ąsias dozes, 
turėtų būti atsižvelgiama į tokius veiksnius, kaip numatomas doz ės ir reak­
cijos tarpusavio priklausomyb ės kreivės nuolydis, doz ės, kurias taikant atsi ­
randa reikšming ų metabolizmo arba toksinio poveikio b ūdo pokyčių, kai 
tikimasi gauti ribin ę vertę arba atskaitos tašk ą mažiausiosios doz ės ekstra­
poliavimui.  
24. Dozi ų dydžių skirtumai parenkami atsižvelgiant į bandomosios chemin ės 
medžiagos savybes ir aprašant š į metodą negali b ūti iš anksto numatyti, 
tačiau tinkamas bandym ų veiksmingumas dažnai užtikrinamas tada, kai 
nustatant maž ėjančius dozių dydžius taikomi koeficientai nuo 2 iki 4; be 
to, jeigu taikomi labai dideli dozi ų dydžių skirtumai (pvz., taikomi didesni 
koeficientai nei 6–10), dažnai patartina naudoti ketvirt ąją bandomąją grupę. 
Apskritai reik ėtų vengti taikyti didesnius koeficientus nei 10; jeigu tokie 
taikomi, jie tur ėtų būti pagrindžiami.  
25. Kaip išsamiau aprašyta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6), konkre ­ 
čios dozės turėtų būti nustatomos atsižvelgiant į tokius veiksnius:  
— žinomus arba numanomus netiesiškumus arba doz ės ir reakcijos tarpu ­
savio priklausomyb ės kreivės išlinkio taškus,  
— toksikokinetines savybes ir dozi ų intervalus, kuriuose pasireiškia meta ­
bolizmo paskatinimo, įsotinimo efektai arba išorin ės ir vidin ės dozių 
tarpusavio netiesiškumas, arba kuriuose nurodyt ųjų dalykų nepasireiškia,  
— pirminius pakitimus, poveikio rodiklius arba pagrindini ų aiškiai nepaste ­
bimų biologini ų procesų veikimo požymius,  
— pagrindinius (arba numanomus) veikimo b ūdo aspektus, pvz., dozes, 
kurias taikant pradeda reikštis citotoksiškumas, sutrikdomi hormon ų 
lygiai, nustelbiami homeostaziniai mechanizmai ir t. t.,  
— dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ės kreivės sritis, kuriose 
būtina atlikti ypa č tikslius vertinimus, pvz., numanomos orientacin ės 
dozės (OD) arba numanomos ribin ės vertės sritis,  
— numanomus poveikio žmon ėms lygius.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Kontrolin ė grupė – tai doz ės negaunan čių gyvūnų grupė arba nešiklio kont ­
rolės grupė, jeigu bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas 
nešiklis. Išskyrus poveik į bandom ąja chemine medžiaga, su kontrolin ės 
grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi lygiai taip pat, kaip su bandom ųjų 
grupių gyvūnais. Naudojant nešikl į, kontrolin ės grupės gyvūnams duodamas 
didžiausias nešiklio t ūris, skiriamas doz ę gaunančioms grup ėms. Jeigu 
bandomoji chemin ė medžiaga duodama su pašaru ir d ėl prastesnio skonio 
gyvūnai suvartoja mažiau pašaro, gali b ūti naudinga pasitelkti papildom ą 
kartu šeriam ą kontrolin ę grupę, kad būtų užtikrinta geresn ė kontrolė. 
27. Jeigu, remiantis išankstini ų tyrimų informacija, galima numatyti, kad, taikant 
šiam tyrimui aprašytas metodikas, vieno dydžio doz ės, atitinkan čios bent 
1 000 mg/kg k ūno masės per par ą, bandymas nesukels neigiamo poveikio 
ir jeigu toksinio poveikio nesitikima atsižvelgiant į panašios strukt ūros 
cheminių medžiag ų duomenis, visas trij ų dydžių dozės tyrimas gali b ūti 
laikomas neb ūtinu. 1 000 mg/kg k ūno masės per par ą ribinė vertė gali 
būti taikoma tada, kai nereikia skirti didesn ės dozės atsižvelgiant į poveikį 
žmogui.  
Bandomosios chemin ės medžiagos dozi ų paruošimas ir davimas  
28. Bandomoji chemin ė medžiaga paprastai duodama per burn ą, su pašaru ar 
geriamuoju vandeniu arba leidžiama zondu. Daugiau informacijos apie 
dozės davimo b ūdus ir metodus pateikta rekomendaciniame dokumente 
Nr. 116 (6). Doz ės davimo b ūdas ir metodas parenkami atsižvelgiant į 
tyrimo tiksl ą, fizines ir chemines bandomosios chemin ės medžiagos savybes, 
jos biologin į įsisavinim ą ir vyraujant į poveikio žmon ėms būdą ir metod ą. 
Pasirinktas doz ės davimo b ūdas ir metodas turi b ūti pagrįsti. Gyvūnų 
gerovės sumetimais doz ės leidimas zondu paprastai tur ėtų būti pasirenkamas 
tik duodant tokias chemines medžiagas, kuri ų davimo b ūdas ir metodas iš 
esmės atitinka galim ą poveikio žmogui b ūdą ir metod ą (pvz., duodant 
vaistus). Maisto produktuose arba aplinkoje esan čios chemin ės medžiagos, 
įskaitant pesticidus, paprastai duodamos su pašaru arba vandeniu. Ta čiau 
tam tikrais atvejais, pvz., tiriant poveik į darbe, gali b ūti tinkamesni kiti 
dozės davimo b ūdai. 
29. Prireikus bandomoji chemin ė medžiaga ištirpinama arba pagaminama jos 
suspensija tinkamame nešiklyje. Reik ėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kit ų 
priedų savybes, jeigu taikytina: poveik į sugerčiai, pasiskirstymui, metabo ­
lizmui arba bandomosios chemin ės medžiagos sulaikymui; poveik į bando­
mosios chemin ės medžiagos chemin ėms savyb ėms, dėl kurių gali pasikeisti 
jos toksiškumo savyb ės; poveik į maisto ar vandens suvartojimui arba 
gyvūnų įmitimui. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirmenyb ę teikti 
vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimyb ę naudoti alie ­
jaus (pvz., kukur ūzų) tirpalą arba emulsija ir tik po to – galimyb ę naudoti 
tirpalus kituose nešikliuose. Jeigu kaip nešiklis naudojamas ne vanduo, 
turėtų būti žinomos to nešiklio toksin ės savybės. Reikėtų turėti informacijos 
apie bandomosios chemin ės medžiagos stabilum ą ir duodam ų tirpalų arba 
pašarų homogeniškum ą (jeigu taikytina) doz ės davimo s ąlygomis (pvz., su 
pašaru).  
30. Jeigu chemin ės medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, 
svarbu užtikrinti, kad įmaišomi bandomosios chemin ės medžiagos kiekiai 
netrikdytų įprasto mitybos režimo arba vandens balanso. Atliekant ilgalaikio 
toksiškumo tyrimus, kai doz ė duodama su pašaru, bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija pašaro sud ėtyje paprastai tur ėtų neviršyti 5 % 
viršutinės ribos visame pašar ų kiekyje, kad b ūtų išvengta mitybos disba ­
lanso. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga duodama su pašaru, gali b ūti 
taikoma pastovi koncentracija (mg/kg pašaro arba ppm) arba pastovus dozės dydis, nustatomas atsižvelgiant į gyvūno kūno masę (mg/kg k ūno 
masės) ir apskai čiuojamas kas savait ę. Turėtų būti nurodytas pasirinktas 
variantas.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. Jeigu doz ė duodama per burn ą, bandomoji chemin ė medžiaga gyv ūnams 
duodama kasdien (septynias dienas per savait ę), paprastai – 12 m ėnesių 
laikotarpiu (taip pat žr. 33 skirsn į), tačiau atsižvelgiant į norminius reikala ­
vimus gali reik ėti taikyti ilgesn ę trukmę. Pasirinkus bet kuri ą kitą dozės 
davimo tvark ą, pvz., penki ų dienų per savait ę, ją būtina pagr įsti. Jeigu 
dozė duodama per od ą, gyvūnai paprastai veikiami bandom ąja chemine 
medžiaga ne trumpiau kaip šešias valandas per par ą, septynias dienas per 
savaitę, kaip nurodyta šio priedo B.9 skyriuje (10), 12 m ėnesių laikotarpiu. 
Dozės davimas per kv ėpavimo takus vykdomas šešias valandas per par ą, 
septynias paras per savait ę, bet gali b ūti taikomas ir penki ų parų per savait ę 
poveikis, jeigu jis pagrindžiamas. Įprastas doz ės davimo laikotarpis – 12 
mėnesių. Jeigu naudojant kitos r ūšies graužikus nei žiurk ės dozė duodama 
tik per nos į, ilgiausia poveikio trukm ė gali būti pakoreguojama siekiant 
sumažinti tos r ūšies gyvūnų patiriamą kančią. Jeigu doz ė duodama trumpiau 
kaip šešias valandas per par ą, būtina tai pagr įsti. Taip pat žr. šio priedo B.8 
skirsnį (8). 
32. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga leidžiama zondu, tai tur ėtų būti daroma 
kasdien panašiu metu, naudojant skrandžio zond ą arba tinkam ą intubacin į 
vamzdelį. Paprastai duodama viena doz ė per parą, bet, jeigu, pvz., chemin ė 
medžiaga turi vietinio dirginamojo poveikio, paros doz ė gali būti duodama 
padalyta į kelias dalis (pvz., du kartus per par ą). Didžiausias vienkartinis 
duodamo skys čio kiekis priklauso nuo bandomojo gyv ūno dydžio. T ūris 
turėtų būti kaip įmanoma mažesnis ir, jeigu naudojami graužikai, paprastai 
neturėtų viršyti 1 ml/100 g k ūno masės (22). Bandomojo tirpalo t ūrio nepas­
tovumas turi b ūti kiek įmanoma sumažintas, kei čiant koncentracij ą taip, kad 
visų dydžių dozių tūris būtų pastovus. Chemin ėms medžiagoms, kurios gali 
turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio, taikoma išimtis; tokios 
medžiagos turi b ūti atskiestos siekiant išvengti sunkaus vietinio poveikio. 
Turėtų būti vengiama atlikti bandymus taikant koncentracijas, kurios gal ėtų 
turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio virškinimo traktui.  
Tyrimo trukm ė 
33. Nors Šis bandymo metodas pirmiausia sumanytas kaip 12 m ėnesių lėtinio 
toksiškumo tyrimas, tyrimo planas gali b ūti taikomas trumpesniems (pvz., 
šešių arba devyni ų mėnesių) arba ilgesniems (pvz., 18 arba 24 m ėnesių) 
tyrimams, atsižvelgiant į tam tikrų reglamentavimo tvark ų reikalavimus arba 
siekiant specifini ų mechanistini ų tikslų. Jeigu pasirenkama ne 12 m ėnesių 
trukmė, ji turėtų būti pagrįsta, ypač jeigu ta trukm ė trumpesn ė nei 12 
mėnesių. Pagalbin ės grupės, įtrauktos tiriamos bandomosios chemin ės 
medžiagos sukeliam ų toksikologini ų pakitimų grįžtamumo steb ėjimo tiks ­
lais, turėtų negauti doz ės ne mažiau kaip keturias savaites, bet ne ilgiau 
kaip trečdalį visos tyrimo trukm ės nutraukus doz ės davimą. Daugiau pata ­
rimų, įskaitant patarimus d ėl išgyvenimo per tyrim ą įvertinimo, pateikta 
rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (6).  
STEBĖJIMAI  
34. Visi gyv ūnai turėtų būti tikrinami, ar jie sveiki arba nenugaiš ę; paprastai tai 
turėtų būti daroma kiekvienos dienos pradžioje ir pabaigoje, įskaitant savait ­
galius ir šven čių dienas. Bendrieji klinikiniai steb ėjimai turėtų būti atliekami 
bent kart ą per parą, pageidautina, tuo pa čiu paros metu, atsižvelgiant į 
stipriausią numatom ą poveikį po dozės davimo, kai doz ė leidžiama zondu.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Kart ą prieš pirm ąjį dozės davimą (kad būtų galima palyginti atskirus 
gyvūnus), po to – pasibaigus pirmajai tyrimo savaitei, o v ėliau – kas m ėnesį 
turėtų būti atliekami išsam ūs visų gyvūnų klinikiniai steb ėjimai. Steb ėjimų 
protokolas tur ėtų būti sudarytas taip, kad steb ėtojų kaita būtų kuo mažesn ė ir 
kad stebėtojai būtų paskiriami neatsižvelgiant į bandomąją grupę. Kiekvien ą 
kartą šie stebėjimai turėtų būti atliekami tuo pa čiu metu, perk ėlus gyvūną iš 
jo narvelio į tam skirt ą vietą. Stebėjimai turėtų būti kruopščiai registruojami, 
pageidautina, pagal toje laboratorijoje aiškiai apibr ėžtą vertinimo sistem ą. 
Turėtų būti stengiamasi užtikrinti, kad steb ėjimo sąlygų kaita būtų kuo 
mažesnė. Be kitų dalykų, turėtų būti registruojami odos, kailio, aki ų, glei­
vinės pakitimai, išskyr ų atsiradimas ir autonominis aktyvumas (pvz., ašaro ­
jimas, plauk ų pašiaušimas, vyzdžio dydis, ne įprasti kvėpavimo pakitimai). 
Taip pat tur ėtų būti registruojami eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą 
rankomis pakitimai, traukuli ų arba tonini ų judesių atsiradimas, stereotipinis 
(pvz., besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu) arba keistas elgesys (pvz., sav ęs luošinimas, vaikš čiojimas atbulomis) (24).
 
36. Naudojant oftalmoskop ą arba kitą tinkamą įrangą, prieš pirm ąjį bandomo ­
sios chemin ės medžiagos davim ą turėtų būti atlikti vis ų gyvūnų oftalmolo ­
giniai tyrimai. Baigus tyrim ą, turėtų būti atlikti vis ų gyvūnų arba bent 
didžiausiąją dozę gavusios grup ės ir kontrolin ės grupės oftalmologiniai 
tyrimai. Jeigu nustatoma aki ų pakitimų, susijusių su dozės davimu, tur ėtų 
būti ištirti visi gyv ūnai. Jeigu strukt ūrinė analizė arba kita informacija rodo 
toksinį poveikį akims, aki ų tyrimų dažnumas tur ėtų būti didesnis.  
37. Jeigu anks čiau atlikus chemin ės medžiagos 28 dien ų ir (arba) 90 dien ų 
kartotinės dozės toksiškumo bandymus nustatyta, kad chemin ė medžiaga 
gali sukelti neurotoksin į poveikį, prieš pradedant tyrim ą ir kas tris m ėnesius 
nuo tyrimo pradžios, bet ne ilgiau kaip 12 m ėnesių laikotarpiu, o taip pat 
baigus tyrim ą (jeigu jis trunka ilgiau nei 12 m ėnesių) galima (bet nepriva ­
loma) įvertinti jutimines reakcijas į įvairaus pob ūdžio dirgiklius (24) (pvz., 
klausos, regos ir proprioreceptorinius) (25) (26) (27), spaudimo (j ėgos) 
stiprumą (28) ir jud ėjimo aktyvum ą (29). Išsamesn ės informacijos apie 
procedūras, kurios gal ėtų būti taikomos, pateikta atitinkamuose literat ūros 
šaltiniuose. Ta čiau galima taikyti ir čia nurodytiems metodams alternatyvius 
metodus.  
38. Jeigu anks čiau atlikus chemin ės medžiagos 28 dien ų ir (arba) 90 dien ų 
kartotinės dozės toksiškumo bandymus nustatyta, kad chemin ė medžiaga 
gali sukelti imunotoksin į poveikį, baigus tyrim ą galima (bet neprivaloma) 
atlikti išsamesnius šios pasekm ės tyrimus.  
Kūno masė, pašarų ir (arba) vandens suvartojimas ir pašaro efekty ­
vumas  
39. Visi gyv ūnai turėtų būti pasveriami prieš pradedant duoti doz ę, kitas 13 
savaičių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau – bent kart ą per mėnesį. 
Pirmąsias 13 savai čių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau – bent 
kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas pašaro suvartojimas ir pašaro efek ­
tyvumas. Jeigu chemin ė medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, pirm ą­
sias 13 savai čių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau – bent kart ą per 
mėnesį turėtų būti matuojamas vandens suvartojimas. Galimyb ė matuoti 
vandens suvartojim ą turėtų būti svarstoma ir atliekant tyrimus, per kuriuos 
pasikeičia gėrimo įpročiai. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematologiniai ir klinikin ės biochemijos tyrimai  
40. Atliekant tyrimus, per kuriuos naudojami graužikai, po trij ų, šešių ir 
dvylikos m ėnesių, taip pat baigus tyrim ą (jeigu jis trunka ilgiau nei 12 
mėnesių), turėtų būti atlikti ne mažesni ų kaip dešimties patin ų ir dešimties 
patelių grupių hematologiniai tyrimai, visada naudojant tuos pa čius gyvūnus. 
Jeigu atliekant tyrimus naudojamos pel ės, norint atlikti visus reikiamus 
hematologinius tyrimus gali reik ėti pagalbini ų gyvūnų (žr. 18 skirsn į). 
Jeigu atliekant tyrimus naudojami ne graužikai, ėminiai dar nebaigus tyrimo 
ir jį baigus, kaip aprašyta graužik ų atveju, imami iš mažesnio gyv ūnų skai­ 
čiaus (pvz., jeigu tiriami šunys – iš keturi ų kiekvienos lyties gyv ūnų kiek­
vienoje grup ėje). Nepaisant to, ar naudojami graužikai, ar ne graužikai, 
matavimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anks čiau atliktą 90 
dienų tyrimą, per kurį buvo taikomi panaš ūs dozių dydžiai, nebuvo paste ­
bėta poveikio hematologiniams parametrams. Kraujo ėminiai tur ėtų būti 
imami iš nurodytos vietos, pvz., širdies punkcijos vietos arba iš užakiduo ­
binio ančio, taikant nuskausminim ą. 
41. Turėtų būti ištirti šie parametrai (30): bendras leukocit ų kiekis ir įvairių 
leukocitų kiekiai, eritrocit ų kiekis, trombocit ų kiekis, hemoglobino koncent ­
racija, hematokritas (procentin ė kraujo ląstelių tūrio dalis), vidutinis eritro ­
cito tūris (VET), vidutinis hemoglobino kiekis eritrocituose (VHKE), vidu ­
tinė eritrocitų hemoglobino koncentracija (VEHK), protrombino laikas ir 
dalinis aktyvintas tromboplastino laikas. Atsižvelgiant į bandomosios 
cheminės medžiagos toksiškum ą, prireikus gali b ūti matuojami ir kiti hema ­
tologiniai parametrai, pvz., Heinco k ūneliai arba kita netipin ė eritrocitų 
morfologija, arba methemoglobinas. Apskritai tur ėtų būti laikomasi lanks ­
taus poži ūrio, kuriuo b ūtų atsižvelgiama į pastebėtą ir (arba) numatom ą 
atitinkamos bandomosios chemin ės medžiagos poveik į. Jeigu bandomoji 
cheminė medžiaga turi poveikio kraujodaros sistemai, gali reik ėti nustatyti 
retikulocit ų kiekį ir atlikti kaul ų čiulpų citologijos tyrimus, ta čiau to neb ū­
tina daryti nuolat.  
42. Siekiant ištirti svarbiausius toksinius poveikius audiniams, ypa č inkstams ir 
kepenims, reik ėtų atlikti kraujo ėminių, paimtų iš ne mažiau kaip dešimties 
kiekvienos grup ės patinų ir dešimties pateli ų (visada iš t ų pačių gyvūnų) 
tokiais pat laiko intervalais, kaip nurodyta d ėl hematologini ų tyrimų, klini­
kinius biocheminius tyrimus. Jeigu atliekant tyrimus naudojamos pel ės, 
norint atlikti visus reikiamus klinikin ės biochemijos tyrimus, gali reik ėti 
pagalbinių gyvūnų. Jeigu atliekant tyrimus naudojami ne graužikai, ėminiai 
dar nebaigus tyrimo ir j į baigus, kaip aprašyta graužik ų atveju, imami iš 
mažesnio gyv ūnų skaičiaus (pvz., jeigu tiriami šunys – iš keturi ų kiekvienos 
lyties gyv ūnų kiekvienoje grup ėje). Nepaisant to, ar naudojami graužikai, ar 
ne graužikai, matavim ų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anks čiau 
atliktą 90 dienų tyrimą, per kur į buvo duodamos panašaus dydžio doz ės, 
nebuvo pasteb ėta poveikio klinikin ės biochemijos parametrams. Rekomen ­
duojama, kad prieš kraujo pavyzdži ų ėmimą gyvūnai (išskyrus peles) b ūtų 
nešeriami per nakt į. Turėtų būti ištirti šie parametrai (30): gliukoz ė, šlapalas 
(šlapalo azotas), kreatininas, bendras baltym ų kiekis, albuminas, kalcis, 
natris, kalis, bendras cholesterolio kiekis, ne mažiau kaip du atitinkami 
kepenų ląstelių tyrimai (alaninaminotransferaz ė, aspartataminotransferaz ė, 
glutamato dehidrogenaz ė ir bendras tulžies r ūgščių kiekis) (31) ir ne mažiau 
kaip du atitinkami kepen ų ir tulžies sistemos tyrimai (šarmin ė fosfatazė, 
gamaglutamiltransferaz ė, 5’-nukleotidaz ė, bendras bilirubino kiekis, bendras 
tulžies rūgščių kiekis) (31). Be to, atsižvelgiant į bandomosios chemin ės 
medžiagos toksiškum ą, gali b ūti naudinga išmatuoti kitus klinikin ės 
chemijos parametrus, pvz., triglicerid ų koncentracij ą nešėrus, specifinius 
hormonus ir cholinesteraz ę. Apskritai tur ėtų būti laikomasi lankstaus 
požiūrio, kuriuo b ūtų atsižvelgiama į pastebėtą arba numatom ą atitinkamos 
bandomosios chemin ės medžiagos poveik į. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Turėtų būti atlikti ne mažiau kaip dešimties kiekvienos grup ės patinų ir 
dešimties pateli ų šlapimo tyrimai, ėminius imant tokiais pat intervalais, 
kokie taikomi hematologin ės ir klinikin ės chemijos tyrim ų tikslais. Mata ­
vimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anks čiau atliktą 90 dienų 
tyrimą, per kurį buvo duodamos panašaus dydžio doz ės, nebuvo pasteb ėta 
poveikio šlapimo analiz ės rezultatams. Ekspert ų rekomendacijoje d ėl klini­
kinės patologijos tyrim ų pateiktas toks parametr ų sąrašas (30): išvaizda, 
tūris, osmosinis sl ėgis arba savitasis svoris, pH, bendras baltym ų kiekis ir 
gliukozė. Taip pat gali b ūti tiriamas ketonas, urobilinogenas, bilirubinas ir 
paslėptasis kraujas. Prireikus išpl ėsti pasteb ėto (-ų) poveikio (- ų) tyrimą, gali 
būti naudojami papildomi parametrai.  
44. Paprastai laikoma, kad pradiniai hematologiniai ir klinikin ės biochemijos 
kintamieji prieš pradedant duoti doz ę turėtų būti nustatomi atliekant šun ų 
tyrimus, bet j ų nebūtina nustatyti atliekant graužik ų tyrimus (30). Visgi, 
jeigu istoriniai pradiniai duomenys (žr. 50 skirsn į) yra netinkami, tur ėtų 
būti svarstoma galimyb ė parengti min ėtus duomenis.  
Patologija  
Bendrasis skrodimas  
45. Paprastai atliekamas išsamus vis ų tiriamųjų gyvūnų bendrasis skrodimas, 
atidžiai ištiriant k ūno pavirši ų ir visas jo angas, kaukol ę, krūtinės ląstą, 
pilvo ertmes ir j ų turinį. Tačiau taip pat gali b ūti numatyta (grup ėse, kuriose 
numatytas gyv ūnų marinimas nebaigus bandymo, arba pagalbin ėse grupėse) 
atlikti tik tokius matavimus, kurie yra susij ę su specifiniais, pagrindiniais 
matais, pvz., neurotoksiškumu arba imunotoksiškumu (žr. 19 skirsn į). Šių 
gyvūnų nebūtina skrosti ar su jais atlikti tolesni ų procedūrų, aprašytų kituose 
skirsniuose. Kontrolinius gyv ūnus gali reik ėti skrosti atsižvelgiant į konkretų 
atvejį ir vadovaujantis tyrimo vadovo nuoži ūra. 
46. Turėtų būti pasveriami vis ų gyvūnų, išskyrus nurodytuosius 45 skirsnio 
paskutinėje dalyje, organai. Vis ų gyvūnų (išskyrus gaištan čius ir (arba) 
numarintus nebaigus bandymo) antinks čiai, sėklidžių prielipai, širdis, 
inkstai, kepenys, kiaušid ės, blužnis, s ėklidės, skydliauk ė (sveriama po fiksa ­
vimo, kartu su prieskydin ėmis liaukomis) ir gimda tur ėtų būti nuvalyti, jeigu 
reikia, pašalinant prigludusius audinius, ir po skrodimo kuo grei čiau 
pasverti, kol neišdžiuvo. Jeigu atliekant tyrim ą naudojamos pel ės, antinks čių 
sverti neb ūtina. 
47. Atsižvelgiant į audinio tip ą ir numatom ą vėliau atlikti histopatologin į tyrimą, 
tinkamiausioje fiksavimo terp ėje turėtų būti konservuojami šie audiniai (32) 
(laužtiniuose skliaustuose nurodyt ų audinių konservuoti neb ūtina): 
Visi labai pakit ę audiniai  Širdis  Kasa  Skrandis ( įskrandis, liaukin ė 
skrandžio dalis)  
Antinksčiai Klubin ė žarna  Prieskydin ė liauka  [Dantys]  
Aorta  Tuš čioji žarna  Periferinis nervas  S ėklidės 
Smegenys ( įskaitant 
didžiųjų smegen ų, smege­
nėlių ir pailg ųjų smegen ų 
(smegenų tilto) išpjovas)  Inkstai  Hipofiz ė Užkr ūčio liauka  
Akloji žarna  Ašar ų liauka 
(viršakiduobin ė) Prostata  Skydliauk ė 
Gimdos kaklelis  Kepenys  Tiesioji žarna  [Liežuvis]  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
Koaguliatori ų liauka  Plau čiai Seili ų liauka  Trach ėja 
Gaubtinė žarna  Limfmazgiai (paviršiniai 
ir giluminiai)  Sėklinės pūslelės Šlapimo p ūslė 
Dvylikapiršt ė žarna  Pieno liauka (patel ėms – 
privaloma, patinams – 
jeigu galima ištirti akimi)
 Skeleto raumuo  Gimda (su gimdos kakleliu)  
Sėklidžių prielipai  [Viršutiniai kv ėpavimo 
takai, įskaitant nos į, 
kriaukles ir šalutines nosies ertmes]
 Oda [Šlapimtakis]  
Akys (su tinklaine)  Stempl ė Stuburo smegenys (trys 
lygiai: sprando, kr ūtinės 
ląstos ir juosmens)  [Šlaplė] 
[Šlaunikaulis su kelio 
sąnariu]  [Uoslės receptoriai]  Blužnis  Makštis  
Tulžies p ūslė (jeigu tiriamos 
ne žiurkės) Kiaušidės [Kr ūtinkaulis]  Kaul ų čiulpų išpjova ir (arba) 
šviežiai paruošta kaul ų čiulpų 
punkcija  
Harderio liauka  
Jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinks čiai, turėtų būti konservuo ­
jami abu organai. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali 
reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomo ­
sios chemin ės medžiagos savybes, tur ėtų būti konservuojami visi numanomi 
tiksliniai organai. Atliekant tyrimus, per kuriuos doz ė duodama per od ą, 
turėtų būti konservuojami organai, nurodyti kaip konservuotini, kai doz ė 
duodama per burn ą; be to, labai svarbu, kad b ūtų paimti ir užkonservuoti 
specifiniai odos ėminiai iš poveikio vietos. Atliekant inhaliacinius tyrimus, 
konservuotin ų ir tirtinų kvėpavimo tak ų audinių sąrašas turėtų būti suda­
romas remiantis šio priedo B.8 skyriuje (8) ir šio priedo B.29 skyriuje (9) 
pateiktomis rekomendacijomis. Tiriant kitus organus ir (arba) audinius (be specialiai konservuojam ų kvėpavimo tak ų audinių), turėtų būti tiriami 
organai, nurodyti d ėl poveikio per virškinam ąjį traktą būdo pateiktame 
organ
ų sąraše. 
Histopatologinis tyrimas  
48. Yra parengtos toksikologin ės patologijos tyrim ų geriausiosios patirties gair ės 
(32). Tur ėtų būti atlikti bent šie histopatologiniai tyrimai:  
— visų didžiausi ąją dozę gavusios grup ės ir kontrolin ės grupės gyvūnų 
audinių, 
— visų per tyrim ą nugaišusi ų arba numarint ų gyvūnų audinių, 
— visų audinių su plika akimi matomais pakitimais,  
— tikslini ų audinių arba vis ų kitų dydžių dozes gavusi ų grupių gyvūnų 
audinių, dėl kurių didžiausi ąją dozę gavusioje grup ėje nustatyta su 
dozės davimu susijusi ų pakitimų, 
— jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinks čiai, turėtų būti tiriami abu 
organai.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
Duomenys  
49. Turėtų būti pateikti kiekvieno gyv ūno duomenys pagal visus vertinamus 
parametrus. Be to, visi duomenys tur ėtų būti apibendrinti lentel ėse, pagal 
kiekvieną bandom ąją grupę nurodant pradedant bandym ą turėtų gyvūnų 
skaičių, atliekant bandym ą nugaišusi ų arba dėl humanišk ų priežasčių numa­
rintų gyvūnų skaičių ir kiekvienos ž ūties arba numarinimo d ėl humanišk ų 
priežasčių laiką, gyvūnų su toksiškumo požymiais skai čių, pastebėtų toksiš­
kumo požymi ų aprašymą, įskaitant kiekvieno toksinio poveikio pasireiškimo 
laiką, trukmę ir sunkum ą, gyvūnų su audini ų pakitimais skai čių, pakitim ų 
tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentin ę dalį. Gyvūnams, 
kuriems pasireišk ė toksinis poveikis arba atsirado audini ų pakitimų, be paki­
timų lygmens įvertinimo, suvestini ų duomenų lentelėse turėtų būti pateikti 
vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai (ištisinio bandymo duomen ų). 
50. Istoriniai kontroliniai duomenys gali b ūti vertingi aiškinant tyrimo rezul ­
tatus, pvz., kai yra požymi ų, kad taikant vienalaik ę kontrolę gauti duomenys 
iš esmės skiriasi, palyginti su naujausiais duomenimis, gautais stebint kont ­
rolinius gyv ūnus, esan čius toje pa čioje bandymo patalpoje arba kolonijoje. 
Istoriniai kontroliniai duomenys, jeigu jie vertinami, tur ėtų būti pateikti tos 
pačios laboratorijos ir tur ėtų būti susiję su to paties amžiaus ir paderm ės, 
išvestos penkeri ų metų laikotarpiu iki svarstomo tyrimo, gyv ūnais. 
51. Jeigu taikytina, skaitiniai rezultatai tur ėtų būti įvertinti tinkamu, visuotinai 
priimtinu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei skirti duomenys 
turi būti pasirinkti planuojant bandym ą (8 skirsnis). Parenkant duomenis, 
turėtų būti numatytos pataisos atsižvelgiant į gyvūnų išgyvenim ą. 
Bandymo ataskaita  
52. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— fizinė būsena, grynumas, fizin ės ir chemin ės savybės, 
— identifikavimo duomenys,  
— chemin ės medžiagos šaltinis,  
— partijos numeris,  
— chemin ės analizės pažyma.  
Nešiklis (jeigu naudojamas):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo).  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir (arba) paderm ė ir pasirinkimo pagrindimas,  
— gyvūnų skaičius ir amžius pradedant bandym ą, nurodant lyt į, ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.,  
— kiekvieno gyv ūno masė pradedant bandym ą. 
Bandymo s ąlygos:  
— dozės davimo b ūdo ir doz ės parinkimo pagrindimas,  
— jeigu taikytina, taikyti statistiniai duomen ų analizės metodai,  
— išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos ir pašaro 
paruošimą, 
— analitiniai duomenys apie pasiekt ą koncentracij ą, preparato stabilum ą ir 
homogeniškum ą, 
— dozės davimo b ūdas ir išsami informacija apie bandomosios chemin ės 
medžiagos davim ą, 
— jeigu tai inhaliaciniai tyrimai: ar doz ė duodama tik per nos į, ar per vis ą 
kūną, 
— faktin ės dozės (mg/kg k ūno masės per par ą) ir bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracijos pašare ir (arba) geriamajame vandenyje (mg/kg arba ppm) perskai čiavimo į faktinę dozę koeficientas, jeigu 
taikytina,
 
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę. 
Rezultatai (tur ėtų būti pateiktos suvestini ų duomenų lentelės ir kiekvieno 
gyvūno duomenys):  
— išgyvenimo duomenys,  
— kūno masė ir (arba) k ūno masės pokyčiai, 
— pašaro suvartojimas, pašaro efektyvumo skai čiavimai, jeigu jie buvo 
atlikti, ir vandens suvartojimas, jeigu taikytina,  
— toksin ės reakcijos duomenys pagal lyt į ir dozės dydį, nurodant toksiš ­
kumo požymius,  
— pasteb ėtų klinikini ų požymių pobūdis, paplitimas (ir, jeigu įvertinta, 
sunkumas) ir trukm ė (grįžtami ar negr įžtami),  
— oftalmologinis tyrimas,  
— hematologiniai tyrimai,  
— klinikin ės biochemijos tyrimai,  
— šlapimo tyrimai,  
— neurotoksiškumo arba imunotoksiškumo tyrim ų rezultatai,  
— galutin ė kūno masė, 
— organ ų masė (ir masių santykiai, jeigu taikytina),  
— skrodimo išvados,  
— išsamus vis ų su dozės davimu susijusi ų histopatologinio tyrimo rezultat ų 
aprašymas,  
— sugerties duomenys, jeigu yra.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Statistinis rezultat ų apdorojimas, jeigu taikytina.  
Rezultatų aptarimas, apimantis:  
— dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybes,  
— veikimo b ūdo informacijos svarstym ą, 
— modeliavimo metod ų aptarimą, 
— OD, NNPL ir MPNPL nustatym ą, 
— istorinius kontrolinius duomenis,  
— reikšm ę žmonėms. 
Išvados.  
LITERAT ŪRA 
1. OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2. Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the SAFEty 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 
163–208.  
3. Barlow SM, Greig JB, Bridges JW  et al.  (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191.  
4. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: 
an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.  
5. Šio priedo B.27 skyrius. 90 dien ų kartotinės dozės toksiškumo per virškina ­
mąjį traktą ne graužikams tyrimas.  
6. OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.or ­
g/env/testguidelines.
 
7. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
8. Šio priedo B.8 skyrius. Po ūmis toksiškumas įkvėpus. 28 dien ų tyrimas.  
9. Šio priedo B.29 skyrius. Pusiau l ėtinis toksiškumas įkvėpus. 90 dien ų 
tyrimas.  
10. Šio priedo B.9 skyrius. Kartotin ės dozės (28 dien ų) toksiškumas (per od ą). 
11. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chemical 
SAFEty Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human SAFEty Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
 
12. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical SAFEty Assessments. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.  
13. Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al.  (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
14. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al . (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69–98.  
15. OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
16. OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
17. Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approa ­
ches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
18. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
19. 2010 m. rugs ėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES 
dėl mokslo tikslais naudojam ų gyvūnų apsaugos, OL L 276, 2010 10 20, 
p. 33.  
20. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
21. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3–906255–04–2.
 
22. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals 
in various housing systems.  
23. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.  
24. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document No. 60.  
25. Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
26. Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.  
27. Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Compa ­
risons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects 
of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.  
28. Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.  
29. Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. 
Teratol. 13: 599–609.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
30. Weingand K, Brown G, Hall R  et al.  (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and SAFEty Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201.  
31. EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
32. Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTIS  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  naudojant š į bandymo metod ą tiriama chemin ė 
medžiaga arba mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  TOKSIŠKUMO PRENATALINIAM VYSTYMUISI BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 414 (2001).  
1.1. ĮVADAS  
Šis toksiškumo prenataliniam vystymuisi bandymo metodas skirtas 
suteikti bendros informacijos apie poveik į vaikingai patelei ir jos 
gimdoje augan čio vaisiaus prenataliniam vystymuisi; tai gali b ūti 
poveikio motinai, iškaitant ž ūtį, įvertinimas, strukt ūrinės anomalijos 
arba vaisiaus augimo pakitimai. Funkciniai tr ūkumai, nors ir yra 
svarbi vystymosi dalis, n ėra šio bandymo metodo sud ėtinė dalis. 
Jie gali b ūti ištiriami darant atskir ą bandymą arba kaip šio bandymo 
papildymas, naudojant neurotoksiškumo vystymuisi bandymo metodą. Jei reikia gauti daugiau informacijos apie funkcini ų trūkumų 
ir kito postnatalinio poveikio bandym ą, reikėtų atitinkamai ži ūrėti 
toksiškumo dviej ų kartų dauginimuisi bandymo metod ą ir neurotok ­
siškumo vystymuisi bandymo metod ą.
 
Gali tekti š į bandymo metod ą specialiai pritaikyti atskiriems atve ­
jams atsižvelgiant į konkrečias žinias, pvz., bandomosios medžiagos 
fizikines ir chemines arba toksikologines savybes. Toks pritaikymas 
priimtinas, kai įrodantys moksliniai duomenys rodo, kad d ėl to 
bandymas bus informatyvesnis. Tokiais atvejais šie moksliniai įrodymai turi b ūti kruopščiai aprašyti bandymo ataskaitoje.
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Vystymosi toksikologija  – neigiamo poveikio organizmo vysty ­
muisi, galin čio atsirasti d ėl veikimo medžiaga prieš apvaisinim ą, 
prenatalinio vystymosi laikotarpiu arba po gimimo iki lytin ės 
brandos, tyrimas. Pagrindiniai toksiškumo vystymuisi požymiai: 1) organizmo ž ūtis, 2) strukt ūros anomalijos, 3) augimo pakitimas ir 4) 
funkciniai tr ūkumai. Vystymosi toksikologija anks čiau buvo vadi ­
nama teratologija.
 
Neigiamas poveikis  – bet koks su veikimu medžiaga susij ęs paki­
timas, palyginti su pamatine verte, mažinantis organizmo geb ą išgy­
venti, daugintis arba prisitaikyti prie aplinkos. Kalbant apie vysty ­
mosi toksikologij ą neigiamas poveikis pla čiausia prasme yra bet 
koks poveikis, kuris trukdo apvaisinto kiaušin ėlio normaliam vysty ­
muisi, prieš gimim ą ir po jo.  
Augimo pakitimas  – palikuonio organo arba k ūno masės ar dydžio 
pakitimas.  
Pakitimai (anomalijos)  – struktūriniai vystymosi pakitimai, kuriuos 
sudaro išsigimimai ir nukrypimai (28).  
Išsigimimas/didel ė anomalija  – strukt ūrinis pakitimas, laikomas 
kenksmingu gyv ūnui (taip pat gali b ūti mirtinas), paprastai retas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Nukrypimas/maža anomalija  – struktūrinis pakitimas, kurio kenks ­
mingas poveikis gyv ūnui yra mažas arba jo visai n ėra; gali b ūti 
laikinas ir gana dažnai pasitaikyti kontrolin ėje populiacijoje.  
Apvaisintas kiaušin ėlis – apvaisinto kiaušin ėlio dalių visuma bet 
kurioje vystymosi stadijoje nuo apvaisinimo iki gimimo, įskaitant 
ekstraembrionines membranas, gemal ą arba vaisi ų. 
Implantacija (nidacija)  – blastocistos susijungimas su gimdos 
epitelio gleivine, įskaitant jos prasiskverbim ą per gimdos epitel į ir 
jos įaugimą į gleivinę. 
Gemalas  – visų organizm ų ankstyvoji arba vystymosi stadija, tiks ­
liau apvaisinto kiaušin ėlio vystymosi produktas nuo didžiosios ašies 
pasirodymo iki pagrindini ų struktūrų atsiradimo.  
Toksiškumas gemalui  – kenksmingas poveikis normaliai gemalo 
struktūrai, vystymuisi, augimui, ir (arba) gyvybingumui.  
Vaisius  – apvaisintas palikuonis postembrioniniu laikotarpiu.  
Toksiškumas vaisiui  – kenksmingas poveikis normaliai vaisiaus 
struktūrai, vystymuisi, augimui ir (arba) gyvybingumui.  
Persileidimas  – apvaisinimo produkt ų – gemalo arba negyvybingo 
vaisiaus – priešlaikinis pašalinimas iš gimdos.  
Resorbcija  – reiškinys, kai gimdoje implantav ęsis apvaisintas kiau ­ 
šinėlis žūsta ir yra resorbuojamas arba buvo resorbuotas.  
Ankstyvoji resorbcija  – implantacijos p ėdsakai be atpaž įstamo 
gemalo ar vaisiaus.  
Vėlyvoji resorbcija  – žuvęs gemalas arba vaisius su išoriniais išsi ­
gimimą rodančiais pakitimais.  
NOAEL  – nepasteb ėto neigiamo poveikio ribos ( No observed 
adverse effect level ) santrumpa, tai yra didžiausia doz ė arba veikimo 
koncentracija, nesukelianti pastebimo neigiamo poveikio.  
1.3. ETALONIN Ė MEDŽIAGA  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Paprastai bandomoji medžiaga duodama vaikingoms patel ėms bent 
nuo implantacijos iki likus vienai parai iki numatyto numarinimo, 
kuris turi įvykti kiek įmanoma ar čiau normalaus atsivedimo dienos, 
nerizikuojant prarasti duomenis, jei įvyktų priešlaikinis atsivedimas. 
Bandymų metodas n ėra skirtas tik organogenez ės laikotarpiui tirti 
(pvz., 5–15 par ų graužikams, 6–18 par ų triušiams), juo taip pat 
tiriamas poveikis vis ą gestacijos laikotarp į nuo ikiimplantacinio 
laikotarpio, jei tinka, iki likus vienai parai iki cezario pj ūvio darymo. 
Prieš pat cezario pj ūvio darym ą patelės numarinamos, ištiriamas 
gimdos turinys ir įvertinamos išoriškai matomos vaisiaus anomalijos 
bei minkštojo audinio ir griau čių pakitimai.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.5.1.  Gyv ūnų rūšies pasirinkimas  
Rekomenduojama bandymams pasirinkti tinkamiausi ą rūšį ir naudoti 
tas laboratorines r ūšis bei veisles, kurios yra paprastai naudojamos 
darant toksiškumo prenataliniam vystymuisi bandymus. Tinka ­
miausia graužik ų rūšis yra žiurk ė, o ne graužik ų – triušis. Kitos 
rūšies naudojim ą reikėtų pagrįsti. 
1.5.2.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Bandomųjų gyvūnų patalpos temperat ūra turi būti 22 °C (± 3 °C) 
graužikams ir 18 °C (± 3 °C) triušiams. Nors santykin ė oro drėgmė 
turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesn ė kaip 70 %, 
išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikėtų siekti, kad ji b ūtų 50–60 %. 
Apšvietimas turi b ūti dirbtinis ir jo seka: 12 h šviesos ir 12 h tamsos. 
Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, o 
geriamojo vandens kiekis neribojamas.  
Poruojama šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Pageidautina supo ­
ruotus gyv ūnus laikyti atskirai, ta čiau taip pat leidžiama juos laikyti 
nedidelėmis grupėmis. 
1.5.3.  Gyv ūnų paruošimas  
Naudojami sveiki ir ankstesniuose bandymuose nenaudoti gyv ūnai, 
kurie mažiausiai 5 paras buvo pratinami prie laboratorini ų sąlygų. 
Apibūdinama bandom ų gyvūnų rūšis, veislė, šaltinis, lytis, mas ė ir 
(arba) amžius. Kiek įmanoma, vis ų bandymo grupi ų gyvūnai turi 
būti vienodos mas ės ir amžiaus. Kiekvienai dozei naudojamos 
jaunos, suaugusios palikuoni ų neturėjusios patel ės. Patelės poruo­
jamos su tos pa čios rūšies ir veisl ės patinais, be to, reik ėtų vengti 
poravimo su t ų pačių tėvų palikuonimis. Graužikams 0 gestacijos 
diena yra vaginalinio kamš čio ir (arba) spermos atsiradimo diena; 
triušiams 0 diena paprastai yra suporavimo arba dirbtinio apvaisi ­
nimo diena, jei taikomas šis metodas. Apvaisintos patel ės suskirs­
tomos atsitiktiniu b ūdu į kontrolin ę ir bandom ąsias grupes. Narveliai 
išdėstomi taip, kad b ūtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas 
poveikis d ėl narvelio buvimo vietos. Kiekvienam gyv ūnui turėtų būti 
priskirtas savitas identifikavimo numeris. Apvaisintos patel ės atsitik­
tinės atrankos b ūdu paskirstomos į kontrolin ę ir bandymo grupes; jei 
patelės apvaisinamos partijomis, kiekvienos partijos gyv ūnai turi b ūti 
tolygiai paskirstyti po visas grupes. Patel ės, apvaisintos to paties 
patino, panašiu b ūdu tolygiai paskirstomos po visas grupes.  
1.6. BANDYMO EIGA  
1.6.1.  Gyv ūnų skaičius ir lytis  
Kiekvienoje bandymo ir kontrolin ėje grupėje turi būti pakankamas 
patelių skaičius, kad darant skrodim ą būtų maždaug 20 pateli ų su 
implantacijos vietomis. Grup ės, kuriose b ūtų mažiau kaip 16 pateli ų 
su implantacijos vietomis, gali netikti. Pateli ų gaištamumas neb ūtinai 
turi būti bandymo rezultat ų negaliojimo priežastis, jei jis n ėra 
didesnis kaip maždaug 10 %.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Dozi ų ruošimas  
Jei dozių ruošimui lengvinti naudojamas nešiklis arba kitas priedas, 
reikėtų atsižvelgti į tokias jo charakteristikas: poveik į absorbcijai, 
pasiskirstymui, medžiag ų apykaitai ir bandomosios medžiagos sulai ­
kymui arba išskyrimui; poveik į bandomosios medžiagos chemin ėms 
savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumo charakteristikos; 
poveikį maisto ar vandens suvartojimui arba gyv ūnų įmitimui. 
Nešiklis turi netur ėti toksiškumo vystymuisi ir dauginimuisi.  
1.6.3.  Dozavimas  
Paprastai bandomosios medžiagos reik ėtų duoti kasdien nuo implan ­
tacijos dienos (pvz., 5 paros po suporavimo) ir baigti dien ą prieš 
numatytą cezario pj ūvį. Jei išankstiniai bandymai, jei turimi j ų 
duomenys, nerodo, kad yra didel ė ikiimplantacini ų nuostoli ų tiki­
mybė, bandym ą galima prat ęsti ir įtraukti vis ą gestacijos laikotarp į 
nuo suporavimo iki vienos paros prieš numatyt ą numarinim ą. Gerai 
žinoma, kad netinkamas elgesys su gyv ūnais arba stresas gestacijos 
metu gali b ūti prenatalinio vados netekimo priežastimi. Siekiant apsi ­
saugoti nuo prenatalinio vados netekimo d ėl veiksnių, nesusijusi ų su 
bandomąja medžiaga, reik ėtų be reikalo netrikdyti pateli ų arba vengti 
išorinių veiksnių sukeliamo streso, pvz., triukšmo.  
Turi būti naudojamos mažiausiai trys skirting ų dozių bandomosios 
grupės ir lygiagre čiai viena kontrolin ė grupė. Sveiki gyv ūnai paskirs ­
tomi atsitiktiniu b ūdu į kontrolin ę ir bandom ųjų gyvūnų grupes. 
Dozės dydžiai tur ėtų skirtis taip, kad j ų toksinį poveikį būtų galima 
sugraduoti. Jei n ėra apribojim ų dėl fizikinių ir chemini ų arba biolo ­
ginių bandomosios medžiagos savybi ų, didžiausia doz ė pasirenkama 
tokia, kad b ūtų sukeltas tam tikras toksinis poveikis vystymuisi ir 
(arba) patelei (klinikiniai požymiai arba k ūno masės mažėjimas), bet 
ne žūtį arba sunkias kan čias. Mažiausiai viena tarpin ė dozė turėtų 
sukelti mažiausi ą pastebim ą toksinį poveikį. Mažiausia doz ė neturėtų 
sukelti jokio toksinio poveikio patelei arba vaisiaus vystymuisi. Turi 
būti pasirinkta tokia maž ėjanti dozės dydžių seka, kad b ūtų paste­
bėtas kiekviena su doz ės dydžiu susieta reakcija ir nepasteb ėto 
neigiamo poveikio riba (NOAEL). Maž ėjančioms doz ės dydžio 
vertėms nustatyti dažnai pakanka dvigubo arba keturgubo koncent ­
racijos skirtumo; ta čiau norint naudoti labai didelius intervalus tarp 
dozių (pvz., daugiklis didesnis kaip 10), dažnai gerai b ūtų pridėti 
ketvirtą bandymo grup ę. Nors bandymo tikslas – nustatyti pateli ų 
NOAEL, gali b ūti priimtini ir tie bandymai, kuriais tokia doz ė nenus­
tatoma (1).  
Dozių dydžiai pasirenkami atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo 
duomenis ir papildom ą informacij ą apie bandomosios medžiagos 
arba gimining ų medžiagų apykaitą ir toksikokinetik ą. Be to, ši infor ­
macija pad ės pagrįsti dozavimo režimo tinkamum ą. 
Lygiagrečiai naudojama kontrolin ė grupė. Ši grup ė turėtų būti 
medžiagos negaunanti kontrolin ė grupė arba nešikl į gaunanti kontro ­
linė grupė, jei bandomajai medžiagai duoti naudojamas nešiklis. 
Visoms grup ėms turėtų būti duodamas vienodas bandomosios 
medžiagos arba nešiklio t ūris. Kontrolin ės (-ių) grupės (-ių) gyvūnai 
prižiūrimi tokiu pat b ūdu, kaip ir bandymo grup ės gyvūnai. Nešiklio 
kontrolinės grupės turėtų gauti nešiklio kiek į, atitinkanti didžiausi ą 
naudoj am ą kiekį (kokį gauna mažiausia doze veikiama grup ė). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Ribinis bandymas  
Jei darant bandym ą pagal šiame bandymo aprašyme nurodyt ą meto­
diką su viena per virškinam ąjį traktą duodama mažiausiai 1 000 
mg/kg kūno masės per parą doze, toksinis poveikis vaikingai patelei 
arba jos palikuonims nepastebimas ir jei toks poveikis nenumatomas, 
atsižvelgiant į turimus duomenis (pvz., giminingos strukt ūros ir 
(arba) apykaitos jungini ų duomenis), neb ūtina daryti viso bandymo 
naudojant tris dozi ų dydžius. Atsižvelgiant į tikėtiną žmonių sąlytį su 
medžiaga, ribiniam bandymui gali tekti naudoti didesnes dozes per 
virškinam ąjį traktą. Kalbant apie kitus davimo b ūdus, pvz., įkvėpimą 
arba veikim ą per odą, bandomosios medžiagos fizikin ės ir chemin ės 
savybės dažnai gali lemti ir riboti didžiausi ą galimą dozę (pvz., 
dėjimas ant odos neturi sukelti sunkaus vietinio toksinio poveikio).  
1.6.5.  Dozi ų davimas  
Bandomoji medžiaga arba nešiklis paprastai duodamas per virškina ­
mąjį traktą, naudojant zond ą. Jei naudojamas kitas davimo b ūdas, 
bandymų laboratorija tur ėtų pagrįsti sprendim ą ir nurodyti pasirin ­
kimo priežastis, be to, padaryti atitinkamus b ūtinus pakeitimus 
(2)(3)(4). Bandomoji medžiaga tur ėtų būti duodama kiekvien ą 
dieną maždaug tuo pa čiu metu.  
Dozė kiekvienam gyv ūnui paprastai tur ėtų būti nustatoma atsižvel ­
giant į patį paskutin į jo svėrimą. Tačiau reikia atsargiai reguliuoti 
dozės dydį paskutinį gestacijos trimestr ą. Dozė pasirenkama atsižvel ­
giant į turimus duomenis, kad b ūtų išvengta per didelio toksinio 
poveikio patelei. Ta čiau jei pastebima, kad toksinis poveikis pate ­
lėms yra per didelis, jos turi b ūti humaniškai numarinamos. Jei per 
didelio toksiškumo požymiai pasireiškia kelioms vaikingoms pate ­
lėms, reikėtų apsvarstyti visos šios doz ės grupės numarinimo klau ­
simą. Kai bandomoji medžiaga duodama per zond ą, gyvūnams turėtų 
būti duodama tik viena doz ė, naudojant skrandžio zond ą arba 
tinkamą intubacin į vamzdel į. Didžiausias gyv ūnui duodamas vien ­
kartinis skys čio tūris priklauso nuo bandomo gyv ūno dydžio. T ūris 
neturi būti didesnis kaip 1 ml/100 g k ūno masės, išskyrus vandeni ­
nius tirpalus, kuri ų galima duoti po 2 ml/100 g k ūno masės. Jei kaip 
nešiklis naudojamas kukur ūzų aliejus, t ūris neturėtų būti didesnis 
kaip 0,4 ml/100 g k ūno masės. Bandomojo tirpalo t ūrio nepasto ­
vumas turi b ūti kiek įmanoma sumažintas, kei čiant koncentracij ą 
taip, kad vis ų dozių tūris būtų pastovus.  
1.6.6.  Pateli ų stebėjimas  
Klinikiniai steb ėjimai ir užrašai daromi mažiausiai kart ą per dien ą, 
geriau kasdien tuo pa čiu laiku, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo 
poveikio pasireiškimo laik ą po medžiagos davimo. Užrašoma gyv ūnų 
būklė, įskaitant gaištamum ą, liguistum ą, atitinkamus elgesio poky ­ 
čius ir visus akivaizdžius toksiškumo požymius.  
1.6.7.  Kūno masė ir maisto suvartojimas  
Gyvūnai sveriami 0 gestacijos dien ą arba ne v ėliau kaip 3 gestacijos 
dieną, jei suporuoti gyv ūnai tiekiami iš išorinio veislyno, pirm ąją 
dozavimo dien ą, mažiausiai kas 3 dien ą dozavimo laikotarpiu ir 
numatyto numarinimo dien ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Maisto suvartojimas tur ėtų būti registruojamas kas tris paras ir turi 
sutapti su k ūno masės nustatymu.  
1.6.8.  Nekroskopija  
Patelės numarinamos dien ą prieš numatom ą atsivedim ą. Patelės, 
kurioms prieš numatom ą numarinim ą pasireiškia persileidimo arba 
priešlaikinio atsivedimo požymiai, tur ėtų būti numarinamos ir atlie ­
kamas išsamus j ų makroskopinis tyrimas.  
Numarintai arba darant bandym ą nugaišusiai patelei tur ėtų būti 
daromas makroskopinis tyrimas visoms strukt ūros anomalijoms 
arba patologiniams pakitimams nustatyti. Darant cezario pj ūvį ir 
vėlesnį vaisiaus tyrim ą, pateles geriau b ūtų vertinti nežinant 
bandymo grup ės, kad būtų kiek įmanoma sumažintas subjektyvumas.  
1.6.9.  Gimdos turinio tyrimas  
Iš karto po numarinimo arba kiek įmanoma grei čiau po patel ės 
nugaišimo gimda išimama ir patvirtinamas gestacijos faktas. Gimdos, 
kuriose n ėra gestacijos požymi ų, turėtų būti papildomai tiriamos 
(pvz., graužik ų atveju dažant amonio sulfidu arba Salewski metodu 
arba taikant kit ą metodą triušiams) siekiant patvirtinti, kad n ėra 
gestacijos (5).  
Gimdos su vaisiumi, įskaitant kaklel į, pasveriamos. Gyv ūnų, nugai­ 
šusių atliekant bandym ą, gimdos su vaisiumi nesveriamos.  
Turėtų būti nustatytas vaiking ų patelių geltonkūnių (corpora lutea ) 
skaičius. 
Gimdos turinys tiriamas gemalo arba žuvusi ų ir gyvybing ų vaisių 
skaičiui nustatyti. Tur ėtų būti apibūdintas resorbcijos laipsnis, 
siekiant nustatyti santykin į apvaisinto kiaušin ėlio žūties laiką (žr. 
1.2 skirsn į). 
1.6.10.  Vaisi ų tyrimas  
Nustatoma kiekvieno vaisiaus mas ė ir lytis.  
Tiriami kiekvieno vaisiaus išoriniai pakitimai (6).  
Reikėtų ištirti vaisiaus griau čių ir minkšt ųjų audinių pakitimus (pvz., 
nukrypimus ir išsigimimus arba anomalijas) (7) (8) (9) (10) (11) (12) 
(13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24). Pagei ­
dautina, bet nereikalaujama klasifikuoti vaisiaus pakitimus. Jei 
daroma klasifikacija, turi b ūti aiškiai nurodyti kiekvienos kategorijos 
apibrėžimo kriterijai. Ypating ą dėmesį reikėtų atkreipti į dauginimosi 
trakto pakitim ų požymius.  
Kiekvienos graužik ų vados pus ė paruošiama griau čių pakitimams 
tirti. Likusi dalis paruošiama minkšt ų audinių pakitimų tyrimui ir 
jie tiriami taikant priimtus arba tinkamus serijini ų pjūvių metodus 
arba kruopštaus bendrojo nekroskopijos metodus.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
Jei naudojami ne graužikai, pvz., triušiai, tiriami visi vaisiai minkšt ų 
audinių ir griau čių pakitimams nustatyti. Vaisi ų kūnai įvertinami 
darant išsami ą nekroskopij ą minkštų audinių pakitimams nustatyti, 
be to, gali b ūti įtrauktos metodikos papildomai įvertinti širdies vidin ę 
struktūrą (25). Nupjaunama pus ė tokiu būdu ištirtų vaisių galvų, 
kurios apdorojamos siekiant įvertinti minkšt ųjų audinių (įskaitant 
akis, smegenis, nosies kanalus ir liežuv į) pakitimus, taikant standar ­
tinius serijini ų pjūvių metodus (26) arba tokio paties jautrumo 
metodą. Šių vaisių kūnai ir likę sveiki vaisiai apdorojami ir tiriami 
jų griaučių pakitimai, taikant tuos pa čius metodus, kurie aprašyti 
graužikams.  
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Duomenys pateikiami atskirai apie kiekvien ą patelę bei jų palikuonis 
ir apibendrinami lentel ėse, kuriose nurodomas kiekvienos bandymo 
grupės ir kiekvienos kartos gyv ūnų skaičius bandymo pradžioje, 
darant bandym ą nugaišusi ų arba dėl gyvūnų gerovės priežas čių 
numarintų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų žūties arba numarinimo 
laikas, vaiking ų patelių skaičius, toksiškumo požymi ų turinčių 
gyvūnų skaičius, pasteb ėtų toksiškumo požymi ų aprašymas, įskaitant 
pradžios laik ą, trukmę ir bet kokio toksinio poveikio sunkum ą, atlikti 
gemalo ar vaisiaus steb ėjimo būdai ir visi atitinkami vados 
duomenys.  
Skaitmeniniai rezultatai turi b ūti įvertinti taikant atitinkam ą statistinį 
metodą, naudojant vad ą kaip duomen ų analizės statistin į vienetą. 
Turi būti taikomas visuotinai priimtas statistinis metodas; statistiniai 
metodai pasirenkami kaip bandymo schemos dalis ir turi b ūti 
pagrįsti. Turėtų būti pateikti duomenys apie gyv ūnus, kurie neišgy ­
veno iki numatyto numarinimo laiko. Prireikus šie duomenys gali būti naudojami grupi ų vidutinėms vertėms apskai čiuoti. Duomen ų 
apie tokius gyv ūnus tinkamumas ir j ų įtraukimas arba ne įtraukimas 
į kurios nors grup ės vidurkį (-ius) turi b ūti pagrįstas ir sprendimas 
dėl jo priimamas kiekvienu atskiru atveju.
 
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS  
Toksiškumo prenataliniam vystymuisi bandymas įvertinamas atsiž ­
velgiant į pastebėtą poveikį. Įvertinimą turi sudaryti ši informacija:  
— patelės ir gemalo ar vaisiaus bandymo rezultatai, įskaitant ryš į 
tarp gyvūno veikimo bandom ąja medžiaga ir bet kokio stebimo 
poveikio dažnumo ir sunkumo, arba tokio ryšio nebuvim ą, 
— kriterijai, taikyti vaisiaus išor ės, minkšt ųjų audinių ir griau čių 
pakitimams klasifikuoti, jei buvo klasifikuojama,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— prireikus, ankstesni duomenys apie kontrolinius gyv ūnus 
bandymo rezultat ų interpretavimui pagerinti,  
— skaičiai, naudoti visoms procentin ėms dalims arba rodikliams 
apskaičiuoti,  
— atitinkama bandymo rezultat ų statistinė analizė, jei reikia, kurioje 
pakaktų informacijos apie analiz ės metodą, kad nepriklausomas 
ekspertas ar statistikos specialistas gal ėtų iš naujo įvertinti bei 
atkurti analiz ės eigą. 
Visuose bandymuose, kuriuos atlikus nepasteb ėta jokio toksinio 
poveikio, tur ėtų būti numatyti papildomi bandymai bandomosios 
medžiagos absorbcijai ir biologiniam kaupimuisi nustatyti.  
2.3. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Toksiškumo prenataliniam vystymuisi bandymas suteiks informacijos 
apie poveik į patelėms gestacijos metu ir j ų palikuoni ų vystymuisi 
gimdoje d ėl kartotinio veikimo medžiaga. Bandymo rezultatus 
reikėtų interpretuoti atsižvelgiant į rezultatus, gautus darant pusiau 
lėtinio toksiškumo, toksiškumo dauginimuisi ir toksikokinetinius 
bandymus. Kadangi akcentuojamas ir bendrasis toksiškumas 
(toksinis poveikis patel ėms), ir toksiškumas vystymuisi, bandymo 
rezultatai leis tam tikru laipsniu atskirti poveik į vystymuisi, kai 
nėra bendro toksiškumo, ir poveik į, kuris sukeliamas tik esant 
koncentracijai, kuri yra toksiška patelei (27).  
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Ataskaitą turi sudaryti ši konkreti informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir, jei reikia, fizik ės ir chemin ės savybės, 
— tapatumas, įskaitant CAS numer į, jei žinomas ar priskirtas,  
— grynumas.  
Nešiklis (jei naudojamas):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir veisl ė, 
— gyvūnų skaičius ir amžius,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.,  
— atskirai kiekvieno gyv ūno masė bandymo pradžioje.  
Bandymo s ąlygos:  
— dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas,  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparato 
ruošimą arba jos d ėjimą į pašarą, gauta koncentracija, preparato 
stabilumas ir vienalytiškumas,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos davim ą, 
— bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame 
vandenyje (ppm) perskai čiavimas į tikrąją dozę (mg/kg k ūno 
masės per parą), jei taikoma,  
— aplinkos s ąlygos,  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę. 
Rezultatai:  
Toksiškumo patelei duomenys atsižvelgiant į dozę, įskaitant šiuos, 
bet jais neapsiribojant:  
— gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, išgyvenusi ų gyvūnų skai­ 
čius, vaiking ų patelių skaičius, persileidim ų ir priešlaikini ų atsi­
vedimų skaičius, 
— žūties darant bandym ą diena arba iki numarinimo išgyvenusi ų 
gyvūnų skaičius, 
— duomenys apie gyv ūnus, neišgyvenusius iki numatyto numari ­
nimo, užregistruojami, bet ne įtraukiami į statistinį grupių palygi­
nimą, 
— visų anomalių klinikinių požymių pastebėjimo diena ir j ų vėlesnė 
eiga,  
— kūno masė, kūno masės kitimas ir gimdos su vaisiumi mas ė, 
įskaitant, neprivalomai, k ūno masės kitimą su gimdos su vaisiumi 
masės pataisa,  
— pašaro suvartojimas ir, jei matuotas, vandens suvartojimas,  
— nekroskopijos rezultatai, įskaitant gimdos mas ę, 
— NOAEL vert ės: poveikio patelei ir poveikio vystymuisi.  
Toksiškumo vystymuisi duomenys pagal doz ę vadoms su implantais, 
įskaitant:  
— geltonk ūnių skaičių, 
— implantacij ų skaičių, gyvų ir žuvusi ų vaisių bei resorbcij ų skaičių 
ir procentin ę dalį, 
— priešimplantacini ų ir poimplantacini ų nuostolių skaičių ir procen ­
tinę dalį. 
Toksiškumo vystymuisi duomenys pagal doz ę vadoms su gyvais 
vaisiais, įskaitant:  
— gyvų palikuoni ų skaičių ir procentin ę dalį, 
— lyčių santykį, 
— vaisių kūno masę, pageidautina pagal lyt į ir abiejų lyčių kartu,  
— išorinius, minkšt ųjų audinių ir griaučių išsigimimus ir kitus svar ­
bius pakitimus,  
— klasifikavimo kriterijus, jei taikomi,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— vaisių ir vadų, turinčių kokių nors išorini ų, minkštųjų audinių 
arba griau čių pakitimų, visą skaičių ir procentin ę dalį, be to, 
atskirų anomalij ų ir kitų atitinkam ų pakitimų tipus ir dažnum ą. 
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; p. 399–410.  
2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; p. 386–398.
 
3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; p. 1–8.  
4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart 
E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350: Inhala ­
tion Developmental Toxicity Study.  
5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  
Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie und Experi ­
mentelle Pathologie , p. 247–367.  
6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo. In  Advances in Teratology . D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; p. 171–173.  
8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32; p. 381–391.  
9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47, p. 229–242.  
10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects 
of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; p. 476.  
11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127, p. 291–306.  
12) Fritz, h. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative of 
Foetal Maturity.  Teratology  11; p. 313–320.  
13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9; p. 398–408.  
14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; p. 309–316.  
15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; p. 169–181.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera.  Supplement to Teratology 
Workshop Manual , p. 163–173.  
17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the 
Possible Influence of the Sex Factor.  American Journal of 
Anatomy  41; p. 411–445.
 
18) Staples, RE. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for Fetal Bone.  Stain Technology  39; p. 61–63.
 
19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton.  
American Journal of Anatomy  36; p. 313–355.  
20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exami ­
nation of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4; 
p. 181–188.
 
21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton . Thomas, Springfield, IL.  
22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology: Principles and Techniques , Wilson J.G. 
and Warkany J. (eds). University of Chicago, Chicago, IL, p. 251–277.
 
23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of Tera ­
tology , Vol. 4. Plenum, NY.  
24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung . 28; p. 233–239.  
25) Staples, RE. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses.  Teratology  9; p. 37–38.  
26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., 
Merker, h.J. and Kwasigroch, TE. (eds.). University of 
Chicago, Chicago, IL, p. 126–144.
 
27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798–63826.  
28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental 
Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) 
Teratology 55; p. 249–292.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  KANCEROGENIŠKUMO TYRIMAI  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 451 (OECD 
bandymo gair ės Nr. 451) (2009). Originalios kancerogeniškumo bandymo 
gairės TG 451 priimtos 1981 m. Šis atnaujintasis B.32 bandymo metodas 
parengtas atsižvelgiant į poreikį įvertinti naujausius pasiekimus gyv ūnų 
gerovės srityje ir normini ų reikalavim ų pasikeitimus (2) (3) (4) (5) (6). 
B.32 bandymo metodas buvo atnaujinamas kartu su šio priedo B.30 skyriumi „L ėtinio toksiškumo tyrimai“ ir šio priedo B.33 skyriumi „Jungti ­
niai lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrimai“, siekiant gauti papil ­
domos informacijos remiantis per tyrim ą naudotais gyv ūnais ir pateikti išsa ­
mesnių rekomendacij ų dėl dozės parinkimo. B.32 bandymo metodas skirtas 
taikyti bandant labai įvairias chemines medžiagas, įskaitant pesticidus ir 
pramonines chemines medžiagas. Reik ėtų atkreipti d ėmesį, kad kai kurios 
vaistams taikytinos išsamios nuostatos ir reikalavimai gali skirtis (žr. Tarp ­
tautinės konferencijos d ėl suderinimo (ICH) Vaist ų kancerogeniškumo 
bandymų gaires S1B).
 
2. Daugelis kancerogeniškumo tyrim ų atliekami naudojant graužik ų rūšis, todėl 
šis metodas pirmiausia taikytinas tyrimams, atliekamiems naudojant šias 
rūšis. Jeigu tokius tyrimus reik ėtų atlikti naudojant ne graužik ų rūšis, 
jiems turėtų būti taikomi aprašant š į bandymo metod ą ir šio priedo B.27 
skyriuje „90 dien ų kartotinės dozės toksiškumo per virškinam ąjį traktą ne 
graužikams tyrimas“ (6) išd ėstyti principai ir proced ūros su atitinkamais 
pakeitimais. Daugiau patarim ų pateikta OECD rekomendaciniame doku ­
mente Nr. 116 d ėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ų plana­
vimo ir atlikimo (7).  
3. Atliekant kancerogeniškumo tyrimus, doz ė paprastai gali b ūti duodama 
trimis būdais – per burn ą, per odą ir per kv ėpavimo takus. Doz ės davimo 
būdas parenkamas atsižvelgiant į bandomosios chemin ės medžiagos fizines 
ir chemines savybes ir labiausiai paplitus į poveikio žmon ėms būdą. Daugiau 
informacijos apie poveikio b ūdo parinkim ą pateikta OECD rekomendaci ­
niame dokumente Nr. 116 (7).  
4. Šis bandymo metodas iš esm ės skirtas poveikio per virškinam ąjį traktą 
būdui, nes šis b ūdas dažniausiai taikomas atliekant kancerogeniškumo 
tyrimus. Norint įvertinti žmoni ų sveikatai gresian čią riziką ir (arba) laikantis 
tam tikros reglamentavimo tvarkos gali reik ėti atlikti kancerogeniškumo 
tyrimus, per kuriuos doz ė būtų duodama per od ą ir kvėpavimo takus, ta čiau 
techniniu poži ūriu abu poveikio b ūdai yra gana sud ėtingi. Šie tyrimai tur ės 
būti planuojami atsižvelgiant į konkretų atvejį, tačiau čia aprašytu bandymo 
metodu, skirtu įvertinti kancerogeniškum ą, kai dozė duodama per burn ą, gali 
būti remiamasi rengiant inhaliacini ų ir (arba) odini ų tyrimų protokol ą, atsiž­
velgiant į rekomendacijas d ėl poveikio laikotarpi ų, klinikini ų ir patologini ų 
parametrų ir t. t. Yra parengtos OECD rekomendacijos d ėl bandom ųjų 
cheminių medžiag ų dozių davimo per od ą (7) ir kv ėpavimo takus (7) (8). 
Planuojant ilgesnius tyrimus, per kuriuos doz ės duodamos per kv ėpavimo 
takus, pirmiausia tur ėtų būti remiamasi šio priedo B.8 skyriumi (9) ir šio 
priedo B.29 skyriumi (10), taip pat OECD rekomendaciniu dokumentu d ėl 
ūmaus poveikio įkvėpus bandym ų (8). Jeigu bandymai atliekami taikant 
poveikio per od ą būdą, turėtų būti remiamasi šio priedo B.9 skyriumi (11).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Atliekant kancerogeniškumo tyrim ą gaunama informacijos apie galimus 
pavojus sveikatai, galin čius kilti d ėl kartotinio poveikio laikotarpiu, kuris 
gali atitikti ir vis ą naudojamos r ūšies gyvūnų gyvenimo trukm ę. Tyrimas 
suteikia informacijos apie bandomosios chemin ės medžiagos toksin į poveikį, 
įskaitant galim ą kancerogeniškum ą, ir gali pad ėti nustatyti tikslinius organus 
bei kaupimosi galimyb ę. Be to, jis gali pad ėti apytiksliai nustatyti nepaste ­
bimo neigiamo poveikio lyg į, susijusį su toksiniu negenotoksini ų kancero­
genų poveikiu ir augli ų sukėlimu; šis įvertis gali b ūti naudojamas nustatant 
saugaus poveikio žmon ėms kriterijus. Taip pat pabr ėžiamas gyv ūnų 
kruopščių klinikinių stebėjimų būtinumas, kad b ūtų gauta kuo daugiau infor ­
macijos.  
6. Pagal š į bandymo metod ą atliekam ų kancerogeniškumo tyrim ų tikslai:  
— nustatyti kancerogenines bandomosios chemin ės medžiagos savybes, d ėl 
kurių dažniau atsiranda neoplazm ų, didėja piktybini ų neoplazm ų santy­
kinė dalis arba trump ėja neoplazm ų atsiradimo laikas, palyginti su viena ­
laikės kontrolės grupėmis, 
— kancerogeninio poveikio tikslinio (- ų) organo (- ų) nustatymas,  
— neoplazm ų atsiradimo laiko nustatymas,  
— auglius sukelian čios dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ės apibū­
dinimas,  
— nepastebimo neigiamo poveikio lygio (NNPL) arba orientacin ės 
dozės (OD) nustatymo pagrindo nustatymas,  
— kancerogeninio poveikio ekstrapoliavimas siekiant nustatyti mažiausio ­
sios dozės poveikio žmon ėms lygius,  
— duomen ų teikimas rengiant bandym ų hipotezes d ėl veikimo b ūdo (2) (7) 
(12) (13) (14) (15).  
PIRMINIAI ASPEKTAI  
7. Vertindama galim ą bandomosios chemin ės medžiagos kancerogeniškum ą, 
bandymų laboratorija, prieš atlikdama tyrim ą, turėtų apsvarstyti vis ą turimą 
informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiag ą, kad planuojant tyrim ą 
pirmiausia b ūtų siekiama padidinti kancerogeniškumo tyrimo veiksmingum ą 
ir sumažinti gyv ūnų naudojim ą. Labai svarbu tur ėti informacijos apie numa ­
nomo kancerogeno veikimo b ūdą ir atsižvelgti į šią informacij ą (2) (7) (12) 
(13) (14) (15), nes tinkamiausio plano parinkimas gali priklausyti nuo, ar bandomoji chemin ė medžiaga yra žinoma arba įtariama kaip kancerogenin ė. 
Daugiau patarim ų, susijusių su veikimo b ūdo aspektais, pateikta rekomen ­
daciniame dokumente Nr. 116 (7).
 
8. Parengti tyrimo plan ą padės informacija apie bandomosios chemin ės 
medžiagos tapatum ą, cheminę struktūrą, fizines ir chemines savybes, toksiš ­
kumo bandym ų in vitro  arba  in vivo , įskaitant genotoksiškumo tyrimus, 
rezultatai, numatomas (-i) panaudojimo b ūdas (-ai) ir galimas poveikis 
žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir mutageniškumo ir (arba) genotoksiš ­
kumo, kancerogeniškumo ir kiti toksikologiniai duomenys apie panašios 
struktūros chemines medžiagas, turimi toksikokinetiniai duomenys (vienos 
dozės ir, jeigu yra, kartotin ės dozės kinetinės savybės) ir duomenys, gauti  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
atlikus kitus kartotinio poveikio tyrimus. Kancerogeniškumo vertinimas 
turėtų būti atliekamas tik gavus pirmin ės informacijos apie toksiškum ą, 
pagrįstos 28 dien ų ir (arba) 90 dien ų kartotinės dozės toksiškumo bandy ­
mais. Be to, naudingos informacijos gali suteikti trumpalaikiai piktybini ų 
auglių sukėlimo ir paskatinimo bandymai. Atliekant bendr ąjį konkrečios 
bandomosios chemin ės medžiagos galimo neigiamo poveikio sveikatai verti ­
nimą, turėtų būti apsvarstyta galimyb ė taikyti etapin į kancerogeniškumo 
bandymo metod ą (16) (17) (18) (19).  
9. Prieš pradedant tyrim ą, atsižvelgiant į bandymo plan ą ir tikslus, tur ėtų būti 
nustatyti tinkamiausi statistiniai rezultat ų analizės metodai. Tur ėtų būti 
apsvarstyta, ar rengiant statistinius duomenis tur ėtų būti atlikta pataisa atsiž ­
velgiant į išgyvenimo rodiklius, kaupiamosios augli ų rizikos ir jos ryšio su 
išgyvenimo trukme analiz ė ir analizė pirmalaikio vienos arba daugiau grupi ų 
pašalinimo atveju. Rekomendacij ų dėl tinkamos statistin ės analizės ir pagrin ­
dinės informacijos apie tarptautiniu mastu pripažintus statistinius metodus 
pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), taip pat rekomendaci ­
niame dokumente Nr. 35 d ėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ų 
analizės ir vertinimo (20).  
10. Atliekant kancerogeniškumo tyrim ą, visada tur ėtų būti atsižvelgiama į 
pagrindinius principus ir aspektus, išd ėstytus OECD rekomendaciniame 
dokumente Nr. 19 d ėl klinikini ų požymių, kaip pasekmi ų žmonėms, pasi­
reiškimo vertinant saugum ą naudojamiems bandomiesiems gyv ūnams pripa ­ 
žinimo, vertinimo ir taikymo (21), pirmiausia jo 62 skirsnyje. Tame skirs ­
nyje teigiama:  „Jeigu per kartotin ės dozės tyrimus gyv ūnams pasireiškia 
klinikinių požymių, kurie progresuoja ir d ėl kurių toliau prast ėja sveikatos 
būklė, turėtų būti priimtas informacija pagr įstas sprendimas, ar nereik ėtų 
humaniškai numarinti gyv ūno. Priimant sprendim ą turėtų būti atsižvelgiama 
į informacijos, kuri b ūtų gauta tęsiant tyrim ą su šiuo gyv ūnu, vertės ir šio 
gyvūno bendrosios b ūklės santykį. jeigu nusprendžiama t ęsti bandym ą su 
šiuo gyv ūnu, atsižvelgiant į poreikį, turėtų būti padidintas steb ėjimų 
dažnumas. Be to, galb ūt būtų įmanoma labai nepakenkiant bandymo tikslui 
laikinai nutraukti doz ės davimą, jeigu dėl to sumaž ėtų skausmas ar kan čia, 
arba sumažinti bandom ąją dozę.“ 
11. Išsami ų rekomendacij ų dėl dozės parinkimo l ėtinio toksiškumo ir kancero ­
geniškumo tyrimams princip ų ir jų svarstym ų pateikta rekomendaciniame 
dokumente Nr. 116 (7), taip pat Tarptautinio gamtos moksl ų instituto leidi ­
niuose (22) (23). Pagrindin ė dozės parinkimo strategija priklauso nuo tyrimo 
pagrindinio tikslo arba tiksl ų (6 skirsnis). Parenkant tinkamus dozi ų dydžius, 
pavojų atranka tur ėtų būti vykdoma atsižvelgiant į mažų dozių sukeliamas 
reakcijas ir į tų pavojų reikšmę. Tai ypa č svarbu tada, kai ketinama atlikti 
jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ą (šio priedo B.33 
skyrius) (12 skirsnis).  
12. Turėtų būti apsvarstyta galimyb ė atlikti jungtin į lėtinio toksiškumo ir kance ­
rogeniškumo tyrim ą (šio priedo B.33 skyrius), o ne atskirai atlikti l ėtinio 
toksiškumo tyrim ą (šio priedo B.30 skyrius) ir kancerogeniškumo tyrim ą 
(šio priedo B.32 skyrius). Palyginti su dviem atskirais tyrimais, atliekant jungtinį bandym ą užtikrinamas didesnis veiksmingumas laiko ir išlaid ų 
požiūriu, neprarandant duomen ų kokybės nei lėtinio poveikio, nei kancero ­
geniškumo bandymo etapu. Ta čiau, atliekant jungtin į lėtinio toksiškumo ir 
kancerogeniškumo tyrim ą (šio priedo B.33 skyrius), tur ėtų būti kruopščiai 
apsvarstyti doz ės parinkimo principai (11 ir 22–25 skirsniai); be to, pripa ­ 
žinta, kad pagal tam tikras reglamentavimo sistemas gali reik ėti atlikti 
atskirus tyrimus.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Aprašant š į bandymo metod ą vartojamos apibr ėžtys pateiktos šio skyriaus 
pabaigoje ir rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).  
BANDYMO PRINCIPAS  
14. Bandomoji chemin ė medžiaga kasdien, paprastai per burn ą, skirtingomis 
dozėmis duodama kelioms bandom ųjų gyvūnų grupėms didžiąją jų gyve­
nimo trukm ės dalį. Taip pat gali b ūti atliekami bandymai doz ę duodant per 
kvėpavimo takus arba per od ą. Atidžiai stebima, ar gyv ūnams nepasireišk ė 
toksiškumo požymi ų ir ar neatsirado neoplastini ų pakitimų. Bandymo metu 
nugaišę arba numarinti gyv ūnai skrodžiami, o baigus bandym ą numarinami 
ir skrodžiami išgyven ę gyvūnai. 
METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
15. Šis bandymo metodas pirmiausia taikomas vertinant kancerogeniškum ą 
graužikams (2 skirsnis). Galimyb ė naudoti ne graužik ų rūšis gali b ūti svars­
toma, jeigu turimi duomenys rodo, kad jie tinkamesni prognozuoti poveik į 
žmonių sveikatai. Gyv ūnų rūšies pasirinkimas tur ėtų būti pagrįstas. Tinka ­
miausia graužik ų rūšis yra žiurk ės, bet galima naudoti ir kit ų rūšių grau­ 
žikus, pvz., peles. Nors peli ų naudojimas atliekant kancerogeniškumo 
bandymus gali b ūti nelabai naudingas (24) (25) (26), pagal kai kurias dabar ­
tines reglamentavimo programas kancerogeniškumo bandymai naudojant peles vis dar yra b ūtini, jeigu nenustatoma, kad toks tyrimas moksliniu 
požiūriu nėra būtinas. Žiurk ės ir pelės yra tinkamiausi bandomieji gyv ūnai, 
nes jų gyvenimo trukm ė palyginti trumpa, jos pla čiai naudojamos atliekant 
farmakologinius ir toksikologinius tyrimus, jos jautrios augli ų sukėlimui, yra 
pakankami gerai aprašyt ų padermių. Atsižvelgiant į šias savybes, yra daug 
informacijos apie j ų fiziologij ą ir patologij ą. Daugiau informacijos apie 
gyvū
nų rūšies ir paderm ės pasirinkim ą pateikta rekomendaciniame doku ­
mente Nr. 116 (7).  
16. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų labora­
torinių padermių gyvūnai. Pageidautina, kad kancerogeniškumo tyrimai b ūtų 
atliekami naudojant tos pa čios paderm ės ir iš to paties šaltinio gautus 
gyvūnus, kokie buvo naudojami per trumpesn į (-ius) išankstin į (-ius) toksiš ­
kumo tyrim ą (-us), tačiau, jeigu žinoma, kad naudojant šios paderm ės ir iš 
šio šaltinio gautus gyv ūnus sunku įgyvendinti per ilgesn ės trukmės tyrimus 
paprastai taikomus išgyvenimo kriterijus [žr. rekomendacin į dokument ą 
Nr. 116 (7)], tur ėtų būti svarstoma galimyb ė naudoti toki ą gyvūnų padermę, 
kurios išgyvenimo per ilgesn ės trukmės tyrimą rodiklis b ūtų priimtinas. 
Patelės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos.  
Laikymas ir š ėrimas  
17. Gyvūnai gali b ūti laikomi po vien ą arba mažomis tos pa čios lyties grup ėmis; 
galimybė laikyti gyv ūnus po vien ą turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu 
tai moksliškai pagr įsta (27) (28) (29). Narveliai tur ėtų būti išdėstyti taip, kad 
galimas narveli ų išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams tur ėtų būtų kuo 
mažesnis. Bandom ųjų gyvūnų laikymo patalpos temperat ūra turėtų būti 
22 °C (± 3 °C). Nors santykinis dr ėgnis turėtų būti ne mažesnis kaip 
30 % ir, pageidautina, ne didesnis kaip 70 % (išskyrus patalp ų valymo 
metą), turėtų būti siekiama palaikyti 50–60 % santykin į drėgnį. Apšvietimas 
turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sek ą. Gyvūnams 
šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo 
vandens kiekio. Š ėrimo režimas tur ėtų atitikti visus bandom ųjų gyvūnų ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
rūšies mitybos reikalavimus; pašaro sud ėtyje turėtų būti kuo mažiau teršal ų, 
įskaitant (be kit ų teršalų) pesticid ų likučius, patvariuosius organinius 
teršalus, fitoestrogenus, sunkiuosius metalus ir mikotoksinus. Tur ėtų būti 
periodiškai – bent pradedant tyrim ą ir pasikeitus naudojamai partijai – 
parengiama analitin ė informacija apie pašarines medžiagas ir pašaro sud ėtyje 
esančių teršalų lygius; ši informacija tur ėtų būti pateikta galutin ėje ataskai ­
toje. Turėtų būti rengiama atitinkama analitin ė informacija apie tyrimo metu 
naudojam ą geriamąjį vandenį. Pašaro parinkimui gali tur ėti įtakos poreikis 
tinkamai įmaišyti bandom ąją cheminę medžiag ą ir laikytis gyv ūnų mitybos 
reikalavim ų, kai bandomoji chemin ė medžiaga duodama su pašaru.  
Gyvūnų paruošimas  
18. Turėtų būti naudojami sveiki gyv ūnai, ne trumpiau kaip septynias paras 
pratinti prie laboratorini ų sąlygų ir anksčiau nenaudoti kitiems bandymams. 
Jeigu naudojami graužikai, doz ė gyvūnams turėtų būti pradedama duoti kaip 
galima anks čiau po atjunkymo ir pripratinimo, pageidautina, ne v ėliau nei 
gyvūnams sueina aštuonios savait ės. Gyvūnai turėtų būti apibūdinti nurodant 
rūšį, padermę, šaltinį, lytį, masę ir amžių. Pradedant tyrim ą kiekvienos lyties 
gyvūnų kūno masės skirtumai turi b ūti kuo mažesni ir pagal kiekvien ą lytį 
nenukrypti nuo vis ų tyrime dalyvaujan čių gyvūnų kūno masės vidurkio 
daugiau kaip ± 20 %. Gyv ūnai turėtų būti atsitiktine tvarka suskirstyti į 
kontrolines ir bandom ąsias grupes. Gyv ūnus suskirs čius atsitiktine tvarka, 
grupių vidutinės kūno masės pagal lyt į neturėtų smarkiai skirtis. Jeigu yra 
statistiniu poži ūriu dideli ų skirtumų, atsitiktinis suskirstymo etapas tur ėtų 
būti pakartotas (jeigu tai įmanoma). Kiekvienam gyv ūnui turėtų būti 
suteiktas unikalus identifikavimo numeris, kuriuo gyv ūnas visam laikui 
pažymimas j į ištatuiruojant, implantuojant mikroschem ą arba kitu tinkamu 
būdu. 
PROCED ŪRA 
Gyvūnų skaičius ir lytis  
19. Turėtų būti naudojami abiej ų lyčių gyvūnai. Turėtų būti naudojama pakan ­
kamai gyv ūnų, kad būtų galima atlikti išsami ą biologinę ir statistin ę analizę. 
Todėl kiekvienoje doz ę gaunančioje ir vienalaik ės kontrolės grupėje turėtų 
būti ne mažiau kaip po 50 kiekvienos lyties gyv ūnų. Atsižvelgiant į tyrimo 
tikslą, gali būti įmanoma padidinti statistin į pagrindini ų įverčių patikimum ą 
nevienodai suskirstant gyv ūnus į įvairių dydžių dozėms skirtas grupes, 
mažiausiajai dozei skirtas grupes sudarant iš daugiau kaip 50 gyv ūnų, 
pvz., kad b ūtų galima apytikriai įvertinti kancerogeniškum ą duodant mažiau ­
siąsias dozes. Ta čiau reikėtų pripažinti, kad nedaug padidinus grup ės dydį 
tyrimo statistinis patikimumas padid ės gana nežymiai. Daugiau informacijos 
apie statistin į tyrimo planavim ą ir dozių dydžių parinkim ą siekiant kuo 
labiau padidinti statistin į patikimum ą pateikta OECD rekomendaciniame 
dokumente Nr. 116 (7).  
Rezervo sudarymas atsižvelgiant į gyvūnų marinim ą nebaigus bandymo 
ir pagalbini ų (kontrolini ų) grupių sudarymas  
20. Jeigu tai moksliškai pagr įsta, rengiantis tyrimui gali b ūti sudarytas rezervas 
atsižvelgiant į gyvūnų marinim ą nebaigus bandymo, pvz., po 12 m ėnesių, 
kad būtų galima gauti informacijos apie neoplastini ų pakitimų vystymąsi ir 
mechanistin ės informacijos. Jeigu tokios informacijos apie bandom ąją 
cheminę medžiag ą jau turima remiantis anks čiau atliktais kartotin ės dozės 
toksiškumo tyrimais, gyv ūnų marinimo nebaigus bandymo moksliškai 
pagrįsti negalima. Jeigu pagal tyrimo plan ą numatytas gyv ūnų marinimas 
nebaigus bandymo, kiekvieno dydžio dozei skirtoje grup ėje, kurioje numa ­
tytas gyv ūnų marinimas nebaigus bandymo, paprastai tur ėtų būti po 10 
kiekvienos lyties gyv ūnų, o bendras pagal tyrimo plan ą numatytas gyv ūnų 
skaičius turėtų būti padidintas numatomu iki tyrimo pabaigos numarinti 
gyvūnų skaičiumi. Gali b ūti numatyta papildoma kontrolini ų gyvūnų 
grupė (paprastai – po penkis kiekvienos lyties gyv ūnus), skirta prireikus 
stebėti ligos būklę tyrimo metu (30). Daugiau patarim ų pateikta rekomenda ­
ciniame dokumente Nr. 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Dozių dydžių grupės ir dozuot ė 
21. Rekomendacijos d ėl visų aspektų, susijusių su dozių dydžių parinkimu ir 
dozių dydžių skirtumų nustatymu, pateiktos rekomendaciniame dokumente 
Nr. 116 (7). Tur ėtų būti taikomi ne mažiau kaip trys dozi ų dydžiai ir 
vienalaikė kontrolė. Dozių dydžiai paprastai grindžiami trumpesnio laiko ­
tarpio kartotini ų dozių arba ribų nustatymo tyrim ų rezultatais ir tur ėtų būti 
nustatomi atsižvelgiant į visus turimus toksikologinius ir toksikokinetinius 
duomenis apie bandom ąją medžiag ą arba panašias chemines medžiagas.  
22. Jeigu doz ė neturėtų būti ribojama atsižvelgiant į bandomosios medžiagos 
fizines ir chemines savybes arba biologin į poveikį, didžiausioji doz ė turėtų 
būti parenkama tokia, kad b ūtų galima nustatyti pagrindinius tikslinius 
organus ir toksin į poveikį, nesukeliant kan čios, sunkaus toksiškumo, liguis ­
tumo arba ž ūties. Atsižvelgiant į toliau 23 skirsnyje išd ėstytus veiksnius, 
didžiausioji doz ė paprastai tur ėtų būti parenkama tokia, kad j ą taikant b ūtų 
sukeliami pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., pasireiškiantys k ūno masės 
prieaugio sumaž ėjimu (apie 10 %). Ta čiau, atsižvelgiant į tyrimo tikslus (žr. 
6 skirsnį), didžiausioji doz ė gali būti parinkta mažesn ė už dozę, kurią taikant 
būtų pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., jeigu taikant doz ę sukeliamas 
dominantis neigiamas poveikis, turintis nedidel ės įtakos gyvenimo trukmei 
arba kūno masei.  
23. Dozi ų dydžiai ir dozi ų dydžių skirtumai gali b ūti parinkti tokie, kad b ūtų 
galima nustatyti doz ės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ę ir – atsižvel ­
giant į bandomosios chemin ės medžiagos veikimo b ūdą – NNPL arba gauti 
kitokį siekiamą tyrimo rezultat ą, pvz., nustatyti orientacin ę dozę (OD) (žr. 
25 skirsn į) taikant mažiausi ąją dozę. Nustatant mažesni ąsias dozes, tur ėtų 
būti atsižvelgiama į tokius veiksnius, kaip numatomas doz ės ir reakcijos 
tarpusavio priklausomyb ės kreivės nuolydis, doz ės, kurias taikant atsiranda 
reikšming ų metabolizmo arba toksinio poveikio b ūdo pokyčių, kai tikimasi 
gauti ribin ę vertę arba atskaitos tašk ą mažiausiosios doz ės ekstrapoliavimui.  
24. Dozi ų dydžių skirtumai parenkami atsižvelgiant į bandomosios chemin ės 
medžiagos savybes ir aprašant š į metodą negali b ūti iš anksto numatyti, 
tačiau tinkamas bandym ų veiksmingumas dažnai užtikrinamas tada, kai 
nustatant maž ėjančius dozių dydžius taikomi koeficientai nuo 2 iki 4; be 
to, jeigu taikomi labai dideli dozi ų dydžių skirtumai (pvz., taikomi didesni 
koeficientai nei 6–10), dažnai patartina naudoti ketvirt ąją bandomąją grupę. 
Apskritai reik ėtų vengti taikyti didesnius koeficientus nei 10; jeigu tokie 
taikomi, jie tur ėtų būti pagrindžiami.  
25. Kaip išsamiau aptarta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), konkre čios 
dozės turėtų būti nustatomos atsižvelgiant į tokius veiksnius:  
— žinomus arba numanomus netiesiškumus arba doz ės ir reakcijos tarpu ­
savio priklausomyb ės kreivės išlinkio taškus,  
— toksikokinetines savybes ir dozi ų intervalus, kuriuose pasireiškia meta ­
bolizmo paskatinimo, įsotinimo efektai arba išorin ės ir vidin ės dozių 
tarpusavio netiesiškumas, arba kuriuose nurodyt ųjų dalykų nepasireiškia,  
— pirminius pakitimus, poveikio rodiklius arba pagrindini ų aiškiai nepaste ­
bimų biologini ų procesų veikimo požymius,  
— pagrindinius (arba numanomus) veikimo b ūdo aspektus, pvz., dozes, 
kurias taikant pradeda reikštis citotoksiškumas, sutrikdomi hormon ų 
lygiai, nustelbiami homeostaziniai mechanizmai ir t. t.,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ės kreivės sritis, kuriose 
būtina atlikti ypa č tikslius vertinimus, pvz., numanomos orientacin ės 
dozės (OD) arba numanomos ribin ės vertės sritis,  
— numanomus poveikio žmon ėms lygius.  
26. Kontrolin ė grupė – tai doz ės negaunan čių gyvūnų grupė arba nešiklio kont ­
rolės grupė, jeigu bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas 
nešiklis. Išskyrus poveik į bandom ąja chemine medžiaga, su kontrolin ės 
grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi lygiai taip pat, kaip su bandom ųjų 
grupių gyvūnais. Naudojant nešikl į, kontrolin ės grupės gyvūnams duodamas 
didžiausias nešiklio t ūris, skiriamas doz ę gaunančioms grup ėms. Jeigu 
bandomoji chemin ė medžiaga duodama su pašaru ir d ėl prastesnio skonio 
gyvūnai suvartoja mažiau pašaro, gali b ūti naudinga pasitelkti papildom ą 
kartu šeriam ą kontrolin ę grupę, kad būtų užtikrinta geresn ė kontrolė. 
Bandomosios chemin ės medžiagos dozi ų paruošimas ir davimas  
27. Bandomoji chemin ė medžiaga paprastai duodama per burn ą, su pašaru ar 
geriamuoju vandeniu arba leidžiama zondu. Daugiau informacijos apie dozės davimo b ūdus ir metodus pateikta rekomendaciniame dokumente 
Nr. 116 (7). Doz ės davimo b ūdas ir metodas parenkami atsižvelgiant į 
tyrimo tiksl ą, fizines ir chemines bandomosios chemin ės medžiagos savybes, 
jos biologin į įsisavinim ą ir vyraujant į poveikio žmon ėms būdą ir metod ą. 
Pasirinktas doz ės davimo b ūdas ir metodas turi b ūti pagrįsti. Gyvūnų 
gerovės sumetimais doz ės leidimas zondu paprastai tur ėtų būti pasirenkamas 
tik duodant tokias chemines medžiagas, kuri ų davimo b ūdas ir metodas iš 
esmės atitinka galim ą poveikio žmogui b ūdą ir metod ą (pvz., duodant 
vaistus). Maisto produktuose arba aplinkoje esan čios chemin ės medžiagos, 
įskaitant pesticidus, paprastai duodamos su pašaru arba vandeniu. Ta čiau 
tam tikrais atvejais, pvz., tiriant poveik į darbe, gali b ūti tinkamesni kiti 
dozės davimo b ūdai.
 
28. Prireikus bandomoji chemin ė medžiaga ištirpinama arba pagaminama jos 
suspensija tinkamame nešiklyje. Reik ėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kit ų 
priedų savybes, jeigu taikytina: poveik į sugerčiai, pasiskirstymui, metabo ­
lizmui arba bandomosios chemin ės medžiagos sulaikymui; poveik į bando­
mosios chemin ės medžiagos chemin ėms savyb ėms, dėl kurių gali pasikeisti 
jos toksiškumo savyb ės; poveik į maisto ar vandens suvartojimui arba 
gyvūnų įmitimui. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirmenyb ę teikti 
vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimyb ę naudoti alie ­
jaus (pvz., kukur ūzų) tirpalą arba emulsija ir tik po to – galimyb ę naudoti 
tirpalus kituose nešikliuose. Jeigu kaip nešiklis naudojamas ne vanduo, 
turėtų būti žinomos to nešiklio toksin ės savybės. Reikėtų turėti informacijos 
apie bandomosios chemin ės medžiagos stabilum ą ir duodam ų tirpalų ir 
pašarų homogeniškum ą (jeigu taikytina) doz ės davimo s ąlygomis (pvz., su 
pašaru).  
29. Jeigu chemin ės medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, 
svarbu užtikrinti, kad įmaišomi bandomosios chemin ės medžiagos kiekiai 
netrikdytų įprasto mitybos režimo arba vandens balanso. Atliekant ilgalaikio 
toksiškumo tyrimus, kai doz ė duodama su pašaru, bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija pašaro sud ėtyje paprastai tur ėtų neviršyti 5 % 
viršutinės ribos visame pašar ų kiekyje, kad b ūtų išvengta mitybos disba ­
lanso. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga duodama su pašaru, gali b ūti 
taikoma pastovi koncentracija (mg/kg pašaro arba ppm) arba pastovus dozės dydis, nustatomas atsižvelgiant į gyvūno kūno masę (mg/kg k ūno 
masės) ir apskai čiuojamas kas savait ę. Turėtų būti nurodytas pasirinktas 
variantas.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Jeigu doz ė duodama per burn ą, bandomoji chemin ė medžiaga gyv ūnams 
duodama kasdien (septynias dienas per savait ę), paprastai (jeigu naudojami 
graužikai) – 24 m ėnesių laikotarpiu (taip pat žr. 32 skirsn į). Pasirinkus bet 
kurią kitą dozės davimo tvark ą, pvz., penki ų dienų per savait ę, ją būtina 
pagrįsti. Jeigu doz ė duodama per od ą, gyvūnai paprastai veikiami bando ­
mąja chemine medžiaga ne trumpiau kaip šešias valandas per par ą, septynias 
dienas per savait ę, kaip nurodyta šio priedo B.9 skyriuje (11), 24 m ėnesių 
laikotarpiu. Doz ės davimas per kv ėpavimo takus vykdomas šešias valandas 
per parą, septynias paras per savait ę, bet gali b ūti taikomas ir penki ų parų 
per savait ę poveikis, jeigu jis pagrindžiamas. Įprastas doz ės davimo laiko ­
tarpis – 24 m ėnesiai. Jeigu naudojant kitos r ūšies graužikus nei žiurk ės dozė 
duodama tik per nos į, ilgiausia poveikio trukm ė gali būti pakoreguojama 
siekiant sumažinti tos r ūšies gyvūnų patiriamą kančią. Jeigu doz ė duodama 
trumpiau kaip šešias valandas per par ą, būtina tai pagr įsti. Taip pat žr. šio 
priedo B.8 skirsn į (9). 
31. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga leidžiama zondu, tai tur ėtų būti daroma 
kasdien panašiu metu, naudojant skrandžio zond ą arba tinkam ą intubacin į 
vamzdelį. Paprastai duodama viena doz ė per parą, bet, jeigu, pvz., chemin ė 
medžiaga turi vietinio dirginamojo poveikio, paros doz ė gali būti duodama 
padalyta į kelias dalis (pvz., du kartus per par ą). Didžiausias vienkartinis 
duodamo skys čio kiekis priklauso nuo bandomojo gyv ūno dydžio. T ūris 
turėtų būti kaip įmanoma mažesnis ir, jeigu naudojami graužikai, paprastai 
neturėtų viršyti 1 ml/100 g k ūno masės (31). Bandomojo tirpalo t ūrio nepas­
tovumas turi b ūti kiek įmanoma sumažintas, kei čiant koncentracij ą taip, kad 
visų dydžių dozių tūris būtų pastovus. Chemin ėms medžiagoms, kurios gali 
turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio, taikoma išimtis; tokios 
medžiagos turi b ūti atskiestos siekiant išvengti sunkaus vietinio poveikio. 
Turėtų būti vengiama atlikti bandymus taikant koncentracijas, kurios gal ėtų 
turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio virškinimo traktui.  
Tyrimo trukm ė 
32. Jeigu naudojami graužikai, įprasta tyrimo trukm ė – 24 m ėnesiai, t. y. 
didžioji naudojam ų gyvūnų įprastos gyvenimo trukm ės dalis. Atsižvelgiant 
į tiriamųjų gyvūnų rūšies paderm ę, gali būti taikoma trumpesn ė arba ilgesn ė 
trukmė, tačiau ji tur ėtų būti pagrįsta. Tam tikros peli ų padermėms, pvz., 
AKR/J, C3H/J arba C57BL/6J, gali b ūti taikomas 18 m ėnesių laikotarpis. 
Toliau pateikta rekomendacij ų dėl tyrimo trukm ės, jo nutraukimo ir d ėl 
išgyvenimo; daugiau rekomendacij ų, įskaitant patarimus d ėl neigiamo 
kancerogeniškumo, susijusio su išgyvenimu per tyrim ą, priimtinumo 
aspektų, pateikta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 d ėl lėtinio 
toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ų planavimo ir atlikimo (7).  
— Turėtų būti svarstoma galimyb ė nutraukti tyrim ą, jeigu mažesnes dozes 
gavusiose grup ėse arba kontrolin ėje grupėje išgyvenusi ų gyvūnų procen­
tinė dalis nebesiekia 25 %.  
— Jeigu d ėl toksinio poveikio pirma laiko ž ūna tik didžiausi ąją dozę gavu­
sios grup ės gyvūnai, tyrimo nereik ėtų nutraukti.  
— Į kiekvienos lyties gyv ūnų išgyvenim ą atsižvelgiama atskirai.  
— Tyrimas netur ėtų būti tęsiamas toliau, jeigu atliekant tyrim ą gaunami 
duomenys nebesuteikia galimyb ės atlikti statistiniu poži ūriu pagrįstą 
vertinimą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
STEBĖJIMAI  
33. Visi gyv ūnai turėtų būti tikrinami, ar jie sveiki arba nenugaiš ę; paprastai tai 
turėtų būti daroma kiekvienos dienos pradžioje ir pabaigoje, įskaitant savait ­
galius ir šven čių dienas. Be to, kart ą per parą turėtų būti patikrinama, ar 
gyvūnams nepasireišk ė specifini ų toksikologin ės reikšmės požymi ų, atsiž­
velgiant į stipriausi ą numatom ą poveikį po doz ės davimo, kai doz ė 
leidžiama zondu. Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas augli ų vysty­
muisi; tur ėtų būti registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo ir už čiuo­
piamo auglio atsiradimo laikas, vieta, dydis, išvaizda ir išsivystymas.  
Kūno masė, pašarų ir (arba) vandens suvartojimas ir pašaro efektyvumas  
34. Visi gyv ūnai turėtų būti pasveriami prieš pradedant duoti doz ę, kitas 13 
savaičių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau – bent kart ą per mėnesį. 
Pirmąsias 13 savai čių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau – bent 
kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas pašaro suvartojimas ir pašaro efek ­
tyvumas. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga duodama su geriamuoju 
vandeniu, pirm ąsias 13 savai čių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau 
– bent kart ą per mėnesį turėtų būti matuojamas vandens suvartojimas. Gali ­
mybė matuoti vandens suvartojim ą turėtų būti svarstoma ir atliekant tyrimus, 
per kuriuos pasikei čia gėrimo įpročiai. 
Hematologiniai ir klinikin ės biochemijos tyrimai bei kiti matavimai  
35. Siekiant per tyrim ą gauti kuo daugiau informacijos, pirmiausia apie veikimo 
būdo aspektus, tyrimo vadovo nuoži ūra gali būti paimti ėminiai, skirti hema ­
tologiniams ir klinikin ės biochemijos tyrimams. Be to, gali b ūti naudinga 
atlikti šlapimo analiz ę. Daugiau informacijos apie toki ų ėminių naudą atlie­
kant kancerogeniškumo tyrim ą pateikta rekomendaciniame dokumente 
Nr. 116 (7). Jeigu priimtina, kraujo ėminių ėmimas hematologiniams ir 
klinikinės biochemijos tyrimams ir šlapimo analiz ė gali būti atliekami per 
gyvūnų marinimo proced ūrą (20 skirsnis) ir baigus tyrim ą, šiuo tikslu 
panaudojant ne mažiau kaip po 10 kiekvienos lyties gyv ūnų kiekvienoje 
grupėje. Kraujo ėminiai tur ėtų būti imami iš nurodytos vietos, pvz., širdies 
punkcijos vietos arba iš užakiduobinio an čio, taikant nuskausminim ą, ir, 
jeigu taikytina, laikomi tinkamomis s ąlygomis. Be to, tyrimams gali b ūti 
paruošti kraujo tepin ėliai, ypač jeigu nustatoma, kad tikslinis organas yra 
kaulų čiulpai; tačiau tokių tyrimų nauda siekiant įvertinti kancerogeniškum ą 
ir (arba) onkogeniškum ą yra abejotina (32).  
PATOLOGIJA  
Bendrasis skrodimas  
36. Paprastai tur ėtų būti atliekamas išsamus vis ų tiriamųjų gyvūnų, išskyrus 
kontrolinius (žr. 20 skirsn į) ir kitus pagalbinius gyv ūnus, bendrasis skro ­
dimas, atidžiai ištiriant k ūno pavirši ų ir visas jo angas, kaukol ę, krūtinės 
ląstą, pilvo ertmes ir j ų turinį. Kontrolinius ir kitus pagalbinius gyv ūnus gali 
reikėti skrosti atsižvelgiant į konkretų atvejį ir vadovaujantis tyrimo vadovo 
nuožiūra. Atliekant kancerogeniškumo tyrim ą organai paprastai nesveriami, 
nes dėl senėjimo pakitim ų, o vėliau – dėl auglių išsivystymo organ ų svėrimo 
duomenys tampa nenaudingi. Ta čiau jie gali b ūti svarbūs atliekant įrodomo­
sios duomen ų galios vertinim ą, o ypač – svarstant veikimo b ūdo aspektus. 
Jeigu atliekant pagalbin į tyrimą sveriami organai, tai tur ėtų būti daroma n ė 
vėliau kaip po met ų nuo tyrimo pradžios.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Atsižvelgiant į audinio tip ą ir numatom ą vėliau atlikti histopatologin į tyrimą, 
tinkamiausioje fiksavimo terp ėje turėtų būti konservuojami šie audiniai (33) 
(laužtiniuose skliaustuose nurodyt ų audinių konservuoti neb ūtina): 
Visi labai pakit ę audiniai  Širdis  Kasa  Skrandis ( įskrandis, liaukin ė 
skrandžio dalis)  
Antinksčiai Klubin ė žarna  Prieskydin ė liauka  [Dantys]  
Aorta  Tuš čioji žarna  Periferinis nervas  S ėklidės 
Smegenys ( įskaitant 
didžiųjų smegen ų, smege­
nėlių ir pailg ųjų smegen ų 
(smegenų tilto) išpjovas)  Inkstai  Hipofiz ė Užkr ūčio liauka  
Akloji žarna  Ašar ų liauka 
(viršakiduobin ė) Prostata  Skydliauk ė 
Gimdos kaklelis  Kepenys  Tiesioji žarna  [Liežuvis]  
Koaguliatori ų liauka  Plau čiai Seili ų liauka  Trach ėja 
Gaubtinė žarna  Limfmazgiai (paviršiniai 
ir giluminiai)  Sėklinės pūslelės Šlapimo p ūslė 
Dvylikapiršt ė žarna  Pieno liauka (patel ėms – 
privaloma, patinams – 
jeigu galima ištirti 
akimi)  Skeleto raumuo  Gimda (su gimdos kakleliu)  
Sėklidžių prielipai  [Viršutiniai kv ėpavimo 
takai, įskaitant nos į, 
kriaukles ir šalutines 
nosies ertmes]  Oda [Šlapimtakis]  
Akys (su tinklaine)  Stempl ė Stuburo smegenys (trys 
lygiai: sprando, kr ūtinės 
ląstos ir juosmens)  [Šlaplė] 
[Šlaunikaulis su kelio 
sąnariu]  [Uoslės receptoriai]  Blužnis  Makštis  
Tulžies p ūslė (jeigu tiriamos 
ne žiurkės) Kiaušidės [Kr ūtinkaulis]  Kaul ų čiulpų išpjova ir (arba) 
šviežiai paruošta kaul ų čiulpų 
punkcija  
Harderio liauka  
Jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinks čiai, turėtų būti konservuo ­
jami abu organai. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali 
reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomo ­
sios chemin ės medžiagos savybes, tur ėtų būti konservuojami visi numanomi 
tiksliniai organai. Atliekant tyrimus, per kuriuos doz ė duodama per od ą, 
turėtų būti konservuojami organai, nurodyti kaip konservuotini, kai doz ė 
duodama per burn ą; be to, labai svarbu, kad b ūtų paimti ir užkonservuoti 
specifiniai odos ėminiai iš poveikio vietos. Atliekant inhaliacinius tyrimus, 
konservuotin ų ir tirtinų kvėpavimo tak ų audinių sąrašas turėtų būti suda­
romas remiantis šio priedo B.8 ir B.29 skyriuose pateiktomis rekomendaci ­
jomis. Tiriant kitus organus ir (arba) audinius (be specialiai konservuojam ų 
kvėpavimo tak ų audinių), turėtų būti tiriami organai, nurodyti d ėl poveikio 
per virškinam ąjį traktą būdo pateiktame organ ų sąraše. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatologinis tyrimas  
38. Yra parengtos toksikologin ės patologijos tyrim ų geriausiosios patirties gair ės 
(33). Tur ėtų būti ištirti bent šie audiniai:  
— visi didžiausi ąją dozę gavusios grup ės ir kontrolin ės grupės gyvūnų 
audiniai,  
— visi per tyrim ą nugaišusi ų arba numarint ų gyvūnų audiniai,  
— visi audiniai su plika akimi matomais pakitimais,  
— jeigu didžiausi ąją dozę gavusioje grup ėje pastebima su doz ės davimu 
susijusių histopatologini ų pakitimų, tiriami tie patys vis ų kitų dydžių 
dozės gavusių grupių gyvūnų audiniai,  
— jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinks čiai, turėtų būti tiriami abu 
organai.  
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
Duomenys  
39. Turėtų būti pateikti kiekvieno gyv ūno duomenys pagal visus vertinamus 
parametrus. Be to, visi duomenys tur ėtų būti apibendrinti lentel ėse, pagal 
kiekvieną bandom ąją grupę nurodant pradedant bandym ą turėtų gyvūnų 
skaičių, atliekant bandym ą nugaišusi ų arba dėl humanišk ų priežasčių numa­
rintų gyvūnų skaičių ir kiekvienos ž ūties arba numarinimo d ėl humanišk ų 
priežasčių laiką, gyvūnų su toksiškumo požymiais skai čių, pastebėtų toksiš­
kumo požymi ų aprašymą, įskaitant kiekvieno toksinio poveikio pasireiškimo 
laiką, trukmę ir sunkum ą, gyvūnų su audini ų pakitimais skai čių, pakitim ų 
tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentin ę dalį. Gyvūnams, 
kuriems pasireišk ė toksinis poveikis arba atsirado audini ų pakitimų, be paki­
timų lygmens įvertinimo, suvestini ų duomenų lentelėse turėtų būti pateikti 
vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai (ištisinio bandymo duomen ų). 
40. Istoriniai kontroliniai duomenys gali b ūti vertingi aiškinant tyrimo rezul ­
tatus, pvz., kai yra požymi ų, kad taikant vienalaik ę kontrolę gauti duomenys 
iš esmės skiriasi, palyginti su naujausiais duomenimis, gautais stebint kont ­
rolinius gyv ūnus, esan čius toje pa čioje bandymo patalpoje arba kolonijoje. 
Istoriniai kontroliniai duomenys, jeigu jie vertinami, tur ėtų būti pateikti tos 
pačios laboratorijos ir tur ėtų būti susiję su to paties amžiaus ir paderm ės, 
išvestos penkeri ų metų laikotarpiu iki svarstomo tyrimo, gyv ūnais. 
41. Jeigu taikytina, skaitiniai rezultatai tur ėtų būti įvertinti tinkamu, visuotinai 
priimtinu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei skirti duomenys 
turi būti pasirinkti planuojant bandym ą (9 skirsnis). Parenkant duomenis, 
turėtų būti numatytos pataisos atsižvelgiant į gyvūnų išgyvenim ą. 
Bandymo ataskaita  
42. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— fizinė būsena, grynumas, fizin ės ir chemin ės savybės, 
— identifikavimo duomenys,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— chemin ės medžiagos šaltinis,  
— partijos numeris,  
— chemin ės analizės pažyma.  
Nešiklis (jeigu naudojamas):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo).  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir (arba) paderm ė ir pasirinkimo pagrindimas,  
— gyvūnų skaičius ir amžius pradedant bandym ą, nurodant lyt į, 
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.,  
— kiekvieno gyv ūno masė pradedant bandym ą. 
Bandymo s ąlygos:  
— dozės davimo b ūdo ir doz ės parinkimo pagrindimas,  
— jeigu taikytina, taikyti statistiniai duomen ų analizės metodai,  
— išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos ir pašaro 
paruošimą, 
— analitiniai duomenys apie pasiekt ą koncentracij ą, preparato stabilum ą ir 
homogeniškum ą, 
— dozės davimo b ūdas ir išsami informacija apie bandomosios chemin ės 
medžiagos davim ą, 
— jeigu tai inhaliaciniai tyrimai: ar doz ė duodama tik per nos į, ar per vis ą 
kūną, 
— faktin ės dozės (mg/kg k ūno masės per par ą) ir bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracijos pašare ir (arba) geriamajame vandenyje (mg/kg arba ppm) perskai čiavimo į faktinę dozę koeficientas, jeigu 
taikytina,
 
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę. 
Rezultatai (tur ėtų būti pateiktos suvestini ų duomenų lentelės ir kiekvieno 
gyvūno duomenys)  
Bendrieji duomenys:  
— išgyvenimo duomenys,  
— kūno masė ir (arba) k ūno masės pokyčiai, 
— pašaro suvartojimas, pašaro efektyvumo skai čiavimai, jeigu jie buvo 
atlikti, ir vandens suvartojimas, jeigu taikytina,  
— toksikonetiniai duomenys, jeigu yra,  
— oftalmoskopini ų tyrimų duomenys (jeigu yra),  
— hematologini ų tyrimų duomenys (jeigu yra),  
— klinikin ės chemijos tyrim ų duomenys (jeigu yra).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Klinikinės išvados:  
— toksiškumo požymiai,  
— nukrypim ų dažnumas (ir, jeigu įvertinta, dydis),  
— klinikini ų požymių pobūdis, sunkumas ir trukm ė (laikinieji ar negr įžta­
mieji).  
Skrodimo duomenys:  
— galutin ė kūno masė, 
— organ ų masė ir masių santykiai, jeigu taikytina,  
— skrodimo išvados, nukrypim ų dažnumas ir dydis.  
Histopatologinis tyrimas:  
— histopatologini ų tyrimų, išskyrus neoplastinius, rezultatai,  
— neoplastini ų tyrimų rezultatai,  
— nustatyt ų didelių ir mikroskopini ų pakitimų sąryšis,  
— išsamus vis ų su dozės davimu susijusi ų histopatologinio tyrimo rezultat ų 
aprašymas, pateikiant sunkumo lygio vertinimus,  
— skaidri ų tarpusavio perži ūros ataskaita.  
Statistinis rezultat ų apdorojimas, jeigu taikytina.  
Rezultatų aptarimas, apimantis:  
— modeliavimo metod ų aptarimą, 
— dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybes,  
— istorinius kontrolinius duomenis,  
— veikimo b ūdo informacijos svarstym ą, 
— OD, NNPL ir MPNPL nustatym ą, 
— reikšm ę žmonėms. 
Išvados.  
LITERAT ŪRA 
1. OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working 
document, Environment Directorate, OECD, Paris.  
2. EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3. Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the SAFEty Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
 
4. Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.  
5. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: 
an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
6. Šio priedo B.27 skyrius. 90 dien ų kartotinės dozės toksiškumo per virškina ­
mąjį traktą ne graužikams tyrimas.  
7. OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.or ­
g/env/testguidelines.  
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9. Šio priedo B.8 skyrius. Po ūmis toksiškumas įkvėpus. 28 dien ų tyrimas.  
10. Šio priedo B.29 skyrius. Pusiau l ėtinis toksiškumas įkvėpus. 90 dien ų 
tyrimas.  
11. Šio priedo B.9 skyrius. Kartotin ės dozės (28 dien ų) toksiškumas (per od ą). 
12. Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801.
 
13. Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581–589.
 
14. Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent 
Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51–56.  
15. Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE 
(2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591–653.
 
16. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical 
SAFEty Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human SAFEty Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
 
17. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Appli ­
cation of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical SAFEty Assessments. Critical Reviews in Toxico ­
logy 36: 9–35.
 
18. Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic 
Toxicity Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 37–68.  
19. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98.
 
20. OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21. OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/ ­
MONO(2000)7, OECD, Paris.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
22. Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpreta ­
tion of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approa ­
ches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
23. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, 
Washington, DC.  
24. Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharma ­
ceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25. Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the 
assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF 
& Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279–284.
 
26. Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of 
Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agroche ­
mical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196–1203.
 
27. 2010 m. rugs ėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES 
dėl mokslo tikslais naudojam ų gyvūnų apsaugos, OL L 276, 2010 10 20, 
p. 33.  
28. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington, D.C., US Dept. of Health 
and Human Services.  
29. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of 
Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3–906255–04–2.
 
30. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals 
in various housing systems.  
31. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15–23.
 
32. Weingand K,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and SAFEty Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198–201.  
33. Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P,  et al.  (2004). Best Practices Guide ­
line: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTIS  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  naudojant š į bandymo metod ą tiriama chemin ė 
medžiaga arba mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33.  JUNGTINIAI L ĖTINIO TOKSIŠKUMO IR KANCEROGENIŠ ­
KUMO TYRIMAI  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 453 (OECD 
bandymo gair ės Nr. 453) (2009). Originalios bandymo gair ės TG 453 
priimtos 1981 m. Šis atnaujintasis B.33 bandymo metodas parengtas atsiž ­
velgiant į poreikį įvertinti naujausius pasiekimus gyv ūnų gerovės srityje ir 
norminių reikalavim ų pasikeitimus (1) (2) (3) (4) (5). B.33 bandymo 
metodas buvo atnaujinamas kartu su šio priedo B.32 skyriumi „Kanceroge ­
niškumo tyrimai“ ir šio priedo B.30 skyriumi „L ėtinio toksiškumo tyrimai“, 
siekiant gauti papildomos informacijos remiantis per tyrim ą naudotais gyv ū­
nais ir pateikti išsamesni ų rekomendacij ų dėl dozės parinkimo. Šis bandymo 
metodas skirtas taikyti bandant labai įvairias chemines medžiagas, įskaitant 
pesticidus ir pramonines chemines medžiagas. Reik ėtų atkreipti d ėmesį, kad 
kai kurios vaistams taikytinos išsamios nuostatos ir reikalavimai gali skirtis [žr. Tarptautin ės konferencijos d ėl suderinimo (ICH) Vaist ų kancerogeniš ­
kumo bandym ų gaires S1B].
 
2. Daugelis l ėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ų atliekami naudojant 
graužikų rūšis, todėl šis metodas pirmiausia taikytinas tyrimams, atliekamiems 
naudojant šias r ūšis. Jeigu tokius tyrimus reik ėtų atlikti naudojant ne graužik ų 
rūšis, jiems taip pat gali b ūti taikomi čia ir šio priedo B.27 skyriuje „90 dien ų 
kartotinės dozės toksiškumo per virškinam ąjį traktą ne graužikams tyrimas“ 
(6) išdėstyti principai ir proced ūros su atitinkamais pakeitimais, kaip aprašyta 
OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 d ėl lėtinio toksiškumo ir 
kancerogeniškumo tyrim ų planavimo ir atlikimo (7).  
3. Atliekant l ėtinio toksiškumo ir (arba) kancerogeniškumo tyrimus, doz ė 
paprastai gali b ūti duodama trimis b ūdais – per burn ą, odą ir kvėpavimo 
takus. Doz ės davimo b ūdas parenkamas atsižvelgiant į bandomosios 
cheminės medžiagos fizines ir chemines savybes ir labiausiai paplitus į 
poveikio žmon ėms būdą. Daugiau informacijos apie poveikio b ūdo parin­
kimą pateikta OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).  
4. Šis bandymo metodas iš esm ės skirtas poveikio per virškinam ąjį traktą 
būdui, nes šis b ūdas dažniausiai taikomas atliekant l ėtinio toksiškumo ir 
kancerogeniškumo tyrimus. Norint įvertinti žmoni ų sveikatai gresian čią 
riziką ir (arba) laikantis tam tikros reglamentavimo tvarkos gali reik ėti atlikti 
ilgalaikius tyrimus, per kuriuos doz ė būtų duodama per od ą ir kvėpavimo 
takus, tačiau techniniu poži ūriu abu poveikio b ūdai yra gana sud ėtingi. Šie 
tyrimai tur ės būti planuojami atsižvelgiant į konkretų atvejį, tačiau čia apra­ 
šytu bandymo metodu, skirtu įvertinti lėtinį toksiškum ą ir kancerogeniš ­
kumą, kai dozė duodama per burn ą, gali būti remiamasi rengiant inhaliacini ų 
ir (arba) odini ų tyrimų protokol ą, atsižvelgiant į rekomendacijas d ėl 
poveikio laikotarpi ų, klinikini ų ir patologini ų parametr ų ir t. t. Yra parengtos 
OECD rekomendacijos d ėl bandom ųjų cheminių medžiag ų dozių davimo 
per kvėpavimo takus (7) (8) ir od ą (7). Planuojant ilgesnius tyrimus, per 
kuriuos doz ės duodamos per kv ėpavimo takus, pirmiausia tur ėtų būti remia­
masi šio priedo B.8 skyriumi (9) ir šio priedo B.29 skyriumi (10), taip pat OECD rekomendaciniu dokumentu d ėl ūmaus poveikio įkvėpus bandym ų 
(8). Jeigu bandymai atliekami taikant poveikio per od ą būdą, turėtų būti 
remiamasi šio priedo B.9 skyriumi (11).
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Atliekant jungtin į lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ą gaunama 
informacijos apie galimus pavojus sveikatai, galin čius kilti d ėl kartotinio 
poveikio laikotarpiu, kuris gali atitikti ir vis ą naudojamos r ūšies gyvūnų 
gyvenimo trukm ę. Tyrimas suteikia informacijos apie bandomosios 
cheminės medžiagos toksin į poveikį, įskaitant galim ą kancerogeniškum ą, ir 
padeda nustatyti tikslinius organus bei kaupimosi galimyb ę. Be to, jis gali 
padėti apytiksliai nustatyti nepastebimo neigiamo poveikio lyg į, susijusį su 
toksiniu negenotoksini ų kancerogen ų poveikiu ir augli ų sukėlimu; šis įvertis 
gali būti naudojamas nustatant saugaus poveikio žmon ėms kriterijus. Taip 
pat pabrėžiamas gyv ūnų kruopščių klinikinių stebėjimų būtinumas, kad b ūtų 
gauta kuo daugiau informacijos.  
6. Pagal š į bandymo metod ą atliekam ų lėtinio toksiškumo ir (arba) kanceroge ­
niškumo tyrim ų tikslai:  
— nustatyti kancerogenines bandomosios chemin ės medžiagos savybes, d ėl 
kurių dažniau atsiranda neoplazm ų, didėja piktybini ų neoplazm ų santy­
kinė dalis arba trump ėja neoplazm ų atsiradimo laikas, palyginti su viena ­
laikės kontrolės grupėmis, 
— neoplazm ų atsiradimo laiko nustatymas,  
— bandomosios chemin ės medžiagos l ėtinio toksiškumo nustatymas,  
— lėtinio toksiškumo ir (arba) kancerogeninio poveikio tikslinio (- ų) organo 
(-ų) nustatymas,  
— dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ės apibūdinimas,  
— nepastebimo neigiamo poveikio lygio (NNPL) arba orientacin ės 
dozės (OD) nustatymo pagrindo nustatymas,  
— kancerogeninio poveikio ekstrapoliavimas siekiant nustatyti mažiausio ­
sios dozės poveikio žmon ėms lygius,  
— žmonėms taikom ų poveikio lygi ų lėtinio toksiškumo prognozavimas,  
— duomen ų teikimas rengiant bandym ų hipotezes d ėl veikimo b ūdo (2) (7) 
(12) (13) (14) (15).  
PIRMINIAI ASPEKTAI  
7. Vertindama galim ą bandomosios chemin ės medžiagos kancerogeniškum ą ir 
lėtinį toksiškum ą, bandym ų laboratorija, prieš atlikdama tyrim ą, turėtų 
apsvarstyti vis ą turimą informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiag ą, 
kad planuojant tyrim ą pirmiausia b ūtų siekiama padidinti jos toksini ų 
savybių tyrimo veiksmingum ą ir sumažinti gyv ūnų naudojim ą. Labai svarbu 
turėti informacijos apie numanomo kancerogeno veikimo b ūdą ir atsižvelgti 
į šią informacij ą (2) (7) (12) (13) (14) (15), nes tinkamiausio plano parin ­
kimas gali priklausyti nuo, ar bandomoji chemin ė medžiaga yra žinoma arba 
įtariama kaip kancerogenin ė. Daugiau patarim ų, susijusių su veikimo b ūdo 
aspektais, pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).  
8. Parengti tyrimo plan ą padės informacija apie bandomosios chemin ės 
medžiagos tapatum ą, chemin ę struktūrą, fizines ir chemines savybes, 
veikimo b ūdą, taip pat toksiškumo bandym ų in vitro  arba  in vivo , įskaitant 
genotoksiškumo tyrimus, rezultatai, numatomas (-i) panaudojimo b ūdas (-ai) 
ir galimas poveikis žmogui, turimi (Q)SAR duomenys ir mutageniškumo ir (arba) genotoksiškumo, kancerogeniškumo ir kiti toksikologiniai duomenys 
apie panašios strukt ūros chemines medžiagas, turimi toksikokinetiniai 
duomenys (vienos doz ės ir, jeigu yra, kartotin ės dozės kinetinės savybės)
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
ir duomenys, gauti atlikus kitus kartotinio poveikio tyrimus. L ėtinis toksiš ­
kumas ir (arba) kancerogeniškumas tur ėtų būti nustatomas (-i) tik gavus 
pirminės informacijos apie toksiškum ą, pagrįstos 28 dien ų ir (arba) 90 
dienų kartotinės dozės toksiškumo bandymais. Be to, naudingos informa ­
cijos gali suteikti trumpalaikiai piktybini ų auglių sukėlimo ir paskatinimo 
bandymai. Atliekant bendr ąjį konkrečios bandomosios chemin ės medžiagos 
galimo neigiamo poveikio sveikatai vertinim ą, turėtų būti apsvarstyta gali ­
mybė taikyti etapin į kancerogeniškumo bandymo metod ą (16) (17) (18) 
(19).  
9. Prieš pradedant tyrim ą, atsižvelgiant į bandymo plan ą ir tikslus, tur ėtų būti 
nustatyti tinkamiausi statistiniai rezultat ų analizės metodai. Tur ėtų būti 
apsvarstyta, ar rengiant statistinius duomenis tur ėtų būti atlikta pataisa atsiž ­
velgiant į išgyvenimo rodiklius, kaupiamosios augli ų rizikos ir jos ryšio su 
išgyvenimo trukme analiz ė ir analizė pirmalaikio vienos arba daugiau grupi ų 
pašalinimo atveju. Rekomendacij ų dėl tinkamos statistin ės analizės ir pagrin ­
dinės informacijos apie tarptautiniu mastu pripažintus statistinius metodus 
pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), taip pat rekomendaci ­
niame dokumente Nr. 35 d ėl lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ų 
analizės ir vertinimo (20).  
10. Atliekant kancerogeniškumo tyrim ą, visada tur ėtų būti atsižvelgiama į 
pagrindinius principus ir aspektus, išd ėstytus OECD rekomendaciniame 
dokumente d ėl klinikini ų požymių, kaip pasekmi ų žmonėms, pasireiškimo 
vertinant saugum ą naudojamiems bandomiesiems gyv ūnams pripažinimo, 
vertinimo ir taikymo (21), pirmiausia jo 62 skirsnyje. Tame skirsnyje teigiama:  „Jeigu per kartotin ės dozės tyrimus gyv ūnams pasireiškia klini ­
kinių požymių, kurie progresuoja ir d ėl kurių toliau prast ėja sveikatos b ūklė, 
turėtų būti priimtas informacija pagr įstas sprendimas, ar nereik ėtų huma­
niškai numarinti gyv ūno. Priimant sprendim ą turėtų būti atsižvelgiama į 
informacijos, kuri b ūtų gauta tęsiant tyrim ą su šiuo gyv ūnu, vertės ir šio 
gyvūno bendrosios b ūklė
s santykį. jeigu nusprendžiama t ęsti bandym ą su 
šiuo gyv ūnu, atsižvelgiant į poreikį, turėtų būti padidintas steb ėjimų 
dažnumas. Be to, galb ūt būtų įmanoma labai nepakenkiant bandymo tikslui 
laikinai nutraukti doz ės davimą, jeigu dėl to sumaž ėtų skausmas ar kan čia, 
arba sumažinti bandom ąją dozę.“ 
11. Išsami ų rekomendacij ų dėl dozės parinkimo l ėtinio toksiškumo ir kancero ­
geniškumo tyrimams princip ų ir jų svarstym ų pateikta rekomendaciniame 
dokumente Nr. 116 (7), taip pat Tarptautinio gamtos moksl ų instituto leidi ­
niuose (22) (23). Pagrindin ė dozės parinkimo strategija priklauso nuo tyrimo 
pagrindinio tikslo arba tiksl ų (6 skirsnis). Parenkant tinkamus dozi ų dydžius, 
pavojų atranka tur ėtų būti vykdoma atsižvelgiant į mažų dozių sukeliamas 
reakcijas ir į tų pavojų reikšmę. Tai ypa č svarbu parenkant dozes čia apra­ 
šomam bendram l ėtinio toksiškumo ir (arba) kancerogeniškumo tyrimui.  
12. Turėtų būti apsvarstyta galimyb ė atlikti čia aprašom ą jungtinį lėtinio toksiš ­
kumo ir kancerogeniškumo tyrim ą, o ne atskirai atlikti l ėtinio toksiškumo 
tyrimą (šio priedo B.30 skyrius) ir kancerogeniškumo tyrim ą (šio 
priedo B.32 skyrius). Palyginti su dviem atskirais tyrimais, atliekant jungtin į 
bandymą užtikrinamas didesnis veiksmingumas laiko ir išlaid ų požiūriu, taip 
pat šiek tiek mažesnis gyv ūnų naudojimas, neprarandant duomen ų kokybės 
nei lėtinio poveikio, nei kancerogeniškumo bandymo etapu. Ta čiau, atliekant 
jungtinį lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ą, turėtų būti kruopš­ 
čiai apsvarstyti doz ės parinkimo principai (11 ir 22–26 skirsniai); be to, 
pripažinta, kad pagal tam tikras reglamentavimo sistemas gali reik ėti atlikti 
atskirus tyrimus. Daugiau patarim ų dėl bendro l ėtinio toksiškumo ir kance ­
rogeniškumo tyrimo planavimo siekiant užtikrinti kuo didesn į tyrimo veiks ­
mingumą mažinant naudojam ų gyvūnų skaičių ir paprastinant įvairias 
bandymų procedūras pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Aprašant š į bandymo metod ą vartojamos apibr ėžtys pateiktos šio skyriaus 
pabaigoje ir rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).  
BANDYMO PRINCIPAS  
14. Tyrimo planas sudaromas iš dviej ų vienalaiki ų etapų – lėtinio toksiškumo 
bandymo etapo ir kancerogeniškumo bandymo etapo (informacijos apie ši ų 
etapų trukmę atitinkamai pateikta 34 ir 35 skirsniuose). Bandomoji chemin ė 
medžiaga paprastai duodama per burn ą, tačiau gali b ūti tinkamas ir doz ės 
davimas per kv ėpavimo takus arba per od ą. Lėtinio toksiškumo bandymo 
etapu bandomoji chemin ė medžiaga kasdien skirtingo dydžio doz ėmis 
duodama kelioms bandom ųjų gyvūnų grupėms, kiekvienai grupei duodant 
vieno dydžio doz ę; įprastas doz ės davimo laikotarpis – 12 m ėnesių, tačiau, 
atsižvelgiant į norminius reikalavimus, gali b ūti taikomos ilgesn ės arba 
trumpesnės trukmės (žr. 34 skirsn į). Ši trukm ė parenkama taip, kad b ūtų 
pakankamai ilga, jog aiškiai pasireikšt ų kaupiamasis toksiškumas, ta čiau jis 
nebūtų painiojamas su sen ėjimo pakitimais. Pagal tyrimo plan ą taip pat gali 
būti numatyta vienas arba daugiau kartu marinti gyv ūnus nebaigus 
bandymo, pvz., po trij ų ir šešių mėnesių; šiuo tikslu gali b ūti įtraukiamos 
papildomos gyv ūnų grupės (žr. 20 skirsn į). Kancerogeniškumo bandymo 
etapu bandomoji chemin ė medžiaga kasdien, paprastai per burn ą, duodama 
kelioms bandom ųjų gyvūnų grupėms didžiąją jų gyvenimo trukm ės dalį. 
Abiem etapais atidžiai stebima, ar gyv ūnams nepasireišk ė toksiškumo 
požymių ir ar neatsirado neoplastini ų pakitimų. Bandymo metu nugaiš ę 
arba numarinti gyv ūnai skrodžiami, o baigus bandym ą numarinami ir skro ­
džiami išgyven ę gyvūnai. 
METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
15. Šis bandymo metodas pirmiausia taikomas vertinant l ėtinį toksiškum ą ir 
kancerogeniškum ą graužikams (2 skirsnis). Galimyb ė naudoti ne graužik ų 
rūšis gali b ūti svarstoma, jeigu turimi duomenys rodo, kad jie tinkamesni 
prognozuoti poveik į žmonių sveikatai. Gyv ūnų rūšies pasirinkimas tur ėtų 
būti pagrįstas. Tinkamiausia graužik ų rūšis yra žiurk ės, bet galima naudoti 
ir kitų rūšių graužikus, pvz., peles. Nors peli ų naudojimas atliekant kance ­
rogeniškumo bandymus gali b ūti nelabai naudingas (24) (25) (26), pagal kai 
kurias dabartines reglamentavimo programas kancerogeniškumo bandymai 
naudojant peles vis dar yra b ūtini, jeigu nenustatoma, kad toks tyrimas 
moksliniu poži ūriu nėra būtinas. Žiurk ės ir pelės yra tinkamiausi bandomieji 
gyvūnai, nes j ų gyvenimo trukm ė palyginti trumpa, jos pla čiai naudojamos 
atliekant farmakologinius ir toksikologinius tyrimus, jos jautrios augli ų sukė­
limui, yra pakankami gerai aprašyt ų padermių. Atsižvelgiant į šias savybes, 
yra daug informacijos apie j ų fiziologij ą ir patologij ą. Ne graužik ų rūšims 
pasireiškian čio lėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo tyrim ų planas ir 
atlikimas prireikus tur ėtų būti grindžiami aprašant š į bandym ą ir šio 
priedo B.27 skyriuje „90 dien ų kartotinės dozės toksiškumo per virškinam ąjį 
traktą ne graužikams tyrimas“ (6) išd ėstytais principais. Daugiau informa ­
cijos apie gyv ūnų rūšies ir paderm ės pasirinkim ą pateikta rekomendaciniame 
dokumente Nr. 116 (7).  
16. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų labora­
torinių padermių gyvūnai. Jungtinis l ėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo 
tyrimas tur ėtų būti atliekamas naudojant tos pa čios paderm ės ir iš to paties 
šaltinio gautus gyv ūnus, kokie buvo naudojami per trumpesn į (-ius) išanks ­
tinį (-ius) toksiškumo tyrim ą (-us), tačiau, jeigu žinoma, kad naudojant šios 
veislės ir šio šaltinio gyv ūnus sunku įgyvendinti per ilgesn ės trukmės 
tyrimus paprastai taikomus išgyvenimo kriterijus [žr. rekomendacin į doku­
mentą Nr. 116 (7)], tur ėtų būti svarstoma galimyb ė naudoti toki ą gyvūnų 
padermę, kurios išgyvenimo per ilgesn ės trukmės tyrimą rodiklis b ūtų priim­
tinas. Patel ės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
17. Gyvūnai gali b ūti laikomi po vien ą arba mažomis tos pa čios lyties grup ėmis; 
galimybė laikyti gyv ūnus po vien ą turėtų būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu 
tai moksliškai pagr įsta (27) (28) (29). Narveliai tur ėtų būti išdėstyti taip, kad 
galimas narveli ų išdėstymo poveikis tyrimo rezultatams tur ėtų būtų kuo 
mažesnis. Bandom ųjų gyvūnų laikymo patalpos temperat ūra turėtų būti 
22 °C (± 3 °C). Nors santykinis dr ėgnis turėtų būti ne mažesnis kaip 
30 % ir, pageidautina, ne didesnis kaip 70 % (išskyrus patalp ų valymo 
metą), turėtų būti siekiama palaikyti 50–60 % santykin į drėgnį. Apšvietimas 
turėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sek ą. Gyvūnams 
šerti tinka įprastas laboratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo 
vandens kiekio. Š ėrimo režimas tur ėtų atitikti visus bandom ųjų gyvūnų 
rūšies mitybos reikalavimus; pašaro sud ėtyje turėtų būti kuo mažiau teršal ų, 
įskaitant (be kit ų teršalų) pesticid ų likučius, patvariuosius organinius 
teršalus, fitoestrogenus, sunkiuosius metalus ir mikotoksinus. Tur ėtų būti 
periodiškai – bent pradedant tyrim ą ir pasikeitus naudojamai partijai – 
rengiama analitin ė informacija apie pašarines medžiagas ir pašaro sud ėtyje 
esančių teršalų lygius; ši informacija tur ėtų būti pateikta galutin ėje ataskai ­
toje. Turėtų būti rengiama atitinkama analitin ė informacija apie tyrimo metu 
naudojam ą geriamąjį vandenį. Pašaro parinkimui gali tur ėti įtakos poreikis 
tinkamai įmaišyti bandom ąją cheminę medžiag ą ir laikytis gyv ūnų mitybos 
reikalavim ų, kai bandomoji chemin ė medžiaga duodama su pašaru.  
Gyvūnų paruošimas  
18. Turėtų būti naudojami sveiki gyv ūnai, ne trumpiau kaip septynias paras 
pratinti prie laboratorini ų sąlygų ir anksčiau nenaudoti kitiems bandymams. 
Jeigu naudojami graužikai, doz ė gyvūnams turėtų būti pradedama duoti kaip 
galima anks čiau po atjunkymo ir pripratinimo, pageidautina, ne v ėliau nei 
gyvūnams sueina aštuonios savait ės. Gyvūnai turėtų būti apibūdinti nurodant 
rūšį, padermę, šaltinį, lytį, masę ir amžių. Pradedant tyrim ą kiekvienos lyties 
gyvūnų kūno masės skirtumai turi b ūti kuo mažesni ir pagal kiekvien ą lytį 
nenukrypti nuo vis ų tyrime dalyvaujan čių gyvūnų kūno masės vidurkio 
daugiau kaip ± 20 %. Gyv ūnai turėtų būti atsitiktine tvarka suskirstyti į 
kontrolines ir bandom ąsias grupes. Gyv ūnus suskirs čius atsitiktine tvarka, 
grupių vidutinės kūno masės pagal lyt į neturėtų smarkiai skirtis. Jeigu yra 
statistiniu poži ūriu dideli ų skirtumų, atsitiktinis suskirstymo etapas tur ėtų 
būti pakartotas (jeigu tai įmanoma). Kiekvienam gyv ūnui turėtų būti 
suteiktas unikalus identifikavimo numeris, kuriuo gyv ūnas visam laikui 
pažymimas j į ištatuiruojant, implantuojant mikroschem ą arba kitu tinkamu 
būdu. 
PROCED ŪRA 
Gyvūnų skaičius ir lytis  
19. Turėtų būti naudojami abiej ų lyčių gyvūnai. Turėtų būti naudojama pakan ­
kamai gyv ūnų, kad būtų galima atlikti išsami ą biologinę ir statistin ę analizę. 
Todėl, jeigu naudojami graužikai, kiekvienoje doz ę gaunančioje (kaip apra ­ 
šyta 22 skirsnyje) ir vienalaik ės kontrolės grupėje, skirtoje tyrimo kancero ­
geniškumo bandymo etapui, tur ėtų būti ne mažiau kaip po 50 kiekvienos 
lyties gyv ūnų. Atsižvelgiant į tyrimo tiksl ą, gali būti įmanoma padidinti 
statistinį pagrindini ų įverčių patikimum ą nevienodai suskirstant gyv ūnus į 
įvairaus dydžio doz ėms skirtas grupes, mažiausiajai dozei skirtas grupes 
sudarant iš daugiau kaip 50 gyv ūnų, pvz., kad b ūtų galima apytikriai įver­
tinti kancerogeniškum ą duodant mažiausi ąsias dozes. Ta čiau reikėtų pripa­ 
žinti, kad nedaug padidinus grup ės dydį tyrimo statistinis patikimumas 
padidės gana nežymiai. Jeigu naudojami graužikai, kiekvienoje doz ę 
gaunančioje (kaip aprašyta 22 skirsnyje) ir vienalaik ės kontrol ės grupėje, ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
skirtoje tyrimo l ėtinio toksiškumo bandymo etapui, tur ėtų būti ne mažiau 
kaip po 10 kiekvienos lyties gyv ūnų. Reikėtų atkreipti d ėmesį, kad šis 
skaičius yra mažesnis nei per l ėtinio toksiškumo tyrim ą (šio priedo B.30 
skyrius). Ta čiau aiškinti duomenis, šio bendro tyrimo l ėtinio toksiškumo 
bandymo etapu gautus naudojant mažesnes gyv ūnų grupes, pad ės 
duomenys, gauti naudojant daugiau gyv ūnų tyrimo kancerogeniškumo 
bandymo etapu. Jeigu tyrimams naudojamos pel ės, į lėtinio toksiškumo 
bandymo etapo kiekvieno dydžio dozei skirt ą grupę gali reik ėti įtraukti 
daugiau gyv ūnų, kad būtų galima atlikti visus reikiamus hematologinius 
tyrimus. Daugiau informacijos apie statistin į tyrimo planavim ą ir dozių 
dydžių parinkim ą siekiant kuo labiau padidinti statistin į patikimum ą pateikta 
OECD rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).  
Rezervo sudarymas atsižvelgiant į gyvūnų marinim ą nebaigus 
bandymo, pagalbin ės grupės sudarymas ir kontrolini ų gyvūnų parūpi­
nimas  
20. Jeigu tai moksliškai pagr įsta, rengiantis tyrimui gali b ūti sudarytas rezervas 
atsižvelgiant į gyvūnų marinimą nebaigus bandymo, pvz., l ėtinio toksiškumo 
bandymo etapu – po 6 m ėnesių, kad būtų galima gauti informacijos apie 
neoplastini ų pakitimų vystymąsi ir mechanistin ės informacijos. Jeigu tokios 
informacijos apie bandom ąją cheminę medžiag ą jau turima remiantis anks ­ 
čiau atliktais kartotin ės dozės toksiškumo tyrimais, gyv ūnų marinimo 
nebaigus bandymo moksliškai pagr įsti negalima. Tyrimo l ėtinio toksiškumo 
etapu, kuris paprastai trunka 12 m ėnesių (34 skirsnis), nebaigus bandymo 
numarintų gyvūnų duomenimis bus galima pasinaudoti tyrimo kanceroge ­
niškumo bandymo etapu ir taip sumažinti bendr ą naudojam ų gyvūnų 
skaičių. Tyrimo l ėtinio toksiškumo bandymo etapu taip pat gali b ūti naudo­
jamos pagalbin ės grupės, skirtos steb ėti tiriamos bandomosios chemin ės 
medžiagos sukelt ų toksikologini ų pakitimų grįžtamumą. Sudarant šias pagal ­
bines grupes gali b ūti apsiribojama tik didžiausiosios doz ės grupe ir kontro ­
line grupe. Gali b ūti numatyta papildoma kontrolini ų gyvūnų grupė 
(paprastai – po penkis kiekvienos lyties gyv ūnus), skirta prireikus steb ėti 
ligos būklę tyrimo metu (30). Daugiau patarim ų dėl nebaigus bandymo 
numatytų marinti, pagalbini ų ir kontrolini ų gyvūnų įtraukimo į tyrimo 
planą, kartu kaip galima labiau sumažinant bendr ą naudojam ų gyvūnų 
skaičių, pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7).  
21. Jeigu į tyrimo plan ą įtraukiami pagalbiniai gyv ūnai ir (arba) jeigu pagal 
tyrimo plan ą numatomas gyv ūnų marinimas nebaigus bandymo, šiuo tikslu 
įtraukiamoje kiekvieno dydžio dozei skirtoje grup ėje paprastai tur ėtų būti po 
10 kiekvienos lyties gyv ūnų, o bendras pagal tyrimo plan ą numatytas 
gyvūnų skaičius turėtų būti padidintas numatomu iki tyrimo pabaigos numa ­
rinti gyv ūnų skaičiumi. Gyv ūnai, kuriuos numatyta marinti nebaigus 
bandymo, ir pagalbiniai gyv ūnai turėtų stebimi taip pat, kaip pagrindinio 
tyrimo lėtinio toksiškumo etapo gyv ūnai, įskaitant k ūno masės stebėjimą, 
pašarų ir vandens suvartojimo steb ėjimą, hematologinius ir klinikin ės 
biochemijos matavimus ir patologinius tyrimus, ta čiau taip pat gali b ūti 
numatyta (grup ėse, kuriose gyv ūnai bus marinami nebaigus bandymo) atlikti 
tik tokius matavimus, kurie yra susij ę su specifiniais, pagrindiniais matais, 
pvz., neurotoksiškumu arba imunotoksiškumu.  
Dozių dydžių grupės ir dozuot ė 
22. Rekomendacijos d ėl visų aspektų, susijusių su dozių dydžių parinkimu ir 
dozių dydžių skirtumų nustatymu, pateiktos rekomendaciniame dokumente 
Nr. 116 (7). L ėtinio toksiškumo ir kancerogeniškumo bandym ų etapais 
turėtų būti taikomi ne mažiau kaip trys dozi ų dydžiai ir vienalaik ė kontrolė. 
Dozių dydžiai paprastai grindžiami trumpesnio laikotarpio kartotini ų dozių 
arba ribų nustatymo tyrim ų rezultatais ir tur ėtų būti nustatomi atsižvelgiant į 
visus turimus toksikologinius ir toksikokinetinius duomenis apie bandom ąją 
medžiagą arba panašias chemines medžiagas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. Jeigu galima numatyti, kad vieno dydžio doz ės, atitinkan čios bent 1 000 
mg/kg kūno masės per par ą, bandymas nesukels neigiamo poveikio, visas 
trijų dydžių dozės tyrimas l ėtinio toksiškumo bandymo etapu gali b ūti 
laikomas neb ūtinu. Šiuo tikslu tur ėtų būti remiamasi išankstini ų tyrimų 
informacija ir panašios strukt ūros chemini ų medžiag ų duomenimis pagr įsta 
nuomone, kad toksinio poveikio nebus. 1 000 mg/kg k ūno masės per par ą 
ribinė vertė gali būti taikoma tada, kai nereikia skirti didesn ės dozės atsiž­
velgiant į poveikį žmogui.  
24. Jeigu doz ė neturėtų būti ribojama atsižvelgiant į bandomosios medžiagos 
fizines ir chemines savybes arba biologin į poveikį, didžiausioji doz ė turėtų 
būti parenkama tokia, kad b ūtų galima nustatyti pagrindinius tikslinius 
organus ir toksin į poveikį, nesukeliant kan čios, sunkaus toksiškumo, liguis ­
tumo arba ž ūties. Didžiausioji doz ė paprastai tur ėtų būti parenkama tokia, 
kad ją taikant b ūtų sukeliami pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., pasireiš ­
kiantys kūno masės prieaugio sumaž ėjimu (apie 10 %). Ta čiau, atsižvelgiant 
į tyrimo tikslus (žr. 6 skirsn į), didžiausioji doz ė gali būti parinkta mažesn ė 
už dozę, kurią taikant b ūtų pastebimi toksiškumo požymiai, pvz., jeigu 
taikant doz ę sukeliamas r ūpimas neigiamas poveikis, turintis nedidel ės 
įtakos gyvenimo trukmei arba k ūno masei.  
25. Dozi ų dydžiai ir dozi ų dydžių skirtumai gali b ūti parinkti tokie, kad b ūtų 
galima nustatyti doz ės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ę ir – atsižvel ­
giant į bandomosios chemin ės medžiagos veikimo b ūdą – NNPL arba gauti 
kitokį siekiamą tyrimo rezultat ą, pvz., nustatyti orientacin ę dozę (OD) (žr. 
27 skirsn į). Nustatant mažesni ąsias dozes, tur ėtų būti atsižvelgiama į tokius 
veiksnius, kaip numatomas doz ės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ės 
kreivės nuolydis, doz ės, kurias taikant atsiranda reikšming ų metabolizmo 
arba toksinio poveikio b ūdo pokyčių, kai tikimasi gauti ribin ę vertę arba 
atskaitos tašk ą mažiausiosios doz ės ekstrapoliavimui. Atliekant bendr ą 
kancerogeniškumo ir (arba) l ėtinio toksiškumo tyrim ą, pirmiausia tur ėtų 
būti siekiama gauti informacijos kancerogeniškumo rizikos vertinimo tiks ­
lais, o informacijos apie l ėtinį toksiškum ą gavimas paprastai yra papildomas 
tikslas. Į tai būtina atsižvelgti parenkant per tyrim ą taikytinus dozi ų dydžius 
ir dozių dydžių skirtumus.  
26. Dozi ų dydžių skirtumai parenkami atsižvelgiant į tyrimo tikslus ir bando ­
mosios chemin ės medžiagos savybes ir aprašant š į metodą negali b ūti iš 
anksto tiksliai numatyti, ta čiau tinkamas bandym ų veiksmingumas dažnai 
užtikrinamas tada, kai nustatant maž ėjančius dozių dydžius taikomi koefi ­
cientai nuo 2 iki 4; be to, jeigu taikomi labai dideli dozi ų dydžių skirtumai 
(pvz., taikomi didesni koeficientai nei 6–10), dažnai patartina naudoti ketvir ­
tąją bandomąją grupę. Apskritai reik ėtų vengti taikyti didesnius koeficientus 
nei 10; jeigu tokie taikomi, jie tur ėtų būti pagrindžiami.  
27. Kaip aprašyta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7), konkre čios dozės 
turėtų būti nustatomos atsižvelgiant į tokius veiksnius:  
— žinomus arba numanomus netiesiškumus arba doz ės ir reakcijos tarpu ­
savio priklausomyb ės kreivės išlinkio taškus,  
— toksikokinetines savybes ir dozi ų intervalus, kuriuose pasireiškia meta ­
bolizmo paskatinimo, įsotinimo efektai arba išorin ės ir vidin ės dozių 
tarpusavio netiesiškumas, arba kuriuose nurodyt ųjų dalykų nepasireiškia,  
— pirminius pakitimus, poveikio rodiklius arba pagrindini ų aiškiai nepaste ­
bimų biologini ų procesų veikimo požymius,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— pagrindinius (arba numanomus) veikimo b ūdo aspektus, pvz., dozes, 
kurias taikant pradeda reikštis citotoksiškumas, sutrikdomi hormon ų 
lygiai, nustelbiami homeostaziniai mechanizmai ir t. t.,  
— dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ės kreivės sritis, kuriose 
būtina atlikti ypa č tikslius vertinimus, pvz., numanomos orientacin ės 
dozės (OD) arba numanomos ribin ės vertės sritis,  
— numanomus poveikio žmon ėms lygius, ypa č parenkant vidutines ir 
mažiausiąsias dozes.  
28. Kontrolin ė grupė – tai doz ės negaunan čių gyvūnų grupė arba nešiklio kont ­
rolės grupė, jeigu bandomajai cheminei medžiagai duoti naudojamas 
nešiklis. Išskyrus poveik į bandom ąja chemine medžiaga, su kontrolin ės 
grupės gyvūnais turėtų būti elgiamasi lygiai taip pat, kaip su bandom ųjų 
grupių gyvūnais. Naudojant nešikl į, kontrolin ės grupės gyvūnams duodamas 
didžiausias nešiklio t ūris, skiriamas doz ę gaunančioms grup ėms. Jeigu 
bandomoji chemin ė medžiaga duodama su pašaru ir d ėl prastesnio skonio 
gyvūnai suvartoja mažiau pašaro, gali b ūti naudinga pasitelkti papildom ą 
kartu šeriam ą kontrolin ę grupę, kad būtų užtikrinta geresn ė kontrolė. 
Bandomosios chemin ės medžiagos dozi ų paruošimas ir davimas  
29. Bandomoji chemin ė medžiaga paprastai duodama per burn ą, su pašaru ar 
geriamuoju vandeniu arba leidžiama zondu. Daugiau informacijos apie dozės davimo b ūdus ir metodus pateikta rekomendaciniame dokumente 
Nr. 116 (7). Doz ės davimo b ūdas ir metodas parenkami atsižvelgiant į 
tyrimo tiksl ą, fizines ir chemines bandomosios chemin ės medžiagos savybes, 
jos biologin į įsisavinim ą ir vyraujant į poveikio žmon ėms būdą ir metod ą. 
Pasirinktas doz ės davimo b ūdas ir metodas turi b ūti pagrįsti. Gyvūnų 
gerovės sumetimais doz ės leidimas zondu paprastai tur ėtų būti pasirenkamas 
tik duodant tokias chemines medžiagas, kuri ų davimo b ūdas ir metodas iš 
esmės atitinka galim ą poveikio žmogui b ūdą ir metod ą (pvz., duodant 
vaistus). Maisto produktuose arba aplinkoje esan čios chemin ės medžiagos, 
įskaitant pesticidus, paprastai duodamos su pašaru arba vandeniu. Ta čiau 
tam tikrais atvejais, pvz., tiriant poveik į darbe, gali b ūti tinkamesni kiti 
dozės davimo b ūdai.
 
30. Prireikus bandomoji chemin ė medžiaga ištirpinama arba pagaminama jos 
suspensija tinkamame nešiklyje. Reik ėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kit ų 
priedų savybes, jeigu taikytina: poveik į sugerčiai, pasiskirstymui, metabo ­
lizmui arba bandomosios chemin ės medžiagos sulaikymui; poveik į bando­
mosios chemin ės medžiagos chemin ėms savyb ėms, dėl kurių gali pasikeisti 
jos toksiškumo savyb ės; poveik į maisto ar vandens suvartojimui arba 
gyvūnų įmitimui. Rekomenduojama, jeigu įmanoma, pirmenyb ę teikti 
vandeniniam tirpalui arba suspensijai, tada svarstyti galimyb ę naudoti alie ­
jaus (pvz., kukur ūzų) tirpalą arba suspensij ą ir tik po to – galimyb ę naudoti 
tirpalus kituose nešikliuose. Jeigu kaip nešiklis naudojamas ne vanduo, turėtų būti žinomos to nešiklio toksin ės savybės. Reikėtų turėti informacijos 
apie bandomosios chemin ės medžiagos stabilum ą ir duodam ų tirpalų ir 
pašarų homogeniškum ą (jeigu taikytina) doz ė
s davimo s ąlygomis (pvz., su 
pašaru).  
31. Jeigu chemin ės medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, 
svarbu užtikrinti, kad įmaišomi bandomosios chemin ės medžiagos kiekiai 
netrikdytų įprasto mitybos režimo arba vandens balanso. Atliekant ilgalaikio 
toksiškumo tyrimus, kai doz ė duodama su pašaru, bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija pašaro sud ėtyje paprastai tur ėtų neviršyti 5 % 
viršutinės ribos visame pašar ų kiekyje, kad b ūtų išvengta mitybos disba ­
lanso. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga duodama su pašaru, gali b ūti 
taikoma pastovi koncentracija (mg/kg pašaro arba ppm) arba pastovus dozės dydis, nustatomas atsižvelgiant į gyvūno kūno masę (mg/kg k ūno 
masės) ir apskai čiuojamas kas savait ę. Turėtų būti nurodytas pasirinktas 
variantas.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. Jeigu doz ė duodama per burn ą, bandomoji chemin ė medžiaga gyv ūnams 
duodama kasdien (septynias dienas per savait ę), paprastai – 12 m ėnesių 
laikotarpiu (l ėtinio toksiškumo bandymo etapas) arba 24 m ėnesių laikotarpiu 
(kancerogeniškumo bandymo etapas); taip pat žr. 33 ir 34 skirsnius. Pasi ­
rinkus bet kuri ą kitą dozės davimo tvark ą, pvz., penki ų dienų per savait ę, ją 
būtina pagr įsti. Jeigu doz ė duodama per od ą, gyvūnai paprastai veikiami 
bandomąja chemine medžiaga ne trumpiau kaip šešias valandas per par ą, 
septynias dienas per savait ę, kaip nurodyta šio priedo B.9 skyriuje (11), 12 
mėnesių laikotarpiu (l ėtinio toksiškumo bandymo etapas) arba 24 m ėnesių 
laikotarpiu (kancerogeniškumo bandymo etapas). Doz ės davimas per kv ėpa­
vimo takus vykdomas šešias valandas per par ą, septynias paras per savait ę, 
bet gali b ūti taikomas ir penki ų parų per savait ę poveikis, jeigu jis pagrin ­
džiamas. Įprastas doz ės davimo laikotarpis – 12 m ėnesių (lėtinio toksiškumo 
bandymo etapas) arba 24 m ėnesiai (kancerogeniškumo bandymo etapas). 
Jeigu naudojant kitos r ūšies graužikus nei žiurk ės dozė duodama tik per 
nosį, ilgiausia poveikio trukm ė gali būti pakoreguojama siekiant sumažinti 
tos rūšies gyvūnų patiriam ą kančią. Jeigu doz ė duodama trumpiau kaip 
šešias valandas per par ą, būtina tai pagr įsti. Taip pat žr. šio priedo B.8 
skirsnį (9). 
33. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga leidžiama zondu, tai tur ėtų būti daroma 
kasdien panašiu metu, naudojant skrandžio zond ą arba tinkam ą intubacin į 
vamzdelį. Paprastai duodama viena doz ė per parą, bet, jeigu, pvz., chemin ė 
medžiaga turi vietinio dirginamojo poveikio, paros doz ė gali būti duodama 
padalyta į kelias dalis (pvz., du kartus per par ą). Didžiausias vienkartinis 
duodamo skys čio kiekis priklauso nuo bandomojo gyv ūno dydžio. T ūris 
turėtų būti kaip įmanoma mažesnis ir, jeigu naudojami graužikai, paprastai 
neturėtų viršyti 1 ml/100 g k ūno masės (31). Bandomojo tirpalo t ūrio nepas­
tovumas turi b ūti kiek įmanoma sumažintas, kei čiant koncentracij ą taip, kad 
visų dydžių dozių tūris būtų pastovus. Chemin ėms medžiagoms, kurios gali 
turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio, taikoma išimtis; tokios 
medžiagos turi b ūti atskiestos siekiant išvengti sunkaus vietinio poveikio. 
Turėtų būti vengiama atlikti bandymus taikant koncentracijas, kurios gal ėtų 
turėti ėsdinamojo arba dirginamojo poveikio virškinimo traktui.  
Tyrimo trukm ė 
34. Įprastas doz ės davimo laikotarpis ir įprasta šio tyrimo l ėtinio toksiškumo 
bandymo etapo trukm ė – 12 m ėnesių, tačiau, atsižvelgiant į tam tikrus 
reglamentavimo tvark ų reikalavimus arba siekiant specifini ų mechanistini ų 
tikslų, tyrimo planas gali b ūti taikomas ir trumpesn ės (pvz., šeši ų arba 
devynių mėnesių) arba ilgesn ės (pvz., 18 arba 24 m ėnesių) trukmės tyri­
mams. Jeigu pasirenkama ne 12 m ėnesių trukmė, ji turėtų būti pagrįsta, ypač 
jeigu ta trukm ė trumpesn ė nei 12 m ėnesių. Visi šiam etapui skirt ų dozių 
dydžių grupių gyvūnai nustatytu laiku numarinami, kad b ūtų galima įvertinti 
lėtinį toksiškum ą ir neoplastin ę patologij ą. Pagalbin ės grupės, įtrauktos 
tiriamos bandomosios chemin ės medžiagos sukeliam ų toksikologini ų paki­
timų grįžtamumo steb ėjimo tikslais, tur ėtų negauti doz ės ne mažiau kaip 
keturias savaites, bet ne ilgiau kaip tre čdalį visos tyrimo trukm ės nutraukus 
dozės davimą. 
35. Jeigu naudojami graužikai, įprasta šio tyrimo kancerogeniškumo etapo 
trukmė – 24 mėnesiai, t. y. didžioji naudojam ų gyvūnų įprastos gyvenimo 
trukmės dalis. Atsižvelgiant į tiriamųjų gyvūnų rūšies paderm ę, gali būti 
taikoma trumpesn ė arba ilgesn ė trukmė, tačiau ji turėtų būti pagrįsta. Tam 
tikros peli ų padermėms, pvz., AKR/J, C3H/J arba C57BL/6J, gali b ūti 
taikomas 18 m ėnesių laikotarpis. Toliau pateikta rekomendacij ų dėl tyrimo 
trukmės, jo nutraukimo ir d ėl išgyvenimo; daugiau rekomendacij ų, įskaitant 
patarimus d ėl neigiamo kancerogeniškumo, susijusio su išgyvenimu per 
tyrimą, priimtinumo aspekt ų, pateikta rekomendaciniame dokumente 
Nr. 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— Turėtų būti svarstoma galimyb ė nutraukti tyrim ą, jeigu mažesnes dozes 
gavusiose grup ėse arba kontrolin ėje grupėje išgyvenusi ų gyvūnų procen­
tinė dalis nebesiekia 25 %.  
— Jeigu d ėl toksinio poveikio pirma laiko ž ūna tik didžiausi ąją dozę gavu­
sios grup ės gyvūnai, tyrimo nereik ėtų nutraukti.  
— Į kiekvienos lyties gyv ūnų išgyvenim ą atsižvelgiama atskirai.  
— Tyrimas netur ėtų būti tęsiamas toliau, jeigu atliekant tyrim ą gaunami 
duomenys nebesuteikia galimyb ės atlikti statistiniu poži ūriu pagrįstą 
vertinimą. 
STEBĖJIMAI (L ĖTINIO TOKSIŠKUMO BANDYMO ETAPAS)  
36. Visi gyv ūnai turėtų būti tikrinami, ar jie sveiki arba nenugaiš ę; paprastai tai 
turėtų būti daroma kiekvienos dienos pradžioje ir pabaigoje, įskaitant savait ­
galius ir šven čių dienas. Bendrieji klinikiniai steb ėjimai turėtų būti atliekami 
bent kart ą per parą, pageidautina, tuo pa čiu paros metu, atsižvelgiant į 
stipriausią numatom ą poveikį po dozės davimo, kai doz ė leidžiama zondu.  
37. Kart ą prieš pirm ąjį dozės davimą (kad būtų galima palyginti atskirus 
gyvūnus), po to – pasibaigus pirmajai tyrimo savaitei, o v ėliau – kas m ėnesį 
turėtų būti atliekami išsam ūs visų gyvūnų klinikiniai steb ėjimai. Steb ėjimų 
protokolas tur ėtų būti sudarytas taip, kad steb ėtojų kaita būtų kuo mažesn ė ir 
kad stebėtojai būtų paskiriami neatsižvelgiant į bandomąją grupę. Kiekvien ą 
kartą šie stebėjimai turėtų būti atliekami tuo pa čiu metu, perk ėlus gyvūną iš 
jo narvelio į tam skirt ą vietą. Stebėjimai turėtų būti kruopščiai registruojami, 
pageidautina, pagal toje laboratorijoje aiškiai apibr ėžtą vertinimo sistem ą. 
Turėtų būti stengiamasi užtikrinti, kad steb ėjimo sąlygų kaita būtų kuo 
mažesnė. Be kitų dalykų, turėtų būti registruojami odos, kailio, aki ų, glei­
vinės pakitimai, išskyr ų atsiradimas ir autonominis aktyvumas (pvz., ašaro ­
jimas, plauk ų pašiaušimas, vyzdžio dydis, ne įprasti kvėpavimo pakitimai). 
Taip pat tur ėtų būti registruojami eisenos, pozos, reakcijos į paėmimą 
rankomis pakitimai, traukuli ų arba tonini ų judesių atsiradimas, stereotipinis 
(pvz., besaikis valymasis, pasikartojantis sukimasis ratu) arba keistas elgesys 
(pvz., sav ęs luošinimas, vaikš čiojimas atbulomis) (32).  
38. Naudojant oftalmoskop ą arba kitą tinkamą įrangą, prieš pirm ąjį bandomo ­
sios chemin ės medžiagos davim ą turėtų būti atlikti vis ų gyvūnų oftalmolo ­
giniai tyrimai. Baigus tyrim ą, turėtų būti atlikti vis ų gyvūnų arba bent 
didžiausiąją dozę gavusios grup ės ir kontrolin ės grupės gyvūnų oftalmolo ­
giniai tyrimai. Jeigu nustatoma aki ų pakitimų, susijusių su dozės davimu, 
turėtų būti ištirti visi gyv ūnai. Jeigu strukt ūrinė analizė arba kita informacija 
rodo toksin į poveikį akims, aki ų tyrimų dažnumas tur ėtų būti didesnis.  
39. Jeigu anks čiau atlikus chemin ės medžiagos 28 dien ų ir (arba) 90 dien ų 
kartotinės dozės toksiškumo bandymus nustatyta, kad chemin ė medžiaga 
gali sukelti neurotoksin į poveikį, prieš pradedant tyrim ą ir kas tris m ėnesius 
nuo tyrimo pradžios, bet ne ilgiau kaip 12 m ėnesių laikotarpiu, o taip pat 
baigus tyrim ą (jeigu jis trunka ilgiau nei 12 m ėnesių) galima (bet nepriva ­
loma) įvertinti jutimines reakcijas į įvairaus pob ūdžio dirgiklius (32) (pvz., 
klausos, regos ir proprioreceptorinius) (33) (34) (35), spaudimo (j ėgos) 
stiprumą (36) ir jud ėjimo aktyvum ą (37). Išsamesn ės informacijos apie 
procedūras, kurios gal ėtų būti taikomos, pateikta atitinkamuose literat ūros 
šaltiniuose. Ta čiau galima taikyti ir čia nurodytiems metodams alternatyvius 
metodus.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. Jeigu anks čiau atlikus chemin ės medžiagos 28 dien ų ir (arba) 90 dien ų 
kartotinės dozės toksiškumo bandymus nustatyta, kad chemin ė medžiaga 
gali sukelti imunotoksin į poveikį, baigus tyrim ą galima (bet neprivaloma) 
atlikti išsamesnius šios pasekm ės tyrimus.  
Kūno masė, pašarų ir (arba) vandens suvartojimas ir pašaro efektyvumas  
41. Visi gyv ūnai turėtų būti pasveriami prieš pradedant duoti doz ę, kitas 13 
savaičių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau – bent kart ą per mėnesį. 
Pirmąsias 13 savai čių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau – bent 
kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas pašaro suvartojimas ir pašaro efek ­
tyvumas. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga duodama su geriamuoju 
vandeniu, pirm ąsias 13 savai čių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau 
– bent kart ą per mėnesį turėtų būti matuojamas vandens suvartojimas. Gali ­
mybė matuoti vandens suvartojim ą turėtų būti svarstoma ir atliekant tyrimus, 
per kuriuos pasikei čia gėrimo įpročiai. 
Hematologiniai ir klinikin ės biochemijos tyrimai  
42. Atliekant tyrimus, per kuriuos naudojami graužikai, po trij ų, šešių ir 
dvylikos m ėnesių, taip pat baigus tyrim ą (jeigu jis trunka ilgiau nei 12 
mėnesių), turėtų būti atlikti vis ų tyrime dalyvaujan čių gyvūnų (po 10 patin ų 
ir 10 pateli ų kiekvienoje grup ėje) hematologiniai tyrimai. Jeigu atliekant 
tyrimus naudojamos pel ės, norint atlikti visus reikiamus hematologinius 
tyrimus gali reik ėti pagalbini ų gyvūnų (žr. 19 skirsn į). Jeigu atliekant 
tyrimus naudojami ne graužikai, ėminiai dar nebaigus tyrimo ir j į baigus, 
kaip aprašyta graužik ų atveju, imami iš mažesnio gyv ūnų skaičiaus (pvz., 
jeigu tiriami šunys – iš keturi ų kiekvienos lyties gyv ūnų kiekvienoje 
grupėje). Nepaisant to, ar naudojami graužikai, ar ne graužikai, matavim ų 
po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anks čiau atliktą 90 dienų tyrimą, 
per kurį buvo duodamos panašaus dydžio doz ės, nebuvo pasteb ėta poveikio 
hematologiniams parametrams. Kraujo ėminiai tur ėtų būti imami iš nuro ­
dytos vietos, pvz., širdies punkcijos vietos arba iš užakiduobinio an čio, 
taikant nuskausminim ą. 
43. Turėtų būti ištirti šie parametrai (38): bendras leukocit ų kiekis ir įvairių 
leukocitų kiekiai, eritrocit ų kiekis, trombocit ų kiekis, hemoglobino koncent ­
racija, hematokritas (procentin ė kraujo ląstelių tūrio dalis), vidutinis eritro ­
cito tūris (VET), vidutinis hemoglobino kiekis eritrocituose (VHKE), vidu ­
tinė eritrocitų hemoglobino koncentracija (VEHK), protrombino laikas ir 
dalinis aktyvintas tromboplastino laikas. Atsižvelgiant į bandomosios 
cheminės medžiagos toksiškum ą, prireikus gali b ūti matuojami ir kiti hema ­
tologiniai parametrai, pvz., Heinco k ūneliai arba kita netipin ė eritrocitų 
morfologija, arba methemoglobinas. Apskritai tur ėtų būti laikomasi lanks ­
taus poži ūrio, kuriuo b ūtų atsižvelgiama į pastebėtą ir (arba) numatom ą 
atitinkamos bandomosios chemin ės medžiagos poveik į. Jeigu bandomoji 
cheminė medžiaga turi poveikio kraujodaros sistemai, gali reik ėti nustatyti 
retikulocit ų kiekį ir atlikti kaul ų čiulpų citologijos tyrimus, ta čiau to neb ū­
tina daryti nuolat.  
44. Siekiant ištirti svarbiausius toksinius poveikius audiniams, ypa č inkstams ir 
kepenims, reik ėtų atlikti kraujo ėminių, paimtų iš visų tyrime dalyvaujan čių 
gyvūnų (po 10 patin ų ir 10 pateli ų kiekvienoje grup ėje) tokiais pat laiko 
intervalais, kaip nurodyta d ėl hematologini ų tyrimų, klinikinius biochemi ­
nius tyrimus. Jeigu atliekant tyrimus naudojamos pel ės, norint atlikti visus 
reikiamus klinikin ės biochemijos tyrimus, gali reik ėti pagalbini ų gyvūnų. 
Jeigu atliekant tyrimus naudojami ne graužikai, ėminiai dar nebaigus tyrimo 
ir jį baigus, kaip aprašyta graužik ų atveju, imami iš mažesnio gyv ūnų skai­ 
čiaus (pvz., jeigu tiriami šunys – iš keturi ų kiekvienos lyties gyv ūnų kiek­
vienoje grup ėje). Nepaisant to, ar naudojami graužikai, ar ne graužikai, 
matavimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anks čiau atliktą 90 
dienų tyrimą, per kur į buvo duodamos panašaus dydžio doz ės, nebuvo 
pastebėta poveikio klinikin ės biochemijos parametrams. Rekomenduojama,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
kad prieš kraujo ėminių ėmimą gyvūnai (išskyrus peles) b ūtų nešeriami per 
naktį. ( 1 ). Turėtų būti ištirti šie parametrai (38): gliukoz ė, šlapalas (šlapalo 
azotas), kreatininas, bendras baltym ų kiekis, albuminas, kalcis, natris, kalis, 
bendras cholesterolio kiekis, ne mažiau kaip du atitinkami kepen ų ląstelių 
tyrimai (alaninaminotransferaz ė, aspartataminotransferaz ė, glutamato dehi ­
drogenazė ir bendras tulžies r ūgščių kiekis) (39) ir ne mažiau kaip du 
atitinkami kepen ų ir tulžies sistemos tyrimai (šarmin ė fosfatazė, gamagluta ­
miltransferaz ė, 5’-nukleotidaz ė, bendras bilirubino kiekis, bendras tulžies 
rūgščių kiekis) (39). Be to, atsižvelgiant į bandomosios chemin ės medžiagos 
toksiškum ą, gali būti naudinga išmatuoti kitus klinikin ės chemijos para ­
metrus, pvz., triglicerid ų koncentracij ą nešėrus, specifinius hormonus ir 
cholinesteraz ę. Apskritai tur ėtų būti laikomasi lankstaus poži ūrio, kuriuo 
būtų atsižvelgiama į pastebėtą arba numatom ą atitinkamos bandomosios 
cheminės medžiagos poveik į. 
45. Turėtų būti atlikti vis ų tyrime dalyvaujan čių gyvūnų (po 10 patin ų ir 10 
patelių kiekvienoje grup ėje) šlapimo tyrimai, ėminius imant tokiais pat inter ­
valais, kokie taikomi hematologin ės ir klinikin ės chemijos tyrim ų tikslais. 
Matavimų po trijų mėnesių galima neatlikti, jeigu per anks čiau atliktą 90 
dienų tyrimą, per kur į buvo duodamos panašaus dydžio doz ės, nebuvo 
pastebėta poveikio šlapimo analiz ės rezultatams. Ekspert ų rekomendacijoje 
dėl klinikin ės patologijos tyrim ų pateiktas toks parametr ų sąrašas (38): 
išvaizda, t ūris, osmosinis sl ėgis arba savitasis svoris, pH, bendras baltym ų 
kiekis ir gliukoz ė. Taip pat gali b ūti tiriamas ketonas, urobilinogenas, bili ­
rubinas ir pasl ėptasis kraujas. Prireikus išpl ėsti pasteb ėto (-ų) poveikio (- ų) 
tyrimą, gali būti naudojami papildomi parametrai.  
46. Paprastai laikoma, kad pradiniai hematologiniai ir klinikin ės biochemijos 
kintamieji prieš pradedant duoti doz ę turėtų būti nustatomi atliekant šun ų 
tyrimus, bet j ų nebūtina nustatyti atliekant graužik ų tyrimus (38). Visgi, 
jeigu istoriniai pradiniai duomenys (žr. 58 skirsn į) yra netinkami, tur ėtų 
būti svarstoma galimyb ė parengti min ėtus duomenis.  
PATOLOGIJA  
Bendrasis skrodimas  
47. Paprastai atliekamas išsamus vis ų bandomųjų gyvūnų bendrasis skrodimas, 
atidžiai ištiriant k ūno pavirši ų ir visas jo angas, kaukol ę, krūtinės ląstą, pilvo 
ertmes ir j ų turinį. Tačiau taip pat gali b ūti numatyta (grup ėse, kuriose 
numatytas gyv ūnų marinimas nebaigus bandymo, arba pagalbin ėse grupėse) 
atlikti tik tokius matavimus, kurie yra susij ę su specifiniais, pagrindiniais 
matais, pvz., neurotoksiškumu arba imunotoksiškumu (žr. 21 skirsn į). Šių 
gyvūnų nebūtina skrosti ar su jais atlikti tolesni ų procedūrų, aprašytų kituose 
skirsniuose. Kontrolinius gyv ūnus gali reik ėti skrosti atsižvelgiant į konkretų 
atvejį ir vadovaujantis tyrimo vadovo nuoži ūra. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) Atliekant kai kuriuos serumo ir plazmos matavimus, ypa č gliukozės, pageidautina, kad 
gyvūnai per nakt į negautų pašaro. Pagrindin ė tokio poreikio priežastis yra ta, kad d ėl 
padidėjusių nuokrypi ų, kurių neišvengiamai atsirast ų, jeigu gyv ūnai būtų šeriami, b ūtų 
paslėpti sunkiau pastebimi padariniai ir b ūtų sunku aiškinti rezultatus. Ta čiau reikėtų 
atkreipti d ėmesį, kad per nakt į gyvūnams neduodant maisto gali b ūti padaryta neigiamos 
įtakos bendrajai gyv ūnų medžiag ų apykaitai ir, ypa č atliekant š ėrimo tyrimus, gali b ūti 
iškraipytas kasdienis bandomosios chemin ės medžiagos poveikis. Visi gyv ūnai turėtų 
būti tiriami tokios pat fiziologin ės būklės, todėl pageidautina, kad išsam ūs arba neuro ­
loginiai tyrimai tur ėtų būti numatyti kitai dienai nei klinikin ės biochemijos tyrimams 
skirtų ėminių ėmimas.
 48. Turėtų būti pasveriami vis ų gyvūnų, išskyrus nurodytuosius 47 skirsnio 
paskutinėje dalyje, organai. Vis ų gyvūnų (išskyrus gaištan čius ir (arba) 
numarintus nebaigus bandymo) antinks čiai, sėklidžių prielipai, širdis, 
inkstai, kepenys, kiaušid ės, blužnis, s ėklidės, skydliauk ė (sveriama po fiksa ­
vimo, kartu su prieskydin ėmis liaukomis) ir gimda tur ėtų būti nuvalyti, jeigu 
reikia, pašalinant prigludusius audinius, ir po skrodimo kuo grei čiau 
pasverti, kol neišdžiuvo.  
49. Atsižvelgiant į audinio tip ą ir numatom ą vėliau atlikti histopatologin į tyrimą, 
tinkamiausioje fiksavimo terp ėje turėtų būti konservuojami šie audiniai (40) 
(laužtiniuose skliaustuose nurodyt ų audinių konservuoti neb ūtina): 
Visi labai pakit ę audiniai  Širdis  Kasa  Skrandis ( įskrandis, liaukin ė 
skrandžio dalis)  
Antinksčiai Klubin ė žarna  Prieskydin ė liauka  [Dantys]  
Aorta  Tuš čioji žarna  Periferinis nervas  S ėklidės 
Smegenys ( įskaitant 
didžiųjų smegen ų, smege­
nėlių ir pailg ųjų smegen ų 
(smegenų tilto) išpjovas)  Inkstai  Hipofiz ė Užkr ūčio liauka  
Akloji žarna  Ašar ų liauka 
(viršakiduobin ė) Prostata  Skydliauk ė 
Gimdos kaklelis  Kepenys  Tiesioji žarna  [Liežuvis]  
Koaguliatori ų liauka  Plau čiai Seili ų liauka  Trach ėja 
Gaubtinė žarna  Limfmazgiai (paviršiniai 
ir giluminiai)  Sėklinės pūslelės Šlapimo p ūslė 
Dvylikapiršt ė žarna  Pieno liauka (patel ėms – 
privaloma, patinams – 
jeigu galima ištirti 
akimi)  Skeleto raumuo  Gimda (su gimdos kakleliu)  
Sėklidžių prielipai  [Viršutiniai kv ėpavimo 
takai, įskaitant nos į, 
kriaukles ir šalutines nosies ertmes]
 Oda [Šlapimtakis]  
Akys (su tinklaine)  Stempl ė Stuburo smegenys (trys 
lygiai: sprando, kr ūtinės 
ląstos ir juosmens)  [Šlaplė] 
[Šlaunikaulis su kelio 
sąnariu]  [Uoslės receptoriai]  Blužnis  Makštis  
Tulžies p ūslė (jeigu tiriamos 
ne žiurkės) Kiaušidės [Kr ūtinkaulis]  Kaul ų čiulpų išpjova ir (arba) 
šviežiai paruošta kaul ų čiulpų 
punkcija  
Harderio liauka  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
Jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinks čiai, turėtų būti konservuo ­
jami abu organai. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali 
reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomo ­
sios chemin ės medžiagos savybes, tur ėtų būti konservuojami visi numanomi 
tiksliniai organai. Atliekant tyrimus, per kuriuos doz ė duodama per od ą, 
turėtų būti tiriami organai, nurodyti kaip tirtini, kai doz ė duodama per 
burną; be to, b ūtina paimti ir užkonservuoti specifinius odos ėminius iš 
poveikio vietos. Atliekant inhaliacinius tyrimus, konservuotin ų ir tirtinų 
kvėpavimo tak ų audinių sąrašas tur ėtų būti sudaromas remiantis šio 
priedo B.8 skyriuje (9) ir šio priedo B.29 skyriuje (10) pateiktomis reko ­
mendacijomis. Tiriant kitus organus ir (arba) audinius (be specialiai konser ­
vuojamų kvėpavimo tak ų audinių), turėtų būti tiriami organai, nurodyti d ėl 
poveikio per virškinam ąjį traktą būdo pateiktame organ ų sąraše. 
Histopatologinis tyrimas  
50. Yra parengtos toksikologin ės patologijos tyrim ų geriausiosios patirties gair ės 
(40). Tur ėtų būti atlikti bent šie histopatologiniai tyrimai:  
— visų didžiausi ąją dozę gavusios grup ės ir kontrolin ės grupės gyvūnų 
audinių, 
— visų per tyrim ą nugaišusi ų arba numarint ų gyvūnų audinių, 
— visų audinių su plika akimi matomais pakitimais,  
— tikslini ų audinių arba vis ų kitų dydžių dozes gavusi ų grupių gyvūnų 
audinių, dėl kurių didžiausi ąją dozę gavusioje grup ėje nustatyta su 
dozės davimu susijusi ų pakitimų, 
— jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinks čiai, turėtų būti tiriami abu 
organai.  
STEBĖJIMAI (KANCEROGENIŠKUMO BANDYMO ETAPAS)  
51. Visi gyv ūnai turėtų būti tikrinami, ar jie sveiki arba nenugaiš ę; paprastai tai 
turėtų būti daroma kiekvienos dienos pradžioje ir pabaigoje, įskaitant savait ­
galius ir šven čių dienas. Be to, kart ą per parą turėtų būti patikrinama, ar 
gyvūnams nepasireišk ė specifini ų toksikologin ės reikšmės požymi ų. Jeigu 
per tyrim ą naudojamas zondas, gyv ūnai turėtų būti tikrinami iš karto po 
dozės davimo. Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas augli ų vystymuisi; 
turėtų būti registruojamas kiekvieno akivaizdžiai matomo ir už čiuopiamo 
auglio atsiradimo laikas, vieta, dydis, išvaizda ir išsivystymas.  
52. Visi gyv ūnai turėtų būti pasveriami prieš pradedant duoti doz ę, kitas 13 
savaičių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau – bent kart ą per mėnesį. 
Pirmąsias 13 savai čių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau – bent 
kartą per mėnesį turėtų būti matuojamas pašaro suvartojimas ir pašaro efek ­
tyvumas. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga duodama su geriamuoju 
vandeniu, pirm ąsias 13 savai čių – ne rečiau kaip kart ą per savait ę, o vėliau 
– bent kart ą per mėnesį turėtų būti matuojamas vandens suvartojimas. Gali ­
mybė matuoti vandens suvartojim ą turėtų būti svarstoma ir atliekant tyrimus, 
per kuriuos pasikei čia gėrimo įpročiai. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematologiniai ir klinikin ės biochemijos tyrimai bei kiti matavimai  
53. Siekiant per tyrim ą gauti kuo daugiau informacijos, pirmiausia apie veikimo 
būdo aspektus, gali b ūti paimti ėminiai, skirti hematologiniams ir klinikin ės 
biochemijos tyrimams, ta čiau jie imami tyrimo vadovo nuoži ūra. Be to, gali 
būti naudinga atlikti šlapimo analiz ę. Informacijos apie šiuos parametrus 
suteiks duomenys apie gyv ūnus, naudotus tyrimo l ėtinio toksiškumo 
bandymo etapu, paprastai trunkan čiu 12 mėnesių (34 skirsnis). Daugiau 
informacijos apie toki ų ėminių naudą atliekant kancerogeniškumo tyrim ą 
pateikta rekomendaciniame dokumente Nr. 116 (7). Jeigu imami kraujo 
ėminiai, tai tur ėtų būti daroma baigiantis bandymo laikotarpiui – prieš pat 
gyvūnų numarinim ą arba marinimo proced ūros metu. Šie ėminiai tur ėtų būti 
imami iš nurodytos vietos, pvz., širdies punkcijos vietos arba iš užakiduo ­
binio ančio, taikant nuskausminim ą. Be to, tyrimams gali b ūti paruošti 
kraujo tepin ėliai, ypač jeigu nustatoma, kad tikslinis organas yra kaul ų 
čiulpai; tačiau kancerogeniškumo bandymo etapu atliekam ų kraujo tepin ėlių 
tyrimų nauda siekiant įvertinti kancerogeniškum ą ir (arba) onkogeniškum ą 
yra abejotina (38).  
PATOLOGIJA  
Bendrasis skrodimas  
54. Paprastai atliekamas išsamus vis ų tiriamųjų gyvūnų, išskyrus kontrolinius ir 
kitus pagalbinius gyv ūnus (žr. 20 skirsn į), bendrasis skrodimas, atidžiai 
ištiriant k ūno pavirši ų ir visas jo angas, kaukol ę, krūtinės ląstą, pilvo ertmes 
ir jų turinį. Kontrolinius ir kitus pagalbinius gyv ūnus gali reik ėti skrosti 
atsižvelgiant į konkretų atvejį ir vadovaujantis tyrimo vadovo nuoži ūra. 
Atliekant kancerogeniškumo tyrim ą organai paprastai nesveriami, nes d ėl 
senėjimo pakitim ų, o vėliau – d ėl auglių išsivystymo organ ų svėrimo 
duomenys tampa nenaudingi. Ta čiau jie gali b ūti svarbūs atliekant įrodomo­
sios duomen ų galios vertinim ą, o ypač – svarstant veikimo b ūdo aspektus. 
Jeigu atliekant pagalbin į tyrimą sveriami organai, tai tur ėtų būti daroma n ė 
vėliau kaip po met ų nuo tyrimo pradžios.  
55. Atsižvelgiant į audinio tip ą ir numatom ą vėliau atlikti histopatologin į tyrimą, 
tinkamiausioje fiksavimo terp ėje turėtų būti konservuojami šie audiniai (40) 
(laužtiniuose skliaustuose nurodyt ų audinių konservuoti neb ūtina): 
Visi labai pakit ę audiniai  Širdis  Kasa  Skrandis ( įskrandis, liaukin ė 
skrandžio dalis)  
Antinksčiai Klubin ė žarna  Prieskydin ė liauka  [Dantys]  
Aorta  Tuš čioji žarna  Periferinis nervas  S ėklidės 
Smegenys ( įskaitant 
didžiųjų smegen ų, smege­
nėlių ir pailg ųjų smegen ų 
(smegenų tilto) išpjovas)  Inkstai  Hipofiz ė Užkr ūčio liauka  
Akloji žarna  Ašar ų liauka 
(viršakiduobin ė) Prostata  Skydliauk ė 
Gimdos kaklelis  Kepenys  Tiesioji žarna  [Liežuvis]  
Koaguliatori ų liauka  Plau čiai Seili ų liauka  Trach ėja 
Gaubtinė žarna  Limfmazgiai (paviršiniai 
ir giluminiai)  Sėklinės pūslelės Šlapimo p ūslė ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
Dvylikapiršt ė žarna  Pieno liauka (patel ėms – 
privaloma, patinams – 
jeigu galima ištirti akimi)
 Skeleto raumuo  Gimda (su gimdos kakleliu)  
Sėklidžių prielipai  [Viršutiniai kv ėpavimo 
takai, įskaitant nos į, 
kriaukles ir šalutines 
nosies ertmes]  Oda [Šlapimtakis]  
Akys (su tinklaine)  Stempl ė Stuburo smegenys (trys 
lygiai: sprando, kr ūtinės 
ląstos ir juosmens)  [Šlaplė] 
[Šlaunikaulis su kelio 
sąnariu]  [Uoslės receptoriai]  Blužnis  Makštis  
Tulžies p ūslė (jeigu tiriamos 
ne žiurkės) Kiaušidės [Kr ūtinkaulis]  Kaul ų čiulpų išpjova ir (arba) 
šviežiai paruošta kaul ų čiulpų 
punkcija  
Harderio liauka  
Jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinks čiai, turėtų būti konservuo ­
jami abu organai. Atsižvelgiant į gautas klinikines ir kitokias išvadas, gali 
reikėti ištirti papildomus audinius. Be to, atsižvelgiant į žinomas bandomo ­
sios chemin ės medžiagos savybes, tur ėtų būti konservuojami visi numanomi 
tiksliniai organai. Atliekant tyrimus, per kuriuos doz ė duodama per od ą, 
turėtų būti tiriami organai, nurodyti kaip tirtini, kai doz ė duodama per 
burną; be to, b ūtina paimti ir užkonservuoti specifinius odos ėminius iš 
poveikio vietos. Atliekant inhaliacinius tyrimus, konservuotin ų ir tirtinų 
kvėpavimo tak ų audinių sąrašas tur ėtų būti sudaromas remiantis šio 
priedo B.8 skyriuje (8) ir šio priedo B.29 skyriuje (9) pateiktomis rekomen ­
dacijomis. Tiriant kitus organus ir (arba) audinius (be specialiai konservuo ­
jamų kvėpavimo tak ų audinių), turėtų būti tiriami organai, nurodyti d ėl 
poveikio per virškinam ąjį traktą būdo pateiktame organ ų sąraše. 
Histopatologinis tyrimas  
56. Yra parengtos toksikologin ės patologijos tyrim ų geriausiosios patirties gair ės 
(40). Tur ėtų būti ištirti bent šie audiniai:  
— visi didžiausi ąją dozę gavusios grup ės ir kontrolin ės grupės gyvūnų 
audiniai,  
— visi per tyrim ą nugaišusi ų arba numarint ų gyvūnų audiniai,  
— visi audiniai su plika akimi matomais pakitimais,  
— jeigu didžiausi ąją dozę gavusioje grup ėje pastebima su doz ės davimu 
susijusių histopatologini ų pakitimų, tiriami tie patys vis ų kitų dydžių 
dozes gavusi ų grupių gyvūnų audiniai,  
— jeigu tai poriniai organai, pvz., inkstai, antinks čiai, turėtų būti tiriami abu 
organai.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
DUOMENYS IR ATASKAITOS (KANCEROGENIŠKUMAS IR L ĖTINIS 
TOKSIŠKUMAS)  
Duomenys  
57. Turėtų būti pateikti kiekvieno gyv ūno duomenys pagal visus vertinamus 
parametrus. Be to, visi duomenys tur ėtų būti apibendrinti lentel ėse, pagal 
kiekvieną bandom ąją grupę nurodant pradedant bandym ą turėtų gyvūnų 
skaičių, atliekant bandym ą nugaišusi ų arba dėl humanišk ų priežasčių numa­
rintų gyvūnų skaičių ir kiekvienos ž ūties arba numarinimo d ėl humanišk ų 
priežasčių laiką, gyvūnų su toksiškumo požymiais skai čių, pastebėtų toksiš­
kumo požymi ų aprašymą, įskaitant kiekvieno toksinio poveikio pasireiškimo 
laiką, trukmę ir sunkum ą, gyvūnų su audini ų pakitimais skai čių, pakitim ų 
tipą ir gyvūnų su kiekvieno tipo pakitimais procentin ę dalį. Gyvūnams, 
kuriems pasireišk ė toksinis poveikis arba atsirado audini ų pakitimų, be paki­
timų lygmens įvertinimo, suvestini ų duomenų lentelėse turėtų būti pateikti 
vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai (ištisinio bandymo duomen ų). 
58. Istoriniai kontroliniai duomenys gali b ūti vertingi aiškinant tyrimo rezul ­
tatus, pvz., kai yra požymi ų, kad taikant vienalaik ę kontrolę gauti duomenys 
iš esmės skiriasi, palyginti su naujausiais duomenimis, gautais stebint kont ­
rolinius gyv ūnus, esan čius toje pa čioje bandymo patalpoje arba kolonijoje. 
Istoriniai kontroliniai duomenys, jeigu jie vertinami, tur ėtų būti pateikti tos 
pačios laboratorijos ir tur ėtų būti susiję su to paties amžiaus ir paderm ės, 
išvestos penkeri ų metų laikotarpiu iki svarstomo tyrimo, gyv ūnais. 
59. Jeigu taikytina, skaitiniai rezultatai tur ėtų būti įvertinti tinkamu, visuotinai 
priimtinu statistiniu metodu. Statistiniai metodai ir analizei skirti duomenys turi būti pasirinkti planuojant bandym ą (9 skirsnis). Parenkant duomenis, 
turėtų būti numatytos pataisos atsižvelgiant į gyvūnų išgyvenim ą.
 
60. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija.  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— fizinė būsena, grynumas, fizin ės ir chemin ės savybės, 
— identifikavimo duomenys,  
— chemin ės medžiagos šaltinis,  
— partijos numeris,  
— chemin ės analizės pažyma.  
Nešiklis (jeigu naudojamas):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas (jeigu tai ne vanduo).  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir (arba) paderm ė ir pasirinkimo pagrindimas,  
— gyvūnų skaičius ir amžius pradedant bandym ą, nurodant lyt į, 
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.,  
— kiekvieno gyv ūno masė pradedant bandym ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Bandymo s ąlygos:  
— dozės davimo b ūdo ir doz ės parinkimo pagrindimas,  
— jeigu taikytina, taikyti statistiniai duomen ų analizės metodai,  
— išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos ir pašaro 
paruošimą, 
— analitiniai duomenys apie pasiekt ą koncentracij ą, preparato stabilum ą ir 
homogeniškum ą, 
— dozės davimo b ūdas ir išsami informacija apie bandomosios chemin ės 
medžiagos davim ą, 
— jeigu tai inhaliaciniai tyrimai: ar doz ė duodama tik per nos į, ar per vis ą 
kūną, 
— faktin ės dozės (mg/kg k ūno masės per par ą) ir bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracijos pašare ir (arba) geriamajame vandenyje (mg/kg arba ppm) perskai čiavimo į faktinę dozę koeficientas, jeigu 
taikytina,
 
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę. 
Rezultatai (tur ėtų būti pateiktos suvestini ų duomenų lentelės ir kiekvieno 
gyvūno duomenys):  
Bendrieji duomenys:  
— išgyvenimo duomenys,  
— kūno masė ir (arba) k ūno masės pokyčiai, 
— pašaro suvartojimas, pašaro efektyvumo skai čiavimai, jeigu jie buvo 
atlikti, ir vandens suvartojimas, jeigu taikytina,  
— toksikonetiniai duomenys, jeigu yra,  
— oftalmoskopini ų tyrimų duomenys (jeigu yra),  
— hematologini ų tyrimų duomenys (jeigu yra),  
— klinikin ės chemijos tyrim ų duomenys (jeigu yra).  
Klinikinės išvados:  
— Toksiškumo požymiai,  
— nukrypim ų dažnumas (ir, jeigu įvertinta, dydis),  
— klinikini ų požymių pobūdis, sunkumas ir trukm ė (laikinieji ar negr įžta­
mieji).  
Skrodimo duomenys:  
— galutin ė kūno masė, 
— organ ų masė ir masių santykiai, jeigu taikytina,  
— skrodimo išvados, nukrypim ų dažnumas ir dydis.  
Histopatologinis tyrimas:  
— histopatologini ų tyrimų, išskyrus neoplastinius, rezultatai,  
— neoplastini ų tyrimų rezultatai,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— nustatyt ų didelių ir mikroskopini ų pakitimų sąryšis,  
— išsamus vis ų su dozės davimu susijusi ų histopatologinio tyrimo rezultat ų 
aprašymas, pateikiant sunkumo lygio vertinimus,  
— skaidri ų tarpusavio perži ūros ataskaita.  
Statistinis rezultat ų apdorojimas, jeigu taikytina.  
Rezultatų aptarimas, apimantis:  
— modeliavimo metod ų aptarimą, 
— dozės ir reakcijos tarpusavio priklausomybes,  
— istorinius kontrolinius duomenis,  
— veikimo b ūdo informacijos svarstym ą, 
— OD, NNPL ir MPNPL nustatym ą, 
— reikšm ę žmonėms. 
Išvados.  
LITERAT ŪRA 
1. OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris.
 
2. EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC.  
3. Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the SAFEty Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208
 
4. Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191  
5. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteriza ­
tion of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445
 
6. Šio priedo B.27 skyrius. 90 dien ų kartotinės dozės toksiškumo per virškina ­
mąjį traktą ne graužikams tyrimas.  
7. OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.or ­
g/env/testguidelines.
 
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9. Šio priedo B.8 skyrius. Po ūmis toksiškumas įkvėpus. 28 dien ų tyrimas.  
10. Šio priedo B.29 skyrius. Pusiau l ėtinis toksiškumas įkvėpus. 90 dien ų 
tyrimas.  
11. Šio priedo B.9 skyrius. Kartotin ės dozės (28 dien ų) toksiškumas (per od ą). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
12. Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793–801.
 
13. Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The 
human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Over ­
view. Crit. Rev. Toxicol. 33:581–589.  
14. Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51–56.
 
15. Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591–653.
 
16. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR  et al.  (2006). Agricultural Chemical 
SAFEty Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human SAFEty Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1–7.
 
17. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T  et al.  (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical SAFEty Assessments. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 9–35.  
18. Doe JE, Boobis AR, Blacker A  et al . (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. 
Crit. Rev. Toxicol. 36: 37–68.  
19. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM  et al.  (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69–98.
 
20. OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris.
 
21. OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety 
evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/ ­
MONO(2000)7, OECD, Paris.  
22. Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpre ­
tation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approa ­
ches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
23. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
24. Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharma ­
ceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
25. Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the 
assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF 
& Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279–284.
 
26. Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of 
Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results 
and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agroche ­
mical Industry. Environ Health Perspect 105:1196–1203.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
27. 2010 m. rugs ėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES 
dėl mokslo tikslais naudojam ų gyvūnų apsaugos, OL L 276, 2010 10 20, 
p. 33.  
28. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services.
 
29. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Struc ­
ture of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. 
ISBN 3–906255–06–9.  
30. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems.
 
31. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15–23.  
32. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60.
 
33. Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
34. Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.  
35. Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Compa ­
risons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.
 
36. Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
 
37. Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experi ­
ments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
 
38. Weingand K, Brown G, Hall R  et al . (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and SAFEty Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201.  
39. EMEA (draft) document „Non-clinical guideline on drug-induced hepatoto ­
xicity“ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
40. Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK  et al.  (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTIS  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  naudojant š į bandymo metod ą tiriama chemin ė 
medžiaga arba mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  TOKSIŠKUMO VIENOS KARTOS DAUGINIMUISI 
BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandomoji medžiaga duodama laipsniškomis doz ėmis kelioms 
eksperimentini ų patinų ir pateli ų grupėms. Patinams doz ės turėtų 
būti duodamos augimo metu bent vien ą spermatogenez ės ciklą 
(maždaug 56 dienas peli ų patinams ir 70 dien ų – žiurkių patinams) 
tam, kad b ūtų galima įvertinti visus neigiamus bandomosios 
medžiagos poveikius spermatogenezei.  
Tėvinės (P) kartos patel ėms dozė turi būti duodama bent dviej ų rujų 
laikotarpį, kad būtų galima įvertinti visus neigiamus bandomosios 
medžiagos poveikius kiaušin ėlių subrendimo atžvilgiu. Tada gyv ūnai 
suporuojami. Bandomoji medžiaga duodama abejoms lytims poravi ­
mosi metu ir v ėliau duodama tik patel ėms, iš pradži ų gestacijos, o 
vėliau laktacijos laikotarpiu. Jei medžiaga duodama per kv ėpavimo 
takus, metod ą reikia atitinkamai pakoreguoti.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Nėra. 
1.6. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
1.6.1.  Pasiruošimas  
Prieš pradedant bandym ą sveiki jauni gyv ūnai atsitiktin ės atrankos 
būdu atrenkami ir suskirstomi į bandom ąją bei kontrolin ę grupes. 
Mažiausiai penkias dienas prieš bandym ą gyvūnai yra pratinami 
prie laboratorini ų sąlygų. Rekomenduojama bandom ąją medžiag ą 
duoti kartu su pašaru ar geriamuoju vandeniu. Galimi ir kiti davimo 
būdai. Visiems gyv ūnams bandomosios medžiagos doz ė turėtų būti 
duodama tuo pa čiu būdu visą atitinkamo eksperimento laikotarp į. Jei 
dozavimui palengvinti naudojamas nešiklis ar kiti priedai, jie tur ėtų 
nedaryti jokio toksinio poveikio. Doz ė turėtų būti duodama septynis 
kartus per savait ę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
1.6.2.  Eksperimentiniai gyv ūnai 
Rūšių parinkimas  
Tinkamiausios gyv ūnų rūšys yra pel ės arba žiurk ės. Reikėtų naudoti 
sveikus dar bandymams nenaudotus gyv ūnus. Mažo vaisingumo 
veislės nenaudotinos. Apib ūdinama bandom ųjų gyvūnų rūšis, veislė, 
lytis, svoris ir (arba) amžius.  
Norint tinkamai įvertinti vaisingum ą, reikėtų tirti tiek patinus, tiek ir 
pateles. Prieš pradedant duoti doz ę, visi bandomieji bei kontroliniai 
gyvūnai turėtų būti atjunkyti.  
Skaičius ir lytis  
Kiekvienoje bandomojoje ir kontrolin ėje grupėje turėtų būti pakan­
kamas gyv ūnų skaičius, kad b ūtų gaunama apie 20 vaiking ų patelių, 
kurioms art ėja arba at ėjo atsivedimo laikas.  
Taip siekiant užtikrinti pakankam ą vaikingų patelių ir prieauglio 
skaičių, kad būtų galima prasmingai įvertinti galim ą bandomosios 
medžiagos poveik į vaisingumui, gestacijai ir t ėvinės kartos P pateli ų 
elgesiui, taip pat pirmosios kartos F  1 palikuoni ų laktacijai, augimui 
bei vystymuisi nuo apvaisinimo iki subrendimo.  
1.6.3.  Bandymo s ąlygos  
Pašaras ir vanduo tur ėtų būti duodami  ad libitum . Artėjant atsive ­
dimo laikui, vaikingos patel ės turėtų būti atskiriamos, perkeliant jas į 
atsivedimo ar atsivedusi ų patelių narvelius, kuriuose gali b ūti būti­
niausių medžiag ų gūžtai įsirengti.  
1.6.3.1.  Dozė 
Turėtų būti naudojamos mažiausiai trys bandomosios bei viena kont ­
rolinė grupės. Jei bandomoji medžiaga duodama naudojant nešikl į, 
kontrolinei grupei turi b ūti duodamas didžiausias nešiklio t ūris. Jei 
bandomoji medžiaga mažina pašaro pasisavinim ą ar sunaudojim ą, 
gali reikėti gretutin ės maitinamos kontrolin ės grupės. Jei nėra apri­
bojimų dėl bandomosios medžiagos fizikini ų ir chemini ų savybių ar 
biologinio poveikio, geriausia, kad didžiausia doz ė tėvinės kartos (P) 
gyvūnams sukelt ų toksinį poveikį, bet ne gaištamum ą. Tarpinė(s) 
bandomosios medžiagos doz ė(s) turėtų sukelti minimal ų bandomajai 
medžiagai priskiriam ą toksinį poveikį, o mažiausia doz ė neturėtų 
sukelti jokio pastebimo neigiamo poveikio t ėvams ar palikuonims. 
Jei medžiagos doz ė duodama per zond ą arba su kapsule, ji apskai ­ 
čiuojama pagal kiekvieno gyv ūno kūno masę ir patikslinama kiek ­
vieną savaitę priklausomai nuo k ūno masės pokyčių. Norint galima 
vaikingoms patel ėms skirtas dozes apskai čiuoti pagal k ūno masės 
duomenis 0 arba 6 gestacijos dien ą. 
1.6.3.2.  Ribinis bandymas  
Mažai toksišk ų medžiagų atveju, jei davus 1 000 mg/kilogramui doz ę 
negaunama įrodymų, kad bandomoji medžiaga slopina dauginim ąsi, 
bandymų su kitomis doz ėmis galima nebedaryti. Jei atlikus išankstin į 
bandymą, kurio metu naudota didel ė medžiagos doz ė, sukelianti 
aiškų toksinį poveikį atsivedusiai patelei, nenustatomas joks 
neigiamas poveikis vaisingumui, bandym ų su kitomis doz ėmis 
galima nebedaryti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
1.6.3.3.  Bandymo atlikimas  
E k s p e r i m e n t ų t v a r k a r a š č i a i 
Kasdieninis doz ės davimas t ėvinės (P) kartos patinams tur ėtų prasi­
dėti tada, kai jie sulaukia 5–9 savai čių amžiaus, buvo atjunkyti ir 
mažiausiai penkias dienas aklimatizavosi. Žiurk ėms dozė duodama 
10 savaičių prieš jas suporuojant (pel ėms aštuonias savaites). Patinus 
galima numarinti ir ištirti pasibaigus poravimosi laikotarpiui arba palikti ir toliau šerti pašaru su bandom ąja medžiaga, kad jie galb ūt 
antrą kartą apvaisint ų pateles, ir juos numarinti po to prieš bandymo 
pabaigą. Tėvinės (P) kartos patel ėms dozė turėtų būti pradėta duoti 
iškart po penkias dienas trukusios aklimatizacijos ir t ęstis mažiausiai 
dvi savaites iki poravimosi periodo pradžios. Šioms patel ėms dozė 
turėtų būti duodama kasdien maždaug tris savaites trunkan čio pora­
vimosi laikotarpio metu ir gestacijos laikotarpio metu iki F
 1 kartos 
palikuoni ų atjunkymo. Jei yra kit ų duomen ų apie bandom ąją 
medžiagą (pvz., bandomosios medžiagos sukeliamas metabolizmas 
arba bioakumuliacija), reik ėtų apsvarstyti, ar nevert ėtų pakeisti 
dozės davimo tvarkarašt į. 
P o r a v i m o s i p r o c e d ū r a 
Tiriant toksiškum ą dauginimuisi, poruojama arba santykiu 1:1 
(vienas patinas su viena patele) arba santykiu 1:2 (vienas patinas su dviem patel ėmis).
 
Poruojant santykiu 1:1, viena patel ė laikoma kartu su vienu patinu 
tol, kol prasideda gestacija arba praeina trys savait ės. Kiekvien ą rytą 
patelės turėtų būti apžiūrimos siekiant nustatyti, ar yra spermos arba 
ar susidar ė makšties kamštis. Nulin ė gestacijos diena yra ta, kai 
randama sperma arba susidar ęs makšties kamštis.  
Tos poros, kurioms nepasiseka susiporuoti, tur ėtų būti ištiriamos 
siekiant nustatyti nevaisingumo priežast į. 
Todėl galima imtis toki ų papildom ų procedūrų kaip poravimo su 
kitais tikrai vaisingais patinais ar vaisingomis patel ėmis, mikrosko ­
piškai analizuojant dauginimosi organus ir tiriant kiaušin ėlio ir sper ­
matozoidų susiformavimo cikl ą. 
V a d o s d y d ž i a i  
Gyvūnams, kuriems vaisingumo bandymo metu duodama doz ė, 
leidžiama normaliai atsivesti palikuoni ų ir auginti juos iki atjun ­
kymo, nestandartizuojant vados dydžio.  
Kai atliekamas vados dydžio standartizavimas, si ūloma atlikti toki ą 
procedūrą. Praėjus 1–4 dienoms po atsivedimo, kiekvienos vados 
dydis gali b ūti reguliuojamas pašalinant perteklin į prieauglį atrankos 
būdu taip, kad kiekvienoje vadoje likt ų keturi patin ėliai ir keturios 
patelės. 
Jei neįmanoma vienoje vadoje tur ėti po keturis kiekvienos lyties 
palikuonis, tai priimtinas dalinis palikuoni ų skaičiaus reguliavimas 
(pvz., penki patin ėliai ir trys patel ės). Tų vadų, kuriose yra mažiau 
nei aštuoni palikuonys, skai čius nėra reguliuojamas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
1.6.4.  Steb ėjimai  
Bandymo metu kiekvienas gyv ūnas turėtų būti stebimas kasdien. 
Reikėtų registruoti atitinkamus elgesio poky čius, komplikuoto arba 
užsitęsusio gestacijos požymius ir visus toksiškumo požymius, įskai­
tant gaištamum ą. Prieš poravimosi period ą ir jo metu galima kasdien 
įvertinti pašaro sunaudojim ą. Po atsivedimo ir laktacijos laikotarpiu 
pašaro sunaudojim ą (ir geriamo vandens sunaudojim ą, jei bandomoji 
medžiaga duodama su vandeniu) reik ėtų įvertinti tą pačią dieną, 
kurią sveriama vada. Pirm ąją dozės davimo dien ą ir vėliau kas 
savaitę reikėtų sverti tėvinės (P) kartos patinus ir pateles. Šie kiek ­
vieno gyv ūno duomenys registruojami atskirai.  
Gestacijos trukm ė turėtų būti pradedama skai čiuoti nuo nulin ės 
dienos. Kiekviena vada turi b ūti apžiūrėta kaip galima grei čiau po 
atsivedimo siekiant nustatyti jaunikli ų lytį, gimusi ų negyvų ir 
gimusių gyvų jauniklių skaičių ir dideles anomalijas.  
Negyvi ir ketvirt ą dieną po gimimo numarinti jaunikliai tur ėtų būti 
išsaugoti ir ištirti siekiant nustatyti galimus sutrikimus. Gim ę gyvi 
jaunikliai tur ėtų būti suskaičiuojami ir vados pasvertos atsivedimo 
rytą, po to ketvirt ą bei septint ą dieną ir toliau kas savait ę iki baigsis 
bandymas, kuomet kiekvienas gyv ūnas bus pasvertas atskirai.  
Reikėtų registruoti pateli ų ar jų palikuoni ų fizinius ar elgesio sutri ­
kimus.  
1.6.5.  Patologija  
1.6.5.1.  Nekroskopija  
Tėvinės kartos (P) gyv ūnams nugaišus bandymo metu ar juos numa ­
rinus, juos reik ėtų makroskopiškai ištirti siekiant nustatyti visas 
struktūrines anomalijas ar patologinius pakitimus, kreipiant ypating ą 
dėmesį į dauginimosi organus. Nugaiš ę ar gaištantys jaunikliai tur ėtų 
būti ištirti siekiant nustatyti defektus.  
1.6.5.2.  Histopatologinis tyrimas  
Mikroskopiniam tyrimui reik ėtų išsaugoti t ėvinės kartos (P) gyv ūnų 
kiaušides, gimd ą, gimdos kaklel į, makštį, sėklides, ants ėklidį, spermą 
gaminančius maišelius, prostat ą, koaguliacijos liauk ą, hipofizę bei 
bandomąja medžiaga paveiktus organus. Jei šie organai nebuvo 
tirti atliekant kitus bandymus su daug skirting ų dozių, juos reik ėtų 
mikroskopiškai ištirti didel ę dozę gavusiems gyv ūnams, kontrolin ės 
grupės gyvūnams bei bandymo metu nugaišusiems gyv ūnams, jei tai 
praktiškai įmanoma.  
Tie šių gyvūnų organai, kuriuose nustatytos anomalijos, tur ėtų būti 
ištirti visiems likusiems t ėvinės kartos (P) gyv ūnams. Tokiu atveju 
reikėtų mikroskopiškai tirti visus audinius, kuriuose pasteb ėti pagrin­
diniai patologiniai poky čiai. Kaip buvo pasi ūlyta aprašant supora ­
vimo proced ūrą, tų gyvūnų, kurie, kaip įtariama, gali b ūti nevaisingi, 
dauginimosi organai gali b ūti mikroskopiškai tiriami.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. DUOMENYS  
Duomenys gali b ūti apibendrinami lentel ėse, kuriose nurodomas 
kiekvienos bandomosios grup ės gyvūnų skaičius bandymo pradžioje, 
vaisingų patinų skaičius, vaiking ų patelių skaičius, poky čių tipai ir 
gyvūnų, kuriuose pasireišk ė kiekvieno tipo poky čiai, skaičius, 
išreikštas procentais.  
Jei įmanoma, skai čiais išreikšti rezultatai tur ėtų būti apdorojami 
tinkamu statistiniu metodu. Galima taikyti bet kur į visuotinai pripa ­ 
žintą statistinį metodą. 
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Jei įmanoma, bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikiama tokia infor ­
macija:  
— panaudota r ūšis/veislė, 
— duomenys apie toksin į atsaką pagal lyt į ir duotą dozę, įskaitant 
vaisingum ą, gestaciją ir gyvybingum ą, 
— nugaišimo laikas bandymo metu arba informacija, kad gyv ūnai 
išgyveno iki bandymo pabaigos,  
— lentelė, kurioje pateikiama kiekvienos vados mas ė, vidutinis 
jauniklių svoris ir kiekvieno jauniklio k ūno masė bandymo 
pabaigoje,  
— toksinis ir kitoks poveikis dauginimuisi, palikuonims bei j ų 
vystymuisi,  
— kiekvienos anomalijos pasteb ėjimo laikas ir tolesn ė eiga,  
— tėvinės kartos (P) gyv ūnų svoris,  
— nekroskopijos metu gauti duomenys,  
— mikroskopini ų tyrimų duomenų išsamus apib ūdinimas,  
— rezultat ų statistinė analizė, jei įmanoma tai padaryti,  
— rezultat ų aptarimas,  
— rezultat ų aiškinimas.  
3.2. ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. 
4. NUORODOS  
Žr. Bendrojo įvado B dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  TOKSIŠKUMO DVIEJ Ų KARTŲ DAUGINIMUISI BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 416 (2001).  
1.1. ĮVADAS  
Šis dviej ų kartų dauginimosi bandymo metodas skirtas suteikti 
bendros informacijos apie bandomosios medžiagos poveik į patinų 
ir patelių dauginimosi sistem ų vientisumui ir veiksmingumui, įskai­
tant lytini ų liaukų funkciją, rujos cikl ą, poravimosi elges į, apvaisi­
nimą, gestacij ą, atsivedim ą, laktacij ą, atjunkym ą ir palikuoni ų 
augimą bei vystym ąsi. Be to, atliekant bandym ą galima gauti infor ­
macijos apie bandomosios medžiagos poveik į ką tik atsivest ų 
jauniklių liguistumui, gaištamumui, preliminari ų duomen ų apie 
toksinį poveikį prenataliniam ir postnataliniam vystymuisi, taigi juo 
galima remtis atliekant v ėlesnius bandymus. Taikant š į metodą 
tiriamas ne tik F1 kartos augimas ir vystymasis, jis taip pat skirtas patinų ir patelių dauginimosi sistem ų vientisumui bei veiksmingumui 
ir F2 kartos augimui bei vystymuisi įvertinti. Norint gauti papil ­
domos informacijos apie toksin į poveikį vystymuisi ir funkcinius 
trūkumus, š į protokol ą galima papildyti kit
ų bandymų segmentais, 
atsižvelgiant į atitinkamus toksiškumo vystymuisi ir (arba) neurotok ­
siškumo vystymuisi metodus, arba šie parametrai gal ėtų būti tiriami 
atliekant atskirus bandymus taikant atitinkamus bandym ų metodus.  
1.2. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Kelioms patin ų ir patelių grupėms duodamos skirtingos bandomosios 
medžiagos doz ės. P kartos patinai tur ėtų gauti doz ę augdami ir 
mažiausiai vien ą visą spermatogenez ės ciklą (maždaug 56 paras 
pelėms ir 70 par ų žiurkėms), kad b ūtų galima gauti informacijos 
apie neigiam ą poveikį spermatogenezei. Poveikis spermai nustatomas 
pagal kelis spermos parametrus (pvz., spermos morfologij ą ir sper­
matozoidų judrumą), audinių preparatuose ir darant išsam ų histopa­
tologinį tyrimą. Jei duomen ų apie spermatogenez ę gauta ankstes ­
niame pakankamos trukm ės kartotin ės dozės bandyme, pvz., 90 
parų bandyme, P kartos patin ų nebūtina įtraukti į vertinim ą. Tačiau 
rekomenduojama išsaugoti P kartos spermos ėminius arba skaitme ­
ninius užrašus, kad juos v ėliau galima b ūtų įvertinti. P kartos patel ės 
turi gauti doz ę augdamos ir kelis visus rujos ciklus, kad b ūtų galima 
nustatyti bet kok į neigiamą bandomosios medžiagos poveik į norma­
liam rujos ciklui. Bandomoji medžiaga duodama t ėvų kartos (P) 
gyvūnams poruojantis, gestacijos metu ir iki j ų F1 palikuoni ų atjun­
kymo. Po atjunkymo medžiaga toliau duodama F1 palikuonims iki j ų 
subrendimo, poravimosi ir, atsiradus F2 kartai, iki šios kartos pali ­
kuonių atjunkymo.  
Visi gyv ūnai stebimi kliniškai ir atliekami patologiniai tyrimai 
toksiškumo požymiams nustatyti, kreipiant ypa č didelį dėmesį į 
poveikį patinų ir patelių dauginimosi sistem ų vientisumui ir veiks ­
mingumui bei palikuoni ų augimui ir vystymuisi.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.3.1.  Gyv ūnų rūšies pasirinkimas  
Tinkamiausia bandom ųjų gyvūnų rūšis yra žiurk ės. Jei naudojama 
kita rūšis, pasirinkimas turi b ūti pagrįstas ir padaromi atitinkami 
reikalingi pakeitimai. Neturi b ūti naudojamos mažo vaisingumo 
veislės arba veisl ės, kurioms dažnai pasireiškia vystymosi tr ūkumai. 
Bandymo pradžioje naudojam ų gyvūnų masės skirtumai turi b ūti 
kiek įmanoma mažesni ir nukrypti ne daugiau kaip 20 % nuo kiek ­
vienos lyties atitinkamos vidutin ės masės. 
1.3.2.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Bandomųjų gyvūnų patalpos temperat ūra turi būti 22 °C (± 3 °C). 
Nors santykin ė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidau ­
tina ne didesn ė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikėtų 
siekti, kad b ūtų 50–60 % dr ėgmė. Apšvietimas turi b ūti dirbtinis, jo 
seka: 12 h šviesos ir 12 h tamsos. Gyv ūnams šerti tinka įprastas 
laboratorijoje naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens 
kiekio. Pašaro pasirinkimui gali tur ėti įtakos būtinybė tinkamai įmai­ 
šyti bandom ąją medžiag ą, duodant j ą šiuo būdu. 
Gyvūnai gali b ūti laikomi narveliuose atskirai arba mažomis tos 
pačios lyties gyv ūnų grupėmis. Poruojama turi b ūti šiam tikslui 
pritaikytuose narveliuose. Pasitvirtinus susiporavimui, suporuotos patelės turi būti laikomos po vien ą atsivedimo arba veisimo narve ­
liuose. Suporuotos žiurk ės taip pat gali b ūti laikomos mažomis 
grupėmis ir atskiriamos likus vienai arba dviem paroms iki atsive ­
dimo. Art ėjant atsivedimui, suporuotos patel ės turi būti aprūpinamos 
tinkamomis ir nustatytomis g ūžtos sukimo medžiagomis.
 
1.3.3.  Gyv ūnų ruošimas  
Naudojami jauni ir sveiki, ankstesniuose bandymuose nedalyvav ę 
gyvūnai, kurie mažiausiai 5 paras yra pratinami prie laboratorijos 
sąlygų. Apibūdinama bandomojo gyv ūno rūšis, veisl ė, šaltinis, 
lytis, mas ė ir (arba) amžius. Turi b ūti žinoma vis ų gyvūnų tarpusavio 
giminystė, kad b ūtų išvengta vien ų tėvų gyvūnų poravimosi. 
Gyvūnai atsitiktinai suskirstomi į kontrolin ę ir bandymo grup ę (reko­
menduojama grupuoti pagal k ūno masę). Narveliai išd ėstomi taip, 
kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks galimas poveikis d ėl 
narvelio buvimo vietos. Kiekvienam gyv ūnui turėtų būti priskirtas 
savitas identifikavimo numeris. P kartos gyv ūnams tai daroma 
prieš pradedant duoti bandom ąją medžiag ą. F1 kartos gyv ūnams tai 
daroma atjunkant poravimui pasirinktus gyv ūnus. Duomenys apie 
visų pasirinkt ų F1 gyvūnų kilmės vadą turi būti registruojami. Be 
to, rekomenduojama kiek manoma anks čiau atskirai identifikuoti 
žiurkiukus, kai numatoma atskirai juos sverti arba daryti kokius nors funkcinius bandymus.
 
Pradėjus duoti dozes t ėvų kartos (P) gyv ūnams jie turi b ūti maždaug 
5–9 savai čių. Visų bandom ųjų grupių gyvūnai turi b ūti kiek 
įmanoma vienodos mas ės ir amžiaus.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4. BANDYMO EIGA  
1.4.1.  Gyv ūnų skaičius ir lytis  
Kiekvienoje bandymo ir kontrolin ėje grupėje turi būti pakankamas 
patelių skaičius, kad atsivedimo momentu arba jam art ėjant būtų ne 
mažiau kaip 20 vaiking ų patelių. Tai gali b ūti neįmanoma bandant 
medžiagas, sukelian čias nepageidaujam ą su bandom ąja medžiaga 
siejamą poveikį (pvz., nevaisingum ą, per didel į toksiškum ą esant 
didelei dozei). Tikslas – gauti pakankam ą atsivedan čių patelių 
skaičių, kad būtų galima prasmingai įvertinti, kokia yra bandomosios 
medžiagos geba paveikti vaisingum ą, gestaciją, motinos elges į, lakta­
ciją, F1 palikuonio augim ą ir vystym ąsi nuo apvaisinimo iki subren ­
dimo ir jo palikuoni ų (F2) vystym ąsi iki atjunkymo. Tod ėl nepa­
vykus gauti norim ą vaikingų patelių skaičių (t. y. 20), bandymas 
nebūtinai bus netinkamas ir turi b ūti vertinamas atsižvelgiant į kiek­
vieną atskirą atvejį. 
1.4.2.  Dozi ų ruošimas  
Rekomenduojama bandom ąją medžiagą duoti per virškinam ąjį traktą 
(su pašaru, geriamuoju vandeniu arba per zond ą), išskyrus kai 
manoma, kad tinkamesnis b ūtų kitas davimo b ūdas (pvz., per od ą 
arba per kv ėpavimo takus).  
Prireikus bandomoji medžiaga ištirpinama arba suspenduojama tinka ­
mame nešiklyje. Rekomenduojama visais įmanomais atvejais iš 
pradžių tirti galimyb ę naudoti vandenin į tirpalą ar suspensij ą, vėliau 
tirpalą ar emulsij ą aliejuje (pvz., kukur ūzų aliejuje) ir tik tuomet 
galimybę tirpinti kitame nešiklyje. Turi b ūti žinomos nešiklio, 
išskyrus vanden į, toksinės savybės. Turėtų būti nustatytas bandomo ­
sios medžiagos stabilumas nešiklyje.  
1.4.3.  Dozavimas  
Turi būti naudojamos mažiausiai trij ų dozių grupės ir lygiagre čiai 
viena kontrolin ė grupė. Jei nėra apribojim ų dėl fizikinių ir chemini ų 
arba biologini ų bandomosios medžiagos savybi ų, didžiausia doz ė 
pasirenkama siekiant sukelti tam tikr ą toksinį poveikį, bet ne ž ūtį 
arba sunkias kan čias. Nenumatyto gaištamumo atveju bandymai, 
kuriuose t ėvų kartos (P) gyv ūnų gaištamumas yra mažesnis kaip 
maždaug 10 %, paprastai yra dar priimtini. Turi b ūti pasirinkta maž ė­
janti dozės koncentracijos seka, siekiant gauti kiekvien ą su dozės 
dydžiu susiet ą reakcij ą ir nepasteb ėto neigiamo poveikio 
ribą (NOAEL). Maž ėjančioms dozės koncentracijos vert ėms nustatyti 
dažnai pakanka dvigubo arba keturgubo koncentracijos skirtumo ir 
dažnai geriau b ūtų papildomai naudoti ketvirt ą bandymo grup ę, 
užuot naudojus labai didelius intervalus tarp dozi ų (pvz., daugiklis 
didesnis kaip 10). Bandom ąją medžiagą dedant į pašarus doz ės netu­
rėtų skirtis daugiau kaip 3 kartus. Doz ės dydis tur ėtų būti pasiren ­
kamas atsižvelgiant į visus turimus toksiškumo duomenis, ypa č 
kartotinių dozių bandymo rezultatus. Be to, reik ėtų nagrinėti visą 
papildom ą informacij ą apie bandomojo junginio arba gimining ų 
medžiagų apykaitą ir kinetik ą. Kartu ši informacija pad ėtų sužinoti, 
ar dozavimo režimo yra tinkamas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Kontrolin ė grupė turėtų būti medžiagos negaunanti grup ė arba nešikl į 
gaunanti kontrolin ė grupė, jei bandomajai medžiagai duoti naudo ­
jamas nešiklis. Išskyrus tai, kad kontrolin ės grupės gyvūnai nevei ­
kiami bandom ąja medžiaga, jie priži ūrimi tokiu pat b ūdu, kaip ir 
bandymo grup ės gyvūnai. Jei naudojamas nešiklis, kontrolin ės 
grupės turėtų gauti nešiklio kiek į, atitinkanti didžiausi ą naudojam ą 
nešiklio t ūrį. Jei bandomoji medžiaga duodama su pašaru ir d ėl to 
sumažėja pašaro suvartojimas arba įsisavinimas, gali tekti naudoti 
lygiagrečiai šeriam ą kontrolin ę grupę. Vietoj lygiagre čiai šeriamos 
kontrolinės grupės galima naudoti duomenis, gautus kontroliuoja ­
muose bandymuose, skirtuose įvertinti sumaž ėjusio pašaro suvarto ­
jimo įtaką dauginimosi parametrams.  
Reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio ir kit ų priedų savybes: poveik į 
absorbcijai, pasiskirstymui, medžiag ų apykaitai ir bandomosios 
medžiagos sulaikymui; poveik į bandomosios medžiagos chemin ėms 
savybėms, dėl kurių gali pasikeisti jos toksiškumas; poveik į maisto 
ar vandens suvartojimui arba gyv ūnų įmitimui.  
1.4.4.  Ribinis bandymas  
Jei darant bandym ą pagal šiame bandyme aprašytas metodikas su 
viena mažiausiai 1 000 mg/kg k ūno masės per par ą doze, kuri yra 
duodama per virškinam ąjį traktą, arba su atitinkamos procentin ės 
dalies doze, dedama į pašarą arba į geriamą vandenį, toksinis 
poveikis t ėvų grupių gyvūnams arba j ų palikuonims nepastebimas 
ir jei toks poveikis nenumatomas atsižvelgiant į turimus duomenis 
apie giminingos strukt ūros ir (arba) apykaitos junginius, neb ūtina 
daryti vis ą bandym ą, naudojant kelias dozi ų koncentracijas. Toks 
ribinis bandymas netaikomas tais atvejais, kai atsižvelgiant į žmonių 
sąlytį su medžiaga reikia naudoti didesnio dydžio per virškinam ąjį 
traktą duodamas dozes. Kalbant apie kitus davimo b ūdus, pvz., per 
kvėpavimo takus arba per od ą, bandomosios medžiagos fizikin ės ir 
cheminės savybės dažnai gali lemti ir riboti didžiausi ą pasiekiam ą 
veikimo lyg į. 
1.4.5.  Dozi ų davimas  
Gyvūnai gauna bandomosios medžiagos doz ę septynias dienas per 
savaitę. Geriau duoti per virškinam ąjį traktą (su pašaru, geriamuoju 
vandeniu arba naudojant zond ą). Jei duodama kitu b ūdu, jis turi b ūti 
pagrįstas, be to, gali tekti daryti atitinkamus pakeitimus. Atitinkamu 
bandymo laikotarpiu visi gyv ūnai turi gauti doz ę vienodu b ūdu. Kai 
bandomoji medžiaga duodama per zond ą, reikia naudoti skrandžio 
vamzdelį. Vienu metu duodamo skys čio tūris neturi b ūti didesnis 
kaip 1 ml/100 g k ūno masės (0,4 ml/100 g k ūno masės yra didžiau ­
sias kiekis naudojant kukur ūzų aliejų), išskyrus vandeninius tirpalus, 
kurių galima duoti po 2 ml/100 g k ūno masės. Išskyrus dirginan čias 
arba ėsdinančias medžiagas, kurios esant didesnei koncentracijai turi 
sunkesnį poveikį, bandomojo tirpalo t ūrio nepastovumas turi b ūti 
kiek įmanoma sumažintas, kei čiant koncentracij ą taip, kad vis ų 
dozių tūris būtų pastovus. Darant bandymus su zondu, jaunikliai 
dažniausiai gauna bandomosios medžiagos netiesiogiai su pienu tol, kol atjunkyti patys pradeda gauti dozes. Jei bandymai daromi medžiagą dedant į pašarą arba geriam ąjį vandenį, jaunikliai papil ­
domai gauna bandomosios medžiagos tiesiogiai, kai paskutin ę lakta­
cijos laikotarpio savait ę jie pradeda ėsti patys.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
Jei medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, 
svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai 
netrukdyt ų įprastai mitybai arba vandens pusiausvyrai. Kai bando ­
moji medžiaga duodama su pašaru, galima naudoti nuolatin ę 
koncentracij ą (ppm) arba nuolatin ę dozę pagal gyv ūno kūno masę; 
naudotas variantas turi b ūti nurodytas. Jei medžiaga duodama per 
zondą, dozė turėtų būti duodama kiekvien ą dieną panašiu laiku ir 
reguliuojama mažiausiai kart ą per savait ę, kad būtų užtikrintas 
stabilus doz ės ir gyvūno kūno masės santykis. Reik ėtų atsižvelgti į 
informacij ą dėl placentinio pasiskirstymo, reguliuojant per zond ą 
duodamą dozę, nustatom ą pagal gyv ūno masę. 
1.4.6.  Eksperimento tvarkaraštis  
Kasdienin ės dozės tėvų kartos (P) patinams ir patel ėms pradedamos 
duoti, kai jie sulaukia 5–9 savai čių. Kasdienin ės F1 patin ų ir patelių 
dozės pradedamos duoti po atjunkymo; reik ėtų turėti omenyje, kad 
tais atvejais, kai bandomoji medžiaga duodama su pašaru arba geria ­
muoju vandeniu, tiesioginis F1 kartos jaunikli ų veikimas bandom ąja 
medžiaga gali vykti laktacijos laikotarpiu. Abiem lytims (P ir F1) dozės turi būti toliau duodamos mažiausiai 10 savai čių prieš poravi ­
mosi laikotarp į. Dozės toliau duodamos abiem lytims 2 savaites 
poravimosi laikotarpiu. Kai patinai nebereikalingi medžiagos poveikio dauginimuisi įvertinimo aspektu, jie turi b ūti humaniškai 
numarinami ir ištiriami. T ėvų kartos (P) patel ėms dozės duodamos 
toliau vis ą gestacijos laik ą ir iki F1 palikuoni ų atjunkymo. Reik ėtų 
atsižvelgti į dozavimo programos pakeitimus, pagr įstus turima infor ­
macija apie bandom ąją medžiag ą, įskaitant turimus toksiškumo, 
medžiagų apykaitos indukcijos arba biologinio kaupimosi duomenis. 
Kiekvieno gyv ūno dozė
 paprastai tur ėtų būti pagrįsta pačiu pasku­
tiniu atskiro gyv ūno masės nustatymu. Ta čiau reikia imtis atsargumo 
priemonių reguliuojant doz ės dydį paskutin į gestacijos trimestr ą. 
P ir F1 kart ų patinų ir pateli ų veikimas medžiaga t ęsiamas iki j ų 
numarinimo. Visi P ir F1 suaug ę patinai ir patel ės turi būti huma­
niškai numarinami, kai j ų nebereikia poveikiui dauginimuisi įvertinti. 
Visi poravimui nepasirinkti F1 palikuonys ir visi F2 palikuonys po atjunkymo turi b ūti humaniškai numarinami.
 
1.4.7.  Poravimo eiga  
1.4.7.1.  Tėvų kartos (P) poravimas  
Kiekvienam suporavimui patel ė atskirai uždaroma į narvelį su vienu 
tą pačią dozę gaunančiu patinu (1:1 poravimas) tol, kol jie susipo ­
ruoja, arba 2 savait ėms. Kiekvien ą dieną patelės apžiūrimos, ar yra 
spermos arba ar susidar ė makšties kamštis. 0 gestacijos diena 
laikoma ta diena, kai randama spermos arba makšties kamštis. Jei poravimasis nes ėkmingas, galima apsvarstyti galimyb ę pakartotinai 
suporuoti patel ę su patikrintais tos pa čios grupės reproduktoriais. 
Susiporav ę gyvūnai aiškiai nurodomi bandymo duomenyse. Reik ėtų 
vengti vien ų tėvų palikuoni ų poravimo.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2.  F 1 kartos poravimas  
Norint poruoti F1 kartos palikuonis F2 kartai gauti, atjunkymo metu 
iš kiekvienos vados pasirenkamas mažiausiai vienas patinas ir viena patelė poravimui su kitais t ą pačią dozę gavusiais kitos vados jaunik ­
liais. Kiekvienos vados jaunikli ų pasirinkimas turi b ūti atsitiktinis, jei 
vienoje vadoje n ėra reikšming ų kūno masės arba išvaizdos skirtum ų. 
Tais atvejais, kai skirtum ų yra, pasirenkami geriausi kiekvienos 
vados atstovai. Praktiškai tai geriausiai b ūtų daryti pagal k ūno 
masę, bet gali labiau tikti atranka pagal išvaizd ą. F1 palikuonys 
poruojami tik pasiek ę lytinę brandą.
 
Turėtų būti įvertintos poros be palikuoni ų, siekiant nustatyti aiški ą 
nevaisingumo priežast į. Galima imtis papildomo poravimo su kitais 
patikrintais patinais arba patel ėmis, atlikti dauginimosi organ ų mikro­
skopinį tyrimą ir rujos cikl ų arba spermatogenez ės tyrimą. 
1.4.7.3.  Antrasis poravimas  
Tam tikrais atvejais, pvz., kai d ėl veikimo medžiaga pakinta vados 
dydis arba pastebimas neaiškus poveikis per pirm ąjį poravimą, reko­
menduojama P arba F1 kart ų suaugusius gyv ūnus dar kart ą poruoti 
naujai vadai gauti. Rekomenduojama dar kart ą poruoti vados netu ­
rėjusias pateles arba patinus su patikrintais priešingos lyties repro ­
duktoriais. Jei laikoma, kad yra b ūtina bet kurios kartos antroji vada, 
gyvūnai turėtų būti poruojami pra ėjus savaitei nuo paskutin ės vados 
atjunkymo.  
1.4.7.4.  Vados dydis  
Gyvūnams leidžiama normaliai atsivesti vad ą ir auginti palikuonis iki 
atjunkymo. Standartizuoti vados dyd į neprivaloma. Standartizavus 
vados dyd į, išsamiai aprašomas taikytas metodas.  
1.5. STEB ĖJIMAI  
1.5.1.  Klinikiniai steb ėjimai  
Bendrasis klinikinis steb ėjimas atliekamas kas dien ą, ir jei medžiaga 
duodama per zond ą, stebėjimo laiką reikėtų nustatyti atsižvelgiant į 
didžiausio laukiamo poveikio po medžiagos davimo laik ą. Turi būti 
užrašomi visi elgesio poky čiai, sunkaus arba ilgesnio atsivedimo 
požymiai ir visi toksiškumo požymiai. Mažiausiai kas savait ę turėtų 
būti atliekamas papildomas išsamesnis kiekvieno gyv ūno tyrimas, 
kurį patogu daryti gyv ūną sveriant. Du kartus per dien ą ir prireikus 
kartą per dien ą savaitgaliais visi gyv ūnai turi b ūti stebimi siekiant 
nustatyti liguistumo požymius ir nugaišusius gyv ūnus. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2.  Tėvų kartos gyv ūnų kūno masė ir pašaro ar vandens suvarto ­
jimas  
Tėvų kartų (P ir F1) gyv ūnai sveriami pirm ąją dozės davimo dien ą ir 
vėliau mažiausiai kart ą per savait ę. Tėvų kartos (P ir F1) patel ės 
sveriamos ne mažiau kaip 0, 7, 14, ir 20 arba 21 gestacijos dien ą, 
laktacijos metu sveriamos tomis pa čiomis dienomis, kaip ir vada, ir 
gyvūnų numarinimo dien ą. Šie rezultatai turi b ūti pateikiami atskirai 
apie kiekvien ą suaugusį gyvūną. Poravimo ir gestacijos laikotarpiu 
pašaro suvartojimas turi b ūti matuojamas mažiausiai kas savait ę. 
Vandens suvartojimas matuojamas mažiausiai kas savait ę, jei bando ­
moji medžiaga duodama su vandeniu.  
1.5.3.  Rujos ciklas  
P ir F1 kart ų patelių rujos ciklo trukm ė ir normalumas įvertinamas 
prieš suporavim ą ir, nebūtinai, poravimo metu darant makšties tepi ­
nėlius tol, kol bus gautas suporavimo įrodymas. Makšties ar gimdos 
kaklelio l ąstelės turi būti imamos atsargiai, kad neb ūtų pažeista glei ­
vinė ir tokiu b ūdu nebūtų sukeltas netikras veisimas (1).  
1.5.4.  Spermos parametrai  
Numarinus P ir F1 patinus užrašoma j ų sėklidžių ir antsėklidžių masė 
ir bent vienas kiekvieno organo pavyzdys paliekamas histopatologi ­
niam tyrimui (žr. 1.5.7, 1.5.8.1 skirsnius). Iš kiekvienos P ir F1 
patinų grupės bent 10 gyv ūnų pogrupio s ėklidės ir ants ėklidžiai 
naudojami homogenizavimui atsparioms spermatid ėms ir ants ėklidžių 
uodegoje sukauptiems spermatozoidams suskai čiuoti. Turi b ūti 
surinkta to paties pogrupio patin ų sperma iš ants ėklidžių uodegos 
arba iš s ėklinio latako spermos judrumui ir morfologijai įvertinti. 
Jei pastebimas su bandom ąja medžiaga susij ęs poveikis arba jei 
yra per kitus bandymus gaut ų duomenų apie galim ą poveikį sperma­
togenezei, tur ėtų būti tiriama vis ų kiekvienos doz ės grupės patinų 
sperma; priešingu atveju galima apsiriboti kontrolin ės grupės ir 
didžiausios doz ės grupės P ir F1 patin ų spermatozoid ų skaičiavimu.  
Skaičiuojamas bendras homogenizavimui atspari ų sėklidžių sperma­
tidžių ir ants ėklidžių uodegos spermatozoid ų skaičius (2) (3). 
Spermos atsargas uodegoje galima apskai čiuoti pagal suspensijos, 
naudojamos kokybiniam įvertinimui, spermatozoid ų koncentracij ą ir 
tūrį, ir spermatozoid ų, išgautų vėliau sumalant ir (arba) homogeni ­
zuojant likus į uodegos audin į, skaičių. Visų dozių patinų grupių 
pasirinktų pogrupių gyvūnų spermatozoidai skai čiuojami iškart po 
gyvūnų numarinimo, išskyrus kai filmuojama analoginiu arba skait ­
meniniu b ūdu arba kai bandiniai yra užšaldomi ir analizuojami 
vėliau. Šiais atvejais kontrolin ės ir didel ės dozės grupės gali būti 
analizuojamos pirmos. Jei su bandom ąja medžiaga susijusio poveikio 
(pvz., poveikio spermatozoid ų skaičiui, judrumui arba morfologijai) 
nėra, kitų grupių analizuoti neb ūtina. Jei didel ę dozę gavusioje 
grupėje pastebimas su bandom ąja medžiaga susij ęs poveikis, reikia 
įvertinti ir mažesni ų dozių grupes.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Antsėklidžio (arba s ėklinio latako) spermatozoid ų judrumas įverti­
nimas arba filmuojamas iš karto po numarinimo. Sperma turi b ūti 
išgauta, kiek įmanoma mažinant galimyb ę jai pakenkti ir skiedžiama 
judrumui analizuoti, taikant tinkamus metodus (4). Subjektyviai arba objektyviai įvertinama vis labiau judresni ų spermatozoid ų procentin ė 
dalis. Kai daroma kompiuterin ė judėjimo analiz ė (5) (6) (7) (8) (9) 
(10), did ėjantis judrumas nustatomas pagal vartotojo nustatytas 
ribines vertes vidutiniam grei čiui išilgai trajektorijos ir tiesiškumui 
arba tiesiškumo indeksui. Jei ėminiai filmuojami (11) arba nekrosko ­
pija įrašinėjama kitu b ūdu, vėliau galima analizuoti tik kontrolin ę ir 
didelę dozę gavusių P ir F1 patin ų grupes, išskyrus kai pastebimas su 
bandomąja medžiaga susij ęs poveikis; šiuo atveju dar reikia įvertinti 
mažesnių dozių grupes. Neturint analoginio arba skaitmeninio vaizdo 
įrašo, visi vis ų apdorotų grupių ėminiai analizuojami darant skro ­
dimą.
 
Daromas ants ėklidžio (arba s ėklinio latako) spermos ėminio morfo ­
loginis įvertinimas. Spermatozoidai (bent 200 vienam ėminiui) išti ­
riami kaip fiksuoti preparatai bei skystoje terp ėje (12) ir klasifikuo ­
jami kaip normal ūs arba nenormal ūs. Morfologin ės spermatozoid ų 
anomalijos b ūtų spermatozoid ų sulipimas, izoliuotos galvut ės ir 
deformuotos galvut ės ir (arba) uodeg ėlės. Daromas vis ų dozių grupių 
pasirinktų pogrupių patinų įvertinimas iš karto po gyv ūnų numari­
nimo arba v ėliau pagal analoginius arba skaitmeninius vaizdo įrašus. 
Fiksuotus tepin ėlius galima analizuoti ir v ėliau. Šiais atvejais kontro ­
linių ir didžiausios doz ės grupės gali būti analizuojamos pirmos. Jei 
su bandom ąja medžiaga susijusio poveikio (pvz., poveikio sperma ­
tozoidų morfologijai) n ėra, kitų grupių analizuoti neb ūtina. Jei didel ę 
dozę gavusioje grup ėje pastebimas su bandom ąja medžiaga susij ęs 
poveikis, reikia įvertinti ir mažesni ų dozių grupes.  
Jei kuris nors iš pirmiau išvardyt ų spermos įvertinimo parametr ų jau 
buvo tiriamas darant bent 90 par ų toksiškumo sistemai bandym ą, šio 
įvertinimo neb ūtina kartoti darant dviej ų kartų bandym ą. Tačiau 
rekomenduojama pasilikti P kartos spermos ėminius arba skaitmeni ­
nius vaizdo įrašus, kad prireikus b ūtų galima įvertinti v ėliau. 
1.5.5.  Palikuonys  
Kiekviena vada tiriama kiek įmanoma grei čiau po atsivedimo (0 
laktacijos para) norint nustatyti jaunikli ų skaičių ir lytį, negyvagi ­
mius, gyvus palikuonis ir tai, ar yra stambi ų anomalij ų. Nulinę 
parą rasti negyvi žiurkiukai, jei jie nemaceruoti, tiriami galimiems 
defektams ir ž ūties priežas čiai nustatyti, v ėliau užkonservuojami. 
Gyvi žiurkiukai suskai čiuojami ir atskirai pasveriami atsivedimo 
metu (0 laktacijos para) arba pirm ą parą, o vėliau – reguliariai, 
pvz., 4, 7, 14, ir 21 laktacijos par ą. Užrašomos pasteb ėtos pateli ų 
arba palikuoni ų fizinės ir elgesio anomalijos.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Palikuoni ų fizinis vystymasis daugiausia registruojamas pagal k ūno 
masės padidėjimą. Kiti fiziniai parametrai (pvz., aus ų ir akių atsivė­
rimas, dant ų prasikalimas, kailio augimas) gali suteikti papildomos 
informacijos, ta čiau šiuos duomenis b ūtų geriau vertinti atsižvelgiant 
į lytinio brendimo duomenis (pvz., amžius ir k ūno masė makšties 
atsidarymo arba apyvarp ės atsiskyrimo metu) (13). Rekomenduojama 
daryti F1 palikuoni ų funkcinius tyrimus (pvz., motorinio aktyvumo, 
sensorinės funkcijos, refleks ų ontogenez ės) prieš ir po atjunkimo, 
visų pirma, susietus su lytiniu brendimu, jei tokia analiz ė neįtraukta 
į atskirus tyrimus. Nustatomas poravimui pasirinkt ų F1 atjunkyt ų 
gyvūnų makšties atsidarymo ir apyvarp ės atsiskyrimo laikas. Išma ­
tuojamas F2 žiurkiuk ų anogenitalinis atstumas nulin ę parą po 
gimimo, jei buvo nustatytas F1 ly čių santykio arba lytinio subren ­
dimo laiko pakitimas.  
Funkcinių stebėjimų galima nedaryti tose grup ėse, kuriose yra aiški ų 
neigiamo poveikio požymi ų (pvz., reikšmingas mas ės didėjimo 
sumažėjimas ir t. t.). Jei daromi funkciniai tyrimai, jie nedaromi 
poravimui atrinktiems žiurkiukams.  
1.5.6.  Bendroji nekroskopija  
Numarinti arba darant bandym ą nugaišę visi tėvų kartos (P ir F1) 
gyvūnai, visi jaunikliai su išorin ėmis anomalijomis arba klinikiniais 
požymiais, be to, atsitiktinai pasirinktas iš kiekvienos F1 ir F2 kartos 
kiekvienos vados kiekvienos lyties jauniklis tiriami makroskopiškai struktūros anomalijoms arba patologiniams pakitimams nustatyti. 
Ypatingas d ėmesys kreipiamas į dauginimosi sistemos organus. 
Humaniškai numarinti leisgyviai jaunikliai ir negyvi jaunikliai, jei 
nemaceruoti, tiriami galimiems defektams ir ž ūties priežas čiai nusta­
tyti, vėliau užkonservuojami.
 
Tiriama vis ų pirmą kartą atsivedusi ų patelių gimda implantavimo 
vietų buvimui ir skai čiui nustatyti, stengiantis nepakenkti histopato ­
loginiam įvertinimui.  
1.5.7.  Organ ų masė 
Numarinus nustatoma vis ų P ir F1 kart ų tėvų kūno ir šių organų 
masė (poriniai organai sveriami atskirai):  
— gimdos, kiaušidži ų, 
— sėklidės, antsėklidžio (viso ir uodegos),  
— prostatos,  
— sėklinių pūslelių su koaguliatori ų liaukomis ir j ų skysčiais ir 
prostatos (kaip vieno vieneto),  
— smegen ų, kepenų, inkstų, blužnies, hipofiz ės, skydliauk ės, anti­
nksčių liaukų ir žinom ų veikiamų organų. 
Po numarinimo nustatoma skrodimui pasirinkt ų F1 ir F2 jaunikli ų 
masė. Sveriami šie vieno atsitiktinai pasirinkto kiekvienos vados 
kiekvienos lyties jauniklio (žr. 1.5.6 skirsn į) organai: smegenys, 
blužnis ir užkr ūčio liauka.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Bendrojo nekroskopijos ir organ ų masės rezultatai įvertinami atsiž ­
velgiant į stebėjimus kit ų kartotin ės dozės bandym ų metu, jei 
įmanoma.  
1.5.8.  Histopatologiniai tyrimai  
1.5.8.1.  Tėvai 
Histopatologiniam tyrimui fiksuojami ir atitinkamoje terp ėje konser ­
vuojami šie t ėvų (P ir F1) kartos gyv ūnų organai ir audiniai arba j ų 
tipiniai ėminiai:  
— makštis, gimda ir kaklelis, kiaušid ės (konservuojamos atitinka ­
moje fiksavimo priemon ėje), 
— viena s ėklidė (konservuojama Bouin arba panašioje fiksavimo 
priemonėje), vienas ants ėklidis, sėklinės pūslelės, prostata ir 
koagulianto liaukos,  
— visų poravimui pasirinkt ų P ir F1 gyv ūnų organas (-ai), ankstes ­
niuose bandymuose identifikuotas (-i) kaip veikiamas (-i) 
organai.  
Daromi išsam ūs histopatologiniai vis ų poravimui pasirinkt ų P ir F1 
gyvūnų, priklausan čių kontrolin ėms ir didel ės dozės grupėms, užkon ­
servuotų organų ir audini ų tyrimai. P kartos gyv ūnų kiaušidži ų 
tyrimas neprivalomas. Dar tiriami mažos bei vidutin ės dozės grupių 
organai, kuriems pasireiškia su bandom ąja medžiaga siejami paki ­
timai, kad b ūtų lengviau nustatyti NOAEL. Be to, daromas histopa ­
tologinis mažos ir vidutin ės dozės grupių gyvūnų, kuriems įtariamas 
sumažėjęs vaisingumas, pvz., kurie negal ėjo susiporuoti, pastoti, b ūti 
reproduktoriumi arba atsivesti sveikus palikuonis, arba kuri ų rujos 
ciklas arba spermatozoid ų skaičius, judrumas arba morfologija buvo 
paveikti, dauginimosi organ ų įvertinimas. Turi b ūti ištirti visi dideli 
pažeidimai, pvz., atrofija arba augliai.  
Daromas išsamus s ėklidžių histopatologinius tyrimas (pvz., naudo ­
jant Bouin fiksavimo skyst į, į parafiną įlietus ėminius ir 4–5 μm 
storio skersinius pj ūvius), siekiant nustatyti su bandom ąja medžiaga 
susietą poveikį, pvz., spermatidži ų sulaikym ą, gemalų ląstelių 
sluoksnių arba tipų trūkumą, daugiabranduoles dideles l ąsteles arba 
spermatogenini ų ląstelių atitrūkimą į prošvais ą (14). Nepažeisto 
antsėklidžio tyrimas, tiriant galvut ę, kūną ir uodeg ą, gali būti 
daromas įvertinant išilgin į pjūvį. Antsėklidis įvertinamas leukocit ų 
infiltracijai, l ąstelių vyraujan čių tipų pokyčiui, netipiškoms l ąstelėms 
ir spermatozoid ų fagocitozei nustatyti. Patin ų dauginimosi organ ų 
tyrimui gali b ūti naudojamas dažymas PAS (jodo perr ūgšties ir 
Šifo reagentu) arba hematoksilinu.  
Po laktacijos kiaušid ėje turi būti pirminiai ir augantys folikulai ir 
dideli laktacijos geltonk ūniai. Darant histopatologin į tyrimą turėtų 
būti nustatytas kokybinis pirmini ų folikulių populiacijos sumaž ė­
jimas. F1 patel ėms daromas kiekybinis pirmini ų folikulų įvertinimas; 
gyvūnų skaičius, kiaušid ės skerspjūvio pasirinkimas ir pj ūvių ėminių 
dydis turi statistiškai atitikti taikom ą įvertinimo metodik ą. Tyrimą 
sudaro pirmini ų folikulų, kurie gali b ūti sujungti su mažais augan ­ 
čiais folikulais, skai čiaus nustatymas, siekiant palyginti paveiktas ir 
kontrolines kiaušides (15) (16) (17) (18) (19).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2.  Atjunkyti jaunikliai  
Histopatologiniam tyrimui fiksuojami ir tinkamoje terp ėje laikomi 
visų jauniklių audiniai, kuriuose pastebima dideli ų anomalij ų, ir 
paveikti organai, be to, fiksuojami ir laikomi histopatologiniam 
tyrimui po vien ą atsitiktinai pasirinkt ą F1 ir F2 kart ų kiekvienos 
vados kiekvienos lyties jaunikl į, kuris nepasirinktas poravimui. 
Daromas išsamus histopatologinis konservuoto audinio apib ūdi­
nimas, ypating ą dėmesį kreipiant dauginimosi sistemai.  
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Duomenys pateikiami atskirai ir apibendrinami lentel ėse, kuriose 
nurodomas kiekvienos bandymo grup ės ir kiekvienos kartos gyv ūnų 
skaičius bandymo pradžioje, darant bandym ą nugaišusi ų arba dėl 
gyvūnų gerovės priežasčių numarint ų gyvūnų skaičius, visų gyvūnų 
nugaišimo arba numarinimo laikas, vaising ų gyvūnų skaičius, 
vaikingų patelių skaičius, toksiškumo požymi ų turinčių gyvūnų skai­ 
čius, pasteb ėtų toksiškumo požymi ų aprašymas, įskaitant jų pradžios 
laiką, trukmę ir bet kokio toksinio poveikio sunkum ą, pastebėtų 
klinikinių požymių tėvams ir palikuonims tipai, histopatologini ų 
pakitimų tipai ir atitinkami vados duomenys.  
Skaitmeniniai rezultatai turi b ūti įvertinti taikant atitinkam ą visuo­
tinai priimt ą statistinį metodą; statistiniai metodai pasirenkami kaip 
bandymo schemos dalis ir turi b ūti pagrįsti. Duomenims analizuoti 
gali padėti dozės ar reakcijos statistiniai modeliai. Ataskaitoje turi 
būti pakankamas kiekis informacijos apie analiz ės metodą ir taikytą 
kompiuterio program ą, kad nepriklausomas ekspertas ar statistikos 
specialistas gal ėtų iš naujo įvertinti bei atkurti analiz ės eigą. 
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS  
Šio toksiškumo dviej ų kartų dauginimuisi bandymo duomenys įver­
tinami atsižvelgiant į pastebim ą poveikį, įskaitant nekroskopij ą ir 
mikroskopinio tyrimo rezultatus. Įvertinamas ryšis tarp bandomosios 
medžiagos ir anomalij ų buvimo, nebuvimo, dažnumo ir sunkumo, 
įskaitant makroskopinius pakitimus, nustatytus paveiktus organus, 
paveiktą vaisingum ą klinikines anomalijas, paveikt ą reprodukavimo 
gebą ir vados charakteristikas, k ūno masės pokyčius, poveik į gaišta­
mumui ir bet kok į kitą toksinį poveikį arba tokio ryšio nebuvimas. 
Įvertinant rezultatus reikia atsižvelgti į bandomosios medžiagos fizi ­
kines ir chemines savybes ir toksikokinetinius duomenis, jei j ų yra.  
Tinkamai darant toksiškumo dauginimuisi bandym ą turi būti gautas 
patenkinamas poveikio nesukelian čios dozės įvertis ir neigiamo 
poveikio dauginimuisi, atsivedimui, laktacijai, postnataliniam vysty ­
muisi, įskaitant augim ą ir lytinį brendimą supratimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Toksiškumo dviej ų kartų dauginimuisi bandymas suteiks informa ­
cijos apie kartotinio medžiagos naudojimo poveik į visais daugini ­
mosi ciklo tarpsniais. Pirmiausia bandymas suteikia informacijos 
apie dauginimosi parametrus ir palikuoni ų vystymąsi, augim ą, bren­
dimą ir išlikim ą. Bandymo rezultatai tur ėtų būti aiškinami atsižvel ­
giant į pusiau l ėtinio toksiškumo, toksiškumo prenataliniam vysty ­
muisi ir į toksikokinetini ų bei kitų atliktų bandymų rezultatus. Šio 
bandymo rezultatai gali b ūti naudojami įvertinant papildom ų 
cheminės medžiagos bandym ų būtinumą. Bandymo rezultat ų ekstra­
poliavimas žmon ėms gali tikti tik tam tikru mastu. Jie labiausiai 
tinka, kai reikia gauti informacijos apie poveikio nesukelian čias 
dozes ir leistin ą žmonių sąlytį su medžiaga (20) (21) (22) (23).  
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskait ą turi sudaryti ši informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— fizinė būsena ir, jei reikia, fizikin ės ir chemin ės savybės, 
— tapatumo duomenys,  
— grynumas.  
Nešiklis (jei naudojamas):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir veisl ė, 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras, kraiko medžiagos ir t. t.,  
— atskirai kiekvieno gyv ūno masė bandymo pradžioje.  
Bandymo s ąlygos:  
— dozės koncentracijos pasirinkimo pagrindimas,  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparato 
ruošimą arba jos d ėjimą į pašarą, gautos koncentracijos vert ės, 
— preparato stabilumas ir vienalytiškumas,  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos davim ą, 
— bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame 
vandenyje (ppm) perskai čiavimas į tikrąją dozę (mg/kg k ūno 
masės per parą), jei tinka,  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Rezultatai:  
— pašaro suvartojimas ir, jei matuojamas, vandens suvartojimas, 
pašaro efektyvumas (k ūno masės padidėjimas vienam suvartoto 
pašaro gramui), P ir F1 gyv ūnų atveju nurodomas suvartotos 
bandomosios medžiagos kiekis, išskyrus bendrojo buvimo laiko ­
tarpį ir mažiausiai paskutin į laktacijos laikotarpio tre čdalį, 
— absorbcijos duomenys (jei yra),  
— P ir F1 gyv ūnų, pasirinkt ų poravimui, k ūno masės duomenys,  
— vados ir jaunikli ų masės duomenys,  
— tėvų kartų kūno masė numarinant ir absoliu čios bei santykin ės 
organų masės duomenys,  
— klinikini ų požymių tipas, sunkumas ir trukm ė (grįžtami ar negr įž­
tami),  
— nugaišimo darant bandym ą laikas arba informacija, kad gyv ūnai 
išgyveno iki numarinimo,  
— duomenys apie toksin į atsaką pagal lyt į ir dozę, įskaitant pora ­
vimosi, vaisingumo, gestacijos, atsivedimo, gyvybingumo ir 
laktacijos rodiklius; ataskaitoje nurodomi skai čiai, naudojami 
rodikliams apskai čiuoti,  
— toksinis arba kito tipo poveikis dauginimuisi, palikuonims, post ­
nataliniam augimui ir t. t.,  
— nekroskopijos rezultatai,  
— išsamus vis ų histopatologini ų rezultatų aprašymas,  
— P ir F1 pateli ų, turinčių normalų ciklą, skaičius ir ciklo trukm ė, 
— suminis spermatozoid ų antsėklidžio uodegoje skai čius, vis labiau 
judresnių spermatozoid ų procentin ė dalis, morfologiškai normali ų 
spermatozoid ų procentin ė dalis ir spermatozoid ų, su kiekviena 
identifikuota anomalija, procentin ė dalis,  
— poravimosi laikas, įskaitant par ų iki poravimosi skai čių, 
— gestacijos trukm ė, 
— implantacij ų, geltonkūnių skaičius, vados dydis,  
— gimusi ų gyvų jauniklių skaičius ir poimplantaciniai nuostoliai,  
— jaunikli ų su aiškiai matomais išsigimimais skai čius; pateikiamas 
silpniausi ų jauniklių skaičius, jei buvo nustatomas,  
— jaunikli ų fiziniai duomenys ir kiti postnatalinio vystymosi 
duomenys; įvertinti fiziniai parametrai turi b ūti pagrįsti, 
— jaunikli ų ir suaugusi ų gyvūnų funkcinių stebėjimų duomenys, kai 
tinka,  
— statistinis duomen ų apdorojimas, jei reikia.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Rezultatų aptarimas.  
Išvados, įskaitant patel ėms ir palikuonims gautas NOAEL vertes.  
4. NUORODOS  
1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Reproduction 
in Mammals : I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston and 
R.V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of 
Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Develop ­
ment and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxi ­
cology  12:92–108.  
3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal of 
Reproduction and Fertility  54:103–107.  
4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reproductive Toxicology  5:39–44  
5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a 
Consensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3):237–244.  
6) Chapin, R.E. et al., (1992) Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6:267–273  
7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimet ­
hanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13:409–421.  
8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5:449–458.  
9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in Toxico ­
logy, Part A., Academic, Orlando, Florida. pp. 319–333.
 
10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat Sperm 
Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: 
Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andro ­
logy 10: 401–415.  
11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomic ­
rographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andro ­
logy 8:330–337.  
12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6:491–505.
 
13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biolo ­
gical Reproduction 17:298303.  
14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, Florida.
 
15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, Orlando, Florida.
 
16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: 
Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, New York, p. 421–426.
 
17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven, New York.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
18) Smith, B.J. et al,. (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5:379–383.  
19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston, and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
 
20) Thomas, J.A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull’s Toxicology, M.O. Amdur, J. 
Doull, and CD. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.  
21) Zenick, h. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male Repro ­
ductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, 
New York.
 
22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOKSIKOKINETIKA  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 417 (OECD bandymo gaires 
Nr. 417) (2010). Tyrimai, per kuriuos nagrin ėjamos bandomosios chemin ės 
medžiagos toksikokinetin ės savybės, atliekami siekiant gauti tinkamos infor ­
macijos apie tos chemin ės medžiagos sugert į, pasiskirstym ą, biologin ę trans­
formaciją (t. y. metabolizm ą) ir šalinim ą, padėti susieti koncentracij ą arba 
dozę su nustatytuoju toksiškumu ir pad ėti suprasti tos chemin ės medžiagos 
toksinio poveikio mechanizm ą. Toksikokinetin ė informacija, kuria nuro ­
doma, kad bandomieji gyv ūnai sistemingai veikiami bandom ąja chemine 
medžiaga, ir atskleidžiama, kurios dalys yra cirkuliacin ės (pradinė cheminė 
medžiaga ir (arba) metabolitai), gali pad ėti suprasti toksikologinius tyrimus 
Pagrindiniai remiantis šiais tyrimais nustatyti toksikokinetiniai parametrai 
taip pat suteiks informacijos apie bandomosios chemin ės medžiagos gali ­
mybę kauptis audiniuose ir (arba) organuose ir galimyb ę sužadinti biologin ę 
transformacij ą, kaip bandomosios chemin ės medžiagos poveikio rezultat ą. 
2. Toksikokinetiniai duomenys gali pad ėti įvertinti toksiškumo gyv ūnams 
duomenų tinkamum ą ekstrapoliuoti, siekiant nustatyti žmogui gresian čius 
pavojus ir (arba) įvertinti rizik ą. Be to, toksikokinetiniai tyrimai gali suteikti 
naudingos informacijos siekiant nustatyti per toksiškumo tyrimus taikytinus 
dozių dydžius (tiesin ė ir netiesin ė kinetika), taikant tam tikr ą dozės davimo 
būdą sukeliam ą poveikį, biologin į įsisavinim ą ir su tyrimo planu susijusius 
aspektus. Tam tikri toksikokinetiniai duomenys gali b ūti naudojami kuriant 
fiziologija pagr įstus toksikokinetinius (FPTK) modelius.  
3. Duomenis apie metabolitus ir (arba) toksikokinetines savybes galima panau ­
doti svarbiais tikslais, pvz., siekiant pagr įsti galimą toksinį poveikį, veikimo 
būdus ir jų sąsają su dozės dydžiu ir poveikio b ūdu. Be to, duomenys apie 
metabolizm ą gali suteikti informacijos, kuri b ūti naudinga vertinant bando ­
mosios chemin ės medžiagos išorini ų metabolit ų poveikio toksikologin ę 
svarbą. 
4. Tinkami toksikokinetiniai duomenys pad ės pagrįsti tolesnį kiekybini ų struk­
tūros ir savybi ų ryšių, analogijos arba grupavimo metod ų priimtinum ą ir 
taikomum ą vertinant chemini ų medžiag ų saugum ą. Be to, kinetiniai 
duomenys gali b ūti naudojami vertinant toksikologin ę kitų tyrimų (pvz.,  
in vivo  ir (arba)  in vitro ) reikšmę. 
5. Jeigu nenurodoma kitokio doz ės davimo b ūdo (pirmiausia žr. 74–78 skirs ­
nius), Šis bandymo metodas taikomas bandom ąją cheminę medžiag ą 
duodant per burn ą. 
PIRMINIAI ASPEKTAI  
6. Reglamentavimo sistemomis siekiama patenkinti skirtingas reikmes ir 
keliami skirtingi reikalavimai d ėl pasekmi ų ir parametr ų, susijusių su įvairių 
klasių cheminių medžiag ų (pvz., pesticid ų, biocidų, pramonini ų cheminių 
medžiagų) toksikokinetin ėmis savyb ėmis, vertinimo. Kitaip nei daugelio 
metodų atveju, šiuo bandymo metodu aprašomi toksikokinetini ų savybių 
bandymai, apimantys įvairius matavimus ir pasekmes. Ateityje gali b ūti 
parengta keletas nauj ų bandym ų metodų ir (arba) rekomendacini ų doku­
mentų, skirtų atskirai išsamiau apib ūdinti kiekvien ą pasekmę. Tai, kokie 
bandymai arba vertinimai atliekami pagal š į bandymo metod ą, nustatyta 
kiekvienos reglamentavimo sistemos reikalavimais.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Yra daug tyrim ų, kurie gal ėtų būti atliekami siekiant reglamentavimo tikslais 
įvertinti bandomosios chemin ės medžiagos toksikokinetines savybes. Ta čiau, 
atsižvelgiant į konkrečias reglamentavimo reikmes arba aplinkybes, norint 
įvertinti bandom ąją cheminę medžiag ą gali reik ėti atlikti ne visus šiuos 
galimus tyrimus. Planuojant toksikokinetinius tyrimus reik ėtų laikytis lanks ­
taus poži ūrio, kuriuo b ūtų atsižvelgiama į tiriamos bandomosios chemin ės 
medžiagos savybes. Kartais, siekiant ištirti bandomosios chemin ės 
medžiagos keliamus pavojus ir rizik ą, gali reik ėti išnagrin ėti tik tam tikr ą 
klausimų rinkinį. Tam tikrais atvejais toksikokinetiniai duomenys gali b ūti 
renkami atliekant vertinimus per kitus toksikologinius tyrimus. Dar kitais 
atvejais, atsižvelgiant į reglamentavimo reikmes ir (arba) vertinant bando ­
mąją cheminę medžiagą kilus nauj ų klausimų, gali reik ėti atlikti papildomus 
ir (arba) išsamesnius toksikokinetinius tyrimus.  
8. Siekdama užtikrinti aukštesn ę tyrimo kokyb ę ir išvengti neb ūtino gyvūnų 
naudojimo, bandym ų laboratorija, prieš atlikdama tyrim ą, turėtų įvertinti 
visą turimą informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiag ą ir susijusius 
metabolitus bei analogus. Šiuo tikslu gal ėtų būti naudojami duomenys, 
gauti taikant kitus susijusius bandymo metodus (tyrimus  in vivo  ir in vitro  
ir (arba) vertinimus  in silico ). Planuojant tyrim ą ir aiškinant rezultatus, gali 
būti naudinga žinoti chemin ės medžiagos fizines ir chemines savybes, pvz., 
oktanolio / vandens pasiskirstymo koeficient ą (išreikšt ą log P  OW ), pKa, 
tirpumą vandenyje, gar ų slėgį ir molekulin ę masę). Šie dydžiai gali b ūti 
nustatomi taikant atitinkamus metodus, kaip aprašyta d ėstant susijusius 
bandymus metodus.  
APRIBOJIMAI  
9. Šis bandymo metodas n ėra skirtas taikyti ypatingomis aplinkyb ėmis, pvz., 
kai naudojamos apvaisintos arba maitinan čios patelės ir jaunikliai arba kai 
siekiama įvertinti galimus chemini ų medžiag ų likučius maistini ų gyvūnų 
organizme. Ta čiau atlikus B.36 tyrim ą gauti duomenys gali b ūti naudojami 
kaip pagalbin ė informacija planuojant specialius tyrimus, per kuriuos 
siekiama ištirti min ėtus dalykus. Šis bandymo metodas n ėra skirtas nanome ­
džiagų bandymams. OECD bandym ų gairių taikymo nanomedžiagoms gali ­
mybės išankstinio vertinimo ataskaitoje nurodoma, kad TG 417 (B.36 
bandymo metodo atitikmuo) negali b ūti taikomos nanomedžiagoms (1).  
APIBRĖŽTYS  
10. Aprašant š į metodą vartojamos apibr ėžtys pateiktos pried ėlyje. 
GYVŪNŲ GEROV ĖS ASPEKTAI  
11. Humaniško elgesio su gyv ūnais gairės pateiktos OECD rekomendaciniame 
dokumente (RD) Nr. 19 (2). OECD rekomendaciniu dokumentu Nr. 19 rekomenduojama remtis atliekant visus aprašant š į bandymo metod ą nuro­
dytus tyrimus  in vivo  ir in vitro .
 
METODŲ APRAŠYMAS  
Bandomieji tyrimai  
12. Rekomenduojama ir raginama atlikti bandomuosius tyrimus, skirtus parinkti 
toksikokinetiniams tyrimams (pvz., metabolizmo, masi ų balanso, analiz ės 
procedūrų, dozių nustatymo, CO  2 iškvėpimo ir t. t.) taikytinus bandym ų 
parametrus. Siekiant apib ūdinti kuriuos nors iš ši ų parametr ų gali ir nereik ėti 
naudoti radioaktyviu izotopu žym ėtąsias chemines medžiagas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Gyvūnų parinkimas  
Rūšis 
13. Pageidautina, kad per toksikokinetinius bandymus naudojam ų gyvūnų rūšis 
(ir paderm ė) būtų tokia pat, kokia naudojama per kitus dominan čios bando ­
mosios chemin ės medžiagos toksikologinius tyrimus. Paprastai tur ėtų būti 
naudojamos žiurk ės, nes jos pla čiai naudojamos atliekant toksikologinius 
tyrimus. Gali b ūti pagrįstas ir kit ų arba papildom ų rūšių naudojimas, jeigu 
svarbūs toksikologiniai tyrimai rodo didel į toksiškum ą šioms rūšims arba 
jeigu įrodoma, kad su jomis susij ęs toksiškumas ir (arba) toksikokinetika yra 
artimesni žmon ėms. Gyvūnų rūšies ir jų padermės pasirinkimas turi b ūti 
pagrįstas. 
14. Jeigu nurodyta kitaip, taikant š į bandymo metod ą bandymai atliekami su 
žiurkėmis. Norint naudoti kitas gyv ūnų rūšis, gali reik ėti pakoreguoti kai 
kuriuos šio metodo aspektus.  
Amžius ir paderm ė 
15. Turėtų būti naudojami jauni, sveiki, suaug ę gyvūnai (paprastai tokie, 
kuriems doz ės davimo metu yra su ėję 6–12 savai čių) (taip pat žr. 13 ir 
14 skirsnius). Jeigu naudojami ne jauni suaug ę gyvūnai, tai tur ėtų būti 
pagrįsta. Pradedant tyrim ą, visi gyv ūnai turėtų būti panašaus amžiaus. 
Atskirų gyvūnų kūno masės skirtumai tur ėtų nenukrypti nuo bandomosios 
grupės masės vidurkio daugiau kaip ± 20 %. Geriausia, kad b ūtų naudojama 
tokia pat paderm ė, kokia buvo naudojama sudarant tos bandomosios 
cheminės medžiagos toksikologin ę duomenų bazę. 
Gyvūnų skaičius ir lytis  
16. Kiekvienai bandomai dozei tur ėtų būti naudojama ne mažiau kaip po keturis 
vienos lyties gyv ūnus. Naudojam ų gyvūnų lyties pasirinkimas tur ėtų būti 
pagrįstas. Jeigu yra įrodymų, kad toksiškumas skirting ų lyčių gyvūnams 
gerokai skiriasi, tur ėtų būti svarstoma galimyb ė naudoti abiej ų lyčių 
gyvūnus (po keturis patinus ir keturias pateles).  
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
17. Bandym ų laikotarpiu gyv ūnai paprastai tur ėtų būti laikomi po vien ą. Ypatin­
gomis aplinkyb ėmis gali b ūti pateisinamas gyv ūnų laikymas grup ėmis. 
Apšvietimas tur ėtų būti dirbtinis, taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos 
seką. Bandom ųjų gyvūnų laikymo patalpos temperat ūra turėtų būti 22 °C 
(± 3 °C), santykinis dr ėgnis – 30–70 %. Gyv ūnams šerti tinka įprastas labo ­
ratorijose naudojamas pašaras, neribojant geriamojo vandens kiekio.  
Bandomoji chemin ė medžiaga  
18. Tiriant visus masi ų balanso ir metabolit ų nustatymo aspektus, tur ėtų būti 
naudojama bandomoji chemin ė medžiaga, žym ėta radioaktyviu izotopu  14 C; 
tačiau, jeigu galima įrodyti, kad:  
— masių balansas ir metabolitai gali b ūti tinkamai įvertinti naudojant nežy ­
mėtą bandomąją cheminę medžiag ą, 
— nenaudojant radioaktyviu izotopu nežym ėtą bandom ąją chemin ę 
medžiagą taikomo metodo analizinis tikslumas ir jautrumas yra toks 
pat arba didesnis nei b ūtų galima užtikrinti naudojant radioaktyviu 
izotopu žym ėtą bandomąją cheminę medžiag ą, ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
radioaktyviu izotopu žym ėtosios bandomosios chemin ės medžiagos naudoti 
nebūtina. Be to, gali b ūti naudojami kiti radioaktyvus ir stabil ūs izotopai, 
ypač jeigu nuo elemento bent iš dalies priklauso tos bandomosios chemin ės 
medžiagos toksiškumas. Jeigu įmanoma, radioaktyvus izotopas tur ėtų būti 
molekulės branduolyje, kuris b ūtų metaboliškai stabilus (nepakei čiamas, 
nepašalinamas d ėl metabolizmo kaip CO  2 ir organizme netampantis vieno 
anglies atomo jungini ų dalimi). Norint atsekti bandomosios chemin ės 
medžiagos metabolin į išliekamum ą, gali reik ėti pažymėti keletą molekulės 
vietų arba tam tikras jos sritis.  
19. Radioaktyviais izotopais žym ėtos ir nežym ėtos bandomosios chemin ės 
medžiagos tur ėtų būti analizuojamos taikant atitinkamus metodus, siekiant 
nustatyti j ų grynumą ir tapatum ą. Radioaktyvios bandomosios chemin ės 
medžiagos radiologinis grynumas tur ėtų būti didžiausias tos chemin ės 
medžiagos atveju pasiekiamas grynumas (geriausia, kad jis b ūtų didesnis 
kaip 95 %); tur ėtų būti imamasi pagr įstų priemoni ų, kad būtų nustatytos 
priemaišos, kuri ų koncentracija 2 % arba didesn ė. Grynumas ir nustatyt ų 
priemaišų tapatumas bei dalis tur ėtų būti nurodyti ataskaitoje. Pagal konkre ­ 
čias reglamentavimo programas gali b ūti nuspręsta parengti daugiau reko ­
mendacijų, padėsiančių apibrėžti ir apib ūdinti iš mišini ų sudarytas bando ­
mąsias chemines medžiagas ir priemaiš ų nustatymo metodus.  
Dozių parinkimas  
Bandomasis tyrimas  
20. Paprastai bandomajam tyrimui pakanka vienos doz ės per burn ą. Dozė turėtų 
būti netoksiška, ta čiau pakankamai didel ė, kad būtų galima nustatyti išsky ­
rose (ir, jeigu reikia, plazmoje) esan čius metabolitus, taip pat pasiekti nusta ­
tytą bandomojo tyrimo tiksl ą, kaip nurodyta šio bandymo metodo 12 skirs ­
nyje.  
Pagrindiniai tyrimai  
21. Per pagrindinius tyrimus rekomenduojama duoti dvi dozes, nes bent iš 
dviejų dozę gaunančių grupių surinkta informacija gali pad ėti nustatyti 
dozes kitiems toksiškumo tyrimams ir įvertinti doz ės ir reakcijos s ąryšį, 
pasireiškus į per jau atliktus toksiškumo bandymus.  
22. Jeigu duodamos dvi doz ės, jos abi tur ėtų būti pakankamai didel ės, kad būtų 
galima nustatyti išskyrose (ir, jeigu reikia, plazmoje) esan čius metabolitus. 
Parenkant dozes tur ėtų būti atsižvelgiama į informacij ą, pagrįstą turimais 
toksiškumo duomenimis. Jeigu informacijos n ėra (pvz., pagr įstos ūmaus 
toksiškumo per virškinam ąjį traktą tyrimais, per kuriuos buvo registruojami 
klinikiniai toksiškumo požymiai, arba kartotin ės dozės toksiškumo tyrimais), 
nustatant didesni ąją dozę gali būti svarstoma galimyb ė taikyti vert ę, kuri 
būtų mažesnė už LD  50 (poveikio per burn ą arba od ą būdai) arba LC  50 
(poveikio per kv ėpavimo takus b ūdas) įvertį arba mažesn ė už apatin ę 
ūmaus toksiškumo intervalo įverčio vertę. Apskritai mažesnioji doz ė turėtų 
būti trupmenin ė didesniosios doz ės dalis.  
23. Kai tiriama tik vieno dydžio doz ė, būtų geriausia, jeigu doz ė būtų pakan­
kamai didel ė, kad būtų galima nustatyti išskyrose (ir, jeigu reikia, plazmoje) 
esančius metabolitus, nesukeliant akivaizdaus toksiškumo. Tur ėtų būti 
pagrįsta, kodėl neduodama antrojo dydžio doz ės. 
24. Kai reikia nustatyti doz ės poveikį kinetiniams procesams, dviej ų dozių gali 
nepakakti, o viena doz ė turi būti pakankamai didel ė, kad būtu įsotinti šie 
procesai. Jeigu po plazmos koncentracijos ir laiko tarpusavio priklauso ­
mybės kreive susidaran čio ploto kitimas remiantis dviem per pagrindin į 
tyrimą taikytais dozi ų dydžiais n ėra tiesinis, tai aiškiai rodo, kad kažkur 
tarp dviej ų dozių dydžių įsotinamas vienas arba daugiau kinetini ų procesų. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. Jeigu chemin ės medžiagos toksiškumas yra mažas, tur ėtų būti taikoma ne 
didesnė kaip 1 000 mg/kg k ūno masės dozė (dozę duodant per burn ą ir per 
odą; rekomendacijos d ėl dozės dydžio, kai doz ė duodama per kv ėpavimo 
takus, pateiktos šio priedo B.2 skyriuje; paprastai ši doz ė turėtų neviršyti 2 
mg/l). Atsižvelgiant į konkrečią cheminę medžiag ą ir reglamentavimo 
reikmes, gali reik ėti naudoti didesn ę dozę. Dozės parinkimas tur ėtų būti 
pagrįstas. 
26. Norint nustatyti kaupimosi galimybes ir (arba) tvarum ą, gali pakakti vienos 
dozės toksikokinetini ų ir pasiskirstymo audiniuose duomen ų. Tačiau tam 
tikromis aplinkyb ėmis gali reik ėti duoti kartotin ę dozę: i) kai norima išsa ­
miai išnagrin ėti kaupimosi galimybes ir (arba) tvarum ą arba toksikokinetini ų 
savybių pakitimus (pvz., ferment ų sužadinimo ir slopinimo) arba ii) kai to 
reikalaujama pagal reglamentavimo sistem ą. Nors, atliekant kartotin ės dozės 
tyrimus, paprastai pakanka duoti mažiausi ąją kartotinę dozę, tam tikromis 
aplinkybėmis gali reik ėti duoti ir didžiausi ąją kartotinę dozę (taip pat žr. 57 
skirsnį). 
Bandomosios chemin ės medžiagos davimas  
27. Bandomoji chemin ė medžiaga tur ėtų būti ištirpinta tokiame pa čiame nešik ­
lyje, koks buvo naudojamas atliekant kitus bandomosios chemin ės 
medžiagos toksiškumo tyrimus, per kuriuos bandomoji chemin ė medžiaga 
buvo duodama zondu per burn ą, arba tur ėtų būti pagaminta homogeniška 
bandomosios chemin ės medžiagos suspensija tokiame nešiklyje, jeigu 
apskritai yra informacijos apie nešikl į. Turėtų būti pateiktas nešiklio parin ­
kimo pagrindimas. Nešiklio ir doz ės dydžio parinkimas tur ėtų būti apsvars ­
tyti planuojant tyrim ą. Įprastas doz ės davimo b ūdas – zondu, ta čiau tam 
tikrais atvejais gali b ūti naudinga doz ę duoti naudojant želatinos kapsul ę 
arba paruošiant maistin į mišinį (abiem atvejais b ūtina pateikti pagrindim ą). 
Turėtų būti pateiktas kiekvienam gyv ūnui faktiškai duotos doz ės patvirti ­
nimas.  
28. Didžiausias skys čio, kuris vienu kartu bus duodamas per burn ą zondu, tūris 
priklauso nuo bandom ųjų gyvūnų dydžio, doz ės nešiklio pob ūdžio ir to, ar 
prieš duodant bandomosios chemin ės medžiagos doz ę gyvūnas kurį laiką 
nešeriamas. Tur ėtų būti pateiktas pašaro davimo arba ribojimo prieš doz ės 
davimą pagrindimas. Paprastai, naudojant vandeninius ar nevandeninius 
nešiklius, t ūris turėtų būti kiek įmanoma mažesnis. Doz ės tūris paprastai 
turėtų neviršyti 10 ml/kg graužiko k ūno masės. Geriau tirpstan čioms rieba ­
luose bandomosioms chemin ėms medžiagoms naudojam ų nešiklių tūris 
turėtų būti ne mažesnis kaip 4 ml/kg k ūno masės. Duodant kartotin ę 
dozę, kai vis ą parą nešerti negalima, tur ėtų būti apsvarstyta galimyb ė 
duoti mažesn ę dozę (pvz., 2–4 ml/kg k ūno masės). Jeigu įmanoma, gali 
būti apsvarstyta galimyb ė naudoti tok į dozės tūrį, kuris atitikt ų duodam ą 
per kitus bandomosios chemin ės medžiagos tyrimus, per kuriuos doz ė 
duodama per burn ą zondu.  
29. Siekiant nustatyti biologin į įsisavinim ą arba santykin ę oralinę sugertį, gali 
būti taikomas intraveninis bandomosios chemin ės medžiagos davimas ir 
atliekamas bandomosios chemin ės medžiagos matavimas kraujyje ir (arba) 
išskyrose. Atliekant intravenin į tyrimą, naudojant tinkam ą nešiklį duodama 
viena bandomosios chemin ės medžiagos doz ė (paprastai tokio pat dydžio 
kaip mažiausioji oralin ė dozė, bet ne didesn ė; žr. apie doz ės parinkim ą). 
Tinkamas šios medžiagos t ūris (pvz., 1 ml/kg k ūno masės) pasirinktoje 
davimo vietoje tur ėtų būti duodamas ne mažiau kaip keturiems reikiamos 
lyties gyv ūnams (jeigu tai pagr įsta, gali b ūti naudojamos abi lytys; žr. 16 
skirsnį). Chemin ę medžiag ą duodant intraveniniu b ūdu, būtina paruošti 
visiškai ištirpint ą dozę arba jos suspensij ą. Intraveniniam doz ės davimo  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
būdui naudojamas nešiklis netur ėtų gadinti kraujo arba jo apytakos. Jeigu 
bandomoji chemin ė medžiaga duodama infuzijos b ūdu, turėtų būti nurodytas 
infuzijos greitis, kuris, jeigu naudojamas infuzijos siurblys, tur ėtų būti suvie­
nodintas visiems gyv ūnams. Jeigu taikomas kaniuliavimas per jungo ven ą 
(duodant chemin ės medžiagos doz ę ir (arba) imant krauj ą) arba jeigu doz ė 
duodama per šlaunies arterij ą, turėtų būti taikoma anestezija. Tur ėtų būti 
deramai parinktas anestezijos tipas, nes jis gali tur ėti įtakos toksikokinetikai. 
Prieš duodant bandomosios chemin ės medžiagos doz ę su nešikliu, gyv ū­
nams turėtų būti duodama pakankamai laiko atsigauti.  
30. Tiriant tam tikras bandom ąsias chemines medžiagas, atsižvelgiant į jų fizines 
ir chemines savybes ir numatom ą naudojimo arba poveikio žmon ėms būdą, 
gali būti taikomi kitokie doz ės davimo b ūdai, pvz., per od ą arba kvėpavimo 
takus (žr. 74–78 skirsnius).  
Matavimai  
Masių balansas  
31. Masi ų balansas nustatomas sudedant su šlapimu, išmatomis ir iškv ėptu oru 
pašalintą duotos (radioaktyvios) doz ės procentin ę dalį ir procentin ę dalį 
audiniuose, likusioje skerdenoje ir narvelio paplavose (žr.46 skirsn į). 
Paprastai laikoma, kad bendras duotos bandomosios chemin ės medžiagos 
(radioaktyvi ų izotopų) regeneravimas yra tinkamas, jeigu jis ne mažesnis 
kaip 90 %.  
Sugertis  
32. Pradin į sugerties įvertį galima gauti iš masi ų balanso įverčio atimant doz ės 
procentin ę dalį virškinimo trakte ir (arba) išmatose. Kaip apskai čiuoti 
procentin ę sugertį nurodyta 33 skirsnyje. Išskyr ų tyrimai aprašyti 44–49 
skirsniuose. Jeigu tikslaus sugerties, pasireiškusios davus doz ę per burn ą, 
laipsnio nustatyti remiantis masi ų balanso tyrimais negalima (pvz., jeigu 
išmatose yra daugiau kaip 20 % duotos doz ės), gali reik ėti atlikti papil ­
domus tyrimus. Šie tyrimai gali b ūti tokie: 1) bandomosios chemin ės 
medžiagos davimas per burn ą ir bandomosios chemin ės medžiagos kiekio 
tulžyje matavimas arba 2) bandomosios chemin ės medžiagos davimas per 
burną ir intraveniniu b ūdu ir grynojo bandomosios chemin ės medžiagos 
kiekio šlapime, taip pat iškv ėptame ore ir skerdenoje matavimas pagal abu 
minėtuosius doz ės davimo b ūdus. Pagal kiekvien ą tyrimo plan ą atliekamas 
radioaktyvumo matavimas, taikomas kaip pakaitinis cheminei medžiagai pritaikytas bandomosios chemin ės medžiagos ir metabolit ų analizės 
metodas.
 
33. Jeigu atliekamas šalinimo su tulžimi tyrimas, paprastai doz ė duodama per 
burną. Atliekant š į tyrimą, į ne mažiau kaip keturi ų reikiamos lyties (arba, 
jeigu tai pagr įsta, į abiejų lyčių) gyvūnų tulžies latakus tur ėtų būti įvedami 
vamzdeliai ir suleidžiama viena bandomosios chemin ės medžiagos doz ė. 
Suleidus bandom ąją cheminę medžiag ą, turėtų būti stebimas radioaktyvi ų 
izotopų ir (arba) bandomosios chemin ės medžiagos šalinimas su tulžimi, 
stebint tiek laiko, kad b ūtų galima įvertinti šiuo b ūdu duodamos doz ės 
procentin ę dalį; šis įvertis gali b ūti naudojamas tiesiogiai apskai čiuoti 
oralinės sugerties laipsn į, kaip nurodyta toliau:  
Procentin ė sugertis ¼ ðKiekis tulžyje þ Kiekis šlapime þ Kiekis iškv ėptame ore 
þ Kiekis skerdenoje – Kiekis virškinimo trakte Þ=Duota doz ė Ü 100 
34. Kai kuri ų klasių bandom ųjų cheminių medžiag ų atveju tiesioginis absor ­
buotos doz ės išskyrimas gali vykti per žarn ų sieneles. Tokiais atvejais 
dozės procentin ės dalies išmatose matavimas po doz ės davimo, naudojant 
žiurkes, kurioms į tulžies latakus įvesti vamzdeliai, nelaikomas tinkamu 
neabsorbuotos doz ės matavimu. Jeigu manoma, kad vyks šalinimas per 
žarnyną, rekomenduojama sugert ą procentin ę dozės dalį nustatyti remiantis 
sugertimi, apskai čiuojama lyginant šalinim ą po dozės davimo per burn ą ir 
šalinimą po intraveninio doz ės davimo (sveikoms žiurk ėms arba žiurk ėms, 
kurioms į tulžies latakus įvesti vamzdeliai) (žr. 35 skirsn į). Be to, jeigu 
manoma, kad b ūtina kiekybiškai įvertinti žarnyno sekrecij ą, rekomenduo ­
jama atlikti šalinimo matavimus naudojant žiurkes, kurioms į tulžies latakus 
įvesti vamzdeliai ir kurioms duota intravenin ė dozė. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biologinis įsisavinimas  
35. Biologinis įsisavinimas gali b ūti nustatomas remiantis plazmos ir (arba) 
kraujo kinetika grup ėse, kurioms doz ės duotos per burn ą arba intraveniniu 
būdu, kaip aprašyta 50–52 skirsniuose, atliekant speciali ą bandomosios 
cheminės medžiagos ir (arba) susijusi ų metabolit ų cheminę analizę, taip 
apsieinant be radioaktyviu izotopu žym ėtųjų cheminių medžiagų. Bandomo ­
sios chemin ės medžiagos arba susijusi ų metabolit ų biologinis 
įsisavinimas (F) gali b ūti apskaičiuojamas taip:  
F ¼ ðPPK  band :=PPK  IV Þ Ü ðDozė IV=Dozė band : Þ; 
čia: PPK – plotas po koncentracijos plazmoje ir laiko tarpusavio priklauso ­
mybės kreive, band. – bandymo b ūdas (per burn ą, per odą arba per kv ėpa­
vimo takus).  
36. Siekiant įvertinti sisteminio poveikio rizik ą, kai per gyv ūnų tyrimus nusta ­
tyta sistemin ė koncentracija lyginama su analogiškais biologini ų stebėjimų 
duomenimis, gautais atlikus poveikio darbuotojams tyrimus, toksiškos sude ­
damosios dalies biologiniam įsisavinimui paprastai teikiama pirmenyb ė prieš 
procentin ę sugertį. Padėtis gali tapti sud ėtingesnė, jeigu dozi ų intervalas yra 
netiesinis, taigi svarbu, kad atliekant toksikokinetinius vertinimus doz ės būtų 
nustatomos taikant tiesin į intervalą. 
Pasiskirstymas audiniuose  
37. Norint nustatyti tikslinius audinius, suprasti pagrindinius toksinio poveikio 
mechanizmus ir gauti informacijos apie bandomosios chemin ės medžiagos ir 
metabolit ų kaupimąsi ir tvarum ą, svarbu tur ėti žinių apie bandomosios 
cheminės medžiagos ir (arba) jos metabolit ų pasiskirstym ą audiniuose. 
Bendros (radioaktyvios) doz ės procentin ė dalis audiniuose ir likusioje sker ­
denoje tur ėtų būti matuojama bent jau baigus šalinimo bandym ą (pvz., 
paprastai ne v ėliau kaip per septynias dienas po doz ės davimo arba anks ­ 
čiau, atsižvelgiant į specifines bandomosios chemin ės medžiagos savybes). 
Jeigu baigiant tyrim ą bandomosios chemin ės medžiagos audiniuose neaptin ­
kama (pvz., bandomoji chemin ė medžiaga buvo pašalinta iki tyrimo 
pabaigos d ėl trumpo pusin ės eliminacijos laiko), tur ėtų būti imamasi atsar ­
gumo priemoni ų, kad duomenys neb ūti aiškinami neteisingai. Tokiu atveju 
pasiskirstymas audiniuose tur ėtų būti tiriamas esant didžiausiai bandomosios 
cheminės medžiagos (ir (arba) metabolit ų) koncentracijai plazmoje ir (arba) 
kraujyje (T  max ) arba esant didžiausiam šalinimo su šlapimu grei čiui (jeigu 
taikytina) (žr. 38 skirsn į). Be to, norint nustatyti bandomosios chemin ės 
medžiagos ir (arba) jos metabolit ų pasiskirstym ą audiniuose, įvertinti 
priklausomyb ę nuo laiko (jeigu taikytina) ir pad ėti nustatyti masi ų balansą, 
ir (arba) paprašius kompetentingai institucijai, gali reik ėti paimti audinius ir 
kitais laiko momentais. Audiniai, kurie tur ėtų būti imami: kepenys, riebalai, 
virškinimo traktas, inkstai, blužnis, visas kraujas, likusi skerdena, tikslini ų 
organų audiniai ir kiti audiniai (pvz., skydliauk ė, eritrocitai, lytiniai organai, 
oda, akys (ypa č pigmentini ų gyvūnų)), kurie gali b ūti svarbūs vertinant 
bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą. Siekiant kuo geriau panau ­
doti gyvūnus ir tuo atveju, kai atliekant pusiau l ėtinio arba l ėtinio toksiš ­
kumo tyrimus pastebimas toksiškumas tiksliniams organams, tur ėtų būti 
svarstoma galimyb ė tais pačiais laiko momentais ištirti papildomus audinius. 
Be to, ataskaitoje tur ėtų būti nurodyta (radioaktyvi) likutin ė koncentracija, 
audinių ir plazmos (kraujo) santykis.  
38. Be to, gali reik ėti (taip pat kompetentingos institucijos prašymu) įvertinti 
pasiskirstym ą audiniuose papildomais laiko momentais, pvz., esant didžiau ­
siai koncentracijai plazmoje ir (arba) kraujyje (pvz., T  max ) arba esant 
didžiausiam šalinimo su šlapimu grei čiui, nustatytiems atliekant atitinkamus 
plazmos ir (arba) kraujo kinetinius arba išsiskyrimo bandymus. Ši informa ­
cija gali b ūti naudinga norint suprasti toksiškum ą ir bandomosios chemin ės 
medžiagos ir metabolit ų kaupimosi ir tvarumo galimyb ę. Turėtų būti 
pateiktas ėminių pasirinkimo pagrindimas; analizei skirti ėminiai paprastai 
turėtų būti tokie pat, kaip nurodyta pirmiau (žr. 37 skirsn į). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Kiekybinis radioaktyvumo įvertinimas pasiskirstymo audiniuose tyrim ų tiks­
lais gali b ūti atliekamas taikant organ ų skrodimą, homogenizavim ą, deginim ą 
ir (arba) tirpinim ą, o tada – surinkt ų likučių scintiliacijos skystyje 
skaičiavimus (SSS). Nustatant bandomosios chemin ės medžiagos pasiskirs ­
tymą organuose ir (arba) audiniuose, gali b ūti naudingi tam tikri metodai, 
kurie dabar yra daugiau ar mažiau išpl ėtoti, pvz., kiekybinis viso k ūno auto­
radiografavimas arba receptori ų mikroskopinis autoradiografavimas (3) (4).  
40. Jeigu doz ė duodama ne per burn ą, gali būti imami ir analizuojami specifiniai 
audiniai, pvz., plau čiai, jeigu tai inhaliaciniai tyrimai, ir oda, jeigu tai 
poveikio per od ą tyrimai. Žr. 74–78 skirsnius.  
Metabolizmas  
41. Siekiant nustatyti ir kiekybiškai įvertinti nepakitusi ą bandom ąją cheminę 
medžiagą ir metabolitus, tur ėtų būti renkamos išskyros (ir, jeigu reikia, 
plazma), kaip aprašyta 44–49 skirsniuose. Kad b ūti lengviau nustatyti meta ­
bolitus tam tikro dydžio dozei skirtoje grup ėje, gali b ūti kartu sudedamos 
atskirai paimtos išskyros. Rekomenduojama apib ūdinti kiekvieno laikotarpio 
metabolitus. Ta čiau, jeigu d ėl ėminio ir (arba) radioaktyvumo nebuvimo to 
padaryti negalima, galima kartu sud ėti skirtingais laikotarpiais paimt ą 
šlapimą ir išmatas, ta čiau negalima kartu sud ėti skirting ų lyčių gyvūnų 
išskyrų arba skirtingas dozes gavusi ų gyvūnų išskyrų. Apibūdinant doz ę 
gavusių gyvūnų šlapimą, išmatas, pasibaigus į radioaktyvum ą ir, jeigu taiky ­
tina, tulžį, turėtų būti taikomi atitinkami kokybiniai ir kiekybiniai metodai.  
42. Turėtų būti imamasi pagr įstų priemoni ų, kad būtų nustatyti visi metabolitai, 
kurių kiekis sudaro 5 % arba daugiau duodamos doz ės, ir parengti bando ­
mosios chemin ės medžiagos apykaitos schem ą. Turėtų būti nustatytos 
bandomosios chemin ės medžiagos, kuri ų nustatytasis kiekis išskyrose sudaro 
5 % arba daugiau duotos doz ės. Nustatant šias chemines medžiagas tur ėtų 
būti tiksliai nustatyta j ų struktūra. Paprastai nustatymas atliekamas metabo ­
lito kochromatografijos b ūdu, taikant žinomus standartus ir dvi nepanašias 
sistemas arba metodus, kuriais galima tiesiogiai nustatyti strukt ūrą, pvz., 
masių spektrometrijos, branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) ir t. t. 
Jeigu taikoma kochromatografija, chromatografijos metod ų, pagal kuriuos, 
taikant dvi skirtingas tirpikli ų sistemas, naudojama ta pati pastovi faz ė, 
taikymas n ėra laikomas tinkama dvimetode metabolit ų nustatymo patikra, 
nes šie metodai n ėra nepriklausomi. Nustatymas kochromatografijos b ūdu 
turėtų būti atliekamas naudojant dvi nepanašias, analitiškai nepriklausomas 
sistemas, pvz., atvirkštin ės ir įprastos fazi ų plono sluoksnio 
chromatografij ą (PSC) ir didelio sl ėgio skysčių chromatografij ą (DSSC). 
Jeigu chromatografinis atskyrimas yra tinkamos kokyb ės, papildomas patvir ­
tinimas spektroskopin ėmis priemon ėmis nebūtinas. Vienareikšmis nusta ­
tymas taip pat gali b ūti užtikrinamas taikant metodus, kuriais gaunama 
informacijos apie strukt ūrą, pvz., skys čių chromatografijos ir masi ų spektro­
metrijos (SC-MS) arba skys čių chromatografijos ir dvigubos masi ų spektro­
metrijos (SC-MS/MS), duj ų chromatografijos ir masi ų spektrometrijos (DC- 
MS) ir BMR spektrometrijos.  
43. Jeigu metabolit ų, kurių kiekis duotoje doz ėje sudaro 5 % arba daugiau, 
nustatyti ne įmanoma, galutin ėje ataskaitoje tur ėtų būti pateiktas pagrindimas 
ir (arba) paaiškinimas. Bandomosios chemin ės medžiagos keliam ų pavojų ir 
(arba) rizikos vertinimo tikslais siekiant geriau suprasti metabolin į kelią, gali 
būti naudinga nustatyti metabolitus, kuri ų kiekis duotoje doz ėje yra 
mažesnis kaip 5 %. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti pateikta informacija apie 
struktūrą. Šiuo tikslu gali b ūti apibūdinama plazma, kraujas arba kiti audi ­
niai. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Šalinimas  
44. Duotos doz ės šalinimo greitis ir laipsnis tur ėtų būti nustatomi matuojant iš 
šlapimo, išmat ų ir iškvėpto oro regeneruotos (radioaktyvios) doz ės procen­
tinę dalį. Šie duomenys taip pat bus naudingi nustatant masi ų balansą. 
Tinkamais laiko intervalais tur ėtų būti nustatyti iš šlapimo, išmat ų ir 
iškvėpto oro pašalintos bandomosios chemin ės medžiagos (radioaktyvi ų 
izotopų) kiekiai (žr. 47–49 skirsnius). Kartotin ės dozės bandymai tur ėtų 
būti tinkamai suplanuoti, kad b ūtų galima surinkti šalinimo duomenis ir 
pasiekti 26 skirsnyje aprašytus tikslus. Tai leis palyginti vienos doz ės 
bandymus.  
45. Jeigu bandomasis tyrimas parod ė, kad su išvepiamu oru pašalinama nedaug 
bandomosios chemin ės medžiagos (radioaktyvi ų izotopų) (kaip nurodyta 49 
skirsnyje), per galutin į tyrimą iškvepiamo oro rinkti nereikia.  
46. Kiekvienas gyv ūnas turėtų būti įkeliamas į atskirą metabolizmo (šlapimo, 
išmatų ir iškvepiamo oro) kamer ą, skirtą surinkti išskyras. Kiekvieno 
rinkimo laikotarpio (žr. 47–49 skirsnius) pabaigoje metabolizmo kameros 
turėtų būti išplautos tinkamu tirpikliu (vadinamuoju „narv ų plovikliu“), 
kad būtų užtikrintas kuo didesnis bandomosios chemin ės medžiagos (radio ­
aktyvių izotopų) regeneravimas. Išskyr ų rinkimas tur ėtų būti baigtas per 
septynias dienas arba regeneravus ne mažiau kaip 90 % duotos doz ės 
(žiūrint, kas pirmiau įvyksta).  
47. Bendri bandomosios chemin ės medžiagos (radioaktyvi ų izotopų) kiekiai 
šlapime tur ėtų būti nustatomi ne mažiau kaip dviem laiko momentais 
pirmąją rinkimo dien ą (vienas iš ši ų laiko moment ų turėtų būti 24 valandos 
po dozės davimo), o v ėliau – kasdien iki tyrimo pabaigos. Si ūloma pirm ąją 
dieną pasirinkti daugiau kaip du ėminių ėmimo laiko momentus (pvz., po 6, 
12 ir 24 val.). Siekiant gauti informacijos apie alternatyvius arba papildomus rinkimo laiko momentus, tur ėtų būti išanalizuoti bandom ųjų tyrimų rezul­
tatai. Tur ėtų būti pateiktas rinkimo tvarkaraš čių pagrindimas.
 
48. Bendri bandomosios chemin ės medžiagos (radioaktyvi ų izotopų) kiekiai 
išmatose tur ėtų būti nustatomi kasdien, pradedant po 24 valand ų nuo 
dozės davimo, iki tyrimo pabaigos, išskyrus atvejus, kai bandomieji tyrimai 
rodo, kad tur ėtų būti taikomi alternatyv ūs arba papildomi rinkimo laiko 
momentai. Tur ėtų būti pateiktas alternatyvi ų rinkimo tvarkaraš čių pagrin­
dimas.  
49. Iškvėpto CO  2 ir kitų lakių medžiag ų rinkimas per konkret ų tyrimą gali būti 
nutraukiamas, jeigu 24 valand ų rinkimo laikotarpiu iškv ėptame ore aptin ­
kama mažiau kaip 1 % duotos doz ės. 
Laiko tyrimai  
Plazmos ir (arba) kraujo kinetika  
50. Šių tyrimų tikslas – gauti bandomosios chemin ės medžiagos pagrindini ų 
toksikokinetini ų parametr ų [pvz., C  max , T  max , pusinės eliminacijos laiko 
(t 1/2 ), PPK] įverčius. Šie tyrimai gali b ūti atliekami duodant vien ą dozę, 
bet labiau tik ėtina, kad reik ės duoti dvi arba daugiau dozi ų. Dozės turėtų 
būti nustatomos atsižvelgiant į bandymo pob ūdį ir (arba) nagrin ėjamą klau­
simą. Nagrinėjant tokius klausimus kaip bandomosios chemin ės medžiagos 
biologinis įsisavinimas ir (arba) siekiant išsiaiškinti doz ės poveikį išsiva­
lymui (pvz., išsiaiškinti, ar išsivalymo proceso įsotinimas priklauso nuo 
dozės), gali reik ėti kinetini ų duomenų. 
51. Atliekant šiuos tyrimus, vieno dydžio dozei skirtoje grup ėje turėtų būti ne 
mažiau kaip po keturis vienos lyties gyv ūnus. Naudojam ų gyvūnų lyties 
pasirinkimas tur ėtų būti pagrįstas. Jeigu yra įrodymų, kad toksiškumas skir ­
tingų lyčių gyvūnams gerokai skiriasi, tur ėtų būti svarstoma galimyb ė 
naudoti abiej ų lyčių gyvūnus (po keturis patinus ir keturias pateles).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Davus bandomosios chemin ės medžiagos (žym ėtos radioaktyviu izotopu) 
dozę, iš kiekvieno gyv ūno tinkamais laiko momentais, taikant tinkam ą 
ėminių ėmimo metodik ą, turėtų būti paimti kraujo ėminiai. Kraujo ėminių 
tūris ir kiekis, kuriuos galima gauti iš vieno gyv ūno, gali b ūti ribojamas 
galimų kartotinio ėminių ėmimo poveikio gyv ūno sveikatai ir (arba) fizio ­
logijai ir (arba) analiz ės metodo jautrumui. Tur ėtų būti išanalizuoti kiek ­
vieno gyv ūno ėminiai. Tam tikromis aplinkyb ėmis (pvz., apib ūdinant meta ­
bolitus) gali reik ėti sudėti daugiau nei iš vieno gyv ūno paimtus ėminius. 
Sudėtiniai ėminiai tur ėtų būti aiškiai identifikuojami, tur ėtų būti pateiktas 
ėminio sud ėjimo pagrindimas. Jeigu naudojama radioaktyviu izotopu žym ė­
toji bandomoji chemin ė medžiaga, gali reik ėti atlikti bendrojo radioakty ­
vumo analiz ę. Jeigu tokia analiz ė atliekama, bendrasis radioaktyvumas 
turėtų būti analizuojamas visame kraujyje arba plazmoje ir raudonuosiuose 
kraujo kūneliuose, kad b ūtų galima apskai čiuoti kraujo k ūnelių ir plazmos 
santykį. Kitais atvejais gali reik ėti atlikti konkretesnius tyrimus, kuriems 
būtina nustatyti pirmin į junginį ir (arba) metabolitus arba įvertinti jungim ąsi 
su baltymais.  
Kinetika kituose audiniuose  
53. Šių tyrimų tikslas – gauti informacijos apie laik ą, suteikian čios galimyb ę 
nagrinėti klausimus, susijusius su tokiais aspektais kaip toksinio veikimo 
būdas, biologinis įsisavinimas ir biologinis tvarumas, kurie įvertinami nusta ­
tant chemin ės medžiagos lygius įvairiuose audiniuose. Audiniai ir laiko 
momentų skaičius parenkami atsižvelgiant į nagrinėtiną klausimą ir bando ­
mosios chemin ės medžiagos toksikologin ę duomen ų bazę. Rengiant ši ų 
papildom ų kinetikos audiniuose tyrim ų planą turėtų būti atsižvelgiama į 
informacij ą, surinktą taip, kaip aprašyta 37–40 skirsniuose. Per šiuos tyrimus 
gali būti duodama viena doz ė arba duodamos kartotin ės dozės. Turėtų būti 
pateiktas taikomo metodo pagrindimas.  
54. Kinetikos kituose audiniuose tyrim ų motyvai gali b ūti tokie:  
— pailgėjusio pusin ės eliminacijos iš kraujo laiko įrodymai, rodantys 
galimą bandomosios chemin ės medžiagos kaupim ąsi įvairiuose audi ­
niuose, arba  
— noras išsiaiškinti, ar konkre čiuose audiniuose pasiekiamas pastovus lygis 
(pvz., per kartotin ės dozės tyrimus, net jeigu gal ėjo būti akivaizdžiai 
pasiektas pastovus bandomosios chemin ės medžiagos lygis kraujyje, 
gali kilti poreikis įsitikinti, ar pastovus lygis pasiektas ir tiksliniuose 
audiniuose).  
55. Atliekant tokius laiko tyrimus, pagal kiekvien ą dozės dydį ir laiko moment ą 
ne mažiau kaip keturiems gyv ūnams turėtų būti duodama tinkama oralin ė 
bandomosios chemin ės medžiagos doz ė ir stebimas pasiskirstymo pasirink ­
tuose audiniuose laikas. Jeigu nepastebima specifinio poveikio kurios nors lyties gyv ūnams, gali b ūti naudojami tik vienos lyties gyv ūnai. Ar analizuoti 
bendrąjį radioaktyvum ą arba pirmin ę cheminę medžiag ą ir (arba) metabo ­
litus, priklauso ir nuo nagrin ėjamo audinio. Pasiskirstymo audiniuose verti ­
nimas tur ėtų būti atliekamas taikant tinkamus metodus.
 
Fermentų sužadinimas ir (arba) slopinimas  
56. Tyrimai, kuriais nagrin ėjamas galimas poveikis ferment ų sužadinimui ir 
(arba) slopinimui arba tiriamos bandomosios chemin ės medžiagos biologinei 
transformacijai, gali b ūti reikalingi vienu arba daugiau iš ši ų atvejų: 
1. kai turimi įrodymai rodo, kad esama priklausomyb ės tarp bandomosios 
cheminės medžiagos biologin ės transformacijos ir padid ėjusio toksiš ­
kumo;  
2. kai turimi toksiškumo duomenys rodo netiesin ę dozės ir metabolizmo 
tarpusavio priklausomyb ę; ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3. kai metabolit ų nustatymo tyrim ų rezultatai rodo, kad nustatytas galb ūt 
toksiškas metabolitas, kuris gal ėjo susidaryti d ėl bandomosios chemin ės 
medžiagos sužadinto ferment ų veikimo;  
4. aiškinantis poveik į, kuris tariamai susij ęs su ferment ų sužadinimo reiš ­
kiniu;  
5. jeigu per bandymus  in vitro  arba  in vivo , naudojant skirting ų rūšių 
gyvūnus arba taikant skirtingas s ąlygas pastebima toksikologiniu poži ūriu 
svarbių bandomosios chemin ės medžiagos metabolini ų savybių pokyčių, 
gali reikėti apibūdinti susijusius fermentus (pvz., I faz ės fermentus, pvz., 
nuo citochromo P450 priklausomos monooksigenaz ės sistemos izofer ­
mentus, II faz ės fermentus, pvz., sulfotransferaz ės arba uridindifosfato 
gliukuronoziltransferaz ės izofermentus, arba kitus susijusius fermentus). 
Ši informacija gali b ūti naudojama siekiant įvertinti tarpr ūšinio ekstra ­
poliavimo tinkamum ą. 
57. Vertinant su bandom ąja chemine medžiaga susijusius toksikokinetinius 
pokyčius, turėtų būti taikomi atitinkami tyrim ų protokolai, kurie tur ėtų 
būti tinkamai patvirtinti ir pagr įsti. Pavyzdini ų tyrimo plan ų sandara: karto ­
tinės radioaktyviu izotopu nežym ėtos bandomosios chemin ės medžiagos 
dozės davimas ir vienos radioaktyviu izotopu žym ėtosios doz ės davimas 
keturiolikt ą dieną arba kartotin ės radioaktyviu izotopu žym ėtosios bandomo ­
sios chemin ės medžiagos doz ės davimas ir ėminių ėmimas pirm ą, septintą ir 
keturiolikt ą dieną, siekiant nustatyti metabolit ų pobūdį. Duodant kartotin ę 
radioaktyviu izotopu žym ėtosios bandomosios chemin ės medžiagos doz ę 
taip pat galima gauti informacijos apie bioakumuliacij ą (žr. 26 skirsn į). 
PAPILDOMI METODAI  
58. Be d ėstant šį bandymo metod ą aprašytų bandymų in vivo , gali būti taikomi 
papildomi metodai, kuriais gali b ūti gauta naudingos informacijos apie 
bandomosios chemin ės medžiagos sugert į, pasiskirstym ą, metabolizm ą 
arba šalinim ą tam tikrų rūšių gyvūnų organizmuose.  
Tyrimų in vitro  informacijos naudojimas  
59. Atliekant tyrimus  in vitro  ir taikant atitinkamas bandym ų sistemas, gali b ūti 
išnagrinėta keletas su bandomosios chemin ės medžiagos metabolizmu susi ­
jusių klausimų. Galimiems metabolitams tirti gali b ūti naudojami k ą tik 
atskirti arba išauginti kepen ų hepatocitai ir l ąstelinės frakcijos (pvz., mikro ­
somos ir citozolis arba S9 frakcijos). Rizikos vertinimo tikslais gali b ūti 
svarbu tur ėti žinių apie vietin į metabolizm ą tiksliniame organe, pvz., plau ­ 
čiuose. Šiais tikslais gali b ūti naudingos tikslini ų audinių mikrosom ų frak­
cijos. Mikrosom ų tyrimai gali b ūti naudingi nagrin ėjant galimus ly čių ir 
gyvenimo etap ų skirtumus ir apib ūdinant ferment ų parametrus (K  m ir 
V max ), kurie gali pad ėti įvertinti metabolizmo priklausomyb ę nuo doz ės 
atsižvelgiant į poveikio lygius. Be to, mikrosomos gali b ūti naudingos 
siekiant nustatyti specifinius fermentus, dalyvaujan čius bandomosios 
cheminės medžiagos metabolizmo procesuose; tai gali b ūti svarbu tarpr ūši­
niam ekstrapoliavimui (taip pat žr. 56 skirsn į). Taip pat gali b ūti tiriama 
biologinės transformacijos sužadinimo galimyb ė, naudojant dominan čios 
bandomosios chemin ės medžiagos doz ę gavusių gyvūnų kepenų ląstelines 
frakcijas (pvz., mikrosomas ir citozol į), atliekant hepatocit ų sužadinimo 
tyrimus  in vitro  arba remiantis specifin ėmis ląstelių linijomis, išskirian čiomis 
reikiamus fermentus. Tam tikromis aplinkyb ėmis ir tinkamomis s ąlygomis 
gali būt svarstoma galimyb ė nustatant galimus gyv ūnų rūšių skirtumus 
biologinės transformacijos poži ūriu naudoti žmogaus audini ų ląstelines frak ­
cijas. Tyrim ų in vitro  rezultatai taip pat gali b ūti naudingi kuriant FPTK 
modelius (5).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. Sugerties per od ą tyrimais  in vitro  galima gauti papildomos informacijos, 
kuria remiantis b ūtų galima apib ūdinti sugert į (6). 
61. Iš kepen ų ląstelių paimtos pirmini ų ląstelių kultūros ir ką tik paimtos 
audinių dalys gali b ūti naudojamos nagrin ėjant panašius klausimus kaip ir 
kepenų mikrosom ų atveju. Tam tikrais atvejais atsakyti į specifinius klau ­
simus gali b ūti įmanoma naudojant l ąstelių linijas, d ėl kurių nustatytas 
atitinkamo fermento išskyrimas, arba inžinerijos b ūdu gautas l ąstelių linijas. 
Kartais gali b ūti naudinga ištirti specifini ų citochromo P450 izosom ų (pvz., 
CYP1A1, 2E1, 1A2 ir kit ų) ir (arba) II faz ės ferment ų slopinim ą ir sužadi ­
nimą naudojant pirmin į junginį ir atliekant tyrimus  in vitro . Gauta informa ­
cija gali b ūti naudinga panašios strukt ūros junginiams.  
Per toksiškumo tyrimus gaut ų toksikokinetini ų duomen ų, kaip papil ­
domos informacijos, naudojimas  
62. Kraujo, audini ų ir (arba) išskyr ų ėminiai, gauti atliekant kitus toksiškumo 
tyrimus, gali suteikti duomen ų apie biologin į įsisavinim ą, plazmos koncent ­
racijos kait ą per tam tikr ą laiką (PPK, C  max ), bioakumuliacijos galimyb ę, 
išsivalymo grei čius ir su lytimi bei gyvenimo etapu susijusius metabolizmo 
ir kinetikos poky čius. 
63. Sudarant tyrimo plan ą, gali būti siekiama atsakyti į klausimus, susijusius su: 
sugerties įsotinimu, biologin ės transformacijos arba šalinimo keliais esant 
didesnėms dozėms, nauj ų metabolini ų kelių veikimu esant didesn ėms 
dozėms ir toksini ų metabolit ų ribojimu taikant tik didesnes dozes.  
64. Kiti pavoj ų vertinimo aspektai gali b ūti susiję su tokiais klausimais:  
— jautrumu pagal amži ų, atsižvelgiant į hematoencefalinio barjero, kepen ų 
būklės ir (arba) detoksifikacijos galimybi ų skirtumus,  
— pogrupi ų jautrumu, atsižvelgiant į biologin ės transformacijos galimybi ų 
arba kitokius toksikokinetinius skirtumus,  
— poveikio dydžiu vaisiui, kai tas poveikis daromas chemin ėms medžia ­
goms prasiskverbiant per placent ą arba žindant naujagim į. 
Toksikokinetinio modeliavimo taikymas  
65. Toksikokinetiniai modeliai gali b ūti naudingi įvairiais pavoj ų ir rizikos verti ­
nimo aspektais, pvz., prognozuojant sistemin į poveikį ir dozę vidaus audi ­
niams. Be to, galima išnagrin ėti specifinius veikimo b ūdo klausimus; šie 
modeliai gali b ūti tarprūšinio ekstrapoliavimo, poveikio b ūdų, dozės davimo 
būdų ir žmogui gresian čios rizikos vertinimo pagrindas. Duomenys, 
naudingi kuriant bandomajai cheminei medžiagai skirtus FPTK modelius, kai naudojamos bet kokios gyv ūnų rūšys: 1) pasiskirstymo koeficientai, 2) 
biochemin ės konstantos ir fiziologiniai parametrai, 3) su konkre čiu poveikio 
būdu susiję sugerties parametrai ir 4) tyrim ų in vivo  kinetiniai duomenys, 
skirti vertinti modelius [pvz., išsivalymo parametrai, skirti tam tikriems (> 10 %) šalinimo b ūdams, su metabolizmu susij ę K
 m ir V  max ]. Kuriant mode ­
lius naudojami bandym ų duomenys tur ėtų būti rengiami taikant moksliškai 
patikimus metodus, o modeli ų rezultatai tur ėtų būti patvirtinami. Siekiant 
palengvinti nekategorizuot ų arba fiziologija pagr įstų modelių kūrimą, dažnai 
nustatomi su tam tikra bandom ąja chemine medžiaga ir gyv ūnų rūšimi susij ę 
parametrai, pvz., sugerties grei čiai, pasiskirstymo kraujyje ir audinyje rodik ­
liai ir metabolizmo konstantos (7).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
66. Rekomenduojama tyrimo ataskaitoje nurodyti turin į. 
Pagrindin ė ataskaitos dalis  
67. Ataskaitos pagrindin ėje dalyje tur ėtų būti pateikta aprašant š į bandymo 
metodą nurodyta informacija, sugrupuota į toliau nurodytus skyrius ir skirs ­
nius.  
Santrauka  
68. Šiame tyrimo ataskaitos skyriuje tur ėtų būti pateikta tyrimo plano santrauka 
ir taikytų metodų aprašas. Jame tur ėtų būti aiškiai pateikti pagrindiniai gauti 
rezultatai, susij ę su masių balansu, metabolit ų pobūdžiu ir gausa, liku čiais 
audiniuose, išsivalymo grei čiu, bioakumuliacijos galimybe, ly čių skirtumais 
ir t. t. Santrauka tur ėtų būti pakankamai išsami, kad ja remiantis b ūtų galima 
įvertinti gautus rezultatus.  
Įvadas  
69. Šiame tyrimo ataskaitos skyriuje tur ėtų būti nurodyti tyrimo tikslai, loginis 
pagrindas ir planas, tai pat atitinkamos nuorodos ir susijusi istorin ė informa­
cija. 
Medžiagos ir metodai  
70. Šiame ataskaitos skyriuje tur ėtų būti pateikti išsam ūs visos susijusios infor ­
macijos aprašai, kuriais apib ūdinama:  
a) Bandomoji chemin ė medžiaga  
Šiame poskyryje tur ėtų būti nuodytas bandomosios chemin ės medžiagos 
tapatumas: chemin ės medžiagos pavadinimas, molekulin ė struktūra, 
kokybinis ir kiekybinis jos chemin ės sudėties įvertinimas, cheminis 
grynumas ir, jeigu įmanoma, priemaiš ų tipas ir kiekiai. Be to, šiame 
poskyryje tur ėtų būti pateikta informacija apie fizines ir chemines 
savybes, nurodant fizin ę būseną, spalvą, bendrąjį tirpumo ir (arba) pasis ­
kirstymo koeficient ą, stabilum ą, jeigu taikytina, ėsdinamąsias savybes. 
Jeigu taikytina, tur ėtų būti pateikta informacija apie izomerus. Jeigu 
bandomoji chemin ė medžiaga žym ėta radioaktyviu izotopu, šiame posky ­
ryje turėtų būti pateikta tokia informacija: radionuklido tipas, žym ės 
vieta, savitasis aktyvumas ir radiocheminis grynumas.  
Turėtų būti nurodyti nešikli ų, skiedikli ų, suspensijos terpi ų ir emulsikli ų 
arba kitų duodant bandomosios chemin ės medžiagos dozes naudojam ų 
medžiagų tipai arba pateikti ši ų medžiag ų aprašai.  
b) Bandomieji gyv ūnai 
Šiame poskyryje tur ėtų būti pateikta informacija apie bandomuosius 
gyvūnus, nurodant pasirinkt ą gyvūnų rūšį, padermę ir amžių pradedant 
tyrimą ir tokio pasirinkimo pagrind ą, taip pat k ūno masę, sveikatos b ūklę 
ir gyvūnų laikymo s ąlygas.  
c) Metodai  
Šiame poskyryje tur ėtų būti pateikta išsami informacija apie tyrimo plan ą 
ir taikytą metodiką. Jame tur ėtų būti aprašyta:  
1. padaryt ų poveikio b ūdo ir poveikio s ąlygų pakeitim ų pagrindimas, 
jeigu taikytina;  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2. dozių dydžių parinkimo pagrindimas;  
3. planuojant tolesnius bandymais pagr įstus tyrimus naudoti bandomieji 
tyrimai, jeigu taikytina. Tur ėtų būti pateikti pamatiniai bandom ųjų 
tyrimų duomenys;  
4. kaip buvo paruoštas doz ės tirpalas ir koks buvo naudojamas (jeigu 
buvo) tirpiklis arba nešiklis;  
5. dozę gaunančių grupių skaičius ir gyv ūnų skaičius grupėje; 
6. dozių dydžiai ir t ūris (ir, jeigu naudoti radioaktyv ūs izotopai, savi ­
tasis dozės aktyvumas);  
7. dozės davimo b ūdas (-ai) ir metodai;  
8. dozių davimo dažnumas;  
9. nešėrimo laikotarpis (jeigu taikytas);  
10. bendras vienam gyv ūnui tenkantis radioaktyvumas;  
11. gyvūnų laikymas;  
12. ėminių ėmimas ir tvarkymas;  
13. taikyti analitiniai metabolit ų išskyrimo, kiekybinio įvertinimo ir j ų 
tapatumo nustatymo metodai;  
14. taikyt ų metodų aptikimo riba;  
15. kiti taikyti eksperimentiniai matavimai ir proced ūros (įskaitant 
metodų tinkamumo metabolit ų analizei patvirtinim ą). 
d) Statistin ė analizė 
Jeigu atliekama tyrimo rezultat ų statistinė analizė, turėtų būti pateikta 
pakankamai informacijos apie analiz ės metodą ir kompiuterin ę programą, 
kad nepriklausomas ekspertas arba statistikos specialistas gal ėtų iš naujo 
įvertinti bei atkurti analiz ės eigą. 
Jeigu taikomos modeliavimo tyrim ų sistemos, pvz., FPTK, aprašant 
modelius tur ėtų būti pateiktas išsamus modelio aprašas, kad b ūtų galima 
atlikti nepriklausom ą modelio atk ūrimą ir patvirtinim ą (žr. 65 skirsn į ir 
priedėlį „Apibrėžtys“).  
Rezultatai  
71. Visi duomenys tur ėtų būti apibendrinti lentel ėse, pateikiant atitinkam ą statis­
tinį įvertinimą, kaip aprašyta šio skyriaus tekste. Radioaktyvumo skai čia­
vimų duomenys tur ėtų būti apibendrinti ir pateikti atsižvelgiant į tyrimą, 
paprastai – mikrogramais arba miligramais, tenkan čiais ėminio masei, ta čiau 
gali būti naudojami ir kiti matavimo vienetai. Šiame skyriuje tur ėtų būti 
pateiktos grafin ės rezultat ų iliustracijos, tipini ų chromatografijos ir spektro ­
metrijos duomen ų kopijos, metabolit ų identifikavimo ir (arba) kiekybinio 
įvertinimo duomenys ir numanomi metaboliniai keliai, nurodant metabolit ų 
molekulin ę struktūrą. Be to, jeigu taikytina, šiame skyriuje tur ėtų būti 
pateikta tokia informacija:  
1. iš šlapimo, išmat ų, iškvėpto oro ir narvelyje buvusio šlapimo ir išmat ų 
paplavų regeneruotas radioaktyvi ų izotopų kiekis ir procentin ė jų dalis:  
— jeigu atliekant tyrimus doz ė duodama per od ą, taip pat tur ėtų būti 
pateikti duomenys apie bandomosios chemin ės medžiagos regenera ­
vimą iš paveiktos odos, odos nuoplov ų ir apie liekam ąjį radioakty ­
vumą odą gaubiančioje aparat ūroje ir metabolizmo kameroje, taip pat 
odos plovimo tyrimo rezultatus. Išsamesnis aptarimas pateiktas 74–77 
skirsniuose,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— jeigu tai inhaliaciniai tyrimai, taip pat tur ėtų būti pateikti duomenys 
apie bandomosios chemin ės medžiagos regeneravim ą iš plaučių ir 
nosies audini ų (8). Išsamesnis aptarimas pateiktas 78 skirsnyje;  
2. Pasiskirstymas audiniuose, nurodomas procentine duotos doz ės dalimi ir 
koncentracija (mikrogramais, tenkan čiais audinio gramui) ir pateikiant 
audinių ir kraujo k ūnelių arba audini ų ir plazmos santykius;  
3. medžiag ų balansas, sudarytas pagal kiekvien ą tyrimą, pateikiant k ūno 
audinių ir išskyr ų aprašus;  
4. koncentracijos plazmoje ir su plazma susij ę toksikokinetiniai parametrai 
(biologinis įsisavinimas, PPK, C  max , T max , išsivalymas, pusin ės elimina ­
cijos laikas), nustatyti atitinkamu (-ais) b ūdu (-ais) davus doz ę; 
5. bandomosios chemin ės medžiagos sugerties greitis ir laipsnis, nustatyti 
atitinkamu (-ais) b ūdu (-ais) davus doz ę; 
6. iš išskyr ų surinkti bandomosios chemin ės medžiagos ir metabolit ų kiekiai 
(nurodomi kaip duotos doz ės procentin ė dalis);  
7. nuoroda į papildom ų duomen ų šaltinius, kuriuose gali b ūti atskirų 
gyvūnų duomenų apie visas matuojamas pasekmes (pvz., doz ės davimo 
būdas, procentinis regeneravimas, toksikokinetiniai parametrai ir t. t.);  
8. diagrama su si ūlomais metabolizmo b ūdais ir metabolit ų molekulin ėmis 
struktūromis.  
Aptarimas ir išvados  
72. Šiame skyriuje autorius (-iai) tur ėtų: 
1. pateikti si ūlomą metabolizmo b ūdą, pagrįstą bandomosios chemin ės 
medžiagos metabolizmo ir perdavimo rezultatais;  
2. aptarti galimas gyv ūnų rūšių ir lyčių skirtumus, susijusius su bandomo ­
sios chemin ės medžiagos perdavimu ir (arba) biologine transformacija;  
3. pateikti lentel ėse ir aptarti metabolit ų tapatumą ir kiekį, išsivalymo grei ­ 
čius, bioakumuliacijos galimyb ę ir pirmin ės cheminės medžiagos ir (arba) 
metabolito (- ų) likučių audiniuose kiek į, taip pat, jeigu taikytina, galimus 
nuo dozės priklausomus toksikokinetini ų parametr ų pokyčius; 
4. įtraukti į šį skyrių susijusius toksikokinetinius duomenis, gautus atliekant 
toksiškumo tyrimus;  
5. pateikti tiksli ą išvadą, kurią galima pagr įsti tyrimo rezultatais;  
6. įtraukti daugiau skyri ų (jeigu reikia arba jeigu taikytina).  
73. Norint pateikti pagalbin ės bibliografin ės informacijos, lenteli ų, diagram ų, 
priedų ir t. t., tur ėtų būti įtraukiami papildomi skyriai.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ALTERNATYV ŪS POVEIKIO B ŪDAI 
Poveikis per od ą 
Dozės davimas per od ą 
74. Šiame skirsnyje pateikiama specifin ės informacijos apie bandomosios 
cheminės medžiagos toksikokinetines savybes, kai doz ė duodama per od ą. 
Nagrinėjant sugert į per od ą reikėtų remtis šio priedo B.44 skyriumi 
[„Sugertis per od ą. In vivo  metodas“ (9)]. Nagrin ėjant kitas pasekmes, 
pvz., pasiskirstym ą ir metabolizm ą, gali būti taikomas šis – B.36 – bandymo 
metodas. Doz ę duodant per od ą, gali būti duodama vieno arba daugiau 
dydžių bandomosios chemin ės medžiagos doz ės. Bandomoji chemin ė 
medžiaga (pvz., neskiesta, skiesta arba preparuota medžiaga, kurios sud ėtyje 
yra chemin ės medžiagos, kuria daromas poveikis per od ą) turėtų būti tokia 
pat, kuri gali tur ėti poveikio žmon ėms arba kitoms galimoms tikslin ėms 
gyvūnų rūšims (arba gali b ūti naudojamas realus tokios medžiagos pakai ­
talas). Doz ės (-ių) dydis (-žiai) tur ėtų būti parenkami pagal šio bandymo 
metodo 20–26 skirsnius. Parenkant per od ą duodamą dozę galima atsižvelgti 
į tokius veiksnius kaip numatomas poveikis žmogui ir (arba) doz ės, kurias 
taikant buvo pasteb ėtas toksiškumas per kitus toksinio poveikio per od ą 
tyrimus. Per od ą duodamos doz ės prireikus tur ėtų būti ištirpinamos tinka ­
mame nešiklyje ir duodamos parenkant tok į tūrį, kurio pakakt ų duoti doz ę. 
Prieš pat bandym ą nuo bandom ųjų gyvūnų kūno sprando srityje nukerpamas 
kailis. Galima ir skusti, bet tai tur ėtų būti atliekama apytikriai prieš 24 
valandas iki bandymo. Jeigu kailis kerpamas arba skutamas, reik ėtų stengtis 
nenutrinti odos, nes d ėl to gali pasikeisti jos pralaidumas. Bandomajai 
cheminei medžiagai užd ėti turėtų būti nukerpama arba nuskutama apie 
10 % kūno paviršiaus Jeigu chemin ės medžiagos labai toksiškos, paden ­
giamas paviršiaus plotas gali b ūti mažesnis nei apytikriai 10 %, bet kaip 
galima didesnis plotas tur ėtų būti padengiamas plonu vienodu sluoksniu. 
Toks pat paviršiaus ploto apdorojimas tur ėtų būti taikomas visoms bandym ų 
per odą grupėms. Vietos, per kurias duodama doz ė, turėtų būti apsaugotos 
tinkama gerai pritvirtinta danga. Gyv ūnai turėtų būti laikomi atskirai.  
75. Turėtų būti atliktas odos plovimo tyrimas, skirtas įvertinti duotos bandomo ­
sios chemin ės medžiagos doz ės dydį, kuris gali b ūti pašalinamas nuo odos 
plaunant paveikt ą odą švelniu muilu ir vandeniu. Šis tyrimas taip pat gali 
padėti nustatyti masi ų balansą, kai bandomoji chemin ė medžiaga duodama 
per odą. Atliekant š į odos plovimo tyrim ą, dviem gyv ūnams tur ėtų būti 
duodama viena bandomosios chemin ės medžiagos doz ė. Dozės dydis tur ėtų 
būti parenkamas pagal šio bandymo metodo 23 skirsn į (taip pat žr. 76 
skirsnį, kuriame aptariama s ąlyčio su oda trukm ė). Turėtų būti nustatyti 
plaunant regeneruojami bandomosios chemin ės medžiagos kiekiai, kad 
būtų galima įvertinti bandomosios chemin ės medžiagos pašalinimo plaunant 
veiksmingum ą. 
76. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga n ėra pernelyg ėsdinanti, ji tur ėtų būti 
dedama ir laikoma ant odos ne trumpiau kaip šešias valandas. Pašalinant 
dangą, paveikta sritis tur ėtų būti nuplaunama pagal odos plovimo proced ūrą 
(žr. 75 skirsn į). Turėtų būti ištirtas ant dangos ir paplavose lik ęs bandomo ­
sios chemin ės medžiagos kiekis. Baigiant tyrimus, kiekvienas gyv ūnas 
turėtų būti humaniškai numarintas pagal antr ąjį (2) literat ūros šaltin į, o 
paveikta oda tur ėtų būti nudirta. Tur ėtų būti ištirtas atitinkamoje paveiktos 
odos dalyje lik ęs bandomosios chemin ės medžiagos (radioaktyvi ų izotopų) 
kiekis.  
77. Vertinant vaist ų toksikokinetines savybes, atsižvelgiant į atitinkam ą regla­
mentavimo sistem ą gali reik ėti taikyti kitokias proced ūras. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Inhaliacinis poveikis  
78. Turėtų būti taikoma viena bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija 
(arba, jeigu reikia, daugiau). Koncentracija (-os) tur ėtų būti parenkamos 
pagal šio bandymo metodo 20–26 skirsnius. Inhaliacinis poveikis tur ėtų 
būti daromas naudojant nosies arba snukio gaubtus, kad b ūtų išvengta suger ­
ties kitais poveikio b ūdais (8). Jeigu taikomos kitokios inhaliacinio poveikio 
procedūros, pakeitimai tur ėtų būti pagrįsti dokumentais. Tur ėtų būti nusta­
tyta inhaliacinio poveikio trukm ė; įprasta poveikio trukm ė – 4–6 val.  
LITERAT ŪRA 
1. OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the SAFEty of 
Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, 
Paris.  
2. OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation; Environmental Health and SAFEty Publications, Series 
on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris.
 
3. Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the 
pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regu ­
latory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81.  
4. Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micro ­
scopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25–40.
 
5. Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist 
H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. 
(2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regula ­
tory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411.
 
6. Šio priedo B.45 skyrius. Sugertis per od ą. In vitro metodas.  
7. IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, 
International Programme on Chemical SAFEty.  
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris.
 
9. Šio priedo B.44 skyrius. Sugertis per od ą. In vivo metodas.  
10. Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural 
Chemical SAFEty Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.  
11. Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel 
Dekker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Priedėlis 
APIBRĖŽTYS  
Sugertis –  cheminės medžiagos sug ėrimas į audinius arba perdavimas iš vieno 
audinio į kitą. Sugertis siejama su pirminiu junginiu ir visais jo metabolitais. 
Nereikėtų painioti su biologiniu įsisavinimu.  
Kaupimasis (bioakumuliacija) –  bandomosios chemin ės medžiagos kiekio 
audiniuose (paprastai – riebaliniuose audiniuose, davus kartotin ę dozę) didėjimas 
laikui bėgant; jeigu bandomosios chemin ės medžiagos patekimo į kūną greitis 
didesnis už tos medžiagos šalinimo greit į, bandomoji chemin ė medžiaga kaupiasi 
organizme ir gali susidaryti toksiškos bandomosios chemin ės medžiagos koncent ­
racijos.  
SPMŠ –  sugerties, pasiskirstymo, metabolizmo ir šalinimo santrumpa.  
PPK (plotas po plazmos koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomyb ės 
kreive) –  plotas po kreive, susidarantis bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracijos ir laiko tarpusavio priklausomyb ės grafike. Jis parodo bendr ą 
per iš anksto nustatyt ą laikotarp į kūno absorbuot ą bandomosios chemin ės 
medžiagos kiek į. Jeigu priklausomyb ė tiesinė, PPK (nuo nulinio laiko momento 
iki begalyb ės) yra proporcingas bendram k ūno sugertam bandomosios chemin ės 
medžiagos kiekiui, nepaisant sugerties grei čio. 
Autoradiografija (viso k ūno autoradiografija) –  metodika, skirta kokybiškai ir 
(arba) kiekybiškai įvertinti radioaktyvios bandomosios chemin ės medžiagos 
buvimą audiniuose, naudojant rentgeno juost ą arba modernesn ę skaitmenin ę 
fosforografij ą, skirtą atvaizduoti radioaktyviu izotopu žym ėtąsias molekules 
arba molekuli ų fragmentus registruojant tiriamo objekto spinduliuojam ą radiaciją. 
Kiekybinė viso kūno autoradiografija, palyginti su organ ų skrodimu, gali b ūti 
naudingesn ė vertinant bandomosios chemin ės medžiagos pasiskirstym ą ir bend­
rąjį radioaktyvios medžiagos regeneravim ą bei išskyrim ą audiniuose. Pvz., šis 
metodas naudingesnis tuo, kad j į galima taikyti kaip pavyzd į naudojant pigmen ­
tinį gyvūną, siekiant įvertinti galim ą bandomosios chemin ės medžiagos jungim ąsi 
su melaninu, galin čiu surišti tam tikras molekules. Ta čiau, nors šiuo metu galima 
gauti tinkamas viso k ūno didelio masto mažo giminiškumo jungimosi viet ų 
apžvalgas, jo geba atpažinti specifines tikslines vietas, pvz., jungimosi prie recep ­
torių vietas, kurioms aptikti b ūtina gana didel ė raiška ir didelis jautris, yra ribota. 
Taikant autoradiografij ą, duodamo junginio masi ų balanso nustatymo bandymai 
turėtų būti atliekami kaip atskira bandym ų grupė arba kaip atskiras tyrimas nei 
pasiskirstymo audiniuose bandymas; visos išskyros (taip pat galb ūt įskaitant 
iškvėptą orą) ir visos skerdenos homogenizuojamos ir apib ūdinamos atliekant 
scintiliacijos skystyje skai čiavimus.  
Šalinimas su tulžimi –  šalinimas per tulžies latakus.  
Bioakumuliacija –  žr. „Kaupimasis“.  
Biologinis įsisavinimas –  duotos doz ės dalis, pasiekianti sistemin ę apytaką arba 
patenkanti į fiziologinio aktyvumo viet ą. Paprastai bandomosios chemin ės 
medžiagos biologinis įsisavinimas siejamas su pirminiu junginiu, ta čiau gali 
būti siejamas ir su jo metabolitu. Nagrin ėjama tik viena chemin ė forma.  Pastaba:  
biologinis įsisavinimas n ėra tas pats, kas sugertis. Pvz., oralin ės sugerties (t. y. 
patekimo į žarnų sieneles ir vartin ę apytakos sistem ą) ir biologinio įsisavinimo (t. 
y. patekimo į sisteminę kraujotak ą ir audinius) skirtum ų, be kitų priežasčių, gali 
atsirasti d ėl cheminės medžiagos irimo vykstant metabolizmui per žarn ų sieneles 
arba atgaliniam nutek ėjimui į žarnos spind į arba dėl presisteminio metabolizmo 
kepenyse (10). Toksin ės sudedamosios dalies (pirminio junginio arba metabolito) 
biologinis įsisavinimas yra labai svarbus parametras vertinant žmon ėms 
gresiančią riziką (atliekant didžiausi ųjų dozių ekstrapoliavim ą į mažiausi ąsias, 
vieno poveikio b ūdo ekstrapoliavim ą į kitą), siekiant nustatyti vidin ę vertę 
remiantis išorine NNPL arba OD verte (taikytos doz ės). Tiriant per burn ą duotos 
dozės poveikį kepenims pakanka ištirti oralin ę sugertį. Tačiau, jeigu poveikis 
daromas ne per patekimo viet ą, vėliau vertinant rizik ą paprastai patikimiau taikyti 
biologinio įsisavinimo, o ne sugerties parametr ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Biologinis tvarumas –  žr. „Tvarumas“.  
Biologinė transformacija –  (paprastai fermentinis) dominan čios bandomosios 
cheminės medžiagos virsmas k ūne kita chemine medžiaga. Metabolizmo sino ­
nimas.  
C max – maksimali (didžiausia) koncentracija kraujyje (plazmoje, serume) davus 
dozę arba maksimalus (didžiausias) šalinimas (su šlapimu arba išmatomis) davus 
dozę. 
Išsivalymo greitis –  kiekybinis matas, rodantis per laiko vienet ą iš kraujo, 
plazmos arba tam tikro audinio pašalinam ą bandomosios chemin ės medžiagos 
kiekį. 
Atskira dalis –  struktūrinė arba biochemin ė kūno, audinio arba l ąstelės dalis 
(arba) vienetas, atskirtas nuo likusios dalies.  
Detoksifikacijos b ūdai –  procesų, kuriais toksiškos chemin ės medžiagos paša ­
linamos iš k ūno vykstant medžiag ų apykaitai arba su išskyromis, seka.  
Pasiskirstymas –  bandomosios chemin ės medžiagos ir jos produkt ų išsisklai­
dymas po organizm ą. 
Fermentai, izofermentai –  baltymai, katalizuojantys chemines reakcijas. Izofer ­
mentai – tai fermentai, katalizuojantys panašias chemines reakcijas, ta čiau 
turintys kitoki ą aminorūgščių seką. 
Fermentų parametrai –  K m – Michaelio konstanta, V  max – didžiausias greitis.  
Šalinimas –  procesas (-ai), kuriuos (-iais) duota bandomoji chemin ė medžiaga ir 
(arba) jos metabolitai pašalinami iš k ūno. 
Išoriškai –  veikiant iš organizmo arba sistemos išor ės arba susidarant organizmo 
arba sistemos išor ėje. 
Ekstrapoliacija –  vienos arba daugiau nežinom ų verčių išvedimas remiantis 
žinomais arba pasteb ėtais dalykais.  
Pusinės eliminacijos laikas (t  1/2 ) – laikas, kurio reikia, kad bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracija atskiroje dalyje sumaž ėtų per pusę. Paprastai 
ši sąvoka vartojama kalbant apie koncentracij ą plazmoje arba apie bandomosios 
cheminės medžiagos kiek į visame k ūne. 
Sužadinimas, ferment ų sužadinimas –  ferment ų sintezė, kaip reakcija į 
aplinkos veiksn į arba molekul ę sukėlėją. 
Tiesiškumas, tiesin ė kinetika –  kinetiniu poži ūriu procesas yra tiesinis, jeigu 
visi perdavimo iš vienos atskirosios dalies į kitą greičiai yra proporcingi 
esamiems kiekiams arba koncentracijoms, t. y. pirmojo laipsnio. Išsivalymo ir pasiskirstymo dydžiai, taip pat pusin ės eliminacijos laikai atitinkamai yra 
konstantos. Pasiektos koncentracijos yra proporcingos dozi ų dydžiams (povei ­
kiui), lengviau prognozuoti akumuliacij ą. Tiesiškum ą arba netiesiškum ą galima 
įvertinti lyginant susijusius parametrus (pvz., PPK), nustatytus davus skirtingas 
dozes arba po vienkartinio ir kartotinio poveikio. Jeigu priklausomyb ės nuo 
dozės nėra, tai gali b ūti požymis, kad junginio metabolizmo procese dalyvau ­
jantys fermentai yra įsotinti; PPK padid ėjimas po kartotin ės dozės, palyginti su 
vienkartiniu poveikiu, gali b ūti metabolizmo slopinimo požymis, o PPK maž ė­
jimas gali b ūti metabolizmo sužadinimo požymis [taip pat žr. (11)].
 
Masių balansas –  bandomosios chemin ės medžiagos patekimo į sistemą ir paša­
linimo iš jos apskaita.  
Medžiagos balansas –  žr. „Masi ų balansas“.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Toksinio poveikio mechanizmas (b ūdas), veikimo mechanizmas (b ūdas) –  
veikimo mechanizmas yra specifin ės biochemin ės sąveikos, per kurias pasireiškia 
bandomosios chemin ės medžiagos poveikis. Veikimo b ūdas yra bendresnio pob ū­
džio būdai, kuriais pasireiškia bandomosios chemin ės medžiagos toksiškumas.  
Metabolizmas –  biologin ės transformacijos sinonimas.  
Metabolitai –  metabolizmo arba metabolini ų procesų produktai.  
Oralinė sugertis –  bandomosios chemin ės medžiagos doz ės procentin ė dalis, 
absorbuota per doz ės davimo viet ą (t. y. per virškinimo trakt ą). Šis labai svarbus 
parametras gali b ūti naudojamas norint sužinoti duotos bandomosios chemin ės 
medžiagos dal į, kuri pasiekia vartin ę veną, o vėliau – kepenis.  
Pasiskirstymo koeficientas –  cheminės medžiagos skirtingo tirpumo dviejuose 
tirpikliuose matas.  
Didžiausieji lygiai kraujyje (plazmoje, serume) –  didžiausia koncentracija 
kraujyje (plazmoje, serume) davus doz ę (taip pat žr. „C  max “). 
Tvarumas (biologinis tvarumas) –  ilgalaikis chemin ės medžiagos išlikimas 
(biologinėje sistemoje) d ėl atsparumo irimui ir (arba) šalinimui.  
Analogijos metodas –  vienos arba daugiau chemini ų medžiagų pasekmės infor­
macijos naudojimas prognozuojant tikslin ės cheminės medžiagos pasekm ę. 
Receptori ų mikroskopin ė autoradiografija (arba receptori ų mikroautora ­
diografija) –  metodika, kuri gali b ūti taikoma tirti ksenobiotini ų medžiag ų 
sąveiką su konkre čiomis audini ų sritimis arba l ąstelių populiacijomis, pvz., atlie ­
kant jungimosi prie receptori ų arba konkre čių veikimo b ūdų tyrimus, kuriems 
gali reikėti didelės raiškos ir didelio jautrio, kuri ų gali būti neįmanoma užtikrinti 
kitokiais metodais, pvz., viso k ūno autoradiografijos.  
Dozės davimo b ūdas (per burn ą, intraveninis, per od ą, įkvepiant ir t. t.) –  
priemonės, kuriomis chemin ės medžiagos perduodamos į kūną (pvz., per burn ą 
zondu, per burn ą su pašaru, per od ą, įkvepiant, suleidžiant į veną ir t. t.).  
Įsotinimas –  būklė, kai vienas arba daugiau kinetini ų procesų (pvz., sugertis, 
metabolizmas arba išsivalymas) yra maksimalaus lygio (t. y. „ įsotintas“).  
Jautris –  metodo arba prietaiso geba išskirti matavimo atsakus, rodan čius skir­
tingus dominan čio kintamojo lygius.  
Pastovūs lygiai kraujyje (plazmoje) –  nepusiausvyrin ė atviros sistemos b ūklė, 
kai visos sistemoje veikian čios jėgos nėra tiksliai atsveriamos priešin ėmis 
jėgomis ir kai vis ų tos sistemos element ų koncentracija yra pastovi, nors 
medžiaga ir teka per sistem ą. 
Sistemų modeliai (fiziologija pagr įsti toksikokinetiniai modeliai, farmakoki ­
netika pagr įsti modeliai, fiziologija pagr įsti farmakokinetiniai modeliai, 
biologija pagr įsti modeliai ir t. t.) –  abstraktūs modeliai, pagal kuriuos mate ­
matine kalba aprašomas sistemos veikimas.  
Tikslinis organas –  audinys, kuriame pasireiškia pagrindinis neigiamas toksin ės 
medžiagos poveikis.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Bandomoji chemin ė medžiaga –  pagal šį bandymo metod ą bandoma chemin ė 
medžiaga arba mišinys.  
Pasiskirstymas audiniuose –  abipusis bandomosios chemin ės medžiagos jud ė­
jimas iš vienos k ūno vietos į kitą. Pasiskirstym ą audiniuose galima ištirti atliekant 
organų skrodim ą, homogenizavim ą, deginim ą ir scintiliacijos skystyje skai čia­
vimus arba taikant kokybin ę ir (arba) kiekybin ę viso kūno autoradiografij ą. 
Pirmasis metodas yra naudingas, kai norima nustatyti koncentracij ą ir procentin į 
regeneravim ą iš audini ų ir likusios t ų pačių gyvūnų skerdenos, ta čiau juo gali 
būti pasiekiama nepakankama raiška visuose audiniuose ir užtikrinamas mažesnis 
nei idealus bendrasis regeneravimas (< 90 %). Žr. pirmiau pateikt ą šio metodo 
apibrėžtį. 
T max – laikas, kurio reikia norint pasiekti C  max . 
Toksikokinetika (farmakokinetika) –  chemini ų medžiag ų sugertis, pasiskirs ­
tymas, metabolizmas ir šalinimas laikui b ėgant.  
Modelių patvirtinimas –  modelio tinkamumo nuosekliai apib ūdinti turimus 
toksikokinetinius duomenis įvertinimo proced ūra. Modeliai gali b ūti vertinami 
taikant statistin į ir vizualin į modeliuojam ų prognozi ų, gautų naudojant eksperi ­
mentines vertes, palyginim ą su bendruoju nepriklausomu kintamuoju (pvz., 
laiku). Vertinimo apimtis tur ėtų būti pagrįsta atsižvelgiant į numatom ą modelio 
paskirtį. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  ŪMIAI VEIKIANT ORGANINIAIS FOSFORO JUNGINIAIS 
SUKELTO UŽDELSTO NEUROTOKSIŠKUMO BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Siekiant įvertinti medžiag ų toksiškum ą reikia atsižvelgti į tam tikrų 
klasių medžiag ų potencial ą sukelti tam tikr ų tipų neurotoksin į 
poveikį, kuris nenustatomas įprastais toksiškumo bandymais. Paste ­
bėta, kad kai kurie organiniai fosforo junginiai sukelia uždelst ą 
neurotoksin į poveikį, tad reikt ų apsvarstyti ši ų medžiag ų įvertinimą. 
Siekiant nustatyti medžiagas, sukelian čias uždelst ą polineuropatij ą, 
gali būti taikomi atrankos bandymai  in vitro , tačiau neigiami 
bandymo  in vitro  duomenys dar ne įrodo, kad duotoji medžiaga 
nėra neurotoksiška.  
Žiūrėti Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Organiniai fosforo junginiai apima organinio fosforo esterius, tioes ­
terius ar organinio fosforo anhidridus, taip pat organinio fosforo, 
organinio fosfono ar organinio fosforamido r ūgštis ar giminingas 
fosforotiono, fosforonotiono ar fosforotioamido r ūgštis, ar kitas 
medžiagas, kurios gali sukelti uždelst ą neurotoksin į poveikį, būdingą 
šiai medžiag ų klasei.  
Uždelstas neurotoksiškumas yra sindromas, susij ęs su ataksijos, 
nugaros smegen ų ir periferinio nervo distalin ės aksonopatijos ilgai 
trunkančiu uždelsimu bei neuropatijos sukeltu esteraz ės slopinimu 
nervų audiniuose.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Norint įrodyti, jog laboratorin ėmis sąlygomis bandom ųjų rūšių 
atsakas labai nesikei čia, etalonin ės medžiagos gali b ūti išbandytos 
su teigiama kontroline gyv ūnų grupe.  
Plačiai naudojamas neurotoksikantas yra tri-o-tolilfosfatas (CAS 
78–30–8, Einecs 201–103–5, CAS nomenklat ūra: fosforo r ūgštis, 
tris(2-metilfenil)esteris), taip pat žinomas kaip tris-o-krezilfosfatas.  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Naminėms vištoms, kurios, jeigu reikia, yra apsaugotos nuo ūmaus 
cholinerginio poveikio, per virškinam ąjį traktą duodama bandomo ­
sios medžiagos vienkartin ė dozė. 21 dien ą stebimi gyv ūnų elgesio 
nukrypimai, ataksija ir paralyžius. Paprastai pra ėjus 24 ir 48 valan ­
doms po dozavimo iš kiekvienos grup ės atsitiktiniu atrankos b ūdu 
paimtoms vištoms atliekami biocheminiai tyrimai, t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esteraz ės slopinimas. Pra ėjus 21 dienai po 
medžiagos poveikio, likusios vištos numarinamos ir tam tikri nerv ų 
audiniai ištiriami histopatologiškai.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.5.1.  Pasiruošimas  
Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesergan čios atlikti bandym ą truk­
dančiomis virusin ėmis ligomis, negaunan čios medikament ų ir netu­
rinčios eisenos pakitim ų, atsitiktin ės atrankos principu paskirstomos į 
bandomąją ir kontrolin ę grupes ir mažiausiai 5 dienas prieš bandym ą 
aklimatizuojamos laboratorijos s ąlygomis.  
Reikia naudoti pakankamai didelius narvus arba aptvarus, kurie leist ų 
vištoms laisvai jud ėti ir būtų lengva steb ėti jų eiseną. 
Bandomoji medžiaga tur ėtų būti dozuojama per virškinam ąjį traktą, 
naudojant zond ą, želatinines kapsules arba lygiaver čiu metodu. Skys ­ 
čiai gali b ūti duodami neskiesti arba ištirpinti nešiklyje, pavyzdžiui, 
kukurūzų aliejuje; kietosios medžiagos tur ėtų būti ištirpinamos, nes 
didelės kietųjų medžiag ų dozės želatinin ėse kapsul ėse gali b ūti 
neefektyviai absorbuojamos. Jei naudojamas kitas nešiklis nei 
vanduo, jo toksin ės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, 
tai prieš bandym ą jos turi b ūti nustatytos.  
1.5.2.  Bandymo s ąlygos  
1.5.2.1.  Bandomieji gyv ūnai 
Rekomenduojamos nuo 8 iki 12 m ėnesių amžiaus jaunos suaugusios 
naminės vištos dedekl ės (Gallus gallus domesticus ). Turėtų būti 
naudojamos standartinio dydžio veisl ės ir atmainos vištos, užaugintos 
sąlygomis, leidžian čiomis laisvai jud ėti. 
1.5.2.2.  Skai čius ir lytis  
Be bandomosios grup ės turi būti dar nešiklio kontrolin ė grupė ir 
teigiamos kontrol ės grupė. Su nešiklio kontrolin ės grupės gyvūnais 
reikia elgtis lygiai taip pat kaip ir su bandomaisiais gyv ūnais, 
išskyrus tai, kad jie negauna bandomosios medžiagos.  
Kiekvienoje paukš čių grupėje turi b ūti toks višt ų skaičius, kad 
mažiausiai šešias b ūtų galima numarinti biocheminiams tyrimams 
(po tris tam tikrais dviem laiko momentais) ir kad po 21 steb ėjimo 
dienos patologiniams tyrimams išgyvent ų dar šešios vištos.  
Teigiamos kontrol ės grupė gali būti bandoma paraleliai su kitomis 
grupėmis arba tai gali b ūti nesenai atlikto ankstesnio bandymo kont ­
rolinė grupė. Šioje grup ėje turi b ūti mažiausiai šešios vištos, 
paveiktos žinomais uždelsto veikimo neurotoksikantais, trys vištos 
yra skirtos biocheminiams tyrimams ir trys patologijai tirti. Reko ­
menduojama periodiškai atnaujinti ankstesni ų bandym ų duomenis. 
Kai bandym ų laboratorija pakei čia kurį nors esmin į bandymo 
elementą (pvz., višt ų atmainą, pašarus, laikymo s ąlygas), turi b ūti 
gauti nauji teigiamos kontrol ės duomenys.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Dozės dydžiai  
Pagrindiniame bandyme naudotin ų dozių dydžiams nustatyti reikia 
atlikti išankstin į bandymą su atitinkamu višt ų ir dozių grupių skai­ 
čiumi. Kad b ūtų galima nustatyti pagrindinio bandymo dozi ų ribas, 
paprastai išankstiniame bandyme turi b ūti tam tikras gaištamumas. 
Norint užkirsti keli ą dėl ūmaus cholinerginio poveikio kylan čioms 
žūtims, galima naudoti atropin ą ar kitą apsaugin ę medžiag ą, kuri 
netrukdyt ų pasireikšti uždelsto neurotoksiškumo atsakams. Siekiant 
apskaičiuoti maksimali ą nemirtin ą bandomosios medžiagos doz ę, 
galima panaudoti daugyb ę tiriamųjų metodų (žiūrėkite metod ą B. 1 
bis). Parenkant doz ę gali būti naudingi anks čiau atliktų bandymų su 
vištomis duomenys arba bet kokia kita toksikologin ė informacija.  
Bandomosios medžiagos doz ės dydis pagrindiniame bandyme turi 
būti kuo aukštesnis atsižvelgiant į išankstinio bandymo rezultatus ir 
aukščiausią ribinę 2 000 mg/kg k ūno masės dozę. Kad ir koks b ūtų 
gaištamumas, po 21 dienos turi likti reikiamas išgyvenusi ų paukščių 
skaičius – šeši biocheminiams ir šeši histologiniams tyrimams. 
Siekiant užkirsti keli ą gaištamumui d ėl ūmaus cholinerginio 
poveikio, galima naudoti atropin ą arba bet kuri ą kitą apsaugin ę 
medžiagą, netrukdan čią pasireikšti uždelsto neurotoksiškumo atsa ­
kams.  
1.5.2.4.  Ribinis bandymas  
Jeigu tirtas doz ės lygis, ne žemesnis, negu 2 000 mg/kg k ūno masės, 
nesukelia pastebim ų toksinių poveikių ir jeigu iš turim ų duomenų 
apie strukt ūriškai panašias medžiagas toksinio poveikio nesitikima, 
didesnių dozių bandymai neb ūtini. Toks ribinis bandymas netai ­
komas tais atvejais, kai atsižvelgiant į žmonių sąlytį su medžiaga 
reikia naudoti didesnio dydžio doz ę. 
1.5.2.5.  Steb ėjimo laikotarpis  
Stebėjimo laikotarpis tur ėtų trukti 21 dien ą. 
1.5.3.  Bandymo eiga  
Po to, kai paukštis gauna apsaugin ę medžiagą, kuri užkerta keli ą nuo 
dėl ūmaus cholinerginio poveikio galimai ž ūčiai, duodama bandomo ­
sios medžiagos vienkartin ė dozė. 
1.5.3.1.  Bendrasis steb ėjimas  
Stebėjimai prasideda tuoj pat po medžiagos davimo. Pirmas dvi 
dienas visos vištos atidžiai stebimos kelis kartus, o v ėliau mažiausiai 
vieną kartą per dien ą 21 dieną arba iki nustatyto numarinimo. Visi 
toksiškumo požymiai turi b ūti registruojami, žymint j ų pradžią, tipą, 
ryškumą ir elgesio nukrypim ų trukmę. Ataksij ą reikėtų vertinti 
mažiausiai pagal keturi ų lygių skalę, taip pat reik ėtų nurodyti para ­
lyžių. Norint pasteb ėti minimal ų toksinį poveikį, vištos, atrinktos 
patologijai, mažiausiai du kartus per savait ę išimamos iš narv ų ir 
stebimas j ų judamasis aktyvumas, priver čiant jas jud ėti, pvz., kop ė­ 
čiomis. Kai pastebimi gaištantys ir patiriantys dideles kan čias bei 
skausmą paukščiai, jie išimami iš narv ų, humaniškai numarinami ir 
atliekama j ų nekroskopija.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
1.5.3.2.  Kūno masė 
Prieš bandomosios medžiagos davim ą visas vištas reikia pasverti, 
vėliau sveriama mažiausiai vien ą kartą per savait ę. 
1.5.3.3.  Biochemija  
Atsitiktin ės atrankos b ūdu šešios vištos iš kiekvienos bandomosios ir 
nešiklio kontrolin ės grupės bei trys vištos iš pozityvin ės kontrolin ės 
grupės (jei ši grup ė paraleliai bandoma) pra ėjus kelioms dienoms po 
dozavimo numarinamos, išimamos galvos smegenys ir juosmens 
dalies nugaros smegenys bei ištiriamas neuropatijos sukeltas este ­
razės slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti s ėdimojo nervo 
audinio neuropatijos sukelt ą esterazės slopinimo aktyvum ą. Paprastai 
praėjus 24 valandoms numarinami trys kontrolin ės ir trys bandomo ­
sios grup ės paukščiai, o praėjus 48 valandoms, dar po tris, tuo tarpu 
trys pozityvin ės kontrolės vištos numarinamos po 24 valand ų. Jeigu 
klinikiniai intoksikacijos požymiai (tai dažnai gali b ūti nustatyta 
stebint cholinergini ų požymių pradžios laik ą) rodo, kad toksiška 
medžiaga perduodama labai l ėtai, tada geriau paukš čių audinių 
pavyzdžius imti du kartus tarp 24 ir 72 valand ų po dozavimo.  
Jei laikoma reikalinga, galima ištirti acetilcholinesteraz ę (AChE). 
Tačiau gali įvykti spontanin ė AChE reaktyvacija  in vivo , o tai gali 
sąlygoti nepakankam ą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, stiprumo 
įvertinimą. 
1.5.3.4.  Bendroji nekroskopija  
Bendrosios nekroskopijos metu reikia apži ūrėti visų gyvūnų galvos 
bei nugaros smegen ų išvaizdą. 
1.5.3.5.  Histopatologinis ištyrimas  
Išgyvenusi ų visą stebėjimo period ą ir nepanaudot ų biocheminiams 
tyrimams paukš čių nervų audiniai turi b ūti mikroskopiškai ištirti. 
Audiniai turi b ūti fiksuojami  in situ , naudojant perfuzijos metod ą. 
Reikia atlikti smegen ėlių (vidurinį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, 
nugaros smegen ų ir periferini ų nervų pjūvius. Reikia atlikti nugaros 
smegenų pjūvius iš viršutinio kaklinio segmento, vidurin ės-krūtininės 
ir juosmens-kryžmens dali ų. Reikia atlikti distalini ų blauzdikaulio 
nervų ir jo atšak ų į skrandžio raumen į bei sėdimojo nervo pj ūvius. 
Šiuos pjūvius reikia dažyti atitinkamais dažais - b ūdingais mielinui ir 
aksonui.  
2. DUOMENYS  
Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio steb ė­
jimo) poži ūriu gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja 
uždelsto neurotoksiškumo bandymo t ęsimo. Tik šiuo poži ūriu 
dviprasmiai arba negalutiniai rezultatai gali reikalauti tolesnio įverti­
nimo.  
Turėtų būti pateikiami kiekvieno paukš čio duomenys. Be to, visi 
duomenys turi b ūti pateikiami lenteli ų forma, nurodant kiekvienoje 
tirtoje grup ėje bandymo pradžioje buvusi ų paukščių skaičių, 
paukščių su pažeidimais, elgesio ar biocheminiais pakitimais skai čių, 
šių pažeidim ų ar pakitim ų tipus ir j ų sunkumo laipsn į bei paukš čių 
procentą su kiekvieno pažeidimo ar pakitimo tipu ir sunkumo 
laipsniu.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitim ų pasireiškim ą ir 
sunkumo laipsn į bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, 
biochemijos ir histopatologini ų pakitimų bei visų kitų pastebėtų paki­
timų bandomojoje ir kontrolin ėje grupėse. 
Skaitmeniniai rezultatai tur ėtų būti apdoroti tinkamais ir priimtinais 
statistiniais metodais. Statistiniai metodai tur ėtų būti pasirinkti 
planuojant bandym ą. 
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, tur ėtų būti ši informacija:  
Bandomieji gyv ūnai: 
— panaudotos atmainos,  
— gyvūnų skaičius ir amžius,  
— gavimo šaltinis, laikymo s ąlygos ir kt.,  
— kiekvieno gyv ūno kūno masė bandymo pradžioje.  
Bandymo s ąlygos:  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos preparat ą, stabi­
lumą ir homogeniškum ą, kur tinkama,  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas,  
— informacija apie bandomosios medžiagos davim ą, 
— informacija apie pašar ų ir vandens kokyb ę, 
— dozės pasirinkimo pagrindimas,  
— informacija apie duotas dozes, įskaitant naudot ą nešiklį, jo tūrį ir 
duotos medžiagos fizikin ę formą, 
— apsaugin ės medžiagos tapatumas ir išsami informacija apie jos 
davimą. 
Rezultatai:  
— kūno masės duomenys,  
— grupės toksinio atsako duomenys, įskaitant nugaišim ą, 
— pasteb ėti klinikiniai poky čiai, jų sunkumo laipsnis ir trukm ė (ar 
grįžtami, ar ne),  
— smulkus biochemini ų metodų ir gautų duomenų aprašymas,  
— nekroskopijos duomenys,  
— smulkus vis ų gautų histopatologini ų duomenų aprašymas,  
— statistinis rezultat ų apdorojimas ten, kur tinka.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
Šis metodas atitinka OECD TG 418.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  ORGANINI Ų FOSFORO JUNGINI Ų SUKELTO UŽDELSTO 
NEUROTOKSIŠKUMO 28 DIEN Ų BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Siekiant įvertinti medžiag ų toksiškum ą reikia atsižvelgti į tam tikrų 
klasių medžiag ų potencial ą sukelti tam tikr ų tipų neurotoksin į 
poveikį, kuris nenustatomas įprastais toksiškumo bandymais. Paste ­
bėta, kad kai kurie organiniai fosforo junginiai sukelia uždelst ą 
neurotoksin į poveikį, tad reikt ų apsvarstyti ši ų medžiag ų įvertinimą. 
Siekiant nustatyti medžiagas, sukelian čias uždelst ą polineuropatij ą, 
gali būti taikomi atrankos bandymai  in vitro , tačiau neigiami 
bandymo  in vitro  duomenys dar ne įrodo, kad duotoji medžiaga 
nėra neurotoksiška.  
Atliekant š į 28 dienų uždelsto neurotoksiškumo bandym ą gaunama 
informacijos apie rizik ą sveikatai, kylan čią gaunant medžiag ą pakar­
totinai tam tikr ą laiko tarp ą. Šiuo bandymu gaunama informacijos 
apie reakcij ą į dozę bei galima nustatyti nepasteb ėto neigiamo 
poveikio rib ą, reikaling ą nustatant medžiagos saugumo kriterijus.  
Žiūrėti Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Organiniai fosforo junginiai apima organinio fosforo esterius, tioes ­
terius ar organinio fosforo anhidridus, taip pat organinio fosforo, 
organinio fosfono ar organinio fosforamido r ūgštis ar giminingas 
fosforotiono, fosforonotiono ar fosforotioamido r ūgštis, ar kitas 
medžiagas, kurios gali sukelti uždelst ą neurotoksin į poveikį, būdingą 
šiai medžiag ų klasei.  
Uždelstas neurotoksiškumas yra sindromas, susij ęs su ataksijos, 
nugaros smegen ų ir periferinio nervo distalin ės aksonopatijos ilgai 
trunkančiu uždelsimu bei neuropatijos sukeltu esteraz ės slopinimu 
nervų audiniuose.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Naminėms vištoms per virškinam ąjį traktą 28 dienas kasdien 
duodama bandomoji medžiaga. Medžiagos davimo periodu ir pra ėjus 
14 dienų po to bent vien ą kartą dienoje gyv ūnai stebimi siekiant 
nustatyti j ų elgesio nukrypimus, ataksij ą ir paralyži ų. Paprastai 
praėjus 24 ir 48 valandoms po paskutinio dozavimo, iš kiekvienos 
grupės atsitiktiniu atrankos b ūdu paimtoms vištoms atliekami bioche ­
miniai tyrimai, t. y. nustatomas neuropatijos sukeltas esteraz ės slopi­
nimas. Pra ėjus dviems savait ėms po paskutin ės dozės, likusios vištos 
numarinamos ir tam tikri nerv ų audiniai ištiriami histopatologiškai.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Pasiruošimas  
Sveikos jaunos suaugusios vištos, nesergan čios atlikti bandym ą truk­
dančiomis virusin ėmis ligomis, negaunan čios medikament ų ir netu­
rinčios eisenos pakitim ų, atsitiktin ės atrankos principu paskirstomos į 
bandomąją ir kontrolin ę grupes ir mažiausiai 5 dienas prieš bandym ą 
aklimatizuojamos laboratorijos s ąlygomis.  
Turi būti naudojami pakankamai dideli narvai arba aptvarai, kurie 
leistų vištoms laisvai jud ėti bei laisvai steb ėti jų eiseną. 
Bandomoji medžiaga kasdien septynias dienas per savait ę dozuojama 
per virškinam ąjį traktą, naudojant zond ą arba želatinines kapsules. 
Skysčiai gali b ūti duodami neskiesti arba ištirpinti nešiklyje, pavyz ­
džiui, kukur ūzų aliejuje; kietosios medžiagos tur ėtų būti ištirpinamos, 
nes didel ės kietųjų medžiag ų dozės želatinin ėse kapsul ėse gali būti 
neefektyviai absorbuojamos. Jei naudojamas kitas nešiklis nei vanduo, jo toksin ės savybės turi būti žinomos, o jeigu nežinomos, 
tai prieš bandym ą jos turi b ūti nustatytos.
 
1.4.2.  Bandymo s ąlygos  
1.4.2.1.  Bandomieji gyv ūnai 
Rekomenduojamos nuo 8 iki 12 m ėnesių amžiaus jaunos suaugusios 
naminės vištos dedekl ės (Gallus gallus domesticus ). Turėtų būti 
naudojamos standartinio dydžio veisl ės ir atmainos vištos, užaugintos 
sąlygomis, leidžian čiomis laisvai jud ėti. 
1.4.2.2.  Skai čius ir lytis  
Reikia sudaryti mažiausiai tris bandom ąsias grupes bei vien ą nešiklio 
kontrolinę grupę. Su nešiklio kontrolin ės grupės gyvūnais reikia 
elgtis lygiai taip pat kaip ir su bandomaisiais gyv ūnais, išskyrus 
tai, kad jie negaut ų bandomosios medžiagos.  
Kiekvienoje paukš čių grupėje reikia panaudoti tok į skaičių vištų, kad 
mažiausiai šešias galima b ūtų numarinti biocheminiams tyrimams (po 
tris, praėjus dviems skirtingiems laiko tarpams) ir, kad pra ėjus 14 
dienų po paskutinio dozavimo patologiniams tyrimams išgyvent ų dar 
šešios vištos.  
1.4.2.3.  Dozi ų dydžiai  
Dozės dydžius reikia parinkti atsižvelgiant į uždelsto neurotoksiš ­
kumo ūmaus bandymo rezultatus arba į jau turimus bandomosios 
medžiagos toksiškumo ar kinetinius duomenis. Pasirinkta didžiausia 
dozė turi sukelti toksin į poveikį, geriausiai uždelst ą neurotoksin į 
poveikį, tačiau turi nesukelti gyv ūno žūties ar nepakeliam ų kančių. 
Kiti mažėjančia tvarka einantys dozi ų lygiai turi sukelti atitinkamai 
mažesnius poky čius (atsakus), o mažiausias doz ės lygis tur ėtų nesu­
kelti pastebim ų neigiamų poveikių. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4.  Ribinis bandymas  
Jeigu tirtas doz ės lygis, ne žemesnis, negu 1 000 mg/kg k ūno 
masės/parai nesukelia pastebim ų toksinių poveikių ir jeigu iš turim ų 
duomenų apie strukt ūriškai panašias medžiagas nesitikima toksiš ­
kumo, didesni ų dozių bandymai neb ūtini. Toks ribinis bandymas 
netaikomas tais atvejais, kai atsižvelgiant į tikėtiną žmonių sąlytį 
su medžiaga reikia naudoti didesnio dydžio doz ę. 
1.4.2.5.  Steb ėjimo periodas  
Visi paukš čiai stebimi mažiausiai vien ą kartą per dien ą visą 
medžiagos dozavimo period ą ir 14 dien ų po jo, iki atliekamas skro ­
dimas.  
1.4.3.  Bandymo eiga  
Paukščiams bandomoji medžiaga duodama 28 dienas kasdien septy ­
nias dienas per savait ę. 
1.4.3.1.  Bendrasis steb ėjimas  
Stebėjimai prasideda tuoj pat po medžiagos davimo. 28 dozavimo 
dienas ir 14 dien ų po to visos vištos atidžiai stebimos mažiausiai 
vieną kartą per dieną arba iki nustatyto numarinimo. Visi toksiškumo 
požymiai turi b ūti registruojami, žymint j ų pradžią, tipą, sunkumo 
laipsnį ir trukm ę. Stebėjimas turi apimti elgesio nukrypimus, bet 
neturi jais apsiriboti. Ataksij ą reikėtų vertinti mažiausiai pagal 
keturių lygių skalę ir reikėtų žymėti paralyži ų. Norint pasteb ėti mini­
malų toksinį poveikį, vištos mažiausiai du kartus per savait ę 
išimamos iš narv ų ir stebimas j ų judamasis aktyvumas, priver čiant 
judėti, pvz., kop ėčiomis. Kai pastebimi gaištantys ir patiriantys 
dideles kan čias bei skausm ą paukščiai, jie išimami iš narv ų, huma­
niškai numarinami ir atliekama j ų nekroskopija.  
1.4.3.2.  Kūno masė 
Prieš pirm ąjį bandomosios medžiagos davim ą visas vištas reikia 
pasverti, v ėliau tai daroma mažiausiai vien ą kartą per savait ę. 
1.4.3.3.  Biochemija  
Atsitiktin ės atrankos b ūdu šešios vištos iš kiekvienos bandomosios ir 
nešiklio kontrolin ės grupių, praėjus kelioms dienoms po paskutin ės 
dozės, numarinamos, išimamos galvos smegenys ir juosmens dalies 
nugaros smegenys bei ištiriamas neuropatijos sukeltas esteraz ės 
slopinimo aktyvumas. Kartais naudinga ištirti s ėdimojo nervo 
audinio neuropatijos sukelt ą esteraz ės slopinimo aktyvum ą. 
Paprastai, pra ėjus 24 valandoms po paskutin ės dozės, numarinami 
trys kontrolin ės ir trys kiekvienos bandomosios grup ės paukščiai, o 
praėjus 48 valandoms, dar po tris. Jeigu ūmaus arba kit ų bandymų 
(pvz. toksikokinetini ų) duomenys rodo, kad po paskutin ės dozės 
geriau pasirinkti kit ą numarinimo laik ą negu siūloma, tuomet galima 
pasirinkti kit ą laiką ir pridėti atitinkamus dokumentus.  
Taip pat galima tirti acetilcholinesteraz ę (AChE). Ta čiau gali įvykti 
spontanin ė AChE reaktyvacija  in vivo , o tai gali s ąlygoti nepakan ­
kamą medžiagos, kaip AChE inhibitoriaus, stiprumo įvertinimą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
1.4.3.4.  Bendroji nekroskopija  
Bendrosios nekroskopijos, kuri atliekama numarintiems ir nugaišu ­
siems gyv ūnams, metu reikia apži ūrėti visų gyvūnų galvos bei 
nugaros smegen ų išvaizdą. 
1.4.3.5.  Histopatologinis ištyrimas  
Išgyvenusi ų visą stebėjimo period ą ir nepanaudot ų biocheminiams 
tyrimams paukš čių nervų audiniai turi b ūti mikroskopiškai ištirti. 
Audiniai turi b ūti fiksuojami  in situ , naudojant perfuzijos metod ą. 
Reikia tirti smegen ėlių (vidurinįjį-pailgąjį lygį), pailgųjų smegenų, 
nugaros smegen ų ir periferini ų nervų dalis. Reikia atlikti nugaros 
smegenų pjūvius iš viršutinio kaklinio segmento, vidurin ės-krūtininės 
ir juosmens-kryžmens dali ų. Reikia atlikti distalini ų blauzdikaulio 
nervų ir jo atšak ų į skrandžio raumen į bei sėdimojo nervo pj ūvius. 
Šiuos pjūvius reikia dažyti atitinkamais dažais - b ūdingais mielinui ir 
aksonui. Pradžioje reikia mikroskopiškai ištirti vis ų kontrolin ės ir 
didžiausios doz ės grupių paukščių fiksuotus audinius. Jeigu didžiau ­
sios dozės grupėje nustatomi pakitimai, reik ėtų mikroskopiškai tirti 
viduriniosios ir mažiausios doz ės grupių paukščių audinius.  
2. DUOMENYS  
Pasirinktų metodų (biochemijos, histopatologijos ir elgesio steb ė­
jimo) poži ūriu gauti neigiami rezultatai paprastai nereikalauja 
uždelsto neurotoksiškumo bandymo t ęsimo. Tik šiuo poži ūriu 
dviprasmiai arba negalutiniai rezultatai gali reikalauti tolesnio įverti­
nimo.  
Turėtų būti pateikiami kiekvieno paukš čio duomenys. Be to, visi 
duomenys turi b ūti pateikiami lenteli ų forma, nurodant kiekvienoje 
tirtoje grup ėje bandymo pradžioje buvusi ų paukščių skaičių, 
paukščių su pažeidimais, elgesio ar biocheminiais pakitimais skai čių, 
šių pažeidim ų ar pakitim ų tipus ir sunkumo laipsn į bei paukš čių 
procentą su kiekvieno pažeidimo ar pakitimo tipu ir sunkumo 
laipsniu.  
Gautus duomenis reikia vertinti pagal pakitim ų pasireiškim ą ir 
sunkumo laipsn į bei nustatant koreliacinius ryšius tarp elgesio, 
biochemijos ir histopatologini ų pakitimų bei visų kitų pastebėtų paki­
timų bandomosiose ir kontrolin ėje grupėse. 
Skaitmeniniai rezultatai tur ėtų būti apdoroti tinkamais ir priimtinais 
statistiniais metodais. Statistiniai metodai tur ėtų būti pasirinkti 
planuojant bandym ą. 
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje, jei įmanoma, pateikiama ši informacija:  
Bandomieji gyv ūnai: 
— panaudotos atmainos,  
— gyvūnų skaičius ir amžius,  
— gavimo šaltinis, laikymo s ąlygos ir kt.,  
— kiekvieno gyv ūno kūno masė bandymo pradžioje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
Bandymo s ąlygos:  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos paruošim ą, 
stabilumą ir homogeniškum ą, kur tinkama,  
— tirpiklio pasirinkimo pagrindimas,  
— išsami informacija apie poveik į bandomąja medžiaga,  
— išsami informacija apie pašar ų ir vandens kokyb ę, 
— dozės pasirinkimo pagrindimas,  
— informacija apie duotas dozes, įskaitant naudot ą nešiklį, jo turį ir 
duotos medžiagos fizikin ę formą, 
— pasirinkus biocheminiams tyrimams kit ą laiką (ne po 24 ir 48 
valandų), tokio pasirinkimo pagrindimas.  
Rezultatai:  
— kūno masės duomenys,  
— duomenys apie toksin į atsaką pagal doz ės lygį, įskaitant nugai ­ 
šimą, 
— nepastebimo neigiamo poveikio riba,  
— pasteb ėti klinikiniai poky čiai, jų sunkumo laipsnis ir trukm ė 
(grįžtami ar ne),  
— smulkus biochemini ų metodų ir gautų duomenų aprašymas,  
— nekroskopijos duomenys,  
— smulkus vis ų gautų histopatologini ų duomenų aprašymas,  
— statistinis rezultat ų apdorojimas ten, kur tinka.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
Šis metodas atitinka OECD TG 419.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  ŽINDUOLI Ų KEPEN Ų LĄSTELIŲ NENUMATYTOS DNR 
SINTEZĖS (NDS) BANDYMAS  IN VIVO  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 486 – Žinduoli ų kepenų ląstelių 
nenumatytos DNR sintez ės (NDS) bandym ą in vivo  (1997).  
1.1. ĮVADAS  
Žinduolių kepenų ląstelių nenumatytos DNR sintez ės (NDS) 
bandymo  in vivo  tikslas – nustatyti medžiagas, kurios sukelia DNR 
pažaidų reparacij ą žinduolių, paveiktų bandomąja medžiaga, kepen ų 
ląstelėse 1, 2, 3, 4.  
Šiuo bandymu galima ištirti genotoksin į cheminių medžiag ų poveikį 
kepenims. Galutinis nustatytas dydis parodo, kad kepen ų ląstelėse 
įvyksta DNR pažaidos, o v ėliau jų reparacij ą. Apskritai, absorbuot ų 
junginių metabolizmo pagrindin ė vieta yra kepenys. Tod ėl kepenys 
yra tinkamas DNR pažaid ų bandymo  in vivo  objektas.  
Jeigu nustatoma, kad bandomoji medžiaga nepasiekia tikslinio 
audinio, šio bandym ų metodo nereik ėtų naudoti.  
Nenumatytos DNR sintez ės (NDS) produktai analizuojami, įvertinant 
žymėtų nukleozid ų transport ą į ląsteles, kuriose nevyksta numatyta 
DNR sintez ė (paprastai vykstanti l ąstelės ciklo S faz ės metu). 
Plačiausiai naudojamas metodas, skirtas šiam įvertinimui, yra tri čiu 
(3H) žym ėto timidino autoradiografija. Atliekant nenumatytos DNR 
sintezės (NDS) bandymus  in vivo , daugiausiai naudojamos žiurki ų 
kepenys. Galima naudoti ir kitus audinius nei kepenys, ta čiau jie 
nėra šio metodo objektas.  
Nenumatytos DNR sintez ės (NDS) nustatymas priklauso nuo 
pažaidos vietoje iškirpt ų ir kitomis pakeist ų DNR bazi ų skaičiaus. 
Todėl nenumatytos DNR sintez ės bandymas ypa č vertingas tada, kai 
siekiama identifikuoti „ilg ų fragment ų pažaidų“ (fragment ų ilgis 
siekia nuo 20 iki 30 bazi ų), sukeltų, paveikus bandom ąja medžiaga, 
reparacijas. Tuo tarpu „trump ų fragment ų pažaidos“ nustatomos, 
esant daug mažesniam jautrumui. Be to, mutageniniai įvykiai pasi ­
reiškia dėl nevykstan čios pažaid ų reparacijos, klaidingai vykstan čios 
reparacijos ar klaidingos DNR replikacijos. Nenumatytos DNR sintezės aktyvumas neparodo pažaid ų reparacijos efektyvumo. Visai 
įmanoma, kad mutagenas s ąveikauja su DNR, ta čiau pažaidos repa ­
racija iškirpos atstatymo b ūdu nevyksta. Tai, kad nenumatytos DNR 
sintezės bandymo metu negaunama specifin ės informacijos apie 
mutagenin į aktyvum ą, kompensuoja didelis matavimo jautrumas, 
nes tiriamas visas genomas.
 
Taip pat žr. Bendrojo įvado B dal į. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Ląstelės, kuriose vyksta reparacija  – ląstelės, kurių grynasis bran ­
duolio granuli ų (GBG) skai čius yra didesnis negu pradin ė vertė, ir tai 
patvirtina bandym ą atliekanti laboratorija.  
Grynasis branduolio granuli ų skaičius (GBG)  – kiekybinis nenu ­
matytos DNR sintez ės aktyvumo l ąstelėse, atliekant nenumatytos 
DNR sintez ės bandym ą autoradiografijos metodu, įvertinimo matas, 
išreiškiamas iš branduolio granuli ų (BG) skai čiaus atimant vidutin į 
citoplazmini ų granulių, esančių nukleoplazminiuose ploteliuose, 
skaičių (CG): GBG = BG -CG. GBG nustatomas kiekvienoje l ąste­
lėje ir tada apskai čiuojama kult ūroje ar paraleliose kult ūrose esan čių 
ląstelių GBG bendra vert ė. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Nenumatyta DNR sintez ė (NDS)  – DNR reparacin ė sintezė, vyks­
tanti po chemin ėmis medžiagomis ar fiziniais veiksniais sukeltos 
DNR pažaidos apimto regiono iškirpimo bei pašalinimo.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Tiriant nenumatyt ą DNR sintez ę (NDS) žinduoli ų kepenų ląstelėse in 
vivo, parodoma, kad reparacin ė DNR sintez ė vyksta po to, kai 
cheminėmis medžiagomis ar fiziniais veiksniais sukeltos DNR 
pažaidos apimtas regionas iškerpamas ir pašalinamas. Šis bandymas 
bendru atveju yra pagr įstas  3 H žymėto timidino įterpimu į kepenų 
ląstelių, kurios sudaro labai nedidel ę ląstelių, esančių ląstelinio ciklo 
S fazėje, dalį, DNR.  3 H žymėto timidino transportas į ląstelę verti­
namas autoradiografijos metodu, kadangi šis metodas n ėra toks 
jautrus ląstelių, esančių S fazėje, atžvilgiu, kaip scintiliacijos skystyje 
nustatymo metodas.  
1.4. BANDYMO METODO APIB ŪDINIMAS  
1.4.1.  Pasiruošimas  
1.4.1.1.  Gyvūnų rūšies pasirinkimas  
Dažniausiai yra naudojamos žiurk ės, tačiau gali b ūti panaudotos ir 
kitos atitinkamos žinduoli ų rūšys. Reik ėtų naudoti dažniausiai varto ­
jamus jaun ų sveikų suaugusi ų gyvūnų laboratorines veisles. 
Bandymo pradžioje gyv ūnų svorio variacijos turi b ūti minimalios ir 
neviršyti ± 20 % kiekvienos lyties gyv ūnų vidutinio svorio.  
1.4.1.2.  Laikymo ir maitinimo s ąlygos  
Taikomos Pagrindinio įvado B dalyje nurodytos s ąlygos, nors sten ­
giamasi, kad dr ėgmė siektų 50–60 %.  
1.4.1.3.  Gyvūnų paruošimas  
Sveiki jauni subrend ę gyvūnai pasirinktinai suskirstomi į kontrolin ę 
bei bandom ąją grupes. Narvai pastatomi taip, kad b ūtų kuo labiau 
sumažintas aplinkos poveikis, susij ęs su narvų išdėstymu. Kiekvienas 
gyvūnas turi savo identifikacijos ženkl ą. Prieš pradedant bandym ą, 
gyvūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorini ų sąlygų mažiau­
siai 5 dienas.  
1.4.1.4.  Bandomosios medžiagos paruošimas  
Kietosios bandomosios chemin ės medžiagos ištirpinamos arba 
suspenduojamos atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose ir prireikus praskiedžiamos prieš duodant gyv ūnams. Skystos bandomosios 
medžiagos dozuojamos iš karto arba prieš tai praskiedžiamos. 
Naudojami švieži bandomosios medžiagos preparatai, nebent duomenys apie medžiagos stabilum ą rodo, kad j ą galima laikyti.
 
1.4.2.  Bandymo s ąlygos  
1.4.2.1.  Tirpiklis/nešiklis  
Naudojamos tirpiklio ar nešiklio doz ės neturėtų kelti jokio toksinio 
poveikio ir netur ėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su 
bandomąja medžiaga. Jeigu naudojami kiti, mažiau žinomi tirpikliai 
ir (arba) nešikliai, reikia pateikti j ų tinkamum ą įrodančius duomenis. 
Jei yra įmanoma, tai pirmiausia rekomenduojama naudoti vandenin į 
tirpiklį arba nešikl į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Kontroliniai m ėginiai  
Atliekant kiekvien ą nepriklausom ą eksperimento dal į, vienu metu 
turi būti naudojami teigiami ir neigiami (tirpiklis/nešiklis) kontroli ­
niai mėginiai.. Kontrolin ės grupės gyvūnai turi b ūti laikomi tomis 
pačiomis sąlygomis kaip ir bandomieji gyv ūnai, tik jie neveikiami 
bandomąja medžiaga.  
Teigiami kontroliniai m ėginiai turi b ūti žinomos medžiagos, suke ­
liančios nenumatyt ą DNR sintez ę, kai jos duodamos tokia doze, kuri, 
kaip tikimasi, užgoš lengvai nustatom ą pašalinį foną. Kai naudo ­
jamos vidutin į atsaką sukeliančios dozės, tai reikia naudoti teigiamus 
kontrolinius m ėginius, kuriems yra b ūtina metabolin ė aktyvacija (4). 
Dozės turi būti taip parenkamos, kad gaunami poveikiai b ūtų aiškūs, 
bet tyrėjas negal ėtų iškart dešifruoti užkoduotus objektinius stikle ­
lius. Teigiamoms kontrolin ėms medžiagoms priklauso:  
Mėginių paėmimo laikas  Medžiaga  CAS Nr.  Einecs Nr.  
Ankstyvasis m ėginių paėmimas 
(2–4 valandos)  N-nitrozodimetilaminas  62–75–9  200–249–8  
Vėlyvasis m ėginių paėmimas 
(12–16 valand ų) N-2-fluorenilacetamidas (2-AAF)  53–96–3  200–188–6  
Kitos atitinkamos teigiamos kontrolin ės medžiagos irgi gali b ūti 
naudojamos. Priimtina, kad teigiama kontrolin ė medžiaga duodama 
kitu būdu nei bandomoji medžiaga.  
1.5. BANDYMO ATLIKIMO METODIKA  
1.5.1.  Gyv ūnų skaičius ir lytis  
Atsižvelgiant į tiriamojo atsako nat ūraliąją biologinę variaciją, reikia 
panaudoti tinkam ą gyvūnų skaičių. Kiekvienoje grup ėje turi b ūti 
mažiausiai 3 bandomieji gyv ūnai. Jei yra didel ė anksčiau atlikt ų 
bandymų duomenų bazė, tai vienu metu naudojamose teigiamose ir 
neigiamose kontrolin ėse grupėse turi b ūti tik po 1 ar 2 gyv ūnus. 
Jei bandymo metu galima gauti anks čiau atliktų bandymų, kuriems 
naudota ta pati gyv ūnų rūšis ir tas pats veikimo bandom ąja medžiaga 
būdas, duomen ų, kurie rodo, kad toksiškumas abiems lytims nelabai 
skiriasi, užtenka ištirti vienos lyties gyv ūnus, geriausia patinus. Jeigu 
žmogaus s ąlytis su bandom ąja medžiaga priklauso nuo lyties, pvz., 
kai kurių farmakologiškai aktyvi ų medžiag ų atveju, reikia ištirti 
atitinkamos lyties gyv ūną. 
1.5.2.  Veikimo tvarkaraštis  
Paprastai bandomosios medžiagos duodamos tik vien ą kartą. 
1.5.3.  Doz ės dydžiai  
Paprastai naudojami 2 doz ės dydžiai. Didžiausia doze laikoma doz ė, 
kuri sukelia tokius toksiškumo požymius, kad pagal t ą pačią seką 
duodama didesn ė dozė būtų mirtina. Apskritai, žemesnioji doz ė turi 
sudaryti nuo 25 % iki 50 % didesniosios doz ės. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Medžiagos, pasižymin čios specifiniu biologiniu aktyvumu, kai j ų 
dozės būna mažos ir netoksiškos (pavyzdžiui tokios kaip hormonai 
ir mitogenai) gali b ūti laikomos išimtimi, kai joms taikomi doz ę 
nustatantys kriterijai ir tada jos tiriamos kiekvienu atveju atskirai. Jeigu nėra tinkam ų duomen ų ir tuo tikslu atliekama intervalo 
paieška, tai ji atliekama toje pa čioje laboratorijoje, panaudojant tos 
pačios rūšies veisl ės ir lyties gyv ūnus bei tą patį veikimo b ūdą kaip 
ir pagrindinio bandymo metu.
 
Didžiausia doz ė taip pat gali b ūti apibrėžiama kaip doz ė, kurią 
davus, kepenyse pasireiškia kai kurie toksiškumo požymiai (pavyz ­
džiui, piknotiniai branduoliai).  
1.5.4.  Ribinis bandymas  
Jei atlikus bandym ą su bent viena 2 000 mg/kg k ūno masės dydžio 
doze, kuri duota per vien ą arba du kartus t ą pačia dieną, nepastebima 
jokio toksinio poveikio bei, remiantis strukt ūriškai panaši ų cheminių 
medžiagų tyrimų duomenimis, genotoksinis poveikis nenumatomas, 
viso bandymo atlikti gali nereik ėti. Atsižvelgiant į numatom ą 
žmogaus s ąlytį su medžiaga, gali reik ėti atlikti ribin į bandymą su 
didesne doze.  
1.5.5.  Dozi ų davimas  
Bandomoji medžiaga yra paprastai duodama priverstinai maitinant 
per vamzdel į, įstatant jį į skrandį, tinkamai įvedant kanul ę per vamz ­
delį. Bandom ąją medžiag ą galima įvesti ir kitais b ūdais, jei jie yra 
pagrindžiami. Ta čiau įvedimas į pilvo ertm ę nerekomenduojamas, 
nes bandomoji medžiaga gali tiesiogiai paveikti kepenis per cirkulia ­
cinę sistemą. Maksimalus skys čio, priverstinai duodamo per vamz ­
delį arba injekuojamo į pilvą vienu metu, t ūris priklauso nuo bando ­
mojo gyv ūno dydžio. T ūris neturi viršyti 2 ml/100 g k ūno masės. 
Didesnių nei šitų tūrių davimas turi b ūti pagrindžiamas. Išskyrus 
dirginančias ar ėsdinančias medžiagas, kuri ų didesnės koncentracijos 
sukelia labai sunk ų poveikį, bandomosios medžiagos t ūrio kitimas 
turi būti sumažinamas iki minimumo, koncentracij ą taip sureguliuo ­
jant, kad esant visiems doz ės lygiams, t ūris būtų pastovus.  
1.5.6.  Kepen ų ląstelių paruošimas  
Kepenų ląstelės yra paruošiamos paimant jas iš gyv ūnų, paveiktų 
bandomąja medžiaga, po doz ės davimo pra ėjus 12–16 valand ų. 
Paprastai reikia paimti papildom ą mėginį (po veikimo medžiaga 
praėjus 2–4 valandoms), nebent po 12–16 valand ų laikotarpiu buvo 
gautas aiškus teigiamas atsakas. Ta čiau mėginius paimti galima ir 
kitu metu, kuris pagrindžiamas, remiantis toksikokinetini ų bandymų 
duomenimis.  
Perleidžiant kolagenaz ę per kepenis  in situ  ir sudarant s ąlygas naujai 
disocijavusioms kepen ų ląstelėms pačioms prisitvirtinti prie tinkamo 
paviršiaus, gaunamos žinduoli ų kepenų ląstelių trumpalaik ės 
kultūros. Neigiam ų kontrolini ų gyvūnų kepenų ląstelių gyvybin ­
gumas mažiausiai turi siekti 50 %.  
1.5.7.  Nenumatytos DNR sintez ės (NDS) nustatymas  
Šviežiai išskirtos žinduoli ų kepenų ląstelės paprastai inkubuojamos 
terpėje, turinčioje 3H žym ėto timidino atitinkamam laikui (pavyz ­
džiui, nuo 3 iki 8 valand ų). Baigiantis inkubacijai, terp ė turi būti 
atskiriama nuo l ąstelių, kurios v ėliau gali b ūti inkubuojamos terp ėje, 
turinčioje nežym ėto timidino pertekli ų tam, kad sumaž ėtų neįsijun­
gusio timidino radioaktyvumas (vadinamasis „šaltasis persekio ­
jimas“). Po inkubacijos l ąstelės plaunamos, fiksuojamos bei džiovi ­
namos. Jei inkubacija užtrunka ilgiau, tai nežym ėto timidino perte ­
klius terp ėje nėra būtinas. Objektiniai stikleliai pamerkiami į autora­
diografinę emulsiją, eksponuojami tamsoje (pvz., laikant šaldytuve 
7–14 dien ų), išryškinami, dažomi ir skai čiuojamos sidabro granul ės, 
susidariusios ekspozicijos metu. Iš kiekvieno gyv ūno paimtų mėginių 
paruošiama nuo 2 iki 3 stikleli ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Analiz ė 
Ląstelės, esančios paruoštuose objektiniuose stikleliuose, turi pasižy ­
mėti normaliomis morfologin ėmis ypatyb ėmis tam, kad b ūtų galima 
įvertinti svarbi ą neplanuot ą DNR sintez ę. Preparatai tiriami mikro ­
skopu, ieškant akivaizdži ų toksiškumo požymi ų (pavyzdžiui, pikno ­
tinių branduoli ų arba sumaž ėjusio įvestos žym ės radioaktyvumo).  
Prieš skai čiuojant granules, objektiniai stikleliai užkoduojami. 
Normaliai kiekvieno gyv ūno atveju 2 objektiniuose stikleliuose įver­
tinama 100 l ąstelių. Jei kiekvieno gyv ūno atveju įvertinama mažiau 
nei 100 l ąstelių, tai šitai pagrindžiama. Granul ės neskaičiuojamos 
branduoliuose, jei l ąstelės yra S faz ėje, tačiau reikia nurodyti l ąstelių, 
esančių S fazėje, skaičių. 
3 H žymėto timidino įjungimas į morfologiškai normali ų ląstelių bran­
duolius bei citoplazm ą, įvertinamas pagal sidabro granuli ų 
sankaupas, turi b ūti tiriamas atitinkamais metodais.  
Granulių skaičius yra nustatomas virš branduolio (branduolio 
granulės, BG) ir nukleoplazminiai ploteliai nustatomi virš cito ­
plazmos (citoplazmin ės granulės, CG). CG skai čius nustatomas 
matuojant labiausiai pažym ėtą citoplazmos plot ą, arba, išvedant 
dviejų ar trijų atsitiktini ų citoplazmini ų granulių, esančių prie bran ­
duolio, skai čiavimų rezultatų vidurkį. Kiti skai čiavimo metodai (pvz. 
visų ląstelių suskaičiavimas) gali b ūti naudojami, jei naudojim ą 
galima pagr įsti (6).  
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Turi būti pateikiami duomenys apie kiekvien ą objektinį stiklelį bei 
tirtą gyvūną. Be to, visi duomenys pateikiami apibendrintai, lenteli ų 
forma. Grynasis branduolio granuli ų (GBG) skai čius nustatomas 
kiekvienoje l ąstelėje, kiekvieno gyv ūno ląstelėse bei kiekvienos 
dozės ar laiko intervalo atveju, iš branduolio granuli ų (BG) skai čiaus 
atimant citoplazmini ų granulių (CG) skai čių. Jei skai čiuojamos 
ląstelės, kuriose vyksta „reparacija“, tai kriterijai, taikomi šioms 
ląstelėms apibūdinti, turi b ūti pagrindžiami bei remtis anks čiau 
gautais neigiam ų kontrolini ų mėginių tyrimo duomenimis. Rezultatai, 
pateikiami skai čiais, gali b ūti vertinami statistiniais metodais. Jei 
atliekami statistiniai tyrimai, tai prieš pradedant bandym ą, jie turi 
būti pasirinkti bei pagrindžiami.  
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Teigiamų/neigiamų atsakų kriterijų pavyzdžiai: 
teigiami  i)  GBG vert ės yra aukš čiau nustatyto slenkstinio 
lygio, kuris pagrindžiamas, remiantis anks čiau 
laboratorijoje gautais duomenimis; arba  
ii) GBG vert ės yra žymiai didesn ės už kontro ­
linio mėginio, naudojamo tuo pa čiu metu, 
vertę; 
neigiami  i)  GBG vert ės atitinka arba yra mažesn ės už 
anksčiau naudoto kontrolinio m ėginio slenks ­
tinį lygį; arba  
ii) GBG vert ės yra nežymiai didesn ės už kontro ­
linio mėginio, naudojamo tuo pa čiu metu, 
vertę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Reikia aptarti duomen ų biologinę vertę: atsižvelgiama į tokius para ­
metrus, kaip variacija tarp atskir ų gyvūnų, dozės ir atsako tarpusavio 
ryšys bei citotoksiškumas. Ta čiau statistin ė svarba netur ėtų būti 
vieninteliu faktoriumi, apsprendžian čiu, ar atsakas teigiamas ar ne.  
Nors daugumos eksperiment ų metu buvo gauti aiškiai teigiami ar 
neigiami rezultatai, išimtiniais atvejais gaut ų rezultatų rinkinys neleis 
padaryti teisingos išvados apie bandomosios medžiagos aktyvum ą. 
Rezultatai gali likti abejotini ar neaišk ūs, nepriklausomai nuo atlikt ų 
eksperiment ų skaičiaus. 
Teigiami rezultatai, gauti tiriant neplanuot ą DNR sintez ę (NDS) 
žinduolių kepenų ląstelėse in vivo , rodo, kad bandomoji medžiaga 
sukelia DNR pažaidas žinduoli ų kepenų ląstelėse in vivo , o pažaid ų 
reparacija vyksta neplanuotos DNR sintez ės (NDS) metu  in vitro . 
Neigiamas rezultatas rodo, kad esant bandymo s ąlygoms, bandomoji 
medžiaga nesukelia DNR pažaid ų, nustatom ų šiuo bandymu.  
Reikia aptarti t ą galimybę, ar bandomoji medžiaga ar jos metabolitai 
pasieks bendr ąją apytaką ar tik tikslin į audinį (pvz., sisteminio 
toksiškumo atveju)  
3. ATASKAITA  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikiama tokia informacija:  
Tirpiklis/nešiklis:  
— priežastys, d ėl kurių buvo pasirinktas šis nešiklis,  
— bandomosios chemin ės medžiagos, esan čios tirpiklyje/nešiklyje, 
tirpumas ir stabilumas, jei toks yra žinomas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— panaudota r ūšis ar veisl ė, 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, maitinimas ir pan.,  
— kiekvieno gyv ūno svoris prieš pradedant bandym ą ir kiekvienos 
grupės svorio riba, vidurkiai bei standartinis nukrypimas.  
Bandymo s ąlygos:  
— teigiami ir neigiami (tirpiklis/nešiklis) kontroliniai m ėginiai,  
— intervalo paieškos bandymo, jei jis buvo vykdomas, duomenys,  
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi doz ės dydžio pasirinkim ą, 
— duomenys apie bandomosios medžiagos paruošim ą, 
— duomenys apie bandomosios medžiagos davim ą, 
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi davimo b ūdo pasirinkim ą, 
— metodai, kuriais patvirtinama, kad bandomoji chemin ė medžiaga 
pateko į bendrąją cirkuliacij ą ar audin į, į kurį ji buvo nukreipta, 
jei tai įmanoma nurodyti,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— tikrosios doz ės (mg/kg k ūno masės/parai) ir bandomosios 
medžiagos koncentracijos maiste/geriamajame vandenyje (ppm) 
perskaičiavimo į tikrąją dozę faktorius, jei naudojamas,  
— duomenys apie pašar ų ir geriamojo vandens kokyb ę, 
— išsamus veikimo bandom ąja medžiaga ir m ėginio paėmimo tvar ­
karaščio aprašymas,  
— metodai toksiškumui įvertinti,  
— kepen ų ląstelių paruošimo ir kultivavimo metodai,  
— panaudotas autoradiografinis metodas,  
— paruošt ų objektini ų stiklelių ir įvertintų ląstelių skaičius, 
— įvertinimo kriterijai,  
— teigiam ų, neigiam ų ar abejotin ų bandymo rezultat ų nustatymo 
kriterijai.  
Rezultatai:  
— kiekvieno objektinio stiklelio, gyv ūno ir gyv ūnų grupės bran­
duolio granuli ų, citoplazmini ų granulių ir grynojo branduolio 
granulių skaičiaus vidutin ės vertės, 
— dozės ir atsako tarpusavio ryšys, jei tai įmanoma nurodyti,  
— statistin ės analizės, jei bet kokios buvo atliktos,  
— toksiškumo požymiai,  
— duomenys apie tuo pa čiu metu naudotus neigiamus (tirpiklis/ne ­ 
šiklis) ir teigiamus kontrolinius m ėginius,  
— anksčiau gauti duomenys apie neigiamus kontrolinius m ėginius, 
nurodant intervalus, vidurkius ir standartinius nukrypimus,  
— „ląstelių, kuriose vyksta reparacija“, skai čius, jeigu jis buvo 
nustatytas,  
— ląstelių, esančių S fazėje skaičius, jeigu jis buvo nustatytas,  
— ląstelių gyvybingumas.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G. 
(1985). An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay. Mutation Res., 156, p. 1–18.  
2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (1987). A Protocol and Guide for the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. 
Mutation Res. 189, p. 123–133.
 
3) Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, 
B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G. (1993). In 
Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., (Eds) 
Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutageni ­
city Testing. Report. Part II revised. Cambridge University Press, 
Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
p. 52–77.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
4) Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, B., 
Doolittle, D.J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C.A. and 
Mori, h. (1993). Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and In  Vivo . Mutation Res. 312, p. 263–285.
 
5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C. (1993). Assessment of the Relation Between the Initial Viabi ­
lity and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes 
Used for the  In Vivo/In Vitro  DNA Repair Assay (UDS). Muta ­
tion Res. 291, p. 21–27.  
6) Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E. (1982). Detec ­
tion of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/In Vitro  Hepatocyte 
DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, p. 553–562.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  ODOS SUARDYMAS  IN VITRO . ODOS SLUOKSNIO 
ELEKTRIN ĖS VARŽOS (OSEV) BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 430 (2004).  
1.1. ĮVADAS  
Odos suardymu vadinamas negr įžtamas odos audini ų pažeidimas po 
bandomosios medžiagos užd ėjimo [kaip apibr ėžta pagal Visuotinai 
suderintą chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifikavimo sistem ą 
(Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures - GHS)] (1). Odos suardomumui įvertinti 
pagal šį metodą nenaudojami gyvi gyv ūnai. 
Odos suardomumas paprastai buvo įvertinamas naudojant laboratori ­
nius gyvūnus (2). Perži ūrint B.4 bandymo metod ą atsižvelgta į gyvū­
nams sukeliamas kan čias ir skausm ą, ir metodas pakoreguotas numa ­
tant in vitro  metodus, taip gyv ūnams nesukeliant skausmo ir kan čių. 
Pirmasis žingsnis reguliavimo tikslais apibr ėžiant alternatyvius 
bandymus, kurie gali b ūti naudojami odos suardomumui bandyti, 
buvo pradiniai tinkamumo patvirtinimo bandymai (3). V ėliau buvo 
atliekamas oficialus odos suardymui įvertinti skirt ų in vitro  metodų 
(4)(5) tinkamumo patvirtinimas (6)(7)(8). Pagal ši ų bandymų rezul­
tatus ir kitus paskelbtus duomenis (9), buvo pateikta rekomendacija, 
pagal kuri ą in vitro  odos suardomumui įvertinti gal ėtų būti taikomi 
šie bandymai (9)(10)(11): žmogaus odos modelio bandymas (žr.  B. 
40bis  bandymo metod ą) ir odos sluoksnio elektrin ės varžos 
bandymas (šis metodas).  
Tinkamumo patvirtinimo ir kituose paskelbtuose bandymuose 
teigiama, kad žiurki ų odos sluoksnio varžos (OSEV) bandymu 
(12)(13) galima patikimai atskirti žinomas od ą suardančias ir odos 
nesuardan čias medžiagas (5)(9).  
Naudojant šiame metode aprašyt ą bandymą, galima nustatyti ardan ­ 
čias chemines medžiagas ir mišinius. Be to, galima nustatyti near ­
dančias medžiagas ir mišinius, jei rezultatams patvirtinti išanalizuo ­
jama kita turima informacija (pvz., pH, strukt ūros ir aktyvumo 
santykių, žmonėms ir (arba) gyv ūnams gaut ų duomenų) įrodomoji 
vertė (1)(2)(11)(14). Paprastai šiuo bandymu negaunama informa ­
cijos apie odos dirginim ą ir nėra galimyb ės ardančias medžiagas 
suskirstyti į kategorijas, kaip tai leidžia daryti Visuotinai suderinta 
klasifikavimo sistema (GHS) (1).  
Norint visiškai įvertinti vienkartinio odos veikimo vietin į poveikį 
odai, rekomenduojama taikyti nuosekli ųjų bandymų strategiją, kuri 
pridedama prie B.4 bandymo metodo (2) ir numatyta Visuotinai suderintoje sistemoje (GHS) (1). Ši ą bandymo strategij ą sudaro 
odos suardymo  in vitro  bandymai (kaip aprašyta šiame metode) ir 
odos dirginimo bandymai prieš sprendžiant klausim ą dėl bandym ų su 
gyvais gyv ūnais.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Odos suardymas  in vivo : negrįžtamas odos pažeidimas; b ūtent, 
matomoji nekroz ė per epiderm į ir odos nekroz ė po bandomosios 
medžiagos užd ėjimo ne ilgiau kaip keturioms valandoms. Odos suar ­
dymo požymiai yra opos, kraujavimas, kruvini šašai ir, baigiantis 14 
parų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas d ėl jos išbalimo, visiškai 
nuplikusios vietos ir randai. Neaiškiems pažeidimams nustatyti reikėtų atlikti histopatologin į tyrimą.
 
Odos sluoksnio elektrin ė varža (OSEV) : pilnutinės odos elektrin ės 
varžos matas, išreikštas varžos verte kiloomais. Paprastas ir pati ­
kimas metodas užtvaro funkcijai įvertinti, registruojant jon ų praėjimą 
per odos sluoksn į Vitstono tiltelio aparato pagalba.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
1 lentelė 
Etaloninės chemin ės medžiagos  
Pavadinimas  Einecs Nr.  CAS Nr.  
1,2-diaminopropanas  201–155–9  78–90–0  Labai ardanti  
Akrilo rūgštis 201–177–9  79–10–7  Labai ardanti  
2-tret-butilfenolis  201–807–2  88–18–6  Ardanti  
Kalio hidroksidas (10 %)  215–181–3  1310–58–3  Ardanti  
Sieros rūgštis (10 %)  231–639–5  7664–93–9  Ardanti  
Oktano rūgštis (kaprilo r ūgštis)  204–677–5  124–07–02  Ardanti  
4-amino-1,2,4-triazolas  209–533–5  584–13–4  Neardanti  
Eugenolis  202–589–1  97–53–0  Neardanti  
Fenetilbromidas  203–130–8  103–63–9  Neardanti  
Tetrachloretilenas  204–825–9  27–18–4  Neardanti  
Izostearino r ūgštis 250–178–0  30399–84–9  Neardanti  
4-(metiltio)-benzaldehidas  222–365–7  3446–89–7  Neardanti  
Didesnė dalis išvardyt ų medžiag ų yra paimta iš ECVAM tarptauti ­
niam tinkamumo patvirtinimo bandymui (4) atrinkt ų chemini ų 
medžiagų sąrašo. Jų atranka pagr įsta šiais kriterijais:  
i) vienodas ardan čių ir neardan čių medžiag ų skaičius; ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) naudojamos prekyboje esan čios medžiagos, kurios priklauso 
didesnei atitinkam ų cheminių junginių klasių daliai;  
iii) įtrauktos labai ardan čios ir mažiau ardan čios medžiagos, siekiant 
nustatyti ardomojo poveikio stiprumu pagr įstus skirtumus;  
iv) pasirinktos chemin ės medžiagos, su kuriomis b ūtų galima dirbti 
laboratorijoje, nesukeliant kit ų rimtų, išskyrus odos suardym ą, 
pavojų. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandomoji medžiaga uždedama ant odos disk ų epidermio paviršiaus 
ne ilgiau kaip 24 h, kai diskai yra įdėti į dviejų kamerų bandymo 
sistemą, kurioje odos diskai šias kameras skiria. Imami humaniškai 
numarintų 28–30 par ų amžiaus žiurki ų odos diskai. Ardan čios 
medžiagos nustatomos pagal j ų gebą paveikti normalaus  stratum 
corneum  vientisum ą ir užtvaro funkcij ą, kuri matuojama kaip 
OSEV sumaž ėjimas mažiau ribin ės vertės (12). Nustatant žiurki ų 
OSEV, buvo pasirinkta ribin ė 5 κΏ vertė, pagrįsta dideliu kiekiu 
duomenų apie labai įvairias chemines medžiagas, pagal kuriuos 
didžioji dauguma ver čių buvo aiškiai didesn ės (dažnai > 10 κΩ) 
arba gerokai mažesn ės (dažnai < 3 κΩ) už šią vertę (12). Paprastai 
medžiagos, kurios gyv ūnams nėra ardančios, bet yra dirginan čios 
arba nedirginan čios, nesumažina OSEV iki vert ės, mažesn ės už šią 
ribinę vertę. Be to, naudojant kitus odos preparatus arba kit ą įrangą, 
ribinė vertė gali pasikeisti, tod ėl reikėtų atlikti papildom ą tinkamumo 
įvertinimą. 
Bandymo proced ūros dalį sudaro dažiklio surišimo pakopa, atliekant 
patvirtinam ąjį OSEV teigiam ų rezultatų, įskaitant vertes apie 5 κΩ, 
bandymą. Dažiklio surišimo pakopoje nustatoma, ar jon ų pralai­
dumas padid ėja dėl fizinio  stratum corneum  suardymo. Buvo įrodyta, 
kad OSEV metodu naudojant žiurki ų odą galima numatyti  in vivo  
odos suardomum ą bandyme su triušiais, įvertinamą pagal B.4 
bandymo metod ą (2). Reikia pažym ėti, kad  in vivo  bandymas su 
triušiais labai mažina odos suardomumo ir odos dirginimo duomenis 
palyginti su žmoni ų odos lopin ėlio bandymu (15).  
1.5. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.5.1.  Gyv ūnai 
Pasirinktoji r ūšis yra žiurk ės, nes šiame bandyme j ų odos jautrumas 
cheminėms medžiagoms buvo įrodytas anks čiau (10). Amžius (kai 
paimama oda) ir žiurki ų veislė yra ypa č svarbi užtikrinant, kad 
plaukų folikulai b ūtų ramybės būsenoje prieš suaugusi ų plaukų 
augimo pradži ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Jaunų, maždaug 22 par ų amžiaus patin ų arba pateli ų (Wistar  arba 
panašios veisl ės žiurkių) nugaros ir šon ų plaukai atsargiai nukerpami 
mažomis žirkl ėmis. Gyv ūnai plaunami atsargiai trinant nukirpt ą plotą 
panardint ą į antibiotiko tirpal ą (kurio sud ėtyje yra, pvz., streptomi ­
cino, penicilino, chloramfenikolio ir amfotericino, kuri ų koncentra ­
cijos pakakt ų bakterijų augimui slopinti). Tre čią arba ketvirt ą dieną 
po pirmo plovimo gyv ūnai dar kart ą plaunami antibiotikais ir panau ­
dojami per 3 dienas po antro plovimo, kai  stratum corneum  atsi­
gauna po plauk ų kirpimo.  
1.5.2.  Odos disk ų paruošimas  
Gyvūnai humaniškai numarinami, kai jie yra 28–30 dien ų amžiaus; 
šis amžius yra ribinis. Nudiriama kiekvieno gyv ūno oda nuo gyv ūno 
nugaros ir šon ų ir pašalinami pertekliniai poodiniai riebalai, juos 
atsargiai nuskutant nuo odos. Išpjaunami odos diskai, kuri ų kiek­
vieno skersmuo maždaug 20 mm. Od ą diskų gamybai galima laikyti 
ir panaudoti v ėliau, jei įrodoma, kad teigiam ų ir neigiam ų kontrolini ų 
bandymų duomenys atitinka duomenis, gautus su k ą tik paruošta 
oda. 
Kiekvienas odos diskas dedamas ant vieno PTFE (politetrafluoreti ­
leno) vamzdelio galo, užtikrinant, kad epidermio paviršius liest ųsi su 
vamzdeliu. Ant vamzdelio galo užspaudžiamas žiedinis tarpiklis odos 
žiedui nejudamai laikyti, o audinio perteklius apkarpomas. Vamz ­
delio ir žiedinio tarpiklio matmenys pateikti 2 paveiksle. Žiedinis 
tarpiklis ir PTFE vamzdelis kruopš čiai užsandarinami vazelinu. 
Spyruokliniu spaustuku vamzdelis tvirtinamas rinktuvo kameroje su MgSO
 4 tirpalu (154 mmol/l) (1 paveikslas). Odos diskas turi b ūti 
visiškai panardintas į MgSO  4 tirpalą. Iš vienos žiurk ės odos galima 
pagaminti 10–15 odos disk ų. 
Prieš pradedant bandym ą matuojama dviej ų odos disk ų elektrinė 
varža, kaip kiekvieno gyv ūno odos kokyb ės kontrol ės procedūros 
dalis. Abiej ų diskų varža turi b ūti didesnė kaip 10 κΩ, kad likusius 
diskus būtų galima naudoti bandymui. Jei varžos vert ė yra mažesn ė 
kaip 10 κΩ, kiti iš tos odos pagaminti diskai išmetami.  
1.5.3.  Bandomosios ir kontrolin ės medžiag ų uždėjimas  
Siekiant užtikrinti tinkam ą bandymo modelio veikim ą, kiekvienas 
bandymas turi b ūti vykdomas lygiagre čiai atliekant kontrolinius 
teigiamus ir neigiamus bandymus. Turi b ūti naudojami vieno gyv ūno 
odos diskai. Rekomenduojamos teigiamo ir neigiamo kontrolini ų 
bandymų medžiagos yra 10 mol/l vandenilio chlorido r ūgštis ir disti ­
liuotas vanduo.  
Skystos bandomosios medžiagos (150 μl) tolygiai užpilamos ant 
epidermio sluoksnio vamzdelio viduje. Kai tiriamos kietos medžiagos, 
ant disko tolygiai uždedamas pakankamas kietos medžiagos kiekis, 
kad būtų padengtas visas epidermio paviršius. Ant kietos medžiagos 
viršaus užpilama dejonizuoto vandens (150 μl) ir vamzdelis nestipriai 
pakratomas. Siekiant pasiekti didžiausi ą įmanomą sąlytį su oda, kietas 
medžiagas gali tekti pašildyti iki 30 °C, kad bandomoji medžiaga 
išsilydytų arba suminkšt ėtų, arba sumalti į granules arba miltelius.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Kiekvienai bandomajai ir kontrolinei medžiagai naudojami trys odos 
diskai. Bandomoji medžiaga uždedama 24 h esant 20–23 °C. Bando ­
moji medžiaga pašalinama plaunant j ą ne didesn ės kaip 30 °C 
temperatūros vandentiekio vandens srove tol, kol daugiau medžiagos 
nebeįmanoma pašalinti.  
1.5.4.  OSEV matavimai  
Odos pilnutin ė varža matuojama kaip OSEV, išmatuota naudojant 
žemos įtampos, kintamosios srov ės Vitstono tiltel į (13). Bendrosios 
tiltelio specifikacijos: 1–3 V darbin ė įtampa, sinusin ė arba sta čia­
kampio formos kintamoji 50–1 000 Hz srov ė ir bent 0,1–30 κΩ 
matavimo intervalas. Tinkamumo patvirtinimo matavimams naudo ­
jamas tiltelis matuoja induktyvum ą, talpą ir varžą iki 2 000 h, 2 000 
μF ir 2 ΜΩ, esant 100 Hz arba 1 kHz dažniui, ir naudojant nuose ­
klaus arba lygiagretaus jungimo vertes. Atliekant suardomumo bandymo OSEV matavimus, užrašoma varža, esant 100 Hz dažniui ir naudojant nuoseklaus jungimo vertes. Prieš matuojant elektrin ę 
varžą odos paviršiaus įtemptis sumažinama įpilant epidermiui 
padengti pakankam ą tūrį 70 % etanolio. Po keli ų sekundži ų etanolis 
iš vamzdelio pašalinamas ir audinys dr ėkinamas įpilant 3 ml MgSO
 4 
tirpalo (154 mmol/l). Tiltelio elektrodai dedami iš abiej ų odos disko 
pusių jo varžai κΩ išmatuoti (1 paveikslas). Elektrod ų matmenys ir 
elektrodų ilgiai žemiau dantyt ų spaustuk ų pateikti 2 paveiksle. 
Spaustukas, prijungtas prie vidinio elektrodo, matuojant varž ą 
remiasi į PTFE vamzdelio virš ų, siekiant užtikrinti, kad reikiama 
elektrodo dalis b ūtų įmerkta į MgSO  4 tirpalą. Išorinis elektrodas 
įstatomas į rinktuvo kamer ą taip, kad jis remt ųsi į kameros dugn ą. 
Užtikrinamas nekintamas atstumas tarp spyruoklinio spaustuko ir PTFE vamzdelio dugno (2 paveikslas), kadangi šis atstumas turi 
įtakos gautai varžos vertei. D ėl tos pačios priežasties atstumas tarp 
vidinio elektrodo ir odos disko turi b ūti pastovus ir kiek įmanoma 
mažesnis (1–2 mm).
 
Jei išmatuota varžos vert ė yra didesn ė kaip 20 κΩ, tai gali b ūti dėl 
bandomosios medžiagos liku čių, dengian čių odos disko epidermio 
paviršių. Galima m ėginti dar kart ą pašalinti ši ą dangą, pvz., užkimšti 
PTFE vamzdelio ang ą pirštinėtu nykščiu ir purtyti maždaug 10 s; 
MgSO  4 tirpalas išpilamas ir varža dar kart ą matuojama, įpylus naujo 
MgSO  4 tirpalo.  
Bandymo aparato savyb ės bei matmenys ir taikoma matavimo proce ­
dūra gali tur ėti įtakos gautoms OSEV vert ėms. 5 κΩ ardymo ribin ė 
vertė buvo nustatyta pagal duomenis, gautus naudojant šiame metode 
aprašytą konkretų aparatą ir proced ūrą. Gali būti taikomos kitos 
ribinės ir kontrolin ės vertės, jei pakinta bandymo s ąlygos arba 
naudojamas kitas aparatas. Taigi metod ą ir varžos ribines vertes 
būtina kalibruoti, bandant eil ę etalonų, pasirinkt ų iš tinkamumo 
patvirtinimo bandyme naudot ų cheminių medžiag ų (4) (5), arba iš 
medžiagų, kurių klasė atitinka bandom ų cheminių medžiag ų klasę. 
Tinkamų etalonini ų cheminių medžiagų rinkinys pateiktas 1 lentel ėje. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Dažiklio surišimo metodai  
Veikiant tam tikroms neardan čioms medžiagoms varža gali sumaž ėti 
iki mažesn ės kaip ribin ė 5 κΩ vertė, todėl jonai gal ėtų prasiskverbti 
per stratum corneum  ir todėl mažėtų elektrinė varža (5). Pvz., neut ­
raliosios organin ės medžiagos ir paviršinio aktyvumo savybi ų turin­ 
čios chemin ės medžiagos ( įskaitant ploviklius, emulsiklius ir kitas 
paviršinio aktyvumo medžiagas) gali pašalinti odos riebalus, tod ėl 
užtvaras tampa pralaidesnis jonams. Taigi, jei n ėra akivaizdži ų 
odos pažeidim ų, o bandom ųjų medžiag ų OSEV vert ės yra mažesn ės 
kaip 5 κΩ arba arti šios vert ės, turi būti atliekamas kontrolini ų 
bandinių ir apdorot ų audinių dažiklio skverbties įvertinimas, siekiant 
nustatyti, ar gautos OSEV vert ės buvo padid ėjusio odos pralaidumo 
ar odos suardymo rezultatas (3)(5). Pastaruoju atveju, kai įtrūksta 
stratum corneum , ant odos paviršiaus užd ėtas sulforodamino B 
dažiklis greitai skverbiasi ir nudažo apa čioje esant į audinį. Šis 
konkretus dažiklis yra atsparus daugeliui įvairių cheminių medžiagų, 
ir jo neveikia toliau aprašyta ekstrahavimo proced ūra. 
1.5.5.1.  Sulforodamino B dažiklio užd ėjimas ir pašalinimas  
Po OSEV įvertinimo magnio sulfatas išpilamas iš vamzdelio ir oda 
kruopščiai apžiūrima, ieškant akivaizdži ų jos pažeidim ų. Jei nėra 
akivaizdži ų didesnių pažeidim ų, sulforodamino B dažiklio (r ūgščiojo 
raudonojo 52; C.I. 45100; Einecs numeris 222–529–8; CAS numeris 
3520–42–1), 150 μl 10 % (m/V) tirpalo distiliuotame vandenyje 
užpilama ant kiekvieno disko epidermio paviršiaus 2 valandoms. Vėliau šie odos diskai maždaug 10 s plaunami kambario tempera ­
tūros vandentiekio vandeniu dažiklio pertekliui/nesurištam dažikliui 
pašalinti. Kiekvienas odos diskas atsargiai išimamas iš PTFE vamz ­
delio ir įdedamas į buteliuką (pvz., 20 ml stiklin į scintiliacin į bute­
liuką) su dejonizuotu vandeniu (8 ml). Indai nestipriai kratomi 5 
min., kad b ūtų pašalintas lik ęs nesurištas dažiklio kiekis. Ši plovimo 
procedūra kartojama, odos diskai išimami ir įdedami į indus su 30 % 
(m/V) natrio dodecilsulfato tirpalo distiliuotame vandenyje ir inku ­
buojami per nakt į esant 60 °C.
 
Po inkubavimo kiekvienas diskas išimamas ir išmetamas, o lik ęs 
tirpalas centrifuguojamas 8 min 21 °C temperat ūroje (santykin ė 
išcentrinė jėga ~175 × g). 1 ml tirpalo virš nuos ėdų skiedžiamas 
penkis kartus (V/V) [t. y. 1 ml + 4 ml] 30 % (m/V) natrio dodecil ­
sulfato tirpalu distiliuotame vandenyje. Tirpalo optinis tankis matuo ­
jamas esant 565 nm bangos ilgiui.  
1.5.5.2.  Dažiklio kiekio apskai čiavimas  
Sulforodamino B dažiklio kiekis vienam diskui apskai čiuojamas 
pagal optinio tankio vertes (5) (sulforodamino B dažiklio molinis ekstinkcijos koeficientas = 8,7 × l0
 4 , esant 565 nm; molekulin ė 
masė = 580). Dažiklio kiekis ant kiekvieno disko nustatomas, naudo ­
jant atitinkam ą kalibravimo kreiv ę, vėliau apskai čiuojamas kartotini ų 
bandinių vidutinis dažiklio kiekis.  
2. DUOMENYS  
Bandomajai medžiagai, be to, teigiamiems ir neigiamiems kontro ­
liniams bandiniams gautos varžos vert ės (κΩ) ir vidutin ės dažiklio 
kiekio vert ės (μg/diskui), jei tinka, pateikiamos lentel ėse (atskir ų 
bandymų duomenys ir vidutin ė vertė ± standartinis nuokrypis), įskai­
tant lygiagre čių/kartotinių bandymų rezultatus, vidurkius ir atskiras 
vertes.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Vidutiniai OSEV rezultatai yra priimtini, jei bandymo laboratorijoje 
lygiagrečiai atliekam ų teigiamų ir neigiam ų kontrolini ų bandym ų 
vertės patenka į metodui priimtinus intervalus. Priimtini varžos inter ­
valai, taikant pirmiau aprašyt ą metodą ir aparat ūrą, pateikti šioje 
lentelėje: 
Kontrolinis 
bandymas  Medžiaga  Varžos 
intervalas ( κΩ) 
Teigiamas  10 mol/l druskos r ūgštis 0,5–1,0  
Neigiamas  Distiliuotas vanduo  10–25  
Vidutiniai dažiklio surišimo rezultatai yra priimtini, jei lygiagre čios 
kontrolini ų bandymų vertės patenka į metodui priimtinus intervalus. 
Rekomenduojami kontrolin ėms medžiagoms priimtini dažiklio kiekio 
intervalai, taikant pirmiau aprašyt ą metodą ir aparat ūrą, pateikti 
toliau:  
Kontrolinis 
bandymas  Medžiaga  Dažiklio kiekio 
intervalas 
(μg/diskas)  
Teigiamas  10 mol/l druskos r ūgštis 40–100  
Neigiamas  Distiliuotas vanduo  15–35  
Laikoma, kad bandomoji medžiaga neardo odos:  
i) jei bandomosios medžiagos OSEV vidutin ė vertė yra didesn ė 
kaip 5 κΩ, arba  
ii) OSEV vidutin ė vertė yra lygi 5 κΩ arba mažesn ė kaip 5 κΩ, ir 
— odos diske nematyti akivaizdži ų pažeidim ų, ir 
— vidutinis dažiklio ant disko kiekis yra gerokai mažesnis už 
vidutinį dažiklio ant disko kiek į, gautą lygiagrečiai atliekant 
teigiamą kontrolin į bandymą su 10 mol/l HCl.  
Laikoma, kad bandomoji medžiaga ardo od ą: 
i) jei OSEV vidurkis yra 5 κΩ arba mažesnis kaip 5 κΩ, ir odos 
diskas yra akivaizdžiai pažeistas, arba  
ii) OSEV vidurkis yra lygus 5 κΩ arba mažesnis kaip 5 κΩ, ir 
— odos diske nematyti akivaizdži ų pažeidim ų, bet 
— vidutinis dažiklio ant disko kiekis yra lygus vidutiniam 
dažiklio ant disko kiekiui, gautam lygiagre čiai atliekant 
teigiamą kontrolin į bandymą su 10 mol/l HCl, arba didesnis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta tokia informacija:  
Bandomoji ir kontrolin ė medžiagos:  
— cheminis (-iai) pavadinimas (-ai), pvz., IUPAC arba CAS pava ­
dinimas, ir CAS numeris, jei žinomas,  
— medžiagos arba preparato grynumas ir sud ėtis (masės procentine 
(-ėmis) dalimi (-is), fizin ė prigimtis,  
— fizikin ės ir chemin ės savybės, pvz., fizikin ė būsena, pH, stabi ­
lumas, tirpumas vandenyje, svarbios atliekamam bandymui,  
— bandomosios ir(arba) kontrolin ės medžiag ų apdorojimas prieš 
bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas),  
— stabilumas, jei žinomas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir lytis,  
— gyvūnų amžius, kai paimama j ų oda,  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, šėrimas ir t.t.,  
— išsami informacija apie odos paruošim ą. 
Bandymo s ąlygos:  
— bandymo aparato kalibravimo kreiv ės, 
— kalibravimo kreiv ės, skirtos dažiklio surišimo bandymui,  
— OSEV matavimams naudojama išsami informacija apie bandym ų 
procedūrą, 
— dažiklio surišimo įvertinimui naudojama išsami informacija apie 
bandymų procedūrą; jei taikoma,  
— visų bandymo proced ūrų pakeitim ų aprašymas,  
— taikyt ų vertinimo kriterij ų aprašymas.  
Rezultatai:  
— lentelėse pateikti OSEV ir dažiklio surišimo bandymo (jei 
taikoma) duomenys pagal atskirus gyv ūnus ir atskirus odos 
bandinius,  
— visų pastebėtų reiškinių aprašymas.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assess ­
ment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. 
http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- 
mono(2001)6.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corro ­
sion.  
3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., 
Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and 
Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corro ­
sivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, p. 219–255.
 
4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. in Vitro 12, 
p. 471–482.  
5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, h.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. in Vitro 12, p. 483–524.
 
6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, p. 62.  
7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., 
Spielmann, h., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, p. 129–147.
 
8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97–3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. ­
niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
 
9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
p. 275–280.  
10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm
 TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test 
methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. 
NIH Publication No. 02–4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicolo ­
gical Methods, National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. ­
niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st–2nd 
November 2001, Secretariat’s Final Summary Report, 27th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from the Secretariat
 
12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  in 
vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, p. 507–512.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro : results of an inter ­
laboratory trial. Toxic. in Vitro 6, p. 191–194.  
14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26: p. 709–720.
 
15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, h.A., Rowson, M., 
Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, p. 845–852.
 
16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxic. in Vitro. 2, p. 7–17.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
1 paveikslas  
Žiurkių odos OSEV bandymo aparatas
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
2 paveikslas  
Politetrafluoretileno (PFTE) ir rinktuvo vamzdeli ų bei naudojam ų elektrod ų 
matmenys
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Viršuje pavaizduoto aparato svarbiausi parametrai:  
— PTFE vamzdelio vidinis skersmuo,  
— elektrod ų ir PTFE bei rinktuvo vamzdeli ų ilgio santykis turi b ūti 
toks, kad elektrodai neliest ų odos disko ir standartinio ilgio elek ­
trodo atkarpa b ūtų panardinta į MgSO  4 tirpalą, 
— MgSO  4 tirpalo tūris rinktuvo vamzdelyje turi užtikrinti 1 
paveiksle parodyt ą skysčio lygių rinktuvo ir PTFE vamzdeliuose 
santykį, 
— odos diskas tur ėtų būti pakankamai tvirtai pritvirtintas prie PTFE 
vamzdelio, kad elektrin ės varžos rodmuo b ūtų tikrasis odos 
savybių matas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40 bis.  ODOS SUARDYMAS  IN VITRO . ŽMOGAUS ODOS 
MODELIO BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 431 (2004).  
1.1. ĮVADAS  
Odos suardymu vadinamas negr įžtamas odos audini ų pažeidimas po 
bandomosios medžiagos užd ėjimo [kaip apibr ėžta pagal Visuotinai 
suderintą chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifikavimo sistem ą 
(Globally Harmonised Classification System for Chemical 
Substances and Mixtures – GHS)] (1). Odos suardomumui įvertinti 
pagal šį metodą nenaudojami gyvi gyv ūnai arba j ų audiniai.  
Odos suardomumas paprastai buvo įvertinamas naudojant laboratori ­
nius gyvūnus (2). Perži ūrint B.4 bandymo metod ą atsižvelgta į gyvū­
nams sukeliamas kan čias ir skausm ą, ir metodas pakoreguotas numa ­
tant in vitro  metodus, taip gyv ūnams nesukeliant skausmo ir kan čių. 
Pirmasis žingsnis reguliavimo tikslais apibr ėžiant alternatyvius 
bandymus, kurie gali b ūti naudojami odos suardomumui bandyti, 
buvo pradiniai tinkamumo patvirtinimo bandymai (3). V ėliau buvo 
atliekamas oficialus odos suardymui įvertinti skirt ų in vitro  metodų 
(4) (5) tinkamumo patvirtinimas (6) (7) (8). Pagal ši ų bandym ų 
rezultatus ir kitus paskelbtus duomenis (9), buvo pateikta rekomen ­
dacija, pagal kuri ą in vitro  odos suardomumui įvertinti gal ėtų būti 
taikomi šie bandymai (10) (11) (12) (13): žmogaus odos modelio bandymas (šis metodas) ir odos sluoksnio elektrin ės varžos 
bandymas (žr. B.40 bandymo metod ą).
 
Tinkamumo patvirtinimo bandym ų metu gauta duomen ų, kad bandy ­
mais, kuriuose naudojami žmogaus odos modeliai (3) (4) (5) (9), galima patikimai atskirti žinomas od ą suardančias ir odos nesuardan ­ 
čias medžiagas. Be to, pagal bandymo protokol ą galima gauti smar ­
kiai odą suardan čių ir mažiau suardan čių medžiag ų skirtumo 
rodmenį.
 
Naudojant šiame metode aprašyt ą bandymą, galima nustatyti ardan ­ 
čias chemines medžiagas ir mišinius. Be to, galima nustatyti near ­
dančias medžiagas ir mišinius, jei rezultatams patvirtinti išanalizuo ­
jama kita turima informacija (pvz., pH, strukt ūros ir aktyvumo 
santykių, žmonėms ir (arba) gyv ūnams gaut ų duomenų) įrodomoji 
vertė (1) (2) (13) (14). Paprastai šiuo bandymu negaunama reikiamos 
informacijos apie odos dirginim ą ir nėra galimyb ės ardančias 
medžiagas suskirstyti į kategorijas, kaip tai leidžia daryti Visuotinai 
suderinta klasifikavimo sistema (GHS) (1).  
Norint visapusiškai įvertinti vienkartinio odos veikimo vietin į 
poveikį odai, rekomenduojama taikyti nuosekli ųjų bandymų strate­
giją, kuri pridedama prie B.4 bandymo metodo (2) ir numatyta 
Visuotinai suderintoje klasifikavimo sistemoje (GHS) (1). Ši ą 
bandymo strategij ą sudaro odos suardymo  in vitro  bandymai (kaip 
aprašyta šiame metode) ir odos dirginimo bandymai prieš sprendžiant 
klausimą dėl bandym ų su gyvais gyv ūnais. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Odos suardymas  in vivo  – negrįžtamas odos pažeidimas; b ūtent, 
matoma epidermio ir tikrosios odos (dermio) nekroz ė praėjus ne 
daugiau kaip keturioms valandoms po bandomosios medžiagos užd ė­
jimo. Tipiniai suardymo požymiai: opos, kraujavimas, kruvini šašai 
ir, baigiantis 14 par ų stebėjimo laikotarpiui, odos blukimas d ėl jos 
išbalimo, visiškai nuplikusios vietos ir randai. Neaišk ūs pažeidimai 
turėtų būti vertinami pasitelkiant histopatologin į tyrimą. 
Ląstelių gyvybingumas  – parametras suminiam l ąstelių populiacijos 
aktyvumui matuoti (pvz., l ąstelių mitochondrini ų dehidrogenazi ų 
geba redukuoti vitalin į dažiklį MTT), kuris, atsižvelgiant į galutinį 
matuojam ą dydį ir taikom ą bandymo schem ą, yra susij ęs su suminiu 
ląstelių kiekiu ir (arba) j ų gyvybingumu.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
1 lentelė 
Etaloninės chemin ės medžiagos  
Pavadinimas  Einecs Nr.  CAS Nr.  
1,2-diaminopropanas  201–155–9  78–90–0  Labai ardanti  
Akrilo rūgštis 201–177–9  79–10–7  Labai ardanti  
2-tret-butilfenolis  201–807–2  88–18–6  Ardanti  
Kalio hidroksidas (10 %)  215–181–3  1310–58–3  Ardanti  
Sieros rūgštis (10 %)  231–639–5  7664–93–9  Ardanti  
Oktano rūgštis (kaprilo r ūgštis)  204–677–5  124–07–02  Ardanti  
4-amino-1,2,4-triazolas  209–533–5  584–13–4  Neardanti  
Eugenolis  202–589–1  97–53–0  Neardanti  
Fenetilbromidas  203–130–8  103–63–9  Neardanti  
Tetrachloretilenas  204–825–9  27–18–4  Neardanti  
Izostearino r ūgštis 250–178–0  30399–84–9  Neardanti  
4-(metiltio)-benzaldehidas  222–365–7  3446–89–7  Neardanti  
Didesnė išvardytų medžiag ų dalis yra įtraukta į ECVAM tarptauti ­
niam tinkamumo patvirtinimo bandymui (4) atrinkt ų chemini ų 
medžiagų sąrašą. Jų atranka pagr įsta šiais kriterijais:  
i) vienodas ardan čių ir neardan čių medžiag ų skaičius; 
ii) naudojamos prekyboje esan čios medžiagos, kurios priklauso 
didesnei atitinkam ų cheminių junginių klasių daliai;  
iii) siekiant nustatyti ardomojo poveikio stiprumu pagr įstus skir­
tumus, įtrauktos labai ardan čios ir mažiau ardan čios medžiagos;  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv) pasirinktos tokios chemin ės medžiagos, su kuriomis b ūtų galima 
dirbti laboratorijoje nesukeliant kit ų rimtų, išskyrus odos suar ­
dymą, pavojų. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandomoji chemin ė medžiaga uždedama ant trij ų matmenų žmogaus 
odos modelio, kur į sudaro bent jau rekonstruotas epidermis ir funk ­
cionalus  stratum corneum . Ardančios medžiagos nustatomos pagal j ų 
sugebėjimą po tam tikro veikimo laikotarpio sumažinti l ąstelių gyvy­
bingumą [nustatom ą, pvz., taikant MTT redukavimo bandym ą (15)] 
iki lygio, kuris b ūtų mažesnis už apibr ėžtą ribinį lygį. Žmogaus odos 
modelio bandymas pagr įstas hipoteze, kad ardan čios chemin ės 
medžiagos gali prasiskverbti per  stratum corneum  difuzijos arba 
suardymo b ūdu ir yra citotoksiškos po juo esan čių sluoksni ų ląste­
lėms. 
1.4.1.  Bandymo eiga  
1.4.1.1.  Žmogaus odos modeliai  
Žmogaus odos modelius galima pasigaminti arba pirkti (pvz., 
EpiDerm  TM ir EPISKIN  TM modelius) (16) (17) (18) (19) arba sukurti 
ar pasigaminti bandym ų laboratorijoje (20) (21). Pripaž įstama, kad 
naudojant žmogaus od ą būtina atsižvelgti į nacionalinius ir tarptau ­
tinius etinius aspektus bei s ąlygas. Turi b ūti patvirtintas vis ų naujų 
modelių tinkamumas (bent tokiu mastu, kuris aprašytas 1.4.1.1.2). 
Šiam bandymui naudojami žmogaus odos modeliai turi atitikti šias 
sąlygas:  
1.4.1.1.1. B e n d r o s i o s m o d e l i u i t a i k o m o s s ą l y g o s  
Epiteliui sukurti turi b ūti naudojami žmogaus keratinocitai. Po funk ­
cionaliu  stratum corneum  turi būti daugybiniai gyvybing ų epitelio 
ląstelių sluoksniai. Be to, odos modelis gali tur ėti stromos kompo ­
nentų sluoksnį. Stratum corneum  turi būti daugiasluoksnis ir tur ėti 
būtinąjį riebalinį profilį, kad susidaryt ų pakankamai tvirtas funkcio ­
nalus užtvaras, per kur į negalėtų greitai prasiskverbti citotoksiniai 
markeriai. Modelio sulaikomosios savyb ės turi neleisti medžiagai 
apeiti  stratum corneum  ir patekti į gyvybing ąjį audinį. Jei bandomo ­
sios medžiagos gal ėtų apeiti  stratum corneum , odos veikimo 
medžiaga modeliavimas b ūtų netinkamas. Odos modelis neturi b ūti 
užterštas bakterijomis ( įskaitant mikoplazm ą) arba grybeliais.  
1.4.1.1.2. F u n k c i n ė s m o d e l i u i t a i k o m o s s ą l y g o s  
Gyvybingumas paprastai kiekybiškai įvertinamas naudojant MTT 
arba kitus medžiag ų apykaitoje dalyvaujan čius vitalinius dažiklius. 
Šiais atvejais iš neigiamo kontrolinio bandinio audinio ekstrahuoto 
(ištirpinto) dažiklio optinis tankis turi b ūti bent 20 kart ų didesnis už 
vien tik ekstrahavimo tirpiklio optin į tankį [apžvalga pateikta (22)]. 
Neigiamo kontrolinio bandinio audinys turi b ūti patvarus kult ūroje 
(užtikrinti panašius gyvybingumo matavimus) vis ą bandomojo 
veikimo trukm ę. Stratum corneum  turi būti pakankamai tvirtas, kad 
galėtų atsispirti greitai chemini ų citotoksini ų markerių (pvz., 1 % 
Triton X-100) skverb čiai. Šią savybę galima įvertinti veikimo 
trukme, per kuri ą ląstelių gyvybingumas sumaž ėja 50 % (ET  50 ) 
(pvz., EpiDerm  TM ir EPISKIN  TM modeliams šis laikas > 2 h). Turi 
būti aišku, kad audinys geba atsikurti laikui b ėgant, ir, pageidautina, 
skirtingose laboratorijose. Be to, jis turi pad ėti nustatyti etalonini ų 
cheminių medžiag ų ardomojo poveikio stiprum ą (žr. 1 lentel ę), kai 
tokios medžiagos naudojamos pagal pasirinkt ą bandymo protokol ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  Bandomosios ir kontrolin ės medžiag ų uždėjimas  
Kiekvienam apdorojimui (veikimo trukmei) naudojami du kartotiniai 
audinio bandiniai, įskaitant kontrolinius bandinius. Tiriant skyst ąsias 
medžiagas, naudojamos bandomosios medžiagos kiekio turi pakakti 
tolygiam odos paviršiaus padengimui medžiaga, kurios reik ėtų 
naudoti ne mažiau kaip 25 μL/cm  2 . Jei bandomos kietosios 
medžiagos, turi b ūti uždedamas pakankamas medžiagos kiekis odos 
paviršiui tolygiai uždengti, j ą reikėtų sudrėkinti dejonizuotu arba 
distiliuotu vandeniu geram s ąlyčiui su oda užtikrinti. Prireikus kieto ­
sios medžiagos prieš naudojim ą sumalamos į miltelius. Paviršiaus 
padengimo metodas turi b ūti tinkamas bandomajai medžiagai (žr. 
pvz., 5 nuorod ą). Pasibaigus veikimo laikotarpiui, bandomoji 
medžiaga turi b ūti kruopščiai nuplauta nuo odos paviršiaus su atitin ­
kamu buferiniu tirpalu arba 0,9 % NaCl.  
Norint užtikrinti adekva čias eksperimentinio modelio charakteris ­
tikas, kiekvienam bandymui naudojami lygiagret ūs teigiami ir 
neigiami kontroliniai bandiniai. Rekomenduojamos teigiam ų kontro­
linių bandinių medžiagos yra ledin ė acto rūgštis arba 8 mol/l KOH. 
Rekomenduojamos neigiam ų kontrolini ų bandinių medžiagos yra 
0,9 % NaCl arba vanduo.  
1.4.1.3.  Ląstelių gyvybingumo matavimai  
Ląstelių gyvybingumas matuojamas tik naudojantis patvirtintais 
kiekybiniais metodais. Be to, naudojamas gyvybingumo matavimo metodas turi tikti naudojamai trij ų matmen ų audinio konstrukcijai 
matuoti. Nespecifinis dažikli ų surišimas turi netrukdyti gyvybingumo 
matavimui. Tod ėl baltymais surišami dažikliai ir medžiag ų apykai­
toje nedalyvaujantys dažikliai netinka (tarkim, neutralusis raudo ­
nasis). Dažniausiai naudojamas MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- 
difeniltetrazolinio bromido, tiazolilo m ėlynojo, Einecs numeris 
206–069–5, CAS numeris 298–93–1)] redukavimo bandymas, kuriuo, kaip buvo įrodyta, gaunami tiksl ūs ir atkuriami rezultatai 
(5), tačiau galima naudoti kitus dažiklius. Esant reikiamai inkuba ­
cijos temperat ūrai, odos bandinys 3 h įdedamas į atitinkamos 
koncentracijos MTT tirpal ą (pvz., 0,3–1 mg/ml). M ėlynos formazano 
nuosėdos ekstrahuojamos tirpikliu (izopropanoliu) ir formazano 
koncentracija nustatoma matuojant optin į tankį, kai bangos ilgis 
yra nuo 540 iki 595 nm.
 
Bandomosios medžiagos cheminis vitalinio dažiklio veikimas gali 
būti panašus į medžiag ų apykaitą ląstelėse, todėl būtų gautas klai ­
dingas gyvybingumo įvertis. Buvo įrodyta, kad taip atsitinka, kai 
tokia bandomoji medžiaga n ėra visiškai nuplaunama nuo odos (9). 
Jei bandomoji medžiaga tiesiogiai veikia vitalin į dažiklį, turi būti 
naudojami papildomi kontroliniai bandiniai, skirti bandom ųjų 
medžiagų trukdžiams nustatyti ir gyvybingumo matavimo pataisoms 
padaryti (9) (23).  
2. DUOMENYS  
Kiekvienam audiniui lentel ėse pateikiamos optinio tankio vert ės ir 
apskaičiuotos ląstelių gyvybingumo procentin ės vertės, gautos 
bandomajai medžiagai ir teigiamiems bei neigiamiems kontroliniams 
bandiniams, įskaitant kartotini ų bandym ų, jei atliekami, duomenis, 
vidutines ir atskiras vertes.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Kiekvieno bandomojo bandinio gautos optinio tankio vert ės gali būti 
naudojamos nustatant gyvybingumo procentin ę dalį lyginant su 
neigiamais kontroliniais bandiniais, kuri ų gyvybingumo vert ė pagal 
susitarimą prilyginama 100 %. Ribin ė ląstelių gyvybingumo procen ­
tinės dalies vert ė, skirianti ardan čias ir neardan čias bandom ąsias 
medžiagas (arba skirtingas ar suardymo savybi ų klases), arba statis ­
tinė (-ės) proced ūra (-os), taikyta (-os) rezultatams įvertinti ir ardan ­ 
čioms medžiagoms nustatyti, turi b ūti aiškiai apibr ėžtos ir patvir ­
tintos dokumentais, be to turi b ūti įrodytas jų tinkamumas. Apskritai, 
šios ribin ės vertės yra nustatytos optimizuojant bandym ą, patikrintos 
pradinio tinkamumo patvirtinimo etapu ir patvirtintos atliekant tinka ­
mumo patvirtinimo bandym ą. Kaip pavyzdys, pateikiama suardymo 
savybių prognozė, taikant EpiDerm  TM modelį (9): 
laikoma, kad bandomoji medžiaga suardo od ą: 
i) jei po 3 min. veikimo odos gyvybingumas yra mažesnis kaip 
50 %, arba  
ii) jei po 3 min. veikimo gyvybingumas yra lygus 50 % arba 
didesnis, bet po 1 h veikimo gyvybingumas yra mažesnis kaip 
15 %.  
Laikoma, kad bandomoji medžiaga neardo odos:  
i) jei po 3 min. veikimo gyvybingumas yra lygus 50 % arba didesnis 
ir po 1 h veikimo gyvybingumas yra lygus 15 % arba didesnis.  
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti ši informacija:  
bandomoji ir kontrolin ė medžiagos:  
— cheminis (-iai) pavadinimas (-ai), pvz., IUPAC arba CAS pava ­
dinimas, CAS numeris, jei žinomas;  
— medžiagos arba preparato grynumas ir sud ėtis (masės procentin ė 
(-ės) dalis (-ys));  
— fizikin ės ir chemin ės savybės, pvz., fizikin ė būsena, pH, stabi ­
lumas, tirpumas vandenyje, svarbios atliekamam bandymui:  
— bandom ųjų/kontrolini ų medžiag ų apdorojimas prieš bandym ą, jei 
taikomas (pvz., šildymas, malimas);  
— stabilumas, jei žinomas.  
Naudoto odos modelio ir protokolo pagrindimas.  
Bandymo s ąlygos:  
— naudota l ąstelių sistema;  
— informacija apie matavimo prietaiso (pvz., spektrofotometro), 
naudoto l ąstelių gyvybingumui matuoti, kalibravim ą; ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— visa konkret ų odos model į patvirtinanti informacija, įskaitant jo 
tinkamum ą; 
— išsami informacija apie taikyt ą bandymo proced ūrą; 
— naudotos bandomosios doz ės; 
— visų bandymo proced ūros pakeitim ų aprašymas;  
— nuoroda į anksčiau gautus duomenis apie model į; 
— taikyt ų vertinimo kriterij ų aprašymas.  
Rezultatai:  
— atskirų bandinių duomenys, suvesti į lenteles;  
— kitų pastebėtų reiškinių aprašymas.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvada.  
4. NUORODOS  
1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assess ­
ment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. 
http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- mono(2001)6.
 
2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corro ­
sion.  
3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., 
Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corro ­
sivity testing. The report recommendations of ECVAM 
Workshop 6 ATLA 23, p. 219–255.
 
4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international vali ­
dation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 
p. 471–482.  
5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, h.G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. In Vitro 12, p. 483–524.
 
6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, p. 62.  
7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, h., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, p. 129–147.
 
8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97–3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. 
niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, h., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, h.G. (2000). The ECVAM preva ­
lidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, p. 371–401.
 
10) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275–280.  
11) ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365–67.  
12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of 
EpiDerm  TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin Trans ­
cutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02–4502. National Toxicology Program 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicolo ­
gical Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam. niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
13) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st–2nd November 2001, Secretariat’s Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat
 
14) Worth AP, Fentem JH, Balls M, Botham PA, Curren RD, Earl 
LK, Esdaile DJ, Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 
26, p. 709–720.
 
15) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, p. 55–63.  
16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and 
Klausner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxic. In Vitro 8, p. 889–891.
 
17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural characte ­
rization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, p. 211–225.
 
18) Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Poura ­
dier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 
p. 133–140.
 
19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas h, Tardy M, 
Thivolet J (1991). In vitro and post –transplantation differentia ­
tion of human keratinocytes grown on the human type IV 
collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental 
Cell Research 193: p. 310–319.  
20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and Rosen ­
berg, h. (1992). The organotypic culture of human skin kerati ­
nocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotech ­
nology 9, p. 163–171.  
21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., 
Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living skin 
construct for clinical applications. Biotechnology and Bioengi ­
neering 43/8, p. 747–756.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical 
assessment of the use of microculture tetrazolium assays to 
measure cell growth and function. Growth Regulation 5, p. 69–84.
 
23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne, C., Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation 
study on  in vitro  tests for acute skin irritation: results and 
evaluation by the Management Team. Toxic. InVitro 15, p. 57–93.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  3T3 NRU FOTOKSIŠKUMO  IN VITRO  BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 432 (2004).  
1.1. ĮVADAS  
Fototoksiškumas apibr ėžiamas kaip toksinis atsakas į ant kūno 
uždėtą medžiag ą, kuris atsiranda arba padid ėja (tampa matomas 
esant mažesn ėms dozėms) po to paveikus šviesa, arba kuris suke ­
liamas sisteminiu b ūdu davus medžiagos ir po to apšvietus od ą. 
3T3 NRU fototoksiškumo  in vitro  bandymas naudojamas bandomo ­
sios medžiagos fototoksiniam potencialui nustatyti, kuris atsiranda 
sužadinus medžiag ą ją veikiant šviesa. Bandymu įvertinamas foto ­
citotoksiškumas, nustatant santykin į ląstelių gyvybingumo maž ėjimą, 
kai jos veikiamos chemine medžiaga esant šviesai, palyginti su gyvy ­
bingumo maž ėjimu tamsoje. Tik ėtina, kad šiuo bandymu nustatytos 
medžiagos yra fototoksiškos  in vivo  po to, kai organizmas jomis 
buvo veikiamas sisteminiu b ūdu ir jos pateko į odą arba kai jomis 
veikiama konkreti odos vieta.  
Apie daug chemini ų medžiag ų rūšių yra paskelbta, jog jos sukelia 
fototoksin į poveikį (1) (2) (3) (4). Vis ų jų bendra savyb ė – gebėjimas 
sugerti saul ės šviesos bang ų ilgio energij ą. Pagal pirm ąjį fotoche­
mijos dėsnį (Grotthaus-Draper  dėsnį) fotocheminei reakcijai vykti 
turi būti sugertas pakankamas šviesos kvant ų kiekis. Taigi prieš 
planuojant biologin į bandym ą, turi būti nustatytas bandomosios 
cheminės medžiagos UV/matomosios šviesos sugerties spektras 
pagal OECD bandym ų rekomendacij ą 101. Buvo padaryta prielaida, 
kad jei molinis ekstinkcijos/sugerties koeficientas yra mažesnis kaip 10 l × mol
 -1 × cm  -1 , maža tikimyb ė, kad chemin ė medžiaga yra 
fotochemiškai aktyvi. Toki ų medžiag ų nebūtina bandyti atliekant 
3T3 NRU fototoksiškumo  in vitro  arba bet kur į kitą biologin į 
bandymą neigiamam fotocheminiam poveikiui nustatyti (1) (5). 
Taip pat žr. 1 pried ėlį. 
3T3 NRU fototoksiškumo  in vitro  bandymo patikimumas ir tinka ­
mumas buvo įvertintas neseniai (6) (7) (8) (9). Buvo įrodyta, kad 
pagal 3T3 NRU fototoksiškumo  in vitro  bandymą galima progno ­
zuoti ūmų fototoksin į poveikį gyvūnams ir žmon ėms in vivo . 
Bandymas neskirtas kitokio pob ūdžio žalingam poveikiui, kuris 
gali atsirasti kartu veikiant cheminei medžiagai ir šviesai, pvz., foto ­
genotoksiškumui, fotoalergijai arba fotokancerogeniškumui, nustatyti ir juo neįmanoma įvertinti fototoksinio potencialo. Be to, bandymas 
netinka, jei norima nustatyti netiesioginius fototoksiškumo mecha ­
nizmus, bandomosios medžiagos metabolit ų poveikį arba mišini ų 
poveikį.
 
Nors iš esm ės reikalaujama, kad atliekant visus  in vitro  bandymus 
genotoksiniam ir kancerogeniniam potencialui prognozuoti, b ūtina 
naudoti metabolines sistemas, fototoksikologijoje iki šiol yra tik reti pavyzdžiai, kai medžiaga turi patirti metabolin į virsmą, kad  in 
vivo arba  in vitro  ji veiktų kaip fototoksiška medžiaga. Tod ėl reika­
lavimas š į bandymą atlikti naudojant metabolin ės aktyvacijos sistem ą 
nėra laikomas b ūtinu arba moksliškai pagr įstu.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Energinė apšvieta  – ultravioletin ės (UV) arba matomosios šviesos, 
krentančios ant paviršiaus, intensyvumas, išreiškiamas W/m  2 arba 
mW/cm  2 . 
Šviesos doz ė – ultravioletin ės (UV) arba matomosios šviesos, kren ­
tančios ant paviršiaus, kiekis ( = intensyvumas × laikas), išreikštas J 
(= W × s) ploto vienetui, pvz., J/m  2 arba J/cm  2 . 
UV šviesos bang ų juostos  – TRK ( Tarptautin ė apšvietimo komisija ) 
rekomendavo šiuos žymenis: UVA (315–400 nm), UVB (280–315 
nm) ir UVC (100–280 nm). Be to, naudojami kiti žymenys; UVB ir 
UVA skiriamoji riba dažnai yra 320 nm, o UVA galima padalyti į 
UV-A1 ir UV-A2, skiriam ąją ribą nustačius ties maždaug 340 nm.  
Ląstelių gyvybingumas  – suminio l ąstelių populiacijos aktyvumo 
įvertinimo parametras (pvz., vitalinio neutraliojo raudonojo dažiklio 
sugėrimas ląstelių lizosomose), kuris, atsižvelgiant į galutinį matuo­
jamą dydį ir taikom ą bandymo schem ą, yra susij ęs su sumini ų 
ląstelių kiekiu ir (arba) j ų gyvybingumu.  
Santykinis l ąstelių gyvybingumas  – ląstelių gyvybingumas, paly ­
ginti su gyvybingumu, gautu naudojant neigiamus kontrolinius 
(nešiklio) bandinius, kuriems buvo taikoma visa bandymo proced ūra 
(arba + Irr arba –Irr), ta čiau jie nebuvo veikiami bandom ąja chemine 
medžiaga.  
FDF (fotodirginimo faktorius)  – faktorius, išreiškiantis dviej ų 
vienodai efektyvi ų bandomosios medžiagos citotoksini ų koncentra ­
cijos verčių (IC  50 ), gautų nesant (–Irr) ir esant (+ Irr) necitotoksiniam 
švitinimui UVA/matom ąja šviesa, santyk į. 
IC 50 – bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant l ąstelių 
gyvybingumas sumaž ėja 50 %.  
VFE (vidutinis fotoefektas)  – matmuo, nustatytas atliekant koncent ­
racijos ir atsako kreivi ų, gautų nesant (–Irr) ir esant (+ Irr) necito ­
toksiniam švitinimui UVA/matom ąja šviesa, matematin ę analizę. 
Fototoksiškumas  – ūmus toksinis atsakas, kuris atsiranda, kai oda iš 
pradžių veikiama tam tikromis chemin ėmis medžiagomis, o v ėliau 
šviesa, arba kuris panašiai sukeliamas, kai oda apšvitinama po to, kai organizmui sisteminiu b ūdu buvo duodama bandomoji chemin ė 
medžiaga.
 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
3T3 NRU fototoksiškumo  in vitro  bandymas yra pagr įstas chemin ės 
medžiagos citotoksiškumo lyginimu, kai ji bandoma, b ūdama apšvi ­
tinta modeliuojamos saul ės šviesos necitotoksine doze, ir tamsoje. 
Šiame bandyme citotoksiškumas yra išreiškiamas kaip su koncentra ­
cija susij ęs vitalinio neutraliojo raudonojo (NR) dažiklio sug ėrimo 
mažėjimas, išmatuotas pra ėjus 24 h po veikimo chemine medžiaga ir 
švitinimo (10). NR yra silpnas katijoninis dažiklis, kuris ne difuzijos būdu lengvai prasiskverbia per l ąstelių membranas, susikaupdamas 
ląstelių lizosomose. D ėl jautrių lizosomos membran ų ląstelių pavir­ 
šiaus pakitim ų lizosomos darosi trapios, be to, vyksta kiti pakitimai, 
kurie laipsniškai tampa negr įžtamais. D ėl tokių ksenobiotikais 
sukeltų pakitimų mažėja NR sug ėrimas ir surišimas. Taigi įmanoma 
atskirti gyvybingas, pažeistas arba žuvusias l ąsteles, o tai yra šio 
bandymo pagrindas.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Balb/c veisl ės pelių 3T3 ląstelės 24 h laikomos kult ūroje mono ­
sluoksniui gauti. Iš pradži ų kiekviena bandomoji medžiaga (8 skir ­
tingų dydžių jos koncentracijos) 1 h inkubuojama dviejose 96 
duobučių lėkšteles. V ėliau viena iš l ėkštelių apšvitinama didžiausia 
doze, kuri n ėra citotoksiška, o kita l ėkštelė laikoma tamsoje. Tuomet 
abiejų lėkštelių apdorojimo terp ė yra keičiama kult ūros terpe ir dar 
po 24 h inkubavimo l ąstelių gyvybingumas nustatomas, matuojant 
neutraliojo raudonojo sug ėrimą. Ląstelių gyvybingumas išreiškiamas 
kaip procentin ė neapdorot ų tirpiklio kontrolini ų bandinių gyvybin ­
gumo dalis ir apskai čiuojamas kiekvienai bandomajai koncentracijai. 
Fototoksiniam potencialui prognozuoti lyginami atsakai į skirtingas 
medžiagos, apšvitintos arba laikytos tamsoje, koncentracijas, kai lygis paprastai b ūna IC
 50 , t. y. toks kad l ąstelių gyvybingumas suma ­ 
žėja iki 50 % palyginti su neapdorotais kontroliniais bandiniais.  
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Paruošiamieji darbai  
1.4.1.1.  Ląstelės 
Atliekant tinkamumo patvirtinimo bandym ą, buvo naudojama neper ­
traukiama peli ų fibroblast ų linija, Balb/c 3T3, 31 klonas, iš  American 
Type Culture Collection  (ATCC), Manassas, VA, JAV arba  Euro­
pean Collection of Cell Cultures  (ECACC), Salisbury, Wiltshire, JK, 
todėl rekomenduojama naudoti šias l ąsteles, gautas iš reikalavimus 
atitinkančios ląstelių saugyklos. Pagal t ą pačią bandymo proced ūrą 
galima naudoti kitas l ąsteles arba l ąstelių linijas, jei kultivavimo 
sąlygos pritaikomos specifiniams l ąstelių poreikiams, ta čiau turi 
būti įrodytas lygiavertiškumas.  
Ląstelės turi būti reguliariai tikrinamos, ar jos neužterštos miko ­
plazma, ir naudojamos tik jei jos visiškai n ėra (11).  
Svarbu, kad l ąstelių jautrumas UV spinduliuotei b ūtų reguliariai 
tikrinamas pagal šiame metode aprašyt ą kokybės kontrol ės proce­
dūrą. Kadangi l ąstelių jautrumas UVA gali padid ėti didėjant persė­
jimų skaičiui, turėtų būti naudojamos mažiausio turimo pers ėjimų 
skaičiaus Balb/c 3T3 l ąstelės, pageidautina mažesnio kaip 100 (žr. 
1.4.2.2.2 skirsn į ir 2 pried ėlį). 
1.4.1.2.  Terp ės ir auginimo s ąlygos  
Įprastu būdu persėjant ląsteles ir atliekant bandymo proced ūras, turi 
būti naudojama tinkama kultivavimo terp ė ir paisoma inkubavimo 
sąlygų, pvz., Balb/c 3T3 l ąstelių terpė yra DMEM ( Dulbecco ’s 
Modified Eagle’s Medium ), papildyta 10 % naujagimi ų veršelių 
serumu, 4 mmol/l glutamino, penicilinu (100 TV) ir streptomicinu 
(100 μg/ml); inkubuojama dr ėgnoje atmosferoje, esant 37 °C, o CO  2 
kiekis siekia 5–7,5 %, priklausomai nuo buferinio tirpalo (žr. 1.4.1.4 
skirsnio antr ą pastraip ą). Ypač svarbu, kad l ąstelių kultivavimo 
sąlygos leist ų užtikrinti l ąstelių ciklo trukm ę, kuri atitinka įprastą 
naudojam ų ląstelių arba jų linijų gyvavimo laikotarp į 
1.4.1.3.  Kult ūrų ruošimas  
Užšaldytų pradinių kultūrų ląstelės sėjamos kultivavimo terp ėje 
atitinkamu tankiu ir bent kart ą persėjamos prieš jas naudojant 3T3 
NRU fototoksinio poveikio  in vitro  bandyme.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Fototoksiškumo bandymui naudojamos l ąstelės sėjamos į kultiva­
vimo terp ę tokiu tankiu, kad pasibaigus bandymui, t. y. kai nusta ­
tomas gyvybingumas, pra ėjus 48 h po l ąstelių pasėjimo, atskiros 
ląstelių kolonijos nesusiliet ų, Balb/c/3T3 linijos l ąstelėms, kultivuo ­
jamoms 96 duobu čių lėkštelėse, rekomenduojamas l ąstelių tankis yra 
1 × 10 ląstelių vienoje duobut ėje. 
Kiekvienai bandomajai cheminei medžiagai skirtos l ąstelės vienodai 
sėjamos į 2 atskiras 96 duobu čių lėkšteles, kurios lygiagre čiai naudo ­
jamos visame bandyme, esant vienodoms kultivavimo s ąlygoms, 
išskyrus laikotarp į, kai vienos l ėkštelės ląstelės švitinamos (+ Irr), 
o kitos – laikomos tamsoje(-Irr).  
1.4.1.4.  Bandomosios medžiagos ruošimas  
Bandomos chemin ės medžiagos turi b ūti iš naujo ruošiamos prieš 
pradedant bandym ą, išskyrus atvejus, kai turimi duomenys įrodo jų 
stabilumą laikymo s ąlygomis. Rekomenduojama visus chemin ės 
medžiagos paruošimo ir l ąstelių pradinio apdorojimo darbus atlikti 
tokiomis apšvietimo s ąlygomis, kuriomis prieš švitinim ą būtų 
išvengta bandomosios medžiagos fotoaktyvinimo arba skilimo.  
Bandomosios medžiagos ištirpinamos buferiniuose drusk ų tirpaluose, 
pvz.,  Earle’s Balanced Salt Solution  (EBSS), arba kituose fiziolo ­
giškai pusiausviruose buferiniuose tirpaluose, kuriuose neturi b ūti 
baltymų komponent ų (pvz., pH indikatorini ų dažiklių ir vitamin ų), 
kad būtų išvengta trukdži ų švitinant. Kadangi švitinamos l ąstelės 
maždaug 50 min. laikomos ne CO  2 inkubatoriuje, reikia imtis prie ­
monių šarmo koncentracijos did ėjimui išvengti. Jei naudojami mažos 
talpos buferiniai tirpalai, pvz., EBSS, pH did ėjimo išvengti galima, 
jei ląstelės inkubuojamos esant 7,5 % CO  2 . Jei ląstelės inkubuojamos 
esant tik 5 % CO  2 , reikėtų pasirinkti didesn ės talpos buferin į tirpalą. 
Cheminės medžiagos, kuri ų tirpumas vandenyje yra ribotas, turi b ūti 
tirpinamos atitinkamame tirpiklyje. Jei naudojamas tirpiklis, jo t ūris 
visose kultivavimo terp ėse, t. y. neigiamuose (tirpikli ų) kontroli ­
niuose bandiniuose ir vis ų bandomosios medžiagos koncentracijos 
verčių bandiniuose, turi b ūti vienodas, ir tirpiklis neturi b ūti citotok­
siškas esant tokiai jo koncentracijai. Bandomosios medžiagos 
koncentracijos vert ės pasirenkamos taip, kad nesusidaryt ų nuosėdos 
arba drumsti tirpalai.  
Rekomenduojami tirpikliai yra dimetilsulfoksidas (DMSO) ir 
etanolis (ETOH). Gali tikti ir kiti mažai citotoksiniai tirpikliai. 
Prieš naudojant turi b ūti patikrintos vis ų tirpiklių konkrečios savyb ės, 
pvz., reagavimas su bandom ąja medžiaga, fototoksinio poveikio 
slopinimas, radikal ų sugavimo ir (arba) cheminio stabilumo tirpiklyje 
savybės. 
Tirpinimui palengvinti galima naudoti s ūkurinį ir (arba) ultragarsin į 
maišymą ir (arba) šildym ą iki atitinkamos temperat ūros, jei tai neturi 
įtakos bandomosios chemin ės medžiagos stabilumui.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5.  Švitinimo s ąlygos  
1.4.1.5.1. Š v i e s o s š a l t i n i s  
Tiriant medžiag ų fototoksiškum ą, tinkamo šviesos šaltinio bei 
šviesos filtr ų pasirinkimas yra svarbiausias veiksnys. UVA bei mato ­
mosios šviesos sritys paprastai yra susijusios su fototoksin ėmis reak­
cijomis  in vivo  (3) (12), o UVB sritis apskritai yra mažiau svarbi ir 
yra ypač citotoksin ė; citotoksin ės savybės stiprėja 1 000 kart ų, jei 
bangos ilgis sumaž ėja nuo 313 iki 280 nm (13). Tarp tinkamo 
šviesos šaltinio pasirinkimo kriterij ų turi būti reikalavimas, kad 
šviesos šaltinio spinduliuot ė atitiktų bandomosios chemin ės 
medžiagos sugeriamos spinduliuot ės bangos ilgius (sugerties 
spektrą), o šviesos doz ės (pasiekiamos per priimtin ą veikimo trukm ę) 
pakaktų žinomoms fototoksiškoms medžiagoms nustatyti. Be to, 
naudojami bang ų ilgiai ir doz ės neturi per daug kenkti bandymo 
sistemai, pvz., šilumos spinduliavimas (infraraudonoji sritis).  
Manoma, kad optimalus b ūdas dirbtinei šviesai gauti yra saul ės 
šviesos imitatoriai. Filtruojamojo saul ės šviesos imitatoriaus šviti ­
nimo galios pasiskirstymas turi b ūti artimas (14) nurodytai dienos 
šviesai lauko s ąlygomis. Saul ės šviesos imitatoriuose naudojamos 
ksenono ir gyvsidabrin ės metalų halogenid ų (legiruotos) lempos 
(15). Pastar ųjų privalumas – mažesnis spinduliuojamos šilumos 
kiekis, be to, jos yra pigesn ės, tačiau ne taip tiksliai atitinka saul ės 
šviesos spektr ą palyginti su ksenono lempomis. Kadangi didel ę visų 
saulės šviesos imitatori ų spinduliuot ės dalį sudaro UVB spinduliuot ė, 
jie turi b ūti tinkamai filtruojami, kad susilpnint ų labai citotoksin ę 
UVB bang ų ilgio spinduliuot ę. Kadangi l ąstelių kultūrai naudojamos 
plastikinės medžiagos turi UV stabilizatori ų, spektras turi b ūti matuo­
jamas per tokio paties, kaip ir bandyme naudojamo tipo 96 duobu čių 
lėkštelės dangtį. Kad ir koki ų būtų imamasi priemoni ų spektro 
dalims silpninti filtravimu ir nepaisant neišvengiamo įrangos filtruo ­
jamojo poveikio, šiuos filtrus pra ėjusios šviesos spektras neturi nu ­
krypti nuo etalonin ės dienos šviesos lauko s ąlygomis (14). Filtruo ­
jamojo saul ės šviesos imitatoriaus, naudojamo vykdant 3T3 NRU 
fototoksiškumo  in vitro  bandymo tinkamumo patvirtinimo bandym ą, 
spinduliuot ės spektro skirstinio pavyzdys pateiktas (8) (16). Taip pat 
žr. 2 pried ėlio 1 paveiksl ą. 
1.4.1.5.2. D o z i m e t r i j a  
Šviesos intensyvumas (energin ė apšvieta) tur ėtų būti reguliariai tikri ­
namas prieš kiekvien ą fototoksiškumo bandym ą, naudojant tinkam ą 
plačiajuostį UV spinduliuot ės matuokl į. Intensyvumas turi b ūti 
matuojamas per tokio paties, kaip ir bandyme naudojamo tipo 96 duobučių plokštel ės dangtį. UV spinduliuot ės matuoklis turi b ūti 
kalibruojamas pagal šviesos šaltin į. UV spinduliuot ės matuoklio 
veikimą būtina tikrinti, ir šiam tikslui rekomenduojama naudoti 
antrą to paties tipo ir vienodo kalibravimo UV spinduliuot ės 
matuoklį. Būtų geriausia, jei filtruojamo šviesos šaltinio spektrinei 
energinei apšvietai matuoti ir pla čiajuosčio UV spinduliuot ės matuo­
klio kalibravimui tikrinti kas tam tikr ą ilgesnį laiko tarp ą būtų naudo­
jamas spektroradiometras.
 
Buvo nustatyta, kad 5 J/cm doz ė (išmatuota UVA srityje) n ėra cito­
toksiška Balb/c 3T3 l ąstelėms ir jos pakanka sužadinti chemines 
medžiagas, kad b ūtų sukeltos fototoksin ės reakcijos (6) (17), pvz., 
norint pasiekti 5 J/cm  2 per 50 min laikotarp į, nustatoma 1,7 mW/cm  2 
energinė apšvieta. Žr. 2 pried ėlio 2 paveiksl ą. Jei naudojama kita 
ląstelių linija arba skirtingas šviesos šaltinis, švitinimo doz ę gali 
tekti kalibruoti taip, kad b ūtų galima pasirinkti tok į dozės režimą, 
kuris neb ūtų kenksmingas l ąstelėms, bet kuriuo gautos doz ės pakaktų 
sužadinti etalonines fototoksines medžiagas. Šviesos trukm ė apskai­ 
čiuojama taip:  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ Í ðšvitinimo doz ė ðJ= ðcmÞ 2 Þ Ü 1 000Þ 
ðenerginė apšvieta ðmW = ðcmÞ 2 Þ Ü 60Þ Î 
(1 J = 1W × s)  
1.4.2.  Bandymo s ąlygos  
1.4.2.1.  Bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės 
Cheminės medžiagos, bandomos šviesoje (+ Irr) ir tamsoje (-Irr), 
koncentracijos ver čių intervalas turi b ūti tinkamai nustatytas doz ės 
intervalo radimo bandymais. Gali b ūti naudinga nustatyti pradin į 
tirpumą ir po 60 min. (arba po tiek laiko, kiek skiriama veikimui 
medžiaga), kadangi tirpumas laikui b ėgant arba švitinimo laikotarpiu 
gali pasikeisti. Siekiant išvengti toksinio poveikio, kur į sukelia netin ­
kamos kultivavimo s ąlygos arba labai šarmin ės arba r ūgštinės 
cheminės medžiagos, l ąstelių kultūrų pH vertės intervalas, prid ėjus 
cheminės medžiagos, tur ėtų būti 6,5–7,8.  
Didžiausia bandomosios medžiagos koncentracija turi atitikti fiziolo ­
gines bandymo s ąlygas, pvz., tur ėtų būti išvengta įtempimo, kur į 
sukelia osmoz ė ir pH. Nelygu, kokia yra bandomoji chemin ė 
medžiaga, gali tekti atsižvelgti į kitas fizikines ir chemines savybes, 
pvz., į veiksnius, ribojan čius didžiausi ą bandom ąją koncentracij ą. 
Palyginti mažai tirpios medžiagos, kurios n ėra toksiškos iki pat soties 
koncentracijos, tur ėtų būti bandomos esant didžiausiai įmanomai 
koncentracijai. Apskritai tur ėtų būti išvengta bandomosios medžiagos 
nuosėdų susidarymo esant bet kuriai bandomajai koncentracijai. 
Didžiausia bandomosios medžiagos koncentracija netur ėtų būti 
didesnė kaip 1 000 μg/ml; osmolingumas neturi b ūti didesnis kaip 
10 mmol. Naudojamos 8 bandomosios medžiagos koncentracijos 
vertės, kurios, skiedžiamos pagal t ą patį skiedimo faktori ų, sudaro 
geometrin ę progresij ą (žr. 2.1 skirsnio antr ąją pastraipą). 
Jei yra informacijos (gautos intervalo radimo bandymu), kad atlie ­
kant bandym ą tamsoje (-Irr) bandomoji chemin ė medžiaga n ėra cito­
toksiška iki pat ribin ės koncentracijos, bet švitinama (+ Irr) yra labai 
citotoksiška, norint atitikti tinkamos duomen ų kokybės reikalavim ą, 
(+ Irr) ir (-Irr) bandymams pasirinktini koncentracijos intervalai gali skirtis.
 
1.4.2.2.  Kontroliniai bandiniai  
1.4.2.2.1. L ą s t e l i ų j a u t r u m a s s p i n d u l i u o t e i , a n k s t e s n i ų 
b a n d y m ų d u o m e n y s  
Turi būti reguliariai (maždaug kas penkt ą pasėjimą) tikrinamas 
ląstelių jautrumas šviesos šaltiniui, įvertinant j ų gyvybingum ą po 
veikimo did ėjančiomis spinduliuot ės dozėmis. Įvertinant turi b ūti 
naudojamos kelios spinduliuot ės dozės, įskaitant tokias, kurios yra 
gerokai didesn ės negu naudojama 3T3 NRU fototoksiškumo 
bandymui. Lengviausias ši ų dozių kiekybinio įvertinimo b ūdas – 
matuoti šviesos šaltinio UV spinduliuot ės dalis. L ąstelės sėjamos 
tokiu tankumu, kuris naudojamas 3T3 NRU fototoksinio poveikio  
in vitro  bandyme, ir apšvitinamos kit ą dieną. Dar po dienos išma ­
tuojamas l ąstelių gyvybingumas, naudojant neutraliojo raudonojo 
sugėrimą. Turi būti įrodyta, kad gautos didžiausios necitotoksin ės 
dozės (pvz., atliekant tinkamumo patvirtinimo bandym ą: 5 J/cm 
[UVA]) pakanka etalonin ėms chemin ėms medžiagoms (1 lentel ė) 
tinkamai klasifikuoti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. J a u t r u m a s s p i n d u l i u o t e i , a t l i e k a m ų b a n d y m ų 
t i k r i n i m a s  
Bandymas atitinka kokyb ės kriterijus, jei apšvitintiems neigiamiems/ 
tirpiklio kontroliniams bandiniams gauta gyvybingumo vert ė yra 
didesnė kaip 80 % palyginti su tamsoje laikomu neigiamu/tirpiklio 
kontroliniu bandiniu.  
1.4.2.2.3. T i r p i k l i o k o n t r o l i n i ų b a n d i n i ų l ą s t e l i ų g y v y b i n ­
g u m a s  
Iš tirpiklio kontrolini ų bandinių ekstrahuoto neutraliojo raudonojo 
absoliutus optinis tankis (OD540NRU) rodo, ar vienoje duobut ėje 
pasėtos 1 × 10  4 ląstelės augo dvi bandymo dienas esant normaliam 
dvigubėjimo laikui. Bandymas atitinka priimtinumo kriterijus, jei 
vidutinė neapdorot ų kontrolini ų bandinių OD540 Nru vert ė yra > 
0,4 (t. y. maždaug dvidešimt kart ų didesnė už fonui naudojamo 
tirpiklio optin į tankį). 
1.4.2.2.4. T e i g i a m a s k o n t r o l i n i s b a n d i n y s  
Lygiagrečiai kiekvienam 3T3 NRU fototoksinio poveikio  in vitro  
bandymui turi b ūti bandoma žinoma fototoksiška medžiaga. Reko ­
menduojamas chlorpromazinas (CPZ). CPZ bandant pagal etalonin į 
3T3 NRU fototoksiškumo  in vitro  bandymo protokol ą, buvo 
apibrėžti šie bandymo priimtinumo kriterijai: CPZ apšvitinus 
(+ Irr): IC50 = 0,1–2,0 μg/ml, CPZ tamsoje (-Irr): IC50 = 7,0– 
90,0 μg/ml. Fotodirginimo faktorius (FDF) tur ėtų būti > 6. Turi 
būti stebimi anks čiau gauti teigiamo kontrolinio bandinio duomenys.  
Vietoj chlorpromazino kaip lygiagre čiai bandomi teigiami kontroli ­
niai bandiniai gali b ūti naudojamos kitos fototoksiškos medžiagos, 
tinkančios dėl cheminės medžiagos klas ės arba tirpumo charakteris ­
tikų. 
1.4.3.  Bandymo eiga (6) (7) (8) (16) (17)  
1.4.3.1.  1-oji diena  
Į kraštines 96 duobu čių audinių kultūros mikrotitravimo l ėkštelės 
duobutes įlašinama po 100 μl kultivavimo terp ės (= tuštieji bandi ­
niai). Į likusias duobutes įlašinama po 100 μl ląstelių suspensijos, 
kurios koncentracija 1 x 10  5 ląstelių/ml kultivavimo terp ės (= 1 x 10  4 
ląstelių/duobutei). Paruošiama po dvi l ėkšteles kiekvienai bandomo ­
sios medžiagos koncentracijai, tirpikliui ir teigiamiems kontroliniams bandiniams.
 
Ląstelės inkubuojamos 24 h (žr. 1.4.1.2 skirsn į) tol, kol jos sudaro 
pusiau susiliejant į monosluoksn į. Per šį inkubavimo laikotarp į 
ląstelės atsigauna, prilimpa ir eksponentiškai did ėja jų skaičius. 
1.4.3.2.  2-oji diena  
Pasibaigus inkubavimui, kultivavimo terp ė nupilama nuo l ąstelių, 
kurios kruopš čiai plaunamos 150 μl inkubavimui naudoto buferinio 
tirpalo. Įpilama 100 μl buferinio tirpalo, kuriame b ūtų tinkamos 
koncentracijos bandomoji chemin ė medžiaga, arba tirpiklis (tirpiklio 
kontrolinis bandinys). Naudojamos 8 skirtingos bandomosios cheminės medžiagos koncentracijos vert ės. Ląstelės su bandom ąja 
medžiaga inkubuojamos tamsoje 60 min. (žr. 1.4.1.2 skirsn į ir 
1.4.1.4 skirsnio antr ąją pastraipą).
 
Iš dviejų lėkštelių, paruošt ų kiekvienai bandomosios medžiagos 
koncentracijai ir kontroliniams bandiniams, viena atsitiktinai pasiren ­
kama citotoksiškumui nustatyti (-Irr) (t. y. kontrolin ė lėkštelė), o kita 
(apdorojamoji l ėkštelė) – fototoksiškumui nustatyti (+ Irr).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
Esant kambario temperat ūrai, ląstelės 50 min. veikiamos šviesa 
(+ Irr) per 96 duobu čių lėkštelės dangtį, naudojant didžiausi ą dar 
necitotoksin ę spinduliuot ės dozę (taip pat žr. 2 pried ėlį). Neap­ 
šviestos l ėkštelės (-Irr) 50 min. (= veikimo šviesa trukm ė) laikomos 
tamsioje d ėžėje, esant kambario temperat ūrai. 
Bandomasis tirpalas nupilamas ir l ąstelės kruopščiai du kartus plau ­
namos 150 μl inkubavimui naudoto buferinio tirpalo, kuriame neb ūtų 
bandomosios medžiagos. Buferinis tirpalas kei čiamas kultivavimo 
terpe ir l ąstelės inkubuojamos (žr. 1.4.1.2 skirsn į.) per nakt į 
(18–22 h).  
1.4.3.3.  3-ioji diena  
1.4.3.3.1. M i k r o s k o p i n i s t y r i m a s  
Ląstelių augimas, morfologija ir monosluoksnio vientisumas turi b ūti 
ištirtas fazi ų kontrasto mikroskopu. Turi b ūti užrašyti l ąstelių morfo­
loginiai poky čiai ir poveikis j ų augimui.  
1.4.3.3.2. N e u t r a l i o j o r a u d o n o j o d a ž i k l i o s u g ė r i m o 
b a n d y m a s  
Ląstelės plaunamos 150 μl iš anksto pašildyto buferinio tirpalo. 
Plovimo tirpalas pašalinamas atsargiai išleidžiant. Į terpę be serumo 
(16) įpilama 100 μl 50 μg/ml neutralaus raudonojo (NR) (3-amino-7- 
dimetilamino-2-metilfenazino hidrochlorido, Einecs numeris 209–035–8; CAS numeris 553–24–2; C.I. 50040) ir 3 h inkubuo ­
jama, kaip aprašyta 1.4.1.2 skirsnyje. Po inkubavimo NR terp ė paša­
linama ir l ąstelės plaunamos 150 μl buferinio tirpalo. Buferinio 
tirpalo perteklius pašalinamas nusausinant arba centrifuguojant.
 
Įpilama tiksliai 150 μl tirpalo NR desorbuoti (tik k ą paruošto: 49 
dalys vandens + 50 dali ų etanolio + 1 dalis acto r ūgšties).  
Mikrotitravimo l ėkštelė nestipriai purtoma 10 min. ant mikrotitra ­
vimo lėkštelės purtykl ės tol, kol NR ekstrahuojamas iš l ąstelių ir 
susidaro vienalytis tirpalas.  
Spektrofotometru matuojamas NR ekstrakto optinis tankis esant 540 
nm, palyginamuoju tirpalu naudojant tuš čiuosius bandinius. 
Duomenys saugomi atitinkamo formato elektronin ėje laikmenoje 
vėlesnei analizei.  
2. DUOMENYS  
2.1. DUOMEN Ų KOKYB Ė IR KIEKYB Ė 
Pagal bandym ų duomenis tur ėtų būti įmanoma atlikti prasming ą 
koncentracijos ir atsako, gauto veikiant šviesa ir tamsoje, analiz ę 
ir, jei įmanoma, nustatyti bandomosios medžiagos koncentracij ą, 
kuriai esant l ąstelių gyvybingumas sumaž ėja 50 % (IC  50 ). Jei nusta ­
tomas citotoksiškumas, koncentracijos intervalas ir atskiros koncent ­
racijos vert ės turi būti parinktos tokiu b ūdu, kad sujungus bandymo 
duomenis b ūtų įmanoma gauti kreiv ę. 
Aiškiai teigiamiems ir aiškiai neigiamiems rezultatams (žr. 2.3 
skirsnio pirm ąją pastraipą) gali pakakti pradinio bandymo, patvirtinto 
vienu pradiniu doz ės intervalo radimo bandymu arba keliais bandy ­
mais.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Dviprasmiški, ribiniai arba neaišk ūs rezultatai turi b ūti išaiškinti 
atliekant papildomus bandymus (taip pat žr. 2.4 skirsnio antr ą 
pastraipą). Tokiais atvejais reik ėtų apsvarstyti galimyb ę keisti 
bandymo s ąlygas. Bandymo s ąlygos, kurias galima keisti – tai 
koncentracijos intervalas arba tarpai tarp jos ver čių, pradinio inkuba ­
vimo trukm ė ir švitinimo-veikimo trukm ė. Vandenyje nepatvarioms 
medžiagoms labiau gali tikti trumpesn ė veikimo trukm ė. 
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS  
Duomenims įvertinti galima apskai čiuoti fotodirginimo (PDF) arba 
vidutinį fotoefekt ą (VFE).  
Fototoksiškumo matams apskai čiuoti (žr. toliau) atskir ų koncentra ­
cijos ir atsako ver čių aibė turi būti aproksimuojama nubr ėžiant 
tinkamą tolydžią koncentracijos ir atsako kreiv ę (modelį). Kreivė 
pagal duomenis paprastai parenkama taikant netiesin ės regresijos 
metodą (18). Norint įvertinti duomen ų kintamumo įtaką parinktajai 
kreivei rekomenduojama taikyti savaiminio gerinimo ( bootstrap ) 
metodą. 
Fotodirginimo faktorius (FDF) apskai čiuojamas taikant ši ą formulę: 
PIF ¼ Í ðIC 50 ð– IrrÞÞ 
ðIC 50 ðþ IrrÞÞ Î 
Jei IC  50 apšvietimo ir tamsos s ąlygomis negalima apskai čiuoti, nega ­
lima nustatyti bandomosios medžiagos FDF. Vidutinis 
fotoefektas (VFE) yra pagr įstas visų koncentracijos ir atsako kreivi ų 
lyginimu (19). Jis apibr ėžiamas kaip tipini ų fotoefekto ver čių 
rinkinio svertinis vidurkis  
MPE ¼ Í Í X  n 
i¼1 w i PE c i Î 
Í X  n 
i¼1 w i Î Î 
Kurią nors koncentracij ą C atitinkantis fotoefektas PE  C apibrėžiamas 
kaip atsako RE  C ir dozės DE  C efektų sandauga, t. y. PE  C = RE  C x 
DE C . Atsako efektas RE  C yra atsakų, nustatom ų tamsoje ir veikiant 
šviesa, skirtumas, t. y. RE  C = R  C (-Irr) – R  C (+ Irr). Doz ės efektas 
apibrėžiamas lygtimi  
DE  c ¼ Æ Æ Æ Æ C=C ä – 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ 
kurioje C* atitinka ekvivalentin ę koncentracij ą, t. y. koncentracij ą, 
kuriai esant + Irr atsakas lygus -Irr atsakui, esant C koncentracijai. 
Jei C* negalima nustatyti tod ėl, kad + Irr kreiv ės atsako vert ės yra 
sistemingai didesn ės arba mažesn ės už R  C (-Irr), doz ės efektas prily ­
ginamas 1. Svoriniai faktoriai w  i nustatomi pagal didžiausi ą atsako 
vertę, t. y. W  i = MAX{R  i (+ Irr), R  i (-Irr)}. Koncentracijos ver čių C i 
tinklelis pasirenkamas taip, kad į kiekvien ą koncentracijos ver čių 
intervalą, apibrėžtą bandyme naudojamomis koncentracijos vert ėmis, 
patektų vienodas tašk ų skaičius. VFE apskai čiuojamas pagal 
didžiausią koncentracijos vert ę, kuriai esant bent viena iš dviej ų 
kreivių vis dar rodo bent 10 % atsako vert ę. Jei ši didžiausia 
koncentracija yra didesn ė kaip + Irr bandyme naudojama didžiausia 
koncentracija, likusioji + Irr kreiv ės dalis nustatoma atsako vertei 
„0“. Atsižvelgiant į tai, ar VFE vert ė yra didesn ė arba ne didesn ė 
už tinkamai pasirinkta ribin ę vertę (VFE  C = 0,15), chemin ė medžiaga 
klasifikuojama kaip fototoksiška.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Programin ės įrangos rinkin į, kuris naudojamas apskai čiuojant FDF ir 
VFE, galima rasti (20).  
2.3. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Pagal tinkamumo patvirtinimo bandymo duomenis (8) prognozuo ­
jama, kad bandomoji medžiaga, kurios FDF < 2 arba VFE < 0,1, 
yra nefototoksin ė. Kai 2 < FDF < 5 arba 0,1 < VFE < 0,15, prog ­
nozuojama: tik ėtina, kad fototoksiška; o kai FDF > 5 arba VFE > 
0,15, prognozuojama: fototoksiška.  
Visos laboratorijos, pradedan čios taikyti š į bandymą, iš pradži ų turi 
išbandyti 1 lentel ėje išvardytas etalonines medžiagas prieš prad ė­
damos bandyti bandom ąsias medžiagas j ų fototoksiškumui įvertinti. 
FDF arba VFE vert ės turi būti artimos 1 lentel ėje nurodytoms 
vertėms. 
1 lentelė 
Cheminis 
pavadinimas  Einecs Nr.  CAS Nr.  PDF  VFE  Sugerties 
maksimumas  Tirpiklis (  1 ) 
Amiodaronas 
HCl 243–293–2  [19774–82–4]  > 3,25  0,20–0,54  242 nm 
300 nm 
(petys)  etanolis  
Choloroproma ­
zina s HCl  200–701–3  [69–09–0]  > 14,4  0,33–0,63  309 nm  etanolis  
Norfloksacinas  274–614–4  [70458–96–7]  > 71,6  0,34–0,90  316 nm  acetonitrilas  
Antracenas  204–371–1  [120–12–7]  >18,5  0,19–0,81  356 nm  acetonitrilas  
Protoporfirinas 
IX, dinatrio  256–815–9  [50865–01–5]  > 45,3  0,54–0,74  402 nm  etanolis  
L-Histidinas  [7006–35–1]  nėra PDF  0,05–0,10  211 nm  vanduo  
Heksacholo ­
rofenas  200–733–8  [70–30–4]  1,1–1,7  0,00–0,05  299 nm 
317 nm 
(petys)  etanolis  
Natrio 
laurilsulfatas  205–788–1  [151–21–3]  1,0–1,9  0,00–0,05  nesugeriama  vanduo  
( 1 ) Tirpiklis, naudotas suger čiai matuoti.  
2.4. DUOMEN Ų AIŠKINIMAS  
Jei fototoksiškumas stebimas tik esant didžiausiai bandomajai 
koncentracijai (ypa č, vandenyje tirpi ų bandom ųjų chemini ų 
medžiagų), pavojui įvertinti gali reik ėti papildom ų analizės duomen ų, 
pavyzdžiui, sugerties per od ą, cheminės medžiagos kaupimosi odoje 
duomenų ir (arba) kit ų bandym ų duomen ų, kaip antai chemin ės 
medžiagos  in vitro  bandymų su gyvūnų arba žmoni ų oda arba su 
odos modeliais duomen ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Jei toksiškumas nenustatomas (+ Irr ir -Irr) ir jei blogas tirpumas 
riboja bandomosios koncentracijos vertes, gali b ūti suabejota bando ­
mosios medžiagos tinkamumu bandyti šiuo metodu ir tur ėtų būti 
numatytas patvirtinamasis bandymas, naudojant, pvz., kit ą modelį. 
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta bent tokia informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— tapatumas, įprasti bendrieji pavadinimai ir IUPAC pavadinimai 
bei CAS numeris, jei žinomas;  
— fizikin ė būsena ir grynumas;  
— fizikin ės ir chemin ės savybės, svarbios atliekamam bandymui;  
— UV/matomosios srities sugerties spektras;  
— stabilumas ir fotocheminis stabilumas, jei žinomas.  
Tirpiklis:  
— tirpiklio pasirinkimo pagrindimas;  
— bandomosios chemin ės medžiagos tirpumas tirpiklyje;  
— tirpiklio kiekio, esan čio apdorojimo terp ėje, procentin ė dalis.  
Ląstelės: 
— ląstelių tipas ir šaltinis;  
— mikoplazmos nebuvimo patvirtinimas;  
— ląstelių sėjimų skaičius, jei žinomas;  
— ląstelių jautrumas spinduliuotei, nustatytas švitinimo įranga, 
naudojama atliekant 3T3 NRU fototoksinio poveikio  in vitro  
bandymą. 
Bandymo s ąlygos (1);  inkubacija prieš ir po apdorojimo : 
— kultivavimo terp ės tipas ir sud ėtis; 
— inkubacijos s ąlygos (CO  2 koncentracija, temperat ūra, drėgmė); 
— inkubacijos trukm ė (prieš apdorojim ą, po apdorojimo).  
Bandymo s ąlygos (2);  veikimas chemine medžiaga : 
— bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos, kuri naudo ­
jama švitinant ir nešvitinant, pasirinkimo pagrindimas;  
— riboto bandomosios chemin ės medžiagos tirpumo atveju ir nesant 
citotoksiškumo: didžiausios bandytos koncentracijos pagrin ­
dimas;  
— veikimo terp ės tipas ir sud ėtis (buferinis druskos tirpalas);  
— veikimo chemine medžiaga trukm ė. 
Bandymo s ąlygos (3);  švitinimas : 
— pasirinkto šviesos šaltinio pagrindimas;  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— šviesos šaltinio ir radiometro gamintojas ir tipas;  
— šviesos šaltinio spektrin ės energin ės apšvietos charakteristikos;  
— naudojamo (- ų) filtro (-ų) praleidimo ir sugerties charakteristikos;  
— radiometro charakteristikos ir išsami informacija apie jo kalibra ­
vimą; 
— šviesos šaltinio atstumas iki bandymo sistemos;  
— UVA energin ė apšvieta esant šiam atstumui, išreikšta mW/cm  2 ; 
— švitinimo UV/matom ąja šviesa trukm ė; 
— UVA doz ė (energinė apšvieta laikas), išreikšta J/cm  2 ; 
— švitinam ų ląstelių kultūrų ir lygiagre čiai tamsoje laikom ų ląstelių 
kultūrų temperat ūra. 
Bandymo s ąlygos (4);  gyvybingumo bandymas, naudojant neutral ųjį 
raudonąjį: 
— apdorojimo neutraliuoju raudonuoju terp ės sudėtis; 
— inkubavimo su neutraliuoju raudonuoju trukm ė; 
— inkubavimo s ąlygos (CO  2 koncentracija, temperat ūra, drėgmė); 
— neutraliojo raudonojo ekstrahavimo s ąlygos (tirpiklis, trukm ė); 
— neutraliojo raudonojo optinio tankio spektrofotometrinio mata ­
vimo bangos ilgis;  
— antrasis (etaloninis) bangos ilgis, jei naudojamas;  
— spektrofotometriniam matavimui naudoto palyginamojo tirpalo 
sudėtis, jei buvo naudojamas.  
Rezultatai:  
— ląstelių gyvybingumas, nustatytas kiekvienai bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracijos vertei, išreikštas lygiagre čių 
tirpiklio kontrolini ų bandinių gyvybingumo vidurkio procentine 
dalimi;  
— koncentracijos ir atsako kreiv ės (santykinis l ąstelių gyvybin ­
gumas kaip chemin ės medžiagos koncentracijos funkcija), gautos 
lygiagretiems (+ Irr) ir (-Irr) bandymams;  
— koncentracijos ir atsako kreivi ų analizė: jei įmanoma, IC  50 (+ Irr) 
ir IC  50 (-Irr) apskai čiavimas;  
— dviejų koncentracijos ir atsako kreivi ų, gautų švitinant ir tamsoje, 
lyginimas, apskai čiuojant fotodirginimo faktori ų (FDF) arba 
vidutinį fotoefekt ą (VFE);  
— bandymo priimtinumo kriterijai; lygiagretus tirpiklio kontrolinis 
bandinys;  
— švitint ų ir nešvitint ų ląstelių absoliutusis gyvybingumas (neutra ­
liojo raudonojo ekstrakto optinis tankis);  
— anksčiau gauti neigiam ų ir tirpikli ų kontrolini ų bandini ų 
duomenys; vidutin ės vertės ir standartiniai nuokrypiai;  
— bandymo priimtinumo kriterijai; lygiagretus teigiamas kontrolinis 
bandinys;  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— teigiamo kontrolinio bandinio IC  50 (+ Irr) ir IC  50 (-Irr) bei 
FDF/VFE;  
— anksčiau gauti teigiam ų kontrolini ų bandinių duomenys: IC  50 
(+ Irr) ir IC  50 (-Irr) bei FDF/VFE; vidurkiai ir standartiniai 
nuokrypiai.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30–31th October 
2001, Secretariat’s Final  
2) Loveli W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of 
substances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: p. 95–102.
 
3) Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In „Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry“ Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam, p XI-XXXV.
 
4) Spielmann, h., Loveli, W.W., Holzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994).  In vitro  phototoxicity testing: The report 
and recommendations of ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 
p. 314–348.
 
5) Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of 
Photobiology“ Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New 
York. 2nd edition, p. 79–110.  
6) OECD (1997) Environmental Health and SAFEty Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water“ Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.
 
7) Spielmann, h, Balls, M., Doring, B., Holzh ūtter, h.G, Kalweit, 
S., Klecak, G, L’Eplattenier, h, Liebsch, M., Loveli, W.W., 
Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., Pfannbecker, 
U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  phototoxicity testing: 
First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity 
assay. Toxic. In Vitro 8, p. 793–796.
 
8) Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 
3 November 1997, ATLA, 26, p. 7–8.  
9) Spielmann, h, Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pechovitch, 
G De Silva, O., Holzh ūtter, h.G, Clothier, R, Desolle, P., 
Gerberick, F., Liebsch, M., Loveli, W.W., Maurer, T., Pfannen ­
becker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., Steiling, 
W., and Brantom, P. (1998). The international ES/COLIPA  In 
vitro  phototoxicity validation study: results of phase II (blind 
trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 
12, p. 305–327.  
10) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In 
Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 
30–31th October 2001, Secretariat’s Final Summary Report, 
15 March 2002, OECD ENV7EHS, available upon request from the Secretariat.
 
11) Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24, 119–124.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
12) Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control for 
cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225–237.  
13) Lambert L.A., Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology“, 
edited by F.N. Marzulli and h.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515–530.
 
14) Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825–1829.  
15) ISO 10977. (1993). Photography – Processed photographic 
colour films and paper prints – Methods for measuring image stability.
 
16) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, 
Vienna, 1993, ISBN 3900734275  
17) ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure:  In 
Vitro  3T3 NRU Phototoxicity Test. Final Version, 7 September, 
1998.  
18) Spielmann, h, Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzh ūtter, h.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Loveli, W.W., 
and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals 
from Annex VII of the European Union  Directive 76/768/EEC , 
in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. ATLA 26, 
p. 679–708.  
19) Holzh ūtter, h.G, and Quedenau, J. (1995) Mathematical mode ­
ling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 
p. 127–138.  
20) Holzh ūtter, h.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 25, 
p. 445–462.
 
21) http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_ 
2349687_l_l_l_l,00. html  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
1 PRIED ĖLIS 
3T3 NRU fototoksiškumo bandymo svarba, taikant nuosekl ųjį metodą chemini ų medžiag ų 
fototoksiškumui tirti
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
2 PRIED ĖLIS 
1 paveikslas  
Filtruoto saul ės šviesos imitatoriaus spektrin ės galios skirstinys
  
(žr. 1.4.1.5.1 skirsnio antr ąją pastraipą) 
1 paveiksle pateiktas filtruoto saul ės šviesos imitatoriaus priimtino spektrin ės energin ės apšvietos 
skirstinio pavyzdys. Jis yra gautas metal ų halogenidais legiruotam šaltiniui, naudojamam 3T3 NRU 
fototoksiškumo bandymo tinkamumo patvirtinimo tyrime (6) (8) (17). Parodyta dviej ų skirtingų 
filtrų ir 96 duobu čių ląstelių kultūros lėkštelės dangčio filtruojamojo poveikio įtaka. H2 filtras buvo 
naudojamas tik toms bandymo sistemoms, kurios gali ištverti didesn į UVB spinduliuot ės kiekį 
(odos modelio ir raudon ųjų kraujo k ūnelių fotohemoliz ės bandymai). Atliekant 3T3 NRU foto ­
toksiškumo bandym ą, buvo naudojamas H1 filtras. Paveiksle parodytas papildomas filtruojamasis 
lėkštelės dangčio poveikis, kuris iš esm ės stebimas UVB srityje, švitinimo spektre vis dar liekant 
UVB spinduliuot ės kiekiui, kurio pakanka chemin ėms medžiagoms, paprastai sugerian čioms UVB 
bangų ilgį, pvz., amiodaronui, sužadinti (žr. 1 lentel ę). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
2 paveikslas  
Balb/c 3T3 l ąstelių jautrumas švitinimui (išmatuotas UVA srityje)  
Ląstelių gyvybingumas (neutraliojo raudonojo sug ėrimo % palyginti su kontroliniais bandiniais 
tamsoje)
  
(žr. 1.4.1.5.2 skirsnio antr ąją pastraipą; 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)  
UVA srityje matuojamas Balb/c 3T3 l ąstelių jautrumas švitinimui saul ės šviesos imitatoriumi, kuris 
naudojamas vykdant 3T3 NRU fototoksiškumo bandymo tinkamumo patvirtinimo tyrim ą. Paveiksle 
parodyti rezultatai, gauti 7 skirtingose laboratorijose, vykdant pradin į tinkamumo patvirtinimo 
tyrimą (1). Dvi kreiv ės su šviesiais simboliais buvo gautos senesn ėms ląstelėms (didelis pers ėjimų 
skaičius), kurios tur ėjo būti pakeistos naujomis l ąstelių pradinėmis kultūromis, o kreiv ės su juodais 
simboliais rodo l ąsteles su priimtinu švitinimo ištveriamumu.  
Pagal šiuos duomenis buvo gauta didžiausia necitotoksin ė švitinimo doz ė 5 J/cm  2 (vertikali br ūkš­
niuota linija). Horizontali br ūkšniuota linija papildomai rodo didžiausi ą priimtiną švitinimo poveik į, 
nurodytą 1.4.2.2 skirsnyje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO BANDYMAS  
ĮVADAS  
1. OECD Chemini ų medžiagų bandymo gair ės ir jomis pagr įsti ES bandymo 
metodai periodiškai persvarstomi atsižvelgiant į mokslo pažang ą, kintan­ 
čias reguliavimo reikmes ir gyv ūnų gerovės sumetimais. Anks čiau buvo 
patvirtintas pradinis bandymo metodas (BM) peli ų odos jautrinimui nusta ­
tyti – vietinio limfmazgio bandymas (angl.  Local Lymph Node Assay , 
LLNA; OECD bandym ų metodika 429; šio priedo B.42 skyrius)(1). 
LLNA tinkamumo patvirtinimas ir susijusi ų darbų apžvalga paskelbta (2) 
(3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) šaltiniuose. Atnaujintas LLNA pagr įstas 
patirties ir mokslini ų duomen ų įvertinimu (12). Tai yra antrasis BM, 
parengtas chemini ų medžiag ų (medžiag ų ir mišini ų) sukeliamo gyv ūnų 
odos jautrinimo potencialui įvertinti. Pagal kit ą BM (t. y. OECD bandym ų 
metodika 406; šio priedo B.6 skyrius) taikomi bandymai su j ūros kiauly ­
tėmis, pirmiausia maksimizacijos ir Buehlerio bandymas su j ūros kiauly ­
tėmis (13). LLNA turi tam tikr ų pranašum ų prieš B.6 ir OECD bandym ų 
metodiką 406 (13) gyv ūnų gerovės prasme. Šis atnaujintas LLNA 
bandymų metodas apima rinkin į naudojimo charakteristik ų standart ų 
(angl.  Performance Standards , PS) (1 pried ėlis), kuriuos galima taikyti 
naujų ir (arba) modifikuot ų bandymo metod ų, kurie funkciškai ir mecha ­
nistiškai panaš ūs į LLNA, tinkamumo patvirtinimo b ūklei įvertinti, 
laikantis OECD rekomendacinio dokumento Nr. 34 (14).  
2. LLNA tiriamas odos jautrinimo indukcinis etapas ir gaunami kiekybiniai 
duomenys, tinkami doz ės ir atsako s ąryšiui įvertinti. Reikia pažym ėti, kad 
silpni arba vidutiniai jautrikliai, kurie yra rekomenduoti kaip tinkamos 
teigiamo poveikio kontrolin ės medžiagos (angl.  positive control chemicals , 
PC) bandymams su j ūrų kiaulytėmis (t. y. B. 6; OECD bandym ų metodika 
406) (13), tinka naudoti LLNA metodui (6) (8) (15). Šiame BM kaip 
vienas iš variant ų aprašytas ir sumažintojo LLNA (rLLNA) metodas, 
kurį taikant galima b ūtų naudoti iki 40 % mažiau gyv ūnų (16) (17) (18). 
rLLNA gali b ūti taikomas, kai reguliavimo reikm ėms būtina patvirtinti 
odos jautrinimo potencialo neigiam ą prognoz ę, jei laikomasi vis ų kitų 
LLNA protokolo specifikacij ų, aprašytų šiame BM. Neigiamo rezultato 
prognozė turi būti grindžiama visa turima informacija, kaip aprašyta 4 
skirsnyje. Prieš taikant rLLNA metod ą, turi būti pateikiamas jo taikymo 
aiškus pagrindimas ir loginis pagrindas. Jei, skirtingai, nei tik ėtasi, atlie ­
kant rLLNA gaunamas teigiamas arba dviprasmis rezultatas, gali prireikti 
papildom ų bandymų rezultatams išaiškinti arba patikslinti. rLLNA netur ėti 
būti taikomas od ą jautrinan čių bandomųjų medžiag ų pavojingumui nusta ­
tyti, kai reikalinga informacija apie doz ės ir atsako s ąryšį, pvz., skirstant į 
kategorijas pagal Reglament ą (EB) Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų medžiag ų 
ir mišinių klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo ir JT pasaulin ės sude­
rintos chemini ų medžiag ų klasifikavimo ir ženklinimo sistemos.  
APIBRĖŽTYS  
3. Vartojamos apibr ėžtys pateiktos 2 pried ėlyje. 
PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI  
4. LLNA yra pakaitinis metodas potencialiai od ą jautrinan čioms chemin ėms 
medžiagoms nustatyti. Nereikia manyti, kad visais atvejais vietoj bandymo 
su jūrų kiaulytėmis (t. y. B.6; OECD bandym ų metodika 406) (13), reikia 
taikyti LLNA bandym ą; tai labiau reiškia, kad šis bandymas yra lygiavertis 
ir gali b ūti taikomas kaip pakaitinis metodas, pagal kur į teigiamų ir 
neigiamų rezultatų paprastai nebereikia papildomai patvirtinti. Prieš atlik ­
dama tyrim ą, bandym ų laboratorija turi apsvarstyti vis ą turimą informacij ą 
apie bandom ąją medžiag ą. Tokia informacija apima bandomosios  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
medžiagos tapatum ą ir chemin ę struktūrą, jos fizikines ir chemines 
savybes, vis ų kitų bandomosios medžiagos  in vitro  arba  in vivo  toksiš­
kumo bandym ų rezultatus ir giminingos strukt ūros medžiag ų toksikologi ­
nius duomenis. Ši informacija turi b ūti apsvarstyta, siekiant nustatyti, ar 
LLNA tinka medžiagai bandyti (atsižvelgiant į tam tikr ų medžiag ų tipų 
nesuderinamum ą su LLNA – žr. 5 skirsn į), ir siekiant parinkti tinkam ą 
dozę. 
5. LLNA yra  in vivo  metodas, tod ėl alerginiam kontaktiniam jautrinimui 
įvertinti naudojami gyv ūnai. Tačiau taikant š į metodą yra galimyb ė suma­ 
žinti šiam tikslui reikaling ų gyvūnų skaičių. Be to, LLNA yra iš esm ės 
geresnis gyv ūnų naudojimo b ūdas (kelia mažiau skausmo ir kan čių) 
bandant alergin į kontaktin į jautrinim ą. LLNA yra pagr įstas imunologini ų 
reiškinių, kuriuos chemin ės medžiagos sukelia jautrinimo indukcijos etapu, 
nagrinėjimu. Kitaip nei darant bandymus su j ūrų kiaulytėmis (t. y. B.6; 
OECD bandym ų metodika 406) (13), taikant LLNA nereikia sukelti ypa č 
didelio odos jautrumo reakcij ų. Be to, taikant LLNA nereikia naudoti 
adjuvantų, kurie reikalingi darant maksimizacijos bandym ą su jūrų kiauly­
tėmis (13). Taigi LLNA sumažina gyv ūnų skausmą ir kančias. Nepaisant 
LLNA pranašum ų prieš B.6 ir OECD bandym ų metodik ą 406, reikia 
pripažinti, kad yra tam tikr ų apribojim ų, dėl kurių gali tekti taikyti B.6 
ir OECD bandym ų metodiką 406 (13) (pvz., klaidingi neigiami rezultatai 
tiriant kai kuriuos metalus LLNA metodu, klaidingi teigiami rezultatai 
tiriant tam tikrus odos dirgiklius (pvz., kai kurias paviršinio aktyvumo 
medžiagų tipo chemines medžiagas))(19) (20), arba bandomosios 
medžiagos tirpumas). Be to, d ėl chemini ų medžiagų klasių arba medžiag ų, 
kuriose yra funkcini ų grupių, veikian čių kaip galimos klaidinan čiosios 
medžiagos (21), gali tekti atlikti bandymus su j ūrų kiaulytėmis (t. y. 
B.6; OECD bandym ų metodika 406) (13). Negana to, remiantis ribota 
tinkamumo patvirtinimo duomen ų baze, kuri ą daugiausia sudaro pesticid ų 
preparatai, pastarojo tipo bandom ųjų medžiag ų atveju labiau tik ėtinas 
teigiamas rezultatas taikant LLNA, nei bandym ą su jūros kiaulyt ėmis 
(22). Tačiau, kai bandomi preparatai, galima apsvarstyti galimyb ę įtraukti 
keletą panašių medžiag ų, kurių rezultatai žinomi, kaip palyginam ąsias 
medžiagas, ir taip įrodyti, kad LLNA yra tinkamas (žr. 16 skirsn į). 
Išskyrus tokius nustatytus apribojimus, LLNA taikytinas bandant bet 
kurias medžiagas, nebent tos medžiagos turi toki ų savybių, dėl kurių 
sumažėtų LLNA tikslumas.  
BANDYMO METODO PRINCIPAS  
6. Pagrindinis principas, kuriuo pagr įstas LLNA metodas, yra jautrikli ų 
sukelta pirmin ė limfocitų proliferacija medžiagos poveikio viet ą drenuo­
jančiame limfmazgyje. Ši proliferacija yra proporcinga naudojamai dozei ir 
alergeno gebai jautrinti, taigi tai yra paprastas b ūdas objektyviai ir kieky ­
biškai išmatuoti jautrinim ą. Proliferacija įvertinama palyginant vidutin ę 
proliferacij ą bandymo grup ėse ir nešikliu paveiktose kontrolin ėse (angl.  
vehicle treated control , VC) grup ėse. Nustatomas vidutin ės proliferacijos 
paveiktose grup ėse ir lygiagre čiose VC grup ėse santykis, vadinamas dirgi ­
nimo rodikliu (angl.  Stimulation Index , SI), kuris turi b ūti ≥ 3, kad bando ­
moji medžiaga gal ėtų būti toliau vertinama kaip galimas odos jautriklis. 
Čia aprašyti metodai yra pagr įsti in vivo  radioaktyvi ųjų indikatori ų naudo­
jimu padid ėjusiam proliferuojan čių ląstelių skaičiui išmatuoti drenuojan ­ 
čiuose aus ų limfmazgiuose. Ta čiau gali b ūti naudojami kiti parametrai 
proliferuojan čių ląstelių skaičiui įvertinti, jei visiškai laikomasi PS reika ­
lavimų (1 priedėlis). ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšių parinkimas  
7. Šiam bandymui pasirinkta gyv ūnų rūšis – pelės. Naudojamos suaugusios 
CBA/Ca arba CBA/J veisl ės pelių patelės, kurios yra netur ėjusios vados ir 
neapvaisintos. Pradedant bandym ą, gyvūnų amžius turi b ūti 8–12 savai čių, 
o gyvūnų masės skirtumas turi b ūti kuo mažesnis ir neviršyti 20 % vidu ­
tinės masės. Galima naudoti kitas veisles ir patinus, jei yra gauta pakan ­
kamai duomen ų, kurie rodyt ų, kad nėra esmini ų veislei ir (arba) ly čiai 
būdingų atsako į LLNA skirtum ų. 
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
8. Pel ės turi būti laikomos grup ėmis (23), nebent pateikiamas pakankamas 
loginis pagrindas, kod ėl peles reikia laikyti atskirai. Patalpos, kurioje 
laikomi bandomieji gyv ūnai, temperat ūra turi būti 22 ± 3 °C. Nors santy ­
kinė oro drėgmė turi būti ne mažesn ė 30 % ir, pageidautina, ne didesn ė 
kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, siektina, kad dr ėgmė būtų 
50–60 %. Apšvietimas turi b ūti dirbtinis, taikant 12 val. šviesos ir 12 
val. tamsos cikl ą. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas 
pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio.  
Gyvūnų ruošimas  
9. Gyv ūnai pasirenkami atsitiktinai, ženklinami, kad b ūtų įmanoma kiekvien ą 
identifikuoti (ta čiau netaikomas joks aus ų ženklinimas), ir laikomi narve ­
liuose mažiausiai 5 paras prieš pradedant taikyti dozes, kad gal ėtų priprasti 
prie laboratorijos s ąlygų. Prieš veikimo medžiaga pradži ą visi gyv ūnai 
apžiūrimi, ar neturi pastebim ų odos pažeidim ų. 
Dozavimo tirpal ų paruošimas  
10. Prieš užtepant ant peli ų ausų, kietosios chemin ės medžiagos ištirpinamos 
arba paskleidžiamos tirpikliuose / nešikliuose ir, jei reikia, atskiedžiamos. Skystos chemin ės medžiagos gali b ūti užtepamos grynos arba atskiestos. 
Netirpios chemin ės medžiagos, pvz., tos, kuri ų paprastai pasitaiko medi ­
cinos įrangoje, prieš užtepant ant peli ų ausų, padidintosios ekstrakcijos 
būdu išskiriamos atitinkamame tirpiklyje, kad b ūtų gautos visos galimos 
išskirti sudedamosios dalys. Bandomosios medžiagos paruošiamos kasdien, 
nebent stabilumo duomenys rodo, kad jas galima laikyti ilgesn į laiką.
 
Patikimumo tikrinimas  
11. Teigiamo poveikio kontrolin ės cheminės medžiagos (angl.  positive control 
chemicals , PC) naudojamos siekiant parodyti tyrimo tinkamum ą joms 
reaguojant pakankamu ir atkartojamu jautrumu kaip jautrinan čioms bando ­
mosioms medžiagoms, kuri ų atsako dydis gerai apib ūdintas. Naudoti lygia ­
grečias PC rekomenduojama tod ėl, kad taip gali b ūti įrodyta laboratorijos 
kompetencija s ėkmingai atlikti bandym ą per kiekvien ą tyrimą ir įvertinti 
atkuriamum ą ir palyginamum ą laboratorijoje ir tarp laboratorij ų. Kiekvieno 
tyrimo metu naudoti PC reikalauja ir kai kurios reguliavimo institucijos, 
todėl naudotojai raginami pasikonsultuoti su atitinkamomis institucijomis 
prieš vykdydami LLNA. Taigi, skatinama įprastai naudoti lygiagre čią PC, 
kad būtų išvengta papildom ų bandym ų su gyvūnais, reikaling ų laikytis 
reikalavim ų, kuris gali kilti PC naudojant tik periodiškai (žr. 12 skirsn į). 
PC turi sukelti teigiam ą LLNA atsak ą esant tokiam poveikio lygiui, kad SI 
padidėtų iki daugiau kaip 3, palyginti su neigiamo poveikio kontrolin ės ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
medžiagos (angl.  negative control , NC) grupe. PC doz ė turi būti paren­
kama taip, kad nesukelt ų per didelio odos sudirginimo ar sisteminio toksiš ­
kumo, o atsako suk ėlimas būtų atkuriamas, bet ne per didelis (t. y. SI > 20 
būtų per didelis). Tinkamiausios PC yra 25 % heksilcinamono aldehidas 
(Chemini ų medžiagų santrump ų tarnybos [CAS] Nr. 101–86–0) acetono ir 
alyvų aliejaus mišinyje (4:1 t ūrio dalys) ir 5 % merkaptobenztiazolas (CAS 
Nr. 149–30–4)  N,N -dimetilformamidas (žr. 1 pried ėlio 1 lentel ę). Gali 
pasitaikyti aplinkybi ų, kai, pateikus pakankamai įrodymų, galima naudoti 
kitas PC, atitinkan čias pirmiau nurodytus kriterijus.  
12. Nors naudoti lygiagre čią PC grup ę rekomenduojama, gali b ūti situacij ų, 
kuriomis gali pakakti periodini ų PC bandym ų (t. y. ≤ 6 mėnesių interva­
lais), jei tai laboratorijos, kurios reguliariai atlieka LLNA (t. y. atlieka LLNA ne re čiau kaip kart ą per mėnesį) ir turi anks čiau atlikt ų PC 
bandymų duomenų bazę, kuri būtų įrodymas, kad laboratorijoje gaunami 
atkuriami ir tiksl ūs rezultatai su PC. Pakankamas profesionalumas atliekant 
LLNA tyrimus gali b ūti sėkmingai įrodomas nuolat gaunant teigiamus 
rezultatus naudojant PC ne mažiau kaip 10-yje nepriklausom ų bandymų, 
atliktų per pagr įstą laikotarp į (t. y. trumpesn į kaip vieneri metai).
 
13. Lygiagreti PC visada turi b ūti naudojama, jei yra proced ūrinių LLNA 
pakeitimų (pvz., pasikeit ė kvalifikuoti darbuotojai, pakeistos bandymo 
metodo medžiagos ir (arba) reagentai, pakeista bandymo metodo įranga, 
pakeistas bandom ųjų gyvūnų tiekėjas); tokie pakeitimai turi b ūti užregist ­
ruoti laboratorijos ataskaitoje. Turi b ūti apsvarstytas toki ų pasikeitim ų 
poveikis anks čiau sukaupt ų duomen ų bazės tinkamumui, vertinant b ūti­
nybę sukurti nauj ą anksčiau sukaupt ų duomenų bazę, skirtą PC rezultat ų 
nuoseklumui dokumentuoti.  
14. Tyr ėjai turi suprasti, kad sprendimas vykdyti PC tyrim ą periodiškai, o ne 
nuolat, turi padarini ų neigiamų tyrimų rezultatų, gautų be lygiagre čios PC 
naudojimo, laikotarpiu tarp kiekvieno periodinio PC tyrimo, tinkamumui ir 
priimtinumui. Pvz., jei, atliekant periodin į PC tyrim ą, gaunamas klaidingas 
neigiamas rezultatas, gali b ūti kvestionuojami neigiami bandomosios 
medžiagos rezultatai, gauti laikotarpiu nuo paskutinio priimtino periodinio 
PC tyrimo iki nepriimtino periodinio PC tyrimo. Ši ų rezultatų padariniai 
turi būti stropiai įvertinti sprendžiant, ar nuolat vykdyti lygiagre čius, ar tik 
periodinius PC tyrimus. Taip pat reikia apsvarstyti galimyb ę lygiagrečios 
PC grupės tyrimams naudoti mažiau gyv ūnų, jei tai moksliškai pateisinama 
ir jei laboratorija savo anks čiau sukauptais duomenimis įrodo, kad galima 
naudoti mažiau peli ų (12).  
15. Nors PC turi b ūti bandoma nešiklyje, apie kur į žinoma, kad jis sukelia 
pastovų atsaką (pvz., acetono ir alyv ų aliejaus mišinyje; 4:1 t ūrio dalys), 
gali būti tam tikr ų reguliavimo situacij ų, kai gali prireikti ištirti ir nestan ­
dartinį nešiklį (kliniškai ir (arba) chemiškai susijus į preparat ą) (24). Jei 
lygiagreti PC bandoma kitokiame nešiklyje nei bandomoji medžiaga, turi būti naudojama atskira VC (nešiklio kontrolin ė cheminė medžiaga), skirta 
lygiagrečiai PC.
 
16. Tais atvejais, kai vertinamos tam tikrai chemini ų medžiagų klasei ar atsak ų 
sričiai priklausan čios bandomosios medžiagos, gali b ūti naudojamos ir 
palyginamosios medžiagos, kad b ūtų parodyta, jog bandymo metodas 
tinkamai veikia nustatant ši ų bandomųjų medžiag ų odos jautrinimo poten ­
cialą. Atitinkamos palyginamosios medžiagos turi pasižym ėti šiomis savy ­
bėmis: 
— strukt ūriniu ir funkciniu panašumu į bandomosios medžiagos klas ę, 
— žinomomis fizin ėmis ir (arba) chemin ėmis charakteristikomis,  
— apie jas turi b ūti patvirtinan čių duomenų, gautų LLNA tyrimais,  
— apie jas turi b ūti patvirtinan čių duomenų, gautų taikant kitus bandym ų 
su gyvūnais modelius ir (arba) iš žmoni ų. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
BANDYMO EIGA  
Gyvūnų skaičius ir dozi ų dydis  
17. Vienai doz ės grupei naudojami ne mažiau kaip keturi gyv ūnai, naudojant 
ne mažiau kaip tris bandomosios medžiagos koncentracijas ir vien ą lygia­
grečią NC (neigiamo poveikio kontrolin ės chemin ės medžiagos) grup ę, 
paveikiam ą tik bandomosios medžiagos nešikliu, ir PC (lygiagre čią arba 
naujausią, remiantis laboratorijos politika pagal 11–15 skirsnius). Reikia 
apsvarstyti poreik į išbandyti kelet ą PC dozių, ypač bandant PC periodiškai. 
Išskyrus tai, kad jie neveikiami bandom ąja medžiaga, kontrolini ų grupių 
gyvūnų priežiūra ir elgesys su jais turi nesiskirti nuo poveikio grup ės 
gyvūnų. 
18. Doz ė ir nešiklis turi b ūti parenkami laikantis (3) ir (5) šaltiniuose patei ­
kiamų rekomendacij ų. Paeilinės dozės paprastai parenkamos iš atitinkamos 
koncentracijos ver čių eilės, pvz., 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 
1 %, 0,5 % ir t. t. Taikoma koncentracijos ver čių eilė turi turėti turėti 
tinkamą loginį pagrindą. Reikia atsižvelgti į visą turimą toksikologin ę 
informacij ą (pvz., apie ūminį toksiškum ą ir odos dirginim ą) ir strukt ūrinę 
bei fizikini ų ir chemini ų savybių informacij ą apie dominan čią bandomąją 
medžiagą (ir (arba) strukt ūriškai panašias medžiagas), kad trys iš eil ės 
taikomos koncentracijos vert ės būtų parinktos taip, kad didžiausios 
koncentracijos poveikis b ūtų kuo didesnis, bet b ūtų išvengta sisteminio 
toksiškumo ir (arba) per didelio vietinio odos dirginimo (3) (25). Jei tokios informacijos neturima, gali prireikti pradinio atrankinio bandymo (žr. 
21–24 skirsnius).
 
19. Nešiklis neturi daryti įtakos bandymo rezultatui ar j į iškraipyti ir turi b ūti 
parinktas taip, kad b ūtų kuo geresnis tirpumas, siekiant gauti didžiausi ą 
įmanomą koncentracij ą gaminant tirpal ą arba suspensij ą, tinkamą bando­
majai medžiagai užtepti. Rekomenduojami nešikliai yra acetono ir alyv ų 
aliejaus mišinys (4:1 t ūrio dalys),  N,N -dimetilformamidas, metiletilketonas, 
propilenglikolis ir dimetilsulfoksidas (19), ta čiau galima naudoti kitus 
nešiklius, jei pateikiamas tinkamas loginis pagrindas. Tam tikrais atvejais 
papildomai kontrolei gali tekti naudoti klinikiniu poži ūriu atitinkant į 
tirpiklį arba komercin į preparatą, turintį bandomosios medžiagos. Reikia 
ypač stengtis užtikrinti, kad nešiklyje b ūtų hidrofilini ų bandom ųjų 
medžiagų, kurios dr ėkintų odą ir iš karto nenutek ėtų, įdedant soliubiliza ­
vimo priemoni ų (pvz., 1 % „Pluronic® L92“). Taigi reikia vengti naudoti 
grynai vandeninius nešiklius.  
20. Apdorojant atskir ų pelių limfmazgius galima įvertinti gyv ūnų variantiš ­
kumą ir statistiškai palyginti skirtumus tarp bandomosios medžiagos ir 
VC grup ės matavimo rezultat ų (žr. 35 skirsn į). Be to, kai surenkami 
atskirų gyvūnų duomenys, realu įvertinti galimyb ę sumažinti peli ų skaičių 
PC grupėje 12. Be to, kai kurios reguliavimo institucijos reikalauja rinkti 
atskirtų gyvūnų duomenis. Vis d ėlto kai kurioms reguliavimo institucijoms 
gali būti priimtini jungtiniai gyv ūnų duomenys ir tokiais atvejais tyr ėjai 
gali turėti pasirinkim ą rinkti atskir ų gyvūnų arba jungtinius duomenis.  
Atrankinis bandymas  
21. Jei neturima informacijos, pagal kuri ą galima nustatyti didžiausi ą bandomą 
dozę (žr. 18 skirsn į), reikia atlikti atrankin į bandymą, kad būtų nustatytas 
tinkamas doz ės lygis atliekant LLNA. Atrankinio bandymo tikslas – nusta ­
tyti gaires didžiausiam pagrindinio LLNA tyrimo doz ės lygiui parinkti, kai 
neturima informacijos apie koncentracij ą, kuri sukelia sistemin į toksiškum ą 
(žr. 24 skirsn į) ir (arba) per didel į vietinį odos dirginim ą (žr. 23 skirsn į). 
Didžiausias bandomas doz ės lygis turi b ūti 100 % bandomosios 
medžiagos, jei tai skys čiai, arba didžiausia įmanoma koncentracija, jei 
tai kietosios medžiagos ar suspensijos.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Atrankinis bandymas atliekamas tokiomis pa čiomis sąlygomis kaip ir 
pagrindinis LLNA tyrimas, išskyrus tai, kad nevertinama limfmazgi ų proli­
feracija ir galima tirti mažiau gyv ūnų kiekvienoje doz ės grupėje. Siūloma 
naudoti vien ą arba du gyv ūnus vienai doz ės grupei. Visos pel ės kasdien 
stebimos, ar poveikio vietoje nepasireiškia sisteminio toksiškumo ar 
vietinio dirginimo klinikiniai požymiai. K ūno masė užrašoma prieš 
bandymą ir prieš j į pabaigiant (6 dien ą). Abi kiekvienos pel ės ausys 
stebimos, ar n ėra eritemos ir įvertinama pagal 1 lentel ę (25). 1 dien ą 
(prieš doz ę), 3 dieną (praėjus maždaug 48 val. po pirmosios doz ės) ir 6 
dieną stormačiu (pvz., skaitmeniniu mikrometru arba ciferblatiniu storio 
matuokliu) atliekami aus ų storio matavimai. Be to, 6 dien ą ausų storis 
gali būti įvertinamas pagal aus ų skylamušio svorio matavimus, atliekamus 
po to, kai gyv ūnai humaniškai numarinami. Per didel į vietinį odos dirgi ­
nimą rodo ≥ 3 edemos įvertis ir (arba) ≥ 25 % ausies storio padid ėjimas 
bet kurią matavimo dien ą (26) (27). Didžiausia pagrindiniam LLNA 
tyrimui parenkama doz ė yra antra pagal dyd į dozė iš atrankinio bandymo 
koncentracij ų eilės (žr. 18 skirsn į), nesukelianti sisteminio toksiškumo ir 
(arba) per didelio vietinio odos dirginimo.  
1 lentelė 
Eritemos įverčiai 
Pastebėjimas  Įvertis  
Eritemos n ėra 0  
Labai nedidel ė eritema (vos pastebima)  1  
Aiški eritema  2  
Nuo vidutin ės iki sunkios eritemos  3  
Nuo sunkios eritemos (buroko raudonumo) iki šašo susida ­
rymo, kuomet nebe įmanoma įvertinti eritemos sunkumo  4 
23. Taikant LLNA metod ą, dirgikliams nustatyti, be aus ų storio padid ėjimo 
25 % (26) (27), naudojamas ir statistiškai reikšmingas paveikt ų pelių ausų 
storio padid ėjimas, palyginti su kontrolin ėmis pelėmis (28) (29) (30) (31) 
(32) (33) (34). Vis d ėlto, nors statistiškai reikšmingas padid ėjimas galimas 
ir ausies storiui esant mažesniam kaip 25 %, tai n ėra siejama konkre čiai su 
per dideliu dirginimu (30) (32) (33) (34).  
24. Toliau išvardyti klinikiniai požymiai gali rodyti sistemin į toksiškum ą (35) 
(36), kai yra naudojami kaip integruoto vertinimo dalis, tod ėl gali nurodyti 
didžiausią dozės lygį, skirtą pagrindiniam LLNA: nerv ų sistemos funkcijos 
pokyčiai (pvz., piloerekcija, ataksija, drebulys ir konvulsijos); elgsenos 
pokyčiai (pvz., agresyvumas, prausimosi poky čiai, žymus aktyvumo 
lygio pokytis); kv ėpavimo poky čiai (t. y. kv ėpavimo dažnio ir intensy ­
vumo poky čiai, pvz., dusulys, žiop čiojimas ir karkalai) ir ėdalo bei 
vandens vartojimo poky čiai. Be to, vertinant turi b ūti atsižvelgiama į 
letargijos ir (arba) nereagavimo požymius ir bet kokius didesnio už nedi ­
delį ar trumpalaik į skausmą ir kančią klinikinius požymius arba > 5 % 
kūno masės sumažėjimą nuo 1 iki 6 dienos, ir į nugaišim ą. Gaištantys 
ar akivaizdžiai skausm ą patiriantys ar didel ės ir ilgalaik ės kančios požy­
mius rodantys gyv ūnai turi b ūti humaniškai numarinti (37).  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Pagrindinio bandymo eksperimentinis planas  
25. Eksperimentinis bandymo planas atrodo taip:  
— 1 diena.  Atskirai nustatoma ir užrašoma kiekvieno gyv ūno masė ir bet 
kokie klinikiniai pasteb ėjimai. Ant kiekvienos ausies išorin ės pusės 
užtepama 25 μl atitinkamai atskiesto bandomosios medžiagos tirpalo, 
vien tik nešiklio arba PC (lygiagre čios arba naujausios, remiantis labo ­
ratorijos politika pagal 11–15 skirsnius).  
— 2 ir 3 dienos.  Pakartojama 1 dien ą daryta proced ūra. 
— 4 ir 5 dienos.  Jokio veikimo.  
— 6 diena.  Užrašoma kiekvieno gyv ūno masė. Į visų tiriamųjų ir kontro ­
linių pelių uodegos ven ą suleidžiama 250 μl sterilaus valgomosios 
druskos ir fosfatinio buferio tirpalo (angl.  phosphate-buffered saline , 
PBS), kuriame yra 20 μCi (7,4 × 10  5 Bq) tričiu prisotinto (  3 H)-metil­
timidino. Arba į visų pelių uodegos ven ą galima suleisti 250 μL 
sterilaus PBS, kuriame yra 2 μCi (7,4 × 10  4 Bq)  125 I-jododeoksiuri ­
dino ir 10  –5 M fluorodeoksiuridino. Po penki ų valandų (5 h) gyv ūnai 
humaniškai numarinami. Kiekvienos pel ės drenuojamieji aus ų limf­
mazgiai išpjaunami ir kiekvieno gyv ūno apdorojami PBS (atskir ų 
gyvūnų metodas); pagal kit ą metodą galima išpjauti limfmazgius iš 
kiekvienos bandymo grup ės visų gyvūnų ausų ir kartu sud ėti į PBS 
(jungtinių poveikio grupi ų metodas). Limfmazgi ų identifikavimo ir 
skrodimo apraš ą bei schemas galima rasti (12) šaltinyje. Norint toliau 
stebėti vietinį odos atsak ą pagrindiniame tyrime, į tyrimo protokol ą 
gali būti įtraukti tokie papildomi parametrai kaip aus ų eritemos įverčiai 
arba ausų storio matavimo rezultatai (gauti storio matuokliu arba aus ų 
skylamušio svorio matavimais atliekant nekroskopij ą). 
Ląstelių suspensijos ruošimas  
26. Limfmazgi ų ląstelių (angl.  lymph node cells , LNC), išpjaut ų iš vieno 
gyvūno abiejų ausų pagal atskir ų gyvūnų metodą arba iš vis ų gyvūnų 
ausų pagal jungtini ų poveikio grupi ų metodą, pavienių ląstelių suspensija 
paruošiama švelniai mechaniškai susmulkinant pro 200 μm nerūdijančio 
plieno tinklel į ar kitu priimtinu pavieni ų ląstelių suspensijos sudarymo 
metodu. LNC du kartus plaunamos gausiu PBS kiekiu ir DNR nusodi ­
namos 5 % trichloracto r ūgštimi (angl.  trichloroacetic acid , TCA) 4 °C 
temperatūroje 18 h (3). Nuos ėdos vėl suspenduojamos 1 ml TCA ir 
suspensija supilama į scintiliacinius m ėgintuvėlius su 10 ml scintiliacinio 
skysčio siekiant suskai čiuoti  3 H, arba tiesiai į mėgintuvėlius gama impul ­
sams skai čiuoti siekiant nustatyti  125 I. 
Ląstelių proliferacijos nustatymas (radioaktyvi ųjų junginių patekimas)  
27. 3 H-metiltimidino patekimas matuojamas skai čiuojant β scintiliacijas kaip 
skilimų skaičių per minut ę (angl.  disintegrations per minute , DPM).  
125 I-jododeoksiuridino patekimas matuojamas skai čiuojant  125 I ir išreiš ­
kiamas kaip DPM. Atsižvelgiant į taikomą metodą, patekimas bus išreiš ­
kiamas DPM / pelei (atskir ų gyvūnų metodas) arba DPM / poveikio grupei 
(jungtinių poveikio grupi ų metodas).  
Sumažintasis LLNA  
28. Kai kuriais atvejais, kai reguliavimo reikm ėms būtina patvirtinti odos 
jautrinimo potencialo neigiam ą prognoz ę, pasirinktinai galima taikyti 
rLLNA protokol ą (16) (17) (18), naudojant mažiau gyv ūnų, jei laikomasi 
visų kitų LLNA protokolo specifikacij ų pagal šį BM. Prieš taikant rLLNA 
metodą, turi būti pateikiamas jo taikymo aiškus pagrindimas ir mokslinis 
pagrindas. Jei gaunamas teigiamas arba dviprasmis rezultatas, gali prireikti 
papildom ų bandymų rezultatams išaiškinti arba patikslinti.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Vienintelis skirtumas tarp LLNA ir rLLNA bandymo metod ų protokol ų 
yra dozės grupių skaičiaus sumažinimas ir d ėl šios priežasties rLLNA 
nesuteikia informacijos apie doz ės ir atsako s ąryšį. Todėl rLLNA neturi 
būti taikomas, kai reikalinga informacija apie doz ės ir atsako s ąryšį. Kaip 
ir kelių dozių LLNA, rLLNA metodu vertinama bandomosios medžiagos 
koncentracija turi b ūti didžiausia koncentracija, kuri pel ėms nesukelia 
akivaizdaus sisteminio toksiškumo ir (arba) per didelio vietinio odos dirgi ­
nimo (žr. 18 skirsn į). 
STEBĖJIMAI  
Klinikiniai steb ėjimai  
30. Kiekviena pel ė kruopščiai apžiūrima bent kart ą per dieną siekiant nustatyti 
bet kokius vietinio dirginimo užtepimo vietoje arba sisteminio toksiškumo 
klinikinius požymius. Visi pasteb ėjimai apie kiekvien ą pelę yra sistemingai 
užrašomi. Į stebėsenos planus turi b ūti įtraukti kriterijai, pagal kuriuos 
galima tuoj pat nustatyti peles, kurioms pasireišk ė sisteminis toksiškumas, 
per didelis vietinis odos dirginimas arba odos ėsdinimas, kad gyv ūnus būtų 
galima numarinti (37).  
Kūno masė 
31. Kaip nurodyta 25 skirsnyje, atskirai kiekvieno gyv ūno masė išmatuojama 
bandymo pradžioje ir humaniškai numarinant pagal plan ą. 
REZULTAT Ų APSKAI ČIAVIMAS  
32. Kiekvienos poveikio grup ės rezultatai išreiškiami kaip dirginimo rodiklis 
(angl.,  Stimulation Index , SI). Taikant atskir ų gyvūnų metodą, SI 
gaunamas dalijant kiekvienos bandomosios medžiagos grup ės vidutin ę 
DPM / gyv ūnui vertę ir PC grup ės vidutin ę DPM / gyv ūnui vertę iš 
tirpiklio / VC grup ės vidutinės DPM /gyv ūnui vertės. Taigi, VC vidutin ė 
SI vertė lygi 1. Taikant jungtini ų poveikio grupi ų metodą, SI gaunamas 
bendrą visos poveikio grup ės gautą radioaktyvi ųjų junginių patekimo dyd į 
dalijant iš visai VC grupei gauto patekimo dydžio; šis dalmuo yra vidutin ė 
SI vertė. 
33. Vertinant rezultatus, atsakas laikomas teigiamu, jei SI ≥ 3. Tačiau, spren ­
džiant, ar ribinis rezultatas turi b ūti paskelbtas teigiamu, galima atsižvelgti 
į dozės ir atsako s ąryšio stiprum ą, statistin į reikšmingum ą ir tirpiklio / 
nešiklio bei PC atsak ų nuoseklum ą (4) (5) (6).  
34. Jei gauti rezultatai n ėra visiškai aišk ūs, reikia atsižvelgti į įvairias bando ­
mosios medžiagos savybes, įskaitant tai, ar jos strukt ūra gimininga žinom ų 
odos jautrikli ų struktūrai, ar ji sukelia per didel į vietinį pelių odos dirgi ­
nimą, ir pasireiškusio doz ės ir atsako s ąryšio tipą. Šie ir kiti aspektai yra 
išsamiai aptarti kitur (7).  
35. Surenkant radioaktyvumo duomenis apie kiekvien ą pelę galima statistiškai 
išanalizuoti doz ės ir atsako s ąryšį tuose duomenyse ir jo laipsn į. Atliekant 
bet kokį statistinį įvertinimą, galima įtraukti doz ės ir atsako s ąryšio verti ­
nimą ir tinkamai pakoreguotus bandymo grupi ų palyginimus (pvz., supo ­
ruotų dozavimo grupi ų palyginimus su lygiagre čiomis VC). Į statistinę 
analizę gali būti įtraukta, pvz., tiesin ė regresija arba Viljamso tyrimas, 
skirtas doz ės ir atsako s ąryšio tendencijoms įvertinti, ir suporuot ų rezultatų 
palyginim ų Daneto tyrimas. Rinkdamasis tinkam ą statistin ės analizės 
metodą tyrėjas turi tur ėti omenyje galimus variantiškumus ir kitas susiju ­
sias problemas, d ėl kurių gali prireikti duomen ų transformacijos ar nepa ­
rametrinės statistin ės analizės. Bet kuriuo atveju tyr ėjui gali tekti atlikti SI 
skaičiavimus ir statistin ę analizę su tam tikrais duomen ų taškais (kartais 
vadinamais „riktais“) ir be j ų. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Duomenys  
36. Duomenys turi b ūti suvesti į lenteles. Kai taikomas atskir ų gyvūnų 
metodas, pateikiamos atskir ų gyvūnų DPM vert ės, DPM/gyv ūnui grupės 
vidurkis, atitinkamas paklaidos rodiklis (pvz., SD, SEM) ir kiekvienos dozės grupės vidutinis SI, palygintas su lygiagre čios VC grup ės rodikliu. 
Kai taikomas jungtini ų poveikio grupi ų metodas, pateikiama vidutin ė DPM 
vertė / mediana ir kiekvienos doz ės grupės vidutinis SI, palygintas su 
lygiagrečios VC grup ės rodikliu.
 
Bandymo ataskaita  
37. Bandymo ataskaitoje pateikiama ši informacija:  
Bandomoji ir kontrolin ė medžiagos:  
— tapatumo duomenys (pvz., CAS ir EB numeriai, jei yra; šaltinis; 
grynumas; žinomos priemaišos; partijos numeris),  
— fizikin ė būsena ir fizikin ės bei chemin ės savybės (pvz., lakumas, stabi ­
lumas, tirpumas),  
— jei tai mišinys – jo sud ėtis ir komponent ų procentin ė dalis.  
Tirpiklis / nešiklis:  
— tapatumo duomenys (grynumas; koncentracija (jei tinka); naudojamas 
tūris), 
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas.  
Bandymo gyv ūnai: 
— CBA peli ų šaltinis;  
— gyvūnų mikrobiologin ė būsena, jei žinoma,  
— gyvūnų skaičius ir amžius,  
— gyvūnų šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.  
Bandymo s ąlygos:  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošim ą ir užtepim ą, 
— dozės pasirinkimo pagrindimas ( įskaitant atrankinio bandymo rezul ­
tatus, jei jis buvo daromas),  
— naudotos nešiklio ir bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės, 
suminis užteptos medžiagos kiekis,  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (įskaitant pašaro tip ą 
ar šaltinį, vandens šaltin į), 
— poveikio medžiaga ir m ėginių ėmimo tvarkaraš čiai, 
— toksiškumo matavimo metodai,  
— tyrimo rezultat ų vertinimo kaip teigiami arba neigiami kriterijai,  
— išsami informacija apie bet kokius nukrypimus nuo protokolo ir paaiš ­
kinimas, kaip tas nukrypimas paveikia tyrimo sistem ą ir rezultatus.  
Patikimumo tikrinimas:  
— paskutin ės patikimumo patikros rezultat ų santrauka, įskaitant informa ­
ciją apie medžiag ą, koncentracij ą ir naudojam ą nešiklį, 
— bandymo laboratorijoje lygiagre čiai ir (arba) anks čiau sukaupti PC ir 
lygiagrečiai gauti NC duomenys,  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— jei lygiagreti PC nebuvo naudojama, naujausio periodinio PC bandymo 
data ir laboratorijos ataskaita ir ataskaita su laboratorijos anks čiau 
sukauptais PC duomenimis, pagrindžian čiais lygiagre čios PC nenaudo ­
jimą. 
Rezultatai:  
— atskirų pelių masė dozės gavimo ir numatyto numarinimo dien ą; taip 
pat kiekvienos poveikio grup ės vidurkis ir atitinkamas paklaidos 
rodiklis (pvz., SD, SEM),  
— toksinio poveikio atsiradimo laikas ir požymiai, įskaitant kiekvieno 
gyvūno odos dirginim ą medžiagos užtepimo vietoje, jei yra,  
— kiekvienos poveikio grup ės atskiros pel ės (atskirų gyvūnų metodas) 
DPM ir SI ver čių arba vidurki ų / median ų (jungtini ų poveikio grupi ų 
metodas) lentel ės, 
— kiekvienos poveikio grup ės DPM/pelei vidurkis ir atitinkamas 
paklaidos rodiklis (pvz., SD, SEM) ir kiekvienos poveikio grup ės 
riktų analizės rezultatai, kai taikomas atskir ų gyvūnų metodas,  
— apskai čiuotas SI ir atitinkamas variantiškumo matas, kuriuo atsižvel ­
giama į atskirų gyvūnų rezultatų variantiškum ą tiek bandomosios 
medžiagos, tiek kontrolin ėje grupėse, kai taikomas atskir ų gyvūnų 
metodas,  
— dozės ir atsako s ąryšis,  
— statistin ė analizė, jei taikoma.  
Rezultatų aptarimas:  
— trumpas rezultat ų, dozės ir atsako s ąryšio analiz ės ir statistin ės 
analizės, jei taikoma, paaiškinimas, padarant išvad ą, ar bandomoji 
medžiaga laikytina od ą jautrinan čia medžiaga.  
NUORODOS  
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guide ­
line for the Testing of Chemicals No 429, Paris. Available at: [http://www. oecd.org/env/testguidelines]
 
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. 
Toxicol ., 30, 165–169.  
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 
13–31.  
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of 
topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory 
exercise,  J. Toxicol. Environ. Health,  53, 563–79.
 
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999–1002.  
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985–997.  
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327–33.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins,  Toxicol ., 146, 49–59.
 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. 
Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol,  34: 258–273.
 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol,  34, 274–286.
 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process,  Reg. Toxicol. Pharmacol,  34: 249–257.
 
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09–7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds. pdf]
 
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemi ­
cals No 406, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testgui ­
delines]  
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and SAFEty Monograph, Series on Testing and Assess ­
ment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and 
Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses 
to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281–284.  
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node 
assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181–185.  
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research 
Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre 
for the Validation of Alternative Methods, April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]
 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. 
The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test 
Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09–6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordi ­
nated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99–4494, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available 
at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90–96.
 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other 
Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication 
Number 10–7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]  
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71–89.  
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404, Paris, France. Available at: http://www.oecd. 
org/document/40/0,3343,en_2649_34 377_37051368_1_1_1_1,00.html]  
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute 
of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih. ­
gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]  
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195–206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the 
differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  
Toxicol. Appl. Pharmacol ., 153, 83–94.  
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245–256.
 
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491–506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, 
R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alter ­
native endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 
212, 60–68.  
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023–1028.  
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity,  OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Paris, France. Available at: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical SAFEty Testing: Advancing In 
Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evalua ­
tions. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acute ­
tox/Tox_workshop.htm]
 
(37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in SAFEty Evaluation,  Environmental Health and SAFEty Mono ­
graph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
1 priedėlis 
Naudojimo charakteristik ų standartai, skirti įvertinti si ūlomus panašius ar 
pakeistus LLNA bandymo metodus odos jautrinimui nustatyti  
ĮVADAS  
1. Naudojimo charakteristik ų standart ų (angl.  Performance Standards , PS) 
paskirtis – pateikti pagrind ą, kuriuo remiantis b ūtų galima nustatyti, ar 
nauji bandymo metodai, tiek patentuoti (t. y. saugomi autoriaus teisi ų, 
turintys prek ės ženklą, registruoti), tiek nepatentuoti, pasižymi pakankamu 
tikslumu ir patikimumu konkretiems bandymo tikslams. Šie PS, pagr įsti 
patvirtinto tinkamumo ir pripažintais bandymo metodais gali b ūti taikomi 
kitų panašių metodų (paprastai vadinam ų „aš irgi“ (angl.  me-too ) bandy­
mais), kurie grindžiami panašiais moksliniais principais ir kuriais matuo ­
jamas ar prognozuojamas tas pats biologinis ar toksinis poveikis, patiki ­
mumui ir tikslumui įvertinti (14).  
2. Prieš naudojant modifikuotus metodus (t. y. pasi ūlytus galimus patvirtino 
bandymo metodo patobulinimus), turi b ūti atliktas įvertinimas, skirtas nusta ­
tyti siūlomų pokyčių poveikį bandymo naudojimo charakteristikoms ir kaip 
smarkiai tokie poky čiai paveiks turim ą informacij ą, skirtą kitiems tinka ­
mumo patvirtinimo proceso komponentams. Atsižvelgiant į siūlomų 
pokyčių skaičių ir pobūdį, gautus duomenis ir tuos paky čius remian čius 
dokumentus, modifikuotiems metodams taikomas toks pat tinkamumo 
patvirtinimo procesas kaip ir aprašytas naujam bandymui arba, jei tinka, 
ribotas patikimumo ir tinkamumo įvertinimas taikant nustatytus PS (14).  
3. Panaš ūs ar modifikuoti metodai, si ūlomi taikyti pagal š į BM, turi b ūti 
įvertinti, kad b ūtų nustatytas j ų patikimumas ir tikslumas, naudojant 
chemines medžiagas, kuriomis apr ėpiamas visas LLNA įverčių intervalas. 
Siekiant išvengti nepageidaujamo gyv ūnų naudojimo, griežtai rekomenduo ­
jama, kad modeli ų kūrėjai, prieš prad ėdami tinkamumo patvirtinimo tyrimus 
pagal PS ir šiame BM pateiktas gaires, pasikonsultuot ų su atitinkamomis 
institucijomis.  
4. Šie PS pagr įsti US-ICCVAM, EC-ECVAM ir Japonijos JaCVAM suderin ­
tais PS (12), skirtais panaši ų ar modifikuot ų LLNA versij ų tinkamumui 
įvertinti. PS sudaro esminiai bandymo metodo komponentai, rekomenduo ­
jamos etalonin ės medžiagos ir tikslumo bei patikimumo standartai, kuriuos 
siūlomas metodas turi atitikti arba viršyti.  
I. Esminiai bandymo metodo komponentai  
5. Siekiant užtikrinti, kad panašus ar modifikuotas LLNA metodas b ūtų funk­
ciškai ir mechanistiškai analogiškas LLNA ir j į taikant b ūtų išmatuojamas 
tas pats biologinis poveikis, į bandymo metodo protokol ą įtraukiami šie 
komponentai:  
— bandomoji medžiaga iš viršaus užtepama ant abiej ų pelės ausų, 
— limfocit ų proliferacija matuojama bandomosios medžiagos poveikio 
vietą drenuojan čiame limfmazgyje,  
— limfocit ų proliferacija matuojama odos jautrinimo indukcinio etapo 
metu,  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— didžiausia parenkama bandomosios medžiagos doz ė yra didžiausioji 
koncentracija, kuri pel ėms nesukelia sisteminio toksiškumo ir (arba) 
per didelio vietinio odos dirginimo. Didžiausia teigiam ų rezultatų etalo­
ninių cheminių medžiag ų dozė turi būti ne mažesn ė kaip atitinkam ų 
etaloninių cheminių medžiag ų LLNA EC3 vert ės (žr. 1 lentel ę), nesu­
keliant pel ėms sisteminio toksiškumo ir (arba) per didelio vietinio odos 
dirginimo,  
— į kiekvien ą tyrimą įtraukiama lygiavert ė VC ir, jei tinka, lygiavert ė PC, 
— naudojami ne mažiau kaip keturi gyv ūnai vienai doz ės grupei,  
— galima rinkti atskir ų gyvūnų arba jungtinius gyv ūnų grupių duomenis.  
Jei kurių nors kriterij ų nesilaikoma, šie PS negali b ūti taikomi panašaus ar 
modifikuoto metodo tinkamumui patvirtinti.  
II. Minimalus etalonini ų chemini ų medžiag ų sąrašas  
6. US-ICCVAM, EC-ECVAM ir Japonijos JaCVAM suderintuose PS (12) 
nustatyta 18 b ūtinųjų etalonini ų cheminių medžiagų, kurios turi b ūti naudo­
jamos, ir keturios pasirinktin ės etalonin ės medžiagos (t. y. medžiagos, su 
kurios atliekant LLNA buvo gauti klaidingi teigiami arba klaidingi neigiami 
rezultatai, palyginti su bandym ų su žmon ėmis ar jūrų kiaulytėmis rezultatais 
(B.6 arba OECD bandym ų metodika 406) (13), ir tod ėl jos suteikia gali ­
mybę įrodyti LLNA lygiavertes ar geresnes naudojimo charakteristikas), 
įtrauktos į LLNA PS. Ši ų cheminių medžiag ų nustatymo kriterijai:  
— į etalonini ų cheminių medžiagų sąrašą buvo įtrauktos t ų tipų medžiagos, 
kurių odos jautrinimo potencialas ir atsak ų, kuriuos galima išmatuoti ar 
numatyti LLNA, intervalas paprastai b ūdavo bandomas,  
— medžiagos yra aiškiai apibr ėžtos chemin ės struktūros, 
— apie kiekvien ą medžiag ą turėta LLNA duomen ų iš bandym ų su jūrų 
kiaulytėmis (t. y. B.6; OECD bandym ų metodika 406) (13) ir (kai 
įmanoma) iš žmoni ų, ir 
— medžiagas lengva gauti iš komercini ų šaltinių. 
Rekomenduojamos etalonin ės chemin ės medžiagos išvardytos 1 lentel ėje. 
Tyrimuose, kuriuose naudojamos si ūlomos etalonin ės cheminės medžiagos, 
turi būti naudojami nešikliai, su kuriais jos išvardytos 1 lentel ėje. Tais 
atvejais, kai nurodytos medžiagos negalima gauti, pateikus pakankam ą 
pagrindim ą, galima naudoti kitas medžiagas, kurios atitinka išvardytus 
atrankos kriterijus.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
1 lentelė 
LLNA PS rekomenduojamos etalonin ės chemin ės medžiagos  
Nr. Chemin ės medžiagos (  1 ) CAS Nr.  Pavidalas  Neš. (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x - 2,0x 
EC3 Tikrasis EC3 
intervalas  LLNA vs. 
GP LLNA vs. 
žmonės 
1 5-chlor-2-metil-4-izotiazolin-3-onas (CMI)/ 
2-metil-4-izotiazolin-3-onas (MI) (  5 ) 26172–55–4/2682–20–4  SKK.  DMF  0,009  1  0,0045– 
0,018  NA +/+  +/+  
2 DNCB  97–00–7  Kiet.  AOO  0,049  15  0,025– 
0,099  0,02– 
0,094  +/+ +/+  
3 4-fenilenediaminas  106–50–3  Kiet.  AOO  0,11  6  0,055– 
0,22 0,07–0,16  +/+  +/+  
4 Kobalto chloridas  7646–79–9  Kiet.  DMSO  0,6  2  0,3–1,2  0,4–0,8  +/+  +/+  
5 Izoeugenolis  97–54–1  SKK.  AOO  1,5  47  0,77–3,1  0,5–3,3  +/+  +/+  
6 2-merkaptobenzotiazolas  149–30–4  Kiet.  DMF  1,7  1  0,85–3,4  NA  +/+  +/+  
7 Citralas  5392–40–5  SKK.  AOO  9,2  6  4,6–18,3  5,1–13  +/+  +/+  
8 HCA  101–86–0  SKK.  AOO  9,7  21  4,8–19,5  4,4–14,7  +/+  +/+  
9 Eugenolis  97–53–0  SKK.  AOO  10,1  11  5,05–20,2  4,9–15  +/+  +/+  
10 Fenilo benzoatas  93–99–2  Kiet.  AOO  13,6  3  6,8–27,2  1,2–20  +/+  +/+  
11 Cinamilo alkoholis (stirolis)  104–54–1  Kiet.  AOO  21  1  10,5–42  NA  +/+  +/+  
12 Imidazolidinilo šlapalas  39236–46–9  Kiet.  DMF  24  1  12–48  NA  +/+  +/+  
13 Metilo metakrilatas  80–62–6  SKK.  AOO  90  1  45–100  NA  +/+  +/+  
14 Chlorobenzenas  108–90–7  SKK.  AOO  25  1  NT  NT  –/–  –/ (*)  
15 Izopropanolis  67–63–0  SKK.  AOO  50  1  NT  NT  –/–  –/+
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Nr. Chemin ės medžiagos (  1 ) CAS Nr.  Pavidalas  Neš. (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x - 2,0x 
EC3 Tikrasis EC3 
intervalas  LLNA vs. 
GP LLNA vs. 
žmonės 
16 Pieno r ūgštis 50–21–5  SKK.  DMSO  25  1  NT  NT  –/–  –/ (*)  
17 Metilo salicilatas  119–36–8  SKK.  AOO  20  9  NT  NT  –/–  –/–  
18 Salicilo r ūgštis 69–72–7  Kiet.  AOO  25  1  NT  NT  –/–  –/–  
Pasirinktin ės medžiagos, skirtos geresn ėms naudojimo charakteristikoms, palyginti su LLNA, įrodyti  
19 Natrio laurilo sulfatas  151–21–3  Kiet.  DMF  8,1  5  4,05–16,2  1,5–17,1  +/–  +/–  
20 Etilenglikolio dimetakrilatas  97–90–5  SKK.  MEK  28  1  14–56  NA  +/–  +/+  
21 Ksilolas  1330–20–7  SKK.  AOO  95,8  1  47,9–100  NA  +/ (**)  +/–  
22 Nikelio chloridas  7718–54–9  Kiet.  DMSO  5  2  NT  NT  –/+  –/+  
Santrumpos: AOO = acetono ir alyv ų aliejaus mišinys (4:1, t ūrio dalys); CAS Nr. = Chemini ų medžiag ų santrump ų tarnybos numeris; DMF =  N,N -dimetilformamidas; DMSO = dimetilsulfoksidas; DNCB = 2,4-dinitroch ­
lorbenzenas; EC3 = numatyta koncentracija, reikalinga dirginimo rodikliui 3 pasiekti; GP = bandymo su j ūrų kiaulytėmis rezultatas (t. y. B. 6 arba OECD bandym ų metodika 406) (13); HCA = heksilcinamono aldehidas; SKK. = 
skystis; LLNA = peli ų Vietinio limfmazgio bandymo rezultatas (t. y. B. 42 arba OECD bandym ų metodika 429) (1); MEK = metiletilketonas; NT = netaikoma, nes dirginimo rodiklis < 3; NA = neapskai čiuota, nes duomenys 
gauti iš vieno tyrimo; Kiet. = kietoji medžiaga; Neš. = bandymo nešiklis. 
(*) Laikoma, kad tai n ėra jautrinanti medžiaga žmon ėms, remiantis tuo, kad n ėra gauta joki ų klinikini ų odos lopo m ėginio rezultat ų, jos nėra tarp odos lopo bandym ų rinkinio alergen ų ir nėra gauta pranešim ų apie žmoni ų 
jautrinimą. 
(**) GP duomen ų neturima/. 
( 1 ) Chemin ės medžiagos paruošiamos kasdien, nebent stabilumo duomenys rodo, kad jas galima laikyti ilgesn į laiką. 
( 2 ) Dėl galimo skirting ų nešiklių poveikio LLNA naudojimo charakteristikoms, turi b ūti naudojamas kiekvienai etaloninei cheminei medžiagai rekomenduojamas nešiklis (24)(32). 
( 3 ) Vidutin ė vertė, jei turima daugiau kaip viena EC3 vert ė. Neigiamo rezultato medžiagoms (t. y. kuri ų dirginimo rodiklis < 3), pateikta didžiausia išbandyta koncentracija. 
( 4 ) LLNA tyrim ų, kurių duomenys gauti, skai čius. 
( 5 ) Prekyboje žinomas kaip „Kathon CG“ (CAS Nr. 55965–84–9), kuris yra CMI ir MI mišinys santykiu 3:1. Kiekvieno komponento santy kinės koncentracijos įvairuoja nuo 1,1 % iki 1,25 % (CMI) ir nuo 0,3 % iki 
0,45 % (MI). Neaktyviosios medžiagos yra magnio druskos (nuo 21,5 % iki 24 %) ir vario nitratas (nuo 0,15 % iki 0,17 %), o liku sią preparato dal į sudaro vanduo (nuo 74 % iki 77 %). „Kathon CG“ tiekia „Sigma-Aldrich“ 
ir „Rohm and Haas“ (dabar – „Dow Chemical Corporation“).
 III. Nustatyti patikimumo ir tikslumo standartai  
7. Panašaus arba modifikuoto LLNA metodo tikslumas turi b ūti toks pat kaip 
LLNA PS arba j į viršyti; vertinama naudojant 18 b ūtinųjų etalonini ų 
cheminių medžiag ų, kurios turi b ūti naudojamos. Taikant nauj ą arba modi ­
fikuotą metodą turi būti teisingai klasifikuojama, pagal sprendim ą „taip“ 
arba „ne“. Vis d ėlto, taikant nauj ą arba modifikuot ą metodą gali būti tiksliai 
klasifikuojamos ne visos iš b ūtinųjų etalonini ų cheminių medžiag ų, kurios 
turi būti naudojamos. Jei, pvz., vienas iš silpn ų jautriklių klasifikuojamas 
neteisingai, galima b ūtų atsižvelgti į neteisingo klasifikavimo login į 
pagrindą ir atitinkamus papildomus duomenis (pvz ., bandymo rezultatus, 
pagal kuriuos teisingai klasifikuojamos kitos medžiagos, kuri ų fizinės, 
cheminės ir jautrinan čiosios savyb ės yra panašios į neteisingai klasifikuotos 
cheminės medžiagos savybes), kad b ūtų įrodytos lygiavert ės naudojimo 
charakteristikos. Tokiais atvejais naujo ar modifikuoto LLNA bandymo 
metodo tinkamumo patvirtinimo išvada b ūtų vertinama kiekvienu konkre čiu 
atveju.  
Atkuriamumas laboratorijoje  
8. Siekiant nustatyti atkuriamum ą laboratorijoje, naujas arba modifikuotas 
LLNA metodas įvertinamas naudojant jautrinan čią medžiag ą, kuri tinkamai 
apibūdinama taikant LLNA. Tod ėl LLNA PS grindžiami heksilcinamono 
aldehido (HCA) kartotini ų bandymų rezultatų variantiškumu. Siekiant įver­
tinti variantiškum ą laboratorijoje, keturiais atskirais bandymais, tarp kuri ų 
turi praeiti ne mažiau kaip savait ė, gaunamos numatytosios slenkstin ės 
koncentracijos (angl.  threshold estimated concentration , ECt) vert ės. Priim­
tinas atkuriamumas laboratorijoje nusakomas laboratorijos geb ėjimu, atlie ­
kant kiekvien ą HCA bandym ą, gauti ECt vertes nuo 5 % ir 20 %, kas 
atitinka 0,5–2,0 kart ų vidutinės EC3 vert ės, nustatytos HCA (10 %), taikant 
LLNA (žr. 1 lentel ę), interval ą. 
Atkuriamumas tarp laboratorij ų 
9. Naujo arba modifikuoto LLNA metodo atkuriamumas tarp laboratorij ų įver­
tinamas naudojant dvi jautrinan čias medžiagas, kurios tinkamai apib ūdi­
namos taikant LLNA. LLNA PS grindžiami skirtingose laboratorijose atliktų HCA ir 2,4-dinitrochlorbenzeno (DNCB) bandym ų rezultatų varian­
tiškumu. ECt vert ės turi būti gautos nepriklausomai, vienu tyrimu, atliktu ne 
mažiau kaip trijose skirtingose laboratorijose. Norint įrodyti priimtin ą atku­
riamumą tarp laboratorij ų, kiekviena laboratorija turi gauti HCA ECt vertes 
nuo 5 % iki 20 % ir DNCB vertes nuo 0,025 % iki 0,1 %, kas atitinka 0,5–2,0 kart ų vidutinės EC3 vert ės, nustatytos atitinkamai HCA (10 %) ir 
DNCB (0,05 %), taikant LLNA (žr. 1 lentel ę), interval ą.
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
2 priedėlis 
Apibrėžtys 
Tikslumas –  bandymo metodo rezultat ų ir patvirtint ų pamatini ų verčių artumas. 
Tikslumas yra bandymo metodo naudojimo charakteristik ų matas ir vienas iš 
tinkamumo aspekt ų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „suta ­
pimas“ ir reiškia tinkam ų bandymo metodo rezultat ų dalį (14).  
Palyginamoji medžiaga –  jautrinanti arba nejautrinanti medžiaga, naudojama kaip 
bandomosios medžiagos palyginimo standartas. Palyginamoji medžiaga turi pasi ­ 
žymėti tokiomis savyb ėmis: i) pastoviu (-iais) ir patikimu (-ais) šaltiniu (-iais), ii) 
struktūriniu ir funkciniu panašumu į bandomų medžiag ų klasę, iii) žinomomis 
fizikinėmis ir chemin ėmis charakteristikomis, iv) patvirtinan čiais duomenimis 
apie žinomus poveikius ir v) žinomu potencialu norim ų atsakų intervale.  
Numatytasis koncentracijos slenkstis (ECt) –  numatyta bandomosios medžiagos 
koncentracija, reikalinga, kad b ūtų pasiektas dirginimo rodiklis, rodantis teigiam ą 
atsaką. 
Numatytoji koncentracija Nr. 3 (EC3) –  numatyta bandomosios medžiagos 
koncentracija, reikalinga, kad b ūtų pasiektas dirginimo rodiklis, lygus trims.  
Klaidingai neigiamas rezultatas –  bandymo metodu bandomoji medžiaga netei ­
singai įvertinta kaip neigiama arba neaktyvi, nors iš ties ų yra teigiama arba 
aktyvi.  
Klaidingai teigiamas rezultatas –  bandymu bandomoji medžiaga neteisingai įver­
tinta kaip teigiama arba aktyvi, nors iš ties ų yra neigiama arba neaktyvi.  
Pavojus –  neigiamo poveikio sveikatai arba ekologijai galimyb ė. Neigiamas 
poveikis pasireiškia tik tada, jei veikimas medžiaga yra pakankamo lygio.  
Atkuriamumas tarp laboratorij ų – laipsnio, kuriuo skirtingos kvalifikuotos labo ­
ratorijos, taikydamos t ą patį protokol ą ir bandan čios tas pa čias bandom ąsias 
medžiagas, gali gauti kokybiškai ir kiekybiškai panašius rezultatus, matas. Atku ­
riamumas tarp laboratorij ų nustatomas atliekant pradinio tinkamumo patvirtinimo 
ir tinkamumo pavirtinimo procesus ir rodo laipsn į, kuriuo bandym ą galima 
sėkmingai perkelti tarp laboratorij ų; tai dar vadinama tarplaboratoriniu atkuria ­
mumu (14).  
Atkuriamumas laboratorijoje –  laipsnio, kuriuo kvalifikuoti darbuotojai toje 
pačioje laboratorijoje gali s ėkmingai atkartoti rezultatus, taikydami konkret ų 
protokolą skirtingu metu, matas. Dar vadinamas laboratoriniu atkuriamumu (14).  
„Aš irgi“ (angl. me-too) bandymas –  šnekamosios kalbos pasakymas, kuriuo 
vadinamas bandymo metodas, strukt ūriškai ir funkciškai panašus į patvirtinto 
tinkamumo ir pripažint ą pamatin į bandymo metod ą. Toks bandymo metodas 
gali būti taikomas palyginamajam tinkamumo patvirtinimui. Taikomas pakai čiui 
su panašiu bandymo metodu (14).  
Riktas –  pastebėjimas, kad vert ė labai skiriasi nuo kit ų atsitiktinio populiacijos 
ėminio ver čių. 
Naudojimo charakteristik ų standartai (angl. PS) –  standartai, pagr įsti patvirtinto 
tinkamumo bandymo metodu, sudarantys pagrind ą įvertinti si ūlomo funkciškai ir 
mechanistiškai panašaus bandymo metodo palyginamum ą. Įtraukiami šie dalykai: 
i) esminiai bandymo metodo komponentai, ii) b ūtinasis sąrašas etalonini ų 
cheminių medžiag ų, parinktų iš tų medžiag ų, kurios naudojamos patvirtinto 
tinkamumo bandymo metodo priimtinoms naudojimo charakteristikoms įrodyti, 
ir iii) panašus tikslumo ir patikimumo lygis, atsižvelgiant į pasiekiam ąjį patvir­
tinto tinkamumo bandymo metodu, kur į siūlomas bandymo metodas turi tur ėti 
vertinamas pagal b ūtinąjį etalonini ų cheminių medžiag ų sąrašą (14).  
Patentuotas bandymo metodas –  bandymo metodas, su kuriuo susijusi gamyba ir 
platinimas yra ribojami patentais, autoriaus teis ėmis, prek ės ženklais ir kt.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Kokybės užtikrinimas –  valdymo procesas, per kur į asmenys, nepriklausomi nuo 
atliekančiųjų bandymus, įvertina, kaip laboratorija laikosi bandymo standart ų, 
reikalavim ų ir užrašų saugojimo proced ūrų bei duomen ų perdavimo tikslumo.  
Etaloninės chemin ės medžiagos –  cheminės medžiagos, kurios yra pasirinktos 
naudoti tinkamumo patvirtinimo procese ir kuri ų atveju atsakas  in vitro  arba  in 
vivo etaloninėje bandymo sistemoje arba dominan čių rūšių atsakas jau žinomas. 
Šios chemin ės medžiagos turi b ūti tipinės chemini ų medžiag ų klasėms, kurioms 
numatyta taikyti bandymo metod ą, ir turi perteikti visus atsakus, kuri ų tikimasi iš 
cheminių medžiag ų, kurioms gali b ūti taikomas metodas – tiek stiprius, tiek 
silpnus, tiek neigiamus. Skirtingais tinkamumo patvirtinimo proceso etapais ir skirtingiems bandymo metodams bei paskirtims gali prireikti skirting ų etalonini ų 
cheminių medžiag ų rinkinių (14).
 
Tinkamumas –  bandymo ir dominan čio poveikio s ąryšio ir bandymo prasmin ­
gumo bei naudingumo konkre čiam tikslui apib ūdinimas. Tai yra matas, kiek 
tiksliai bandymu išmatuojamas ar numanomas dominantis biologinis poveikis. Tinkamumas apima bandymo metodo tikslumo (sutapimo) aspekt ą (14).
 
Patikimumas –  juo įvertinamas laipsnis, kuriuo bandymo metodas gali b ūti ilgai­
niui atkartojamai atliekamas vienoje ir skirtingose laboratorijose, taikant t ą patį 
protokolą. Jis įvertinamas skai čiuojant atkuriamum ą laboratorijoje ir tarp labora ­
torijų (14).  
Odos jautrinimas –  imunologinis procesas, vykstantis paveik ų individą išoriškai 
paveikus cheminiu alergenu, kuris sukelia odos imunin į atsaką, dėl kurio gali 
atsirasti kontaktinis jautrinimas.  
Dirginimo rodiklis (angl. SI) –  vertė, apskaičiuojama bandomosios medžiagos 
jautrinimo potencialui įvertinti – tai yra paveikt ų grupių proliferacijos s ąryšio su 
lygiagrečios nešiklio kontrolin ės grupės proliferacija koeficientas.  
Bandomoji medžiaga (dar vadinama bandom ąja chemine medžiaga) –  bet kuri 
medžiaga ar mišinys, bandomi taikant š į bandymų metodą. 
Patvirtinto tinkamumo bandymo metodas –  bandymo metodas, kurio tinkamumo 
patvirtinimo tyrimai atlikti, nustatant tinkamum ą (įskaitant tikslum ą) ir patiki ­
mumą konkrečiam tikslui. Svarbu pažym ėti, kad patvirtinto tinkamumo bandymo 
metodas gali b ūti nepakankam ų naudojimo charakteristik ų tikslumo ir patiki ­
mumo prasme, kad b ūtų pripažintas tinkamu si ūlomam tikslui (14).  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  NEUROTOKSIŠKUMO GRAUŽIKAMS BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 424 (1997).  
Šis bandymo metodas buvo sukurtas gauti informacijai, kuri yra 
būtina norint patvirtinti arba papildomai apib ūdinti galim ą cheminių 
medžiagų neurotoksin į poveikį suaugusiems gyv ūnams. Šį metodą 
galima derinti su egzistuojan čiais bandymo metodais, darant karto ­
tinės dozės toksiškumo bandymus, arba daryti atskir ą bandym ą. 
Rekomenduojama susipažinti su OECD neurotoksiškumo bandymo 
strategijos ir metod ų vadovu (1), kuris pad ėtų planuoti bandymus, 
pagrįstus šiuo bandymo metodu. Šis vadovas yra ypa č reikalingas, 
kai rengiamasi daryti šiame metode rekomenduot ų įprastų stebėjimų 
ir bandymo metodik ų pakeitimus. Vadovas buvo parengtas norint 
palengvinti kit ų bandymo metodik ų, taikytinų konkrečiomis aplinky ­
bėmis, pasirinkim ą. 
Šis metodas neskirtas įvertinti neurotoksiškum ą vystymuisi.  
1.3.4. ĮVADAS  
Vertinant chemini ų medžiag ų toksines savybes, svarbu atsižvelgti į 
neurotoksiškumo galimyb ę. Jau kartotin ės dozės bandym ų metode 
sisteminiam toksiniam poveikiui nustatyti vykdomi galimo neurotok ­
siškumo steb ėjimai. Šis bandymo metodas gali b ūti taikomas planuo ­
jant bandym ą, kuris leist ų gauti papildomos informacijos arba patvir ­
tinti neurotoksin į poveikį, pastebėtą kartotin ės dozės sisteminio 
toksiškumo bandymuose. Ta čiau nagrin ėjant galim ą tam tikr ų 
cheminių medžiag ų klasių neurotoksiškum ą, gali būti prieita prie 
išvados, kad šios medžiagos gal ėtų būti tinkamiau įvertintos taikant 
šį metodą, kai neturima išankstini ų duomenų apie galim ą neurotok ­
siškumą, kurie būtų gauti vykdant kartotin ės dozės sisteminio toksiš ­
kumo bandymus. Tai gal ėtų būti, pvz.:  
— neurologini ų požymių arba neuropatologini ų pažeidim ų stebė­
jimas, darant kitus nei kartotin ės dozės sisteminio toksiškumo 
bandymus; arba  
— strukt ūros panašum ų buvimas arba kita informacija, kuri leist ų 
medžiagas susieti su kitomis neurotoksiškomis medžiagomis.  
Be to, gali b ūti kitų pavyzdži ų, kai galėtų tikti šis bandym ų metodas; 
daugiau informacijos pateikiama nuorodoje (1).  
Šis metodas buvo kuriamas taip, kad j į būtų galima pritaikyti konkre ­
tiems poreikiams, norint patvirtinti specifin į cheminės medžiagos 
histopatologin į neurotoksiškum ą ir jos neurotoksiškum ą, veikiant į 
elgseną, be to, apib ūdinti ir kiekybiškai įvertinti neurotoksin į 
poveikį. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
Anksčiau neurotoksiškumas buvo prilyginamas neuropatijai, esant 
neuropatologiniams pažeidimams arba neurologini ų funkcijų sutriki­
mams, pvz., konvulsijos, paralyžius arba drebulys. Nors neuropatija yra svarbus neurotoksiškumo pasireiškimas, dabar paaišk ėjo, kad yra 
daug kitų toksinio poveikio nerv ų sistemai požymi ų (pvz., motorin ės 
koordinacijos netekimas, jutimo tr ūkumai, mokymosi ir atminties 
sutrikimai), kuri ų galima nepasteb ėti darant neuropatologinius arba 
kitų tipų bandymus.
 
Šis neurotoksiškumo bandymo metodas skirtas nustatyti pagrindin į 
neurobihevioristin į ir neuropatologin į poveikį suaugusiems grauži ­
kams. Nors poveikis elgesiui gali rodyti neigiam ą įtaką organizmui 
ir tuo atveju, kai morfologini ų pakitimų nėra, ne visi elgesio paki ­
timai yra b ūdingi nerv ų sistemai. Taigi visus pasteb ėtus pakitimus 
reikėtų įvertinti kartu su susijusiais histopatologiniais, hematologi ­
niais arba biocheminiais duomenimis ir kit ų sisteminio toksinio 
poveikio tip ų duomenimis. Šiam metodui numatytus bandymus 
neurotoksiniam poveikiui apib ūdinti ir kiekybiškai įvertinti sudaro 
specifinės histopatologinio ir elgesio įvertinimo metodikos, kurias 
papildomai gali patvirtinti elektrofiziologiniai ir (arba) biocheminiai 
tyrimai (1) (2) (3) (4).  
Neurotoksin ės medžiagos gali veikti įvairias nerv ų sistemos vietas ir 
įvairiais veikimo mechanizmais. Kadangi jokiu vienu bandym ų 
rinkiniu negalima išsamiai įvertinti vis ų medžiag ų neurotoksiškumo, 
gali tekti taikyti kitus  in vivo  arba  in vitro  bandymus, atitinkan čius 
pastebėtą arba numatom ą neurotoksiškumo tip ą. 
Be to, šis bandymo metodas gali b ūti taikomas atsižvelgiant į reko­
mendacijas, pateiktas OECD neurotoksiškumo bandymo strategijos ir metodų vadove (1), siekiant parengti bandymus, skirtus papildomai 
apibūdinti doz ės ir reakcijos santyk į arba padidinti jo kiekybinio 
įvertinimo jautrum ą, kad būtų galima geriau įvertinti nepasteb ėto 
neigiamo poveikio rib ą arba pateikti negin čijamų įrodymų apie 
žinomus arba sp ėjamus chemin ėsmedžiagos keliamus pavojus. 
Pvz., galima parengti bandymus neurotoksiškumo mechanizmui 
(-ams) identifikuoti ir įvertinti arba papildyti duomenis, kurie jau 
buvo gauti taikant bazines elgesio ir neuropatologini ų stebėjimų 
metodikas. Darant tokius bandymus nereikia pakartotinai gauti 
duomenų, kurie gaunami taikant šiame metode rekomenduotas etalo ­
nines metodikas, jei tokie duomenys jau yra ir n ėra laikomi b ūtinais 
tyrimo rezultatams aiškinti.
 
Šis neurotoksiškumo bandymas, daromas atskirai arba kartu su kitais 
bandymais, suteikia informacijos, kuri leidžia:  
— nustatyti, ar nerv ų sistema yra visam laikui arba gr įžtamai 
paveikta bandom ąja chemine medžiaga;  
— papildomai apib ūdinti nerv ų sistemos pakitimus, susijusius su 
cheminės medžiagos veikimu, ir suprasti veikian čio mechanizmo 
esmę; ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— nustatyti doz ės ir reakcijos bei laiko ir reakcijos santykius, kad 
būtų galima įvertinti nepasteb ėto neigiamo poveikio rib ą (kuri 
gali būti naudojama nustatant chemin ės medžiagos saugos krite ­
rijus).  
Taikant š į bandymo metod ą, bandomoji medžiaga duodama per virš ­
kinamąjį traktą. Kiti medžiagos davimo b ūdai (pvz., per od ą arba per 
kvėpavimo takus) gali b ūti tinkamesni ir gali tekti keisti rekomen ­
duojamas metodikas. Davimo b ūdo pasirinkimas priklauso nuo 
žmonių sąlyčio su medžiaga aplinkybi ų ir turimos informacijos 
apie toksikologij ą ir kinetik ą. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Neigiamas poveikis  – bet koks su veikimu medžiaga susij ęs paki­
timas, palyginti su pamatine verte, mažinantis organizmo geb ą išgy­
venti, daugintis arba prisitaikyti prie aplinkos.  
Dozė – skirtas bandomosios medžiagos kiekis. Doz ė išreiškiama 
bandomosios medžiagos mase bandomojo gyv ūno masės vienetui 
(pvz., mg/kg) arba kaip pastovios koncentracijos pašare vert ės (ppm).  
Dozavimas  – bendrasis terminas dozei, jos davimo dažnumui ir 
trukmei apib ūdinti.  
Neurotoksiškumas  – nerv ų sistemos strukt ūros arba funkcijos 
neigiamas pakitimas d ėl veikimo chemine, biologine arba fizikine 
medžiaga.  
Neurotoksiška medžiaga  – bet kuri chemin ė, biologin ė arba fizikin ė 
medžiaga, galinti sukelti neurotoksin į poveikį. 
NOAEL  – nepasteb ėto neigiamo poveikio ribos santrumpa, tai yra 
didžiausia doz ė, nesukelianti su veikimu susieto neigiamo poveikio.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandomoji chemin ė medžiaga duodama kelioms laboratorini ų grau­ 
žikų grupėms per virškinam ąjį traktą, naudojant kelias doz ės 
koncentracijos vertes. Paprastai tenka duoti kartotines dozes ir doza ­
vimo režimas gali b ūti 28 parų, pusiau l ėtinis (90 par ų) arba lėtinis 
(1 metai arba ilgiau). Be to, šiam bandymo metodui parengtos meto ­
dikos gali b ūti taikomos darant ūmaus neurotoksiškumo bandym ą. 
Gyvūnai bandomi siekiant aptikti arba apib ūdinti elgesio ir (arba) 
neurologines anomalijas. Kiekvienu steb ėjimo laikotarpiu įvertinami 
įvairūs elgesio, kuriam neurotoksiškos medžiagos gal ėtų daryti įtaką, 
aspektai. Pasibaigus bandymui, kiekvienos grup ės kiekvienos lyties 
gyvūnų pogrupio gyv ūnams daroma perfuzija  in situ  ir ruošiami bei 
tiriami galvos bei stuburo smegen ų ir periferiniai nerv ų preparatai.  
Kai daromas atskiras (stand-alone) bandymas neurotoksiškumui 
aptikti arba neurotoksiniam poveikiui apib ūdinti, kiekvienos grup ės 
gyvūnai, kurie nebuvo panaudoti perfuzijai ir v ėlesniam histopatolo ­
giniam tyrimui (žr. 1 lentel ę), gali būti naudojami darant specialius 
elgesio bandymo, neuropatologinius, neurocheminius arba elektrofi ­
ziologinius bandymus, kuriais galima b ūtų papildyti duomenis, 
gautus darant šiame bandymo metode numatytus tipinius bandymus 
(1). Šie papildomi bandymai gali b ūti ypač naudingi, kai praktiniai 
stebėjimai arba numatomas poveikis rodo specifin į chemin ės 
medžiagos neurotoksiškumo tip ą arba veikiam ą organą. Be to, liku ­
sieji gyvūnai gali b ūti naudojami darant vertinimus, kurie yra numa ­
tyti taikant graužik ų kartotinės dozės toksiškumo bandym ų metodus.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Kai šis bandymo metodas vykdomas kartu su kitais bandymo meto ­
dais, reikia tur ėti pakankam ą gyvūnų skaičių norint vykdyti abiem 
bandymams reikalingus steb ėjimus.  
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Gyv ūnų rūšies pasirinkimas  
Tinkamiausia graužik ų rūšis yra žiurk ės, nors galima naudoti kitas 
graužikų rūšis, jei toks naudojimas b ūtų pagrįstas. Paprastai naudo ­
jamos laboratorin ės jaunų, suaugusi ų ir sveik ų gyvūnų veislės. 
Patelės turi būti neturėjusios palikuoni ų ir neapvaisintos. Doz ė 
paprastai pradedama duoti kiek įmanoma grei čiau po atjunkymo, ir 
būtų gerai, kad gyv ūnui būtų ne daugiau kaip šešios savait ės, tačiau 
bet kuriuo atveju anks čiau nei gyv ūnas sulaukia devyni ų savaičių. 
Vis dėlto, kai bandymas daromas kartu su kitais bandymais, š į 
amžiaus reikalavim ą gali tekti keisti. Naudojam ų gyvūnų masė ir 
vidutinė kiekvienos lyties mas ė bandymo pradžioje neturi skirtis 
daugiau kaip ± 20 %. Kai prieš ilgalaik į bandymą daromas trumpa ­
laikis kartotin ės dozės bandymas, abiem bandymams turi b ūti naudo­
jami tos pa čios veislės ir šaltinio gyv ūnai. 
1.4.2.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Eksperimentini ų gyvūnų patalpos temperat ūra turėtų būti 22 °C 
± 3 °C). Nors santykin ė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir 
pageidautina ne didesn ė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, 
reikėtų užtikrinti 50–60 %. Apšvietimas turi b ūti dirbtinis, esant 12 h 
šviesos ir 12 h tamsos sekai. Reikia kiek įmanoma sumažinti didel į 
neištisinį triukšm ą. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje 
naudojamas pašaras, neribojant geriamo vandens kiekio. Pašaro pasi ­
rinkimui gali tur ėti įtakos būtinybė tinkamai įmaišyti bandom ąją 
medžiagą, duodant j ą šiuo būdu. Gyvūnai narveliuose gali b ūti 
laikomi atskirai arba mažomis tos pa čios lyties grup ėmis. 
1.4.3.  Gyv ūnų ruošimas  
Sveiki ir jauni gyv ūnai atsitiktinai suskirstomi į bandomąją ir kontro ­
linę grupes. Narveliai išd ėstomi taip, kad b ūtų kiek įmanoma suma ­ 
žintas bet koks galimas poveikis d ėl narvelio vietos. Gyv ūnai pažen ­
klinami, kad juos b ūtų įmanoma identifikuoti, ir laikomi narveliuose 
mažiausiai penkias (5) paras prieš bandymo pradži ą, kad gal ėtų 
priprasti prie laboratorini ų sąlygų. 
1.4.4.  Davimo b ūdas ir dozi ų ruošimas  
Taikant š į bandymo metod ą, bandomoji medžiaga duodama per virš ­
kinamąjį traktą. Duoti per virškinam ąjį traktą galima naudojant 
zondą, su pašaru, su geriamuoju vandeniu arba duodant kapsules. 
Galima naudoti kitus davimo b ūdus (pvz., per od ą arba per kv ėpa­
vimo takus), bet tada gali tekti keisti rekomenduojamas metodikas. Davimo b ūdo pasirinkimas priklauso nuo žmogaus s ąlyčio su 
medžiaga ypatybi ų ir turimos informacijos apie toksikologij ą ar kine­
tiką. Reikia pagr įsti davimo b ūdo pasirinkim ą ir nurodyti d ėl to 
daromus šio bandymo metodo proced ūrų pakeitimus.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
Prireikus bandomoji medžiaga ištirpinama arba suspenduojama tinka ­
mame nešiklyje. Rekomenduojama iš pradži ų apsvarstyti galimyb ę 
naudoti vandenin į tirpalą ar suspensij ą, vėliau tirpal ą ar emulsij ą 
aliejuje (pvz., kukur ūzų aliejuje) ir tik tuomet galimyb ę tirpinti 
kitame nešiklyje. Turi b ūti žinomos nešiklio toksin ės savybės. Be 
to, reikėtų atsižvelgti į šias nešiklio charakteristikas: poveik į absorb­
cijai, pasiskirstymui, medžiag ų apykaitai ir bandomosios medžiagos 
sulaikymui, d ėl ko gali keistis bandomosios medžiagos chemin ės 
savybės; poveik į maisto ar vandens suvartojimui arba gyv ūnų 
įmitimui.  
1.5. BANDYMO EIGA  
1.5.1.  Gyv ūnų skaičius ir lytis  
Darant atskir ą bandymą kiekvienos doz ės grupei ir kontrolinei grupei 
turi būti naudojama mažiausiai 20 gyv ūnų (10 pateli ų ir 10 patin ų) 
norint išsamiai įvertinti klinikini ų ir funkcini ų stebėjimų rezultatus. 
Baigus bandym ą mažiausiai penkiems patinams ir penkioms pate ­
lėms iš šių 10 patin ų ir 10 pateli ų daroma perfuzija  in situ  ir jie 
naudojami išsamiam neurohistopatologiniam tyrimui. Tais atvejais, 
kai neurotoksiškumo požymiai pasireiškia tik ribotam tam tikros 
dozės grupės gyvūnų skaičiui, reikėtų numatyti šiuos gyv ūnus 
įtraukti į pasirinkt ųjų perfuzijai gyv ūnų skaičių. Kai bandymas 
daromas kartu su kartotin ės dozės toksiškumo bandymu, abiej ų 
bandymų tikslams pasiekti turi b ūti naudojamas atitinkamas gyv ūnų 
skaičius. Įvairiems bandym ų deriniams reikalingas mažiausias 
gyvūnų skaičius grupėje pateiktas 1 lentel ėje. Jei numatomi tarpiniai 
numarinimai arba planuojama sudaryti grupes poveikio gr įžtamumui, 
jo išsilaikymui arba po apdorojimo v ėluojančiam toksiniam poveikiui 
stebėti, arba kai numatoma daryti papildomus steb ėjimus, gyv ūnų 
skaičius turėtų būti padidintas siekiant užtikrinti, kad b ūtų gyvūnų, 
reikalingų stebėjimams ir histopatologiniam tyrimui.  
1.5.2.  Bandomosios ir kontrolin ė grupės 
Paprastai turi b ūti naudojamos mažiausiai trys skirting ų dozių grupės 
ir kontrolin ė grupė, tačiau, jei įvertinus kitus duomenis nelaukiama 
poveikio esant kartotinei 1 000 mg/kg k ūno masės/parą dozei, galima 
daryti ribin į bandymą. Jei atitinkam ų duomenų nėra, galima daryti 
intervalo nustatymo bandym ą, siekiant palengvinti naudojamos doz ės 
pasirinkimo keli ą. Kontrolin ės grupės gyvūnai prižiūrimi kaip ir 
medžiagą gaunančių grupių gyvūnai, išskyrus tai, kad jie neveikiami 
bandomąja medžiaga. Jei duodant bandom ąją medžiag ą naudojamas 
nešiklis, kontrolin ė grupė turi gauti didžiausi ą naudojam ą nešiklio 
tūrį. 
1.5.3.  Patikimumo tikrinimas  
Bandymą daranti laboratorija turi pateikti duomenis, įrodančius jos 
kompetencij ą atlikti bandym ą ir naudojam ų metodik ų jautrum ą. 
Tokie duomenys turi patvirtinti įrodymus d ėl sugebėjimo rasti ir 
prireikus kiekybiškai įvertinti skirting ų stebimų parametr ų pakitimus, 
pvz., autonomini ų požymių, jutiminio aktyvumo, grybšnio j ėgos ir 
motorinio aktyvumo. Informacija apie chemines medžiagas, kurios sukelia įvairių tipų neurotoksin į poveikį ir kurios gal ėtų būti naudo­
jamos kaip teigiamo poveikio kontrolin ės medžiagos, pateikta 2–9 
nuorodose. Galima naudoti anks čiau gautus duomenis, jei nebus 
keičiami esminiai bandymo metodik ų aspektai. Rekomenduojama 
periodiškai atnaujinti anks čiau gautus duomenis. Kiekvien ą kartą, 
kai bandymus daranti laboratorija kei čia kurį nors bandymo arba jo 
metodikų esminį element ą, reikėtų gauti nauj ų duomen ų, kurie 
rodytų nekintam
ą metodikų jautrumą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4.  Doz ės pasirinkimas  
Dozės koncentracijos vertes reik ėtų pasirinkti atsižvelgiant į visus 
anksčiau gautus toksiškumo ir kinetinius duomenis apie bandom ąją 
medžiagą arba giminingas medžiagas. Didžiausia doz ė turėtų būti 
pasirinkta siekiant sukelti neurotoksin į poveikį arba aišk ų sistemin į 
toksinį poveikį. Vėliau turėtų būti pasirinkta maž ėjanti doz ės 
koncentracijos seka siekiant parodyti kiekvien ą su dozės dydžiu 
susietą reakciją ir nepasteb ėto neigiamo poveikio rib ą (NOAEL), 
atitinkant į mažiausi ą dozę. Iš esm ės turėtų būti nustatyti toki ų 
dozių dydžiai, kad b ūtų įmanoma atskirti pirmin į toksinį poveikį 
nervų sistemai ir su sisteminiu toksiškumu susiet ą poveikį. Paprastai 
pakanka nuo dviej ų iki trijų dozių intervalų, ir dažnai gerai b ūtų 
naudoti ketvirt ą bandymo grup ę, norint naudoti labai didelius inter ­
valus tarp dozi ų (pvz., daugiklis didesnis kaip 10). Jei yra patikim ų 
duomenų apie žmogaus s ąlytį su medžiaga, į juos irgi reikia atsiž ­
velgti.  
1.5.5.  Ribinis bandymas  
Jei darant bandym ą pagal šiame bandyme aprašytas metodikas su 
viena mažiausiai 1 000 mg/kg k ūno masės/parą doze neurotoksinis 
poveikis nepastebimas arba jei toksinio poveikio nelaukiama, atsiž ­
velgiant į turimus duomenis apie giminingos strukt ūros junginius, 
nėra nebūtina daryti vis ą bandymą, naudojant tris dozi ų koncentra ­
cijas. Atsižvelgiant į numatom ą žmogaus s ąlytį su medžiaga gali 
tekti naudoti didesnes per virškinam ąjį traktą duodamas ribinio 
bandymo dozes. Kalbant apie kitus davimo b ūdus, pvz., per kv ėpa­
vimo takus arba veikim ą per odą, bandomosios medžiagos fizikin ės 
ir chemin ės savybės dažnai gali apibr ėžti didžiausi ą pasiekiam ą 
veikimo koncentracij ą. Darant ūmaus poveikio per virškinam ąjį 
traktą bandym ą ribinio bandymo doz ė turi būti mažiausiai 2 000 
mg/kg.  
1.5.6.  Dozavimas  
Gyvūnai gauna bandomosios medžiagos doz ę kasdien, septynias 
dienas per savait ę, ne trumpiau kaip 28 paras; penki ų parų dozės 
režimas arba trumpesn ė veikimo trukm ė turi būti pagrįsti. Kai bando ­
moji medžiaga duodama per zond ą, naudojamas skrandžio zondas 
arba tinkamas intubacinis vamzdelis. Didžiausias gyv ūnui duodamas 
vienkartinis skys čio tūris priklauso nuo bandomo gyv ūno dydžio. 
Tūris neturėtų būti didesnis kaip 1 ml/100 g k ūno masės. Tačiau 
vandenini ų tirpalų atveju galima duoti 2 ml/100 g k ūno masės. 
Išskyrus dirginan čias arba ėsdinančias medžiagas, kurios esant 
didesnei koncentracijai turi sunkesn į poveikį, bandomojo tirpalo 
tūrio nepastovumas turi b ūti kiek įmanoma sumažintas, kei čiant 
koncentracij ą taip, kad vis ų dozių tūris būtų pastovus.  
Jei medžiagos duodamos su pašaru arba geriamuoju vandeniu, 
svarbu užtikrinti, kad naudojami bandomosios medžiagos kiekiai 
netrukdyt ų įprastai mitybai arba vandens pusiausvyrai. Kai bando ­
moji medžiaga duodama su pašaru, galima naudoti pastovi ą koncent­
raciją (ppm) arba pastovi ą dozę pagal gyv ūno kūno masę; naudotas 
variantas turi b ūti nurodytas. Jei medžiaga duodama per zond ą, dozė 
turėtų būti duodama kiekvien ą dieną panašiu laiku ir reguliuojama 
pastoviam doz ės ir gyvūno kūno masės santykiui užtikrinti. Jei prieš 
ilgalaikį bandymą daromas kartotin ės dozės bandymas, darant abu 
bandymus turi b ūti naudojamas panašus pašaras. Jei darant ūmaus 
toksiškumo bandymus ne įmanoma duoti vienkartin ę dozę, ji gali b ūti 
duodama mažesn ėmis dalimis ne ilgiau kaip per 24 h.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6. STEB ĖJIMAI  
1.6.1.  Steb ėjimų ir tyrim ų dažnumas  
Darant kartotin ės dozės bandymus, steb ėjimo laikotarpis turi atitikti 
dozavimo laikotarp į. Darant ūmaus toksiškumo bandymus, stebima 
14 parų po medžiagos davimo. Pagalbini ų grupių gyvūnai, kurie 
negauna bandomosios medžiagos pasibaigus veikimo laikotarpiui, irgi turi b ūti stebimi tok į laikotarp į.
 
Stebėjimai turi b ūti daromi pakankamu dažniu siekiant kiek 
įmanoma padidinti tikimyb ę aptikti bet kok į elgesio nukrypim ą ir 
(arba) neurologines anomalijas. Reik ėtų stebėti kasdien vienodu 
laiku, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo poveikio pasireiškimo 
laiką po medžiagos davimo. Klinikini ų stebėjimų ir funkcini ų tyrimų 
dažnis apibendrintas 2 lentel ėje. Jei ankstesniuose bandymuose gauti 
kinetiniai duomenys rodo, kad steb ėjimų, tyrimų arba steb ėjimų po 
tyrimų laikas turi b ūti kitas, reik ėtų patvirtinti kit ą laiko grafik ą 
didžiausiam informacijos kiekiui gauti. Padaryti grafiko pakeitimai 
turi būti pagrįsti. 
1.6.1.1.  Bendrosios sveikatos b ūklės ir gaištamumo ar liguistumo steb ėjimas  
Visi gyvūnai turi b ūti bent kart ą per dien ą apžiūrėti jų sveikatos 
būklei nustatyti ir bent du kartus per dien ą liguistumui ir gaišta ­
mumui nustatyti.  
1.6.1.2.  Išsam ūs klinikiniai steb ėjimai  
Nuodugniai turi b ūti apžiūrimi visi šiam tikslui atrinkti gyv ūnai (žr. 
1 lentelę) – kartą prieš pirm ą veikimą medžiaga (kad b ūtų galima 
daryti to paties gyv ūno palyginimus) ir v ėliau skirtingais intervalais, 
atsižvelgiant į bandymo trukm ę (žr. 2 lentel ę). Pagalbini ų sveiks­
tančių gyvūnų grupių nuodugni klinikin ė apžiūra turi būti daroma 
baigiantis pasveikimo laikotarpiui. Nuodugni klinikin ė apžiūra 
daroma ne narvelyje, bet standartiškai įrengtoje vietoje. Steb ėjimų 
rezultatai turi b ūti kruopš čiai užrašyti, naudojant įvertinimo balais 
sistemas, kurias sudaro kiekvienos apži ūros matavim ų kriterijai 
arba įvertinimo balais skal ės. Bandym ų laboratorija turi aiškiai 
apibrėžti taikomus kriterijus arba bal ų skales. Reikia stengtis užtik ­
rinti, kad bandymo s ąlygų skirtumai b ūtų kiek įmanoma mažesni 
(išskyrus pagal metodik ą susietas su apdorojimu) ir apži ūras darytų 
patyrę specialistai, kurie nežinot ų apie faktin į apdorojim ą. 
Rekomenduojama apži ūras daryti strukt ūriniu būdu, kai darant kiek ­
vieną apžiūrą kiekvienam gyv ūnui sistemingai taikomi aiškiai 
apibrėžti kriterijai ( įskaitant normalaus „intervalo“ apibr ėžimą). 
„Normalus intervalas“ turi b ūti tinkamai dokumentuojamas. Turi 
būti užrašyti visi pasteb ėti požymiai. Be to, visais įmanomais atvejais 
turi būti užrašytas pasireiškian čių požymių mastas. Klinikiniai steb ė­
jimai turi apimti odos, kailio, aki ų, gleivinių, sekrecijų ir ekskrecij ų 
dažnį ir autonomin į aktyvum ą (pvz., ašarojim ą, plaukų pašiaušim ą, 
vyzdžių dydį, neįprastą kvėpavimą ir (arba) kv ėpavimą per burn ą, 
visus neįprastus šlapinimosi arba tuštinimosi požymius, šlapimo 
išblukimą), tačiau neapsiriboti vien tuo.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Turi būti pažym ėta bet kokia ne įprasta reakcija, susijusi su k ūno 
padėtimi, aktyvumo lygiu (pvz., naudojimosi tipiniu plotu sumaž ė­
jimas arba padid ėjimas) ir judesi ų koordinacija. Užrašomi eisenos 
(pvz., krypuojanti eisena, ataksija), laikysenos (pvz., kuprojimasis) ir reakcijos į priežiūrą, apgyvendinim ą arba kitus aplinkos dirgiklius 
pakitimai, taip pat klonini ų arba tonini ų judesių, traukuli ų arba 
drebulio buvimas, stereotipinis elgesys (per dažnas k ūno prisiži ūrė­
jimas, ne įprasti galvos judesiai, nuolatinis sukimasis ratu) arba 
keistas elgesys (pvz., kandžiojimasis arba per didelis laižymasis, 
savęs žalojimas, vaikš čiojimas atbulomis, vokalizacija) arba agresija.
 
1.6.1.3.  Funkciniai bandymai  
Visiems šiam tikslui atrinktiems gyv ūnams dar daromi į nuodugnius 
klinikinius steb ėjimus panaš ūs funkciniai bandymai vien ą kartą prieš 
paveikimą bandomąja medžiaga ir dažnai v ėliau (žr. 1 lentel ę). Be to, 
funkcinių bandymų dažnumas priklauso nuo bandymo trukm ės (žr. 2 
lentelę). Be 2 lentel ėje nustatyt ų stebėjimo laikotarpi ų, turėtų būti 
daromi funkciniai pagalbini ų grupių sveikimo steb ėjimai kiek 
įmanoma prieš pat numatyt ą numarinim ą. Funkcinius bandymus 
turi sudaryti jutiminio aktyvumo bandymai įvairių dirgiklių atžvilgiu 
[pvz., garsini ų, regėjimo ir proprioceptini ų dirgiklių (5) (6) (7)], 
galūnių grybšnio j ėgos įvertinimas (8) ir motorinio aktyvumo įverti­
nimas (9). Motorinis aktyvumas matuojamas naudojant mechanizuot ą 
įtaisą, kuriuo galima nustatyti aktyvumo did ėjimą ir mažėjimą. Jei 
naudojama kita apibr ėžta sistema, ji turi b ūti kiekybinio įvertinimo 
sistema ir turi b ūti įrodytas jos jautrumas ir patikimumas. Kiekvienas 
įtaisas tikrinamas siekiant užtikrinti j ų patikimum ą bėgant laikui ir 
įtaisų tarpusavio suderinamum ą. Papildomos išsamios informacijos 
apie metodus pateikta atitinkamose nuorodose. Jei n ėra duomen ų 
(pvz., informacijos apie strukt ūros ir aktyvumo santyk į, epidemiolo ­
ginių duomen ų, kitų toksikologini ų tyrimų), kurie rodyt ų galimą 
neurotoksiškum ą, reikėtų numatyti įtraukti labiau specializuotus juti ­
minės ir motorin ės funkcijos arba mokymosi ir atminties tyrimus 
šiam poveikiui išsamiau ištirti. Daugiau informacijos apie speciali ­
zuotus tyrimus pateikta (1).  
Išimtiniais atvejais funkcini ų tyrimų su gyvūnais galima nedaryti, jei 
gyvūnams pasireiškia tokio laipsnio toksiškumo požymiai, kad tai 
labai trukdyt ų atlikti funkcin į tyrimą. Sprendimas ne įtraukti gyv ūnų 
į funkcinį tyrimą turi būti pagrįstas. 
1.6.2.  Kūno masė ir pašaro ar vandens suvartojimas  
Jei bandymai vyksta mažiau kaip 90 par ų, visi gyv ūnai turi b ūti 
sveriami mažiausiai kart ą per savait ę, be to, mažiausiai kas savait ę 
matuojamas pašaro suvartojimas (vandens suvartojimas, kai bando ­
moji medžiaga duodama su vandeniu). Darant ilgalaikius bandymus, 
visi gyvūnai sveriami mažiausiai kart ą per savait ę pirmąsias 13 
savaičių ir vėliau mažiausiai kas 4 savaites. Pašaro suvartojimas 
matuojamas (vandens suvartojimas, kai bandomoji medžiaga duodama su vandeniu) mažiausiai kart ą per savait ę pirmąsias 13 
savaičių ir vėliau maždaug kas tris m ėnesius, išskyrus kai sveikatos 
būklė arba kūno masės kitimas reikalauja daryti kitaip.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3.  Oftalmologiniai tyrimai  
Jei bandymas trunka ilgiau kaip 28 paras, prieš bandomosios 
medžiagos davim ą ir pasibaigus bandymui b ūtina ištirti vis ų gyvūnų 
arba bent vieno didel ės dozės grupės ir kontrolin ės grupės gyvūno 
akis, naudojant oftalmoskop ą arba lygiavert į tinkamą prietaisą. Jei 
nustatomi aki ų pakitimai arba jei klinikiniai požymiai rodo oftalmo ­
loginio tyrimo b ūtinumą, turi būti ištirti visi gyv ūnai. Darant ilgalai ­
kius bandymus, akys tiriamos po 13 savai čių. Oftalmologini ų tyrimų 
daryti neb ūtina, jei šie duomenys yra gauti darant kitus panašios 
trukmės ir panašaus dydžio dozi ų bandymus.  
1.6.4.  Hematologiniai ir klinikiniai biocheminiai tyrimai  
Kai neurotoksiškumo bandymas daromas kartu su kartotin ės dozės 
sisteminio toksiškumo bandymu, hematologiniai tyrimai ir klinikiniai biochemin ės analizės daromos taip, kaip nurodyta atitinkamame 
sisteminio toksiškumo bandymo metode. Ėminius reikia imti taip, 
kad būtų kiek įmanoma sumažintas bet koks neurologinis poveikis 
elgesiui.
 
1.6.5.  Histopatologiniai tyrimai  
Turi būti planuojamas neuropatologinis tyrimas, siekiant papildyti ir 
išplėsti stebėjimų rezultatus, gautus bandymo  in vivo  stadijoje. 
Mažiausiai 5 kiekvienos lyties ar grup ės gyvūnai (žr. 1 lentel ę ir 
kitą pastraipą) fiksuojami  in situ , taikant visuotinai pripažintus perfu ­
zijos ir fiksavimo metodus (žr. 3 nuorodos 5 skyri ų ir 4 nuorodos 50 
skyrių). Turi b ūti užrašyti visi pasteb ėti dideli pakitimai. Kai 
bandymas daromas kaip atskiras bandymas neutoksiškoms medžia ­
goms atrinkti arba neurotoksiniam poveikiui apib ūdinti, likusieji 
gyvūnai gali b ūti panaudoti specifiniams neurologinio elgesio (10) 
(11), neuropatologiniams (10) (11) (12) (13), neurocheminiams (10) 
(11) (14) (15) arba elektrofiziologiniams tyrimams (10) (11) (16) (17), kurie gali papildyti čia aprašytas metodikas ir tyrimus, arba 
padidinti histopatologiniuose tyrimuose naudojam ų gyvūnų skaičių. 
Šie papildomi tyrimai yra ypa č naudingi, kai praktiniai steb ėjimai 
arba numatomas poveikis rodo specifin į neurotoksiškumo tip ą arba 
veikiamą organą (2) (3). Be to, likusieji gyv ūnai gali b ūti panaudoti 
įprastiems patologiniams įvertinimams, kaip aprašyta kartotini ų dozių 
bandymų metode.
 
Visi į parafiną įlieti audinio m ėginiai dažomi įprastu būdu, pvz., 
hematoksilinu ir eozinu (H&E), ir daromas mikroskopinis tyrimas. Jei pasireiškia arba įtariami periferin ės neuropatijos požymiai, tiriami 
į plastiką įlieti periferini ų nervų audinio ėminiai. Be to, klinikiniai 
požymiai gali nurodyti papildomas bandymo vietas arba poreik į 
naudoti specialias dažymo metodikas. Papildomos vietos, kurias reikėtų ištirti, aprašytos nuorodose (3) (4). Be to, konkretiems pato ­
loginių pakitimų tipams parodyti gali b ūti naudojami atitinkami 
specialūs dažai (18).
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Tipiniai centrin ės ir periferin ės nervų sistemos pj ūviai tiriami histo ­
logiškai (žr. 3 nuorodos 5 skyri ų ir 4 nuorodos 50 skyri ų). Tiriamas 
vietas paprastai sudaro: priekin ės smegenys, didži ųjų smegenų pusru­
tulių vidurys, įskaitant hipokampo pj ūvį, viduriniosios smegenys, 
smegenėlės, tiltas, pailgosios smegenys, akis su regos nervu ir 
tinklaine, stuburo smegenys kaklo ir juosmens sustor ėjimų vietose, 
užpakalin ės nugaros smegen ų šaknelės mazgai, užpakalin ės ir prie­
kinės nugaros smegen ų šaknelės pluoštai, proksimalinis s ėdmens 
nervas, proksimalinis blauzdikaulio nervas (prie kelio) ir blauzdi ­
kaulio nervo šakos į blauzdos raumen į. Daromas stuburo smegen ų 
ir periferini ų nervų skersinis arba įstrižas ir išilginis pj ūvis. Reikia 
atkreipti d ėmesį į nervų sistemos vaskuliarizacij ą. Be to, turi b ūti 
tiriamas raumen ų ėminys, vis ų pirma, blauzdos raumuo. Ypating ą 
dėmesį reikia kreipti į centrinės ir periferin ės nervų sistemų vietas 
su ląsteline ir pluoštine strukt ūra, kurios yra žinomos kaip ypa č 
veikiamos neurotoksiškomis medžiagomis.  
Informacija apie neuropatologinius pakitimus, paprastai atsirandan ­ 
čius dėl veikimo toksiškomis medžiagomis, pateikta nuorodose (3) 
(4). Rekomenduojamas audinio ėminių tyrimas etapais, kai iš pradži ų 
lyginami didel ės dozės ir kontrolin ės grupės gyvūnų audinių pjūviai. 
Jei lyginant šias grupes neuropatologini ų pakitimų nenustatoma, 
toliau analizuoti nereikia. Jei didel ės dozės grupėje pastebimi neuro ­
patologiniai pakitimai, reikia koduoti ir nuosekliai tirti vis ų galbūt 
paveiktų audinių ėminius, gautus tarpin ės ir mažos doz ės grupėms. 
Jei kokie nors neuropatologini ų pakitimų įrodymai gaunami darant 
kokybinį tyrimą, daromas antras vis ų pakitimus turin čių nervų 
sistemos sri čių tyrimas. Vis ų dozių grupių galimai paveikt ų sričių 
pjūviai koduojami ir atsitiktinai paskiriami tirti, nenurodant kodo. 
Turi būti užrašytas kiekvieno pažeidimo dažnumas ir sunkumas. 
Įvertinus visas vis ų dozių grupių sritis, kod ą galima atskleisti ir 
daroma statistin ė analizė dozės ir reakcijos santykiui įvertinti. Turi 
būti aprašyti kiekvieno pažeidimo įvairaus sunkumo laipsnio pavyz ­
džiai.  
Neuropatologini ų tyrimų rezultatai įvertinami atsižvelgiant į elgesio 
stebėjimus ir matavimus, be to, į duomenis, gautus darant ankstes ­
nius ir lygiagre čius bandomosios medžiagos sisteminio toksiškumo 
bandymus.  
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Pateikiami atskir ų gyvūnų duomenys. Papildomai visi duomenys 
apibendrinami ir suvedami į lenteles, kuriose kiekvienai bandymo 
arba kontrolinei grupei nurodomas gyv ūnų skaičius, darant bandym ą 
nugaišusi ų arba dėl gyvūnų gerovės priežasčių numarint ų gyvūnų 
skaičius, toksiškumo požymi ų turinčių gyvūnų skaičius, stebim ų 
toksiškumo požymi ų aprašymas, įskaitant bet kokio toksinio 
poveikio pradžios laik ą, trukmę, tipą ir sunkum ą, pažeidim ų turinčių 
gyvūnų skaičius, įskaitant pažeidimo (- ų) tipą ir sunkum ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Bandymo rezultatai įvertinami kaip neuropatologinio poveikio ir 
poveikio elgesiui (be to, neurocheminio arba elektrofiziologinio 
poveikio, jei vykdomi papildomi tyrimai) dažnumas, sunkumas ir jų koreliacija ir bet koks kitas pastebimas neigiamas poveikis. Jei 
įmanoma, skaitmeniniai rezultatai įvertinami taikant tinkam ą ir visuo­
tinai priimt ą statistin į metodą. Statistiniai metodai pasirenkami 
rengiant bandymo plan ą.
 
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— fizinė būsena (įskaitant izomerizavim ą, grynum ą ir fizikines ir 
chemines savybes);  
— tapatumo duomenys.  
Nešiklis (jei naudojamas):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis ir veisl ė; 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, aklimatizavimas, maistas ir t. t.;  
— kiekvieno gyv ūno masė bandymo pradžioje.  
Bandymo s ąlygos:  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos ar preparato 
ruošimą, jo dėjimą į maistą, gautą koncentracij ą, preparato stabi ­
lumą ir vienalytiškum ą; 
— duodamos doz ės specifikacija, įskaitant išsami ą informacij ą apie 
nešiklį, duodamos medžiagos tur į ir fizikin į pavidalą; 
— informacija apie bandomosios medžiagos davimo b ūdą; 
— pasirinkto doz ės dydžio pagrindimas;  
— veikimo b ūdo ir trukm ės pasirinkimo pagrindimas;  
— bandomosios medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame 
vandenyje (ppm) perskai čiavimas į tikrąją dozę (mg/kg k ūno 
masės/parą), jei tinka;  
— išsami informacija apie maisto ir vandens kokyb ę. 
Stebėjimo ir bandymo metodikos:  
— išsami informacija apie kiekvienos grup ės gyvūnų atranką į 
pogrupį perfuzijai daryti;  
— išsami informacija apie vertinimo balais sistemas, įskaitant kiek ­
vieno matavimo vykdant nuodugnius klinikinius steb ėjimus krite ­
rijus ir bal ų skales;  
— išsami informacija apie funkcinius bandymus nustatant jutimin į 
aktyvumą įvairių dirgiklių atžvilgiu (pvz., garsini ų, regėjimo ir 
proprioceptini ų dirgiklių); galūnių grybšnio j ėgos įvertinimo, 
motorinio aktyvumo įvertinimo ( įskaitant išsami ą informacij ą 
apie aktyvumui nustatyti naudojamus automatizuotus įtaisus) ir 
kitos taikytos metodikos;  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— išsami informacija apie oftalmologinius tyrimus ir, jei tinka, 
hematologiniai tyrimai ir klinikin ės biochemijos bandymai, nuro ­
dant atitinkamas etalonines vertes;  
— išsami informacija apie specifinius elgesio, neuropatologini ų, 
neurochemini ų arba elektrofiziologini ų tyrimų metodikas.  
Rezultatai:  
— kūno masė ar kūno masės pokyčiai, įskaitant k ūno masę numa­
rinant;  
— maisto ir vandens suvartojimas, jei tinka;  
— reakcijos į toksinį poveikį duomenys pagal lyt į ir dozės dydį, 
įskaitant toksiškumo požymius arba gaištamum ą; 
— nuodugini ų klinikini ų stebėjimų tipas, sunkumas ir trukm ė 
(pradžios laikas ir v ėlesnė eiga) (nurodyti gr įžtamumą arba 
negrįžtamumą); 
— visų funkcinio bandymo rezultat ų išsamus aprašymas;  
— nekroskopijos rezultatai;  
— išsamus vis ų turimų elgesio, neuropatologini ų, neurochemini ų 
arba elektrofiziologini ų rezultatų aprašymas;  
— absorbcijos ir medžiagos apykaitos duomenys, jei yra;  
— statistinis rezultat ų apdorojimas, jei daromas.  
Rezultatų aptarimas:  
— informacija apie doz ės ir reakcijos santyk į; 
— ryšys su bet kokiu kitu toksišku poveikiu ir išvada apie bando ­
mosios chemin ės medžiagos neurotoksiškum ą; 
— nestebimo neigiamo poveikio lygis.  
Išvados:  
— prašoma pateikti bandomosios chemin ės medžiagos bendrojo 
neurotoksiškumo įvertinimą. 
4. NUORODOS  
1) OECD Giudance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.  
2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.  
3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
 
4) Spencer, P.S. and Schaumburg, h.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
h.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 
p. 999–1003.  
6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indust ­
rial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, p. 691–704.  
7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observa ­
tional Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, p. 267–283.  
8) Meyer, O.A., Tilson, h.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). 
A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb 
Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, p. 233–236.
 
9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, h.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory 
Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, p. 599–609.
 
10) Tilson, h.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. 
Marcel Dekker, New York.  
12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, p. 689–695.  
13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl. Toxicol., 18, p. 343–352.
 
14) O’Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 
10, p. 445–452.  
15) O’Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, p. 368–378.
 
16) Fox. D.A., Lowndes, h.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, p. 299–335.
 
17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxico ­
logy. Spencer, P.S. and Schaumburg, h.H. eds., Williams and 
Wilkins Co., Baltimore/London, p. 726–742.  
18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livings ­
tone. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
1 lentelė 
Mažiausias gyv ūnų skaičius vienoje grup ėje darant neurotoksiškumo bandym ą atskirai arba kartu su kitais 
bandymais  
NEUROTOKSIŠKUMO BANDYMAS, DARYTAS KAIP:  
atskiras bandymas  bandymas, daromas 
kartu su 28 par ų 
bandymu  bandymas, daromas 
kartu su 90 par ų 
bandymu  bandymas, daromas 
kartu su l ėtinio toksiš ­
kumo bandymu  
Bendras gyv ūnų skaičius 
grupėje 10 patinų ir 10 
patelių 10 patinų ir 10 
patelių 15 patinų ir 15 
patelių 25 patinai ir 25 
patelės 
Gyvūnų, atrinktų funkci­
niam tyrimui, įskaitant 
nuodugnius klinikinius 
stebėjimus, skai čius 10 patinų ir 10 
patelių 10 patinų ir 10 
patelių 10 patinų ir 10 
patelių 10 patinų ir 10 
patelių 
Gyvūnų, atrinktų perfuzijai  
in situ  ir neurohistopatolo ­
giniam tyrimui, skai čius 5 patinai ir 5 
patelės 5 patinai ir 5 
patelės 5 patinai ir 5 
patelės 5 patinai ir 5 patel ės 
Gyvūnų, atrinktų kartotinės 
dozės/pusiau l ėtinio/lėtinio 
toksiškumo steb ėjimui, 
hematologiniam, kliniki ­
niam biocheminiam, histo ­
patologiniam ir t. t. tyrimui, kaip nurodyta atitinkamose 
rekomendacijose, skai čius
 5 patinai ir 5 
patelės 10 patinų ( 1 ) ir 10 
patelių ( 1 ) 20 patinų ( 1 ) ir 20 
patelių ( 1 ) 
Papildomi steb ėjimai, jei 
reikia  5 patinai ir 5 
patelės 
( 1 ) Įskaitant penkis gyv ūnus, atrinktus funkciniam bandymui ir nuodugniems klinikiniams steb ėjimams, kurie yra neurotoksiškumo 
tyrimo dalis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
2 lentelė 
Klinikini ų stebėjimų ir funkcini ų tyrimų dažnumas  
Stebėjimų tipas  Bandymo trukm ė 
ūmus 28 par ų 90 par ų l ėtinis 
Visi gyvūnai Bendroji svei ­
katos būklė kasdien  kasdien  kasdien  kasdien  
Gaištamumas/ 
liguistumas  du kartus per 
dieną du kartus per 
dieną du kartus per 
dieną du kartus per 
dieną 
Gyvūnai, atrinkti 
funkciniams stebėjimams
 Nuodugn ūs 
klinikiniai stebėjimai
 — prieš pirm ą 
veikimą 
— po 8 h nuo 
dozės 
davimo, didžiausio numatomo 
poveikio 
momentu 
— 7 ir 14 par ą 
po dozės 
davimo
 — prieš pirm ą 
veikimą 
— vėliau kart ą 
per savait ę — prieš pirm ą 
veikimą 
— kartą per 
pirmą arba 
antrą savaitę 
po veikimo 
— vėliau kas 
mėnesį — prieš pirm ą 
veikimą 
— kartą, pasi­
baigus 
pirmam mėnesiui po 
veikimo 
— vėliau kas tris 
mėnesius
 
Funkciniai 
tyrimai  — prieš pirm ą 
veikimą 
— po 8 h nuo 
dozės 
davimo, 
didžiausio 
numatomo poveikio momentu 
— 7 ir 14 par ą 
po dozės 
davimo
 — prieš pirm ą 
veikimą 
— ketvirt ą 
apdorojimo savaitę, kuo 
arčiau 
veikimo laikotarpio pabaigos
 — prieš pirm ą 
veikimą 
— kartą per 
pirmą arba 
antrą savaitę 
po veikimo 
— vėliau kas 
mėnesį — prieš pirm ą 
veikimą 
— kartą, pasi­
baigus pirmam 
mėnesiui po 
veikimo 
— vėliau kas tris 
mėnesius
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  SUGERTIS PER OD Ą. IN VIVO  METODAS  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 427 (2004).  
1.1. ĮVADAS  
Sąlytis su daugeliu chemini ų medžiag ų įvyksta iš esm ės per odą, o 
atliekant didesn ę dalį toksikologini ų bandym ų su laboratoriniais 
gyvūnais, medžiagos doz ė duodama per virškinam ąjį traktą. Šioje 
rekomendacijoje aprašytas  in vivo  sugerties per od ą bandymas užtik ­
rina sąsają, kuri yra b ūtina bandym ų per virškinam ąjį traktą duome­
nims ekstrapoliuoti, kai daromi s ąlyčio per od ą saugos įvertinimai.  
Medžiaga prieš pasiekdama apytak ą turi kirsti daug odos l ąstelių 
sluoksnių. Daugelio medžiag ų greitį lemia iš negyv ų ląstelių suda­
rytas  stratum corneum . Skvarba per od ą priklauso nuo chemin ės 
medžiagos lipofiliškumo ir epidermio išorinio sluoksnio storio, be to, nuo kit ų veiksnių, pavyzdžiui, medžiagos molekulin ės masės ir 
koncentracijos. Apskritai, žiurki ų ir triušių oda yra pralaidesn ė paly­
ginti su žmogaus oda, o j ūrų kiaulyčių ir beždžioni ų odos pralai ­
dumas yra panašesnis į žmogaus odos pralaidum ą.
 
Sugerties per od ą matavimo metodai gali b ūti suskirstyti į dvi kate­
gorijas;  in vivo  ir in vitro . In vivo  metodu galima gauti naudingos 
informacijos apie įvairių laboratorini ų rūšių sugertį per odą. Neseniai 
buvo sukurti  in vitro  metodai. Juose taikoma medžiagos pernaša per 
visą gyvūnų arba žmogaus odos sluoksnio stor į arba jo dal į į indą su 
skysčiu. In vitro  metodas yra aprašytas kaip atskiras bandymo 
metodas (1). Rekomenduojama naudotis OECD rekomendaciniu 
dokumentu d ėl sugerties per od ą bandym ų vykdymo (2), kuris 
padėtų pasirinkti konkre čiam atvejui tinkamiausi ą metodą, kadangi 
šiame dokumente pateikta daugiau informacijos apie abiej ų in vivo  ir 
in vitro  metodų tinkamum ą. 
Šiame dokumente aprašytu  in vivo  metodu galima nustatyti bando ­
mosios medžiagos skvarb ą per odą į sistemin ę dalį. Metodas yra 
plačiai taikomas daug met ų (3) (4) (5) (6) (7). Nors daugeliu atveju 
gali tikti  in vitro  sugerties per od ą bandymai, b ūna atvejų, kai 
reikiamus duomenis galima gauti tik atliekant  in vivo  bandymą. 
Prie in vivo  metodo pranašum ų reikėtų priskirti tai, kad jame naudo ­
jama fiziologiniu ir medžiag ų apykaitos poži ūriu vientisa sistema, 
naudojamos daugumai toksiškumo bandym ų įprastos rūšys, be to, 
metodą galima modifikuoti pritaikant j į kitoms r ūšims. Trūkumai: 
gyvų gyvūnų naudojimas, b ūtinybė naudoti žym ėtąsias medžiagas, 
kad rezultatai b ūtų patikimi, sunkumai nustatant ankstyv ąjį sugerties 
tarpsnį ir rekomenduojamos r ūšies (žiurk ės) bei žmogaus odos pralai ­
dumo skirtumai. Gyv ūnų oda paprastai yra pralaidesn ė, todėl sugertis 
per žmogaus od ą gali būti pervertinta (6) (8) (9). Šarmini ų (ardančių) 
medžiagų nereikėtų tirti su gyvais gyv ūnais. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Nesugertoji doz ė – atitinka doz ę, nuplaunam ą po veikimo nuo odos 
paviršiaus, ir vis ą dozę, esančią ant nesandaraus apdangalo, įskaitant 
visą dozę, kuri, kaip įrodoma, išgaravo nuo odos paviršiaus veikimo 
laikotarpiu.  
Sugertoji doz ė (in vivo ) – sudaro šlapime, narvelio plovimo vande ­
nyje, išmatose, iškv ėptame ore (jei matuojamas), kraujyje, audiniuose 
(jei imami) ir likusioje k ūno dalyje esanti doz ė, pašalinus užd ėjimo 
vietos od ą. 
Sugeriamoji doz ė – atitinka ant odos arba odoje po plovimo esan čią 
dozę. 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Viena arba kelios tinkamo dydžio bandomosios medžiagos (geriausia 
su žymėtaisiais atomais) doz ės dedamos ant nuskustos gyv ūnų odos 
tokiu pavidalu, kuris atitikt ų tipinį preparato naudojim ą. Nustatyt ą 
laiką bandomasis preparatas laikomas ant odos, uždengtas tinkamu 
apdangalu (nesandariu, pusiau sandariu arba sandariu), kad b ūtų 
išvengta bandomojo preparato nurijimo. Pasibaigus veikimo laikui, 
apdangalas nuimamas, oda plaunama atitinkamu plovikliu, apdan ­
galas bei plovimo medžiagos paliekamos analizei ir uždedamas naujas apdangalas. Gyv ūnai prieš veikim ą, veikimo metu ir jam 
pasibaigus laikomi atskiruose medžiag ų apykaitai matuoti skirtuose 
narveliuose ir vis ą šį laiką analizei renkamos išskyros ir iškv ėptas 
oras. Iškv ėpto oro galima nerinkti, kai yra pakankamai informacijos, 
kad lakiųjų radioaktyvi ųjų apytakos produkt ų susidaro mažai arba j ų 
nesusidaro. Kiekviename bandyme paprastai naudojamos kelios 
gyvūnų grupės, veikiamos bandomuoju preparatu. Viena grup ė 
numarinama pasibaigus veikimo laikotarpiui. Kitos grup ės numari­
namos vėliau pagal nustatyt ą grafiką (2). Pasibaigus bandini ų ėmimo 
laikui, numarinami likusieji gyv ūnai, analizei surenkamas kraujas, 
medžiagos užd ėjimo vieta išpjaunama analizei atlikti, o k ūnas anali­
zuojamas bet kokiai neišsiskyrusiai medžiagai nustatyti. Bandiniai tiriami tinkamais b ūdais ir 
įvertinamas sugerties per od ą laipsnis 
(6) (8) (9).  
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Gyv ūnų rūšies parinkimas  
Dažniausiai naudojama gyv ūnų rūšis yra žiurk ės, tačiau galima 
naudoti beplaukes veisles ir r ūšis, kurių sugerties per od ą greitis 
būtų panašūs į sugerties per žmogaus od ą greitį (3) (6) (7) (8) (9). 
Naudojami gerai žinom ų laboratorini ų rūšių sveiki jauni subrend ę 
vienos lyties (paprastai vyriškos) gyv ūnai. Bandymo pradžioje kiek ­
vieno gyv ūno masė neturi nukrypti daugiau kaip 20 % nuo vidutin ės 
masės. Pvz., tinka vyriškos lyties 200–250 g mas ės žiurkės, ypač tos, 
kurių masė atitinka viršutin ę šio intervalo dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Gyv ūnų skaičius ir lytis  
Kiekvienas bandomasis preparatas tam tikr ą nustatyt ą laikotarp į 
bandomas su atskira bent keturi ų vienos lyties gyv ūnų grupe. Kiek ­
viena gyv ūnų grupė numarinama, pra ėjus skirtingam laiko tarpui, 
pvz., pasibaigus veikimo laikotarpiui (paprastai 6 arba 24 h) ir v ėliau 
(pvz., po 48 ir 72 h). Jei yra duomen ų, kad patin ų ir pateli ų 
TOKSIŠKUMAS PER od ą labai skiriasi, pasirenkama jautresn ė 
lytis. Jei toki ų duomenų nėra, galima naudoti bet kuri ą lytį. 
1.4.3.  Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Patalpos, kurioje bandomi gyv ūnai, temperat ūra turi b ūti 22 °C 
(± 3 °C). Nors santykinis oro dr ėgnumas tur ėtų būti bent 30 % ir 
neviršyti 70 %, reik ėtų siekti, kad dr ėgnumas b ūtų 50–60 %, išskyrus 
patalpos plovimo metu. Apšvietimas turi b ūti dirbtinis – pakaitomis 
12 h šviesos ir 12 h tamsos. Gyv ūnams šerti tinka įprastas labora ­
torijoje naudojamas pašaras, kurio kiekis, kaip ir geriamo vandens kiekis, neribojamas. Bandymo ir, patartina, aklimatizavimo laiko ­
tarpiu gyv ūnai turėtų būti laikomi atskiruose medžiag ų apytakai 
tirti skirtuose narveliuose. Kadangi išbarstytas pašaras ir išlaistytas vanduo iškreipt ų rezultatus, tokia tikimyb ė turi būti kiek įmanoma 
sumažinta.
 
1.4.4.  Gyv ūnų ruošimas  
Gyvūnai ženklinami, kad kiekvien ą iš jų būtų įmanoma atskirai 
identifikuoti, ir prieš bandymo pradži ą laikomi narveliuose mažiau ­
siai penkias paras, per kurias jie gal ėtų aklimatizuotis laboratorin ėmis 
sąlygomis.  
Pasibaigus aklimatizavimui ir maždaug 24 h iki dozavimo nuskutama 
visų gyvūnų oda pečių ir nugaros srityje. Pažeistos odos ir sveikos 
odos pralaidumo savyb ės skiriasi, tod ėl reikia stengtis nenutrinti 
odos. Po nuskutimo ir likus maždaug 24 h iki medžiagos užd ėjimo 
ant odos (žr. 1.4.7 skirsn į) odos paviršius nuskustame plote plau ­
namas acetonu odos riebalams pašalinti. Papildomai plauti muilu ir vandeniu nerekomenduojama, kadangi bet koks muilo likutis gal ėtų 
skatinti bandomosios medžiagos sugert į. Plotas turi b ūti pakankamai 
didelis, kad b ūtų įmanoma patikimai apskai čiuoti sugert ą bandomo ­
sios medžiagos kiek į vienam cm
 2 odos, pageidautina ne mažesnis 
kaip 10 cm  2 . Tokį plotą įmanoma paruošti 200–250 g mas ės žiur­
kėms. Po paruošimo gyv ūnai grąžinami į apykaitos matavimo narve ­
lius. 
1.4.5.  Bandomoji medžiaga  
Bandomoji medžiaga – objektas, kurio skvarbos charakteristikas 
reikia tirti. Geriausia b ūtų naudoti bandom ąją medžiag ą su žymėtai­
siais atomais.  
1.4.6.  Bandomasis preparatas  
Bandomosios medžiagos preparatas (pvz., grynas, skiestas arba 
bandomosios chemin ės medžiagos turintis preparatas, kuris bus 
dedamas ant odos) turi atitikti preparat ą (arba būti tikroviškas jo 
pakaitalas), su kuriuo gali įvykti žmoni ų arba kitų galimų tikslinių 
rūšių sąlytis. Visi nukrypimai nuo tikrovišk ų preparato naudojimo 
sąlygų turi būti pagrįsti. Prireikus bandomoji medžiaga tirpinama 
arba suspenduojama tinkamame tirpiklyje. Jei tirpiklis – ne vanduo, 
turi būti žinomos jo sugerties charakteristikos ir s ąveika su bando ­
mąja medžiaga.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7.  Užd ėjimas ant odos  
Odos paviršiuje apibr ėžiama tam tikro paviršiaus ploto vieta 
medžiagai užd ėti. Tuomet toje vietoje tolygiai uždedamas žinomas 
bandomo preparato kiekis. Šis kiekis paprastai tur ėtų būti panašus į 
kiekį, kurį žmonės gali gauti pe s ąlytį su medžiaga, dažniausiai 1–5 
mg/cm  2 kietosios medžiagos arba mažiau kaip 10 μl/cm  2 skysčio. 
Visas kitas dozes reikia pagr įsti numatomomis naudojimo s ąlygomis, 
bandymo tikslais arba bandomojo preparato fizikin ėmis charakteris ­
tikomis. Po užd ėjimo apdorota vieta turi b ūti apsaugota nuo laižymo. 
Tipinio įtaiso pavyzdys pavaizduotas 1 paveiksle. Paprastai užd ėjimo 
vieta apsaugoma nesandariu apdangalu (pvz., pralaidžiu nailono 
marlės apdangalu). Ta čiau neribot ų dozių taikymo atvejais užd ėjimo 
vieta turėtų būti sandarinama. Jei d ėl pusiau laki ų medžiag ų gara­
vimo nepriimtinai sumaž ėja regeneravimo laipsnis (žr. dar 1.4.10 
skirsnio pirm ą pastraipą), garuojan čią medžiagą būtina sugauti užd ė­
jimo įtaisą dengiančiu medžio angli ų filtru (žr.1 paveiksl ą). Svarbu, 
kad nei vienas įtaisas nekenkt ų odai, nesugert ų bandomojo preparato 
ir nereaguotu su juo. Gyv ūnai grąžinami atgal į atskirus medžiag ų 
apykaitos matavimo narvelius, kad b ūtų galima toliau rinkti j ų 
išskyras.  
1.4.8.  Veikimo trukm ė ir bandini ų ėmimas  
Veikimo trukm ė – laiko tarpas nuo bandomojo preparato užd ėjimo 
iki jo pašalinimo nuplaunant od ą. Veikimo trukm ė turėtų būti 
tinkama (paprastai 6 arba 24 h), pagr įsta numatoma žmoni ų sąlyčio 
su medžiaga trukme. Pasibaigus veikimo laikotarpiui, gyv ūnai 
laikomi medžiag ų apykaitos matavimo narveliuose iki jie numari ­
nami pagal grafik ą. Visą bandymo laikotarp į gyvūnai turi b ūti regu­
liariai stebimi siekiant nustatyti toksiškumo požymius ir (arba) neįprastas reakcijas. Pasibaigus veikimo laikotarpiui, apdorotoji oda 
turi būti apžiūrima siekiant nustatyti matomus dirginimo požymius.
 
Visą bandymo laikotarp į turi būti įmanoma medžiag ų apykaitos 
matavimo narveliuose atskirai rinkti susikaupian čius šlapim ą ir 
išmatas. Be to, turi b ūti įmanoma rinkti  14 C žymėtą anglies dioksid ą 
ir lakiuosius  14 C žymėtus anglies junginius, kurie turi b ūti analizuo ­
jami, jei susidaro didelis j ų kiekis (> 5 %). Šlapimas, išmatos ir 
sugerčiai (pvz.,  14 C žymėto anglies dioksido ir laki ųjų 14 C jungini ų) 
naudoti skys čiai turėtų būti renkami atskirai iš kiekvienos grup ės 
kiekvienu m ėginio ėmimo laiku. Jei yra pakankamai informacijos 
apie tai, kad laki ųjų apykaitos produkt ų susidaro mažai arba jie 
išvis nesusidaro, galima naudoti atvirus narvelius.  
Išmatos renkamos vis ą veikimo laikotarp į, iki 24 h nuo pradinio 
sąlyčio su oda ir v ėliau kasdien iki eksperimento pabaigos. Nors 
paprastai pakanka trij ų išmatų rinkimo laikotarpi ų, atsižvelgiant į 
numatytą bandomojo preparato paskirt į arba į turimus kinetinius 
duomenis, tyrimui gali b ūti numatyti tinkamesni arba papildomi 
laiko taškai.  
Pasibaigus veikimo laikotarpiui, apsauginis įtaisas nuimamas nuo 
kiekvieno gyv ūno ir laikomas atskirai analizei. Vis ų gyvūnų apdo­
rotoji oda turi b ūti plaunama bent tris kartus plovimo priemone, 
naudojant tinkamus tamponus. Reikia stengtis neužteršti kit ų kūno 
dalių. Plovimo priemon ė turi atitikti įprastą higienai naudojam ą prie­
monę, pvz., naudojamas vandeninis muilo tirpalas. Galiausiai oda 
išdžiovinama. Visi tamponai ir plovimo vandenys turi b ūti paliekami 
analizei. Prieš gr ąžinant gyv ūnus, kurie priklauso grup ėms, laiko ­
moms vėlesniems bandymo etapams, į atskirus narvelius, ant j ų 
apdorotos vietos uždedamas naujas jai apsaugoti skirtas apdangalas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9.  Baigiamosios proced ūros 
Atskiri kiekvienos grup ės gyvūnai numarinami pagal grafik ą numa­
tytu laiku, j ų kraujas surenkamas analizei. Analizei nuimamas apsau ­
ginis įtaisas arba apdangalas. Atskirai analizei pašalinama oda prepa ­
rato uždėjimo vietoje ir panaši doz ės nepaveikta nuskustos odos 
dalis. Užd ėjimo vieta gali b ūti dalijama į sluoksnius ir  stratum 
corneum  atskiriamas nuo apa čioje esančio epidermio, siekiant gauti 
daugiau informacijos apie bandomosios chemin ės medžiagos pasis ­
kirstymą. Šios medžiagos pasiskirstymas b ėgant laikui nuo veikimo 
laikotarpio pabaigos tur ėtų suteikti duomen ų apie tai, kaip bet kuri 
bandomoji medžiaga įsiskverbia į stratum corneum . Odos dalijimui 
palengvinti (po paskutinio odos plovimo ir gyv ūno numarinimo) 
nuimami visi apsauginiai apdangalai. Žiurk ės oda užd ėjimo vietoje 
ir aplink j ą esančios odos žiedas išpjaunamas ir prismeigiamas prie 
lentos. Lengvai spaudžiant ant odos paviršiaus uždedamas lipniosios 
juostos gabaliukas, kuris v ėliau nuimamas kartu su  stratum corneum  
dalimi. Kiti juostos gabaliukai dedami tol, kol juosta nustoja lipti prie odos paviršiaus, kai pašalinamas visas  stratum corneum . Kiek­
vieno gyv ūno visi juost ų gabaliukai sudedami į vieną indą, į kurį 
pridedama audinio tirpinimo priemon ės stratum corneum  ištirpinti. 
Prieš pradedant analizuoti vis ą likusią kūno dalį jo sugertai dozei 
nustatyti, galima pašalinti visus paveiktus audinius atskiriems mata ­
vimams atlikti. Atskir ų gyvūnų kūnai paliekami analizei. Paprastai 
pakanka nustatyti sumin į kiekį. Gali būti pašalinti konkret ūs organai 
atskirai analizei (jei to reikia kitiems tyrimams). Šlapimas, rastas pūslėje po numarinimo pagal grafik ą, turi būti supilamas kartu su 
anksčiau surinktu šlapimu. Iš medžiag ų apykaitos tyrimo narveli ų 
surinkus išmatas po planinio numarinimo, narvelius ir j ų gaudykles 
reikia išplauti atitinkamu tirpikliu. Panašiu b ūdu turi b ūti analizuo ­
jama kita potencialiai užteršta įranga.
 
1.4.10.  Analiz ė 
Visuose bandymuose turi b ūti pasiektas atitinkamas regeneravimo 
laipsnis (t. y. vidutiniškai 100 ± 10 % radioaktyvumo). Turi b ūti 
pagrįsti šio intervalo neatitinkantys regeneravimo laipsniai. 
Duodamos doz ės kiekis kiekviename m ėginyje turi b ūti analizuo ­
jamas taikant patvirtintas proced ūras. 
Į statistinę analizę turi būti įtrauktas kiekvieno medžiagos užd ėjimo 
kartotinių bandymų dispersijos įvertinimas.  
2. DUOMENYS  
Kiekvieną kartą imant bandomosios medžiagos ir (arba) apykaitos 
produktų mėginius, kiekvienam gyv ūnui atliekami toliau išvardyti 
matavimai. Be atskir ų duomen ų reikia pateikti pagal m ėginio 
ėmimo laik ą sugrupuotas vidutines vertes.  
— kiekis, susij ęs su apsaugin ėmis priemon ėmis; 
— kiekis, kuris gali b ūti pašalintas nuo odos;  
— kiekis odoje (ant odos), kurio ne įmanoma nuplauti nuo odos;  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— kiekis kraujo m ėginyje;  
— kiekis išskyrose ir iškv ėptame ore (jei matuojamas);  
— kiekis, lik ęs kūne ir visuose atskirai analizei pašalintuose orga ­
nuose.  
Bandomosios medžiagos ir (arba) apykaitos produkt ų kiekis išsky ­
rose, iškv ėptame ore, kraujyje ir k ūne leis nustatyti sumin į sugertos 
medžiagos kiek į kiekvienu laiko momentu. Be to, galima apskai ­ 
čiuoti bandomosios chemin ės medžiagos kiek į, kuris įsigėrė veikimo 
laikotarpiu kiekviename cm  2 bandomąja medžiaga veikiamos odos.  
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Į bandymo ataskait ą turi būti įtraukti protokole nustatyti reikalavimai, 
įskaitant naudotos sistemos pagrindim ą, ir ją turi sudaryti šie punktai:  
Bandomoji medžiaga:  
— tapatumas [pvz., CAS numeris, jei žinomas; šaltinis; grynumas 
(radiocheminis grynumas); žinomos priemaišos; siuntos numeris];  
— fizikin ė būsena ir fizikin ės bei chemin ės savybės (pvz., pH, 
lakumas, tirpumas, stabilumas, molekulin ė masė ir log P  ov . 
Bandomasis preparatas:  
— sudėtis ir naudojimo pagrindimas;  
— išsami informacija apie bandom ąjį preparatą, uždedamas kiekis, 
koncentracija, tirpiklis, stabilumas ir vienalytiškumas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis/veislė; 
— skaičius, amžius ir lytis;  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.;  
— atskirų gyvūnų kūno masė bandymo pradžioje.  
Bandymo s ąlygos:  
— informacija apie bandomojo preparato užd ėjimą (uždėjimo vieta, 
mėginių ėmimo metodai, sandarus/nesandarus apdangalas, t ūris, 
ekstrahavimas, aptikimas);  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę. 
Rezultatai:  
— visi toksiškumo požymiai;  
— sugerties duomenys (išreikšti kaip greitis, kiekis arba procentin ė 
dalis), pateikiami lentel ėse; ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— suminiai per bandym ą regeneruoti kiekiai;  
— rezultat ų aiškinimas, lyginimas su visais turimais bandomojo 
junginio sugerties per od ą duomenimis.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method.  
2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
3) ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.
 
4) Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol . 8(5), p. 829–835.  
5) Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
6) EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Appli ­
cations. Exposure Assessment Group, Office of Health and Envi ­
ronmental Assessment.  
7) EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870–7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances.  
8) Bronaugh RL, Wester RC, Bucks D, Maibach HI and Sarason R 
(1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance ingredients 
in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic . 28, 
p. 369–373.  
9) Feldman RJ and Maibach HI (1970) Absorption of some organic 
compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol . 54, 
p. 399–404.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
1 paveikslas  
Tipinio įtaiso, naudojamo užd ėjimo ant odos vietai apibr ėžti ir apsaugoti, atliekant  
in vivo  sugerties per od ą bandymus, konstrukcijos pavyzdys
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  SUGERTIS PER OD Ą. IN VITRO  METODAS  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 428 (2004).  
1.1. ĮVADAS  
Šis metodas skirtas informacijai apie bandomosios medžiagos, 
uždėtos ant išpjautos odos, sugert į gauti. Jį galima derinti su suger ­
ties per od ą in vivo  metodu (1) arba taikyti atskirai. Rekomenduo ­
jama naudotis OECD rekomendaciniu dokumentu d ėl sugerties per 
odą bandym ų vykdymo (2), kuris pad ėtų planuoti šiuo metodu 
pagrįstus bandymus. Rekomendacinis dokumentas yra parengtas 
siekiant pad ėti pasirinkti tinkamas  in vitro  procedūras, skirtas taikyti 
konkrečiomis aplinkyb ėmis, kad b ūtų galima užtikrinti šiuo metodu 
gautų rezultatų patikimum ą. 
Metodai suger čiai ir pernašai per od ą matuoti gali b ūti suskirstyti į 
dvi kategorijas:  in vivo  ir in vitro . In vivo  sugerties per od ą metodai 
yra gerai žinomi ir farmakokinetin ė informacija gaunama įvairioms 
gyvūnų rūšims.  In vivo  metodas yra atskirai aprašytas 1 nuorodoje. 
Be to,  in vitro  metodai daug met ų yra naudojami suger čiai per od ą 
matuoti. Nors oficial ūs šiame bandymo metode aprašyt ų in vitro  
metodų tinkamumo patvirtinimo bandymai nebuvo atlikti, 1999 m. 
OECD ekspertai sutar ė, kad yra pakankamas kiekis įvertintų 
duomenų in vitro  metodui patvirtinti (3). Papildom ų išsamių 
duomenų, kurie konkre čiai pagrįstų šį patvirtinim ą, įskaitant didel į 
tiesioginių in vitro  ir in vivo  metodų palyginam ųjų duomenų skaičių, 
pateikta rekomendaciniame dokumente (2). Yra keletas monografij ų, 
kuriose ši tema apžvelgiama ir išsamiai pagrindžiamas  in vitro  
metodas (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12).  In vitro  metodais 
matuojama chemini ų medžiag ų difuzija į odą ir per od ą į indą su 
skysčiu, kai galima naudoti negyv ą odą tik difuzijai matuoti arba 
naudoti k ą tik paruošt ą, medžiag ų apykaitos poži ūriu veikli ą odą 
difuzijai per od ą ir medžiag ų apykaitai matuoti. Tokie metodai 
visų pirma imti taikyti kaip atrankos metodai lyginant skirtinguose 
preparatuose esan čių cheminių medžiagų tiekimą į odą ir per od ą, be 
to, juos galima taikyti kaip naudingus modelius suger čiai per žmoni ų 
odą įvertinti.  
In vitro  metodas gali tikti ne visuomet ir ne visoms chemini ų 
medžiagų klasėms. Galbūt in vitro  bandymo metodas tikt ų pradiniam 
kokybiniam skverbties per od ą įvertinimui. Tam tikrais atvejais gali 
tekti papildyti bandym ą in vivo  duomenimis. Reik ėtų ieškoti infor ­
macijos rekomendaciniame dokumente (2) toliau tikslinti aplinkybes, 
kuriomis tikt ų in vitro  metodas. Papildomos išsamios informacijos 
sprendimui paremti pateikta (3).  
Šiame metode pateikti bendrieji principai, kaip matuoti chemin ės 
medžiagos sugert į ir pernaš ą per išpjaut ą odą. Galima naudoti 
daugelio žinduoli ų rūšių odą, įskaitant žmoni ų. Odos pralaidumo 
savybės nepakinta išpjovus j ą iš kūno, kadangi pagrindinis difuzijos 
užtvaras yra negyvas  stratum corneum ; aktyvi chemini ų medžiag ų 
pernaša per od ą nėra nustatyta. Yra įrodyta, kad, vykstant suger čiai 
per odą, oda gali dalyvauti kai kuri ų cheminių medžiag ų apykaitoje 
(6), tačiau šis procesas neapriboja faktin ės sugertos doz ės įsiskver­
bimo grei čio, nors jis gali tur ėti įtakos į kraujo apytak ą patenkan čios 
medžiagos savyb ėms. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Nesugertoji doz ė – atitinka doz ę, nuplaunam ą po veikimo nuo odos 
paviršiaus, ir vis ą dozę, esančią ant nesandaraus apdangalo, įskaitant 
visą dozę, kuri, kaip įrodoma, išgaravo nuo odos paviršiaus veikimo 
laikotarpiu.  
Sugertoji doz ė (in vitro ) – bandomosios medžiagos, per apibr ėžtą 
laikotarpį pasiekusios rinktuvo skyst į arba didįjį kraujo apytakos rat ą 
masė. 
Sugeriamoji doz ė (in vitro ) – atitinka doz ę, po plovimo esan čią ant 
odos arba odoje.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandomoji medžiaga, kurioje gali b ūti žymėtųjų atomų, uždedama 
ant odos bandinio, skirian čio du difuzijos kameros skyrius, pavir ­ 
šiaus. Esant apibr ėžtoms sąlygoms chemin ė medžiaga laikoma ant 
odos apibr ėžtą laiką ir vėliau nuplaunama taikant atitinkam ą plovimo 
procedūrą. Visą bandymą tam tikrais laiko tarpais imami rinktuvo 
skysčio mėginiai ir analizuojami cheminei medžiagai ir (arba) jos 
medžiagų apykaitos produktams nustatyti.  
Kai naudojamos medžiag ų apykaitos poži ūriu aktyvios sistemos, 
bandomosios chemin ės medžiagos medžiag ų apykaitos produktai 
gali būti analizuojami taikant atitinkamus metodus. Prireikus po 
bandymo kiekybiškai nustatomas bandomosios chemin ės medžiagos 
ir jos medžiag ų apykaitos produkt ų pasiskirstymas.  
Atitinkamomis s ąlygomis, aprašytomis šiame metode ir rekomenda ­
ciniame dokumente (2), nustatyt ą laikotarp į matuojama bandomosios 
medžiagos sugertis, atliekant rinktuvo skys čio ir apdorotos odos 
analizę. Odoje likusi bandomoji medžiaga turi b ūti laikoma sugerta, 
išskyrus atvejus, kai galima įrodyti, kad sugert į galima nustatyti vien 
tik pagal rinktuvo skys čio vertes. Kit ų sudėtinių dalių (nuo odos 
nuplautos ir odos sluoksni ų viduje likusios medžiagos) analiz ė 
leidžia išsamiau įvertinti duomenis, įskaitant bandomosios medžiagos 
pasiskirstym ą ir regeneravimo laipsn į. 
Norint įrodyti bandym ų laboratorijoje naudojamos bandymo sistemos 
veikimą ir patikimum ą, reikia tur ėti su atitinkamomis etalonin ėmis 
medžiagomis gautus rezultatus, kurie atitikt ų literatūroje paskelbtus 
taikomo metodo rezultatus. Š į reikalavim ą galima įvykdyti lygiagre ­ 
čiai bandant atitinkam ą etaloninę medžiagą (geriau toki ą, kurios lipo ­
filinės savybės mažai skiriasi nuo bandomosios medžiagos savybi ų) 
ir bandom ąją medžiag ą arba gauti anks čiau sukauptus tinkamus 
duomenis apie kelias skirting ų lipofilini ų savybių etalonines 
medžiagas (pvz., kofein ą, benzenkarboksir ūgštį ir testosteron ą). 
1.4. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.4.1.  Difuzijos kameros  
Difuzijos kamer ą sudaro tiektuvo ir rinktuvo skyriai, tarp kuri ų 
dedama oda (tipin ės konstrukcijos pavyzdys pateiktas 1 paveiksle). 
Kameroje oda turi b ūti įtvirtinama sandariai, turi b ūti užtikrinamos 
tinkamos s ąlygos su odos apa čia susilie čiančio rinktuvo tirpalui 
maišyti, imti jo m ėginius ir kontroliuoti kameros bei jos turinio 
temperatūrą. Tinka nepratekamojo ir pratekamojo tipo difuzijos 
kameros. Paprastai tiektuvo skyriai ne sandarinami, jei naudojama ribota bandomojo preparato doz ė. Tačiau naudojant neribotas dozes 
ir pagal tam tikrus ribot ų dozių naudojimo scenarijus tiektuvo skyriai 
gali būti sandarinami.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Rinktuvo skystis  
Pirmenyb ė teikiama fiziologiniu poži ūriu palankiam rinktuvo skys ­ 
čiui, nors galima naudoti ir kitus skys čius, jei jų naudojimas b ūtų 
pagrįstas. Turi b ūti pateikta tiksli rinktuvo skys čio sudėtis. Turi b ūti 
įrodyta, kad bandomosios chemin ės medžiagos tirpumas rinktuvo 
skystyje yra pakankamas, tod ėl šis veiksnys nebus kli ūtis sugerčiai. 
Be to, rinktuvo skystis neturi daryti įtakos odos preparato vienti ­
sumui. Pratekamojo tirpalo sistemoje srautas turi nesudaryti kli ūčių 
bandomajai medžiagai patekti į rinktuvo skyst į. Skystis neprateka ­
mojo tipo kameroje turi b ūti nepertraukiamai maišomas ir reguliariai 
imami jo m ėginiai. Jei tiriama medžiag ų apykaita, rinktuvo skystis 
turi užtikrinti odos gyvybingum ą visą bandymo laik ą. 
1.4.3.  Odos preparatai  
Galima naudoti žmoni ų arba gyv ūnų odą. Pripažįstama, kad naudo ­
jant žmoni ų odą būtina atsižvelgti į nacionalinius ir tarptautinius 
etinius aspektus bei s ąlygas. Nors labiau tinka gyva oda, galima 
naudoti negyv ą oda, jei galima įrodyti, kad oda yra nepažeista. 
Tinka epidermin ės membranos (atskirtos fermentiniu, šiluminiu 
arba cheminiu b ūdu) arba į sluoksnius padalyta oda (paprastai 
200–400 μm storio), paruošta dermatomu. Galima naudoti viso storio 
odą, tačiau reikėtų vengti per didelio storio ( ca. >  1 mm), išskyrus 
kai specialiai reikia nustatyti bandom ąją cheminę medžiag ą odos 
sluoksniuose. Turi b ūti pagrįstas rūšies pasirinkimas, anatomin ė 
vieta ir paruošimo metodas. Vienam bandomajam preparatui reikia pateikti bent keturi ų kartotini ų bandymų priimtinus duomenis.
 
1.4.4.  ODOS PREPARAT Ų VIENTISUMAS  
Svarbu tinkamai paruošti od ą. Netinkamai ruošiant galima pažeisti  
stratum corneum , todėl turi būti tikrinamas paruoštos odos vienti ­
sumas. Kai tiriama odos medžiag ų apykaita, k ą tik išpjauta oda turi 
būti naudojama kuo grei čiau ir esant s ąlygoms, apie kurias b ūtų 
žinoma, kad jos užtikrina medžiag ų apykaitos aktyvum ą. Pagal 
bendrai priimtas taisykles k ą tik išpjauta oda turi b ūti panaudota 
per 24 h, ta čiau priimtinas laikymo laikotarpis gali skirtis, atsižvel ­
giant į medžiag ų apykaitoje dalyvaujan čių ferment ų sistemą ir 
laikymo temperat ūrą (13). Kai odos preparatai naudojami ne iš 
karto, turi b ūti pateikti duomenys, kurie rodyt ų barjerinės funkcijos 
išsaugojim ą. 
1.4.5.  Bandomoji medžiaga  
Bandomoji medžiaga – objektas, kurio skvarbos charakteristikas 
reikia tirti. Geriausia b ūtų naudoti bandom ąją medžiag ą su žymėtai­
siais atomais.  
1.4.6.  Bandomasis preparatas  
Bandomosios medžiagos preparatas (pvz., grynas, skiestas arba 
bandomąją cheminę medžiag ą turintis preparatas, dedamas ant 
odos) turi atitikti (arba b ūti tikrovišku pakaitalu) preparat ą, su kuriuo 
gali įvykti žmoni ų arba kitų galimų tikslinių rūšių sąlytis. Visi nukr ­
ypimai nuo tikrovišk ų preparato naudojimo s ąlygų turi būti pagrįsti. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7.  Bandom ųjų medžiag ų koncentracijos vert ės ir preparatai  
Paprastai naudojamos kelios bandomosios medžiagos koncentracijos 
vertės, į kurių diapazon ą patenka viršutin ės galimo žmoni ų sąlyčio 
su medžiaga vert ės. Be to, reik ėtų numatyti tipin ės sudėties preparat ų 
bandymą. 
1.4.8.  Užd ėjimas ant odos  
Paprastai ant žmoni ų odos patenka ribotos chemini ų medžiagų dozės. 
Todėl naudojamas kiekis paprastai tur ėtų atkartoti galimo žmoni ų 
sąlyčio su medžiaga kiek į, dažniausiai 1–5 mg/cm  2 kietosios 
medžiagos arba mažiau kaip 10 μl/cm  2 skysčio. Kiekį reikia pagr įsti 
numatomomis naudojimo s ąlygomis, bandymo tikslais arba bando ­
mojo preparato fizikin ėmis charakteristikomis. Pvz., dedamas ant 
odos kiekis gali b ūti neribotas, jei ploto vienetui tenka dideli kiekiai.  
1.4.9.  Temperat ūra 
Temperat ūra daro įtaką cheminių medžiagų pasyviajai difuzijai (taigi 
jų sugerčiai per od ą). Difuzijos skyriaus ir odos temperat ūra turi būti 
stabili ir maždaug atitikti k ūno temperat ūrą 32 ± 1 °C. Skirtingos 
konstrukcijos kameroms reikalinga nevienoda vandens vonios arba 
kaitinamo bloko temperat ūra, siekiant užtikrinti, kad rinktuvo/odos 
temperatūra atitiktų fiziologin ę normą. Pageidautina, kad santykin ė 
drėgmė būtų 30–70 %  
1.4.10.  Veikimo trukm ė ir mėginių ėmimas  
Oda gali b ūti veikiama bandomuoju preparatu vis ą bandymo trukm ę 
arba trumpiau (t. y. kartoti konkret ų žmonių sąlyčio su medžiaga 
būdą). Bandomojo preparato perteklius nuplaunamas atitinkama 
plovimo priemone, o plovimo skys čiai surenkami analizei. Bando ­
mojo preparato šalinimo proced ūra priklausys nuo numatom ų naudo­
jimo sąlygų ir turi būti pagrįsta. Paprastai reikalingas 24 h m ėginių 
ėmimo laikotarpis sugerties kreivei tinkamai apib ūdinti. Kadangi 
odos vientisumas gali prad ėti blogėti anksčiau nei po 24 h, m ėginių 
ėmimo trukm ė paprastai neturi b ūti didesnė kaip 24 h. Jei bandomo ­
sios medžiagos skverbiasi per od ą greitai, ši s ąlyga gali b ūti nerei­
kalinga, ta čiau lėtai prasiskverbian čias medžiagas gali tekti bandyti 
ilgiau. Rinktuvo skys čio mėginių ėmimo dažnumas turi b ūti toks, 
kad būtų įmanoma gauti bandomosios medžiagos sugerties kreiv ės 
grafinį vaizdą. 
1.4.11.  Baigiamosios proced ūros 
Turi būti analizuojami visi bandymo sistemos komponentai ir nusta ­
tytas regeneravimo laipsnis. Šiuos komponentus sudaro tiektuvo skyrius, odos paviršiaus plovimo skys čiai, odos preparatas ir rink ­
tuvo skystis ir skyrius. Kai kuriais atvejais oda gali b ūti padalyta į 
medžiagos veikiam ą odos plot ą ir į odą po kameros junge, bei į 
stratum corneum , epiderm į ir odą atskirai analizei atlikti.
 
1.4.12.  Analiz ė 
Visuose bandymuose turi b ūti pasiektas atitinkamas regeneravimo 
laipsnis (t. y. reik ėtų siekti 100 ± 10 % radioaktyvumo vidurkio, o 
nukrypimai turi b ūti pagrįsti). Bandomosios medžiagos kiekis rink ­
tuvo skystyje, odos preparate, odos paviršiaus ir aparat ūros plovimo 
skysčiuose turi b ūti nustatytas, taikant tinkam ą metodą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. DUOMENYS  
Turi būti pateikta rinktuvo skys čio analizė, bandomosios chemin ės 
medžiagos pasiskirstymas bandymo sistemoje ir sugerties kaip laiko funkcijos kreiv ė. Kai oda veikiama ribota doze, turi b ūti apskaičiuo­
jamas nuo odos nuplautas kiekis, odoje lik ęs kiekis (ir skirtingose 
odos sluoksniuose, jei daroma analiz ė) ir rinktuvo skystyje esantis 
kiekis (greitis ir naudotos doz ės kiekis arba procentin ė dalis). Kartais 
sugertį per odą galima išreikšti naudojant tik apie rinktuvo skyst į 
gautus duomenis. Ta čiau, kai pasibaigus bandymui bandomoji 
medžiaga lieka odoje, š į kiekį gali tekti įtraukti į suminį sugertos 
medžiagos kiek į (žr. 3 nuorodos 66 pastraip ą). Kai oda veikiama 
neribota doze, duomen ų gali pakakti skvarbos konstantai (Kp) 
apskaičiuoti. Esant šioms s ąlygoms, absorbuotos medžiagos procen ­
tinė dalis nėra svarbi.
 
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikiami protokole nustatyti reikala ­
vimai, įskaitant naudotos sistemos pagrindim ą, ir joje turi b ūti nuro­
doma tokia informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— fizinė būsena, fizikin ės ir chemin ės savybės (bent molekulin ė 
masė ir log P  ov ), grynumas (radiocheminis grynumas);  
— identifikavimo informacija (pvz., siuntos numeris);  
— tirpumas rinktuvo skystyje.  
Bandomasis preparatas:  
— sudėtis ir naudojimo pagrindimas;  
— vienalytiškumas.  
Bandymo s ąlygos:  
— odos šaltiniai ir vieta, paruošimo metodas, laikymo prieš 
bandymą sąlygos, bet koks pradinis apdorojimas (plovimas, 
apdorojimas antibiotikais ir t. t.), odos vientisumo matavimai, medžiagų apykaitos b ūsena, naudojimo pagrindimas;
 
— kameros konstrukcija, rinktuvo skys čio sudėtis, rinktuvo skys čio 
srautas arba m ėginių ėmimo laikas ir proced ūros; 
— informacija apie bandomojo preparato užd ėjimą ir naudotos 
dozės kiekybinis nustatymas;  
— veikimo trukm ė; 
— išsami informacija apie bandomojo preparato šalinim ą nuo odos, 
pvz., odos plovimas;  
— išsami odos analiz ė ir visos taikytos odos dalijimo proced ūros 
siekiant parodyti pasiskirstym ą odoje;  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— kameros ir įrangos plovimo proced ūros; 
— mėginių ėmimo metodai, ekstrahavimo metodai, aptikimo ribin ės 
vertės ir analiz ės metodo tinkamumo patvirtinimas.  
Rezultatai:  
— atliekant bandym ą regeneruoti suminiai kiekiai (taikyta doz ė = 
odos plovimo skys čiai + oda + rinktuvo skystis + kameros 
plovimo skys čiai); 
— į lenteles surašyti regeneravimo atskir ų kamerų kiekvienoje 
sekcijoje laipsniai;  
— sugerties kreiv ė; 
— lentelėse pateikti sugerties duomenys (išreikšti kaip sugerties 
greitis, kiekis arba procentin ė dalis).  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados.  
4. NUORODOS  
1) Testing Method B.44. Skin Absorption:  In vivo  Method.  
2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD. Paris.  
3) OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, 
Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.  
4) Kemppainen BW and Reifenrath WG. (1990). Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton.  
5) Bronaugh RL and Collier, SW. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications , RL 
Bronaugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, p. 237–241.
 
6) Bronaugh RL and Maibach HI. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications . CRC 
Press, Boca Raton.  
7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
 
8) Diembeck W, Beck h, Benech-Kieffer F, Courtellemont P, 
Dupuis J, Loveli W, Paye M, Spengler J, Steiling W (1999). Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd 
Chem Tox, 37, p. 191–205.
 
9) Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
10) Howes D, Guy R, Hadgraft J, Heylings JR  et al . (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
11) Schaefer h and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles 
of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
12) Roberts MS and Walters KA. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
13) Jewell, C, Heylings, JR., Clowes, HM. And Williams, FM. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitroch ­
lorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: p. 356–365.  
1 paveikslas  
Nepratekamojo tipo difuzijos kameros  in vitro  sugerties per od ą bandymams 
atlikti konstrukcijos pavyzdys
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IN VITRO  ODOS DIRGINIMAS. REKONSTRUOTO ŽMOGAUS 
EPIDERMIO BANDYMO METODAS  
ĮVADAS  
1. Odos dirginimu vadinama gr įžtamoji odos pažaida po bandomosios 
medžiagos užtepimo ne ilgiau kaip 4 valandoms [kaip apibr ėžta Jungtini ų 
Tautų (JT) visuotinai suderintoje chemini ų medžiag ų klasifikavimo ir 
ženklinimo sistemoje (angl. GHS)] ir 2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų 
medžiagų ir mišini ų klasifikavimo, ženklinimo ir pakavimo (KŽP) 
(1)(3)]. Šis bandymo metodas (BM) apima  in vitro  procedūrą, pagal 
kurią galima nustatyti dirginan čiųjų cheminių medžiagų (ir mišini ų) pavojų 
pagal JT GHS ir ES KŽP 2- ąją kategorij ą (1) (2) (3). ES ir kituose 
regionuose, kuriuose netaikoma papildomoji JT GHS 3-ioji kategorija 
(švelnūs dirgikliai), šis BM taip pat gali b ūti taikomas neklasifikuojamoms 
cheminėms medžiagoms, t. y. priskirtoms JT GHS ir ES KŽP grupei „n ėra 
kategorijos“, identifikuoti (1)(3). Šis BM gali b ūti taikomas chemini ų 
medžiagų galimybei dirginti od ą nustatyti, kaip atskiras pakaitinis 
bandymas, skirtas  in vivo  odos dirginimui bandyti pagal nuosekli ųjų 
bandymų strategiją (4 ir šio priedo B.4 skyrius).
 
2. Odos dirginimas paprastai buvo vertinamas naudojant laboratorinius 
gyvūnus [OECD bandym ų metodika 404; šio priedo B.4 skyrius](4). R ūpi­
nantis gyv ūnų gerove, B.4 metodu (pakeistu 2004 m.) galima nustatyti 
ėsdinamąjį ar dirginam ąjį poveikį odai pagal nuosekli ųjų bandymų strate­
giją, taikant patvirtinto tinkamumo  in vitro  ir ex vivo  metodus ir taip 
apsaugant gyv ūnus nuo skausmo ir kan čių. Nuosekliosios bandym ų stra­
tegijos B.4 arba OECD bandym ų metodikos 404 (4) ėsdinimo bandymams 
tinka trys patvirtinto tinkamumo  in vitro  bandymų metodai, priimti kaip 
OECD bandym ų metodikos 430, 431 bei 435 (5) (6) (7), o du iš j ų – kaip 
šio priedo B.40 ir B.40a skyriai.  
3. Šis BM skirtas odos dirginimui pagal žmogaus sveikatos įvertį. Jis 
pagrįstas rekonstruoto žmogaus epidermio (angl.  reconstructed human 
epidermis , RhE) modeliu, kurio bendroji schema (kaip l ąstelių šaltinis 
naudojami žmogaus epidermio keratinocitai, reprezentatyvusis audinys ir citoarchitektonika) labai artima žmogaus odos paviršinio sluoksnio, t. y. 
epidermio biochemin ėms ir fiziologin ėms savyb ėms. Be to, į šį BM 
įtrauktas naudojimo charakteristik ų standartų (angl. PS) rinkinys (2 prie ­
dėlis), skirtas įvertinti panašius ir modifikuotus RhE pagr įstus bandymo 
metodus, kuriuos EC-ECVAM (8) pareng ė pagal OECD metodikos doku ­
mentą Nr. 34 (9).
 
4. Yra trys patvirtinto tinkamumo metodai, atitinkantys š į BM. Buvo atlikti 
dviejų in vitro  bandymo metod ų (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) 
(18) (19) (20), kuri ų komercinis pavadinimas „EpiSkin  TM “ (patvirtinto 
tinkamumo pamatinis metodas, angl.  Validated Reference Method , 
VRM), pradinio tinkamumo patvirtinimo, optimizavimo ir tinkamumo patvirtinimo tyrimai, naudojant RhE model į. Remiantis PS pagr įstų tinka­
mumo patvirtinimu (21), dviej ų kitų komercini ų in vitro  odos dirginimo 
RhE metod ų rezultatai yra panaš ūs VRM: „EpiDerm
 TM “ SIT (EPI-200) ir 
„SkinEthic  TM “ RHE metodai (22).  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Prieš taikant si ūlomą panašų arba modifikuot ą in vitro  RhE metod ą, kuris 
nėra VRM, „EpiDerm  TM “ SIT (EPI-200) arba „SkinEthic  TM “ RHE, regla ­
mentavimo tikslais reikia nustatyti jo patikimum ą, tinkamum ą (tikslumą) ir 
siūlomo naudojimo apribojimus, siekiant užtikrinti jo panašum ą į VRM, 
pagal šiame BM nustatytus PS (2 pried ėlis) Be to, prieš kuriant panaš ų ar 
modifikuot ą in vitro  RhE metod ą, tvirtinant jo tinkamum ą ir pateikiant 
oficialiai patvirtinti, rekomenduojama laikytis OECD aiškinamojo pagrind ų 
dokumento, skirto  in vitro  odos dirginimo bandymams (23).  
APIBRĖŽTYS  
6. Vartojamos apibr ėžtys pateiktos 1 pried ėlyje. 
PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI  
7. Šio BM apribojimas, kur į rodo tinkamumo patvirtinimo tyrimas (16), yra 
tai, kad pagal j į cheminių medžiagų negalima priskirti papildomai JT GHS 
3-iajai kategorijai (šveln ūs dirgikliai) (1). Kai taikomas kaip dalinis pakai ­
tinis bandymas, gali prireikti paskesnio  in vivo  bandymo, kad b ūtų visiškai 
apibūdintas odos dirginimo potencialas (4 ir šio priedo B.4 skyrius). Pripa ­ 
žįstama, kad žmogaus odos bandymams taikomi nacionaliniai ir tarptauti ­
niai etikos principai ir s ąlygos.  
8. Šis BM skirtas odos korozijos/dirginimo nuosekli ųjų bandymų strategijos 
B.4 (OECD bandym ų metodika 404)  in vitro  odos dirginimo komponentui 
(4). Nors taikant š į BM negaunama pakankamos informacijos apie odos 
koroziją, reikia pažym ėti, kad odos korozijai skirtas B.40a (OECD 
bandymų metodika 431) yra pagr įstas ta pa čia RhE bandymo sistema, 
tačiau taikomas kitas protokolas (B.40a skyrius). Šis metodas pagr įstas 
RhE modeliais, pagal kuriuos naudojami žmogaus keratinocitai, kurie d ėl 
to in vitro  atitinka dominan čios rūšies tikslin į organą. Be to, jis tiesiogiai 
apima pradin į veikiančios uždegimin ės kaskados / mechanizmo (l ąstelės ir 
audinio pažeidim ą, dėl kurio patiriama vietin ė trauma) etap ą, įvykstantį 
dirginant  in vivo . Atliekant šiam BM skirt ą tinkamumo patvirtinim ą 
buvo išbandyta daug chemini ų medžiag ų ir į empirinę tinkamumo patvir ­
tinimo tyrimo duomen ų bazę iš viso įtrauktos 58 chemin ės medžiagos (16) 
(18) (23). Tai yra kietosios medžiagos, skys čiai, pusiau kietosios 
medžiagos ir vaškai. Skys čiai gali būti vandeniniai ir nevandeniniai; kieto ­
sios medžiagos gali b ūti tirpios ir netirpios vandenyje. Kai įmanoma, 
kietosios medžiagos prieš užtepim ą sumalamos iki smulki ų miltelių; 
niekaip kitaip m ėginio apdoroti nereikia. Dujos ir purškalai tinkamumo 
patvirtinimo tyrimu kol kas įvertinti nebuvo (24). Nors šias medžiagas 
įmanoma bandyti pagal RhE metodik ą, pagal š į BM duj ų ir purškal ų 
bandyti negalima. Taip pat reikia pažym ėti, kad labai spalvingos chemin ės 
medžiagos gali trukdyti atlikti l ąstelių gyvybingumo matavimus ir patai ­
soms būtina naudoti pritaikytas kontrolines medžiagas (žr. 24–26 skirs ­
nius).  
9. Jei klasifikacija neabejotina, bandomajai cheminei medžiagai turi pakakti 
vienos bandym ų serijos su trimis kartotiniais audiniais. Ta čiau, jei rezul ­
tatai ribiniai, pvz., kartotini ų matavim ų rezultatai nesutampa ir (arba) vidu ­
tinė procentin ė gyvybingumo vert ė lygi 50 ± 5 %, turi b ūti apsvarstyta, ar 
nereikia antrosios serijos ir tre čiosios, jei pirm ųjų dviejų serijų rezultatai 
išsiskirtų. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
BANDYMO PRINCIPAS  
10. Bandomoji chemin ė medžiaga užtepama ant trima čio RhE modelio, suda ­
ryto iš normali ų žmogaus odos keratinocit ų, kurie buvo kultivuojami, kad 
galėtų būti gautas daugiasluoksnis labai gerai diferencijuotas žmogaus  
epidermio  modelis. J į sudaro suformuoti pamatinis, dygliuotasis ir gr ūdė­
tasis sluoksniai ir daugiasluoksnis  stratum corneum , turintis tarpl ąstelinių 
žvynelių pavidalo lipid ų sluoksni ų, kurių struktūra yra analogiška  in vivo  
nustatytai strukt ūrai. 
11. Chemini ų medžiag ų sukeltas odos dirginimas, pasireiškiantis eritema ir 
edema, yra įvykių kaskados, prasidedan čios prasiskverbimu pro  stratum 
corneum  ir po juo esan čių keratinocit ų sluoksni ų pažeidimu, padarinys. 
Žūvantys keratinocitai išleidžia mediatorius, kurie pradeda uždegimin ę 
kaskadą, veikian čią dermio  ląsteles, pirmiausia stromos ir endotelio 
ląsteles. Matom ą eritemą ir edemą sukelia b ūtent endotelio l ąstelių išsiplė­
timas ir padid ėjęs pralaidumas (24). RhE grindžiamais metodais matuojami 
kaskadą sukeliantys įvykiai.  
12. Ląstelių gyvybingumas RhE modeliuose matuojamas pagal gyvybinio 
dažiklio MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromido 
(tiazolilio m ėlio), CAS Nr. 298–93–1, fermentin ę konversij ą į mėlyną 
formazano drusk ą, kurios kiekis išmatuojamas išskyrus iš audini ų (25). 
Dirginančios chemin ės medžiagos identifikuojamos pagal j ų gebą suma­ 
žinti ląstelių gyvybingum ą iki mažesnio nei nustatyto slenkstinio lygio 
(t. y. ≤ 50 % JT GHS/ES KŽP 2-ajai kategorijai). Atsižvelgiant į regla­
mentavimo sistem ą, kurioje naudojami šio BM rezultatai, chemin ės 
medžiagos, po kuri ų poveikio l ąstelių gyvybingumas viršija nustatyt ą 
slenkstinį lygį, gali būti laikomos nedirginan čiomis (t. y. > 50 %, „n ėra 
kategorijos“).  
KVALIFIKACIJOS ĮRODYMAS  
13. Prieš prad ėdamos įprastu būdu taikyti bet kur į iš trijų patvirtinto tinka ­
mumo metod ų, kurie atitinka š į BM, laboratorijos turi įrodyti technin ę 
kvalifikacij ą, naudodamos dešimt etalonini ų cheminių medžiagų, išvardyt ų 
1 lentelėje. Taikant panašius metodus, parengtus pagal š į BM, arba 
pakeitus bet kur į iš trijų patvirtinto tinkamumo metod ų, turi būti laikomasi 
šio BM 2 pried ėlyje aprašyt ų PS reikalavim ų, kad metodas gal ėtų būti 
taikomas reglamentuojamiems bandymams.  
14. Rekomenduojama, kad, įrodydamas kvalifikacij ą, naudotojas patikrint ų 
gautų audinių apsaugines savybes, nurodytas RhE modelio gamintojo. 
Tai ypač svarbu, jei audiniai vežami ilgus nuotolius ar laiko tarp ą. Kai 
metodas s ėkmingai patvirtintas ir įrodyta jo taikymo kvalifikacija, v ėliau 
tokio tikrinimo pastoviai daryti neb ūtina. Tačiau, jei metodas taikomas 
pastoviai, rekomenduojama ir toliau reguliariai vertinti audini ų apsaugines 
savybes.  
1 lentelė 
Etaloninės chemin ės medžiagos  ( 1 ) 
Cheminės medžiaga  CAS Nr.  In vivo  įvertis (  2 ) Fizikin ė būsena JT GHS/ES KŽP 
kategorija  
naftalenacto r ūgštis 86–87–3  0  Kieta m.  Be kat.  
izopropanolis  67–63–0  0,3  Skystis  Be kat.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Cheminės medžiaga  CAS Nr.  In vivo  įvertis (  2 ) Fizikin ė būsena JT GHS/ES KŽP 
kategorija  
metilstearatas  112–61–8  1  Kieta m.  Be kat.  
heptilbutiratas  5877–93–9  1,7  Skystis  Be kat. 
(3-ioji papildomoji 
kategorija ) ( 3 ), ( 4 ) 
heksilsalicilatas  6255–76–3  2  Skystis  Be kat. 
(3-ioji papildomoji 
kategorija ) ( 3 ), ( 4 ) 
ciklamenaldehidas  103–95–7  2,3  Skystis  2 kat.  
1-bromheksanas  111–25–1  2,7  Skystis  2 kat.  
kalio hidroksidas (5 % vand.)  1311–58–3  3  Skystis  2 kat.  
1-metil-3-fenil-1-piperazinas  5277–27–2  3,3  Kieta m.  2 kat.  
Heptanalis  111–71–7  3,4  Skystis  2 kat.  
( 1 ) Šios etalonin ės cheminės medžiagos yra tinkamumo patvirtinimo tyrime naudojam ų etalonini ų cheminių medžiag ų poaibis. 
( 2 ) In vivo  įvertis pagal B.4 ir OECD bandym ų metodiką 404 (4). 
( 3 ) Pagal ši ą bandymo metod ą, JT GHS 3-ioji papildomoji kategorija (šveln ūs dirgikliai) (1) prilyginama „n ėra kategorijos“. 
( 4 ) JT GHS 3-ioji papildomoji kategorija netaikoma pagal ES KŽP.  
BANDYMO EIGA  
15. Toliau aprašomi odos dirginimui įvertinti naudojamo RhE metodo kompo ­
nentai ir proced ūros. RhE modelis gali b ūti atkurtas, paruoštas vietoje arba 
įsigytas. Galimos standartin ės taikymo proced ūros (angl.  Standard Opera ­
ting Procedures , SOP): „EpiSkin  TM “, „EpiDerm  TM “ SIT (EPI-200) ir 
„SkinEthic  TM “ RHE) (26) (27) (28). Bandymai turi b ūti atliekami kaip 
nurodyta toliau:  
RhE Bandymo Metodo Komponentai  
Bendrosios s ąlygos  
16. Epiteliui atkurti turi b ūti naudojami normal ūs žmogaus odos keratinocitai. 
Po funkciniu  stratum corneum  turi būti keli gyvybing ų epitelio l ąstelių 
sluoksniai (pamatinis sluoksnis, dygliuotasis ( stratum spinosum ), grūdė­
tasis ( stratum granulosum )). Stratum corneum  turi būti daugiasluoksnis 
ir turėti pagrindinius lipid ų sluoksnius, kad b ūtų gautas patvarus funkcinis 
barjeras, kuris b ūtų atsparus chemini ų citotoksini ų žymeklių, pvz., natrio 
dodecilsulfato (SDS) arba „Triton X-100“, greitam prasiskverbimui. 
Apsaugin ė funkcija gali b ūti įvertinta nustatant koncentracij ą, kuriai 
esant cheminis žymeklis, pra ėjus nustatytam poveikio laikui, sumažina 
audinių gyvybingum ą 50 % (IC  50 ) arba nustatant tam tikros pastovios 
koncentracijos cheminio žymeklio poveikio trukm ę, per kuri ą ląstelių 
gyvybingumas sumaž ėja 50 % (ET  50 ). Modelis turi tur ėti sulaikymo 
savybes, kurios apsaugot ų nuo medžiagos patekimo į gyvąjį audinį apei­
nant stratum corneum , dėl ko būtų blogai modeliuojamas odos veikimas 
medžiaga. RhE modelis turi b ūti neužterštas bakterijomis, virusais, miko ­
plazma ar grybeliais.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Funkcinės sąlygos  
Gyvybingumas  
17. Gyvybingumo dydžiui nustatyti taikomas MTT bandymas (25). Naudojan ­
tieji RhE model į turi užtikrinti, kad kiekviena RhE modelio partija atitikt ų 
apibrėžtus neigiamo poveikio kontrolin ės medžiagos (angl. NC) kriterijus. 
Paties ekstrahavimo tirpalo optinis tankis (angl.  optical density , OD) turi 
būti pakankamai mažas, t. y. OD < 0,1. Neigiamo poveikio kontrolin ės 
medžiagos OD ver čių (odos dirginimo bandymo metodo s ąlygomis) priim ­
tinumo interval ą (viršutin ę ir apatin ę ribas) nustato hE modelio gaminto ­
jas/tiekėjas, o 3-ų patvirtinto tinkamumo metod ų priimtinumo intervalai 
nurodyti 2 lentel ėje. Reikia patvirtinti dokumentais, kad NC paveiktas 
audinys yra stabilus kult ūroje (gaunami panaš ūs gyvybingumo matavimo 
rezultatai) vis ą veikimo medžiaga laikotarp į. 
2 lentelė 
Neigiamo poveikio kontrolin ės medžiagos OD ver čių priimtinumo intervalai  
Apatinė priimtinumo riba  Viršutin ė priimtinumo riba  
EpiSkin  TM (SM)  ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200)  ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE  ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Apsaugin ė funkcija  
18. Stratum corneum  ir jo lipid ų sudėtis turi b ūti pakankama, kad jie b ūtų 
atsparūs greitam chemini ų citotoksini ų žymeklių, pvz., SDS arba Triton 
X-100, prasiskverbimui, įvertintam matuojant IC  50 arba ET  50 (3 lentelė). 
Morfologija  
19. Turi b ūti atliktas RhE modelio histologinis tyrimas, siekiant įrodyti, kad ji 
turi į žmogaus  epidermį panašią struktūrą (įskaitant daugiasluoksn į stratum 
corneum ). 
Atkuriamumas  
20. Reikia įrodyti bandymo metodo rezultat ų, gautų naudojant teigiamo 
poveikio kontrolin ę cheminę medžiag ą (PC) ir neigiamo poveikio kontro ­
lines medžiagas (NC), ilgalaik į atkuriamum ą. 
Kokybės kontrolė (angl.  quality control , QC)  
21. RhE modelio gamintojas/tiek ėjas turi užtikrinti ir įrodyti, kad kiekviena 
naudojama RhE modelio partija atitinka nustatytus produkcijos išleidimo 
kriterijus, iš kuri ų svarbiausi yra  gyvybingumo  (17),  apsaugin ės funkcijos  
(18 skirsnis) ir  morfologijos  (19 skirsnis) kriterijai. Šie duomenys turi b ūti 
pateikti taikantiesiems metod ą, kad jie gal ėtų įtraukti ši ą informacij ą į 
bandymo ataskait ą. IC  50 arba ET  50 priimtinumo interval ą (viršutin ę ir 
apatinę ribas) turi nustatyti RhE modelio gamintojas/tiek ėjas (arba tyr ėjas, 
kai naudojamas vietinis modelis). Tik su kokybiškais audiniais gauti rezul ­
tatai gali b ūti laikomi patikimais prognozuojant dirginimo klasifikacij ą. 3 
lentelėje pateikti patvirtinto tinkamumo trij ų metodų priimtinumo interval ų 
pavyzdžiai.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
3 lentelė 
QC partijos išleidimo kriterij ų pavyzdžiai  
Apatinė priimtinumo riba  Viršutin ė priimtinumo riba  
EpiSkin  TM (SM) 
(18 valand ų apdorojimas naudojant 
SDS)(26)  IC 50 = 1,0 mg/ml  IC  50 = 3,0 mg/ml  
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % „Triton X-100“)(27)  ET 50 = 4,8 val.  ET  50 = 8,7 val.  
SkinEthic  TM RHE 
(1 % „Triton X-100“)(28)  ET 50 = 4,0 val.  ET  50 = 9,0 val.  
Bandomosios ir kontrolin ės chemini ų medžiag ų užtepimas  
22. Kiekvienai bandomajai cheminei medžiagai ir kontrolinei medžiagai kiek ­
vienoje bandymo serijoje turi b ūti naudojami bent trys kartotiniai bandi ­
niai. Tiriant skyst ąsias ir kiet ąsias medžiagas, naudojamos bandomosios 
cheminės medžiagos kiekis turi b ūti pakankamas, kad  epidermio  paviršius 
būtų tolygiai padengtas medžiaga, bet vengiama neribotos doz ės, t. y. 
naudotinas minimalus kiekis turi b ūti 25 μl/cm  2 arba 25 mg/cm  2 . Jei 
bandomos kietosios medžiagos, prieš j ų užtepimą epidermio  paviršių reikia 
suvilgyti dejonizuotu arba distiliuotu vandeniu, kad b ūtų užtikrintas geras 
bandomosios chemin ės medžiagos s ąlytis su  epidermio  paviršiumi. Jei 
įmanoma, kiet ąsias medžiagas reikia bandyti smulki ų miltelių pavidalu. 
Pasibaigus veikimo medžiaga laikotarpiui, bandomoji medžiaga turi b ūti 
kruopščiai nuplauta nuo  epidermio  paviršiaus vandeniniu buferiniu tirpalu 
arba 0,9 % NaCl. Atsižvelgiant į tai, kuris iš trij ų patvirtinto tinkamumo 
RhE metodas taikomas, poveikio trukm ė gali būti nuo 15 iki 60 min, o 
inkubavimo temperat ūra – nuo 20 °C iki 37 °C. Šios poveikio trukm ės ir 
temperatūros optimizuojamos kiekvienam RhE metodui ir išreiškia skir ­
tingas būdingąsias šių metodų savybes; išsamiau žr. ši ų metodų standar­
tines taikymo proced ūras (SOP) (26) (27) (28).  
23. Kiekvienoje bandym ų serijoje lygiagre čiai turi būti naudojamos NC ir PC, 
siekiant įrodyti, kad gyvybingumas (su NC), apsaugin ė funkcija ir pasi ­
reiškęs audinių jautrumas (su PC) atitinka anks čiau sukaupt ų duomen ų 
priimtinumo interval ą. Siūloma PC yra 5 % vandeninis SDS. Si ūlomos 
NC chemin ės medžiagos yra vanduo arba fiziologinis tirpalas fosfatiniame 
buferyje (angl.  phosphate buffered saline , PBS).  
Ląstelių gyvybingumo matavimai  
24. Svarbiausias bandymo proced ūros elementas yra tai, kad gyvybingumas 
matuojamas ne iš karto, kai baigiama veikti bandom ąja chemine medžiaga, 
bet praėjus pakankamai ilgam inkubaciniam laikotarpiui po veikimo ir 
audinių plovimo šviežia terpe. Per š į laikotarp į sudaromos s ąlygos atsigauti 
po silpno dirginimo poveikio ir atsirasti aiškiam citotoksiniam poveikiui. 
Bandymo optimizavimo tarpsniu (11) (12) (13) (14) (15) buvo nustatyta, kad optimali inkubacinio laikotarpio po apdorojimo trukm ė lygi 42 h.
 
25. MTT bandymas yra patvirtinto tinkamumo kiekybinis metodas, kuris turi 
būti taikomas l ąstelių gyvybingumui pagal š į BM matuoti. Jis yra suderi ­
namas su trima čiu audinio modeliu. Audinio ėminys 3 valandas laikomas 
reikiamos koncentracijos MTT tirpale (pvz., 0,3–1 mg/ml). M ėlynos 
spalvos formazano junginio nuos ėdos ekstrahuojamos iš audinio tirpikliu 
(pvz., izopropanoliu, par ūgštintu izopropanoliu), o formazano koncentra ­
cija matuojama nustatant OD esant 570 nm bang ų ilgiui ir ne didesniam 
kaip ± 30 nm filtro juostos plo čiui. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Bandomosios chemin ės medžiagos optin ės savybės arba jos cheminis 
poveikis MTT gali trukdyti atliekant tyrim ą ir taip gali b ūti gautas klai ­
dingas gyvybingumo įvertis (nes bandomoji medžiaga gali trukdyti atsirasti 
spalvai, leisti jai išnykti arba sukelti spalvos atsiradim ą). Tai gali įvykti, 
kai tam tikra bandomoji medžiaga nevisiškai pašalinama iš audinio skalau ­
jant arba kai ji prasiskverbia į epidermį. Jei bandomoji chemin ė medžiaga 
tiesiogiai veikia MTT (MTT reduktori ų), yra iš prigimties spalvota arba 
nusidažo apdorojant audin į, reikia naudoti papildomas kontrolines 
medžiagas, kad b ūtų galima aptikti bandomosios chemin ės medžiagos trik ­
džius taikomam gyvybingumo matavimo metodui ir padaryti patais ą. 
Išsamų aprašą, kaip taikyti patais ą tiesioginiam MTT redukavimui ir trik ­
džiams d ėl dažalų, galima rasti trij ų patvirtinto tinkamumo metod ų SOP 
(26) (27) (28).  
Priimtinumo kriterijai  
27. Pagal kiekvien ą metodą, kai taikomos patvirtinto tinkamumo RhE modeli ų 
partijos (žr. 21 skirsn į), turi būti gautos tokios NC paveikt ų audinių OD 
vertės, kurios rodyt ų visus vežimo bei pri ėmimo etapus ir vis ą dirginimo 
bandymo protokolo proces ą praėjusių audinių kokybę. Kontrolini ų 
medžiagų OD vert ės neturi b ūti mažesn ės nei pagal anks čiau sukauptus 
duomenis nustatytos apatin ės ribinės vertės. Panašiai, PC, t. y. 5 % vande ­
niniu SDS, paveikti audiniai turi geb ėti atsakyti į dirginan čios chemin ės 
medžiagos veikim ą BM sąlygomis (26) (27) (28). Reikia nustatyti susiju ­
sius ir tinkamus kartotini ų audinių kintamumo matus (pvz., jei taikomi 
standartiniai nuokrypiai (angl.  standard deviation , SD), jie turi b ūti iš 
vienpusio 95 % leidžiam ųjų nuokryp ų intervalo, apskai čiuoto pagal anks ­ 
čiau sukauptus duomenis; VRM SD < 18 %).  
Rezultatų aiškinimas ir prognozavimo modelis  
28. Gautos kiekvienos bandomosios chemin ės medžiagos OD vert ės gali būti 
taikomos nustatant gyvybingumo procentin ę dalį, palyginti su NC, kuri ų 
gyvybingumas prilyginamas 100 %. Ribin ė ląstelių gyvybingumo procen ­
tinės dalies vert ė, skirianti dirginan čias bandom ąsias chemines medžiagas 
nuo neklasifikuojam ųjų, ir statistin ė (-ės) proced ūra (-os), taikyta (-os) 
rezultatams įvertinti ir dirginan čioms chemin ėms medžiagoms identifi ­
kuoti, turi b ūti aiškiai apibr ėžtos ir patvirtintos dokumentais, taip pat turi 
būti įrodytas j ų tinkamumas. Toliau pateiktos dirginimui prognozuoti 
naudojamos ribin ės vertės: 
— laikoma, kad bandomoji chemin ė medžiaga yra dirginanti od ą pagal JT 
GHS/ES KŽP 2- ąją kategorij ą, jei audinio gyvybingumas po veikimo 
medžiaga ir paskesnio inkubavimo yra mažesnis arba lygus ( ≤) 50 %,  
— atsižvelgiant į reglamentavimo sistem ą, kurioje naudojami šio BM 
rezultatai, gali b ūti laikoma, kad bandomoji chemin ė medžiaga yra 
nedirginanti odos pagal JT GHS/ES KŽP „n ėra kategorijos“ klasifika ­
ciją, jei audinio gyvybingumas po veikimo medžiaga ir paskesnio 
inkubavimo yra didesnis kaip (>) 50 %.  
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Duomenys  
29. Lentel ėse turi būti pateikti kiekvieno atskiro audinio kartotinio bandinio 
duomenys (pvz., optinio tankio vert ės ir apskai čiuotų ląstelių gyvybin ­
gumo procentini ų verčių duomenys kiekvienai bandomajai cheminei 
medžiagai, įskaitant klasifikavim ą), įtraukiant ir pakartot ų bandym ų, jei 
reikia, duomenis. Be to, ataskaitoje reikia pateikti kiekvienos bandym ų 
serijos vidutin ės vertės ± standartinio nuokrypio duomenis. Ataskaitoje 
reikia nurodyti pasteb ėtas spalvot ų bandom ųjų chemini ų medžiag ų 
sąveikas su MTT reagentu.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Bandymo ataskaita  
30. Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
Bandomoji ir kontrolin ė cheminės medžiagos:  
— cheminis (-iai) pavadinimas (-ai), pvz., CAS pavadinimas ir CAS 
numeris, EC pavadinimas ir numeris, jei žinomas,  
— grynumas ir sud ėtis (masės procentine (- ėmis) dalimi (-is)),  
— fizikin ės ir chemin ės savybės (pvz., fizin ė būsena, stabilumas, lakumas, 
pH ir tirpumas vandenyje, jei žinomas), svarbios atliekamam tyrimui),  
— bandom ųjų ir (arba) kontrolini ų cheminių medžiag ų apdorojimas prieš 
bandymą, jei taikomas (pvz., šildymas, malimas),  
— laikymo s ąlygos.  
RhE modelio ir naudoto protokolo pagrindimas.  
Bandymo s ąlygos:  
— naudota l ąstelių sistema,  
— visa su konkre čiu RhE modeliu susijusi informacija, įskaitant jo naudo ­
jimo charakteristikas. J ą turi sudaryti šie ir kiti duomenys:  
i) gyvybingumas;  
ii) apsaugin ė funkcija;  
iii) morfologija;  
iv) atkuriamumas ir prognozuojamumas;  
v) kontrolin ės medžiagos modelio kokybei nustatyti,  
— išsami informacija apie taikyt ą bandymo proced ūrą: 
— naudotos bandomosios doz ės, veikimo medžiaga trukm ė ir inkubacinis 
laikotarpis po veikimo,  
— visų bandymo proced ūros pakeitim ų aprašymas,  
— nuoroda į anksčiau sukauptus modelio duomenis. J ą turi sudaryti šie ir 
kiti duomenys:  
i) kokybės kontrolės duomen ų priimtinumas atsižvelgiant į anksčiau 
sukauptus partijos duomenis;  
ii) teigiam ų ir neigiam ų kontrolini ų verčių priimtinumas atsižvelgiant į 
teigiamo ir neigiamo poveikio kontrolini ų medžiag ų vidurkius ir 
intervalus,  
— taikyt ų vertinimo kriterij ų, įskaitant prognoz ės modelio ribinio (-i ų) 
taško (-ų) pagrindimo kriterijus, aprašymas,  
— nuoroda į anksčiau sukauptus duomenis.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Rezultatai:  
— atskirų bandomųjų cheminių medžiag ų kiekvienos bandym ų serijos ir 
kiekvieno kartotinio matavimo duomen ų lentelės, 
— su tiesioginiais MTT reduktoriais ir (arba) spalvotomis bandomosiomis 
cheminėmis medžiagomis naudot ų kontrolini ų medžiag ų nuoroda,  
— kitų pastebėtų reiškinių aprašymas.  
Rezultatų aptarimas  
Išvada  
NUORODOS  
(1) UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York 
and Geneva. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/pub ­
li/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]  
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin 
irritation Performance Standards“, issued by the ECVAM Scientific Advi ­
sory Committee (ESAC30), 9 April 2009. Available at: [http://ecvam.jrc.e ­
c.europa.eu]  
(3) 2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) 
Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų medžiagų ir mišini ų klasifikavimo, ženklinimo 
ir pakavimo, iš dalies kei čiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 
1999/45/EB ir iš dalies kei čiantis Reglament ą (EB) Nr. 1907/2006. OL 
L 353, 2008 12 31, p. 1.  
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Paris. Available at: [http://www.oec ­
d.org/env/testguidelines]  
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 
430, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Paris. Available at: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A 
prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57–93.  
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in 
Vitro 16, 765–770.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114.  
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351–367.  
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329–349.
 
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irri ­
tation Task Force report 2, ATLA 30, 109–129.
 
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the 
skin integrity function test, ATLA 35, 559–601.
 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 
603–619.  
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351–358.
 
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin 
models to  in vitro  skin irritation testing. Available at: [http://ecvam.jrc.e ­
c.europa.eu]  
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 November 2008. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/ document/24/0,3746,en_2649_34377 _47858904_1_1_1_1,00.html]
 
(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, 231–243.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55–63.  
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation 
Validation Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min - 42 
hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Available at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for:  In vitro  
EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corpo ­
ration’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Avai ­
lable at: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irri ­
tation test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of 
chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Available at: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7–18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.
 
(30) 2001 m. rugpj ūčio 6 d. Komisijos direktyva 2001/59/EB, 28-t ą kartą deri­
nanti su technikos pažanga Tarybos direktyv ą 67/548/EEB d ėl įstatymų ir 
kitų teisės aktų, reglamentuojan čių pavojing ų medžiagų klasifikavim ą, paka­
vimą ir ženklinim ą etiketėmis, suderinimo, OL L 225, 2001 8 21, p. 1.  
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1–4.
 
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irrita ­
tion and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and 
animal  in vivo  data, ALTEX, 14, 359–365.  
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact Derma ­
titis, 62, 109–116.
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
1 priedėlis 
Apibrėžtys 
Tikslumas –  bandymo metodo rezultat ų ir patvirtint ų pamatini ų verčių artumas. 
Tikslumas yra bandymo metodo naudojimo charakteristik ų matas ir vienas iš 
tinkamumo aspekt ų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „suta ­
pimas“ ir reiškia tinkam ų bandymo metodo rezultat ų dalį (9). 
Ląstelių gyvybingumas –  parametras suminiam l ąstelių populiacijos aktyvumui 
matuoti, pvz., l ąstelių mitochondrini ų dehidrogenazi ų geba redukuoti gyvybin į 
dažiklį MTT ([3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolinio bromid ą, tiazolilo 
mėlį), kuris, atsižvelgiant į galutinį matuojam ą dydį ir taikom ą bandymo schem ą, 
yra susijęs su sumini ų ląstelių kiekiu ir (arba) j ų gyvybingumu.  
Sutapimas –  tai yra bandymo metod ų, kuriais gaunami vienareikšmiai rezultatai, 
naudojimo charakteristik ų matas ir vienas iš tinkamumo aspekt ų. Terminas varto ­
jamas kaip lygiavertis terminui „tikslumas“ ir apibr ėžiamas kaip dalis vis ų išban­
dytų chemini ų medžiag ų, kurios tiksliai klasifikuotos kaip teigiamos arba 
neigiamos (9).  
ET 50 – gali būti įvertintas kaip veikimo trukm ė, per kuri ą ląstelių gyvybingumas 
sumažėja 50 % jas veikiant tam tikros pastovios koncentracijos cheminiu 
žymekliu, žr. taip pat IC  50 . 
ES KŽP (2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamen ­
tas (EB) Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifikavimo, ženkli ­
nimo ir pakavimo) –  Europos S ąjungos (ES) įgyvendina JT GHS chemini ų 
medžiagų (medžiag ų ir mišini ų) klasifikavimo sistem ą (3). 
GHS (Visuotinai suderinta chemini ų medžiag ų klasifikavimo ir ženklinimo 
sistema) –  sistema, kurioje pateikiama chemini ų medžiag ų (medžiag ų ir mišini ų) 
klasifikacija pagal standartizuotus fizini ų pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai 
tipus ir nagrin ėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signa ­
liniai žodžiai, pavojaus pareiškimai, įspėjamieji pareiškimai ir saugos duomen ų 
lapai, kad b ūtų galima informuoti apie medžiag ų neigiam ą poveikį, siekiant 
apsaugoti žmones ( įskaitant darbuotojus, darbininkus, vež ėjus, vartotojus ir 
avarijų likvidatorius) ir aplink ą (1). 
IC 50 – gali būti įvertintas kaip cheminio žymeklio koncentracija, kuriai esant 
ląstelių gyvybingumas sumaž ėja 50 % (IC  50 ) praėjus nustatytai veikimo trukmei, 
žr. taip pat ET  50 . 
Neribota doz ė – ant epidermio  tepamas bandomosios medžiagos kiekis, didesnis 
už kiekį, kurio reikia visiškai ir tolygiai uždengti  epidermio  paviršių. 
„Aš irgi“ (angl. me-too) bandymas –  šnekamosios kalbos pasakymas, kuriuo 
vadinamas bandymo metodas, strukt ūriškai ir funkciškai panašus į patvirtinto 
tinkamumo ir pripažint ą pamatin į bandymo metod ą. Toks bandymo metodas 
gali būti taikomas palyginamajam tinkamumo patvirtinimui. Taikomas pakai čiui 
su panašiu bandymo metodu (9).  
Naudojimo charakteristik ų standartai (angl. PS) –  standartai, pagr įsti patvirtinto 
tinkamumo bandymo metodu, sudarantys pagrind ą įvertinti si ūlomo funkciškai ir 
mechanistiškai panašaus bandymo metodo palyginamum ą. Įtraukiami šie dalykai: 
i) esminiai bandymo metodo komponentai, ii) b ūtinasis sąrašas etalonini ų 
cheminių medžiag ų, parinktų iš tų medžiag ų, kurios naudojamos patvirtinto 
tinkamumo bandymo metodo priimtinoms naudojimo charakteristikoms įrodyti, 
ir iii) panašus tikslumo ir patikimumo lygis, atsižvelgiant į pasiekiam ąjį patvir­
tinto tinkamumo bandymo metodu, kur į siūlomas bandymo metodas turi tur ėti 
vertinamas pagal b ūtinąjį etalonini ų cheminių medžiag ų sąrašą (9). ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Etaloninės chemin ės medžiagos –  cheminės medžiagos, kurios yra pasirinktos 
naudoti tinkamumo patvirtinimo procese ir kuri ų atveju atsakas  in vitro  arba  in 
vivo etaloninėje bandymo sistemoje arba dominan čių rūšių atsakas jau žinomas. 
Šios chemin ės medžiagos turi b ūti tipinės chemini ų medžiag ų klasėms, kurioms 
numatyta taikyti bandymo metod ą, ir turi perteikti visus atsakus, kuri ų tikimasi iš 
cheminių medžiag ų, kurioms gali b ūti taikomas metodas – tiek stiprius, tiek 
silpnus, tiek neigiamus. Skirtingais tinkamumo patvirtinimo proceso etapais ir skirtingiems bandymo metodams bei paskirtims gali prireikti skirting ų etalonini ų 
cheminių medžiag ų rinkinių (9).
 
Tinkamumas –  bandymo ir dominan čio poveikio s ąryšio ir bandymo prasmin ­
gumo bei naudingumo konkre čiam tikslui apib ūdinimas. Tai yra matas, kiek 
tiksliai bandymu išmatuojamas ar numanomas dominantis biologinis poveikis. 
Tinkamumas apima bandymo metodo tikslumo (sutapimo) aspekt ą (9). 
Patikimumas –  juo įvertinamas laipsnis, kuriuo bandymo metodas gali b ūti ilgai­
niui atkartojamai atliekamas vienoje ir skirtingose laboratorijose, taikant t ą patį 
protokolą. Jis įvertinamas skai čiuojant atkuriamum ą laboratorijoje ir tarp labora ­
torijų (9). 
Pakaitinis bandymas –  bandymas, skirtas pakeisti bandym ą, kuris paprastai 
naudojamas ir pripažintas tinkamu pavojui nustatyti ir (arba) rizikai įvertinti, ir 
nustatytas kaip visomis įmanomomis bandymo aplinkyb ėmis ir naudojant visas 
galimas chemines medžiagas užtikrinantis lygiavert ę ar geresn ę žmonių ar 
gyvūnų sveikatos arba aplinkos apsaug ą (pagal paskirt į), palyginti su pripažintu 
bandymu (9).  
Jautrumas –  visų teigiamų (veikliųjų) medžiag ų, kurios yra tinkamai klasifi ­
kuotos atliekant bandym ą, dalis. Jis yra bandymo metodo, kuriuo gaunami viena ­
reikšmiai rezultatai, tikslumo matas ir yra svarbus bandymo metodo tinkamumo vertinimo veiksnys (9).
 
Odos dirginimas –  grįžtamosios odos pažaidos gavimas po bandomosios 
medžiagos užtepimo ne ilgiau kaip 4 valandoms. Odos dirginimas yra vietinis 
neimunogeninis atsakas, kuris atsiranda netrukus po veikimo medžiaga (29). Jo pagrindin ė savybė – grįžtamumas vykstant uždegiminiams atsakams ir esant su 
uždegiminiu procesu susijusiems b ūdingiems klinikiniams dirginimo požymiams 
(eritemai, edemai, niež ėjimui ir skausmui).
 
Specifiškumas –  visų neigiamų (neveikli ųjų) medžiag ų, kurios yra tinkamai klasi ­
fikuotos atliekant bandym ą, dalis. Jis yra bandymo metodo, kuriuo gaunami 
vienareikšmiai rezultatai, tikslumo matas ir yra svarbus bandymo metodo tinka ­
mumo vertinimo veiksnys (9).  
Nuosekliųjų bandymų strategija –  bandymai taikant bandymo metodus nuosekliu 
būdu; kiekvienu paskesniu lygiu bandymo metodai parenkami remiantis anks ­
tesnio bandymo lygio rezultatais (9).  
Bandomoji chemin ė medžiaga (dar vadinama bandom ąja medžiaga) –  bet kuri 
medžiaga ar mišinys, bandomi taikant š į bandymų metodą. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
2 priedėlis 
Naudojimo charakteristik ų standartai, skirti įvertinti si ūlomus panašius ar 
pakeistus  in vitro  rekonstruoto žmogaus  epidermio  (RhE) metodus odos 
jautrinimui nustatyti  
ĮVADAS  
1. Naudojimo charakteristik ų standart ų (angl. PS) paskirtis – pateikti 
pagrindą, kuriuo remiantis b ūtų galima nustatyti, ar nauji bandymo 
metodai, tiek patentuoti (t. y. saugomi autoriaus teisi ų, turintys prek ės 
ženklą, registruoti), tiek nepatentuoti, pasižymi pakankamu tikslumu ir 
patikimumu konkretiems bandymo tikslams. Šie PS, pagr įsti patvirtinto 
tinkamumo ir pripažintais metodais, gali b ūti taikomi kit ų panašių metodų 
(paprastai vadinam ų „analogiškais“ bandymais), kurie grindžiami panašiais 
moksliniais principais ir kuriais matuojamas ar prognozuojamas tas pats biologinis ar toksinis poveikis, patikimumui ir tikslumui įvertinti (9).
 
2. Prieš naudojant modifikuotus metodus (t. y. pasi ūlytus galimus patvirtino 
bandymo metodo patobulinimus), turi b ūti atliktas įvertinimas, skirtas 
nustatyti si ūlomų pokyčių poveikį bandymo naudojimo charakteristikoms 
ir kaip smarkiai tokie poky čiai paveiks turim ą informacij ą, skirtą kitiems 
tinkamumo patvirtinimo proceso komponentams. Atsižvelgiant į siūlomų 
pokyčių skaičių ir pobūdį, gautus duomenis ir tuos paky čius remian čius 
dokumentus, modifikuotiems metodams taikomas toks pat tinkamumo 
patvirtinimo procesas kaip ir aprašytas naujam bandymui arba, jei tinka, 
ribotas patikimumo ir tinkamumo įvertinimas taikant nustatytus PS (9).  
3. Panaš ūs („me-too“) arba modifikuoti kurio nors iš trij ų patvirtinto tinka ­
mumo metod ų [„EpiSkin™“ (patvirtinto tinkamumo pamatinis metodas – 
VRM), „EpiDerm™“ SIT (EPI-200) ir „SkinEthic™“ RHE] metodai, siūlomi naudoti pagal š į BM, turi b ūti įvertinti, kad b ūtų galima nustatyti 
jų patikimum ą ir tikslum ą naudojant chemines medžiagas, kurios atitinka 
visą Draize dirginimo bal ų intervalą. Kai įvertinama naudojant 20 reko ­
menduojam ų etalonini ų cheminių medžiag ų (1 lentel ė), pasiūlytų panašių 
ar modifikuot ų metodų patikimumo ir tikslumo vert ės turi būti panašios ar 
geresnės už vertes, gautas VRM (2 lentel ė) (2) (16). Tikslumo ir patiki ­
mumo vert ės, kurias reikia pasiekti, pateiktos šio pried ėlio 8–12 skirs ­
niuose. Įtrauktos atitinkamas chemini ų medžiag ų klases atstovaujan čios 
neklasifikuojamos (JT GHS/ES KŽP „n ėra kategorijos“) ir klasifikuojamos 
(JT GHS/ES KŽP 2-osios kategorijos) (1) medžiagos, kad pasi ūlyto 
metodo patikimum ą ir tikslum ą) būtų
 galima palyginti su VRM rodikliais. 
Metodo patikimumas, galimyb ės juo tinkamai identifikuoti JT GHS/ES 
KŽP 2-osios kategorijos dirginan čias chemines medžiagas ir, atsižvelgiant 
į reglamentavimo sistem ą, pagal kuri ą gaunami duomenys, galimyb ės juo 
tinkamai identifikuoti JT GHS/ES KŽP kategorijos neturin čias chemines 
medžiagas turi b ūti nustatyti prieš pradedant j į taikyti nauj ų medžiag ų 
bandymams.  
4. Šie PS yra pagr įsti EC-ECVAM PS (8), atnaujintais pagal JT GHS ir ES 
KŽP klasifikavimo ir ženklinimo sistemas (1) (3). Pradiniai PS buvo apibrėžti atlikus tinkamumo patvirtinimo tyrim ą (21) ir pagr įsti ES klasi ­
fikavimo sistema, apibr ėžta 2001 m. rugpj ūčio 6 d. Komisijos direktyvoje 
2001/59/EB, 28-t ą kartą derinančioje su technikos pažanga Tarybos direk ­
tyvą 67/548/EEB d ėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojan čių 
pavojingų medžiag ų klasifikavim ą, pakavim ą ir ženklinim ą etiketėmis, 
suderinimo (
 1 ). Dėl JT GHS sistemos patvirtinimo klasifikavimui ir  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) OL L 225, 2001 8 21, p. 1.
 ženklinimui ES (ES KŽP) (3), kas įvyko tarp šio BM tinkamumo patvirti ­
nimo tyrimo užbaigimo ir pabaigimo, PS buvo atnaujinti (8). Šis 
atnaujinimas daugiausia susij ęs su: i) PS etalonini ų cheminių medžiag ų 
rinkiniu ir ii) nustatytomis patikimumo ir tikslumo vert ėmis (2) (23).  
RHE ODOS DIRGINIMO  IN VITRO  BANDYMO METOD Ų NAUDOJIMO 
CHARAKTERISTIK Ų STANDARTAI  
5. PS sudaro šie trys elementai (9):  
I) Esminiai bandymo metodo komponentai  
II) Būtinasis etalonini ų cheminių medžiag ų sąrašas  
III) Nustatytos patikimumo ir tikslumo vert ės 
I) Esminiai bandymo metodo komponentai  
6. Juos sudaro patvirtino tinkamumo metodo esminiai strukt ūriniai, funkciniai 
ir procedūriniai elementai, kurie turi b ūti įtraukti į pasiūlyto mechanistiškai 
ir funkciškai panašaus arba modifikuoto metodo protokol ą. Šie kompo ­
nentai apima unikalias metodo charakteristikas, svarbiausias proced ūros 
detales ir kokyb ės kontrol ės priemones. Esmini ų bandymo komponent ų 
laikymasis padeda užtikrinti, kad panašus arba modifikuotas si ūlomas 
metodas b ūtų grindžiamas tomis pa čiomis sąvokomis kaip ir atitinkamas 
VRM (9). Esminiai bandymo metodo komponentai išsamiai aprašyti BM 16–21 skirsniuose, o bandymas turi b ūti atliekamas laikantis ši ų dalykų:
 
— Bendr ųjų sąlygų (16 skirsnis)  
— Funkcini ų sąlygų, kurios apima:  
— gyvybingum ą (17 skirsnis),  
— apsaugin ę funkciją (18 skirsnis),  
— morfologij ą (19 skirsnis),  
— atkuriamum ą (20 skirsnis) ir  
— kokyb ės kontrolę (21 skirsnis).  
II) Būtinasis etalonini ų chemini ų medžiag ų sąrašas  
7. Etalonin ės chemin ės medžiagos naudojamos nustatyti, ar panašaus arba 
modifikuoto metodo, kuris įrodyta, kad yra strukt ūriškai ir funkciškai 
pakankamai panašus į VRM arba atitinka nedidel į vieno iš trij ų patvirtinto 
tinkamumo metod ų pakeitim ą, patikimumas ir tikslumas yra panašus ar 
geresnis už VRM rodiklius (2) (8) (16) (23). 1 lentel ėje išvardytos 20 
rekomenduojam ų etalonini ų cheminių medžiag ų yra iš skirting ų cheminių 
medžiagų klasių (t. y. jų kategorij ų, pagrįstų funkcinėmis grup ėmis) ir 
atitinka vis ą Draize dirginimo įverčių intervalą (nuo nedirginan čios iki 
stipriai dirginan čios). Į sąrašą įtrauktos chemin ės medžiagos yra: 10 JT 
GHS/ES KŽP 2-osios kategorijos medžiag ų ir 10 kategorijos neturin čių 
medžiagų, iš kurių 3 yra JT GHS 3-iosios papildomosios kategorijos 
cheminės medžiagos. Pagal ši ą bandymo metod ą, 3-ioji papildomoji kate ­
gorija prilyginama „n ėra kategorijos“. 1 lentel ėje išvardytos chemin ės 
medžiagos parinktos iš medžiag ų, naudotų optimizavimo etapu, kuris 
buvo vykdomas po VRM pradinio tinkamumo patvirtinimo ir tinkamumo patvirtinimo tyrime, tikrinant chemin į funkcionalum ą ir fizinį būvį (14) 
(18). Šios etalonin ės chemin ės medžiagos yra mažiausias skai čius 
medžiagų, kurias reikia naudoti si ūlomo panašaus ar modifikuoto metodo 
tikslumui ir patikimui įvertinti, ta čiau neturi b ūti naudojamos kuriant 
naujus metodus. Tais atvejais, kai s ąraše chemini ų medžiag ų neturima, 
galima naudoti kitas medžiagas, apie kurias turima pakankamai  in vivo  
duomenų, pirmiausia renkantis iš medžiag ų, naudotų optimizavimo etapu
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
po VRM pradinio tinkamumo patvirtinimo ir tinkamumo patvirtinimo 
tyrime. Jei norima, š į būtinąjį etalonini ų cheminių medžiagų sąrašą galima 
papildyti kitomis chemin ėmis medžiagomis, apie kurias turima pakankama  
in vivo  duomenų, siekiant papildomai įvertinti si ūlomo metodo tikslum ą. 
1 lentelė 
Būtinasis etalonini ų chemini ų medžiag ų sąrašas, skirtas panašaus ar modifikuoto RhE odos dirginimo metodo 
tikslumo ir patikimumo vert ėms nustatyti  ( 1 ) 
Cheminės medžiaga  CAS numeris  Fizikin ė būsena In vivo  įvertis  VRM  in vitro  
kat. JT GHS/ES KŽP  in 
vivo kat. 
1-brom-4-chlorbutanas  6940–78–9  Skystis  0  2 kat.  Be kat.  
dietilftalatas  84–66–2  Skystis  0  Be kat.  Be kat.  
naftalenacto r ūgštis 86–87–3  Kieta m.  0  Be kat.  Be kat.  
alilfenoksiacetatas  7493–74–5  Skystis  0,3  Be kat.  Be kat.  
izopropanolis  67–63–0  Skystis  0,3  Be kat.  Be kat.  
4-metiltiobenzaldehidas  3446–89–7  Skystis  1  2 kat.  Be kat.  
metilstearatas  112–61–8  Kieta m.  1  Be kat.  Be kat.  
heptilbutiratas  5870–93–9  Skystis  1,7  Be kat.  Be kat.  
heksilsalicilatas  6259–76–3  Skystis  2  Be kat.  Be kat.  
cinamaldehidas  104–55–2  Skystis  2  2 kat.  Be kat. 
(3-ioji papildomoji 
kat.) ( 3 ) 
1-dekanolis  ( 2 ) 112–30–1  Skystis  2,3  2 kat.  2 kat.  
ciklamenaldehidas  103–95–7  Skystis  2,3  2 kat.  2 kat.  
1-bromheksanas  111–25–1  Skystis  2,7  2 kat.  2 kat.  
2-chlormetil-3,5-dimetil-4- 
metoksipiridino hidro ­
chloridas  86604–75–3  Kieta m.  2,7  2 kat.  2 kat.  
di-n-propil disulfidas  ( 2 ) 629–19–6  Skystis  3  Be kat.  2 kat.  
kalio hidroksidas (5 % vand.)  1310–58–3  Skystis  3  2 kat.  2 kat.  
5–(1,1-dimetiletil)-2-metil 
benzentiolis  7340–90–1  Skystis  3,3  2 kat.  2 kat.  
1-metil-3-fenil-1-piperazinas  5271–27–2  Kieta m.  3,3  2 kat.  2 kat.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Cheminės medžiaga  CAS numeris  Fizikin ė būsena In vivo  įvertis  VRM  in vitro  
kat. JT GHS/ES KŽP  in 
vivo kat. 
Heptanalis  111–71–7  Skystis  3,4  2 kat.  2 kat.  
tetrachloretilenas  127–18–4  Skystis  4  2 kat.  2 kat.  
( 1 ) Chemini ų medžiagų atranka pagr įsta šiais kriterijais: i) chemines medžiagas galima nusipirkti, ii) jos atitinka vis ą Draize dirginimo 
balų intervalą (nuo nedirginan čios iki stipriai dirginan čios), iii) jos turi gerai apibr ėžtą cheminę struktūrą, iv) jos atitinka tinkamumo 
patvirtinimo procese taikyt ą cheminį funkcionalum ą ir v) jos nesusijusios su ypa č didelio toksiškumo parametrais (pvz., kance ­
rogeniškumu arba toksiškumu reprodukcijos sistemai) ir su labai didel ėmis šalinimo išlaidomis. 
( 2 ) Chemin ės medžiagos, kurios yra dirginan čios triušiui, bet yra patikim ų įrodymų, kad jos n ėra dirginan čios žmonėms (31) (32) (33). 
( 3 ) Pagal JT GHS, n ėra ES KŽP.  
III) Nustatytos patikimumo ir tikslumo vert ės 
8. Siekiant nustatyti pasi ūlytų panašių ar modifikuot ų metodų patikimum ą ir 
tinkamum ą, kad juos b ūtų galima taikyti skirtingose laboratorijose, visos 1 
lentelėje išvardytos 20 etalonini ų cheminių medžiag ų turi būti išbandytos 
bent trijose laboratorijose. Ta čiau, jei si ūlomas metodas bus taikomas tik 
vienoje laboratorijoje, tinkamumui patvirtinti bandymai keliose laboratori ­
jose nereikalingi. Vis d ėlto svarbu, kad tokius tinkamumo patvirtinimo 
tyrimus nepriklausomai įvertintų pripažintos tarptautin ės tvirtinimo institu ­
cijos, laikydamosi tarptautini ų rekomendacij ų (9). Kiekvienoje laboratori ­
joje visos 20 etalonini ų chemini ų medžiag ų turi būti išbandytos trimis 
skirtingomis bandym ų serijomis, atliekamomis su skirtingomis audini ų 
partijomis ir per pakankamai ilg ą laiko interval ą. Kiekvienos serijos 
metu turi b ūti lygiagre čiai išbandyti ne mažiau kaip trys audini ų kartotiniai 
bandiniai, skirti kiekvienai įtrauktai cheminei medžiagai, NC ir PC.  
9. Siūlomo metodo patikimumo ir tikslumo vert ės turi būti skaičiuojamos 
atsižvelgiant į visus keturis toliau nurodytus kriterijus, užtikrinant, kad 
patikimumo ir tinkamumo vert ės būtų apskaičiuojamos apibr ėžtu ir 
nuosekliu b ūdu: 
1. Metodo variantiškumui laboratorijoje bei tarp laboratorij ų ir prognoza ­
vimo gebai (tikslumui) apskai čiuoti tinka tik iki galo atlikt ų bandymų 
serijų duomenys.  
2. Galutin ė kiekvienos iš etalonini ų cheminių medžiagų klasifikacija kiek ­
vienoje dalyvaujan čioje laboratorijoje turi b ūti gaunama taikant gyvy ­
bingumo vidutin ę vertę, gautą iš skirting ų visos bandym ų serijos 
bandymų. 
3. Metodo variantiškumui tarp laboratorij ų apskaičiuoti tinka tik tie 
cheminių medžiag ų duomenys, kurie gauti iki galo atlikus bandym ų 
serijas visose dalyvaujan čiose laboratorijose.  
4. Tikslumo vert ės turi būti skaičiuojamos remiantis atskir ų laboratorij ų 
prognozėmis, kurias 20- čiai etalonini ų cheminių medžiag ų gavo skir ­
tingos dalyvaujan čios laboratorijos.  
Šiuo aspektu  bandym ų seką sudaro trys nepriklausomos serijos, vienoje 
laboratorijoje atliekamos su viena bandom ąja chemine medžiaga.  Iki galo 
atlikta seka  – tai vienos bandomosios chemin ės medžiagos bandym ų 
serijų seka vienoje laboratorijoje, kurios vis ų serijų rezultatai galiojantys. 
Tai reiškia, kad d ėl bet kurios negaliojan čios serijos tampa netinkami visos 
trijų serijų sekos rezultatai.  
Atkuriamumas laboratorijoje  
10. Atlikus atkuriamumo laboratorijoje įvertinimą, klasifikacij ų (JT GHS/ES 
KŽP 2-oji kategorija ir „n ėra kategorijos“), nustatyt ų skirtingomis neprik ­
lausomomis 20 etalonini ų cheminių medžiag ų bandymų serijomis vienoje 
laboratorijoje, sutapimas turi b ūti lygus arba didesnis ( ≥) kaip 90 %.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Tarplaboratorinis atkuriamumas  
11. Jei si ūlomas metodas bus taikomas tik vienoje laboratorijoje, tarplaborato ­
rinio atkuriamumo įvertinimas neb ūtinas. Jei metodai skirti naudoti skir ­
tingose laboratorijose, klasifikacij ų (JT GHS/ES KŽP 2-oji kategorija ir 
„nėra kategorijos“), nustatyt ų skirtingomis nepriklausomomis 20 etalonini ų 
cheminių medžiag ų bandymų serijomis ne mažiau kaip trijose laboratori ­
jose sutapimas turi b ūti lygus arba didesnis ( ≥) kaip 80 %.  
Prognozavimo geba (tikslumas)  
12. Siūlomo panašaus ar modifikuoto metodo tikslumas (jautrumas, specifiš ­
kumas ir bendras tikslumas) turi b ūti panašus ar geresnis už VRM rodik ­
lius, atsižvelgiant į papildom ą informacij ą, susijusią su dominan čios rūšies 
tinkamumu (2 lentel ė). Jautrumas turi b ūti lygus arba didesnis ( ≥) kaip 
80 % (2) (8) (23). Ta čiau papildomas specialus apribojimas taikomas 
pasiūlyto in vitro  metodo jautrumui, nes tik  in vivo  2-osios kategorijos 
cheminės medžiagos,  1-dekanolis  ir di-n-propil disulfidas , gali būti netei­
singai klasifikuotos kaip neturin čios kategorijos daugiau kaip vienoje daly ­
vaujančioje laboratorijoje. Specifiškumas turi b ūti lygus arba didesnis ( ≥) 
kaip 70 % (2) (8) (23). N ėra papildom ų apribojim ų siūlomo  in vitro  
metodo specifiškumui, t. y. bet kuri dalyvaujanti laboratorija gali netei ­
singai klasifikuoti bet kuri ą in vivo  kategorijos neturin čia chemin ę 
medžiagą, jei galutinis bandymo metodo specifiškumas atitinka priimtinas 
ribas. Bendras tikslumas turi b ūti lygus arba didesnis ( ≥) kaip 75 % (2) (8) 
(23). Nors 1 lentel ėje išvardyt ų 20 etalonini ų cheminių medžiag ų VRM 
jautrumas lygus 90 %, apibr ėžta mažiausia jautrumo vert ė bet kuriam 
panašiam ar modifikuotam metodui nustatyta 80 %, nes tiek 1-dekanolis  
(ribinė cheminė medžiaga), tiek  di-n-propil disulfidas  (klaidingai neigiama 
VRM medžiaga) žinomos kaip nedirginan čios žmon ėms (31) (32) (33), 
nors bandymuose su triušiais nustatytos kaip dirginan čios. Kadangi RhE 
modeliai grindžiami žmogaus kilm ės ląstelėmis, jie gali prognozuoti šias 
chemines medžiagas kaip nedirginan čias (JT GHS/ES KŽP „n ėra katego ­
rijos“).  
2 lentelė 
Būtinosios jautrumo, specifiškumo ir bendro tikslumo prognozin ės vertės, kad bet kuris 
panašus ar modifikuotas metodas b ūtų laikomas galiojan čiu 
Jautrumas  Specifiškumas  Bendras tikslumas  
≥ 80 %  ≥ 70 %  ≥ 75 %  
Tyrimo priimtinumo kriterijai  
13. Gali b ūti, kad vienas ar keli bandymai, skirti vienai ar kelioms bandomo ­
sioms chemin ėms medžiagoms, neatitinka bandymo priimtinumo kriterij ų, 
skirtų bandomosioms ir kontrolin ėms medžiagoms, arba yra nepriimtini d ėl 
kitų priežasčių. Trūkstamiems duomenims gauti, kiekvienai bandomajai 
cheminei medžiagai leidžiama atlikti iki dviej ų papildom ų bandym ų 
(„pakartotinis bandymas“). Tiksliau sakant, kadangi, bandant pakartotinai, reikia lygiagre čiai bandyti ir PC bei NC, kiekvienai bandomajai cheminei 
medžiagai leidžiama atlikti iki dviej ų papildom ų bandymų serijų.
 
14. Suprantama, kad, net ir atlikus pakartotinius bandymus, mažiausias trij ų 
galiojančių serijų skaičius kiekvienai išbandytai cheminei medžiagai n ėra 
gaunamas su kiekviena etalonine chemine medžiaga kiekvienoje dalyvau ­
jančioje laboratorijoje, tod ėl duomen ų matrica gaunama ne visa. Tokiais 
atvejais, kad duomen ų rinkiniai b ūtų laikomi priimtinais, turi b ūti laiko­
masi visų šių trijų kriterijų: 
1. Su visomis 20 etalonini ų cheminių medžiag ų turi būti iki galo atlikta 
bent viena visa bandym ų serijų seka.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. Kiekvienoje iš trij ų dalyvaujan čių laboratorij ų, ne mažiau kaip 85 % 
serijų sekų turi būti iki galo atliktos (20 chemini ų medžiag ų; t. y. 
vienoje laboratorijoje leidžiamos trys negaliojan čios bandym ų serijų 
sekos).  
3. Turi b ūti iki galo atlikta ne mažiau kaip 90 % vis ų galimų serijų sekų 
bent trijose laboratorijose (kai 20 chemini ų medžiag ų bandomos 3 
laboratorijose; t. y. iš viso leidžiamos 6 negaliojan čios bandym ų serijų 
sekos).  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B.47.  GALVIJ Ų RAGENOS PADRUMST ĖJIMO IR PRALAIDUMO 
BANDYMO METODAS AKIS ĖSDINAN ČIOMS IR STIPRIAI 
DIRGINAN ČIOMS MEDŽIAGOMS NUSTATYTI  
ĮVADAS  
1. Galvij ų ragenos padrumst ėjimo ir pralaidumo (angl.  Bovine Corneal 
Opacity and Permeability , BCOP) bandymo metodas yra  in vitro  bandymo 
metodas, kur į tam tikromis aplinkyb ėmis ir su tam tikrais apribojimais 
galima taikyti chemines medžiagas ir mišinius klasifikuojant kaip „akis 
ėsdinančias ir stipriai dirginan čias medžiagas“ (1) (2) (3). Pagal š į 
bandymų metodą stipriai dirginan čios medžiagos apibr ėžiamos kaip 
medžiagos, sukelian čios akių pažeidimus, kurie triušiui nepraeina per 21 
dieną po paveikimo ta medžiaga. Nors BCOP bandymas n ėra laikomas 
tinkamu visiškai pakeisti triušio akies  in vivo  bandymą, šį bandymą reko­
menduojama atlikti kaip vien ą iš pakopin ės bandymo strategijos, taikomos 
reguliavimo tikslais klasifikuojant ir ženklinant tam tikroje srityje naudo ­
jamas medžiagas, sudedam ųjų dalių (4) (5). Bandom ąsias medžiagas ir 
mišinius (6) galima klasifikuoti kaip akis ėsdinančias arba stipriai dirgi ­
nančias medžiagas neatliekant papildom ų bandymų su triušiais. Chemin ė 
medžiaga, kurios bandymo rezultatai neigiami, tur ėtų būti išbandyta su 
triušiais, taikant nuosekli ąją bandymų metodiką, aprašytą OECD bandym ų 
gairėse Nr. 405 (7) (šio priedo B.5 skyrius).  
2. Šio bandymo metodo paskirtis – aprašyti proced ūras, taikomas vertinant, 
ar bandomoji medžiaga gali sukelti ėsdinimą arba stipr ų dirginim ą, spren­
džiant pagal jos geb ėjimą sukelti izoliuotos galvijo ragenos padrumst ėjimą 
arba didesn į pralaidum ą. Toksinis poveikis ragenai vertinamas pagal: i) 
sumažėjusią šviesos skvarb ą (padrumst ėjimą) ir ii) padid ėjusią fluoresceino 
natrio druskos dažiklio skvarb ą (pralaidum ą). Bandom ąja medžiaga 
paveiktos ragenos padrumst ėjimo ir pralaidumo vertinimo rezultatai susu ­
muojami siekiant apskai čiuoti in vitro  dirginimo skaitin ę vertę (angl.  In 
Vitro Irritancy Score , IVIS), kuri naudojama klasifikuojant bandomosios 
medžiagos dirginimo lyg į. 
3. Akis dirginan čios medžiagos, sukelian čios akių pažeidimus, kurie praeina 
mažiau kaip per 21 dien ą, ir akių nedirginan čios medžiagos taip pat buvo 
išbandytos taikant BCOP bandymo metod ą. Tačiau BCOP bandymo 
metodo tikslumas ir patikimumas bandant ši ų kategorij ų chemines 
medžiagas n ėra oficialiai įvertintas.  
4. Apibr ėžtys pateiktos 1 pried ėlyje. 
PRADINIAI SVARSTYMAI IR APRIBOJIMAI  
5. Šis bandymo metodas pagr įstas Alternatyvi ų metodų patvirtinimo tarpži ­
nybinio koordinavimo komiteto (angl.  Interagency Coordinating 
Committee on the Validation of Alternative Methods , ICCVAM) BCOP 
bandymo metodo protokolu (8), parengtu atlikus tarptautin į patvirtinimo 
tyrimą (4) (5) (9), padedant Europos alternatyvi ų metodų patvirtinimo 
centrui (angl.  European Centre for the Validation of Alternative Methods , 
ECVAM) bei Japonijos alternatyvi ų metodų patvirtinimo centrui (angl.  
Japanese Centre for the Validation of Alternative Methods , JaCVAM). 
Šis protokolas parengtas remiantis informacija, gauta iš In vitro bandym ų 
metodų instituto (angl.  Institute for In Vitro Sciences , IIVS) ir iš 
INVITTOX protokolo Nr. 124 (10), kuris buvo naudojamas 1997–1998 m. atliekant Europos bendrijos finansuot ą BCOP bandymo metodo preli ­
minaraus patvirtinimo tyrim ą. Abu šie protokolai parengti remiantis BCOP 
bandymo metodika, kuri ą pirmasis apraš ė Gautheron  et al.  (11).
 ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
6. Nustatyti šio metodo apribojimai susij ę su didele klaidingai teigiam ų rezul­
tatų dalimi alkoholi ų bei keton ų atveju ir didele klaidingai neigiam ų rezul­
tatų dalimi kiet ųjų medžiag ų atveju, kaip nurodyta patvirtinimo duomen ų 
bazėje (žr. 44 skirsn į) (5). Iš duomen ų bazės pašalinus ši ų cheminių ir 
fizikinių kategorij ų chemines medžiagas, BCOP bandymo metodo tiks ­
lumas pagal ES, EPA ir GHS klasifikavimo sistemas iš esm ės pagerėjo 
(5). Remiantis ši ų bandymų tikslu (t. y. tiktai nustatyti akis ėsdinančias ir 
(arba) stipriai dirginan čias medžiagas), klaidingi neigiami rezultatai neturi 
lemiamos reikšm ės, nes šios chemin ės medžiagos v ėliau bus išbandytos su 
triušiais arba taikant kitus deramai patvirtintus  in vitro  bandymus, atsiž ­
velgiant į reguliavimo reikalavimus ir taikant nuosekli ąją bandymo meto ­
diką pagal įrodomosios duomen ų galios metod ą. Be to, naudojant dabar ­
tinę patvirtinimo duomen ų bazę negalima deramai įvertinti tam tikr ų klasių 
cheminių medžiag ų arba produkt ų (pvz., mišini ų). Tačiau tyrėjai galėtų 
apsvarstyti šio bandymo metodo taikymo vis ų tipų bandomosioms medžia ­
goms (įskaitant mišinius) galimybes, kai teigiamas rezultatas gal ėtų būti 
priimtas kaip orientacinis aki ų ėsdinimo arba stipraus dirginimo atsakas. 
Tačiau teigiami rezultatai, gauti bandant alkoholius arba ketonus, tur ėtų 
būti aiškinami atsargiai, vengiant nepagr įstų prognozi ų. 
7. Visos proced ūros su galvij ų akimis ir galvij ų ragenomis tur ėtų būti atlie­
kamos pagal bandym ų laboratorijos taisykles ir proced ūras, taikytinas 
gyvūninės kilmės medžiagoms, įskaitant audinius ir audini ų skysčius, bet 
neapsiribojant tik jais. Rekomenduojama laikytis bendr ųjų laboratorijose 
taikytinų atsargumo priemoni ų (12).  
8. Šio bandymo metodo apribojimas yra tas, kad, nors pagal j į ir atsižvel ­
giama į tam tikr ą poveikį akims, vertinam ą pagal triušio aki ų dirginimo 
bandymo metod ą, ir iš dalies į to poveikio lyg į, pagal šį metodą neatsiž­
velgiama į akies jungin ės ir rainel ės pažeidimus. Be to, nors pagal BCOP 
bandymo metod ą ir negalima įvertinti ragenos pažeidim ų grįžtamumo  per 
se, pasiūlyta, remiantis triušio aki ų tyrimais, pagal pradin į ragenos pažei ­
dimų gylio vertinim ą nustatyti, ar poveikis negr įžtamas, ar gr įžtamas (13). 
Galiausiai pagal BCOP bandymo metod ą negalima įvertinti galimo siste ­
minio toksiškumo, susijusio su poveikiu akims.  
9. Toliau dedamos pastangos siekiant geriau apib ūdinti BCOP bandymo 
metodo naudingum ą ir apribojimus, j į naudojant silpnai dirginan čioms ir 
nedirginan čioms medžiagoms nustatyti (taip pat žr. 45 skirsn į). Be to, 
naudotojai kvie čiami teikti patvirtinimo organizacijoms pavyzdžius ir 
(arba) duomenis, kuriais remiantis b ūtų galima oficialiai įvertinti galim ą 
būsimą BCOP bandymo metodo paskirt į, įskaitant silpnai dirginan čių 
medžiagų ir nedirginan čių medžiag ų nustatym ą. 
10. Kiekviena laboratorija, pradedanti taikyti š į bandymo metod ą, turėtų 
naudoti 2 pried ėlyje nurodytas patikros chemines medžiagas (angl.  profi­
ciency substances ). Laboratorija gali naudoti šias chemines medžiagas 
norėdama įrodyti savo technin ę kompetencij ą taikyti BCOP bandymo 
metodą, prieš pateikdama BCOP bandymo duomenis teis ės aktuose numa ­
tytais pavoj ų klasifikavimo tikslais.  
BANDYMO PRINCIPAS  
11. BCOP bandymo metodas yra tipinis konkretaus organo tyrimo modelis, 
pagal kur į galima išsaugoti normal ų trumpalaik į fiziologin į ir biochemin į 
galvijų ragenos funkcionavim ą in vitro . Pagal šį bandymo metod ą bando­
mosios medžiagos sukeltas pažeidimas nustatomas kiekybiškai įvertinant 
ragenos padrumst ėjimo ir pralaidumo poky čius, atitinkamai naudojant 
drumsties matuokl į (angl.  opacitometer ) ir regimosios šviesos spektrofoto ­
metrą. Abu matavimai atliekami siekiant apskai čiuoti IVIS, kuri naudo ­
jama  in vitro  dirginimo pavojaus kategorijai nustatyti, kad b ūtų galima 
prognozuoti bandomosios medžiagos geb ą dirginti akis  in vivo  (žr. „Spren ­
dimo kriterijai“).  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. Pagal BCOP bandymo metod ą naudojamos izoliuotos ragenos, paimtos iš 
ką tik paskerst ų galvijų akių. Ragenos padrumst ėjimas kiekybiškai įverti­
namas matuojant ragenos praleidžiam ą šviesos kiek į. Ragenos pralaidumas 
kiekybiškai įvertinamas kaip fluoresceino natrio druskos dažiklio kiekis, 
prasiskverb ęs per vis ą ragenos stor į, matuojant užpakalin ės kameros 
terpėje. Bandomosios medžiagos uždedamos ant ragenos epitelio pavir ­ 
šiaus jos įdedant į ragenos laikiklio priekin ę kamerą. 3 priedėlyje pateiktas 
ragenos laikiklio, naudojamo atliekant BCOP bandym ą, aprašas ir schema. 
Ragenų laikiklių galima įsigyti iš įvairių komercini ų šaltinių arba pasida ­
ryti. 
Galvijų akių šaltinis bei amžius ir gyv ūnų rūšies pasirinkimas  
13. Į skerdyklas atvežti galvijai paprastai paskerdžiami vartoti žmon ėms arba 
kitais komerciniais tikslais. Kaip BCOP bandymams skirt ų ragenų šaltinis 
gali būti naudojami tik sveiki gyv ūnai, kurie laikomi tinkamais naudoti 
žmonių maisto grandin ėje. Kadangi galvij ų svorio intervalas gana didelis ir 
priklauso nuo veisl ės, amžiaus bei lyties, rekomenduojamo skerdžiamo 
gyvūno svorio nenustatyta.  
14. Ragen ų dydžiai gali skirtis d ėl gyvūnų amžiaus skirtumo. Ragenos, kuri ų 
horizontalus skersmuo didesnis kaip 30,5 mm, o ragenos storis per vidur į 
ne mažesnis kaip 1 100 μm, paprastai gaunamos iš senesni ų kaip aštuo ­
nerių metų galvijų, o ragenos, kuri ų horizontalus skersmuo mažesnis kaip 
28,5 mm, o ragenos storis per vidur į mažesnis kaip 900 μm, paprastai 
gaunamos iš jaunesni ų kaip penkeri ų metų galvijų (14). Dėl šios priežas ­
ties senesni ų kaip 60 m ėnesių galvijų akys paprastai nenaudojamos. 
Galvijų, kurių amžius mažesnis kaip 12 m ėnesių, akys paprastai neb ūdavo 
naudojamos, nes jos dar nevisiškai išsivys čiusios, ir j ų ragenos storis bei 
skersmuo yra gerokai mažesni nei suaugusi ų galvijų. Tačiau jaunų gyvūnų 
(t. y. 6–12 m ėnesių) ragenas naudoti leidžiama, nes j ų naudojimas teikia 
tam tikrų pranašum ų, pvz., jų lengviau gauti, amžiaus intervalas yra nedi ­
delis ir darbuotojams kyla mažiau pavoj ų, susijusių su galvij ų spongifor ­
minės encefalopatijos poveikiu (15). Kadangi b ūtų naudinga geriau įver­
tinti ragenos dydžio arba storio s ąryšį su ėsdinančių ir dirginan čių 
medžiagų poveikiu, naudotojai kvie čiami teikti duomenis apie apytiksl į 
gyvūnų, iš kurių gautos per tyrim ą naudotos ragenos, amži ų ir (arba) svor į. 
Akių rinkimas ir gabenimas į laboratorij ą 
15. Akis surenka skerdykl ų darbuotojai. Kad mechaninis ir kitoks aki ų pažei­
dimas būtų kuo mažesnis, gyv ūną paskerdus, akys turi b ūti išimamos kuo 
greičiau. Kad ant aki ų nepatekt ų galinčių dirginti chemini ų medžiag ų, 
skerdyklų darbuotojai tur ėtų nenaudoti valikli ų gyvūno galvai nuplauti.  
16. Akys turi b ūti visiškai panardintos į Hankso subalansuot ą druskos tirpal ą 
(angl.  Hanks’ Balanced Salt Solution , HBSS), supilt ą į tinkamo dydžio 
talpyklą, ir vežamos į laboratorij ą taip, kad b ūtų kuo mažiau pažeistos ir 
(arba) užkr ėstos bakterijomis. Kadangi akys renkamos skerdžiant gyv ūnus, 
jos gali b ūti išteptos krauju ir kitomis biologin ėmis medžiagomis, įskaitant 
bakterijas ir kitus mikroorganizmus. Tod ėl svarbu užtikrinti, kad užteršimo 
pavojus b ūtų kuo mažesnis (pvz., laikant ind ą su akimis ant dr ėgno ledo, į 
HBSS, naudojam ą vežant akis, įdedant antibiotik ų [pvz., 100 IU/mL peni ­
cilino ir 100 μg/mL streptomicino]).  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Laikotarpis nuo aki ų surinkimo iki ragen ų panaudojimo per BCOP 
bandymą turėtų būti kuo mažesnis (paprastai renkama ir naudojama t ą 
pačią dieną), ir turi b ūti įrodyta, kad šis laiko tarpas netur ės neigiamos 
įtakos bandymo rezultatams. Šie rezultatai grindžiami aki ų atrankos krite ­
rijais ir atsaku į teigiamas bei neigiamas kontrolines medžiagas. Visos 
akys, naudojamos atliekant bandym ą, turėtų būti iš to paties tam tikr ą 
dieną surinktos aki ų rinkinio.  
BCOP bandymui skirt ų akių atrankos kriterijai  
18. Akis atvežus į laboratorij ą, atidžiai apži ūrima, ar jos neturi tr ūkumų, įskai­
tant padid ėjusį drumstum ą, įbrėžimus ir neovaskuliarizacij ą. Turėtų būti 
naudojamos tik toki ų trūkumų neturinčių akių ragenos.  
19. Be to, v ėliau, per tam tikrus bandymo etapus, įvertinama kiekvienos 
ragenos kokyb ė. Ragenos, kuri ų padrumst ėjimas po pradinio vienos 
valandos trukm ės kalibravimo laikotarpio yra didesn ė kaip septyni drums ­
ties vienetai, atmetamos (PASTABA: drumsties matuoklis tur ėtų būti kali­
bruotas pagal standartus, taikomus drumsties vienetams nustatyti, žr. 3 priedėlį).
 
20. Kiekviena apdorojam ų (bandom ąja medžiaga, kartu naudojamomis neigia ­
momis ir teigiamomis kontrolin ėmis medžiagomis) m ėginių grupė turi būti 
sudaryta ne mažiau kaip iš trij ų akių. Atliekant BCOP bandym ą trys 
ragenos tur ėtų būti apdorojamos neigiamomis kontrolin ėmis medžiagomis. 
Kadangi visos ragenos yra išimamos iš viso akies obuolio ir įdedamos į 
ragenų kameras, gali likti ši ų žmogaus veiksm ų padarini ų, kurie tur ės 
įtakos kai kuri ų ragenų padrumst ėjimo ir pralaidumo vert ėms (atsižvelgiant 
į neigiamas kontrolines medžiagas). Be to, padrumst ėjimo ir pralaidumo 
vertės, gautos naudojant neigiamas kontrolines grupes, naudojamos bando ­
mosios medžiagos ir teigiamos kontrolin ės grupės padrumst ėjimo ir pralai ­
dumo vert ėms, naudojamoms apskai čiuojant IVIS vertes, pakoreguoti.  
EIGA  
Akių paruošimas  
21. Trūkumų neturinčios ragenos, stengiantis nepažeisti ragenos epitelio ir 
endotelio, išpjaunamos su 2–3 mm plo čio skleros apvadu, kuris palie ­
kamas tam, kad v ėliau būtų patogiau paimti ragen ą. Izoliuotos ragenos 
įdedamos į specialius ragen ų laikiklius, sudarytus iš priekini ų ir užpaka ­
linių kamerų, kurios lie čiasi su atitinkamai ragenos epitelio ir endotelio 
paviršiumi. Abi kameros iki viršaus pripildomos pašildyta Eagle’o mini ­
malia pagrindine terpe (angl.  Eagle's Minimum Essential Medium , EMEM) 
(pirmiau užpakalin ė kamera) taip, kad nesusidaryt ų burbulų. Tada ne trum ­
piau kaip vien ą valandą palaikoma 32 ± 1 °C įtaiso temperat ūra, kad 
susilygint ų ragenų bei terp ės temperat ūra ir, kiek tai įmanoma, b ūtų 
pasiektas normalus medžiag ų apykaitos aktyvumas (apytiksl ė ragenos 
paviršiaus temperat ūra in vivo  yra 32 °C).  
22. Po temperat ūros nusistov ėjimo laikotarpio, abi kameros pripildomos naujos 
pašildytos EMEM, ir registruojami pamatiniai kiekvienos ragenos padrumstėjimo rodmenys. Visos ragenos, turin čios makroskopini ų audinio 
pažeidimų (pvz., įbrėžimų, pigmento sankaup ų, neovaskuliarizacijos 
požymių) arba kuri ų drumstis yra didesn ė kaip septyni drumsties vienetai, 
atmetamos. Apskai čiuojama vis ų stabilios b ūsenos ragen ų drumsties vidu ­
tinė vertė. Ne mažiau kaip trys ragenos, kuri ų drumsties vert ės yra artimos 
vidutinei vis ų ragenų drumsties vertei, pasirenkamos kaip neigiama (arba 
tirpiklio) kontrolin ė mėginių grupė. Likusios ragenos padalijamos į bando­
mąją grupę ir teigiam ą kontrolin ę grupę.
 ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Kadangi vandens šilumin ė talpa didesn ė už oro, vanduo užtikrina stabi ­
lesnę inkubacin ę temperat ūrą. Todėl ragenos laikikl į ir jo turin į rekomen ­
duojama laikyti vandens vonioje, kurioje b ūtų palaikoma 32 ± 1 °C tempe ­
ratūra. Tačiau gali b ūti naudojami ir oro inkubatoriai, jeigu bus imtasi 
priemonių vienodai temperat ūrai palaikyti (pvz., iš anksto pašildant laikik ­
lius ir terp ę). 
Bandomosios medžiagos užd ėjimas  
24. Taikomi du skirtingi apdorojimo protokolai: vienas – skys čiams ir pavir ­ 
šinio aktyvumo medžiagoms (kietosioms medžiagoms arba skys čiams), 
kitas – kietosioms ne paviršinio aktyvumo medžiagoms.  
25. Skys čiai bandomi neskiesti, o paviršinio aktyvumo medžiagos – naudojant 
10 proc. koncentracijos tirpal ą (pagal mas ę), medžiag ą ištirpinant 0,9 % 
natrio chlorido tirpale, distiliuotame vandenyje arba kitame tirpiklyje, 
kuris, kaip buvo įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai. 
Pusiau kietosios medžiagos, tepalai ir vaškai paprastai bandomi kaip skys ­ 
čiai. Jeigu naudojama kitokia skiedimo koncentracija, tai turi b ūti deramai 
pagrįsta. Ragenos veikiamos skys čiais ir paviršinio aktyvumo medžia ­
gomis 10 minu čių. Jeigu taikoma kitokia poveikio trukm ė, tai turi b ūti 
tinkamai moksliškai pagr įsta. 
26. Nepaviršinio aktyvumo medžiagos paprastai bandomos naudojant 20 proc. 
koncentracijos tirpalus arba suspensijas, pagamintus medžiag ą ištirpinus 
0,9 % natrio chlorido tirpale, distiliuotame vandenyje arba kitame tirpik ­
lyje, kuris, kaip buvo įrodyta, neturi neigiamo poveikio bandymo sistemai. 
Tam tikromis aplinkyb ėmis ir pateikus deram ą mokslinį pagrindim ą, kieto­
sios medžiagos taip pat gali b ūti bandomos neatskiestos, jas tiesiogiai 
uždedant ant ragenos paviršiaus, taikant atviros kameros metod ą (žr. 29 
skirsnį). Ragenos veikiamos kietosiomis medžiagomis keturias valandas, 
tačiau skysčių ir aktyvi ųjų paviršiaus medžiag ų atveju gali b ūti taikoma 
kitokia poveikio trukm ė, pateikiant tinkam ą mokslinį pagrindim ą. 
27. Atsižvelgiant į bandomosios medžiagos fizikines ir chemines savybes 
(pvz., ar tai kietoji medžiaga, ar klampus arba neklampus skystis), galima 
taikyti įvairius apdorojimo b ūdus. Pagrindinis kriterijus – užtikrinti, kad 
bandomoji medžiaga tinkamai padengt ų epitelio pavirši ų ir kad ji b ūtų 
gerai nuvalyta per plovimo etapus. Neklampiems ir mažai klampiems 
skysčiams paprastai taikomas uždaros kameros metodas, o pusiau klam ­
pioms bei klampioms skystoms bandomosioms medžiagoms ir neatskies ­
toms kietosioms medžiagoms – atviros kameros metodas.  
28. Pagal uždaros kameros metod ą bandomosios medžiagos kiekis, kurio 
pakanka ragenos epitelio paviršiui padengti (750 μL), įdedamas į priekinę 
kamerą per dozavimo angas, esan čias viršutiniame kameros paviršiuje; 
veikimo laikotarpiui kameros angos uždaromos. Svarbu užtikrinti, kad kiekviena ragena b ūtų veikiama bandom ąja medžiaga tinkam ą laiko tarp ą.
 
29. Pagal atviros kameros metod ą prieš apdorojim ą iš priekin ės kameros 
išimamas lango užrakto žiedas ir stiklinis langas. Kontrolin ė arba bando ­
moji medžiaga (750 μL arba toks bandomosios medžiagos kiekis, kurio 
pakaktų visai ragenai padengti) tiesiogiai uždedama ant ragenos epitelio 
paviršiaus naudojant mikropipet ę. Jeigu bandom ąją medžiag ą sunku 
įtraukti į pipetę, bandomoji medžiaga gali b ūti spaudimo b ūdu įstumiama 
į stūmoklinę pipetę, naudojam ą dozuojant. St ūmoklinės pipetės galas 
įkišamas į švirkšto dozavimo galiuk ą taip, kad chemin ę medžiag ą spau­
dimo būdu būti galima įšvirkšti į stūmoklinės pipetės galiuką. Švirkšto 
stūmoklis stumiamas, tuo pat metu pipet ės stūmoklį traukiant į viršų. 
Jeigu pipet ės galiuke atsiranda oro burbuliuk ų, bandomoji medžiaga paša ­
linama (išstumiama), ir proced ūra kartojama tol, kol galiukas užpildomas 
be oro burbuliuk ų. Prireikus gali b ūti naudojamas įprastas švirkštas (be 
adatos), kadangi j į naudojant galima tiksliai išmatuoti bandomosios 
medžiagos kiek į ir lengviau padengti ragenos epitelio pavirši ų. Baigus 
dozuoti, stiklinis langas įdedamas atgal į priekinę kamerą, taip vėl atku­
riant uždar ą sistemą. ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Inkubacija pasibaigus veikimui medžiaga  
30. Pasibaigus veikimo laikotarpiui, bandomoji medžiaga, neigiama kontrolin ė 
medžiaga arba teigiama kontrolin ė medžiaga pašalinama iš priekin ės 
kameros, epitelis nuplaunamas ne mažiau kaip tris kartus (arba kol nelieka matomų bandomosios medžiagos žymi ų) naudojant EMEM (kurios sud ė­
tyje yra raudonojo fenolio). Nuplovimui naudojama terp ė, kurios sud ėtyje 
yra raudonojo fenolio, nes taip galima steb ėti raudonojo fenolio spalvos 
pokytį ir nustatyti r ūgštinių arba šarmini ų medžiag ų nuplovimo veiksmin ­
gumą. Jeigu raudonasis fenolis vis dar praranda spalv ą (yra geltonas arba 
purpurinis) arba jeigu bandomoji medžiaga yra vis dar matoma, ragenos 
plaunamos daugiau kaip tris kartus. Iš terp ės pašalinus bandom ąją 
medžiagą, ragenos paskutin į kartą nuplaunamos naudojant EMEM (be 
raudonojo fenolio). EMEM (be raudonojo fenolio) paskutiniam plovimui naudojama tam, kad prieš drumsties matavim ą raudonasis fenolis tikrai 
būtų pašalintas iš priekin ės kameros. Tada priekin ė kamera iš naujo pripil ­
doma nauja EMEM be raudonojo fenolio.
 
31. Jeigu bandymas atliekamas naudojant skys čius arba paviršinio aktyvumo 
medžiagas, nuplautos ragenos dar dvi valandas laikomos 32 ± 1 °C tempe ­
ratūroje. Tam tikrais atvejais ragenas gali b ūti naudinga palaikyti ir ilgiau 
nei dvi valandas po veikimo bandom ąja medžiaga; d ėl to sprendžiama 
kiekvienu konkre čiu atveju. Ragenos, kurios buvo veikiamos kietosiomis 
medžiagomis, pasibaigus keturi ų valandų veikimo laikotarpiui kruopš čiai 
nuplaunamos, bet papildomai inkubuoti j ų nereikia.  
32. Pasibaigus inkubacijos laikotarpiui, jeigu bandymai atliekami su skys čiais 
ir paviršinio aktyvumo medžiagomis, ir pasibaigus keturi ų valandų 
veikimo laikotarpiui, jeigu bandymai atliekami su kietosiomis nepaviršinio aktyvumo medžiagomis, registruojamas kiekvienos ragenos padrumst ė­
jimas ir pralaidumas. Be to, kiekviena ragena apži ūrima vizualiai ir regist ­
ruojamos susijusios pastabos (pvz., audinio nusilupimas, bandomosios 
medžiagos liku čiai, nevienodas padrumst ėjimas). Šios pastabos gali b ūti 
svarbios, nes jos gali b ūti susijusios su drumsties matuoklio rodmen ų 
svyravimais.
 
Kontrolin ės medžiagos  
33. Per kiekvien ą bandym ą kartu naudojamos neigiamos kontrolin ės 
medžiagos arba tirpiklis (nešiklis) bei teigiamos kontrolin ės medžiagos.  
34. Kai bandoma 100 % grynumo skysta chemin ė medžiaga, pagal BCOP 
bandymo metod ą kartu naudojama neigiama kontrolin ė medžiaga (pvz., 
0,9 % natrio chlorido tirpalas arba distiliuotas vanduo), kad bandymo sistemoje b ūtų galima aptikti netipinius poky čius ir gauti pamatinius 
duomenis, kuriais remiantis b ūtų galima įvertinti bandymo rezultatus. Be 
to, taip užtikrinama, kad bandymo s ąlygos netur ėtų netinkamos įtakos 
atsakui į dirginim ą.
 
35. Kai bandoma atskiesta skysta, paviršinio aktyvumo arba kietoji chemin ė 
medžiaga, pagal BCOP bandymo metod ą tuo pat metu išbandoma tirpiklio 
(nešiklio) kontrolin ė mėginių grupė, kad bandymo sistemoje b ūtų galima 
aptikti netipinius poky čius ir gauti pamatinius duomenis, kuriais remiantis 
būtų galima įvertinti bandymo rezultatus. Galima naudoti tik tokius tirpik ­
lius (nešiklius), kurie, kaip buvo įrodyta, neturi neigiamos įtakos bandymo 
sistemai.  
36. Norint patikrinti, ar sukeliamas tinkamas atsakas, per kiekvien ą bandymą 
tuo pat metu patikrinama teigiama kontrolin ė medžiaga, kuri yra žinoma 
kaip akis dirginanti medžiaga. Kadangi pagal š į bandymo metod ą BCOP 
bandymas atliekamas siekiant nustatyti ėsdinančias arba stipriai dirginan ­ 
čias medžiagas, geriausia kaip teigiam ą kontrolin ę medžiagą naudoti etalo ­
ninę cheminę medžiag ą (angl.  reference substance ), kuri naudojama pagal 
šį bandymo metod ą sukelia stipr ų atsaką. Tačiau norint užtikrinti galimyb ę 
įvertinti atsako į teigiamą kontrolin ę medžiag ą kaitą per tam tikr ą laiką, 
dirginamasis poveikis netur ėtų būti pernelyg stiprus.  
37. Pavyzdžiui, bandant skystas medžiagas tinkamos naudoti teigiamos kontro ­
linės medžiagos yra dimetilformamidas arba 1 % natrio hidroksidas. 
Bandant kietas medžiagas tinkamos naudoti teigiamos kontrolin ės 
medžiagos pavyzdys yra 20 % (m/t) imidazolis 0,9 % natrio chlorido 
tirpale.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Lyginamosios chemin ės medžiagos (angl.  benchmark substances ) yra 
naudingos norint įvertinti tam tikrai chemini ų medžiag ų arba produkt ų 
kategorijai priskiriam ų nežinom ų chemini ų medžiag ų akių dirginimo 
potencialą arba santykin į akis dirginan čios medžiagos dirginimo potencial ą 
tam tikrame atsako į dirginim ą intervale.  
Išmatuoti rezultatai  
39. Padrumst ėjimas nustatomas pagal ragenos praleidžiam ą šviesos kiek į. 
Ragenos padrumst ėjimas kiekybiškai vertinamas naudojant drumsties 
matuoklį, kuriuo gaunamos drumsties vert ės tolydžioje skal ėje. 
40. Pralaidumas nustatomas pagal fluoresceino natrio druskos dažiklio kiek į, 
prasiskverbus į per visus ragenos l ąstelių sluoksnius (t. y. nuo išorinio 
ragenos paviršiaus epitelio per vidinio ragenos paviršiaus endotel į). Į prie­
kinę ragenos laikiklio kamer ą, kuri liečiasi su ragenos epitelio paviršiumi, 
įpilama 1 mL fluoresceino natrio druskos tirpalo (4 arba 5 mg/mL, kai 
atitinkamai bandomos skystos ir paviršinio aktyvumo medžiagos arba nepaviršinio aktyvumo medžiagos), o į užpakalin ę kamerą, kuri lie čiasi 
su ragenos endotelio paviršiumi, pripilama naujos EMEM. Tada laikiklis 
horizontalioje pad ėtyje 90 ± 5 min. laikomas 32 ± 1 °C temperat ūroje. 
Naudojant UV/VIS spektrofotometrijos metodik ą, išmatuojamas fluores ­
ceino natrio druskos, prasiskverbusios į užpakalin ę kamerą, kiekis. Spek ­
trofotometrinio matavimo duomenys, gauti naudojant 490 nm ilgio bangas, 
registruojami kaip optinio tankio (OD
 490 ) arba sugerties vert ės, išmatuotos 
tolydžioje skal ėje. Fluoresceino pralaidumo vert ės nustatomos kaip OD  490 
vertės, išmatuotos regimosios šviesos spektrofotometru, taikant standartin į 
1 cm storio sluoksn į. 
41. Arba galima naudoti 96 duobu čių mikrotitravimo l ėkštelės skaitytuv ą, 
jeigu: i) galima nustatyti l ėkštelės skaitytuvo, skirto fluoresceino OD  490 
vertėms nustatyti, tiesin į intervalą ir ii) 96 duobu čių plokštelėje, naudoja ­
moje OD  490 vertėms, atitinkan čioms standartin į 1 cm storio sluoksn į, 
nustatyti, naudojamas tinkamas fluoresceino m ėginių kiekis (tam gali 
reikėti pilnai pripildyti duobut ę [įprastas kiekis – 360 μL]). 
DUOMENYS IR J Ų TEIKIMAS  
Duomenų vertinimas  
42. Padrumst ėjimo ir vidutinio pralaidumo (OD  490 ) vertes pakoregavus atsiž ­
velgiant į normalios drumsties ir neigiamos kontrolin ės medžiagos pralai ­
dumo OD  490 vertes, kiekvienos apdorot ų mėginių grupės vidutin ės 
padrumstėjimo ir pralaidumo OD  490 vertės turi būti įrašytos į empiriniu 
būdu gautą formulę, skirtą kiekvienos apdorot ų mėginių grupės in vitro  
dirginimo skaitinei vertei (IVIS) apskai čiuoti:  
IVIS = vidutin ė padrumst ėjimo vert ė + (15 × vidutin ė pralaidumo OD  490 
vertė). 
Sina et al.  (16) nurod ė, kad ši formul ė buvo gauta atliekant vidaus ir 
tarplaboratorinius tyrimus. Buvo atlikta duomen ų, gautų atlikus 36 
junginių serijos tyrim ą daugelyje laboratorij ų, daugiavariant ė analizė, 
siekiant gauti geriausiai  in vivo  ir in vitro  duomenis atitinkan čią lygtį. 
Šią analizę atlikę dviejų skirtingų bendrovi ų mokslininkai gavo beveik 
tapačias lygtis.  
43. Be to, padrumst ėjimo ir pralaidumo vert ės turėtų būti įvertintos atskirai, 
siekiant nustatyti, ar bandomoji medžiaga suk ėlė ėsdinimą arba stipr ų 
dirginimą vien dėl padrumst ėjimo arba vien d ėl pralaidumo rezultat ų (žr. 
„Sprendimo kriterijai“).  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Sprendimo kriterijai  
44. Chemin ė medžiaga, kurios IVIS ne mažesn ė kaip 55,1, laikoma ėsdinančia 
arba stipriai dirginan čia medžiaga. Kaip nurodyta 1 skirsnyje, jeigu nenus ­
tatoma, kad chemin ė medžiaga yra akis ėsdinanti arba stipriai dirginanti 
medžiaga, klasifikavimo ir ženklinimo tikslais tur ėtų būti atlikti papildomi 
bandymai. Lyginant su triušio akies  in vivo  bandymo metodo duomenimis, 
klasifikuojamais pagal EPA (1), ES (2) arba GHS (3) klasifikavimo 
sistemas, bendras BCOP bandymo metodo tikslumas – nuo 79 % (113/143) iki 81 % (119/147), klaidingai teigiam ų rezultatų dalis – nuo 
19 % (20/103) iki 21 % (22/103), klaidingai neigiam ų rezultatų dalis – nuo 
16 % (7/43) iki 25 % (10/40). Iš duomen ų bazės pašalinus tam tikr ų 
cheminių (pvz., alkoholius, ketonus) arba fizikini ų (pvz., kiet ąsias 
medžiagas) kategorij ų chemines medžiagas, BCOP bandymo metodo tiks ­
lumas pagal ES, EPA ir GHS klasifikavimo sistemas yra nuo 87 % (72/83) 
iki 92 % (78/85), klaidingai teigiam ų rezultatų dalis – nuo 12 %. (7/58) iki 
16 % (9/56), klaidingai neigiam ų rezultatų dalis – nuo 0 % (0/27) iki 12 % 
(3/26).
 
45. Net jeigu bandomoji medžiaga nepriskiriama akis ėsdinančių arba stipriai 
dirginančių medžiag ų kategorijai, BCOP bandym ų duomenys, naudojami 
kartu su triušio akies  in vivo  bandymo arba deramai patvirtinto  in vitro  
bandymo duomenimis, gali b ūti naudingi toliau vertinant BCOP bandym ų, 
kuriais siekiama nustatyti silpnai dirginan čias ir nedirginan čias medžiagas, 
metodo naudingum ą ir apribojimus (šiuo metu rengiamos toksiškumo 
akims  in vitro  bandymų metodų rekomendacinis dokumentas).  
Tyrimo priimtinumo kriterijai  
46. Tyrimas laikomas priimtinu, jeigu naudojant teigiam ą kontrolin ę medžiagą 
gauta IVIS neviršija dviej ų dabartinio istorinio vidurkio, atnaujinamo ne 
rečiau kaip kart ą per tris m ėnesius arba, kai bandymai atliekami nedažnai 
(t. y. rečiau kaip kart ą per mėnesį), kiekvien ą kartą laboratorijose atlikus 
priimtiną bandym ą, standartini ų nuokrypi ų. Vertinant atsak ą į neigiam ą 
kontrolinę medžiag ą arba tirpikl į (nešiklį) gautos padrumst ėjimo ir pralai ­
dumo vert ės neturėtų viršyti nustatyt ų normalios drumsties ir pralaidumo 
verčių viršutini ų ribų, nustatyt ų galvijų ragenoms, apdorotoms tinkama 
neigiama kontroline medžiaga arba tirpikliu (nešikliu).  
Bandymo ataskaita  
47. Bandym ų ataskaitoje tur ėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija, jeigu 
ji yra svarbi atlikto tyrimo atžvilgiu.  
Bandomosios ir kontrolin ės medžiagos  
Cheminės medžiagos pavadinimas (-ai), pvz., Chemini ų medžiag ų sant­
rumpų tarnybos (angl.  Chemical Abstracts Service , CAS) naudojamas 
struktūrinis pavadinimas ir kiti pavadinimai, jeigu jie žinomi;  
CAS registracijos numeris (RN), jeigu jis žinomas;  
cheminės medžiagos arba mišinio grynumas ir sud ėtis (masės procenti ­
nėmis dalimis), kiek tai žinoma remiantis turima informacija;  
tyrimui svarbios fizikin ės ir chemin ės savybės, pvz., fizinis b ūvis, 
lakumas, pH, stabilumas, chemini ų junginių klasė, tirpumas vandenyje;  
bandomosios ir (arba) kontrolin ės chemin ės medžiagos apdorojimas prieš 
bandymą, jeigu tai atliekama (pvz., pašildymas, sumalimas);  
stabilumas, jeigu jis žinomas.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Informacija apie r ėmėją ir bandym ų laboratorij ą 
Rėmėjo pavadinimas ir adresas, bandym ų laboratorija ir tyrimo vadovas;  
informacija apie aki ų šaltinį (t. y. vieta, kurioje buvo paimtos akys);  
akių laikymo ir gabenimo s ąlygos (pvz., aki ų paėmimo data ir laikas, 
laikotarpis iki bandym ų pradžios, gabenimo terp ė ir temperat ūra, antibio ­
tikai (jei jie naudoti));  
jeigu yra informacijos, specifin ės gyvūnų, iš kurių buvo paimtos akys, 
charakteristikos (pvz., gyv ūno, kurio akys buvo paimtos, amžius, lytis, 
svoris).  
Taikyto bandymo metodo ir protokolo pagrindimas  
Bandymo metodo integralumas  
Bandymo metodo integralumo (t. y. tikslumo ir patikimumo) užtikrinimo 
per tam tikr ą laiką procedūra (pvz., periodiniai bandymai su patikros 
medžiagomis, istorini ų duomenų apie neigiamas ir teigiamas kontrolines 
medžiagas naudojimas).  
Bandymo priimtinumo kriterijai  
Priimtini kartu naudojam ų teigiamų ir neigiam ų kontrolini ų grupių verčių 
intervalai, atsižvelgiant į istorinius duomenis;  
jeigu turima, priimtini kartu naudojam ų lyginamųjų medžiag ų kontrolin ės 
grupės verčių intervalai, atsižvelgiant į istorinius duomenis.  
Bandymo s ąlygos  
Taikytos bandymo sistemos aprašas;  
naudoto ragen ų laikiklio tipas;  
prietaisų, naudotų matuojant padrumst ėjimą ir pralaidum ą (pvz., drumsties 
matuoklio ir spektrofotometro), kalibravimo informacija;  
informacija apie naudotas galvij ų ragenas, įskaitant informacij ą apie jų 
kokybę; 
išsami informacija apie taikyt ą bandymo metod ą; 
naudota (-os) bandomosios medžiagos koncentracija (-os);  
bandymo metodo pakeitim ų, jeigu jų buvo padaryta, aprašas;  
informacija apie istorinius duomenis, gautus taikant š į modelį (pvz., 
neigiamos ir teigiamos kontrolin ės medžiagos; patikros medžiagos, lygina ­
mosios chemin ės medžiagos);  
taikytų vertinimo kriterij ų aprašas.  
Rezultatai  
Atskirų mėginių duomenų lentelė (pvz., padrumst ėjimo ir OD  490 vertės, 
bandomajai medžiagai ir teigiamoms, neigiamoms bei lyginamosioms 
cheminėms medžiagoms [jeigu jos naudojamos] apskai čiuotos IVIS vert ės, 
pateiktos lentel ės pavidalu, jeigu taikytina, kartu pateikiant atlikt ų pakar­
totinių bandymų duomenis ir vidutines kiekvieno bandymo rezultat ų vertes 
su standartiniais nuokrypiais);  
kitų nustatytų poveikių apibūdinimas.  
Aptarimas ir rezultatai  
Išvada  
LITERAT ŪRA 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
(2) 2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamen ­
tas (EB) Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifika ­
vimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies kei čiantis ir panaikinantis 
direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies kei čiantis 
Reglament ą (EB) Nr. 1907/2006; OL L 353, 2008 12 31, p. 1.  
(3) UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Label ­
ling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007. Paskelbta:
 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02file ­
s_e.html]  
(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Paskelbta:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation 
of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Paskelbta:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(6) EB (2006). 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos 
reglamentas (EB) Nr. 1907/2006 d ėl chemini ų medžiagų registracijos, 
įvertinimo, autorizacijos ir apribojim ų (REACH), įsteigiantis Europos 
cheminių medžiag ų agentūrą, iš dalies kei čiantis Direktyv ą 
1999/45/EB bei panaikinantis Tarybos reglament ą (EEB) 
Nr. 793/93, Komisijos reglament ą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direk ­
tyvą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 
93/105/EB bei 2000/21/EB; OL L 396, 2006 12 30, p. 1.  
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Paskelbta:  
[http://www.oecd.org/docu ­
ment/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_ 1_1_1_1,00.html]  
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method 
Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants 
and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Paskelbta:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal 
Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06- 4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Paskelbta:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_i ­
ce.htm]  
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and 
Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, 
Italy: European Centre for the Validation of Alternative 
Methods (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular 
irritancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guide ­
line for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Paskelbta:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.  
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  Can. 
J. Zool.  73:2159-2165.  
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, 
E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). 
A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl 
Toxicol  26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Paskelbta:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Paskelbta:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTYS  
Tikslumas –  bandymo metodo rezultat ų ir patvirtint ų pamatini ų verčių sutapimo 
artumas. Tikslumas yra bandymo metodo naudojimo charakteristik ų matas ir 
vienas iš tinkamumo aspekt ų. Terminas dažnai vartojamas pakaitomis su terminu 
„sutapimas“ reikšme „tinkam ų bandymo metodo rezultat ų dalis“.  
Lyginamoji chemin ė medžiaga –  cheminė medžiaga, naudojama kaip standartas, 
su kuriuo lyginama bandomoji medžiaga. Lyginamoji chemin ė medžiaga turi 
turėti tokias savybes: i) tinkam ą (-us) ir patikim ą (-us) šaltin į (-ius); ii) jos 
struktūrinės ir funkcin ės savybės turi būti panašios į bandomųjų medžiag ų kate­
gorijos savybes; iii) turi b ūti žinomos jos fizikin ės ir chemin ės savybės; iv) turi 
būti duomen ų, patvirtinan čių žinomą poveikį; v) turi b ūti žinomas jos stiprumas 
pageidaujamo poveikio intervalo ribose.  
Ragena –  permatoma priekin ė akies obuolio dalis, dengianti rainel ę bei vyzd į ir 
praleidžianti švies ą į vidų. 
Ragenos padrumst ėjimas –  išmatuota ragenos padrumst ėjimo vert ė, gauta 
rageną baigus veikti bandom ąja medžiaga. Padid ėjusi ragenos drumstis rodo 
ragenos pažeidim ą. Padrumst ėjimą galima vertinti subjektyviai, kaip tai daroma 
per Draize‘o triušio akies bandym ą, arba objektyviai, naudojant prietais ą, pvz., 
drumsties matuokl į. 
Ragenos pralaidumas –  kiekybinis ragenos epitelio pažeidimo įvertinimas nusta ­
tant fluoresceino natrio druskos dažiklio kiek į, prasiskverbiant į per visus ragenos 
ląstelių sluoksnius.  
EPA 1 kategorija –  ėsdinimas (negr įžtamas akies audinio suardymas) arba 
ragenos pakenkimas arba dirginimas, trunkantis ilgiau kaip 21 dien ą (1). 
ES R41 kategorija –  akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis reg ėjimo 
pablogėjimas po to, kai ant išorinio akies paviršiaus buvo užd ėta bandomosios 
medžiagos, iki galo nepraeinantis per 21 dien ą nuo užd ėjimo.  
Klaidingai neigiam ų rezultat ų dalis –  visų teigiamų medžiag ų, kurios taikant 
bandymo metod ą buvo klaidingai identifikuotos kaip neigiamos, dalis. Tai yra 
vienas iš bandymo metodo naudojimo charakteristik ų rodiklių. 
Klaidingai teigiam ų rezultat ų dalis –  visų neigiamų medžiag ų, kurios taikant 
bandymo metod ą buvo klaidingai identifikuotos kaip teigiamos, dalis. Tai yra 
vienas iš bandymo metodo naudojimo charakteristik ų rodiklių. 
GHS (Visuotinai suderinta chemini ų medžiag ų klasifikavimo ir ženklinimo 
sistema) –  sistema, kurioje pateikiama chemini ų medžiagų (medžiag ų ir mišini ų) 
klasifikacija pagal standartizuotus fizikini ų pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai 
tipus ir nagrin ėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signa ­
liniai žodžiai, pavojingumo fraz ės, atsargumo fraz ės ir saugos duomen ų lapai, 
kad būtų galima informuoti apie medžiag ų neigiamą poveikį, siekiant apsaugoti 
žmones (įskaitant darbuotojus, darbininkus, vež ėjus, vartotojus ir avarij ų likvida­
torius) ir aplink ą (3). ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
GHS 1 kategorija –  akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis reg ėjimo 
pablogėjimas po to, kai ant išorinio akies paviršiaus buvo užd ėta bandomosios 
medžiagos, iki galo nepraeinantis per 21 dien ą nuo užd ėjimo (3).  
Pavojus –  medžiagos savyb ė arba aplinkyb ės, dėl kurių organizmui, sistemai 
arba populiacijai (arba jos daliai), kuri ą veikia toji medžiaga, gali b ūti padarytas 
kenksmingas poveikis.  
In vitro  dirginimo skaitin ė vertė (IVIS) –  empiriniu b ūdu gauta formul ė, 
naudojama atliekant BCOP bandym ą, kai kiekvienos bandom ųjų mėginių grupės 
vidutinės padrumst ėjimo ir pralaidumo vert ės susumuojamos, kad b ūtų apskai­ 
čiuota kiekvienos bandom ųjų mėginių grupės bendra  in vitro  skaitinė vertė. IVIS  
= vidutin ė padrumst ėjimo vert ė + (15 x vidutin ė pralaidumo vert ė). 
Neigiamas kontrolinis m ėginys –  bandom ąja medžiaga neapdorota m ėginio 
kopija, turinti visas sudedam ąsias bandymo sistemos dalis. Šis m ėginys tiriamas 
kartu su bandom ąja medžiaga apdorotais m ėginiais ir kitais kontroliniais m ėgi­
niais, siekiant nustatyti, ar tirpiklis veikia bandymo sistem ą. 
Nedirginan čios medžiagos –  cheminės medžiagos, nepriskiriamos EPA I, II arba 
III kategorijos, ES R41 arba R36 kategorijos arba GHS 1, 2A arba 2B kategorijos akis dirginan čioms medžiagoms.
 
Akis ėsdinanti medžiaga –  a) chemin ė medžiaga, negr įžtamai suardanti akies 
audinį; b) chemin ės medžiagos, priskiriamos GHS 1 kategorijos, EPA I katego ­
rijos arba ES R41 kategorijos akis dirginan čioms medžiagoms (1) (2) (3).  
Akis dirginanti medžiaga –  a) chemin ė medžiaga, kuri, užd ėta ant priekinio 
akies paviršiaus, sukelia gr įžtamus akies pažeidimus; b) chemin ės medžiagos, 
priskiriamos EPA II arba III kategorijos, ES R36 kategorijos arba GHS 2A 
arba 2B kategorijos akis dirginan čioms medžiagoms (1) (2) (3).  
Akis stipriai dirginanti medžiaga –  a) chemin ė medžiaga, kuri, užd ėta ant 
priekinio akies paviršiaus, sukelia akies audinio pažeidimus, nepraeinan čius per 
21 dieną nuo tos medžiagos užd ėjimo, arba sukelia didel į fizinį regos pablog ė­
jimą; b) chemin ės medžiagos, priskiriamos GHS 1 kategorijos, EPA I kategorijos 
arba ES R41 kategorijos akis dirginan čioms medžiagoms (1) (2) (3).  
Drumsties matuoklis –  prietaisas, naudojamas ragenos padrumst ėjimui išmatuoti 
kiekybiškai įvertinant šviesos prasiskverbim ą per ragen ą. Paprastai šis prietaisas 
yra sudarytas iš dviej ų skyrių, iš kurių kiekvienas turi savo šviesos šaltin į ir 
fotoelement ą. Vienas skyrius skirtas apdorotai ragenai, kitas – prietaisui kali ­
bruoti ir prietaiso nulinei pad ėčiai nustatyti. Halogenin ės lempos šviesa perduo ­
dama per kontrolin į skyrių (tuščią kamerą be langų ar skysčių) į fotoelement ą ir 
lyginama su šviesa, perduota į fotoelement ą per bandymo skyri ų, kuriame yra 
kamera su ragena. Palyginamas iš fotoelement ų perduoto šviesos kiekio skir ­
tumas ir skaitmeniniame ekrane parodoma skaitin ė drumsties vert ė. 
Teigiamas kontrolinis m ėginys –  mėginio kopija, turinti visas sudedam ąsias 
bandymo sistemos dalis ir apdorota chemine medžiaga, kuri, kaip yra žinoma, sukelia teigiam ą atsaką. Norint užtikrinti galimyb ę įvertinti atsako į teigiamą 
kontrolinę medžiag ą kaitą per tam tikr ą laiką, dirginamasis poveikis netur ėtų 
būti pernelyg stiprus.
 ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Patikimumas –  bandymo metodo, taikomo pagal t ą patį protokolą, atkuriamumo 
toje pačioje laboratorijoje ir kitose laboratorijose matas. Patikimumas įvertinamas 
apskaičiuojant atkuriamum ą laboratorijoje ir tarp laboratorij ų ir pakartojamum ą 
laboratorijoje.  
Tirpiklio (nešiklio) kontrolinis m ėginys –  neapdorotas m ėginys, turintis visas 
sudedamąsias bandymo sistemos dalis, įskaitant tirpikl į (nešiklį), kuris tiriamas 
kartu su bandom ąja medžiaga apdorotais m ėginiais ir kitais kontroliniais m ėgi­
niais, siekiant nustatyti pamatin į mėginių, apdorotų tuo pačiu tirpikliu (nešikliu), 
atsaką. Atliekant bandym ą kartu su neigiamu kontroliniu m ėginiu, šis m ėginys 
taip pat parodo, ar tirpiklis (nešiklis) veikia bandymo sistem ą. 
Pakopiniai bandymai –  nuosekli bandymo metodika, pagal kuri ą tam tikra eil ės 
tvarka nagrin ėjama visa turima informacija apie bandom ąją medžiag ą, kiekvie­
noje pakopoje taikant įrodomosios duomen ų galios metodik ą siekiant nustatyti, ar 
yra pakankamai duomen ų sprendimui d ėl pavojingumo kategorijos priimti, prieš 
pereinant prie kitos pakopos. Jeigu bandomosios medžiagos geb ą dirginti akis 
galima nustatyti remiantis turima informacija, papildom ų bandym ų atlikti 
nereikia. Jeigu bandomosios medžiagos dirginamosios gebos nustatyti remiantis 
turima informacija negalima, taikoma nuosekli gyv ūnų bandymo metodika, kol 
gaunami duomenys, kuriais remiantis galima aiškiai nustatyti tos medžiagos kategoriją.
 
Patvirtintas bandymo metodas –  bandymo metodas, kurio patvirtinimo tyrimai 
buvo atlikti siekiant nustatyti jo tinkamum ą (įskaitant tikslum ą) ir patikimum ą 
konkrečiai paskir čiai. Svarbu atkreipti d ėmesį, kad patvirtintas bandymo metodas 
gali būti nepakankamai tikslus ir patikimas, kad j į būtų galima pripažinti tinkamu 
siūlomai paskir čiai. 
Įrodomoji duomen ų galia –  metodika, pagal kuri ą vertinamos tam tikr ų infor­
macijos dali ų privalumai ir tr ūkumai, siekiant priimti ir pagr įsti sprendim ą dėl 
cheminės medžiagos pavojingumo.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
2 priedėlis 
Patikros medžiagos BCOP bandymo atveju  
Prieš prad ėdamos sistemingai taikyti bandymo metod ą, susijusį su šiuo bandymo 
metodu, laboratorijos gali pageidauti įsitikinti savo techniniu tinkamumu šiam 
bandymui atlikti. Tokiu tikslu jos pam ėgina teisingai nustatyti dešimties 1 lente ­
lėje siūlomų chemini ų medžiag ų akių ėsdinimo kategorij ą. Šios chemin ės 
medžiagos parinktos atsižvelgiant į įvairų vietinio akies dirginimo ir (arba) ėsdi­
nimo atsak ą, pagrįstą triušio akies  in vivo  bandymo rezultatais (TG 405) (t. y. JT 
GHS 1, 2A, 2B kategorijos arba „Neklasifikuojama ir neženklinama“) (3) (7). Tačiau, atsižvelgiant į patvirtint ą šių bandymų naudingum ą (t. y. tik nustatyti akis 
ėsdinančias ir (arba) stipriai dirginan čias medžiagas), klasifikavimui aktual ūs 
rezultatai, susij ę su tinkamumo pasitikrinimu, yra tik du ( ėsdinanti ir (arba) 
stipriai dirginanti arba ne ėsdinanti ir (arba) stipriai nedirginanti medžiaga). Kiti 
atrankos kriterijai yra šie: chemin ės medžiagos turi b ūti parduodamos rinkoje, turi 
būti kokybišk ų in vivo  pamatini ų duomenų ir turi būti kokybišk ų duomen
ų apie 
abu in vitro  metodus, apie kuriuos yra rengiamos bandym ų gairės. Dėl šios 
priežasties dirginan čios chemin ės medžiagos buvo atrinktos iš ICCVAM reko ­
menduojam ų 122 etalonini ų cheminių medžiagų, skirtų in vitro  toksiškumo akims 
bandymo metodams patvirtinti, s ąrašo (žr. H pried ėlį: ICCVAM rekomenduo ­
jamos etalonin ės chemin ės medžiagos) (5). Pamatiniai duomenys pateikti 
ICCVAM istorin ės apžvalgos dokumentuose, skirtuose BCOP ir izoliuotos vištos 
akies (angl.  Isolated Chicken Eye , ICE) bandymo metodams (17) (18).  
1 lentelė 
BCOP bandymo atveju rekomenduojamos technin ės patikros chemin ės medžiagos  
Cheminė medžiaga  CASNR  Cheminės medžiagos 
klasė ( 1 ) Fizinis būvis In vivo  
kategorija (  2 ) In vitro  kategorija (  3 ) 
Benzalkonio 
chloridas (5 %)  8001-54-5  Onio junginys  Skysta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) stipriai 
dirginanti  
Chlorheksidinas  55-56-1  Aminas, 
amidinas  Kieta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) stipriai 
dirginanti  
Dibenzoil-L-vyno 
rūgštis 2743-38-6  Karboksir ūgšties 
esteris  Kieta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) stipriai 
dirginanti  
Imidazolas  288-32-4  Heterociklinis 
junginys  Kieta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) stipriai 
dirginanti  
Trichloracto 
rūgštis (30 %)  76-03-9  Karboksir ūgštis Skysta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) stipriai 
dirginanti  
2,6-dibenzoil ­
chloridas  4659-45-4  Acilhalogenidas  Skysta  2A 
kategorija  Neėsdinanti ir (arba) stipriai 
nedirginanti  
Etil-2-metil 
acetoacetatas  609-14-3  Ketonas, esteris  Skysta  2B 
kategorija  Neėsdinanti ir (arba) stipriai 
nedirginanti  
Amonio nitratas  6484-52-2  Neorganin ė 
druska  Kieta  2A 
kategorija  Neėsdinanti ir (arba) stipriai 
nedirginanti  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Cheminė medžiaga  CASNR  Cheminės medžiagos 
klasė ( 1 ) Fizinis būvis In vivo  
kategorija (  2 ) In vitro  kategorija (  3 ) 
Glicerinas  56-81-5  Alkoholis  Skysta  Neženklina ­
ma Neėsdinanti ir (arba) stipriai 
nedirginanti  
n-heksanas  110-54-3  Angliavandenilis 
(aciklinis)  Skysta  Neženklina ­
ma Neėsdinanti ir (arba) stipriai 
nedirginanti  
Santrumpos: CASRN – Chemini ų medžiag ų pavadinim ų santrump ų tarnybos registracijos numeris. 
( 1 ) Chemin ės medžiagos klas ės kiekvienai bandomajai medžiagai priskirtos taikant standartin ę klasifikavimo sistem ą, remiantis Nacio ­
nalinės medicinos bibliotekos medicinos objekt ų pavadinim ų (MeSH) klasifikavimo sistema (paskelbta http//www.nlm.nih.gov/ 
mesh). 
( 2 ) Remiantis rezultatais, gautais atlikus triušio akies  in vivo  bandymą (OECD TG 405), ir taikant JT GHS (3)(7). 
( 3 ) Remiantis BCOP ir ICE rezultatais.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
3 priedėlis 
BCOP BANDYMUI NAUDOJAMAS RAGENOS LAIKIKLIS  
1. BCOP ragen ų laikikliai gaminami iš inertin ės medžiagos (pvz., polipropi ­
leno). Laikikliai yra sudaryti iš dviej ų dalių (priekin ės ir užpakalin ės 
kamerų) ir turi dvi panašias cilindro pavidalo vidines kameras. Kiekvienos 
kameros talpa yra 5 ml, j ų galuose yra stikliniai langai, per kuriuos regist ­
ruojamos padrumst ėjimo matavim ų vertės. Kiekviena vidin ė kamera yra 1,7 
cm skersmens ir 2,2 cm gylio (  1 ). Kad būtų išvengta nutek ėjimo, ant užpa ­
kalinės kameros uždedamas apvalus žiedas. Ragenos endoteliu į apačią 
padedamos ant apvalaus užpakalini ų kamerų žiedo, o priekin ės kameros 
padedamos ant ragen ų epitelio. Kameros įtvirtinamos trimis ner ūdijančiais 
varžtais, esan čiais ties išoriniais kameros kraštais. Kiekvienos kameros gale 
yra stiklinis langas, kur į galima išimti, kad b ūtų patogiau pasiekti ragen ą. 
Kad būtų išvengta nutek ėjimo, tarp stiklinio lango ir kameros taip pat 
įdedamas apvalus žiedas. Kiekvienos kameros viršuje yra dvi angos, per 
kurias įpilama bei pašalinama terp ė ir bandomieji junginiai. Apdorojimo ir 
inkubacijos laikotarpiais jos uždaromos guminiais dangteliais.
  
Žodynėlis: 
Glass disc: stiklinis diskas  
PTFE-O-ring: PTFE apvalus žiedas  
Refill: pripildymo anga  
Hanger: laikiklis  
Cap: dangtelis  
Nut: veržl ė 
O-ring: apvalus žiedas  
Posterior compartment: galinis skyrius  
Anterior compartment: priekinis skyrius  
Fixing screws: fiksuojamieji varžtai  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Pateikti matmenys yra pagr įsti ragenos laikikliu, naudojamu 12–60 m ėnesių karvėms. 
Jeigu naudojami 6–12 m ėnesių gyvūnai, laikiklis tur ėtų būti pagamintas taip, kad kiek ­
vienos kameros talpa b ūtų 4 ml, o kiekvienos vidin ės kameros skersmuo – 1,5 cm, gylis 
– 2,2 cm. Projektuojant naujus ragen ų laikiklius, labai svarbu užtikrinti, kad priekin ėje 
kameroje veikiamo ragenos paviršiaus ploto ir užpakalin ės kameros talpos santykis b ūtų 
toks pat, kaip įprastam ragen ų laikikliui apskai čiuotas santykis. Tai yra b ūtina tam, kad 
būtų teisingai nustatytos pralaidumo vert ės, nustatomos IVIS skai čiavimams pagal 
siūlomą formulę.
 DRUMSTIES MATUOKLIS  
2. Drumsties matuoklis yra šviesos skvarbos matavimo prietaisas. Halogenin ės 
lempos šviesa perduodama per kontrolin į skyrių (tuščią kamerą be langų ar 
skysčių) į fotoelement ą ir lyginama su šviesa, į fotoelement ą perduota per 
bandymo skyri ų, kuriame yra kamera su ragena. Palyginamas iš fotoele ­
mentų perduoto šviesos kiekio skirtumas ir skaitmeniniame ekrane paro ­
doma skaitin ė drumsties vert ė. Nustatomi drumsties vienetai.  
3. Drumsties matuokliu turi b ūti gaunamas tiesinis atsakas tam tikrame drums ­
ties rodmen ų intervale, apiman čiame ribas, taikomas pagal įvairius klasifi ­
katorius, aprašytus pagal prognozavimo model į (t. y. iki ribos, susijusios su 
ėsdinimu ir (arba) stipriu dirginimu). Norint užtikrinti tikslius tiesinius 
rodmenis iki 75–80 drumsties vienet ų, būtina sukalibruoti drumsties 
matuoklį naudojant įvairius kalibratorius. Kalibratoriai (neskaidr ūs polies­
terio lapai) įdedami į kalibravimo kamer ą (ragenos kamer ą, pritaikyt ą kali­
bravimo priemon ėms laikyti) ir registruojami drumsties matuoklio 
rodmenys. Kalibravimo kamera pritaikoma laikyti kalibratorius tarp šviesos 
šaltinio ir fotoelemento daugmaž tokiu atstumu, kokiu įdedamos ragenos 
atliekant padrumst ėjimo matavimus. Pirmiausia drumsties matuoklis sukali ­
bruojamas iki 0 drumsties vienet ų, naudojant kalibravimo kamer ą be kali­
bratoriaus. Tada vienas po kito į kalibravimo kamer ą dedami trys kalibra ­
toriai ir matuojama drumstis. Naudojant kalibratorius Nr. 1, 2 ir 3 tur ėtų būti 
gauti drumsties rodmenys, atitinkantys nustatytas t ų kalibratori ų vertes – 
atitinkamai 75, 150 ir 225 drumsties vienetus su 5 proc. paklaida.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B.48.  IZOLIUOTOS VIŠTOS AKIES BANDYMO METODAS AKIS 
ĖSDINAN ČIOMS IR STIPRIAI DIRGINAN ČIOMS 
MEDŽIAGOMS NUSTATYTI  
ĮVADAS  
1. Izoliuotos vištos akies (angl.  Isolated Chicken Eye , ICE) bandymo metodas 
yra in vitro  bandymo metodas, kur į tam tikromis aplinkyb ėmis ir su tam 
tikrais apribojimais galima taikyti siekiant chemines medžiagas ir mišinius 
suklasifikuoti kaip akis ėsdinančias ir stipriai dirginan čias medžiagas (1) (2) 
(3). Šiose bandym ų gairėse stipriai dirginan čios medžiagos apibr ėžiamos 
kaip medžiagos, sukelian čios akių pažeidimus, kurie triušiui nepraeina per 
21 dieną po paveikimo ta medžiaga. Nors šis bandymo metodas n ėra 
laikomas tinkamu visiškai pakeisti triušio akies  in vivo  bandym ą, ICE 
bandymo metod ą rekomenduojama taikyti kaip vien ą iš pakopin ės bandymo 
strategijos, taikomos reguliavimo tikslais klasifikuojant ir ženklinant tam tikroje srityje naudojamas medžiagas, sudedam ųjų dalių (4) (5). Bandom ąsias 
medžiagas ir mišinius (6), kurie, atliekant š į bandymą, priskiriami teigiam ų 
medžiagų kategorijai, galima klasifikuoti kaip akis ėsdinančias arba stipriai 
dirginančias medžiagas neatliekant papildom ų bandymų su triušiais. Chemin ė 
medžiaga, kurios bandymo rezultatai neigiami, tur ėtų būti išbandyta su triu ­ 
šiais, taikant nuosekli ąją bandymo metodik ą, aprašyt ą OECD bandym ų
 
gairėse Nr. 405 (7) (šio priedo B.5 skyrius).  
2. Šio bandymo metodo paskirtis – aprašyti proced ūras, taikomas vertinant, ar 
bandomoji medžiaga gali sukelti ėsdinimą arba stipr ų dirginim ą, sprendžiant 
pagal jos geb ėjimą sukelti toksin į poveikį išimtai vištos akiai. Toksinis 
poveikis ragenai matuojamas šiais b ūdais: i) kokybiškai vertinant padrums ­
tėjimą, ii) kokybiškai vertinant epitelio pažeidimus ant akies užd ėjus fluo­
resceino (fluoresceino sulaikymas), iii) kiekybiškai matuojant storio padid ė­
jimą (pabrinkim ą) ir iv) kokybiškai vertinant makroskopinius morfologinius 
paviršiaus pažeidimus. Ragenos padrumst ėjimo, pabrinkimo ir pažeidim ų 
vertinimas baigus veikti bandom ąja medžiaga atliekamas atskirai ir tada 
susumuojamas siekiant nustatyti akies dirginimo kategorijas.  
3. Akis dirginan čios medžiagos, sukelian čios akių pažeidimus, kurie praeina 
mažiau kaip per 21 dien ą, ir akių nedirginan čios medžiagos taip pat buvo 
išbandytos taikant ICE bandymo metod ą. Tačiau ICE bandymo metodo tiks ­
lumas ir patikimumas bandant ši ų kategorij ų chemines medžiagas n ėra 
oficialiai įvertintas.  
4. Apibrėžtys pateiktos 1 pried ėlyje. 
PRADINIAI SVARSTYMAI IR APRIBOJIMAI  
5. Šis bandymo metodas pagr įstas Alternatyvi ų metodų patvirtinimo tarpžiny ­
binio koordinavimo komiteto (ICCVAM) ICE bandymo metodo protokolu 
(8), parengtu atlikus tarptautin į patvirtinimo tyrim ą (4) (5) (9), padedant 
Europos alternatyvi ų metodų patvirtinimo centrui, Japonijos alternatyvi ų 
metodų patvirtinimo centrui ir TNO Gyvenimo kokyb ės – Toksikologijos 
ir taikomosios farmakologijos departamentui (Nyderlandai). Protokolas 
pagrįstas informacija, gauta iš paskelbt ų protokol ų ir iš TNO dabar taikomo 
protokolo (10) (11) (12) (13) (14).  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. Nustatyti šio metodo apribojimai pagr įsti klaidingai teigiam ų rezultatų dalimi 
alkoholių atveju ir klaidingai neigiam ų rezultatų dalimis kiet ųjų medžiag ų ir 
paviršinio aktyvumo medžiag ų atveju (žr. 47 skirsn į) (4). Iš duomen ų bazės 
pašalinus ši ų chemini ų ir fizikini ų kategorij ų chemines medžiagas, ICE 
bandymo metodo tikslumas pagal ES, EPA ir GHS klasifikavimo sistemas 
iš esmės pagerėjo (4). Remiantis ši ų bandymų tikslu (t. y. tiktai nustatyti akis 
ėsdinančias ir (arba) stipriai dirginan čias medžiagas), klaidingi neigiami 
rezultatai neturi lemiamos reikšm ės, nes šios chemin ės medžiagos v ėliau 
bus išbandytos su triušiais arba taikant kitus deramai patvirtintus  in vitro  
bandymus, atsižvelgiant į reguliavimo reikalavimus ir taikant nuosekli ąją 
bandymo metodik ą pagal įrodomosios duomen ų galios metod ą. Be to, 
naudojant dabartin ę patvirtinimo duomen ų bazę negalima deramai įvertinti 
tam tikrų klasių cheminių medžiag ų arba produkt ų (pvz., mišini ų). Tačiau 
tyrėjai galėtų apsvarstyti šio bandymo metodo taikymo vis ų tipų cheminėms 
medžiagoms ( įskaitant mišinius) galimybes, kai teigiamas rezultatas gal ėtų 
būti priimtas kaip orientacinis aki ų ėsdinimo arba stipraus dirginimo atsakas. 
Tačiau teigiami rezultatai, gauti bandant alkoholius, tur ėtų būti aiškinami 
atsargiai, vengiant nepagr įstų prognozi ų. 
7. Visos proced ūros su višt ų akimis tur ėtų būti atliekamos pagal bandym ų 
laboratorijos taikytinas žmogaus arba gyv ūninės kilmės medžiag ų, įskaitant 
audinius ir audini ų skysčius, bet neapsiribojant tik jais, tvarkymo taisykles ir 
procedūras. Rekomenduojama laikytis bendr ųjų laboratorijose taikytin ų atsar­
gumo priemoni ų (15).  
8. Šio bandymo metodo apribojimas yra tas, kad, nors pagal j į ir atsižvelgiama 
į tam tikrą poveikį akims, vertinam ą pagal triušio aki ų dirginimo bandymo 
metodą, ir iš dalies į to poveikio lyg į, pagal š į metodą neatsižvelgiama į 
akies jungin ės ir rainel ės pažeidimus. Be to, nors pagal ICE bandymo 
metodą ir negalima įvertinti ragenos pažeidim ų grįžtamumo  per se , remiantis 
triušio aki ų tyrimais pasi ūlyta naudoti pradin į ragenos pažeidim ų gylio verti ­
nimą, siekiant atskirti, ar poveikis negr įžtamas, ar gr įžtamas (16). Galiausiai 
pagal ICE bandymo metod ą negalima įvertinti galimo sisteminio toksiškumo, 
susijusio su poveikiu akims.  
9. Toliau dedamos pastangos siekiant geriau apib ūdinti ICE bandymo metodo 
naudingum ą ir apribojimus, siekiant nustatyti silpnai dirginan čias ir nedirgi ­
nančias medžiagas (taip pat žr. 48 skirsn į). Be to, naudotojai kvie čiami teikti 
patvirtinimo organizacijoms pavyzdžius ir (arba) duomenis, kuriais remiantis 
būtų galima oficialiai įvertinti galim ą būsimą ICE bandymo metodo paskirt į, 
įskaitant silpnai dirginan čių akis medžiag ų ir nedirginan čių medžiag ų nusta­
tymą. 
10. Kiekviena laboratorija, pradedanti taikyti š į bandymo metod ą, turėtų naudoti 
2 priedėlyje nurodytas patikros chemines medžiagas. Laboratorija gali 
naudoti šias chemines medžiagas nor ėdama įrodyti savo technin ę kompeten ­
ciją taikyti ICE bandymo metod ą, prieš pateikdama ICE bandym ų duomenis 
teisės aktuose numatytais pavoj ų klasifikavimo tikslais.  
BANDYMO PRINCIPAS  
11. ICE bandymo metodas yra tipinis konkretaus organo tyrimo modelis, pagal 
kurį galima išsaugoti trumpalaik į vištos akies funkcionavim ą in vitro . Pagal 
šį bandymo metod ą bandomosios medžiagos padarytas pažeidimas nusta ­
tomas įvertinant ragenos pabrinkim ą, padrumst ėjimą ir fluoresceino sulai ­
kymą. Pirmieji du parametrai vertinami kokybiškai, o ragenos pabrinkimas 
– kiekybiškai. Kiekvieno matavimo rezultatai paver čiami skaitine verte, kuri 
naudojama bendram dirginimo indeksui apskai čiuoti, arba priskiriami tam 
tikrai kokybinei kategorijai, kuri naudojama  in vitro  akies ėsdinimo ir 
stipraus dirginimo kategorijai nustatyti. Tada kiekvien ą iš šių rezultatų 
galima naudoti prognozuoti bandomosios medžiagos geb ą ėsdinti arba 
stipriai dirginti akis  in vivo  (žr. „Sprendimo kriterijai“).  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Vištų akių šaltinis ir amžius  
12. Paprastai šiam bandymui b ūdavo naudojamos višt ų akys, paimtos skerdy ­
kloje, kurioje vištos b ūdavo paskerdžiamos vartoti žmon ėms, taip pašalinant 
poreikį naudoti laboratorinius gyv ūnus. Naudojamos tik sveik ų gyvūnų, kurie 
laikomi tinkamais naudoti žmoni ų maisto grandin ėje, akys.  
13. Nors kontroliuojamas tyrimas, kuriuo b ūtų siekiama įvertinti tinkamiausi ą 
vištų amžių, nebuvo atliktas, pagal š į bandymo metod ą anksčiau būdavo 
naudojamos tokio amžiaus ir svorio vištos, kokio paprastai b ūna pavasariniai 
viščiukai, apdorojami paukš čių skerdykloje (t. y. apie 7 savai čių amžiaus, 
1,5–2,5 kg svorio).  
Akių paėmimas ir gabenimas į laboratorij ą 
14. Galvos tur ėtų būti nuimtos iš karto po to, kai viš čiukai numarinami, paprastai 
elektrošoku, ir įpjaunant kakl ą, kad nub ėgtų kraujas. Tur ėtų būti rastas netoli 
laboratorijos esantis vietinis višt ų šaltinis, kad galvas b ūtų galima nuvežti iš 
skerdyklos į laboratorij ą pakankamai greitai, taip užtikrinant, kad j ų pažei­
dimo ir (arba) užteršimo bakterijomis tikimyb ė būtų kuo mažesn ė. Laiko­
tarpis nuo višt ų galvų surinkimo iki aki ų panaudojimo per ICE bandym ą 
turėtų būti kuo mažesnis (paprastai iki dviej ų valandų), ir turi b ūti įrodyta, 
kad šis laikotarpis netur ės neigiamos įtakos bandymo rezultatams. Šie rezul ­
tatai grindžiami aki ų atrankos kriterijais ir atsaku į teigiamų ir neigiam ų 
kontrolini ų medžiag ų poveikį. Visos akys, naudojamos atliekant bandym ą, 
turėtų būti iš to paties tam tikr ą dieną surinkto aki ų rinkinio.  
15. Kadangi akys išpjaunamos laboratorijoje, iš skerdyklos vežamos sveikos 
galvos laikomos aplinkos temperat ūroje, plastikin ėse dėžėse, drėkinamose 
izotoniniu druskos tirpalu sudr ėkintomis audinio skiaut ėmis. 
ICE bandymui skirt ų akių atrankos kriterijai  
16. Išimtos akys, kuri ų pamatin ės nusidažymo fluoresceinu arba ragenos 
padrumstėjimo vert ės yra didel ės (t. y. didesn ės kaip 0,5), išmetamos.  
17. Kiekviena apdorojam ų mėginių grupė ir kartu naudojama kontrolin ė mėginių 
grupė sudaroma ne mažiau kaip iš trij ų akių. Neigiama kontrolin ė grupė ir 
tirpiklio (nešiklio) kontrolin ė grupė (jeigu naudojamas tirpiklis n ėra druskos 
tirpalas) sudaroma bent iš vienos akies.  
EIGA  
Akių paruošimas  
18. Atsargiai, nepažeidžiant ragenos, išpjaunami aki ų vokai. Ragenos sveikumas 
greitai įvertinamas ant ragenos paviršiaus kelioms sekund ėms užlašinus 2 % 
(m/t) fluoresceino natrio druskos tirpalo laš ą ir jį nuplovus izotoniniu druskos 
tirpalu. Tada fluoresceinu apdorotos akys apži ūrimos naudojant mikroskop ą 
su plyšine lempa, siekiant įsitikinti, kad ragena yra nepažeista (t. y. kad 
fluoresceino sulaikymo ir ragenos padrumst ėjimo vert ės yra ne didesn ės 
kaip 0,5).  
19. Jeigu ragena nepažeista, akis išpjaunama iš kaukol ės, nepažeidžiant ragenos. 
Akies obuolys ištraukiamas iš akiduob ės tvirtai suimant mirksim ąją 
membran ą chirurgin ėmis žnypl ėmis, tada lenktomis, bukais galais žirkl ėmis 
nupjaunami akies raumenys. Svarbu pernelyg nespausti ragenos (pvz., spau ­
džiamaisiais įrankiais), kad ji neb ūtų pažeista.  
20. Akį išėmus iš akiduob ės, matoma regos nervo dalis tur ėtų būti palikta. Iš 
akiduobės išimta akis padedama ant sugeriamojo audinio, tada nupjaunama 
mirksimoji membrana ir kiti jungiamieji audiniai.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Išimta akis įtvirtinama ner ūdijančio plieno d ėkle taip, kad ragena b ūtų 
pasukta vertikaliai. Tada d ėklas perkeliamas į superfuzijos aparato kamer ą 
(16). Dėklai superfuzijos aparate padedami taip, kad lašantis izotoninio 
druskos tirpalas patekt ų ant visos ragenos. Superfuzijos aparato kamerose 
turėtų būti palaikoma 32 ± 1,5 °C temperat ūra. 3 pried ėlyje pateikta super ­
fuzijos aparato ir aki ų dėklų, kuriuos galima nusipirkti arba pasigaminti, 
schema. Aparato konstrukcija gali b ūti pakeista atsižvelgiant į konkrečios 
laboratorijos poreikius (pvz., norint sudaryti galimyb ę įdėti kitokį akių 
skaičių). 
22. Akis įdėjus į superfuzijos aparat ą, jos dar kart ą apžiūrimos per plyšin į mikro­
skopą, siekiant įsitikinti, ar jos nebuvo pažeistos per išpjovimo proced ūrą. 
Kartu turi b ūti išmatuotas ragenos storis ties ragenos virš ūne, naudojant gylio 
matavimo prietais ą, įrengtą mikroskope su plyšine lempa. Akys, kuri ų i) 
fluoresceino sulaikymo skaitin ė vertė didesnė kaip 0,5, ii) ragen ų drumstis 
didesnė kaip 0,5 arba kurios iii) turi kitoki ų pažeidimo požymi ų, turėtų būti 
pakeistos. Iš aki ų, kurios nebuvo atmestos pagal kur į nors iš ši ų kriterijų, 
grupės turi būti atmestos tos akys, kuri ų ragenos storio nuokrypis nuo vis ų 
akių vidurkio didesnis kaip 10 %. Naudotojai tur ėtų žinoti, kad naudojant 
mikroskopus su plyšine lempa gauti ragen ų storio duomenys gali skirtis, 
jeigu bus pasirinktos nevienodos plyšio plo čio nuostatos. Tur ėtų būti nusta­
tytas 0,095 mm plo čio plyšys.  
23. Apžiūrėjus akis ir įsitikinus j ų tinkamumu, jos daugmaž 45–60 minu čių 
laikomos inkubacin ėmis sąlygomis, kad iki dozavimo j ų temperat ūra susily­
gintų su bandymo sistemos temperat ūra. Pasibaigus temperat ūros nusistov ė­
jimo laikotarpiui, registruojamos ragenos storio ir drumsties nulin ės atskaitos 
vertės, kurios bus naudojamos kaip pamatin ės (t. y. laikas = 0). Kaip pama ­
tinė vertė naudojama fluoresceino skaitin ė vertė išpjovimo metu.  
Bandomosios medžiagos užd ėjimas  
24. Iš karto po to, kai užrašomi nulin ės atskaitos matavimai, akis (su d ėklu) 
išimama iš superfuzijos aparato, padedama horizontaliai ir ant ragenos užde ­
dama bandomosios medžiagos.  
25. Skystos bandomosios medžiagos paprastai bandomos grynos, ta čiau prireikus 
(t. y. pagal tam tikr ą tyrimo plano dal į) jas galima atskiesti. Pageidautina, 
kad chemin ėms medžiagoms skiesti b ūtų naudojamas fiziologinis tirpalas. 
Kontroliuojamomis s ąlygomis gali b ūti naudojami ir kiti tirpikliai, ta čiau 
būtina įrodyti tirpiklio, kuris n ėra fiziologinis tirpalas, tinkamum ą. 
26. Skystos bandomosios medžiagos ant ragenos užlašinamos taip, kad visas 
ragenos paviršius b ūtų tolygiai padengtas bandom ąja medžiaga; standartinis 
kiekis yra 0,03 ml.  
27. Jeigu įmanoma, kietosios medžiagos tur ėtų būti kuo smulkiau sutrinamos 
grūstuvėje su piesta arba panašioje smulkinimo priemon ėje. Milteliai ant 
ragenos beriami taip, kad jos paviršius b ūtų tolygiai padengtas bandom ąja 
medžiaga; standartinis kiekis yra 0,03 g.  
28. Bandomoji medžiaga (skysta arba kieta) užd ėta palaikoma 10 sekundži ų, 
tada nuplaunama nuo akies aplinkos temperat ūros izotoniniu druskos tirpalu 
(naudojant apie 20 ml tirpalo). Tada akis ( įdėta į laikiklį) vėl įdedama į 
superfuzijos aparat ą, į pradinę vertikalią padėtį. 
Kontrolin ės medžiagos  
29. Per kiekvien ą bandym ą kartu tur ėtų būti naudojami kontroliniai neigiami 
mėginiai, tirpiklio (nešiklio) kontroliniai m ėginiai ir teigiami kontroliniai 
mėginiai.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Kai bandomi gryni skys čiai arba kietosios chemin ės medžiagos, pagal ICE 
bandymo metod ą kartu kaip neigiama kontrolin ė medžiaga naudojamas fizio ­
loginis tirpalas, kad b ūtų galima aptikti netipinius bandymo sistemos poky ­ 
čius ir kad bandymo s ąlygos netur ėtų netinkamos įtakos atsakui į dirginim ą. 
31. Kai bandomi atskiesti skys čiai, tam, kad b ūtų galima aptikti netipinius 
bandymo sistemos poky čius ir kad bandymo s ąlygos netur ėtų netinkamos 
įtakos atsakui į dirginim ą, taikant bandymo metod ą kartu naudojama kontro ­
linė tirpiklio (nešiklio) m ėginių grupė. Kaip nurodyta 25 skirsnyje, galima 
naudoti tik tokius tirpiklius (nešiklius), kurie, kaip įrodyta, neturi neigiamos 
įtakos bandymo sistemai.  
32. Norint patikrinti, ar sukeliamas tinkamas atsakas, per kiekvien ą bandym ą 
kaip teigiama kontrolin ė medžiaga naudojama žinoma akis dirginanti 
medžiaga. Kadangi pagal š į bandymo metod ą ICE bandymas atliekamas 
siekiant nustatyti ėsdinančias arba stipriai dirginan čias medžiagas, kaip 
teigiamą kontrolin ę medžiag ą reikėtų naudoti etalonin ę cheminę medžiag ą, 
kuri naudojama pagal š į bandymo metod ą sukelia stipr ų dirginim ą. Tačiau, 
norint užtikrinti galimyb ę įvertinti atsako į teigiamą kontrolin ę medžiag ą 
kaitą per tam tikr ą laiką, dirginamasis poveikis netur ėtų būti pernelyg stiprus. 
Turėtų būti gauta pakankamai  in vitro  duomen ų apie teigiam ą kontrolin ę 
medžiagą, kad būtų galima apskai čiuoti statistiškai apibr ėžtą priimtin ą 
teigiamos kontrolin ės medžiagos poveikio interval ą. Jeigu tinkam ų istorinių 
ICE bandymo metodo duomen ų apie tam tikr ą teigiamą kontrolin ę medžiagą 
nėra, gali reik ėti atlikti tyrimus šiai informacijai gauti.  
33. Pavyzdžiui, per skyst ų chemini ų medžiag ų bandymus tinkamos naudoti 
teigiamos kontrolin ės medžiagos yra 10 % acto r ūgštis arba 5 %. benzalkonio 
chloridas, o kiet ųjų chemini ų medžiag ų bandymams tinkam ų naudoti 
teigiamų kontrolini ų medžiagų pavyzdžiai yra natrio hidroksidas arba imida ­
zolis.  
34. Lyginamosios chemin ės medžiagos yra naudingos norint įvertinti tam tikrai 
cheminių medžiagų arba gamini ų kategorijai priskiriam ų nežinom ų cheminių 
medžiagų gebą dirginti akis arba santykin ę akis dirginan čios medžiagos 
dirginamąją gebą tam tikrame atsako į dirginim ą intervale.  
Išmatuoti rezultatai  
35. Apdorojamos ragenos vertinamos prieš apdorojim ą ir po 30, 75, 120, 180 bei 
240 minu čių (± 5 minut ės) nuo nuplovimo apdorojus. Taikant šiuos laiko 
momentus, užtikrinamas tinkamas matavim ų kiekis per keturi ų valandų 
veikimo laikotarp į, o tarp matavim ų paliekama pakankamai laiko reikiamoms 
visų akių apžiūroms.  
36. Vertinami tokie poveikiai: ragenos padrumst ėjimas, pabrinkimas, fluores ­
ceino sulaikymas ir morfologiniai padariniai (pvz., epitelio išop ėjimas arba 
atsilaisvinimas). Visi poveikiai, išskyrus fluoresceino sulaikym ą (jis nusta ­
tomas tik prieš apdorojim ą ir po 30 minu čių nuo apdorojimo bandom ąja 
medžiaga), vertinami kiekvienu pirmiau nurodytu laiko momentu.  
37. Patariama padaryti ragenos padrumst ėjimo, fluoresceino sulaikymo, morfo ­
loginių padarinių ir, jei atliekami histopatologiniai tyrimai, j ų metu nustatyt ų 
padarinių nuotraukas.  
38. Baigus keturi ų valandų tyrimą, naudotojams si ūloma išsaugoti akis tinka ­
mame fiksatyve (pvz., neutraliame buferiniame formalino tirpale), kad b ūtų 
galima ištirti galimus histopatologinius pakitimus.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Ragen ų pabrinkimas nustatomas remiantis ragenos storio matavimais, atlie ­
kamais optiniu storma čiu, įrengtu mikroskope su plyšine lempa. Jis išreiš ­
kiamas procentais ir apskai čiuojamas remiantis ragenos storio matavimais 
pagal šią formulę: 
" 
ragenos storis laiko momentu t  Ä ragenos storis laiko momentu  ¼ 0 
ragenos storis laiko momentu  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Apskai čiuojamas vis ų bandomųjų akių vidutinis procentinis ragenos pabrin ­
kimas kiekvienu steb ėjimo laiko momentu. Remiantis didžiausi ąja vidutine 
ragenos pabrinkimo verte, nustatyta kuriuo nors laiko momentu, kiekvienai bandomajai medžiagai priskiriama bendra kategorin ė vertė.
 
41. Nustatant skaitines vertes, ragenos padrumst ėjimas skai čiuojamas tame 
ragenos plote, kuris labiausiai nepraleidžia šviesos. Apskai čiuojama vis ų 
bandomųjų akių vidutinė ragenos padrumst ėjimo vert ė kiekvienu steb ėjimo 
laiko momentu. Remiantis didžiausia vidutine ragenos padrumst ėjimo verte, 
nustatyta kuriuo nors laiko momentu, kiekvienai bandomajai medžiagai suteikiama bendra kategorin ė vertė (1 lentel ė).
 
1 lentelė 
Ragenos padrumst ėjimo vert ės 
Vertė Steb ėjimo išvados  
0 Jokios padrumst ėjimo 
0,5 Labai nežymus padrumst ėjimas  
1 Padrumst ėję pavieniai ploteliai; rainel ės raštas aiškiai matomas  
2 Aiškiai matomas pusskaidris plotas; rainel ės raštas šiek tiek neryškus  
3 Stiprus ragenos padrumst ėjimas; rainel ės rašto aiškiai nematyti; vyzdžio dydis 
beveik ne įžiūrimas  
4 Visiškas ragenos susidrumstimas; rainel ės nematyti  
42. Vidutin ė fluoresceino sulaikymo vert ė visoms bandomosioms akims apskai ­ 
čiuojama tik po 30 minu čių nuo steb ėjimo pradžios; pagal ši ą vertę nusta­
toma kiekvienos bandomosios medžiagos bendra kategorin ė vertė (2 lentelė). 
2 lentelė 
Fluoresceino sulaikymo vert ės 
Vertė Steb ėjimo išvados  
0 Fluoresceino sulaikymo nepasteb ėta 
0,5 Labai mažas sulaikymas pavien ėse ląstelėse 
1 Sulaikymas pavien ėse ląstelėse, išsidėsčiusiose per vis ą apdorotą ragenos plot ą 
2 Sulaikymas sutelktuose arba susisiekian čiuose pavieni ų ląstelių plotuose  
3 Fluoresceino sulaikymas dideliuose susisiekian čiuose ragenos plotuose  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Morfologinis poveikis apima ragenos epitelio l ąstelių „išopėjimą“, epitelio 
„atsilaisvinim ą“, ragenos paviršiaus „šiurkšt ėjimą“ ir bandomosios 
medžiagos „prilipim ą“ prie ragenos. Ši ų požymių lygis gali b ūti įvairus, 
požymiai gali pasireikšti kartu. Ši ų požymių klasifikavimas yra subjektyvus, 
priklauso nuo tyr ėjo interpretacijos.  
DUOMENYS IR J Ų TEIKIMAS  
Duomenų vertinimas  
44. Nustatant kiekvieno ICE bandym ų metu gauto rezultato kategorij ą, ragenų 
padrumstėjimo, pabrinkimo ir fluoresceino sulaikymo matavimo rezultatai 
turėtų būti vertinami atskirai. Tada vis ų ICE bandym ų rezultatų kategorijos 
susumuojamos ir nustatoma kiekvienos bandomosios medžiagos dirginimo 
kategorija.  
Sprendimo kriterijai  
45. Įvertinus kiekvien ą rezultatą, remiantis iš anksto nustatytais intervalais, 
galima nustatyti ICE kategorijas. Ragenos storio (3 lentel ė), padrumst ėjimo 
(4 lentelė) ir fluoresceino sulaikymo (5 lentel ė) rezultatai aiškinami pagal 
šias skales:  
3 lentelė 
ICE klasifikavimo kriterijai atsižvelgiant į ragenos stor į 
Vidutinis ragenos pabrinkimas (proc.) (*)  ICE kategorija  
0–5 I  
Daugiau kaip 5, bet ne daugiau kaip 12  II  
Daugiau kaip 12, bet ne daugiau kaip 18 
(praėjus daugiau kaip 75 min. nuo apdorojimo)  II 
Daugiau kaip 12, bet ne daugiau kaip 18 (pra ėjus 
ne daugiau kaip 75 min. nuo apdorojimo)  III 
Daugiau kaip 18, bet ne daugiau kaip 26  III  
Daugiau kaip 26, bet ne daugiau kaip 32 (pra ėjus 
daugiau kaip 75 min. nuo apdorojimo)  III 
Daugiau kaip 26, bet ne daugiau kaip 32 (pra ėjus 
ne daugiau kaip 75 min. nuo apdorojimo)  IV 
Daugiau kaip 32  IV  
(*) Ragen ų pabrinkimo vert ės naudojamos tik tada, kai storis matuojamas naudojant  Haag-Streit BP900  
mikroskop ą su plyšine lempa su gylio matuokliu Nr. I ir nusta čius plyšio plot į ties rodmeniu 9½, 
atitinkančiu 0,095 mm. Naudotojams reik ėtų žinoti, kad naudojant mikroskopus su plyšine lempa gauti 
ragenų storio duomenys gali skirtis, jeigu bus pasirinktas nevienodas plyšio plotis.  
4 lentelė 
ICE klasifikavimo kriterijai atsižvelgiant į padrumst ėjimą 
Vidutinė didžiausia padrumst ėjimo vert ė (*) ICE kategorija  
0,0–0,5  I  
0,6–1,5  II  
1,6–2,5  III  
2,6–4,0  IV  
(*) Žr. 1 lentel ę. ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
5 lentelė 
ICE klasifikavimo kriterijai atsižvelgiant į vidutinį fluoresceino sulaikym ą 
Vidutinė fluoresceino sulaikymo vert ė praėjus 30 
min. nuo apdorojimo (*)  ICE kategorija  
0,0–0,5  I  
0,6–1,5  II  
1,6–2,5  III  
2,6–3,0  IV  
(*) Žr. 2 lentel ę. 
46. Bendra bandomosios medžiagos  in vitro  dirginimo kategorija nustatoma 
pagal dirginimo klasifikatori ų, kuriuo apibendrinamos nustatytos ragen ų 
pabrinkimo, padrumst ėjimo ir fluoresceino sulaikymo kategorijos pagal 6 
lentelėje pateikt ą sistemą. 
6 lentelė 
Bendrosios  in vitro  dirginimo kategorijos  
Kategorija  Trij ų rezultatų deriniai  
Ėsdinanti ir (arba) stipriai dirginanti chemin ė 
medžiaga  3 × IV 
2 × IV, 1 × III 
2 × IV, 1 × II (*) 
2 × IV, 1 × I (*) Ragenos drumstis po 30 min. ne mažesn ė kaip 3 
(ne mažiau kaip dviej ų akių) 
Ragenos drumstis kuriuo nors laiko momentu yra lygi 4 (ne mažiau kaip dviej ų akių) 
Didelis epitelio susilpn ėjimas (bent vienos akies)
 
(*) Retai pasitaikantys deriniai.  
47. Kaip nurodyta 1 skirsnyje, jeigu nenustatoma, kad chemin ė medžiaga yra 
akis ėsdinanti arba stipriai dirginanti medžiaga, klasifikavimo ir ženklinimo 
tikslais tur ėtų būti atlikti papildomi bandymai. Lyginant su triušio akies  in 
vivo bandymo metodo duomenimis, klasifikuojamais pagal EPA (1), ES (2) 
arba GHS (3) klasifikavimo sistemas, bendras ICE bandymo metodo tiks ­
lumas nustatant akis ėsdinančias ir stipriai dirginan čias medžiagas yra nuo 
83 % (120/144) iki 87 % (134/154), klaidingai teigiam ų rezultatų dalis – nuo 
6 % (7/122) iki 8 % (9/116), klaidingai neigiam ų rezultatų dalis – nuo 41 % 
(13/32) iki 50 %. (15/30). Iš duomen ų bazės pašalinus tam tikr ų cheminių 
(pvz., alkoholius ir aktyvi ąsias paviršiaus medžiagas) arba fizikini ų (pvz., 
kietąsias medžiagas) klasi ų chemines medžiagas, ICE bandymo metodo tiks ­
lumas pagal ES, EPA ir GHS klasifikavimo sistemas yra nuo 91 % (75/82) 
iki 92 % (69/75), klaidingai teigiam ų rezultatų dalis – nuo 5 % (4/73) iki 6 % 
(4/70), klaidingai neigiam ų rezultatų dalis – nuo 29 % (2/7) iki 33 % (3/9) 
(4). 
48. Net jeigu bandomoji medžiaga nepriskiriama akis ėsdinančių arba stipriai 
dirginančių medžiag ų kategorijai, ICE bandym ų duomenys, naudojami 
kartu su triušio akies  in vivo  bandymo arba deramai patvirtinto  in vitro  
bandymo duomenimis, gali b ūti naudingi toliau vertinant ICE bandym ų, 
kuriais siekiama nustatyti silpnai dirginan čias ir nedirginan čias medžiagas, 
metodo naudingum ą ir apribojimus (šiuo metu rengiamos toksiškumo akims  
in vitro  bandymų metodų rekomendacinis dokumentas).  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Tyrimo priimtinumo kriterijai  
49. Tyrimas laikomas priimtinu, jeigu kartu naudojant neigiam ą kontrolin ę 
grupę, tirpiklio (nešiklio) kontrolin ę grupę ir teigiam ą kontrolin ę grupę, 
nustatoma, kad chemin ė medžiaga atitinkamai priskirtina nedirginan čių 
medžiagų arba stipriai dirginan čių ir (arba) ėsdinančių medžiag ų kategorijai.  
Bandymo ataskaita  
50. Bandym ų ataskaitoje tur ėtų būti pateikta toliau nurodyta informacija, jeigu ji 
yra svarbi atlikto tyrimo atžvilgiu.  
Bandomosios ir kontrolin ės medžiagos  
Cheminės medžiagos pavadinimas (-ai), pvz., Chemini ų medžiagų santrump ų 
tarnybos (angl.  Chemical Abstracts Service , CAS) naudojamas strukt ūrinis 
pavadinimas ir kiti pavadinimai, jeigu jie žinomi;  
CAS registracijos numeris (RN), jeigu jis žinomas;  
cheminės medžiagos arba mišinio grynumas ir sud ėtis (masės procentin ėmis 
dalimis), kiek tai žinoma remiantis turima informacija;  
tyrimui svarbios fizikin ės ir chemin ės savybės, pvz., fizinis b ūvis, lakumas, 
pH, stabilumas, chemin ės medžiagos klas ė, tirpumas vandenyje;  
bandomosios ir (arba) kontrolin ės medžiagos apdorojimas prieš bandym ą, 
jeigu tai atliekama (pvz., pašildymas, sumalimas);  
stabilumas, jeigu jis žinomas.  
Informacija apie r ėmėją ir bandym ų laboratorij ą 
Rėmėjo pavadinimas ir adresas, bandym ų laboratorija ir tyrimo vadovas;  
informacija apie aki ų šaltinį (pvz., vieta, kurioje buvo paimtos akys);  
akių laikymo ir gabenimo s ąlygos (pvz., aki ų surinkimo data ir laikas, laiko ­
tarpis iki bandym ų pradžios);  
jeigu yra informacijos, specifin ės gyvūnų, iš kuri ų buvo paimtos akys, 
charakteristikos (pvz., gyv ūno, kurio akys buvo paimtos, amžius, lytis, 
svoris).  
Taikyto bandymo metodo ir protokolo pagrindimas  
Bandymo metodo integralumas  
Bandymo metodo integralumo (t. y. tikslumo ir patikimumo) užtikrinimo per 
tam tikrą laiką procedūra (pvz., periodiniai bandymai su patikros chemin ėmis 
medžiagomis, istorini ų duomen ų apie neigiamas ir teigiamas kontrolines 
medžiagas naudojimas).  
Bandymo priimtinumo kriterijai  
Jeigu turima, priimtini kartu naudojam ų lyginam ųjų kontrolini ų medžiag ų 
poveikio intervalai, pagr įsti istoriniais duomenimis.  
Bandymo s ąlygos  
Taikytos bandymo sistemos aprašas;  
naudotas mikroskopas su plyšine lempa(pvz., modelis);  
naudoto mikroskopo su plyšine lempa instrumentin ės nuostatos;  
informacija apie naudotas višt ų akis, įskaitant informacij ą apie jų kokybę; ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
išsami informacija apie taikyt ą bandymo metodik ą; 
naudota (-os) bandomosios medžiagos koncentracija (-os);  
bandymo metodikos pakeitim ų, jeigu jų buvo padaryta, aprašas;  
informacija apie istorinius duomenis, gautus taikant š į modelį (pvz., 
neigiamos ir teigiamos kontrolin ės medžiagos, patikros chemin ės medžiagos, 
lyginamosios chemin ės medžiagos);  
taikytų vertinimo kriterij ų aprašas.  
Rezultatai  
Kitų nustatytų poveikių apibūdinimas;  
akies nuotraukos, jeigu reikia.  
Aptarimas ir rezultatai  
Išvada  
LITERAT ŪRA 
(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
(2) 2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamen ­
tas (EB) Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifika ­
vimo, ženklinimo ir pakavimo, iš dalies kei čiantis ir panaikinantis 
direktyvas 67/548/EEB bei 1999/45/EB ir iš dalies kei čiantis 
Reglament ą (EB) Nr. 1907/2006; OL L 353, 2008 12 31, p. 1.  
(3) United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classifi ­
cation and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN 
New York and Geneva, 2007. Paskelbta:  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Paskelbta:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospec ­
tive study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to identify 
potential ocular corrosives and severe eye irritants. Paskelbta:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(6) EB (2006). 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos 
reglamentas (EB) Nr. 1907/2006 d ėl chemini ų medžiag ų registracijos, 
įvertinimo, autorizacijos ir apribojim ų (REACH), įsteigiantis Europos 
cheminių medžiagų agentūrą, iš dalies kei čiantis Direktyv ą 1999/45/EB 
bei panaikinantis Tarybos reglament ą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos 
reglament ą (EB) Nr. 1488/94, Tarybos direktyv ą 76/769/EEB ir Komi ­
sijos direktyvas 91/155/EEB, 93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB; OL L 396, 2006 12 30, p. 1.
 
(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Paskelbta:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_ 
1_1_1_1,00.html]  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. 
In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular Toxi ­
city Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corro ­
sives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alter ­
native Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Paskelbta:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Identi ­
fying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye 
Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Paskelbta:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enuc ­
leated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  31:69-76.
 
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Paskelbta:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/pre ­
diction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37.  
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline 
for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents 
in Healthcare Settings. Paskelbta:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method.  
Paskelbta: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_ 
brd_bcop.htm]  
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Paskelbta:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm] ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTYS  
Tikslumas –  bandymo metodo rezultat ų ir patvirtint ų pamatini ų verčių sutapimo 
artumas. Tikslumas yra bandymo metodo naudojimo charakteristik ų matas ir 
vienas iš tinkamumo aspekt ų. Terminas dažnai vartojamas pakaitomis su terminu 
„sutapimas“ reikšme „tinkam ų bandymo metodo rezultat ų dalis“.  
Lyginamoji chemin ė medžiaga –  cheminė medžiaga, naudojama kaip standartas, 
su kuriuo lyginama bandomoji medžiaga. Lyginamoji chemin ė medžiaga turi 
turėti tokias savybes: i) tinkam ą (-us) ir patikim ą (-us) šaltin į (-ius); ii) jos 
struktūrinės ir funkcin ės savybės turi būti panašios į bandomųjų medžiag ų kate­
gorijos savybes; iii) turi b ūti žinomos jos fizikin ės ir chemin ės savybės; iv) turi 
būti duomen ų, patvirtinan čių žinomą poveikį; v) turi b ūti žinomas jos stiprumas 
pageidaujamo atsako intervalo ribose.  
Ragena –  permatoma priekin ė akies obuolio dalis, dengianti rainel ę bei vyzd į ir 
praleidžianti švies ą į vidų. 
Ragenos padrumst ėjimas –  išmatuota ragenos padrumst ėjimo vert ė, gauta 
rageną baigus veikti bandom ąja medžiaga. Padid ėjusi ragenos drumstis rodo 
ragenos pažeidim ą. 
Ragenos pabrinkimas –  objektyvi per ICE bandym ą nustatoma ragenos išsip ū­
timo lygio vert ė, gauta ragen ą baigus veikti bandom ąja medžiaga. Išreiškiamas 
procentais ir apskai čiuojamas remiantis išmatuotu pamatiniu (nustatytu prieš 
skiriant doz ę) ragenos storiu ir ragenos storiu, vienodais intervalais užregistruotu 
rageną baigus veikti bandom ąja medžiaga per ICE bandym ą. Ragenos pabrin ­
kimo lygis rodo ragenos pažeidim ą. 
EPA 1 kategorija –  ėsdinimas (negr įžtamas akies audinio suardymas) arba 
ragenos pakenkimas arba dirginimas, trunkantis ilgiau kaip 21 dien ą (1). 
ES R41 kategorija –  akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis reg ėjimo 
pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus užd ėjus bandomosios medžiagos, iki 
galo nepraeinantis per 21 dien ą nuo užd ėjimo (2).  
Klaidingai neigiam ų rezultat ų dalis –  visų teigiamų medžiag ų, kurios taikant 
bandymo metod ą buvo klaidingai identifikuotos kaip neigiamos, dalis. Tai yra 
vienas iš bandymo metodo naudojimo charakteristik ų rodiklių. 
Klaidingai teigiam ų rezultat ų dalis –  visų neigiamų medžiag ų, kurios taikant 
bandymo metod ą buvo klaidingai identifikuotos kaip teigiamos, dalis. Tai yra 
vienas iš bandymo metodo naudojimo charakteristik ų rodiklių. 
Fluoresceino sulaikymas –  per ICE bandym ą subjektyviai nustatomas fluores ­
ceino natrio druskos kiekis, išlik ęs ragenos epitelio l ąstelėse, rageną baigus veikti 
bandomąja medžiaga. Fluoresceino sulaikymo laipsnis rodo ragenos epitelio 
pažeidimą. 
GHS (Visuotinai suderinta chemini ų medžiag ų klasifikavimo ir ženklinimo 
sistema) –  sistema, kurioje pateikiama chemini ų medžiagų (medžiag ų ir mišini ų) 
klasifikacija pagal standartizuotus fizikini ų pavojų, pavojų sveikatai bei aplinkai 
tipus ir nagrin ėjami atitinkami informaciniai elementai, pvz., piktogramos, signa ­
liniai žodžiai, pavojingumo fraz ės, atsargumo fraz ės ir saugos duomen ų lapai, 
kad būtų galima informuoti apie medžiag ų neigiamą poveikį, siekiant apsaugoti 
žmones (įskaitant darbuotojus, darbininkus, vež ėjus, vartotojus ir avarij ų likvida­
torius) ir aplink ą (3). ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
GHS 1 kategorija –  akies audinio pažeidimas arba smarkus fizinis reg ėjimo 
pablogėjimas, ant išorinio akies paviršiaus užd ėjus bandomosios medžiagos, iki 
galo nepraeinantis per 21 dien ą nuo užd ėjimo (3).  
Pavojus –  medžiagos savyb ė arba aplinkyb ės, dėl kurių organizmui, sistemai 
arba populiacijai (arba jos daliai), kuri ą veikia toji medžiaga, gali b ūti padarytas 
kenksmingas poveikis.  
Neigiamas kontrolinis m ėginys –  bandom ąja medžiaga neapdorota m ėginio 
kopija, turinti visas sudedam ąsias bandymo sistemos dalis. Šis m ėginys tiriamas 
kartu su bandom ąja medžiaga paveiktais m ėginiais ir kitais kontroliniais m ėgi­
niais, siekiant nustatyti, ar tirpiklis veikia bandymo sistem ą. 
Nedirginan čios medžiagos –  cheminės medžiagos, nepriskiriamos EPA I, II arba 
III kategorijos, ES R41 arba R36 kategorijos arba GHS 1, 2A arba 2B kategorijos akis dirginan čioms medžiagoms (1) (2) (3).
 
Akis ėsdinanti medžiaga –  a) chemin ė medžiaga, negr įžtamai suardanti akies 
audinį; b) chemin ės medžiagos, priskiriamos GHS 1 kategorijos, EPA I katego ­
rijos arba ES R41 kategorijos akis dirginan čioms medžiagoms (1) (2) (3).  
Akis dirginanti medžiaga –  a) chemin ė medžiaga, kuri, užd ėta ant priekinio 
akies paviršiaus, sukelia gr įžtamus akies pažeidimus; b) chemin ės medžiagos, 
priskiriamos EPA II arba III kategorijos, ES R36 kategorijos arba GHS 2A 
arba 2B kategorijos akis dirginan čioms medžiagoms (1) (2) (3).  
Akis stipriai dirginanti medžiaga –  a) chemin ė medžiaga, kuri, užd ėta ant 
priekinio akies paviršiaus, sukelia akies audinio pažeidimus, nepraeinan čius per 
21 dieną nuo tos medžiagos užd ėjimo, arba sukelia didel į fizinį regos pablog ė­
jimą; b) chemin ės medžiagos, priskiriamos GHS 1 kategorijos, EPA I kategorijos 
arba ES R41 kategorijos akis dirginan čioms medžiagoms (1) (2) (3).  
Teigiamas kontrolinis m ėginys –  mėginio kopija, turinti visas sudedam ąsias 
bandymo sistemos dalis ir apdorota chemine medžiaga, kuri, kaip yra žinoma, 
sukelia teigiam ą atsaką. Norint užtikrinti galimyb ę įvertinti atsako į teigiamą 
kontrolinę medžiag ą kaitą per tam tikr ą laiką, dirginamasis poveikis netur ėtų 
būti pernelyg stiprus.  
Patikimumas –  bandymo metodo, taikomo pagal t ą patį protokolą, atkuriamumo 
toje pačioje laboratorijoje ir kitose laboratorijose matas. Patikimumas įvertinamas 
apskaičiuojant atkuriamum ą laboratorijoje ir tarp laboratorij ų ir pakartojamum ą 
laboratorijoje.  
Mikroskopas su plyšine lempa –  prietaisas, naudojamas tiesiogiai ištirti ak į, jos 
vaizdą padidinant binokuliniu mikroskopu ir sukuriant tiesiogin į stereoskopin į 
vaizdą. Taikant ICE bandymo metod ą, šis prietaisas naudojamas vištos akies 
priekinėms sudedamosios dalims apži ūrėti ir ragenos storiui objektyviai išmatuoti 
pritaisytu gylio matavimo prietaisu.  
Tirpiklio (nešiklio) kontrolinis m ėginys –  neapdorotas m ėginys, turintis visas 
sudedamąsias bandymo sistemos dalis, įskaitant tirpikl į (nešiklį), kuris tiriamas 
kartu su bandom ąja medžiaga apdorotais m ėginiais ir kitais kontroliniais m ėgi­
niais, siekiant nustatyti pamatin į mėginių, apdorotų tuo pačiu tirpikliu (nešikliu), 
atsaką. Atliekant bandym ą kartu su neigiamu kontroliniu m ėginiu, šis m ėginys 
taip pat parodo, ar tirpiklis (nešiklis) veikia bandymo sistem ą. ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Pakopiniai bandymai –  nuosekli bandymo metodika, pagal kuri ą tam tikra eil ės 
tvarka nagrin ėjama visa turima informacija apie bandom ąją medžiag ą, kiekvie­
noje pakopoje taikant įrodomosios duomen ų galios metodik ą siekiant nustatyti, ar 
yra pakankamai duomen ų sprendimui d ėl pavojingumo kategorijos priimti, prieš 
pereinant prie kitos pakopos. Jeigu bandomosios medžiagos geb ą dirginti akis 
galima nustatyti remiantis turima informacija, papildom ų bandym ų atlikti 
nereikia. Jeigu bandomosios medžiagos dirginamosios gebos nustatyti remiantis turima informacija negalima, taikoma nuosekli gyv ūnų bandymo metodika, kol 
gaunami duomenys, kuriais remiantis galima aiškiai nustatyti tos medžiagos 
kategoriją.
 
Patvirtintas bandymo metodas –  bandymo metodas, kurio patvirtinimo tyrimai 
buvo atlikti siekiant nustatyti jo tinkamum ą (įskaitant tikslum ą) ir patikimum ą 
konkrečiai paskir čiai. Svarbu atkreipti d ėmesį, kad patvirtintas bandymo metodas 
gali būti nepakankamai tikslus ir patikimas, kad j į būtų galima pripažinti tinkamu 
siūlomai paskir čiai. 
Įrodomoji duomen ų galia –  metodika, pagal kuri ą vertinamos tam tikr ų infor­
macijos dali ų privalumai ir tr ūkumai, siekiant priimti ir pagr įsti sprendim ą dėl 
cheminės medžiagos pavojingumo.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
2 priedėlis 
PATIKROS CHEMIN ĖS MEDŽIAGOS ICE BANDYM Ų METODO ATVEJU  
Prieš prad ėdamos sistemingai taikyti bandymo metod ą, susijusį su šiomis 
bandymų gairėmis, laboratorijos gali pageidauti įsitikinti savo techniniu tinka ­
mumu pam ėgindamos teisingai nustatyti dešimties 1 lentel ėje siūlomų cheminių 
medžiagų akių ėsdinimo kategorij ą. Šios chemin ės medžiagos parinktos atsižvel ­
giant į įvairų vietinio akies dirginimo ir (arba) ėsdinimo atsak ą, pagrįstą triušio 
akies  in vivo  bandymo rezultatais (TG 405) (t. y. JT GHS 1, 2A, 2B kategorijos 
arba „Neklasifikuojama arba neženklinama“) (3) (7). Ta čiau, atsižvelgiant į 
patvirtintą šių bandym ų naudingum ą (t. y. tik nustatyti akis ėsdinančias ir 
(arba) stipriai dirginan čias medžiagas), klasifikavimui aktual ūs rezultatai, susij ę 
su techninio tinkamumo pasitikrinimu, yra tik du ( ėsdinanti ir (arba) stipriai 
dirginanti arba ne ėsdinanti ir (arba) stipriai nedirginanti medžiaga). Kiti atrankos 
kriterijai yra šie: chemin ės medžiagos turi b ūti parduodamos rinkoje, turi b ūti 
kokybiškų in vivo  pamatini ų duomenų ir turi būti kokybišk ų duomenų apie abu  
in vitro  metodus, apie kuriuos yra rengiamos bandym ų gairės. Dėl šios priežasties 
dirginančios chemin ės medžiagos buvo atrinktos iš ICCVAM rekomenduojam ų 
122 etalonini ų cheminių medžiag ų, skirtų in vitro  toksiškumo akims bandymo 
metodams patvirtinti, s ąrašo (žr. H pried ėlyje pateikt ą ICCVAM rekomenduo ­
jamų etalonini ų cheminių medžiag ų sąrašą) (4). Pamatiniai duomenys pateikti 
ICCVAM istorin ės apžvalgos dokumentuose, skirtuose galvij ų ragenos padrums ­
tėjimo ir pralaidumo (BCOP) ir ICE bandymo metodams (17) (18).  
1 lentelė 
ICE bandym ų metodo atveju rekomenduojamos patikros chemin ės medžiagos  
Cheminė medžiaga  CASNR  Cheminės 
medžiagos klas ė ( 1 ) Fizinis būvis In vivo  
kategorija (  2 ) In vitro  kategorija (  3 ) 
Benzalkonio chlo ­
ridas (5 %)  8001-54-5  Onio junginys  Skysta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) 
stipriai dirginanti  
Chlorheksidinas  55-56-1  Aminas, 
amidinas  Kieta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) 
stipriai dirginanti  
Dibenzoil-L-vyno 
rūgštis 2743-38-6  Karboksir ūgš­
ties esteris  Kieta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) 
stipriai dirginanti  
Imidazolas  288-32-4  Heterociklinis 
junginys  Kieta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) 
stipriai dirginanti  
Trichloracto r ūgštis 
(30 %)  76-03-9  Karboksir ūgštis Skysta  1 kategorija  Ėsdinanti ir (arba) 
stipriai dirginanti  
2,6-dichlorbenzoil ­
chloridas  4659-45-4  Acilhalogenidas  Skysta  2A kategorija  Neėsdinanti ir (arba) 
stipriai nedirginanti  
Etil-2-metil 
acetoacetatas  609-14-3  Ketonas, esteris  Skysta  2B kategorija  Neėsdinanti ir (arba) 
stipriai nedirginanti  
Amonio nitratas  6484-52-2  Neorganin ė 
druska  Kieta  2A kategorija  Neėsdinanti ir (arba) 
stipriai nedirginanti  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Cheminė medžiaga  CASNR  Cheminės 
medžiagos klas ė ( 1 ) Fizinis būvis In vivo  
kategorija (  2 ) In vitro  kategorija (  3 ) 
Glicerinas  56-81-5  Alkoholis  Skysta  Neženklinama  Neėsdinanti ir (arba) 
stipriai nedirginanti  
n-heksanas  110-54-3  Angliavande ­
nilis 
(aciklinis)  Skysta  Neženklinama  Neėsdinanti ir (arba) 
stipriai nedirginanti  
Santrumpos: CASRN – Chemini ų medžiag ų pavadinim ų santrump ų tarnybos registracijos numeris. 
( 1 ) Chemin ės klasės kiekvienai bandomajai medžiagai priskirtos taikant standartin ę klasifikavimo sistem ą, remiantis Nacionalin ės 
medicinos bibliotekos medicinos objekt ų pavadinim ų (MeSH) klasifikavimo sistema (paskelbta http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Remiantis rezultatais, gautais atlikus triušio akies  in vivo  bandymą (OECD TG 405), ir taikant JT GHS (3)(7). 
( 3 ) Remiantis BCOP ir ICE rezultatais.  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
3 priedėlis 
ICE superfuzijos aparato ir aki ų dėklų schemos  
(Daugiau bendrosios informacijos apie superfuzijos aparat ą ir akies 
dėklą pateikta Burton et al. (17))
  ▼M2 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  IN VITRO  ŽINDUOLI Ų LĄSTELĖS MIKROBRANDUOLIO 
BANDYMAS  
ĮVADAS  
1. In vitro  mikrobranduolio (MNvit) tyrimas yra genotoksiškumo bandymas, 
skirtas tarpfazini ų ląstelių citoplazmos mikrobranduoliams (angl.  micro­
nuclei , MN) aptikti. Mikrobranduoliai gali susidaryti iš acentrini ų chromo­
somų fragment ų (t. y. neturin čių centromeros) arba ištis ų chromosom ų, 
kurie ląstelių dalijimosi anafaz ės etapu negali migruoti link poli ų. Šiuo 
tyrimu aptinkamas klastogenini ų ir aneugenini ų chemini ų medžiag ų 
(medžiagų ir mišini ų) (1) (2) aktyvumas l ąstelėse, kurios dalijosi veikiant 
bandomąja medžiaga arba po veikimo. Pagal š į bandymo metod ą (BM) 
galima naudoti protokolus su aktino polimerizacijos inhibitoriumi citocha ­
lazinu B (citoB) arba be jo. CitoB prid ėjimas prieš tikslin ę mitozę suteikia 
galimybę atpažinti ir selektyviai analizuoti mikrobranduoli ų dažnumą ląste­
lėse, kuriose įvyko viena mitoz ė, nes tokios l ąstelės turi du branduolius (3) 
(4). Pagal š į bandymo metod ą taip pat galima naudoti protokolus be cito ­
kenezės blokavimo, jei yra įrodymų, kad analizuojamoje l ąstelių populia­
cijoje įvyko mitoz ė. 
2. Be MNvit tyrimo naudojimo chemin ėms medžiagoms (medžiagoms ir 
mišiniams), kurios indukuoja mikrobranduolius, atpažinti, citokinez ės 
blokavimo, imunocheminio kinetochor ų ženklinimo arba hibridizacijos su 
centromeriniais/telomeriniais zondais (fluorescencin ė in situ  
hibridizacija (FISH)) naudojimas taip pat gali suteikti informacijos apie 
chromosom ų pažeidimo ir mikrobranduoli ų formavimosi mechanizmus 
(5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Ženklinimo ir hibri ­
dizacijos proced ūras galima taikyti, kai yra padid ėjęs mikrobranduoli ų 
formavimasis ir tyr ėjas nori nustatyti, ar t ą padidėjimą sukėlė klastrogeni ­
niai ir (arba) aneugeniniai reiškiniai.  
3. Mikrobranduoliai parodo pažeidim ą, kuris buvo perduotas dukterin ėms 
ląstelėms, o metafaz ės ląstelėse užfiksuotos chromosom ų aberacijos negali 
būti perduodamos. Kadangi mikrobranduolius inferfaz ės ląstelėse galima 
įvertinti palyginti objektyviai, laboratorijos darbuotojai turi tik nustatyti, ar 
įvyko ląstelių dalijimasis ir kiek l ąstelių turi mikrobranduol į. Todėl prepa­
ratai gali b ūti įvertinti palyginti spar čiai ir analiz ė gali būti automatizuota. 
Todėl vienos operacijos metu įmanoma įvertinti ne šimtus, o t ūkstančius 
ląstelių, todėl tyrimo našumas padid ėja. Galiausiai, kadangi mikrobranduo ­
liai gali susidaryti chromosomoms įgaunant pirmin ę struktūrą („išnyks ­
tant“), yra galimyb ė aptikti aneuploidij ą sukelian čias medžiagas, kurias 
sunku tyrin ėti įprastais chromosom ų aberacijos bandymais, pvz., OECD 
bandymų metodika 473 (šio priedo B.10 skyrius) (17). Vis d ėlto MNvit 
tyrimas nesuteikia galimyb ės atskirti poliploidij ą sukelian čias chemines 
medžiagas nuo sukelian čių klastogeniškum ą, jei netaikoma speciali meto ­
dika, pvz., FISH, aprašyta 2 pastraipoje.  
4. MNvit tyrimas yra  in vitro  metodas, kuriame paprastai naudojamos kulti ­
vuotos žmogaus arba graužik ų ląstelės. Jis suteikia išsam ų pagrindą išty­
rinėti chromosom ų pažeidimo potenciali ą in vitro , kadangi galima aptikti 
tiek aneugenus, tiek klastogenus.  
5. MNvit tyrimas yra patikimas ir veiksmingas įvairių tipų ląstelėms ir esant 
citoB arba jo nesant. Yra daug duomen ų, patvirtinan čių MNvit tyrimo 
tinkamum ą naudojant įvairias graužik ų ląstelių linijas (CHO, V79, 
CHL/IU ir L5178Y) ir žmogaus limfocitus (18) (19) (20) (21) (22) (23) 
(24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Pirmiausia tai yra tarptautiniai 
tinkamumo patvirtinimo tyrimai, kuriuos koordinavo Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22), ir tarptautinio genotoksiškumo bandym ų seminaro ataskaitos (4) (16). Turimi duomenys 
buvo pakartotinai įvertinti įrodymų visumos retrospektyviniu tinkamumo 
patvirtinimo tyrimu, kur į atliko Europos Komisijos Europos alternatyvi ų
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
metodų tinkamumo patvirtinimo centras (ECVAM), o ECVAM mokslinis 
patariamasis komitetas (ESAC) patvirtino tyrimo metod ą kaip moksliškai 
patikimą (32) (33) (34). Buvo aprašytas žmogaus TK6 limfoblast ų linijos 
(35), HepG2 l ąstelių (36) (37) ir pagrindini ų Sirijos žiurk ėno embrionini ų 
ląstelių (38) naudojimas, nors jos nebuvo naudojamos tinkamumo patvir ­
tinimo tyrimuose.  
APIBRĖŽTYS  
6. Vartojamos apibr ėžtys pateiktos 1 pried ėlyje. 
PRADINIAI ASPEKTAI  
7. Bandymus atliekant  in vitro  paprastai reikia naudoti egzogenin į metabo­
linio suaktyvinimo šaltin į, nebent l ąstelės yra metaboliškai paj ėgios bando ­
mųjų medžiag ų atžvilgiu. Egzogenin ė metabolinio suaktyvinimo sistema 
nevisiškai atkartoja  in vivo  sąlygas. Taip pat reikia pasir ūpinti išvengti 
sąlygų, dėl kurių būtų gauti dirbtinai teigiami rezultatai, kurie neperteikia 
būdingo mutageniškumo ir gali atsirasti d ėl tokių veiksnių kaip ryšk ūs pH 
ar osmoliškumo poky čiai arba aukštas citoksiškumo lygis (39) (40) (41). 
Jei bandomoji chemin ė medžiaga prid ėjimo metu sukelia pH pokyt į 
terpėje, pH turi b ūti pakoreguotas, geriausia – pagrindinio tirpalo buferiu, 
kad visi kiekiai esant bandomajai koncentracijai, ir vis ų kontrolini ų 
medžiagų rodikliai išlikt ų tokie patys.  
8. Mikrobranduoli ų indukcijai analizuoti svarbiausia, kad tiek paveiktose, tiek 
nepaveiktose kult ūrose būtų įvykusi mitoz ė. Informatyviausias mikrobran ­
duolių vertinimo etapas vyksta l ąstelėse, kuriose veikiant bandom ąja 
medžiaga arba po to įvyko viena mitoz ė. 
BANDYMO PRINCIPAS  
9. Žmogaus arba žinduoli ų kilmės ląstelių kultūros veikiamos bandom ąja 
medžiaga tiek naudojant egzogenin į metabolinio suaktyvinimo šaltin į, 
tiek jo nenaudojant, nebent naudojamos pakankamos metabolizacin ės 
gebos l ąstelės. Visuose bandymuose naudojamas lygiagretus 
tirpiklis/nešiklis (VC) ir teigiamo poveikio kontrolin ės chemin ės 
medžiagos (PC).  
10. Veikiant bandom ąja medžiaga arba po to l ąstelės auginamos pakankam ą 
laikotarpį, kad įvyktų chromosomos arba verpst ės pažeidimas, d ėl kurio 
interfazin ėse ląstelėse imtų formuotis mikrobranduoliai. Aneuploidijai 
indukuoti bandomoji medžiaga paprastai turi veikti mitoz ės metu. 
Surinktos ir nudažytos interfazin ės ląstelės analizuojamos ieškant mikro ­
branduoli ų. Geriausia, jei mikrobranduoliai vertinami tik tose l ąstelėse, 
kuriose mitoz ė baigta veikiant bandom ąja medžiaga arba laikotarpiu po 
veikimo, jei toks taikomas. Citokinez ės blokatoriumi paveiktose kult ūrose 
tai pasiekiama vertinant tik dvibranduolines l ąsteles. Jei n ėra citokinez ės 
blokatoriaus, svarbu įrodyti, kad analizuotos l ąstelės greičiausiai būtų besi­
dalijusios veikiant bandom ąja medžiaga arba po to. Pagal visus protokolus 
svarbu įrodyti, kad l ąstelių proliferacija įvyko tiek kontrolin ėje, tiek 
paveiktoje kult ūrose, ir bandomosios medžiagos sukelt ą citotoksiškum ą 
arba citostaz ę reikia įvertinti kult ūrose (arba lygiagre čiose kult ūrose), 
kuriose įvertinti mikrobranduoliai.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Preparatai  
11. Galima naudoti kultivuotus pagrindinius žmogaus periferinius kraujo 
limfocitus (5) (19) (42) (43) ir kelet ą graužikų ląstelių linijų, pvz., 
CHO, V79, CHL/IU ir L5178Y l ąsteles (18) (19) (20) (21) (22) (25) 
(26) (27) (28) (30). Kit ų ląstelių linijų ir tipų naudojimas turi b ūti pagrįstas 
remiantis įrodytomis j ų naudojimo charakteristikomis tyrime, kaip aprašyta 
priimtinumo kriterij ų skyriuje. Kadangi tyrimo jautrumui tur ės poveikį 
foninis mikrobranduoli ų dažnis, rekomenduojama naudoti l ąstelių tipus, 
pasižymin čius žemu ir stabiliu mikrobranduoli ų formavimosi foniniu 
dažniu.  
12. Žmogaus periferiniai kraujo limfocitai turi b ūti gauti iš jaun ų (maždaug 
18–35 met ų amžiaus), sveik ų, nerūkančių asmenų, kurie neseniai žinomai 
nebuvo paveikti genotiksiškomis chemin ėmis medžiagomis ar spinduliuote. 
Jei ląstelės naudojimui surenkamos daugiau kaip iš vieno donoro, turi b ūti 
nurodytas donor ų skaičius. Mikrobranduoli ų dažnis did ėja su amžiumi ir ši 
tendencija ryškesn ė moteryse, nei vyruose (44) ir į tai turi b ūti atsižvelgta 
parenkant keli ų donorų ląsteles.  
Terpės ir kultūros sąlygos  
13. Kult ūroms palaikyti turi b ūti naudojama atitinkama kult ūrų terpė ir inku­
bacijos sąlygos (indai su kult ūromis, CO  2 koncentracija ir dr ėgmė). Nusta­
tytos ląstelių linijos ir atmainos turi b ūti reguliariai tikrinamos, ar nesi ­
keičia modalinis chromosom ų skaičius ir nėra užteršimo mikoplazma, o 
užsiteršus arba pakitus modaliniam chromosom ų skaičiui neturi b ūti 
naudojamos. Turi b ūti žinomas normali l ąstelių ciklo trukm ė taikomomis 
kultūros sąlygomis bandymus atliekan čioje laboratorijoje. Jei naudojamas 
citokinezės blokavimo metodas, citokinez ės inhibitoriaus koncentracija turi 
būti optimizuota konkre čiam ląstelių tipui ir užtikrinti ger ą dvibranduolini ų 
ląstelių gamybą įvertinimui atlikti.  
Kultūrų paruošimas  
14. Nustatytos l ąstelių linijos ir atmainos: l ąstelės paskleidžiamas iš pradini ų 
kultūrų, pasėjamos kult ūros terpėje tokiu tankiu, kad kult ūros nepasiekt ų 
monosluoksni ų susiliejimo, o suspensij ų kultūros nepasiekt ų per didelio 
tankio prieš surinkimo laik ą, ir inkubuojamos 37 °C temperat ūroje. 
15. Limfocitai: antikoaguliantu (pvz., heparinu) apdorotas kraujas arba atskirti 
limfocitai kultivuojami esant mitogenui, pvz., fitohemaglutininui (PHA), prieš paveikiant bandom ąja medžiaga ir citoB.
 
Metabolinis suaktyvinimas  
16. Kai naudojamos nepakankamo endogeninio metabolinio paj ėgumo ląstelės, 
turi būti naudojamos egzogenin ės metabolizavimo sistemos. Dažniausiai 
naudojama sistema yra kofaktoriumi papildyta pomitochondrin ė frakcija 
(S9), paruošta iš graužik ų kepenų, apdorota fermentus indukuojan čiomis 
medžiagomis, pvz., „Aroclor 1254“ (45) (46), arba fenobarbitono ir β- 
naftoflavono deriniu (46) (47) (48) (49). Pastarasis derinys neprieštarauja Stokholmo konvencijai d ėl patvari ųjų organini ų teršalų (50) ir 
Reglamentui (EB) Nr. 850/2004 d ėl patvariųjų organini ų teršalų (66) ir 
įrodyta, kad jis toks pat veiksmingas kaip „Aroclor 1254“ indukuojant 
mišrios funkcijos oksidazes (46) (47) (48) (49). S9 frakcija paprastai naudojama 1–10 % (t ūrio dalys) koncentracijos galutin ėje bandymo 
terpėje. Metabolinio suaktyvinimo sistemos b ūsena gali priklausyti nuo 
bandomos chemin ės medžiagos klas ės ir kai kuriais atvejais gali b ūti 
tikslinga naudoti daugiau kaip vien ą S9 koncentracij ą.
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Naudojant genetiškai modifikuotas l ąstelių linijos, išreiškian čias tam tikrus 
žmogaus arba graužik ų aktyvinan čius fermentus, gali nebereik ėti egzoge ­
ninės metabolinio suaktyvinimo sistemos ir jos gali b ūti naudojamos kaip 
bandomosios l ąstelės. Tokiais atvejais l ąstelių linijų parinkimas turi b ūti 
moksliškai pagr įstas, pvz., mišriosios funkcijos oksidazi ų tinkamumu 
bandomosios medžiagos metabolizmui (51) ir j ų reagavimu į žinomus 
klastogenus ir aneugenus (žr. atskir ą skyrių apie priimtinumo kriterijus). 
Reikia pripažinti, kad bandomosios medžiagos gali nepavykti metaboli ­
zuoti išreikštos mišrios funkcijos oksidaze (- ėmis); tokiu atveju neigiami 
rezultatai nerodyt ų, kad bandomoji medžiaga negali indukuoti mikrobran ­
duolių. 
Bandomosios medžiagos paruošimas  
18. Prieš apdorojant l ąsteles, kietosios chemin ės medžiagos ištirpinamos atitin ­
kamuose tirpikliuose arba nešikliuose ir, jei reikia, atskiedžiamos. Skystos 
medžiagos gali b ūti pilamos tiesiai į bandymo sistemas ir (arba) prieš 
apdorojim ą atskiedžiamos. Dujos ar lakiosios chemin ės medžiagos turi 
būti bandomos atitinkamai pakeitus standartinius protokolus, pvz., apdoro ­
jant sandariuose induose (52) (53). Turi b ūti naudojama šviežiai paruošta 
bandomoji medžiaga, nebent stabilumo duomenys rodo, kad j ą galima 
laikyti ilgesn į laiką. 
Bandymo s ąlygos  
Tirpikliai / nešikliai:  
19. Naudojamos koncentracijos tirpiklis / nešiklis neturi reaguoti su bandom ąja 
medžiaga arba b ūti nesuderinamas su l ąstelių išgyvenimu arba S9 veiklos 
palaikymu. Jei naudojamas kitas nei dažniausiai naudojamas tirpiklis / nešiklis (pvz., vanduo, l ąstelių kultūros terpė, dimetilo sulfoksidas), j ų 
naudojimas turi b ūti pagrįstas duomenimis, rodan čiais jų suderinamum ą 
su bandom ąja medžiaga ir genetinio toksiškumo nebuvim ą. Rekomenduo ­
jama, kad, kai įmanoma, pirmiausia b ūtų įvertinta galimyb ė naudoti vande ­
ninį tirpiklį / nešiklį.
 
CitoB kaip citokinez ės blokatoriaus naudojimas  
20. Vienas iš svarbiausi ų MNvit tyrimo naudojimo charakteristik ų aspektų yra 
užtikrinimas, kad vertinamos l ąstelės poveikio metu arba laikotarpiu po 
poveikio, jei toks taikomas, b ūtų baigusios mitoz ę. CitoB yra medžiaga, 
kuri plačiausiai naudojama citokinezei blokuoti, nes slopina aktino susi ­
jungimą ir taip neleidžia dukterin ėms ląstelėms atsiskirti po mitoz ės, dėl 
ko ima formuotis dvibranduolin ės ląstelės (5) (54) (55). Tod ėl mikrobran ­
duolių vertinimą galima apriboti l ąstelėmis, kuriose mitoz ė įvyko poveikio 
metu arba po jo. Kartu galima matuoti bandomosios medžiagos poveik į 
ląstelių proliferacijos kinetikai. CitoB turi b ūti naudojamas kaip citoki ­
nezės blokatorius, kai naudojami žmogaus limfocitai, kadangi l ąstelių 
ciklo trukm ė tarp kult ūrų ir donor ų skirsis ir ne visi limfocitai reaguos į 
PHA. Bandant l ąstelių linijas, kai norima nustatyti, ar vertinamos l ąstelės 
pasidalijo, yra taikomi kiti metodai – jie aprašyti toliau (žr. 26 skirsn į). 
21. Reikiam ą citoB koncentracij ą laboratorija turi nustatyti kiekvienam l ąstelių 
tipui, kad pasiekt ų optimalų dvibranduolini ų ląstelių dažnį tirpiklio/nešiklio 
kontrolinėse kultūrose. Tinkama citoB koncentracija paprastai yra 3–6 
μg/ml. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Ląstelių proliferacijos bei citotoksiškumo matavimas ir poveikio koncent ­
racijos parinkimas  
22. Nustatant didžiausi ą bandymui naudojam ą bandomosios medžiagos 
koncentracij ą reikia vengti koncentracij ų, kurios gali sukelti dirbtini ų 
teigiamų rezultatų, pvz., toki ų kurios sukelia per didel į citotoksiškum ą, 
nusėdimą kultūros terpėje ir žymius pH arba osmoliškumo poky čius (39) 
(40) (41).  
23. Ląstelių proliferacijos matavimai atliekami siekiant užtikrinti, kad paveik ­
tose ląstelėse tyrimo metu įvyko mitoz ė ir kad paveikimas atliekamas 
palaikant reikiam ą citotoksiškumo lyg į (žr. 29 skirsn į). Ląstelėse, kurioms 
būtinas metabolinis suaktyvinimas naudojant santykin į ląstelių skaičiaus 
padidėjimą (angl.  relative increase in cell counts , RICC) arba santykin į 
populiacijos padvigub ėjimą (angl.  relative population doubling , RPD), 
citotoksiškumas turi b ūti nustatytas su metaboliniu l ąstelių suaktyvinimu 
ir be jo, nebent naudojamas citoB. Kai naudojamas citoB, citotoksiškumas 
gali būti nustatytas taikant replikacijos indeks ą (RI) (formul ė pateikta 2 
priedėlyje).  
24. Ląstelių apdorojimas citoB ir santykinio vienbranduolini ų, dvibranduolini ų 
ir daugiabranduolini ų ląstelių dažnio kult ūroje išmatavimas yra tikslus 
metodas l ąstelių proliferacijos poveikiui ir poveikio medžiaga cititok ­
siškam ar citostatiškam aktyvumui kiekybiškai įvertinti (5) ir užtikrina, 
kad būtų įvertintos tik tos l ąstelės, kurios pasidalijo veikimo metu arba 
po to.  
25. Tyrimuose naudojant citoB citostaz ė / citotoksiškumas gali b ūti kieky­
biškai įvertinti pagal citokinez ės blokavimo proliferacijos indeks ą (angl.  
cytokinesis-block proliferation index , CBPI) (5) (26) (56) arba nustatyti 
pagal RI, apskai čiuotą pagal ne mažiau kaip 500 kult ūros ląstelių 
(formulės pateiktos 2 pried ėlyje). Kai citoB naudojamas l ąstelių prolifera ­
cijai įvertinti, CBPI arba RI turi b ūti nustatyti pagal ne mažiau kaip 500 
kultūros ląstelių. Šiuos ir kitus matavimus galima naudoti citotoksiškumui 
nustatyti palyginant paveiktas ir kontrolines kult ūras. Naudingos informa ­
cijos gali suteikti kit ų citotoksiškumo žymekli ų įvertinimas (pvz., susilie ­
jimo, ląstelių skaičiaus, apoptoz ės, nekroz ės, metafaz ės skaičiaus).  
26. Tyrimuose be citoB b ūtina įrodyti, kad kult ūroje įvertintų ląstelių daliji­
masis įvyko veikiant bandom ąja medžiaga arba po to, nes kitaip galimos 
klaidingai neigiamos reakcijos. Tarp metod ų, kurie naudojami užtikrinti, 
kad būtų vertinamos pasidalijusios l ąstelės, yra bromodeoksiuridino 
(BrdU) įterpimas ir paskesnis aptikimas, nustatant pasidalijusias l ąsteles 
(57), klon ų formavimas, kai paveikiamos l ąstelės iš nuolatini ų ląstelių 
linijų ir įvertinamos  in situ  ant mikroskopo objektinio stiklelio (prolifera ­
cijos indeksas, PI) (25) (26) (27) (28) arba santykinio populiacijos 
padvigubėjimo (RPD) ar santykinio l ąstelių skaičiaus padid ėjimo (RICC) 
matavimas ar kiti patvirtini metodai (16) (56) (58) (59) (formul ės pateiktos 
2 priedėlyje). Naudingos informacijos gali suteikti kit ų citotoksiškumo ar 
citostazės žymekli ų įvertinimas (pvz., susiliejimo, l ąstelių skaičiaus, apop ­
tozės, nekroz ės, metafaz ės skaičiaus).  
27. Turi b ūti įvertinos bent trys analizuojamos bandymo koncentracijos. Norint 
tai padaryti gali prireikti atlikti eksperiment ą naudojant didesn į skaičių 
nedaug besiskirian čių koncentracij ų ir išanalizuoti mikrobranduoli ų forma­
vimąsi tose koncentracijose, sudaran čiose reikiam ą citotoksiškumo inter ­
valą. Kita galima strategija – atlikti išankstin į citotoksiškumo bandym ą, 
skirtą susiaurinti galutinio bandymo interval ą. 
28. Didžiausia koncentracija turi b ūti siekiama sudaryti 55 ± 5 % citotoksiš ­
kumą. Didesni lygiai gali sukelti chromosom ų pažeidim ą – šalutin į cito­
toksiškumo poveik į (60). Jei pasireiškia citotoksiškumas, parinktos bando ­
mosios koncentracijos turi apimti interval ą nuo sukelian čios 55 ± 5 % 
citotoksiškum ą iki mažo arba jokio citotoksiškumo.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Jei stebima, kad citotoksiškumo n ėra arba iškrenta nuos ėdos, didžiausia 
bandomoji koncentracija turi atitikti 0,01 M, 5 mg/ml arba 5 μl/ml, taikant 
mažiausią vertę. Analizei parinktas koncentracijas paprastai turi skirti ne 
daugiau kaip 10 % intervalas. Jei bandom ųjų medžiag ų koncentracijos ir 
atsako sąryšio kreiv ė yra stati, gali reik ėti glaudžiau išd ėstyti bandomosios 
medžiagos koncentracijas, kad b ūtų įvertintos ir vidutinio bei mažo toksiš ­
kumo intervalo kult ūros. 
30. Jei ribojantis veiksnys yra tirpumas, didžiausia koncentracija, jeigu jos 
neriboja citotoksiškumas, turi b ūti mažiausia koncentracija, kuriai esant 
kultūrose matoma šiek tiek nuos ėdų, jei tai netrukdo įvertinimui. Nuos ėdų 
iškritimas turi b ūti įvertintas tokiais metodais kaip šviesos mikroskopija, 
užfiksuojant nuos ėdas, kurios išlieka arba atsiranda kultivavimo metu (iki 
veikimo pabaigos).  
Kontrolin ės medžiagos  
31. Kiekvieno eksperimento metu turi b ūti naudojamos lygiagre čios teigiamos 
ir tirpiklio/nešiklio kontrolin ės medžiagos tiek su metaboliniu suaktyvi ­
nimu, tiek be jo.  
32. PC b ūtinos įrodyti naudojam ų ląstelių ir bandymo protokolo geb ėjimą 
identifikuoti klastogenus bei aneugenus ir patvirtinti S9 preparato metabo ­
linę gebą. PC turi b ūti naudojami žinomi mikrobranduoli ų formavimosi 
sukėlikliai, o j ų koncentracija turi b ūti tokia, kad b ūtų nedidelis bet atku ­
riamas padid ėjimas nuo foninio ir įrodytas bandymo sistemos jautrumas. 
PC koncentracijos turi b ūti parinktos taip, kad poveikiai b ūtų aiškūs, bet 
iškart neatskleist ų vertintojui koduot ų preparat ų ant objektinio stiklelio 
tapatumo.  
33. Bandymo sistemos metaboliniam paj ėgumui ir gebai aptikti klastogen ą 
įrodyti turi b ūti naudojamos klastogenas, kuriame b ūtinas metabolinis 
suaktyvinimas (pvz., ciklofosfamidas, benzo[a]pirenas). Jei pateisinama, galima naudot kitas PC. Kadangi kai kurios PC, kurioms b ūtinas metabo ­
linis suaktyvinimas, tam tikromis poveikio s ąlygomis ar tam tikrose 
ląstelių linijose gali b ūti aktyvios be egzogeninio metabolinio suaktyvi ­
nimo, jo poreikis ir S9 preparato aktyvumas turi b ūti išbandyti parinktoje 
ląstelių linijoje ir naudojant parinktas koncentracijas.
 
34. Šiuo metu nežinoma joki ų aneugen ų, kurių genotoksiniam aktyvumui 
būtinas metabolinis suaktyvinimas (16). Šiuo metu pripažintos aneugeninio 
aktyvumo PC yra, pvz., kolchicinas ir vinblastinas. Kitos chemin ės 
medžiagos gali b ūti naudojamos, jei jos indukuoja mikrobranduolius 
vien tik arba daugiausia d ėl aneugeninio aktyvumo. Siekiant išvengti 
dviejų PC (klastogeniškumui ir aneugeniškumui) be metabolinio suaktyvi ­
nimo, aneugeniškumo kontrolin ė medžiaga gali b ūti naudojama kaip PC be 
S9, o klastogeniškumo kontrolin ė medžiaga – naudojamos metabolinio 
suaktyvinimo sistemos tinkamumui išbandyti. PC klastogeniškumui ir aneugeniškumui turi b ūti naudojamos l ąstelėse, kurioms nereikia S9. 
Siūlomos PC įtrauktos į 3 priedėlį.
 
35. Galima apsvarstyti su chemin ės medžiagos klase susijusios PC naudojimo 
galimybę, jei turima tinkam ų cheminių medžiag ų. Visos naudojamos PC 
turi būti tinkamos l ąstelių tipui ir suaktyvinimo s ąlygoms.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Tirpiklio / nešiklio kontrolin ė medžiagos turi b ūti naudojamos kiekvienu 
užaugintos kult ūros surinkimo metu. Be to, turi b ūti naudojama ir nepa ­
veikta NC (jei n ėra tirpiklio / nešiklio), nebent yra paskelbt ų arba anks čiau 
laboratorijoje sukaupt ų duomenų apie kontrol ę, rodančių, kad pasirinktu 
tirpikliu esant naudojamai koncentracijai nesukeliama joki ų genotoksišk ų 
ar kitų kenksming ų poveikių. 
BANDYMO EIGA  
Poveikio medžiaga planas  
37. Siekiant padidinti aneugen ų ar klastogen ų, veikiančių tam tikru l ąstelės 
ciklo etapu, aptikimo tikimyb ę, svarbu, kad bandom ąja medžiaga visais 
ląstelių ciklais b ūtų paveiktas pakankamas skai čius ląstelių. Todėl ląstelių 
linijų ir pagrindini ų ląstelių kultūrų veikimo medžiaga planas gali kiek 
skirtis nuo limfocit ų plano, nes j ų ląstelių ciklui prad ėti būtinas mitoge ­
ninis stimuliavimas; tai išnagrin ėta 41–43 skirsniuose (16).  
38. Teoriniai aptarimai, kaip ir paskelbti duomenys (18), rodo, kad dauguma 
aneugenų ir klastogen ų bus aptikti per trump ą 3–6 val. poveikio laikotarp į 
esant ir nesant S9, po ko bandomoji medžiaga pašalinama ir t ęsiamas 
1,5–2,0 ląstelių ciklų augimo laikotarpis (6). L ąstelės mėginiams imamos 
praėjus laikui, kuris lygus 1,5–2,0 normali ų (t. y. neapdorot ų) ląstelių 
ciklų, po poveikio medžiaga pradžios arba pabaigos (žr. 1 lentel ę). 
Mėginių ėmimo ar atsigavimo trukm ė gali būti pailginta, jei žinoma arba 
įtariama, kad bandomoji medžiaga turi poveik į ląstelių ciklo trukmei (pvz., 
bandant nukleozid ų analogus).  
39. Dėl S9 preparat ų galimo citotoksiškumo kultivuotoms žinduoli ų ląstelėms, 
pailginta 1,5–2,0 normali ų ląstelių ciklų poveikio trukm ė taikoma tik 
nenaudojant S9. Kai veikimas pailgintas, si ūlomi variantai, kaip paveikti 
ląsteles bandom ąja chemine medžiaga naudojant citoB arba jo nenaudo ­
jant. Šie variantai skirti situacijoms, kai gali b ūti nerimaujama d ėl galimos 
bandomosios medžiagos ir citoB s ąveikos.  
40. Siūlomi ląstelių veikimo medžiaga planai pateikti 1 lentel ėje. Šie bendro ­
sios paskirties veikimo medžiaga planai gali b ūti pakeisti, atsižvelgiant į 
bandomosios medžiagos stabilum ą ar reaktyvum ą ar naudojam ų ląstelių 
savitas augimo charakteristikas. Bet koks veikimas medžiaga turi prasid ėti 
ir baigtis l ąstelėms augant eksponentiškai. Šie planai išsamiau pateikti 
41–47 skirsniuose.  
1 lentelė 
MNvit tyrimo l ąstelių veikimo ir surinkimo laikas  
Limfocitai, pagrindin ės ląstelės ir ląstelių 
linijos, veikiamos medžiaga naudojant citoB  + S9  Paveikite 3–6 val. esant S9; 
pašalinkite S9 ir veikimo terp ę; 
pridėkite naują terpę ir citoB; 
surinkite pra ėjus 1,5–2,0 normali ų ląstelių 
ciklų. 
– S9 
Trumpas poveikis  Paveikite 3–6 val.; 
pašalinkite veikimo terp ę; 
pridėkite naują terpę ir citoB; 
surinkite pra ėjus 1,5–2,0 normali ų ląstelių 
ciklų. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Pailgintas poveikis  A variantas:  paveikite 1,5–2,0 normali ų 
ląstelių ciklų, esant citoB; 
surinkite pasibaigus poveikio laikotarpiui.  
B variantas:  paveikite 1,5–2,0 normali ų 
ląstelių ciklų; 
pašalinkite bandom ąją medžiag ą; 
pridėkite naują terpę ir citoB; 
surinkite pra ėjus 1,5–2,0 normali ų ląstelių 
ciklų. 
Ląstelių linijos, veikiamos medžiaga nenaudojant citoB 
(taip pat, kaip pagal pirmiau nurodyt ą planą, tik nepridedant citoB)  
Limfocitai, pagrindin ės ląstelės ir ląstelių linijos su citoB  
41. Jei tai limfocitai, veiksmingiausias metodas yra prad ėti veikti bandom ąja 
medžiaga pra ėjus 44–48 val. po stimuliavimo PHA, kai bus pasibaig ęs 
ciklo sinchronizavimas (5). Pradiniame tyrime l ąstelės 3–6 val. veikiamos 
bandomąja medžiaga nesant ir esant S9. Veikimo terp ė pašalinama ir 
pakeičiama nauja terpe, kurioje yra citoB, o l ąstelės surenkamos po 
1,5–2,0 normali ų ląstelių ciklų. 
42. Jei abiej ų pradinių trumpalaikio (3–6 val.) veikimo bandym ų rezultatai yra 
neigiami arba dviprasmiai, naudojamas pailgintas veikimas medžiaga be S9. Galimi du veikimo variantai, kurie vienodai priimtini. Ta čiau gali b ūti 
tikslingiau rinktis A variant ą stimuliuojamiems limfocitams, kai eksponen ­
tinis augimas gali imti maž ėti praėjus 96 val. po stimuliavimo. Be to, pagal 
B variant ą paskutinio m ėginio ėmimo metu l ąstelių kultūros turi neb ūti 
pasiekusios susiliejimo.
 
— A variantas: l ąstelės veikiamos bandom ąja medžiaga 1,5–2,0 normali ų 
ląstelių ciklų su surenkamos pra ėjus veikimo laikui.  
— B variantas: l ąstelės veikiamos bandom ąja medžiaga 1,5–2,0 normali ų 
ląstelių ciklų. Veikimo terp ė pašalinama ir pakei čiama nauja, o l ąstelės 
surenkamos po papildom ų 1,5–2,0 normali ų ląstelių ciklų. 
43. Pagrindin ės ląstelės ir ląstelių linijos turi b ūti veikiamos panašiai kaip 
limfocitai, išskyrus tai, kad j ų nebūtina 44–48 val. stimuliuoti PHA. Jei 
ląstelės ne limfocitai, jos turi b ūti veikiamos taip, kad baigiantis tyrimui 
tevyktų jų logaritminio augimo etapas.  
Ląstelių linijos be citoB  
44. Ląstelės turi būti 3–6 val. veikiamos esant ir nesant S9. Veikimo terp ė 
pašalinama ir pakei čiama nauja terpe, o l ąstelės surenkamos po 1,5–2,0 
normalių ląstelių ciklų. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Jei abiej ų pradinių trumpalaikio (3–6 val.) veikimo bandym ų rezultatai yra 
neigiami arba dviprasmiai, naudojamas pailgintas veikimas medžiaga (be 
S9). Galimi du veikimo variantai, kurie vienodai priimtini:  
— A variantas: l ąstelės veikiamos bandom ąja medžiaga 1,5–2,0 normali ų 
ląstelių ciklų su surenkamos pra ėjus poveikio laikui.  
— B variantas: l ąstelės veikiamos bandom ąja medžiaga 1,5–2,0 normali ų 
ląstelių ciklų. Veikimo terp ė pašalinama ir pakei čiama nauja, o l ąstelės 
surenkamos po papildom ų 1,5–2,0 normali ų ląstelių ciklų. 
46. 3–6 val. veikimo medžiaga pabaigoje monosluoksniuose gali b ūti mito­
zinių ląstelių (atpažįstamų iš apvalios formos ir atsiskyrimo nuo pavir ­ 
šiaus). Kadangi šios mitozin ės ląstelės lengvai atsiskiria, jas galima prarasti 
pašalinant terp ę su bandom ąja medžiaga. Reikia pasir ūpinti surinkti jas 
plaunant kult ūras ir grąžinti atgal, kad surinkimo metu neb ūtų prarastos 
mitozės etapo ląstelės, kuriose gali b ūti mikrobranduoli ų. 
Kultūrų skaičius 
47. Su kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija turi b ūti naudojamos 
pakartotin ės kultūros; tokios turi b ūti ir nešiklio/tirpiklio bei NC kult ūros. 
Jeigu remiantis anks čiau sukauptais laboratorijos duomenimis galima 
įrodyti, kad skirtumai tarp kartotinio pas ėjimo kult ūrų yra minimal ūs, 
galima naudoti pavienes kult ūras. Jei naudojamos pavien ės kultūros, reko­
menduojama analizuoti didesn į koncentracij ų skaičių. 
Ląstelių surinkimas ir preparat ų ant objektinio stiklelio paruošimas  
48. Kiekviena kult ūra surenkama ir apdorojama atskirai. Ruošiamos l ąstelės 
gali būti paveikiamos hipotoniniu šoku, ta čiau šis veiksmas neb ūtinas, jei 
pakankamas l ąstelių paskleidimas pasiekiamas kitais b ūdais. Preparat ą ant 
objektinio stiklelio galima paruošti įvairiais būdais, jei įvertinimui gaunami 
aukštos kokyb ės ląstelių preparatai. Turi b ūti išsaugota l ąstelių citoplazma, 
kad būtų galima aptikti mikrobranduolius ir (taikant citokinez ės blokavimo 
metodą) patikimai identifikuoti dvibranduolines l ąsteles.  
49. Preparatai ant objektinio stiklelio gali b ūti nudažyti įvairiais metodais, 
pvz., Giemsa arba fluorescenciniais specialiai DNR skirtais dažikliais (59). Jei naudojami specialiai DNR skirti dažai (pvz., akridino oranžas 
(61) arba Hoechst 33258 dažas, turintis pironino-Y (62)), galima pašalinti 
kai kuriuos artefaktus, kurie atsiranda naudojant specialiai DNR neskirtus dažus. Mikrobranduoli ų turiniui (chromosomai ar jos fragmentui) identifi ­
kuoti gali b ūti naudojami antikinetochoro antik ūnai, FISH su pancentro ­
metriniais DNR zondais arba užpildinis  in situ  ženklinimas su pancentro ­
meroms skirtais užpildais, kartu su atitinkamu DNR priešpriešiniu dažymu, jei domina mechanistin ė informacija apie j ų formavim ąsi (15) (16). Gali 
būti naudojami kiti klastogen ų ir aneugen ų diferencijavimo metodai, jei 
įrodyta, kad jie veiksmingi.
 
Analizė 
50. Prieš analizuojant mikroskopu visi preparatai ant objektinio stiklelio, įskai­
tant preparatus su tirpikliu / nešikliu ir kontrolin ėmis medžiagomis, turi 
būti nepriklausomai užkoduoti. Kitas b ūdas – analizuoti koduotus m ėgi­
nius naudojantis patvirtinto tinkamumo, automatizuot ą srauto citometrijos 
ar vaizdo analizavimo sistem ą. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. CitoB apdorotose kult ūrose mikrobranduoli ų dažnis turi b ūti išanalizuotas 
bent 2 000 dvibranduolini ų ląstelių kiekvienai koncentracijai (ne mažiau 
kaip 1 000 dvibranduolini ų ląstelių iš vienos kult ūros; po dvi kult ūras 
vienai koncentracijai). Jei naudojamos pavien ės kultūros, iš jų turi būti 
įvertinta ne mažiau kaip 2 000 dvibranduolini ų ląstelių. Jei įvertinimui 
pagal kiekvien ą koncentracij ą yra gerokai mažiau kaip po 1 000 dvibran ­
duolinių ląstelių iš vienos kult ūros arba 2 000, jei naudojama pavien ė 
kultūra, ir reikšmingo mikrobranduoli ų skaičiaus padid ėjimo neaptikta, 
bandymas turi b ūti pakartotas naudojant daugiau l ąstelių arba mažiau 
toksiškas koncentracijai (kas tinka). Reikia atsargumo nevertinti netaisy ­
klingos formos dvibranduolini ų ląstelių arba tų, kurių du branduoliai yra 
labai skirtingo dydžio; be to, dvibranduolini ų ląstelių nereikia painioti su 
prastai pasklidusiomis daugiabranduolin ėmis ląstelėmis. Ląstelės, kuriose 
yra daugiau kaip du pagrindiniai branduoliai, neturi b ūti analizuojamos 
vertinant mikrobranduolius, kadangi jose pradinis mikrobranduoli ų dažnis 
gali būti didesnis (63) (64). Vienbranduolini ų ląstelių įvertinimas yra 
priimtinas, jei bandomoji medžiaga įrodytai veikia citoB aktyvum ą. 
52. Ląstelių linijose, tiriamose neapdorojus CitoB, mikrobranduoliai turi b ūti 
išanalizuoti bent 2 000 l ąstelių kiekvienai koncentracijai (ne mažiau kaip 
1 000 ląstelių iš vienos kult ūros; po dvi kult ūras vienai koncentracijai). Jei 
naudojama tik po vien ą kultūrą koncentracijai, iš tos kult ūros turi b ūti 
įvertinta ne mažiau kaip 2 000 l ąstelių. 
53. Kai naudojamas citoB, l ąstelių proliferacijai įvertinti (žr. 2 pried ėlį) CBPI 
arba RI turi b ūti nustatyti pagal ne mažiau kaip 500 kult ūros ląstelių. Jei 
medžiaga veikiama nesant citoB, svarbu pateikti įrodymą, kad vertinamos 
ląstelės proliferavo, kaip aptarta 24–27 skirsniuose.  
Priimtinumo kriterijai  
54. Laboratorija, si ūlanti naudoti šiame BM aprašyt ą MNvit tyrim ą, turi įrodyti 
savo gebėjimą patikimai ir tiksliai aptikti žinomo aneugeninio ir klastoge ­
ninio aktyvumo chemines medžiagas su metaboliniu suaktyvinimu ir be jo, taip pat ir žinomas neigiamo poveikio medžiagas, naudodama 3 pried ėlyje 
nurodytas chemines medžiagas. Kaip savo geb ėjimo teisingai taikyti į BM 
įrodymą laboratorija turi pateikti įrodymą, kad ląstelėse, kuriose verti ­
namas mikrobranduolio formavimasis, įvyko vienas branduolio pasidali ­
jimas, jei bandymas atliekamas nenaudojant citoB.
 
55. 3 pried ėlyje nurodytas chemines medžiagas rekomenduojama naudoti kaip 
etalonines. Galima naudoti pakaitines ar papildomas chemines medžiagas, jeigu jų aktyvumas žinomas ir jos indukuoja mikrobranduolius tokiu pa čiu 
veikimo mechanizmu ir jei įrodyta, kad jos susijusios su chemin ėmis 
medžiagomis, kurios bus bandomos taikant MNvit proced ūrą. Pateisinimas 
gali būti tinkamumo patvirtinimo tyrimas, kuriame naudota plati medžiag ų 
įvairovė arba kuris sutelktas į siauresn į spektrą, remiantis bandomosios 
medžiagos chemine klase ar tyrin ėjamu pažaidos mechanizmu.
 
56. Tirpiklio / nešiklio kontrolin ės medžiagos ir nepaveikt ų kultūrų mikro­
branduoli ų dažnumas turi b ūti atkuriamai mažas ir pastovus (paprastai 
5–25 mikrobranduoliai/1 000 l ąstelių, kai ląstelės yra 11 skirsnyje nuro ­
dyto tipo). Kit ų tipų ląstelių atsakų intervalai gali b ūti kitokie ir jie turi 
būti nustatyti tvirtinant j ų tinkamum ą naudoti MNvit tyrime. Kontroli ­
niams intervalams pagal anks čiau sukauptus duomenis sudaryti turi b ūti 
naudojami neigiam ų medžiag ų, tirpiklių ir PC duomenys. Šios vert ės turi 
būti naudojamos nusprendžiant d ėl lygiagre čios NC/PC tinkamumo ekspe ­
rimentui.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Jei tyrimui si ūlomi nedideli protokolo pakeitimai (pvz., naudoti automati ­
zuotą, o ne rankin ę įvertinimo metodik ą; naudoti nauj ą ląstelių tipą), 
pakeitimo veiksmingumas turi b ūti įrodytas prieš pakeist ą protokol ą 
imant laikyti tinkamu naudoti. Veiksmingumo įrodymas apima įrodymą, 
kad galima aptikti pagrindinius chromosomos pertraukimo ir padid ėjimo ar 
sumažėjimo mechanizmus ir kad atskiros bandomosios medžiagos klasei ar 
plačiai medžiag ų grupei galima gauti atitinkamus teigiamus ir neigiamus 
rezultatus.  
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Rezultatų vertinimas  
58. Jei naudojama citokinez ės blokavimo metodika, vertinant mikrobranduoli ų 
indukciją naudojamas tik dvibranduolini ų ląstelių su mikrobranduoliais 
(nepriklausomai nuo mikrobranduoli ų skaičiaus ląstelėje) dažnis. 
Naudingos informacijos gali suteikti l ąstelių su vienu, dviem ar keliais 
mikrobranduoliais įvertinimas, bet tai neprivaloma.  
59. Lygiagre čiai turi būti nustatyti vis ų medžiaga paveikt ų ir tirpiklio/nešiklio 
kontrolini ų kultūrų citotoksiškumo ir (arba) citostaz ės rodikliai (58). Vis ų 
medžiaga paveikt ų ir kontrolini ų kultūrų CBPI arba RI turi b ūti apskai­ 
čiuoti kaip l ąstelių ciklo delsos rodikliai, kai taikomas citokinez ės bloka­
vimo metodas. Jei n ėra citoB, turi b ūti taikomas RPD arba RICC ar PI (žr. 
2 priedėlį). 
60. Turi b ūti pateikti duomenys apie atskir ą kultūrą. Be to, visi duomenys turi 
būti suvesti į lenteles.  
61. Chemin ės medžiagos, kurios MNvit tyrime indukuoja mikrobranduolius, 
tai gali daryti tod ėl, kad indukuoja chromosom ų nutraukim ą, netekim ą 
arba abiej ų veiksmų derinį. Siekiant nustatyti, ar mikrobranduoli ų induk­
cijos mechanizm ą suaktyvina klastogenin ė ir (arba) aneugenin ė veikla, gali 
būti atliekama papildoma analiz ė naudojant antikinetochoro antik ūnus, 
centromeroms skirtus  in situ  zondus ar kitus metodus.  
Rezultatų vertinimas ir aiškinimas  
62. Nėra reikalaujama papildomais bandymais tikrinti aiškiai teigiam ą arba 
neigiamą reakciją. Dviprasmiai rezultatai gali b ūti patikslinti išanalizavus 
papildomas 1 000 l ąstelių iš visų kultūrų, kad neb ūtų prarastas kodavimas. 
Jei toks metodas neišaiškina rezultato, reikia atlikti papildomus bandymus. Tolesniuose eksperimentuose reikia atsižvelgti į tyrimo parametr ų pasikei­
timą iš atitinkamai platesnio arba siauresnio s ąlygų intervalo. Gali pasi ­
keisti tokie tyrimo parametrai kaip tiriamosios koncentracijos intervalas, 
veikimo medžiaga ir l ąstelių surinkimo laikas ir (arba) metabolinio suak ­
tyvinimo s ąlygos.
 
63. Yra keletas teigiamo rezultato nustatymo kriterij ų, pvz., su koncentracija 
susijęs arba statistiškai reikšmingas mikrobranduol į turinčių ląstelių skai­ 
čiaus padid ėjimas. Pirmiausia turi b ūti apsvarstytas rezultat ų biologinis 
tinkamumas. Įvertinimas, ar gautos vert ės patenka ar nepatenka į anksčiau 
sukauptų duomenų kontrolin į intervalą, gali būti pravartus vertinant atsako 
biologinį reikšmingum ą. Bandymo rezultatams įvertinti galima taikyti 
atitinkamus statistinius metodus (65). Ta čiau statistinio bandymo rezultatai 
turi būti įvertinti doz ės ir atsako s ąryšio atžvilgiu. Taip pat reikia atsiž ­
velgti į atkuriamum ą ir anksčiau sukauptus duomenis.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Nors daugumos eksperiment ų rezultatai bus aiškiai teigiami ar neigiami, 
kai kuriais atvejais, remiantis duomen ų rinkiniu, nebus įmanoma priimti 
galutinio sprendimo apie bandomosios medžiagos aktyvum ą. Tokie 
dviprasmiai arba abejotini atsakai gali b ūti gaunami neatsižvelgiant į 
eksperimento pakartojim ų skaičių. 
65. Teigiami MNvit tyrimo duomenys rodo, kad bandomoji medžiaga sukelia 
chromosomos tr ūkimą ar netekim ą kultivuotose žinduoli ų ląstelėse. 
Neigiami rezultatai rodo, kad bandymo s ąlygomis bandomoji medžiaga 
nesukelia chromosomos tr ūkimų ir (arba) padid ėjimo ar sumaž ėjimo kulti ­
vuotose žinduoli ų ląstelėse. 
Bandymo ataskaita  
66. Bandym ų ataskaitoje turi b ūti bent ši informacija, jeigu ji susijusi su 
tyrimu:  
Bandomoji chemin ė medžiaga  
— identifikavimo duomenys ir Chemini ų medžiag ų santrump ų tarnybos 
numeris bei EC numeris,  
— fizinis b ūvis ir grynumas,  
— fizikin ės ir chemin ės savybės, svarbios su tyrimo vykdymu,  
— bandomosios chemin ės medžiagos reaktyvumas su tirpikliu/nešikliu 
arba ląstelių kultūros terpe.  
Tirpiklis/nešiklis  
— tirpiklio/nešiklio pasirinkimo pagrindimas,  
— bandomosios medžiagos tirpumas ir stabilumas tirpiklyje/nešiklyje.  
Ląstelės 
— naudojam ų ląstelių tipas ir šaltinis,  
— naudojamo l ąstelių tipo tinkamumas,  
— mikoplazmos nebuvimas, jei taikoma,  
— informacija apie l ąstelių ciklo trukm ę, padvigub ėjimo laiką arba proli ­
feracijos indeksas,  
— jei naudojami limfocitai, kraujo donor ų lytis, amžius ir skai čius, jei 
taikoma,  
— jei naudojami limfocitai, ar medžiaga veikiamas visas kraujas ar atskirti 
limfocitai,  
— eigų skaičius, jei taikoma,  
— ląstelių kultūros išlaikymo metodai, jei taikoma,  
— chromosom ų modalinis skai čius, 
— normali (neigiamo poveikio kontrolin ės medžiagos) l ąstelių ciklo 
trukmė. 
Bandymo s ąlygos  
— citokinez ės blokavimo medžiagos (pvz., citoB) tapatumas, jeigu ji 
naudojama, ir jos koncentracija ir l ąstelės poveikio trukm ė, 
— koncentracij ų ir kultūrų skaičiaus parinkimo loginis pagrindas, įskaitant 
citotoksiškumo duomenis ir tirpumo apribojimus, jei turima duomen ų, 
— terpės sudėtis, CO  2 koncentracija, jei taikoma,  
— bandomosios medžiagos koncentracija,  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— nešiklio ir prid ėtos bandomosios medžiagos koncentracija (ir (arba) 
tūris), 
— inkubacijos temperat ūra ir trukm ė, 
— veikimo medžiaga trukm ė, 
— surinkimo laikas po paveikimo,  
— ląstelių tankis pas ėjimo metu, jei taikoma,  
— metabolinio suaktyvinimo sistemos tipas ir sud ėtis, įskaitant priimti ­
numo kriterijus,  
— teigiamo poveikio kontrolin ės chemin ės medžiagos ir neigiamo 
poveikio kontrolin ės medžiagos,  
— preparat ų ant objektinio stiklelio paruošimo metodai ir taikoma dažymo 
metodika,  
— mikrobranduoli ų identifikavimo kriterijai,  
— tirtų ląstelių skaičius, 
— citotoksiškumo matavimo metodai,  
— bet kokia su citotoksiškumu susijusi papildoma informacija,  
— tyrimo vertinimo kaip teigiami, neigiami arba dviprasmiai kriterijai,  
— taikomas (-i) statistin ės analizės metodas (-ai),  
— metodai, pvz., kinetochor ų antikūnų naudojimas, skirti apib ūdinti, ar 
mikrobranduolyje yra visos ar fragmentuotos chromosomos, jei 
taikoma.  
Rezultatai  
— naudojas citotoksiškumo matas, pvz., CBPI arba RI, jei taikomas cito ­
kinezės blokavimo metodas; RICC, RPD arba PO, kai min ėtas metodas 
netaikomas; kitos pastabos, jei taikoma, pvz., l ąstelių susiliejimas, 
apoptozė, nekrozė, metafazi ų skaičius, dvibranduolini ų ląstelių dažnis,  
— nuosėdų iškritimo požymiai,  
— veikimo medžiaga terp ės pH ir osmoliškumo duomenys, jei nustatyti,  
— analizei priimt ų ląstelių apibrėžimas,  
— vienbranduolini ų, dvibranduolini ų ir daugiabranduolini ų ląstelių papli­
timas, jei taikomas citokinez ės blokavimo metodas,  
— ląstelių su mikrobranduoliais skai čius, atskirai kiekvienos medžiaga 
paveiktos ir kontrolin ės kultūros, kai tinka, nurodant, ar tai dvibran ­
duolinės ar vienbranduolin ės ląstelės, 
— koncentracijos ir atsako s ąryšis, kai įmanoma,  
— lygiagre čiai naudojamos neigiamo poveikio medžiagos (tirpiklio/ne ­ 
šiklio) ir teigiamo poveikio kontrolin ės cheminės medžiagos (koncent ­
racija ir tirpikliai) duomenys,  
— anksčiau sukaupti neigiamo poveikio medžiagos (tirpiklio/nešiklio) ir 
teigiamo poveikio kontrolin ės chemin ės medžiagos duomenys, nuro ­
dant intervalus, vidurkius ir standartin į nuokryp į bei pasikliaujam ąjį 
intervalą (pvz., 95 %),  
— statistin ė analizė, p vertės, jeigu yra.  
Rezultatų aptarimas  
Išvados  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
NUORODOS  
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res.,  392, 1–4.  
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3–15.  
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios.,  43, 233–246.  
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen ., 35, 167–172.
 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084–1104.  
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res.,  161, 193–198.  
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen.,  13, 34–43.
 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res.,  
234, 9–20.  
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with 
biotinylated gamma satellite DNA,  Mutagenesis,  6, 297–302.
 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis,  8, 329–334.  
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytoge ­
netic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds 
and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with a 
centromeric probe,  Mutation Res.,  319, 205–213.  
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis,  8, 519–525.  
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes follo ­
wing exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor 
fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res.,  322, 
9–20.  
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific cent ­
romeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res.,  
372, 233–245.  
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res.,  
372, 211–219.  
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res.,  540, 153–163.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test,  Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines]  
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res.,  607, 13–36.
 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res.,  607, 37–60.
 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res.,  607, 61–87.  
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., 
Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study 
on the  in vitro  micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res.,  
607, 88–124.
 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res.,  607, 125–152.
 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res.,  392, 
187–208.  
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res.,  392, 
45–59.  
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res.,  410, 81–116.  
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemi ­
cally induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, 183–190.  
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55–71.  
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells - results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137–163.
 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res.,  517, 123–134.
 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in a 
Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis,  14, 569–580.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International 
collaborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res.,  607, 
1–152.  
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 
25 th meeting, 16–17 November, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/in ­
dex.htm]  
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]
 
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis,  23, 271–283.  
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and 
Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid 
and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res.,  347, 105–115.  
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesis,  17, 257–260.  
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol.,  198, 315–328.
 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian 
hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res.,  392, 
61–70.  
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under 
extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res.,  257, 147–205.
 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res.,  268, 
297–305.  
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789–886.  
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymp ­
hocytes,  Mutation Res.,  147, 29–36.  
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res.,  392, 11–18.  
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. 
Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the 
frequency of micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31–45.
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res.,  113, 173–215.  
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol.,  
4, 55–65.
 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- 
induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis,  7, 175–177.  
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85–88.  
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen.,  28, 51–59.  
(50) UNEP (2001), Stokholmo konvencija d ėl patvariųjų organinių teršalų, Jung­
tinių Tautų aplinkos programa (UNEP). Prieinama: [http://www.pops.int/]  
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investi ­
gation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to 
genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis,  11, 
247–274.  
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Muta ­
tion Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., Costa, 
D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91–103.
 
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795–801.
 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a 
detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res.,  285, 35–44.
 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res.,  521, 103–112.  
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to 
„Report from the  in vitro  micronucleus assay working group“,  Mutation 
Res.,  564, 97–100.  
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res.,  139, 61–65.  
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res.,  655, 1–3.  
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in 
whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res.,  341, 
169–184.  
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191–201.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res.,  120, 241–247.  
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res.,  120, 269–275.
 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res.,  120, 241–247.  
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res.,  534, 65–75.  
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463–467.  
(66) 2004 m. balandžio 29 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) 
Nr. 850/2004 d ėl patvariųjų organini ų teršalų ir iš dalies kei čiantis Direk ­
tyvą 79/117/EEB, OL L 229, 2004 4 30, p. 5.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
1 priedėlis 
Apibrėžtys 
Aneugenas –  bet kokia medžiaga ar procesas, kurie, s ąveikaudami su mitoziniu ir 
mejoziniu l ąstelių dalijimosi ciklu, l ąstelėse ar organizmuose sukelia aneuploidij ą. 
Aneuploidija –  bet koks nukrypimas nuo normalaus diploidinio (arba haploidinio) 
chromosom ų skaičiaus viena ar daugiau kaip viena chromosoma, ta čiau ne visu 
chromosom ų rinkiniu ar keliais (poliploidija).  
Apoptozė – užprogramuota l ąstelių žūtis, kuriai b ūdinga serija etap ų, per kuriuos 
ląstelės suyra į membrana apsuptas daleles, kurios v ėliau pašalinamos fagocitoze 
arba numetimo b ūdu. 
Ląstelių proliferacija –  ląstelių skaičiaus didėjimas dėl mitozinio l ąstelių daliji­
mosi.  
Centromera –  chromosomos DNR sritis, kurioje susikabina abi chromatid ės ir 
kurioje greta vienas kito prisitvirtin ę abu kinetochorai.  
Klastogenas –  bet kokia medžiaga ar procesas, sukeliantys strukt ūrinius chromo ­
somų nukrypimus l ąstelių populiacijose ar organizmuose.  
Citokinez ė – ląstelių dalijimosi procesas iškart po mitoz ės, kuomet susidaro dvi 
dukterinės ląstelės, turinčios po vien ą branduol į. 
Citokinez ės blokavimo proliferacijos indeksas (CBPI) –  antrojo pasidalijimo 
ląstelių dalis medžiaga paveiktoje populiacijoje nepaveiktos kontrolin ės kultūros 
atžvilgiu (formul ė pateikta 2 pried ėlyje).  
Citostazė – ląstelių augimo slopinimas (formul ė pateikta 2 pried ėlyje).  
Citotoksiškumas –  žalingas poveikis l ąstelių struktūrai ar funkcijai, kuris galiau ­
siai sukelia l ąstelės žūtį. 
Genotoksiškas –  bendrasis terminas, kuriuo išreiškiamas vis ų tipų DNR arba 
chromosom ų pažeidimas, įskaitant nutraukimus, adukt ų pergrupavim ą, mutacijas, 
chromosom ų aberacijas ir aneuploidij ą. Ne visų tipų genotoksiškumo poveikiai 
sukelia mutacijas ar pastov ų chromosom ų pažeidim ą. 
Interfazin ės ląstelės – ląstelės, nesančios mitoz ės fazės. 
Kinetochoras –  baltymin ė struktūra, susidaranti chromosomos centromere, prie 
kurios dalijantis l ąstelėms jungiasi verpst ės siūlai ir dėl to dukterin ės chromo ­
somos tvarkingai išsid ėsto dukterini ų ląstelių poliuose.  
Mikrobranduolys –  atskiras mažas branduolys, esantis šalia pagrindinio l ąstelių 
branduolio, atsirad ęs mitozės ar mejoz ės telofazės metu, kai chromosom ų frag­
mentai ar ištisos chromosomos įgauna pirmin ę struktūrą („išnyksta“).  
Mitozės – ląstelės branduolio dalijimasis, paprastai skirstomas į profazę, prome­
tafazę, metafaz ę, anafazę ir telofaz ę. 
Mitozinis indeksas –  metafazėje esančių ląstelių sąryšis, padalytas iš viso l ąstelių 
populiacijos skai čiaus, rodantis tos l ąstelių populiacijos proliferacijos laipsn į. 
Mutageniškas –  sukeliantis paveldim ą DNR bazin ės poros sekos (- ų) pokytį 
genuose arba chromosom ų struktūroje (chromosom ų aberacijas).  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Neatsijungimas –  porinių chromatidži ų nesugebėjimas atsijungti ir tinkamai atsis ­
kirti į besivystan čias dukterines l ąsteles, dėl ko pastarosiose susidaro nenormalus 
chromosom ų skaičius. 
Poliploidija –  chromosom ų skaičiaus aberacijos l ąstelėse arba organizmuose, 
apimančios visą chromosom ų rinkinį ar rinkinius, skirtingai nuo atskiros chro ­
mosomos ar chromosom ų (aneuploidija).  
Proliferacijos indeksas (PI) –  citotoksiškumo matavimo metodas, kai nenaudo ­
jamas citoB (formul ė pateikta 2 pried ėlyje).  
Santykinis l ąstelių skaičiaus padid ėjimas (angl. RICC) –  citotoksiškumo mata ­
vimo metodas, kai nenaudojamas citoB (formul ė pateikta 2 pried ėlyje).  
Santykinis populiacijos padvigub ėjimas (angl. RPD) –  citotoksiškumo matavimo 
metodas, kai nenaudojamas citoB (formul ė pateikta 2 pried ėlyje).  
Replikacijos indeksas (RI) –  medžiaga paveiktos kult ūros ląstelių pasidalijimo 
ciklų skaičiaus sąryšis su nepaveiktos kontrolin ės kultūros rodikliu poveikio ir 
atsigavimo laikotarpiu (formul ė pateikta 2 pried ėlyje).  
Bandomoji chemin ė medžiaga (dar vadinama bandom ąja medžiaga) –  bet kuri 
medžiaga ar mišinys, bandomi taikant š į bandymų metodą. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
2 priedėlis 
Citotoksiškumo įvertinimo formul ės 
1. Kai naudojamas citoB , citotoksiškumo vertinimas turi b ūti grindžiamas 
citokinezės blokavimo proliferacijos indeksu (CBPI) arba replikacijos 
indeksu (RI) (16) (58). CBPI nurodo vidutin į ląstelės ciklų skaičių citoB poveikio 
laikotarpiu ir gali b ūti naudojamas l ąstelių proliferacijai skai čiuoti. RI rodo santy ­
kinį branduoli ų skaičių medžiaga paveiktose kult ūrose, palyginti su kontrolin ėmis 
kultūromis ir gali b ūti naudojamas citostaz ės procentinei daliai skai čiuoti:  
% citostaz ės = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
Ir: 
T = bandom ąja chemine medžiaga paveikta kult ūra 
C = nešiklio kontrolin ė kultūra 
Čia: 
CBPI ¼ ððvienbranduolini ų ląstelių skaičiusÞ þ 
ð2 Ü dvibranduolini ų ląstelių skaičiusÞ þ ð3 Ü daugiabranduolini ų ląstelių skaičiusÞÞ 
ðbendras ląstelių skaičiusÞ 
Taigi, CBPI lygus 1 (visos l ąstelės yra vienbranduolin ės) atitinka 100 % citos ­
tazę. 
Citostazė = 100 – RI  
RI ¼ ððdvibranduolini ų ląstelių skaičiusÞ þ ð2 Ü daugiabranduolini ų ląstelių skaičiusÞÞ ö 
ðbendras ląstelių skaičiusÞ T 
ððdvibranduolini ų ląstelių skaičiusÞ þ ð2 Ü daugiabranduolini ų ląstelių skaičiusÞÞ ö 
ðbendras ląstelių skaičiusÞ C Ü 100  
T = medžiaga paveiktos kult ūros 
C = nešiklio kontrolin ės kultūros 
2. Taigi, RI = 53 % reiškia, kad, palyginti su skai čiumi kontrolin ės kultūros 
ląstelių, kurios nepasidalijo sudarydamos dvibranduolines ir daugiabranduolines 
ląsteles, 53 % šio skai čiaus pasidalijo medžiaga paveiktoje kult ūroje, t. y. 47 % 
citostazė. 
3. Kai nenaudojamas citoB , citotoksiškum ą rekomenduojama vertinti pagal 
santykinį ląstelių skaičiaus padid ėjimą (RICC) arba santykin į populiacijos 
padvigubėjimą (RPD)(58), kadangi jais abiem atsižvelgiama į pasidalijusi ą 
ląstelių populiacijos dal į. 
RICC ¼ ðLąstelių skaičiaus padid ėjimas medžiaga paveiktose kult ūrose ðgalutinis – pradinis ÞÞ 
ðLąstelių skaičiaus padid ėjimas kontrolin ėse kultūrose ðgalutinis – pradinis ÞÞ Ü 100 
RPD ¼ ðPopuliacij ų padvigub ėjimų skaičius medžiaga paveiktose kult ūroseÞ 
ðPopuliacij ų padvigub ėjimų skaičius kontrolin ėse kultūroseÞ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
čia: 
Populiacijos padvigub ėjimas = [log (l ąstelių skaičius po paveikimo ÷ pradinis 
ląstelių skaičius)] ÷ log 2  
4. Taigi, RICC arba RPD, lygus 53 %, rodo 47 % citotoksiškum ą/citostazę. 
5. Vartojant proliferacijos indeks ą (PI), citotoksiškumas gali b ūti įvertintas 
skaičiuojant skai čių klonų, sudaryt ų iš 1 ląstelės (cl1), 2 l ąstelių (cl2), 3–4 
ląstelių (cl4) ir 5–8 l ąstelių (cl8)  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. PI vartojamas kaip vertingas ir patikimas citotoksiškumo parametras ir  in 
situ be citoB kultivuojamoms l ąstelių linijoms (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
3 priedėlis 
Naudojimo charakteristikoms įvertinti rekomenduojamos etalonin ės chemin ės medžiagos  ( 1 ) 
Kategorija  Chemin ės medžiaga  CAS Nr.  EC Nr.  
1. Klastogenai, aktyv ūs be metabolinio suaktyvinimo  
Citozino arabinozidas  147–94–4  205–705–9  
Mitomicinas C  50–07–7  200–008–6  
2. Klastogenai, kuriems reikia metabolinio suaktyvinimo  
Benzo(a)pirenas  50–32–8  200–028–5  
Ciklofosfamidas  50–18–0  200–015–4  
3. Aneugenai  
Kolchicinas  64–86–8  200–598–5  
Vinblastinas  143–67–9  205–606–0  
4. Neigiamos medžiagos  
Di(2-etilheksil)ftalatas  117–81–7  204–211–0  
Nalidiksin ė rūgštis 389–08–2  206–864–7  
Pirenas  129–00–0  204–927–3  
Natrio chloridas  7647–14–5  231–598–3  
( 1 ) Rekomenduojama naudoti etalonines chemines medžiagas. Galima naudoti pakaitines ar papildomas chemines medžiagas, jeigu j ų 
aktyvumas žinomas ir jos indukuoja mikrobranduolius tokiu pa čiu veikimo mechanizmu ir jei įrodyta, kad jos susijusios su 
cheminėmis medžiagomis, kurios bus bandomos taikant MNvit proced ūrą. Atsižvelgiant į paskirtį, pateisinimas gali b ūti ir tinka ­
mumo patvirtinimo tyrimas, kuriame naudota plati medžiag ų įvairovė arba kuris sutelktas į siauresnį spektrą, remiantis bandomosios 
medžiagos chemine klase ar tyrin ėjamu pažaidos mechanizmu.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO BANDYMAS. 
DA 
ĮVADAS  
1. OECD Chemini ų medžiagų bandymo gair ės ir ES bandym ų metodai perio ­
diškai persvarstomi atsižvelgiant į mokslo pažang ą, kintančias reguliavimo 
reikmes ir gyv ūnų gerovės sumetimais. Pirmasis bandym ų metodas (BM) 
(B.42) peli ų odos jautrinimui nustatyti – vietinio limfmazgio bandymas 
(LLNA; OECD bandym ų metodika 429; šio priedo B.42 skyrius) buvo 
persvarstytas (1). LLNA tinkamumo patvirtinimas ir susijusi ų darbų 
apžvalga paskelbta (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) šaltiniuose. Pagal 
LLNA limfocit ų proliferacijai matuoti naudojamas radioizotopinis timi ­
dinas arba jodas ir tod ėl tyrimas yra riboto naudojimo, kadangi sunku 
įsigyti, naudoti ar pašalinti radioaktyvias medžiagas. LLNA: DA (kur į 
sukūrė „Daicel Chemical Industries, Ltd.“) yra neradioaktyvaus pob ūdžio 
LLNA modifikacija, kuria adenozino trifosfato (ATP) kiekis įvertinamas 
bioliuminescencija kaip limfocit ų proliferacijos rodikliu. LLNA: DA 
bandymo metodo tinkamum ą patvirtino, apsvarst ė ir rekomenduoja tarp ­
tautinė tarpusavio vertinimo komisija; jis laikomas naudingu su tam tikrais 
apribojimais identifikuojant od ą jautrinan čias ir nejautrinan čias chemines 
medžiagas (10) (11) (12) (13). Šis BM yra parengtas chemini ų medžiag ų 
(medžiagų ir mišini ų) sukeliamam gyv ūnų odos jautrinimo potencialui 
įvertinti. Pagal šio priedo B.6 skyri ų ir OECD bandym ų metodika 406 
naudojami bandymai su j ūros kiaulyt ėmis, pirmiausia maksimizacijos ir 
Buehlerio bandymas su j ūros kiaulyt ėmis (14). LLNA (šio priedo B.42 
skyrius; OECD bandym ų metodika 429) ir dvi neradioaktyvaus pob ūdžio 
modifikacijos, LLNA: DA (šio priedo B.50 skyrius; OECD bandym ų 
metodika 442 A) ir LLNA: BrdU-ELISA (šio priedo B.51 skyrius; 
OECD bandym ų metodika 442 B), yra pranašesn ės už bandymus su 
jūros kiaulyt ėmis pagal B.6 and OECD bandym ų metodik ą 406 (14) 
tuo, kad sumažinamas ir patobulinamas gyv ūnų naudojimas.  
2. Panašiai, kaip LLNA, LLNA: DA metodu tiriamas odos jautrinimo induk ­
cinis etapas ir gaunami kiekybiniai duomenys, tinkami doz ės ir atsako 
sąryšiui įvertinti. Be to, galimyb ė aptikti odos jautriklius nenaudojant 
DNR žym ėjimo izotop ų, panaikina galimyb ę darbuotojams b ūti apšvitin ­
tiems dirbant ir atliek ų pašalinimo sunkumus. D ėl to savo ruožtu galima 
naudoti daugiau peli ų odos jautrikliams aptikti, tod ėl galima dar sumažinti 
jūros kiauly čių naudojim ą odos jautrinimo potencialui išbandyti (t. y. B.6; 
OECD bandym ų metodika 406) (14).  
APIBRĖŽTYS  
3. Vartojamos apibr ėžtys pateiktos 1 pried ėlyje. 
PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI  
4. LLNA: DA yra modifikuotas LLNA metodas galimai od ą jautrinan čioms 
cheminėms medžiagoms identifikuoti su tam tikrais apribojimais. Nereikia 
manyti, kad visais atvejais vietoj LLNA arba bandymo su j ūrų kiaulytėmis 
(t. y. B.6; OECD bandym ų metodika 406) (14), reikia taikyti LLNA: DA 
bandymą; tai labiau reiškia, kad šis bandymas yra lygiavertis ir gali b ūti 
taikomas kaip pakaitinis metodas, pagal kur į teigiamų ir neigiam ų rezultatų 
paprastai nebereikia papildomai patvirtinti (10) (11). Prieš atlikdama 
tyrimą bandymų laboratorija turi apsvarstyti vis ą turimą informacij ą apie 
bandomąją medžiag ą. Tokia informacija apima medžiagos tapatum ą ir ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
cheminę struktūrą, jos fizikines ir chemin ės savybes, vis ų kitų bandomo ­
sios medžiagos  in vitro  arba  in vivo  toksiškumo bandym ų rezultatus ir 
giminingos strukt ūros medžiag ų toksikologinius duomenis. Ši informacija 
turi būti apsvarstyta, siekiant nustatyti, ar LLNA: DA tinka bandomajai 
medžiagai (atsižvelgiant į tam tikr ų medžiag ų tipų nesuderinamum ą su 
LLNA: DA (žr. 5 skirsn į)), ir parinkti tinkam ą dozę. 
5. LLNA: DA yra  in vivo  metodas, tod ėl jautrinan čiam poveikiui d ėl aler­
ginio sąlyčio įvertinti naudojami gyv ūnai. Tačiau jis turi galimyb ę suma­ 
žinti gyv ūnų naudojim ą šiam tikslui, palyginti su bandymais su j ūros 
kiaulytėmis (B.6; OECD bandym ų metodika 406) (14). Be to, LLNA: 
DA iš esm ės pagerina b ūdą, kuriuo gyv ūnai naudojami jautrinimui d ėl 
alerginio s ąlyčio bandyti (kelia mažiau skausmo ir kan čių), kadangi, skir ­
tingai nei B.6 and OECD bandym ų metodika 406, taikant LLNA: DA 
nereikia sukelti ypa č didelio odos jautrumo reakcij ų. Nepaisant LLNA: 
DA pranašum ų prieš B.6 ir OECD bandym ų metodik ą 406 (14), yra 
tam tikrų apribojim ų, dėl kurių gali tekti taikyti B.6 ir OECD bandym ų 
metodiką 406 (pvz., tiriant kai kuriuos metalus, klaidingi teigiami rezul ­
tatai tiriant tam tikrus odos dirgiklius (pvz., kai kurias paviršinio aktyvumo tipo chemines medžiagas) (6) (1 ir šio priedo B.42 skyrius), bandomosios 
medžiagos tirpumas). Be to, d ėl chemini ų klasių arba medžiag ų, kuriose 
yra funkcini ų grupių, veikiančių kaip galimos klaidinan čiosios medžiagos 
(16), gali tekti atlikti bandymus su j ūrų kiaulytėmis (t. y. B.6; OECD 
bandymų metodika 406 (14)). Nustatytus LLNA apribojimus (1 ir šio 
priedo B.42 skyrius) rekomenduojama taikyti ir LLNA: DA (10). Be to, 
LLNA: DA gali netikti naudoti bandyti medžiagas, kurios turi poveik į 
ATP lygiui (pvz., medžiagas, kurios veikia kaip ATP inhibitoriai) arba tas, kurios trukdo tiksliai išmatuoti tarpl ąstelinį ATP (pvz., ATP ardan čių 
fermentų buvimą, tarpląstelinio ATP buvim ą limfmazgyje). Išskyrus tokius 
nustatytus apribojimus. LLNA: DA turi b ūti tinkamas bandant bet kurias 
chemines medžiagas, nebent tos medžiagos turi toki ų savybių, kurios 
kenktų LLNA: DA tikslumui. Be to, reikia išnagrin ėti ribinių teigiamų 
rezultatų galimybę, kai dirginimo rodiklio (SI) vert ės gaunamos nuo 1,8 
iki 2,5 (žr. 31, 32 skirsnius). Tai grindžiama 44 medžiag ų tinkamumo 
patvirtinimo duomen ų baze, taikant SI ≥ 1,8 (žr. 6 skirsn į), kurioje 
LLNA: DA teisingai identifikavo visus 32 LLNA jautriklius, bet netei ­
singai identifikavo tris iš 12 LLNA nejautrikli ų, kurių SI vertės nuo 1,8 iki 
2,5 (t. y. ribinis teigiamas rezultatas) (10). Ta čiau, kadangi tas pats 
duomenų rinkinys buvo naudojamas SI vert ėms nustatyti ir tyrimo prog ­
nozinėms savyb ėms apskai č
iuoti, pateikti rezultatai gali pervertinti tikr ąsias 
prognozines savybes.  
BANDYMO METODO PRINCIPAS  
6. Pagrindinis principas, kuriuo pagr įstas LLNA: DA metodas, yra jautrinan ­ 
čiųjų medžiagų sukelta pirmin ė limfocitų proliferacija chemin ės medžiagos 
poveikio viet ą drenuojan čiame limfmazgyje. Ši proliferacija yra propor ­
cinga naudojamai dozei ir alergeno gebai jautrinti, taigi tai yra paprastas 
būdas objektyviai ir kiekybiškai išmatuoti jautrinim ą. Proliferacija įverti­
nama palyginant vidutin ę proliferacij ą bandymo grup ėse ir nešikliu paveik ­
tose kontrolin ėse (angl.  vehicle treated control , VC) grup ėse. Nustatomas 
vidutinės proliferacijos paveiktose grup ėse ir kontrolin ėse VC grup ėse 
santykis, vadinamas SI, kuris turi b ūti ≥ 1,8, kad bandomoji medžiaga 
galėtų būti toliau vertinama kaip galinti od ą dirginanti medžiaga. Čia ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
aprašytos proced ūros pagrįstos ATP kiekio matavimu bioliuminescencijos 
būdu (žinoma, kad ji koreliuoja su gyv ų ląstelių skaičiumi) (17), kas 
parodo padid ėjusį proliferuojan čių ląstelių skaičių drenuojan čiuose aus ų 
limfmazgiuose (18) (19). Pagal bioliuminescencijos metod ą liuciferaz ės 
fermentas panaudojamas šviesai katalizuoti iš ATP ir liuciferino, vykstant 
šiai reakcijai:  
ATP + Luciferin  + O 2
 Oxyluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 + Light  
Skleidžiamos šviesos intensyvumas tiesiškai proporcingas ATP koncentracijai 
ir išmatuojamas liuminometru. Liuciferino-liuciferaz ės tyrimas yra jautrus 
ATP kiekio nustatymo metodas, taikomas labai įvairiai paskir čiai (20).  
BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšių parinkimas  
7. Šiam bandymui pasirinkta gyv ūnų rūšis – pelės. LLNA: DA tinkamumo 
patvirtinimo tyrimai buvo atlikti išimtinai su CBA/J veisle, kuri d ėl to 
laikoma tinkamiausia veisle (12) (13). Naudojamos suaugusios peli ų 
patelės, kurios yra netur ėjusios vados ir neapvaisintos. Pradedant bandym ą, 
gyvūnų amžius turi b ūti 8–12 savai čių, o gyvūnų masės skirtumas turi b ūti 
kiek įmanoma mažesnis ir neviršyti 20 % vidutin ės masės Galima naudoti 
kitas veisles ir patinus, jei yra gauta pakankamai duomen ų, kurie rodyt ų, 
kad nėra esmini ų veislei ir (arba) ly čiai būdingų atsako į LLNA: DA 
skirtumų 
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
8. Pel ės turi būti laikomos grup ėmis (21), nebent pateikiamas pakankamas 
loginis pagrindas, kod ėl peles reikia laikyti atskirai. Patalpos, kurioje 
laikomi bandomieji gyv ūnai, temperat ūra turi būti 22 ± 3 °C. Nors santy ­
kinė oro drėgmė turi būti ne mažesn ė kaip 30 % ir pageidautina ne didesn ė 
kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikia užtikrinti 50–60 %. 
Apšvietimas turi b ūti dirbtinis, taikant 12 val. šviesos ir 12 val. tamsos 
ciklą. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, 
neribojant geriamo vandens kiekio.  
Gyvūnų paruošimas  
9. Gyv ūnai pasirenkami atsitiktinai, ženklinami, kad b ūtų įmanoma kiekvien ą 
identifikuoti (ta čiau netaikomas joks aus ų ženklinimas), ir laikomi narve ­
liuose mažiausiai 5 paras prieš pradedant taikyti dozes, kad gal ėtų priprasti 
prie laboratorijos s ąlygų. Prieš veikimo medžiaga pradži ą visi gyv ūnai 
apžiūrimi, ar neturi pastebim ų odos pažeidim ų. 
Dozavimo tirpal ų paruošimas  
10. Prieš užtepant ant peli ų ausų, kietosios chemin ės medžiagos ištirpinamos 
arba paskleidžiamos tirpikliuose / nešikliuose ir, jei reikia, atskiedžiamos. 
Skystos chemin ės medžiagos gali b ūti užtepamos grynos arba atskiestos. 
Netirpios chemin ės medžiagos, pvz., tos, kuri ų paprastai pasitaiko medi ­
cinos įrangoje, prieš užtepant ant peli ų ausų, padidintosios ekstrakcijos 
būdu išskiriamos atitinkamame tirpiklyje, kad b ūtų gautos visos galimos 
išskirti sudedamosios dalys. Bandomosios medžiagos paruošiamos kasdien, 
nebent stabilumo duomenys rodo, kad jas galima laikyti ilgesn į laiką. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Patikimumo tikrinimas  
11. Teigiamo poveikio kontrolin ės chemin ės medžiagos (PC) naudojamos 
siekiant parodyti tyrimo tinkamum ą joms reaguojant pakankamu ir atkar ­
tojamu jautrumu kaip jautrinan čioms bandomosioms medžiagoms, kuri ų 
atsako dydis gerai apib ūdintas. Naudoti lygiagre čias PC rekomenduojama 
todėl, kad jos parodo laboratorijos kompetencij ą sėkmingai atlikti bandym ą 
kiekvieną tyrimą ir įvertinti atkuriamum ą bei palyginamum ą laboratorijoje 
ir tarp laboratorij ų. Kiekvieno tyrimo metu naudoti PC reikalauja ir kai 
kurios reguliavimo institucijos, tod ėl naudotojai raginami pasikonsultuoti 
su atitinkamomis institucijomis prieš vykdydami LLNA: DA. Taigi, skati ­
nama įprastai naudoti lygiagre čią PC, kad b ūtų išvengta papildom ų 
bandymų su gyvūnais, reikaling ų laikytis reikalavim ų, kuris gali kilti PC 
naudojant tik periodiškai (žr. 12 skirsn į). PC turi sukelti teigiam ą LLNA: 
DA atsak ą esant tokiam poveikio lygiui, kuris numatytas padidinti SI ≥ 
1,8, palyginti su neigiamo poveikio kontrolin ės medžiagos (NC) grupe. PC 
dozė turi būti parenkama taip, kad nesukelt ų per didelio odos sudirginimo 
ar sisteminio toksiškumo, o atsako suk ėlimas būtų atkuriamas, bet ne per 
didelis (pvz., SI > 10 b ūtų laikomas per dideliu). Tinkamiausia PC yra 
25 % heksilcinamono aldehidas (Chemini ų medžiag ų santrump ų tarnybos 
[CAS] Nr. 101–86–0) ir 25 % eugenolis (CAS Nr. 97–53–0,) acetone: alyvų aliejuje (4:1, t ūrio dalys). Gali pasitaikyti aplinkybi ų, kai, pateikus 
pakankamai įrodymų, galima naudoti kitas PC, atitinkan čias pirmiau nuro ­
dytus kriterijus.
 
12. Nors naudoti lygiagre čią PC grup ę rekomenduojama, gali b ūti situacij ų, 
kuriomis gali pakakti periodini ų bandymų naudojant PC (t. y. ≤ 6 mėnesių 
intervalais), jei tai laboratorijos, kurios reguliariai atlieka LLNA: DA (t. y. 
atlieka LLNA: DA ne re čiau kaip kart ą per mėnesį) ir turi įsteigusios 
anksčiau sukaupt ų PC duomen ų bazę, kuri rodo laboratorijos geb ėjimą 
gauti atkuriamus ir tikslius rezultatus su PC. Pakankamas profesionalumas atliekant LLNA: DA tyrimus gali b ūti sėkmingai įrodomas pastoviai 
gaunant teigiamus rezultatus naudojant PC ne mažiau kaip 10-yje neprik ­
lausomų bandym ų, atliktų per pagr įstą laikotarp į (t. y. trumpesn į kaip 
vieneri metai).
 
13. Lygiagreti PC visada turi b ūti naudojama, jei yra proced ūrinių LLNA: DA 
pakeitimų (pvz., pasikeit ė parengti darbuotojai, pakeistos bandymo metodo 
medžiagos ir (arba) reagentai, pakeista bandymo metodo įranga, pakeistas 
bandomųjų gyvūnų tiekėjas), o tokie pakeitimai turi b ūti užregistruoti 
laboratorijos ataskaitose. Turi b ūti apsvarstytas toki ų pasikeitim ų poveikis 
anksčiau sukaupt ų duomenų bazės tinkamumui, vertinant b ūtinybę sukurti 
naują anksčiau sukaupt ų duomenų bazę, skirtą PC rezultat ų nuoseklumui 
dokumentuoti.  
14. Tyr ėjai turi suprasti, kad sprendimas vykdyti PC tyrim ą periodiškai, o ne 
nuolat, turi padarini ų neigiamų tyrimų rezultatų, gautų be lygiagre čios PC 
naudojimo, laikotarpiu tarp kiekvieno periodinio PC tyrimo, tinkamumui ir 
priimtinumui. Pvz., jei, atliekant periodin į PC tyrim ą, gaunamas klaidingas 
neigiamas rezultatas, gali b ūti kvestionuojami neigiami bandomosios 
medžiagos rezultatai, gauti laikotarpiu nuo paskutinio priimtino periodinio 
PC tyrimo iki nepriimtino periodinio PC tyrimo. Ši ų rezultatų padariniai 
turi būti stropiai įvertinti sprendžiant, ar nuolat vykdyti lygiagre čius, ar tik 
periodinius PC tyrimus. Taip pat reikia apsvarstyti galimyb ę lygiagrečios 
PC grupės tyrimams naudoti mažiau gyv ūnų, jei tai moksliškai pateisinama 
ir jei laboratorija savo anks čiau sukauptais duomenimis įrodo, kad galima 
naudoti mažiau peli ų (22).  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Nors PC turi b ūti bandoma nešiklyje, kuris žinomai sukelia pastov ų atsaką 
(pvz., acetono ir alyv ų aliejaus mišinyje; 4:1, t ūrio dalys), gali b ūti tam 
tikrų reguliavimo situacij ų, kai gali prireikti ištirti ir nestandartin į nešiklį 
(kliniškai/chemiškai susijus į preparat ą) (23). Jei lygiagreti PC bandoma 
kitokiame nešiklyje nei bandomoji medžiaga, turi b ūti naudojama atskira 
VC, skirta lygiagre čiai PC.  
16. Tais atvejais, kai vertinamos tam tikrai cheminei klasei ar atsak ų sričiai 
priklausan čios medžiagos, gali b ūti naudojamos ir palyginamosios 
cheminės medžiagos, kad b ūtų parodyta, jog bandymo metodas tinkamai 
veikia nustatant ši ų medžiag ų odos jautrinimo potencial ą. Atitinkamos 
palyginamosios medžiagos turi pasižym ėti šiomis savyb ėmis: 
— strukt ūriniu ir funkciniu panašumu į bandomosios chemin ės medžiagos 
klasę, 
— žinomomis fizin ėmis ir chemin ėmis charakteristikomis,  
— apie jas turi b ūti patvirtinan čių duomenų, gautų LLNA: DA tyrimais,  
— apie jas turi b ūti patvirtinan čių duomenų, gautų kitų gyvūnų modeliais 
ir (arba) iš žmoni ų. 
BANDYMO EIGA  
Gyvūnų skaičius ir dozi ų dydis  
17. Vienai doz ės grupei naudojami ne mažiau kaip keturi gyv ūnai, naudojant 
ne mažiau kaip tris bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijas ir 
vieną lygiagre čią NC grup ę, paveikiam ą tik bandomosios medžiagos 
nešikliu, ir PC (lygiagre čią arba naujausi ą, remiantis laboratorijos politika 
pagal 11–15 skirsnius). Reikia apsvarstyti poreik į išbandyti kelet ą PC 
dozių, ypač bandant PC periodiškai. Išskyrus neveikim ą bandom ąja 
medžiaga, kontrolini ų grupių gyvūnai turi b ūti prižiūrimi ir jais r ūpinamasi 
taip pat, kaip poveikio grup ės gyvūnais. 
18. Doz ė ir nešiklis turi b ūti parenkami laikantis (2) ir (24) šaltiniuose patei ­
kiamų rekomendacij ų. Paeilinės dozės paprastai parenkamos iš atitinkamos 
koncentracijos ver čių eilės, pvz., 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 
1 %, 0,5 % ir t. t. Taikomai koncentracijos ver čių eilei turi b ūti skirtas 
tinkamas loginis pagrindas. Reikia atsižvelgti į visą turimą toksikologin ę 
informacij ą (pvz., apie ūminį toksiškum ą ir odos dirginim ą) ir strukt ūrinę 
bei fizikini ų ir chemini ų savybių informacij ą apie dominan čią bandomąją 
cheminę medžiag ą (ir (arba) strukt ūriškai panašias medžiagas), kad trys iš 
eilės taikomos koncentracijos vert ės būtų parinktos taip, kad didžiausios 
koncentracijos poveikis b ūtų kuo didesnis, bet išvengta sisteminio toksiš ­
kumo ir (arba) per didelio vietinio odos dirginimo (24) (25). Jei tokios 
informacijos neturima, gali prireikti pradinio atrankinio bandymo (žr. 21–24 skirsnius).
 
19. Nešiklis neturi kenkti ar iškraipyti bandymo rezultato ir turi b ūti parinktas 
taip, kad b ūtų kuo geresnis tirpumas, siekiant gauti didžiausi ą įmanomą 
koncentracij ą gaminant tirpal ą/suspensij ą, tinkamą bandomajai medžiagai 
užtepti. Rekomenduojami nešikliai yra acetono ir alyv ų aliejaus mišinys 
(4:1, tūrio dalys), N,N-dimetilformamidas, metiletilketonas, propilengli ­
kolis ir dimetilsulfoksidas (6), ta čiau galima naudoti kitus nešiklius, jei 
pateikiamas tinkamas loginis pagrindas. Tam tikrais atvejais papildomai 
kontrolei gali tekti naudoti klinikiniu poži ūriu atitinkant į tirpiklį arba 
komercin į preparatą, turintį bandomosios medžiagos. Reikia ypa č stengtis 
užtikrinti, kad į nešiklyje b ūtų hidrofilini ų medžiagų, kurios dr ėkintų odą ir 
iš karto nenutek ėtų, įdedant soliubilizavimo priemoni ų (pvz., 1 % 
„Pluronic® L92“). Taigi reikia vengti naudoti grynai vandeninius nešik ­
lius. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Apdorojant atskir ų pelių limfmazgius galima įvertinti nepastovum ą tarp 
gyvūnų ir statistiškai palyginti skirtumus tarp bandomosios medžiagos ir 
VC grupės matavimo rezultat ų (žr. 33 skirsn į). Be to, tik tada, kai suren ­
kami atskir ų gyvūnų duomenys, realu įvertinti galimyb ę sumažinti peli ų 
skaičių PC grup ėje (22). Negana to, kai kurios reguliavimo institucijos 
reikalauja gauti atskirt ų gyvūnų duomenis. Reguliarus atskir ų gyvūnų 
duomenų rinkimas turi r ūpinimosi gyv ūnų gerove privalum ų, nes išven ­
giama dvigubo bandymo, kurio reik ėtų, jei bandomosios medžiagos rezul ­
tatus, iš pradži ų gautus kitu b ūdu (pvz., iš jungtini ų gyvūnų duomenų), 
vėliau vertint ų reguliavimo institucijos, kurios vadovaujasi kitais reikala ­
vimais (pvz., atskir ų gyvūnų duomenimis).  
Atrankinis bandymas  
21. Jei neturima informacijos, skirtos didžiausiai bandomai dozei nustatyti (žr. 
18 skirsn į), reikia atlikti atrankin į bandymą, kad būtų nustatytas tinkamas 
dozės lygis pagal LLNA: DA metod ą. Atrankinio bandymo tikslas – nusta ­
tyti gaires didžiausiam pagrindinio LLNA: DA tyrimo doz ės lygiui 
parinkti, kai neturima informacijos apie koncentracij ą, kuri sukelia siste ­
minį toksiškum ą (žr. 24 skirsn į) ir (arba) per didel į vietinį odos dirginim ą 
(žr. 23 skirsn į). Didžiausias bandomas doz ės lygis turi b ūti 100 % bando ­
mosios medžiagos, jei tai skys čiai, arba didžiausia įmanoma koncentracija, 
jei tai kietosios medžiagos ar suspensijos.  
22. Atrankinis bandymas atliekamas tokiomis pa čiomis sąlygomis kaip ir 
pagrindinis LLNA: DA tyrimas, išskyrus tai, kad nevertinama limfmazgi ų 
proliferacija ir galima tirti mažiau gyv ūnų kiekvienoje doz ės grupėje. 
Siūloma naudoti vien ą arba du gyv ūnus vienai doz ės grupei. Visos pel ės 
kasdien stebimos, ar poveikio vietoje nepasireiškia sisteminio toksiškumo 
ar vietinio dirginimo klinikiniai požymiai. K ūno masė užrašoma prieš 
bandymą ir prieš j į pabaigiant (8 dien ą). Abi kiekvienos pel ės ausys 
stebimos, ar n ėra eritemos ir įvertinama pagal 1 lentel ę (25). 1 dien ą 
(prieš doz ę), 3 dieną (praėjus maždaug 48 valand ų po pirmosios doz ės), 
7 dieną (24 valandos prieš pabaigim ą) ir 8 dien ą stormačiu (pvz., skait ­
meniniu mikrometru arba ciferblatiniu storio matuokliu) atliekami aus ų 
storio matavimai. Be to, 8 dien ą ausų storis gali b ūti įvertinamas aus ų 
skylamušio svorio matavimais, atliekamais po to, kai gyv ūnai humaniškai 
numarinami. Per didel į vietinį dirginim ą rodo ≥ 3 edemos įvertis ir (arba) 
≥ 25 % ausies storio padid ėjimas bet kuri ą matavimo dien ą (26) (27). 
Didžiausia pagrindiniam LLNA: DA tyrimui parenkama doz ė yra antra 
pagal dyd į dozė iš atrankinio bandymo koncentracij ų eilės (žr. 18 skirsn į), 
nesukelianti sisteminio toksiškumo ir (arba) per didelio vietinio odos dirgi ­
nimo.  
1 lentelė 
Eritemos įverčiai 
Pastebėjimas  Įvertis  
Eritemos n ėra 0  
Labai nedidel ė eritema (vos juntama)  1  
Aiški eritema  2  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Pastebėjimas  Įvertis  
Nuo vidutin ės iki sunkios eritemos  3  
Nuo sunkios eritemos (buroko raudonumo) iki šašo susidarymo, kuomet 
nebeįmanoma įvertinti eritemos sunkumo  4 
23. Taikant LLNA metod ą, dirgikliams nustatyti, be aus ų storio padid ėjimo 
25 % (26) (27), naudojamas ir statistiškai reikšmingas paveikt ų pelių ausų 
storio padid ėjimas, palyginti su kontrolin ėmis pelėmis (28) (29) (30) (31) 
(32) (33) (34). Vis d ėlto, nors statistiškai reikšmingas padid ėjimas galimas 
ir ausies storiui esant mažesniam kaip 25 %, tai n ėra siejama konkre čiai su 
per dideliu dirginimu (30) (31) (32) (33) (34).  
24. Šie klinikiniai požymiai gali rodyti sistemin į toksiškum ą (35), kai yra 
naudojami kaip integruoto įvertinimo dalis, tod ėl gali nurodyti didžiausi ą 
dozės lygį, skirtą pagrindiniam LLNA: DA: nerv ų sistemos funkcijos 
pokyčiai (pvz., piloerekcija, ataksija, drebulys ir konvulsijos); elgsenos 
pokyčiai (pvz., agresyvumas, prausimosi poky čiai, žymus aktyvumo 
lygio pokytis); kv ėpavimo b ūdo pokyčiai (t. y. kv ėpavimo dažnio ir inten ­
syvumo poky čiai, pvz., dusulys, žiop čiojimas ir karkalai) ir ėdalo bei 
vandens vartojimo poky čiai. Be to, vertinant turi b ūti atsižvelgiama į 
letargijos ir (arba) nereagavimo požymius ir bet kokius didesnio už nedi ­
delį ar trumpalaik į skausmą ir kančią klinikinius požymius arba > 5 % 
kūno masės sumažėjimą nuo 1 iki 8 dienos, ir į mirtingum ą. Gaištantys 
ar didelio skausmo ir kan čios požymius rodantys gyv ūnai turi b ūti huma­
niškai numarinti (36).  
Pagrindinio bandymo eksperimentinis planas  
25. Eksperimentinis bandymo planas atrodo taip:  
— 1 diena.  Atskirai nustatoma ir užrašoma kiekvieno gyv ūno masė ir bet 
kokie klinikiniai pasteb ėjimai. Ant kiekvienos ausies išorin ės pusės 
šepetėliu, suvilgytu 1 % natrio laurilo sulfato (SLS) vandeniniame 
tirpale, SLS tirpalas užtepamas keturiais penkiais pot ėpiais padengiant 
visą paviršių. Praėjus vienai valandai po SLS užtepimo, ant kiekvienos 
ausies išorin ės pusės užtepama 25 μl atitinkamai atskiesto bandomo ­
sios medžiagos tirpalo, vien tik nešiklio arba PC (lygiagre čios arba 
naujausios, remiantis laboratorijos politika pagal 11–15 skirsnius).  
— 2, 3 ir 7 dienos.  Pakartojamas pradinis paveikimas 1 % SLS vande ­
niniu tirpalu ir 1 dien ą atlikta bandomosios medžiagos užtepimo 
procedūra. 
— 4, 5 ir 6 dienos.  Jokio veikimo.  
— 8 diena.  Užrašoma kiekvieno gyv ūno masė ir bet kokie klinikiniai 
pastebėjimai. Pra ėjus maždaug 24–30 valand ų po paveikimo 7 dien ą, 
gyvūnai humaniškai numarinami. Kiekvienos pel ės drenuojamieji aus ų 
limfmazgiai išpjaunami ir kiekvieno gyv ūno atskirai apdorojami fosfa ­
tiniame buferyje (PBS). Limfmazgi ų identifikavimo ir skrodimo apraš ą 
bei schemas galima rasti (22) šaltinyje. Norint toliau steb ėti vietinį 
odos atsak ą pagrindiniame tyrime, į tyrimo protokol ą gali būti įtraukti 
tokie papildomi parametrai kaip aus ų eritemos įverčiai arba aus ų storio 
matavimo rezultatai (gauti storio matuokliu arba aus ų skylamušio 
svorio matavimais atliekant nekroskopij ą). ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Ląstelių suspensijos ruošimas  
26. Limfmazgi ų ląstelių (LNC), išpjaut ų iš kiekvienos pel ės abiejų ausų, 
pavienių ląstelių suspensija paruošiama limfmazgius sudedant tarp dviej ų 
stiklinių objektini ų stiklelių ir lengvai paspaudžiant, kad jie susitraiškyt ų. 
Įsitikinus, kad audinys pasklido plonu sluoksniu, stikleliai atskiriami. 
Audinys ant abiej ų stiklelių pamerkiamas į PBS laikant kiekvien ą stiklelį 
kampu virš Petri l ėkštelės ir apiplaunant PBS, kartu nugramdant audin į 
nuo stiklelio l ąstelių grandikliu. Kadangi NC gyv ūnų limfmazgiai maži, 
svarbu dirbti atsargiai, kad b ūtų išvengta bet kokio dirbtinio poveikio SI 
vertėms. Abiems stikleliams apiplauti turi b ūti naudojama 1 ml PBS. LNC 
suspensija Petri l ėkštelėje turi būti lengvai homogenizuota l ąstelių gran­
dikliu. Po to 20 μl LNC suspensijos m ėginys paimamas mikropipete, 
pasirūpinant ne įtraukti akimi matomos membranos, ir sumaišomas su 
1,98 ml PBS, kad b ūtų gautas 2 ml m ėginys. Po to pagal t ą pačią proce­
dūrą paruošiamas antras 2 ml m ėginys, kad iš kiekvieno gyv ūno būtų 
paruošta po du m ėginius.  
Ląstelių proliferacijos nustatymas (ATP kiekio limfocituose matavimas)  
27. Padid ėjęs ATP kiekis limfmazgiuose išmatuojamas liuciferino/liuciferaz ės 
metodu, naudojant ATM matavimo rinkin į, kuriuo bioliuminescencija 
išmatuojama santykiniais liuminescencijos vienetais (angl.  Relative Lumi ­
nescence Units , RLU) Tyrimo laikas po gyv ūno numarinimo, kada matuo ­
jamas ATP kiekis, kiekvieno gyv ūno atveju turi b ūti vienodas (maždaug 
30 minučių), kadangi laikoma, kad po gyv ūno žūties ATP kiekis palaips ­
niui mažėja (12). Taigi, proced ūrų serija nuo aus ų limfmazgi ų išpjovimo 
iki ATP matavimo turi b ūti atlikta per 20 minu čių, laikantis nustatyto 
plano, kuris kiekvienam gyv ūnui vienodas. ATP liuminescencija kiekvie ­
name 2 ml m ėginyje turi b ūti matuojama taip, kad kiekvienam gyv ūnui 
būtų gauti du matavimo rezultatai. Po to apskai čiuojamas liuminescencijos 
vidurkis, kuris naudojamas tolesniuose skai čiavimuose (žr. 30 skirsn į). 
STEBĖJIMAI  
Klinikiniai steb ėjimai  
28. Kiekviena pel ė kruopščiai apžiūrima bent kart ą per dien ą bet kokiems 
vietinio dirginimui užtepimo vietoje arba sisteminio toksiškumo kliniki ­
niams požymiams nustatyti. Visi pasteb ėjimai apie kiekvien ą pelę yra 
sistemingai užrašomi. Į stebėsenos planus turi b ūti įtraukti kriterijai, 
pagal kuriuos galima tuoj pat nustatyti peles, kurioms pasireišk ė sisteminis 
toksiškumas, per didelis vietinis odos dirginimas arba odos ėsdinimas, kad 
gyvūnus būtų galima numarinti (36).  
Kūno masė 
29. Kaip nurodyta 25 skirsnyje, atskirai kiekvieno gyv ūno masė išmatuojama 
bandymo pradžioje ir po numatyto humaniško numarinimo.  
REZULTAT Ų APSKAI ČIAVIMAS  
30. Kiekvienos poveikio grup ės rezultatai išreiškiami kaip vidutinis SI. SI 
gaunamas dalijant kiekvienos bandomosios medžiagos grup ės vidutin ę 
RLU/gyv ūnui vertę ir PC grup ės vidutinę RLU/gyv ūnui vertę iš tirpik ­
lio/VC grup ės vidutin ės RLU/gyv ūnui vertės. Taigi, VC vidutin ė SI 
vertė lygi 1.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Vertinant rezultatus, atsakas laikoma teigiamu, jei SI ≥ 1,8 (10). Ta čiau, 
sprendžiant, ar ribinis rezultatas (t. y. SI vert ė yra nuo 1,8 iki 2,5) turi b ūti 
paskelbtas teigiamu, galima atsižvelgti į dozės ir atsako s ąryšio stiprum ą, 
statistinį reikšmingum ą ir tirpiklio/nešiklio bei PC atsak ų nuoseklum ą (2) 
(3) (37).  
32. Kai gaunamas teigiamas ribinis atsakas (SI yra nuo 1,8 iki 2,5), tyr ėjai gali 
pageidauti įvertinti papildom ą informacij ą, pvz., doz ės ir atsako s ąryšį, 
sisteminio toksiškumo arba per didelio sudirginimo požymius ir, kai tinka, statistin į reikšmingum ą kartu su SI vert ėmis, kad patvirtint ų, jog 
tokie rezultatai iš ties ų teigiami (10). Reikia atsižvelgti ir į įvairias bando ­
mosios medžiagos savybes, įskaitant tai, ar jos strukt ūra gimininga žinom ų 
odą jautrinan čių medžiag ų struktūrai, ar ji sukelia per didel į pelių odos 
dirginimą, ir pastebimo doz ės ir atsako s ąryšio tipą. Šie ir kiti aspektai yra 
išsamiai aptarti kitur (4).
 
33. Surenkant duomenis apie kiekvien ą pelę galima statistiškai išanalizuoti 
dozės ir atsako s ąryšį tuose duomenyse ir jo laipsn į. Atliekant bet kok į 
statistinį įvertinimą, galima įtraukti doz ės ir atsako s ąryšio vertinim ą ir 
tinkamai pakoreguotus bandymo grupi ų palyginimus (pvz., suporuot ų 
dozavimo grupi ų palyginimus su lygiagre čiomis tirpiklio/VC). Į statistinę 
analizę gali būti įtraukta, pvz., tiesin ė regresija arba Viljamso tyrimas, 
skirtas doz ės ir atsako s ąryšio tendencijoms įvertinti, ir suporuot ų rezultatų 
palyginim ų Daneto tyrimas. Rinkdamasis tinkam ą statistin ės analizės 
metodą tyrėjas turi tur ėti omenyje galimus variantiškum ų skirtingumus ir 
kitas susijusias problemas, d ėl kurių gali prireikti duomen ų transformacijos 
ar neparametrin ės statistin ės analizės. Bet kuriuo atveju tyr ėjui gali tekti 
atlikti SI skai čiavimus ir statistin ę analizę su tam tikrai duomen ų taškais 
(kartais vadinamais „riktais“) ir be j ų. 
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Duomenys  
34. Duomenys pateikiami lentel ėse, nurodant atskir ų gyvūnų RLU vertes, 
DPM/gyv ūnui grupės vidurkis, atitinkamas paklaidos rodiklis (pvz., SD, 
SEM) ir kiekvienos doz ės grupės vidutinis SI, palygintas su lygiagre čios 
tirpiklio / nešiklio grup ės rodikliu.  
Bandymo ataskaita  
35. Bandymo ataskaitoje pateikiama ši informacija:  
Bandomoji ir kontrolin ė cheminės medžiagos  
— tapatumo duomenys (pvz., CAS numeris ir EC numeris, jei yra; 
šaltinis; grynumas; žinomos priemaišos; partijos numeris),  
— fizikin ė būsena ir fizikin ės ir chemin ės savybės (pvz., lakumas, stabi ­
lumas, tirpumas),  
— jei tai mišinys – jo sud ėtis ir komponent ų procentin ė dalis.  
Tirpiklis / nešiklis  
— tapatumo duomenys (grynumas; koncentracija (jei tinka); naudojamas 
tūris), 
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Bandomo gyv ūnai 
— CBA peli ų šaltinis,  
— gyvūnų mikrobiologin ė būsena, jei žinoma,  
— gyvūnų skaičius ir amžius,  
— gyvūnų šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.  
Bandymo s ąlygos  
— ATP rinkinio šaltinis, partijos numeris ir gamintojo kokyb ės užtikri­
nimo / kokyb ės kontrolės duomenys,  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošim ą ir užtepim ą, 
— dozės pasirinkimo pagrindimas ( įskaitant atrankinio bandymo rezul ­
tatus, jei bandymas buvo daromas),  
— naudotos nešiklio ir bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės, 
suminis užteptos medžiagos kiekis,  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (įskaitant pašaro tip ą 
ar šaltinį, vandens šaltin į), 
— poveikio medžiaga ir m ėginių ėmimo tvarkaraš čiai, 
— toksiškumo matavimo metodai,  
— tyrimo rezultat ų vertinimo kaip teigiami arba neigiami kriterijai,  
— išsami informacija apie bet kokius nukrypimus nuo protokolo ir paaiš ­
kinimas, kaip tas nukrypimas paveiks tyrimo sistem ą ir rezultatus.  
Patikimumo tikrinimas  
— paskutin ės patikimumo patikros rezultat ų santrauka, įskaitant informa ­
ciją apie medžiag ą, koncentracij ą ir naudojam ą nešiklį, 
— bandymo laboratorijoje lygiagre čiai ir (arba) anks čiau sukaupti PC ir 
lygiagrečiai gauti neigiamos (tirpiklio / nešiklio) kontrol ės duomenys,  
— jei lygiagreti PC nebuvo naudojama, naujausio periodinio PC bandymo 
data ir laboratorijos ataskaita ir ataskaita su laboratorijos anks čiau 
sukauptais PC duomenimis, pagrindžian čiais lygiagre čios PC nenaudo ­
jimą. 
Rezultatai  
— atskirų pelių masė dozės gavimo ir numatyto numarinimo dien ą; taip 
pat kiekvienos poveikio grup ės vidurkis ir atitinkamas paklaidos 
rodiklis (pvz., SD, SEM),  
— toksinio poveikio atsiradimo laikas ir požymiai, įskaitant kiekvieno 
gyvūno odos dirginim ą medžiagos užtepimo vietoje, jei yra,  
— kiekvieno gyv ūno numarinimo ir ATP matavimo laikas,  
— kiekvienos poveikio grup ės atskiros pel ės RLU ir SI ver čių lentelės, 
— kiekvienos poveikio grup ės RLU/pelei vidurkis ir atitinkamas 
paklaidos rodiklis (pvz., SD, SEM) ir kiekvienos poveikio grup ės 
riktų analizės rezultatai,  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— apskai čiuotas SI ir atitinkamas variantiškumo matas, kuriuo atsižvel ­
giama į atskirų gyvūnų rezultatų variantiškum ą tiek bandomosios 
medžiagos, tiek kontrolin ėje grupėse, 
— dozės ir atsako s ąryšis,  
— statistin ė analizė, jei tinka.  
Rezultatų aptarimas  
— trumpas rezultat ų, dozės ir atsako s ąryšio analiz ės ir statistin ės 
analizės, jei tinka, paaiškinimas, padarant išvad ą, ar bandomoji 
medžiaga turi b ūti laikoma odos jautrikliu.  
1.1. NUORODOS  
(1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test 
Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, 
OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node 
assay: status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999–1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. 
(1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985–997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for 
identifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  
Food Chem. Toxicol.,  36, 327–333.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and 
Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the 
sensitising potency of low molecular weight chemicals using a 
local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins.  Toxicol ., 146, 49–59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test 
method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review 
evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee 
on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alterna ­
tive Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 
99–4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam. ­
niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., 
Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent 
scientific peer review panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258–273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: 
III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. Pharmacol. 34 , 274–286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM 
review process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249–257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonra ­
dioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical 
Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10–7551A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Avai ­
lable at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna- 
DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the 
murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental 
Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/im ­
munotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), 
Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Phar­
macol. Toxicol. Meth.,  58, 1–10.
 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., 
Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, 
E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, 
M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate 
measurement.  J. Pharmacol. Toxicol. Meth.,  58, 11–26.
 
(14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines 
for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., 
Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node 
assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT).  Food 
Chem. Toxicol ., 46, 1896–1904.
 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for 
REACH.  Reg. Toxicol. Pharmacol ., 55, 90–96.
 
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The 
use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and 
cytotoxicity.  J. Immunol. Meth ., 160, 81–88.  
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of 
the proliferative response of lymphocytes by measurement of intra ­
cellular ATP.  J. Immunol. Meth ., 72, 127–132.  
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), 
Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population.  Biomat.,  24, 
27–34.
 
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of 
biomass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346–370.  
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide 
for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, 
DC: National Academies Press.  
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine 
Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09–7357, 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immu ­
notox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regula ­
tory and potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71–89.  
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), 
The local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 
93, 13–31.  
(25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline 
No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Avai ­
lable at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. 
(2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly 
classify irritants and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: 
Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcom ­
plete.pdf].
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), 
Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopro ­
pylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 
21, 195–206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, 
T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  153, 83–94.
 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined 
murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation 
and irritancy potential of chemicals.  Toxicol. Meth.,  8, 245–256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected 
acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reacti ­
vity, and comparison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 
491–506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vande ­
briel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory vali ­
dation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 60–68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being 
too sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of 
evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. 
Health Perspect ., 115, 1023–1028.  
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/ 
JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical SAFEty Testing: Advancing  In Vitro  Approaches and Humane Endpoints for Systemic 
Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute 
of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs. ­
nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]
 
(36) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment 
and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation , Environmental Health and 
SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, 
ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. 
and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation 
potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. Toxicol. Environ. Health,  53, 563–79.
 
(38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and Interna ­
tional Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard 
Assessment,  Environment, Health and SAFEty Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTYS  
Tikslumas –  bandymo metodo rezultat ų ir patvirtint ų pamatini ų verčių artumas. 
Tikslumas yra bandymo metodo naudojimo charakteristik ų matas ir vienas iš 
tinkamumo aspekt ų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „suta ­
pimas“ ir reiškia tinkam ų bandymo metodo rezultat ų dalį (38).  
Palyginamoji medžiaga –  jautrinanti arba nejautrinanti medžiaga, naudojama kaip 
bandomosios medžiagos palyginimo standartas. Palyginamoji medžiaga turi pasi ­ 
žymėti tokiomis savyb ėmis: i) pastoviu (-iais) ir patikimu (-ais) šaltiniu (-iais), ii) 
struktūriniu ir funkciniu panašumu į bandomų medžiag ų klasę, iii) žinomomis 
fizikinėmis ir chemin ėmis charakteristikomis, iv) patvirtinan čiais duomenimis 
apie žinomus poveikius ir v) žinomu potencialu norim ų atsakų intervale.  
Klaidingai neigiamas rezultatas –  bandymo metodu bandomoji medžiaga netei ­
singai įvertinta kaip neigiama arba neaktyvi, nors iš ties ų yra teigiama arba 
aktyvi.  
Klaidingai teigiamas rezultatas –  bandymu bandomoji medžiaga neteisingai įver­
tinta kaip teigiama arba aktyvi, nors iš ties ų yra neigiama arba neaktyvi.  
Pavojus –  neigiamo poveikio sveikatai arba ekologijai galimyb ė. Neigiamas 
poveikis pasireiškia tik tada, jei veikimas medžiaga yra pakankamo lygio.  
Atkuriamumas tarp laboratorij ų – laipsnio, kuriuo skirtingos kvalifikuotos labo ­
ratorijos, taikydamos t ą patį protokol ą ir bandan čios tas pa čias bandom ąsias 
medžiagas, gali gauti kokybiškai ir kiekybiškai panašius rezultatus, matas. Atku ­
riamumas tarp laboratorij ų nustatomas atliekant pradinio tinkamumo patvirtinimo 
ir tinkamumo pavirtinimo procesus ir rodo laipsn į, kuriuo bandym ą galima 
sėkmingai perkelti tarp laboratorij ų; tai dar vadinama tarplaboratoriniu atkuria ­
mumu (38).  
Atkuriamumas laboratorijoje –  laipsnio, kuriuo kvalifikuoti darbuotojai toje 
pačioje laboratorijoje gali s ėkmingai atkartoti rezultatus, taikydami konkret ų 
protokolą skirtingu metu, matas. Dar vadinamas laboratoriniu atkuriamumu (38).  
Riktas –  pastebėjimas, kad vert ė labai skiriasi nuo kit ų atsitiktinio populiacijos 
ėminio ver čių. 
Kokybės užtikrinimas –  valdymo procesas, per kur į asmenys, nepriklausomi nuo 
atliekančiųjų bandymus, įvertina, kaip laboratorija laikosi bandymo standart ų, 
reikalavim ų ir užrašų saugojimo proced ūrų bei duomen ų perdavimo tikslumo.  
Patikimumas –  juo įvertinamas laipsnis, kuriuo bandymo metodas gali b ūti ilgai­
niui atkartojamai atliekamas vienoje ir skirtingose laboratorijose, taikant t ą patį 
protokolą. Jis įvertinamas skai čiuojant atkuriamum ą laboratorijoje ir tarp labora ­
torijų (38).  
Odos jautrinimas –  imunologinis procesas, vykstantis paveik ų individą išoriškai 
paveikus cheminiu alergenu, kuris sukelia odos imunin į atsaką, dėl kurio gali 
atsirasti kontaktinis jautrinimas.  
Dirginimo rodiklis (angl. SI) –  vertė, apskaičiuojama bandomosios medžiagos 
jautrinimo potencialui įvertinti – tai yra paveikt ų grupių proliferacijos s ąryšio su 
lygiagrečios nešiklio kontrolin ės grupės proliferacija koeficientas.  
Bandomoji medžiaga (dar vadinama bandom ąja chemine medžiaga) –  bet kuri 
medžiaga ar mišinys, bandomi taikant š į bandymų metodą. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  ODOS JAUTRINIMAS. VIETINIO LIMFMAZGIO BANDYMAS. 
BrdU-ELISA  
ĮVADAS  
1. OECD Chemini ų medžiagų bandymo gair ės ir ES bandym ų metodai perio ­
diškai persvarstomi atsižvelgiant į mokslo pažang ą, kintančias reguliavimo 
reikmes ir gyv ūnų gerovės sumetimais. Pirmasis bandym ų metodas (BM) 
(B.42) peli ų odos jautrinimui nustatyti – vietinio limfmazgio bandymas 
(LLNA; OECD bandym ų metodika 429; šio priedo B.42 skyrius) buvo 
persvarstytas (1) šaltinis ir šio priedo B.42 skyrius). LLNA tinkamumo patvirtinimas ir susijusi ų darbų apžvalga paskelbta (2) (3) (4) (5) (6) (7) 
(8) (9) šaltiniuose. Pagal LLNA limfocit ų proliferacijai matuoti naudo ­
jamas radioizotopinis timidinas arba jodas ir tod ėl tyrimas yra riboto 
naudojimo, kadangi sunku įsigyti, naudoti ar pašalinti radioaktyvias 
medžiagas. LLNA: BrdU-ELISA [imunofermentin ė analizė] yra neradioak ­
tyvaus pob ūdžio LLNA modifikacija, kurioje limfocit ų proliferacijai 
matuoti naudojamos neradioaktyvus 5-brom-2-deoksiuridinas (BrdU) (Chemini ų medžiag ų santrump ų tarnybos [CAS] Nr. 59–14–3) ELISA 
tyrimo sistemoje. LLNA: BrdU-ELISA tinkamum ą patvirtino, apsvarst ė 
ir rekomenduoja tarptautin ė nepriklausoma mokslin ė tarpusavio vertinimo 
komisija; jis laikomas naudingu su tam tikrais apribojimais identifikuojant odą jautrinan čias ir nejautrinan čias chemines medžiagas (10) (11) (12). Šis 
BM yra parengtas chemini ų medžiag ų (medžiag ų ir mišini ų) sukeliamam 
gyvūnų odos jautrinimo potencialui įvertinti. Pagal šio priedo B.6 skyri ų ir 
OECD bandym ų metodika 406 naudojami bandymai su j ūros kiaulyt ėmis, 
pirmiausia maksimizacijos ir Buehlerio bandymas su j ūros kiaulyt ėmis 
(13). LLNA (šio priedo B.42 skyrius; OECD bandym ų metodika 429) ir 
dvi neradioaktyvaus pob ūdžio modifikacijos, LLNA: BrdU-ELISA (šio 
priedo B.51 skyrius; OECD bandym ų metodika 442 B) ir LLNA: DA 
(šio priedo B.50 skyrius; OECD bandym ų metodika 442 A), yra prana ­ 
šesnės už bandymus su j ūros kiaulyt ėmis pagal B.6 and OECD bandym ų 
metodiką 406 (13) tuo, kad sumažinamas ir patobulinamas gyv ūnų naudo­
jimas.  
2. Panašiai, kaip LLNA, LLNA: BrdU-ELISA metodu tiriamas odos jautri ­
nimo indukcinis etapas ir gaunami kiekybiniai duomenys, tinkami doz ės ir 
atsako sąryšiui įvertinti. Be to, galimyb ė aptikti odos jautriklius nenaudo ­
jant DNR žym ėjimo izotop ų, panaikina galimyb ę darbuotojams b ūti apšvi­
tintiems dirbant ir atliek ų pašalinimo sunkumus. D ėl to savo ruožtu galima 
naudoti daugiau peli ų odos jautrikliams aptikti, tod ėl galima dar sumažinti 
jūros kiauly čių naudojim ą odos jautrinimo potencialui išbandyti (t. y. B.6; 
OECD bandym ų metodika 406) (13).  
APIBRĖŽTYS  
3. Vartojamos apibr ėžtys pateiktos 1 pried ėlyje. 
PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI  
4. LLNA: BrdU-ELISA yra modifikuotas LLNA metodas galimai od ą jautri­
nančioms chemin ėms medžiagoms identifikuoti su tam tikrais apribojimais. 
Nereikia manyti, kad visais atvejais vietoj LLNA arba bandymo su j ūrų 
kiaulytėmis (t. y. B.6; OECD bandym ų metodika 406) (13), reikia taikyti 
LLNA: BrdU-ELISA bandym ą; tai labiau reiškia, kad šis bandymas yra 
lygiavertis ir gali b ūti taikomas kaip pakaitinis metodas, pagal kur į 
teigiamų ir neigiam ų rezultatų paprastai nebereikia papildomai patvirtinti 
(10) (11). Prieš atlikdama tyrim ą, bandym ų laboratorija turi apsvarstyti 
visą turimą informacij ą apie bandom ąją medžiag ą. Tokia informacija 
apima medžiagos tapatum ą ir chemin ę struktūrą, jos fizikines ir chemines  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
savybes, vis ų kitų bandomosios medžiagos  in vitro  arba  in vivo  toksiš­
kumo bandym ų rezultatus ir giminingos strukt ūros medžiag ų toksikologi ­
nius duomenis. Ši informacija turi b ūti apsvarstyta, siekiant nustatyti, ar 
LLNA: BrdU-ELISA tinka bandomajai medžiagai (atsižvelgiant į tam tikrų 
medžiagų tipų nesuderinamum ą su LLNA: BrdU-ELISA (žr. 5 skirsn į)), ir 
parinkti tinkam ą dozę. 
5. LLNA: BrdU-ELISA yra  in vivo  metodas, tod ėl jautrinan čiam poveikiui 
dėl alerginio s ąlyčio įvertinti naudojami gyv ūnai. Tačiau jis turi galimyb ę 
sumažinti gyv ūnų naudojim ą šiam tikslui, palyginti su bandymais su j ūros 
kiaulytėmis (B.6; OECD bandym ų metodika 406) (13). Be to, LLNA: 
BrdU-ELISA iš esm ės pagerina b ūdą, kuriuo gyv ūnai naudojami jautri ­
nimui dėl alerginio s ąlyčio bandyti, kadangi, skirtingai nei B.6 and OECD 
bandymų metodika 406, taikant LLNA: BrdU-ELISA nereikia sukelti ypa č 
didelio odos jautrumo reakcij ų. Be to, taikant LLNA: BrdU-ELISA 
nereikia naudoti adjuvant ų, kurie reikalingi darant maksimizacijos 
bandymą su jūrų kiaulytėmis (šio priedo B.6 skyrius, 13). Taigi, LLNA: 
BrdU-ELISA sumažina gyv ūnų kančias. Nepaisant LLNA: BrdU-ELISA 
pranašum ų prieš B.6 ir OECD bandym ų metodiką 406 (13), yra tam tikr ų 
apribojim ų, dėl kurių gali tekti taikyti B.6 ir OECD bandym ų metodiką 
406 (pvz., tiriant kai kuriuos metalus, klaidingi teigiami rezultatai tiriant 
tam tikrus odos dirgiklius [pvz., kai kurias paviršinio aktyvumo tipo 
chemines medžiagas] (6) (1 ir šio priedo B.42 skyrius), bandomosios 
medžiagos tirpumas). Be to, d ėl chemini ų klasių arba medžiag ų, kuriose 
yra funkcini ų grupių, veikiančių kaip galimos klaidinan čiosios medžiagos 
(15), gali tekti atlikti bandymus su j ūrų kiaulytėmis (t. y. B.6; OECD 
bandymų metodika 406 (13)). Nustatytus LLNA apribojimus (1 ir šio 
priedo B.42 skyrius) rekomenduojama taikyti ir LLNA: BrdU-ELISA (10). Išskyrus tokius nustatytus apribojimus. LLNA: BrdU-ELISA turi būti tinkamas bandant bet kurias chemines medžiagas, nebent tos 
medžiagos turi toki ų savybių, kurios kenkt ų LLNA: BrdU-ELISA tiks ­
lumui. Be to, reikia išnagrin ėti ribinių teigiamų rezultatų galimyb ę, kai 
dirginimo rodiklio (SI) vert ės gaunamos nuo 1,6 iki 1,9 (žr. 31, 32 skirs ­
nius). Tai grindžiama 43 medžiag ų tinkamumo patvirtinimo duomen ų 
baze, taikant SI ≥ 1,6 (žr. 6 skirsn į), kurioje LLNA: BrdU-ELISA teisingai 
identifikavo visus 32 LLNA jautriklius, bet neteisingai identifikavo du iš 11 LLNA nejautrikli ų, kurių SI vertės nuo 1,6 iki 1,9 (t. y. ribinis 
teigiamas rezultatas) (10). Ta čiau, kadangi tas pats duomen ų rinkinys 
buvo naudojamas SI vert ėms nustatyti ir tyrimo prognozin ėms savyb ėms 
apskaičiuoti, pateikti rezultatai gali pervertinti tikr ąsias prognozines 
savybes.
 
BANDYMO METODO PRINCIPAS  
6. Pagrindinis principas, kuriuo pagr įstas LLNA: BrdU-ELISA metodas, yra 
jautrinančiųjų medžiag ų sukelta pirmin ė limfocitų proliferacija chemin ės 
medžiagos poveikio viet ą drenuojan čiame limfmazgyje. Ši proliferacija yra 
proporcinga naudojamai dozei ir alergeno gebai jautrinti, taigi tai yra paprastas b ūdas objektyviai ir kiekybiškai išmatuoti jautrinim ą. Prolifera ­
cija įvertinama palyginant vidutin ę proliferacij ą bandymo grup ėse ir nešikl į 
gavusiose kontrolin ėse grupėse (VC). Nustatomas vidutin ės proliferacijos 
paveiktose grup ėse ir kontrolin ėse VC grup ėse santykis, vadinamas SI, 
kuris turi b ūti ≥ 1,6, kad bandomoji medžiaga gal ėtų būti toliau vertinama 
kaip galinti od ą dirginanti medžiaga. Čia aprašytos proced ūros yra 
pagrįstos BrdU kiekio matavimu padid ėjusiam proliferuojan čių ląstelių
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
skaičiui nustatyti drenuojan čiuose aus ų limfmazgiuose. BrdU yra analo ­
giškas timidinui ir panašiai įsiterpia į proliferuojan čių ląstelių DNR. BrdU 
įterpimas matuojamas ELISA metodu, pagal kur į naudojamas BrdU speci ­
finis antik ūnas, kuris dar pažymimas peroksidaze. Kai pridedama 
medžiagos, peroksidaz ė sureaguoja su substratu ir susidaro spalvotas 
produktas, kuris kiekybiškai įvertinamas pagal konkret ų sugerties laipsn į 
mikrotitravimo plokšteli ų skaitytuvu.  
BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšių parinkimas  
7. Šiam bandymui pasirinkta gyv ūnų rūšis – pel ės. LLNA: BrdU-ELISA 
tinkamumo patvirtinimo tyrimai buvo atlikti išimtinai su CBA/JN veisle, 
kuri dėl to laikoma tinkamiausia veisle (10) (12). Naudojamos suaugusios 
CBA/Ca arba CBA/J veisl ės pelių patelės, kurios yra netur ėjusios vados ir 
neapvaisintos. Pradedant bandym ą, gyvūnų amžius turi b ūti 8–12 savai čių, 
o gyvūnų masės skirtumas turi b ūti kiek įmanoma mažesnis ir neviršyti 
20 % vidutin ės masės Galima naudoti kitas veisles ir patinus, jei yra gauta 
pakankamai duomen ų, kurie rodyt ų, kad nėra esmini ų veislei ir (arba) 
lyčiai būdingų atsako į LLNA: BrdU-ELISA skirtum ų 
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
8. Pel ės turi būti laikomos grup ėmis (16), nebent pateikiamas pakankamas 
loginis pagrindas, kod ėl peles reikia laikyti atskirai. Patalpos, kurioje 
laikomi bandomieji gyv ūnai, temperat ūra turi būti 22 ± 3 °C. Nors santy ­
kinė oro drėgmė turi būti ne mažesn ė kaip 30 % ir pageidautina ne didesn ė 
kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikia užtikrinti 50–60 %. 
Apšvietimas turi b ūti dirbtinis, taikant 12 val. šviesos ir 12 val. tamsos 
ciklą. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas pašaras, 
neribojant geriamo vandens kiekio.  
Gyvūnų ruošimas  
9. Gyv ūnai pasirenkami atsitiktinai, ženklinami, kad b ūtų įmanoma kiekvien ą 
identifikuoti (ta čiau netaikomas joks aus ų ženklinimas), ir laikomi narve ­
liuose mažiausiai 5 paras prieš pradedant taikyti dozes, kad gal ėtų priprasti 
prie laboratorijos s ąlygų. Prieš veikimo medžiaga pradži ą visi gyv ūnai 
apžiūrimi, ar neturi pastebim ų odos pažeidim ų. 
Dozavimo tirpal ų paruošimas  
10. Prieš užtepant ant peli ų ausų, kietosios chemin ės medžiagos ištirpinamos 
arba paskleidžiamos tirpikliuose/nešikliuose ir, jei reikia, atskiedžiamos. Skystos chemin ės medžiagos gali b ūti užtepamos grynos arba atskiestos. 
Netirpios chemin ės medžiagos, pvz., tos, kuri ų paprastai pasitaiko medi ­
cinos įrangoje, prieš užtepant ant peli ų ausų, padidintosios ekstrakcijos 
būdu išskiriamos atitinkamame tirpiklyje, kad b ūtų gautos visos galimos 
išskirti sudedamosios dalys. Bandomosios medžiagos paruošiamos kasdien, nebent stabilumo duomenys rodo, kad jas galima laikyti ilgesn į laiką.
 
Patikimumo tikrinimas  
11. Teigiamo poveikio kontrolin ės cheminės medžiagos (angl.  positive control 
chemicals , PC) naudojamos siekiant parodyti tyrimo tinkamum ą joms 
reaguojant pakankamu ir atkartojamu jautrumu kaip jautrinan čioms bando ­
mosioms medžiagoms, kuri ų atsako dydis gerai apib ūdintas. Naudoti lygia ­
grečias PC rekomenduojama tod ėl, kad jos parodo laboratorijos kompeten ­
ciją sėkmingai atlikti bandym ą per kiekvien ą tyrimą ir įvertinti atkuria ­
mumą ir palyginamum ą laboratorijoje ir tarp laboratorij ų. Kiekvieno 
tyrimo metu naudoti PC reikalauja ir kai kurios reguliavimo institucijos, 
todėl naudotojai raginami pasikonsultuoti su atitinkamomis institucijomis 
prieš vykdydami LLNA: BrdU-ELISA. Taigi, skatinama įprastai naudoti  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
lygiagrečią PC, kad b ūtų išvengta papildom ų bandymų su gyvūnais, reika ­
lingų laikytis reikalavim ų, kuris gali kilti PC naudojant tik periodiškai (žr. 
12 skirsn į). PC turi sukelti teigiam ą LLNA: BrdU-ELISA atsak ą esant 
tokiam poveikio lygiui, kuris numatytas padidinti SI ≥ 1,6, palyginti su 
neigiamo poveikio kontrolin ės medžiagos (NC) grupe. PC doz ė turi būti 
parenkama taip, kad nesukelt ų per didelio odos sudirginimo ar sisteminio 
toksiškumo, o atsako suk ėlimas būtų atkuriamas, bet ne per didelis (pvz., 
SI > 14 b ūtų laikomas per dideliu). Tinkamiausia PC yra 25 % heksilci ­
namono aldehidas (CAS Nr. 101–86–0) ir 25 % eugenolis (CAS 
Nr. 97–53–0,) acetone: alyv ų aliejuje (4:1, t ūrio dalys). Gali pasitaikyti 
aplinkybi ų, kai, pateikus pakankamai įrodymų, galima naudoti kitas PC, 
atitinkančias pirmiau nurodytus kriterijus.  
12. Nors naudoti lygiagre čią PC grup ę rekomenduojama, gali b ūti situacij ų, 
kuriomis gali pakakti periodini ų bandymų naudojant PC (t. y. ≤ 6 mėnesių 
intervalais), jei tai laboratorijos, kurios reguliariai atlieka LLNA: BrdU-ELISA (t. y. atlieka LLNA: BrdU-ELISA ne re čiau kaip kart ą per 
mėnesį) ir turi įsteigusios anks čiau sukaupt ų PC duomen ų bazę, kuri rodo 
laboratorijos geb ėjimą gauti atkuriamus ir tikslius rezultatus su PC. Pakan ­
kamas profesionalumas atliekant LLNA: BrdU-ELISA tyrimus gali b ūti 
sėkmingai įrodomas pastoviai gaunant teigiamus rezultatus naudojant PC 
ne mažiau kaip 10-yje nepriklausom ų bandymų, atliktų per pagr įstą laiko­
tarpį (t. y. trumpesn į kaip vieneri metai).
 
13. Lygiagreti PC visada turi b ūti naudojama, jei yra proced ūrinių LLNA: 
BrdU-ELISA pakeitim ų (pvz., pasikeit ė parengti darbuotojai, pakeistos 
bandymo metodo medžiagos ir (arba) reagentai, pakeista bandymo metodo 
įranga, pakeistas bandom ųjų gyvūnų tiekėjas), o tokie pakeitimai turi b ūti 
užregistruoti laboratorijos ataskaitose. Turi b ūti apsvarstytas toki ų pasikei­
timų poveikis anks čiau sukaupt ų duomen ų bazės tinkamumui, vertinant 
būtinybę sukurti nauj ą anksčiau sukaupt ų duomenų bazę, skirtą PC rezul ­
tatų nuoseklumui dokumentuoti.  
14. Tyr ėjai turi suprasti, kad sprendimas vykdyti PC tyrim ą periodiškai, o ne 
nuolat, turi padarini ų neigiamų tyrimų rezultatų, gautų be lygiagre čios PC 
naudojimo, laikotarpiu tarp kiekvieno periodinio PC tyrimo, tinkamumui ir priimtinumui. Pvz., jei, atliekant periodin į PC tyrim ą, gaunamas klaidingas 
neigiamas rezultatas, gali b ūti kvestionuojami neigiami bandomosios 
medžiagos rezultatai, gauti laikotarpiu nuo paskutinio priimtino periodinio PC tyrimo iki nepriimtino periodinio PC tyrimo. Ši ų rezultatų padariniai 
turi būti stropiai įvertinti sprendžiant, ar nuolat vykdyti lygiagre čius, ar tik 
periodinius PC tyrimus. Taip pat reikia apsvarstyti galimyb ę lygiagrečios 
PC grupės tyrimams naudoti mažiau gyv ūnų, jei tai moksliškai pateisinama 
ir jei laboratorija savo anks čiau sukauptais duomenimis įrodo, kad galima 
naudoti mažiau peli ų (17).
 
15. Nors PC turi b ūti bandoma nešiklyje, kuris žinomai sukelia pastov ų atsaką 
(pvz., acetono ir alyv ų aliejaus mišinyje; 4:1, t ūrio dalys), gali b ūti tam 
tikrų reguliavimo situacij ų, kai gali prireikti ištirti ir nestandartin į nešiklį 
(kliniškai/chemiškai susijus į preparat ą) (18). Jei lygiagreti PC bandoma 
kitokiame nešiklyje nei bandomoji medžiaga, turi b ūti naudojama atskira 
VC, skirta lygiagre čiai PC.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. Tais atvejais, kai vertinamos tam tikrai cheminei klasei ar atsak ų sričiai 
priklausan čios bandomosios medžiagos, gali b ūti naudojamos ir palygina ­
mosios medžiagos, kad b ūtų parodyta, jog bandymo metodas tinkamai 
veikia nustatant ši ų bandom ųjų medžiag ų odos jautrinimo potencial ą. 
Atitinkamos palyginamosios medžiagos turi pasižym ėti šiomis savyb ėmis: 
— strukt ūriniu ir funkciniu panašumu į bandomosios chemin ės medžiagos 
klasę, 
— žinomomis fizin ėmis ir chemin ėmis charakteristikomis,  
— apie jas turi b ūti patvirtinan čių duomenų, gautų LLNA: BrdU-ELISA 
tyrimais,  
— apie jas turi b ūti patvirtinan čių duomenų, gautų kitų gyvūnų modeliais 
ir (arba) iš žmoni ų. 
BANDYMO EIGA  
Gyvūnų skaičius ir dozi ų dydis  
17. Vienai doz ės grupei naudojami ne mažiau kaip keturi gyv ūnai, naudojant 
ne mažiau kaip tris bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijas ir 
vieną lygiagre čią NC grup ę, paveikiam ą tik bandomosios medžiagos 
nešikliu, ir PC grup ę (lygiagre čią arba naujausi ą, remiantis laboratorijos 
politika pagal 11–15 skirsnius). Reikia apsvarstyti poreik į išbandyti kelet ą 
PC dozių, ypač bandant PC periodiškai. Išskyrus neveikim ą bandomąja 
medžiaga, kontrolini ų grupių gyvūnai turi b ūti prižiūrimi ir jais r ūpinamasi 
taip pat, kaip poveikio grup ės gyvūnais. 
18. Doz ė ir nešiklis parenkami laikantis 2 ir 19 šaltiniuose pateikiam ų reko­
mendacijų. Paeilinės dozės paprastai parenkamos iš atitinkamos koncent ­
racijos ver čių eilės, pvz., 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 
0,5 % ir t. t. Taikomai koncentracijos ver čių eilei turi b ūti skirtas tinkamas 
loginis pagrindas. Reikia atsižvelgti į visą turimą toksikologin ę informacij ą 
(pvz., apie ūminį toksiškum ą ir odos dirginim ą) ir strukt ūrinę bei fizikini ų 
ir chemini ų savybių informacij ą apie dominan čią bandom ąją cheminę 
medžiagą (ir (arba) strukt ūriškai panašias medžiagas), kad trys iš eil ės 
taikomos koncentracijos vert ės būtų parinktos taip, kad didžiausios 
koncentracijos poveikis b ūtų kuo didesnis, bet išvengta sisteminio toksiš ­
kumo ir (arba) per didelio vietinio odos dirginimo (19) (20 ir šio priedo B.4 skyrius). Jei tokios informacijos neturima, gali prireikti pradinio 
atrankinio bandymo (žr. 21–24 skirsnius).
 
19. Nešiklis neturi kenkti ar iškraipyti bandymo rezultato ir turi b ūti parinktas 
taip, kad b ūtų kuo geresnis tirpumas, siekiant gauti didžiausi ą įmanomą 
koncentracij ą gaminant tirpal ą/suspensij ą, tinkamą bandomajai medžiagai 
užtepti. Rekomenduojami nešikliai yra acetono ir alyv ų aliejaus mišinys 
(4:1, tūrio dalys),  N,N -dimetilformamidas, metiletilketonas, propilengli ­
kolis ir dimetilsulfoksidas (6), ta čiau galima naudoti kitus nešiklius, jei 
pateikiamas tinkamas loginis pagrindas. Tam tikrais atvejais papildomai 
kontrolei gali tekti naudoti klinikiniu poži ūriu atitinkant į tirpiklį arba 
komercin į preparatą, turintį bandomosios medžiagos. Reikia ypa č stengtis 
užtikrinti, kad nešiklyje b ūtų hidrofilini ų bandom ųjų medžiag ų, kurios 
drėkintų odą ir iš karto nenutek ėtų, įdedant soliubilizavimo priemoni ų 
(pvz., 1 % „Pluronic® L92“). Taigi reikia vengti naudoti grynai vandeni ­
nius nešiklius.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Apdorojant atskir ų pelių limfmazgius galima įvertinti nepastovum ą tarp 
gyvūnų ir statistiškai palyginti skirtumus tarp bandomosios medžiagos ir 
VC grupės matavimo rezultat ų (žr. 33 skirsn į). Be to, tik tada, kai suren ­
kami atskir ų gyvūnų duomenys, realu įvertinti galimyb ę sumažinti peli ų 
skaičių PC grup ėje (17). Negana to, kai kurios reguliavimo institucijos 
reikalauja gauti atskirt ų gyvūnų duomenis. Reguliarus atskir ų gyvūnų 
duomenų rinkimas turi r ūpinimosi gyv ūnų gerove privalum ų, nes išven ­
giama dvigubo bandymo, kurio reik ėtų, jei bandomosios medžiagos rezul ­
tatus, iš pradži ų gautus kitu b ūdu (pvz., iš jungtini ų gyvūnų duomenų), 
vėliau vertint ų reguliavimo institucijos, kurios vadovaujasi kitais reikala ­
vimais (pvz., atskir ų gyvūnų duomenimis).  
Atrankinis bandymas  
21. Jei neturima informacijos, skirtos didžiausiai bandomai dozei nustatyti (žr. 
18 skirsn į), reikia atlikti atrankin į bandymą, kad būtų nustatytas tinkamas 
dozės lygis pagal LLNA: BrdU-ELISA metod ą. Atrankinio bandymo 
tikslas – nustatyti gaires didžiausiam pagrindinio LLNA: BrdU-ELISA 
tyrimo doz ės lygiui parinkti, kai neturima informacijos apie koncentracij ą, 
kuri sukelia sistemin į toksiškum ą (žr. 24 skirsn į) ir (arba) per didel ė vietinį 
odos dirginim ą (žr. 23 skirsn į). Didžiausias bandomas doz ės lygis turi b ūti 
100 % bandomosios medžiagos koncentracija, jei tai skys čiai, arba 
didžiausia įmanoma koncentracija, jei tai kietosios medžiagos ar suspen ­
sijos.  
22. Atrankinis bandymas atliekamas tokiomis pa čiomis sąlygomis kaip ir 
pagrindinis LLNA: BrdU-ELISA tyrimas, išskyrus tai, kad nevertinama limfmazgi ų proliferacija ir galima tirti mažiau gyv ūnų kiekvienoje doz ės 
grupėje. Siūloma naudoti vien ą arba du gyv ūnus vienai doz ės grupei. 
Visos pel ės kasdien stebimos, ar poveikio vietoje nepasireiškia sisteminio 
toksiškumo ar vietinio dirginimo klinikiniai požymiai. K ūno masė užra­ 
šoma prieš bandym ą ir prieš j į pabaigiant (6 dien ą). Abi kiekvienos pel ės 
ausys stebimos, ar n ėra eritemos ir įvertinama pagal 1 lentel ę (20 ir šio 
priedo B.4 skyrius). 1 dien ą (prieš doz ę), 3 dieną (praėjus maždaug 48 val. 
po pirmosios doz ės) ir 6 dien ą stormačiu (pvz., skaitmeniniu mikrometru 
arba ciferblatiniu storio matuokliu) atliekami aus ų storio matavimai. Be to, 
6 dieną ausų storis gali b ūti įvertinamas aus ų skylamušio svorio matavi ­
mais, atliekamais po to, kai gyv ūnai humaniškai numarinami. Per didel į 
vietinį dirginim ą rodo ≥ 3 edemos įvertis ir (arba) ≥ 25 % ausies storio 
padidė
jimas bet kuri ą matavimo dien ą (21) (22). Didžiausia pagrindiniam 
LLNA: BrdU-ELISA tyrimui parenkama doz ė yra antra pagal dyd į dozė iš 
atrankinio bandymo koncentracij ų eilės (žr. 18 skirsn į), nesukelianti siste ­
minio toksiškumo ir (arba) per didelio vietinio odos dirginimo.  
1 lentelė 
Eritemos įverčiai 
Pastebėjimas  Įvertis  
Eritemos n ėra 0  
Labai nedidel ė eritema (vos juntama)  1  
Aiški eritema  2  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Pastebėjimas  Įvertis  
Nuo vidutin ės iki sunkios eritemos  3  
Nuo sunkios eritemos (buroko raudonumo) iki šašo susida ­
rymo, kuomet nebe įmanoma įvertinti eritemos sunkumo  4 
23. Taikant LLNA metod ą, dirgikliams nustatyti, be aus ų storio padid ėjimo 
25 % (21) (22), naudojamas ir statistiškai reikšmingas paveikt ų pelių ausų 
storio padid ėjimas, palyginti su kontrolin ėmis pelėmis (22) (23) (24) (25) 
(26) (27) (28). Vis d ėlto, nors statistiškai reikšmingas padid ėjimas galimas 
ir ausies storiui esant mažesniam kaip 25 %, tai n ėra siejama konkre čiai su 
per dideliu dirginimu (25) (26) (27) (28) (29).  
24. Šie klinikiniai požymiai gali rodyti sistemin į toksiškum ą (30), kai yra 
naudojami kaip integruoto įvertinimo dalis, tod ėl gali nurodyti didžiausi ą 
dozės lygį, skirtą pagrindiniam LLNA: BrdU-ELISA: nerv ų sistemos funk ­
cijos poky čiai (pvz., piloerekcija, ataksija, drebulys ir konvulsijos); 
elgsenos poky čiai (pvz., agresyvumas, prausimosi poky čiai, žymus akty ­
vumo lygio pokytis); kv ėpavimo b ūdo pokyčiai (t. y. kv ėpavimo dažnio ir 
intensyvumo poky čiai, pvz., dusulys, žiop čiojimas ir karkalai) ir ėdalo bei 
vandens vartojimo poky čiai. Be to, vertinant turi b ūti atsižvelgiama į 
letargijos ir (arba) nereagavimo požymius ir bet kokius didesnio už nedi ­
delį ar trumpalaik į skausmą ir kančią klinikinius požymius arba > 5 % 
kūno masės sumažėjimą nuo 1 iki 6 dienos, ir į mirtingum ą. Gaištantys 
ar didelio skausmo ir kan čios požymius rodantys gyv ūnai turi b ūti huma­
niškai numarinti (31).  
Pagrindinio bandymo eksperimentinis planas  
25. Eksperimentinis bandymo planas atrodo taip:  
— 1 diena.  Atskirai nustatoma ir užrašoma kiekvieno gyv ūno masė ir bet 
kokie klinikiniai pasteb ėjimai. Ant kiekvienos ausies išorin ės pusės 
užtepama 25 μl atitinkamai atskiesto bandomosios medžiagos tirpalo, 
vien tik nešiklio arba PC (lygiagre čios arba naujausios, remiantis labo ­
ratorijos politika pagal 11–15 skirsnius).  
— 2 ir 3 dienos.  Pakartojama 1 dien ą daryta proced ūra. 
— 4 diena.  Jokio veikimo.  
— 5 diena.  Intraoeritonealiai suleidžiama 0,5 ml (5 mg/pelei) BrdU 
(10 mg/ml) tirpalo.  
— 6 diena.  Užrašoma kiekvieno gyv ūno masė ir bet kokie klinikiniai 
pastebėjimai. Pra ėjus maždaug 24 valandoms (24 h) po BrdU injek ­
cijos gyvūnai humaniškai numarinami. Kiekvienos pel ės drenuojamieji 
ausų limfmazgiai išpjaunami ir kiekvieno gyv ūno atskirai apdorojami 
fosfatiniame buferyje (PBS). Limfmazgi ų identifikavimo ir skrodimo 
aprašą bei schemas galima rasti (17) šaltinyje. Norint toliau steb ėti 
vietinę odos atsak ą pagrindiniame tyrime, į tyrimo protokol ą gali 
būti įtraukti tokie papildomi parametrai kaip aus ų eritemos įverčiai 
arba ausų storio matavimo rezultatai (gauti storio matuokliu arba 
ausų skylamušio svorio matavimais atliekant nekroskopij ą). ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Ląstelių suspensijos ruošimas  
26. Limfmazgi ų ląstelių (LNC), išpjaut ų iš kiekvienos pel ės abiejų ausų, 
pavienių ląstelių suspensija paruošiama švelniai mechaniškai susmulkinant 
pro 200 μm nerūdijančio plieno tinklel į ar kitu priimtinu pavieni ų ląstelių 
suspensijos sudarymo metodu (pvz., panaudojant vienkartin į plastikin į 
grūstuvą limfmazgiams sutraiškyti ir prakošiant pro #70 nailonin į sietą). 
LNS suspensijos paruošimo proced ūra šiame tyrime labai svarbi, tod ėl 
kiekvienas operatorius turi iš anksto įgyti jos įgūdžių. Kadangi NC gyv ūnų 
limfmazgiai maži, svarbu dirbti atsargiai, kad b ūtų išvengta bet kokio 
dirbtinio poveikio SI vert ėms. Kiekvienu atveju LNC suspensijos tikslinis 
tūris turi b ūti pakoreguotas iki nustatyto optimizuoto t ūrio (maždaug 15 
ml). Optimizuotas t ūris nustatomas taip, kad b ūtų pasiekta 0,1–0,2 vidutin ė 
NC grupės sugertis.  
Ląstelių proliferacijos nustatymas (BrdU kiekio limfocit ų DNR matavimas)  
27. BrdU matuojamas ELISA metodu, naudojant komercin į rinkinį (pvz., 
„Roche Applied Science“, Mannheim, Vokietija, katalogo Nr. 11 647 229 001). Netrukus, 100 μl LNC suspensijos įlašinama į tris plokš čia­
dugnės mikroplokštel ės šulinėlius. Po LNC fiksacijos ir denat ūracijos į 
kiekvieną šulinėlį įdedama antiBrdU antik ūnų ir leidžiama sureaguoti. Po 
to antiBrdU antik ūnai pašalinami išplaunant, pridedama substrato tirpalo ir 
leidžiama sudaryti chromogen ą. Tada išmatuojama sugertis esant 370 nm, 
naudojant standartin į 492 nm bang ų ilgį. Visais atvejais tyrimo s ąlygos turi 
būti optimizuotos (žr. 26 skirsn į).
 
STEBĖJIMAI  
Klinikiniai steb ėjimai  
28. Kiekviena pel ė kruopščiai apžiūrima bent kart ą per dien ą bet kokiems 
vietinio dirginimui užtepimo vietoje arba sisteminio toksiškumo kliniki ­
niams požymiams nustatyti. Visi pasteb ėjimai apie kiekvien ą pelę yra 
sistemingai užrašomi. Į stebėsenos planus turi b ūti įtraukti kriterijai, 
pagal kuriuos galima tuoj pat nustatyti peles, kurioms pasireišk ė sisteminis 
toksiškumas, per didelis vietinis odos dirginimas arba odos ėsdinimas, kad 
gyvūnus būtų galima numarinti (31).  
Kūno masė 
29. Kaip nurodyta 25 skirsnyje, atskirai kiekvieno gyv ūno masė išmatuojama 
bandymo pradžioje ir po numatyto humaniško numarinimo.  
REZULTAT Ų APSKAI ČIAVIMAS  
30. Kiekvienos poveikio grup ės rezultatai išreiškiami kaip vidutinis SI. SI 
gaunamas dalijant kiekvienos bandomosios medžiagos grup ės vidutin ę 
BrdU ženklinimo rodiklio / gyv ūnui vertę ir PC grup ės vidutinę BrdU 
ženklinimo rodiklio / gyv ūnui vertę iš tirpiklio/VC grup ės vidutin ės 
BrdU ženklinimo rodiklio vert ės. Taigi, VC vidutin ė SI vertė lygi 1.  
BrdU ženklinimo rodiklis nustatomas taip:  
BrdU ženklinimo rodiklis = (ABS  em – ABS blank  em ) – (ABS  ref – ABS blank  ref ) 
Čia: em = skleidžiam ų bangų ilgis; ref = standartinis bang ų ilgis.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Vertinant rezultatus, atsakas laikoma teigiamu, jei SI ≥ 1,6 (10). Ta čiau, 
sprendžiant, ar ribinis rezultatas (t. y. SI vert ė yra nuo 1,6 iki 1,9) turi b ūti 
paskelbtas teigiamu, galima atsižvelgti į dozės ir atsako s ąryšio stiprum ą, 
statistinį reikšmingum ą ir tirpiklio/nešiklio bei PC atsak ų nuoseklum ą (3) 
(6) (32).  
32. Kai gaunamas teigiamas ribinis atsakas (SI yra nuo 1,6 iki 1,9), tyr ėjai gali 
pageidauti įvertinti papildom ą informacij ą, pvz., doz ės ir atsako s ąryšį, 
sisteminio toksiškumo arba per didelio sudirginimo požymius ir, kai tinka, statistin į reikšmingum ą kartu su SI vert ėmis, kad patvirtint ų, jog 
tokie rezultatai iš ties ų teigiami (10). Reikia atsižvelgti ir į įvairias bando ­
mosios medžiagos savybes, įskaitant tai, ar jos strukt ūra gimininga žinom ų 
odą jautrinan čių medžiag ų struktūrai, ar ji sukelia per didel į pelių odos 
dirginimą, ir pastebimo doz ės ir atsako s ąryšio tipą. Šie ir kiti aspektai yra 
išsamiai aptarti kitur (4).
 
33. Surenkant duomenis apie kiekvien ą pelę galima statistiškai išanalizuoti 
dozės ir atsako s ąryšį tuose duomenyse ir jo laipsn į. Atliekant bet kok į 
statistinį įvertinimą, galima įtraukti doz ės ir atsako s ąryšio vertinim ą ir 
tinkamai pakoreguotus bandymo grupi ų palyginimus (pvz., suporuot ų 
dozavimo grupi ų palyginimus su lygiagre čiomis tirpiklio/VC). Į statistinę 
analizę gali būti įtraukta, pvz., tiesin ė regresija arba Viljamso tyrimas, 
skirtas doz ės ir atsako s ąryšio tendencijoms įvertinti, ir suporuot ų rezultatų 
palyginim ų Daneto tyrimas. Rinkdamasis tinkam ą statistin ės analizės 
metodą tyrėjas turi tur ėti omenyje galimus variantiškum ų skirtingumus ir 
kitas susijusias problemas, d ėl kurių gali prireikti duomen ų transformacijos 
ar neparametrin ės statistin ės analizės. Bet kuriuo atveju tyr ėjui gali tekti 
atlikti SI skai čiavimus ir statistin ę analizę su tam tikrai duomen ų taškais 
(kartais vadinamais „riktais“) ir be j ų. 
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Duomenys  
34. Duomenys pateikiami lentel ėse, nurodant atskir ų gyvūnų BrdU ženklinimo 
rodiklio vertes, BrdU ženklinimo rodiklio/gyv ūnui grupės vidurkis, atitin ­
kamas paklaidos rodiklis (pvz., SD, SEM) ir kiekvienos doz ės grupės 
vidutinis SI, palygintas su lygiagre čios tirpiklio/nešiklio grup ės rodikliu.  
Bandymo ataskaita  
35. Bandymo ataskaitoje pateikiama ši informacija:  
Bandomoji ir kontrolin ė cheminės medžiagos:  
— tapatumo duomenys (pvz., CAS numeris ir EC numeris, jei yra; 
šaltinis; grynumas; žinomos priemaišos; partijos numeris),  
— fizikin ė būsena ir fizikin ės ir chemin ės savybės (pvz., lakumas, stabi ­
lumas, tirpumas),  
— jei tai mišinys – jo sud ėtis ir komponent ų procentin ė dalis.  
Tirpiklis / nešiklis:  
— tapatumo duomenys (grynumas; koncentracija (jei tinka); naudojamas 
tūris), 
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Bandomo gyv ūnai: 
— CBA peli ų šaltinis,  
— gyvūnų mikrobiologin ė būsena, jei žinoma,  
— gyvūnų skaičius ir amžius,  
— gyvūnų šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir t. t.  
Bandymo s ąlygos:  
— ELISA rinkinio šaltinis, partijos numeris ir gamintojo kokyb ės užtik­
rinimo/kokyb ės kontrolės duomenys (antik ūnų jautrumas bei specifiš ­
kumas ir aptikimo riba),  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos ruošim ą ir užtepim ą, 
— dozės pasirinkimo pagrindimas ( įskaitant atrankinio bandymo rezul ­
tatus, jei bandymas buvo daromas),  
— naudotos nešiklio ir bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės, 
suminis užteptos medžiagos kiekis,  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (įskaitant pašaro tip ą 
ar šaltinį, vandens šaltin į), 
— poveikio medžiaga ir m ėginių ėmimo tvarkaraš čiai, 
— toksiškumo matavimo metodai,  
— tyrimo rezultat ų vertinimo kaip teigiami arba neigiami kriterijai,  
— išsami informacija apie bet kokius nukrypimus nuo protokolo ir paaiš ­
kinimas, kaip tas nukrypimas paveiks tyrimo sistem ą ir rezultatus.  
Patikimumo tikrinimas:  
— paskutin ės patikimumo patikros rezultat ų santrauka, įskaitant informa ­
ciją apie medžiag ą, koncentracij ą ir naudojam ą nešiklį, 
— bandymo laboratorijoje lygiagre čiai ir (arba) anks čiau sukaupti PC ir 
lygiagrečiai gauti neigiamos (tirpiklio/nešiklio) kontrol ės duomenys,  
— jei lygiagreti PC nebuvo naudojama, naujausio periodinio PC bandymo 
data ir laboratorijos ataskaita ir ataskaita su laboratorijos anks čiau 
sukauptais PC duomenimis, pagrindžian čiais lygiagre čios PC nenaudo ­
jimą. 
Rezultatai:  
— atskirų pelių masė dozės gavimo ir numatyto humaniško numarinimo 
dieną; taip pat kiekvienos poveikio grup ės vidurkis ir atitinkamas 
paklaidos rodiklis (pvz., SD, SEM),  
— toksinio poveikio atsiradimo laikas ir požymiai, įskaitant kiekvieno 
gyvūno odos dirginim ą medžiagos užtepimo vietoje, jei yra,  
— kiekvienos poveikio grup ės atskiros pel ės BrdU ženklinimo rodikli ų ir 
SI verčių lentelės, 
— kiekvienos poveikio grup ės BrdU ženklinimo rodikliui/pelei vidurkis ir 
atitinkamas paklaidos rodiklis (pvz., SD, SEM) ir kiekvienos poveikio 
grupės riktų analizės rezultatai,  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— apskai čiuotas SI ir atitinkamas variantiškumo matas, kuriuo atsižvel ­
giama į atskirų gyvūnų rezultatų variantiškum ą tiek bandomosios 
medžiagos, tiek kontrolin ėje grupėse, 
— dozės ir atsako s ąryšis,  
— statistin ė analizė, jei tinka.  
Rezultatų aptarimas:  
— trumpas rezultat ų, dozės ir atsako s ąryšio analiz ės ir statistin ės 
analizės, jei tinka, paaiškinimas, padarant išvad ą, ar bandomoji 
medžiaga turi b ūti laikoma odos jautrikliu.  
NUORODOS  
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Avai ­
lable at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999–1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985–997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. 
Toxicol., 36, 327–33.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of 
uncertainty margins. Toxicol., 146, 49–59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative 
Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the 
Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99–4494. Research Triangle Park, N.C. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258–273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274–286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249–257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioac ­
tive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10–7552A/B. Research Triangle Park, 
NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPR ­
PRept2009.pdf]
 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129–134.
 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.or ­
g/env/testguidelines]  
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90–96.
 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09–7357. Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available 
at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf]  
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89.  
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 
13–31.  
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.  
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Back ­
ground Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih. ­
gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195–206.  
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. 
Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83–94.
 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.  ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506.  
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van 
Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. 
Toxicol., 212, 60–68.
 
(28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728.  
(29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023–1028.
 
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical SAFEty Testing: Advancing  In 
Vitro  Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evalua ­
tions. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acute ­
tox/Tox_workshop.htm].
 
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in SAFEty Evaluation, Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., 
Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and 
Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563–79.
 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and SAFEty Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTYS  
Tikslumas –  bandymo metodo rezultat ų ir patvirtint ų pamatini ų verčių artumas. 
Tikslumas yra bandymo metodo naudojimo charakteristik ų matas ir vienas iš 
tinkamumo aspekt ų. Terminas dažnai vartojamas kaip lygiavertis terminui „suta ­
pimas“ ir reiškia tinkam ų bandymo metodo rezultat ų dalį (33).  
Palyginamoji medžiaga –  jautrinanti arba nejautrinanti medžiaga, naudojama kaip 
bandomosios medžiagos palyginimo standartas. Palyginamoji medžiaga turi pasi ­ 
žymėti tokiomis savyb ėmis: i) pastoviu (-iais) ir patikimu (-ais) šaltiniu (-iais), ii) 
struktūriniu ir funkciniu panašumu į bandomų medžiag ų klasę, iii) žinomomis 
fizikinėmis ir chemin ėmis charakteristikomis, iv) patvirtinan čiais duomenimis 
apie žinomus poveikius ir v) žinomu potencialu norim ų atsakų intervale.  
Klaidingai neigiamas rezultatas –  bandymo metodu bandomoji medžiaga netei ­
singai įvertinta kaip neigiama arba neaktyvi, nors iš ties ų yra teigiama arba aktyvi 
(33).  
Klaidingai teigiamas rezultatas –  bandymu bandomoji medžiaga neteisingai įver­
tinta kaip teigiama arba aktyvi, nors iš ties ų yra neigiama arba neaktyvi (33).  
Pavojus –  neigiamo poveikio sveikatai arba ekologijai galimyb ė. Neigiamas 
poveikis pasireiškia tik tada, jei veikimas medžiaga yra pakankamo lygio.  
Atkuriamumas tarp laboratorij ų – laipsnio, kuriuo skirtingos kvalifikuotos labo ­
ratorijos, taikydamos t ą patį protokol ą ir bandan čios tas pa čias bandom ąsias 
medžiagas, gali gauti kokybiškai ir kiekybiškai panašius rezultatus, matas. Atku ­
riamumas tarp laboratorij ų nustatomas atliekant pradinio tinkamumo patvirtinimo 
ir tinkamumo pavirtinimo procesus ir rodo laipsn į, kuriuo bandym ą galima 
sėkmingai perkelti tarp laboratorij ų; tai dar vadinama tarplaboratoriniu atkuria ­
mumu (33).  
Atkuriamumas laboratorijoje –  laipsnio, kuriuo kvalifikuoti darbuotojai toje 
pačioje laboratorijoje gali s ėkmingai atkartoti rezultatus, taikydami konkret ų 
protokolą skirtingu metu, matas. Dar vadinamas laboratoriniu atkuriamumu (33).  
Riktas –  pastebėjimas, kad vert ė labai skiriasi nuo kit ų atsitiktinio populiacijos 
ėminio ver čių. 
Kokybės užtikrinimas –  valdymo procesas, per kur į asmenys, nepriklausomi nuo 
atliekančiųjų bandymus, įvertina, kaip laboratorija laikosi bandymo standart ų, 
reikalavim ų ir užrašų saugojimo proced ūrų bei duomen ų perdavimo tikslumo.  
Patikimumas –  juo įvertinamas laipsnis, kuriuo bandymo metodas gali b ūti ilgai­
niui atkartojamai atliekamas vienoje ir skirtingose laboratorijose, taikant t ą patį 
protokolą. Jis įvertinamas skai čiuojant atkuriamum ą laboratorijoje ir tarp labora ­
torijų (33).  
Odos jautrinimas –  imunologinis procesas, vykstantis paveik ų individą išoriškai 
paveikus cheminiu alergenu, kuris sukelia odos imunin į atsaką, dėl kurio gali 
atsirasti kontaktinis jautrinimas.  
Dirginimo rodiklis (angl. SI) –  vertė, apskaičiuojama bandomosios medžiagos 
jautrinimo potencialui įvertinti – tai yra paveikt ų grupių proliferacijos s ąryšio su 
lygiagrečios nešiklio kontrolin ės grupės proliferacija koeficientas.  
Bandomoji medžiaga (dar vadinama bandom ąja chemine medžiaga) –  bet kuri 
medžiaga ar mišinys, bandomi taikant š į bandymų metodą. ▼M3 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  ŪMUS TOKSIŠKUMAS ĮKVĖPUS. ŪMAUS TOKSIŠKUMO 
KLASĖS NUSTATYMO METODAS  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD „Test Guideline“ (TG) 436 (OECD 
bandymo gaires Nr. 436) (2009). Pirmosios ūmaus toksiškumo įkvėpus 
bandymo gair ės TG 403 priimtos 1981 m., v ėliau jos buvo atnaujintos 
(žr. šio priedo B.2 skyri ų (1)). Parengti ūmaus toksiškumo įkvėpus klasės 
(ŪITK) metod ą (2) (3) (4) nuspr ęsta priėmus atnaujint ąjį ūmaus toksiškumo 
per virškinam ąjį traktą klasės (ŪOTK) metod ą (šio priedo B.1 tris skyrius) 
(5). Retrospektyvus ūmaus toksiškumo įkvėpus klasės bandymo metodo 
veiksmingumo vertinimas parod ė, kad šis metodas yra tinkamas taikyti 
klasifikavimo ir ženklinimo tikslais (6). Ūmaus toksiškumo įkvėpus klasės 
bandymo metodas suteiks galimyb ę atlikti nuoseklius veiksmus taikant 
pastovias tikslines koncentracijas, siekiant įvertinti bandomosios chemin ės 
medžiagos toksiškum ą. Pagrindin ė metodo pasekm ė – mirtingumas, ta čiau 
didelį skausmą arba kan čią patiriantys gyv ūnai arba gaištantys gyv ūnai 
turėtų būti humaniškai numarinami siekiant sumažinti kan čią. Pasekmi ų 
žmonėms gairės pateiktos OECD rekomendaciniame dokumente (RD) 
Nr. 19 (7).  
2. Šio bandymo metodo taikymo ir aiškinimo gair ės pateiktos rekomendaci ­
niame dokumente Nr. 39 d ėl ūmaus toksiškumo įkvėpus bandym ų (RD 
Nr. 39) (8).  
3. Aprašant š į bandymo metod ą vartojamos apibr ėžtys pateiktos 1 pried ėlyje ir 
RD Nr. 39 (8).  
4. Taikant š į bandymo metod ą gaunama informacijos apie bandomosios 
cheminės medžiagos pavojingas savybes siekiant j ą įvertinti ir klasifikuoti 
pagal Reglament ą (EB) Nr. 1272/2008 (9) kaip ūmų toksiškum ą sukelian ­ 
čias chemines medžiagas. Jeigu reikalingi taškiniai LC  50 įverčiai arba 
koncentracijos ir reakcijos tarpusavio priklausomyb ės tyrimai, reik ėtų taikyti 
šio priedo B.2 skyriuje (1) aprašyt ą bandymo metod ą. Daugiau rekomenda ­
cijų dėl bandymo metodo pasirinkimo pateikta RD Nr. 39 (8). Šis bandymo 
metodas n ėra specialiai skirtas specialiosios paskirties medžiag ų, pvz., mažo 
tirpumo izomerini ų arba pluoštini ų medžiag ų arba dirbtini ų nanomedžiag ų, 
bandymams.  
PIRMINIAI ASPEKTAI  
5. Prieš svarstydama galimyb ę atlikti bandymus pagal š į bandymo metod ą, 
bandymų laboratorija, siekdama sumažinti bandym ų su gyvūnais poreik į, 
turėtų peržiūrėti visą turimą informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiagą, 
įskaitant esamus tyrimus, kuri ų duomenys leist ų neatlikti papildom ų 
bandymų. Pasirinkti tinkamiausi ą gyvūnų rūšį, paderm ę, lytį, poveikio 
būdą ir tinkamas bandym ų koncentracijas gali pad ėti informacija apie 
bandomosios chemin ės medžiagos tapatum ą, cheminę struktūrą, fizines ir 
chemines savybes, taip pat toksiškumo bandym ų in vitro  arba  in vivo  rezul­
tatai, numatomi panaudojimo b ūdai ir galimas poveikis žmogui, 
turimi (Q)SAR duomenys ir toksikologiniai duomenys apie panašios struk ­
tūros chemines medžiagas. Jeigu, atsižvelgiant į ėsdinamąjį ( 1 ) arba stipr ų 
dirginamąjį poveikį, numatoma, kad koncentracija gali sukelti didel į 
skausmą arba kan čią, tokia koncentracija netur ėtų būti bandoma pagal š į 
bandymo metod ą [žr. RD Nr. 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Ėsdinimas gal ėtų būti vertinamas remiantis ekspert ų nuomone, grindžiama tokiais įrody­
mais: patirtimi su žmon ėmis ir gyv ūnais, esamais ( in vitro ) duomenimis, pvz., šio 
priedo B.40 skyriumi (10) ir B.40 bis skyriumi (11) arba OECD TG 435 (12), pH 
vertėmis, informacija apie panašias chemines medžiagas arba kitais susijusiais duome ­
nimis.
 BANDYMO PRINCIPAS  
6. Šis bandymas grindžiamas nuoseklia metodika, pagal kuri ą keturių valandų 
poveikio laikotarpiu gaunama pakankamai informacijos apie bandomosios cheminės medžiagos ūmų toksiškum ą įkvėpus, kad t ą medžiagą būtų galima 
klasifikuoti. Atsižvelgiant į specialius reglamentavimo tikslus, gali b ūti 
taikomi ir kitokie poveikio laikotarpiai. Kad ir kokie b ūtų nustatytieji 
koncentracijos lygiai, bandymai atliekami naudojant po tris kiekvienos lyties gyvūnus. Atsižvelgiant į gyvūnų gaištamum ą ir (arba) liguistum ą, gali 
pakakti dviej ų lygių, kad būtų galima spr ęsti apie bandomosios chemin ės 
medžiagos ūmų toksiškum ą. Jeigu pateikiama įrodymų, kad kurios nors 
lyties gyv ūnai yra jautresni už kitos lyties gyv ūnus, bandymas gali b ūti 
tęsiamas naudojant tik jautresniosios lyties gyv ūnus. Remiantis pirmesniojo 
lygio taikymo rezultatais, nustatoma, kas tur ėtų būti daroma toliau, pvz.:
 
a) daugiau bandym ų atlikti nereikia;  
b) turėtų būti atliekami bandymai naudojant po tris kiekvienos lyties 
gyvūnus arba  
c) turėtų būti atliekami bandymai naudojant šešis jautresniosios lyties 
gyvūnus, t. y. toksiškumo klas ės apatinės ribos įverčiai turėtų būti nusta­
tomi remiantis šešiais gyv ūnais kiekvienoje koncentracijos lygio grup ėje, 
nepaisant lyties.  
7. Gaištantys gyv ūnai arba gyv ūnai, kurie akivaizdžiai patiria skausm ą arba 
kuriems pasireiškia didel ės ir ilgalaik ės kančios požymi ų, turėtų būti huma­
niškai numarinami ir aiškinant bandymo rezultatus laikomi atliekant bandymą nugaišusiais gyv ūnais. Sprendimo numarinti gaištan čius arba 
sunkiai ken čiančius gyvūnus priėmimo kriterijai ir numatomos arba neišven ­
giamos ž ūties nustatymo rekomendacijos yra pateikti rekomendaciniame 
dokumente Nr. 19 d ėl pasekmi ų žmonėms (7).
 
METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
8. Turėtų būti naudojami sveiki, jauni, bet suaug ę plačiai naudojam ų labora­
torinių padermių gyvūnai. Tinkamiausia r ūšis yra žiurk ės; jeigu naudojama 
kita rūšis, turėtų būti pateiktas jos naudojimo pagrindimas.  
Gyvūnų paruošimas  
9. Patel ės turėtų būti dar be vados ir neapvaisintos. Poveikio dien ą gyvūnai 
turėtų būti jauni, bet suaug ę, 8–12 savai čių amžiaus, o mas ė pagal kiekvien ą 
lytį turėtų ± 20 % tikslumu atitikti anks čiau dozę gavusių gyvūnų vidutinę 
masę. Gyvūnai atrenkami atsitiktine tvarka ir paženklinami, kad b ūtų galima 
identifikuoti kiekvien ą gyvūną. Ne mažiau kaip penkias paras iki bandymo 
pradžios gyv ūnai laikomi savo narveliuose, kad priprast ų prie laboratorini ų 
sąlygų. Prieš bandym ą gyvūnai taip pat tur ėtų būti trumpai papratinami prie 
bandymo aparat ūros, nes tai pad ės sumažinti įtampą, kylančią patekus į 
naują aplinką. 
Gyvūnų laikymas  
10. Bandom ųjų gyvūnų laikymo patalpos temperat ūra turėtų būti 22 ± 3 °C. 
Tinkamiausias santykinis dr ėgnis – 30–70 %, bet jis gali b ūti nepasiekiamas, 
jeigu naudojamas nešiklis yra vanduo. Prieš doz ės davimą ir davus doz ę 
gyvūnai turėtų būti laikomi narveliuose suskirstyti grup ėmis pagal lyt į ir 
koncentracij ą; narvelyje laikom ų gyvūnų skaičius turėtų būti toks, kad 
būtų galima aiškiai steb ėti kiekvien ą gyvūną ir kad b ūtų patiriama kuo 
mažiau žalos d ėl kanibalizmo ir grumtyni ų. Jeigu doz ė gyvūnams duodama 
tik per nos į, gali reik ėti juos pripratinti prie uždarom ųjų vamzdeli ų. Užda­
romieji vamzdeliai gyv ūnams netur ėtų kelti didel ės fizinės, terminės arba  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
suvaržymo įtampos. Varžymas gali tur ėti fiziologini ų pasekmių, pvz., tur ėti 
poveikio k ūno temperat ūrai (hipertermija) ir (arba) per minut ę įkvepiamam 
tūriui. Jeigu yra bendr ųjų duomenų, rodančių, kad toki ų pastebim ų pokyčių 
neįvyksta, pripratinimas prie uždarom ųjų vamzdeli ų nebūtinas. Gyv ūnai, 
kurių visas k ūnas veikiamas aerozoliu, poveikio laikotarpiu tur ėtų būti 
laikomi atskirai, kad bandomasis aerozolis neb ūtų filtruojamas per kit ų 
narvelyje esan čių gyvūnų kailį. Išskyrus poveikio laikotarp į, gyvūnams 
šerti tinka įprastas ir sertifikuotas laboratorijose naudojamas pašaras, 
duodant neribot ą geriamo vandens kiek į. Apšvietimas tur ėtų būti dirbtinis, 
taikant 12 h šviesos ir 12 h tamsos sek ą. 
Inhaliacin ės kameros  
11. Parenkant inhaliacin ę kamerą, turėtų būti atsižvelgiama į bandomosios 
cheminės medžiagos pob ūdį ir bandymo tiksl ą. Pirmenyb ė teikiama doz ės 
davimui tik per nos į (ši sąvoka apima s ąvokas „tik per galv ą“, „tik per nos į“ 
ir „tik per šnip ą“). Pirmenyb ė dozės davimui tik per nos į paprastai teikiama 
tiriant skyst ųjų arba kiet ųjų dalelių aerozolius ir garus, kurie gali konden ­
suotis ir tapti aerozoliais. Specialieji tyrimo tikslai gali b ūti sėkmingiau 
pasiekti taikant poveikio per vis ą kūną metodą, tačiau tai turi b ūti pagrįsta 
tyrimo ataskaitoje. Siekiant užtikrinti atmosferos pastovum ą naudojant 
poveikio per vis ą kūną kamerą, visa bandom ųjų gyvūnų užimama erdv ė 
turėtų neviršyti 5 % kameros t ūrio. Poveikio tik per nos į ir poveikio per 
visą kūną metodų principai ir konkret ūs šių metodų privalumai bei tr ūkumai 
aprašyti RD Nr. 39 (8).  
POVEIKIO S ĄLYGOS  
Koncentracij ų taikymas  
12. Rekomenduojama taikyti pastov ų keturių valandų poveikio laikotarp į, 
neskaitant pusiausvirinimo laikotarpio. Siekiant užtikrinti speciali ųjų reika­
lavimų laikymąsi gali būti taikomos kitokios trukm ės, tačiau tyrimo ataskai ­
toje turėtų būti pateiktas j ų pagrindimas [žr. RD Nr. 39 (8)]. Gyv ūnai, kurie 
veikiami poveikio per vis ą kūną kamerose, tur ėtų būti laikomi atskirai, kad 
kiti viename narvelyje laikomi gyv ūnai laižydami nenuryt ų bandomosios 
cheminės medžiagos. Poveikio metu gyv ūnas netur ėtų būti šeriamas. 
Vandens gali b ūti duodama per vis ą poveikio per vis ą kūną laikotarp į. 
13. Gyvūnai veikiami bandom ąja medžiaga duj ų, garų, aerozoli ų arba jų mišinių 
pavidalu. Per tyrim ą naudotina fizin ė būsena priklauso nuo fizini ų ir 
cheminių bandomosios chemin ės medžiagos savybi ų, pasirinktos koncentra ­
cijos ir (arba) fizinio pavidalo, kuris veikiausiai bus tvarkant ir naudojant 
bandomąją cheminę medžiag ą. Higroskopin ės ir chemiškai reaguojan čios 
bandomosios chemin ės medžiagos tur ėtų būti bandomos sauso oro s ąly­
gomis. Tur ėtų būti imamasi atsargumo priemoni ų, kad būtų išvengta sprogi ų 
koncentracij ų susidarymo.  
Dalelių dydžio pasiskirstymas  
14. Daleli ų rūšiavimas pagal dyd į turėtų būti taikomas visiems aerozoliams ir 
garams, kurie gali kondensuotis ir tapti aerozoliais. Kad poveikis b ūtų pada­
rytas visoms svarbioms kv ėpavimo tak ų sritims, rekomenduojama naudoti 
aerozolius, kuri ų masės medianinis aerodinaminis skersmuo (MMAS) yra 
1–4 μm, o geometrinis standartinis nuokrypis ( σ g ) – 1,5–3,0 (8) (13) (14). 
Nors turėtų būti imamasi pagr įstų priemoni ų, kad šio standarto b ūtų laiko­
masi, jeigu jo įgyvendinti ne įmanoma, tur ėtų būti pateikta ekspert ų 
nuomonė. Pvz., metal ų garai gali b ūti mažesni už š į standartą, o įelektrintos 
dalelės, pluoštai ir higroskopin ės medžiagos (dydžiui did ėjant drėgnoje 
kvėpavimo tak ų aplinkoje) gali viršyti š į standartą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Bandomosios chemin ės medžiagos paruošimas nešiklyje  
15. Siekiant užtikrinti reikiam ą bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą 
ir dalelių dydį atmosferoje, gali b ūti naudojamas nešiklis. Paprastai pirme ­
nybė teikiama vandeniui. Siekiant užtikrinti reikiam ą dalelių dydžio pasis ­
kirstymą, iš daleli ų sudaryta medžiaga gali b ūti apdorojama mechaniškai, 
tačiau turėtų būti imamasi atsargumo priemoni ų, kad bandomoji medžiaga 
nebūtų suskaidyta arba kad b ūtų pakeistos jos savyb ės. Kai manoma, kad 
mechaniškai apdorojus bandom ąją cheminę medžiag ą pasikeitė jos chemin ė 
sudėtis (pvz., d ėl labai aukštos temperat ūros, susidariusios d ėl trinties 
pernelyg stipriai malant), bandomosios chemin ės medžiagos sud ėtis turėtų 
būti patikrinta analiz ės būdu. Turėtų būti imamasi tinkam ų atsargumo prie ­
monių, kad bandomoji chemin ė medžiaga neb ūtų užteršta. Neb ūtina tikrinti 
netrapių granuliuot ų medžiag ų, kurios specialiai paruoštos taip, kad j ų 
nebūtų galima įkvėpti. Turėtų būti atliekamas trynimo bandymas, skirtas 
įrodyti, kad tvarkant granuliuot ą medžiag ą nesusidaro įkvepiamų dalelių. 
Jeigu atliekant trynimo bandym ą susidaro įkvepiamų dalelių, turėtų būti 
atliekamas toksiškumo įkvėpus bandymas.  
Kontroliniai gyv ūnai 
16. Vienalaik ės neigiamos kontrol ės (naudojant or ą) grupė nebūtina. Jeigu 
bandymo atmosferos suk ūrimo tikslais naudojamas nešiklis n ėra vanduo, 
nešiklio kontrolin ė grupė turėtų būti naudojama tik tuo atveju, jeigu n ėra 
istorinių toksiškumo įkvėpus duomen ų. Jeigu atlikus nešiklyje paruoštos 
bandomosios chemin ės medžiagos toksiškumo tyrim ą nustatoma, kad 
medžiaga n ėra toksiška, vadinasi, ir nešiklis, esant ištirtai koncentracijai, 
nėra toksiškas; taigi nešiklio kontrol ė nebūtina. 
POVEIKIO S ĄLYGŲ STEBĖJIMAS  
Oro srautas kameroje  
17. Kiekvieno poveikio metu tur ėtų būti atidžiai reguliuojamas, nuolat stebimas 
ir ne rečiau kaip kart ą per valand ą registruojamas per kamer ą tekantis oro 
srautas. Bandymo atmosferoje susidariusios koncentracijos (arba jos pasto ­
vumo) steb ėjimas yra vienas iš vis ų dinamini ų parametr ų matavim ų, sutei­
kiantis galimyb ę netiesiogiai kontroliuoti visus svarbius dinaminius atmos ­
feros kūrimo parametrus. Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas tam, kad 
būtų išvengta pakartotinio įkvėpimo doz ės davimo tik per nos į kamerose, 
kai per poveikio sistem ą tekantis oro srautas yra nepakankamas užtikrinti 
dinaminį bandomosios chemin ės medžiagos atmosferos sraut ą. Yra nustatyti 
metodai, kurie gali b ūti taikomi norint įrodyti, kad pasirinktomis veikimo 
sąlygomis ne įvyksta pakartotinio įkvėpimo (8) (15). Deguonies koncentra ­
cija turėtų būti ne mažesn ė kaip 19 %, anglies dioksido – ne didesn ė kaip 
1 %. Jeigu yra pagrindo manyti, kad ši ų standartų įgyvendinti ne įmanoma, 
turėtų būti matuojamos deguonies ir anglies dioksido koncentracijos.  
Kameros temperat ūra ir santykinis dr ėgnis 
18. Kameroje tur ėtų būti palaikoma 22 ± 3 °C temperat ūra. Tiek doz ę duodant 
tik per nos į, tiek veikiant vis ą kūną, santykinis dr ėgnis turėtų būti stebimas 
ir registruojamas ne mažiau kaip tris kartus, kai poveikio trukm ė keturios 
valandos, ir kas valand ą, kai poveikio trukm ė mažesnė. Tinkamiausias 
santykinis dr ėgnis – 30–70 %, ta čiau jis gali b ūti nepasiekiamas (pvz., 
bandant vandens pagrindo mišinius) arba neišmatuojamas d ėl trukdžių, atsi­
randančių bandomajai cheminei medžiagai taikant bandymo metod ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Bandomoji chemin ė medžiaga. Vardin ė koncentracija  
19. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti apskaičiuota ir užregistruota vardin ė koncentra ­
cija poveikio kameroje. Vardin ė koncentracija yra sukurtos bandomosios 
cheminės medžiagos mas ės ir viso oro srauto, perleisto per kamer ų sistemą, 
tūrio santykis. Vardin ė koncentracija n ėra naudojama apib ūdinti poveik į 
gyvūnui, tačiau, vardin ę koncentracij ą palyginus su faktine, nustatomas 
generavimo, kur į užtikrina bandym ų sistema, efektyvumas, kuriuo remiantis 
galima nustatyti generavimo problemas.  
Bandomoji chemin ė medžiaga. Faktin ė koncentracija  
20. Faktin ė koncentracija yra bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija 
inhaliacin ės kameros gyv ūno kvėpavimo zonoje. Faktines koncentracijas 
galima nustatyti specialiaisiais metodais (pvz., taikant tiesioginio ėminių 
ėmimo, adsorbcijos arba chemini ų reakcijų metodus ir tada atliekant anali ­
zinį apibūdinimą) arba nespecialiaisiais metodais, pvz., atliekant gravimet ­
rinę analizę naudojant filtrus. Gravimetrin ė analizė gali būti taikoma tik 
vienos sudedamosios dalies milteli ų aerozoliams arba mažo lakumo skyst ųjų 
dalelių aerozoliams ir tur ėtų būti grindžiama tinkamais prieš tyrim ą atliktais 
bandomosios chemin ės medžiagos savybi ų apibūdinimais. Iš daugiau kaip 
vienos sudedamosios dalies sudaryt ų miltelių aerozolių koncentracijos taip 
pat gali b ūti nustatomos atliekant gravimetrin ę analizę. Tačiau tam reikalingi 
analitiniai duomenys, įrodantys, kad ore esan čios medžiagos sud ėtis panaši į 
pirminės medžiagos sud ėtį. Jeigu tokios informacijos n ėra, tyrimo metu gali 
reikėti vienodais intervalais atlikti pakartotin ę bandomosios chemin ės 
medžiagos (geriausia, kad ji b ūtų ore) analiz ę. Jeigu aerozolin ės medžiagos 
gali garuoti arba sublimuoti, tur ėtų būti įrodyta, kad pasirinktu metodu 
surinktos visos faz ės. Tyrimo ataskaitoje tur ėtų būti nurodytos tikslin ės, 
vardinės ir faktin ės koncentracijos, ta čiau atliekant statistin ę analizę, skirtą 
apskaičiuoti mirtinas koncentracijos vertes, naudojamos tik faktin ės koncent ­
racijos.  
21. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti naudojama viena bandomosios chemin ės 
medžiagos partija, o bandomasis ėminys tur ėtų būti laikomas tokiomis s ąly­
gomis, kad b ūtų išsaugotas jo grynumas, homogeniškumas ir stabilumas. 
Prieš pradedant tyrim ą reikėtų apibūdinti bandomosios chemin ės medžiagos 
savybes, įskaitant jos grynum ą ir, jeigu tai techniškai įmanoma, tapatum ą, 
taip pat nustatyt ų teršalų ir priemaiš ų kiekius. Be kit ų duomenų, tai galima 
pagrįsti šiais duomenimis: sulaikymo trukme ir susijusia didžiausios 
koncentracijos sritimi, molekuline mase, nustatyta atlikus spektroskopin ę 
arba dujų chromatografijos analiz ę, arba kitais įverčiais. Nors bandomojo 
ėminio tapatumo nustatymas n ėra bandym ų laboratorijos pareiga, bandym ų 
laboratorijai gali b ūti naudinga patvirtinti bent kai kurias pateik ėjo nurodytas 
savybes (pvz., spalv ą, fizinę būseną ir t. t.).  
22. Poveikio atmosfera tur ėtų būti kaip įmanoma pastovesn ė ir turėtų būti 
stebima nuolat ir (arba) su pertraukomis, atsižvelgiant į analizės metodą. 
Jeigu ėminiai imami su pertraukomis, per keturi ų valandų tyrimą kameros 
atmosferos ėminiai tur ėtų būti imami ne mažiau kaip du kartus. Jeigu tai 
neįmanoma d ėl nedideli ų oro srauto grei čių arba maž ų koncentracij ų, gali 
būti imamas vienas ėminys per vis ą poveikio laikotarp į. Jeigu ėminiai paste ­
bimai skiriasi, tiriant kitas koncentracijas per poveikio laikotarp į turėtų būti 
imami keturi ėminiai. Atskiri kameroje susidariusios koncentracijos ėminiai 
neturėtų nukrypti nuo vidutin ės kameroje susidariusios koncentracijos 
daugiau kaip ± 10 %, kai tiriamos dujos ir garai, arba daugiau kaip 
± 20 %, kai tiriami skyst ųjų arba kiet ųjų dalelių aerozoliai. Tur ėtų būti 
apskaičiuotas ir užregistruotas pusiausvyros nusistov ėjimo kameroje laiko ­
tarpis (t  95 ). Į poveikio trukm ę įtraukiamas laikas, per kur į susidaro bando ­
moji chemin ė medžiaga, ir atsižvelgiama į laiką, kurio reikia, kad b ūtų 
pasiekta t  95 . t 95 apskaičiavimo gair ės pateiktos RD Nr. 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. Jeigu tiriami labai sud ėtingi mišiniai, sudaryti iš gar ų ir (arba) duj ų, ir 
aerozoliai (pvz., deginimo atmosferos ir bandomosios chemin ės medžiagos, 
pučiamos iš specialiai varom ų galutinio naudojimo produkt ų arba prietais ų), 
kiekvienos faz ės veikimas inhaliacin ėje kameroje gali b ūti skirtingas, tod ėl 
iš kiekvienos faz ės (garų ir (arba) duj ų ir aerozolio) tur ėtų būti parinkta bent 
viena indikacin ė cheminė medžiaga (analit ė); paprastai šiuo tikslu pasiren ­
kama pagrindin ė veiklioji mišinio chemin ė medžiaga. Jeigu bandomoji 
cheminė medžiaga yra mišinys, tur ėtų būti nurodyta viso mišinio, o ne tik 
veikliosios sudedamosios dalies (analit ės) analizin ė koncentracija. Daugiau 
informacijos apie faktines koncentracijas pateikta RD Nr. 39 (8).  
Bandomoji chemin ė medžiaga. Daleli ų dydžio pasiskirstymas  
24. Aerozoli ų dalelių dydžio pasiskirstymas tur ėtų būti nustatomas bent kart ą 
per kiekvien ą keturių valandų trukmės poveikio laikotarp į naudojant pako ­
pinį ėmiklį arba alternatyv ų prietaisą, pvz., aerodinamin į dalelių rūšiuotuvą. 
Jeigu galima įrodyti, kad pakopiniu ėmikliu arba alternatyviu prietaisu 
gaunami lygiaver čiai rezultatai, atliekant tyrim ą gali būti naudojamas alter ­
natyvus prietaisas. Siekiant įsitikinti pagrindinio prietaiso surenkamuoju 
veiksmingumu, kartu su pagrindiniu prietaisu tur ėtų būti naudojamas 
antrasis prietaisas, pvz., gravimetrinis filtras, gaudykl ė arba barboteris. 
Atlikus daleli ų dydžio analiz ę nustatyta mas ės koncentracija tur ėtų neviršyti 
priimtinų filtruojamosios analiz ės būdu nustatytos mas ės koncentracijos rib ų 
[žr. RD Nr. 39 (8)]. Jeigu lygiavertiškum ą galima įrodyti pradiniame tyrimo 
etape, tolesnius patvirtinamuosius matavimus galima praleisti. Gyv ūnų 
gerovės sumetimais tur ėtų būti imamasi priemoni ų, kad būtų kuo mažiau 
negalutini ų duomen ų, dėl kurių galėtų reikėti pakartoti poveik į. Garuose 
esančios dalelės turėtų būti rūšiuojamos tuo atveju, jeigu bent kiek tik ėtina, 
kad susidarant aerozoliui gali kondensuotis garai, arba jeigu gar ų atmosfe­
roje aptinkama daleli ų, dėl kurių gali susidaryti mišri ų fazių (žr. 14 skirsn į). 
PROCED ŪRA 
Pagrindinis bandymas  
25. Kiekvienam lygiui naudojama po tris kiekvienos lyties gyv ūnus arba po 
šešis jautresniosios lyties gyv ūnus. Jeigu naudojant kitos r ūšies graužikus 
nei žiurkės dozė duodama tik per nos į, ilgiausia poveikio trukm ė gali būti 
pakoreguojama siekiant sumažinti tos r ūšies gyvūnų patiriam ą kančią. 
Pradinei dozei taikytina koncentracija parenkama kaip vienas iš keturi ų 
nustatytųjų lygių: pradinis koncentracijos lygis tur ėtų būti toks, kuris, tik ė­
tina, sukels toksiškum ą kai kuriems doz ę gaunantiems gyv ūnams. Pagal 
dujoms, garams ir aerozoliams (nurodytiems 2–4 pried ėliuose) skirtas 
bandymų schemas bandymai tur ėtų būti atliekami taikant ribines CLP 1–4 
kategorijų vertes (9), nustatytas dujoms (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) 
(2 priedėlis), garams (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (3 pried ėlis) ir aerozoliams 
(0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4h) (4 pried ėlis). 5 kategorija, kuri n ėra reglamentuo ­
jama Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9), yra susijusi su koncentracijomis, 
viršijančiomis atitinkamas ribines koncentracijas. Kiekvienai pradinei 
koncentracijai taikoma atitinkama bandym ų schema. Atsižvelgiant į huma­
niškai numarint ų arba nugaišusi ų gyvūnų skaičių, bandymo proced ūra 
vykdoma vadovaujantis pateiktomis rodykl ėmis, kol nebus galima nustatyti 
kategorijos.  
26. Laiko tarpas tarp dozi ų davimo grup ėms nustatomas atsižvelgiant į toksiš­
kumo požymi ų atsiradimo laik ą, trukmę ir sunkum ą. Kito koncentracijos 
lygio doz ės davimas gyv ūnams nukeliamas iki to laiko, kai bus pagr įstai 
įsitikinta, kad pirmiau bandytieji gyv ūnai išgyveno. Rekomenduojamas 
uždelsto toksiškumo steb ėjimo laikotarpis tarp kiekvieno koncentracijos 
lygio dozi ų davimo – trys arba keturios paros. Prireikus, pvz., reakcijos 
be traukuli ų atveju, laiko tarpas gali b ūti koreguojamas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Ribinis bandymas  
27. Ribinis bandymas atliekamas tada, kai bandomoji chemin ė medžiaga yra 
nežinoma arba kai manoma, kad ji iš esm ės netoksiška, t. y. sukelianti 
toksinį poveikį tik taikant didesn ę nei normin ę koncentracij ą. Informacijos 
apie bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą galima gauti remiantis 
žiniomis apie panašias bandytas chemines medžiagas arba panašius mišinius, atsižvelgiant į toksikologin ės reikšmės turinčių sudedam ųjų dalių tapatumą 
ir procentin ę dalį. Tais atvejais, kai informacijos apie medžiagos toksiškum ą 
yra mažai arba jos išvis n ėra arba kai numanoma, kad bandomoji chemin ė 
medžiaga yra toksiška, tur ėtų būti atliekamas pagrindinis bandymas [daugiau 
rekomendacij ų pateikta RD Nr. 39 (8)].
 
28. Taikant įprastą procedūrą, po tris kiekvienos lyties gyv ūnus arba šeši 
jautresniosios lyties gyv ūnai veikiami 20 000 ppm koncentracija, jeigu tai 
dujos, 20 mg/l koncentracija, jeigu tai garai, 5 mg/l koncentracija, jeigu tai 
dulkių ir (arba) miglos tipo medžiagos (jeigu tokios koncentracijos pasie ­
kiamos); ši proced ūra taikoma kaip šiam bandymo metodui skirtas ribinis 
bandymas. Atliekant aerozoli ų bandymus, pirmiausia tur ėtų būti siekiama 
užtikrinti įkvepiamą dalelių dydį (t. y. MMAS tur ėtų būti 1–4 μm). 
Daugelio bandom ųjų cheminių medžiag ų atveju tai įmanoma pasiekti, kai 
koncentracija yra 2 mg/l. Atlikti aerozoli ų bandymus taikant didesn ę kaip 2 
mg/l koncentracij ą turėtų būti mėginama tik tuo atveju, jeigu įmanoma 
pasiekti įkvepiamą dalelių dydį [žr. RD Nr. 39 (8)]. Pagal GHS (16) gyv ūnų 
gerovės sumetimais rekomenduojama neatlikti bandym ų viršijant ribin ę 
koncentracij ą. Galimyb ė atlikti GHS 5 kategorijos (16), kuri n ėra reglamen ­
tuojama Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9), medžiag ų bandymus tur ėtų 
būti svarstoma tik tuo atveju, jeigu labai tik ėtina, kad tokio bandymo rezul ­
tatai turės tiesiogin ės reikšmės žmonių sveikatos apsaugai; tokiu atveju 
tyrimo ataskaitoje pateikiamas pagrindimas. Tiriant potencialiai sprogias bandomąsias chemines medžiagas tur ėtų būti imamasi atsargumo priemoni ų, 
kad nesusidaryt ų sprogimui palanki ų sąlygų. Siekiant išvengti neb ūtino 
gyvūnų naudojimo, prieš ribin į bandym ą turėtų būti atliktas atskiras 
bandymas be gyv ūnų, siekiant įsitikinti, ar įmanoma pasiekti ribiniam 
bandymui reikalingas kameros s ąlygas.
 
STEBĖJIMAI  
29. Poveikio laikotarpiu tur ėtų būti dažnai atliekami klinikiniai gyv ūnų stebė­
jimai. Baigus duoti doz ę, dozės davimo dien ą klinikiniai steb ėjimai turėtų 
būti atliekami bent du kartus arba daugiau, atsižvelgiant į gyvūnų reakciją į 
gautą dozę, o vėliau – bent kart ą per parą, iš viso stebint 14 dien ų. Tikslios 
stebėjimų laikotarpio trukm ės nenustatoma; ji tur ėtų būti parenkama atsiž ­
velgiant į klinikini ų požymių atsiradimo laik ą ir gyvūnų atsigavimo laiko ­
tarpio trukm ę. Svarbu atkreipti d ėmesį į toksiškumo požymi ų atsiradimo ir 
išnykimo laik ą, ypač jeigu toksiškumo požymi ų atsiranda tik po tam tikro 
laiko. Visi steb ėjimai sistemingai registruojami, išsaugant atskirus įrašus 
apie kiekvien ą gyvūną. Gaištantys gyv ūnai ir gyv ūnai, kurie patiria didelius 
skausmus ir (arba) kuriems pasireiškia ilgalaiki ų sunkios kan čios požymi ų, 
gyvūnų gerovės sumetimais tur ėtų būti humaniškai numarinami. Atliekant 
klinikinių toksiškumo požymi ų tyrimus, tur ėtų būti imamasi atsargumo prie ­
monių, kad prasta pradin ė išvaizda ir trumpalaikiai kv ėpavimo tak ų paki­
timai, atsirad ę dėl poveikio proced ūros, nebūtų palaikyti doz ės davimo 
poveikiu. Reik ėtų atsižvelgti į principus ir kriterijus, apibendrintus Reko ­
mendaciniame dokumente d ėl pasekmi ų žmonėms (7). Kai gyv ūnai numa ­
rinami dėl humanišk ų priežasčių arba randami nugaiš ę, kiek įmanoma tiks ­
liau užregistruojamas ž ūties laikas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Narveliuose tur ėtų būti stebimi odos ir kailio, aki ų ir gleivin ės pakitimai, 
taip pat kv ėpavimo, kraujo, autonomin ės ir centrin ės nervų sistemų, soma­
tomotorin ės veiklos ir elgsenos pakitimai. Jeigu įmanoma, tur ėtų būti išskirti 
vietinis ir sisteminis poveikiai. Ypa č reikėtų stebėti, ar nepasireiškia 
drebulys, traukuliai, viduriavimas, mieguistumas, miego ir komos b ūsenos, 
ar neteka seil ės. Matuojant temperat ūrą tiesiojoje žarnoje, galima gauti 
patvirtinam ųjų sulėtėjusio kvėpavimo arba nukritusios ar pakilusios tempe ­
ratūros įrodymų, susijusių su dozės davimu arba izoliavimu.  
Kūno masė 
31. Kiekvieno gyv ūno masė turėtų būti vieną kartą užregistruojama pratinimo 
laikotarpiu, tada poveikio dien ą dar nedavus doz ės (nulinė diena) ir bent 
pirmąją, trečiąją ir septint ąją dienomis (o v ėliau – kas savait ę), taip pat 
žūties arba numarinimo metu, jeigu tai įvyksta po pirmosios dienos. K ūno 
masė yra labai svarbus toksiškumo gyv ūnams rodiklis, tod ėl gyvūnai, kurių 
masė, palyginti su vert ėmis, gautomis prieš tyrim ą, nukrenta 20 % arba 
daugiau, tur ėtų būti atidžiai stebimi. Pasibaigus poveikio pasekmi ų stebė­
jimo laikotarpiui, išgyven ę gyvūnai pasveriami ir humaniškai numarinami.  
Patologija  
32. Visiems bandomiesiems gyv ūnams, įskaitant nugaišusius atliekant bandym ą 
arba numarintus ir pašalintus iš tyrimo gyv ūnų gerovės sumetimais, daromas 
bendrasis skrodimas. Jeigu skrodimo negalima atlikti iš karto po to, kai aptinkamas nugaiš ęs gyvūnas, gyvūnas turėtų būti laikomas pakankamai 
šaltoje vietoje (bet neužšaldomas), siekiant kuo labiau pristabdyti autoliz ę. 
Skrodimai tur ėtų būti atliekamai kaip galima anks čiau, paprastai – per dien ą 
arba dvi. Visi dideli patologiniai pakitimai tur ėtų būti užregistruojami pagal 
kiekvieną gyvūną, ypatingą dėmesį skiriant kv ėpavimo tak ų pakitimams.
 
33. Norint padidinti tyrimo aiškinam ąją reikšmę, gali būti atliekamos papil ­
domos apži ūros, iš anksto numatytos pagal tyrimo plan ą, pvz., išgyvenusi ų 
žiurkių plaučių svėrimas ir (arba) dirginimo įrodymų gavimas atliekant 
kvėpavimo tak ų apžiūrą mikroskopu. Taip pat gali b ūti tiriami organai, 
turintys didel ės 24 valandas arba ilgiau išgyvenusi ų gyvūnų patologijos 
požymių, arba organai, apie kuriuos žinoma arba d ėl kurių manoma, kad 
jiems buvo pakenkta. Mikroskopu apži ūrėjus visus kv ėpavimo takus, galima 
gauti naudingos informacijos apie bandom ąsias chemines medžiagas, kurios 
reaguoja su vandeniu, pvz., r ūgštis ir higroskopines bandom ąsias chemines 
medžiagas.  
DUOMENYS IR ATASKAITOS  
Duomenys  
34. Turėtų būti pateikti kiekvieno gyv ūno masės duomenys ir skrodimo išvados. 
Klinikinių stebėjimų duomenys tur ėtų būti apibendrinti lentel ėse, pagal kiek ­
vieną bandomąją grupę nurodant naudot ų gyvūnų skaičių, gyvūnų, kuriems 
pasireiškė toksiškumo požymi ų, skaičių, atliekant bandym ą nugaišusi ų arba 
dėl humanišk ų priežasčių numarint ų gyvūnų skaičių, kiekvieno gyv ūno 
žūties laiką, taip pat pateikiant toksinio poveikio aprašym ą, pasireiškimo 
laiką ir grįžtamumą, skrodimo išvadas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Bandymo ataskaita  
35. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikta tokia informacija (jeigu taikytina):  
Bandomieji gyv ūnai ir jų laikymas:  
— laikymo s ąlygų aprašymas, nurodant gyv ūnų skaičių narvelyje (arba 
skaičiaus pokyt į), kraiko medžiag ą, aplinkos temperat ūrą ir santykin į 
drėgnį, šviesos ir tamsos kait ą paros metu ir š ėrimo režim ą, 
— naudota r ūšis (paderm ė) ir, jeigu tai ne žiurk ės, kitos rūšies naudojimo 
pagrindimas,  
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis,  
— atsitiktin ės atrankos metodas,  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (įskaitant pašaro tip ą 
arba šaltin į, vandens šaltin į), 
— prieš bandym ą sudarytų sąlygų aprašymas, nurodant š ėrimo režim ą, 
izoliavimo ir apsaugos nuo lig ų būdą. 
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— fizinė būsena, grynumas ir, jeigu taikytina, fizin ės ir chemin ės savybės 
(įskaitant izomerij ą), 
— identifikavimo duomenys ir Chemini ų medžiag ų santrump ų tarnybos 
(angl. CAS) registracijos numeris, jeigu jis žinomas.  
Nešiklis:  
— nešiklio naudojimo pagrindimas ir nešiklio parinkimo pagrindimas (jeigu 
tai ne vanduo),  
— istoriniai arba vienalaikiai duomenys, įrodantys, kad nešiklis nedaro 
neigiamo poveikio tyrimo rezultatams.  
Inhaliacin ė kamera:  
— inhaliacin ės kameros aprašas, nurodant matmenis ir t ūrį, 
— įrangos, naudotos darant poveik į gyvūnams ir kuriant atmosfer ą, šaltinis 
ir aprašas,  
— temperat ūros, drėgnio, daleli ų dydžio ir faktin ės koncentracijos mata ­
vimo įranga,  
— oro šaltinis, tiekiamo ir (arba) ištraukiamo oro apdorojimas ir kondicio ­
navimo sistema,  
— įrangos kalibravimo siekiant užtikrinti homogenišk ą bandymo atmosfer ą 
metodai,  
— slėgių skirtumas (teigiamas ar neigiamas),  
— kameroje esan čios dozės davimo angos (jeigu doz ė duodama tik per 
nosį); gyvūnų vieta sistemoje (jeigu doz ė duodama per vis ą kūną), 
— bandymo atmosferos laikinas homogeniškumas ir (arba) pastovumas,  
— temperat ūros ir dr ėgnio jutikli ų vieta ir kameroje sukurtos bandymo 
atmosferos ėminių ėmimas,  
— oro srauto grei čiai, per doz ės davimo ang ą tekančio oro srauto greitis 
(jeigu doz ė duodama tik per nos į) arba gyv ūnų kiekis kameroje (jeigu 
dozė duodama per vis ą kūną), 
— informacija apie deguonies ir anglies dioksido kiekio matavimo įrangą, 
jeigu tokia naudota,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— inhaliacin ės kameros pusiausvyros pasiekimo laikas (t  95 ), 
— tūrio pokyčių kiekis per valand ą, 
— matavimo prietaisai (jeigu naudojami).  
Poveikio duomenys:  
— tikslin ės koncentracijos parinkimo pagrindiniam tyrimui pagrindimas,  
— vardin ės koncentracijos (inhaliacin ėje kameroje sukurtos bandomosios 
cheminės medžiagos bendrosios mas ės ir viso per kamer ą perleisto oro 
srauto tūrio santykis),  
— faktin ės bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos, nustatytos 
gyvūnų kvėpavimo zonoje; jeigu bandomi mišiniai, įgaunantys įvairias 
fizines būsenas (dujos, garai, aerozoliai), kiekviena iš ši ų būsenų gali 
būti analizuojama atskirai,  
— visos koncentracijos ore tur ėtų būti nurodomos mas ės vienetais (pvz., 
mg/l, mg/m  3 ir t. t.); skliaustuose taip pat gali b ūti nurodoma t ūrio 
vienetais (pvz., ppm, ppb),  
— dalelių dydžio pasiskirstymas, mas ės medianinis aerodinaminis 
skersmuo (MMAS) ir geometrinis standartinis nuokrypis ( σ g ), nurodant 
jų apskaičiavimo metodus. Tur ėtų būti nurodytos atliktos atskiros daleli ų 
dydžio analiz ės. 
Bandymo s ąlygos:  
— išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos paruošim ą, 
nurodant proced ūras, taikytas siekiant sumažinti kiet ųjų chemini ų 
medžiagų dalelių dydį arba paruošti bandomosios chemin ės medžiagos 
tirpalus. Jeigu mechaniniais procesais gal ėjo būti pakeista bandomosios 
cheminės medžiagos sud ėtis, pateikite bandomosios chemin ės medžiagos 
sudėties patikros analizi ų rezultatus,  
— įrangos, naudotos kuriant bandymo atmosfer ą ir veikiant gyv ūnus 
bandymo atmosfera, aprašas (pageidautina, pateikiant diagram ą), 
— išsami informacija apie taikyt ą cheminės analizės metodą ir metodo 
tinkamumo patvirtinim ą (nurodant bandomosios chemin ės medžiagos 
regeneravimo iš ėminių ėmimo terp ės veiksmingum ą), 
— bandom ųjų koncentracij ų parinkimo pagrindimas.  
Rezultatai:  
— kameros temperat ūrų, drėgnio ir oro sraut ų lentelės, 
— kameros vardin ės ir faktin ės koncentracijos duomen ų lentelės, 
— dalelių dydžių lentelės, pateikiant analizini ų ėminių ėmimo duomenis, 
dalelių dydžių pasiskirstym ą ir MMAS bei σ g skaičiavimus,  
— kiekvieno gyv ūno reakcijos duomen ų ir jam taikyto koncentracijos lygio 
lentelės (t. y. gyv ūnų, kuriems pasireišk ė toksiškumo požymi ų, nurodant 
gaištamum ą, poveikio pob ūdį, sunkum ą ir trukm ę), 
— kiekvieno gyv ūno masė, nustatyta tyrimo dienomis; ž ūties data ir laikas, 
jeigu gyv ūnas nugaišo dar prieš numatyt ą numarinim ą; toksiškumo 
požymių atsiradimo laikas ir ar ši ų požymių pasireiškimas kiekvieno 
gyvūno atveju buvo gr įžtamasis,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— kiekvieno gyv ūno skrodimo išvados ir histopatologini ų tyrimų rezultatai, 
jeigu yra,  
— kategorija pagal CLP klasifikacij ą ir LC  50 ribinė vertė. 
Rezultatų aptarimas ir aiškinimas  
— Ypatingas d ėmesys tur ėtų būti skiriamas metod ų, taikytų siekiant laikytis 
šio bandymo metodo kriterij ų, pvz., susijusi ų su ribine koncentracija 
arba daleli ų dydžiu, aprašymui,  
— atsižvelgiant į bendruosius rezultatus, tur ėtų būti aprašyta daleli ų įkvė­
pimo galimyb ė, ypač jeigu nebuvo įmanoma taikyti daleli ų dydžio krite ­
rijaus,  
— pateikiant bendr ąjį tyrimo vertinim ą, turėtų būti nurodytas metod ų, 
taikytų nustatyti vardines ir faktines koncentracijas, nuoseklumas ir 
faktinės koncentracijos santykis su vardine koncentracija,  
— turėtų būti aprašyta tik ėtina žūties priežastis ir vyraujantis veikimo b ūdas 
(sisteminis ar vietinis),  
— atsižvelgiant į OECD rekomendaciniame dokumente d ėl pasekmi ų 
žmonėms (7) nustatytus kriterijus, tur ėtų būti pateiktas paaiškinimas, ar 
kilo poreikis humaniškai numarinti gyv ūnus, patirian čius skausm ą arba 
sunkią ilgalaikę kančią. 
LITERAT ŪRA 
1. Šio priedo B.2 skyrius. Ūmus toksiškumas įkvėpus. 
2. Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and 
Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. 
Toxicol.  77: 243–254.  
3. Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic- 
Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71: 537–549.  
4. Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to 
LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1: 129–134.  
5. Šio priedo B.1 tris skyrius. Ūmus toksiškumas per virškinam ąjį traktą. 
Ūmaus toksiškumo klas ės nustatymo metodas.  
6. OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft 
TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. 
Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ ­
testguidelines]
 
7. OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in SAFEty Evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/ ­
testguidelines]
 
8. OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/ ­
testguidelines]
 
9. 2008 m. gruodžio 16 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) 
Nr. 1272/2008 d ėl chemini ų medžiag ų ir mišini ų klasifikavimo, ženklinimo 
ir pakavimo, iš dalies kei čiantis ir panaikinantis direktyvas 67/548/EEB bei 
1999/45/EB ir iš dalies kei čiantis Reglament ą (EB) Nr. 1907/2006, OL 
L 353, 2008 12 31, p. 1.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
10. Šio priedo B.40 skyrius. Odos ėsdinimas  in vitro . Odos sluoksnio elektrin ės 
varžos (OSEV) bandymas.  
11. Šio priedo B.40 bis skyrius. Odos ėsdinimas  in vitro . Žmogaus odos modelio 
bandymas.  
12. OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
13. Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2  nd 
Edition) Informa Healthcare, New York.  
14. SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute 
Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18: 321–327.  
15. Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167
 
16. UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welco ­
me_e.html]
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
1 priedėlis 
APIBRĖŽTIS  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  naudojant š į bandymo metod ą tiriama chemin ė 
medžiaga arba mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
2 priedėlis 
Procedūra, atliktina taikant kiekvien ą pradinę dujų koncentracij ą (ppm/4 h)  
Bendros pastabos (  1 ) 
Šiame priede kiekvienai pradinei koncentracijai pateiktos atitinkamos bandym ų 
schemos, kuriomis nurodytos taikytinos proced ūros. 
2a priedėlis. Pradinė koncentracija – 100 ppm.  
2b priedėlis. Pradinė koncentracija – 500 ppm.  
2c priedėlis. Pradinė koncentracija – 2 500 ppm.  
2d priedėlis. Pradinė koncentracija – 20 000 ppm.  
Atsižvelgiant į humaniškai numarint ų arba nugaišusi ų gyvūnų skaičių, bandym ų 
procedūra vykdoma vadovaujantis pateiktomis rodykl ėmis. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) Toliau pateiktose lentel ėse pateiktos nuorodos į visuotinai suderint ą cheminių medžiag ų 
klasifikavimo ir ženklinimo sistem ą (angl. GHS). ES atitikmuo – Reglamentas (EB) 
Nr. 1272/2008. Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9) nereglamentuojamas 5 kategorijos 
cheminių medžiag ų ūmus toksiškumas įkvėpus.
 2a priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 100 ppm/4 h duj ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
2b priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 500 ppm/4 h duj ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
2c priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 2 500 ppm/4 h duj ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
2d priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 20 000 ppm/4 h duj ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
3 priedėlis 
Procedūra, atliktina taikant kiekvien ą pradinę garų koncentracij ą (mgl/l/4 h)  
Bendros pastabos (  1 ) 
Šiame priede kiekvienai pradinei koncentracijai pateiktos atitinkamos bandym ų 
schemos, kuriomis nurodytos taikytinos proced ūros. 
3a priedėlis. Pradinė koncentracija – 0,5 mg/l.  
3b priedėlis. Pradinė koncentracija – 2,0 mg/l.  
3c priedėlis. Pradinė koncentracija – 10 mg/l.  
3d priedėlis. Pradinė koncentracija – 20 mg/l.  
Atsižvelgiant į humaniškai numarint ų arba nugaišusi ų gyvūnų skaičių, bandym ų 
procedūra vykdoma vadovaujantis pateiktomis rodykl ėmis. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) Toliau pateiktose lentel ėse pateiktos nuorodos į visuotinai suderint ą cheminių medžiag ų 
klasifikavimo ir ženklinimo sistem ą (angl. GHS). ES atitikmuo – Reglamentas (EB) 
Nr. 1272/2008. Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9) nereglamentuojamas 5 kategorijos 
cheminių medžiag ų ūmus toksiškumas įkvėpus.
 3a priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 0,5 mg/l/4 h gar ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
3b priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 2 mg/l/4 h gar ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
3c priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 10 mg/l/4 h gar ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
3d priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 20 mg/l/4 h gar ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
4 priedėlis 
Procedūra, atliktina taikant kiekvien ą pradinę aerozoli ų koncentracij ą 
(mgl/l/4 h)  
Bendros pastabos (  1 ) 
Šiame priede kiekvienai pradinei koncentracijai pateiktos atitinkamos bandym ų 
schemos, kuriomis nurodytos taikytinos proced ūros. 
4a priedėlis. Pradinė koncentracija – 0,05 mg/l.  
4b priedėlis. Pradinė koncentracija – 0,5 mg/l.  
4c priedėlis. Pradinė koncentracija – 1 mg/l.  
4d priedėlis. Pradinė koncentracija – 5 mg/l.  
Atsižvelgiant į humaniškai numarint ų arba nugaišusi ų gyvūnų skaičių, bandym ų 
procedūra vykdoma vadovaujantis pateiktomis rodykl ėmis. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) Toliau pateiktose lentel ėse pateiktos nuorodos į visuotinai suderint ą cheminių medžiag ų 
klasifikavimo ir ženklinimo sistem ą (angl. GHS). ES atitikmuo – Reglamentas (EB) 
Nr. 1272/2008. Reglamentu (EB) Nr. 1272/2008 (9) nereglamentuojamas 5 kategorijos 
cheminių medžiag ų ūmus toksiškumas įkvėpus.
 4a priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 0,05 mg/l/4 h gar ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
4b priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 0,5 mg/l/4 h aerozoli ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
4c priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 1 mg/l/4 h aerozoli ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
4d priedėlis 
Ūmus inhaliacinis toksiškumas.  
Bandymų procedūra taikant pradin ę 5 mg/l/4 h aerozoli ų koncentracij ą
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  TOKSINIO POVEIKIO NERV Ų SISTEMOS VYSTYMUISI 
TYRIMAS  
ĮŽANGA  
1. Šis bandym ų metodas atitinka EBPO Bandym ų gaires (angl. OECD  Test 
Guideline (TG) ) Nr. 426 (2007). 1995 m. birželio m ėn. Kopenhagoje EBPO 
Toksinio poveikio dauginimuisi ir vystymuisi tyrimo darbo grup ė aptarė 
poreikį atnaujinti esamas EBPO toksinio poveikio dauginimuisi ir vysty ­
muisi bandym ų gaires ir parengti naujas dar neaptart ų vertinam ųjų baigčių 
bandymų gaires (1). Darbo grup ė rekomendavo toksinio poveikio nerv ų 
sistemos vystymuisi bandym ų gaires rengti remiantis JAV aplinkos 
apsaugos agent ūros (angl. US EPA) gair ėmis; šios gair ės nuo to laiko 
buvo pakeistos (2). 1996 m. birželio m ėn. Kopenhagoje įvyko antras 
konsultacinis pos ėdis, surengtas siekiant pad ėti Sekretoriatui rengti nauj ų 
toksinio poveikio nerv ų sistemos vystymuisi bandymo gairi ų projektą, 
taip pat patarti d ėl pagrindini ų šių gairių punktų, pavyzdžiui, d ėl dalykų, 
susijusių su gyvūnų rūšių pasirinkimu, dozi ų davimo laikotarpiu, bandymo 
laikotarpiu, vertinamosiomis baigtimis ir rezultat ų vertinimo kriterijais. JAV 
toksinio poveikio nerv ų sistemai rizikos vertinimo gair ės paskelbtos 1998 
m. (3). EBPO ekspert ų konsultacinis pos ėdis ir Tarptautinio gyvyb ės 
mokslų instituto (angl. ILSI) Rizikos moksl ų instituto seminaras surengtas 
2000 m. spalio m ėn., ekspert ų konsultacinis pos ėdis įvyko 2005 m. Toki ­
juje. Šie pos ėdžiai surengti moksliniams ir techniniams klausimams, susiju ­
siems su esamomis bandym ų gairėmis, aptarti; rengiant š į bandymų metodą 
atsižvelgta į per posėdžius pateiktas rekomendacijas (4) (5) (6) (7). Papil ­
doma informacija apie šio bandym ų metodo taikym ą, aiškinim ą ir terminus 
pateikiama EBPO Rekomendaciniame dokumente (angl. OECD  Guidance 
Document ) Nr. 43 ‘Reproductive Toxicity Testing and Assesment’ (8) ir 
Nr. 20 ‘Neurotoxicity Testing’ (9).  
PRADINIAI ASPEKTAI  
2. Yra žinoma, kad kai kurios chemin ės medžiagos daro toksin į poveikį 
žmonių ir kitų rūšių gyvūnų nervų sistemos vystymuisi (10) (11) (12) 
(13). Galim ą cheminės medžiagos toksin į poveikį nervų sistemos vysty ­
muisi gali prireikti nustatyti tam, kad b ūtų galima nustatyti ir įvertinti 
cheminės medžiagos toksines savybes. Toksinio poveikio nerv ų sistemos 
vystymuisi tyrim ų tikslas – surinkti duomenis, įskaitant duomenis apie 
dozių ir atsako ryšio ypatumus, apie galim ą funkcinį ir morfologin į poveikį 
palikuoni ų nervų sistemos vystymuisi, galint į atsirasti toms medžiagoms 
palikuonis veikiant gimdoje ir gyvenimo pradžioje.  
3. Toksinio poveikio nerv ų sistemos vystymuisi tyrim ą galima atlikti kaip 
atskirą tyrimą, įtraukti į toksinio poveikio dauginimuisi ir (arba) toksinio 
poveikio suaugusi ų gyvūnų nervų sistemai tyrim ą (pvz., B.34 (14), B.35 
(15), B.43 (16) bandym ų metodai) arba sujungti su toksinio poveikio prena ­
taliniam vystymuisi tyrimu (pvz., B.31 bandym ų metodas (17)). Jeigu 
toksinio poveikio nerv ų sistemos vystymuisi tyrimas įtraukiamas į kitą 
tyrimą arba sujungiamas su kitu tyrimu, b ūtina išlaikyti abiej ų rūšių tyrimų 
vientisum ą. Visi bandymai tur ėtų atitikti taikomus teis ės aktus, valdžios 
institucijų ir įstaigų gaires dėl laboratorini ų gyvūnų naudojimo moksliniams 
tyrimams (pvz., 18).  
4. Bandym ų laboratorijos darbuotojai, prieš atlikdami tyrim ą, turėtų susipažinti 
su visa turima informacija apie bandom ąją cheminę medžiag ą. Ši informa ­
cija – tai chemin ės medžiagos tapatumas ir strukt ūra, jos fizikin ės ir 
cheminės savybės, visų kitų cheminės medžiagos  in vitro  arba  in vivo  
toksinio poveikio bandym ų rezultatai, giminingos strukt ūros chemini ų 
medžiagų toksikologiniai duomenys ir numatomas (-i) medžiagos naudo ­
jimo būdas (-ai). Ši informacija yra reikalinga, kad visiems suinteresuotie ­
siems asmenims b ūtų įrodyta, jog bandymas yra svarbus žmoni ų sveikatai 
saugoti ir pad ės pasirinkti tinkam ą pradinę dozę. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
BANDYM Ų METODO PRINCIPAS  
5. Bandomoji chemin ė medžiaga duodama gyv ūnams gestacijos ir laktacijos 
laikotarpiu. Bandymai su motinin ėmis patel ėmis atliekami siekiant įvertinti 
poveikį vaikingoms ir žindan čioms patel ėms, jie taip pat gali suteikti paly ­
ginamosios informacijos (motinin ės patelės versus  palikuonys). Palikuonys 
toksiniam poveikiui nerv ų sistemos vystymuisi įvertinti atrenkami iš vad ų 
atsitiktine tvarka. Vertinim ą sudaro steb ėjimai, kuriais siekiama nustatyti 
bendras neurologines ir elgsenos anomalijas, įskaitant fizin į vystymąsi, 
elgsenos ontogenez ę, motorin į aktyvum ą, motorin ę ir jutimin ę funkcijas, 
mokymąsi ir atmint į; jį taip pat sudaro galvos smegen ų masės ir neuropa ­
tologinis vertinimas postnatalinio vystymosi ir brandos laikotarpiais.  
6. Kai bandym ų metodas yra taikomas kaip atskiras tyrimas, papildomai turimi 
kiekvienos grup ės gyvūnai gali b ūti panaudoti konkretiems neurobihevioris ­
tiniams, neuropatologiniams, neurocheminiams arba elektrofiziologiniams 
bandymams, kuri ų rezultatais galima papildyti duomenis, gautus atliekant 
pagal šį bandymų metodą rekomenduojamus tyrimus (16) (19) (20) (21). 
Papildomi bandymai gali b ūti ypač naudingi, kai praktiniai steb ėjimai, 
numatomas poveikis arba veikimo mechanizmo/b ūdo duomenys atskleidžia, 
kad neurotoksiškumas yra specifinio pob ūdžio. Šie papildomi bandymai gali 
būti taikomi ir motinin ėms patelėms, ir jaunikliams. Be to, dar galima atlikti  
ex vivo  arba  in vitro  bandymus, jei jais nekei čiamas  in vivo  bandym ų 
vientisumas.  
PASIRENGIMAS BANDYMUI  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
7. Tinkamiausia bandom ųjų gyvūnų rūšis yra žiurk ės; jei reikia, galima 
naudoti kitas gyv ūnų rūšis. Tačiau reikėtų atkreipti d ėmesį, kad pagal š į 
bandymų metodą nurodytas gestacinio ir postnatalinio laikotarpi ų dienų 
skaičius yra b ūdingas b ūtent dažniausiai naudojam ų veislių žiurkėms; 
jeigu pasirenkama kita gyv ūnų rūšis arba ne dažniausiai naudojama veisl ė, 
reikėtų atitinkamai pakoreguoti dien ų skaičių. Kitos r ūšies naudojimas 
turėtų būti pagrįstas toksikologiniais, farmakokinetikos ir (arba) kitais 
duomenimis. Į pagrindim ą reikėtų įtraukti informacij ą apie tai, ar yra atlikti 
tos rūšies postnatalinis neurobihevioristinis ir neuropatologinis vertinimai. 
Jeigu anks čiau buvo atliktas bandymas, per kur į kilo rūpestį keliančių klau­
simų, reikėtų atkreipti d ėmesį į rūšis/veislę, dėl kurios kilo r ūpestį keliantis 
klausimas. D ėl skirting ų veislių žiurkėms būdingų skirting ų elgsenos 
savybių reikėtų surinkti įrodymus, kad pasirinktos veisl ės žiurkės yra pakan ­
kamai vaisingos ir pakankamai jautrios. Kit ų rūšių patikimum ą ir jautrum ą 
tiriant toksin į poveik į nervų sistemos vystymuisi reik ėtų pagrįsti 
dokumentais.  
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
8. Bandom ųjų gyvūnų patalpos temperat ūra turėtų būti 22 ± 3 °C. Nors santy ­
kinė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesn ė kaip 
70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikėtų siekti, kad ji b ūtų 50–60 %. 
Apšvietimas tur ėtų būti dirbtinis, jo seka: 12 h šviesos ir 12 h tamsos. 
Apšvietimo cikl ą taip pat galima keisti prieš poravim ąsi ir per tyrim ą, 
siekiant įvertinti funkcines ir elgsenos tamsoje (švie čiant raudonai šviesai), 
t. y. laikotarpiu, kada gyv ūnai paprastai b ūna aktyvūs, vertinam ąsias baigtis 
(22). Darant bet kokius šviesos ir tamsos ciklo pakeitimus, reik ėtų numatyti 
pakankamai laiko aklimatizavimuisi, kad gyv ūnai galėtų prisitaikyti prie 
naujo ciklo. Gyv ūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje naudojamas 
pašaras, o geriamojo vandens kiekis neribojamas. Pašaro ir vandens pob ūdį 
reikėtų aprašyti, abu reik ėtų ištirti, ar juose n ėra teršalų. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Gyv ūnai narveliuose gali b ūti laikomi atskirai arba mažomis tos pa čios 
lyties grup ėmis. Poruojama tur ėtų būti šiam tikslui pritaikytuose narve ­
liuose. Pasitvirtinus susiporavimui arba ne v ėliau kaip 15 gestacijos dien ą 
suporuoti gyv ūnai turėtų būti atskiriami ir laikomi po vien ą atsivedimo arba 
veisimo narveliuose. Narveliai išd ėstomi taip, kad b ūtų kiek įmanoma 
sumažintas bet koks galimas poveikis d ėl narvelio buvimo vietos. Art ėjant 
atsivedimui, suporuotos patel ės turėtų būti aprūpinamos tinkamomis ir 
nustatytomis g ūžtos sukimo medžiagomis. Gerai žinoma, kad netinkamas 
elgesys su gyv ūnais arba stresas gestacijos metu gali tur ėti neigiam ų pada­
rinių, tarp jų – būti prenatalinio vados netekimo, vaisiaus arba postnatalinio 
vystymosi pakitim ų priežastimi. Siekiant apsisaugoti nuo vaisiaus praradimo 
dėl veiksnių, nesusijusi ų su bandomosios chemin ės medžiagos davimu, su 
gyvūnais gestacijos laikotarpiu reik ėtų elgtis atsargiai ir vengti išor ės 
veiksnių, pavyzdžiui, pernelyg didelio išor ės triukšmo, keliamo streso.  
Gyvūnų paruošimas  
10. Reik ėtų naudoti sveikus dar bandymams nenaudotus ir prie laboratorijos 
sąlygų pripratintus gyv ūnus, nebent tyrimas yra įtrauktas į kitą tyrimą (žr. 
3 punktą). Bandomieji gyv ūnai turėtų būti aprašomi nurodant j ų rūšį, veislę, 
šaltinį, lytį, masę ir amžių. Kiekvienam gyv ūnui reikėtų priskirti unikal ų 
identifikavimo numer į ir kiekvien ą gyvūną juo pažym ėti. Kiek įmanoma, 
visų bandymo grupi ų gyvūnai turėtų būti vienodos mas ės ir amžiaus ir 
atitikti normalias tiriamos r ūšies ir veisl ės savybes. Kiekvienu doz ės 
lygmeniu tur ėtų būti naudojamos jaunos, suaugusios, palikuoni ų neturėju­
sios patel ės. Reikėtų vengti vien ų tėvų palikuoni ų poravimo ir pasir ūpinti, 
kad taip nenutikt ų. 0 gestacijos diena (GD) yra vaginalinio kamš čio ir (arba) 
spermos atsiradimo diena. Jeigu iš tiek ėjo įsigyjamos jau vaikingos patel ės, 
reikėtų joms leisti kur į laiką aklimatizuotis (pvz., 2–3 dienas). Apvaisintos 
patelės atsitiktin ės atrankos b ūdu suskirstomos į kontrolin ę ir bandom ąją 
grupes ir kuo tolygiau paskirstomos po visas grupes (pvz., norint užtikrinti vienodą paskirstym ą po visas grupes, rekomenduojama taikyti stratifikuot ą 
atsitiktinę atranką, pavyzdžiui, pagal k ūno masę). Grupėse turėtų būti po 
vienodą skaičių to paties patino apvaisint ų patelių.
 
BANDYMO PROCED ŪRA 
Gyvūnų skaičius ir lytis  
11. Kiekvienoje bandymo ir kontrolin ėje grupėje turėtų būti pakankamas 
vaikingų patelių, kurios bus veikiamos bandom ąja chemine medžiaga, skai ­ 
čius tam, kad b ūtų gauta pakankamai palikuoni ų neurotoksiškumui vertinti. 
Kiekvienu doz ės lygmeniu iš viso rekomenduojama naudoti po 20 vad ų. 
Grupėms galima taikyti kartotinio arba šachmatinio dozavimo model į, jeigu 
kiekvienoje grup ėje užtikrinamas reikiamas bendras vad ų skaičius ir taikomi 
tinkami statistiniai modeliai kartotinio dozavimo rezultatams apskaityti.  
12. 4 postnatalin ę dieną (PND) arba prieš tai (atsivedimo diena yra 0 PND) 
kiekvienos vados jaunikli ų skaičius pakoreguojamas išimant atsitiktine 
tvarka atrinktus perteklinius jauniklius, kad visos vados b ūtų vienodo 
dydžio (23). Vados dydis netur ėtų viršyti naudojamos veisl ės graužik ų 
vidutinio vados dydžio (8–12). Vadoje tur ėtų būti, jeigu tik tai įmanoma, 
po vienod ą skaičių vyriškos ir moteriškos lyties jaunikli ų. Selektyvus 
jauniklių eliminavimas, pvz., pagal k ūno masę, nepriimtinas. Vadas stan ­
dartizavus (atlikus brokavim ą) prieš atliekant tolesn į funkcinių vertinam ųjų 
baigčių bandym ą, tie konkret ūs jaunikliai, kuriuos ketinama tirti prieš 
nujunkym ą, ir tie, kuriuos ketinama tirti po nujunkymo, tur ėtų būti pažymėti 
unikalia žyma, naudojant bet kur į tinkamą humanišk ą jauniklių ženklinimo 
metodą (pvz., 24).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Gyvūnų suskirstymas funkciniams ir elgsenos bandymams, galvos 
smegenų masės ir neuropatologiniam įvertinimui  
13. Pagal š į bandymų metodą galima taikyti įvairius būdus gyvūnams, kuriems  
in utero  ir laktacijos laikotarpiu bus atliekami funkciniai ir elgsenos 
bandymai, vertinamas lytinis subrendimas, nustatoma galvos smegen ų 
masė ir atliekamas neuropatologinis vertinimas, suskirstyti (25). Tam tikrais 
atvejais papildomai galima atlikti ir kitus neurobihevioristin ės funkcijos 
(pvz., socialin ės elgsenos), neurocheminius arba neuropatologinius 
bandymus, jeigu d ėl to nebus pažeistas pagrindini ų reikaling ų bandym ų 
vientisumas.  
14. Jaunikliai atrenkami iš kiekvienos doz ės grupės ir paskirstomi vertinamo ­
sioms baigtims vertinti 4 PND arba v ėliau. Jauniklius reik ėtų atrinkti taip, 
kad per kiekvien ą bandymą kiekvienos doz ės grupėje iš kiekvienos vados 
būtų, kiek tai yra įmanoma, paimta po lygiai abiej ų lyčių gyvūnų. Atliekant 
motorinio aktyvumo bandym ą, bandymai visais amžiaus etapais iki nujun ­
kymo atliekami su ta pa čia vyriškos ir moteriškos lyties jaunikli ų pora (žr. 
35 punktą). Atliekant visus kitus elgsenos bandymus, galima imti tas pa čias 
arba skirtingas vyriškos ir moteriškos lyties gyv ūnų poras. Atliekant nujun ­
kytų jauniklių versus  suaugusi ų gyvūnų kognityvin ės funkcijos bandymus, 
gali tekti paskirti skirtingus jauniklius, taip siekiant išvengti rezultat ų iškrai­
pymo dėl amžiaus ir d ėl išsidresavimo per ankstesnius t ų rodiklių mata­
vimus (26) (27). Prad ėjus nujunkym ą (21 PND) bandymams neatrinktus 
jauniklius galima humaniškai numarinti. Visus jaunikli ų suskirstymo pakei ­
timus reik ėtų nurodyti. Statistinis mato vienetas tur ėtų būti vada (arba moti ­
ninė patelė), ne jauniklis.  
15. Tyrimams iki ir po nujunkymo, kognityviniams bandymams, patologiniams 
tyrimams ir t. t. jauniklius galima suskirstyti įvairiais b ūdais (1 pvz., paro ­
dyta bendra strukt ūra, 1 pried ėlyje pateikti paskirstymo pavyzdžiai). Reko ­
menduojamas minimalus gyv ūnų skaičius kiekvienos doz ės grupėje atlie­
kant tyrimus iki ir po nujunkymo yra toks: 
Klinikiniai steb ėjimai ir k ūno masė Visi gyv ūnai 
Išsamūs klinikiniai steb ėjimai  Po 20 kiekvienos lyties (po 1 
kiekvienos lyties iš vados)  
Galvos smegen ų masė (po fiksavimo) 
11–22 PND  Po 10 kiekvienos lyties (po 1 
iš vados)  
Galvos smegen ų (nefiksuot ų) masė ~70 
PND  Po 10 kiekvienos lyties (po 1 
iš vados)  
Neuropatologija (panardinimas arba perfu ­
zinė fiksacija) 11–22 PND  Po 10 kiekvienos lyties (po 1 
iš vados)  
Neuropatologija (perfuzin ė fiksacija) ~70 
PND  Po 10 kiekvienos lyties (po 1 
iš vados)  
Lytinis subrendimas  Po 20 kiekvienos lyties (po 1 
kiek vienos lyties iš vados)  
Kiti vystymosi parametrai (pasirinktinai)  Visi gyv ūnai 
Elgsenos ontogenez ė Po 20 vienos lyties (po 1 
kiekvienos lyties iš vados)  
Motorinis aktyvumas  Po 20 vienos lyties (po 1 
kiekvienos lyties iš vados)  
Motorinė ir jutimin ė funkcijos  Po 20 vienos lyties (po 1 
kiekvienos lyties iš vados)  
Mokymasis ir atmintis  Po 10 kiekvienos lyties (  a ) 
(po 1 iš vados)  
( a ) Pagal tai, kokio jautrumo kognityvin ės funkcijos bandymas yra atliekamas, reik ėtų 
apsvarstyti galimyb ę tirti didesnio gyv ūnų skaičiaus grup ę, pvz., po vien ą vyriškos 
ir moteriškos lyties gyv ūną iš kiekvienos vados (gyv ūnų suskirstymas parodytas 1 
priedėlyje) (daugiau informacijos apie imties dyd į pateikta EBPO Rekomendaci ­
niame dokumente Nr. 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dozavimas  
16. Turėtų būti naudojamos mažiausiai trij ų dydžių dozės ir lygiagre čiai naudo ­
jama viena kontrolin ė grupė. Dozės turėtų būti išskirstomos intervalais taip, 
kad toksinis poveikis b ūtų laipsniškas. Jei n ėra apribojim ų dėl fizikinio ir 
cheminio chemin ės medžiagos pob ūdžio arba biologini ų jos savybi ų, turi 
būti pasirenkama tokia didžiausia doz ė, kuri sukelt ų tam tikr ą toksinį 
poveikį motininei patelei (pvz., klinikinius požymius, k ūno masės augimo 
sumažėjimą (ne daugiau kaip 10 %) ir (arba) b ūtų gauta duomen ų apie 
dozės apribojimus d ėl jos toksiškumo tiksliniam organui). Didel ės dozės 
riba pagal k ūno masę gali būti 1000 mg vienam k ūno masės kg per 
dieną su tam tikromis išimtimis. Pavyzdžiui, jei numatomas žmoni ų sąlytis 
su bandom ąja chemine medžiaga, gali paaišk ėti, kad reikia naudoti didesnio 
dydžio doz ę. Taip pat reik ėtų atlikti parengtinius tyrimus arba preliminarius 
dozės dydžio intervalo nustatymo tyrimus ir jais nustatyti, iki kokio dydžio 
dozė motininei patelei yra minimaliai toksiška. Jeigu atlikus standartin į 
toksiškumo vystymuisi tyrim ą arba parengtin į tyrimą yra nustatoma, kad 
bandomoji chemin ė medžiaga yra toksiška vystymuisi, didžiausia doz ė 
turėtų būti maksimali doz ė, kuri nesukelia pernelyg didelio toksinio 
poveikio palikuonims, mirties  in utero  ir ką tik gimusi ų jauniklių mirties 
arba išsigimim ų, pakankam ų, kad kliudyt ų atlikti prasming ą toksinio 
poveikio nerv ų sistemai vertinim ą. Reikėtų stengtis, kad mažiausia doz ė 
būtų tokia, kuri nesukelt ų jokių toksinio poveikio motininei patelei arba 
vystymuisi, įskaitant nerv ų sistemos, požymi ų. Kitus doz ės dydžius reik ėtų 
pasirinkti maž ėjančia tvarka taip, kad b ūtų pastebėtas kiekvienas su doze 
susijęs atsakas ir b ūtų nustatyta nepasteb ėto neigiamo poveikio 
riba (NOAEL) arba aptikimo ribai artimas doz ės dydis, kad pagal tai 
būtų galima nustatyti etalonin ę dozę. Nustatant doz ės dydį mažėjančia 
tvarka, intervalas, kai doz ės dydis skiriasi 2–4 kartus, dažnai b ūna opti­
malus; vietoj dideli ų intervalų tarp dozi ų (pvz., kai j ų dydis skiriasi daugiau 
kaip 10 kart ų) dažnai geriau naudoti papildom ą ketvirtą bandomąją grupę. 
17. Doz ės dydžiai tur ėtų būti pasirenkami atsižvelgiant į visus turimus toksiš ­
kumo duomenis ir į papildom ą informacij ą apie bandomosios chemin ės 
medžiagos arba gimining ų medžiag ų metabolizmo ir toksikokinetines 
savybes. Ši informacija taip pat gali pad ėti pagrįsti dozavimo režimo tinka ­
mumą. Galimyb ę dozes jaunikliams duoti tiesiogiai reik ėtų svarstyti atsiž ­
velgiant į sąlyčio su bandom ąja chemine medžiaga ir farmakokinetin ę infor­
maciją (28) (29). Prieš pradedant tyrimus, per kuriuos doz ės būtų duodamos 
tiesiogiai, reik ėtų atidžiai įvertinti naud ą ir trūkumus (30).  
18. Lygiagre čiai tiriama kontrolin ė grupė turėtų būti medžiagos negaunanti 
kontrolinė grupė arba nešikl į gaunanti kontrolin ė grupė, jei bandomajai 
cheminei medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Visiems gyv ūnams paprastai 
turėtų būti duodamas vienodas, matuojant pagal k ūno masę, chemin ės 
medžiagos arba nešiklio t ūris. Jei dozi ų ruošimui palengvinti naudojamas 
nešiklis arba kitas priedas, reik ėtų atsižvelgti į tokias jo charakteristikas: 
poveikį bandomosios chemin ės medžiagos absorbcijai, pasiskirstymui, meta ­
bolizmui ar sulaikymui; poveik į bandomosios chemin ės medžiagos chemi ­
nėms savyb ėms, dėl kurio gali pasikeisti jos toksiškumas; poveik į pašaro ar 
vandens suvartojimui arba gyv ūnų įmitimui. Nešiklis netur ėtų kelti 
poveikio, kuris trukdyt ų aiškinti tyrimo rezultatus, neurobihevioristiniu 
požiūriu jis taip pat netur ėtų būti toksiškas ir netur ėtų veikti dauginimosi 
ar vystymosi. Jei nešiklis yra naujas, tur ėtų būti naudojama ne tik nešikl į 
gaunanti kontrolin ė grupė, bet ir nieko negaunanti kontrolin ė grupė. Su 
kontrolinės (-ių) grupės (-ių) gyvūnais reikia elgtis lygiai taip pat, kaip ir 
su bandymo grup ės gyvūnais. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Dozių davimas  
19. Bandomoji chemin ė medžiaga arba nešiklis tur ėtų būti duodamas tokiu 
būdu, kuris yra artimiausias galimo žmogaus s ąlyčio su ta medžiaga 
būdui, remiantis turima metabolizmo ir pasiskirstymo bandom ųjų gyvūnų 
organizme informacija. Dažniausiai duodama per virškinam ąjį traktą (pvz., 
per zondą, kartu su pašaru, geriamuoju vandeniu), bet kiti b ūdai (pvz., per 
odą, kvėpavimo takus) taip pat gali b ūti taikomi atsižvelgiant į tai, kokie yra 
žmogaus s ąlyčio su ta medžiaga ypatumai, tik ėtinas arba žinomas b ūdas 
(išsamesni paaiškinimai pateikti Rekomendaciniame dokumente Nr. 43(8)). Pasirinkt ą davimo b ūdą reikėtų pagrįsti. Bandomoji chemin ė 
medžiaga tur ėtų būti duodama kiekvien ą dieną maždaug tuo pa čiu laiku.
 
20. Doz ė kiekvienam gyv ūnui paprastai tur ėtų būti nustatoma atsižvelgiant į 
patį paskutin į jo svėrimą. Tačiau reguliuojant doz ės dydį paskutin į gesta­
cijos trimestr ą reikia imtis atsargumo priemoni ų. Jei pastebima, kad toksinis 
poveikis motinin ėms patelėms yra per didelis, jos tur ėtų būti humaniškai 
numarinamos.  
21. Bandomoji chemin ė medžiaga arba nešiklis suporuotoms patel ėms turėtų 
būti duodamas ne re čiau kaip kart ą per dien ą nuo implantacijos dienos (6 
GD) iki laktacijos laikotarpio pabaigos (21 PND), kad jaunikliai b ūtų 
bandomosios chemin ės medžiagos veikiami prenatalinio ir postnatalinio 
nervų sistemos vystymosi laikotarpiais. Amžius, nuo kurio pradedama 
duoti dozes, ir dozi ų davimo trukm ė bei dažnumas gali b ūti koreguojami, 
jeigu pagal turimus duomenis tokia bandymo strukt ūra yra artimesn ė 
žmogaus patiriamam poveikiui. Dozi ų davimo kit ų rūšių gyvūnams trukm ę 
reikėtų pakoreguoti taip, kad b ūtų užtikrinta, kad gyv ūnai gautų bandomo ­
sios medžiagos visais ankstyvaisiais smegen ų vystymosi etapais (t. y. prena ­
talinį ir ankstyv ąjį postnatalin į žmogaus galvos smegen ų augimą atitinkan ­ 
čiais laikotarpiais). Dozes galima prad ėti duoti nuo gestacijos pradžios (0 
GD), tačiau reikėtų atsižvelgti į tai, kad bandomoji chemin ė medžiaga gali 
sukelti priešimplantacinius nuostolius. Jei dozes b ūtų pradedama duoti 6 
GD, šios rizikos b ūtų išvengiama, bet tada vystymosi etapais nuo 0 iki 6 
GD bandymas nevykt ų. Jeigu laboratorija įsigyja jau suporuotus gyv ūnus, 
dozes duoti nuo 0 GD yra ne įmanoma, taigi 6 GD b ūtų tinkama pradin ė 
diena. Bandym ų laboratorija tur ėtų nustatyti dozavimo režim ą, remdamasi 
atitinkama informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos poveik į, 
ankstesnę patirtį ir logistikos aspektus; be kit ų dalykų ji gali prat ęsti 
dozių davimą ir po nujunkymo. Jaunikli ų atsivedimo dien ą gyvūnams 
dozių reikėtų neduoti, jei jie atsived ė dar ne visus palikuonis. Dažniausiai 
daroma prielaida, kad jaunikliai bus veikiami per motinos pien ą; tačiau, kai 
neturima pakankamai įrodymų, kad jaunikliai bus veikiami nepertraukiamai, 
reikėtų svarstyti galimyb ę dozes duoti jaunikliams tiesiogiai. Nepertrau ­
kiamo veikimo įrodymų galima gauti, pvz., iš farmakokinetin ės informa ­
cijos, toksiškumo palikuonims arba biologini ų žymeklių pokyčių (28).  
STEBĖJIMAI  
Motininių patelių stebėjimas  
22. Visas motinines pateles reik ėtų bent kart ą per dien ą apžiūrėti jų sveikatos 
būklei nustatyti ir patikrinti, ar jos negaišta ir ar nenugaišo.  
23. Dozi ų davimo ir steb ėjimo laikotarpiais periodiškai (bent kart ą, kai doz ės 
duodamos gestaciniu laikotarpiu, ir dukart, kai doz ės duodamos laktaciniu 
laikotarpiu) reik ėtų atlikti išsamesnius klinikinius steb ėjimus, stebint bent po 
dešimt motinini ų patelių kiekvienu doz ės lygmeniu. Gyv ūnai turėtų būti 
stebimi ne narvelyje, kuriame yra laikomi, steb ėjimus turi atlikti parengti 
techniniai darbuotojai, nežinantys apie gyv ūnams duodamas dozes, naudo ­
dami standartizuotas proced ūras, padedan čias sumažinti stres ą gyvūnams ir 
stebėtojo šališkum ą ir kuo labiau padidinti skirting ų stebėtojų gautų rezul­
tatų patikimum ą. Jeigu įmanoma, b ūtų gerai, jei steb ėjimus per vien ą tyrimą 
atliktų tas pats techninis darbuotojas.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Pasteb ėjus požymi ų, juos reik ėtų užrašyti. Jeigu įmanoma, taip pat reik ėtų 
užrašyti stebim ų požymių stiprumą. Klinikiniai steb ėjimai tur ėtų apimti 
odos, kailio, aki ų, gleivini ų, sekrecij ų dažnį ir autonomin į aktyvum ą 
(pvz., ašarojim ą, plaukų pašiaušim ą, vyzdžių dydį, neįprastą kvėpavimą ir 
(arba) kv ėpavimą per burn ą, visus ne įprastus šlapinimosi arba tuštinimosi 
požymius), ta čiau neapsiriboti vien tuo.  
25. Taip pat tur ėtų būti pažymėta bet kokia ne įprasta reakcija, susijusi su k ūno 
padėtimi, aktyvumo lygiu (pvz., naudojimosi tipiniu plotu sumaž ėjimas arba 
padidėjimas) ir judesi ų koordinacija. Tur ėtų būti užrašomi eisenos (pvz., 
krypuojanti eisena, ataksija), laikysenos (pvz., kuprojimasis), reakcijos į 
elgesį su gyvūnu, vietą arba kitus aplinkos dirgiklius pakitimai, taip pat 
kloninių arba tonini ų judesių, traukulių arba drebulio buvimas, stereotipinis 
elgesys (pvz., besaikis valymasis, ne įprasti galvos judesiai, nuolatinis suki ­
masis ratu), keistas elgesys (pvz., kandžiojimasis arba per didelis laižy ­
masis, žalojimasis, vaikš čiojimas atbulomis, vokalizacija) arba agresija.  
26. Toksinio poveikio požymius, įskaitant j ų atsiradimo pradži ą, paros met ą, 
laipsnį ir trukm ę, reikėtų užrašyti.  
27. Gyv ūnus reikėtų sverti, kai jiems duodamos doz ės, per vis ą tyrimą: bent 
kartą per savait ę, jaunikli ų atsivedimo arba artim ą jam dien ą ir 21 PND 
(nujunkymo dien ą). Jeigu tyrime naudojamas zondas, motinin ės patelės 
turėtų būti sveriamos bent dukart per savait ę. Prireikus po kiekvieno k ūno 
masės matavimo dozes reik ėtų koreguoti. Pašaro suvartojim ą gestacijos ir 
laktacijos laikotarpiais reik ėtų matuoti bent kart ą per savait ę. Vandens 
suvartojim ą reikėtų matuoti bent kart ą per savait ę, jeigu gyv ūnas yra 
veikiamas per vanden į. 
Palikuoni ų stebėjimas  
28. Visus palikuonis reik ėtų bent kart ą per dien ą atidžiai apži ūrėti, ar nepasi ­
reiškia toksinio poveikio požymiai, ar jie negaišta ir ar nenugaišo.  
29. Dozi ų davimo ir steb ėjimo laikotarpiais reik ėtų atlikti išsamesnius pali ­
kuonių klinikinius tyrimus. Palikuonius (bent po vien ą kiekvienos lyties 
jauniklį iš vados) tur ėtų stebėti parengti techniniai darbuotojai, nežinantys 
apie gyv ūnams duodamas dozes, naudodami standartizuotas proced ūras, 
padedančias sumažinti šališkum ą ir kuo labiau padidinti skirting ų stebėtojų 
gautų rezultatų patikimum ą. Jeigu įmanoma, b ūtų gerai, jei steb ėjimus 
atliktų tas pats techninis darbuotojas. Reik ėtų stebėti bent 24 ir 25 punk ­
tuose aptartas stebimu vystymosi laikotarpiu aktualias vertinam ąsias baigtis.  
30. Visus toksinio poveikio palikuonims požymius, įskaitant j ų atsiradimo 
pradžią, paros met ą, laipsnį ir trukm ę, reikėtų užrašyti.  
Fiziniai ir vystymosi parametrai  
31. Vystymosi parametr ų iki nujunkymo poky čiai (pvz., ausies kaušelio išsily ­
ginimas, aki ų atsivėrimas, kandži ų prasikalimas) yra glaudžiai susij ę su 
kūno mase (30) (31). K ūno masė gali būti geriausias fizinio vystymosi 
rodiklis. Tod ėl atlikti vystymosi parametr ų matavimus yra rekomenduojama 
tik tada, kai turima įrodymų, kad iš ši ų vertinam ųjų baigčių bus gauta 
papildomos informacijos. Ši ų parametr ų vertinimo laikas nurodytas 1 lente ­
lėje. Pagal tai, kokio poveikio tikimasi, ir tai, kokie yra pradiniai matavimo 
rezultatai, gali b ūti tikslinga numatyti papildomus laiko momentus arba 
matavimus atlikti kitais vystymosi etapais.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Vertinant fizin į vystymąsi, rekomenduotina tyrim ą atlikti postkoitaliniu, o 
ne postnatalinio amžiaus etapu (33). Jeigu bandymai su jaunikliais atliekami 
nujunkymo dien ą, šiuos bandymus rekomenduojama atlikti iki faktinio 
nujunkymo, kad d ėl patiriamo su nujunkymu susijusio streso rezultatai 
nebūtų iškreipiami. Be to, dvi dienas po nujunkymo nereik ėtų atlikti 
jokių jauniklių bandymų, atliktinų po nujunkymo.  
1 lentelė 
Fizinių ir vystymosi parametr ų bei funkcini ų/elgsenos vertinam ųjų baigčių vertinimo 
laikas  ( a ) 
Amžiaus 
tarpsniai 
Vertinamosios baigtys  Iki nujunkymo (  b ) Paaug ę jaunikliai (  b ) Jauni suaug ę gyvūnai (  b ) 
Fiziniai ir vystymosi parametrai  
Kūno masė ir kliniki ­
niai stebėjimai  Kas savait ę ( c ) Ne re čiau kaip kas 
dvi savaites  Ne rečiau kaip kas 
dvi savaites  
Galvos smegen ų masė 22 PND (  d ) Bandymo pabaigoje  
Neuropatologija  22 PND (  d ) Bandymo pabaigoje  
Lytinis subrendimas  —  Pagal poreik į —  
Kiti vystymosi 
parametrai (  e ) Pagal poreik į —  —  
Funkcinės/elgsenos vertinamosios baigtys  
Elgsenos ontogenez ė Ne mažiau kaip du 
matavimai  
Motorinis aktyvumas 
(įskaitant įpročių 
formavim ąsi) 1–3 kartus (  f ) —  Vien ą kartą 
Motorinė ir jutimin ė 
funkcijos  — Vien ą kartą Vien ą kartą 
Mokymasis ir atmintis  —  Vien ą kartą Vien ą kartą 
( a ) Šioje lentel ėje nurodoma, kiek mažiausiai kart ų reikėtų atlikti matavimus. Pagal tai, kokio poveikio 
tikimasi, ir tai, kokie yra pradiniai matavimo rezultatai, gali b ūti tikslinga numatyti papildomus laiko 
momentus (pvz., senesni gyv ūnai) arba matavimus atlikti kitais vystymosi etapais. 
( b ) Bandym ų su jaunikliais rekomenduojama neatlikti dvi dienas po nujunkymo (žr. 32 punkt ą). Rekomen ­
duojamas bandym ų su paaugusiais jaunikliais amžius: mokymasis ir atmintis = 25 ± 2 PND; motorin ė ir 
jutiminė funkcijos = 25 ± 2 PND. Rekomenduojamas bandym ų su jaunais suaugusiais gyv ūnais amžius 
yra 60–70 PND. 
( c ) Kūno masę reikėtų matuoti bent du kartus per savait ę, kai dozės jaunikliams duodamos tiesiogiai, kad 
tuo atveju, jeigu k ūno masė sparčiai auga, dozes b ūtų galima pakoreguoti. 
( d ) Galvos smegen ų masę ir neuropatologij ą, jei reikia, galima vertinti kuriuo nors ankstesniu etapu (pvz., 
11 PND) (žr. 39 punkt ą). 
( e ) Kiti vystymosi parametrai, ne tik k ūno masė (pvz., aki ų atsivėrimas) taip pat tur ėtų būti prireikus 
užrašomi (žr. 31 punkt ą). 
( f ) Žr. 35 punkt ą. 
33. Reik ėtų suskaičiuoti gyvus jauniklius ir nustatyti j ų lytį, pvz., vizualiai 
įvertinti arba išmatuoti anogenitalin į atstumą (34) (35), kiekvien ą vados 
jauniklį reikėtų atskirai pasverti vos atsivest ą ar netrukus po atsivedimo, 
bent kartą per savait ę laktacijos laikotarpiu, o v ėliau – bent kart ą per dvi 
savaites. Vertinant lytin į subrendim ą, reikėtų nustatyti bent vieno kiekvienos 
vados patin ėlio ir vienos patel ės amžių ir kūno masę, kada susiformuoja 
makštis (35) arba atsiskiria apyvarp ė (37).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Elgsenos ontogenez ė 
34. Tiriant pasirinkt ų elgsenos rodikli ų ontogenez ę, bent po vien ą kiekvienos 
lyties jaunikl į iš vados reik ėtų vertinti atitinkamu amžiaus laikotarpiu, visas 
bandymo dienas visiems elgsenos rodikliams vertinti naudojant tuos pa čius 
jauniklius. Matavimo dienos tur ėtų būti tolygiai paskirstytos per t ą laiko­
tarpį; turėtų būti aprašomi įprasti arba su doz ės davimu susij ę tos elgsenos 
ontogenez ės pokyčiai (38). Štai keletas elgsenos rodikli ų, kurių ontogenez ę 
būtų galima vertinti, pavyzdži ų: išsitiesimo refleksas, neigiamas geotaksis 
(angl. negative geotaxis), motorinis aktyvumas (38) (39) (40).  
Motorinis aktyvumas  
35. Motorin į aktyvum ą reikėtų stebėti (41) (42) (43) (44) (45) laikotarpiu iki 
nujunkymo ir gyv ūnui suaugus. D ėl bandym ų nujunkymo laikotarpiu žr. 32 
punktą. Bandymo sesija tur ėtų trukti pakankamai ilgai, kad b ūtų galima 
matyti, jog dozi ų negaunantys kontrolin ės grupės gyvūnai priprato prie 
bandymo sesijos s ąlygų. Motorin į aktyvum ą itin rekomenduojama naudoti 
elgsenos ontogenezei vertinti. Kai jis naudojamas kaip elgsenos ontogenez ės 
kriterijus, visose bandymo iki nujunkymo sesijose reik ėtų naudoti tuos 
pačius gyvūnus. Bandymas tur ėtų būti atliekamas pakankamai dažnai, kad 
būtų galima įvertinti pripratimo prie sesijos s ąlygų ontogenez ę (44). Tam iki 
nujunkymo dienos įskaitytinai gali prireikti įvertinti tris arba daugiau laiko ­
tarpių (pvz., 13, 17, 21 PND). Bandymus su tais pa čiais arba tos pa čios 
vados gyv ūnais dar reik ėtų atlikti gyv ūnams suaugus, art ėjant tyrimo 
pabaigai (pvz., 60–70 PND). Bandymus kitomis dienomis galima atlikti 
papildomai pagal poreik į. Motoriniam aktyvumui steb ėti reikėtų naudoti 
automatizuot ą aktyvumo fiksavimo prietais ą, kuriuo b ūtų galima nustatyti 
aktyvumo did ėjimą ir mažėjimą (t. y. pradin ė prietaisu išmatuoto aktyvumo 
reikšmė neturėtų būti nei tokia maža, kad neb ūtų galima nustatyti jo suma ­ 
žėjimo, nei tokia didel ė, kad neb ūtų galima nustatyti aktyvumo padid ėjimo). 
Kiekvieną prietaisą reikėtų patikrinti pagal standartines proced ūras, siekiant, 
kiek įmanoma, užtikrinti patikim ą skirting ų prietaisų veikimą visomis 
dienomis. Prietaisus bandomosioms grup ėms reikėtų paskirstyti kuo propor ­
cingiau. Bandym ą reikėtų atlikti atskirai su kiekvienu gyv ūnu. Bandym ų 
laiką bandomosioms grup ėms reikėtų proporcingai paskirstyti, kad b ūtų 
išvengta rezultat ų iškraipymo d ėl cirkadinio aktyvumo ritmo. Reik ėtų 
stengtis užtikrinti, kad bandymo s ąlygos kuo mažiau skirt ųsi ir neb ūtų 
sistemiškai susietos su dozi ų davimu. Tarp kintam ųjų, kurie gali paveikti 
daugelį elgsenos mat ų, įskaitant motorin į aktyvum ą, yra: bandymo narvelio 
triukšmo izoliacija, dydis ir forma, temperat ūra, santykin ė drėgmė, apšvie­
timo sąlygos, kvapai, narvelio, kuriame gyv ūnas laikomas nuolat, arba 
naujo bandym ų narvelio naudojimas ir aplinkos dirgikliai.  
Motorinė ir jutimin ė funkcijos  
36. Motorin ę ir jutimin ę funkcijas reik ėtų nuodugniai ištirti bent vien ą kartą per 
paaugusio jauniklio amžiaus laikotarp į ir vieną kartą per jauno suaugusio 
gyvūno amžiaus laikotarp į (pvz., 60–70 PND). D ėl bandym ų nujunkymo 
laikotarpiu žr. 32 punkt ą. Bandym ų reikėtų atlikti pakankamai – tiek, kad 
būtų gautas reikiamas skai čius kiekybini ų jutiminio modalumo (pvz., soma ­
tosensorinio, vestibuliarinio) ir motorini ų funkcijų (pvz., jėgos, koordina ­
cijos) pavyzdži ų. Keletas motorin ės ir jutimin ės funkcijų pavyzdži ų: eksten­
zoriaus ištiesimo reakcija (46), išsitiesimo refleksas (47) (48), pripratimas 
prie garsinio dirgiklio (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54), sukeltasis poten ­
cialas (55).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Mokymosi ir atminties bandymai  
37. Asociatyvaus mokymosi ir atminties bandym ą reikėtų atlikti po nujunkymo 
(pvz., 25 ± 2 dien ą) ir tam naudoti jaunus suaugusius gyv ūnus (60 PND 
amžiaus ir vyresnius). D ėl bandym ų nujunkymo laikotarpiu žr. 32 punkt ą. 
Šiais dviem vystymosi etapais galima atlikti t ą patį arba kitą (-us) bandym ą 
(-us). Pasirenkant bandym ą (-us) nujunkyt ų ir suaugusi ų žiurkių mokymuisi 
ir atminčiai tirti, leidžiamas tam tikras lankstumas. Ta čiau bandymas (-ai) 
turėtų būti parengtas (-i) taip, kad atitikt ų du kriterijus. Pirma, mokymasis 
turėtų būti vertinamas kaip pokytis, kuris įvyksta per kelet ą kartojam ų 
bandymų arba sesij ų arba, kai bandymas yra vienas, kaip b ūsenos pokytis 
dėl neasociatyvaus mokymosi patirties poveikio. Antra, per bandym ą (-us) 
reikėtų tirti ne tik pradin į mokymąsi (įgūdžių įgijimą), bet ir tam tikr ą 
atminties mat ą (trumpalaik ę arba ilgalaik ę atmintį), tačiau šio atminties 
mato negalima aprašyti tol, kol per t ą patį bandymą nebus įvertintas įgūdžių 
įgijimas. Jeigu mokymosi ir atminties bandymas (-ai) atskleidžia bandomo ­
sios chemin ės medžiagos poveik į, galima apsvarstyti galimyb ę atlikti papil ­
domą (-us) bandym ą (-us), kad remiantis jutimini ų, motyvacijos ir (arba) 
motorinių gebėjimų pokyčiais būtų galima atmesti alternatyvius aiškinimus. 
Mokymosi ir atminties bandym ų metodą, be pamin ėtų dviejų kriterijų, dar 
rekomenduojama pasirinkti pagal jo jautrum ą tiriamosios chemin ės 
medžiagos klas ės medžiagoms, jeigu literat ūroje esama tokios informacijos. 
Jeigu tokios informacijos n ėra, tai bandymai, kuriuos b ūtų galima atlikti 
laikantis nurodyt ųjų kriterijų, pavyzdžiui, yra šie: pasyvaus vengimo 
(angl.  passive avoidance ) (43) (56) (57), geb ėjimo prisiminti tam tikr ą 
padėtį po pertraukos (angl.  delayed-matching-to-position ), kai tiriamos suau ­
gusios žiurk ės (58) ir žiurki ų jaunikliai (59), poveikio per uosl ę (angl.  
olfactory conditioning ) (43) (60), Morris vandens labirinto (angl.  Morris 
water maze ) (61) (62) (63), Biel arba Sinsina čio labirinto (angl.  Biel or 
Cincinnati maze ) (64) (65), radialini ų atšakų labirinto (angl.  radial arm 
maze ) (66), T labirinto (angl.  T-maze ) (43), nuo režimo priklausan čios 
elgsenos susiformavimo ir išlikimo (angl.  acquisition and retention of 
schedule-controlled behaviour ) (26) (67) (68). Literat ūroje aptariami ir 
kiti bandymai, skirti nujunkytoms (26) (27) ir suaugusioms žiurk ėms (19) 
(20).  
Nekroskopija  
38. Po palikuoni ų nujunkymo galima atlikti motinini ų gyvūnų eutanazij ą. 
39. Neuropatologinis palikuoni ų vertinimas bus atliekamas naudojant 22 PND 
arba anks čiau, 11–22 PND, ir tyrimo pabaigoje humaniškai numarint ų 
gyvūnų audinius. Tiriant 22 PND numarintus palikuonis, reik ėtų vertinti 
jų galvos smegen ų audinius; tiriant tyrimo pabaigoje numarintus gyv ūnus 
– ir centrin ės nervų sistemos (CNS), ir periferin ės nervų sistemos (PNS) 
audinius. 22 PND arba anks čiau numarinti gyv ūnai gali b ūti fiksuojami 
panardinant į fiksatyvą arba perfuzin ės fiksacijos b ūdu. Tyrimo pabaigoje 
numarinti gyv ūnai turėtų būti fiksuojami perfuzin ės fiksacijos b ūdu. Visi 
audinių mėginių paruošimo aspektai nuo gyv ūnų perfuzijos iki audini ų 
mėginių išpjovimo, audini ų paruošimo ir objektini ų stiklelių dažymo tur ėtų 
būti tarpusavyje taip suderinti, kad kiekvienoje partijoje b ūtų reprezenta ­
tyvių mėginių iš kiekvienos doz ės grupės. Išsamesn ės neuropatologini ų 
tyrimų gairės išdėstytos EBPO Rekomendaciniame dokumente Nr. 20 (9), 
taip pat žr. (103).  
Audinių mėginių paruošimas  
40. Visas pagrindines per nekroskopij ą pastebėtas anomalijas reik ėtų registruoti. 
Paimti audini ų mėginiai tur ėtų atspindėti visas pagrindines nerv ų sistemos 
sritis. Audini ų mėginius reik ėtų laikyti tinkamame fiksatyve ir tirti pagal 
standartizuotus paskelbtus histologini ų tyrimų protokolus (69) (70) (71) 
(103). CNS ir PNS audinius galima įterpti į parafiną, tačiau kai reikalinga  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
didesnė rezoliucija (pvz., tiriant periferinius nervus, kai įtariama periferin ė 
neuropatija ir (arba) kai atliekama morfometrin ė periferini ų nervų analizė), 
po fiksavimo gali b ūti tikslinga naudoti osm į ir įterpti į epoksidin ę dervą. 
Morfometrinei analizei atlikti visais doz ės lygmenimis paimti galvos 
smegenų audiniai tur ėtų būti įterpti į tinkamą terpę tuo pačiu metu, siekiant 
išvengti artefakt ų susitraukimo d ėl pernelyg ilgo laikymo fiksatyve (6).  
Neuropatologinis tyrimas  
41. Šio kokybinio tyrimo paskirtis:  
i) nustatyti nerv ų sistemos sritis, kuriose yra neuropatologini ų pokyčių 
požymių; 
ii) nustatyti neuropatologini ų pokyčių, kurie atsirado d ėl veikimo bando ­
mąja chemine medžiaga, pob ūdį; ir 
iii) nustatyti neuropatologini ų pokyčių sunkumo interval ą. 
Reprezentatyvius histologiniam tyrimui skirtus audini ų mėginių mikroskopu 
turėtų ištirti tinkamai parengtas patologas, kuris nustatyt ų, ar esama neuro ­
patologini ų pokyčių požymių. Visus neuropatologinius poky čius reikėtų 
įvertinti subjektyviu balu, žymin čiu pokyčio dydį. 22 PND arba anks čiau 
humaniškai numarint ų gyvūnų galvos smegen ų dalims įvertinti gali pakakti 
hematoksilino ir eozino daž ų. Tačiau tyrimo pabaigoje numarint ų gyvūnų 
CNS ir PNS audini ų dalims tirti rekomenduojama naudoti mielino dažus 
(pvz.,  luxol fast blue/cresyl violet ) ir sidabravimo dažus (pvz.,  Bielschowsky  
arba Bodian ). Remiantis profesionalia patologo nuomone ir pagal tai, kokio 
pobūdžio pakitim ų pastebėta, galima apsvarstyti galimyb ę naudoti kitus 
dažus, skirtus konkretiems pakitimams nustatyti ir apib ūdinti (pvz., glialinio 
fibrilinės rūgšties baltymo (GFAP) arba lektino histochemin į dažymą glia­
liniams ir mikroglialiniams poky čiams įvertinti (72),  Fluoro-Jade  dažus 
nekrozei nustatyti (73) (74) arba sidabravimo dažus, skirtus neuron ų dege­
neracijai nustatyti (75)).  
42. Reik ėtų atlikti morfometrin į (kiekybin į) vertinim ą, nes jo duomenys gali 
padėti nustatyti su doz ės davimu susijus į poveikį ir yra vertingi aiškinant 
su dozės davimu susijusius galvos smegen ų masės arba morfologijos skir ­
tumus (76) (77). Kad b ūtų galima atlikti morfometrin į vertinim ą, reikėtų 
paimti ir paruošti nerv ų audinio m ėginį. Morfometrin į vertinim ą gali suda ­
ryti, pvz., konkre čių smegenų sričių tiesiniai arba zoniniai matavimai (78). 
Tiesiniams arba zoniniams matavimams atlikti reikia naudoti homologiškus 
kruopščiai pagal patikimus mikroskopinius parametrus pasirinktus pj ūvius 
(6). Stereologij ą galima naudoti, kai norima nustatyti su doz ės davimu 
susijusį poveikį tokiems parametrams kaip konkre čių neuroanatomini ų 
sričių dydis ar l ąstelių skaičius (79) (80) (81) (82) (83) (84).  
43. Smegenis reik ėtų ištirti, ar n ėra su doz ės davimu susijusi ų neuropatologini ų 
pokyčių; norint užtikrinti, kad tyrimas b ūtų nuodugnus, iš vis ų svarbiausi ų 
smegenų sričių (pvz., uosl ės svogūnėlių, smegenų žievės, hipokampo, baza ­
linių ganglijų, gumburo, pogumburio, vidurini ų smegen ų (keturkalnio, 
smegenų dangčio ir smegen ų kojyčių), tilto, pailg ųjų smegenų, smegenėlių) 
reikėtų paimti pakankamai m ėginių. Svarbu, kad tiriant visus gyv ūnus būtų 
imami tos pa čios plokštumos pj ūviai. Iš tyrimo pabaigoje humaniškai numa ­
rintų gyvūnų reikėtų paimti reprezentatyvius nugaros smegen ų ir PNS 
pavyzdžius. Tarp tiriam ų sričių turėtų būti akis su regos nervu ir tinklaine, 
nugaros smegenys kaklo ir juosmens sustor ėjimų vietose, užpakalin ės ir 
priekinės nugaros smegen ų šaknelės pluoštai, proksimalinis s ėdmens nervas, 
proksimalinis blauzdikaulio nervas (prie kelio) ir blauzdikaulio nervo šakos 
į blauzdos raumen į. Nugaros smegen ų ir periferin ės nervų sistemos pj ūviai 
turėtų būti ir kryžminiai arba skersiniai, ir išilginiai.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Atliekant neuropatologin į vertinim ą reikėtų tirti ne tik l ąstelių pokyčius 
(pvz., neuron ų vakuolizacij ą, degeneracij ą, nekrozę) ir audini ų pokyčius 
(pvz., glioz ę, leukocitin ę infiltracij ą, cistų susiformavim ą), bet ir tai, ar 
nėra nervų sistemos vystymosi pažeidim ų požymių (6) (85) (86) (87) (88) 
(89). Šiuo poži ūriu svarbu, kad su doz ės davimu susij ęs poveikis b ūtų 
atskirtas nuo normalaus vystymosi požymi ų, kurie atsiranda numarinimo 
laiką atitinkan čiame vystymosi etape (90). Reikšming ų pokyčių, rodančių 
vystymosi sutrikimus, pavyzdžiai (s ąrašas nėra baigtinis):  
— uoslės svogūnėlių, didžiųjų galvos smegen ų arba smegen ėlių bendro 
dydžio arba formos poky čiai; 
— įvairių galvos smegen ų sričių (pvz., smegen ėlių išorinio užuomazginio 
sluoksnio, didžiosios smegen ų jungties) santykinio dydžio poky čiai, 
įskaitant j ų sumažėjimą arba padid ėjimą dėl ląstelių populiacij ų, kurios 
paprastai b ūna kintan čios, mažėjimo ir ilgesnio nei įprastai gyvavimo, 
taip pat d ėl aksonų projekcij ų; 
— proliferacijos, migracijos ir diferenciacijos poky čiai, kuriuos atspindi 
pernelyg didel ės apoptoz ės arba nekroz ės plotai, ektopini ų, sutrikdytos 
orientacijos arba pakitusios sandaros neuron ų populiacij ų grupės arba 
išsklaidytos populiacijos, santykinio įvairių žievės sluoksni ų struktūrų 
dydžio poky čiai; 
— mielino kaupimosi poky čiai, įskaitant bendr ą struktūrų, kuriose kaupiasi 
mielinas, dydžio sumaž ėjimą arba poky čius; 
— hidrocefalijos požymiai, ypa č skilvelių padidėjimas, smegen ų vanden­
tiekio stenoz ė ir smegen ų pusrutuli ų suplonėjimas.  
Dozės ir atsako tarpusavio ryšys neuropatologini ų pokyčių atveju  
45. Kokybinei ir kiekybinei neuropatologinei analizei atlikti rekomenduojama 
taikyti toliau aptart ą nuoseklųjį metodą. Iš pradži ų lyginami didel ės dozės ir 
kontrolinės grupės gyvūnų audinių dalys. Jeigu didel ės dozės grupės gyvū­
nams neuropatologini ų pakitimų nenustatoma, toliau analizuoti nereikia. 
Jeigu didel ės dozės gyvūnų grupėje nustatomi neuropatologiniai poky čiai, 
tada tiriami vidutin ės ir mažos doz ės grupių gyvūnai. Jeigu didel ės dozės 
grupė nebetiriama d ėl nugaišimo arba kito rezultatus iškreipian čio toksiš­
kumo, reik ėtų tirti, ar neuropatologini ų pokyčių nėra didelės ir vidutin ės 
dozės grupėse. Jeigu mažesni ų dozių grupėse pastebima toksinio poveikio 
nervų sistemai požymi ų, atliekama ši ų grupių gyvūnų neuropatologin ė 
analizė. Jeigu atliekant kokybinius arba kiekybinius tyrimus yra nustatomi 
su dozės davimu susij ę neuropatologiniai poky čiai, reikėtų, remiantis vis ų 
dozių grupių gyvūnų vertinimu, nustatyti pažeidim ų arba morfometrini ų 
pokyčių pasireiškimo, dažnumo ir laipsnio priklausomyb ę nuo doz ės. Per 
šį vertinim ą reikėtų vertinti visas galvos smegen ų sritis, kuriose pasteb ėta 
neuropatologini ų pokyčių požymių. Apibūdinant kiekvieno pob ūdžio pažei ­
dimą reikėtų apibrėžti kriterijus, pagal kuriuos yra nustatomas kiekvienas 
pažeidimo laipsnis, ir nurodyti požymius, pagal kuriuos kiekvienas laipsnis yra atskiriamas. Kiekvieno pob ūdžio pažeidimo dažnum ą ir sunkumo laipsn į 
reikėtų
 užrašyti, paskui atlikti statistin ę analizę ir įvertinti doz ės ir atsako 
tarpusavio ryšio pob ūdį. Rekomenduojama naudoti koduotus objektinius 
stiklelius (91).  
DUOMENYS IR ATASKAITA  
Duomenys  
46. Duomenys pateikiami atskirai ir apibendrinami lentel ėse, nurodant kiek ­
vienos bandymo grup ės pakitim ų pobūdį, motinini ų patelių skaičių, pali­
kuonių skaičių pagal lytis ir vadas, kuriose atsirado kiekvienos r ūšies paki­
timų. Jeigu palikuonys buvo tiesiogiai veikiami postnataliniu laikotarpiu, 
reikėtų nurodyti veikimo b ūdą, trukmę ir laikotarp į. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Rezultatų įvertinimas ir aiškinimas  
47. Neurotoksiškumo vystymuisi tyrimas suteiks informacijos apie kartotinio 
sąlyčio su chemine medžiaga poveik į in utero  ir ankstyvuoju postnatalinio 
vystymosi laikotarpiu. Kadangi akcentuojamos ir bendrojo toksiškumo, ir toksiškumo vystymuisi vertinamosios baigtys, tyrimo rezultatai leis atskirti poveikį nervų sistemos vystymuisi, kai n ėra bendrojo motinin ės patelės 
toksiškumo, ir poveik į, kuris sukeliamas tik esant koncentracijai, kuri 
toksiška ir motininiam gyv ūnui (27). Kadangi tyrimo strukt ūra, statistin ė 
analizė ir biologinis duomen ų reikšmingumas yra susij ę sudėtingais ryšiais, 
norint tinkamai interpretuoti neurotoksiškumo vystymuisi duomenis, reik ės 
remtis ekspert ų vertinimu (107) (109). Bandymo rezultatams aiškinti reik ėtų 
taikyti įrodomosios vert ės analizę (20) (92) (93) (94). Reik ėtų aptarti 
elgsenos arba morfologini ų duomenų, jei toki ų gauta, modelius, taip pat 
duomenis apie doz ės ir atsako ryš į. Į šį apibūdinimą reikėtų įtraukti 
duomenis vis ų tų tyrimų, kurie b ūtų svarbūs vertinant neurotoksiškum ą
 
vystymuisi, įskaitant žmoni ų epidemiologinius tyrimus arba konkre čių 
atvejų ataskaitas, tyrimus su bandomaisiais gyv ūnais (pvz., toksikokineti ­
nius duomenis, informacij ą apie strukt ūrą ir aktyvum ą, kitų toksiškumo 
tyrimų duomenis). Taip pat reik ėtų įtraukti duomenis apie bandomosios 
cheminės medžiagos doz ės ir neurotoksiškumo kiekvienos lyties gyv ūnams 
tarpusavio ryšio buvim ą arba nebuvim ą, dažnum ą ir mastą (20) (95).  
48. Vertinant duomenis reik ėtų aptarti ir biologin į, ir statistin į reikšmingum ą. Į 
statistinę analizę reikėtų žvelgti kaip į priemon ę, kuri duomenis padeda 
aiškinti, o ne nulemia j ų aiškinim ą. Tai, kad statistinio reikšmingumo nepa ­
kanka, negali b ūti vienintelis kriterijus padaryti išvadai, kad su dozi ų 
davimu susijusio poveikio n ėra, kaip ir statistinio reikšmingumo buvimas 
neturėtų būti vienintelis kriterijus padaryti išvadai, kad su dozi ų davimu 
susijusio poveikio esama. Siekiant išvengti galim ų klaiding ų neigiam ų 
išvadų ir sunkum ų, kurių kyla, kai reikia įrodyti nesam ą dalyką, reikėtų 
aptarti turimus teigiamus ir ankstesnius kontrolinius duomenis, ypa č tais 
atvejais, kai su dozi ų davimu susijusio poveikio n ėra (102) (106). Klaiding ų 
teigiamų duomenų tikimybę reikėtų aptarti atsižvelgiant į bendrą statistinį 
duomenų įvertinimą (96). Be kit ų dalykų, taip pat reik ėtų įvertinti neuro ­
patologini ų ir elgsenos pakitim ų tarpusavio ryš į, jei jis pasteb ėtas. 
49. Visus rezultatus reik ėtų analizuoti naudojant pagal bandymo strukt ūrą 
tinkamus statistinius modelius (108). Parametrin ės arba neparametrin ės 
analizės metodus reik ėtų rinktis atsižvelgiant į tokius veiksnius kaip 
duomenų pobūdis (transformuoti ar ne), j ų pasiskirstymas, santykinis pasi ­
rinktos statistin ės analizės patikimumas. Statistin ę analizę reikėtų pasirinkti 
pagal tyrimo tiksl ą ir strukt ūrą, siekiant minimizuoti I tipo (klaidingi 
teigiami rezultatai) ir II tipo (klaidingi neigiami rezultatai) klaid ų kiekį 
(96) (97) (104) (105). Kai vystymosi tyrimams yra naudojamos po kelet ą 
palikuoni ų vienu metu atsivedan čių gyvūnų rūšys ir tiriama po kelet ą vienos 
vados jaunikli ų, į statistinį modelį reikėtų įtraukti ir vad ą ir taip apsisaugoti 
nuo pernelyg dideli ų I tipo klaid ų (98) (99) (100) (101). Statistinis mato 
vienetas tur ėtų būti vada, ne jauniklis. Bandymus reik ėtų suplanuoti taip, 
kad tos pa čios vados gyv ūnai nebūtų laikomi nepriklausomais steb ėjimo 
objektais. Visos pakartotinai vertinamos to paties subjekto vertinamosios baigtys tur ėtų būti analizuojamos taikant tokius statistinius modelius, 
kuriuose atsižvelgiama į tai, kad šie matai n ėra savarankiški.
 
Bandymo ataskaita  
50. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti pateikta ši informacija:  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir, jei reikia, fizikin ės ir chemin ės savybės; 
— tapatumo duomenys, įskaitant šaltin į; ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— preparato grynumas ir žinomos ir (arba) numanomos priemaišos.  
Nešiklis (jei naudojamas):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei tai ne vanduo ir ne fiziologinis 
tirpalas.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudojamos r ūšys ir veisl ės ir pagrindimas, jei pasirinktos ne žiurk ės; 
— bandom ųjų gyvūnų tiekėjas; 
— gyvūnų skaičius, amžius bandymo pradžioje ir lytis;  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras, vanduo ir t. t.;  
— kiekvieno gyv ūno masė bandymo pradžioje.  
Bandymo s ąlygos:  
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi doz ės dydžio pasirinkim ą; 
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi doz ės davimo b ūdo ir laikotarpio pasi ­
rinkimą; 
— duodamos doz ės specifikacija, įskaitant išsami ą informacij ą apie nešikl į, 
duodamos medžiagos t ūrį ir fizikin į pavidalą; 
— duomenys apie bandomosios chemin ės medžiagos preparato ruošim ą ir 
(arba) jos d ėjimą į pašarą, gautą preparato koncentracij ą, stabilum ą ir 
vienalytiškum ą; 
— metodas, taikytas motinin ėms patel ėms ir jaunikliams paženklinti 
unikalia žyma;  
— atsitiktin ės atrankos, taikytos motinin ėms patelėms suskirstyti į dozes 
gaunančias grupes, jaunikliams brokuoti ir suskirstyti į bandymo grupes, 
išsamus aprašas;  
— informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos davimo b ūdą; 
— bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos pašaruose, geriama ­
jame vandenyje arba įkvepiamos bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracijos (ppm) perskai čiavimas į tikrąją dozę (mg/kg k ūno 
masės per parą), jei reikia;  
— aplinkos s ąlygos;  
— duomenys apie pašaro ir vandens (pvz., vandentiekio, distiliuotas) 
kokybę; 
— tyrimo pradžios ir pabaigos datos.  
Stebėjimo ir bandymo proced ūros: 
— išsamus steb ėjimų ir proced ūrų standartizavimo aprašas ir naudotos 
apibrėžtys stebėjimų rezultatams įvertinti balais;  
— taikyt ų bandymo proced ūrų sąrašas ir jų taikymo pagrindimas;  
— duomenys apie taikytas elgsenos/funkcini ų, patologini ų, neurochemini ų 
arba elektropsichologini ų bandymų procedūras, taip pat informacija ir 
išsamūs duomenys apie automatizuotus prietaisus;  
— prietais ų kalibravimo proced ūros ir proced ūros, skirtos užtikrinti, kad 
prietaisų parodymai b ūtų lygiaverčiai ir kad bandymai su dozes gaunan ­ 
čiomis grup ėmis būtų atliekami proporcingai;  
— glaustas pagrindimas paaiškinant sprendimus, kuriuos priimant remtasi 
profesionaliu vertinimu.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Rezultatai (pavieniai ir suvestiniai, jei reikia, nurodant vidurk į ir disper ­
siją): 
— gyvūnų skaičius tyrimo pradžioje ir tyrimo pabaigoje;  
— gyvūnų ir vadų skaičius, naudotas bandymui pagal kiekvien ą metodą; 
— kiekvieno gyv ūno ir vados, iš kurios jis kil ęs, identifikavimo numeris;  
— vados dydis ir vidutin ė atsivestų jauniklių masė pagal lyt į; 
— kūno masė ir duomenys apie k ūno masės pokyčius, įskaitant motinini ų 
patelių ir jaunikli ų kūno masę numarinimo etapu;  
— duomenys apie pašaro ir vandens, jei reikia (pvz., jeigu bandomoji 
cheminė medžiaga yra duodama su vandeniu), suvartojim ą; 
— duomenys apie toksin į atsaką pagal lyt į ir dozės dydį, taip pat apie 
toksiškumo požymius arba nugaišusius gyv ūnus, įskaitant, jei reikia, 
nugaišimo laik ą ir priežast į; 
— išsami ų pastebėtų klinikinių požymių tipas, sunkumas, trukm ė, pradžios 
data, paros laikas, tolesn ė eiga;  
— kiekvieno vystymosi parametro (mas ės, lytinio subrendimo ir elgsenos 
ontogenez ės) balas kiekvienu steb ėjimo momentu;  
— išsamus nustatyt ų elgsenos, funkcini ų, neuropatologini ų, neurochemini ų, 
elektropsichologini ų požymių aprašas pagal lyt į, įskaitant padid ėjimą ir 
sumažėjimą dėl kontrolės; 
— nekroskopijos duomenys;  
— smegen ų masė; 
— visos diagnoz ės pagal neurologinius požymius ir pažeidimus, įskaitant 
natūraliai atsirandan čias ligas arba b ūsenas;  
— požymi ų pavyzdži ų nuotraukos;  
— mažo padidinimo mikroskopin ės nuotraukos morfometrijai naudot ų 
pjūvių homologijai įvertinti;  
— absorbcijos ir metabolizmo duomenys, taip pat papildomi duomenys iš 
atskirų toksikokinetini ų tyrimų, jei turimi;  
— statistinis rezultat ų apdorojimas, įskaitant duomenims ir rezultatams, 
nepaisant to, ar jie buvo reikšmingi, ar ne, analizuoti taikytus statistinius 
modelius;  
— tyrimo grup ės narių sąrašas, įskaitant profesin į parengim ą. 
Rezultatų aptarimas:  
— informacija apie doz ės ir atsako santyk į pagal lyt į ir grupę; 
— tai, kiek visas kitas toksinis poveikis tur ėjo įtakos išvadai d ėl bandomo ­
sios chemin ės medžiagos galimo neurotoksiškumo, pagal lyt į ir grupę; 
— tai, kiek toksikokinetiniai duomenys tur ėjo įtakos išvadai;  
— panašumas į kitų žinomų neurotoksišk ų medžiag ų poveikį; ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— duomenys, kuriais pagrindžiamas bandym ų metodo patikimumas ir 
jautrumas (t. y. teigiami ir ankstesni kontroliniai duomenys);  
— neuropatologinio ir funkcinio poveikio ryšys, jei yra;  
— NOAEL arba etalonin ė dozė motininėms patelėms ir jaunikliams pagal 
lytį ir grupę. 
Išvados:  
— bendras duomen ų aiškinimas remiantis rezultatais, įskaitant išvad ą, ar 
bandomoji chemin ė medžiaga suk ėlė neurotoksin į poveikį vystymuisi, ir 
NOAEL.  
LITERAT ŪROS ŠALTINIAI  
(1) OECD (1995). Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13–14 June 1995.
 
(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98–239. Paskelbta: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_ ­
Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].
 
(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Paskelbta: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordis ­
play.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].  
(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79–91.
 
(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., 
Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and 
pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101–111.
 
(6) Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., 
Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatho ­
logy. Environ. Health Perspect., 109:93–100.  
(7) OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 
23–25 October 2000.  
(8) OECD (2008). OECD Environment, Health and SAFEty Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Paris. July 2008. Paskelbta: [http://search.oecd.org/officialdocuments/ 
displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].
 
(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and SAFEty Publications 
Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neuro ­
toxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Paskelbta: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_ 34377_1916054_1_1_ 1_1,00.html].
 
(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantita ­
tive comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173–292.
 
(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000)  Experimental and 
Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition,  ISBN 0195084772, Oxford Univer ­
sity Press, New York.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188–197.  
(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998)  Handbook of Developmental Neuroto ­
xicology , 1 st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, New York.  
(14) Šio priedo B.34 skyrius „Toksiškumo vienos kartos dauginimuisi 
bandymas“.  
(15) Šio priedo B.35 skyrius „Toksiškumo dviej ų kartų dauginimuisi 
bandymas“.  
(16) Šio priedo B.43 skyrius „Neurotoksiškumo graužikams bandymas“.  
(17) Šio priedo B.31 skyrius „Toksiškumo prenataliniam vystymuisi 
bandymas“.  
(18) 2010 m. rugs ėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 
2010/63/ES d ėl mokslo tikslais naudojam ų gyvūnų apsaugos. OL L 276, 
2010 10 20, p. 33.  
(19) WHO (1986)  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals , (Environmental Health Criteria 
60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, 
USA. Paskelbta: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].  
(20) WHO (2001)  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles 
and Approaches,  (Environmental Health Criteria 223), World Health Orga ­
nization Publications, Geneva. Paskelbta: [http://www.intox.org/databank/ ­
documents/supplem/supp/ehc223.htm].  
(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995)  Neurotoxicology: Approaches and 
Methods , 1 st Edition , ISBN 012168055X, Academic Press, New York.  
(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:499–509.  
(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent 
litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2–6.  
(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. 
Animal Sci., 27:110–112.  
(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a 
primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118–136.
 
(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979)  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987)  
Perinatal Development: A Psychobiological Perspective.  Academic 
Press, Orlando.  
(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003)  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research . ILSI Press, 
Washington, DC.  
(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI 
expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87–94.  
(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1–4.  
(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to 
Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceu ­
ticals for Human Use.
 
(32) Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433–439.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal 
age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter 
gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449–457.
 
(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital 
distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383–390.
 
(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but 
not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350–365.
 
(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579–586.
 
(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separa ­
tion as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298–303.
 
(38) Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489–95.  
(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896–920.  
(40) Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In:  Handbook of 
Behavioral Teratology.  Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, 
New York, pp. 67–100.  
(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53–66.  
(42) Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity,  Handbook of Psychopharmacology , 
Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) ‘Plenum Press’, 
New York, pp. 37–82.  
(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neuroto ­
xicity following neonatal exposure to 3,3 ′-iminodipropionitrile in the rat. 
Neurotoxicol. Teratol., 15:117–129.  
(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor 
activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247–260.  
(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of 
motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assess ­
ments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599–609.  
(46) Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) 
Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neuroto ­
xicol. Teratol., 19:1997. 405–411.  
(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Phy ­
siol. Behav., 64:661–669.  
(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 40:589–591.  
(49) Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In:  Neural Mechanisms 
of Startle Behavior , Eaton, R.C. (ed), ‘Plenum Press’, New York, pp. 
287–351.  
(50) Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 
59:107–128.  
(51) Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction. In  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , Tilson, 
H., Mitchell, C. (eds). ‘Raven Press’, New York, pp. 181–211.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:199–211.  
(53) Crofton, K.M., Lassiter, T.L., Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototo ­
xicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25–30.
 
(54) Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure.  Neurobehav. Toxicol. Teratol. , 
6:437–445.  
(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes. In:  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), ‘Raven Press’, New 
York. pp. 125–145.  
(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3 ′-iminopropionitrile. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 105:321–332.  
(57) Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247–296.
 
(58) Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 
10:237–244.  
(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98–105.  
(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 
17:465–479.  
(61) Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47–60.  
(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water 
maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29–69.  
(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze 
in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60–90.  
(64) Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance 
in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235–241.
 
(65) Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387–399.  
(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and 
Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced micro ­
cephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327–332.  
(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity 
of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 
71:342–352.  
(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding.  J. Gerontol.,  36:338–341.  
(69) Fix, A.S., Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A 
technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 
122–131.  
(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994)  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, 
Washington, DC, pp. 84–107.  
(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002)  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5 th edition, ‘Churchill Livingstone’, London.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evalua ­
tion of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and 
microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291–304.
 
(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer 
for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123–130.  
(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) 
Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 
53:365–372.  
(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) 
Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545–561.
 
(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., 
Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. 
Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745–755.
 
(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in 
rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for 
developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417–432.
 
(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav . Toxicol. , 
1:129–135.  
(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998)  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, New 
York.  
(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A prac ­
tical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305–310.
 
(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262–268.  
(82) Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology. J. Neurocytol., 26:707–710.  
(83) West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of 
neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51–61.
 
(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. 
Neuroscience, 130: 813–831.  
(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of 
growth deficiency in rats exposed  in utero  to undernutrition, ethanol, or 
the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113–121.
 
(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/is ­
chemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 
84:294–298.  
(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental 
neurotoxicology. In:  Handbook of Developmental Neurotoxicology , 
Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3–41.  
(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade 
of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing 
brain. „Science“, 283:70–74.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. ‘Science’, 287:1056–1060.
 
(90) Friede, R. L. (1989)  Developmental Neuropathology . Second edition. 
‘Springer-Verlag’, Berlin.  
(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127–133.
 
(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure 
standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401–405.  
(93) US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA 
NCEA-F-0644A.  
(94) US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274–56322.  
(95) Danish Environmental Protection Agency (1995)  Neurotoxicology.  Review 
of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Lade ­
foged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxico ­
logy, 5:113–126.  
(97) Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 
8:21–27.  
(98) Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329–335.  
(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in 
teratology studies. Teratology, 12:165–172.  
(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 
14: 221–228.  
(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587–90.
 
(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345–352.
 
(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an  ad hoc  
working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A 'best practices' approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing – for today. Toxicol. Pathol. 
34:296–313.
 
(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205–210.
 
(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295–301.
 
(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):266–287.
 
(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints.  Neurotoxicology 
and Teratology, 30(4):288–325 .
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints.  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):326–348.
 
(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4):349–381.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
1 pvz.  
Bendra funkcini ų ir (arba) elgsenos bandym ų, neuropatologinio vertinimo ir galvos smegen ų 
masės tyrimo schema. Ši diagrama parengta pagal 13–15 punktuose pateikt ą aprašą (PND = 
postnatalin ė diena). Gyv ūnų suskirstymo pavyzdžiai pateikti 1 pried ėlyje.
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
1 priedėlis 
1. Galimo suskirstymo pavyzdžiai aptarti ir išd ėstyti lentel ėje toliau. Šie 
pavyzdžiai pateikti norint parodyti, kad tiriamuosius gyv ūnus pagal įvairias 
bandymų paradigmas galima suskirstyti įvairiais b ūdais. 
1 pavyzdys  
2. Elgsenos ontogenez ės bandymams iki nujunkymo naudojama viena grup ė, 
kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jaunikli ų (po 1 patin ą ir 1 patel ę iš 
vados) vienam doz ės lygmeniui. Iš ši ų gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir 
dozės lygmens jaunikli ų (t. y. po 1 patin ėlį arba 1 patel ę iš vados) yra 
humaniškai numarinami 22 PND. Galvos smegenys išimamos, pasveriamos 
ir parengiamos histopatologiniam vertinimui. Galvos smegen ų masės 
duomenys taip pat yra renkami naudojant likusi ų to paties doz ės lygmens 
10 patinėlių ir 10 pateli ų nefiksuotas galvos smegenis.  
3. Kita grup ė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jaunikli ų (po 1 patin ėlį ir 1 
patelę iš vados) vienam doz ės lygmeniui, yra naudojama funkciniams ir 
(arba) elgsenos bandymams po nujunkymo (atliekami išsam ūs klinikiniai 
stebėjimai, vertinamas motorinis aktyvumas, paaugusi ų jauniklių reakcija į 
garsinius dirgiklius ir atliekamas kognityvin ės funkcijos bandymas). Iš ši ų 
gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir doz ės lygmens jaunikli ų (t. y. po 1 
patinėlį arba 1 patel ę iš vados) tyrimo pabaigoje (apie 70 PND) duodama 
anestetiko, jie fiksuojami perfuzijos b ūdu. Po papildomo fiksavimo  in situ  
galvos smegenys išimamos ir parengiamos neuropatologiniam vertinimui.  
4. Jaun ų suaugusi ų gyvūnų (pvz., 60–70 PND amžiaus) kognityvin ės funkcijos 
bandymams naudojama tre čia grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties 
jauniklių (t. y. po 1 patin ėlį ir 1 patel ę iš vados) vienam doz ės lygmeniui. Iš 
šių gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir doz ės lygmens gyv ūnų (t. y. po 1 
patinėlį arba 1 patel ę iš vados) tyrimo pabaigoje humaniškai numarinami, j ų 
galvos smegenys išimamos ir pasveriamos.  
5. 20 likusi ų kiekvienos lyties iš grup ės gyvūnų yra paliekami galimiems 
papildomiems bandymams atlikti.  
1 lentelė 
Jauniklio nr. (  a ) Bandymui paskirt ų 
jauniklių skaičius Tyrimas/Bandymas  
V M  
1 5  20 V + 20 M  Elgsenos ontogenez ė 
10 V + 10 M  22 PND galvos smegen ų masė/ 
neuropatologin ė morfometrija  
10 V + 10 M  22 PND galvos smegen ų masė 
2 6  20 V + 20 M  Išsam ūs klinikiniai steb ėjimai  
20 V + 20 M  Motorinis aktyvumas  
20 V+ 20 M  Lytinis subrendimas  
20 V + 20 M  Motorin ė ir jutimin ė funkcijos  
20 V + 20 M  Mokymasis ir atmintis (25 
PND)  
10 V + 10 M  Jaun ų suaugusi ų gyvūnų galvos 
smegenų masė/neuropatologin ė 
morfometrija ~ 70 PND  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Jauniklio nr. (  a ) 
Bandymui paskirt ų 
jauniklių skaičius Tyrimas/Bandymas  
V M  
3 7  20 V + 20 M  Mokymasis ir atmintis (jauni 
suaugę gyvūnai) 
10 V + 10 M  Jaun ų suaugusi ų gyvūnų galvos 
smegenų masė ~ 70 PND  
4 8  —  Rezerviniai gyv ūnai kitiems 
gyvūnams pakeisti arba papildo ­
miems bandymams atlikti  
( a ) Šiame pavyzdyje vados yra išbrokuotos, kad likt ų po 4 patin ėlius ir 4 pateles; 
patinėliai žymimi numeriais nuo 1 iki 4, patel ės – nuo 5 iki 8.  
2 pavyzdys  
6. Elgsenos ontogenez ės bandymams iki nujunkymo naudojama viena grup ė, 
kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jaunikli ų (po 1 patin ėlį ir 1 patel ę iš 
vados) vienam doz ės lygmeniui. Iš ši ų gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir 
dozės lygmens jaunikli ų (t. y. po 1 patin ėlį arba 1 patel ę iš vados) yra 
humaniškai numarinami 11- ą PND. Galvos smegenys išimamos, pasve ­
riamos ir parengiamos histopatologiniam vertinimui.  
7. Kita grup ė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jaunikli ų (po 1 patin ėlį ir 1 
patelę iš vados) vienam doz ės lygmeniui, yra naudojama bandymams po nujun ­
kymo (atliekami išsam ūs klinikiniai steb ėjimai, vertinamas motorinis akty ­
vumas, lytinio subrendimo amžius, motorin ė ir jutimin ė funkcijos). Iš ši ų 
gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir doz ės lygmens jaunikli ų (t. y. po 1 patin ėlį 
arba 1 patel ę iš vados) tyrimo pabaigoje (apie 70 PND) duodama anestetiko, jie 
fiksuojami perfuzijos b ūdu. Po papildomo fiksavimo  in situ  galvos smegenys 
išimamos, pasveriamos ir parengiamos neuropatologiniam vertinimui.  
8. Paaugusi ų jauniklių ir jaunų suaugusių gyvūnų kognityvin ės funkcijos bandy ­
mams naudojama grup ė, kurią sudaro po 10 kiekvienos lyties jaunikli ų (t. y. 
po 1 patin ėlį arba 1 patel ę iš vados) vienam doz ės lygmeniui. 23 PND 
amžiaus gyv ūnų ir jaunų suaugusi ų gyvūnų kognityvinei funkcijai bandyti 
yra naudojami skirtingi gyv ūnai. Tyrimo pabaigoje po 10 kiekvienos lyties iš 
grupės gyvūnų, su kuriais atlikti suaugusiems gyv ūnams skirti bandymai, yra 
numarinami, j ų galvos smegenys išimamos ir pasveriamos.  
9. 20 likusi ų kiekvienos lyties iš grup ės gyvūnų, kurie nebuvo pasirinkti 
bandymams, yra numarinami ir sunaikinami po nujunkymo.  
2 lentelė 
Jauniklio nr. (  a ) Bandymui paskirt ų 
jauniklių skaičius Tyrimas/bandymas  
V M  
1 5  20 V + 20 M  Elgsenos ontogenez ė 
10 V + 10 M  11 PND galvos smegen ų masė/ 
neuropatologin ė morfometrija  
2 6  20 V + 20 M  Išsam ūs klinikiniai steb ėjimai  
20 V + 20 M  Motorinis aktyvumas  
20 V + 20 M  Lytinis subrendimas  
20 V + 20 M  Motorin ė ir jutimin ė funkcijos  
10 V + 10 M  Jaun ų suaugusi ų gyvūnų galvos 
smegenų masė/neuropatologin ė 
morfometrija ~ 70 PND  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Jauniklio nr. (  a ) Bandymui paskirt ų 
jauniklių skaičius Tyrimas/bandymas  
V M  
3 7  10 V + 10 M (  b ) Mokymasis ir atmintis (23 
PND)  
3 7  10 V + 10 M (  b ) Mokymasis ir atmintis (jauni 
suaugę gyvūnai) 
Jaunų suaugusi ų gyvūnų galvos 
smegenų masė 
4 8  —  Gyv ūnai numarinami ir sunaiki ­
nami 21 PND  
( a ) Šiame pavyzdyje vados yra išbrokuotos, kad likt ų po 4 patin ėlius ir 4 pateles; 
patinėliai žymimi skai čiais nuo 1 iki 4, patel ės – nuo 5 iki 8. 
( b ) Kognityviniams bandymams yra naudojami skirtingi 23 PND amžiaus jaunikliai ir 
jauni suaug ę gyvūnai (pvz., lygin ės arba nelygin ės vados, kuri ų iš viso yra 20).  
3 pavyzdys  
10. Smegen ų masės ir neuropatologiniam vertinimui 11 PND naudojama viena 
grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jaunikli ų (po 1 patin ėlį ir 1 
patelę iš vados) vienam doz ės lygmeniui. Iš ši ų gyvūnų po 10 kiekvienos 
lyties ir doz ės lygmens jaunikli ų (t. y. po 1 patin ėlį arba 1 patel ę iš vados) 
yra humaniškai numarinami 11 PND. J ų galvos smegenys išimamos, pasve ­
riamos ir parengiamos histopatologiniam vertinimui. Galvos smegen ų masės 
duomenys taip pat yra renkami naudojant likusi ų to paties doz ės lygmens 
10 patinėlių ir 10 pateli ų nefiksuotas galvos smegenis.  
11. Kita grup ė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jaunikli ų (po 1 patin ėlį ir 1 
patelę iš vados) vienam doz ės lygmeniui, yra naudojama elgsenos ontoge ­
nezės (motorinio aktyvumo) tyrimams, tyrimams po nujunkymo (motori ­
niam aktyvumui ir lytinio subrendimo amžiui vertinti), paaugusi ų jauniklių 
kognityvinei funkcijai bandyti.  
12. Motorin ės ir jutimin ės funkcijų (reakcijos į garsinius dirgiklius) bandymams 
ir išsamiems klinikiniams steb ėjimams atlikti naudojama viena grup ė, kurią 
sudaro po 20 kiekvienos lyties jaunikli ų (po 1 patin ėlį ir 1 patel ę iš vados) 
vienam doz ės lygmeniui. Iš ši ų gyvūnų po 10 kiekvienos lyties ir doz ės 
lygmens jaunikli ų (t. y. po 1 patin ėlį arba 1 patel ę iš vados) tyrimo pabai ­
goje (apie 70 PND) duodama anestetiko, jie fiksuojami perfuzijos b ūdu. Po 
papildomo fiksavimo  in situ  galvos smegenys išimamos, pasveriamos ir 
parengiamos neuropatologiniam vertinimui.  
13. Jaun ų suaugusi ų gyvūnų kognityvin ės funkcijos bandymams yra naudojama 
grupė, kurią sudaro po 20 kiekvienos lyties jaunikli ų (t. y. po 1 patin ėlį ir 1 
patelę iš vados) vienam doz ės lygmeniui. Iš ši ų gyvūnų po 10 kiekvienos 
lyties ir doz ės lygmens gyv ūnų (t. y. po 1 patin ėlį arba 1 patel ę iš vados) 
tyrimo pabaigoje humaniškai numarinami, j ų galvos smegenys išimamos ir 
pasveriamos.  
3 lentelė 
Jauniklio nr. (  a ) Bandymui paskirt ų 
jauniklių skaičius Tyrimas/bandymas  
V M  
1 5  10 V + 10 M  11 PND galvos smegen ų masė/ 
neuropatologin ė morfometrija  
10 V + 10 M  11 PND galvos smegen ų masė 
2 6  20 V + 20 M  Elgsenos ontogenez ė (motorinis 
aktyvumas)  
20 V + 20 M  Motorinis aktyvumas  
20 V + 20 M  Lytinis subrendimas  
20 V + 20 M  Mokymasis ir atmintis (27- ą 
PND)  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Jauniklio nr. (  a ) Bandymui paskirt ų 
jauniklių skaičius Tyrimas/bandymas  
V M  
3 7  20 V + 20 M  Reakcija į garsinį dirgiklį (paau­
gusiems jaunikliams ir jauniems suaugusiems gyv ūnams)
 
20 V + 20 M  Išsam ūs klinikiniai steb ėjimai  
10 V + 10 M  Jaun ų suaugusi ų gyvūnų galvos 
smegenų masė/neuropatologija 
70 PND morfometrija  
4 8  20 V + 20 M  Mokymasis ir atmintis (jauni 
suaugę gyvūnai) 
10 V + 10 M  Jaun ų suaugusi ų gyvūnų 
smegenų masė 
( a ) Šiame pavyzdyje vados yra išbrokuotos, kad likt ų po 4 patin ėlius ir 4 pateles; 
patinėliai žymimi numeriais nuo 1 iki 4, patel ės – nuo 5 iki 8.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
2 priedėlis 
Sąvokos  
Cheminė medžiaga: medžiaga arba mišinys.  
Bandomoji chemin ė medžiaga: bet kuri pagal š į bandym ų metodą bandoma 
medžiaga arba mišinys.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  POVEIKIU GRAUŽIK Ų GIMDAI PAGR ĮSTA BIOANALIZ Ė. 
TRUMPALAIKIS ESTROGENINI Ų SAVYBI Ų ATRANKOS 
BANDYMAS  
ĮVADAS  
1. Šis bandym ų metodas atitinka EBPO Bandym ų gaires (angl.  OECD Test 
Guideline  (TG)) Nr. 440 (2007). 1998 m. EBPO iniciatyva prad ėtas didelės 
svarbos darbas – perži ūrėti esamas gaires ir parengti naujas galimai endo ­
krininę sistemą ardančių medžiagų atrankos ir bandymo gaires. Viena iš šio 
darbo dali ų – parengti poveikiu graužik ų gimdai pagr įstos bioanaliz ės 
gaires. Paskui buvo įgyvendinta plati poveikiu graužik ų gimdai pagr įstos 
bioanalizės tinkamumo patvirtinimo programa, be kita ko, buvo parengtas 
dokumentas su išsamia įvadine informacija (2) (3), atlikti plat ūs tyrimai 
vienoje laboratorijoje ir skirtingose laboratorijose siekiant parodyti bioana ­
lizės su stipriu etaloniniu estrogenu, silpnais estrogen ų receptori ų agonistais, 
stipriu estrogen ų receptori ų antagonistu ir neigiama etalonine chemine 
medžiaga aktualum ą ir atkuriamum ą (4) (5) (6) (7) (8) (9). Šis bandym ų 
metodas B.54 yra paremtas patirtimi, įgyta įgyvendinant tinkamumo patvir ­
tinimo bandymo program ą, ir per ši ą program ą gautais estrogen ų agonistų 
tyrimo rezultatais.  
2. Poveikiu gimdai pagr įsta bioanaliz ė yra trumpalaikis atrankos bandymas, 
sukurtas 4-ajame dešimtmetyje (27) (28), pirm ą kartą ekspertų komitetas 
jį standartizavo atrankai atlikti 1962 m. (32) (35). Jis pagr įstas gimdos 
masės didėjimu arba poveik į gimdai turin čiu atsaku (jei norite susipažinti 
išsamiau, žr. 29). J į atliekant vertinama, ar chemin ė medžiaga gali paskatinti 
biologinį aktyvum ą, atitinkant į natūralių estrogen ų (pvz., 17ß-estradiolio) 
agonistų arba antagonist ų veikimą, tačiau šis bandymas antagonistams 
nustatyti taikomas daug re čiau negu agonistams. Gimda į estrogenus 
reaguoja dvejopai. Pirminis atsakas yra mas ės padidėjimas dėl vandens 
sugėrimo. Paskui audiniui augant ima did ėti masė (30). Žiurki ų ir pelių 
gimdos atsakas kokybiniu poži ūriu yra panašus.  
3. Ši bioanaliz ė yra in vivo  atrankos analiz ė, jos taikym ą reikėtų vertinti pagal 
EBPO Konceptuali ą endokrinin ę sistemą ardančių chemini ų medžiag ų 
bandymo ir vertinimo sistem ą (angl.  Conceptual Framework for the Testing 
and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals ) (2 pried ėlis). Pagal ši ą 
konceptuali ą sistemą poveikiu gimdai pagr įsta bioanaliz ė yra 3 lygmens  in 
vivo analizė, kurią atliekant gaunama duomen ų apie vien ą endokrinin ės 
sistemos mechanizm ą, t. y. estrogenin į poveikį. 
4. Poveikiu gimdai pagr įsta bioanaliz ė yra sukurta kaip  in vitro  ir in vivo  
bandymų serijos dalis, ji yra skirta chemin ėms medžiagoms, kurios gali 
sąveikauti su endokrinine sistema, nustatyti ir taip pad ėti atlikti rizikos 
žmogaus sveikatai ir aplinkai vertinim ą. EBPO tinkamumo patvirtinimo 
programoje buvo naudojami ir stipr ūs, ir silpni estrogen ų agonistai siekiant 
įvertinti, kaip analiz ė padeda nustatyti estrogenines chemines medžiagas (4) 
(5) (6) (7) (8). Šia programa buvo aiškiai parodytas bandym ų metodo 
jautrumas estrogen ų agonistams nustatyti ir gauti geri atkuriamumo toje 
pačioje laboratorijoje ir skirtingose laboratorijose rezultatai.  
5. Kalbant apie neigiamas chemines medžiagas, į tinkamumo patvirtinimo 
programą įtraukta tik viena etalonin ė cheminė medžiaga, poveikiu gimdai 
pagrįsta analize ir  in vitro  rišimosi prie receptori ų bei receptori ų analize 
patvirtinta kaip „neigiama“; taip pat buvo įvertinti papildomi bandym ų 
duomenys, nesusij ę su EBPO tinkamumo patvirtinimo programa, kuriais 
dar išsamiau patvirtintas poveikiu gimdai pagr įstos bioanaliz ės tinkamumas 
estrogenų agonistų atrankai atlikti (16).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI  
6. Estrogen ų agonistai ir antagonistai veikia kaip estrogen ų receptori ų a ir b 
ligandai ir gali atitinkamai skatinti arba slopinti transkripcin ę receptori ų 
veiklą. Dėl to gali kilti pavojus sveikatai, įskaitant poveik į dauginimuisi 
ir vystymuisi. D ėl to chemin ę medžiag ą reikia greitai įvertinti ir nustatyti, 
ar ji gali veikti kaip estrogeno agonistas arba antagonistas. Nors ligand ų 
rišimosi prie estrogen ų receptori ų afiniškumas arba reporterini ų genų tran­
skripcijos aktyvinimas  in vitro  yra informatyvus veiksnys, jis yra tik vienas 
iš keleto galimo pavojaus determinant ų. Kiti galimi determinantai – tai 
metabolinis aktyvavimas ir deaktyvavimas patekus į organizm ą, pasiskirs ­
tymas tiksliniuose audiniuose, pašalinimas iš organizmo, priklausantis, bent 
jau iš dalies, nuo bandomosios chemin ės medžiagos ir jos davimo b ūdo. Dėl 
to reikia atlikti galimo chemin ės medžiagos veikimo  in vivo  atitinkamomis 
sąlygomis atrankos bandym ą, išskyrus tuos atvejus, kai reikiama informacija 
jau būna turima iš chemin ės medžiagos absorbcijos, pasiskirstymo, metabo ­
lizmo, pašalinimo (ADME) charakteristikos. Gimdos audiniai, ypa č labora­
torinių graužikų, kurių rujos ciklas trunka apie 4 dienas, reaguoja į stimu­
liavimą estrogenais spar čiai ir energingai augdami. Įvairių rūšių graužikai, 
ypač žiurkės, taip pat pla čiai naudojami toksiškumo tyrimuose pavojin ­
gumui apib ūdinti. Tod ėl graužiko gimda yra tinkamas tikslinis organas 
estrogenų agonistų ir antagonist ų in vivo  atrankos bandymui atlikti.  
7. Šis bandym ų metodas yra pagr įstas tais EBPO tinkamumo patvirtinimo 
tyrime naudotais protokolais, kurie ir vienos laboratorijos, ir skirting ų labo­
ratorijų tyrimuose patvirtinti kaip patikimi ir atkartojami (5) (7). Šiuo metu 
galima taikyti du metodus, tai yra: suaugusi ų patelių, kurioms atlikta 
ovariektomija, t. y. OVX suaugusi ų patelių metodą ir nesubrendusi ų patelių, 
kurioms neatlikta ovariektomija, t. y. nesubrendusi ų patelių metodą. Per 
EBPO tinkamumo patvirtinimo bandymo program ą buvo įrodyta, kad abiej ų 
metodų jautrumas ir atkuriamumas yra panaš ūs. Tačiau, kadangi nesubren ­
dusio gyv ūno pogumburio–hipofiz ės–lytinių liaukų (angl. HPG) ašis dar 
neaktyvi, šis metodas yra ne toks specifiškas, bet apima platesn į tyrimą 
negu tada, kai naudojamas gyv ūnas, kuriam atlikta ovariektomija, nes nesu ­
brendęs gyvūnas gali reaguoti į chemines medžiagas, kurios s ąveikauja su 
pogumburio–hipofiz ės–lytinių liaukų ašimi, ne tik su estrogeno recepto ­
riumi. Žiurki ų pogumburio–hipofiz ės–lytinių liaukų ašis ima funkcionuoti 
maždaug 15 dien ą po atsivedimo. Iki tol paspartinti subrendimo duodant, 
pavyzdžiui, GnRH, negalima. Art ėjant pateli ų lytinio subrendimo laikui, iki 
makšties atsiv ėrimo patelei įvyksta keli tušti ciklai, per kuriuos makštis 
neatsiveria ir ovuliacija ne įvyksta, ta čiau būna tam tikr ų hormonini ų svyra­
vimų. Jeigu chemine medžiaga pogumburio–hipofiz ės–lytinių liaukų ašis 
yra tiesiogiai arba netiesiogiai stimuliuojama, patel ė anksti subr ęsta, anksti 
vyksta ovuliacija, spart ėja makšties atsiv ėrimo procesas. Tok į poveikį daro 
ne tik chemin ės medžiagos, kurios veikia pogumburio–hipofiz ės–lytinių 
liaukų ašį, – kai kurie pašarai, kuri ų metabolizuojan čios energijos lygis 
yra didesnis, skatina augim ą ir spartina makšties atsiv ėrimą, nors nėra estro­
geniniai. Tokios chemin ės medžiagos OVX suaugusiems gyv ūnams nesu ­
kels poveik į gimdai turin čio atsako, nes j ų pogumburio–hipofiz ės–lytinių 
liaukų ašis nefunkcionuoja.  
8. Rūpinantis gyv ūnų gerove reik ėtų taikyti tą metodą, pagal kur į naudojamos 
nesubrendusios žiurk ės, vengti chirurginio gyv ūnų paruošimo, stengtis, jei 
galima, nenaudoti t ų gyvūnų, kurie turi koki ų nors rujos pradžios požymi ų 
(žr. 30 punkt ą). ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Poveik į gimdai turintis atsakas b ūna ne vien estrogenin ės kilmės, t. y. 
atsaką gali sukelti ir kitos chemin ės medžiagos, ne vien estrogen ų agonistai 
arba antagonistai. Pavyzdžiui, santykinai didel ės progesterono, testosterono 
arba įvairių sintetinių progestin ų dozės gali daryti stimuliuojam ąjį poveikį 
(30). Bet kur į atsaką galima ištirti histologiškai ir patikrinti, ar makš čiai 
daromas keratinizavimo ir rag ėjimo poveikis (30). Kad ir kokios kilm ės 
būtų galimas atsakas, teigiami poveikiu gimdai pagr įstos bioanaliz ės rezul­
tatai paprastai tur ėtų paskatinti imtis tolesni ų aiškinimosi tyrim ų. Papildom ų 
duomenų apie estrogenin į poveikį galima gauti atliekant  in vitro  analizę, 
pavyzdžiui, rišimosi prie ER, transkripcijos aktyvinimo analiz ę, arba  in vivo  
analizę, pavyzdžiui, pateli ų lytinio subrendimo analiz ę. 
10. Atsižvelgiant į tai, kad poveikiu gimdai pagr įsta bioanaliz ė yra in vivo  
atrankos analiz ė, pasirinktas tinkamumo patvirtinimo metodas pad ėjo ir 
atsižvelgti į gyvūnų gerovę, ir laikytis daugiapakopi ų bandymų strategijos. 
Todėl atliekant analiz ę buvo stengiamasi tiksliai patvirtinti estrogeninio 
poveikio – tai svarbiausias r ūpestis, kylantis d ėl daugelio chemini ų 
medžiagų, – rezultat ų atkuriamum ą ir jautrum ą, bet mažai d ėmesio skirta 
antiestrogeninio poveikio aspektams. Buvo išbandytas tik vienas stipriai veikiantis antiestrogenas, nes akivaizdžiai antiestrogeninio pob ūdžio (kurio 
nenustelbia tam tikras estrogeninis poveikis) chemini ų medžiag ų yra labai 
nedaug. Šis bandym ų metodas taikomas pagal estrogeninio poveikio proto ­
kolą, o protokolas, kuriame aptariamas antagonist ų analizės būdas, yra 
pateiktas Rekomendaciniame dokumente (37). Chemini ų medžiag ų, 
darančių grynai antiestrogenin į poveikį, analizės atkuriamumas ir jautrumas 
bus išsamiau apibr ėžtas vėliau, bandym ų metodikai tapus įprasta, kur į laiką 
ją panaudojus ir nusta čius daugiau tokio pob ūdžio poveik į turinčių 
cheminių medžiag ų. 
11. Pripaž įstama, kad visos proced ūros, kurioms naudojami gyv ūnai, turi atitikti 
gyvūnų priežiūros vietinius reikalavimus; toliau nurodyti gyv ūnų priežiūros 
ir elgesio su gyv ūnais reikalavimai yra b ūtiniausi veiklos reikalavimai ir už 
juos viršesni yra vietiniai reikalavimai, pavyzdžiui, 2010 m. rugs ėjo 22 d. 
Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES d ėl mokslo tikslais 
naudojam ų gyvūnų apsaugos (38). Daugiau humaniško elgesio su gyv ūnais 
gaires galima rasti EBPO (25).  
12. Kaip ir prieš bet kuri ą kitą analizę, kuriai atlikti naudojami gyvi gyv ūnai, 
prieš pradedant ši ą analizę itin svarbu įsitikinti, kad duomenys tikrai reika ­
lingi. Pavyzdžiui, dvi s ąlygos, kada duomenys gali b ūti reikalingi, yra 
tokios:  
— yra didel ė sąlyčio tikimyb ė (konceptualios sistemos (2 pried ėlis) 1 
lygmuo) arba estrogeninio poveikio požymiai (2 lygmuo) ir siekiama nustatyti, ar toks poveikis gali pasireikšti  in vivo ;
 
— atliekant 4 arba 5 lygmens  in vivo  bandymus nustatoma estrogeninio 
poveikio požymi ų ir yra siekiama pagr įsti, kad šis poveikis yra susij ęs 
su estrogen ų mechanizmu, kurio  in vitro  bandymu išsiaiškinti ne įma­
noma.  
13. Sąvokos, vartojamos šiame bandym ų metodo aprašyme, pateiktos 1 pried ė­
lyje. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
BANDYM Ų METODO PRINCIPAS  
14. Poveikiu gimdai pagr įstos bioanaliz ės jautrumas paremtas bandym ų su 
gyvūnais sistema, pagal kuri ą pogumburio–hipofiz ės–kiaušidži ų ašis 
nefunkcionuoja, d ėl to endogeninis cirkuliuojan čių estrogen ų lygis yra 
žemas. Taip užtikrinama maža pradin ė gimdos mas ė ir didžiausias galimas 
atsako į duodamus estrogenus spektras. Yra dvi š į reikalavim ą atitinkan čios 
graužikų patelių būsenos, kada jos yra jautrios estrogenams:  
i) kol patel ės yra nesubrendusios, po nujunkymo iki lytinio subrendimo, ir  
ii) jaunos suaugusios patel ės, kurioms atlikta ovariektomija, pra ėjus pakan ­
kamai laiko, kad gimdos audiniai gal ėtų regresuoti.  
15. Bandomoji chemin ė medžiaga duodama kasdien per virškinam ąjį traktą, 
naudojant zond ą, arba poodin ėmis injekcijomis. Skirtingos bandomosios 
cheminės medžiagos doz ės duodamos ne mažiau kaip dviem dozes gaunan ­ 
čioms bandom ųjų gyvūnų grupėms (paaiškinimai pateikti 33 punkte), kiek ­
vienai grupei duodant po vieno dydžio doz ę: pagal nesubrendusi ų gyvūnų 
metodą – tris dienas iš eil ės, pagal OVX suaugusi ų gyvūnų metodą – ne 
trumpiau kaip tris dienas iš eil ės. Gyvūnų nekroskopija atliekama pra ėjus 
maždaug 24 valandoms po paskutin ės dozės davimo. Tiriant estrogen ų 
agonistus vertinama, ar dozes gaunan čių grupių gyvūnų gimdos mas ės 
padidėjimo vidurkis yra statistiškai reikšmingas, palyginti su nešiklio 
grupe. Statistiškai reikšmingas dozes gaunan čios grupės gyvūnų gimdos 
masės vidurkio padid ėjimas rodo, kad per ši ą bioanaliz ę gautas teigiamas 
atsakas.  
METODO APRAŠYMAS  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
16. Galima naudoti dažniausiai naudojam ų veislių laboratorinius graužikus. 
Pavyzdžiui, tinkamumo patvirtinimo tikslais naudotos Sprague-Dawley ir Wistar veisli ų žiurkės. Jei žinoma arba įtariama, kad kai kuri ų veislių 
gyvūnų gimda reaguoja ne taip jautriai, toki ų gyvūnų naudoti nereik ėtų. 
Laboratorija tur ėtų įrodyti naudojamos veisl ės gyvūnų jautrumą taip, kaip 
aptarta 26 ir 27 punktuose.
 
17. Poveikiu gimdai pagr įstai bioanalizei atlikti nuo 4-ojo dešimtme čio dažniau ­
siai buvo naudojamos žiurk ės ir pelės. EBPO tinkamumo patvirtinimo 
tyrimai buvo atliekami tik su žiurk ėmis, laikantis nuomon ės, kad abi 
rūšys turėtų būti lygiavert ės ir kad, siekiant saugoti išteklius ir gyv ūnus, 
tinkamumui visame pasaulyje patvirtinti tur ėtų pakakti vienos r ūšies. 
Toksiškumo dauginimuisi ir vystymuisi tyrimuose dažniausiai pasirenkama rūšis yra žiurk ės. Kadangi jau anks čiau sukaupta plati duomen ų apie peles 
bazė, siekiant poveikiu graužik ų gimdai pagr įstą bioanaliz ės metodą išplėsti 
pritaikant j į pelėms, kaip bandom ųjų gyvūnų rūšiai, su pel ėmis atliktas 
riboto masto kontrolinis tinkamumo patvirtinimo tyrimas. Laikantis pradinio siekio saugoti išteklius ir gyv ūnus, pasirinktas tarpinis metodas, pagal kur į 
buvo panaudota nedaug bandom ųjų cheminių medžiag ų, dalyvavo nedaug 
laboratorij ų ir nebuvo naudoti koduot ų mėginių bandymai. Iš šio tarpinio 
tinkamumo patvirtinimo tyrimo matyti, kad poveikiu jaun ų suaugusi ų pelių, 
kurioms atlikta ovariektomija, gimdai pagr įsta bioanaliz ė ir kokybiniu, ir 
kiekybiniu poži ūriu tiksliai atitinka žiurki ų tyrimo duomenis. Jei poveikiu 
gimdai pagr įsta bioanaliz ė yra pradin ė, atliekama prieš ilgalaik į tyrimą, 
abiem tyrimams galima naudoti tos pa čios veislės ir to paties šaltinio 
gyvūnus. Pagal tarpin į metodą naudotos tik OVX pel ės ir ataskaitoje n ėra 
pateikiama pakankamai tvirt ų duomenų nesubrendusi ų pelių modelio tinka ­
mumui patvirtinti, tod ėl šiame bandym ų metode į nesubrendusi ų pelių 
modelį nebuvo atsižvelgta.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. Taigi kai kuriais atvejais vietoj žiurki ų galima naudoti peles. Jeigu pasiren ­
kama ši gyv ūnų rūšis, pasirinkim ą reikėtų pagrįsti pagal toksikologinius, 
farmakokinetinius ir (arba) kitus kriterijus. Jei naudojamos pel ės, protokol ą 
gali tekti pakeisti. Pavyzdžiui, peli ų pašaro suvartojimas pagal k ūno masę 
yra didesnis už žiurki ų, todėl fitoestrogeno kiekis pel ėms duodamuose paša ­
ruose turėtų būti mažesnis negu žiurk ėms duodamuose pašaruose (9) (20) 
(22).  
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
19. Visos proced ūros turėti atitikti vietos laboratorini ų gyvūnų priežiūros stan­
dartus. Šiose nuostatose pateikti b ūtiniausi gyv ūnų priežiūros ir elgesio su 
gyvūnais reikalavimai, vietos taisykl ės, pavyzdžiui, 2010 m. rugs ėjo 22 d. 
Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 2010/63/ES d ėl mokslo tikslais 
naudojam ų gyvūnų apsaugos, yra už juos viršesn ės. Bandom ųjų gyvūnų 
patalpos temperat ūra turi b ūti 22 °C (gali svyruoti ± 3 °C). Santykin ė 
drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesn ė kaip 
70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą. Reikėtų siekti, kad santykin ė drėgmė 
būtų 50–60 %. Apšvietimas tur ėtų būti dirbtinis. Per par ą apšvietimo seka 
turėtų būti 12 h šviesos ir 12 h tamsos.  
20. Laboratorinis pašaras ir vanduo tur ėtų būti duodami  ad libitum . Jauni 
suaugę gyvūnai narveliuose gali b ūti laikomi atskirai arba tos pa čios lyties 
grupėmis po tris. D ėl jauno nesubrendusi ų gyvūnų amžiaus juos laikyti 
rekomenduojama socialin ėmis grupėmis. 
21. Yra žinoma, kad didelis fitoestrogen ų kiekis laboratoriniuose pašaruose 
pakankamai smarkiai skatina graužik ų gimdos mas ę didėti – tiek, kad tai 
gali trukdyti atlikti poveikiu gimdai pagr įstą bioanaliz ę (13) (14) (15). Kai 
naudojami nesubrend ę gyvūnai, didelis fitoestrogen ų kiekis laboratoriniuose 
pašaruose ir j ų metabolizuojanti energija taip pat gali paskatinti ankstyv ą 
lytinį subrendim ą. Fitoestrogen ų pašaruose vis ų pirma atsiranda d ėl to, kad į 
juos dedama sojos ir alfalfa produkt ų, ištirta, kad fitoestrogen ų kiekis įvai­
riose laboratorini ų pašarų partijose b ūna skirtingas (23). K ūno masė yra 
svarbus kintamasis, nes vartojamo pašaro kokyb ė yra susijusi su k ūno 
mase. Tod ėl su tokiais pa čiais pašarais faktiškai suvartojamas fitoestrogen ų 
kiekis, lyginant skirting ų rūšių ir amžiaus gyv ūnus, gali skirtis (9). Nesu ­
brendusios žiurki ų patelės pašaro pagal k ūno masę gali suvartoti maždaug 
dukart daugiau negu jaunos suaugusios patel ės, kurioms atlikta ovariekto ­
mija. Jaunos suaugusios pel ės pašaro pagal k ūno masę gali suvartoti 
maždaug keturiskart daugiau negu jaunos suaugusios žiurki ų patelės, 
kurioms atlikta ovariektomija.  
22. Tačiau poveikiu gimdai pagr įstos bioanaliz ės rezultatai (9) (17) (18) (19) 
rodo, kad nedidelis fitoestrogen ų kiekis pašaruose yra priimtinas ir nema ­ 
žina bioanaliz ės jautrumo. Rekomenduojama, kad fitoestrogen ų kiekis 
jaunoms Sprague Dawley ir Wistar veisli ų žiurkėms duodamuose pašaruose 
sudarytų ne daugiau kaip 350 μg genisteino ekvivalent ų vienam laborato ­
rinio pašaro gram ų (6) (9). Tok į pašarą taip pat tikt ų naudoti, kai bandymas 
atliekamas su jaunomis suaugusiomis žiurki ų patelėmis, kurioms atlikta 
ovariektomija, nes jauni gyv ūnai, palyginti su nesubrendusiais gyv ūnais, 
pašaro pagal k ūno masę suvartoja mažiau. Jeigu reikia naudoti peles, 
kurioms atlikta ovariektomija, arba fitoestrogenams jautresnes žiurkes, reikėtų apsvarstyti galimyb ę proporcingai sumažinti fitoestrogen ų kiekį 
pašaruose (20). Be to, d ėl skirtingos įvairių pašarų metabolin ės energijos 
gali keistis lytinio brendimo pradžios laikas (21) (22).
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Prieš tyrim ą reikėtų kruopščiai pasirinkti pašarus, kad j ų fitoestrogen ų 
(paaiškinimai pateikti (6) (9)) arba metabolizuojan čios energijos kiekis 
nebūtų padidintas, nes tai gali iškreipti rezultatus (15) (17) (19) (22) (36). 
Tam, kad laboratorijos taikoma bandymo sistema veikt ų tinkamai, taip, kaip 
nurodyta 26 ir 27 punktuose, svarbu patikrinti abu šiuos veiksnius. Kaip 
gerą laboratorijos praktik ą (GLP) atitinkanti apsaugin ė priemonė turėtų būti 
paimtas reprezentatyvus kiekvienos pašar ų, duodam ų per tyrim ą, partijos 
mėginys, kad b ūtų galima ištirti juose esan čių fitoestrogen ų kiekį (pvz., 
kai gimdos kontrolinis svoris, palyginti su ankstesniais kontroliniais duome ­
nimis, yra didelis arba kai atsakas į etalonin į estrogen ą, 17 
alfa-etinilestradiol į, yra neadekvatus). Alikvotines dalis reik ėtų išanalizuoti 
per tyrim ą arba užšaldyti – 20 °C temperat ūroje ar taip, kad m ėginys iki 
analizės nesuirtų. 
24. Kai kurio kraiko sud ėtyje gali b ūti natūraliai susidariusi ų estrogenini ų arba 
antiestrogenini ų chemini ų medžiag ų (pvz., yra žinoma, kad kukur ūzų 
burbuolės kotai veikia žiurki ų rujos cikliškum ą ir yra antiestrogeniniai). 
Pasirinktame kraike tur ėtų būti kuo mažesnis fitoestrogen ų kiekis.  
Gyvūnų paruošimas  
25. Bandomieji gyv ūnai, neturintys ligos arba fizini ų anomalij ų požymių, yra 
atsitiktine tvarka suskirstomi į kontrolin ę ir dozes gaunan čias grupes. 
Narveliai tur ėtų būti išdėstomi taip, kad b ūtų kiek įmanoma sumažintas 
bet koks galimas poveikis d ėl narvelio vietos. Gyv ūnus reikėtų paženklinti 
unikaliomis žymomis. Nesubrendusius gyv ūnus aklimatizacijos laikotarpiu 
iki nujunkymo geriau laikyti viename narvelyje su motinin ėmis arba kitomis 
žindančiomis patel ėmis. Jaun ų suaugusi ų gyvūnų ir nesubrendusi ų gyvūnų, 
kurie pristatyti kartu su motinin ėmis patel ėmis arba kitomis žindan čiomis 
patelėmis, aklimatizacijos laikotarpis iki tyrimo pradžios tur ėtų trukti apie 5 
dienas. Jeigu nesubrend ę gyvūnai yra įsigyti jau nujunkyti ir be motinini ų 
patelių, aklimatizacijos laikotarp į gali tekti sutrumpinti, nes dozes reik ėtų 
pradėti duoti iškart po nujunkymo (žr. 29 punkt ą). 
BANDYMO PROCED ŪRA 
Laboratorijos kompetencijos patikrinimas  
26. Laboratorijos kompetencij ą patikrinti galima dvejopai:  
— periodiškai tikrinti pagal pradinio bazinio teigiamo kontrolinio tyrimo 
rezultatus (žr. 27 punkt ą). Ne rečiau kaip kas 6 m ėnesius ir kaskart, kai 
atsiranda pokytis, galintis paveikti analiz ės eigą (pvz., nauji pašarai, 
skrodimus atliekan čio personalo pasikeitimas, gyv ūnų veislės arba 
tiekėjo pasikeitimas ir t. t.), reik ėtų patikrinti bandymo sistemos (gyv ūnų 
modelio) jautrum ą, tam panaudojant atitinkam ą etaloninio estrogeno 
17a-etinilestradiolio (CAS Nr. 57–63–6) (EE) doz ę (remiantis 27 punkte 
nurodyto bazinio teigiamo kontrolinio tyrimo rezultatais);  
— vykdyti lygiagre čią kontrolę, į kiekvien ą analizę įtraukiant grup ę, kuriai 
duodama atitinkama etaloninio estrogeno doz ė. 
Jeigu sistema reaguoja ne taip, kaip tik ėtasi, bandymo s ąlygas reik ėtų išna­
grinėti ir atitinkamai pakeisti. Rekomenduojama etaloninio estrogeno doz ė, 
kuri būtų naudojama pagal bet kur į iš būdų, sudarytų ED70–80.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Bazinis teigiamas kontrolinis tyrimas  – laboratorija prieš pirm ą kartą 
atlikdama tyrim ą pagal šį bandymų metodą turėtų patikrinti savo kompe ­
tenciją, t. y. išbandyti gyv ūnų modelio jautrum ą nustatydama atsak ą į etalo­
ninio estrogeno 17a-etinilestradiolio (CAS Nr. 57–63–6) (EE) doz ę, kai 
skiriamos ne mažiau kaip keturios doz ės. Gimdos mas ės atsakas bus paly ­
gintas su turimais ankstesniais duomenimis (žr. literat ūros sąrašo 5 punkt ą). 
Jeigu šis bazinis teigiamas kontrolinis tyrimas neduoda laukt ų rezultatų, 
bandymo s ąlygas reik ėtų išnagrinėti ir atitinkamai pakeisti.  
Gyvūnų skaičius ir būklė 
28. Kiekvienoje dozes gaunan čioje ir kontrolin ėje grupėje turėtų būti mažiausiai 
6 gyvūnai (ir pagal nesubrendusi ų gyvūnų, ir pagal OVX suaugusi ų gyvūnų 
metodo protokolus).  
Nesubrendusi ų gyvūnų amžius  
29. Kai poveikiu gimdai pagr įstai bioanalizei atlikti naudojami nesubrend ę 
gyvūnai, būtina nurodyti j ų atsivedimo dat ą. Dozes reik ėtų pradėti duoti 
pakankamai anksti, siekiant užtikrinti, kad chemin ės medžiagos vartojimo 
pabaigoje fiziologinis endogenini ų estrogenų, susijusių su lytiniu brendimu, 
pakilimas dar neb ūtų prasidėjęs. Kita vertus, turima duomen ų, kad labai 
jauni gyv ūnai gali b ūti ne tokie jautr ūs. Apibrėždama optimal ų amžių kiek­
viena laboratorija tur ėtų atsižvelgti į savo pa čios turimus brendimo 
duomenis.  
Bendra rekomendacija – žiurk ėms dozes prad ėti duoti iš karto po ankstyvo 
nujunkymo 19 postnatalin ę dieną (atsivedimo diena yra žymima kaip 0 
postnatalin ė diena). Žiurk ėms dozes baigti duoti geriausia 21 postnatalin ę 
dieną ir bet kokiu atveju – iki 25 postnatalin ės dienos, nes sukakus šiam 
amžiui pradeda funkcionuoti pogumburio-hipofiz ės–kiaušidži ų ašis ir endo ­
geniniai estrogeno lygiai gali prad ėti kilti, kartu gali padid ėti pradin ė 
gimdos mas ė ir grupės standartiniai nuokrypiai (2) (3) (10) (11) (12).  
Ovariektomijos proced ūra 
30. Kai naudojamos žiurki ų ir pelių patelės (dozes gaunanti ir kontrolin ė 
grupės), kurioms reikia atlikti ovariektomij ą, tai turėtų būti atlikta 6–8 j ų 
amžiaus savait ę. Kai ovariektomija atliekama žiurk ėms, nuo ovariektomijos 
iki pirmos doz ės davimo tur ėtų praeiti ne mažiau kaip 14 dien ų, kad gimda 
regresuotų iki minimalios, stabilios pradin ės būklės. Nuo pel ėms atliktos 
ovariektomijos iki pirmos doz ės davimo tur ėtų praeiti bent 7 dienos. 
Kadangi nedidelis kiaušidži ų audinio kiekis yra pakankamas, kad pasiga ­
mintų reikšmingas cirkuliuojan čių estrogen ų (3) kiekis, prieš naudojant 
gyvūnus reikėtų patikrinti – bent penkias dienas iš eil ės (pvz., 10–14 
dieną po ovariektomijos, kai ji atlikta žiurk ėms) stebėti iš makšties paimto 
tepinėlio epitelines l ąsteles. Jeigu yra koki ų nors požymi ų, kad prasideda 
gyvūnų ruja, šių gyvūnų nereikėtų naudoti. V ėliau per nekroskopij ą reikėtų 
ištirti kiaušidži ų pašalinimo vietas ir patikrinti, ar n ėra kiaušidži ų audinio 
likučių. Jei yra, to gyv ūno reikėtų neįskaityti į atliekamus skai čiavimus (3).  
31. Ovariektomijos proced ūra pradedama gyv ūnui esant pilvo (kni ūbščioje) 
gulimojoje pad ėtyje, jį tinkamai nuskausminus. Pj ūvis dorsolateralinei 
pilvo sienelei atverti tur ėtų būti apie 1 cm ilgio ir daromas per vidur į tarp 
šonkaulių krašto ir kryžkaulio, per kelis milimetrus atitrauktas į šoną link 
lateralinės strėnų raumens ribos. Kiaušides iš pilvo ertm ės reikėtų išimti ant 
sterilaus paviršiaus. Kiaušides reik ėtų atskirti kiaušintaki ų ir gimdos susi ­
jungimo vietose. Įsitikinus, kad n ėra didelio kraujavimo, pilvo sienel ę 
reikėtų susiūti, odą sukabinti chirurgin ėmis kabėmis arba atitinkamai susi ūti. 
Perrišimo taškai schematiškai parodyti 1 pvz., Po operacijos reik ėtų taikyti 
tinkamą analgezij ą pagal graužik ų gydymo patirties turin čio veterinarijos 
gydytojo rekomendacijas.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Kūno masė 
32. Kai taikomas OVX suaugusio gyv ūno metodas, k ūno masė ir gimdos mas ė 
nekoreliuoja, nes gimdos mas ę veikia hormonai, pavyzdžiui, estrogenai, o 
ne augimo veiksniai, nuo kuri ų priklauso k ūno dydis. Kai taikomas nesu ­
brendusių gyvūnų modelis, kol gyv ūnas bręsta, kūno masė, priešingai, b ūna 
susijusi su gimdos mase (34). Taigi, kai taikomas nesubrendusi ų gyvūnų 
modelis, naudojam ų gyvūnų masės variacija tyrimo pradžioje turi b ūti kuo 
mažesnė ir neviršyti ± 20 % vidutin ės masės. Tai reiškia, kad veis ėjas turėtų 
standartizuoti vados dyd į ir taip užtikrinti, kad skirting ų motinini ų gyvūnų 
palikuonys b ūtų šeriami maždaug vienodai. Gyv ūnus reikėtų suskirstyti į 
grupes (kontrolin ę ir gaunan čią dozes) atsitiktine tvarka pagal mas ę, kad 
kiekvienos grup ės kūno masės vidurkis statistiškai nesiskirt ų nuo kit ų 
grupių. Reikėtų stengtis į tą pačią dozes gaunan čią grupę, jei įmanoma, 
neskirti tos pa čios vados gyv ūnų nepadidinus tyrimui naudojam ų vadų 
skaičiaus. 
Dozavimas  
33. Norint nustatyti, ar bandomoji chemin ė medžiaga gali daryti estrogenin į 
poveikį in vivo , paprastai pakanka dviej ų dydžių dozės grupių ir kontrolin ės 
grupės, todėl rūpinantis gyv ūnų gerove tokiai strukt ūrai yra teikiama pirme ­
nybė. Jeigu yra siekiama nubr ėžti dozės ir atsako tarpusavio ryšio kreiv ę 
arba duomenis ekstrapoliuoti mažesn ėms dozėms, reikalingos bent trij ų 
dydžių dozės grupės. Jeigu reikalinga informacija ne tik apie estrogenin į 
veikimą (pavyzdžiui, reikia įvertinti stiprum ą), reikėtų pasirinkti kitok į 
dozavimo režim ą. Kontrolin ės grupės gyvūnai turėtų būti laikomi tomis 
pačiomis sąlygomis kaip ir bandomieji gyv ūnai, išskyrus tai, kad jiems 
neduodama bandomosios chemin ės medžiagos. Jei bandomajai cheminei 
medžiagai duoti yra naudojamas nešiklis, kontrolin ė grupė turėtų gauti 
tokį patį nešiklio kiek į, koks yra duodamas dozes gaunan čioms grup ėms 
(arba didžiausi ą jo kiekį iš duodamo dozes gaunan čioms grup ėms, kai šis 
kiekis skirtingose grup ėse yra skirtingas).  
34. Kai atliekama poveikiu gimdai pagr įsta bioanaliz ė, reikia parinkti tokias 
dozes, kad b ūtų užtikrinta, jog gyv ūnas nenugaiš, ir kad pra ėjus trims 
dienoms iš eil ės nuo chemin ės medžiagos davimo pradžios doz ę didinant 
iki maksimalaus 1 000 mg/kg per dien ą kiekio gyv ūnams dar nepasireikšt ų 
reikšmingas toksiškas poveikis ir jie nepatirt ų didelių kančių. Visus doz ės 
dydžius reik ėtų siūlyti ir pasirinkti atsižvelgiant į jau turimus bandomosios 
cheminės medžiagos ar jai gimining ų medžiag ų toksiškumo ir (toksiko)ki ­
netinius duomenis. Pasirenkant didžiausi ą dozę pirmiausia reik ėtų atsižvelgti 
į LD50 ir (arba) ūmaus toksiškumo informacij ą, kad būtų išvengta gyv ūnų 
mirties, didelio skausmo arba kan čių (24) (25) (26). Didžiausia doz ė turėtų 
atitikti maksimali ą toleruojam ą dozę (MTD); tyrimas, atliktas su tokio 
dydžio doze, kuri ą duodant pasireišk ė teigiamas poveik į gimdai turintis 
atsakas, taip pat b ūtų tinkamas. Atrankos tikslais dideli intervalai (pvz., 
po pusę log vieneto, o tai atitinka doz ės progresij ą 3,2, arba net po vien ą 
log vienet ą) tarp dozi ų dažniausiai b ūna priimtini. Jeigu tinkam ų duomenų 
dozėms nustatyti n ėra, galima atlikti doz ės dydžio intervalo nustatymo 
tyrimą, kuris pad ėtų nustatyti, kokias dozes naudoti.  
35. Kitu atveju, jeigu agonisto estrogeninio poveikio stiprum ą galima įvertinti 
pagal  in vitro  (arba  in silico ) duomenis, pasirenkant doz ę į juos taip pat 
galima atsižvelgti. Pavyzdžiui, bandomosios chemin ės medžiagos kiekis, 
kuris sukelt ų tokį patį poveikį gimdai turint į atsaką kaip etaloninis agonistas 
(etinilestradiolis), yra įvertinamas pagal jo santykin į in vitro  poveikio 
stiprumą, palyginti su etinilestradioliu. Didžiausia bandomoji doz ė būtų 
apskaičiuota padauginus š į dozės ekvivalent ą iš atitinkamo koeficiento, 
pvz., 10 arba 100.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Dozės dydžio intervalo nustatymas  
36. Jeigu reikia, iš pradži ų galima atlikti doz ės dydžio intervalo nustatymo 
tyrimą su keliais gyv ūnais. Šiuo tikslu toksiškumo gyv ūnams arba kan čių 
klinikiniams požymiams apib ūdinti galima remtis EBPO Rekomendaciniu 
dokumentu Nr. 19 (25). Jeigu pagal š į dozės dydžio intervalo nustatymo 
tyrimą tai yra įmanoma, po trij ų dozės davimo dien ų, praėjus 24 valandoms 
po paskutin ės dozės davimo, gimd ą galima išpjauti ir pasverti. Šiais duome ­
nimis paskui galima pasinaudoti pagrindiniame tyrime (pasirenkant tinkam ą 
maksimali ą ir mažesn ę dozes, dozi ų grupių skaičių). 
Dozių davimas  
37. Bandomoji chemin ė medžiaga duodama per virškinam ąjį traktą naudojant 
zondą arba poodin ėmis injekcijomis. Pasirenkant davimo b ūdą reikia atsiž ­
velgti į gyvūnų gerovės, toksikologinius aspektus, pavyzdžiui, artimum ą 
žmonių sąlyčio su chemine medžiaga b ūdui (pvz., naudojant zond ą atkarto­
jamas sąlytis per virškinam ąjį traktą, poodinėmis injekcijomis – s ąlytis per 
kvėpavimo takus arba sugertis per od ą), fizikines ir (arba) chemines bando ­
mosios medžiagos savybes, ypa č į turimą toksikologin ę informacij ą ir 
duomenis apie metabolizm ą ir kinetik ą (t. y. tai, kad reikia vengti pirmojo 
pasažo metabolizmo, arba tai, kad poveikis b ūna didesnis, jei duodama tam 
tikru būdu). 
38. Jei yra įmanoma, pirmiausia rekomenduojama naudoti vandenin į tirpalą ir 
(arba) suspensij ą. Bet dauguma estrogen ų ligandų arba jų metabolini ų 
prekursori ų dažnai b ūna hidrofobiniai, tod ėl dažniausiai naudojamas tirpalas 
ir (arba) aliejin ė suspensija (pvz., su kukur ūzų, žemės riešutų, sezamo arba 
alyvuogių aliejumi). Ta čiau šių aliejų kaloringumas ir j ų sudėtyje esančių 
riebalų kiekis yra nevienodas, taigi nešiklis gali paveikti bendr ą metaboli ­
zuojančios energijos (ME) įsisavinim ą ir dėl to pakeisti matuojamas verti ­
namąsias baigtis, pavyzdžiui, gimdos mas ę, ypač kai taikomas nesubren ­
dusių gyvūnų metodas (33). Taigi prieš atliekant tyrim ą visus ketinamus 
naudoti nešiklius reik ėtų išbandyti per kontrolinius bandymus be nešiklio. 
Bandomąsias chemines medžiagas galima ištirpinti minimaliame kiekyje 
95 % etanolio arba kito atitinkamo tirpiklio ir atskiesti iki darbin ės koncent ­
racijos, esan čios bandomajame nešiklyje. Toksiškos tirpiklio savyb ės turi 
būti žinomos, jas reik ėtų išbandyti atskiroje kontrolin ėje grupėje, kurioje 
naudojamas tik tirpiklis. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga yra laikoma 
stabilia, tam, kad ji lengviau tirpt ų, galima j ą lengvai pakaitinti, greitai 
mechaniškai pamaišyti. Reik ėtų nustatyti bandomosios chemin ės medžiagos 
stabilumą nešiklyje. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga per vis ą tyrimą 
išlieka stabili, galima parengti vien ą pradinę alikvotin ę bandomosios 
cheminės medžiagos dal į ir kasdien j ą skiesti nustatytomis doz ėmis. 
39. Dozavimo trukm ė priklausys nuo taikomo modelio (26 punkte aptartas 
nesubrendusi ų gyvūnų modelis, 30 punkte – OVX suaugusi ų gyvūnų 
modelis). Nesubrendusioms žiurki ų patelėms bandomosios chemin ės 
medžiagos doz ės duodamos kasdien tris dienas iš eil ės. Dozes duoti tris 
dienas rekomenduojama ir žiurki ų patelėms, kurioms atlikta ovariektomija, 
bet ilgesnis dozi ų davimas yra galimas ir gali pagerinti silpn ų cheminių 
medžiagų nustatymo rezultatus. Jei naudojamos peli ų patelės, kurioms 
atlikta ovariektomija, tur ėtų pakakti dozes duoti tris dienas; kai naudojami 
stiprūs estrogen ų agonistai, šio laikotarpio prat ęsimas iki septyni ų dienų 
pastebimai didesn ės naudos neduoda, ta čiau per tinkamumo patvirtinimo 
tyrimą (16) toks ryšys su silpnais estrogenais nenustatytas, taigi suaugu ­
sioms pel ėms, kurioms atlikta ovariektomija, dozi ų davimo laikotarp į 
galima prat ęsti iki 7 dien ų iš eilės. Dozė turėtų būti duodama kiekvien ą 
dieną panašiu laiku. Prireikus dozes reik ėtų tikslinti, kad b ūtų išlaikytas 
pastovus doz ės dydis pagal santyk į su gyvūno kūno mase (pvz., bandomo ­
sios chemin ės medžiagos miligramai vienam k ūno masės kilogramui per 
dieną). Kalbant apie bandomosios medžiagos kiek į, reikėtų užtikrinti, kad 
pagal santyk į su kūno mase jis kuo mažiau keist ųsi, – tikslinti doz ės tirpalo 
koncentracij ą taip, kad visais doz ės lygmenimis ir naudojant visus doz ės 
davimo b ūdus būtų užtikrintas pastovus bandomosios chemin ės medžiagos 
kiekis pagal santyk į su kūno mase.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. Kai bandomoji chemin ė medžiaga duodama per zond ą, gyvūnams per vien ą 
dieną turėtų būti duodama tik viena doz ė naudojant skrandžio zond ą arba 
tinkamą intubacin į vamzdel į. Didžiausias gyv ūnui vienu metu duodamo 
skysčio kiekis priklauso nuo bandomojo gyv ūno dydžio. Reik ėtų laikytis 
vietos gyv ūnų priežiūros taisykli ų, tačiau šis kiekis netur ėtų būti didesnis 
kaip 5 ml/kg k ūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kuri ų galima duoti 
po 10 ml/kg k ūno masės. 
41. Kai bandomoji chemin ė medžiaga duodama poodin ėmis injekcijomis, jos 
turėtų būti suleidžiamos viena paros doze. Doz ės turėtų būti leidžiamos 
mentikaulio arba str ėnų srityje sterilia adata (pvz., 23 arba 25 dydžio) ir 
tuberkulino švirkštu. Injekcijos vietos nuskusti neb ūtina. Jei doz ė praran­
dama, injekcijos vietoje prateka arba suduodama ne visa, tai reik ėtų užra­ 
šyti. Vienai žiurkei per par ą reikėtų suleisti ne daugiau kaip 5 ml/kg k ūno 
masės injekcijos, injekcij ą padalijus ir suleidus dviejose vietose, išskyrus 
tuos atvejus, kai naudojami vandeniniai tirpalai ir galima leisti 10 ml/kg 
kūno masės injekcijas.  
Stebėjimai  
Bendri ir klinikiniai steb ėjimai  
42. Bendrus klinikinius steb ėjimus reik ėtų atlikti bent kart ą per dieną ir dažniau, 
jei pastebima toksiškumo požymi ų. Stebėjimus geriausia atlikti tuo pa čiu 
metu, kiekvien ą dieną, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo poveikio po 
dozės davimo laik ą. Reikėtų visus gyv ūnus tikrinti, ar nenugaišo, ar 
negaišta, vertinti bendrus klinikinius požymius, pavyzdžiui, elgsenos, 
odos, kailio, aki ų, gleivinės pakitimus, sekreto ir ekskrecij ų dažnį, autono­
minį aktyvum ą (pvz., ašarojim ą, plaukų pašiaušim ą, vyzdžio dyd į, neįprastą 
kvėpavimą). 
Kūno masė ir pašaro suvartojimas  
43. Visus gyv ūnus reikėtų kasdien pasverti 0,1 g tikslumu, pradedant sverti 
prieš pat tyrimo pradži ą, t. y. kai gyv ūnai suskirstomi į grupes. Kitas 
būdas – galima matuoti per tyrim ą kiekvieno narvelio gyv ūnų suvartojamo 
pašaro kiek į sveriant š ėrimo įrenginį. Pašaro suvartojimo rezultatus reik ėtų 
išreikšti gramais vienai žiurkei per dien ą. 
Skrodimas ir gimdos mas ės matavimas  
44. Praėjus dvidešimt keturioms valandoms po paskutin ės dozės davimo žiurk ės 
humaniškai numarinamos. Idealiu atveju nekroskopija atliekama gyv ūnus 
imant atsitiktine tvarka iš įvairių grupių, siekiant išvengti tiesiogin ės didė­
jančios ar maž ėjančios progresijos kurioje nors doz ės grupėje, nes tai gal ėtų 
šiek tiek paveikti duomenis. Bioanaliz ės tikslas – išmatuoti ir dar dr ėgnos 
gimdos, ir nusausintos gimdos mas ę. Dar drėgno organo mas ę sudaro gimda 
ir luminalinis skystis. Nusausinto organo mas ė matuojama iš gimdos 
nuspaudus ir pašalinus luminalin į turinį. 
45. Jei skrodžiami nesubrend ę gyvūnai, prieš skrodim ą apžiūrima, kokia yra 
makšties atsiv ėrimo būklė. Skrodimas pradedamas atveriant pilvo sienel ę 
nuo gaktos simfizio. Paskui nuo dorsalin ės pilvo sienel ės atskiriami gimdos 
ragai ir kiaušid ės, jei jos yra. Nuo ventralin ės ir lateralin ės gimdos ir makš ­
ties pusės atskiriama šlapimo p ūslė ir šlapimtakiai. Skaidulin ės sąaugos tarp 
tiesiosios žarnos ir makšties yra atskiriamos, kol bus matoma makšties angos susijungimo su tarpviet ės oda vieta. Gimda ir makštis atskiriamos 
nuo kūno įpjaunant makšties sienel ę iš karto virš susijungimo su tarpviet ės 
oda vietos, kaip parodyta 2 pvz., Gimd ą reikėtų atskirti nuo k ūno sienelės
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
atsargiai nupjaunant gimdos pasaitus j ų prisijungimo taškuose per vis ą 
kiekvieno gimdos rago dorsolateralin į ilgį. Išimtą iš kūno gimdą reikėtų 
pakankamai greitai sutvarkyti, kad audiniai neišdži ūtų. Masės praradimas 
dėl išdžiuvimo tampa dar svarbesnis, kai dirbama su smulkiais audiniais, 
tokiais kaip gimdos (23). Jeigu yra kiaušid ės, jos atskiriamos prie kiaušin ­
takių stengiantis, kad iš gimdos rago neištek ėtų luminalinis skystis. Jeigu 
gyvūnui buvo atlikta ovariektomija, reik ėtų patikrinti, ar kiaušidži ų pašali­
nimo vietoje n ėra kiaušidži ų audinio liku čių. Nupjaunamas perteklinis rieba ­
linis sluoksnis ir jungiamieji audiniai. Makštis išpjaunama iš gimdos po 
gimdos kakleliu taip, kad gimdos kaklelis likt ų prie gimdos k ūno, kaip 
parodyta 2 pav.  
46. Kiekvien ą gimdą reikėtų įdėti į unikalia žyma pažym ėtą ir pasvert ą indą 
(pvz., petri l ėkštelę arba plastikin ę svėrimo vonel ę) ir toliau stengiantis, kad 
iki svėrimo audiniai neišdži ūtų (pvz., į indą galima pad ėti fiziologiniu 
skysčiu šiek tiek sudr ėkintą filtravimo popieri ų). Gimda su liminaliniu 
skysčiu sveriama 0,1 mg tikslumu (dar dr ėgnos gimdos mas ė). 
47. Kiekviena gimda paskui ruošiama atskirai – pašalinamas luminalinis skystis. 
Abu gimdos ragai praduriami arba perpjaunami išilgai. Gimda padedama ant šiek tiek sudr ėkinto filtravimo popieriaus (pvz., vatmano Nr. 3) ir leng ­
viau prispaudžiama antru šiek tiek sudr ėkintu filtravimo popieriaus lakštu, 
kad luminalinis skystis visiškai pasišalint ų. Gimda be luminalinio skys čio 
pasveriama 0,1 mg tikslumu (nusausintos gimdos mas ė).
 
48. Gimdos mas ės duomenis tyrimo pabaigoje galima panaudoti užtikrinimui, 
kad nebūtų viršytas atitinkamas nesubrendusi ų ir neporuot ų žiurkių amžius, 
bet šiuo aspektu lemiam ą reikšmę turi ankstesni duomenys apie laborato ­
rijos naudojam ą žiurkių veislę (dėl rezultatų aiškinimo žr. 56 punkt ą). 
Neprivalomi tyrimai  
49. Pasvert ą gimdą galima d ėti į 10 % neutral ų buferinį formalin ą, kad vėliau 
nudažius hematoksilino ir eozino (HE) dažais b ūtų galima atlikti histopato ­
loginius tyrimus. Makšt į galima atitinkamai tirti (žr. 9 punkt ą). Kiekybini ų 
palyginim ų tikslais dar galima atlikti morfometrinius endometrinio epitelio 
matavimus.  
DUOMENYS IR ATASKAITA  
Duomenys  
50. Tyrimo duomenis tur ėtų sudaryti š į informacija:  
— gyvūnų skaičius analiz ės pradžioje;  
— gyvūnų, kurie atliekant analiz ę nugaišo arba d ėl humanišk ų priežasčių 
buvo numarinti, skai čius, identifikavimo duomenys, nugaišimo arba 
humaniško numarinimo data ir laikas;  
— gyvūnų, kuriems pasireišk ė toksiškas poveikis, skai čius, identifikavimo 
duomenys ir pasteb ėtų toksiškumo požymi ų apibūdinimas, įskaitant 
duomenis apie kiekvieno toksiškumo požymio pasireiškimo pradži ą, 
trukmę, stiprumą; ir 
— gyvūnų, kuriems pasireišk ė kokio nors pob ūdžio pažeidimai, skai čius, 
identifikavimo duomenys ir pažeidimo apib ūdinimas.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Reik ėtų užrašyti kiekvieno gyv ūno kūno masę, dar drėgnos gimdos ir 
nusausintos gimdos mas ę. Norint nustatyti, ar bandomosios chemin ės 
medžiagos vartojimas suk ėlė statistiškai reikšming ą (p< 0,05) gimdos 
masės didėjimą, reikėtų taikyti vienpus ę statistinę agonistų analizę. Reikėtų 
atlikti atitinkam ą statistinę analizę ir nustatyti, koki ų su dozių vartojimu 
susijusių pokyčių įvyko, vertinant dar dr ėgnos ir nusausintos gimdos 
masę. Pavyzdžiui, duomenis galima vertinti taikant kovariacin ės 
analizės (ANCOVA) metod ą, nes kūno masė nekroskopijos metu yra kova ­
rijuojantis dydis. Prieš analizuojant duomenis galima atlikti gimdos 
duomenų variacijas stabilizuojan čią logaritmin ę transformacij ą. Kiekvienos 
dozės grupės ir nešiklio kontrolin ės grupės duomen ų poroms prasmingai 
palyginti ir patikimumo intervalams apskai čiuoti galima taikyti Dunett ir 
Hsu metod ą. Galimoms išskirtims nustatyti ir variacij ų homogeniškumui 
įvertinti galima naudoti stjudentizuotas netik čių diagramas. Šios proced ūros 
buvo taikomos EBPO tinkamumo patvirtinimo programoje, statistin ės 
analizės sistemoje buvo naudojama PROC GLM proced ūra (SAS Institute, 
Cary, NC) (8 versija) (6) (7).  
52. Gautin ėje ataskaitoje pateikiama ši informacija:  
Bandymą atliekanti įstaiga:  
— atsakingi darbuotojai ir j ų pareigos atliekant tyrim ą; 
— bazinio teigiamo kontrolinio bandymo duomenys ir periodin ės teigiamos 
kontrolės duomenys (žr. 26 ir 27 punktus).  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— bandom ųjų cheminių medžiag ų apibūdinimas;  
— fizikin ė būsena ir, jei reikia, fizikin ės ir chemin ės savybės; 
— skiedimo metodas ir periodiškumas;  
— visi surinkti duomenys apie stabilum ą; 
— visų dozavimo sprendim ų analizė. 
Nešiklis:  
— bandomojo nešiklio apib ūdinimas (pob ūdis, tiekėjas ir partija);  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas (jei nešiklis ne vanduo).  
Bandomieji gyv ūnai: 
— rūšis, veislė ir jų pasirinkimo pagrindimas;  
— tiekėjas ir konkreti tiek ėjo įranga;  
— amžius prista čius ir atsivedimo data;  
— jei gyv ūnai yra nesubrend ę, – ar pristatyti kartu su motinine arba kita 
žindančia patele ir nujunkymo data;  
— gyvūnų aklimatizacijos proced ūros duomenys;  
— viename narvelyje laikom ų gyvūnų skaičius; 
— kiekvieno gyv ūno ir gyv ūnų grupės identifikavimo duomenys ir ženkli ­
nimo metodas.  
Analizės sąlygos:  
— duomenys apie atsitiktin ės atrankos eig ą (t. y. taikytas metodas);  
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi doz ės dydžio pasirinkim ą; ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— duomenys apie bandomosios chemin ės medžiagos sud ėtį, gautą koncent­
raciją, stabilum ą ir vienalytiškum ą; 
— išsam ūs duomenys apie tai, kaip bandomoji chemin ė medžiaga 
duodama, ir pagrindin ė priežastis, nul ėmusi davimo b ūdo pasirinkim ą; 
— pašarai (pavadinimas, r ūšis, tiekėjas, sudėtis ir, jei žinoma, fitoestrogen ų 
kiekis);  
— vandens šaltinis (pvz., vandentiekio ar filtruotas vanduo) ir tiekimas 
(vamzdeliais iš didelio konteinerio, buteliais ir t. t.);  
— kraikas (pavadinimas, r ūšis, tiekėjas, sudėtis); 
— duomenys apie laikymo narvelyje s ąlygas, apšvietimo intervalus, 
patalpos temperat ūrą ir drėgmę, patalpos valym ą; 
— išsamus nekroskopijos ir gimdos sv ėrimo proced ūrų aprašas;  
— statistini ų procedūrų aprašas.  
Rezultatai  
Apie kiekvien ą gyvūną: 
— visi kasdieniai kiekvieno gyv ūno kūno masės rodikliai (nuo suskirstymo 
į grupes iki nekroskopijos (0,1 g tikslumu);  
— kiekvieno gyv ūno amžius (dienomis, skai čiuojant nuo atsivedimo 
dienos, kuri laikoma 0 diena), kada pradedama duoti bandomosios 
cheminės medžiagos;  
— kiekvienos doz ės davimo data ir laikas;  
— apskai čiuotas kiekis ir duodama doz ė, pastabos, ar duodant arba po 
davimo doz ė nebuvo prarasta;  
— kasdienis gyv ūno būsenos registravimas, įskaitant svarbius simptomus ir 
pastebėtus dalykus;  
— įtariama nugaišimo priežastis (jeigu per tyrim ą gyvūnas randamas gaiš ­
tantis arba nugaiš ęs); 
— humaniško numarinimo data ir laikas ir laiko intervalas nuo paskutin ės 
dozės davimo;  
— dar dr ėgnos gimdos mas ė (0,1 mg tikslumu) ir pastabos d ėl luminalinio 
skysčio praradimo per skrodim ą ir paruošim ą sverti;  
— nusausintos gimdos mas ė (0,1 mg tikslumu).  
Apie kiekvien ą gyvūnų grupę: 
— dienos k ūno masės vidurkis (0,1 g tikslumu) ir standartiniai nuokrypiai 
(nuo suskirstymo į grupes iki nekroskopijos);  
— dar dr ėgnos gimdos mas ės vidurkis ir nusausintos gimdos mas ės 
vidurkis (0,1 mg tikslumu) bei standartiniai nuokrypiai;  
— pašaro suvartojimas per dien ą, jei matuojama (skai čiuojamas vieno 
gyvūno suvartoto pašaro kiekis gramais);  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— statistin ės analizės rezultatai lyginant dozes gaunan čių grupių gyvūnų 
dar drėgnos ir nusausintos gimdos mas ės rodiklius su tais pa čiais 
nešiklio kontrolini ų grupių gyvūnų rodikliais;  
— statistin ės analizės rezultatai lyginant dozes gaunan čių grupių gyvūnų 
kūno masę ir kūno masės prieaug į su tais pa čiais nešiklio kontrolini ų 
grupių gyvūnų rodikliais.  
53. Svarbi ų pagal bandym ų metodą rekomenduojam ų aspektų santrauka  
Žiurkės Pel ės 
Gyvūnai 
Veislė Dažniausiai naudojama laboratorini ų graužikų veislė 
Gyvūnų skaičius Ne mažiau kaip po 6 gyv ūnus vienoje doz ės grupėje 
Grupių skaičius Ne mažiau kaip 2 bandymo grup ės (paaiškinimai pateikti 33 
punkte) ir neigiamos kontrol ės grupė 
Paaiškinimai d ėl teigiamos kontrol ės grupių pateikti 26 ir 27 
punktuose  
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
Gyvūnų patalpos 
temperatūra 22 °C ± 3 °C  
Santykinė drėgmė 50–60 %, ne mažesn ė kaip 30 % ir ne didesn ė kaip 70 %  
Apšvietimo seka per par ą 12 h šviesos, 12 h tamsos  
Pašaras ir geriamasis 
vanduo  Ad libitum  
Laikymas  Atskirai arba grup ėmis ne daugiau kaip po tris gyv ūnus (nesu ­
brendusius gyv ūnus rekomenduojama laikyti socialin ėmis 
grupėmis) 
Pašaras ir kraikas  Rekomenduojama užtikrinti, kad naudojamuose pašaruose ir 
kraike būtų mažai fitoestrogen ų 
Protokolas  
Metodas  Metodas, kai naudojamos 
nesubrendusios patel ės, 
kurioms neatlikta evariektomija 
(šiam metodui teikiama pirme ­
nybė) 
Metodas, kai naudojamos 
suaugusios patel ės, kurioms 
atlikta ovariektomija  Metodas, kai naudojamos suau ­
gusios patel ės, kurioms atlikta 
ovariektomija  
Nesubrendusi ų gyvūnų 
amžius, nuo kurio prade ­
dama duoti dozes  Ne anks čiau kaip 18 PND. 
Dozes reik ėtų baigti duoti iki 
25 PND  Šiam bandym ų metodui 
neaktualu  
Amžius, kada atliekama 
ovariektmija  6–8 amžiaus savait ę 
Gyvūnų, kuriems atlikta 
ovariektomija, amžius, 
nuo kurio pradedama duoti dozes
 Nuo ovariektomijos iki pirmos 
dozės davimo turi praeiti ne 
mažiau kaip 14 dien ų Nuo ovariektomijos iki pirmos 
dozės davimo turi praeiti ne 
mažiau kaip 7 dienos  
Kūno masė K ūno masės variacija tur ėtų būti minimali, ne didesn ė kaip 
± 20 % vidutin ės masės ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Žiurkės Pel ės 
Dozavimas  
Davimo b ūdas Per virškinam ąjį traką naudojant zond ą arba poodin ės injekcijos  
Davimo periodiškumas  Viena doz ė per dien ą 
Kiekis duodant per zond ą 
ir su injekcija  ≤ 5ml/kg k ūno masės (arba iki 10 ml/kg k ūno masės, kai 
duodami vandeniniai tirpalai) (jei daromos injekcijos, 2 injek ­
cijos vietos)  
Davimo trukm ė 3 dienos iš eil ės, kai taikomas 
nesubrendusi ų gyvūnų modelis 
Ne trumpiau kaip 3 dienos iš 
eilės, kai taikomas OVX 
gyvūnų modelis  7 dienos iš eil ės, kai taikomas 
OVX gyv ūnų modelis  
Nekroskopijos laikas  Pra ėjus apie 24 h nuo paskutin ės dozės 
Rezultatai  
Teigiamas atsakas  Statistiškai reikšmingas gimdos (dar dr ėgnos ir (arba) nusau ­
sintos) mas ės vidurkio paadid ėjimas  
Etaloninis estrogenas  17 α-etinilestradiolis  
REKOMENDACIJOS D ĖL REZULTAT Ų AIŠKINIMO IR PRI ĖMIMO  
54. Apskritai estrogeninio poveikio bandym ą reikėtų laikyti teigiamu, jeigu 
gimdos mas ės padidėjimas yra statistiškai reikšmingas (p< 0,05) bent jau 
didelės dozės lygmeniu, palyginti su tirpalo kontroline grupe. Teigiamas 
rezultatas dar patvirtinamas pademonstruojant biologiškai galim ą ryšį tarp 
dozės ir atsako stiprumo, turint omenyje, kad vienu metu pasireiškiantis 
estrogneninis ir antiestrogeninis bandomosios chemin ės medžiagos poveikis 
gali turėti įtakos reakcijos į dozę kreivės formai.  
55. Kad gautus duomenis b ūtų galima prasmingai aiškinti, reik ėtų stengtis 
neviršyti maksimalios toleruojamos doz ės. Kūnos masės sumažėjimą, klini­
kinius požymius ir kitus gautus duomenis reik ėtų šiuo poži ūriu kruopš čiai 
įvertinti.  
56. Svarbus poveikiu gimdai pagr įstos bioanaliz ės duomen ų priėmimo kriterijus 
yra nešiklio kontrolin ės grupės gyvūnų gimdos mas ė. Didelės kontrolin ės 
vertės gali kelti abejoni ų dėl bioanaliz ės jautrumo ir geb ėjimo nustatyti labai 
silpnus estrogen ų agonistus. Peržvelgus literat ūros šaltinius ir duomenis, 
gautus tvirtinant poveikiu gimdai pagr įstos bioanaliz ės tinkamum ą, matyti, 
kad dideli kontrolini ų verčių vidurkiai tikrai atsiranda spontaniškai, ypa č kai 
naudojami nesubrend ę gyvūnai (2) (3) (6) (9). Nesubrendusi ų žiurkių 
gimdos mas ė priklauso nuo daugelio kintam ųjų, pavyzdžiui, veisl ės arba 
kūno masės, galutin ės aukščiausios gimdos mas ės ribos nurodyti ne įma­
noma. Pavyzdžiui, jeigu kontrolin ės grupės nesubrendusi ų žiurkių nusau­
sintos gimdos mas ė yra 40–45 mg, rezultatus reik ėtų vertinti kaip įtartinus, 
o jei gimdos mas ė yra didesn ė negu 45 mg, bandym ą gali tekti pakartoti. 
Tačiau tai kiekvienu atveju reikia vertinti atskirai (3) (6) (8). Kai bandymai 
atliekami su suaugusiomis žiurk ėmis, ne iki galo atlikus ovariektomij ą 
paliekama kiaušidži ų audinio, kuris gali gaminti endogeninius estrogenus 
ir stabdyti gimdos mas ės regresij ą. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Jeigu nešiklio kontrolin ės grupės gyvūnų nusausintos gimdos mas ė sudaro: 
nesubrendusi ų žiurkių patelių – mažiau negu 0,09 % k ūno masės, jaunų 
suaugusių patelių, kurioms atlikta ovariektomija, – 0,04 % [žr. 31 lentel ę 
(2)], tada tik ėtina, kad rezultatai yra priimtini. Jeigu kontrolin ės gimdos 
masės vertės yra didesn ės už šias reikšmes, reik ėtų nuodugniai patikrinti 
įvairius veiksnius, tarp j ų – gyvūnų amžių, ar tinkamai atlikta ovariektomija, 
fitoestrogen ų kiekį pašaruose ir t. t.; neigiamus tyrimo rezultatus (estroge ­
ninio veikimo požymi ų nenustatoma) reik ėtų vertinti labai atsargiai.  
58. Anks čiau surinktus nešiklio kontrolini ų grupių duomenis reik ėtų saugoti 
laboratorijoje. Anks čiau surinktus duomenis apie atsak ą į teigiamus etalo ­
ninius estrogenus, pavyzdžiui, 17a-etinilestradiol į, taip pat reik ėtų saugoti 
laboratorijoje. Laboratorijos taip pat gali išbandyti atsak ą į žinomus silpnus 
estrogenų agonistus. Visus šiuos duomenis galima palyginti su turimais 
duomenimis (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8), kad b ūtų užtikrinta, jog pagal labo ­
ratorijos metodus atliekami tyrimai yra pakankamai jautr ūs. 
59. Per EBPO tinkamumo patvirtinimo tyrim ą nusausintos gimdos mas ės 
duomenų variacijos buvo mažesn ės, palyginti su dar dr ėgnos gimdos 
masės duomenimis (6) (7). Ta čiau reikšmingas bet kurio iš ši ų matų atsakas 
rodytų, kad bandomoji chemin ė medžiaga tikrai daro estrogenin į poveikį. 
60. Poveik į gimdai turintis atsakas b ūna ne vien estrogenin ės kilmės, tačiau 
teigiamus poveikiu gimdai pagr įstos bioanaliz ės rezultatus paprastai reik ėtų 
aiškinti kaip galimo estrogeninio poveikio  in vivo  įrodymą ir imtis tolesnio 
aiškinimosi tyrim ų (žr. 9 punkt ą ir EBPO Konceptuali ą endokrinin ę sistemą 
ardančių cheminių medžiag ų bandymo ir vertinimo sistem ą (2 priedas)).  
1 pvz.  
Chirurginio kiaušidži ų pašalinimo schema
  
Procedūra pradedama atveriant dorsolateralin ę pilvo sienel ę per vidur į tarp 
šonkaulių krašto ir kryžkaulio, per kelis milimetrus į šoną link lateralin ės 
strėnų raumens ribos. Pilvo ertm ėje surandamos kiaušid ės. Kiaušid ės 
fiziškai išimamos iš pilvo ertm ės ant sterilaus paviršiaus, tarp kiaušid ės ir 
gimdos dedama ligat ūra kraujavimui sustabdyti, kiaušid ės atskiriamos 
pjūviu virš ligat ūros kiaušintaki ų ir kiekvieno gimdos rago susijungimo 
vietose. Įsitikinus, kad n ėra didelio kraujavimo, pilvo sienel ę reikėtų susiūti, 
odą sukabinti chirurgin ėmis kabėmis arba atitinkamai susi ūti. Iki naudojimo 
bandyme reik ėtų palaukti bent 14 dien ų, kol gyv ūnai atsigaus ir gimdos 
masė regresuos.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
2 pvz.  
Gimdos audini ų išėmimas ir parengimas mas ės matavimui
  
Procedūra pradedama atveriant pilvo sienel ę prie gaktos simfizio. Paskui nuo 
dorsalinės pilvo sienel ės atskiriama kiekviena kiaušid ė, jei yra, ir gimdos ragai. 
Nuo pilvin ės ir lateralin ės gimdos ir makšties pus ės atskiriama šlapimo p ūslė ir 
šlapimtakiai. Skaidulin ės sąaugos tarp tiesiosios žarnos ir makšties yra atski ­
riamos taip, kad b ūtų galima matyti makšties angos ir tarpviet ės odos susijun ­
gimo viet ą. Gimda ir makštis atskiriamos nuo k ūno įpjaunant makšties sienel ę iš 
karto virš susijungimo su tarpviet ės oda vietos, kaip parodyta 2 pvz., Gimd ą 
reikėtų atskirti nuo k ūno sienel ės atsargiai nupjaunant gimdos pasaitus j ų prisi­
jungimo taškuose per vis ą kiekvieno gimdos rago dorsolateralin į ilgį. Išėmus iš 
kūno nupjaunami perteklinis riebalinis sluoksnis ir jungiamasis audinys. Jeigu 
kiaušidės yra, jos atskiriamos prie kiaušintaki ų, stengiantis, kad iš gimdos rago 
neištekėtų luminalinis skystis. Jeigu gyv ūnui buvo atlikta ovariektomija, reik ėtų 
patikrinti, ar kiaušidži ų pašalinimo vietoje n ėra kiaušidži ų audinio liku čių. 
Makštis atskiriama nuo gimdos po gimdos kakleliu, kad gimdos kaklelis likt ų 
prie gimdos k ūno, kaip parodyta 2 pvz., Paskui gimd ą galima pasverti.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
1 priedėlis 
SĄVOKOS  
Antiestrogeninis poveikis  tai chemin ės medžiagos savyb ė stabdyti 17ß estra ­
diolio veikim ą žinduolių organizme.  
Cheminė medžiaga  tai medžiaga arba mišinys.  
Atsivedimo data  yra 0 postnatalin ė diena.  
Dozavimas  bendras terminas, apimantis doz ės dydį, jos dažn į ir dozės davimo 
trukmę. 
Dozė duodamas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis. Atliekant poveikiu 
gimdai pagr įstą bioanaliz ę dozė išreiškiama bandomosios chemin ės medžiagos 
mase bandomojo gyv ūno masės vienetui per dien ą (pvz., mg/kg k ūno masės/per 
dieną). 
Maksimali toleruojama doz ė (MTD)  didžiausias chemin ės medžiagos kiekis, 
kuriam patekus į bandom ųjų gyvūnų organizm ą gyvūnai nenugaišta (žymima 
LD 0 ) (IUPAC, 1993).  
Estrogeninis poveikis  tai chemin ės medžiagos savyb ė žinduoli ų organizm ą 
veikti kaip 17ß estradiolis.  
X postnatalin ė diena  X-oji diena nuo atsivedimo.  
Jautrumas  visų teigiamų/veiklių cheminių medžiag ų, kurios yra teisingai sukla ­
sifikuojamos pagal bandymo rezultatus, dalis. Tai bandym ų metodo, kur į taikant 
gaunami kategoriški rezultatai, tikslumo matas, kuris yra svarbus kriterijus verti ­
nant bandym ų metodo tinkamum ą. 
Specifiškumas  visų neigiamų/neveiklių cheminių medžiag ų, kurios yra teisingai 
suklasifikuojamos pagal bandymo rezultatus, dalis. Tai bandym ų metodo, kur į 
taikant gaunami kategoriški rezultatai, tikslumo matas, kuris yra svarbus kriterijus vertinant bandym ų metodo tinkamum ą.
 
Bandomoji chemin ė medžiaga  bet kuri pagal š į bandym ų metodą bandoma 
medžiaga arba mišinys.  
Turintis poveik į gimdai  sąvoka vartojama teigiamam poveikiui gimdos audini ų 
augimui apib ūdinti.  
Tinkamumo patvirtinimas  mokslinis procesas, kurio paskirtis – aprašyti darbo 
reikalavimus ir bandym ų metodo apribojimus siekiant parodyti metodo patiki ­
mumą ir tinkamum ą konkrečiam tikslui.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
2 priedėlis
 
VMG-mamm: Bandym ų su žinduoliais ir žinduoli ų vertinimo tinkamumo patvirtinimo valdymo grup ė (angl.  Validation Management Group on Mammalian Testing and Assess ­
ment )
 PASTABOS D ĖL KONCEPTUALIOS SISTEMOS  
1 pastaba.  Prisijungti prie tyrimo ir pasitraukti iš tyrimo galima visais lygme ­
nimis; tai priklauso nuo esam ų informacijos poreiki ų pavojingumo 
ir rizikos vertinimo tikslais.  
2 pastaba.  5 lygmeniu ekotoksikologija tur ėtų apimti vertinam ąsias baigtis, 
kuriomis žymimi žalingo poveikio mechanizmai ir galima žala populiacijai.
 
3 pastaba.  Kai daugialypis modelis apima keleto atskir ų vertinam ųjų baigčių 
tyrimą, tas modelis b ūtų taikomas vietoj pavieni ų vertinam ųjų 
baigčių analizės. 
4 pastaba.  Kiekviena chemin ė medžiaga tur ėtų būti vertinama kiekvienu 
atveju atskirai, atsižvelgiant į visą turimą informacij ą ir koncep ­
tualios sistemos lygmenis.  
5 pastaba.  Kol kas šis planas apima ne visk ą. 3, 4 ir 5 lygmenyse jis apima 
analizę, kurią vykdyti jau galima arba kurios tinkamumas dar 
tvirtinamas. Antrosios grup ės analizė įtraukta preliminariai. Kai 
ji bus išpl ėtota ir patvirtinta, ja planas bus oficialiai papildytas.  
6 pastaba.  Nereik ėtų suprasti, kad 5 lygmuo apima tik baigiamuosius 
bandymus. Šiuo lygmeniu įtraukiami bandymai laikomi padedan ­ 
čiais įvertinti bendr ą pavojingum ą ir riziką. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
LITERAT ŪROS ŠALTINIAI  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: 
Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and 
Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic 
Bioassay. OECD Environmental Health and SAFEty Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.
 
(3) Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Utero ­
trophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and 
Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445–520.
 
(4) OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay – Phase 1. OECD Environmental Health 
and SAFEty Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006)33.
 
(5) Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. 
(2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to 
screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ 
Health Perspect. 109:785–94.  
(6) OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic 
Bioassay: Phase 2 – Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by 
Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and SAFEty Publica ­
tion Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.  
(7) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530–1549.
 
(8) Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The 
OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550–1558.
 
(9) Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to 
validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two – Dietary phytoestrogen 
analyses. Environ. Health Persp. 111:1559–1567.  
(10) Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Prolifera ­
tive pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I
 125 ]iododeoxyuridine.  Endocrinology  113:582–587.  
(11) Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The 
postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b- estradiol.  Endocrinology  117:2229–2237.
 
(12) Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleisch ­
mann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active 
UV screens.  SÖFW-J.  127:10–15.  
(13) Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a 
commercial animal ration. Science118:650–651.  
(14) Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance 
discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd . Cosmet. 
Toxicol.  13:425–427.  
(15) Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, 
Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  in vivo  
responses to exogenously administered estrogens.  Environ. Health 
Perspec.  106:369–373.
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
(16) OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Utero ­
trophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and SAFEty 
Publication Series on Testing and Assessment No. 67.  
(17) Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in 
rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145–157.  
(18) Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence 
of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517–1525.
 
(19) Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). 
Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given diffe ­
rent phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature 
rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613–620.
 
(20) Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, 
Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal 
opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477–485.  
(21) Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. 
(2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent 
sexual development.  J. Appl. Toxicol.  20:343–347.  
(22) Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, 
Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 
26:381–393.
 
(23) Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The 
mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A 
standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596–601.
 
(24) OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(25) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
(26) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.
 
(27) Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320–333.  
(28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 
19: 33–41.  
(29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment 
of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288–305.
 
(30) Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284–291.  
(31) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92–64–12367–9, Paris.  
(32) Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, 
Academic Press.  
(33) Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for 
endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401–416.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
(34) Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (1–2): 159–184.  
(35) Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in 
vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807–1808.  
(36) Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evalua ­
tion of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410–1414.
 
(37) OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Proce ­
dure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. 
No. 71.  
(38) 2010 m. rugs ėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 
2010/63/ES d ėl mokslo tikslais naudojam ų gyvūnų apsaugos. OL L 276, 
2010 10 20, p. 33).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  ŽIURKI Ų HERSHBERGER  BIOANALIZ Ė: TRUMPALAIK Ė 
(ANTI)ANDROGENINI Ų SAVYBI Ų ATRANKOS ANALIZ Ė 
ĮVADAS  
1. Šis bandym ų metodas atitinka EBPO Bandym ų gaires (angl. OECD  Test 
Guideline  (TG)) Nr. 441 (2009). 1998 m. EBPO iniciatyva prad ėtas didelės 
svarbos darbas – perži ūrėti esamas gaires ir parengti naujas endokrinin ę 
sistemą galimai ardan čių medžiag ų atrankos ir bandym ų gaires. Viena iš 
šio darbo dali ų – parengti žiurki ų Hershberger  bioanaliz ės gaires. Ši analiz ė 
farmacijos pramon ėje taikoma jau kelet ą dešimtme čių, o oficialaus ekspert ų 
komiteto pirm ą kartą buvo standartizuota 1962 m. kaip androgenini ų 
cheminių medžiag ų atrankos priemon ė (2). 2001–2007 m. įvykdyta plati 
žiurkių Hershberger  bioanaliz ės tinkamumo patvirtinimo programa, per 
kurią parengtas aiškinamosios informacijos dokumentas (23), išsamios 
informacijos apie metodus rinkinys (3), skrodimo vadovas (21), atlikti platūs tyrimai vienoje laboratorijoje ir skirtingose laboratorijose, kuriais 
siekta įrodyti bioanaliz ės patikimum ą ir atkuriamum ą. Šie tinkamumo 
patvirtinimo tyrimai buvo atlikti su stipriu etaloniniu androgenu (testesto ­
rono propionatu (TP)), dviem stipriais sintetiniais androgenais (trenbolono 
acetatu ir metiltestosteronu), stipriu antiandrogeniniu vaistu (flutamidu), 
stipriu nat ūralaus androgeno (dihidrotestosterono – DHT) sintez ės inhibito ­
riumi (finasteridu), keliais silpnais antiandrogeniniais pesticidais (linuronu, vinklozolinu, procimidonu, p,p' DDE), stipriu 5 α
 reduktaz ės inhibitoriumi 
(finasteridu) ir dviem žinomomis neigiamomis chemin ėmis medžiagomis 
(dinitrofenoliu ir nonilfenoliu) (4) (5) (6) (7) (8). Šis bandym ų metodas 
yra paremtas ilgamete ankstesnio bioanaliz ės taikymo patirtimi, patirtimi, 
įgyta įgyvendinant bandymo tinkamumo patvirtinimo program ą, taip pat j ą 
įgyvendinant gautais rezultatais.  
2. Hershberger  bioanaliz ė yra trumpalaikis  in vivo  atrankos bandymas, 
kuriame naudojami pagalbiniai patin ėlių dauginimosi sistemos audiniai. 
Analizė sukurta 4-ajame dešimtmetyje, 5-ajame dešimtmetyje ji buvo 
pakeista – į ją įtraukti į androgenus reaguojantys patin ėlių dauginimosi 
sistemos raumenys (2) (9–15). 7-ajame dešimtmetyje remiantis standarti ­
zuota protokolo versija (2) (14) buvo įvertinta daugiau kaip 700 galim ų 
androgenų; 7-ajame dešimtmetyje ši analiz ė buvo laikoma standartiniu ir 
androgenų, ir antiandrogen ų tyrimo metodu (2) (15). Ši bioanaliz ė grin­
džiama penki ų nuo androgen ų priklausom ų audinių masės pokyčiais tiriant 
lytinės brandos amžiaus kastruotus žiurki ų patinėlius. Ją atliekant verti ­
namas chemin ės medžiagos geb ėjimas paskatinti androgen ų agonistų, anta­
gonistų arba 5α-reduktaz ės inhibitori ų veikimą atitinkant į biologin į akty­
vumą. Į šį bandymų metodą įtraukti penki tiksliniai nuo androgen ų priklau­
somi audiniai: ventralin ė prostatos skiltis (angl. VP), s ėklinės pūslelės (angl. 
SV) (taip pat skys čiai ir koaguliacijos liaukos), išang ės pakeliamasis ir 
stormeninis akytk ūnio (angl. LABC) raumuo, abi Kuperio liaukos (angl. 
COW) ir varpos galva (angl. GP). Tiriant lytin ės brandos amžiaus kast ­
ruotus žiurki ų patinėlius, visi šie penki audiniai reaguoja į androgenus – 
jų absoliuti mas ė padidėja. Kai tie patys audiniai stimuliuojami duodant 
stipraus etaloninio androgeno, kad j ų masė padidėtų, davus antiandrogeno 
visi šie penki audiniai sureaguoja ir j ų absoliuti mas ė sumažėja. Pagal 
pradinį Hershberger  bioanaliz ės modelį buvo numatyta naudoti chirurgiškai 
kastruotus lytin ės brandos amžiaus patin ėlius, šis modelis patvirtintas  
Hershberger  tinkamumo patvirtinimo programos 1, 2 ir 3 etapais.  
3. Hershberger  bioanaliz ė yra mechanistin ė in vivo  androgen ų agonistų, andro­
genų antagonist ų ir 5a-reduktaz ės inhibitori ų atrankos analiz ė; jos taikym ą 
reikėtų vertinti pagal EBPO konceptuali ą endokrinin ę sistemą ardančių 
cheminių medžiag ų bandymo ir vertinimo sistem ą (2 pried ėlis). Pagal ši ą ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
konceptuali ą sistemą Hershberger  bioanaliz ė yra 3 lygmens  in vivo  analizė, 
kurią atliekant gaunama duomen ų apie vien ą endokrinin ės sistemos mecha ­
nizmą, t. y. (anti)androgenin į poveikį. Ši bioanaliz ė sukurta kaip  in vitro  ir 
in vivo  bandymų serijos dalis ir yra skirta chemin ėms medžiagoms, kurios 
gali sąveikauti su endokrinine sistema, nustatyti ir taip pad ėti atlikti pavo ­
jingumo ir rizikos žmogaus sveikatai ir aplinkai vertinim ą. 
4. Kadangi kastravimo proced ūra kelia su gyv ūnų gerove susijusi ų abejonių, 
kaip alternatyv ą Hershberger  bioanalizei bandyta naudoti stimuliuojamus 
neoperuotus (nekastruotus) nujunkytus patin ėlius ir taip išvengti kastracijos 
etapo. Bandymo su stimuliuojamais nujunkytais gyv ūnais metodo tinka ­
mumas buvo patvirtintas (24); ta čiau atliekant  Hershberger  bioanaliz ės 
modelio, pagal kur į naudojami nujunkyti gyv ūnai, tinkamumo patvirtinimo 
tyrimus, bandomo dydžio silpn ų antiandrogen ų dozių poveikį nuo andro ­
genų priklausom ų organų masei pavyko nustatyti ne visais atvejais. Tod ėl 
šis modelis į šį bandymų metodą neįtrauktas. Ta čiau pripaž įstant, kad šis 
modelis ne tik gali b ūti naudingas saugant gyv ūnų gerovę, bet ir suteikti 
informacijos apie kitus veikimo b ūdus, jis yra aprašytas EBPO Rekomen ­
daciniame dokumente Nr. 115 (25).  
PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI  
5. Androgen ų agonistai ir antagonistai veikia kaip androgen ų receptori ų 
ligandai ir gali atitinkamai aktyvinti arba slopinti receptoriaus kontroliuo ­
jamą genų transkripcij ą. Be to, kai kurios chemin ės medžiagos kai kuriuose 
androgenų veikiamuose audiniuose slopina testosterono virtim ą stipresniu 
natūraliu androgenu dihidrotestosteronu (5a-reduktaz ės inhibitoriai). Tokios 
cheminės medžiagos gali kelti pavoj ų sveikatai, įskaitant poveik į reproduk ­
cijai ir vystymuisi. D ėl to reguliavimo tikslais chemin ę medžiag ą reikia 
greitai įvertinti ir nustatyti, ar ji gali veikti kaip androgeno agonistas, anta ­
gonistas arba 5a-reduktaz ės inhibitorius. Nors ligand ų rišimosi prie andro ­
genų receptori ų afiniškumas, matuojamas pagal rišim ąsi prie receptori ų arba 
reporterini ų genų transkripcijos aktyvinim ą in vitro , yra informatyvus 
veiksnys, jis yra tik vienas iš keleto galimo pavojaus determinant ų. Kiti 
galimi determinantai – metabolinis aktyvavimas ir deaktyvavimas patekus į organizm ą, pasiskirstymas veikiamuose audiniuose, pašalinimas iš orga ­
nizmo. D ėl to reikia atlikti galimos chemin ės medžiagos veikimo  in vivo  
esant tam tikroms s ąlygoms ir tam tikram s ąlyčiui atrankos analiz ę. In vivo  
įvertinimas ne toks svarbus, jeigu chemin
ės medžiagos savyb ės (absorbcija, 
pasiskirstymas, metabolizmas, šalinimas (angl. ADME)) yra žinomos. Nuo androgenų priklausomi audiniai, ypa č lytinės brandos amžiaus kastruot ų 
žiurkių patinėlių, į stimuliavim ą androgenais reaguoja spar čiai ir energingai 
augdami. Įvairių rūšių graužikai, ypa č žiurkės, taip pat pla čiai naudojami 
toksiškumo tyrimuose pavojingumui apib ūdinti. Tod ėl analizės modelis, 
pagal kur į naudojamos lytin ės brandos amžiaus kastruotos žiurk ės ir tiriami 
penki veikiami audiniai, tinka androgen ų agonistų ir antagonist ų bei 5a- 
reduktazės inhibitori ų in vivo  atrankos analizei atlikti.
 
6. Šis bandym ų metodas yra pagr įstas tais EBPO tinkamumo patvirtinimo 
tyrime naudotais protokolais, kurie pasitvirtino kaip patikimi ir atkartojami 
ir vienos laboratorijos, ir skirting ų laboratorij ų tyrimuose (4) (5) (6) (7) (8). 
Į šį bandymų metodą yra įtrauktos ir androgen ų, ir antiandrogen ų bandymo 
procedūros. 
7. Nors TP doz ė, skirting ų laboratorij ų naudota pagal EBPO  Hershberger  
bioanalizės tinkamumo patvirtinimo program ą antiandrogenams nustatyti, 
šiek tiek skyr ėsi (0,2 arba 0,4 mg/kg/d, poodin ės injekcijos), skirtumas 
tarp šių dviejų protokol ų variantų, lyginant galimybes nustatyti silpn ą 
arba stipr ų antiandrogen ų poveikį, nebuvo didelis. Ta čiau, aišku, TP doz ė 
neturėtų būti labai didel ė, kad neblokuot ų silpnų androgen ų receptori ų (AR) 
antagonist ų poveikio, arba labai maža, kad androgenini ų audinių augimo 
atsakas neb ūtų silpnas, nors antiandrogenai kartu ir neb ūtų duodami.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Atskir ų nuo androgen ų priklausom ų audinių augimo atsakas b ūna ne vien 
androgenin ės kilmės, t. y. kitos chemin ės medžiagos, ne vien androgen ų 
agonistai, gali pakeisti tam tikr ų audinių masę. Tačiau keleto audini ų lygia­
gretaus augimo atsakas patvirtina, kad labiau veikia androgenams b ūdingas 
mechanizmas. Pavyzdžiui, d ėl didelių stiprių estrogen ų dozių gali padid ėti 
sėklinių pūslelių masė; tačiau panašus kit ų nuo androgen ų priklausom ų 
audinių atsakas atliekant analiz ę nepasireiškia. Antiandrogenin ės chemin ės 
medžiagos gali veikti kaip androgen ų receptori ų antagonistai arba kaip 5a- 
reduktazės inhibitoriai. 5a-reduktaz ės inhibitori ų poveikis b ūna įvairus, nes 
virtimas stipresnio veikimo dihidrotestosteronu skirtinguose audiniuose b ūna 
skirtingas. Antiandrogenai, kurie slopina 5 α-reduktaz ę, pavyzdžiui, finaste ­
ridas, palyginti su stipriais AR antagonistais, pavyzdžiui, flutamidu, ryškiau veikia ventralin ę prostatos skilt į negu kitus audinius. Šiuo skirtingu audini ų 
atsaku galima remtis norint atskirti, ar tam tikro pob ūdžio veikimas yra 
susijęs su AR, ar 5 α-reduktaze. Be to, androgen ų receptoriai yra laipsniškai 
susiję su kitų steroidini ų hormonų veikla, ir kai kurie kiti hormonai, kai yra 
duodami didel ėmis viršfiziologinio dydžio doz ėmis, gali surišti TP ir 
slopinti jo augim ą skatinant į poveikį (13). Dar nuo androgen ų priklausom ų 
audinių augimas gali sul ėtėti dėl aktyvesnio steroid ų metabolizmo ir d ėl to 
rezultato – sumaž ėjusio testosterono kiekio kraujo serume. Tod ėl įprastu 
atveju visus teigiamus  Hershberger  bioanaliz ės rezultatus reik ėtų įvertinti 
įrodomosios vert ės metodais, tarp j ų – in vitro  analize, pavyzdžiui, rišimosi 
prie androgen ų ir estrogen ų receptori ų (ER) analize, atitinkama transkrip ­
cijos aktyvinimo analize arba kitokia  in vivo  analize, kuria tiriami panaš ūs 
androgenų veikiami audiniai, pavyzdžiui, patin ėlių
 lytinio brendimo analize, 
15 dienų nekastruot ų suaugusi ų patinėlių analize, arba 28 arba 90 dien ų 
kartotinės dozės tyrimais.  
9. Patirtis rodo, kad ksenobiotiniai androgenai yra retesni negu ksenobiotiniai 
antiandrogenai. Tod ėl numatoma, kad  Hershberger  bioanaliz ė bus dažniau ­
siai taikoma antiandrogen ų atrankai. Ta čiau androgen ų bandymo proced ūras 
vis dėlto galima rekomenduoti taikyti steroidin ėms ar steroidams giminin ­
goms chemin ėms medžiagos arba chemin ėms medžiagoms, kuri ų galimo 
androgeninio poveikio požymi ų pastebėta taikant konceptualios sistemos 
(2 priedėlis) 1 arba 2 lygmens metodus. Atliekant 5 lygmens analiz ę taip 
pat galima pasteb ėti su (anti)androgenin ėmis savyb ėmis siejam ą neigiamą 
poveikį, todėl reikia įvertinti, ar chemin ės medžiagos poveikis yra endokri ­
ninio pob ūdžio.  
10. Pripaž įstama, kad visos proced ūros, kuriose naudojami gyv ūnai, turėtų 
atitikti vietinius gyv ūnų globos reikalavimus; toliau nurodyti globos ir 
elgesio su gyv ūnais reikalavimai yra b ūtiniausi veiklos reikalavimai, 
vietinės taisyklės, pavyzdžiui, 2010 m. rugs ėjo 22 d. Europos Parlamento 
ir Tarybos direktyva 2010/63/ES d ėl mokslo tikslais naudojam ų gyvūnų 
apsaugos (26), yra už juos viršesn ės. Išsamesn ės humaniško elgesio su 
gyvūnais gairės pateiktos EBPO (17).  
11. Kaip ir kitais atvejais, kai bioanalizei yra naudojami bandomieji gyv ūnai, 
reikėtų kruopščiai įvertinti, ar šis tyrimas tikrai b ūtinas. Iš esm ės toks 
sprendimas gali b ūti grindžiamas dviem priežastimis:  
— yra didel ė sąlyčio tikimyb ė (konceptualios sistemos 1 lygmuo) arba 
atliekant  in vitro  analizę pastebėti (anti)androgeninio poveikio požymiai 
(2 lygmuo), tod ėl reikia nustatyti, ar toks poveikis gali pasireikšti  in 
vivo; 
— atliekant 4 arba 5 lygmens  in vivo  bandymus pasireiškia (anti)androge ­
ninį poveikį atitinkantys požymiai, tod ėl konkret ų veikimo b ūdą reikia 
ištirti, pvz., nustatyti, ar poveikis pasireišk ė dėl (anti)androgeninio 
mechanizmo.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Sąvokos, vartojamos šiame bandym ų metodo aprašyme, pateiktos 1 pried ė­
lyje. 
BANDYM Ų METODO PRINCIPAS  
13. Hershberger  bioanaliz ės jautrumas užtikrinamas naudojant patin ėlius, kurių 
organizme vyksta minimali endogenini ų androgen ų gamyba. Tam naudo ­
jami kastruoti patin ėliai, praėjus pakankamai laiko nuo kastravimo, kad 
veikiami audiniai regresuot ų iki minimalios, vienodos pradin ės masės. 
Taigi atliekant stipri ų androgen ų atrankos analiz ę endogeninis cirkuliuo ­
jančių androgen ų lygis būna žemas ir b ūna padaryta taip, kad pogumbu ­
rio–hipofiz ės–lytinių liaukų ašis nebegal ėtų jo kompensuoti atsako mecha ­
nizmais, audini ų gebėjimas reaguoti b ūtų kuo didesnis, o pradin ės audinio 
masės skirtumai – kuo mažesni. Atliekant galimo antiandrogeninio veikimo 
atrankos analiz ę, nuoseklesni ų audinių masės prieaugio rezultat ų galima 
gauti, kai audiniai stimuliuojami etaloniniu androgenu. Tod ėl Hershberger  
bioanalizei atlikti reikia imti tik po 6 kiekvieno dydžio doz ės grupės 
gyvūnus, o kitais atvejais analizei, kuriai naudojami nekastruoti lytiškai 
subrendę arba suaug ę patinėliai, rekomenduojama naudoti po 15 kiekvieno 
dydžio doz ės grupės patinėlių. 
14. Lytin ės brandos amžiaus žiurki ų patinėlius reikėtų kastruoti reikiamu b ūdu, 
tam naudoti patvirtintus anestetikus ir taikyti sterilius metodus. Pirmas kelias dienas po operacijos reik ėtų duoti analgetik ų, kad gyv ūnai nepatirt ų 
pooperacinio diskomforto. Kastracija padidina analiz ės, skirtos silpniems 
androgenams ir antiandrogenams nustatyti, tikslum ą, nes kastruojant pašali ­
nami kompensaciniai endokrininiai atsakomieji mechanizmai, veikiantys nekastruot ų gyvūnų organizme ir galintys sumažinti duodam ų androgen ų 
ir antiandrogen ų poveikį, ir eliminuojami dideli testosterono kiekio skirting ų 
gyvūnų kraujo serume skirtumai. Taigi, kai naudojami kastruoti gyv ūnai, 
šio endokrininio veikimo atrankos analizei j ų reikia mažiau.
 
15. Kai atliekama galimo androgeninio veikimo atrankos analiz ė, bandomoji 
cheminė medžiaga duodama per virškinam ąjį traktą naudojant zond ą arba 
poodinėmis injekcijomis kasdien dešimt dien ų iš eilės. Bandomosios 
cheminės medžiagos duodama ne mažiau kaip dviem dozes gaunan čioms 
bandomųjų gyvūnų grupėms, kiekvienai grupei duodamos to paties dydžio 
dozės. Gyvūnų nekroskopija atliekama pra ėjus maždaug 24 valandoms po 
paskutinės dozės davimo. Statistiškai reikšmingas dviej ų arba daugiau 
veikiamų organų masės padidėjimas bandomosios chemin ės medžiagos 
grupėse, palyginti su nešiklio kontroline grupe, rodo, kad bandomoji 
cheminė medžiaga gali veikti kaip androgenas (žr. 60 punkt ą). Androgen ų, 
pavyzdžiui, trenbolono, kurio 5 α – reduktaz ė negali veikti, poveikis, paly ­
ginti su TP poveikiu, yra ryškesnis išang ės pakeliamajam raumeniui ir 
stormeniniam akytk ūnio raumeniui bei varpos galvai, ta čiau turėtų pasi­
reikšti didesnis vis ų audinių augimas.  
16. Kai atliekama galimo antiandrogeninio veikimo atrankos analiz ė, bandomoji 
cheminė medžiaga duodama per virškinam ąjį traktą naudojant zond ą arba 
poodinėmis injekcijomis kasdien dešimt dien ų iš eilės, kartu kasdien 
sušvirkščiant poodines TP injekcijas (0,2 arba 0,4 mg/kg/d). Per tinkamumo 
patvirtinimo program ą nustatyta, kad galima švirkšti 0,2 arba 0,4 mg/kg/d 
TP injekcijas, nes abiej ų dydžių dozės yra veiksmingos ir padeda aptikti 
antiandrogenus, tod ėl atliekant analiz ę reikėtų pasirinkti tik vieno dydžio 
dozę, kuri bus naudojama. Skirtingos bandomosios chemin ės medžiagos 
dozės duodamos ne mažiau kaip trims dozes gaunan čioms bandom ųjų 
gyvūnų grupėms, kiekvienai grupei duodamos to paties dydžio doz ės. 
Gyvūnų nekroskopija atliekama pra ėjus maždaug 24 valandoms po pasku ­
tinės dozės davimo. Statistiškai reikšmingas dviej ų arba daugiau veikiam ų 
organų masės sumažėjimas grup ėse, kurių gyvūnams duota bandomosios 
cheminės medžiagos ir TP, palyginti su kontroline grupe, kurios gyv ūnams 
duota tik TP, rodo, kad bandomoji chemin ė medžiaga gali veikti kaip anti ­
androgenas (žr. 61 punkt ą). ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
METODO APRAŠYMAS  
Rūšių ir veislės parinkimas  
17. Hershberger  bioanalizei nuo 4-ojo dešimtme čio yra naudojamos žiurk ės. 
Nors biologiniu poži ūriu gali b ūti, kad ir žiurk ėms, ir pel ėms pasireikšt ų 
panašus atsakas, bet remiantis 70 met ų patirtimi taikant model į, pagal kur į 
naudojamos žiurk ės, Hershberger  bioanalizei pasirinktos žiurk ės. Be to, 
kadangi  Hershberger  bioanaliz ė gali būti pradinė, atliekama prieš ilgalaik į 
tyrimą, abiem tyrimams galima naudoti tos pa čios rūšies, veisl ės ir to paties 
šaltinio gyv ūnus. 
18. Pagal š į protokol ą laboratorijoms leidžiama pasirinkti t ą žiurkių, kurios bus 
naudojamos tyrime, veisl ę, kurią anksčiau naudojo tyrime dalyvaujanti labo ­
ratorija. Galima naudoti dažniausiai naudojam ų veislių žiurkes; ta čiau tų 
veislių žiurkės, kurios subr ęsta daug v ėliau negu per 42 dienas nuo atsive ­
dimo, netur ėtų būti naudojamos, nes kastravus 42 dien ų amžiaus patin ėlius 
gali būti neįmanoma išmatuoti varpos galvos mas ės: ją išmatuoti galima tik 
tada, kai apyvarp ė atsiskiria nuo varpos k ūno. Taigi veisli ų, išvestų iš 
Fisher  344 žiurki ų, nereikėtų naudoti, išskyrus retus atvejus.  Fisher  344 
žiurkių lytinio vystymosi laikotarpis yra kitoks negu kit ų dažnai naudojam ų 
veislių, pavyzdžiui,  Sprague Dawley  arba  Wistar , žiurkių (16). Jeigu keti ­
nama naudoti toki ą veislę, laboratorija tur ėtų šios veisl ės žiurkes kastruoti 
kiek vyresnio amžiaus ir geb ėti įrodyti naudojamos veisl ės jautrum ą. Labo­
ratorija tur ėtų aiškiai nurodyti pagrindines priežastis, nul ėmusias tos veisl ės 
žiurkių pasirinkim ą. Jeigu atrankos analiz ė yra pradin ė, atliekama prieš 
kartotinių dozių bandymą per virškinam ąjį traktą, dauginimosi ir vystymosi 
tyrimą arba ilgalaik į tyrimą, geriausia, jei visuose tyrimuose b ūtų naudojami 
tos pačios veislės ir to paties šaltinio gyv ūnai. 
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
19. Visos proced ūros turėtų atitikti laboratorini ų gyvūnų priežiūros vietinius 
reikalavimus. Šiose nuostatose pateikti tik b ūtiniausi gyv ūnų priežiūros ir 
elgesio su gyv ūnais reikalavimai, ir griežtesn ės vietinės taisyklės, pavyz­
džiui, 2010 m. rugs ėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 
2010/63/ES d ėl mokslo tikslais naudojam ų gyvūnų apsaugos, yra už juos 
viršesnės (26). Bandom ųjų gyvūnų patalpos temperat ūra turėtų būti 22 °C 
(gali svyruoti apie ± 3 °C). Santykin ė oro drėgmė turėtų būti mažiausiai 
30 % ir pageidautina ne didesn ė kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo 
laiką. Reikėtų siekti, kad santykin ė drėgmė būtų 50–60 %. Apšvietimas 
turėtų būti dirbtinis. Per par ą apšvietimo seka tur ėtų būti 12 h šviesos ir 
12 h tamsos.  
20. Gyv ūnus geriau laikyti grup ėmis, o ne izoliuotus, d ėl to, kad gyv ūnai yra 
jauni, ir d ėl to, kad žiurk ės yra social ūs gyvūnai. Kai viename narvelyje 
gyvūnai laikomi po du arba tris, išvengiama susigr ūdimo ir su tuo susijusio 
streso, kuris gali paveikti hormonin ę pagalbini ų lyties audini ų vystymosi 
kontrolę. Narvelius reik ėtų kruopščiai išvalyti, kad b ūtų pašalinti galimi 
teršalai, ir išd ėstyti taip, kad b ūtų kiek įmanoma sumažintas bet koks 
galimas poveikis d ėl narvelio vietos. Gyv ūnų susigrūdimo bus išvengta, 
jei bus naudojami tinkamo dydžio (~ 2 000 kvadratini ų centimetr ų ploto) 
narveliai.  
21. Kiekvien ą gyvūną reikėtų humanišku b ūdu atskirai paženklinti (pvz., ausies 
žyma arba įsagu). Tai, koks ženklinimo metodas taikomas, reik ėtų užrašyti.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Laboratorinis pašaras ir vanduo tur ėtų būti duodami  ad libitum . Hersh­
berger  bioanaliz ę atliekančios laboratorijos tur ėtų naudoti dažniausiai per 
bandymus su chemin ėmis medžiagomis naudojamus pašarus. Bioanaliz ės 
tinkamumo patvirtinimo tyrimuose nepasteb ėta jokio su pašarais susijusio 
poveikio arba poky čių. Tai, kokie pašarai naudojami, užrašoma; vien ą labo­
ratorinių pašarų mėginį reikėtų pasilikti, jei ateityje prireikt ų jį išanalizuoti.  
Nuo androgen ų priklausom ų organų masės pokyčių rezultatų kriterijai  
23. Per tinkamumo patvirtinimo tyrim ą negauta duomen ų, kad kūno masės 
mažėjimas tur ėtų poveikio tiriam ų audinių (t. y. audini ų, kuriuos per š į 
tyrimą reikėtų sverti) mas ės didėjimui arba maž ėjimui.  
24. Iš įvairių tinkamumo patvirtinimo programoje s ėkmingai naudot ų veislių 
žiurkių nuo androgen ų priklausom ų organų masė yra didesn ė sunkesni ų 
veislių žiurkių, palyginti su lengvesn ėmis veislėmis. Todėl absoliuti organ ų 
masė, kurios reik ėtų tikėtis teigiam ų ir neigiam ų kontrolini ų rezultatų atve­
jais, nėra įtraukta į Hershberger  bioanaliz ę kaip rezultat ų kriterijus.  
25. Kadangi audiniui nustatytas variacijos koeficientas (angl. CV) yra atvirkš ­ 
čiai proporcingas statistinei galiai,  Hershberger  bioanaliz ės rezultat ų krite­
rijai yra grindžiami didžiausia kiekvienam tiriamam audiniui nustatyta varia ­
cijos koeficiento verte (1 lentel ė). Variacijos koeficientai nustatyti per 
EBPO tinkamumo patvirtinimo tyrimus. Jeigu gaunami neigiami rezultatai, laboratorijos tur ėtų išnagrinėti kontrolin ės grupės ir didelę dozę gaunančios 
grupės variacijos koeficient ų vertes ir nustatyti, ar nebuvo viršytos didžiau ­
sios šių rezultatų kriterijų – variacijos koeficient ų – vertės.
 
26. Tyrim ą reikėtų pakartoti, jeigu: 1) trys arba daugiau iš dešimties galim ų 
atskirų variacijos koeficient ų kontrolin ėje grupėje ir dideles dozes gaunan ­ 
čioje grup ėje viršija maksimalias vertes, nustatytas agonist ų ir antagonist ų 
tyrimams, kaip nurodyta 1 lentel ėje, ir 2) bent dviej ų tiriamų audinių 
pokytis buvo nereikšmingas, t. y. r vert ės buvo 0,05–0,10.  
1 lentelė 
Didžiausios leidžiamos variacijos koeficient ų vertės, pagal EBPO 
tinkamumo patvirtinimo tyrimus nustatytos veikiamiems pagalbiniams 
lyties audiniams, kai taikomas kastruot ų gyvūnų modelis  ( 1 ) 
Audinys  Antiandrogeninis 
poveikis  Androgeninis poveikis  
Sėklinės pūslelės 40 %  40 %  
Ventralin ė prostatos skiltis  40 %  45 %  
Išangės pakeliamasis raumuo 
ir stormeninis akytk ūnio 
raumuo  20 %  30 %  
Kuperio liaukos  35 %  55 %  
Varpos galva  17 %  22 %  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Atitinkamo audinio variacijos koeficiento apatin ė riba buvo nustatyta pagal eil ės tvarka 
nuo mažiausios iki didžiausios išd ėstytas variacijos koeficiento vertes – visus per visus 
tinkamumo patvirtinimo bandymus taikant konkret ų modelį (agonistų arba antagonist ų) 
apskaičiuotus vidurkius. Variacijos koeficiento riba br ėžta tame taške, kuriame padid ė­
jimo intervalas iki artimiausios didžiausios variacijos koeficiento vert ės šioje sekoje yra 
daug didesnis negu tarp keleto prieš tai išd ėstytų variacijos koeficient ų verčių – „trūkio 
taške“. Reik ėtų pažymėti, kad nors pagal ši ą analizę antagonist ų modeliui nustatyti 
santykinai patikimi „tr ūkio taškai“, agonist ų analizės variacijos koeficient ų kreivės 
atspindėjo vienod ą didėjimą, todėl apatinės variacijos koeficient ų ribos šiuo metodu 
nustatytos kiek dirbtinai.
 BANDYMO PROCED ŪRA 
Atitiktis taisykl ėms ir laboratorijos patikrinimas  
27. Kitaip negu poveikiu gimdai pagr įstoje analiz ėje (šio priedo B.54 skyrius), 
prieš pradedant  Hershberger  analizę laboratorijos kompetencijos tikrinti 
nereikia, nes per tyrim ą kartu atliekama ir teigiama (testosterono propio ­
natas ir flutamidas), ir neigiama kontrol ė. 
Gyvūnų skaičius ir būklė 
28. Kiekvienoje dozes gaunan čioje ir kontrolin ėje grupėje turi būti mažiausiai 6 
gyvūnai. Tai galioja ir androgen ų, ir antiandrogen ų protokolams.  
Kastracija  
29. Gyv ūnus priėmus reikėtų leisti jiems kelet ą dienų aklimatizuotis, siekiant 
įsitikinti, ar jie yra sveiki ir gyvybingi. Kadangi iki 42 dien ų amžiaus arba 
iki 42-os postnatalin ės dienos gyv ūnų, kuriuos ketinama kastruoti, apyvarp ė 
dar gali b ūti neatsiskyrusi, gyv ūnus reikėtų kastruoti 42- ą arba vėlesnę 
PND, ne anks čiau. Gyvūnai kastruojami taikant anestezij ą – kapšelis įpjau­
namas, abi s ėklidės ir antsėklidžiai išimami, kraujagysl ės ir sėkliniai latakai 
perrišami. Įsitikinus, kad kraujavimo n ėra, kapšelis užsiuvamas arba suka ­
binamas chirurgin ėmis kabėmis. Pirmas kelias dienas po operacijos gyv ū­
nams reik ėtų duoti analgetik ų pooperaciniam diskomfortui sumažinti. Jeigu 
iš gyvūnų tiekėjo įsigyjami jau kastruoti gyv ūnai, tiekėjas turėtų užtikrinti, 
kad gyvūnų amžiaus ir lytinio subrendimo etapo duomenys yra teisingi.  
Aklimatizavimasis po kastracijos  
30. Gyv ūnams po kastracijos reik ėtų leisti dar bent 7 dienas aklimatizuotis 
laboratorijos s ąlygomis ir tiriam ų audinių masei regresuoti. Gyv ūnus reikėtų 
kasdien steb ėti ir pašalinti visus gyv ūnus, kuriems pasireiškia ligos arba 
fizinės anomalijos požymi ų. Taigi dozes galima prad ėti duoti (tyrimo 
metu) jau 49- ą PND, bet ne v ėliau kaip 60- ą PND. Gyv ūnų amžius nekros ­
kopijos metu tur ėtų būti ne didesnis kaip 70 PND. Šis lankstumas suteikia 
galimybę laboratorijai veiksmingai suplanuoti bandymo eig ą. 
Kūno masė ir grupės sudarymas atsitiktine tvarka  
31. Atskir ų gyvūnų kūno masės skirtumai nulemia audini ų masės skirtumus ir 
vienoje grup ėje, ir tarp skirting ų grupių. Padidėjus audinio mas ės skirtu­
mams, padid ėja variacijos koeficientas (angl. CV) ir sumaž ėja tyrimo statis ­
tinė galia (kartais dar vadinama tyrimo jautrumu). Tod ėl kūno masės varia­
cijas reik ėtų kontroliuoti ir bandymo, ir statistin ėmis priemon ėmis. 
32. Kontrol ė bandymo priemon ėmis – tai užtikrinimas, kad k ūno masės 
reikšmės ir tarp vienos bandymo grup ės, ir tarp skirting ų bandymo grupi ų 
gyvūnų skirtųsi nedaug. Pirma, reik ėtų vengti naudoti ne įprastai mažus arba 
didelius gyv ūnus ir jų neįtraukti į bandymo kohort ą. Naudojam ų gyvūnų 
masė bandymo pradžioje neturi skirtis daugiau kaip ± 20 %, palyginti su 
vidutine mase (pvz., lytin ės brandos amžiaus kastruot ų žiurkių: 175g 
± 35g). Antra, gyv ūnus reikėtų suskirstyti į grupes (kontrolin ę ir gaunan čią 
dozes) atsitiktine tvarka pagal mas ę, kad kiekvienos grup ės kūno masės 
vidurkis statistiškai nesiskirt ų nuo kitų grupių. Bloko atsitiktin ės atrankos 
procedūrą reikėtų aprašyti.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Kadangi d ėl toksiškumo dozes gaunan čios grupės gyvūnų kūno masė, paly­
ginti su kontrolin ės grupės, gali sumaž ėti, kaip statistin į lydintį kintamąjį 
galima naudoti k ūno masę pirmosiomis bandomosios chemin ės medžiagos 
davimo dienomis, o ne nekroskopijos metu.  
Dozavimas  
34. Norint nustatyti, ar bandomoji chemin ė medžiaga gali daryti androgenin į 
poveikį in vivo , paprastai pakanka dviej ų dydžių bandomosios chemin ės 
medžiagos dozi ų grupių, teigiamos kontrol ės ir nešiklio (neigiamos) kont ­
rolės grupės (žr. 43 punkt ą), todėl rūpinantis gyv ūnų gerove tokiai strukt ūrai 
yra teikiama pirmenyb ė. Jeigu siekiama nubr ėžti dozės ir atsako tarpusavio 
ryšio kreiv ę arba duomenis ekstrapoliuoti mažesn ėms dozėms, reikalingos 
bent trijų dydžių dozės grupės. Jeigu reikalinga informacija ne tik apie 
androgenin į veikimą (pavyzdžiui, reikia įvertinti stiprum ą), reikėtų pasirinkti 
kitokį dozavimo režim ą. Atliekant bandymus su antiandrogenais bandomoji 
cheminė medžiaga duodama kartu su etaloniniu androgen ų agonistu. 
Reikėtų naudoti ne mažiau kaip 3 bandom ąsias grupes, kurioms duodamos 
skirtingos bandomosios chemin ės medžiagos doz ės, teigiamos ir neigiamos 
kontrolės grupės (žr. 44 punkt ą). Kontrolin ės grupės gyvūnai turėtų būti 
laikomi tomis pa čiomis sąlygomis kaip ir bandomieji gyv ūnai, išskyrus 
tai, kad jie neveikiami bandom ąja chemine medžiaga. Jei bandomoji 
cheminė medžiaga duodama naudojant nešikl į, kontrolinei grupei tur ėtų 
būti duodamas didžiausias nešiklio kiekis iš duodamo bandymo grup ėms. 
35. Visus doz ės dydžius reik ėtų siūlyti ir pasirinkti atsižvelgiant į jau turimus 
bandomosios chemin ės medžiagos ar jai giminingos medžiagos toksiškumo 
ir (toksiko)kinetinius duomenis. Pasirenkant didžiausi ą dozę reikėtų atsiž­
velgti, pirma, į LD50 ir (arba) ūmaus toksiškumo informacij ą, kad būtų 
išvengta gyv ūnų nugaišimo, didelio skausmo arba kan čių (17) (18) (19) 
(20), ir, antra, į turimą informacij ą apie po ūmio ir ūmaus toksiškumo 
bandymuose naudojamas dozes. Apskritai didžiausia doz ė neturėtų sukelti 
galutinės gyvūnų kūno masės sumažėjimo daugiau kaip 10 %, palyginti su 
kontroline mase. Didžiausia doz ė turėtų būti mažesnioji iš ši ų dozių: 1) 
didžiausia doz ė, kurią duodant 10 dien ų iš eilės ir didinant iki maksimalaus 
1 000 mg/kg/d dydžio, užtikrinama, kad gyv ūnai nenugaiš, jiems nepasi ­
reikš reikšmingas toksinis poveikis ir jie nepatirs dideli ų kančių (žr. 36 
punktą), arba 2) doz ė, daranti (anti)androgenin į poveikį. Atrankos tikslais 
dideli intervalai, pvz., po pus ę log vieneto (tai atitinka doz ės progresij ą 3,2) 
arba net po vien ą log vienet ą tarp dozi ų yra priimtini. Jeigu n ėra tinkam ų 
duomenų, padedan čių nustatyti dozes, galima atlikti doz ės dydžio intervalo 
nustatymo bandym ą (žr. 37 punkt ą). 
Ribinis doz ės dydis  
36. Jeigu atliekant bandym ą ir duodant ribin ę 1 000 mg/kg k ūno masės per 
dieną dozę ir mažesn ę dozę šiame tyrime aptarta tvarka statistiškai reikš ­
mingas dauginimosi organo mas ės pokytis nesukeliamas, tada galima daryti 
išvadą, kad papildom ų dydžių dozės nereikalingos. Nuostatos d ėl ribinės 
dozės netaikomos tais atvejais, kai, atsižvelgiant į žmonių sąlytį su 
medžiaga, reikia naudoti didesnio dydžio dozes.  
Dozės dydžio intervalo nustatymas  
37. Jeigu reikia, iš pradži ų galima atlikti doz ės dydžio intervalo nustatymo 
tyrimą su keliais gyv ūnais ir pasirinkti reikiamas doz ės grupes [taikant 
ūmaus toksiškumo bandym ų metodus (šio priedo B.1 bis, B.1 tris skyriai 
(27), EBPO Bandym ų gairės Nr. 425 (19))].  Hershberger  biologiniam 
tyrimui reikia parinkti tokias dozes, kad b ūtų užtikrinta, jog chemin ę 
medžiagą duodant dešimt dien ų iš eilės ir dozę didinant iki maksimalaus  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
1 000 mg/kg/d kiekio gyv ūnas nenugaiš, jam nepasireikš reikšmingas 
toksinis poveikis ir jis nepatirs dideli ų kančių, kaip pažym ėta 35 ir 36 
punktuose. Šiuo tikslu toksiškumo gyv ūnams arba kan čių klinikiniams 
požymiams apib ūdinti galima remtis EBPO Rekomendaciniu dokumentu 
(17). Jeigu pagal š į dozės dydžio intervalo nustatymo tyrim ą tai yra 
įmanoma, po dešimties doz ės davimo dien ų, praėjus 24 valandoms po 
paskutinės dozės davimo, tiriamus audinius galima išpjauti ir pasverti. 
Tuomet tais duomenimis galima pasinaudoti pasirenkant dozes pagrindiniam tyrimui.
 
Etaloninės chemin ės medžiagos ir nešiklis  
38. Etaloninis androgen ų agonistas tur ėtų būti testosterono propionatas (TP), 
CAS Nr. 57–82–5. Etalonin ė TP dozė gali būti 0,2 mg/kg KM/d arba 0,4 
mg/kg KM/d. Etaloninis androgen ų antagonistas tur ėtų būti flutamidas (FT), 
CAS Nr. 1311–84–7. Etalonin ė FT dozė turėtų būti 3 mg/kg k ūno masės/d, 
FT reikėtų duoti kartu su etaloninio TP doze.  
39. Jeigu yra įmanoma, pirmiausia rekomenduojama naudoti vandenin į tirpalą 
arba suspensij ą. Tačiau, kadangi dauguma androgen ų ligandų arba jų meta­
bolinių prekursori ų dažnai b ūna hidrofobiniai, dažniausiai naudojamas 
tirpalas arba aliejin ė suspensija (pvz., su kukur ūzų, žemės riešutų, sezamo 
arba alyvuogi ų aliejumi). Bandom ąsias chemines medžiagas galima ištirpinti 
minimaliame 95 % etanolio arba kito atitinkamo tirpiklio kiekyje ir atskiesti 
iki darbin ės koncentracijos, esan čios bandomajame nešiklyje. Toksin ės 
tirpiklio savyb ės turėtų būti žinomos, jas reik ėtų išbandyti atskiroje kontro ­
linėje grupėje, kurioje naudojamas tik tirpiklis. Jeigu bandomoji chemin ė 
medžiaga yra laikoma stabilia, tam, kad lengviau tirpt ų, galima j ą lengvai 
pakaitinti, greitai mechaniškai pamaišyti. Reik ėtų nustatyti bandomosios 
cheminės medžiagos stabilum ą nešiklyje. Jeigu bandomoji chemin ė 
medžiaga per vis ą tyrimą išlieka stabili, galima parengti vien ą pradinę alik­
votinę bandomosios chemin ės medžiagos dal į ir kasdien j ą skiesti nustaty ­
tomis doz ėmis, ėmusis atsargumo priemoni ų, kad mėginiai neb ūtų užteršti ir 
sugadinti.  
Dozių davimas  
40. TP reik ėtų duoti poodin ėmis injekcijomis, FT – per virškinam ąjį traktą 
naudojant zond ą. 
41. Bandomoji chemin ė medžiaga duodama per virškinam ąjį traktą naudojant 
zondą arba poodin ėmis injekcijomis. Pasirenkant davimo b ūdą reikia atsiž ­
velgti į gyvūnų gerovę, taip pat į fizikines ir chemines bandomosios 
cheminės medžiagos savybes. Be to, prieš pradedant intensyvius ilgalaikius 
bandymus, jei injekcija gaunami teigiami rezultatai, taip pat reikia atsiž ­
velgti į toksikologinius aspektus, pavyzdžiui, artimum ą žmonių sąlyčio su 
chemine medžiaga b ūdui (pvz., zondu atkartojamas s ąlytis per virškinam ąjį 
traktą, poodinėmis injekcijomis – s ąlytis per kv ėpavimo takus arba sugertis 
per odą), į turimą toksikologin ę informacij ą ir duomenis apie metabolizm ą 
ir kinetiką (t. y. tai, kad reikia vengti pirmojo pasažo metabolizmo, arba tai, 
kad poveikis b ūna didesnis, jei duodama tam tikru b ūdu). 
42. Gyv ūnams dozes reik ėtų duoti tokiu pa čiu būdu ir periodiškumu dešimt 
dienų iš eilės maždaug kas 24 valandas. Doz ės dydį reikėtų kasdien tikslinti 
remiantis lygiagre čiai atliekamais k ūno masės matavimais. Doz ę ir davimo 
laiką reikėtų kasdien, davus doz ę, užrašyti. Kad gautus duomenis b ūtų 
galima prasmingai aiškinti, reik ėtų stengtis neviršyti maksimalios 35 punkte 
aptartos doz ės. Kūno masės sumažėjimą, klinikinius požymius ir kitus 
gautus duomenis tuo tikslu reik ėtų kruopščiai vertinti. Kaip virškinamojo 
trakto zond ą reikėtų naudoti skrandžio zond ą arba atitinkam ą intubacijos  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
vamzdelį. Didžiausias gyv ūnui duodamas vienkartinis skys čio tūris 
priklauso nuo bandomo gyv ūno dydžio. Reik ėtų laikytis vietos gyv ūnų 
priežiūros taisykli ų, tačiau šis kiekis netur ėtų būti didesnis kaip 5 ml/kg 
kūno masės, išskyrus vandeninius tirpalus, kuri ų galima duoti po 10 ml/kg 
kūno masės. Kai daromos poodin ės injekcijos, doz ės turėtų būti leidžiamos 
mentikaulio arba str ėnų srityje sterilia adata (pvz., 23 arba 25 dydžio) ir 
tuberkulino švirkštu. Injekcijos vietos nuskusti neb ūtina. Jei doz ė praran­
dama, injekcijos vietoje prateka arba suduodama ne visa, tai reik ėtų užra­ 
šyti. Bendras vienai žiurkei per dien ą sušvirkščiamas injekcijos kiekis netu ­
rėtų viršyti 0,5 ml/kg k ūno masės. 
Specialios androgen ų agonistams skirtos proced ūros 
43. Atliekant bandymus su androgen ų agonistais, nešiklio grup ė yra neigiamos 
kontrolės grupė, grupė, kuriai duodama TP doz ės, – teigiamos kontrol ės 
grupė. Androgen ų agonistų veikimą atitinkanti biologin ė veikla yra 
bandoma duodant bandom ąją cheminę medžiag ą pasirinktomis doz ėmis 
dozes gaunan čioms grup ėms 10 dien ų iš eilės. Bandomosios chemin ės 
medžiagos grup ės gyvūnų penkių pagalbini ų lyties audini ų masė yra lygi­
nama su nešiklio grup ės mase ir tikrinama, ar esama statistiškai reikšmingo 
masės padidėjimo.  
Specialios androgen ų antagonistams ir 5 α-reduktaz ės inhibitoriams 
skirtos proced ūros 
44. Atliekant bandymus su androgen ų antagonistais ir 5 α-reduktaz ės inhibito ­
riais, grup ė, kuriai duodama TP, yra neigiamos kontroles grup ė, o grupė, 
kuriai tuo pat metu duodamos etalonin ės TP ir FT doz ės yra teigiamos 
kontrolės grupė. Androgen ų antagonist ų ir 5α-reduktaz ės inhibitori ų 
veikimą atitinkan čios biologin ės veiklos bandymai atliekami duodant etalo ­
ninę TP dozę ir bandomosios chemin ės medžiagos doz ę 10 dien ų eilės. 
Grupės, kuriai duodama ir TP, ir bandomosios chemin ės medžiagos, gyv ūnų 
penkių pagalbini ų lyties audini ų masė yra lyginama su grup ės, kuriai 
duodama tik etalonin ė TP dozė, mase ir tikrinama, ar esama statistiškai 
reikšmingo mas ės padidėjimo.  
STEBĖJIMAI  
Klinikiniai steb ėjimai  
45. Bendrus klinikinius steb ėjimus reik ėtų atlikti bent kart ą per dieną ir dažniau, 
jei pastebima toksiškumo požymi ų. Stebėjimus geriausia atlikti tuo pa čiu 
metu, kiekvien ą dieną, atsižvelgiant į didžiausio laukiamo poveikio po 
dozės davimo laik ą. Reikėtų tikrinti visus gyv ūnus, ar jie nenugaišo, ar 
negaišta, vertinti bendrus klinikinius požymius, pavyzdžiui, elgsenos, 
odos, kailio, aki ų, gleivinės pakitimus, sekreto ir ekskrecij ų dažnį, autono­
minį aktyvum ą (pvz., ašarojim ą, plaukų pašiaušim ą, vyzdžio dyd į, neįprastą 
kvėpavimą). 
46. Jeigu gyv ūnas randamas nugaiš ęs, jis išimamas ir sutvarkomas, o jo 
duomenys toliau neanalizuojami. Duomenis apie gyv ūnus, nugaišusius iki 
nekroskopijos, reik ėtų įtraukti į tyrimo duomenis, kartu nurodyti akivaiz ­
džias nugaišimo priežastis. Visus gaištan čius gyvūnus reikėtų humaniškai 
numarinti. Duomenis apie gaišusius ir v ėliau numarintus gyv ūnus reikėtų 
įtraukti į tyrimo duomenis, kartu nurodyti akivaizdžias priežastis, d ėl kurių 
gyvūnai ėmė gaišti.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Kūno masė ir pašaro suvartojimas  
47. Visus gyv ūnus reikėtų kasdien pasverti 0,1 g tikslumu, pradedant sverti 
prieš pat tyrimo pradži ą, t. y. kai gyv ūnai suskirstomi į grupes. Kitas 
būdas – galima matuoti per tyrim ą kiekvieno narvelio gyv ūnų suvartojamo 
pašaro kiek į sveriant š ėrimo įrenginį. Pašaro suvartojimo rezultatus reik ėtų 
išreikšti gramais vienai žiurkei per dien ą. 
Skrodimas ir audini ų bei organ ų masės matavimas  
48. Praėjus maždaug 24 valandoms po paskutin ės bandomosios chemin ės 
medžiagos doz ės davimo žiurkes reik ėtų numarinti, nukraujinti įprasta 
tyrimą vykdančios laboratorijos taikoma tvarka ir atlikti nekroskopij ą. 
Duomenis apie humaniško numarinimo metod ą reikėtų įtraukti į laborato­
rijos ataskait ą. 
49. Idealiu atveju nekroskopijai gyv ūnus reikėtų imti atsitiktine tvarka iš įvairių 
grupių, siekiant išvengti tiesiogin ės didėjančios ar maž ėjančios progresijos 
kurioje nors doz ės grupėje, nes tai gal ėtų paveikti duomenis. Visus per 
nekroskopij ą gautus duomenis, t. y. apie patologinius poky čius ir (arba) 
matomus pažeidimus, reik ėtų pažymėti ir nurodyti ataskaitoje.  
50. Penkis nuo androgen ų priklausomus audinius (ventralin ę prostatos skilt į, 
sėklines pūsleles, išang ės pakeliam ąjį raumenį ir stormenin į akytkūnio 
raumenį, Kuperio liaukas, varpos galv ą) reikėtų pasverti. Šiuos audinius 
reikėtų išpjauti, atsargiai pašalinti nereikalingus suaugusius audinius ir 
riebalinį sluoksnį bei sverti šviežius (nefiksuotus). Kiekvien ą audinį reikėtų 
tvarkyti itin atsargiai, kad jie neprarast ų skysčių ir neišdži ūtų, nes dėl to gali 
rastis reikšming ų klaidų ir padid ėti duomen ų variacija, kadangi bus užre ­
gistruota mažesn ė masė. Kai kurie audiniai gali b ūti labai maži arba juos 
gali būti sunku išskrosti, jau d ėl to atsiras duomen ų variacija. Tod ėl svarbu, 
kad lyties pagalbini ų audinių skrodimą atliekantys asmenys išmanyt ų stan­
dartines ši ų audinių skrodimo proced ūras. EBPO yra parengusi standartin ės 
operavimo tvarkos (angl. SOP) vadov ą skrodimams (21). Kruopš čiai pasi­
rengus pagal standartin ės operavimo tvarkos vadov ą galima užtikrinti, kad 
galimų variacijos šaltini ų tyrime b ūtų kuo mažiau. Idealiu atveju už konkre ­
taus audinio skrodim ą turėtų būti atsakingas tas pats prozektorius, siekiant 
pašalinti skirtumus, galin čius atsirasti d ėl to, kad skirtingi prozektoriai audi ­
nius tvarko skirtingai. Jeigu to padaryti ne įmanoma, nekroskopij ą reikėtų 
suplanuoti taip, kad vienas prozektorius skrost ų tam tikrus vis ų dozes 
gavusių grupių gyvūnų audinius ir neb ūtų taip, kad vienas asmuo skrost ų 
visus kontrolin ės grupės gyvūnų audinius, o kitas b ūtų atsakingas už dozes 
gavusias grupes. Kiekvieno gyv ūno kiekvien ą lyties pagalbin į audinį reikėtų 
pasverti nenusausint ą 0,1 mg tikslumu ir mases užrašyti.  
51. Kai kurie audiniai gali b ūti labai maži arba juos gali b ūti sunku išskrosti, 
jau dėl to atsiras duomen ų variacija. Atliekant ankstesnius darbus nustatyta 
įvairių variacijos koeficient ų, kurie būna skirtingi ir priklauso nuo labora ­
torijos kompetencijos. Keletu atvej ų vienoje konkre čioje laboratorijoje buvo 
pastebėta didelių tokių audinių kaip ventralin ė prostatos skiltis arba Kuperio 
liaukos absoliu čios masės skirtum ų. 
52. Kepen ų, abiejų inkstų ir antinks čių masės matai n ėra privalomi. V ėlgi nuo 
audinių reikėtų pašalinti vis ą nereikaling ą fasciją ir riebalus. Kepenis reik ėtų 
pasverti ir duomenis užrašyti 0,1 g tikslumu, abu inkstus ir antinks čius 
reikėtų pasverti ir duomenis užrašyti 0,1 mg tikslumu. Kepenys, inkstai ir 
antinksčiai yra ne tik androgen ų veikiami organai; pagal juos taip pat 
galima ištirti naudingus sisteminio toksiškumo rodiklius.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Liuteinizuojan čio hormono (LH), folikulus stimuliuojan čio hormono (FSH) 
ir testosterono (T) kiekio serume matavimai n ėra privalomi. Testosterono 
lygis serume yra naudingas rodiklis, kai norima nustatyti, ar bandomoji cheminė medžiaga skatina testosterono metabolizm ą kepenyse, mažindama 
jo lygį serume. Neturint testosterono duomen ų toks poveikis gali b ūti 
priskirtas antiandrogeniniam mechanizmui. Liuteinizuojan čio hormono 
lygiai suteikia informacijos apie antiandrogeno geb ėjimą ne tik mažinti 
organo mas ę, bet ir paveikti pogumburio–hipofiz ės funkciją, o tai atliekant 
ilgalaikius tyrimus gali paskatinti atsirasti s ėklidžių auglius. Folikulus 
stimuliuojantis hormonas yra svarbus spermatogenez ės hormonas. T4 ir 
T3 kiekio serume rodikliai taip pat n ėra privalomi, bet suteikia naudingos 
papildomos informacijos apie geb ėjimą ardyti skydliauk ės hormon ų 
homeostaz ę. Jeigu reikia atlikti hormon ų matavimus, žiurk ėms prieš nekros ­
kopiją reikėtų duoti anestetiko ir atliekant kardialin ę punktacij ą paimti j ų 
kraujo, anestezijos metod ą reikėtų pasirinkti atidžiai – tok į, kuris nedaryt ų 
poveikio hormon ų matavimui. Serumo paruošimo metod ą, radioimunologin ę 
analizę arba kitas matavimo priemones, analiz ės procedū
ras ir rezultatus 
reikėtų aprašyti. Liuteinizuojan čio hormono lygius reik ėtų nurodyti ng 
viename serumo ml, testosterono lyg į taip pat reik ėtų nurodyti ng viename 
serumo ml.  
54. Audini ų skrodimas yra aprašytas išsamiame skrodimo vadove, kuriame kaip 
papildoma medžiaga pateikiamos vykdant tinkamumo patvirtinimo programą padarytos nuotraukos (21). Skrodimo vaizdin ė medžiaga yra 
paskelbta Kor ėjos maisto ir vaist ų administracijos tinklalapyje (22).
 
— Gyvūną paguldžius ventraline puse į viršų patikrinti, ar apyvarp ė yra 
atsiskyrusi nuo varpos galvos. Jei taip, atitraukti apyvarp ę ir atskirti 
varpos galv ą, ją pasverti (0,1 mg tikslumu) ir mas ę užrašyti.  
— Atverti pilvo od ą ir sienel ę, atidengiant vidaus organus. Jeigu norima 
pasverti neprivalomus sverti organus, išimti ir 0,1 g tikslumu pasverti 
kepenis, išimti skrand į ir žarnas, išimti ir 0,1 mg tikslumu pasverti abu 
inkstus ir antinks čius. Šiuos organus išpjovus atidengiama šlapimo p ūslė 
ir pradedamas tiriam ų vyriškųjų pagalbini ų audinių skrodimas.  
— Norint išpjauti ventralin ę prostatos skilt į, šlapimo p ūslę reikia atskirti 
nuo ventralinio raumen ų sluoksnio išilgai, per vidur į perpjaunant jungia ­
mąjį audinį. Šlapimo p ūslę pastumti į priekį sėklinių pūslelių link, 
atidengiant kairi ąją ir dešini ąją ventralin ės prostatos skiltis (dengiamas 
riebalinio sluoksnio). Atsargiai nupjauti riebalin į sluoksnį nuo dešinio ­
sios ir kairiosios ventralin ės prostatos skil čių. Švelniai išstumti ventra ­
linės prostatos dešini ąją skiltį iš šlaplės ir nupjauti. Laikant dešini ąją 
ventralinės prostatos skilt į, švelniai išstumti ventralin ės prostatos kairi ąją 
skiltį iš šlaplės ir nupjauti; 0,1 mg tikslumu pasverti ir mas ę užrašyti.  
— Norint išpjauti s ėklines pūsleles ir koaguliacijos liaukas, reikia pastumti 
šlapimo p ūslę uodegos link, atidengiant s ėklinį lataką ir dešini ąją bei 
kairiąją sėklines pūsleles ir koaguliacijos liaukas. Kad neištek ėtų skystis, 
hemostatu užspausti s ėklinių pūslelių ir koaguliacijos liauk ų pagrindą 
sėklinio latako ir šlapl ės susijungimo vietoje. Atsargiai išpjauti s ėklines 
pūsleles ir koaguliacijos liaukas, nenu ėmus hemostato nupjauti riebalus 
ir jungiamuosius audinius, įdėti į prieš tai pasvert ą svėrimo vonel ę, 
nuimti hemostat ą, 0,1 mg tikslumu pasverti ir mas ę užrašyti.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— Norint išpjauti išang ės pakeliam ąjį raumenį ir stormenin į akytkūnio 
raumenį atidengiami raumenys ir varpos pagrindas. Išang ės pakeliamieji 
raumenys yra išsid ėstę aplink gaubtin ę žarną, priešakin ė išangės pake­
liamojo raumens ir stormeninio akytk ūnio raumens dalis yra prisitvirti ­
nusi prie varpos stormens. Oda ir jungiamieji audiniai atskiriami nuo 
tarpvietės, einančios nuo varpos pagrindo iki priekin ės išangės dalies. 
Stormeniniai akytk ūnio raumenys laipsniškai nupjaunami nuo stormens 
ir audinių. Gaubtin ė žarna perpjaunama į dvi dalis, tada galima išpjauti 
ir išimti vis ą išangės pakeliamojo raumens ir stormeninio akytk ūnio 
raumens blok ą. Nuo išang ės pakeliamojo raumens ir stormeninio akyt ­
kūnio raumens reik ėtų nupjauti riebalin į sluoksnį ir jungiamuosius audi ­
nius, išang ės pakeliam ąjį raumenį ir stormenin į akytkūnio raumen į 0,1 g 
tikslumu pasverti ir mas ę užrašyti.  
— Išėmus išang ės pakeliam ąjį raumenį ir stormenin į akytkūnio raumen į, 
abipus ir giliau į dorsalinę pusę nuo varpos stormens yra po Kuperio 
arba stormenin ę šlaplės liauką. Jas reikia išpjauti labai atsargiai, sten ­
giantis nepradurti plonos kapsul ės, kad neištek ėtų skystis. Abi Kurperio 
liaukas 0,1 mg tikslumu pasverti, mas ę užrašyti.  
— Jeigu iš kurios nors liaukos per nekroskopij ą arba skrodim ą išteka 
skystis, tai taip pat reik ėtų užrašyti.  
55. Jeigu kiekvienai cheminei medžiagai įvertinti reikia atlikti didesnio kiekio 
gyvūnų nekroskopij ą negu der ėtų per vien ą dieną, tyrimo pradži ą galima 
išdėstyti dviem iš eil ės dienoms, tada nekroskopija ir su ja susij ę darbai 
paskirstomi dviem dienoms. Jeigu darbas taip paskirstomas, per vien ą dieną 
reikėtų panaudoti pus ę dozes gaunan čios grupės gyvūnų. 
56. Po skrodimo gyv ūnų kūnus reikėtų tinkamai sutvarkyti.  
ATASKAITA  
Duomenys  
57. Duomenys (t. y. k ūno masė, pagalbini ų lyties audini ų masė, neprivalomi 
matavimai ir kitos reakcijos bei pastabos) nurodomi apie kiekvien ą gyvūną 
ir apie kiekvien ą gyvūnų grupę (visų atliktų matavim ų vidurkiai ir standar ­
tiniai nuokrypiai). Duomenys apibendrinami lentel ėse. Reikėtų nurodyti 
gyvūnų skaičių bandymo pradžioje, gyv ūnų, kurie vykstant bandymui 
rasti nugaiš ę arba kuriems pasireišk ė toksiškas poveikis, pasteb ėto toksiško 
poveikio požymiai, įskaitant j ų pasireiškimo pradži ą, trukmę ir stiprum ą. 
58. Galutin ėje ataskaitoje tur ėtų būti pateikiama ši informacija:  
Bandymą atliekanti įstaiga:  
— įstaigos pavadinimas, adresas;  
— tyrimo vadovas, kitas personalas ir j ų pareigos tyrime;  
— tyrimo pradžios ir pabaigos datos, t. y. atitinkamai pirma bandomosios 
cheminės medžiagos davimo diena ir paskutin ė nekroskopijos diena.  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— bandomosios (- ųjų) chemin ės (-ių) medžiagos (- ų) šaltinis, partijos/ ­
siuntos numeris, tapatumas, grynumas, visas tiek ėjo adresas ir bando ­
mosios (- ųjų) cheminės (-ių) medžiagos (- ų) apibūdinimas;  
— fizikin ė būsena ir, jei svarbu, fizikin ės ir chemin ės savybės; 
— laikymo s ąlygos, skiedimo metodas ir periodiškumas;  
— visi surinkti duomenys apie stabilum ą; 
— visų dozių tirpalų arba suspensij ų analizė. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Nešiklis:  
— nešiklio apib ūdinimas (pob ūdis, tiekėjas ir partijos numeris);  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas (jei nešiklis ne vanduo).  
Bandomieji gyv ūnai ir gyv ūnų priežiūra: 
— rūšis/veislė ir jų pasirinkimo pagrindimas;  
— gyvūnų šaltinis arba tiek ėjas, įskaitant vis ą adresą; 
— pristatyt ų gyvūnų skaičius ir amžius;  
— laikymo s ąlygos (temperat ūra, apšvietimas ir t. t.);  
— pašarai (pavadinimas, r ūšis, tiekėjas, sudėtis ir, jei žinoma, fitoestrogen ų 
kiekis);  
— kraikas (pavadinimas, r ūšis, tiekėjas, sudėtis); 
— laikymo narveliuose s ąlygos ir viename narvelyje laikom ų gyvūnų skai­ 
čius. 
Analizės sąlygos:  
— amžius kastravimo metu, aklimatizacijos po kastravimo trukm ė; 
— kiekvieno gyv ūno kūno masė bandymo pradžioje (0,1 g tikslumu);  
— atsitiktin ės atrankos procesas, suskirstymas į nešiklio, etalonin ės ir 
bandomosios chemin ės medžiagos grupes ir narvelius;  
— kiekvienos grup ės gyvūnų kūno masės vidurkis ir standartinis nuokrypis 
padieniui per vis ą tyrimą; 
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi doz ės dydžio pasirinkim ą; 
— tai, kaip bandomoji chemin ė medžiaga duodama, ir pagrindin ė prie­ 
žastis, nul ėmusi davimo b ūdo pasirinkim ą; 
— jeigu tiriamas antiandrogeninis poveikis, duodamas TP (doz ė ir koncent ­
racija);  
— duodama bandomoji chemin ė medžiaga (doz ė ir koncentracija);  
— dozės davimo laikas;  
— nekroskopijos proced ūros, įskaitant nukraujinimo, anestezavimo 
priemones;  
— jeigu atliekama serumo analiz ė, reikėtų pateikti duomenis apie metod ą. 
Pavyzdžiui, jeigu taikoma radioimunoanaliz ė (RIA), reik ėtų aprašyti 
RIA proced ūrą, RIA priemoni ų rinkinio šaltin į, priemoni ų rinkinio 
galiojimo pabaigos datas, scintiliacij ų skaičiavimo proced ūrą, standarti ­
zavimą. 
Rezultatai:  
— kiekvieno gyv ūno kasdienio steb ėjimo dozi ų davimo laikotarpiu 
duomenys, tarp j ų: 
— kūno masė (0,1 g tikslumu);  
— klinikiniai požymiai (jei yra);  
— visi pašar ų suvartojimo matavimai arba pastabos;  
— pastabos apie kiekvieno gyv ūno nekroskopij ą, tarp jų: ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— nekroskopijos data;  
— dozes gavusi gyv ūnų grupė; 
— gyvūno identifikavimo žyma;  
— prozektorius;  
— nekroskopijos ir skrodimo laikas;  
— gyvūno amžius;  
— galutin ė kūno masė nekroskopijos metu, pažymint statistiškai reikš ­
mingą padidėjimą arba sumaž ėjimą; 
— gyvūnų nukraujinimo ir skrodimo per nekroskopij ą tvarka;  
— penkių tiriamų nuo androgen ų priklausom ų audinių masė: 
— ventralin ės prostatos skilties (0,1 mg tikslumu);  
— sėklinių pūslelių ir koaguliacijos liauk ų su skys čiu (abiejų, 0,1 mg 
tikslumu);  
— išangės pakeliamojo raumens ir stormeninio akytk ūnio raumens 
komplekso (0,1 mg tikslumu);  
— Kuperio liauk ų (abiejų masė sveriant šviežias, 0,1 mg tikslumu);  
— varpos galvos (mas ė sveriant švieži ą, 0,1 mg tikslumu);  
— kitų pasirinkt ų audinių masė, jei audiniai sveriami:  
— kepen ų (0,1 g tikslumu);  
— inkstų (abiejų, 0,1 mg tikslumu);  
— antinks čių (abiejų, 0,1 mg tikslumu);  
— bendros pastabos ir komentarai.  
— Serume esan čių hormonų analizė, jei atliekama:  
— liuteinizuojan čio hormono kiekis serume (neprivaloma – ng/serumo 
ml) ir  
— testosterono kiekis serume (neprivaloma – ng/serumo ml);  
— bendros pastabos ir komentarai.  
Duomenų apibendrinimas  
Duomenis reik ėtų apibendrinti lentel ėje, kurioje reik ėtų nurodyti kiekvienos 
grupės imties dyd į, verčių vidurkį, standartin ę vidurkio paklaid ą arba stan ­
dartinį nuokrypį. Lentelėse reikėtų nurodyti k ūno masę nekroskopijos metu, 
kūno masės pokyčius nuo dozi ų davimo pradžios iki nekroskopijos, tiriam ų 
pagalbinių lyties audini ų masę, kitų pasirinktinai tiriam ų organų masę. 
Rezultatų aptarimas  
Rezultatų analizė 
59. Kūno ir organo, kurio nekroskopija atliekama, mas ę reikėtų statistiškai 
analizuoti, vertinant variacij ų vienalytiškum ą palyginti su atitinkamomis 
duomenų transformacijomis, jeigu to reikia. Bandom ųjų grupių rezultatus 
reikėtų lyginti su kontrolin ės grupės rezultatais taikant tokius metodus kaip 
ANOVA, taip pat atliekant porini ų duomen ų palyginimus (pvz.,  Dunett  
vienakryptis bandymas) ir analiz ę pagal statistinio skirtumo kriterij ų, pvz., 
p ≤ 0,05. Tas grupes, kurios įvertintos kaip statistiškai reikšmingos, reik ėtų 
pažymėti. Tačiau „santykin ės organo“ mas ės reikėtų vengti d ėl to, kad 
statistinės prielaidos, kuriomis grindžiama ši duomen ų manipuliacija, yra 
nepagrįstos. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. Kai tiriamas androgen ų agonistų veikimas, kontroline grupe tur ėtų būti 
bandymo grup ė, kuriai duodamas tik nešiklis. Bandomajai cheminei 
medžiagai b ūdingas veikimo b ūdas gali sukelti santykinai skirting ą audinių 
atsaką, pavyzdžiui, trenbolonas, kurio 5 alfa-reduktaz ė negali veikti, daro 
ryškesnį poveikį išangės pakeliamajam raumeniui, stormeniniam akytk ūnio 
raumeniui ir varpos galvai, palyginti su TP. Statistiškai reikšming ą (p≤ 
0,05) bet kuri ų dviejų arba didesnio skai čiaus tiriam ų nuo androgen ų 
priklausom ų audinių (ventralin ės prostatos skilties, išang ės pakeliamojo 
raumens ir stormeninio akytk ūnio raumens, varpos galvos, Kuperio liauk ų 
ir sėklinių pūslelių bei koaguliacijos liauk ų) masės padidėjimą reikėtų 
laikyti teigiamu androgen ų agonistų tyrimo rezultatu; tur ėtų pasireikšti 
kiek didesnis vis ų tiriamų audinių augimas. Jungtin į visų pagalbini ų lyties 
organų (angl. ASO) audini ų atsako įvertinimą galima atlikti taikant atitin ­
kamą daugiavarian čių duomenų analizę. Taip galima pagerinti analiz ę, ypač 
tais atvejais, kai statistiškai reikšmingas atsakas pastebimas tik viename audinyje.
 
61. Kai tiriamas androgen ų antagonist ų veikimas, kontroline grupe tur ėtų būti 
bandymo grup ė, kuriai duodama etaloninio androgeno (vien testosterono 
propionato). Bandomajai cheminei medžiagai b ūdingas veikimo b ūdas gali 
sukelti santykinai skirting ą audinių atsaką, pavyzdžiui, 5 alfa-reduktaz ės 
inhibitoriai, tokie kaip finasteridas, daro ryškesn į poveikį ventralinei pros ­
tatos skilčiai negu kitiems audiniams, palyginti su stipriais androgen ų anta­
gonistais, tokiais kaip flutamidas. Statistiškai reikšming ą (p≤ 0,05) bet kuri ų 
dviejų arba didesnio skai čiaus tiriam ų nuo androgen ų priklausom ų audinių 
(ventralin ės prostatos skilties, išang ės pakeliamojo raumens ir stormeninio 
akytkūnio raumens, varpos galvos, Kuperio liauk ų ir sėklinių pūslelių bei 
koaguliacijos liauk ų) masės sumažėjimą vien dėl duoto TP reik ėtų laikyti 
teigiamu androgen ų antagonist ų tyrimo rezultatu; tur ėtų pasireikšti kiek 
mažesnis vis ų tiriamų audinių augimas. Jungtin į visų pagalbini ų lyties 
organų audinių atsako įvertinimą galima atlikti taikant atitinkam ą daugiava ­
riančių duomenų analizę. Taip galima pagerinti analiz ę, ypač tais atvejais, 
kai statistiškai reikšmingas atsakas pastebimas tik viename audinyje.  
62. Duomenis reik ėtų apibendrinti lentel ėje, kurioje reik ėtų nurodyti kiekvienos 
grupės imties ver čių vidurkį, standartin ę vidurkio paklaid ą (standartin į 
nuokrypį taip pat galima nurodyti) ir imties dyd į. Taip pat reik ėtų pateikti 
lenteles su kiekvieno gyv ūno duomenimis. Kiekvieno gyv ūno duomen ų 
vertes, vidurkius, kontrolini ų duomen ų standartin ę paklaidą (standartin į 
nuokrypį) ir variacijos koeficient ą reikėtų išanalizuoti ir patikrinti, ar jie 
atitinka priimtinus nuoseklaus der ėjimo su numatytomis anks čiau surinkt ų 
duomenų vertėmis kriterijus. Jeigu variacijos koeficientai viršija 1 lentel ėje 
nurodytas kiekvieno organo masei nustatyt ų variacijos koeficient ų vertes 
(žr. 25 ir 26 punktus), reik ėtų patikrinti šiuos dalykus: gal duomenys 
buvo klaidingai užrašyti arba įvesti arba laboratorija dar neišmoko tiksliai 
atlikti nuo androgen ų priklausom ų audinių skrodimo ir reikalingas tolesnis 
mokymasis/praktika. Apskritai variacijos koeficientas (standartinis 
nuokrypis, padalytas iš organo mas ės vidurkio) yra skirtingose laboratori ­
jose ir tyrimuose atkuriamas rodiklis. Tarp pateikt ų duomenų turėtų būti 
bent šie: ventralin ės prostatos skilties, s ėklinių pūslelių, išangės pakeliamojo 
raumens ir stormeninio akytk ūnio raumens, Kuperio liauk ų, varpos galvos, 
kepenų, kūno masė ir kūno masės pokytis nuo dozi ų davimo pradžios iki 
nekroskopijos. Pateikiant duomenis k ūno masę taip pat galima perskai čiuoti 
pritaikius kovariacij ą, tačiau šių duomenų nereikėtų įrašyti vietoj neperskai ­ 
čiuotų duomen ų. Be to, jeigu kurios nors grup ės gyvūnų apyvarp ė dar 
neatsiskyrusi, apyvarp ės atsiskyrim ą reikėtų registruoti ir statistiškai lyginti 
su kontroline grupe, tam taikant tiksl ųjį Fišerio (angl.  Fisher Exact ) testą. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Tikrinant kompiuterini ų duomenų įvestis ir lyginant su pradiniais duomen ų 
lapais tikslumui užtikrinti, organo mas ės vertės, kurios biologiškai yra 
neįmanomos arba kurios daugiau negu trimis standartiniais nuokrypiais 
skiriasi nuo doz ę gavusios grup ės vidurkio, tur ėtų būti atidžiai tikrinamos, 
kai kurias gali tekti išimti kaip galimas duomen ų užrašymo klaidas.  
64. Tvirtinant tyrimo rezultat ų tinkamum ą svarbus rezultat ų aiškinimo etapas 
dažnai būna tyrimo rezultat ų palyginimas su EBPO variacijos koeficient ų 
vertėmis (1 lentel ė). Ankstesnius nešiklio kontrolini ų grupių duomenis 
reikėtų saugoti laboratorijoje. Ankstesnius duomenis apie atsak ą į teigiamas 
etalonines chemines medžiagas, pavyzdžiui, TP ir FT, taip pat reik ėtų 
saugoti laboratorijoje. Laboratorijos taip pat gali periodiškai išbandyti atsak ą 
į žinomus silpnus androgen ų agonistus ir saugoti šiuos duomenis. Šiuos 
duomenis galima palyginti su turimais EBPO duomenimis, taip užtikrinant, kad pagal laboratorijos metodus atliekami tyrimai b ūtų pakankamai statis ­
tiškai tiksl ūs ir turėtų pakankam ą statistinę galią.
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
1 priedėlis 
SĄVOKOS  
Androgeninis  sąvoka, vartojama teigiamam poveikiui nuo androgen ų priklau­
somų audinių augimui apib ūdinti.  
Antiandrogeninis poveikis  tai chemin ės medžiagos savyb ė stabdyti testosterono 
propionato veikim ą žinduolių organizme.  
Cheminė medžiaga  tai medžiaga arba mišinys.  
Atsivedimo data  yra 0 postnatalin ė diena.  
Dozė duodamas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis. Atliekant  Hershberger  
biologinį tyrimą dozė išreiškiama bandomosios chemin ės medžiagos mase bando ­
mojo gyv ūno kūno masės vienetui per dien ą (pvz., mg/kg k ūno masės/per dien ą). 
Dozavimas  bendras terminas, apimantis doz ės dydį, jos dažn į ir dozavimo 
trukmę. 
Gaištantis  sąvoka, kuria apib ūdinamas gaištantis gyv ūnas, t. y. gyv ūno, kuris 
netrukus nugaiš, b ūsena.  
X postnatalin ė diena  X-oji gyvenimo diena nuo atsivedimo.  
Jautrumas  galimybė taikant bandym ų metodą teisingai identifikuoti savybi ų, dėl 
kurių atliekamas bandymas, turin čias chemines medžiagas.  
Specifiškumas  galimybė taikant bandym ų metodą teisingai identifikuoti savybi ų, 
dėl kurių atliekamas bandymas, neturin čias chemines medžiagas.  
Bandomoji chemin ė medžiaga  bet kuri pagal š į bandym ų metodą bandoma 
medžiaga arba mišinys.  
Tinkamumo patvirtinimas  mokslinis procesas, kurio paskirtis – aprašyti darbo 
reikalavimus ir bandym ų metodo apribojimus siekiant parodyti metodo patiki ­
mumą ir tinkamum ą konkrečiam tikslui.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
2 priedėlis
 
VMG-mamm: Bandym ų su žinduoliais ir žinduoli ų vertinimo tinkamumo patvirtinimo valdymo grup ė (angl. Validation Management Group on Mammalian Testing and Assess ­
ment)
 PASTABOS D ĖL KONCEPTUALIOS SISTEMOS  
1 pastaba.  Pradėti dalyvauti tyrime ir pasitraukti iš tyrimo galima visais 
lygmenimis; tai priklauso nuo esam ų informacijos poreiki ų pavo­
jingumo ir rizikos vertinimo tikslais.  
2 pastaba.  5 lygmeniu ekotoksikologija tur ėtų apimti vertinam ąsias baigtis, 
kuriomis žymimi žalingo poveikio mechanizmai ir galima žala populiacijai.
 
3 pastaba.  Kai daugialypis modelis apima keleto atskir ų vertinam ųjų baigčių 
tyrimą, tas modelis b ūtų taikomas vietoj pavieni ų vertinam ųjų 
baigčių analizės. 
4 pastaba.  Kiekviena chemin ė medžiaga tur ėtų būti vertinama kiekvienu 
atveju atskirai, atsižvelgiant į visą turimą informacij ą ir koncep ­
tualios sistemos lygmenis.  
5 pastaba.  Kol kas šis planas apima ne visk ą. 3, 4 ir 5 lygmenyse jis apima 
analizę, kurią vykdyti jau galima arba kurios tinkamumas dar 
tvirtinamas. Antrosios grup ės analizė įtraukta preliminariai. Kai 
ji bus išpl ėtota ir patvirtinta, ja planas bus oficialiai papildytas.  
6 pastaba.  Nereik ėtų suprasti, kad 5 lygmuo apima tik baigiamuosius 
bandymus. Šiuo lygmeniu įtraukiami bandymai laikomi padedan ­ 
čiais įvertinti bendr ą pavojingum ą ir riziką. 
LITERAT ŪROS ŠALTINIAI  
(1) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10  th -11 th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. 
Academic Press, NY.  
(3) Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate 
the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and anti ­
androgenic activity in castrate-immature male rats. In:  Current Protocols 
in Toxicology  16.9.1–16.9.15. J Wiley and Sons Inc.  
(4) OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the valida ­
tion of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testos ­
terone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental Health and SAFEty, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 62. 
ENV/JM/MONO(2006)30.  
(5) OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists 
and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories. Environmental Health and SAFEty, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 86. ENV/JM/MONO(2008)3.  
(6) OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate 
Model Protocol. Environmental Health and SAFEty, Monograph Series on Testing and Assessment N
 o 73. ENV/JM/MONO(2007)20.  
(7) Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). 
The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use 
of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized 
protocol. Env. Health Persp. 114:1265–1269.
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
(8) Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E 
(2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to 
screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671–8.
 
(9) Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. 
Biochem J26:413–422.  
(10) Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated 
male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem 
J26:1306–1314.  
(11) Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an 
index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp 
Therap 99:38–44.  
(12) Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113–119.
 
(13) Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19- 
nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175–180.  
(14) Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and 
myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.  
(15) Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in 
Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151–220.
 
(16) Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: 
Humana Press, p 38.  
(17) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on 
Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.  
(18) OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
– Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92–64–12367–9, Paris.  
(19) OECD (2008). Acute oral toxicity – up-and-down procedure. OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(20) OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental 
Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No 24. 
ENV/JM/MONO(2001)4.  
(21) Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265–1269. Žr. The dissection guidance provided to the labo ­
ratories, II skyri ų: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.
 
(22) Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hersh ­
berger assay procedure, including a dissection video. http://rndmoa.kfda. ­
go.kr/endocrine/reference/education_fr.html.  
(23) OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay. Environmental Health and SAFEty Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.
 
(24) OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
(25) OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic proper ­
ties. Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
(26) 2010 m. rugs ėjo 22 d. Europos Parlamento ir Tarybos direktyva 
2010/63/ES d ėl mokslo tikslais naudojam ų gyvūnų apsaugos (OL L 276, 
2010 10 20, p. 33).  
(27) Šie šio priedo skyriai:  
B.1 bis „ Ūmus toksiškumas per virškinam ąjį traktą. Fiksuot ųjų dozių 
metodas“  
B.1 tris „ Ūmus toksiškumas per virškinam ąjį traktą. Ūmaus toksiškumo 
klasės metodas“.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56.  IŠPLĖSTINIS TOKSIŠKUMO VIENOS KARTOS DAUGINIMUISI 
BANDYMAS  
ĮVADAS  
1. Šis bandym ų metodas atitinka EBPO Bandym ų gaires (angl. OECD  Test 
Guideline  (TG)) Nr. 443 (2012). Jis parengtas pagal Tarptautinio gyvyb ės 
mokslų instituto (angl. ILSI) Sveikatos ir aplinkos moksl ų instituto (angl. 
HESI) Žem ės ūkio chemini ų medžiag ų saugos įvertinimo (angl. ASCA) 
techninio komiteto pasi ūlymą dėl vienos kartos dauginimosi bandymo, 
išplėsto iki F  1 gyvenimo etapo, paskelbt ą Cooper et al., 2006 (1). Bandymo 
modelis buvo patobulintas ir išsamiau paaiškintas siekiant, kad jis b ūtų 
lankstesnis ir b ūtų pabrėžta, jog bandym ą pradedant yra svarbu remtis turi ­
mais duomenimis, o v ėliau stebint gyvus gyv ūnus bandym ą pakreipti 
reikiama linkme ir pritaikyti pagal poreikius. Pagal š į bandym ų metodą 
pateikiamas išsamus aprašas, kaip vykdomas Išpl ėstinis toksiškumo vienos 
kartos dauginimuisi bandymas. Pagal bandym ų metodą aptariamos trys F  1 
gyvūnų kohortos:  
1 kohorta: vertinamos dauginimosi/vystymosi vertinamosios baigtys; š į 
pogrupį galima išpl ėsti – įtraukti F  2 kartą; 
2 kohorta: vertinamas galimas s ąveikos su chemine medžiaga poveikis 
nervų sistemos vystymuisi;  
3 kohorta: vertinamas galimas s ąveikos su chemine medžiaga poveikis 
imuninės sistemos vystymuisi.  
2. Sprendimai, ar vertinti antr ą gyvūnų kartą, ar atsisakyti neurotoksiškumo 
vystymuisi vertinimo kohortos ir (arba) imunotoksiškumo vystymuisi verti ­
nimo kohortos, priimami pagal turimas žinias apie vertinam ą cheminę 
medžiagą ir pagal įvairių reguliavimo institucij ų poreikius. Bandym ų 
metodo tikslas – surinkti išsamius duomenis apie tai, kaip b ūtų galima 
atlikti bandym ą ir kaip reik ėtų vertinti kiekvien ą gyvūnų kohortą. 
3. Rėmimosi vidaus kriterijais priimant sprendimus d ėl antros gyv ūnų kartos 
tvarka, skirta toms reguliavimo institucijoms, kurios tokius kriterijus taiko, 
aptarta EBPO Rekomendaciniame dokumente (angl.  Guidance Document ) 
Nr. 117 (39).  
PRADINIAI ASPEKTAI IR TIKSLAI  
4. Pagrindinis išpl ėstinio toksiškumo vienos kartos dauginimuisi bandymo 
tikslas – įvertinti tam tikrus per kitokio pob ūdžio toksiškumo tyrimus never ­
tinamus gyvenimo etapus ir išbandyti poveik į, kurį gali sukelti s ąlytis su 
chemine medžiaga prenataliniu ir postnataliniu laikotarpiais. Kai tiriamos dauginimosi vertinamosios baigtys, yra numatyta, kad, norint nustatyti poveikį patinėlių ir pateli ų dauginimosi organams, pirmiausia pasinaudo ­
jama informacija, gauta iš kartotini ų dozių tyrimų (įskaitant toksiškumo 
dauginimosi sistemai atrankos tyrimus, pvz. žr. EBPO Bandym ų gaires 
Nr. 422 (32)) arba trumpalaiki ų endokrinin ę sistemą galimai ardan čių 
medžiagų atrankos analizi ų (pvz., Poveikiu gimdai pagr įstos analiz ės – 
bandymų metodas B.54 (36) ir  Hershberger  analizės – bandym ų metodas 
B.55 (37)), jei tokios informacijos turima. Be kita ko gali b ūti atliekama: 
patinėliams – rujos cikl ų spermatogenez ė (sėklidžių histopatologija), pate ­
lėms – skai čiuojami folikulai/vertinamas oocit ų subrendimas, kiaušidži ų 
vientisumas (histopatologija). Taigi išpl ėstinis toksiškumo vienos kartos 
dauginimuisi bandymas padeda ištirti dauginimosi vertinam ąsias baigtis, 
kurioms įvertinti reikalinga patin
ėlių ir patelių sąveika, patel ės su apvaisin ­
tais kiaušin ėliais, patel ės su palikuonimis ir F  1 karta iki šios kartos gyv ūnų 
lytinio subrendimo (išsamesn ės informacijos apie š į bandymų metodą yra 
pateikta EBPO Rekomendaciniame dokumente Nr. 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Šis bandym ų metodas yra skirtas įvertinti, kok į poveikį cheminės medžiagos 
daro vystymuisi prenataliniu ir postnataliniu laikotarpiais, taip pat nuodug ­
niai įvertinti sistemin į toksiškum ą vaikingoms ir žindan čioms patel ėms bei 
jauniems ir suaugusiems palikuonims. Išsami pagrindini ų vystymosi verti ­
namųjų baigčių, pavyzdžiui, palikuoni ų gyvybingumo, k ą tik gimusi ų 
jauniklių sveikatos, išsivystymo atsivedant, fizinio ir funkcinio vystymosi 
iki subrendimo, analiz ė turėtų padėti nustatyti konkre čius tirtinus palikuoni ų 
organus. Be to, atliekant bandym ą bus gauta ir (arba) patvirtinta informacija 
apie bandomosios chemin ės medžiagos poveik į suaugusi ų patinėlių ir 
patelių dauginimosi sistem ų vientisumui ir funkcionavimui. Konkre čiai 
nagrinėjami šie parametrai (bet ne tik): lytini ų liaukų funkcija, rujos ciklas, 
spermos brendimas ants ėklidžiuose, elgsena poruojantis, apvaisinimas, 
gestacija, atsivedimas ir laktacija. Be to, informacija, gauta atliekant neuro ­
toksiškumo ir imunotoksiškumo vystymuisi vertinimus, bus apib ūdintas 
galimas poveikis toms sistemoms. Per šiuos bandymus gauti duomenys turėtų pad
ėti nustatyti nepasteb ėto neigiamo poveikio doz ės ribas (angl. 
NOAEL), žemiausias pasteb ėto neigiamo poveikio doz ės ribas (angl. 
LOAEL) ir (arba) etalonines dozes pagal įvairias vertinam ąsias baigtis; 
dar šiuos duomenys b ūtų galima panaudoti per ankstesnius kartotini ų 
dozių tyrimus nustatytam poveikiui apib ūdinti ir (arba) tolesniems bandy ­
mams pakreipti reikiama linkme.  
6. Protokolas schematiškai pavaizduotas 1 pvz., Kelioms lytiškai subrendusi ų 
patinėlių ir patelių grupėms nepertraukiamai duodamos skirtingos bandomo ­
sios chemin ės medžiagos doz ės. Šiai tėvinei (P) kartai doz ės duodamos 
nustatytą laikotarp į iki poravimosi (šis laikotarpis pasirenkamas pagal 
turimą informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiag ą, bet turi b ūti ne 
trumpesnis kaip dvi savait ės) ir dvi savaites per poravimosi laikotarp į. P 
patinėliai toliau tiriami bent iki F  1 nujunkymo. Dozes jiems reik ėtų duoti ne 
trumpiau kaip 10 savai čių. Dozes galima duoti ir ilgiau, jeigu poveik į 
dauginimuisi reikia išsiaiškinti tiksliau. P patel ėms dozės nepertraukiamai 
duodamos gestacijos ir laktacijos laikotarpiais iki bandymo nutraukimo, kai 
jų vados nujunkomos (t. y. doz ės duodamos 8–10 savai čių). F  1 palikuonys 
toliau gauna bandomosios chemin ės medžiagos dozes nuo nujunkymo iki 
brandos.Jeigu vertinama antra karta (žr. EBPO Rekomendacin į dokument ą 
Nr. 117 (39)), F  1 palikuonims doz ės duodamos iki F  2 nujunkymo arba iki 
bandymo nutraukimo.  
7. Visi gyv ūnai stebimi kliniškai ir atliekami patologiniai tyrimai toksiškumo 
požymiams nustatyti, ypa č daug dėmesio skiriant patin ų ir patelių daugini­
mosi sistem ų vientisumui ir funkcionavimui bei palikuoni ų sveikatai, 
augimui ir vystymuisi. Nujunkyti ir atrinkti palikuonys suskirstomi į specia­
lius pogrupius (1–3 kohortas, žr. 33, 34 punktus ir 1 schem ą) ir tiriami 
toliau; be kit ų dalykų, tiriamas lytinis subrendimas, dauginimosi organ ų 
vientisumas ir funkcijos, neurologin ės ir elgsenos vertinamosios baigtys, 
imuninės sistemos funkcijos.  
8. Atliekant bandym ą reikėtų vadovautis pagrindiniais principais ir prielai ­
domis, išd ėstytomis EBPO Rekomendaciniame dokumente Nr. 19  On the 
recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for 
experimental animals used in safety evaluations  (34).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Kai bus atlikta pakankamai daug bandym ų, kad būtų galima patikrinti šio 
naujo bandym ų modelio poveik į, bandym ų metodas bus persvarstytas ir 
prireikus patikslintas atsižvelgiant į įgytą patirtį. 
1 schema  
Išplėstinio toksiškumo vienos kartos dauginimuisi bandymo schema
  
METODO APIB ŪDINIMAS/PASIRENGIMAS BANDYMUI  
Gyvūnai 
Gyvūnų rūšių ir veislių parinkimas  
10. Rūšių pasirinkim ą toksiškumo dauginimuisi bandymui atlikti reik ėtų 
kruopščiai apgalvoti atsižvelgiant į visą turimą informacij ą. Tačiau, atsiž ­
velgiant į bendrų duomenų kiekį ir galimybes palyginti su bendrojo toksiš ­
kumo bandymais, dažniausiai pasirenkama gyv ūnų rūšis yra žiurk ės, tad 
pagal šį bandymų metodą pateikiami kriterijai ir rekomendacijos yra skirti 
būtent šiai r ūšiai. Jei naudojama kita r ūšis, pasirinkimas tur ėtų būti pagrįstas 
ir turėtų būti padaromi atitinkami reikalingi protokolo pakeitimai. Neturi 
būti naudojamos mažo vaisingumo veisl ės arba veisl ės, kurioms savaime 
pasireiškia vystymosi defektai.  
Amžius, k ūno masė ir įtraukimo kriterijai  
11. Reik ėtų naudoti sveikus, bandymuose dar nenaudotus t ėvinius gyv ūnus. 
Reikėtų tirti ir patin ėlius, ir pateles; patel ės turėtų būti dar netur ėjusios 
palikuoni ų ir nevaikingos. Pradedant duoti dozes P gyv ūnai turėtų būti 
lytiškai subrend ę, panašios mas ės (kaip ir kiti tos lyties gyv ūnai), poravimo 
metu panašaus amžiaus (apie 90 dien ų), reprezentatyv ūs tos rūšies ir veisl ės 
gyvūnų, su kuriais atliekamas bandymas, pavyzdžiai. Atvežtiems gyv ūnams 
leidžiama aklimatizuotis ne trumpiau kaip 5 dienas. Gyv ūnai atsitiktine 
tvarka suskirstomi į kontrolin ę ir bandom ąją grupes taip, kad grupi ų gyvūnų 
kūno masės vidurkis b ūtų panašus (t. y. ± 20 % vidurkio).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
12. Bandom ųjų gyvūnų patalpos temperat ūra turėtų būti 22 °C (± 3°). Santy ­
kinė drėgmė turėtų būti 30–70 %, idealus intervalas – 50–60 %. Apšvie ­
timas turėtų būti dirbtinis ir jo seka per par ą turėtų būti 12 h šviesos ir 12 h 
tamsos. Galima naudoti standartinius laboratorini ų gyvūnų pašarus, geria ­
mojo vandens kiekis neribojamas. Reik ėtų atkreipti d ėmesį į fitoestrogen ų 
kiekį pašaruose, nes didelis fitoestrogen ų kiekis pašaruose gali paveikti kai 
kurias dauginimosi vertinam ąsias baigtis. Rekomenduojama naudoti standar ­
tinius, žinomos sud ėties pašarus, kuri ų sudėtyje būtų kuo mažiau estroge ­
ninių cheminių medžiag ų (2) (30). Pašaro pasirinkimui gali tur ėti įtakos 
būtinybė tinkamai įmaišyti bandom ąją cheminę medžiag ą, duodam ą pagal 
šį metodą. Reikėtų nustatyti bandomosios chemin ės medžiagos kiek į, viena­
lytiškymą ir stabilum ą nešiklyje. Reik ėtų reguliariai tikrinti, ar pašaruose ir 
geriamajame vandenyje n ėra teršalų. Kiekvienos per tyrim ą naudojamo 
pašaro partijos pavyzdžius reik ėtų laikyti reikiamomis s ąlygomis (pvz., 
užšaldžius – 20 °C temperat ūroje), kol bus baigta rengti ataskaita tam 
atvejui, jeigu pašaro sudedam ąsias dalis dar reik ėtų išsamiau analizuoti.  
13. Gyv ūnus reikėtų laikyti mažomis tos pa čios lyties ir tokias pa čias dozes 
gaunančių gyvūnų grupėmis. Siekiant išvengti galim ų sužalojim ų, gyvūnus 
galima laikyti atskirai (pvz., patinus po poravimosi). Poruojama tur ėtų būti 
šiam tikslui pritaikytuose narveliuose. Pasitvirtinus susiporavimui, patel ės, 
kurios, kaip manoma, yra apvaisintos, laikomos po vien ą atsivedimo arba 
veisimo narveliuose ir yra apr ūpinamos tinkamomis ir nustatytomis g ūžtos 
sukimo medžiagomis. Vados jaunikliai laikomi kartu su motinomis iki 
atjunkymo. F  1 gyvūnai laikomi mažomis grup ėmis su tos pa čios lyties ir 
dozes gaunan čios grupės gyvūnais nuo nujunkymo iki bandymo nutrau ­
kimo. Moksliškai pagr įstais atvejais gyv ūnus galima laikyti atskirai. Fitoest ­
rogenų kiekis pasirinktame kraike tur ėtų būti kuo mažesnis.  
Gyvūnų skaičius ir ženklinimas  
14. Paprastai kiekvienoje dozes gaunan čioje ir kontrolin ėje grupėje turėtų būti 
pakankamas poruojam ų gyvūnų porų skaičius, kad vienoje doz ės grupėje 
būtų gauta bent 20 vaiking ų patelių. Taip siekiama užtikrinti pakankam ą 
vaikingų patelių skaičių, kad būtų galima prasmingai įvertinti galim ą 
cheminės medžiagos poveik į vaisingumui, gestacijai ir P kartos pateli ų 
elgesiui, taip pat F  1 palikuoni ų augimui ir vystymuisi nuo apvaisinimo iki 
subrendimo. Nepavykus gauti norimo vaiking ų patelių skaičiaus (t. y. 20), 
bandymas neb ūtinai bus netinkamas ir turi b ūti vertinamas kiekvienu atveju 
atskirai, atsižvelgiant į galimą priežastin į ryšį su bandom ąja chemine 
medžiaga.  
15. Prieš pradedant duoti dozes kiekvienas P gyv ūnas paženklinamas unikaliu 
numeriu. Jeigu iš ankstesni ų laboratorijos duomen ų matyti, kad reikšmingai 
patelių daliai rujos ciklas gali b ūti ne toks kaip įprasta (4 ar 5 dien ų 
trukmės), rekomenduojama prieš pradedant duoti dozes įvertinti rujos 
ciklą. Taip pat, siekiant užtikrinti, kad bent 20 pateli ų kiekvienoje grup ėje 
rujos ciklas tyrimo pradžioje b ūtų toks, kaip įprasta (4 arba 5 dienos), grup ę 
galima padidinti. Visi F  1 palikuonys juos atsivedus yra paženklinami 
unikalia žyma ir pirm ą kartą patikrinami 0 arba 1- ą postnatalin ę 
dieną (PND). Vis ą tyrimą reikėtų saugoti duomenis apie tai, iš kokios 
vados yra paimtas kiekvienas F  l ir F  2 (jei reikia) gyv ūnas. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
Turima informacija apie bandom ąją cheminę medžiagą 
16. Su esama informacija svarbu susipažinti priimant sprendimus d ėl dozių 
davimo b ūdo, nešiklio pasirinkimo, gyv ūnų rūšių parinkimo, doz ės dydžio 
pasirinkimo ir galimo dozavimo grafiko keitimo. Tod ėl planuojant išpl ėstinį 
toksiškumo vienos kartos dauginimuisi bandym ą reikia atsižvelgti į visą 
svarbią turimą informacij ą apie bandom ąją cheminę medžiagą, t. y. fizikines 
ir chemines savybes, toksikokinetinius duomenis (tarp j ų – konkre čioms 
rūšims būdingą metabolizm ą), toksikodinamines savybes, strukt ūros ir 
veikimo s ąsajas (angl. SAR),  in vitro  metabolinius procesus, ankstesni ų 
toksiškumo tyrim ų rezultatus ir svarbi ą informacij ą apie strukt ūriniu 
požiūriu analogiškas medžiagas. Pirmin ės informacijos apie absorbcij ą, 
pasiskirstym ą, metabolizm ą ir šalinim ą (angl. ADME) bei biologin į 
kaupimą galima gauti iš chemin ės struktūros, fizikini ų ir chemini ų 
duomenų, jungimosi su plazmos baltymais masto ir toksikokinetini ų (TK) 
tyrimų, o toksiškumo tyrim ų rezultatai suteikia papildomos informacijos, 
pvz., apie NOAEL, metabolizm ą arba metabolizmo indukcij ą. 
Toksikokinetini ų duomenų vertinimas  
17. Nors toksikokinetiniai duomenys iš anks čiau atliktų dozių dydžio intervalo 
nustatymo arba kit ų tyrimų nėra privalomi, jie itin naudingi planuojant 
tyrimo strukt ūrą, pasirenkant doz ės dydį ir aiškinant rezultatus. Ypa č 
naudingi tie duomenys, kuriais: 1) patvirtinamas besivystan čio vaisiaus ir 
jauniklio s ąlytis su bandom ąja chemine medžiaga (arba atitinkamais meta ­
bolitais), 2) suteikiama duomen ų apie vidin ę dozimetrij ą ir 3) įvertinama 
galima nuo doz ės priklausoma kinetini ų procesų saturacija. Į papildomus 
toksikokinetinius duomenis, pavyzdžiui, metabolit ų ypatumus, koncentracij ą 
per tam tikr ą laiką ir kt., taip pat reik ėtų atsižvelgti, jei ši ų duomenų turima. 
Atliekant pagrindin į tyrimą taip pat galima rinkti papildomus toksikokine ­
tinius duomenis, jeigu tai netrukdo rinkti ir aiškinti pagrindinio tyrimo vertinamųjų baigčių.
 
Apskritai, planuojant išpl ėstinį toksiškumo vienos kartos dauginimuisi 
tyrimą būtų naudingi šie TK duomenys:  
— gestacijos laikotarpio pabaigoje (pvz., 20- ą gestacijos dien ą) – motinos 
ir vaisiaus kraujo;  
— laktacijos laikotarpio viduryje (10- ą PND) – motinos ir jauniklio kraujo 
ir (arba) pieno;  
— ankstyvuoju laikotarpiu po atjunkymo (pvz., 28- ą PND) – nujunkyt ų 
jauniklių kraujo m ėginių. 
Nustatant konkre čias analites (pvz., pagrindin ę cheminę medžiag ą ir (arba) 
metabolitus) ir atrankos schem ą reikėtų vadovautis lankstumo principu. 
Pavyzdžiui, m ėginių skaičius ir surinkimo laikas nustatyt ą mėginių surin­
kimo dien ą priklausys nuo s ąlyčio būdo ir iš anksto turim ų žinių apie 
toksikokinetines savybes nevaiking ų gyvūnų organizme. Bandom ąją 
medžiagą dedant į pašarus užtenka nustatyti vien ą laiką, kada m ėginiai 
surenkami kiekvien ą iš tų dienų; jei dozės duodamos per zond ą, gali tekti 
nustatyti ne vien ą papildom ą mėginių surinkimo laik ą, kad vidini ų dozių 
intervalo įvertis būtų tikslesnis. Ta čiau matuoti medžiagos koncentracijos 
pokytį laiko atžvilgiu vis ą tam tikrą kraujo ėmimo dien ą nebūtina. Jei reikia, 
tiriant vaisius ir naujagimius vienos lyties ir vados gyv ūnų kraują galima 
sujungti.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Davimo b ūdas 
18. Pasirenkant davimo b ūdą reikėtų atsižvelgti į tai, kuris b ūdas yra artimiau ­
sias žmogaus s ąlyčio su ta medžiaga b ūdui (-ams). Nors pagal protokol ą yra 
numatyta bandom ąją cheminę medžiag ą duoti su pašaru, protokol ą galima 
pakeisti ir bandom ąją cheminę medžiagą duoti kitais b ūdais (su geriamuoju 
vandeniu, per zond ą, kvėpavimo takus, od ą) atsižvelgiant į cheminės 
medžiagos savybes ir tai, kokia informacija yra reikalinga.  
Nešiklio pasirinkimas  
19. Prireikus bandomoji chemin ė medžiaga tirpinama tinkamame nešiklyje arba 
paruošiama jos suspensija. Rekomenduojama vis ų pirma apsvarstyti gali ­
mybę, jei tik įmanoma, naudoti vandenin į tirpalą ar suspensij ą; jei neįma­
noma, tada – aliejin į tirpalą ar suspensij ą (pvz., kukur ūzų aliejuje). Jei 
nešiklis yra ne vanduo, turi b ūti žinomos jo toksiškumo savyb ės. Reikėtų 
vengti naudoti nešiklius, kuriems yra b ūdingas toksiškumas (pvz., aceton ą, 
DMSO). Reik ėtų nustatyti bandomosios chemin ės medžiagos stabilum ą 
nešiklyje. Jei dozi ų ruošimui palengvinti naudojamas nešiklis arba kitas 
priedas, reik ėtų atsižvelgti į tokias jo charakteristikas: poveik į bandomosios 
cheminės medžiagos absorbcijai, pasiskirstymui, metabolizmui arba sulai ­
kymui; poveik į bandomosios chemin ės medžiagos chemin ėms savyb ėms, 
dėl kurio gali pasikeisti jos toksiškumas; poveik į maisto ar vandens suvar ­
tojimui arba gyv ūnų įmitimui.  
Dozės pasirinkimas  
20. Paprastai per tyrim ą reikėtų tirti bent trij ų dydžių dozes ir vykdyti lygia ­
grečią kontrolę. Pasirinkdamas reikiamus doz ės dydžius tyr ėjas turėtų atsiž­
velgti į visą turimą informacij ą, taip pat į informacij ą apie dozavim ą per 
ankstesnius tyrimus, toksikokinetinius duomenis, gautus tiriant vaikingus ir 
nevaikingus gyv ūnus, informacij ą apie perdavimo laktacijos laikotarpiu 
mastą ir numatom ą žmogaus s ąlytį su medžiaga. Jeigu turima toksikokine ­
tinių duomen ų, iš kurių matyti, kad toksikokinetini ų procesų saturacija 
priklauso nuo doz ės dydžio, reik ėtų imtis atsargumo priemoni ų ir vengti 
didelių dozių, kurios akivaizdžiai sukelia saturacij ą, – žinoma, jeigu 
žmogaus s ąlyčio su medžiaga lygis bus daug žemesnis už saturacijos 
tašką. Tokiais atvejais didžiausia doz ė turėtų būti tokia, kuriai esant fiksuo ­
jamas per ėjimo prie tiesinio toksikokinetinio modelio (tiesin ės toksikokine ­
tinės priklausomyb ės) perlinkio taškas, arba doz ė, esanti virš perlinkio 
taško.  
21. Jeigu reikiam ų toksikokinetini ų duomenų nėra, dozės dydį reikėtų pasirinkti 
pagal poveikio toksiškum ą, nebent yra apribojim ų dėl bandomosios 
cheminės medžiagos fizikinio ir (arba) cheminio pob ūdžio. Jeigu doz ės 
dydis pasirenkamas pagal toksiškum ą, didžiausia doz ė pasirenkama tokia, 
kad būtų sukeltas tam tikras toksinis poveikis, bet kad gyv ūnai nenugaišt ų ir 
nepatirtų didelių kančių. 
22. Kitus doz ės dydžius reik ėtų pasirinkti maž ėjančia tvarka taip, kad b ūtų 
pastebėtas kiekvienas su doze susij ęs atsakas ir b ūtų nustatyta nepasteb ėto 
neigiamo poveikio riba (NOAEL) arba aptikimo ribai artimas doz ės dydis, 
kad pagal tai b ūtų galima nustatyti etalonin ę dozę jautriausiai (-ioms) verti ­
namajai (-osioms) baig čiai (-ims). Kad intervalai tarp NOAEL ir LOAEL 
nebūtų dideli, dažniausiai optimal ūs intervalai b ūna tokie, kuriais doz ės 
didėja dukart arba keturiskart. Užuot palikus labai didelius intervalus tarp 
dozių (pvz., kai jos skiriasi daugiau kaip 10 kart ų), geriau įtraukti ketvirt ą 
bandymo grup ę. 
23. Kontrolin ės grupės gyvūnai turėtų būti laikomi tomis pa čiomis sąlygomis 
kaip ir bandomieji gyv ūnai, išskyrus tai, kad jie neveikiami bandom ąja 
chemine medžiaga. Ši grup ė turėtų būti medžiagos negaunanti kontrolin ė 
grupė arba nešikl į gaunanti kontrolin ė grupė, jei bandomajai cheminei 
medžiagai duoti naudojamas nešiklis. Jei naudojamas nešiklis, kontrolin ė 
grupė turėtų gauti nešiklio kiek į, atitinkant į didžiausi ą naudojam ą nešiklio 
tūrį. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Ribinis bandymas  
24. Jeigu atliekant kartotini ų dozių tyrimus negauta duomen ų, kad ne mažiau 
kaip 1 000 mg/kg k ūno masės/per dien ą dozė yra toksiška, arba jeigu, 
remiantis duomenimis apie strukt ūriniu ir (arba) metaboliniu poži ūriu gimi­
ningų chemini ų medžiag ų metabolines savybes, įskaitant  in vivo/in vitro  
panašumą, toksiškumo netur ėtų būti, kelių dydžių dozių tyrimo gali nerei ­
kėti. Tokiais atvejais išpl ėstinį toksiškumo vienos kartos dauginimuisi 
bandymą galima atlikti su viena kontroline grupe ir viena ne mažiau kaip 
1 000 mg/kg k ūno masės/per dien ą dydžio doz ės grupe. Ta čiau jeigu naudo ­
jant tokį dozės dydį pasireiškia toksiškumo dauginimuisi arba vystymuisi 
požymių, reikės toliau atlikti bandymus naudojant mažesnes dozes, kad b ūtų 
nustatytas NOAEL. Šios nuostatos d ėl bandomos doz ės ribų taikomos tik 
tada, kai, atsižvelgiant į žmogaus s ąlytį su medžiaga, didesni ų dozių naudoti 
nereikia.  
PROCED ŪRA 
Palikuoni ų veikimas  
25. Geriausia dozes duoti kartu su pašaru. Reik ėtų atkreipti d ėmesį į tai, kad 
darant bandymus su zondu jaunikliai dažniausiai gauna bandomosios cheminės medžiagos netiesiogiai su pienu tol, kol, juos nujunkius, doz ės 
jiems pradedamos duoti tiesiogiai. Jeigu bandymai daromi medžiag ą dedant 
į pašarą arba geriam ąjį vandenį, jaunikliai papildomai gauna bandomosios 
cheminės medžiagos tiesiogiai, kai paskutin ę laktacijos laikotarpio savait ę 
pradeda ėsti patys. Jeigu bandomosios chemin ės medžiagos į pieną patenka 
nedaug arba jeigu tr ūksta duomen ų, kad palikuonys yra nepertraukiamai 
veikiami, galima svarstyti galimyb ę keisti tyrimo model į. Tokiais atvejais, 
remiantis turima toksikokinetine informacija, toksiškumo palikuonims arba biologinių žymeklių pokyčių duomenimis (3) (4), reik ėtų apsvarstyti gali ­
mybę laktacijos laikotarpiu dozes jaunikliams duoti tiesiogiai. Prieš prade ­
dant tyrimus, per kuriuos doz ės žindomiems jaunikliams b ūtų duodamos 
tiesiogiai, reik ėtų atidžiai įvertinti naud ą ir trūkumus (5).
 
Dozių davimo tvarkaraštis ir dozi ų davimas  
26. Tam tikros informacijos apie rujos ciklus, patin ėlių ir patelių dauginimosi 
trakto histopatologin ę ir sėklidžių ir (arba) ants ėklidžių spermos analiz ę 
galima gauti iš ankstesni ų atitinkamos trukm ės kartotin ės dozės toksiškumo 
tyrimų. Todėl atliekant išpl ėstinį toksiškumo vienos kartos dauginimuisi 
bandymą bandymo trukm ė iki suporavimo pasirenkama tokia, kad b ūtų 
galima nustatyti poveik į funkciniams poky čiams, kurie gali sutrikdyti 
elgseną poravimosi metu ir vaisingum ą. Dozės iki poravimosi tur ėtų būti 
duodamos pakankamai ilgai, kad P patel ės ir patinėliai būtų veikiami pasto ­
viosios b ūsenos sąlygomis. Dažniausiai 2 savai čių iki poravimosi dozi ų 
davimo trukm ė abiem lytims yra laikoma pakankama. Kai tiriamos patel ės, 
šis laikotarpis apima 3–4 rujos ciklus ir tur ėtų būti pakankamas neigiamam 
poveikiui rujos cikliškumui nustatyti. Kai tiriami patin ėliai, tokia trukm ė 
atitinka br ęstančių spermatozoid ų tranzito į antsėklidžius laikotarp į ir turėtų 
padėti nustatyti poveik į spermai jai pasigaminus s ėklidėse (paskutiniais 
spermos išskyrimo ir brendimo ants ėklidžiuose etapais). Iki bandymo 
nutraukimo, kai yra suplanuota atlikti s ėklidžių ir antsėklidžių histopatolo ­
ginę ir spermos parametr ų analizę, P ir F  1 gyvūnai bus tur ėję sąlytį su 
medžiaga bent vien ą ištisą spermatogenin į ciklą ((6) (7) (8) ir EBPO Reko ­
mendacinis dokumentas Nr. 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Patin ėlių sąlyčio su medžiaga scenarijus iki poravimosi galima keisti, jeigu 
per ankstesnius tyrimus buvo aiškiai nustatytas toksiškumas s ėklidėms 
(pablogėjo spermatogenez ė) arba pasireišk ė poveikis spermos vientisumui 
ir funkcionalumui. Panašiai pateli ų atveju – turint duomen ų apie bandomo ­
sios chemin ės medžiagos poveik į rujos ciklui, kartu ir lytiniam jautrumui, 
gali būti pagrįsta rinktis kitokius s ąlyčio su medžiaga iki poravimosi scena ­
rijus. Ypatingais atvejais galima leisti dozes P patel ėms pradėti duoti tik jau 
gavus teigiamus tepin ėlio reakcijos į spermą rezultatus (žr. EBPO Reko ­
mendacin į dokument ą Nr. 151 (40)).  
28. Nusta čius dozių davimo iki poravimosi trukm ę, gyvūnams bandomosios 
cheminės medžiagos duodama nepertraukiamai po 7 dienas per savait ę iki 
pat nekroskopijos. Visiems gyv ūnams doz ės turėtų būti duodamos tokiu pat 
metodu. Doz ės duodamos 2 savaites poravimosi laikotarpiu ir P patel ėms – 
gestacijos bei laktacijos laikotarpiu iki bandymo nutraukimo, kai jaunikliai 
nujunkomi. Patin ėliams doz ės duodamos tokiu pa čiu būdu iki bandymo 
nutraukimo, kai F  1 gyvūnai nujunkomi. Nekroskopija pirmiau atliekama 
patelėms, jų nekroskopij ą reikėtų atlikti tą pačią ar panaši ą laktacijos laiko ­
tarpio dien ą. Patinėlių nekroskopij ą galima išd ėstyti didesniam dien ų skai­ 
čiui pagal laboratorijos galimybes. Jeigu laktacijos laikotarpiu doz ės nepra­
dėtos duoti tiesiogiai, jas reik ėtų pradėti tiesiogiai duoti pasirinktiems F  1 
patinėliams ir patel ėms nujunkymo laikotarpiu ir toliau duoti iki supla ­
nuotos nekroskopijos dienos pagal kohortos gyv ūnų paskirstymo tvark ą. 
29. Jei chemin ės medžiagos duodamos su pašarais ar geriamuoju vandeniu, 
svarbu garantuoti, kad naudojamas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis 
netrikdytų normalios mitybos arba g ėrimo pusiausvyros. Kai bandomoji 
cheminė medžiaga duodama su pašaru, jos doz ė gali būti išreiškiama kaip 
pastovi koncentracija pašaruose (ppm) arba kaip pastovus doz ės dydis pagal 
gyvūno kūno masės vienetą; pasirinkt ą variantą reikėtų nurodyti.  
30. Kai bandomoji chemin ė medžiaga duodama per zond ą, vienu metu 
duodamo skys čio tūris paprastai netur ėtų viršyti 1 ml/100 g k ūno masės 
(0,4 ml/100 g k ūno masės yra didžiausias kiekis naudojant aliej ų, pvz., 
kukurūzų). Išskyrus dirginan čias arba ėsdinančias chemines medžiagas, 
kurios esant didesnei koncentracijai turi sunkesn į poveikį, bandomojo 
tirpalo tūrio nepastovumas turi b ūti kiek įmanoma sumažintas kei čiant 
koncentracij ą taip, kad vis ų dozių tūris būtų pastovus. Doz ė turėtų būti 
duodama kiekvien ą dieną panašiu laiku. Doz ė kiekvienam gyv ūnui 
paprastai tur ėtų būti nustatoma atsižvelgiant į patį paskutin į jo svėrimą; 
suaugusių patinėlių ir suaugusi ų nevaiking ų patelių dozė koreguojama 
bent kas savait ę, vaikingų patelių ir F1 gyv ūnų iki atjunkymo ir 2 savaites 
po atjunkymo – kas dvi dienas. Jeigu iš toksikokinetini ų duomenų matyti, 
kad bandomosios chemin ės medžiagos per placent ą perduodama mažai, per 
zondą duodamos doz ės dydį paskutin ę gestacijos savait ę gali tekti pakore ­
guoti, kad patelei neb ūtų duodama pernelyg toksiška doz ė. Patelėms, 
kurioms doz ės duodamos per zond ą arba kitu b ūdu, kurį taikant gyv ūnus 
reikia liesti, jaunikli ų atsivedimo dien ą dozės duoti nereik ėtų; tą dieną 
bandomosios chemin ės medžiagos geriau neduoti, kad neb ūtų sutrikdytas 
jauniklių atsivedimo procesas.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Poravimas  
31. Kiekviena P patel ė uždaroma į narvelį su vienu atsitiktine tvarka atrinku ir 
nesusijusiu t ą pačią dozę gaunančiu patinėliu (1:1 poravimas) tol, kol jie 
susiporuoja, arba 2 savait ėms. Jeigu patin ėlių nepakanka, pavyzdžiui, d ėl to, 
kad patin ėliai nugaišo iki suporavimo, tada jau suporuotas (-i) patin ėlis 
(-iai) poruojamas (-i) (1:1) su antra (kitomis) patele (- ėmis) taip, kad 
visos patel ės būtų suporuotos. 0 gestacijos diena apibr ėžiama kaip diena, 
kurią pasitvirtina susiporavimo faktas (randama spermos arba makšties 
kamštis). Gyv ūnus reikėtų iš karto atskirti, kai tik pastebima, kad gyv ūnai 
susiporavo. Jeigu per 2 savaites gyv ūnai nesusiporuoja, juos reik ėtų atskirti 
ir nebebandyti j ų suporuoti. Duomenyse suporuotos poros turi b ūti aiškiai 
pažymėtos. 
Vados dydis  
32. Praėjus 4 dienoms po atsivedino, kiekvienos vados dydis gali b ūti koreguo ­
jamas pašalinant perteklin į prieaugl į atrankos b ūdu taip, kad kiekvienoje 
vadoje, kiek tai yra įmanoma, likt ų penki patin ėliai ir penkios patel ės. 
Selektyvus jaunikli ų pašalinimas, pvz., pagal k ūno masę, nepriimtinas. Jei 
neįmanoma vienoje vadoje tur ėti po penkis kiekvienos lyties palikuonis, 
priimtinas dalinis palikuoni ų skaičiaus koregavimas (pvz., šeši patin ėliai ir 
keturios patel ės). 
Jauniklių atrinkimas tyrimams po nujunkymo (žr. 1 schem ą) 
33. Nujunkymo metu (apie 21 PND) iš vis ų turimų vadų po 20 jaunikli ų 
paskiriama į kiekvienos doz ės grupę ir kontrolin ę grupę ir laikomi toles ­
niems tyrimams iki lytin ės brandos (nebent dar prieš tai reik ėtų atlikti 
kokius nors tyrimus). Jaunikliai atrenkami atsitiktine tvarka, išskyrus tai, kad netur ėtų būti imami akivaizdžiai silpniausi jaunikliai (gyv ūnai, kurių 
kūno masė yra daugiau negu dviem standartiniais nuokrypiais mažesn ė už 
atitinkamos vados jaunikli ų masės vidurkį), nes jie grei čiausiai nėra repre­
zentatyvūs dozes gaunan čios grupės pavyzdžiai.
 
21 PND atrinkti F  1 jaunikliai atsitiktine tvarka paskirstomi į tris gyv ūnų 
kohortas:  
1 kohorta (1A ir 1B) = toksiškumo dauginimuisi/vystymuisi bandymas;  
2 kohorta (2A ir 2B) = neurotoksiškumo vystymuisi bandymas;  
3 kohorta = imunotoksiškumo vystymuisi bandymas.  
1A kohorta: po vien ą patinėlį ir vieną patelę iš vados grup ėje (20 kiek ­
vienos lyties grup ėje): prioritetin ė atranka pirminiam poveikio dauginimosi 
sistemai ir bendrojo toksiškumo įvertinimui.  
1B kohorta: po vien ą patinėlį ir vieną patelę iš vados grup ėje (po 20 
kiekvienos lyties grup ėje): prioritetin ė atranka tolesniam dauginimosi 
sistemos veikimo vertinimui poruojant F  1 gyvūnus, kai šie įvertinami (žr. 
EBPO Rekomendacin į dokument ą Nr. 117 (39)), ir papildomiems histopa ­
tologiniams duomenims surinkti tais atvejais, kai įtariama, jog medžiaga yra 
toksiška dauginimosi arba endokrininei sistemai arba kai 1A pogrupio rezul ­
tatai yra nevienareikšmiai.  
2A kohorta: iš viso 20 jaunikli ų grupėje (po 10 patin ėlių ir 10 pateli ų 
grupėje; po vien ą patinėlį arba vien ą patelę iš vados) yra paskiriami neuro ­
bihevioristiniam bandymui atlikti, po kurio atliekamas jau suaugusi ų 
gyvūnų neurohistopatologinis tyrimas.  
2B kohorta: iš viso 20 jaunikli ų grupėje (po 10 patin ėlių ir 10 pateli ų 
grupėje; po vien ą patinėlį arba vien ą patelę iš vados) yra paskiriami neuro ­
histopatologiniam vertinimui nujunkymo metu (21 arba 22 PND). Jeigu 
gyvūnų skaičius nepakankamas, pirmenyb ė teikiama 2A kohortai.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
3 kohorta: iš viso 20 jaunikli ų grupėje (po 10 patin ėlių ir 10 pateli ų grupėje; 
po vieną iš vados, jei įmanoma). Iš kontrolin ės grupės 56-ą (± 3) PND gali 
tekti paimti papildomus jauniklius, kurie b ūtų panaudoti kaip nuo T l ąstelių 
priklausom ų antikūnų atsako analiz ės (angl. TDAR) teigiamos kontrol ės 
grupės gyvūnai. 
34. Jeigu gyv ūnų skaičiaus nepakanka vis ų kohortų tikslams, pirmenyb ė 
tiekiama 1 kohortai, nes jos gyv ūnus galima panaudoti F  2 gyvūnų kartai 
gauti. Pagal konkre čius poreikius, pvz., jeigu įtariama, kad chemin ė 
medžiaga yra neurotoksiška, imunotoksiška arba toksiškai veikia daugini ­
mąsi, į bet kuri ą iš kohort ų galima paskirti papildomus jauniklius. Šiuos 
jauniklius galima panaudoti tyrimams skirtingais laiko momentais atlikti 
arba papildomoms vertinamosioms baigtims įvertinti. Į kohortas nepaskirti 
jaunikliai perduodami klinikiniams biocheminiams tyrimams (55 punktas) ir bendrajai nekroskopijai (68 punktas) atlikti.
 
P gyvūnų antrasis poravimas  
35. Paprastai P gyv ūnus antrą kartą poruoti nerekomenduojama, nes taip praran ­
dama svarbi informacija apie pirmos vados implantacijos viet ų skaičių (taigi 
prarandami poimplantacini ų ir perinatalini ų nuostoli ų duomenys, galimo 
teratogeninio poveikio rodikliai). Jeigu reikia patikrinti arba išsiaiškinti poveikį veikiamoms patel ėms, tyrim ą geriau prat ęsti ir poruoti F
 1 kartos 
gyvūnus. Tačiau visada galima antr ą kartą poruoti P patin ėlius ir pateles, 
su kuriomis bandymai dar neatlikti, ir taip patikslinti nevienareikšmius 
rezultatus arba išsamiau apibr ėžti per pirm ą poravim ą pastebėtą poveikį 
vaisingumui.  
GYVŲ GYVŪNŲ STEBĖJIMAI  
Klinikiniai steb ėjimai  
36. P ir atrinkt ų F 1 gyvūnų bendrieji klinikiniai steb ėjimai atliekami kart ą per 
dieną. Jeigu doz ės duodamos per zond ą, klinikinius steb ėjimus reik ėtų 
atlikti prieš duodant doz ę ir po to (stebint, ar n ėra toksiškumo požymi ų, 
susijusių su didžiausia koncentracija plazmoje). Turi b ūti užrašomi visi su 
tuo susiję elgesio poky čiai, sunkaus arba ilgesnio jaunikli ų atsivedimo 
proceso požymiai ir visi toksiškumo požymiai. Du kartus per dien ą, o 
savaitgaliais – vien ą kartą per dien ą, visi gyv ūnai stebimi, ar nepasireiškia 
didelio toksiškumo požymi ų, ar gyvūnai negaišta ir ar n ėra nugaiš ę. 
37. Kas savait ę turėtų būti atliekamas papildomas išsamesnis kiekvieno P ir F  1 
gyvūno (po nujunkymo) tyrimas, j į patogu daryti tuo pa čiu metu, kai 
gyvūnas sveriamas, kad gyv ūnui būtų keliama kuo mažiau streso d ėl jo 
lietimo. Steb ėjimai turėtų būti kruopš čiai atliekami ir registruojami, tam 
naudojant bandym ų laboratorijos nustatytas vertinimo balais sistemas. Turi 
būti imamasi priemoni ų, garantuojan čių kuo mažesn į bandymo s ąlygų 
kitimą. Stebėjimas turi apimti odos, kailio, aki ų, gleivinės pakitim ų, išskyrų, 
išmatų, autonominio aktyvumo (pvz., ašarojimo, plauk ų pašiaušimo, 
vyzdžio dydžio, ne įprasto kv ėpavimo) registravim ą, bet neturi tuo apsiriboti. 
Reikėtų registruoti eisenos, pozos, reakcijos į lietimą pakitimus, klonini ų ar 
toninių judesių atsiradim ą bei stereotipin į (pvz., besaik į valymąsi, pasikar ­
tojantį sukimąsi ratu) ar keist ą (pvz., sav ęs luošinim ą, vaikščiojimą atbu­
lomis) elges į. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Kūno masė ir pašaro bei vandens suvartojimas  
38. P gyv ūnai sveriami pirm ąją dozės davimo dien ą ir vėliau mažiausiai kart ą 
per savait ę. P patel ės laktacijos laikotarpiu sveriamos tomis pa čiomis 
dienomis kaip ir vada (žr. 44 punkt ą). Kiekvienas F  1 gyvūnas atskirai 
pasveriamas prad ėjus nujunkym ą (21 PND) ir v ėliau sveriamas mažiausiai 
kartą per savait ę. Kūno masė taip pat užrašoma t ą dieną, kai gyv ūnai 
lytiškai subr ęsta (baigia atsiskirti apyvarp ė ir aiškiai susiformuoja makštis). 
Visi gyvūnai pasveriami numarinimo dien ą. 
39. Per tyrim ą pašaro ir vandens (jei bandomoji chemin ė medžiaga duodama su 
geriamuoju vandeniu) suvartojimas užrašomas bent kart ą per savait ę tą 
pačią dieną, kurią gyvūnas sveriamas (išskyrus tuos atvejus, kai gyv ūnai 
laikomi kartu). Kiekvieno narvelio F  1 gyvūnų pašaro suvartojimas užra ­ 
šomas kiekvien ą savaitę nuo tada, kai gyv ūnai suskirstomi į atitinkamas 
kohortas.  
Rujos ciklai  
40. Pirmin ės informacijos apie su bandom ąja chemine medžiaga susijus į 
poveikį rujos ciklui gali b ūti turima iš ankstesni ų kartotini ų dozių toksiš­
kumo tyrim ų ir ja galima pasinaudoti rengiant konkre čios bandomosios 
cheminės medžiagos išpl ėstinio toksiškumo vienos kartos dauginimuisi 
tyrimo protokol ą. Paprastai rujos cikliškumo vertinimas (pagal makšties 
citologiją) prasideda dozi ų davimo laikotarpio pradžioje ir t ęsiasi tol, kol 
pasitvirtina susiporavimas arba baigiasi 2 savai čių poravimosi laikotarpis. 
Jeigu prieš tyrim ą buvo atliktas pateli ų atrankos bandymas tikrinant, ar rujos 
ciklai yra normal ūs, tuomet prad ėjus tyrimą naudinga toliau imti tepin ėlius; 
tačiau jeigu tyrimo pradžioje kyla abejoni ų dėl nebūdingo poveikio (pavyz ­
džiui, nuo pat pradži ų pastebimai sumaž ėja pašaro suvartojimas), prieš 
pradedant likus dviem savait ėms iki poravimosi tirti tepin ėlius, gyvūnams 
galima leisti adaptuotis prie dozi ų davimo, bet ne ilgiau kaip dvi savaites. 
Jeigu patel ės tyrimo laikotarpis d ėl to prasit ęsia (t. y. iki 4 savai čių iki 
poravimosi), reik ėtų apsvarstyti galimyb ę įsigyti jaunesnius gyv ūnus ir 
pratęsti patinėlių tyrimo iki poravimosi laikotarp į. Makšties ar gimdos 
kaklelio l ąstelės turi būti imamos atsargiai, kad neb ūtų pažeista gleivin ė ir 
dėl to nebūtų sukeltas pseudovaikingumas (10) (11).  
41. 1A kohortos F  1 patelių makšties tepin ėlius reikėtų tirti kasdien nuo makšties 
susiformavimo pradžios tol, kol bus pasteb ėtas pirmas kornifikuotas tepi ­
nėlis, tam, kad b ūtų galima nustatyti laiko interval ą tarp šių dviejų 
momentų. 1A kohortos F  1 patelių rujos ciklus taip pat reik ėtų stebėti dvi 
savaites nuo maždaug 75 PND. Be to jeigu F  1 kartos gyv ūnus reikia 
poruoti, 1B kohortos pateli ų makšties citologij ą reikės stebėti nuo gyv ūnų 
uždarymo poromis iki susiporavimo požymi ų atsiradimo.  
Poravimas ir gestacija  
42. Be standartini ų rodiklių (pvz., kūno masės, pašaro suvartojimo, klinikini ų 
stebėjimų, įskaitant tikrinim ą, ar gyvūnai negaišta ir (arba) ar nenugaišo), 
užrašomos gyv ūnų patalpinimo poromis datos, inseminacijos data ir 
jauniklių atsivedimo data, prekoitalinis intervalas (nuo susiporavimo iki 
inseminacijos), apskai čiuojama gestacijos trukm ė (nuo inseminacijos iki 
jauniklių atsivedimo). P pateles numatomo jaunikli ų atsivedimo dien ą 
reikėtų atidžiai ištirti, ar n ėra distocijos požymi ų. Reikėtų užrašyti visas 
guolio sukimo arba žindymo anomalijas.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Jaunikli ų atsivedimo diena patelei yra 0 laktacijos diena (0 LD), o palikuo ­
niui – 0 postnatalin ė diena (0 PND). Dar visus palyginimus galima atlikti 
pagal postkoitalin į laiką, siekiant pašalinti postnatalinio vystymosi duomen ų 
iškraipym ą dėl skirtingos gestacijos laikotarpio trukm ės; taip pat reik ėtų 
užrašyti s ąlyginį jauniklių atsivedimo laik ą. Tai ypač svarbu, kai bandomoji 
cheminė medžiaga veikia gestacijos trukm ę. 
Palikuoni ų parametrai  
44. Kiekviena vada tiriama kuo grei čiau po atsivedimo (0 arba 1- ą laktacijos 
dieną) norint nustatyti jaunikli ų skaičių ir lytį, negyvagimius, gyvagimius, 
tai, ar nėra didelių anomalij ų (matomų išorinių anomalij ų, įskaitant gomurio 
nesuaugim ą, ar nėra poodini ų kraujosrūvų, ar odos spalva arba tekst ūra yra 
normali, ar n ėra bambagysl ės, ar netr ūksta pieno, ar n ėra išdžiuvusio 
sekreto). Be to, atliekant pirmuosius klinikinius naujagimi ų tyrimus reik ėtų 
kokybiškai įvertinti k ūno temperat ūrą, aktyvum ą, reakciją į lietimą. 0 PND 
arba vėliau rasti negyvi jaunikliai tiriami galimiems defektams ir nugaišimo 
priežasčiai nustatyti. Gyvi jaunikliai suskai čiuojami ir atskirai pasveriami 0 
PND arba 1 PND, o v ėliau – reguliariai, pvz., 4, 7, 14, ir 21 PND. Klini ­
kinius tyrimus, atliekamus pagal gyv ūnų amžių, reikėtų kartoti, kai pali ­
kuonys yra sveriami, arba dažniau, jeigu konkre čiais atvejais palikuoni ų 
atsivedimo metu buvo gauta specifini ų duomen ų. Stebėjimai turi apimti 
išorines anomalijas, odos, kailio, aki ų, gleivini ų pokyčius, sekrecij ų ir 
ekskrecijų dažnį ir autonomin į aktyvum ą, bet neturi tuo apsiriboti. Taip 
pat turi b ūti registruojami eisenos poky čiai, laikysena ir reakcija į elgesį 
su gyvūnu, kloniniai ar toniniai judesiai, stereotipinis ar keistas elgesys.  
45. Bent vien ą kartą tarp 0 PND ir 4 PND kiekvienam jaunikliui reik ėtų pama­
tuoti anogenitalin į atstumą (angl. AGD). Jauniklio k ūno masės duomenis 
reikėtų surinkti t ą dieną, kurią matuojamas anogenitalinis atstumas; 
paprastai anogenitalinis atstumas tur ėtų atitikti jauniklio dyd į, geriausia, 
jei jo reikšm ė būtų lygi skai čiui, gautam iš k ūno masės skaičiaus ištraukus 
kubinę šaknį (12). 12 arba 13 PND reik ėtų tikrinti, ar vyriškos lyties 
jaunikliai turi spenelius ir (arba) areoles.  
46. Visi pasirinkti F  1 gyvūnai kasdien vertinami – tikrinama, ar patin ėlių varpos 
galva ir apyvarp ė neatsiskyr ė ir ar pateli ų makštis nesusiformavo iki numa ­
tytos šių vertinam ųjų baigčių atsiradimo dienos, siekiant nustatyti, ar lytinis 
brendimas n ėra ankstyvas. Reik ėtų pažymėti visas lyties organ ų anomalijas, 
pavyzdžiui, ištisin į makšties kamšt į, hipospadij ą arba nesuaugusi ą varpą. F 1 
gyvūnų lytinis subrendimas lyginamas su fiziniu išsivystymu – nustatoma, 
kokio amžiaus yra gyv ūnas, kai atsiskiria patin ėlių varpos galva ir apyvarp ė, 
susiformuoja pateli ų makštis (13).  
Galimo neurotoksiškumo vystymuisi vertinimas (2A ir 2B kohortos)  
47. Neurotoksiškumui įvertinti iš kiekvienos dozes gaunan čios grupės paimama 
po 10 2A kohortos patin ėlių ir pateli ų ir po 10 2B kohortos patin ėlių ir 
patelių (kiekvien ą kohortą sudaro po 1 patin ėlį arba 1 patel ę iš vados; iš 
kiekvienos vados paimama bent po 1 jaunikl į; atrenkama atsitiktine tvarka). 
Su 2A kohortos gyv ūnais atliekami reakcijos į garsinius dirgiklius, funk ­
cinių stebėjimų bandym ų rinkinio bandymai, atliekamas motorinio akty ­
vumo (žr. 48–50 punktus) ir neuropatologiniai vertinimai (žr. 74–75 
punktus). Reik ėtų stengtis užtikrinti, kad bandymo s ąlygos kuo mažiau  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
skirtųsi ir neb ūtų sistemiškai susietos su dozi ų davimu. Tarp kintam ųjų, 
kurie gali paveikti elgsen ą yra: garso lygis (pvz., nepertraukiamas 
triukšmas), temperat ūra, drėgmė, apšvietimas, kvapai, paros laikas, aplinkos 
dirgikliai. Neurotoksiškumo tyrim ų rezultatus reik ėtų aiškinti atsižvelgiant į 
atitinkamus ankstesnius kontrolinius etaloninius intervalus. 2B kohortos 
gyvūnus reikėtų naudoti neuropatologiniam vertinimui atlikti 21 PND 
arba 22 PND (žr. 74–75 punktus).  
48. Bandym ą su garsiniais dirgikliais reik ėtų atlikti 24 PND (± 1 diena) su 2A 
kohortos gyv ūnais. Bandomosios ir kontrolin ės grupių bandymo dien ą 
reikėtų suderinti. Kiekvien ą sesiją sudaro 50 bandym ų. Atliekant garsini ų 
dirgiklių bandymą nustatomas kiekvieno bloko reakcijos, pažym ėtos per 10 
bandymų (5 blokai po 10 bandym ų), amplitud ės vidurkis, bandymo s ąlygos 
optimizuojamos, kad b ūtų sudaryta galimyb ė priprasti prie sesijos s ąlygų. 
Šios proced ūros turėtų atitikti bandym ų metodą B.53 (35).  
49. Reikiamu laiku tarp 63 ir 75 PND su 2A kohortos gyv ūnais atliekami 
funkcinių stebėjimų bandymų rinkinio bandymai ir automatizuotas moto ­
rinio aktyvumo bandymas. Šios proced ūros turėtų atitikti bandym ų metodus 
B.43 (33) ir B.53 (35). Funkcini ų stebėjimų bandym ų rinkinį sudaro 
nuodugnus subjekto išvaizdos, elgesio ir funkcinio vientisumo apib ūdi­
nimas. Šie vertinimai atliekami gyv ūnus stebint narveliuose, kuriuose jie 
laikomi nuolat, perk ėlus į standartiškai įrengtą stebėjimo (atvir ą) vietą, 
kur gyvūnai gali laisvai jud ėti, ir atliekant manipuliacinius bandymus. 
Bandymai pradedami nuo mažiausiai interaktyvi ų ir baigiami interaktyviau ­
siais. Vertinam ų rodiklių sąrašas pateiktas 1 pried ėlyje. Visus gyv ūnus 
turėtų atidžiai steb ėti parengti ir gyv ūnų statuso bandyme nežinantys steb ė­
tojai, taikydami standartizuotas proced ūras, kad rezultat ų skirtumai d ėl skir­
tingų stebėtojų būtų kuo mažesni. B ūtų gerai, kad, jeigu įmanoma, per vien ą 
bandymą gyvūnus vertint ų tas pats steb ėtojas. Jeigu tai ne įmanoma, b ūtina 
patikrinti, ar skirting ų stebėtojų rezultatai yra patikimi. Kiekvieno elgesio 
parametro bandym ų rinkinio bandymuose turi b ūti naudojamos praktiniame 
darbe nustatytos skal ės ir vertinimo balais kriterijai. Jeigu galima, stebi ­
moms vertinamosioms baigtims vertinti reik ėtų naudoti objektyvius kieky ­
binius matus, tarp j ų – subjektyv ų skirstym ą. Vertinant motorin į aktyvum ą 
bandymai su kiekvienu gyv ūnu atliekami atskirai. Bandymo sesija tur ėtų 
trukti pakankamai ilgai, kad b ūtų galima matyti, jog kontrolin ės grupės 
gyvūnai priprato prie bandymo sesijos s ąlygų. Motorinis aktyvumas tur ėtų 
būti stebimas naudojant automatin į aktyvumo fiksavimo prietais ą, kuriuo 
turi būti galima nustatyti ir aktyvumo padid ėjimą, ir sumaž ėjimą (t. y. 
pradinė prietaisu matuojamo aktyvumo reikšm ė neturėtų būti labai maža – 
tokia, kad neb ūtų galima nustatyti jo sumaž ėjimo, arba labai didel ė – tokia, 
kad nebūtų galima nustatyti aktyvumo padid ėjimo). Kiekvien ą prietaisą 
reikėtų patikrinti pagal standartines proced ūras, siekiant, kiek įmanoma, 
užtikrinti patikim ą skirtingų prietaisų veikimą visomis dienomis. Prietaisus 
bandomosioms grup ėms reikėtų paskirstyti kuo proporcingiau. Bandym ų 
laiką bandomosioms grup ėms reikėtų paskirstyti proporcingai, kad b ūtų 
išvengta rezultat ų iškraipymo d ėl cirkadinio aktyvumo ritmo.  
50. Jeigu iš turimos informacijos matyti, kad reikia atlikti kitus funkcinius 
bandymus (pvz., jutimini ų, socialini ų, kognityvini ų funkcij ų), šiuos 
bandymus reik ėtų įtraukti nepažeidžiant kit ų per tyrim ą atliekam ų vertinimų 
vientisumo. Jeigu šie bandymai atliekami su tais pa čiais gyvūnais, kurie 
buvo naudoti atliekant standartinius bandymus su garsiniais dirgikliais, 
funkcinių stebėjimų bandym ų rinkinio ir motorinio aktyvumo bandymus, 
reikėtų suplanuoti kitokius bandymus, kad kuo labiau sumaž ėtų šių 
bandymų rezultatų iškraipymo rizika. Papildomi bandymai gali b ūti ypač 
naudingi, kai praktiniai steb ėjimai, numatomas poveikis arba elgsenos 
mechanizmo/b ūdo duomenys atskleidžia specifin į neurotoksiškumo pob ūdį. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Galimo imunotoksiškumo vystymuisi vertinimas (3 kohorta)  
51. 56 (± 3 dienos) PND iš kiekvienos bandomosios grup ės po dešimt 3 
kohortos patin ėlių ir patelių (po 1 patin ėlį arba 1 patel ę iš vados; iš kiek ­
vienos vados bent po 1 jaunikl į; atrinktų atsitiktine tvarka) panaudojami nuo 
T ląstelių priklausom ų antikūnų atsako analizei, t. y. pirminio IgM antik ūnų 
atsako į nuo T ląstelių priklausomus antigenus, pavyzdžiui, avi ų raudonuo ­
sius kraujo k ūnelius (angl.  Sheep Red Blood Cells (SRBC )) arba moliusk ų 
hemocianin ą (angl.  Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH )), atsižvelgiant į 
vykdomas imunotoksiškumo bandymo proced ūras, analizei (14) (15). 
Atsaką galima vertinti skai čiuojant specialias l ąstelių plokšteles (angl. 
PFC) blužnyje arba nustatant SRBC arba KLH b ūdingus IgM antik ūnus 
serume ELISA metodu tuo metu, kai atsakas yra stipriausias. Atsakas dažniausiai b ūna stipriausias ketvirt ą (atsakas pagal PFC metod ą) arba 
penktą (ELISA) dien ą po intravenin ės imunizacijos. Kai pirminis antik ūnų 
atsakas yra tiriamas skai čiuojant lą
stelių plokšteles, gyv ūnų pogrupius 
leidžiama vertinti skirtingomis dienomis, jeigu: gyv ūnų pogrupiai imunizuo ­
jami ir gyv ūnai numarinami taip, kad l ąstelių plokštelės būtų skaičiuojamos 
tada, kai atsakas yra stipriausias; pogrupiuose turi b ūti po vienod ą vyriškos 
ir moteriškos lyties palikuoni ų skaičių iš visų dozės grupių, įskaitant kontro ­
linę grupę; vertinami maždaug tokio paties postnatalinio amžiaus pogrupi ų 
gyvūnai.Sąlytis su bandom ąja chemine medžiaga t ęsis tol, kol liks viena 
diena iki blužnies pa ėmimo PFC tyrimui arba serumo pa ėmimo ELISA 
tyrimui.  
Tolesnis galimo toksiškumo dauginimuisi vertinimas (1B kohorta)  
52. 1B kohortos gyv ūnus galima laikyti tyrimui ilgiau negu 90 PND ir, jei 
reikia, juos sukergti, kad b ūtų gauta F  2 karta. Tos pa čios dozės grupės 
patinėliai ir patel ės uždaromi kartu (stengiantis nesuporuoti t ų pačių tėvų 
palikuoni ų) ir laikomi dvi savaites nuo 90 PND arba v ėlesnės dienos, bet ne 
vėliau kaip nuo 120 PND. Proced ūra tokia pati, kokia taikyta P gyv ūnams. 
Tačiau, atsižvelgiant į įrodomosios vert ės analizę, vadas gali pakakti numa ­
rinti 4 PND, užuot jas laikius iki nujunkymo ir ilgiau.  
GALUTINIAI STEB ĖJIMAI  
Klinikinė biochemija/hematologija  
53. Stebima, ar P gyv ūnams nepasireiškia sisteminis poveikis. Nutraukus 
bandymą, iš nustatytos vietos paimami atsitiktine tvarka atrinkt ų – po 
dešimt iš vienos doz ės grupės – numarint ų nešertų P kartos vienos doz ės 
grupės patinėlių ir pateli ų kraujo m ėginiai; šie m ėginiai saugomi reikia ­
momis sąlygomis, atliekami daliniai arba išsam ūs jų hematologiniai, klini ­
kiniai biocheminiai, T4 ir TSH tyrimai, kiti tyrimai pagal žinom ą bando­
mosios chemin ės medžiagos poveikio pob ūdį (žr. EBPO Rekomendacin į 
dokument ą Nr. 151 (40)). Tur ėtų būti tiriami šie hematologiniai parametrai: 
hematokrito vert ė, hemoglobino koncentracija, eritrocit ų skaičius, bendras 
leukocitų skaičius ir leukocit ų formulė, trombocit ų skaičius ir kraujo kreš ė­
jimo laikas/geba. Plazmoje arba serume tiriama: gliukoz ė, bendras choles ­
terolis, šlapalas, kreatininas, bendras baltymas ir albuminas, mažiausiai du 
fermentai, rodantys poveik į kepenų ląstelėms (tokie kaip alaninaminotrans ­
ferazė, aspartataminotransferaz ė, šarminė fosfatazė, gamaglutamiltranpepti ­
dazė ir sorbitoldehidrogenaz ė). Tam tikromis aplinkyb ėmis papildomi 
fermentų ir tulžies r ūgščių tyrimai gali suteikti naudingos informacijos. 
Be to, iš vis ų gyvūnų paimtą kraują galima saugoti, jei prireikt ų jo analiz ės 
vėliau, norint išsiaiškinti neaišk ų poveikį arba gauti duomen ų apie sąlytį su ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 873
 
medžiaga organizmo viduje. Jeigu P gyv ūnų antros kartos poruoti neketi ­
nama, kraujo m ėginiai paimami prieš pat numarinim ą arba numarinimo 
metu. Jeigu gyv ūnai paliekami, kraujo m ėginius reik ėtų paimti prieš kelias 
dienas iki poravimo antr ą kartą. Jeigu iš turim ų kartotini ų dozių bandymų 
duomenų matyti, kad bandomoji chemin ė medžiaga to parametro neveikia, 
prieš bandym ą nutraukiant reik ėtų atlikti šlapimo tyrimus, per kuriuos įver­
tinami šie parametrai: išvaizda, t ūris, osmoliališkumas ar santykinis tankis, 
pH, baltymai, gliukoz ė, kraujas ar kraujo l ąstelės, ląstelių liekanos. Šlapimo 
mėginius taip pat galima surinkti tam, kad b ūtų galima steb ėti, ar į jį pateko 
bandomoji chemin ė medžiaga ir (arba) jos metabolitas (-ai).  
54. Taip pat stebima, ar F  1 gyvūnams nepasireiškia sisteminis poveikis. 
Nutraukus bandym ą, iš atsitiktine tvarka atrinkt ų – po dešimt iš vienos 
dozės grupės – nešert ų 1A kohortos patin ėlių ir pateli ų paimami kraujo 
mėginiai; šie m ėginiai saugomi reikiamomis s ąlygomis, atliekami standarti ­
niai klinikiniai biocheminiai tyrimai, taip pat vertinamas skydliauk ės 
hormonų lygis serume (T4 ir TSH), atliekamas hematologinis tyrimas 
(bendras leukocit ų skaičius, leukocit ų formulė, eritrocit ų skaičius), tiriamas 
šlapimas.  
55. 4 PND atliekama nebereikaling ų jauniklių bendroji nekroskopija, matuo ­
jama skydliauk ės hormono (T4) koncentracija serume. Jei reikia, vienos 
vados gimusi ų jauniklių (4 PND) krauj ą galima tirti kartu, atliekant bioche ­
minius/skydliauk ės hormon ų tyrimus. Taip pat paimama nujunkyt ų gyvūnų, 
kuriems 22 PND atliekama bendroji nekroskopija ( į pogrupius neatrinkt ų F 1 
gyvūnų), kraujo T4 ir TSH analizei atlikti.  
Spermos parametrai  
56. Matuojami vis ų P kartos patin ėlių spermos parametrai, išskyrus tuos atvejus, 
kai turima duomen ų, kad per 90 dien ų tyrimą spermos parametrai nebuvo 
paveikti. Reik ėtų patikrinti vis ų A1 kohortos patin ėlių spermos parametrus.  
57. Nutraukus bandym ą, užrašoma vis ų P ir F  1 patinėlių (1A kohorta) s ėklidžių 
ir antsėklidžių masė. Bent viena s ėklidė ir vienas ants ėklidis paliekamas 
histopatologiniam tyrimui. Lik ęs antsėklidis panaudojamas ants ėklidžio 
uodegoje esantiems spermos rezervams suskai čiuoti (16) (17). Spermato ­
zoidai iš ants ėklidžio uodegos (arba s ėklinio latako) surenkami taikant 
metodus, kuriais kuo mažiau b ūtų trukdoma įvertinti spermos judrum ą ir 
morfologij ą (18).  
58. Spermatozoid ų judrumą galima vertinti iš karto po numarinimo arba analiz ę 
galima atlikti v ėliau. Vis judresni ų spermatozoid ų procentin ę dalį galima 
nustatyti subjektyviai arba objektyviai pasitelkiant kompiuterin ę judrumo 
analizę (19) (20) (21) (22) (23) (24). Vertinant spermos morfologij ą, 
spermos m ėginiai iš ants ėklidžio uodegos (arba s ėklinio latako) ištiriami 
kaip fiksuoti preparatai bei skystoje terp ėje (25) ir bent po 200 vieno 
mėginio spermatozoid ų suskirstomi į normalius (normali ir galvut ė, ir 
jungiančioji dalis/uodeg ėlė) ir nenormalius. Morfologin ės spermatozoid ų 
anomalijos b ūtų spermatozoid ų sulipimas, izoliuotos galvut ės ir defor ­
muotos galvut ės ir (arba) uodeg ėlės (26). Deformuotos arba didel ės sper­
matozoidų galvutės gali būti spermos išskyrimo defekt ų požymis.  
59. Jeigu per nekroskopij ą spermos m ėginiai užšaldomi, tepin ėliai fiksuojami ir 
spermos judrumo vaizdo analiz ė užrašoma (27), v ėlesnę analizę galima 
atlikti tik su kontrolin ės grupės arba dideles dozes gavusiais patin ėliais. 
Tačiau jeigu pastebimas su doz ės davimu susij ęs poveikis, reik ėtų įvertinti 
ir mažesni ų dozių grupes.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Bendroji nekroskopija  
60. Nutraukus bandym ą arba darant bandym ą anksčiau nugaišusiems P ir F  1 
gyvūnams atliekama nekroskopija ir makroskopiškai patikrinamos visos 
struktūrinės anomalijos arba patologiniai pakitimai. Ypatingas d ėmesys 
skiriamas dauginimosi sistemos organams. Humaniškai numarinti gaištantys jaunikliai ir nugaiš ę jaunikliai, jei nemaceruoti, tiriami galimiems defektams 
ir nugaišimo priežas čiai nustatyti, v ėliau užkonservuojami.
 
61. Suaugusioms P ir F  1 patelėms yra tiriamas makšties tepin ėlis nekroskopijos 
dieną siekiant nustatyti rujos ciklo etap ą ir sulyginti su dauginimosi organ ų 
histopatologiniais duomenimis. Vis ų P (ir, jei reikia, F  1 ) patelių gimda yra 
tiriama implantavimo viet ų buvimui ir skai čiui nustatyti, stengiantis nepa ­
kenkti histopatologiniam įvertinimui.  
Organų masė ir audini ų konservavimas. P ir F  1 gyvūnai 
62. Nutraukus bandym ą, visų P ir F  1 suaugusių gyvūnų iš atitinkam ų kohortų 
(kaip nurodyta toliau) k ūno masę ir toliau išvardyt ų dar drėgnų organų masę 
po skrodimo reikia užrašyti kuo skubiau, kad nesp ėtų išdžiūti. Organai 
užkonservuojami reikiamomis s ąlygomis. Jeigu nenurodyta kitaip, poriniai 
organai sveriami atskirai arba kartu, nuosekliai laikantis tyrim ą atliekančios 
laboratorijos įprastai taikomos praktikos.  
— Gimda (su kiaušintakiais ir kakleliu), kiaušid ės. 
— Sėklidės, antsėklidžiai (visas organas ir uodega, iš kur imti m ėginiai 
spermatozoidams skai čiuoti).  
— Prostata (ir dorsolateralin ė, ir ventralin ė skiltys kartu). Prostatos 
kompleks ą išpjauti reik ėtų labai atsargiai, stengiantis nepradurti skys čio 
pilnų pūslelių. Jeigu dozi ų davimas paveik ė bendrą prostatos mas ę, 
dorsolateralin į ir ventralin į segmentus po fiksavimo reik ėtų atsargiai 
atskirti ir atskirai pasverti.  
— Sėklinės pūslelės su koaguliacijos liaukomis ir j ų skysčiais (kaip vienas 
vienetas).  
— Smegenys, kepenys, inkstai, širdis, blužnis, užkr ūčio liauka, hipofiz ė, 
skydliauk ė (po fiksavimo), antinks čių liaukos ir žinomi veikiami organai 
arba audiniai.  
63. Be pirmiau išvardyt ų organų, atitinkamomis s ąlygomis konservuojami 
periferinių nervų, raumenų, nugaros smegen ų, akių ir regos nervo, skrandžio 
ir žarnyno sistemos, šlapimo p ūslės, plaučių, trachėjos (su skydliauke ir 
prieskydine liauka), kaul ų čiulpų, sėklinio latako (patin ėlių), pieno liauk ų 
(patinėlių ir patelių) ir makšties m ėginiai.  
64. Visi 1A kohortos gyv ūnų organai pasveriami ir užkonservuojami histopa ­
tologiniam įvertinimui atlikti.  
65. Prenataliniu ir postnataliniu laikotarpiais sukeltam imunotoksiniam povei ­
kiui tirti iš kiekvienos dozes gaunan čios grupės paimama po dešimt 1A 
kohortos patin ėlių ir patelių (po 1 patin ėlį arba patel ę iš vados, iš kiekvienos 
vados paimama bent po 1 jaunikl į, atrinktą atsitiktine tvarka) ir nutraukus 
bandymą tiriami šie dalykai:  
— sveriami limfmazgiai, esantys arti s ąlyčio su chemine medžiaga vietos, 
ir nutolę (papildomai, nes vis ų 1A kohortos gyv ūnų antinksčių liaukos, 
užkrūčio liauka, blužnis jau b ūna pasverti);  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— blužnies limfocit ų subpopuliacijos analiz ė (CD4+ ir CD8+ T limfocitai, 
B limfocitai, l ąstelės – nat ūraliosios žudik ės) panaudojant vien ą 
blužnies dal į, kita blužnies dalis konservuojama histopatologiniam įver­
tinimui.  
Neimunizuot ų (1A kohortos) gyv ūnų blužnies limfocit ų subpopuliacij ų 
analizė parodys, ar s ąlytis yra susij ęs su „pad ėjėjų“ (CD4+) arba citotok ­
sinių (CD8+) užkr ūčio liaukos išskirt ų limfocitų arba ląstelių – natūraliųjų 
žudikių pasiskirstymo poky čiais (spar čia reakcija į neoplastines l ąsteles ir 
patogenus) esant imunologiškai stabiliai b ūsenai.  
66. Iš 1B kohortos gyv ūnų sveriami šie organai ir paruošiami ši ų atitinkam ų 
audinių blokai:  
— makštis (nesverta);  
— gimda su kakleliu;  
— kiaušid ės 
— sėklidės (bent viena);  
— antsėklidžiai;  
— sėklinės pūslelės ir koaguliacijos liaukos;  
— prostata;  
— hipofiz ė; 
— nustatyti tiksliniai organai.  
1B kohortos gyv ūnų histopatologin į įvertinimą reikėtų atlikti, jeigu 1A 
kohortos gyv ūnų tyrimo rezultatai yra nevienareikšmiai, arba tais atvejais, 
kai kyla įtarimų, kad medžiaga gali b ūti toksiška dauginimosi arba endo ­
krininei sistemoms.  
67. 2A ir 2B kohortos: neurotoksiškumo vystymuisi bandymai (21 arba 22 PND 
ir suaugusi ų palikuoni ų). 2A kohortos gyv ūnai numarinami po elgsenos 
bandymo, galvos smegen ų masė užrašoma, atliekama išsami neurohistopa ­
tologija neurotoksiškumui įvertinti. 2B kohortos gyv ūnai numarinami 21 
arba 22 PND, galvos smegen ų masė užrašoma, atliekamas išsamus mikro ­
skopinis galvos smegen ų tyrimas neurotoksiškumui įvertinti. Perfuzin ė 
fiksacija yra reikalaujama 2A kohortos gyv ūnams, bet neprivaloma 2B 
kohortos gyv ūnams, kaip numatyta pagal B.53 metod ą (35).  
Organų masė ir audini ų konservavimas. F  1 nujunkyti gyv ūnai 
68. Į kohortas neatrinkti jaunikliai, taip pat silpniausi jaunikliai po nujunkymo, 
22 PND, yra numarinami, nebent iš gaut ų rezultatų paaiškėja, kad reikia 
toliau tirti gyvus gyv ūnus. Atliekama numarint ų jauniklių bendroji nekros ­
kopija, taip pat įvertinami j ų dauginimosi organai, kaip aptarta 62 ir 63 
punktuose.Iki 10 kiekvienos lyties iš kiekvienos grup ės gyvūnų, priklau­
sančių kuo įvairesnėms vadoms, galvos smegenys, blužnys ir užkr ūčio 
liaukos tur ėtų būti pasveriamos ir laikomos reikiamomis s ąlygomis. Be to, 
šių patinėlių ir patelių jauniklių pieno liauk ų audinius reik ėtų užkonservuoti 
tolesnei mikroskopinei analizei (  1 ) (žr. EBPO Rekomendacin į dokument ą 
Nr. 151 (40)). Didel ės anomalijos ir paveikti audiniai saugomi tam atvejui, 
jei prireikt ų atlikti jų histopatologin į tyrimą. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Tyrimai parod ė, kad krūtų liaukos, ypa č krūtų vystymasis ankstyvuoju gyvenimo laiko ­
tarpiu, yra jautri estrogeninio poveikio vertinamoji baigtis. Tvirtinant tinkamum ą į 
bandymų metodą rekomenduota įtraukti abiej ų lyčių jauniklių pieno liauk ų vertinam ąsias 
baigtis.
 Histopatologija. P gyv ūnai 
69. Daromi išsam ūs histopatologiniai vis ų P gyvūnų, priklausan čių kontroli­
nėms ir didel ės dozės grupėms, organ ų, išvardyt ų 62 ir 63 punktuose, 
tyrimai. Dar tiriami mažesni ų dozių grupių gyvūnų organai, kuriems pasi ­
reiškia su dozi ų davimu siejami pakitimai, kad b ūtų lengviau nustatyti 
NOAEL. Be to, daromas histopatologinis vis ų gyvūnų, kuriems įtariamas 
sumažėjęs vaisingumas, pvz., kurie negal ėjo susiporuoti, pastoti, b ūti repro­
duktoriumi arba atsivesti sveik ų palikuoni ų arba kuri ų rujos ciklas arba 
spermatozoid ų skaičius, judrumas arba morfologija buvo paveikti, daugini ­
mosi organ ų įvertinimas.  
Histopatologija. F  1 gyvūnai 
1 kohortos gyv ūnai 
70. Daromi išsam ūs histopatologiniai vis ų 1A kohortos gyv ūnų, priklausan čių 
kontrolinėms ir didel ės dozės grupėms, organ ų, išvardyt ų 62 ir 63 punk ­
tuose, tyrimai. Iš kiekvienos vados reik ėtų paimti bent po vien ą kiekvienos 
lyties jaunikl į. Dar turėtų būti tiriami mažesni ų dozių grupių gyvūnų organai 
ir audiniai, kuriems pasireiškia su dozi ų davimu siejami pakitimai, ir visi 
dideli pažeidimai, kad b ūtų lengviau nustatyti NOAEL. Vertinant prenata ­
liniu ir postnataliniu laikotarpiais limfoidiniams organams sukelt ą poveikį, 
reikėtų atlikti 1A kohortos 10 patin ėlių ir 10 pateli ų limfmazgi ų ir kaulų 
čiulpų histopatologin į įvertinimą, šalia visiems 1A kohortos gyv ūnams jau 
atlikto histopatologinio užkr ūčio liaukos, blužnies, antinks čių liaukų įverti­
nimo.  
71. Jeigu įtariama, kad medžiaga gali b ūti toksiška dauginimosi arba endokri ­
ninei sistemai, atliekamas vis ų 1B kohortos gyv ūnų dauginimosi ir endo ­
krininių audinių, paruoštų 66 punkte nurodytais blokais, histopatologinis 
tyrimas. 1B kohortos gyv ūnų histopatologinis tyrimas atliekamas ir tada, 
kai 1A kohortos tyrimo rezultatai yra nevienareikšmiai.  
72. Suaugusi ų patelių kiaušidėse turėtų būti pirmapradži ų ir augan čių folikulų, 
geltonkūnių; todėl atliekant histopatologin į tyrimą reikėtų stengtis F  1 patelių 
pirmapradžius ir mažus augan čius folikulus bei geltonk ūnius įvertinti kieky ­
biškai; gyv ūnų skaičius, kiaušidži ų pjūvio pasirinkimas ir pj ūvio mėginių 
dydis tur ėtų statistiškai atitikti taikom ą įvertinimo metodik ą. Folikulus 
galima skai čiuoti pirmiausia imant kontrolin ės ir didel ės dozės grupių 
gyvūnus, ir jeigu juos tiriant pastebimas neigiamas poveikis, tada ištirti 
mažesnes dozes gavusius gyv ūnus. Tyrim ą sudaro pirmini ų folikulų skai­ 
čiavimas, taip pat galima skai čiuoti ir mažus augan čius folikulus, kad b ūtų 
galima palyginti paveiktas ir kontrolines kiaušides (žr. EBPO Rekomenda ­
cinį dokument ą Nr. 151 (40)). Geltonk ūnio vertinim ą reikėtų atlikti lygia ­
grečiai rujos cikliškumo bandymui, kad vertinant b ūtų galima atsižvelgti į 
rujos ciklo etap ą. Kiaušintakis, gimda ir makštis tiriami tikrinant atitin ­
kamus organams b ūdingus vystymosi požymius.  
73. Išsamus s ėklidžių histopatologinis tyrimas atliekamas visiems F  1 patinė­
liams siekiant nustatyti su dozi ų davimu susijus į poveikį sėklidžių poky­ 
čiams ir vystymuisi bei spermatogenezei (38). Jeigu įmanoma, reik ėtų ištirti 
sėklidės kanalėlių pjūvius. Ants ėklidžių galvutė, kūnas ir uodega bei s ėkli­
niai latakai tiriami tikrinant atitinkamus organams b ūdingus vystymosi 
požymius ir reikalingus P patin ėlių parametrus.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
2 kohortos gyv ūnai 
74. Neurohistopatologinis tyrimas atliekamas visiems didel ės dozės grupės ir 
kontrolinės grupės 2A kohortos gyv ūnams pagal lyt į, užbaigus neurobihe ­
vioristinį bandymą (po 75 PND, bet ne v ėliau kaip 90 PND). Smegen ų 
histopatologinis tyrimas atliekamas visiems didel ės dozės ir kontrolin ės 
grupės 2B kohortos gyv ūnams pagal lytis 21 arba 22 PND. Dar tiriami 
mažesnės ir vidutin ės dozės grupių gyvūnų organai ir audiniai, kuriems 
pasireiškia su bandom ąja medžiaga siejami pakitimai, kad b ūtų lengviau 
nustatyti NOAEL. 2A ir 2B kohort ų gyvūnų smegenys tiriami įvairiais 
pjūviais, kad b ūtų galima ištirti uosl ės svogūnėlius, smegen ų žievę, hipo­
kampą, bazalinius ganglijus, gumbur ą, pogumbur į, vidurines smegenis 
(keturkaln į, smegen ų dangtį ir smegen ų kojytes), smegen ų kamieną ir 
smegenėles. Tik 2A kohortos gyv ūnams atliekami aki ų (tinklain ės ir 
regos nervo), periferinio nervo, raumen ų ir stuburo smegen ų mėginių 
tyrimai. Visos neurohistologin ės procedūros turėtų atitikti bandym ų metodą 
B.53 (35).  
75. Morfometrinius (kiekybinius) vertinimus reik ėtų atlikti imant reprezentaty ­
vias smegen ų sritis (kruopš čiai pagal mikroskopinius parametrus pasirinktus 
homologinius pj ūvius), į juos galima įtraukti tiesinius ir (arba) zoninius 
konkrečių smegenų sričių matavimus. Kiekvienam parametro (lygiui) ištirti 
reikėtų imi bent tris pj ūvius iš eil ės, kad būtų galima pasirinkti vienalytiš ­
kiausią ir reprezentatyviausi ą konkrečios vertintinos smegen ų srities pj ūvį. 
Neuropatologas tur ėtų atitinkamai įvertinti, ar matavimams parengti pj ūviai 
yra vienalytiški, palyginti su kitais to paties m ėginio pjūviais, ir ar juos 
galima įtraukti į tyrimą, nes visų pirma tiesiniai matavimai gali pakisti už 
palyginti trumpo atstumo (28). Nevienalytišk ų pjūvių nereikėtų naudoti. 
Nors tikslas yra į imtį įtraukti visus tam tikslui paskirtus gyv ūnus (po 10 
kiekvienos lyties ir doz ės lygmens), tinka ir mažesnis gyv ūnų skaičius. 
Tačiau imtis, sudaryta iš mažiau negu 6 kiekvienos lyties ir doz ės lygmens 
gyvūnų, pagal šį bandymų metodą dažniausiai bus laikoma nepakankama. 
Stereologij ą galima naudoti, kai norima nustatyti su doz ės davimu susijus į 
poveikį tokiems parametrams kaip konkre čių neuroanatomini ų sričių dydis 
ar ląstelių skaičius. Visi audini ų mėginių paruošimo aspektai nuo audini ų 
fiksacijos iki audini ų mėginių išpjovimo, audini ų paruošimo ir objektini ų 
stiklelių dažymo tur ėtų būti tarpusavyje taip suderinti, kad kiekvienoje 
partijoje b ūtų reprezentatyvi ų mėginių iš kiekvienos doz ės grupės. Jei reikia 
atlikti morfometrin ę arba stereologin ę analizę, visais doz ės lygmenimis 
paimti galvos smegen ų audiniai tur ėtų būti įlieti į tinkamą terpę tuo pačiu 
metu, siekiant išvengti susitraukimo artefakt ų, kurie gali b ūti susiję su 
pernelyg ilgu laikymu fiksatyve.  
ATASKAITA  
Duomenys  
76. Duomenys tur ėtų būti pateikiami atskirai ir apibendrinami lentel ėse. Jei 
reikia, apie kiekvien ą bandymo grup ę ir apie kiekvien ą kartą turėtų būti 
pateikiami šie duomenys: gyv ūnų skaičius bandymo pradžioje, per bandym ą 
rastų nugaišusi ų arba dėl humanišk ų priežasčių numarint ų gyvūnų skaičius, 
nugaišimo d ėl bet kurios priežasties ir humaniško numarinimo laikas, 
vaisingų gyvūnų skaičius, vaiking ų patelių skaičius, vadą atsivedusi ų patelių 
skaičius, gyvūnų, kuriems pasireišk ė toksiškumo požymiai, skai čius. Atas­
kaitoje taip pat reik ėtų pateikti toksiškumo apib ūdinimą, įskaitant pasireiš ­
kimo pradži ą, trukmę ir sunkum ą. Požymiai turi b ūti registruojami žymint 
jų pradžią, tipą, sunkumo laipsn į ir trukm ę. 
77. Skai čiais išreikšti rezultatai tur ėtų būti apdoroti tinkamu ir priimtinu statis ­
tiniu metodu. Statistinius metodus reik ėtų pasirinkti rengiant bandymo 
modelį, pagal juos tur ėtų būti tinkamai tvarkomi nenormalieji duomenys 
(pvz., skai čiavimo duomenys), cenz ūruotieji duomenys (pvz., riboto steb ė­
jimo laiko), ne nepriklausomi duomenys (pvz., poveikis vadai ir kartojami 
matavimai), nevienoda sklaida. Apibendrintieji tiesiniai mišr ūs modeliai ir  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
dozės bei atsako tarpusavio ryšio modeliai apima pla čią analitini ų prie­
monių, kurias gali b ūti tikslinga taikyti pagal š į bandymų metodą surink­
tiems duomenims, klas ę. Ataskaitoje tur ėtų būti pakankamas kiekis infor ­
macijos apie analiz ės metodą ir taikytą kompiuterio program ą, kad neprik ­
lausomas ekspertas ar statistikos specialistas gal ėtų įvertinti/iš naujo įvertinti 
analizės eigą. 
Rezultatų įvertinimas  
78. Šio toksiškumo bandymo duomenys įvertinami atsižvelgiant į pastebėtą 
poveikį, įskaitant nekroskopij ą ir mikroskopinio tyrimo rezultatus. Verti ­
nant, be kit ų dalykų, vertinamas ryšys tarp doz ės ir anomalij ų, įskaitant 
didelius pažeidimus, atsiradimo, dažnumo ir sunkumo arba to ryšio nebu ­
vimas. Veikiami organai, vaisingumas, klinikin ės anomalijos, dauginimosi ir 
vados rodikliai, k ūno masės pokyčiai, gaištamumas ir kitoks toksiškas 
poveikis ir poveikis vystymuisi taip pat tur ėtų būti vertinami. Ypa č daug 
dėmesio reik ėtų skirti konkre čiai lyčiai pasireiškusiems poky čiams. Įverti­
nant rezultatus reikia atsižvelgti į bandomosios chemin ės medžiagos fizi ­
kines ir chemines savybes ir toksikokinetinius duomenis, įskaitant perda ­
vimą per placent ą ir išskyrim ą į pieną, jei tokių duomenų turima.  
Bandymo ataskaita  
79. Bandymo ataskait ą turėtų sudaryti ši per bandym ą su P, (jei reikia) su F  1 ir 
F 2 gyvūnais gauta informacija:  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— visa svarbi turima informacija apie chemin ę medžiag ą, toksikokinetines 
ir toksikodinamines bandomosios chemin ės medžiagos savybes;  
— tapatumo duomenys;  
— grynumas.  
Nešiklis (jei naudojamas):  
— nešiklio pasirinkimo pagrindimas, jei nešiklis ne vanduo.  
Bandomieji gyv ūnai: 
— naudota r ūšis/veislė; 
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras, kraiko medžiagos ir t. t.;  
— kiekvieno gyv ūno kūno masė bandymo pradžioje;  
— P pateli ų makšties tepin ėlių duomenys prieš dozi ų davimo pradži ą (jeigu 
tuo metu duomenys renkami);  
— P kartos gyv ūnų poravimo duomenys, nurodant patin ėlius ir pateles, su 
kuriomis jie poruoti, poravimo s ėkmė; 
— duomenys apie vadas, kurioms priklauso F  1 kartos gyv ūnai. 
Bandymo s ąlygos:  
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi doz ės dydžio pasirinkim ą; 
— išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos preparato 
ruošimą arba jos d ėjimą į pašarą, gautos koncentracijos vert ės; ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— preparato stabilumas ir vienalytiškumas nešiklyje arba priede (pvz., 
pašaruose, geriamajame vandenyje), kraujyje ir (arba) piene naudojimo 
ir laikymo tarp dozi ų davimo s ąlygomis;  
— išsami informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos davimo b ūdą; 
— bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos pašare ar geriamajame 
vandenyje (ppm) perskai čiavimas į tikrąją dozę (mg/kg k ūno masės per 
parą), jei tinka;  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę (įskaitant pašaro 
sudėtį, jei turima duomen ų); 
— išsamus atsitiktin ės atrankos, taikomos jaunikliams brokuoti ir suskirs ­
tyti į bandymo grupes, aprašas;  
— aplinkos s ąlygos;  
— tyrimo grup ės narių sąrašas, įskaitant profesin į parengim ą. 
Rezultatai (suvestiniai duomenys ir duomenys apie kiekvien ą gyvūną pagal 
lytį ir dozę): 
— pašaro suvartojimas ir, jei matuojamas, vandens suvartojimas, pašaro 
efektyvumas (k ūno masės padidėjimas vienam suvartoto pašaro gramui, 
išskyrus t ą laiką, kai gyvūnai laikomi kartu, ir išskyrus laktacijos laiko ­
tarpį), P ir F  1 gyvūnams nurodomas suvartotos bandomosios chemin ės 
medžiagos kiekis (kai duodama su pašaru/geriamuoju vandeniu);  
— absorbcijos duomenys (jei yra);  
— P gyv ūnų kūno masė; 
— atrinkt ų F 1 gyvūnų kūno masės po atjunkymo duomenys;  
— nugaišimo darant bandym ą laikas arba informacija, kad gyv ūnai išgy­
veno iki bandymo nutraukimo;  
— klinikini ų požymių tipas, sunkumas ir trukm ė (grįžtami ar negr įžtami),  
— kraujo, šlapimo ir klinikini ų cheminių tyrimų duomenys, įskaitant TSH 
ir T4;  
— blužnies l ąstelių (T, B, nat ūraliųjų žudikių) fenotipin ė analizė; 
— kaulų čiulpų akytumas;  
— duomenys apie atsak ą į toksiškum ą; 
— P ir F  1 patelių, kurių rujos ciklas yra normalus arba nenormalus, skai ­ 
čius ir ciklo trukm ė; 
— laikas iki susiporavimo (prekoitalinis intervalas, dien ų skaičius nuo 
uždarymo poromis iki susiporavimo);  
— toksinis ir kitoks poveikis dauginimuisi, taip pat gyv ūnų, kurie 
sėkmingai susiporavo, buvo vaikingi, atsived ė ir žindė palikuonis, 
pateles apvaisinusi ų patinėlių, patelių, kurioms pasireišk ė distocija/kuri ų 
jauniklių atsivedimo procesas truko ilgiau arba buvo sunkus, skai čius ir 
procentin ė dalis;  
— gestacijos ir, jei turima duomen ų, jauniklių atsivedimo proceso trukm ė; 
— implantacij ų skaičius, vados dydis ir vyriškos lyties jaunikli ų procentin ė 
dalis;  
— poimplantacini ų nuostolių atvejų, gyvagimi ų ir negyvagimi ų skaičius ir 
procentin ė dalis;  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— vados mas ės ir jaunikli ų masės duomenys (patin ėlių ir patelių duomenys 
pateikiami kartu), silpniausi ų jauniklių, jei jų nustatoma, skai čius; 
— jaunikli ų su akivaizdžiai matomomis anomalijomis skai čius; 
— toksinis arba kito tipo poveikis palikuonims, postnataliniam augimui, 
gyvybingumui ir t. t.;  
— duomenys apie fizinius jaunikli ų parametrus ir kiti postnatalinio vysty ­
mosi duomenys;  
— duomenys apie F  1 gyvūnų lytinį subrendim ą; 
— jaunikli ų ir suaugusi ų gyvūnų funkcinių stebėjimų duomenys, kai tinka,  
— P ir suaugusi ų F 1 gyvūnų kūno masė numarinant ir absoliu čios bei 
santykinės organų masės duomenys;  
— nekroskopijos duomenys;  
— išsamus vis ų histopatologini ų rezultatų aprašymas;  
— P ir F  1 patinėliams – suminis spermatozoid ų antsėklidžio uodegoje 
skaičius, vis judresni ų spermatozoid ų procentin ė dalis, morfologiškai 
normalių spermatozoid ų procentin ė dalis ir spermatozoid ų su kiekviena 
identifikuota anomalija procentin ė dalis;  
— P ir F  1 patelių kiaušidėse esančių folikulų skaičius ir subrendimo etapas, 
jei reikia;  
— geltonk ūnių F 1 patelių kiaušidėse skaičius; 
— statistinis rezultat ų apdorojimas, jei daromas.  
2 kohortos parametrai:  
— išsamus steb ėjimų ir metodikos standartizavimo proced ūrų aprašas ir 
taikytos apibr ėžtys stebėjimų rezultatams įvertinti balais;  
— taikyt ų bandymo proced ūrų sąrašas ir jų taikymo pagrindimas;  
— duomenys apie taikytas elgsenos/funkcini ų, neuropatologini ų ir morfo ­
metrinių bandymų procedūras, taip pat informacija ir išsam ūs duomenys 
apie automatizuotus prietaisus;  
— prietais ų kalibravimo proced ūros ir proced ūros, skirtos užtikrinti, kad 
prietaisų parodymai b ūtų lygiaverčiai ir kad bandymo proced ūros būtų 
proporcingai taikomos dozes gaunan čioms grup ėms; 
— glaustas pagrindimas paaiškinant sprendimus, kuriuos priimant remtasi 
profesionaliu vertinimu;  
— išsamus nustatyt ų elgsenos, funkcini ų, neuropatologini ų ir neuroche ­
minių požymių aprašas pagal lyt į ir dozės grupę, įskaitant padid ėjimą 
ir sumažėjimą dėl kontrolės; 
— smegen ų masė; 
— visos diagnoz ės pagal neurologinius požymius ir pažeidimus, įskaitant 
natūraliai atsirandan čias ligas arba b ūsenas;  
— požymi ų pavyzdži ų nuotraukos;  
— mažo padidinimo mikroskopin ės nuotraukos morfometrijai naudot ų 
pjūvių homologijai įvertinti;  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— statistinis rezultat ų apdorojimas, įskaitant duomenims ir rezultatams, 
nepaisant to, ar jie buvo reikšmingi, ar ne, analizuoti taikytus statistinius 
modelius;  
— tai, kiek visas kitas toksinis poveikis tur ėjo įtakos išvadai d ėl bandomo ­
sios chemin ės medžiagos galimo neurotoksiškumo, pagal lyt į ir dozės 
grupę; 
— tai, kiek toksikokinetiniai duomenys tur ėjo įtakos išvadai;  
— duomenys, kuriais pagrindžiamas bandym ų metodo patikimumas ir 
jautrumas (t. y. teigiami ir ankstesni kontroliniai duomenys);  
— neuropatologinio ir funkcinio poveikio ryšys, jei yra;  
— NOAEL arba etalonin ė dozė motininėms patelėms ir jaunikliams pagal 
lytį ir grupę; 
— bendras duomen ų aiškinimas remiantis gautais rezultatais, įskaitant 
išvadą, ar chemin ė medžiaga suk ėlė neurotoksišk ą poveikį vystymuisi, 
ir NOAEL.  
3 kohortos parametrai:  
— IgM antik ūnų serume titrai (jautrinimas SRBC ir KLH), blužnies IgM 
PFC vienetai (jautrinimas SRBC);  
— laboratorija, kuri pirm ą kartą rengiasi atlikti analiz ę, per optimizavimo 
procedūrą (visos laboratorijos periodiškai (pvz., kasmet)) tur ėtų patvir­
tinti TDAR metodo rezultatyvum ą; 
— bendras duomen ų aiškinimas remiantis gautais rezultatais, įskaitant 
išvadą, ar chemin ė medžiaga suk ėlė imunotoksin į poveikį vystymuisi, 
ir NOAEL.  
Rezultatų aptarimas.  
Išvados, įskaitant t ėviniams gyv ūnams ir palikuonims gautas NOAEL vertes.  
Reikėtų pateikti vis ą informacij ą, kuri buvo gauta ne per bandym ą, bet yra 
naudinga aiškinant rezultatus (pvz., poveikio panašumas į kurios nors 
žinomos neurotoksiškos medžiagos poveik į). 
Rezultatų aiškinimas  
80. Išplėstinis toksiškumo vienos kartos dauginimuisi bandymas suteiks infor ­
macijos apie kartotinio chemin ės medžiagos naudojimo poveik į visais 
reikiamais dauginimosi ciklo tarpsniais. Pirmiausia bandymas suteikia infor ­
macijos apie dauginimosi sistem ą ir palikuoni ų iki 90 PND amžiaus vysty ­
mosi, augimo, išgyvenimo ir funkcines vertinam ąsias baigtis.  
81. Aiškinant bandymo rezultatus reik ėtų atsižvelgti į visą turimą informacij ą 
apie chemin ę medžiag ą, įskaitant fizikines ir chemines savybes, TK ir 
toksikodinamines savybes, turim ą svarbią informacij ą apie strukt ūriškai 
analogiškas medžiagas, anks čiau atliktų toksiškumo tyrim ų su bandom ąja 
chemine medžiaga rezultatus (pvz., ūmaus toksiškumo, toksiškumo po 
pakartotinio suvartojimo, mechanistini ų tyrimų ir tyrim ų, per kuriuos 
vertinta, ar vertinant  in vitro/in vivo  metabolines savybes tarp gyv ūnų 
rūšių yra reikšming ų kokybini ų ir kiekybini ų skirtumų). Bendrosios nekros ­
kopijos ir organ ų masės rezultatai įvertinami atsižvelgiant į stebėjimus kitų 
kartotinės dozės bandym ų metu, jei įmanoma. Vertinant palikuoni ų augimo 
sumažėjimą galima vertinti, ar bandomosios chemin ės medžiagos poveikis 
pieno sud ėčiai turėjo tam įtakos (29).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
2 kohorta (Neurotoksiškumas vystymuisi)  
82. Neurobihevioristinius ir neuropatologinius rezultatus reik ėtų aiškinti atsiž ­
velgiant į visus duomenis, laikantis duomen ų įrodomosios vert ės principo ir 
remiantis ekspert ų vertinimu. Reik ėtų aptarti elgsenos arba morfologini ų 
duomenų, jei toki ų gauta, pavyzdžius, taip pat duomenis apie atsak ą į 
dozes. Į šį apibūdinimą reikėtų įtraukti neurotoksiškumo vystymuisi, įskai­
tant žmoni ų epidemiologinius tyrimus arba byl ų ataskaitas, bandym ų su 
bandomaisiais gyv ūnais duomenis (pvz., toksikokinetinius duomenis, infor ­
maciją apie strukt ūrą ir aktyvum ą, kitų toksiškumo tyrim ų duomenis). Verti ­
nant duomenis reik ėtų aptarti ir biologin į, ir statistin į reikšmingum ą. Be kitų 
dalykų, taip pat reik ėtų įvertinti neuropatologini ų ir elgsenos pakitim ų 
tarpusavio ryš į, jei jis pasteb ėtas. Informacijos, kuri pad ėtų aiškinti neuro ­
toksiškumo vystymuisi rezultatus, galima rasti Bandym ų metode B.53 (35) 
ir Tyl et al., 2008 (31).  
3 kohorta (Imunotoksiškumas vystymuisi)  
83. Imunin ės funkcijos slopinim ą arba aktyvinim ą, nustatom ą pagal TDAR (nuo 
T ląstelių priklausom ų antikūnų atsaką), reikėtų įvertinti atsižvelgiant į visų 
atliktų stebėjimų rezultatus. TDAR rezultat ų reikšmingum ą gali patvirtinti 
kiti imunologiniu poži ūriu susiję rodikliai (pvz., kaul ų čiulpų akytumas, 
limfoidini ų audinių masė ir histopatologija, limfocit ų subpopuliacijos pasis ­
kirstymas). TDAR nustatytas poveikis gali b ūti ne toks reikšmingas, jeigu 
kiti toksiškumo aspektai steb ėti esant mažesnei s ąlyčio koncentracijai.  
84. EBPO Rekomendaciniame dokumente Nr. 43 pateikiama informacija, pad ė­
sianti aiškinti dauginimosi ir neurotoksiškumo rezultatus (26).  
LITERAT ŪROS ŠALTINIAI  
(1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. 
Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers 
and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical SAFEty Assessment’,  Critical Reviews in Toxico ­
logy, 36, 69–98.
 
(2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530–536.
 
(3) Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing 
of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.
 
(4) Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), ‘Direct Dosing of Preweaning 
Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI 
Expert Working Group’, International Journal of Toxicology, 24, 87–94.  
(5) Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), ‘Stimulating 
Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment’,  Toxicolo ­
gical Sciences , 49, 1–4.  
(6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Repro ­
duction – a Literature Survey’,  Journal of the American College of Toxi ­
cologists , 14, 293–327.  
(7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356–369.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
(8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats – overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1–21.
 
(9) Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’,  Birth Defects Research , Part B, 68, 408–415.  
(10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , Part B, 
80 (2), 84–97.  
(11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, in C.R. Auston and R.V. 
Short (eds.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization , 
Cambridge, New York.  
(12) Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. 
Reynolds (1999), ‘Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations 
in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights’,  Reproductive Toxicology,  13: 383–390.
 
(13) Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), ‘Preputial Sepa ­
ration as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat’,  
Biological Reproduction , 17, 298–303.  
(14) Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’,  Methods , 41, 9–19.  
(15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23–35.  
(16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology,  12, 92–108.
 
(17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility,  54, 103–107.  
(18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences  Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Reproductive 
Toxicology,  5, 39–44.  
(19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology,  10, 
237–244.
 
(20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology,  6, 267–273.
 
(21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology,  13, 409–421.  
(22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 
449–458.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
(23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Part A , Academic, Orlando, Florida. 
pp. 319–333.  
(24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology , 10, 401–415.  
(25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen 
Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491–505.  
(26) OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, 
ENV/JM/MONO(2008)16,OECD, Paris.  
(27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology , 8, 330–337.  
(28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), ‘A ‘Best Practices’ Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing – for Today’,  Toxicological Patho ­
logy, 34, 296–313.
 
(29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8–16.
 
(30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet 
Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in 
CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives,  115(12), 1717–1726.
 
(31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental 
Endpoints’,  Neurotoxicology and Teratology, 30 : 349–381.
 
(32) OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , OECD Guideline for 
Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paris.  
(33) Šio priedo B.43 skyrius ‘Neurotoksiškumo graužikams bandymas’.  
(34) OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ ­
MONO(2000)7, OECD, Paris.
 
(35) Šio priedo B.53 skyrius ‘Neurotoksiškumo vystymuisi bandymas’.  
(36) Šio priedo B.54 skyrius ‘Poveikiu graužik ų gimdai pagr įstas biologinis 
tyrimas: Trumpalaikis estrogenini ų savybių atrankos bandymas’.  
(37) Šio priedo B.55 skyrius ‘Žiurki ų Hershberger  biologinis tyrimas: Trumpa ­
laikis (anti)andriogenini ų savybių atrankos tyrimas’.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
(38) OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Paris.  
(39) OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris.
 
(40) OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assess ­
ment, No. 151, OECD, Paris.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
1 priedėlis 
Per funkcinio steb ėjimo bandym ų rinkinio bandymus matuojami ir stebimi rodikliai (2A 
kohorta)  
Nuolatinio laikymo narvelis ir atvira 
vieta  Manipuliaciniai  Fiziologiniai  
Laikysena  Iš ėmimo lengvumas  Temperat ūra 
Nevalingi kloniniai ir toniniai 
judesiai  Manipuliavimo gyv ūnu 
lengvumas  Kūno masė 
Akies vok ų užkritimas  Raumens tonusas  Vyzdžio reakcija  
Plaukų pašiaušimas  Reakcija į prisiartinim ą Vyzdžio dydis  
Seilėjimasis  Reakcija į prisilietim ą 
Ašarojimas  Reakcija į garsą 
Vokalizacija  Reakcija į uodegos 
suspaudim ą 
Vaikščiojimas atbulomis  Reakcija išsitiesiant  
Eisenos anomalijos  Kreivai statoma p ėda 
Budrumas  Priekin ės galūnės grybšnio 
jėga 
Stereotipinis elgesys  Užpakalin ės galūnės grybšnio 
jėga 
Keistas elgesys  
Dėmės 
Kvėpavimo anomalijos  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
2 priedėlis 
SĄVOKOS  
Cheminė medžiaga:  medžiaga arba mišinys.  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  bet kuri pagal š į bandym ų metodą bandoma 
medžiaga arba mišinys.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  H295R STEROIDOGENEZ ĖS ANALIZ Ė 
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka EBPO  Test Guideline  (TG) 456 (2011). 1998 
m. EBPO iniciatyva prad ėta labai svarbi veikla, kurios tikslas – patikslinti 
esamas ir parengti naujas galim ų endokrinin ę sistemą ardančių cheminių 
medžiagų atrankos ir bandymo gaires. 2002 m. EBPO konceptuali endokri ­
ninę sistemą ardančių cheminių medžiagų bandymo ir vertinimo sistema yra 
penkių lygmenų, kurių kiekvienas atitinka skirting ą biologinio sud ėtingumo 
lygį (1). Atliekant šio bandymo metodo aprašyme apib ūdinamą in vitro  
H295R  steroidogenez ės analizę, naudojama antinks čių žievės karcinomos 
pažeistų žmogaus l ąstelių linija (NCI-H295R l ąstelės), ir tai yra 2 lygmens 
(in vitro  analizės mechanistiniams duomenims surinkti) analiz ė, kuri atlie ­
kama chemini ų medžiagų atrankos ir vertinimo pirmenyb ės nustatymo tiks ­
lais. Ši analiz ė, kaip chemin ės medžiagos poveikio steroidogenezei, b ūtent 
17β-estradiolio (E2) ir testosterono gamybai, patikrinimo b ūdas, buvo 
kuriama ir standartizuojama keliais etapais. H295R analiz ė buvo optimi ­
zuota ir jos tinkamumas – patvirtintas (2) (3) (4) (5).  
2. H295R steroidogenez ės analizės tikslas – nustatyti chemines medžiagas, 
kurios veikia E2 ir testosterono gamyb ą. H295R analiz ę numatyta naudoti 
siekiant nustatyti ksenobiotikus, kuri ų taikinys (-iai) – endogeniniai kompo ­
nentai, lemiantys l ąstelių viduje vykstan čių biochemini ų reakcijų seką, kuri 
prasideda cholesterolio reakcij ų seka ir baigiasi E2 ir (arba) testosterono 
gamyba. H295R analiz ė nėra skirta chemini ų medžiag ų, kurios steroidoge ­
nezę veikia d ėl savo poveikio pogumburio-hipofiz ės-gonadų (PHG) ašiai, 
nustatymui. Šios analiz ės tikslas – atsakyti, ar chemin ė medžiaga gali indu ­
kuoti arba slopinti testosterono ir E2 gamyb ą, ar ne; ta čiau kai kuriais 
atvejais (žr. 53 ir 54 punktus) galima gauti kiekybinius rezultatus. Analiz ės 
rezultatai išreiškiami santykiniais hormon ų gamybos poky čiais, palyginti su 
kontroliniais tirpikliais. Šia analize nesiekiama gauti konkre čios mechanis ­
tinės informacijos apie bandomosios chemin ės medžiagos s ąveiką su endo­
krinine sistema. Naudojant l ąstelių liniją, buvo atlikti moksliniai tyrimai 
siekiant nustatyti konkre čių fermentų ir tarpini ų hormonų, kaip antai proges ­
terono, poveik į (2). 
3. Šio bandymo metodo aprašyme vartojam ų sąvokų ir santrump ų apibrėžtys 
pateiktos pried ėlyje. Išsamus protokolas, įskaitant tirpal ų ruošimo, l ąstelių 
auginimo instrukcijas ir nurodymus d ėl įvairių šio bandymo eigos aspekt ų, 
pateikiamas EBPO parengto dokumento  Multi-Laboratory Validation of the 
H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production  (4) (Testosterono ir estradiolio gamybos moduliato ­
riams nustatyti atliekamos H295R steroidogenez ės analizės tinkamumo 
patvirtinimas keliose laboratorijose) I–III pried ėliuose.
 
PRADINIAI ASPEKTAI IR APRIBOJIMAI  
4. Lytini ų steroidini ų hormon ų biosintez ėje dalyvauja penki skirtingi 
fermentai, kurie katalizuoja šešias skirtingas reakcijas. Prie citochromo 
P450 (CYP) grup ės priskiriamo cholesterolio šonin ės grandin ės skalumo 
fermento (CYP11A) sukeliamas cholesterolio virsmas į pregnenolon ą yra 
pirmasis biochemini ų reakcijų sekos, kuri baigiasi galutini ų produkt ų 
steroidų sinteze, etapas. Atsižvelgiant į kitų dviejų reakcijų eilės tvarką, 
steroidogenez ės reakcijų seka skyla į dvi reakcij ų trajektorijas – Δ 5 -hidro­
ksisteroid ų reakcijų seką ir Δ 4 -ketosteroid ų reakcijų seką, kurios susieina 
androstenediono gamybos etape (1 paveikslas).  
5. 17β-hidroksisteroid-dehidrogenaz ės (17β-HSD) veikiamas androstenedionas 
virsta į testosteron ą. Testosteronas yra ir tarpinis junginys, ir hormonas 
galutinis produktas. Vyriškos lyties gyv ūnų organizme testosteronas, 
veikiamas 5 α-reduktaz ės, kurios galima rasti androgeninio poveikio tikslini ų 
audinių, kaip antai prostatos ir s ėklinių pūslelių audinių ląstelių membra­
nose, branduolio apvalkale ir endoplazminiame tinkle, gali virsti dihidrotestosteronu (DHT). DHT androgeninis poveikis gerokai stipresnis už testosterono, ir jis taip pat laikomas hormonu galutiniu produktu. 
H295R analiz ė nesuteikia galimyb ės nustatyti DHT koncentracijos (žr. 10 
punktą).
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Fermentas, kuris dalyvauja steroidogenez ės reakcij ų sekoje ir paver čia 
androgenines chemines medžiagas estrogenin ėmis, yra aromataz ė 
(CYP19). CYP19 paver čia testosteron ą 17β-oestradioliu, o androstenedion ą 
– estronu. E2 ir testosteronas laikomi hormonais steroidogenez ės reakcijų 
sekos galutiniais produktais.  
7. Skirting ų rūšių gyvūnų organizmuose CYP17, kaip liaz ės, poveikio tarpi ­
niams substratams specifiškumas skiriasi. Žmogaus organizme šis fermentas teikia pirmenyb ę Δ
 5 -hidroksisteroid ų reakcijų sekos substratams (pregneno ­
lonui), o žiurk ės – Δ 4 -ketosteroid ų reakcijų sekos substratams (progeste ­
ronui) (19). Tokiais CYP17, kaip liaz ės, poveikio skirtumais galima paaiš ­
kinti kai kuriuos nuo gyv ūno rūšies priklausomus reakcijos į chemines 
medžiagas, kurios  in vivo  keičia steroidogenez ę, skirtumus (6). Tyrimais 
nustatyta, kad H295 l ąstelės tiksliausiai atspindi suaugusio žmogaus anti ­
nksčių fermentų ekspresijos ir steroid ų gamybos ypatumus (20), ta čiau 
žinoma, kad šios l ąstelės ekspresuoja ir Δ 5 -hidroksisteroid ų, ir Δ 4 -ketoste­
roidų reakcijų sekose, kurios baigiasi androgen ų sinteze, dalyvaujan čius 
fermentus(7) (11) (13) (15).  
1 paveikslas  
Steroidogenez ės reakcij ų seka H295R l ąstelėse.
 
Pastaba.  
Fermentai išskirti kursyvu, hormonai – pajuodintu šriftu, o str ėlytės rodo 
sintezės kryptį. Pilkas fonas – tai kortikosteroid ų reakcijų sekos ir 
produktai. Lytini ų steroidų reakcijų sekos ir produktai apibr ėžti ratu. CYP 
= citochromas P450; HSD = hidroksisteroid-dehidrogenaz ė; DHEA = 
dehidroepiandrosteronas.  
8. Žmogaus antinks čių žievės karcinomos l ąstelių linija H295R – naudingas  in 
vitro  modelis, kai siekiama ištirti poveik į steroidini ų hormonų sintezei (2) 
(7) (8) (9) (10). H295R l ąstelių linijos ekspresuoja genus, kurie koduoja 
visus pirmiau min ėtus svarbiausius steroidogenez ėje dalyvaujan čius 
fermentus (11) (15) (1 paveikslas). Tai yra unikali savyb ė, nes šių genų 
in vivo  ekspresijos ypatumai priklauso nuo audinio ir vystymosi etapo, ir 
tipinėmis aplinkyb ėmis vieno audinio ar vieno vystymosi etapo, kuriame 
būtų ekspresuojami visi steroidogenez ėje dalyvaujantys genai, neb ūna (2). 
H295R l ąstelės turi pagal sritis nediferencijuot ų žmogaus vaisiaus anti ­
nksčių ląstelių fiziologines savybes (11). Šios l ąstelės – tai savo geb ėjimu ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
gaminti visus steroidinius hormonus, kuri ų yra suaugusio žmogaus anti ­
nksčių žievėje ir gonadose, išsiskirianti  in vitro  sistema, kuri suteikia gali ­
mybę atlikti poveikio ir kortikosteroid ų sintezei, ir lytini ų steroidini ų 
hormonų, tokių kaip androgen ų ir estrogen ų, gamybai bandymus, nors ši 
analizė buvo patvirtinta kaip tinkama tik poveikiui testosteronui ir E2 nusta ­
tyti. Naudojant bandym ų sistemą nustatytus poky čius, t. y. testosterono ir 
E2 gamybos pakitimus, gali sukelti daugyb ė skirtingų bandomųjų cheminių 
medžiagų sąveikos su steroidogenezin ėmis funkcijomis, kurias ekspresuoja 
H295R ląstelės, reakcijų. Tai gali b ūti steroidini ų hormonų gamyboje, trans ­
formacijoje ar eliminacijoje dalyvaujan čių fermentų ekspresijos, sintez ės ar 
funkcijos moduliacija (12) (13) (14). Hormon ų gamyba gali b ūti slopinama 
dėl tiesioginio konkurencingo rišimosi prie reakcij ų sekoje dalyvaujan čio 
fermento, poveikio kofaktoriams, kaip antai nikotinamido adenino dinukleo ­
tido fosfatui (NADF) ir cikliniam adenozino monofosfatui (CAMF), ir 
(arba) aktyvesnio steroid ų metabolizmo ar tam tikr ų steroidogenez ės reak­
cijų sekoje dalyvaujan čių fermentų genų ekspresijos supresijos. Inhibavimas 
gali būti ir tiesiogini ų, ir netiesiogini ų su hormon ų gamyba susijusi ų 
procesų funkcija, o indukcija paprastai yra netiesioginio pob ūdžio, pvz., 
pasireiškia d ėl poveikio kofaktoriams, tokiems kaip NADF ir cAMP (kaip 
forskolino atveju), steroid ų metabolizmo slopinimo (13) ir (arba) d ėl 
teigiamos steroidogenez ės genų ekspresijos reguliacijos.  
9. H295R analiz ė turi kelis pranašumus:  
— H295R analiz ė suteikia galimyb ę nustatyti iš testosterono ir E2 gamybos 
apimties padid ėjimą ir sumaž ėjimą; 
— suteikia galimyb ę tiesiogiai įvertinti galim ą cheminės medžiagos poveik į 
ląstelių gyvybingumui ir (arba) citotoksiškum ą. Tai yra svarbi ypatyb ė, 
nes tai suteikia galimyb ę atskirti poveik į, kuris pasireiškia d ėl citotok­
siškumo, nuo poveikio, kuris pasireiškia d ėl tiesiogin ės chemini ų 
medžiagų sąveikos su steroidogenez ės reakcijų sekomis; to negalima 
padaryti naudojant audini ų eksplant ų sistemas, kurios sudarytos iš 
kelių rūšių skirtingo jautrumo ir skirtingas funkcijas atliekan čių ląstelių; 
— nereikia naudoti gyv ūnų; 
— H295R l ąstelių liniją galima įsigyti rinkoje.  
10. Pagrindiniai analiz ės apribojimai:  
— H295R analiz ės metabolin ė geba nežinoma, bet ji tikriausiai yra paly ­
ginti nedidel ė, todėl šia analize turb ūt nepavyks nustatyti chemini ų 
medžiagų, kurių metabolizm ą reikia suaktyvinti.  
— Kadangi H295R l ąstelių linijos šaltinis – antinks čių audinys, joje yra 
fermentų, kurie gali gaminti gliukokortikoidus ir mineralkortikoidus, 
taip pat lytinius hormonus, tod ėl poveikis gliukokortikoid ų ir mineral ­
kortikoidų gamybai gali tur ėti įtaką analize nustatomai testosterono ir E2 
koncentracijai.  
— analiz ė nesuteikia galimyb ės nustatyti DHT koncentracijos, tod ėl 
manoma, kad šiuo bandymo metodu neb ūtų įmanoma nustatyti chemini ų 
medžiagų, kurios slopina 5 α-reduktaz ę, o tokiu atveju galima naudoti 
Hershberger'io analiz ę (16).  
— Naudojant H295R analiz ės metod ą, nepavyks nustatyti chemini ų 
medžiagų, kurios trikdo steroidogenez ę veikdamos 
pogumburio-hipofiz ės-gonadų (PHG) aš į, nes tokį tyrimą galima atlikti 
tik su neporuotais gyv ūnais. 
BANDYMO METODO PRINCIPAS  
11. Analiz ės paskirtis – nustatyti chemines medžiagas, kurios veikia T ir E2 
gamybą. Testosteronas taip pat yra tarpinis junginys E2 gamybos reakcij ų 
sekoje. Naudojant ši ą analizę, galima nustatyti chemines medžiagas, kurios 
paprastai slopina arba indukuoja steroidogenez ės reakcijų sekos fermentus.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Paprastai ši analiz ė atliekama standartin ėmis ląstelių auginimo s ąlygomis 24 
duobučių kultūrų auginimo plokštel ėse. Taip pat šiai analizei galima naudoti 
kitų dydžių plokšteles, ta čiau pasėlio ir bandymo s ąlygas reik ėtų atitinkamai 
pakoreguoti siekiant išsaugoti atitikt į veiksmingumo kriterijams.  
13. Praėjus 24 valand ų aklimacijos daugiaduob ėse plokštel ėse laikotarpiui, 
ląstelės 48 valandas veikiamos septyni ų dydžių koncentracijos bandom ąja 
chemine medžiaga ir kiekvienos koncentracijos chemin ė medžiaga bandoma 
ne mažiau kaip trijose duobut ėse. Fiksuotos koncentracijos tirpiklis ir 
žinomas hormon ų gamybos inhibitorius ir induktorius naudojami kaip 
neigiami ir teigiami kontroliniai bandiniai. Pasibaigus veikimo chemine 
medžiaga laikui, terp ė pašalinama iš vis ų plokštelės duobučių. Pašalinus 
terpę, nedelsiant analizuojamas kiekvienoje duobut ėje esančių ląstelių gyvy­
bingumas. Hormon ų koncentracij ą terpėje galima išmatuoti įvairiais b ūdais, 
pvz., naudojant hormon ų matavimo rinkinius, kuri ų galima įsigyti rinkoje, ir 
(arba) instrumentiniais analiz ės metodais, pvz., taikant skys čių chromatogra ­
fijos ir masi ų spektrometrijos metod ą. Gauti analiz ės duomenys – pokytis 
kartais, lyginant su kontroliniu tirpikliu ir mažiausio pasteb ėto poveikio 
koncentracija (LOEC). Jeigu analiz ės rezultatai neigiami, didžiausia bandyta 
koncentracija nurodoma kaip nepasteb ėto poveikio koncentracija (NOEC). 
Išvados d ėl cheminės medžiagos geb ėjimo paveikti steroidogenez ę turėtų 
būti pagrįstos ne mažiau kaip du kartus atskirai atliktais bandymais. 
Bandymą atliekant pirm ą kartą, galima nustatyti koncentracijos interval ą, 
vėliau, bandym ą atliekant antr ą ir, jei taikoma, tre čią kartą (jeigu iškyla 
tirpumo arba citotoksiškumo problem ų arba manoma, kad chemin ės 
medžiagos aktyvumas siekia bandyt ų koncentracijos lygi ų intervalo 
pabaigą) – pakoreguoti koncentracij ą. 
LĄSTELIŲ AUGINIMO MITYBOS TERP ĖJE PROCESAS  
Ląstelių linija  
14. NCI-H295R l ąstelių galima įsigyti iš biologini ų išteklių centro ‘American 
Type Culture Collections’ (ATCC), pasirašius moksliniams tyrimams skirt ų 
medžiagų perdavimo sutart į (angl.  Material Transfer Agreement , MTA) (  1 ). 
Įvadas  
15. Kadangi l ąstelėms senstant ir did ėjant ląstelių pasažų skaičiui, jų gebėjimas 
gaminti E2 kei čiasi (2), prieš naudojant l ąsteles, jos tur ėtų būti auginamos 
mitybos terp ėje pagal special ų protokol ą, o pasaž ų skaičių nuo ląstelių 
atšildymo ir l ąstelių pasažų skaičių tuo metu, kai jos užšaldomos ir pade ­
damos saugojimui skystame azote, reik ėtų užsirašyti. Pirmas skai čius rodo 
faktinį ląstelių pasažų skaičių, o antrasis – pasaž ų skaičių tuo metu, kai 
ląstelės buvo užšaldytos ir pad ėtos saugojimui. Pavyzdžiui, l ąstelės, kurios 
buvo užšaldytos po penkto pasažo, atšildytos, tuomet v ėl paaugintos 
mitybos terp ėje ir padalytos tris kartus (4 pasažai, nes šviežiai atšildytos 
ląstelės laikomos pirmo pasažo l ąstelėmis), bus paženklintos kaip 4,5 
pasažas. Numeravimo sistemos pavyzdys pavaizduotas tinkamumo patvirti ­
nimo ataskaitos (4) I pried ėlyje. 
16. Pradin ė terpė naudojama kaip priedais papildyt ų ir užšaldymo terpi ų 
pagrindas. Priedais papildyta terp ė būtina ląstelių auginimui. Užšaldymo 
terpė specialiai skirta tam, kad nepakenkiant l ąstelėms būtų galima užšaldyti 
jas ilgalaikiam saugojimui. Prieš naudojant auginimo terp ės priedą „Nu- 
serum“ (arba panaš ų tokių pat savybi ų serumą, kurį naudojant gaunami 
duomenys atitinka bandymo atlikimo ir kokyb ės kontrol ės (KK) reikala ­
vimus), kuris yra priedais papildytos terp ės sudedamoji dalis, reik ėtų ištirti 
jame natūraliai esan čių testosterono ir E2 koncentracij ą. Kaip šie tirpalai 
ruošiami, aprašyta tinkamumo patvirtinimo ataskaitos (4) II pried ėlyje. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manasas (Virdžinija, JAV) [http://www.lgcstandards- 
atcc.org/].
 17. Prad ėjus auginti H295R l ąstelių kultūrą iš originalios ATCC l ąstelių grupės, 
ląstelės turėtų būti auginamos penkis pasažus (t. y. l ąstelės padalijamos 4 
kartus). Tuomet penkto pasažo l ąstelės užšaldomos saugojimui skystame 
azote. Prieš užšaldant l ąsteles, ankstesnio ketvirto pasažo l ąstelių mėginys 
analizuojamas KK plokštel ėje (žr. 36 ir 37 punktus), siekiant patikrinti, ar 
bazinė hormon ų gamyba ir reakcija į teigiamus kontrolinius bandinius 
atitinka 5 lentel ėje nurodytus analiz ės KK kriterijus.  
18. H295R l ąstelės turi būti auginamos mitybos terp ėje, užšaldomos ir laikomos 
skystame azote siekiant užtikrinti, kad l ąstelių auginimui ir naudojimui 
visada būtų atitinkamo pasažo ir (arba) amžiaus l ąstelių. Didžiausias pasaž ų 
skaičius auginimui pa ėmus nauj ą ( 1 ) arba užšaldyt ą ( 2 ) ląstelių grupę, kad 
ląstelių kultūrą būtų galima naudoti H295R analizei, netur ėtų viršyti 
10.Pavyzdžiui, tinkamos b ūtų tos ląstelių iš po penkto pasažo užšaldytos 
ląstelių grupės kultūros, kurių pasažai b ūtų žymimi skai čių deriniais nuo 4.5 
iki 10.5. Siekiant išauginti l ąsteles iš ši ų užšaldyt ų ląstelių grupių, reikėtų 
vadovautis 19 punkte aprašytu procesu. Prieš naudojant šias l ąsteles bandy ­
mams, jas reik ėtų auginti mitybos terp ėje dar ne mažiau kaip keturis (4) 
pasažus (4.5 pasažas).  
Ląstelių auginimas iš užšaldytos pradin ės ląstelių kultūros 
19. Šis l ąstelių auginimo iš užšaldytos pradin ės ląstelių kultūros procesas 
taikomas, kai l ąstelių auginimui ir bandymams iš skysto azoto išimama 
jame saugota nauja l ąstelių grupė. Šis procesas išsamiai aprašytas tinka ­
mumo patvirtinimo ataskaitos (4) III pried ėlyje. Ląstelės išimamos iš skysto 
azoto, kuriame jos buvo saugomos, greitai atšildomos, supilamos į centri­
fuginį mėgintuvėlį su priedais papildyta terpe, centrifuguojamos kambario 
temperatūroje, vėl suspenduojamos priedais papildytoje terp ėje ir perke ­
liamos į kultūrų auginimo kolbas. Kit ą dieną terpę reikia pakeisti. H295R 
ląstelės auginamos inkubatoriuje 37 °C temperat ūroje, esant 5 % CO  2 
koncentracijai ore ir terp ę atnaujinant 2–3 kartus per savait ę. Ląstelėms 
užpildžius maždaug 85–90 % kult ūrų auginimo kolbos, jas reik ėtų padalyti. 
Padalyti l ąsteles būtina siekiant užtikrinti l ąstelių sveikatą ir augim ą ir kad 
būtų galima pasilikti l ąstelių biologiniams tyrimams atlikti. L ąstelės tris 
kartus praplaunamos fosfatiniu buferiniu drusk ų tirpalu (FBDT, be Ca  2+ 
Mg 2+ ) ir atlaisvinamos iš kult ūrų auginimo kolbos, į FBDT (be Ca  2+ 
Mg 2+ ) įpilant atitinkamo atskiriamojo fermento, pvz., tripsino. L ąstelėms 
atsiskyrus nuo kult ūrų auginimo kolbos sieneli ų, nedelsiant reik ėtų sustab­
dyti fermento veikim ą, į kolbą įpilant priedais papildytos terp ės, kurios 
kiekis tur ėtų būti 3 kartus didesnis už l ąstelių apdorojimui naudoto 
fermento. L ąstelės supilamos į centrifugin į mėgintuvėlį, centrifuguojamos 
kambario temperat ūroje, supernatantas pašalinamas, o nus ėdusios ląstelės 
vėl suspenduojamos priedais papildytoje terp ėje. Atitinkamas l ąstelių tirpalo 
kiekis supilamas į naują kultūrų auginimo kolb ą. Ląstelių tirpalo kiek į 
reikėtų pakoreguoti taip, kad kult ūrų auginimo kolb ą ląstelės užpildyt ų 
per 5–7 dienas. Rekomenduojamas pers ėjimo santykis 1:3–1:4. Plokštel ę 
reikėtų atidžiai paženklinti. Dabar l ąstelės jau paruoštos naudojimui analiz ės 
tikslais, o l ąstelių perteklių reikėtų užšaldyti skystame azote, kaip aprašyta 
20 punkte.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) Nauja l ąstelių grupė – tai iš ATCC gauta šviežia l ąstelių grupė. 
( 2 ) Užšaldyta l ąstelių grupė – tai ląstelės, kurios prieš tai buvo auginamos mitybos terp ėje, 
vėliau užšaldytos laboratorijoje, bet ne ATCC.
 H295R l ąstelių užšaldymas (l ąstelių paruošimas saugojimui skystame 
azote)  
20. Siekiant paruošti H295R l ąsteles užšaldymui, reik ėtų vadovautis pirmiau 
aprašytu l ąstelių padalijimo procesu iki pakartotinio centrifuginio m ėgintu­
vėlio dugne nus ėdusių ląstelių suspendavimo. Šiuo atveju nus ėdusios 
ląstelės pakartotinai suspenduojamos užšaldymo terp ėje. Tirpalas supilamas 
į atitinkamai paženklint ą kriogenin į buteliuk ą, kuris šaldomas – 80°C 
temperatūroje 24 valandas, v ėliau perkeliamas saugojimui į suskystint ą 
azotą. Šis procesas išsamiai aprašytas tinkamumo patvirtinimo ataskaitos 
III priedėlyje (4).  
Bandymams skirt ų ląstelių sėjimas plokštel ėse ir paruošimas inkuba ­
vimui  
21. Kiek reik ės pagal 19 punkte pateiktus nurodymus paruošt ų 24 duobu čių 
plokštelių, priklausys nuo chemini ų medžiag ų, kurių bandymus numatoma 
atlikti, skai čiaus ir kult ūrų auginimo ind ų užpildymo l ąstelėmis. Iš esm ės 
ląstelių iš vienos (75 cm  2 ) 80–90 % užpildytos kult ūrų auginimo kolbos 
pakanka 1–1,5 (24 duobu čių) plokštel ės, kai tikslinis tankis – 
200 000–300 000 l ąstelių viename terp ės mililitre; po 24 valand ų duobutės 
užpildomos maždaug 50–60 %. Paprastai atliekant analiz ę tai yra optimalus 
ląstelių tankis hormon ų gamybai. Esant didesniam tankiui, testosterono ir 
E2 gamybos ypatumai kei čiasi. Prieš atliekant analiz ę pirmą kartą, reko­
menduojama išbandyti skirtingus pas ėlio tankius – nuo 200 000 iki 300 000 
ląstelių viename mililitre, ir tolesniems eksperimentams rinktis tok į tankį, 
kurį naudojant po 24 valand ų duobutė būtų užpildyta 50–60 %.  
2 paveikslas  
H295R l ąstelių, kurių pasėlio 24 duobu čių plokštel ėje tankis – 50 %, fotomikrografija, 
padaryta prie duobut ės krašto (A) ir duobut ės centre (B) pra ėjus 24 valandoms.
  
22. Terp ė pipete ištraukiama iš kult ūrų auginimo kolbos, o l ąstelės tris kartus 
praplaunamos steriliu FBDT (be Ca  2+ Mg 2+ ). Siekiant atskirti l ąsteles nuo 
kultūrų auginimo kolbos sieneli ų, (į FBDT) įpilama fermento tirpalo. 
Praėjus atitinkamam laikotarpiui, per kur į ląstelės atsiskiria nuo kolbos 
sienelių, fermento veikim ą reikėtų sustabdyti į kolbą įpilant priedais papil ­
dytos terp ės, kurios kiekis tur ėtų būti 3 kartus didesnis už l ąstelių apdoro­
jimui naudoto fermento kiek į. Ląstelės supilamos į centrifugin į mėgintuvėlį, 
centrifuguojamos kambario temperat ūroje, supernatantas pašalinamas, o 
nusėdusios ląstelės vėl suspenduojamos priedais papildytoje terp ėje. Ląstelių ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
tankis apskai čiuojamas naudojant, pvz., hemocitometr ą arba ląstelių skai­ 
čiuotuvą. Ląstelių tirpalą reikėtų atskiesti iki naudojimui plokštel ėse pagei­
daujamo tankio ir kruopš čiai išmaišyti siekiant užtikrinti l ąstelių tankio 
homogeniškum ą. Ląsteles reik ėtų pasėti plokštel ėje, į kiekvien ą duobutę 
įpilant po 1 ml l ąstelių tirpalo, o plokšteles ir duobutes – paženklinti. 
Plokštelės su pas ėliu 24 valandas inkubuojamos 37 °C temperat ūroje, 
esant 5 % CO  2 koncentracijai ore, kad l ąstelės galėtų prikibti prie duobu čių. 
KOKYBĖS KONTROL ĖS REIKALAVIMAI  
23. Labai svarbu, kad į duobutes b ūtų įpilta tiksliai tiek tirpal ų ir mėginių, kiek 
reikia, nes nuo ši ų kiekių priklauso koncentracija, naudojama apskai čiuojant 
analizės rezultatus.  
24. Prieš prad ėdama auginti l ąsteles mitybos terp ėje ir atlikdama visus tolesnius 
bandymus, kiekviena laboratorija tur ėtų įrodyti, kad j ų naudojama hormon ų 
matavimo sistema yra jautri (29–31 punktai).  
25. Jeigu hormonams matuoti numatoma naudoti antik ūnais grindžiamus 
analizės metodus, prieš pradedant bandymus, reik ėtų ištirti, ar chemin ės 
medžiagos, kuri ų bandymus numatoma atlikti, negali tur ėti neigiamos įtakos 
testosterono ir E2 kiekiui nustatyti naudojamos matavimo sistemos tiks ­
lumui, kaip išd ėstyta 32 punkte.  
26. Šiai analizei rekomenduojama kaip tirpikl į naudoti dimetilsulfoksid ą 
(DMSO). Jeigu naudojamas kitas tirpiklis, reikia nustatyti:  
— bandomosios chemin ės medžiagos, forskolino ir prochlorazo tirpum ą 
tirpiklyje;  
— citotoksiškum ą, kaip tirpiklio koncentracijos funkcij ą. 
Rekomenduojama, kad didžiausia leidžiama tirpiklio koncentracija neviršyt ų 
10 kartų atskiestos mažiausio citotoksiškumo tirpiklio koncentracijos.  
27. Prieš atlikdama bandymus pirm ą kartą, laboratorija tur ėtų atlikti kvalifika ­
cinį eksperiment ą, kuris įrodytų, kad joje galima sukurti ir palaikyti atitin ­
kamas ląstelių auginimo mitybos terp ėje ir eksperimento s ąlygas, kurios 
būtinos atliekant chemini ų medžiag ų bandymus, kaip aprašyta 33–35 
punktuose.  
28. Pradedant chemini ų medžiag ų bandymus su nauja l ąstelių grupe, prieš 
pradedant naudoti nauj ą ląstelių grupę, pasitelkus kontrolin ę plokštel ę 
reikėtų įvertinti ląstelių veiksmingum ą, kaip aprašyta 36 ir 37 punktuose.  
Hormonų matavimo sistemos veiksmingumas  
Metodo jautrumas, patikimumas, tikslumas ir kryžminis reaktyvumas su 
mėginio matrica  
29. Siekdama ištirti testosterono ir E2 gamyb ą H295R l ąstelėse, kiekviena labo ­
ratorija gali naudoti savo pasirinkt ą hormonų matavimo sistem ą, jeigu ji 
atitinka veiksmingumo kriterijus, įskaitant kiekybinio nustatymo rib ą. Tech­
niškai tai gali b ūti 100 pg/ml testosterono atveju ir 10 pg/ml E2 atveju; šie 
skaičiai grindžiami baziniais atliekant tinkamumo patvirtinimo tyrimus 
nustatytais hormon ų kiekiais. Vis d ėlto, atsižvelgiant į tai, koks bazinis 
hormonų kiekis nustatytas bandymus atliekan čioje laboratorijoje, tinkama 
gali būti ir didesn ė, ir mažesn ė koncentracija. Prieš prad ėdama naudoti 
KK plokšteles ir prad ėdama bandym ų serijas, laboratorija tur ėtų įrodyti,  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
kad hormon ų analize, kuri ą numatoma naudoti, t. y. analizuojant priedais 
papildytą terpę, į kurią suleista vidinio kontrolinio bandinio hormono, 
hormonų koncentracij ą priedais papildytoje terp ėje galima nustatyti taip 
patikimai ir tiksliai, kad analiz ė atitiktų 1 ir 5 lentel ėse nurodytus KK 
kriterijus. Į priedais papildyt ą terpę reikia suleisti kiekvieno ne mažiau 
kaip trijų dydžių koncentracijos hormono (pvz., 100, 500 and 2 500 
pg/ml testosterono; 10, 50 ir 250 pg/ml E2; arba galima naudoti mažiausios koncentracijos testosterono ir E2 preparat ą, t. y. pasirinkti galim ą mažiausi ą 
koncentracij ą, apskaičiuotą pagal pasirinktos hormon ų matavimo sistemos 
radimo ribas), ir j ą reikėtų ištirti. Nustatyta hormon ų koncentracija neek ­
strahuotuose m ėginiuose tur ėtų skirtis nuo nominaliosios koncentracijos ne 
daugiau kaip 30 %, o pakartoti to paties m ėginio matavimai netur ėtų skirtis 
daugiau kaip 25 % (taip pat žr. papildomus KK kriterijus 8 lentel ėje). Jeigu 
šie KK kriterijai įvykdyti, daroma prielaida, kad pasirinkta hormon ų mata­
vimo analiz ės sistema yra pakankamai patikima, tiksli ir kryžmiškai nerea ­
guoja su terp ės sudedamosiomis dalimis (m ėginio matrica) taip, kad tai 
galė
tų stipriai paveikti analiz ės rezultatus. Šiuo atveju prieš matuojant 
hormonus, ekstrahuoti m ėginių nereikia.  
30. Jeigu 1 ir 8 lentel ėse nurodyti KK kriterijai ne įvykdyti, gali pasireikšti 
stiprus matricos efektas, ir eksperiment ą reikia atlikti su ekstrahuota terpe, 
į kuria buvo suleista vidinio kontrolinio bandinio hormono. Ekstrahavimo 
proceso pavyzdys aprašytas tinkamumo patvirtinimo ataskaitos II pried ėlyje 
(4). Hormon ų koncentracij ą kiekviename ekstrahuotame m ėginyje reik ėtų 
matuoti trijose duobut ėse (  1 ). Jeigu galima įrodyti, kad po ekstrahavimo 
terpės sudedamosios dalys neturi neigiamos įtakos taikant hormon ų nusta­
tymo metod ą atliekamų matavim ų tikslumui, kaip apibr ėžta KK kriterijuose, 
visi tolesni eksperimentai tur ėtų būti atliekami naudojant ekstrahuotus m ėgi­
nius. Jeigu po ekstrahavimo KK kriterijai ne įvykdomi, naudojama hormon ų 
matavimo sistema yra netinkama H295R steroidogenez ės analizei atlikti, 
todėl reikėtų naudoti kit ą hormonų nustatymo metod ą. 
Standartin ė kreivė 
31. Hormon ų koncentracija kontroliniuose bandiniuose tirpikliuose (KBT) 
turėtų būti standartin ės kreivės tiesinės koreliacijos atkarpoje. B ūtų geriau, 
jei KBT reikšm ės būtų išsidėsčiusios arti tiesin ės koreliacijos atkarpos 
vidurio; tai užtikrint ų galimybę išmatuoti, kaip stipriai indukuojama ir slopi ­
nama hormon ų sintezė. Atsižvelgiant į tai, pasirenkamos praskiestos terp ės 
(arba ekstraktai), kurias numatoma vertinti. Tiesinis ryšis nustatomas taikant 
atitinkam ą statistinį metodą. 
Cheminių medžiag ų poveikio matavim ų tikslumui bandymas  
32. Jeigu hormonams matuoti numatoma naudoti antik ūnais grindžiamus 
analizės metodus, pvz., imunofermentin ės analizės sistemas (angl. ELISA) 
ir radioimunin ės analizės metodus, prieš pradedant faktinius chemini ų 
medžiagų bandymus, reik ėtų ištirti kiekvien ą cheminę medžiag ą, kurios 
bandymus numatoma atlikti, siekiant nustatyti, ar ji negali tur ėti neigiamos 
įtakos hormon ų matavimo sistemos tikslumui (tinkamumo patvirtinimo atas ­
kaitos (4) III pried ėlis, nes kai kurios chemin ės medžiagos gali pakenkti ši ų 
bandymų tikslumui (17). Jeigu, atlikus hormon ų analizę nustatoma, kad 
matavimo netikslumai testosterono ir (arba) E2 atveju atitinka arba viršija 20 % bazin ės hormon ų gamybos, chemin ės medžiagos poveikio hormon ų 
analizės tikslumui bandym ą (angl.  Chemical Hormone Assay Interference 
Test, pvz., aprašyt ąjį tinkamumo patvirtinimo ataskaitos (4) II pried ėlio 5.0 
skyriuje) reik ėtų atlikti su visais praskiestais pradiniais bandom ųjų cheminių
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Pastaba.  Jeigu ekstrahuoti b ūtina, kiekviename ekstrakte matavimai kartojami tris kartus. 
Kiekvienas m ėginys ekstrahuojamas tik kart ą.
 medžiagų tirpalais, kad b ūtų galima nustatyti slenkstin ę dozę, kurią viršijus 
užfiksuojama dideli ų netikslum ų (≥ 20 %). Jeigu matavimo netikslumai 
nesiekia 30 %, rezultatus galima pakoreguoti atsižvelgiant į poveikį mata­
vimų tikslumui. Jeigu matavimo netikslumai viršija 30 %, duomenys nega ­
lioja ir ši ų dydžių koncentracijos analiz ės duomenis reik ėtų atmesti. Jeigu 
esant skirtingai citotoksiško poveikio neturin čiai koncentracijai bandomoji 
cheminė medžiaga stipriai neigiamai veikia hormon ų matavimo sistemos 
tikslumą, reikėtų naudoti kit ą hormonų matavimo sistem ą. Siekiant išvengti 
neigiamos chemini ų medžiag ų priemaiš ų įtakos matavim ų tikslumui, reko ­
menduojama iš terp ės hormonus ekstrahuoti naudojant tinkam ą tirpiklį; 
galimi metodai aprašyti tinkamumo patvirtinimo ataskaitoje (4).  
1 lentelė 
Hormonų matavimo sistem ų veiksmingumo kriterijai  
Parametras  Kriterijus  
Matavimo metodo jautrumas  Kiekybinio nustatymo riba (LOQ) 
Testosteronas: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ 
ml (  a ) 
Hormonų ekstrahavimo veiksmin ­
gumas (tik kai ekstrahuoti b ūtina) Vidutinis iš tirpalo regeneruotas 
hormono kiekis (remiantis trimis matavimais) nuo prid ėto kiekio netu ­
rėtų skirtis daugiau kaip 30 %.
 
Cheminės medžiagos poveikis 
matavimų tikslumui (tik antik ūnais 
grindžiamos sistemos)  Neturėtų būti stiprių (atitinkamo 
hormono atveju ≥ 30 % bazinio 
hormonų gamybos lygio) kryžmini ų 
reakcijų nė su vienu l ąstelių gami­
namu hormonu (  b ) ( c ) 
( a ) Pastaba.  Metodo matavimo ribos pagr įstos bazinio hormon ų gamybos lygio reikš ­
mėmis, kurios pateikiamos 5 lentel ėje, ir priklauso nuo veiksmingumo. Jeigu 
galima pasiekti didesn į bazinį hormonų gamybos lyg į, riba gali b ūti aukštesn ė. 
( b ) Esant didesniam procentiniam dydžiui, kai kurie testosterono antik ūnai gali kryž ­
miškai reaguoti su androstendionu, o E2 antik ūnai– su estronu. Tokiais atvejais 
neįmanoma tiksliai nustatyti poveikio 17 β-HSD. Vis d ėlto šie duomenys gali 
suteikti naudingos informacijos apskritai apie poveik į estrogen ų ar androgen ų 
gamybai. Tokiais atvejais duomenis reik ėtų išreikšti kaip androgen ų ir (arba) 
estrogenų, o ne E2 ir testosterono reakcij ą. 
( c ) Ląstelių gaminami hormonai: cholesterolis, pregnenolonas, progesteronas, 11- 
deoksikortikosteronas, kortiosteronas, aldosteronas, 17 α-pregnenolonas, 17 α- 
progesteronas, deoksikortizolis, kortizolis, DHEA, androstenedionas, estronas.  
Laboratorijos kvalifikacinis bandymas  
33. Prieš prad ėdama nežinom ų chemini ų medžiag ų bandymus, laboratorija, 
atlikdama laboratorijos kvalifikacin į bandym ą, turėtų įrodyti, kad joje 
galima sukurti ir palaikyti atitinkamas l ąstelių auginimo mitybos terp ėje ir 
bandymų sąlygas, kurios b ūtinos siekiant s ėkmingai atlikti analiz ę. Kadangi 
analizės atlikimo s ėkmė tiesiogiai susijusi su analiz ę atliekančiais laborato ­
rijos darbuotojais, įvykus laboratorijos personalo poky čiams, šias proce ­
dūras reikėtų iš dalies pakartoti.  
34. Šis kvalifikacinis bandymas atliekamas tokiomis pat s ąlygomis, kurios 
išvardytos 38–40 punktuose: l ąstelėse veikiamos 7 dydži ų koncentracijos 
stipriais, vidutinio stiprumo ir silpnais induktoriais ir inhibitoriais, taip pat 
neigiamo kr ūvio chemine medžiaga (žr. 2 lentel ę). Kaip matyti iš 2 lentel ės, 
tarp chemini ų medžiagų, kurių bandymus reikia atlikti – stiprus induktorius 
forskolinas (CAS Nr. 66575–29–9), stiprus inhibitorius prochlorazas (CAS Nr. 67747–09–5), vidutinio stiprumo induktorius atrazinas (CAS 
Nr. 1912–24–9), vidutinio stiprumo inhibitorius aminogliutetimidas (CAS 
Nr. 125–84–8), silpnas E2 gamybos induktorius ir silpnas testosterone
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
gamybos inhibitorius bisfenolis A (CAS Nr. 80–05–7) ir neigiama chemin ė 
medžiaga žmogaus choriono gonadotropinas (ŽCG) (CAS Nr. 9002–61–3). 
Visų cheminių medžiag ų bandymai atliekami naudojant atskiras plokšteles, 
taip, kaip nurodyta 6 lentel ėje. Atliekant bandymus su kvalifikaciniam 
bandymui skirtomis chemin ėmis medžiagomis, kasdien naudojama po 
vieną KK plokštel ę (4 lentel ė, 36–37 punktai).  
2 lentelė 
Kvalifikaciniam bandymui skirtos chemin ės medžiagos ir j ų 
koncentracija  
Kvalifikaciniam bandymui 
skirta chemin ė medžiaga  Bandomoji koncentracija [ μM] 
prochlorazas  0 (  a ); 0,01; 0,03; 0,1; 0.3; 1; 3; 10;  
forskolinas  0 (  a ); 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3, 10, 30;  
atrazinas  0 (  a ); 0,03; 0.1; 1; 3; 10; 30; 100;  
aminogliutetimidas  0 (  a ); 0,03; 0.1; 1; 3; 10; 30; 100;  
bisfenolis A  0 (  a ); 0,03; 0.1; 1; 3; 10; 30; 100;  
HCG  0 (  a ); 0,03; 0.1; 1; 3; 10; 30; 100.  
( a ) Kontrolinis bandinys tirpiklis (DMSO) (0), 1 μl DMSO/duobut ėje. 
Atliekant laboratorijos kvalifikacin į bandym ą, kvalifikaciniam bandymui 
skirtų chemini ų medžiag ų poveikio H295R l ąstelėms bandymas tur ėtų 
būti atliekamas 24 duobu čių plokštel ėse. Visos bandom ųjų chemini ų 
medžiagų dozės nurodomos μM. Dozės suleidžiamos į duobutes su 0,1 % 
t/t DMSO. Bandymai su kiekviena bandom ąja koncentracija atliekami 
trijose duobut ėse (6 lentel ė). Kiekvienai cheminei medžiagai naudojamos 
atskiros plokštel ės. Atliekant bandymus, kasdien naudojama po vien ą KK 
plokštelę. 
35. Ląstelių gyvybingumo ir hormon ų analizės atliekamos, kaip nurodyta 42–46 
punktuose.Slenkstin ę vertę (mažiausi ą pastebėto poveikio koncentracij ą, 
LOEC) ir sprendim ą dėl klasifikacijos reik ėtų nurodyti ataskaitoje ir paly ­
ginti su 3 lentel ėje pateiktomis reikšm ėmis. Duomenys laikomi priimtinais, 
jeigu jie atitinka 3 lentel ėje nurodyt ą LOEC ir sprendim ą dėl klasifikacijos.  
3 lentelė 
Kvalifikaciniam bandymui skirt ų chemini ų medžiag ų slenkstin ės vertės (LOECs) ir 
sprendimai d ėl klasifikacijos  
CAS Nr.  LOEC [μM] Sprendimas d ėl klasifikacijos  
testostero ­
nas E2 testosteronas  E2  
prochlorazas  67747–09–5  ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (slopinimas)  + (slopinimas)  
forskolinas  66575–29–9  ≤ 10 ≤ 0,1 + (indukcija)  + (indukcija)  
atrazinas  1912–24–9  ≤ 100  ≤ 10 + (indukcija)  + (indukcija)  
aminogliutetimi ­
das 125–84–8  ≤ 100  ≤ 100  + (inhibavimas)  + (inhibavimas)  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
CAS Nr.  LOEC [μM] Sprendimas d ėl klasifikacijos  
testostero ­
nas E2 testosteronas  E2  
bisfenolis A  80–05–7  ≤ 10 ≤ 10 + (inhibavimas)  + (inhibavimas)  
HCG  9002–61–3  netaiky ­
tina netaiky­
tina neigiama  neigiama  
( a ) + – teigiama 
netaikytina – netaikytina, nes citotoksiško poveikio neturinti neigiamo kontrolinio bandinio koncentracija 
neturėtų sukelti poky čių. 
Kokybės kontrol ės plokštel ė 
36. Kokyb ės kontrol ės (KK) plokštel ė naudojama siekiant patikrinti H295R 
ląstelių veiksmingum ą standartin ėmis ląstelių auginimo s ąlygomis ir siekiant 
sukurti hormon ų koncentracijos kontroliniuose bandiniuose tirpikliuose, 
teigiamuose ir neigiamuose kontroliniuose bandiniuose ir kit ų laikui bėgant 
vertinamų KK rodikli ų istorinių duomenų bazę. 
— KK plokštel ėje H295R l ąstelių veiksmingumas tur ėtų būti vertinamas 
kaskart kai imama nauja ATCC l ąstelių grupė arba pirm ąkart panau ­
dojus prieš tai užšaldyt ą pradinę ląstelių kultūrą, nebent su ta l ąstelių 
grupe buvo atliekamas laboratorijos kvalifikacinis bandymas (32–34 punktai).
 
— KK plokštel ė suteikia galimyb ę išsamiai įvertinti analiz ės sąlygas (pvz., 
ląstelių gyvybingum ą, kontrolinius bandinius tirpiklius, neigiamus ir 
teigiamus kontrolinius bandinius, taip pat atliekant vien ą ir kelias 
analizes gaunam ų duomen ų kintamum ą) atliekant chemini ų medžiag ų 
bandymus ir turi b ūti naudojama kaskart, kai atliekamas bandymas.  
37. KK bandymas atliekamas 24 duobu čių plokštel ėje, vadovaujantis tais 
pačiais inkubavimo, dozavimo, l ąstelių gyvybingumo (citotoksiškumo) 
vertinimo, hormon ų ekstrahavimo ir hormon ų analizės atliekant chemini ų 
medžiagų bandymus procesais, kurie aprašyti 38–46 punktuose. QC plokš ­
telėje yra duobu čių su tirpalu tuštiesiems bandymams, kontroliniais bandi ­
niais tirpikliais ir dviej ų dydžių koncentracijos žinomu E2 ir testosterono 
sintezės induktoriumi (forskolinu, 1; 10 μM) ir inhibitoriumi (prochlorazu, 
0,1; 1 μM) Be to, atrinktose duobut ėse kaip gyvybingumo (citotoksiškumo) 
analizės teigiamas kontrolinis bandinys naudojamas MeOH. 4 lentel ėje 
pateikiamas išsamus išd ėstymo plokštel ėje aprašymas. Kriterijai, kuri ų 
reikia laikytis KK plokštel ėje, išvardyti 5 lentel ėje. Mažiausias bazinis 
hormonų testosterono ir E2 gamybos lygis turi b ūti pasiektas ir kontrolinio 
bandinio tirpiklio, ir tuš čiajam bandymui skirtose duobut ėse. 
4 lentelė 
Išdėstymas kokyb ės kontrol ės plokštel ėje, kai siekiama atlikti chemin ėmis medžiagomis 
neveikiam ų H295R l ąstelių ir H295R l ąstelių, veikiam ų žinomais E2 ir testosterono 
gamybos inhibitoriais (PRO = prochlorazas) ir stimuliatoriais (FOR = forskolinas), veiksmingumo bandymus. Užbaigus poveikio eksperiment ą ir pašalinus terp ę, į visas 
MeOH duobutes suleidžiama 70 % metanolio tirpalo, kuris naudojamas kaip teigiamas 
kontrolinis bandinys citotoksiškumui įvertinti (žr. citotoksiškumo analiz ę tinkamumo 
patvirtinimo ataskaitos (4) III pried ėlyje).
 
1 2  3  4  5  6  
A tuš čiasis 
bandyma­
s ( a ) tuščiasis 
bandyma­
s ( a ) tuščiasis 
bandyma­
s ( a ) tuščiasis 
bandymas (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) tuščiasis 
bandymas (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) tuščiasis 
bandymas (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2  3  4  5  6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0.1 μM PRO 0.1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Tuščiajam bandymui skirtose duobut ėse esančioms ląstelėms suleidžiama tik terp ės (t. y. be tirpiklio). 
( b ) Metanolio (MeOH) suleidžiama  po to , kai užbaigiamas poveikio bandymas ir terp ė pašalinama iš ši ų 
duobučių. 
( c ) Kontrolinis bandinys tirpiklis DMSO (po 1 μl duobutėje). 
5 lentelė 
Kokybės kontrol ės plokšteli ų veiksmingumo kriterijai  
Testosteronas  E2  
Bazinis hormono 
gamybos lygis kontroli ­
niame bandinyje 
tirpiklyje (KBT)  ≥ 5 kartus viršija LOQ  ≥ 2,5 karto viršija 
LOQ  
Indukcija (10 μM 
forskolino)  ≥ 1,5 karto didesn ė 
gamybos apimtis, 
palyginti su KBT  ≥ 7,5 karto didesn ė 
gamybos apimtis, 
palyginti su KBT  
Inhibavimas (1 μM 
prochlorazo)  ≤ 0,5 karto mažesn ė 
gamybos apimtis, 
palyginti su KBT  ≤ 0,5 karto mažesn ė 
gamybos apimtis, 
palyginti su KBT  
LĄSTELIŲ VEIKIMO CHEMIN ĖMIS MEDŽIAGOMIS PROCESAS  
38. Prieš bandym ą inkubuotos l ąstelės išimamos iš inkubatoriaus (21 punktas) ir 
apžiūrimos po mikroskopu, siekiant prieš dozavim ą įsitikinti, kad j ų būklė 
(kibimas, morfologija).yra gera.  
39. Ląstelės dedamos į mikrobiologin ės saugos spint ą, pašalinama priedais 
papildyta terp ė ir ji pakei čiama nauja priedais papildyta terpe (po 1 ml 
duobutėje). Šiam bandymo metodui rekomenduojamas tirpiklis DMSO. 
Vis dėlto, jei yra priežas čių, dėl kurių reikėtų naudoti kitus tirpiklius, 
reikėtų aprašyti mokslin į loginį pagrindim ą. Ląstelės veikiamos bandom ąja 
chemine medžiaga, 1 μl atitinkamo pradinio tirpalo su DMSO (žr. tinka ­
mumo patvirtinimo ataskaitos (4) II pried ėlį) suleidžiant į 1 ml priedais 
papildytos terp ės (duobut ės tūris). Gaunama galutin ė DMSO koncentracija 
duobutėse – 0,1 %. Kad medžiagos gerai susimaišyt ų, paprastai rekomen ­
duojama atitinkam ą bandomosios chemin ės medžiagos pradin į tirpalą su 
DMSO sumaišyti su priedais papildyta terpe, kad kiekvienoje doz ėje būtų 
pageidaujama galutin ė koncentracija, ir pašalinus sen ą terpę, tuo mišiniu 
nedelsiant pripildyti kiekvien ą duobutę. Jeigu taikomas šis b ūdas, DMSO 
koncentracija (0,1 %) tur ėtų išlikti nuosekli visose duobut ėse. Naudojant 
stereomikroskop ą, apžiūrima, ar duobut ėse, kuriose yra dviej ų didžiausi ų 
dydžių koncentracija, nesusidar ė nuosėdos ar drumzl ės – tai reikšt ų, kad 
bandomoji chemin ė medžiaga ne visiškai ištirpo. Pasteb ėjus tokias savybes 
(drumzles, nuos ėdas), duobut ės su mažesn ės koncentracijos medžiaga taip 
pat apžiūrimos (ir taip toliau), ir tie koncentracijos dydžiai, kuriems esant 
medžiagos nevisiškai ištirpo, išbraukiamos iš tolesnio vertinimo ir analiz ės. 
Plokštelė 48 valandoms gražinama į inkubatori ų, kuriame palaikoma 37 °C 
temperatūra ir 5 % CO  2 koncentracija ore. Bandomosios chemin ės 
medžiagos išd ėstymas plokštel ėje pateikiamas 6 lentel ėje. Iš pradini ų 
tirpalų, pažymėtų skaičiais nuo 1 iki 7 matyti, kokia tvarka bandomosios 
cheminės medžiagos doz ė didėja. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
6 lentelė 
Bandomosios medžiagos, kuria veikiamos H295R l ąstelės, dozavimo 24 duobu čių 
plokštelėje schema  
1 2  3  4  5  6  
A DMSO  DMSO  DMSO  4 pradinis 
tirpalas  4 pradinis 
tirpalas  4 pradinis 
tirpalas  
B 1 pradinis 
tirpalas  1 pradinis 
tirpalas  1 pradinis 
tirpalas  5 pradinis 
tirpalas  5 pradinis 
tirpalas  5 pradinis 
tirpalas  
C 2pradinis 
tirpalas  2 pradinis 
tirpalas  2 pradinis 
tirpalas  6 pradinis 
tirpalas  6 pradinis 
tirpalas  6 pradinis 
tirpalas  
D 3 pradinis 
tirpalas  3 pradinis 
tirpalas  3 pradinis 
tirpalas  7 pradinis 
tirpalas  7 pradinis 
tirpalas  7 pradinis 
tirpalas  
40. Po 48 valand ų plokštel ės, kuriose l ąstelės buvo veikiamos chemin ėmis 
medžiagomis, išimamos iš inkubatoriaus; per mikroskop ą įvertinama kiek ­
vienoje duobut ėje esančių ląstelių būklė (kibimas, morfologija, užpildymo 
laipsnis) ir apži ūrima, ar n ėra citotoksiškumo požymi ų. Terpė iš kiekvienos 
duobutės padalijama į dvi vienodas dalis (po maždaug 490 μl) ir jos perke ­
liamos į du atskirus atitinkamai paženklintus buteliukus (t. y. vienas 
bandinys bus naudojamas kaip atsarginis terp ės iš kiekvienos duobut ės 
ėminys). Kad l ąstelės neišdžiūtų, terpė sykiu pašalinama iš vienos eilut ės 
arba stulpelio duobu čių ir pakeičiama ląstelių gyvybingumo ir (arba) cito ­
toksiškumo analizei skirta terpe. Jeigu l ąstelių gyvybingum ą ir (arba) cito ­
toksiškum ą numatoma vertinti ne tuoj pat, o v ėliau, kiekviena duobut ė 
papildoma FBDT su Ca  2+ ir Mg  2+ . Terpės užšaldomos – 80 °C temperat ū­
roje ir saugomos iki tolesnio j ų apdorojimo siekiant ištirti hormon ų koncent­
raciją (žr. 44–46 punktus). Nors – 80 °C temperat ūroje saugomoje terp ėje 
esantys testosteronas ir E2 yra iš esm ės stabilūs ne mažiau kaip 3 m ėnesius, 
kiekvienoje laboratorijoje hormon ų stabilumas saugojimo laikotarpiu tur ėtų 
būti patvirtintas dokumentais.  
41. Pašalinus terp ę, nedelsiant nustatomas kiekvienoje plokštel ėje, kurioje 
ląstelės buvo veikiamos chemin ėmis medžiagomis, esan čių ląstelių gyvy­
bingumas ir (arba) pasireišk ęs citotoksiškumas.  
Ląstelių gyvybingumo nustatymas  
42. Pasirinktu l ąstelių gyvybingumo ir (arba) citotoksiškumo analiz ės metodu 
galima nustatyti galim ą bandomosios chemin ės medžiagos poveik į ląstelių 
gyvybingumui. Naudojant š į analizės metodą, turėtų būti galimyb ė tiksliai 
nustatyti duobut ėje esančių gyvybing ų ląstelių procentin ę dalį, arba reik ėtų 
įrodyti, kad ši analiz ė yra tiesiogiai palyginama su analiz ės sistema  Live/­
Dead ® (jos tiesine funkcija) (žr. tinkamumo patvirtinimo ataskaitos (4) III 
priedėlį). Kitas analiz ės metodas, kuris yra toks pat veiksmingas, – tai MTT 
(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromido] bandymas (18). 
Ląstelių gyvybingumo vertinimas naudojant min ėtus metodus yra santykinis 
vertinimas, kuris neb ūtinai turi patvirtinti tiesin į ryšį su visomis duobut ėje 
esančiomis ląstelėmis. Todėl chemikai laborantai tur ėtų lygiagrečiai subjek ­
tyviai vizualiai įvertinti kiekvien ą duobutę, padaryti ir archyve išsaugoti 
skaitmenines kontrolini ų bandinių tirpiklių ir dviej ų didžiausi ų dydžių 
netoksiškos koncentracijos tirpal ų nuotraukas, kad v ėliau būtų galima įver­
tinti tikslų ląstelių tankį, jei to prireikt ų. Jeigu paži ūrėjus matyti arba gyvy ­
bingumo ir (ar) citotoksiškumo analiz ė patvirtina, kad l ąstelių skaičius padi­
dėjo, įtariamą padidėjimą reikia patikrinti ir patvirtinti. Jeigu l ąstelių skai­ 
čiaus padid ėjimas patvirtinamas, tai reik ėtų nurodyti bandymo ataskaitoje. 
Ląstelių gyvybingumas išreiškiamas santykiu su vidutiniu kontroliniuose 
bandiniuose tirpikliuose nustatytu atsaku, t. y. 100 % l ąstelių gyvybingumu, 
ir apskaičiuojamas pagal naudot ą ląstelių gyvybingumo ir (arba) citotoksiš ­
kumo analiz ės metodą. Atliekant MTT analiz ę, galima naudoti ši ą formulę: ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% gyvybing ų ląstelių = (atsakas duobut ėje – vidutinis atsakas MeOH 
apdorotose [= 100 % žuvusi ų ląstelių] duobut ėse) ÷ (vidutinis atsakas 
KBT duobut ėse – vidutinis atsakas MeOH apdorotose [= 100 % žuvusi ų 
ląstelių] duobutėse) 
43. Duobut ės, kuriose l ąstelių gyvybingumas (palyginti su vidutiniu gyvybin ­
gumu kontroliniuose bandiniuose tirpikliuose, t. y. 100 % gyvybingumu), yra mažesnis nei 80 %, netur ėtų būti įtraukiamos į galutinę duomen ų 
analizę. Jeigu steroidogenez ė slopinama esant beveik 20 % citotoksiškumui, 
tai reikėtų atidžiai įvertinti, siekiant įsitikinti, kad citotoksiškumas n ėra 
inhibavimo priežastis.
 
Hormonų analizė 
44. Testosterono ir E2 analizei kiekviena laboratorija gali naudoti savo pasi ­
rinktą hormonų matavimo sistem ą. Atsarginius terp ės mėginius iš kiek ­
vienos gydymo grup ės galima naudoti tirpal ų praskiedimui, kad koncentra ­
cija patekt ų į standartin ės kreivės tiesinės koreliacijos atkarp ą. Kaip min ėta 
29 punkte, kiekviena laboratorija, prieš atlikdama KK bandymus arba bandydama chemines medžiagas, tur ėtų priedais papildytos terp ės, į kurią 
suleista vidinio kontrolinio bandinio hormono, analize įrodyti, kad jos 
naudojama hormon ų matavimo sistema (pvz., ELISA, RIA, LC-MS, 
LC-MS/MS) atitinka KK kriterijus. Siekiant užtikrinti, kad bandymo sistemos sudedamosios dalys nedaryt ų neigiamos įtakos hormon ų matavim ų 
tikslumui, prieš atliekant hormon ų matavimus, juos gali tekti ekstrahuoti iš 
terpių (žr. sąlygas, kuriomis m ėginius ekstrahuoti b ūtina arba ne, 30 
punkte). Ekstrahuoti m ėginius rekomenduojama vadovaujantis tinkamumo 
patvirtinimo ataskaitos (4) III pried ėlyje nurodyta tvarka.
 
45. Jeigu hormon ų gamybai įvertinti naudojamas komercinis bandym ų rinkinys, 
hormonų analizę reikėtų atlikti taip, kaip nurodyta bandym ų rinkinio gamin ­
tojo parengtoje instrukcijoje. Dauguma gamintoj ų yra sukūrę unikalią proce­
dūrą, pagal kuri ą atliekamos hormon ų analizės. Praskiestus m ėginius reikia 
pakoreguoti taip, kad numatyta hormon ų koncentracija kontroliniuose 
bandiniuose tirpikliuose išsid ėstytų apie pavien ės analizės standartin ės 
kreivės tiesinės koreliacijos atkarpos vidur į (tinkamumo patvirtinimo atas ­
kaitos (4) III pried ėlis). Į standartin ės kreivės tiesinės koreliacijos atkarp ą 
nepatekusias reikšmes reik ėtų atmesti.  
46. Galutin ė hormonų koncentracija apskai čiuojama taip:  
Pavyzdys 
Ekstrahuota:  450 μl terpės 
Atskiesta:  250 μl analizės buferiniame tirpale  
Praskiesta atliekant analiz ę santykiu 1:10 (kad m ėginys patekt ų į 
standartin ės kreivės tiesinės koreliacijos 
atkarpą) 
Hormonų koncentracija atliekant 
analizę: 150 pg/ml (jau pakoreguota pagal 
koncentracij ą mililitrui analizuoto 
mėginio)  
Regeneruota:  89 %  
Galutinė hormonų koncentracija  (hormon ų koncentracija (viename mili ­
litre) ÷ regeneruota dalis) (praskiedimo 
faktorius)  
Galutinė hormonų koncentracija  (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Bandomosios koncentracijos pasirinkimas  
47. Analiz ė turėtų būti atliekama ne mažiau kaip du kartus. Jeigu bandomosios 
koncentracijos dydži ų negalima pasirinkti remiantis anks čiau gauta informa ­
cija, pvz., informacija apie tirpumo ribas arba citotoksiškum ą, analizę atlie­
kant pirm ą kartą, rekomenduojama bandom ąją koncentracij ą išdėstyti 
dešimtainio logaritmo (log  10 ) intervalais, kai 10–3 M – didžiausia koncent ­
racija. Jeigu chemin ė medžiaga yra tirpi ir necitotoksiška esant jokiai 
bandomajai koncentracijai ir pirm ąkart atliekant analiz ę su bet kurio dydžio 
koncentracijos tirpalu, rezultatai buvo neigiami, tuomet tai reikia patvirtinti dar viena analize tokiomis pat s ąlygomis, kokiomis buvo atlikta pirmoji (7 
lentelė). Jeigu pirm ąkart atlikus analiz ę, gauti rezultatai yra  dviprasmiški  (t. 
y. kartais išreikštas pokytis yra statistiškai reikšmingas, palyginti su KBT, naudojant tik vieno dydžio koncentracij ą) arba teigiami (t. y. kartais 
išreikštas pokytis naudojant dviej ų ar gretim ų dydžių koncentracij ą yra 
statistiškai reikšmingas), bandym ą reikėtų pakartoti, kaip nurodyta 7 lente ­
lėje, patikslinus pasirinktus bandomosios koncentracijos dydžius. Analiz ę 
atliekant antr ą ir trečią kartą (jei taikytina), bandom ąją koncentracij ą reikėtų 
pakoreguoti remiantis pirm ąkart atliktos analiz ės rezultatais, koncentracijos 
dydžius išd ėstant per 1/2-log nuo poveik į sukėlusios koncentracijos ( pvz., 
jeigu atliekant pirmin ę analizę su 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM 
koncentracijos tirpalais, indukcinis poveikis pasireišk ė esant 1 ir 10 μM 
koncentracijai, antr ąkart reikėtų bandyti toki ų
 dydžių koncentracij ą: 0,1, 
0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), nebent reikia mažesn ės koncentracijos LOEC 
pasiekti. Pastaruoju atveju, analiz ę atliekant antr ą kartą reikėtų naudoti ne 
mažiau kaip penki ų dydžių koncentracij ą, mažesn ę už pirm ąkart naudot ą 
mažiausią koncentracij ą, taikant 1/2-log skal ę. Jeigu antr ą kartą atlikta 
analizė nepatvirtina pirm ąkart atliktos analiz ės rezultat ų (t. y. naudojant 
koncentracij ą, kuri ± 1 skiriasi nuo prieš tai bandytos koncentracijos, kurios 
analizės rezultatai buvo teigiami, statistiškai reikšming ų rezultatų negauta), 
pirminio bandymo s ąlygomis reikia atlikti tre čią bandym ą. Pirmą kartą 
atlikus analiz ę gauti dviprasmiški rezultatai laikomi neigiamais, jeigu n ė 
viena iš dviej ų tolesnių analizių nepatvirtino nustatyto poveikio. Dvipras ­
miškai rezultatai laikomi teigiamu atsaku (poveikiu), jeigu atsak ą galima 
patvirtinti bent dar vien ąkart atlikta analize, koncentracij ą pakoregavus 
± 1 (žr. 55 skyri ų „Duomen ų aiškinimo tvarka“.)  
7 lentelė 
Sprendim ų matrica pagal galimus rezultat ų scenarijus  
1 bandymo kartas  2 bandymo kartas  3 bandymo kartas  Sprendimas  
Scenarijus  Sprendimas  Scenarijus  Sprendimas  Scenarijus  Teigiamas  Neigiamas  
Rezultatai 
neigiami  Patvirtinti (  a ) Rezultatai 
teigiami  Nutraukti  X  
Rezultatai 
neigiami  Patvirtinti (  a ) Rezultatai 
teigiami  Atlikti išsamesn ę 
analizę ( b ) Rezul­
tatai 
neigiami  X 
Rezultatai 
dviprasmiški (  c ) Atlikti išsamesn ę 
analizę ( b ) Rezultatai 
neigiami  Patvirtinti (  a ) Rezul ­
tatai 
neigiami  X 
Rezultatai 
dviprasmiški (  c ) Atlikti išsamesn ę 
analizę ( b ) Rezultatai 
neigiami  Patvirtinti (  a ) Rezul ­
tatai 
teigiami  X 
Rezultatai 
dviprasmiški (  c ) Atlikti išsamesn ę 
analizę ( b ) Rezultatai 
teigiami  X 
Rezultatai 
teigiami  Atlikti išsamesn ę 
analizę ( b ) Rezultatai 
neigiami  Patvirtinti (  a ) Rezul ­
tatai 
teigiami  X ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
1 bandymo kartas  2 bandymo kartas  3 bandymo kartas  Sprendimas  
Scenarijus  Sprendimas  Scenarijus  Sprendimas  Scenarijus  Teigiamas  Neigiamas  
Rezultatai 
neigiami  Patvirtinti (  a ) Rezultatai 
teigiami  Atlikti išsamesn ę 
analizę ( b ) Rezul­
tatai 
teigiami  X 
Rezultatai 
teigiami  Atlikti išsamesn ę 
analizę ( b ) Rezultatai 
teigiami  Nutraukti  X  
( a ) Patvirtinti ankstesnio bandymo karto rezultatus taikant tok į pat eksperimento model į. 
( b ) Pakartoti analiz ę koncentracijos dydžius išd ėstant kas 1/2-log (pasirenkant koncentracijos dydžius, kurie nedaug skiriasi nuo 
koncentracijos, kurios bandymo rezultatai atliekant ankstesn į eksperiment ą buvo visai kitokie. 
( c ) Kartais išreikštas pokytis esant vienai koncentracijai statistiškai reikšmingai skiriasi, lyginant su KBT.  
Bandymo plokštel ės kokybės kontrol ė 
48. Be kriterij ų, kurie keliami KK plokštelei, reikia laikytis ir kit ų kokybės 
kriterijų, susijusių su priimtinu rezultat ų kintamumu kartojant eksperiment ą 
toje pačioje duobut ėje, atliekant kartotinius bandymus, hormon ų matavimo 
sistemų tiesinės priklausomyb ės ir jautrumo kintamumu, rezultat ų kinta­
mumu pakartotinai matuojant hormon ų koncentracij ą tame pa čiame mėgi­
nyje (jei taikytina, žr. 30 punkt ą dėl ekstrahavimui keliam ų reikalavim ų) ir 
po terpės ekstrahavimo regeneruoto papildomai suleisto hormono procen ­
tinės dalies kintamumu; šie kriterijai pateikiami 8 lentel ėje. Jeigu šie krite ­
rijai neįvykdyti, skai čiuoklėje reikėtų nurodyti, jog susijusio m ėginio atveju 
KK kriterijai nebuvo įvykdyti, ir reik ėtų atlikti pakartotin ę mėginio analiz ę 
arba išbraukti to m ėginio duomenis iš duomen ų aibės. 
8 lentelė. 
Priimtini H295R analiz ės bandym ų plokštelės parametr ų intervalai ir (arba) kintamumas 
(%) 
LOQ: hormon ų matavimo sistemos LOQ VK: variacijos koeficientas; KBT: kontrolinis 
bandinys tirpiklis; SSPM: skilim ų skaičius per minut ę. 
Lyginama  Testosteronas  E2  
Bazinis hormon ų gamybos 
lygis kontroliniuose bandi ­
niuose tirpikliuose  Kartais didesnis už LOQ  ≥ 5 kartus  ≥ 2,5 karto  
Poveikio bandymai – 
Variacijos kontroliniuose bandiniuose tirpikliuose 
toje pačioje plokštel ėje 
koeficientai (toje pa čioje 
duobutėje
 Absoliučioji koncentracija  ≤ 30 %  ≤ 30 %  
Poveikio eksperimentai – 
KBT skirtingose plokšte ­
lėse VK (kartotiniai 
eksperimentai)  Pokytis kartais  ≤ 30 %  ≤ 30 %  
Hormonų matavimo 
sistema – jautrumas  Nustatomas sumaž ėjimas 
kartais, palyginti su KBT  ≥ 5 kartus  ≥ 2,5 karto  
Hormonų matavimo 
sistema – Kartotini ų KBT 
rodiklių VK (  a ) Absoliučioji koncentracija  ≤ 25 %  ≤ 25 %  
Terpės ekstrahavimas– 
Vidinio 3H etalono regene ­
ravimas (jei taikytina)  SSPM  ≥ 65 % nominaliosios reikšm ės 
( a ) Kartotiniai to paties m ėginio rodikliai.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
DUOMEN Ų ANALIZ Ė IR TEIKIMAS  
Duomenų analizė 
49. Siekiant įvertinti santykin į cheminėmis priemon ėmis pakeisto hormon ų 
gamybos lygio padid ėjimą ir (arba) sumaž ėjimą, rezultatus reikia normali ­
zuoti pagal vidutin ę KBT vert ę kiekvienoje bandomojoje plokštel ėje, o 
rezultatus reik ėtų išreikšti poky čiu, lyginant su KBT kiekvienoje bandomo ­
joje plokštel ėje. Visi duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± 1 standartinis 
nuokrypis (SN).  
50. Į duomenų analizę įtraukiami tik t ų duobučių hormonų duomenys, kuriose 
citotoksiškumas buvo mažesnis nei 20 %. Santykiniai poky čiai apskai čiuo­
jami taip:  
Santykinis pokytis  = (hormon ų koncentracija kiekvienoje duobut ėje)÷ 
(vidutinė hormonų koncentracija visose duobut ėse su kontroliniu bandiniu 
tirpikliu)  
51. Jeigu paži ūrėjus į duobutę matyti arba 42 punkte aprašyta gyvybingumo ir 
(arba) citotoksiškumo analiz ė patvirtina, kad l ąstelių skaičius padid ėjo, 
tariamą padidėjimą reikia patikrinti ir patvirtinti. Jeigu l ąstelių skaičiaus 
padidėjimas patvirtinamas, tai reik ėtų nurodyti bandymo ataskaitoje.  
52. Prieš atliekant statistines analizes, reik ėtų įvertinti prielaidas d ėl normalumo 
ir sklaidos homogeniškumo. Normališkum ą reikėtų vertinti naudojant stan ­
dartinius tikimybi ų grafikus ar kitus atitinkamus statistinius metodus (pvz., 
Šapiro ir Vilko ( Shapiro-Wilk ) kriterijų. Jeigu duomenys (poky čiai kartais) 
nenormaliai pasiskirst ę, reikėtų pamėginti transformuoti duomenis, kad jie 
priartėtų prie normaliojo skirstinio. Jeigu duomenys normaliai pasiskirst ę 
arba artėja prie normaliojo skirtinio, skirtumus tarp chemini ų medžiag ų 
koncentracijos grupi ų ir kontrolini ų bandinių tirpiklių reikėtų analizuoti 
naudojant parametrin į kriterijų (pvz., Duneto ( Dunnett ) kriterij ų), kai  
koncentracija  – nepriklausomas kintamasis, o  atsakas  (pokytis kartais) – 
priklausomas kintamasis. Jeigu duomenys pasiskirst ę nenormaliai, reik ėtų 
naudoti atitinkam ą neparametrin į kriterijų (pvz., Kruskalo ir Voliso ( Kruskal 
Wallis ) kriterijų, Stylo keli ų pusių-vienpusį kriterijų (angl.  Steel's Many-one 
rank test ); skirtumai laikomi reikšmingais kai  p≤ 0,05 . Statistiniai vertinimai 
atliekami remiantis vidutin ėmis kiekvienos duobut ės reikšmėmis, kurios 
atspindi nepriklausomus pakartotinius duomen ų taškus. Manoma, kad d ėl 
didelio dozi ų intervalo bandym ą atliekant pirm ą kartą (log  10 pagrįsta 
sklaida) daugeliu atveju nebus galimyb ės aprašyti aiškaus koncentracijos 
ir atsako ryšio, kai dvi didžiausios doz ės yra ant sigmoidin ės kreivės 
tiesinės koreliacijos atkarpos. Tod ėl analizuojant pirmo bandymo karto ar 
bet kurias kitas duomen ų aibes, kuriose bus ši s ąlyga ( pvz., kur negalima 
įvertinti didžiausio veiksmingumo), bus taikoma I tipo fiksuot ų kintamųjų 
statistika, kaip aprašyta pirmiau.  
53. Jeigu kreiv ės tiesinės koreliacijos atkarpoje yra daugiau kaip du duomen ų 
taškai ir kai galima apskai čiuoti didžiausi ą veiksmingum ą – kaip numatoma 
kai kurių antrą kartą atliekam ų bandymų, kai koncentracijos dydžiai išd ė­
liojami kas pus ę logaritmo, atveju – veiksmingai koncentracijai (pvz., VK50 
ir VK20) apskai čiuoti, reik ėtų naudoti probito, logito arba kit ą atitinkam ą 
regresijos model į. 
54. Rezultatus reik ėtų pateikti ir grafik ų (diagram ų, kuriose pavaizduotas 
vidurkis ± 1 SN), ir lenteli ų (LOEC, NOEC, poveikio kryptis ir didžiausio 
atsako stiprumas, kuris yra doz ės ir atsako santykio duomen ų aibės dalis) 
forma (žr. pavyzd į 3 paveiksle). Duomen ų vertinimas laikomas patikimu, 
jeigu jis pagr įstas ne mažiau kaip du kartus atliktais nepriklausomais bandy ­
mais. Eksperimentas arba bandymo kartas laikomas nepriklausomu, jeigu jis 
atliktas skirtingomis datomis naudojant nauj ą tirpalų ir kontrolini ų bandinių 
rinkinį. Bandym ą atliekant antr ą ir trečią kartą (jei reikia), koncentracijos 
intervalą galima pakoreguoti remiantis pirmo bandymo karto rezultatais, 
siekiant tiksliau apibr ėžti dozės ir atsako santykio interval ą, kuriame yra 
LOEC (žr. 47 punkt ą). ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
3 paveikslas  
Duomenų, gautų atlikus H295R analiz ę, vertinimo ir pateikimo grafiko ir lentel ės forma pavyzdys.  
Žvaigždut ė rodo statistiškai reikšmingus skirtumus, palyginti su KBT (p< 0,05). LOEC: mažiausio pasteb ėto 
poveikio koncentracija; Didžiausias pokytis: didžiausias atsako, steb ėto esant bet kuriai koncentracijai, stiprumas, 
palyginti su vidutinio atsaku KBT (= 1).
  
Cheminė medžiaga  LOEC  Didžiausias pokytis  
Forskolinas  0,01  0,15 karto  
Letrozolas  0,001  29 kartus  
Duomenų aiškinimo tvarka  
55. Bandomoji chemin ė medžiaga laikoma teigiama, jeigu kartais išreikšta 
indukcija statistiškai skiriasi ( p ≤ 0,05) nuo KBT esant dviej ų gretutini ų 
dydžių koncentracijai atlikus nepriklausomus bandymus ne mažiau kaip du 
kartus (7 lentel ė). Bandomoji chemin ė medžiaga laikoma neigiama, jeigu 
atlikus nepriklausomus bandymus du kartus, j ų rezultatai buvo neigiami, 
arba jeigu atlikus nepriklausomus tris kartus, dviej ų iš jų rezultatai buvo 
neigiami, o vieno – dviprasmiški arba teigiami. Jeigu trij ų nepriklausom ų 
eksperiment ų metu gauti duomenys neatitinka 7 lentel ėje išvardyt ų spren­
dimo kriterij ų, eksperiment ų rezultatai priskiriami prie neaiškintin ų 
duomenų. Rezultat ų, kurie gauti koncentracijai viršijant tirpumo ribas arba 
esant citotoksiškai koncentracijai, negalima įtraukti į rezultatų aiškinim ą. 
Bandymo ataskaita  
56. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti ši informacija:  
Bandymą atliekanti įstaiga  
— įstaigos pavadinimas ir vieta;  
— tyrimo vadovas, kiti personalo nariai ir j ų pareigos atliekant tyrim ą; 
— tyrimo pradžios ir pabaigos datos.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Bandomoji chemin ė medžiaga, reagentai ir kontroliniai bandiniai  
— Identifikaciniai duomenys (pavadinimas ir (arba) atitinkamas CAS Nr.), 
šaltinis, serijos ir (arba) partijos numeris, grynumas, tiek ėjas ir bando ­
mosios chemin ės medžiagos, reagent ų ir kontrolini ų bandinių apibūdi­
nimas;  
— bandomosios chemin ės medžiagos fizinis pob ūdis ir atitinkamos fizi ­
kinės ir chemin ės savybės; 
— bandom ųjų cheminių medžiag ų, reagentų ir kontrolini ų bandinių saugo­
jimo sąlygos bei paruošimo b ūdas ir dažnis;  
— bandomosios chemin ės medžiagos stabilumas.  
Ląstelės 
— Ląstelių šaltinis ir r ūšis; 
— bandyme naudojam ų ląstelių pasažų skaičius (ląstelių pasažų identifika ­
cinis žym ėjimas);  
— ląstelių kultūrų priežiūros tvarkos aprašymas.  
Prieš atliekant bandym ą keliami reikalavimai (jei taikytina)  
— Chemin ės medžiagos poveikio hormon ų analizės tikslumui bandymo 
aprašymas ir rezultatai;  
— hormon ų ekstrahavimo veiksmingumo matavim ų aprašymas ir rezultatai;  
— visų analitinių analizių, kurias numatoma atlikti, standartin ė ir kalibra ­
vimo kreiv ės; 
— pasirinkt ų analitinių analizių aptikimo ribos.  
Bandymo s ąlygos  
— Terpės sudėtis; 
— bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija;  
— ląstelių tankis (apskai čiuota arba nustatyta l ąstelių koncentracija po 24 ir 
48 valand ų); 
— bandomosios chemin ės medžiagos tirpumas (tirpumo riba, jei nustatyta);  
— inkubavimo laikas ir s ąlygos.  
Bandymo rezultatai  
— Neapdoroti kiekvienoje duobut ėje esančio kontrolinio bandinio ir bando ­
mųjų cheminių medžiag ų duomenys: pasikartojantys rodikliai originali ų 
duomenų, užfiksuot ų prietaisu, kuriuo matuojama hormon ų gamybos 
apimtis, forma ( pvz., OD, fluorescenciniai vienetai, SSPM ir kt.);  
— skirstinio normališkumo patvirtinimas arba duomen ų transformacijos 
paaiškinimas;  
— vidutinis atsakas ± 1 SN kiekvienoje duobut ėje, kuri buvo vertinta;  
— citotoksiškumo duomenys (bandomoji koncentracija, kuri suk ėlė citotok­
siškumą); 
— patvirtinimas, kad KK reikalavimai įvykdyti;  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— santykinis pokytis, palyginti su KBT, pakoreguotas atsižvelgiant į cito­
toksiškum ą; 
— diagrama, kurioje pavaizduotas santykinis pokytis (pokytis kartais) esant 
kiekvienai koncentracijai, SN ir statistinio reikšmingumo lygiui, kaip 
nurodyta 49–54 punktuose.  
Duomenų aiškinimas  
— Vadovaudamiesi nustatyta tvarka, paaiškinkite rezultatus ir aptarkite 
nustatytus faktus.  
Rezultatų aptarimas  
— Ar atsižvelgiant į tyrimo duomenis, yra požymi ų, rodančių, kad netie ­
sioginis poveikis gliukokortikoid ų ir mineralkortikoid ų reakcijų sekoms 
galėjo paveikti testosterono ir E2 duomenis?  
Išvados  
LITERAT ŪROS ŠALTINIAI  
(1) OECD (2002) OECD Conceptual Framework for the Testing and Assess ­
ment of Endocrine Disrupting Chemicals, šio priedo B.54 skyriaus 2 prie ­
dėlyje. 
(2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for 
rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, 114–124.
 
(3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. 
P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies.  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, 23 – 30.
 
(4) OECD (2010),  Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production , 
OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/ ­
MONO(2010)31, Paris. Available at http://www.oecd.org/documen ­
t/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_ 1_1_1,00.html]  
(5) OECD (2010),  Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133, 
ENV/JM/MONO(2010)32, Paris. Available at: http://www.oecd.org/docu ­
ment/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_ 1_1_1,00.html]  
(6) Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Available at: 
http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05. pdf]
 
(7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR,  Toxicol. 
Sci., 81, 78–89.
 
(8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells,  
Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, 44–54.
 
(9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone,  Environ. Health Perspect.,  118: 265–272.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
(10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell 
line, Environ. Sci. Poll. Res.,  17:1137–1148.  
(11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocor ­
tical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis,  Cancer Res.,  50, 5488–5496.
 
(12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroi ­
dogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the H295R cell line,  Chemosphere,  80:578–584.
 
(13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. 
and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line,  
Environ. Sci. Technol.,  39:2777–2785.
 
(14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 
and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137–1148.  
(15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, 731–737.
 
(16) Chapter B.55 of this Annex: Hershberger Bioassay in Rats: A short-term 
Screening Assay for (Anti)Androgenic Properties.  
(17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, 222–231.  
(18) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
65, 55–63.  
(19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598–1606.  
(20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 
26:484–492.
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Priedėlis 
SĄVOKOS  
Užpildymas –  ląstelių užimama ploto dalis arba leidžiama proliferacijos apimtis 
mitybos terp ėje. 
Cheminė medžiaga –  medžiaga arba mišinys.  
VK –  variacijos koeficientas; tai – skirstinio standartinio nuokrypio ir jo aritme ­
tinio vidurkio santykis.  
CYP –  (angl.  cytochrome P450 ) citochromo P 450 monooksigenaz ės; tai – gen ų 
grupė ir dėl jų gaminami fermentai, kurie dalyvauja katalizuojant labai daug 
įvairių biochemini ų reakcijų, įskaitant steroidini ų hormonų sintezę ir metabo ­
lizmą. 
SSPM –  skilimų skaičius per minut ę; tai – per minut ę tam tikrame radioakty ­
viosios medžiagos kiekyje skilusi ų atomų skaičius. 
E2 –  17β-oestradiolis, svarbiausias estrogenas žinduoli ų sistemose.  
H295R l ąstelės – žmogaus antinks čių žievės karcinomos l ąstelės, kurios turi 
pagal sritis nediferencijuot ų žmogaus vaisiaus antinks čių ląstelių fiziologines 
savybes ir kurios ekspresuoja visus steroidogenez ės reakcijų sekoje dalyvaujan ­ 
čius fermentus. J ų galima įsigyti iš ATCC.  
Užšaldymo terp ė – naudojama l ąstelių užšaldymui ir užšaldyt ų ląstelių saugo­
jimui. Tai – pradin ė terpė, sumaišyta su priedu „BD Nu-serum“ ir 
dimetilsulfoksidu.  
Tiesinės koreliacijos atkarpa –  pagal hormon ų matavimo sistemos duomenis 
sudarytos standartin ės kreivės atkarpa, kurioje rezultatai proporcingi m ėginyje 
esančios analit ės koncentracijai.  
LOQ –  (angl.  Limit of Quantification ) kiekybinio nustatymo riba; tai – mažiau ­
sias chemin ės medžiagos kiekis, kur į galima atskirti nuo nesamo chemin ės 
medžiagos kiekio (tuš čiosios vert ės) neperžengiant nustatytos pasikliautinumo 
ribos. Šio metodo tikslais naudojam ą LOQ, jeigu nenurodyta kitaip, paprastai 
nustato bandymo sistem ų gamintojas.  
LOEC –  (angl.  Lowest Observed Effect Concentration ) mažiausia pasteb ėto 
poveikio koncentracija; tai – mažiausia koncentracija, kuri ą naudojant analiz ės 
metu pasireišk ęs atsakas statistiškai skiriasi nuo nustatyto naudojant kontrolin į 
bandinį tirpiklį. 
NOEC –  (angl.  No Observed Effect Concentration ) nepasteb ėto poveikio 
koncentracija; tai – didžiausia išbandyta koncentracija, kuriai esant per analiz ę 
nenustatyta teigiamo atsako.  
Pasažas –  skaičius, reiškiantis, kiek kart ų ląstelės pasidalijo nuo l ąstelių išaugi­
nimo iš užšaldytos pradin ės ląstelių kultūros. Pirminis iš užšaldytos pradin ės 
ląstelių kultūros paimtos l ąstelės pasažas žymimas vienetu (1). Vien ą kartą pasi­
dalijusios l ąstelės ženklinamos kaip antro pasažo l ąstelės ir t. t.  
FBDT –  Dulbecco  fosfatinis buferinis drusk ų tirpalas.  
Kokybės kontrol ė – santrumpa KK;tai – priemon ės, būtinos duomen ų patiki­
mumui užtikrinti.  
Kokybės kontrol ės plokštel ė – 24 duobu čių plokštelė, kurioje yra dviej ų dydžių 
koncentracijos teigiamo ir neigiamo kontrolini ų bandinių ir kuri naudojama 
naujos ląstelių grupės veiksmingumui steb ėti arba kaip teigiama analiz ės kontrolė 
atliekant chemini ų medžiag ų bandymus.  
Bandymo kartas –  nepriklausomas eksperimentas, kur į atliekant naudojamas 
naujas tirpal ų ir kontrolini ų bandinių rinkinys.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Pradinė terpė – pagrindas kitiems reagentams ruošti. Ji sudaryta iš modifikuotos 
terpės „Dulbecco's Modified Eagle's Medium“ (DMEM) ir maisto medžiag ų 
mišinio „Ham's F-12“ (F12), santykiu 1:1 sumaišyt ų 15 mM buferinio tirpalo 
HEPES, be fenolio raudonojo ir natrio bikarbonato. Natrio bikarbonatas įmai­ 
šomas kaip buferinis tirpalas, žr. tinkamumo patvirtinimo ataskaitos (4) II prie ­
dėlį. 
Priedais papildyta terp ė – tai pradin ė terpė, sumaišyta su priedu „BD 
Nu-Serum“ ir mišiniu „ITS+ premium“, žr. tinkamumo patvirtinimo ataskaitos 
(4) II pried ėlį. 
Steroidogenez ė – sintezės reakcijų seka, kurios metu cholesterolis virsta įvairiais 
steroidiniais hormonais. Keli steroid ų sintezės reakcijų sekos tarpiniai junginiai, 
kaip antai progesteronas ir testosteronas, ne tik patys yra svarb ūs hormonai, bet ir 
atlieka tolesniame sintez ės reakcijų sekos etape atlieka susidaran čių hormonų 
pirmtakų funkciją. 
Testosteronas –  vienas iš dviej ų svarbiausi ų androgen ų žinduolių sistemose.  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  bet kuri medžiaga ar mišinys, bandomas 
taikant šį bandymų metodą. 
Bandomoji plokštel ė – plokštelė, kurioje H295R l ąstelės veikiamos bandomo ­
siomis chemin ėmis medžiagomis. Bandomojoje plokštel ėje yra kontrolinio 
bandinio tirpiklio ir bandomosios chemin ės medžiagos; naudojamos septyni ų 
dydžių koncentracijos chemin ės medžiagos ir kiekvienos koncentracijos 
medžiaga bandoma trijose duobut ėse. 
Tripsinas 1X –  praskiestas fermento tripsino (kasos serino proteaz ės) tirpalas, 
naudojamas siekiant atskirti l ąsteles nuo l ąstelių auginimo plokštel ės, žr. tinka ­
mumo patvirtinimo ataskaitos (4) III pried ėlį. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  GRAUŽIK Ų SOMATINI Ų IR EMBRIONINI Ų LĄSTELIŲ 
TARPGENINI Ų MUTACIJ Ų ANALIZ Ė 
ĮVADAS  
1. Šis bandym ų metodas atitinka EBPO Bandym ų gaires (angl. OECD  Test 
Guideline  (TG)) Nr. 488 (2013). Pagal esamus ES bandym ų metodus 
galima atlikti daug įvairios  in vitro  mutacijų analizės, padedan čios aptikti 
chromosom ų ir (arba) gen ų mutacijas. Turima bandym ų metodų, skirtų in 
vivo vertinamosioms baigtims (t. y. chromosom ų aberacijoms ir nenumatytai 
DNR sintezei) tirti; ta čiau per tuos bandymus gen ų mutacijos n ėra vertina ­
mos.Transgenini ų graužikų (angl. TGR) mutacij ų analize patenkinamas 
poreikis tur ėti praktišk ą ir plačiai prieinam ą metodą in vivo  bandym ų 
genų mutacijoms vertinti.  
2. Transgenini ų graužikų mutacijų analizė buvo nuodugniai išnagrin ėta (24) 
(33). Šioje analiz ėje naudojamos transgenin ės žiurkės ir pelės, kurių chro­
mosomose yra daug integruot ų plazmidži ų arba fag ų universali ų vektorių 
kopijų. Transgenin ės ląstelės turi reporterini ų genų, pagal kuriuos aptin ­
kamos bandom ųjų cheminių medžiag ų in vivo  sukeltos įvairaus pob ūdžio 
mutacijos.  
3. Graužiko organizme vykstan čios mutacijos skai čiuojamos išskiriant trans ­
geną ir analizuojant reporterinio geno neturin čios bakterijos nešiotojos 
reporterinio geno fenotip ą. Atliekant transgenini ų graužikų genų mutacijų 
analizę įvertinamos praktiškai iš bet kurio graužik ų organų audinio išskirt ų 
genetiškai neutrali ų genų mutacijos. Tod ėl atliekant ši ą analizę išvengiama 
daugelio esam ų apribojim ų, susijusių su in vivo  endogenini ų genų mutacijų 
tyrimais (pvz., ne visi audiniai tinka analizei, neigiama/teigiama mutacij ų 
atranka).  
4. Iš įrodomosios vert ės analizės matyti, kad transgenai reaguoja į mutagenus 
panašiai kaip endogeniniai genai, ypa č tais atvejais, kai vertinamos bazi ų 
porų pakaitos, skaitymo r ėmelio poslinkio mutacijos, nedidel ės delecijos ir 
intarpai (24).  
5. Per tarptautinius genotoksiškumo bandym ų seminarus (angl. IWGT) patvir ­
tinta, kad transgenini ų graužikų genų mutacijų analizę galima taikyti  in vivo  
genų mutacijoms nustatyti, ir rekomenduotas analiz ės įgyvendinimo proto ­
kolas (15) (29). Šis bandym ų metodas parengtas pagal tas rekomendacijas. 
Išsamesnė analizė, kuria pagrindžiamas šio protokolo taikymas, pateikta 
(16).  
6. Numatoma, kad ateityje transgenini ų graužikų genų mutacijų analizę galbūt 
bus galima sujungti su kartotini ų dozių toksiškumo tyrimu (šio priedo B.7 
skyrius). Ta čiau reikia surinkti duomenis, kuriais b ūtų patvirtinta, kad trans ­
geninių graužikų genų mutacijų analizės jautrumas nepakis, jei laikotarpis 
nuo paskutin ės dozės davimo iki m ėginių paėmimo bus trumpesnis, t. y. 
viena diena, – toks laikotarpis yra taikomas per kartotini ų dozių toksikolo ­
ginį tyrimą, – o ne trys dienos, kaip atliekant transgenini ų graužikų genų 
mutacijų analizę. Taip pat reikia surinkti duomenis, kuriais b ūtų parodyta, 
jog tai, kad naudojama transgenin ė, o ne tradicin ė graužikų veislė, neturės 
neigiamos įtakos kartotini ų dozių analizei. Kai šie duomenys bus turimi, 
bandymų metodas bus atnaujintas.  
7. Pagrindini ų sąvokų apibrėžtys pateiktos priede.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
PRADINIAI ASPEKTAI  
8. Transgenini ų graužikų genų mutacijų analizė, kurios taikymui pagal š į 
bandymų metodą pagrįsti yra turima pakankamai duomen ų, yra: bakterio ­
fago su  lacZ  genu analiz ė naudojant peles (Muta™Mouse analiz ė); lacZ  
geno plazmid ės analizė naudojant peles;  gpt  delta ( gpt ir Spi  – )analizė 
naudojant peles ir žiurkes;  lacI  geno analiz ė naudojant peles ir žiurkes 
(Big Blueä), kai šio įvairaus pob ūdžio analiz ė atliekama standartin ėmis 
sąlygomis. Be to, mutacijoms įvertinti pagal Big Blue® ir Muta™Mouse 
modelius galima taikyti  cII teigiamos atrankos analiz ę. Pagal transgenini ų 
graužikų modelius mutagenez ė paprastai yra vertinama skai čiuojant muta ­
cijų dažnį; tačiau jeigu reikia, iš molekulin ės mutacijų analizės galima gauti 
papildomos informacijos (žr. 24 punkt ą). 
9. Šie graužik ų in vivo  genų mutacijų bandymai ypa č tinka mutageniniam 
pavojui vertinti, nes analiz ės rezultatai priklauso nuo  in vivo  metabolizmo, 
farmakokinetikos, DNR pažaid ų reparacijos ir apeinan čios pažaidas DNR 
sintezės, nors šie rezultatai gali skirtis d ėl gyvūnų rūšies, audinio ir DNR 
pažaidos pob ūdžio. Gen ų mutacijų in vivo  analizė yra naudinga, kai norima 
išsamiau ištirti  in vitro  sistema nustatyt ą mutagenin į poveikį ir papildyti 
bandymų, per kuriuos naudotos kitos  in vivo  vertinamosios baigtys, rezul ­
tatus (24). Gen ų mutacija yra ne tik priežastiniais ryšiais susijusi su v ėži­
niais susirgimais – ji yra svarbi vertinamoji baigtis prognozuojant mutacij ų 
sukeliamas nev ėžines somatini ų audinių ligas (12) (13) ir per embrionini ų 
ląstelių liniją perduodamas ligas.  
10. Kai turima duomen ų, kad bandomoji chemin ė medžiaga arba atitinkamas 
metabolitas nepasieks n ė vieno iš reikiam ų audinių, transgenini ų graužikų 
genų mutacijų analizę atlikti nėra tikslinga.  
BANDYM Ų METODO PRINCIPAS  
11. Atliekant 8 punkte aptart ą analizę tiriamasis genas – pagal kilm ę bakterinis 
arba bakteriofaginis – iš graužiko genomo DNR yra išgaunamas transgen ą 
įterpus į λ bakteriofago arba plazmid ės universal ų vektorių. Per šią proce­
dūrą iš reikiamo graužiko audinio genomo DNR išskiriama, paruošiama  in 
vitro  (t. y. liambda vektori ų pakavimas, plazmidži ų ligacija ir elektropora ­
cija universaliam vektoriui išgauti), paskui nustatomos bakterijose nešioto ­
jose tam tikromis s ąlygomis vykstan čios mutacijos. Analizei naudojami 
neutralūs transgenai, kuriuos lengva išskirti iš daugumos audini ų. 
12. Per pagrindin į transgenini ų graužikų genų mutacijų bandymą graužikui tam 
tikrą laiką duodama chemin ė medžiaga. Chemines medžiagas galima duoti 
bet kuriuo tam tinkamu b ūdu, taip pat ir implantuojant (pvz., kai bandyme 
naudojami medicininiai prietaisai). Visas laikotarpis, kuriuo gyv ūnui 
duodamos doz ės, vadinamas  medžiagos davimo laikotarpiu . Pasibaigus 
medžiagos davimo laikotarpiui, iki gyv ūnų numarinimo chemin ė medžiaga 
paprastai nebeduodama, o neištaisytos DNR pažaidos fiksuojamos kaip stabilios mutacijos. Literat ūros šaltiniuose šis laikotarpis vadinamas įvairiai: 
pasireiškimo, fiksavimo arba ekspresijos laikotarpiu; šio laikotarpio pabaiga 
yra mėginių ėmimo laikas  (15) (29). Gyv ūną numarinus genomo DNR yra 
izoliuojama iš reikiamo (- ų) audinio (-i ų) ir išgryninama.
 ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Vieno gyv ūno audinio duomenys, gauti iš keli ų pakavimo/ligacijos opera ­
cijų, dažniausiai yra sumuojami, mutacij ų dažnis paprastai įvertinamas 
imant 10  5 10 7 plokšteles arba kolonijas sudaran čių vienetų. Kai taikomi 
teigiamos atrankos metodai, bendras plokšteles sudaran čių vienetų skaičius 
yra nustatomas naudojant atskir ą neselektyvi ų lėkštelių rinkinį. 
14. Teigiami atrankos metodai buvo sukurti tam, kad b ūtų lengviau surasti  gpt 
geno mutacijas  [gpt delt a analizė naudojant peles ir žiurkes , gpt  – fenotipo 
analizė (20) (22) (28)] ir  lacZ  geno analiz ė [Muta™Mouse arba  lacZ  plaz­
midžių analizė naudojant peles (3) (10) (11) (30)];  lacI  genų mutacijos Big 
Blue® gyv ūnų organizmuose nustatomos naudojant neselektyv ų metodą, 
kuriuo mutacijos nustatomos pagal spalvot ų (mėlynų) plokšteli ų susida­
rymą. Yra ir teigiamos atrankos metod ų, kuriuos galima taikyti λ bakterio­
fago universalaus vektoriaus  cII geno taškin ėms mutacijoms nustatyti 
[analizė, kai naudojamos Big Blue® pel ės arba žiurk ės, ir Muta™Mouse 
analizė (17)] ir λ red ir gam  genų delecijos mutacijoms nustatyti [Spi  – 
atrankos analiz ė naudojant  gpt delta peles ir žiurkes (21) (22) (28)].  Muta­
cijų dažnis  apskaičiuojamas plokšteli ų/plazmidži ų, kuriose yra transgeno 
mutacijų, skaičių padalijus iš bendro plokšteli ų/plazmidži ų, išskirtų iš to 
paties DNR m ėginio, skai čiaus. TGR gen ų mutacijų tyrimuose mutacij ų 
dažnis yra vienas iš ataskaitoje nurodom ų parametr ų. Be to,  mutacijų dažnis  
gali būti apskaičiuojamas kaip l ąstelių, nešančių nepriklausomas  mutacijas, 
dalis; šio skai čiavimo rezultatus reikia koreguoti pagal klonin ę ekspansij ą, 
kuri įvertinama pagal išskirt ų mutacijų seką (24).  
15. Mutacijas, skai čiuojamas atliekant  lacI, lacZ, cII  ir gpt taškinių mutacijų 
analizę, pirmiausia sudaro bazi ų porų pakaitos, skaitymo r ėmelio poslinkio 
mutacijos ir nedideli intarpai/delecijos. Santykin ė šių tipų mutacijų dalis, 
palyginti su savaimin ėmis mutacijomis, yra panaši į endogeninio  Hprt  geno. 
Didelių delecijų nustatoma tik atliekant Spi  – atrankos ir  lacZ  plazmidži ų 
analizę (24). Tiriamos mutacijos – pel ėms arba žiurk ėms in vivo  pasireiš­
kiančios mutacijos.  In vitro  ir ex vivo  mutacijos, kurios gali kilti per fag ų/­
plazmidži ų išgavos, sintez ės arba pažaid ų reparacinius procesus, yra santy ­
kinai retos ir kai kuriose sistemose gali b ūti specialiai pažymimos arba 
atmetamos taikant bakterijos nešiotojos/teigiamos atrankos sistem ą. 
METODO APRAŠYMAS  
Paruošiamieji darbai  
Gyvūnų rūšies parinkimas  
16. Šiuo metu galima taikyti įvairius transgenini ų pelių genų mutacijos nusta ­
tymo modelius, šios sistemos naudojamos pla čiau negu transgenini ų žiurkių 
modeliai. Jeigu žiurki ų modelis yra akivaizdžiai tinkamesnis negu peli ų 
(pvz., kai tiriamas tik žiurk ėms nustatom ų auglių karcinogenez ės mecha­
nizmas ir šis tyrimas derinamas su toksiškumo žiurk ėms tyrimu arba jeigu 
yra žinoma, kad žiurki ų metabolizmas geriau atspindi žmoni ų metabolizm ą), 
reikėtų apsvarstyti galimyb ę naudoti transgenini ų žiurkių modelius.  
Laikymo ir š ėrimo sąlygos  
17. Bandom ųjų gyvūnų patalpos temperat ūra turi būti 22 °C (± 3 °C). Nors 
santykinė drėgmė turėtų būti mažiausiai 30 % ir pageidautina ne didesn ė 
kaip 70 %, išskyrus patalpos plovimo laik ą, reikėtų siekti, kad santykin ė oro 
drėgmė būtų 50–60 %. Apšvietimas tur ėtų būti dirbtinis – pakaitomis 12 h 
šviesos ir 12 h tamsos per par ą. Gyvūnams šerti tinka įprastas laboratorijoje  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
naudojamas pašaras, o geriamojo vandens kiekis neribojamas. Jei bando ­
moji medžiaga duodama su pašarais, juos renkantis turi b ūti užtikrinama, 
kad bandom ąją medžiag ą būtų galima tinkamai su jais sumaišyti. Gyv ūnai 
turėtų būti laikomi mažomis grup ėmis (ne daugiau kaip po penkis) tos 
pačios lyties gyv ūnus, jeigu n ėra agresyvaus elgesio pavojaus. Moksliškai 
pagrįstais atvejais gyv ūnus galima laikyti atskirai.  
Gyvūnų paruošimas  
18. Sveiki jauni lytiškai subrend ę gyvūnai (kuri ų amžius pradedant duoti 
cheminę medžiagą yra 8–12 savai čių) atsitiktine tvarka suskirstomi į kontro­
linę ir dozes gaunan čią grupes. Kiekvienas gyv ūnas paženklinamas unikalia 
žyma. Gyv ūnams leidžiama aklimatizuotis prie laboratorini ų sąlygų mažiau­
siai 5 dienas. Narveliai išd ėstomi taip, kad b ūtų kiek įmanoma sumažintas 
bet koks galimas poveikis d ėl narvelio vietos. Bandymo pradžioje gyv ūnų 
svorio variacija turi b ūti kuo mažesn ė; jų svoris turi b ūti ne didesnis kaip 
± 20 % atitinkamos lyties gyv ūnų vidutinio svorio.  
Dozių ruošimas  
19. Kietosios bandomosios chemin ės medžiagos prieš duodant gyv ūnams turėtų 
būti ištirpinamos atitinkamuose tirpikliuose ar nešikliuose arba tur ėtų būti 
paruošta j ų suspensija, prireikus jos įmaišomos į pašarą arba geriam ąjį 
vandenį. Skystos bandomosios chemin ės medžiagos gali b ūti duodamos iš 
karto arba prieš tai praskiestos. Jeigu bandomoji chemin ė medžiaga 
duodama per kv ėpavimo takus, j ą galima duoti duj ų, garų arba kieto/skysto 
aerozolio pavidalu atsižvelgiant į tai, kokios yra jos fizikin ės ir chemin ės 
savybės. Naudojami švieži bandomosios chemin ės medžiagos preparatai, 
nebent duomenys apie medžiagos stabilum ą rodo, kad j ą galima laikyti.  
Bandymo s ąlygos  
Tirpiklis/nešiklis  
20. Naudojamos tirpiklio ar nešiklio doz ės neturėtų kelti jokio toksinio poveikio 
ir neturėtų kilti spėlionių, kad jis gali chemiškai reaguoti su bandom ąja 
chemine medžiaga. Jeigu naudojami kiti mažiau žinomi tirpikliai/nešikliai, 
prieš pradedant juos naudoti reikia pateikti j ų tinkamum ą įrodančius 
duomenis. Jeigu yra įmanoma, pirmiausia rekomenduojama naudoti vande ­
ninį tirpiklį arba nešikl į. 
Teigiamos kontrol ės grupės 
21. Paprastai reik ėtų naudoti lygiagre čios teigiamos kontrol ės grupių gyvūnus. 
Tačiau kiekviena laboratorija, kuri yra įrodžiusi savo kompetencij ą (žr. 23 
punktą) ir kuri ši ą analizę atlieka nuolat, metodo s ėkmingumui patvirtinti 
gali į kiekvien ą bandymą įtraukti ankstesni ų bandymų teigiamos kontrol ės 
gyvūnų DNR. Per ankstesnius bandymus paimtos DNR tur ėtų būti tų pačių 
rūšių gyvūnų ir audini ų ir tinkamai laikomos (žr. 36 punkt ą). Kai naudo ­
jamos lygiagre čios teigiamos kontrol ės grupės, dozes joms n ėra būtina duoti 
tuo pačiu būdu, kokiu yra duodama bandomoji chemin ė medžiaga; ta čiau 
turėtų būti įrodyta, kad viename arba keliuose reikiamuose teigiamos kont ­
rolės grupės gyvūnų audiniuose d ėl bandomosios chemin ės medžiagos 
vyksta mutacijos. Teigiamos kontrol ės grupei duodamos chemin ės 
medžiagos doz ės turėtų būti pasirenkamos tokios, kad sukelt ų silpną arba 
vidutinį poveikį, pagal kur į būtų galima kritiškai vertinti analiz ės rezultaty ­
vumą ir jautrum ą. Teigiamos kontrol ės chemini ų medžiagų pavyzdžiai ir kai 
kurie jų veikiami audiniai yra išvardyti 1 lentel ėje. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
1 lentelė 
Teigiamos kontrol ės chemini ų medžiag ų pavyzdžiai ir kai kurie j ų veikiami audiniai  
Teigiamos kontrol ės cheminė 
medžiaga ir CAS Nr.  Einecs pavadinimas ir Einecs 
Nr. Apibūdinimas  Mutacijos tikslinis organas  
Žiurkių Peli ų 
N-etil-N-nitrozošlapalas 
[CAS Nr. 759–73–9]  N-etil-N-nitrošlapalas 
[212–072–2]  Tiesiogiai 
veikiantis mutagenas
 Kepenys, 
plaučiai Kaulų čiulpai, gaub ­
tinė žarna, gaubtin ės 
žarnos epitelis, 
plonoji žarna, 
kepenys, plau čiai, 
blužnis, inkstai, kiaušidžių granulio ­
zinės ląstelės, pati­
nėlių embrionin ės 
ląstelės
 
Etilkarbamatas (uretanas) 
[CAS Nr. 51–79–6]  Uretanas 
[200–123–1]  Mutagenas, reika ­
lingas metabo ­
lizmas, bet pasi ­
reiškia tik silpnas 
poveikis  Kaulų čiulpai, pries ­
krandis, plonoji žarna, kepenys, 
plaučiai, blužnis
 
2,4-Diaminotoluenas 
[CAS Nr. 95–80–7]  4-metil-m-fenilenedia ­
minas 
[202–453–1]  Mutagenas, reika ­
lingas metabo ­
lizmas, teigiamas 
atliekant Spi  - 
analizę Kepenys  Kepenys  
Benzo[a]pirenas 
[CAS Nr. 50–32–8]  Benzo[def]chrizenas 
[200–028–5]  Mutagenas, reika ­
lingas metabolizmas
 Kepenys, 
taukinė Kaulų čiulpai, 
krūtys, gaubtin ė 
žarna, prieskrandis, liaukinė skrandžio 
dalis, širdis, 
kepenys, plau čiai, 
patinėlių embrio ­
ninės ląstelės
 
Neigiamos kontrol ės grupės 
22. Kiekvien ą kartą į imamus m ėginius reik ėtų įtraukti neigiamos kontrol ės 
grupių, kurioms buvo duodamas tik tirpiklis arba tik nešiklis ir kurios visais 
kitais aspektais buvo laikomos tomis pa čiomis sąlygomis kaip dozes gavu ­
sios grup ės, mėginius. Jeigu neturima anks čiau surinkt ų arba nėra anksčiau 
paskelbtų kontrolini ų duomenų, iš kurių būtų matyti, kad pasirinktas tirpik ­
lis/nešiklis nesukelia delecij ų arba nedaro mutageninio poveikio, kiekvien ą 
kartą į imamus m ėginius reik ėtų įtraukti ir kontrolini ų grupių, kurioms 
medžiagos neduota, m ėginius, taip siekiant nustatyti, ar nešiklio kontrolin ės 
grupės mėginiai yra tinkami.  
Laboratorijos kompetencijos patikrinimas  
23. Kompetencij ą atlikti ši ą analizę reikėtų patikrinti įrodant, kad pagal 
paskelbtus duomenis gebama atkartoti šiuos numatytus rezultatus (24): 1) 
mutacijų dažnio naudojant teigiamas kontrolines chemines medžiagas ( įskai­
tant silpn ą atsaką), pavyzdžiui, išvardytas 1 lentel ėje, nemutagenus ir kont ­
rolinius nešiklius; ir 2) transgen ų išgavos iš genomo DNR (pvz., pakavimo 
efektyvumo).  
Mutacijų sekos nustatymas  
24. Reguliavimo tikslais nereikalaujama nustatyti mutacij ų DNR sekos, ypa č 
kai gaunami aišk ūs teigiami arba neigiami rezultatai. Ta čiau nustatytos 
sekos duomenys gali b ūti naudingi, kai pastebima atskir ų atvejų skirtumų. 
Tuomet seka gali b ūti nustatoma tam, kad b ūtų galima atmesti mutacij ų 
banko (angl.  jackpot ) arba klonavimosi tikimyb ę, – nustatoma unikali ų 
mutacijų konkrečiame audinyje dalis. Norint nustatyti, ar klonin ės mutacijos  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
prisidėjo prie mutacij ų dažnio, dažniausiai pakanka nustatyti maždaug 10 
mutacijų viename vieno gyv ūnų audinyje sek ą; norint matematiškai pako ­
reguoti mutacij ų dažnį, atsižvelgiant į kloniškum ą gali prireikti nustatyti 
bent 25 mutacij ų sekas. Galimyb ė nustatyti mutacij ų seką svarstytina ir 
tada, kai pastebimas šioks toks mutacij ų dažnio padid ėjimas (t. y. nedaug 
viršijantis kontrolini ų grupių, kurioms medžiagos neduodama, vertes). 
Mutacijų spektro skirtumai tarp mutuojan čių kolonijų palyginus gyv ūnus, 
kuriems medžiagos duodama, ir gyv ūnus, kuriems medžiagos neduodama, 
gali padėti patvirtinti mutagenin į poveikį (29). Mutacij ų spektras taip pat 
gali būti naudingas pl ėtojant mechanistines hipotezes. Jeigu sekos nusta ­
tymą ketinama įtraukti į tyrimo protokol ą, reikėtų ypač atkreipti d ėmesį į 
tokių tyrimų struktūrą, ypač į vieno mėginio mutacij ų sekų skaičių, tam, kad 
pagal taikom ą statistinį modelį būtų užtikrinta pakankama statistin ė galia 
(žr. 43 punkt ą). 
BANDYMO PROCED ŪRA 
Gyvūnų skaičius ir lytis  
25. Gyv ūnų skaičius vienoje grup ėje nustatomas iš anksto ir tur ėtų būti toks, 
kad gyvūnų pakaktų statistinei galiai užtikrinti ir kad b ūtų galima nustatyti 
bent mutacij ų dažnio dvigub ėjimą. Grupę turi sudaryti ne mažiau kaip penki 
gyvūnai; tačiau jeigu statistin ė galia nepakankama, gyv ūnų skaičių reikėtų 
didinti tiek, kiek reikia. Paprastai naudojami patin ėliai. Tam tikrais atvejais 
būna pagrindo bandymus daryti tik su patel ėmis; pavyzdžiui, kai bandomi 
konkrečiai moterims skirti vaistai arba kai tiriamas moterims b ūdingas meta ­
bolizmas. Jeigu tarp ly čių yra dideli ų toksiškumo arba metabolizmo skir ­
tumų, reikia naudoti ir patin ėlius, ir pateles.  
Dozių davimo laikotarpis  
26. Kadangi pasteb ėta, jog mutacijos did ėja su kiekviena doze, dozes reikia 
kartoti, duoti kasdien 28 dienas. Paprastai manoma, kad toks laikotarpis yra pakankamas ir tam, kad silpni mutagenai sukelt ų pakankamai mutacij ų, 
ir tam, kad veikimo laiko pakakt ų nustatyti mutacijoms organuose, kuri ų 
ląstelės lėtai proliferuoja. Kai kuriems vertinimams atlikti gali b ūti tikslinga 
taikyti kitok į dozavimo režim ą; alternatyv ūs dozavimo režimai tur ėtų būti 
moksliškai pagr įsti protokole. Doz ės neturėtų būti duodamos trumpiau, negu 
reikia visiems atitinkamiems metabolizuojantiems fermentams iki galo suža ­
dinti; jeigu doz ės duodamos trumpiau, gali tekti paskirti kelis m ėginių 
surinkimo laiko momentus, tinkamus organams, kuri ų ląstelių proliferacijos 
tempas yra skirtingas. Bet kuriuo atveju protokolui pagr įsti reikėtų remtis 
visa turima informacija (pvz., apie bendr ąjį toksiškum ą arba metabolizm ą, 
farmakokinetik ą), ypač tada, kai nukrypstama nuo pirmiau išd ėstytų stan­
dartinių rekomendacij ų. Nors esant ilgesniam negu 8 savai čių dozių
 davimo 
laikotarpiui ir b ūtų lengiau pasiekti didesn į jautrumą, tai reik ėtų tiksliai 
paaiškinti ir pagr įsti, nes dozes duodant ilgiau, mutacij ų dažnumas gali 
akivaizdžiai padid ėti dėl kloninės ekspansijos (29).  
Dozės dydžiai  
27. Dozi ų dydis tur ėtų būti pagrįstas dozės dydžio intervalo nustatymo tyrimo, 
kuriuo vertintas bendrasis toksiškumas ir per kur į buvo taikytas tas pats 
medžiagos davimo b ūdas, rezultatais arba ankstesniais po ūmio toksiškumo 
bandymų rezultatais. Tos pa čios graužik ų veislės netransgeniniai gyv ūnai 
gali būti naudojami doz ės dydžio intervalui nustatyti. Atliekant pagrindin į 
bandymą ir norint surinkti informacij ą apie atsak ą į dozes, iš viso per tyrim ą 
reikėtų naudoti neigiamos kontrol ės grupę (žr. 22 punkt ą), ne mažiau kaip 
trijų dydžių, kurie skiriasi tinkamais intervalais, dozes, išskyrus tuos atvejus, 
kai naudojama ribin ė dozė (žr. 28 punkt ą). Didžiausia doz ė turėtų būti 
maksimali toleruojama doz ė (MTD). MTD laikoma doz ė, kuri sukelia  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
tokius toksiškumo požymius, kad pagal t ą pačią seką duodama didesn ė dozė 
būtų mirtina. Chemin ėms medžiagoms, pasižymin čioms specifiniu biolo ­
giniu aktyvumu, kai j ų dozės būna mažos ir netoksiškos (pavyzdžiui, 
hormonams ir mitogenams), ir chemin ėms medžiagoms, kurioms b ūdinga 
toksikokinetini ų savybių saturacija, gali b ūti taikoma doz ės dydžio nusta ­
tymo kriterij ų išimtis; šias chemines medžiagas reik ėtų vertinti kiekvienu 
atveju atskirai. Naudojam ų dozių dydis tur ėtų apimti interval ą nuo maksi ­
malios doz ės iki tokios, kuri yra labai mažai toksiška arba visai netoksiška.  
Ribinis bandymas  
28. Jeigu iš duomen ų, gautų per dozės dydžio intervalo nustatymo bandymus 
arba bandymus su giminingomis graužik ų veislėmis, matyti, kad tais atve ­
jais, kai duodama doz ė yra ne mažesn ė už ribinę (žr. toliau), jokio paste ­
bimo toksinio poveikio neb ūna, ir, remiantis strukt ūriškai panaši ų cheminių 
medžiagų bandym ų duomenimis, manoma, kad medžiaga netur ėtų būti 
genotoksiška, išsamus bandymas su trij ų dydžių dozėmis gali b ūti nebū­
tinas. Kai dozi ų davimo laikotarpis yra 28 dienas (t. y. doz ės duodamos 
kasdien 28 dienas), ribin ė dozė yra 1 000 mg/kg k ūno masės per dien ą. 
Jeigu doz ė duodama 14 dien ų arba trumpiau, ribin ė dozė yra 2 000 mg/kg 
kūno masės per dien ą (jeigu dozi ų davimo grafikas yra kitoks, doz ės 
duodamos ne 28 dienas kasdien, tai protokole reik ėtų moksliškai pagr įsti, 
žr. 26 punkt ą). 
Dozių davimas  
29. Bandomoji chemin ė medžiaga paprastai b ūna duodama per zond ą, naudo­
jant skrandžio zond ą arba tinkam ą intubacin į vamzdelį. Apskritai rengiantis 
atlikti analiz ę reikėtų atsižvelgti į numatom ą žmogaus s ąlyčio su medžiaga 
būdą. Todėl kitus sąlyčio su medžiaga b ūdus (su geriamuoju vandeniu, 
poodinėmis, intravenin ėmis injekcijomis, užd ėjus ant odos, per kv ėpavimo 
takus, lašinant į trachėją, su pašaru, implantuojant) galima taikyti, kai juos 
galima pagr įsti. Injekcijos į pilvą nerekomenduojamos, nes fiziologiškai šis 
būdas nėra artimas žmogaus s ąveikos su medžiaga b ūdui. Maksimalus 
skysčio, kurį galima duoti per zond ą arba sušvirkšti per vien ą kartą, tūris 
priklauso nuo bandomojo gyv ūno dydžio. Šis t ūris neturėtų būti didesnis 
kaip 2 ml/100g k ūno masės. Didesnio nei šis t ūrio naudojim ą reikėtų 
pagrįsti. Išskyrus dirginan čias ar ėsdinančias medžiagas, kuri ų didesnės 
koncentracijos paprastai sukelia sunkesn į poveikį, bandomojo t ūrio svyra­
vimai turi b ūti kuo mažesni: koncentracija pakoreguojama taip, kad vis ų 
dozių tūris būtų toks pats.  
Mėginių ėmimo laikas  
Somatinės ląstelės 
30. Mėginių ėmimo laikas yra svarbus veiksnys, nes j į nulemia mutacijoms 
pasireikšti reikalingas laikotarpis. Šis laikotarpis priklauso nuo audinio ir yra susijęs su ląstelių populiacijos dalijimosi ciklo trukme: kaul ų čiulpų ir 
plonosios žarnos atsakas b ūna greitas, kepen ų – lėtesnis. Tinkamas kompro ­
misas mutacij ų dažniui matuoti ir tuose audiniuose, kuri ų ląstelių prolifera ­
cija yra sparti, ir tuose, kuri ų ląstelių proliferacija yra l ėta, – dozes duoti 28 
dienas iš eil ės (kaip nurodyta 26 punkte), o m ėginius imti pra ėjus trims 
dienoms po paskutin ės dozės davimo; vis d ėlto audiniuose, kuri ų ląstelių 
proliferacija yra l ėta, didžiausias mutacij ų dažnis šiomis s ąlygomis dar gali 
būti nepasiektas. Jeigu audiniai, kuri ų ląstelių proliferacija yra l ėta, yra ypa č 
svarbūs, tada mėginius gali b ūti tikslinga paimti v ėliau, po 28 dien ų nuo 28 
dienų dozių davimo laikotarpio pabaigos (16) (29). Tokiais atvejais m ėgi­
niai imami v ėliau, ne po 3 dien ų; tai reikėtų moksliškai pagr įsti. ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Embrionin ės ląstelės 
31. Transgenini ų graužikų analizė labai tinka patin ėlių embrionin ėse ląstelėse 
(7) (8) (27) sukeltoms gen ų mutacijoms tirti, nes spermatogenez ės laikas ir 
kinetika yra tiksliai apibr ėžta (27). Kadangi kiaušin ėlių, kuriuos b ūtų galima 
analizuoti, skai čius būna nedidelis, net ir įvykus superovuliacijai, ir kadangi 
oocituose DNR sintez ė nevyksta, mutacij ų patelių embrionin ėse ląstelėse 
transgenine analize nustatyti negalima (31).  
32. Patin ėlių embrionini ų ląstelių mėginių paėmimo laik ą reikėtų pasirinkti taip, 
kad į mėginį patektų įvairios įvairiais vystymosi etapais paveiktos embrio ­
ninės ląstelės ir kad tuo etapu, kada imamas m ėginys, embrionin ės ląstelės 
būtų pakankamai paveiktos. Peli ų embrionini ų ląstelių vystymosi nuo sper ­
matogonini ų kamienini ų ląstelių iki subrendusi ų spermatozoid ų, kurie 
pasiekia s ėklinį lataką/antsėklidžio uodeg ą, laikotarpis trunka apie 49 dienas 
(36), žiurki ų – apie 70 dien ų (34) (35). Jeigu doz ės duodamos 28 dienas, o 
paskui po trij ų dienų paimami m ėginiai, m ėginių, paimtų iš sėkliniame 
latake/ants ėklidžio uodegoje susikaupusios spermos (7) (8), l ąstelės bus 
buvusios veikiamos apytiksliai v ėlesniuoju spermatogenez ės laikotarpiu, 
kuris apima mejozin į ir pomejozin į etapus, bet neapima spermatogonij ų 
arba kamienini ų ląstelių etapo. Norint tinkamai paimti l ąstelių, kurios 
sąlyčio su medžiaga laikotarpiu buvo spermotoginin ės kamienin ės ląstelės, 
mėginius iš s ėklinio latako/ants ėklidžio uodegos, reikia m ėginius imti 
vėliau, praėjus ne mažiau kaip 7 savait ėms (kai naudojamos pel ės) arba 
10 savai čių (kai naudojamos žiurk ės) nuo dozi ų davimo laikotarpio 
pabaigos.  
33. Ląsteles, paimtas iš s ėklinių kanalėlių laikantis 28 + 3 dien ų režimo, sudaro 
mišri populiacija, atspindinti visus embrionini ų ląstelių vystymosi etapus (7) 
(8). Vertinant gen ų mutacijoms nustatyti paimtus ši ų ląstelių mėginius gauti 
duomenys apie etapus, kuriais sukeliamos embrionini ų ląstelių mutacijos, 
bus ne tokie tiksl ūs kaip tuo atveju, kai spermatozoid ų mėginiai paimami iš 
sėklinio latako/ants ėklidžio uodegos (nes iš kanal ėlių paimtuose m ėginiuose 
yra įvairaus pob ūdžio embrionini ų ląstelių, į šią ląstelių populiacij ą patenka 
kai kurios somatin ės ląstelės). Tačiau jeigu l ąstelių mėginiai paimami ne tik 
iš sėkliniame kanale/ants ėklidžio uodegoje esan čių spermatozoid ų, bet ir iš 
sėklinių latakėlių, laikantis tik 28 + 3 dien ų mėginių ėmimo režimo, yra 
paimama l ąstelių, kurios buvo veikiamos visais pagrindiniais embrionin ės 
ląstelės vystymosi etapais, ir tokie m ėginiai gali b ūti naudingi kai kuriems 
embrionini ų ląstelių mutagenams nustatyti.  
Stebėjimai  
34. Bendrus klinikinius steb ėjimus reikia atlikti mažiausiai kart ą per dien ą, 
geriausiai tuo pa čiu dienos metu, atsižvelgiant į numatom ų poveikių piką. 
Gyvūnų sveikatos b ūklę reikia registruoti. Mažiausiai du kartus per dien ą 
visi gyvūnai turėtų būti patikrinami – ar negaišta, ar nenugaiš ę. Visi 
gyvūnai turėtų būti sveriami bent kart ą per savait ę ir numarinant. Suvarto ­
jamo pašaro kiekis turi b ūti matuojamas bent kas savait ę. Jeigu bandomoji 
medžiaga duodama su geriamuoju vandeniu, suvartoto vandens kiek į reikėtų 
išmatuoti kaskart, kai vanduo kei čiamas, ir bent kart ą per savait ę. Gyvūnus, 
kuriems pasireiškia nemirtini pernelyg didelio toksiškumo požymiai, reik ėtų 
numarinti iki bandymo pabaigos (23).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Audinių surinkimas  
35. Audini ų surinkim ą reikėtų aiškiai apibr ėžti. Kadangi galima tirti praktiškai 
bet kuriame audinyje sukeltas mutacijas, audinius, kurie bus surenkami, 
reikėtų pasirinkti remiantis tyrimo paskirtimi ir visais turimais tiriamos 
cheminės medžiagos mutageniškumo, karcinogeniškumo arba toksiškumo 
duomenimis. Svarb ūs veiksniai, į kuriuos reik ėtų atsižvelgti, – tai davimo 
būdas (pagal tai, koks (-ie) yra tik ėtinas (-i) žmogaus s ąlyčio su medžiaga 
būdas (-ai)), numatomas pasiskirstymas audinyje, galimas veikimo mecha ­
nizmas. Jeigu bendros informacijos n ėra, reikėtų surinkti kelis galin čius būti 
svarbius somatinius audinius. Tarp j ų turėtų būti greitos l ąstelių prolifera ­
cijos, lėtos ląstelių proliferacijos audiniai ir audiniai iš s ąlyčio vietos. Taip 
pat reikėtų paimti spermatozoid ų iš sėklinio latako/ants ėklidžio uodegos, 
besivystan čių embrionini ų ląstelių iš sėklinių kanalėlių (kaip paaiškinta 32 
ir 33 punktuose) ir saugoti tam atvejui, jeigu ateityje prireikt ų atlikti 
embrionini ų ląstelių mutageniškumo analiz ę. Organus reik ėtų pasverti; jei 
organai didesni, iš vis ų gyvūnų reikėtų surinkti vienod ą jų plotą. 
Audinių ir DNR saugojimas  
36. Audinius (arba audini ų homogenatus) reik ėtų saugoti – 70 °C arba žemes ­
nėje temperat ūroje ir panaudoti DNR izoliavimui per 5 metus. Izoliuot ą 
DNR, kuri saugoma sušaldyta 4 °C atitinkamoje buferin ėje medžiagoje, 
mutacijų analizei geriausia panaudoti per vienus metus.  
Audinių atranka mutacij ų analizei atlikti  
37. Audinius reik ėtų pasirinkti pagal šiuos kriterijus: 1) tai, kaip doz ės 
duodamos arba kurioje vietoje įvyksta pirmasis s ąlytis (pvz., liaukin ė skran­
džio dalis, jeigu doz ės duodamos per virškinam ąjį traktą, plaučiai, jeigu 
dozės duodamos per kv ėpavimo takus, arba oda, jeigu doz ės dedamos ant 
kurios nors odos vietos); 2) bendrojo toksiškumo tyrimuose pastebimus farmakokinetinius parametrus, iš kuri ų matyti, kaip medžiaga pasiskirsto, 
išlieka arba kaupiasi audiniuose arba kuriuos audinius veikia toksiškai. 
Jeigu tyrimai atliekami karcinogeniškumo tyrimams papildyti, reik ėtų 
atkreipti d ėmesį į audinius, kuriems daromas karcinogeninis poveikis. Audi ­
nius analizei reik ėtų pasirinkti taip, kad b ūtų galima kuo tiksliau aptikti 
chemines medžiagas, kurios tiesiogiai veikia kaip  in vitro  mutagenai, yra 
greitai metabolizuojamos, labai reaktyvios arba sunkiai absorbuojamos, arba 
chemines medžiagas, kurias duodant tikslinis audinys nustatomas pagal jos davimo b ūdą (6).
 
38. Jeigu anks čiau surinktos informacijos neturima, tada, atsižvelgiant į sąlyčio 
vietą pagal dozi ų davimo b ūdą, mutageniškum ą reikėtų įvertinti bent kepe ­
nims ir bent vienam audiniui, kurio l ąstelės sparčiai dalijasi (pvz., liaukin ę 
skrandžio dal į, kaulų čiulpus). Dauguma atvej ų pirmiau išd ėstytus reikala ­
vimus galima įvykdyti analizuojant du kruopš čiai atrinktus audinius, bet kai 
kuriais atvejais reik ės analizuoti tris arba daugiau audini ų. Jeigu yra 
pagrindo nerimauti konkre čiai dėl poveikio embrionin ėms ląstelėms, taip 
pat ir dėl teigiamo somatini ų ląstelių atsako, reik ėtų įvertinti, ar embrionini ų 
ląstelių audiniuose nevyksta mutacij ų. 
Matavimo metodai  
39. Standartinius laboratorinius arba paskelbtus mutacij ų nustatymo metodus 
galima taikyti, kai vykdoma ši ų modelių transgenin ė analizė: lacZ  lambda 
bakteriofag ų ir plazmidži ų (30);  lacI  pelių (2) (18);  gpt delta peli ų (22);  gpt 
delta žiurki ų (28);  cII (17). Pakeitimus reik ėtų pagrįsti ir tinkamai aprašyti. 
Kelių pakavim ų duomenis galima sumuoti ir panaudoti reikiamam plokš ­
telių arba kolonij ų skaičiui gauti. Ta čiau tai, kad reikia didesnio pakavimo 
reakcijų skaičiaus, kad b ūtų gautas reikiamas plokšteli ų skaičius, gali b ūtų 
netinkamos DNR kokyb ės požymis. Tokiais atvejais duomenis reik ėtų 
vertinti atsargiai, nes jie gali b ūti nepatikimi. Optimalus plokšteli ų arba 
kolonijų skaičius viename DNR m ėginyje priklauso nuo statistin ės pakan­
kamo mutacij ų skaičiaus aptikimo tikimyb ės esant pasirinktam savaimini ų ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
mutacijų dažniui. Bendrais atvejais, kai savaimini ų mutacijų dažnis yra apie 
3 × 10  –5 , reikia ne mažiau kaip 125 000–300 000 plokšteli ų (15). Kai 
atliekama Big Blue®  lacI  analizė, svarbu parodyti, kad, lygiagre čiai į kiek­
vieną lėkštelę įterpus atitinkamas spalv ų kontrolines priemones, galima 
nustatyti vis ų fenotipų spalvų mutacijas. Audinius ir iš j ų paimtus m ėginius 
(duomenis) reik ėtų apdoroti ir analizuoti bloko principu, pagal kur į nešik­
lio/kontrolin ės grupės, teigiamos kontrol ės grupės (jei ji naudojama) arba 
teigiamos kontrol ės DNR (jei naudojama) ir kiekvienos bandomosios grup ės 
duomenys b ūtų apdorojami kartu.  
DUOMENYS IR ATASKAITA  
Rezultatų apdorojimas  
40. Kiekvieno gyv ūno bandym ų rezultatai tur ėtų būti pateikiami lentel ėse. 
Gyvūnas yra eksperimentinis vienetas. Ataskaitoje reik ėtų nurodyti bendr ą 
ląstelių plokšteles sudaran čių vienetų (angl. pfu) arba kolonijas sudaran čių 
vienetų (angl. cfu) skai čių, mutacijų skaičių, kiekvieno gyv ūno kiekvieno 
audinio mutacij ų dažnį. Jeigu vyksta kelios pakavimo/išlaisvinimo reakcijos, 
reikėtų nurodyti vienam DNR m ėginiui tenkan čių reakcijų skaičių. Reikėtų 
saugoti kiekvienos reakcijos duomenis, bet ataskaitoje nurodyti tik bendr ą 
pfu arba cfu skai čių. Reikėtų nurodyti 34 punkte paaiškintus toksiškumo 
duomenis ir klinikinius požymius. Reik ėtų nurodyti kiekvienos analizuotos 
mutacijos sekos nustatymo rezultatus, apskai čiuotą kiekvieno gyv ūno ir 
audinio mutacij ų dažnį. 
Statistinis rezultat ų įvertinimas ir aiškinimas  
41. Teigiam ą rezultatą galima nustatyti pagal kelet ą kriterijų, pavyzdžiui, nuo 
dozės dydžio priklausom ų mutacijų dažnio padid ėjimą arba akivaizd ų muta­
cijų dažnio padid ėjimą, gyvūnams gavus pavien ę dozę ir paėmus vien ą 
mėginį, palyginti su tirpiklio/nešiklio kontroline grupe. Norint gauti pakan ­
kamai duomen ų dozės ir atsako tarpusavio ryšiui įvertinti, reik ėtų analizuoti 
bent tris bandom ąsias dozės grupes. Nors pirmiausia reikia siekti, kad rezul ­
tatai būtų biologiškai aktual ūs, bandymo rezultatams įvertinti kaip pagalbin ę 
priemonę galima taikyti atitinkamus statistinius metodus (4) (14) (15) (25) 
(26). Pagal taikomus statistinius testus eksperimentiniu vienetu tur ėtų būti 
laikomas gyv ūnas. 
42. Jei tiriant bandom ąją cheminę medžiag ą gaunami rezultatai, neatitinkantys 
pirmiau pamin ėtų kurio nors audinio kriterij ų, medžiaga pagal ši ą analizę 
laikoma nemutageniška. Kad neigiamas rezultatas b ūtų biologiškai priim ­
tinas, audinio s ąlytį su medžiaga reik ėtų patvirtinti.  
43. DNR sekai analizuoti galima taikyti įvairius rezultatus aiškinti padedan čius 
statistinius metodus (1) (5) (9) (19).  
44. Patikrinus duomenis apie tai, ar stebimos vert ės patenka į anksčiau nustatyt ą 
kontrolinį intervalą, galima gauti papildomos informacijos atsako biologi ­
niam reikšmingumui įvertinti (32).  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Bandymo ataskaita  
45. Bandymo ataskaitoje tur ėtų būti ši informacija:  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— tapatumo duomenys ir CAS Nr., jei žinomas;  
— šaltinis, partijos numeris, jei yra;  
— fizikin ė būsena ir grynumas;  
— atliekamam bandymui svarbios fizikin ės ir chemin ės savybės; 
— bandomosios chemin ės medžiagos stabilumas, jei žinomas.  
Tirpiklis/nešiklis:  
— priežastys, d ėl kurių buvo pasirinktas šis nešiklis;  
— bandomosios chemin ės medžiagos, esan čios tirpiklyje/nešiklyje, 
tirpumas ir stabilumas, jei yra žinomas;  
— preparat ų su pašarais, geriamuoju vandeniu arba inhaliacini ų preparatų 
ruošimas;  
— analitiniai preparat ų determinantai (pvz., stabilumas, vienalytiškumas, 
nominalioji koncentracija).  
Bandomieji gyv ūnai: 
— rūšis/veislė ir jų pasirinkimo pagrindimas;  
— gyvūnų skaičius, amžius ir lytis;  
— šaltinis, laikymo s ąlygos, pašaras ir kt.;  
— kiekvieno gyv ūno svoris prieš pradedant bandym ą ir kiekvienos grup ės 
svorio intervalas, vidurkiai bei standartinis nuokrypis.  
Bandymo s ąlygos:  
— teigiamos ir neigiamos (tirpiklis/nešiklis) kontrol ės duomenys;  
— dozės dydžio intervalo nustatymo bandymo duomenys;  
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi doz ės dydžio pasirinkim ą; 
— duomenys apie bandomosios medžiagos paruošim ą; 
— išsam ūs duomenys apie bandomosios chemin ės medžiagos davimo 
būdą; 
— pagrindin ė priežastis, nul ėmusi davimo b ūdo pasirinkim ą; 
— toksiškumo gyv ūnams matavimo metodai, įskaitant, jei galima, histopa ­
tologinę arba hematologin ę analizę, tai, kaip dažnai gyv ūnai buvo 
stebimi ir buvo matuojama j ų kūno masė; 
— metodai, kuriais patvirtinama, kad bandomoji chemin ė medžiaga pateko 
į veikiamą organą arba bendr ąją apytaką, jei gauti neigiami rezultatai;  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos pašaruose ir (arba) 
geriamajame vandenyje (ppm) perskai čiavimas į tikrąją dozę (mg/kg 
kūno masės per parą) ir suvartojimas, jei tinka;  
— išsami informacija apie pašaro ir vandens kokyb ę; 
— išsamus veikimo bandom ąja medžiaga ir m ėginio paėmimo tvarkaraš čio 
aprašymas, pasirinkimo pagrindimas;  
— eutanazijos metodas;  
— audini ų izoliavimo ir konservavimo proced ūros; 
— graužik ų genomo DNR izoliavimo, transgen ų išlaisvinimo iš genomo 
DNR, transgenin ės DNR perk ėlimo į bakterijas nešiotojas metodai;  
— visų ląstelių, priemoni ų rinkinių ir reagent ų (jei naudojami) šaltinis, 
partijos numeris;  
— mutacij ų skaičiavimo metodai;  
— mutacij ų molekulin ės analizės metodai ir j ų naudojimas mutacij ų 
dažniui tikslinti pagal kloniškum ą ir (arba) mutacij ų dažniui skai čiuoti, 
jei reikia.  
Rezultatai:  
— gyvūno būklė iki bandymo ir per bandym ą, įskaitant toksiškumo požy ­
mius;  
— kūno ir organo mas ė numarinimo metu;  
— apie kiekvien ą audinį/gyvūną: mutacijų skaičius, vertint ų plokšteli ų arba 
kolonijų skaičius, mutacij ų dažnis;  
— apie kiekvien ą audinį/gyvūnų grupę: vienam DNR m ėginiui tenkan čių 
pakavimo reakcij ų skaičius, bendras mutacij ų skaičius, vidutinis muta ­
cijų dažnis, standartinis nuokrypis;  
— dozės ir atsako tarpusavio ryšys (jei įmanoma nurodyti);  
— apie kiekvien ą audinį/gyvūną: nepriklausom ų mutacijų skaičius, vidu­
tinis mutacij ų dažnis, jeigu molekulin ė mutacijų analizė buvo atlikta;  
— lygiagre čios kontrol ės ir ankstesni kontroliniai duomenys, nurodant 
intervalus, vidurkius ir standartinius nuokrypius;  
— lygiagre čios teigiamos kontrol ės (arba nelygiagre čios DNR teigiamos 
kontrolės) duomenys;  
— analitiniai determinantai, jei yra (pvz., DNR koncentracija, naudota 
pakavimui, DNR sekos nustatymo duomenys);  
— statistin ės analizės ir metodai, jei taikyta.  
Rezultatų aptarimas  
Išvada  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
LITERAT ŪROS ŠALTINIAI  
(1) Adams,  W.T. and T.R.  Skopek  (1987), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391–396.  
(2) Bielas, J.H. (2002), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’,  Mutation Res. , 518: 107–112.  
(3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg 
(1995), ‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo 
Mutations’  Nature , 377(6550): 657–659  
(4) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’,  Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 
246–255.  
(5) Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413.
 
(6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
and V. Thybaud (1999), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141–151.  
(7) Douglas, G.R.,J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92: 
7485–7489.
 
(8) Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2–3): 197–212.
 
(9) Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411–1418.  
(10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  in 
vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86(20): 7971–7975.
 
(11) Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli H ost’, Biotechniques , 14(3): 326, 330.  
(12) Erikson, R.P. (2003), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125–136.  
(13) Erikson, R.P. (2010), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96–106 . 
(14) Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249–255.  
(15) Heddle, J.A.,S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. 
Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), ‘In vivo Trans ­
genic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253–259.
 
(16) Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. 
Mutagen. , 41: 1–6.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
(17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
and S. Garges (1996), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo M uta­
tions in a Bacteriophage λ Transgene Target’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 
93(17): 9073–9078.  
(18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. 
Short (1990), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Muta ­
genicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218.  
(19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns 
(2008), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra 
using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 772–778.  
(20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni 
(1996), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi – and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470.
 
(21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9–15.  
(22) Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 
455(1–2): 191–215.  
(23) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in SAFEty Evaluation, Series on Testing and Assessment, N  o 19, 
ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.  
(24) OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, N  o 103, ENV/JM/ ­
MONO(2009)7, OECD, Paris.  
(25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231–245.  
(26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. 
Brooks,.G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van 
Delft and N.J. Gorelick (1997), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlabo ­
ratory Study’, Mutation. Res., 388(2–3): 249–289.
 
(27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. 
Yauk(2006), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations 
and Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Trans ­
genic Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164–193.
 
(28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71–78.
 
(29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. 
Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), ‘ In vivo  Trans­
genic Mutation Assays’,  Mutation Res ., 540: 141–151.
 
(30) Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ 
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo ’ in: G. Pfeifer (ed.),  
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  
Plenum Press, New York, NY, USA, pp. 391–410.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
(31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and 
G.R. Douglas (2005), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection 
of Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1–2): 
117–123.  
(32) Hayashi , M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.
 
(33) OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation 
Assays , Series on Testing and Assessment, N  o 145, ENV/JM/ ­
MONO(2011)20, OECD, Paris.  
(34) Clermont, Y. (1972), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals seminife ­
rous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 
198–236.  
(35) Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epidi ­
dymis’, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., 
Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, the Netherlands, pp. 1071–1148.
 
(36) Russell, L.B. (2004), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25–36.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Priedėlis 
APIBRĖŽTYS  
Dozių davimo laikotarpis:  visas laikotarpis, kuriuo gyv ūnui duodamos doz ės. 
Bazių poros pakaita:  mutacijos pob ūdis, kai viena DNR nukleotido baz ė pakei­ 
čiama kita DNR nukleotido baze.  
Kapsidė: viruso dalel ę gaubiantis baltyminis apvalkal ėlis. 
Cheminė medžiaga:  medžiaga arba mišinys.  
Kloninė ekspansija:  didelio skai čiaus ląstelių pasigaminimas iš vienos (mutavu ­
sios) ląstelės. 
Kolonijas sudarantis vienetas (angl. cfu):  gyvybing ų bakterijų skaičiaus matas.  
Konkatemeras:  ilga ištisin ė biomolekul ė, susidedanti iš keli ų identiškų serijomis 
susijungusi ų kopijų. 
Cos vieta:  vienos gijos DNR 12 nukleotid ų segmentas, esantis abiejuose lambda 
bakteriofago dvigubos gijos genomo galuose.  
Delecija:  mutacija, per kuri ą iš genomo prarandamas nukleotidas arba daugiau 
nukleotid ų (seka).  
Elektroporacija:  elektros impuls ų taikymas l ąstelių membranos pralaidumui 
didinti.  
Endogeninis genas:  genomui b ūdingas genas.  
Ekstrabinomin ė variacija:  didesnė kartotinio populiacijos dalies įverčio varia­
cija negu b ūtų galima tik ėtis, jeigu populiacija tur ėtų binominį skirstinį. 
Skaitymo r ėmelio poslinkio mutacija:  genetinė mutacija, kylanti d ėl kelių 
įsiterpusių arba dingusi ų nukleotid ų, kurių skaičius DNR sekoje, kuriuo koduo ­
jamas baltymas/peptidas, nesidalija iš trij ų. 
Įterpimas:  vienos arba keli ų nukleotid ų bazių porų įterpimas į DNR sek ą. 
Bankas (angl.  jackpot ): didelis skai čius mutacij ų, kurios kilo iš vienos mutacijos 
dėl kloninės ekspansijos.  
Didelės delecijos:  daugiau negu keleto kilobazi ų delecijos DNR (kurios efekty ­
viai nustatomos atliekant Spi  – atrankos ir  lacZ  plazmidži ų analizę). 
Ligacija:  dviejų DNR molekul ės galų kovalentiškas susijungimas naudojant 
DNR ligaz ę. 
Mitogenas:  cheminė medžiaga, kuri stimuliuoja l ąstelių dalijimosi pradži ą, 
paskatindama mitoz ę (pvz., ląstelių dalijimąsi). 
Neutralus genas:  genas, kurio nepaveik ė nei teigiami, nei neigiami atrankos 
veiksniai.  
Pakavimas:  infekcini ų fago daleli ų sintezė iš fago kapsid ės ir uodegos baltym ų 
preparato ir fago DNR molekuli ų konkatemero. Paprastai naudojamas DNR, 
klonuotai į lambda vektori ų (atskirtai cos vietomis), pakuoti į infekcines lambda 
daleles.  
Pakavimo efektyvumas:  tai, kaip efektyviai supakuoti bakteriofagai yra išski ­
riami bakterijose nešiotojose.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Plokšteles sudarantis vienetas (angl. pfu):  gyvybing ų bakteriofag ų skaičiaus 
matas.  
Taškinė mutacija:  bendra s ąvoka, kuria žymimos mutacijos, paveikian čios tik 
nedidelę DNR sek ą, įskaitant nedidelius įterpimus, delecijas ir bazi ų porų 
pakaitas.  
Teigiama atranka:  metodas, pagal kur į gali išlikti tik mutacijos.  
Reporterinis genas:  genas, pagal kur į mutavęs geno produktas yra lengvai 
nustatomas.  
Mėginių ėmimo laikas:  laikotarpio iki gyv ūnų numarinimo, kuriuo chemin ė 
medžiaga neduodama ir kuriuo neištaisytos DNR pažaidos fiksuojamos kaip stabilios mutacijos.
 
Universalus vektorius:  vektorius, kuris yra sudarytas taip, kad gali daugintis 
dviejų skirtingų rūšių nešiotojuose; tod ėl į universal ų vektorių įterptą DNR 
galima bandyti arba ta DNR galima manipuliuoti dviej ų skirtingų tipų ląstelėse 
arba dviejuose skirtinguose organizmuose.  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  bet kuri pagal š į bandym ų metodą bandoma 
medžiaga arba mišinys.  
Transgeninis:  organizmas, kurio genomas buvo pakeistas vien ą arba kelis genus 
perkėlus iš kitų rūšių, ir tai, kas yra su tuo organizmu susij ę arba yra jo dalis.  ▼M5 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
C DALIS. EKOTOKSIŠKUMO NUSTATYMO METODAI  
TURINYS  
C.1. ŪMUS TOKSIŠKUMAS ŽUVIMS  
C.2. DAPHNIA  SP. ŪMAUS JUDRUMO 
SLOPINIMO (IMOBILIZAVIMO) BANDYMAS  
C.3. G ĖLO VANDENS DUMBLIAI IR CIANOBAKTERIJOS. 
AUGIMO INHIBAVIMO BANDYMAS  
C.4. LENGVO BIOLOGINIO SKAIDUMO NUSTATYMAS  
I DALIS.  BENDRIEJI KLAUSIMAI  
II DALIS.  DOC IŠNYKIMO BANDYMAS (C.4 – A METODAS)  
III DALIS.  MODIFIKUOTAS OECD ATRANKOS BANDYMAS (C.4 – B 
METODAS)  
IV DALIS.  CO  2 IŠSISKYRIMO BANDYMAS (C.4 – C METODAS)  
V DALIS.  MANOMETRINIS RESPIROMETRINIS BANDYMAS (C.4 – D 
METODAS)  
VI DALIS.  UŽDAROSIOS KOLBOS BANDYMAS (C.4 – E METODAS)  
VII DALIS.  M.I.T.I. BANDYMAS (C.4 -F METODAS)  
C.5. SKAIDYMAS. BIOCHEMINIS DEGUONIES SUVARTOJIMAS  
C.6. SKAIDYMAS. CHEMINIS DEGUONIES SUVARTOJIMAS  
C.7. SKAIDYMAS. ABIOTINIS SKAIDYMAS. HIDROLIZ Ė KAIP 
pH FUNKCIJA  
C.8. TOKSIŠKUMAS SLIEKAMS  
C.9. BIOLOGINIS SKAIDYMAS – ZAHN-WELLENS BANDYMAS  
C.10.  AEROBINIO NUOTEK Ų TVARKYMO MODELIAVIMO 
BANDYMAS: C.10-A: VEIKLIOJO DUMBLO AERATORIAI. C.10-B: BIOLOGIN ĖS PLĖVELĖS
 
C.11.  BIOLOGINIS SKAIDYMAS. AKTYVIOJO DUMBLO KV ĖPA­
VIMO INHIBAVIMO BANDYMAS  
C.12.  BIOLOGINIS SKAIDYMAS. MODIFIKUOTAS SCAS 
BANDYMAS  
C.13.  BIOLOGINIS KONCENTRAVIMAS. DINAMINIS 
BANDYMAS SU ŽUVIMIS  
C.14.  ŽUV Ų MAILIAUS AUGIMO BANDYMAS  
C.15.  TRUMPALAIKIO TOKSIŠKUMO ŽUVIMS BANDYMAS 
EMBRIONO IR TRYNIO MAIŠELIO STADIJOSE  
C.16.  NAMIN ĖS BITĖS. ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER VIRŠKINA ­
MĄJĮ TRAKTĄ 
C.17.  NAMIN ĖS BITĖS. ŪMAUS KONTAKTINIO TOKSIŠKUMO 
BANDYMAS  
C.18.  ADSORBCIJA/DESORBCIJA TAIKANT STATIN ĖS PUSIAUS ­
VYROS METOD Ą ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19.  ADSORBCIJOS KOEFICIENTO (K  oc ) NUSTATYMAS DIRVO ­ 
ŽEMYJE IR NUOTEK Ų DUMBLE AUKŠTOS SKYRIMO 
GALIOS SKYS ČIŲ CHROMATOGRAFIJA (HPLC)  
C.20.  DAPHNIA MAGNA  REPRODUKCIJOS BANDYMAS  
C.21.  DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. AZOTO TRANSFOR ­
MAVIMO BANDYMAS  
C.22.  DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. ANGLIES TRANSFOR ­
MAVIMO BANDYMAS  
C.23.  AEROBINIS IR ANAEROBINIS TRANSFORMAVIMAS 
DIRVOŽEMYJE  
C.24.  AEROBINIS IR ANAEROBINIS TRANSFORMAVIMAS 
VANDENS TELKINI Ų DUGNO NUOS ĖDŲ SISTEMOSE  
C.25.  AEROBIN Ė MINERALIZACIJA PAVIRŠINIAME VANDE ­
NYJE. BIOLOGINIO SKAIDYMO BANDYMO MODELIAVIMAS
 
C.26.  LEMNA  SPP. AUGIMO INHIBAVIMO BANDYMAS  
▼M4 
C.27.  TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOS Ė­
DOSE IR VANDENYJE, NAUDOJANT NUOS ĖDAS SU 
ĮTERPTA BANDOM ĄJA CHEMINE MEDŽIAGA  
C.28.  TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOS Ė­
DOSE IR VANDENYJE, NAUDOJANT VANDEN Į SU 
ĮTERPTA BANDOM ĄJA CHEMINE MEDŽIAGA  
C.29.  LENGVAS BIOLOGINIS SKAIDUMAS. CO  2 SANDARIUOSE 
INDUOSE (VIRŠUTIN ĖS ERDVĖS TYRIMAS)  
C.30. BIOLOGINIS KAUPIMASIS DUGNO MAŽAŠER ĖSE 
KIRMĖLĖSE ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. ŪMUS TOKSIŠKUMAS ŽUVIMS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šio metodo tikslas – nustatyti medžiagos ūmų mirtiną toksiškum ą 
žuvims g ėlame vandenyje. Kad b ūtų galima pasirinkti tinkamiausi ą 
bandymo metod ą (stacionar ų, pusiau stacionar ų arba dinamin į), 
kuriuo vis ą bandymo laik ą būtų užtikrinta pakankamai pastovi 
bandomosios medžiagos koncentracija, pageidautina tur ėti kiek 
galima daugiau informacijos apie medžiagos tirpum ą vandenyje, 
garų slėgį, cheminį patvarum ą, disociacijos konstantas ir biologin į 
skaidumą. 
Planuojant bandym ą ir aiškinant jo rezultatus, tur ėtų būti atsižvelgta į 
papildom ą informacij ą (pvz., strukt ūrinė formulė, grynumo laipsnis, 
reikšming ų priemaiš ų prigimtis ir procentinis kiekis, pried ų buvimas 
ir jų kiekis, pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo)).  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Ūmus toksiškumas – stebimas neigiamas poveikis, sukeltas orga ­
nizme per trump ą medžiagos veikimo laik ą (paros). Šiame bandyme 
ūmus toksiškumas išreiškiamas vidutine mirtina koncentracija (LC  50 ) 
– medžiagos koncentracija vandenyje, nuo kurios per nepertraukiamo veikimo laikotarp į, kurį reikia nurodyti, ž ūsta 50 % bandomosios 
partijos žuv ų.
 
Kiekviena bandomosios medžiagos koncentracija nurodoma mase 
tūrio vienetui (mg/l). J ą dar galima išreikšti mase mas ės vienetui 
(mg/kg).  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Kaip priemon ė parodyti, kad laboratorin ėmis bandymo s ąlygomis 
bandomųjų rūšių gyvūnų reakcija labai nepakito, gali b ūti atliekamas 
bandymas su etalonine medžiaga.  
Šiam bandymui etalonin ės medžiagos n ėra apibrėžtos. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Galima atlikti ribin į bandym ą su 100 mg/l koncentracija, norint 
įrodyti, kad LC  50 yra didesn ė nei ši koncentracija.  
Žuvys 96 valandas veikiamos bandom ąja medžiaga, dedama į 
vandenį esant tam tikram koncentracijos ver čių intervalui. Gaišta ­
mumo duomenys užrašomi bent kas 24 valandas, ir, jei įmanoma, 
per kiekvien ą stebėjimo laiko atkarp ą apskaičiuojama koncentracija, 
nuo kurios ž ūsta 50 % žuv ų (LC  50 ). 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Kokybės kriterijai taikomi ir ribinio bandymo metodui, ir viso 
bandymo metodui.  
Gaištamumas kontroliniuose bandymuose bandymo pabaigoje neturi 
būti didesnis kaip 10 % (arba viena žuvis, jei naudojama mažiau kaip 
dešimt žuv ų). 
Ištirpusio deguonies koncentracija vis ą laiką turi būti didesnė kaip 
60 % oro prisotinimo vert ės. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Bandomosios medžiagos koncentracija vis ą bandymo laik ą laikoma 
80 % pradin ės koncentracijos vert ės ribose.  
Medžiagų, kurios lengvai tirpsta bandomojoje terp ėje ir kurių tirpalai 
patvarūs, t. y. kuriuose ištirpinta medžiaga žymiai negaruoja, 
nesuyra, nesihidrolizuoja arba neadsorbuojama, pradine koncentracija galima laikyti vardin ę medžiagos koncentracij ą. Turi būti pateikti 
įrodymai, kad koncentracijos buvo išlaikytos per vis ą bandym ą ir 
kad kokyb ės kriterijai buvo įvykdyti.
 
Medžiagų, kurios:  
i) mažai tirpsta bandomojoje terp ėje arba  
ii) gali sudaryti patvarias emulsijas arba dispersijas; arba  
iii) yra nepatvarios vandeniniuose tirpaluose;  
pradine koncentracija laikoma koncentracija, nustatyta tirpale (ar, jei 
techniškai tai ne įmanoma, išmatuota vandens t ūryje) bandymo 
pradžioje. Koncentracija nustatoma po to, kai nusistovi pusiausvyra, tačiau prieš įdedant bandom ąsias žuvis.
 
Visais šiais atvejais siekiant patvirtinti faktines veikimo koncentra ­
cijas arba kokyb ės kriterij ų vykdym ą, bandymo metu turi b ūti 
daromi tolesni matavimai.  
pH vertė neturi keistis daugiau kaip 1 pH vienetu.  
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Galima naudoti trij ų tipų metodiką: 
Bandymas stacionariomis s ąlygomis  
Toksiškumo bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka. (Tirpalai vis ą 
bandymą nekeičiami).  
Bandymas pusiau stacionariomis s ąlygomis  
Bandymas, kai bandomasis tirpalas neteka, ta čiau per ilgesn į laiko 
tarpą (pvz., kas 24 valandas) daromas reguliarus dozuojamasis 
bandomojo tirpalo atnaujinimas.  
Dinaminis bandymas  
Toksiškumo bandymas, kai vanduo bandymo kamerose atnaujinamas 
visą laiką, bandom ąją medžiag ą tiekiant su vandeniu, naudojamu 
bandomajai terpei atnaujinti.  
1.6.1.  Reagentai  
1.6.1.1.  Bandom ųįų medžiagų tirpalai  
Pradiniai reikiamos koncentracijos tirpalai ruošiami ištirpinant 
medžiagą dejonizuotame vandenyje arba vandenyje pagal 1.6.1.2.  
Pasirinktos bandymo koncentracijos tirpalai ruošiami skiedžiant 
pradinį tirpalą. Jei bandomos didel ės koncentracijos, medžiaga gali 
būti tiesiogiai ištirpinta skiedimo vandenyje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Paprastai medžiagos turi b ūti bandomos tik iki tirpumo ribos. Norint 
užtikrinti, kad kai kurios medžiagos (pvz., vandenyje mažai tirpios 
medžiagos, medžiagos, kuri ų didelis P  ow , arba medžiagos, kurios 
sudaro patvari ą dispersij ą, o ne tikr ąjį tirpalą vandenyje) pasiekt ų 
didžiausią tirpią/pastovią koncentracij ą, galima atlikti bandym ą naudo­
jant koncentracij ą, didesnę už medžiagos tirpumo rib ą. Tačiau svarbu, 
kad tokia koncentracija kitais atžvilgiais nesutrikdyt ų bandymo 
sistemos (pvz., vandens paviršiuje nesusidaryt ų bandomosios 
medžiagos pl ėvelė, kuri neleist ų į vandenį patekti deguoniui, ir t. t.).  
Ruošiant vandenyje mažai tirpi ų medžiag ų pradinius tirpalus arba 
norint pagerinti ši ų medžiag ų dispergavim ą bandomojoje terp ėje, 
kaip pagalbin ę priemon ę galima naudoti dispergavim ą ultragarsu, 
organinius tirpiklius, emulsiklius arba dispergentus. Kai naudojamos 
tokios pagalbin ės medžiagos, visuose bandom ųjų koncentracij ų tirpa­
luose turi b ūti toks pat pagalbin ės medžiagos kiekis, ir papildoma 
kontrolinė žuvis turi b ūti veikiama pagalbine medžiaga, kurios 
koncentracija tokia pat, kaip ir bandym ų serijoje. Toki ų pagalbini ų 
medžiagų koncentracija turi b ūti kiek įmanoma mažesn ė ir jokiu 
būdu neturi b ūti didesnė kaip 100 mg/l bandomojoje terp ėje. 
Bandymas turi b ūti atliekamas nereguliuojant pH vert ės. Jei yra 
įrodymų apie žym ų pH vert ės kitimą, patartina bandym ą kartoti 
reguliuojant pH vert ę, ir bandymo rezultatus pateikti ataskaitoje. 
Tokiu atveju pradinio tirpalo pH vert ė turi būti pakoreguota iki 
skiedimo vandens pH vert ės, jei nėra ypatingos priežasties to neda ­
ryti. Šiam tikslui geriausia naudoti HC1 ir NaOH. Šis pH regulia ­
vimas turi b ūti daromas taip, kad bandomosios medžiagos koncent ­
racija pradiniame tirpale žymiai nepasikeist ų. Jei reguliuojant pH 
įvyksta kokia nors chemin ė reakcija arba bandomoji medžiaga 
fiziškai iškrenta į nuosėdas, tai turi b ūti nurodyta ataskaitoje.  
1.6.1.2.  Laikymo ir skiedimo vanduo  
Galima naudoti geriam ąjį vandentiekio vanden į (neužteršt ą potencia­
liai kenksmingos koncentracijos chloru, sunkiaisiais metalais arba 
kitomis medžiagomis), geros kokyb ės gamtinį vandenį arba atkurt ąjį 
vandenį (žr. 1 pried ėlį). Geriausiai tinka vanduo, kurio bendrasis 
kietumas yra nuo 10 iki 250 mg/litre (skai čiuojant CaCO  3 ) ir kurio 
pH yra nuo 6,0 iki 8,5.  
1.6.2.  Aparat ūra 
Visa aparat ūra turi būti pagaminta iš chemiškai inertišk ų medžiag ų: 
— automatin ė skiedimo sistema (dinaminiam bandymui),  
— deguonies matuoklis,  
— įranga vandens kietumui nustatyti,  
— atitinkama termostatavimo aparat ūra, 
— pH-metras.  
1.6.3.  Bandomosios žuvys  
Žuvys turi b ūti sveikos ir netur ėti jokių matomų nenormalumo 
požymių. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Žuvų rūšį reikia rinktis remiantis praktiniais kriterijais, pvz., gali ­
mybė žuvis gauti ištisus metus ir prieži ūros paprastumas, patogumas 
bandyti, santykinis jautrumas chemin ėms medžiagoms bei kitais 
reikšmingais ekonominiais, biologiniais arba ekologiniais faktoriais. Be to, renkantis žuv ų rūšis, reikia atkreipti d ėmesį į gautų duomenų 
palyginamumo poreik į ir esamą tarptautin į derinimą (1 nuoroda).
 
Žuvų, kurias rekomenduojama naudoti šiame bandyme, s ąrašas 
pateiktas 2 pried ėlyje; tinkamiausios r ūšys yra zebrin ė danija ir 
vaivorykštinis up ėtakis.  
1.6.3.1.  Laikymas  
Pageidautina, kad bandomosios žuvys b ūtų iš vienos partijos ir pana ­ 
šaus ilgio bei amžiaus. Žuvys turi b ūti laikomos bent 12 par ų 
tokiomis s ąlygomis:  
įkrova:  
atitinkanti sistem ą (su recirkuliavimu arba su pratek ėjimu) ir žuv ų 
rūšį, 
vanduo:  
žr. 1.6.1.2,  
šviesa:  
kasdienis apšvietimas nuo 12 iki 16 valand ų, 
ištirpusio deguonies koncentracija:  
bent 80 % oro prisotinimo vert ės, 
maitinimas:  
tris kartus per savait ę arba kas dien ą, nutraukiant maitinim ą prieš 24 
valandas iki bandymo pradžios.  
1.6.3.2.  Gaištamumas  
Po 48 valand ų prisitaikymo laikotarpio užrašomi gaištamumo 
duomenys ir taikomi tokie kriterijai:  
— populiacijos gaištamumas per septynias paras didesnis kaip 10 %:  
visa partija atmetama,  
— populiacijos gaištamumas 5–10 %:  
laikoma dar septynias paras.  
Jei gaištamumas nedid ėja, partija priimama, priešingu atveju turi 
būti atmesta,  
— populiacijos gaištamumas mažesnis kaip 5 %:  
partija priimama.  
1.6.4.  Adaptavimas  
Prieš naudojant visos žuvys bent septynias paras turi b ūti laikomos 
vandenyje, kurio kokyb ė ir temperat ūra atitinka bandymo s ąlygas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Bandymo proced ūra 
Norint gauti informacijos apie koncentracij ų, kurias reikia naudoti 
pagrindiniame bandyme interval ą, prieš galutin į bandymą gali būti 
atliekamas intervalo nustatymo bandymas.  
Atliekamas vienas kontrolinis bandymas be bandomosios medžiagos 
ir, jei tinka, bandym ų serija papildoma dar vienu kontroliniu 
bandymu, kuriame naudojama pagalbin ė medžiaga.  
Pagal tai, kokios yra bandomosios medžiagos fizikin ės ir chemin ės 
savybės, turi būti pasirinktas bandymas stacionariomis, pusiau stacio ­
nariomis s ąlygomis arba dinaminis bandymas, kad b ūtų tenkinami 
kokybės kriterijai.  
Žuvys veikiamos medžiaga, kaip aprašyta toliau:  
— trukm ė – 96 valandos,  
— gyvūnų skaičius – bent 7 vienai koncentracijai,  
— rezervuarai – tinkamo t ūrio, atsižvelgiant į rekomenduojam ą 
įkrovą, 
— įkrova – didžiausia rekomenduojama bandymo stacionariomis ir 
pusiau stacionariomis s ąlygomis įkrova – 1 g/l; sistemoms su 
pratekėjimu galima naudoti didesn ę įkrovą, 
— bandomoji koncentracija – bent penkios koncentracijos, kurios 
skiriasi pastoviu faktoriumi, ne didesniu kaip 2,2, bei kiek įmanoma apima gaištamumo interval ą nuo 0 iki 100 %,
 
— vanduo – žr. 1.6.1.2,  
— šviesa – kasdienis apšvietimas, kurio trukm ė nuo 12 iki 16 
valandų, 
— temperat ūra – tinkama r ūšiai (2 pried ėlis), tačiau konkre čiame 
bandyme palaikoma ± 1 °C tikslumu,  
— ištirpusio deguonies koncentracija – ne mažesn ė kaip 60 % oro 
prisotinimo vert ės, pasirinktos temperat ūros sąlygomis,  
— maitinimas – jokio.  
Žuvys tikrinamos po pirm ųjų 2–4 valand ų ir bent kas 24 valandas. 
Žuvis laikoma nugaišusia, jei lie čiant uodegos stiebel į (caudal 
peduncle ) nėra jokios reakcijos ir jei nesimato joki ų kvėpavimo 
judesių. Po apži ūros nugaišusios žuvys pašalinamos ir užrašomas 
nugaišusi ų žuvų skaičius. Užrašomi pastebimi nenormalumai (pvz., 
pusiausvyros netekimas, plaukimo manieros, kv ėpavimo funkcijos, 
pigmentacijos poky čiai ir t. t.).  
pH, ištirp ęs deguonis ir temperat ūra turi būti matuojami kas dien ą. 
Ribinis bandymas  
Taikant šiame bandymo metode aprašytas metodikas, galima atlikti 
ribinį bandymą su koncentracija 100 mg/litre, kai norima įrodyti, kad 
LC 50 yra didesn ė nei ši koncentracija.  
Jei medžiagos prigimtis yra tokia, kad 100 mg/litre koncentracijos 
bandymo vandenyje pasiekti negalima, ribinis bandymas turi b ūti 
atliekamas su koncentracija, lygia medžiagos tirpumui (arba su 
didžiausia koncentracija, kurioje susidaro patvari dispersija) naudo ­
jamoje terp ėje (dar žr. 1.6.1.1 punkt ą). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Ribinis bandymas turi b ūti atliekamas su 7–10 žuv ų, toks pat žuv ų 
skaičius turi b ūti naudojamas kontroliniame (-iuose) bandyme 
(-uose). (Pagal binominio skirstinio teorij ą, jei bandyme su 10 
žuvų gaištamumas yra nulinis, pasikliovimo tikimyb ė, kad LC  50 
yra didesn ė nei ribiniame bandyme naudota koncentracija, yra 
99,9 %. Gaištamumo nebuvimas naudojant 7, 8 arba 9 žuvis rodo 
bent 99 % pasikliovimo tikimyb ę, kad LC  50 yra didesn ė nei naudota 
koncentracija).  
Jei gaištamumo atvej ų pasitaiko, turi b ūti atliekamas visas tyrimas. 
Jei stebimi subletal ūs padariniai, tai turi b ūti užrašyta ataskaitoje.  
2. DUOMENYS IR VERTINIMAS  
Kiekvienam laikotarpiui, kurio rezultatai buvo užrašyti (24, 48, 72 ir 
96 valandos), logaritminiame tikimybiniame popieriuje braižykite gaištamumo, nustatyto kiekvienu rekomenduojamu veikimo laiko ­
tarpiu, procentin ės vertės priklausomyb ės nuo koncentracijos kreiv ę.
 
Kai įmanoma, kiekvienu matavimo laikotarpiu reikia įvertinti LC  50 ir 
pasikliovimo ribas (p = 0,05), tam taikant standartines metodikas; 
šios vertės turi būti apvalinamos iki vieno ar, daugiausia, iki dviej ų 
reikšmini ų skaitmen ų (apvalinimo iki dviej ų skaitmen ų pavyzdys: 
170 vietoj 173,5; 0,13 vietoj 0,127; 1,2 vietoj 1,21).  
Tais atvejais, kai atsako procentin ės vertės ir koncentracijos priklau ­
somybės kreivės polinkis yra per status, kad b ūtų galima skai čiuoti 
LC 50 , pakanka grafinio šios vert ės įverčio. 
Kai dviem gretimoms koncentracijoms, kuri ų santykis 2,2, gaunamos 
0 ir 100 % gaištamumo vert ės, šių dviejų verčių pakanka pažym ėti 
intervalui, į kurį patenka LC  50 . 
Jei pastebima, kad bandomosios medžiagos patvarumo arba homo ­
geniškumo užtikrinti ne įmanoma, tai turi b ūti nurodyta ataskaitoje, o 
aiškinti rezultatus reikia atsargiai.  
3. ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta, jei įmanoma, tokia informa ­
cija: 
— informacija apie bandom ąsias žuvis (mokslinis pavadinimas, 
veislė, tiekėjas, bet koks išankstinis apdorojimas, dydis ir kiek ­
vienai bandomajai koncentracijai naudot ų žuvų skaičius), 
— skiedimo vandens šaltinis ir pagrindin ės chemin ės savybės (pH, 
kietumas, temperat ūra), 
— mažai vandenyje tirpios medžiagos atveju, pradinio tirpalo ir 
bandomųjų tirpalų ruošimo metodas;  
— kiekvienos pagalbin ės medžiagos koncentracija,  
— naudot ų koncentracij ų sąrašas ir visa turima informacija apie 
bandomosios medžiagos patvarum ą naudotos koncentracijos 
bandomajame tirpale,  
— jei atliekama chemin ė analizė, taikyti metodai ir gauti rezultatai,  
— ribinio bandymo, jei jis buvo atliekamas, rezultatai,  
— taikytos bandymo metodikos pasirinkimo priežastys ir detal ės 
(pvz., stacionariomis s ąlygomis, pusiau stacionariomis s ąlygomis, 
dozavimo srautas, pratek ėjimo srautas, ar buvo naudojamas aera ­
vimas, žuv ų įkrovą ir t. t.),  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— bandymo įrangos aprašymas,  
— apšvietimo režimas,  
— ištirpusio deguonies koncentracija bandomuosiuose tirpaluose, j ų 
pH vertė ir temperat ūra kas 24 valandas,  
— įrodymas, kad kokyb ės kriterijai įvykdyti,  
— lentelė, kurioje pateiktas kiekvieno rekomenduojamo matavimo 
laikotarpio bendras gaištamumas kiekvienos koncentracijos atveju ir kontroliniame bandyme (ir kontroliniame bandyme su pagalbine medžiaga, jei reikia),
 
— atsako procentin ės vertės priklausomyb ės nuo koncentracijos 
kreivės grafikas bandymo pabaigoje,  
— jei įmanoma, kiekvieno rekomenduojamo matavimo laikotarpio 
LC 50 vertės (su 95 % pasikliovimo ribomis),  
— statistin ės metodikos, taikytos LC  50 vertėms nustatyti,  
— jei naudota etalonin ė medžiaga, gauti rezultatai,  
— didžiausia bandomoji koncentracija, kuri ą naudojant gaištamumas 
bandymo laikotarpiu yra nulinis,  
— mažiausia bandomoji koncentracija, bandymo laikotarpiu suke ­
lianti 100 % gaištamum ą. 
4. NUORODOS  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates.  
2) AFNOR-Determination of the acute toxicity of a substance to  
Brachydanio rerio  – Static and Flow Through methods – NFT 
90–303 June 1985.  
3) AFNOR- Determination of the acute toxicity of a substance to  
Salmo gairdneri  – Static and Flow – Through methods – NFT 
90–305 June 1985.  
4) ISO 7346/1, / 2 and/3 – Water Quality – Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish (Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan – Teleostei, Cypri ­
nidae). Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. 
Part 3: Flow-through method.
 
5) Eidgenossisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmet ­
hoden – Part II 1974.  
6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (11) und 1 
(15).  
7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata , 1980.  
9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The 
Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660–75–009, 1975.  
10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4–78–012, January 1978.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
12) Standard methods for the examination of water and waste ­
water, fourteen edition, APHA-AWW A-WPCF, 1975.  
13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxicityof a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.
 
14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grund ­
lagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemi ­
kalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
15) Litchfield, J. T.and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, tExp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
 
16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 
3, 793–821.  
18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3–32.
 
19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and 
J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65–84.
 
20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC  50 . US EPA.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
1 priedėlis 
Atkurtasis vanduo  
Skiedimui tinkamo vandens pavyzdys  
Visos chemin ės medžiagos turi b ūti analiziškai grynos.  
Vanduo turi b ūti geros kokyb ės distiliuotas vanduo arba dejonizuotas vanduo, 
kurio savitasis laidumas b ūtų mažesnis kaip 5 μScm  -1 . 
Vandens distiliavimo aparate neturi b ūti jokių varinių detalių. 
Pradiniai tirpalai  
CaCl  2 × 2H  2 O (kalcio chloridas, dihidratas): 
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro.  11,76 g  
MgSO  4 × 7H  2 0 (magnio sulfatas, heptahidratas): 
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro.  4,93 g  
NaHCO  3 (natrio hidrokarbonatas): 
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro.  2,59 g  
KCl (kalio chloridas): 
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro.  0,23 g  
Atkurtasis skiedimo vanduo  
Sumaišykite 25 ml kiekvieno iš ši ų keturių tirpalų ir praskieskite vandeniu iki 1 
litro.  
Aeruokite tol, kol ištirpusio deguonies koncentracija pasiekia oro prisotinimo 
vertę. 
pH turi b ūti 7,8 ± 0,2.  
Prireikus reguliuokite pH NaOH (natrio hidroksidu) arba HC1 (druskos r ūgštimi).  
Taip paruošt ą skiedimo vanden į padėkite į šalį 12 valand ų, jo nereikia daugiau 
aeruoti.  
Ca ir Mg jon ų koncentracij ų suma šiame tirpale yra lygi 2,5 mmol/litre. Ca ir Mg 
jonų santykis lygus 4:1, o Na ir K jon ų santykis lygus 10:1. Bendrasis šio tirpalo 
šarmingumas lygus 0,8 mmol/litre.  
Joks nukrypimas nuo skiedimo vandens ruošimo b ūdo neturi keisti vandens 
sudėties arba savybi ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
2 priedėlis 
Žuvų rūšys, rekomenduojamos naudoti bandymuose  
Rekomenduojamos r ūšys Rekomenduo ­
jamas bandymo 
temperatūros 
intervalas (°C)  Rekomenduo ­
jamas bandomojo 
gyvūno bendras 
ilgis (cm)  
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
Hamilton-Buchanan) Zebrin ė danija  nuo 20 iki 24  3,0 ± 0,5  
Pimephalespromelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafinesque) Juodoji dr ūtgalvė rainė nuo 20 iki 24  5,0 ± 2,5  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) Paprastasis karpis  nuo 20 iki 24  6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) 
Cyprinodontidae  (Tomminck and Schlege 
1850) Japonin ė medaka  nuo 20 iki 24  3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Paprastasis gupis  nuo 20 iki 24  3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidae)  (Rafinesque Linneaus 1758) Mels ­
važiaunis saulešeris  nuo 20 iki 24  5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmo ­
nidae)  (Walbaum 1988) Vaivorykštinis 
upėtakis  nuo 12 iki 17  6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linneaus 1758) Paprastoji mekn ė nuo 20 iki 24  6,0 ± 2,0  
Rinkimas  
Lentelėje nurodytas žuvis lengva auginti ir (arba) j ų galima gauti ištisus metus. 
Žuvis galima auginti ir veisti žuv ų fermose arba laboratorijoje, lig ų ir parazit ų 
kontrolės sąlygomis, kad bandomieji gyv ūnai būtų sveiki ir b ūtų žinoma j ų 
kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio krašt ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
3 priedėlis 
Koncentracijos pavyzdys. Gaištamumo dalis procentais  
LC 50 nustatymo naudojant logaritmin į tikimybin į popierių pavyzdys
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. DAPHNIA SP. ŪMAUS JUDRUMO SLOPINIMO 
(IMOBILIZAVIMO) BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis ūmaus judrumo slopinimo bandymas atitinka OECD TG 202 
(2004).  
1.1. ĮVADAS  
Šiame bandymo metode aprašomas ūmaus toksiškumo bandymas, 
skirtas įvertinti chemini ų medžiag ų poveikį dafnijoms. Kiek 
įmanoma buvo naudojami esami bandymo metodai (1)(2)(3).  
1.2. S ĄVOKOS  
Šiame bandymo metode taikomos šios s ąvokos:  
EC 50 – apskai čiuotoji koncentracija, kuriai esant 50 % dafnij ų 
nustoja jud ėti per nustatyt ą veikimo laikotarp į. Jei vartojama kita 
apibrėžtis, ji ir jos nuoroda turi b ūti pateiktos ataskaitoje.  
Judrumo slopinimas (imobilizavimas)  – imobilizuotais laikomi tie 
gyvūnai, kurie negali plaukti pra ėjus 15 s nuo švelnaus bandymo 
indo purtymo (net jei jie vis dar gali judinti čiulptukus).  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Jaunos dafnijos, kuri ų amžius bandymo pradžioje mažesnis kaip 24 
h, 48 h veikiamos įvairios koncentracijos bandom ąja medžiaga. 
Judrumo slopinimo duomenys užrašomi po 24 h bei 48 h ir lyginami su kontrolin ėmis vertėmis. Rezultatai analizuojami po 48 h siekiant 
apskaičiuoti EC
 50 (apibrėžtys pateiktos 1.2 skirsnyje). Papildomai 
galima nustatyti EC  50 po 24 h.  
1.4. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Turėtų būti žinomas bandomosios medžiagos tirpumas vandenyje ir 
garų slėgis, be to, reik ėtų turėti patikim ą analizės metodą medžiagos 
kiekiui bandomuosiuose tirpaluose nustatyti, kurio regeneravimo 
laipsnis ir ribin ė nustatymo vert ė būtų žinomi. Naudinga žinoti 
medžiagos strukt ūrinę formulę, grynum ą, patvarum ą vandenyje 
arba veikiant šviesai, P  ow ir lengvo biologinio skaidumo bandymo 
rezultatus (žr. C.4 metod ą). 
Pastaba. Nurodymai, kaip bandyti medžiagas, kuri ų fizikinės ir 
cheminės savybės apsunkina j ų bandymą, pateikti (4).  
1.5. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Siekiant įsitikinti, kad bandymo s ąlygos yra patikimos, galima atlikti 
bandymus etalonin ės medžiagos EC  50 nustatyti. Šiam tikslui reko ­
menduojama naudoti tarplaboratoriniuose bandymuose naudotas 
toksines medžiagas (1)(5) (  1 ). Bandym ą (-us) su etalonine medžiaga 
būtų gerai kartoti kas m ėnesį, bet ne re čiau kaip du kartus per metus.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Pagal šiuos tarplaboratorini ų bandym ų rezultatus ir ISO 6341 technin ę pataisą kalio 
dichromato (K  2 Cr 2 O 7 ) EC  50 vertė po 24 h yra nuo 0,6 mg/l iki 1,7 mg/l.
 1.6. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Bandymas yra tinkamas, jei laikomasi ši ų kriterijų: 
— kontroliniuose ėminiuose, įskaitant ėminius, turin čius tirpinimo 
priemonę, imobilizuota ne daugiau kaip 10 % dafnij ų, 
— pasibaigus bandymui, ištirpusio deguonies koncentracija kontro ­
liniuose ir bandymo induose tur ėtų būti ≥ 3 mg/l.  
Pastaba. Kalbant apie pirm ą kriterijų, judrumo slopinimas arba kiti 
ligos arba įtampos požymiai, pvz., spalvos kitimas, ne įprastas 
elgesys, pvz., iškilimas į vandens pavirši ų, turėtų pasireikšti ne 
daugiau kaip 10 % kontrolini ų dafnijų. 
1.7. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.7.1.  Aparat ūra 
Bandymo indai ir kiti prietaisai, kurie lie čiasi su bandomaisiais tirpa ­
lais, turi b ūti pagaminti vien tik iš stiklo arba kitos chemiškai iner ­
tiškos medžiagos. Bandymui paprastai naudojami stikliniai m ėgintu­
vėliai arba chemin ės stiklinės; prieš kiekvien ą naudojim ą jos turėtų 
būti plaunamos taikant įprastas laboratorijos proced ūras. Bandymo 
indai nesandariai uždaromi, kad b ūtų sumažinti vandens nuostoliai 
dėl garavimo ir dulk ės nepatekt ų į tirpalus. Lakiosios medžiagos 
turėtų būti bandomos visiškai užpildytuose uždarytuose induose, 
kurie būtų pakankamai dideli, kad deguonies koncentracija nepa ­
siektų ribinių arba per maž ų verčių (žr. 1.6 skirsn į ir 1.8.3 skirsnio 
pirmą pastraipą). 
Be to, naudojama kai kuri arba visa toliau išvardyta įranga: deguonies 
matuoklis (su mikroelektrodu arba kitokiu įtaisu, tinkamu ištirpusiam 
deguoniui mažo t ūrio ėminiuose matuoti); pH-metras; tinkamas įtaisas 
temperatūrai reguliuoti; įranga bendrajai organinei angliai (TOC) 
nustatyti; įranga cheminiam deguonies suvartojimui (COD) nustatyti; 
įranga vandens kietumui nustatyti ir t. t.  
1.7.2.  Bandomasis organizmas  
Daphnia magna  Straus yra labiausiai bandymui tinkama r ūšis, nors 
leidžiama naudoti ir kitas tinkamas  Daphnia  rūšis (pvz.,  Daphnia 
pulex ). Pradedant bandym ą, gyvūnai turi b ūti jaunesni kaip 24 h 
amžiaus ir, siekiant sumažinti kintamum ą, labai rekomenduojama 
nenaudoti pirmosios dafnij ų palikuoni ų vados. Jos tur ėtų būti gautos 
iš sveikos pradin ės kultūros (t. y. nerodan čios įtampos požymi ų, 
pvz., didelio gaištamumo, vyriškos lyties atstov ų ir kiaušin ėlių 
(ephippia ) buvimo, pirmosios vados v ėlavimo, gyv ūnų spalvos pasi ­
keitimo ir t. t.). Vis ų konkrečiam bandymui naudojam ų organizm ų 
kultūra turėtų būti gauta iš tos pa čios pradin ės dafnijų kultūros. 
Pradinės kultūros gyvūnus reikėtų laikyti tokiomis s ąlygomis (šviesa, 
temperatūra, terpė), kurios b ūtų panašios į bandymo s ąlygas. Jei 
bandymui reikalinga terp ė skiriasi nuo įprastos dafnij ų kultūros 
terpės, būtų gerai numatyti dafnij ų aklimatizavimo laikotarp į. Todėl 
veislei naudojamos dafnijos bent 48 h iki bandymo pradžios 
laikomos skiedimo vandenyje esant bandymo temperat ūrai. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Laikymo ir skiedimo vanduo  
Laikymo ir skiedimo vanduo gali b ūti gamtinis vanduo (paviršinis 
arba gruntinis vanduo), atkurtasis arba vandentiekio vanduo, iš kurio pašalinamas chloras, jei dafnijos jame išgyvena kult ūros veisimo, 
aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu, nerodydamos įtampos 
požymių. Bet koks vanduo, kuris atitinka 1 pried ėlyje išvardytas 
priimtino skiedimo vandens chemines charakteristikas, tinka bandymui. Jo kokyb ė turėtų būti stabili vis ą bandymo laik ą. Atkur­
tasis vanduo gali b ūti gaminamas į dejonizuot ą arba distiliuot ą 
vandenį dedant tam tikrus pripažinto analizinio grynumo reagent ų 
kiekius. Atkurtojo vandens pavyzdžiai pateikti (1) (6) ir 2 pried ėlyje. 
Būtina atkreipti d ėmesį, kad tiriant metal ų turinčias medžiagas, reikia 
vengti naudoti terpes, turin čias žinomus chelantus, tokias kaip 2 
priedėlyje nurodytas M4 ir M7 terpes. pH vert ė turi būti nuo 6 iki 
9. Daphnia magna  rekomenduojamas vandens kietumas – nuo 140 
iki 250 mg/l (skai čiuojant CaCO
 3 ), o kitoms  Daphnia  rūšims gali 
tikti mažesnis kietumas. Prieš naudojant bandymui, skiedimo vanden į 
galima aeruoti, kad ištirpusio deguonies koncentracija pasiekt ų sotį. 
Jei naudojamas gamtinis vanduo, kokyb ės parametrus reik ėtų matuoti 
bent du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad šios charakteristikos 
galėjo labai pasikeisti (žr. pirmesn ę pastraipą ir 1 pried ėlį). Be to, 
reikėtų nustatyti sunki ųjų metalų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni) 
kiekį. Jei naudojamas vandentiekio vanduo, iš kurio pašalintas 
chloras, pageidautina kasdien atlikti chloro analiz ę. Jei skiedimo 
vandens šaltinis yra paviršinis arba gruntinis vanduo, reik ėtų matuoti 
savitąjį laidį ir bendrąją organinę anglį (TOC) arba chemin į deguo­
nies suvartojim ą (COD).  
1.7.4.  Bandomieji tirpalai  
Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai paprastai ruošiami 
skiedžiant pradin į tirpalą. Pradinius tirpalus geriau ruošti tirpinant 
bandomąją medžiag ą skiedimo vandenyje. Kiek įmanoma reikia 
vengti naudoti tirpiklius, emulsiklius arba dispergentus. Ta čiau 
kartais toki ų junginių gali prireikti tinkamos koncentracijos pradi ­
niam tirpalui ruošti. Nurodymai d ėl tinkamų tirpiklių, emulsikli ų ir 
dispergent ų pateikti (4). Bet kuriuo atveju bandomosios medžiagos 
koncentracija bandomuosiuose tirpaluose neturi b ūti didesn ė kaip 
tirpumo skiedimo vandenyje ribin ė vertė. 
Bandymas tur ėtų būti atliekamas nereguliuojant pH. Jei pH vert ė yra 
ne 6–9 intervale, gali b ūti atliekamas antras bandymas, pradinio 
tirpalo pH nustatant pagal skiedimo vandens pH vert ę, buvusią iki 
bandomosios medžiagos prid ėjimo. pH reguliuojamas taip, kad 
pradinio tirpalo koncentracija labai nesikeist ų ir neprad ėtų vykti 
kokia nors chemin ė reakcija arba nesusidaryt ų bandomosios 
medžiagos nuos ėdos. Labiausiai tinka HC1 ir NaOH.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. PROCED ŪRA 
1.8.1.  Veikimo s ąlygos  
1.8.1.1.  Bandomosios ir kontrolin ės grupės 
Į bandymo indus įpilami reikalingi skiedimo vandens ir bandomosios 
medžiagos t ūriai. Oro/vandens t ūrio santykis inde turi b ūti vienodas 
bandomosioms ir kontrolin ėms grupėms. Tuomet į bandymo indus 
dedamos dafnijos. Kiekvienai bandomajai koncentracijai ir kiek ­
vienam kontroliniam ėminiui reikia naudoti bent 20 gyv ūnų, kuriuos 
geriau būtų padalyti į keturias grupes po penkis gyv ūnus. Kiek ­
vienam gyv ūnui turėtų tekti bent 2 ml bandomojo tirpalo (t. y. 10 
ml tūris penkioms dafnijoms bandymo inde). Bandym ą galima atlikti 
taikant pusiau statin į atnaujinim ą arba pratek ėjimo sistem ą, kai 
bandomosios medžiagos koncentracija n ėra pastovi.  
Be tirpalų grupės su bandom ąja medžiaga bandym ų turi būti atlie­
kamas vienos kontrolin ės skiedimo vandens ėminių grupės bandymas 
ir prireikus vienos kontrolin ės ėminių grupės su tirpinimo medžiaga 
bandymas.  
1.8.1.2.  Bandomosios koncentracijos vert ės 
Jei nėra informacijos apie bandomosios medžiagos toksiškum ą, 
galima atlikti intervalo nustatymo bandym ą galutinio bandomosios 
koncentracijos intervalo vert ėms nustatyti. Šiuo tikslu dafnijos 
veikiamos bandomosios medžiagos tirpalais, kuri ų koncentracijos 
vertės labai skiriasi. Penkios dafnijos veikiamos kiekvienos koncent ­
racijos tirpalu 48 h arba mažiau, kartotiniai ėminiai neb ūtini. 
Veikimo laikotarp į galima sutrumpinti (pvz., 24 h arba mažiau), jei 
intervalo nustatymo bandymui tinkamus duomenis galima gauti per 
trumpesnį laiką. 
Turėtų būti naudojamos bent penkios koncentracijos vert ės. Jos turi 
sudaryti geometrin ę progresij ą, kurios vardiklis geriausiu atveju netu ­
rėtų būti didesnis kaip 2,2. Jei naudojama mažiau koncentracijos 
verčių, tai būtina pagr įsti. Pageidautina, kad didžiausia bandomoji 
koncentracija slopint ų judrumą 100 %, o mažiausia bandomoji 
koncentracija nedaryt ų pastebimo poveikio.  
1.8.1.3.  Inkubavimo s ąlygos  
Temperat ūra turi b ūti 18 °C–22 °C ir atliekant kiekvien ą atskirą 
bandymą ji neturi nukrypti daugiau kaip ± 1 °C. Rekomenduojamas 
16 h šviesos ir 8 h tamsos ciklas. Be to, priimtina visiška tamsa, 
ypač jei bandomosios medžiagos yra nestabilios veikiant šviesai.  
Atliekant bandym ą indų turinys neaeruojamas. pH vert ė nereguliuo ­
jama visą bandymą. Atliekant bandym ą dafnijos pašaro negauna.  
1.8.1.4.  Trukm ė 
Bandymo trukm ė 48 h.  
1.8.2.  Steb ėjimai  
Kiekvienas bandymo indas turi b ūti tikrinamas po 24 h ir 48 h nuo 
bandymo pradžios, siekiant nustatyti, ar yra nejudan čių dafnijų 
(apibrėžtys pateiktos 1.2 skirsnyje). Be judrumo slopinimo duomen ų 
ataskaitoje turi b ūti pateikti duomenys apie bet kok į neįprastą elgesį 
arba išvaizd ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Analiziniai matavimai  
Bandymo pradžioje ir pabaigoje matuojama ištirpusio deguonies 
koncentracija ir pH vert ė kontrolinio (-i ų) ėminio (-ių) ir didžiausios 
bandomosios medžiagos koncentracijos induose. Kontrolini ų ėminių 
ištirpusio deguonies koncentracija turi atitikti bandymo tinkamumo 
kriterijų (žr. 1.6 skirsn į). pH vert ė bet kuriame iš bandymo ind ų 
paprastai netur ėtų keistis daugiau kaip 1,5 vieneto. Paprastai tempe ­
ratūra matuojama kontrolini ų ėminių induose arba aplinkos oro 
temperatūra ir būtų gerai, jei ji b ūtų užrašoma nepertraukiamai vis ą 
bandymą arba bent bandymo pradžioje ir pabaigoje.  
Bandomosios medžiagos koncentracija tur ėtų būti matuojama 
bandymo pradžioje ir pabaigoje bent tuose induose, kuriuose bando ­
moji koncentracija yra mažiausia ir didžiausia (4). Rekomenduojama rezultatus pagr įsti matuojamomis koncentracijos vert ėmis. Tačiau jei 
yra duomen ų, kurie leist ų įrodyti, kad vis ą bandymą bandomosios 
medžiagos koncentracija nenukrypo daugiau kaip ± 20 % nuo vardinės arba išmatuotos pradin ės koncentracijos vert ės, rezultatai 
gali būti grindžiami vardin ėmis arba išmatuotomis pradin ėmis 
vertėmis.
 
1.9. RIBINIS BANDYMAS  
Taikant šiame bandymo metode aprašytas proced ūras, galima atlikti 
ribinį bandymą su bandomosios medžiagos koncentracija 100 mg/l 
arba koncentracija iki ribinio tirpumo vert ės (iš šių dviejų pasiren­
kant mažesn ę), jei norima įrodyti, kad EC  50 yra didesn ė už šią 
koncentracij ą. Ribinis bandymas turi b ūti atliekamas su 20 dafnij ų 
(geriausia, kad jos b ūtų suskirstytos į keturias grupes po penkias 
dafnijas), tas pats dafnij ų skaičius turi b ūti naudojamas kontroliniam 
(-iams) bandymui (-ams). Jei vyksta koks nors judrumo slopinimas, turi būti atliekamas visas tyrimas. Turi b ūti užrašytas kiekvienas 
neįprasto elgesio atvejis.
 
2. DUOMENYS  
Duomenys turi b ūti apibendrinti lentel ėse, nurodant kiekvienai apdo ­
rotai ir kontrolinei grupei naudot ų dafnijų skaičių, judrumo slopinim ą 
kiekvieno steb ėjimo metu. Braižomas po 24 h ir 48 h nejudan čių 
dafnijų procentin ės dalies kaip bandomosios koncentracijos funkcijos 
grafikas. Duomenys analizuojami taikant atitinkamus statistinius metodus (pvz., probit ų analizę ir t. t.) kreivi ų krypties koeficientams 
ir EC
 50 vertėms apskai čiuoti, esant 95 % pasikliovimo riboms (p = 
0,05) (7) (8).  
Jei gautiems duomenims standartiniai EC  50 apskaičiavimo metodai 
netinka, turi b ūti naudojama didžiausia koncentracija, kuri dar nesu ­
kelia judrumo slopinimo, ir mažiausia koncentracija, sukelianti 100 % judrumo slopinim ą, apytikrei EC
 50 vertei gauti (ja laikomas 
šių dviejų koncentracijos ver čių geometrinis vidurkis).  
3. ATASKAITOS PATEIKIMAS  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti ši informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir atitinkamos fizikin ės ir chemin ės savybės, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— chemin ės medžiagos identifikavimo duomenys, įskaitant 
grynumą. 
Bandomieji gyv ūnai: 
— Daphnia  šaltinis ir r ūšis, tiekėjas (jei žinomas) ir naudotos 
kultūros auginimo s ąlygos (įskaitant pašaro šaltin į, rūšį ir kiekį, 
šėrimo dažnum ą). 
Bandymo s ąlygos:  
— bandymo ind ų aprašymas: ind ų tipas, tirpalo t ūris, dafnij ų skai­ 
čius viename bandymo inde, bandymo ind ų (kartotini ų) skaičius 
vienai koncentracijai,  
— pradinio ir bandomojo tirpal ų ruošimo metodai, įskaitant kokio 
nors tirpiklio arba dispergento naudojim ą, naudotos koncentra ­
cijos vert ės, 
— duomenys apie skiedimo vanden į: šaltinis ir vandens kokyb ės 
charakteristikos (pH, kietumas, Ca/Mg santykis, Na/K santykis, šarmingumas, savitasis laidis ir t. t.); atkurtojo vandens sud ėtis, 
jei naudojamas,
 
— inkubavimo s ąlygos: temperat ūra, šviesos intensyvumas ir perio ­
diškumas, ištirpusio deguonies kiekis, pH ir t. t.  
Rezultatai:  
— kiekvieno steb ėjimo metu imobilizuot ų dafnijų arba dafnij ų, 
kurioms pasireišk ė kitoks neigiamas poveikis ( įskaitant ne įprastą 
elgesį), skaičius ir procentin ė dalis kontroliniuose ėminiuose ir 
kiekvienoje apdorotoje grup ėje, taip pat stebimo poveikio tipo 
aprašymas,  
— bandymo su etalonine medžiaga rezultatai ir data, jei yra,  
— vardin ės bandomosios koncentracijos vert ės ir visų analizių 
bandomosios medžiagos koncentracijai bandymo induose nusta ­
tyti rezultatai; be to, ataskaitoje turi b ūti pateiktas metodo rege ­
neravimo laipsnis ir ribin ė nustatymo vert ė, 
— visi bandymo metu atlikti fizikiniai ir cheminiai temperat ūros, pH 
ir ištirpusio deguonies matavimai,  
— judrumo slopinimo EC  50 po 48 h, nurodant pasikliovimo inter ­
valus ir jiems apskai čiuoti naudotus regresijos modeli ų grafikus, 
dozės ir atsako kreivi ų krypties koeficientai ir j ų standartinis 
nuokrypis; statistin ės procedūros, taikytos EC  50 nustatyti; (be 
to, ataskaitoje turi b ūti nurodyti judrumo slopinimo duomenys, 
gauti po 24 h, jei jie buvo matuojami),  
— visų nukrypim ų nuo bandymo metodo paaiškinimas ir nuro ­
dymas, ar nukrypimas tur ėjo įtakos bandymo rezultatams.  
4. NUORODOS  
1) ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, Crus ­
tacea) – Acute toxicity test. Third edition,  
2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and SAFEty Publication. Series on Testing and Assessment. No. 23. Paris 2000.
 
5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study 
of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  
Daphnia . 
6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. 
Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society 
for Testing and Materials. p. 65–84  
8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3  rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
1 priedėlis 
KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMIN ĖS 
CHARAKTERISTIKOS  
Medžiaga  Koncentracija  
Kietosios dalel ės < 20 mg/l  
Bendroji organin ė anglis  < 2 mg/l  
Nejonizuotas amoniakas  < 1 μg/l 
Liekamasis chloras  < 10 μg/l 
Bendras organini ų fosforo pesticid ų kiekis  < 50 ng/l  
Bendras organini ų fosforo pesticid ų ir polichlorint ų bifenilų 
kiekis  < 50 ng/1  
Bendras organinio chloro kiekis  < 25 ng/1  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
2 priedėlis 
TINKAMO ATKURTOJO BANDYMO VANDENS PAVYZDŽIAI  
ISO bandymo vanduo (1)  
Pradiniai tirpalai (atskiros medžiagos)  Atkurtajam vandeniui paruošti 
į 1 l vandens įpilamas šis 
pradinių tirpalų tūris (*)  Medžiaga  Kiekis, įdedamas į 1 l 
vandens (*)  
Kalcio chloridas 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g  25 ml  
Magnio sulfatas 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g  25 ml  
Natrio hidrokarbonatas 
NaHCO  3 2,59 g  25 ml  
Kalio chloridas 
KCl 0,23 g  25 ml  
(*) Tinkamo grynumo vanduo, pvz., dejonizuotas, distiliuotas arba atvirkštinio osmoso 
būdu gautas vanduo, kurio savitasis laidis b ūtų ne didesnis kaip 10 μS.cm  -1 . 
Elendt M7 ir M4 terp ė 
Aklimatizavimas Elendt M7 ir M4 terp ėje 
Kai kurios laboratorijos tur ėjo sunkum ų, norėdamos dafnijas perkelti tiesiai į M4 
ir M7 terpes. Labiau pasisek ė jas aklimatizuojant laipsniškai, t. y. perkeliant 
dafnijas iš j ų terpės į 30 %  Elendt , paskui į 60 %  Elendt  ir pagaliau į 100 %  
Elendt . Gali reik ėti aklimatizuoti vis ą mėnesį. 
Ruošimas  
Mikroelementai  
Atskirų mikroelement ų pradiniai tirpalai (I) iš pradži ų ruošiami naudojant 
tinkamo grynumo vanden į, pvz., dejonizuot ą, distiliuot ą arba atvirkštinio osmoso 
būdu gautą vandenį. Iš šių skirting ų tirpalų (I) ruošiamas antras pradinis 
tirpalas (II), turintis visus mikroelementus (sud ėtinis tirpalas), t. y.:  
I pradinis (-iai) tirpalas (-ai) 
(atskira medžiaga)  Į vandenį įdėtas kiekis 
(mg/1)  Koncentracija (palyginti 
su M4 terpe) (kart ų) II pradiniam sud ėtiniam tirpalui paruošti į vandenį 
įpilamas šis I pradinio tirpalo t ūris (ml/1)  
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190  20 000  1,0  0,25  
MnCl  2 .4H  2 O 7 210  20 000  1,0  0,25  
LiCl 6 120  20 000  1,0  0,25  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
I pradinis (-iai) tirpalas (-ai) 
(atskira medžiaga)  Į vandenį įdėtas kiekis 
(mg/1)  Koncentracija (palyginti 
su M4 terpe) (kart ų) II pradiniam sud ėtiniam tirpalui paruošti į vandenį 
įpilamas šis I pradinio tirpalo t ūris (ml/1)  
M4 M7  
RbCl  1 420  20 000  1,0  0,25  
SrCl  2 .6H  2 O 3 040  20 000  1,0  0,25  
NaBr  320  20 000  1,0  0,25  
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230  20 000  1,0  0,25  
CuCl  2 .2H  2 O 335  20 000  1,0  0,25  
ZnCl  2 260 20 000  1,0  1,0  
CoCl  2 .6H  2 O 200  20 000  1,0  1,0  
KI 65  20 000  1,0  1,0  
Na 2 SeO  3 43,8 20 000  1,0  1,0  
NH  4 VO  3 11,5 20 000  1,0  1,0  
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000  2 000  —  —  
FeSO  4 .7H  2 O 1 991  2 000  —  —  
Na2EDTA ir FeSO  4 tirpalai ruošiami atskirai, supilami kartu ir iškart apdorojami autoklave.  
Taip gaunama:  
2 1 Fe-EDTA tirpalas  1 000  20,0  5,0  
M4 ir M7 terp ės 
M4 ir M7 terp ės, naudojant II pradin į tirpalą, makroelementus ir vitaminus, yra 
ruošiamos taip:  
Į vandenį įdėtas kiekis 
(mg/l)  Koncentracija (palyginti 
su M4 terpe) (kart ų) Terpei ruošti įpilto II pradinio tirpalo t ūris (ml/1)  
M4 M7  
II pradinis tirpalas (mikro ­
elementų mišinys)  20 50  50  
Pradiniai mitybini ų 
makroelement ų tirpalai 
(atskira medžiaga)  
CaCl  2 · 2H  2 0 293 800  1 000  1,0  1,0  
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600  2 000  0,5  0,5  
KCl 58 000  10 000  0,1  0,1  
NaHCO  3 64 800  1 000  1,0  1,0  
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000  5 000  0,2  0,2  
NaNO  3 2 740  10 000  0,1  0,1  
KH  2 PO 4 1 430  10 000  0,1  0,1  
K 2 HPO  4 1 840  10 000  0,1  0,1  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Į vandenį įdėtas kiekis 
(mg/l)  Koncentracija (palyginti 
su M4 terpe) (kart ų) Terpei ruošti įpilto II pradinio tirpalo t ūris (ml/1)  
M4 M7  
Vitaminų mišinio pradinis 
tirpalas  — 10 000  0,1  0,1  
Vitaminų mišinio pradinis tirpalas ruošiamas į 1 litrą vandens įdedant tok į 3 vitamin ų kiekį: 
Tiamino hidrochloridas  750  10 000  
Cianokobalaminas (B  12 ) 10  10 000  
Biotinas  7,5  10 000  
Vitaminų mišinio pradinis tirpalas laikomas užšaldytas mažomis alikvotin ėmis 
dalimis. Į terpę vitaminai dedami prieš pat naudojim ą. 
Pastaba. : Jei ruošiant galutin ę terpę norima išvengti drusk ų nuosėdų susida­
rymo, alikvotin ės pradinio tirpalo dalys pilamos į maždaug 500–800 
ml dejonizuoto vandens ir skiedžiama iki 1 litro.  
Pastaba. : Pirm ąją publikacij ą apie M4 terp ę galima rasti  Elendt, B.P. (1990) . 
Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructural approach to 
antennal damage in  Daphnia magna  Straus . Protoplasma, 154, p. 
25–33.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. GĖLO VANDENS DUMBLIAI IR CIANOBAKTERIJOS. 
AUGIMO INHIBAVIMO BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 201 (2006) (1).  
1.1. ĮVADAS  
Bandymo metodai yra periodiškai perži ūrimi ir atnaujinami, atsižvel ­
giant į mokslo pažang ą. C.2 bandymo metod ą reikėjo pataisyti, 
siekiant įtraukti papildomas r ūšis ir atitikti chemini ų medžiag ų pavo­
jaus įvertinimo reikalavimus bei klasifikavim ą. Pataisymas atliktas 
atsižvelgiant į didelį praktinį patyrimą, mokslo pažang ą toksiškumo 
dumbliams tyrimo srityje ir plat ų naudojim ą norminiuose teis ės 
aktuose, kurie atsirado po pradinio pri ėmimo.  
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Šiame bandymo metode vartojamos šios apibr ėžtys ir santrumpos:  
Biomasė: populiacij ą sudarančios gyvos medžiagos mas ė, išreikšta 
tam tikrame t ūrio vienete esan čios sausos medžiagos mase; pvz., 
mg dumbli ų/litre bandymo tirpalo. Paprastai „biomas ė“ yra apibr ė­ 
žiama kaip mas ė, bet šiame bandyme šis žodis yra vartojamas 
masei tūrio vienete apibr ėžti. Be to, šiame bandyme vietoj biomas ės 
paprastai matuojami pakaitiniai parametrai, pvz., l ąstelių skaičius, 
fluorescencija ir t. t., tod ėl terminas „biomas ė“ taikomas ir šiems 
pakaitiniams matams.  
Variacijos koeficientas : dimensijos neturintis parametro kintamumo 
matas, apibr ėžiamas kaip standartinio nuokrypio ir vidurkio santykis. 
Jį galima išreikšti procentais. Kartotini ų kontrolini ų ėminių kultūrų 
vidutinio savitojo augimo grei čio vidutinis variacijos koeficientas 
turėtų būti apskaičiuojamas taip:  
1. Apskai čiuojamas atitinkamo kartotinio ėminio vidutinio savitojo 
augimo grei čio % CV pagal kasdienius (atskir ų laikotarpi ų) 
augimo grei čius. 
2. Apskai čiuojama vis ų pagal 1 punkt ą apskaičiuotų verčių vidutinė 
vertė kasdieni ų (atskirų laikotarpi ų) kartotini ų kontrolini ų ėminių 
kultūrų vidutinio savitojo augimo grei čio vidutiniam variacijos 
koeficientui gauti.  
EC x : bandymo terp ėje ištirpusios bandomosios medžiagos koncentra ­
cija, kuriai esant bandymo organizmo augimo greitis per nustatyt ą 
veikimo laikotarp į (tiksliai nurodom ą, jei nukrypsta nuo visos arba 
normalios bandymo trukm ės) sumažėja x % (pvz., 50 %). EC vertei, 
gautai pagal augimo greit į arba pagal išeig ą, vienareikšmiškai žym ėti 
vartojami simboliai „E  r C“ ir „E  y C“. 
Auginimo terp ė: visiškai paruošta sintetin ė kultūros terpė, kurioje 
auga bandomosios medžiagos veikiami bandymo dumbliai. Bando ­
moji medžiaga paprastai tirpinama bandymo terp ėje. 
Augimo greitis  (vidutinis specifinis augimo greitis ): logaritminis 
biomasės didėjimas veikimo laikotarpiu.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC) : mažiausia 
bandymo terp ėje ištirpusios bandomosios medžiagos koncentracija, 
kuriai esant medžiagos poveikis augimo maž ėjimui per nustatyt ą 
veikimo laikotarp į yra statistiškai reikšmingas palyginti su kontroli ­
niais ėminiais (kai p < 0,05). Ta čiau esant visoms didesn ėms kaip 
LOEC bandymo koncentracijos vert ėms, kenksmingas poveikis turi 
būti lygus arba didesnis nei poveikis, kuris b ūtų esant LOEC. Kai 
negalima įvykdyti ši ų dviejų sąlygų, turi būti pateiktas išsamus paaiš ­
kinimas, kaip buvo pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC) vert ė. 
Nestebimo poveikio koncentracija (NOEC) : vos mažesn ė nei LOEC 
bandymo koncentracija.  
Atsako kintamasis : toksiškumui įvertinti naudojamas kintamasis, 
gautas pagal bet kur į nors iš matuojam ų parametr ų, skirtingais apskai ­ 
čiavimo metodais aprašan čių biomasę. Šiame metode atsako kinta ­
mieji yra augimo grei čiai ir išeiga, gauti tiesiogiai matuojant biomas ę 
arba kurį nors iš išvardyt ų pakaitini ų parametr ų. 
Savitasis augimo greitis : atsako kintamasis, apibr ėžiamas kaip 
stebimo parametro (šiame bandymo metode – biomas ės) natūraliųjų 
logaritmų skirtumo ir atitinkamo laikotarpio dalmuo.  
Išeiga : matuojamo kintamojo ver čių veikimo laikotarpio pabaigoje ir 
pradžioje skirtumas biomas ės padidėjimui bandymo metu išreikšti.  
1.3. BANDYMO TAIKOMUMAS  
Šį bandymo metod ą lengviausia taikyti vandenyje tirpioms medžia ­
goms, kurios bandymo s ąlygomis tikriausiai lieka vandenyje. Norint 
bandyti lakias, stipriai absorbuojamas, spalvotas, mažai tirpias medžiagas arba medžiagas, galin čias veikti bandymo terp ės mitybini ų 
arba mineralini ų medžiag ų įsisavinim ą, gali tekti atlikti tam tikrus 
procedūros pakeitimus (pvz., naudoti uždar ą sistemą, kondicionuoti 
bandymo indus). Rekomendacijos d ėl tam tikr ų tinkamų pakeitim ų 
pateiktos (2), (3) ir (4) nuorodose.
 
1.4. BANDYMO ESM Ė 
Šio bandymo tikslas – nustatyti medžiagos poveik į gėlo vandens 
mikrodumbli ų ir (arba) cianobakterij ų augimui. Pagal eksponent ės 
dėsnį augantys bandymo organizmai paprastai 72 h laikotarpiu 
veikiami bandom ąja medžiaga periodinio kult ūrų auginimo s ąlygomis. 
Nežiūrint į palyginti trump ą bandymo trukm ę, galima įvertinti poveik į 
kelioms kartoms.  
Sistemos atsakas yra dumbli ų kultūrų, veikiam ų įvairios koncentra ­
cijos bandom ąja medžiaga, serijos (bandymo vienet ų) augimo maž ė­
jimas. Atsakas įvertinamas kaip bandomosios medžiagos koncentra ­
cijos funkcija palyginti su kartotini ų kontrolini ų ėminių kultūrų, 
neveikiam ų bandomąja medžiaga, augimu. Siekiant visiškai išreikšti 
sistemos atsak ą į toksinius poveikius (optimal ųjį jautrį), kultūroms 
leidžiama pakankamai ilg ą laiką neribotai augti pagal eksponent ę 
pakankamos mitybos ir nuolatinio apšvietimo s ąlygomis, kad b ūtų 
galima išmatuoti savitojo augimo grei čio mažėjimą. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Augimas ir augimo inhibavimas yra kiekybiškai įvertinami matuojant 
dumblių biomasę kaip laiko funkcij ą. Dumbli ų biomasė yra išreiš ­
kiama sausos medžiagos mase t ūrio vienetui, pvz., mg dumbli ų/litre 
bandymo tirpalo. Ta čiau sausos medžiagos mas ę yra sunku išmatuoti, 
todėl taikomi pakaitiniai parametrai. Iš ši ų pakaitini ų parametr ų 
dažniausiai taikomas l ąstelių skaičius. Kitus pakaitinius parametrus 
sudaro ląstelių tūris, fluorescencija, optinis tankis ir t. t. Tur ėtų būti 
žinomas išmatuoto pakaitinio parametro perskai čiavimo į biomasę 
faktorius.  
Bandymo rezultatas – augimo inhibavimas, išreiškiamas kaip 
biomasės didėjimo veikimo laikotarpiu logaritmas (vidutinis savitasis 
augimo greitis). Pagal bandymo tirpal ų serijai gautus vidutinius savi ­
tuosius augimo grei čius apskai čiuojama apibr ėžtą augimo grei čio 
mažėjimą x % (pvz., 50 %) sukelianti koncentracija, kuri išreiškiama 
E r C x (pvz., E  r C 50 ). 
Taikant š į metodą pagal ES teis ės aktus, rezultatai tur ėtų būti skai­ 
čiuojami remiantis vidutiniu savituoju augimo grei čiu dėl 2.2 skirs ­
nyje nurodyt ų priežasčių. Šiame metode taikomas papildomas atsako 
kintamasis – išeiga, kuris gali b ūti reikalingas kai kuri ų valstybių 
nustatytiems specifiniams norminiams reikalavimams įvykdyti. Jis 
yra apibr ėžiamas kaip biomas ės veikimo laikotarpio pabaigoje ir 
pradžioje skirtumas. Pagal bandymo tirpal ų serijai gaut ą išeigą nusta­
toma apibr ėžtą išeigos maž ėjimą x % (pvz., 50 %) sukelianti koncent ­
racija, kuri išreiškiama E  y C x (pvz., E  y C 50 ). 
Be to, galima statistiškai nustatyti mažiausi ą stebimo poveikio 
koncentracij ą (LOEC) ir nestebimo poveikio koncentracij ą (NOEC).  
1.5. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Informacij ą apie bandom ąją medžiag ą, kuri gali b ūti naudinga 
bandymo s ąlygoms nustatyti, sudaro strukt ūrinė formulė, grynumas, 
patvarumas veikiant šviesai, patvarumas bandymo s ąlygomis, šviesos 
absorbcijos savyb ės, pKa ir virsmo tyrim ų rezultatai, įskaitant biolo ­
ginio skaidumo vandenyje rezultatus.  
Reikėtų žinoti bandomosios medžiagos tirpum ą vandenyje, pasiskirs ­
tymo oktanolio ir vandens mišinyje koeficient ą (P ow ) ir garų slėgį, be 
to, reikėtų turėti patvirtinto tinkamumo kiekybinio nustatymo 
bandymo tirpaluose metod ą, kurio atgavimo efektyvumas ir aptikimo 
riba būtų paskelbti.  
1.6. ETALONIN Ė MEDŽIAGA  
Kaip priemon ė bandymo proced ūrai patikrinti gali b ūti bandoma (-os) 
etaloninė (-ės) medžiaga (-os), pvz., 3,5-dichlorfenolis, naudotas tarp ­
tautiniame tarplaboratoriniame bandyme (4). Dar kaip etalonin ę 
medžiagą žaliesiems dumbliams galima naudoti kalio dichromat ą. 
Pageidautina etalonin ę medžiag ą bandyti bent du kartus per metus.  
1.7. BANDYMO TINKAMUMAS  
Turėtų būti vykdomi šie bandymo charakteristik ų kriterijai jo tinka ­
mumui patvirtinti:  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Per 72 h bandymo laikotarp į kontrolini ų ėminių kultūrų biomasė 
turėtų eksponentiškai padid ėti bent 16 kart ų. Šis skai čius atitinka 
savitąjį augimo greit į 0,92 para  –1 . Dažniausiai naudojam ų rūšių 
augimo greitis paprastai yra gerokai didesnis (žr. 1 pried ėlį). Šis 
kriterijus gali b ūti neįvykdytas, jei naudojamos r ūšys, kurios auga 
lėčiau nei išvardytos 1 pried ėlyje. Toki atveju bandymas tur ėtų 
būti pratęstas kontrolin ės kultūros kiekiui padidinti bent 16 
kartų, ir augimas vis ą bandymo laik ą turi vykti pagal eksponent ės 
dėsnį. Jei tik pasiekiamas mažiausias nustatytas dauginimosi 
faktorius 16, bandymo laikotarpis gali b ūti sutrumpintas ne 
mažiau kaip iki 48 h neribotam eksponentiniam augimui bandymo laikotarpiu užtikrinti.
 
— Atskir ų laikotarpi ų (0–1, 1–2 ir 2–3 par ų, 72 h bandym ų) kontro­
linių kultūrų savitųjų augimo grei čių vidutinis variacijos koefi ­
cientas (žr. 1.2 skirsnio punkt ą „variacijos koeficientas“) neturi 
viršyti 35 %. Atskir ų laikotarpi ų savitojo augimo grei čio skaičia­
vimas pateiktas 2.2.1 skirsnio antroje pastraipoje. Šis kriterijus taikomas vidutinei variacijos koeficiento vertei, apskai čiuotai 
kartotinių kontrolini ų ėminių kultūroms.
 
— Pseudokirchneriella subcapitata  ir Desmodesmus subspicatus  
kontrolini ų kultūrų vidutinių savitųjų augimo grei čių variacijos 
koeficientas vis ą bandymo laikotarp į neturi viršyti 7 %. Kit ų 
rečiau naudojam ų rūšių atveju ši vert ė neturėtų viršyti 10 %.  
1.8. METODO APRAŠYMAS  
1.8.1.  Aparat ūra 
Bandymo indai ir kita aparat ūrą, kuri lie čiasi su bandymo tirpalais, 
turėtų būti pagaminta vien tik iš stiklo arba kitos chemiškai inertin ės 
medžiagos. Indai tur ėtų būti gerai išplauti, siekiant užtikrinti, kad 
jokie organiniai arba neorganiniai teršalai negal ėtų veikti dumbli ų 
augimo arba bandymo tirpal ų sudėties. 
Paprastai kaip bandymo indai naudojamos stiklin ės kolbos, kuri ų 
matmenų pakaktų talpinti kult ūros kiekį, reikaling ą bandymo metu 
atliekamiems matavimams, ir užtikrinti pakankam ą CO  2 masės perne­ 
šimą iš atmosferos (žr. 1.8.9 skirsnio antr ąją pastraipą). Atkreipiamas 
dėmesys į tai, kad skys čio tūrio turi pakakti analiziniams nustatymams 
(žr. 1.8.11 skirsnio penkt ąją pastraipą). 
Be to, bus reikalinga visa arba tik kai kuri ši įranga:  
— Kultūros auginimo aparat ūra: rekomenduojama naudoti spint ą arba 
kamerą, kurioje temperat ūrą būtų galima išlaikyti ±2 °C tikslumu.  
— Apšvietimo matavimo prietaisai: svarbu pažym ėti, kad išmatuot ą 
vertę veiks šviesos intensyvumo matavimo metodas ir ypa č 
jutiklio (kolektoriaus) tipas. Pageidautina matavimus atlikti naudo ­
jant sferin į (4 π) jutiklį (kuris reaguoja į tiesiogin ę ir atspind ėtą 
šviesą, krintančią visais kampais virš ir žemiau matavimo plokš ­
tumos) arba 2 π jutiklį (kuris reaguoja į šviesą, krintančia visais 
kampais virš matavimo plokštumos).  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Aparat ūra dumbli ų biomasei nustatyti. L ąstelių skaičius, kuris yra 
dažniausiai taikomas dumbli ų biomasės pakaitinis parametras, gali 
būti nustatytas naudojant elektronin į dalelių skaitiklį, mikroskop ą 
su skaičiavimo kamera arba tek ėjimo citometr ą. Kiti biomas ės 
pakaitiniai parametrai gali b ūti matuojami naudojant tek ėjimo cito­
metrą, fluorimetr ą, spektrofotometr ą arba kolorimetr ą. Naudinga 
apskaičiuoti perskai čiavimo faktori ų, kuris susiet ų sausos 
medžiagos mas ę ir daleli ų skaičių. Siekiant užtikrinti tinkamus 
matavimus spektrofotometru, esant mažoms biomas ės koncentra ­
cijos vert ėms, gali tekti naudoti kiuvetes, kuri ų šviesos kelio ilgis 
būtų bent 4 cm.  
1.8.2.  Bandymo organizmai  
Galima naudoti kelias nepritvirtint ų mikrodumbli ų ir cianobakterij ų 
rūšis. Buvo patikrinta, kad šiame bandymo metode nurodytai 
bandymo proced ūrai tinka 1 pried ėlyje išvardyti štamai.  
Jei naudojamos kitos r ūšys, ataskaitoje tur ėtų būti nurodytas štamas ir 
(arba) kilm ė. Turi būti patvirtinta, kad pasirinkt ų bandymo dumbli ų 
eksponentinis augimas gali b ūti užtikrintas vis ą bandymo laikotarp į 
vyraujančiomis bandymo s ąlygomis.  
1.8.3.  Auginimo terp ė 
Rekomenduojamos dvi alternatyvios auginimo terp ės: OECD ir AAP 
terpės. Šių terpių sudėtis pateikta 2 pried ėlyje. Atkreipiamas d ėmesys, 
kad skiriasi abiej ų terpių pradinė pH vertė ir buferin ė talpa (pH did ė­
jimui reguliuoti). Tod ėl bandym ų rezultatai gali skirtis d ėl naudojamos 
bandymo terp ės, ypač kai bandomos jonin ės medžiagos.  
Auginimo terpes gali tekti tam tikrais atvejais modifikuoti, pvz., kai 
bandomi metalai ir chelantai arba bandymai atliekami, esant skirtin ­
goms pH vert ėms. Modifikuot ų terpių naudojimas turi b ūti detaliai 
aprašytas ir pagr įstas (3)(4).  
1.8.4.  Pradin ė biomasės koncentracija  
Visų bandymo kult ūrų pradinė biomasė turi būti vienoda ir gana 
maža, kad b ūtų įmanomas eksponentinis augimas vis ą inkubavimo 
laikotarpį ir nebūtų mitybini ų medžiag ų išeikvojimo rizikos. Pradin ė 
biomasė neturėtų viršyti 0,5 mg/l sausos medžiagos mas ės. Rekomen ­
duojamos šios pradin ės ląstelių koncentracijos vert ės: 
Pseudokirchneriella subcapitata:  5 × 10  3 – 10  4 ląstelių/ml 
Desmodesmus subspicatus  2–5 × 10  3 ląstelių/ml 
Navicula pelliculosa  10  4 ląstelių/ml 
Anabaena flos-aquae  10  4 ląstelių/ml 
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 – 10  5 ląstelių/ml 
1.8.5.  Bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės 
Tikėtinus poveikius atitinkantis koncentracijos intervalas gali b ūti 
nustatytas atliekant intervalo nustatymo bandymus. Galutiniam nusta ­
tomajam bandymui tur ėtų būti pasirinktos bent penkios koncentracijos 
vertės, išdėstytos pagal geometrin ę progresij ą, kurios vardiklis b ūtų ne 
didesnis kaip 3,2. Jei bandomosios medžiagos koncentracijos atsako kreivė yra guls čia, galima pagr įsti didesn į vardiklį. Koncentracijos 
verčių eilutė turi sudaryti interval ą, atitinkant į 5–75 % dumbli ų 
augimo grei čio mažėjimą.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Kartotiniai ir kontroliniai ėminiai  
Pagal bandymo plan ą turėtų būti trys kartotiniai kiekvienos bandymo 
koncentracijos ėminiai. Jei nereikia nustatyti NOEC, bandymo schema 
gali būti pakeista padidinant koncentracijos ver čių skaičių ir sumaži ­
nant kiekvienos bandymo koncentracijos kartotini ų ėminių skaičių. 
Kartotinių kontrolini ų ėminių skaičius turi b ūti ne mažesnis kaip 
trys ir geriausiu atveju tur ėtų būti du kartus didesnis nei kiekvienos 
bandymo koncentracijos kartotini ų ėminių skaičius. 
Galima paruošti atskir ą bandymo tirpal ų rinkinį bandomosios 
medžiagos koncentracijos vert ėms nustatyti analiz ės metodais (žr. 
1.8.11 skirsnio ketvirt ąją ir šeštąją pastraipas).  
Kai bandomajai medžiagai soliubilizuoti naudojamas tirpiklis, turi b ūti 
įtraukti papildomi kontroliniai ėminiai, turintys tirpiklio, kurio 
koncentracija atitikt ų naudojam ą bandymo kult ūroms.  
1.8.7.  Sėjimo kult ūros ruošimas  
Norint bandymo dumblius pritaikyti prie bandymo s ąlygų ir užtikrinti, 
kad į bandymo tirpalus s ėjamų dumblių augimo tarpsnis b ūtų ekspo­
nentinis, 2–4 dienos prieš bandymo pradži ą sėjimo kult ūra ruošiama 
bandymo terp ėje. Dumbli ų biomasė turėtų būti reguliuojama taip, kad 
iki pat bandymo pradžios s ėjimo kult ūros augimas b ūtų iš esmės 
eksponentinis. S ėjimo kult ūra turėtų būti inkubuojama bandymo 
kultūrų sąlygomis. Matuojamas s ėjimo kult ūros biomas ės didėjimas, 
kad būtų galima užtikrinti bandymo štamo normal ų augimo interval ą 
auginimo s ąlygomis. Dumbli ų auginimo proced ūros pavyzdys apra ­ 
šytas 3 pried ėlyje. Siekiant išvengti vienalaikio l ąstelių dalijimosi 
bandymo eigoje, gali b ūti reikalinga antra s ėjimo kult ūros daugini ­
mosi pakopa.  
1.8.8.  Bandymo tirpal ų ruošimas  
Turi būti vienoda vis ų bandymo tirpal ų auginimo terp ės koncentracija 
ir pradin ė bandymo dumbli ų biomasė. Pasirinktos koncentracijos 
bandymo tirpalai paprastai ruošiami maišant bandomosios medžiagos pradinį tirpalą ir auginimo terp ę bei sėjimo kult ūrą. Pradiniai tirpalai 
paprastai ruošiami tirpinant medžiag ą bandymo terp ėje.
 
Tirpikliai, pvz., acetonas,  tret-butilo alkoholis ir dimetilformamidas, 
gali būti naudojami kaip nešikliai vandenyje mažai tirpioms medžia ­
goms įdėti į bandymo terp ę (2)(3). Tirpiklio koncentracija netur ėtų 
viršyti 100 μl/l ir visų bandymo serijos kult ūrų (įskaitant kontrolines) 
tirpiklio koncentracija tur ėtų būti vienoda.  
1.8.9.  Inkubavimas  
Bandymo indai užkemšami orui nelaidžiais kamš čiais. Indai kratomi ir 
statomi į kultūros auginimo aparat ą. Būtina, kad bandymo metu 
dumbliai b ūtų suspenduoti CO  2 pernešimui palengvinti. Šiuo tikslu 
reikėtų nuolat maišyti arba purtyti. Kult ūrų temperat ūra turėtų būti 
21–24 °C intervale ir reguliuojama ±2 °C tikslumu. Jei naudojamos kitos nei 1 pried ėlyje nurodytos r ūšys, pvz., tropin ės rūšys, galb ūt 
labiau tikt ų aukštesn ė temperat ūra, jei būtų įmanoma užtikrinti tinka ­
mumo kriterijus. Rekomenduojama kolbas statyti atsitiktinai ir kasdien 
keisti jų vietą inkubatoriuje.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
Bandymo metu kontrolini ų ėminių terpės pH netur ėtų padidėti 
daugiau kaip 1,5 vieneto. Jei bandomi ir junginiai, kurie iš dalies 
jonizuojasi pH vert ėms esant arti bandymo terp ės pH, gali tekti riboti 
pH kitim ą atkuriamiems ir tiksliai apibr ėžtiems rezultatams gauti. 
Techniškai įmanoma pakeisti pH vert ę < 0,5 pH vieneto, ir tai galima 
pasiekti esant atitinkamam CO  2 masės pernešimo iš aplinkos į 
bandymo tirpal ą greičiui, pvz., didinant maišymo greit į. Kita galimyb ė 
– mažinti CO  2 suvartojim ą, mažinant pradin ę biomasę arba bandymo 
trukmę. 
Paviršius, ant kurio yra inkubuotos kult ūros, turėtų būti nuolat ir 
vienodai apšviestas liuminescencini ų lempų šviesa, pvz., šaltai balta 
arba dienos šviesos tipo šviesa. Dumbli ų ir cianobakterij ų štamų 
reikalavimai šviesai skiriasi. Šviesos intensyvumas tur ėtų būti pasi­
rinktas taip, kad atitikt ų naudojam ą bandymo organizm ą. Rekomen ­
duotoms žali ųjų dumblių rūšims pasirinktas šviesos intensyvumas 
bandymo tirpal ų lygyje tur ėtų atitikti 60–120 μE•m  –2 •s –1 intervalą, 
kai jis matuojamas esant fotosintezei optimaliam bang ų ilgių inter­
valui 400–700 nm ir naudojant atitinkam ą jutiklį. Kai kurios r ūšys, 
ypač Anabaena flos-aquae , gerai auga esant mažesniam šviesos inten ­
syvumui ir gali b ūti pažeistos esant dideliam intensyvumui. Tokioms 
rūšims turėtų būti pasirinktas vidutinis šviesos intensyvumas 40–60 
μE•m  –2 •s –1 . (Jei apšvietos matavimo prietaisai kalibruoti liuksais, 
šaltai baltos šviesos 4 440–8 880 liuks ų apšvieta maždaug atitinka 
60–120 μE•m  –2 •s –1 šviesos intensyvum ą). Šviesos intensyvumas virš 
inkubavimo vietos neturi kisti daugiau kaip ±15 % vidutinio šviesos 
intensyvumo.  
1.8.10.  Bandymo trukm ė 
Bandymo trukm ė paprastai yra 72 h. Ta čiau ji gali b ūti trumpesn ė 
arba ilgesn ė, jei vykdomi visi 1.7 skirsnio tinkamumo kriterijai.  
1.8.11.  Matavimai ir analiziniai nustatymai  
Dumblių biomasė kiekvienoje kolboje nustatoma bent kasdien vis ą 
bandymo laikotarp į. Jei matavimai atliekami naudojant mažus t ūrius, 
paimamus pipete iš bandymo tirpalo, papildyti šiuos t ūrius nereikia.  
Biomasės matavimai atliekami skai čiuojant l ąsteles mikroskopu 
rankiniu b ūdu arba elektroniniu daleli ų skaitikliu (l ąstelių skaičių ir 
(arba) biologin į tūrį). Galima taikyti kitus metodus, pvz., pratekam ąją 
citometrij ą, in vitro  arba  in vivo  chlorofilo fluorescencij ą (6)(7) arba 
optinio tankio matavim ą, jei galima įrodyti patenkinam ą koreliacij ą su 
biomase, atitinkan čia bandymo biomas ės interval ą. 
Tirpalų pH turi b ūti išmatuotas bandymo pradžioje ir pabaigoje.  
Jei yra analiz ės proced ūra naudojamo intervalo bandomosios 
medžiagos koncentracijai nustatyti, bandymo tirpalai tur ėtų būti anali­
zuojami pradinei koncentracijai patikrinti ir veikimo koncentracijos 
vertėms bandymo eigoje užtikrinti.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
Gali pakakti nustatyti maž ą ir didel ę bandomosios medžiagos 
koncentracij ą bandymo pradžioje ir pabaigoje ir koncentracij ą, kuri 
maždaug atitikt ų laukiam ą EC  50 vertę, jei tikėtina, kad bandymo 
laikotarpiu veikimo koncentracijos vert ės keisis mažiau kaip 20 % 
vardinės vertės. Rekomenduojama nustatyti visas bandymo koncent ­
racijos vertes bandymo pradžioje ir pabaigoje, jei manoma, kad 
koncentracija vargu ar išliks 80–120 % vardin ės vertės. Rekomenduo ­
jama veikimo laikotarpiu kas 24 h papildomai imti analizei laki ų, 
nepatvarių arba stipriai adsorbuojam ų medžiagų mėginius, kad galima 
būtų geriau apibr ėžti bandomosios medžiagos nuostol į. Bus reikalingi 
papildomi ši ų medžiag ų kartotiniai ėminiai. Visais atvejais bandomo ­
sios medžiagos koncentracij ą reikia nustatyti tik viename kiekvienos 
bandymo koncentracijos kartotinio ėminio inde (arba analizuoti 
sujungtų kartotini ų ėminių turinį). 
Bandymo terp ės, kurios specialiai ruošiamos veikimo koncentracijai 
nustatyti bandymo eigoje, tur ėtų būti apdorojamos kaip ir bandymo 
terpės, t. y. į jas turėtų būti sėjami dumbliai ir indai inkubuojami 
vienodomis s ąlygomis. Jei reikia nustatyti ištirpusios bandomosios 
medžiagos koncentracij ą, gali tekti dumblius atskirti nuo terp ės. 
Pageidautina atskirti centrifugavimu, esant mažai perkrovos j ėgos 
vertei, kurios pakakt ų dumbliams nusodinti.  
Jei yra duomen ų, kad visą bandymą bandomosios medžiagos koncent ­
racijos kitimas buvo patenkinamas ir ne didesnis kaip ±20 % vardin ės 
arba išmatuotos pradin ės koncentracijos vert ės, rezultat ų analizę 
galima atlikti pagal vardin ę arba išmatuot ą pradinę vertę. Jei 
nuokrypis nuo vardin ės arba išmatuotos pradin ės koncentracijos yra 
didesnis kaip ±20 %, rezultat ų analizė turėtų būti atliekama pagal 
veikimo laikotarpio geometrinio vidurkio koncentracij ą arba taikant 
modelius, aprašan čius bandomosios medžiagos koncentracijos maž ė­
jimą (3)(8).  
Dumblių augimo inhibavimo bandymas yra dinamiškesn ė bandymo 
sistema palyginti su daugeliu kit ų trumpalaiki ų toksiškumo vandens 
organizmams bandym ų. Dėl tos priežasties gali b ūti sunku apibr ėžti 
faktines veikimo koncentracijos vertes, ypa č adsorbuojam ų medžiagų, 
bandomų esant mažoms koncentracijos vert ėms. Tokiais atvejais 
medžiagos išnykimas iš tirpalo d ėl adsorbcijos ant dumbli ų, kurių 
biomasė didėja, nereiškia, kad ji pasišalino iš bandymo sistemos. 
Analizuojant bandymo rezultat ą, reikėtų patikrinti, ar d ėl bandomosios 
medžiagos koncentracijos maž ėjimo bandymo eigoje maž ėja augimo 
inhibavimas. Jei taip, galima nagrin ėti, kaip taikyti tinkam ą modelį, 
aprašantį bandomosios medžiagos koncentracijos maž ėjimą (8). Jei ne, 
rezultatų analizę galbūt tiktų pagrįsti pradin ėmis (vardin ėmis arba 
išmatuotomis) koncentracijos vert ėmis. 
1.8.12.  Kiti steb ėjimai  
Bandymo pabaigoje s ėjimo kult ūra turėtų būti apžiūrėta per mikro ­
skopą jos normaliai ir sveikai išvaizdai patikrinti ir visiems dumbli ų 
išvaizdos nukrypimams (kuriuos gali sukelti veikimas bandom ąja 
medžiaga) steb ėti. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Ribinis bandymas  
Kai kuriomis aplinkyb ėmis, pvz., kai pradinis bandymas rodo, kad 
bandomosios medžiagos toksinis poveikis nepasireiškia esant mažesnei kai 100 mg•l
 –1 arba tirpum ą bandymo terp ėje atitinkan čiai 
koncentracijai (kuri b ūtų mažesnė), galima atlikti ribin į bandym ą, 
kuriame b ūtų lyginami kontrolin ės grupės ir vienos apdorot ų ėminių 
grupės (100 mg•l  –1 arba tirpumo vertei lygi koncentracija) atsakai. 
Labai rekomenduojama, kad jis b ūtų patvirtintas analizuojant veikian ­ 
čios medžiagos koncentracij ą. Ribiniam bandymui taikomos visos 
anksčiau aprašytos bandymo s ąlygos ir tinkamumo kriterijai, išskyrus 
tai, kad b ūtų ne mažiau kaip šeši kartotiniai apdoroti ėminiai. Vidur ­
kiams palyginti kontrolini ų ir apdorot ų ėminių grupių atsako kinta ­
mieji gali b ūti analizuojami taikant statistin į kriterijų, pvz., Stjudento  t 
kriterijų. Jei dviej ų grupių dispersijos yra nelygios, analiz ė turėtų būti 
atliekama taikant  t kriterijų, pritaikyt ą nelygioms dispersijoms.  
1.8.14.  Metodo modifikacija, jei bandomos ryški ų spalvų medžiagos  
Apšvietimas (šviesos intensyvumas) tur ėtų būti didžiausias, koks gali 
būti šiame bandymo metode nustatytame diapazone: 120 μE m-2 s-1 
arba didesnis.  
Šviesos kelias tur ėtų būti sutrumpinamas sumažinant bandymo tirpal ų 
tūrį (5–25 ml).  
Dumblius reik ėtų pakankamai suaktyvinti (pavyzdžiui, lengvai pakra ­
tant kolb ą), kad jie b ūtų dažnai apšvie čiami stipriu šviesos šaltiniu 
kultūros paviršiuje.  
2. DUOMENYS  
2.1. AUGIMO KREIVI Ų GAVIMAS  
Biomasę bandymo induose galima išreikšti matuojam ų pakaitini ų 
parametrų vienetais (pvz., l ąstelių skaičiumi, fluorescencija).  
Augimo kreivi ų grafikams gauti į lenteles surašomos įvertintos 
bandymo ir kontrolini ų kultūrų biomasės koncentracijos vert ės, 
bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės ir matavimo laikas, 
skaičiuojamas bent sveikos valandos tikslumu. Šioje stadijoje gali 
būti naudingos logaritmini ų ir linijini ų parametr ų skalė, bet logarit ­
minės skalės yra privalomos ir paprastai jos geriau rodo augimo 
vaizdo kitimus bandymo laikotarpiu. Atkreipiamas d ėmesys į tai, 
kad logaritmin ėse koordinat ėse gauta eksponentinio augimo kreiv ę 
yra tiesė, kurios palinkimas (krypties koeficientas) žymi savit ąjį 
augimo greit į. 
Pagal grafikus tiriama, ar visa bandym ą kontrolin ės kultūros auga 
laukiamu grei čiu pagal eksponent ės dėsnį. Kritiškai tiriami visi 
duomenų taškai ir grafiko išvaizda, neapdoroti duomenys ir proce ­
dūros tikrinamos, norint rasti galimas klaidas. Ypa č tikrinami visi 
duomenų taškai, kurie atrodyt ų, kad nukrypo d ėl sistemingosios 
paklaidos. Jei akivaizd ų, kad galima identifikuoti ir (arba) laikyti 
labai tik ėtinomis proced ūros klaidas, konkretus duomen ų taškas 
žymimas kaip riktas ir ne įtraukiamas į vėliau atliekama statistin ę 
analizę. (Nulinė dumblių koncentracija viename iš dviej ų arba trij ų 
kartotinių ėminių indų gali rodyti, kad į indą nebuvo tinkamai pas ėta 
arba jis buvo blogai išplautas). Duomen ų taškų atmetimo kaip rikt ų 
priežastys turi b ūti aiškiai nurodytos bandym ų ataskaitoje. Priimamos 
priežastys yra tik (retos) proced ūros klaidos ir ne vien tik blogas 
preciziškumas. Statistin ės riktų identifikavimo proced ūros šio tipo 
problemai taikomos ribotai ir negali pakeisti ekspert ų įvertinimo. 
Riktus (pažym ėtus, kad jie yra tokie) geriau b ūtų palikti tarp duomen ų 
taškų, kurie v ėliau kokiu nors b ūdu pateikiami kaip grafiniai arba 
lentelių duomenys.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. ATSAKO KINTAMIEJI  
Bandymo tikslas – nustatyti bandomosios medžiagos poveik į dumblių 
augimui. Šiame bandymo metode aprašyti du atsako kintamieji, nes valstybės narės juos skirtingai vertina ir skiriasi norminiai reikala ­
vimai. Siekiant užtikrinti rezultat ų priimtinum ą visose valstyb ėse 
narėse, poveikis tur ėtų būti įvertintas taikant abu toliau aprašytus 
atsako kintamuosius a ir b.
 
a) Vidutinis savitasis augimo greitis: šis atsako kintamasis yra apskai ­ 
čiuojamas pagal biomas ės logaritmin į padidėjimą bandymo laiko ­
tarpiu, išreiškiam ą parai.  
b) Išeiga: šis atsako kintamasis yra biomas ės bandymo pabaigoje ir 
pradžioje skirtumas.  
Taikant š į metodą pagal ES teis ės aktus, rezultatai tur ėtų būti skai­ 
čiuojami remiantis vidutiniu savituoju augimo grei čiu dėl toliau nuro ­
dytų priežasčių. Reikėtų pažymėti, kad n ėra lygintinos toksiškumo 
vertės, apskaičiuotos taikant šiuos du kintamuosius, ir šis skirtumas 
turi būti suvoktas naudojant bandymo rezultatus. D ėl atitinkam ų 
metodų matematinio pagrindo, savitojo augimo grei čio vidurkiu 
pagrįstos EC  x vertės (E  r C x ), paprastai bus didesn ės nei išeiga pagr įsti 
rezultatai (E  y C x ), jei laikomasi šio bandymo metodo s ąlygų. Tai netu ­
rėtų būti interpretuojama kaip dviej ų atsako kintam ųjų jautrio skir ­
tumas, tiesiog vert ės skiriasi matematiškai. Vidutinio savitojo augimo 
greičio sąvoka pagr įsta bendr ąja dumbli ų eksponentinio augimo neri ­
bojamose kult ūrose schema, kuri ą taikant toksiškumas įvertinamas 
pagal poveik į augimo grei čiui, kuris nepriklauso nuo kontroliniams 
ėminiams gauto absoliutaus savitojo augimo grei čio lygio, koncentra ­
cijos ir atsako kreiv ės krypties koeficiento arba nuo bandymo 
trukmės. Priešingai, rezultatai, pagr įsti išeiga kaip atsako kintamuoju, 
priklauso nuo vis ų šių kitų kintamųjų. E y C x priklauso nuo kiekvie ­
name bandyme naudojam ų dumblių rūšių savitojo augimo grei čio ir 
nuo didžiausio savitojo augimo grei čio, kuris gali b ūti skirtingas 
dumblių rūšims ir netgi štamams. Šis atsako kintamasis netur ėtų 
būti taikomas lyginant dumbli ų rūšių arba net skirting ų štamų jautrį 
toksinėms medžiagoms. Nors toksiškumui įvertinti moksliniu poži ūriu 
būtų geriau taikyti vidutin į savitąjį augimo greit į, išeiga pagr įsti 
toksiškumo įverčiai irgi yra įtraukti į šį bandymo metod ą, siekiant 
atitikti kai kuri ų šalių galiojančių norminių teisės aktų reikalavimus.  
2.2.1.  Vidutinis augimo greitis  
Vidutinis savitasis augimo greitis per tam tikr ą laikotarp į yra apskai ­ 
čiuojamas kaip kiekvieno atskiro kontrolini ų ir apdorot ų ėminių indo 
biomasės logaritminis padid ėjimas pagal lygt į: 
μ iÄj ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i ðpara  – 1 Þ 
čia: 
μ i–j : – vidutinis savitasis augimo greitis per laik ą i – j; 
X i : – biomas ė laiku  i; 
X j : – biomas ė laiku  j. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Kiekvienai apdorot ų ir kontrolini ų ėminių grupei apskai čiuojama 
augimo grei čio vidutin ė vertė ir dispersijos įverčiai. 
Apskaičiuojamas vis ą bandymo trukm ę atitinkantis vidutinis savitasis 
augimo greitis (paprastai 0–3 paros), kaip pradin ę vertę naudojant 
pasėtos biomas ės pradinę vardinę vertę, bet ne matuojam ą pradinę 
vertę, nes šiuo b ūdu paprastai gaunamas didesnis preciziškumas. Jei 
biomasei matuoti naudojama įranga galima gana tiksliai nustatyti 
mažą sėjinio biomas ę (pvz., tek ėjimo citometras), galima naudoti 
išmatuotą pradinę biomasės koncentracij ą. Be to, įvertinamas augimo 
greitis atskirais laikotarpiais, apskai čiuojamas kaip kiekvienos 
bandymo dienos savitieji augimo grei čiai (0–1, 1–2 ir 2–3 paros) ir 
tiriama, ar kontrolini ų ėminių augimo greitis lieka pastovus (žr. tinka ­
mumo kriterijus, 1.7 skirsnis). Gerokai mažesnis savitasis augimo 
greitis pirm ąją parą palyginti su bendruoju vidutiniu savituoju augimo 
greičiu gali rodyti v ėlavimo tarpsnio buvim ą. Tuo tarpu kai kontro ­
linių kultūrų vėlavimo tarpsn į galima labai sumažinti ir praktiškai 
pašalinti tinkamai paskleidžiant iš anksto paruošt ą kultūrą, veikiam ų 
kultūrų vėlavimo tarpsnis gali rodyti atsigavim ą po pradinio toksinio 
streso arba sumaž ėjusį palyginti su pradiniu veikim ą dėl bandomosios 
medžiagos nuostoli ų (įskaitant sorbcij ą ant dumbli ų biomasės). Taigi 
galima įvertinti atskir ų laikotarpi ų augimo greit į, kad būtų galima 
įvertinti bandomosios medžiagos poveikius veikimo laikotarpiu. 
Dideli atskiriems laikotarpiams gaut ų augimo grei čių ir vidutinio 
augimo grei čio skirtumai rodo, kad yra nuokrypis nuo pastovaus 
eksponentinio augimo ir kad reikia atlikti nuodugn ų augimo kreivi ų 
tyrimą. 
Kiekvieno apdoroto kartotinio ėminio augimo grei čio mažėjimas 
procentais apskai čiuojamas pagal lygt į: 
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
čia: 
% I  r vidutinio savitojo augimo grei čio mažėjimas procentais;  
μ C kontrolinės grupės vidutinio savitojo augimo grei čio (μ) vidutinė 
vertė; 
μ T apdoroto kartotinio ėminio vidutinis savitasis augimo greitis.  
Kai bandymo tirpalams ruošti naudojami tirpikliai, inhibavimo 
procentinei daliai apskai čiuoti geriau b ūtų naudoti tirpiklio kontroli ­
nius ėminius, o ne kontrolinius ėminius be tirpikli ų. 
2.2.2.  Išeiga  
Išeiga apskai čiuojama kaip biomas ės bandymo pabaigoje ir pradin ės 
biomasės skirtumas kiekvienam atskiram kontrolini ų ir apdorot ų 
ėminių indui. Kiekvienai bandymo koncentracijai ir kontroliniam 
ėminiui apskai čiuojama išeigos vidutin ė vertė ir dispersijos įverčiai. 
Kiekvieno apdoroto kartotinio ėminio išeigos maž ėjimą procentais (% 
I y ) galima apskai čiuoti taip:  
%I y ¼ ðY C – Y  T Þ 
Y C Ü 100 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
čia: 
% I  y : išeigos maž ėjimas procentais;  
Y C : vidutin ė kontrolin ės grupės išeigos vert ė; 
Y T : apdoroto kartotinio ėminio išeigos vert ė. 
2.3. KONCENTRACIJOS IR ATSAKO SANTYKIO KREIV ĖS 
BRĖŽIMAS  
Braižomas ir nuodugniai tiriamas inhibavimo procentin ės vertės ir 
bandomosios medžiagos koncentracijos logaritmo grafikas, atmetant visus duomen ų taškus, kurie buvo pažym ėti kaip riktas per pirm ąjį 
tarpsnį. Iš akies arba taikant kompiuterin į interpoliavim ą per duomen ų 
taškus br ėžiama tolydi linija pradiniam koncentracijos ir atsako 
santykio vaizdui gauti, v ėliau taikomas detalesnis metodas, pageidau ­
tina taikyti kompiuterin į statistinį metodą. Atsižvelgiant į numatyt ą 
duomenų paskirtį, kokybę (preciziškum ą), duomen ų kiekį ir jų 
analizės priemoni ų buvimą, gali būti nuspręsta (ir kartais tinkamai 
pagrįsta) stabdyti duomen ų analizę šioje stadijoje ir tiesiog iš akies 
nubrėžtoje kreiv ėje rasti pagrindinius skai čius EC
 50 ir EC  10 (ir (arba) 
EC 20 ) (dar žr. skirsn į apie skatinamuosius poveikius). Pagr įstomis 
priežastimis netaikyti statistinio metodo gali b ūti: 
— Duomenys netinka kompiuteriniais metodais gauti rezultatus, kurie 
būtų patikimesni nei eskspert ų įvertinimu gauti rezultatai; tokiomis 
aplinkybėmis kai kuriomis kompiuterin ėmis programomis netgi 
nepasiseka gauti patikimo sprendinio (iteracijos gali nekonverguoti ir t. t.).
 
— Negalima tinkamai apdoroti skatinamo augimo atsak ų, taikant 
turimas kompiuterines programas (žr. toliau).  
2.4. STATISTIN ĖS PROCED ŪROS  
Tikslas – gauti kiekybin į koncentracijos ir atsako santyk į, taikant 
regresinę analizę. Galima taikyti svertin ę tiesinę regresiją, atlikus 
atsako duomen ų tiesinam ąjį transformavim ą, pvz., į probito, logito 
arba Weibullo  vienetus (9), bet geresn ės yra netiesin ės regresijos 
metodų procedūros, kurias taikant geriau apdorojami neišvengiami 
duomenų netolygumai ir nukrypimai nuo glodži ųjų skirstinių. Artėjant 
į nulinį arba visišk ą inhibavim ą, tokie netolygumai d ėl transforma ­
vimo gali padid ėti ir trukdyti analizei (9). Reik ėtų pažymėti, kad 
tipiniai analiz ės metodai, taikant probito, logito arba  Weibullo  trans­
formuotus dydžius, yra skirti dichotominiams (pvz., mirtingumas arba išlikimas) duomenims ir turi b ūti modifikuojami, norint juos pritaikyti 
augimo arba biomas ės duomenims. Specifin ės EC
 x verčių nustatymo 
pagal tolydžiuosius duomenis proced ūros yra pateiktos (10)(11) ir 
(12). Netiesin ės regresijos taikymas detaliau aprašytas 4 pried ėlyje. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Kiekvienam analizuojamam atsako kintamajam naudojamas koncent ­
racijos ir atsako santykis EC  x verčių taškiniams įverčiams apskai ­ 
čiuoti. Kai įmanoma, tur ėtų būti nustatyti kiekvieno įverčio 95 % 
pasikliautinieji r ėžiai. Atsako duomen ų atitiktis regresijos modeliui 
turėtų būti įvertinta grafiškai arba statistiškai. Regresin ė analizė turėtų 
būti atliekama naudojant atskirus kartotini ų ėminių atsakus, bet ne 
apdorotų ėminių grupių vidurkius. Ta čiau jei netiesin ę kreivę yra 
sunku arba nepavyksta pritaikyti d ėl per didel ės duomen ų sklaidos, 
problemą galima apeiti, atliekant grup ės vidutini ų verčių regresiją, 
kuri yra praktinis b ūdas sumažinti įtariamųjų riktų įtaką. Šio varianto 
taikymas tur ėtų būti nurodytas bandym ų ataskaitoje kaip nukrypimas 
nuo normalios proced ūros, nes pritaikant kreiv ę pagal atskirus karto ­
tinius ėminius nebuvo gautas tinkamas rezultatas.  
Be to, jei turimi regresijos modeliai (metodai) netinka duomenims, 
EC 50 įverčiai ir pasikliautinieji r ėžiai gali b ūti gauti taikant tiesin į 
interpoliavim ą ir savaiminio gerinimo metodus ( anglų k. bootstrap ­
ping) (13).  
Norint įvertinti LOEC, taigi ir NOEC, ir bandomosios medžiagos 
poveikį augimo grei čiui, yra b ūtina palyginti apdorot ų ėminių vidu­
tines vertes, taikant dispersin ės analizės (ANOVA) metodus. Tuomet 
kiekvienai koncentracijai gautas vidurkis turi b ūti lyginamas su kont ­
rolinio ėminio vidurkiu, taikant atitinkam ą kartotinių palyginim ų arba 
trendo kriterijaus metod ą. Gali b ūti naudingas  Dunnetto  arba  
Williamso  kriterijus (14)(15)(16)(17)(18). Yra b ūtina įvertinti, ar 
galioja ANOVA dispersijos vienalytiškumo prielaida. Š į įvertinimą 
galima atlikti grafiškai arba taikant formal ųjį kriterijų (18). Tinkami 
kriterijai yra  Levene  arba  Bartletto  kriterijai. Neatitikt į prielaidai d ėl 
dispersijų vienalytiškumo kartais galima pataisyti atliekant duomen ų 
logaritmin į transformavim ą. Jei dispersijos nevienalytiškumas yra 
labai didelis ir jo ne įmanoma pataisyti transformavimo keliu, reik ėtų 
nagrinėti galimyb ę taikyti kitus analiz ės metodus, pvz., žingsnio maži ­
nimo  Jonkheere  trendo kriterijus. Papildomus nurodymus d ėl NOEC 
nustatymo galima rasti (12).  
Atsižvelgiant į naujus mokslo pasiekimus rekomenduojama atsisakyti 
NOEC sąvokos ir j ą pakeisti regresija pagr įstais EC  x taškiniais įver­ 
čiais. Atitinkama šio dumbli ų bandymo x vert ė nėra nustatyta. Atrodo, 
kad tiktų į 10–20 % interval ą patenkanti vert ė (pagal pasirinkt ą atsako 
kintamąjį), ir pageidautina ataskaitoje pateikti abi EC  10 ir EC  20 vertės. 
2.5. AUGIMO SKATINIMAS  
Mažoms koncentracijos vert ėms kartais yra stebimas augimo skatinimas 
(neigiamas inhibavimas). Šio reiškinio priežastis gali b ūti hormez ė 
(„toksinis skatinimas“) arba augim ą skatinančių priemoni ų pridėjimas 
su bandom ąja medžiaga į mažiausi ą naudojamos terp ės tūrį. Atkrei­
piamas dėmesys į tai, kad neorganini ų mitybinių medžiagų pridėjimas 
neturėtų daryti kok į nors tiesiogin į poveikį, kadangi bandymo terp ėje 
visą bandymą turėtų būti užtikrintas mitybini ų medžiag ų perteklius. Į 
skatinimą mažomis doz ėmis paprastai galima nekreipti d ėmesio apskai ­ 
čiuojant EC  50 , jei jis n ėra labai didelis. Ta čiau jei jis yra labai didelis 
arba reikia apskai čiuoti maž ą x atitinkan čią EC  x vertę, gali tekti taikyti 
specialias proced ūras. Jei įmanoma, reik ėtų vengti skatinam ųjų atsakų 
pašalinimo iš duomen ų analizės, ir jei turima kreivi ų pritaikymo progra ­
minė įranga negali leisti mažo skatinimo, galima taikyti tiesin ę interpo­
liaciją ir savaiminio gerinimo metod ą. Jei skatinimas labai didelis, 
galima nagrin ėti hormez ės taikymo klausim ą (19).  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. NETOKSINIS AUGIMO INHIBAVIMAS  
Šviesą sugerian čios bandomosios medžiagos gali b ūti augimo grei čio 
mažėjimo priežastimi d ėl to, kad tamsinimas mažina gaunamos 
šviesos kiek į. Tokie fizikinio tipo reiškiniai tur ėtų būti atskirti nuo 
toksinių poveikių, keičiant bandymo s ąlygas, ir ataskaitoje apie juos 
reikėtų paskelbti atskirai. Rekomendacijas galima rasti (2) ir (3)..  
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
3.1. BANDYM Ų ATASKAITA  
Bandymų ataskaitą turi sudaryti ši informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir atitinkamos fizikochemin ės savybės, įskaitant 
ribinę tirpumo vandenyje koncentracij ą, 
— cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynum ą. 
Bandymo r ūšys: 
— štamas, tiek ėjas arba šaltinis ir naudotos auginimo s ąlygos.  
Bandymo s ąlygos:  
— bandymo pradžios data ir jo trukm ė, 
— bandymo schemos aprašymas: bandymo indai, kult ūros tūriai, 
biomasės tankis bandymo pradžioje,  
— terpės sudėtis, 
— bandymo koncentracijos vert ės ir kartotiniai ėminiai (pvz., karto ­
tinių ėminių skaičius, bandymo koncentracijos ver čių skaičius ir 
taikyta geometrin ė progresija),  
— bandymo tirpal ų ruošimo aprašymas, įskaitant tirpikli ų naudojim ą 
ir t. t.,  
— kultūros auginimo aparat ūra, 
— šviesos intensyvumas ir kokyb ė (šaltinis, vienalytiškumas),  
— temperat ūra, 
— bandytos koncentracijos vert ės: vardinės bandymo koncentracijos 
vertės ir visi bandomosios medžiagos nustatymo bandymo induose 
rezultatai. Ataskaitoje tur ėtų būti nurodytas metodo atgavimo 
laipsnis ir kiekybinio nustatymo riba esant bandymo matricai,  
— visi nukrypimai nuo šio bandymo metodo,  
— biomas ės nustatymo metodas ir duomenys apie matuojamo para ­
metro ir sausos medžiagos mas ės koreliacij ą. 
Rezultatai:  
— visų apdorotų indų tirpalų pH vertės bandymo pradžioje ir pabai ­
goje,  
— kiekvienos kolbos biomas ė kiekviename matavimo taške ir 
biomasės matavimo metodas,  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— augimo kreiv ės (biomas ės kaip laiko funkcijos grafikas),  
— apskai čiuoti kiekvieno apdoroto kartotinio ėminio atsako kinta ­
mieji, jų vidutinės vertės ir kartotini ų ėminių variacijos koefi ­
cientas,  
— grafinis koncentracijos ir poveikio santykio pateikimas,  
— toksiškumo įverčiai pagal atsako kintamuosius, pvz., EC  50 , EC  10 , 
EC 20 ir atitinkami pasikliautinieji intervalai. Jei buvo apskai ­ 
čiuotos, LOEC ir NOEC vert ės ir jų nustatymo statistiniai 
metodai,  
— jei buvo taikytas dispersin ės analizės metodas ANOVA, poveikio, 
kurį galima aptikti, dydis (pvz., mažiausiais reikšminis skirtumas),  
— bet koks augimo skatinimas, nustatytas kuriam nors apdorojimo 
atvejui,  
— visi kiti steb ėti reiškiniai, pvz., dumbli ų morfologiniai poky čiai, 
— rezultat ų aptarimas, įskaitant nukrypim ų nuo šio bandymo metodo 
įtaką bandymo rezultatams.  
4. LITERAT ŪRA 
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test  
(2) ISO 1998: Water quality – Guidance for algal growth inhibition 
tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442
 
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, no. 23.
 
(4) ISO 1998: Water quality – Sampling – Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667–16.  
(5) ISO 1993: Water quality – Algal growth inhibition test. ISO 
8692  
(6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.
 
(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determina ­
tions of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22,5 (1977), pp.919–925
 
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073–2079.
 
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713–718.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. 
Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.  
(11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485–1494.
 
(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096–1121
 
(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons with 
a control. Biometrics 20: 482–491.  
(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103–117.  
(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.  
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe 
dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
1 Priedėlis 
Patvirtinti bandymams tinkami štamai  
Žalieji dumbliai  
— Pseudokirchneriella subcapitata , (anksčiau vadinti  Selenastrum capricor ­
nutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (anksčiau vadinti  Scenedesmus subspicatus ) 86.81 
SAG  
Diatomėjos 
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cianobakterijos  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Štamų šaltiniai  
Rekomenduojamus štamus galima gauti kaip vienos r ūšies dumbli ų kultūrą iš šių 
rinkinių (abėcėlės tvarka):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110–2209  
USA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology,  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
UK 
SAG: Collection of Algal Cultures  
Inst. Plant Physiology  
University of Göttingen  
Nicholausberger Weg 18  
D-3400 Göttingen  
GERMANY  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
USA ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Rekomenduojam ų rūšių išvaizda ir charakteristikos  
P. subcapitata  D. subspicatus  N. pelliculosa  A. flos-aquae  S. leopoliensis  
Išvaizda  Lenktos, 
susuktos 
atskiros ląstelės
 Ovalo formos, 
daugiausia 
atskiros ląstelės
 Strypeliai  Ovalo formos 
ląstelių 
grandinės Strypeliai  
Dydis (L × W) μm 8–14 × 2–3  7–15 × 3–12  7,1 × 3,7  4,5 × 3  6 × 1  
Ląstelės tūris (μm 3 /ląstelė) 40–60 (  1 ) 60–80 (  1 ) 40–50 (  1 ) 30–40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Sausų ląstelių masė (mg/ląstelė) 2–3 × 10  –8 3–4 × 10  –8 3–4 × 10  –8 1–2 × 10  –8 2–3 × 10  –9 
Augimo greitis (  3 ) (para  –1 ) 1,5–1,7  1,2–1,5  1,4  1,1–1,4  2,0–2,4  
( 1 ) Išmatuotas elektroniniu daleli ų skaitikliu. 
( 2 ) Apskai čiuotas pagal dyd į. 
( 3 ) Dažniausiai buvo stebimas augimo OECD terp ėje greitis, esant šviesos intensyvumui maždaug 70 μE•m  –2 •s –1 ir 21 °C.  
Konkrečios rekomendacijos d ėl siūlomų naudoti bandymo r ūšių auginimo ir 
tvarkymo  
Pseudokirchneriella subcapitata ir Desmodesmus subspicatus  
Šiuos žaliuosius dumblius paprastai lengva priži ūrėti įvairiose kult ūros terpėse. 
Informacij ą apie tinkamas terpes galima gauti iš kult ūros rinkini ų tiekėjų. 
Ląstelės paprastai yra pavien ės ir jų tanki lengva matuoti elektroniniu daleli ų 
skaitikliu arba mikroskopu.  
Anabaena flos-aquae  
Pradinei kult ūrai laikyti tinka įvairios auginimo terp ės. Ypač svarbu neleisti 
pasibaigti atnaujinamos atskiro ėminio kult ūros eksponentinio augimo tarpsniui, 
nes atgaivinti pasibaigus šiam tarpsniui b ūtų sunku.  
Anabaena flos-aquae  sudaro lizdo formos l ąstelių grandinių agregatus. Ši ų agre­
gatų dydis gali keistis atsižvelgiant į auginimo s ąlygas. Šiuos agregatus gali tekti 
suardyti, kai biomasei nustatyti skai čiuojama mikroskopu arba elektroniniu 
dalelių skaitikliu.  
Grandinėms suardyti ir dumbli ų skaičiaus kintamumui sumažinti dalinius ėminius 
galima apdoroti ultragarsu. L ąstelės gali būti sunaikintos, jei jos apdorojamos 
ultragarsu ilgiau nei reikia grandin ėms sutrumpinti. Kiekvieno apdorojimo ultra ­
garsu intensyvumas ir trukm ė turi būti vienodi.  
Skaičiuojamas pakankamas skai čius hemocitometro lauk ų (bent 400 l ąstelių) 
kintamumui sumažinti. D ėl to pager ėtų tankio mikroskopinio nustatymo patiki ­
mumas.  
Suminiam  Anabaena  ląstelių tūriui nustatyti galima naudoti elektronin į dalelių 
skaitiklį, ląstelių grandines sutrumpinus atsargiai apdorojant ultragarsu. L ąstelių 
irimui išvengti apdorojimo ultragarsu energija turi b ūti reguliuojama.  
Siekiant užtikrinti, kad bandymo indams aps ėti naudojama dumbli ų suspensija 
būtų gerai sumaišyta ir vienalyt ė, naudojamas s ūkurinis maišytuvas arba panašus 
tinkamas b ūdas. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Bandymo indai statomi ant sukamojo arba slankiojamojo tipo purtykl ės stalo ir 
maišomi 150 apsisukim ų per minut ę greičiu. Dar galima naudoti periodiškai 
nutraukiam ą maišymą, kuris sumažint ų Anabaena  polinkį sudaryti gniužulus. 
Jei gniužulai susidaro, b ūtina imtis priemoni ų gauti tipinius biomasei matuoti 
skirtus ėminius. Gali tekti stipriai maišyti prieš ėminių ėmimą, norint suardyti 
dumblių gniužulus.  
Synechococcus leopoliensis  
Pradinei kult ūrai laikyti tinka įvairios auginimo terp ės. Informacij ą apie tinkamas 
terpes galima gauti iš kult ūros rinkini ų tiekėjų. 
Synechococcus leopoliensis  auga kaip pavien ės strypelio formos l ąstelės. Ląstelės 
yra labai mažos, tod ėl biomasės matavimams yra sunkiau naudoti skai čiavimą 
mikroskopu. Tinka elektroniniai daleli ų skaitikliai su įranga mažesn ėms kaip 
maždaug 1 μm dydžio dalel ėms skaičiuoti. Be to, tinka  in vitro  fluorimetriniai 
matavimai.  
Navicula pelliculosa  
Pradinei kult ūrai laikyti tinka įvairios auginimo terp ės. Informacij ą apie tinkamas 
terpes galima gauti iš kult ūros rinkini ų tiekėjų. Atkreipiamas d ėmesys į tai, kad 
terpėje turi būti silikato.  
Tam tikromis auginimo s ąlygomis  Navicula pelliculosa  gali sudaryti agregatus. 
Dėl lipidų susidarymo dumbli ų ląstelės kartais gali kauptis paviršiaus pl ėvelėje. 
Norint tokiomis aplinkyb ėmis gauti tipinius ėminius, b ūtina imtis speciali ų prie­
monių, kai daliniai ėminiai imami biomasei nustatyti. Gali b ūti reikalingas stiprus 
maišymas, pvz., s ūkuriniu maišytuvu.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
2 priedėlis 
Auginimo terp ės 
Galima naudoti vien ą iš šių dviejų auginimo terpi ų: 
OECD terp ė: originali OECD TG 201 terp ė, be to, naudojama pagal ISO 8692  
JAV AAA AAP terp ė, be to, naudojama pagal ASTM.  
Šioms terp ėms ruošti turi b ūti naudojamos analiziškai grynos chemin ės 
medžiagos ir dejonizuotas vanduo.  
AAP terp ės (JAV AAA) ir OECD TG 201 terp ė 
Komponentas  EPA  OECD  
mg/l mmol  mg/l  mmol  
NaHCO  3 15,0 0,179  50,0  0,595  
NaNO  3 25,5 0,300  
NH  4 Cl 15,0  0,280  
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16  0,0598  12,0  0,0590  
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41  0,0300  18,0  0,122  
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6  0,0592  15,0  0,0609  
K 2 HPO  4 1,044  0,00599  
KH  2 PO 4 1,60 0,00919  
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160  0,000591  0,0640  0,000237  
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300  0,000806  0,100  0,000269 (*)  
H 3 BO 3 0,186  0,00300  0,185  0,00299  
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415  0,00201  0,415  0,00210  
ZnCl  2 0,00327  0,000024  0,00300  0,0000220  
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143  0,000006  0,00150  0,00000630  
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726  0,000030  0,00700  0,0000289  
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012  0,00000007  0,00001  0,00000006  
pH 7,5  8,1  
(*) EDTA ir geležies molinis santykis vos viršija vienet ą. Tai apsaugo nuo geležies jon ų nusodinimo, bet tuo 
pačiu kiek įmanoma sumažinamas sunki ųjų metalų chelatinimas.  
Atliekant bandym ą su diatom ėjomis  Navicula pelliculosa , į abi terpes turi b ūti 
papildomai įdėta Na  2 SiO  3 ·9H  2 O 1,4 mg Si/l koncentracijai gauti.  
Terpės pH vert ė gaunama, nusistov ėjus pusiausvyrai tarp karbonatin ės sistemos ir 
atmosferos oro CO  2 dalinio sl ėgio. pH ir molin ės hidrokarbonato koncentracijos 
santykį, esant 25 °C, apytikriai galima išreikšti taip:  
pH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
Esant 15 mg NaHCO  3 /l, pH  eq = 7,5 (JAV AAA terp ė) ir esant 50 mg NaHCO  3 /l, 
pH eq = 8,1 (OECD terp ė). 
Bandymo terp ės elementin ė sudėtis 
Elementas  EPA  OECD  
mg/l mg/l  
C 2,144  7,148  
N 4,202  3,927  
P 0,186  0,285  
K 0,469  0,459  
Na 11,044  13,704  
Ca 1,202  4,905  
Mg 2,909  2,913  
Fe 0,033  0,017  
Mn 0,115  0,115  
OECD terp ės ruošimas  
Mitybinė medžiaga  Pradinio tirpalo koncentracija  
1 pradinis tirpalas: mitybiniai 
makroelementai  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
2 pradinis tirpalas: geležies  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
3 pradinis tirpalas: mikroelementai  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
4 pradinis tirpalas: hidrokarbonatas  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 O 
Pradiniai tirpalai sterilizuojami filtravimu per membran ą (vidutinis aku čių 
skersmuo 0,2 μm) arba apdorojami autoklave (120 °C, 15 min). Tirpalai laikomi 
tamsoje, esant 4 °C.  
Negalima apdoroti autoklave 2 ir 4 pradini ų tirpalų, jie sterilizuojami filtravimu 
per membran ą. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Auginimo terp ė ruošiama į vandenį įpilant atitinkam ą 1–4 pradini ų tirpalų tūrį: 
Į 500 ml sterilizuoto vandens įpilama:  
— 10 ml 1 pradinio tirpalo  
— 1 ml 2 pradinio tirpalo  
— 1 ml 3 pradinio tirpalo  
— 1 ml 4 pradinio tirpalo  
Sterilizuotu vandeniu skiedžiama iki 1 000 ml.  
Tirpalai paliekami pakankam ą laiką stovėti, kad nusistov ėtų terpės ir atmosferos 
CO 2 pusiausvyra, prireikus kelias valandas barbotuojant steril ų filtruotą orą. 
AAP terp ės ruošimas  
A1.1. 1 ml kiekvieno A1.2.1–A1.2.7 pradinio tirpalo įpilama į maždaug 900 
ml dejonizuoto arba distiliuoto vandens ir skiedžiama iki 1 litro.  
A1.2. Mitybini ų makroelement ų pradiniai tirpalai ruošiami tirpinant šiuos 
medžiagų kiekius 500 ml dejonizuoto arba distiliuoto vandens. 
A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 ir A1.2.4 reagentai gali b ūti sujungti į vieną 
pradinį tirpaląruošiami tirpinant šiuos medžiag ų kiekius 500 ml dejo ­
nizuoto arba distiliuoto vandens. A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 ir A1.2.4 
reagentai gali b ūti sujungti į vieną pradinį tirpalą. 
A1.2.1.  NaNO  3 –12,750 g.  
A1.2.2.  MgCL  2 · 6H 2 O –6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O –2,205 g.  
A1.2.4.  Mitybini ų makroelement ų pradiniai tirpalai  – (žr. A1.3).  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O –7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 –0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 –7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O – žr. A1.1 pastab ą. 
A1.1 pastaba – Naudojamas tik tokiu atveju, kai bandymo r ūšis yra 
diatomėjos. Gali b ūti įdėtas tiesiogiai (202,4 mg) arba kaip pradinis 
tirpalas, kad galutin ė terpės koncentracija b ūtų 20 mg/l Si.  
A1.3. Mitybini ų mikroelement ų pradinis tirpalas ruošiamas 500 ml dejoni ­
zuoto arba distiliuoto vandens tirpinant:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 –92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O –207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 –1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O –79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O –0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O –3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O –0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O –150,000 mg.  
[dinatrio(etilendinitrilo)tetraacetatas].  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O –0,005 mg žr A1.2. pastab ą. 
A1.2 pastaba – Naudojamas tik diatom ėjų rūšių pradinių kultūrų terpei.  
A1.4. pH vert ė 7,5 ± 0,1 nustatoma 0,1 N arba 1,0 N NaOH arba HCl.  
A1.5. Terp ės filtruojamos į sterilų indą per 0,22 μm membranin į filtrą, jei 
būtų naudojamas daleli ų skaitiklis, arba 0,45 μm filtrą, jei daleli ų skai­
tiklis neb ūtų naudojamas.  
A1.6. Nenaudojama terp ė laikoma tamsoje, maždaug 4 °C temperat ūroje. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
3 priedėlis 
Dumblių auginimo proced ūros pavyzdys  
Bendrosios pastabos  
Kultūros auginimo pagal ši ą procedūrą tikslas – gauti dumbli ų kultūras toksiš ­
kumo bandymams.  
Siekiant užtikrinti dumbli ų kultūrų apsaugą nuo užkr ėtimo bakterijomis, turi b ūti 
taikomi tinkami metodai. Pageidautina naudoti akseniškas kult ūras, tačiau turi 
būti gautos ir naudojamos vienal ąsčių dumblių kultūros. 
Visi veiksmai turi b ūti atliekami steriliomis s ąlygomis, kad b ūtų išvengta užkr ė­
timo bakterijomis ir kitais dumbliais.  
Įranga ir medžiagos  
Žr. bandymo metodo skyriaus aparat ūros aprašym ą. 
Dumblių kultūrų gavimo proced ūros 
Mitybinių medžiag ų tirpalų (terpių) ruošimas:  
Visos terp ės mitybini ų medžiag ų druskos ruošiamos kaip koncentruoti pradiniai 
tirpalai, kurie laikomi tamsoje ir šaltai. Šie tirpalai sterilizuojami filtravimu arba 
apdorojant autoklave.  
Terpė ruošiama į sterilų distiliuot ą vandenį įpilant tiksl ų pradinio tirpalo kiek į, 
imantis priemoni ų apsaugoti j ą nuo užkr ėtimo. Ruošiant kiet ąją terpę įdedama 0,8 
procento agaro.  
Pradinė kultūra: 
Pradinės kultūros yra mažos dumbli ų kultūros, kurios reguliariai pernešamos į 
šviežią terpę kaip pradin ė bandymų medžiaga. Jei kult ūros reguliariai nenaudo ­
jamos, jos s ėjamos ant guls čiojo agaro m ėgintuvėliuose. Šios kult ūros perne ­ 
šamos į šviežią terpę bent kart ą per du m ėnesius.  
Pradinės kultūros auginamos k ūginėse kolbose su atitinkama terpe (t ūris apie 100 
ml). Kai dumbliai inkubuojami 20 °C temperat ūroje nuolatinio apšvietimo s ąly­
gomis, pernešti reikia kas savait ę. 
Į kolba su šviežia terpe sterilia pipete pernešamas toks „senos“ kult ūros kiekis, 
kad pradin ė greitai augan čių rūšių koncentracija b ūtų maždaug 100 kart ų 
mažesnė nei senos kult ūros. 
Rūšies augimo greitis gali b ūti nustatytas iš augimo kreiv ės. Jei greitis žinomas, 
galima įvertinti, koks turi b ūti į naują terpę pernešamos kult ūros tankis. Tai turi 
būti daroma anks čiau kaip kult ūra pasiekia ž ūties tarpsn į. 
Iš anksto paruošta kult ūra 
Iš anksto paruošta kult ūra skirta gauti dumbli ų kiekį, reikaling ą bandymo kult ū­
roms sėti. Iš anksto paruošta kult ūra inkubuojama bandymo s ąlygomis ir naudo ­
jama tuomet, kai dar auga eksponentiškai, paprastai maždaug po 2–4 inkubavimo parų. Kai dumbli ų kultūroje yra deformuot ų arba nenormali ų ląstelių, jos turi b ūti 
pašalintos.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
4 Priedėlis 
Duomenų analizė taikant netiesin ę regresiją 
Bendrieji klausimai  
Dumblių ir kitų mikrobų augimo bandym ų atsakas – biomas ės augimas yra iš 
prigimties tolydusis arba metrinis kintamasis: proceso greitis, jei naudojamas 
augimo greitis, ir jo integralas pagal laik ą, kintamuoju pasirinkus biomas ę. 
Abu dydžiai lyginami su atitinkamu neveikiam ų kartotini ų kontrolini ų ėminių 
vidutiniu atsaku, kuris yra didžiausias atsakas taikomomis s ąlygomis, kai 
dumblių bandymo pagrindiniai lemiami veiksniai yra šviesa ir temperat ūra. 
Sistema yra paskirstytoji arba vienalyt ė ir į biomasę galima ži ūrėti kaip į ištisinį 
parametrą, neatsižvelgiant į atskiras l ąsteles. Tokios sistemos šio tipo atsako 
dispersijos pasiskirstymas (paprastai aprašomas lognormaliuoju arba normaliuoju 
paklaidų skirstiniu) susij ęs vien tik su bandymo veiksniais. Jis yra priešingas 
tipiniams dichotomini ų duomenų biologinio bandymo atsakams, kuriems dažnai 
daroma prielaida, kad vyraujantis dispersijos komponentas yra atskir ų organizm ų 
atsparumas (paprastai binominio skirstinio). Šiuo atveju kontrolini ų ėminių 
atsakai yra nulis arba fono lygis.  
Esant paprastai situacijai, normalizuotas arba santykinis atsakas r monotoniškai 
mažėja nuo 1 (nulinis inhibavimas) iki 0 (visiškas (100 %) inhibavimas). Atkrei ­
piamas dėmesys į tai, kad visi atsakai turi asocijuot ąją paklaidą ir kad gali b ūti 
apskaičiuotas tariamas neigiamas inhibavimas, kaip vien tik atsitiktin ės paklaidos 
rezultatas.  
Regresin ė analizė 
Modeliai  
Regresinės analizės tikslas – koncentracijos ir atsako santykio kreiv ę kiekybiškai 
aprašyti kaip matematin ę regresijos funkcij ą Y = f (C) arba dažniau F (Z), kai Z 
= log C. Naudojant atvirkštin ę funkciją C = f  –1 (Y), galima apskai čiuoti EC  x 
vertes, įskaitant EC  50 , EC  10 ir EC  20 , bei jų 95 % pasikliautinuosius r ėžius. Pasi ­
rodė, kad kelios paprastos matematini ų funkcijų formos tinka s ėkmingai aprašyti 
koncentracijos ir atsako santykius, gaunamus atliekant dumbli ų augimo inhiba ­
vimo bandymus. Tokios funkcijos b ūtų, pvz., logistin ė lygtis, nesimetrin ė 
Weibulo  lygtis ir lognormaliojo skirstinio funkcija, kurios visos yra sigmoid ės, 
asimptotiškai art ėjančios prie vieneto, kai C → 0, ir prie nulio, kai C → bega­
lybę. 
Neseniai buvo pasi ūlyta vietoj asimptotini ų modelių taikyti tolydžiosios ribin ės 
funkcijos modelius (pvz.,  Koymano „populiacijos augimo inhibavimo“ model į, 
Kooijman et al. 1996). Pagal š į modelį daroma prielaida, kad poveikio n ėra, 
kai koncentracija yra mažesn ė nei tam tikra ribin ė vertė EC0+, kuri įvertinama 
ekstrapoliuojant atsako ir koncentracijos santyk į iki susikirtimo su koncentracijos 
verčių ašimi, kai santykiui išreikšti naudojama paprasta tolydžioji funkcija, nedi ­
ferencijuojama pradžios taške.  
Atkreipiamas d ėmesys į tai, kad jei kompensuojamas dispersijos nevienalytiš ­
kumas, analiz ė gali būti tiesiog liekam ųjų kvadratų (darant prielaid ą apie pastovi ą 
dispersiją) arba svertini ų mažiausi ų kvadratų sumos minimizavimas.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Procedūra 
Procedūrą galima bendrais bruožais apib ūdinti taip: pasirenkama atitinkama funk ­
cinė lygtis Y = f (C) ir pritaikoma duomenims, taikant netiesin ę regresiją. Pagei­
dautina naudoti kiekvienos atskiros kolbos matavim ų duomenis, bet ne vidutines 
kartotinių ėminių vertes, iš duomen ų siekiant gauti kiek įmanoma daugiau infor ­
macijos. Ta čiau, kita vertus, jei dispersija yra didel ė, praktinis patyrimas rodo, 
kad kartotini ų ėminių vidutinės vertės gali užtikrinti tvirtesn į matematin į įverti­
nimą, mažiau paveikt ą duomenų sisteming ųjų paklaidų, palyginti su tuo atveju, 
kai imamas kiekvienas paliktas atskiras duomen ų taškas.  
Pažymimi duomen ų taškai, br ėžiama pritaikyta kreiv ė ir tiriama, ar parinkta 
kreivė tinka. Šiam tikslui gali b ūti ypač naudinga liekan ų analizė. Jei pasirinktoji 
koncentracijos ir atsako pritaikymo funkcija tinka ne visai kreivei arba kuriai nors 
jos esminei daliai aprašyti, pvz., atsako duobei esant mažoms koncentracijos vertėms, vietoj simetrin ės pasirenkama kita pritaikoma kreiv ė, pvz., nesimetrin ė 
Weibulo  funkcijos kreiv ė. Neigiamas inhibavimas gali kelti problem ų, pvz., 
naudojant lognormali ąją pasiskirstymo funkcij ą, kai irgi reik ės taikyti kit ą regre­
sijos funkcij ą. Tokių neigiamų verčių nerekomenduojama prilyginti nuliui arba 
priskirti joms kit ą mažą teigiamą vertę, nes taip b ūtų iškreiptas paklaid ų pasis­
kirstymas. Galb ūt tiktų pritaikyti kreiv ę atskirai kreivi ų dalims, pvz., mažo inhi ­
bavimo daliai, norint įvertinti EC
 low x skaičius. Pagal pritaikyt ą lygtį apskaičiuo­
jami (taikant „atvirkštin į įvertinimą“ C = f  –1 (Y) būdingųjų taškų įverčiai EC  x , ir 
ataskaitoje pateikiamas bent EC  50 įvertis ir vienas iš dviej ų EC  low x  įverčių. 
Praktinių bandym ų patyrimas parod ė, kad dumbli ų bandymo preciziškumas 
paprastai leidžia gana tiksliai įvertinti 10 % atitinkant į inhibavimo lyg į, jei yra 
pakankamas duomen ų taškų skaičius, išskyrus kai esant mažoms koncentracijos 
vertėms trukdantis veiksnys yra augimo skatinimas. EC  20 įverčio preciziškumas 
dažnai yra gerokai geresnis palyginti su EC  10 , nes EC  20 paprastai yra apytikriai 
tiesiojoje vidurin ės koncentracijos atsako kreiv ės dalyje. Kartais EC  10 yra sunku 
interpretuoti d ėl augimo skatinimo. Taigi, nors EC  10 paprastai galima gauti 
pakankamu tikslumu, ataskaitoje visuomet rekomenduojama pateikti EC  20 . 
Svertiniai koeficientai  
Bandymų dispersija apskritai yra nepastovi ir jos dal į paprastai sudaro propor ­
cingasis komponentas, taigi kaip įprasta sėkmingai atliekama svertin ė regresija. 
Tokiai analizei naudojami svertiniai koeficientai paprastai laikomi atvirkš čiai 
proporcingais dispersijai:  
W i = 1/Var(r  i ) 
Daug regresijos program ų leidžia pasirinkti svertin ės regresijos analiz ę, svertinius 
koeficientus pateikiant lentel ėje. Būtų patogu svertinius koeficientus normali ­
zuoti, dauginant juos iš n/ Σ w i (n yra duomen ų taškų skaičius), taigi j ų suma 
yra lygi vienetui.  
Atsakų normalizavimas  
Normalizavimas pagal vidutin į kontrolinio ėminio atsak ą sukelia kai kuri ų meto­
dinių problem ų ir gaunama gana sud ėtingos strukt ūros dispersij ą. Dalinant 
atsakus iš vidutinio kontrolinio ėminio atsako inhibavimo procentinei vertei 
gauti, atsiranda papildoma vidutinio kontrolinio ėminio atsako paklaida. Išskyrus 
kai ši paklaida yra labai maža, turi b ūti daroma regresijos svertini ų koeficient ų ir 
pasikliautin ųjų rėžių kontrolinio ėminio kovariacijos pataisa (17). Atkreipiamas 
dėmesys į tai, kad yra labai svarbus vidutinio kontrolinio ėminio atsako įverčio 
preciziškumas, kad b ūtų kiek įmanoma sumažinta santykinio atsako sumin ė 
dispersija. Ši dispersija atrodo taip:  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
apatinis indeksas i rodo koncentracij ą i, indeksas 0 atitinka kontrolinius ėminius  
Y i = santykinis atsakas = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ), 
kurio dispersija:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂Y i / ∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
ir kadangi  
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 ir (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 , 
esant normaliam duomen ų skirstiniui ir m  i bei m  0 yra kartotiniai ėminiai:  
Var(r  i ) = σ 2 /m i , 
taigi sumin ė santykinio atsako dispersija Y  i tampa:  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Kontrolinio ėminio vidurkio paklaida yra atvirkš čiai proporcinga suvidurkintai 
kvadratinei šakniai iš kontrolini ų kartotinių ėminių skaičiaus, ir kartais pasiteisina 
įtraukti sukauptus duomenis ir šiuo b ūdu labai sumažinti paklaid ą. Pagal kit ą 
procedūrą nereikia normalizuoti duomen ų ir pritaikyti absoliu čius atsakus, įskai­
tant kontrolini ų ėminių atsakų duomenis, bet imti kontrolini ų ėminių atsako vert ę 
kaip papildom ą parametr ą, kurį reikia pritaikyti netiesin ės regresijos metodu. Jei 
paprastai taikoma 2 parametr ų regresijos lygtis, taikant š į metodą reikia pritaikyti 
pagal 3 parametrus, tod ėl reikia daugiau duomen ų taškų, nei taikant netiesin ę 
regresiją duomenims, kurie yra normalizuojami naudojant iš anksto nustatyt ą 
kontrolini ų ėminių atsaką. 
Atvirkštiniai pasikliautinieji intervalai  
Netiesinės regresijos pasikliautin ųjų intervalų apskaičiavimas taikant atvirkštin į 
įvertinimą yra gana sud ėtingas ir paprastuose statistini ų kompiuterini ų program ų 
rinkiniuose jo n ėra kaip tipin ės pasirinkties. Apytikrius pasikliautinuosius inter ­
valus galima gauti, taikant tipines netiesin ės regresijos programas ir parametr ų 
pakeitimą (Bruce ir Versteeg, 1992), kur į sudaro matematin ės lygties perrašymas 
pagal reikiamus tašk ų įverčius, pvz., EC  10 ir EC  50 kaip parametrus, kuriuos reikia 
įvertinti. (Tegul bus funkcij ą I = f (α, β, koncentracija) ir naudojami apibr ėžia­
mieji santykiai f ( α, β, EC  10 ) = 0,1 bei f ( α, β, EC  50 ) = 0,5 funkcijai f ( α, β, 
koncentracija) pakeisti lygiaverte funkcija g (EC  10 , EC  50 , koncentracija).  
Labiau tiesioginis apskai čiavimas (Andersen et al, 1998) atliekamas nekei čiant 
pradinės lygties ir taikant  Tayloro  eilutės skleidin į apie r  i ir r 0 vidurkius.  
Neseniai populiariais tapo savaiminio gerinimo ( boot strap ) metodai. Empiriniam 
dispersijos skirstiniui įvertinti taikant tokius metodus, naudojami išmatuoti 
duomenys ir atsitiktini ų skaičių generatoriaus valdomas dažnas kartotinis ėminių 
ėmimas.  
Literatūra 
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485–1494  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. LENGVO BIOLOGINIO SKAIDUMO MATAVIMAS  
I DALIS.  BENDRIEJI KLAUSIMAI  
I.1. ĮVADAS  
Aprašyti šeši metodai, kurie leidžia tirti chemini ų medžiag ų biolo­
ginio skaidumo lengvum ą aerobinėje vandenin ėje terpėje: 
a) Ištirpusios organin ės anglies (DOC) išnykimo (Die-Away) (C.4- 
A metodas);  
b) Modifikuotas OECD ( Organization for Economic Cooperation 
and Development  – Ekonominio bendradarbiavimo ir pl ėtros 
organizacija) atrankos bandymas – DOC išnykimas (C.4-B metodas);
 
c) Anglies dioksido (CO  2 ) išsiskyrimas (modifikuotas Sturm 
bandymas) (C.4-C metodas);  
d) Manometrin ė respirometrija (C.4-D metodas);  
e) Uždarosios kolbos ( closed bottle ) metodas (C.4-E metodas);  
f) MITI ( Ministry of International Trade and Industry  (Tarptau ­
tinės prekybos ir pramon ės ministerija) – Japonija) (C.4-F 
metodas).  
Bendrieji ir įprastieji vis ų šešių bandymų klausimai pateikti metodo I 
dalyje. Atskiriems metodams specifiniai klausimai pateikti II–VII dalyse. Pried ėliuose pateikiamos apibr ėžtys, formul ės ir rekomenda ­
cijos.
 
OECD tarplaboratorinio lyginimo bandymai, atlikti 1988 m. parod ė, 
kad šiais metodais gauti rezultatai yra suderinami. Ta čiau priklau ­
somai nuo fizikini ų bandomosios medžiagos savybi ų, pirmenyb ė gali 
būti teikiama vienam arba kitam metodui.  
I.2. TINKAMO METODO PARINKIMAS  
Norint parinkti tinkamiausi ą metodą, labai svarbi yra informacija 
apie chemin ės medžiagos tirpum ą, garų slėgį ir adsorbcijos charak ­
teristikas. Turi b ūti žinoma chemin ė medžiagos strukt ūra arba 
formulė, norint skai čiuoti teorines vertes ir (arba) tikrinti išmatuotas 
parametrų vertes, pvz., ThOD, ThCO  2 , DOC, TOC, COD (žr. 1 ir 2 
priedėlius).  
Bandomosios chemin ės medžiagos, kuri ų tirpumas vandenyje yra 
bent 100 mg/l, ir jei jos n ėra lakios ir neadsorbuojamos, gali b ūti 
įvertintos visais metodais. Toms chemin ėms medžiagoms, kurios 
mažai tirpsta vandenyje, yra lakios arba yra adsorbuojamos, tinkami metodai nurodyti 1 lentel ėje. Būdas, kaip reikia elgtis su mažai 
vandenyje tirpiomis ir lakiomis medžiagomis, yra aprašytas 3 prie ­
dėlyje. Vidutiniškai lakios chemin ės medžiagos gali b ūti bandomos 
DOC išnykimo metodu, jei bandymo induose (kurie turi b ūti 
tinkamai užkimšti) dujoms yra pakankamai vietos. Šiuo atveju turi 
būti įdiegta abiotin ė kontrolė, kad būtų galima atsižvelgti į bet 
kokius fizinius nuostolius.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
1 lentelė 
Bandymo metod ų tinkamumas  
Bandymas  Analiz ės metodas  Tinkamumas medžiagoms, kurios yra:  
mažai tirpios  lakios  adsorbuojamos  
DOC išnykimas  Ištirpusi organin ė anglis  —  —  +/-  
Modifikuotas OECD 
atrankos bandymas – DOC išnykimas
 Ištirpusi organin ė anglis  —  —  +/-  
CO 2 išsiskyrimas  Respirometrija: CO  2 
išsiskyrimas  + —  +  
Manometrin ė respirometrija  Manometrin ė respirometrija: 
deguonies suvartojimas  + +/-  +  
Uždarosios kolbos  Respirometrija: ištirp ęs 
deguonis  +/- +  +  
MITI  Respirometrija: deguonies 
suvartojimas  + +/-  +  
Norint aiškinti gautus rezultatus, ypa č kai rezultatai yra žemi arba 
ribiniai, reikalinga informacija apie bandomosios medžiagos grynumą arba apie pagrindini ų komponent ų santykin ę dalį.
 
Informacija apie bandom ųjų medžiag ų toksiškum ą bakterijoms (4 
priedėlis) gali b ūti labai naudinga, kai reikia pasirinkti tinkamas 
bandomąsias koncentracijas, ir gali b ūti esminė, kai reikia teisingai 
paaiškinti, kod ėl biologinio skaidymo vert ės yra mažos.  
I.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Norint tikrinti metodik ą, lygiagre čiai įprastiems bandymams tinkamai 
paruoštoje kolboje bandomos etalonin ės medžiagos, kurios atitinka 
lengvo biologinio skaidumo kriterijus.  
Tinkamos chemin ės medžiagos yra anilinas (šviežiai distiliuotas), 
natrio acetatas ir natrio benzoatas. Visos šios etalonin ės medžiagos 
skaidomos ši ų bandym ų sąlygomis, net jei s ėjimo kult ūra ir nėra 
specialiai įdėta. 
Buvo siūloma, kad reik ėtų rasti etalonin ę medžiag ą, kuri b ūtų 
lengvai biologiškai skaidoma, ta čiau tik kai yra įdėta sėjimo kultūros. 
Buvo pasi ūlytas kalio hidroftalatas, ta čiau prieš priimant j į kaip 
etaloninę medžiag ą, reikia apie ši ą medžiag ą surinkti daugiau 
duomenų. 
Respirometriniuose bandymuose junginiai su azotu gali tur ėti įtakos 
deguonies suvartojimui d ėl nitrifikavimo (žr. 2 ir 5 pried ėlius).  
I.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Į bandomosios medžiagos tirpal ą arba suspensij ą mineralin ėje terpėje 
dedama s ėjimo kult ūra ir tirpalas inkubuojamas aerobin ėmis sąly­
gomis tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje. S ėjimo kult ūros DOC 
kiekis bandomosios medžiagos tirpale turi b ūti kiek įmanoma 
mažesnis lyginant su bandomosios medžiagos DOC kiekiu. Atsižvel ­
giama į sėjimo kult ūros endogenin į aktyvum ą, lygiagre čiai atliekant 
tuščiuosius bandymus su s ėjimo kult ūra, bet be bandomosios 
medžiagos, nors l ąstelių endogeninis aktyvumas, kai yra bandomo ­
sios medžiagos, nevisiškai tiksliai atitinka aktyvum ą endogeninio 
aktyvumo kontroliniame bandyme. Metodik ų veikimui tikrinti lygia ­
grečiai atliekamas bandymas su etalonine medžiaga.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Paprastai skaidymo eiga sekama nustatant parametrus, pvz., DOC, 
CO 2 susidarym ą ir deguonies suvartojim ą; matavimai daromi pakan ­
kamai dažnai, kad galima b ūtų nustatyti biologinio skaidymo pradži ą 
ir pabaigą. Jei naudojami automatiniai respirometrai, matavimas yra 
nepertraukiamas. Kai matuojamas kitas parametras, kartais papil ­
domai matuojama DOC, ta čiau tai paprastai daroma tik bandymo 
pradžioje ir pabaigoje. Galima naudoti specifin ę cheminę analizę, 
kai norima įvertinti pradin į bandomosios medžiagos skaidym ą ir 
nustatyti bet kurios susidariusios tarpin ės medžiagos koncentracij ą 
(privaloma MITI bandyme).  
Paprastai bandymas t ęsiamas 28 paras. Ta čiau bandym ą galima 
baigti anks čiau nei po 28 par ų, t. y. kai biologinio skaidymo kreiv ė 
pasiekia guls čiąją dalį bent po trij ų matavim ų. Bandymai gali b ūti 
pratęsti ir atliekami ilgiau nei 28 paras, kai kreiv ė rodo, kad biolo ­
ginis skaidymas prasid ėjo, tačiau 28 par ą gulsčioji dalis dar nepa ­
siekta.  
I.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
I.5.1.  Atkuriamumas  
Dėl biologinio skaidymo prigimties ir d ėl mišrios bakterij ų populia­
cijų, naudojamos kaip s ėjimo kult ūros, sudėties matavimai turi b ūti 
daromi bent du kartus.  
Bendra patirtis rodo, kad, kuo didesn ė bandymo pradžioje į bando­
mąją terpę įdėtų mikroorganizm ų koncentracija, tuo mažesn ė bus 
lygiagrečių bandymų sklaida. Tarplaboratorinio lyginimo bandymai 
taip pat parod ė, kad gali labai skirtis rezultatai, gauti skirtingose 
laboratorijose, ta čiau lengvai biologiškai skaidom ų junginių atveju 
rezultatai paprastai yra pakankamai panaš ūs. 
I.5.2.  Bandymo tinkamumas  
Bandymas yra tinkamas, jei skirtumas tarp bandomosios medžiagos 
šalinimo pakartotinai gaut ų kraštinių verčių gulsčioje kreiv ės dalyje, 
bandymo pabaigoje arba 10 par ų lango pabaigoje, kai tinkama, yra 
mažesnis kaip 20 %, ir jei etalonin ės medžiagos skaidymo procentin ė 
vertė iki 14 paros pasiek ė lengvo biologinio skaidumo lyg į. Jei kuri 
nors iš ši ų sąlygų neįvykdyta, bandymas turi b ūti pakartotas. D ėl 
metodų tikslumo mažos vert ės nebūtinai reiškia, kad bandomoji 
medžiaga aplinkos s ąlygomis biologiškai neskaidi, ta čiau jos rodo, 
kad biologiniam skaidumui nustatyti b ūtina tęsti darbą. 
Jei toksiškumo bandyme, kuriame naudojama ir bandomoji 
medžiaga, ir etalonin ė cheminė medžiaga, skaidymas po 14 par ų 
yra mažesnis kaip 35 % (pagal DOC) arba mažesnis kaip 25 % 
(pagal ThOD arba ThCO  2 ), bandomosios chemin ės medžiagos gali 
būti laikomos inhibuojan čiomis (dar žr. 4 pried ėlį). Bandym ų serijos 
turi būti pakartotos, jei įmanoma, naudojant mažesn ę bandomosios 
medžiagos koncentracij ą ir (arba) didesn ę sėjimo kult ūros koncent ­
raciją, tačiau ne didesn ę kaip 30 mg kiet ųjų dalelių/litre.  
I.6. BENDROSIOS METODIKOS IR PREPARATAI  
Bendrosios bandym ų sąlygos apibendrintos 2 lentel ėje. Aparat ūra ir 
kitos eksperimento s ąlygos, specifiškai siejamos su atskiru bandymu, 
aprašytos toliau pateiktame to bandymo aprašyme.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
2 lentelė 
Bandymų sąlygos  
Bandymas  DOC išnykimas  CO 2 
išsiskyrimas  Manometrin ė 
respirometrija  OECD atrankos 
bandymas  Uždarosios 
kolbos 
bandymas  MITI (I)  
Bandomosios 
medžiagos 
koncentracija  
mg/l 100  2–10  100  
mg DOC/l  10–40  10–20  10–40  
mg ThOD/l  50–100  5–10  
Sėjimo 
kultūros 
koncentracija (ląstelių/l, 
apytikriai)
 ≤ 30 mg/l SS 
arba ≤ 100 ml ištakio/l 
(10 7–1 0 8 ) 0,5 ml 
antrinio 
ištakio/l 
(10 5 ) ≤ 5 ml 
ištakio/l 
(10 4–1 0 6 ) 30 mg/l SS 
(10 7–1 0 8 ) 
Elementų 
koncentracija 
mineralin ėje 
terpėje 
P 116  11,6  29  
N 1,3  0,13  1,3  
Na 86  8,6  17,2  
K 122  12,2  36,5  
Mg 2,2  2,2  6,6  
Ca 9,9  9,9  29,7  
Fe 0,05– 0,1  0,05– 0,1  0,15  
pH 7,4 ± 0,2  geriau 7,0  
Temperat ūra 22 ± 2 °C  25 ± 1 °C  
DOC = ištirpusi organin ė anglis  ThOD = teorinis deguo ­
nies suvartojimas  SS = Suspenduotos 
kietosios dalel ės 
I.6.1.  Skiedimo vanduo  
Naudojamas dejonizuotas arba distiliuotas vanduo, kuriame neb ūtų 
inhibuojan čios koncentracijos nuoding ųjų medžiag ų (pvz., Cu  2 + 
jonų). Vandenyje organin ės anglies neturi b ūti daugiau kaip 10 % 
to kiekio, kuris yra bandomojoje medžiagoje. Didelis bandymo vandens grynumas reikalingas tam, kad b ūtų eliminuotos didel ės 
tuščiųjų bandinių vertės. Užterštumas gali atsirasti d ėl vandeniui 
būdingų priemaiš ų ir dėl jonitinių dervų bei bakterij ų ir dumbli ų 
irimo produkt ų. Kiekvienoje bandym ų serijoje naudokite tik vienos 
partijos vanden į, iš anksto patikrint ą atliekant DOC analiz ę. Toks 
tikrinimas n ėra būtinas uždarosios kolbos bandyme, ta čiau vandens 
suvartojamas deguonies kiekis turi b ūti mažas.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Pradiniai mineralini ų komponent ų tirpalai  
Norint ruošti bandomuosius tirpalus, ruošiami atitinkam ų koncentra ­
cijų mineralini ų komponent ų pradiniai tirpalai. DOC išnykimo, 
modifikuotos OECD atrankos, CO  2 išsiskyrimo, manometrin ės respi­
rometrijos, uždarosios kolbos bandymuose galima naudoti tokius 
pradinius (su skirtingais skiedimo faktoriais) tirpalus.  
Skiedimo faktoriai ir specialios mineralin ės terpės ruošimas MITI 
bandymui pateikti konkre čių metodų aprašymuose.  
Pradiniai tirpalai:  
Paruoškite šiuos pradinius tirpalus, naudodami analiziškai grynas 
medžiagas. 
a) kalio dihidrofosfatas, KH  2 PO 4 8,50 g  
kalio hidrofosfatas, K  2 HPO  4 21,75 g  
natrio hidrofosfatas, dihidratas, Na  2 HPO  4 . 2 H  2 O 33,40 g  
Amonio chloridas NH  4 CL 0,50 g  
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro. 
Tirpalo pH turi b ūti 7,4.  
b) kalcio chloridas, bevandenis, CaCl  2 27,50 g  
arba kalcio chloridas, dihidratas, CaCl  2 , 2 H  2 O 36,40 g  
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro  
c) magnio sulfatas, heptahidratas, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50 g  
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro  
d) geležies (III) chloridas, heksahidratas, FeC1  3 . 
6H 2 O 0,25 g  
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro  
Pastaba . Jei nenorite ruošti šio tirpalo prieš pat į bandymą, vienam 
tirpalo litrui įlašinkite vien ą lašą konc. HCl arba įdėkite 0,4 g etilen ­
diamintetraacto r ūgšties dinatrio druskos (EDTA).  
I.6.3.  Chemini ų medžiag ų pradiniai tirpalai  
Pavyzdžiui, dejonizuotame vandenyje ištirpinkite 1–10 g (kiek 
reikia) bandomosios arba etalonin ės medžiagos ir skieskite iki 1 
litro, jei tirpumas didesnis kaip 1 g/l. Pagal kit ą būdą pradinius 
tirpalus ruoškite mineralin ėje terpėje arba chemin ę medžiag ą dėkite 
tiesiai į mineralin ę terpę. Kaip ruošti mažiau tirpias chemines 
medžiagas, žr. 3 pried ėlį, tačiau MITI bandyme (C.4-F metodas) 
nei tirpikliai, nei emulsikliai neturi b ūti naudojami.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4.  Sėjimo kult ūros 
Sėjimo kult ūrą galima gauti iš įvairių šaltinių: aktyvusis dumblas, 
nuotekų ištakiai (nechloruoti), paviršiniai vandenys ir dirvožemiai, 
arba mišiniai iš ši ų šaltinių. Jei DOC išnykimo, CO  2 išsiskyrimo ir 
manometrin ės respirometrijos bandymams naudojamas aktyvusis 
dumblas, jis turi b ūti imamas iš nuotek ų valymo įrenginių arba labo ­
ratorinių valymo įrenginių, į kuriuos daugiausia patenka buitin ės 
nuotekos. Buvo nustatyta, kad naudojant s ėjimo kult ūras iš kit ų 
šaltinių, rezultatų sklaida didesn ė. Modifikuotam OECD atrankos ir 
uždarosios kolbos bandymams reikia labiau praskiestos s ėjimo 
kultūros be dumblo dribsni ų, todėl labiau pageidautinas šaltinis yra 
antrinis ištakis iš buitini ų nuotekų valymo įrenginio arba laborato ­
rinio valymo įrenginio. MITI bandymui s ėjimo kult ūra daroma iš 
įvairių šaltinių gauto mišinio ir aprašyta šio specialaus bandymo 
skyriuje.  
I.6.4.1.  Sėjimo kultūra iš aktyvi ųjų dumblų 
Iš daugiausia buitines nuotekas valan čio valymo įrenginio arba labo ­
ratorinio valymo įrenginio aeravimo talpos surinkite švieži ą akty­
viojo dumblo bandin į. Prireikus stambias daleles šalinkite filtruodami 
per tankų tinklinį filtrą ir toliau dumbl ą laikykite aerobin ėmis sąly­
gomis.  
Kita galimyb ė – pašalin ę visas stambias daleles, leiskite dumblui 
nusistovėti arba centrifuguokite (pvz., 10 min veikiant 100 g). Skyst į 
nuo dumblo pilkite lauk. Dumbl ą galite plauti mineraline terpe. 
Suspenduokite koncentruot ą dumblą mineralin ėje terpėje, kad 
suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija b ūtų 3–5 g/l, ir aeruokite 
tol, kol dumbl ą panaudosite.  
Dumblas turi b ūti imamas iš gerai veikian čio standartinio įrenginio. 
Jei dumbl ą reikia imti iš didelio našumo valymo įrenginio, arba, jei 
manoma, kad dumble yra inhibitori ų, jis turi b ūti plaunamas. Gerai 
sumaišytą, pakartotinai suspenduot ą dumblą palikite nusistov ėti arba 
centrifuguokite, nupilkite nuo jo skyst į ir išplaut ą dumblą dar kartą 
suspenduokite kitame mineralin ės terpės tūryje. Šiuos veiksmus 
kartokite tol, kol bus galima manyti, kad substrato pertekliaus arba inhibitorių neliko.
 
Prieš pat dumblo naudojim ą, paimkite v ėl visiškai suspenduoto arba 
neapdoroto dumblo bandin į sausų suspenduot ų kietųjų dalelių masei 
nustatyti.  
Pagal kit ą būdą galima homogenizuoti aktyv ųjį dumblą (3–5 g/l 
suspenduot ų kietųjų dalelių). Maišykite dumbl ą 2 min. vidutiniu 
greičiu mechaniniame maišiklyje. Palikite sumaišyt ą dumblą 30 
min. arba ilgiau, jei to reikia, ir dekantuokite skyst į, kurį naudosite 
kaip sėjimo kult ūrą, pagal norm ą 10 ml/l mineralin ės terpės. 
I.6.4.2.  Kiti s ėjimo kultūros šaltiniai  
Ją galima gauti iš valymo įrenginio arba laboratorinio valymo įren­
ginio, apdorojan čių daugiausia buitines nuotekas, antrinio ištakio. 
Paimkite švieži ą bandinį ir, kol gabenate, laikykite j į aerobinėmis 
sąlygomis. Palikite nusistov ėti 1 h arba filtruokite per stamb ų filtrinį 
popierių, ir dekantuot ą ištakį arba filtrat ą laikykite aerobin ėmis sąly­
gomis, kol naudosite. Vienam litrui mineralin ės terpės galima 
naudoti iki 100 ml šios r ūšies sėjimo kult ūros. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Kitas sėjimo terpės šaltinis yra paviršinis vanduo. Šiuo atveju paim ­
kite tinkamo paviršinio vandens, pvz., up ės, ežero, bandin į ir laiky­
kite aerobin ėmis sąlygomis, kol panaudosite. Prireikus s ėjimo kultūrą 
koncentruokite filtravimo arba centrifugavimo b ūdu. 
I.6.5.  Sėjimo kult ūrų pradinis kondicionavimas  
Sėjimo kult ūros gali b ūti iš anksto kondicionuojamos eksperimento 
sąlygoms, ta čiau iš anksto prie bandomosios chemin ės medžiagos 
neadaptuojamos. Pradinis kondicionavimas susideda iš aktyviojo 
dumblo tirpalo mineralin ėje terpėje arba antrinio ištakio 5–7 par ų 
trukmės aeravimo bandymo temperat ūroje. Kartais pradinis kondicio ­
navimas gerina bandymo metod ų preciziškum ą, nes sumažina 
tuščiųjų bandinių vertes. Laikoma, kad MITI bandymo s ėjimo 
kultūrai pradinis kondicionavimas neb ūtinas.  
I.6.6.  Abiotinio skaidymo kontroliniai bandiniai  
Kai reikia, nustatykite galim ą bandomosios medžiagos abiotin į skai­
dymą, matuodami DOC pašalinim ą, deguonies suvartojim ą arba 
anglies dioksido išsiskyrim ą steriliuose kontroliniuose bandiniuose 
be sėjimo kult ūros. Sterilizuokite filtruodami per membran ą 
(0,2–0,45 μm) arba prid ėkite reikiamos koncentracijos tinkamos 
toksinės medžiagos. Jei naudojamas filtravimas per membran ą, steri­
lumui užtikrinti bandinius imkite aseptiniu b ūdu. Jei bandomosios 
medžiagos adsorbcijos galimyb ė nebuvo iš anksto atmesta, 
bandymai, kuriuose biologinis skaidymas nustatomas matuojant 
DOC šalinim ą, ypač jei sėjimo kult ūra iš aktyviojo dumblo, turi 
būti su abiotinio skaidymo kontroliniu bandiniu, į kurį dedama 
sėjimo kult ūra ir nuodijama.  
I.6.7.  Kolb ų skaičius 
Kolbų skaičius tipiniame bandyme nurodytas skyriuje su atitinkamo 
metodo aprašymu. Galima naudoti tokio tipo kolbas:  
— bandomoji suspensija: su bandom ąja medžiaga ir s ėjimo kult ūra, 
— sėjimo kult ūros tuščiasis bandinys: tik su s ėjimo kult ūra, 
— metodikos tikrinimo bandinys: su etalonine medžiaga ir s ėjimo 
kultūra, 
— abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandinys: sterilus, su 
bandomąja medžiaga (žr. I.6.6),  
— adsorbcijos kontrolinis bandinys: su bandom ąja medžiaga, s ėjimo 
kultūra ir sterilizavimo medžiaga,  
— toksiškumo kontrolinis bandinys: su bandom ąja medžiaga, etalo ­
nine medžiaga ir s ėjimo 
— kultūra. 
Būtina, kad nustatymas bandomojoje suspensijoje ir s ėjimo kult ūros 
tuščiajame bandinyje b ūtų daromas lygiagre čiai. Patartina matavimus 
kitose kolbose taip pat daryti lygiagre čiai. 
Tačiau tai ne visuomet gali b ūti įmanoma. Užtikrinkite, kad b ūtų 
paimtas pakankamas skai čius bandini ų arba padaryta matavim ų, 
norint įvertinti pašalinimo procentin ę vertę po 10 par ų lango.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. DUOMENYS IR VERTINIMAS  
Skaičiuojant skaidymo procentin ę vertę, D  t , naudojamos vidutin ės 
vertės dviejų parametro matavim ų bandym ų induose ir tuš čiajame 
bandinyje su s ėjimo kult ūra. Formul ės pateiktos kituose konkre čius 
bandymus aprašan čiuose skyriuose. Skaidymo eiga vaizduojama 
grafiškai ir pažymima 10 par ų langas. Apskai čiuokite ir pateikite 
medžiagos šalinimo, baigiantis 10 par ų langui, procentin ę vertę ir 
gulsčiąją kreivės dalį atitinkan čią vertę arba bandymo pabaigos 
vertę, kuri tinka.  
Respirometriniuose bandymuose junginiai, turintys azoto, gali tur ėti 
įtakos deguonies suvartojimui d ėl nitrifikavimo (žr. 2 ir 5 pried ėlius).  
I.7.1.  Skaidymas, nustatomas pagal DOC kiekio matavim ą 
Skaidymo procentin ė vertė D  t kiekvieną kartą, kai paimamas 
bandinys, turi b ūti skaičiuojama atskirai kolboms su bandom ąja 
medžiaga, naudojant dviej ų DOC matavimu vidutines vertes, kad 
būtų galima įvertinti bandymo tinkamum ą (žr. I.5.2.). Skaidymas 
skaičiuojamas pagal lygt į: 
D t ¼ Í 
1 – Í ðC t – C  bt Þ 
ðC o – C  b0 Þ Î Î 
Ü 100  
čia: 
D t = skaidymo % laiku t,  
C o = vidutin ė pradinė DOC koncentracija terp ėje su bandom ąja 
medžiaga ir s ėjimo kult ūra (DOC mg/l),  
C t = vidutin ė DOC koncentracija terp ėje su bandom ąja 
medžiaga ir s ėjimo kult ūra laiku t (DOC mg/l),  
C bo = vidutin ė pradinė DOC koncentracija tuš čiojo bandinio 
terpėje su mineraline s ėjimo kult ūra (DOC mg/l),  
C bt = vidutin ė DOC koncentracija tuš čiojo bandinio terp ėje su 
mineraline s ėjimo kult ūra laiku t (DOC mg/l).  
Visos koncentracijos nustatomos eksperimentiškai.  
I.7.2.  Skaidymas, nustatomas atliekant specifin ę analizę 
Kai yra specifin ės analizės duomenys, pradinis biologinis skaidymas 
skaičiuojamas pagal formul ę: 
D t ¼ Í ðS b – S  a Þ 
ðS b Þ Î 
Ü 100  
čia: 
D t = skaidymo % laiku t, paprastai 28 paros,  
S a = likutinis bandomosios medžiagos kiekis terp ėje su sėjimo 
kultūra bandymo pabaigoje (mg),  
S b = likutinis bandomosios medžiagos kiekis tuš čiajame bandinyje 
su vandeniu (terpe), į kurį buvo įdėta tik bandomoji 
medžiaga (mg).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
1.7.3.  Abiotinis skaidymas  
Naudojant steril ų kontrolin į bandinį abiotiniam skaidymui nustatyti, 
abiotinio skaidymo procentin ė vertė skaičiuojama pagal formul ę: 
Abiotinio skaidymo %  ¼ Í ðC sðoÞ – C  sðtÞ Þ 
ðC sðoÞ Þ Î 
Ü 100  
čia: 
C s(o) = DOC koncentracija steriliame kontroliniame bandinyje 0 
parą 
C s(t) = DOC koncentracija steriliame kontroliniame bandinyje t 
parą 
I.8. ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta, jei įmanoma, tokia informa ­
cija: 
— bandomoji ir etalonin ė cheminė medžiaga, j ų grynumas,  
— bandymo s ąlygos,  
— sėjimo kultūra: prigimtis ir ėmimo vieta (-os), koncentracija ir bet 
koks pradinis kondicionavimas,  
— nuotekose esan čių pramonini ų nuotekų dalis ir prigimtis, jei tai 
žinoma,  
— bandymo trukm ė ir temperat ūra, 
— apdorojimo b ūdas mažai tirpi ų cheminių medžiag ų atveju,  
— taikytas bandymo metodas; b ūtina moksliškai pagr įsti ir paaiš ­
kinti bet kok į metodikos keitim ą, 
— specifikacija,  
— visi steb ėti inhibavimo reiškiniai,  
— bet koks stebimas abiotinis skaidymas,  
— specifin ės cheminės analizės duomenys, jei yra,  
— analiziniai duomenys apie tarpinius produktus, jei yra,  
— bandomosios medžiagos ir etalonin ės medžiagos skaidymo 
procentin ės dalies kitimo laike grafikas; turi b ūti aiškiai nurodyta 
vėlavimo faz ė, skaidymo faz ė, 10 parų langas ir kreiv ės krypties 
koeficientas (1 pried ėlis). Jei bandymas atitinka tinkamumo krite ­
rijus, grafikui sudaryti galima naudoti skaidymo procentini ų 
verčių vidutines vertes, gautas kolbose su bandom ąja medžiaga,  
— šalinimo procentin ė dalis po 10 par ų lango ir kreiv ės gulsčioje 
dalyje arba bandymo pabaigoje.  
II DALIS.  DOC IŠNYKIMO BANDYMAS  (C.4-A metodas)  
II.1. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Išmatuotas mineralin ės terpės su sėjimo kult ūra ir žinomos koncent ­
racijos bandom ąja medžiaga (nuo 10 iki 40 mg/l DOC), kuri nomi ­
naliai yra vienintelis organin ės anglies šaltinis, t ūris yra aeruojamas 
tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje 22 ± 2 °C temperat ūroje. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Skaidymas sekamas, 28 paras trumpais intervalais atliekant DOC 
analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skai čiuojamas pašalintos 
DOC koncentracij ą (pataisyta d ėl DOC koncentracijos s ėjimo 
kultūros tuščiajame kontroliniame bandinyje) reiškiant pradin ės 
koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo 
laipsnį galima skai čiuoti pagal papildom ą cheminę analizę, atliekam ą 
inkubavimo pradžioje ir pabaigoje.  
II.2. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
II.2.1.  Aparat ūra 
a) Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litr ų, tūris priklauso nuo 
DOC analizei reikalingo t ūrio; 
b) purtykl ė, skirta k ūginėms kolboms d ėti, arba su automatiniu 
termostatavimu arba naudojama patalpoje su pastovia tempera ­
tūra, ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima b ūtų 
palaikyti aerobines s ąlygas;  
c) filtravimo aparatas su tinkamomis membranomis;  
d) DOC analizatorius;  
e) ištirpusio deguonies nustatymo aparat ūra; 
f) centrifuga.  
II.2.2.  Mineralin ės terpės ruošimas  
Apie pradini ų tirpalų ruošimą, žr. I.6.2.  
Sumaišykite 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilkite 
po 1 ml (b) – (d) tirpal ų ir praskieskite skiedimo vandeniu iki 1 litro.  
II.2.3.  Sėjimo kult ūros ruošimas ir pradinis kondicionavimas  
Sėjimo kult ūrą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyvusis dumblas; 
nuotekų ištakiai; paviršiniai vandenys; dirvožemiai arba mišiniai iš 
šių šaltinių. 
Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5.  
II.2.4.  Kolb ų ruošimas  
Pavyzdžiui, į atskiras 2 l k ūgines kolbas įpilkite po 800 ml minera ­
linės terpės ir pakankam ą tūrį bandomosios ir etalonin ės medžiagos 
pradinių tirpalų, kad DOC koncentracija atitikt ų 10–40 mg/l. Patik ­
rinkite pH vertes ir prireikus nustatykite lygi ą 7,4. Įdėkite į kolbas 
sėjimo kultūros iš aktyviojo dumblo arba kito šaltinio (žr. I.6.4), kad 
galutinė suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija b ūtų ne didesn ė 
kaip 30 mg/l. Taip pat paruoškite s ėjimo kultūros tirpalo mineralin ėje 
terpėje kontrolin į bandinį, kuriame neb ūtų bandomosios arba etalo ­
ninės medžiagos.  
Jei reikia, vien ą indą naudokite tikrinti galimam bandomosios 
medžiagos inhibuojamajam poveikiui, į panašios koncentracijos 
bandomosios ir etalonin ės medžiag ų tirpalą mineralin ėje terpėje 
įdėję sėjimo kult ūros. 
Be to, jei reikia, paruoškite dar vien ą sterilią kolbą su chemine 
medžiaga be s ėjimo kult ūros, kad gal ėtumėte nustatyti, ar vyksta 
bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas (žr. I.6.6).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Papildomai, jei kyla įtarimas, kad bandom ąją medžiag ą labai adsor ­
buoja stiklas, dumblas ir t. t., atlikite parengiam ąjį vertinim ą 
galimam adsorbcijos laipsniui nustatyti ir, tuo pa čiu, bandymo tinka ­
mumui šiai cheminei medžiagai (žr. 1 lentel ę). Paruoškite kolb ą su 
bandomąja medžiaga, s ėjimo kult ūra ir sterilizavimo medžiaga.  
Visus tirpalus kolbose skieskite mineraline terpe iki 1 l ir, išmaiš ę, iš 
kiekvienos kolbos paimkite bandin į DOC pradinei koncentracijai 
nustatyti (žr. 2.4 pried ėlį). Uždenkite kolb ų angas pvz., aliuminio 
folija taip, kad tarp kolbos ir j ą supančios aplinkos laisvai jud ėtų 
oras. Tuomet bandymui prad ėti įstatykite kolbas į purtyklę. 
II.2.5.  Kolb ų skaičius tipiniame bandyme  
1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija  
3 ir 4 kolba: s ėjimo kult ūros tuščiasis bandinys  
5 kolba: metodikos tikrinimo bandinys  
ir pageidautina bei kai b ūtina: 
6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandinys  
7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandinys  
8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys  
Žr. dar I.6.7.  
II.2.6.  Bandymo proced ūra 
Visą bandymo laik ą žinomais laiko tarpais, bet pakankamai dažnai, 
kad galima b ūtų nustatyti 10 par ų lango pradži ą ir šalinimo procen ­
tinę vertę 10 parų lango pabaigoje, kiekvienoje kolboje po du kartus 
nustatykite DOC koncentracij ą. Imkite tik mažiausi ą bandomosios 
suspensijos t ūrį, reikaling ą kiekvienam nustatymui.  
Jei būtina, prieš imdami bandin į, kompensuokite garavimo iš kolb ų 
nuostolius, įpildami reikiam ą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš 
imdami bandin į, gerai sumaišykite kult ūros terpę ir užtikrinkite, kad 
prieš bandinio ėmimą ant kolbos sieneli ų prilipusi medžiaga b ūtų 
ištirpinta arba suspenduota. Pa ėmę bandinį, jį iš karto filtruokite 
per membranin į filtrą arba centrifuguokite (žr. 2.4 pried ėlį). Nufil­
truotus arba centrifuguotus bandinius analizuokite t ą pačią dieną arba 
laikykite 2–4 °C temperat ūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – 
žemesnėje kaip –18 °C temperat ūroje. 
II.3. DUOMENYS IR ATASKAITA  
II.3.1.  Rezultat ų apdorojimas  
Apskaičiuokite skaidymo procentin ę vertę laiku t, kaip nurodyta 
I.7.1. (DOC nustatymas) ir, neprivalomai, kaip I.7.2. (specifin ė 
analizė). 
Visus rezultatus užrašykite pateiktose specifikacijose.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Rezultat ų tinkamumas  
Žr. I.5.2.  
II.3.3.  Ataskaita  
Žr. I.8.  
II.4. SPECIFIKACIJA  
Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.  
DOC IŠNYKIMO BANDYMAS  
1. LABORATORIJA  
2. BANDYMO PRADŽIOS DATA  
3. BANDOMOJI MEDŽIAGA  
Pavadinimas:  
Pradinio tirpalo koncentracija: … mg/l, kaip chemin ės 
medžiagos  
Pradinė koncentracija terp ėje, t  0 : … mg/l, kaip chemin ės 
medžiagos  
4. SĖJIMO KULT ŪRA 
Šaltinis:  
Kaip apdorota:  
Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:  
Suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: 
mg/l.  
5. ANGLIES NUSTATYMAS  
Anglies analizatorius:  
Kolba Nr.  DOC (mg/l) po n par ų 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Bandomoji 
cheminė medžiaga 
ir sėjimo kult ūra 1 a 1 
a 2 
a, vidutin ė vertė 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, vidutin ė vertė 
C b(t) ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Kolba Nr.  DOC (mg/l) po n par ų 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Sėjimo kult ūros 
tuščiasis bandinys 
be bandomosios 
medžiagos  3 C 1 
C 2 
C, vidutin ė verte 
C c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, vidutin ė vertė 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ Í ðC cðtÞ þ C dðtÞ Þ 
ð2Þ Î 
6. NEAPDOROT Ų DUOMEN Ų VERTINIMAS  
Kolba Nr.  skaidymo % po n par ų 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 – Í ðC aðtÞ – C  blðtÞ Þ 
ðC aðoÞ – C  blðoÞ Þ ! 
Ü 100  0 
2 D 2 ¼ Í 
1 – Í ðC bðtÞ – C  blðtÞ Þ 
ðC bðoÞ – C  blðoÞ Þ Î Î 
Ü 100  0 
Vidutinė 
vertė ( 1 ) D ¼ Í ðD 1 – D  2 Þ 
ð2Þ Î 
0 
( 1 ) D  1 ir D  2 vidutinė vertė neturi būti skaičiuojama, jei tarp j ų yra didelis skirtumas.  
Pastaba . Panašūs formatai gali b ūti taikomi etaloninei medžiagai ir 
toksiškumo kontroliniams bandiniams.  
7. ABIOTINIO SKAIDYMO KONTROLINIS BANDINYS  
(neprivalomas)  
Laikas (paros)  
0 t  
DOC koncentracija (mg/l) steriliame kontro ­
liniame bandinyje  C s(o) C s(t) 
biotinio skaidymo %  ¼ Í 
ðC sðoÞ – C  sðtÞ Þ 
ðC sðoÞ Þ Ü 100 Î 
8. SPECIFIN Ė CHEMIN Ė ANALIZ Ė (neprivaloma)  
Bandomosios medžiagos likutinis 
kiekis bandymo pabaigoje (mg/l)  Pirminio skaidymo %  
Sterilus kontrolinis bandinys  S  b ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Bandomosios medžiagos likutinis 
kiekis bandymo pabaigoje (mg/l)  Pirminio skaidymo %  
Bandymo terp ė su sėjimo kult ūra s  a Í ðS b – S  a Þ 
ðS b Þ Î 
Ü 100  
III DALIS.  MODIFIKUOTAS OECD ATRANKOS 
BANDYMAS (C.4-B metodas)  
III.1. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Į išmatuot ą mineralin ės terpės tūrį su žinoma koncentracija bando ­
mosios medžiagos (nuo 10 iki 40 mg/l DOC), kuri nominaliai yra vienintelis organin ės anglies šaltinis, įpilama sėjimo kult ūros 0,5 ml 
vienam litrui terp ės. Mišinys yra aeruojamas tamsoje arba išsklaidy ­
toje šviesoje 22 ± 2 °C temperat ūroje.
 
Skaidymas sekamas, 28 paras trumpais intervalais atliekant DOC 
analizę. Biologinio skaidymo laipsnis skai čiuojamas pašalintos 
DOC koncentracij ą (pataisyta d ėl DOC koncentracijos s ėjimo 
kultūros tuščiajame kontroliniame bandinyje) reiškiant pradin ės 
koncentracijos procentine dalimi. Pradinio biologinio skaidymo 
laipsnį galima skai čiuoti pagal papildom ą cheminę analizę, atliekam ą 
inkubavimo pradžioje ir pabaigoje.  
III.2. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
III.2.1.  Aparat ūra 
1) Kūginės kolbos, pvz., nuo 250 ml iki 2 litr ų, tūris priklauso nuo 
DOC analizei reikalingo t ūrio; 
2) purtykl ė, skirta k ūginėms kolboms d ėti, kuri b ūtų arba su auto ­
matiniu termostatavimu arba naudojama patalpoje su pastovia 
temperatūra, ir pakankamo galingumo, kad visose kolbose galima 
būtų palaikyti aerobines s ąlygas;  
3) filtravimo aparatas, su tinkamomis membranomis;  
4) DOC analizatorius;  
5) ištirpusio deguonies nustatymo aparat ūra; 
6) centrifuga.  
III.2.2.  Mineralin ės terpės ruošimas  
Apie pradini ų tirpalų ruošimą žr. I.6.2.  
Sumaišykite 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilkite 
po 1 ml (b) – (d) tirpal ų ir praskieskite skiedimo vandeniu iki 1 litro.  
Šiame metode kaip s ėjimo kult ūra naudojama tik 0,5 ml ištakio/litre 
ir todėl gali tekti didinti terp ės mikroelement ų ir augimo faktori ų 
koncentracij ą. Tai daroma įpilant po 1 ml kiekvieno ši ų tirpalų 
vienam galutinio terp ės tūrio litrui.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Mikroelement ų tirpalas: 
Mangano sulfatas, tetrahidratas, MnSO  4 . 4H  2 O 39,9 mg  
Boro rūgštis, H  3 BO 3 57,2 mg  
Cinko sulfatas, heptahidratas, ZnSO  4 . 7H  2 O 42,8 mg  
Amonio heptamolibdatas, (NH  4 ) 6 MO  7 O 24 34,7 mg  
Fe-chelatas (FeCl  3 ir etilendiamintetraacto r ūgštis)  100,0 mg  
Ištirpinkite skiedimo vandenyje ir praskieskite juo iki 
1 000 ml  
Vitaminų tirpalas:  
Mielių ekstraktas  15,0 mg  
Ištirpinkite mieli ų ekstraktą 100 ml vandens. Sterilizuokite filtruo ­
dami per 0,2 μm membran ą arba pagaminkite šviežiai.  
III.2.3.  Sėjimo kult ūros ruošimas ir pradinis kondicionavimas  
Sėjimo kult ūra ruošiama iš nuotek ų valymo įrenginio arba laborato ­
rinio valymo įrenginio, valan čių daugiausia buitines nuotekas, 
antrinio ištakio. Žr. I.6.4.2. ir I.6.5.  
Naudojama 0,5 ml vienam litrui mineralin ės terpės. 
III.2.4.  Kolb ų ruošimas  
Pavyzdžiui, į atskiras 2 l k ūgines kolbas įpilkite po 800 ml minera ­
linės terpės ir pakankam ą tūrį bandomosios ir etalonin ės medžiagos 
pradinių tirpalų, kad DOC koncentracija atitikt ų 10–40 mg/l. Patik ­
rinkite pH vert ę ir prireikus nustatykite lygi ą 7,4. Įdėkite į kolbas 0,5 
ml/l sėjimo kultūros iš nuotek ų ištakio (žr. I.6.4.2). Taip pat paruoš ­
kite sėjimo kult ūros tirpalo mineralin ėje terpėje kontrolin į bandinį, 
kuriame neb ūtų bandomosios arba etalonin ės medžiagos.  
Jei reikia, vien ą indą naudokite tikrinti galimam bandomosios 
medžiagos inhibuojamajam veikimui, į panašios koncentracijos 
bandomosios ir etalonin ės medžiag ų tirpalą mineralin ėje terpėje 
įdėję sėjimo kult ūros. Be to, jei reikia, paruoškite dar vien ą sterilią 
kolbą su chemine medžiaga be s ėjimo kult ūros, kad gal ėtumėte 
nustatyti, arba vyksta bandomosios medžiagos abiotinis skaidymas 
(žr. I.6.6.).  
Papildomai, jei kyla įtarimas, kad bandom ąją medžiag ą labai adsor ­
buoja stiklas, dumblas ir t. t., atlikite parengiam ąjį vertinim ą 
galimam adsorbcijos laipsniui nustatyti ir, tuo pa čiu, bandymo tinka ­
mumui šiai cheminei medžiagai (žr. 1 lentel ę). Paruoškite kolb ą su 
bandomąja medžiaga, s ėjimo kult ūra ir sterilizavimo medžiaga.  
Visus tirpalus kolbose skieskite mineraline terpe iki 1 l ir, tirpalus 
išmaišę, iš kiekvienos kolbos paimkite bandin į DOC pradinei 
koncentracijai nustatyti (žr. 2.4 pried ėlį). Uždenkite kolb ų angas,  
pvz., aliuminio folija taip, kad tarp kolbos ir j ą supančios aplinkos 
laisvai jud ėtų oras. Tuomet bandymui prad ėti įstatykite kolbas į 
purtyklę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Kolb ų skaičius tipiniame bandyme  
1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija  
3 ir 4 kolba: s ėjimo kult ūros tuščiasis bandinys  
5 kolba: metodikos tikrinimo bandinys  
ir pageidautina bei kai b ūtina: 
6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandinys  
7 kolba: adsorbcijos kontrolinis bandinys  
8 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys  
Žr. dar I.6.7.  
III.2.6.  Bandymo proced ūra 
Visą bandym ą žinomais laiko intervalais, bet pakankamai dažnai, 
kad galima b ūtų nustatyti 10 par ų lango pradži ą ir procentin ę šali­
nimo vert ę 10 parų lango pabaigoje, nustatykite po du kartus DOC 
koncentracijas kiekvienoje kolboje. Imkite tik minimal ų kiekvienam 
nustatymui reikaling ą bandomosios suspensijos t ūrį. 
Jei būtina, prieš imdami bandin į kompensuokite garavimo iš kolb ų 
nuostolius, įpildami reikiam ą kiekį skiedimo vandens (I.6.1). Prieš 
imdami bandin į, gerai sumaišykite kult ūros terpę ir užtikrinkite, kad 
prieš bandinio ėmimą ant kolbos sieneli ų prilipusi medžiaga b ūtų 
ištirpinta arba suspenduota. Pa ėmę bandinį, jį iš karto filtruokite 
per membranin į filtrą arba centrifuguokite (žr. 2.4 pried ėlį). Nufil­
truotus arba centrifuguotus bandinius analizuokite t ą pačią dieną arba 
laikykite 2–4 °C temperat ūroje ne ilgiau kaip 48 h, jei ilgiau – 
žemesnėje kaip -18 °C temperat ūroje. 
III.3. DUOMENYS IR ATASKAITA  
III.3.1.  Rezultat ų apdorojimas  
Apskaičiuokite skaidymo procentin ę vertę laiku t, kaip nurodyta 
I.7.1. (DOC nustatymas) ir, neprivalomai, kaip I.7.2 (specifin ė 
analizė). 
Visus rezultatus užrašykite pateiktose specifikacijose.  
III.3.2.  Rezultat ų tinkamumas  
Žr. I.5.2.  
III.3.3.  Ataskaita  
Žr. I.8.  
III.4. SPECIFIKACIJA  
Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.  
MODIFIKUOTAS OECD ATRANKOS BANDYMAS  
1. LABORATORIJA  
2. BANDYMO PRADŽIOS DATA  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. BANDOMOJI MEDŽIAGA  
Pavadinimas:  
Pradinio tirpalo koncentracija: … mg/l, kaip chemin ės 
medžiagos  
Pradinė koncentracija terp ėje: … mg/l, kaip chemin ės 
medžiagos  
4. SĖJIMO KULT ŪRA 
Šaltinis:  
Kaip apdorota:  
Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:  
Suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: 
mg/l 
5. ANGLIES NUSTATYMAS  
Anglies analizatorius:  
Kolba Nr.  DOC (mg/l) po n par ų 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Bandomoji 
cheminė medžiaga 
ir sėjimo kult ūra 1 a 1 
a 2 
a, vidutin ė vertė 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, vidutin ė vertė 
C b(t) 
Sėjimo kult ūros 
tuščiasis bandinys 
be bandomosios medžiagos
 3 C 1 
C 2 
C, vidutin ė vertė 
C c(t) , 
4 d 1 
d 2 
d, vidutin ė vertė 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ Í ðC cðtÞ þ C dðtÞ Þ 
ð2Þ Î 
6. NEAPDOROT Ų DUOMEN Ų VERTINIMAS  
Kolba Nr.  Skaidymo % po n par ų 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 – Í ðC aðtÞ – C  blðtÞ Þ 
ðC aðoÞ – C  blðoÞ Þ Î Î 
Ü 100  0 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Kolba Nr.  Skaidymo % po n par ų 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 – Í ðC bðtÞ – C  blðtÞ Þ 
ðC bðoÞ – C  blðoÞ Þ Î Î 
Ü 100  0 
Vidutinė 
vertė (*) D ¼ Í 
ðD 1 – D  2 Þ 
ð2Þ Î 
0 
(*) D  1 ir D  2 vidutinė vertė neturi būti skaičiuojama, jei tarp j ų yra didelis skirtumas.  
Pastaba . Panašūs formatai gali b ūti taikomi etaloninei medžiagai ir 
toksiškumo kontroliniams bandiniams.  
7. ABIOTINIO SKAIDYMO KONTROLINIS BANDINYS  
(neprivalomas)  
Laikas (paros)  
0 t  
DOC koncentracija (mg/l) steriliame kontro ­
liniame bandyme  C s(o) C s(t) 
abiotinio skaidymo %  ¼ Í 
ðC sðoÞ – C  sðtÞ Þ 
ðC sðoÞ Þ Ü 100 Î 
8. SPECIFIN Ė CHEMlN Ė ANALIZ Ė (neprivaloma)  
Bandomosios medžiagos likutis 
bandymo pabaigoje (mg/l)  Pirminis suirimas, %  
Sterilus kontrolinis bandinys  S  b 
Bandymo terp ė su sėjimo kult ūra S  a Í Í ðS b – S  a Þ 
ðS b Þ Î 
Ü 100 Î 
IV DALIS.  CO  2 IŠSISKYRIMO BANDYMAS  (C.4-C metodas)  
IV.1. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Išmatuotas mineralin ės terpės su sėjimo kult ūra tūris, kuriame kaip 
vienintelis nominalus organin ės anglies šaltinis yra žinomos koncent ­
racijos bandomoji chemin ė medžiaga (10–20 mg DOC arba TOC/l), 
tamsoje arba išsklaidytoje šviesoje yra aeruojamas, reguliuojamu 
greičiu barbotuojant anglies dioksido neturint į orą. Skaidymas 28 
paras stebimas, nustatant susidariusio anglies dioksido, sugeriamo bario arba natrio hidroksidu, kiek į, matuojam ą likusio hidroksido 
titravimu arba kaip neorganin ė anglis. Iš bandomosios chemin ės 
medžiagos susidariusio anglies dioksido kiekis (pataisytas atsižvel ­
giant į anglies dioksido, susidaran čio tuščiajame bandinyje su s ėjimo 
kultūra, kiekį) yra skai čiuojamas kaip procentin ė ThCO
 2 vertė. 
Kitaip biologinio skaidymo laipsn į galima skai čiuoti atliekant papil ­
domą DOC analiz ę inkubavimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
IV.2.1.  Aparat ūra 
a) 2–5 litr ų talpos kolbos, kiekviena su aeravimo vamzdžiu, beveik 
siekiančiu indo dugn ą, ir išleidimo anga;  
b) magnetiniai maišikliai, kai vertinamos mažai tirpios chemin ės 
medžiagos;  
c) dujų sugėrimo kolbos;  
d) įtaisas reguliuoti ir matuoti oro sraut ą; 
e) aparatas anglies dioksidui išplauti, kuriuo ruošiamas oras, netu ­
rintis anglies dioksido; pagal kit ą būdą galima naudoti iš balion ų 
tiekiamų CO  2 neturinčio deguonies ir CO  2 neturinčio azoto 
mišinį, dujas maišant teisingu santykiu (20 % O  2 : 80 % N  2 ); 
f) įtaisas anglies dioksidui nustatyti titravimo b ūdu arba kokio nors 
tipo neorganin ės anglies analizatorius;  
g) membraninio filtravimo įtaisas (neprivalomas);  
h) DOC analizatorius (neprivalomas).  
IV.2.2.  Mineralin ės terpės ruošimas  
Apie pradini ų tirpalų ruošimą žr. I.6.2.  
Sumaišykite 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilkite 
po 1 ml (b) – (d) tirpal ų ir praskieskite skiedimo vandeniu iki 1 litro.  
IV.2.3.  Sėjimo kult ūros ruošimas ir pradinis kondicionavimas  
Sėjimo kult ūrą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyvusis dumblas; 
nuotekų ištakiai; paviršiniai vandenys; dirvožemiai arba mišiniai iš 
šių šaltinių. 
Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5.  
IV.2.4.  Kolb ų ruošimas  
Kaip pavyzdys, toliau nurodyti t ūriai ir mas ės 5 litrų kolboms su 3 1 
suspensijos. Jei naudojate mažesnius t ūrius, kiekius atitinkamai keis ­
kite, tačiau užtikrinkite, kad b ūtų galima tiksliai matuoti susidariusio 
anglies dioksido kiek į. 
Į kiekvien ą 5 litrų kolbą įpilkite 2 400 ml mineralin ės terpės. Įpilkite 
atitinkam ą tūrį paruošto aktyviojo dumblo (žr. I.6.4.1 ir I.6.5), kad 
suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija mišinio su s ėjimo kult ūra 
galutiniame 3 1 t ūryje būtų ne didesn ė kaip 30 mg/l. Kitas b ūdas, kai 
paruoštas dumblas iš pradži ų skiedžiamas mineralin ėje terpėje 
ruošiant 500–1 000 mg/l suspensij ą, po to alikvotinis šios suspensijos 
tūris pilamas į 5 litrų kolbos turin į, kad koncentracija b ūtų 30 mg/l; 
tai užtikrina didesn į preciziškum ą. Galima naudoti kitus s ėjimo 
kultūros šaltinius (žr. I.6.4.2).  
Per naktį šiuos mišinius su s ėjimo kult ūra aeruokite CO  2 neturinčiu 
oru, kad iš sistemos b ūtų išvalytas anglies dioksidas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Į lygiagrečiam bandymui skirtas kolbas atskirai įpilkite bandomosios 
ir etalonin ės medžiag ų žinomus pradini ų tirpalų tūrius, kad d ėl įdėtų 
cheminių medžiag ų būtų gautos nuo 10 iki 20 mg DOC arba TOC/l 
koncentracijos; į kai kurias kolbas chemini ų medžiag ų nedėkite, bet 
palikite jas kaip s ėjimo kultūros kontrolinius bandinius. Mažai tirpias 
medžiagas d ėkite tiesiai į kolbas, remdamiesi mase arba t ūriu, arba 
darykite, kaip aprašyta 3 pried ėlyje. 
Jei reikia, vien ą kolbą naudokite bandomosios chemin ės medžiagos 
galimam inhibuojamajam veikimui tikrinti, įdėdami į ją ir bandomo ­
sios, ir etalonin ės chemin ės medžiagos, kuri ų koncentracija b ūtų 
tokia pat, kaip ir kitose kolbose.  
Be to, jei reikia patikrinti, arba nevyksta bandomosios chemin ės 
medžiagos abiotinis skaidymas, tur ėkite sterili ą kolbą su bandom ąja 
chemine medžiaga be s ėjimo kult ūros (žr. I.6.6). Sterilizuokite 
įdėdami atitinkamos koncentracijos nuodingos medžiagos.  
Suspensijas visose kolbose skieskite iki 3 litr ų, įpildami mineralin ės 
terpės, prieš tai aeruojamos CO  2 neturinčiu oru. Neprivaloma, bet 
galima siurbti bandinius DOC analizei (žr. 2.4 pried ėlį) ir (arba) 
specifinei analizei. Prie kolb ų oro išleidimo ang ų prijunkite duj ų 
sugėrimo kolbas.  
Jei naudojamas bario hidroksidas, prie kiekvienos 5 1 kolbos 
nuosekliai prijunkite po tris duj ų sugėrimo kolbas, kuri ų kiekvienoje 
būtų 100 ml 0,0125 M bario hidroksido tirpalo. Tirpale neturi b ūti 
sulfato ir karbonato nuos ėdų ir jo koncentracija turi b ūti nustatyta 
prieš pat tirpalo naudojim ą. Jei naudojamas natrio hidroksidas, 
junkite dvi gaudykles, iš kuri ų antroji b ūtų kontrolin ė, siekiant 
įrodyti, kad visas anglies dioksidas buvo absorbuotas pirmoje gaudy ­
klėje. Tinka duj ų sugėrimo kolbos, uždarytos serumo buteli ų dang­ 
čiais. Į kiekvien ą kolbą įpilkite 200 ml 0,05 M natrio hidroksido 
tirpalo, kurio pakanka sugerti vis ą kiekį anglies dioksido, išsisky ­
rusio visiškai suskaidant bandom ąją medžiag ą. Natrio hidroksido 
tirpalas, net šviežiai paruoštas, turi karbonat ų pėdsakus; pataisa pada ­
roma atimant tuš čiajame bandinyje susidariusio karbonato kiek į. 
IV.2.5.  Kolb ų skaičius tipiniame bandyme  
1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija  
3 ir 4 kolba: s ėjimo kult ūros tuščiasis bandinys  
5 kolba: metodikos tikrinimo bandinys  
ir pageidautina bei kai b ūtina: 
6 kolba: abiotinio skaidymo sterilus kontrolinis bandinys  
7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys  
Žr. dar I.6.7.  
IV.2.6.  Bandymo proced ūra 
Pradėkite bandym ą, per suspensijas barbotuodami 30–100 ml/min 
oro be CO  2 srautą. CO  2 nustatyti periodiškai imkite anglies dioksido 
absorbento bandinius. Norint identifikuoti 10 par ų lango period ą, 
rekomenduojama pirm ąsias dešimt dien ų analizę atlikti kas antr ą 
arba kas tre čią dieną, o po to iki 28 paros – kas penkt ą dieną. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
28 parą paimkite bandinius (neprivalomai) DOC ir (arba) specifinei 
analizei, išmatuokite suspensij ų pH vertes ir į kiekvien ą kolbą įpil­
kite 1 ml koncentruotos druskos r ūgšties; aeruokite kolbas per nakt į, 
kad iš bandom ųjų suspensij ų būtų pašalintas anglies dioksidas. 29 
parą atlikite paskutin ę išsiskyrusio anglies dioksido analiz ę. 
CO 2 matavimo dien ą atjunkite ar čiausiai kolbos prijungt ą absorber į 
su bario hidroksidu, ir titruokite bario hidroksido tirpal ą 0,05 M HC1 
tirpalu, indikatoriumi naudodami fenolftalein ą. Perkelkite likusius 
absorberius per vien ą vietą arčiau kolbos ir kitame nuosekliai 
sujungtų absorberi ų gale prijunkite nauj ą absorber į su 100 ml šviežio 
0,0125 M bario hidroksido. Titruokite, kai tai b ūtina, pvz., kai 
pirmojoje gaudykl ėje matyti daug nuos ėdų, bet jų dar nėra antroje, 
arba bent kart ą per savait ę. Kitu atveju, jei absorbentu naudojamas 
NaOH, švirkštu iš ar čiau kolbos stovin čio absorberio paimkite maž ą 
natrio hidroksido tirpalo bandin į (tai priklauso nuo naudojamo 
anglies analizatoriaus charakteristik ų). Purkškite bandin į į anglies 
analizatoriaus IC dal į, kad galėtumėte tiesiogiai nustatyti išsiskyrus į 
anglies dioksid ą. 
Antrosios gaudykl ės turinį analizuokite tik bandymo pabaigoje, kad 
būtų galima padaryti patais ą dėl galimo anglies dioksido išnešimo.  
IV.3. DUOMENYS IR ATASKAITA  
IV.3.1.  Rezultat ų apdorojimas  
Absorberyje titruojant sugerto CO  2 kiekis nustatomas pagal toki ą 
formulę: 
mg CO  2 = (100 × C  B – 0,5 × V × C  A ) × 44  
čia: 
V = 100 ml absorberio turinio titruoti sunaudotos HC1 t ūris (ml)  
C B = bario hidroksido tirpalo koncentracija (M)  
C A = druskos r ūgšties tirpalo koncentracija (M)  
jei C  B lygi 0,0125 M ir C  A lygi 0,05 M, 100 ml bario hidroksido 
tirpalui titruoti reikia 50 ml, ir CO  2 masė nustatoma pagal lygt į: 
Í ð0,05Þ 
ð2Þ Î 
Ü ð44 Ü ml HCI sunaudoto titravimui  ¼ 1,1 Ü ml HCIÞ 
Taigi šiuo atveju titravimui sunaudoto HC1 t ūrio perskai čiavimo į 
susidariusio CO  2 mg faktorius yra 1,1.  
Naudodami atitinkamas titravimo vertes, apskai čiuokite vien iš 
sėjimo kult ūros bei iš s ėjimo kult ūros ir bandomosios chemin ės 
medžiagos gauto CO  2 mases, ir ši ų masių skirtumas yra mas ė 
CO 2 , susidariusio vien tik iš bandomosios chemin ės medžiagos.  
Pavyzdžiui, jei vien tik s ėjimo kultūros bandinio titravimas duoda 48 
ml, o sėjimo terp ės ir bandomosios chemin ės medžiagos bandinio 
titravimas duoda 45 ml,  
CO 2 iš sėjimo kult ūros = 1,1 × (50–48) = 2,2 mg  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 iš sėjimo kult ūros ir bandomosios chemin ės medžiagos = 1,1 x 
(50–45) = 5,5 mg  
taigi, iš bandomosios chemin ės medžiagos susidariusio CO  2 masė 
lygi 3,3 mg.  
Procentin ė biologinio skaidymo vert ė skaičiuojama pagal formul ę: 
Skaidymo % ¼ Í ðmg CO  2 išsiskyrusio Ü 100Þ 
ðThCO  2 Ü mg pridėtos bandomosios chemin ės medžiagosÞ Î 
arba,  
skaidymo % ¼ Í ðmg CO  2 išsiskyrusio Ü 100Þ 
ðpridėtos bandyme TOC kiekis  ðmgÞ Ü 3,67Þ Î 
3,67 yra anglies mas ės perskai čiavimo į anglies dioksido mas ę 
(44/12) faktorius.  
Skaidymo po bet kurio laiko intervalo procentin ę vertę gaukite prid ė­
dami procentines ThCO  2 vertes, apskai čiuotas kiekvienai parai, iki to 
laiko, kuriuo jis buvo išmatuotas.  
Absorberiams su natrio hidroksidu susidariusio anglies dioksido 
kiekį, išreikštą IC (mg), skai čiuokite daugindami IC koncentracij ą 
absorbente iš absorbento t ūrio. 
Procentin ę skaidymo vert ę skaičiuokite pagal:  
% of ThCO  2 ¼ Í 
ðIC kolboje su bandom ą medžiaga ðmgÞ – IC kolboje su tuš čiuoju bandiniu ðmgÞÞ 
ðTOC, prid ėtos kaip bandomoji medžiaga, mas ė ðmgÞÞ Î 
Ü 100 
Apskaičiuokite DOC šalinim ą (neprivaloma), kaip aprašyta I.7. Užra ­ 
šykite šiuos ir visus kitus rezultatus prid ėtose specifikacijose.  
IV.3.2.  Rezultat ų tinkamumas  
Bandomosios chemin ės medžiagos suspensijos mineralin ėje terpėje 
IC kiekis bandymo pradžioje turi b ūti mažesnis kaip 5 % TC, ir 
tuščiajame bandinyje bandymo pabaigoje viso išsiskyrusio CO  2 
kiekis paprastai neturi b ūti didesnis kaip 40 mg/l terp ės. Jei 
gaunamos didesn ės kaip 70 mg CO  2 /litre vert ės, duomenys ir ekspe ­
rimento metodika turi b ūti kritiškai ištirti.  
Žr. dar I.5.2.  
IV.3.3.  Ataskaita  
Žr. I.8.  
IV.4. SPECIFIKACIJA  
ANGLIES DIOKSIDO IŠSISKYRIMO BANDYMAS  
1. LABORATORIJA  
2. BANDYMO PRADŽIOS DATA  
3. BANDOMOJI MEDŽIAGA  
Pavadinimas:  
Pradinio tirpalo koncentracija: … mg/l, kaip chemin ės 
medžiagos  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Pradinė koncentracija terp ėje: … mg/l, kaip chemin ės 
medžiagos  
Bendras į kolbą įdėtos C kiekis: … mg C  
ThCO  2 : mg CO  2 
4. SĖJIMO KULT ŪRA 
Šaltinis:  
Kaip apdorota:  
Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:  
Suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: 
mg/l 
5. ANGLIES DIOKSIDO SUSIDARYMAS IR SKAIDUMAS  
Metodas: Ba(OH)  2 /NaOH/kitas  
Laikas 
(paros)  Bandinyje susidar ęs 
CO 2 (mg)  Tuščiajame bandinyje 
susidaręs CO  2 
(mg)  Bendras susidar ęs CO  2 
(mg) 
(bandinio vidutin ė 
vertė atėmus tuščiojo 
bandinio vidutin ę 
vertę) ThCO  2 
bendras Í ðCO  2 Þ 
ðThCO  2 Þ Î 
Ü 100  
1 
2 vidutinė 
vertė 3 
4 vidutinė 
vertė 1 2  1  2  vidutinė 
vertė 
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Pastaba . Panašūs formatai gali b ūti taikomi etaloninei medžiagai ir 
toksiškumo kontroliniams bandiniams.  
6. ANGLIES ANALIZ Ė (neprivaloma)  
Anglies analizatorius:  
Laikas (paros)  Tuš čiasis bandinys, mg/l  Bandomoji chemin ė medžiaga, mg/l  
0 C  b(o) C 0 
28 (*)  C  b(t) C t 
(*) Arba inkubavimo pabaigoje  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
pašalintos DOC %  ¼ Í 
1 – ðC t – C  bðtÞ Þ 
ðC t – C  bðoÞ Þ Î 
Ü 100  
7. ABIOTINIS SKAIDYMAS  (neprivalomas)  
abiotinio skaidymo %  ¼ Í 
ðCO  2 susidaręs CO sterilioje kolboje po 28 par ųÞ 
ðThCO  2 ðmgÞÞ Î 
Ü 100  
V DALIS.  MANOMETRINIS RESPIROMETRINIS 
BANDYMAS  (C.4-D metodas)  
V.1. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Išmatuotas mineralin ės terpės su sėjimo kult ūra tūris, turintis 
žinomos koncentracijos bandom ąją cheminę medžiag ą (100 mg/litre 
bandomosios medžiagos, duodan čios bent 50–100 mg ThOD/l), kuri 
nominaliai yra vienintelis organin ės anglies šaltinis, pastovioje 
temperatūroje (± 1 °C arba tiksliau) maišomas uždaroje kolboje iki 
28 parų. Deguonies suvartojimas nustatomas arba matuojant deguo ­
nies (elektrolitiškai pagaminto) kiek į, kurio reikia pastoviam duj ų 
tūriui respirometro kolboje palaikyti, arba pagal t ūrio arba sl ėgio 
(arba abiej ų kartu) kitim ą aparate. Išsiskyr ęs anglies dioksidas suge ­
riamas kalio hidroksido tirpalu arba kitu tinkamu absorbentu. Bando ­
mosios chemin ės medžiagos suvartoto deguonies kiekis (pataisytas 
atsižvelgiant į deguonies, suvartoto lygiagre čiai atliekamame tuš čia­
jame bandyme su s ėjimo kult ūra, kiekį) yra reiškiamas procentine 
ThOD arba COD verte. Neprivalomai, iš papildomos specifin ės 
analizės, atliekamos inkubavimo pradžioje ir pabaigoje, duomen ų 
galima apskai čiuoti pirmin į biologin į skaidym ą, o atliekant DOC 
analizę – biologin į suskaidym ą. 
V.2. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
V.2.1.  Aparat ūra 
a) tinkamas respirometras;  
b) termostatas, palaikantis temperat ūrą ± 1 °C tikslumu arba geriau;  
c) membraninio filtravimo įtaisas (neprivalomas);  
d) anglies analizatorius (neprivalomas).  
V.2.2.  Mineralin ės terpės ruošimas  
Apie pradini ų tirpalų ruošimą, žr. I.6.2.  
Sumaišykite 10 ml (a) tirpalo su 800 ml skiedimo vandens, įpilkite 
po 1 ml (b) – (d) tirpal ų ir praskieskite skiedimo vandeniu iki 1 litro.  
V.2.3.  Sėjimo kult ūros ruošimas ir pradinis kondicionavimas  
Sėjimo kult ūrą galima ruošti iš įvairių šaltinių: aktyvusis dumblas; 
nuotekų ištakiai; paviršiniai vandenys; dirvožemiai arba mišiniai iš 
šių šaltinių. 
Žr. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 ir I.6.5.  
V.2.4.  Kolb ų ruošimas  
Mineraline terpe skiesdami pradinius tirpalus, ruoškite atskiras serijas 
bandomosios ir etalonin ės chemini ų medžiag ų tirpalų, kuriuose 
cheminės medžiagos koncentracija paprastai b ūtų 100 mg/litre 
(gauti ThOD bent 50–100 mg/l).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
ThOD skai čiuokite pagal amonio drusk ų susidarym ą, jei nesitikite 
nitrifikavimo, kai skai čiuoti reikia pagal nitrat ų susidarym ą (žr. 2.2 
priedėlį). 
Nustatykite pH vertes ir prireikus nustatykite 7,4 ± 0,2.  
Mažai tirpios medžiagos turi b ūti pridedamos v ėlesnėje pakopoje (žr. 
toliau).  
Jei reikia nustatyti bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą, 
ruoškite dar vien ą tirpalą mineralin ėje terpėje, kuriame b ūtų ir bando­
moji ir etalonin ė medžiagos tokios koncentracijos, kokios yra atski ­
ruose tirpaluose.  
Jei reikia matuoti fizikochemin į deguonies suvartojim ą, ruoškite 
bandomosios chemin ės medžiagos tirpal ą, paprastai 100 mg ThOD/ ­
litre, kuris buvo sterilizuotas pridedant tinkamos nuodingos 
medžiagos (žr. I.6.6).  
Įpilkite reikiamus bandomosios ir etalonin ės medžiagos tirpal ų tūrius, 
atitinkamai, bent į dvi kolbas. Į kitas kolbas įpilkite tik mineralin ės 
terpės (sėjimo kult ūros kontroliniai bandiniai) ir, jei reikia, maišyt ą 
bandomosios ir etalonin ės chemini ų medžiag ų tirpalą ir steril ų 
tirpalą. 
Jei bandomoji medžiaga mažai tirpi, d ėkite jos pagal mas ę arba tūrį 
tiesiai šioje pakopoje arba apdorokite, kaip aprašyta 3 pried ėlyje. Į 
CO 2 absorberio sekcijas įpilkite kalio hidroksido, natrio kalki ų 
granulių arba kito absorbento.  
V.2.5.  Kolb ų skaičius tipiniame bandyme  
1 ir 2 kolba: bandomoji suspensija  
3 ir 4 kolba: s ėjimo kult ūros tuščiasis bandinys  
5 kolba: metodikos tikrinimo bandinys  
ir pageidautina bei kai b ūtina: 
6 kolba: sterilus kontrolinis bandinys  
7 kolba: toksiškumo kontrolinis bandinys  
Žr. dar I.6.7.  
V.2.6.  Bandymo proced ūra 
Leiskite kolboms pasiekti tinkam ą temperat ūrą ir į atitinkamas kolbas 
įdėkite tiek s ėjimo kult ūros iš paruošto aktyviojo dumblo arba 
kitokio jos šaltinio, kad suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija 
būtų ne didesn ė kaip 30 mg/litre. Surinkite įrangą, įjunkite purtykl ę, 
patikrinkite hermetiškum ą ir pradėkite matuoti deguonies suvarto ­
jimą. Paprastai toliau priži ūrėti nereikia, išskyrus tai, kad reikia užra ­ 
šyti būtinus rodmenis ir atlikti kasdienius tikrinimus norint įsitikinti, 
kad palaikoma teisinga temperat ūra ir tinkamas maišymas.  
Pagal dažnai ir reguliariais intervalais užrašomus rodmenis skai čiuo­
kite deguonies suvartojim ą, taikydami įrangos gamintojo nurodytus 
metodus. Inkubavimo pabaigoje, paprastai po 28 par ų, matuokite 
kolbų turinio pH, ypa č jei deguonies suvartojimas yra mažas arba 
didesnis nei ThODN  H4 (azoto turintiems junginiams).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Jei reikia, bandymo pradžioje ir pabaigoje iš respirometrini ų kolbų 
paimkite bandinius DOC analizei arba specifinei cheminei analizei 
(žr. 2.4 pried ėlį). Imdami bandymo pradžioje užtikrinkite, kad 
kolboje likusios bandomosios suspensijos t ūris būtų žinomas. Kai 
deguonį vartoja azoto turinti bandomoji medžiaga, nustatykite nitrito 
ir nitrato koncentracijos did ėjimą per 28 paras ir apskai čiuokite 
pataisą dėl deguonies, suvartoto nitrifikavimui (5 pried ėlis). 
V.3. DUOMENYS IR ATASKAITA  
V.3.1.  Rezultat ų apdorojimas  
Padalinkite kiek į (mg) deguonies, suvartoto bandomosios chemin ės 
medžiagos per tam tikr ą laiką (pataisyt ą atsižvelgiant į deguonies, 
suvartoto per t ą patį laiką tuščiajame sėjimo kult ūros kontroliniame 
bandinyje, kiek į) iš paimtos bandomosios chemin ės medžiagos 
masės. Taip gausite BOD, skai čiuojamą mg deguonies/mg bandomo ­
sios chemin ės medžiagos, taigi:  
BOD ¼ ðO 2 suvartojimas bandom ąja chemine medžiaga  ðmgÞ – O  2 suvartojimas tuš čiagame bandinyje ðmgÞÞ 
ðbandomosios medžiagos kolboje  ðmgÞÞ 
= mg O  2 vienam mg bandomosios chemin ės medžiagos  
biologinio skaidymo procentin ę vertę skaičiuokite pagal: 
biologinio skaidymo %  ¼ % ThOD ¼ Í 
ðBODðmg O  2=mg chemin ės medžiagosÞÞ 
ðThODðmg O  2 cheminei medžiagai ÞÞ Î 
Ü 100  
arba pagal: 
% COD ¼ Í 
ðBODðmg O  2=mg chemin ės medžiagosÞÞ 
ðCODðmg O  2 cheminės medžiagosÞÞ Î 
Ü 100  
Reikia pažym ėti, kad šie du metodai neb ūtinai duoda t ą pačią vertę; 
geriau naudoti pirmesn į metodą. 
Azoto turin čioms bandomosioms medžiagoms naudokite atitinkamas 
ThOD vertes (NH  4 arba NO  3 ) pagal tai, kas yra žinoma apie nitri ­
fikavimo galimyb ę arba ko iš jo laukiama (2.2 pried ėlis). Jei nitrifi ­
kavimas vyksta, ta čiau ne iki galo, pataisas nitrifikuoti suvartotam 
deguoniui skai čiuokite pagal nitrito ir nitrato koncentracij ų pokyčius 
(5 priedėlis). 
Kai atliekama neprivaloma organin ės anglies ir (arba) specifin ė 
analizė, apskaičiuokite skaidymo procentin ę vertę, kaip tai aprašyta 
I.7. 
Visus rezultatus užrašykite į pridedamas specifikacijas.  
V.3.2.  Rezultat ų tinkamumas  
Paprastai deguonies suvartojimas s ėjimo kult ūros tuščiajame bandi ­
nyje per 28 paras yra 20–30 mg O  2 /l ir neturi b ūti didesnis kaip 60 
mg/l. Jei vert ės didesnės kaip 60 mg/l, b ūtina kritiškai ištirti 
duomenis ir eksperimento metodikas. Jei pH vert ė nepatenka į 
6–8,5 interval ą, o bandomoji medžiaga deguonies suvartoja mažiau 
kaip 60 %, bandymas turi b ūti pakartotas su mažesne bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracija.  
Žr. dar I.5.2.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Ataskaita  
Žr. I.8.  
V.4. SPECIFIKACIJA  
Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.  
MANOMETRIN ĖS RESPIROMETRIJOS BANDYMAS  
1. LABORATORIJA  
2. BANDYMO PRADŽIOS DATA  
3. BANDOMOJI MEDŽIAGA  
Pavadinimas:  
Pradinio tirpalo koncentracija: … mg/l  
Pradinė koncentracija terp ėje, C  0 : … mg/l  
Tūris bandymo kolboje (V): … ml  
ThOD arba COD: … mg O  2 /mg bandomosios medžiagos (NH  4 
arba NO  3 ) 
4. SĖJIMO KULT ŪRA 
Šaltinis:  
Kaip apdorota:  
Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:  
Suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija reakcijos mišinyje: 
… mg/l  
5. DEGUONIES SUVARTOJIMAS. BIOLOGINIS SKAI ­
DUMAS  
Laikas (paros)  
0 7  14  21  28  
O 2 suvarto­
jimas. (mg) 
bandomoji 
cheminė 
medžiaga  1 
2 
a, vidutin ė 
vertė 
O 2 suvarto­
jimas (mg) 
tuščiasis 
bandinys  3 
4 
b, vidutin ė 
vertė 
Pataisyta BOD 
vertė (mg)  (a 1 - b m ) 
(a 2 - b m ) 
BOD vienam 
mg bandomo ­
sios chemin ės 
medžiagos ða 1 – bÞ 
ðC o VÞ 
ða 2 – bÞ 
ðC o VÞ ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Laikas (paros)  
0 7  14  21  28  
Skaidymo % 
Í ðBODÞ 
ðThODÞ Î 
Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
vidutinė 
vertė (*) 
V = terpės tūris bandymo kolboje 
(*) D  1 ir D  2 vidutinė vertė neturi būti skaičiuojama, jei tarp ver čių yra didelis skirtumas.  
Pastaba.  Panašūs formatai gali b ūti taikomi etaloninei medžiagai ir 
toksiškumo kontroliniams bandiniams.  
6. PATAISA D ĖL NITRIFIKAVIMO  (žr. 5 pried ėlį) 
Para 0  28  Skirtumas  
i) Nitrato koncentracija (mg N/l)  (N)  
ii) Deguonies ekvivalentas (4,57 × N × V) (mg)  —  —  
iii) Nitrito koncentracija (mg N/l)  (N)  
iv) Deguonies ekvivalentas (3,43 × N × V) (mg)  —  —  
ii + iv) Bendrasis deguonies ekvivalentas  —  —  
7. ANGLIES ANALIZ Ė (neprivaloma)  
Anglies analizatorius:  
Laikas (paros)  Tuš čiasis bandinys, mg/l  Bandomoji chemin ė medžiaga, mg/l  
0 C  b(o) C 0 
28 (*)  C  b(t) C t 
(*) Arba inkubavimo pabaigoje.  
DOC pašalinimas %  ¼ Í 
1 – Í ðC t – C  blt Þ 
ðC o – C  blo Þ Î Î 
Ü 100  
8. SPECIFIN Ė CHEMIN Ė ANALIZ Ė (neprivaloma)  
S b = koncentracija fizikochemini ų procesų (steriliame) kont ­
roliniame bandinyje po 28 par ų 
S a = koncentracija kolboje su s ėjimo kult ūra po 28 par ų. 
biologinio skaidymo % =  Í ðS b – S  a Þ 
ðS b Þ Î 
Ü 100  
9. ABIOTINIS SKAIDYMAS  (neprivalomas)  
a = deguonies suvartojimas steriliose kolbose po 28 par ų 
(mg)  
deguonies suvartojimas mg bandomosios chemin ės medžiagos 
= ða Ü 100Þ 
ðC o VÞ ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(žr. 1 ir 3 skirsnius)  
abiotinio skaidymo %  ¼ ða Ü 100Þ 
ðC o V Ü ThODÞ 
VI DALIS.  UŽDAROSIOS KOLBOS BANDYMAS  (C.4-E 
metodas)  
VI.1 BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Į bandomosios chemin ės medžiagos tirpal ą mineralin ėje terpėje, 
paprastai 2–5 mg/l, dedama s ėjimo kult ūra, turinti palyginti mažai 
mikroorganizm ų iš mišrios populiacijos, ir tirpalas laikomas tamsoje 
visiškai pilnose ir uždarytose kolbose pastovios temperat ūros sąly­
gomis. Skaidymas sekamas 28 paras analizuojant ištirpus į deguonį. 
Bandomosios medžiagos suvartotas deguonies kiekis, pakoregavus 
atsižvelgiant į deguonies, suvartoto lygiagre čiai atliekamame tuš čia­
jame bandyme su s ėjimo kult ūra, kiekį, yra išreikiamas procentine 
ThOD arba COD verte.  
VI.2. METODO APRAŠYMAS  
VI.2.1.  Aparat ūra 
a) BOD kolbos su šlifo kamš čiais, pvz., 250–300 ml;  
b) vandens vonia arba inkubatorius kolboms laikyti pastovioje 
temperatūroje (± 1 °C arba geriau) ir be apšvietimo;  
c) didelės stiklinės kolbos (2–5 litr ų) terpei ruošti ir BOD kolboms 
pildyti;  
d) deguonies elektrodas ir matuoklis, arba įranga ir reagentai titruoti 
Winklerio metodu.  
VI.2.2.  Mineralin ės terpės ruošimas  
Apie pradini ų tirpalų ruošimą žr. I.6.2.  
Sumaišykite po 1 (vien ą) ml (a) – (d) tirpal ų ir praskieskite skiedimo 
vandeniu iki 1 litro.  
VI.2.3.  Sėjimo kult ūros ruošimas  
Sėjimo kult ūra paprastai gaunama iš nuotek ų valymo įrenginio arba 
laboratorinio valymo įrenginio, į kuriuos daugiausia patenka buitin ės 
nuotekos, antrinio ištakio. Alternatyvus s ėjimo kult ūros šaltinis yra 
paviršinis vanduo. Paprastai 1 litrui terp ės naudokite nuo vieno lašo 
(0,05 ml) iki 5 ml filtrato; gali tekti atlikti bandymus, kad gal ėtumėte 
nustatyti tam tikram ištakiui optimal ų tūrį (žr. I.6.4.2 ir I.6.5).  
VI.2.4.  Kolb ų ruošimas  
Stipriai aeruokite mineralin ę terpę bent 20 min. Atlikite kiekvien ą 
bandymų grupę su mineraline terpe, gauta vienos partijos. Dažniau ­
siai terpė yra tinkama naudoti po 20 h laikymo bandymo tempera ­
tūroje. Kontrol ės tikslams nustatykite ištirpusio deguonies koncent ­
raciją; jos vertė 20 °C temperat ūroje turi b ūti apie 9 mg/l. Visus oru 
prisotintos terp ės pernešimo ir užpildymo veiksmus atlikite neleis ­
dami susidaryti oro burbuliukams, pvz., naudodami sifonus.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Paruoškite lygiagre čias BOD kolb ų grupes bandomajai ir etaloninei 
cheminei medžiagai nustatyti tuo pat metu darom ų eksperiment ų 
serijose. Surinkite pakankam ą skaičių BOD kolb ų, įskaitant kolbas 
tuščiajam bandiniui su s ėjimo kultūra, kad gal ėtumėte daryti bent po 
du deguonies suvartojimo matavimus norimais laiko tarpais, pvz., po 
0, 7, 14, 21 ir 28 par ų. Norint užtikrinti galimyb ę identifikuoti 10 
parų langą, kolbų gali reik ėti daugiau.  
Į dideles kolbas įpilkite visiškai aeruotos mineralin ės terpės, kad ji 
užimtų maždaug tre čdalį kolbos t ūrio. Tuomet į atskiras dideles 
kolbas įpilkite pakankam ą kiekį bandomosios ir etalonin ės chemini ų 
medžiagų pradinių tirpalų taip, kad galutin ė chemini ų medžiag ų 
koncentracija paprastai b ūtų ne didesn ė kaip 10 mg/litre. Į vieną 
didelę kolbą su tuščiojo kontrolinio bandinio terpe chemini ų 
medžiagų nedėkite. 
Norint užtikrinti, kad s ėjimo kult ūros aktyvumas neb ūtų ribojamas, 
ištirpusio deguonies koncentracija BOD kolbose neturi sumaž ėti 
daugiau kaip iki 0,5 mg/litre. Tai nustato maždaug 2 mg/litre rib ą 
tiriamosios chemin ės medžiagos koncentracijai. Ta čiau sunkiai skai ­
domų junginių ir tų junginių, kurių ThOD mažas, koncentracija gali 
būti 5–10 mg/l. Kai kuriais atvejais b ūtų patartina atlikti lygiagre čias 
bandymų serijas su dviem bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracijomis, pvz., 2 ir 5 mg/l. Paprastai ThOD skai čiuokite 
pagal amonio drusk ų susidarym ą, tačiau, jei manoma arba žinoma, 
kad gali vykti nitrifikavimas, skai čiuokite remdamiesi nitrato susida ­
rymu (ThOD  NO3 : žr. 2.2 pried ėlį). Jei nitrifikavimas vyksta, ta čiau ne 
iki galo, pataisas nitrifikuoti suvartotam deguoniui skai čiuokite pagal 
nitrito ir nitrato koncentracij ų pokyčius (žr. 5 pried ėlį). 
Jei turi b ūti ištirtas bandomosios medžiagos toksiškumas (pvz., jei 
anksčiau buvo nustatytos mažos biologinio skaidumo vert ės), reikia 
turėti dar vien ą kolbų seriją. 
Paruoškite dar vien ą didelę kolbą, kurioje b ūtų aeruota mineralin ė 
terpė (maždaug tre čdalis kolbos t ūrio) ir bandomoji bei etalonin ė 
cheminės medžiagos, kuri ų galutinė koncentracija b ūtų tokia pati, 
kaip ir kitose didel ėse kolbose.  
Į tirpalus didel ėse kolbose įpilkite sėjimo kult ūros iš antrinio ištakio 
(nuo vieno lašo arba apie 0,05 ml iki 5 ml/l) arba iš kito šaltinio, 
pvz., upės vandens (žr. I.6.4.2). Pabaigoje tirpalus skieskite aeruota 
mineraline terpe iki žym ės ant kolbos, naudodami į jos dugn ą 
nuleistą žarną, kad būtų atitinkamas maišymas.  
VI.2.5.  Kolb ų skaičius tipiniame bandyme  
Tipiniame bandyme naudojamos tokios kolbos:  
— bent 10 su bandom ąja chemine medžiaga ir s ėjimo kult ūra 
(bandomoji suspensija),  
— bent 10 tik su s ėjimo kultūra (tuščiasis sėjimo kultūros bandinys),  
— bent 10 su etalonine chemine medžiaga ir s ėjimo kult ūra (meto­
dikos tikrinimo bandinys),  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— ir, kai b ūtina, 6 kolbos su bandom ąja chemine medžiaga, etalo ­
nine chemine medžiaga ir s ėjimo kultūra (toksiškumo kontrolinis 
bandinys). Ta čiau, norint užtikrinti galimyb ę identifikuoti 10 par ų 
langą, kolbų reikėtų maždaug du kartus daugiau.  
VI.2.6. Bandymo proced ūra 
Naudodami žarn ą, nuleistą į apatinį atitinkamos didel ės kolbos 
ketvirtį (ne į dugną), iš karto išpilstykite kiekvien ą paruoštą tirpalą 
į atitinkam ą BOD kolb ų grupę taip, kad visos BOD kolbos b ūtų 
visiškai užpildytos. Švelniai patapšnokite kolbas, kad b ūtų pašalinti 
visi oro burbuliukai. Neatid ėliojant nustatykite pradin ę ištirpusio 
deguonies koncentracij ą kolbose, taikydami Winklerio arba elektrodo 
metodą. Kolbų turinį galite išsaugoti v ėlesnei analizei Winklerio 
metodu, prid ėdami mangano (II) sulfato ir natrio hidroksido 
(pirmasis Winklerio reagentas). Gerai užkimštas kolbas su deguo ­
nimi, surištu į rudą mangano (III) hidratuot ą oksidą, laikykite 
tamsoje 10–20 °C temperat ūroje ne ilgiau kaip 24 valandas prieš 
atlikdami likusius veiksmus pagal Winklerio metod ą. Likusias lygia ­
grečiai paruoštas kolbas užkimškite taip, kad į jas nepatekt ų oro 
burbuliuk ų, ir inkubuokite tamsoje 20 °C temperat ūroje. Kiekvien ą 
seriją turi lydėti pilna lygiagreti serija, skirta tuš čiojo bandinio terp ės 
su sėjimo kultūra analizei. Paimkite iš kiekvienos serijos bent po dvi 
kolbas ištirpusio deguonies analizei tam tikrais laiko tarpais (bent kas 
savaitę) per 28 inkubavimo paras.  
Savaitiniai bandiniai turi leisti įvertinti šalinimo procentin ę vertę 14 
parų lange, tuo tarpu bandini ų analizė kas 3–4 paras turi leisti iden ­
tifikuoti 10 par ų langą, o tam reik ėtų maždaug du kartus daugiau 
kolbų. 
Azoto turin čioms bandomosioms medžiagoms turi b ūti daroma 
pataisa dėl deguonies suvartojimo bet kokiame nitrifikavimo procese. 
Tam padaryti taikykite O  2 -elektrodo metod ą ištirpusio deguonies 
koncentracijai nustatyti, o po to iš BOD kolbos paimkite bandin į 
nitrito ir nitrato analizei. Pagal nitrito ir nitrato koncentracijos padi ­
dėjimą apskaičiuokite suvartot ą deguonį (žr. 5 pried ėlį). 
VI.3. DUOMENYS IR ATASKAITA  
VI.3.1.  Rezultat ų apdorojimas  
Iš pradžių apskaičiuokite BOD, kuris pasireiškia per kiekvien ą laiko 
periodą, atimdami deguonies suvartojimo tuš čiajame bandinyje vert ę 
(mg O  2 /litre) iš deguonies suvartojimo bandom ąja medžiaga. Gauti 
savitajai BOD vertei, skai čiuojamai mg deguonies vienam mg bando ­
mosios chemin ės medžiagos, ši ą pataisytą suvartojimo vert ę dalinkite 
iš bandomosios medžiagos koncentracijos (mg/litre). Biologinio skai ­
dumo procentin ę vertę skaičiuokite dalindami savit ąjį BOD iš savi ­
tojo ThOD (apskai čiuoto pagal 2.2 pried ėlį) arba COD (nustatyto 
analizės būdu, žr. 2.3 pried ėlį), taigi:  
BOD ¼ Í ðO 2 suvartojimas bandom ąja chemine medžiaga  ðmgÞ – O  2 suvartojimas tuš čiajame bandinyje ðmgÞÞ 
ðbandomosios medžiagos kiekis kolboje  ðmgÞÞ Î ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= kiekis O  2 (mg) vienam mg bandomosios chemin ės medžiagos 
Skaidymo % ¼ Í ðBOD ðmg O  2=mg bandomosios chemin ės medžiagosÞÞ 
ðThODðmg O  2=mg bandomosios chemin ės medžiagosÞÞ Î 
Ü 100  
Arba 
Skaidymo % ¼ Í ðBOD ðmg O  2=mg bandomosios chemin ės medžiagosÞÞ 
ðCODðmg O  2=mg bandomosios chemin ės medžiagosÞÞ Î 
Ü 100  
Reikia pažym ėti, kad šie du metodai neb ūtinai duoda t ą pačią vertę; 
geriau naudoti pirmesn į metodą. 
Azoto turin čioms medžiagoms naudokite atitinkamas ThOD vertes 
(NH  4 arba NO  3 ) pagal tai, kas yra žinoma apie nitrifikavimo gali ­
mybę arba ko iš jo laukiama (2.2 pried ėlis). Jei nitrifikavimas vyksta, 
tačiau ne iki galo, pataisas nitrifikuoti suvartotam deguoniui skai ­ 
čiuokite pagal nitrito ir nitrato koncentracij ų pokyčius (5 pried ėlis). 
VI.3.2.  Rezultat ų tinkamumas  
Deguonies suvartojimas tuš čiajame bandinyje su s ėjimo kult ūra po 
28 parų turi būti ne didesnis kaip 1,5 mg/litre ištirpusio deguonies. 
Jei vertės didesnės, reikia tikrinti eksperimento metodikas. Likutin ė 
deguonies koncentracija bet kuriuo momentu bandymo kolbose neturi sumaž ėti daugiau kaip iki 0,5 mg/litre. Toki ų mažų deguonies 
lygių nustatymas yra tinkamas tik tokiu atveju, jei ištirpusio deguo ­
nies nustatymo metodu įmanoma tiksliai juos matuoti.
 
Žr. dar I.5.2.  
VI.3.3.  Ataskaita  
Žr. I.8.  
VI.4. SPECIFIKACIJA  
Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.  
UŽDAROSIOS KOLBOS BANDYMAS  
1. LABORATORIJA  
2. BANDYMO PRADŽIOS DATA  
3. BANDOMOJI MEDŽIAGA  
Pavadinimas:  
Pradinio tirpalo koncentracija: … mg/litre  
Pradinė koncentracija kolboje: … mg/litre  
ThOD arba COD: … mg O  2 /mg bandomosios medžiagos  
4. SĖJIMO KULT ŪRA 
Šaltinis:  
Kaip apdorota:  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Pradinis kondicionavimas, jei toks buvo:  
Koncentracija reakcijos mišinyje: … mg/litre  
5. DO NUSTATYMAS  
Metodas: Winklerio/elektrodas  
Kolbų turinio analiz ė 
Inkubavimo trukm ė (paros)  DO (mg/l)  
0 n  1 n 2 
Tuščiasis bandinys 
(be chemin ės 
medžiagos)  1 C  1 
2 C  2 
Vidutinė vertė 
m b ¼ ðC 1 þ C 2 Þ 
ð2Þ 
Bandomoji chemin ė 
medžiaga  1 a  1 
2 a  2 
Vidutinė vertė 
m t ¼ ða 1 þ a 2 Þ 
ð2Þ 
Pastaba.  Panašus formatas gali b ūti taikomas etaloninei medžiagai ir 
toksiškumo kontroliniam bandiniui.  
6. PATAISA D ĖL NITRIFIKAVIMO  (žr. 5 pried ėlį) 
Inkubavimo trukm ė (paros)  0  n  1 n 2 n 3 
i) Nitrato koncentracija (mg N/litre)  
ii) Nitrato koncentracijos pokytis (mg N/litre)  —  
iii) Deguonies ekvivalentas (mg/litre)  —  
iv) Nitrito koncentracija (mg N/litre)  
v) Nitrito koncentracijos pokytis (mg N/litre)  —  
vi) Deguonies ekvivalentas (mg/litre)  —  
iii + vi) Bendrasis deguonies ekvivalentas (mg/litre)  —  
7. DO SUVARTOJIMAS. SKAIDYMO %  
Suvartota per n par ų (mg/litre)  
n 1 n 2 n 3 
KOLBA 1: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) 
KOLBA 2: (m  to – m  tx ) – (m  bo – m  bx ) ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Suvartota per n par ų (mg/litre)  
n 1 n 2 n 3 
KOLBA 1: 
D 1 % ¼ ð½ðm to – m  tx Þ – ðm bo – m  bx Þâ Ü 100Þ 
ðbandymo koncentracija  Ü cheminės medžiagos ThOD Þ 
KOLBA 2: 
D 2 % ¼ ð½ðm to – m  tx Þ – ðm bo – m  bx Þâ Ü 100Þ 
ðbandymo koncentracija  Ü cheminės medžiagos Ü ThODÞ 
D % vidutin ė vertė (*) = ðD 1 – D  2 Þ 
ð2Þ 
(*) Jei tarp lygiagre čių nustatym ų yra didelis skirtumas, vidutin ės vertės neskaičiuokite.  
m to = vertė bandymo kolboje laiku 0  
m tx = vertė bandymo kolboje laiku x  
m bo = tuščiojo bandinio vidutin ė vertė laiku 0  
mb x = tuščiojo bandinio vidutin ė vertė laiku x  
Taip pat darykite patais ą dėl nitrifikavimo, naudodami 6 skyriaus iii 
+ vi.  
8. DO SUVARTOJIMAS TUŠ ČIAJAME BANDINYJE  
Deguonies suvartojimas tuš čiajame bandinyje: (m  bo – m  b28 ) 
mg/litre. Šis suvartojimas svarbus bandymo tinkamumui. Suvartojimas turi b ūti mažesnis kaip 1,5 mg/litre.
 
VII DALIS.  M.I.T.I. BANDYMAS  (C.4-F metodas)  
VII.1. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Deguonies suvartojimas maišomu bandomosios medžiagos tirpalu 
arba suspensija mineralin ėje terpėje, į kurį dedama specialiai auginta 
neadaptuot ų mikroorganizm ų kultūra, 28 paras automatiškai matuo ­
jamas tamsoje ir 25 ± 1 °C temperat ūroje laikomame uždarame 
respirometre. Išsiskyr ęs anglies dioksidas absorbuojamas natrio 
kalkėmis. Biologinis skaidumas reiškiamas deguonies suvartojimo 
(pataisyto atsižvelgiant į suvartojim ą tuščiajame bandinyje) procen ­
tine teorinio suvartojimo (ThOD) dalimi. Be to, pirminio biologinio skaidumo procentin ė vertė skaičiuojama pagal papildomos specifin ės 
cheminės analizės, atliekamos inkubavimo pradžioje ir pabaigoje, 
duomenis ir, neprivalomai, pagal DOC analiz ės duomenis.
 
VII.2. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
VII.2.1.  Aparat ūra 
a) Automatinis elektrolitinis BOD matuoklis arba respirometras, 
paprastai su 6 kolbomis, kuri ų kiekvienos t ūris 300 ml, ir su 
indu CO  2 absorbentui laikyti;  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) patalpa su pastovia temperat ūra ir (arba) vandens vonia 
25 °C ± 1 °C arba geriau;  
c) membraninio filtravimo įtaisas (neprivalomas);  
d) anglies analizatorius (neprivalomas).  
VII.2.2.  Mineralin ės terpės ruošimas  
Paruoškite šiuos pradinius tirpalus, naudodami analiziškai grynus 
reagentus ir vanden į (I.6. 1): 
a) Kalio dihidrofosfatas, KH  2 PO 4 8,50 g  
Kalio hidrofosfatas, K  2 HPO  4 21,75 g  
Natrio hidrofosfatas, dodekahidratas, Na  2 HPO  4 12 
H 2 O 44,60 g  
Amonio chloridas, NH  4 Cl 1,70 g  
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro  
Tirpalo pH turi b ūti 7,2  
b) Magnio sulfatas, heptahidratas, MgSO  4 7 H  2 O 22,50 g  
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro  
(c) Kalcio chloridas, bevandenis, CaCl  2 27,50 g  
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro  
(d) Geležies (III) chloridas, heksahidratas, FeCl  3 6 
H 2 O 0,25 g  
Ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 1 litro  
Imkite 3 ml kiekvieno (a), (b), (c) ir (d) tirpalo ir praskieskite iki 1 
litro.  
VII.2.3.  Sėjimo kult ūros ruošimas  
Surinkite šviežius bandinius iš ne mažiau kaip dešimties viet ų, 
daugiausia iš toki ų, kuriose įvairios chemin ės medžiagos naudojamos 
ir šalinamos. Iš toki ų vietų kaip, pvz., nuotek ų valymo įrenginių, 
pramonini ų nuotekų valymo įrenginių, upių, ežerų, jūrų, surinkite 1 
l dumblo, paviršiaus dirvožemio, vandens ir t. t. bandini ų ir gerai 
juos kartu sumaišykite. Pašalinkite paviršiuje plaukiojan čias 
medžiagas ir palikite nusistov ėti, po to natrio hidroksidu arba fosforo 
rūgštimi nustatykite skys čio virš nuos ėdų pH vertę 7 ± 1.  
Atitinkam ą filtruoto skys čio virš nuos ėdų tūrį naudokite užpildyti 
aktyviojo dumblo užpildymo ir išleidimo ( fill-and-draw ) indą ir 
aeruokite skyst į maždaug 231/2 h. Trisdešimt minu čių po aeravimo 
pabaigos maždaug tre čdalį viso skys čio virš nuos ėdų išpilkite ir ant 
nusodintos medžiagos užpilkite tok į pat tūrį tirpalo (pH 7), kuriame 
būtų po 0,1 % gliukoz ės, peptono ir kalio dihidrofosfato, ir v ėl 
aeruokite. Kartokite ši ą procedūrą kartą per dieną. Dumblo įrenginys 
turi būti eksploatuojamas laikantis geros praktikos: ištakiai turi b ūti 
skaidrūs, turi būti palaikoma 25 ± 2 °C temperat ūra, pH turi b ūti 7 ± 
1, dumblas turi gerai nusistov ėti, turi būti pakankamas aeravimas, 
kad mišinys vis ą laiką būtų aerobinis, turi b ūti paprasčiausių viena­
ląsčių organizm ų ir dumblo aktyvumas turi b ūti tikrinamas pagal 
etaloninę medžiag ą bent kas tris m ėnesius. Dumblo kaip s ėjimo 
kultūros nenaudokite anks čiau kaip po m ėnesio nuo proceso 
pradžios, bet ne v ėliau kaip po keturi ų mėnesių. Po to, imkite bandi ­
nius bent iš 10 viet ų reguliariais laiko tarpais, kart ą per tris m ėnesius.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Norint, kad senojo ir naujojo dumblo aktyvumas b ūtų toks pat, 
sumaišykite vienodus t ūrius filtruoto skys čio virš naudojamo akty ­
viojo dumblo ir filtruoto skys čio virš šviežiai surinkto dešimties 
šaltinių mišinio ir auginkite mikroorganizmus supiltuose skys čiuose, 
kaip tai aprašyta aukš čiau. Imkite dumbl ą naudoti kaip s ėjimo 
kultūrą 18–24 h po to, kai įrenginys buvo įkrautas.  
VII.2.4.  Kolb ų ruošimas  
Paruoškite tokias šešias kolbas:  
Nr. 1: bandomosios chemin ės medžiagos tirpalas skiedimo vande ­
nyje, 100 mg/l  
Nr. 2, 3 ir 4: bandomosios chemin ės medžiagos tirpalas mineralin ėje 
terpėje, 100 mg/l  
Nr. 5: etalonin ės chemin ės medžiagos (pvz., anilino) tirpalas mine ­
ralinėje terpėje, 100 mg/l  
Nr. 6: tik mineralin ė terpė 
Mažai tirpias medžiagas d ėkite tiesiai pagal mas ę arba pagal t ūrį arba 
apdorokite, kaip aprašyta 3 pried ėlyje, išskyrus tai, kad neturi b ūti 
naudojami nei tirpikliai, nei emulsikliai. Į visas kolbas specialiuose 
induose įdėkite CO  2 absorbento. Kolbose Nr. 2, 3 ir 4 nustatykite pH 
vertę 7,0.  
VII.2.5.  Bandymo proced ūra 
Į kolbas Nr. 2, 3 ir 4 (bandomosios suspensijos), Nr. 5 (aktyvumo 
kontrolinis bandinys) ir Nr. 6 (tuš čiasis bandinys su s ėjimo kult ūra) 
įpilkite maž ą tūrį sėjimo kult ūros, kad suspenduot ų kietųjų dalelių 
koncentracija b ūtų 30 mg/l. S ėjimo kult ūros nedėkite į kolbą Nr. 1, 
kurioje yra abiotinio skaidymo kontrolinis bandinys. Surinkite įrangą, 
patikrinkite hermetiškum ą, įjunkite purtykles ir prad ėkite matuoti 
deguonies suvartojim ą tamsoje. Kasdien tikrinkite temperat ūrą, 
purtyklę ir kulonometrin į deguonies suvartojimo registravimo įren­
ginį bei stebėkite bet kokius kolb ų turinio spalvos kitimus. Deguo ­
nies suvartojimo rodmenis šešiose kolbose registruokite tiesiogiai 
tinkamu metodu, pvz., šeši ų taškų savirašiu, br ėžiančiu BOD kreiv ę. 
Inkubavimo pabaigoje, kuris paprastai t ęsiamas 28 paras, išmatuokite 
kolbų turinio pH ir nustatykite likusios bandomosios medžiagos ir 
kiekvieno tarpinio produkto koncentracij ą, ir, vandenyje tirpios 
medžiagos atveju, DOC koncentracij ą (2.4 pried ėlis). Imkit ės 
ypatingų priemoni ų lakiųjų chemini ų medžiag ų atveju. Jei tikit ės, 
kad gali vykti nitrifikavimas, nustatykite nitrito ir nitrato koncentra ­
ciją, jei tai įmanoma.  
VII.3. DUOMENYS IR ATASKAITA  
VII.3.1.  Rezultat ų apdorojimas  
Padalinkite kiek į (mg) deguonies, bandomosios chemin ės medžiagos 
suvartoto per tam tikr ą laiką ir pataisyt ą atsižvelgiant į deguonies, 
suvartoto per t ą patį laiką tuščiajame sėjimo kult ūros bandinyje, 
kiekį, iš naudojamos bandomosios chemin ės medžiagos mas ės. 
Taip gaunamas BOD, skai čiuojamas mg deguonies/mg bandomosios 
medžiagos, taigi:  
BOD ¼ Í ðO 2 suvartojimas bandom ąja chemine medžiaga  ðmgÞ – O  2 suvartojimas tuš čiajame bandinyje ðmgÞÞ 
ðbandomosios medžiagos kiekis kolboje  ðmgÞÞ Î 
= kiekis O  2 (mg) vienam mg bandomosios chemin ės medžiagos  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Tuomet biologinio skaidymo procentin ė vertė gaunama pagal lygt į: 
Skaidymo % ¼ % ThOD ¼ Í 
ðBOD ðmg O  2= mg chemin ės medžiagosÞÞ 
ðThOD ðmg O  2= mg chemin ės medžiagosÞÞ Î 
Ü 100  
Mišinių ThOD skai čiuokite pagal elementin ę analizę, kaip paprasto 
junginio. Naudokite atitinkamas ThOD (ThOD  NH4 arba ThOD  NO3 ) 
vertes pagal tai, ar nitrifikavimas nevyksta, ar jis yra visiškas (2.2 
priedėlis). Jei nitrifikavimas vyksta, ta čiau ne iki galo, pataisas nitri ­
fikuoti suvartotam deguoniui skai čiuokite pagal nitrito ir nitrato 
koncentracij ų pokyčius (5 pried ėlis). 
Pirminio biologinio skaidymo procentin ę vertę skaičiuokite pagal 
specifinės (pradin ės) chemin ės medžiagos kiekio maž ėjimą (žr. 
I.7.2).  
D t ¼ Í ðS b – S  a Þ 
ðS b Þ Î 
Ü 100 %  
Nurodykite ataskaitoje, jei sumaž ėjo bandomosios medžiagos 
koncentracija kolboje Nr. 1, kurioje matuojamas fizikocheminis paša ­
linimas, o bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą (S b ), šioje 
kolboje po 28 par ų naudokite apskai čiuoti biologinio skaidymo 
procentinei vertei.  
Kai daromi DOC nustatymai (neprivalomi), apskai čiuokite biologinio 
suskaidymo procentin ę vertę pagal:  
D t ¼ Í 
1 – ðC t – C  bt Þ 
ðC o – C  bo Þ Î 
Ü 100 %,  
kaip aprašyta I.7.1. punkte. Jei DOC kiekis sumaž ėjo kolboje Nr. 1, 
DOC koncentracij ą šioje kolboje naudokite apskai čiuoti biologinio 
skaidymo procentinei vertei.  
Visus rezultatus užrašykite pateiktose specifikacijose.  
VII.3.2.  Rezultat ų tinkamumas  
Paprastai deguonies suvartojimas s ėjimo kult ūros tuščiajame bandi ­
nyje per 28 paras yra 20–30 mg O  2 /litre ir neturi b ūti didesnis kaip 
60 mg/litre. Jei vert ės didesnės kaip 60 mg/litre, b ūtina kritiškai 
ištirti duomenis ir eksperimento metodikas. Jei pH vert ė nepatenka 
į 6–8,5 interval ą, o bandomoji medžiaga deguonies suvartoja mažiau 
kaip 60 %, bandymas turi b ūti pakartotas su mažesne bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracija.  
Žr. dar I.5.2.  
Jei anilino skaidymo procentin ė vertė, apskaičiuota pagal deguonies 
suvartojim ą, po 7 par ų ne didesn ė kaip 40 % ir po 14 par ų ne 
didesnė kaip 65 %, laikoma, kad bandymas netinkamas.  
VII.3.3.  Ataskaita  
Žr. I.8.  
VII.4. SPECIFIKACIJA  
Toliau pateiktas specifikacijos pavyzdys.  
MITI (I) BANDYMAS  
1. LABORATORIJA  
2. BANDYMO PRADŽIOS DATA  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. BANDOMOJI MEDŽIAGA  
Pavadinimas:  
Pradinio tirpalo koncentracija: … mg/l kaip chemin ės 
medžiagos  
Pradinė koncentracija terp ėje, C  0 : … mg/l kaip chemin ės 
medžiagos  
Reakcijos mišinio t ūris, V: … ml  
ThOD: … mg O  2 /1 
4. SĖJIMO KULT ŪRA 
Dumblo bandini ų ėmimo vietos: 
1) …  6) …  
2) …  7) …  
3) …  8) …  
4) …  9) …  
5) …  10) …  
Suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija aktyviajame dumble 
po aklimatizavimo sintetin ėmis nuotekomis =… mg/l  
Aktyviojo dumblo t ūris vienam litrui galutinai paruoštos 
terpės =… ml  
Dumblo koncentracija galutinai paruoštoje terp ėje =… mg/l  
5. DEGUONIES SUVARTOJIMAS. BIOLOGINIS 
SKAIDUMAS  
Naudoto respirometro tipas:  
Laikas (paros)  
0 7  14  21  28  
Bandomosios 
medžiagos suvar ­
tojamo O  2 kiekis 
(mg)  a 1 
a 2 
a 3 
O 2 suvartojimas 
(mg) tuščiajame 
bandyme  b 
Pataisyta O  2 
suvartojimo vert ė 
(mg)  (a 1 – b  1 ) 
(a 2 – b  1 ) 
(a 3 – b  1 ) 
BOD vienam mg 
bandomosios cheminės 
medžiagos
 ða – bÞ 
ðC o VÞ 1 Kolba  
2 Kolba  
3 Kolba  
Skaidymo % 
Í 
ðBODÞ 
ðThODÞ Î 
Ü 100 1 
2 
3 
vidutinė vertė (*) 
(*) Vidutini ų verčių neskaičiuokite, jei tarp lygiagre čių nustatym ų yra didelis skirtumas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Pastaba.  Panašūs formatai gali b ūti taikomi etaloninei medžiagai.  
6. ANGLIES ANALIZ Ė (neprivaloma):  
Anglies analizatorius:  
Kolba  DOC  
Pašalintos DOC %  Vidutin ė vertė 
Matuota  Pataisyta  
Vanduo + bandomoji 
medžiaga  a —  —  
Dumblas + bandomoji 
medžiaga  b 1 b 1 – c 
Dumblas + bandomoji 
medžiaga  b 2 b 2 – c 
Dumblas + bandomoji 
medžiaga  b 3 b 3 – c 
Kontrolinis tuš čiasis 
bandinys  c —  —  —  
Pašalintos DOC % :  Í ða 1 – ðb – cÞÞ 
ðaÞ Î 
Ü 100  
7. SPECIFIN ĖS CHEMIN ĖS ANALIZ ĖS DUOMENYS  
Likutinis bandomosios medžiagos 
kiekis bandymo pabaigoje  Skaidymas %  
Tuščiasis bandinys su vandeniu  S  b 
Terpė su sėjimo kult ūra S a1 
S a2 
S a3 
Skaidymo % ¼ Í ðS b – S  a Þ 
ðS b Þ Î 
Ü 100 
Apskaičiuokite skaidymo % atitinkamai kolbose a  1 , a 2 ir a  3 . 
8. PASTABA  
Turi būti pridedama BOD kitimo laike kreiv ė, jei yra.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
1 priedėlis 
SANTRUMPOS IR APIBR ĖŽTYS  
DO : Ištirp ęs deguonis (mg/l) yra vandeniniame bandinyje ištirpusio deguo ­
nies koncentracija.  
BOD : Biocheminis deguonies suvartojimas (g) yra deguonies kiekis, kur į 
suvartoja mikroorganizmai, įsisavindami bandom ąją medžiag ą; taip 
pat skaičiuojamas g suvartoto deguonies g bandomosios medžiagos 
(žr. C.5 metod ą). 
COD : Cheminis deguonies suvartojimas (g) yra deguonies kiekis, suvartotas 
bandomąją medžiag ą oksiduojant karštu, r ūgščiu dichromato tirpalu; 
COD yra turimo oksiduojamos medžiagos kiekio matas; taip pat skai ­ 
čiuojamas g deguonies, suvartoto g bandomosios medžiagos (žr. C.6 
metodą). 
DOC : Ištirpusi organin ė anglis yra organin ė anglis tirpale arba organin ė 
anglis, kuri praeina per 0,45 μm filtrą arba lieka skystyje virš nuos ėdų 
po 15 min centrifugavimo 40 000 m.s  -2 (apie 4 000 g) pagrei čiu. 
ThOD : Teorinis deguonies suvartojimas (mg) yra bendras deguonies kiekis, 
kurio reikia visiškai oksiduoti chemin ę medžiag ą; jis skai čiuojamas 
pagal molekulin ę formulę (žr. 2.2 pried ėlį), dar kitaip skai čiuojamas 
mg deguonies, suvartojamo oksiduoti 1 mg bandomosios medžiagos.  
ThCO  2 : Teorinis anglies dioksido kiekis (mg) yra apskai čiuotas anglies diok ­
sido, kuris susidaro iš žinomo arba išmatuoto anglies kiekio bandomo ­
joje medžiagoje, kai ji visiškai mineralizuojama, kiekis; taip pat skai ­ 
čiuojamas mg anglies dioksido, kuris susidaro iš 1 mg bandomosios 
medžiagos.  
TOC : Bendroji bandinio organin ė anglis yra ištirpusios ir suspenduotos orga ­
ninės anglies bendras kiekis.  
IC : Neorganin ė anglis  
TC : Bendroji anglis yra bandinio organin ės ir neorganin ės anglies bendras 
kiekis.  
Pirminis biologinis skaidymas  
Biologiškai veikiamos medžiagos chemin ės sandaros pokytis, kai ji netenka tai 
medžiagai b ūdingų savybių. 
Biologinis suskaidymas (aerobinis):  
Pasiektas skaidymo lygis, kai mikroorganizmai bandom ąją medžiag ą visiškai 
suvartoja ir susidaro anglies dioksidas, vanduo, mineralin ės druskos ir naujos 
mikrobiologin ės ląstelinės sudedamosios dalys (biomas ė). 
Lengvai biologiškai skaidomas  
Cheminių medžiag ų, su kuriomis buvo atliekami kai kurie apibr ėžti atrankos 
pagal biologin į suskaidym ą bandymai, sutartinis klasifikavimas; šie bandymai 
yra tokie tiksl ūs, kad laikoma, kad vandens terp ėse aerobin ėmis sąlygomis 
tokie junginiai greitai ir visiškai biologiškai suyra.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Natūraliai biologiškai skaidomas  
Cheminių medžiagų, apie kuri ų biologinį skaidymą (pirminį arba suskaidym ą) bet 
kokiame pripažintame biologinio skaidumo bandyme yra neabejotin ų duomenų, 
klasifikavimas.  
Apdorojamumas  
Galimybė medžiagas paversti šalinamais junginiais biologinio nuotek ų valymo 
metu, neigiamai neveikiant normalios valymo proces ų eigos. Dažniausiai 
tinkamos apdoroti yra lengvai biologiškai skaidomos medžiagos, bet ne visi 
natūraliai biologiškai skaidomi junginiai. Gali vykti ir abiotiniai procesai.  
Vėlavimo trukm ė 
Laikas nuo s ėjimo kult ūros įdėjimo DOC išnykimo bandyme iki kol skaidymo 
procentin ė vertė pasiekia bent 10 %. V ėlavimo trukm ė dažnai yra labai kintamas 
dydis ir jo atkuriamumas blogas.  
Skaidymo trukm ė 
Laikas nuo v ėlavimo laikotarpio pabaigos iki to laiko, kai skaidymas pasiekia 
90 % didžiausios skaidymo vert ės lygio.  
10 parų langas  
10 parų iš karto po to, kai skaidymo vert ė pasiekė 10 %.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
2 priedėlis 
ATITINKAM Ų BENDR ŲJŲ PARAMETR Ų SKAI ČIAVIMAS IR 
NUSTATYMAS  
Nuo pasirinkto metodo priklauso, kokie bus reikalingi bendrieji parametrai. 
Šiame skyriuje aprašomas ši ų dydžių išvedimas. Ši ų parametr ų taikymas apra ­ 
šomas skyriuose apie atskirus metodus.  
1. Anglies kiekis  
Anglies kiekis skai čiuojamas pagal žinom ą cheminę sudėtį arba nustatomas 
bandomosios medžiagos elementine analize.  
2. Teorinis deguonies suvartojimas (ThOD)  
Teorinis deguonies suvartojimas (ThOD) gali b ūti apskaičiuotas, jei žinoma 
elementin ė sudėtis, arba jis gali b ūti nustatytas atliekant elementin ę analizę. 
Junginio:  
C c H h Cl Cl N n Na na O o P p S s 
jei nitrifikavimas nevyksta,  
ThOD  NH4 ¼ Í ð16 ½2 c þ 1=2 ðh – cl – 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na – oâÞ 
ðMWÞ Î 
mg/mg  
kai nitrifikavimas vyksta  
ThOD  NO3 ¼ Í ð16 ½2 c þ 1=2 ðh – clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na – oâÞ 
ðMWÞ Î 
mg/mg  
3. Cheminis deguonies suvartojimas (COD)  
Cheminis deguonies suvartojimas (COD) nustatomas pagal C.6 metod ą. 
4. Ištirpusi organin ė anglis (DOC)  
Ištirpusi organin ė anglis (DOC) pagal apibr ėžtį yra bet kurios chemin ės 
medžiagos arba medžiag ų mišinio vandenyje organin ė anglis, praeinanti 
per 0,45 μm filtrą. 
Bandiniai iš bandymo ind ų siurbiami ir iš karto filtruojami filtravimo įtaisu, 
naudojant atitinkam ą membranin į filtrą Pirmieji 20 ml (kiekis gali b ūti 
mažesnis, kai naudojami maži filtrai) filtrato išpilami. 10–20 ml t ūrio 
arba mažesni bandiniai, jei jie įpurškiami (t ūris priklauso nuo anglies anali ­
zatoriui reikalingo t ūrio), paliekami anglies kiekiui analizuoti. DOC 
koncentracija nustatoma organin ės anglies analizatoriumi, kuriuo galima 
tiksliai nustatyti anglies koncentracij ą, atitinkan čią 10 % arba mažesn ę nei 
10 % bandyme naudotos pradin ės DOC koncentracijos.  
Filtruotus bandinius, kuri ų negalima analizuoti t ą pačią darbo dien ą, 48 h 
galima laikyti šaldytuve 2–4 °C temperat ūroje, arba žemesn ėje nei –18 °C, 
jei laikoma ilgiau.  
Pastabos  
Membraniniai filtrai, kad b ūtų hidrofiliški, dažnai impregnuojami paviršinio 
aktyvumo medžiagomis. Tod ėl filtre gali b ūti iki keli ų mg ištirpusios orga ­
ninės anglies, kuri trukdyt ų biologinio skaidumo nustatymams. Paviršinio 
aktyvumo medžiagos ir kitos tirpios organin ės medžiagos iš filtr ų šalinamos 
juos virinant tris kartus po vien ą valandą dejonizuotame vandenyje. Toliau 
filtrai gali b ūti savaitę laikomi vandenyje. Jei naudojamos vienkart ės filtra­
vimo tūtos, kiekviena partija turi b ūti patikrinta, norint įsitikinti, kad nesu ­
sidaro ištirpusi organin ė anglis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
Atsižvelgiant į membraninio filtro tip ą, bandomoji chemin ė medžiaga gali 
būti sulaikyta d ėl jos adsorbavimo. Tod ėl būtų patartina tikrinti, ar filtras 
neadsorbuoja chemin ės medžiagos.  
Kai norima lyginti TOC ir DOC, vietoje filtravimo gali b ūti taikomas 15 
min centrifugavimas 40 000 m. sec  -2 (4 000 g) pagreičiu. Metodas nepati ­
kimas, jei DOC pradin ė koncentracija yra < 10 mg/l, nes arba pašalinamos 
ne visos bakterijos, arba anglis v ėl ištirpsta kaip bakterij ų plazmos dalis.  
NUORODOS  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, p. 65.
 
— Wagner, R, Von Wasser, 1976, vol. 46, p. 139.  
— DIN-Entwurf 38409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, 
Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und StoffkenngroBen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen 
Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), NonnenausschuB 
Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut fur Normung e. V.
 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 1), p. 169.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
3 priedėlis 
MAŽAI TIRPI Ų MEDŽIAG Ų BIOLOGINIO SKAIDUMO VERTINIMAS  
Mažai tirpi ų medžiag ų biologinio skaidumo bandymuose ypatingas d ėmesys turi 
būti kreipiamas į toliau nurodytus aspektus.  
Jei homogeniniai skys čiai retai kelia bandinio ėmimo problem ų, tai kiet ąsias 
medžiagas rekomenduojama homogenizuoti tinkamu b ūdu, kad b ūtų išvengta 
paklaidų dėl nehomogeniškumo. Reikalingos specialios atsargumo priemon ės, 
kai reikia paimti keli ų miligram ų reprezentatyvius chemini ų medžiag ų mišinių 
arba daug priemaiš ų turinčių medžiag ų bandinius.  
Bandymuose galima taikyti įvairius maišymo b ūdus. Reikia stengtis užtikrinti tik 
tokį maišymą, kad medžiaga b ūtų disperguotoje b ūsenoje, ir vengti perkaitinimo, 
per didelio putojimo ir per dideli ų šlyties jėgų. 
Galima naudoti emulsikl į, su kuriuo gaunama patvari chemin ės medžiagos 
dispersija. Jis neturi b ūti nuodingas bakterijoms ir neturi b ūti biologiškai skai ­
domas arba bandymo s ąlygomis putoti.  
Emulsikliams taikomi kriterijai tinka ir tirpikliams.  
Kietosioms bandomosioms medžiagoms nerekomenduojama naudoti kietuosius 
nešiklius, ta čiau jie gali tikti aliejingoms medžiagoms.  
Kai naudojamos pagalbin ės medžiagos, pvz., emulsikliai, tirpikliai ir nešikliai, 
turi būti bandomas tuš čiasis bandinys, kuriame b ūtų pagalbin ė medžiaga.  
Bet kuris iš trij ų respirometrini ų bandymų, CO  2 , BOD, MITI, gali b ūti taikomas 
mažai tirpi ų junginių biologiniam skaidumui tirti.  
NUORODOS  
— de Morsier, A. et al., Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, vol. 16, p. 833.  
— Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water-soluble compounds. 
Chemosphere. 1984, vol. 13, p. 169.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
4 priedėlis 
CHEMINI Ų MEDŽIAG Ų, KURIOS GALI B ŪTI NUODINGOS S ĖJIMO 
KULTŪRAI, BIOLOGINIO SKAIDUMO VERTINIMAS  
Kai tiriant chemin ę medžiagą lengvo biologinio skaidumo bandymuose paaišk ėja, 
kad ji biologiškai neskaidoma, tai, jei norima atskirti, ar tai inhibuojamasis veikimas ar medžiagos inertiškumas, rekomenduojama tokia proced ūra (Reynolds  
et al ., 1987).
 
Toksiškumo ir biologinio skaidumo bandymuose turi b ūti naudojama panaši arba 
identiška s ėjimo kult ūra. 
Norint įvertinti chemini ų medžiag ų, tiriamų lengvo biologinio skaidumo bandy ­
muose, toksiškum ą, tiktų, kaip manoma, atskirai arba kartu taikyti dumblo kv ėpa­
vimo intensyvumo inhibavimo (aktyviojo dumblo kv ėpavimo inhibavimo 
bandymas – Direktyva 88/302/EEB), BOD ir (arba) augimo inhibavimo metodus.  
Manoma, kad, jei reikia išvengti inhibavimo d ėl medžiagos toksiškumo, bando ­
mųjų medžiag ų, naudojam ų lengvo biologinio skaidumo bandymuose, koncent ­
racija turėtų būti mažesn ė nei 1/10 EC  50 vertės (arba mažesn ė nei EC  20 vertė), 
gautos toksiškumo bandymuose. Nepanašu, kad junginiai, kuri ų EC  50 vertė yra 
didesnė kaip 300 mg/l, b ūtų toksiški biologinio skaidumo bandymuose.  
Mažesnės kaip 20 mg/l EC  50 vertės greičiausiai tur ėtų kelti problem ų toliau 
atliekamiems bandymams. Turi b ūti naudojamos mažos bandomosios koncentra ­
cijos, tod ėl reikia taikyti tiksl ų ir jautrų uždarosios kolbos metod ą arba naudoti  
14 C žymėtas mežiagas. Kitaip dar b ūtų galima naudoti aklimatizuot ą sėjimo 
kultūrą, kuri, galb ūt, leistų naudoti bandom ąją medžiag ą didesnėmis koncentra ­
cijomis. Ta čiau šiuo atveju prarandamas specifinis lengvo biologinio skaidumo 
bandymo kriterijus.  
NUORODOS  
Reynolds, L. et al.. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, p. 225.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
5 priedėlis 
DEGUONIES SUVARTOJIMO PATAISA D ĖL NITRIFIKAVIMO 
KELIAM Ų TRUKDŽI Ų 
Jei nekreipiama d ėmesio į nitrifikavim ą, kai biologinis skaidumas vertinamas 
pagal bandom ųjų medžiag ų suvartojamo deguonies kiek į, tai paklaidos medžia ­
goms, kuriose n ėra azoto, yra nežymios (ne didesn ės kaip 5 %), net jei terp ės 
amonio azoto oksidavimas bandomojo ir tuš čiojo bandinio induose vyksta nevie ­
nodai. Ta čiau, jei bandomosios medžiagos turi azoto, paklaidos gali b ūti didelės. 
Jei nitrifikavimas įvyko, tačiau nevisiškai, stebimas reakcijos mišinio suvartojamo 
deguonies kiekis gali b ūti pakoreguotas atsižvelgiant į deguonies kiek į, suvartot ą 
amonio jonui oksiduoti į nitritą ir nitrat ą, jei nitrito ir nitrato koncentracij ų 
pokytis inkubavimo metu nustatomas atsižvelgiant į tokias reakcij ų lygtis: 
2NH  4 Cl + 3O  2 = 2HNO  2 + 2HCl + 2 H  2 O (1)  
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Suminė reakcija:  
2NH  4 Cl + 4O  2 = 2HNO  3 + 2HCl + 2 H  2 O (3)  
Pagal 1) lygt į, 28 g azoto, kuris yra amonio chloride (NH  4 Cl), oksiduoti į nitritą, 
reikia 96 g deguonies, t. y. faktorius lygus 3,43 (96/28). Tokiu pat b ūdu pagal 3) 
lygtį 28 g azoto, kai jis oksiduojamas į nitratą, suvartoja 128 g deguonies, t. y. 
faktorius lygus 4,57 (128/28).  
Kadangi reakcijos yra nuoseklios ir vyksta d ėl tam tikr ų ir skirting ų bakterijų 
rūšių veiklos, įmanomas dalykas, kad nitrito koncentracija gali tiek did ėti, tiek ir 
mažėti; pastaruoju atveju susidaryt ų ekvivalentiškas kiekis nitrato. Taigi, deguo ­
nies, suvartoto nitratui susidaryti, kiekis lygus 4,57 ir nitrato koncentracijos 
padidėjimo sandaugai, o deguonies kiekis nitritui susidaryti lygus 3,43 ir nitrito 
koncentracijos padid ėjimo sandaugai arba – 3,43 ir nitrito koncentracijos suma ­ 
žėjimo sandaugai, kai nitrito koncentracija maž ėja. 
T. y.: 
O 2 , suvartotas nitratui susidaryti = 4,57 × nitrato koncentracijos 
padidėjimo (4) 
Ir 
O 2 , suvartotas nitritui susidaryti = 3,43 × nitrito koncentracijos 
padidėjimo (5) 
Ir 
O 2 netenkama d ėl nitrito išnykimo = – 3,43 × nitrito koncent ­
racijos sumaž ėjimo (6) 
Taigi  
O 2 suvartojimas d ėl nitrifikavimo = ± 3,43 × nitrito konc. 
pokyčio. + 4,57 × nitrato konc. padid ėjimo (7) 
Ir todėl 
O 2 , suvartotas C oksiduoti = bendrasis steb ėtas suvartotas kiekis 
– nitrifikavimui suvartotas kiekis  (8) 
Kitu atveju, jei nustatytas tik bendrasis oksiduoto azoto kiekis, tai, kaip pirmin ė 
aproksimacija, galima laikyti, kad deguonies suvartojimas d ėl nitrifikavimo lygus 
4,57 × oksiduoto N koncentracijos padid ėjimo.  
Toliau angliai oksiduoti suvartoto deguonies kiekio pataisyta vert ė lyginama su 
ThOD NH  3 verte, kuri skai čiuojama 2 pried ėlyje. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. SKAIDYMAS. BIOCHEMINIS DEGUONIES SUVARTOJIMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šio metodo tikslas yra išmatuoti kiet ųjų arba skyst ųjų organini ų 
medžiagų biochemin į deguonies suvartojim ą (COD).  
Šiame bandyme gauti duomenys taikomi vandenyje tirpioms medžia ­
goms; ta čiau taip pat galima bandyti, bent iš esm ės, lakiąsias 
medžiagas arba medžiagas, kurios mažai tirpsta vandenyje.  
Metodas tinka tik toms bandomosioms organin ėms medžiagoms, 
kurios, b ūdamos bandyme naudojamos koncentracijos, neinhibuot ų 
bakterijų veiklos. Jei bandomoji medžiaga n ėra tiek tirpi, kad galima 
būtų pasiekti bandymo koncentracij ą, gerai bandomosios medžiagos 
dispersijai gauti galima taikyti specialias priemones, pvz., disperga ­
vimą ultragarsu.  
Kai reikia aiškinti žemus rezultatus ir parinkti tinkamas bandom ąsias 
koncentracijas, gali b ūti naudinga informacija apie chemin ės 
medžiagos toksiškum ą. 
1.2. APIBR ĖŽTIS IR VIENETAI  
BOD apibr ėžiamas kaip mas ė ištirpusio deguonies, suvartoto bioche ­
minio oksidavimo procesui nustatytame tirpalo t ūryje vykti apibr ėž­
tomis sąlygomis.  
Rezultatai skai čiuojami BOD gramais vienam gramui bandomosios 
medžiagos.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Pageidautina naudoti tinkam ą etalonin ę medžiag ą, skirtą tikrinti 
sėjimo kult ūros aktyvum ą. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Gerai aeruojamoje tinkamoje terp ėje ištirpinta arba disperguota 
medžiaga, kurios kiekis žinomas, veikiama mikroorganizm ų kultūra 
ir tamsoje inkubuojama apibr ėžtos pastovios aplinkos temperat ūros 
sąlygomis.  
BOD yra nustatomas pagal ištirpusio deguonies kiekio skirtum ą 
bandymo pradžioje ir pabaigoje. Bandymo trukm ė turi būti ne trum ­
pesnė kaip penkios paros ir ne ilgesn ė kaip 28 paros.  
Lygiagrečiai turi b ūti daromas nustatymas tuš čiajame bandinyje, 
kuriame neb ūtų bandomosios medžiagos.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Negalima laikyti, kad BOD nustatymas yra tinkamas medžiagos 
biologinio skaidumo nustatymas. Į šį bandym ą galima ži ūrėti tik 
kaip į atrankos bandym ą. 
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Ruošiamas pradinis medžiagos tirpalas arba dispersija gauti BOD 
koncentracijai, atitinkan čiai taikom ą metodą. Tuomet pagal bet kur į 
tinkamą nacionalin į arba tarptautin į standartizuot ą metodą nusta­
tomas BOD.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. DUOMENYS IR VERTINIMAS  
BOD pradiniame tirpale skai čiuojamas pagal parinkt ą standartin į 
metodą ir verčiamas į BOD gramus vienam gramui bandomosios 
medžiagos.  
3. ATASKAITA  
Turi būti nurodytas taikytas metodas.  
Biocheminis deguonies suvartojimas turi b ūti bent trij ų tinkamų 
matavimų vidurkis.  
Turi būti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga informacija ir 
pastabos, ypa č apie priemaišas, fizin ę būseną, toksiškumo įtaką ir 
medžiagai b ūdingą sudėtį, kuri tur ėtų įtakos rezultatams.  
Turi būti nurodyta, ar buvo naudotas biologinio nitrifikavimo inhi ­
bavimo priedas.  
4. NUORODOS  
Standartizuot ų metodų sąrašas, pavyzdžiui:  
NF T 90–103: Biocheminio deguonies suvartojimo nustatymas  
NBN 407: Biocheminis deguonies suvartojimas  
NEN 3235 5.4: Biocheminio deguonies suvartojimo (BDS) nusta ­
tymas.  
Biocheminio deguonies suvartojimo nustatymas. Vandens ir susijusi ų 
medžiagų tyrimo metodai, HMSO, Londonas.  
ISO 5815: Biocheminio deguonies suvartojimo nustatymas po n 
dienų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. SKAIDYMAS. CHEMINIS DEGUONIES SUVARTOJIMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šio metodo tikslas yra standartiniu sutartu b ūdu išmatuoti kiet ųjų 
arba skyst ųjų organini ų medžiag ų chemin į deguonies 
suvartojim ą (COD) nustatytomis laboratorin ėmis sąlygomis.  
Atliekant š į bandym ą ir aiškinant gautus rezultatus bus naudinga 
informacija apie medžiagos formul ę (pvz., halogen ų druskos, orga ­
ninių junginių geležies (II) druskos, chloro organiniai junginiai).  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Cheminis deguonies suvartojimas yra medžiagos oksiduojamumo 
matas, reiškiamas ekvivalentiniu oksiduojan čio reagento, kur į suvar­
toja medžiaga nustatytomis laboratorin ėmis sąlygomis, deguonies 
kiekiu.  
Rezultatas skai čiuojamas COD gramais vienam gramui bandomosios 
medžiagos.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nebūtina kiekvienu atveju, kai tiriama nauja medžiaga, naudoti etalo ­
nines medžiagas. Jas daugiausia reikia naudoti tuomet, kai kartkar ­
tėmis daroma metodo veiksmingumo patikra ir norint lyginti rezul ­
tatus, kai taikomas kitas metodas.  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Iš anksto nustatytas vandenyje ištirpintos arba disperguotos 
medžiagos kiekis dvi valandas oksiduojamas, su gr įžtamuoju šaldy ­
tuvu, kalio dichromatu stipriai r ūgščioje sieros r ūgšties terp ėje, kai 
katalizatorius sidabro sulfatas. Likusio dichromato kiekis nustatomas titruojant standartizuotu geležies (II) amonio sulfato tirpalu.
 
Jei medžiaga turi chloro, nustatymui trukdan čio chlorido įtakai 
mažinti dedama gyvsidabrio (II) sulfato (  1 ). 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Dėl to, kad tai sutartinis nustatymo b ūdas, COD yra „oksiduoja ­
mumo indikatorius“ ir naudojamas kaip praktinis organin ės 
medžiagos kiekio nustatymo metodas.  
Bandymui gali trukdyti chloridas; taip pat nustatant COD gali truk ­
dyti neorganin ės redukuojan čios arba oksiduojan čios medžiagos.  
Kai kurie cikliniai junginiai ir didelis skai čius lakiųjų medžiag ų 
(pvz., mažesn ės molekulin ės masės sočiosios rūgštys) šiame 
bandyme n ėra visiškai oksiduojamos.  
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Ruošiamas pradinis medžiagos tirpalas arba dispersija COD vertei 
nuo 250 mg iki 600 mg litre gauti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) Norint išvengti gyvsidabrio išsisklaidymo aplinkoje, panaudoti tirpalai su gyvsidabrio 
druskomis turi b ūti apdoroti.
 Pastabos  
Mažai tirpi ų ir nedisperguojam ų medžiagų atveju galima pasverti tam 
tikrą kiekį į labai smulkius miltelius sumaltos medžiagos arba 
skystos medžiagos, atitinkan čios maždaug 5 mg COD, ir įdėti ją į 
eksperimento ind ą su vandeniu.  
Dažnai, ir ypa č mažai tirpi ų medžiag ų atveju, chemin į deguonies 
suvartojim ą (COD) geriau nustatyti taikant metodo pakeitim ą, t. y. 
uždaroje sistemoje su sl ėgio lygintuvu (H. Kelkenberg, 1975). 
Taikant š į metodo keitim ą, dažnai galima s ėkmingai kiekybiškai 
nustatyti junginius, pvz., acto r ūgštį, kuriuos standartiniu metodu 
nustatyti sunku. Ta čiau ir šiuo metodu nepasiseka nustatyti piridino. 
Jei kalio dichromato koncentracija, kaip nurodyta 1 nuorodoje, padi ­
dinama iki 0,25 N (0,0416 M), palengv ėja tiesioginis 5–10 mg 
medžiagos sv ėrimas, kas yra svarbu nustatant mažai vandenyje tirpi ų 
medžiagų COD (2 nuoroda).  
Kitu atveju COD nustatomas pagal bet kur į atitinkam ą nacionalin į 
arba tarptautin į standartizuot ą metodą. 
2. DUOMENYS IR VERTINIMAS  
Bandymų kolboje turimas COD skai čiuojamas pagal pasirinkt ą stan­
dartizuotą metodą ir verčiamas į COD gramus vienam gramui bando ­
mosios medžiagos.  
3. ATASKAITA  
Turi būti nurodytas taikytas etaloninis metodas.  
Cheminis deguonies suvartojimas turi b ūti bent trij ų matavim ų 
vidurkis. Turi b ūti pateikta visa rezultatams aiškinti reikalinga infor ­
macija ir pastabos, ypa č apie priemaišas, fizin ę būseną ir medžiagai 
būdingas savybes (jei žinomos), kurios tur ėtų įtakos rezultatams.  
Ataskaitoje turi b ūti nurodyta apie gyvsidabrio (II) sulfato naudojim ą 
nustatymui trukdan čio chlorido įtakai mažinti.  
4. NUORODOS  
1) Kelkenberg, H., Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  
Standartizuot ų metodų sąrašas, pvz.:  
NBN T 91–201 Cheminio deguonies suvartojimo nustatymas.  
ISBN O 11 7512494 Cheminis deguonies suvartojimas (dich ­
romato vert ė) užterštuose vandenyse ir nuotekose.  
NF T 90–101 Cheminio deguonies suvartojimo nustatymas.  
DS 217 = Vandens analiz ė. Cheminio deguonies suvartojimo 
nustatymas.  
DIN 38409-H-41 Cheminio deguonies suvartojimo (COD) 
nustatymas intervale virš 15 mg/l.  
NEN 3235 5.3 Cheminio deguonies suvartojimo nustatymas.  
ISO 6060 Vandens kokyb ė. Dichromato metodai cheminiam 
deguonies suvartojimui nustatyti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. SKAIDYMAS. ABIOTINIS SKAIDYMAS. HIDROLIZ Ė KAIP pH 
FUNKCIJA  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 111 (2004).  
1.1. ĮVADAS  
Cheminės medžiagos gali patekti į paviršinius vandenis tiesiogiai j ų 
pridedant, pasklidus purškiamoms medžiagoms, d ėl nuotėkio, 
drenažo, atliek ų šalinimo, pramonini ų, buitinių arba žem ės ūkio 
nuotekų ir nuosėdų iš atmosferos, o vandenyje gali pasikeisti vyks ­
tant cheminiams (pvz., hidroliz ės, oksidacijos), fotocheminiams ir 
(arba) mikrobiologiniams procesams. Šioje rekomendacijoje apra ­ 
šytas laboratorinis bandymo metodas, skirtas chemini ų medžiag ų 
abiotiniam hidroliziniam virsmui vandens sistemose įvertinti, esant 
aplinkoje dažniausiai pasitaikan čioms pH vert ėms (pH 4–9). Reko ­
mendacija grindžiama jau priimtomis rekomendacijomis (1) (2) (3) 
(4) (5) (6) (7).  
Bandymai atliekami siekiant nustatyti: i) bandomosios medžiagos 
hidrolizės greitį kaip pH funkcij ą ir ii) konkre čius hidroliz ės 
produktus, galin čius veikti organizmus, arba j ų tipą ir susidarymo 
bei išnykimo greit į. Tokius tyrimus gali reik ėti atlikti su chemin ėmis 
medžiagomis, kurios tiesiogiai dedamos į vandenį arba kurios gali 
patekti į aplinką kitais pirmiau aprašytais b ūdais. 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Žr. 2 pried ėlį. 
1.3. BANDYMO METODO TINKAMUMAS  
Bandymo metodas iš esm ės tinka visoms chemin ėms medžiagoms 
(nežymėtosioms arba žym ėtosioms), kurioms nustatyti yra sukurtas 
pakankamo tikslumo ir jautrio analiz ės metodas. Jis taikytinas mažai 
lakiems ir nelakiems pakankamai tirpiems vandenyje junginiams. 
Bandymas netur ėtų būti taikomas chemin ėms medžiagoms, kurios 
labai greitai išgaruoja iš vandens (pvz., fumigantai, organiniai tirpik ­
liai), tod ėl negali b ūti laikomos tirpale šio bandymo s ąlygomis. 
Taikant š į bandymo metod ą gali būti sunku bandyti vandenyje 
labai mažai tirpias medžiagas (8).  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Sterilūs vandeniniai skirting ų pH verčių (pH 4, 7 ir 9) buferiniai 
tirpalai apdorojami bandom ąja medžiaga ir inkubuojami tamsoje 
kontroliuojamomis laboratorijos s ąlygomis (esant pastoviai tempera ­
tūrai). Kas tam tikr ą laiko tarp ą buferiniai tirpalai analizuojami 
bandomajai medžiagai ir hidroliz ės produktams nustatyti. Naudojant 
žymėtąją bandomąją medžiag ą (pvz.,  14 C), lengviau galima nustatyti 
masių balansą. 
Šis bandymo metodas yra pakopinis. Šios pakopos parodytos ir 
paaiškintos 1 pried ėlyje. Kiekvien ą pakopą lemia ankstesn ės pakopos 
rezultatai.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Hidrolizės greičiui matuoti gali b ūti naudojama nežym ėtoji arba 
žymėtoji bandomoji medžiaga. Paprastai geriau naudoti žym ėtąją 
medžiagą, kai reikia tirti hidroliz ės kelią ir nustatyti masi ų balansą; 
tačiau tam tikrais atvejais žym ėjimas nėra būtinas. Rekomenduojama 
žymėti 14 C, tačiau gali b ūti naudojami ir kiti izotopai, pvz.,  13 C, 15 N, 
3 H. Jei įmanoma, žym ėtasis atomas tur ėtų būti patvariausioje (-iose) 
molekulės dalyje (-yse). Pvz., jei bandomoji medžiaga turi vien ą 
žiedą, žymėtasis atomas turi b ūti šiame žiede; jei bandomoji 
medžiaga turi du žiedus arba daugiau, gali tekti atlikti atskirus tyrimus kiekvieno žiedo su žym ėtuoju atomu kitimui įvertinti ir 
atitinkamai informacijai apie hidroliz ės produkt ų susidarym ą gauti. 
Bandomosios medžiagos grynumas turi b ūti bent 95 %.
 
Prieš atliekant hidroliz ės bandym ą, reikėtų turėti tokią informacij ą 
apie bandom ąją medžiag ą: 
a) tirpumas vandenyje [A.6 bandymo metodas];  
b) tirpumas organiniuose tirpikliuose;  
c) garų slėgis [A.4 bandymo metodas] ir (arba) Henrio d ėsnio 
konstanta;  
d) pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo) [A.8 bandymo 
metodas];  
e) disociacijos konstanta (pK  a ) [112 OECD rekomendacija] (9);  
f) tiesioginio ir netiesioginio fotocheminio transformavimo vande ­
nyje greitis, jei tinka.  
Reikėtų turėti analizės metodus bandomosios medžiagos kiekiui 
nustatyti ir, jei tinka, hidroliz ės produktams ir j ų kiekiui vandeni ­
niuose tirpaluose nustatyti (žr. 1.7.2 skirsn į). 
1.6. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Jei įmanoma, tur ėtų būti naudojamos etalonin ės medžiagos hidroliz ės 
produktams ir j ų kiekiui nustatyti, taikant spektroskopinius ir chro ­
matografijos metodus arba kitus tinkamo jautrumo metodus.  
1.7. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
1.7.1.  Atgavimas  
Bent dviej ų kartotini ų buferini ų tirpalų ėminių arba jų ekstrakt ų 
analizė iškart po bandomosios medžiagos prid ėjimo yra pirmasis 
analizės metodo pakartojamumo ir bandomosios medžiagos įdėjimo 
metodikos tolygumo rodiklis. V ėlesnių bandymo etap ų atgavimo 
laipsnis gaunamas atliekant masi ų balansą (kai naudojama žym ėtoji 
medžiaga). Žym ėtųjų ir nežym ėtųjų chemini ų medžiag ų atgavimo 
laipsnis turi b ūti nuo 90 % iki 110 % (7). Jei š į intervalą techniškai 
sunku pasiekti, nežym ėtosioms chemin ėms medžiagoms leidžiamas 
70 % atgavimo laipsnis, ta čiau jį reikia pagr įsti. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Analiz ės metodo pakartojamumas ir jautrumas  
Vėliau analiz ės metodo (- ų), taikyto (- ų) bandomajai medžiagai ir 
hidrolizės produktams kiekybiškai nustatyti, pakartojamumas gali 
būti tikrinamas atliekant t ų pačių buferinių tirpalų (arba jų ekstraktų) 
kartotinę analizę, kai susidaro kiekybiniam nustatymui pakankamas 
hidrolizės produkt ų kiekis.  
Analizės metodas turi b ūti pakankamai jautrus bandomajai medžiagai 
kiekybiškai nustatyti, kai jos koncentracija sumaž ėja iki 10 % 
pradinės koncentracijos arba dar labiau. Be to, prireikus analiz ės 
metodai turi b ūti pakankamai jautr ūs visų hidrolizės produkt ų kiekiui 
nustatyti, kai jie sudaro 10 % arba daugiau įdėtos medžiagos 
koncentracijos (bet kuriuo tyrimo metu) iki 25 % arba mažiau j ų 
didžiausios koncentracijos.  
1.7.3.  Hidroliz ės kinetikos duomen ų pasikliovimo intervalai  
Turėtų būti apskaičiuoti ir pateikti vis ų regresijos koeficient ų, greičio 
konstantų, pusėjimo trukm ės verčių ir visų kitų kinetinių parametr ų 
(pvz., DT50) pasikliovimo intervalai.  
1.8. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.8.1.  Įranga ir aparat ūra 
Tyrimas tur ėtų būti atliekamas naudojant stiklinius indus (pvz., 
mėgintuvėlius, mažas kolbas), tamsoje ir steriliomis s ąlygomis, jei 
būtina, išskyrus atvejus, kai išankstin ė informacija (pvz., pasiskirs ­
tymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo)) rodo, kad bandomoji medžiaga gali prilipti prie stiklo. Tokiu atveju reik ėtų numatyti 
kitas medžiagas (pvz., teflon ą). Bandomosios medžiagos sukibimo 
su stiklu problema gali b ūti iš dalies sumažinta taikant vien ą iš šių 
metodų:
 
— nustatyti bandymo ind ų stiklo sorbuotos bandomosios medžiagos 
ir hidroliz ės produkt ų masę, 
— naudoti ultragarso voni ą, 
— užtikrinti, kad kiekvienu bandinio ėmimo laikotarpiu visi stikli ­
niai indai b ūtų plaunami tirpikliu,  
— naudoti produkt ų preparatus,  
— naudoti padidint ą antrojo tirpiklio kiek į bandomajai medžiagai į 
sistemą įdėti; jei naudojamas antrasis tirpiklis, jis netur ėtų sukelti 
bandomosios medžiagos hidroliz ės. 
Paprastai reikia tur ėti purtykles su reguliuojamos temperat ūros 
vandens vonia arba reguliuojamos temperat ūros inkubatorius įvai­
riems bandomiesiems tirpalams inkubuoti.  
Reikia tur ėti tipinę laboratorin ę įrangą, įskaitant, vis ų pirma, ši ą: 
— pH metr ą, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— analiz ės prietaisus, pvz., duj ų chromatografijos (GC), efektyvio ­
sios skys čių chromatografijos (HPLC), plonasluoksn ės 
chromatografijos (TLC) įrangą, įskaitant atitinkamas aptikimo 
sistemas žym ėtosioms ir nežym ėtosioms medžiagoms analizuoti 
arba atvirkštinio izotop ų skiedimo metodo įrangą, 
— nustatymo prietaisus (pvz., MS, GC-MS, HPLC-MS, MBR ir t. t.),  
— skysčių scintiliacin į skaitiklį, 
— dalijamuosius piltuvus, skirtus skys čius ekstrahuoti skys čiais, 
— įrangą tirpalams ir ekstraktams koncentruoti (pvz., sukam ąjį 
garintuvą), 
— temperat ūros reguliavimo įtaisą (pvz., vandens voni ą). 
Cheminius reagentus sudaro, pvz.:  
— analiziškai gryni organiniai tirpikliai, pvz., heksanas, dichlorme ­
tanas ir kt.,  
— scintiliacinis skystis,  
— buferiniai tirpalai (išsami informacija pateikta 1.8.3 skirsnyje).  
Visi hidroliz ės bandymams naudojami stikliniai indai, analiziškai 
grynas vanduo ir buferiniai tirpalai tur ėtų būti sterilizuoti.  
1.8.2.  Bandomosios medžiagos įdėjimas  
Tiriamoji medžiaga turi b ūti įpilama kaip vandeninis tirpalas į skir­
tingus buferinius tirpalus (žr. 3 pried ėlį). Jei būtina siekiant užtikrinti 
tinkamą ištirpinim ą, bandomosios medžiagos įdėjimui ir paskirstymui 
leidžiama naudoti nedidel į su vandeniu maiši ų tirpiklių kiekį (pvz., 
acetonitrilo, acetono, etanolio), bet jis paprastai turi b ūti ne didesnis 
kaip 1 % v/v. Jei numatoma naudoti didesn ę tirpiklių koncentracij ą 
(pvz., mažai tirpi ų bandomųjų medžiag ų atveju), tai gal ėtų būti leis­
tina tik tais atvejais, kai galima įrodyti, kad tirpiklis neturi įtakos 
bandomųjų medžiag ų hidrolizei.  
Preparatų paprastai nerekomenduojama naudoti, nes negalima atmesti 
galimybės, kad preparato ingredientai gali paveikti hidroliz ės 
procesą. Tačiau jei bandomosios medžiagos yra mažai tirpios vande ­
nyje arba limpa prie stiklo (ž. 1.8.1 skirsn į), preparato naudojimas 
gali būti tinkama išeitis.  
Naudojama tik viena bandomosios medžiagos koncentracija; ji neturi 
būti didesnė kaip 0,01 mol/l arba kaip pus ė soties koncentracijos (žr. 
1 priedėlį). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Buferiniai tirpalai  
Hidrolizės bandymas turi b ūti atliekamas, kai pH vert ės yra 4, 7 ir 9. 
Todėl buferiniai tirpalai turi b ūti paruošiami naudojant analiziškai 
grynus reagentus ir vanden į. Kai kurios tinkamos buferin ės sistemos 
pateiktos 3 pried ėlyje. Reikia pažym ėti, kad naudojama buferin ė 
sistema gali daryti įtaką hidrolizės greičiui, ir, kai tai stebima, reikia 
naudoti kit ą buferinę sistemą ( 1 ). 
Kiekvieno buferinio tirpalo pH vert ė turi būti tikrinama kalibruotu 
pH-metru, kurio tikslumas b ūtų bent 0,1, esant reikiamai tempera ­
tūrai. 
1.8.4.  Bandymo s ąlygos  
1.8.4.1.  Bandymo temperat ūra 
Hidrolizės bandymai tur ėtų būti atliekami esant pastoviai tempera ­
tūrai. Norint ekstrapoliuoti, svarbu užtikrinti temperat ūros pastovum ą 
bent ± 0,5 °C tikslumu.  
Pradinis bandymas (1 pakopa) atliekamas 50 °C temperat ūroje, jei 
nežinomos bandomosios medžiagos hidroliz ės savybės. Aukštesni ų 
pakopų kinetiniai bandymai atliekami esant bent trims skirtingoms 
temperatūros vertėms (įskaitant bandym ą esant 50 °C), nebent atlie ­
kant 1 pakopos bandym ą nustatoma, kad bandomoji medžiaga yra 
atspari hidrolizei. Si ūlomas temperat ūros intervalas – 10–70 °C 
(gerai būtų, kad viena iš temperat ūros verčių būtų mažesnė kaip 
25 °C), į kurį patektų ataskaitoje pateikiama 25 °C temperat ūra ir 
didesnė dalis lauko s ąlygomis pasitaikan čios temperat ūros verčių. 
1.8.4.2.  Šviesa ir deguonis  
Visi hidroliz ės bandymai tur ėtų būti atliekami taikant bet kur į iš 
tinkamų metodų, kuris leist ų išvengti fotoliz ės reiškini ų. Reikėtų 
imtis visų tinkamų priemoni ų, kad nepatekt ų deguonis (pvz., prieš 
ruošiant tirpal ą, 5 minutes barbotuoti hel į, azotą arba argon ą). 
1.8.4.3.  Bandymo trukm ė 
Pradinis bandymas tur ėtų būti atliekamas 5 paras, o aukštesni ųjų 
pakopų bandymai tur ėtų būti atliekami tol, kol hidrolizuojasi 90 % 
bandomosios medžiagos, bet ne ilgiau kaip 30 par ų. 
1.8.5.  Bandymo proced ūra 
1.8.5.1.  Pradinis bandymas (1 pakopa)  
Pradinis bandymas atliekamas esant 50 ± 0,5 °C ir pH 4,0, 7,0 ir 9,0. 
Jei po 5 par ų hidrolizuojasi mažiau kaip 10 % (t  o,5 , 25 °C > 1 metai) 
medžiagos, bandomoji medžiaga priskiriama hidrolizei atsparioms medžiagoms ir paprastai daugiau bandyti nereikia. Jei žinoma, kad 
medžiaga yra nepatvari (
 2 ) aplinkos temperat ūrą atitinkan čiomis sąly­
gomis, pradinio bandymo atlikti nereikia. Analiz ės metodas turi b ūti 
pakankamai tikslus ir jautrus, kad juo b ūtų galima nustatyti pradin ės 
koncentracijos sumaž ėjimą 10 %.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey ir Mill rekomenduoja vietoj fosfatinio naudoti boratin į arba acetatin į buferinį 
tirpalą (11). 
( 2 ) Tokią informacij ą galima gauti iš kit ų šaltinių, pvz., giminingos strukt ūros jungini ų 
hidrolizės duomenys, nurodyti literat ūroje arba gauti atliekant kitus pradinius, pusiau 
kiekybinius bandomosios medžiagos hidroliz ės bandymus ankstesn ėje parengtin ėje stadi­
joje.
 1.8.5.2.  Nepatvari ų medžiagų hidrolizė (2 pakopa)  
Aukštesnės pakopos (sud ėtingesnis) bandymas turi b ūti atliekamas 
esant tokioms pH vert ėms, kurioms esant pradinio bandymo metu 
buvo nustatytas medžiagos nepatvarumas. Pasirinkta bandomosios 
medžiagos buferini ų tirpalų temperat ūra palaikoma naudojant termo ­
statą. Pirmojo laipsnio hidrolizei patikrinti, kiekvienas reakcijos 
tirpalas tur ėtų būti analizuojamas tokiais laiko tarpais, kad b ūtų 
gauti bent šeši atskiri duomen ų taškai – paprastai nuo 10 % iki 
90 % pradin ės medžiagos hidroliz ės. Atskiri kartotiniai bandiniai 
(bent du bandiniai iš atskir ų reakcijos ind ų) imami ir j ų turinys 
analizuojamas bent šešis kartus (kad b ūtų gauta ne mažiau kaip 
dvylika kartotini ų duomenų taškų). Laikoma, kad nepakanka naudoti 
vieną didelį ėminį, iš kurio b ūtų imamos atskiros alikvotin ės bando­
mojo tirpalo dalys kiekvienu m ėginio ėmimo momentu, kadangi toks 
būdas neleidžia analizuoti duomen ų kintamumo ir gali kilti problem ų 
dėl bandomojo tirpalo užteršimo. Sterilumo patvirtinimo bandymai 
turėtų būti atliekami baigus aukštesn ės pakopos bandym ą (t. y. 
įvykus 90 % hidrolizei arba po 30 par ų). Tačiau jei skaidymas (t. 
y. virsmas) nestebimas, sterilumo bandym ų atlikti neb ūtina. 
1.8.5.3.  Hidroliz ės produkt ų nustatymas (3 pakopa)  
Visi pagrindiniai hidroliz ės produktai, bent tie, kurie sudaro > 10 % 
naudotos doz ės, turėtų būti nustatomi taikant tinkamus analiz ės 
metodus.  
1.8.5.4.  Neprivalomi bandymai  
Hidrolizei neatspari ą bandomąją medžiag ą gali tekti bandyti papil ­
domai, esant kitoms nei 4, 7 ir 9 pH vert ėms. Pvz., d ėl fiziologini ų 
priežasčių gali reik ėti atlikti bandym ą rūgštesnėje terpėje (pvz., kai 
pH yra 1,2) ir esant vienai fiziologiškai artimai temperat ūros vertei 
(37 °C).  
2. DUOMENYS  
Bandomosios medžiagos ir hidroliz ės produkt ų, jei jų yra, kiekis, 
nustatytas kiekvienu bandinio ėmimo etapu, kiekvienai pH vertei 
bei bandymo temperat ūrai, turėtų būti nurodytas įdėtos pradin ės 
koncentracijos % ir, prireikus, mg/l. Be to, naudojant žym ėtąją 
bandomąją medžiag ą, turėtų būti pateikiamas masi ų balansas, 
išreikštas įdėtos pradin ės medžiagos koncentracijos procentine 
dalimi.  
Ataskaitoje pateikiamas logaritminis bandomosios medžiagos 
koncentracijos kaip laiko funkcijos duomen ų grafikas. Be to, turi 
būti nustatyti visi pagrindiniai hidroliz ės produktai, bent tie, kuri ų 
kiekis sudaro ≥ 10 % įdėtos dozės, ir jų susidarymo bei išnykimo 
greičiams parodyti turi b ūti gauti j ų koncentracijos logaritmo kaip 
laiko funkcijos grafikai, kokie buvo gauti pradin ės medžiagos atveju.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Pusėjimo trukm ės arba DT  50 vertės nustatomos tiksliau, taikant 
atitinkamo kinetinio modelio apskai čiavimus. Pus ėjimo trukm ės ir 
(arba) DT  50 vertės (įskaitant pasikliovimo ribas) pateikiamos kiek ­
vienai pH ir temperat ūros vertei, kartu aprašomas taikytas modelis, 
kinetikos laipsnis ir nustatymo koeficientas (r  2 ). Be to, jei tinka, 
apskaičiavimai taikomi hidroliz ės produktams.  
Atliekant grei čio tyrimus, esant skirtingoms temperat ūros vertėms, 
pseudopirmojo laipsnio hidroliz ės greičio konstantos (k  obs ) turėtų 
būti aprašytos kaip temperat ūros funkcija. Apskai čiavimas tur ėtų 
būti pagrįstas k  obs konstantos padalijimu į hidrolizės, katalizuojamos 
rūgštine, neutralia ir šarmine terpe, konstantas (atitinkamai k  H , k neutral  
ir k  OH ) ir Arenijaus lygtimi:  
k obs ¼ ðk H ½H þ âÞ þ ðk neutral Þ þ ðk OH ½OH Ä âÞ ¼ Í Ê 
Σ 
i ¼ H,neutral,OH ÌÊ 
A i e ÄB i=T Ì Î 
kurioje A  i ir B  i yra geriausios atitikties tiesi ų, gautų naudojant tiesin ę 
ln k  i kaip atvirkštin ės absoliu čiosios temperat ūros (T) funkcijos 
regresiją, atkarpa ir krypties koeficientas. Taikant Arenijaus lygtis 
hidrolizei, katalizuojamai r ūgštine, neutralia ir šarmine terpe, 
gaunamos pseudopirmojo laipsnio grei čio konstantos, taigi pus ėjimo 
trukmės vertės gali būti apskaičiuotos kitoms temperat ūros vertėms, 
kurioms tiesioginis grei čio konstantos nustatymas bandymo keliu yra 
neįmanomas (10).  
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Didžioji dalis hidroliz ės reakcijų vyksta pseudopirmojo laipsnio reak ­
cijos grei čiu, taigi pus ėjimo trukm ės vertės nepriklauso nuo koncent ­
racijos (žr. 2 pried ėlio 4 lygt į). Dėl šios priežasties laboratorinius 
rezultatus, gautus 10–2–10–3 mol/l, paprastai galima taikyti aplinkos 
sąlygoms ( ≤ 10–6 mol/1) (10). Kelis įvairių chemini ų medžiag ų 
hidrolizės greičių, išmatuot ų švariame ir gamtiniame vandenyje, 
gero sutapimo pavyzdžius, jei buvo matuojamos pH ir temperat ūros 
vertės, paskelb ė Mabey ir Mill (11).  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti bent ši informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— įprastas pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, 
struktūrinė formulė (rodanti žym ėtojo atomo pad ėtį, jei naudo ­
jama žym ėtoji medžiaga) ir atitinkamos fizikin ės ir chemin ės 
savybės (žr. 1.5 skirsn į), 
— bandomosios medžiagos grynumas (priemaišos),  
— radiocheminis žym ėtosios chemin ės medžiagos grynumas ir 
molinis aktyvumas (jei tinka).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Buferiniai tirpalai:  
— ruošimo datos ir išsami informacija,  
— naudoti buferiniai tirpalai ir vanduo,  
— buferini ų tirpalų molinė koncentracija ir pH.  
Bandymo s ąlygos:  
— tyrimų atlikimo datos,  
— įdėtos bandomosios medžiagos kiekis,  
— metodai ir tirpikliai (tipas ir kiekis), naudoti bandomajai 
medžiagai įdėti, 
— inkubuojam ų buferuot ų bandomosios medžiagos tirpal ų tūris, 
— naudotos inkubavimo sistemos aprašymas,  
— pH ir temperat ūra tyrimo laikotarpiu,  
— mėginių ėmimo laikas,  
— ekstrahavimo metodas (-ai),  
— bandomosios medžiagos ir jos hidroliz ės buferiniuose tirpaluose 
kiekybinio nustatymo ir identifikavimo metodai,  
— kartotini ų bandinių skaičius. 
Rezultatai:  
— taikyt ų analizės metodų pakartojamumas ir jautrumas,  
— atgavimo laipsnio vert ės (tinkamu patvirtinto tyrimo % vert ės yra 
pateiktos 1.7.1 skirsnyje),  
— kartotini ų bandinių duomenys ir vidurkiai lenteli ų pavidalu,  
— masių balansas tyrim ų eigoje ir j ų pabaigoje (kai naudojama 
žymėtoji bandomoji medžiaga),  
— pradinio bandymo rezultatai,  
— rezultat ų aptarimas ir aiškinimas,  
— visi pradiniai duomenys ir skai čiai. 
Šią informacij ą reikia pateikti tik nusta čius hidroliz ės greitį: 
— bandomosios medžiagos ir, jei tinka, hidroliz ės produkt ų 
koncentracijos ver čių kaip laiko funkcijos grafikus kiekvienai 
pH ir temperat ūros vertei,  
— Arenijaus lygties rezultat ų duomenis esant 20 °C/25 °C tempe ­
ratūrai, pH vertes, grei čio konstant ą [h -1 arba para  -1 ], pusėjimo 
trukmę arba DT  50 , temperat ūros vertes [°C], įskaitant pasiklio ­
vimo ribas ir koreliacijos koeficientus (r  2 ), arba palyginam ąją 
informacij ą; 
— siūlomą hidrolizės kelią. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. NUORODOS  
1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals Nr. 111, adopted 12 May 1981.  
2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 °C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
4) European Union (ES) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: 
Fate and Behaviour in the Environment.
 
5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser 
(October 1980).  
7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and SAFEty Publications Series on Testing and Assess ­
ment Nr. 23.
 
9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994–2000): Addenda 6–11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, 
November 1993).  
11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental condi ­
tions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383–415.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
1 priedėlis 
Pakopinio hidroliz ės bandymo schema
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
2 priedėlis 
Apibrėžtys ir vienetai  
Visais atvejais tur ėtų būti naudojami  Tarptautin ės vienetų sistemos (SI)  vienetai.  
Bandomoji medžiaga  – bet kuri medžiaga, ar tai b ūtų pradinis junginys ar 
atitinkami virsmo produktai.  
Virsmo produktai  – visos medžiagos, susidaran čios vykstant biotiniam arba 
abiotiniam bandomosios medžiagos virsmui.  
Hidrolizės produktai  – visos medžiagos, susidaran čios vykstant bandomosios 
medžiagos hidrolizinio virsmo reakcijoms.  
Hidrolizė – bandomosios medžiagos RX reakcija su vandeniu, kai reakcijos 
centro X grup ė pakeičiama vien tik OH: 
RX + HOH → ROH + HX  [1]  
Pagal šią supaprastint ą proceso lygt į RX koncentracijos maž ėjimo greitis apra ­ 
šomas lygtimi: 
greitis = k [H  2 O] [RX]  antrojo laipsnio reakcija  
arba 
greitis = k [RX]  pirmojo laipsnio reakcija  
priklausomai nuo greit į ribojančios stadijos. Kadangi palyginus su bandomosios 
medžiagos koncentracija vandens perteklius yra didelis, šio tipo reakcija paprastai aprašoma pseudopirmojo laipsnio reakcija, kurios stebima grei čio konstanta apra ­ 
šoma lygtimi: 
k
 obs = k [H  2 O] [2]  
ir gali būti nustatyta taikant ši ą išraišką (*): 
k obs ¼ Í ð1Þ 
ðtÞ Î 
ln Í 
ðC o Þ 
ðC t Þ Î 
[3] 
čia t – laikas,  
C 0 , C t – RX koncentracija laike 0 ir t.  
Šios konstantos vienet ų dimensija (laikas)  -1 , o reakcijos pus ėjimo trukm ė (laikas, 
per kurį sureaguoja 50 % RX) aprašoma lygtimi:  
t 0,5 ¼ Í ðln2Þ 
ðk obs Þ Î 
[4] 
Pusėjimo trukm ė (t 0,5 ) – laikas, per kur į hidrolizuojasi 50 % bandomosios 
medžiagos, kai reakcija gali b ūti aprašyta pirmojo laipsnio kinetika; trukm ė 
nepriklauso nuo koncentracijos.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Jei logaritminis duomen ų kaip laiko funkcijos grafikas n ėra tiesė (aprašanti pirmojo 
laipsnio reakcijos greit į), [3] lygtis netinka bandomojo junginio hidroliz ės greičio 
konstantai nustatyti.
 DT 50 (išnykimo trukm ė 50) – laikas, per kur į bandomosios medžiagos koncent ­
racija sumaž ėja 50 %; ši trukm ė ir pusėjimo trukm ė t 0,5 skiriasi, kai reakcija 
neatitinka pirmojo laipsnio kinetikos.  
k įvertinimas esant skirtingoms temperat ūros vertėms 
Kai reakcijos grei čio konstantos žinomos dviem temperat ūros vertėms, reakcijos 
greičio konstantos vert ės kitai temperat ūrai gali b ūti apskaičiuotos taikant Areni ­
jaus lygtį: 
k ¼ Í 
A Ü e – Ê ðEÞ 
ðR Ü TÞ Ì Î 
arba ln  k ¼ Í ð–EÞ 
ðR Ü TÞ Î 
þ ln A  
ln k kaip l/T funkcijos grafikas yra ties ė, kurios krypties koeficientas – E/R  
čia: 
k = grei čio konstanta, išmatuota esant skirtingoms temperat ūros vertėms, 
E = aktyvacijos energija [kJ/mol],  
T = absoliu čioji temperat ūra [K],  
R = duj ų konstanta [8,314 J/mol. K]  
Aktyvacijos energija buvo apskai čiuota, taikant regresin ę analizę arba šią lygtį: 
E ¼ R Ü Í 
ðln k 2 – ln k  1 Þ Ê Ä ð1Þ 
ðT 1 Þ Ö – Ä ð1Þ 
ðT 2 Þ Ö Ì Î 
čia: T  2 > T  1 . ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
3 priedėlis 
Buferinių tirpalų sistemos  
A. CLARK IR LUBS  
CLARK ir LUBS buferiniai mišiniai  (*) 
Sudėtis pH  
0,2 N HCl ir 0,2 N KCl esant 20 °C  
47,5 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml  1,0  
32,25 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml  1,2  
20,75 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml  1,4  
13,15 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml  1,6  
8,3 ml HC1 + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml  1,8  
5,3 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml  2,0  
3,35 ml HCl + 25 ml KCl skiesti iki 100 ml  2,2  
0,1 M kalio biftalato + 0,1 N HCl esant 20 °C  
46,70 ml 0,1 N HCl + 50 ml biftalato iki 100 ml  2,2  
39,60 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato iki 100 ml  2,4  
32,95 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato iki 100 ml  2,6  
26,42 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato iki 100 ml  2,8  
20,32 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato iki 100 ml  3,0  
14,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato iki 100 ml  3,2  
9,90 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato iki 100 ml  3,4  
97 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato iki 100 ml  3,6  
2,63 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato iki 100 ml  3,8  
0,1 M kalio biftalato + 0,1 N NaOH esant 20 °C  
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  4,0  
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  4,2  
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  4,4  
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  4,6  
17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  4,8  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Šiose lentel ėse pateiktos pH vert ės buvo apskai čiuotos pagal potencialo matavimus, taikant Sorensen stan ­
dartines lygtis (1909 m.). Atitinkamos pH vert ės yra 0,04 vieneto didesn ės nei nurodytos lentel ėje.
 Sudėtis pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  5,0  
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  5,2  
35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  5,4  
39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  5,6  
43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  5,8  
45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml biftalato iki 100 ml  6,0  
CLARK ir LUBS buferiniai mišiniai (t ęsinys)  
0,1 M kalio dihidrofosfato + 0,1 N NaOH esant 20 °C  
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  6,0  
8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  6,2  
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  6,4  
17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  6,6  
23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  6,8  
29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  7,0  
35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  7,2  
39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  7,4  
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  7,6  
45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  7,8  
46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato iki 100 ml  8,0  
0,1 M H  3 BO 3 + 0,1 M KC1 + 0,1 N NaOH esant 20 °C  
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  7,8  
3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  8,0  
5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  8,2  
8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  8,4  
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  8,6  
16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  8,8  
21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  9,0  
26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  9,2  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  9,4  
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  9,6  
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  9,8  
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml boro r ūgšties iki 100 ml  10,0  
B. KOLTHOFF IR VLEESCHOUWER  
KOLTHOFF ir VLEESCHOUWER citratiniai buferiniai tirpalai  
Sudėtis pH  
0,1 M monokalio citrato ir 0,1 N HC1, esant 18 °C  (*) 
49,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml  2,2  
43,4 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml  2,4  
36,8 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml  2,6  
30,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml  2,8  
23,6 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml  3,0  
17,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml  3,2  
10,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml  3,4  
4,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato iki 100 ml  3,6  
0,1 M monokalio citrato ir 0,1 N NaOH, esant 18 °C  (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  3,8  
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  4,0  
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  4,2  
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  4,4  
31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  4,6  
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  4,8  
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  5,0  
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  5,2  
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  5,4  
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  5,6  
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  5,8  
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato iki 100 ml  6,0  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
( 1 ) Apsaugai nuo pel ėsių augimo įdedamas nedidelis timolio arba panašios medžiagos kristalas.
 C. SÖRENSEN  
SÖRENSEN boratiniai mišiniai  
Sudėtis Sörensen 
18 °C  Walbum , pH, esant  
ml borakso  ml HCl/NaOH  10 °C  40 °C  70 °C  
0,05 M borato + 0,1 N HC1  
5,25 4,75  7,62  7,64  7,55  7,47  
5,50 4,50  7,94  7,98  7,86  7,76  
5,75 4,25  8,14  8,17  8,06  7,95  
6,00 4,00  8,29  8,32  8,19  8,08  
6,50 3,50  8,51  8,54  8,40  8,28  
7,00 3,00  8,08  8,72  8,56  8,40  
7,50 2,50  8,80  8,84  8,67  8,50  
8,00 2,00  8,91  8,96  8,77  8,59  
8,50 1,50  9,01  9,06  8,86  8,67  
9,00 1,00  9,09  9,14  8,94  8,74  
9,50 0,50  9,17  9,22  9,01  8,80  
10,00  0,00  9,24  9,30  9,08  8,86  
0,05 M borato + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0  9,24  9,30  9,08  8,86  
9,0 1,0  9,36  9,42  9,18  8,94  
8,0 2,0  9,50  9,57  9,30  9,02  
7,0 3,0  9,68  9,76  9,44  9,12  
6,0 4,0  9,97  10,06  9,67  9,28  
SÖRENSEN fosfatiniai mišiniai  
Sudėtis pH  
0,0667 M monokalio fosfato + 0,0667 M dinatrio fosfato, esant 20 °C  
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOKSIŠKUMAS SLIEKAMS  
DIRBTINIO DIRVOŽEMIO BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Šiame laboratoriniame bandyme bandomoji medžiaga maišoma su 
dirbtiniu dirvožemiu, į kurį 14 parų dedami sliekai. Kai baigiasi 
šis laikas (ir neprivalomai po septyni ų parų), tiriamas medžiagos 
mirtinas poveikis sliekams. Bandyme pateiktas metodas, kaip daryti palyginus greit ą medžiagų, kurios per od ą ir virškinimo trakt ą veikia 
sliekus, poveikio patikrinim ą
 
1.2. APIBR ĖŽTIS IR VIENETAS  
LC 50 – koncentracija medžiagos, d ėl kurios, kaip nustatyta, per 
bandymo laik ą žūsta 50 % bandom ųjų gyvūnų. 
1.3. ETALONIN Ė MEDŽIAGA  
Periodiškai naudojama etalonin ė medžiaga, kaip priemon ė parodyti, 
kad bandymo sistemos jautrumas žymiai nepakito.  
Etalonine medžiaga rekomenduojama naudoti analiziškai gryn ą chlo­
racetamid ą. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Dirvožemis yra nepastovi terp ė, todėl šiame bandyme naudojamas 
tiksliai apibr ėžtas dirbtinis priemolio dirvožemis. Suaug ę Eisenia 
foetida  rūšies sliekai (žr. pried ėlio pastab ą) laikomi apibr ėžtos sudė­
ties dirbtiniame dirvožemyje, apdorotame įvairios koncentracijos 
bandomąja medžiaga. Ind ų turinys po 14 par ų (ir neprivalomai po 
septynių parų) nuo bandymo pradžios yra pasklaidomas ant pad ėklo, 
ir kiekvienai naudotai koncentracijai skai čiuojami lik ę gyvi sliekai.  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Bandymas sudarytas taip, kad atkuriamumas bandymo substrato ir 
organizmo atžvilgiu b ūtų kiek įmanoma geresnis. Gaištamumas kont ­
roliniuose bandiniuose bandymo pabaigoje turi b ūti ne didesnis kaip 
10 %, kitaip bandymas yra netinkamas.  
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Medžiagos  
1.6.1.1. B a n d y m o s u b s t r a t a s  
Bandymo pagrindiniu substratu naudojamas apibr ėžtas dirbtinis 
dirvožemis.  
a) Pagrindinis substratas (procentin ė sudėtis skaičiuojama sausos 
medžiagos masei)  
— 10 % saman ų durpių (pH reikšm ė kiek įmanoma ar čiau 
5,5–6,0, be matom ų augalų liekanų ir smulkiai malt ų), ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % kaolinito molio; pageidautina, kad kaolinito jame b ūtų 
daugiau kaip 50 %,  
— apie 69 % pramoninio kvarco sm ėlio (daugiausia tai turi b ūti 
smulkus sm ėlis, kurio daugiau kaip 50 % daleli ų dydis būtų 
nuo 0,05 iki 0,2 mm). Jei medžiagos dispergavimas vandenyje nepakankamas, kiekvienam bandymo indui reik ėtų turėti 10 g 
smėlio, kurį vėliau būtų galima maišyti su bandom ąja 
medžiaga,
 
— apie 1 % kalcio karbonato (CaCO  3 ), smulkiai malto, 
chemiškai gryno, dedamo padidinti pH vert ę iki 6,0 ± 0,5.  
b) Bandymo substratas  
Bandymo substratas susideda iš pagrindinio substrato, bandomo ­
sios medžiagos ir dejonizuoto vandens.  
Vanduo jame sudaro maždaug nuo 25 % iki 42 % sauso pagrin ­
dinio substrato mas ės. Vandens kiekis substrate nustatomas džio ­
vinant bandin į 105 °C temperat ūroje iki pastoviosios mas ės. 
Pagrindinis kriterijus – dirbtin į dirvožem į reikia dr ėkinti tol, kol 
nėra stovinčio vandens. B ūtina rūpestingai maišyti, kad bando ­
moji medžiaga tolygiai b ūtų pasiskirstyta substrate. Bandomosios 
medžiagos įterpimo į substratą būdas turi b ūti nurodytas ataskai ­
toje. 
c) Kontrolinis substratas  
Kontrolin į substratą sudaro pagrindinis substratas ir vanduo. Jei 
naudojamas priedas, papildomame kontroliniame bandinyje turi 
būti toks pat priedo kiekis.  
1.6.1.2. B a n d y m o i n d a i  
Maždaug vieno litro talpos stiklinis indas (tinkamai uždengtas plas ­
tiko dang čiu, lėkštele ar plastiko pl ėvele su ventiliacijos angomis), 
užpildytas tokiu kiekiu dr ėgno bandymo substrato ar kontrolinio 
substrato, kuris atitikt ų 500 g sauso substrato mas ę. 
1.6.2.  Bandymo s ąlygos  
Indai turi b ūti laikomi nuolat apšviestose klimato kamerose 
20 ± 2 °C temperat ūroje. Apšvieta turi b ūti nuo 400 iki 800 liuks ų. 
Bandymo trukm ė – 14 par ų, tačiau gaištamum ą, pasirinktinai, galima 
vertinti po septyni ų parų nuo bandymo pradžios.  
1.6.3.  Bandymo proced ūra 
B a n d o m o s i o s m e d ž i a g o s k o n c e n t r a c i j o s v e r t ė s 
Bandomosios medžiagos koncentracija skai čiuojama medžiagos mase 
sauso pagrindinio substrato masei (mg/kg).  
I n t e r v a l o n u s t a t y m o b a n d y m a s  
Norint tur ėti informacij ą, kokias koncentracijas naudoti galutiniame 
bandyme, intervalo nustatymo bandyme gali b ūti nustatytas koncent ­
racijų, dėl kurių gaištamumas kinta nuo 0 iki 100 %, intervalas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Medžiaga turi b ūti išbandyta tokios koncentracijos: 1 000; 100; 10; 
1; 0,1 mg medžiagos kilogramui bandymo substrato (sausos mas ės). 
Jei turi būti atliekamas visas galutinis bandymas, tai intervalo nusta ­
tymo bandyme kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam bandymui 
be medžiagos pakakt ų po vien ą bandymų partiją, kurioje b ūtų 10 
sliekų. 
G a l u t i n i s b a n d y m a s  
Intervalo nustatymo rezultatai naudojami parinkti bent penkias 
geometrin ę progresij ą sudarančias koncentracijas, kurios apima tik 
gaištamumo interval ą nuo 0 iki 100 % ir skiriasi pastoviu daugikliu, 
ne didesniu kaip 1,8.  
Bandymai, naudojant toki ą koncentracij ų seriją, turi leisti kiek 
įmanoma tiksliau įvertinti LC  50 vertę ir jos pasikliovimo ribas.  
Galutiniame bandyme kiekvienai koncentracijai ir kontroliniam 
bandymui be medžiagos imamos bent keturios bandym ų partijos, 
kurių kiekvienoje b ūtų 10 sliekų. Šių lygiagrečių bandymų rezultatai 
pateikiami vidutin ės vertės ir standartinio nuokrypio pavidalu.  
Kai dvi gretimos koncentracijos, kuri ų santykis 1,8, duoda tik 0 % ir 
tik 100 % gaištamum ą, šių dviejų verčių pakanka pažym ėti interval ą, 
į kurį patenka LC  50 . 
P a g r i n d i n i o b a n d y m o s u b s t r a t o i r b a n d o m o s i o s 
m e d ž i a g o s m a i š y m a s  
Bandymo substratas turi b ūti gaminamas, kai tai įmanoma, be joki ų 
priedų, išskyrus vanden į. Prieš pat bandymo pradži ą bandomosios 
medžiagos emulsija ar dispersija dejonizuotame vandenyje ar kitame 
tirpiklyje sumaišoma su pagrindiniu bandymo substratu arba tolygiai ant jo užpurškiama plonu chromatografiniu ar panašios r ūšies purkš ­
tuvu.
 
Jei bandomoji medžiaga netirpsta vandenyje, ji gali b ūti ištirpinta 
kuo mažesniame tinkamo organinio tirpiklio t ūryje (pvz., heksane, 
acetone ar chloroforme).  
Bandomajai medžiagai tirpinti, disperguoti ar emulguoti galima 
naudoti tik lengvai garuojan čias medžiagas. Prieš naudojant 
bandymo substratas turi b ūti vėdinamas. Išgaravusio vandens kiekis 
turi būti papildytas. Kontroliniame bandinyje turi b ūti toks pat kiek ­
vieno naudoto priedo kiekis.  
Jei bandomoji medžiaga netirpsta ir negali b ūti disperguota ar emul ­
guota organiniuose tirpikliuose, 10 g smulkaus malto kvarco ir 
bandomosios medžiagos, kiek jos reikia 500 g sauso dirbtinio dirvo ­ 
žemio apdoroti, mišinys maišomas su 490 g sauso bandomojo substrato.
 
Kiekvienai bandym ų partijai į stiklinį indą dedama šlapio bandymo 
substrato, atitinkan čio 500 g sauso substrato, ir ant bandymo 
substrato viršaus dedama 10 sliek ų, kurie prieš tai 24 valandas 
buvo laikomi panašiame šlapiame pagrindiniame substrate, po to 
greitai nuplauti vandeniu, vandens pertekli ų sugeriant filtriniu popie ­
riumi.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Indai uždengiami perforuotu plastikiniu dang čiu, lėkštele ar pl ėvele, 
kad substratas nedži ūtų, ir 14 par ų laikomi bandymo s ąlygomis.  
Vertinimas turi b ūti atliekamas po 14 par ų (ir pasirinktinai po 
septynių parų) nuo bandymo pradžios. Substratas paskleidžiamas 
ant stiklin ės ar nerūdijančio plieno plokšt ės. Sliekai apži ūrimi ir 
nustatomas gyv ųjų sliekų skaičius. Sliekai laikomi nugaišusiais, jei 
jie neatsako į švelnų mechanin į priekinio galo dirginim ą. 
Kai tikrinimas atliekamas po septyni ų parų, indas v ėl užpildomas 
substratu, ir lik ę gyvi sliekai dedami ant to paties bandymo substrato 
viršaus.  
1.6.4.  Bandomieji organizmai  
Bandomieji organizmai turi b ūti suaugę Eisenia foetida  (žr. pried ėlio 
pastabą) (bent dviej ų mėnesių amžiaus su  clitellum ), drėgnų sliekų 
masė yra nuo 300 iki 600 mg. (Apie auginimo metod ą žr. pried ėlį.) 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS IR VERTINIMAS  
Ataskaitoje pateikiamos bandomosios medžiagos koncentracijos su 
nuoroda į atitinkam ą procentin į kiekį nugaišusi ų sliekų. 
Kai duomenys yra tinkami skai čiuoti, LC  50 vertė ir pasikliovimo 
ribos (p = 0,05) turi b ūti nustatyti taikant standartinius metodus 
(Litchfield ir Wilcoxon, 1949, lygiaver čiam metodui). LC  50 turi 
būti nurodyta mg bandomosios medžiagos vienam kilogramui 
bandymo substrato (sauso).  
Tais atvejais, kai koncentracijos kreiv ė yra per stati, kad b ūtų galima 
skaičiuoti LC  50 , pakanka grafinio šios vert ės įverčio. 
Kai dvi gretimos koncentracijos, kuri ų santykis 1,8, duoda tik 0 % ir 
tik 100 % gaištamum ą, šių dviejų verčių pakanka pažym ėti interval ą, 
į kurį patenka LC  50 . 
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje pateikiama, jei įmanoma, tokia informacija:  
— tvirtinimas, kad bandymas buvo atliekamas pagal aukš čiau 
minėtus kokyb ės kriterijus,  
— atliktas bandymas (intervalo nustatymo bandymas ir (ar) galutinis 
bandymas),  
— tikslus bandymo s ąlygų aprašymas arba patvirtinimas, kad 
bandymas buvo atliktas pagal metod ą; turi būti nurodyti visi 
nukrypimai,  
— tikslus aprašymas, kaip bandomoji medžiaga buvo įmaišyta į 
pagrindin į bandymo substrat ą, 
— informacija apie bandomuosius organizmus (r ūšis, amžius, mas ės 
vidutinė vertė ir intervalas, laikymo ir auginimo s ąlygos, 
tiekėjas), ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— metodas, taikytas nustatyti LC  50 , 
— bandymo rezultatai, įskaitant visus naudotus duomenis,  
— bandom ųjų organizm ų pastebėtų simptom ų ar elgesio poky čių 
aprašymas,  
— gaištamumas kontroliniuose bandiniuose,  
— LC  50 ar didžiausia bandyta koncentracija, kurioje gaištamumas 
nulinis, ir mažiausia bandyta koncentracija, kurioje gaištamumas 
100 %, 14 par ų (pasirinktinai septynios paros) nuo bandymo 
pradžios,  
— koncentracijos ir atsako kreiv ės brėžinys,  
— rezultatai, gauti su etalonine medžiaga, šiame bandyme ar iš 
ankstesniųjų kokybės kontrolės tyrimų. 
4. NUORODOS  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 207, Decision of the Council 
C(81)30 final.  
2) Edwards, C. A. and Lofty],. R., 1977, Biology of Earthworms, 
Chapman and Hall, London, p. 331.  
3) Bouche. M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Syste ­
matique, Institut National de la Recherche Agronomique, p. 671.  
4) Litchfield, J. T. andWilcoxon, F., A simplified method of evalua ­
tion dose effect experiments. I. Pharm. Exp. Therap., vol. 96, 
1949, p. 99.  
5) Commission of the European Communities, Development of a 
standardized laboratory method for assessing the toxicity of 
chemical substances to earthworms, Report EUR 8714 EN, 1983.  
6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizitatstest am Regenwurm  Eisenia foetida  in künstlichem Boden“, in: 
Rudolph/Boje, Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Priedėlis 
Sliekų auginimas ir laikymas prieš bandymus  
Norint auginti gyv ūnus, į auginimo d ėžę su šviežiai paruoštu substratu dedama 
nuo 30 iki 50 suaugusi ų sliekų, kurie išimami po 14 par ų. Šiuos gyv ūnus galima 
naudoti kitoms auginimo partijoms. Iš kokon ų gauti sliekai bandymuose naudo ­
jami, kai subr ęsta (nurodytomis s ąlygomis po dviej ų ar trijų mėnesių). 
Laikymo ir auginimo s ąlygos  
Klimato kamera : temperat ūra 20 ± 2 °C, geriau, jei nuolat apšviesta 
(apšvieta nuo 400 iki 800 liuks ų). 
Auginimo d ėžės : tinkami negil ūs 10–20 1 t ūrio indai.  
Substratas :  Eisenia foetida  gali būti veisiami įvairių gyvulių išma­
tose. Rekomenduojama auginimo terpe naudoti mišin į, 
kurį sudaro 50 % pagal t ūrį durpės ir 50 % karvi ų ar 
arklių mėšlas. Terp ės pH vert ė turi būti nuo 6 iki 7 
(reguliuojama kalcio karbonatu), savitasis joninis laidis 
mažas (mažesnis nei 6 mohm ar druskos 0,5 % 
koncentracijos tirpalo).  
Substratas turi b ūti drėgnas, bet ne per šlapias.  
Be aukščiau pateikto metodo galima naudoti kitus 
sėkmingus b ūdus. 
Pastaba. Eisenia foetida  yra dviej ų veislių, kurias kai kurie taksonomijos specia ­
listai išskyr ė į rūšis (Bouche, 1972). Šios veisl ės morfo­
logiškai yra panašios, ta čiau viena j ų – Eisenia foetida 
foetida  – ant segment ų turi tipiškus skersus dryžius ar 
juostas, o kita –  Eisenia foetida andrei  – to neturi ir yra 
margos rausvos spalvos. Jei įmanoma, turi b ūti naudo­
jama  Eisenia foetida andrei . Galima naudoti ir kitas 
rūšis, jei yra reikiamos metodikos.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIOLOGINIS SKAIDYMAS  
ZAHN-WELLENS BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Metodo tikslas yra įvertinti vandenyje tirpi ų, nelakių organini ų 
medžiagų galimą biologin į suskaidym ą, kai jas statiniame bandyme 
veikia palyginti didel ės koncentracijos mikroorganizmai.  
Ant suspenduot ų kietųjų dalelių gali vykti fizikochemin ė adsorbcija, 
ir į tai turi b ūti atsižvelgta aiškinant rezultatus (žr. 3.2).  
Bandomosios medžiagos naudojamos tokios koncentracijos, kad 
atitiktų DOC vertes intervale nuo 50 iki 400 mg/litre ar COD vertes 
nuo 100 iki 1 000 mg/litre (DOC = ištirpusi organin ė anglis; COD = 
cheminis deguonies suvartojimas). Šios palyginti didel ės koncentra ­
cijos turi analizinio patikimumo pranašum ą. Junginiai, kurie turi 
toksinių savybių, gali sulėtinti arba inhibuoti skaidymo proces ą. 
Bandomosios medžiagos biologiniam suskaidymui įvertinti šiame 
bandyme taikomas ištirpusios organin ės anglies koncentracijos arba 
cheminio deguonies poreikio matavimas.  
Lygiagrečiai taikant specifin į analizės metodą gali būti įmanoma 
įvertinti medžiagos pirmin į biologin į skaidym ą (pirminės chemin ės 
sandaros išnykimas).  
Metodas tinka tik toms organin ėms bandomosioms medžiagoms, 
kurios bandyme naudojamomis koncentracijomis:  
— tirpios vandenyje bandymo s ąlygomis,  
— garų slėgis bandymo s ąlygomis yra labai mažas,  
— neinhibuoja bakterij ų, 
— bandymo sistemoje adsorbuojamos tik ribotu laipsniu,  
— iš bandomojo tirpalo nepradingsta d ėl putojimo.  
Norint paaiškinti gautus rezultatus, ypa č kai rezultatai yra žemi arba 
ribiniai, naudinga b ūtų turėti informacijos apie bandomosios 
medžiagos pagrindini ų komponent ų santykin ę dalį. 
Kai reikia paaiškinti žemus rezultatus ir pasirinkti tinkamas bando ­
mąsias koncentracijas, pageidautina tur ėti informacijos apie 
medžiagos toksiškum ą mikroorganizmams.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Bandymo pabaigoje pasiektas skaidymo lygis ataskaitoje pateikiamas 
kaip „Biologinis skaidumas Zahn-Wellens bandyme“:  
D T ð%Þ ¼ Í " 
1 – Í ðC T – C  B Þ 
ðC A – C  BA Þ Î # 
Ü 100 Î 
čia: 
D T = biologinis skaidymas (%) laiku T,  
C A = DOC (ar COD) vert ės bandomajame mišinyje po trij ų 
valandų nuo bandymo pradžios (mg/l) (DOC = ištirpusi 
organinė anglis, COD = cheminis deguonies suvarto ­
jimas),  
C T = DOC ar COD vert ės bandomajame mišinyje bandinio 
ėmimo metu (mg/l),  
C B = DOC ar COD vert ė tuščiajame bandinyje bandinio ėmimo 
metu (mg/l),  
C BA = DOC ar COD vert ė tuščiajame bandinyje, išmatuota po 
trijų valandų nuo bandymo pradžios (mg/l).  
Skaidymo laipsnis apvalinamas iki artimiausio sveikojo procent ų 
skaičiaus. 
Skaidymo procentin ė vertė nurodoma kaip bandomosios medžiagos 
DOC (ar COD) pašalinimo procentin ė vertė. 
Skaidymo vert ės, išmatuotos po trij ų valandų, ir apskai čiuotos, bet 
geriau išmatuotos, pradin ės vertės skirtumas gali suteikti naudingos 
informacijos apie medžiagos šalinim ą (žr. 3.2. Rezultat ų aiškinimas).  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, etalonin ės 
medžiagos gali b ūti naudingos, ta čiau specifin ės etalonin ės 
medžiagos vis dar negali b ūti rekomenduotos.  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Aktyvusis dumblas, mineralin ė mitybin ė terpė ir bandomoji 
medžiaga, kaip vienintelis anglies šaltinis vandeniniame tirpale, dedami kartu į vieno–keturi ų litrų tūrio stiklin į indą su maišikliu ir 
aeratoriumi. Mišinys ne ilgiau kaip 28 paras maišomas ir aeruojamas 
20–25 °C temperat ūroje išsklaidytoje šviesoje arba tamsioje patal ­
poje. Skaidymo procesas kontroliuojamas nustatant DOC (ar COD) vertes filtruotame tirpale kasdien ar kitokiais reguliariais tinkamais 
laiko tarpais. Po kiekvieno matavimo nustatytos DOC (ar COD) 
pašalinimo vert ės ir vertės, gautos po trij ų valandų nuo bandymo 
pradžios, santykis reiškiamas procentine biologinio skaidymo verte ir yra naudojamas kaip tam momentui nustatytas skaidymo laipsnio 
matas. Rezultatas br ėžiamas kaip kitimas laike ir gaunama biologinio 
skaidymo kreiv ė.
 
Kai taikomas specifinis analiz ės metodas, galima nustatyti pradin ės 
medžiagos koncentracijos poky čius dėl jos molekuli ų biologinio 
skaidymo (pirminis biologinis skaidumas).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Tarplaboratorinio lyginimo bandymas parod ė, kad šio metodo atku ­
riamumas yra tinkamas.  
Metodo jautrumas labai priklauso nuo tuš čiojo bandinio kintamumo 
ir, kiek mažiau, nuo ištirpusios organin ės anglies nustatymo preci ­
ziškumo ir bandomosios medžiagos kiekio skystyje.  
1.6. BANDYMO METODIKOS APRAŠYMAS  
1.6.1.  Pasirengimas  
1.6.1.1. R e a g e n t a i  
Bandymo vanduo – geriamasis vanduo, kuriame organin ės anglies 
kiekis < 5 mg/litre. Bendra kalcio ir magnio jon ų koncentracija 
neturi būti didesnė kaip 2,7 mmol/litre; priešingu atveju, reikia atitin ­
kamai skiesti dejonizuotu arba distiliuotu vandeniu. 
Sieros rūgštis, analizinis reagentas (A.R.):  50 g/l  
Natrio hidroksido tirpalas A.R.:  40 g/l  
Mineralinis mitybinis tirpalas: viename litre dejonizuoto 
vandens ištirpinkite:  
amonio chlorido, NH  4 Cl, A.R.:  38,5 g  
natrio dihidrofosfato, NaH  2 PO 4 x2H  2 O, A.R.:  33,4 g,  
kalio dihidrofosfato, KH  2 PO 4 , A.R.:  8,5 g,  
dikalio monohidrofosfato, K  2 HPO  4 , A.R.:  21,75 g.  
Mišinys naudojamas ir kaip mitybin ė, ir kaip buferuojanti terp ė. 
1.6.1.2. A p a r a t ū r a 
Nuo vieno iki keturi ų litrų talpos stikliniai indai (pvz., cilindriniai 
indai).  
Maišymo įtaisas su stikliniu ar metaliniu maišikliu ant tinkamo ilgio 
veleno (maišiklis turi suktis maždaug 5–10 cm virš indo dugno). Vietoj jo galima naudoti magnetin į maišiklį su 7–10 cm ilgio 
magnetu.
 
Stiklinis vamzdis, kurio vidinis skersmuo 2–4 mm, orui tiekti. Vamz ­
džio anga turi b ūti maždaug 1 cm aukštyje virš indo dugno.  
Centrifuga (apie 3 550 g).  
pH-metras.  
Ištirpusio deguonies matuoklis.  
Popieriniai filtrai.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Membraninio filtravimo aparatas.  
Membraniniai filtrai, aku čių dydis 0,45 μm. Membraniniai filtrai 
tinka, jei užtikrinama, kad filtravimo pakopoje jie neišskiria anglies ir nesugeria medžiagos.
 
Analizės įranga organin ės anglies kiekiui ir cheminiam deguonies 
suvartojimui nustatyti.  
1.6.1.3. S ė j i m o k u l t ū r o s r u o š i m a s  
Aktyvusis dumblas iš biologinio valymo įrenginio yra plaunamas 
(kelis kartus), centrifuguojant arba nusodinant iš bandymo vandens (žr. anksčiau).
 
Aktyvusis dumblas turi b ūti atitinkamos b ūsenos. Tokio dumblo yra 
tinkamai veikian čiame nuotek ų valymo įrenginyje. Norint gauti kiek 
įmanoma daugiau įvairių bakterijų rūšių ar štamų, gali būti geriau 
maišyti skirting ų šaltinių sėjimo kult ūras (pvz., skirting ų valymo 
įrenginių, dirvožemio ekstrakt ų, upės vandens ir t. t.). Mišinys turi 
būti apdorojamas, kaip aprašyta anks čiau. 
Kaip tikrinti aktyviojo dumblo aktyvum ą, žr. „Veikimo tikrinimas“, 
toliau.  
1.6.1.4. B a n d o m ų j ų t i r p a l ų r u o š i m a s  
Į bandymo ind ą įpilkite 500 ml bandymo vandens, 2,5 ml/litre mine ­
ralinio mitybinio tirpalo ir tiek aktyviojo dumblo, kad galutiniame 
mišinyje sausosios medžiagos b ūtų nuo 0,2 iki 1,0 g/litre. Įpilkite 
pakankam ą kiekį pradinio bandomosios medžiagos tirpalo, kad DOC 
koncentracija galutiniame mišinyje b ūtų nuo 50 iki 400 mg/litre. 
Atitinkamos COD vert ės yra nuo 100 iki 1 000 mg/litre. Praskieskite 
bandymo vandeniu iki bendrojo t ūrio nuo vieno iki keturi ų litrų. Tai, 
kokį bendrąjį tūrį pasirinkti, priklauso nuo bandini ų skaičiaus, kurie 
bus imami DOC ar COD nustatyti, ir nuo analiz ės metodikai reika ­
lingo tūrio. 
Paprastai galima laikyti, kad pakanka dviej ų litrų tūrio. Kiekvienai 
bandymų serijai lygiagre čiai ruošiamas bent vienas kontrolinis indas 
(su tuščiuoju bandiniu); jame yra tik aktyviojo dumblo ir mineralinio 
mitybinio tirpalo, praskiest ų bandymo vandeniu iki to paties t ūrio, 
kaip ir induose su bandom ąja medžiaga.  
1.6.2.  Bandymo proced ūra 
Išsklaidytoje šviesoje ar tamsioje patalpoje 20–25 °C temperat ūroje 
laikomų bandymo ind ų turinys maišomas magnetin ėmis maišykl ėmis 
ar sraigtiniais maišytuvais. Aeruojama susl ėgtuoju oru, valomu 
leidžiant per medviln ės filtrą ir, jei būtina, per plovimo kolb ą. Reikia 
užtikrinti, kad dumblas nenusistov ėtų, o deguonies koncentracija 
būtų ne mažesn ė kaip 2 mg/litre.  
pH vertė turi būti tikrinama vienodais laiko tarpais (pvz., kasdien) ir, 
jei būtina, nustatoma 7–8 pH vert ė. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Garavimo nuostoliai reikiamais kiekiais kompensuojami dejonizuotu 
ar distiliuotu vandeniu prieš pat kiekvien ą bandinio ėmimą. Gerai 
būtų pažymėti skysčio lygį ant indo sienel ės prieš bandymo pradži ą. 
Naujos žym ės daromos po kiekvieno bandinio ėmimo (neaeruojant ir 
nemaišant). Norint aptikti bandomosios medžiagos adsorbcij ą akty­
viuoju dumblu, pirmieji bandiniai visuomet imami po trij ų valandų 
nuo bandymo pradžios.  
Bandomosios medžiagos šalinimas sekamas, darant kasdien ar kitais 
vienodais laiko tarpais DOC ar COD nustatym ą. Bandiniai iš 
bandymo ir tuš čiojo bandymo ind ų filtruojami per kruopš čiai išplaut ą 
popieriaus filtr ą. Pirmieji bandomojo tirpalo filtrato 5 ml išpilami. 
Sunkiai filtruojamas dumblas gali b ūti prieš tai pašalintas 10 minu čių 
centrifugavimu. DOC ir COD nustatymas daromas bent po du kartus. Bandymo trukm ė ne daugiau kaip 28 paros.
 
Pastaba . Jei bandiniai lieka drumsti, jie filtruojami per membraninius 
filtrus. Membraniniai filtrai neturi išskirti ar adsorbuoti joki ų orga­
ninių medžiag ų. 
A k t y v i o j o d u m b l o v e i k i m o t i k r i n i m a s  
Norint patikrinti funkcin ę aktyviojo dumblo geb ą, lygiagre čiai kiek­
vienai bandym ų serijai turi b ūti atliekamas bandymas su žinoma 
medžiaga. Buvo nustatyta, kad šiam tikslui tinka dietilenglikolis.  
A d a p t a v i m a s  
Jei analiz ė atliekama palyginti dažnai (pvz., kasdien), adaptavim ą 
galima aiškiai atpažinti iš skaidymo kreiv ės (žr. 2 paveiksl ą). 
Todėl bandymas neturi b ūti pradedamas prieš pat savaitgal į. 
Jei adaptavimas įvyksta laikotarpio pabaigoje, bandym ą galima 
pratęsti, kol skaidymas bus baigtas.  
Pastaba . Jei reikia daugiau žini ų apie adaptuoto dumblo elgsen ą, tas 
pats aktyvusis dumblas dar kart ą naudojamas su ta pa čia bandom ąja 
medžiaga pagal toki ą metodiką: 
Išjunkite maišytuv ą ir aeratori ų ir leiskite dumblui nusistov ėti. Skystį 
virš dumblo nusiurbkite, įpilkite ne daugiau kaip du litrus bandymo 
vandens, 15 minu čių maišykite ir leiskite v ėl nusistov ėti. Skystį virš 
dumblo nusiurbkite dar kart ą, likusį dumblą naudokite bandymui su 
ta pačia medžiaga pagal 1.6.1.4 ir 1.6.2 pakartoti. Vietoj nusodinimo, 
aktyvųjį dumblą galima atskirti centrifugavimu.  
Adaptuotas dumblas gali b ūti sumaišomas su šviežiu dumblu, kad 
sausos medžiagos koncentracija b ūtų nuo 0,2 iki 1 g/litre.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n a l i z ė s p r i e m o n ė s 
Paprastai bandiniai filtruojami per kruopš čiai išplaut ą filtrinį popierių 
(plaukite dejonizuotu vandeniu).  
Bandiniai, kurie lieka drumsti, filtruojami per membranin į filtrą (0,45 
μm). 
DOC koncentracija bandini ų filtratuose (pirmieji 5 ml išpilami) 
nustatoma du kartus naudojant TOC nustatymo aparat ūrą. Jei filtrato 
negalima analizuoti t ą pačią dieną, iki kitos dienos jis turi b ūti 
laikomas šaldytuve. Ilgiau laikyti nerekomenduojama.  
COD koncentracija bandinio filtratuose nustatoma su COD analiz ės 
įranga, taikant toliau 2 nuorodoje aprašyt ą metodiką. 
2. DUOMENYS IR VERTINIMAS  
DOC ir (ar) COD koncentracija bandiniuose, gautuose pagal 1.6.2, 
nustatoma bent po du kartus. Skaidymas laiku T apskai čiuojamas 
pagal formul ę (su apibr ėžtimis), pateikt ą 1.2 aukš čiau. 
Skaidymo laipsnis apvalinamas iki artimiausio sveikojo procent ų 
skaičiaus. Bandymo pabaigoje pasiekto skaidymo vert ė ataskaitoje 
pateikiama kaip „Biologinis skaidumas Zahn-Wellens bandyme“.  
Pastaba . Jei medžiaga visiškai suskaidoma dar nesibaigus bandymo 
laikui ir rezultat ą patvirtina kit ą dieną atlikta dar viena analiz ė, 
bandymą galima baigti.  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje pateikiama, jei įmanoma, tokia informacija:  
— pradin ė medžiagos koncentracija,  
— visa kita informacija ir bandym ų rezultatai, susij ę su bandom ąja 
medžiaga, etalonine medžiaga, jei buvo naudota, ir tuš čiuoju 
bandymu,  
— koncentracija po trij ų valandų, 
— biologinio skaidymo kreiv ė su aprašymu,  
— data ir vieta, iš kurios buvo imti bandomieji organizmai, adapta ­
vimo būsena, naudota koncentracija ir t. t.,  
— mokslinis bet koki ų bandymo metodikos keitim ų pagrindimas.  
3.2. DUOMEN Ų AIŠKINIMAS  
Dienas ar savaites vykstantis laipsniškas DOC (COD) šalinimas 
rodo, kad medžiaga biologiškai skaidoma.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Tačiau kai kuriais atvejais reikšm ės gali turėti fizikochemin ė adsorb­
cija, ir tai matyti, kai nuo bandymo pradžios per pirm ąsias tris 
valandas vyksta dalinis ar visiškas pašalinimas, o kontrolinio ir bandomojo skys čių virš dumblo skirtumas išlieka netik ėtai mažas.
 
Jei reikia atskirti biologin į skaidymą (ar dalinį biologinį skaidymą) ir 
adsorbciją, būtina atlikti tolesnius bandymus.  
Tai galima daryti įvairiais b ūdais, tačiau įtikinamiausias b ūdas yra 
pamatiniame bandyme (geriau, kad tai b ūtų respirometrinis 
bandymas) kaip s ėjimo kultūrą naudoti skyst į virš dumblo ar dumbl ą. 
Bandomosios medžiagos, kuri ų neadsorbcinio DOC (COD) šalinimo 
vertės bandyme yra didel ės, turi būti laikomos potencialiai biolo ­
giškai skaidomomis. Dalinis neadsorbcinis šalinimas rodo, kad cheminė medžiaga bent kažkiek yra biologiškai skaidoma. Mažos 
ar nulinės DOC (COD) šalinimo vert ės gali būti dėl mikroorganizm ų 
inhibavimo bandom ąja medžiaga, tai dar gali parodyti dumblo irimas 
ir jo kiekio maž ėjimas, dėl ko skystis virš dumblo drums čiasi. 
Bandymas turi b ūti pakartotas naudojant mažesn ę bandomosios 
medžiagos koncentracij ą.
 
Naudojant specifin į junginio analiz ės metod ą ar bandom ąsias 
medžiagas su žym ėtais 14 C atomais, gali b ūti pasiektas didesnis 
jautrumas. Jei bandomasis junginys turi  14 C, 14 CO 2 surinkimas 
patvirtintų, kad biologinis skaidymas įvyko.  
Kai duomenys pateikiami kaip pirminio biologinio skaidymo rezul ­
tatai, turi b ūti paaiškinta, jei tai įmanoma, kaip pakito chemin ė 
sandara, kad neliko pradin ės bandomosios medžiagos atsako.  
Turi būti pateiktas analiz ės metodo tinkamumo patvirtinimas ir 
tuščiojo bandinio terp ėje nustatyta skaidymo vert ė. 
4. NUORODOS  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 B, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Commis ­
sion Directive 84/449/EEC (OL L 251, 1984 9 19, p. 1).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Priedėlis 
VERTINIMO PAVYZDYS 
Organinis junginys:  4-Etoksibenzoin ė rūgštis 
Teorinė bandomoji koncentracija:  600 mg/l  
Teorinis DOC kiekis:  390 mg/l  
Sėjimo kult ūra Nuotek ų valymo įrenginys…  
Koncentracija:  1 gramas sausos medžiagos/litre  
Adaptavimo b ūsena:  Neadaptuotas  
Analizė: DOC nustatymas  
Bandinio kiekis:  3 ml  
Kontrolin ė medžiaga:  Dietilenglikolis  
Junginio toksiškumas:  N ėra toksiškumo požymi ų, kai jo mažiau kaip 
1 000 mg/l 
Taikytas bandymas: fermentavimo m ėgintuvėlių 
bandymas  
Bandymo 
trukmė Kontrolin ė medžīaga Bandomoji medžiaga  
Tuščiojo 
bandinio 
DOC (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l DOC 
grynasis 
kiekis 
mg/l Skaidymas 
% DOC (  1 ) 
mg/l DOC 
grynasis 
kiekis 
mg/l Skaidymas 
% 
0 —  —  300,0  —  —  390,0  —  
3 valandos  4,0  298,0  294,0  2  371,6  367,6  6  
1 para  6,1  288,3  282,2  6  373,3  367,2  6  
2 paros  5,0  281,2  276,2  8  360,0  355,0  9  
5 paros  6,3  270,5  264,2  12  193,8  187,5  52  
6 paros  7,4  253,3  245,9  18  143,9  136,5  65  
7 paros  11,3  212,5  201,2  33  104,5  93,2  76  
8 paros  7,8  142,5  134,7  55  58,9  51,1  87  
9 paros  7,0  35,0  28,0  91  18,1  11,1  97  
10 parų 18,0  37,0  19,0  94  20,0  2,0  99  
( 1 ) Trijų matavim ų vidutinė vertė. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
1 paveikslas  
Biologinio skaidymo kreivi ų pavyzdžiai
  
2 paveikslas  
Dumblo adaptavimo pavyzdžiai
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  AEROBINIO NUOTEK Ų TVARKYMO MODELIAVIMO 
BANDYMAS: C.10-A: VEIKLIOJO DUMBLO AERATORIAI. C.10-B: 
BIOLOGIN ĖS PLĖVELĖS 
C.10-A: veikliojo dumblo aeratoriai  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) 303 (2001) 
(OECD bandym ų gairės Nr. 303). XX a. šeštajame dešimtmetyje buvo 
suprasta, kad prad ėtos naudoti naujos paviršinio aktyvumo medžiagos 
sukelia pernelyg didel ę putodarą nuotekų valymo įrenginiuose ir up ėse. 
Šios medžiagos nebuvo nuodugniai pašalinamos taikant aerobin į valymą ir 
tam tikrais atvejais jos apribodavo organin ės medžiagos šalinim ą. Todėl 
buvo atliekami įvairūs tyrimai siekiant nustatyti, kaip paviršinio aktyvumo 
medžiagas b ūtų įmanoma pašalinti iš nuotek ų, ir ar pramon ės pagamintos 
naujos chemin ės medžiagos atitinka nuotek ų valymo reikalavimus. Siekiant 
šių tikslų taikyti pavyzdiniai įrenginiai, atitinkantys dviej ų pagrindini ų tipų 
aerobinį biologin į nuotekų valymą (valymas veikliuoju dumblu ir perkolia ­
cija arba filtravimas). B ūtų buvę nepatogu ir labai brangu platinti kiekvien ą 
naują cheminę medžiag ą ir stebėti didelius valymo įrenginius net vietiniu 
mastu.  
PRADINIAI SVARSTYMAI  
Veikliojo dumblo aeratoriai  
2. Pateikiamas veikliojo dumblo pavyzdini ų įrenginių, kurių dydis yra 
300–2 000 ml aprašymas. Kai kurie įrenginiai gan ėtinai panaš ūs į tikrus 
įrenginius, t. y. jie turi dumblo nusodintuvus, kai dumblas pumpuojamas 
atgal į aeracijos rezervuar ą, o kituose įrenginiuose n ėra nusodintuvo, pvz., 
Swisher (1). Aparat ų dydis turi b ūti kruopš čiai pasirenkamas, nes, pirma, 
aparatas turi b ūti ganėtinai didelis, kad b ūtų tinkamas mechaniniam 
veikimui, ir pakankamai erdvus, kad iš jo b ūtų galima imti ėminius nepa ­
darant jokio poveikio aparato eksploatavimui, nors, kita vertus, aparatas 
netūrėtų būti toks didelis, jog jam reik ėtų numatyti daug erdv ės ir medžiag ų. 
3. Plačiausiai ir veiksmingiausiai naudojami dviej ų tipų aparatai, t. y. Husmano 
įrenginiai (2) ir akyt ųjų indų įrenginiai (3) (4); pirmasis naudojamas tiriant 
paviršinio aktyvumo medžiagas, kurios aprašytos šiame bandymo metode. Kiti įrenginiai taip pat buvo gana pla čiai naudojami, pvz., Eckenfelder (5). 
Atliekant š į modeliavimo bandym ą tenka skirti gana daug l ėšų ir gerokai 
pasistengti, tod ėl tuo pat metu buvo nagrin ėti paprastesni ir pigesni atrankos 
bandymai (jie pateikiami šio priedo (6) C.4–F skyriuje). Naudojant įvairias 
paviršinio aktyvumo medžiagas ir kitas chemines medžiagas įrodyta, kad 
atrankos bandym ų reikalavimus atitikusios medžiagos (lengvai biologiškai 
skaidžios) taip pat buvo suskaidytos atliekant modeliavimo bandym ą. 
Atrankos bandym ų reikalavim ų neatitikusios kai kurios medžiagos atitiko 
būdingojo biologinio skaidumo bandymo reikalavimus (šio priedo C.12 
(7) ir C.19 (8) skyriai), ta čiau tik dalis iš šios grup ės medžiag ų buvo 
suskaidytos atliekant modeliavimo bandym ą, nors būdingojo biologinio skai ­
dumo bandymo reikalavim ų neatitikusios chemin ės medžiagos nebuvo 
suskaidytos atliekant modeliavimo bandymus (9) (10) (11).
 
4. Tam tikrais tikslais pakanka vienodomis darbo s ąlygomis atlikt ų modelia­
vimo bandym ų; rezultatai pateikiami kaip procentin ė pašalintos chemin ės 
bandomosios chemin ės medžiagos arba ištirpusios organin ės anglies dalis. 
Šio bandymo aprašymas pateiktas šiame bandymo metode. Ta čiau šiame 
tekste pateikiama keletas variant ų, priešingai negu ankstesn ėje šio skyriaus 
versijoje, kurioje aprašytas sintetini ų nuotekų valymas tik vieno tipo apara ­
tūra ir šiam tikslui pasirenkant bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
mikrobų populiacijos suvienodinimo proced ūrą bei naudojant gan ėtinai 
apytikslį dumblo nuostoli ų metodą. Aprašomas alternatyvus aparat ūros 
tipas, sugerties režimas, nuotekos ir dumblo nuostoli ų pašalinimas. Šis 
tekstas nuosekliai atitinka standart ą ISO 11 733 (12), kuris nuodugniai 
patikrintas j į rengiant, ta čiau metodas nebuvo patikrintas atliekant tarplabo ­
ratorinio lyginimo bandym ą. 
5. Bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija kitais tikslais nuotekose 
turi būti žinoma tiksliau ir tod ėl privaloma rinktis išsamesn į metodą. Pvz., 
dumblo nuostoli ų norma turi b ūti tiksliau kontroliuojama kiekvien ą dieną ir 
bandymo atlikimo laikotarpiu bei įrenginiai naudojami pasirenkant kelias 
nuostolių normas. Siekiant užtikrinti visa apimant į metodą, atliekant 
bandymus taip pat tur ėtų būti naudojamos dvi arba trys skirtingos tempera ­
tūros. Šį metodą yra apraš ęs Birch (13) (14) ir jo santrauka pateikta 6 
priedėlyje. Tačiau dabartin ės žinios n ėra pakankamos siekiant nustatyti, 
kuris kinetinis modelis valant nuotekas taikytinas chemini ų medžiagų biolo­
giniam skaidumui ir apskritai vandens aplinkoje. 6 pried ėlyje kaip pavyzdys 
nurodytas Mono kinetikos taikymas galioja tik 1 mg/l arba didesn ės 
koncentracijos chemin ėms medžiagos, ta čiau kai kuri ų nuomone net šis 
teiginys turi b ūti pagrindžiamas. Bandymai naudojant koncentracijas, visap ­
usiškiau atitinkan čias nustatom ąsias nuotekose, nurodyti 7 pried ėlyje, tačiau 
jie ir pateiktieji 6 pried ėlyje yra įtraukti į priedėlius, tačiau jie nėra skelbiami 
kaip atskirieji bandymo metodai.  
Filtrai  
6. Kur kas mažiau d ėmesio skiriama pavyzdiniams laistomiesiems reaktoriams; 
turbūt todėl, kad jie yra gerokai griozdiškesni ir ne tokie kompaktiški, 
palyginti su veikliojo dumblo įrenginio modeliais. Gerikte ir kt. suk ūrė 
laistomuosius reaktorius ir naudojo juos taikydami bandymo įrenginio ir 
kontrolinio įrenginio mikrob ų populiacijos suvienodinimo proced ūrą (15). 
Šie reaktoriai buvo gan ėtinai dideli (aukštis 2 m; talpa 60 l) ir kiekvienam 
reikėjo ne mažiau negu 2 l/h nuotek ų. Bauman ir kt. (16) laistomuosius 
reaktorius modeliavo poliesterio minkštos mas ės strypelius įkišdami į 1 m 
vamzdžius (vidinis vamzdžio skersmuo 14 mm); prieš įkišant į vamzdžius 
šiuos strypelius pastarieji koncentruotame veikliajame dumble b ūdavo palai ­
komi ne trumpiau negu 30 min. Bandomoji chemin ė medžiaga, kuri buvo 
vienintelis anglies šaltinis mineralini ų druskų tirpale, tiekta vamzdžiu žemyn 
ir biologinis skaidymas vertintas nuotekose matuojant ištirpusi ą organinę 
anglį (toliau – DOC) ir CO  2 kiekį išsiskirian čiose dujose.  
7. Biologini ų filtrų veikimas modeliuotas kitais b ūdais (15); mažu kampu į 
horizontal ę pakreiptų besisukan čių vamzdži ų vidiniais paviršiais leista sr ūti 
nuotekoms (apie 250 ml/h) su bandom ąja chemine medžiaga ir be šios 
medžiagos bei surinktame ištakyje nustatytas DOC kiekis ir (arba) konkre ­ 
čios bandomosios chemin ės medžiagos kiekis.  
BANDYMO METODO ESM Ė 
8. Taikant š į metodą nustatomas pašalinamas vandenyje ištirpusi ų organini ų 
cheminių medžiag ų kiekis vykstant pirminiam biologiniam skaidymui ir 
(arba) visiškam biologiniam skaidymui, kur į nuolat naudojamose bandymo 
sistemose, modeliuojan čiose aktyviojo dumblo procesus, užtikrina aerobiniai 
mikroorganizmai. Lengvai skaidoma organin ė terpė ir organin ė bandomoji 
cheminė medžiaga yra anglies ir energijos šaltiniai mikroorganizmams.  
9. Naudojami du nuolatos vienodomis s ąlygomis, kurios pasirenkamos atsiž ­
velgiant į bandymo tiksl ą, vienu metu veikiantys bandymo įrenginiai (veik ­
liojo dumblo įrenginiai arba akytieji indai). Paprastai vidutin ė hidraulin ė 
išbuvimo trukm ė yra 6 val., o vidutinis dumblo amžius (dumblo išbuvimo 
trukmė) yra 6–10 dien ų. Dumblas naudojamas vienu iš dviej ų metodų: tik į 
vieną iš įrenginių įleidžiamą organinę terpę paprastai įleidžiama bandomo ­
sios chemin ės medžiagos, kurios koncentracija yra nuo10 mg/l ištirpusios 
organinės anglies (DOC) iki 20 mg/l DOC. Antrasis įrenginys naudojamas 
kaip kontrolinis įrenginys siekiant nustatyti organin ės terpės biologin į skai­
dymą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. Dažnai imamuose ištakio ėminiuose vis ų pirma tur ėtų būti nustatomas DOC 
kiekis arba cheminis deguonies suvartojimas (COD) ir atliekant speciali ą 
analizę įvertinama bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija (jeigu 
reikia) ištakyje iš įrenginio, į kurį buvo leidžiama bandomoji chemin ė 
medžiaga. DOC ir COD koncentracij ų skirtumas ištakyje iš bandomojo ir 
kontrolinio įrenginių laikomas atsiradusiu d ėl bandomosios chemin ės 
medžiagos arba jos organini ų metabolit ų. Šis skirtumas lyginamas su įter­
piant bandom ąją medžiagą intakyje užtikrinta DOC arba COD koncentracija, 
kad būtų nustatytas bandomosios chemin ės medžiagos pašalinimas.  
11. Biologin į skaidymą paprastai galima atskirti nuo bioadsorbcijos ir šiuo tikslu 
nuodugniai išanalizuojant šalinimo–laiko kreiv ę bei galima paprastai patvir ­
tinti taikant lengvo biologinio skaidymo, kuriam pasirenkama aklimatizuota sėjimo kult ūra iš įrenginio, į kurį buvo įterpta bandomosios chemin ės 
medžiagos.
 
INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ CHEMIN Ę MEDŽIAG Ą 
12. Bandomosios chemin ės medžiagos grynumas, tirpumas vandenyje, lakumas 
ir sugerties charakteristikos tur ėtų būti žinomos siekiant teisingai aiškinti 
rezultatus. Su lakiosiomis ir netirpiomis chemin ėmis medžiagomis paprastai 
neįmanoma atlikti bandym ų, jeigu nesiimama speciali ų atsargumo priemoni ų 
(žr. 5 pried ėlį). Taip pat tur ėtų būti žinoma chemin ė struktūra ar bent jau 
empirinė formulė siekiant apskai čiuoti teorines vertes ir (arba) patikrinti 
išmatuotas parametr ų vertes, pvz., teorin į deguonies poreik į (toliau – 
ThOD), ištirpusi ą organin ę anglį (DOC) ir chemin į deguonies 
suvartojim ą (COD).  
13. Informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą mikroorga ­
nizmams (žr. 4 pried ėlį) gali praversti renkantis atitinkamas atliekant 
bandymą taikomas koncentracijas ir gali b ūti svarbi aiškinant mažas biolo ­
ginio skaidumo vertes.  
ATITIKTIES LYGIS  
14. Šį pradinį modeliavimo (patvirtinimo) bandym ą taikant pirminio biologinio 
skaidymo paviršinio aktyvumo medžiagoms turi b ūti pašalinama daugiau 
negu 80 % konkre čios chemin ės medžiagos, kad paviršinio aktyvumo 
medžiagą būtų leidžiama pateikti rinkai. Jeigu neužtikrinama 80 % vert ė, 
galima atlikti š į modeliavimo (patvirtinimo) bandym ą ir paviršinio aktyvumo 
medžiagą rinkai galima pateikti tik tuo atveju, jeigu pašalinama daugiau 
negu 90 % konkre čios chemin ės medžiagos. D ėl chemini ų medžiag ų 
apskritai nekeliamas atitikties ir (arba) neatitikties klausimas ir užtikrinam ą 
procentin ę pašalinimo dal į galima naudoti apytiksliai apskai čiuojant galim ą 
koncentracij ą aplinkoje, taikytin ą įvertinant chemini ų medžiag ų keliamą 
pavojų. Rezultatai dažnai pateikiami pagal model į „viskas ar nieko“. Atlikus 
tam tikrą grynųjų cheminių medžiag ų tyrimų skaičių nustatyta, kad daugiau 
negu trijų ketvirčių atvejais buvo pašalinta > 90 % DOC ir 80 % atvej ų 
pašalinta daugiau negu 90 % chemini ų medžiagų, kurioms nebuvo b ūdingas 
bent kiekis didesnis biologinis skaidumas.  
15. Atliekant š į bandymą nuotekose viso labo yra tik kelios chemin ės medžiagos 
(pvz., paviršinio aktyvumo medžiagos), kuri ų koncentracijos (apie 10 mg 
C/1) naudojamos atliekant bandym ą. Kai kurios chemin ės medžiagos, jeigu 
jų koncentracijos atitinka nurodyt ąsias vertes, gali veikti kaip inhibitoriai, 
tačiau kitų cheminių medžiag ų šalinimo kinetika gali b ūti skirtinga esant 
mažoms koncentracijoms. Skaidym ą įmanoma įvertinti tiksliau, jeigu b ūtų 
naudojami modifikuoti metodai, kiek įmanoma mažesn ės bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracijos ir surinktus duomenis b ūtų galima 
naudoti apskai čiuojant kinetines konstantas. Ta čiau būtinų eksperimentini ų 
metodų patikimumas kol kas n ėra iki galo validuotas ir taip pat neparengti 
biologinio skaidymo reakcijas apib ūdinantys kinetiniai modeliai (žr. 7 prie ­
dėlį). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
ETALONIN ĖS CHEMIN ĖS MEDŽIAGOS  
16. Siekiant užtikrinti, kad bandymo proced ūra būtų taikoma pagal reikala ­
vimus, tikslinga bandymus su chemin ėmis medžiagomis, kuri ų ypatybės 
yra žinomos, retkar čiais atlikti kartu su bandom ųjų chemini ų medžiag ų 
tyrimu. Šioms chemin ėms medžiagoms priskiriama adipo r ūgštis, 2-fenilfe ­
nolis, 1-naftoliai, difeno r ūgštis, 1-naftalenkarboksir ūgštis ir t. t. (9) (10) 
(11).  
BANDYMO REZULTAT Ų ATKURIAMUMAS  
17. Parengta kur kas mažiau, palyginti su ataskaitomis apie lengvo biologinio 
skaidumo bandymus, tyrim ų ataskaitų apie modeliavimo bandymus. Karto ­
tinių ėminių (paimtų vienu metu) tyrim ų rezultatų atkuriamumas yra aukštas 
(10–15 %), jeigu bandymas atliekamas su chemin ėmis medžiagomis, kurios 
suskaidomos 80 % ar daugiau procent ų, tačiau kur kas mažiau suskaidom ų 
cheminių medžiag ų rezultatų kintamumas yra didesnis. Per 9 savaites, 
leidžiamas atliekant bandym ą, skirtingais atvejais taip pat buvo nustatyti 
tam tikrų ribinių chemini ų medžiag ų ganėtinai nesugretinami rezultatai 
(pvz., 10 %, 90 %).  
18. Naudojant dviej ų tipų aparatus buvo nustatyti mažai besiskiriantys rezultatai, 
tačiau tam tikros chemin ės medžiagos išsamiau ir nuosekliau suskaidytos 
buitinėse nuotekose negu OECD sintetin ėse nuotekose.  
BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Aparatūra 
Bandymo sistema  
19. Vienos bandomosios chemin ės medžiagos bandymo sistem ą sudaro 
bandymo įrenginys ir kontrolinis įrenginys; ta čiau atliekant tik specialias 
analizes (pirminis biologinis skaidymas) pakanka vien bandymo įrenginio. 
Vieną kontrolin į įrenginį galima naudoti su keliais bandymo įrenginiais, 
jeigu bandymai atliekami su ta pa čia ar skirtingomis bandomosiomis 
medžiagomis. Jeigu naudojamas bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio 
mikrobų populiacijos suvienodinimas (3 pried ėlis) kiekvienas bandymo įren­
ginys privalo tur ėti atskirą kontrolės įrenginį. Galima naudoti aktyviojo 
dumblo įrenginio model į, Husmano įrenginį, (1 priedėlio 1 pav.) arba akyt ąjį 
indą (1 priedėlio 2 pav.). Abiem atvejais b ūtini pakankamo dydžio laikymo 
indai, kuriuose b ūtų kaupiamas intakiai ir ištakiai, bei intakio dozavimo 
siurbliai (intakis maišomas su bandomosios chemin ės medžiagos tirpalu 
arba tiekiamas atskirai).  
20. Kiekvien ą aktyviojo dumblo įrenginį sudaro žinomos talpos aeracinis rezer ­
vuaras, kurio talpa yra apie 3 litrai veikliojo dumblo, ir maždaug 1,5 litro 
talpos skirtuvas (antrinis nusodintuvas); talp ą galima šiek tiek pakeisti, jeigu 
reguliuojamas skirtuvo aukštis. Leidžiama naudoti skirtingo dydžio indus, jeigu juos ketinama naudoti taikant palyginamojo dydžio hidraulines apkrovas. Jeigu bandymo patalpoje ne įmanoma išlaikyti pageidaujamo inter ­
valo temperat ūrą, rekomenduojama naudoti indus su vandeniu užpildyta 
ertme, jeigu vandens temperat ūrą įmanoma reguliuoti. Pneumatiniu siurbliu 
ar dozavimo siurbliu veiklusis dumblas reguliariais intervalais nuolatos ar su pertrūkiais iš skirtuvo recirkuliuojamas į aeracinį rezervuar ą.
 
21. Akytojo indo sistem ą sudaro vidinis akytasis cilindras k ūgio formos dugnu, 
įdėtas į šiek tiek didesn į tokios pa čios formos ind ą, pagamint ą iš nelaidžios 
plastikinės medžiagos. Akytajam indui tinkama medžiaga b ūtų akytasis 
polietilenas, kurio didžiausias poros dydis neviršija 90 μm, o medžiaga ne 
storesnė negu 2 mm. Dumblas iš valomos organin ės terpės išskiriamas vyks ­
tant skirtuminiam per ėjimui per akyt ąją sienelę. Ištakiai surenkami žiedo 
pavidalo ertm ėje, iš kurios jie sr ūva į kaupiam ąjį indą. Nusodinimo procesas 
nevyksta, tod ėl dumblas n ėra grąžinamas. Vis ą sistemą galima sumontuoti  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
vandens vonioje, kurioje vandens temperat ūrą įmanoma reguliuoti termo ­
statinėmis priemon ėmis. Akytieji indai užsikemša ir pradiniuose etapuose 
per jų kraštus gali tek ėti skystis. Šiuo atveju akytasis įdėklas pakei čiamas 
švariu įdėklu, tačiau pirmiau dumblas siurbiamas iš indo į švarią talpyklą bei 
tada pakei čiamas užsikimš ęs įdėklas. Nušluos čius nepralaid ų išorinį cilindrą 
įterpiamas švarus įdėklas ir dumblas gr ąžinamas į indą. Prie užsikimšusio 
įdėklo šonų prilipęs visas dumblas taip pat r ūpestingai nugramdomas ir 
perkeliamas. Užsikimš ę indai valomi plona vandens čiurkšle, kad b ūtų paša­
linamas lik ęs dumblas, ir mirkant natrio hipochlorito tirpale, o tada vande ­
nyje ir galiausiai kruopš čiai skalaujami vandeniu.  
22. Dumbl ą aeruojant abiej ų sistemų aeraciniuose rezervuaruose b ūtina taikyti 
tinkamus metodus, pvz., akyto stiklo antgal į (difuzoriaus akmenis) ir susl ėg­
tąjį orą. Jeigu reikia, oras turi b ūti valomas j į leidžiant per tinkam ą filtrą ir 
kondicionuojamas. Sistema turi tek ėti pakankamas oro kiekis, kad b ūtų 
išlaikomos aerobin ės sąlygos ir kad atliekant bandym ą dumblo dribsniai 
visą laiką būtų suspenduoti.  
Filtravimo įtaisas ar centrifuga  
23. Ėminių filtravimo įtaisas su b ūtino akytumo (nominalusis apert ūros 
skersmuo 0,45 μm) membraniniais filtrais, sugerian čiais tirpiąsias chemines 
medžiagas ir išskirian čiais kuo mažesn į organinės anglies kiek į. Jeigu 
naudojami organin ę anglį išskiriantys filtrai, jie kruopš čiai plaunami karštu 
vandeniu, kad b ūtų pašalinta išplaunamoji organin ė anglis. Antraip 
leidžiama naudoti centrifug ą, tinkančią užtikrinti 40 000 m/s  2 . 
Analizės įranga  
24. Įrenginiai, b ūtini nustatyti:  
— DOC (ištirpusi ą organinę anglį) ir TOC (bendr ąją organinę anglį) arba 
COD (chemin į deguonies suvartojim ą), 
— konkre čią cheminę medžiag ą, jeigu reikia,  
— suspenduotas medžiagas, pH, deguonies koncentracij ą vandenyje,  
— temperat ūrą, rūgštingumą ir šarmingum ą, 
— amonio, nitrit ų ir nitratų kiekį, jeigu bandymas atliekamas nitrifikacijos 
sąlygomis.  
Vanduo  
25. Vandentiekio vanduo, kuriame mažiau negu 3 mg/l DOC. Nustatomas 
šarmingumas, jeigu n ėra žinomas.  
26. Dejonizuotas vanduo, kuriame mažiau negu 2 mg/l DOC.  
Organinė terpė 
27. Kaip organin ę terpę leidžiama naudoti sintetines nuotekas, buitines nuotekas 
ar abiejų mišinį. Įrodyta (žr. (11) (14)), kad naudojant tik buitines nuotekas 
pašalinama didesn ė DOC procentin ė dalis ir kad šiuo atveju net įmanoma 
šalinti tam tikras chemines medžiagas ir jas biologiškai skaidyti, nors šios 
cheminės medžiagos n ėra biologiškai skaidomos, jeigu naudojamos OECD 
sintetinės nuotekos. Taip pat jeigu nuolat ar su pertr ūkiais pridedama 
buitinių nuotekų, veiklųjį dumblą dažnai pavyksta stabilizuoti, įskaitant 
esminę ypatybę tinkamai nusistov ėti. Vadinasi, rekomenduojama naudoti 
buitines nuotekas. Išmatuojamos kiekvienos organin ės terpės naujos partijos 
DOC arba COD vert ės. Turėtų būti žinomas organin ės terpės rūgštingumas 
arba šarmingumas. Jeigu r ūgštingumas ar šarmingumas yra per mažas, į 
organinę terpę gali tekti įterpti tinkamo buferinio tirpalo (natrio hidrokarbo ­
nato arba kalio dihidrofosfato), kad atliekant bandym ą aeracijos rezervuare 
pH vertė būtų maždaug 7,5 ± 0,5. Kiekvienu pavieniu atveju nustatomas 
įterptinas buferinio tirpalo kiekis ir pasirenkamas jo įterpimo laikas. Jeigu 
mišiniai naudojami nuolat ar su pertr ūkiais, turi b ūti užtikrinama beveik 
pastovi mišinio DOC vert ė (arba COD vert ė), pvz., šiuo tikslu naudojant 
skiedimą vandeniu.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Sintetinės nuotekos  
28. Kiekviename vandentiekio vandens litre ištirpinama: 160 mg peptono, 110 
mg mėsos ekstrakto, 30 mg karbamido, 28 mg bevandenio kalio dihidro ­
fosfato (K  2 HPO  4 ), 7 mg natrio chlorido (NaCl), 4 mg kalcio chlorido dihi ­
drato (CaCl  2 .2H  2 O), 2 mg magnio sulfato heptahidrato (Mg  2 SO 4 .7H  2 0). 
Šios OECD sintetin ės nuotekos yra pavyzdin ės ir jas naudojant užtikrinama 
vidutinė 100 mg/l DOC koncentracija intakyje. Antraip leidžiama naudoti 
kitokią sudėtį, kai užtikrinama beveik tokia pati DOC koncentracija, labiau 
atitinkanti tikr ųjų nuotekų vertę. Jeigu b ūtinas mažesn ės koncentracijos 
intakis, sintetin ės nuotekos skiedžiamos, pvz., 1:1 santykiu, vandentiekio 
vandeniu, kad b ūtų užtikrinta maždaug 50 mg/l koncentracija. Naudojant 
mažesnės koncentracijos intak į būtų skatinamas greitesnis nitrifikuojan čių 
organizm ų augimas ir šis keitimas tur ėtų būti naudojamas tuo atveju, 
jeigu turi b ūti tiriamas nitrifikuojan čių nuotekų įrenginių modeliavimas. 
Koncentruot ų šių sintetinių nuotekų galima pasiruošti iš distiliuoto vandens 
ir jas laikyti vien ą savaitę maždaug 1 °C temperat ūroje. Jeigu reikia, skie ­
džiama distiliuotu vandeniu. (Ši terp ė neatitinka reikalavim ų, pvz., azoto 
koncentracija yra labai didel ė, palyginti maža anglies koncentracija, ta čiau 
kol kas geresn ė priemonė nėra pasiūlyta, t. y. kaip buferinio skys čio įterpti 
daugiau fosfato ir papildom ą peptono kiek į.) 
Buitinės nuotekos  
29. Naudojamos šviežios nusistov ėjusios nuotekos, kiekvien ą dieną rinktos iš 
valymo įrenginių, į kuriuos daugiausiai patenka buitin ės nuotekos. Jos tur ėtų 
būti renkamos iki pirminio nusodinimo ir iš pirminio nusodinimo rezervuaro 
nuleidimo kanalo arba iš veikliojo dumblo įrenginio tiekimo bei turi b ūti 
beveik be stambi ųjų dalelių. Nuotekas galima naudoti jas palaikius kelias 
dienas (ta čiau apskritai jos netur ėtų būti laikomos ilgiau negu septynias 
dienas) maždaug 4 °C temperat ūroje, jeigu įrodoma, kad laikant DOC 
vertė (arba COD vert ė) nėra kiek daugiau sumaž ėjusi (t. y. mažiau negu 
20 %). Siekiant apriboti sistemos trukdžius kiekvienos naujos partijos DOC vertė (arba COD vert ė) prieš pradedant naudoti tur ėtų būti koreguojama 
atsižvelgiant į atitinkam ą pastovią vertę, pvz., skiedžiant vandentiekio 
vandeniu.
 
Veiklusis dumblas  
30. Veiklusis dumblas s ėjimo kult ūrai įterpti renkamas iš nuotek ų valymo įren­
ginio aeracijos rezervuaro arba iš laboratorinio veikliojo dumblo įrenginio, 
kuriuo valomos tik buitin ės nuotekos.  
Pradiniai bandomosios chemin ės medžiagos tirpalai  
31. Chemini ų medžiag ų, kurios yra atitinkamo tirpumo, reikiamos koncentra ­
cijos pradiniai tirpalai pasiruošiami (pvz., 1–5 g/l) iš dejonizuoto vandens 
ar iš sintetini ų nuotekų mineralin ės dalies. (Netirpiosios ir lakiosios 
cheminės medžiagos aprašytos 5 pried ėlyje). Nustatoma pradini ų tirpalų 
DOC vert ė ir bendrosios organin ės anglies (TOC) vert ė ir pakartojami kiek ­
vienos naujos partijos matavimai. Jeigu DOC ir TOC vert ės skirtumas viršija 
20 %, patikrinamas bandomosios chemin ės medžiagos tirpumas vandenyje. 
Bandomosios chemin ės medžiagos DOC vert ė arba koncentracijos vert ė, 
išmatuota taikant speciali ą pradinio tirpalo analiz ę, lyginama su vardine 
verte siekiant nustatyti, ar atsistatymas yra gan ėtinai geras (paprastai galima 
tikėtis > 90 %). Įvertinama, vis ų pirma dispersij ų atžvilgiu, ar DOC galima 
ar negalima naudoti kaip analiz ės parametr ą, arba įmanoma naudoti tik 
bandomajai cheminei medžiagai b ūdingą analizės metodą. Dispersijoms 
būtina centrifuguoti ėminius. Specialiu analiz ės metodu išmatuojama kiek ­
vienos naujos partijos DOC, COD vert ė arba bandomosios chemin ės 
medžiagos kiekis.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Nustatoma pradinio tirpalo pH vert ė. Jeigu nustatomos kraštutin ės vertės, jos 
patvirtina, kad bandymo sistemos veikliojo dumblo pH vertei gal ėjo būti 
padarytas poveikis prid ėjus chemin ės medžiagos. Šiuo atveju pradinis 
tirpalas neutralizuojamas mažu neorganin ės rūgšties ar baz ės kiekiu siekiant 
užtikrinti, kad pH vert ė būtų 7 ± 0,5, ta čiau privaloma r ūpintis, jog neb ūtų 
nusodinama bandomoji chemin ė medžiaga.  
PROCED ŪRA 
33. Aprašyta proced ūra taikoma veikliojo dumblo įrenginiams; j ą teko šiek tiek 
pritaikyti akytojo indo sistemai.  
Sėjimo kultūros ruošimas  
34. Prieš pradedant bandym ą į bandymo sistem ą įterpiama veikliojo dumblo 
arba mažos mikroorganizm ų koncentracijos s ėjimo kult ūros. Aeruojama 
sėjimo kult ūra kambario temperat ūroje laikoma tol, kol pradedama naudoti, 
ir ją būtina naudoti per 24 val. Pirmuoju atveju iš veiksmingai eksploatuo ­
jamo nuotek ų biologinio valdymo įrenginio arba laboratorinio valymo įren­
ginio, kuriam tiekiamos daugiausiai buitin ės nuotekos, paimamas veikliojo 
dumblo m ėginys. Jeigu turi b ūti modeliuojamos nitrifikavimo s ąlygos, 
dumblas imamas iš nuotek ų valymo įrenginio su nitrifikacijos procesu. 
Nustatoma suspenduot ų medžiag ų koncentracija ir, jeigu reikia, dumblas 
sutankinamas taip, kad į bandymo sistem ą būtų įterpiamas tik b ūtinasis 
dumblo kiekis. Užtikrinama, kad sausosios medžiagos koncentracija b ūtų 
apie 2,5 g/l.  
35. Antruoju atveju kaip s ėjimo kult ūra naudojamas 2 ml/l–10 ml/l koncentra ­
cijos ištakis iš buitini ų nuotekų biologinio valymo įrenginio. Norint naudoti 
kiek įmanoma daugiau skirting ų rūšių bakterijų gali būti tikslinga prid ėti iš 
kitų įvairių šaltinių, pvz., paviršinio vandens, paimtos s ėjimo kult ūros. Šiuo 
atveju veikliojo dumblo dribsni ų susidarymas ir j ų kiekio did ėjimas vyksta 
bandomojoje sistemoje.  
Organinės terpės dozavimas  
36. Užtikrinama, kad intakio ir ištakio talpyklos bei intakio ind ų ir ištakio ind ų 
jungiamieji vamzdeliai b ūtų kruopščiai išvalyti, kad iš pat pradži ų ir atlie­
kant bandym ą būtų užkirstas kelias augti mikroorganizmams. Bandymo 
sistemos sumontuojamos patalpoje, kurioje įmanoma reguliuoti temperat ūrą 
(paprastai 20–25 °C), arba naudojami bandymo įrenginiai su vandeniu užpil ­
dyta ertme. Pasiruošiamas pakankamas kiekis b ūtinos organin ės terpės 
(27–29 pastraipos). Pirmiausiai organin ės terpės pripildomas aeracinis rezer ­
vuaras ir skirtuvas bei įterpiama s ėjimo kult ūra (34, 35 pastraipos). Prade ­
dama aeracija, kad dumblas b ūtų suspenduojamas, prisotinamas deguonies, 
ir imamasi dozuoti intak į bei regeneruoti nusodint ąjį dumblą. Iš laikymo 
indų paimtos organin ės terpės įdedama į bandymo ir kontrolini ų įrenginių 
aeracijos rezervuarus (20, 21 pastraipos) ir iš panaši ų laikymo ind ų paimami 
atitinkami ištaki ų kiekiai. Norint užtikrinti įprastą 6 val. hidraulin ę išbuvimo 
trukmę organinė terpė pumpuojama 0,5 l/val sparta. Siekiant užtikrinti ši ą 
spartą, matuojamas kiekvien ą dieną įterpiamos organin ės terpės kiekis ir 
šiuo tikslu daromi įrašai apie laikymo induose sumaž ėjusios terp ės kiekį. 
Gali tekti taikyti kitus įterpimo b ūdus siekiant nustatyti su pertr ūkiais atlie ­
kamo chemini ų medžiag ų išleidimo ir „didelio vienkartinio“ chemini ų 
medžiagų kiekio poveik į. 
37. Jeigu ruošiam ą organinę terpę ketinama naudoti ilgiau negu vien ą dieną, 
privaloma rinktis aušinim ą 4 °C temperat ūroje arba kitus tinkamus išsaugo ­
jimo metodus siekiant užtikrinti, kad už bandymo įrenginių ribų neaugtų 
mikrobai ir nevykt ų biologinio skaidymo procesas (29 pastraipa). Jeigu 
naudojamos sintetin ės nuotekos, koncentruot ą pradinį tirpalą (pvz., 10 
kartų viršijant į įprastą koncentracij ą, 28 pastraipa) leidžiama pasiruošti ir 
laikyti maždaug 4 °C temperat ūroje. Prieš naudojant š į pradinį tirpalą galima 
pagal reikalavimus maišyti su atitinkamu vandentiekio vandens kiekiu; j į 
leidžiama pumpuoti tiesiogiai, ta čiau atitinkamas vandentiekio vandens 
kiekis turi b ūti tiekiamas atskirai.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Bandomosios chemin ės medžiagos dozavimas  
38. Į intakio laikymo ind ą įpilamas atitinkamas bandomosios chemin ės 
medžiagos pradinio tirpalo kiekis (31 pastraipa) arba naudojant atskir ą 
siurblį šis tirpalas pumpuojamas tiesiogiai į aeracijos rezervuar ą. Įprasta 
vidutinė bandymo koncentracija intakyje tur ėtų būti 10–20 mg/l DOC, o 
didžiausia koncentracijos vert ė neturėtų viršyti 50 mg/l. Jeigu bandomosios 
cheminės medžiagos tirpumas vandenyje yra mažas arba jeigu numatomas 
galimas toksinis poveikis, koncentracija mažinama iki 5 mg/l DOC arba dar 
iki mažesn ės vertės, tačiau tik tuo atveju, kai specialus analiz ės metodas yra 
prieinamas ir kai jis taikomas (naudojant specialius dozavimo metodus leidžiama įterpti mažai vandenyje tirpi ų ištirpusi ų bandom ųjų chemini ų 
medžiagų, žr. 5 pried ėlį).
 
39. Bandom ąją cheminę medžiag ą imama įterpti po laikotarpio, kai sistema yra 
stabilizuojama ir veiksmingai šalina (apie 80 %) organin ės terpės DOC. 
Prieš pradedant įterpinėti bandom ąją cheminę medžiagą privaloma patikrinti, 
ar visi įrenginiai veikia vienodai veiksmingai; jeigu jie veikia skirtingai, šiuo 
atveju paprastai rekomenduojama sumaišyti skirting ą dumblą ir į kiekvien ą 
įrenginį įdėti vienodą šio dumblo kiek į. Jeigu kaip s ėjimo kultūra naudojama 
(maždaug) 2,5 g/l (sausoji mas ė) veikliojo dumblo, bandymo pradžioje 
galima įterpti bandomosios chemin ės medžiagos, nes iš pradži ų pridedant 
kaskart vis didesnius kiekius yra užtikrinama, kad veiklusis dumblas tinka ­
miau prisitaikyt ų prie bandomosios chemin ės medžiagos. Kad ir kokiu b ūdu 
būtų pridedama bandomosios chemin ės medžiagos, laikymo inde (-uose) 
rekomenduojama reguliariais intervalais matuoti atitinkam ą srautą ir (arba) 
kiekius.  
Veikliojo dumblo tvarkymas  
40. Atliekant bandym ą veikliojo dumblo kiet ųjų dalelių koncentracija nepaisant 
naudojamos s ėjimo kultūros paprastai stabilizuojasi 1–3 g/l sausosios mas ės 
intervalo ribose, ta čiau šiuo atveju svarbi organin ės terpės kokybė ir 
koncentracija bei koncentracija priklauso nuo naudojimo s ąlygų, esamų 
mikroorganizm ų pobūdžio ir bandomosios chemin ės medžiagos poveikio.  
41. Suspenduot ų kietųjų medžiag ų kiekis aeracijos rezervuare nustatomas ne 
rečiau negu kart ą per savait ę ir perteklinis dumblas yra šalinamas siekiant 
išlaikyti 1–3 g/l (sausosios mas ės) koncentracij ą arba koreguojama vidutin ė 
pastovi dumblo amžiaus vert ė (paprastai 6–10 dien ų). Jeigu, pvz., pasiren ­
kama 8 dien ų dumblo išbuvimo trukm ė, kiekvien ą dieną iš aeracijos rezer ­
vuaro išimama ir pašalinama 1/8 veikliojo dumblo kiekio dalis. Ši operacija atliekama kasdien arba geriausiai b ūtų naudoti automatin į su pertr ūkiais 
veikiantį eksploatavimo siurbl į. Išlaikant pastovi ą ar griežtai apibr ėžtas 
ribas atitinkan čią suspenduot ų medžiag ų koncentracij ą nepavyksta užtikrinti 
pastovios dumblo išbuvimo trukm ės (toliau – DST), kuri laikytina eksploa ­
taciniu kintamuoju, nuo kurio priklauso bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracijos nuotakyje vert ė.
 
42. Atliekant bandym ą bet koks prie aeracijos rezervuaro ir skirtuvo sieneli ų 
prilipęs dumblas ne re čiau negu kart ą per dieną šalinamas taip, kad dumblas 
vėl būtų suspenduojamas. Reguliariai tikrinami ir valomi visi vamzdžiai ir 
vamzdynas siekiant užtikrinti, kad nesusidaryt ų biologin ė plėvelė. Skirtuve 
nusistovėjęs dumblas recirkuliuojamas į aeracijos rezervuar ą; šiuo tikslu 
rekomenduojama naudoti tr ūkųjį pumpavim ą. Akytojo indo sistemoje recir ­
kualiavimas nenaudojamas, ta čiau šiuo atveju užtikrinama, kad švar ūs vidi­
niai indai b ūtų įstatomi pirmiau negu gerokai padid ėja kiekis inde (21 
pastraipa).  
43. Husmano įrenginiuose gali sutrikti dumblo nusodinimo ir šalinimo procesai. 
Šias triktis galima pašalinti naudojant vien ą ar kelias toliau aprašytas proce ­
dūras; jos vienu metu taikomos bandymo ir kontroliniuose įrenginiuose:  
— reguliariai, pvz., kiekvien ą savaitę, galima prid ėti šviežio dumblo ar 
dribsniklio (pvz., 2 ml/indas su 50 g/l FeCl  3 ), tačiau užtikrinama, kad 
nevyktų bandomosios chemin ės medžiagos reakcija su FeCl  3 arba kad ji 
nebūtų nusodinama,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— pneumatin į siurblį galima pakeisti peristaltiniu siurbliu siekiant sukurti 
dumblo recirkuliacijos sraut ą, kurio dydis beveik lygus intakio srautui, 
naudotinam nusodintame dumble sukuriant anaerobin ę zoną (pneuma ­
tinio siurblio geometrin ės ypatyb ės apriboja b ūtiniausią grąžinamo 
dumblo sraut ą, kad jis b ūtų maždaug 12 kart ų didesnis negu intakio 
srautas),  
— dumbl ą iš skirtuvo tr ūkiuoju būdu galima pumpuoti į aeracijos rezer ­
vuarą (pvz., 5 min. kas 2,5 val. ir recirkuliuoti 1 l/val–1,5 l/val.),  
— siekiant pašalinti putojimo sukeltus nuostolius galima naudoti 
mažiausios koncentracijos netoksišk ą priešput į (pvz., silikonin ę 
alyvą), 
— orą per skirtuve esant į dumblą galima p ūsti trumpais stipriais pli ūps­
niais (pvz., 10 sek. kart ą per valand ą), 
— organin ę terpę tolygiais tarpsniais galima įvedinėti į aeracijos rezer ­
vuarą (pvz., 3–10 min. kart ą per valand ą). 
Ėminių ėmimas ir analiz ė 
44. Reguliariais intervalais matuojama aeracijos rezervuar ų veikliajame dumble 
ištirpusio deguonies koncentracija, temperat ūra ir pH vert ė. Užtikrinama, 
kad visada b ūtų pakankamas deguonies kiekis (> 2 mg/l) ir kad tempera ­
tūros vertė atitiktų privalomojo intervalo ribas (paprastai 20 °C – 25 °C). Į 
aeracijos ind ą ar į intakį įterpiant nedidelius neorganin ės bazės arba rūgšties 
kiekius arba didinant organin ės terpės buferinę talpą (žr. 27 pastraip ą) užtik­
rinama, kad pH vert ė būtų 7,5 ± 0,5. Vykstant nitrifikacijos procesui susi ­
daro rūgštis, oksiduojant 1 mg N sukuriamas maždaug 7 mg CO  3 - ekviva­
lentas. Matavimo dažnumas priklauso nuo matuotino parametro ir sistemos stabilumo bei matuojama gali b ūti kasdien ar kart ą per savait ę.
 
45. Išmatuojama intaki ų į kontrolinius ir bandymo indus DOC arba COD vert ė. 
Taikant speciali ą analizę išmatuojama bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracija bandomajame intakyje arba ji apytiksliai apskai čiuojama 
naudojant pradinio tirpalo koncentracij ą (31 pastraipa), išmatuojamas 
naudotas kiekis ir į bandymo įrenginį įleistas nuotek ų kiekis. Rekomenduo ­
jama apskai čiuoti bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą siekiant 
sumažinti koncentracijos duomen ų kintamum ą. 
46. Iš surinkto ištakio (pvz., 24 val. jungtinis kiekio) imami tinkami ėminiai ir 
filtruojami per membran ą (poros dydis 0,45 μm) arba 15 minu čių centrifu­
guojami užtikrinant maždaug 40 000 m/s  2 . Leidžiama centrifuguoti, jeigu 
filtravimą sunku atlikti. Nustatoma DOC arba COD vert ė siekiant išmatuoti 
visišką biologin į suskaidym ą ir, jeigu b ūtina, naudojant bandomajai 
cheminei medžiagai b ūdingą analizės metodą išmatuojamas pirminis biolo ­
ginis suskaidymas.  
47. Taikant COD vert ę gali sunkiai sektis atlikti analiz ę, kai naudojamos mažos 
koncentracijos, tod ėl rekomenduojama tik tuo atveju, jeigu pasirenkama 
ganėtinai didel ė bandymo koncentracija (apie 30 mg/l). Taip pat, jeigu 
naudojamos lengvai adsorbuojamos chemin ės medžiagos, rekomenduojama, 
kad dumblo adsorbuojamos chemin ės medžiagos kiekis b ūtų matuojamas 
naudojant šiai bandomajai medžiagai b ūdingą analizės metodą. 
48. Ėminių ėmimo dažnumas priklauso nuo numatomos bandymo trukm ės. 
Rekomenduojamas dažnumas – trys kartai per savait ę. Jeigu įrenginiai 
eksploatuojami veiksmingai, laukiama nuo vienos iki ne daugiau negu 6 savaičių po bandomosios chemin ės medžiagos įterpimo, kol pasibaigus 
pritaikymui nusistov ės stabili b ūsena. Siekiant įvertinti bandymo rezultatus 
visų pirmiausiai b ūtina nustatyti 15 validuot ų kreivės plokščiosios dalies 
verčių (59 pastraipa); ši proced ūra paprastai trunka 3 savaites. Bandym ą 
galima užbaigti, jeigu užtikrinamas pakankamas šalinimo mastas (pvz., > 90 %), ir jeigu turimos min ėtos 15 ver čių, kurios atitinka per 3 savaites 
kiekvieną dieną atliktą analizę. Bandymo trukm ė paprastai neturi b ūti 
ilgesnė negu 12 savai čių po bandomosios chemin ės medžiagos įterpimo.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Jeigu dumble vyksta nitrifikacijos procesas ir jeigu turi b ūti tiriamas bando ­
mosios chemin ės medžiagos poveikis nitrifikacijai, bent vien ą kartą per 
savaitę analizuojami iš bandymo ir kontrolini ų įrenginių ištakio paimti 
ėminiai siekiant nustatyti amonio ir (arba) nitrit ų bei nitrat ų kiekį. 
50. Visos analiz ės turėtų būti atliekamos kai tik įmanoma, ypa č azoto kiekio 
nustatymas. Jeigu analizi ų atlikimas turi b ūti atidedamas, sklidinuose sanda ­
riai užkimštuose buteliuose ir tamsoje ėminiai laikomi apie 40 °C tempera ­
tūroje. Jeigu ėminiai turi b ūti laikomi ilgiau negu 48 val., jie saugomi 
užšaldyti, par ūgštinti (pvz., 10 ml/l 400 g/l sieros r ūgšties tirpalo) arba 
pridedant tinkamos toksiškos chemin ės medžiagos (pvz., 20 ml/l 10 g/l 
gyvsidabrio (II) chlorido tirpalo). Pasir ūpinama, kad pasirinkus išsaugojimo 
metodą nebūtų daromas poveikis analiz ės rezultatams.  
Bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrob ų populiacijos suvienodi ­
nimo proced ūra 
51. Jeigu turi b ūti suvienodinama bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio 
mikrobų populiacija (3 pried ėlis), tarp bandymo įrenginio ir jo kontrolinio 
įrenginio aeracijos rezervuar ų kiekvien ą dieną sukeičiamas vienodas veik ­
liojo dumblo kiekis (150 ml–1 500 ml dumblo aeracijos rezervuarams, kuriuose yra 3 litrai skys čio). Jeigu didel į bandomosios chemin ės medžiagos 
kiekį sugeria dumblas, šiuo atveju kei čiamas tik skirtuvuose nusistoj ęs 
skystis. Apskai čiuojant bandymo rezultatus (55 pastraipa) abiem atvejais 
naudojamas pataisos faktorius.
 
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Rezultatų apdorojimas  
52. Kiekvieno pasirinkto įvertinimo laiko bandomosios chemin ės medžiagos 
pašalinta procentin ė DOC arba COD dalis apskai čiuojama pagal ši ą lygtį: 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
kur: 
D t = pašalinta procentin ė DOC arba COD dalis t laiko momentu  
C s = su bandoma chemine medžiaga siejama intakio DOC arba COD vert ė, 
visų pirmiausiai įvertinta remiantis pradiniu tirpalu (mg/l)  
E = t laiko momentu bandomajame ištakyje išmatuota DOC arba DOC 
vertė (mg/l)  
E o = t laiko momentu kontroliniame ištakyje išmatuota DOC arba COD 
vertė (mg/l)  
53. Atliekant bandym ą DOC arba COD šalinimo mastas iš kontrolinio įrenginio 
organinės terpės praverčia vertinant veikliojo dumblo biologinio skaidymo 
veiksmingum ą. Pašalinama procentin ė dalis apskai čiuojama pagal ši ą lygtį: 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
kur: 
D B = iš kontrolinio įrenginio organin ės terpės t laiko momentu pašalinta 
procentin ė DOC arba COD dalis  
C M = kontrolinio ištakio organin ės terpės DOC arba COD vert ė (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Arba su organine terpe susijusi pašalinta DOC arba COD dalis ir bandomoji 
cheminė medžiaga bandymo įrenginyje apskai čiuojama pagal ši ą lygtį: 
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
kur: 
D T = bendra procentin ė iš bandomojo intakio pašalinta DOC arba COOD 
dalis  
C T = bendro bandomojo intakio DOC ar COD vert ė arba apskai čiuota 
atsižvelgiant į pradinius tirpalus (mg/l)  
54. Pašalintas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis, jeigu matuojama 
naudojant special ų analizės metodą kiekvieno įvertinimo metu, apskai čiuo­
jamas pagal ši ą lygtį: 
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
kur: 
D ST = procentin ė bandomosios chemin ės medžiagos pradinio pašalinimo 
dalis t laiko momentu  
S i = išmatuota arba apytiksliai apskai čiuota bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija bandomajame intakyje (mg/l)  
S e = išmatuota bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija bando ­
majame ištakyje laiko momentu t (mg/l)  
55. Jeigu naudojama bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrob ų popu­
liacijos suvienodinimo proced ūra, bandomosios chemin ės medžiagos skie ­
dimas aeracijos rezervuare kompensuojamas taikant dumblo keitimo proce ­
dūrą ir pataisos faktori ų (žr. 3 pried ėlį). Jeigu naudota 6 val. vidutin ė 
hidraulinė išbuvimo trukm ė ir jeigu aeracijos rezervuare esan čio veikliojo 
dumblo pakeista pus ė kiekio, siekiant apibr ėžti tikrąjį bandomosios 
cheminės medžiagos šalinimo mast ą Dtc nustatytos kasdienin ės išmetimo 
vertės (Dt, 52 pastraipa) turi b ūti tikslinamos pagal lygt į: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Tyrimo rezultat ų išraiška  
56. Brėžiamas šalinamos procentin ės dalies D  t (arba D  tc ) ir D  st , jeigu turima, 
priklausomyb ės nuo laiko grafikas (žr. 2 pried ėlį). Atsižvelgiant į bandomo ­
sios chemin ės medžiagos ( per se  arba kaip DOC) šalinimo kreiv ės formą 
galima daryti tam tikras su šalinimo procesu susijusias išvadas.  
Adsorbavimas  
57. Jeigu prad ėjus bandym ą nustatomas didelio kiekio DOC šalinimas iš bando ­
mosios chemin ės medžiagos, šiuo atveju tik ėtina, kad bandomoji chemin ė 
medžiaga šalinama j ą absorbuojant veikliojo dumblo kietosioms medžia ­
goms. Šį šalinimą įmanoma įrodyti nustatant adsorbuojamos bandomosios 
medžiagos kiek į ir šiuo tikslu atliekant speciali ą analizę. Neįprasta, jeigu 
atliekant bandym ą iš adsorbuojam ų chemini ų medžiag ų būtų šalinamas 
didelis DOC kiekis; paprastai didelis kiekis šalinamas iš pradži ų, o vėliau 
jis laipsniškai maž ėja ir prilygsta pusiausvyros vertei. Ta čiau jeigu adsor ­
buojant bandom ąją cheminę medžiag ą buvo sukeltas vienoks ar kitoks 
mikrobų populiacijos aklimatizavimas, šalinimas DOC kiekis iš bandomo ­
sios chemin ės medžiagos v ėliau turėtų didėti ir atitikti aukšt ą kreivės plokš­ 
čiosios srities vert ę. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Vėlavimo tarpsnis  
58. Kaip ir atliekant statinius bandymus, darant daugelio bandom ųjų cheminių 
medžiagų atrankos bandymus b ūtinas vėlavimo tarpsnis, kol visiškai užbai ­
giamas biologinis skaidymas. V ėlinimo tarpsnyje skaidan čios bakterijos akli ­
matizuojasi arba prisitaiko ir bandomoji chemin ė medžiaga šiame etape 
beveik nešalinama; tada prasideda pradinis ši ų bakterijų augimas. Laikoma, 
kad šis etapas yra pasibaig ęs, o skaidymo etapas yra prasid ėjęs, jeigu paša ­
linta maždaug 10 % pradinio bandomosios chemin ės medžiagos kiekio 
(pasibaigus adsorbcijai, jeigu ji vyksta). V ėlavimo tarpsnis dažnai b ūna 
labai kintantis, tod ėl jį sunkiai sekasi atkurti.  
Kreivės plokščiosios dalies tarpsnis  
59. Atliekant nepertraukiam ą bandym ą šalinimo kreiv ės plokščiosios dalies 
tarpsnis apibr ėžiamas kaip didžiausio skaidymo tarpsnis. Kreiv ės plokščio­
sios dalies tarpsnis netur ėtų būti trumpesnis negu 3 savait ės ir per jį turi būti 
išmatuota apie 15 galiojan čių verčių. 
Vidutinis bandomosios chemin ės medžiagos šalinimo laipsnis  
60. Vidutin ė vertė apskaičiuojama naudojant kreiv ės plokščiosios dalies tarpsnio 
bandomosios chemin ės medžiagos šalinimo vertes (D  t ). Suapvalinus iki arti ­
miausio sveikojo skai čiaus (1 %) nustatomas bandomosios chemin ės 
medžiagos šalinimo laipsnis. Taip pat rekomenduojama apskai čiuoti vidu ­
tinės vertės 95 % pasikliovimo interval ą. 
Organinės terpės šalinimas  
61. Brėžiama iš kontrolinio įrenginio (D  B ) organinės terpės šalinamos DOC arba 
COD procentin ės dalies priklausomyb ės nuo laiko kreiv ė. Vidutinis šalinimo 
laipsnis nurodomas taip pat kaip bandomosios medžiagos šalinimo laipsnis (60 pastraipa).
 
Biologinio skaidymo požymiai  
62. Jeigu veiklusis dumblas didesnio bandomosios chemin ės medžiagos kiekio 
neadsorbuoja ir šalinimo kreiv ė yra būdinga biologinio skaidymo kreiv ė su 
vėlinimu, skaidymo etap ą ir kreiv ės plokščiosios dalies tarpsn į (58, 59 
pastraipos), išmatuot ą šalinimą galima patikimai laikyti biologiniu skaidymu. 
Jeigu iš pradži ų šalinamas didelis kiekis, modeliavimo bandymas neturi 
skirtis biologinio ir abiotinio šalinimo proces ų atžvilgiais. Šiais atvejais ir 
kitais atvejais, jeigu kyla koki ų nors dvejoni ų dėl biologinio skaidymo (pvz., 
jeigu vyksta išp ūtimas), analizuojamos adsorbuotos bandomosios chemin ės 
medžiagos ar atliekami papildomi statiniai biologinio skaidymo bandymai 
remiantis biologinius procesus aiškiai apib ūdinančiais parametrais. Šie 
bandymai – tai deguonies suvartojimo metodai (šio priedo (6) C.4 D, E ir F skyrius) arba bandymas matuojant susidariusio anglies dioksido kiek į (šio 
priedo (6) C.4 C skyrius) ar ISO viršutin ės erdvės tyrimo metodas (18) 
naudojant modeliavimo bandymo iš anksto apdorot ą sėjimo kult ūrą. Jeigu 
išmatuojamas pašalintas DOC kiekis ir pašalintas konkre čios chemin ės 
medžiagos kiekis ir jeigu nustatomas didelis pašalinamos procentin ės dalies 
skirtumas (pirmoji vert ė mažesnė negu pastaroji), šiuo atveju galima daryti 
prielaidą, kad ištakiuose yra tarpini ų organini ų produktų, kurie kur kas 
sunkiau skaidomi negu pradin ė cheminė medžiaga.
 
Bandymo rezultat ų validumas  
63. Informacija apie įprastą sėjimo kult ūros biologin į skaidym ą gaunama tuo 
atveju, jeigu nustatomas kontrolinio įrenginio organin ės terpės šalinimo 
laipsnis (53 pastraipa). Bandymas laikomas galiojan čiu, jeigu DOC arba 
COD šalinimo laipsnis kontroliniame (-iuose) įrenginyje (-iuose) yra > 
80 % po dviej ų savaičių ir nebuvo pasteb ėta jokių neįprastų ypatybių. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Jeigu buvo naudota lengvai biologiškai skaidoma (etalonin ė) chemin ė 
medžiaga, biologinio skaidymo laipsnis (D  t , 52 pastraipa) tur ėtų būti > 
90 %.  
65. Jeigu bandymas atliekamas nitrifikacijos s ąlygomis, vidutin ė ištakių 
koncentracija tur ėtų būti < 1 mg/l amoniako-N ir < 2 mg/l nitrit ų-N. 
66. Jeigu ši ų kriterijų (63–65 pastraipos) n ėra laikomasi, bandymas kartojamas 
naudojant iš kito šaltinio paimt ą sėjimo kult ūrą, išbandoma etalonin ė 
cheminė medžiaga ir persvarstomos visos bandymo proced ūros. 
Bandymo ataskaita  
67. Į bandymo ataskait ą turi būti įtraukiama:  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— tapatyb ės nustatymo duomenys,  
— fizinis pob ūdis ir, jeigu reikia, fizin ės bei chemin ės savybės. 
Bandymo s ąlygos:  
— bandymo sistemos tipas; bet kokie netirpi ų ir lakiųjų cheminių medžiagų 
bandymo pakeitimai,  
— organin ės terpės tipas,  
— pramonini ų nuotekų dalis nuotekose ir j ų pobūdis, jeigu žinoma,  
— sėjimo kult ūra, pobūdis ir ėminių ėmimo vieta (-os), koncentracija ir 
išankstinis apdorojimas, jeigu taikytas,  
— bandomosios chemin ės medžiagos pradinis tirpalas: DOC ir TOC kiekis; 
paruošimo b ūdas, jeigu suspensija; naudota bandymo koncentracija; prie ­ 
žastys, jeigu kraštinis intervalas yra 10–20 g/l DOC; įterpimo metodas; 
pirmo įdėjimo data; bet kokie poky čiai, 
— vidutinis dumblo amžius ir vidutin ė hidraulin ė išbuvimo trukm ė; dumblo 
nuostolių nustatymo metodas; dumblo išsip ūtimo mažinimo metodai, 
dumblo nuostoliai ir t. t.,  
— naudoti analiz ės metodai; bandymo temperat ūra, 
— dumblo p ūtimosi savyb ės, dumblo indeksas (DI), veikliojo mišinio 
drumzlinumas (VMD),  
— bet kokie nuokrypiai nuo standartini ų procedūrų ir visos aplinkyb ės, dėl 
kurių gali būti daromas poveikis rezultatams.  
Bandymo rezultatai:  
— visi išmatuoti duomenys (DOC, COD, speciali analiz ė, pH, temperat ūra, 
deguonies koncentracija, suspenduotos medžiagos, N chemin ės 
medžiagos, jeigu reikia,  
— visos apskai čiuotosios D  t (arba D  tc ), D  B , D St vertės, pateiktos lentel ėje ir 
šalinimo kreiv ės, 
— informacija apie v ėlinimo ir kreiv ės plokščiosios dalies tarpsnius, 
bandymo trukm ę, bandomosios chemin ės medžiagos šalinimo ir kontro ­
linio įrenginio organin ės terpės šalinimo laipsn į bei statistin ė informacija 
ir pareiškimai apie biologin į skaidym ą bei bandymo validumas,  
— rezultat ų aptarimas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
LITERAT ŪRA 
1. Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation“, 2nd Edn. Marcel Dekker 
Inc. New York, 1085 pp.  
2. German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in 
washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698–706.  
3. Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, 
Medmenham, UK.  
4. Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature 
on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909–915.
 
5. Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
6. Chapter C.4 of this Annex, Determination of „Ready“ Biodegradability.  
7. Šio priedo C.12 skyrius, Biologinis skaidymas, Modifikuotas SCAS 
bandymas.  
8. Šio priedo C.19 skyrius. Dirvožemio ir nuotek ų dumblo adsorbcijos koefi ­
ciento (K  OC ) nustatymas naudojant didelio našumo skys čių 
chromatografij ą (HPLC).  
9. Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 
3:157–173.  
10. Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclu ­
sions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55.  
11. Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. pp 113–138, In: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. 
Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.  
12. ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and biode ­
gradability of organic substances in an aqueous medium - activated sludge simulation test.
 
13. Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33–48.  
14. Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 
340–343.  
15. Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determi ­
nations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. 
Wat.Res. 14: 753–758.  
16. Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220.
 
17. Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91–98 
ISBN 011 751661 9.  
18. ISO 14593 (1998). Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
1 priedėlis 
1 paveikslas  
Biologinio skaidumo įvertinimo įranga  
Husmano įrenginys
  
A. Laikymo indas  
B. Dozavimo siurblys  
C. Aeracijos rezervuaras (3 l talpos)  
D. Nusodintuvas  E. Pneumatinis siurblys  
F. Surinkimo indas  
G. Aeratorius  
H. Oro srauto matuoklis  
2 paveikslas  
Biologinio skaidumo įvertinimo įranga  
Akytasis indas
  
A. Laikymo indas  
B. Dozavimo siurblys  
C. Akytasis aeravimo rezervuaras  
D. Išorinis nelaidus indas  E. Surinkimo indas  
F. Oro sklaidytuvas  
G. Oro srauto matuoklis  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
3 paveikslas  
3 litrų talpos akytojo indo aeravimo rezervuaro dalys
  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
2 priedėlis 
Šalinimo kreiv ės pavyzdys
  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
3 priedėlis 
[INFORMACINIS PRIEDAS]  
BANDYMO ĮRENGINI Ų MIKROB Ų POPULIACIJOS SUVIENODINIMAS  
Siekiant pam ėginti suvienodinti bandymo įrenginio, kuriam tiekiamos nuotekos ir 
bandomoji chemin ė medžiaga, bei kontrolinio įrenginio, kuriam tiekiamos tik 
nuotekos, mikrob ų populiacij ą pradėta taikyti kasdienin ė dumblo apkeitimo 
procedūra (1). Ši proced ūra vadinama mikrob ų populiacijos suvienodinimo 
procedūra, o metodas – suvienodintos mikrob ų populiacijos įrenginių metodas. 
Mikrobų populiacijos suvienodinimo proced ūra iš pradži ų buvo atliekama naudo ­
jant Husmano veikliojo dumblo įrenginius, ta čiau ji taip pat naudota akyt ųjų indų 
įrenginiuose (2) (3). Įrenginių, kuriuose naudota mikrob ų populiacijos suvieno ­
dinimo proced ūra, ir įrenginių, kuriuose ji nebuvo taikoma, Husmano įrenginys 
ar akytasis indas, rezultatai skyr ėsi ne per daugiausiai, tod ėl neverta gaišti laiko ir 
eikvoti energij ą bei įrenginiuose taikyti min ėtą procedūrą. 
Naudojant dumblo apkeitim ą galima sudaryti gana didelio šalinimo regimyb ę, nes 
dalis bandomosios chemin ės medžiagos yra perkeliama ir bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracijos vert ės bandymo ir kontroliniuose ištakiuose beveik 
suvienodėja. Todėl būtina naudoti pataisos faktorius, kurie pasirenkami atsižvel ­
giant į pakeistąją dalį ir vidutin ę hidraulinio išbuvimo trukm ę. Išsamesn ė infor­
macija apie apskai čiavimą paskelbta (1).  
Patikslintosios DOC ar COD šalinimo laipsnio vert ės apskaičiuojamos pagal ši ą 
bendrąją formulę: 
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
kur: 
D tc = patikslintoji DOC ar COD šalinimo procentin ė dalis  
D t = apskai čiuotoji DOC ar COD šalinimo procentin ė dalis  
a = veikliojo dumblo įrenginių pakeičiamosios frakcijos t ūris 
r = vidutin ė hidraulin ė išbuvimo trukm ė (h) 
Jeigu, pvz., aeracijos rezervuaro pus ė tūrio yra pakei čiama (a = 0,5) ir vidutin ė 
hidraulinė išbuvimo trukm ė yra 6 val. pataisos apskai čiavimo formul ė: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
LITERAT ŪRA 
1. Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units 
of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135.  
2. Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Acti ­
vated Sludge Simulation Test. pp. 113–138. In: Laboratory Tests for Simula ­
tion of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. 
Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.  
3. Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, 
Stevenage, UK.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
4 priedėlis 
VEIKLIOJO DUMBLO SLOPINIMO ĮVERTINIMAS  
Procesas naudojant bandom ąsias chemines medžiagas  
1. Atliekant modeliavimo bandym ą cheminė medžiaga (ar nuotekos) gali b ūti 
biologiškai neskaidoma ar pašalinama ir net gal slopinti dumblo mikroorga ­
nizmų veiklą. Kitos chemin ės medžiagos biologiškai skaidomos, jeigu j ų maža 
koncentracija, ta čiau būdamos didel ės koncentracijos jos sukuria slopinam ąjį 
poveikį (hormez ė). Slopinam ąjį poveikį galima nustatyti ankstyvajame etape 
arba apibr ėžti atliekant toksiškumo bandym ą, kuriam naudojama panaši ar 
tapati sėjimo kult ūra, pasirinkta modeliavimo bandymui (1). Galima rinktis 
deguonies suvartojimo slopinimo metod ą (šio 2 pried ėlio C.11 skyrius), ISO 8 
192 (3)) arba dumblo organizm ų augimo slopinimo metod ą (ISO 15 522 (4)).  
2. Atliekant modeliavimo bandym ą bet koks slopinimas b ūtų akivaizdžiai 
įrodomas nusta čius, kad ištirpusios organin ės anglies (DOC) arba cheminio 
deguonies suvartojimo (COD) skirtumas bandymo indo ištakyje ir kontrolinio indo ištakyje yra didesnis negu DCO, kuri įterpta kaip bandomoji chemin ė 
medžiaga. Kitu b ūdu išreikšta procentin ė DOC šalinimo iš organin ės terpės 
vykstant poveikiui dalis (ir biocheminis deguonies suvartojimas BOD, cheminis deguonies suvartojimas COD ir (arba) NH
 + 4 ) būtų sumažinama 
įterpus bandomosios chemin ės medžiagos. Jeigu tai nustatoma, bandymas 
turėtų būti pakartojamas bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą 
mažinant tol, kol b ūtų užtikrinamas toks lygis, kad slopinimas b ūtų panaiki­
namas, ir turb ūt koncentracija b ūtų toliau mažinama, kol bandomojo chemin ė 
medžiaga b ūtų biologiškai suskaidyta. Ta čiau jeigu bandomoji chemin ė 
medžiaga (ar nuotekos) proces ą neigiamai veikia pasirinkus visas bandom ąsias 
koncentracijas, galima daryti prielaid ą, kad chemin ę medžiag ą būsią sunku, o 
gal ir neįmanoma skaidyti biologin ėmis priemon ėmis, tačiau galbūt būtų verta 
pakartoti bandym ą naudojant iš kito šaltinio gaut ą veiklųjį dumblą ir (arba) 
dumblui taikyti keli ų etapų aklimatizavimo proces ą. 
3. Priešingai, jeigu atliekant modeliavimo bandym ą bandomoji chemin ė 
medžiaga biochemin ėmis priemon ėmis pašalinama pirmame etape, jos 
koncentracija tur ėtų būti didinama, jeigu privaloma nustatyti, ar chemin ė 
medžiaga gali sukelti slopinam ąjį poveikį. 
4. Primintina, kad m ėginant nustatyti slopinimo laipsn į veikliojo dumblo popu ­
liacija gali pakisti, tod ėl mikroorganizmai ilgainiui gal ėtų įgyti atsparum ą 
slopinančiosios chemin ės medžiagos poveikiui.  
5. Slopinimo laipsnio apskai čiavimas:  
BOD (biocheminio deguonies suvartojimo), DOC, COD šalinimo R  o iš 
bandymo ir kontrol ės įrenginių bendroji procentin ė dalis apskai čiuojama 
pagal lygt į: 
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
kur: 
I = bandymo ar kontrolini ų ėminių indų intakio BOD, DOC, COD koncent ­
racija (mg/l)  
E = atitinkamos ištakio koncentracijos (mg/l)  
I ir E vert ės DOC vert ės atžvilgiu turi b ūti tikslinamos atsižvelgiant į 
bandymo įrenginiuose naudojam ą bandom ąją cheminę medžiag ą, antraip 
slopinimo procentin ės dalies apskai čiavimas neb ūtų tikslus.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Dėl naudojamos chemin ės medžiagos atsirandan čio slopinimo laipsn į galima 
apskaičiuoti pagal ši ą lygtį: 
% slopinimo ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
kur: 
R c = procentin ė pašalinimo dalis kontrolini ų ėminių induose  
R t = procentin ė pašalinimo dalis bandymo induose  
LITERAT ŪRA 
1. Reynolds L  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
2. Šio priedo C.11 skyrius. Biologinis skaidymas. Veikliojo dumblo respiracijos 
slopinimo bandymas.  
3. ISO 8192 (2007) Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.  
4. ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
5 priedėlis 
Mažai vandenyje tirpios bandomosios chemin ės medžiagos ir lakiosios 
cheminės medžiagos  
Mažai vandenyje tirpios chemin ės medžiagos  
Apie mažai vandenyje tirpi ų ir netirpi ų cheminių medžiag ų naudojim ą atliekant 
bandymus, kuriais modeliuojamas nuotek ų valymas, kol kas t ėra paskelbtos 
kelios ataskaitos (1) (2) (3).  
Nėra sukurto bendro bandomosios chemin ės medžiagos paskleidimo metodo, 
kuris būtų taikomas visoms netirpioms chemin ėms medžiagoms. Du iš standarte 
ISO 10 634 (4) aprašyt ų keturių metodų, atrodo, b ūtų tinkami paskleisti bando ­
mąsias chemines medžiagas, jeigu bandomosios chemin ės medžiagos tiriamos 
modeliavimo metodais; taikant paskleidimo metodus naudojami emulsikliai ir 
(arba) ultragarso energija. Tur ėtų būti nustatomas sukurto paskleidimo stabi ­
lumas; jis vertinamas ne trumpesniu negu 24 val. laikotarpiu. Tinkamai stabili ­
zuotos dispersijos laikomos nuolat maišomoje talpykloje (38 pastraipa); tada tam 
tikromis doz ėmis į aeracinį rezervuar ą tiekiamos atskirai nuo buitini ų (ar sinte ­
tinių) nuotekų. 
Jeigu dispersijos yra stabilios, šiuo atveju ištiriama, kaip galima nustatyti disper ­
sinės formos bandom ąją cheminę medžiag ą. Kažin ar DOC vert ė būtų tinkama, 
todėl privaloma parengti bandomajai cheminei medžiagai tinkam ą specialų 
analizės metodą, kurį būtų galima taikyti ištakiams, ištaki ų medžiagoms ir veik ­
liajam dumblui. Bandomosios chemin ės medžiagos pokytis modeliuojant veik ­
liojo dumblo proces ą turėtų būti apibrėžiamas skystosios ir kietosios medžiagos 
fazėje. Vadinasi, tur ėtų būti apskaičiuojamas „mas ės balansas“ siekiant nustatyti, 
ar bandomoji chemin ė medžiaga buvo biologiškai suskaidyta. Ta čiau šiuo atveju 
būtų patvirtinamas tik pirminis biologinis skaidymas. Visišk ą biologin į suskai­
dymą turėtų būti mėginama įrodyti atliekant respirometrin į lengvo biologinio 
skaidumo bandym ą (šio priedo (5) C, F arba D C.4 skyrius) ir šiuo tikslu naudoti 
dumblą su sėjimo kult ūra, kuris atliekant modeliavimo bandym ą veikiamas 
bandomąją chemine medžiaga.  
Lakiosios chemin ės medžiagos  
Nesiliauja svarstymas ir gin čai dėl nuotekų apdorojimo modeliavimo taikymo 
lakiosioms chemin ėms medžiagoms. Panašiai kaip d ėl mažai vandenyje tirpi ų 
bandomųjų chemini ų medžiag ų, tėra paskelbtos tik kelios ataskaitos, kuriose 
aprašyti modeliavimo bandymai naudojant laki ąsias chemines medžiagas. Įprasto 
tipo maišymo įrenginys pritaikomas užsandarinant aeracijos rezervuarus ir nuso ­
dintuvus, srauto matuokliais matuojant ir reguliuojant oro sraut ą bei per gaudy ­
kles tekan čias išėjimo dujas, kad b ūtų surinkta lakioji organin ė medžiaga. Tam 
tikrais atvejais naudojamas vakuuminis siurblys, kuriuo iš ėjimo dujos ištrau ­
kiamos per „šalt ąją“ gaudykl ę arba analizin ė gaudyklė su „Tenax“ ir duj ų chro­
matografijos analiz ėms skirtu silikageliu. Gaudykl ėje esanti bandomoji chemin ė 
medžiaga gali b ūtų nustatoma analiz ės metodu.  
Bandymas atliekamas dviem etapais. Įrenginiai iš pradži ų naudojami be dumblo, 
tačiau su sintetin ėmis nuotekomis ir bandom ąja chemine medžiaga, kuri pumpuo ­
jama į aeracijos rezervuar ą. Penkias dienas imami intakio, ištakio ir iš ėjimo dujų 
ėminiai ir analizuojami bandomosios chemin ės medžiagos atžvilgiu. Naudojant 
gautus duomenis galima apskai čiuoti procentin ę iš sistemos pašalintos bandomo ­
sios chemin ės medžiagos dal į (R vs ). 
Tada naudojimo s ąlygomis, tapa čiomis atliekant šalinimo tyrim ą, atliekamas 
įprastas biologinis bandymas (su dumblu). Taip pat matuojamos DOC arba 
COD vert ės siekiant patikrinti, ar įrenginiai veikia pagal reikalavimus. Pirmame 
bymo etape atliekamos vienkartin ės analizės siekiant intakyje, ištakyje ir iš ėjimo 
dujose nustatyti bandomosios chemin ės medžiagos kiek į; po aklimatizavimo 
analizės atliekamos dažniau. Tada naudojantis nuostovios b ūsenos duomenis 
galima vėl apskaičiuoti skystojo etapo metu taikant visus procesus (R  T ) (fizinius 
ir biologinius) pašalintos bandomosios chemin ės medžiagos procentin ę dalį ir iš 
sistemos pašalint ą proporcing ą dalį (R V ). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Apskaičiavimas:  
a) Atliekant ne biologin į bandymą iš sistemos pašalint ą procentin ę bandomosios 
cheminės medžiagos dal į (R VP ) galima apskai čiuoti pagal ši ą lygtį: 
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
kur: 
R VP = bandomosios chemin ės medžiagos pašalinimas d ėl lakiųjų junginių 
šalinimo (%),  
S VP = gaudykl ėje surinktas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis, 
išreikštas skystosios faz ės koncentracijos ekvivalentu,  
S IP = bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija intakyje (mg/l).  
b) Atliekant biologin į bandymą procentin ę iš sistemos pašalintos bandomosios 
cheminės medžiagos dal į (R V ) galima apskai čiuoti pagal ši ą lygtį: 
R V ¼ S V 
S I · 100 
kur: 
R V = bandomosios chemin ės medžiagos pašalinimas d ėl lakiųjų junginių 
šalinimo (%) atliekant biologin į bandymą, 
S V = atliekant biologin į bandym ą gaudykl ėje surinktas bandomosios 
cheminės medžiagos kiekis, išreikštas skystosios faz ės skystojo 
intakio koncentracijos ekvivalentu (mg/l),  
S I = bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija intakyje (mg/l).  
c) Atliekant biologin į bandym ą ir taikant visus procesus pašalinta procentin ė 
bandomosios chemin ės medžiagos dalis (R  T ) apskaičiuojama pagal ši ą lygtį: 
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
kur: 
S E = bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija (skystame) ištakyje 
(mg/l).  
d) Vadinasi, vykstant biologiniam skaidymui ir adsorbcijai pašalinta procentin ė 
dalis (R  BA ) apskaičiuojama pagal ši ą lygtį: 
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Turėtų būti atliekami atskiri bandymai siekiant nustatyti, ar bandomoji 
cheminė medžiaga yra adsorbuojama; jeigu adsorbuojama, šiuo atveju galima 
taikyti tolesn į koregavim ą. 
e) Palyginus iš biologinio (R  v ) bandymo sistem ų ir nebiologinio bandymo (R  vp ) 
sistemų pašalintos bandomosios chemin ės medžiagos proporcijas galima 
nustatyti bendr ąjį poveikį, kurį biologinis valymas padar ė bandomąją cheminę 
medžiagą išleidžiant į atmosfer ą. 
Pavyzdys:  
Benzenas  
Dumblo išbuvimo trukm ė = 4 dienos  
Sintetinių nuotekų išbuvimo trukm ė = 8 val.  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Vadinasi,  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % ir R  BA = 85 %.  
Daroma prielaida, kad dumblas neabsorbuoja benzeno.  
LITERAT ŪRA 
1. Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939–854.  
2. Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
3. Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
 
4. ISO 10634 (1995) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment 
of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of 
their biodegradability in an aqueous medium.  
5. Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
6 priedėlis 
Dumblo išbuvimo trukm ės (SRT) poveikis chemini ų medžag ų 
apdorojamumui  
ĮVADAS  
1. Naudojant aprašyt ą metodą įvertinama, ar bandomas chemine medžiagas 
(paprastai d ėl savo sud ėties laikomas biologiškai skaidžiomis, ta čiau ne 
lengvai skaidžiomis) įmanoma biologiškai suskaidyti laikantis t ų reikala­
vimų, kurie taikomi nuotek ų valymo įrenginiams. Rezultatai pateikiami 
kaip procentin ė pašalinimo ir biologinio suskaidymo vert ė. Atsižvelgiant į 
veikliojo dumblo įrenginių naudojimo s ąlygas ir intakio pasirinkim ą galima 
taikyti įvairias bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos ištakyje 
vertes. Atliekant bandymus taikoma tik viena nominalioji dumblo dribsni ų 
koncentracija arba viena nominalioji dumblo išbuvimo trukm ė (SRT) ir 
pasirinkus aprašytus dumblo nuostoli ų režimus SRT vert ė gali gerokai 
skirtis atliekant bandym ą (kiekvien ą kitą dieną ir vieną dieną). 
2. Pasirinkus š į variantą (1) (2) SRT kontroliuojama nustatant kur kas 
mažesnes ribines vertes per kiekvien ą 24 val. laikotarp į (būtent taip nutinka 
pasirinkus didel į mastą), todėl ištakiuose nusistovi pastovesn ė koncentracija. 
Rekomenduojama naudoti buitines nuotekas, nes šiuo atveju užtikrinama tolygesnė ir didesn ė procentin ė pašalinimo dalis. Taip pat nustatomas tam 
tikro SRT ver čių skaičiaus poveikis ir atliekant nuodugnesnius tyrimus 
galima apib ūdinti temperat ūros interval ų poveikį ištakio koncentracijai.
 
3. Apskritai kol kas n ėra susitarta, kokius kinetinius modelius taikyti, kai 
valant nuotekas biologiškai skaidomos chemin ės medžiagos. Nuspr ęsta (1) 
(2), kad renkant duomenis taikytinas bakterij ų augimo ir substrato naudo ­
jimo Mono kinetikos modelis, nes šis metodas skirtas taikyti tik toms chemi ­
nėms medžiagoms, kuri ų pagaminami dideli kiekiai ir tod ėl sukuriama 
didesnė negu 1 mg/l koncentracija. Supaprastinto modelio tinkamumas ir 
padarytos prielaidos buvo pagr įstos naudojant alkoholio etoksilatus, kuriems 
būdingas kintan čio laipsnio pirminis biologinis skaidumas.  
Pastaba.  Šis metodas variantas didesni ąja dalimi atitinka šio bandymo 
metodo C.10-A aprašym ą ir toliau pateikiama tik ta informacija, 
kuri neatitinka teksto.  
BANDYMO METODO ESM Ė 
4. Veikliojo dumblo akytieji indai, naudojami siekiant palengvinti (beveik) 
nenutrūkstamąjį mišriojo skys čio nuostoli ų susidarym ą, siekiant labai tiksliai 
kontroliuoti dumblo išbuvimo trukm ę (SRT arba θ s ), taikomi nenaudojant 
bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio mikrob ų populiacijos suvienodi ­
nimo proced ūros ir pasirenkant SRT ver čių bei, jeigu reikia, temperat ūros 
verčių intervalą. Išbuvimo trukm ė paprastai b ūna 2–10 dien ų ir pasirenkama 
5–20 °C temperat ūra. Nuotekos (pirmenyb ė teikiama buitin ėms nuotekoms) 
ir bandomosios chemin ės medžiagos tirpalas į įrenginį atskirai tiekiami 
tokiais kiekiais, kad b ūtų užtikrinama privaloma nuotek ų išbuvimo trukm ė 
(3–6 val.) ir reikiama bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija inta ­
kyje. Siekiant užsitikrinti galimyb ę palyginti, tuo pa čiu metu eksploatuojami 
kontroliniai įrenginiai, kuriems bandomoji chemin ė medžiaga n ėra tiekiama.  
5. Leidžiama naudoti kit ų tipų įrenginius, ta čiau būtina ypač stengtis tinkamai 
kontroliuoti SRT. Pvz., pasirinkus įrenginius su įrengtu nusodintuvu, gali 
tekti taikyti leidžiam ąją kietųjų medžiag ų nuostolių, kurių randasi iš įren­
ginio ištekant ištakiui, nuokryp ą. Be to, tur ėtų būti imamasi speciali ų atsar­
gumo priemoni ų siekiant išvengti paklaid ų, kurių gali įsivelti kintant nuso ­
dintuve esan čio dumblo kiekiui.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Kiekvienas įrenginys naudojamas apibr ėžus jo eksploatavimo s ąlygų rinkinį 
ir, kai užtikrinama pusiausvyra, vidutin ės pastovios bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracijos ištakiuose ir, jeigu reikia, DOC koncentracijos nusistovi maždaug per tris savaites. Įvertinama ne tik procentin ė pašalintos 
bandomosios chemin ės medžiagos ir, jeigu reikia, DOC procentin ė dalis, 
tačiau taip pat br ėžiamas įrenginio eksploatavimo s ąlygų ir koncentracijos 
ištakyje santykio grafikas. Remiantis min ėtais dalykais galima apskai čiuoti 
pradines kinetines konstantas ir s ąlygas, kurias pasirinkus b ūtų įmanoma 
numatyti bandomosios chemin ės medžiagos apdorojimo s ąlygas.
 
INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ CHEMIN Ę MEDŽIAG Ą 
7. Taikomos C.10 A skyriaus 12 ir 13 pastraipos.  
ATITIKTIES LYGIS  
8. Taikomos C.10 A skyriaus 14 ir 15 pastraipos.  
ETALONIN Ė BANDOMOJI CHEMIN Ė MEDŽIAGA  
9. Taikoma C.10 A skyriaus 16 pastraipa.  
BANDYMO REZULTAT Ų ATKURIAMUMAS  
10. Taikomos C.10 A skyriaus 17 ir 18 pastraipos.  
BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Aparatūra 
11. Tinkamas įrenginys b ūtų modifikuota akytojo indo sistema (6.1 pried ėlis). Ją 
sudaro iš akytojo propileno (jo storis 3,2 mm; poros dydis maždaug 90 μm) 
pagamintas vidaus indas (arba įdėklas); jį gaminant naudota sand ūrinė suvi­
rinimo si ūlė. (Šis įrenginys yra kur kas tvirtesnis negu aprašytasis šio 
skyriaus C.10 A 21 pastraipoje). Įdėklas įstatomas į nelaidų polietilenin į 
išorinį indą, sudaryt ą iš dviej ų dalių: apskrito dugno, kuriame išgr ęžtos 
angos dviem oro linijoms ir dumblo išleidimo linijai prijungti, bei ant šio 
pagrindo užsukto viršutinio cilindro, turin čio išėjimo angą, įrengtą taip, kad 
būtų užtikrinama žinoma akytojo indo t ūrio vertė (3 l). Vienoje iš oro linij ų 
yra difuzoriaus akmenys, o kita linija yra atviru galu ir į inde esan čius 
akmenis nukreipta statmenu kampu. Šia sistema sukuriama b ūtina turbulen ­
cija siekiant užtikrinti, kad indo turinys b ūtų visiškai sumaišomas ir kad 
ištirpusio deguonies koncentracij ų vertės būtų didesnės negu 2 mg/l.  
12. Reikiamas įrenginių skaičius reguliuojamoje temperat ūroje (intervalas 
5–20 °C (± 1 °C) laikomas vandens voniose ar pastovios temperat ūros patal­
pose. Būtina naudoti siurblius, kuriais į aeracijos rezervuarus b ūtų 
leidžiamas bandomosios chemin ės medžiagos tirpalas ir nusistojusios 
nuotekos (leidimo norma atitinkamai 0–1,0 ml/min ir 0–25 ml/min), o trečiuoju siurbliu iš aeracijos rezervuar ų šalinamas perteklinis dumblas. 
Labai mažas b ūtinasis perteklinio dumblo srautas sukuriamas naudojant 
siurblį, nustatyt ą veikti didesne sparta, ir įjungiamą veikti su pertr ūkiais 
(trūkųjį veikimą užtikrina laikma čio jungiklis, įsijungiantis ir veikiantis 10 
sekundžių per min.); siurblio tiekimo intervalas yra 3 ml/min., tod ėl užtik­
rinama 0,5 ml/min. šalinimo norma.
 
Filtravimo įtaisas ar centrifuga  
13. Taikoma C10 A skyriaus 23 pastraipa.  
Analizės įranga  
14. Taikoma C.10 A skyriaus 24 pastraipa.  
Vanduo  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Taikomos C.10 A skyriaus 25 ir 26 pastraipos.  
Organinė terpė 
16. Taikoma C.10 A skyriaus 27 pastraipa.  
Sintetinės nuotekos  
17. Taikoma C.10 A skyriaus 28 pastraipa.  
Buitinės nuotekos  
18. Taikoma C.10 A skyriaus 29 pastraipa.  
Veiklusis dumblas  
19. Taikoma C10 A skyriaus 30 pastraipa.  
Pradiniai bandomosios chemin ės medžiagos tirpalai  
20. Taikomos C.10 A skyriaus 31 ir 32 pastraipos.  
BANDYMO EIGA  
Sėjimo kultūros ruošimas  
21. Taikoma tik C.10 A skyriaus 34 pastraipa – naudojamas veiklusis dumblas 
(apie 2,5 g/l).  
Bandymo įrenginių skaičius 
22. Norint atlikti paprast ą bandymą, t. y. išmatuoti procentin ę pašalinam ą dalį, 
pakanka vieno SRT, ta čiau siekiant gauti duomenis, reikalingus apskai čiuo­
jant pradines kinetines konstantas, b ūtina turėti 4 ar 5 SRT vertes. Paprastai 
pasirenkamos 2–10 dien ų vertės. Praktin ėms reikm ėms bandym ą patogu 
vienu metu atlikti su 4 ar 5 SRT vert ėmis; vykdant išsamesnius tyrimus 
naudojamos tos pa čios SRT vert ės ar turbūt skirtingų verčių intervalas, kai 
pasirenkamos kitos temperat ūros vertės (5–20 °C). Pirminiam biologiniam 
skaidumui (pagrindinis naudojimas) paprastai reikalingas tik vienas įren­
ginys, kuriame taikomas tam tikr ų sąlygų rinkinys. Ta čiau visiškam biolo ­
giniam skaidumui b ūtinas kontrolinis įrenginys, kuriame naudojamos kiek ­
vieno rinkinio s ąlygos ir kuriam tiekiamos nuotekos, o ne bandomoji 
cheminė medžiaga. Jeigu daroma prielaida bandom ąją cheminę medžiag ą 
esant naudojamose nuotekose, vertinant pirmin į biologin į skaidum ą priva­
loma naudoti kontrolinius įrenginius ir atitinkamai tikslinti apskai čiavimus.  
Organinės terpės ir bandomosios chemin ės medžiagos dozavimas  
23. C.10 A skyriaus 36–39 pastraipos yra taikomos, ta čiau atkreiptinas d ėmesys, 
kad bandomosios chemin ės medžiagos tirpalas dozuojamas atskirai ir kad 
pasirenkami skirtingi dumblo šalinimo laipsniai. Be to, stebimi ir, jeigu reikia, ± 10 % tikslumu reguliuojami intaki ų, ištakių srautai ir dumblo šali ­
nimo dažnumas, pvz., du kartus per dien ą. Jeigu pasirinkus buitines 
nuotekas kyla sunkum ų taikant analiz ės metodus, atliekamas bandymas 
naudojant sintetines nuotekos, ta čiau šiuo atveju turi b ūti užtikrina, kad 
taikant skirting ą terpę būtų gaunami palyginami kinetiniai duomenys.
 
Veikliojo dumblo įrenginių tvarkymas  
24. Taikomos C.10 A skyriaus 40–43 pastraipos, ta čiau SRT vert ė kontroliuo ­
jama tik „tolygiu“ dumblo šalinimu.  
Ėminių ėmimas ir analiz ė 
25. Taikomos C.10 A skyriaus 44–50 pastraipos, išskyrus bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracijos vert ę ir DOC vert ę, kurios nustatymas 
nėra privalomas; COD vert ė neturėtų būti naudojama.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Rezultatų apdorojimas  
26. Taikomos C.10 A skyriaus 52–54 pastraipos.  
Tyrimo rezultat ų išraiška  
27. Taikomos C.10 A skyriaus 56–62 pastraipos.  
Kinetinių konstant ų apskaičiavimas  
28. Laikytina, kad veikiau vert ėtų nurodyti vidutin ę stabilios b ūsenos bandomo ­
sios chemin ės medžiagos koncentracijos ištakyje vert ę ir apibūdinti, kaip ji 
kinta atsižvelgiant į įrenginio eksploatavimo s ąlygas, negu nurodyti procen ­
tinę pirminio biologinio skaidumo dal į. Šį reikalavim ą galima įvykdyti pasi ­
naudojus 6.2 pried ėlio (6) lygtimi, kuri ą pritaikius galima apskai čiuoti K  S , 
μ m ir θ SC vertes ir kritin ę dumblo išbuvimo trukm ę. 
(Antraip apytiksles K  S ir μm vertes galima nustatyti naudojant nesud ėtingą 
kompiuterin ę programą, kad pagal 2 lygt į (6.2 pried ėlis) apskai čiuota teorin ė 
kreivė būtų suderinama su gautomis eksperimentin ėmis vertėmis. Nors joks 
nurodytas tirpalas nebus unikalus, ta čiau galima apskai čiuoti apytiksles K  Sr 
ir μ m vertes).  
Rezultatų kintamumas  
29. Įprastas dalykas, kad nustatomos pavieni ų chemini ų medžiag ų skirtingos 
kinetinių parametr ų vertės. Paprastai laikoma, kad dumblo ruošimo s ąlygos 
bei pagrindin ės bandymo s ąlygos (nurodytos 5 pastraipoje ir atliekant kitus 
bandymus) daro didel į poveikį nustatomoms vert ėms. Vien ą iš šio kinta ­
mumo atžvilgi ų aptaria Grady ir kt. (4), kuris pasi ūlė, kad terminai „esamas“ 
ir „būdingas“ tur ėtų būti taikomi dviem ekstremaliosioms s ąlygoms, apib ū­
dinančioms tas fiziologin ės būklės ribas, kuriomis atliekant bandym ą 
įmanoma apib ūdinti sėjimo kult ūrą. Jeigu atliekant bandym ą nenumatoma 
galimybė būklei kisti, šiuo atveju kinetini ų parametr ų vertės atitinka 
aplinkos s ąlygas, kuriomis mikroorganizmai buvo paimti; šios vert ės vadi­
namos „esamomis“ arba užtikrinamomis šiuo metu. Savo ruožtu, jeigu atlie ­
kant bandym ą nustatomos tokios s ąlygos, kad b ūtų sudaryta galimyb ė 
sukurti baltym ų sintezės sistemą ir taip užtikrinta didžiausia galima augimo 
norma, apskai čiuoti kinetiniai parametrai vadinami „b ūdingais“ ir jie 
priklauso tik nuo substrato pob ūdžio bei s ėjimo kult ūros bakterij ų tipo. 
Rekomendacin ės esamosios vert ės apskaičiuojamos išlaikant maž ą substrato 
koncentracijos ir atitinkam ų mikroorganizm ų (S o /X o ) santykį, pvz., 0,0025, 
ir būdingosios vert ės nustatomos taikant didel į santykį, pvz., bent jau 20. 
Abiem atvejais S  o vertė turėtų būti lygi atitinkamai Ks vertei ar j ą viršyti, 
pusinės soties konstanta.  
30. Kintamumas ir kiti biologinio skaidumo kinetiniai parametrai buvo aptarti 
neseniai surengtame SETAC seminare (5). Remiantis šiais tyrimais, patei ­
kiant jų ataskaitas ir rengiant j ų projektus ateityje bus galima aiškiau suprasti 
nuotekų valymo įrenginiuose galiojan čius kinetinius parametrus siekiant 
patikimiau aiškinti turimus duomenis bei si ūlyti tinkamesnius b ūsimų 
bandymų metodų projektus.  
LITERAT ŪRA 
1. Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol Deterg.: 33–48.  
2. Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340–343.  
3. Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
4. Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res., 30 (3): 742–748.  
5. Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4–6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
6.1 pried ėlis 
Akytasis indas su SRT kontrole
  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
6.2 pried ėlis 
Kinetinių konstant ų apskaičiavimas  
1. Padarius prielaid ą, kad taikoma Mono kinetika ir atsižvelgiant į veikliųjų 
kietųjų medžiagų bei substrato masi ų balansą veikliojo dumblo sistemoje (1) 
galima sudaryti šias nuostovios b ūsenos išraiškas:  
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
arba 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
kur: 
S 1 = substrato koncentracija ištakyje, (mg/l)  
K S = pusinės soties konstanta, kuriai esant koncentracija μ = μ m /2 (mg/l)  
μ = savitoji augimo sparta (d  –1 ) 
μ m = didžiausia μ m (d –1 ) vertė 
K d = savitoji veikli ųjų kietųjų medžiag ų irimo sparta (d  –1 ) 
θ S = vidutin ė dumblo išbuvimo trukm ė, SRT (d)  
Išnagrinėjus šią lygtį daromos šios išvados:  
i) ištakio koncentracija n ėra susijusi su intakio koncentracija (S  0 ); vadinasi, 
procentin ė biologinio skaidymo vert ė skiriasi atsižvelgiant į intakio 
koncentracij ą, S 0 ; 
ii) vienintelis įrenginio kontrolinis parametras, darantis poveik į S 1 , yra 
dumblo išbuvimo trukm ė, θ S ; 
iii) jeigu intakyje koncentracijos vert ė yra S  0 , kritinė dumblo išbuvimo 
trukmė būtų: 
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
kur: 
θ SC = kritinė dumblo išbuvimo trukm ė; jeigu ji b ūtų trumpesn ė, šiuo 
atveju atitinkami mikroorganizmai b ūtų pašalinami iš įrenginio.  
iv) kiti lygties (2) parametrai siejami su kinetiniais augimo parametrais, 
todėl temperat ūros vertė, tikėtina, darys poveik į ištakio substrato lygiui 
ir kritiniam dumblo amžiui, t. y. dumblo išlaikymo trukm ė, būtina užtik ­
rinant tam tikr ą valymo laipsn į ilgėja, jeigu pasirenkama žemesn ė 
temperatūra. 
2. Atsižvelgiant į akytojo indo sistemos kiet ųjų medžiag ų masės balansą ir 
darant prielaid ą, kad kiet ųjų medžiag ų koncentracija įrenginio ištakyje X  2 , 
palyginti su koncentracija aeracijos rezervuare, yra maža, X  1 , dumblo išbu ­
vimo trukm ė 
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
ir 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
kur: 
V = aeracijos rezervuaro t ūris (l)  
X 1 = kietųjų medžiag ų koncentracija aeracijos rezervuare (mg/l)  
X 2 = kietųjų medžiag ų koncentracija ištakyje (mg/l)  
Q 0 = ištakio srautas (l/d)  
Q 1 = perteklinio dumblo srautas (l/d)  
Vadinasi, iš anksto pasirinkt ą bet koki ą dumblo išbuvimo trukm ę įmanoma 
kontroliuoti reguliuojant perteklinio dumblo sraut ą Q 1 . 
Išvados  
3. Pagrindinis bandymo tikslas – leisti susidaryti ištakio koncentracijai ir, vadi ­
nasi, taip numatyti bandomosios chemin ės medžiagos lygius priiman čiuo­
siuose vandenyse.  
4. Brėžiant S  1 kreivę, kai atsižvelgiama į θ S , kartais įmanoma nesunkiai įver­
tinti kritin ę dumblo išbuvimo trukm ę, pvz., 3 kreiv ė 1 pvz., Jeigu šito 
padaryti ne įmanoma, θ SC galima apskai čiuoti, kartu su apytikr ėmis μ m ir 
K S vertėmis, kai S  1 kreivė brėžiama atsižvelgiant į S 1 •θ S . 
Pertvarkius 1 lygt į gaunama  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Jeigu K  d vertė yra maža, šiuo atveju 1 + θ s • K  d ~ 1 ir [5] virsta:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Vadinasi, br ėžiamas grafikas tur ėtų būti tiesi linija (žr. 2 pav.), kurios kryp ­
ties koeficientas 1/ μ m , ir atkarpa K  S /μ m ; taip pat θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
1 paveikslas  
Trys temperat ūros vertės; penkios SRT vert ės
 
2 paveikslas  
Regresijos ties ė SRT S  1 atsižvelgiant į S 1 , kai T = 5 °C
  
Žodynėlis 
ištakio koncentracija  
kreivė ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
7 priedėlis 
BANDYMAS ESANT MAŽAM ( μg/l) KONCENTRACIJOS INTER ­
VALUI  
1. Daug chemini ų medžiag ų vandens aplinkoje, net nuotekose, b ūna labai 
mažos koncentracijos ( μg/l). Kadangi j ų koncentracijos mažos, tod ėl šios 
cheminės medžiagos, ko gero, n ėra augimą sukeliantys pirminiai substratai 
ir veikiau tik ėtina, kad jos b ūsiančios suskaidytos kaip neaugantys antriniai 
substratai, veikiantys kartu su gamtoje pasitaikan čiomis organin ėmis 
medžiagomis. Vadinasi, ši ų cheminių medžiagų skaidymas neatitinka 6 prie ­
dėlyje aprašyto modelio. Aprašyta daug modeli ų, kuriuos b ūtų galima 
taikyti, ir atsižvelgiant į nuotekų valymo sistemose pasirenkamas s ąlygas 
vienu metu galima taikyti daugiau negu vien ą modelį. Siekiant išspr ęsti šį 
klausimą privaloma atlikti kur kas daugiau mokslini ų tyrimų. 
2. Kol kas galima taikyti pagrindin ėje teksto dalyje (C.10 A skyriuje) aprašyt ą 
procedūrą, tačiau tik pirminio biologinio skaidumo atžvilgiu, ir šiuo tikslu 
naudoti tinkamas mažas koncentracijas (< 100 μg/l) ir patvirtintas analiz ės 
procedūras. Procentin ę biologin ę skaidymo vert ę galima apskai čiuoti (žr. 
Bandymo metodo 54 pastraip ą), jeigu atsižvelgiama į abiotinius procesus 
(adsorbcij ą, lakumą ir t. t.). Pavyzdžiu laikytinas Niholmo ir jo koleg ų (1)(2) 
atliktas tyrimas naudojant 4 val. cikl ą pildymo ir išleidimo sistemoje. Jie 
pateikė 5 chemini ų medžiag ų, įterpiamų į sintetines nuotekas (5–100 μg/l), 
pseudopirmojo laipsnio konstantas. (Nustatant visišk ą biologin į skaidym ą 
galima naudoti  14 C pažym ėtąsias bandom ąsias chemines medžiagas). 
Minėtas aprašymas nepatenka į šio bandymo metodo taikymo srit į, nes 
kol kas n ėra parengt ų suderintų procedūrų, nors į standarte ISO 14 592 
(3) pasiūlytą metodą įtrauktos  14 C paženklint ųjų cheminių medžiagų naudo­
jimo gair ės. 
SCAS bandymas  
3. Vėliau buvo pasi ūlytas paprastesnis dviej ų etapų bandymas (4) (5) (6); po 
pusiau nepertraukiamo veikimo aktyviojo dumblo (SCAS) metodo atliekami trumpalaikiai kinetiniai bandymai su m ėginiais, paimtais iš SCAS įrenginių. 
SCAS sistema naudojama žinant šalinamo dumblo kiek į (priešingai negu 
originaliame C.12 bandymo metode) ir į ją tiekiamos modifikuotos OECD 
sintetinės nuotekos arba buitin ės nuotekos. Sintetin ės nuotekos buvo modi ­
fikuotos (d ėl kintančios pH vert ės ir per mažos dumblo nus ėdimo gebos) į 
jas įterpiant fosfato buferio, mieli ų ekstrakto, geležies (III) chlorido ir mikro ­
elementų druskų bei jų COD vert ė padidinta maždaug 750 mg/l (šiuo tikslu 
padidinta peptono ir m ėsos ekstrakto koncentracija). Įrenginiai naudoti 24 
val. ciklu: 23 val. aeracija, dumblo šalinimas, nusodinimas, nusistojusio 
skysčio (ištakio šalinimas), tada sintetini ų nuotekų ir bandomosios chemin ės 
medžiagos įterpimas, ne didesn ės negu 100 μg/l koncentracijos (t. y. 
maždaug tokia pati koncentracija kaip naudotoji atliekant trumpalaik į 
bandymą). Kartą per savait ę 10 % bendro dumblo kiekio pakei čiama šviežiu 
dumblu siekiant išlaikyti subalansuot ą mikrobų populiacij ą.
 
4. Prad ėjus aeracij ą ir ją užbaigus matuojamos bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracijos ir bandymas t ęsiamas tol, kol užtikrinamas 
tolygus bandomosios chemin ės medžiagos šalinimas; šis procesas trunka 
nuo vienos savait ės iki kelių mėnesių. 
Trumpalaikis bandymas  
5. Trumpalaikis bandymas (pvz., 8 val.) atliekamas siekiant nustatyti veiklia ­
jame dumble, kurio kilm ė yra žinoma, ta čiau skirtinga, esan čios bandomo ­
sios chemin ės medžiagos irimo pseudopirmojo laipsnio kinetin ę konstant ą. 
Dumblo ėminiai paimami iš SCAS reaktori ų – aeracijos laikotarpio pabai ­
goje, kai organinio substrato koncentracija maža – atliekant aklimatizacijos 
eksperiment ą (3, 4 pastraipos). Dumbl ą taip pat galima paimti ir palyginti iš 
gretimo SCAS įrenginio, kuriame nenaudota bandomoji chemin ė medžiaga.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
Įterpiami dviej ų ar daugiau koncentracij ų (koncentracijos intervalas 1–50 
μg/l) dumblo ir bandomosios chemin ės medžiagos mišiniai yra aeruojami 
nepridedant sintetini ų nuotekų arba kito organinio substrato. Ne ilgesn į negu 
24 val. laikotarp į reguliariais intervalais nustatomas tirpale likusios bando ­
mosios chemin ės medžiagos kiekis, pvz., kas valand ą (šiuo atžvilgiu 
paisoma chemin ės medžiagos skaidomumo). Prieš atliekant b ūtiną analizę 
ėminiai yra centrifuguojami.  
Apskaičiavimai  
6. Naudojant SCAS įrenginius gauti duomenys taikomi apskai čiuojant bando ­
mosios chemin ės medžiagos procentin ę šalinimo dal į (54 pastraipa). Taip 
pat vidutin ę greičio konstant ą K 1 (normalizuot ą suspenduot ų medžiag ų 
koncentracij ą) galima apskai čiuoti pagal ši ą lygtį: 
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
kur: 
t = aeracijos trukm ė (23 val.)  
C e = koncentracija aeracijos laikotarpio pabaigoje ( μg/l) 
C i = koncentracija aeracijos laikotarpio pradžioje ( μg/l) 
SS = veikliojo dumblo suspenduot ų medžiag ų koncentracija (g/l)  
7. Atliekant trumpalaik į bandym ą brėžiama likusios log % koncentracijos 
priklausomyb ė nuo trukm ės ir linijos pradin ės dalies (10–50 % skaidymas) 
statumas yra tapatus K  1 . Konstanta normalizuojama dumblo kiet ųjų 
medžiagų koncentracijos atžvilgiu ir šiuo tikslu kreiv ės krypties koeficientas 
dalinamas iš dumblo kiet ųjų medžiagų koncentracijos. Į pateikiam ą rezultatą 
taip pat turi b ūti įtraukta informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracijas ir suspenduotas medžiagas, dumblo išbuvimo trukm ę, dumblo 
įkrovą, šaltinį ir duomenys (jeigu turima) apie bandomosios chemin ės 
medžiagos pradin į poveikį. 
Rezultatų kintamumas  
8. Kintamumas ir kiti biologinio skaidumo kinetiniai parametrai buvo aptarti 
neseniai surengtame SETAC seminare (7). Remiantis šiais tyrimais, patei ­
kiant jų ataskaitas ir rengiant j ų projektus ateityje bus galima aiškiau suprasti 
nuotekų valymo įrenginiuose galiojan čius kinetinius parametrus siekiant 
patikimiau aiškinti turimus duomenis bei si ūlyti tinkamesnius b ūsimų 
bandymų metodų projektus.  
LITERAT ŪRA 
1. Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz 
B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.
 
2. Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.
 
3. ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evalua ­
tion of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentra ­
tions in water.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
4. Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
 
5. Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.  
6. Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegra ­
dability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, 
UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.  
7. Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4–6
 th Sept. 1996. SETAC- Europe, 
Brussels.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C. 10-B. Biologin ės plėvelės 
ĮVADAS  
1. Modeliavimo bandymai paprastai atliekami su chemin ėmis medžiagomis, 
kurios neatitiko lengvo biologinio skaidomumo atrankos bandymo (šio priedo (9) C.4 A–F skyrius), ta čiau kurios atitiko b ūdingojo biologinio 
skaidumo bandymo reikalavimus. Vis ų pirma modeliavimo bandymai taip 
pat taikomi bet kokiai cheminei medžiagai, apie kuri ą būtina gauti daugiau 
informacijos, ypa č tas chemines medžiagas, kuri ų gaminami dideli kiekiai, o 
šiaip atliekamas veikliojo dumblo bandymas (C.10 A). Ta čiau tam tikromis 
aplinkybėmis būtina speciali informacija apie chemin ės medžiagos elgsen ą, 
kai ši medžiaga naudojama valant nuotekas, jeigu taikoma biologin ė plėvelė, 
būtent laistomieji reaktoriai, pasukamieji nardinamieji reaktoriai, kybantieji 
sluoksniai.
 
2. Gerike ir kt. (1) naudojo didelius, bandom ųjų matmenų laistomuosius reak ­
torius, kuriuos naudojant taikyta bandymo įrenginio ir kontrolinio įrenginio 
mikrobų populiacijos suvienodinimo proced ūra. Šie reaktoriai užima daug 
vietos ir jiems reikia palyginti dideli ų nuotekų ar sintetini ų nuotekų kiekių. 
Truesdale ir kt. (2) aprašo mažesnius filtrus (6 p ėd. × 6 col. skersmens), į 
kuriuos tiekiamos nuotekos be paviršinio aktyvumo medžiagos, ta čiau 
kuriems vis tiek b ūtina tiekti gana didelius kiekius. Reikalingas ne trum ­
pesnis negu 14 savai čių laikotarpis, kol susiformuoja „brandi“ biologin ė 
plėvelė, ir būtinas papildomas 4–8 savai čių laikotarpis po bandomosios 
paviršinio aktyvumo medžiagos įterpimo, kad gal ėtų vykti aklimatizavimo 
procesas.  
3. Baumann ir kt. (3) suk ūrė kur kas mažesn į filtrą, kuriame naudojami polies ­
terio minkštos mas ės strypeliai, iš anksto panardinami į veiklųjį dumblą, 
atstojantį biologin ės plėvelės formavim ąsi skatinan čią inertinę terpę. 
Naudota bandomoji chemin ė medžiaga, kuri buvo vienintelis anglies šaltinis, 
ir biologinis skaidumas įvertinamas išmatavus ištirpusios organin ės 
anglies (DOC) vert ę intakyje ir ištakyje bei atsižvelgiant į į CO  2 kiekį 
išėjimo dujose.  
4. Visiškai skirtingo poži ūrio laikėsi Gloyna  ir kiti.  (4), kuris išrado sukam ąjį 
vamzdinį reaktorių. Ant pasukamojo vamzdžio vidinio paviršiaus žinomame 
plote buvo išauginta biologin ė plėvelė; šiuo tikslu per nedideliu kampu į 
horizontal ę pakreipto vamzdžio viršutin ę dalį buvo leidžiamas intakis. 
Naudojant reaktori ų buvo tiriamas paviršinio aktyvumo medžiag ų biologinis 
skaidumas (5) ir nustatin ėjamas tinkamiausias biologin ės plėvelės storis bei 
per plėvelę vykstanti difuzija (6). Kiti autoriai toliau tobulino reaktori ų, 
įskaitant jo modifikavim ą, kad būtų įmanoma nustatyti CO  2 kiekį išėjimo 
dujose.  
5. Sukam ąjį vamzdin į reaktorių Analitikų nuolatinis komitetas (Jungtin ė Kara­
lystė) patvirtino kaip standartin į metodą, taikytin ą įvertinant chemini ų 
medžiagų biologin į skaidum ą (7), nuotek ų apdorojamum ą ir jų toksiškum ą 
(8). Toliau aprašytiems metodams b ūdingas paprastumas, glaustumas, atku ­
riamumas ir juos taikant naudojamas palyginti nedidelis organin ės terpės 
kiekis.  
BANDYMO METODO ESM Ė 
6. Ant iš l ėto besisukan čio pakreipto vamzdžio vidinio paviršiaus pilamos 
sintetinės ar buitin ės nuotekos ir bandomoji chemin ė medžiaga (pilamas j ų 
mišinys ar jos pilamos atskirai). Ant vidinio paviršiaus išauginamas į biolo­
ginio filtro terp ėje naudojamuosius mikroorganizmus panaši ų mikroorga ­
nizmų sluoksnis. Pasirenkamos tokios reaktoriaus eksploatavimo s ąlygos, 
kad būtų užtikrinamas reikiamas organin ės medžiagos šalinimas ir, jeigu 
reikia, amonio oksidavimas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Ištakis iš vamzdžio yra surenkamas ir arba nusodinamas, ir (arba) filtruo ­
jamas; tada taikant special ų metodą atliekama ištirpusios organin ės 
anglies (DOC) ir bandomosios chemin ės medžiagos analiz ė. Tuo pa čiu 
metu ir tomis pa čiomis sąlygomis, siekiant tur ėti galimyb ę palyginti, 
eksploatuojami kontroliniai įrenginiai, kuriems bandomoji chemin ė 
medžiaga n ėra tiekiama. DOC koncentracij ų skirtumas ištakyje iš bando ­
mojo ir kontrolinio įrenginių laikomas atsiradusiu d ėl bandomosios 
cheminės medžiagos arba jos organini ų metabolit ų. Šis skirtumas lyginamas 
su įterpiamos bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija (kaip DOC) 
siekiant apskai čiuoti pašalinam ą bandomosios chemin ės medžiagos kiek į. 
8. Biologin į skaidym ą nuo bioadsorbcijos paprastai įmanoma atskirti nuodug ­
niai išnagrin ėjus šalinimo ir laiko kreiv ę. Patvirtinim ą paprastai galima užsi ­
tikrinti atliekant lengvo biologinio skaidymo bandym ą (deguonies suvarto ­
jimo arba anglies dioksido susidarymo); šiuo atveju naudojama aklimati ­
zuota sėjimo kult ūra, bandymo pabaigoje paimta iš reaktori ų, į kuriuos 
tiekiama bandomoji chemin ė medžiaga.  
INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ CHEMIN Ę MEDŽIAG Ą 
9. Bandomosios chemin ės medžiagos grynumas, tirpumas vandenyje, lakumas 
ir sugerties charakteristikos tur ėtų būti žinomos siekiant teisingai aiškinti 
rezultatus.  
10. Su lakiosiomis ir mažai tirpiomis chemin ėmis medžiagomis paprastai ne įma­
noma atlikti bandym ų, jeigu nesiimama speciali ų atsargumo priemoni ų (žr. 
C.10 skyriaus 5 pried ėlį). Taip pat tur ėtų būti žinoma chemin ė struktūra ar 
bent jau empirin ė formulė siekiant apskai čiuoti teorines vertes ir (arba) 
patikrinti išmatuotas parametr ų vertes, pvz., teorin į deguonies poreik į (toliau 
– ThOD), ištirpusi ą organinę anglį (DOC).  
11. Informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą mikroorga ­
nizmams (žr. C,10 A skyriaus 4 pried ėlį) gali praversti renkantis atitinkamas 
atliekant bandym ą taikomas koncentracijas ir gali b ūti svarbi aiškinant 
mažas biologinio skaidumo vertes.  
ATITIKTIES LYGIAI  
12. Iš pradži ų buvo reikalauta, kad paviršinio aktyvumo medžiag ų pirminis 
biologinis skaidumas b ūtų 80 % ar didesnis, ir šiuo atveju chemin ę 
medžiagą būdavo leidžiama pateikti rinkai. Jeigu neužtikrinama 80 % 
vertė, galima atlikti š į modeliavimo (patvirtinimo) bandym ą ir paviršinio 
aktyvumo medžiag ą rinkai galima pateikti tik tuo atveju, jeigu pašalinama 
daugiau negu 90 % konkre čios chemin ės medžiagos. D ėl chemini ų 
medžiagų apskritai nekeliamas atitikties ir (arba) neatitikties klausimas ir 
užtikrinam ą procentin ę pašalinimo dal į galima naudoti apytiksliai apskai ­ 
čiuojant galim ą koncentracij ą aplinkoje, taikytin ą įvertinant chemini ų 
medžiagų keliamą pavojų. Atlikus gryn ųjų chemini ų medžiag ų tam tikr ą 
skaičių tyrimų nustatyta, kad daugiau negu trimis ketvir čiais atvej ų buvo 
pašalinta > 90 % DOC ir 80 % pašalinta daugiau negu 90 % chemini ų 
medžiagų atveju, kurioms nebuvo b ūdingas bent kiekis didesnis biologinis 
skaidumas.  
ETALONIN ĖS CHEMIN ĖS MEDŽIAGOS  
13. Siekiant užtikrinti, kad bandymo proced ūra būtų taikoma pagal reikala ­
vimus, tikslinga retkar čiais atlikti bandymus su etalonin ėmis chemin ėmis 
medžiagomis, kuri ų ypatybės yra žinomos. Šioms chemin ėms medžiagoms 
priskiriama adipo r ūgštis, 2-fenilfenolis, 1-naftoliai, difeno r ūgštis, 1-nafta ­
lenkarboksir ūgštis.  
BANDYMO REZULTAT Ų ATKURIAMUMAS  
14. Laboratorija Jungtin ėje Karalyst ėje nustat ė, kad santykinis standartinis 
nuokrypis atliekant bandymus turi b ūti 3,5 % ir 5 % tarp bandym ų (7). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Įrenginys  
Sukamieji vamzdiniai reaktoriai  
15. Įrenginį sudaro (žr. 8 pried ėlio 1 ir 2 pav.) akrilo vamzdži ų grupė (kiekvieno 
ilgis 30,5 cm ir 5 cm vidinis skersmuo), paremta guma apjuostais ratais, 
įtaisytais į metalinį atraminį rėmą. Kiekvienas vamzdis turi išorin ę briauną 
(apie 0,5 cm storio), kad jis nenuslyst ų nuo ratų, vidaus paviršius išklotas 
šiurkščia iš labai plon ų minkštojo plieno pluošto si ūlelių pagaminta kempine 
ir viršutin ėje (tiekimo) dalyje yra 0,5 cm storio skyst į sulaikanti vidin ė 
briauna. Vamzdžiai į horizontal ę pakreipti maždaug vieno laipsnio kampu, 
kad bandom ąją terpę leidžiant į švarų vamzdį būtų užtikrinama reikiama 
sąlyčio trukm ė. Gumos juosta apjuosti ratai sukami l ėtaeigiu, kei čiamo 
sukių dažnio varikliu. Vamzdži ų temperat ūra kontroliuojama įrenginį 
sumontuojant pastoviosios temperat ūros patalpoje.  
16. Kiekvien ą reaktoriaus vamzd į įdėjus į šiek tiek didesn į užtaisytu galu 
vamzdį ir užtikrinus, kad jungtys neb ūtų laidžios dujoms, šiuo atveju šarmi ­
niame tirpale galima surinkti iš ėjimo CO  2 ir tada išmatuoti j ų kiekį (6).  
17. Organin ės terpės, į kurią įterpta bandomosios chemin ės medžiagos, jeigu 
taikoma, kiekvienam vamzdžiui tiekimo atsarga 24 val. yra 20 l laikymo 
inde (A) (žr. 2 pav.). Jeigu reikia, atskirai galima įterpti bandomosios 
cheminės medžiagos tirpalo. Netoli kiekvieno laikymo indo dugno yra 
anga, tinkamu vamzdeliu, pvz., iš silikoninio kau čiuko, per peristaltin į 
siurblį (B) yra sujungta su stikliniu arba akrilo tiekimo vamzdeliu, kuris 
2–4 cm įkištas į pakreipto vamzdžio (C) viršutin ę (tiekimo) dal į. Ištakiui 
leidžiama laš ėti iš apatin ės pakreiptojo vamzdžio dalies; ištakis surenkamas 
kitame laikymo inde (D). Prieš atliekant analiz ę laukiama, kol ištakis nusis ­
tovi, arba jis filtruojamas.  
Filtravimo įtaisas–centrifuga  
18. Ėminių filtravimo įtaisas su b ūtino akytumo (nominalusis apert ūros 
skersmuo 0,45 μm) membraniniais filtrais, adsorbuojan čiais organines 
chemines medžiagas arba išskirian čiais kuo mažesn į organin ės anglies 
kiekį. Jeigu naudojami organin ę anglį išskiriantys filtrai, jie kruopš čiai plau­
nami karštu vandeniu, kad b ūtų pašalinta išplaunamoji organin ė anglis. 
Antraip leidžiama naudoti centrifug ą, tinkančią užtikrinti 40 000 m/s  2 . 
19. Analiz ės įranga, naudojama nustatyti:  
— DOC ir (arba) bendr ąją organinę anglį (TOC) arba chemin į deguonies 
suvartojim ą (COD),  
— konkre čią cheminę medžiag ą (HPLC, GC ir t. t.), jeigu reikia,  
— pH, temperat ūrą, rūgštingumą, šarmingum ą, 
— amonio, nitrit ų ir nitratų kiekį, jeigu bandymas atliekamas nitrifikacijos 
sąlygomis.  
Vanduo  
20. Vandentiekio vanduo, kuriame mažiau negu 3 mg/l DOC.  
21. Distiliuotas ar dejonizuotas vanduo, kuriame mažiau negu 2 mg/l DOC.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Organinė terpė 
22. Kaip organin ę terpę leidžiama naudoti sintetines nuotekas, buitines nuotekas 
ar abiejų mišinį. Įrodyta, kad naudojant tik buitines nuotekas pašalinama 
didesnė procentin ė DOC dalis (veikliojo dumblo įrenginiuose) ir kad šiuo 
atveju net įmanoma biologiškai skaidyti tam tikras chemines medžiagas, 
nors šios chemin ės medžiagos n ėra biologiškai skaidomos, jeigu naudojamos 
OECD sintetin ės nuotekos. Vadinasi, rekomenduojama naudoti buitines 
nuotekas. Išmatuojamos kiekvienos organin ės terpės naujos partijos DOC 
(arba COD) vert ės. Turėtų būti žinoma organin ės terpės rūgštingumo arba 
šarmingumo vert ė. Jeigu rūgštingumo ar šarmingumo vert ė yra per maža, į 
organinę terpę gali tekti įleisti tinkamo buferinio tirpalo (natrio hidrokarbo ­
nato arba kalio dihidrofosfato), kad atliekant bandym ą pH vertė reaktoriuje 
būtų maždaug 7,5 ± 0,5. Įterptinas buferinio tirpalo kiekis nustatomas ir jo 
įterpimo laikas pasirenkamas kiekvienu pavieniu atveju.  
Sintetinės nuotekos  
23. Kiekviename vandentiekio vandens litre ištirpinama: 160 mg peptono, 110 
mg mėsos ekstrakto, 30 mg karbamido, 28 mg bevandenio kalio dihidro ­
fosfato (K  2 HPO  4 ), 7 mg natrio chlorido (NaCl), 4 mg kalcio chlorido dihi ­
drato (CaCl  2 .2H  2 O), 2 mg magnio sulfato heptahidrato (Mg  2 SO 4 .7H  2 0). 
Šios OECD sintetin ės nuotekos yra pavyzdin ės ir jas naudojant užtikrinama 
vidutinė 100 mg/l DOC koncentracija intakyje. Antraip leidžiama naudoti 
kitokias sud ėtis, kai užtikrinama beveik tokia pati DOC koncentracija, kuri 
labiau atitinka tikr ųjų nuotekų vertę. Koncentruot ų šių sintetinių nuotekų 
galima pasiruošti iš distiliuoto vandens ir jas laikyti vien ą savaitę maždaug 
1 °C temperat ūroje. Jeigu reikia, skiedžiama vandentiekio vandeniu. (Ši 
terpė neatitinka reikalavim ų, pvz., azoto koncentracija yra labai didel ė, paly­
ginti maža anglies koncentracija, ta čiau kol kas geresn ė priemon ė nėra 
pasiūlyta, t. y. kaip buferinio skys čio įterpti daugiau fosfato ir papildom ą 
peptono kiek į). 
Buitinės nuotekos  
24. Naudojamos šviežios nusistov ėjusios nuotekos, kiekvien ą dieną rinktos iš 
valymo įrenginių, į kuriuos daugiausiai patenka buitin ės nuotekos. Jos tur ėtų 
būti renkamos iki pirminio nusodinimo ir iš pirminio nusodinimo rezervuaro 
nuleidimo kanalo arba iš veikliojo dumblo įrenginio tiekimo bei turi b ūti 
beveik be stambi ųjų dalelių. Nuotekas galima naudoti jas palaikius kelias 
dienas maždaug 4 °C temperat ūroje, jeigu įrodoma, kad laikant DOC vert ė 
(arba COD vert ė) nėra kiek daugiau sumaž ėjusi (t. y. mažiau negu 20 %). 
Siekiant apriboti sistemos trukdžius kiekvienos naujos partijos DOC vert ė 
(arba COD vert ė) prieš pradedant naudoti tur ėtų būti reguliuojama atsižvel ­
giant į atitinkam ą pastovią vertę, pvz., skiedžiant vandentiekio vandeniu.  
Tepalas  
25. Glicerolio arba alyvuogi ų aliejumi leidžiama tepti peristaltinio siurblio vele ­
nėlius: abu aliejus leidžiama naudoti su silikoninio kau čiuko vamzdeliais.  
Pradiniai bandomosios chemin ės medžiagos tirpalai  
26. Atitinkamo tirpumo chemini ų medžiag ų pradiniai tirpalai pasiruošiami 
reikiamos koncentracijos (pvz., 1–5 g/l) iš dejonizuoto vandens ar iš sinte ­
tinių nuotekų mineralin ės dalies. D ėl netirpiųjų cheminių medžiagų žr. C.10 
A skyriaus 5 pried ėlį. Šis metodas nepritaikytas lakiosioms chemin ėms 
medžiagoms, jeigu vamzdiniai reaktoriai n ėra modifikuoti (16 pastraipa). 
Nustatomos pradini ų tirpalų DOC ir TOC vert ės ir pakartojami kiekvienos 
naujos partijos matavimai. Jeigu DOC ir TOC vert ės skirtumas viršija 20 %, 
patikrinamas bandomosios chemin ės medžiagos tirpumas vandenyje. Bando ­
mosios chemin ės medžiagos DOC vert ė arba koncentracijos vert ė, išmatuota  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
taikant speciali ą pradinio tirpalo analiz ę, lyginama su nominali ąja verte 
siekiant nustatyti, ar atsistatymas yra gan ėtinai geras (paprastai galima tik ėtis 
> 90 %). Įvertinama, vis ų pirma dispersij ų atžvilgiu, ar DOC galima ar 
negalima naudoti kaip analiz ės parametro, arba įmanoma naudoti tik bando ­
majai cheminei medžiagai b ūdingą analizės metodą. Iš dispersij ų paimti 
mėginiai turi b ūti centrifuguojami. Naudojant special ų analizės metodą išma­
tuojama kiekvienos naujos partijos DOC, COD vert ė arba bandomosios 
cheminės medžiagos kiekis.  
27. Nustatoma pradinio tirpalo pH vert ė. Jeigu nustatomos kraštutin ės vertės, jos 
patvirtina, kad bandymo sistemos veikliojo dumblo pH vertei gal ėjo būti 
padarytas poveikis prid ėjus chemin ės medžiagos. Šiuo atveju pradinis 
tirpalas neutralizuojamas mažu neorganin ės rūgšties ar baz ės kiekiu siekiant 
užtikrinti, kad pH vert ė būtų 7 ± 0,5, ta čiau privaloma r ūpintis, jog neb ūtų 
nusodinama bandomoji chemin ė medžiaga.  
PROCED ŪRA 
Organinės terpės paruošimas dozavimui  
28. Užtikrinama, kad intakio ir ištakio talpyklos bei intakio ind ų ir ištakio ind ų 
jungiamieji vamzdeliai b ūtų kruopščiai išvalyti, kad iš pat pradži ų ir atlie­
kant bandym ą būtų užkirstas kelias augti mikroorganizmams.  
29. Iš kiet ųjų medžiag ų arba iš koncentruoto pradinio tirpalo kiekvien ą dieną 
pasiruošiama sintetini ų nuotekų (23 pastraipa); jos ruošiamos tinkamai skie ­
džiant vandentiekio vanden į. Išmatuojamas b ūtinasis kiekis cilindre ir pride ­
dama į švarų intakio ind ą. Taip pat, jeigu reikia, į sintetines nuotekas prieš 
skiedimą įdedamas reikiamas kiekis bandomosios chemin ės medžiagos 
pradinio tirpalo arba etalonin ės chemin ės medžiagos. Bandomosios 
cheminės medžiagos atskir ą atskiestą tirpalą leidžiama pasiruošti atskiroje 
talpykloje ir į pakreiptuosius vamzdžius š į tirpalą tiekti skirtingu dozavimo 
siurbliu, jeigu taip ruoštis tirpal ą yra patogiau arba jeigu b ūtina išvengti 
bandomosios chemin ės medžiagos nuostoli ų. 
30. Antraip (šiam b ūdui teikiama pirmenyb ė) naudojamos kiekvien ą dieną švie­ 
žiai surinktos, jeigu įmanoma, nusistov ėjusios buitin ės nuotekos (24 
pastraipa).  
Sukamųjų vamzdini ų reaktorių naudojimas  
31. Vienai bandomajai cheminei medžiagai ištirti reikalingi du tapat ūs vamzdi­
niai reaktoriai, kurie sumontuojami pastovios temperat ūros (paprastai 22 
± 2 °C) patalpoje.  
32. Peristaltiniai siurbliai sureguliuojami taip, kad į 18 ± 2 s ūk./min. sukamus 
pakreiptus vamzdžius b ūtų tiekiama 250 ± 25 ml/h organin ės terpės (be 
bandomosios medžiagos). Atliekant bandym ą siurblio vamzdžiai iš pradži ų 
ir paskui reguliariai sutepami tepalu (25 pastraipa) norint užtikrinti tinkam ą 
veikimą ir prailginti vamzdyno eksploatavimo trukm ę. 
33. Vamzdži ų pokrypis į horizontal ę sureguliuojamas taip, kad tiekiamos 
medžiagos išbuvimo trukm ė švariame vamzdyje b ūtų 125 ± 12,5 sek. Išbu ­
vimo trukm ė apskaičiuojama į mitybinę terpę pridedant nebiologinio žyme ­
klio (pvz., NaCL, inertinio dažiklio): trukm ė, per kuri ą sukuriama didžiausia 
koncentracija ištakyje, laikoma vidutine išbuvimo trukme (jeigu naudojama 
storiausia pl ėvelė, šiuo atveju išbuvimo trukm ė gali pailg ėti ne daugiau negu 
30 min.).  
34. Nustatyta, kad taikant šias normas, greit į ir trukmę užtikrinamas pakankamas 
(> 80 %) DOC (arba COD) pašalinimas ir paruošiami nitrifikuoti ištakiai. Srauto dydis tur ėtų būti keičiamas, jeigu šalinimas yra nepakankamas arba 
jeigu turi b ūti modeliuojama konkretaus valymo įrenginio veikla. Pastaruoju 
atveju organin ės terpės dozavimo norma koreguojama taip, kad reaktoriaus 
veiklos parametrai atitikt ų valymo įrenginio veiklos parametrus.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Sėjimo kultūros įdėjimas  
35. Jeigu naudojamos sintetin ės nuotekos, kad prad ėtų augti mikroorganizmai 
gali pakakti oru atliekamo s ėjimo kult ūros įdėjimo, tačiau antraip b ūtina 3 
dienas prid ėti po 1 ml/l nusodintojo dumblo.  
Matavimai  
36. Reguliariais intervalais tikrinama, ar doz ės, normos ir s ūkių dažnio vert ės 
atitinka nustatyt ąsias ribines vertes. Taip pat matuojama ištakio pH vert ė, 
ypač tuo atveju, jeigu numanoma vyksiant nitrifikacijos proces ą. 
Ėminių ėmimas ir analiz ė 
37. Ėminių ėmimo metodas, modelis ir dažnumas pasirenkami atsižvelgiant į 
bandymo tiksl ą. Pvz., imami žvalgomieji intakio ir ištakio ėminiai arba 
ėminiai imami ilgesniu laikotarpiu, pvz., 3–6 val. Pirmuoju etapu, kai 
nenaudojama bandomoji chemin ė medžiaga, ėminiai imami du kartus per 
savaitę. Ėminiai 15 min. (18 pastraipa) filtruojami per membranas ar cent ­
rifuguojami maždaug 40 000 m/sec  2 . Prieš atliekant membranin į filtravim ą 
gali tekti palaukti, kol ėminiai nusistov ės ir (arba) juos filtruoti per stamb ų 
filtrą. Ne mažiau negu du kartus nustatomos DOC (arba COD) vert ės ir, 
jeigu reikia, BOD, amonio, nitrit ų ir (arba) nitrat ų vertės. 
38. Visos analiz ės turėtų būti atliekamos iš karto po ėminių paėmimo ar j ų 
paruošimo. Jeigu analizi ų atlikimas turi b ūti atidedamas, sklidinuose sanda ­
riai užkimštuose buteliuose ir tamsoje ėminiai laikomi apie 4 °C tempera ­
tūroje. Jeigu ėminius būtina laikyti ilgiau negu 48 val., jie sand ėliuojami 
užšaldyti, par ūgštinti arba pridedant tinkamos toksiškos chemin ės medžiagos 
(pvz., 20 ml/l 10 g/l gyvsidabrio (II) chlorido tirpalo). Pasir ūpinama, kad 
naudojant išsaugojimo metod ą nebūtų daromas poveikis analiz ės rezulta­
tams.  
Darbinės būsenos paruošimo laikotarpis  
39. Šiuo laikotarpiu paviršin ė biologin ė plėvelė auga, kol jos storis atitinka 
optimalią vertę; paprastai šis laikotarpis trunka maždaug dvi savaites ir jo 
trukmė neturėtų viršyti šeši ų savaičių. DOC (arba COD) šalinimo vert ė (44 
pastraipa) did ėja ir ima atitikti kreiv ės plokščiosios srities vert ę. Kai abie ­
juose vamzdžiuose užtikrinama panaši kreiv ės plokščiosios dalies vert ė, 
vienas iš vamzdži ų likusiai bandymo daliai pasirenkamas kaip kontrolinis 
vamzdis; šioje bandymo dalyje vamzdži ų veikimo parametrai netur ėtų kisti.  
Bandomosios chemin ės medžiagos įterpimas  
40. Šiame etape į kitą reaktorių įterpiama reikiamos koncentracijos (paprastai 
10–20 mg C/l) chemin ė medžiaga. Į kontrolin į vamzdį tiekiama tik organin ė 
terpė. 
Aklimatizavimo laikotarpis  
41. Du kartus per savait ę privalomai atliekamos DOC (arba COD) analiz ės ir, 
jeigu turi b ūti įvertintas pirminis biologinis skaidumas, atliekant speciali ą 
analizę taip pat matuojama bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija. 
Nuo pirmojo bandomosios chemin ės medžiagos įterpimo laukiama nuo 
vienos iki šeši ų savaičių (ar ilgiau, jeigu pasirenkamos specialios s ąlygos), 
kol pasibaigia aklimatizavimas. Kai procentin ės šalinimo dalies (43–45 
pastraipos) vert ė ima atitikti didžiausi ą vertę, per 3 savaites nustatomos 
12–15 galiojan čių kreivės plokščiosios dalies tarpsnio reikšmi ų siekiant įver­
tinti vidutin ę šalinimo procentin ę dalį. Bandymas laikomas užbaigtu, jeigu 
užtikrinamas gan ėtinai didelis šalinimo laipsnis. Bandymo trukm ė paprastai 
neturi būti ilgesnė negu 12 savai čių po pirmojo bandomosios chemin ės 
medžiagos įterpimo.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Plėvelės šalinimas  
42. Ganėtinai reguliariais intervalais iš vamzdži ų staigiai šalinami dideli perte ­
klinės plėvelės kiekiai. Siekiant rezultat ų palyginamum ą apsaugoti nuo 
poveikio, atliekant bandymus turi b ūti aprėpiami bent du išsam ūs augimo 
ir šalinimo ciklai.  
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Rezultatų apdorojimas  
43. Kiekvieno pasirinkto įvertinimo laiko bandomosios chemin ės medžiagos 
šalinimo procentin ė DOC arba COD dalis apskai čiuojama pagal ši ą lygtį: 
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
kur: 
D t = pašalinta procentin ė DOC arba COD dalis t laiko momentu;  
C s = su bandom ąja chemine medžiaga susijusi DOC (arba COD) koncent ­
racija ištakyje; j ą geriausiai apskai čiuoti atsižvelgiant į pradinio 
tirpalo koncentracij ą (mg/l) ir prid ėtą jo kiekį; 
E = t laiko momentu bandomajame ištakyje išmatuota DOC (arba COD) 
vertė (mg/l);  
Eo = t laiko momentu kontroliniame ištakyje išmatuota DOC (arba COD) 
vertė (mg/l).  
Apskaičiuojamos etalonin ės chemin ės medžiagos vert ės, jeigu ji bandoma.  
Kontrolinio reaktoriaus veikimo parametrai  
44. Atliekant bandym ą DOC (arba COD) šalinimo laipsnis (D  B ) iš kontrolinio 
reaktoriaus organin ės terpės praverčia vertinant biologin ės plėvelės biolo­
ginio skaidymo veiksmingum ą. Pašalinama procentin ė dalis apskai čiuojama 
pagal šią lygtį: 
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
kur: 
C m = kontrolinio intakio organin ės terpės DOC (arba COD) vert ė (mg/l).  
45. Pašalintas bandomosios chemin ės medžiagos kiekis (D  ST ), jeigu matuojama 
naudojant special ų analizės metodą kiekvieno įvertinimo metu, apskai čiuo­
jamas pagal ši ą lygtį: 
DST ¼ 100 ð1 Ä S e=S i Þ % 
kur: 
Si = išmatuota arba ver čiau apytiksliai apskai čiuota bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracija bandomajame intakyje (mg/l)  
Se = laiko momentu t išmatuota bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracija bandomajame ištakyje (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Jeigu taikant analiz ės metodus nustatoma nekintan čio nuotek ų atitikmens 
teigiamoji vert ė S c mg/l, procentin ė šalinimo vert ė (D  SC ) apskaičiuojama 
pagal šią lygtį: 
DSC ¼ 100 ðS i Ä S e þ S c Þ=ðS i þ ScÞ % 
Tyrimo rezultat ų išraiška  
46. Brėžiamas šalinimo procentin ės dalies D  t ir D  ST (arba D  SC ), jeigu turima, 
priklausomyb ės nuo laiko grafikas (žr. C.10 A skyriaus 2 pried ėlį). Naudo­
jamas vidutinis (išreikštas kaip artimiausias sveikasis skai čius) ir standartinis 
nuokrypis, susij ęs su D  T (ir D  ST , jeigu turima) 12–15 ver čių, nustatyt ų 
kreivės plokščiosios dalies tarpsnyje kaip bandomosios chemin ės medžiagos 
procentin ė šalinimo dalis. Atsižvelgiant į šalinimo kreiv ės formą galima 
daryti kelias su šalinimo procesais susijusias išvadas.  
Adsorbavimas  
47. Jeigu prad ėjus bandym ą nustatomas didelio kiekio DOC šalinimas iš bando ­
mosios chemin ės medžiagos, šiuo atveju tik ėtina, kad bandomoji chemin ė 
medžiaga šalinama tod ėl, kad ją absorbuoja biologin ė plėvelė. Šį procesą 
gali būti įmanoma įrodyti iš pl ėvelės paimtoje kietojoje medžiagoje nusta ­ 
čius adsorbuotos bandomosios chemin ės medžiagos kiek į. Neįprasta, jeigu 
atliekant bandym ą iš adsorbuojam ų chemini ų medžiag ų būtų šalinamas 
didelis DOC kiekis; paprastai didelis kiekis šalinamas iš pradži ų, o vėliau 
jis laipsniškai maž ėja ir prilygsta pusiausvyros vertei. Ta čiau jeigu adsor ­
buojant bandom ąją cheminę medžiag ą buvo sukeltas mikrob ų populiacijos 
aklimatizavimas, šalinimas DOC kiekis iš bandomosios chemin ės medžiagos 
vėliau turėtų didėti ir atitikti aukšt ą kreivės plokščiosios srities vert ę. 
Vėlavimo tarpsnis  
48. Kaip ir atliekant statinius bandymus, darant daugelio bandom ųjų cheminių 
medžiagų atrankos bandymus b ūtinas vėlavimo tarpsnis, kol visiškai užbai ­
giamas biologinis skaidymas. V ėlinimo tarpsnyje skaidan čios bakterijos akli ­
matizuojasi arba prisitaiko ir šiame etape beveik nešalinama bandomoji 
cheminė medžiaga; tada prasideda pradinis ši ų bakterijų augimas. Laikoma, 
kad šis etapas yra pasibaig ęs, o skaidymo etapas yra prasid ėjęs, jeigu paša ­
linta maždaug 10 % pradinio bandomosios chemin ės medžiagos kiekio 
(pasibaigus adsorbcijai, jeigu ji vyksta). V ėlavimo tarpsnis dažnai b ūna 
labai kintantis, tod ėl jį sunkiai sekasi atkurti.  
Kreivės plokščiosios dalies tarpsnis  
49. Atliekant nepertraukiam ą bandym ą šalinimo kreiv ės plokščiosios dalies 
tarpsnis apibr ėžiamas kaip didžiausio skaidymo etapas. Kreiv ės plokščiosios 
dalies tarpsnis netur ėtų būti trumpesnis negu 3 savait ės ir per j į turi būti 
išmatuota apie 15 galiojan čių verčių. 
Vidutinis bandomosios chemin ės medžiagos šalinimo laipsnis  
50. Vidutin ė vertė apskaičiuojama naudojant kreiv ės plokščiosios dalies tarpsnio 
bandomosios chemin ės medžiagos šalinimo vertes (D  t ) (ir D  st , jeigu turima). 
Suapvalinus iki artimiausio sveikojo skai čiaus (1 %) nustatomas bandomo ­
sios chemin ės medžiagos šalinimo laipsnis. Taip pat rekomenduojama 
apskaičiuoti vidutin ės vertės 95 % pasikliovimo interval ą. Panašiai apskai ­ 
čiuojamas organin ės terpės kontroliniame inde vidutinis šalinimo laipsnis 
(D B ). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Biologinio skaidymo požymiai  
51. Jeigu biologin ė plėvelė neadsorbuoja didesnio bandomosios chemin ės 
medžiagos kiekio ir šalinimo kreiv ė yra būdinga biologinio skaidymo kreiv ė 
su vėlinimu, skaidymo etap ą ir kreivės plokščiosios dalies tarpsn į (48, 49 
pastraipos), išmatuot ą šalinimą galima patikimai laikyti biologiniu skaidymu. 
Jeigu iš pradži ų šalinamas didelis kiekis, modeliavimo bandymas neturi 
skirtis biologinio ir abiotinio šalinimo proces ų atžvilgiais. Šiais atvejais ir 
kitais atvejais, jeigu kyla koki ų nors dvejoni ų dėl biologinio skaidymo (pvz., 
jeigu vyksta išp ūtimas), analizuojama pl ėvelės ėminiuose adsorbuota bando ­
moji chemin ė medžiaga ar remiantis biologinius procesus aiškiai apib ūdi­
nančiais parametrais atliekami papildomi statiniai (atrankos) biologinio skai ­
dymo bandymai. Šie bandymai – tai deguonies suvartojimo metodai (šio 
priedo D, E ir F C.4 skyrius) arba CO  2 matavimo bandymas (šio 
priedo V.4–C skyrius arba viršutin ės erdvės tyrimas) (10); kaip s ėjimo 
kultūra naudojama iš atitinkamo reaktoriaus paimta iš anksto apdorota biolo ­
ginė plėvelė. 
52. Jeigu išmatuojamas pašalintas DOC kiekis ir pašalintas konkre čios chemin ės 
medžiagos kiekis ir jeigu nustatomas didelis pašalinimo procentini ų dalių 
skirtumas (pirmoji dalis mažesn ė negu pastaroji), šiuo atveju galima daryti 
prielaidą, kad ištakiuose yra tarpini ų organini ų produktų, kurie kur kas 
sunkiau skaidomi; šie dalykai turi b ūti ištirti.  
Bandymų rezultatų validumas  
53. Bandymas laikomas validuotu, jeigu DOC (arba COD) šalinimo laipsnis 
(D B ) kontroliniuose įrenginiuose yra > 80 % po dviej ų savaičių, jeigu ir 
nebuvo pasteb ėta jokių neįprastų ypatybių. 
54. Jeigu bandoma lengvai biologiškai skaidoma (etalonin ė) cheminė medžiaga, 
biologinio skaidymo laipsnis tur ėtų būti > 90 % ir bet koki ų dviejų verčių 
skirtumas netur ėtų būti didesnis negu 5 %. Jeigu ši ų dviejų kriterijų nėra 
laikomasi, šiuo atveju persvarstytinos bandymo proced ūros ir (arba) naudo ­
tinos kito šaltinio buitin ės nuotekos.  
55. Be to, dviej ų įrenginių (jeigu naudojami) biologinio skaidymo vert ės apdo­
rojant bandom ąją cheminę medžiag ą neturėtų skirtis daugiau negu 5 %. 
Jeigu šio kriterijaus vert ės neatitinka nustatyt ųjų, tačiau šalinimo laipsnis 
yra didelis, analiz ė atliekama dar tris savaites. Jeigu šalinimo laipsnis yra 
mažas, tiriamas bandomosios chemin ės medžiagos slopinamasis poveikis, 
jeigu jis n ėra žinomas, ir bandymas kartojamas naudojant mažesn ę bando­
mosios chemin ės medžiagos koncentracij ą, kai šitą įmanoma padaryti.  
Bandymo ataskaita  
56. Į bandymo ataskait ą turi būti įtraukiama:  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— tapatyb ės nustatymo duomenys,  
— fizinis pob ūdis ir, jeigu reikia, fizin ės bei chemin ės savybės. 
Bandymo s ąlygos:  
— bet kokie bandymo sistemos keitimai, ypa č tuo atveju, jeigu bandymai 
atliekami su netirpiomis arba lakiomis medžiagomis,  
— organin ės terpės tipas,  
— pramonini ų nuotekų dalis nuotekose ir j ų pobūdis, jeigu naudojamos ir 
žinoma,  
— sėjimo kult ūros įdėjimas,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— pradinis bandomosios chemin ės medžiagos tirpalas – DOC (ištirpusios 
organinės anglies) ir TOC (bendrosios organin ės anglies) kiekis; kaip 
paruošta, jeigu suspensija; naudota (-os) bandymo koncentracija (-os), priežastys, jeigu nesilaikoma intervalo 10–20 mg/l DOC; prid ėjimo 
metodas; pirmo įdėjimo data; bet kokie koncentracijos poky čiai,
 
— vidutin ė hidraulin ė išbuvimo trukm ė (be augimo); vamzdžio s ūkių 
dažnis; apytikslis pokrypio kampas, jeigu j į įmanoma nustatyti,  
— plėvelės šalinimo informacija; trukm ė ir intensyvumas,  
— bandymo temperat ūra ir intervalas,  
— naudoti analiz ės metodai.  
Bandymo rezultatai:  
— visi išmatuoti duomenys (DOC, COD, speciali analiz ė, pH, temperat ūra, 
N chemin ės medžiagos, jeigu reikia,  
— visos apskai čiuotosios D  t (arba D  tc ), D  B , D s vertės, pateiktos lentel ėje ir 
šalinimo kreiv ės, 
— informacija apie v ėlinimo ir kreiv ės plokščiosios dalies tarpsnius, 
bandymo trukm ę, bandomosios chemin ės medžiagos, etalonin ės 
cheminės medžiagos (jeigu buvo bandyta) organin ės terpės (kontrolinio 
įrenginio) šalinimo laipsn į bei statistin ė informacija ir pareiškimai apie 
biologinį skaidym ą bei bandymo validumas,  
— rezultat ų aptarimas.  
LITERAT ŪRA 
1. Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. 
Res. 14: 753–758.  
2. Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable 
material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444.  
3. Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. 
Ökotox. 10: 214–220.  
4. Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355–1357.  
5. Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling 
filter. JAOCS 43: 92–94.  
6. Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881.  
7. Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
London.  
8. Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of 
chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London.
 
9. Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas AF.  
10. ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of 
released inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
8 priedėlis 
1 paveikslas  
Sukamieji vamzdžiai
  
Žodynėlis 
plano vaizdas  
A-B vaizdas  
varomieji ratai  
atraminiai ratai  
pavaros variklis  
lėtinančioji pavara  
vidinė briauna  
kreipimo mechanizmas  
kūginė krumplin ė pavara  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
2 paveikslas  
Srauto diagrama
  
A: Tiekimo talpykla  
B: Peristaltinis siurblys  
C: Sukamasis vamzdis  
D: Ištakio rinkimo indas  
SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS:  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  bet kokia naudojant š į bandymo metod ą tiriama 
cheminė medžiaga ar mišinys.  
Cheminės medžiagos –  „pabrėžtina, kad terminas „chemin ė medžiaga“ UNCED 
sutartyse ir kituose dokumentuose vartojamas platesne reikšme ir apima chemines medžiagas, produktus, preparatus ar bet kokius kitus terminus, kurie gali b ūti 
vartojami esamose sistemose siekiant nurodyti apr ėptį“.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIOLOGINIS SKAIDYMAS  
AKTYVIOJO DUMBLO KV ĖPAVIMO INHIBAVIMO BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Aprašytas metodas įvertina bandomosios medžiagos poveik į mikro­
organizmams, kai apibr ėžtomis sąlygomis ir naudojant skirtingas 
bandomosios medžiagos koncentracijas matuojamas kv ėpavimo 
intensyvumas.  
Šio metodo tikslas yra duoti greit ą atrankos metod ą, kuriuo galima 
būtų identifikuoti medžiagas, galin čias neigiamai veikti aerobinius 
mikrobinio valymo įrenginius, ir nustatyti bandom ųjų medžiag ų 
koncentracijas, kurias naudojant neb ūtų inhibavimo ir kurios b ūtų 
tinkamos naudoti biologinio skaidumo bandymuose.  
Prieš galutin į bandym ą gali būti atliekamas intervalo nustatymo 
bandymas. Jis suteikia informacijos apie koncentracij ų, kurias reikia 
naudoti pagrindiniame bandyme, interval ą. 
Į bandymo schem ą įtraukti du kontroliniai bandymai be bandomosios 
medžiagos, vienas atliekamas bandym ų serijos pradžioje, o kitas – 
pabaigoje. Be to kiekviena aktyviojo dumblo partija turi b ūti patik­
rinta naudojant etalonin ę medžiag ą. 
Šį metodą lengviausia taikyti medžiagoms, kurios d ėl jų tirpumo 
vandenyje ir mažo lakumo grei čiausiai lieka vandenyje.  
Medžiagoms, kuri ų tirpumas bandomojoje terp ėje yra ribotas, gali 
būti neįmanoma nustatyti EC  50 . 
Išvados, padarytos pagal rezultatus, kurie remiasi deguonies suvarto ­
jimu, gali b ūti klaidingos, kai bandomoji medžiaga turi polink į 
atskirti oksidavim ą ir fosforilinim ą oksidacinio fosforilinimo procese.  
Norint atlikti bandym ą, naudinga tur ėti tokią informacij ą: 
— tirpumas vandenyje,  
— garų slėgis, 
— strukt ūrinė formulė, 
— bandomosios medžiagos grynumas.  
Patarimas  
Aktyviajame dumble gali b ūti potencialiai patogenini ų organizm ų, 
todėl elgtis su juo reikia atsargiai.  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Kvėpavimo intensyvumas yra nuotek ų aerobiniame dumble esan čių 
mikroorganizm ų suvartojamo deguonies kiekis, paprastai reiškiamas 
mg O  2 vienam mg dumblo per valand ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Norint skai čiuoti konkre čios koncentracijos bandomosios medžiagos 
inhibuojam ąjį veikimą, kvėpavimo intensyvumas reiškiamas dviej ų 
kontrolini ų kvėpavimo intensyvumo ver čių vidurkio procentine 
dalimi: 
Í 
1 – Í ð2R s Þ 
ðRc 1 þ Rc  2 Þ ÎÎ 
Ü 100 ¼ inhibavimo procentin ė vertė 
čia: 
R s = deguonies suvartojimo intensyvumas bandant konkre čią 
bandomosios medžiagos koncentracij ą, 
Rc 1 = deguonies suvartojimo intensyvumas 1 kontroliniame 
bandyme,  
Rc 2 = deguonies suvartojimo intensyvumas 2 kontroliniame 
bandyme.  
EC 50 šiame metode yra bandomosios medžiagos koncentracija, kuri ą 
naudojant kv ėpavimo intensyvumas sudaro 50 % kv ėpavimo inten ­
syvumo kontroliniame kv ėpavimo bandyme šiame metode aprašy ­
tomis sąlygomis.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Rekomenduojama etalonine medžiaga naudoti 3,5-dichlorfenol į, 
kuris yra žinomas kv ėpavimo inhibitorius, ir naudoti j į kaip prie ­
monę patikrinti, ar dumblo jautrumas n ėra nenormalus, nustatant 
medžiagos EC  50 kiekvienai aktyviojo dumblo partijai.  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Aktyvusis dumblas maitinamas standartiniame kiekyje mitybin ės 
terpės, kurią sudaro sintetin ės nuotekos, ir po 30 min ar 3 valand ų 
sąlyčio, arba abiem atvejais, matuojamas dumblo kv ėpavimo inten ­
syvumas. Be to, dar matuojamas to paties aktyviojo dumblo kv ėpa­
vimo intensyvumas dedant įvairios koncentracijos bandomosios 
medžiagos, kai kitos s ąlygos yra identiškos. Konkre čios koncentra ­
cijos bandomosios medžiagos inhibuojamasis veikimas išreiškiamas 
dviejuose kontroliniuose bandymuose gaut ų verčių vidurkio procen ­
tine dalimi. Pagal matavimus skirtingose koncentracijose apskai čiuo­
jama EC  50 vertė. 
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Bandymo rezultatai tinkami, jei:  
— kvėpavimo intensyvumo vert ės abiejuose kontroliniuose bandy ­
muose skiriasi ne daugiau kaip 15 %,  
— 3,5-dichlorfenolio EC  50 (30 minu čių ir (ar) trij ų valandų) yra 
priimtiname intervale nuo 5 mg/litre iki 30 mg/litre.  
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Reagentai  
1.6.1.1. B a n d o m o s i o s m e d ž i a g o s t i r p a l a i  
Bandomosios medžiagos tirpalai ruošiami iš pradinio tirpalo prieš pat 
tyrimo pradži ą. Jei daroma pagal toliau aprašyt ą rekomenduojam ą 
metodiką, tinka 0,5 g/litre koncentracijos pradinis tirpalas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. K o n t r o l i n i a m e b a n d y m e n a u d o j a m o s m e d ž i a g o s 
t i r p a l a s  
3,5-dichlorfenolio tirpal ą galima ruošti, pavyzdžiui, taip: tirpinkite 
0,5 g 3,5-dichlorfenolio 10 ml 1 M NaOH, skieskite distiliuotu vandeniu maždaug iki 30 ml, pilkite maišydami 0,5 M H
 2 SO 4 , kol 
pradeda kristi nuos ėdos, tam maždaug reikia 8 ml 0,5 M H  2 SO 4 , ir 
galiausiai distiliuotu vandeniu skieskite mišin į iki vieno litro. pH 
vertė turi būti intervale nuo 7 iki 8.  
1.6.1.3. S i n t e t i n ė s n u o t e k o s  
Sintetinių nuotekų mitybin ė terpė ruošiama tirpinant tokius ši ų 
medžiagų kiekius 1 litre vandens:  
— 16 g peptono,  
— 11 g m ėsos ekstrakto,  
— 3 g karbamido,  
— 0,7 g NaCl,  
— 0,4 g CaCl  2 x2H  2 0, 
— 0,2 g MgS0  4 x7H  2 0, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
1 pastaba . Šios sintetin ės nuotekos yra koncentratas, kurio koncent ­
racija 100 kart ų didesnė nei nuotek ų, aprašytų OECD technin ėje 
ataskaitoje „Proposed metod for the determination of the biodegra ­
dability of surfactants used in synthetic detergents“ (Si ūlomas pavir ­ 
šinio aktyvumo medžiag ų, naudojam ų sintetiniuose plovikliuose, 
biologinio skaidumo nustatymo metodas) (1976 m. birželio 11 d.), į kurį pridėta dikalio hidrofosfato.
 
2 pastaba . Jei paruošta terp ė naudojama ne iš karto, ji turi b ūti laikoma 
tamsoje nuo 0 iki 4 °C ir ne ilgiau, kaip vien ą savaitę sąlygomis, kurios 
nekeistų nuotekų sudėties. Prieš dedant saugoti, terp ę galima sterili ­
zuoti, arba peptonas ir m ėsos ekstraktas dedami prieš pat bandymo 
pradžią. Prieš naudojant, terp ė turi būti gerai sumaišoma ir nustatoma 
jos pH vert ė. 
1.6.2.  Aparat ūra 
Matavimo aparatas, kurio tiksli konstrukcija n ėra svarbi. Ta čiau 
kolboje turi likti neužimtos erdv ės, o zondas turi sandariai uždaryti 
matavimo kolb ą. 
Be įprastos laboratorijos įrangos dar reikalinga tokia speciali įranga:  
— matavimo aparatas,  
— aeravimo įtaisas,  
— pH-elektrodas ir pH matavimo įranga,  
— O  2 elektrodas.  
1.6.3.  Sėjimo kultūros ruošimas  
Bandymuose mikrobine s ėjimo kult ūra naudojamas aktyvusis 
dumblas iš valymo įrenginio, valan čio daugiausia buitines nuotekas.  
Jei būtina, grįžus į laboratorij ą stambias daleles galima pašalinti, 
paliekant dumbl ą trumpą laiką, pvz., 15 minu čių, nusistov ėti, ir 
viršutinį smulkesni ų dalelių sluoksnį dekantuoti ir toliau naudoti. 
Kitu būdu dumbl ą galima sumaišyti, kelioms sekund ėms įjungus 
maišytuvą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Be to, jei manoma, kad gali b ūti inhibuojan čių medžiag ų, dumblas 
turi būti išplautas vandentiekio vandeniu ar izotoniniu tirpalu. Po 
centrifugavimo skystis nuo nuos ėdų dekantuojamas (plaunama tris 
kartus).  
Nedidelis dumblo kiekis sveriamas ir džiovinamas. Remiantis šiuo 
rezultatu galima apskai čiuoti, kiek šlapio dumblo reikia suspenduoti 
vandenyje, kad gautame aktyviojo dumblo ir vandens mišinyje suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija b ūtų nuo 2 g/litre iki 4 
g/litre. Toks kiekis atitinka koncentracij ą bandomojoje terp ėje nuo 
0,8 iki 1,6 g/litre, jei b ūtų taikoma toliau rekomenduota metodika.
 
Jei nėra galimyb ės dumblą panaudoti rinkimo dien ą, vienam litrui 
aktyviojo dumblo, paruošto, kaip aprašyta aukš čiau, įpilama 50 ml 
sintetinių nuotekų mitybinės terpės; ir mišinys per nakt į aeruojamas 
20 ± 2 °C temperat ūroje. Dien ą jis ir toliau aeruojamas, kol bus 
panaudotas. Prieš naudojant dumbl ą, tikrinama pH vert ė ir prireikus 
nustatoma intervale nuo 6 iki 8. Suspenduot ų kietųjų dalelių 
koncentracija aktyviojo dumblo ir nuotek ų mišinio bandinyje turi 
būti nustatyta, kaip tai aprašyta ankstesn ėje pastraipoje.  
Jei ta pati dumblo partija turi b ūti naudojama kitomis dienomis (ne 
ilgiau kaip keturios paros), kiekvienos darbo dienos pabaigoje 
vienam litrui dumblo įpilama dar 50 ml sintetini ų nuotekų mitybinės 
terpės. 
1.6.4.  Bandymo proced ūra 
Trukmė/sąlyčio trukmė: 30 minu čių ir (arba) trys valandos aera ­
vimo sąlygomis  
Vanduo  Geriamasis vanduo (prireikus 
dechloruotas)  
Oro tiekimas  Švarus, be alyvos oras. Oro srautas nuo 
0,5 iki 1 l/min.  
Matavimo aparat ūra Plokš čiadugnė kolba, pvz., BOD kolba  
Deguonies matuoklis  Tinkamas deguonies elektrodas ir 
registravimo įrenginys  
Mitybinis tirpalas  Sintetin ės nuotekos (žr. aukš čiau) 
Bandomoji medžiaga  Bandomosios medžiagos tirpalas 
ruošiamas iš naujo bandymo pradžioje  
Etaloninė medžiaga  pvz., 3,5-dichlorfenolis (bent trij ų 
koncentracij ų) 
Kontroliniai bandymai  Sėjimo kult ūros bandinys be bandomo ­
sios medžiagos  
Temperat ūra 20 ± 2 °C.  
Toliau pateikiama si ūloma eksperimento metodika, kuri ą galima 
taikyti ir bandomajai, ir etaloninei medžiagai trij ų valandų sąlyčio 
trukmės atveju:  
Naudojami keli indai (pvz., vieno–trij ų litrų talpos laboratorin ės stik­
linės). 
Turi būti naudojamos bent penkios koncentracijos, besiskirian čios 
pastoviu santykiu, geriausiai ne didesniu kaip 3,2.  
Laiku „0“ 16 ml sintetini ų nuotekų mitybinės terpės vandeniu skie ­
džiama iki 300 ml. Įpilama 200 ml mikrobin ės sėjimo kult ūros ir 
visas mišinys (500 ml) supilamas į pirmąjį indą (pirmasis kontrolinis 
bandinys C  1 ). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Bandymo indai turi b ūti visą laiką aeruojami tiek, kad ištirpusio O  2 
kiekis būtų ne mažesnis kaip 2,5 mg/litre ir kad prieš pat kv ėpavimo 
intensyvumo matavim ą O 2 koncentracija b ūtų apie 6,5 mg/litre.  
Laiku „15 minu čių“ (15 minu čių trukmė yra laisvai pasirenkama, 
tačiau tai patogus laiko tarpas) kartojama, kas padaryta anks čiau, 
tik prieš tai, skiedžiant vandeniu iki 300 ml ir pilant mikrobin ės 
sėjimo kult ūros iki 500 ml, į 16 ml sintetini ų nuotekų įpilama 100 
ml pradinio bandomosios medžiagos tirpalo. Šis mišinys supilamas į 
antrą indą ir aeruojamas, kaip nurodyta aukš čiau. Kas 15 minu čių 
veiksmų seka kartojama imant skirtingus bandomosios medžiagos 
pradinio tirpalo t ūrius, kad b ūtų gauta eil ė indų su skirtingomis 
bandomosios medžiagos koncentracijomis. Galiausiai ruošiamas 
antrasis kontrolinis bandinys (C  2 ). 
Po trijų valandų fiksuojama pH vert ė, ir gerai sumaišytas pirmojo 
indo turinio bandinys supilamas į matavimo aparat ą, kuriuo ne ilgiau 
kaip 10 minu čių matuojamas kv ėpavimo intensyvumas.  
Šis nustatymas kas 15 minu čių kartojamas su kiekvieno indo turiniu 
tokiu būdu, kad s ąlyčio trukmė visuose induose b ūtų trys valandos.  
Tokiu pat b ūdu su kiekviena mikrobin ės sėjimo terp ės partija 
bandoma etalonin ė medžiaga.  
Jei reikia matuoti po 30 minu čių sąlyčio, būtina taikyti kitok į mata­
vimo režim ą (pvz., tur ėti daugiau nei vien ą deguonies matuokl į). 
Jei reikia nustatyti chemin į deguonies suvartojim ą, ruošiami papil ­
domi indai su bandom ąja medžiaga, sintetini ų nuotekų mitybine 
terpe ir vandeniu, bet be aktyviojo dumblo. Deguonies suvartojimas 
matuojamas ir užrašomas po 30 minu čių ir (ar) trij ų valandų aera­
vimo (sąlyčio trukmė). 
2. DUOMENYS IR VERTINIMAS  
Kvėpavimo intensyvumas skai čiuojamas pagal savirašio užraš ą 
apytikriai tarp 6,5 mg/litre O  2 ir 2,5 mg/litre O  2 , ar 10 minu čių 
tuo laikotarpiu, kai kv ėpavimo intensyvumas yra mažas. Kv ėpavimo 
kreivės dalis, kurioje matuojamas kv ėpavimo intensyvumas, turi b ūti 
tiesiška.  
Jei kvėpavimo intensyvumas dvejuose kontroliniuose bandiniuose 
vienas nuo kito skiriasi daugiau kaip 15 %, ar etalonin ės medžiagos 
EC 50 (30 minu čių ir (ar) trij ų valandų) nėra priimtiname intervale 
(nuo 5 iki 30 mg/litre 3,5-dichlorfenoliui), bandymas yra netinkamas ir turi būti pakartotas.
 
Inhibavimo procentin ė vertė skaičiuojama kiekvienai bandomajai 
koncentracijai (žr. 1.2). Procentin ės inhibavimo vert ės priklausomyb ė 
nuo koncentracijos br ėžiama logaritminiame-normaliame (ar 
logaritminiame-tikimybiniame) popieriuje, ir gaunama EC  50 vertė. 
95 % pasikliovimo ribos EC  50 vertėms gali b ūti nustatyti, taikant 
standartines metodikas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje pateikiama, jei įmanoma, tokia informacija:  
— bandomoji medžiaga: cheminio identifikavimo duomenys,  
— bandymo sistema: aktyviojo dumblo šaltinis, koncentracija ir bet 
koks pradinis kondicionavimas,  
— bandymo s ąlygos:  
— reakcijos mišinio pH vert ė prieš kv ėpavimo intensyvumo 
matavimą, 
— bandymo temperat ūra, 
— bandymo trukm ė, 
— etalonin ė medžiaga ir jos išmatuota EC  50 vertė, 
— abiotinis deguonies suvartojimas (jei tai vyko).  
— rezultatai:  
— visi matavimuose gauti duomenys,  
— inhibavimo kreiv ė ir metodas EC  50 skaičiuoti,  
— EC  50 ir, jei įmanoma, 95 % pasikliovimo ribos, EC  20 ir EC  80 , 
— visi pasteb ėjimai ir bet kokie nukrypimai nuo šio bandymo 
metodo, kurie gal ėtų turėti įtakos rezultatui.  
3.2. DUOMEN Ų AIŠKINIMAS  
Į EC  50 vertę turi būti žiūrima tiktai kaip į orientacin į bandomosios 
medžiagos toksiškum ą nuotekų valymo aktyviuoju dumblu procesui 
ar nuotek ų mikroorganizmams, kadangi aplinkos sud ėtingų sąveikų 
laboratoriniame bandyme negalima tiksliai modeliuoti. Be to, bando ­
mosios medžiagos, kurios gali inhibuoti amoniako oksidavim ą, taip 
pat gali duoti netipiškas inhibavimo kreives. Taigi šios kreiv ės turi 
būti aiškinamos atsargiai.  
4. NUORODOS  
1) International Standard ISO 8192–1986.  
2) Broecker, B., Zahn, R., Water Research 11, 1977, p. 165.  
3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L., Chemosphere 10, 1981, p. 
245. 
4) ETAD (Ecological and Tox.icological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries), Recommended Method No 103, also described by:
 
5) Robra, B., Wasserl Abwasser 117, 1976, p. 80.  
6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, p. 247.  
7) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 209, Decision of the Council 
C(84) 30 final.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIOLOGINIS SKAIDYMAS  
MODIFIKUOTAS SCAS BANDYMAS  
1. METODAS  
1.1. ĮVADAS  
Metodo tikslas yra įvertinti vandenyje tirpi ų, nelakių organini ų 
medžiagų galimą biologin į suskaidym ą, kai jas ilg ą laiką veikia 
palyginti didel ės koncentracijos mikroorganizmai. Mikroorganizm ų 
gyvybingumas tuo laikotarpiu palaikomas kasdien pridedant nusisto ­
vėjusių nuotekų mitybin ės terpės. (Savaitgaliais nuotekas galima 
laikyti 4 °C temperat ūroje. Dar galima naudoti sintetines nuotekas, 
kurios naudojamos OECD patvirtinamajame bandyme).  
Ant suspenduot ų kietųjų dalelių gali vykti fizikochemin ė adsorbcija, 
todėl į tai turi b ūti atsižvelgta aiškinant rezultatus (žr. 3.2).  
Dėl skystosios faz ės didelės sulaikymo trukm ės (36 valandos) ir d ėl 
nutrūkstamo mitybini ų medžiag ų pridėjimo bandymas nemodeliuoja 
nuotekų valymo įrenginio s ąlygų. Rezultatai, gauti su įvairiomis 
bandomosiomis medžiagomis, rodo, kad bandymas turi didel į biolo­
ginio skaidymo potencial ą. 
Bandyme sudarytos s ąlygos yra labai palankios atrankai ir (ar) adap ­
tavimui mikroorganizm ų, galinčių suskaidyti bandom ąją medžiag ą. 
(Metodika gali b ūti taikoma ruošti aklimatizuotas s ėjimo kult ūras 
kitiems bandymams).  
Šiame bandyme bandomosios medžiagos biologiniam suskaidymui 
įvertinti naudojamas ištirpusios organin ės anglies kiekio matavimas. 
Būtų geriau, jei DOC b ūtų nustatoma po par ūgštinimo ir prap ūtimo, 
nei kaip skirtumas C  bendroji  – C  neorganin ė . 
Lygiagrečiai taikant specifin į analizės metodą, gali būti įmanoma 
įvertinti medžiagos pirmin į biologin į skaidym ą (pirminės chemin ės 
sandaros išnykimas).  
Metodas tinka tik toms organin ėms bandomosioms medžiagoms, 
kurios bandyme naudojamomis koncentracijomis:  
— tirpios vandenyje (bent 20 mg/l ištirpusios organin ės anglies),  
— garų slėgis yra labai mažas,  
— neinhibuoja bakterij ų, 
— bandymo sistemoje adsorbuojamos tik nežymiu laipsniu,  
— iš bandomojo tirpalo nepradingsta d ėl putojimo.  
Turi būti nustatytas organin ės anglies kiekis bandomoje medžiagoje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Norint paaiškinti gautus rezultatus, ypa č kai rezultatai yra žemi arba 
ribiniai, naudinga but ų turėti informacijos apie bandomosios 
medžiagos pagrindini ų komponent ų santykin ę dalį. 
Kai reikia paaiškinti žemus rezultatus ir pasirinkti tinkam ą bando­
mąją koncentracij ą, naudinga tur ėti informacijos apie medžiagos 
toksiškum ą mikroorganizmams.  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
C T = bandomojo junginio koncentracija, skai čiuojama organin ės 
anglies kiekiu, kuris yra nusistov ėjusiose nuotekose ar 
pridedamas į jas aeravimo laikotarpio pradžioje (mg/litre),  
C t = ištirpusios organin ės anglies koncentracija, nustatyta bando ­
majame skystyje virš nuos ėdų aeravimo laikotarpio pabai ­
goje (mg/litre),  
C c = ištirpusios organin ės anglies koncentracija, nustatyta kontro ­
linio bandinio skystyje virš nuos ėdų aeravimo laikotarpio 
pabaigoje (mg/litre).  
Šiame bandyme biologinis skaidymas nustatomas kaip organin ės 
anglies išnykimas. Biologin į skaidym ą galima išreikšti:  
1. Kasdien įdedamos medžiagos šalinimo procentine verte D  da : 
D da ¼ Í ðC T – ðC T – C  c ÞÞ 
ðC T Þ Ü 100 Î 
[1] 
čia 
D da = skaidymas/kasdieninis prid ėjimas.  
2. Kiekvienos dienos pradžioje turimo medžiagos kiekio šalinimo 
procentin ė vertė D ssd : 
D ssd ¼ ÍÍ ð2C T þ C ti – C  ci – 3C  tði þ 1Þ þ 3C  cði þ 1Þ Þ 
ð2C T þ C ti – C  ci Þ Î 
Ü 100 Î 
[2 (a)]  
≈ ÍÍ ð2C T – 2ðC t – C  c ÞÞ 
ð2C T þ ðC t – C  c ÞÞ Î 
Ü 100 Î 
[2 (b)]  
čia 
D ssd = skaidymas/medžiagos kiekis dienos pradžioje;  
indeksai i ir (i + 1) nurodo matavimo dien ą. 
2(a) lygtį rekomenduojama taikyti, jei ištakio DOC kinta diena po 
dienos, o 2(b) lygtis gali b ūti taikoma, kai ištakio DOC diena po 
dienos palyginti nekinta.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Kai kuriais atvejais, kai tiriamos naujos medžiagos, etalonin ės 
medžiagos gali b ūti naudingos, ta čiau nėra specifin ės etalonin ės 
medžiagos, kuri ą galima b ūtų rekomenduoti šiam bandymui.  
Visų pirma, yra pateikti duomenys apie kelis junginius, įvertintus 
tarplaboratorinio lyginimo bandymuose (žr. 1 pried ėlį), kad retkar ­ 
čiais būtų galima metod ą sutikrinti ir jo rezultatus lyginti su rezulta ­
tais, gautais kitais metodais.  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Aktyvusis dumblas iš nuotek ų valymo įrenginio dedamas į pusiau 
nepertraukiamo veikimo aktyviojo dumblo įrenginį (Semi-Continuous 
Activated Sludge  (SCAS)). Įdedama bandomosios medžiagos ir 
nusistovėjusių buitinių nuotekų, ir mišinys aeruojamas 23 valandas. 
Paskui aeravimas stabdomas, dumblas paliekamas nusistov ėti ir 
skystis virš dumblo pašalinamas.  
Aeravimo kameroje lik ęs dumblas maišomas su kita bandomosios 
medžiagos ir nuotek ų dalimi ir ciklas kartojamas.  
Biologinio skaidymo buvimas įrodomas, nustatant ištirpusios orga ­
ninės anglies kiek į skystyje virš dumblo. Ši vert ė lyginama su verte, 
gauta skys čiui kontroliniame m ėgintuvėlyje, kuriame buvo tik nusis ­
tovėjusios nuotekos.  
Kai taikomas specifinis analiz ės metodas, galima nustatyti pradin ės 
medžiagos koncentracijos poky čius dėl jos molekuli ų biologinio 
skaidymo (pirminis biologinis skaidumas).  
1.5. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
Šio metodo, kuris remiasi ištirpusios organin ės medžiagos šalinimu, 
atkuriamumas dar n ėra nustatytas. (Kai tiriamas pirminis biologinis 
skaidymas, labai tiksl ūs duomenis yra gaunami medžiagoms, kurios 
labai išsiskaido).  
Metodo jautrumas labai priklauso nuo tuš čiojo bandinio kintamumo 
ir, kiek mažiau, nuo ištirpusios anglies nustatymo preciziškumo ir 
bandomosios medžiagos kiekio skystyje kiekvieno ciklo pradžioje.  
1.6. BANDYMO PROCED ŪROS APRAŠYMAS  
1.6.1.  Paruošiamieji darbai  
Oro tiekimo vamzdeliai (1 paveikslas) jungiami prie reikiamo skai ­ 
čiaus švari ų aeravimo įrenginių, skirtų kiekvienai bandomajai 
medžiagai ir kontroliniams bandiniams, arba galima naudoti origina ­
lųjį 1,5 litro SCAS bandymo įrenginį. Į įrenginius per medviln ės 
filtrą tiekiamame susl ėgtame ore turi neb ūti organin ės anglies ir, 
garavimo nuostoliams mažinti, oras turi b ūti prisotintas vandens 
garų. 
Aktyviojo dumblo ir nuotek ų mišinio bandinys, kuriame b ūtų nuo 1 
iki 4 g/litre suspenduot ų kietųjų dalelių, gaunamas iš daugiausia 
buitines nuotekas valan čio aktyviojo dumblo įrenginio. Kiekvienam 
aeravimo įrenginiui reikia maždaug 150 ml aktyviojo dumblo ir 
nuotekų mišinio.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Pradiniams bandomosios medžiagos tirpalams ruošti naudojamas 
distiliuotas vanduo; paprastai reikia, kad organin ės anglies koncent ­
racija būtų 400 mg/litre, tokiu atveju bandomojo junginio koncent ­
racija kiekvieno aeravimo ciklo pradžioje, kai nevyksta biologinis skaidymas, yra 20 mg/litre.
 
Galima naudoti didesnes koncentracijas, jei tai įmanoma atsižvelgiant 
į medžiagos toksiškum ą mikroorganizmams.  
Nustatomas organin ės anglies kiekis pradiniuose tirpaluose.  
1.6.2.  Bandymo s ąlygos  
Bandymas turi b ūti atliekamas 20–25 °C temperat ūroje. 
Naudojama didel ė aerobini ų mikroorganizm ų koncentracija (nuo 1 
iki 4 g/litre suspenduot ų kietųjų dalelių), ir tikroji sulaikymo trukm ė 
yra 36 valandos. Anglingoji medžiaga nuotek ų mitybinėje terpėje 
stipriai oksiduojama, paprastai tai įvyksta per aštuonias valandas 
nuo kiekvieno aeravimo ciklo pradžios. Po to, iki aeravimo laiko ­
tarpio pabaigos dumblas kv ėpuoja endogeniškai, tuo metu vienintelis 
substratas yra bandomasis junginys, jei jis pats nebuvo lengvai įsisa­
vintas. Šios savyb ės, kartu su s ėjimo kultūros kasdieniu keitimu, kai 
terpe naudojamos buitin ės nuotekos, užtikrina labai palankias akli ­
matizavimo s ąlygas ir galimyb ę biologiškai stipriai skaidyti.  
1.6.3.  Bandymo proced ūra 
Iš tinkamo aktyviojo dumblo valymo įrenginio ar laboratorinio įren­
ginio, skirto valyti daugiausia buitines nuotekas, imamas nuotek ų ir 
aktyviojo dumblo mišinys, kuris vis ą laiką, kol bus panaudotas labo ­
ratorijoje, laikomas aerobin ėmis sąlygomis. Į kiekvien ą aeravimo 
įrenginį ir į kontrolin į įrenginį įpilama po 150 ml šio mišinio (jei 
naudojamas originalus SCAS bandymo įtaisas, nurodytus t ūrius 
reikia dauginti iš 10) ir pradedama aeruoti. Po 23 valand ų aeravimas 
baigiamas ir dumblas 45 minut ėms paliekamas nusistov ėti. Kiek­
vienas indas paeiliui atkemšamas, ir iš jo išsiurbiama 100 ml skys čio 
virš dumblo. Prieš pat naudojim ą paimamas nusistov ėjusių buitinių 
nuotekų bandinys, ir 100 ml nuotek ų įpilama į kiekvien ą aeravimo 
įrenginį su likusiu jame dumblu. V ėl pradedama aeruoti. Šioje pako ­
poje bandomoji medžiaga nededama, ir į įrenginius kasdien pilama 
buitinių nuotekų tik tol, kol skystis virš nusistov ėjusio dumblo tampa 
skaidrus. Tai dažniausiai trunka ne ilgiau kaip dvi savaites, per t ą 
laiką ištirpusios organin ės anglies kiekis skystyje virš dumblo kiek ­
vieno aeravimo ciklo pabaigoje priart ėja prie pastovios vert ės. 
Kai šis laikotarpis baigiasi, atskirieji nusistov ėjusio dumblo bandiniai 
yra sumaišomi ir į kiekvien ą įrenginį dedama po 50 ml gauto sud ė­
tinio dumblo.  
Į kontrolinius įrenginius įpilama 95 ml nusistov ėjusių nuotekų ir 5 
ml vandens, į bandomuosius įrenginius įpilama 95 ml nusistov ėjusių 
nuotekų ir 5 ml atitinkamos bandomojo junginio pradinio tirpalo 
(400 mg/litre). Aeruoti pradedama iš naujo ir aeravimas t ęsiamas 
23 valandas. Po to dumblas paliekamas 45 minut ėms nusistov ėti, 
skystis virš dumblo nusiurbiamas ir jame nustatomas ištirpusios orga ­
ninės anglies kiekis.  
Aukščiau aprašytas užpylimo ir siurbimo procesas kartojamas 
kasdien iki bandymo pabaigos.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Prieš paliekant dumbl ą nusistovėti, gali jį tekti nuvalyti nuo įrenginio 
sienelių, kad kietosios dalel ės nesikaupt ų virš skys čio. Norint 
išvengti kryžminio užkr ėtimo, kiekvienas įrenginys turi tur ėti atskirą 
gremžtuk ą ar šepetį. 
Geriausia b ūtų, kad ištirpusi organin ė anglis skystyje virš dumblo b ūtų 
nustatoma kasdien, nors analiz ę leidžiama atlikti re čiau. Prieš analiz ę 
skysčiai filtruojami per išplautus 0,45 μm membraninius filtrus ar cent ­
rifuguojami. Membraniniai filtrai tinka, jei užtikrinama, kad filtravimo 
pakopoje jie neišskiria anglies ir nesugeria medžiagos. Centrifuguo ­
jamo bandinio temperat ūra neturi b ūti didesnė kaip 40 °C.  
Bandymo trukm ė junginiams, kurie yra mažai biologiškai skaidomi 
arba visiškai neskaidomi, n ėra apibrėžta, tačiau patirtis rodo, kad 
dažniausiai tai turi trukti bent 12 savai čių, bet ne ilgiau kaip 26 
savaites.  
2. DUOMENYS IR VERTINIMAS  
Ištirpusios anglies kiekio vert ės, nustatytos bandomuosiuose ir kont ­
roliniuose skys čiuose virš nuos ėdų, atidedamos grafiškai kaip laiko 
funkcija.  
Baigus biologin į skaidym ą, bandomajame bandinyje nustatytas lygis 
artėja prie kontroliniame bandinyje nustatyto lygio. Kai skirtumas 
tarp abiej ų lygių trijuose iš eil ės matavimuose nekinta, dar daroma 
tiek matavim ų, kiek jų pakanka duomenims statistiškai apdoroti, ir 
skaičiuojama bandomosios medžiagos biologinio skaidymo procen ­
tinė vertė (D  da ar D  ssd , žr. 1.2).  
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje pateikiama, jei įmanoma, tokia informacija:  
— visa informacija apie nuotek ų prigimtį, naudoto įrenginio tip ą ir 
eksperimentiniai rezultatai, gauti bandomajai medžiagai, etalo ­
ninei medžiagai, jei buvo naudojama, ir tuš čiajam bandiniui,  
— temperat ūra, 
— šalinimo kreiv ė su aprašymu, skai čiavimo būdu (žr. 1.2),  
— data ir vieta, kur buvo imti aktyviojo dumblo ir nuotek ų bandi­
niai, adaptavimo b ūsena, koncentracija ir t. t.,  
— mokslinis bet koki ų bandymo metodikos keitim ų pagrindimas,  
— parašas ir data.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. DUOMEN Ų AIŠKINIMAS  
Kadangi medžiaga, skirta šiuo metodu bandyti, biologiškai n ėra 
lengvai skaidoma, bet koks DOC šalinimas vien tik d ėl biologinio 
skaidymo paprastai vyksta laipsniškai dienas ar savaites, išskyrus tuos atvejus, kai įvyksta staigus aklimatizavimas, apie kur į rodo 
staigus išnykimas, įvykstantis po keli ų savaičių.
 
Tačiau kartais svarb ų vaidmen į gali vaidinti fizikochemin ė adsorb­
cija; tai rodo prid ėtos DOC visiškas ar dalinis išnykimas bandymo 
pradžioje. Kas atsitinka v ėliau, priklauso nuo kai kuri ų faktorių, pvz., 
adsorbcijos laipsnio ir suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracijos 
išleidžiamajame ištakyje. Paprastai skirtumas tarp DOC koncentra ­
cijos kontroliniame bandinyje ir bandomosios medžiagos skystyje 
virš nuos ėdų laipsniškai did ėja nuo pradin ės mažos vert ės ir toliau 
šis skirtumas, pasiek ęs naują vertę, išlieka toks iki bandymo 
pabaigos, jei ne įvyksta aklimatizavimas.  
Jei reikia atskirti biologin į skaidymą (ar dalinį biologinį skaidymą) ir 
adsorbciją, būtina atlikti tolesnius bandymus. Tai galima daryti įvai­
riais būdais, tačiau įtikinamiausias b ūdas yra pamatiniame bandyme 
(geriau, kad tai b ūtų respirometrinis bandymas) s ėjimo kult ūra 
naudoti skyst į virš dumblo ar dumbl ą. 
Bandomosios medžiagos, kuri ų neadsorbcinio DOC šalinimo vert ės 
bandyme yra didel ės, turi būti laikomos potencialiai biologiškai skai ­
domomis. Dalinis neadsorbcinis šalinimas rodo, kad chemin ė 
medžiaga bent kažkiek yra biologiškai skaidoma.  
Mažos ar nulin ės DOC šalinimo vert ės gali būti dėl mikroorganizm ų 
inhibavimo bandom ąja medžiaga, tai dar gali parodyti dumblo irimas 
ir jo kiekio maž ėjimas, dėl ko skystis virš dumblo drums čiasi. 
Bandymas turi b ūti pakartotas naudojant mažesn ę bandomosios 
medžiagos koncentracij ą. 
Naudojant specifin į junginio analiz ės metod ą ar bandom ąsias 
medžiagas su žym ėtais 14 C atomais, gali b ūti pasiektas didesnis 
jautrumas. Jei bandomasis junginys turi  14 C, 14 CO 2 surinkimas 
patvirtintų, kad biologinis skaidymas įvyko.  
Kai duomenys pateikiami, kaip pirminio biologinio skaidymo rezul ­
tatai, turi b ūti paaiškinta, jei tai įmanoma, kaip pakito chemin ė 
sandara, kad neliko pradin ės bandomosios medžiagos atsako.  
Turi būti pateiktas analiz ės metodo tinkamumo patvirtinimas ir 
tuščiojo bandinio terp ėje nustatyta skaidymo vert ė. 
4. NUORODOS  
1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 302 A, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
1 priedėlis 
SCAS bandymas. Rezultat ų pavyzdys  
Medžiaga  C T 
(mg/l)  C t – C  c 
(mg/l)  Biologinio 
skaidymo 
procentas 
D da Bandymo trukm ė 
(paros)  
4-acetilaminobenzensulfonatas  17,2  2,0  85  40  
Tetrapropilenbenzensulfonatas  17,3  8,4  51,4  40  
4-nitrofenolis  16,9  0,8  95,3  40  
Dietilenglikolis  16,5  0,2  98,8  40  
Anilinas  16,9  1,7  95,9  40  
Ciklopentano tetrakarboksilatas  17,9  3,2  81,1  120  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
2 priedėlis 
Bandymo aparato pavyzdys
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOLOGINIS KONCENTRAVIMAS. DINAMINIS BANDYMAS 
SU ŽUVIMIS  
1. METODAS  
Šis biologinio koncentravimo metodas yra OECD TG 305 (1996) 
kopija.  
1.1. ĮVADAS  
Šis metodas aprašo pratek ėjimo sąlygomis vykstan čio medžiag ų 
biologinio kaupimosi žuvyse gebos apib ūdinimo metodik ą. Nors 
kur kas geriau taikyti dinamin į bandymo metod ą, leidžiama naudoti 
pusiau stacionarius režimus, jei jie atitinka tinkamumo kriterijus.  
Metode pateikiamas pakankamas kiekis bandymui atlikti reikaling ų 
detalių, tačiau paliekama atitinkama laisv ė eksperimento schemai 
pritaikyti konkre čių laboratorij ų sąlygoms ir keisti bandom ųjų 
medžiagų charakteristikas. Jis labiausiai tinka patvarioms organin ėms 
medžiagoms, kuri ų log P  ow vertės yra nuo 1,5 iki 6,0 (1), ta čiau gali 
būti taikomas ir ypatingai lipofilin ėms medžiagoms (kuri ų log P  ow > 
6,0). Toki ų ypatingai lipofilini ų medžiag ų biologinio koncentravimo 
faktoriaus (BKF), kartais žymimo K  B , išankstinis įvertis grei čiausiai 
būtų didesnis, nei pastoviosios b ūsenos biologinio koncentravimo 
faktoriaus (BKF  NB ) vertė, kurios reik ėtų laukti laboratoriniuose 
bandymuose. Medžiag ų, kurių log P  ow vertės yra iki 9,0, išankstiniai 
biologinio koncentravimo faktoriaus įverčiai gali būti gauti naudojant 
Bintein  et al . lygtį (2). Parametrams, kurie apib ūdina biologinio 
koncentravimo geb ą, priklauso sugerties grei čio konstanta (k  1 ), apsi­
valymo grei čio konstanta (k  2 ) ir BKF  NB . 
Žymėtuosius atomus turin čios bandomosios medžiagos gali paleng ­
vinti vandens ir žuv ų bandinių analizę ir gali būti naudojamos norint 
nustatyti, ar reikia atlikti irimo produkt ų identifikavim ą ir kiekybin į 
nustatymą. Jei matuojamas bendras radioaktyvi ųjų likučių kiekis 
(pvz., deginant arba tirpinant audinius), BKF remiasi pradinio junginio, vis ų sulaikytų metabolit ų, o taip pat įsisavintos anglies 
kiekiu. Taigi, BKF vert ės, besiremian čios bendruoju radioaktyvi ųjų 
likučių kiekiu, negali b ūti tiesiogiai lyginamos su BKF vert ėmis, 
gautomis atliekant tik pradinio junginio specifin ę cheminę analizę.
 
Norint nustatyti BKF, kuris remiasi tik pradinio junginio kiekiu, 
tyrimuose su žym ėtaisiais atomais gali b ūti naudojamos gryninimo 
metodikos, o pagrindiniai metabolitai gali b ūti apibūdinti, jei 
manoma, kad tai yra b ūtina. Analizuojant ir identifikuojant liku čius 
audiniuose, galima sujungti medžiag ų apykaitos žuvyse tyrimus su 
biologinio koncentravimo tyrimais.  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Biologinis koncentravimas/biologinis kaupimas yra bandomosios 
medžiagos koncentracijos did ėjimas organizme (nustatytuose jo audi ­
niuose) arba organizmo paviršiuje lyginant su bandomosios medžiagos koncentracija aplinkin ėje terpėje.
 
Biologinio koncentravimo faktorius (BKF arba K  B ) bet kuriuo šio 
koncentravimo bandymo sugerties tarpsnio metu yra bandomosios medžiagos koncentracijos žuvies viduje (paviršiuje) arba nustatytuose 
jos audiniuose (C
 f , μg/g (ppm)) ir chemin ės medžiagos koncentra ­
cijos aplinkin ėje terpėje (C  w kaip μg/ml (ppm)) santykis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Pastoviosios b ūsenos biologinio koncentravimo faktorius (BKF  NB 
arba K  B ) žymiai nekinta ilgesn į laiko tarp ą, bandomosios medžiagos 
koncentracijai aplinkin ėje terpėje šį laiko tarp ą esant pastoviai.  
Horizontalioji dalis arba pastovioji b ūsena pasiekiama tuomet, kai 
bandomosios medžiagos koncentracijos žuvyje (C  f ) priklausomyb ės 
nuo laiko kreiv ė tampa lygiagreti laiko ašiai, o trys C  f vertės, gautos 
paeiliui analizuojant bent kas dvi paras paimtus bandinius, viena nuo 
kitos nesiskiria daugiau kaip ± 20 %, ir n ėra žymių skirtumų tarp 
trijų bandinių ėmimo period ų. Kai analizuojami sujungti bandiniai, 
reikia ne mažiau kaip keturi ų paeiliui padaryt ų analizių. Lėtai suge­
riamoms bandomosioms medžiagoms labiau tikt ų septynių parų 
tarpai.  
Biologinio koncentravimo faktorius, apskai čiuotas tiesiog iš kinetini ų 
greičio konstant ų (k  1 /k 2 ), yra vadinamas kinetiniu koncentravimo 
faktoriumi, BKF  K . 
Pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo) (P  ow ) yra chemin ės 
medžiagos pusiausvyrojo tirpumo n–oktanolyje ir vandenyje santykis (A.8 metodas), taip pat išreiškiamas K
 ow . P ow logaritmas naudojamas 
kaip chemin ės medžiagos biologinio koncentravimo vandens orga ­
nizmuose gebos rodiklis.  
Veikimo arba sugerties tarpsnis yra laikas, kur į žuvis yra veikiama 
bandomąja medžiaga.  
Sugerties grei čio konstanta (k  1 ) yra skaitin ė vertė, apibūdinanti 
bandomosios medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje 
(arba nustatytuose jos audiniuose) did ėjimo greit į, kai žuvis veikiama 
chemine medžiaga (k  1 išreiškiama para  -1 ). 
Tarpsnis po veikimo arba apsivalymo (netekimo) tarpsnis yra laikas 
po to, kai bandomoji žuvis buvo pernešta iš terp ės su bandom ąja 
medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos n ėra, per kur į tiriamas 
apsivalymas (arba bendras maž ėjimas) nuo šios medžiagos žuvyje 
(arba nustatytuose jos audiniuose).  
Apsivalymo (netekimo) grei čio konstanta (k  2 ) yra skaitin ė vertė, 
apibūdinanti bandomosios medžiagos koncentracijos žuvyje arba 
jos paviršiuje (arba nustatytuose jos audiniuose) maž ėjimo greit į po 
to, kai bandomoji žuvis buvo pernešta iš terp ės su bandom ąja 
medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos n ėra (k  2 išreiškiama para  -1 ). 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandymas susideda iš dviej ų tarpsnių: veikimo (sugerties) ir tarpsnio 
po veikimo (apsivalymo). Sugerties tarpsnio metu atskiros vienos rūšies žuvų grupės veikiamos bent dviej ų koncentracij ų bandomąja 
medžiaga. V ėliau apsivalymo tarpsniui jos pernešamos į terpę be 
bandomosios medžiagos. Apsivalymo tarpsnis b ūtinas visuomet, 
išskyrus atvejus, kai medžiagos sugertis sugerties tarpsnio metu buvo nežymi (pvz., BKF yra mažesnis kaip 10). Bandomosios medžiagos koncentracija žuvyje (jos paviršiuje) (arba nustatytuose 
jos audiniuose) matuojama abiejuose bandymo tarpsniuose. Be 
dviejų bandom ųjų koncentracij ų, kontrolin ė žuvų grupė laikoma 
tokiomis pa čiomis sąlygomis, bet be bandomosios medžiagos, norint 
biologinio koncentravimo bandyme pasteb ėtą galimą neigiam ą 
poveikį palyginti su palyginam ąja kontroline grupe ir gauti bando ­
mosios medžiagos fono koncentracijas.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Sugerties tarpsnis vykdomas 28 paras, jei ne įrodoma, kad pusiaus ­
vyra yra pasiekta anks čiau. Sugerties tarpsnio trukm ės ir pastoviosios 
būsenos laiko prognoz ė gali būti padaryta pagal 3 papildymo lygt į. 
Pernešus žuvis į kitą švarų indą su ta pačia terpe, bet be bandomo ­
sios medžiagos, pradedamas apsivalymo periodas. Pageidautina, jei 
įmanoma, biologinio koncentravimo faktori ų apskaičiuoti ir kaip 
santykį koncentracijos žuvyje (C  f ) su koncentracija vandenyje (C  w ) 
tariamosios pastoviosios b ūsenos sąlygomis (BKF  NB ) ir kaip kinetin į 
biologinio koncentravimo faktori ų (BKF  K ), išreiškiam ą sugerties (k  1 ) 
ir apsivalymo (k  2 ) greičio konstant ų santykiu, darant prielaid ą apie 
pirmojo laipsnio kinetik ą. Jei pirmojo laipsnio kinetikos akivaizdžiai 
nepaisoma, turi b ūti naudojami sud ėtingesni modeliai (5 pried ėlis). 
Jei pastovioji b ūsena per 28 paras nepasiekiama, sugerties tarpsnis 
turi būti pratęstas, kol ji bus pasiekta, bet ne ilgiau kaip iki 60 par ų; 
tuomet pradedamas apsivalymo tarpsnis.  
Sugerties grei čio konstanta, apsivalymo (netekimo) grei čio konstanta 
(ar konstantos, jei naudojami sud ėtingesni modeliai), biologinio 
koncentravimo faktorius ir, jei įmanoma, kiekvieno ši ų parametr ų 
pasikliovimo ribos apskai čiuojami pagal model į, kuris geriausiai 
aprašo žuvyse ir vandenyje išmatuotas bandomosios medžiagos koncentracijas.
 
BKF yra išreiškiamas kaip žuvies bendrosios šlapios mas ės funkcija. 
Tačiau specialiems tikslams, jei žuvis yra pakankamai didel ė, gali 
būti naudojami nustatyti audiniai arba organai (pvz., raumuo, 
kepenys) arba žuvis gali b ūti padalinta į valgomąją (filė) ir neval ­
gomą (viduriai) dalis. Kadangi daugelio organini ų medžiag ų biolo­
ginio koncentravimo geba aiškiai priklauso nuo lipofiliškumo, taip pat yra atitinkama priklausomyb ė tarp riebal ų kiekio bandomosiose 
žuvyse ir stebimo toki ų medžiag ų biologinio koncentravimo. Tokiu 
būdu, norint sumažinti š į bandymo rezultat ų kintamumo šaltin į, lipo­
filiškų (t. y. kuri ų log P
 ow > 3) medžiag ų biologinis koncentravimas 
turi būti apskaičiuojamas ne tik viso k ūno masei, bet ir riebal ų 
kiekiui.  
Kai tai galima įgyvendinti, riebal ų kiekis turi b ūti nustatomas toje 
pačioje biologin ėje medžiagoje, kurioje nustatoma bandomosios 
medžiagos koncentracija.  
1.4. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Prieš atliekant biologinio koncentravimo bandym ą apie bandom ąją 
medžiagą turi būti žinoma tokia informacija:  
— tirpumas vandenyje,  
— pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo) P  ow (taip pat 
žymimas K  ow , nustatomas HPLC metodu pagal A. 8),  
— hidroliz ė, 
— fotocheminis virsmas vandenyje, nustatytas apšvietimo saul ės 
arba modeliuota saul ės spinduliuote s ąlygomis ir biologinio 
koncentravimo bandyme naudoto apšvietimo s ąlygomis (3),  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— paviršiaus įtempis (t. y. medžiagoms, kurioms log P  ow negali būti 
nustatytas),  
— garų slėgis, 
— biologinio skaidumo lengvumas (jei reikia).  
Kita reikalinga informacija yra toksiškumas bandyme naudojamoms 
žuvų rūšims, geriausiai asimptotiška (t. y. nuo laiko nepriklausanti) 
LC 50 vertė. Reikia tur ėti tinkamą žinomo tikslumo, preciziškumo ir 
jautrumo analizin į metodą bandomajai medžiagai bandomuosiuose 
tirpaluose ir biologin ėje medžiagoje kiekybiškai nustatyti, taip pat 
bandinių ruošimo ir laikymo detales. Tai pat turi b ūti žinoma bando ­
mosios medžiagos analizinio nustatymo vandenyje ir žuvies audi ­
niuose riba. Kai naudojama  14 C žymėta bandomoji medžiaga, turi 
būti žinoma radioaktyvumo d ėl priemaiš ų buvimo procentin ė dalis.  
1.5. BANDYMO TINKAMUMAS  
Turi būti taikomos tokios s ąlygos, kad bandymas b ūtų tinkamas:  
— temperat ūros kitimas mažesnis kaip ± 2 °C;  
— ištirpusio deguonies koncentracija neturi sumaž ėti daugiau kaip 
iki 60 % soties koncentracijos;  
— sugerties tarpsnio metu bandomosios medžiagos koncentracija 
kameroje palaikoma vidutini ų išmatuot ų verčių ribose su ± 
20 % nuokrypiu;  
— bandymo pabaigoje kontrolini ų ir veikiam ų žuvų gaištamumas 
arba kiti neigiami veiksniai (liga) yra mažesnis kaip 10 %; jei 
bandymas vyksta kelias savaites arba m ėnesius, gaištamumas 
arba kiti neigiami veiksniai abiejose žuv ų grupėse turi b ūti 
mažesni kaip 5 % per m ėnesį, o bendras gaištamumas ne didesnis 
kaip 30 %.  
1.6. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Tikrinant eksperimento metodik ą, prireikus b ūtų naudinga naudoti 
etalonines medžiagas su žinoma biologinio koncentravimo geba. Tačiau specialios medžiagos vis dar negali b ūti rekomenduotos.
 
1.7. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.7.1.  Aparat ūra 
Reikia ži ūrėti, kad visoms įrangos dalims gaminti b ūtų vengiama 
naudoti medžiagas, kurios gali tirpti, sugerti arba išsiplauti ir tur ėti 
neigiamą poveikį žuvims. Gali b ūti naudojami sta čiakampio arba 
ritinio formos standartiniai rezervuarai, kurie b ūtų pagaminti iš 
chemiškai inertišk ų medžiag ų ir kurių tūris atitikt ų įkrovos dyd į. 
Minkšti plastikiniai vamzdžiai turi b ūti kuo mažiau naudojami. 
Geriausiai naudoti vamzdžius iš teflono  ® , nerūdijančio plieno ir 
(arba) stiklo. Patirtis rodo, kad medžiagoms su dideliu sugerties koeficientu, pvz., sintetiniams piretroidams, gali b ūti reikalingas sila ­
nizuotas stiklas. Tokiais atvejais įranga po naudojimo tur ėtų būti 
išmesta.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Vanduo  
Bandymuose dažniausiai naudojamas gamtinis vanduo, jis turi b ūti 
imamas iš neužteršto ir vienodos kokyb ės šaltinio. Skiedimo vandens 
kokybė turi būti tokia, kad pasirinkt ų rūšių žuvys než ūtų per akli­
matizavimo ir bandymo laik ą ir jų išvaizdoje arba elgesyje neatsi ­
rastų kažko ne įprasto. Geriausiu atveju reik ėtų pademonstruoti, kad 
bandomosios r ūšys skiedimo vandenyje gali išlikti, augti ir daugintis 
(pvz., laboratorin ėje kultūroje arba atliekant toksiškumo ilgaamžiš ­
kumo ciklui bandym ą). Apibūdinant vanden į turi būti nurodyta bent 
pH vertė, kietumas, bendras kiet ųjų dalelių kiekis, bendroji organin ė 
anglis, taip pat pageidautina nurodyti amonio ir nitrito jon ų kiekį bei 
šarmingum ą, ir, jūros žuvų rūšių atveju, s ūrumą. Parametrai, kurie 
būtų svarbūs žuvų optimaliai gerovei, yra visiškai žinomi, ta čiau 1 
priedėlyje pateiktos rekomenduojamos bandymuose naudojamo g ėlo 
ir jūros vandens įvairių komponent ų didžiausios koncentracijos.  
Vandens kokyb ė turi būti pastovi vis ą bandymo laik ą. pH vert ė turi 
būti 6,0– 8,5 intervale, ta čiau konkre čiame bandyme pH reikšm ė turi 
būti ± 0,5 pH vieneto ribose. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo 
per daug netur ėtų įtakos bandymo rezultatui (pavyzdžiui, sudary ­
damas kompleksus su bandom ąja medžiaga) arba neigiamai veikt ų 
žuvų būrio elgesį, bandiniai per tam tikrus laiko tarpus turi b ūti 
imami analizei. Sunki ųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, 
Ni), pagrindini ų anijonų ir katijon ų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Cl, SO  4 ), 
pesticidų (pvz., bendrojo fosforo organini ų ir chloro organini ų pesti­
cidų kiekio), bendrosios organin ės anglies ir suspenduot ų kietųjų 
dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris m ėnesius, 
jei žinoma, kad skiedimo vandens kokyb ė yra gana pastovi. Jei 
įrodyta, kad vandens kokyb ė yra pastovi bent metus, analiz ė gali 
būti atliekama ne taip dažnai, o tarpai tarp j ų padidinti (pvz., kas 
šešis mėnesius).  
Natūralus kiet ųjų dalelių kiekis, o taip pat bendrosios organin ės 
anglies (TOC) kiekis skiedimo vandenyje turi b ūti kuo mažesnis, 
kad būtų išvengta bandomosios medžiagos sugerties organine 
medžiaga, d ėl ko gali sumaž ėti bandomosios medžiagos biologinis 
prieinamumas (4). Didžiausias kiet ųjų dalelių leistinas kiekis yra 5 
mg/l (sausos medžiagos, sulaikomos 0,45 μm filtru), o bendrosios 
organinės anglies – 2 mg/l (žr. 1 pried ėlį). Jei reikia, vanduo prieš 
naudojim ą turi būti filtruojamas. D ėl bandom ųjų žuvų (ekskrement ų) 
ir maisto liku čių susidaręs organin ės anglies kiekis turi b ūti kiek 
įmanoma mažesnis. Organin ės anglies koncentracija bandymo rezer ­
vuare vis ą bandymo laik ą neturi viršyti bandomojoje medžiagoje ir, 
jei naudojama, tirpinimo medžiagoje esan čios organin ės anglies 
koncentracijos daugiau kaip 10 mg/l (± 20 %)  
1.7.3.  Bandomieji tirpalai  
Ruošiamas reikiamos koncentracijos bandomosios medžiagos pradinis 
tirpalas. Pradin į tirpalą geriausiai b ūtų ruošti bandom ąją medžiag ą 
tiesiog maišant arba plakant skiedimo vandenyje. Naudoti tirpiklius arba disperguojan čias medžiagas (tirpinimo medžiagas) nerekomen ­
duojama; ta čiau jų gali prireikti kai kuriais atvejais, norint pagaminti 
pakankamai koncentruot ą pradinį tirpalą. Tirpikliai, kuriuos b ūtų 
galima naudoti, yra etanolis, metanolis, etilenglikolio monometilo eteris, etilenglikolio dimetilo eteris, dimetilformamidas ir trietilengli ­
kolis. Disperguojan čios medžiagos, kurias galima naudoti, yra 
Cremophor RH40, Tween 80, metilceliulioz ės 0,01 % tirpalas ir 
HCO-40. Naudojant biologiškai lengvai skaidomas medžiagas reikia žiūrėti, kad neatsirast ų problem ų dėl bakterij ų augimo bandymuose 
pratekančiame vandenyje. Bandomoji medžiaga gali tur ėti žymėtuosius 
atomus ir turi b ūti aukščiausio grynumo (pvz., geriausiai > 98 %).
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Bandymuose su pratekan čiu vandeniu bandomajai koncentracijai 
bandymo kameroje užtikrinti reikalinga sistema, kuri nuolat dozuot ų 
ir skiestų bandomosios medžiagos pradin į tirpalą (pvz., dozuojantis 
siurblys, proporcingas skiestuvas, saturatoriaus sistema). Geriausiai būtų daryti bent penkis vandens t ūrio keitimus per dien ą kiekvienoje 
bandymo kameroje. Geriau naudoti dinamin į režimą, tačiau kai tai 
neįmanoma (pvz., kai tai kenkia bandomiesiems organizmams), 
galima taikyti pusiau stacionari ąją metodik ą, jei ji atitinka tinka ­
mumo kriterijus. Pradinio tirpalo ir skiedimo vandens srautas turi 
būti tikrinamas 48 valandas prieš bandym ą ir vėliau bent kasdien 
visą bandymo laik ą. Šio tikrinimo metu nustatomas srautas per kiek ­
vieną kamerą ir užtikrinama, kad jis kameroje arba tarp kamer ų 
nesikeistų daugiau kaip 20 %.
 
1.7.4.  Žuv ų rūšies parinkimas  
Pasirenkant r ūšis svarbu yra tai, ar jas lengva gauti, ar galima gauti 
tinkamų dydžių žuvis ir ar galima žuvis tinkamai priži ūrėti labora­
torijoje. Kiti žuv ų rūšies pasirinkimo kriterijai apima rekreacin ę, 
komercin ę, ekologin ę svarbą, taip pat palyginam ą jautrum ą, 
sėkmingą naudojim ą praeityje ir t. t.  
Rekomenduojamos bandomosios r ūšys pateiktos 2 pried ėlyje. Galima 
naudoti kitas r ūšis, tačiau tinkamoms bandymo s ąlygoms užtikrinti 
gali tekti keisti bandymo metodik ą. Šiuo atveju ataskaitoje turi b ūti 
pateikta r ūšies pasirinkimo priežastis ir bandymo metodas.  
1.7.5.  Žuv ų laikymas  
Laikomų žuvų populiacija bent dvi savaites aklimatizuojama vande ­
nyje bandymo temperat ūroje ir pakankamai maitinama tos pa čios 
rūšies maistu, kuris bus naudojamas bandyme.  
Po 48 valand ų stabilizacijos periodo, registruojamas gaištamumas ir 
taikomi tokie kriterijai:  
— populiacijos gaištamumas per septynias paras didesnis kaip 10 %: 
visa partija atmetama,  
— populiacijos gaištamumas per septynias paras 5–10 %: aklimati ­
zuojama dar septynias papildomas paras,  
— populiacijos gaištamumas per septynias paras mažesnis kaip 5 %: 
partija priimama, jei gaištamumas per kitas septynias dienas didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama.
 
Reikia ži ūrėti, kad bandymuose naudojamos žuvys netur ėtų paste­
bimų ligų ir nenormalum ų. Pašalinamos visos ligotos žuvys. Žuvys 
dvi savaites prieš pradedant bandym ą arba bandymo metu neturi b ūti 
gydomos nuo lig ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. BANDYMO ATLIKIMAS  
1.8.1.  Išankstinis bandymas  
Gali būti naudinga atlikti išankstin į bandym ą, norint optimizuoti 
galutinio bandymo s ąlygas, pvz., bandomosios medžiagos koncent ­
raciją (-as), sugerties ir apsivalymo tarpsni ų trukmę. 
1.8.2.  Veikimo s ąlygos  
1.8.2.1. S u g e r t i e s t a r p s n i o t r u k m ė 
Sugerties tarpsnio trukm ės prognozavimas gali b ūti daromas 
remiantis praktine patirtimi (pvz., iš ankstesnio panašios chemin ės 
medžiagos sugerties tyrimo) arba pagal tam tikras empirines priklau ­
somybes, naudojant tirpumo vandenyje duomenis arba bandomosios medžiagos pasiskirstymo koeficient ą (n-oktanolis/vanduo) (žr. 3 prie ­
dėlį).
 
Sugerties tarpsnis turi trukti 28 paras, jei negalima įrodyti, kad pu ­
siausvyra pasiekta anks čiau. Jei pastovioji b ūsena nepasiekiama per 
28 paras, sugerties tarpsnis turi b ūti pratęstas, atliekant tolesnius 
matavimus, kol pasiekiama pastovioji b ūsena, bet ne ilgiau kaip iki 
60 parų. 
1.8.2.2. A p s i v a l y m o t a r p s n i o t r u k m ė 
Pusės sugerties tarpsnio laiko paprastai pakanka, kad sugertos 
medžiagos kiekis sumaž ėtų iki atitinkamos vert ės (pvz., 95 %) (žr. 
3 priedėlį dėl šio įverčio aiškinimo). Jei laikas, reikalingas 95 % 
netekimo vertei pasiekti yra ne įvykdomai ilgas, pavyzdžiui, du kartus 
ilgesnis nei normali sugerties tarpsnio trukm ė (t. y. daugiau kaip 56 
paros), galima naudoti trumpesn į periodą (pvz., kol bandomosios 
medžiagos koncentracija pasiekia mažiau nei 10 % pastoviosios 
būsenos koncentracijos). Ta čiau medžiag ų, kurių sugerties ir apsiva ­
lymo modelis yra sud ėtingesnis nei tas, kur į vaizduoja žuv ų vienoje 
kameroje modelis, turintis pirmojo laipsnio kinetik ą, netekimo 
greičio konstantoms nustatyti naudojami ilgesni apsivalymo tarpsniai. 
Tačiau šio periodo trukm ę gali apspr ęsti laikas, kur į bandomosios 
medžiagos koncentracija žuvyje yra vis dar didesn ė nei analizinio 
aptikimo riba.  
1.8.2.3. B a n d o m ų j ų ž u v ų s k a i č i u s 
Bandomajai koncentracijai parenkamas toks žuv ų skaičius, kad kiek ­
vieną bandinio ėmimą bandiniui tekt ų ne mažiau kaip keturios žuvys. 
Jei reikia didesnio statistinio reikšmingumo, vienam bandiniui žuv ų 
reikės daugiau.  
Jei naudojamos suaugusios žuvys, nurodykite, kokios – vienos lyties 
žuvys ar abiej ų lyčių žuvys – buvo naudojamos bandyme. Jei naudo ­
jamos abiej ų lyčių žuvys, prieš veikimo pradži ą turi būti dokumen ­
tuota, kad riebal ų kiekio skirtumas tarp ly čių yra nereikšmingas; gali 
būti būtina sujungti visas vyriškos ir moteriškos lyties žuvis į vieną 
grupę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Kiekvienam atskiram bandymui parenkamos panašios mas ės žuvys, 
kad mažiausi ų žuvų masė nebūtų mažesnė kaip du tre čdaliai didžiau ­
sios žuvies mas ės. Visos žuvys turi b ūti tų pačių metų ir iš to paties 
šaltinio. Kadangi kartais paaišk ėja, kad žuv ų masė ir amžius turi 
didelę įtaką BKF vert ėms (1), šios detal ės turi būti tiksliai registruo ­
jamos. Norint įvertinti vidutin ę masę, rekomenduojama prieš 
bandymą pasverti atskir ą bandinį, paimtą iš turimų žuvų atsargų. 
1.8.2.4. Į k r o v a  
Norint mažinti C  w sumažėjimą dėl žuvų pridėjimo bandymo 
pradžioje ir išvengti ištirpusio deguonies koncentracijos maž ėjimo, 
naudojami dideli vandens ir žuv ų kiekio santykiai. Svarbu, kad 
įkrovos dydis atitikt ų naudojam ą bandomąją rūšį. Bet kuriuo atveju 
paprastai rekomenduojamas įkrovos dydis yra 0,1–1,0 g žuvies 
(šlapios mas ės) litrui vandens parai. Dideles įkrovas galima taikyti, 
jei įrodoma, kad reikiam ą bandomosios medžiagos koncentracij ą 
įmanoma palaikyti ± 20 % ribose ir kad ištirpusio deguonies 
koncentracija netampa mažesn ė už 60 % soties koncentracijos.  
Pasirenkant tinkamus įkrovos režimus, atsižvelgiama į žuvų rūšies 
įprastosios gyvenimo aplinkos s ąlygas. Pavyzdžiui, dugne gyvenan ­ 
čioms žuvims tam pa čiam vandens t ūriui gali b ūti reikalingas 
didesnis akvariumo dugno plotas nei j ūros žuvų rūšims.  
1.8.2.5. M a i t i n i m a s  
Aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu žuvys maitinamos tinkamu 
maistu, kurio žinomas riebal ų ir bendrasis baltym ų kiekis ir kurio 
pakanka, kad žuvys b ūtų sveikos ir b ūtų palaikoma j ų kūno masė. 
Žuvys aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu maitinamos kasdien, pašaro kiekis sudaro maždaug 1–2 % k ūno masės per par ą; taip 
bandymo metu riebal ų koncentracija daugumoje žuv ų rūšių palai­
koma santykinai pastovi. Norint išlaikyti k ūno masės ir riebal ų 
kiekio atitikim ą, maisto kiekis turi b ūti perskai čiuotas, pvz., kart ą 
per savait ę. Šiam apskai čiavimui atlikti žuv ų masė kiekvienoje kame ­
roje gali b ūti įvertinta pagal neseniai iš šios kameros bandiniui 
paimtų žuvų masę. Nesverkite žuv ų, kurios lieka kameroje.
 
Nesuvalgytas maistas ir išmatos kasdien iš kameros išsiurbiami 
netrukus po maitinimo (nuo 30 minu čių iki vienos valandos). 
Kameros vis ą bandymo laik ą turi būti kuo švaresn ės, kad būtų palai­
koma kiek įmanoma mažesn ė organinių medžiagų koncentracija, nes 
organinės anglies buvimas gali riboti bandomosios medžiagos biolo ­
ginį prieinamum ą (1). 
Kadangi daugelis pašar ų gaminama iš žuvies milt ų, pašaras turi b ūti 
analizuojamas, ieškant bandomosios medžiagos. Taip pat pageidau ­
tina analizuoti pašar ą pesticidams ir sunkiesiems metalams nustatyti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. Š v i e s a i r t e m p e r a t ū r a 
Apšvietimo periodo trukm ė paprastai lygi 12–16 valand ų, o tempe ­
ratūra (± 2 °C) turi b ūti tinkama žuv ų rūšims (žr. 2 pried ėlį). Turi 
būti žinomas apšvietimo tipas ir jo charakteristikos. Reikia atkreipti 
dėmesį į galimą bandomosios medžiagos fotochemin į virsmą tyrimo 
metu naudoto apšvietimo s ąlygomis. Turi b ūti naudojamas tinkamas 
apšvietimas, vengiant žuvis veikti gamtoje nesan čiais fotocheminio 
irimo produktais. Kai kuriais atvejais gali b ūti reikalingas filtras, 
kuris nepraleist ų trumpesnio nei 290 nm bangos ilgio UV spindu ­
liuotės. 
1.8.2.7. B a n d o m o j i k o n c e n t r a c i j a  
Žuvys pratek ėjimo sąlygomis veikiamos vandenyje bent dvej ų 
koncentracij ų bandom ąja medžiaga. Paprastai didesn ė (arba 
didžiausia) bandomosios medžiagos koncentracija parenkama taip, 
kad ji būtų lygi maždaug 1 % jos ūmios asimptotin ės LC  50 ir būtų 
bent dešimt kart ų didesnė nei jos aptikimo riba vandenyje taikomu 
analizės metodu.  
Didžiausi ą bandomosios medžiagos koncentracij ą taip pat galima 
nustatyti padalinant ūmios 96 h LC  50 vertę iš atitinkamo ūmios ir 
lėtinės koncentracij ų santykio (kai kuri ų cheminių medžiag ų atitin­
kamas santykis gali keistis maždaug nuo 3 iki 100). Jei galima, 
pasirinkite kitoki ą koncentracij ą (-as), kuri b ūtų didesnė už nurody ­
tąją 10 kartų. Jei tai ne įmanoma d ėl 1 % LC  50 sąlygos ir analizinio 
nustatymo ribos, galima taikyti mažesn į nei 10 daugikl į arba turi b ūti 
atsižvelgta į galimyb ę naudoti  14 C žymėtą bandom ąją medžiag ą. 
Neturi būti naudojama koncentracija, kuri b ūtų didesnė nei bando ­
mosios medžiagos tirpumas.  
Jei naudojama tirpinimo medžiaga, jos koncentracija turi b ūti ne 
didesnė kaip 0,1 ml/l ir ji turi b ūti vienoda visuose bandymo 
induose. Turi b ūti žinoma, koki ą bendrosios organin ės anglies kiekio 
bandymo vandenyje dal į kartu sudaro ši medžiaga ir bandomoji 
medžiaga. Ta čiau reikia d ėti visas pastangas, kad toki ų medžiag ų 
naudoti nereik ėtų. 
1.8.2.8. K o n t r o l i n i a i b a n d y m a i  
Papildomai bandymo bandini ų serijai turi b ūti atliekamas skiedimo 
vandens tikrinimas arba, jei tinka, vandens su tirpinimo medžiaga tikrinimas, jei buvo nustatyta, kad tirpinimo medžiaga neveikia žuv ų. 
Jei taip n ėra, turi būti atliekami abu kontroliniai bandymai.
 
1.8.3.  Vandens kokyb ės matavim ų dažnis  
Bandymo metu visuose induose b ūtina matuoti ištirpus į deguonį, 
TOC, pH ir temperat ūrą. Bendrasis kietumas ir s ūrumas, jei tinka, 
turi būti nustatyti kontroliniuose bandiniuose ir viename inde su 
didesne (arba didžiausia) koncentracija. Turi b ūti nustatomas bent 
jau ištirpęs deguonis ir s ūrumas, jei tinka, ir tai daroma tris kartus 
– sugerties tarpsnio pradžioje, maždaug per vidur į ir pabaigoje, o 
apsivalymo laikotarpiu – kart ą per savait ę. TOC turi b ūti nustatyta 
bandymo pradžioje (24 valandos ir 48 valandos prieš pradedant 
sugerties tarpsn į) prieš žuv ų pridėjimą ir bent kart ą per savait ę suger­
ties iš apsivalymo tarpsni ų metu. Temperat ūra turi būti matuojama 
kasdien, pH kiekvieno laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, o kietumas 
kartą kiekviename bandyme. Temperat ūrą bent viename inde b ūtų 
geriausiai kontroliuoti nuolat.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Bandini ų ėmimas ir žuv ų bei vandens analiz ė 
1.8.4.1. Ž u v i e s i r v a n d e n s b a n d i n i o ė m i m o g r a f i k a s  
Vanduo iš bandymo kamer ų bandomosios medžiagos koncentracijai 
nustatyti imamas prieš žuv ų pridėjimą ir sugerties bei apsivalymo 
tarpsnių metu. Mažiausiai vandens bandinys imamas tuo pa čiu 
metu kaip ir žuvies bandinys ir dar prieš maitinim ą. Sugerties 
tarpsnio metu bandomosios medžiagos koncentracija nustatoma tikri ­
nant atitikt į patikimumo kriterijams.  
Žuvų bandinys imamas bent penkis kartus sugerties tarpsnio metu ir 
bent keturis kartus apsivalymo tarpsnio metu. Kadangi, remiantis 
tokiu bandini ų skaičiumi, kai kuriais atvejais bus sunku gauti pakan ­
kamai tiksl ų BKF vert ės įvertį, ypač kai pasirodo, kad apsivalymo 
kinetika n ėra pirmojo laipsnio, galima b ūtų patarti abiem tarpsniais 
bandinius imti dažniau (žr. 4 pried ėlį). Papildomi bandiniai dedami 
saugoti ir analizuojami tik tuo atveju, jei pasirodo, kad pirmosios 
eilės analizės duomen ų nepakanka BKF apskai čiuoti norimu tiks ­
lumu.  
Tinkamo bandini ų ėmimo grafiko pavyzdys pateiktas 4 pried ėlyje. 
Naudojant kitas P  ow numanomas vertes veikimo laikui, per kur į būtų 
pasiekta 95 % sugerties, apskai čiuoti, gali b ūti lengvai sudaryti kiti 
grafikai.  
Bandinių ėmimas sugerties tarpsnio metu t ęsiamas tol, kol pasie ­
kiama pastovioji b ūsena, bet ne ilgiau kaip 28 paras. Jei pastovioji 
būsena nebuvo pasiekta per 28 paras, bandini ų ėmimas tęsiamas 
toliau, kol pasiekiama pastovioji b ūsena, bet ne ilgiau kaip iki 60 
parų. Prieš pradedant apsivalymo tarpsn į, žuvys pernešamos į švarius 
rezervuarus.  
1.8.4.2. B a n d i n i ų ė m i m a s i r b a n d i n i o r u o š i m a s  
Vandens bandiniai analizei gaunami, pvz., siurbiant juos vamzdžiais 
iš inertiškos medžiagos, įstatytais į bandymo kameros vidur į. 
Kadangi įrodyta, kad filtravimas ir centrifugavimas ne visuomet 
leidžia atskirti bandomosios medžiagos biologiškai ne įsisavinam ą 
dalį nuo tos dalies, kuri yra biologiškai prieinama (ypa č labai lipo ­
filinių cheminių medžiag ų, t. y. toki ų medžiag ų, kurių log P  ow > 5) 
(1) (5), bandini ų tokiais b ūdais negalima apdoroti.  
Vietoj to reikia imtis priemoni ų, kad rezervuarai b ūtų kiek įmanoma 
švaresni, o bendrosios organin ės anglies kiekis sugerties ir apsiva ­
lymo tarpsni ų metu turi b ūti nuolat kontroliuojamas.  
Per kiekvien ą bandinio ėmimą iš bandymo kameros paimamas atitin ­
kamas žuv ų skaičius (paprastai ne mažiau kaip keturios žuvys). 
Bandinio žuvys iš karto nuplaunamos vandeniu, „sausinamos“ filtra ­
vimo popieriumi, tuojau pat numarinamos pa čiu tinkamiausiu ir 
humaniškiausiu b ūdu ir sveriamos.  
Vandenį ir žuvis geriausiai analizuoti iš karto po bandinio ėmimo, 
kad būtų išvengta irimo arba kit ų nuostolių, ir apskai čiuoti apytikrius 
sugerties bei apsivalymo grei čius bandymo eigoje. Iš karto atlikta 
analizė taip pat leidžia nev ėluojant nustatyti, kada pasiekiama hori ­
zontalioji sugerties kreiv ės dalis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Jei iš karto analiz ė neatliekama, bandiniai laikomi tinkamu b ūdu. 
Prieš pradedant tyrim ą gaunama informacija apie tinkam ą konkrečios 
bandomosios medžiagos laikymo metod ą, pvz., užšaldym ą, laikymą 
4 °C temperat ūroje, laikymo trukm ę, ekstrahavim ą ir t. t.  
1.8.4.3. A n a l i z ė s m e t o d o k o k y b ė 
Kadangi visa bandymo proced ūra iš esmės priklauso nuo bandomajai 
medžiagai nustatyti taikomo analiz ės metodo tikslumo, preciziškumo 
ir jautrumo, eksperimentiškai patikrinkite, ar konkretaus metodo cheminės analizės preciziškumas ir atkuriamumas, taip pat bandomo ­
sios medžiagos regeneravimas iš vandens ir žuvies yra pakankami. 
Taip pat patikrinkite, kad bandomoji medžiaga neb ūtų aptinkama 
naudojamame skiedimo vandenyje.
 
Jei būtina, bandyme gautoms C  w ir C  f vertės koreguojamos atsižvel ­
giant į regeneravimo ir fono kontroliniuose bandiniuose gautas 
vertes. Su žuvies ir vandens bandiniais vis ą laiką elgiamasi taip, 
kad užteršimas ir nuostoliai (pvz., d ėl bandinio ėmimo įtaiso adsorb ­
cijos) but ų kuo mažesni.  
1.8.4.4. Ž u v i e s b a n d i n i o a n a l i z ė 
Jei bandyme naudojamos žym ėtuosius atomus turin čios medžiagos, 
galima nustatyti bendr ą jų kiekį (t. y. pradin ę medžiag ą ir metabo ­
litus) arba bandiniai gali b ūti gryninami, kad pradin ę medžiag ą 
galima būtų analizuoti atskirai. Taip pat pasiekus pastovi ąją būseną 
arba sugerties tarpsnio pabaig ą (kas anks čiau) galima apib ūdinti 
pagrindinius metabolitus. Jei BKF, apskai čiuotas pagal bendr ąjį 
žymėtuosius atomus turin čių likučių kiekį, yra ≥ 1 000 %, b ūtų 
patartina, o kai kuri ų cheminių medžiag ų kategorij ų, pvz., pesticid ų, 
atveju labai rekomenduotina, identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus, kurie sudaro ≥ 10 % bendrojo liku čių kiekio žuvies 
audiniuose pastoviosios b ūsenos sąlygomis. Jei yra identifikuoti ir 
kiekybiškai nustatyti irimo produktai, kurie sudaro ≥ 10 % bendrojo 
žymėtuosius atomus turin č
ių likučių kiekio žuvies audiniuose, taip 
pat rekomenduojama identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus bandymo vandenyje.
 
Bandomosios medžiagos koncentracija paprastai turi b ūti nustatoma 
kiekvienoje pasvertoje atskiroje žuvyje. Jei tai ne įmanoma, kiekvieno 
bandinio ėmimo metu bandinius galima jungti, ta čiau bandini ų 
jungimas riboja statistines metodikas, kurios gal ėtų būti taikomos 
duomenims apdoroti. Jei svarbi yra specifin ė statistinė metodika ir 
jos statistinis reikšmingumas, tuomet bandyme turi b ūti naudojamas 
pakankamas žuv ų skaičius, kuris atitikt ų norimą bandinių jungimo 
metodiką ir statistin į reikšmingum ą (6) (7).  
BKF turi b ūti išreikštas kaip visos šlapios mas ės funkcija, o labai 
lipofiliškoms medžiagoms – kaip riebal ų kiekio funkcija. Riebal ų 
kiekis žuvyje nustatomas kiekvieno bandinio ėmimo metu, jei tai 
įmanoma. Riebal ų kiekiui nustatyti turi b ūti taikomi tinkami metodai 
(3 priedėlio 8 ir 2 nuorodos). Etaloniniu metodu gali b ūti rekomen ­
duota ekstrahavimo chloroformo ir metanolio mišiniu metodika (9). 
Įvairiais metodais gaunamos nevienodos vert ės (10), tod ėl svarbu 
pateikti taikyto metodo detales. Kai tai įmanoma, turi b ūti atliekama 
to paties ekstrakto, kuris buvo gautas bandomajai medžiagai anali ­
zuoti, riebal ų analizė, kadangi riebalus dažnai reikia pašalinti iš ekst ­
rakto prieš j į analizuojant chromatografiškai. Riebal ų kiekis žuvyje 
(mg/kg šlapios mas ės) bandymo pabaigoje turi nesiskirti nuo 
bandymo pradžioje nustatyto kiekio daugiau kaip ± 25 %. Taip pat reikia pateikti procentais apskai čiuotą sausos audinio medžiagos 
kiekį, kad riebal ų koncentracij ą būtų galima apskai čiuoti sausos 
medžiagos kiekiui.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Bandomosios medžiagos sugerties kreiv ė gaunama aritmetin ėje 
skalėje brėžiant sugerties tarpsnio metu gautos koncentracijos žuvyje 
arba jos paviršiuje (arba nustatytuose audiniuose) kitim ą laike. Jei 
kreivė pasiekė horizontali ąją dalį, t. y. pasidaro beveik asimptotiška 
laiko ašiai, pastoviosios b ūsenos BKF  NB apskaičiuojamas taip: 
Í ðC f ðpastovioji b ūsenaÞ ðvidutinė vertėÞÞ 
ðC w ðpastovioji b ūsenaÞ ðvidutinė vertėÞÞ Î 
Kai pastovioji b ūsena nepasiekiama, BKF  NB pakankamu pavojui 
įvertinti tikslumu gali b ūti įmanoma apskai čiuoti pagal 80 % 
(1,6/k  2 ) arba 95 % (3,0/k  2 ) „pastoviosios b ūsenos“ pusiausvyros.  
Taip pat nustatomas koncentravimo faktorius (BKF  K ), kaip dviej ų 
pirmojo laipsnio kinetini ų konstant ų k 1 /k 2 santykis. Apsivalymo 
greičio konstanta (k  2 ) paprastai nustatoma pagal apsivalymo kreiv ę 
(t. y. bandomosios medžiagos žuvyje koncentracijos maž ėjimo laike 
grafiką). Tuomet, turint k  2 vertę ir Cf, kuri gaunama pagal sugerties 
kreivę, apskaičiuojama sugerties grei čio konstanta (k  1 ) (taip pat žr. 5 
priedėlį). Tinkamiausias metodas BKF  K ir greičio konstantoms k  1 ir k 2 
apskaičiuoti yra netiesini ų parametr ų vertinimo metod ų taikymas 
panaudojant kompiuter į (11). Kitaip k  1 ir k  2 apskaičiuoti gali b ūti 
naudojami grafiniai metodai. Jei apsivalymo kreiv ė akivaizdžiai yra 
ne pirmojo laipsnio, turi b ūti taikomi sud ėtingesni modeliai (žr. 3 prie ­
dėlio nuorodas) ir prašoma biologin ės statistikos specialisto patarimo.  
2.3. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Rezultatai turi b ūti aiškinami atsargiai, jei išmatuotos bandom ųjų 
tirpalų koncentracijos yra arti analizinio metodo aptikimo ribos.  
Aiškiai apibr ėžtos sugerties ir apsivalymo kreiv ės yra biologinio 
koncentravimo duomen ų geros kokyb ės ženklas. Dviej ų bandomųjų 
koncentracij ų sugerties (apsivalymo) konstant ų kitimas turi b ūti 
mažesnis kaip 20 %. Steb ėti dviejų naudojam ų bandomųjų koncent­
racijų dideli sugerties (apsivalymo) grei čių skirtumai turi b ūti regist­
ruojami ir pateikti galimi aiškinimai. Dažniausiai gerai suplanuotuose tyrimuose BKF ver čių pasikliovimo riba art ėja prie ± 20 %.
 
3. ATASKAITA  
Bandymo ataskaita turi apimti toki ą informacij ą: 
3.1. BANDOMOJI MEDŽIAGA:  
— fizikin ė prigimtis ir, jei tinka, fizikin ės ir chemin ės savybės, 
— cheminio identifikavimo duomenys ( įskaitant organin ės anglies 
kiekį, jei tinka),  
— jei turi žym ėtųjų atomų, tiksli žym ėtojo (-ų) atomo (- ų) padėtis ir 
su priemaišomis siejamo radioaktyvumo procentin ė dalis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. BANDOMOSIOS R ŪŠYS 
— mokslinis pavadinimas, r ūšis, šaltinis, bet koks išankstinis apdo ­
rojimas, aklimatizavimas, amžius, dydžio intervalas ir t. t.  
3.3. BANDYMO S ĄLYGOS:  
— naudota bandymo metodika (pvz., dinaminis bandymas arba 
bandymas pusiau stacionariomis s ąlygomis),  
— naudoto apšvietimo tipas ir charakteristikos bei apšvietimo 
periodas (-ai),  
— bandymo schema (pvz., bandymo kamer ų skaičius ir dydis, 
vandens t ūrio pasikeitimo sparta, lygiagre čių bandymų skaičius, 
žuvų skaičius lygiagre čiame bandyme, bandyme naudot ų 
koncentracij ų skaičius, sugerties ir apsivalymo tarpsni ų trukmė, 
žuvų ir vandens bandini ų ėmimo dažnis),  
— pradini ų tirpalų ruošimo metodas ir j ų keitimo dažnis (jei naudo ­
jama tirpinimo medžiaga, turi b ūti nurodyta jos koncentracija ir 
dėl jos susidar ęs organin ės anglies kiekis bandymo vandenyje),  
— vardin ės bandomosios koncentracijos, bandymo rezervuaruose 
nustatytų koncentracij ų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokry ­
piai bei metodas, kuriuo jie buvo nustatyti,  
— skiedimo vandens šaltinis, bet kokio jo apdorojimo aprašymas, 
bandomųjų žuvų galimybi ų gyventi vandenyje įrodymo rezultatai 
ir vandens charakteristikos: pH, kietumas, temperat ūra, ištirpusio 
deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organin ė anglis, suspenduotos kietosios dalel ės, bando­
mosios terp ės sūrumas (jei tinka) ir visi kiti daryti matavimai,
 
— vandens kokyb ė bandymo rezervuaruose, pH, kietumas, TOC, 
temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija,  
— detali informacija apie maitinim ą (pvz., maisto tipas, šaltinis, 
sudėtis (bent riebal ų ir baltym ų kiekis, jei įmanoma) duodamas 
kiekis ir maitinimo dažnis),  
— informacija apie žuv ų ir vandens bandini ų apdorojim ą, įskaitant 
ruošimo, laikymo, ekstrahavimo detales ir bandomosios 
medžiagos bei riebal ų (jei nustatomi) analiz ės metodikas (ir 
preciziškum ą). 
3.4. REZULTATAI:  
— bet koki ų atliktų išankstini ų tyrimų rezultatai,  
— kontrolini ų žuvų ir žuvų kiekvienoje veikimo kameroje gaišta ­
mumas bei bet koks j ų neįprastas elgesys,  
— riebal ų kiekis žuvyje (jei nustatyta atliekant bandym ą), 
— kreivės (įskaitant visus matavimuose gautus duomenis), rodan ­ 
čios bandomosios medžiagos sugert į žuvimis, j ų apsivalym ą ir 
laiką iki pastoviosios b ūsenos,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— Cf ir Cw (ir j ų standartinis nuokrypis bei intervalas, jei tinka) 
visiems bandinio ėmimo atvejams (Cf išreikšta μg/g viso k ūno 
arba tam tikr ų jo audini ų, pvz., riebal ų, šlapios mas ės (ppm), o 
Cw – μg/ml (ppm)). Cw vert ės kontrolini ų bandym ų serijose 
(taip pat turi b ūti nurodytas fonas),  
— pastoviosios b ūsenos biologinio koncentravimo faktorius 
(BKF  NB ) ir (arba) kinetinis koncentravimo faktorius (BKF  K ) ir, 
jei taikytina, 95 % pasikliovimo ribos sugerties ir apsivalymo 
(netekimo) grei čio konstantoms (viskas apskai čiuota viso gyv ūno 
kūno ir bendro riebal ų kiekio, jei nustatytas, arba tam tikr ų jo 
audinių atžvilgiu), pasikliovimo ribos ir standartinis nuokrypis 
(kai yra) bei apskai čiavimo (duomen ų analizės) metodai kiek ­
vienai naudotos bandomosios medžiagos koncentracijai,  
— jei naudojamos žym ėtuosius atomus turin čios medžiagos ir jei to 
reikia, gali b ūti pateikti bet koki ų aptiktų metabolit ų kaupimosi 
rezultatai,  
— visa, kas bandyme buvo ne įprasto, bet koks nukrypimas nuo ši ų 
metodikų ir bet kuri kita susijusi informacija.  
Mažinkite rezultat ų, kurie būtų „nenustatyti aptikimo riboje“, kiek į, 
kurdami išankstinio bandymo metodus ir vykdydami bandym ų plana­
vimą, kadangi tokie rezultatai negali b ūti panaudoti grei čio konstan ­
toms apskai čiuoti.  
4. NUORODOS  
1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. 
Toxicol. 102, p. 117–156.  
2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Nonlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29–390.
 
3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and SAFEty Guidance Docu ­
ment Series on Testing and Assessment of Chemicals. No. 3.  
4) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavai ­
lability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
 
5) US EPA 822-R-94–002 (1994) Great Lake Water Quality Initia ­
tive Technical Support Document for the Procedure to Deter ­
mine Bioaccumulation Factors. July 1994.  
6) US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher’s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
 
7) US EPA (1974). Section 5, A(l) Analysis of Human or Animal 
Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research 
Triangle Park, N.C. 27711.
 
8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: 
degradation, toxicity, bioaccumulation“ Ch. 2.3, Part II. 
Government Publishing Office, the Hague, The Netherlands.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
9) Gardner et al, (1995) Limn. & Oceanogr. 30, 1099–1105.  
10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, 
pp 1431–1436.  
11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. 
Nyholm.
 
12) ASTM E-1022–84 (Reapproved 1988) Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Molluscs.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
1 priedėlis 
Skiedimui tinkamo vandens chemin ės savybės 
Medžiaga  Didžiausia koncentracija  
1 Kietosios dalel ės 5 mg/l  
2 Bendroji organin ė anglis  2 mg/l  
3 Nejonizuotas amoniakas  1 μg/l 
4 Liekamasis chloras  10 μg/l 
5 Bendras fosforo organini ų pesticidų kiekis  50 ng/l  
6 Bendras chloro organini ų pesticidų ir polichlorint ų 
bifenilų kiekis  50 ng/l  
7 Bendras organinis chloras  25 ng/l  
8 Aliuminis  1 μg/l 
9 Arsenas  1 μg/l 
10 Chromas  1 μg/l 
11 Kobaltas  1 μg/l 
12 Varis  1 μg/l 
13 Geležis  1 μg/l 
14 Švinas  1 μg/l 
15 Nikelis  1 μg/l 
16 Cinkas  1 μg/l 
17 Kadmis  100 ng/l  
18 Gyvsidabris  100 ng/l  
19 Sidabras  100 ng/l  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
2 priedėlis 
Bandymui rekomenduojamos žuv ų rūšys 
Rekomenduojamos r ūšys Rekomenduo ­
jamas bandymo 
temperatūros 
intervalas (°C)  Rekomenduo ­
jamas bandomojo 
gyvūno bendras 
ilgis (cm)  
1 Danio rerio  ( 1 )(Teleostei, Cyprinidae)  (Hamilton- 
Buchanan) Zebrin ė danija  20–25  3,0 ± 0,5  
2 Pimephales promelas  (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque)  Juodoji dr ūtgalvė rainė 20–25  5,0 ± 2,0  
3 Cyprinus  carpio ( Teleostei, Cyprinidae ) (Linnaeus) 
Paprastasis karpis  20–25  5,0 ± 3,0  
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae)  (Temminck ir 
Schlegel) Japonin ė medaka  20–25  4,0 ± 1,0  
5 Poecilia  reticulata (Teleostei,  Poeciiidae ) (Peters) 
Paprastasis gupis  20–25  3,0 ± 1,0  
6 Lepomis macrochirus (Teleostei , Centrarchidae ) 
(Rafinesque) Melsvažiaunis saulešeris  20–25  5,0 ± 2,0  
7 Oncorhynchus mykiss ( Teleostei,  Salmonidae) 
(Walbaum)  Vaivorykštinis up ėtakis  13–17  8,0 ± 4,0  
8 Gasterosteus  aculeatus  (Teleostei, Gusterosteidoe) 
(Linnaeus) Trispygl ė dyglė 18–20  3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., VoL 252, p. 231.  
Skirtingose šalyse naudojamos įvairios upi ų žiočių ir jūros žuvų rūšys, pvz.: 
Spotas  Leiostomus xanthurus  
Lėlžuvė Cyprinodon variegatus  
Priekrantin ė menidija  Menidia beryllina  
Gyvavedis šaineris  Cymatogaster aggregata  
Kalifornijos j ūrų liežuvis  Parophrys vetulus  
Siauragalv ė plernė Leptocottus armatus  
Trispyglė dyglė Gasterosteus aculeatus  
Paprastasis vilkešeris  Dicentrarchus labrax  
Paprastoji aukšl ė Alburnus alburnus  
Rinkimas  
Lentelėje nurodytas g ėlųjų vandenų žuvis lengva auginti ir (arba) j ų galima gauti ištisus metus, tuo 
tarpu galimyb ė gauti jūros ir upi ų žiočių žuvų iš dalies apsiriboja atitinkamomis šalimis. Žuvis 
galima auginti ir veisti žuv ų fermose arba laboratorijoje lig ų ir parazit ų kontrolės sąlygomis, kad 
bandomieji gyv ūnai būtų sveiki ir b ūtų žinoma j ų kilmė. Šių žuvų yra daugelyje pasaulio krašt ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
3 priedėlis 
Sugerties ir apsivalymo tarpsni ų trukmės prognozavimas  
1. Sugerties tarpsnio trukm ės prognozavimas  
Prieš atliekant bandym ą, k 2 įvertis, taigi, pastoviajai b ūsenai pasiekti reika ­
lingo laiko tam tikra procentin ė dalis, gali b ūti gauta iš empirini ų priklau­
somybių tarp k  2 ir pasiskirstymo koeficiento (n-oktanolis/vanduo) (P  ow ) 
arba k  2 ir tirpumo vandenyje (s).  
k 2 (para  -1 ) įvertis gali b ūti gautas, pvz., pagal toki ą empirinę priklausomyb ę (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95)  (1 lygtis)  
Kitos priklausomyb ės pateiktos 2 nuorodoje.  
Jei pasiskirstymo koeficientas (P  ow ) nežinomas, įvertis gali b ūti padarytas (3), 
jei žinomas medžiagos tirpumas vandenyje (s), taikant lygt į: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994),  (2 lygtis)  
kurioje  
s = tirpumas (mol/l): (n = 36).  
Šios priklausomyb ės tinka tik toms chemin ėms medžiagoms, kuri ų log 
(P ow ) vertės yra nuo 2 iki 6,5 (4).  
Pastoviajai b ūsenai pasiekti reikalingo laiko tam tikra procentin ė dalis, 
taikant k  2 įvertį, gali būti nustatyta iš bendrosios kinetin ės lygties, aprašan ­ 
čios sugert į ir apsivalym ą (pirmojo laipsnio kinetika):  
Í ðdC f Þ 
ðdtÞ Î 
¼ ðk 1 · C w – k 2 · Cf Þ 
arba, jei C  w yra pastovus dydis:  
C f ¼ Í ðk 1 Þ 
ðk 2 Þ Î 
· C w ð1 – e Äk 2 t Þ (3 lygtis)  
Artėjant prie pastoviosios b ūsenos (t→ ∞), 3 lygtis gali b ūti supaprastinta 
(5) (6) iki:  
C f ¼ Í ðk 1 Þ 
ðk 2 Þ Î 
· C w arba C  f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
Tokiu atveju, k  l /k 2 · C w yra arti koncentracijos žuvyje „pastoviosios 
būsenos“ sąlygomis (C  f , s ). 
3 lygtis gali b ūti pertvarkyta į 
C f ¼ ðC f ,sð1 – e Äk 2 t ÞÞ arba Í ðC f Þ 
ðC fs Þ Î 
¼ ð1 – e Äk 2 t Þ (4 lygtis)  
Taikant 4 lygt į, galima prognozuoti laik ą, reikaling ą pasiekti tam tikr ą 
pastoviosios b ūsenos procentin ę dalį, kai pagal 1 arba 2 lygt į iš anksto 
yra įvertinta k  2 . ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Statistiškai priimtiniems duomenims (BKF  K ) gauti statistiškai optimalios 
sugerties tarpsnio trukm ės atskaitos tašku laikomas laikas, per kur į kreivė, 
vaizduojanti priklausomyb ę tarp bandomosios medžiagos žuvyje koncent ­
racijos logaritmo ir tiesin ėje skalėje atidėto laiko, pasiekt ų jos vidurio tašk ą 
arba 1,6/k  2 , arba 80 % pastoviosios b ūsenos, tačiau ne didesnis kaip 3,0/k  2 , 
arba 95 % pastoviosios b ūsenos (7).  
Laikas 80 % pastoviosios b ūsenos pasiekti yra lygus (4 lygtis):  
0,80 ¼ 1 – e Äk 2 t 80 arba t 80 ¼ Í ð1,6Þ 
ðk 2 Þ Î 
(5 lygtis)  
Panašiu b ūdu, laikas 95 % pastoviosios b ūsenos pasiekti yra lygus:  
t 95 ¼ Í ð3,0Þ 
ðk 2 Þ Î 
(6 lygtis)  
Pvz., sugerties tarpsnio trukm ė (sug) bandomajai medžiagai, kurios 
log P  ow = 4, būtų (taikant lygtis 1, 5 ir 6): 
log 10 k 2 = – 0,414.(4) + 1,47  k  2 = 0,652 paros  -1 
sug (80 %) = 1,6/0,652, t. y. 2,45 paros (59 valandos)  
arba sug (95 %) = 3,0/0,652, t. y. 4,60 paros (110 valand ų) 
Panašiai, jei bandomosios medžiagos s = 10–5 mol/l (log(s)= – 5,0), sug 
trukmė būtų (taikant lygtis 1,2, 5 ir 6):  
log 10 (P ow ) = – 0,862 (– 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 k 2= – 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 paros  –1 
sug (80 %) = 1,6/0,246, t. y. 6,5 paros (156 valandos)  
arba sug (95 %) = 3,0/0,246, t. y. 12,2 paros (293 valandos)  
Kaip alternatyva, lygtis:  
T eq = 6,54 × 10  3 P ow + 55,31 (valandos)  
gali būti naudojama apskai čiuoti laik ą, reikaling ą tikrajai pastoviajai 
būsenai pasiekti (4).  
2. Apsivalymo tarpsnio trukm ės prognozavimas  
Laikas, per kur į organizme sulaikytos medžiagos kiekis sumaž ėja iki tam 
tikros pradin ės koncentracijos procentin ės dalies, taip pat gali b ūti progno ­
zuojamas, taikant bendr ąją lygtį, kuri aprašo sugert į ir apsivalym ą (pirmojo 
laipsnio kinetika) (1) (8).  
Apsivalymo tarpsnio atveju daroma prielaida, kad C  w lygi nuliui. Lygtis 
gali būti paversta į lygtį: 
Í ðdC f Þ 
ðdtÞ Î 
¼ ðÄk 2 C f Þ arba  C f ¼ ðC f,o · e Äk 2 t Þ ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
kurioje  C f , o yra koncentracija apsivalymo tarpsnio pradžioje. Tuomet 50 % 
apsivalymas bus pasiektas per laik ą (t 50 ): 
Í ðC f Þ 
ðC f,o Þ Î 
¼ Í ð1Þ 
ð2Þ Î 
¼ ðe Äk 2 t 50 Þ arba  t 50 ¼ Í ð0,693Þ 
ðk 2 Þ Î 
Panašiai, 95 % apsivalymas bus pasiektas per laik ą: 
t 95 ¼ Í ð3,0Þ 
ðk 2 Þ Î 
Jei pirmajam periodui naudojama sugerties trukm ė sudaro 80 % (1,6/k  2 ), o 
apsivalymo tarpsnyje sumaž ėjimas sudaro 95 % (3,0/k  2 ), tuomet apsiva ­
lymo tarpsnis trunka maždaug du kartus ilgiau nei sugerties tarpsnis.  
Tačiau svarbu pažym ėti, kad įverčiai remiasi prielaida, kad sugerties ir 
apsivalymo modeliai atitinka pirmojo laipsnio kinetik ą. Jei pirmojo laipsnio 
kinetikos akivaizdžiai nepaisoma, turi b ūti naudojami sud ėtingesni modeliai 
(pvz., (1) nuoroda).  
Nuorodos (3 pried ėlio) 
1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982). Alternative models for describing 
the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, p. 309–320.
 
2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particu ­
late matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality 
Institute.  
3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982). Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4–10.
 
4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coeffi ­
cient of lipophilic compounds on bioconcentralion kinetics with fish. 
Wat. Res. 22 (6), pp. 701–707.  
5) Branson D. R, Blau G. E, Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785–792.  
6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of 
tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte P., Klein W. and Bourdeau P.H. Part 4.4, pp. 
243–255. SCOPE, 1985, John Wiley & amp; Sons Ltd N.Y.
 
7) Reilly P. M, Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhotf 
M.W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to esti ­
mate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55. pp. 614–622.
 
8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. 
Chemosphere, 9, p. 3–19.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
4 priedėlis 
Bandinių ėmimo tiriant medžiag ų, kurių log P  ow = 4, Biologin į koncentravim ą, grafiko teorinis pavyzdys  
Žuvų bandinių ėmimas  Bandinių ėmimo tvarkaraštis  
Vandens bandini ų 
skaičius Žuvų skaičius bandinyje  Mažiausias reikalingas 
dažnis (paros)  Papildomas bandini ų 
ėmimas  
Sugerties tarpsnis  -1 
0 2 (*) 
2 Pridėti 45–80 žuv ų 
1-asis  0,3  0,4  2 
(2) 4 
(4) 
2-asis  0,6  0,9  2 
(2) 4 
(4) 
3-asis  1,2  1,7  2 
(2) 4 
(4) 
4-asis  2,4  3,3  2 
(2) 4 
(4) 
5-asis  4,7  2  6  
Apsivalymo tarpsnis  Pernešti žuvis į 
vandenį be bandomo ­
sios medžiagos  
6-asis  5,0  5,3  4 
(4) 
7-asis  5,9  7,0  4 
(4) 
8-asis  9,3  11,2  4 
(4) 
9-asis  14,0  17,5  6 
(4) 
(*) Vandens bandinys imamas po to, kai buvo patiekti mažiausiai trys „kameros t ūriai“.  
Pastaba : Prieš bandym ą darytas k  2 įvertis, kai log P  ow = 4,0, yra 0,652 paros  -1 . Bendra bandymo trukm ė nustatyta 3 × sug = 3 × 4,6 
paros, t. y. 14 par ų. Kaip vertinti „sug“, žr. 3 pried ėlį.„“ 
Vertės skliausteliuose rodo bandini ų (vandens, žuv ų) skaičių, kurį reikia paimti, jei daromas papildomas bandini ų ėmimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
5 priedėlis 
Modelio pasirinkimas  
Buvo padaryta prielaida, kad biologinio koncentravimo duomenys „pakankamai“ 
gerai aprašomi paprasto dviej ų kamerų ir dviejų parametr ų modelio, k ą rodo 
ištiesinta kreiv ė, aproksimuojanti koncentracijos žuvyje apsivalymo tarpsnio 
metu taškus, kai jie vaizduojami pusiau logaritminiame popieriuje. (Jei šie taškai negali būti aprašyti ištiesinta kreive, tuomet reikia naudoti sud ėtingesnius mode ­
lius, žr. pvz., Spacie ir Hamelink, 3 pried ėlio 1 nuoroda).
 
Grafinis metodas apsivalymo (netekimo) grei čio konstantai k  2 nustatyti  
Pusiau logaritminiame popieriuje nubraižykite kiekviename žuvies bandinyje 
rastos bandomosios medžiagos koncentracijos kitimo laike grafik ą. Šios ties ės 
krypties koeficientas yra k  2 . 
k 2 ¼ ðln ðC f1= C f2 ÞÞ 
ðt 2 – t 1 Þ
 
Atkreipkite d ėmesį, kad nukrypimai nuo ties ės gali reikšti, kad apsivalymo 
modelis yra sud ėtingesnis, nei pirmojo laipsnio kinetika. Norint spr ęsti apie tai, 
ar apsivalymo tipas nukrypsta nuo pirmojo laipsnio kinetikos, galima taikyti 
grafinį metodą. 
Grafinis metodas sugerties grei čio konstantai k  1 nustatyti  
Duotai k  2 vertei k  1 apskaičiuokite taip:  
k 1 ¼ ðC f k 2 Þ 
ðC w Ü ð1 – e Äk 2 t ÞÞ (1 lygtis)  
C f vertė nustatoma pagal lygios sugerties kreiv ės, nubrėžtos remiantis gautais 
duomenimis, kai braižoma log koncentracijos priklausomyb ė nuo laiko (aritme ­
tinėje skalėje), vidurio tašk ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Kompiuteriniai metodai sugerties ir apsivalymo (netekimo) grei čio 
konstantoms apskai čiuoti  
Geriausia priemon ė biologinio koncentravimo faktoriui ir k  1 bei k  2 greičio 
konstantoms apskai čiuoti yra netiesini ų parametr ų vertinimo metod ų taikymas 
panaudojant kompiuter į. Jei duota koncentracijos kitimo laike duomen ų aibė ir 
modelis, šios programos apskai čiuoja k  1 ir k  2 vertes:  
C f ¼ C w · Í ðk 1 Þ 
ðk 2 Þ Î 
Ü ð1 – e Äk 2 t Þ 0 < t < t  c (2 lygtis)  
C f ¼ C w · Í ðk 1 Þ 
ðk 2 Þ Î 
Ü ððe Äk 2 ðt – t  c Þ Þ – ðe Ä k 2 t ÞÞ t > t  c (3 lygtis)  
čia: t  c = sugerties tarpsnio pabaigos laikas.  
Šis metodas duoda k  1 ir k  2 standartinio nuokrypio įverčius. 
Kadangi k  2 didesnei daliai atvej ų pagal apsivalymo kreiv ę gali būti įvertinta 
palyginus labai tiksliai ir kadangi tarp dviej ų parametr ų k 1 ir k  2 , jei juos vertinti 
vienu metu, yra stipri koreliacija, galima b ūtų patarti iš pradži ų tik pagal apsi ­
valymo duomenis apskai čiuoti k  2 , o vėliau pagal sugerties duomenis, taikant 
netiesinę regresiją, apskaičiuoti k  1 . ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  ŽUV Ų MAILIAUS AUGIMO BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis toksiškumo augimui bandymo metodas yra OECD TG 215 
(2000) kopija.  
1.1. ĮVADAS  
Šis bandymas skirtas įvertinti ilgo veikimo chemin ėmis medžiagomis 
poveikį žuvų mailiaus augimui. Jis pagr įstas Europos S ąjungoje 
sukurtu ir tarplaboratoriniais bandymais patikrintu (1) (3) dinaminiu 
metodu, taikytu įvertinti chemini ų medžiag ų poveikį vaivorykštinio 
upėtakio ( Oncorynchus mykiss ) mailiaus augimui. Galima naudoti 
kitas dokumentais tinkamai patvirtintas r ūšis. Pvz., įgyta patirties 
atliekant zebrin ės danijos ( Danio rerio ) ( 1 ) (3) (4) ir japonin ės 
medakos ( medaka, Oryzias latipes ) (5) (6) (7) augimo bandymus.  
Žr. taip pat C dalies bendr ąjį įvadą. 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Mažiausia pastebim ą poveikį sukelianti koncentracija (LOEC)  – 
mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant 
medžiaga turi didel į poveikį (p < 0,05) lyginant su kontroliniais 
bandiniais. Ta čiau visų didesnių kaip LOEC bandom ųjų koncentra ­
cijų kenksmingas poveikis turi b ūti lygus ar didesnis už LOEC 
poveikį. 
Nepasteb ėto poveikio koncentracija (NOEC)  – bent kiek už LOEC 
mažesnė bandomoji koncentracija.  
EC X – šiame bandyme tai bandomosios medžiagos koncentracija, 
kuriai esant žuv ų augimo grei čio pokytis lyginant su kontroliniais 
bandiniais yra x %.  
Įkrova  – gyvų žuvų masė, tenkanti vandens t ūrio vienetui.  
Žuvų tankis  – žuvų skaičius, tenkantis vandens t ūrio vienetui.  
Atskiros žuvies savitasis augimo greitis  išreiškia atskiros žuvies 
augimo greit į pagal jos pradin ę masę. 
Vidutinis savitasis augimo greitis rezervuare  išreiškia rezervuaro 
populiacijos vidutin į augimo greit į esant vienai koncentracijai.  
„Pseudo “ savitasis augimo greitis  išreiškia atskir ų žuvų augimo 
greitį lyginant su rezervuaro populiacijos vidutine pradine mase.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish 
(Danio rerio ), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, p. 231–236.
 1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Eksponentinio augimo tarpsnio žuv ų mailius pasveriamas, dedamas į 
bandymo kameras, kur jis geriau dinaminio bandymo s ąlygomis ar, 
jei neįmanoma, atitinkamomis pusiau statinio bandymo (periodinio 
atnaujinimo) s ąlygomis yra veikiamas bandomosios medžiagos 
subletalios koncentracijos intervalo vandeniniais tirpalais. Bandymo 
trukmė 28 paros. Žuvys maitinamos kasdien. Maisto norma nusta ­
toma pagal pradin ę žuvų masę ir po 14 par ų gali būti apskaičiuojama 
iš naujo. Bandymo pabaigoje žuvys v ėl sveriamos. Taikant regresijos 
modelį analizuojamas poveikis augimo grei čiui norint nustatyti 
koncentracij ą, sukelian čią x % augimo grei čio pokytį, t y. EC  X 
(pvz., EC  10 , EC  20 ar EC  30 ). Be to, mažiausiai pastebim ą poveikį 
sukeliančiai koncentracijai (LOEC), taigi ir nepasteb ėto poveikio 
koncentracijai (NOEC) nustatyti duomenis galima lyginti su kontro ­
linių bandinių vertėmis. 
1.4. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Reikėtų turėti ūmaus toksiškumo bandymo (žr. C.1 bandymo 
metodą), geriau atlikto su šiam bandymui pasirinkta r ūšimi, rezul ­
tatus. Tai reikšt ų, kad yra žinomas bandomosios medžiagos tirpumas 
vandenyje ir gar ų slėgis ir kad yra patikimas analiz ės metodas 
bandomajai medžiagai bandomuosiuose tirpaluose kiekybiškai nusta ­
tyti žinomu tikslumu ir aptikimo riba, kurie nurodyti ataskaitoje.  
Naudingą informacij ą sudaro strukt ūrinė formulė, medžiagos 
grynumas, stabilumas vandenyje ir veikiant šviesai, pK  a , P  ow ir 
lengvo biologinio skaidumo bandymo rezultatai (žr. C.4 metod ą). 
1.5. BANDYMO TINKAMUMAS  
Bandymas yra tinkamas, jei įvykdytos šios s ąlygos:  
— baigiant bandym ą kontrolinio (-i ų) bandinio (-i ų) žuvų gaišta­
mumas turi b ūti ne didesnis kaip 10 %,  
— kontrolinio (-i ų) bandinio (-i ų) vidutin ė žuvų masė turi būti 
pakankamai padid ėjusi, kad b ūtų galima aptikti mažiausi ą 
augimo grei čio kitimą, kuris laikomas reikšmingu. Tarplaborato ­
rinio lyginimo bandymas (2) parod ė, kad kontrolini ų bandinių 
vaivorykštinio up ėtakio vidutin ė masė per 28 paras turi padid ėti 
bent pusę jo pradin ės vidutinės masės (t. y. 50 %); pvz., pradin ė 
masė: 1 g/žuviai (= 100 %), galutin ė masė po 28 par ų: ≥ 1,5 
g/žuviai ( ≥ 150 %),  
— ištirpusio deguonies koncentracija per vis ą bandymą turi sudaryti 
bent 60 % oro prisotinimo vert ės (ASV),  
— kiekvienu bandymo momentu bandymo kamer ų vandens tempe ­
ratūra turi nesiskirti daugiau kaip ± 1 °C ir b ūti palaikoma 2 °C 
intervale bandomosioms r ūšims nurodytame intervale (1 prie ­
dėlis). 
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Aparat ūra 
Įprasta laboratorin ė įranga ir ši speciali įranga:  
— deguonies ir pH matuokliai,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— įranga vandens kietumui ir šarmingumui nustatyti,  
— atitinkama aparat ūra temperat ūrai kontroliuoti, geriau nuolatin ės 
kontrolės aparatūra, 
— rezervuarai, pagaminti iš chemiškai inertiškos medžiagos, kuri ų 
talpa atitinka rekomenduot ą įkrovą bei žuv ų tankį (žr. 1.8.5 
skirsnį ir 1 pried ėlį), 
— reikiamo tikslumo svarstykl ės (t. y. ± 0,5 % tikslumo).  
1.6.2.  Vanduo  
Galima naudoti bet kok į vandenį, kuriame žuvys gali ilgai gyventi ir 
augti. Vandens kokyb ė turi būti pastovi vis ą bandymo laik ą. pH 
vertė turi būti 6,5– 8,5, ta čiau atliekant konkret ų bandym ą pH 
reikšmė neturi kisti daugiau kaip ± 0,5 pH vieneto. Rekomenduo ­
jamas didesnis kaip 140 mg/l (skai čiuojant CaCO  3 ) kietumas. Norint 
užtikrinti, kad skiedimo vanduo per daug netur ėtų įtakos bandymo 
rezultatui (pvz., nesudaryt ų kompleksini ų junginių su bandom ąja 
medžiaga), bandiniai tam tikrais laiko tarpais turi b ūti analizuojami. 
Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindini ų 
anijonų ir katijon ų (pvz., Ca, Mg, Na, K, C1, SO  4 ), pesticid ų (pvz., 
bendro fosforo organini ų pesticidų ir bendro chloro organini ų pesti­
cidų kiekio), bendrosios organin ės anglies ir suspenduot ų kietųjų 
dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris m ėnesius, 
jei žinoma, kad skiedimo vandens kokyb ė yra gana pastovi. Jei 
buvo įrodyta, kad vandens kokyb ė yra pastovi bent metus, analiz ė 
gali būti atliekama ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas 
šešis mėnesius). Kai kurios skiedimui tinkamo vandens charakteris ­
tikos yra pateiktos 2 pried ėlyje. 
1.6.3.  Bandomieji tirpalai  
Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant 
pradinį tirpalą. 
Pradinį tirpalą geriau ruošti bandom ąją medžiag ą maišant ar plakant 
skiedimo vandenyje mechanin ėmis priemon ėmis (pvz., maišykle ar 
ultragarsu). Pakankamai koncentruotam pradiniam tirpalui ruošti 
galima naudoti prisotinimo kolon ėles (tirpumo kolon ėles). 
Kartais norint gauti tinkamos koncentracijos pradin į tirpalą gali tekti 
naudoti tirpiklius ar dispergatorius (tirpinimo medžiagas). Tinkami 
tirpikliai yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dime ­
tilformamidas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra  
Cremophor  RH40,  Tween  80, 0,01 % metilceliulioz ė ir HCO-40. 
Reikėtų atsargiai naudoti lengvai biologiškai skaidomas medžiagas 
(pvz., aceton ą) ir (ar) labai lakius junginius, nes, atliekant dinaminius 
bandymus, jie gali kelti problem ų dėl bakterij ų kaupimosi. Naudo ­
jama tirpinimo medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio žuv ų 
augimui ir neigiamo poveikio mailiui, kaip kad nustatoma atliekant 
kontrolinį bandymą vien tik su tirpikliu.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Įvairios bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo kameras 
tiekti dinamini ų bandymų metu reikalinga sistema, kuri nepertrau ­
kiamai dozuot ų ir skiest ų bandomosios medžiagos pradin į tirpalą 
(pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradini ų tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi b ūti 
kartais, geriau kasdien, tikrinami ir per vis ą bandymą neturėtų kisti 
daugiau kaip 10 %. Tarplaboratorinio palyginimo bandymas (2) parodė, kad, atliekant bandym ą su vaivorykštiniu up ėtakiu, yra 
priimtinas 6 litr ų/g žuvies/parai vandens keitimo dažnis (žr. 1.8.2.2 
skirsnį).
 
Pusiau statiniams (atnaujinimo) bandymams terp ės atnaujinimo 
dažnis priklausys nuo bandomosios medžiagos stabilumo, ta čiau 
vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo 
bandymai (žr. 1.4 skirsn į) rodo, kad bandomosios medžiagos 
koncentracija laikotarpiu tarp atnaujinim ų yra nestabili (t. y. yra už 
80–120 % vardin ės koncentracijos rib ų ar mažesn ė kaip 80 % išma ­
tuotos pradin ės koncentracijos), reik ėtų numatyti dinamin į bandymą. 
1.6.4.  Rūšių parinkimas  
Šiam bandymui rekomenduojama r ūšis yra vaivorykštinis up ėtakis 
(Oncorhynchus mykiss ), nes didžiausia tarplaboratorinio palyginimo 
bandymų patirtis buvo sukaupta naudojant ši ą rūšį (1) (2). Galima 
naudoti ir kitas dokumentais tinkamai patvirtintas r ūšis, bet tinka ­
moms bandymo s ąlygoms gauti bandymo metodik ą gali tekti pritai ­
kyti. Pvz., įgyta patirties su zebrine danija ( Danio rerio ) (3) (4) ir 
japonine medaka ( medaka, Oryzias latipes ) (5) (6) (7). Tokiu atveju 
ataskaitoje reikia pateikti r ūšies pasirinkimo priežast į ir bandymo 
metodą. 
1.6.5.  Žuv ų laikymas  
Pasirenkamos vienos populiacijos ir geriau to paties neršto bando ­
mosios žuvys, kurios prieš bandym ą bent dvi savaites buvo laikomos 
tokios kokyb ės vandenyje ir tokiomis apšvietimo s ąlygomis, kurios 
panašios į bandymo s ąlygas. Jų dienos maisto davinys laikymo ir 
bandymo laikotarpiu turi sudaryti ne mažiau kaip 2 % k ūno masės, 
bet geriau 4 % k ūno masės. 
Po 48 valand ų stabilizavimo laikotarpio užrašomi gaištamumo 
duomenys ir taikomi šie kriterijai:  
— populiacijos gaištamumas per septynias paras yra didesnis kaip 
10 %: visa partija atmetama,  
— populiacijos gaištamumas 5–10 %: žuvys papildomai aklimati ­
zuojamos dar septynias paras; jei per kitas septynias paras gaiš ­
tamumas yra didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama,  
— populiacijos gaištamumas per septyniais paras yra mažesnis kaip 
5 %: partija priimama.  
Dvi savaites prieš bandym ą ir visą bandymo laik ą žuvys netur ėtų 
būti gydomos vaistais.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. BANDYMO SCHEMA  
„Bandymo schema“ – bandomosios koncentracijos ver čių ir tarpo 
tarp jų pasirinkimas, rezervuar ų skaičiaus kiekvienai koncentracijai 
ir žuvų skaičiaus viename rezervuare parinkimas. Geriausia b ūtų, kad 
bandymo schema b ūtų pasirinkta atsižvelgiant į: 
— tyrimo tiksl ą, 
— taikom ą statistinės analizės metodą, 
— bandymo ištekli ų buvimą ir kainą. 
Jei įmanoma, išd ėstant tiksl ą reikėtų nurodyti statistin ę galią duoto 
dydžio (pvz., augimo grei čio) skirtumui aptikti, arba kitaip, koks turi 
būti EC  X (pvz., kai x = 10, 20 ar 30 ir geriau ne mažesnis kaip 10) 
įvertinimo preciziškumas. Be šito negalima tiksliai apibr ėžti tyrimo 
apimties.  
Svarbu pripažinti, kad vienam statistin ės analizės metodui taikytas 
optimalus (geriausiai panaudoja išteklius) planas neb ūtinai yra opti ­
malus kitam metodui. Taigi rekomenduotas planas LOEC/NOEC įvertinti nebus toks pat kaip regresinei analizei rekomenduotas 
planas.
 
Dėl Stephan ir Rogers (8) svarstyt ų priežasčių regresin ė analizė 
dažniausiai tinka geriau nei dispersin ė analizė. Tačiau nerandant 
tinkamo regresijos modelio (r  2 < 0,9), reikia taikyti NOEC/LOEC 
įvertinimą. 
1.7.1.  Regresin ės analizės planas  
Svarbūs regresijos metodu analizuojamos bandymo schemos nagri ­
nėtini klausimai yra šie:  
— Bandymui naudotos koncentracijos b ūtinai turi apr ėpti poveikio 
koncentracij ą (pvz., EC  10 , 20 , 30 ) ir dominan čio medžiagos 
poveikio koncentracijos ver čių intervalą. Poveikio koncentracijos 
įverčių preciziškumas bus geriausias, kai poveikio koncentracijos 
bus per bandom ųjų koncentracijos ver čių intervalo vidur į. Tinka­
moms bandomosioms koncentracijoms parinkti gali b ūti 
naudingas išankstinis intervalo nustatymo bandymas.  
— Norint tur ėti tinkamą statistinį modelį, bandymui turi b ūti naudo­
jamas vienas kontrolinis rezervuaras ir penki papildomi rezer ­
vuarai, skirti skirtingoms koncentracijos vert ėms. Jei naudojama 
tirpinimo medžiaga, be bandomosios serijos, turi b ūti dar vienas 
kontrolinis bandinys su didžiausios bandomosios koncentracijos 
tirpinimo medžiaga (žr. 1.8.3 ir 1.8.4 skirsnius).  
— Galima naudoti tinkam ą geometrin ės progresijos ar logaritmin ę 
eilutę (9) (žr. 3 pried ėlį). Geriau naudoti logaritmin ę bandomųjų 
koncentracij ų eilutę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— Jei yra daugiau kaip šeši rezervuarai, papildomi rezervuarai turi 
būti panaudoti lygiagretiems bandymams arba paskirstyti visam 
koncentracijos ver čių intervalui tarpams tarp j ų sumažinti. Abi 
šios priemon ės vienodai tinka.  
1.7.2.  NOEC/LOEC įvertinimo planas taikant dispersin ę 
analizę (ANOVA)  
Kiekvienai koncentracijos vertei geriau b ūtų turėti dar vien ą rezer­
vuarą ir statistin ė analizė turėtų būti atliekama rezervuaro lygiu (10). 
Jei nėra rezervuar ų lygiagrečiam bandymui, ne įmanoma atsižvelgti į 
kintamum ą tarp rezervuar ų be to kintamumo, kuris atsiranda d ėl 
atskirų žuvų. Tačiau patirtis rodo (11), kad tiriamu atveju kinta ­
mumas tarp rezervuar ų buvo labai mažas lyginant su kintamumu 
viename rezervuare (t. y. tarp žuv ų). Taigi santykinai priimtina alter ­
natyva yra statistin ę analizę daryti kiekvienos žuvies lygiu.  
Paprastai naudojamos bent penkios koncentracijos vert ės, sudaran ­ 
čios eilutę pagal geometrin ę progresij ą, kurios koeficientas geriausiai 
turėtų būti ne didesnis kaip 3,2.  
Kai bandymai atliekami turint rezervuarus lygiagretiems bandymams, 
lygiagrečių kontrolini ų rezervuar ų skaičius, taigi ir žuv ų skaičius, turi 
būti dvigubai didesnis negu kiekvienai bandomajai koncentracijai 
pasirinktas skai čius, kuris turi b ūti vienodas (12) (13) (14). Kita 
vertus, jei rezervuar ų lygiagretiems bandymams n ėra, kontrolin ės 
grupės žuvų skaičius turi b ūti lygus kiekvienai bandomajai koncent ­
racijai naudojamam žuv ų skaičiui. 
Jei dispersin ė analizė (ANOVA) turi b ūti atliekama rezervuar ų lygiu, 
o ne kiekvienos žuvies lygiu (tam reik ėtų kiekvien ą žuvį paženklinti 
ar naudoti „pseudo“ savituosius augimo grei čius (žr. 2.1.2 skirsn į)), 
reikia tur ėti pakankam ą rezervuar ų lygiagretiems bandymams 
skaičių, kad būtų galima nustatyti standartin į nuokryp į tarp „vienos 
koncentracijos rezervuar ų“. Vadinasi, dispersin ės analizės paklaidai 
reikėtų turėti bent 5 laisv ės laipsnius (10). Jei atliekami tik lygia ­
gretūs kontroliniai bandymai, esama pavojaus, kad paklaidos kinta ­
mumas bus pakit ęs, nes paklaida gali did ėti didėjant tiriamo augimo 
greičio vidutinei vertei. Kadangi augimo greitis koncentracijai did ė­
jant greičiausiai maž ės, atsiranda tendencija per daug sureikšminti 
kintamum ą. 
1.8. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.8.1.  Bandom ųjų žuvų atranka ir sv ėrimas  
Svarbu, kad žuv ų masės skirtumas bandymo pradžioje b ūtų kuo 
mažesnis. Bandymams rekomenduot ų skirtingų rūšių žuvų masės 
tinkami intervalai yra pateikti 1 pried ėlyje. Būtų geriausia, kad 
bandymo pradžioje visos partijos žuv ų masės kitimo intervalas 
būtų lygus žuv ų masės aritmetiniam vidurkiui ± 10 % ir jokiu 
būdu nebūtų didesnis kaip 25 %. Vidutinei masei nustatyti rekomen ­
duojama prieš bandym ą pasverti žuv ų ėminio dal į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
Žuvys turi b ūti nustojamos maitinti prieš 24 h iki bandymo pradžios. 
Toliau jos turi b ūti atsitiktinai atrenkamos. Vartojant bendr ąjį anes­
tetiką (pvz., vandenin į 100 mg/l (3-aminobenzenkarbonin ės rūgšties 
etilesterio metansulfonato (MS 222) tirpal ą, neutralizuot ą sumaišant 
dvi dalis natrio hidrokarbonato ir vien ą dalį MS 222), žuvys turi b ūti 
atskirai pasveriamos gyv ų žuvų (sausai nušluostyt ų filtro popieriumi) 
masei nustatyti 1 pried ėlyje nurodytu tikslumu. Tos žuvys, kuri ų 
masė atitinka numatyt ą intervalą, paliekamos ir v ėliau paskirstomos 
tarp bandymo ind ų. Turi b ūti registruojama bendra kiekvieno 
bandymo indo gyv ų žuvų masė. Anestetiko vartojimas, taip pat 
apdorojimas ( įskaitant šluostym ą ir svėrimą) žuvų mailiui gali sukelti 
įtampą ir jį galima sužeisti, ypa č jei tai maž ų žuvų rūšys. Taigi 
apdoroti maili ų reikia ypa č atsargiai ir vengti bandom ųjų gyvūnų 
įtampos ir sužeidim ų. 
Žuvys vėl sveriamos 28 bandymo par ą (žr. 1.8.6 skirsn į). Tačiau, jei 
manoma, kad b ūtina perskai čiuoti maisto davin į, žuvys gali b ūti 
sveriamos 14 bandymo par ą (žr. 1.8.2.3 skirsn į). Galima taikyti 
kitus metodus, pvz., fotografavim ą norint nustatyti žuv ų dydžio 
pokytį, pagal kur į būtų galima reguliuoti maisto davin į. 
1.8.2.  Veikimo s ąlygos  
1.8.2.1.  Trukm ė 
Bandymo trukm ė ≥ 28 paros.  
1.8.2.2.  Įkrova ir žuv ų tankis  
Svarbu, kad įkrova ir žuv ų tankis atitikt ų naudojamas žuv ų rūšis (žr. 
1 priedėlį). Jei žuv ų tankis per didelis, d ėl perpildymo sukeltos 
įtampos maž ėja augimo greitis ir žuvys gali susirgti. Jei žuv ų tankis 
per mažas, gali atsirasti teritorinis elgesys, kuris irgi gali veikti 
augimą. Bet kuriuo atveju įkrova turi b ūti gana maža, kad be aera ­
vimo būtų palaikoma bent 60 % ASV ištirpusio deguonies koncent ­
racija. Tarplaboratorinis bandymas (2) parod ė, kad vaivorykštiniam 
upėtakiui priimtina įkrova, kai 40 1 t ūrio vandenyje yra 16 up ėtakių 
po 3–5 g mas ės. Rekomenduojamas vandens keitimo atliekant 
bandymą dažnis yra 6 litrai/g žuvies/parai.  
1.8.2.3.  Maitinimas  
Žuvys turi b ūti šeriamos atitinkamu maistu (1 pried ėlis) ir pakan ­
kamai dažnai, kad b ūtų garantuotas priimtinas augimo greitis. 
Reikėtų stengtis išvengti mikrob ų dauginimosi ir vandens drums ­
tumo. Vaivorykštiniam up ėtakiui 4 % k ūno masės davinys per par ą 
turėtų atitikti šias s ąlygas (2) (15) (16) (17). Paros davinys turi b ūti 
padalytas į dvi lygias dalis ir sušeriamas žuvims per du kartus darant 
bent penki ų valandų pertrauk ą. Davinys grindžiamas kiekvieno 
bandymo indo bendra pradine žuv ų mase. Jei žuvys v ėl sveriamos 
14 parą, davinys perskai čiuojamas. Prieš sveriant žuvys turi b ūti 
nemaitintos 24 h.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Nesuėstas maistas ir išmatos iš bandymo ind ų turi būti šalinami 
kasdien r ūpestingai išsiurbiant kiekvieno rezervuaro dugn ą. 
1.8.2.4.  Šviesa ir temperat ūra 
Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperat ūra turi atitikti žuv ų rūšį 
(1 priedėlis). 
1.8.3.  Bandomosios medžiagos koncentracijos  
Paprastai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentra ­
cijas, neatsižvelgiant į bandymo schem ą (žr. 1.7.2 skirsn į). Anks­
tesnės žinios apie bandomosios medžiagos toksiškum ą (pvz., 
ūmaus toksiškumo bandymo ir (ar) koncentracij ų intervalo nustatymo 
tyrimo duomenys) tur ėtų padėti renkantis tinkamas bandom ąsias 
koncentracijas. Sprendim ą naudoti mažiau kaip penkias koncentra ­
cijas reikia pagr įsti. Didžiausia išbandyta koncentracija netur ėtų būti 
didesnė kaip medžiagos tirpumo vandenyje ribin ė koncentracija.  
Jei pradinio tirpalo ruošimui lengvinti naudojama tirpinimo 
medžiaga, jos galutin ė koncentracija turi b ūti ne didesn ė kaip 0,1 
ml/l, ir geriau b ūtų, jei ji visuose bandymo induose b ūtų vienoda (žr. 
1.6.3 skirsn į). Tačiau reikėtų kiek įmanoma stengtis vengti šias 
medžiagas naudoti.  
1.8.4.  Kontroliniai bandiniai  
Skiedimo vandens kontrolini ų bandini ų skaičius priklauso nuo 
bandymo schemos (žr. 1.7–1.7.2 skirsnius). Jei naudojama tirpinimo 
medžiaga, į bandymo schem ą turi būti įtrauktas toks tirpinimo 
medžiagos kontrolini ų bandinių skaičius, kiek yra skiedimo vandens 
kontrolini ų bandinių. 
1.8.5.  Kiekybini ų analizių ir matavim ų dažnis  
Atliekant bandym ą bandomosios medžiagos koncentracij ų vertės 
nustatomos reguliariais tarpais (žr. toliau).  
Atliekant dinaminius bandymus, skiediklio ir toksin ės medžiagos 
pradinio tirpalo srautai turi b ūti tikrinami tam tikrais laiko tarpais, 
geriau kasdien, ir vis ą bandymą neturi kisti daugiau kaip 10 %. Jei 
tikimasi, kad bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės bus 
lygios vardinei koncentracijai ± 20 % (t. y. 80–120 % intervalu; žr. 
1.6.2 ir 1.6.3 skirsnius), rekomenduojama bent didžiausi ą ir 
mažiausią bandomąją koncentracij ą nustatyti bandymo pradžioje, o 
vėliau kas savait ę. Jei atliekant bandymus nesitikima, kad bandomo ­
sios medžiagos koncentracija gali likti ± 20 % vardin ės koncentra ­
cijos vert ės (pagal bandomosios medžiagos stabilumo duomenis), 
būtina nustatyti visas bandom ąsias koncentracijas, bet pagal t ą patį 
grafiką. 
Jei tikimasi, kad atliekant pusiau statinius (atnaujinimo) bandymus, 
bandomosios medžiagos koncentracija liks ± 20 % vardin ės koncent ­
racijos vert ės, rekomenduojama nustatyti bent didžiausi ą ir mažiausi ą 
bandomąją koncentracij ą iš karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo 
atnaujinim ą tyrimo pradžioje ir kas savait ę vėliau. Jei tai bandymai, 
kuriuos atliekant nemanoma, kad koncentracija liks ± 20 % vardin ės 
koncentracijos vert ės, turi b ūti nustatomos visos koncentracijos 
vertės laikantis to paties kaip ir stabilesn ėms medžiagoms analiz ės 
režimo.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Rekomenduojama rezultatus pagr įsti išmatuotomis koncentracijos 
vertėmis. Tačiau jei yra įrodymų, kad bandomosios medžiagos 
koncentracija vis ą bandymo laik ą buvo pakankamai palaikoma ± 
20 % vardin ės koncentracijos vert ės ar išmatuotos pradin ės koncent ­
racijos vert ės, rezultatai gali b ūti grindžiami vardine ar išmatuota 
vertėmis. 
Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., pro 0,45 μm akytumo filtr ą) ar 
centrifuguoti. Rekomenduojama metodika b ūtų centrifugavimas. 
Tačiau, jei filtras bandomosios medžiagos neadsorbuoja, priimtinas 
būtų ir filtravimas.  
Atliekant bandym ą visuose bandymo induose turi b ūti matuojama 
ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperat ūra. Turi b ūti 
matuojamas kontrolini ų bandinių ir indo su didžiausios koncentra ­
cijos bandiniu bendras kietumas, šarmingumas ir s ūrumas (jei tinka). 
Matuojama bent ištirpusio deguonies koncentracija ir s ūrumas (jei 
tinka) tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabaigoje). Atlie ­
kant pusiau statinius bandymus, ištirpusio deguonies koncentracij ą 
rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiekvien ą vandens 
atnaujinim ą ir po jo ar bent kart ą per savait ę. Atliekant statinius 
bandymus su atnaujinimu pH vert ė turi būti matuojama prieš kiek ­
vieną vandens atnaujinim ą ir po jo, o atliekant dinaminius bandymus 
– bent kart ą per savait ę. Vandens kietumas ir šarmingumas kiek ­
vienam bandymui matuojami vien ą kartą. Temperat ūrą bent viename 
bandymo inde geriau kontroliuoti nuolatos.  
1.8.6.  Steb ėjimai  
Masė: baigiant bandym ą visos gyvos žuvys turi b ūti pasvertos gyv ų 
žuvų (sausai nušluostyt ų filtro popieriumi) masei nustatyti grup ėmis 
pagal bandymo indus ar atskirai kiekviena žuvis. Labiau tinka 
svėrimas bandymo induose, nes, sveriant kiekvien ą žuvį, jas reikėtų 
atskirai ženklinti. Nustatant atskir ų žuvų masę kiekvienos žuvies 
savitajam augimo grei čiui nustatyti, pasirinktoji ženklinimo metodika 
gyvūnams neturi kelti įtampos (gali tikti žuv ų šaltojo ženklinimo 
alternatyvos, pvz., plonas spalvotas valas).  
Žuvys vis ą bandymo laik ą turi būti tiriamos kasdien ir bet kokios 
išorės anomalijos (pvz., kraujavimas, spalvos pakeitimas) bei 
neįprastas elgesys turi b ūti pažym ėti. Turi b ūti registruojami visi 
gaištamumo atvejai, o negyvos žuvys kuo grei čiau pašalinamos. Jei 
įkrova ir žuv ų tankis yra pakankami, negyvos žuvys kitomis nekei ­ 
čiamos, kad b ūtų išvengta poveikio augimui d ėl vienam rezervuarui 
tenkančio žuvų skaičiaus kitimo. Ta čiau maitinimo norm ą reikia 
koreguoti.  
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Rekomenduojama, kad, rengiant bandymo schem ą ir ją analizuojant, 
dalyvautų statistikas, nes šis bandymo metodas leidžia smarkiai keisti 
eksperimento plan ą, pvz., bandymo kamer ų skaičių, bandom ųjų 
koncentracij ų skaičių, žuvų skaičių ir t. t. Atsižvelgiant į bandymo 
schemos variant ų įvairovę, jokių specialių nurodym ų dėl statistin ės 
metodikos čia nepateikiama.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Augimo greitis netur ėtų būti apskaičiuojamas bandymo indams, jei 
gaištamumas juose didesnis kaip 10 %. Ta čiau gaištamumas turi b ūti 
nurodytas visoms bandomosioms koncentracijoms.  
Nesvarbu, koks metodas taikomas duomenims analizuoti, svarbiausia 
sąvoka yra savitasis augimo greitis r tarp laiko t  1 ir t 2 . Jis gali b ūti 
nustatytas keliais b ūdais pagal tai, ar žuvys yra ženklinamos atskirai 
ar ne, arba pagal tai, ar reikia nustatyti rezervuarui vidutin į greitį. 
r 1 ¼ ÍÍ ðlog e W 2 – log  e W 1 Þ 
ðt 2 – t 1 Þ Î 
Ü 100 Î 
r 2 ¼ ÍÍ ððlog e W 2 Þ – ðlog e W 1 ÞÞ 
ðt 2 – t 1 Þ Î 
Ü 100 Î 
r 3 ¼ ÍÍ ððlog e W 2 Þ – ðlog e W 1 ÞÞ 
ðt 2 – t 1 Þ Î 
Ü 100 Î 
čia: 
r 1 = atskiros žuvies savitasis augimo greitis  
r 2 = vidutinis savitasis augimo greitis rezervuarui  
r 3 = „pseudo“ savitasis augimo greitis  
w 1 , w 2 = konkre čios žuvies mas ė, atitinkamai, laiku t  1 ir t 2 
log e w 1 = atskiros žuvies mas ės tyrimo pradžioje logaritmas  
log e w 2 = atskiros žuvies mas ės tyrimo pabaigoje logaritmas  
log e w 1 = tyrimo pradžioje nustatytos rezervuaro žuv ų masės 
w 1 logaritmų verčių vidurkis  
log e w 2 = tyrimo pabaigoje nustatytos rezervuaro žuv ų masės 
w 2 logaritmų verčių vidurkis  
t 1 , t 2 = tyrimo laikotarpio pradžios ir pabaigos laikas (paros).  
r 1 , r 2 , r 3 gali būti apskaičiuoti 0–28 par ų laikotarpiui ir, jei tinka (t. 
y. kai buvo matuojama 14-t ą parą), 0–14 ir 14–28 par ų laikotar­
piams.  
2.1.1.  Rezultat ų analizė taikant regresij ą (koncentracijos ir atsako 
santykio modeliavimas)  
Šis analiz ės metodas nustato atitinkam ą savitojo augimo grei čio ir 
koncentracijos matematiškai išreiškiam ą santykį, taigi leidžia įver­
tinti EC  x , t. y. kiekvien ą reikiamą EC vert ę. Taikant š į metodą 
atskiros žuvies r vert ės (r  1 ) apskaičiuoti nebūtina, vietoj to analiz ė 
gali būti pagrįsta vidutine r verte rezervuarui (r  2 ). Geriau taikyti 
pastarąjį metodą. Jis taip pat labiau tinka naudojant mažiausi ų 
žuvų rūšis. 
Norint ištirti koncentracijos ir atsako santyk į, vidutiniai savitieji 
augimo grei čiai rezervuarui (r  2 ) turi būti grafiškai pažymimi kaip 
koncentracijos funkcija.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Santykiui tarp r  2 ir koncentracijos išreikšti turi b ūti pasirinktas atitin ­
kamas modelis ir jo pasirinkimas turi b ūti atitinkamai pagr įstas. 
Jei kiekviename rezervuare likusi ų gyvų žuvų skaičius yra nevie ­
nodas, modelio pritaikymo procese, paprastame ar netiesiniame, 
reikėtų naudoti svorinius koeficientus siekiant atsižvelgti į nevienod ą 
grupių dydį. 
Modelio pritaikymo metodas turi leisti įvertinti, pvz., EC  20 ir nusta­
tyti jos sklaid ą (standartin ę paklaidą ar pasikliovimo interval ą). 
Pritaikyto modelio grafikas tur ėtų būti parodytas lyginant su duome ­
nimis, kad b ūtų galima įvertinti pritaikyto modelio tinkamum ą (8) 
(18) (19) (20).  
2.1.2.  Rezultat ų analizė LOEC įvertinti  
Jei atliekant bandym ą rezervuarai lygiagre čiam bandymui yra 
visoms koncentracijos vert ėms, LOEC įvertinimas gali b ūti grin­
džiamas vidutinio savitojo augimo grei čio rezervuarui dispersine 
analize (ANOVA) (žr. 2.1 skirsn į), vėliau taikant tinkam ą metodą 
(pvz., Dunnett ar Williams bandym ą (12) (13) (14) (21), kuriuo 
kiekvienos koncentracijos vidutin ė r vertė lyginama su kontrolini ų 
bandinių vidutine r verte norint nustatyti mažiausi ą koncentracij ą, 
kuriai šis skirtumas yra reikšmingas esant 0,05 tikimyb ės lygmeniui. 
Jei parametriniams metodams reikiamos hipotez ės (nenormalus 
pasiskirstymas (pvz.,  Shapiro–Wilk  bandymas) ar heterogenin ė 
sklaida ( Bartlett  bandymas)) nepasitvirtina, reik ėtų numatyti 
duomenų pertvarkym ą sklaidoms homogenizuoti prieš atliekant 
dispersinę analizę ar atlikti svorin ę dispersin ę analizę. 
Jei atliekant bandym ą rezervuarai lygiagre čiam bandymui yra ne 
visoms koncentracijos vert ėms, rezervuarais pagr įsta dispersin ė 
analizė bus nejautri ar ne įmanoma. Šiuo atveju priimtinas kompro ­
misas yra dispersinei analizei panaudoti kiekvienos žuvies „pseudo“ 
savitąjį augimo greit į r 3 . 
Toliau vidutin ė r 3 vertė kiekvienai koncentracijai gali b ūti lyginama 
su vidutine r  3 verte kontroliniams bandiniams. Tuomet LOEC gali 
būti nustatytas taip, kaip buvo daryta pirmiau. B ūtina pripažinti, kad 
šis metodas neatsižvelgia į kintamum ą tarp rezervuar ų, išskyrus 
kintamum ą tarp atskir ų žuvų, ir šiuo poži ūriu nesuteikia jokios 
apsaugos. Ta čiau patirtis rodo (8), kad kintamumas tarp rezervuar ų 
buvo labai mažas lyginant su kintamumu rezervuare (t. y. tarp žuv ų). 
Jei analiz ė neapima kiekvienos žuvies duomen ų, būtina numatyti 
išskirčių identifikavimo metod ą ir pagrįsti jo taikym ą. 
2.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Rezultatai turi b ūti aiškinami atsargiai, jei išmatuotos bandom ųjų 
tirpalų toksinių medžiag ų koncentracijos vert ės yra arti analiz ės 
metodo aptikimo ribos arba jei atliekant pusiau statinius bandymus 
bandomosios medžiagos tirpalo prieš atnaujinim ą koncentracija yra 
mažesnė kaip šviežiai paruošto tirpalo koncentracija.  
2.3. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir atitinkamos fizikin ės ir chemin ės savybės, 
— cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynum ą, ir, jei 
tinka, analiz ės metodas bandomajai medžiagai kiekybiškai nusta ­
tyti. 
2.3.2.  Bandomieji gyv ūnai: 
— mokslinis pavadinimas (gali b ūti), 
— veislė, dydis, tiek ėjas, bet koks išankstinis apdorojimas ir t. t.  
2.3.3.  Bandymo s ąlygos:  
— taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis/su atnaujinimu, 
dinaminis, įkrova, žuv ų tankis ir t. t.),  
— bandymo schema (pvz., bandymo ind ų skaičius, bandomosios 
koncentracijos ir lygiagre čių bandinių skaičius, žuvų skaičius 
viename inde),  
— pradini ų tirpalų ruošimo metodas ir j ų atnaujinimo dažnis (jei 
naudojama tirpinimo medžiaga, turi b ūti nurodyta jos koncentra ­
cija),  
— vardin ės bandomosios koncentracijos, bandymo ind ų nustatytų 
koncentracij ų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei 
nustatymo metodas ir įrodymai, kad buvo daromi tikr ųjų bando­
mosios medžiagos tirpal ų matavimai,  
— skiedimo vandens charakteristikos: pH, kietumas, šarmingumas, 
temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro 
lygiai (jei matuoti), bendroji organin ė anglis, suspenduotos kieto ­
sios dalel ės, bandymo terp ės sūrumas (jei matuota) ir visi kiti 
daryti matavimai,  
— bandymo ind ų vandens kokyb ė: pH, kietumas, temperat ūra ir 
ištirpusio deguonies koncentracija,  
— išsami informacija apie š ėrimą (pvz., davinio r ūšis (-ys), šaltinis, 
duodamas kiekis ir š ėrimo dažnumas).  
2.3.4.  Rezultatai:  
— duomenys, kad kontroliniai bandiniai atitinka išgyvenimo patiki ­
mumo kriterij ų, ir duomenys apie gaištamum ą visose bandomo ­
siose koncentracijose,  
— taikytos statistin ės analizės metodikos, statistika, pagr įsta lygia­
grečiais bandymais ar žuvimis, duomen ų apdorojimas ir naudot ų 
metodikų pagrindimas,  
— lentelėse pateikti 0, 14 (jei matuota) ir 28 paros atskir ų žuvų ir 
vidutinės žuvų masės duomenys rezervuarui vidutinio augimo 
greičio ar „pseudo“ savitojo augimo grei čio (jei tinka) vert ės 
0–28 parų laikotarpiu ar galb ūt 0–14 ir 14–28 par ų laikotarpiu,  
— statistin ės analizės (t. y. regresin ės analizės ar dispersin ės 
analizės) rezultatai, geriau lenteli ų ir grafik ų pavidalu, LOEC 
(p = 0,05) bei NOEC ar ECx vert ės, nurodant, kai įmanoma, 
atitinkamas standartines paklaidas,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— visi pasitaikantys žuv ų neįprasto elgesio atvejai ir visi matomi 
bandomosios medžiagos poveikiai.  
3. NUORODOS  
1) Solbe J.F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth rate of Fish. WRc Report No. PRD 1388-M/2.
 
2) Ashley S., Mallett M.J. and Grandy N.J. (1990). EEC Ring Test 
of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
3) Crossland N.O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, PP 1855–1870.  
4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P.D., Market M., Munk 
R., Scholz N. and Höfte B.B. (1991). Effect of 3,4-dichloroa ­
niline on the early life stages of the Zebrafish ( Brachydanio 
rerio ): results of a comparative laboratory study. Ecotox. 
Environ. SAFEty, 21, p. 157–164.  
5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological 
field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
 
6) Holcombe, G.W., Benoit D.A., Hammermeister, D.E., Leonard, 
E.N. and Johnson, R.D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka ( Oryzias latipes ). Arch. 
Environ. Conta. Toxicol. 28, p. 287–297.
 
7) Benoit, D.A., Holcombe, G.W. and Spehar, R.L. (1991). Guide ­
lines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka { Oryzias latipes ). Ecological Research Series 
EPA-600/3–91–063. U. S. Environmental Protection Agency, Duluth, Minesota.
 
8) Stephan C.E. and Rogers J.W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth 
Symposium, ASTM STP 891, R C Bahner and D J Hansen, 
Eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, p. 328–338.
 
9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS 1/RM/28, p. 81.
 
10) Cox D.R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.  
11) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on 
Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10–12 December 
1991.
 
12) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, p. 1096–1121.
 
13) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with 
a control. Biometrics, 20, p. 482–491.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
14) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, p. 103–117.  
15) Johnston, W.L., Atkinson, J.L., Glanville N.T. (1994). A tech ­
nique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout,  Oncorhyn ­
chus mykiss : effect of feeding level. Aquaculture 120, 123–133.
 
16) Quinton, J. C. and Blake, R.W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response 
in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss . Journal of Fish 
Biology, 37, 33–41.  
17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, 
Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 P.  
18) Bruce, R.D. and Versteeg D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 
11, 1485–1494.  
19) DeGraeve, G.M., Cooney, J.M., Pollock, T.L., Reichenbach, 
J.H., Dean, Marcus, M.D. and McIntyre, D.O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth 
test; intra and interlaboratory study report EA-6189 (American 
Petroleum Institute Publication, n. 4468). Electric Power Research Institute, Palo alto, CA.
 
20) Norbert-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic 
toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection 
Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minesota. 
Tech. Rep. No 05–88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. p. 12.
 
21) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, p. 510–531.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼C1 
1 priedėlis 
BANDYMAMS REKOMENDUOJAMOS ŽUV Ų RŪŠYS IR TINKAMOS BANDYMO S ĄLYGOS  
Rūšys Rekomenduoj amas 
bandy mo 
temperaturos 
diapazonas 
(°C) Apšvietimo trukm ė 
(valandos)  Rekomenduoj amas 
žuvų pradinės 
masės diapazonas 
(g) Būtinas matavimo 
tikslumas  Įkrova 
(g/l) Gyvūnų tankis 
(litrui)  Maistas  Bandymo trukm ė 
(paros)  
Rekomenduojamos r ūšys: 
Oncorhynchus mykiss  
Vaivorykštinis up ėtakis  12,5–16,0  12–16  1–5  100 mg tikslumu  1,2–2,0  4  Sausas firminis lašišini ų mailių 
maistas  ≥ 28 
Kitos dokumentais tinkamai 
patvirtintos r ūšys: 
Danio rerio  
Zebrinė danija  21–25  12–16  0,050–0,100  1 mg tikslumu  0,2–1,0  5–10  Gyvas maistas ( Brachionus 
Artemia ) ≥ 28 
Oryzias latipes  
Japoninė medaka  21–25  12–16  0,050–0,100  1 mg tikslumu  0,2–1,0  5–20  Gyvas maistas ( Brachionus 
Artemia ) ≥ 28
2 priedėlis 
KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMIN ĖS 
CHARAKTERISTIKOS  
Medžiaga  Koncentracija  
Kietosios dalel ės < 20 mg/l  
Bendroji organin ė anglis  < 2 mg/l  
Nejonizuotas amoniakas  < 1 μg/l 
Liekamasis chloras  < 10 μg/l 
Bendras fosforo organini ų pesticidų kiekis  < 50 ng/l  
Bendras chloro organini ų pesticidų ir polichlorint ų bife­
nilų kiekis  < 50 ng/l  
Bendras organinis chloras  < 25 ng/l  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
3 priedėlis 
Toksiškumo bandymui tinkam ų koncentracij ų logaritmin ė eilutė (9) 
Stulpelis (koncentracij ų tarp 100 ir 10 ar tarp 10 ir 1 skai čius) (*)  
1 2  3  4  5  6  7  
100 100  100  100  100  100  100  
32 46  56  63  68  72  75  
10 22  32  40  46  52  56  
3,2 10  18  25  32  37  42  
1,0 4,6  10  16  22  27  32  
2,2 5,6  10  15  19  24  
1,0 3,2  6,3  10  14  18  
1,8 4,0  6,8  10  13  
1,0 2,5  4,6  7,2  10  
1,6 3,2  5,2  7,5  
1,0 2,2  3,7  5,6  
1,5 2,7  4,2  
1,0 1,9  3,2  
1,4 2,4  
1,0 1,8  
1,3 
1,0 
(*) Stulpelyje galima pasirinkti penki ų (ar daugiau) viena po kitos einan čių koncentracij ų eilutę. Stulpelio (x) koncentracij ų vidurio 
taškai randami stulpelyje (2x + 1). S ąraše nurodytos vert ės gali būti išreikštos procentine t ūrio dalimi ar mas ės koncentracija (mg/l 
ar μg/l). Vert ės gali būti padaugintos ar padalytos iš 10, pakelto bet kuriuo tinkamu laipsniu. 1 stulpel į galima b ūtų naudoti, jei 
toksiškumo lygio neapibr ėžtis yra didel ė. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  TRUMPALAIKIO TOKSIŠKUMO BANDYMAS ŽUVIMS 
EMBRIONO IR TRYNIO MAIŠELIO STADIJOSE  
1. METODAS  
Šis trumpalaikio toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 212 
(1998) kopija.  
1.1. ĮVADAS  
Šis trumpalaikio toksiškumo žuv ų embrionui ir mailiui su trynio 
maišeliu bandymas yra trumpalaikis bandymas, kai k ą tik apvaisinti 
žuvų ikrai yra veikiami nuo j ų apvaisinimo iki mailiaus su trynio 
maišeliu stadijos pabaigos. Toksiškumas embrionui ir mailiui su trynio maišeliu bandomas be maitinimo, bandymas turi b ūti baigtas, 
kai mailius dar maitinamas iš trynio maišelio.
 
Bandymo tikslas – nustatyti chemini ų medžiagų letalius ir mažesniu 
laipsniu subletalius poveikius specifin ėms vystymosi stadijoms ir 
bandytai r ūšiai. Šis bandymas tur ėtų suteikti vertingos informacijos, 
nes jis gal ėtų: a) būti jungtimi tarp letalumo ir subletalumo 
bandymų; b) būti taikomas kaip atrankos bandymas numatant vis ą 
pradinio gyvenimo stadij ų bandym ą ar lėtinio toksiškumo 
bandymus; ir c) b ūti taikomas bandyti r ūšis, kurių auginimo metodai 
nėra pakankamai pažang ūs, kad apr ėptų perėjimo iš endogeninio į 
egzogenin į maitinimo laikotarp į. 
Žinotina, kad paprastai tik visas žuvies gyvenimo ciklo stadijas 
apimantys bandymai gali duoti tiksl ų lėtinio toksiškumo žuvims 
įvertį ir kad bent kiek sutrumpinus veikim ą neįtraukiant kurios 
nors gyvenimo stadijos, gali sumaž ėti jautrumas, taigi gali b ūti nepa­
kankamai įvertintas l ėtinis toksiškumas. Tod ėl manoma, kad 
embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandymas tur ėtų būti ne 
toks jautrus kaip visas pradinio gyvenimo stadij ų bandymas, ypa č 
turint galvoje labai lipofiliškas chemines medžiagas (log P  ow > 4) ir 
specifinio toksinio veikimo chemines medžiagas. Ta čiau mažesni ų 
jautrumo skirtum ų tarp dviej ų bandymų reikėtų tikėtis nespecifinio 
narkotinio poveikio tipo chemin ėms medžiagoms (1).  
Dar prieš šio bandymo paskelbim ą daugiausia patirties atliekant 
embriono ir mailiaus su trynio maišeliu bandym ą buvo sukaupta 
su gėlavandene žuvimi  Danio rerio  Hamilton-Buchanan ( Teleostei, 
Cyprinidae  – įprastas pavadinimas zebrin ė danija). Taigi smulkesni 
nurodymai, kaip atlikti šios žuv ų rūšies bandym ą, pateikti 1 pried ė­
lyje. Tačiau tai netrukdo naudoti kitas r ūšis, kurias bandant yra 
sukaupta patirties (1 lentel ė). 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Mažiausia pastebim ą poveikį sukelianti koncentracija (LOEC) : 
mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant 
medžiagos poveikis yra statistiškai reikšmingas lyginant su kontro ­
liniais bandiniais (kai p < 0,05). Ta čiau visų didesnių kaip LOEC 
bandomųjų koncentracij ų kenksmingas poveikis turi b ūti lygus ar 
didesnis kaip LOEC poveikis.  
Nepasteb ėto poveikio koncentracija (NOEC) : bent kiek už LOEC 
mažesnė bandomoji koncentracija.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Embriono ir mailiaus su trynio maišeliu augimo stadij ų žuvys 
veikiamos vandeniniais keli ų koncentracijos ver čių bandomosios 
medžiagos tirpalais. Bandymo protokolas leidžia pasirinkti pusiau statinį ar dinamin į bandymą. Pasirinkimas priklauso nuo bandomo ­
sios medžiagos prigimties. Bandymas pradedamas sud ėjus apvai ­
sintus ikrus į bandymo kameras ir baigiamas prieš pat t ą momentą 
kai kurioje nors kameroje lervos trynio maišelis yra visiškai absor ­
buotas ar kai iš bado pradeda gaišti kontrolini ų bandinių žuvys. 
Įvertinami letal ūs ir subletal ūs poveikiai ir lyginami su kontrolin ėmis 
vertėmis mažiausiai stebimo poveikio koncentracijai, taigi ir neste ­
bimo poveikio koncentracijai nustatyti. Kitaip poveikiai gali b ūti 
analizuojami taikant regresijos model į norint nustatyti koncentracij ą 
kuri sukelt ų x % pokyt į (t. y. LC/ECx, čia x yra tam tikras % 
išreikštas poveikis).
 
1.4. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Reikėtų turėti ūmaus toksiškumo bandymo (žr. C.1 bandymo metod ą), 
geriau atlikto su šiam bandymui pasirinkta r ūšimi, rezultatus. Rezul ­
tatai gali b ūti naudingi ankstyv ųjų gyvenimo tarpsni ų bandymui pasi ­
renkant atitinkam ą bandom ųjų koncentracij ų intervalą. Turi b ūti 
žinomas medžiagos tirpumas vandenyje ( įskaitant tirpum ą bandymo 
vandenyje) ir bandomosios medžiagos gar ų slėgis. Turi b ūti patikimas 
metodas ištirpintai bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti 
žinomu tikslumu ir aptikimo riba, kurie nurodomi ataskaitoje.  
Informacij ą apie bandom ąją medžiagą kuri yra vertinga bandymo s ąly­
goms nustatyti, sudaro strukt ūrinė formulė, medžiagos grynumas, 
stabilumas veikiant šviesai ir bandymo s ąlygomis, pKa, P  ow ir lengvo 
biologinio skaidumo bandymo rezultatai (žr. C.4 metod ą). 
1.5. BANDYMO TINKAMUMAS  
Bandymas yra tinkamas, jei tenkinamos šios s ąlygos:  
— bendras apvaisint ų ikrų išgyvenamumas kontroliniuose bandi ­
niuose ir, jei tinka, induose vien tik su tirpikliu turi b ūti didesnis 
arba lygus ribin ėms vertėms, apibr ėžtoms 2 ir 3 pried ėliuose,  
— ištirpusio deguonies koncentracija vis ą bandym ą turi sudaryti 
60–100 % oro prisotinimo vert ės (ASV),  
— kiekvienu bandymo momentu temperat ūros verčių bandymo 
kamerose ar skirtingomis bandymo dienomis skirtumas turi 
būti ne didesnis kaip ± 1,5 °C ir temperat ūra turėtų būti palai­
koma bandymo r ūšims nurodytu intervalu (2 ir 3 pried ėliai). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Bandymo kameros  
Galima naudoti bet kokius stiklinius ar chemiškai inertiškos 
medžiagos indus. Ind ų matmenys turi b ūti gana dideli, kad atitikt ų 
įkrovos sąlygas (žr. 1.7.1.2 skirsn į). Bandymo indus bandymo plote 
rekomenduojama išd ėstyti atsitiktinai. Jei laboratorijoje yra siste ­
mingi poveikiai, kuriuos b ūtų galima kontroliuoti suskirstant į 
blokus, indus geriau išd ėstyti nevisiškai atsitiktinai, bet pagal rando ­
mizuotą blokinę schemą kiekviename bloke darant kiekvien ą apdo­
rojimą. Jei taikoma blokin ė schema, į tai būtina atsižvelgti v ėliau 
analizuojant duomenis. Bandymo kameros turi b ūti apsaugotos nuo 
nepageidautin ų trikdžių. 
1.6.2.  Žuv ų rūšių parinkimas  
Rekomenduotos žuv ų rūšys nurodytos 1A lentel ėje. Tai netrukdo 
naudoti kit ą rūšį (pavyzdžiai pateikti 1B lentel ėje), bet, norint suda ­
ryti tinkamas bandymo s ąlygas, gali tekti pritaikyti bandymo meto ­
diką. Šiuo atveju ataskaitoje turi b ūti pagrįstas rūšies parinkimo 
motyvas ir tyrimo metodas.  
1.6.3.  Veislini ų žuvų laikymas  
Detalių apie veislini ų žuvų laikymą tinkamomis s ąlygomis galima 
rasti OECD TG 210 (  1 ) ir nuorodose (2) (3) (4) (5) (6).  
1.6.4.  Embrion ų ir lervų apdorojimas  
Embrionai ir lervos gali b ūti veikiami mažesniuose pagrindin į indą 
dalijančiuose induose, j ų šonines ar galines sieneles pakei čiant 
tinklu, kad tirpalas gal ėtų tekėti per ind ą. Galima padaryti taip, 
kad per mažus indus tek ėtų neturbulentinis srautas, tik reikia paka ­
binti juos ant svirties, kuri indus kelt ų ir nuleist ų, bet visą laiką 
organizmai turi b ūti panardinti; taip pat galima naudoti sifonin ę 
tekėjimo sistem ą. Apvaisinti lašišini ų žuvų ikrai gali b ūti laikomi 
dėžėse ar tinkluose su pakankamai didel ėmis akutėmis, kad išsiritu ­
sios lervos gal ėtų pro jas iškristi. Lervoms pernešti atliekant pusiau 
statinius bandymus su visišku kasdieniu atnaujinimu tinka Pastero pipetės (žr. 1.6.6 skirsn į).
 
Jei ikrų talpyklos, grotel ės ar tinkleliai buvo naudojami ikrams pagrin ­
diniame inde laikyti, šitos apribojimo priemon ės turėtų būti pašalintos 
išsiritus lervoms, ta čiau reikia palikti tinklelius, kurie neleist ų ištrūkti 
žuvims. Jei lervas reikia pernešti, j ų neturi veikti oras, o žuvims iš ikr ų 
talpyklų pernešti neturi b ūti naudojami tinklai (tokia atsargumo prie ­
monė gal ir neb ūtina kai kurioms ne tokioms gležnoms r ūšims, pvz., 
karpiui). Šio pernešimo laikas įvairioms r ūšims skirtingas ir pernešti 
nėra visuomet b ūtina. Taikant pusiau statin į metodą galima naudoti 
chemines stiklines ar negilias talpyklas ir, jei b ūtina, turin čias tinklo 
ekraną truputį pakeltą virš stiklin ės dugno. Jei ši ų talpyklų tūris yra 
pakankamas, kad atitikt ų įkrovos reikalavimus (žr. 1.7.1.2 skirsn į), 
embrionų ar lervų pernešti neb ūtina. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Paris, 1992, Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test
 1.6.5.  Vanduo  
Bandymams galima naudoti bet kok į vandenį, kuris atitinka priim ­
tino praskiedimo vandens chemines charakteristikas, nurodytas 4 
priedėlyje, ir kuriame bandymo r ūšis rodo kontrolin į išgyvenamum ą 
bent tokį, koks aprašytas 2 ir 3 pried ėliuose. Vandens kokyb ė turėtų 
būti vienoda vis ą bandymo laik ą. pH reikšm ė neturėtų kisti daugiau 
kaip ± 0,5 pH vieneto. Norint garantuoti, kad skiedimo vanduo per 
daug netur ėtų įtakos bandymo rezultatui (pvz., nesudaryt ų komplek ­
sinių junginių su bandom ąja medžiaga) ar nedaryt ų neigiamo 
poveikio neršian čių žuvų elgesiui, vandens bandiniai turi b ūti kart­
karčiais analizuojami. Sunki ųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, 
Cd ir Ni), pagrindini ų anijonų ir katijon ų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Cl ir 
SO 4 ), pesticid ų (pvz., bendro fosforo organini ų ir chloro organini ų 
pesticidų kiekio), bendrosios organin ės anglies ir suspenduot ų 
kietųjų dalelių analizė turi būti atliekama, pavyzdžiui, kas tris m ėne­
sius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokyb ė yra gana pastovi. Jei 
būtų parodyta, kad vandens kokyb ė yra pastovi bent metus, analiz ė 
gali būti atliekama ne taip dažnai, o intervalai padidinti (pvz., kas 
šešis mėnesius).  
1.6.6.  Bandomieji tirpalai  
Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai ruošiami skiedžiant 
pradinį tirpalą. 
Pradinį tirpalą geriau ruošti bandom ąją medžiag ą tiesiog maišant ar 
purtant skiedimo vandenyje mechanin ėmis priemon ėmis (pvz., 
maišykle ar ultragarsu). Pakankamai koncentruotam pradiniam tirpalui 
ruošti galima naudoti prisotinimo kolon ėles (tirpumo kolon ėles). Kiek 
įmanoma, reikia vengti naudoti tirpiklius ar dispergatorius (tirpinimo 
medžiagas); ta čiau kartais, norint gauti tinkamos koncentracijos 
pradinį tirpalą tokias medžiagas gali tekti naudoti. Tinkami tirpikliai 
yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas, dimetilforma ­
midas ir trietilenglikolis. Tinkami dispergatoriai yra  Cremophor  
RH40, Tween 80, 0,01 % metilceliulioz ė ir HCO-40. Reik ėtų atsargiai 
naudoti lengvai biologiškai irstan čias medžiagas (pvz., aceton ą) ir (ar) 
labai lakius junginius, nes, atliekant dinaminius bandymus, jie gali kelti problem ų dėl bakterij ų kaupimosi. Naudojama tirpinimo 
medžiaga neturi daryti reikšmingo poveikio išgyvenamumui ir 
neigiamo poveikio ankstyvosioms stadijoms, kaip kad nustatoma atlie ­
kant kontrolin į bandym ą vien tik su tirpikliu. Ta čiau reikia kiek 
įmanoma stengtis toki ų medžiagų nenaudoti.
 
Pusiau statiniam metodui galima taikyti dvi atnaujinimo metodikas: 
1) nauji bandomosios medžiagos tirpalai paruošiami švariuose induose ir gyvi lik ę ikrai bei lervos mažuose seno tirpalo t ūriuose 
švelniai pernešami į naujus indus vengiant s ąlyčio su oru; ar 2) 
bandomieji organizmai paliekami senuose induose, ta čiau pakei ­ 
čiama dalis (bent trys ketvir čiai) jų vandens. Terp ės atnaujinimo 
dažnis priklausys nuo bandomosios medžiagos stabilumo, ta čiau 
vandenį atnaujinti rekomenduojama kasdien. Jei pradiniai stabilumo 
bandymai (žr. 1.4 skirsn į) rodo, kad bandomosios medžiagos 
koncentracija laikotarpiu tarp atnaujinim ų yra nestabili (t. y. yra už 
80–120 % vardin ės koncentracijos rib ų ar yra mažesn ė kaip 80 % 
išmatuotos pradin ės koncentracijos), reik ėtų numatyti dinaminio 
bandymo taikym ą. Bet kuriuo atveju reik ėtų pasirūpinti, kad atnau ­
jinant vanden į lervos nepatirt ų įtampos.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
Bandomosios koncentracijos tirpalams į bandymo kameras tiekti 
atliekant dinaminius bandymus reikalinga sistema, kuri nepertrau ­
kiamai dozuot ų ir skiest ų bandomosios medžiagos pradin į tirpalą 
(pvz., dozavimo siurblys, proporcingasis skiestuvas, prisotinimo sistema). Pradini ų tirpalų ir skiedimo vandens srautai turi b ūti 
kartais, geriau kasdien, tikrinami ir vis ą bandym ą turi nekisti 
daugiau kaip 10 %. Tinkamas pasirod ė esąs srautas, atitinkantis 
bent penkis bandymo kameros t ūrius per 24 h (2).
 
1.7. BANDYMO PROCED ŪRA 
Vertingos informacijos, kaip atlikti žuv ų embriono ir mailiaus su 
trynio maišeliu toksiškumo bandymus, yra literat ūroje, kurios keli 
pavyzdžiai įtraukti į šio teksto nuorod ų dalį (7) (8) (9).  
1.7.1.  Veikimo s ąlygos  
1.7.1.1.  Trukm ė 
Bandymą geriau prad ėti per 30 min. nuo ikr ų apvaisinimo. 
Embrionai į bandomąjį tirpalą dedami prieš prasidedant blastodisko 
segmentacijos stadijai ar kuo grei čiau jai prasid ėjus, bet b ūtinai prieš 
gastrulės stadijos pradži ą. Jei ikrus tiekia prekybininkas, prad ėti 
bandymą iš karto po apvaisinimo gali b ūti neįmanoma. Kadangi 
bandymo pradžios v ėlavimas gali labai paveikti bandymo jautrum ą 
bandymas tur ėtų būti pradėtas per aštuonias valandas po apvaisi ­
nimo. Dėl tos priežasties, kad lervos veikimo laikotarpiu nemaiti ­
namos, bandymas tur ėtų būti baigtas prieš pat t ą moment ą kai 
kurioje nors bandymo kameroje kurios nors lervos trynio maišelis 
bus visiškai absorbuotas ar kai iš bado prad ės gaišti kontrolini ų 
bandinių gyvūnai. Trukm ė priklauso nuo naudotos r ūšies. Kai kurios 
rekomenduojamos trukm ės yra nurodytos 2 ir 3 pried ėliuose.  
1.7.1.2.  Įkrova  
Bandymo pradžioje turim ų apvaisint ų ikrų skaičiaus turi pakakti 
statistikos reikalavimams įvykdyti. Ikrai tarp veikimo koncentracij ų 
turi būti paskirstyti atsitiktinai ir kiekvienai koncentracijai turi b ūti 
naudojama bent 30 apvaisint ų ikrų, vienodai (ar kuo vienodžiau, nes 
kai kurias r ūšis gali b ūti sunku gauti vienodas įkrovas) paskirstyt ų 
bent trims tos pa čios koncentracijos bandymo kameroms. Įkrova 
(biomasė bandomojo tirpalo t ūrio vienetui) turi b ūti pakankamai 
maža, kad be aeracijos ištirpusio deguonies koncentracij ą būtų 
galima palaikyti bent 60 % oro prisotinimo koncentracijos. Dinami ­
niams bandymams yra rekomenduota ne didesn ė kaip 0,5 g/l per 24 
h ir bet kuriuo momentu ne didesn ė kaip 5 g/l tirpalo (2).  
1.7.1.3.  Šviesa ir temperat ūra 
Apšvietimo laikotarpis ir vandens temperat ūra turi atitikti žuv ų rūšį 
(2 ir 3 pried ėliai). Temperat ūrai nuolatos kontroliuoti gali b ūti 
patogu tur ėti papildom ą bandymo ind ą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Bandomosios medžiagos koncentracijos  
Paprastai reikia naudoti penkias bandomosios medžiagos koncentra ­
cijas, besiskirian čias pastoviu santykiu, geriausiai ne didesniu kaip 
3,2. Renkantis koncentracijos ver čių intervalą turi būti išnagrin ėta 
ūmaus toksiškumo tyrim ų kreivė, siejanti LC  50 ir veikimo trukm ę. 
Tam tikromis aplinkyb ėmis gali pasiteisinti mažiau kaip penki ų 
koncentracijos ver čių naudojimas, pvz., atliekant ribin ės koncentra ­
cijos vertės nustatymo bandymus, ar siauresnio koncentracijos ver čių 
intervalo naudojimas. Mažiau kaip penki ų koncentracijos ver čių 
naudojimas turi b ūti pagrįstas. Medžiagos koncentracijos ver čių, 
didesnių kaip 96 h LC  50 ar 100 mg/l, ži ūrint, kuri mažesn ė, bandyti 
nebūtina. Netur ėtų būti atliekami bandymai su koncentracijos 
vertėmis, didesn ėmis kaip medžiagos tirpumo ribin ė koncentracija.  
Jei pradinio tirpalo ruošimui lengvinti naudojama tirpinimo 
medžiaga (žr. 1.6.6 skirsn į), jos galutin ė koncentracija turi b ūti ne 
didesnė kaip 0,1 ml/l ir geriau, kai ji visuose bandymo induose b ūtų 
vienoda.  
1.7.3.  Kontroliniai bandiniai  
Be bandomosios serijos, turi b ūti vienas skiedimo vandens kontro ­
linis bandinys (su lygiagre čiais bandiniais, kai reikia) ir, jei tinka, 
vienas kontrolinis bandinys su tirpinimo medžiaga (su lygiagre čiais 
bandiniais, kai reikia).  
1.7.4.  Kiekybini ų analizių ir matavim ų dažnis  
Atliekant bandym ą bandomosios medžiagos koncentracij ų vertės 
nustatomos reguliariais tarpais.  
Jei manoma, kad atliekant pusiau statinius bandymus bandomosios 
medžiagos koncentracija lieka vardin ės koncentracijos ± 20 % vert ės 
(t. y. 80–120 % intervalo; žr. 1.4 ir 1.6.6 skirsnius), rekomenduo ­
jama mažiausiai tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais nustatyti 
bent didžiausi ą ir mažiausi ą bandom ąją koncentracij ą iš karto po 
tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinim ą (t. y. tą patį tirpalą 
reikia analizuoti imant šviežio tirpalo bandinius ir prieš pat jo atnau ­
jinimą). 
Jei tai bandymai, kuriuos atliekant nesitikima, kad koncentracija liks 
lygi vardinei vertei ± 20 % (pagal medžiagos stabilumo duomenis), 
turi būti nustatomos visos šviežiai paruošt ų tirpalų ir tirpalų prieš 
atnaujinim ą koncentracijos vert ės laikantis to paties analiz ės režimo 
(t. y. bent tris kartus lygiais bandymo laiko tarpais). Bandomosios 
medžiagos koncentracij ą prieš atnaujinim ą reikia nustatyti tik 
viename tos pa čios koncentracijos inde. Tarp nustatym ų turi būti 
ne ilgesnis kaip septyni ų parų tarpas. Rekomenduojama rezultatus 
pagrįsti išmatuotomis koncentracijos vert ėmis. Tačiau jei yra 
įrodymų, leidžiančių parodyti, kad bandomosios medžiagos koncent ­
racija visą bandymo laik ą buvo tinkamai palaikoma ± 20 % vardin ės 
koncentracijos vert ės ar išmatuotos pradin ės koncentracijos vert ės, 
rezultatai gali b ūti grindžiami vardine ar išmatuota vert ėmis. 
Atliekant dinaminius bandymus tinka bandini ų ėmimo režimas, 
panašus į aprašytąjį pusiau statiniams bandymams (bet sen ų tirpalų 
koncentracijos matavimas šiuo atveju netinka). Ta čiau jei šis 
bandymas trunka ilgiau kaip septynias paras, b ūtų pageidautina 
pirmą savaitę padidinti bandini ų ėmimo dažn į (pvz., trys matavim ų 
serijos) norint įsitikinti, kad bandomosios koncentracijos vert ės nesi­
keičia. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Bandinius gali tekti filtruoti (pvz., per filtr ą, kurio aki ų dydis 0,45 
μm) ar centrifuguoti. Ta čiau, kadangi nei centrifugavimu, nei filtra ­
vimu ne visuomet galima atskirti biologiškai neprieinam ą bandomo ­
sios medžiagos dal į nuo biologiškai prieinamos dalies, bandini ų 
apdorojimas šiais b ūdais gali b ūti netaikomas.  
Atliekant bandym ą visuose bandymo induose turi b ūti matuojama 
ištirpusio deguonies koncentracija, pH ir temperat ūra. Turi b ūti 
matuojamas kontrolini ų bandini ų ir vieno indo su didžiausios 
koncentracijos bandiniu bendras kietumas ir s ūrumas (jei tinka). 
Mažiausiai ištirpusio deguonies koncentracija ir s ūrumas (jei tinka) 
turi būti matuojami tris kartus (bandymo pradžioje, viduryje ir pabai ­
goje). Atliekant pusiau statinius bandymus ištirpusio deguonies koncentracij ą rekomenduojama matuoti dažniau, geriau prieš kiek ­
vieną vandens atnaujinim ą ir po jo ar bent kart ą per savait ę. Atlie­
kant pusiau statinius bandymus pH vert ė turi būti matuojama prieš 
kiekvieną vandens atnaujinim ą ir po jo, atliekant dinaminius 
bandymus – bent kart ą per savait ę. Vandens kietumas kiekvienam 
bandymui matuojamas vien ą kartą. Temperat ūrą būtina matuoti 
kasdien, o bent viename inde b ūtų geriau ją kontroliuoti be perstojo 
visą laiką.
 
1.7.5.  Steb ėjimai  
1.7.5.1.  Embrioninio vystymosi stadija  
Embrionin ė stadija (t. y. gastrul ės stadija) veikimo bandom ąja 
medžiaga pradžioje turi b ūti kiek įmanoma tiksliau verifikuota. Tai 
galima padaryti naudojant tinkamai išlaikyt ų ir nuvalyt ų ikrų repre­
zentatyvų bandinį. Embrionini ų stadijų aprašymo ir iliustravimo 
pavyzdžių galima rasti literat ūroje (2) (5) (10) (11).  
1.7.5.2.  Išsiritimas ir išgyvenamumas  
Išsiritimo ir išgyvenamumo steb ėjimai turi b ūti daromi bent kasdien, 
o gauti skai čiai registruojami. Gali b ūti pageidautina bandymo 
pradžioje steb ėti dažniau (pvz., pirm ąsias tris valandas kas 30 
minučių), nes kartais išgyvenamumo laikas gali b ūti svarbesnis nei 
vien tik ž ūčių skaičius (pvz., ūmaus toksiškumo atveju). Negyvi 
embrionai ir lervos turi b ūti pašalinti iš karto, kai tik bus pasteb ėti, 
nes jie greitai suyra. Šalinti reik ėtų labai atsargiai, kad neb ūtų 
užgauti ar fiziškai sužaloti šalia esantys ikrai/lervos, kadangi jie 
yra labai gležni ir jautr ūs. Žūties kriterijai kinta pagal gyvenimo 
stadiją: 
— ikrams : ypač ankstyvosiomis stadijomis, pastebimas permato ­
mumo sumaž ėjimas ir spalvos pokytis d ėl baltymo koaguliacijos 
ir (ar) nus ėdimo, dėl to atsiranda baltas matinis atspalvis,  
— embrionams : kūno judėjimo ir (ar) širdies plakimo nebuvimas ir 
(ar) matinio atspalvio atsiradimas r ūšims, kuri ų embrionai yra 
normaliai permatomi,  
— lervoms : nejudamumas ir (ar) kv ėpavimo jud ėjimo, ir (ar) širdies 
plakimo nebuvimas, ir (ar) balta matin ė centrinės nervų sistemos 
spalva ir (ar) reakcijos į mechaninius dirgiklius nebuvimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Nenormali išvaizda  
Kūno ir (ar) pigmentacijos anomalij ų turinčių lervų skaičius ir trynio 
maišelio absorbcijos stadija turi b ūti registruojami atitinkamais laiko 
tarpais atsižvelgiant į bandymo trukm ę ir į aprašytos anomalijos 
prigimtį. Pastebėtina, kad nenormal ūs embrionai ir lervos pasitaiko 
natūraliai ir kai kuri ų rūšių gali sudaryti kelis kontrolinio (-i ų) 
bandinio (-i ų) procentus. Iš bandymo ind ų turi būti pašalinami tik 
nugaišę nenormal ūs gyvūnai. 
1.7.5.4.  Nenormalus elgesys  
Anomalijos, pvz., hiperventiliacija, nekoordinuotas plaukimas ir neti ­
piškas nejudamumas, turi b ūti registruojamos atitinkamais laiko 
tarpais atsižvelgiant į bandymo trukm ę. Šie pasteb ėti poveikiai, 
nors juos sunku įvertinti kiekybiškai, gali pad ėti aiškinti gaištamumo 
duomenis, t. y. suteikti informacijos apie medžiagos toksinio 
veikimo b ūdą. 
1.7.5.5.  Ilgis  
Baigiant bandym ą rekomenduojama išmatuoti atskir ų gyvūnų ilgį; 
galima matuoti standartin į, ilgį iki uodegos peleko išsišakojimo ar 
bendrą ilgį. Tačiau jei supuvo uodegos pelekas ar yra iš ėstas, turi 
būti imamas standartinis ilgis. Paprastai, jei bandymas atliekamas 
teisingai, ilgio variacijos koeficientas lygiagretiems kontroliniams bandiniams turi b ūti ≤ 20 %.
 
1.7.5.6.  Mas ė 
Baigiant bandym ą galima išmatuoti atskir ų gyvūnų masę; geriau 
nustatyti saus ų gyvūnų masę (po 24 h esant 60 °C temperat ūrai), 
o ne gyv ų (sausai nušluostyt ų filtro popieriumi). Paprastai jei 
bandymas atliekamas teisingai, mas ės variacijos koeficientas lygia ­
gretiems kontroliniams bandiniams turi b ūti ≤ 20 %.  
Darant steb ėjimus bus gauta dalis nurodyt ų duomen ų ar visi 
duomenys, kuriems atliekama statistin ė analizė: 
— bendras gaištamumas,  
— sveikų lervų skaičius bandymo pabaigoje,  
— išsiritimo pradžia ir jo pabaiga (t. y. 90 % išsiritusi ų ikrų kiek­
viename vienodos koncentracijos inde),  
— kiekvien ą parą išsiritančių lervų skaičius, 
— iki bandymo pabaigos išgyvenusi ų gyvūnų ilgis (ir mas ė), 
— deformuot ų ar nenormalios išvaizdos lerv ų skaičius, 
— nenormalaus elgesio lerv ų skaičius. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Rekomenduojama, kad rengiant bandymo schem ą ir bandym ą anali­
zuojant dalyvaut ų statistikas, nes šis bandymo metodas leidžia smar ­
kiai keisti eksperimento plan ą pvz., bandymo kamer ų skaičių, 
bandomųjų koncentracij ų skaičių, pradinį apvaisint ų ikrų skaičių, 
matuojam ų parametr ų skaičių. Atsižvelgiant į bandymo schemos 
variantų įvairovę, jokių specialių nurodym ų dėl statistinės metodikos 
čia nepateikiama.  
Jei reikia įvertinti LOEC ar NOEC vertes, b ūtina analizuoti kiek ­
vieno vienodos koncentracijos rinkinio duomen ų sklaidą taikant 
dispersinę analizę (ANOVA) ar faktorin ės analizės lenteles. Norint 
daryti atskiros koncentracijos ir kontrolini ų bandinių gautų rezultatų 
visuotinį lyginimą, gali būti naudingas Dunnetto metodas (12) (13). 
Yra ir kit ų naudingų metodų pavyzdži ų (14) (15). Taikant dispersin ę 
analizę ar kitas metodikas, aptinkamo poveikio dydis (t. y. kriterijaus 
galia) turi b ūti apskaičiuotas ir pateiktas ataskaitoje. Žinotina, kad ne 
visus 1.7.5.6 skirsnyje išvardytus steb ėjimus galima statistiškai apdo ­
roti taikant dispersin ę analizę. Pvz., bendras gaištamumas ir gyv ų 
lervų skaičius bandymo pabaigoje gal ėtų būti analizuojami taikant 
probito modelio metodus.  
Jei reikia įvertinti LC ar EC  X vertes, tyrimo rezultatams taikant 
statistinį metodą, pvz., mažiausi ų kvadratų ar netiesini ų mažiausi ų 
kvadratų metodą, turi būti pritaikyta tinkama (-os) kreiv ė (-ės), pvz., 
logistinė kreivė. Kreivė (-ės) turi būti parametrizuota (-os) taip, kad 
nustatomos LC ar EC  X vertės ir jų standartin ė paklaida gal ėtų būti 
įvertintos tiesiogiai. Tai labai palengvina LC ar EC  X pasikliovimo 
ribų apskaičiavimą. Jei nėra svarbi ų priežasčių pirmenyb ę teikti 
kitiems pasikliovimo lygmenims, turi b ūti nurodomas dvipusis 
95 % pasikliovimo intervalas. Pageidautina, kad pritaikymo metodi ­
koje būtų numatytos priemon ės atitikimo stokos reikšmingumui įver­
tinti. Galima taikyti grafinius kreivi ų pritaikymo metodus. Regresin ė 
analizė tinka visiems 1.7.5.6 skirsnyje išvardytiems steb ėjimams.  
2.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Rezultatai turi b ūti aiškinami atsargiai, jei matuojamos bandom ųjų 
tirpalų toksinių medžiag ų koncentracijos vert ės yra arti analiz ės 
metodo aptikimo ribos. Taip pat labai atsargiai reik ėtų aiškinti rezul ­
tatus, gautus koncentracijos vert ėms, didesn ėms kaip medžiagos 
tirpumo vandenyje vert ės. 
2.3. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
2.3.1.  Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir atitinkamos fizikin ės ir chemin ės savybės, 
— cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynum ą, ir, jei tinka, 
analizės metodas bandomajai medžiagai kiekybiškai nustatyti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Bandomieji gyv ūnai: 
— mokslinis pavadinimas, veisl ė, motinini ų žuvų skaičius (t. y. kiek 
moteriškos lyties žuv ų buvo naudojama bandymui reikaling ų 
ikrų skaičiui gauti), apvaisint ų ikrų surinkimo šaltinis ir metodas 
ir vėlesnis apdorojimas.  
2.3.3.  Bandymo s ąlygos:  
— taikytas bandymo metodas (pvz., pusiau statinis ar dinaminis, 
laikas nuo apvaisinimo iki bandymo pradžios, įkrova ir t. t.),  
— apšvietimo laikotarpio (-i ų) trukmė, 
— bandymo schema (pvz., bandymo ind ų skaičius ir lygiagre čių 
bandinių skaičius, embrion ų skaičius vienam lygiagre čiam bandi ­
niui),  
— pradini ų tirpalų ruošimo metodas ir j ų atnaujinimo dažnis (jei 
naudojama tirpinimo medžiaga, turi b ūti nurodyta jos koncentra ­
cija),  
— vardin ės bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandymo ind ų 
tirpalų koncentracijos vert ės, jų vidutinės vertės, standartiniai 
nuokrypiai ir nustatymo metodas; jei bandomoji medžiaga tirpsta esant mažesnei koncentracijai nei išmatuotos koncentracijos, įrodymai, kad buvo matuojama ištirpintos bandomosios 
medžiagos koncentracija tirpale,
 
— skiedimo vandens charakteristikos: pH, kietumas, šarmingumas, 
temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro 
lygiai (jei matuoti), bendroji organin ė anglis, suspenduotos kieto ­
sios dalel ės, bandymo terp ės sūrumas (jei matuotas) ir visi kiti 
daryti matavimai,  
— bandymo ind ų vandens kokyb ė: pH, kietumas, temperat ūra ir 
ištirpusio deguonies koncentracija.  
2.3.4.  Rezultatai:  
— visų parengiam ųjų bandomosios medžiagos stabilumo tyrim ų 
rezultatai,  
— įrodymai, kad kontroliniai bandiniai atitinka bendro bandomosios 
rūšies išgyvenamumo priimtinumo standart ą (2 ir 3 pried ėliai), 
— embriono ir lervos stadijos žuv ų gaištamumo/išgyvenamumo ir 
bendro gaištamumo/išgyvenamumo duomenys,  
— ikrų inkubavimo par ų skaičius ir išsiritusi ų lervų skaičius, 
— ilgio (ir mas ės) duomenys,  
— morfologini ų anomalij ų, jei yra, dažnis ir aprašymas,  
— poveikio elgesiui, jei yra, dažnumas ir aprašymas,  
— duomen ų statistinė analizė ir apdorojimas,  
— jei bandymo duomenims buvo taikoma dispersin ė analizė, kiek­
vieno įvertinto atsako mažiausia pastebim ą poveikį sukelianti 
koncentracija (LOEC), kai p = 0,05, ir nepasteb ėto poveikio 
koncentracija (NOEC), įskaitant taikyt ų statistini ų metodik ų 
aprašymą ir nuorod ą, kokio dydžio poveikis gali b ūti aptiktas,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— jei bandymo duomenims buvo taikomas regresin ės analizės 
metodas, LC ir EC  X , jų pasikliovimo intervalai ir šioms vert ėms 
apskaičiuoti naudoto pritaikyto modelio grafikas,  
— visų nukrypim ų nuo bandymo metodo paaiškinimai.  
3. NUORODOS  
1) Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short Term 
Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test 
Methods. Final report to the Commission of the European Communities, pp 60. June 1990.
 
2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage 
Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and 
Materials. E 1241–88. 26 pp.  
3) Brauhn J.L. and Schoettger R.A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3–75–011, Duluth, Minnesota.
 
4) Brungs W.A. and Jones B.R. (1977) Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3–77–061, Duluth, Minnesota.
 
5) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish 
(Brachydanio rerio ) in Fisheries Research. A Literature Review. 
J. Biol. 10, 121–173.  
6) Legault R. (1958) A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish,  Brachy­
danio rerio  (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp 328–330.  
7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J.E., Rosander B. 
and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxicity Test with Zebrafish ( Brachydanio rerio ) Using Chromium and 
Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemistry, 6, 
pp 61–71.
 
8) Birge J.W., Black J.A. and Westerman A.G. (1985). Short-term 
Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the 
Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Estimating Chronic Values for Single Compounds and Complex Effluents. 
Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp 807–821.
 
9) Van Leeuwen C.J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986) Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related 
Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout (Salmo gairdneri ). J. Aquatic Toxicology, 9, 129–145.
 
10) Kirchen R.V. and W. R. West (1969). Teleostean Development. 
Carolina Tips 32(4): 1–4. Carolina Biological Supply Company.  
11) Kirchen R.V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. Its 
care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 pp.
 
12) Dunnett C.W. (1955) A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, pp 1096–1121.  
13) Dunnett C.W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, 482–491.  
14) Mc Clave J.T., Sullivan J.H. and Pearson J.G. (1980). Statistical 
Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings of 4th 
Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
15) Van Leeuwen C.J., Adema D.M.M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp 321–334.  
16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or 
Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS l/RM/28, December 1992, pp 81.
 
17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish,  Brachydanio 
rerio . Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, 126–134.  
18) Meyer A., Bierman C.H. and Orti G. (1993). The phylogenetic 
position of the Zebrafish ( Danio rerio ), a model system in 
developmental biology – an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: 231–236.
 
19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference 
Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Envi ­
ronmental SAFEty 32, 19–28.  
20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka,  Oryzias latipes . EPA report EPA/600/3–91/064, Dec. 
1991, EPA, Duluth.  
21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, ( Oryzias latipes ). EPA 
report EPA/600/3–91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
22) De Graeve G.M., Cooney J.D., McIntyre DO., Poccocic T.L., 
Reichenbach N.G., Dean J.H. and Marcus M.D. (1991). Vali ­
dity in the performance of the seven-day Fathead minnow 
{}{Pimephales promelas ) larval survival and growth test: an 
intra- and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, 1189–1203.
 
23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estuarine 
and Marine fish.
 
24) Balon E.K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., 
Dordrecht, 280 pp.  
25) Blaxter J.H.S. (1988). Pattern and variety in development, In: 
W.S. Hoar and D.J. Randall Eds., Fish Physiology, vol. XIA, 
Academic press, pp 1–58.  
1 A lentel ė 
BANDYMUI REKOMENDUOJAMOS ŽUV Ų RŪŠYS  
GĖLAVANDEN ĖS 
Oncorhynchus mykiss  
Vaivorykštinis up ėtakis (9)(16)  
Danio rerio  
Zebrinė danija (7)(17)(18)  
Cyprinus caprio  
Paprastasis karpis (8)(19)  
Oryzias latipes  
Japoninė medaka (20)(21)  
Pimephales promelas  
Juodoji dr ūtgalvė rainė (8)(22)  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
1 B lentel ė 
Kitų dokumentais tinkamai patvirtint ų naudotų rūšių pavyzdžiai  
GĖLAVANDEN ĖS S ŪRIAVANDEN ĖS (JŪRŲ) 
Carassius auratus  
Sidabrinis karosas (8)  Menidia peninsulae  
Menidija (23)(24)(25)  
Lepomis macrochirus  
Melsvažiaunis saulešeris (8)  Clupea harengus  
Atlantinė silkė (24)(25)  
Gadus morhua  
Atlantinė menkė (24)(25)  
Cyprinodon variegatus  
Lėlžuvė (23)(24)(25)  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
1 priedėlis 
TOKSIŠKUMO ZEBRIN ĖS DANIJOS (BRACHYDANIO RERIO) 
EMBRIONUI IR MAILIUI SU TRYNIO MAIŠELIU BANDYMO 
REKOMENDACIJOS  
ĮVADAS  
Zebrinė danija yra Indijos  Coromandel  pakrančių žuvis, gyvenanti srauniose 
upėse. Tai yra paplitusi karpi ų šeimos akvarium ų žuvis, informacijos apie jos 
priežiūros ir auginimo b ūdus galima rasti standartiniuose žinynuose apie tropik ų 
žuvis. Žuvies biologija ir naudojimas žuvininkyst ės tyrimams buvo apžvelgti 
Laale (1).  
Žuvis retai yra ilgesn ė kaip 45 mm. Jos cilindro formos k ūnas turi 7–9 tamsiai 
mėlynas horizontalias sidabriškas juostas. Šios juostos eina iki uodegos ir 
analinių pelekų. Nugara gelsvai žalsva. Patinai yra plonesni už pateles. Patel ės 
yra labiau sidabriškos ir su labiau išp ūstu pilvu, ypa č prieš neršt ą. 
Suaugusios žuvys gali pak ęsti didelius temperat ūros, pH ir kietumo svyravimus. 
Tačiau norint gauti sveikas žuvis, kurios neršt ų geros kokyb ės ikrus, reikia 
sudaryti optimalias s ąlygas.  
Neršto metu patinas persekioja patel ę ir bado j ą galva, ir kai tik ikrai yra išner ­ 
šiami, jie iškart apvaisinami. Ikrai, b ūdami permatomi ir nelipn ūs, krenta į dugną, 
kur juos gali suryti t ėvai. Nerštui įtakos turi apšvietimas. Jei ryt ą šviesos 
pakanka, žuvis paprastai neršia anksti, kai tik išaušta.  
Patelė gali neršti keli ų šimtų ikrų partijomis kas savait ę. 
MOTININI Ų ŽUVŲ BŪSENA. REPRODUKCIJA IR ANKSTYVOSIOS 
GYVENIMO STADIJOS  
Parinkite atitinkam ą skaičių sveikų žuvų ir prieš numatyt ą neršto laik ą bent dvi 
savaites laikykite tinkamame vandenyje (pvz., 4 pried ėlis). Žuvų grupei turi b ūti 
leista bent kart ą neršti prieš ruošiant bandymui skirt ų ikrų partiją. Žuvų tankis 
šiuo laikotarpiu turi b ūti ne didesnis kaip 1 gramas žuv ų litrui vandens. Tankis 
gali būti didesnis, jei vanduo kei čiamas reguliariai ar naudojamos valymo 
sistemos. Temperat ūra rezervuaruose turi b ūti 25 ± 2 °C. Žuvys tur ėtų būti 
šeriamos įvairiu maistu, kur į gali sudaryti, pvz., atitinkamas parduodamas sausas 
maistas, gyvos k ą tik išsiritusios artemijos, chironomid ės, dafnijos, baltosios 
kirmėlės (Enchytraeids ). 
Toliau bendrais bruožais išd ėstytos dvi metodikos, kurias taikant bandymui 
galima gauti pakankam ą skaičių sveikų apvaisint ų ikrų: 
i) Į 50 1 skiedimo vandens pripildyt ą akvarium ą, apsaugot ą nuo tiesiogin ės 
šviesos, įleidžiama aštuonios patel ės ir 16 patin ų, kurie kiek įmanoma netrik ­
domi bent 48 valandas. Dienos prieš bandymo pradži ą vidurdien į akvariumo 
dugne padedamas pad ėklas nerštui. Pad ėklą nerštui sudaro 5–7 cm aukš čio 
rėmas (iš organinio stiklo ar kitos tinkamos medžiagos), jo viršuje tvirtinamas 
stambių 2–5 mm aku čių tinklas, apa čioje – smulki ų 10–30 μm akučių tinklas. 
Prie rėmo stambaus tinklo pritvirtinami keli „medžiai“ nerštui, padaryti iš 
nesusuktos nailono virvut ės. Žuvims 12 valand ų pabuvus tamsoje, nerštui 
pradėti įjungiama silpna šviesa. Po neršto pra ėjus 2–4 valandoms, pad ėklas 
išimamas ir surenkami ikrai. Pad ėklas nerštui neleidžia žuvims suryti ikr ų, be 
to, palengvina j ų surinkim ą. Žuvų grupei turi b ūti leista bent kart ą neršti prieš 
ruošiant bandymui skirt ų ikrų partiją. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) Nuo penki ų iki dešimties patin ų ir patelių bent dvi savaites prieš numatyt ą 
nerštą laikomi atskirai. Po 5–10 par ų patelių pilvai bus išsip ūtę ir matyti j ų 
genitaliniai speneliai. Patinai speneli ų neturi. Neršiama nerštui skirtuose rezer ­
vuaruose, turin čiuose netikr ą tinklinį dugną (kaip pirmiau). Rezervuaras 
pripildomas skiedimo vandens taip, kad vandens virš tinklo b ūtų 5–10 cm. 
Parą prieš numatyt ą nerštą į rezervuar ą įleidžiama viena patel ė ir du patinai. 
Vandens temperat ūra palaipsniui didinama, kol pasiekiama vienu laipsniu 
didesnė negu aklimatizacijos temperat ūra. Šviesa išjungiama ir stengiamasi 
kiek įmanoma netrikdyti rezervuare esan čių žuvų. Rytą nerštui prad ėti įjun­
giama silpna šviesa. Po 2–4 valand ų žuvys išimamos ir surenkami ikrai. Jei 
ikrų reikia daugiau nei gali išneršti viena patel ė, lygiagre čiai galima įrengti 
pakankam ą skaičių rezervuar ų. Jei prieš bandym ą buvo registruota kiekvienos 
patelės reprodukcijos geba (partijos dydis ir kokyb ė), nerštui galima atrinkti 
geriausios reprodukcijos gebos pateles.  
Ikrai turi b ūti pernešti į bandymo indus naudojant stiklinius vamzdelius (vidinis 
skersmuo ne mažesnis kaip 4 mm), turin čius lanksčias siurbimo kriaušes. Su ikrais 
pernešamo vandens turi b ūti kuo mažiau. Ikrai yra sunkesni už vanden į ir iškrenta iš 
vamzdelio. Reikia ži ūrėti, kad ikrams (ir lervoms) nepatekt ų oro. Siekiant užtikrinti, 
kad pradin ėse vystymosi stadijose neb ūtų nukrypim ų nuo normos, ikr ų partijų 
ėminiai turi b ūti ištirti mikroskopu. Ikr ų dezinfekuoti negalima.  
Ikrų daugiausia ž ūva per pirm ąsias 24 h po apvaisinimo. Šiuo laikotarpiu dažnai 
jų žūva 5–40 %. Ikrai išsigimsta d ėl nesėkmingo apvaisinimo ar d ėl nenormalaus 
vystymosi. Atrodo, kad ikr ų partijos kokyb ė priklauso nuo pateli ų, nes kai kurios 
patelės visą laiką neršia geros kokyb ės ikrus, o kitoms tai niekuomet nepavyksta. 
Skiriasi ikr ų partijų vystymosi greitis ir išsiritimo trukm ė. Sėkmingai apvaisint ų 
ikrų ir lervų su trynio maišeliu išliekamumas yra geras, paprastai didesnis kaip 
90 %. Esant 25 °C temperat ūrai lervos išsirita per 3–5 paras po apvaisinimo, o 
trynio maišelis absorbuojamas maždaug per 13 par ų po apvaisinimo.  
Embrionin į vystymąsi gerai apraš ė Hisaoka ir Battle (2). D ėl ikrų ir išsiritusi ų 
lervų permatomumo žuvies vystym ąsi galima sekti ir pasteb ėti išsigimimus. 
Praėjus maždaug keturioms valandoms po neršto neapvaisintus ikrus galima 
atskirti nuo apvaisint ų (3). Šiam tyrimui ikrai ir lervos dedami į mažo tūrio 
bandymo indus ir tiriami mikroskopu.  
Ankstyvosioms gyvenimo stadijoms taikomos bandymo s ąlygos išvardytos 2 
priedėlyje. Optimalios praskiedimo vandens pH ir kietumo vert ės yra atitinkamai 
lygios 7,8 ir 250 mg CaCO  3 /l. 
APSKAIČIAVIMAI IR STATISTIKA  
Siūlomas dviej ų stadijų metodas. Iš pradži ų statistiškai analizuojamas gaišta ­
mumas, nenormalaus vystymosi ir išsiritimo trukm ės duomenys. V ėliau toms 
koncentracijoms, kurioms esant neigiamo poveikio šiems parametrams nebuvo 
aptikta, statistiškai įvertinamas k ūno ilgis. Si ūloma taikyti š į metodą, nes nuo 
toksiškos medžiagos gali selektyviai ž ūti kai kurios mažesn ės žuvys, v ėluoti 
išsiritimo laikas ir atsirasti akivaizdži ų išsigimim ų, taigi dėl to gali b ūti netikslūs 
ilgio matavimai. Be to, kiekvienam veikimui reik ės išmatuoti maždaug tok į pat 
skaičių žuvų, ir taip bus garantuotas bandymo statistikos tinkamumas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
LC 50 IR EC  50 NUSTATYMAS  
Išgyvenusi ų ikrų ir lervų procentin ė dalis darant patais ą dėl gaištamumo kontro ­
liniuose bandiniuose apskai čiuojama pagal  Abbotto  formulę (4): 
P ¼ 100 – Í ðC – P’Þ 
ðCÞ Ü 100 Î 
čia, 
P = Pataisytas išgyvenamumas %  
P’ = bandomajai koncentracijai steb ėta išgyvenamumo vert ė % 
C = kontroliniams bandiniams steb ėta išgyvenamumo vert ė % 
Jei įmanoma, bandymo pabaigoje tinkamu metodu nustatoma LC  50 . 
Jei vertinant EC  50 į statistiką norima įtraukti morfologines anomalijas, rekomen ­
dacijų galima rasti Stephan darbe (5).  
LOEC IR NOEC ĮVERTINIMAS  
Ikrų ir mailiaus su trynio maišeliu bandymo tikslas – nenulines koncentracijos vertes 
palyginti su kontroliniais bandiniais, t. y. nustatyti LOEC. Taigi turi b ūti taikomos 
visuotinio palyginimo ( multiple comparison ) metodikos (6) (7) (8) (9) (10).  
NUORODOS  
1) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish ( Brachydanio 
rerio ) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, 
p. 121–173.  
2) Hisaoka K.K. and Battle H.I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 
p. 311.  
3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabarbling 
(Brachydanio rerio  Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 
2, p. 173–181.  
4) Finney D.J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, p. 1–333.  
5) Stephan C.E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J.G. Pearson, R.B. Foster and W.E. Bishop, Eds., American 
Society for Testing and Materials, p. 69–81.
 
6) Dunnett C.W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, p. 1096–1121.
 
7) Dunnett C.W. (1964) New Tables for Multiple Comparisons with a 
Control. Biometrics, 20, p. 482–491.  
8) Williams D.A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. 
Biometrics, 27, p. 103–117.  
9) Williams D.A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, p. 519–531.  
10) Sokal R.R. and Rohlf F.J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W.H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼C1 
2 priedėlis 
REKOMENDUOJAM Ų RŪŠIŲ BANDYMO S ĄLYGOS, TRUKM Ė IR IŠGYVENAMUMO KRITERIJAI  
Rūšis Temp erat ūra 
(°C) Sūrumas 
(0/00)  Apšviet imo 
trukmė 
(valandos)  Stadijų trukmė 
(paros)  
Tipiška bandymo trukm ė Išgyvenamumas kontroliniuose 
bandiniuose 
(ne mažesnis kaip %)  
Embrion as  Mailius su trynio 
maišeliu  Išsiritimo s ėkmė Po išsiritimo  
GĖLAVANDEN ĖS 
Brachydanio rerio  
Zebrinė danija  25 ± 1  —  12–16  3–5  8–10  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 5 par ų po 
išsiritimo (8–10 par ų) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Vaivorykštinis up ėtakis  10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  3 ) 30–35  25–30  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 20 par ų 
po išsiritimo (50–55 paros)  66 70  
Cyprinus carpio  
Paprastasis karpis  21–25  —  12–16  5  > 4  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 4 par ų po 
išsiritimo (8–9 paros)  80 75  
Oryzias latipes  
Japoninė medaka  24 ± 1 (  1 ) 
23 ± 1 (  1 ) — 12–16  8–11  4–8  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 5 par ų po 
išsiritimo (13–16 par ų) 80 80  
Pimephales promelas  
Juodoji dr ūtagalvė rainė 25 ± 2  —  16  4–5  5  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 4 par ų po 
išsiritimo (8–9 paros)  60 70  
( 1 ) Embrionams 
( 2 ) Lervoms 
( 3 ) Embrionas ir lerva vien ą savaitę po išsiritimo laikomi tamsoje, išskyrus kai jie yra tikrinami. Toliau susilpnintas apšvietimas vis ą bandymo laik ą.
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼C1 
3 priedėlis 
Kitų dokumentais tinkamai patvirtint ų rūšių bandymo s ąlygos, trukm ė ir išgyvenamumo kriterijai  
Rūšis Temperat ūra 
(°C) Sūrumas (0/00)  Apšvietimo 
trukmė 
(valandos)  Stadijų trukmė (paros)  
Tipiška embriono ir mailiaus sutrynio maišeliu 
bandymo trukm ė Kontrolini ų bandinių 
išgyvenamumas 
(ne mažesniskaip %)  
Embrionas  Mailiaus 
sutrynio maišeliu 
bandymas  Išsiritimo s ėkmė Poišsiritimo  
GĖLAVANDEN ĖS 
Carassius auratus  
Sidabrinis karosas  24 ± 1  —  —  3–4  > 4  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 4 par ų po 
išsiritimo (7 paros)  — 80  
Lepomis macrochirus  
Melsvažiaunis saulešeris  21 ± 1  —  16  3  > 4  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 4 par ų po 
išsiritimo (7 paros)  — 75  
JŪROS  
Menidia peninsulae  
Priekrantin ė menidija  22–25  15–22  12  1,5  10  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 5 par ų po 
išsiritimo (6–7 paros)  80 60  
Clupea harengus  
Atlantinė silkė 10 ± 1  8–15  12  20–25  3–5  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 3 par ų po 
išsiritimo (23–27 paros)  60 80  
Gadus morhua  
Atlantinė menkė 5 ± 1  5–30  12  14–16  3–5  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 3 par ų po 
išsiritimo (18 par ų) 60 80  
Cyprinodon variegatus  
Lėlžuvė 25 ± 1  15–30  12  —  —  Kiek įmanoma grei čiau po apvaisinimo 
(ankstyvoji gastrul ės stadija) iki 4/7 par ų 
po išsiritimo (28 paros)  > 75  80
4 PRIED ĖLIS 
KAI KURIOS TINKAMO SKIEDIMO VANDENS CHEMIN ĖS 
CHARAKTERISTIKOS  
Medžiaga  Koncentracija  
Kietosios dalel ės < 20 mg/l  
Bendroji organin ė anglis  < 2 mg/l  
Nejonizuotas amoniakas  < 1 μg/l 
Liekamasis chloras  < 10 μg/l 
Bendras fosforo organini ų pesticidų kiekis  < 50 ng/l  
Bendras chloro organini ų pesticidų ir polichlorint ų bife­
nilų kiekis  < 50 ng/1  
Bendras organinis chloras  < 25 ng/1  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  NAMIN ĖS BIT ĖS. ŪMUS TOKSIŠKUMAS PER 
VIRŠKINAM ĄJĮ TRAKT Ą 
1. METODAS  
Šis ūmaus toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 213 (1998) 
kopija.  
1.1. ĮVADAS  
Šis toksiškumo bandymas yra laboratorinis metodas, skirtas įvertinti 
augalų apsaugos priemoni ų ir kitų cheminių medžiag ų ūmų toksiš­
kumą per virškinam ąjį traktą suaugusioms namin ėms bitėms darbi­
ninkėms. 
Vertinant ir nustatant chemini ų medžiag ų toksiškumo charakteris ­
tikas, gali b ūti reikalinga nustatyti ūmų toksiškum ą per virškinam ąjį 
traktą naminėms bitėms, pvz., kai galimas namini ų bičių veikimas 
chemine medžiaga. Ūmaus toksiškumo per virškinam ąjį traktą 
bandymas atliekamas norint nustatyti pesticid ų ir kitų chemini ų 
medžiagų būdingą toksiškum ą bitėms. Šio bandymo rezultatai tur ėtų 
būti naudojami pesticid ų pavojaus bit ėms vertinimo programose 
pagal sek ą nuo laboratorini ų toksiškumo bandym ų iki bandym ų 
pusiau lauko ir lauko s ąlygomis (1). Pesticidai gali b ūti bandomi 
kaip veikliosios medžiagos (v. m.) ar kaip preparatai.  
Turi būti vartojamas toksiškumo etalonas bi čių jautrumui ir bandymo 
metodo preciziškumui tikrinti.  
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Ūmus toksiškumas per virškinam ąjį traktą – neigiamas poveikis, 
kuris pasireiškia ne v ėliau kaip po 96 valand ų (h) davus vienkartin ę 
bandomosios medžiagos doz ę. 
Dozė – suvartotos medžiagos kiekis. Doz ė išreiškiama kaip bando ­
mosios medžiagos mas ė (μg) vienam bandomajam gyv ūnui 
(μg/bitei). Tikroji doz ė kiekvienai bitei negali b ūti apskaičiuota, 
nes bitės šeriamos kartu, ta čiau galima įvertinti vidutin ę dozę 
(bendras bandomosios medžiagos suvartotas kiekis/bandom ųjų bičių 
skaičius viename narvelyje).  
Oralinė LD  50 (vidutinė mirtina doz ė) – yra statistiškai apskai čiuota 
vienkartin ė medžiagos doz ė, kurią duodant per virškinamaj į traktą 
gali žūti 50 % gyv ūnų. LD  50 vertė yra išreiškiama ( μg) bandomosios 
medžiagos vienai bitei. Jei tai pesticidai, bandomoji medžiaga gali 
būti veiklioji medžiaga (v. m.) ar preparatas, kuriame yra viena ar 
daugiau kaip viena veiklioji medžiaga.  
Mirštamumas  – gyvūnas registruojamas kaip žuv ęs, kai jis visiškai 
nejuda.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Taikant tam tikr ą dozių intervalą, suaugusios namin ės bitės darbi­
ninkės (Apis mellifera ) yra veikiamos sacharoz ės tirpale ištirpinta 
bandomąja medžiaga. Toliau bit ės maitinamos tuo pa čiu maistu be 
bandomosios medžiagos. Mirštamumas registruojamas kasdien bent 
48 h ir lyginamas su mirštamumu kontroliniuose bandiniuose 
vertėmis. Jei mirštamumas did ėja 24–48 h laikotarpiu, o miršta ­
mumas kontroliniuose bandiniuose lieka priimtino lygio, t. y. ≤ 
10 %, bandym ą reikia tęsti ne ilgiau kaip iki 96 h. Rezultatai anali ­
zuojami LD  50 po 24 h ir 48 h, o jei bandymas t ęsiamas, po 72 h ir 
96 h apskai čiuoti. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. BANDYMO TINKAMUMAS  
Bandymas yra tinkamas, jei tenkinamos šios s ąlygos:  
— baigiant bandym ą vidutinis mirštamumas visuose kontroliniuose 
bandiniuose turi b ūti ne didesnis kaip 10 %,  
— toksiškumo etalono LD  50 atitinka apibr ėžtą intervalą. 
1.5. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.5.1.  Bičių rinkimas  
Turi būti naudojamos jaunos suaugusios tos pa čios veislės bitės 
darbinink ės, t. y. to paties amžiaus, vienodai maitinamos ir t. t. 
Bitės turi b ūti gaunamos iš tinkamai maitinam ų, sveikų, kiek 
įmanoma be lig ų ir vienos motin ėlės kolonijų, kurių istorija ir fizio ­
loginė būsena yra žinoma. Jos gali b ūti renkamos t ą rytą, kai numa ­
toma naudoti, ar vakare prieš bandym ą ir laikomos bandymo s ąly­
gomis iki kitos dienos. Tinka iš r ėmų surinktos bit ės be perų. Reikia 
vengti rinkti bites ankstyv ą pavasarį ar vėlyvą rudenį, nes tokiu metu 
keičiasi bičių fiziologija. Jei bandymai turi b ūti atliekami anksti 
pavasarį ar vėlai rudenį, bitės gali būti užaugintos inkubatoriuje ir 
vieną savaitę maitinamos bi čių duonele (nuo korio surinktomis žieda ­
dulkėmis) ir sacharoz ės tirpalu. Bit ės, apdorotos chemin ėmis medžia ­
gomis, pvz., antibiotikais, preparatais varaozei gydyti ir t. t., toksiš ­
kumo bandymams netur ėtų būti naudojamos, jei po apdorojimo 
paskutinį kartą dar nėra praėję keturių savaičių. 
1.5.2.  Laikymo ir maitinimo s ąlygos  
Naudojami lengvai plaunami ir gerai v ėdinami narveliai. Galima 
naudoti bet kurios tinkamos medžiagos, pvz., ner ūdijančio plieno, 
vielos tinklelio, plastiko, vienkartinius medinius narvelius ir t. t. 
Geriau naudoti 10 bi čių vienam narveliui grupes. Narveli ų dydis 
turi atitikti bi čių skaičių, t. y. joms reikia palikti pakankamai vietos.  
Bitės bandymo patalpoje turi b ūti laikomos tamsoje esant 25 ± 2 °C 
temperatūrai. Santykinis dr ėgnis, paprastai apie 50–70 %, turi b ūti 
registruojamas per vis ą bandymą. Bičių tvarkymo proced ūras, įskai­
tant apdorojim ą ir stebėjimus, galima daryti (dienos) šviesoje. Maist ą 
sudaro sacharoz ės vandeninis tirpalas, kurio galutin ė koncentracija 
yra 500 g/l (50 % w/v). Sudavus bandymo dozes maitinama pasi ­
rinktinu laiku. Maitinimo įtaisas turi leisti registruoti maisto tiekim ą į 
kiekvieną narvelį. Galima naudoti stiklin į mėgintuvėlį (maždaug 50 
mm ilgio ir 10 mm plo čio, kurio atviras galas susiaurinamas 
maždaug iki 2 mm skersmens).  
1.5.3.  Bičių ruošimas  
Surinktos bit ės yra atsitiktinai paskirstomos į bandymo narvelius, 
kurie atsitiktinai išd ėstomi bandymo patalpoje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Prieš bandymo pradži ą bitės gali būti nemaitintos ne daugiau kaip 2 
h. Rekomenduojama prieš apdorojim ą bičių nemaitinti, kad bandymo 
pradžioje vis ų bičių virškinimo traktas b ūtų vienodai apkrautas. Prieš 
pradedant bandym ą gaištančios bitės turi būti pašalintos ir pakeistos 
sveikomis.  
1.5.4.  Dozi ų ruošimas  
Jei bandomoji medžiaga yra su vandeniu maišomas junginys, j ą 
galima tiesiogiai disperguoti 50 % sacharoz ės tirpale. Vandenyje 
blogai tirpiems technin ės paskirties produktams ir medžiagoms 
galima naudoti bit ėms mažai toksiškus nešiklius, pvz., organin į 
tirpiklį, emulsiklius ar dispergatorius (pvz., aceton ą, dimetilforma ­
midą, dimetilsulfoksid ą). Nešiklio koncentracija priklauso nuo 
bandomosios medžiagos tirpumo ir turi b ūti vienoda visoms bandy ­
toms koncentracijoms. Ta čiau paprastai nešiklio koncentracija yra 
1 % ir didesn ės naudoti nereik ėtų. 
Turi būti paruošti atitinkami kontroliniai tirpalai, t. y. jei bandomajai 
medžiagai tirpinti naudojamas tirpiklis ar dispergatorius, turi b ūti 
naudojamos dvi atskiros kontrolini ų bandinių grupės: vienas doza ­
vimo tirpal ų koncentracijos tirpiklio/nešiklio tirpalas vandenyje ir 
vienas sacharoz ės tirpale.  
1.6. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.6.1.  Bandym ų ir kontrolin ės grupės 
Dozių ir lygiagre čių bandinių skaičius turi atitikti statistinius LD  50 
nustatymo reikalavimus esant 95 % pasikliovimo riboms. Paprastai 
bandymui reikia penki ų LD  50 intervalo dozi ų, išdėstytų pagal 
geometrin ę progresij ą, kurios koeficientas b ūtų ne didesnis kaip 
2,2. Tačiau skiedimo faktorius ir dozavimui naudojam ų koncentracij ų 
skaičius turi b ūti nustatyti pagal toksiškumo kreiv ės (mirtingumas 
kaip dozės funkcija) krypties koeficient ą ir atsižvelgiant į rezultatams 
analizuoti pasirinkt ą statistinį metodą. Dozavimui tinkamas koncent ­
racijas galima pasirinkti pagal intervalo nustatymo bandymo rezul ­
tatus.  
Kiekvienos bandymo koncentracijos doz ę turi gauti ne mažiau kaip 
trys bandym ų grupės po 10 bi čių. Be bandomosios serijos, turi b ūti 
bandomos ne mažiau kaip trys kontrolin ės grupės po 10 bi čių. Kont­
rolinės grupės taip pat turi b ūti įtrauktos ir naudojamiems tirpik ­
liams/nešikliams (žr. 1.5.4 skirsn į). 
1.6.2.  Toksiškumo etalonas  
Į bandymų seriją turi būti įtrauktas toksiškumo etalonas. Kiekvienai 
bandomajai dozei tur ėtų būti bent trys narveliai su 10 bi čių kiekvie­
name narvelyje. Kaip toksiškumo etalon ą geriau naudoti dimetoat ą, 
kuriam literat ūroje nurodytas oralin ės LD  50 24 h vertės intervalas yra 
0,10– 0,35 μg veikliosios medžiagos vienai bitei (2). Ta čiau būtų 
priimtini ir kiti toksiškumo etalonai, jei b ūtų pateikta pakankamai 
duomenų laukiamam atsakui į dozės poveikį patikrinti (pvz., para ­
tionas).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Veikimas  
1.6.3.1.  Dozi ų davimas  
Kiekvienai bi čių bandymo grupei turi b ūti duodama 100–200 μl 
50 % sacharoz ės vandeninio tirpalo, kuriame b ūtų reikiamos 
koncentracijos bandomoji medžiaga. Blogai tirpiems, mažo toksiš ­
kumo produktams ar mažos koncentracijos preparatams reikalingas 
didesnis t ūris, nes turi b ūti sunaudota didesn ė sacharoz ės tirpalo 
dalis. Turi b ūti kontroliuojamas grup ės suvartotas apdoroto maisto 
kiekis. Maist ą suvartojus (paprastai per 3–4 h), maitinimo įtaisas turi 
būti pašalintas iš narvelio ir pakeistas maitinimo įtaisu vien tik su 
sacharozės tirpalu. Toliau sacharoz ės tirpalai duodami pasirinktinu 
laiku. Esant kai kuri ų junginių didesnei koncentracijai, maisto gali 
būti suvartota mažai arba bit ės gali jį visiškai atmesti. Ne v ėliau kaip 
po 6 h nesuvartotas apdorotas maistas turi b ūti pakeistas vien tik 
sacharozės tirpalu. Turi b ūti įvertintas nesuvartoto apdoroto maisto 
kiekis (pvz., matuojant nesuvartoto apdoroto maisto t ūrį arba mas ę). 
1.6.3.2.  Trukm ė 
Geriausia bandymo trukm ė po to, kai bandomasis tirpalas pakei ­ 
čiamas vien tik sacharoz ės tirpalu, yra 48 h. Jei mirštamumas po 
pirmųjų 24 h vis dar did ėja daugiau kaip 10 %, bandymo trukm ė 
turi būti prailginta ne daugiau kaip iki 96 h, jei mirštamumas kontro ­
liniuose bandiniuose yra ne didesnis kaip 10 %.  
1.6.4.  Steb ėjimai  
Mirštamumas registruojamas po 4 h nuo bandymo pradžios, o v ėliau 
po 24 h ir 48 h (t. y. po doz ės davimo). Jei reikalingas prailgintas 
stebėjimo laikotarpis, tolesni vertinimai turi b ūti daromi kas 24 h ne 
ilgiau kaip iki 96 h, jei mirštamumas kontroliniuose bandiniuose yra 
ne didesnis kaip 10 %.  
Turi būti įvertintas grup ės suvartoto maisto kiekis. Apdoroto ir neap ­
doroto maisto vartojimo grei čio per 6 h lyginimas gali suteikti infor ­
macijos apie apdoroto maisto priimtinum ą. 
Turi būti registruojami visi bandymo metu pasteb ėti neįprasto elgesio 
reiškiniai.  
1.6.5.  Ribinis bandymas  
Kartais (pvz., kai manoma, kad bandomosios medžiagos toksiškumas 
turėtų būti mažas) galima atlikti ribin į bandymą naudojant 100 μg 
veikliosios medžiagos vienai bitei, taip norint parodyti, kad LD  50 yra 
didesnė už šią vertę. Turi būti naudojama ta pati metodika, įskaitant 
tris lygiagre čias bandym ų grupes bandomajai dozei, atitinkamus 
kontrolinius bandinius ir toksiškumo etalon ą. Jei pasitaiko mirties 
atvejų, turi būti daromas visas tyrimas. Jei pastebimi subletal ūs 
poveikiai (žr. 1.6.4 skirsn į), jie turi b ūti užregistruoti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
2.1. DUOMENYS  
Duomenys tur ėtų būti apibendrinti lenteli ų pavidalu, kiekvienos 
dozės grupei, taip pat kontrolini ų bandinių ir toksiškumo etalono 
grupėms nurodant naudot ų bičių skaičių, mirštamum ą kiekvienu 
stebėjimo momentu ir ne įprastai besielgian čių bičių skaičių. Miršta­
mumo duomenis analizuokite atitinkamais analiz ės metodais (pvz., 
probito funkcijos analiz ė, slenkamasis vidurkis, binominio skirstinio 
tikimybė) (3) (4). Nubraižykite atsako, kaip doz ės funkcijos, kreives 
kiekvienam rekomenduotam steb ėjimo momentui ir apskai čiuokite 
kreivių krypties koeficientus ir vidutines mirtinas dozes (LD  50 ) su 
95 % pasikliovimo ribomis. Galima padaryti pataisas d ėl miršta­
mumo kontroliniuose bandiniuose naudojant Abbotto patais ą (4) 
(5). Jei apdorotas maistas suvartojamas nevisiškai, turi b ūti nustatyta 
grupės suvartota bandomosios medžiagos doz ė. LD  50 turi būti 
išreikšta μg bandomosios medžiagos vienai bitei.  
2.2. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti ši informacija:  
2.2.1.  Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir atitinkamos fizikin ės ir chemin ės savybės (pvz., 
stabilumas vandenyje, gar ų slėgis), 
— cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant strukt ūrinę formulę, 
grynumą (t. y. pesticidams – identiškumas ir veikliosios (- ųjų) 
medžiagos (- ų) koncentracija).  
2.2.2.  Bandomieji gyv ūnai: 
— mokslinis pavadinimas, veisl ė, apytikris amžius (savait ėmis), 
rinkimo b ūdas, rinkimo data,  
— informacija apie bandym ų bičių rinkimui naudotas kolonijas, 
įskaitant sveikat ą, visas suaugusi ų bičių ligas, prieš tai taikyt ą 
apdorojim ą ir t. t.  
2.2.3.  Bandymo s ąlygos:  
— bandymo patalpos temperat ūra ir santykinis dr ėgnis,  
— laikymo s ąlygos, įskaitant narveli ų tipą, dydį ir medžiag ą, 
— pradini ų ir bandom ųjų tirpalų ruošimo b ūdai (turi b ūti nurodytas 
tirpiklis, jei naudojamas, ir jo koncentracija),  
— bandymo schema, pvz., naudotos bandomosios koncentracijos ir 
jų skaičius, kontrolini ų bandinių skaičius; kiekvienai bandomajai 
koncentracijai ir kontroliniam bandiniui naudot ų narvelių skaičius 
ir bičių skaičius viename narvelyje,  
— bandymo data.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Rezultatai:  
— parengtinio intervalo nustatymo tyrimo, jei darytas, rezultatai,  
— neapdoroti duomenys: mirštamumas po kiekvienos bandytos 
dozės ir kiekvienu steb ėjimo momentu,  
— dozės ir atsako kreivi ų brėžinys baigiant bandym ą, 
— bandomosios medžiagos ir toksiškumo etalono LD  50 vertės su 
95 % pasikliovimo ribomis, nustatytos kiekvienu rekomenduotu 
stebėjimo momentu,  
— LD  50 nustatymui taikyti statistiniai metodai,  
— mirštamumas kontroliniuose bandiniuose,  
— kitas steb ėtas ar išmatuotas biologinis poveikis, pvz., bi čių 
neįprastas elgesys ( įskaitant bandomosios doz ės atmetim ą), 
maisto vartojimo greitis apdorot ų ir neapdorot ų bičių grupėse, 
— visi nukrypimai nuo čia aprašyt ų bandymo metodik ų ir visa kita 
susijusi informacija.  
3. NUORODOS  
1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products 
– Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151–165. March 
1993.  
2) Gough, H. J., Mclndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L.) 1981–1992. Journal of 
Apicultural Research, 22, 119–125.
 
3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Exper. Then, 96, 99–113.
 
4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, 265–267.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  NAMIN ĖS BITĖS – ŪMAUS KONTAKTINIO TOKSIŠKUMO 
BANDYMAS  
1. METODAS  
Sis ūmaus toksiškumo bandymo metodas yra OECD TG 214 (1998) 
kopija.  
1.1. ĮVADAS  
Šis toksiškumo bandymas yra laboratorinis metodas, skirtas įvertinti 
augalų apsaugos priemoni ų ir kitų cheminių medžiag ų ūmų kontak­
tinį toksiškum ą suaugusioms namin ėms bitėms darbinink ėms. 
Vertinant ir nustatant chemini ų medžiag ų toksiškumo charakteris ­
tikas, gali b ūti reikalinga nustatyti ūmų kontaktin į toksiškum ą nami­
nėms bitėms, pvz., kai yra galimas namini ų bičių veikimas chemine 
medžiaga. Ūmaus toksiškumo per virškinam ąjį traktą bandymas atlie ­
kamas norint nustatyti pesticid ų ir kitų cheminių medžiag ų būdingą 
toksiškum ą bitėms. Šio bandymo rezultatai tur ėtų būti naudojami 
pesticidų pavojaus bit ėms vertinimo programose pagal sek ą nuo 
laboratorini ų toksiškumo bandym ų iki bandym ų pusiau lauko ir 
lauko sąlygomis (1). Pesticidai gali b ūti bandomi kaip veikliosios 
medžiagos (v. m.) ar kaip preparatai.  
Turi būti vartojamas toksiškumo etalonas bi čių jautrumui ir bandymo 
metodo preciziškumui tikrinti  
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Ūmus kontaktinis toksiškumas  – neigiamas poveikis, kuris pasi ­
reiškia ne v ėliau kaip per 96 h po vienkartin ės bandomosios 
medžiagos doz ės vietinio užd ėjimo.  
Dozė – uždėtos medžiagos kiekis. Doz ė yra išreiškiama kaip bando ­
mosios medžiagos mas ė (μg) vienam bandomajam gyv ūnui 
(μg/bitei).  
Kontaktin ė LD  50 (vidutinė mirtina doz ė) – yra statistiškai apskai ­ 
čiuota vienkartin ė medžiagos doz ė, kurią naudojant gali ž ūti 50 % 
gyvūnų. LD  50 vertė yra išreiškiama ( μg) bandomosios medžiagos 
vienai bitei. Jei tai pesticidai, bandomoji medžiaga gali b ūti veiklioji 
medžiaga (v. m.) ar preparatas, kuriame yra viena ar daugiau kaip 
viena veiklioji medžiaga.  
Mirštamumas  – gyvūnas registruojamas kaip žuv ęs, kai jis visiškai 
nejuda.  
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Taikant tam tikr ą dozių intervalą, suaugusios namin ės bitės darbi­
ninkės (Apis mellifera ) yra veikiamos tinkamame nešiklyje ištirpinta 
bandomąja medžiaga j ą tiesiogiai užlašinant ant kr ūtinės (lašeliais). 
Bandymo trukm ė yra 48 h. Jei mirštamumas per 24–48 h did ėja, o 
mirštamumas kontroliniuose bandiniuose lieka priimtino lygio, t. y. < 10 %, bandym ą reikia tęsti ne ilgiau kaip iki 96 h. Mirštamumas 
registruojamas kasdien ir lyginamas su mirštamumo kontroliniuose 
bandiniuose vert ėmis. Rezultatai yra analizuojami LD
 50 po 24 h ir 48 
h, o jei bandymas yra t ęsiamas, po 72 h ir 96 h apskai čiuoti. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. BANDYMO TINKAMUMAS  
Bandymas yra tinkamas, jei tenkinamos šios s ąlygos:  
— baigiant bandym ą vidutinis mirštamumas visuose kontroliniuose 
bandiniuose turi b ūti ne didesnis kaip 10 %,  
— toksiškumo etalono LD  50 atitinka apibr ėžtą intervalą. 
1.5. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.5.1.  Bičių rinkimas  
Turi būti naudojamos jaunos suaugusios bit ės darbinink ės, t. y. to 
paties amžiaus, vienodai maitinamos, tos pa čios veislės ir t. t. Bit ės 
turi būti gaunamos iš tinkamai maitinam ų, sveikų, kiek įmanoma be 
ligų ir vienos motin ėlės kolonijų, kurių istorija ir fiziologin ė būsena 
yra žinoma. Jos gali b ūti renkamos t ą rytą, kai numatomos naudoti, 
ar vakare prieš bandym ą ir laikomos bandymo s ąlygomis iki kitos 
dienos. Tinka iš r ėmų surinktos bit ės be perų. Reikėtų vengti rinkti 
bites ankstyv ą pavasarį ar vėlyvą rudenį, nes tokiu metu kei čiasi 
bičių fiziologija. Jei bandymai turi b ūti atliekami anksti pavasar į ar 
vėlai rudenį, bitės gali būti užaugintos inkubatoriuje ir vien ą savaitę 
maitinamos bi čių duonele (nuo korio surinktomis žiedadulk ėmis) ir 
sacharozės tirpalu. Bit ės, apdorotos chemin ėmis medžiagomis, pvz., 
antibiotikais, preparatais varaozei gydyti ir t. t., toksiškumo bandy ­
mams netur ėtų būti naudojamos, jei po apdorojimo paskutin į kartą 
dar nėra praėję keturių savaičių. 
1.5.2.  Laikymo ir maitinimo s ąlygos  
Naudojami lengvai plaunami ir gerai v ėdinami narveliai. Galima 
naudoti bet kurios tinkamos medžiagos, pvz., ner ūdijančio plieno, 
vielos tinklelio, plastiko, vienkartinius medinius narvelius ir t. t. Narvelių dydis turi atitikti bi čių skaičių, t. y. joms reikia palikti 
pakankamai vietos. Geriau naudoti dešimties bi čių vienam narveliui 
grupes.
 
Bitės bandymo patalpoje turi b ūti laikomos tamsoje esant 25 ± 2 °C 
temperatūrai. Santykinis dr ėgnumas, paprastai apie 50–70 %, turi 
būti registruojamas per vis ą bandymą. Bičių tvarkymo proced ūras, 
įskaitant apdorojim ą ir stebėjimus, galima daryti (dienos) šviesoje. 
Maistą sudaro sacharoz ės vandeninis tirpalas, kurio galutin ė koncent­
racija yra 500 g/l (50 % w/v), duodamas pasirinktinu laiku per vis ą 
bandymą naudojant bi čių maitinimo įtaisą. Tai gali b ūti stiklinis 
mėgintuvėlis (maždaug 50 mm ilgio ir 10 mm plo čio, kurio atviras 
galas susiaurinamas maždaug iki 2 mm skersmens)  
1.5.3.  Bičių ruošimas  
Surinktos bit ės gali būti apmarintos anglies dioksidu ar azotu, kad 
būtų galima užd ėti bandom ąją medžiag ą. Anestezuojan čios 
medžiagos kiekis ir veikimo trukm ė turi būti kiek įmanoma mažesni. 
Prieš pradedant bandym ą mirštančios bitės turi būti pašalintos ir 
pakeistos sveikomis.  
1.5.4.  Dozi ų ruošimas  
Bandomoji medžiaga turi b ūti užlašinama tirpalo nešiklyje pavidalu, 
t. y. ištirpinta organiniame tirpiklyje ar vandenyje, turin čiame 
drėkiklio. Kaip organin į tirpiklį geriau b ūtų naudoti aceton ą, tačiau 
galima naudoti kitus mažai toksiškus bit ėms tirpiklius (pvz., dime ­
tilformamid ą, dimetilsulfoksid ą). Jei tai vandenyje disperguoti chemi ­
niai preparatai ir organiniuose tirpikliuose netirpios labai polin ės 
organinės medžiagos, b ūtų lengviau užlašinti nedidel ės koncentra ­
cijos komerciniame dr ėkiklyje (pvz.,  Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, 
Tween ) paruoštus tirpalus.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Turi būti paruošti atitinkami kontroliniai tirpalai, t. y. jei bandomajai 
medžiagai tirpinti naudojamas tirpiklis ar dispergatorius, turi b ūti 
naudojamos dvi atskiros kontrolini ų bandinių grupės: vienos grup ės 
bitės apdorojamos vandeniu, kitos grup ės bitės tirpikliu/nešikliu.  
1.6. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.6.1.  Bandym ų ir kontrolin ės grupės 
Dozių ir lygiagre čių bandinių skaičius turi atitikti statistinius LD  50 
nustatymo reikalavimus esant 95 % pasikliovimo riboms. Paprastai 
bandymui reikia penki ų LD  50 intervalo dozi ų, išdėstytų geometrine 
progresija, kurios koeficientas b ūtų ne didesnis kaip 2,2. Ta čiau 
skiedimo faktorius ir dozavimui naudojam ų koncentracij ų skaičius 
turi būti nustatyti pagal toksiškumo kreiv ės (mirštamumas kaip 
dozės funkcija) krypties koeficient ą ir atsižvelgiant į rezultatams 
analizuoti pasirinkt ą statistinį metodą. Dozavimui tinkamas koncent ­
racijas galima pasirinkti pagal intervalo nustatymo bandymo rezul ­
tatus.  
Kiekvienai bandymo koncentracijai doz ę turi gauti ne mažiau kaip 
trys bandym ų grupės po 10 bi čių. 
Be bandomosios serijos, turi b ūti bandomos trys kontrolin ės grupės 
po 10 bičių. Jei naudojamas organinis tirpiklis ar dr ėkiklis, tirpikliui 
ar drėkikliui turi b ūti naudojamos papildomos trys kontrolin ės 
grupės, kurių kiekvienoje b ūtų po 10 bi čių 
1.6.2.  Toksiškumo etalonas  
Į bandymų seriją turi būti įtrauktas toksiškumo etalonas. Laukiamai 
LD 50 dozei apimti turi b ūti pasirenkamos bent trys doz ės. Kiekvienai 
bandomajai dozei turi b ūti bent trys narveliai su 10 bi čių kiekvie­
name narvelyje. Kaip toksiškumo etalon ą geriau naudoti dimetoat ą, 
kuriam literat ūroje nurodytas kontaktin ės LD  50 24 h vertės intervalas 
yra 0,10– 0,30 μg veikliosios medžiagos vienai bitei (2). Ta čiau būtų 
priimtini ir kiti toksiškumo etalonai, jei b ūtų pateikta pakankamai 
duomenų laukiamam atsakui į dozės poveikį patikrinti (pvz., para ­
tionas).  
1.6.3.  Veikimas  
1.6.3.1.  Dozi ų davimas  
Apmarintos bit ės apdorojamos atskirai darant vietin į užlašinim ą. 
Bitės skirtingoms bandomosioms doz ėms ir kontroliniams bandi ­
niams paskirstomos atsitiktinai. Ant kiekvienos bit ės krūtinės dorsa­
linės pusės mikropipete užlašinamas 1 μl tinkamos koncentracijos 
bandomosios medžiagos tirpalo. Galima naudoti kitokius t ūrius, jei 
tai bus pagr įsta. Po užlašinimo bit ės paskirstomos po narvelius ir 
joms duodama sacharoz ės tirpalo.  
1.6.3.2.  Trukm ė 
Geriausia bandymo trukm ė yra 48 h. Jei mirštamumas 24–48 h 
laikotarpiu did ėja daugiau kaip 10 %, bandymo trukm ė turi būti 
prailginta ne daugiau kaip iki 96 h, jei mirštamumas kontroliniuose 
bandiniuose yra ne didesnis kaip 10 %.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Steb ėjimai  
Mirštamumas registruojamas po 4 h nuo doz ės davimo, o v ėliau po 
24 h ir 48 h. Jei reikalingas prailgintas steb ėjimo laikotarpis, tolesni 
vertinimai turi b ūti daromi kas 24 h ne ilgiau kaip iki 96 h, jei 
mirštamumas kontroliniuose bandiniuose yra ne didesnis kaip 10 %.  
Turėtų būti registruojami visi bandymo metu pasteb ėti neįprasto 
elgesio reiškiniai  
1.6.5.  Ribinis bandymas  
Kartais (pvz., kai manoma, kad bandomosios medžiagos toksiškumas 
turėtų būti mažas) galima atlikti ribin į bandymą naudojant 100 μg 
veikliosios medžiagos vienai bitei, taip norint parodyti, kad LD  50 yra 
didesnė už šią vertę. Turėtų būti naudojama ta pati metodika, įskai­
tant tris lygiagre čias bandym ų grupes bandomajai dozei, atitinkamus 
kontrolinius bandinius ir toksiškumo etalon ą. Jei pasitaiko miršta ­
mumo atvej ų, turi būti daromas visas tyrimas. Jei pastebimas suble ­
talus poveikis (žr. 1.6.4 skirsn į), jis turi b ūti užregistruotas.  
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
2.1. DUOMENYS  
Duomenys turi b ūti apibendrinti lenteli ų pavidalu, kiekvienos doz ės 
grupei, taip pat kontrolini ų bandinių ir toksiškumo etalono grup ėms 
nurodant naudot ų bičių skaičių, mirštamum ą kiekvienu steb ėjimo 
momentu ir ne įprastai besielgian čių bičių skaičių. Mirštamumo 
duomenis analizuokite atitinkamais analiz ės metodais (pvz., probito 
funkcijos analiz ė, slenkamasis vidurkis, binominio skirstinio tiki ­
mybė) (3) (4). Nubraižykite atsako, kaip doz ės funkcijos, kreives 
kiekvienam rekomenduotam steb ėjimo momentui (t. y. 24 h, 48 h 
ir, jei tinka, 72 h, 96 h) ir apskai čiuokite kreivi ų krypties koefi ­
cientus ir vidutines mirtinas dozes (LD  50 ) su 95 % pasikliovimo 
ribomis. Galima padaryti pataisas d ėl mirštamumo kontroliniuose 
bandiniuose naudojant Abbotto patais ą (4) (5). LD  50 turi būti 
išreikšta μg bandomosios medžiagos vienai bitei.  
2.2. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti tokia informacija:  
2.2.1.  Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir atitinkamos fizikin ės ir chemin ės savybės (pvz., 
stabilumas vandenyje, gar ų slėgis), 
— cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant strukt ūrinę formulę, 
grynumą (t. y. pesticidams – identiškumas ir veikliosios (- ųjų) 
medžiagos (- ų) koncentracija).  
2.2.2.  Bandomieji gyv ūnai: 
— mokslinis pavadinimas, veisl ė, apytikris amžius (savait ėmis), 
rinkimo b ūdas, rinkimo data,  
— informacija apie bandym ų bičių rinkimui naudotas kolonijas, 
įskaitant sveikat ą, visas suaugusi ų bičių ligas, prieš tai taikyt ą 
apdorojim ą ir t. t.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Bandymo s ąlygos:  
— bandymo patalpos temperat ūra ir santykinis dr ėgnis,  
— laikymo s ąlygos, įskaitant narveli ų tipą, dydį ir medžiag ą, 
— bandomosios medžiagos davimo b ūdai, pvz., naudojamas 
tirpiklis, užlašinamo bandomojo tirpalo t ūris, naudotos anestezuo ­
jančios medžiagos,  
— bandymo schem ą, pvz., naudotos bandomosios doz ės ir jų skai­ 
čius, kontrolini ų bandini ų skaičius; kiekvienai bandomajai 
koncentracijai ir kontroliniam bandiniui naudot ų narvelių skaičius 
ir bičių skaičius viename narvelyje,  
— bandymo data.  
2.2.4.  Rezultatai:  
— parengtinio intervalo nustatymo tyrimo, jei darytas, rezultatai,  
— neapdoroti duomenys: mirštamumas po kiekvienos bandytos 
dozės ir kiekvienu steb ėjimo momentu,  
— dozės ir atsako kreivi ų brėžinys bandymo pabaigoje,  
— bandomosios medžiagos ir toksiškumo etalono LD  50 vertės su 
95 % pasikliovimo ribomis, nustatytos kiekvienu rekomenduotu stebėjimo momentu,
 
— LD  50 nustatymui taikyti statistiniai metodai,  
— mirštamumas kontroliniuose bandiniuose,  
— kitas pasteb ėtas ar išmatuotas biologinis poveikis ir bet koks 
bičių neįprastas elgesys,  
— visi nukrypimai nuo čia aprašyt ų bandymo metodik ų ir visa kita 
susijusi informacija.  
3. NUORODOS  
1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products 
– Honeybees. EPPO bulletin, vol. 23, N.1, 151–165. March, 1993.
 
2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees ( Apis mellifera  L.), 1981–1992. Journal of 
Apicultural Research 22 119–125.
 
3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol, and Exper. Then, 96, p. 99–113.
 
4) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
5) Abbott, W.S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, p. 265–267.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  ADSORBCIJA/DESORBCIJA TAIKANT STATIN ĖS PUSIAUS ­
VYROS BANDYM Ą 
1. METODAS  
Šis metodas yra OECD ( Organization for Economic Cooperation 
and Development  – Ekonominio bendradarbiavimo ir pl ėtros organi ­
zacijos) TG ( Test Guidlines  – Bandym ų gairės) 106 dėl dirvožemio 
adsorbcijos/desorbcijos taikant statin ės pusiausvyros metod ą kopija 
(2000).  
1.1. ĮVADAS  
Metode atsižvelgiama į tarplaboratorinio lyginimo bandym ą ir į 
seminaro apie dirvožemio atrank ą tobulinant adsorbcijos metod ą 
medžiagą (1) (2) (3) (4), taip pat į nacionaliniu lygiu taikomas reko ­
mendacijas (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).  
Adsorbcijos/desorbcijos tyrimai yra naudingi kuriant svarbi ą infor­
maciją apie chemini ų medžiagų judrumą ir jų pasiskirstym ą biosferos 
dirvožemio, vandens ir oro dalyse (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) 
(19) (20) (21). Informacija gali b ūti naudojama prognozuojant ar 
įvertinant, pvz., chemin ės medžiagos skaidym ą (22) (23), kitim ą ir 
organizm ų įsisavinam ą kiekį (24); jos išplovim ą per dirvos sluoks ­
nius (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28); lakum ą nuo dirvožemio 
(21) (29) (30); nuot ėkį nuo žem ės paviršiaus į gamtinius vandenis 
(18) (31) (32). Adsorbcijos duomenys gali b ūti naudojami palygi ­
nimo ir modeliavimo tikslais (19) (33) (34) (35).  
Cheminės medžiagos pasiskirstymas tarp dirvožemio ir vandenini ų 
fazių yra sudėtingas procesas, kuris priklauso nuo daugelio skirting ų 
veiksnių: medžiagos chemin ės prigimties (12) (36) (37) (38) (39) 
(40), dirvožemio charakteristik ų (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) 
(44) (45) (46) (47) (48) (49) ir klimato veiksni ų, pvz., lietaus, tempe ­
ratūros, saulės šviesos ir v ėjo. Čia pateiktas metodas yra supapras ­
tintas laboratorinis modelis, kuris negali iki galo išaiškinti chemin ės 
medžiagos adsorbcijos dirvožemiu reiškini ų ir mechanizm ų. Ir nors 
šis metodas negali apimti vis ų aplinkoje pasitaikan čių atvejų, jis 
suteikia vertingos informacijos apie aplinkai svarbi ą chemin ės 
medžiagos adsorbcij ą. 
Žr. taip pat bendr ąjį įvadą. 
1.2. TAIKYMO SRITIS  
Metodu siekiama įvertinti, kaip medžiagos dirvožemyje elgiasi 
adsorbcijos/desorbcijos poži ūriu. Tikslas yra gauti sorbcijos vert ę, 
kuri galėtų būti naudojama pasiskirstymui įvairiomis aplinkos s ąly­
gomis prognozuoti; šiuo tikslu nustatomi chemini ų medžiagų adsorb­
cijos pusiausvyros koeficientai kaip dirvožemio charakteristik ų (pvz., 
organinės anglies kiekio, molio kiekio, dirvožemio strukt ūros bei 
pH) funkcija. Turi b ūti naudojamas įvairių tipų dirvožemis, kad 
būtų galima kiek įmanoma pla čiau apimti konkre čios medžiagos 
sąveiką su natūraliai pasitaikan čiu dirvožemiu.  
Pagal šį metodą adsorbcija yra chemin ės medžiagos susijungimo su 
dirvožemio paviršiumi procesas; metodas neskiria skirting ų adsorb­
cijos proces ų (fizikochemin ės adsorbcijos) ir kit ų procesų, pvz., 
paviršiumi katalizuojamo skaidymo, t ūrio adsorbcijos ar chemin ės 
reakcijos. Neatsižvelgiama į adsorbcij ą, kuri vyksta ant dirvožemyje 
susidaran čių koloidini ų dalelių (skersmuo < 0,2 μm). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Adsorbcijai svarbiausi dirvožemio parametrai yra: organin ės anglies 
kiekis (3) (4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48), molio 
kiekis, dirvožemio strukt ūra (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) 
(48) ir, jei tai jonizuojami junginiai, pH vert ė (3) (4) (42). Kiti 
dirvožemio parametrai, kurie gal ėtų veikti konkre čios medžiagos 
adsorbciją/desorbcij ą, yra efektyvioji katijon ų mainų geba (ECEC), 
amorfinių geležies ir aliuminio oksid ų kiekis, ypa č vulkanin ės kilmės 
ir tropikų dirvožemiui (4), taip pat savitasis paviršius (49).  
Bandymas skirtas chemin ės medžiagos adsorbcijai ant skirting ų 
dirvožemio tip ų su kintamu organin ės anglies kiekiu, molio kiekiu 
ir dirvožemio strukt ūra bei pH įvertinti. J į sudaro trys tarpsniai:  
1 tarpsnis.  Pradinis tyrimas norint nustatyti:  
— dirvožemio/tirpalo santyk į, 
— adsorbcijos pusiausvyros nusistov ėjimo trukm ę ir 
pusiausvyros s ąlygomis adsorbuotos medžiagos 
kiekį, 
— medžiagos adsorbcij ą ant bandymo ind ų paviršių ir 
bandomosios medžiagos stabilum ą bandymo laiko ­
tarpiu.  
2 tarpsnis.  Atrankos bandymas: tiriama penki ų skirting ų tipų 
dirvožemio adsorbcija matuojant adsorbcijos kinetik ą 
vienai koncentracijai ir nustatant pasiskirstymo koefi ­
cientus K  d ir K  oc . 
3 tarpsnis.  Freundlicho adsorbcijos izotermi ų apskaičiavimas norint 
nustatyti koncentracijos įtaką adsorbcijos dirvožemiu 
laipsniui.  
Desorbcijos tyrimas taikant desorbcijos kinetik ą/Freund­
licho desorbcijos izotermes (1 pried ėlis). 
1.3. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Simbolis  Apibr ėžtis Vienetai  
ðA t i Þ adsorbcijos procentin ė dalis laiku t  i ; %  
A eq adsorbcijos procentin ė dalis adsorbcijos pusiausvyros 
sąlygomis  % 
ðm ads 
s ðt i ÞÞ bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu laiku Δt i , 
masė μg 
ðm ads 
s ðΔt i ÞÞ bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu per laik ą 
Δt i , masė μg 
ðm ads 
s ðeqÞÞ bandomosios medžiagos, adsorbuotos dirvožemiu adsorb ­
cijos pusiausvyros s ąlygomis, mas ė μg 
m 0 adsorbcijos bandymo pradžioje m ėgintuvėlyje esančios 
bandomosios medžiagos mas ė μg 
ðm ads 
m ðt i ÞÞ bandomosios medžiagos mas ė, nustatyta tirpalo alikvoti ­
nėje dalyje ðv A 
a Þ laiku t  i μg 
ðm ads 
aq ðeqÞÞ medžiagos tirpale mas ė adsorbcijos pusiausvyros 
sąlygomis  μg 
m soil dirvožemio faz ės kiekis, išreikštas sauso dirvožemio mase  g ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Simbolis  Apibr ėžtis Vienetai  
C st medžiagos pradinio tirpalo mas ės koncentracija  μg cm  -3 
C o sąlytyje su dirvožemiu esan čio bandomojo tirpalo pradin ė 
masės koncentracija  μg cm  -3 
ðC ads 
aq ðt i ÞÞ medžiagos vandenin ės fazės masės koncentracija laiku t  i , 
kai buvo atliekama analiz ė μg cm  -3 
ðC ads 
s ðeqÞÞ dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis adsorbcijos pu ­
siausvyros s ąlygomis  μg g  -1 
ðC ads 
aq ðeqÞÞ medžiagos vandenin ės fazės masės koncentracija adsorb ­
cijos pusiausvyros s ąlygomis  μg cm  -3 
V 0 sąlytyje su dirvožemiu esan čios vandenin ės fazės pradinis 
tūris atliekant adsorbcijos bandym ą cm 3 
ðv A 
a Þ alikvotin ės tirpalo dalies t ūris, kuriame matuojama bando ­
moji medžiaga  cm 3 
K d adsorbcijos pasiskirstymo koeficientas  cm  3 g -1 
K oc pagal organin ę anglį normalizuotas adsorbcijos 
koeficientas  cm 3 g -1 
k om pagal organin ę medžiag ą normalizuotas pasiskirstymo 
koeficientas  cm 3 g -1 
ðK ads 
F Þ Freundlicho adsorbcijos koeficientas  μg -1–1/n  (cm  3 ) 1/n g -1 
1/n Freundlicho lygties laipsnio rodiklis  
ðD t i Þ desorbcijos procentin ė dalis laiku t  i % 
ðD Δt i Þ desorbcijos procentin ė dalis, atitinkanti laiko interval ą Δt i % 
K des tariamasis desorbcijos koeficientas  cm  3 g -1 
ðK des 
F Þ Freundlicho desorbcijos koeficientas  μg 1–1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
ðm des 
aq ðt i ÞÞ bandomosios medžiagos, desorbuotos nuo dirvožemio 
laiku t  i masė μg 
ðm des 
m ðΔt i ÞÞ bandomosios medžiagos, desorbuotos nuo dirvožemio per 
laiką Δt i , masė μg 
ðm des 
m ðeqÞÞ medžiagos mas ė, analiziškai nustatyta vandenin ėje fazėje 
desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis  μg 
ðm des 
aq ðeqÞÞ bandomosios medžiagos, desorbuotos desorbcijos pusiaus ­
vyros sąlygomis, bendroji mas ė μg 
ðm des 
s ðΔt i ÞÞ medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu pra ėjus laiko 
tarpui At  i , masė μg 
ðm A 
aq Þ medžiagos, likusios po adsorbcijos pusiausvyros bandymo 
dėl nevisiško t ūrio pakeitimo, mas ė μg 
ðC des 
s ðeqÞÞ bandomosios medžiagos, kuri liko adsorbuota dirvožemiu 
desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis, kiekis  μg g -1 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Simbolis  Apibr ėžtis Vienetai  
ðC des 
aq ðeqÞÞ bandomosios medžiagos vandenin ės fazės masės koncent ­
racija desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis  μg cm  -3 
V T vandeninės fazės, esančios sąlytyje su dirvožemiu atliekant 
desorbcijos kinetikos bandym ą nuosekliuoju metodu, 
bendras t ūris cm 3 
V R tirpalo virš nuos ėdų, pašalinto iš m ėgintuvėlio pasiekus 
adsorbcijos pusiausvyr ą ir pakeisto tokiu pat t ūriu 0,01 M 
CaCl  2 tirpalo, tūris cm 3 
ðv D 
a Þ tirpalo, paimto iš m ėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos 
kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kinetikos bandym ą 
nuosekliuoju metodu, alikvotin ės dalies t ūris cm 3 
ðV r 
r Þ tirpalo, paimto iš m ėgintuvėlio (i) bandomosios medžiagos 
kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kinetikos bandym ą 
(lygiagretusis metodas), t ūris cm 3 
ðV F 
r Þ tirpalo, paimto iš m ėgintuvėlio bandomosios medžiagos 
kiekiui nustatyti desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis, t ūris cm 3 
MB masi ų balansas  %  
m E bandomosios medžiagos, dviem pakopomis ekstrahuotos iš 
dirvožemio ir nuo sieneli ų, bendroji mas ė μg 
V rec adsorbcijos pusiausvyros s ąlygomis regeneruoto tirpalo 
virš nuos ėdų tūris cm 3 
p ow pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo)  
pKa disociacijos konstanta  
S w tirpumas vandenyje  g 1–1  
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Žinomi bandomosios medžiagos, neturin čios ar turin čios žymėtųjų 
atomų, tirpalo 0,01 M CaCl  2 tūriai yra sumaišomi su žinomos 
sauso dirvožemio mas ės bandiniais, prieš tai laikytais pusiausvyrai 
nusistovėti 0,01 M CaCl  2 . Mišinys tam tikr ą laiką maišomas. Paskui 
dirvožemio suspensija atskiriama centrifugavimu ir, jei to pageidau ­
jama, filtravimu, o vandenin ė fazė analizuojama. Dirvožemio 
bandiniu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis apskai čiuo­
jamas kaip skirtumas tarp pradinio bandomosios medžiagos kiekio 
tirpale ir jos kiekio bandymo pabaigoje (netiesioginis metodas).  
Pagal kitą metodą atliekama dirvožemio analiz ė ir tiesiogiai nusta ­
tomas adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis (tiesioginis 
metodas). Šis metodas, kur į sudaro pakopinis dirvožemio ekstraha ­
vimas atitinkamu tirpikliu, rekomenduojamas tais atvejais, kai nega ­
lima tiksliai nustatyti bandomosios medžiagos tirpalo koncentracijos skirtumo. Toki ų atvejų pavyzdžiai yra: bandomosios medžiagos 
adsorbcija ant bandymo ind ų paviršiaus; bandomosios medžiagos 
nestabilumas bandymo metu; silpna adsorbcija, tod ėl tirpalo koncent ­
racijos pokytis yra labai mažas; stipri adsorbcija, tod ėl tirpalo 
koncentracija labai sumaž ėja ir negali b ūti tiksliai nustatyta. Naudo ­
jant medžiag ą su žymėtaisiais atomais, dirvožemio galima ir neek ­
strahuoti, jei dirvožemio faz ės analizei taikomas sudeginimo ir 
skysčių scintiliacijos skai čiavimo metodas. Ta čiau skysčių scintilia­
cijos skai čiavimas n ėra specifinis metodas ir juo negalima atskirti 
pradinių produktų nuo jų kitimo produkt ų; taigi jis turi b ūti taikomas 
tik tokiu atveju, jei chemin ė medžiaga yra stabili tyrimo metu.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Cheminiai reagentai turi b ūti analiziškai gryni. Rekomenduojama 
naudoti bent 95 % grynumo žinomos sud ėties žymėtųjų atomų netu­
rinčias bandom ąsias medžiagas ar žinomos sud ėties radioaktyviai 
grynas medžiagas su žym ėtaisiais atomais. Jei radioaktyvi ųjų indika­
torių pusėjimo trukm ė yra trumpa, turi b ūti taikomos skilimo 
pataisos.  
Prieš atliekant adsorbcijos/desorbcijos bandym ą apie bandom ąją 
medžiagą turi būti žinoma ši informacija:  
a) tirpumas vandenyje (A.6);  
b) garų slėgis (A.4) ir (ar) Henry’o d ėsnio konstanta;  
c) abiotinis skaidymas: hidroliz ė kaip pH funkcija (C.7);  
d) pasiskirstymo koeficientas (A.8);  
e) lengvas biologinis skaidumas (C.4) ar aerobinis ir anaerobinis 
kitimas dirvožemyje;  
f) jonizuojam ų medžiag ų pKa;  
g) tiesiogin ė fotolizė vandenyje (t. y. vandeninio tirpalo UV-VIS 
absorbcijos spektras, kvantin ė išeiga) ir fotocheminis skaidymas 
ant dirvožemio.  
1.6. BANDYMO TAIKOMUMAS  
Bandymas tinka chemin ėms medžiagoms, kurioms yra nustatytas 
pakankamo tikslumo analiz ės metodas. Svarbus parametras, kuris 
gali turėti įtakos rezultat ų patikimumui, ypa č taikant netiesiogin į 
metodą, yra bandomosios medžiagos stabilumas bandymo metu. 
Taigi stabilum ą būtina tikrinti darant pradin į tyrimą; jei bandymo 
metu stebimas medžiagos kitimas, darant pagrindin į tyrimą rekomen ­
duojama analizuoti dirvožemio ir vandenin ę fazes.  
Gali kilti sunkum ų atliekant bandym ą su bandomosiomis medžia ­
gomis, kuri ų tirpumas vandenyje yra mažas (S  w < 10  -4 g l -1 ), taip 
pat esant dideliam bandom ųjų medžiag ų kiekiui, nes medžiagos 
koncentracija vandenin ėje fazėje negali b ūti analiziškai nustatyta 
pakankamai tiksliai. Šiais atvejais b ūtina imtis papildom ų priemoni ų. 
Nurodymai, kaip spr ęsti šias problemas, pateikti atitinkamuose šio 
metodo aprašymo skirsniuose.  
Bandant laki ąsias medžiagas reikia imtis atsargumo priemoni ų 
nuostoliams bandymo metu išvengti.  
1.7. METODO APRAŠYMAS  
1.7.1.  Aparat ūra ir cheminiai reagentai  
Reikalinga ši standartin ė laboratorijos įranga:  
a) mėgintuvėliai ar indai bandymams atlikti. Svarbu, kad šie m ėgin­
tuvėliai ar indai:  
— būtų pritaikyti centrifugavimo aparatui, norint sumažinti tvar ­
kymo ir pernešimo paklaidas,  
— būtų pagaminti iš inertin ės medžiagos, kurios paviršiuje 
bandomosios medžiagos adsorbcija b ūtų kuo mažesn ė; ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) maišymo įtaisas: vertikalioji purtykl ė ar lygiavert ė įranga; maišant 
maišymo įtaisu dirvožemis turi sudaryti suspensij ą; 
c) centrifuga: geriau didelio apsisukim ų dažnio, pvz., centrifugavimo 
jėga > 3 000 g, su termostatu, iš vandeninio tirpalo galinti paša ­
linti daleles, kuri ų skersmuo didesnis kaip 0,2 μm. Maišant ir 
centrifuguojant konteineriai turi b ūti uždengti dang čiais, kad 
būtų išvengta nuostoli ų dėl medžiag ų lakumo ir vandens nugara ­
vimo; adsorbcijai ant dang čių sumažinti turi b ūti naudojami 
dezaktyvuoti dang čiai, pvz., užsukami teflonu iškloti dang čiai; 
d) neprivalomas: filtravimo įtaisas; filtr ų poringumas – 0,2 μm, 
sterilūs, vienkartiniai. Ypating ą dėmesį reikia kreipti parenkant 
filtro medžiag ą, kad b ūtų išvengta bet koki ų bandomosios 
medžiagos nuostoli ų ant filtro; mažai tirpioms medžiagoms nere ­
komenduojama naudoti filtr ų iš organin ės medžiagos;  
e) analizės aparatūra, tinkama bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracijai nustatyti;  
f) laboratorin ė krosnis, kurioje galima palaikyti 103–110 °C tempe ­
ratūrą. 
1.7.2.  Dirvožemio tipo apib ūdinimas ir parinkimas  
Dirvožemio tip ą turėtų apibūdinti trys parametrai, kurie laikomi 
darančiais didžiausi ą įtaką adsorbcijos gebai: organin ė anglis, 
molio kiekis ir dirvožemio strukt ūra bei pH. Kaip min ėta (žr. skirsn į 
„Taikymo sritis“), konkre čios medžiagos adsorbcijai/desorbcijai 
įtakos gali tur ėti kitos fizikin ės ir chemin ės dirvožemio savyb ės, ir 
tokiais atvejais į jas turi b ūti atsižvelgta.  
Metodai, taikyti dirvožemiui apib ūdinti, yra labai svarb ūs ir daro 
didelę įtaką rezultatams. Taigi atitinkamu ISO metodu (ISO- 
10390–1) rekomenduojama išmatuoti dirvožemio 0,01 M CaCl  2 
tirpale (t. y. tirpale, naudojamame adsorbcijos/desorbcijos bandy ­
muose) pH vert ę. Taip pat rekomenduojama, kad standartiniais meto ­
dais (pvz., ISO „ Handbook of Soil Anglysis “) būtų nustatytos kitos 
reikalingos dirvožemio savyb ės; tai leidžia sorbcijos duomenis anali ­
zuoti pagal visam pasauliui standartizuotus dirvožemio parametrus. Kai kurie duomenys apie esamus standartinius dirvožemio analiz ės ir 
apibūdinimo metodus pateikti nuorodose (50–52). Dirvožemio 
bandymo metodams kalibruoti rekomenduojama naudoti etaloninius dirvožemius.
 
Nurodymai, kaip parinkti dirvožem į adsorbcijos/desorbcijos bandy ­
mams, pateikti 1 lentel ėje. Parinkti septyni dirvožemio tipai apima 
vidutinėse geografin ėse zonose pasitaikan čius dirvožemio tipus. Jei 
bandomosios medžiagos yra jonizuojamos, parinkti dirvožemio tipai turi apimti plat ų pH verčių intervalą, kad būtų galima įvertinti joni ­
zuotos ir nejonizuotos medžiagos adsorbcij ą. Nurodymai, kiek skir ­
tingų dirvožemio tip ų naudoti įvairiose bandymo pakopose, pateikti 
1.9 skirsnyje „Bandymo proced ūra“.
 
Jei labiau tinka kit ų tipų dirvožemis, jis turi b ūti apibūdintas tais 
pačiais parametrais ir jo savyb ės turi įvairuoti panašiai kaip 1 lente ­
lėje aprašytos savyb ės, net jei tiksliai kriterij ų ir neatitinka.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
1 lentelė 
Nurodymai, kaip parinkti dirvožemio bandinius adsorbcijos ir desorbcijos bandymams  
Dirvožemio tipas  pH intervalas (0,01 M 
CaCl  2 ) Organinės anglies 
kiekis (%)  Molio kiekis (%)  Dirvožemio 
struktūra (  1 ) 
1 4,5– 5,5  1,0– 2,0  65–80  molis  
2 > 7,5  3,5– 5,0  20–40  sunkus priemolis  
3 5,5– 7,0  1,5– 3,0  15–25  dulkiškas priemolis  
4 4,0– 5,5  3,0– 4,0  15–30  priemolis  
5 < 4,0– 6,0 (  2 ) < 0,5– 1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10–15 (  2 ) rišlus sm ėlis 
6 > 7,0  < 0,5– 1,0 (  2 ) ( 3 ) 40–65  sunkus priemolis/ 
molis  
7 < 4,5  > 10  < 10  sm ėlis/rišlus sm ėlis 
( 1 ) Pagal FAO ( Food and Agricultural Organization  – Maisto ir žem ės ūkio organizacija) ir JAV sistem ą (85). 
( 2 ) Būtų geriau, jei atitinkam ų kintamųjų vertės būtų nurodytame intervale. Ta čiau, jei kyla sunkum ų rasti tinkam ą 
dirvožem į, priimtinos mažesn ės nei nurodytos mažiausios vert ės. 
( 3 ) Dirvožemis, kuriame organin ės anglies yra mažiau kaip 0,3 %, gali sutrikdyti koreliacij ą tarp organin ės anglies kiekio 
ir adsorbcijos. Taigi rekomenduojama naudoti dirvožem į, kuriame organin ės anglies b ūtų ne mažiau kaip 0,3 %.  
1.7.3.  Dirvožemio bandini ų rinkimas ir laikymas  
1.7.3.1.  Rinkimas  
Specialių bandinių ėmimo metod ų arba priemoni ų rekomenduoti 
negalima; bandini ų ėmimo metodas priklauso nuo tyrimo tikslo 
(53) (54) (55) (56) (57) (58).  
Reikia atsižvelgti į šiuos dalykus:  
a) būtina turėti išsamią informacij ą apie lauko sklypo istorij ą; infor­
maciją sudaro vieta, augmenijos danga, apdorojimas pesticidais ir 
(ar) trąšomis, biologiniai priedai ar atsitiktinis užteršimas. Reikia 
laikytis dirvožemio bandini ų ėmimo ISO standarto (ISO 10381–6) 
rekomendacij ų atsižvelgiant į bandinio ėmimo vietos aprašym ą; 
b) bandini ų ėmimo vieta turi b ūti apibrėžta UTM ( Universal Trans ­
versal Mercator-Projection/European Horizontal Datum  – 
Universalioji skersin ė Merkatoriaus projekcija/Europos horizonta ­
lusis atskaitos lygis) ar geografini ų koordina čių; tai leistų ateityje 
vėl paimti konkret ų dirvožem į ar padėtų apibūdinti dirvožem į 
pagal įvairias klasifikavimo sistemas, taikomas skirtingose šalyse. 
Be to, reikia rinkti tik A horizonte, ne giliau kaip 20 cm. Jei konkrečiai 7 tipo dirvožemio dal į sudaro O
 h horizontas, jis turi 
būti įtrauktas į bandinį. 
Dirvožemio bandiniai turi b ūti gabenami konteineriuose esant tokiai 
temperatūrai, kuri garantuot ų pradines dirvožemio savybes ir j ų labai 
nepakeist ų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Laikymas  
Geriau naudoti k ą tik iš lauko paimt ą dirvožem į. Jei tai ne įmanoma, 
išdžiovintas ore dirvožemis gali b ūti laikomas kambario temperat ūros 
sąlygomis. Rekomendacij ų apie laikymo trukm ės ribas nepateikiama, 
tačiau daugiau kaip trejus metus laikytas dirvožemis prieš naudojant 
turi būti vėl analizuojamas organin ės anglies kiekiui, pH ir katijon ų 
mainų gebai (CEC) nustatyti.  
1.7.3.3.  Dirvožemio bandini ų apdorojimas ir paruošimas bandymui  
Dirvožemis džiovinamas ore kambario temperat ūros sąlygomis (geriau 
20–25 °C). Smulkinti reikia kuo mažesne j ėga, kad pradin ė dirvožemio 
sandara pasikeist ų kuo mažiau. Dirvožemis sijojamas, kol lieka ≤ 2 mm 
dydžio dalel ės; sijoj ant reik ėtų laikytis ISO standarto dirvožemio 
bandinių ėmimo rekomendacij ų (ISO 10381–6). Rekomenduojama 
dirvožem į kruopščiai homogenizuoti, nes tai pagerina rezultat ų atku­
riamumą. Kiekvieno dirvožemio bandinio dr ėgmės kiekis nustatomas 
tris alikvotines dalis kaitinant 105 °C temperat ūroje tol, kol mas ė 
daugiau nesikei čia (maždaug 12 h). Visiems skai čiavimams nurodoma 
krosnyje išdžiovinto dirvožemio mas ė, t. y. dirvožemio, at ėmus 
drėgmės kiekį, masė. 
1.7.4.  Bandomosios medžiagos paruošimas maišymui su dirvožemiu  
Bandomoji medžiaga ištirpinama 0,01 M CaCl  2 tirpale, kuriam ruošti 
naudojamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo; kaip vandeninis 
tirpiklis CaCl  2 tirpalas yra naudojamas centrifugavimui palengvinti 
ir katijon ų mainams kiek įmanoma sumažinti. Pradinio tirpalo 
koncentracija turi b ūti trimis dydžio eil ėmis didesn ė nei taikomo 
metodo aptikimo riba. Ši riba garantuoja tikslius matavimus taikant šį metodą; be to, pradinio tirpalo koncentracija turi b ūti mažesn ė nei 
bandomosios medžiagos tirpumo vandenyje vert ė.
 
Pradinį tirpalą geriau gaminti prieš pat maišym ą su dirvožemio bandi ­
niais, tirpalas turi b ūti uždengtas ir laikomas tamsoje esant 4 °C. 
Laikymo trukm ė priklauso nuo bandomosios medžiagos stabilumo ir 
nuo tirpalo koncentracijos.  
Atitinkama tirpinimo medžiaga gali b ūti reikalinga tik mažai tirpioms 
medžiagoms (S  w < 10–4 g 1–1), kai bandom ąją medžiag ą sunku 
ištirpinti. Ši tirpinimo medžiaga: a) turi maišytis su vandeniu, pvz., metanolis ar acetonitrilas; b) jo koncentracija neturi b ūti didesnė kaip 
1 % bendrojo pradinio tirpalo t ūrio ir turi b ūti mažesn ė nei sąlytyje 
su dirvožemiu esan čios bandomosios medžiagos koncentracija 
(geriau, jei mažesn ė kaip 0,1 %); c) neturi b ūti veiklioji paviršiaus 
medžiaga arba dalyvauti solvoliz ės reakcijoje su bandom ąja 
medžiaga. Duomen ų ataskaitoje turi b ūti nurodytas ir pagr įstas tokios 
tirpinimo medžiagos naudojimas.
 
Kitas mažai tirpioms medžiagoms taikomas b ūdas yra prid ėti bando­
mosios medžiagos į bandymo sistem ą naudojant pagalbin į tirpiklį: 
bandomoji medžiaga ištirpinama organiniame tirpiklyje, alikvotin ė 
šio tirpalo dalis pridedama į dirvožemio ir 0,01 M CaCl  2 tirpalo 
distiliuotame ar dejonizuotame vandenyje sistem ą. Organinio 
tirpiklio kiekis vandenin ėje fazėje turi būti kuo mažesnis, paprastai 
ne didesnis kaip 0,1 %. Medžiagos prid ėjimas naudojant tirpal ą orga­
niniame tirpiklyje gali pabloginti t ūrio atkuriamum ą. Taigi gali atsi ­
rasti papildoma paklaida, nes bandomosios medžiagos ir pagalbinio 
tirpiklio koncentracija visuose bandymuose gali b ūti nevienoda.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. ADSORBCIJOS/DESORBCIJOS BANDYMO B ŪTINOSIOS 
SĄLYGOS  
1.8.1.  Analiz ės metodas  
Pagrindiniai parametrai, galintys tur ėti įtakos sorbcijos matavimams, 
yra tirpalui ir adsorbuotoms faz ėms analizuoti taikomo analiz ės 
metodo tikslumas, bandomosios medžiagos stabilumas ir grynumas, 
sorbcijos pusiausvyros pasiekimas, tirpalo koncentracijos poky čio 
dydis, dirvožemio/tirpalo santykis ir dirvožemio strukt ūros pokyčiai 
nusistovint pusiausvyrai (35) (59–62). Keletas pavyzdži ų, susijusių 
su tikslumo problemomis, pateikta 2 pried ėlyje. 
Taikomo analiz ės metodo patikimumas turi b ūti patikrintas pagal 
koncentracij ų intervalą, kuris grei čiausiai bus taikomas atliekant 
bandymą. Bandytojas gali laisvai tobulinti atitinkam ą metodą, turintį 
reikiamą tikslumą, preciziškum ą, atkuriamum ą, aptikimo ribas ir 
regeneravimo lyg į. Toliau pateikti nurodymai, kaip tok į bandym ą 
atlikti.  
Atitinkamas 0,01 M CaCl  2 tirpalo tūris, pvz., 100 cm  3 , 4 h purtomas 
su tam tikra labai adsorbuojan čio, t. y. turin čio didelį organinės 
anglies ir molio kiek į, dirvožemio mase, pvz., 20 g; ši mas ė ir 
tūris gali skirtis priklausomai nuo analiz ės poreikių, tačiau dirvože ­
mio/tirpalo santykis 1:5 yra patogus pradžios taškas. Mišinys centri ­
fuguojamas ir vandenin ė fazė gali būti filtruojama. Į vandenin ę fazę 
įpilamas tam tikras t ūris bandomosios medžiagos pradinio tirpalo 
vardinei koncentracijai pasiekti koncentracijos intervale, kuris grei ­ 
čiausiai bus taikomas atliekant bandym ą. Šis tūris turi sudaryti ne 
daugiau kaip 10 % galutinio vandenin ės fazės tūrio, kad kuo mažiau 
pasikeistų pradinio pusiausvyros nusistov ėjimo tirpalo savyb ės. 
Tirpalas analizuojamas.  
Norint patikrinti analiz ės metodo artefaktus ir d ėl dirvožemio atsira ­
dusius matricos efektus, turi b ūti įtrauktas vienas tuš čiasis bandinys, 
kurį sudaro sistema dirvožemis + CaCl  2 tirpalas (be bandomosios 
medžiagos).  
Analizės metodus, kurie gali b ūti taikomi sorbcijai matuoti, sudaro 
dujų ir skysčių chromatografija ( Gas-Liquid Chromatography , GLC), 
didelio efektyvumo skys čių chromatografija ( high-performance 
liquid chromatography , UPLC), spektrometrija (pvz., GC/masi ų 
spektrometrija, HPLC/masi ų spektrometrija) ir skys čių scintiliacijos 
skaičiavimas (medžiag ų su žym ėtaisiais atomais). Nesvarbu, koks 
analizės metodas taikomas, tinkamu laikomas regeneravimo lygis, 
kuris sudaro 90–110 % vardin ės vertės. Norint medžiag ą aptikti ir 
įvertinti po įvykdyto atskyrimo, analiz ės metodo aptikimo riba turi 
būti bent dviem dydžio eil ėmis mažesn ė nei vardin ė koncentracija.  
Adsorbcijos tyrimams taikomo analiz ės metodo charakteristikos ir 
aptikimo riba yra labai svarbios apibr ėžiant bandymo s ąlygas ir 
gautus tyrim ų rezultatus. Šis metodas nekei čia bendrosios bandymo 
procedūros ir numato alternatyvius sprendimus, jei galimybes riboja 
analizės metodas ir laboratorijos įranga.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Optimalaus dirvožemio/tirpalo santykio parinkimas  
Tinkamo dirvožemio ir tirpalo santykio parinkimas sorbcijos tyri ­
mams priklauso nuo pasiskirstymo koeficiento K  d ir nuo pageidau ­
jamo santykinio adsorbcijos laipsnio. Matavimo, pagr įsto adsorbcijos 
lygties forma ir analiz ės metodo riba, statistin į tikslumą nustatant 
medžiagos tirpalo koncentracij ą lemia šios koncentracijos pokytis. 
Taigi naudinga pasirinkti kelias pastovias santykio vertes, kurioms 
adsorbuotos medžiagos procentin ė dalis yra didesn ė kaip 20 %, 
geriau > 50 % (62), ir pasir ūpinti, kad bandomosios medžiagos 
tirpalo koncentracija norint j ą tiksliai nustatyti b ūtų pakankamai 
didelė. Tai ypa č svarbu, kai yra didel ė adsorbcijos procentin ė dalis.  
Patogus b ūdas parinkti tinkam ą dirvožemio/vandens santyk į pagrįstas 
K d vertės įverčiu darant išankstinius tyrimus arba taikant sukurtus 
vertinimo metodus (3 pried ėlis). Tinkam ą santykį galima pasirinkti 
pagal dirvožemio/tirpalo santykio ir K  d grafiką nustatytai adsorbcijos 
procentinei daliai (1 pav.). Šiam grafikui nubr ėžti daroma prielaida, 
kad adsorbcijos lygtis yra tiesiška (  1 ). Tinkamas s ąryšis gaunamas K  d 
(4) lygtį pertvarkant į (1) lygtį: 
ÍÍ ðV 0 Þ 
ðm soil Þ Î 
¼ ÍÍ ðm 0 Þ 
ðm ads s ðeqÞÞ Î 
– 1 Î 
K d Î 
(1) 
ar į jos logaritmin ę išraišką, darant prielaid ą, kad R = m  soil /V 0 and 
A eq %/100 = Í ðm ads 
s ðeqÞÞ 
ðm 0 Þ Î 
: 
logR ¼ Ä logK  d þ log " 
ðA eq %= 100Þ 
ð1 – A  eq %= 100Þ # 
(2)
 
1 pvz.,  Dirvožemio/tirpalo santykio ir K  d sąryšis esant įvairioms 
adsorbuotos medžiagos procentin ėms dalims  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) ðC ads 
s ðeqÞÞ ¼ ðK d Þ · ðC ads 
aq ðeqÞÞ:
 1 pvz., reikiamas dirvožemio/tirpalo santykis pateiktas kaip K  d funk­
cija esant įvairiems adsorbcijos lygiams. Pvz., jei dirvožemio/tirpalo 
santykis yra 1:5 ir K  d 20, adsorbcijos laipsnis maždaug 80 %. 50 % 
adsorbcijai gauti esant tam pa čiam K  d turi būti taikomas santykis 
1:25. Šis tinkamo dirvožemio/tirpalo santykio pasirinkimo b ūdas 
leidžia bandytojui lanks čiai prisitaikyti prie bandymo poreiki ų. 
Sunkiau yra panaudoti tas sritis, kuriose medžiaga adsorbuojama 
labai stipriai arba labai silpnai. Jei adsorbcija vyksta silpnai, reko ­
menduojamas 1:1 dirvožemio/tirpalo santykis, nors kai kuriems 
dirvožemiams su dideliu organin ės medžiagos kiekiu š į santykį 
būtina padidinti norint gauti suspensij ą. Reikia pasir ūpinti analiz ės 
metodu mažiems tirpalo koncentracijos poky čiams matuoti; kitaip 
adsorbcijos matavimas bus netikslus. Kita vertus, esant labai dide ­
liems pasiskirstymo koeficientams K  d , dirvožemio/tirpalo santyk į 
galima mažinti iki 1:100, kad chemin ės medžiagos tirpale likt ų 
daug. Tačiau reikia stengtis gerai sumaišyti ir b ūtina duoti pakan ­
kamai laiko sistemai pasiekti pusiausvyr ą. Alternatyvus ši ų ribinių 
atvejų naudojimo b ūdas, kai n ėra tinkamo analiz ės metodo, yra K  d 
vertės prognoz ė taikant vertinimo metodikas, pagr įstas, pvz, P  ow 
vertėmis (3 pried ėlis). Tai gali b ūti naudinga ypa č silpnai adsorbuo ­
jamoms ar polin ėms medžiagoms, kuri ų P ow < 20, ir lipofilin ėms ar 
stipriai sorbuojamoms chemin ėms medžiagoms, kuri ų P ow > 10  4 . 
1.9. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.9.1.  Bandymo s ąlygos  
Visi bandymai atliekami aplinkos temperat ūros ir, jei įmanoma, 
pastovios temperat ūros nuo 20 °C iki 25 °C s ąlygomis.  
Centrifugavimo s ąlygos turi b ūti tokios, kad b ūtų galima pašalinti iš 
tirpalo didesnes kaip 0,2 μm daleles. Ši vert ė atitinka mažiausi ą dydį, 
iki kurio dalel ė dar laikoma kiet ąja dalele, ir tai yra riba tarp kiet ųjų 
ir koloidini ų dalelių. Kaip nustatyti centrifugavimo s ąlygas, nurodyta 
4 priedėlyje. 
Jei negalima garantuoti, kad centrifugavimo priemon ės pašalins 
didesnes kaip 0,2 μm daleles, b ūtų galima taikyti centrifugavimo ir 
filtravimo pro 0,2 μm filtrus derin į. Norint išvengti ant filtr ų bet 
kokių bandomosios medžiagos nuostoli ų, indai turi b ūti pagaminti 
iš tinkamos inertin ės medžiagos. Bet kuriuo atveju turi b ūti įrodyta, 
kad filtruojant nepatiriama joki ų bandomosios medžiagos nuostoli ų. 
1.9.2.  1 tarpsnis. Pradinis tyrimas  
Pradinio tyrimo vykdymo tikslas jau buvo nurodytas skirsnyje 
„Taikymo sritis“. Toliau pateikiamos rekomendacijos, kaip atlikti tokį bandymą.
 
1.9.2.1.  Optimalaus dirvožemio/tirpalo santykio ver čių parinkimas  
Naudojami du dirvožemio tipai ir trys dirvožemio/tirpalo santykio 
vertės (šeši bandymai). Vieno tipo dirvožemyje yra didelis organin ės 
anglies ir mažas molio kiekis, kito tipo dirvožemyje – mažas orga ­
ninės anglies ir didelis molio kiekis. Si ūloma naudoti tokius dirvo ­ 
žemio ir tirpalo santykius:  
— 50 g dirvožemio 50 cm  3 bandomosios medžiagos vandeninio 
tirpalo (santykis 1/1),  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g dirvožemio ir 50 cm  3 bandomosios medžiagos vandeninio 
tirpalo (santykis 1/5),  
— 2 g dirvožemio ir 50 cm  3 bandomosios medžiagos vandeninio 
tirpalo (santykis 1/25).  
Mažiausias dirvožemio kiekis, su kuriuo gali b ūti atliekamas 
bandymas, priklauso nuo laboratorijos įrangos ir taikom ų analizės 
metodų charakteristik ų. Tačiau norint gauti patikimus bandymo 
rezultatus, rekomenduojama naudoti bent 1 g, o geriau 2 g dirvo ­ 
žemio.  
Bandomosios medžiagos stabilumui CaCl  2 tirpale ir jos galimai 
adsorbcijai ant bandymo ind ų paviršių patikrinti vienas kontrolinis 
bandinys, kur į sudaro 0,01 M CaCl  2 tirpale ištirpinta bandomoji 
medžiaga (be dirvožemio), pereina tiksliai tas pa čias pakopas kaip 
ir bandomosios sistemos.  
Tuščiasis bandinys kiekvienam dirvožemiui su tuo pa čiu dirvožemio 
kiekiu ir bendru 50 cm  3 0,01 M CaCl  2 tirpalo tūriu (be bandomosios 
medžiagos) bandomas pagal t ą pačią bandymo metodik ą. Atliekant 
analizę šis bandinys yra fono kontrol ės priemon ė trukdančioms 
medžiagoms ar užterštiems dirvožemiams aptikti.  
Visi bandymai, įskaitant kontrolinius ir tuš čiuosius, turi b ūti atlie­
kami bent po du kartus. Bendras tyrimui paruošt ų bandinių skaičius 
gali būti apskaičiuotas atsižvelgiant į taikomą metodą. 
Pradinio tyrimo ir pagrindinio tyrimo metodai paprastai yra tie patys, 
būtinos daryti išimtys nurodomos.  
Pusiausvyrai pasiekti ore išdžiovinti dirvožemio bandiniai sumaišomi 
su ne mažesnio kaip 45 cm  3 tūrio 0,01 M CaCl  2 tirpalu ir mišinys 
purtomas per nakt į (12 h) prieš bandymo dien ą. Po to galutiniam 50 
cm 3 tūriui gauti įpilamas tam tikras t ūris bandomosios medžiagos 
pradinio tirpalo. Šis įpilamo pradinio tirpalo t ūris: a) neturi sudaryti 
daugiau kaip 10 % galutinio 50 cm  3 vandeninės fazės tūrio, kad kuo 
mažiau pasikeist ų pradinei pusiausvyrai nusistov ėti naudoto tirpalo 
savybės; b) būtų toks, kad s ąlytyje su dirvožemiu esan čio bandomo ­
sios medžiagos pradinio tirpalo koncentracija (C  0 ) būtų bent dviem 
dydžio eil ėmis didesn ė nei analiz ės metodo aptikimo ribos vert ė; šis 
ribinis dydis leidžia daryti tikslius matavimus esant didelio laipsnio 
adsorbcijai (> 90 %) ir v ėliau apskai čiuoti adsorbcijos izotermes. Be 
to, rekomenduojama, kad pradin ė medžiagos koncentracija (C  0 ), jei 
tai įmanoma, b ūtų ne didesn ė kaip pus ė tirpumo vert ės. 
Toliau pateikiamas pavyzdys, kaip apskai čiuoti pradinio tirpalo 
koncentracij ą (C  st ). Tarkime, kad aptikimo riba yra 0,01 μg cm  -3 ir 
adsorbcijos laipsnis 90 %; taigi s ąlytyje su dirvožemiu esan čios 
bandomosios medžiagos pradin ė koncentracija turi b ūti 1 μg cm  -3 
(dviem dydžio eil ėmis didesn ė kaip aptikimo ribos vert ė). Darant 
prielaidą, kad įpilamo pradinio tirpalo t ūris yra didžiausias, koks 
buvo rekomenduotas, t. y. 5 cm  3 į 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 pusiaus­
vyros nusistov ėjimo tirpalo (pradinis tirpalas sudaro 10 % 50 cm  3 
bendrojo vandenin ės fazės tūrio), pradinio tirpalo koncentracija turi 
būti 10 μg cm  -3 ; ji yra trimis dydžio eil ėmis didesn ė kaip analiz ės 
metodo aptikimo ribin ė vertė. 
Vandenin ės fazės pH vert ė turi būti matuojama prieš s ąlytį su dirvo­ 
žemiu ir po jo, kadangi jos vaidmuo visame adsorbcijos procese yra 
svarbus, ypa č jei tai jonizuojamosios medžiagos.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Mišinys purtomas tol, kol pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra. Pu ­
siausvyros nusistov ėjimo trukm ė dirvožemiams yra labai nevienoda, 
atsižvelgiant į cheminę medžiag ą ir dirvožem į; paprastai pakanka 24 
h (77). Darant pradin į tyrimą, bandinius 48 h maišymo laikotarpiu 
galima imti nuosekliai (pvz., 4, 8, 24, 48 h). Ta čiau rinktis analiz ės 
laiką reikėtų lanksčiai ir atsižvelgus į laboratorijos darbo grafik ą. 
Yra du b ūdai bandomosios medžiagos vandeniniam tirpalui anali ­
zuoti: a) lygiagretusis metodas ir b) nuoseklusis metodas. Pabr ėžtina, 
kad, nors eksperimentinio darbo lygiagre čiuoju metodu yra daugiau, 
matematinis rezultat ų apdorojimas yra paprastesnis (5 pried ėlis). 
Tačiau metod ą pasirinkti leidžiama pa čiam bandytojui, kuris tur ės 
atsižvelgti į laboratorijos įrangą ir lėšas. 
(a) Lygiagretusis metodas: paruošiami bandiniai su vienodu dirvo ­ 
žemio/tirpalo santykiu, bandini ų reikia tiek, kiek laiko tarp ų pasi­
rinkta adsorbcijos kinetikai tirti. Po centrifugavimo ir, jei pagei ­
daujama, filtravimo vandenin ė fazė kiek įmanoma visa regene ­
ruojama ir analizuojama, pvz., pirmojo m ėgintuvėlio po 4 h, 
antrojo m ėgintuvėlio – po 8 h, tre čiojo mėgintuvėlio – po 24, 
ir t. t.  
(b) Nuoseklusis metodas: kiekvienam dirvožemio/tirpalo santykiui 
paruošiama tik po du bandinius. Nustatytais laiko tarpais mišinys centrifuguojamas faz ėms atskirti. Maža alikvotin ė tirpalo dalis 
tuojau pat analizuojama bandomajai medžiagai nustatyti; 
bandymas t ęsiamas su pradiniu mišiniu. Jei po centrifugavimo 
taikomas filtravimas, laboratorijoje turi b ūti priemoni ų mažiems 
alikvotini ų dalių tūriams filtruoti. Rekomenduojama bendr ą alik­
votinių dalių tūrį imti ne didesn į kaip 1 % bendrojo tirpalo t ūrio, 
kad atliekant bandym ą labai nepakist ų dirvožemio/tirpalo 
santykis ir nesumaž ėtų adsorbuojamos medžiagos mas ė.
 
Pagal vardin ę pradinę koncentracij ą ir bandinio ėmimo momentui (t  i ) 
išmatuotą koncentracij ą, pataisyt ą tuščiojo bandymo verte, kiek ­
vienam laiko momentui (t  i ) apskaičiuojama adsorbcijos  ðA t i Þ procen­
tinė dalis. Braižomi ðA t i Þ kitimo laike grafikai (5 pried ėlis, 1 pav.), 
kad būtų galima nustatyti, ar jau pasiekta pusiausvyros horizontalioji 
kreivės dalis (  1 ) Bandomosios medžiagos vandenin ės fazės koncent ­
racijos kitimo laike grafikai taip pat gali b ūti panaudoti nustatant, ar 
pasiekta pusiausvyros horizontalioji kreiv ės dalis (žr. 5 pried ėlis, 2 
pav.). Taip pat apskai čiuojama K  d vertė pusiausvyros s ąlygomis. 
Pagal šią K d vertę 1 pvz., pasirenkamas tinkamas dirvožemio/tirpalo 
santykis, kad adsorbcijos procentin ė dalis būtų didesnė kaip 20 %, o 
geriau, jei > 50 % (61). Visos taikomos lygtys ir grafik ų sudarymo 
principai pateikti skirsnyje „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 pried ėlyje. 
1.9.2.2.  Adsorbcijos pusiausvyros nusistov ėjimo trukm ės ir pusiausvyros 
sąlygomis adsorbuotos medžiagos kiekio nustatymas  
Kaip jau sakyta, ðA t i Þ ar ðC ads 
aq Þ kitimo laike grafikai leidžia įvertinti, 
ar pasiekta adsorbcijos pusiausvyra ir koks yra pusiausvyros s ąly­
gomis adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis. Toki ų grafikų 
pavyzdžiai pateikti 5 pried ėlio 1 ir 2 paveiksluose. Pusiausvyros 
nusistovėjimo trukm ė – tai laikas, per kur į sistema pasiekia kreiv ės 
horizontali ąją dalį. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Bandomosios medžiagos vandenin ės fazės koncentracijos (ðC ads 
aq Þ kitimo laike grafikai 
taip pat gali b ūti panaudoti nustatant, ar pasiekta pusiausvyros horizontalioji kreiv ės dalis 
(žr. 5 priedo 2 pav.).
 Jei konkre čiai medžiagai kreiv ės lygiagre čioji dalis nepasiekiama, bet 
adsorbcija vis ą laiką didėja, gali būti padėtį sunkinan čių veiksnių, pvz., 
biologinis skaidymas ar l ėta difuzija. Biologin į skaidym ą galima 
įrodyti bandym ą pakartojant su steriliu dirvožemio bandiniu. Jei ir 
dabar lygiagre čios kreivės dalies nėra, bandytojas turi ieškoti kit ų reiš­
kinių, trukdančių vykdyti specifin į tyrimą; tai galima padaryti atitin ­
kamai pakeitus bandymo s ąlygas (temperat ūrą, purtymo trukm ę, dirvo­ 
žemio/tirpalo santyk į). Bandytojas pats turi spr ęsti, ar tęsti bandym ą, 
nepaisant to, kad gali ir nepavykti pasiekti pusiausvyr ą. 
1.9.2.3.  Adsorbcija ant bandymo ind ų paviršiaus ir bandomosios medžiagos 
stabilumas  
Tam tikros informacijos apie bandomosios medžiagos adsorbcij ą ant 
bandymo ind ų paviršiaus, taip pat apie jos stabilum ą galima gauti 
analizuojant kontrolinius bandinius. Jei pastebimas medžiagos išeik ­
vojimas yra didesnis nei analiz ės metodo standartin ė paklaida, gali 
vykti abiotinis skaidymas ir (ar) adsorbcija ant bandymo ind ų pavir­ 
šiaus. Šiuos du reiškinius galima atskirti, jei ind ų sienelės gerai 
nuplaunamos žinomu kiekiu atitinkamo tirpiklio ir plovimui naudotas 
tirpalas analizuojamas ieškant bandomosios medžiagos. Jei adsorb ­
cija ant ind ų paviršiaus nevyksta, medžiagos išeikvojimas rodo abio ­
tinį bandomosios medžiagos nestabilum ą. Jei adsorbcija įrodoma, 
būtina keisti medžiagas, iš kuri ų pagaminti bandymo indai. Ta čiau 
šiuo bandymu surinkti duomenys apie adsorbcij ą ant bandymo ind ų 
sienelių negali b ūti tiesiogiai ekstrapoliuoti dirvožemio/tirpalo 
bandymui. Šiai adsorbcijai įtakos gali tur ėti dirvožemis.  
Papildomos informacijos apie bandomosios medžiagos stabilum ą 
galima gauti nustatant pradin ės medžiagos mas ės balansą per tam 
tikrą laiką. Tokiu atveju atliekama vandenin ės fazės, dirvožemio 
ekstraktų ir bandymo ind ų sienelių analizė ieškant bandomosios 
medžiagos. Skirtumas tarp prid ėtos bandomosios medžiagos mas ės 
ir bandomosios medžiagos vandenin ėje fazėje, ekstraktuose ir ant 
bandymo ind ų sienelių masių sumos yra lygus masei medžiagos, 
kuri buvo suardyta ir (ar) išgaravo, ir (ar) nebuvo ekstrahuota. Norint nustatyti masi ų balansą, atliekant bandym ą turi būti pasiekta adsorb ­
cijos pusiausvyra.
 
Masių balansas daromas dviem dirvožemiams ir kiekvieno dirvo ­ 
žemio vienam dirvožemio/tirpalo santykiui, kuriam pusiausvyros 
sąlygomis gaunamas didesnis kaip 20 %, o geriau > 50 % išeikvo ­
jimas. Baigus santykio nustatymo bandym ą, kai po 48 h atliekama 
paskutinė vandenin ės fazės bandinio analiz ė, fazės yra atskiriamos 
centrifugavimu ir, jei pageidaujama, filtravimu. Vandenin ė fazė rege­
neruojama kuo didesniu laipsniu, paskui bandomajai medžiagai iš 
dirvožemio ekstrahuoti į jį įpilama tinkamo ekstrahavimo tirpiklio 
(ekstrahavimo faktorius bent 95 %). Rekomenduojama nuosekliai ekstrahuoti bent du kartus. Nustatomas medžiagos kiekis dirvožemio 
ir bandymo ind ų ekstraktuose ir apskai čiuojamas masi ų balansas (10 
lygtis, „Duomenys ir ataskaita“). Jei jis yra mažesnis kaip 90 %, laikoma, kad bandomoji medžiaga bandymo metu yra nestabili. Tačiau tyrimus galima t ęsti toliau, atsižvelgiant į bandomosios 
medžiagos nestabilum ą; šiuo atveju rekomenduojama darant pagrin ­
dinį tyrimą analizuoti abi fazes.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.3.  2 tarpsnis. Adsorbcijos kinetika vienai bandomosios medžiagos 
koncentracijai  
Naudojamas iš 1 lentel ės pasirinkt ų penkių tipų dirvožemis. Jei tinka, 
tarp šių penkių tipų naudinga tur ėti kai kuriuos dirvožemio tipus, 
naudotus darant pradin į tyrimą. Tuomet pradiniam tyrimui naudo ­
tiems dirvožemio tipams 2 tarpsnio bandym ų atlikti nereikia.  
Pusiausvyros nusistov ėjimo trukm ė, dirvožemio/tirpalo santykis, 
dirvožemio bandinio mas ė, sąlytyje su dirvožemiu esan čios vande ­
ninės fazės tūris ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentracija 
pasirenkami pagal pradinio tyrimo rezultatus. Analiz ę būtų geriau 
atlikti maždaug po 2, 4, 6, 8 (galb ūt dar po 10 h) ir po 24 h s ąlyčio; 
maišymo trukm ė gali būti padidinta ne daugiau kaip iki 48 h, jei 
cheminei medžiagai pagal santykio nustatymo rezultatus reikalinga didesnė pusiausvyros nusistov ėjimo trukm ė. Tačiau analiz ės laiką 
reikėtų rinktis lanks čiai.
 
Kiekvienas bandymas (vienas dirvožemis ir vienas tirpalas) atlie ­
kamas bent du kartus, kad b ūtų galima įvertinti rezultat ų sklaidą. 
Atliekant kiekvien ą bandymą imamas tuš čiasis bandinys. J į sudaro 
dirvožemis ir 0,01 M CaCl  2 tirpalas be bandomosios medžiagos, 
kurių masė ir tūris yra atitinkamai tokie pat kaip ir bandinio su 
bandomąja medžiaga. Norint išvengti netik ėtumų, pagal t ą pačią 
bandymo metodik ą tiriamas kontrolinis bandinys tik su bandom ąja 
medžiaga, ištirpinta 0,01 M CaCl  2 tirpale (be dirvožemio).  
Adsorbcijos procentin ė dalis apskai čiuojama kiekvienam laiko 
momentui ðA t i Þ ir (ar) laiko tarpui  ðA Δt i Þ (pagal poreik į) ir patei ­
kiamas adsorbcijos kitimo laike grafikas. Apskai čiuojamas pasiskirs ­
tymo koeficientas K  d pusiausvyros s ąlygomis, taip pat pagal orga ­
ninę anglį normalizuotas adsorbcijos koeficientas K  oc (nepolinių 
organinių medžiag ų). 
Adsorbcijos kinetikos bandymo rezultatai  
Tiesinė K  d vertė paprastai tiksliai aprašo dirvožemio sorbcin ę 
elgseną (35) (78) ir yra chemini ų medžiag ų būdingo judrumo dirvo ­ 
žemyje išraiška. Pvz., paprastai chemin ės medžiagos, kuri ų K d ≤ 1 
cm 3 g -1 , kokybiškai laikomos judriomis. Panašiai MacCall  et al . (16) 
buvo sukurta judrumo klasifikavimo schema, pagr įsta K  oc vertėmis. 
Be to, yra išplovimo klasifikavimo schemos, pagr įstos K  oc ir 
DT-50 (  1 ) santykiu (32) (79).  
Pagal paklaid ų analizės tyrimus (61) mažesn ės kaip 0,3 cm  3 g -1 K d 
vertės negali b ūti tiksliai įvertintos pagal vandenin ės fazės koncent ­
racijos maž ėjimą, netgi taikant palankiausi ą (tikslumo poži ūriu) 
dirvožemio/tirpalo santyk į, t. y. 1:1. Šiuo atveju rekomenduojama 
analizuoti abi fazes, dirvožem į ir tirpalą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: laikas, per kur į suskaidoma 50 % bandomosios medžiagos.
 Atsižvelgiant į šias pastabas, rekomenduojama t ęsti adsorbcin į 
cheminės medžiagos dirvoje elgsenos ir jos potencialaus judrumo 
tyrimą nustatant Freundlicho adsorbcijos izotermes toms sistemoms, 
kurioms pagal šio metodo aprašym ą galima tiksliai nustatyti K  d 
vertes. Tiksliai nustatyti galima, jei K  d ir dirvožemio/tirpalo santykio 
sandaugos vert ė yra > 0,3 matuojant vandenin ės fazės koncentracijos 
mažėjimą (netiesioginis metodas) ar > 0,1, kai analizuojamos abi 
fazės (tiesioginis metodas) (61).  
1.9.4.  3 tarpsnis. Adsorbcijos izoterm ės ir desorbcijos kinetika/desorbcijos 
izotermės 
1.9.4.1. A d s o r b c i j o s i z o t e r m ė s 
Taikomos penkio  2 s bandomosios medžiagos koncentracijos, ir b ūtų 
gerai, jei j ų vertė apimtų dvi dydžio eiles; pasirenkant šias koncent ­
racijas reikia atsižvelgti į tirpumą vandenyje ir gaunam ą vandenin ės 
fazės pusiausvyros koncentracij ą. Tas pats dirvožemio/tirpalo 
santykis turi b ūti taikomas per vis ą tyrimą. Adsorbcijos bandymas 
atliekamas taip, kaip aprašyta pirmiau, skirtumas tik toks, kad vande ­
ninė fazė analizuojama vien ą kartą pusiausvyros nusistov ėjimo 
momentu, nustatytu pagal 2 tarpsnio rezultatus. Nustatoma tirpal ų 
pusiausvyros koncentracija ir pagal medžiagos kiekio tirpale suma ­ 
žėjimą arba tiesioginiu metodu apskai čiuojamas adsorbuotos 
medžiagos kiekis. Adsorbuotos medžiagos mas ė, tenkanti dirvožemio 
masės vienetui, grafiškai pateikiama kaip bandomosios medžiagos 
pusiausvyros koncentracijos funkcija (žr. „Duomenys ir ataskaita“).  
Bandymo adsorbcijos izotermei gauti rezultatai  
Iš ligi šiol pasi ūlytų matematini ų adsorbcijos modeli ų dažniausiai 
adsorbcijos procesams apib ūdinti taikoma Freundlicho izoterm ė. 
Smulkesn ė informacija aiškinant adsorbcijos modelius ir j ų svarbą 
pateikta nuorodose (41) (45) (80) (81) (82).  
Pastaba . Reikėtų paminėti, kad skirting ų medžiag ų K F (Freundlicho 
adsorbcijos koeficiento) vertes galima lyginti, jei šios K  F vertės yra 
išreikštos tais pa čiais vienetais (83).  
1.9.4.2. D e s o r b c i j o s k i n e t i k a  
Šio bandymo tikslas yra ištirti, ar chemin ę medžiag ą dirvožemis 
adsorbuoja gr įžtamai ar negr įžtamai. Ši informacija yra svarbi, 
kadangi, cheminei medžiagai esant lauko dirvožemyje, desorbcijos 
procesas taip pat vaidina svarb ų vaidmen į. Be to, desorbcijos 
duomenys yra naudingi kaip įvesties duomenys kompiuteriu mode ­
liuojant išplovim ą ir ištirpusi ų medžiagų nuotėkį. Jei norima vykdyti 
desorbcijos tyrim ą, rekomenduojama, kad kiekvienai sistemai, kuriai 
ankstesniame adsorbcijos kinetikos bandyme buvo galima tiksliai 
nustatyti K  d , būtų daromas toliau aprašytas tyrimas.  
Panašiai kaip darant adsorbcijos kinetikos tyrim ą, yra du desorbcijos 
kinetikos bandymo metodai: a) lygiagretusis metodas ir b) nuose ­
klusis metodas. Pasirinkti metod ą leidžiama bandytojui, kuris turi 
atsižvelgti į laboratorijos įrangą ir lėšas. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
(a) Lygiagretusis metodas: kiekvienam desorbcijai tirti pasirinktam 
dirvožemio tipui paruošiami bandiniai, kuri ų dirvožemio/tirpalo 
santykis b ūtų vienodas ir kuri ų būtų tiek, kiek laiko tarp ų pasi­
rinkta desorbcijos kinetikai tirti. Geriau naudoti laiko tarpus, pasirinktus adsorbcijos kinetikai tirti; ta čiau bendras laikas gali 
būti atitinkamai padidintas, kad sistema gal ėtų pasiekti desorb ­
cijos pusiausvyr ą. Atliekant kiekvien ą bandym ą (vienas dirvo ­ 
žemis, vienas tirpalas) imamas vienas tuš čiasis bandinys. J į 
sudaro dirvožemis ir 0,01 M CaCl
 2 tirpalas be bandomosios 
medžiagos, kuri ų masė ir tūris atitinkamai yra tokie pat kaip ir 
bandinio su bandom ąja medžiaga. Pagal t ą pačią bandymo meto ­
diką tiriamas kontrolinis bandinys tik su bandom ąja medžiaga, 
ištirpinta 0,01 M CaCl  2 tirpale (be dirvožemio). Visi dirvožemio 
ir tirpalo mišiniai purtomi, kol pasiekiama adsorbcijos pusiaus ­
vyra (kaip nustatyta pirmiau pagal 2 tarpsn į). Toliau faz ės atski­
riamos centrifugavimu ir vandenin ės fazės yra kuo daugiau paša ­
linamos. Pašalinti tirpalai pakei čiami tokiu pat t ūriu 0,01 M 
CaCl  2 tirpalo be bandomosios medžiagos ir nauji mišiniai v ėl 
purtomi. Pirmojo m ėgintuvėlio vandenin ė fazė kuo geriau rege ­
neruojama ir analizuojama, pvz., po 2 h, antrojo m ėgintuvėlio – 
po 4 h, tre čiojo mėgintuvėlio – po 6 h ir t. t., kol pasiekiama 
desorbcijos pusiausvyra.  
b) Nuoseklusis metodas: baigus adsorbcijos kinetikos bandym ą, 
mišinys centrifuguojamas ir vandenin ė fazė kiek įmanoma 
daugiau pašalinama. Pašalintas tirpalas pakei čiamas tokiu pat 
tūriu 0,01 M CaCl  2 tirpalo be bandomosios medžiagos. Naujas 
mišinys purtomas tol, kol pasiekiama desorbcijos pusiausvyra. 
Per tą laiką tam tikrais laiko tarpais mišinys yra centrifuguo ­
jamas faz ėms atskirti. Maža alikvotin ė tirpalo dalis tuojau pat 
analizuojama bandomajai medžiagai nustatyti; toliau bandymas 
tęsiamas su pradiniu mišiniu. Kiekvienos atskiros alikvotin ės 
dalies tūris turi sudaryti mažiau kaip 1 % bendro t ūrio. Dirvo ­ 
žemio ir tirpalo santykiui palaikyti įpilamas toks pat kiekis 
šviežio 0,01 M CaCl  2 tirpalo ir purtoma iki kito laiko tarpo.  
Apskaičiuojama desorbcijos procentin ė dalis kiekvienam laiko 
momentui ðD t i Þ ir (ar) laiko tarpui  ðD Δt i Þ (pagal tyrimo poreikius) 
ir braižomas kitimo laike grafikas. Taip pat apskai čiuojamas desorb ­
cijos koeficientas K  des pusiausvyros s ąlygomis. Visos taikomos 
lygtys pateiktos skirsnyje „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 pried ėlyje. 
Desorbcijos kinetikos bandymo rezultatai  
Bendri desorbcijos procentin ės dalies ðD t i Þ ir adsorbcijos ðA t i Þ 
kitimo laike grafikai leidžia įvertinti adsorbcijos proceso gr įžtamumą. 
Adsorbcija laikoma gr įžtama, jei laikas desorbcijos pusiausvyrai 
pasiekti yra trumpesnis nei dvigubas laikas adsorbcijos pusiausvyrai pasiekti ir bendra desorbcija sudaro daugiau kaip 75 % adsorbuoto kiekio.
 
1.9.4.3. D e s o r b c i j o s i z o t e r m ė s 
Freundlicho desorbcijos izoterm ės apskaičiuojamos dirvožemiams, 
kuriems buvo apskai čiuojamos adsorbcijos izoterm ės. Desorbcijos 
bandymas atliekamas, kaip aprašyta skirsnyje „Desorbcijos kinetika“, 
išskyrus tai, kad vandenin ė fazė analizuojama tik vien ą kartą, kai nusis ­
tovi desorbcijos pusiausvyra. Apskai čiuojamas desorbuotos bandomo ­
sios medžiagos kiekis. Desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis lik ęs dirvo­ 
žemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis grafiškai patei ­
kiamas kaip bandomosios medžiagos tirpalo pusiausvyros koncentra ­
cijos funkcija (žr. „Duomenys ir ataskaita“ ir 5 pried ėlį). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
Analizės duomenys pateikiami lentel ėse (žr. 6 pried ėlį). Pateikiami 
atskiri matavimai ir apskai čiuotos vidutin ės vertės. Adsorbcijos 
izotermės pateikiamos grafiškai. Apskai čiavimai daromi, kaip nuro ­
dyta toliau.  
Atliekant š į bandymą laikoma, kad 1 cm  3 vandeninio tirpalo mas ė 
yra 1 g. Dirvožemio/tirpalo santykis gali b ūti išreikštas m/m ar m/v, 
skaitmenin ė šių dydžių vertė yra vienoda.  
2.1. ADSORBCIJA  
Adsorbcija ðA t i Þ yra apibr ėžiama bandymo s ąlygomis dirvožemiu 
adsorbuotos medžiagos procentine dalimi nuo jos kiekio bandymo pradžioje. Jei bandomoji medžiaga yra stabili ir indo sienel ės jos 
žymiai neadsorbuoja,
 ðA t i Þ kiekvienu laiko momentu t  i apskaičiuo­
jama pagal lygt į: 
A t i ¼ Í ðm ads 
s ðt i Þ · 100Þ 
ðm 0 Þ Î 
ð%Þ (3)  
čia: 
ðA t i Þ = adsorbcijos procentin ė dalis laiko momentu t  i (%), 
m ads 
s ðt i Þ = laiku t  i dirvožemiu adsorbuotos bandomosios 
medžiagos mas ė (μg), 
m 0 = bandymo pradžioje m ėgintuvėlyje esančios bandomo ­
sios medžiagos mas ė (μg). 
Informacija, kaip apskai čiuoti adsorbcij ą ðA t i Þ lygiagre čiuoju ir 
nuosekliuoju metodu, išsamiai aprašyta 5 pried ėlyje. 
Pasiskirstymo koeficientas K  d yra medžiagos kiekio dirvožemio 
fazėje ir vandeninio tirpalo mas ės koncentracijos santykis bandymo 
sąlygomis, pasiekus adsorbcijos pusiausvyr ą. 
K d ¼ Í ðC ads 
s ðeqÞÞ 
ðC ads 
aq ðeqÞÞ Î 
¼ Í ðm ads 
s ðeqÞÞ 
ðm ads 
aq ðeqÞÞ Î 
· Í ðV 0 Þ 
ðm soil Þ Î 
v ðcm 3 g Ä1 Þ (4) 
čia: 
ðC ads 
s ðeqÞÞ = dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis adsorbcijos 
pusiausvyros s ąlygomis ( μg g  -1 ), 
ðC ads 
aq ðeqÞÞ = medžiagos vandenin ės fazės masės koncentracija 
adsorbcijos pusiausvyros s ąlygomis ( μg g  -3 ). Ši 
koncentracija nustatoma analiz ės būdu atsižvelgiant 
į vertes, gautas tuš čiaisiais bandymais;  
ðm ads 
s ðeqÞÞ = dirvožemiu adsorbuotos medžiagos mas ė adsorbcijos 
pusiausvyros s ąlygomis ( μg); 
ðm ads 
aq ðeqÞÞ = tirpale esan čios medžiagos mas ė adsorbcijos pusiaus ­
vyros sąlygomis ( μg); 
m soil = dirvožemio faz ės kiekis, išreikštas sauso dirvožemio 
mase (g);  
V o = sąlytyje su dirvožemiu esan čios vandenin ės fazės 
pradinis t ūris (cm  3 ). 
A eq ir K  d santykis aprašomas lygtimi:  
K d ¼ Í ðA eq Þ 
ð100 Ä A eq Þ Î 
· Í ðV 0 Þ 
ðm soil Þ Î 
(cm  3 g -1 ) (5)  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
čia: 
A eq = adsorbcijos procentin ė dalis adsorbcijos pusiausvyros s ąly­
gomis %  
Pagal organin ę anglį normalizuotas adsorbcijos koeficientas K  oc 
susieja pasiskirstymo koeficient ą K d ir dirvožemio bandinio orga ­
ninės anglies kiek į: 
K oc ¼ K  d · Í ð100Þ 
ð%OCÞ Î 
(cm  3 g -1 ) (6)  
čia: 
OC % = organin ės anglies dirvožemio bandinyje procentin ė 
dalis (g g  -1 ). 
K oc koeficientas rodo vienintel ę vertę, kuri apib ūdina daugiausia 
nepolinių organini ų chemini ų medžiag ų pasiskirstym ą tarp dirvo ­ 
žemio organin ės anglies ar nuos ėdų ir vandens. Ši ų chemini ų 
medžiagų adsorbcija susiejama su organin ės medžiagos kiekiu adsor ­
buojančioje kietojoje medžiagoje (7); taigi K  oc vertės priklauso nuo 
humusinių dalių, kurių sorbcijos galia labai skiriasi d ėl kilmės, 
genezės ir t. t. specifini ų charakteristik ų. 
2.1.1.  Adsorbcijos izoterm ės 
Freundlicho adsorbcijos izotermi ų lygtis susieja adsorbuotos bando ­
mosios medžiagos kiek į ir bandomosios medžiagos tirpalo koncent ­
raciją pusiausvyros s ąlygomis (8 lygtis).  
Duomenys apdorojami, kaip nurodyta skirsnyje „Adsorbcija“, ir 
kiekvienam m ėgintuvėliui po adsorbcijos bandymo apskai čiuojamas 
dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos kiekis  ðC ads 
s ðeqÞÞ, 
kitur žymimas x/m). Daroma prielaida, kad pusiausvyra yra pasiekta ir kad
 ðC ads 
s ðeqÞÞ rodo pusiausvyros vert ę: 
C ads 
s ðeqÞ ¼ Í ðm ads 
s ðeqÞÞ 
ðm soil Þ Î 
¼ Í ð½C 0 – C  ads 
aq ðeqÞâ · V 0 Þ 
ðm soil Þ Î 
ðμg g Ä1 Þ (7) 
Freundlicho adsorbcijos lygtis pateikta (8):  
C ads 
s ðeqÞ ¼ K  ads 
F · C ads 
aq ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8)  
ar tiesės pavidalu:  
logC  ads 
s ðeqÞ ¼ Í logK  ads 
F þ 1 
n·logC  ads aq ðeqÞ Î 
(9) 
čia: 
ðK ads 
F Þ = Freundlicho adsorbcijos koeficientas; jo dimensija yra 
cm 3 g -1 , tik jei l/n = 1; visais kitais atvejais į ðK ads 
F Þ 
(μg 1–1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ); 
n = regresijos konstanta; l/n dažniausiai kinta 0,7– 1,0 inter ­
vale, ir tai rodo, kad sorbcijos duomenys dažnai yra šiek 
tiek netiesiški.  
Gali būti nubrėžti 8 ir 9 lyg čių grafikai ir taikant 9 lygt į regresijos 
analizės metodu apskai čiuojami ðK ads 
F Þ ir l/n. Taip pat apskai čiuo­
jamas logaritmin ės lygties koreliacijos koeficientas r  2 . Tokių grafikų 
pavyzdys pateiktas 2 pav.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
2 pvz.,  Freundlicho adsorbcijos įprastas ir ištiesintas grafikas  
2.1.2.  Masi ų balansas  
Masių balansas (MB) apibr ėžiamas kaip medžiagos, galin čios būti 
analiziškai regeneruotos po adsorbcijos bandymo, procentin ė dalis 
nuo medžiagos vardinio kiekio bandymo pradžioje.  
Duomenų apdorojimas skirsis, jei tirpiklis visiškai maišosi su 
vandeniu. Jei tirpiklis maišosi su vandeniu, ekstrahuojant tirpikliu regeneruojamos medžiagos kiekiui nustatyti galima taikyti duomen ų 
apdorojimo b ūdą, aprašytą skirsnyje „Desorbcija“. Jei tirpiklis su 
vandeniu maišosi blogiau, reikia nustatyti regeneruotos medžiagos 
kiekį.
 
Adsorbcijos atveju masi ų balansas MB apskai čiuojamas, kaip nuro ­
dyta toliau. Daroma prielaida, kad narys (m  E ) atitinka bandomosios 
cheminės medžiagos, organiniu tirpikliu ekstrahuojamos iš dirvo ­ 
žemio ir nuo bandymo indo sieneli ų, masių sumą: 
MB ¼ Í ððV rec · C ads 
aq ðeqÞ þ m  E Þ · 100Þ 
ðV 0 · C 0 Þ Î 
ð%Þ (10)  
čia: 
MB = masi ų balansas (%),  
m E = bandomosios medžiagos, dviem pakopomis ekstrahuotos 
iš dirvožemio ir nuo sieneli ų, bendroji mas ė (μg); 
C o = sąlytyje su dirvožemiu esan čio bandomojo tirpalo 
pradinė masės koncentracija ( μg cm  -3 ), 
V rec = adsorbcijos pusiausvyros s ąlygomis regeneruoto tirpalo 
virš nuos ėdų tūris (cm  -3 ). 
2.2. DESORBCIJA  
Desorbcija (D) apibr ėžiama kaip desorbuotos bandomosios 
medžiagos procentin ė dalis nuo medžiagos, prieš tai adsorbuotos 
bandymo s ąlygomis, kiekio:  
D t i ¼ Í ðm des 
aq ðt i ÞÞ 
ðm ads s ðeqÞÞ Î 
· 100ð%Þ (11)  
čia: 
ðD t i Þ = desorbcijos procentin ė dalis laiko momentu t  i (%), ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
ðm des 
aq ðt i ÞÞ = laiko momentu t  i (μg) nuo dirvožemio desorbuotos 
bandomosios medžiagos mas ė, 
ðm ads 
s ðeqÞÞ = adsorbcijos pusiausvyros s ąlygomis dirvožemiu 
adsorbuotos bandomosios medžiagos mas ė (μg). 
Informacija, kaip apskai čiuoti desorbcijos procentin ę dalį D t i lygia­
grečiuoju ir nuosekliuoju metodu, išsamiai aprašyta 5 pried ėlyje. 
Tariamasis desorbcijos koeficientas (K  des ) bandymo s ąlygomis yra 
dirvožemio faz ėje likusios medžiagos kiekio ir desorbuotos 
medžiagos vandeninio tirpalo mas ės koncentracijos santykis pasiekus 
desorbcijos pusiausvyr ą: 
K des ¼ ÍÍ ðm ads 
s ðeqÞ – m  des 
aq ðeqÞÞ 
ðm des 
aq ðeqÞÞ ÎÍ ðV T Þ 
ðm soil Þ ÎÎ 
(cm  3 g -1 ) (12) 
čia: 
K des = desorbcijos koeficientas (cm  3 g -1 ); 
ðm des 
aq ðeqÞÞ = nuo dirvožemio desorbuotos bandomosios medžiagos 
bendroji mas ė desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis 
(ug);  
V T = atliekant desorbcijos kinetikos bandym ą sąlytyje su 
dirvožemiu esan čios vandenin ės fazės bendrasis 
tūris (cm  3 ). 
Kaip apskai čiuoti ðm des 
aq ðeqÞÞ nurodyta 5 pried ėlio skirsnyje „Desorb ­
cija“.  
Pastaba.  
Jei prieš tai atliekant adsorbcijos bandym ą buvo taikomas lygiagre ­
tusis metodas, laikoma, kad t ūris V  T 12 lygtyje yra lygus V  o . 
2.2.1.  Desorbcijos izoterm ės 
Freundlicho desorbcijos izotermi ų lygtis susieja desorbcijos pusiaus ­
vyros sąlygomis likusios dirvožemiu adsorbuotos bandomosios 
medžiagos kiek į ir bandomosios medžiagos tirpalo koncentracij ą 
(16 lygtis).  
Desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis likusios dirvožemiu adsorbuotos 
medžiagos kiekis kiekvienam m ėgintuvėliui apskai čiuojamas taip:  
C des 
s ðeqÞ ¼ Í ðm ads 
s ðeqÞ – m  des 
aq ðeqÞÞ 
ðm soil Þ Î 
(μg g  -1 ) (13) 
ðm des 
aq ðeqÞÞ yra apibr ėžiama taip:  
m des 
aq ðeqÞ ¼ m  des 
m ðeqÞ · Í ðV 0 Þ 
ðV F 
r Þ Î 
– m  A 
aq (μg) (14)  
čia: 
ðC des 
s ðeqÞÞ = bandomosios medžiagos, kuri liko adsorbuota 
dirvožemiu desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis, 
kiekis (μg g  -1 ); 
ðm des 
m ðeqÞÞ = medžiagos, analiziškai nustatytos vandenin ėje terpėje 
desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis, mas ė (μg); ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
ðm A 
aq Þ = bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos 
pusiausvyros bandymo d ėl nevisiško t ūrio pakeitimo, 
masė (μg); 
ðm des 
aq ðeqÞÞ = medžiagos, esan čios tirpale adsorbcijos pusiausvyros 
sąlygomis, mas ė (μg); 
m A 
aq ¼ m  ads 
aq ðeqÞ · Í ðV 0 – V  R Þ 
ðV 0 Þ Î 
(15) 
ðV F 
r Þ = tirpalo, paimto iš m ėgintuvėlio bandomosios medžiagos 
kiekiui nustatyti desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis, 
tūris (cm  3 ) 
V R = tirpalo virš nuos ėdų, pašalinto iš m ėgintuvėlio pasiekus 
adsorbcijos pusiausvyr ą ir pakeisto tokiu pat t ūriu 0,01 
M CaCl  2 tirpalo, tūris (cm  3 ); 
Freundlicho desorbcijos lygtis pateikta (16):  
C des 
s ðeqÞ ¼ K  des 
F · C des 
aq ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16)  
ar tiesės pavidalu:  
logC  des 
s ðeqÞ ¼ logK  des 
F þ 1=n logC  des 
aq ðeqÞ (17)  
čia: 
ðK des 
F Þ = Freundlicho desorbcijos koeficientas;  
n = regresijos konstanta;  
ðC des 
aq ðeqÞÞ = medžiagos vandenin ėje fazėje masės koncentracija 
desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis ( μg cm  -3 ). 
Gali būti nubrėžti 16 ir 17 lyg čių grafikai ir taikant 17 lygt į regre­
sijos analiz ės metodu apskai čiuojami ðK des 
F Þ ir l/n.  
Pastaba:  
Jei Freundlicho adsorbcijos ar desorbcijos laipsnio rodiklis l/n yra 
lygus 1, Freundlicho lyg čių adsorbcijos ar desorbcijos konstantos 
(ðK ads 
F Þ ir ðK des 
F Þ) bus lygios atitinkamai adsorbcijos ar desorbcijos 
pusiausvyros konstantoms (K  d ir K  des ), ir C  s priklausomyb ės nuo C  aq 
grafikas bus ties ė. Jei laipsni ų rodikliai n ėra lygūs 1, C  s priklauso­
mybės nuo C  aq grafikai nebus ties ės ir adsorbcijos bei desorbcijos 
konstantos keisis išilgai izotermi ų. 
2.2.2.  Bandymo ataskaita  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti ši informacija:  
— išsamus naudot ų dirvožemio bandini ų identifikavimas, įskaitant:  
— geografin ę vietos nuorod ą (platuma, ilguma),  
— bandinio ėmimo dat ą, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— naudojimo paskirt į (pvz., žem ės ūkio paskirties dirvožemis, 
miškas ir t. t.),  
— bandinio ėmimo gyl į, 
— smėlio/dumblo/molio kiek į, 
— pH vertes (0,01 M CaCl2),  
— organin ės anglies kiek į, 
— organin ės medžiagos kiek į, 
— azoto kiek į, 
— C/N santyk į, 
— katijon ų mainų gebą (mmol/kg),  
— visą informacij ą apie dirvožemio bandini ų rinkimą ir laikym ą, 
— jei tinka, vis ą informacij ą, reikaling ą bandomosios medžiagos 
adsorbcijai/desorbcijai aiškinti,  
— metodus, taikomus kiekvienam parametrui nustatyti,  
— atitinkama informacija apie bandom ąją medžiag ą, 
— bandymo temperat ūra, 
— centrifugavimo s ąlygos,  
— analiz ės metodika, taikyta bandomajai medžiagai analizuoti,  
— priežastys, kurios pagr įstų tirpinimo medžiagos naudojim ą pradi­
niam bandomosios medžiagos tirpalui ruošti,  
— apskai čiavimuose daryt ų pataisų aiškinimai, jei tinka,  
— duomenys pagal form ą (6 priedėlis) ir grafikai,  
— visa informacija ir pasteb ėjimai, padedantys aiškinti bandym ų 
rezultatus.  
3. NUORODOS  
1) Kukowski H. and Br ūmmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. 
UBA Report 106 02 045, Part II.  
2) Franzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Repre ­
sentative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02 045, 
Part I.  
3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication no. 
1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, 
December 1994.  
4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 
18–20 January 1995 (June 1995).  
5) US-Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163–1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09–88–096, Date: 1/1988.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
6) US-Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96–048, April 1996.
 
7) ASTM Standards, E 1195–85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (K  oc ) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments.  
8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guide ­
lines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.  
9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially dange ­
rous to health or especially harmful to the environment.  
11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protec ­
tion Products, Biological Research Centre for Agriculture and 
Forestry, Braunschweig, Germany.  
12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and the 
prediction of the mobilities of pesticides in soils“, in Methodo ­
logical Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. 
P. Jamet), INRA, Paris, (Review).  
13) Calvet R., (1980) „Adsorption-Desorption Phenomena“ in Inte ­
ractions between herbicides and the soil. (RJ. Hance ed.), 
Academic Press, London, pp. 83–122.  
14) Hasset J.J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments“ in Reactions and 
Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society 
of America (S.S.S. A), Special Publication no. 22, pp 31–44.  
15) van Genuchten M. Th., Davidson J.M., and Wierenga P.J., 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations 
for the prediction of pesticide movement through porous 
media“. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), 29–35.  
16) McCall P.J., Laskowski D.A., Swann R.L., and Dishburger H.J., 
(1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemi ­
cals and their use, in environmental fate analysis“, in Test Proto ­
cols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
 
17) Lambert S.M., Porter P.E., and Schieferrstein R.H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil“. 
Weeds, 13, 185–190.  
18) Rhodes R.C., Belasco I.J., and Pease H.L., (1970) „Determina ­
tion of mobility and adsorption of agrochemicals in soils“. J. 
Agric. Food Chem., 18, 524–528.  
19) Russell M.H., (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil“ in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T.R. Roberts and P.C. Kearney). John Wiley & 
Sons Ltd.  
20) Esser H.O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D.B., Vonk J.W. 
and Holland P.T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides“, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
901–932.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
21) Guth J.A., Burkhard N., and D.O. Eberle, (1976), „Experimental 
models for studying the persistence of pesticides in soils“. Proc. 
BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp 137–157, BCPC, Surrey, UK.
 
22) Furminge C.G.L., and Osgerby J.M., (1967), „Persistence of 
herbicides in soil“. J. Sci. Fd Agric, 18, 269–273.  
23) Burkhard N., and Guth J.A., (1981), „Chemical hydrolysis of 2- 
Chloro-4,6-bis(alkylamino)-l, 3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption“. Pestic. 
Sci. 12, 45–52.
 
24) Guth J.A., Gerber H.R., and Schlaepfer T., (1977). „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological availa ­
bility of soil-applied pesticides“. Proc. Br. Crop Prot. Conf, 3, 961–971.
 
25) Osgerby J.M., (1973), „Process affecting herbicide action in 
soil“. Pestic. Sci., 4, 247–258.  
26) Guth J.A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Boden“. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, 143–154.  
27) Hamaker J.W., (1975), „The interpretation of soil leaching expe ­
riments“, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R Haque and V.H. freed), pp. 135–172, Plenum Press, NY.
 
28) Helling C.S., (1971), „Pesticide mobility in soils“. Soil Sci. Soc. 
Amer. Proc, 35, 732–210.  
29) Hamaker J.W., (1972), „Diffusion and volatilization“ in Organic 
chemicals in the soil environment (CAT. Goring and J.W. 
Hamaker eds), Vol. I, 49–143.  
30) Burkhard N. and Guth J.A., (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system“. Pestic. Sci. 12, 37–44.
 
31) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297–325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
32) Gustafson D.I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide teachability“. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), 339–357.
 
33) Leistra M., and Dekkers W.A., (1976). „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils“. J. of Soil 
Sci., 28, 340–350.  
34) Bromilov R.H., and Leistra M., (1980), „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils“. Pest. Sci., 11, 389–395.
 
35) Green R.E., and Karickoff S.W., (1990), „Sorption estimates for 
modeling“, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp.80–101,
 
36) Lambert S.M., (1967), „Functional relationship between sorption 
in soil and chemical structure“. J. Agri. Food Chem., 15, 
572–576.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
37) Hance R.J., (1969), „An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils“. J. Agri. Food Chem., 17, 667–668.  
38) Briggs G. G (1969), „Molecular structure of herbicides and their 
sorption by soils“. Nature, 223, 1288.  
39) Briggs G.G. (1981). „Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor“. J. Agric. Food Chem., 29, 1050–1059.
 
40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of soil 
sorption of organic polutance by molecular topology“. J. Agric. 
Food Chem., 32, 243–246.  
41) Bailey G.W., and White J.L., (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil“. Residue Rev., 32, 29–92.
 
42) Bailey G.W., J.L. White and Y. Romberg., (1968), „Adsorption 
of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate“. Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
32:222–234.
 
43) Karickhoff S.W., (1981) „Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. Chemosphere 10, 833–846.
 
44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption of 
6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners“. Environ. Toxicol. SAFEty 21, 1–17.
 
45) Hamaker J.W., and Thompson J.M., (1972). „Adsorption in 
organic chemicals“ in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49–143.
 
46) Deli J., and Warren G.F., 1971, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils“. Weed Sci. 19:67–69.  
47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J.M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils“. Weed Science, Vol. 23, 454–457.
 
48) Haues M.H.B., Stacey M., and Thompson J.M., (1968) 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic prepara ­
tions“ in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p. 75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
49) Pionke H.B., and Deangelis R.J., (1980), „Methods for distribu ­
ting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase“, CREAMS, in A Field Scale Model for Chemi ­
cals, Runoff and Erosion from Agricultural Management 
Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
 
50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition (1994).  
51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.  
52) Black, Evans D.D., White J.L., Ensminger L.E., and Clark F.E., 
eds. „Methods of Soil Analysis“, Vol 1 and 2, American Society 
of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
53) ISO/DIS 10381–1 Soil Quality – Sampling – Part 1: Guidance 
on the design of sampling programmes.  
54) ISO/DIS 10381–2 Soil Quality – Sampling – Part 2: Guidance 
on sampling techniques.  
55) ISO/DIS 10381–3 Soil Quality – Sampling – Part 3: Guidance 
on safety of sampling.  
56) ISO/DIS 10381–4 Soil Quality – Sampling – Part 4: Guidance 
on the investigation of natural and cultivated soils.  
57) ISO/DIS 10381–5 Soil Quality – Sampling – Part 5: Guidance 
on the investigation of soil contamination of urban and industrial 
sites.  
58) ISO 10381–6, 1993: Soil Quality – Sampling – Part 6: Guidance 
on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
59) Green R.E., and Yamane V.K., (1970) „Precision in pesticide 
adsorption measurements“. Soil Sci. Am. Proc., 34, 353–354.  
60) Grover R., and Hance R.J. (1970), „Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine“. Soil Sci., 109–138.  
61) Boesten, J.J.T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in pesticide/soil system“. Pest. Sci. 1990, 30, 31–41.
 
62) Boesten, J.J.T.I. „Influence of soil/liquid ratio on the experi ­
mental error of sorption coefficients in relation to OECD guide ­
line 106“ Proceedings of 5th international workshop on environ ­
mental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26–29 April 1994.
 
63) Bastide J., Cantier J.M., et Coste C, (1980), „Comportement de 
substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure 
chimique“. Weed Res. 21, 227–231.  
64) Brown D.S., and Flagg E.W., (1981), „Empirical prediction of 
organic pollutants sorption in natural sediments“. J. Environ. Qual., 10(3), 382–386.
 
65) Chiou C.T., Porter P.E., and Schmedding D.W., (1983), „Parti ­
tion equilibria of non-ionic organic compounds between soil 
organic matter and water“. Environ. Sci. Technol., 17(4), 227–2311.
 
66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic 
substances by soils and sediments“. J. Environm. Sci. Health, 
B19 (3), 297–312.  
67) Vowles P.D., and Mantoura R.F.C., (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons“. Chemosphere, 16(1), 109–116.
 
68) Lyman W.J., Reehl W.F.and Rosenblatt D.H. (1990). Handbook 
of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Beha ­
viour of Organic Compounds. American Chemical Society, 
Washington DC.  
69) Keniga E.E., and Goring, C.A.I. (1980). „Relationship between 
water solubility, soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota“ in Aquatic Toxicology 
(eds J. G Eaton, et al.), pp.78–115, ASTM STP 707, Phila ­
delphia.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
70) Chiou C.T., Peters L.J., and Freed V.H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic 
compounds“. Science, Vol. 206, 831–832.  
71) Hassett J.J., Banwart W.I., Wood S.G., and Means J.C., (1981), 
„Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption“. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 38–42.
 
72) Karickhoff S.W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils“. 
Chemosphere, Vol. 10(8), 833–846.  
73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbicides 
et insecticides par le sol. Relation solubilité – reactivité“. Revue 
de l’Agric, 34 (4), 319–322.  
74) Müller M., Kordel W. (1996), „Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil“. Chemosphere, 32(12), 2493–2504.  
75) Kordel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil – results of a ring test“. Chemosphere 30 (7), 1373–1384.  
76) Kordel W., Stutte J., Kotthoff G (1993), „HPLC – screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil – comparison of different stationary phases“. Chemosphere 27 (12), 2341–2352.
 
77) Hance, R.J., (1967), „The speed of Attainment of Sorption Equi ­
libria in Some Systems Involving Herbicides“. Weed Research, 
Vol. 7, pp. 29–36.  
78) Koskinen W.C., and Harper S.S., (1990), „The retention 
processes: mechanisms“ in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. 
Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
79) Cohen S.Z., Creeger S.M., Carsel R.F., and Enfield C. G (1984), 
„Potential pesticide contamination of groundwater from agricul ­
tural uses“, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297–325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
 
80) Giles C.H., (1970), „Interpretation and use of sorption isot ­
herms“ in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. 
Monograph No. 37, 14–32.  
81) Giles, C.H.; McEwan J.H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960), 
„Studies in adsorption: XI. A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption 
mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of 
soils“. J. Chem. Soc, 3973–93.
 
82) Calvet R., Tercé M., and Arvien J.C., (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiques gėnėrales de 1'adsorption“. Ann. Agron. 31: 239–251.
 
83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation“, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13–15 May 1996, Stratford-upon-Avon, U.K.  
84) Guth, J.A., (1985), „Adsorption/desorption“, in Joint International 
Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Envi ­
ronmental Hazard Assessment, July 1–3, Canterbury, UK.  
85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
1 PRIED ĖLIS 
Bandymo schema
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
2 priedėlis 
ANALIZ ĖS METODO IR KONCENTRACIJOS POKY ČIO ĮTAKA 
ADSORBCIJOS REZULTAT Ų TIKSLUMUI  
Iš toliau pateiklamos lentel ės (84) matyti, kad, jei tirpale esan čios bandomosios 
medžiagos pradin ės masės (m  0 = 110 μg) ir pusiausvyros mas ės (ðm ads 
aq ððeqÞÞÞ = 
100 μg) skirtumas labai mažas, d ėl 5 % paklaidos matuojant pusiausvyros 
koncentracij ą, susidaro 50 % paklaida apskai čiuojant dirvožemiu adsorbuotos 
medžiagos mas ę (ðm ads 
s ðeqÞÞ) ir 52,4 % paklaida apskai čiuojant K  d . 
Dirvožemio kiekis  m  soil = 10 g  
Tirpalo tūris V  0 = 100 cm  3 
ðm ads 
aq ðeqÞÞ 
(μg) ðC ads 
aq ðeqÞÞ 
(μg cm  -3 ) R ðm ads 
s ðeqÞäÞ 
(μg) ðC ads 
s ðeqÞäÞ 
(μg g -1 ) R‡ K  d * R‡  
Kai A = 9 %
 m 0 = 110 μg ar 
C 0 = 1,100 μg/cm3 100 1,000  Tikroji 
vertė 10 1,00  Tikroji 
vertė 1 
101 1,010  1 %  9  0,90  10 %  0,891  10,9 %  
105 1,050  5 %  5  0,50  50 %  0,476  52,4 %  
109 1,090  9 %  1  0,10  90 %  0,092  90,8 %  
Kai A = 55 %
 m 0 = 110 μg ar 
C 0 = 1,100 μg/cm3 50,0 0,500  Tikroji 
vertė 60,0 6,00  Tikroji 
vertė 12,00  
50,5 0,505  1 %  59,5  5,95  0,8 %  11,78  1,8 %  
52,5 0,525  5 %  57,5  5,75  4,0 %  10,95  8,8 %  
55,0 0,550  10 %  55,0  5,50  8,3 %  10,00  16,7 %  
Kai A = 99 %
 m 0 = 110 μg ar 
C 0 = 1,100 μg/cm3 1,100  0,011  Tikroji 
vertė 108,9  10,89  Tikroji 
vertė 990 
1,111  0,01111  1 %  108,889  10,8889  0,01 %  980  1,0 %  
1,155  0,01155  5 %  108,845  10,8845  0,05 %  942  4,8 %  
1,21 0,0121  10 %  108,790  10,8790  0,10 %  899  9,2 % 
ðäm ads 
s ðeqÞÞ = ððm 0 Þ – ðm ads 
aq ÞðeqÞÞ, ðC ads 
s ðeqÞÞ ¼ Í ÄÜ ðC 0 Þ – ðC ads 
aq ÞðeqÞ ä V 0 Ö 
ðm soil Þ Î 
. 
Kd ¼ Í ððm ads 
s ÞðeqÞÞ 
ððm ads 
aq ÞðeqÞÞ Î 
Ü Í ðV 0 Þ 
ðm soil Þ Î 
m ads 
s ðeqÞ = bandomosios medžiagos dirvožemio faz ėje masė pusiausvyros 
sąlygomis, μg; 
ðm ads 
aq ðeqÞÞ = bandomosios medžiagos vandenin ėje fazėje masė pusiausvyros 
sąlygomis, μg; 
ðC ads 
s ðeqÞÞ = bandomosios medžiagos dirvožemio faz ėje kiekis pusiausvyros 
sąlygomis, μg g -1 ; 
ðC ads 
aq ðeqÞÞ = bandomosios medžiagos vandenin ės fazės koncentracija pu ­
siausvyros s ąlygomis, μg cm  -3 ; 
R = analizin ė paklaida nustatant ðm ads 
aq ðeq;ÞÞ 
R‡ = apskai čiuota paklaida d ėl analizin ės paklaidos R.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
3 priedėlis 
K D VERTINIMO METODAI  
1. Vertinimo metodai leidžia daryti K  d vertės prognoz ę, pagrįstą koreliacija, 
su, pvz., P  ow vertėmis (12) (39) (63–68), tirpumo vandenyje duomenimis 
(12) (19) (21) (39) (68–73) ar poliškumo duomenimis, gautais taikant 
atvirkštini ų fazių HPLC metod ą (74–76). Kaip parodyta 1 ir 2 lentel ėse, 
pagal tas lygtis apskai čiuojamos K  OC ar K  om vertės ir po to netiesiogiai 
pagal šias lygtis apskai čiuojama K  d : 
K oc ¼ K  d · Í ð100Þ 
ð%ocÞ Î 
ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ Í ðK d Þ 
ð1,724Þ Î 
· Í ð100Þ 
ð%ocÞ Î 
ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Šių koreliacij ų koncepcija pagr įsta dviem prielaidomis: 1) tai dirvožemio 
organinė medžiaga, kuri iš esm ės daro įtaką medžiagos adsorbcijai; ir 2) 
vykstančios sąveikos yra daugiausia nepolin ės. Todėl šios koreliacijos: 1) 
netinka arba tik iš dalies tinka polin ėms medžiagoms, ir 2) netinka tais 
atvejais, kai organin ės medžiagos dirvožemyje kiekis yra labai mažas (12). 
Be to, nors tarp P  ow ir adsorbcijos buvo nustatytos patenkinamos korelia ­
cijos (19), to negalima pasakyti apie tirpumo vandenyje ir adsorbcijos laipsnio priklausomyb ę (19) (21); taigi tyrimai yra labai prieštaringi.
 
3. Kai kurie adsorbcijos koeficiento ir pasiskirstymo koeficiento (n-oktanolis/ ­
vanduo) bei tirpumo vandenyje koreliacij ų pavyzdžiai pateikti atitinkamai 1 
ir 2 lentel ėse. 
1 lentelė 
Koreliacijos tarp adsorbcijos pasiskirstymo koeficiento ir pasiskirstymo koeficiento (n-oktanolis/vanduo) 
pavyzdžiai; kiti pavyzdžiai pateikti (12) (68)  
Medžiagos  Koreliacijos lygtys  Autoriai  
Pakeisto karbamido dariniai  log Ko  m = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981)(39)  
Chlorinti aromatiniai 
junginiai  log K  oc = – 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al . (1983) (65)  
Įvairūs pesticidai  log Ko  m = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl ir Mingelgrin (1984) (66)  
Aromatiniai angliavandeniliai  log K  oc = – 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles ir Mantoura (1987) (67)  
2 lentelė 
Koreliacijos tarp adsorbcijos pasiskirstymo koeficiento ir tirpumo vandenyje pavyzdžiai; kiti pavyzdžiai 
pateikti (68) (69)  
Junginiai  Koreliacijos lygtys  Autoriai  
Įvairūs pesticidai  log K  om = 3,8–0,561 log S  w Gerstl ir Mingelgrin (1984) (66)  
Alifatinės, aromatin ės chlo­
rintos medžiagos  log K  om = (4,040 +/- 0,038) – (0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70)  
α-naftolis  logK  oc = 4,273–0,686 log S  w Hassetetal. (1981) (71)  
Ciklinės, alifatin ės aroma­
tinės medžiagos  Log K  oc = – 1,405–0,921 log S  w – 
0,00953 (mp-25)  Karickhoff (1981) (72)  
Įvairūs junginiai  log K  om = 2,75–0,45 log  Moreale van Blade (1982)  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
4 priedėlis 
SKAIČIAVIMAI CENTRIFUGAVIMO S ĄLYGOMS APIBR ĖŽTI 
1. Centrifugavimo trukm ė nustatoma pagal ši ą formulę darant prielaid ą, kad 
dalelės yra rutulio formos:  
t ¼ Í ð9Þ 
ð2Þ Î " 
ðηÞ 
ðω 2 rp 2 ðρ s Ä ρ aq ÞÞ # 
lnðR b=R t Þ (1)  
Siekiant supaprastinti, visi paramerai yra išreikšti ne SI vienetais (g, cm).  
Čia: 
ω = sukimosi greitis (= 2 π rpm/60), rad s  -1 , 
rpm = apsisukim ų dažnis, min  -1 , m 
η = tirpalo klampumas, g s  -1 cm -1 , 
r p = dalelių spindulys, cm,  
ρ s = dirvožemio tankis, g cm  -3 , 
ρ aq = tirpalo tankis, g cm  -3 , 
R t = nuotolis nuo centrifugos rotoriaus centro iki tirpalo centrifuga ­
vimo mėgintuvėlyje viršaus, cm,  
R b = nuotolis nuo centrifugos rotoriaus centro iki tirpalo centrifuga ­
vimo mėgintuvėlyje apačios, cm,  
R b -R t = dirvožemio ir tirpalo mišinio stulpelio centrifugavimo m ėgintu­
vėlyje ilgis, cm.  
Kad būtų garantuotas visiškas atskyrimas, praktikoje dažniausiai vartojama 
trukmė yra lygi dvigubai apskai čiuotai trukmei.  
2. 1 lygtis gali b ūti dar supaprastinta darant prielaid ą, kad tirpalo klampumas 
(η) ir tankis ( ρ aq ) yra lygūs vandens 25 °C klampumui ir tankiui; taigi, η = 
8,95 × 10–3g s  -1 cm -1 ir ρ aq = 1,0 g cm  -3 . 
Tuomet centrifugavimo trukm ė išreiškiama 2 lygtimi:  
t ¼ Í ð3:7Þ 
ððrpmÞ 2: ðr p Þ 2 ðρ s Ä lÞÞ Î 
ln Í ðRbÞ 
ðRtÞ Î 
(2) 
3. Iš 2 lygties aišku, kad norint pasiekti tam tikro dydžio daleli ų atsiskyrim ą 
(mūsų atveju 0,1 μm spindulio) centrifugavimo režimui, t. y. laikui (t) ir 
apsisukim ų dažniui (min  -1 ), apibrėžti yra svarb ūs du parametrai: 1) dirvo ­ 
žemio tankis ir 2) mišinio stulpelio centrifugavimo m ėgintuvėlyje ilgis (R  b 
– R  t ), t. y. nuotolis, kur į dirvožemio dalel ė įveikia nuo tirpalo viršaus iki 
mėgintuvėlio dugno; akivaizdu, kad tam tikro t ūrio mišinio stulpelio m ėgin­
tuvėlyje ilgis priklauso nuo m ėgintuvėlio spindulio kvadratu.  
4. 1 pvz., pavaizduotas centrifugavimo trukm ės (t) kitimas pagal centrifugos 
apsisukim ų dažnį (min  -1 ) esant skirtingiems dirvožemi ų tankiams ( ρ s ) (1a 
pav.) ir skirtingiems mišinio stulpelio centrifugavimo m ėgintuvėlyje ilgiams 
(1b pav.). Iš 1a pvz., matyti, kad dirvožemio tankio įtaka yra akivaizdi; 
pvz., tradicinis centrifugavimas 3000 min  -1 dažniu trunka maždaug 240 
min, kai dirvožemio tankis 1,2 g cm  -3 , tuo tarpu ši trukm ė yra tik 50 
min, jei tankis 2,0 g cm  -3 . Panašiai, pagal 1b pvz., centrifuguojant tradi ­
ciniu 3 000 min  -1 dažniu, centrifugavimo trukm ė yra maždaug 50 min, jei 
mišinio stulpelio ilgis lygus 10 cm, ir tik 7 min, jei ilgis lygus 1 cm. Ta čiau 
svarbu rasti optimal ų santykį tarp centrifugavimo režimo, kai turi b ūti kuo 
mažesnis ilgis, ir galimyb ės bandym ą darančiajam lengvai atskirti fazes po 
centrifugavimo.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Be to, apibr ėžiant bandym ų sąlygas dirvožemio/tirpalo faz ėms atskirti, 
svarbu atsižvelgti į galimą trečios „pseudofaz ės“, koloidini ų dalelių buvimą. 
Šios dalel ės, kurios yra mažesn ės kaip 0,2 μm, gali daryti didel ę įtaką 
visam medžiagos adsorbcijos dirvožemio suspensija mechanizmui. Centri ­
fuguojant, kaip aprašyta pirmiau, koloidin ės dalelės lieka vandenin ėje 
fazėje ir analizuojamos kartu su ja. Taigi prarandama informacija apie j ų 
poveikį. 
Jei bandymus atliekanti laboratorija turi ultracentrifugavimo ar ultrafiltra ­
vimo priemones, medžiagos adsorbcija/desorbcija dirvožemiu gal ėtų būti 
ištirta išsamiau, įskaitant informacij ą apie medžiagos adsorbcij ą koloidi­
nėmis dalelėmis. Šiuo atveju norint atskirti tris fazes: dirvožem į, koloidines 
daleles ir tirpal ą, turi būti taikomas ultracentrifugavimas 60 000 min  -1 apsi­
sukimų dažniu ar ultrafiltravimas pro filtr ą, kurio akytumas 100 000 
Daltonų. Atitinkamai turi b ūti pakeistas bandym ų protokolas, kad visos 
trys fazės būtų išanalizuotos.  
1a pav.
  
Centrifugavimo trukm ės (t) kitimas pagal centrifugos apsisukim ų dažnį (min  -1 ) 
esant skirtingam dirvožemio tankiui ( ρ s ). R  t = 10 cm, R  b -R t = 10 cm, η = 8,95 × 
10–3 g s  -1 cm -1 ir ρ aq = 1,0 g cm  -3 esant 25 °C temperat ūrai. 
1b pav.
  
Centrifugavimo trukm ės (t) kitimas pagal centrifugos apsisukim ų dažnį (min  -1 ) 
esant skirtingam mišinio stulpelio centrifugavimo m ėgintuvėlyje ilgiui (R  b -R t ) = 
L; R  t = 10 cm, η = 8,95 × 10–3g s- cm  -1 , ρ aq = 1,0 g cm  -3 esant 25 °C 
temperatūrai ir ρ s = 2,0 g cm  -3 . ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
5 priedėlis 
ADSORBCIJOS A (%) IR DESORBCIJOS D (%) APSKAI ČIAVIMAS  
Metodikai taikyta tokia laiko schema:
  
Darant visus skai čiavimus daroma prielaida, kad bandomoji medžiaga yra stabili, 
ir jos labai neadsorbuoja indo sienel ės. 
ADSORBCIJA A (A %)  
a) Lygiagretusis metodas  
Kiekvienam m ėgintuvėliui (i) kiekvienu laiko momentu (t  i ) adsorbcijos 
procentin ė dalis apskai čiuojama pagal lygt į: 
A t i ¼ ðm ads 
s ðt i Þ · 100Þ 
ðm 0 Þ (%) (1)  
Šios lygties nariai gali b ūti apskaičiuoti taip: 
m 0 = C  0 V 0 (μg) (2)  
ðm ads 
s ðt i ÞÞ ¼ ðm 0 – C  ads 
aq ðt i Þ V 0 Þ (μg) (3)  
kai: 
A t i = adsorbcijos procentin ė dalis (%) laiko momentu t  i ; 
ðm ads 
s ðt i ÞÞ = dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos mas ė 
laiko momentu t  i , kai buvo atliekama analiz ė (μg); 
m 0 = bandymo pradžioje m ėgintuvėlyje buvusios bandomosios 
medžiagos mas ė (μg); 
C 0 = sąlytyje su dirvožemiu esan čio bandomojo tirpalo 
pradinė masės koncentracija ( μg cm  -3 ); ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
ðC ads 
aq ðt i ÞÞ = medžiagos vandenin ės fazės masės koncentracija laiko 
momentu t  i , kai atliekama analiz ė (μg × cm  -3 ); ši 
koncentracija nustatoma analiz ės būdu atsižvelgiant į 
tuščiuosiuose bandymuose gautas vertes,  
V 0 = sąlytyje su dirvožemiu esan čio bandomojo tirpalo 
pradinis t ūris (cm  3 ). 
Adsorbcijos procentin ės dalies A t i ar C ads 
aq ðt i Þ vertės pažymimos grafike 
pagal laik ą ir nustatomas sorbcijos pusiausvyros pasiekimo laikas. Toki ų 
grafikų pavyzdžiai pateikti atitinkamai 1 pvz., ir 2 pav.
  
1 pav.  
Adsorbcijos pusiausvyros grafikas
  
2 pav.  
Bandomosios medžiagos mas ės koncentracijos (C  aq ) kitimas laike  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Nuoseklusis metodas  
Toliau pateiktose lygtyse atsižvelgiama į tai, kad pagal adsorbcijos mata ­
vimo metodik ą bandomosios medžiagos kiekis tam tikrais laiko tarpais 
nustatomas mažose vandenin ės fazės alikvotin ėse dalyse.  
— Kiekvienam laiko tarpui dirvožemiu adsorbuotos medžiagos kiekis 
apskaičiuojamas taip:  
— pirmajam laiko tarpui Δt 1 = t 1 - t 0 
ðm ads 
s ðΔt 1 ÞÞ ¼ ðm 0 – m  ads 
m ðt 1 ÞÞ · Í ðV 0 Þ 
ðv A a Þ Î 
(4) 
— antrajam laiko tarpui Δt 2 = t 2 - t 1 
m ads 
s ðΔt 2 Þ ¼ m  ads 
m ðt 1 Þ · Í V 0 
ðv A a Þ Î 
– m  ads 
m ðt 2 Þ · Í ðV 0 – v  A 
a Þ 
ðv A a Þ Î 
(5) 
— trečiajam laiko tarpui Δt 3 = t 3 - t 2 
m ads 
s ðΔt 3 Þ ¼ m  ads 
m ðt 2 Þ · Í ðV 0 – v  A 
a Þ 
ðv A 
a Þ Î 
– m  ads 
m ðt 3 Þ · Í ðV 0 – 2·v A 
a Þ 
ðv A 
a Þ Î 
(6) 
— n-ajam laiko tarpui Δt n = t n - t n - l 
ðm ads 
s ðΔt n ÞÞ ¼ ðm ads 
m ðt nÄ1 ÞÞ · Í ðV 0 – ðn – 2Þ · v A 
a Þ 
ðv A a Þ Î 
– m  ads 
m ðt n Þ · Í ðV 0 – ðn – 1Þ · v A 
a Þ 
ðv A a Þ Î 
(7) 
— Kiekvienam laiko tarpui procentin ė adsorbcijos A Δt i dalis apskai čiuo­
jama pagal ši ą lygtį: 
A Δt i ¼ ðm ads 
s ðΔt i ÞÞ 
ðm 0 Þ · 100 ð%Þ (8)  
tuo tarpu procentin ė adsorbcijos dalis  A t i laiko momentu t  i apskaičiuo­
jama pagal lygt į: 
A t i ¼ Σ Δt i 
j¼Δt 1 m ads 
s ðjÞ 
m 0 ·100 ð%Þ (9)  
Adsorbicijos vert ėsA t i ar A Δt i (žiūrint, kuri reikalinga tyrimui) pažy ­
mimos grafike pagal laik ą ir nustatomas sorbcijos pusiausvyros pasie ­
kimo laikas.  
— Pusiausvyros pasiekimo laiku t  eq : 
— dirvožemiu adsorbuotos bandomosios medžiagos mas ė lygi:  
m ads 
s ðeqÞ ¼ Σ Δt i ¼1 n 
m ads 
s ðΔt i Þ (10)  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— bandomosios medžiagos tirpale mas ė yra lygi: 
Ê 
m ads 
aq ðeqÞ ¼ m  0 – Σ Δt i ¼1 n 
m ads 
s ðΔt i Þ Ì 
(11) 
— ir adsorbcijos procentin ė dalis pusiausvyros s ąlygomis yra lygi:  
A eq ¼ ðm ads 
s ðeqÞÞ 
ðm 0 Þ · 100 ð%Þ (12)  
Pirmiau naudoti parametrai apibr ėžiami kaip: 
ðm ads 
s ÞðΔt 1 Þ, ðm ads 
s ÞðΔt 2 Þ,:::, ðm ads 
s ÞðΔt n Þ = bandomosios medžiagos, 
adsorbuotos dirvožemiu atitin ­
kamai per laiko tarpus Δ t1 , 
Δ t2 ,…, Δ tn masė (μg); 
ðm ads 
m Þðt 1 Þ, ðm ads 
m Þðt 2 Þ,:::, ðm ads 
n Þðt n Þ = atitinkamai laiko momentu 
t 1 , t 2 , t n nustatyta bandomo ­
sios medžiagos mas ė (μg); 
ðm ads 
s ðeqÞÞ = adsorbcijos pusiausvyros 
sąlygomis dirvožemiu adsor ­
buotos medžiagos mas ė (μg); 
ðm ads 
aq ðeqÞÞ = adsorbcijos pusiausvyros 
sąlygomis tirpale esan čios 
medžiagos mas ė (μg); 
ðv A 
a Þ = alikvotin ės dalies, kurioje 
nustatoma bandomoji 
medžiaga, t ūris (cm  3 ); 
ðA Δt i Þ = adsorbcijos, atitinkan čios 
laiko tarp ą Δt i , procentin ė 
dalis (%); 
ðA eq Þ = adsorbcijos procentin ė dalis 
adsorbcijos pusiausvyros 
sąlygomis (%).  
DESORBCIJA D (%)  
Laikas t  0 , kuris laikomas desorbcijos kinetikos bandymo pradžia, yra tas 
momentas, kai kuo didesnis regeneruoto bandomosios medžiagos tirpalo t ūris 
(kai pasiekiama adsorbcijos pusiausvyra) yra pakei čiamas tokiu pat 0,01 M 
CaCl  2 tirpalo tūriu. 
a) Lygiagretusis metodas  
Laiko momentu t  i matuojama mas ė bandomosios medžiagos, esan čios iš 
mėgintuvėlio (i) paimtame vandenin ės terpės tūryje ðV i 
r Þ, ir desorbuotos 
medžiagos mas ė apskaičiuojama pagal lygt į: 
ðm des 
aq ðt i ÞÞ ¼ ðm des 
m ðt i ÞÞ · Í ðV 0 Þ 
ðv i r Þ Î 
– Í 
m A 
aq Î 
(13) 
Desorbcijos pusiausvyros s ąlygomis t  i = t eq , todėl ðm des 
aq ðt i ÞÞ = ðm des 
aq ðeqÞÞ 
Per laiko tarp ą (Δt i ) desorbuotos medžiagos mas ė nustatoma pagal lygt į: 
ðm des 
aq ðΔt i ÞÞ ¼ ðm des 
aq Þðt i Þ – Í 
Σ i ¼ 1 
j ¼ 1 m des 
aq ðjÞ Î 
(14) 
Desorbcijos procentin ė dalis apskai čiuojama:  
laiko momentu t  i pagal lygt į: ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ ððm des 
aq Þðt i ÞÞ 
ðm ads s ðeqÞÞ ·100 ð%Þ (15)  
ir per laiko tarp ą (Δt i ) pagal lygt į: 
D Δt i ¼ ððm des 
aq ÞðΔt i ÞÞ 
ððm ads s ÞðeqÞÞ · 100 ð%Þ (16)  
čia: 
ðD t i Þ = desorbcijos procentin ė dalis laiko momentu t  i (%), 
ðD Δt i Þ = desorbcijos procentin ė dalis, atitinkanti laiko tarp ą 
Δt i (%), 
ðm des 
aq ðt 1 ÞÞ = laiko momentu t  i desorbuotos bandomosios 
medžiagos mas ė (μg), 
ðm des 
aq ðΔt 1 ÞÞ = per laiko tarp ą Δt i desorbuotos bandomosios 
medžiagos mas ė (μg), 
ðm des 
m ðt i ÞÞ = bandomosios medžiagos, analiz ės būdu nustatytos 
laiko momentu t  i analizei paimtame tirpalo t ūryje 
ðV i 
r Þ masė (μg); 
ðm A 
aq Þ = bandomosios medžiagos, likusios po adsorbcijos 
pusiausvyros bandymo d ėl nevisiško t ūrio pakei ­
timo, mas ė (μg); 
ðm A 
aq Þ ¼ ðm ads 
aq ðeqÞÞ · Í V 0 – V  R 
ðV 0 Þ Î 
(17) 
ðm ads 
aq ÞðeqÞ = tirpale esan čios bandomosios medžiagos mas ė adsorb­
cijos pusiausvyros s ąlygomis ( μg); 
V R = tirpalo virš nuos ėdų, pašalinto iš m ėgintuvėlio pasiekus 
adsorbcijos pusiausvyr ą ir pakeisto tokiu pat t ūriu 0,01 
M CaCl  2 tirpalo, tūris (cm  3 ); 
ðV i 
r Þ = tirpalo, paimto iš m ėgintuvėlio (i) bandomosios 
medžiagos kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kine ­
tikos bandym ą, tūris (cm  3 ). 
Desorbcijos vert ės ðD t i Þ ar ðD Δt i Þ (žiūrint, kuri reikalinga tyrimui) pažy ­
mimos pagal laik ą grafike ir nustatomas desorbcijos pusiausvyros pasie ­
kimo laikas.  
b) Nuoseklusis metodas  
Šiose lygtyse atsižvelgta į tai, kad anks čiau taikytoje adsorbcijos metodi ­
koje bandomoji medžiaga buvo nustatin ėjama nedidel ėse vandenin ės fazės 
alikvotinėse dalyse ðv A 
a Þ (nuoseklusis metodas pagal 1.9 poskyr į „Bandymo 
eiga“). Daroma prielaida, kad: a) po adsorbcijos kinetikos bandymo iš 
mėgintuvėlio pašalintas tirpalas virš nuos ėdų buvo pakeistas tokiu pat 
tūriu 0,01 M CaCl  2 tirpalo (v  R ) ir b) s ąlytyje su dirvožemiu esan čios 
vandeninės fazės bendras t ūris (V  T ) darant desorbcijos kinetikos bandym ą 
yra pastovus ir apibr ėžiamas lygtimi: 
ðV T Þ ¼ ðV 0 Þ – Í 
Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ðiÞ Î 
(18) ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Laiko momentu t  i : 
— bandomosios medžiagos mas ė matuojama mažame alikvotin ės dalies 
tūryje ðv D 
a Þ ir desorbuotos medžiagos mas ė apskaičiuojama pagal lygt į: 
ðm des 
aq ðt i ÞÞ ¼ ðm des 
m ðt i ÞÞ · Í ðV T Þ 
ðv D 
a Þ Î 
– Í 
m A 
aq · Í ðV T – ði Ä 1Þ v D 
a Þ 
ðV T Þ ÎÎ 
(19) 
— desorbcijos procentin ė dalis pusiausvyros s ąlygomis t  i = t  eq , todėl 
ðm des 
aq Þðt i Þ = ðm des 
aq ÞðeqÞ. 
— desorbcijos procentin ė dalis ðD t i Þ apskaičiuojama pagal ši ą lygtį: 
D t i ¼ ððm des 
aq Þðt i ÞÞ 
ððm ads 
s ÞðeqÞÞ · 100 ð%Þ (20)  
Per laiko tarp ą (Δt i ): 
Per kiekvien ą laiko tarp ą desorbuotos medžiagos kiekis apskai čiuojamas 
taip: 
— pirmajam laiko tarpui Δt 1 = t 1 - t 0 
ðm des 
aq ðΔt 1 ÞÞ ¼ ðm des 
m ðt 1 ÞÞ · Í ðV T Þ 
ðv D 
a Þ Î 
– ðm A 
aq Þ and ðm des 
s ðt 1 ÞÞ ¼ ðm aq 
s ðeqÞÞ – ðm des 
aq ðΔt 1 ÞÞ (21)  
— antrajam laiko tarpui Δt 2 = t 2 - t 1 
ðm des 
aq ðΔt 2 ÞÞ ¼ ðm des 
m ðt 2 ÞÞ · Í ðV T Þ 
ðv D a Þ Î 
– ðm des 
aq ðΔt 1 ÞÞ · Í Ä V T – v  D 
a Ö 
ðV T Þ Î 
– ðm A 
aq Þ · Í Ä V T – v  D 
a Ö 
ðV T Þ Î 
ðm des 
s ðt 2 ÞÞ ¼ ðm ads 
s ðeqÞÞ – ½m des 
aq ðΔt 1 Þ þ ðm des 
aq ðΔt 2 ÞÞâ (22) 
— n-ajam laiko tarpui Δt n = t n - t n-1 
ðm des 
aq ðΔt n ÞÞ ¼ " 
m des 
m ðt n Þ · Í ðV T Þ 
ðv D 
a Þ Î 
– ðm A 
aq Þ · Í Ê 
V T – ðn Ä 1Þ v D 
a Ì 
ðV T Þ Î 
– Í 
Σ nÄ1 
i ¼ 1; n ≠ 1 ÎÍ ðV T – ðn Ä iÞ v D 
a Þ 
ðV T Þ m des 
aq ðΔt i Þ Î # 
Í 
m des 
s ðt n Þ ¼ m  ads 
s ðeqÞ – Í 
Σ n 
i ¼ 1; n ≠ 1 m des 
aq ðΔt i Þ ÎÎ 
(23) 
Galiausiai desorbcijos procentin ė dalis kiekvienam laikotarpiui  ðD Δt i Þ 
apskaičiuojama pagal ši ą lygtį: 
D Δt i ¼ ðm des 
aq ðΔt i ÞÞ 
ðm ads 
s ðeqÞÞ 100ð%Þ (24)  
tuo tarpu desorbcijos procentin ė dalis  D t i laiko momentu t  i ; nustatoma 
pagal lygt į: 
D t i ¼ Í Í 
Σ Δt i 
j ¼ Δt 1 m des 
aq ðjÞ Î 
ðm ads 
s ðeqÞÞ · 100 Î 
¼ Ê 
m des 
aq ðt i Þ Ì 
ðm ads 
s ðeqÞÞ ·100ð%Þ (25)  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
Šiose lygtyse naudoti parametrai apibr ėžiami kaip: 
ðm des 
s ðΔt 1 ÞÞ, ðm des 
s ðΔt 2 ÞÞ,…, ðm des 
s ðΔt n ÞÞ = medžiagos, kuri dar liko 
adsorbuota dirvožemiu 
pasibaigus atitinkamai laiko tarpams At
 1 , At  2 ,…, 
Δt n masė (μg); 
ðm des 
aq ðΔt 1 ÞÞ, ðm des 
aq ðΔt 2 ÞÞ,…, ðm des 
aq ðΔt n ÞÞ = bandomosios medžiagos, 
desorbuotos atititinkamai per laiko tarpus At
 1 , 
At 2 ,…, Δt n , masė (μg); 
ðm des 
m ðt 1 ÞÞ, ðm des 
m ðt 2 ÞÞ,…, ðm des 
m ðt n ÞÞ =  medžiagos mas ė, nustatyta 
alikvotinės dalies t ūryje 
ðv D 
a Þatitinkamai laiko 
momentais t  1 , t  2 ,…, t  n , 
(μg); 
V T = vandenin ės fazės, esančios 
sąlytyje su dirvožemiu 
atliekant desorbcijos kine ­
tikos bandym ą pagal 
nuoseklųjį metodą, bendras 
tūris (cm  3 ); 
ðm A 
aq Þ =  bandomosios medžiagos, 
likusios po adsorbcijos pu ­
siausvyros bandymo d ėl 
nevisiško t ūrio pakeitimo, 
masė (μg); 
ðm A 
aq Þ ¼ 8 
> > > : ÊÊ 
V 0 – Ê 
Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ðiÞ ÌÌ 
– ðV R Þ Ì 
Ê 
V 0 – Ê 
Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ðiÞ ÌÌ 9 
> > > ; 
· Ê 
m ads 
aq ðeqÞ Ì 
(26) 
V R = tirpalo virš nuos ėdų, paša­
linto iš m ėgintuvėlio 
pasiekus adsorbcijos pusi ­
ausvyrą ir pakeisto tokiu 
pat tūriu 0,01 M CaCl  2 
tirpalo, tūris (cm  3 ); 
ðv D 
a Þ =  tirpalo, paimto iš m ėgintu­
vėlio (i) bandomosios 
medžiagos kiekiui nustatyti atliekant desorbcijos kine ­
tikos bandym ą, alikvotin ės 
dalies tūris (cm
 3 ); 
ðv D 
a ≤ 0,02 · V T Þ (27)  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
6 priedėlis 
DIRVOŽEMI Ų ADSORBCIJA IR DESORBCIJA. DUOMEN Ų PATEIKIMO LENTEL ĖS 
Bandyta medžiaga:  
Bandytas dirvožemis:  
Sauso dirvožemio mas ės dalis (105 °C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperat ūra: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . °C  
Analizės metodo tinkamumas  
Pasverta dirvožemio  g  
Sauso dirvožemio mas ė g  
CaCl  2 tirpalo tūris cm  3 
Galutinio tirpalo vardin ė koncentracija  μg cm  3 
Galutinio tirpalo analizin ė koncentracija  μg cm  3 
Taikyto analiz ės metodo esm ė: 
Analizės metodo kalibravimas:  
Bandyta medžiaga:  
Bandytas dirvožemis:  
Sauso dirvožemio mas ės dalis (105 °C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperat ūra: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  ° C 
Taikytas analiz ės metodas:  Netiesioginis  □ Lygiagretusis  □ Nuoseklusis  □ 
Tiesioginis  □ 
Adsorbcijos bandymas. Bandiniai  
Simbolis  Vienetai  Pusiausvyros 
nusistovėjimo 
laikas  Pusiausvyros 
nusistovėjimo 
laikas  Pusiausvyros 
nusistovėjimo 
laikas  Pusiausvyros 
nusistovėjimo 
laikas  
Mėgintuvėlio Nr.  
Pasverta dirvožemio  —  g  
Sauso dirvožeio mas ė m  soil g 
Vandens pasvertame dirvože ­
myje tūris (apskai čiuotas)  V WS cm 3 
0,01 M CaCl  2 tirpalo tūris 
pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti
 cm 3 
Pradinio tirpalo t ūris cm  3 
Su dirvožemiu s ąlytyje esan čios 
vandeninės fazės bendras t ūris V 0 cm 3 
Bandomosios medžiagos tirpalo 
pradinė koncentracija  C 0 μg cm  -3 
Bandomosios medžiagos mas ė 
bandymo pradžioje  m 0 μg ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Simbolis  Vienetai  Pusiausvyros 
nusistovėjimo 
laikas  Pusiausvyros 
nusistovėjimo 
laikas  Pusiausvyros 
nusistovėjimo 
laikas  Pusiausvyros 
nusistovėjimo 
laikas  
Po sumaišymo ir centrifugavimo  
NETIESIOGINIS METODAS  
Lygiagretusis metodas  
Bandomosios medžiagos vande ­
ninės fazės koncentracija, įskai­
tant tuščiojo bandymo patais ą C ads 
aq ðt i Þ μg cm  -3 
Nuoseklusis metodas  
Alikvotin ės tirpalo dalies t ūryje 
V a A išmatuota medžiagos mas ė m ads 
m ðt i Þ μg 
NETIESIOGINIS METODAS  
Dirvožemiu adsorbuotos bando ­
mosios medžiagos mas ė m ads 
s ðt i Þ μg 
Adsorbcijos apskai čiavimas  
Adsorbcija  A  t i % 
A Δt i % 
Vidutinės vertės 
Adsorbcijos koeficientas  K  d cm 3 g -1 
Vidutinės vertės 
Adsorbcijos koeficientas  K  oc cm 3 g -1 
Vidutinės vertės 
Bandyta medžiaga:  
Bandytas dirvožemis:  
Sauso dirvožemio mas ės dalis (105 °C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperat ūra: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . °C  
Adsorbcijos bandymas: tuštieji ir kontroliniai bandymai  
Simbolis  Vienetai  Tuščiasis 
bandymas  Tuščiasis 
bandymas  Kontrolinis 
bandymas  
Mėgintuvėlio Nr.  
Pasverta dirvožemio  g  0  0  
Vandens pasvertame dirvožemyje t ūris 
(apskaičiuotas)  cm 3 — —  
Įpilto 0,01 M CaCl  2 tirpalo tūris cm  3 
Įpiltas bandomosios medžiagos 
pradinio tirpalo t ūris cm 3 0 0  
Bendras vendenin ės fazės tūris 
(apskaičiuotas)  cm 3 — —  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Simbolis  Vienetai  Tuščiasis 
bandymas  Tuščiasis 
bandymas  Kontrolinis 
bandymas  
Pradinė bandomosios medžiagos 
vandeninės fazės koncentracija  μg cm  -3 
Po sumaišymo ir centrifugavimo  
Vandenin ės fazės koncentracija  μg cm  -3 
Pastaba. Prireikus stulpeli ų galima prid ėti. 
Bandyta medžiaga:  
Bandytas dirvožemis:  
Sauso dirvožemio mas ės dalis (105 °C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperat ūra: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . °C  
Masių balansas  
Simbolis  Vienetai  
Mėgintuvėlio Nr.  
Pasverta dirvožemio  —  g  
Sauso dirvožemio mas ė m  soil g 
Vandens pasvertame dirvožemyje t ūris 
(apskaičiuotas)  V WS ml 
0,01 M CaCl  2 tirpalo tūris pusiausvyrai 
su dirvožemiu pasiekti  ml 
Pradinio tirpalo t ūris cm  3 
Su dirvožemiu s ąlytyje esan čios vande ­
ninės fazės bendras t ūris V 0 cm 3 
Bandomosios medžiagos tirpalo pradin ė 
koncentracija  C 0 μg cm  -3 
Pusiausvyros nusistov ėjimo trukm ė —  h  
Po sumaišymo ir centrifugavimo  
Bandomosios medžiagos vandenin ės 
fazės koncentracija, iskaitant tuš čiojo 
bandymo patais ą C ads 
aq ðeqÞ μg cm  -3 
Pusiausvyros nusistovejimo trukm ė t  eq h 
1-asis praskiedimas tirpikliu  
Nupiltos vandenin ės fazės tūris V  rec cm 3 
Įpilto tirpiklio t ūris ΔV cm  3 
1-asis ekstrahavimas tirpikliu  
Tirpiklio faz ėje analizuojamos medžiagos 
signalas  S E1 var. 
Tirpiklyje ištirpusios bandomosios 
medžiagos koncentracija  C E1 μg cm  -3 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Simbolis  Vienetai  
Medžiagos, ekstrahuotos iš dirvožemio ir 
nuo indo sieneli ų, masė m E1 μg 
2-asis praskiedimas tirpikliu  
Nupilto tirpiklio t ūris ΔV s cm 3 
Įpilto tirpiklio t ūris ΔV’ cm  3 
2-asis ekstrahavimas tirpikliu  
Tirpiklio faz ėje analizuojamos medžiagos 
signalas  S E2 var. 
Tirpiklyje ištirpusios bandomosios 
medžiagos koncentracija  C E2 μg cm  -3 
Medžiagos, ekstrahuotos is dirvožemio ir 
nuo indo sieneli ų, masė m E2 μg 
Per dvi pakopas ekstrahuotos bandomo ­
sios medžiagos bendra mas ė m E μg 
Masių balansas  MB  %  
Bandyta medžiaga:  
Bandytas dirvožemis:  
Sauso dirvožemio mas ės dalis (105 °C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperat ūra: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . °C  
Adsorbcijos izoterm ės 
Simbolis  Vienetai  
Mėgintuvėlio Nr.  
Pasverta dirvožemio  —  g  
Sauso dirvožemio mas ė E  g  
Vandens pasvertame dirvože ­
myje tūris (apskai čiuotas)  V WS cm 3 
0,01 M CaCl  2 tirpalo tūris 
pusiausvyrai su dirvožemiu pasiekti
 cm 3 
Įpilto pradinio tirpalo t ūris cm  3 
Su dirvožemiu s ąlytyje esan čios 
vandeninės fazės bendras t ūris 
(apskaičiuotas)  V 0 cm 3 
Tirpalo koncentracija  C  0 μg cm  -3 
Pusiausvyros nusistov ėjimo 
trukmė — h  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Simbolis  Vienetai  
Po sumaišymo ir centrifugavimo  
Bandomosios medžiagos vande ­
ninės fazės koncentracija, įskai­
tant tuščiojo bandymo patais ą C ads 
aq ðeqÞ μg cm  -3 
Temperat ūra °C  
Adsorbuotos medžiagos mas ė, 
tenkanti dirvožemio mas ės 
vienetui  C ads 
s ðeqÞ μg g  -1 
Regresijos analiz ė: 
K F ads vertė: 
l/n vertė: 
Regresijos koeficientas r  2 : 
Bandyta medžiaga:  
Bandytas dirvožemis:  
Sauso dirvožemio mas ės dalis (105 °C, 12h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperat ūra: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . °C 
Taikytas analiz ės metodas:  Netiesioginis  □ Lygiagretusis  □ Nuoseklusis  □ 
Desorbcijos bandymas  
Simbolis  Vienetai  Laiko 
tarpas  Laiko 
tarpas  Laiko 
tarpas  Laiko 
tarpas  
Mėgintuvėlio, gauto iš adsorbcijos 
pakopos tarpsnio, Nr.  
Adsorbcijos pusiausvyros s ąlygomis 
dirvožemio adsorbuotos medžiagos mas ė m ads 
s ðeqÞ μg 
Pašalintos vandenin ės fazės tūris, 
pakeistas 0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Su dirvožemiu s ąlytyje 
esančios vandenin ės fazės 
bendras t ūris 
(apskaičiutas)  PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Bandomosios medžiagos, likusios po 
adsorbcijos pusiausvyros bandymo d ėl 
nevisiško t ūrio pakeitimo, mas ė m A 
aq μg 
Desorbcijos kinetika  
Laiko momentu t  i nuo dirvožemio desor ­
buotos medžiagos išmatuota mas ė m des 
m ðt i Þ μg 
Tirpalo, paimto iš m ėgin­
tuvėlio (i) bandomajai 
medžiagai nustatyti, t ūris PM V  f i cm 3 
SM v  a D cm 3 
Laiko momentu t  i nuo dirvožemio desor ­
buotos medžiagos mas ė (apskaičiuota)  m des 
aq ðt i Þ μg 
Per laiko tarp ą Δt i nuo dirvožemio 
desorbuotos medžiagos mas ė 
(apskaičiuota)  m des 
aq ðΔt i Þ μg ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Simbolis  Vienetai  Laiko 
tarpas  Laiko 
tarpas  Laiko 
tarpas  Laiko 
tarpas  
Desorbcijos procentin ė dalis  
Desorbcija laiko momentu t  i D ti % 
Desorbcija per laiko tarp ą Δt i D Δt i % 
Tariamas desorbcijos koeficientas  K  des 
PM: lygiagretusis metodas  
SM: nuoseklusis metodas  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  ADSORBCIJOS KOEFICIENTO (K  oc ) NUSTATYMAS DIRVO ­ 
ŽEMYJE IR AKTYVIAJAME DUMBLE AUKŠTOS SKYRIMO 
GALIOS SKYS ČIŲ CHROMATOGRAFIJA (HPLC)  
1. METODAS  
Šis metodas yra OECD TG121 (2001) kopija.  
1.1. ĮVADAS  
Medžiagų sorbciją dirvožemiu ar nuotek ų dumblu gali apib ūdinti 
parametrai, bandymais nustatyti taikant C.18 bandymo metod ą. 
Svarbus parametras yra adsorbcijos koeficientas, kuris apibr ėžiamas 
kaip medžiagos dirvožemyje/dumble koncentracijos ir medžiagos 
vandeninės fazės koncentracijos santykis adsorbcijos pusiausvyros 
sąlygomis. Adsorbcijos koeficientas, normalizuotas pagal dirvožemio 
organinės anglies kiek į, K  oc yra naudingas chemin ės medžiagos ir 
dirvožemio bei nuotek ų dumblo organin ės medžiagos surišimo gebos 
rodiklis ir leidžia lyginti įvairias chemines medžiagas. Šis parametras 
gali būti įvertintas taikant koreliacijas su tirpumu vandenyje ir pasis ­
kirstymo koeficientu (n-oktanolis/vanduo) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).  
Pagal aprašyt ą šio bandymo metod ą adsorbcijos dirvožemiu ir 
nuotekų dumblu koeficientui K  oc nustatyti taikomas HPLC (8). Įver­ 
čiai yra patikimesni nei gauti pagal QSAR ( Quantitative 
Structure-Activity Relationships  – kiekybiniai strukt ūros ir aktyvumo 
ryšiai) apskai čiavimus (9). Kaip vertinimo metodas, jis negali 
visiškai pakeisti įkrovos pusiausvyros bandym ų, atliekam ų pagal 
C.18 bandymo metod ą. Tačiau įvertintas K  oc gali būti naudingas 
tinkamiems bandym ų parametrams pasirinkti adsorbcijai/desorbcijai 
tirti pagal C.18 bandymo metod ą apskaičiuojant Kd (pasiskirstymo 
koeficient ą) ar K  f (Freundlicho adsorbcijos koeficient ą) pagal 3 lygt į 
(žr. 1.2 skirsn į). 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
K D – pasiskirstymo koeficientas, apibr ėžiamas kaip dviej ų fazių 
sistemoje, sudarytoje iš sorbento (dirvožemio ar nuotek ų dumblo) 
ir vandenin ės fazės, ištirpintos bandomosios medžiagos pusiausvyros 
koncentracijos C santykis; jis yra bematis dydis, jei abiej ų fazių 
koncentracija išreikšta mas ės/masės koncentracija. Jei vandenin ės 
fazės koncentracija išreikšta mas ės/tūrio koncentracija, vienetas yra 
ml g  -1 . K d gali keistis kei čiantis sorbento savyb ėms ir gali priklausyti 
nuo koncentracijos.  
K d ¼ Í ðC soil Þ 
ðC aq Þ Î 
or Í ðC sludge Þ 
ðC aq Þ Î 
(1) 
čia: 
C soil = bandomosios medžiagos dirvožemyje koncentracija 
pusiausvyros s ąlygomis ( μg g -1 ) 
C sludge  = bandomosios medžiagos dumble koncentracija pu ­
siausvyros s ąlygomis ( μg g -1 ) 
C aq = bandomosios medžiagos vandenin ės fazės koncentra ­
cija pusiausvyros s ąlygomis ( μg g -1 , μg ml  -1 ). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f – Freundlicho adsorbcijos koeficientas, apibr ėžiamas kaip bando ­
mosios medžiagos dirvožemyje ar nuotek ų dumble koncentracija 
(x/m), kai vandenin ės fazės pusiausvyros koncentracija C  aq lygi 
vienetui; vienetai yra μg g  -1 sorbento. Vert ė gali keistis kei čiantis 
sorbento savyb ėms. 
log Í ðxÞ 
ðmÞ Î 
¼ logK  f þ Í ð1Þ 
ðnÞ · logC  aq Î 
(2) 
čia: 
x/m = kiekis x ( μg) bandomosios medžiagos, pusiausvyros s ąly­
gomis adsorbuotos sorbentu, kurio kiekis m (g)  
l/n = Freundlicho adsorbcijos izoterm ės lygties krypties koefi ­
cientas  
C aq = bandomosios medžiagos vandenin ės fazės koncentracija pu ­
siausvyros s ąlygomis ( μg ml  -1 ) 
Kai C aq ¼ 1; logK  f ¼ log Í ðxÞ 
ðmÞ Î 
K oc – pasiskirstymo koeficientas (K  d ) ar Freundlicho adsorbcijos 
koeficientas (K  f ), normalizuoti pagal sorbento organin ės anglies 
kiekį (f oc ); ypač nejoninių cheminių medžiagų atveju jis yra apytikris 
medžiagos ir sorbento adsorbcijos laipsnio rodiklis ir leidžia lyginti 
skirtingas chemines medžiagas. Pagal tai, kokios yra K  d ir K  f dimen­
sijos, K  oc gali būti bematis arba jo vienetai yra ml g-  l ar μg g  -1 
organinės medžiagos.  
Koc ¼ Í ðKdÞ 
ðfocÞ Î 
ðbedimensinis arba ml ·g Ä1 Þ ar 
Í ðKf Þ 
ðfocÞ Î 
ðμg·g Ä1 Þ (3) 
K oc ir K  d santykis n ėra visuomet tiesiškas, taigi įvairių dirvožemi ų 
K oc vertės gali būti skirtingos, ta čiau jų kintamumas yra daug 
mažesnis lyginant su K  d ar K  f verčių kintamumu.  
Adsorbcijos koeficientas (K  oc ) nustatomas iš sulaikymo faktoriaus 
(k’) naudojant pasirinkt ų etalonini ų medžiag ų log k’ pagal log K  oc 
kalibracin į grafiką. 
k' ¼ Í ðt R – t 0 Þ 
ðt 0 Þ Î 
(4) 
čia: 
t R = bandomosios ir etalonin ės medžiagos sulaikymo trukm ė 
HPLC metodu (minut ės), 
t 0 = eliuento sulaikymo trukm ė (dead time ) HPLC metodu 
(minutės) (žr. 1.8.2 skirsn į). 
P ow – pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo), apibr ėžiamas 
kaip medžiagos n – oktanolio tirpalo ir vandens tirpalo koncentra ­
cijos santykis; jis yra bematis dydis.  
Pow ¼ Í ðCoctanolÞ 
ðCaqÞ Î 
ð¼ KowÞ (5)  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Prieš taikant metod ą reikia žinoti strukt ūrinę formulę, grynum ą ir 
disociacijos konstant ą (jei tinka). Vertinga yra informacija apie 
tirpumą vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, apie pasiskirstymo 
koeficient ą (n-oktanolis/vanduo) ir apie hidroliz ės charakteristikas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Išmatuotiems bandomosios medžiagos HPLC sulaikymo duomenims 
ir jos adsorbcijos koeficientui K  oc susieti turi b ūti gauta log K  oc 
pagal log k kalibracin ė kreivė. Turi būti panaudoti ne mažiau kaip 
šeši etaloniniai taškai, bent vienas j ų žemiau laukiamos bandomosios 
medžiagos vert ės ir vienas aukš čiau šios vert ės. Metodo tikslumas 
labai padid ėja, jei naudojamos etalonin ės medžiagos strukt ūra yra 
panaši į bandomosios medžiagos. Jei toki ų duomenų nėra, vartotojas 
gali pats pasirinkti atitinkamas kalibravimo medžiagas. Tokiu atveju reikėtų pasirinkti bendresn į rinkinį struktūriškai nevienaly čių 
medžiagų. Rekomenduojamos naudoti medžiagos ir nuotek ų dumblo 
K
 oc vertės yra pateiktos 1 pried ėlio 1 lentel ėje ir dirvožemio – 3 
lentelėje. Kitų kalibravimo medžiag ų pasirinkim ą būtina pagrįsti. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Bandymas HPLC metodu atliekamas analiz ės kolonėlėse, kurių 
kietąją fazę sudaro pramonin ės gamybos cianpropilo kietoji faz ė, 
turinti lipofilines ir polines dalis. Naudojama vidutinio poliškumo 
nejudama faz ė, nešiklis – silicio dioksidas: 
– O –Si  – CH  2 – CH  2 –CH  2 – CN  
silicio 
dioksidas  nepolinė tarpinė dalis  polin ė dalis  
Bandymo metodo principas yra panašus į A.8 bandymo metodo 
(pasiskirstymo koeficientas, HPLC metodas) princip ą. Bandomajai 
medžiagai einant per kolon ėlę kartu su judam ąja faze, vyksta 
medžiagos ir nejudamosios faz ės sąveika. Dėl pasidalijimo tarp juda ­
mosios ir nejudamosios fazi ų bandomoji medžiaga sulaikoma. 
Kadangi nejudamoji faz ė susideda iš polin ės ir nepolin ės dalies, 
vyksta jos s ąveika su molekul ės polinėmis ir nepolin ėmis grupėmis, 
panašiai kaip ant organin ės medžiagos, kurios nešiklis yra dirvo ­ 
žemis ar nuotek ų valymo dumblas. Taip galima nustatyti santyk į 
tarp kolon ėlės sulaikymo trukm ės ir adsorbcijos ant organin ės 
medžiagos koeficiento.  
Didelę įtaką sorbcijai turi pH vert ė, ypač polinių medžiagų sorbcijai. 
Žemės ūkio paskirties dirvožemio ar nuotek ų valymo įrenginių 
talpyklų pH paprastai yra 5,5–7,5. Jei medžiagos gali jonizuotis, 
naudojant tinkamus buferinius tirpalus turi b ūti atliekami du 
bandymai medžiagai esant joninio ir nejoninio pavidalo, ta čiau tik 
tais atvejais, kai bandomosios medžiagos disociacijos laipsnis pH 
5,5–7,5 intervale yra bent 10 %.  
Kadangi vertinimui naudojamas santykis tarp HPLC kolon ėlės sulai­
kymo trukm ės ir adsorbcijos koeficiento, nereikia jokio kiekybinio 
analizės metodo, b ūtina nustatyti tik sulaikymo trukm ę. Jei yra 
tinkamas etalonini ų medžiagų rinkinys ir galima naudoti standartines 
bandymo s ąlygas, metodas leidžia greitai ir veiksmingai įvertinti 
adsorbcijos koeficient ą K oc . 
1.5. METODO TAIKOMUMAS  
HPLC metodas taikomas chemin ėms medžiagoms (nežym ėtoms ar su 
žymėtaisiais atomais), kurioms galima pritaikyti tinkam ą aptikimo 
sistemą (pvz., spektrofotometr ą, radioaktyvumo detektori ų) ir kurios 
yra gana stabilios vykstant bandymui. Jis gali b ūti ypač naudingas 
cheminėms medžiagoms, sunkiai tiriamoms kitomis bandymo siste ­
momis (t. y. lakioms medžiagoms; medžiagoms, kurios tirpsta esant 
mažesnei nei analiziškai nustatoma koncentracija; medžiagoms, kuri ų 
giminingumas inkubavimo sistem ų paviršiams yra didelis). Metodas 
gali būti taikomas mišiniams, kuri ų išplovimo juostos neatsiskiria. 
Tokiu atveju turi b ūti nurodyta mišinio jungini ų viršutinė ir apatin ė 
log K  oc verčių riba.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Kartais priemaišos gali trukdyti aiškinant HPLC rezultatus, ta čiau jos 
nėra tokios svarbios, jei bandomoji medžiaga gali b ūti aiškiai identi ­
fikuota analiziškai ir atskirta nuo priemaiš ų. 
Metodas patikrintas naudojant medžiagas, išvardytas pried ėlio 1 
lentelėje, taip pat juo buvo tiriamos įvairios ši ų klasių medžiagos:  
— aromatiniai aminai (pvz., trifluralinas, 4-chloranilinas, 3,5-dini ­
troanilinas, 4-metilanilinas, N-metilanilinas, 1-naftilaminas),  
— aromatini ų karboksilini ų rūgščių esteriai (pvz., benzenkarbonin ės 
rūgšties metilesteris, 3,5-dinitrobenzenkarbonin ės rūgšties etiles ­
teris),  
— aromatiniai angliavandeniliai (pvz., toluenas, ksilenas, etilben ­
zenas, nitrobenzenas),  
— ariloksifenoksipropionin ės rūgšties esteriai (pvz., diklofopmetilas, 
fenoksapropetilas, fenoksaprop-P-etilas),  
— fungicidai benzimidazolo ir imidazolo pagrindu (pvz., karbenda ­
zimas, fuberidazolas, triazoksidas),  
— karboksilini ų rūgščių amidai (pvz., 2-chlorbenzamidas, N, 
N-dimetilbenzamidas, 3,5-dinitrobenzamidas, N-metilbenzamidas, 2-nitrobenzamidas, 3-nitrobenzamidas),
 
— chlorinti angliavandeniliai (pvz., endosulfanas, DDT, heksachlor ­
benzenas, kvintozenas, 1,2,3-trichlorbenzenas),  
— fosforo organiniai insekticidai (pvz., azinfosmetilas, disulfotonas, 
fenamifosas, izofenfosas, pirazofosas, sulprofosas, triazofosas),  
— fenoliai (pvz., fenolis, 2-nitrofenolis, 4-nitrofenolis, pentachlorfe ­
nolis, 2,4,6-trichlorfenolis, 1-naftolis),  
— fenilkarbamido dariniai (pvz., izoproturonas, monolinuronas, 
pencikuronas),  
— pigmentiniai dažai (pvz., r ūgštusis geltonas 219, bazinis m ėlynas 41, 
tiesioginis raudonas 81),  
— poliaromatiniai angliavandeniliai (pvz., acenaftenas, naftalenas),  
— herbicidai 1,3,5-triazino pagrindu (pvz., prometrinas, propazinas, 
simazinas, terbutrinas),  
— triazolo dariniai (pvz., tebukonazolas, triadimefonas, tradime ­
nolis, triapentenolis).  
Metodas netinka medžiagoms, reaguojan čioms su eliuentu ar su neju ­
damąja faze. Jis taip pat netinka medžiagoms, kurios su neorgani ­
niais komponentais reaguoja specifiniu b ūdu (pvz., su molio mine ­
ralais sudaro klasterinius kompleksinius junginius). Metodas gali 
netikti paviršiaus veikliosioms medžiagoms, neorganiniams jungi ­
niams ir vidutinio stiprumo ar stiprioms organin ėms rūgštims ir 
bazėms. Galima nustatyti log K  oc vertes 1,5–5,0 intervale. Jonizuo ­
jamos medžiagos turi b ūti matuojamos naudojant buferin ę judamąją 
fazę, tačiau reikia ži ūrėti, kad nesusidaryt ų buferinio tirpalo kompo ­
nentų ar bandomosios medžiagos nuos ėdų. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
1.6.1.  Tikslumas  
Paprastai bandomosios medžiagos adsorbcijos koeficientas gali b ūti 
įvertintas ± 0,5 log vieneto tikslumu lyginant su verte, nustatyta 
įkrovos pusiausvyros metodu (žr. pried ėlio 1 lentel ę). Galima 
pasiekti didesn į tikslumą, jei naudota etalonin ė medžiaga ir bando ­
moji medžiaga yra panašios strukt ūros. 
1.6.2.  Pakartojamumas  
Nustatymas turi b ūti daromas bent du kartus. Atskir ų matavim ų log 
K oc turi skirtis mažiau kaip 0,25 log vieneto.  
1.6.3.  Atkuriamumas  
Iki šiol sukaupta patirtis taikant metod ą patvirtina jo tinkamum ą. 
Tiriant HPLC metod ą pagal 48 medžiagas (daugiausia pesticidus), 
apie kurias yra patikim ų adsorbcijos dirvožemiu K  oc duomenų, 
gautas koreliacijos koeficientas R = 0,95 (10) (11).  
Metodui tobulinti ir jo tinkamumui patvirtinti buvo atliekamas tarpla ­
boratorinio palyginimo bandymas dalyvaujant 11 laboratorij ų (12). 
Rezultatai pateikti pried ėlio 2 lentel ėje. 
1.7. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.7.1.  Adsorbcijos koeficiento pradinis įvertinimas  
Adsorbcijos laipsnio rodikliu, ypa č nejonizuot ų medžiagų atveju, gali 
būti naudojamas pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo) P  ow 
(= K  ow ) ir tam tikru laipsniu tirpumas vandenyje, taigi jie gali b ūti 
naudojami pradiniam intervalui nustatyti. Kelioms chemini ų 
medžiagų grupėms buvo paskelbta nemažai nauding ų koreliacij ų 
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).  
1.7.2.  Aparat ūra 
Būtina turėti skysčių chromatograf ą su nepulsuojan čiu siurbliu ir 
atitinkamu aptikimo įtaisu. Rekomenduojama naudoti injekcijos 
vožtuvą ir injekcijos kilp ą. Naudojamos pramonin ės gamybos cian ­
propilo dervos, chemiškai surištos su silicio dioksido nešikliu (pvz., 
Hypersil ir Zorbax CN). Tarp injekcijos sistemos ir analiz ės kolo­
nėlės galima įtaisyti tos pa čios medžiagos apsaugin ę kolonėlę. Skir­
tingų tiekėjų kolonėlių skiriamoji galia gali labai skirtis. Vadovautis 
reikėtų šiomis sulaikymo faktori ų k’ vertėmis: log k’ > 0,0, jei log 
K oc = 3,0, ir log k’ > 0,4, jei log K  oc = 2,0, jei judam ąja faze 
naudojamas metanolio/vandens 55/45 % mišinys.  
1.7.3.  Judamosios faz ės 
Buvo bandytos kelios judamosios faz ės, rekomenduoti galima šias 
dvi: 
— metanolio/vandens (55/45 % v/v) mišin į, 
— metanolio/0,01 M citratinio buferio pH 6,0 (55/45 % v/v) mišin į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Eliuavimo tirpikliui ruošti naudojamas HPLC grynumo metanolis ir 
distiliuotas vanduo ar citratinis buferinis tirpalas. Prieš naudojant 
mišinys nudujinamas. Turi b ūti taikomas izokratinis eliuavimas. Jei 
metanolio/vandens mišiniai netinka, galima išm ėginti kitus organinio 
tirpiklio/vandens mišinius, pvz., etanolio/vandens ar acetonitrilo/van ­
dens mišinius. Tiriant jonizuojamas medžiagas pH vertei stabilizuoti, 
rekomenduojama naudoti buferin į tirpalą. Reikia vengti drusk ų 
nuosėdų susidarymo ir nesugadinti kolon ėlės, o taip gali atsitikti su 
kai kuriais organin ės fazės/buferinio tirpalo mišiniais.  
Negalima naudoti pried ų, pvz., jon ų porų reagentų, nes jie gali veikti 
nejudamosios faz ės sorbcines savybes. Tokie nejudamosios faz ės 
pokyčiai gali b ūti negrįžtami. Dėl šios priežasties privaloma, kad 
bandymai naudojant priedus b ūtų atliekami atskirose kolon ėlėse. 
1.7.4.  Tirpiniai  
Bandomoji ir etalonin ė medžiagos turi b ūti ištirpintos judamojoje 
fazėje. 
1.8. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.8.1.  Bandymo s ąlygos  
Darant matavimus turi b ūti registruojama temperat ūra. Sąlygų pasto­
vumui užtikrinti labai rekomenduojama kolon ėlę laikyti termostatuo ­
jamoje kameroje, kai daromi kalibravimo, vertinimo ir bandomosios medžiagos matavimai.
 
1.8.2.  Eliuento sulaikymo trukm ės t o nustatymas  
Eliuento sulaikymo trukmei nustatyti galima taikyti du skirtingus 
metodus (žr. taip pat 1.2 skirsn į). 
1.8.2.1.  Eliuento sulaikymo trukm ės nustatymas naudojant homologines 
serijas  
Įrodyta, kad šiuo metodu gaunamos patikimos ir etalonin ės t o vertės. 
Detalės pateiktos bandymo metodo A.8 „Pasiskirstymo koeficientas 
(n–oktanolis/vanduo), HPLC metodas“ aprašyme.  
1.8.2.2.  Eliuento sulaikymo trukm ės nustatymas naudojant inertiškas 
medžiagas, kuri ų nesulaiko kolon ėlė 
Metodas pagr įstas formamido, karbamido ar natrio nitrato tirpal ų 
injekcija. Matavimai turi b ūti daromi bent du kartus.  
1.8.3.  Sulaikymo trukm ės t R nustatymas  
Etaloninės medžiagos turi b ūti parinktos, kaip aprašyta 1.3 skirsnyje. 
Jų sulaikymo trukmei nustatyti medžiagos gali b ūti įšvirkštos kaip 
mišrusis etalonas, jei b ūtų patvirtinta, kad kiekvieno etaloninio stan ­
darto sulaikymo trukmei kiti esantys etaloniniai standartai įtakos 
neturi. Kalibruoti b ūtina lygiais tarpais bent du kartus per dien ą, 
kad būtų galima atsižvelgti į netikėtus kolon ėlės veikimo poky čius. 
Gera praktika reikalauja, kad kalibravimo injekcijos b ūtų daromos 
prieš ir po bandomosios medžiagos injekcijos, norint patikrinti, ar neįvyko sulaikymo trukm ės poslinkis. Bandomosios medžiagos kuo 
mažesniais kiekiais (kad b ūtų išvengta kolon ėlės perkrovos) įšvirkš­ 
čiamos atskirai ir nustatoma j ų sulaikymo trukm ė.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Matavimo patikimumui padidinti turi b ūti daromi bent du matavimai. 
Atskirų matavim ų log K  oc turi skirtis mažiau kaip 0,25 log vieneto.  
1.8.4.  Įvertinimas  
Pagal eliuento sulaikymo trukm ę t o ir pasirinkt ų etalonini ų medžiagų 
t R taikant 4 lygt į apskaičiuojami sulaikymo faktoriai k’ (žr. 1.2 
skirsnį). Etalonini ų medžiag ų log k’ duomenys br ėžiami grafike 
pagal jų log K  oc vertes, gautas įkrovos pusiausvyros bandymuose 
ir pateiktas pried ėlio 1 ir 3 lentel ėse. Toliau pagal š į grafiką gauta 
bandomosios medžiagos log k’ vert ė yra naudojama jos log K  oc 
vertei nustatyti. Jei gauti rezultatai rodo, kad bandomosios medžiagos 
log K  oc yra už kalibravimo intervalo rib ų, bandym ą reikia pakartoti 
naudojant kitas labiau tinkamas etalonines medžiagas.  
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
Ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
— bandomosios ir etalonin ės medžiagos identifikavimas bei j ų 
grynumas ir, jei tinka, pK  a vertės, 
— įrangos ir darbo s ąlygų aprašymas, pvz., analiz ės (ir apsaugin ės) 
kolonėlės tipas bei matmenys, aptikimo b ūdas, judamoji faz ė 
(komponent ų santykis ir pH), bandym ų temperat ūros intervalas,  
— eliuento sulaikymo trukm ė ir jos nustatymo metodas,  
— į kolonėlę įšvirkštos bandomosios ir etalonin ės medžiagos 
kiekiai,  
— kalibravimui naudot ų etalonini ų medžiag ų sulaikymo trukm ė, 
— regresijos kreiv ės detalės (log k’ pagal log K  oc ) ir šios kreiv ės 
grafikas,  
— vidutiniai sulaikymo duomenys ir įvertinta bandomosios 
medžiagos log K  oc vertė, 
— chromatogramos.  
3. NUORODOS  
1) W.J. Lyman, W.F. Reehl, D.H. Rosenblatt (ed). (1990). Hand ­
book of chemical property estimation methods, chapt. 4, McGraw-Hill, New York.
 
2) J. Hodson, N.A. Williams (1988). The estimation of the adsorp ­
tion coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 
1 67.  
3) G.G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships 
between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, 1050–1059.
 
4) C.T. Chiou, P.E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, 227–231.
 
5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances 
by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, 297–312.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
6) C.T. Chiou, L.J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept 
of soil water equilibria for nonionic organic compounds, 
Science, 106, 831–832.  
7) S.W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, 833–846.
 
8) W. Kordel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the adsorp ­
tion coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121–128.
 
9) M. Mueller, W. Kordel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. 
Chemosphere, 32(12), 2493–2504.  
10) W. Kordel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 
27(12), 2341–2352.
 
11) B. von Oepen, W. Kordel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, 285–304.  
12) W. Kordel, G. Kotthoff, J. Muller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373–1384.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
Priedėlis 
1 lentelė 
Dirvožemi ų ir nuotek ų dumblų K oc verčių ir HPLC atrankos metodu apskai čiuotų verčių palyginimas  ( 1 ), ( 2 ) 
Medžiaga  CAS Nr.  Nuotek ų 
dumblo log 
K oc log K  oc 
HPLC  A Dirvo žemi ų 
log K  oc log K  oc 
HPLC  A 
Atrazinas  1912–24–9  1,66  2,14  0,48  1,81  2,20  0,39  
Linuronas  330–55–2  2,43  2,96  0,53  2,59  2,89  0,30  
Fentionas  55–38–9  3,75  3,58  0,17  3,31  3,40  0,09  
Monuronas  150–68–5  1,46  2,21  0,75  1,99  2,26  0,27  
Fenantrenas  85–01–8  4,35  3,72  0,63  4,09  3,52  0,57  
Benzoinės rūgšties 
fenilesteris  93–99–2  3,26  3,03  0,23  2,87  2,94  0,07  
Benzamidas  55–21–0  1,60  1,00  0,60  1,26  1,25  0,01  
4-nitrobenzamidas  619–80–7  1,52  1,49  0,03  1,93  1,66  0,27  
Acetanilidas  103–84–4  1,52  1,53  0,01  1,26  1,69  0,08  
Anilinas  62–53–3  1,74  1,47  0,27  2,07  1,64  0,43  
2,5-dichloranilinas  95–82–9  2,45  2,59  0,14  2,55  2,58  0,03  
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), 121–128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), 107–119.  
2 lentelė 
Tarplaboratorinio palyginimo bandymo (11 dalyvaujan čių laboratorij ų), atlikto HPLC metodui patobulinti ir 
tinkamumui patvirtinti, rezultatai  ( 1 ) 
Medžiaga  CAS-Nr.  log K  oc K oc log K  oc 
(OECD 106)  (HPLC-metodas)  
Atrazinas  1912–24–9  1,81  78 + 16  1,89  
Monuronas  150–68–5  1,99  100 + 8  2,00  
Triapentenolis  77608–88–3  2,37  292 + 58  2,47  
Linuronas  330–55–2  2,59  465 + 62  2,67  
Fentionas  55–38–9  3,31  2 062 + 648  3,31  
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), 1373–1384.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
3 lentelė 
Rekomenduojamos etalonin ės medžiagos HPLC atrankos metodui, pagr įstam duomenimis apie adsorbcij ą 
dirvožemiu  
Etaloninė medžiaga  CAS-Nr.  log K  oc vidutinės 
vertės pagal 
įkrovos 
pusiausvyr ą K oc duomenų 
skaičius log S.D.  Šaltinis  
Acetanilidas  103–84–4  1,25  4  0,48  (  a ) 
Fenolis  108–95–2  1,32  4  0,70  (  a ) 
2-Nitrobenzamidas  610–15–1  1,45  3  0,90  (  b ) 
N, N-dimetilbenzamidas  611–74–5  1,52  2  0,45  (  a ) 
4-Metilbenzamidas  619–55–6  1,78  3  1,76  (  a ) 
Metilbenzoatas  93–58–3  1,80  4  1,08  (  a ) 
Atrazinas  1912–24–9  1,81  3  1,08  (  c ) 
Izoproturonas  34123–59–6  1,86  5  1,53  (  c ) 
3 -Nitrobenzamidas  645–09–0  1,95  3  1,31  (  b ) 
Anilinas  62–53–3  2,07  4  1,73  (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamidas  121–81–3  2,31  3  1,27  (  c ) 
Karbendazimas  10605–21-  2,35  3  1,37  (  c ) 
Triadimenolis  55219–65–3  2,40  3  1,85  (  c ) 
Triazoksidas  72459–58–6  2,44  3  1,66  (  c ) 
Triazofosas  24017–47–4017–4 ­
7–8 2,55 3  1,78  (  c ) 
Linuronas  330–55–2  2,59  3  1,97  (  c ) 
Naftalenas  91–20–3  2,75  4  2,20  (  a ) 
Endosulfandiolis  2157–19–9  3,02  5  2,29  (  c ) 
Metiokarbas  2032–65–7  3,10  4  2,39  (  c ) 
Rūgštusis geltonas 219  63405–85–6  3,16  4  2,83  (  a ) 
1,2,3-trichlorobenzenas  87–61–6  3,16  4  1,40  (  a ) 
y-HCH  58–89–9  3,23  5  2,94  (  a ) 
Fentionas  55–38–9  3,31  3  2,49  (  c ) 
Tiesioginis raudonasis 81  2610–11–9  3,43  4  2,68  (  a ) 
Pirazofosas  13457–18–6  3,65  3  2,70  (  c ) 
α-Endosulfanas  959–98–8  4,09  5  3,74  (  c ) 
Dichlofopmetilas  51338–27–3  4,20  3  3,77  (  c ) 
Fenantrenas  85–01–8  4,09  4  3,83  (  a ) 
Bazinis m ėlynasis 41 (mišinys)  26850–47–5 
12270–13–2  4,89 4  4,46  (  a ) 
DDT  50–29–3  5,63  —  (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No. 106 01 044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein. (1991). Chemosphere, 22, 285–304 
( c ) Pramon ės pateikti duomenys.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20  DAPHNIA MAGNA REPRODUKCIJOS BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis toksiškumo reprodukcijai bandymo metodas yra OECD TG 211 
(1998) kopija.  
1.1. ĮVADAS  
Pagrindinis šio bandymo tikslas – įvertinti chemini ų medžiag ų 
poveikį Daphnia magna  reprodukcijos našumui.  
1.2. APIBR ĖŽTYS IR VIENETAI  
Motininiai gyv ūnai – nuo bandymo pradžios naudojamos moteriškos 
lyties dafnijos, kuri ų yra tiriamas reprodukcijos našumas.  
Palikuonys  – atliekant bandym ą atvestos dafnijos.  
Mažiausia pastebim ą poveikį sukelianti koncentracija (LOEC)  – 
mažiausia bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiaga per nustatyt ą veikimo laikotarp į daro statistiškai reikš ­
mingą poveikį, lyginant su kontroliniais bandiniais, reprodukcijai ir 
motininių gyvūnų gaištamumui (p < 0,05). Ta čiau visų didesnių kaip 
LOEC bandom ųjų koncentracij ų kenksmingas poveikis turi b ūti 
lygus ar didesnis kaip LOEC koncentracijos bandomosios medžiagos poveikis. Jei šios dvi s ąlygos negali b ūti įvykdytos, turi b ūti 
pateiktas išsamus paaiškinimas, kod ėl buvo pasirinkta LOEC (taigi 
ir NOEC).
 
Nepasteb ėto poveikio koncentracija (NOEC)  – bandomoji koncent ­
racija bent kiek mažesn ė už LOEC, kuri per nustatyt ą veikimo laiko ­
tarpį nedaro statistiškai reikšmingo poveikio (p < 0,05) lyginant su 
kontroliniais bandiniais.  
EC x – vandenyje ištirpintos bandomosios medžiagos koncentracija, 
kuriai  esant Daphnia magna  reprodukcija per nustatyt ą veikimo 
laikotarpį sumažėja x %.  
Būdingasis prieaugio greitis  – populiacijos augimo matas, apimantis 
reprodukcijos našum ą ir amžiui b ūdingą gaištamum ą (20) (21) (22). 
Stacionarios b ūsenos populiacij ų būdingasis prieaugio greitis lygus 
nuliui. Augan čių populiacij ų greitis yra teigiamas, o nykstan čių 
populiacij ų – neigiamas. Aišku, kad pastarosios yra neilgaamž ės ir 
galiausiai išnyksta.  
Aptikimo riba  – mažiausia koncentracija, kai medžiag ą galima 
aptikti, bet nenustatyti kiekybiškai.  
Nustatymo riba  – mažiausia kiekybiškai nustatoma koncentracija.  
Gaištamumas  – gyvūnas registruojamas nugaiš ęs, kai jis nejuda, t. y. 
kai negali plaukti arba kai, 15 s lengvai papur čius bandymo ind ą, 
nepastebima judant gal ūnių ar pilvelio. (Jei taikoma kitas apibr ėžtis, 
ji turi būti pateikta kartu su nuoroda.).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Jaunos moteriškos lyties dafnijos (motininiai gyv ūnai), kuri ų amžius 
bandymo pradžioje mažesnis kaip 24 h, yra veikiamos bandom ąja 
medžiaga, ištirpinta vandenyje tam tikram koncentracijos ver čių 
intervalui gauti. Bandymo trukm ė 21 para. Baigiant bandym ą įverti­
namas vienam gyvam motininiam gyv ūnui tenkan čių gyvų pali­
kuonių bendras skai čius. Suaugusi ųjų atvesti jaunikliai, kurie ž ūva 
atliekant bandym ą, į skaičiavimus ne įtraukiami. Motinini ų gyvūnų 
reprodukcijos našum ą galima išreikšti kitais b ūdais (pvz., gyv ų pali­
kuonių, atvestų vieno gyv ūno per par ą nuo pirmos palikuoni ų paste­
bėjimo dienos, skai čiumi), tačiau ataskaitoje šie skai čiai turi b ūti 
pateikiami papildomai prie bendro gyv ų jaunikli ų skaičiaus, 
bandymo pabaigoje tenkan čio vienam motininiam gyv ūnui. Mažiau ­
siai pastebim ą poveikį sukelian čiai koncentracijai (LOEC), kartu ir 
nepastebėto poveikio koncentracijai, nustatyti (NOEC) bandom ąja 
medžiaga veikiam ų gyvūnų reprodukcijos našumas lyginamas su 
kontrolinio (-i ų) bandinio (-i ų) našumu. Be to, duomenys analizuo ­
jami taikant, kiek įmanoma, regresijos model į, kad būtų galima įver­
tinti koncentracij ą, kuriai esant reprodukcijos našumas sumaž ėtų x % 
(t. y. the EC  50 , EC  20 , ar EC  10 ). 
Ataskaitoje taip pat turi b ūti nurodytas motinini ų gyvūnų išlikimo 
laipsnis ir pirmosios vados atsiradimo laikas. Gali b ūti ištirti kiti 
medžiagos veikiami parametrai, pvz., augimas (pvz., ilgis) ir galb ūt 
būdingasis prieaugio greitis.  
1.4. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Reikėtų turėti su  Daphnia magna  atlikto trumpalaikio toksiškumo 
bandymo (žr. C.2 metodo I dal į) rezultatus. Rezultatas gali b ūti 
naudingas pasirenkant atitinkam ą reprodukcijos bandym ų bandomo ­
sios koncentracijos interval ą. Turi b ūti žinomas bandomosios 
medžiagos tirpumas vandenyje ir gar ų slėgis, be to, bandomosios 
medžiagos tirpal ų koncentracijai kiekybiškai nustatyti turi b ūti priei­
namas patikimas analiz ės metodas, kurio žinomi regeneravimo efek ­
tyvumas ir nustatymo riba.  
Informacija apie bandom ąją medžiagą, galinti b ūti vertinga nustatant 
bandymo s ąlygas, apima strukt ūrinę formulę, medžiagos grynum ą, 
stabilumą šviesoje, stabilum ą bandymo s ąlygomis, pKa, P  ow ir 
lengvo biologinio skaidumo bandymo rezultatus (žr. C.4 metod ą). 
1.5. BANDYMO TINKAMUMAS  
Metodas yra tinkamas, jei, atliekant kontrolin į (-ius) bandym ą (-us), 
įvykdomi šie veiksmingumo kriterijai:  
— bandymo pabaigoje motinini ų gyvūnų gaištamumas (moteriškos 
lyties dafnij ų) yra ne didesnis kaip 20 %,  
— iš vieno iki bandymo pabaigos išgyvenusio motininio gyv ūno 
gautų gyvų palikuoni ų vidutinis skai čius yra ≥ 60. 
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Aparat ūra 
Bandymo indai ir kita aparat ūra, su kuria lie čiasi bandomieji tirpalai, 
turi būti pagaminti vien tik iš stiklo ar kitos chemiškai inertiškos 
medžiagos. Bandymams paprastai naudojamos laboratorin ės stiklinės. 
Be to, yra reikalinga ši aparat ūra arba jos dalis:  
— deguonies matuoklis (su mikroelektrodu ar kita tinkama įranga 
ištirpusiam deguoniui mažo t ūrio bandiniuose matuoti),  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— atitinkama aparat ūra pastoviai temperat ūrai palaikyti,  
— pH-metras,  
— įranga vandens kietumui nustatyti,  
— įranga bendrosios organin ės anglies vandenyje 
koncentracijai (TOC) ar įranga cheminiam deguonies 
suvartojimui (COD) nustatyti,  
— tinkama aparat ūra apšvietimo režimui kontroliuoti ir šviesos 
intensyvumui matuoti.  
1.6.2.  Bandomieji organizmai  
Bandymui reik ėtų naudoti  Daphnia magna Straus . Galima naudoti 
kitas dafnij ų rūšis, jei jos atitinka nustatytus tinkamumo kriterijus 
(dafnijų rūšiai turi b ūti taikomas su kontrolini ų bandinių reproduk ­
cijos našumu susij ęs tinkamumo kriterijus). Jei naudojamos kitos 
dafnijų rūšys, jos turi b ūti aiškiai apibr ėžtos ir jų naudojimas turi 
būti pagrįstas. 
Kloną geriau b ūtų identifikuoti pagal genotip ą. Tyrimas (1) parod ė, 
kad A klono (jo kilm ė – IRCHA ( Institut de Recherche en Chimie 
Appliquee ), Prancūzija) (3) reprodukcijos našumas vis ą laiką atitinka 
tinkamumo kriterij ų, pagal kur į vieno motininio gyv ūno, išlikusio 
gyvo auginant šiame metode aprašytomis s ąlygomis, vidutinis pali ­
kuonių skaičius ≥ 60. Tačiau priimtini ir kiti klonai, jei parodoma, 
kad dafnij ų kultūra atitinka bandymo tinkamumo kriterijus.  
Bandymo pradžioje gyv ūnai turi būti jaunesni kaip 24 h ir neturi b ūti 
pirmoji palikuoni ų karta. Jie turi b ūti gauti iš sveik ų motinini ų 
gyvūnų (t. y. be streso požymi ų, pvz., didelis gaištamumas, vyriškos 
lyties atstov ų ir ephippia  buvimas, v ėlavimas atvesti pirm ąją vadą, 
pasikeitusi gyv ūnų spalva ir t. t.). Motininiai gyv ūnai turi b ūti 
laikomi tokiomis s ąlygomis (šviesa, temperat ūra, terpė, maitinimas 
ir gyvūnų skaičius tūrio vienetui), kurios b ūtų panašios į bandymo 
sąlygas. Jei bandymui naudota auginimo terp ė skiriasi nuo įprastos 
dafnijų auginimo terp ės, motinini ų gyvūnų stresui išvengti gera prak ­
tika reikalauja leisti dafnijoms paprastai maždaug per tris savaites (t. 
y. vienos kartos laikotarpiu) aklimatizuotis.  
1.6.3.  Bandomoji terp ė 
Rekomenduojama šiems bandymams naudoti visiškai apibr ėžtą terpę. 
Taip galima išvengti sunkiai apib ūdinamų priedų naudojimo (pvz., 
jūros dumbli ų, dirvožemio ekstrakto ir t. t.), taigi pager ėja tarplabo ­
ratorinio standartizavimo galimyb ės. Buvo nustatyta, kad geriausiai 
tinka Elendt M4 (4) ir M7 terp ės (žr. 1 pried ėlį). Tačiau yra priim ­
tinos ir kitos terp ės (pvz., (5) (6)), jei jose išauginta dafnij ų kultūra 
atitinka bandymui nustatytus tinkamumo kriterijus.  
Jei naudojamos terp ės su neapibr ėžtais priedais, šie priedai turi b ūti 
aiškiai apib ūdinti ir bandymo ataskaitoje turi b ūti informacija apie j ų 
sudėtį, ypač apie organin ės anglies kiek į, nes ji gali b ūti tiekiamo 
maisto dalis. Rekomenduojama nustatyti organinio priedo pradinio tirpalo bendr ąją organinę anglį (TOC) ir (ar) chemin į deguonies 
suvartojim ą (COD) ir įvertinti d ėl jų paruoštoje terp ėje susidarant į 
TOC/COD. Rekomenduojama, kad terp ės (t. y. prieš pridedant 
dumblių) TOC lygis b ūtų mažesnis kaip 2 mg/l (7).
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Bandant metal ų turinčias medžiagas, svarbu suprasti, kad bandomo ­
sios terpės savybės (pvz., kietumas, chelatavimo geba) gali tur ėti 
įtakos bandomosios medžiagos toksiškumui. D ėl šios priežasties 
pageidautina tur ėti visiškai apibr ėžtą terpę. Tačiau vienintel ės 
visiškai apibr ėžtos terpės, kurios, kiek šiandien žinoma, tikt ų ilgą 
laiką auginti  Daphnia magna , yra Elendt  M4 ir M7. Abiejose terp ėse 
esama chelatavimo medžiagos EDTA. Darbas (2) parod ė, kad, repro ­
dukcijos bandym ą atliekant M4 ir M7 terp ėje, kadmio „tariamasis 
toksiškumas“ paprastai yra mažesnis lyginant su EDTA neturin čia 
terpe. Taigi M4 ir M7 nerekomenduojama naudoti bandant metal ų 
turinčias medžiagas, taip pat reik ėtų vengti naudoti terpes, turin čias 
žinomas chelatavimo medžiagas. Metal ų turinčioms medžiagoms 
patartina naudoti kit ą terpę, pvz., ASTM ( American Society for 
Testing and Materials ) atkurtąjį kietą gėlą vandenį (7) be EDTA, į 
kurį pridėta jūros dumbli ų ekstrakto (8). Šis ASTM atkurtojo kieto 
gėlo vandens ir j ūros dumbli ų ekstrakto derinys taip pat tinka ilg ą 
laiką auginti ir bandyti  Daphnia magna  (2), nors d ėl jūros dumbli ų 
ekstrakto organinio komponento vis dar pasireiškia nedidelis chela ­
tuojantis veikimas.  
Bandymo pradžioje ir toliau per vis ą bandymą ištirpusio deguonies 
koncentracija turi b ūti didesnė kaip 3 mg/l. pH vert ė turi būti 6–9 ir 
atliekant bet kur į bandymą ji paprastai neturi kisti daugiau kaip 1,5 
vieneto. Rekomenduojamas 140 mg/l (pagal CaCO  3 ) kietumas. 
Bandymai, atlikti esant šiam ar aukštesniam lygiui, parod ė, kad 
reprodukcijos našumas atitinka tinkamumo kriterijus (9) (10).  
1.6.4.  Bandomieji tirpalai  
Pasirinktos koncentracijos bandomieji tirpalai paprastai ruošiami 
skiedžiant pradin į tirpalą. Pradinius tirpalus geriau ruošti tirpinant 
medžiagą bandomojoje terp ėje. 
Kartais, norint gauti tinkamos koncentracijos pradin į tirpalą, gali 
tekti naudoti organinius tirpiklius ar dispergatorius, ta čiau reikia 
kiek įmanoma stengtis ši ų medžiag ų nenaudoti. Tinkami tirpikliai 
yra acetonas, etanolis, metanolis, dimetilformamidas ir trietilengli ­
kolis. Tinkami dispergatoriai yra  Cremophor  RH40, 0,01 % metilce ­
liuliozė ir HCO-40. Bet kuriuo atveju bandomosios medžiagos 
bandomojo tirpalo koncentracija neturi b ūti didesnė kaip tirpumo 
bandomojoje terp ėje riba.  
Tirpikliai naudojami pradiniam tirpalui ruošti, kuris gali b ūti tiksliai 
dozuojamas vandeniu. Kai pirmiau išvardyti tirpikliai galutin ėje 
bandomojoje terp ėje bus rekomenduojamos koncentracijos (t. y. ≤ 
0,1 ml/l), jie nebus toksiški ir nepadidins medžiagos tirpumo vande ­
nyje.  
Dispergatoriai gali pad ėti tiksliai dozuoti ir disperguoti. Kai pirmiau 
išvardyti dispergatoriai galutin ėje bandomojoje terp ėje bus rekomen ­
duojamos koncentracijos ( ≤ 0,1 ml/1), jie nebus toksiški ir nepadi ­
dins medžiagos tirpumo vandenyje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. BANDYMO SCHEMA  
Bandymo indai paskirstomi pagal apdorojimo b ūdus, o toliau visi 
bandymo indai turi b ūti tvarkomi atsitiktiniu b ūdu. Taip nedarant, 
gali atsirasti nukrypimas, kuris gal ėtų būti aiškinamas koncentracijos 
poveikiu. Ypa č jei bandymo vienetai tvarkomi tokia seka, kokia jie 
buvo apdoroti, arba atsižvelgiant į koncentracij ą, kai kurie su laiku 
susiję veiksniai, pvz., operatoriaus nuovargis ar kita klaida esant 
didesnėms koncentracijos vert ėms gali tur ėti rimtesni ų padarini ų. 
Be to, jei bandymo rezultatus gali veikti bandymo pradin ės ar 
aplinkos, pvz., pad ėties laboratorijoje, s ąlygos, reik ėtų svarstyti 
blokinę bandymo schem ą. 
1.8. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.8.1.  Veikimo s ąlygos  
1.8.1.1.  Trukm ė 
Bandymo trukm ė – 21 para.  
1.8.1.2.  Įkrova  
Motininiai gyv ūnai laikomi atskirai po vien ą bandymo inde su 
50–100 ml terp ės. 
Kartais, atsižvelgiant į analizės metodikos bandomajai medžiagai 
nustatyti reikalavimus, gali b ūti reikalingas didesnis t ūris, nors 
cheminei analizei atlikti leidžiama kartu supilti tos pa čios koncent ­
racijos bandinius. Jei naudojamas didesnis kaip 100 ml t ūris, gali 
tekti padidinti dafnij ų maisto davin į, kad turimo maisto pakakt ų ir 
būtų garantuota tinkamumo kriterij ų atitiktis. Dinaminiams bandy ­
mams d ėl technini ų priežasčių galima numatyti alternatyvias 
bandymo schemas (pvz., keturias grupes po 10 gyv ūnų didesniame 
bandymo t ūryje), tačiau visi bandymo schemos pakeitimai turi b ūti 
nurodyti ataskaitoje.  
1.8.1.3.  Gyvūnų skaičius 
Pusiau statiniams bandymams kiekvienai koncentracijai imama bent 
10 atskirai laikom ų gyvūnų ir bent 10 atskirai laikom ų gyvūnų kont­
rolinės serijos bandiniams.  
Buvo parodyta, kad dinaminiams bandymams kiekvienai koncentra ­
cijai tinka naudoti 40 gyv ūnų, padalyt ų į keturias grupes po 10 
gyvūnų (1). Galima naudoti mažiau bandom ųjų organizm ų, bet kiek ­
vienai koncentracijai rekomenduojama naudoti ne mažiau kaip po 20 
gyvūnų, padalytų į du ar daugiau bandini ų su vienodu gyv ūnų skai­ 
čiumi (pvz., į keturis bandinius su 5 dafnijomis kiekvienam bandi ­
niui). Atkreiptinas d ėmesys, kad, jei atliekant bandymus su grup ėmis 
laikomais gyv ūnais, motininiai gyv ūnai žūva, reprodukcijos našumo 
bus neįmanoma išreikšti kaip bendro gyv ų palikuoni ų skaičiaus, 
tenkančio vienam bandymo pabaigoje gyvam motininiam gyv ūnui. 
Tokiais atvejais reprodukcijos našumas išreiškiamas kaip „bendras 
skaičius gyvų palikuoni ų, tenkantis vienam bandymo pradžioje buvu ­
siam gyv ūnui“.  
1.8.1.4.  Maitinimas  
Atliekant pusiau statinius bandymus geriau maitinti kasdien, ta čiau 
ne mažiau kaip tris kartus per savait ę (tai atitinka terp ės keitimą). 
Nukrypimai nuo ši ų sąlygų (pvz., dinamini ų bandym ų) nurodomi 
ataskaitoje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Atliekant bandym ą motininių gyvūnų maistą turėtų sudaryti ši ų gyvų 
dumblių ląstelės: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum  (dabar  
Pseudokirchneriella subcapitata  (11)) ir  Scenedesmus subspicatus . 
Tiekiamas maistas tur ėtų būti apskai čiuotas pagal organin ės 
anglies (C) kiek į, duodam ą kiekvienam motininiam gyv ūnui. 
Tyrimas (12) parod ė, kad  Daphnia magna  pakanka gauti 0,1– 0,2 
mg C/dafnijai/parai, kad b ūtų pasiektas bandymo tinkamumo krite ­
rijus, atitinkantis palikuoni ų skaičių. Maistą galima tiekti vienodai 
visą bandymo laik ą ar, jei norima, mažiau bandymo pradžioje ir 
daugiau bandymo eigoje, atsižvelgiant į motinini ų gyvūnų augimą. 
Šiuo atveju vis ą laiką davinys turi atitikti rekomenduot ą intervalą 
0,1– 0,2 mg C/dafnijai/parai.  
Jei maitinimo lygiui nustatyti naudojami pakeitimo parametrai, pvz., 
dumblių ląstelių skaičius ar šviesos absorbcija (t. y. kad b ūtų pato­
giau, nes anglies kiekiui nustatyti reikia daug laiko), kiekviena labo ­
ratorija turi daryti savo nomogram ą, kuri pakeitimo parametr ą susietų 
su anglies kiekiu dumbliuose (žr. 2 pried ėlį apie nomogramos 
darymą). Nomogramas b ūtina tikrinti bent kart ą per metus ir dažniau, 
jei kinta dumbli ų auginimo s ąlygos. Buvo nustatyta, kad šviesos 
absorbcija yra geresnis anglies kiekio pakeitimo parametras negu 
ląstelių skaičius (13).  
Dafnijos maitinamos koncentruota dumbli ų suspensija, kad į 
bandymo indus pilamos kult ūros terpės tūris būtų kiek įmanoma 
mažesnis. Dumbliams koncentruoti galima naudoti centrifugavim ą 
ir pakartotin į suspendavim ą distiliuotame vandenyje, dejonizuotame 
vandenyje ar dafnij ų kultūros terpėje. 
1.8.1.5.  Šviesa  
16 h trukm ės apšvietimas, kurio intensyvumas ne didesnis kaip 
15–20 μΕ m -2 s -1 . 
1.8.1.6.  Temperat ūra 
Band terp ės temperat ūra turi būti 18–22 °C. Ta čiau, jei įmanoma, atlie ­
kant visus bandymus temperat ūra neturėtų kisti daugiau kaip 2 °C taikant 
šiuos intervalus (pvz., 18–20, 19–21 ar 20–22 °C). Temperat ūrai kontro ­
liuoti gali b ūti naudingas papildomas bandymo indas.  
1.8.1.7.  Aeravimas  
Atliekant bandym ą bandomieji tirpalai neaeruojami.  
1.8.2.  Bandomoji koncentracija  
Paprastai naudojamos bent penkios bandomosios koncentracijos 
vertės, sudaran čios geometrin ę progresij ą, kurios daugiklis b ūtų ne 
didesnis kaip 3,2, ir kiekvienai bandomosios koncentracijos vertei daromas atitinkamas skai čius lygiagre čiųjų bandym ų (žr. 1.8.1.3 
skirsnį). Jei naudojamos mažiau kaip penkios koncentracijos vert ės, 
tai reikia pagr įsti. Neturi b ūti bandomos medžiagos, jei j ų koncent­
racija yra didesn ė nei tirpumo bandomojoje terp ėje riba.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Nustatant koncentracij ų intervalą būtina žinoti:  
i) jei tikslas – nustatyti LOEC/NOEC, mažiausia bandomoji 
koncentracija turi b ūti gana maža, kad j ą naudojant vaisingumas 
lyginant su kontroliniu bandiniu neb ūtų pastebimai mažesnis. Jei 
taip nėra, bandym ą reikia pakartoti su dar mažesne mažiausia 
koncentracija;  
ii) jei tikslas – nustatyti LOEC/NOEC, didžiausia bandomoji 
koncentracija turi b ūti gana didel ė, kad ją naudojant vaisingumas 
lyginant su kontroliniu bandiniu b ūtų daug mažesnis. Jei taip 
nėra, bandym ą reikia pakartoti su dar didesne didžiausia koncent ­
racija;  
iii) jei vertinama reprodukcij ą veikianti EC  x , jai apibr ėžti atitinkamu 
pasikliovimo lygiu patartina naudoti pakankam ą koncentracijos 
verčių skaičių. Jei vertinama reprodukcij ą veikianti EC  50 , patar­
tina, kad didžiausia bandomoji koncentracija b ūtų didesnė kaip ši 
EC 50 . Priešingu atveju, nors EC  50 vis dar galima įvertinti, EC  50 
pasikliovimo intervalas b ūtų labai platus, ir gali b ūti neįmanoma 
tinkamai įvertinti parinkto modelio tinkamumo;  
iv) reikėtų vengti į bandomosios koncentracijos ver čių intervalą 
įtraukti koncentracijos vertes, kurios b ūtų statistiškai reikšmingos 
suaugusių gyvūnų išlikimui, nes taip pasikeist ų bandymo 
principas, ir jis iš paprasto reprodukcijos bandymo tapt ų sudė­
tinio reprodukcijos ir gaištamumo bandymu, kuriam reikalinga daug sud ėtingesnė statistinė analizė.
 
Tinkamas bandom ąsias koncentracijas parinkti tur ėtų padėti anksčiau 
gautos žinios apie bandom ąją medžiag ą (pvz., trumpalaikio toksiš ­
kumo ir (ar) intervalo nustatymo tyrim ų duomenys).  
Jei bandomiesiems tirpalams ruošti naudojamas tirpiklis ar disperga ­
torius (žr. 1.6.4 skirsn į), jų galutinė koncentracija visuose bandymo 
induose turi b ūti vienoda ir ne didesn ė kaip 0,1 ml/l.  
1.8.3.  Kontroliniai bandiniai  
Be bandomosios medžiagos bandini ų serijos, bandoma viena 
bandymo terp ės kontrolini ų bandinių serija ir, jei tinka, viena 
tirpiklio ar dispergatoriaus kontrolini ų bandinių serija. Naudojamo 
tirpiklio ar dispergatoriaus koncentracija turi b ūti tokia, kokia yra 
induose su bandom ąja medžiaga. Turi b ūti atliekamas atitinkamas 
skaičius lygiagre čiųjų bandymų (žr. 1.8.1.3 skirsn į). 
Paprastai jei bandymas atliekamas tinkamai, kontrolinio (-i ų) 
bandinio (-i ų) variacijos apie vidutin ę motininio gyv ūno produkuot ų 
palikuoni ų vertę koeficientas turi b ūti ≤ 25 %, ir jis turi b ūti nuro­
domas bandymo schemoms su atskirai laikomais gyv ūnais. 
1.8.4.  Bandomosios terp ės atnaujinimas  
Bandomosios terp ės atnaujinimo dažnis priklauso nuo bandomosios 
medžiagos, ta čiau ji tur ėtų būti atnaujinama tris kartus per savait ę. 
Jei pagal išankstinius stabilumo bandymus (žr. 1.4 skirsn į) bando­
mosios medžiagos koncentracija ilgiausiu (t. y. trij ų parų) atnauji­
nimo laikotarpiu yra nestabili (t. y. yra už 80–120 % vardin ės 
koncentracijos rib ų ar yra mažesn ė kaip 80 % išmatuotos pradin ės 
koncentracijos), reik ėtų numatyti dažnesn į terpės atnaujinim ą arba 
taikyti dinamin į bandymą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Kai atnaujinama pusiau statini ų bandym ų terpė, paruošiama antra 
bandymo ind ų serija, ir į juos pernešami motininiai gyv ūnai naudo ­
jant, pvz., tinkamo skersmens stiklin ę pipetę. Su Daphnia  perne­ 
šamos terp ės tūris turi būti kuo mažesnis.  
1.8.5.  Matavimai  
Stebėjimų rezultatai, gauti atliekant bandym ą, registruojami specifi ­
kacijose (žr. 3 ir 4 pried ėlių pavyzdžius). Jei reikia daryti kitus 
matavimus (žr. 1.3 ir 1.8.8), gali b ūti atliekami papildomi steb ėjimai.  
1.8.6.  Palikuonys  
Kiekvieno motininio gyv ūno atvestus palikuonis geriau atskirti ir 
skaičiuoti kasdien nuo pirmosios vados atsiradimo, kad jie nevartot ų 
suaugusiems gyv ūnams skirto maisto. Pagal š į metodą reikia skai ­ 
čiuoti tik gyvus palikuonis, ta čiau reikia registruoti neapvaisint ų 
kiaušinių ar negyv ų palikuoni ų skaičių. 
1.8.7.  Gaištamumas  
Motininių gyvūnų gaištamum ą geriau registruoti kasdien, bent jau 
tuomet, kai skai čiuojami palikuonys.  
1.8.8.  Kiti parametrai  
Nors šis metodas iš esm ės yra skirtas reprodukcijos rezultatams 
vertinti, galima kiekybiškai įvertinti ir kitus rezultatus, kad b ūtų 
įmanoma j ų statistinė analizė. Labai pageidautina, kad b ūtų daromi 
augimo matavimai, nes jie suteikia informacijos apie galimus suble ­
talius rezultatus, kurie gali b ūti naudingesni nei vien tik reproduk ­
cijos matavimas; baigiant bandym ą rekomenduojama išmatuoti moti ­
ninių gyvūnų ilgį (t. y. kūno ilgį, išskyrus analin į dyglį). Kiti para ­
metrai, kuriuos galima išmatuoti ar apskai čiuoti, yra pirmosios vados 
(ir vėlesnių vadų) atsiradimo laikas, vieno gyv ūno vadų skaičius ir 
dydis, neapvaisint ų kiaušini ų skaičius, vyriškos lyties atstov ų ar 
ephippia  buvimas ir populiacijos prieaugio b ūdingasis greitis.  
1.8.9.  Analizini ų nustatym ų ir matavim ų dažnis  
Deguonies koncentracija, temperat ūra, kietumas ir pH vert ės turi būti 
matuojamos bent kart ą per savait ę prieš ir po terp ės atnaujinimo 
kontroliniame (-iuose) bandinyje (-iuose) ir induose su didžiausia 
bandomosios medžiagos koncentracija.  
Atliekant bandym ą bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės 
nustatomos reguliariais laiko tarpais.  
Jei pusiau statiniuose bandymuose daroma prielaida, kad bandomo ­
sios medžiagos koncentracija lieka ± 20 % vardin ės koncentracijos 
vertės (t. y. 80–120 % intervalo, žr. 1.4 ir 1.8.4), rekomenduojama 
nustatyti bent didžiausi ą ir mažiausi ą bandom ąją koncentracij ą iš 
karto po tirpalo paruošimo ir prieš pat jo atnaujinim ą pirmąją 
bandymo savait ę (t. y. turi b ūti atliekama to paties tirpalo m ėginių 
analizė iš karto po tirpalo paruošimo ir j į atnaujinant). V ėliau šis 
nustatymas turi b ūti kartojamas bent kas savait ę. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Jei tai yra bandymai, kuriuos atliekant nesitikima, kad koncentracija 
liks ± 20 % vardin ės koncentracijos vert ės, būtina analizuoti vis ų 
koncentracijos ver čių bandomuosius tirpalus iš karto po j ų paruošimo 
ir prieš pat atnaujinim ą. Tačiau bandymuose, kur išmatuota pradin ė 
bandomosios medžiagos koncentracija nesudaro ± 20 % vardin ės 
vertės, bet galima gauti pakankamai įrodymų, kad pradin ės koncent ­
racijos vert ės yra pakartojamos ir stabilios (t. y. 80–120 % pradin ės 
koncentracijos ver čių intervalo), bandymo antr ą ar trečią savaitę 
cheminių analizių skaičių galima sumažinti ir apsiriboti didžiausios 
ir mažiausios bandomosios koncentracijos nustatymu. Visais atvejais 
prieš atnaujinim ą turi būti daromas tik vieno lygiagretaus kiekvienos 
koncentracijos bandinio bandomosios koncentracijos nustatymas.  
Jei taikomas dinaminis bandymas, tinka pusiau statini ų bandym ų 
bandinių ėmimo režimas (bet „sen ų“ tirpalų analizė šiuo atveju 
netinka). Ta čiau, norint patikrinti bandomosios koncentracijos ver čių 
stabilumą, patartina pirm ąją savaitę bandinius imti dažniau (pvz., trys 
matavimų serijos). Šio tipo bandymuose skiediklio srautas ir bando ­
moji medžiaga turi b ūti kontroliuojami kasdien.  
Jei yra įrodymų, kad bandomosios medžiagos koncentracija vis ą 
bandymą gali būti išlaikyta ± 20 % vardin ės koncentracijos ar išma ­
tuotos pradin ės koncentracijos vert ės, rezultatai gali b ūti išreikšti 
vardinėmis ar išmatuotomis pradin ėmis vertėmis. Jei vardin ės ar 
išmatuotos pradin ės koncentracijos nuokrypis yra didesnis kaip ± 
20 %, rezultatai tur ėtų būti išreiškiami kaip laiko svorinis vidurkis 
(žr. 5 pried ėlį). 
2. DUOMENYS IR ATASKAITA  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Šio bandymo tikslas – nustatyti, kok į poveikį daro bandomoji 
medžiaga bendram kiekiui palikuoni ų, kuriuos atveda kiekvienas 
iki bandymo pabaigos gyvas išlik ęs motininis gyv ūnas. Bendras 
vieno motininio gyv ūno palikuoni ų skaičius apskai čiuojamas kiek ­
vienam bandymo indui (t. y. lygiagretusis bandinys). Jei kuriame 
nors inde motininis gyv ūnas atliekant bandym ą žūva arba pasirodo, 
kad yra vyriškos lyties, lygiagretusis bandinys iš analiz ės pašali­
namas. Tuomet analiz ė bus pagr įsta mažesniu skai čiumi lygiagre ­ 
čiųjų bandinių. 
Norint įvertinti LOEC, taigi ir NOEC, susijusi ą su chemin ės 
medžiagos poveikiu reprodukcijos našumui, b ūtina apskai čiuoti vidu ­
tinį reprodukcijos našum ą visiems kiekvienos koncentracijos lygia ­
gretiesiems bandiniams ir grupin į liekamąjį standartin į nuokryp į, o 
tai galima padaryti taikant dispersin ę analizę (ANOVA). Toliau kiek ­
vienos koncentracijos vidutin ė vertė turi būti palyginta su kontrolinio 
bandinio vidutine verte taikant atitinkam ą daugybinio lyginimo 
metodą. Gali būti naudingi Dunnetto ar Williamso bandymai (14) 
(15) (16) (17). B ūtina patikrinti, ar taikant dispersin ę analizę galioja 
sklaidos homogeniškumo prielaida. Rekomenduojama tai daryti 
grafiškai, o ne taikant formal ų reikšmingumo kriterij ų (18); tinkama 
alternatyva b ūtų Bartletto bandymas. Jei ši prielaida negalioja, 
reikėtų numatyti duomen ų transformavim ą sklaidoms homogenizuoti 
prieš atliekant dispersin ę analizę ar atlikti svorin ę dispersin ę analizę. 
Taikant dispersin ę analizę aptinkamo poveikio dydis (t. y. mažiausias 
reikšmingas skirtumas) turi b ūti apskaičiuotas ir pateiktas ataskaitoje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Koncentracijai, kuri sukelt ų reprodukcijos našumo sumaž ėjimą 50 % 
(t. y. EC  50 ), įvertinti pagal duomenis turi b ūti pritaikyta tinkama 
kreivė, pvz., logistin ė kreivė taikant statistin į, pvz., mažiausi ų kvad­
ratų, metodą. Kreivė galėtų būti parametrizuota taip, kad EC  50 ir jos 
standartin ė paklaida b ūtų įvertinta tiesiogiai. Tai labai palengvint ų 
EC 50 pasikliovimo rib ų apskaičiavimą. Jei nėra svarbių priežasčių, 
kodėl turėtų būti naudojami kiti pasikliovimo lygiai, turi b ūti nuro­
dyti dvipus ės 95 % pasikliovimo ribos. Pritaikymo metodika geriau 
turėtų numatyti b ūdą atitikties nebuvimo reikšmingumui įvertinti. Tai 
galima padaryti grafiškai arba liekam ąją kvadratų sumą padalijus į 
„atitikties nebuvimo“ dal į ir „grynos paklaidos komponent ų“ dalį ir 
daryti atitikties nebuvimo reikšmingumo tikrinim ą. Kadangi po apdo ­
rojimų, po kuri ų vaisingumas b ūna didelis, gali b ūti didesn ė 
jauniklių skaičiaus sklaida negu po apdorojim ų, po kuri ų vaisin­
gumas būna mažas, reik ėtų atsižvelgti į galimybę stebėtoms vert ėms 
taikyti svorinius koeficientus, kad b ūtų galima atspind ėti skirting ą 
sklaidą skirtingose apdorojimo grup ėse (žr. (18) nuorod ą, kurioje 
pateikiama pagrindin ė informacija).  
Analizuojant galutinio tarplaboratorinio bandymo duomenis (2), 
logistinė kreivė buvo pritaikyta naudojant š į modelį, nors galima 
naudoti kitus tinkamus modelius:  
Y ¼ Í 
ðcÞ 
Í 
1 þ Í ðxÞ 
ðx 0 Þ Î b Î Î 
Čia: 
Y = bendras jaunikli ų skaičius, tenkantis vienam gyvam motini ­
niam gyv ūnui bandymo pabaigoje (apskai čiuotas kiekvienam 
indui),  
x = medžiagos koncentracija,  
c = laukiamas jaunikli ų skaičius, kai x = 0,  
x 0 = populiacijos EC  50 , 
b = krypties koeficiento parametras.  
Šis modelis tur ėtų tikti daugeliui situacij ų, tačiau pasitaikys 
bandymų, kuriems jis netinka. Reik ėtų patikrinti modelio tinkamum ą, 
kaip užsiminta pirmiau. Kai kuriais atvejais gali tikti  hormesis  
modelis, kur į taikant b ūna didesnis maž ų koncentracijos ver čių 
poveikis (19).  
Gali būti įvertintos kitos poveikio koncentracijos vert ės, pvz., EC  10 
ar EC  20 , bet modelio parametrams nustatyti geresnis gali pasirodyti 
kitas būdas, nei buvo naudotas EC  50 įvertinti.  
2.2. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti: 
2.2.1.  Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir atitinkamos fizikin ės ir chemin ės savybės, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— cheminio identifikavimo duomenys, įskaitant grynum ą. 
2.2.2.  Bandomieji gyv ūnai: 
— klonas (jei nustatytas jo genotipas), tiek ėjas ar šaltinis (jei 
žinomas) ir taikytos auginimo s ąlygos. Jei naudojama ne  
Daphnia magna  rūšis, tai turi b ūti nurodyta ataskaitoje ir 
pagrįsta. 
2.2.3.  Bandymo s ąlygos:  
— taikyta bandymo metodika (pvz., pusiau statinis ar dinaminis 
bandymas, t ūris, įkrova ir  Daphnia  skaičius litrui),  
— apšvietimo trukm ė ir šviesos intensyvumas,  
— bandymo schema (pvz., lygiagre čiųjų bandinių skaičius, vieno 
lygiagrečiojo bandinio motinini ų gyvūnų skaičius), 
— naudotos auginimo terp ės detalės, 
— organin ės medžiagos priedai, jei naudoti, įskaitant sud ėtį, šaltinį, 
ruošimo metod ą, pradinių tirpalų TOC/COD, gaut ų bandymo 
terpės TOC/COD ver čių įvertinimas,  
— išsami informacija apie maitinim ą, įskaitant kiek į (mg  C/Daph­
nia/parai) ir programa (pvz., maisto r ūšies (-ių) tipas, įskaitant, 
jei tai dumbliai, specifin į pavadinim ą (rūšį) ir, jei žinomas, štam ą, 
auginimo s ąlygas),  
— pradini ų tirpalų paruošimo metodas ir atnaujinimo dažnumas 
(tirpiklis ar dispergatorius, jei naudojami, ir j ų koncentracija).  
2.2.4.  Rezultatai:  
— visų išankstini ų bandomosios medžiagos stabilumo tyrim ų rezul­
tatai,  
— bandomosios koncentracijos vardin ės vertės ir medžiagos kiekiui 
bandymo induose nustatyti analizi ų rezultatai (žr. 4 pried ėlio 
specifikacij ų pavyzdžius); taip pat ataskaitoje pateikiamas metodo 
regeneravimo našumas ir nustatymo riba,  
— vandens kokyb ė bandymo induose (t. y. pH, temperat ūra, ištir­
pusio deguonies koncentracija, TOC ir (ar) COD bei kietumas, jei tinka) (žr. 3 pried ėlio specifikacijos pavyzd į),
 
— išsamus kiekvieno motininio gyv ūno gyvų palikuoni ų registra­
vimas (žr. 3 pried ėlio specifikacijos pavyzd į), 
— nugaišusi ų motinini ų gyvūnų skaičius ir nugaišimo diena (žr. 3 
priedėlio specifikacijos pavyzd į), 
— kontrolini ų bandinių vaisingumo variacijos koeficientas (pagr įstas 
bendru gyv ų palikuoni ų skaičiumi, tenkan čiu vienam iki 
bandymo pabaigos gyvam išlikusiam motininiam gyv ūnui), 
— vienam iki bandymo pabaigos gyvam išlikusiam motininiam 
gyvūnui tenkan čio gyvų palikuoni ų bendro skai čiaus (kiekvienam 
lygiagrečiajam bandiniui) ir bandomosios medžiagos koncentra ­
cijos grafikas,  
— mažiausia pastebim ą poveik į reprodukcijai sukelianti 
koncentracija (LOEC), įskaitant taikyt ų statistinių metodikų apra­ 
šymą ir nurodym ą, kokio dydžio poveikis gali b ūti aptiktas, ir 
nepastebėto poveikio koncentracija (NOEC); jei tinka, taip pat 
turi būti pateikta motinini ų gyvūnų gaištamumo LOEC/NOEC,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— jei tinka, reprodukcijos EC  x ir pasikliovimo intervalai bei jai 
apskaičiuoti taikyto modelio grafikas, doz ės ir atsako kreiv ės 
krypties koeficientas ir jos standartin ė paklaida,  
— kiti steb ėti biologiniai rezultatai ar matavimai: pateikiami visi kiti 
pastebėti ar matuoti biologiniai rezultatai (pvz., motinini ų gyvūnų 
augimas), įskaitant bet kur į tinkamą pagrindim ą, 
— bet kokio nukrypimo nuo bandymo metodo pagrindimas.  
3. NUORODOS  
1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20–21 March 1993.  
2) OECD Environmental Health and SAFEty Publications. Series 
on Testing and Assessment No.6. Report of the Final Ring Test of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997.
 
3) Baird D.J., Barber J., Bradley M.C., Soares A.M.V.M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental SAFEty, 21, 257–265.
 
4) Elendt B.P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia magna  
Straus. Protoplasma, 154, 25–33.  
5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Orga ­
nisms. (Fourth ed.). EPA/600/4–90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
 
6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. Toxicol., 47, 775–782.  
7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. 
E729–88a. American Society for Testing and Materials, Phila ­
delphia P.A. 20 pp.  
8) Baird D.J., Soares A.M.V.M., Girling A., Barber J., Bradley 
M.C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; prob ­
lems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Confe ­
rence on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H. L0kke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.) pp 144–148.
 
9) Parkhurst B.R., Forte J.L. and Wright G.P. (1981). Reproduci ­
bility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna . Bull. 
Environ. Contam. and Toxicol., 26, 1–8.  
10) Cowgill U.M. and Milazzo D.P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. 
Arch. Hydrobiol., 120(2), 185–196.  
11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, 
F-1990. Biologice Prace, 36, 209.  
12) Sims I.R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard  
Daphnia  juvenile production test. Environmental Toxicology 
and Chemistry, 12, 2053–2058.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, 459–466.
 
14) Dunnett C.W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, 1096–1121.  
15) Dunnett C.W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482–491.  
16) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27, 103–117.  
17) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, 510–531.  
18) Draper N.R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, 
second edition, Wiley, N.Y.  
19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93–96.  
20) Wilson E.O. and Bossert, W.H. (1971). A Primer of Population 
Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
21) Poole R.W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. Mc 
Graw Hill Series in Population Biology, New York, p 532.  
22) Meyer J.S., Ingersoll C.G., McDonald L.L. and Boyce M.S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, 1156–1166.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
1 priedėlis 
VISIŠKAI APIBR ĖŽTŲ ELENDT M7 IR M4 TERPI Ų RUOŠIMAS  
Aklimatizavimas  Elendt  M7 ir M4 terp ėse 
Kai kurios laboratorijos tur ėjo sunkum ų, norėdamos dafnijas pernešti tiesiai į M4 
(1) ir M7 terpes. Ta čiau šiek tiek pasisek ė aklimatizuojant laipsniškai, t. y. 
perkeliant dafnijas iš j ų terpės į 30 %  Elendt , paskui į 60 %  Elendt  ir pagaliau 
į 100 %  Elendt . Gali reik ėti aklimatizuoti vis ą mėnesį. 
RUOŠIMAS  
Mikroelementai  
Atskirų mikroelement ų pradiniai tirpalai (I) iš pradži ų ruošiami naudojant 
tinkamo grynumo vanden į, pvz., dejonizuot ą, distiliuot ą arba atvirkštinio osmoso 
būdu gautą vandenį. Iš šių skirting ų tirpalų (I) ruošiamas antras pradinis 
tirpalas (II), kuriame yra visi mikroelementai (sud ėtinis tirpalas), t. y.:  
I pradinis tirpalas 
(atskira medžiaga)  Į vandenį įdėtas 
kiekis 
mg/l Koncentracija 
(lyginant su M4 
terpe) 
(kartų) Ruošiant bendr ą II pradin į tirpalą, į 
vandenį įpilto I pradinio tirpalo t ūris 
ml/l 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190  20 000  1,0  0,25  
MnCl  2 * 4H  2 O 7 210  20 000  1,0  0,25  
LiCl 6 120  20 000  1,0  0,25  
RbCl  1 420  20 000  1,0  0,25  
SrCl  2 * 6H  2 O 3 040  20 000  1,0  0,25  
NaBr  320  20 000  1,0  0,25  
Na 2 MoO  4 * 2H  2 O 1 260  20 000  1,0  0,25  
CuCl  2 * 2H  2 O 335  20 000  1,0  0,25  
ZnCl  2 260 20 000  1,0  1,0  
CuCl  2 * 6H  2 O 200  20 000  1,0  1,0  
KI 65  20 000  1,0  1,0  
Na 2 SeO  3 43,8 20 000  1,0  1,0  
NH  4 VO  3 11,5 20 000  1,0  1,0  
Na 2 EDTA * 2H  2 O 5 000  2 000  —  —  
FeSO  4 * 7H  2 O 1 991  2 000  —  —  
Na 2 EDTA ir FeSO  4 tirpalai ruošiami atskirai, v ėliau supilami kartu ir iškart apdorojami autoklave. Taip gaunamas:  
21 Fe-EDTA tirpalas  1 000  20,0  5,0  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
M4 ir M7 terp ės 
M4 ir M7 terp ės naudojant II pradin į tirpalą, makroelementus ir vitaminus yra 
ruošiamos taip:  
Į vandenį įdėtas 
kiekis 
mg/l Koncentracija 
(lyginant su M4 
terpe) 
(kartų) Terpei paruošti įpilto pradinio tirpalo 
tūris 
ml/l 
M4 M7  
II pradinis vis ų mikroelement ų tirpalas  20  50  50  
Mitybinių makroelement ų pradiniai tirpalai (atskira medžiaga)  
CaCl  2 * 2H  2 O 293 800  1 000  1,0  1,0  
MgSO  4 * 7H  2 O 246 600  2 000  0,5  0,5  
KCl 58 000  10 000  0,1  0,1  
NaHCO  3 64 800  1 000  1,0  1,0  
Na 2 SiO  3 * 9H  2 O 50 000  5 000  0,2  0,2  
NaNO  3 2 740  10 000  0,1  0,1  
KH  2 PO 4 1 430  10 000  0,1  0,1  
K 2 HPO  4 1 840  10 000  0,1  0,1  
Vitaminų mišinio pradinis tirpalas  —  10 000  0,1  0,1  
Vitaminų mišinio pradinis tirpalas ruošiamas į 1 litrą įdedant toki ų šių vitaminų kiekį: 
Tiamino hidrochloridas  750  10 000  —  —  
Ciankobalaminas (B  12 ) 10  10 000  —  —  
Biotinas  7,5  10 000  —  —  
Vitaminų mišinio pradinis tirpalas laikomas užšaldytas mažomis alikvotin ėmis dalimis. Į terpę vitaminai dedami prieš pat naudojim ą. 
Pastaba  Jei ruošdami galutin ę terpę norite išvengti drusk ų nuosėdų susidarymo, įpilkite alikvotines pradinio tirpalo dalis į maždaug 
500–800 ml dejonizuoto vandens ir praskieskite iki 1 litro.  
Pastaba  Pirmąją publikacij ą apie M4 terp ę galima rasti Elendt, B. P. (1990).  Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructural 
approach to antennal damage in Daphnia magna Straus . Protoplasma, 154, p. 25–33.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
2 priedėlis 
BENDROSIOS ORGANIN ĖS ANGLIES (TOC) ANALIZ Ė IR DUMBLI Ų 
MAISTO TOC KIEKIO NOMOGRAM Ų GAVIMAS  
Pripažinta, kad dumbli ų maisto anglies kiekis tiesioginiu metodu paprastai nema ­
tuojamas, bet taikoma jo koreliacija (t. y. nomogramos) su pakeitimo parametrais, pvz., dumbli ų ląstelių skaičiumi ar šviesos absorbcija.
 
TOC reik ėtų matuoti taikant oksidavimo aukštos temperat ūros sąlygomis metod ą, 
bet ne UV ar persulfatin į metodą (žr. The Instrumental Determination of Total 
Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn , London WC1V 6HB).
 
Nomogramai gauti dumbliai ir auginimo terp ė atskiriami centrifuguojant, paskui 
dumbliai v ėl suspenduojami distiliuotame vandenyje. Kiekvieno bandinio pakei ­
timo parametras ir TOC koncentracija matuojami tris kartus. Analizuojami disti ­
liuoto vandens tuštieji bandiniai ir j ų TOC koncentracija atimama iš dumbli ų 
bandinio TOC koncentracijos.  
Nomograma nustatytam anglies koncentracij ų diapazonui tur ėtų būti tiesinė. 
Pavyzdžiai pateikti toliau.  
Pastaba. J ų negalima naudoti perskai čiavimams; svarbu, kad laboratorijos tur ėtų 
savo darytas nomogramas.
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼C1 
3 priedėlis 
TERPĖS ATNAUJINIMO, FIZIKOCHEMINIO MONITORINGO, MAITINIMO, DAFNIJ Ų REPRODUKCIJOS IR SUAUGUSI Ų GYVŪNŲ GAIŠTAMUMO DUOMEN Ų 
REGISTRAVIMO LENTEL ĖS PAVYZDYS  
Bandymo Nr.:  Pradžios data:  Klonas:  Terp ė: Maisto tipas:  Bandomoji medžiaga:  Vardin ė konc.:  
Para 0  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  
Terpės atnaujinimas 
(dėti varnelę) 
pH (  1 ) naujos  
senos  
O 2 mg/l (  1 ) naujos  
senos  
Temperat ūra °C (  1 ) naujos  
senos  
Duota maisto (d ėti 
varnelę) 
Nėra gyvų 
palikuoni ų ( 2 ) Bendras  
1 indas  
2 
3 
4 
5
 2008R0440 — L T — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼C1 
Bandymo Nr.:  Pradžios data:  Klonas:  Terp ė: Maisto tipas:  Bandomoji medžiaga:  Vardin ė konc.:  
Para 0  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  
6 
7 
8 
9 
10 
Bendras  
Bendras suaugusi ų gyvūnų 
gaištamumas (  3 ) 
( 1 ) Nurodomas bandymui naudotas indas. 
( 2 ) Registruojamas vis ų suaugusi ų gyvūnų giaštamumas, atitinkamame langelyje įrašant „„M““ 
( 3 ) Registruojami neapvaisinti kiaušiniai, aitinkamame langelyje įrašant „„AB““
 4 priedėlis 
CHEMIN ĖS ANALIZ ĖS REZULTAT Ų REGISTRAVIMO LENTEL ĖS PAVYZDYS  
a) Išmatuotos koncentracijos vert ės 
Vardinė konc.  1 savaitės bandinys  2 savai čių bandinys  3 savai čių bandinys  
Šviežias  Senas  Šviežias  Senas  Šviežias  Senas  
b) Išmatuotos koncentracijos vert ės, išreikštos vardin ės koncentracijos procentine dalimi  
Vardinė konc.  1 savaitės bandinys  2 savai čių bandinys  3 savai čių bandinys  
Šviežias  Senas  Šviežias  Senas  Šviežias  Senas  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
5 priedėlis 
LAIKO SVERTINIO VIDURKIO APSKAI ČIAVIMAS  
Laiko svertinis vidurkis  
Darant prielaid ą, kad bandomosios medžiagos koncentracija laikotarpyje tarp 
terpės atnaujinim ų gali maž ėti, būtina nustatyti koncentracijos vert ę, kuri atspin ­
dėtų motinines dafnijas veikian čios medžiagos koncentracijos ver čių diapazon ą. 
Pasirinkimas turi b ūti pagrįstas biologiniais ir statistiniais sumetimais. Pvz., jei 
manoma, kad reprodukcij ą labiausiai veikia didžiausia koncentracija, reikia 
naudoti didžiausios koncentracijos vert ę. Tačiau jei svarbesniu laikomas kaupia ­
masis ar ilgalaikis toksiškos medžiagos poveikis, labiau tinka koncentracijos 
vidurkis. Šiuo atveju tinkamas naudoti vidurkis yra laiko svertin ė vidutinė 
koncentracijos vert ė, nes ją nustatant atsižvelgiama į momentin į koncentracijos 
kitimą laike.  
1 paveikslas  
Laiko svertinio vidurkio pavyzdys
  
1 paveiksle pateiktas septyni ų parų trukmės (supaprastinto) bandymo pavyzdys, 
terpę atnaujinant 0, 2 ir 4 par ą. 
Zigzagas rodo koncentracijos vert ę bet kuriuo matavimo momentu. Daroma prie ­
laida, kad koncentracijos maž ėjimas atitinka irimo pagal eksponent ę procesą. 
Šeši pažym ėti taškai rodo stebimas koncentracij ų vertes, išmatuotas kiekvieno 
atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje.  
Stora linija rodo laiko svertinio vidurkio pad ėtį. 
Laiko svertinis vidurkis apskai čiuojamas taip, kad plotas po laiko svertinio 
vidurkio tiese yra lygus plotui po koncentracijos kitimo kreive. Pirmiau pateikto 
pavyzdžio apskai čiavimas parodytas 1 lentel ėje. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
1 lentelė 
Laiko svertinio vidurkio apskai čiavimas  
Atnaujinimo Nr.  Paros  Konc. 0  Konc. 1  Ln(konc. 0)  Ln(konc. 1)  Plotas  
1 2  10,000  4,493  2,303  1,503  13,767  
2 2  11,000  6,037  2,398  1,798  16,544  
3 3  10,000  4,066  2,303  1,403  19,781  
Bendras par ų skaičius: 7  Bendras 
plotas  50,091  
LS vidurkis  7,156  
„Paros“ – atnaujinimo laikotarpio par ų skaičius, 
„Konc. 0“ – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje išmatuota koncentracija,  
„konc. 1“ – kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pabaigoje išmatuota koncentracija,  
„Ln(konc. 0)“ – konc. 0 nat ūralusis logaritmas,  
„Ln(konc. 1)“ – konc. 1 nat ūralusis logaritmas,  
„Plotas“ – plotas po eksponent ės kreive kiekvienam atnaujinimo laikotarpiui. Jis 
apskaičiuojamas:  
Plotas ¼ Í ðConc 0 – Conc 1Þ 
ðLnðConc 0Þ – LnðConc 1ÞÞ Î 
Ü Paros  
Laiko svertinis vidurkis („LS vidurkis“) yra „bendro ploto“ ir „bendro par ų 
skaičiaus“ dalmuo.  
Savaime aišku, kad darant dafnij ų reprodukcijos bandym ą lentelė turėtų būti 
išplėsta iki 21 paros.  
Aišku, kad matuojant tik kiekvieno atnaujinimo laikotarpio pradžioje ir pabaigoje 
neįmanoma patvirtinti, kad irimo procesas iš tikr ųjų vyksta eksponentiškai. Kito ­
kiai kreivei b ūtų gautas kitas ploto apskai čiavimo rezultatas. Ta čiau irimo pagal 
eksponentin ę kreivę procesas n ėra neįmanomas ir, kai n ėra kitos informacijos, tai 
turbūt labiausiai naudoti tinkama kreiv ė. 
Tačiau reikia b ūti atsargiems, jei, atnaujinimo laikotarpio pabaigoje atliekant 
cheminę analizę, nerandama jokios medžiagos. Jei negalima įvertinti, kaip greitai 
medžiaga išnyko iš tirpalo, ne įmanoma gauti tikrojo ploto po kreive, taigi ne įma­
noma gauti pagr įsto laiko svertinio vidurkio.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. AZOTO TRANSFOR ­
MAVIMO BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 216 (2000).  
1.1. ĮVADAS  
Šiame bandymo metode aprašytas laboratorinis metodas, skirtas ilga ­
laikiam poveikiui azoto virsme dalyvaujan čių dirvožemio mikroorga ­
nizmų aktyvumui tirti, kai chemine medžiaga paveikiama vien ą 
kartą. Bandymas iš esm ės pagrįstas Europos ir Viduržemio j ūros 
augalų apsaugos organizacijos ( European and Mediterranean Plant 
Protection Organization ) rekomendacijomis (1). Ta čiau buvo atsiž ­
velgta ir į kitus nurodymus, įskaitant Vokietijos  Biologische Bunde ­
sanstalt  (2), JAV aplinkos apsaugos agent ūros (3) SETAC (4) ir 
Tarptautin ės standartizacijos organizacijos (5) rekomendacijas. Belgi ­
rate, Italijoje, 1995 m. vykusiame OECD seminare d ėl dirvožemi ų ir 
nuosėdinių uolienų atrankos (6) buvo susitarta d ėl šiame bandyme 
naudojam ų dirvožemi ų skaičiaus ir tipo. Dirvožemio ėminių ėmimo, 
tvarkymo ir laikymo rekomendacijos pagr įstos ISO rekomendaciniu 
dokumentu (7) ir Belgirato seminaro rekomendacijomis. Įvertinant 
bandomųjų medžiagų toksiškumo charakteristikas, gali tekti nustatyti 
jų poveikį dirvožemio mikrobiniam aktyvumui, pvz., kai reikia tur ėti 
duomenų apie galim ą šalutinį augalų apsaugos produkt ų poveikį 
dirvožemio mikroflorai arba kai tikimasi kit ų nei augal ų apsaugos 
produktai chemini ų medžiag ų poveikio dirvožemio mikroorganiz ­
mams. Azoto transformavimo bandymas atliekamas siekiant nustatyti tokių chemini ų medžiag ų poveikį dirvožemio mikroflorai. Jei 
bandomos agrochemin ės medžiagos (pvz., augal ų apsaugos 
produktai, tr ąšos, miškininkyst ėje naudojamos chemin ės medžiagos), 
atliekami azoto transformavimo ir anglies transformavimo bandymai. Jei bandomos ne agrochemin ės medžiagos, pakanka azoto transfor ­
mavimo bandymo. Ta čiau jei atliekant toki ų chemini ų medžiag ų 
azoto transformavimo bandym ą jų EC
 50 vertės patenka į intervalą, 
nustatytą prekyboje esantiems nitrifikacijos inhibitoriams (pvz., nitra ­
pirinui), papildomai informacijai gauti gali b ūti atliekamas anglies 
transformavimo bandymas.  
Dirvožem į sudaro gyvieji ir negyvieji komponentai, esantys sud ėti­
nuose ir heterogeniniuose mišiniuose. Mikroorganizmai vaidina 
svarbų vaidmen į vykstant derling ų dirvožemi ų organini ų medžiag ų 
skaidymui ir transformavimui, kai didelis r ūšių skaičius prisideda 
prie įvairių dirvožemio derlingumo aspekt ų. Visi ilgalaikiai toki ų 
biochemini ų procesų trukdžiai gali pažeisti mitybini ų element ų 
ciklą, o tai gali pakeisti dirvožemio derlingum ą. Anglies ir azoto 
transformavimas vyksta visuose derlinguose dirvožemiuose. Nors už šiuos procesus atsakingos mikrobiologin ės kolonijos įvairiuose 
dirvožemiuose yra skirtingos, transformavimo keliai iš esm ės yra 
tokie patys.
 
Aprašytas bandymo metodas skirtas ilgalaikiam neigiamam 
medžiagos poveikiui azoto transformavimui aerobiniuose pavirši ­
niuose dirvožemiuose nustatyti. Be to, taikant š į bandymo metod ą 
galima įvertinti medžiag ų poveikį dirvožemio mikroflora sukeliamam 
anglies transformavimui. Nutr ūkus anglies ir azoto jungtims, vyksta 
nitratų susidarymas. Taigi jei nustatoma, kad apdorotame ir kontro ­
liniame dirvožemyje nitrat ų susidarymo greitis yra vienodas, yra 
didelė tikimybė, kad pagrindiniai anglies skaidymo keliai yra nepa ­
liesti ir funkcionuoja. Bandymui pasirinktas substratas (liucernos milteliai) turi palank ų anglies ir azoto santyk į (paprastai nuo 12/1 
iki 16/1). D ėl šios priežasties anglies tr ūkumas atliekant bandym ą 
sumažėja ir jei chemin ė medžiaga pažeist ų mikrobiologines kolo ­
nijas, jos gal ėtų atsistatyti per 100 par ų.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Bandymai, pagal kuriuos parengtas šis bandymo metodas, iš pradži ų 
buvo skirti medžiagoms, kuri ų kiekį, pasiekiant į dirvožem į, buvo 
galima numatyti. Tai pasitaiko, pvz., naudojant augal ų apsaugos 
produktus, kuri ų laukuose barstomos medžiagos norma yra žinoma. 
Bandant agrochemines medžiagas, pakanka dviej ų dozių, atitinkan čių 
numatom ą arba prognozuojam ą naudojimo norm ą. Agrochemines 
medžiagas galima bandyti kaip veikliuosius ingredientus (v. i.) arba kaip preparatus. Ta čiau bandymas neapsiriboja agrochemin ėmis 
medžiagomis. Kei čiant į dirvožem į dedamos bandomosios medžiagos 
kiekį ir duomen ų įvertinimo b ūdą, bandym ą dar galima naudoti 
cheminėms medžiagoms, kuri ų kiekis, tik ėtinai patenkantis į dirvo­ 
žemį, yra nežinomas. Taigi, jei tai ne agrochemin ės medžiagos, 
nustatomas medžiagos keli ų koncentracijos ver čių poveikis azoto 
transformavimui. Ši ų bandym ų duomenys yra naudojami doz ės ir 
reakcijos santykio kreivei gauti ir EC
 × vertėms apskai čiuoti, kai x 
yra apibrėžiamas kaip poveikio %.  
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Azoto transformavimas  – azoto turin čios organin ės medžiagos skai ­
dymas mikroorganizmais iki atitinkamo galutinio produkto, neorga ­
ninio nitrato, vykstant amonifikacijos ir nitrifikacijos procesams.  
EC x (efektyvioji koncentracija)  – bandomosios medžiagos koncent ­
racija dirvožemyje, kai azoto transformavimas į nitratą inhibuojamas 
x procent ų. 
EC 50 (vidutinė efektyvioji koncentracija)  – bandomosios medžiagos 
koncentracija dirvožemyje, kai azoto transformavimas į nitratą inhi­
buojamas 50 procent ų (50 %).  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Sijotas dirvožemis apdorojamas bandom ąja medžiaga arba palie ­
kamas neapdorotas (kontrolinis). Jei bandomos agrochemin ės 
medžiagos, rekomenduojama naudoti mažiausiai dvi bandymo koncentracijas, kurios pasirenkamos pagal didžiausi ą lauke numa ­
tomą koncentracij ą. Po 0, 7, 14 ir 28 inkubavimo par ų apdoroti ir 
kontroliniai dirvožemio ėminiai ekstrahuojami atitinkamu tirpikliu ir 
ekstraktuose nustatomas nitrato kiekis. Lyginamas nitrato susidarymo greitis apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose ir apskai čiuojamas 
apdorotojo ėminio procentinis nuokrypis nuo kontrolinio ėminio. 
Visi bandymai atliekami mažiausiai 28 paras. Jei 28 par ą apdoroto 
ir neapdoroto dirvožemio skirtumas yra lygus arba didesnis kaip 25 %, matavimai t ęsiami ne ilgiau kaip iki 100 par ų. Jei bandomos 
ne agrochemin ės medžiagos, į dirvožemio ėminius dedama keli ų 
koncentracijos ver čių bandomoji medžiaga, o susidariusio nitrato 
kiekis apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose matuojamas po 28 
inkubavimo par ų. Daugini ų koncentracijos ver čių bandymų rezultatai 
analizuojami taikant regresijos model į ir apskai čiuojamos EC
 × vertės 
(t. y. EC  50 , EC  25 ir (arba) EC  10 ). Žr. apibr ėžtis. 
1.5. BANDYMO TINKAMUMAS  
Bandymų su agrochemin ėmis medžiagomis rezultatai pagr įsti paly­
ginti mažu (t. y. vidutin ė vertė ± 25 %) nitrato koncentracijos kontro ­
liniame ir apdorotame dirvožemio ėminyje skirtumu, taigi didel ė 
kontrolini ų ėminių duomen ų sklaida gali b ūti klaiding ų rezultatų 
priežastimi. Tod ėl kartotini ų kontrolini ų ėminių rezultatai neturi 
skirtis daugiau kaip ± 15 %.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Aparat ūra 
Naudojami bandymo indai, pagaminti iš chemiškai inertiškos 
medžiagos. Jie turi b ūti reikiamos talpos atsižvelgiant į dirvožemio 
inkubavimui taikom ą metodik ą, t. y. viso vieno ėminio arba keli ų 
atskirų dirvožemio dalini ų ėminių inkubavim ą (žr. 1.7.1.2 skirsn į). 
Reikia stengtis kiek įmanoma sumažinti vandens nuostolius, bet tuo 
pačiu užtikrinti duj ų mainus atliekant bandym ą (pvz., indai gali b ūti 
uždengiami polietileno pl ėvele su skylut ėmis). Bandant laki ąsias 
medžiagas, reikia naudoti uždaromus ir sandarius dujoms indus. J ų 
dydis pasirenkamas taip, kad dirvožemio ėminys sudaryt ų maždaug 
vieną ketvirtąją indo tūrio. 
Naudojama tipin ė laboratorin ė įranga, įskaitant ši ą: 
— maišymo įtaisas: mechanin ė purtyklė arba lygiavert ė įranga,  
— centrifuga (3 000 g) arba filtravimo įtaisas (filtravimo popierius 
be nitratų), 
— atitinkamo jautrumo ir atkuriamumo nitrat ų analizės prietaisas.  
1.6.2.  Dirvožemi ų pasirinkimas ir skai čius 
Naudojamas vienos r ūšies dirvožemis. Rekomenduojamas dirvo ­ 
žemis, kurio charakteristikos:  
— smėlio kiekis: ne mažesnis kaip 50 % ir ne didesnis kaip 75 %;  
— pH: 5,5– 7,5;  
— organin ės anglies kiekis: 0,5–1,5 %;  
— turėtų būti matuojama mikrobin ė biomasė (8)(9), ir jos anglies 
kiekis turi sudaryti ne mažiau kaip 1 % bendrosios dirvožemio organinės anglies.
 
Dirvožemis, kurio tokios charakteristikos, dažniausiai atitinka 
blogiausią atvejį, kadangi chemin ės medžiagos absorbcija yra 
mažiausia, o mikrofloros galimyb ė jos gauti yra didžiausia. Taigi 
bandymų su kitais dirvožemiais paprastai nereikia atlikti. Ta čiau 
tam tikromis aplinkyb ėmis, pvz., jei medžiag ą iš esmės numatoma 
naudoti konkre čiame dirvožemyje, pvz., r ūgščiajame miško dirvože ­
myje, arba jei naudojamos elektrostatin į krūvį turinčios chemin ės 
medžiagos, gali tekti naudoti papildom ą dirvožem į. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Dirvožemio ėminių rinkimas ir laikymas  
1.6.3.1.  Rinkimas  
Reikia tur ėti išsamios informacijos apie lauko viet ą, iš kurios imamas 
bandymo dirvožemis. Nurodoma tiksli pad ėtis, augal ų danga, apdo ­
rojimo augal ų apsaugos produktais datos, apdorojimas organin ėmis ir 
neorganin ėmis trąšomis, biologini ų priedų dėjimas arba atsitiktiniai 
teršalai. Dirvožemio ėmimui pasirinkta vieta tur ėtų užtikrinti ilgalaik į 
naudojim ą. Tinka nuolatin ės ganyklos, laukai su kasmetiniais gr ūdi­
niais augalais (išskyrus kukur ūzus) arba tankiai pas ėtų žaliųjų trąšų 
laukai. Pasirinkta ėminio ėmimo vieta neturi b ūti apdorota augal ų 
apsaugos produktais mažiausiai vienerius metus prieš ėminių 
ėmimą. Be to, mažiausiai šešis m ėnesius neturi b ūti dedama orga ­
ninių trąšų. Mineralines tr ąšas galima naudoti tik tuo atveju, jei to 
reikia pas ėliams, o dirvožemio ėminiai imami ne anks čiau kaip trys 
mėnesiai po tr ęšimo. Reikia vengti naudoti dirvožem į, apdorot ą 
trąšomis, turin čiomis žinom ų biocidini ų savybių (pvz., kalcio ciana ­
midu).  
Reikia vengti imti ėminius esant ilgalaikiam (ilgesniam kaip 30 par ų) 
sausros arba potvynio laikotarpiui arba iš karto jam pasibaigus. Ariamų dirvožemi ų ėminiai imami iš 0–20 cm gylio. Pievose (gany ­
klose) arba kitame ilg ą laiką (bent vien ą auginimo sezon ą) nearia­
muose dirvožemiuose didžiausias ėminio ėmimo gylis gali b ūti šiek 
tiek didesnis kaip 20 cm (pvz., iki 25 cm).
 
Dirvožemio ėminiai vežami tokiuose induose ir esant tokioms tempe ­
ratūros sąlygoms, kurios neleist ų reikšmingai pakisti pradin ėms 
dirvožemio savyb ėms. 
1.6.3.2.  Laikymas  
Pageidautina naudoti neseniai lauke paimtus dirvožemius. Jei laikymo 
laboratorijoje ne įmanoma išvengti, dirvožemis gali b ūti ne ilgiau kaip 
tris mėnesius laikomas tamsoje, esant 4 ± 2 °C. Lakant dirvožemius, 
turi būti užtikrintos aerobin ės sąlygos. Jei dirvožemis imamas iš 
vietovių, kuriose jis b ūna įšalęs mažiausiai tris m ėnesius per metus, 
jį galima laikyti šešis m ėnesius, esant nuo –18 °C iki –22 °C. 
Laikomo dirvožemio mikrobin ė biomasė matuojama prieš kiekvien ą 
bandymą ir biomas ės anglis turi sudaryti mažiausiai 1 % viso dirvo ­ 
žemio organin ės anglies kiekio (žr. 1.6.2 skirsn į). 
1.6.4.  Dirvožemio tvarkymas ir ruošimas bandymui  
1.6.4.1.  Pradinis inkubavimas  
Jei dirvožemis buvo laikomas saugykloje (žr. 1.6.3.2 skirsn į), reko­
menduojamas pradinis inkubavimas, kurio trukm ė būtų nuo 2 iki 28 
parų. Temperat ūra ir dirvožemio dr ėgmės kiekis pradinio inkubavimo 
laikotarpiu turi atitikti bandymo s ąlygas (žr. 1.6.4.2 ir 1.7.1.3 skirs ­
nius)..  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Fizikin ės ir chemin ės savybės 
Iš dirvožemio rankiniu b ūdu pašalinami dideli daiktai (pvz., 
akmenys, augal ų dalys ir t. t.), tuomet dr ėgnas dirvožemis sijojamas 
iki 2 mm arba mažesni ų dalelių, neleidžiant jam perdaug išdži ūti. 
Drėgmės kiekis dirvožemio ėminyje reguliuojamas distiliuotu arba 
dejonizuotu vandeniu iki vert ės, sudaran čios 40–60 % didžiausios 
vandens sulaikymo gebos.  
1.6.4.3.  Gerinimas pridedant organinio substrato  
Dirvožem į reikėtų pagerinti atitinkamu organiniu substratu, pvz., 
žaliosios liucernos mas ės milteliais (pagrindinis komponentas:  Medi­
cago sativa ), kurių C/N santykis yra nuo 12/1 iki 16/1. Rekomen ­
duojamas liucernos ir dirvožemio santykis yra 5 g liucernos vienam kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos mas ės).
 
1.6.5.  Bandomosios medžiagos ruošimas įterpti į dirvožem į 
Bandomoji medžiaga paprastai įterpiama naudojant nešikl į. Nešikliu 
gali būti vanduo (vandenyje tirpi ų medžiag ų) arba inertin ė kietoji 
medžiaga, pvz., smulkus kvarcinis sm ėlis (daleli ų dydis: 0,1–0,5 
mm). Kit ų nei vanduo skyst ųjų nešiklių (pvz., organini ų tirpiklių, 
pvz., acetono, chloroformo) reik ėtų vengti, kadangi jie gali pakenkti 
mikroflorai. Jei kaip nešiklis naudojamas sm ėlis, jo daleles galima 
padengti bandom ąja medžiaga, ištirpinta arba suspenduota atitinka ­
mame tirpiklyje. Tokiais atvejais prieš maišant su dirvožemiu 
tirpiklis išgarinamas. Siekiant optimaliai paskirstyti bandom ąją 
medžiagą dirvožemyje, rekomenduojama naudoti 10 g sm ėlio vienam 
kilogramui dirvožemio (sausos medžiagos mas ės). Kontroliniai 
ėminiai apdorojami tik lygiaver čiu vandens ir (arba) kvarcinio sm ėlio 
kiekiu.  
Jei bandomos lakiosios chemines medžiagos, apdorojant reikia kiek 
įmanoma vengti nuostoli ų ir stengtis užtikrinti tolyg ų pasiskirstym ą 
dirvožemyje (pvz., bandom ąją medžiag ą reikėtų įšvirkšti keliose 
dirvožemio vietose).  
1.6.6.  Bandymo koncentracijos vert ės 
Jei bandomos agrochemin ės medžiagos, naudojamos mažiausiai 
dvejopa koncentracija. Mažesn ė koncentracija tur ėtų rodyti bent 
didžiausią kiekį, kuris tik ėtinai pasiekt ų dirvožem į praktinėmis sąly­
gomis, tuo tarpu didesn ė koncentracija tur ėtų būti mažesn ės koncent ­
racijos kartotinis dydis. Į dirvožem į įterpiamos bandomosios 
medžiagos koncentracijos vert ės apskaičiuojamos darant prielaid ą 
apie tolyg ų įterpimą į 5 cm gyl į ir dirvožemio santykin į tankį 1,5. 
Agrochemini ų medžiag ų, tiesiogiai įterpiamų į dirvožem į, arba 
cheminių medžiag ų, kurių dirvožem į pasiekiantis kiekis gali b ūti 
numatytas, rekomenduojamos bandymo koncentracijos vert ės yra 
didžiausia numatoma aplinkos koncentracija ( Predicted Environ ­
mental Concentration  - PEC) ir penkis kartus didesn ė koncentracija. 
Medžiagos, kurias numatoma įterpti į dirvožem į kelis kartus per 
vieną sezoną, bandomos esant koncentracijos vert ėms, gautoms 
PEC vert ę padauginus iš didžiausio numatomo įterpimų skaičiaus. 
Tačiau viršutin ė bandymo koncentracijos vert ė neturi b ūti daugiau 
kaip dešimt kart ų didesnė už didžiausi ą vienkartinio įterpimo norm ą. 
Jei bandomos ne agrochemin ės medžiagos, naudojama mažiausiai 
penkių koncentracijos ver čių eilė pagal geometrin ę progresij ą. 
Bandymo koncentracijos vert ės turi atitikti interval ą, reikaling ą 
EC × vertėms nustatyti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.7.1.  Veikimo s ąlygos  
1.7.1.1.  Apdorojami ir kontroliniai ėminiai  
Jei bandomos agrochemin ės medžiagos, dirvožemis dalijamas į tris 
vienodos mas ės dalis. Dvi dalys maišomos su produkto turin čiu 
nešikliu, o tre čioji maišoma su nešikliu be produkto (kontrolinis 
bandymas). Rekomenduojama paruošti mažiausiai tris kartotinius apdorotų dalių ir neapdorotos dalies dirvožemio ėminius. Jei 
bandomos ne agrochemin ės medžiagos, dirvožemis dalijamas į šešias 
vienodos mas ės dalis. Penki ėminiai maišomi su bandomosios 
medžiagos turin čiu nešikliu, o šeštasis ėminys sumaišomas su 
nešikliu be chemin ės medžiagos. Rekomenduojama paruošti bent 
tris apdorot ų dirvožemio dali ų ir neapdorotos dirvožemio dalies 
kartotinius ėminius. Reikia stengtis užtikrinti tolyg ų bandomosios 
medžiagos pasiskirstym ą apdorotuose dirvožemio ėminiuose. 
Maišant reik ėtų vengti dirvožemio sutankinimo ir grumst ų susida­
rymo.
 
1.7.1.2.  Dirvožemio ėminių inkubavimas  
Dirvožemio ėminius galima inkubuoti dviem b ūdais: kaip vientisus 
kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio ėminius arba kaip 
seriją atskirų ir vienodo dydžio kiekvieno apdoroto ir neapdoroto 
dirvožemio m ėginių. Tačiau bandant laki ąsias medžiagas bandymas 
atliekamas tik vienu b ūdu, naudojant atskir ų mėginių seriją. Kai 
dirvožemis inkubuojamas kaip vientisas ėminys, ruošiamas didelis 
kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio kiekis ir prireikus imami jo m ėginiai analizei atliekant bandym ą. Kiekvienam apdo ­
rotam ir kontroliniam ėminiui iš pradži ų paruoštas kiekis priklauso 
nuo mėginių dydžio, analizei naudojam ų kartotinių mėginių skaičiaus 
ir nuo numatomo didžiausio m ėginių ėmimo kart ų skaičiaus. Dirvo ­ 
žemiai, inkubuojami kaip vientisas ėminys, prieš imant m ėginius turi 
būti gerai sumaišomi. Kai dirvožemiai inkubuojami kaip serija 
atskirų dirvožemio m ėginių, kiekvienas apdorotas ir neapdorotas 
vientisas dirvožemio ėminys dalijamas į reikiamą mėginių
 skaičių, 
kurie prireikus yra naudojami. Atliekant bandymus, kuriuose gali 
būti numatyta m ėginius imti daugiau kaip du kartus, reikia paruošti 
pakankam ą skaičių mėginių, kad būtų galima atsižvelgti į visus 
kartotinius m ėginius ir m ėginių ėmimo kart ų skaičių. Mažiausiai 
trys bandymo dirvožemio kartotiniai ėminiai inkubuojami aerobi ­
nėmis sąlygomis (žr. 1.7.1.1 skirsn į). Atliekant visus bandymus 
turi būti naudojami atitinkami indai su pakankamo t ūrio laisvąja 
erdve, kad b ūtų išvengta anaerobini ų sąlygų. Kai bandomos lakiosios 
medžiagos, bandymas turi b ūti atliekamas naudojant serij ą atskirų 
mėginių. 
1.7.1.3.  Bandymo s ąlygos ir trukm ė 
Bandymas atliekamas tamsoje, esant 20 ± 2 °C temperat ūrai. 
Drėgmės kiekis dirvožemio ėminiuose vis ą bandymo laik ą turi būti 
palaikomas ± 5 % tikslumu ir turi sudaryti nuo 40 % iki 60 % dirvo ­ 
žemio didžiausios vandens sulaikymo gebos (žr. 1.6.4.2 skirsn į). 
Prireikus galima įpilti distiliuoto arba dejonizuoto vandens.  
Mažiausia bandym ų trukmė – 28 dienos. Jei bandomos agrochemin ės 
medžiagos, lyginamas nitrat ų susidarymo greitis apdorotuose ir kont ­
roliniuose ėminiuose. Jei 28 par ą jis skiriasi daugiau kaip 25 %, 
bandymas t ęsiamas tol, kol gaunamas 25 % arba mažesnis skirtumas, 
bet ne ilgiau kaip 100 par ų. Jei bandomos ne agrochemin ės 
medžiagos, bandymas baigiamas po 28 par ų. 28 parą nustatomas 
nitratų kiekis apdorotuose ir kontroliniuose dirvožemio ėminiuose 
ir apskaičiuojamos EC  x vertės. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Dirvožemi ų ėminių ėmimas ir analiz ė 
1.7.2.1.  Dirvožemio ėminių ėmimo grafikas  
Jei bandomos agrochemin ės medžiagos, dirvožemio ėminiai nitratui 
nustatyti analizuojami 0, 7, 14 ir 28 par ą. Jei bandym ą reikia tęsti, 
papildomi matavimai po 28 dienos daromi kas 14 par ų. 
Jei bandomos ne agrochemin ės medžiagos, naudojamos mažiausiai 
penkios bandymo koncentracijos vert ės ir dirvožemio ėminiai nitratui 
nustatyti analizuojami prieš bandymo pradži ą (0 parų) ir veikimo 
laikotarpiui pasibaigus (28 par ą). Jei manoma, kad b ūtinas tarpinis 
matavimas, j į galima daryti, pvz., 7 par ą. Duomenys, gauti 28 par ą, 
naudojami chemin ės medžiagos EC  × vertei nustatyti. Jei pageidau ­
jama, 0 dienos kontrolini ų ėminių duomenys gali b ūti naudojami 
pradinei nitrato koncentracijai dirvožemyje pateikti.  
1.7.2.2.  Dirvožemio ėminių analizė 
Kiekvieną kartą paėmus ėminius, nustatomas nitrato kiekis, kuris 
susidaro kiekviename apdorotame ir kontroliniame kartotiniame ėminyje. Nitratas ekstrahuojamas iš dirvožemio ėminius purtant 
atitinkamame ekstrahavimo tirpiklyje, pvz., 0,1 mol/l kalio chlorido 
tirpale. Rekomenduojamas santykis 5 ml KC1 tirpalo vienam gramui 
dirvožemio, skai čiuojant sauso dirvožemio masei. Ekstrahavimui 
optimizuoti, dirvožemio ir ekstrahavimo tirpalo t ūris neturi b ūti 
didesnis kaip pus ė indo tūrio. Mišiniai purtomi 60 min. esant 150 
min
 -1 apsisukim ų dažniui. Mišiniai centrifuguojami arba filtruojami 
ir skystoji faz ė analizuojama nitratui nustatyti. Daleli ų neturinčius 
skystuosius ekstraktus galima laikyti prieš analiz ę ne ilgiau kaip 
šešis mėnesius, esant -20 ± 5 °C.  
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Jei bandomos agrochemin ės medžiagos, užrašomas kiekviename 
kartotiniame dirvožemio ėminyje susidariusio nitrato kiekis ir vis ų 
kartotinių ėminių vidutinės vertės pateikiamos lentel ėse. Azoto trans ­
formavimo greitis įvertinamas taikant atitinkamus visuotinai priimtus 
statistinius metodus (pvz., F bandym ą, 5 % reikšmingumo lygmuo). 
Susidariusio nitrato kiekis išreiškiamas mg nitrato/kg sauso dirvože ­
mio/parai. Nitrato susidarymo kiekviename apdorotame ėminyje 
greitis lyginamas su grei čiu, gautu kontroliniam ėminiui, ir apskai ­ 
čiuojama procentais išreikšta nuokrypio nuo kontrolinio ėminio 
vertė. 
Jei bandomos ne agrochemin ės medžiagos, nustatomas kiekviename 
kartotiniame ėminyje susidariusio nitrato kiekis, ir EC  × vertėms įver­
tinti braižoma doz ės ir reakcijos santykio kreiv ė. Nitrato kiekis (t. y. 
mg nitrato/kg sauso dirvožemio), nustatytas apdorotuose ėminiuose 
po 28 par ų, lyginamas su kontroliniuose ėminiuose nustatytu kiekiu. 
Pagal šiuos duomenis kiekvienai bandymo koncentracijai apskai čiuo­
jamos inhibavimo % vert ės. Šios procentin ės vertės pateikiamos 
grafike kaip koncentracijos funkcija, ir EC  × vertėms apskai čiuoti 
taikomos statistin ės metodikos. Be to, taikant tipines metodikas 
(10) (11) (12), nustatomos apskai čiuotos EC  × vertės pasikliovimo 
ribos (p = 0,95).  
Didelį azoto kiek į turinčios bandomosios medžiagos gali prisid ėti 
prie susidariusio nitrato kiekio padid ėjimo atliekant bandym ą. Jei 
šios medžiagos bandomos esant j ų didelei koncentracijai (pvz., 
cheminės medžiagos, kurias numatoma naudoti dedant kelis kartus), 
į bandymo schem ą turi būti įtraukti atitinkami kontroliniai ėminiai 
(t. y. dirvožemis su bandom ąja medžiaga, bet be augalini ų miltų). Į 
šių kontrolini ų ėminių duomenis turi b ūti atsižvelgta apskai čiuojant 
EC × vertes.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Jei vertinant agrochemini ų medžiag ų bandymų rezultatus, ėminyje, 
turinčiame mažesn ę koncentracij ą (t. y. didžiausi ą numatom ą 
koncentracij ą), ir kontroliniame ėminyje nitrato susidarymo grei čio 
skirtumas yra lygus 25 % arba mažesnis bet kuriuo m ėginio ėmimo 
metu po 28 paros, produkt ą galima įvertinti kaip nedarant į ilgalaikio 
poveikio azoto transformavimui dirvožemiuose. Kai įvertinami kit ų 
nei agrochemin ės medžiagos chemini ų medžiagų bandymo rezultatai, 
naudojamos EC  50 , EC  25 ir (arba) EC  10 vertės. 
3. ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
Išsamus naudojamo dirvožemio identifikavimas, įskaitant:  
— geografin ę vietos nuorod ą (platuma, ilguma),  
— informacija apie vietos istorij ą (t. y. augalin ė danga, apdorojimas 
augalų apsaugos produktais, apdorojimas tr ąšomis, atsitiktiniai 
teršalai ir t. t.),  
— naudojimo paskirtis (pvz., žem ės ūkio paskirties žem ė, miškas ir t. t.),  
— ėminio ėmimo gylis (cm),  
— smėlio/dumblo/molio kiekis (% sausos medžiagos mas ės), 
— pH vert ė (vandenyje),  
— organin ės anglies kiekis (% sausos medžiagos mas ės), 
— azoto kiekis (% sausos medžiagos mas ės), 
— pradin ė nitrato koncentracija (mg nitrato/kg sausos medžiagos 
masės), 
— jonų mainų geba (mmol/kg),  
— mikrobin ė biomas ė, išreikšta bendrosios organin ės anglies 
procentine dalimi,  
— metod ų, taikytų kiekvienam parametrui nustatyti, nuorodos,  
— visa informacija apie dirvožemio ėminių ėmimą ir laikym ą, 
— išsami informacija apie pradin į dirvožemio inkubavim ą, jei 
daromas.  
Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir, jei tinka, fizikin ės ir chemin ės savybės, 
— cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka, įskaitant strukt ūrinę 
formulę, grynum ą (t. y. augal ų apsaugos produkt ų atveju veik ­
liojo ingrediento procentin ę dalį), azoto kiek į. 
Substratas:  
— substrato šaltinis,  
— sudėtis (t. y. liucernos miltai, žaliosios liucernos mas ės miltai),  
— anglies, azoto kiekis (% sausos medžiagos mas ės), ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
— sieto aku čių dydis (mm).  
Bandymo s ąlygos:  
— išsami informacija apie dirvožemio gerinim ą organiniu substratu,  
— naudot ų bandomosios medžiagos koncentracijos ver čių skaičius 
ir, jei tinka, pasirinkt ų koncentracijos ver čių pagrindimas,  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos įterpimą į dirvo­ 
žemį, 
— inkubavimo temperat ūra, 
— drėgmės kiekis dirvožemyje pradedant bandym ą ir jį atliekant,  
— taikytas dirvožemio inkubavimo metodas (t. y. kaip vientisas 
ėminys arba kaip keli m ėginiai),  
— kartotini ų ėminių skaičius, 
— ėminių ėmimo skai čius, 
— metodas, taikomas nitratui iš dirvožemio ekstrahuoti.  
Rezultatai:  
— analiz ės metodika ir įranga, naudota nitratui analizuoti,  
— lenteli ų duomenys, įskaitant atskiras ir vidutines nitrato analiz ės 
vertes,  
— apdorot ų ir kontrolini ų kartotini ų ėminių rezultatų nuokrypis,  
— apskai čiavimams darom ų pataisų aiškinimai, jei tinka,  
— procentais išreikštas nitrato susidarymo grei čio nuokrypis kiek ­
vieną kartą imant m ėginį, arba, jei tinka, EC  50 vertė esant 95 
procentų pasikliovimo ribai, kitos EC  x vertės (t. y. EC  25 arba 
EC 10 ) ir pasikliovimo ribos, doz ės ir reakcijos santykio kreiv ės 
grafikas,  
— statistinis rezultat ų apdorojimas,  
— visa informacija ir pasteb ėjimai, kurie pad ėtų aiškinti rezultatus.  
4. NUORODOS  
1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994.
 
2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990).  
3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  
4) SET AC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
 
5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the 
Influence of Chemicals on these Processes. Technical 
Committee ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality – BiologicalMethods . ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.  
7) ISO 10381–6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
8) ISO 14240–1 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.  
9) ISO 14240–2 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113.
 
11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  DIRVOŽEMIO MIKROORGANIZMAI. ANGLIES TRANS ­
FORMAVIMO BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 217 (2000).  
1.1. ĮVADAS  
Šiame bandymo metode aprašytas laboratorinis metodas, skirtas ilga ­
laikiam poveikiui azoto transformavime dalyvaujan čių dirvožemio 
mikroorganizm ų aktyvumui tirti, kai chemine medžiaga paveikiama 
vieną kartą. Bandymas iš esm ės pagrįstas Europos ir Viduržemio 
jūros augal ų apsaugos organizacijos rekomendacijomis (1). Ta čiau 
buvo atsižvelgta į kitus nurodymus, įskaitant Vokietijos  Biologische 
Bundesanstalt  (2), JAV aplinkos apsaugos agent ūros (3) SET AC (4) 
rekomendacijas. Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame OECD semi ­
nare dėl dirvožemi ų ir nuosėdinių uolienų atrankos (5) buvo susitarta 
dėl šiame bandyme naudojam ų dirvožemi ų skaičiaus ir tipo. Dirvo ­ 
žemio ėminių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomendacijos pagr įstos 
ISO rekomendaciniu dokumentu (6) ir Belgirato seminaro rekomen ­
dacijomis.  
Vertinant bandom ųjų medžiag ų toksiškumo charakteristikas, gali 
tekti nustatyti j ų poveikį dirvožemio mikrobiniam aktyvumui, pvz., 
kai reikia tur ėti duomen ų apie galim ą šalutinį augalų apsaugos 
produktų poveikį dirvožemio mikroflorai arba kai tikimasi kit ų nei 
augalų apsaugos produktai chemini ų medžiag ų poveikio dirvožemio 
mikroorganizmams. Anglies transformavimo bandymas atliekamas 
siekiant nustatyti toki ų chemini ų medžiag ų poveikį dirvožemio 
mikroflorai. Jei bandomos agrochemin ės medžiagos (pvz., augal ų 
apsaugos produktai, tr ąšos, miškininkyst ėje naudojamos chemin ės 
medžiagos), atliekami anglies ir azoto transformavimo bandymai. 
Jei bandomos ne agrochemin ės medžiagos, pakanka azoto transfor ­
mavimo bandymo. Ta čiau jei atliekant toki ų chemini ų medžiag ų 
azoto transformavimo bandym ą, jų EC  50 vertės patenka į intervalą, 
nustatytą prekyboje esantiems nitrifikacijos inhibitoriams (pvz., nitra ­
pirinui), papildomai informacijai gauti gali b ūti atliekamas anglies 
transformavimo bandymas.  
Dirvožem į sudaro gyvieji ir negyvieji komponentai, esantys sud ėti­
nuose ir heterogeniniuose mišiniuose. Mikroorganizmai vaidina 
svarbų vaidmen į vykstant derling ų dirvožemi ų organini ų medžiag ų 
skaidymui ir transformavimui, kai didelis r ūšių skaičius prisideda 
prie įvairių dirvožemio derlingumo aspekt ų. Visi ilgalaikiai toki ų 
biochemini ų procesų trukdžiai gali pažeisti mitybini ų element ų 
ciklą, o tai gali pakeisti dirvožemio derlingum ą. Anglies ir azoto 
transformavimas vyksta visuose derlinguose dirvožemiuose. Nors už šiuos procesus atsakingos mikrobiologin ės kolonijos įvairiuose 
dirvožemiuose yra skirtingos, transformavimo keliai iš esm ės yra 
tokie patys.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Šis bandymo metodas skirtas nustatyti ilgalaik į neigiamą medžiagos 
poveikį anglies transformavimui aerobiniuose paviršiniuose dirvože ­
miuose. Šis bandymas yra jautrus už anglies transformavim ą atsa­
kingų mikrobini ų kolonijų dydžio ir aktyvumo poky čiams, kadangi 
atliekant š į bandymą, kolonijos patiria cheminio poveikio įtampą ir 
anglies bad ą. Naudojamas sm ėlėtas dirvožemis, turintis mažai orga ­
ninių medžiagų. Šis dirvožemis apdorojamas bandom ąja medžiaga ir 
inkubuojamas s ąlygomis, kurios užtikrina greit ą mikrobin ę medžiagų 
apykaitą. Šiomis s ąlygomis greitai išsenka lengvai iš dirvožemio 
įsisavinamos anglies šaltiniai. Tai sukelia anglies tr ūkumą, dėl 
kurio žūsta mikrob ų ląstelės ir atsiranda neveiklumo b ūsena ir 
(arba) sporuliacija. Jei bandymas trunka ilgiau kaip 28 paras, galima išmatuoti ši ų reakcijų sumą (neapdoroto dirvožemio) kontroliniuose 
ėminiuose, kaip laipsnišk ą veikliosios mikrobin ės biomasės, dalyvau ­
jančios medžiag ų apykaitoje, maž
ėjimą (7). Jei dirvožemyje su 
anglies tr ūkumu biomas ė bandymo s ąlygomis yra veikiama dirvože ­
myje esan čios chemin ės medžiagos, biomas ės kiekis gali neatsistatyti 
iki kontroliniame ėminyje esan čio kiekio. Tod ėl bet kuriuo bandymo 
metu bandomosios medžiagos sukelti trukdžiai dažnai t ęsiasi iki 
bandymo pabaigos.  
Bandymai, naudoti šiam bandymo metodui parengti, iš pradži ų buvo 
skirti medžiagoms, kuri ų kiekį, pasiekiant į dirvožem į, buvo galima 
numatyti. Taip pasitaiko, pvz., naudojant augal ų apsaugos produktus, 
kurių laukuose barstomos medžiagos norma yra žinoma. Bandant 
agrochemines medžiagas, pakanka dviej ų dozių, atitinkan čių numa­
tomą arba prognozuojam ą naudojimo norm ą. Agrochemines 
medžiagas galima bandyti kaip veikliuosius ingredientus (v.i.) arba kaip preparatus. Ta čiau bandymas neapsiriboja chemin ėmis medžia ­
gomis, turin čiomis prognozuojamas aplinkos koncentracijos vertes. 
Keičiant į dirvožem į dedamos bandomosios medžiagos kiek į ir 
duomenų įvertinimo b ūdą, bandym ą dar galima naudoti chemin ėms 
medžiagoms, kuri ų kiekis, tik ėtinai patenkantis į dirvožem į, yra neži ­
nomas. Taigi jei tai ne agrochemin ės medžiagos, nustatomas 
medžiagos keli ų koncentracijos ver čių poveikis anglies transforma ­
vimui. Ši ų bandym ų duomenys yra naudojami doz ės ir reakcijos 
santykio kreivei gauti ir EC
 x vertėms apskai čiuoti, kai x yra apibr ė­ 
žiamas kaip poveikio %.  
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Anglies transformavimas  – organin ės medžiagos skaidymas mikro ­
organizmais iki atitinkamo neorganinio galutinio produkto – anglies dioksido.
 
EC x (efektyvioji koncentracija)  – bandomosios medžiagos koncent ­
racija dirvožemyje, kai anglies transformavimas į anglies dioksid ą 
inhibuojamas x procent ų. 
EC 50 (vidutinė efektyvioji koncentracija)  – bandomosios medžiagos 
koncentracija dirvožemyje, kai anglies transformavimas į anglies 
dioksidą inhibuojamas 50 procent ų. 
1.3 ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Nėra. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Sijotas dirvožemis apdorojamas bandom ąja medžiaga arba palie ­
kamas neapdorotas (kontrolinis). Jei bandomos agrochemin ės 
medžiagos, rekomenduojama naudoti mažiausiai dvejop ą bandymo 
koncentracij ą, kuri pasirenkama pagal didžiausi ą lauke numatom ą 
koncentracij ą. Po 0, 7, 14 ir 28 inkubavimo par ų apdoroti ir kontro ­
liniai dirvožemio ėminiai maišomi su gliukoze ir 12 h nepertrau ­
kiamai matuojamas gliukoz ės sukeliamo kv ėpavimo greitis. Kv ėpa­
vimo greitis yra išreiškiamas kaip išsiskyrusio anglies dioksido (mg anglies dioksido/kg sauso dirvožemio/h) arba suvartoto deguonies 
(mg deguonies/kg dirvožemio/h) kiekis. Vidutinis kv ėpavimo greitis 
apdorotame dirvožemyje lyginamas su kv ėpavimo grei čiu kontroli ­
niame ėminyje ir apskai čiuojamas apdorotojo ėminio procentinis 
nuokrypis nuo kontrolinio ėminio. Visi bandymai atliekami mažiau ­
siai 28 paras. Jei 28 par ą apdoroto ir neapdoroto dirvožemio skir ­
tumas yra lygus arba didesnis kaip 25 %, matavimai t ęsiami kas 14 
parų ne daugiau kaip iki 100 par ų. Jei bandomos ne agrochemin ės 
medžiagos, į dirvožemio ėminius dedama keli ų koncentracijos ver čių 
bandomoji medžiaga, ir po 28 par ų matuojamas gliukoz ės sukeliamo 
kvėpavimo greitis (t. y. susidariusio anglies dioksido arba suvartoto 
deguonies vidutinis kiekis). Koncentracijos ver čių serijos bandym ų 
rezultatai analizuojami taikant regresijos model į ir apskai č
iuojamos 
EC x vertės (t. y. EC  50 , EC  25 ir (arba) EC  10 ). Žr. apibr ėžtis. 
1.5. BANDYMO TINKAMUMAS  
Bandymų su agrochemin ėmis medžiagomis rezultatai pagr įsti paly­
ginti mažu (t. y. vidutin ė vertė ± 25 %) išsiskyrusio anglies dioksido 
arba suvartoto deguonies kiekio kontroliniame ir apdorotame dirvo ­ 
žemio ėminyje skirtumu, taigi didel ė kontrolini ų ėminių duomen ų 
sklaida gali b ūti klaiding ų rezultatų priežastimi. Tod ėl kartotini ų 
kontrolini ų ėminių rezultatų skirtumas turi b ūti mažesnis kaip ± 
15 %.  
1.6. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.6.1.  Aparat ūra 
Naudojami bandymo indai, pagaminti iš chemiškai inertiškos 
medžiagos. Jie turi b ūti reikiamos talpos atsižvelgiant į dirvožemi ų 
inkubavimui taikom ą metodik ą, t. y. viso vieno ėminio arba keli ų 
atskirų dirvožemio dalini ų ėminių inkubavim ą (žr. 1.7.1.2 skirsn į). 
Reikia stengtis kiek įmanoma sumažinti vandens nuostolius, bet tuo 
pačiu užtikrinti duj ų mainus atliekant bandym ą (pvz., indai gali b ūti 
uždengiami polietileno pl ėvele su skylut ėmis). Bandant laki ąsias 
medžiagas, reikia naudoti uždaromus ir sandarius dujoms indus. J ų 
dydis pasirenkamas taip, kad dirvožemio ėminys sudaryt ų maždaug 
vieną ketvirtąją indo tūrio. 
Gliukozės sukeliamam kv ėpavimui nustatyti reikia tur ėti inkubavimo 
sistemas ir prietaisus anglies dioksido susidarymui arba deguonies 
suvartojimui matuoti. Toki ų sistemų pavyzdžiai ir prietaisai aprašyti 
literatūroje (8) (9) (10) (11).  
1.6.2.  Dirvožemi ų pasirinkimas ir skai čius 
Naudojamas vienos r ūšies dirvožemis. Rekomenduojamas dirvo ­ 
žemis, kurio charakteristikos:  
— smėlio kiekis: ne mažesnis kaip 50 % ir ne didesnis kaip 75 %,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5– 7,5,  
— organin ės anglies kiekis: 0,5– 1,5 %,  
— matuojama mikrobin ė biomasė (12)(13) ir jos anglies kiekis turi 
sudaryti ne mažiau kaip 1 % bendrosios dirvožemio organin ės 
anglies.  
Dirvožemis, kurio tokios charakteristikos, dažniausiai atitinka 
blogiausią atvejį, kadangi chemin ės medžiagos absorbcija yra 
mažiausia, o mikrofloros galimyb ė jos gauti yra didžiausia. Taigi 
bandymų su kitais dirvožemiais paprastai nereikia atlikti. Ta čiau 
tam tikromis aplinkyb ėmis, pvz., jei medžiag ą iš esmės numatoma 
naudoti konkre čiame dirvožemyje, pvz., r ūgščiajame miško dirvože ­
myje, arba naudojamos elektrostatin į krūvį turinčios chemin ės 
medžiagos, gali tekti naudoti papildom ą dirvožem į. 
1.6.3.  Dirvožemio ėminių rinkimas ir laikymas  
1.6.3.1.  Rinkimas  
Reikia tur ėti išsamios informacijos apie lauko viet ą, iš kurios imamas 
bandymo dirvožemis. Nurodoma tiksli pad ėtis, augal ų danga, apdo ­
rojimo augal ų apsaugos produktais datos, apdorojimas organin ėmis ir 
neorganin ėmis trąšomis, biologini ų priedų dėjimas arba atsitiktiniai 
teršalai. Dirvožemio ėmimui pasirinkta vieta tur ėtų užtikrinti ilgalaik į 
naudojim ą. Tinka nuolatin ės ganyklos, laukai su kasmetiniais gr ūdi­
niais augalais (išskyrus kukur ūzus) arba tankiai pas ėtų žaliųjų trąšų 
laukai. Pasirinkta ėminio ėmimo vieta neturi b ūti apdorojama augal ų 
apsaugos produktais mažiausiai vienerius metus iki ėminių ėmimo. 
Be to, mažiausiai šešis m ėnesius netur ėjo būti dedama organini ų 
trąšų. Mineralines tr ąšas galima naudoti tik tuo atveju, jei to reikia 
pasėliams, o dirvožemio ėminiai imami ne anks čiau kaip trys m ėne­
siai po tr ęšimo. Reikia vengti naudoti dirvožem į, apdorotą trąšomis, 
turinčiomis žinom ų biocidini ų savybių (pvz., kalcio cianamidas).  
Reikia vengti imti ėminius esant ilgalaikiam (ilgesniam kaip 30 par ų) 
sausros arba potvynio laikotarpiui arba iš karto jam pasibaigus. Ariamų dirvožemi ų ėminiai imami iš 0–20 cm gylio. Pievose (gany ­
klose) arba kituose ilg ą laiką (bent vien ą auginimo sezon ą) nearia­
muose dirvožemiuose didžiausias ėminio ėmimo gylis gali b ūti šiek 
tiek didesnis kaip 20 cm (pvz., iki 25 cm). Dirvožemio ėminiai 
vežami tokiuose induose ir esant tokioms temperat ūros sąlygoms, 
kurios neleist ų reikšmingai pakisti pradin ėms dirvožemio savyb ėms.
 
1.6.3.2.  Laikymas  
Pageidautina naudoti neseniai lauke paimtus dirvožemius. Jei 
laikymo laboratorijoje ne įmanoma išvengti, dirvožemiai gali b ūti 
ne ilgiau kaip tris m ėnesius laikomi tamsoje, esant 4 ± 2 °C. Laikant 
dirvožem į, turi būti užtikrintos aerobin ės sąlygos. Jei dirvožemis 
imamas iš vietovi ų, kuriose jis b ūna įšalęs mažiausiai tris m ėnesius 
per metus, j į galima laikyti šešis m ėnesius, esant –18 °C. Laikomo 
dirvožemio mikrobin ė biomasė matuojama prieš kiekvien ą bandymą 
ir biomas ės anglis turi sudaryti mažiausiai 1 % viso dirvožemio 
organinės anglies kiekio (žr. 1.6.2 skirsn į). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  Dirvožemio tvarkymas ir ruošimas bandymui  
1.6.4.1.  Pradinis inkubavimas  
Jei dirvožemis buvo laikomas saugykloje (žr. 1.6.4.2 ir 1.7.1.3 skirs ­
nius), rekomenduojama daryti pradin į inkubavim ą, kurio trukm ė būtų 
nuo 2 iki 28 par ų. Temperat ūra ir dirvožemio dr ėgmės kiekis 
pradinio inkubavimo laikotarpiu turi atitikti bandymo s ąlygas (žr. 
1.6.4.2 ir 1.7.1.3 skirsnius).  
1.6.4.2.  Fizikin ės ir chemin ės savybės 
Iš dirvožemio rankiniu b ūdu pašalinami dideli daiktai (pvz., 
akmenys, augal ų dalys ir t. t.), tuomet dr ėgnas dirvožemis sijojamas 
iki 2 mm arba mažesni ų dalelių. Drėgmės kiekis dirvožemio ėminyje 
reguliuojamas distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu iki vert ės, suda­
rančios 40–60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos.  
1.6.5.  Bandomosios medžiagos ruošimas įterpti į dirvožem į 
Bandomoji medžiaga paprastai įterpiama naudojant nešikl į. Kaip 
nešiklis gali b ūti naudojamas vanduo (vandenyje tirpi ų medžiag ų) 
arba inertin ė kietoji medžiaga, pvz., smulkus kvarcinis sm ėlis 
(dalelių dydis: 0,1– 0,5 mm). Kit ų nei vanduo skyst ųjų nešiklių 
(pvz., organini ų tirpiklių, pvz., acetono, chloroformo) reik ėtų vengti, 
kadangi jie gali kenkti mikroflorai. Jei kaip nešiklis naudojamas 
smėlis, jo daleles galima padengti bandom ąja medžiaga, ištirpinta 
arba suspenduota atitinkamame tirpiklyje. Tokiais atvejais prieš maišant su dirvožemiu tirpiklis išgarinamas. Siekiant optimaliai 
paskirstyti bandom ąją medžiag ą dirvožemyje, rekomenduojama 
naudoti 10 g sm ėlio vienam kilogramui dirvožemio (sausos 
medžiagos mas ės). Kontroliniai ėminiai apdorojami tik lygiaver čiu 
vandens ir (arba) kvarcinio sm ėlio kiekiu.
 
Jei bandomos lakiosios chemin ės medžiagos, apdorojant reikia kiek 
įmanoma vengti nuostoli ų ir stengtis užtikrinti tolyg ų pasiskirstym ą 
dirvožemyje (pvz., bandom ąją medžiag ą reikėtų įšvirkšti keliose 
dirvožemio vietose).  
1.6.6.  Bandymo koncentracijos vert ės 
Jei bandomi augal ų apsaugos produktai arba kitos numatomos 
aplinkos koncentracijos medžiagos, turi b ūti bandoma mažiausiai 
dvejopa koncentracija. Mažesn ė koncentracija tur ėtų rodyti bent 
didžiausią kiekį, kuris tik ėtinai pasiekt ų dirvožem į praktinėmis sąly­
gomis, tuo tarpu didesn ė koncentracija tur ėtų būti mažesn ės koncent ­
racijos kartotinis dydis. Į dirvožem į įterpiamos bandomosios 
medžiagos koncentracijos vert ės apskaičiuojamos darant prielaid ą 
apie tolyg ų įterpimą į 5 cm gyl į ir dirvožemio santykin į tankį 1,5. 
Agrochemini ų medžiag ų, tiesiogiai įterpiamų į dirvožem į, arba 
cheminių medžiag ų, kurių dirvožem į pasiekiantis kiekis gali b ūti 
numatytas, rekomenduojamos bandymo koncentracijos vert ės yra 
didžiausia numatoma aplinkos koncentracija ( Predicted Environ ­
mental Concentration – PEC ) ir penkis kartus didesn ė koncentracija. 
Medžiagos, kurias numatoma įterpti į dirvožem į kelis kartus per 
vieną sezoną, bandomos esant koncentracijos vert ėms, gautoms  
PEC  vertę padauginus iš didžiausio numatomo įterpimų skaičiaus. 
Tačiau viršutin ė bandymo koncentracijos vert ė neturi b ūti daugiau 
kaip dešimt kart ų didesnė už didžiausi ą vienkartinio įterpimo norm ą. 
Jei bandomos ne agrochemin ės medžiagos, naudojama mažiausiai 
penkių koncentracijos ver čių eilė pagal geometrin ę progresij ą. 
Bandymo koncentracijos vert ės turi atitikti interval ą, reikaling ą EC  x 
vertėms nustatyti.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.7.1.  Veikimo s ąlygos  
1.7.1.1.  Apdorojami ir kontroliniai ėminiai  
Jei bandomos agrochemin ės medžiagos, dirvožemis dalijamas į tris 
vienodos mas ės dalis. Dvi dalys maišomos su produkto turin čiu 
nešikliu, o tre čioji maišoma su nešikliu be produkto (kontrolinis 
bandymas). Rekomenduojama paruošti mažiausiai tris kartotinius apdorotų dalių ir neapdorotos dalies dirvožemio ėminius. Jei 
bandomos ne agrochemin ės medžiagos, dirvožemis dalijamas į šešias 
vienodos mas ės dalis. Penki ėminiai maišomi su bandomosios 
medžiagos turin čiu nešikliu, o šeštasis ėminys sumaišomas su 
nešikliu be chemin ės medžiagos. Rekomenduojama paruošti mažiau ­
siai tris apdorot ų dirvožemio dali ų ir neapdorotos dirvožemio dalies 
kartotinius ėminius. Reikia stengtis užtikrinti tolyg ų bandomosios 
medžiagos pasiskirstym ą apdorotuose dirvožemio ėminiuose. 
Maišant reik ėtų vengti dirvožemio sutankinimo ir grumst ų susida­
rymo.
 
1.7.1.2.  Dirvožemio ėminių inkubavimas  
Dirvožemio ėminius galima inkubuoti dviem b ūdais: kaip vientisus 
kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio ėminius arba kaip 
seriją atskirų ir vienodo dydžio kiekvieno apdoroto ir neapdoroto 
dirvožemio m ėginių. Tačiau bandant laki ąsias medžiagas, bandymas 
atliekamas tik vienu b ūdu, naudojant atskir ų mėginių seriją. Kai 
dirvožemis inkubuojamas kaip vientisas ėminys, ruošiamas didelis 
kiekvieno apdoroto ir neapdoroto dirvožemio ėminio kiekis ir 
prireikus imami jo m ėginiai analizei atliekant bandym ą. Kiekvienam 
apdorojimui ir kontroliniams ėminiams iš pradži ų paruoštas kiekis 
priklauso nuo m ėginių dydžio, analizei naudojam ų kartotini ų 
mėginių skaičiaus ir nuo numatomo didžiausio m ėginių ėmimo 
kartų skaičiaus. Dirvožemis, inkubuojamas kaip vientisas ėminys, 
prieš imant m ėginius turi b ūti gerai sumaišomas. Kai dirvožemis 
inkubuojamas kaip serija atskir ų dirvožemio m ėginių, kiekvienas 
apdorotas ir neapdorotas vientisas dirvožemio ėminys dalijamas į 
reikiamą mėginių skaičių, kurie prireikus yra naudojami. Atliekant 
bandymus, kuriuose gali b ūti numatyta m ėginius imti daugiau kaip 
du kartus, reikia paruošti pakankam ą skaičių mėginių, kad būtų 
galima atsižvelgti į visus kartotinius m ėginius ir m ėginių ėmimo 
kartų skaičių. Mažiausiai trys bandymo dirvožemio kartotiniai 
ėminiai inkubuojami aerobin ėmis sąlygomis (žr. 1.7.1.1 skirsn į). 
Atliekant visus bandymus turi b ūti naudojami atitinkami indai su 
pakankamo t ūrio laisvąja erdve, kad b ūtų išvengta anaerobini ų 
sąlygų. Kai bandomos lakiosios medžiagos, bandymas turi b ūti atlie­
kamas naudojant serij ą atskirų mėginių. 
1.7.1.3.  Bandymo s ąlygos ir trukm ė 
Bandymas atliekamas tamsoje, esant 20 ± 2 °C temperat ūrai. 
Drėgmės kiekis dirvožemio ėminiuose vis ą bandymo laik ą turi būti 
palaikomas ± 5 % tikslumu ir turi sudaryti nuo 40 % iki 60 % dirvo ­ 
žemio didžiausios vandens sulaikymo gebos (žr. 1.6.4.2 skirsn į). 
Prireikus galima įpilti distiliuoto arba dejonizuoto vandens.  
Mažiausia bandym ų trukmė – 28 dienos. Jei bandomos agrochemin ės 
medžiagos, lyginami išsiskyrusio anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekiai apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose. Jei 28 
parą jie skiriasi daugiau kaip 25 %, bandymas t ęsiamas tol, kol 
gaunamas 25 % arba mažesnis skirtumas, bet ne ilgiau kaip 100 parų. Jei bandomos ne agrochemin ės medžiagos, bandymas 
baigiamas po 28 par ų. 28 parą nustatomas išsiskyrusio anglies diok ­
sido arba suvartoto deguonies kiekis apdorotuose ir kontroliniuose 
dirvožemio ėminiuose ir apskai čiuojamos EC
 x vertės. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Dirvožemi ų ėminių ėmimas ir analiz ė 
1.7.2.1.  Dirvožemio ėminių ėmimo grafikas  
Jei bandomos agrochemin ės medžiagos, dirvožemio ėminiai gliu ­
kozės sukeliamo kv ėpavimo grei čiui nustatyti analizuojami 0, 7, 14 
ir 28 par ą. Jei bandym ą reikia tęsti, papildomi matavimai po 28 
paros daromi kas 14 par ų. 
Jei bandomos ne agrochemin ės medžiagos, naudojamos mažiausiai 
penkios bandymo koncentracijos vert ės ir dirvožemio ėminiai gliu ­
kozės sukeliamo kv ėpavimo grei čiui nustatyti analizuojami prieš 
bandymo pradži ą (0 parų) ir veikimo laikotarpiui pasibaigus (28 
parą). Jei manoma, kad b ūtinas tarpinis matavimas, j į galima daryti, 
pvz., 7 par ą. Duomenys, gauti 28 par ą, naudojami chemin ės 
medžiagos EC  x vertei nustatyti. Jei pageidaujama, 0 dienos kontro ­
linių ėminių duomenys gali b ūti naudojami pradiniam veikliosios 
mikrobinės biomas ės, dalyvaujan čios medžiag ų apykaitoje, kiekiui 
dirvožemyje įvertinti (12).  
1.7.2.2.  Gliukoz ės sukeliamo kv ėpavimo grei čio matavimas  
Gliukozės sukeliamo kv ėpavimo greitis kiekviename apdorotame ir 
kontroliniame kartotiniame ėminyje nustatomas kiekvien ą kartą 
paėmus mėginius. Dirvožemio m ėginiai maišomi su pakankamu gliu ­
kozės kiekiu didžiausiai betarpiškai kv ėpavimo reakcijai nustatyti. 
Gliukozės kiekis, reikalingas konkretaus dirvožemio didžiausiai 
kvėpavimo reakcijai nustatyti, gali b ūti įvertintas, atliekant pradin į 
bandymą su keliomis gliukoz ės koncentracijos vert ėmis (14). Ta čiau 
smėlio dirvožemiui, turin čiam 0,5–1,5 % organin ės anglies, paprastai 
pakanka 2 000–4 000 mg gliukoz ės vienam kg sauso dirvožemio. 
Gliukozę galima sumalti į miltelius su švariu kvarciniu sm ėliu 
(10 g sm ėlio/kg sauso dirvožemio) ir paruošti vienalyt į mišinį su 
dirvožemiu.  
Gliukoze pagerinto dirvožemio ėminiai inkubuojami tinkamame 
aparate kv ėpavimo grei čiui matuoti nepertraukiamai, kas valand ą 
arba kas dvi valandas (žr. 1.6.1 skirsn į), esant 20 ± 2 °C. Išsiskyrusio 
anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis matuojamas 12 h iš eilės, matavimus pradedant kiek įmanoma anks čiau, t. y. 1–2 h po 
gliukozės pridėjimo. Išmatuojamas bendras per 12 h išsiskyrusio 
anglies dioksido arba suvartoto deguonies kiekis ir nustatomas vidu ­
tinis kvėpavimo greitis.
 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Jei bandomos agrochemin ės medžiagos, užrašomas kiekviename 
kartotiniame dirvožemio ėminyje susidariusio anglies dioksido arba 
suvartoto deguonies kiekis ir vis ų kartotini ų ėminių vidutinės vertės 
pateikiamos lentel ėse. Rezultatai įvertinami taikant atitinkamus 
visuotinai priimtus statistinius metodus (pvz., F bandym ą, 5 % reikš ­
mingumo lygmuo). Gliukoz ės sukeliamo kv ėpavimo greitis išreiš ­
kiamas mg anglies dioksido/kg sauso dirvožemio/h. Vidutinis anglies dioksido išsiskyrimo arba deguonies suvartojimo greitis kiekviename apdorotame ėminyje lyginamas su grei čiu, gautu kontroliniam 
ėminiui, ir apskai čiuojama procentais išreikšta nuokrypio nuo kontro ­
linio ėminio vert ė.
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Jei bandomos ne agrochemin ės medžiagos, nustatomas kiekviename 
kartotiniame ėminyje išsiskyrusio anglies dioksido arba suvartoto 
deguonies kiekis, ir EC  x vertėms įvertinti braižoma doz ės ir reakcijos 
santykio kreiv ė. Gliukoz ės sukeliamas kv ėpavimo greitis (t. y. mg 
anglies dioksido arba mg deguonies/kg sauso dirvožemio/h), nusta ­
tytas apdorotuose ėminiuose po 28 par ų, lyginamas su kontroliniams 
ėminiams nustatytu grei čiu. Pagal šiuos duomenis kiekvienai 
bandymo koncentracijai apskai čiuojamos inhibavimo % vert ės. Šios 
procentin ės vertės pateikiamos grafike kaip koncentracijos funkcija, 
o EC  x vertėms apskai čiuoti taikomos statistin ės metodikos. Be to, 
taikant tipines metodikas (15) (16) (17), nustatomos apskai čiuotos 
EC x vertės pasikliovimo ribos (p = 0,95).  
2.2. REZULTAT Ų AIŠKINIMAS  
Jei vertinant agrochemini ų medžiag ų bandymų rezultatus, ėminyje, 
turinčiame mažesn ę koncentracij ą (t. y. didžiausi ą numatom ą 
koncentracij ą), bei kontroliniame ėminyje kv ėpavimo grei čio skir­
tumas bet kuriuo m ėginio ėmimo metu po 28 paros yra lygus 
25 % arba mažesnis, produkt ą galima įvertinti kaip nedarant į ilga­
laikio poveikio anglies transformavimui dirvožemiuose. Kai įverti­
nami kitų nei agrochemin ės medžiagos chemini ų medžiagų bandymo 
rezultatai, naudojamos EC  50 , EC  25 ir (arba) EC  10 vertės. 
3. ATASKAITA  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti pateikta ši informacija:  
Išsamus naudojamo dirvožemio identifikavimas, įskaitant:  
— geografin ę vietos nuorod ą (platuma, ilguma),  
— informacij ą apie vietos istorij ą (t. y. augalin ė danga, apdorojimas 
augalų apsaugos produktais, apdorojimas tr ąšomis, atsitiktiniai 
teršalai ir t. t.),  
— naudojimo tip ą (pvz., žem ės ūkio paskirties žem ė, miškas ir t. t.),  
— ėminio ėmimo gyl į (cm),  
— smėlio/dumblo/molio kiek į (% sausos medžiagos mas ės), 
— pH vert ę (vandenyje),  
— organin ės anglies kiek į (% sausos medžiagos mas ės), 
— azoto kiek į (% sausos medžiagos mas ės), 
— jonų mainų gebą (mmol/kg),  
— pradin ę mikrobin ę biomas ę, išreikšt ą bendrosios organin ės 
anglies procentine dalimi,  
— metod ų, taikytų kiekvienam parametrui nustatyti, nuorodas,  
— visą informacij ą apie dirvožemio ėminių ėmimą ir laikym ą, 
— visą informacij ą apie pradinio dirvožemio inkubavim ą, jei 
daromas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir, jei tinka, fizikin ės ir chemin ės savybės, 
— cheminio identifikavimo duomenys, jei tinka, įskaitant strukt ūrinę 
formulę, grynum ą (t. y. augal ų apsaugos produkt ų atveju veik ­
liojo ingrediento procentin ę dalį), azoto kiek į. 
Bandymo s ąlygos:  
— išsami informacija apie dirvožemio gerinim ą organiniu substratu,  
— naudot ų bandomosios medžiagos koncentracijos ver čių skaičius 
ir, jei tinka, pasirinkt ų koncentracijos ver čių pagrindimas,  
— išsami informacija apie bandomosios medžiagos įterpimą į dirvo­ 
žemį, 
— inkubavimo temperat ūra, 
— drėgmės kiekis dirvožemyje pradedant bandym ą ir jį atliekant,  
— taikytas dirvožemio inkubavimo metodas (t. y. kaip vientisas 
ėminys arba kaip eil ė atskirų mėginių), 
— kartotini ų ėminių skaičius, 
— ėmimo skai čius. 
Rezultatai:  
— metodas ir įranga kvėpavimo grei čiui matuoti,  
— lenteli ų duomenys, įskaitant atskiras ir vidutines anglies dioksido 
arba deguonies vertes,  
— apdorot ų ir kontrolini ų kartotini ų ėminių rezultatų nuokrypis,  
— apskai čiavimams darom ų pataisų aiškinimai, jei tinka,  
— procentais išreikštas gliukoz ės sukeliamo kv ėpavimo grei čio 
nuokrypis kiekvien ą kartą imant m ėginį, arba, jei tinka, EC  50 
vertė esant 95 procent ų pasikliovimo ribai, kitos EC  x vertės 
(t. y. EC  25 arba EC  10 ) ir pasikliovimo ribos, doz ės ir reakcijos 
santykio kreiv ės grafikas,  
— statistinis rezultat ų apdorojimas, jei tinka,  
— visa informacija ir pasteb ėjimai, kurie pad ėtų aiškinti rezultatus.  
4. NUORODOS  
1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil 
Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994.  
2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Pl ant Protection Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990).
 
3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
4) SET AC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. 
SETAC-Europe, Brussels.  
5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.  
6) ISO 10381–6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of 
aerobic microbial processes in the laboratory.  
7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in „Pesticide Effects on Soil Microflora“. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45–60.
 
8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil Respiration, in „Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties“. 
Agronomy Monograph N  o 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and 
D.R. Keeney. 41: 831–871.  
9) ISO 11266–1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
11) Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E. A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an 
automated technique based on infrared gas analyses. Plant and 
Soil, 116: 77–81.  
12) ISO 14240–1 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration method.  
13) ISO 14240–2 (1997). Soil quality – Determination of soil micro ­
bial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
14) Malkomes, H.-P. (1986). Einflu β von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegen ūber Pflanzens ­
chutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence 
of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of 
Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunsch ­
weig, 38: 113–120.
 
15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. 
Then, 96, 99–113.  
16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  AEROBINIS IR ANAEROBINIS TRANSFORMAVIMAS 
DIRVOŽEMYJE  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 307 (2002)  
1.1. ĮVADAS  
Šis bandymo metodas pagr įstas esamomis rekomendacijomis (1) (2) 
(3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). Šiame bandymo metode aprašytas metodas 
skirtas chemini ų medžiag ų aerobiniam ir anaerobiniam transforma ­
vimui dirvožemyje įvertinti. Bandymai yra atliekami siekiant nusta ­
tyti: i) bandomosios medžiagos virsmo greit į ir ii) transformavimo 
produktų, kurie gali veikti augalus bei dirvožemio organizmus, tip ą ir 
susidarymo bei išnykimo greit į. Taip turi b ūti tiriamos chemin ės 
medžiagos, kurios tiesiogiai įterpiamos į dirvožem į arba kurios gali 
pasiekti dirvožemio aplink ą. Be to, toki ų laboratorini ų tyrimų rezul­
tatai gali b ūti naudojami atitinkam ų lauko tyrim ų ėminių ėmimo ir 
analizės protokolams kurti.  
Aerobinių ir anaerobini ų tyrimų vieno tipo dirvožemiui paprastai 
pakanka virsmo keliams vertinti (8) (10) (11). Transformavimo greitis tur ėtų būti įvertinamas bent trims papildomiems dirvožemio 
tipams (8) (10).
 
Belgirate, Italijoje, 1995 m. vykusiame OECD seminare d ėl dirvo­ 
žemių ir nuosėdinių uolienų atrankos (10) buvo konkre čiai sutarta 
dėl šiame bandyme naudojam ų dirvožemi ų skaičiaus ir tipo. 
Bandomų dirvožemi ų tipas tur ėtų atitikti aplinkos s ąlygas, kuriose 
medžiaga bus naudojama arba išmetama. Pvz., chemin ės medžiagos, 
kurios gali b ūti išmetamos subtropinio arba tropinio klimato s ąly­
gomis, tur ėtų būti bandomos  Ferrasol  arba  Nitosol  tipo dirvože ­
miuose (Maisto ir žem ės ūkio organizacijos (FAO) sistema). Be to, 
seminare buvo pateiktos dirvožemio ėminių ėmimo, tvarkymo ir 
laikymo rekomendacijos, pagr įstos ISO rekomendaciniu dokumentu 
(15). Be to, šiame metode nagrin ėjami ryžių laukų dirvožemiai.  
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Bandomoji medžiaga  – bet kuri medžiaga (tai gali b ūti pradinis 
junginys arba medžiagos virsmo produktai).  
Transformavimo produktai  – visos medžiagos, susidaran čios vyks­
tant bandomosios medžiagos biotinio arba abiotinio virsmo reakci ­
joms, įskaitant CO  2 ir surištuosius liku čius. 
Surištieji liku čiai – dirvožemyje, augale arba gyv ūne esantys jungi ­
niai, kurie po ekstrahavimo lieka matricoje pradin ės medžiagos arba 
jos metabolito (- ų) ar transformavimo produkt ų pavidalu. Ekstraha ­
vimo metodas iš esm ės turi nekeisti pa čių junginių arba matricos 
struktūros. Ryšio prigimt į galima iš dalies išaiškinti, taikant matric ą 
keičiančius ekstrahavimo metodus ir sud ėtingus analiz ės metodus. 
Pvz., tokiu b ūdu iki šiol yra identifikuotos kovalentin ės, joninės ir 
sorbcinio tipo jungtys, be to, pagautieji junginiai. Apskritai, surišt ųjų 
likučių susidarymas labai mažina biologin į įsisavinamum ą ir biolo­
ginį kaupimąsi (12) (modifikuota IUPAC 1984 (13) apibr ėžtis).  
Aerobinis transformavimas  – reakcijos, vykstan čios esant molekuli ­
niam deguoniui (14).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Anaerobinis transformavimas  – reakcijos, vykstan čios nesant mole ­
kulinio deguonies (14).  
Dirvožemis  – mineralini ų ir organini ų cheminių sudedam ųjų dalių 
mišinys, kuriame organinius komponentus sudaro didel į anglies ir 
azoto kiek į turintys ir didel ės molekulin ės masės junginiai ir kurio 
gyvieji organizmai yra maži (daugiausia mikro-) organizmai. Galima 
apdoroti dviej ų būsenų dirvožem į: 
a) nepaliest ą, koks susidaro per laik ą, esantį tipiškuose įvairių 
dirvožemio tip ų sluoksniuose;  
b) paliest ą, koks jis paprastai yra ariamuose laukuose arba koks jis 
imamas kasant ir panaudojamas šiame bandymo metode (14).  
Mineralizacija  – yra visiškas organinio junginio skilimas į CO  2 ir H  2 O 
aerobinėmis sąlygomis, ir į CH  4 , CO  2 bei H  2 O anaerobin ėmis sąly­
gomis. Šiame bandymo metode, kai naudojamas  14 C žymėtas junginys, 
mineralizacija yra didelio laipsnio skilimas, kai žym ėtasis anglies 
atomas oksiduojamas, susidarant atitinkamam  14 CO 2 kiekiui (14).  
Pusėjimo trukm ė – t  0,5 , laikas, per kur į bandomosios medžiagos 
koncentracija sumaž ėja 50 %, kai transformavimui aprašyti tinka 
pirmojo laipsnio kinetika; ji nepriklauso nuo koncentracijos.  
DT 50 (išnykimo trukm ė 50)  – laikas, per kur į bandomosios 
medžiagos koncentracija sumaž ėja 50 %; ši trukm ė ir pusėjimo 
trukmė t 0,5 skiriasi, kai transformavimas neatitinka pirmojo laipsnio 
kinetikos.  
DT 75 (išnykimo trukm ė 75) – laikas, per kur į bandomosios 
medžiagos koncentracija sumaž ėja 75 %.  
DT 90 (išnykimo trukm ė 90)  – laikas, per kur į bandomosios 
medžiagos koncentracija sumaž ėja 90 %.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Etaloninės medžiagos naudojamos, jei transformavimo produktams 
apibūdinti ir (arba) identifikuoti taikomi spektroskopiniai ir chroma ­
tografijos metodai.  
1.4. BANDYMO TINKAMUMAS  
Metodas tinka visoms chemin ėms medžiagoms (nežym ėtoms arba 
žymėtoms), kurioms nustatyti yra sukurtas pakankamo tikslumo ir 
jautrio analiz ės metodas. Jis tinka mažai lakiems, nelakiems, vande ­
nyje tirpiems arba netirpiems junginiams. Bandymas neturi b ūti 
taikomas chemin ėms medžiagoms, kurios labai greit išgaruoja iš 
dirvožemio (pvz., fumigantai, organiniai tirpikliai), tod ėl negali b ūti 
laikomos dirvožemyje šio bandymo s ąlygomis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Transformavimo grei čiui matuoti gali b ūti naudojama pažym ėtoji 
arba žym ėtoji bandomoji medžiaga. Žym ėtoji medžiaga reikalinga 
transformavimo keliui tirti ir masi ų balansui nustatyti. Rekomenduo ­
jama žym ėti 14 C, bet gali b ūti naudingi kiti izotopai, pvz.,  13 C, 15 N, 
3 H, 32 P. Kiek tai įmanoma, žym ėtasis atomas turi b ūti patvariausioje 
(-iose) molekul ės dalyje (-yse) (  1 ). Bandomosios medžiagos 
grynumas turi b ūti mažiausiai 95 %.  
Prieš pradedant atlikti aerobinio ir anaerobinio transformavimo dirvo ­ 
žemyje bandym ą, turi būti gauta ši informacija apie bandom ąją 
medžiagą: 
a) tirpumas vandenyje (A.6 metodas);  
b) tirpumas organiniuose tirpikliuose;  
c) garų slėgis (A.4 metodas) ir Henrio d ėsnio konstanta;  
d) pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo) (A.8 metodas);  
e) cheminis patvarumas tamsoje (hidroliz ė) (C.7 metodas);  
f) pK  a jei molekul ė gali atiduoti arba prisijungti protonus (OECD 
TG 112) (16).  
Kitą naudingą informacij ą gali sudaryti duomenys apie bandomosios 
medžiagos toksišk ą poveik į dirvožemio mikroorganizmams 
[bandymo metodai C.21 ir C.22] (16).  
Reikia tur ėti analizės metodus ( įskaitant ekstrahavimo ir gryninimo 
metodus) bandomajai medžiagai ir jos transformavimo produktams identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti.
 
1.6. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Dirvožemio ėminiai apdorojami bandom ąja medžiaga ir inkubuojami 
tamsoje, naudojant biometrines kolbas arba pratek ėjimo sistemas 
kontroliuojamomis laboratorin ėmis sąlygomis (esant pastoviai tempe ­
ratūrai ir dirvožemio dr ėgmei). Po tam tikro intervalo dirvožemio 
ėminiai ekstrahuojami ir analizuojami pradinei medžiagai ir jos trans ­
formavimo produktams nustatyti. Be to, naudojant atitinkamus absorbcijos įtaisus, renkami ir analizuojami lakieji produktai. Naudo ­
jant
 14 C žymėtą medžiag ą ir surenkant išsiskyrus į 14 CO 2 , galima 
išmatuoti įvairias bandomosios medžiagos mineralizacijos grei čio 
vertes ir nustatyti masi ų balansą, įskaitant dirvožemiu surištus liku ­ 
čius. 
1.7. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
1.7.1.  Regeneravimas  
Mažiausiai dviej ų kartotini ų dirvožemio ėminių ekstrahavimas ir 
analizė iškart po bandomosios medžiagos prid ėjimo yra pirmasis 
analizės metodo pakartojamumo ir bandomosios medžiagos įterpimo 
metodikos tolygumo rodiklis. V ėlesnių bandymo stadij ų regenera ­
vimo laipsnis gaunamas matuojant atitinkam ų masės verčių balansą. 
Žymėtųjų chemini ų medžiag ų regeneravimo laipsnis turi b ūti nuo 
90 % iki 110 % (8), nežym ėtųjų cheminių medžiag ų – nuo 70 % 
iki 110 % (3).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Pvz., jei bandomoji medžiaga turi vien ą žiedą, žymėtasis atomas turi b ūti šiame žiede; jei 
bandomoji medžiaga turi du žiedus arba daugiau, gali tekti daryti atskirus tyrimus kiek ­
vieno žiedo su žym ėtuoju atomu likimui įvertinti ir atitinkamai informacijai apie virsmo 
produktų susidarym ą gauti.
 1.7.2.  Analiz ės metodo pakartojamumas ir jautrumas  
Bandomosios medžiagos ir transformavimo produkt ų kiekybin ės 
analizės metodo pakartojamumas (išskyrus pradin į ekstrahavimo 
efektyvum ą) gali būti patikrintas atliekant kartotin ę to paties dirvo ­ 
žemio, inkubuoto pakankamai ilgai, kad gal ėtų susidaryti transforma ­
vimo produktai, ekstrakto analiz ę. 
Bandomosios medžiagos ir transformavimo produkt ų analizės 
metodo aptikimo riba (LOD) turi b ūti mažiausiai 0,01 mg× kg  -1 
dirvožemio (kaip bandomosios medžiagos) arba 1 % įterpiamos 
dozės, imant mažesni ąją vertę. Turi būti apibrėžta kiekybinio nusta ­
tymo riba (LOQ).  
1.7.3.  Transformavimo duomen ų tikslumas  
Atliekant bandomosios medžiagos koncentracijos ver čių kaip laiko 
funkcijos regresin ę analizę gaunama atitinkama informacija apie 
transformavimo kreiv ės patikimum ą ir leidžia apskai čiuoti pusėjimo 
trukmės verčių pasikliovimo ribas (jei reakcija atitinka pseudopir ­
mojo laipsnio kinetik ą) arba DT  50 vertes ir, jei tinka, DT  75 ir DT  90 
vertes.  
1.8. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.8.1.  Įranga ir cheminiai reagentai  
Inkubavimo sistemas sudaro statin ės uždaros sistemos arba tinkamos 
pratekėjimo sistemos (7) (17). Tinkami pratek ėjimo ir biometrinio tipo 
dirvožemio inkubavimo aparatai pavaizduoti 1 ir 2 paveiksluose. Kiek ­
viena iš inkubavimo sistem ų turi savo pranašum ų ir trūkumų (7) (17).  
Reikalinga tipin ė laboratorin ė įranga, vis ų pirma ši:  
— analiz ės prietaisai, pvz., duj ų ir skysčių chromatografijos (GLC), 
efektyviosios skys čių chromatografijos (HPLC), plonasluoksn ės 
chromatografijos (TLC) įranga, įskaitant atitinkamas aptikimo 
sistemas pažym ėtosioms arba nepažym ėtosioms medžiagoms 
analizuoti, arba atvirkštinio izotop ų skiedimo metodas,  
— identifikavimui skirti prietaisai (pvz., MS, GC-MS, HPLC-MS, 
MBR ir t. t.),  
— skysčių scintiliacinis skaitiklis,  
— aparat ūra radioaktyviosioms medžiagoms oksiduoti,  
— centrifuga,  
— ekstrahavimo aparat ūra (pvz., centrifugos m ėgintuvėliai žema ­
temperatūriam ekstrahavimui ir Soksleto aparatas nepertrau ­
kiamam ekstrahavimui su gr įžtamuoju šaldytuvu),  
— įranga tirpalams ir ekstraktams koncentruoti (pvz., sukamasis 
garintuvas),  
— vandens vonia,  
— mechaninio maišymo įtaisas (pvz., tešlos maišytuvas, sukamasis 
maišytuvas).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Naudojami cheminiai reagentai, pvz.:  
— NaOH, analiziškai grynas, 2 mol dm  -3 , arba kitas tinkamas 
šarmas (pvz., KOH, etanolaminas),  
— H  2 SO 4 , analiziškai gryna, 0,05 mol dm  -3 , 
— etilenglikolis, analiziškai grynas,  
— kietosios sugerian čios medžiagos, pvz., natrio kalk ės ir poliure ­
tano kamš čiai, 
— organiniai tirpikliai, analiziškai gryni, pvz., acetonas, metanolis 
ir t. t.,  
— scintiliacinis skystis.  
1.8.2.  Bandomosios medžiagos įterpimas  
Norint bandomosios medžiagos įterpti į dirvožem į ir paskirstyti jame, 
ji gali būti ištirpinta vandenyje (dejonizuotame arba distiliuotame) 
arba prireikus kiek įmanoma mažesniame kiekyje acetono arba kit ų 
organinių tirpiklių (6), kuriuose bandomoji medžiaga b ūtų pakan­
kamai tirpi ir patvari. Ta čiau pasirinkto tirpiklio kiekis neturi daryti 
reikšmingos įtakos dirvožemio mikrobiniam aktyvumui (žr. 1.5 ir 
1.9.2–1.9.3 skirsnius). Reikia vengti naudoti tirpiklius, kurie inhi ­
buoja mikrobin į aktyvum ą, pvz., chloroform ą, dichlormetan ą ir 
kitus halogenintus tirpiklius.  
Be to, bandomoji medžiaga gali b ūti įterpiama kaip kietoji medžiaga, 
pvz., sumaišyta su kvarciniu sm ėliu (6) arba su mažu bandymo 
dirvožemio m ėginiu, kuris išdžiovinamas ore ir sterilizuojamas. Jei 
bandomoji medžiaga pridedama naudojant tirpikl į, tirpikliui 
leidžiama išgaruoti prieš tai kaip sodrintas m ėginys yra įterpiamas 
į pradinį nesterilų dirvožemio ėminį. 
Įprastoms chemin ėms medžiagoms, kurios į dirvožem į iš esmės 
patenka su nuotek ų dumblu arba dirbant žem ės ūkio darbus, bando ­
moji medžiaga iš pradži ų turi būti dedama į dumblą, kuris vėliau 
įterpiamas į dirvožemio ėminį (žr. 1.9.2 ir 1.9.3 skirsnius).  
Nerekomenduojama sistemingai naudoti preparatus. Ta čiau, pvz., jei 
bandomoji medžiaga mažai tirpi, preparat ų naudojimas gali b ūti 
tinkamas pakaitinis b ūdas. 
1.8.3.  Dirvožemiai  
1.8.3.1.  Dirvožemio atranka  
Transformavimo keliui nustatyti galima naudoti tipin į dirvožem į; 
rekomenduojama naudoti sm ėlingą priemolį, dulkišką priemolį, prie­
molį arba priesm ėlį (pagal FAO ir USDA klasifikacij ą (18)), kurio 
pH vertė 5,5– 8,0, organin ės anglies kiekis 0,5– 2,5 % ir mikrobin ė 
biomasė sudaro bent 1 % bendrosios organin ės anglies (10).  
Transformavimo grei čiui tirti turi b ūti naudojami mažiausiai trys 
papildomi dirvožemiai, sudarantys atitinkam ų dirvožemi ų intervalą. 
Dirvožemiai turi skirtis organin ės anglies kiekiu, pH, molio ir mikro ­
binės biomasės kiekiu (10).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Visi dirvožemiai apib ūdinami, nurodant bent tekst ūrą (% smėlio, % 
dumblo, % molio) (pagal FAO ir USDA klasifikacij ą (18)), pH, 
katijonų mainų gebą, organin ės anglies kiek į, tūrinį tankį, vandens 
sulaikymo charakteristikas (  1 ) ir mikrobin ę biomasę (tik aerobiniams 
tyrimams). Rezultatams aiškinti gali b ūti naudinga papildoma infor ­
macija apie dirvožemio savybes. Dirvožemio charakteristikoms 
nustatyti gali b ūti taikomi metodai, rekomenduojami nuorodose 
(19)(20)(21)(22)(23). Mikrobin ė biomasė turi būti nustatoma taikant 
substrato sukeliamo kv ėpavimo (SIR) metod ą (25)(26) arba pakaiti ­
nius metodus (20).  
1.8.3.2.  Dirvožemi ų ėminių ėmimas, tvarkymas ir laikymas  
Reikia tur ėti detalios informacijos apie lauko viet ą, iš kurios imamas 
bandymo dirvožemis. Nurodoma tiksli pad ėtis, augal ų danga, apdo ­
rojimas chemin ėmis medžiagomis, apdorojimas organin ėmis ir neor ­
ganinėmis trąšomis, biologini ų priedų dėjimas arba kiti teršalai. Jei 
per paskutinius ketverius metus dirvožemiai buvo apdorojami bando ­
mąja medžiaga arba jos strukt ūriniais analogais, tokie dirvožemiai 
neturi būti naudojami transformavimo tyrimams (10) (15).  
Dirvožemis turi b ūti tik ką paimtas iš lauko (iš A horizonto arba 
viršutinio 20 cm sluoksnio), dirvožemiui turint tok į vandens kiek į, 
kuris lengvint ų sijojimą. Reikia vengti imti dirvožemi ų, išskyrus 
ryžių laukų dirvožemi ų, ėminius esant ilgalaikiam (ilgesniam kaip 
30 parų) sausros, šal čių arba patvinimo laikotarpiui arba iš karto 
jam pasibaigus (14). Ėminiai turi b ūti transportuojami tokiu b ūdu, 
kad kiek įmanoma mažiau pasikeist ų vandens kiekis dirvožemyje, 
ėminiai turi b ūti laikomi tamsoje, esant kiek įmanoma didesniam 
gryno oro kiekiui. Paprastai šiam tikslui tinka nesandariai užrištas 
polietileninis maišas.  
Dirvožemis, pa ėmus jo ėminius, turi b ūti apdorotas kiek įmanoma 
greičiau. Augmenija, didesn ė dirvožemio fauna ir akmenys turi b ūti 
pašalinti prieš sijojant dirvožem į per 2 mm siet ą, ant kurio lieka maži 
akmenys, fauna ir augal ų likučiai. Prieš sijojant reikia vengti per 
didelio dirvožemio dži ūvimo ir smulkinimo (15).  
Kai žiem ą imti ėminius lauke sunku (dirvožemis įšąla arba yra 
padengtas sniego sluoksniu), j į galima imti iš dirvožemio kr ūvos, 
laikomos šiltnamyje po augaline danga (pvz., žol ės arba žol ės ir 
dobilų mišinio danga). Labiau pageidautina tirti dirvožemius, tik k ą 
paimtus iš lauko, ta čiau jei surinkt ą ir apdorot ą dirvožem į tenka 
laikyti prieš tyrimo pradži ą, turi būti tinkamos laikymo s ąlygos 
mikrobiniam aktyvumui užtikrinti ir laikyti galima tik ribot ą laiką 
(ne ilgiau kaip tris m ėnesius, esant 4 ± 2 °C) (  2 ). Išsamūs nurodymai, 
kaip imti, tvarkyti ir laikyti biologinio transformavimo bandymams skirtus dirvožemi ų ėminius, pateikti (8) (10) (15) (26) (27).
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Vandens sulaikymo charakteristikos gali b ūti matuojamos, kaip lauko dr ėgmės imlumas, 
kaip vandens sulaikymo geba arba kaip vandens siurbimo įtemptis (hidraulinis poten ­
cialas) (pF). Aiškinimai pateikti 1 pried ėlyje. Bandymo ataskaitoje turi b ūti nurodyta, ar 
dirvožemi ų vandens sulaikymo charakteristikos ir t ūriniai tankiai buvo matuojami nepa ­
liestuose lauko ėminiuose, ar paliestuose (apdorotuose) ėminiuose. 
( 2 ) Naujų tyrimų rezultatai rodo, kad vidutinio klimato zon ų dirvožemiai irgi gali b ūti 
laikomi esant –20 C ilgiau kaip tris m ėnesius (28)(29) ir perdaug neprarasti mikrobinio 
aktyvumo.
 Prieš apdorot ą dirvožem į naudojant šiam bandymui, jam taikomas 
pradinis inkubavimas, kad gal ėtų sudygti ir b ūtų pašalintos s ėklos 
ir būtų atkurta mikrobin ės medžiag ų apykaitos pusiausvyra, kai 
ėminių ėmimo arba laikymo s ąlygas pakei čia inkubavimo s ąlygos. 
Paprastai pakanka 2–28 par ų trukmės pradinio inkubavimo laiko ­
tarpio, siekiant temperat ūros ir drėgmės sąlygas priartinti prie tikrojo 
bandymo s ąlygų (15). Laikymo ir pradinio inkubavimo trukm ė kartu 
neturi būti ilgesnė kaip trys m ėnesiai.  
1.9. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.9.1.  Bandymo s ąlygos  
1.9.1.1.  Bandymo temperat ūra 
Visą bandymo laikotarp į dirvožemiai inkubuojami tamsoje esant 
pastoviai temperat ūrai, kuri atitikt ų klimatines naudojimo arba išme ­
timo sąlygas. Rekomenduojama 20 ± 2 °C temperat ūra visoms 
bandomosioms medžiagoms, kurios gali pasiekti dirvožem į vidutinio 
klimato s ąlygomis. Temperat ūra turi būti kontroliuojama.  
Jei chemin ės medžiagos naudojamos arba išmetamos šaltesnio 
klimato sąlygomis (pvz., šiaur ės šalyse, rudens ir žiemos laikotarpiu), 
papildomi dirvožemio ėminiai inkubuojami esant žemesnei tempera ­
tūrai (pvz., 10 ± 2 °C).  
1.9.1.2.  Drėgmės kiekis  
Atliekant transformavimo bandymus aerobin ėmis sąlygomis, turi b ūti 
nustatomas ir palaikomas dirvožemio dr ėgmės kiekis (  1 ), atitinkantis 
pF nuo 2,0 iki 2,5 (3). Dirvožemio dr ėgmės kiekis išreiškiamas 
vandens mase sauso dirvožemio mas ės vienetui, ir turi b ūti regulia­
riai tikrinamas (pvz., kas 2 savaites) pasveriant inkubavimo kolbas, o 
vandens nuostoliai kompensuojami įpilant vandens (pageidautina 
filtravimu sterilizuoto vandentiekio vandens). Reikia imtis atsargumo priemonių, kad pilant vanden į būtų išvengta bandomosios medžiagos 
ir (arba) transformavimo produkt ų nuostolių dėl garavimo ir (arba) 
fotodestrukcijos (jei vyksta) arba jie b ūtų kiek įmanoma sumažinti.
 
Atliekant transformavimo bandymus anaerobin ėmis ir ryži ų lauko 
sąlygomis, dirvožemis yra prisotinamas vandeniu užtvindant.  
1.9.1.3.  Aerobin ės inkubavimo s ąlygos  
Pratekėjimo sistemose aerobin ės sąlygos užtikrinamos tarpais pu čiant 
arba ištisai per sistem ą ventiliuojant sudr ėkintą orą. Biometrin ėse 
kolbose oro mainai užtikrinami difuzijos b ūdu. 
1.9.1.4.  Sterilios aerobin ės sąlygos  
Informacijai apie abiotinio bandomosios medžiagos transformavimo 
svarbą gauti, dirvožemio ėminiai gali b ūti sterilizuojami (steriliza ­
vimo metodai pateikti 16 ir 29 nuorodose), apdorojami sterilia 
bandomąja medžiaga (pvz., tirpalas pilamas per steril ų filtrą) ir 
aeruojami sudr ėkintu steriliu oru, kaip aprašyta 1.9.1.3 skirsnyje. 
Jei tiriamas ryži ų laukų dirvožemis, dirvožemis ir vanduo sterilizuo ­
jami ir inkubavimas vykdomas kaip aprašyta 1.9.1.6 skirsnyje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Dirvožemis neturi b ūti per drėgnas arba per sausas, kad b ūtų galima užtikrinti tinkam ą 
dirvožemio mikrofloros aeravim ą ir mitybą. Optimaliam mikrob ų augimui rekomenduo ­
jamas drėgmės kiekis sudaro 40–60 % vandens sulaikymo gebos (WHC) ir 0,1– 0,33 bar 
(6). Pastarasis intervalas atitinka pF interval ą 2,0– 2,5. Tipinis įvairių tipų dirvožemi ų 
drėgmės kiekis pateiktas 2 pried ėlyje.
 1.9.1.5.  Anaerobin ės inkubavimo s ąlygos  
Anaerobin ėms sąlygoms sudaryti ir palaikyti, dirvožemis apdoro ­
jamas bandom ąja medžiaga ir aerobin ėmis sąlygomis 30 par ų arba 
pusėjimo trukm ės ar DT  50 laikotarpį (atsižvelgiant į tai, kuris trum ­
pesnis), inkubuotas dirvožemis užpilamas vandeniu (1–3 cm vandens sluoksniu), o per inkubavimo sistem ą prapučiamos inertin ės dujos 
(pvz., azotas arba argonas) (
 1 ) Bandymo sistema turi užtikrinti 
sąlygas matuoti pvz., pH vert ę, deguonies koncentracij ą ir 
oksidacijos-redukcijos potencial ą, ir turėti lakiųjų produktų gaudy­
kles. Sistema turi b ūti uždara, kad b ūtų išvengta oro patekimo difu ­
zijos būdu. 
1.9.1.6.  Ryžių laukų dirvožemio inkubavimo s ąlygos  
Transformavimui ryži ų laukų dirvožemiuose tirti dirvožemis užpi ­
lamas maždaug 1–5 cm vandens sluoksniu ir bandomoji medžiaga 
dedama į vandenin ę fazę (9). Rekomenduojama naudoti mažiausiai 5 
cm gylio dirvožemio sluoksn į. Sistema v ėdinama oru, kaip aerobi ­
nėmis sąlygomis. Turi b ūti kontroliuojama ir pateikiama ataskaitoje 
vandeninio sluoksnio pH vert ė, deguonies koncentracija ir 
oksidacijos-redukcijos potencialas. Prieš pradedant transformavimo tyrimus b ūtinas mažiausiai dviej ų savaičių pradinio inkubavimo 
laikotarpis (žr. 1.8.3.2 skirsn į).
 
1.9.1.7.  Bandymo trukm ė 
Transformavimo grei čio ir kelio tyrimai paprastai netur ėtų trukti 
ilgiau kaip 120 par ų ( 2 ) (3) (6) (8), kadangi po šio termino tik ėtinas 
dirvožemio mikrobinio aktyvumo maž ėjimas dirbtin ėje, nuo nat ūra­
laus papildymo atskirtoje laboratorin ėje sistemoje. Jei b ūtina apibū­
dinti bandomosios medžiagos išnykim ą ir pagrindini ų transforma ­
vimo produkt ų susidarym ą ir išnykim ą, tyrimai gali b ūti tęsiami 
ilgesnį laiką (pvz., 6 arba 12 m ėnesių) (8). Ilgesni inkubavimo laiko ­
tarpiai turi b ūti pagrįsti bandymo ataskaitoje, be to, papildyti 
biomasės matavimais šiais laikotarpiais ir jiems pasibaigus.  
1.9.2.  Bandymo proced ūra 
Maždaug 50–200 g dirvožemio (kaip sauso dirvožemio) dedama į 
kiekvieną inkubavimo kolb ą (žr. 3 pried ėlio 1 ir 2 paveikslus) ir 
dirvožemis apdorojamas bandom ąja medžiaga vienu iš metod ų, apra­ 
šytų 1.8.2 skirsnyje. Jei bandomajai medžiagai įterpti naudojami 
organiniai tirpikliai, jie turi b ūti išgarinti iš dirvožemio. Tuomet 
dirvožemis gerai sumaišomas mentele ir (arba) purtant kolb ą. Jei 
tyrimas daromas ryži ų lauko sąlygomis, dirvožemis ir vanduo turi 
būti gerai sumaišyti po bandomosios medžiagos įterpimo. Daroma 
mažų alikvotini ų apdoroto dirvožemio dali ų (pvz., 1 g) analiz ė 
bandomajai medžiagai nustatyti ir taip patikrinti pasiskirstymo toly ­
gumą. Pakaitiniai metodai pateikti toliau.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Aerobin ės sąlygos vyrauja paviršiniame dirvožemiuose ir net popaviršiniuose dirvože ­
miuose, kaip buvo parodyta ES organizuotame tyrim ų projekte (K. Takagi  et al . (1992). 
Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in 
subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internal Symp. Environm. Aspects 
Pesticides Microbiol., 270–277, 17–21 August 1992, Sigtuna, Sweden). Anaerobin ės 
sąlygos gali pasitaikyti tik atsitiktinai, kai dirvožemiai užliejami po dideli ų liūčių arba 
kai sudaromos ryži ų laukų sąlygos. 
( 2 ) Aerobinius tyrimus galima b ūtų baigti daug anks čiau nei po 120 par ų, jei tuo metu jau 
būtų žinomas galutinis virsmo kelias ir aiškiai pasiekta galutin ė mineralizacija. Bandymas 
gali būti baigtas po 120 par ų arba kai produktais virsta mažiausiai 90 % bandomosios 
medžiagos, ta čiau turi susidaryti mažiausiai 5 % C0  2 .
 Apdorojimo norma turi atitikti didžiausi ą augalų apsaugos produkto 
normą, rekomenduojam ą naudojimo instrukcijose, ir atitinkam ą toly­
gaus įterpimo lauke gyl į (pvz., į viršutin į 10 cm dirvožemio 
sluoksnį ( 1 )). Pvz., jei chemin ės medžiagos skirtos lapams arba dirvo ­ 
žemiui be įterpimo, atitinkamas gylis, pagal kur į apskaičiuojamas į 
kiekvieną kolbą dedamos chemin ės medžiagos kiekis, lygus 2,5 cm. 
Jei chemin ės medžiagos įterpiamos į dirvožem į, taikomas gylis yra 
naudojimo instrukcijose apibr ėžtas įterpimo gylis. Jei tai bendrosios 
paskirties chemin ės medžiagos, įterpimo norma turi b ūti įvertinta 
atsižvelgiant į patį tipiškiausi ą patekimo b ūdą; pvz., kai pagrindinis 
patekimo į dirvožem į būdas yra nuotek ų dumblas, chemin ė medžiaga 
turi būti dozuojama su dumblu, esant koncentracijai, kuri rodyt ų 
tikėtiną medžiagos koncentracij ą dumble, o į dirvožem į dedamo 
dumblo kiekis turi atitikti įprastą dumblo įkrovą į žemės ūkio paskir ­
ties dirvožemius. Jei šios koncentracijos nepakanka pagrindiniams transformavimo produktams identifikuoti, gali b ū
ti naudingas atskir ų 
dirvožemio ėminių, turinčių didesnes medžiagos normas, inkuba ­
vimas, tačiau reikėtų vengti per dideli ų normų, darančių įtaką dirvo­ 
žemio mikrobin ėms funkcijoms (žr. 1.5 ir 1.8.2 skirsnius).  
Taikant kit ą būdą, bandom ąja medžiaga galima apdoroti didesn ę 
dirvožemio įkrovą (t. y. 1–2 kg), kruopš čiai sumaišyti, naudojant 
atitinkam ą maišymo įtaisą, ir mažomis 50–200 g dalimis padalyti į 
inkubavimo kolbas (pvz., naudojant ėminio dalytuvus). Mažos apdo ­
roto dirvožemio įkrovos alikvotin ės dalys (pvz., 1 g) analizuojamos 
bandomosios medžiagos tolygiam pasiskirstymui patikrinti. Tokia metodika yra geresn ė, kadangi bandom ąją medžiag ą galima tolygiau 
paskirstyti dirvožemyje.
 
Be to, tomis pa čiomis sąlygomis (aerobin ėmis), kaip ir bandom ąja 
medžiaga apdoroti ėminiai, inkubuojami neapdoroto dirvožemio 
ėminiai. Šie ėminiai yra naudojami biomasei matuoti vykstant 
bandymui ir jam pasibaigus.  
Kai į dirvožem į įterpiama organiniame (-iuose) tirpiklyje (-iuose) 
ištirpinta bandomoji medžiaga, dirvožemio ėminiai, apdoroti tokiu 
pačiu tirpiklio (- ų) kiekiu, inkubuojami tokiomis pa čiomis sąlygomis 
(aerobinėmis), kaip ir bandom ąja medžiaga apdoroti ėminiai. Šie 
ėminiai naudojami biomasei nustatyti tyrimo pradžioje, tyrim ų 
metu ir juos užbaigus, kad b ūtų galima patikrinti tirpiklio (- ų) 
poveikį mikrobinei biomasei.  
Kolbos su apdorotu dirvožemiu prijungiamos prie matavimo prate ­
kėjimo sąlygomis sistemos, aprašytos 1 paveiksle, arba uždaromos, 
naudojant 2 paveiksle pavaizduot ą sugėrimo kolon ėlę (žr. 3 pried ėlį). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Pradinė koncentracija pagal plot ą apskaičiuojama taikant ši ą lygtį: 
C dirvožemio ½mg =kg dirvožemio â ¼ Í ðA½kg=haâ·10 6 ½mg =kgâÞ 
ðl½mâ·ð10 4 ½m 2=haâÞ·ðd½kg dirvožemio =m 3 âÞÞ Î 
C dirvože  = pradinė koncentracija dirvožemyje [mg kg-1] 
A = įterpimo norma [kg ha-1]; 1 = lauko dirvožemio sluoksnio storis [m]; d = sauso 
dirvožemio t ūrinis tankis [kg m  -3 ]. 
Paprastai, esant 1 kg ha  -1 įterpimo normai, koncentracija 10 cm dirvožemio sluoksnyje 
maždaug lygi 1 mg kg  -1 (darant prielaid ą, kad tūrinis tankis yra lygus 1 g cm  -3 ).
 1.9.3.  Mėginių ėmimas ir matavimas  
Praėjus tam tikram laiko tarpui, paimamos dvi inkubavimo kolbos, 
dirvožemio m ėginiai ekstrahuojami skirtingo poliškumo tirpikliais ir 
analizuojami bandomajai medžiagai ir (arba) transformavimo produk ­
tams nustatyti. Darant gerai suplanuot ą tyrimą, naudojamas pakan ­
kamas kolb ų skaičius, kad kiekvienam m ėginio ėmimui būtų galima 
paaukoti dvi kolbas. Be to, vis ą kiekvieno dirvožemio inkubavimo 
laikotarpį ir jam pasibaigus įvairiais laiko intervalais imami sug ė­
rimui naudot ų tirpalų arba kiet ųjų medžiag ų mėginiai (pirm ąjį 
mėnesį 7 parų intervalai ir v ėliau 17 par ų intervalai) ir atliekama 
jų analizė lakiesiems produktams nustatyti. Be dirvožemio m ėginio, 
imamo iš karto po medžiagos įterpimo (0 paros m ėginio), būtina 
papildomai imti m ėginį mažiausiai 5 kartus. Laiko intervalai turi 
būti pasirinkti taip, kad b ūtų galima gauti bandomosios medžiagos 
išnykimo ir transformavimo produkt ų susidarymo bei išnykimo 
kreives (pvz., 0, 1, 3, 7 paros; 2, 3 savait ės; 1, 2, 3 m ėnesiai ir t. t.).  
Kai naudojama  14 C žymėta bandomoji medžiaga, neekstrahuojamos 
medžiagos radioaktyvumas kiekybiškai nustatomas sudeginant, ir kiekvienam m ėginio ėmimo intervalui apskai čiuojamas masi ų 
balansas.
 
Jei inkubuojama anaerobin ėmis ir ryži ų lauko sąlygomis, dirvožemis 
ir vandenin ės fazės analizuojamos kartu bandomajai medžiagai ir 
transformavimo produktams nustatyti arba prieš ekstrahavim ą ir 
analizę atskiriamos filtravimu ar centrifugavimu.  
1.9.4.  Neprivalomi bandymai  
Norint įvertinti temperat ūros ir dirvožemio dr ėgmės įtaką bandomo ­
sios medžiagos ir (arba) jos transformavimo produkt ų transforma ­
vimo dirvožemyje grei čiams, gali b ūti naudingi aerobiniai tyrimai 
nesteriliomis s ąlygomis, esant papildomoms temperat ūros ir dirvo ­ 
žemio drėgmės vertėms. 
Galima papildomai pam ėginti apib ūdinti neekstrahuojam ų medžiag ų 
radioaktyvum ą, pvz., ekstrahavimui naudojant virškritin ę takiąją 
terpę. 
2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Bandomosios medžiagos, transformavimo produkt ų, lakiųjų 
medžiagų (tik %) ir neekstrahuojam ų medžiag ų kiekiai pateikiami 
kaip pradin ės koncentracijos procentin ė dalis ir, jei tinka, mg kg  -1 
dirvožemio (sausojo dirvožemio masei) kiekvienam m ėginio ėmimo 
intervalui. Masi ų balansas kiekvienam m ėginio ėmimo intervalui turi 
būti pateiktas kaip naudotos pradin ės koncentracijos procentin ė dalis. 
Grafiškai pavaizdavus bandomosios medžiagos koncentracijos ver čių 
ir laiko santyk į, bus galima įvertinti jos transformavimo pus ėjimo 
trukmę arba DT  50 . Turi būti identifikuoti pagrindiniai transforma ­
vimo produktai ir br ėžiamas jų koncentracijos ver čių kitimo laike 
grafikas susidarymo ir išnykimo grei čiams parodyti. Pagrindiniu 
transformavimo produktu laikomas kiekvienas produktas, kuris bet 
kuriuo tyrimo metu sudaro ≥ 10 % naudotos doz ės. 
Absorbuoti lakieji produktai tam tikru laipsniu rodo dirvožemyje 
esančios bandomosios medžiagos ir jos transformavimo produkt ų 
lakumą. ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Tiksliau pus ėjimo trukm ės arba DT  50 vertės ir, jei tinka, DT  75 ir 
DT 90 vertės nustatomos taikant atitinkamus kinetini ų modelių apskai­ 
čiavimus. Pus ėjimo trukm ės ir DT  50 vertės pateikiamos ataskaitoje 
kartu su taikyto modelio aprašymu, kinetikos laipsniu ir nustatymo koeficientu (r
 2 ). Geriau taikyti pirmojo laipsnio kinetik ą, išskyrus kai 
r 2 < 0,7. Be to, jei reikia, atliekami pagrindini ų transformavimo 
produktų apskaičiavimai. Atitinkami modeli ų pavyzdžiai aprašyti 
31–35 nuorodose.  
Darant transformavimo grei čio tyrimus, esant įvairioms temperat ūros 
vertėms, transformavimo grei čiai turi būti aprašyti kaip temperat ūros 
funkcija bandymo temperat ūros verčių intervale, taikant toki ą Areni­
jaus lygtį: 
k ¼ A·e ÄB=T arba lnk ¼ 1nA – Í ðBÞ 
ðTÞ Î 
kurioje ln A ir B yra regresijos ties ės, gautos naudojant tiesin ę lnk 
kaip l/T funkcijos regresij ą, atkarpa ir krypties koeficientas, k yra 
greičio konstanta, esant temperat ūrai T, ir T yra temperat ūra Kelvino 
laipsniais. Reikia atkreipti d ėmesį į ribotą temperat ūros interval ą, 
kuriame Arenijaus lygtis galioja, kai transformavim ą valdo mikrob ų 
veikimas.  
2.2. REZULTAT Ų ĮVERTINIMAS IR AIŠKINIMAS  
Nors tyrimas atliekamas dirbtin ėje laboratorin ėje sistemoje, rezultatai 
leis įvertinti bandomosios medžiagos transformavimo greit į ir trans­
formavimo produkt ų susidarymo bei išnykimo greit į lauko sąlygomis 
(36)(37).  
Bandomosios medžiagos transformavimo kelio tyrimas suteikia 
informacijos apie tai, kaip dirvožemyje pasikei čia įterptosios 
medžiagos strukt ūra, vykstant chemin ėms ir mikrobin ėms reakci ­
joms.  
3. ATASKAITA  
BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti ši informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— bendrinis pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, 
struktūrinė formulė (rodanti žym ėtojo (-ųjų) atomo (- ų) padėtį, 
jei naudojama žym ėtoji medžiaga) ir atitinkamos fizikin ės ir 
cheminės savybės (žr. 1.5 skirsn į), 
— bandomosios medžiagos grynumas (priemaišos),  
— radiocheminis žym ėtosios chemin ės medžiagos grynumas ir savi ­
tasis aktyvumas (jei tinka).  
Etaloninės medžiagos:  
— etalonini ų medžiag ų, naudojam ų transformavimo produktui 
apibūdinti ir (arba) identifikuoti, cheminis pavadinimas ir struk ­
tūra. 
Bandomieji dirvožemiai:  
— ėmimo vietos detal ės, 
— dirvožemi ų ėmimo data ir metodika,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— dirvožemi ų savybės, pvz., pH vert ė, organin ės anglies kiekis, 
tekstūra (% sm ėlio, % dulki ų, % molio), katijon ų mainų geba, 
tūrinis tankis, vandens sulaikymo charakteristika ir mikrobin ė 
biomasė, 
— dirvožemio laikymo trukm ė ir sąlygos (jei laikomas).  
Bandymo s ąlygos:  
— tyrimų datos,  
— įterptos bandomosios medžiagos kiekis,  
— naudoti tirpikliai ir bandomosios medžiagos įterpimo b ūdas, 
— iš pradži ų apdoroto dirvožemio ir kiekvienai analizei imamo 
dirvožemio mas ė, 
— naudotos inkubavimo sistemos aprašymas,  
— oro srauto vert ės (tik pratek ėjimo sistemoms),  
— temperat ūra bandymo pradžioje,  
— dirvožemio dr ėgmės kiekis inkubavimo metu,  
— mikrobin ė masė aerobini ų tyrimų pradžioje, j ų eigoje ir pabai ­
goje,  
— pH vert ė, deguonies koncentracija ir oksidacijos-redukcijos 
potencialas anaerobini ų ir ryžių laukų tyrimų pradžioje, j ų eigoje 
ir pabaigoje,  
— ekstrahavimo metodas (-ai),  
— bandomosios medžiagos, pagrindini ų jos transformavimo dirvo ­ 
žemyje produkt ų bei sugert ų medžiag ų kiekybinio nustatymo ir 
identifikavimo metodai,  
— kartotini ų ir kontrolini ų ėminių skaičius. 
Rezultatai:  
— mikrobinio aktyvumo nustatymo rezultatai,  
— taikyt ų analizės metodų pakartojamumas ir jautrumas,  
— regeneravimo laipsnio vert ės (tinkamu patvirtinto tyrimo % 
vertės yra pateiktos 1.7.1 skirsnyje),  
— rezultat ų, išreiškiam ų kaip įterptos pradin ės dozės procentin ė 
dalis ir, jei tinka, kaip mg kg  -1 dirvožemio (sauso dirvožemio), 
lentelės, 
— masių balansas tyrim ų eigoje ir juos užbaigus,  
— dirvožemio neekstrahuojamo (surištojo) radioaktyvumo arba 
likučių apibūdinimas,  
— išsiskyrusio CO  2 ir kitų lakiųjų medžiag ų kiekybinis apskai čia­
vimas,  
— bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindini ų transformavimo 
produktų koncentracijos dirvožemyje kaip laiko funkcijos 
kreivės, 
— bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindini ų transformavimo 
produktų pusėjimo arba DT  50 , DT  75 ir DT  90 vertės, įskaitant 
pasikliovimo ribas,  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— abiotinio skilimo steriliomis s ąlygomis grei čio įvertis,  
— bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindini ų transformavimo 
produktų transformavimo kinetikos įvertinimas,  
— pasiūlyti transformavimo keliai, jei tinka,  
— rezultat ų aptarimas ir aiškinimas,  
— neapdoroti duomenys (t. y. ėminių chromatogramos, transforma ­
vimo grei čio apskai čiavimų pavyzdžiai ir transformavimo 
produktams identifikuoti naudotos priemon ės). 
4. NUORODOS  
1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Assess ­
ment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental 
Fate.  
2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
3) European Union (ES) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
of 14 July 1995 amending Council Directive 91/414/EEC 
concerning the placing of plant protection products on the 
market. Annex II, Part A and Annex III, Part A: Fate and Behaviour in the Environment.
 
4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the 
product and its metabolites in soil, water and air.  
5) BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Prufung von Pflanzens ­
chutzmitteln, Teil IV, 4–1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln 
im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.  
6) ISO/DIS 11266–1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: 
Aerobic conditions.  
7) ISO 14239 (1997). Soil Quality – Laboratory incubation systems 
for measuring the mineralization of organic chemicals in soil 
under aerobic conditions.  
8) SET AC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil -Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
 
10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.  
11) Guth, J. A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123–157.
 
12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley – VCH (1998).  
13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945–956 (IUPAC 1984)  
14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981)  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
15) ISO 10381–6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
16) Annex V to Dir. 67/548/EEC  
17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114.
 
18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 
26:305 (1962).  
19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Minera ­
logical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd 
Edition.  
20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, 
Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.  
21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality – 
General aspects; chemical and physical methods of analysis; 
biological methods of analysis. First Edition.  
22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologis ­
chen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen 
Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method 
for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. 
Soil Biol. Biochem. 10, 215–221.  
25) ISO 14240–1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of soil 
microbial biomass -Part 1: Substrate-induced respiration method. 
Part 2: fumigation-extraction method.  
26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesti ­
cide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. 
Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45–60.  
27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and bio-transformation of pesticides in aqueous environment. Proceedings of the 16
 th Symposium on 
Environmental Science of Pesticide, 105–120.  
28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59–63 (SETAC-Europe).
 
29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjodahl-Svensson K., 
Stenstrom J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold 
storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, 
Soil Microbiology and Soil Quality, 68–69 (SETAC-Europe).  
30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethy ­
lene oxide on soil microbial content and some chemical charac ­
teristics. Plant and Soil 102, 197–200.  
31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. 
Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. 
BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181–199.
 
33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, R.W. 
(1975). Principles of pesticide degradation in soil. In „Environ ­
mental Dynamics of Pesticides“. R. Haque and V.H. Freed, 
Eds., 135–172.  
34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpreta ­
tion and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz -Nachrichten Bayer 39, 
188–204.
 
35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 47–60.  
36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissi ­
pation in soil; a new model based on spatial variability. Envi ­
ronm. Sci. Technol. 24, 1032–1041.  
37) Hurle K., Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 83–122.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
1 priedėlis 
VANDENS ĮTEMPTIS (HIDRAULINIS POTENCIALAS), LAUKO DR ĖGMĖS 
IMLUMAS (FC) IR VANDENS SULAIKYMO GEBA (WHC)  ( 1 ) 
Vandens stulpelio aukštis 
(cm)  pF (  a ) bar (  b ) Pastabos  
10 7 7 10  4 Sausas dirvožemis  
1,6 × 10  4 4,2 16  Augal ų vytimo taškas  
10 4 4 10  
10 3 3 1  
6 × 10  2 2,8 0,6  
3,3 × 10  2 2,5 0,33 (  c ) 
Lauko dr ėgmės imlumo 
intervalas (  d ) 10 2 2 0,1  
60 1,8  0,06  
33 1,5  9 
>> > > > > > > > = 
>> > > > > > > > ; 0,033
 
10 1  0,01  WHC (apytikr ė vertė) 
1 0  0,001  Vandeniu prisotintas 
dirvožemis  
( a ) pF = vandens stulpelio aukš čio, išreikšto cm, logaritmas. 
( b ) 1 bar = 10  5 Pa. 
( c ) Atitinka apytikr į vandens kiek į 10 % sm ėlyje, 35 % priemolyje ir 45 % molyje. 
( d ) Lauko dr ėgmės imlumas n ėra pastovus dydis, bet atsižvelgiant į dirvožemio tip ą kinta nuo F 1,5 iki 2,5.  
Vandens įtemptis  matuojama vandens stulpelio aukš čio cm arba bar. D ėl didelio siurbimo įtempties 
intervalo ji išreiškiama tiesiog kaip pF vert ė, kuri atitinka vandens stulpelio aukš čio, išreikšto cm, 
logaritmą. 
Lauko dr ėgmės imlumas  apibrėžiamas kaip vandens kiekis, kur į veikiant sunkio j ėgai gali sulaikyti 
natūralus dirvožemis 2 paras po ilgesnio lietaus laikotarpio arba po pakankamo dr ėkinimo. Jis 
nustatomas nepaliestam dirvožemiui  in situ  lauke. Taigi matavimas netaikomas paliesto dirvožemio 
laboratoriniams ėminiams. FC vert ės, nustatytos paliestam dirvožemiui, gali tur ėti didelių siste­
mingų nuokrypi ų. 
Vandens sulaikymo geba  (WHC) nustatoma laboratorijoje nepaliestam ir paliestam dirvožemiui, 
dirvožem į kolonėlėje sotinant kapiliarais kylan čiu vandeniu. Ji yra ypa č naudinga apibr ėžiant 
paliestą dirvožem į ir gali b ūti iki 30 % didesn ė už lauko dr ėgmės imlumą (1). Be to, j ą bandymo 
keliu lengviau nustatyti nei patikimas FC vertes.  
Pastabos  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
2 priedėlis 
DRĖGMĖS KIEKIS (g vandens 100 g sauso dirvožemio) ĮVAIRIŲ ŠALIŲ ĮVAIRAUS TIPO 
DIRVOŽEMYJE  
Dirvožemio tipas  Šalis  Dr ėgmės kiekis, kai  
WHC (  1 ) pF = 1,8  pF = 2,5  
Smėlis Vokietija  28,7  8,8  3,9  
Rišlus sm ėlis Vokietija  50,4  17,9  12,1  
Rišlus sm ėlis Šveicarija  44,0  35,3  9,2  
Dulkiškas priemolis  Šveicarija  72,8  56,6  28,4  
Sunkus priemolis  Brazilija  69,7  38,4  27,3  
Sunkus priemolis  Japonija  74,4  57,8  31,4  
Priesmėlis Japonija  82,4  59,2  36,0  
Dulkiškas priemolis  JAV  47,2  33,2  18,8  
Priesmėlis JAV  40,4  25,2  13,3  
( 1 ) Vandens sulaikymo geba (WHC – Water Holding Capacity).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
3 priedėlis 
1 paveikslas  
Pratekėjimo aparato chemini ų medžiag ų virsmui dirvožemyje tirti pavyzdys  ( 1 ), ( 2 )
 
2 paveikslas  
Biometrinio tipo kolbos chemini ų medžiag ų virsmui dirvožemyje tirti pavyzdys  ( 3 )
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123–157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.
 C.24.  AEROBINIS IR ANAEROBINIS TRANSFORMAVIMAS 
VANDENS TELKINI Ų DUGNO NUOS ĖDŲ SISTEMOSE  
1. METODAS  
Šis bandymo metodas atitinka OECD TG 308 (2002).  
1.1. ĮVADAS  
Cheminės medžiagos gali patekti į negilius arba gilius paviršinius 
vandenis pvz., šiais b ūdais: tiesioginio prid ėjimo, purškiam ų 
medžiagų sklaidos, nuot ėkio, drenažo, atliek ų šalinimo, pramonini ų, 
buitinių arba žem ės ūkio nuotek ų ir nusėdimo iš atmosferos. Šiame 
bandymo metode aprašytas laboratorinis metodas skirtas įvertinti 
organinių cheminių medžiag ų aerobinį ir anaerobin į transformavim ą 
vandens telkini ų dugno nuos ėdų sistemose. Jis yra pagr įstas turi­
momis rekomendacijomis (1) (2) (3) (4) (5) (6). Belgirate, Italijoje, 
1995 m. vykusiame OECD seminare d ėl dirvožemi ų ir nuosėdinių 
uolienų atrankos (7) buvo konkre čiai sutarta d ėl šiame bandyme 
naudojam ų dirvožemi ų skaičiaus ir tipo. Be to, seminare buvo 
pateiktos dirvožemio ėminių ėmimo, tvarkymo ir laikymo rekomen ­
dacijos, pagr įstos ISO rekomendaciniu dokumentu (8). Tokie tyrimai 
skirti chemin ėms medžiagoms, kurios tiesiogiai dedamos į vandenį 
arba kurios gali pasiekti vandenin ę aplinką pirmiau aprašytais b ūdais. 
Gamtinių vandens telkini ų dugno nuos ėdų sistemų sąlygos dažnai 
yra aerobin ės viršutin ėje vandenin ėje fazėje. Nuosėdų paviršiniame 
sluoksnyje s ąlygos gali b ūti aerobin ės arba anaerobin ės, o giliau 
esančiose nuos ėdose jos paprastai yra anaerobin ės. Siekiant apr ėpti 
visas šias galimybes, šiame dokumente aprašyti aerobiniai ir anaero ­
biniai bandymai. Atliekant aerobin į bandymą, modeliuojamas aero ­
binio vandens stulpas virš aerobini ų nuosėdų, po kuriomis yra 
sluoksnis su anaerobini ų sąlygų gradientu. Atliekant anaerobin į 
bandymą modeliuojama visiškai anaerobin ė vandens ir nuos ėdų 
sistema. Jei aplinkyb ės rodo, kad b ūtina labai nukrypti nuo ši ų reko­
mendacijų, pvz., naudojant nepaliest ų nuosėdų kernus arba nuos ėdas, 
kurios gal ėjo būti veikiamos bandom ąja medžiaga, šiam tikslui yra 
kiti skirti metodai (9).  
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Visai atvejais turi b ūti naudojami tarptautin ės vienetų sistemos (SI) 
vienetai.  
Bandomoji medžiaga  – bet kuri medžiaga (tai gali b ūti pradinis 
junginys ar medžiagos transformavimo produktai)  
Transformavimo produktai  – visos medžiagos, susidaran čios vyks­
tant bandomosios medžiagos biotinio arba abiotinio transformavimo reakcijoms, įskaitant CO
 2 ir surištuosiuos liku čius. 
Surištieji liku čiai – dirvožemyje, augale arba gyv ūne esantys jungi ­
niai, kurie po ekstrahavimo lieka matricoje pradin ės medžiagos arba 
jos metabolito (- ų) pavidalu. Ekstrahavimo metodas iš esm ės turi 
nekeisti pa čių junginių arba matricos strukt ūros. Ryšio prigimt į 
galima iš dalies išaiškinti, taikant matric ą keičiančius ekstrahavimo 
metodus ir sud ėtingus analiz ės metodus. Pvz., tokiu b ūdu šiandien 
yra identifikuotos kovalentin ės, joninės ir sorbcinio tipo jungtys, be 
to, pagautieji junginiai. Apskritai, surišt ųjų likučių susidarymas labai 
mažina biologin į įsisavinamum ą ir biologin į kaupimąsi (10) (modi ­
fikuota IUPAC 1984 (11) apibr ėžtis). ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Aerobinis transformavimas (oksidavimas)  – reakcijos, vykstan čios 
esant molekuliniam deguoniui (12).  
Anaerobinis transformavimas (dezoksidavimas)  – reakcijos, vyks ­
tančios nesant molekulinio deguonies (12).  
Gamtiniai vandenys  – paviršiniai vandenys, paimti iš tvenkini ų, 
upių, upelių ir t. t.  
Nuosėdos: – mineralini ų ir organini ų komponent ų mišinys, kurio 
organinius komponentus sudaro didel ės molekulin ės masės junginiai, 
turintys didel į anglies ir azoto kiek į. Jas nusodina gamtinis vanduo, 
su kuriuo nuos ėdos sudaro s ąlyčio pavirši ų. 
Mineralizacija : – visiškas organinio junginio skilimas į CO  2 ir H  2 O 
aerobinėmis sąlygomis, ir į CH  4 , CO  2 ir H  2 O anaerobin ėmis sąly­
gomis. Šiame bandymo metode, kai naudojamas žym ėtasis junginys, 
mineralizacija yra didelio laipsnio molekul ės skilimas, kai žym ėtasis 
anglies atomas kiekybiškai oksiduojamas arba redukuojamas, susida ­
rant atitinkamam  14 CO 2 arba  14 CH 4 kiekiui.  
Pusėjimo trukm ė – t  0,5 , laikas, per kur į bandomosios medžiagos 
koncentracija sumaž ėja 50 %, kai transformavimui aprašyti tinka 
pirmojo laipsnio kinetika; ji nepriklauso nuo pradin ės koncentracijos.  
DT 50 (išnykimo trukm ė 50)  – laikas, per kur į bandomosios 
medžiagos koncentracija sumaž ėja 50 %.  
DT 75 (išnykimo trukm ė 75)  – laikas, per kur į bandomosios 
medžiagos koncentracija sumaž ėja 75 %.  
DT 90 (išnykimo trukm ė 90)  – laikas, per kur į bandomosios 
medžiagos koncentracija sumaž ėja 90 %.  
1.3. ETALONIN ĖS MEDŽIAGOS  
Etaloninės medžiagos naudojamos, jei transformavimo produktams 
identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti taikomi spektroskopiniai ir chro ­
matografijos metodai.  
1.4. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Transformavimo grei čiui matuoti gali b ūti naudojama nežym ėtoji 
arba žym ėtųjų atomų turinti bandomoji medžiaga, bet geriau naudoti 
žymėtąją medžiag ą. Žymėtoji medžiaga reikalinga transformavimo 
keliui tirti ir masi ų balansui nustatyti. Rekomenduojama žym ėti 
14 C, bet gali b ūti naudingi kiti izotopai, pvz.,  13 C, 15 N, 3 H, 32 P. 
Kiek tai įmanoma, žym ėtasis atomas turi b ūti patvariausioje (-iose) 
molekulės dalyje (-yse) (  1 ). Bandomosios medžiagos cheminis ir 
(arba) radiocheminis grynumas turi b ūti mažiausiai 95 %.  
Prieš pradedant bandym ą, turi būti gauta ši informacija apie bando ­
mąją medžiag ą: 
a) tirpumas vandenyje (A.6 metodas);  
b) tirpumas organiniuose tirpikliuose;  
c) garų slėgis (A.4 metodas) ir Henrio d ėsnio konstanta;  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Pvz., jei bandomoji medžiaga turi vien ą žiedą, žymėtasis atomas turi b ūti šiame žiede; jei 
bandomoji medžiaga turi du žiedus arba daugiau, gali tekti daryti atskirus tyrimus kiek ­
vieno žiedo su žym ėtuoju atomu likimui įvertinti ir atitinkamai informacijai apie virsmo 
produktų susidarym ą gauti.
 d) pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo) (A.8 metodas);  
e) adsorbcijos koeficientas (K  d , K f , K oc , jei tinka) (C. 18 metodas);  
f) hidroliz ė (C.7 metodas);  
g) disociacijos konstanta (pK  a ), (OECD TG 112) (13);  
h) bandomosios medžiagos chemin ė struktūra ir žym ėtųjų izotopų 
padėtis, jei taikomi.  
Pastaba . Ataskaitoje turi b ūti nurodyta matavim ų temperat ūra. 
Kitą naudingą informacij ą gali sudaryti duomenys apie bandomosios 
medžiagos toksin į poveikį mikroorganizmams, duomenys apie 
lengvą ir (arba) b ūdingąjį biologin į skaidum ą, duomenys apie aero ­
binį arba anaerobin į transformavim ą dirvožemyje.  
Reikia tur ėti analizės metodus ( įskaitant ekstrahavimo ir gryninimo 
metodus) bandomajai medžiagai ir jos transformavimo vandenyje bei 
nuosėdose produktams identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti (žr. 1.7.2 
skirsnį). 
1.5. BANDYMO METODO PRINCIPAS  
Pagal šiame bandyme aprašyt ą metodą naudojamos aerobin ė ir anae­
robinė vandenini ų nuosėdų (žr. 1 pried ėlį) sistema, kurioje galima:  
i) matuoti bandomosios medžiagos transformavimo vandens ir 
nuosėdų sistemoje greit į; 
ii) matuoti bandomosios medžiagos transformavimo nuos ėdose 
greitį; 
iii) matuoti bandomosios medžiagos ir (arba) transformavimo 
produktų mineralizacijos greit į (kai naudojama  14 C žymėtoji 
bandomoji medžiaga);  
iv) identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti transformavimo vandenin ėje 
ir nuosėdų fazėse produktus, įskaitant masi ų balansą (kai naudo ­
jama žym ėtoji bandomoji medžiaga);  
v) matuoti bandomosios medžiagos ir jos transformavimo produkt ų 
pasiskirstym ą tarp dviej ų fazių inkubavimo tamsoje laikotarpiu 
(siekiant išvengti, pvz., dumbli ų žydėjimo), esant pastoviai 
temperatūrai. Nustatomos pus ėjimo trukm ės, DT  50 , DT  75 ir 
DT 90 vertės, kai tai leidžia daryti turimi duomenys, bet j ų nerei­
kėtų ekstrapoliuoti gerokai ilgesnei nei bandymo laikotarpis 
trukmei (žr. 1.2 skirsn į). 
Aerobiniams ir anaerobiniams tyrimams reikia tur ėtų mažiausiai 
dviejų tipų nuosėdas ir jas atitinkan čias vandenines fazes (7). Ta čiau 
gali pasitaikyti atvej ų, kai reikia naudoti daugiau kaip dviej ų tipų 
vandenines nuos ėdas, pvz., norint tirti chemin ę medžiag ą, kuri gali 
būti gėlame ir (arba) j ūros vandenyje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6. BANDYMO TINKAMUMAS  
Metodas iš esm ės tinka visoms chemin ėms medžiagoms (nežym ėto­
sioms arba žym ėtosioms), kurioms nustatyti yra sukurtas pakankamo 
tikslumo ir jautrio analiz ės metodas. Jis tinka mažai lakiems, nela ­
kiems, vandenyje tirpiems arba netirpiems junginiams. Bandymas neturi būti taikomas chemin ėms medžiagoms, kurios labai greit išga ­
ruoja iš vandens (pvz., fumigantai, organiniai tirpikliai), tod ėl negali 
būti laikomos vandenyje ir (arba) nuos ėdose šio bandymo s ąlygomis.
 
Iki šiol metodas buvo taikomas chemini ų medžiagų transformavimui 
gėlame vandenyje ir nuos ėdose tirti, bet iš esm ės jį dar galima taikyti 
upių žiočių ar jūros sistemoms. Jis netinka tekan čio vandens (pvz., 
upių) arba atvirosios j ūros sąlygoms modeliuoti.  
1.7. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
1.7.1.  Regeneravimas  
Mažiausiai dviej ų kartotini ų vandens ir nuos ėdų ėminių ekstraha ­
vimas ir analiz ė iškart po bandomosios medžiagos prid ėjimo yra 
pirmasis analiz ės metodo pakartojamumo ir bandomosios medžiagos 
įterpimo metodikos tolygumo rodiklis. V ėlesnių bandymo stadij ų 
regeneravimo laipsnis gaunamas matuojant atitinkam ų masės verčių 
balansą (kai naudojama žym ėtoji medžiaga). Žym ėtųjų chemini ų 
medžiagų regeneravimo laipsnis turi b ūti nuo 90 % iki 110 % (6), 
nežymėtųjų cheminių medžiag ų – nuo 70 % iki 110 %.  
1.7.2.  Analiz ės metodo pakartojamumas ir jautris  
Bandomosios medžiagos ir transformavimo produkt ų kiekybin ės 
analizės metodo pakartojamumas (išskyrus pradin į ekstrahavimo 
efektyvum ą) gali būti patikrintas atliekant kartotin ę to paties vandens 
arba nuos ėdų ėminių, inkubuot ų pakankamai ilgai, kad gal ėtų susi­
daryti transformavimo produktai, ekstrakto analiz ę. 
Bandomosios medžiagos ir transformavimo produkt ų analizės 
metodo aptikimo riba (LOD) turi b ūti mažiausiai 0,01 mg × kg  -1 
vandens arba nuos ėdų (kaip bandomosios medžiagos) arba 1 % į 
bandymo sistem ą dedamos pradin ės dozės, imant mažesni ąją vertę. 
Turi būti apibrėžta kiekybinio nustatymo riba (LOQ).  
1.7.3.  Transformavimo duomen ų tikslumas  
Atliekant bandomosios medžiagos koncentracijos ver čių kaip laiko 
funkcijos regresin ę analizę gaunama atitinkama informacija apie 
transformavimo kreiv ės tikslum ą ir leidžia apskai čiuoti pus ėjimo 
trukmės verčių pasikliovimo ribas (jei reakcija atitinka pseudopir ­
mojo laipsnio kinetik ą) arba DT  50 vertes ir, jei tinka, DT  75 ir DT  90 
vertes.  
1.8. METODO APRAŠYMAS  
1.8.1.  Bandymo sistema ir aparat ūra 
Tyrimas turi b ūti daromas naudojant stiklinius indus (pvz., butelius, 
centrifugavimo m ėgintuvėlius), išskyrus kai išankstin ė informacija 
(pvz., pasiskirstymo koeficientas (n-oktanolis/vanduo), sorbcijos 
duomenys ir t. t.) rodo, kad bandomoji medžiaga gali sukibti su stiklu; šiam atvejui reik ėtų numatyti pakaitin ę medžiag ą (pvz., 
tefloną). Jei žinoma, kad bandomoji medžiaga gali sukibti su stiklu, 
šią problem ą būtų galima iš dalies sumažinti, taikant vien ą iš šių 
metodų:
 ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— nustatyti stiklu sorbuotos bandomosios medžiagos ir transforma ­
vimo produkt ų masę, 
— užtikrinti, kad baigus bandym ą visi stikliniai indai b ūtų plaunami 
tirpikliu,  
— naudoti produkt ų preparatus (žr. dar 1.9.2 skirsn į), 
— naudoti padidint ą antrojo tirpiklio kiek į bandomajai medžiagai į 
sistemą įvesti; jei naudojamas antrasis tirpiklis, jame neturi tirpti 
bandomoji medžiaga.  
Tipinės bandymo aparat ūros pavyzdžiai, t. y. duj ų pratekėjimo ir 
biometrinio tipo sistemos, pavaizduoti atitinkamai 2 ir 3 pried ėliuose 
(14). Kitos tinkamos inkubavimo sistemos aprašytos 15 nuorodoje. Bandymo aparat ūros konstrukcija turi užtikrinti oro ir azoto main ų ir 
lakiųjų produktų sugavimo s ąlygas. Aparat ūros matmenys turi atitikti 
bandymo reikalavimus (žr. 1.9.1 skirsn į). Ventiliacij ą galima užtik ­
rinti nestipriai barbotuojant or ą arba azot ą arba juos leidžiant virš 
vandens paviršiaus. Pataruoju atveju galima patarti nestipriai maišyti 
viršutinį vandens sluoksn į, kad deguonis ir azotas geriau pasklist ų 
vandenyje. Neturi b ūti naudojamas CO
 2 neturintis oras, kadangi d ėl 
to gali padid ėti vandens pH vert ė. Bet kuriuo atveju drumsti 
nuosėdas nepageidautina ir to turi b ūti kiek įmanoma vengiama. 
Mažai lakios chemin ės medžiagos turi b ūti bandomos biometrinio 
tipo sistemoje, nestipriai maišant vandens paviršin į sluoksnį. Be to, 
galima naudoti uždarus indus su atmosferiniu oru arba azotu užpil ­
dyta laisv ąja erdve ir buteliukus viduje lakiesiems produktams 
sugauti (16). Atliekant aerobin į bandym ą reikia reguliariai keisti 
laisvojoje erdv ėje esančias dujas biomas ės suvartotam deguoniui 
kompensuoti.  
Tinkamos priemon ės lakiems transformavimo produktams sugerti, 
kurių gali būti ir daugiau, yra 1 mol dm  -3 kalio arba natrio hidro ­
ksido tirpalas anglies dioksidui sugerti (  1 ) ir etilenglikolis, etanola ­
minas arba 2 % parafino tirpalas ksilene organiniams junginiams 
sugerti. Anaerobin ėmis sąlygomis susidariusius lakiuosius produktus, 
pvz., metan ą, galima rinkti, pvz., molekuliniais sietais. Tokie lakieji 
produktai gali b ūti sudeginti, pvz., iki CO  2 , leidžiant dujas CuO 
užpildytu kvarciniu vamzdeliu, kaitinamu iki 900 °C temperat ūros, 
o susidarius į CO  2 sugerti absorberyje šarmo tirpalu (17).  
Reikia tur ėti laboratorinius bandomosios medžiagos ir transforma ­
vimo produkt ų analizės prietaisus (pvz., duj ų ir skys čių 
chromatografijos (GLC), efektyviosios skys čių chromatografijos 
(HPLC), plonasluoksn ės chromatografijos (TLC), masi ų 
spektroskopijos (MS), duj ų chromatografijos-masi ų spektroskopijos 
(GC-MS), skys čių chromatografijos-masi ų spektroskopijos (LC- 
MS), magnetinio branduoli ų rezonanso (MBR) ir t. t. įrangą), atitin­
kamas aptikimo sistemas žym ėtosioms arba nežym ėtosioms medžia ­
goms analizuoti. Be to, reikia tur ėti skysčių scintiliacin į skaitiklį ir 
oksidacinio sudeginimo aparat ūrą (nuosėdų ėminiams sudeginti prieš 
radioaktyvumo analiz ę) žymėtosioms medžiagoms analizuoti.  
Būtina turėti kita tipin ę laboratorin ę įrangą fizikocheminei ir biolo ­
ginei analizei atlikti (žr. 1.8.2.2 skirsnio lentel ę), stiklinius indus, 
atitinkamas chemines medžiagas ir reagentus.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Kadangi šie šarminiai sug ėrimo tirpalai sugeria anglies dioksid ą, esantį ventiliuojamame 
ore ir susidarius į dėl kvėpavimo darant aerobinius bandymus, jie reguliariai turi b ūti 
keičiami, kad b ūtą išvengta soties, taigi absorbcijos gebos praradimo.
 1.8.2.  Vandens telkini ų dugno nuos ėdų atranka ir skai čius 
Kiekvienu atveju ėminių ėmimo vietos pasirenkamos atsižvelgiant į 
bandymo tiksl ą. Pasirenkant ėminių ėmimo vietas, turi b ūti atsiž­
velgta į galimo žem ės ūkio, pramon ės arba buitini ų nuotekų pate­
kimo į vandens basein ą ir į prieš srov ę esančius vandens šaltinius 
istoriją. Nuosėdos neturi b ūti naudojamos, jei per ankstesnius 4 
metus jos buvo teršiamos bandom ąja medžiaga arba jos strukt ūriniais 
analogais.  
1.8.2.1.  Nuos ėdų atranka  
Aerobiniams tyrimams paprastai naudojamos dviej ų rūšių nuosėdos (7). 
Pasirinktos dviej ų rūšių nuosėdos turi skirtis organin ės anglies kiekiu ir 
tekstūra. Vienos r ūšies nuosėdos turi tur ėti didelį organinės anglies kiek į 
(2,5– 7,5 %) ir b ūti smulkios tekst ūros, kitos r ūšies nuosėdos turi tur ėti 
mažą organinės anglies kiek į (0,5– 2,5 %) ir b ūti stambios tekst ūros. 
Organinės anglies kiekio skirtumas paprastai turi b ūti ne mažesnis kaip 
2 %. „Smulki tekst ūra“ apibrėžiama kaip turinti (molio + dumblo) (  1 ) 
kiekį > 50 %, o „stambi tekst ūra“ apibrėžiama kaip turinti (molio + 
dumblo) kiek į < 50 %. Dviej ų rūšių nuosėdų (molio + dumblo) kiekio 
skirtumas paprastai turi b ūti ne mažesnis kaip 20 %. Tais atvejais, kai 
cheminė medžiaga gali pasiekti j ūros vanden į, mažiausiai viena iš 
vandens ir dumblo sistem ų turi būti jūrinės kilmės. 
Norint atlikti griežtai anaerobin į tyrimą, dviejų rūšių nuosėdos (įskai­
tant virš j ų esantį vandenį) turi būti imamos iš anaerobini ų paviršinio 
vandens t ūrio zonų (7). Nuos ėdos ir virš j ų esančios vandenin ės 
fazės turi būti tvarkomos ir vežamos atsargiai, apsaugant nuo deguo ­
nies patekimo.  
Pasirenkant nuos ėdas gali b ūti svarbūs kiti parametrai, į kuriuos turi 
būti atsižvelgta kiekvienu konkre čiu atveju. Pvz., nuos ėdų pH verčių 
intervalas tur ėtų būti svarbus bandant chemines medžiagas, kuri ų 
transformavimas ir (arba) sorbcija gali priklausyti nuo pH vert ės. 
Sorbcijos priklausomyb ę nuo pH vert ės gali rodyti bandomosios 
medžiagos pK  a vertė. 
1.8.2.2.  Vandens ir nuos ėdų ėminių apibūdinimas  
Pagrindiniai vandens ir nuos ėdų parametrai, kurie turi b ūti išmatuoti 
ir pateikti ataskaitoje (su taikyto metodo nuoroda), ir bandymo 
stadija, kurioje tie parametrai turi b ūti nustatyti, yra apibendrinti 
toliau pateiktoje lentel ėje. Informacija apie t ų parametr ų nustatymo 
metodus pateikta nuorodose (18)(19)(20)(21).  
Be to, kiekvienu konkre čiu atveju gali tekti matuoti ir pateikti atas ­
kaitoje kitus parametrus (pvz., g ėlo vandens: daleles, šarmingum ą, 
kietumą, laidį, NO  3 /PO  4 (santykį ir atskiras vertes); nuos ėdų: kati­
jonų mainų gebą, vandens sulaikymo geb ą, karbonat ų kiekį, bendrą 
azoto ir fosforo kiek į; jūros sistemoms: druskingum ą). Be to, gali 
būti naudinga nuos ėdų ir vandens analiz ė nitratams, sulfatams, biolo ­
giškai kaupiamos geležies ir kitiems galimiems elektron ų akcepto­
riams nustatyti įvertinant oksidacijos-redukcijos s ąlygas, ypa č anae­
robinio transformavimo atveju.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) (Molis + dumblas) yra mineralin ė dalis nuos ėdų, kurių dalelių dydis < 50 μm.
 Vandenį ir nuosėdas apibūdinančių parametr ų matavimas (7)(22)(23)  
Parametras  Bandymo stadija  
Ėminio 
ėmimas- 
lauke  Vėlesnis 
tvarkymas  Aklimatiza ­
cijos 
pradžia  Bandymo 
pradžia  Bandymo 
eiga Bandymo 
pabaiga  
Vanduo  
Kilmė/Šaltinis  x  
Temperat ūra x  
pH x  x  x  x  x  
Bendroji organin ė anglis (TOC)  x  x  x  
O 2 koncentracija (*)  x  x  x  x  x  
Oksidacijos redukcijos 
potencialas (*)  x x  x  x  
Nuosėdos 
Kilmė/Šaltinis  x  
Sluoksnio gylis  x  
pH x  x  x  x  x  
Dalelių dydžio skirstinys  x  
TOC  x  x  x  x  
Mikrobin ė biomasė (*) x  x  x  
Oksidacijos redukcijos 
potencialas (**)  Stebė­
jimas (spalva/ kvapas)
 x x  x  x  
(*) Mikrobinio kv ėpavimo grei čio nustatymo metodas (26), fumigacijos metodas (27) arba mikroorganizm ų skaičiavimo 
metodai (pvz., bakterij ų, aktinomice čių, grybelių ir bendro kolonij ų skaičiaus), darant aerobinius tyrimus; metano 
susidarymo greitis, darant anaerobinius tyrimus. 
(**) Nauj ų tyrimų rezultatai parod ė, kad vandens deguonies ir oksidacijos-redukcijos potencialo matavimai neturi mecha ­
nizmo nustatymo ir prognozavimo vert ės, kai kalbama apie mikrob ų populiacijos paviršiniuose vandenyse augim ą ir 
vystymąsi (24)(25). Biocheminio deguonies poreikio (BOD, imant ėminį lauke, bandymo pradžioje ir pabaigoje) ir 
mitybinių mikroelement ų/makroelement ų Ca, Mg ir Mn vandenyje nustatymas (bandymo pradžioje ir pabaigoje) ir 
bendro N bei bendro P kiekio nuos ėdose matavimas (imant ėminį lauke ir bandymo pabaigoje) gali b ūti geresnė 
priemonė aerobinio biologinio virsmo grei čiams ir keliams interpretuoti bei įvertinti.  
1.8.3.  Ėminių ėmimas, tvarkymas ir laikymas  
1.8.3.1.  Ėminių ėmimas  
Imant nuos ėdas būtina vadovautis ISO rekomendacinio dokumento 
projektu d ėl dugno nuos ėdų ėminių ėmimo (8). Nuos ėdų ėminiai turi 
būti imami iš viso viršutinio 5–10 cm storio nuos ėdų sluoksnio. 
Nuosėdas atitinkantis vanduo turi b ūti imamas iš tos pa čios vietos 
arba vietov ės ir tuo pa čiu metu, kaip ir nuos ėdos. Atliekant anaero ­
binį tyrimą, nuosėdos ir jas atitinkantis vanduo turi b ūti imami, 
apsaugant nuo deguonies patekimo (28) (žr. 1.8.2.1 skirsn į). Kai 
kurie ėminių ėmimo įtaisai aprašyti literat ūroje (8) (23).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2.  Tvarkymas  
Nuosėdos atskiriamos nuo vandens filtravimu ir šlapios sijojamos per 
2 mm siet ą, naudojant toje pat vietoje buvusio vandens pertekli ų, 
kuris vėliau išpilamas. Tuomet žinomas nuos ėdų ir vandens kiekis 
sumaišomas norimu santykiu (žr. 1.9.1 skirsn į) inkubavimo kolbose 
ir ruošiamas aklimatizacijai (žr. 1.8.4 skirsn į). Darant anaerobin į 
tyrimą, visos ruošimo operacijos turi b ūti vykdomos neleidžiant 
patekti deguoniui (29) (30) (31) (32) (33).  
1.8.3.3.  Laikymas  
Rekomenduojama naudoti k ą tik paruoštas nuos ėdas ir vanden į, 
tačiau jei būtina ėminius laikyti, nuos ėdos su vandeniu sijojamos, 
kaip pirmiau aprašyta, užpilamos vandeniu (6–10 cm vandens sluoksniu) ir laikomos kartu su juo tamsoje ne ilgiau kaip 4 savaites, 
esant 4 ± 2 °C
 4 [13] (7) (8) (23). Ėminiai, skirti aerobiniams tyri ­
mams, turi b ūti laikomi leidžiant laisvai patekti orui (pvz., atviruose 
induose), ėminiai, skiri anaerobiniams tyrimams, laikomi neleidžiant 
patekti deguoniui. Nuos ėdos su vandeniu neturi užšalti arba 
nuosėdos neturi išdži ūti. 
1.8.4.  Nuos ėdų ar vandens ėminių ruošimas bandymui  
Prieš pridedant bandomosios medžiagos reikia aklimatizacijos laiko ­
tarpio, kai kiekvienas nuos ėdų ar vandens ėminys supilamas į pagrin­
diniame bandyme naudojam ą inkubavimo ind ą ir aklimatizuojamas 
esant tiksliai tokioms pa čioms kaip ir bandymo inkubavimo s ąly­
goms (žr. 1.9.1 skirsn į). Aklimatizacijos laikotarpis reikalingas 
reikiamam sistemos stabilumui pasiekti, kur į rodo pH vert ė, deguo­
nies koncentracija vandenyje, nuos ėdų ir vandens 
oksidacijos-redukcijos potencialas ir makroskopinis fazi ų atsisky­
rimas. Paprastai aklimatizacijos laikotarpis turi trukti nuo vienos iki 
dviejų savaičių, bet neturi b ūti ilgesnis kaip keturios savait ės. Atas­
kaitoje turi b ūti pateikti šiuo laikotarpiu darom ų matavim ų rezultatai.  
1.9. BANDYMO PROCED ŪRA 
1.9.1.  Bandymo s ąlygos  
Bandymas turi b ūti atliekamas inkubavimo aparate (žr. 1.8.1 skirsn į), 
esant vandens ir nuos ėdų tūrio santykiui nuo 3: 1 iki 4: 1, ir 2,5 cm 
(± 0,5 cm) nuos ėdų sluoksnio storiui. (  1 ) Rekomenduojama naudoti 
ne mažiau kaip 50 g nuos ėdų (skaičiuojant sausai medžiagai) vienam 
inkubavimo indui.  
Bandymas turi b ūti atliekamas tamsoje esant pastoviai 10–30 °C 
temperatūrai. Tikslinga naudoti (20 ± 2) °C temperat ūrą. Prireikus 
kiekvienam konkre čiam atvejui galima numatyti papildom ą mažesnę 
temperatūrą (pvz., 10 °C), atsižvelgiant į informacij ą, kurios turi 
suteikti bandymas. Inkubavimo temperat ūra turi būti kontroliuojama 
ir nurodoma ataskaitoje.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Naujausi tyrimai parod ė, kad, jei laikoma esant 4 °C, gali sumaž ėti nuosėdų organinės 
anglies kiekis, d ėl ko gali sumaž ėti mikrobinis aktyvumas.
 1.9.2.  Bandomosios medžiagos apdorojimas ir įdėjimas  
Naudojama viena chemin ės medžiagos bandymo koncentracija (  1 ). 
Augalų apsaugai skirtoms chemin ėms medžiagoms, kurios tiesiogiai 
pilamos į vandens telkinius, didžiausia etiket ėje nurodyta dozavimo 
koncentracija turi b ūti laikoma didžiausia taikoma norma, apskai ­ 
čiuojama pagal bandymo indo vandens paviršiaus plot ą. Visais kitais 
atvejais naudojama koncentracija turi b ūti pagrįsta į aplinką išme­
tamo kiekio įverčiais. Būtina užtikrinti, kad b ūtų naudojama atitin ­
kama bandomosios medžiagos koncentracija, siekiant apib ūdinti 
transformavimo keli ą ir transformavimo produkt ų susidarym ą ir išny­
kimą. Gali tekti naudoti didesnes dozes (pvz., 10 kart ų) tais atvejais, 
kai bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės bandymo pradžioje 
yra arti aptikimo ribos ir (arba) jei pagrindiniai transformavimo produktai negali b ūti lengvai rasti, kai jie sudaro 10 % bandomosios 
medžiagos įdėjimo normos. Ta čiau, jei naudojamos didesn ės 
bandymo koncentracijos vert ės, medžiaga neturi daryti reikšmingo 
neigiamo poveikio vandens ir nuos ėdų sistemos mikrobiniam akty ­
vumui. Siekiant gauti pastovi ą bandomosios medžiagos koncentracij ą 
skirtingų matmenų induose, gali b ūti naudinga reguliuoti įdedamos 
medžiagos kiek į pagal vandens sluoksnio gyl į
 inde ir jo gyl į lauko 
sąlygomis (laikant, kad jis yra lygus 100 cm, bet galima naudoti ir 
kitas gylio vertes). Apskai čiavimo pavyzdys pateiktas 4 pried ėlyje. 
Būtų geriausia bandom ąją medžiagą pilti į bandymo sistemos vande ­
ninę fazę kaip vandenin į tirpalą. Jei kitaip ne įmanoma, bandomajai 
medžiagai įpilti ir paskirstyti leidžiama naudoti nedidelius kiekius su 
vandeniu maiši ų tirpiklių (pvz., acetono, etanolio), ta čiau jie neturi 
sudaryti daugiau kaip 1 % v/v ir neturi neigiamai veikti bandymo sistemos mikrobinio aktyvumo. Bandomosios medžiagos vandeninius 
tirpalus reikia ruošti kruopš čiai, visiškam vienalytiškumui užtikrinti 
gali būti naudinga naudoti generavimo kolon ėles ir išankstin į 
maišymą. Po vandeninio tirpalo įpylimo į bandymo sistem ą vande­
ninę fazę rekomenduojama nestipriai maišyti, stengiantis kiek 
įmanoma mažiau liesti nuos ėdas.
 
Preparatų paprastai nerekomenduojama naudoti, nes preparato ingre ­
dientai gali veikti bandomosios medžiagos ir (arba) transformavimo 
produktų pasiskirstym ą tarp vandens ir nuos ėdų fazių. Tačiau jei 
bandomoji medžiaga yra mažai tirpi vandenyje, preparatas gali b ūti 
tinkamas pasirinkimas.  
Inkubavimo ind ų skaičius priklauso nuo m ėginių ėmimo kart ų skai­ 
čiaus (žr. 1.9.3 skirsn į). Turi būti naudojamas pakankamas bandymo 
sistemų skaičius, kad kiekvien ą kartą imant m ėginį būtų galima 
paaukoti dvi sistemas. Jei naudojami kiekvienos vandens ir nuos ėdų 
sistemos kontroliniai ėminiai, jie neturi b ūti apdorojami bandom ąja 
medžiaga. Kontroliniai įrenginiai gali b ūti naudojami nuos ėdų mikro­
binei biomasei ir vandens bei nuos ėdų bendrajai organinei angliai 
nustatyti tyrimo pabaigoje. Du iš kontrolini ų įrenginių (t. y. po vien ą 
kontrolinį įrenginį kiekvienoms vandenin ėms nuosėdoms) gali b ūti 
naudojami reikiamiems nuos ėdų ir vandens parametrams kontroliuoti 
aklimatizacijos laikotarpiu (žr. 1.8.2.2 skirsnio lentel ę). Du papildomi 
kontroliniai įrenginiai turi b ūti įtraukti tuo atveju, kai bandomoji 
medžiaga įpilama naudojant tirpikl į, kad būtų galima matuoti jo 
neigiamą poveikį bandymo sistemos mikrobiniam aktyvumui.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Toms chemin ėms medžiagoms, kurios į paviršinius vandenis patenka skirtingais b ūdais, 
kai dėl to gaunamos labai skirtingos koncentracijos vert ės, gali būti naudingas bandymas 
naudojant antr ą koncentracij ą, jei mažesni ąją koncentracij ą galima nustatyti pakankamai 
tiksliai.
 1.9.3.  Bandymo trukm ė ir mėginių ėmimas  
Tyrimas paprastai neturi b ūti ilgesnis kaip 100 par ų (6), ir turi vykti 
tol, kol nustatomas skilimo kelias ir pasiskirstymo tarp vandens ir 
nuosėdų charakteristika arba 90 % bandomosios medžiagos išsis ­
klaido transformavimo keliu ir (arba) išgaruoja. M ėginiai turi b ūti 
imami bent šešis kartus ( įskaitant nulin į laiką), naudojant nepriva ­
lomą pradinį tyrimą (žr. 1.9.4 skirsn į) tinkamam m ėginių ėmimo 
režimui ir bandymo trukmei nustatyti, išskyrus kai apie bandom ąją 
medžiagą yra pakankamas kiekis duomen ų iš ankstesni ų tyrimų. Jei 
tiriamos hidrofobin ės bandomosios medžiagos, pradiniu tyrimo laiko ­
tarpiu gali b ūti reikalingi papildomi m ėginių ėmimo taškai pasiskirs ­
tymo tarp vandens ir nuos ėdų fazių greičiui nustatyti.  
Atitinkamu m ėginio ėmimo laiku inkubavimo indai su visu turiniu 
(kartotiniai m ėginiai) imami analizei atlikti. Nuos ėdos ir virš j ų 
esantis vanduo analizuojami atskirai (  1 ). Paviršinis vanduo atsargiai 
nupilamas, kiek įmanoma mažiau lie čiant nuos ėdas. Bandomosios 
medžiagos ir transformavimo produkt ų ekstrahavimas ir apib ūdi­
nimas turi b ūti daromas taikant atitinkamas analiz ės metodikas. 
Reikia imtis priemoni ų pašalinti medžiag ą, kuri gal ėjo adsorbuotis 
ant inkubavimo indo arba jungiamuosiuose vamzdeliuose, naudoja ­
muose lakiosioms medžiagoms sugauti.  
1.9.4.  Neprivalomas pradinis bandymas  
Jei trukm ė ir mėginių ėmimo režimas negali b ūti įvertinti pagal 
ankstesnius atitinkamus bandomosios medžiagos tyrimus, gali b ūti 
tikslinga atlikti išankstin į bandymą, kuris turi b ūti atliekamas tomis 
pačiomis bandymo s ąlygomis, kurios yra numatytos galutiniam 
tyrimui. Ataskaitoje turi b ūti trumpai nurodytos išankstinio bandymo, 
jei atliekamas, s ąlygos ir rezultatai.  
1.9.5.  Matavimai ir analiz ė 
Kiekvieną kartą imant m ėginį matuojama ir ataskaitoje nurodoma 
bandomosios medžiagos ir transformavimo produkt ų koncentracija 
vandenyje ir nuos ėdose (kaip koncentracija ir įdėto kiekio procentin ė 
dalis). Paprastai galioja taisykl ė, kad transformavimo produktai, 
kurių randama ≥ 10 % nuo bendro vandens ir nuos ėdų sistemos 
pradinio radioaktyvumo, turi b ūti identifikuoti, išskyrus kai galima 
pagrįsti, kad tai ne įmanoma. Be to, turi b ūti identifikuoti transforma ­
vimo produktai, kuri ų koncentracija vis ą tyrimo laik ą didėja, netgi jei 
jų koncentracija n ėra didesn ė už pirmiau pateiktas ribines vertes, 
kadangi toks reiškinys gali rodyti j ų išsilaikym ą. Tai turi b ūti nagri­
nėjama kiekvienu konkre čiu atveju, ataskaitoje pateikiant pagr įstus 
paaiškinimus.  
Ataskaitoje turi b ūti pateikti rezultatai, kiekvienu m ėginio ėmimo 
metu gauti duj ų ar lakiųjų medžiag ų sugavimo sistemose (CO  2 ir 
kiti produktai, t. y. lakieji organiniai junginiai). Turi b ūti pateiktos 
mineralizacijos grei čio vertės. Kiekvienam m ėginio ėmimo laikui 
pateikiamas neekstrahuojam ų (surištųjų) likučių kiekis.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) Tais atvejais, kai gali vykti greitas anaerobinio virsmo produkt ų pakartotinis oksida ­
vimas, imant m ėginius ir analizuojant turi b ūti užtikrinamos anaerobin ės sąlygos.
 2. DUOMENYS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
Kiekvieną kartą imant m ėginį turi būti apskaičiuojamas įdėto radio­
aktyvumo bendras masi ų balansas arba regeneravimo laipsnis (žr. 
1.7.1 skirsn į). Rezultatai turi b ūti pateikiami kaip prid ėto radioakty ­
vumo procentin ė dalis. Ataskaitoje turi b ūti pateiktas radioaktyvumo 
pasiskirstymas tarp vandens ir nuos ėdų kiekvien ą kartą imant mėginį, 
išreikštas kaip koncentracija ir kaip procentin ės dalys.  
Turi būti apskaičiuota bandomosios medžiagos pus ėjimo trukm ė, 
DT 50 ir, jei tinka, DT  75 ir DT  90 kartu nurodant pasikliovimo ribas 
(žr. 1.7.3 skirsn į). Informacijos apie bandomosios medžiagos išsis ­
klaidymo vandenyje ir nuos ėdose greit į galima gauti naudojant atitin ­
kamus įvertinimo b ūdus. Tai gali b ūti pseudopirmojo laipsnio kine ­
tikos taikymas, empirin ės geriausio kreivi ų atitikimo metodikos, 
kuriose taikomi grafinis arba skaitmeninis sprendimai, ir sud ėtingesni 
įvertinimo b ūdai, taikantys, pvz., vieno arba keli ų skyrių modelius. 
Daugiau informacijos galima rasti atitinkamuose paskelbtuose litera ­
tūros šaltiniuose (35) (36) (37).  
Visi būdai turi savo privalum ų ir silpnųjų vietų ir labai skiriasi 
sudėtingumu. Prielaida apie pirmojo laipsnio kinetik ą gali būti per 
didelis skilimo ir pasiskirstymo proces ų supaprastinimas, ta čiau esant 
galimybei gaunamas dydis (grei čio konstanta arba pus ėjimo trukm ė), 
kurį lengva suprasti ir kuris yra labai naudingas kuriant imitacin į 
modelį ir apskai čiuojant numatomas aplinkos koncentracijos vertes. 
Taikant empirinius metodus arba tiesines transformacijas, galima gauti geresn į kreivių ir duomen ų atitikimą, taigi geriau įvertinti pus ė­
jimo trukm ę, DT
 50 ir, jei tinka, DT  75 ir DT  90 vertes. Ta čiau gautųjų 
konstantų taikymas yra ribotas. Taikant modelius su skyriais galima 
gauti kelias rizikos įvertinimui naudingas konstantas, kurios aprašo 
skilimo skirtinguose skyriuose greit į ir chemin ės medžiagos pasis ­
kirstymą. Be to, tokie modeliai tur ėtų būti naudojami pagrindini ų 
transformavimo produkt ų susidarymo ir skilimo grei čio konstantoms 
įvertinti. Visais atvejais pasirinktas metodas turi b ūti pagrįstas ir 
tyrėjas turi grafiškai ir (arba) statistiškai parodyti ger ą atitikimo 
kokybę. 
3. ATASKAITA  
3.1. BANDYMO ATASKAITA  
Bandymo ataskaitoje turi b ūti ši informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— bendrinis pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, 
struktūrinė formulė (rodanti žym ėtojo (-ųjų) atomo (- ų) padėtį, 
jei naudojama žym ėtoji medžiaga) ir atitinkamos fizikin ės ir 
cheminės savybės, 
— bandomosios medžiagos grynumas (priemaišos),  
— radiocheminis žym ėtosios chemin ės medžiagos grynumas ir 
molinis aktyvumas (jei tinka).  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Etaloninės medžiagos:  
— etalonini ų medžiag ų, naudojam ų transformavimo produktams 
apibūdinti ir (arba) identifikuoti, cheminis pavadinimas ir struk ­
tūra. 
Bandomosios nuos ėdos ir vanduo:  
— vandens telkini ų dugno nuos ėdų ėmimo vieta (-os), įskaitant, jei 
įmanoma, užteršimo istorij ą, 
— visa informacija apie vandens ir nuos ėdų sistemų ėminių ėmimą, 
laikymą (jei taikomas) ir aklimatizavim ą, 
— vandens ir nuos ėdų ėminių charakteristikos, išvardytos 1.8.2.2 
skirsnio lentel ėje. 
Bandymo s ąlygos:  
— naudota bandymo sistema (pvz., taikanti pratek ėjimą, biometrin ė, 
ventiliavimo b ūdas, maišymo b ūdas, vandens t ūris, nuos ėdų 
masė, vandens ir nuos ėdų sluoksni ų storis, bandymo ind ų 
matmenys ir t. t.),  
— bandomosios medžiagos d ėjimas į bandymo sistem ą: naudota 
bandymo koncentracija, kartotini ų ir kontrolini ų ėminių skaičius, 
bandomosios medžiagos įdėjimo būdas (pvz., tirpiklis, jei naudo ­
jamas), ir t. t.,  
— inkubavimo temperat ūra, 
— mėginių ėmimo laikas,  
— ekstrahavimo metodai ir j ų efektyvumas, be to, analiz ės metodai 
ir aptikimo ribos,  
— transformavimo produkt ų apibūdinimo ar identifikavimo metodai,  
— nukrypimai tyrimo metu nuo bandymo protokolo arba bandymo 
sąlygų. 
Rezultatai:  
— tipinių analizių neapdorot ų duomen ų skaičiai (visi neapdoroti 
duomenys turi b ūti saugomi GLP archyve),  
— taikyt ų analizės metodų pakartojamumas ir jautrumas,  
— regeneravimo laipsnio vert ės (tinkamu patvirtinto tyrimo % 
vertės yra pateiktos 1.7.1 skirsnyje),  
— bandomosios medžiagos ir, jei tinka, transformavimo produkt ų ir 
neekstrahuojamo radioaktyvumo rezultat ų, išreiškiam ų kaip 
naudotos doz ės % ir mg kg  -1 , gautų vandenyje, nuos ėdose ir 
visoje sistemoje (tik %), lentel ės, 
— masių balansas tyrim ų eigoje ir juos užbaigus,  
— transformavimo vandens bei nuos ėdų dalyse ir visoje sistemoje 
(įskaitant mineralizacij ą) grafinis vaizdas,  
— mineralizacijos grei čio vertės, ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindini ų transformavimo 
produktų transformavimo vandenyje, nuos ėdose ir visoje siste ­
moje pus ėjimo arba DT  50 , ir, jei tinka DT  75 ir DT  90 vertės, 
įskaitant pasikliovimo ribas,  
— bandomosios medžiagos ir, jei tinka, pagrindini ų transformavimo 
produktų transformavimo kinetikos įvertinimas,  
— pasiūlytas transformavimo kelias, jei tinka,  
— rezultat ų aptarimas.  
4. NUORODOS  
1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5–1: Degradability 
and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
 
2) Commission for registration of pesticides: Application for regist ­
ration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product 
and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The 
Netherlands.  
3) MAFF Pesticides SAFEty Directorate. (1992). Preliminary 
guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. 
United-Kingdom.
 
4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada, pp 35–37.
 
5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. 
Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162–3, Anae ­
robic aquatic metabolism.  
6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the 
environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
 
7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, 
Italy, 18–20 January 1995.  
8) ISO/DIS 5667–12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments.  
9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98–080.
 
10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945–956 (IUPAC 1984).  
12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994–2000): Addenda 6–11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
 
14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149–158.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate 
of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. 
Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85–114. J. Wiley & Sons.  
16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocula ­
tion and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631–637.
 
17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with  14 C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, 661–667.  
18) Black, C.A. (1965). Methods of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
19) APHA (1989). Standard Methods for Examination of Water and 
Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
 
20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Methods and Applications. 
Longman.  
21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measu ­
rements. Anal. Chemistry 44, 1038–1039.  
22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. 
From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests“, 3–4 July 1991.
 
23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine 
environments. From the Workshop On Sediment Toxicity 
Assessment (WOSTA), 8–10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 
2858–2868.
 
25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329–338.
 
26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197–203.
 
27) ISO-14240–2. (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment 
from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13–21.  
29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General method for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850–857.
 
30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., 
Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of 
chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 
1527–1550.  
31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499–1509.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A batch test for assessing 
the mineralisation of  14 C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597–3603.
 
33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemi ­
cals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712- 
C-98–090.  
34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961–968.
 
35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187–203.
 
36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47–60.  
37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and 
Diseases, pp. 1349–1354.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
1 priedėlis 
NURODYMAI D ĖL AEROBINI Ų IR ANAEROBINI Ų BANDYMO 
SISTEM Ų 
Aerobinė bandym ų sistema  
Šiame bandymo metode aprašyt ą aerobinę bandymo sistem ą sudaro aerobinis 
vandens sluoksnis (tipin ė deguonies koncentracijos ver čių intervalas nuo 7 iki 
10 mg 1–1) ir nuos ėdų sluoksnis, aerobinis paviršiuje ir anaerobinis giliau po 
paviršiniu sluoksniu (tipin ės vidutin ės oksidacijos-redukcijos potencialo (E  h ) 
vertės anaerobin ėje nuosėdų zonoje yra nuo -80 iki -190 mV). Dr ėgnas oras 
leidžiamas virš vandens paviršiaus kiekviename inkubavimo įrenginyje pakan ­
kamam deguonies kiekiui erdv ėje virš skys čio užtikrinti.  
Anaerobin ė bandym ų sistema  
Bandymo naudojant anaerobin ę bandymo sistem ą metodika iš esm ės atitinka 
metodiką, aprašytą aerobinei sistemai, išskyrus tai, kad virš vandens paviršiaus 
leidžiamas dr ėgnas azotas kiekviename inkubavimo įrenginyje pakankamam 
azoto kiekiui erdv ėje virš skys čio užtikrinti. Nuos ėdos ir vanduo laikomi anae ­
robiniais, kai oksidacijos-redukcijos potencialas (E  h ) yra mažesnis kaip -100 mV.  
Atliekant anaerobin į bandymą, mineralizacijos įvertinimą sudaro ir išsiskyrusio 
anglies dioksido bei metano kiekio matavimas.  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
2 priedėlis 
DUJŲ PRATEK ĖJIMO APARAT ŪROS PAVYZDYS
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
3 priedėlis 
BIOMETRIN ĖS APARAT ŪROS PAVYZDYS
  ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
4 priedėlis 
Į BANDYMO INDUS DEDAMOS DOZ ĖS APSKAI ČIAVIMO 
PAVYZDYS  
Cilindro vidinis skersmuo:  = 8 cm  
Vandens stulpelio gylis, išskyrus nuos ėdas: = 12 cm  
Paviršiaus plotas: 3,142 × 4  2 = 50,3 cm  2 
Įterpimo norma: 500 g bandomosios 
medžiagos/ha atitinka 5 μg/cm  2 
Bendras kiekis μg: 5 × 50,3  = 251,5 μg 
Kiekis nustatomas pagal 100 cm stulpelio gyl į: 
12 x 251,5 ÷ 100  = 30,18 μg 
Vandens stulpelio t ūris: 50,3 x 12  = 603 ml  
Koncentracija vandenyje: 30,18÷603  = 0,050 μg/ml arba 50 μg/l ▼C1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  AEROBIN Ė MINERALIZACIJA PAVIRŠINIAME VANDE ­
NYJE. BIOLOGINIO SKAIDYMO BANDYMO MODELIA ­
VIMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 309 (2004) (1).  
1.1. ĮVADAS  
Šio bandymo tikslas – išmatuoti mažos koncentracijos bandomosios 
medžiagos biologinio skaidymo eig ą aerobiniame gamtiniame vande ­
nyje ir kiekybiškai įvertinti steb ėjimus grei čio kinetini ų lygčių pavi­
dalu. Šis modeliavimo bandymas yra laboratorinis atskir ų ėminių 
kratomos kolbos bandymas organini ų medžiag ų aerobinio biologinio 
skaidymo gamtinio paviršinio vandens (g ėlo, sūroko arba j ūros) 
ėminiuose grei čiui nustatyti. Jis yra pagr įstas ISO/DIS 14592–1 
(2), be to, į jį yra įtraukti C.23 ir C.24 bandymo metod ų (3)(4) 
elementai. Siekiant išvengti bandymo mikrokosmo savybi ų blogė­
jimo, kai bandym ų trukmė yra didel ė, atskirų ėminių bandym ą 
galima pakeisti pusiau nepertraukiamu procesu. Pagrindinis modelia ­
vimo bandymo tikslas – nustatyti bandomosios medžiagos minerali ­
zaciją paviršiniame vandenyje, ir mineralizacija sudaro skaidymo 
kinetikos išraiškos pagrind ą. Tačiau papildomas antrinis bandymo 
tikslas – gauti duomen ų apie pirmin į skaidymą ir pagrindini ų virsmo 
produktų susidarym ą. Virsmo produkt ų identifikavimas ir, jei 
įmanoma, j ų koncentracijos kiekybinis įvertinimas yra ypa č svarbus 
labai lėtai mineralizuojamoms medžiagoms (pvz., kuri ų visos lieka ­
mosios  14 C pusėjimo trukm ė viršija 60 par ų). Dėl analizini ų apribo­
jimų pagrindiniams virsmo produktams identifikuoti ir kiekybiškai 
įvertinti paprastai tur ėtų būti naudojama didesn ė bandomosios 
medžiagos koncentracija (pvz., > 100 μg/l). 
Šio bandymo s ąlygomis maža koncentracija yra tokia gana maža 
koncentracija (pvz., mažesn ė kaip 1 μg/l – 100 μg/l), kuri gal ėtų 
užtikrinti, kad gauta biologinio skaidymo kinetika atitinka aplinkoje laukiamą kinetiką. Mažos koncentracijos bandomoji medžiaga bus 
kaip antrinis substratas palyginti su visa biologiškai skaidomos 
anglies substrat ų, esančių bandymo gamtiniame vandenyje, mase. 
Taigi tikėtina, kad biologinio skaidymo kinetika yra pirmojo laipsnio 
(„ne augimo“ kinetika) ir kad bandomoji medžiaga gali b ūti skai­
doma „kometabolizmo“ b ūdu. Pirmojo laipsnio kinetika reiškia, kad 
skaidymo greitis (mg/l/par ą) yra proporcingas per laik ą mažėjančiai 
substrato koncentracijai. Esant tikrajai pirmo laipsnio kinetikai, savi ­
toji skaidymo grei čio konstanta, k, n ėra laiko ir koncentracijos funk ­
cija. T. y. k mažai kinta bandymo laikotarpiu ir nekinta d ėl koncent ­
racijos padidinimo tarp bandym ų. Pagal apibr ėžtį, savitoji skaidymo 
greičio konstanta yra lygi santykiniam koncentracijos poky čiui per 
laiką: k = (1/C) · (dC/dt). Nors nustatytomis s ąlygomis paprastai 
laukiama pirmojo laipsnio kinetikos, gali b ūti tam tikr ų aplinkybi ų, 
kai labiau tikt ų kito tipo kinetika. Nukrypimus nuo pirmojo laipsnio 
kinetikos galima steb ėti, kai biologinio virsmo greit į riboja ne reak ­
cijos greitis, bet mas ės pernešimo reiškiniai, pvz., difuzijos greitis. 
Tačiau duomenis beveik visuomet galima aprašyti pseudopirmojo 
laipsnio kinetika, darant prielaid ą apie grei
čio konstantos priklauso ­
mybę nuo koncentracijos.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Informacija apie bandomosios medžiagos biologin į skaidum ą esant 
didesnei koncentracijai (pvz., tipini ų atrankos bandym ų) ir informa ­
cija apie abiotin į skaidum ą, virsmo produktus ir atitinkamas fiziko ­
chemines savybes tur ėtų būti gauta prieš bandym ą, kad ji gal ėtų 
padėti parengti bandymo plan ą ir interpretuoti rezultatus.  14 C žymėtų 
bandomųjų medžiag ų naudojimas ir  14 C fazinio pasiskirstymo 
bandymo pabaigoje nustatymas sudaro s ąlygas visiškam biologiniam 
skaidumui nustatyti. Kai naudojama nežym ėta bandomoji medžiaga, 
visišką biologin į skaidym ą galima tik įvertinti, jei bandomos 
didesnės koncentracijos vert ės ir yra žinomi visi pagrindiniai virsmo 
produktai.  
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Pirminis biologinis skaidymas . Mikroorganizmais veikiamos 
cheminės medžiagos strukt ūros pokytis (virsmas), jai netenkant 
cheminės tapatybės. 
Funkcinis biologinis skaidymas . Mikroorganizmais veikiamos 
cheminės medžiagos strukt ūros pokytis (virsmas), jai netenkant 
būdingos savyb ės. 
Visiškas aerobinis biologinis skaidymas . Mikroorganizmais 
veikiamos chemin ės medžiagos skaidymas esant deguoniui į anglies 
dioksidą, vandenį ir į visų kitų ją sudarančių elementų neorganines 
druskas (mineralizacija) ir naujos biomas ės bei organin ės mikrobin ės 
biosintezės produkt ų gamyba.  
Mineralizacija . Mikroorganizmais veikiamos chemin ės medžiagos 
arba organin ės medžiagos skaidymas esant deguoniui į anglies diok ­
sidą, vanden į ir į visų kitų ją sudarančių element ų neorganines 
druskas.  
Vėlavimo tarpsnis . Laikas nuo bandymo pradžios iki skaidom ųjų 
mikroorganizm ų adaptacijos momento ir chemin ės medžiagos arba 
organinės medžiagos biologinio skaidymo laipsnio padid ėjimo iki 
nustatomo lygio (pvz., 10 % didžiausio teorinio biologinio skaidymo 
arba mažiau, atsižvelgiant į matavimo metodo tikslum ą). 
Didžiausias biologinio skaidymo laipsnis . Chemin ės medžiagos 
arba organin ės medžiagos biologinio skaidymo laipsnis procentais, 
kurį pasiekus biologinis skaidymas toliau bandant nebevyksta.  
Pirminis substratas . Gamtini ų anglies ir energijos šaltini ų rinkinys, 
kuris užtikrina mikrobin ės biomasės augimą ir gyvavim ą. 
Antrinis substratas . Tokios mažos koncentracijos substrato kompo ­
nentas, d ėl kurio skaidymo tik nežymiai padid ėja veikliųjų mikro­
organizm ų anglies ir energijos ištekliai, palyginti su anglies ir ener ­
gijos ištekliais, kuriuos tiekia pagrindiniai substrato komponentai 
(pirminiai substratai).  
Skaidymo grei čio konstanta . Pirmojo arba pseudopirmojo laipsnio 
kinetikos grei čio konstanta, k (d  –1 ), kuri rodo skaidymo proces ų 
greitį. Atliekant siuntos bandym ą, k apskai čiuojama pagal pradin ę 
skaidymo kreiv ės, gautos pasibaigus v ėlavimo tarpsniui, dal į. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Pusėjimo trukm ė, t 1/2 (d). Terminas, vartojamas pirmojo laipsnio 
reakcijos grei čiui apibūdinti. Tai laikas, per kur į koncentracija suma ­ 
žėja 2 kartus. Pus ėjimo trukm ė ir skaidymo grei čio konstanta yra 
susietos lygtimi t  1/2 = ln2/k.  
Skaidymo pus ėjimo trukm ė. DT  50 (d). Terminas, vartojamas kieky ­
biškai įvertinti biologinio skaidymo bandym ą. Tai laikas, įskaitant 
vėlavimo tarpsn į, per kur į pasiekiamas 50 % biologinis skaidymas.  
Aptikimo riba (LOD) ir kiekybinio nustatymo riba (LOQ) . Apti­
kimo riba (LOD) – medžiagos koncentracija, kai jai esant mažesnei 
negalima atskirti medžiagos tapatyb ės požymių ir analizini ų trukdžių. 
Kiekybinio nustatymo riba (LOQ) – medžiagos koncentracija, kai koncentracijai esant mažesnei ji negali b ūti nustatyta priimtinu tiks ­
lumu.
 
Ištirpusi organin ė anglis (DOC) . Ta vandens ėminio organin ės 
anglies dalis, kuri negali b ūti pašalinta fazi ų atskyrimu, pvz., 15 
min trukm ės centrifugavimu esant 40 000 ms  –2 pagreičiui arba 
membraniniu filtravimu, naudojant membranas, kuri ų poros yra 0,2 
μm – 0,45 μm skersmens.  
Suminis organin ės 14 C aktyvumas (TOA) . Suminis  14 C aktyvumas, 
atitinkantis organin ę anglį. 
Ištirpusios organin ės 14 C aktyvumas (DOA) . Suminis  14 C akty­
vumas, atitinkantis ištirpusi ą organinę anglį. 
Kietųjų dalelių organin ės 14 C aktyvumas (POA) . Suminis  14 C 
aktyvumas, atitinkantis kiet ųjų dalelių organinę anglį. 
1.3. BANDYMO TAIKOMUMAS  
Šis modeliavimo bandymas skirtas nelakioms arba mažai lakioms 
organinėms medžiagoms, bandomoms esant mažai koncentracijai. 
Jei naudoti atmosferai atviras kolbas (pvz., užkimštas vata), 
medžiagos, kuri ų Henrio d ėsnio konstanta yra mažesn ė nei maždaug 
1 Pa·m  3 /mol (apie 10  –5 atm·m  3 /mol), praktiškai gali b ūti priskirtos 
nelakioms. Naudojant uždarytas kolbas su laisv ąja erdve, galima 
bandyti mažai lakias medžiagas (kuri ų Henrio d ėsnio konstantos < 
100 Pa·m  3 /mol arba < 10  –3 atm·m  3 /mol), nepatiriant bandymo 
sistemos nuostoli ų. Gali būti 14 C žymėtų medžiag ų nuostoliai, jei 
nebūtų imamasi tinkam ų atsargumo priemoni ų šalinant CO  2 . Tokiais 
atvejais gali tekti gaudyti CO  2 naudojant vidin į šarminį absorbent ą 
arba naudoti išorin ę CO  2 absorbento sistem ą (tiesioginis  14 CO 2 
nustatymas; žr. 3 pried ą). Biologinio skaidymo kinetikai nustatyti 
bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės turi būti mažesn ės 
nei tirpumo vandenyje vert ės. Tačiau reikėtų pažymėti, literatūroje 
pateikiamos tirpumo vandenyje vert ės gali būti gerokai didesn ės nei 
bandomosios medžiagos tirpumas gamtiniuose vandenyse. Ypa č 
mažai vandenyje tirpi ų bandom ųjų medžiag ų tirpumas gali b ūti 
nustatytas naudojant bandomus gamtinius vandenis.  
Metodas gali b ūti taikomas norint modeliuoti biologin į skaidym ą 
stambių dalelių neturinčiame paviršiniame vandenyje (pelaginis 
bandymas) arba drumstame paviršiniame vandenyje, pvz., kuris 
gali būti arti vandens ir nuos ėdų sąlyčio paviršiaus (suspenduot ų 
nuosėdų bandymas).  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. BANDYMO METODO ESM Ė 
Atliekamas atskir ų ėminių bandymas, inkubuojant bandom ąją 
medžiagą tik su paviršiniu vandeniu (pelaginis bandymas) arba su 
paviršiniu vandeniu, į kurį pridėta 0,01–1 g/l sausos mas ės suspen­
duotų kietųjų dalelių (nuosėdų) (suspenduot ų nuosėdų bandymas) 
vandens telkiniui su suspenduotomis kietosiomis dalel ėmis arba su 
suspenduotomis nuos ėdomis modeliuoti. Apatin ę šio intervalo dal į 
atitinkanti suspenduot ų kietų dalelių (nuosėdų) koncentracija yra 
tipinė didesnės dalies paviršini ų vandenų koncentracija. Bandymo 
kolbos inkubuojamos tamsoje esant aplinkos temperat ūrai, aerobi ­
nėmis ir maišymo s ąlygomis. Skaidymo kinetikai nustatyti tur ėtų 
būti naudojamos bent dvi skirtingos bandomosios medžiagos 
koncentracijos vert ės. Koncentracijos vert ės turi skirtis 5–10 kart ų 
ir turi atitikti tik ėtina koncentracijos aplinkoje interval ą. Didžiausia 
bandomosios medžiagos koncentracija tur ėtų būti ne didesn ė kaip 
100 μg/l, bet siekiant užtikrinti, kad biologinis skaidymas atitikt ų 
pirmojo laipsnio kinetik ą, pageidautina didžiausia bandymo koncent ­
racija yra 10 μg/l arba mažesn ė. Mažiausia koncentracija netur ėtų 
būti didesnė kaip 10 μg/l, bet pageidautina 1–2 μg/l arba mažesn ė 
kaip 1 μg/l bandymo koncentracija. Pakankamai tiksli analiz ė esant 
tokioms mažoms koncentracijos vert ėms dažniausiai gali b ūti 
pasiekta naudojant komercines  14 C žymėtas medžiagas. D ėl anali­
zinių apribojim ų dažnai ne įmanoma išmatuoti bandomosios 
medžiagos koncentracij ą reikiamu tikslumu, jei pridedamos bando ­
mosios medžiagos koncentracija ≤ 100 μg/l (žr. 1.7.2 skirsnio antr ąją 
pastraipą). Pagrindiniams virsmo produktams identifikuoti galima 
naudoti didesnes bandomosios medžiagos koncentracijos vertes 
(> 100 μg/l ir kartais > 1 mg/l), jei n ėra specifinio maž ą aptikimo 
ribą turinčio analizės metodo. Jei bandant naudojama didesn ė bando­
mosios medžiagos koncentracija, rezultat ų gali būti neįmanoma 
panaudoti pirmojo laipsnio skaidymo konstantai ir pus ėjimo trukmei 
įvertinti, kadangi skaidymas gali neatitikti pirmojo laipsnio kinetikos.  
Skaidymas stebimas atitinkamais laiko intervalais, matuojant lieka ­
mąją 14 C arba liekam ąją bandomosios medžiagos koncentracij ą, kai 
taikoma specifin ė analizė. Patvariausios molekul ės dalies žym ėjimas  
14 C užtikrina visiškos mineralizacijos nustatym ą, žymint  14 C mažiau 
patvarią molekulės dalį arba taikant specifin ę analizę, galima įvertinti 
tik pirmin į biologinį skaidymą. Tačiau patvariausioje dalyje neb ūtinai 
turi būti molekulei b ūdinga funkcin ė grupė (kuri gal ėtų būti susieta 
su specifine savybe, pvz., toksiškumu, biologiniu kaupimusi ir t. t.). Tokiu atveju galb ūt būtų tikslinga naudoti bandom ąją medžiag ą, 
kurios funkcin ė grupė būtų žymėta
 14 C specifin ės savybės išnykimui 
stebėti. 
1.5. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Šiame bandyme galima naudoti žym ėtąsias ir nežym ėtas bandom ą­
sias medžiagas. Rekomenduojama taikyti  14 C žymėjimo metod ą ir 
paprastai tur ėtų būti žymėta patvariausia (-ios) molekul ės dalis (-ys) 
(žr. dar 1.4 skirsn į). Jei medžiagos turi daugiau kaip vien ą aromatin į 
žiedą, geriau b ūtų 14 C žymėti vieną arba daugiau anglies atom ų 
kiekviename žiede. Be to, geriau b ūtų žymėti 14 C vieną arba daugiau 
anglies atom ų abiejose lengvai skaidom ų jungčių pusėse. Bandomo ­
sios medžiagos cheminis ir (arba) radiocheminis grynumas tur ėtų 
būti > 95 %. Siekiant palengvinti  14 C matavimus, kai atliekami 
mažos koncentracijos medžiag ų bandymai, žym ėtųjų medžiag ų savi­
tasis aktyvumas tur ėtų būti maždaug 50 μCi/mg (1,85 MBq) arba 
didesnis. Turi b ūti ši informacija apie bandom ąją medžiag ą: ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— tirpumas vandenyje [A.6 metodas],  
— tirpumas organiniame (-iuose) tirpiklyje (-iuose) (tirpiklyje ištir ­
pintų arba mažo tirpumo vandenyje medžiag ų), 
— disociacijos konstanta (pKa), jei medžiaga gali prisijungti arba 
atiduoti protonus [OECD TG 112] (5),  
— garų slėgis [A.4 metodas] ir Henrio d ėsnio konstanta,  
— cheminis stabilumas vandenyje ir tamsoje (hidroliz ė) [C.7 
metodas].  
Kai vandenyje mažai tirpios medžiagos yra bandomos j ūros vande ­
nyje, gali b ūti naudinga žinoti išs ūdymo konstant ą (arba „Se čenovo 
konstantą“) K  s , apibrėžiamą lygtimi: log (S/S’) = K  s C m , kurioje S ir 
S’ yra medžiagos tirpumas g ėlame ir jūros vandenyje, C  m – molinė 
druskos koncentracija.  
Jei bandymas atliekamas kaip „suspenduot ų nuosėdų bandymas“, 
reikėtų turėti šią informacij ą: 
— pasiskirstymo koeficientas n-oktanolis/vanduo [A.8 metodas],  
— adsorbcijos koeficientas [C.18 metodas].  
Kita naudinga informacija gali b ūti: 
— koncentracija aplinkoje, jei žinoma arba įvertinta,  
— bandomosios medžiagos toksiškumas mikroorganizmams [C.11 
metodas],  
— lengvas ir (arba) b ūdingasis biologinis skaidumas [C.4 A–F, 
C.12, C.9 metodai, OECD TG 302 (5)],  
— aerobinio arba anaerobinio biologinio skaidumo dirvožemyje ir 
nuosėdų (vandens) virsmo tyrimai [C.23, C.24 metodai].  
1.6. ETALONIN Ė MEDŽIAGA  
Etalonine medžiaga tur ėtų būti naudojama medžiaga, kuri paprastai 
lengvai skaidoma aerobin ėmis sąlygomis (pvz., anilinas arba natrio 
benzoatas). Tik ėtina anilino ir natrio benzoato skaidymo trukm ė 
paprastai yra mažesn ė kaip 2 savait ės. Etalonini ų medžiag ų naudo­
jimo tikslas – užtikrinti, kad bandymo vandens mikrobinis akty ­
vumas atitikt ų tam tikras ribas; t. y. kad mikrob ų populiacija vande ­
nyje būtų aktyvi.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. KOKYB ĖS KRITERIJAI  
1.7.1.  Atgavimas  
Iškart po bandomosios medžiagos prid ėjimo kiekviena pradin ė 
bandymo koncentracija tur ėtų tikrinama matuojant bent dviej ų karto­
tinių ėminių 14 C aktyvum ą arba atliekant chemin ę analizę nežymėtų 
medžiagų atveju. Taip gaunama informacija apie analiz ės metodo 
tinkamum ą ir pakartojamum ą ir apie bandomosios medžiagos pasis ­
kirstymo vienodum ą. Atliekant v ėlesnę duomenų analizę, paprastai 
naudojamas išmatuotas pradinis  14 C aktyvumas arba bandomosios 
medžiagos koncentracija, bet ne vardin ė koncentracija, kadangi 
tokiu būdu kompensuojami nuostoliai d ėl sorbcijos ir dozavimo 
paklaidos.  14 C žymėtos bandomosios medžiagos atgavimo laipsnis 
bandymo pabaigoje nurodomas kaip masi ų balansas (žr. 1.8.9.4 
skirsnio paskutin ę pastraipą). Geriausiu atveju žym ėtųjų chemini ų 
medžiagų masių balansas tur ėtų būti intervale nuo 90 % iki 110 %, 
analizės tikslumas tur ėtų užtikrinti 70 % – 110 % nežym ėtų bando­
mųjų medžiag ų atgavimo laipsn į. Šiuos intervalus reik ėtų interpre­
tuoti kaip kontrolinius skai čius ir jie netur ėtų būti naudojami kaip 
bandymo priimtinumo kriterijai. Gal ėtų būti nustatomas bandomosios 
medžiagos, kai jos koncentracija yra mažesn ė nei pradin ė koncent­
racija, ir pagrindini ų virsmo produkt ų analizės tikslumas.  
1.7.2.  Analiz ės metodo pakartojamumas ir jautris  
Bandomosios medžiagos ir prireikus virsmo produkt ų kiekybin ės 
analizės metodo pakartojamumas ( įskaitant pradinio ekstrahavimo 
efektyvum ą) gali būti patikrintas penkis kartus atliekant paviršinio 
vandens atskir ų ekstraktų analizę. 
Jei įmanoma, bandomosios medžiagos ir virsmo produkt ų analizės 
metodo aptikimo riba (LOD) tur ėtų būti bent 1 % į sistemą pridėto 
pradinio kiekio. Kiekybinio nustatymo riba (LOQ) tur ėtų būti lygi 
10 % naudotos koncentracijos arba mažesn ė. Didelio skai čiaus orga ­
ninių medžiag ų ir jų virsmo produkt ų cheminei analizei dažnai 
reikia, kad b ūtų pridedama palyginti didel ės koncentracijos bando ­
moji medžiaga, t. y. > 100 μg/l. 
1.8. BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
1.8.1.  Įranga  
Bandymą galima atlikti atitinkamos talpos (pvz., 0,5 arba 1,0 litro) 
kūginėse arba cilindrin ėse kolbose, užkimštose polisiloksaniniais 
arba guminiais kamš čiais, arba serumo kolbose su CO  2 nelaidžiais 
dangčiais (pvz., su butilkau čiuko membrana). Kitaip bandym ą galima 
atlikti naudojant daug kolb ų, ir imti vis ą kolbos turin į, bent dviej ų 
kolbų, kiekvienam m ėginio ėmimo intervalui (žr. 1.8.9.1 skirsnio 
paskutinę pastraip ą). Nelaki ų bandom ųjų medžiag ų, kurios n ėra 
žymėtos, nebūtina sandariai užkimšti kamš čiaus arba dang čiais; 
tinka nesandar ūs vatos kamš čiai, kurie apsaugot ų nuo oro teršal ų 
(žr. 1.8.9.1 skirsnio antr ąją pastraipą). Mažai lakios medžiagos tur ėtų 
būti bandomos biometro tipo sistemoje, nestipriai maišant vandens 
paviršių. Siekiant apsisaugoti nuo užkr ėtimo bakterijomis, prieš 
naudojim ą indus galima sterilizuoti kaitinant krosnyje arba apdoro ­
jant autoklave. Be to, naudojama ši tipin ė laboratorin ė įranga:  
— purtykl ė arba magnetin ės maišykl ės bandymo kolb ų turiniui 
nuolat maišyti;  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— centrifuga,  
— pH-metras,  
— nefelometras drumstumui matuoti nefelometriniais metodais,  
— krosnis arba mikrobang ė krosnis sausos medžiagos masei nustatyti,  
— membraninio filtravimo aparatas,  
— autoklavas arba krosnis stikliniams indams sterilizuoti karš čiu, 
— priemon ės dirbti su  14 C žymėtomis medžiagomis,  
— įranga CO  2 sugavimo tirpal ų ir, jei reikia, nuos ėdų mėginių 14 C 
aktyvumui kiekybiškai įvertinti,  
— analiz ės įranga bandomajai (ir etaloninei) medžiagai nustatyti, jei 
taikoma specifin ė cheminė analizė (pvz., duj ų chromatografas, 
didelio sl ėgio skysčių chromatografas).  
1.8.2.  Bandomosios medžiagos pradiniai tirpalai  
Bandomosios ir etalonin ės medžiagos pradiniams tirpalams ruošti 
naudojamas dejonizuotas vanduo (žr. 1.8.7 skirsnio pirm ąją 
pastraipą). Dejonizuotame vandenyje netur ėtų būti medžiag ų, kurios 
galėtų būti toksiškos mikroorganizmams, ir ištirpusios organin ės 
anglies (DOC) tur ėtų būti ne daugiau kaip 1 mg/l (6).  
1.8.3.  Paviršinio vandens ėminių rinkimas ir gabenimas  
Paviršinio vandens ėminių ėmimo vieta tur ėtų būti pasirinkta atsiž ­
velgiant į bandymo tiksl ą tam tikromis aplinkyb ėmis. Pasirenkant 
ėminių ėmimo vietas, turi b ūti atsižvelgta į galimų žemės ūkio, 
pramonės arba buitini ų šaltinių istoriją. Jei žinoma, kad vandens 
aplinka ketverius ankstesniu metus buvo teršiama bandom ąja 
medžiaga arba jos strukt ūriniais analogais, bandymo vanduo netur ėtų 
būti imamas, išskyrus kai tyr ėjas specialiai tiria skaidymo greit į anks­ 
čiau užterštose vietose. Vandens pH ir temperat ūra turėtų būti matuo­
jama ėminių rinkimo vietoje. Be to, reik ėtų nurodyti ėminio ėmimo 
gylį ir vandens ėminio išvaizd ą (pvz., spalv ą ir drumstum ą) (žr. 3 
skyrių). Turėtų būti išmatuota deguonies koncentracija ir (arba) oksi ­
dacijos redukcijos potencialas vandenyje ir nuos ėdų paviršiniame 
sluoksnyje, kad galima b ūtų įrodyti aerobini ų sąlygų buvimą, išskyrus 
kai jos yra akivaizdžios, sprendžiant pagal išvaizd ą ir vietos istorinius 
duomenis. Paviršinis vanduo tur ėtų būti gabenamas labai gerai išplau ­
tuose induose. Gabenamo vandens temperat ūra neturėtų labai viršyti 
bandymo temperat ūrą. Rekomenduojama atšaldyti iki 4 °C, jei 
vanduo gabenamas ilgiau kaip 2–3 h. Vandens ėminys neturi b ūti 
užšalęs. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Paviršinio vandens laikymas ir ruošimas  
Pageidautina bandym ą pradėti per par ą nuo ėminio pa ėmimo. Jei 
vandenį tenka laikyti, jo laikymo trukm ė turėtų būti kiek įmanoma 
trumpesnė ir jokiu atveju neturi viršyti 4 savai čių. Iki naudojimo 
vandens ėminys tur ėtų būti laikomas 4 °C temperat ūroje ir aeruo ­
jamas. Prieš naudojim ą turėtų būti pašalintos stambios dalel ės, pvz., 
filtravimu per nailono filtr ą, kurio aku čių dydis apie 100 μm, arba 
per akytą popieriaus filtr ą, arba sedimentacijos b ūdu. 
1.8.5.  Vandens su nuos ėdų priedu ruošimas (neprivaloma)  
Atliekant suspenduot ų nuosėdų bandym ą, paviršin ės nuosėdos 
dedamos į kolbą su gamtiniu vandeniu (filtruojamu stambioms dale ­
lėms pašalinti, kaip aprašyta 1.8.4 skirsnyje) suspensijai gauti; 
suspenduot ų kietųjų dalelių koncentracija tur ėtų būti nuo 0,01 iki 1 
g/l. Paviršin ės nuosėdos turėtų būti iš tos pa čios vietos, iš kurios 
buvo paimtas vandens ėminys. Atsižvelgiant į konkrečią vandens 
aplinką, paviršin ės nuosėdos gali b ūti apibūdinamos dideliu orga ­
ninės anglies kiekiu (2,5–7,5 %) ir smulkiagr ūde tekstūra arba 
mažu organin ės anglies kiekiu (0,5–2,5 %) ir stambiagr ūde tekstūra 
(3). Paviršines nuos ėdas galima ruošti taip: išimami keli nuos ėdų 
kernai, naudojant skaidraus plastiko vamzd į, iškart po ėminio 
paėmimo nupjaunami viršutiniai aerobiniai sluoksniai (nuo paviršiaus 
iki ne didesnio kaip 5 mm gylio) ir supilami kartu. Gautas nuos ėdų 
ėminys tur ėtų būti gabenamas inde su didele laisv ąja erdve orui, kad 
nuosėdas būtų galima laikyti aerobin ėmis sąlygomis (atšaldoma iki 
4 °C, jei jos gabenamos ilgiau kaip 2–3 h). Nuos ėdų ėminys tur ėtų 
būti suspenduotas bandymo vandenyje santykiu 1:10 ir iki naudo ­
jimo laikomas 4 °C temperat ūroje ir aeruojamas. Jei nuos ėdas tenka 
laikyti, jų laikymo trukm ė turėtų būti kiek įmanoma trumpesn ė ir 
jokiu atveju neturi viršyti 4 savai čių. 
1.8.6.  Pusiau nepertraukiama proced ūra (neprivaloma)  
Gali tekti inkubuoti ilgiau (kelis m ėnesius), jei yra ilgas v ėlavimo 
tarpsnis prieš prasidedant didesniam bandomosios medžiagos skai ­
dymui, kur į būtų galima išmatuoti. Jei tai žinoma iš ankstesni ų 
medžiagos bandym ų, bandym ą galima prad ėti, taikant pusiau neper ­
traukiamą procedūrą, kuri sudaryt ų sąlygas periodiškai atnaujinti 
bandymo vandens arba suspensijos dal į (žr. 2 pried ą). Kitu b ūdu 
įprastas atskir ų ėminių bandymas gali b ūti pakeistas pusiau neper ­
traukiamu bandymu, jei bandomosios medžiagos skaidymas neprasi ­
deda per maždaug 60 bandymo par ų, taikant atskir ų ėminių proce­
dūrą (žr. 1.8.8.3 skirsnio antr ąją pastraipą). 
1.8.7.  Bandomosios (arba etalonin ės) medžiagos prid ėjimas  
Jei medžiagos gerai tirpsta vandenyje (> 1 mg/l) ir j ų lakumas yra 
mažas (Henrio d ėsnio konstantos < 1 Pa·m  3 /mol arba < 10  –5 
atm·m  3 /mol), pradin į tirpalą galima ruošti naudojant dejonizuot ą 
vandenį (žr. 1.8.2 skirsn į); atitinkamas pradinio tirpalo t ūris įpilamas 
į bandymo indus reikiamai koncentracijai pasiekti. Vis ų įpilamų 
pradinių tirpalų tūris turėtų būti kiek įmanoma mažesnis (< 10 % 
skysčio galutinio t ūrio, jei įmanoma). Pagal kit ą procedūrą, į kurią 
galima ži ūrėti kaip į organini ų tirpiklių naudojimo alternatyv ą, 
bandomoji medžiaga ištirpinama didesniame bandymo vandens 
tūryje. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Jei neišvengiama, vandenyje mažai tirpi ų nelakiųjų medžiagų tirpalai 
turėtų būti ruošiami naudojant lak ųjį organin į tirpiklį, tačiau į 
bandymo sistem ą pridėto tirpiklio kiekis netur ėtų būti didesnis kaip 
1 % V/V ir netur ėtų neigiamai veikti mikrob ų aktyvumo. Tirpiklis 
neturėtų veikti bandomosios medžiagos stabilumo vandenyje. 
Tirpiklis tur ėtų būti pašalintas iki visiškai mažo kiekio, kad labai 
nepadidint ų DOC koncentracijos bandymo vandenyje arba suspensi ­
joje. Tai tur ėtų būti tikrinama atliekant medžiagai specifin ę analizę 
arba DOC analiz ę, jei įmanoma (6). Reik ėtų imtis priemoni ų apriboti 
pernešto tirpiklio kiek į tik būtinuoju kiekiu ir užtikrinti, kad bando ­
mosios medžiagos kiekis gal ėtų ištirpti galutiniame bandymo 
vandens t ūryje. Galima taikyti kitus metodus bandomajai medžiagai 
pridėti į bandymo indus, kaip aprašyta (7) ir (8). Kai bandomajai 
medžiagai prid ėti naudojamas organinis tirpiklis, tirpiklio ir bandymo 
vandens (be joki ų priedų) kontroliniai ėminiai ir bandymo vandens 
su pridėta etalonine medžiaga ėminiai tur ėtų būti apdorojami panašiai 
kaip aktyvieji bandymo indai, į kuriuos prid ėta nešiklyje ištirpinta 
bandomoji medžiaga. Tirpiklio kontrolini ų ėminių tikslas – ištirti 
galimą neigiamą tirpiklio poveik į mikrobų populiacijai pagal etalo ­
ninės medžiagos skaidym ą. 
1.8.8.  Bandymo s ąlygos  
1.8.8.1.  Bandymo temperat ūra 
Inkubuoti reik ėtų tamsoje (pageidautina) arba išsklaidytoje šviesoje, 
esant reguliuojamai (± 2 °C) tikslumu temperat ūrai, kuri gali b ūti 
lauko temperat ūra arba tipin ė 20–25 °C temperat ūra. Lauko tempe ­
ratūra gali būti faktinė ėminio temperat ūra jo ėmimo momentu arba 
vidutinė ėminio ėmimo vietos lauko temperat ūra. 
1.8.8.2.  Maišymas  
Turi būti užtikrintas nuolatinis purtymas arba maišymas, kad dalel ės 
ir mikroorganizmai b ūtų suspenduoti. Be to, maišymas lengvina 
deguonies pernešim ą iš laisvosios erdv ės į skystį, taigi gali b ūti 
užtikrintos reikiamos aerobin ės sąlygos. Kolbos statomos ant purty ­
klės (maišymas maždaug 100 min  –1 dažniu) arba naudojama magne ­
tinė maišyklė. Maišymas turi b ūti nuolatinis. Ta čiau purtymas arba 
maišymas tur ėtų būti kiek įmanoma švelnesnis, bet visgi turi užtik ­
rinti vienalyt ę suspensij ą. 
1.8.8.3.  Bandymo trukm ė 
Bandymo trukm ė paprastai netur ėtų būti ilgesnė kaip 60 par ų, 
išskyrus kai taikoma pusiau nepertraukiama proced ūra ir periodinis 
bandymo suspensijos atnaujinimas (žr. 1.8.6 skirsn į ir 2 pried ą). 
Tačiau atskir ų ėminių bandymo trukm ė gali būti padidinta iki ne 
ilgiau kaip 90 par ų, jei bandomosios medžiagos skaidymas prasideda 
per pirmąsias 60 par ų. Skaidymas stebimas atitinkamais laiko tarpais 
nustatant liekamosios  14 C aktyvum ą arba išsiskyrusio  14 CO 2 kiekį 
(žr. 1.8.9.4 skirsn į) ir (arba) atliekant chemin ę analizę (1.8.9.5 
skirsnis). Inkubavimo trukm ė turi būti pakankamai ilga skaidymo 
procesui įvertinti. Pageidautina, kad skaidymo laipsnis b ūtų didesnis 
kaip 50 %; l ėtai skaidom ų medžiag ų skaidymo laipsnis turi b ūti 
pakankamas (paprastai didesnis kaip 20 % skaidymas) kinetin ės skai­
dymo grei čio konstantos įverčiui gauti.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Periodiškai turi b ūti matuojama pH vert ė ir deguonies koncentracija 
bandymo sistemoje, išskyrus kai tokie matavimai neb ūtini, turint 
ankstesnius panaši ų bandymų duomenis, gautus toje pa čioje vietoje 
paimtiems vandens ir nuos ėdų ėminiams. Kai kuriomis aplinkyb ėmis, 
esant gerokai didesnei koncentracijai vandenyje arba nuos ėdose, dėl 
pirminių substratų metabolizmo išsiskyrusio CO  2 kiekio ir deguonies 
kiekio sumaž ėjimo gali pakakti labai pakeisti vykstan čio bandymo 
sąlygas.  
1.8.9.  Darbo eiga  
1.8.9.1.  Kolb ų ruošimas pelaginiam bandymui  
Į bandymo kolbas įpilamas reikiamas bandymo vandens kiekis, kuris 
sudarytų apie trečdalį kolbos tūrio, bet ne mažiau kaip apie 100 ml. 
Jei naudojama daug kolb ų (kad m ėginį sudarytų visas kolbos 
turinys), reikiamas bandymo vandens t ūris irgi yra apie 100 ml, 
nes maži ėminių tūriai gali tur ėti įtakos vėlavimo tarpsnio trukmei. 
Bandomoji medžiaga pridedama naudojant pradin į tirpalą, kaip apra ­ 
šyta 1.8.2 ir 1.8.7 skirsniuose. Tur ėtų būti naudojamos bent dvi 
skirtingos bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės, kurios skir ­
tųsi 5–10 kart ų, kad būtų galima nustatyti skaidymo kinetikos laipsn į 
ir apskaičiuoti kinetin ę skaidymo grei čio konstant ą. Abi pasirinktos 
koncentracijos vert ės turėtų būti mažesn ės kaip 100 μg/l ir pageidau ­
tina intervale < 1–10 μg/l. 
Užkimškite kolbas kamš čiais arba uždenkite orui ir CO  2 nelaidžiais 
dangčiais. Jei naudojamos  14 C nežym ėtos ir nelakios bandomosios 
medžiagos, tinka nesandar ūs vatos kamš čiai, kurie apsaugot ų nuo oro 
teršalų (žr. 1.8.1 skirsn į), jei žinoma, kad visi pagrindiniai skaidymo 
produktai yra nelak ūs ir jei taikomas netiesioginis CO  2 nustatymo 
metodas (žr. 3 pried ą). 
Inkubuokite kolbas pasirinktoje temperat ūroje (žr. 1.8.8.1 skirsn į). 
Paimkite m ėginius cheminei analizei arba  14 C matavimams bandymo 
pradžioje (t. y. prieš biologinio skaidymo pradži ą; žr. 1.7.1 skirsn į) ir 
vėliau atitinkamais laiko intervalais bandymo eigoje. M ėginius 
galima imti kaip dalinius m ėginius (pvz., 5 ml alikvotines dalis) iš 
kiekvieno kartotinio ėminio arba kiekvienu m ėginio ėmimo momentu 
imti visą kolbos turin į. Bandomosios medžiagos mineralizacija gali 
būti nustatyta netiesiogiai arba tiesiogiai (žr. 3 pried ą). Norint gauti 
patikimą greičio konstantos įvertį, skaidymo tarpsniu (t. y. pasibaigus 
vėlavimo tarpsniui) paprastai turi b ūti paimti bent penki m ėginiai, 
išskyrus kai galima pagr įsti, kad greitai skaidomoms medžiagoms 
pakanka trij ų mėginių. Jei medžiagos skaidomos l ėtai, skaidymo 
tarpsniu nesunku atlikti daugiau matavim ų, taigi tur ėtų būti naudo­
jama daugiau tašk ų k vertei gauti. Negalima nurodyti tam tikro 
mėginių ėmimo grafiko, kadangi biologinio skaidymo greitis yra 
nevienodas; ta čiau lėto skaidymo atveju rekomenduojamas vienas 
mėginys per savait ę. Jei bandomoji medžiaga skaidoma greit, m ėgi­
nius reikėtų imti kart ą per parą pirmąsias tris paras ir v ėliau kas antr ą 
arba trečią parą. Tam tikromis aplinkyb ėmis, pvz., jei medžiagos 
greitai hidrolizuojasi, m ėginius gali tekti imti kas valand ą. Prieš 
bandymus rekomenduojama atlikti parengiam ąjį tyrimą reikiamiems 
mėginių ėmimo intervalams nustatyti. Jei m ėginius reikia tur ėti kitai 
specifinei analizei, patariama paimti daugiau m ėginių ir tuomet 
atrinkti tuos, kurie turi b ūti analizuojami pasibaigus bandymui 
taikant atbulin ės krypties strategij ą, t. y. paskutiniai m ėginiai anali ­
zuojami pirmi (žr. 1.8.9.5 skirsnio antr ąją pastraipą dėl nurodym ų 
laikomų ėminių stabilumui užtikrinti).  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Kolb ų ir ėminių skaičius 
Paruošiamas pakankamas skai čius bandymo kolb ų, kad būtų: 
— bandymo kolbos; bent dvi kolbos kiekvienai bandomosios 
medžiagos koncentracijai (geriau ne mažiau kaip 3) arba daug bandymo kolb ų kiekvienai koncentracijai, jei kiekvien ą imamą 
mėginį sudaro visas kolbos turinys (žymimos F
 T ), 
— bandymo kolbos masi ų balansui apskai čiuoti; bent dvi kolbos 
kiekvienai bandymo koncentracijai (žymimos F  M ), 
— tuščiojo kontrolinio ėminio kolba, be bandomosios medžiagos; 
bent viena tuš čiojo ėminio bandymo kolba, kurioje b ūtų tik 
bandymo vanduo (žymima F  B ), 
— etaloninio kontrolinio ėminio kolbos; dvi kolbos su etalonine 
medžiaga (pvz., anilinu arba natrio benzoatu, 10 μg/l) (žymimos 
F C ). Etaloninio kontrolinio ėminio paskirtis – patvirtinti 
mažiausią mikrobų aktyvum ą. Jei tinka, galima naudoti žym ėtąją 
etaloninę medžiag ą, ir kai bandomosios medžiagos skaidymas 
stebimas atliekant chemin ę analizę, 
— sterilumo kontrol ės kolbos; viena arba dvi kolbos, kuriose b ūtų 
sterilizuotas bandymo vanduo galimam abiotiniam skaidymui arba kitokio tipo ne biologiniam bandomosios medžiagos šali ­
nimui tirti (žymimos F
 S ). Biologin į aktyvum ą galima stabdyti 
bandymo vanden į apdorojant autoklave (121 °C; 20 min) arba 
pridedant toksin ės medžiagos (pvz., natrio azido (NaN  3 ) 10–20 
g/l, gyvsidabrio (II) chlorido (HgCl  2 ) 100 mg/l arba formalino at 
100 mg/l) arba švitinant gama spinduliuote. Jei naudojamas 
HgCl  2 , jis turėtų būti šalinamas kaip toksiškos atliekos. Jei 
naudojamas vanduo su dideli nuos ėdų kiekiu, gauti sterilias 
sąlygas nelengva; šiuo atveju rekomenduojamas pakartotinis 
apdorojimas autoklave (pvz., tris kartus). Reik ėtų atsižvelgti į 
tai, kad apdorojant autoklave gali pakisti nuos ėdų sorbcinės 
charakteristikos,  
— tirpiklio kontrolin ės kolbos, kuriose b ūtų bandymo vanduo ir 
bandymo vanduo su etalonine medžiaga; po dvi kolbas, apdo ­
rotas tuo pa čiu tirpiklio kiekiu, kurioms taikoma ta pati proce ­
dūra, kaip ir bandomosioms medžiagoms. Tirpiklio kontrolini ų 
ėminių tikslas – ištirti galim ą neigiamą tirpiklio poveik į mikrobų 
populiacijai, nustatant etalonin ės medžiagos skaidym ą. 
Rengdamas bandymo plan ą, tyrėjas turėtų išnagrin ėti santykin į 
bandinio kartotini ų ėminių ir didesnio m ėginių skaičiaus santykio 
reikšmingum ą. Tikslus reikiam ų kolbų skaičius priklausys nuo 
taikomo skaidymo matavimo metodo (žr. 1.8.9.1 skirsnio tre čiąją 
pastraipą; 1.8.9.4 skirsn į ir 3 pried ą). ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
Kiekvienu m ėginio ėmimo momentu iš kiekvienos bandymo kolbos 
turėtų būti imami du daliniai m ėginiai (pvz., 5 ml alikvotin ės dalys). 
Jei naudojama daug kolb ų, kai mėginį sudaro visas kolbos turinys, 
kiekvieną kart imant m ėginį turėtų būti paimtos bent dvi kolbos (žr. 
1.8.9.1 skirsnio pirm ąją pastraipą). 
1.8.9.3.  Kolb ų ruošimas suspenduot ų nuosėdų bandymui [neprivaloma]  
Į bandymo indus įpilami reikiami t ūriai bandymo vandens ir 
nuosėdų, jei reikia (žr. 1.8.5 skirsn į). Kolbų ruošimas suspenduot ų 
nuosėdų bandymui atitink ą kolbų ruošimą pelaginiam bandymui (žr. 
1.8.9.1 ir 1.8.9.2 skirsnius). Geriausia naudoti serumo butelius arba panašios formos kolbas. Užkimštos kolbos dedamos horizontaliai ant 
purtyklės. Aišku, kad atviros kolbos su
 14 C nežymėtomis, nelakiomis 
medžiagomis yra statomos; šiuo atveju rekomenduojama maišyti magnetine maišykle ir naudoti stiklu dengtus magnetinius strypelius. Prireikus buteliai aeruojami tinkamoms aerobin ėms sąlygoms užtik ­
rinti.
 
1.8.9.4.  Radiocheminiai nustatymai  
Išsiskyręs 14 CO 2 yra matuojamas netiesiogiai ir tiesiogiai (žr. 3 
priedą). 14 CO 2 nustatomas netiesiogiai kaip skirtumas tarp pradinio  
14 C aktyvumo bandymo vandenyje arba suspensijoje ir paimto 
mėginio suminio liekamojo aktyvumo, išmatuoto po m ėginio rūgšti­
nimo iki pH 2–3 ir CO  2 pašalinimo. Taip pašalinama neorganin ė 
anglis ir išmatuotas liekamasis aktyvumas yra organin ės medžiagos 
aktyvumas. Netiesioginis  14 CO 2 nustatymas netur ėtų būti taikomas, 
jei kaip pagrindiniai bandomosios medžiagos virsmo produktai susi ­
daro lakieji junginiai (žr. 3 pried ą). Jei įmanoma, išsiskyrusio  14 CO 2 
kiekis tur ėtų būti matuojamas tiesiogiai (žr. 3 pried ą) kiekvien ą kartą 
imant mėginį bent iš vienos bandymo kolbos; taikant ši ą procedūrą, 
galima patikrinti masi ų balansą ir biologinio skaidymo proces ą, bet ji 
tinka tik bandymams, atliekamiems su uždarytomis kolbomis.  
Jei atliekant bandym ą išsiskyrusio  14 CO 2 kiekis matuojamas tiesio ­
giai, šiam tikslui bandymo pradžioje tur ėtų būti paruošta daugiau 
kolbų. Rekomenduojamas tiesioginis  14 CO 2 nustatymas, jei kaip 
pagrindiniai bandomosios medžiagos virsmo produktai susidaro lakieji junginiai. Kiekvien ą kartą matuojant, papildom ų bandymo 
kolbų turinys yra r ūgštinamas iki pH 2–3 ir
 14 CO 2 surenkamas 
vidiniu arba išoriniu absorbentu (žr. 3 pried ą). 
14 C žymėtos bandomosios medžiagos ir pagrindini ų virsmo produkt ų 
koncentracijos vert ės gali būti nustatytos, taikant radiochemin ę chro­
matografij ą (pvz., plonasluoksn ę chromatografij ą, RAD-TLC) arba 
HPLC ir radiochemin į aptikimo metod ą. 
Papildomai galima nustatyti liekamojo radioaktyvumo fazin į pasis­
kirstymą (žr. 1 pried ą), bandomosios medžiagos likut į ir virsmo 
produktus.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Baigus bandym ą, turėtų būti nustatytas masi ų balansas, tiesiogiai 
matuojant  14 CO 2 atskirose bandymo kolbose, iš kuri ų atliekant 
bandymą mėginiai nebuvo imami (žr. 3 pried ą). 
1.8.9.5.  Specifin ė cheminė analizė 
Jei yra jautrus specifinis analiz ės metodas, j į galima taikyti vietoj 
radiochemini ų metodu pirminiam biologiniam skaidymui įvertinti, 
matuojant sumin ę bandomosios medžiagos liekam ąją koncentracij ą. 
Jei naudojama žym ėtoji bandomoji medžiaga (visiškai mineralizacijai 
matuoti), specifin ė cheminė analizė gali būti atliekama lygiagre čiai 
papildomai informacijai gauti ir proced ūrai patikrinti. Be to, specifin ė 
cheminė analizė gali būti taikoma nustatyti virsmo produktus, susi ­
dariusiems skaidant bandom ąją medžiag ą, ir ši analiz ė rekomenduo ­
jama medžiagoms, kuri ų mineralizacijos pus ėjimo trukm ė ilgesnė 
kaip 60 par ų. Kiekvien ą kart imant m ėginį turėtų būti išmatuota ir 
pateikta ataskaitoje bandomosios medžiagos ir virsmo produkt ų 
koncentracija (kaip koncentracija ir kaip įdėto kiekio procentin ė 
dalis). Apskritai, jei bet kuriuo m ėginio ėmimo momentu aptikti 
virsmo produktai sudaro ≥ 10 % įdėtos medžiagos koncentracijos, 
jie turėtų būti identifikuoti, išskyrus kai jie gana patikimai patvirti ­
nami kitu b ūdu. Virsmo produkt ų, kurių koncentracija vis ą tyrimą 
didėja, irgi tur ėtų būti identifikuojami, net jei j ų koncentracija nevir ­ 
šija pirmiau nurodytos ribin ės vertės, nes tai gal ėtų rodyti patvarum ą. 
Reikėtų spręsti virsmo produkt ų analizės sterilumo kontrol ės 
ėminiuose klausim ą, jei manoma, kad gal ėtų vykti greitas abiotinis 
bandomosios medžiagos virsmas (pvz., hidroliz ė). Virsmo produkt ų 
kiekybinio nustatymo ir identifikavimo b ūtinybė turėtų būti nagrinė­
jama kiekvienu konkre čiu atveju, pagrindim ą pateikiant ataskaitoje. 
Ekstrahavimas organiniais tirpikliais tur ėtų būti taikomas pagal atitin ­
kamos analiz ės metodikos rekomendacijas.  
Visi mėginiai turėtų būti laikomi 2–4 °C temperat ūroje ir nesiliesti su 
oru, jei analiz ė atliekama per 24 h (pageidautina). Laikant ilgiau, 
mėginiai tur ėtų būti užšaldomi žemiau –18 °C arba konservuojami 
cheminiu b ūdu. Konservuojam ų mėginių rūgštinti nerekomenduo ­
jama, kadangi r ūgštinti m ėginiai gali b ūti nestabil ūs. Jei analizei 
skirti mėginiai laikomi ilgiau kaip 24 h, tur ėtų būti atliktas stabilumo 
laikymo s ąlygomis tyrimas, kuris įrodytų nagrinėjamų chemini ų 
medžiagų stabilum ą, kai laikoma –18 °C temperat ūroje arba konser ­
vavimo sąlygomis. Jei analiz ės metodą sudaro ekstrahavimas tirpikliu 
arba kietosios faz ės ekstrahavimas ( anglų k. SPE), ekstrahuoti reik ėtų 
iškart paėmus mėginį arba ne v ėliau kaip per 24 h, jei m ėginys 
atšaldomas.  
Atsižvelgiant į analizės metodo jautr į, gali tekti imti didesnio t ūrio 
ėminius nei nurodyta 16 skirsnyje. Bandym ą būtų lengva atlikti, jei 
būtų naudojami vieno litro bandymo t ūriai 2–3 litr ų talpos kolbose, 
iš kurių būtų galima imti maždaug 100 ml m ėginius.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS  
2.1. REZULTAT Ų APDOROJIMAS  
2.1.1.  Duomen ų grafikas  
Mėginių ėmimo laikas suapvalinamas iki sveiko valand ų skaičiaus 
(išskyrus kai medžiaga skyla dideliu laipsniu per minutes arba valandas), bet ne iki sveiko par ų skaičiaus. Braižomi bandomosios 
medžiagos liekamojo aktyvumo (
 14 C žymėtų medžiag ų) arba lieka ­
mosios koncentracijos (nežym ėtų medžiagų) įverčių kaip laiko funk ­
cijos grafikai, naudojant linijinius ir pusiau logaritminius parametrus (žr. 1a, 1b paveikslus). Jei skaidymas vyko, lyginami F
 T ir F  S kolbų 
rezultatai. Jei kolb ų su bandom ąja medžiaga (F  T ) ir sterili ų kolbų 
(F S ) rezultat ų vidurkiai skiriasi mažiau kaip 10 %, galima daryti 
prielaidą, kad stebimas skaidymas iš esm ės yra abiotinis. Jei skai ­
dymas F  S kolbose vyksta mažesniu laipsniu, skai čiai gali būti naudo­
jami F  T kolboms gaut ų rezultatų pataisai daryti (atimant), kad ūbtų 
galima įvertinti biologinio skaidymo laipsn į. Kai atliekama nepriva ­
loma pagrindini ų virsmo produkt ų analizė, be bandomosios 
medžiagos išnykimo grafiko tur ėtų būti pateikti virsmo produkt ų 
susidarymo ir išnykimo grafikai.  
Pagal skaidymo kreiv ę nustatoma v ėlavimo tarpsnio trukm ė t L 
(pusiau logaritminis grafikas) tiesi ąją kreivės dalį ekstrapoliuojant į 
nulinį skaidymo laik ą arba nustatant maždaug 10 % skaidymo 
trukmę (žr. 1a ir 1b paveikslus). Pagal pusiau logaritmin į grafiką 
įvertinama pirmojo laipsnio grei čio konstanta k ir jos standartin ė 
paklaida, atliekant ln (liekamojo  14 C aktyvumo arba bandomosios 
medžiagos koncentracijos) kaip lakiko funkcijos tiesin ę regresiją. 
Konkrečiai, kai atliekami  14 C matavimai, reikia naudoti tik pradin ės 
tiesinės kreivės dalies, pasibaigus v ėlavimo tarpsniui, duomenis, ir 
geriau atrinkti nedidel į skaičių tipinių duomen ų, bet ne didesn į 
skaičių mažiau apibr ėžtų duomenų. Šiuo atveju neapibr ėžtį sudaro 
paklaidos, b ūdingos taikant rekomenduojam ą tiesioginio liekamojo  
14 C aktyvumo (žr. toliau) matavimo metod ą. Kartais galb ūt reikėtų 
apskaičiuoti dvi skirtingas grei čio konstantas, jei skaidymas atitinka 
dviejų tarpsnių schemą. Šiuo tikslu nustatomi du skirtingi skaidymo 
kreivės tarpsniai. Grei čio konstantos k ir pus ėjimo trukm ė t ½ = ln2/k 
turėtų būti apskai čiuojamos atskirai kiekvienai kartotini ų ėminių 
kolbai, kai daliniai m ėginiai imami iš tos pa čios kolbos, arba naudo ­
jant vidutines vertes, kai kiekvien ą kartą kaip mėginys imamas visas 
kolbos turinys (žr. 1.8.9.2 skirsnio paskutin ę pastraipą). Kai taikoma 
pirmoji nurodyta proced ūra, ataskaitoje tur ėtų būti pateikta grei čio 
konstanta ir pus ėjimo trukm ė, gauta atskirai kiekvienai kolbai, j ų 
vidutinė vertė ir jos standartin ė paklaida. Jei buvo naudojamos 
didelės bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės, skaidymo 
kreivė gali gerokai nukrypti nuo ties ės (pusiau logaritminio grafiko) 
ir pirmojo laipsnio kinetika gali negalioti. Taigi ne įmanoma apibr ėžti 
pusėjimo trukm ės. Tačiau ribotam duomen ų intervalui galima taikyti 
pseudopirmojo laipsnio kinetik ą ir įvertinti skaidymo pus ėjimo 
trukmę DT  50 (laikas 50 % skaidymo laipsniui pasiekti). Ta čiau reikia 
atminti, kad skaidymo eigos, išskyrus pasirinkt ą duomenų intervalą, 
negalima prognozuoti taikant DT  50 , kuri aprašo tik nurodyt ą 
duomenų rinkinį. Nesunku gauti statistiniams apskai čiavimams ir 
kreivės pritaikymui palengvinti skirtas analizines priemones ir reko ­
menduojama naudoti šio tipo programin ę įrangą. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Jei atliekama specifin ė cheminė analizė, įvertinamos pirminio skai ­
dymo grei čio konstantos ir pus ėjimo trukm ės vertės, kaip tai buvo 
atliekama visiškai mineralizacijai. Jei pirminis skaidymas yra greit į 
ribojantis procesas, kartais galima naudoti visos skaidymo eigos duomenų taškus. Taip yra tod ėl, kad priešingai
 14 C aktyvumo mata ­
vimui, šie matavimai yra tiesioginiai.  
Jei naudojamos  14 C žymėtos medžiagos, masi ų balansas bent 
bandymo pabaigoje tur ėtų būti išreikštas kaip naudotos pradin ės 
koncentracijos procentin ė dalis.  
2.1.2.  Liekamasis aktyvumas  
Kai biologiškai skaidoma  14 C žymėta organin ės medžiagos dalis, 
didžiausia  14 C dalis virsta  14 CO 2 , kita jo dalis naudojama biomasei 
didinti ir (arba) nel ąstelinių metabolit ų sintezei. Taigi vykstant 
„visiškam“ biologiniam medžiagos skaidymui, ne visa jos anglis virsta
 14 CO 2 . 14 C, patekęs į biosintez ės būdu gautus produktus, 
vėliau lėtai išsiskiria kaip  14 CO 2 dėl „antrinės mineralizacijos“. D ėl 
šių priežasčių liekamojo organinio  14 C aktyvumo (išmatuoto paša ­
linus CO  2 ) arba gauto  14 CO 2 kiekio kaip laiko funkcijos kreiv ėse 
atsiranda „uodega“, kai skaidymas jau yra baigtas. Tai apsunkina duomenų kinetinį interpretavim ą ir tik pradin ė kreivės dalis (pasi ­
baigus vėlavimo tarpsniui ir anks čiau nei pasiekiamas maždaug 50 % 
skaidymas) paprastai tur ėtų būti naudojama skaidymo grei čio 
konstantai įvertinti. Jei bandomoji medžiaga yra skaidoma, suminis 
liekamasis organin ės
 14 C aktyvumas yra visuomet didesnis nei  14 C 
aktyvumas, atitinkantis likusi ą nesuskaidyt ą bandomąją medžiagą. Jei 
bandomoji medžiaga skaidoma pagal pirmojo laipsnio reakcij ą ir 
pastovi dalis α mineralizuojama į CO  2 , pradinis  14 C išnykimo 
(suminės organin ės 14 C kaip laiko funkcijos) kreiv ės krypties koefi ­
cientas bus lygus α, padaugintai iš bandomosios medžiagos (arba, jei 
kalbėti tiksliai, bandomosios medžiagos  14 C žymėtosios dalies) 
atitinkamos koncentracijos kreiv ės krypties koeficiento. Taigi naudo ­
jant nepataisyto suminio organin ės 14 C aktyvumo matavimus, apskai ­ 
čiuota skaidymo grei čio konstanta bus sumažinta. Bandomosios 
medžiagos koncentracijos ver čių apskaičiavimo pagal išmatuot ą 
radiochemin į aktyvum ą metodikos, pagr įstos įvairiomis supaprasti ­
nančiomis prielaidomis, yra aprašytos literat ūroje (2)(9)(10)(11). 
Tokias metodikas lengviausia taikyti greitai skaidomoms medžia ­
goms.  
2.2. REZULTAT Ų INTERPRETAVIMAS  
Jei nustatoma, kad didinant koncentracij ą k nesikei čia (t. y., jei 
apskaičiuotoji k vert ė yra maždaug tokia pati, esant skirtingoms 
bandomosios medžiagos koncentracijos vert ėms), galima daryti prie ­
laidą, kad esamas bandymo s ąlygas, t. y. bandom ąją medžiag ą, 
vandens ėminį ir bandymo temperat ūrą, atitinka pirmojo laipsnio 
greičio konstanta. Ekspert ų sprendimu turi b ūti įvertinta, kokiu 
laipsniu rezultatus galima apibendrinti ir ekstrapoliuoti kitoms siste ­
moms. Jei naudojama didel ė bandomosios medžiagos koncentracija, 
ir dėl tos priežasties skaidymas neatitinka pirmojo laipsnio kinetikos, 
duomenys negali b ūti naudojami tiesiogiai įvertinti pirmojo laipsnio 
greičio konstant ą arba atitinkam ą pusėjimo trukm ę. Tačiau 
duomenys, gauti atliekant bandymus, kuriuose naudojama didel ė 
bandomosios medžiagos koncentracija, vis dar gali b ūti naudingi 
visiškos mineralizacijos laipsniui įvertinti ir (arba) virsmo produk ­
tams aptikti ir kiekybiškai nustatyti.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Jei yra žinomi kit ų nei biologinis skaidymas išnykimo proces ų (pvz., 
hidrolizės arba garavimo) grei čiai, juos galima atimti iš bandymo 
metu stebimo suminio išnykimo grei čio apytikriam biologinio skai ­
dymo įverčiui gauti. Hidroliz ės duomenis galima, pvz., gauti pagal 
sterilumo kontrol ės ėminio duomenis arba atlikti lygiagret ų bandymą, 
naudojant didesn ę bandomosios medžiagos koncentracij ą. 
Netiesioginis ir tiesioginis  14 CO 2 nustatymas (1.8.9.4 skirsnis ir 3 
priedas) gali b ūti taikomas tik bandomosios medžiagos mineraliza ­
cijos į CO  2 laipsniui matuoti. Radiochemin ė chromatografija (RAD- 
TLC) arba HPLC gali b ūti naudojama  14 C žymėtos bandomosios 
medžiagos koncentracijos vert ėms nustatyti ir pagrindini ų virsmo 
produktų susidarymui analizuoti (1.8.9.4 skirsnio tre čioji pastraipa). 
Norint tiesiogiai įvertinti pus ėjimo trukm ę, būtina, kad neb ūtų 
pagrindini ų virsmo produkt ų (pagal apibr ėžtį sudarančių ≥ 10 % 
pridėto bandomosios medžiagos kiekio). Jei esama pagrindini ų 
virsmo produkt ų, kaip jie yra apibr ėžti pagal š į bandym ą, reikia 
atlikti detal ų duomen ų įvertinimą. Jį gali sudaryti pakartotinis 
bandymas ir (arba) virsmo produkt ų identifikavimas (žr. 1.8.9.5 
skirsnio pirm ąją pastraipą), išskyrus kai virsmo produkt ų likimas 
gali būti pakankamai pagr įstai įvertintas naudojant turimus duomenis 
(pvz., informacij ą apie skaidymo keli ą). Kadangi CO  2 virtusios 
bandomosios medžiagos anglies dalis kinta (labiausiai d ėl bandomo ­
sios medžiagos ir kit ų esančių substratų koncentracijos, bandym ų 
sąlygų ir mikrob ų populiacijos), šiuo bandymu ne įmanoma tiesiogiai 
įvertinti visišk ą biologinį skaidymą, kaip DOC išnykimo metodu; bet 
rezultatas yra panašus į respirometriniu bandymu gaunam ą rezultatą. 
Todėl mineralizacijos laipsnis bus lygus arba mažesnis kaip mažiau ­
sias visiško biologinio skaidymo lygis. Išsamesniam visiško biolo ­
ginio skaidymo (mineralizacijos ir įjungimo į biomasę) vaizdui gauti, 
bandymo pabaigoje reik ėtų atlikti  14 C fazinio pasiskirstymo analiz ę 
(žr. 1 pried ą). Telkinyje su kietosiomis dalel ėmis  14 C sudarys į 
biomasę įjungtas  14 C ir organin ėmis dalel ėmis sorbuotas  14 C. 
2.3. BANDYMO TINKAMUMAS  
Jei etalonin ė medžiaga nesuskaidoma per numatom ą laiko interval ą 
(anilino ir natrio benzoato – paprastai trumpesn ė kaip dvi savait ės), 
turėtų būti suabejota bandymo tinkamumu ir turi b ūti papildomai 
patikrintas arba tur ėtų būti pakartotas naujo vandens ėminio 
bandymas. ISO atliktame tarplaboratoriniame metodo tyrime, kuriame dalyvavo septynios po Europ ą išdėstytos laboratorijos, 
buvo priimta, kad anilino skaidymo grei čio konstant ų intervalas 
yra 0,3–1,7 para
 –1 , jo vidurkis 0,8 d  –1 ir standartin ė paklaida ±0,4 
d –1 (t ½ = 0,9 paros). Tipin ės vėlavimo trukm ės vertės buvo 1–7 
paros. Nurodoma, kad tirt ų vandens ėminių bakterijų biomasė atitiko 
10 3 – 10  4 kolonijas sudaran čių vienetų (anglų k. CFU) viename ml. 
Skaidymo greitis daug mitybini ų medžiag ų turinčiuose vidurio 
Europos vandenyse buvo didesnis nei šiauriniuose oligotrofiniuose vandenyse, galb ūt dėl skirtingos trofin ės būsenos arba d ėl ankstesnio 
cheminių medžiag ų veikimo.
 
Suminis žym ėtųjų medžiag ų atgavimas (masi ų balansas) bandymo 
pabaigoje tur ėtų būti nuo 90 % iki 110 %, tuo tarpu nežym ėtų 
medžiagų pradinis atgavimas bandymo pradžioje tur ėtų būti nuo 
70 % iki 110 %. Ta čiau nurodyti intervalai tur ėtų būti suprantami 
tik kaip kontroliniai skai čiai ir netaikomi kaip bandymo pri ėmimo 
kriterijai.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. BANDYM Ų ATASKAITA  
Tyrimo tipas, t. y. pelaginis arba suspenduot ų nuosėdų bandymas, 
turėtų būti aiškiai nurodytas bandym ų ataskaitoje, kurioje dar turi 
būti bent ši informacija:  
Bandomoji medžiaga ir etalonin ė (-ės) medžiaga (-os):  
— įprasti pavadinimai, cheminiai pavadinimai (rekomenduojama 
vartoti IUPAC ir (arba) CAS pavadinimus), CAS numeriai, struk ­
tūrinės formulės (rodančios 14 C padėtį, jei naudojama žym ėtoji 
medžiaga) ir atitinkamos fizikochemin ės savybės (žr. 1.5 ir 1.6 
skirsnius),  
— medžiag ų, naudojam ų kaip virsmo produkt ų identifikavimo ir 
kiekybinio nustatymo etalonai, cheminiai pavadinimai, CAS 
numeriai, strukt ūrinės formulės (rodančios 14 C padėtį, jei naudo ­
jama žym ėtoji medžiaga) ir atitinkamos fizikochemin ės savybės, 
— bandomosios ir etalonin ės medžiag ų grynumas (priemaišos),  
— radiocheminis žym ėtosios chemin ės medžiagos grynumas ir savi ­
tasis aktyvumas (jei tinka).  
Paviršinis vanduo:  
Turi būti pateikta bent ši informacija apie paimta vandens ėminį: 
— ėminio ėmimo vieta ir jos aprašymas, įskaitant, jei įmanoma, 
užteršimo istorij ą, 
— ėminio ėmimo data ir laikas,  
— mitybin ės medžiagos (suminis N, amonis, nitritas, nitratas, 
suminis P, ištirp ęs ortofosfatas),  
— ėmimo gylis,  
— ėminio išvaizda (pvz., spalva ir drumstumas),  
— DOC ir TOC,  
— BOD,  
— temperat ūra ir pH ėminio ėmimo vietoje ir ėmimo laiku,  
— deguonies koncentracija arba oksidacijos redukcijos potencialas 
(privaloma, jei n ėra aiškaus aerobini ų sąlygų įrodymo),  
— druskingumas arba laidis (j ūros ir sūroko vandens atveju),  
— suspenduotos kietosios dalel ės (drumsto ėminio atveju),  
— visa kita galima informacija apie ėminio viet ą ėmimo momentu 
(pvz., faktiniai arba anks čiau sukaupti duomenys apie upi ų arba 
jūros srovių srautą, šalia esan čius pagrindinius ištakius ir ištaki ų 
tipą, oro sąlygas prieš ėminio ėmimą), 
ir neprivalomai:  
— mikrob ų biomasė (pvz., tiesioginis skai čius, naudojant akridino 
oranžinį, arba kolonijas sudaran čių vienetų skaičius), ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— neorganin ė anglis,  
— chlorofilo a koncentracija kaip specifinis dumbli ų biomasės 
įvertis.  
Be to, tur ėtų būti pateikta ši papildoma informacija apie nuos ėdas, jei 
atliekamas suspenduot ų nuosėdų bandymas:  
— nuosėdų ėmimo gylis,  
— nuosėdų išvaizda (pvz., spalvotos, purvinos, dumblinos arba 
smėlėtos), 
— tekstūra (pvz., % stambaus sm ėlio, smulkaus sm ėlio, dumblo ir 
molio),  
— sausų suspenduot ų kietųjų dalelių masė g/l, TOC koncentracija 
arba masės nuostolis iškaitinus, kaip organin ės medžiagos kiekio 
matas,  
— pH,  
— deguonies koncentracija arba oksidacijos redukcijos potencialas 
(privaloma, jei n ėra aiškaus aerobini ų sąlygų įrodymo).  
Bandymų sąlygos:  
— laiko tarpas nuo ėminio paėmimo iki jo panaudojimo laboratori ­
niame bandyme, ėminio laikymas ir pradinis apdorojimas, tyrim ų 
atlikimo data,  
— įdėtos bandomosios medžiagos kiekis, bandomosios ir etalonin ės 
medžiagos koncentracija,  
— bandomosios medžiagos įdėjimo būdas, įskaitant tirpikli ų naudo­
jimą, 
— naudoto paviršinio vandens ir nuos ėdų (jei naudotos) t ūris ir 
analizei imamo kiekvieno m ėginio tūris, 
— naudotos bandymo sistemos aprašymas,  
jei neturi b ūti užtikrinamos tamsos s ąlygos, informacija apie „išsklai ­
dyto šviesos“ s ąlygas,  
— informacija apie metod ą (-us), taikyt ą (-us) sterilumo kontrol ės 
ėminiams gauti (pvz., temperat ūra, apdorojim ų autoklave trukm ė 
ir skaičius), 
— inkubavimo temperat ūra, 
— informacija apie analiz ės metodus, radiochemini ų matavim ų, 
masės balanso tikrinimo ir fazinio pasiskirstymo matavimo (jei 
atliekamas) metod ą (-us),  
— kartotini ų ėminių skaičius. 
Rezultatai:  
— atgavimo procentin ės dalies vert ės (žr. 1.7.1 skirsn į), 
— taikyt ų analizės metodų pakartojamumas ir jautrumas, įskaitant 
aptikimo rib ą (LOD) ir kiekybinio nustatymo rib ą (LOQ) (žr. 
1.7.2 skirsn į), ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— visų matavim ų duomenys ( įskaitant m ėginių ėmimo laiko taškus) 
ir apskai čiuotos vert ės lentelių ir skaidymo kreivi ų pavidalu; 
kiekvienai bandymo koncentracijai ir kiekvienai kartotinio ėminio kolbai nurodomas logaritminio grafiko tiesin ės korelia­
cijos krypties koeficientas, v ėlavimo tarpsnio ir pirmojo laipsnio 
arba pseudopirmojo laipsnio grei čio konstantos (jei įmanoma) 
įvertis, atitinkama skaidymo pus ėjimo trukm ė (arba pus ėjimo 
periodas, t
 50 ), 
— ataskaitoje atitinkamos vert ės pateikiamos kaip atskir ų kartotini ų 
ėminių rezultatų vidurkis, pvz., v ėlavimo tarpsnio trukm ės, skai­
dymo grei čio konstantos ir skaidymo pus ėjimo trukm ės (arba 
t 50 ), 
— sistema priskiriama prie neprisitaikiusios arba prisitaikiusios 
pagal skaidymo kreiv ės išvaizdą ir galim ą bandymo koncentra ­
cijos įtaką, 
— galutinio mas ės balanso tikrinimo ir fazinio pasiskirstymo mata ­
vimų (jei buvo atliekami) rezultatai,  
— mineralizuotos  14 C dalis ir galutinis pirminio skaidymo lygis, jei 
taikoma specifin ė analizė, 
— įdėtų ir pagrindini ų virsmo produkt ų identifikavimas, molin ė 
koncentracija ir procentin ė dalis (žr. 1.8.9.5 skirsnio pirm ąją 
pastraipą), jei tinka,  
— siūlomas virsmo kelias, jei tinka,  
— rezultat ų aptarimas.  
4. LITERAT ŪRA 
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water – 
Simulation Biodegradation Test  
2. ISO/DIS 14592–1 (1999) Water quality – Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concent ­
rations – Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions.  
3. Testing Method C.23. Aerobic and anaerobic transformation in 
soil. 
4. Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments.  
5. OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris.  
6. ISO 8245 (1999). Water quality – Guidelines on the determina ­
tion of total organic carbon (TOC) and dissolved organic 
carbon (DOC).  
7. ISO 10634 (1995). Water quality – Guidance for the preparation 
and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
 
8. OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Assess ­
ment. No 22 (to be published summer 2000).  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
9. Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol.47, 394–401.  
10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at low 
concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. 
Saf. 45, 274–283.  
11. ISO/CD 14592–1 (1999). Ring test report: Water Quality – 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 – report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface water/sedi ­
ment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
1 Priedas  
14 C Fazinis pasiskirstymas  
Norint patikrinti proced ūrą, įprasti liekamojo suminio organin ės 14 C 
aktyvumo (TOA) matavimai tur ėtų būti papildyti masi ų balanso matavimais, 
įskaitant tiesiogin į išsiskyrusio ir absorbentu sugauto  14 CO 2 nustatymą (žr. 3 
priedą). Patvirtintas  14 CO 2 susidarymas jau pats savaime yra tiesioginis biolo ­
ginio skaidymo, bet ne abiotinio skaidymo arba kit ų mažėjimo mechanizm ų, 
pvz., garavimo ir sorbcijos, įrodymas. Papildoma naudinga informacija, apib ūdi­
nanti biologinio skaidumo charakteristikas, gali b ūti gauta matuojant TOA pasis ­
kirstymą tarp skystosios faz ės (ištirpusios organin ės 14 C aktyvum ą DOA) ir 
kietųjų dalelių fazės (kietųjų dalelių organinės 14 C aktyvum ą POA), kiet ąsias 
daleles atskyrus membraniniu filtravimu arba centrifugavimu. Be bandomosios medžiagos anglies, kuri buvo panaudota nauj ų ląstelių medžiagai sintetinti ir taip 
pateko į kietąją biomasę, POA sudaro bandomoji medžiaga, sorbuota ant mikrob ų 
biomasės ir ant kit ų kietųjų dalelių. Ištirpusios organin ės medžiagos
 14 C susida­
rymas gali b ūti įvertintas kaip DOA biologinio skaidymo pabaigoje (skaidymo 
kaip laiko funkcijos kreiv ės gulsčioji dalis).  
Liekamosios  14 C faziniam pasiskirstymui pasirinktuose ėminiuose įvertinti, 
ėminiai filtruojami per 0,22 μm arba 0,45 μm membranin į filtrą, pagamint ą iš 
medžiagos, kuri neadsorbuoja dideli ų bandomosios medžiagos kieki ų (gali tikti 
polikarbonatiniai filtrai). Jei bandomosios medžiagos sorbcija ant filtro per didel ė, 
kad į ją būtų galima neatsižvelgti (turi b ūti tikrinama prieš bandym ą), vietoj 
filtravimo galima naudoti didelio grei čio centrifugavim ą (2 000 g; 10 min).  
Filtratas arba centrifugatas apdorojamas taip, kaip 3 priede aprašyta nefiltruotiems 
ėminiams. Membraniniai filtrai ištirpinami atitinkamame scintiliacijos skystyje ir 
skaičiuojama kaip visuomet, paprastai taikant tik išorinio etalono santykio 
metodą gesinimo pataisai įvertinti, arba naudojamas ėminio oksidatorius. Jei 
buvo naudojamas centrifugavimas, susidariusi kiet ųjų dalelių tabletė suspenduo ­
jama 1–2 ml distiliuoto vandens ir skystis supilamas į scintiliacijos buteliuk ą. 
Centrifugavimo m ėgintuvėlis du kartus plaunamas 1 ml distiliuoto vandens ir 
plovimo vanduo supilamas į buteliuk ą. Prireikus suspensija gali b ūti įlieta į 
gelį scintiliacijai skystyje skai čiuoti. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
2 Priedas  
Pusiau nepertraukiamo skaidymo proced ūra 
Gali tekti inkubuoti keliems m ėnesiams pakankamam patvari ų medžiag ų skai­
dymo laipsniui pasiekti. Bandymo trukm ė paprastai netur ėtų būti ilgesnė kaip 60 
parų, išskyrus kai pradinio vandens ėminio charakteristikos išlaikomos atnauji ­
nant bandymo suspensija. Ta čiau bandymo laikotarpis gali b ūti pratęstas iki ne 
daugiau kaip 90 par ų neatnaujinant bandymo suspensijos, jei bandomosios 
medžiagos skaidymas prasid ėjo per pirm ąsias 60 par ų. 
Inkubuojant ilg ą laiką gali sumaž ėti mikrob ų populiacijos įvairovė dėl įvairių 
išnykimo mechanizm ų ir dėl galimo vandens ėminio pagrindini ų mitybini ų 
medžiagų ir pirmini ų anglies substrat ų išeikvojimo. Tod ėl lėtai skaidom ų 
medžiagų skaidymo grei čiui nustatyti rekomenduojama taikyti pusiau nepertrau ­
kiamą bandymą. Bandymas tur ėtų būti pradėtas taikant pusiau nepertraukiam ą 
procedūrą, jei ankstesnis patyrimas rodo, kad reik ės trijų mėnesių inkubavimo 
laikotarpio 20 % medžiagos skaidymo laipsniui pasiekti. Kitu b ūdu įprastas 
atskirų ėminių bandymas gali b ūti pakeistas pusiau nepertraukiamu bandymu, 
jei maždaug per 60 bandymo par ų, taikant atskir ų ėminių procedūrą, bandomo ­
sios medžiagos skaidymas neprasid ėjo. Pusiau nepertraukiama proced ūra gali būti 
sustabdyta ir bandymas t ęsiamas kaip atskir ų ėminių bandymas, kai yra pasie ­
kiamas didelis skaidymo laipsnis (pvz., > 20 %).  
Atliekant pusiau nepertraukiam ą bandymą, maždaug tre čdalis bandymo suspen ­
sijos tūrio kas dvi savaites kei čiamas iš naujo paimtu vandeniu su bandom ąją 
medžiaga, kurios koncentracija atitinka pradin ę koncentracij ą. Tokiu pat b ūdu į 
pakaitinį vandenį įdedama nuos ėdų, kurių koncentracija atitinka pradin ę koncent­
raciją (nuo 0,01 iki 1 g/l), jei atliekamas neprivalomas suspenduot ų nuosėdų 
bandymas. Atliekant suspenduot ų nuosėdų bandymą svarbu, kad kei čiant vanden į 
būtų išlaikoma visiškai suspenduot ų dalelių sistema ir kad b ūtų vienoda kiet ųjų 
dalelių ir vandens buvimo trukm ė, nes priešingu atveju galima netekti laukiamo 
panašumo su vienalyte vandenine sistema be nejudan čiųjų fazių. Dėl šių prie­ 
žasčių būtų geriau, jei taikant pusiau nepertraukiam ą procedūrą suspenduot ų 
nuosėdų pradinė koncentracija atitikt ų nurodyto intervalo apatines vertes.  
Daroma prielaida, kad d ėl nustatyt ų bandomosios medžiagos kieki ų įdėjimo iš 
dalies atnaujinant bandymo suspensij ą, pradinė bandomosios medžiagos koncent ­
racija nėra viršijama, taigi išvengiama adaptacijos, kuri dažnai stebima esant 
didelei bandomosios medžiagos koncentracijai. Kadangi proced ūrą sudaro pakar ­
totinis sėjimas ir suvartot ų mitybini ų medžiag ų bei pirmini ų substratų kompen­
savimas, atstatoma pradin ė mikrobų įvairovė ir bandymo trukm ė iš esmės gali 
būti begalin ė. Reikia atkreipti d ėmesį, kad taikant pusiau nepertraukiam ą proce­
dūrą turi būti daroma liekamosios bandomosios medžiagos koncentracijos pataisa 
dėl bandomosios medžiagos kiekio, prid ėto ir pašalinto per kiekvien ą atnaujinimo 
procedūrą. Jei jungini ų sorbcija maža, vietoj sumin ės bandomosios medžiagos 
koncentracijos galima naudoti ištirpusios bandomosios medžiagos koncentracij ą ir 
atvirkščiai. Nurodytomis s ąlygomis (0,1–1 g kiet ųjų dalelių/l) mažai sorbuojamos 
(< 5 %) medžiagos, kuri ų log K  ow < 3 (tinka neutraliems, lipofiliniams jungi ­
niams). Tai galima įrodyti šiuo apskai čiavimo pavyzdžiu. 0,1 g/l kiet ųjų dalelių 
atitinka maždaug 10 mg anglies viename litre (anglies dalis f  C = 0,01). Darant 
prielaidą, kad:  
log K  ow (bandomosios medžiagos) = 3,  
K oc = 0,42 × K  ow , 
pasiskirstymo koeficientas, K  d = f C × K  oc , 
ištirpusiai medžiagai tenkanti sumin ės koncentracijos dalis (C vandenyje (C  w )/C 
suminė (C t ) yra:  
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 
0,1 × 10  –3 ) = 0,999.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
3 Priedas  
14 CO  2 Nustatymas  
Netiesioginis  14 CO  2 nustatymas  
Atliekant įprastus matavimus, netiesioginis metodas paprastai reikalauja mažiau ­
siai laiko ir yra tiksliausias, jei bandomoji medžiaga yra nelaki ir nevirsta lakiais virsmo produktais. Nefiltruoti m ėginiai pvz., 5 ml t ūrio, tiesiog supilami į scin­
tiliacijos buteliukus. Tinkamas m ėginių pradinis aktyvumas yra 5 000 
dpm-10 000 dpm (80–170 Bq) ir mažiausias pradinis aktyvumas yra apie 1 000 dpm. CO
 2 turėtų būti pašalintas, par ūgštinus iki pH 2–3 1–2 lašais koncentruotos 
H 3 PO 4 arba HCl. CO  2 galima pašalinti, barbotuojant or ą maždaug ½-1 h. Kitaip 
buteliukus galima stipriai purtyti 1–2 h (pvz., ant mikroplokšteli ų purtyklės) arba 
per naktį purtant švelniau. CO  2 šalinimo proced ūros efektyvumas turi b ūti tikri­
namas (prat ęsiant aeravimo arba purtymo trukm ę). Įpilama scintiliacijos skys čio, 
tinkamo vandenini ų mėginių scintiliacijai skai čiuoti, mėginys maišomas s ūkuriniu 
maišytuvu ir radioaktyvumas nustatomas skai čiuojant scintiliacij ą skystyje ir 
atimant fono aktyvum ą, nustatyt ą bandymo tuš čiajam ėminiui (F  B ). Jei bandymo 
vanduo n ėra labai spalvotas arba kiet ųjų dalelių koncentracija n ėra didelė, 
mėginių gesinimas bus tolygus ir pataisoms d ėl gesinimo daryti pakakt ų išorinio 
etalono. Jei bandymo vanduo yra labai spalvotas, patais ą dėl gesinimo gali tekti 
daryti naudojant vidin į etaloną. Jei kietųjų dalelių koncentracija yra didel ė, gali 
būti neįmanoma gauti vienaly čio tirpalo arba gelio arba gali labai skirtis m ėginių 
gesinimas. Tokiu atveju galima taikyti toliau aprašyt ą skaičiavimo metod ą, 
taikomą bandymo suspensijoms. Jei bandymas atliekamas kaip suspenduot ų 
nuosėdų bandymas,  14 CO 2 galima matuoti netiesiogiai, imant vienalyt į 10 ml 
bandymo vandens ir suspensijos m ėginį ir atskiriant fazes centrifugavimu, 
esant tinkamam pagrei čiui (pvz., 40 000 m/s  2 , 15 min). V ėliau vandenin ė fazė 
apdorojama kaip pirmiau aprašyta. Kiet ųjų dalelių fazės 14 C aktyvumui (POA) 
nustatyti nuos ėdas vėl suspenduojamos mažame t ūryje distiliuoto vandens, 
suspensija supilama į scintiliacijos buteliukus ir įpilama scintiliacijos skys čio 
geliui gauti (šiam tikslui yra special ūs scintiliacijos skys čiai). Atsižvelgiant į 
kietųjų dalelių tipą (pvz., organini ų medžiag ų kiekį jose), gal b ūtų tikslinga 
mėginį per naktį skaidyti audini ų soliubilizavimo priemone ir prieš įpilant scinti ­
liacijos skys čio homogenizuoti s ūkuriniu maišytuvu. Kitaip POA gali b ūti nusta­
tytas mėginį sudeginant oksidacijos įrenginyje, esant deguonies pertekliui. Skai ­ 
čiuojant visuomet reik ėtų įtraukti vidinius etalonus, ir gali tekti daryti pataisas d ėl 
gesinimo, kiekvienam atskiram m ėginiui naudojant vidin į etaloną. 
Tiesioginis  14 CO  2 nustatymas  
Jei išsiskyr ęs 14 CO 2 yra matuojamas tiesiogiai, tai tur ėtų būti daroma ruošiant 
daugiau kolb ų bandymo pradžioje, kiekvienam matavimui imti vis ą bandymo 
kolbos turin į, jį rūgštinti iki pH 2–3 ir surinkti  14 CO 2 vidiniu (bandymo pradžioje 
įdėtu į kiekvien ą bandymo kolb ą) arba išoriniu absorbentu. Absorbentu gali b ūti 
šarmas (pvz., 1 N NaOH tirpalas arba NaOH granul ės), etanolaminas, absorbentai 
etanolamino pagrindu ir prekyboje esantys absorbentai. Atliekant tiesiogin į 14 CO 2 
matavimą, kolbos tur ėtų būti uždarytos, pvz., butilkau čiuko membrana.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
1a paveikslas.  
Aritmetinio duomen ų grafiko pavyzdys (liekamasis aktyvumas kaip laiko funkcija)
  
1b paveikslas.  
Pusiau logaritminio duomen ų grafiko pavyzdys (ln liekamojo aktyvumo kaip laiko funkcija)
  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  LEMNA  SPP. AUGIMO INHIBAVIMO BANDYMAS  
1. METODAS  
Šis metodas atitinka OECD TG 221 (2006) (1). Daug ES institucij ų 
sutaria, kad tiriant ryški ų spalvų medžiagas  Lemna  bandymas yra 
tinkama dumbli ų bandymo alternatyva (2)(3).  
1.1. ĮVADAS  
Šis bandymo metodas yra skirtas medžiag ų toksiškumui genties  
Lemna  (plūdena) gėlavandeniams augalams įvertinti. Jis yra pagr įstas 
esamomis rekomendacijomis (4)(5)(6)(7)(8)(9), bet į jį įtraukti ši ų 
metodų pakeitimai, siekiant atsižvelgti į naujus tyrimus ir konsulta ­
cijas dėl daugelio pagrindini ų problem ų. Pasiūlyto metodo tinka ­
mumas buvo patvirtintas atliekant tarptautin į tarplaboratorin į 
bandymą (10).  
Šiame bandymo metode aprašomas toksiškumo bandymas naudojant  
Lemna gibba  ir Lemna minor  rūšis, kurios abi buvo pla čiai tiriamos 
ir yra pirmiau nurodyt ų standartų tiriamasis objektas.  Lemna  spp. 
klasifikavimas yra sud ėtingas, nes j į apsunkina didelio kiekio feno ­
tipų buvimas. Nors  Lemna  atsakas į toksines medžiagas gali b ūti 
genetinis kintamumas, šiuo metu nepakanka duomen ų apie šio kinta ­
mumo šaltin į, kad šiam bandymui b ūtų galima rekomenduoti speci ­
finį kloną. Reikėtų pažymėti, kad bandymas n ėra atliekamas steriliai, 
bet atliekant atskiras bandymo pakopas imamasi žingsni ų kiek 
įmanoma sumažinti užkr ėtimą kitais organizmais.  
Aprašytos bandymo su bandymo tirpalo atnaujinimu (pusiau stacio ­
nariojo ir pratekamojo srauto) ir be atnaujinimo (stacionariojo) detalės. Atsižvelgiant į bandymo tikslus ir norminius reikalavimus, 
rekomenduojama išnagrin ėti galimyb ę taikyti pusiau stacionar ųjį ir 
pratekamojo srauto metodus, pvz., jei medžiagos greit išnyksta iš 
tirpalo dėl garavimo, fotocheminio skaidymo, nus ėdimo arba biolo ­
ginio skaidymo. Papildomi nurodymai pateikti (11).
 
1.2. APIBR ĖŽTYS  
Šiame bandymo metode vartojamos šios apibr ėžtys ir santrumpos:  
Biomasė: populiacij ą sudarančios sausos gyvos medžiagos mas ė. 
Šiame bandyme vietoj biomas ės paprastai matuojami pakaitiniai 
parametrai, pvz., gniužul ų skaičius arba gniužul ų plotas, taigi 
terminas „biomas ė“ taikomas ir šiems pakaitiniams matams.  
Chlorozė: gniužulų audinio pageltimas.  
Klonas : organizmas arba l ąstelė, gauta iš vieno individo nelytinio 
dauginimosi b ūdu. Taigi to paties klono individai yra genetiškai 
tapatūs. 
Kolonija : sujungtų moterinių ir dukterini ų gniužulų (paprastai nuo 2 
iki 4) sankaupa. Kartais vadinama augalu.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : bandymo terp ėje ištirpusios bandomosios medžiagos koncent ­
racija, kuriai esant  Lemna  augimo greitis per nustatyt ą veikimo laiko ­
tarpį (tiksliai nurodom ą, jei nukrypsta nuo visos arba normalios 
bandymo trukm ės) sumaž ėja x % (pvz., 50 %). EC vertei, gautai 
pagal augimo greit į arba pagal išeig ą, vienareikšmiškai žym ėti varto­
jami simboliai „E  r C“ augimo grei čiui ir „E  y C“išeigai, toliau nurodant 
naudotą matuojam ą kintamąjį, pvz., E  r C (gniužul ų skaičius). 
Pratekamojo srauto : bandymas, kur į atliekant bandymo tirpalai 
keičiami nepertraukiamai.  
Gniužulas : atskira (pavien ė) plūdenos augalo „lapo formos“ struk ­
tūra. Tai yra mažiausiais galintis daugintis vienetas, t. y. individas.  
Gumbuotumas : žymi gumbuot ų arba išsip ūtusių gniužulų išvaizdą. 
Augimas : matuojamo kintamojo, pvz., gniužul ų skaičiaus, sausos 
medžiagos mas ės, šviežios medžiagos mas ės arba gniužul ų ploto, 
didėjimas bandymo laikotarpiu.  
Augimo greitis (vidutinis savitasis augimo greitis) : logaritminis 
biomasės didėjimas veikimo laikotarpiu.  
Mažiausia stebimo poveikio koncentracija (LOEC) : mažiausia 
bandomosios medžiagos koncentracija, kuriai esant medžiagos poveikis augimo maž ėjimui per nustatyt ą veikimo laikotarp į yra 
statistiškai reikšmingas palyginti su kontroliniais ėminiais (kai p < 
0,05). Tačiau esant visoms didesn ėms kaip LOEC bandymo koncent ­
racijos vert ėms, kenksmingas poveikis turi b ūti lygus arba didesnis 
nei poveikis, kuris b ūtų esant LOEC. Kai negalima įvykdyti ši ų 
dviejų sąlygų, turi būti pateiktas išsamus paaiškinimas, kaip buvo 
pasirinkta LOEC (taigi ir NOEC) vert ė.
 
Matuojami kintamieji : visų tipų kintamieji, kurie yra matuojami 
bandymo rezultatui išreikšti, naudojant vien ą arba daugiau skirting ų 
atsako kintam ųjų. Šiame metode matuojami kintamieji yra gniužul ų 
skaičius, gniužul ų plotas, šviežios medžiagos mas ė ir sausos 
medžiagos mas ė. 
Monokult ūra: vienos r ūšies augal ų kultūra. 
Nekrozė: žuvęs (t. y. baltas arba vandens persisunk ęs) gniužul ų 
audinys.  
Nestebimo poveikio koncentracija (NOEC) : vos mažesn ė nei 
LOEC bandymo koncentracija.  
Fenotipas : stebimos organizmo charakteristikos, nustatomos pagal jo 
genų sąveiką su aplinka.  
Atsako kintamieji : toksiškumui įvertinti naudojami kintamieji, gauti 
pagal bet kur į nors iš matuojam ų kintamųjų, skirtingais apskai čia­
vimo metodais apib ūdinančių biomasę. Šiame metode iš matuojam ų 
kintamųjų gauti atsako kintamieji yra gniužul ų skaičius, gniužul ų 
plotas, šviežios medžiagos mas ė arba sausos medžiagos mas ė. 
Pusiau stacionarusis (atnaujinimo) bandymas : bandymas, kur į 
atliekant bandymo tirpalas periodiškai kei čiamas po tam tikro laiko 
tarpo.  
Stacionarusis bandymas : bandymas, kur į atliekant bandymo tirpalas 
neatnaujinamas.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Bandymo rezultatas : aprašo bendr ąjį veiksnį, kurį siekiama pakeisti 
palyginti su kontroliniu ėminiu, veikiant bandom ąja chemine 
medžiaga. Šiame bandymo metode bandymo rezultatas yra augimo inhibavimas, kuris gali b ūti išreikštas skirtingais atsako kintamaisiais, 
pagrįstais vienu arba daugiau matuojam ųjų kintamųjų.
 
Bandymo terp ė: visiškai paruošta sintetin ė kultūros terpė, kurioje 
auga bandomosios medžiagos veikiami bandymo augalai. Bandomoji 
medžiaga paprastai tirpinama bandymo terp ėje. 
Išeiga : matuojamo kintamojo vert ė biomasės skirtumui veikimo 
laikotarpio pabaigoje ir pradžioje išreikšti.  
1.3. BANDYMO ESM Ė 
Pagal eksponent ės dėsnį augančios Lemna  genties augal ų kultūros 
septynių parų laikotarpiu auginamos kaip monokult ūra esant skirtin ­
goms bandomosios medžiagos tirpalo koncentracijos vert ėms. 
Bandymo tikslas – su medžiaga susijusi ų poveikių vegetatyviniam 
augimui šiuo laikotarpiu kiekybinis įvertinimas, pagr įstas pasirinkt ų 
matuojam ų kintamųjų įvertinimu. Gniužul ų skaičius yra pagrindinis 
matuojamas kintamasis. Be to, nustatomas dar bent vienas kitas matuojamas kintamasis (suminis gniužul ų plotas, sausos medžiagos 
masė arba šviežios medžiagos mas ė), kadangi kitus matuojamus 
kintamuosius kai kurios medžiagos gali veikti labiau nei gniužul ų 
skaičių. Norint kiekybiškai įvertinti su medžiaga susijusius povei ­
kius, augimas bandymo tirpaluose yra lyginamas su augimu kontro ­
liniuose ėminiuose ir nustatoma apibr ėžtą augimo grei čio mažėjimą 
x % (pvz., 50 %) sukelianti koncentracija, kuri išreiškiama EC
 x 
(pvz., EC  50 ). 
Bandymo rezultatas yra augimo inhibavimas, išreiškiamas kaip loga ­
ritminis matuojamo kintamojo padid ėjimas (vidutinis savitasis 
augimo greitis) veikimo laikotarpiu. Pagal bandymo tirpal ų serijoje 
gautus vidutinius savituosius augimo grei čius nustatoma apibr ėžtą 
augimo grei čio mažėjimą x % (pvz., 50 %) sukelianti koncentracija, 
kuri išreiškiama E  r C x (pvz., E  r C 50 ). 
Šiame metode taikomas papildomas atsako kintamasis – išeiga, kuris 
gali būti reikalingas kai kuri ų valstybių nustatytiems specifiniams 
norminiams reikalavimams įvykdyti. Jis yra apibr ėžiamas kaip 
biomasės veikimo laikotarpio pabaigoje ir pradžioje skirtumas. 
Pagal bandymo tirpal ų serijoje gaut ą išeigą apskaičiuojama apibr ėžtą 
išeigos maž ėjimą x % (pvz., 50 %) sukelianti koncentracija, kuri 
išreiškiama E  y C x (pvz., E  y C 50 ). 
Be to, galima statistiškai nustatyti mažiausi ą stebimo poveikio 
koncentracij ą (LOEC) ir nestebimo poveikio koncentracij ą (NOEC).  
1.4. INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ MEDŽIAG Ą 
Turėtų būti atitinkamo jautrio analiz ės metodas medžiagos kiekiui 
bandymo terp ėje kiekybiškai nustatyti.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Informacij ą apie bandom ąją medžiag ą, kuri gali b ūti naudinga 
bandymo s ąlygoms nustatyti, sudaro strukt ūrinė formulė, grynumas, 
tirpumas vandenyje, patvarumas veikiant vandeniui ir šviesai, pK  a , 
K ow , garų slėgis ir biologinis skaidumas. Tirpumas vandenyje ir gar ų 
slėgis gali b ūti naudojamas Henrio d ėsnio konstantai apskai čiuoti, 
kuri rodyt ų, ar atliekant bandym ą yra tikimyb ė prarasti didel į bando­
mosios medžiagos kiek į. Tai pad ėtų nustatyti, ar reik ėtų imtis 
konkrečių priemoni ų tokiems nuostoliams kontroliuoti. Jei duomenys 
apie bandomosios medžiagos tirpum ą ir patvarum ą yra abejotini, šias 
savybes rekomenduojama įvertinti bandymo s ąlygomis, t. y. 
bandymui naudotos auginimo terp ės, temperat ūros, apšvietimo 
režimo sąlygomis.  
Jei yra ypa č svarbu kontroliuoti bandymo terp ės pH vert ę, pvz., kai 
bandomi metalai arba vandenyje nepatvarios medžiagos, į auginimo 
terpę rekomenduojama įpilti buferinio tirpalo (žr. 1.7.4 skirsnio 
pirmąją pastraipą). Papildomi nurodymai, kaip bandyti medžiagas, 
kurių fizikinės chemin ės savybės apsunkina j ų bandymus, yra 
pateikti (11) nuorodoje.  
1.5. ETALONIN Ė MEDŽIAGA  
Kaip priemon ė bandymo proced ūrai patikrinti gali b ūti bandoma 
(-os) etalonin ė (-ės) medžiaga (-os), pvz., 3,5-dichlorfenolis, 
naudotas tarptautiniame tarplaboratoriniame bandyme (10). Patartina 
etaloninę medžiag ą bandyti bent du kartus per metus arba lygiagre ­ 
čiai bandomosios medžiagos toksiškumo nustatymui, jei bandymai 
atliekami re čiau. 
1.6. BANDYMO TINKAMUMAS  
Kad bandymas b ūtų tinkamas, gniužul ų skaičiaus kontroliniuose 
ėminiuose dvigub ėjimo trukm ė turi būti trumpesn ė kaip 2,5 paros 
(60 h), atitinkanti padid ėjimą maždaug septynis kartus per septynias 
paras ir vidutin į savitąjį augimo greit į 0,275 d  –1 . Šiame bandymo 
metode aprašytomis terpi ų ir bandymo s ąlygomis š į kriterijų galima 
pasiekti atliekant stacionar ųjį bandymą (8). Be to, tikimasi, kad š į 
kriterijų bus galima pasiekti pusiau stacionariojo ir pratekamojo 
srauto bandymo s ąlygomis. Dvigub ėjimo trukm ės apskaičiavimas 
pateiktas 2.1 skirsnyje.  
1.7. METODO APRAŠYMAS  
1.7.1.  Aparat ūra 
Visa įranga, kuri lie čiasi su bandymo terpe, tur ėtų būti pagaminta 
vien tik iš stiklo arba kitos chemiškai inertin ės medžiagos. Stikliniai 
indai, skirti kult ūroms auginti ir bandymams atlikti, tur ėtų būti išva­
lyti nuo chemini ų medžiag ų priemaiš ų, kurios gal ėtų būti išplautos į 
bandymo terp ę, ir jie tur ėtų būti sterilūs. Bandymo indai tur ėtų būti 
pakankamai plat ūs, kad skirting ų kolonijų gniužulai kontrolini ų 
ėminių induose gal ėtų augti nesant sanklotos bandymo pabaigoje. 
Neturi reikšm ės, jei šaknys lie čia bandymo ind ų dugną, bet patartina 
naudoti ne mažesnio kaip 20 mm gylio ir 100 ml t ūrio indus. 
Nesvarbu kokio tipo bandymo indai pasirenkami, jei jie atitinka 
šiuos reikalavimus. Tinka atitinkam ų matmenų cheminės stiklinės, 
kristalizatoriai arba stiklin ės Petri  lėkštelės. Bandymo indai turi 
būti uždengti garavimui ir atsitiktiniam užteršimui sumažinti, bet 
tuo pat metu turi užtikrinti b ūtinus oro mainus. Tinkami bandymo 
indai ir ypa č dangčiai neturi mesti šeš ėlių arba pakeisti šviesos spek ­
trines charakteristikas.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Kultūros ir bandymo indai netur ėtų būti laikomi kartu. Geriausia tai 
būtų pasiekti naudojant atskiras klimatines auginimo kameras, inku ­
batorius arba patalpas. Turi b ūti įmanoma kontroliuoti ir užtikrinti 
pastovaus lygio apšvietim ą ir temperat ūrą (žr. 1.7.8 skirsn į). 
1.7.2.  Bandymo organizmas  
Šiam bandymui naudojamas organizmas yra  Lemna gibba  arba  
Lemna minor . Toksiškumo bandymui naudojam ų plūdenų rūšių 
trumpas aprašymas pateiktas 1 pried ėlyje. Augalin ė medžiaga gali 
būti gauta iš kult ūros rinkinio, kitos laboratorijos arba iš lauko. Jei 
kultūra renkama lauke, kult ūrai auginami augalai bent aštuonias 
savaites prieš bandym ą turėtų būti laikomi toje pa čioje terpėje, kuri 
naudojama bandymams. Pradin ėms kultūroms rinkti naudojamose 
lauko vietose neturi b ūti akivaizdži ų užkrėtimo šaltini ų. Jei kultūros 
gaunamos iš kitos laboratorijos arba iš kult ūros rinkinio, jos tur ėtų 
būti panašiai laikomos bent tris savaites. Ataskaitoje tur ėtų būti 
visuomet nurodytas bandymui naudojamos augalin ės medžiagos 
šaltinis, r ūšis ir klonas (jei žinomas).  
Turėtų būti naudojamos monokult ūros, kurios netur ėtų aiškiai 
matomų užkrėtimo kitais organizmais, pvz., dumbliais ir pirmuo ­
nimis, požymi ų. Sveikus  L. minor  augalus sudaro kolonijos, turin čios 
nuo dviej ų iki penki ų gniužulų, tuo tarpu sveikas  L. gibba  kolonijas 
gali sudaryti iki septyni ų gniužulų. 
Bandymui naudojam ų augalų kokybė ir vienodumas darys didel ę 
įtaką bandymo rezultatui, tod ėl jie turėtų būti kruopščiai atrenkami. 
Turėtų būti naudojami jauni, greitai augantys augalai, neturintys 
matomų pažeidim ų arba spalvos poky čio (chloroz ės). Geros kokyb ės 
kultūros požymis – didelis skai čius kolonij ų, kurias sudaryt ų bent du 
gniužulai. Didelis vieno gniužulo kolonij ų skaičius rodo aplinkos 
sukeltą stresą, pvz., dėl riboto mitybini ų medžiag ų kiekio, ir toki ų 
kultūrų augalinė medžiaga bandymams netur ėtų būti naudojama.  
1.7.3.  Auginimas  
Norint sumažinti kult ūros prieži ūros dažnum ą (pvz., kai tam tikr ą 
laikotarpį nesiruošiama atlikti bandym ų su Lemna ), kultūras galima 
laikyti sumažinto apšvietimo ir temperat ūros (4–10 °C) s ąlygomis. 
Kultūros auginimo detal ės pateiktos 2 pried ėlyje. Esant akivaizdiems 
užkrėtimo dumbliais arba kitais organizmais požymiams, tur ėtų būti 
atliekamas  Lemna  gniužulų dalinių ėminių paviršinis sterilizavimas, 
juos vėliau pernešant į naujai paruošt ą terpę (žr. 2 pried ėlį). Jei taip 
atsitinka, likusi užkr ėsta kultūra turėtų būti pašalinta.  
Bent septynios paros prieš bandym ą pakankamas skai čius kolonij ų 
steriliu būdu pernešamas į naują sterilią terpę, kurioje kult ūra 7–10 
parų auginama bandymo s ąlygomis.  
1.7.4.  Bandymo terp ė 
Lemna minor  ir Lemna gibba  rekomenduojamos skirtingos terp ės, 
kaip aprašyta toliau. Reik ėtų labai kruopš čiai išnagrin ėti pH regu ­
liuoti skirto buferinio tirpalo (MOPS (4-morfolinpropansulfonr ūgš­
ties, CAS Nr. 1132–61–2; EINECS Nr. 214–478–5)  L. minor  terpėje 
ir NaHCO  3 L. gibba  terpėje) naudojim ą bandymo terp ėje, jei kyla 
įtarimų, kad jis gali reaguoti su bandom ąja medžiaga ir gali veikti jos 
toksiškumo pasireiškim ą. Be to, priimtina  Steinbergo  terpė (12), jei ji 
atitinka bandymo tinkamumo kriterijus.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
L. minor  auginti ir bandyti rekomenduojama modifikuota Švedijos 
standarto (SIS)  Lemna  auginimo terp ė. Šios terp ės sudėtis pateikta 3 
priedėlyje. 
L. gibba  auginti ir bandyti rekomenduojama auginimo terp ė 20X – 
AAP, aprašyta 3 pried ėlyje. 
Be to,  L. minor  tinka  Steinbergo  terpė, aprašyta 3 pried ėlyje, bet ji 
gali būti naudojama ir  L. gibba  auginti, jei atitinka bandymo tinka ­
mumo kriterijus.  
1.7.5.  Bandymo tirpalai  
Bandymo tirpalai paprastai ruošiami skiedžiant pradin į tirpalą. 
Bandomosios medžiagos pradiniai tirpalai dažniausiai ruošiami tirpi ­
nant medžiag ą auginimo terp ėje. 
Didžiausia bandyta bandomosios medžiagos koncentracija paprastai 
neturėtų būti didesnė nei medžiagos tirpum ą bandymo s ąlygomis 
atitinkanti koncentracija. Ta čiau reikėtų pažymėti, kad  Lemna  spp. 
plaukia paviršiumi ir gali b ūti veikiama medžiag ų, kurios kaupiasi 
vandens ir oro s ąlyčio paviršiuje (pvz., mažai vandenyje tirpi ų, 
hidrofobini ų arba paviršinio aktyvumo medžiag ų). Tokiomis aplinky ­
bėmis veikia kitos nei tirpale esan čios medžiagos ir bandymo 
koncentracijos vert ės, atsižvelgiant į bandomosios medžiagos charak ­
teristikas, gali b ūti didesnės nei tirpumo vandenyje vert ė. Jei bando ­
mosios medžiagos mažai tirpsta vandenyje, koncentruot ą pradinį 
tirpalą arba medžiagos dispersij ą gali tekti ruošti naudojant organin į 
tirpiklį arba dispergent ą, kad būtų lengviau įdėti tikslius bandomo ­
sios medžiagos kiekius į bandymo terp ę ir palengvinti jos disperga ­
vimą ir tirpinim ą. Reikia kiek įmanoma vengti naudoti tokias 
medžiagas. Neturi b ūti fitotoksiškumo d ėl tokių pagalbini ų tirpiklių 
arba dispergent ų naudojimo. Pvz., įprastų tirpiklių, kurie nesukelia 
fitotoksiškumo, kai j ų koncentracija ne didesn ė nei 100 μl·l –1 , sąraše 
yra acetonas ir dimetilformamidas. Jei naudojamas tirpiklis arba dispergentas, jo galutin ė koncentracija tur ėtų būti nurodyta ataskai ­
toje ir būti kiek įmanoma mažesn ė (≤ 100 μl·l
 –1 ), be to, visuose 
apdorotuose ir kontroliniuose ėminiuose tur ėtų būti vienoda tirpiklio 
arba dispergento koncentracija. Papildomi nurodymai d ėl dispergent ų 
naudojimo pateikti (11).  
1.7.6.  Bandymo ir kontrolini ų ėminių grupės 
Išankstiniai bandomosios medžiagos toksiškumo  Lemna  duomenys, 
pvz., intervalo nustatymo bandymo, pad ėtų pasirinkti tinkamas 
bandymo koncentracijos vertes. Atliekant galutin į toksiškumo nusta ­
tymo bandym ą, turėtų būti pasirinktos bent penkios koncentracijos 
vertės, išdėstytos pagal geometrin ę progresij ą. Pageidautina, kad 
gretimų bandymo koncentracijos ver čių santykis b ūtų ne didesnis 
kaip 3,2, bet ši vert ė gali būti didesnė, jei koncentracijos ir atsako 
santykio kreiv ė yra guls čia. Reikėtų pagrįsti mažesnio nei penki ų 
koncentracijos ver čių skaičiaus naudojim ą. Kiekvienai koncentracijai 
turėtų būti naudojami bent trys kartotiniai ėminiai.  
Nustatant bandymo koncentracijos ver čių intervalą (intervalo nusta ­
tymo ir (arba) galutinio toksiškumo bandymo), reik ėtų atsižvelgti į 
šias aplinkybes:  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— Norint nustatyti EC  x vertę, ji turėtų būti tarp bandymo koncent ­
racijos ver čių reikiamam pasikliautinumo lygmeniui užtikrinti. 
Pvz., jei įvertinama EC  50 , didžiausia bandymo koncentracija 
turėtų būti didesn ė nei EC  50 vertė. Jei EC  50 vertė yra už 
bandymo koncentracijos ver čių intervalo rib ų, atitinkami pasik ­
liautinieji intervalai bus dideli ir gali b ūti neįmanomas tinkamas 
statistinio modelio atitikimo įvertinimas.  
— Jei reikia įvertinti LOEC/NOEC, mažiausia bandymo koncentra ­
cija turėtų būti pakankamai maža, kad augimas neb ūtų gerokai 
mažesnis nei kontroliniuose ėminiuose. Be to, didžiausia 
bandymo koncentracija tur ėtų būti gana didel ė, augimas b ūtų 
gerokai mažesnis nei kontroliniuose ėminiuose. Jei taip n ėra, 
bandymą reikės pakartoti taikant kit ą koncentracijos ver čių inter­
valą (išskyrus kai didžiausia koncentracija atitinka ribin ę tirpumo 
vandenyje koncentracij ą arba didžiausi ą reikiamą ribinę koncent­
raciją, pvz., 100 mg·l  –1 ). 
Atliekant kiekvien ą bandymą turėtų būti kontroliniai ėminiai, kuriuos 
sudarytų ta pati kaip ir bandymo induose mitybin ė terpė, tas pats 
gniužulų ir kolonij ų skaičius, tos pa čios aplinkos s ąlygos ir proce ­
dūros, tik neb ūtų bandomosios medžiagos. Jei naudojamas pagalbinis 
tirpiklis arba dispergentas, tur ėtų būti įtrauktas papildomas kontro ­
linis ėminys, turintis tirpiklio (dispergento), kurio koncentracija 
atitiktų naudojam ą induose su bandom ąja medžiaga. B ūtų gerai, jei 
kartotinių kontrolini ų ėminių indų skaičius (ir tirpiklio ind ų, jei 
naudojamas) b ūtų bent du kartus didesnis nei kiekvienai bandymo 
koncentracijai naudojam ų indų skaičius. 
Jei nereikia nustatyti NOEC, bandymo schema gali b ūti pakeista 
padidinant koncentracijos ver čių skaičių ir sumažinant kiekvienos 
bandymo koncentracijos kartotini ų ėminių skaičių. Tačiau kartotini ų 
kontrolini ų ėminių skaičius turi b ūti ne mažesnis kaip trys.  
1.7.7.  Veikimas  
Kolonijos, sudarytos iš 2–4 matom ų gniužulų paimamos iš s ėjimo 
kultūros indo ir steriliomis s ąlygomis atsitiktinai paskirstomos tarp 
bandymo ind ų. Kiekviename inde tur ėtų būti iš viso 9–12 gniužul ų. 
Kiekviename bandymo inde tur ėtų būti vienodas gniužul ų ir kolonij ų 
skaičius. Patyrimas, sukauptas taikant š į metodą, ir tarplaboratorinio 
tyrimo duomenys parod ė, kad naudojant tris kartotinius vienos 
koncentracijos ėminius, kuri ų kiekviename iš pradži ų būtų 9–12 
gniužulų, pakanka aptikti skirtumus tarp apdorot ų ėminių augimo, 
esant 4–7 % inhibavimui, apskai čiuotam pagal augimo greit į 
(10–15 %, apskai čiuotam pagal išeig ą) (10).  
Reikia taikyti atsitiktinio bandymo ind ų išdėstymo inkubatoriuje 
schemą, siekiant kiek įmanoma sumažinti pad ėties erdvėje, šviesos 
intensyvumo arba temperat ūros skirtum ų įtaką. Be to, atliekant steb ė­
jimus reikia taikyti blokin ę schemą arba atsitiktin į indų padėties 
keitimą (arba dažniau keisti pad ėtį). ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Jei išankstinis patvarumo bandymas rodo, kad ne įmanoma užtikrinti 
bandomosios medžiagos koncentracijos (t. y. išmatuotoji koncentra ­
cija sumaž ėja iki mažiau kaip 80 % išmatuotos pradin ės koncentra ­
cijos) vis ą bandymo trukm ę (7 paras), rekomenduojamas pusiau 
stacionarusis bandymo režimas. Šiuo atveju kolonijoms veikti naudo ­
jami bandymo ir kontrolini ų ėminių tirpalai tur ėtų būti keičiami 
naujais bent du kartus per bandym ą (pvz., 3 ir 5 par ą). Dažnis, 
kuriuo terp ė keičiama į naują, priklausys nuo bandomosios 
medžiagos patvarumo; dažniau gali tekti keisti labai nepatvari ų 
arba laki ų medžiag ų tirpalus, siekiant užtikrinti beveik pastovias 
koncentracijos vertes. Kai kuriomis aplinkyb ėmis gali tekti taikyti 
pratekamojo srauto proced ūrą (11)(13).  
Veikimo per lapus (purškiant) scenarijus pagal š į bandymo metod ą 
netaikomas, vietoj to žr. (14).  
1.7.8.  Inkubavimo s ąlygos  
Siekiant užtikrinti šviesos intensyvum ą, pasirenkam ą 85–135 
μE·m  –2 ·s –1 (atitinka 6 500–10 000 liuks ų) intervale, kai optimal ų 
fotosintez ės diapazon ą atitinkanti spinduliuot ė (400–700 nm) matuo ­
jama tokiu pat atstumu nuo šviesos šaltinio, kaip ir  Lemna  gniužulai, 
turėtų būti naudojama nuolatin ė šiltai arba šaltai balta liuminescen ­
cinių lempų šviesa. Šviesos intensyvumas virš bandymo vietos neturi 
kisti daugiau kaip ± 15 % pasirinkto šviesos intensyvumo. Išmatuot ą 
vertę veiks šviesos aptikimo ir matavimo metodas, ypa č jutiklio 
tipas. Sferiniai jutikliai (kurie reaguoja į šviesą, krintančią visais 
kampais virš ir žemiau matavimo plokštumos) ir „kosinusiniai“ jutik ­
liai (kurie reaguoja į šviesą, krintančią visais kampais virš matavimo 
plokštumos) yra geresni nei vienos krypties jutikliai, ir šiame 
bandyme aprašytam daugiataškio šviesos šaltinio tipui bus gaunami 
didesni rodmenys.  
Temperat ūra bandymo induose tur ėtų būti 24 ± 2 °C. Bandymo metu 
kontrolini ų ėminių terpės pH netur ėtų padidėti daugiau kaip 1,5 
vieneto. Ta čiau didesnis nei 1,5 vieneto nuokrypis nepaneigt ų 
bandymo tinkamumo, jei b ūtų galima įrodyti, kai tinkamumo krite ­
rijai yra vykdomi. Reikia imtis papildom ų atsargumo priemoni ų dėl 
pH kitimo specialiais atvejais, pvz., bandant nepatvarias medžiagas arba metalus. Papildomi nurodymai pateikti (11).
 
1.7.9.  Trukm ė 
Bandymas baigiamas pra ėjus 7 paroms nuo augal ų pernešimo į 
bandymo indus.  
1.7.10.  Matavimai ir analiziniai nustatymai  
Bandymo pradžioje suskai čiuojamas ir užrašomas gniužul ų skaičius 
bandymo induose, imantis priemoni ų užtikrinti, kad b ūtų įskaityti 
atsikišę, aiškiai matomi gniužulai. Gniužul ų skaičius, ar jis b ūtų 
normalus arba nenormalus, turi b ūti nustatytas bandymo pradžioje, 
bent kartą kas 3 paras veikimo laikotarpiu (t. y. bent 2 kartus 7 par ų 
laikotarpiu) ir bandymo pabaigoje. Tur ėtų būti pažym ėti augalų 
vystymosi poky čiai, pvz., gniužul ų dydžio, išvaizdos, nekroz ės požy­
miai, chloroz ė arba gumbuotumas, kolonij ų smulkėjimas arba 
plūdrumo netekimas, šakn ų ilgis ir išvaizda. Be to, reik ėtų pažymėti 
reikšmingas bandymo terp ės savybes (pvz., neištirpusios medžiagos 
buvimą, dumblių augimą bandymo inde).  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Be gniužul ų skaičiaus nustatymo bandymo eigoje, dar įvertinamas 
bandomosios medžiagos poveikis vienam (arba daugiau) iš ši ų 
matuojam ų kintamųjų: 
(i) suminiam gniužul ų plotui;  
(ii) sausos medžiagos masei;  
(iii) šviežios medžiagos masei.  
Suminio gniužul ų ploto pranašumas – j į galima nustatyti kiekvie ­
name bandymo ir kontrolinio ėminio inde bandymo pradžioje, jo 
eigoje ir pabaigoje. Sausos arba šviežios medžiagos mas ė turėtų 
būti nustatyta bandymo pradžioje, imant s ėjimo kult ūros ėminį, 
atitinkant į bandymo pradžioje naudojam ą kultūrą, ir bandymo pabai ­
goje, imant augalin ę medžiag ą iš kiekvieno bandymo ir kontrolinio 
ėminio indo. Jei gniužul ų plotas nematuojamas, geriau matuoti 
sausos medžiagos mas ę, bet ne šviežios medžiagos mas ę. 
Suminis gniužul ų plotas, sausos medžiagos mas ė ir šviežios 
medžiagos mas ė gali būti nustatyta taip:  
i) Suminis gniužul ų plotas : Visų kolonijų suminis gniužul ų plotas 
gali būti nustatytas atliekant vaizd ų analizę. Bandymo indo ir 
augalų siluetas gali b ūti fiksuojamas vaizdo kamera (t. y. pasta ­ 
čius indą ant šviesos d ėžės) ir gautas vaizdas apdorojamas skait ­
meniniu b ūdu. Vėliau kalibruojant pagal plokš čius žinomo ploto 
vaizdus, gali b ūti nustatytas suminis gniužul ų plotas. Reik ėtų 
imtis priemoni ų indo krašto sukeltiems trukdžiams pašalinti. 
Taikant kit ą daugiau darbo reikalaujant į metodą, daroma 
bandymo ind ų ir augalų fotokopija, išpjaunamas gautas kolonij ų 
siluetas ir j ų plotas nustatomas lap ų ploto analizatoriumi arba 
naudojant milimetrin į popierių. Be to, gali tikti kiti metodai 
(pvz., kolonij ų silueto ploto ir vienetinio ploto popieriaus 
masės santykis).  
(ii) Sausos medžiagos mas ė: Visų bandymo ind ų visos kolonijos 
surenkamos ir plaunamos distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu. 
Sausinamos sugeriamuoju popieriumi vandens pertekliui paša ­
linti ir džiovinamos 60 °C temperat ūroje iki pastovios mas ės. 
Turėtų būti įskaityti visi šakn ų likučiai. Sausos medžiagos mas ė 
turėtų būti išreikšta bent 0,1 mg tikslumu.  
(iii) Šviežios medžiagos mas ė: Visos kolonijos surenkamos į iš 
anksto pasvertus polistireno (arba kitos inertin ės medžiagos) 
mėgintuvėlius su mažomis (1 mm) skylut ėmis užapvalintuose 
dugnuose. M ėgintuvėliai 10 min centrifuguojami 3 000 min  –1 
apsisukim ų dažniu, esant kambario temperat ūrai. Mėgintuvėliai 
su sausomis kolonijomis sveriami iš naujo ir šviežios medžiagos masė apskaičiuojama atimant tuš čio mėgintuvėlio masę.
 
1.7.10.1.  Matavim ų ir analizini ų nustatym ų dažnis  
Jei taikoma stacionariojo bandymo schema, kiekvieno apdoroto 
ėminio pH vert ė turėtų būti matuojama bandymo pradžioje ir pabai ­
goje. Jei taikoma pusiau stacionariojo bandymo schema, tur ėtų būti 
matuojama kiekvienos naujos bandymo tirpalo dalies pH vert ė prieš 
kiekvieną atnaujinim ą ir dar atitinkamo panaudoto tirpalo pH vert ė. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Šviesos intensyvumas tur ėtų būti matuojamas tose auginimo 
kameros, inkubatoriaus arba patalpos vietose, kurios nuo šviesos 
šaltinio nutolusios tokiu pat atstumu kaip ir  Lemna  gniužulai. Matuo ­
jama bent vien ą kartą bandymo laikotarpiu. Terp ės temperat ūra 
pakaitiniame inde, kuris laikomas tokioms pa čiomis auginimo 
kameros, inkubatoriaus arba patalpos s ąlygomis, tur ėtų būti užrašoma 
bent kartą per dien ą. 
Bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės yra nustatomos 
bandymo eigoje atitinkamais laiko tarpais. Mažiausias reikalavimas atliekant stacionariuosius bandymus yra koncentracijos matavimas bandymo pradžioje ir pabaigoje.
 
Atliekant pusiau stacionariuosius bandymus, kai nelaukiama, kad 
bandomosios medžiagos koncentracija nesikeis daugiau kaip ± 
20 % palyginti su vardine koncentracija, b ūtina analizuoti visus 
naujai paruoštus bandymo tirpalus ir pa čius atnaujintus tirpalus kiek ­
vieno atnaujinimo momentu (žr. 1.7.7 skirsnio tre čiąją pastraipą). 
Tačiau atliekant tuos bandymus, kuri ų išmatuota pradin ė bandomo ­
sios medžiagos koncentracija neatitinka vardin ės ± 20 % tikslumu, 
bet apie kuriuos galima pateikti pakankamai įrodančių duomenų, kad 
pradinės koncentracijos vert ės yra atkartojamos ir pastovios (t. y. 
atitinka 80–120 % pradin ės koncentracijos interval ą), galima atlikti 
tik didžiausios ir mažiausios bandymo koncentracijos tirpal ų cheminę 
analizę. Visais atvejais bandomosios medžiagos koncentracij ą reikia 
nustatyti tik viename kiekvienos bandymo koncentracijos kartotinio 
ėminio inde (arba analizuoti sujungt ų kartotini ų ėminių turinį). 
Jei atliekamas pratekamojo srauto bandymas, tinka ėminių ėmimo 
režimas, taikomas aprašytiems pusiau stacionariesiems bandymams, įskaitant analiz ę bandymo pradžioje, pusiaukel ėje ir bandymo pabai ­
goje, bet šiuo atveju nereikia matuoti panaudot ų tirpalų koncentra ­
cijos. Atliekant šio tipo bandymus, skiediklio ir bandomosios 
medžiagos tirpalo arba bandomosios medžiagos pradinio tirpalo srautas tur ėtų būti tikrinamas kasdien.
 
Jei yra duomen ų, kad vis ą bandym ą bandomosios medžiagos 
koncentracijos kitimas buvo patenkinamas ir ne didesnis kaip ± 
20 % vardin ės arba išmatuotos pradin ės koncentracijos vert ės, rezul­
tatų analizę galima atlikti pagal vardin ę arba išmatuot ą pradinę vertę. 
Jei nuokrypis nuo vardin ės arba išmatuotos pradin ės koncentracijos 
yra didesnis kaip ± 20 %, rezultat ų analizė turėtų būti atliekama 
pagal veikimo laikotarpio geometrinio vidurkio koncentracij ą arba 
taikant modelius, aprašan čius bandomosios medžiagos koncentracijos 
mažėjimą (11).  
1.7.11.  Ribinis bandymas  
Kai kuriomis aplinkyb ėmis, pvz., kai pradinis bandymas rodo, kad 
bandomosios medžiagos toksinis poveikis nepasireiškia esant mažesnei kai 100 mg·l
 –1 arba tirpum ą bandymo terp ėje atitinkan čiai 
koncentracijai (kuri b ūtų mažesnė), galima atlikti ribin į bandym ą, 
kuriame b ūtų lyginami kontrolin ės grupės ir vienos apdorot ų ėminių 
grupės (100 mg·l  –1 arba tirpumo vertei lygi koncentracija) atsakai. 
Labai rekomenduojama, kad jis b ūtų patvirtintas atliekant veikimo 
koncentracijos analiz ę. Labai rekomenduojama, kad jis b ūtų patvir­
tintas analizuojant veikian čios medžiagos koncentracij ą. Ribiniam 
bandymui taikomos visos anks čiau aprašytos bandymo s ąlygos ir 
tinkamumo kriterijai, išskyrus tai, kad kartotini ų apdorotų ėminių 
turėtų būti du kartus daugiau. Vidurkiams palyginti augimas kontro ­
linių ir apdorot ų ėminių grupėse gali b ūti analizuojamas taikant 
statistinį kriterijų, pvz., Stjudento  t kriterijų. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. DUOMENYS IR ATASKAITOS RENGIMAS  
2.1. DVIGUB ĖJIMO TRUKM Ė 
Norint nustatyti gniužul ų skaičiaus dvigub ėjimo trukm ę (T  d ) ir 
tyrimo atitikt į šiam tinkamumo kriterijui (1.6 skirsnis), gautiems 
kontrolini ų ėminių duomenims taikoma ši formul ė: 
T d = ln 2/μ 
kurioje μ yra vidutinis savitasis augimo greitis, nustatytas kaip apra ­ 
šyta 2.2.1 skirsnio pirmojoje ir antrojoje pastraipoje.  
2.2. ATSAKO KINTAMIEJI  
Bandymo tikslas – nustatyti bandomosios medžiagos poveik į Lemna  
vegetatyviniam augimui. Šiame bandymo metode aprašyti du atsako kintamieji, nes valstyb ės narės juos skirtingai vertina ir skiriasi 
norminiai reikalavimai. Siekiant užtikrinti rezultat ų priimtinum ą 
visose valstyb ėse narėse, poveikis tur ėtų būti įvertintas taikant abu 
toliau aprašytus atsako kintamuosius a ir b.
 
a) Vidutinis savitasis augimo greitis: šis atsako kintamasis yra 
apskaičiuojamas pagal kontrolini ų ėminių ir kiekvienos apdorot ų 
ėminių grupės gniužul ų skaičiaus logaritmo ir papildomai kit ų 
matuojam ų parametr ų (suminio gniužul ų ploto, sausos medžiagos 
masės arba šviežios medžiagos mas ės) logaritmo pokyt į per laiką 
(išreiškiam ą para). Jis kartais vadinamas santykiniu augimo 
greičiu (15).  
b) Išeiga: šis atsako kintamasis yra apskai čiuojamas pagal kontro ­
linių ėminių ir kiekvienos apdorot ų ėminių grupės gniužul ų skai­ 
čiaus ir papildomai kit ų matuojam ų parametr ų (suminio gniužul ų 
ploto, sausos arba šviežios medžiagos mas ės) pokytį bandymo 
laikotarpiu.  
Reikėtų pažymėti, kad n ėra lygintinos toksiškumo vert ės, apskai ­ 
čiuotos taikant šiuos du kintamuosius, ir šis skirtumas turi b ūti 
suvoktas naudojant bandymo rezultatus. D ėl atitinkam ų metodų 
matematinio pagrindo, savitojo augimo grei čio vidurkiu pagr įstos 
EC x vertės (E  r C x ), paprastai bus didesn ės nei išeiga pagr įsti rezultatai 
(E y C x ), jei laikomasi šio bandymo metodo s ąlygų. Tai netur ėtų būti 
interpretuojama kaip dviej ų atsako kintam ųjų jautrio skirtumas, 
tiesiog vert ės skiriasi matematiškai. Vidutinio savitojo augimo 
greičio sąvoka pagr įsta bendrąja plūdenų eksponentinio augimo neri ­
bojamose kult ūrose schema, kuri ą taikant toksiškumas įvertinamas 
pagal poveik į augimo grei čiui, kuris nepriklauso nuo kontroliniams 
ėminiams gauto absoliutaus savitojo augimo grei čio lygio, koncent ­
racijos ir atsako kreiv ės krypties koeficiento arba nuo bandymo 
trukmės. Priešingai, rezultatai, pagr įsti išeiga kaip atsako kintamuoju, 
priklauso nuo vis ų šių kitų kintamųjų. E y C x priklauso nuo kiekvie ­
name bandyme naudojam ų plūdenų rūšių savitojo augimo grei čio ir 
nuo didžiausio savitojo augimo grei čio, kuris gali b ūti skirtingas 
plūdenų rūšims ir netgi klonams. Šis atsako kintamasis netur ėtų 
būti taikomas lyginant pl ūdenų rūšių arba net skirting ų klonų jautrį 
toksinėms medžiagoms. Nors toksiškumui įvertinti moksliniu 
požiūriu būtų geriau taikyti vidutin į savitąjį augimo greit į, išeiga 
pagrįsti toksiškumo įverčiai irgi yra įtraukti į šį bandymo metod ą, 
siekiant atitikti kai kuri ų šalių galiojančių norminių teisės aktų reika­
lavimus.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Toksiškumo įverčiai turėtų būti pagrįsti gniužul ų skaičiumi ir vienu 
papildomu matuojamu kintamuoju (suminiu gniužul ų plotu, sausos 
medžiagos mase arba šviežios medžiagos mase), nes kai kurios medžiagos gali veikti kit ą matuojam ą kintamąjį gerokai stipriau nei 
gniužulų skaičių. Šis poveikis neb ūtų nustatytas apskai čiuojant vien 
tik gniužul ų skaičių.
 
Gniužulų skaičius ir visi kiti užrašyti matuojami kintamieji, t. y. 
suminis gniužul ų plotas, sausos medžiagos mas ė arba šviežios 
medžiagos mas ė, surašomi į lenteles kartu su kiekvien ą matavim ą 
atitinkančiomis bandomosios medžiagos koncentracijos vert ėmis. 
Vėlesnė duomenų analizė, pvz., LOEC, NOEC arba EC  x įvertinti, 
turėtų būti pagrįsta atskirų kartotinių ėminių vertėmis, bet ne apskai ­ 
čiuota kiekvienos apdorot ų ėminių grupės vidurkiu.  
2.2.1.  Vidutinis savitasis augimo greitis  
Vidutinis savitasis augimo greitis tam tikru laikotarpiu apskai čiuo­
jamas kiekvienam kontroliniam ir apdorotam kartotiniam ėminiui 
kaip augimo kintam ųjų: gniužulų skaičiaus ir vieno kito matuojamo 
kintamojo (suminio gniužul ų ploto, sausos arba šviežios medžiagos 
masės), logaritminis padid ėjimas, taikant ši ą formulę: 
μ i–j ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
čia: 
— μ i–j : vidutinis savitasis augimo greitis per laik ą i – j 
— N  i : bandymo arba kontrolinio indo matuojamas kintamasis laiku  i 
— N  j : bandymo arba kontrolinio indo matuojamas kintamasis laiku  j 
— t: laikotarpis nuo  i iki j 
Kiekvienai apdorot ų ir kontrolini ų ėminių grupei apskai čiuojama 
augimo grei čio vidutin ė vertė ir dispersijos įverčiai. 
Turėtų būti apskaičiuotas viso bandymo laikotarpio (pirmiau pateik ­
toje formul ėje i yra bandymo pradžios laikas,  j – bandymo pabaigos 
laikas) vidutinis savitasis augimo greitis. Kiekvienai bandymo koncentracijai ir kontroliniam ėminiui apskai čiuojama vidutinio savi ­
tojo augimo grei čio vidutin ė vertė ir dispersijos įverčiai. Be to, tur ėtų 
būti įvertintas augimo greitis atskirais laikotarpiais, kad b ūtų galima 
įvertinti bandomosios medžiagos poveikius veikimo laikotarpiu 
(pvz., nagrin ėjant logaritmines augimo kreives). Dideli atskiriems 
laikotarpiams gaut ų augimo grei čių ir vidutinio augimo grei čio skir­
tumai rodo, kad yra nuokrypis nuo pastovaus eksponentinio augimo ir kad reikia atlikti nuodugn ų augimo kreivi ų tyrimą. Šiuo atveju 
apskaičiavimas su atsarga b ūtų apdorotų kultūrų savitojo augimo 
greičio didžiausiu inhibavimo laikotarpiu ir kontrolini ų ėminių 
augimo grei čio tuo pa čiu laikotarpiu lyginimas.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Kiekvieno apdoroto kartotinio ėminio augimo grei čio mažėjimas 
procentais (I  r ) gali b ūti apskai čiuotas kiekvienai koncentracijai 
(apdorotų ėminių grupei) pagal ši ą lygtį: 
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
čia: 
— % I  r : vidutinio savitojo augimo grei čio mažėjimas procentais;  
— μ C : kontrolini ų ėminių μ vidutinė vertė; 
— μ T : apdorot ų ėminių grupės μ vidutinė vertė. 
2.2.2.  Išeiga  
Poveikis išeigai nustatomas kiekvienam bandymo indui pagal du 
bandymo pradžioje ir pabaigoje matuojamus kintamuosius: gniužul ų 
skaičių ir vieną kitą matuojam ą kintamąjį (suminį gniužulų plotą, 
sausos medžiagos mas ę arba šviežios medžiagos mas ę). Sausos 
arba šviežios medžiagos pradin ė biomasė nustatoma pagal gniužul ų 
ėminį, imamą iš tos pa čios kultūros, kuri s ėjama į bandymo indus 
(žr. 1.7.3 skirsnio antr ąją pastraipą). Kiekvienai bandymo koncentra ­
cijai ir kontroliniam ėminiui apskai čiuojama išeigos vidutin ė vertė ir 
dispersijos įverčiai. Kiekvienos apdorot ų ėminių grupės vidutin į 
išeigos maž ėjimą procentais (% I  y ) galima apskai čiuoti taip:  
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
čia: 
— % I  y : išeigos maž ėjimas procentais  
— b  C : kontrolini ų ėminių grupės galutinės ir pradin ės masių 
skirtumas  
— b  T : apdorot ų ėminių grupės galutinės ir pradin ės masių skir­
tumas  
2.2.3.  Koncentracijos ir atsako santykio kreivi ų brėžimas  
Turėtų būti braižomos koncentracijos ir atsako santykio kreiv ės, 
kurios susieja atsako kintamojo (I  r arba I  y , apskaičiuoto kaip paro ­
dyta 2.2.1 skirsnio paskutin ėje pastraipoje arba 2.2.2 skirsnyje) vidu ­
tinį mažėjimo laipsn į procentais ir bandomosios medžiagos koncent ­
racijos logaritm ą. 
2.2.4.  EC  x įvertinimas  
EC x įverčiai (pvz., EC  50 ) turėtų būti pagrįsti vidutiniu savituoju 
augimo grei čiu (E  r C x ) ir išeiga (E  y C x ), kurių kiekvienas savo ruožtu 
turėtų būti pagrįstas gniužul ų skaičiumi ir vienu papildomu matuo ­
jamu kintamuoju (suminiu gniužul ų plotu, sausos medžiagos mase 
arba šviežios medžiagos mase). Tai daroma d ėl tos priežasties, kad 
yra bandom ųjų medžiagų, kurios skirtingai veikia gniužul ų skaičių ir 
kitus matuojamus kintamuosius. Taigi reikiami toksiškumo para ­
metrai yra kiekvienam inhibavimo laipsniui x apskai čiuotos keturios 
EC x vertės: E  r C x (gniužulų skaičius); E  r C x (suminis gniužul ų plotas, 
sausos medžiagos mas ė arba šviežios medžiagos mas ė); E  y C x (gniu­ 
žulų skaičius) ir E  y C x (suminis gniužul ų plotas, sausos medžiagos 
masė arba šviežios medžiagos mas ė). ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. STATISTIN ĖS PROCED ŪROS  
Tikslas – gauti kiekybin į koncentracijos ir atsako santyk į, taikant 
regresinę analizę. Galima taikyti svertin ę tiesinę regresiją, atlikus 
atsako duomen ų tiesinam ąjį transformavim ą, pvz., į probito, logito 
arba Weibullo  vienetus (16), bet geresn ės yra netiesin ės regresijos 
metodų procedūros, kurias taikant geriau apdorojami neišvengiami 
duomenų netolygumai ir nukrypimai nuo glodži ųjų skirstinių. Artė­
jant į nulinį arba visišk ą inhibavim ą, tokie netolygumai d ėl trans­
formavimo gali padid ėti ir trukdyti analizei (16). Reik ėtų pažymėti, 
kad tipiniai analiz ės metodai, taikant probito, logito arba  Weibullo  
transformuotus dydžius, yra skirti dichotominiams (pvz., mirtin ­
gumas arba išlikimas) duomenims ir turi b ūti modifikuojami, norint 
juos pritaikyti augimo arba biomas ės duomenims. Specifin ės EC  x 
verčių nustatymo pagal tolydžiuosius duomenis proced ūros yra 
pateiktos (17), (18) ir (19).  
Kiekvienam analizuojamam atsako kintamajam naudojamas koncent ­
racijos ir atsako santykis EC  x verčių taškiniams įverčiams apskai ­ 
čiuoti. Kai įmanoma, tur ėtų būti nustatyti kiekvieno įverčio 95 % 
pasikliautinieji r ėžiai. Atsako duomen ų atitiktis regresijos modeliui 
turėtų būti įvertinta grafiškai arba statistiškai. Regresin ė analizė 
turėtų būti atliekama naudojant atskirus kartotini ų ėminių atsakus, 
bet ne apdorot ų ėminių grupių vidurkius.  
Be to, jei turimi regresijos modeliai (metodai) netinka duomenims, 
EC 50 įverčiai ir pasikliautinieji r ėžiai gali b ūti gauti taikant tiesin į 
interpoliavim ą ir savaiminio gerinimo metodus ( anglų k. bootstrap ­
ping) (20).  
Norint įvertinti LOEC, taigi ir NOEC, yra b ūtina palyginti apdorot ų 
ėminių vidutines vertes, taikant dispersin ės analizės (ANOVA) 
metodus. Tuomet kiekvienai koncentracijai gautas vidurkis turi b ūti 
lyginamas su kontrolinio ėminio vidurkiu, taikant atitinkam ą karto­
tinių palyginim ų arba trendo kriterijaus metod ą. Gali būti naudingas  
Dunnetto  arba  Williamso  kriterijus (21)(22)(23)(24).. Yra b ūtina įver­
tinti, ar galioja ANOVA dispersijos vienalytiškumo prielaida. Š į 
įvertinimą galima atlikti grafiškai arba taikant formal ųjį kriterijų 
(25). Tinkami kriterijai yra  Levene  arba  Bartletto  kriterijai. Neatitikt į 
prielaidai d ėl dispersij ų vienalytiškumo kartais galima pataisyti atlie ­
kant duomen ų logaritmin į transformavim ą. Jei dispersijos nevienaly ­
tiškumas yra labai didelis ir jo ne įmanoma pataisyti transformavimo 
keliu, reik ėtų nagrinėti galimyb ę taikyti kitus analiz ės metodus, pvz., 
žingsnio mažinimo  Jonkheere  trendo kriterijus. Papildomus nuro ­
dymus dėl NOEC nustatymo galima rasti (19).  
Atsižvelgiant į naujus mokslo pasiekimus rekomenduojama atsisakyti 
NOEC sąvokos ir j ą pakeisti regresija pagr įstais EC  x taškiniais įver­ 
čiais. Atitinkama šio  Lemna  bandymo x vert ė nėra nustatyta. Ta čiau 
atrodo, kad tikt ų į 10–20 % interval ą patenkanti vert ė (pagal pasi ­
rinktą atsako kintam ąjį), ir pageidautina ataskaitoje pateikti abi EC  10 
ir EC  20 vertės. 
3. ATASKAITOS RENGIMAS  
3.1. BANDYM Ų ATASKAITA  
Bandymų ataskaitą turi sudaryti ši informacija:  
Bandomoji medžiaga:  
— fizikin ė būsena ir atitinkamos fizikochemin ės savybės, įskaitant 
ribinę tirpumo vandenyje koncentracij ą, ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— cheminio identifikavimo duomenys (pvz., CAS numeris), įskai­
tant grynum ą. 
Bandymo r ūšys: 
— mokslinis pavadinimas, klonas (jei žinomas) ir šaltinis.  
Bandymo s ąlygos:  
— taikyta bandymo proced ūra (stacionarusis, pusiau stacionarusis 
arba pratekamojo srauto bandymas),  
— bandymo pradžios data ir jo trukm ė, 
— bandymo terp ė, 
— bandymo schemos aprašymas: bandymo indai ir dang čiai, tirpalų 
tūriai, kolonij ų ir gniužul ų skaičius bandymo inde bandymo 
pradžioje,  
— bandymo koncentracijos vert ės (vardinės ir išmatuotos, jei tinka) 
vienos koncentracijos kartotini ų ėminių skaičius, 
— pradini ų ir bandymo tirpal ų ruošimo metodai, įskaitant tirpikli ų 
arba dispergent ų naudojim ą, 
— bandymo temperat ūra, 
— šviesos šaltinis, šviesos intensyvumas ir vienalytiškumas,  
— apdorot ų ir kontrolini ų ėminių terpės pH vert ės, 
— bandomosios medžiagos koncentracijos vert ės, analizės metodas 
ir atitinkami kokyb ės įvertinimo duomenys (tinkamumo patvirti ­
nimo tyrimai, analiz ės rezultat ų standartiniai nuokrypiai arba 
pasikliautinieji r ėžiai),  
— gniužul ų skaičiaus ir kit ų matuojam ų kintamųjų, pvz., sausos 
medžiagos mas ės, šviežios medžiagos mas ės arba gniužul ų 
ploto, nustatymas,  
— visi nukrypimai nuo šio bandymo metodo.  
Rezultatai:  
— neapdoroti duomenys: gniužul ų skaičius kiekviename bandymo ir 
kontroliniame inde ir kiti matuojami kintamieji kiekvienu steb ė­
jimo ir analiz ės atveju,  
— kiekvieno matuojamo kintamojo vidurkis ir standartinis 
nuokrypis,  
— kiekvien ą koncentracij ą atitinkan čios augimo kreiv ės (rekomen ­
duojama matuojam ą kintamąjį logaritmuoti, žr. 2.2.1 skirsnio 
antrąją pastraipą), 
— kontrolinio ėminio dvigub ėjimo trukm ė (augimo greitis) pagal 
gniužulų skaičių, 
— apskai čiuoti kiekvieno apdoroto kartotinio ėminio atsako kinta ­
mieji, jų vidutinės vertės ir kartotini ų ėminių variacijos koefi ­
cientas,  
— grafinis koncentracijos ir poveikio santykio pateikimas,  
— toksiškumo įverčiai pagal atsako kintamuosius, pvz., EC  50 , EC  10 , 
EC 20 , ir atitinkami pasikliautinieji intervalai. Jei buvo apskai ­ 
čiuotos, LOEC ir NOEC vert ės ir jų nustatymo statistiniai 
metodai,  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— jei buvo taikytas dispersin ės analizės metodas ANOVA, 
poveikio, kur į galima aptikti, dydis (pvz., mažiausiais reikšminis 
skirtumas),  
— bet koks augimo skatinimas, nustatytas kuriam nors apdorojimo 
atvejui,  
— visi stebimi fitotoksiškumo požymiai ir bandymo tirpal ų stebė­
jimai,  
— rezultat ų aptarimas, įskaitant nukrypim ų nuo šio bandymo 
metodo įtaką bandymo rezultatams.  
4. LITERAT ŪRA 
(1) OECD TG 221 (2006) Lemna Sp. Growth Inhibition Test  
(2) The use of Lemna studies for coloured substances is detailed in 
Section 13.5.3 of the EU Manual of Decisions dated July 2006, at http://ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals
 
(3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment – Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, pateikiama 
adresu
 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/inform ­
ation_requirements_en.htm?time=1234958685#A  
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733–742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.
 
(5) USEPA – United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., „Public draft“. EPA 712-C-96–156. 8pp.
 
(6) AFNOR – Association Française de Normalisation. (1996). XP 
T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance de  
Lemna minor . 10pp.  
(7) SSI – Swedish Standards Institute. (1995). Water quality – 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duck­
weed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).  
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater 
Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37–120 pp  
(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and 
Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series No. 145.
 
(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency.
 
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and 
Assessment No.23.  
(12) ISO DIS 20079. Water Quality – Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) – Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory – Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA-600/3–77 108. September 1977.
 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). Bioas ­
says with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of sprayed 
and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353–359.  
(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxi ­
cology and Chemistry, 12, 481–483.  
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 
19, 713–718.  
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.
 
(18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485–1494.
 
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assess ­
ment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
(21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096–1121.  
(22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482–491.  
(23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103–117.  
(24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
(25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe 
dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
1 Priedėlis 
Lemna  SPP Aprašymas.  
Vandens augalas, kurio įprastas pavadinimas pl ūdena,  Lemna  spp., priklauso  
Lemnaceae  šeimai, kuri ą sudaro kelios pasaulyje paplitusios keturi ų genčių 
rūšys. Jų skirtinga išvaizda ir klasifikavimas yra išsamiai aprašytas (1)(2).  
Lemna gibba  ir L. minor  rūšis atitinka vidutinio klimato zon ų rūšis ir paprastai 
naudojamos toksiškumo bandymams atlikti. Abi r ūšis turi plaukiojant į arba 
panardint ą disko formos kamien ą (gniužul ą) ir iš apatinio kiekvieno gniužulo 
vidurio skleidžiasi labai plona šaknis.  Lemna  spp. retai žydi ir augalai dauginasi 
vegetatyviniu b ūdu susidarant naujiems gniužulams (3). Palyginti su senais auga ­
lais jaunesni augalai yra šviesesni, turi trumpesnes šaknis ir yra sudaryti iš dviej ų 
arba trijų skirtingo dydžio gniužul ų. Mažo dydžio  Lemna  yra paprastos strukt ūros 
augalai, kurie dauginasi nelytiniu b ūdu, ir dėl trumpos vienos kartos trukm ės šios 
genties augalai labai tinka laboratoriniams bandymams (4)(5).  
Kadangi gali skirtis r ūšių jautris, tinka tik vienos r ūšies jautrio tarpusavio lygi ­
nimas.  
Bandymams atlikti naudot ų Lemna  rūšių pavyzdžiai. R ūšių naudojimo 
nuorodos:  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, Stockholm University.
 
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935–941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. 
EPA 712-C-96–156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90–337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality – Determination of 
growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in 
Swedish).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). pp. 
733–742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft“. EPA 
712-C-96–156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959–1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assess ­
ment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481–483.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102–2111.  
Lemna  rūšių šaltiniai  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, Canada, M5S 3 B2  
Tel: +1–416–978–3641  
Fax:+1–416–978–5878  
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695–8002  
United States  
phone 001 (919) 515–7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 STOCKHOLM  
SWEDEN  
Tel: +46 8 674 7240  
Fax +46 8 674 7636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
Germany  
e-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Literatūra 
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the desc ­
riptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221–287.  
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82–991150–0–0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1–14.  
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7–22.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
2 priedėlis 
Pradinės kultūros prieži ūra 
Pradines kult ūras galima laikyti ilgesn į laiką žemesnėje temperat ūroje (4–10 °C) 
ir nereikia rekultivuoti.  Lemna  auginimo terp ė gali būti tokia pat, kaip ir 
bandymo terp ė, bet pradin ėms kultūroms galima naudoti kit ų mitybinių medžiagų 
turinčias terpes.  
Periodiškai tam tikras skai čius jaunų, šviesiai žali ų augalų steriliai pernešami į 
naujos kult ūros indus su nauja terpe. Esant šiame metode si ūlomoms v ėsesnėms 
sąlygoms, pers ėti galima ne re čiau kaip kas tris m ėnesius.  
Kultūroms auginti tur ėtų būti naudojami chemiškai švar ūs (rūgštimi išplauti) ir 
sterilūs stikliniai indai ir taikomi sterilaus apdorojimo metodai. Jei pradin ė 
kultūra užkrečiama, pvz., dumbliais arba grybeliais, reikia imtis b ūtinų žingsnių 
užkrato organizmams pašalinti. Dumbli ų ir daugumos kit ų užkrečiančių orga­
nizmų atveju tai galima pasiekti, atliekant paviršin į sterilizavim ą. Imamas 
užkrėstos augalin ės medžiagos ėminys ir nupjaunamos šaknys. Medžiaga iš 
pradžių stipriai purtoma švariame vandenyje ir nuo 30 s iki 5 minu čių įmerkiama 
į 0,5 % (V/V) natrio hipochlorito tirpal ą. Vėliau augalin ė medžiaga skalaujama 
steriliu vandeniu ir pernešama keli ų atskirų ėminių pavidalu į kultūros auginimo 
indus su nauja auginimo terpe. Po tokio apdorojimo daug gniužul ų žūsta, ypač 
ilgiau apdorojant, bet tam tikra likusi ų augalų dalis paprastai nebeturi užkrato. Jie 
gali būti naudojami naujoms kult ūroms sėti. ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
3 Priedėlis 
Terpės 
L. minor  ir L. gibba  auginti rekomenduojamos skirtingos terp ės. L. minor  reko­
menduojama Švedijos standarto (SIS) terp ė, o L. gibba  rekomenduojama 20X 
AAP terp ė. Toliau pateikta abiej ų terpių sudėtis. Šioms terp ėms ruošti tur ėtų būti 
naudojamos analiziškai grynos chemin ės medžiagos ir dejonizuotas vanduo.  
Švedijos standarto (SIS)  Lemna  auginimo terp ė 
— Pradiniai tirpalai I–V sterilizuojami autoklave (120 °C, 15 min) arba filtra ­
vimu per membran ą (vidutinis aku čių skersmuo 0,2 μm). 
— VI (ir papildomai VII) pradiniai tirpalai sterilizuojami tik filtravimu per 
membran ą; jų negalima apdoroti autoklave.  
— Sterilūs pradiniai tirpalai tur ėtų būti laikomi šaltai ir tamsoje. I–V pradiniai 
tirpalai tur ėtų būti pašalinti po šeši ų mėnesių, o VI (ir papildomo VII) tirpal ų 
laikymo trukm ė vienas m ėnuo.  
Pradinis 
tirpalas Nr.  Medžiaga  Pradinio tirpalo 
koncentracija 
(g·l –1 ) Paruoštos terp ės 
koncentracija 
(mg·l  –1 ) Paruošta terp ė 
Elementas  Koncentracija 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P  32; 14 
6,0; 2,4  
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75  Mg; S  7,4; 9,8  
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36  Ca; Cl  9,8; 17,5  
IV Na 2 CO 3 4,0 20  C  2,3  
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 0,010 0,050 
0,0050 
0,010
 1,00 
0,20 0,010 0,050 
0,0050 
0,010
 B 
Mn Mo Zn 
Cu 
Co
 0,17 
0,056 0,0040 0,011 
0,0013 
0,0020
 
VI FeCl  3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (buferinis tirpalas)  490 490  —  —  
— 1 litrui SIS terp ės paruošti į 900 ml dejonizuoto vandens įpilama:  
— 10 ml I pradinio tirpalo  
— 5 ml II pradinio tirpalo  
— 5 ml III pradinio tirpalo  
— 5 ml IV pradinio tirpalo  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml V pradinio tirpalo  
— 5 ml VI pradinio tirpalo  
— 1 ml VII pradinio tirpalo (papildomai)  
Pastaba.:  Papildomo VII pradinio tirpalo (MOPS buferio) gali prireikti tam tikroms 
bandomosioms medžiagoms (žr. 1.4 skirsnio paskutin ę pastraipą). 
— 0,1 mol/l arba 1 mol/l HCl arba NaOH nustatoma pH vert ė 6,5 ± 0,2 ir 
dejonizuotu vandeniu skiedžiama iki vieno litro t ūrio. 
20X AAP auginimo terp ė 
Pradiniam tirpalams ruošti naudojamas sterilus distiliuotas arba dejonizuotas 
vanduo.  
Sterilūs pradiniai tirpalai tur ėtų būti laikomi šaltai ir tamsoje. Pradini ų tirpalų 
laikymo trukm ė tokiomis s ąlygomis yra bent 6–8 savait ės. 
20X – AAP terpei ruošiami penki pradiniai mitybini ų medžiagų tirpalai (A1, A2, 
A3, B ir C), naudojant analiziškai grynas medžiagas. Auginimo terpei gauti 20 
ml kiekvieno pradinio mitybini ų medžiag ų tirpalo įpilama į maždaug 850 ml 
dejonizuoto vandens. 0,1 mol/l arba 1 mol/l HCl arba NaOH nustatoma pH vertė 7,5 ± 0,1 ir dejonizuotu vandeniu skiedžiama iki vieno litro t ūrio. Terpė 
filtruojama į sterilų indą per 0,2 μm (maždaug) membranin į filtrą.
 
Bandymams skirt ą auginimo terp ę reikėtų ruošti 1–2 paros prieš naudojim ą, kad 
galėtų nusistovėti pH vert ė. Auginimo terp ės pH vert ė turėtų būti patikrinta prieš 
naudojim ą ir prireikus reguliuojama, įpilant 0,1 mol/l arba 1 mol/l NaOH arba 
HCl, kaip aprašyta pirmiau.  
Pradinis 
tirpalas Nr.  Medžiaga  Pradinio tirpalo 
koncentracija 
(g·l –1 ) (*) Paruoštos terp ės 
koncentracija 
(mg·l  –1 ) (*) Paruošta terp ė 
Elementas  Koncentracija 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4
 510 
240 90
 Na; N 
Mg Ca
 190; 84 
58,08 24,04
 
A2 MgSO  4 ·7H  2 O 15 290  S  38,22  
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30  K; P  9,4; 3,7  
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 0,16 
0,30 
3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 3,2 
6,0 
66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn Fe 
— 
Zn Co 
Mo 
Cu
 0,65 
2,3 0,66 
— 
31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300  Na; C  220; 43  
(*) Jei nenurodyta kitaip.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Išnaša: Teoriškai tinkama galutin ė hidrokarbonato koncentracija (kuri leist ų išvengti 
didesnio pH reguliavimo) yra lygi 15 mg/l, bet ne 300 mg/l. Ta čiau anksčiau 
20X-AAP terpei ruošti, įskaitant tarplaboratorin į šio metodo tyrim ą, buvo naudo ­
jama 300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse and R. Lacey. (1999) The OECD  Lemna  
Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guide ­
line. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc – Environment Agency).  
STEINBERGO terp ė (pagal ISO 20079)  
Koncentracijos vert ės ir pradiniai tirpalai  
— Modifikuota  Steinbergo  terpė naudojama standarte ISO 20079 tik  Lemna 
minor  (nes pagal j į leidžiama naudoti tik  Lemna minor ), bet bandymai 
parodė, kad ger ų rezultatų galima gauti ir su  Lemna gibba . 
— Terpei ruošti tur ėtų būti naudojamos analiziškai grynos chemin ės medžiagos 
ir dejonizuotas vanduo.  
— Mitybin ė terpė ruošiama iš pradini ų tirpalų arba iš 10 kart ų didesnės koncent ­
racijos terp ės, kuri yra didžiausia terp ės koncentracija, kai dar nesusidaro 
nuosėdos. 
1 lentelė. 
Pastovios pH vert ės STEINBERGO terp ė (modifikuota pagal Altenburger į) 
Medžiaga  Mitybin ė terpė 
Makroelementai  molin ė masė mg/l  mmol/l  
KNO  3 101,12  350,00  3,46  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15  295,00  1,25  
KH  2 PO 4 136,09  90,00  0,66  
K 2 HPO  4 174,18  12,60  0,072  
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37  100,00  0,41  
Mikroelementai  molin ė masė μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83  120,00  1,94  
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43  180,00  0,63  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92  44,00  0,18  
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84  180,00  0,91  
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21  760,00  2,81  
EDTA dinatrio dihidratas  372,24  1 500,00  4,03  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
2 lentelė. 
Pradiniai tirpalai (makroelement ų) 
1. Makroelementai (50 kart ų koncentruoti)  g/l  
1 pradinis tirpalas:  
KNO  3 17,50  
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
2 pradinis tirpalas:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
3 pradinis tirpalas:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
3 lentelė. 
Pradiniai tirpalai (mikroelement ų) 
2. Mikroelementai (1 000 kart ų koncentruoti)  mg/l  
4 pradinis tirpalas:  
H 3 BO 3 120,0  
5 pradinis tirpalas:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
6 pradinis tirpalas:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
7 pradinis tirpalas:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
8 pradinis tirpalas:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00  
EDTA dinatrio dihidratas  1 500,00  
— 2 ir 3 pradiniai tirpalai ir atskirai 4–7 pradiniai tirpalai gali b ūti supilti kartu 
(atsižvelgiant į reikiamą koncentracij ą). 
— Siekiant užtikrinti ilgesn ę laikymo trukm ę, pradiniai tirpalai 20 min apdoro ­
jami autoklave, esant 121 °C, arba atliekamas j ų sterilus filtravimas (0,2 μm). 
Labai rekomenduojama steriliai filtruoti (0,2 μm) 8 pradin į tirpalą. 
Galutinės koncentracijos STEINBERGO terp ės (modifikuotos) ruošimas  
— 20 ml 1, 2 ir 3 pradini ų tirpalų (žr. 2 lentel ę) įpilama į maždaug 900 ml 
dejonizuoto vandens, kad b ūtų išvengta nuos ėdų susidarymo.  
— Įpilama po 1,0 ml 4, 5, 6, 7 ir 8 pradini ų tirpalų (žr. 3 lentel ę). 
— pH vert ė turėtų būti 5,5 ± 0,2 (reguliuojama įpilant kiek įmanoma mažesn į 
NaOH arba HCl tirpalo t ūrį). ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Skiedžiama vandeniu iki 1 000 ml.  
— Jei pradiniai tirpalai yra sterilizuoti ir naudojamas tinkamas vanduo, papil ­
domai sterilizuoti neb ūtina. Jei sterilizuojama galutin ė terpė, 8 pradinis 
tirpalas tur ėtų būti įpilamas po terp ės apdorojimo autoklave (20 min, esant 
121 °C).  
10 kartų didesnės koncentracijos tarpin ės STEINBERGO terp ės (modifi ­
kuotos) ruošimas  
— 20 ml 1, 2 ir 3 pradini ų tirpalų (žr. 2 lentel ę) įpilama į maždaug 30 ml 
vandens, kad b ūtų išvengta nuos ėdų susidarymo.  
— Įpilama po 1,0 ml 4, 5, 6, 7 ir 8 pradini ų tirpalų (žr. 3 lentel ę). Skiedžiama 
vandeniu iki 100 ml.  
— Jei pradiniai tirpalai yra sterilizuoti ir naudojamas tinkamas vanduo, papil ­
domai sterilizuoti neb ūtina. Jei sterilizuojama galutin ė terpė, 8 pradinis 
tirpalas tur ėtų būti įpilamas po terp ės apdorojimo autoklave (20 min, esant 
121 °C).  
— Terpės pH vert ė (galutinės koncentracijos) tur ėtų būti 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27.  TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOS ĖDOSE 
IR VANDENYJE, NAUDOJANT NUOS ĖDAS SU ĮTERPTA 
BANDOM ĄJA CHEMINE MEDŽIAGA  
ĮVADAS  
2. Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 218 (2004). 
Šiuo bandymo metodu siekiama įvertinti ilgalaik į chemini ų medžiag ų 
poveikį nuosėdose gyvenan čioms gėlųjų vandenų dvisparnio vabzdžio  
Chironomus  sp. lervoms. Šis bandymas grindžiamas turimais toksiškumo 
bandymo su  Chironomus riparius  ir Chironomus tentans  protokolais, 
kurie parengti Europoje (1) (2) (3) ir Šiaur ės Amerikoje (4) (5) (6) (7) (8) 
ir patikrinti tarplaboratorinio lyginimo bandymais (1) (6) (9). Taip pat leidžiama naudoti kitas dvisparni ų vabzdžių rūšis, pvz.,  Chironomus yoshi ­
matsui  (10) (11), kurios tinkamai pagr įstos dokumentais.
 
2. Pasirinkus šiame bandymo metode naudojam ą poveikio metod ą į nuosėdas 
įterpiama bandomoji chemin ė medžiaga. Atitinkamo poveikio scenarijaus 
pasirinkimas priklauso nuo numatomo bandymo taikymo. Pasirinkus bando ­
mosios chemin ės medžiagos įterpimo į nuosėdas scenarij ų turi būti mode­
liuojami nuos ėdose paprastai susikaupiantys chemini ų medžiagų lygiai. Į šią 
poveikio sistem ą įtrauktas bandomosios chemin ės medžiagos įtepimas į 
nuosėdų—vandens bandymo sistemos nuos ėdas. 
3. Chemin ės medžiagos, kurias b ūtina ištirti siekiant nustatyti j ų poveikį nuosė­
dose gyvenantiems organizmams, paprastai šiame skyriuje išlieka ilg ą laiko­
tarpį. Nuosėdose gyvenan čius organizmus galima veikti keliais b ūdais. Kiek ­
vieno poveikio b ūdo santykin ė svarba ir laikas, sugaištamas, kol taikant 
kiekvieną būdą užtikrinamas bendrasis toksiškas poveikis, priklauso nuo 
atitinkamos chemin ės medžiagos fizini ų ir chemini ų savybių. Jei tai lengvai 
absorbuojamos chemin ės medžiagos (pvz., kai K  ow > 5) ar kovalentiniais 
saitais su nuos ėdomis susijusios chemin ės medžiagos, užteršto maisto nuri ­
jimas gal ėtų būti tinkamas poveikio b ūdas. Siekiant, kad stipriomis lipofili ­
nėmis savyb ėmis pasižymin čių cheminių medžiag ų toksiškumas b ūtų verti­
namas tinkamai, galima svarstyti galimyb ę, ar nereik ėtų į nuosėdas įterpti 
maisto prieš taikant bandom ąją cheminę medžiagą. Norint atsižvelgti į visus 
galimus poveikio b ūdus pagrindinis d ėmesys taikant š į bandymo metod ą 
skiriamas ilgalaikiui poveikiui. Bandymo trukm ė naudojant  C. Riparius  ir 
C. Yoshimatsui  yra 20–28 dienos ir 28–65 dienos, jeigu pasirenkama  C. 
tentans . Jeigu konkre čiam tikslui, pvz., tiriant nestabili ų cheminių medžiagų 
poveikį, būtini trumpalaikiai duomenys, papildomus kartotinius ėminius 
galima paimti po dešimties par ų laikotarpio.  
4. Išmatuotas poveikis yra bendras išsiritusi ų suaugusi ųjų skaičius ir išsiritimo 
trukmė. Rekomenduojama, kad lerv ų išgyvenimo ir augimo rodikliai b ūtų 
matuojami tik po dešimties par ų laikotarpio, jeigu b ūtini papildomi trumpa ­
laikiai duomenys, ir šiuo atveju, jeigu reikia, naudojant papildomus pakar ­
totinius ėminius.  
5. Rekomenduojama naudoti sintetines nuos ėdas. Sintetin ės nuosėdos keliais 
atžvilgiais yra tinkamesn ės negu nat ūralios nuos ėdos: 
— darant bandym ą kintamumas yra sumažinamas, nes kintamumas sudaro 
atkuriamą „standartin ę matricą“ ir nėra būtina nustatyti neužteršt ą ir 
švarų nuosėdų šaltinį, 
— bandymus galima prad ėti bet kuriuo metu ir nepaisyti bandom ųjų 
nuosėdų sezoninio kintamumo bei šiuo atveju neb ūtina iš anksto apdo ­
roti nuosėdų, kad iš j ų būtų pašalinta b ūdingoji fauna; naudojant sinte ­
tines nuos ėdas taip pat sumažinamos išlaidos, išleidžiamos lauke renkant 
įprastiems bandymams reikaling ą nuosėdų kiekį, 
— naudojant sintetines nuos ėdas galima lyginti toksiškum ą ir atitinkamai 
klasifikuoti chemines medžiagas.  
6. Taikom ų sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 pried ėlyje. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
BANDYMO METODO ESM Ė 
7. Pirmos stadijos chironomid ų lervos veikiamos tam tikros koncentracijos 
bandomąja chemine medžiaga nuos ėdų–vandens sistemose. Bandomoji 
cheminė medžiaga įterpiama į nuosėdas ir pirmos stadijos lervos sudedamos 
į bandymo laboratorines stiklines, kuriose nuos ėdų ir vandens koncentracijos 
yra stabilizuotos. Bandymo pabaigoje matuojama chironomid ų išsinėrimo ir 
augimo sparta. Taip pat galima matuoti lerv ų išgyvenim ą ir masę po 10 
parų, jeigu reikia (naudojant kartotinius ėminius, kai b ūtina). Šie duomenys 
analizuojami taikant regresijos model į siekiant įvertinti koncentracij ą, kuri 
būtų x % sumažinusi lerv ų išsinėrimą, arba lerv ų išgyvenim ą ar augim ą 
(pvz., EC  15 , EC  50 ir t. t.) arba hipotez ę tikrinant statistiniais kriterijais 
siekiant nustatyti NOEC/LOEC (stebimo poveikio nedaran čią koncentracij ą 
ir (arba) mažiausi ą stebimo poveikio koncentracij ą). Pastaruoju atveju pasi ­
telkus statistinius kriterijus poveikio vertes b ūtina lyginti su kontrolin ėmis 
vertėmis. 
INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ CHEMIN Ę MEDŽIAG Ą 
8. Turėtų būti žinomas bandomosios chemin ės medžiagos tirpumas vandenyje, 
jos garų slėgis, išmatuotas ar apskai čiuotas nuos ėdų susidarymas ir stabi ­
lumas vandenyje bei nuos ėdose. Tur ėtų būti prieinamas analiz ės metodas 
kiekybiniam bandomosios chemin ės medžiagos kiekiui nustatyti pavirši ­
niame vandenyje, por ų vandenyje ir nuos ėdose su žinomu ir praneštu tiks ­
lumu bei aptikimo riba. Naudinga informacija laikytina bandomosios 
cheminės medžiagos strukt ūrinė formulė ir grynumas. Bandomosios 
cheminės medžiagos cheminis išliekamumas (pvz., išsklaidymas, abiotinis 
ir biotinis suirimas ir t. t.) taip pat laikytinas naudinga informacija. Išsamios bandomųjų cheminių medžiag ų, kurios d ėl jų fizinių ir chemini ų savybių 
sunkiai pritaikomos bandymams atlikti, gair ės pateiktos (12).
 
ETALONIN ĖS CHEMIN ĖS MEDŽIAGOS  
9. Bandymus su etalonin ėmis chemin ėmis medžiagomis galima atlikti perio ­
diškai ir juos darant b ūtų užtikrinama, kad bandymo protokolas ir bandymo 
sąlygos būtų patikimos. Etalonin ės toksiškos medžiagos, tinkamos naudoti 
atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymus ir patvirtinimo tyrimus: 
lindanas, trifluralinas, pentachlorfenolis, kadmio chloridas ir kalio chloridas 
(1) (2) (5) (6) (13).  
BANDYMO VALIDUMAS  
10. Bandymas laikomas validuotu, jeigu taikomos šios s ąlygos:  
— bandymo pabaigoje lerv ų išsinėrimas kontroliniuose bandiniuose turi 
būti ne mažesnis negu 70 %; (1) (6),  
— C. riparius  ir C. yoshimatsui  iš kontrolini ų indų suaugėliais turėtų tapti 
12–23 dienomis po lerv ų įleidimo į indus;  C. tentans , šis laikotarpis turi 
būti 20–65 dienos,  
— bandymo pabaigoje pH vert ė ir ištirpusio deguonies koncentracija tur ėtų 
būti matuojama kiekviename inde; deguonies koncentracijos vert ė esant 
naudojamai temperat ūrai turėtų būti bent 60 % soties ore vert ės ir pavir­ 
šinio vandens pH vert ė visuose bandymo induose tur ėtų atitikti 6–9 
intervalą, 
— vandens temperat ūra neturėtų skirtis daugiau negu ± 1,0 °C. Vandens 
temperatūrą galima reguliuoti naudojant izotermin ę patalpą ir šiuo atveju 
patalpos temperat ūra turėtų būti patvirtinama atitinkamu laiko intervalu.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Bandymo indai  
11. Tyrimas atliekamas naudojant 600 ml laboratorines stiklines (skersmuo 
8 cm). Leidžiama rinktis kitus indus, ta čiau juos naudojant tur ėtų būti užtik­
rinamas tinkamas paviršinio vandens ir nuos ėdų storis. Nuos ėdų paviršiaus 
plotas tur ėtų būti toks, kad vienai lervai tekt ų 2–3 cm  2 . Nuosėdų storio ir 
paviršinio vandens sluoksnio storio santykis tur ėtų būti 1:4. Bandymo indai 
ir kiti įrenginiai, kurie liesis su bandymo sistema, tur ėtų būti vien iš stiklo ar 
kitos cheminiu atžvilgiu neutralios medžiagos (pvz., teflono).  
Rūšių pasirinkimas  
12. Renkantis atliekant bandym ą naudojam ą rūšį pirmenyb ė teikiama  Chiro­
nomus riparius . Taip pat leidžiama naudoti  Chironomus tentans , tačiau 
juos sunkiau priži ūrėti ir jiems b ūtinas ilgesnis bandymo laikotarpis. Be 
to, leidžiama naudoti  Chironomus yohimatsui . Su  Chironomus riparius  
susiję kultūrų auginimo metodai aprašyti 2 pried ėlyje. Taip pat pateikiama 
informacija apie kit ų rūšių, t. y.  Chironomus tentans  (4) ir  Chironomus 
yoshimatsui  (11), kult ūrų auginimo s ąlygas. Rūšies tapatyb ės nustatymas 
turi būti patvirtinamas prieš bandym ą, tačiau patvirtinimas n ėra būtinas 
prieš kiekvien ą bandym ą, jeigu organizmas paimtas iš vietoje išaugintos 
kultūros. 
Nuosėdos 
13. Pirmenyb ė teikiama pasiruoštoms nuos ėdoms (jos dar vadinamos pertvarky ­
tomis, dirbtin ėmis ar sintetin ėmis nuos ėdomis). Ta čiau jeigu naudojamos 
natūralios nuos ėdos, turėtų būti nurodomos j ų charakteristikos (bent pH, 
organinės anglies kiekis, kit ų parametr ų apibrėžtis, pvz., C/N santykis, ir 
taip pat rekomenduojama pateikti granuliometrin ę sudėtį) ir nuosėdose neturi 
būti jokių teršalų bei kitų organizm ų, kurie gal ėtų konkuruoti su chirono ­
midais ar juos vartoti. Taip pat rekomenduojama, kad prieš nuos ėdas prade ­
dant naudoti toksiškumo bandymui su chironomidais, nat ūralios nuos ėdos 
kondicionuojamos septynias dienas tomis pa čiomis sąlygomis, kurios 
taikomos kitam bandymui. Atliekant š į bandymą (1) (15) (16) rekomenduo ­
jama naudoti iš dirbtinio dirvožemio, kuris naudojamas taikant bandymo 
metodą C.8 (14), pasiruoštas sintetines nuos ėdas: 
a) 4–5 % durpi ų (sausoji mas ė): pH vert ė kiek įmanoma turi b ūti 5,5–6,0; 
privaloma naudoti smulkiai sumaltus (daleli ų dydis ≤ 1 mm) durpi ų 
miltelius; jos turi b ūti džiovintos tik ore;  
b) 20 % (sausoji mas ė) kaolino molio (pageidautina, kad kaolinito jame 
būtų daugiau negu 30 %);  
c) 75–76 % (sausoji mas ė) kvarcinio sm ėlio (smulkusis sm ėlis turėtų suda­
ryti didžiausi ą dalį, daugiau negu 50 % daleli ų dydis 50–200 μm); 
d) įpilama dejonizuoto vandens, kad galutinio mišinio dr ėgnumas b ūtų 
30—50 %;  
e) įdedama chemijos poži ūriu gryno kalcio karbonato (CaCO  3 ), kad galu ­
tinio nuos ėdų mišinio pH vert ė būtų 7,0 ± 0,5; galutinio mišinio sud ėtyje 
turėtų būti 2 % (± 0,5 %) organin ės anglies ir jos kiekis koreguojamas 
atitinkamais durpi ų ir smėlio kiekiais atsižvelgiant į a–c.  
14. Turėtų būti žinomas durpi ų, kaolino molio ir sm ėlio gavimo šaltinis. 
Nuosėdų sudedamosios dalys tur ėtų būti patikrinamos, ar jose n ėra chemin ės 
taršos pėdsakų (pvz., sunki ųjų metalų, chlororganini ų komponent ų, fosforor ­
ganinių komponent ų ir t. t.). Sintetini ų nuosėdų pasiruošimo pavyzdys apra ­ 
šytas 3 pried ėlyje. Taip pat leidžiama maišyti saus ąsias sudedam ąsias dalis, 
jeigu įmanoma įrodyti, kad užpylus paviršinio vandens n ėra atskiriamos 
nuosėdų sudedamosios dalys (pvz., neima pl ūduriuoti kietosios durpi ų 
dalelės) ir kad durp ės ar nuos ėdos yra kondicionuotos pagal reikalavimus.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Vanduo  
15. Kaip bandymo vanden į leidžiama rinktis bet kok į vandenį, atitinkant į 2 ir 4 
priedėliuose išvardytas skiedimui tinkamo vandens chemines savybes. Bet 
kokį tinkamą vandenį, natūralų vandenį (paviršin į ar gruntin į), regeneruot ą 
vandenį (žr. 2 pried ėlį) arba vandentiekio vanden į, iš kurio pašalintas 
chloras, leidžiama rinktis kaip kult ūros auginimo vanden į ir bandymo 
vandenį, jeigu chironomidai jame be streso požymi ų išgyvena kult ūros 
veisimo ir bandymo laikotarpiu. Bandymo vandens pH vert ė pradedant 
bandymą turėtų būti 6–9, o bendrasis kietumas ne didesnis negu 400 mg/l 
kaip CaCO  3 . Tačiau jeigu galima daryti prielaid ą, kad vandens kietumo 
jonai gali s ąveikauti su bandom ąja chemine medžiaga, tur ėtų būti naudo­
jamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis 
Elendt Medium M4). Atliekant tyrim ą turėtų būti naudojamas to paties tipo 
vanduo. 4 pried ėlyje išvardyt ų vandens kokyb ės charakteristik ų vertės turėtų 
būti matuojamos ne re čiau negu du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad 
šios charakteristikos yra gerokai pakitusios.  
Pradiniai tirpalai. Nuos ėdos su įterpta bandom ąja chemine medžiaga  
16. Pasirinktos koncentracijos nuos ėdos su įterpta bandom ąja chemine medžiaga 
paprastai pasiruošiamos bandomosios chemin ės medžiagos tirpalo įpilant 
tiesiogiai į nuosėdas. Bandomosios chemin ės medžiagos pradinis tirpalas 
ištirpinamas dejonizuotame vandenyje ir maišymo įtaisu, tiekimo maišikliu 
ar rankomis maišomas su sintetin ėmis nuos ėdomis. Jeigu bandomoji 
cheminė medžiaga sunkiai tirpsta vandenyje, j ą galima ištirpinti kuo mažes ­
niame tinkamo organinio tirpiklio kiekyje (pvz., heksane, acetone arba chlo ­
roforme). Šis tirpalas maišomas su 10 g smulkaus kvarco sm ėlio vienam 
bandymo indui. Palaukiama, kol tirpiklis išgaruoja ir jis turi b ūti visiškai 
pašalinamas iš sm ėlio; tada bandymo laboratorin ėje stiklin ėje smėlis 
maišomas su reikiamu nuos ėdų kiekiu. Norint bandom ąją cheminę medžiagą 
soliubilizuoti, disperguoti ar emulguoti leidžiama naudoti tik lengvai garuo ­
jančias medžiagas. Atkreiptinas d ėmesys, kad ruošiantis nuos ėdas turi b ūti 
atsižvelgiama į bandomoje chemin ėje medžiagoje ir sm ėlio mišinyje esant į 
smėlį (t. y. nuos ėdos turėtų būti pasiruošiamos naudojant mažiau sm ėlio). 
Privaloma pasir ūpinti, kad į nuosėdas įterpiama bandomoji chemin ė 
medžiaga b ūtų kruopščiai ir tolygiai paskirstoma nuos ėdose. Jeigu b ūtina, 
galima analizuoti ėminio dal į siekiant nustatyti vienalytiškum ą. 
BANDYMO PLANAS  
17. Sudarant bandymo plan ą pasirenkamos bandymo koncentracijos ir j ų 
paskirstymas, kiekvienos koncentracijos ind ų skaičius ir lerv ų skaičius 
inde. Pateikiamas EC taško nustatymo, NOEC nustatymo ir ribos bandymo 
atlikimo aprašymas.  
Regresin ės analizės planas  
18. Bandymui naudotos koncentracijos b ūtinai turi apr ėpti poveikio koncentra ­
ciją (pvz., EC  15 , EC  50 ) ir dominan čio medžiagos poveikio koncentracijos 
verčių diapazon ą. Apskritai tikslumo ir ypa č validumo vertes, kurias naudo ­
jant galima įvertinti poveikio koncentracijas (EC  x ), įmanoma patikslinti, 
jeigu poveikio koncentracijos vert ės atitinka bandom ųjų koncentracij ų inter­
valą. Nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai mažesni ų negu mažiausioji teigiamoji 
koncentracija arba didesni ų negu didžiausioji koncentracija ver čių. Pradinis 
intervalo nustatymo bandymas praver čia renkantis naudotin ų koncentracij ų 
intervalą (žr. 27 pastraip ą). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Jeigu turi b ūti nustatomos poveikio koncentracijos (EC  x ), turėtų būti atlie­
kami bent penki bandymai naudojant kiekvien ą koncentracijos vert ę ir trys 
kartotiniai bandymai. Bet kuriuo atveju rekomenduojama naudoti pakan ­
kamą bandomųjų koncentracij ų skaičių, kad modelis b ūtų reikiamai įverti­
namas. Koncentracij ų koeficiento vert ė neturėtų būti didesnė negu 2 (išimt į 
leidžiama taikyti tais atvejais, jeigu doz ės ir reakcijos santykio kreiv ė turi 
nuolaidų statumą). Kartotini ų ėminių skaičių atliekant kiekvien ą apdorojim ą 
galima mažinti, jeigu padid ėja skirting ą atsaką sukelian čių bandom ųjų 
koncentracij ų skaičius. Didinant kartotini ų ėminių skaičių arba mažinant 
bandomųjų koncentracij ų intervalo ribas b ūtų taikomi siauresni bandymo 
pasikliovimo intervalai. Papildomi kartotiniai ėminiai būtini tuo atveju, 
jeigu reikia įvertinti 10 par ų lervų išgyvenim ą ir augim ą. 
NOEC/LOEC įvertinimo planas  
20. Jeigu reikia įvertinti LOEC arba NOEC, tur ėtų būti naudojamos ne mažiau 
negu keturi ų kartotini ų bandym ų penkios bandomosios koncentracijos ir 
koncentracij ų koeficiento vert ė ne turėtų viršyti 2. Kartotini ų bandymų skai­ 
čius turėtų būti pakankamas siekiant užtikrinti reikiam ą statistinę galią, kad 
būtų aptinkamas 20 % skirtumas nuo kontrolinio 5 % reikšmingumo 
lygmens (p = 0,05). Nustatant vystymosi greit į paprastai naudojama disper ­
sinė analizė (ANOVA), pvz., Dunnett bandymas ir Williams bandymas (17) 
(18) (19) (20). Nustatant išskridimo norm ą galima naudoti 
Cochran-Armitage, Fisher (su Bonferroni pataisa) arba Mantel-Haentzal 
bandymus.  
Ribinis bandymas  
21. Ribin į bandymą galima atlikti (viena bandomoji koncentracija ir kontrolinis 
ėminys), jeigu darant pradin į intervalo nustatymo bandym ą nebuvo nustatyta 
jokių poveikių. Ribinio bandymo tikslas – atlikti bandym ą naudojant gan ė­
tinai didel ę koncentracij ą, kad sprendim ą priimantys asmenys gal ėtų išskirti 
galimą toksinį bandomosios chemin ės medžiagos poveik į ir kad būtų nusta­
tyta ribin ė koncentracijos vert ė, kuri jokiu b ūdu neturi b ūti naudojama. 
Rekomenduojama 1 000 mg/kg (sausoji mas ė). Paprastai poveikiui bando ­
mąja medžiaga ir kontroliniam ėminiui būtini ne mažiau negu šeši pakarto ­
tiniai bandymai. Turi b ūti įrodoma pakankama statistin ė galia aptikti 20 % 
skirtumą nuo kontrolin ės vertės esant 5 % reikšmingumo lygiui (p = 0,05). 
Jeigu atsakas nurodomas metriniais vienetais (vystymosi greitis ir mas ė), 
t-bandymas yra tinkamas statistinis metodas, jeigu duomenys atitinka šio bandymo reikalavimus (atitiktis, vienalyt ės dispersijos). Jeigu ši ų reikala­
vimų nesilaikoma, leidžiama naudoti nelygiavert ės dispersijos t-bandym ą 
arba neparametrin į bandym ą, pvz., Wilcoxon-Mann-Whithey bandym
ą. 
Nustatant išsiritimo norm ą atliktinas Fisher bandymas.  
PROCED ŪRA 
Poveikio s ąlygos  
Nuosėdų su įterpta bandom ąja chemine medžiaga ir vandens sistemos pasi ­
ruošimas  
22. Bandomosios chemin ės medžiagos įtepimo proced ūra aprašyta bandymo 
metode C.8: Nustatant toksiškum ą sliekams rekomenduojama taikyti bando ­
mąją medžiag ą (14). Nuos ėdos su įterpta bandom ąja medžiaga dedamos į 
indus ir užpilamos paviršiniu vandeniu, kad b ūtų užtikrintas nuos ėdų ir 
vandens santykis 1:4 (žr. 11 ir 15 pastraipas). Nuos ėdų sluoksnio storis 
turėtų būti 1,5—3 cm. Kad į vandens t ūrį pilant bandymo vanden į nuosėdų 
sudedamosios dalys neatsiskirt ų ir kietosios dalel ės vėl nebūtų suspenduo ­
jamos skystyje, nuos ėdas leidžiama uždengti plastiko disku, kol vanduo 
pilamas ant nuos ėdų, ir vėliau diskas nedelsiant nuimamas. Taip pat 
leidžiama naudoti kitus įtaisus.  
23. Bandymo indai tur ėtų būti uždengiami (pvz., stiklo plokšt ėmis) Jeigu b ūtina, 
atliekant tyrim ą leidžiama įpilti vandens, kad b ūtų užtikrinamas pradinis 
vandens t ūris ir kompensuojama išgaruojanti vandens dalis. Papildomai 
turėtų būti pilamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo, kad nesusidaryt ų 
druskos.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilizavimas  
24. Pasiruošus nuos ėdas su įterpta bandom ąja chemine medžiaga ir paviršiniu 
vandeniu rekomenduojama palaukti, kol bandomoji chemin ė medžiaga iš 
hidratuotos faz ės pereis į nuosėdas (3) (4) (6) (13). Šis procesas tur ėtų 
būti visų pirma atliekamas laikantis darant bandym ą taikomų temperat ūros 
ir aeracijos s ąlygų. Nuosėdoms ir cheminei medžiagai b ūdinga tam tikra 
pusiausvyros nusistov ėjimo trukm ė bei ji gali apr ėpti kelias valandas ar 
dienas ir retais atvejais ne daugiau negu kelias savaites (4–5 savaites). 
Šiuo atveju b ūtų pakankamai laiko biologiškai suskaidyti daugel į cheminių 
medžiagų ir pusiausvyra nenusistov ėtų, tačiau rekomenduojama rinktis 48 
val. pusiausvyros nusistov ėjimo laikotarp į. Kito šio pusiausvyros nusistov ė­
jimo laikotarpio pabaigoje tur ėtų būti matuojama bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija paviršiniame vandenyje, por ų vandenyje ir nuos ė­
dose, bent jau didžiausios koncentracijos ir mažiausios koncentracijos (žr. 38 pastraipą). Naudojantis šiais bandomosios chemin ės medžiagos analiziniais 
nustatymais galima apskai čiuoti mas ės balansą ir išreikšti rezultatus atsiž ­
velgiant 
į išmatuotas koncentracijas.  
Bandomųjų organizm ų pridėjimas  
25. Keturias ar penkias dienas prieš bandom ųjų organizm ų įdėjimą į bandymo 
indus, kiaušin ėlių masė turėtų būti paimama iš s ėjimo kultūrų ir sudedama į 
mažus indus auginimo terp ėje. Leidžiama naudoti iš kamienin ės kultūros 
gautą terpę arba švieži ą pasiruošt ą terpę. Jeigu naudojama pastaroji, į augi­
nimo terp ę turėtų būti įdedamas mažas kiekis pašaro, pvz., žali ųjų dumblių 
ir (arba) įlašinami keli lašeliai smulkiai sumalt ų žuvų maisto gabal ėlių 
suspensijos filtrato (žr. 2 pried ėlį). Turėtų būti naudojamos tik neseniai 
padėtų kiaušinėlių masės. Paprastai lervos ima ristis po keli ų dienų nuo 
kiaušinėlių padėjimo ( Chironomus riparius  20 °C temperat ūroje išsirita 
per 2–3 dienas,  Chironomus tentans  23 °C temperat ūroje išsirita per 1–4 
dienas ir  Chironomus yoshimatui  25 °C temperat ūroje) ir lervos augdamos 
pereina keturias stadijas, iš kuri ų kiekviena trunka 4–8 dienas. Atliekant 
bandymą turėtų būti naudojamos pirmosios stadijos lervos (2–3 arba 1–4 
dienų po išsiritimo). Mašal ų stadiją įmanoma nustatyti pagal galvut ės apval­
kalo plotį (6). 
26. Pirmos stadijos dvidešimt lerv ų buka pipete atsitiktinai paskirstoma kiek ­
vienam bandymo indui, kuriame yra nuos ėdų su įterpta bandom ąja chemine 
medžiaga ir vandens. Vandens aeravimas turi b ūti nutraukiamas, kol lervos 
dedamos į bandymo ind ą, ir ši būsena išlaikoma dar 24 valandas po lerv ų 
įdėjimo (žr. 25 ir 32 pastraipas). Pagal taikom ą bandymo plan ą (žr. 19 ir 20 
pastraipas) kiekviena koncentracija veikiama ne mažiau negu 60 lerv ų, jeigu 
nustatomas ES taškas, arba 80 lerv ų, jeigu apibr ėžiama NOEC.  
Bandomosios koncentracijos  
27. Intervalo nustatymo bandymas gali b ūti naudingas siekiant apibr ėžti darant 
galutinį bandym ą pasirinktin ų koncentracij ų intervalą. Šiuo tikslu naudo ­
jamos labai besiskirian čių bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ų 
serijos. Siekiant užtikrinti galutiniam bandymui naudojam ų chironomid ų 
vienodą paviršiaus tankum ą, jie veikiami kiekviena bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija tol, kol įvertinamos atitinkamos bandomosios 
koncentracijos ir kartotiniai ėminiai nėra reikalingi.  
28. Atliekant galutin į bandymą naudojamos bandomosios koncentracijos pasi ­
renkamos atsižvelgiant į intervalo nustatymo bandymo rezultat ą. Turėtų būti 
naudojamos ne mažiau negu penkios koncentracijos kaip aprašyta 18–20 
pastraipose.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Kontroliniai ėminiai  
29. Kontrolini ų ėminių indai be jokios bandomosios chemin ės medžiagos, ta čiau 
su nuosėdomis, tur ėtų būti naudojami atliekant bandym ą su atitinkamu skai ­ 
čiumi kartotini ų ėminių (žr. 19–20 pastraip ą). Jeigu taikant bandom ąją 
cheminę medžiag ą naudotas tirpiklis (žr. 16 pastraip ą), turėtų būti įdedamas 
tirpiklio kontrolinis ėminys.  
Bandymo sistema  
30. Naudojamos statin ės sistemos. Išskirtiniais atvejais leidžiama naudoti pusiau 
statines ar dinamines sistemas su tr ūkiuoju ar tolygiu paviršinio vandens 
atnaujinimu, pvz., jeigu vandens kokyb ės reikalavimai neatitinka taikom ų 
bandomajam organizmui ar daro poveik į cheminei pusiausvyrai (pvz., ištir ­
pusio deguonies lygiai pernelyg sumaž ėja, labai padid ėja šalinimo produkt ų 
koncentracija arba iš nuos ėdų ima sunktis mineral ų skystis ir daro poveik į 
pH ir (arba) vandens kietumo vert ėms). Tačiau paprastai pakanka kit ų pavir­ 
šinio vandens kokyb ės gerinimo metod ų, pvz., aeracijos, ir jiems teiktina 
pirmenyb ė. 
Pašaras  
31. Lervas b ūtina maitinti; pageidautina kiekvien ą dieną ar bent tris kartus per 
savaitę. Per pirm ąsias 10 par ų jaunoms lervoms per dien ą turėtų pakakti 
0,25–0,5 mg ( C. yoshimatui  lervoms 0,35–0,5 mg) žuv ų maisto (vandens 
suspensija arba smulkiai sumaltas maistas, pvz., Tetra-Min arba Tetra-Phyll, 
išsami informacija pateikta 2 pried ėlyje). Senesn ėms lervoms pašaro reikia 
šiek tiek daugiau: likusiai bandymo daliai kiekvien ą dieną lervoms tur ėtų 
pakakti 0,5–1 mg. Pašaro kiekis tur ėtų būti mažinamas vis ų apdorojim ų 
atvejais ir kontrolin ėje grupėje, jeigu nustatomas grybelio atsiradimas arba 
jeigu aptinkama, kad kontrolin ės grupės gyvūnai gaišta. Jeigu grybelio 
augimo nepavyksta sustabdyti, bandymas turi b ūti pakartotas. Jeigu 
bandymai atliekami su lengvai absorbuojamomis chemin ėmis medžiagomis 
(pvz., kai K  ow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuos ėdomis susijusiomis 
cheminėmis medžiagomis, išgyvenimui ir nat ūraliam augimui b ūtiną pašaro 
kiekį galima įterpti į sintetines nuos ėdas prieš stabilizavimo laikotarp į. Šiuo 
tikslu turi b ūti naudojamas ne žuv ų maistas, o augalinis pašaras, pvz., 
pridedama 0,5 % (sausoji mas ė) smulkiai sumalt ų lapų, pvz., didžiosios 
dilgėlės (Urtica dioeca ), baltojo šilkmedžio ( Morus alba ), persinio dobilo 
(Trifolium repens ), daržinio špinato ( Spinacia oleracea ) arba galima naudoti 
kitą augalinę medžiag ą (Cerophyl  arba alfa celiulioz ę). 
Inkubacijos s ąlygos  
32. Rekomenduojama vis ų pirma 24 valandas po lerv ų įdėjimo nestipriai aeruoti 
bandymo ind ų paviršin į vandenį ir vėliau aeruojama per vis ą bandymo 
atlikimo trukm ę (privaloma steb ėti, ar ištirpusio deguonies koncentracijos 
vertė nėra mažesn ė negu 60 % soties ore vert ės (ASV)). Aeruojant naudo ­
jama stiklin ė Pastero pipet ė, pritvirtinta 2–3 cm virš nuos ėdų sluoksnio (t. y. 
vienas ar keli burbulai per sek.). Darant bandymus su lakiosiomis chemi ­
nėmis medžiagomis galima nuspr ęsti nuosėdų–vandens sistemos neaeruoti.  
33. Atliekant bandym ą išlaikoma pastovi 20 °C (± 2 °C) temperat ūra. Atliekant 
bandymą su C. tentans  ir C. yoshimatui  atitinkamai rekomenduojama pasi ­
rinkti 25 °C (± 2 °C) temperat ūrą. Naudojamas 16 val. apšvietimo laiko ­
tarpis; šviesos intensyvumo vert ės turėtų būti 500–1 000 liuks ų. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Poveikio trukm ė 
34. Poveikis prasideda lervas įdėjus į indus su bandom ąją chemine medžiaga ir 
kontrolini ų ėminių indus. Jeigu naudojami  C. riparius  ir C. yoshimatsui , 
poveikio trukm ė yra 28 dienos, o kai pasirenkama  C. tentans  – 65 dienos. 
Jeigu mašalai atsiranda anks čiau, bandym ą galima nutraukti ne anks čiau 
negu po penki ų dienų atsiradus paskutiniam kontrolin ės grupės suaugu ­
siajam.  
Stebėjimai  
Lervų išsinėrimas  
35. Nustatoma vystymosi trukm ė ir bendras vis ų iki galo išsin ėrusių mašalų 
patinų ir patelių skaičius. Patin ėliai lengviau atpaž įstami žiūrint į jų plunks­
niškus čiuptuvėlius. 
36. Bandymo indai tur ėtų būti stebimi bent tris kartus per savait ę siekiant 
nustatyti bet koki ą neįprastą veikseną (pvz., nuos ėdų susidarym ą, neįprastą 
plūduriavimą) palyginti su kontroliniai indais. Numatomo lerv ų išsinėrimo 
laikotarpiu b ūtina skaičiuoti kasdien ą atsirandan čius mašalus. Kiekvien ą 
dieną registruojami visi atsirad ę mašalai ir nurodoma j ų lytis. Nusta čius 
tapatybę mašalai pašalinami iš ind ų. Turėtų būti registruojamos visos prie 
užbaigiant bandym ą padėtos kiaušin ėlių masės ir po to pašalinamos, kad 
lervos pakartotinai neb ūtų įdėtos į nuosėdas. Taip pat registruojamas 
matomų lėliukų skaičius, kurios n ėra išsiritusios. Išsinerian čių lervų skaičia­
vimo gair ės pateiktos 5 pried ėlyje. 
Augimas ir išgyvenimas  
37. Jeigu privaloma pateikti duomenis apie 10 par ų lervų išgyvenim ą ir augim ą, 
iš pradžių turi būti įtraukiami papildomi bandymo indai, kad juos b ūtų 
galima naudoti v ėliau. Šių papildom ų indų nuosėdos sijojamos 250 μm 
sietu siekiant surinkti lervas. Nejudumas ar nepakankamas atsakas į mecha­
ninius dirgiklius yra gaišimo kriterijai. Neatsigavusios lervos taip pat tur ėtų 
būti laikomos nugaišusiomis (bandymo pradžioje nugaišusios lervos gal ėjo 
būti žuvusios nuo mikrob ų). Nustatoma bandymo inde išgyvenusi ų lervų 
sausoji mas ė (be pelen ų) ir apskai čiuojama vidutin ė pavienė indo sausoji 
masė. Tikslinga nustatyti, kurios stadijos yra išgyvenusi lerva; šiuo tikslu 
galima matuoti kiekvieno individo galvos apvalkalo plot į. 
Analiziniai matavimai  
Bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija  
38. Prieš pradedant bandym ą (t. y. prieš įdedant lervas) bent iš kiekvieno apdo ­
rojimo indo imami biri ųjų nuosėdų ėminiai ir į juos atsižvelgiant bei naudo ­
jant analizin į nustatym ą įvertinama bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracija nuos ėdose. Bandymo pradžioje ir pabaigoje rekomenduojama 
analizuoti bent paviršinio vandens, por ų vandens ir nuos ėdų ėminius (žr. 24 
pastraipą) esant didžiausiai koncentracijai ir mažesnei koncentracijai. Nusta ­ 
čius bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą gaunama informacijos 
apie bandomosios chemin ės medžiagos elgsen ą ir (arba) pasiskirstym ą 
vandens–nuos ėdų sistemoje.  
39. Jeigu atliekami tarpiniai matavimai (pvz., 7 dien ą) ir jeigu analizei atlikti 
reikalingi dideli ėminiai, kuriuos pa ėmus bandymo sistemai b ūtų padarytas 
poveikis, analiziniai nustatymai tur ėtų būti atliekami naudojant iš panašiai 
apdorotų papildom ų bandymo ind ų paimtus ėminius (įskaitant bandom ųjų 
organizm ų buvimą), tačiau biologiniam steb ėjimui nenaudot ų indų. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Siekiant izoliuoti laisv ąjį vandenį rekomenduojama naudoti 30 min. trukm ės 
centrifugavimo proced ūrą, pvz., 10 000 g ir 4 °C. Ta čiau jeigu įrodoma, kad 
bandomosios chemin ės medžiagos filtrai neadsorbuoja, taip pat galima 
rinktis filtravim ą. Tam tikrais atvejais gali neb ūti įmanoma analizuoti por ų 
vandens koncentracij ų, nes ėminys yra pernelyg mažas.  
Fiziniai ir cheminiai parametrai  
41. Tinkamu b ūdu turėtų būti matuojama bandymo ind ų pH ir temperat ūros 
vertės (žr. 10 pastraip ą). Bandymo pradžioje ir jo pabaigoje tur ėtų būti 
matuojama kontrolini ų ėminių ir vieno bandymo indo kietumo ir amoniako 
vertės esant didžiausiai koncentracijai.  
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Rezultatų apdorojimas  
42. Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios chemin ės medžiagos poveik į 
mašalų patelių ir patinėlių vystymosi grei čiui ir bendram j ų skaičiui, arba, 
jeigu atliekamas 10 par ų bandymas, poveik į lervų išgyvenimui ir j ų masei. 
Jeigu neturima duomen ų apie statistiniu poži ūriu skirting ą lyčių jautrumą, 
atliekant statistin ę analizę patinėlių ir pateli ų rezultatus galima sujungti. 
Apie lyčių jautrumo skirtumus galima spr ęsti naudojant statistines prie ­
mones, pvz., atliekant χ 2 -r × 2 lentel ės bandym ą. Jeigu reikia, po 10 par ų 
turi būti nustatomas lerv ų išgyvenimas ir vidutin ė kiekvieno indo sausoji 
masė. 
43. Visų pirmiausiai remiantis bandymo pradžioje (žr. 38 pastraip ą) išmatuo ­
tomis nuos ėdų koncentracijomis apskai čiuojamos saus ąja mase pagr įstos ir 
išreikštos poveikio koncentracijos.  
44. Indo statistinius duomenis, norint apskai čiuoti EC  50 arba bet kokio kito EC  x 
taškinį įvertį, leidžiama naudoti kaip patikimus kartotinius duomenis. 
Apskaičiuojant kiekvieno EC  x pasikliovimo interval ą turėtų būti atsižvel ­
giama į kiekvieno indo skirtingum ą arba būti įrodoma, kad šis kintamumas 
yra toks mažas ir kad jo galima nepaisyti. Jeigu modeliui taikomas mažiau ­
siųjų kvadratų metodas, kiekvieno indo statistikos duomenims taikoma 
transformacija siekiant pagerinti dispersijos vienalytiškum ą. Tačiau EC  x 
vertės turėtų būti apskaičiuojamos atsak ą transformavus į pradinę vertę. 
45. Jeigu taikant statistin ę analizę siekiama apibr ėžti NOEC/LOEC ir šiuo tikslu 
tikrinama hipotez ė, turi būti atsižvelgiama į su indais susijus į skirtingum ą, 
pvz., įterpiant ANOVA. Antraip jeigu susiklosto situacijos, kad įprastos 
ANOVA prielaidos gali b ūti pažeidžiamos, galima naudoti išsamesnius 
bandymus (21).  
Išsinėrimo santykis  
46. Išsin ėrimo santykiai yra kiekybiniai duomenys ir juos galima analizuoti 
atliekant Cochran-Armitage bandym ą, taikom ą mažėjimo tvarka, jeigu 
laikoma, kad atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir šie duomenys atitinka 
minėtą prielaid ą. Jeigu ne, šiuo atveju leidžiama rinktis Fisher arba 
Mantel-Haentzal bandym ą su pakoreguotomis pagal Bonferroni-Holm p 
vertėmis. Jeigu turima įrodymų, kad naudojant t ą pačią koncentracij ą karto­
tinių ėminių kintamumas yra didesnis negu b ūtų galima nustatyti atsižvel ­
giant į binomin į skirstinį (dažnai vadinam ą „pertekline dispersija“), šiuo 
atveju tur ėtų būti pasirenkamas (21) pasi ūlytas išsamus Cochran-Armitage 
arba Fisher bandymas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Nustatoma inde išsiritusi ų mašalų suma ne ir dalinama iš įdėtų lervų skai­ 
čiaus na:  
ER ¼ n e 
n a 
kur: 
ER = išsin ėrimo santykis  
n e = iš indo išsin ėrusių mašalų skaičius 
n a = į indą įdėtų lervų skaičius 
47. Jeigu ėminiai yra dideli ir jeigu nustatoma perteklin ė dispersija, šiuo atveju 
galima rinktis kit ą alternatyv ą, t. y. išsin ėrimo santyk į laikyti nenutr ūksta­
muoju atsaku ir rinktis Williamso bandym ą, jeigu daroma prielaida, kad 
atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir atitiksi ąs šiuos ER duomenis. Jeigu 
monotoniškumas n ėra užtikrinamas, pirmenyb ė teiktina Duneto bandymui. 
Didelio ėminio dydis šiuo atveju apibr ėžiamas išsin ėrusių mašalų ir neišsi­
nėrusių mašalų skaičiumi, kuris abiem atvejais viršija penkis, atsižvelgiant į 
kartotinį ėminį (indą). 
48. Norint taikyti ANOVA metod ų vertes, ER vert ės pirmiausiai tur ėtų būti 
transformuojamos naudojant arksinuso kvadratin ės šaknies transformacij ą 
arba Tukey-Freeman transformacij ą siekiant gauti apytiksl į įprastą skirstinį 
ir suvienodinti dispersijas. Leidžiama naudoti Cochran-Armitage, Fisherio (Bonferroni) arba Mantel-Haentzal bandymus, jeigu taikomi absoliutieji dažniai. Arcsin-sqrt transformacija taikoma pasirenkant ER vert ės kvadra­
tinės šaknies arksinus ą (sin
 –1 ). 
49. Išsin ėrimo santyki ų EC  x vertės apskaičiuojamos naudojant regresijos analiz ę 
(arba, pvz., probit (22), logit, Weitbull, atitinkam ą komercin ę programin ę 
įrangą ir t. t.). Jeigu regresijos analiz ė nepavyksta (pvz., jeigu t ėra mažiau 
negu du daliniai atsakai), naudojami kiti neparametriniai metodai, pvz., slankiojo vidurkio metodas ar interpoliacijos metodas.
 
Vystymosi greitis  
50. Vidutin ė vystymosi trukm ė yra vidutinis laikotarpis nuo lerv ų įdėjimo 
(nulinė bandymo diena) ir iki eksperimentin ės mašalų kohortos išsin ėrimo. 
(Apskaičiuojant tikr ąją vystymosi trukm ę turėtų būti atsižvelgiama į lervų 
amžių, kai jos buvo įdedamos). Vystymosi greitis yra atvirkštinis dydis 
vystymosi trukm ės atžvilgiu (vienetas: 1/diena) ir atitinka t ą lervos vysty ­
mosi atkarp ą, kuris vyksta per vien ą dieną. Vystymosi grei čiui, palyginti su 
šių nuosėdų toksiškumo tyrim ų įvertinimu, teikiama pirmenyb ė, nes jo 
dispersija yra mažesn ė, ir jis vienalytiškesnis bei glaudžiau atitinka įprastą 
pasiskirstym ą, jeigu lyginama su vystymosi trukme. Vadinasi, leidžiama 
veikiau rinktis patikim ą parametrin į bandym ą su vystymosi grei čiu negu 
su vystymosi trukme. Vystymosi grei čio kaip nenutr ūkstamo atsako EC  x 
vertes galima įvertinti naudojant regresijos analiz ę (pvz., (23), (24)).  
51. Atliekant šiuos statistinius tyrimus laikoma, kad tikrinimo x dien ą pastebėtas 
mašalų skaičius išsinėrė per vidutin į laiko interval ą nuo x dienos iki x-1 
dienos (l = tikrinimo intervalo trukm ė (paprastai viena diena)). Vienam indui 
taikoma vidutin ė vystymosi grei čio vertė (x) apskaičiuojama pagal ši ą lygtį: 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
kur: 
x: indui taikoma vidutin ė vystymosi grei čio vertė 
i: tikrinimo intervalo indeksas  
m: didžiausias tikrinimo interval ų skaičius 
ƒ i : per tikrinimo interval ą i išsinėrusių mašalų skaičius 
n e : bendras eksperimento pabaigoje išsin ėrusių mašalų skaičius (= P ƒ i 
x i : per interval ą i išsinėrusių mašalų vystymosi greitis  
x i ¼ 1 Í 
diena  i Ä 1 i 
2 Î 
kur: 
diena  i : tikrinimo diena (diena po poveikio)  
l i : tikrinimo intervalo i trukm ė (dienos, paprastai 1 diena)  
Bandymo ataskaita  
52. Į bandymo ataskait ą turi būti įtraukiama bent ši informacija:  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— fizinis pob ūdis ir, jeigu reikia, fizin ės bei chemin ės savybės (tirpumas 
vandenyje, gar ų slėgis, pasiskirstymo dirvoje koeficientas (ar nuos ėdose, 
jeigu žinomas), stabilumas vandenyje ir t. t.),  
— chemin ės tapatyb ės nustatymo duomenys (bendrinis pavadinimas, 
cheminis pavadinimas, strukt ūrinė formulė, CAS numeris ir t. t.), įskai­
tant grynum ą ir analin ės metodas atliekant bandomosios chemin ės 
medžiagos kiekybin į nustatym ą. 
Bandomosios r ūšys: 
— naudojami bandomieji gyv ūnai: rūšis, mokslinis pavadinimas, organizmo 
gavimo šaltinis ir veisimo s ąlygos,  
— informacija apie kiaušin ėlių masės ir lervų tvarkymą, 
— gyvūnų amžius, kai jie buvo įdėti į bandymo indus.  
Bandymo s ąlygos:  
— naudotos nuos ėdos, t. y. nat ūralios ar sintetin ės nuosėdos, 
— jei naudojamos nat ūralios nuos ėdos, nuos ėdų ėminių ėmimo vieta ir jos 
aprašymas, įskaitant, jeigu įmanoma, taršos aprašas; charakteristikos: pH, 
organinės anglies kiekis, C/N santykis ir granuliometrin ė analizė (jeigu 
reikia),  
— sintetini ų nuosėdų pasiruošimas: sudedamosios dalys ir charakteristikos 
(organinės anglies kiekis, pH, dr ėgmė ir t. t. bandymo pradžioje),  
— bandymo vandens pasiruošimas (jeigu naudojamas regeneruotas vanduo) 
ir charakteristikos (deguonies koncentracija, pH. Laidumas, kietumas ir t. 
t. bandymo pradžioje),  
— nuosėdų ir vandens sluoksni ų storis,  
— paviršinio vandens ir por ų vandens t ūris; drėgnųjų nuosėdų masė su 
porų vandeniu ir be jo,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— bandymo indai (medžiaga ir dydis),  
— bandomosios chemin ės medžiagos įterpimo į nuosėdas metodas: 
naudotos bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos, kartotini ų 
ėminių skaičius ir naudoti tirpikliai, jeigu buvo naudoti,  
— nuosėdų—vandens sistemos, į kurią įterpta bandomosios chemin ės 
medžiagos, stabilizavimo pusiausvyros faz ė: trukmė ir sąlygos,  
— inkubacijos s ąlygos: temperat ūra, šviesos ciklas ir intensyvumas, aeracija 
(dažnumas ir intensyvumas),  
— išsami informacija apie maist ą, įskaitant jo tip ą, paruošiam ą, kiekį ir 
maitinimo tvark ą. 
Rezultatai:  
— nominaliosios bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandomosios 
koncentracijos ir vis ų analizių rezultatai siekiant bandymo inde nustatyti 
bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą, 
— vandens kokyb ė bandymo induose, t. y. pH, temperat ūra, ištirp ęs 
deguonis, kietumas ir amoniako kiekis,  
— išgaruojan čio bandymo vandens papildymas, jeigu taikoma,  
— iš kiekvieno indo per dien ą išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius, 
— lervų, kurios inde neišsin ėrė kaip mašalai, skai čius, 
— vidutin ė pavienė lervų sausoji mas ė inde ir tam tikros stadijos lerv ų 
sausoji mas ė inde, jeigu reikia,  
— išsinėrusių mašalų skaičius atliekant tapat ų bandym ą ir bandomoji 
koncentracija (mašal ų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),  
— atliekant tapat ų bandymą išsinėrusių mašalų vidutinis vystymosi greitis ir 
apdorojimo norma (mašal ų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),  
— toksinio poveikio įvertinimai, pvz., ECx (ir susij ę pasikliovimo inter ­
valai), NOEC ir (arba) LOEC bei jiems nustatyti naudoti statistikos 
metodai,  
— rezultat ų aptarimas, įskaitant bet kok į poveikį bandymo rezultatams, 
kuris būtų padarytas nukrypus nuo šio bandymo metodo.  
LITERAT ŪRA 
1. BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.
 
2. Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
 
3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
 
4. ASTM International/E1706–00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; 
Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
 
5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994.
 
7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inverte ­
brates.  
8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9. Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chiro­
nomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10. Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides  
in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
11. Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and SAFEty Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14. Šio priedo bandymo metodas C.8. Toksiškumas sliekams.  
15. Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
16. Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chiro ­
nomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.  
17. Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.  
18. Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482–491.  
19. Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117.
 
20. Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose 
control. Biometrics, 28: 510–531.  
21. Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered 
binary data. Biometrics 48: 577–585.  
22. Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
23. Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.  
24. Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
1 priedėlis 
SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS  
Šiame bandymo metode vartojam ų terminų apibrėžtys:  
Pasiruoštosios nuos ėdos ar regeneruotos, dirbtin ės arba sintetin ės nuosėdos yra 
natūralių nuosėdų fizines sudedam ąsias dalis atitinkan čių medžiag ų mišinys.  
Paviršinis vanduo  – bandymo inde ant nuos ėdų užpiltas vanduo.  
Laisvasis vanduo  ar porų vanduo – ertmes tarp nuos ėdų ir dirvožemio kiet ųjų 
dalelių užpildantis vanduo.  
Nuosėdos su įterpta bandom ąja chemine medžiaga  – nuosėdos, į kurias 
prileista bandomosios chemin ės medžiagos.  
Bandomoji chemin ė medžiaga  – bet kokia naudojant š į bandymo metod ą 
tiriama chemin ė medžiaga ar mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
2 priedėlis 
Rekomendacijos d ėl Chironomus riparius  auginimo  
1. Chironomus  lervas galima auginti kristalizatoriuose ar didel ėse talpyklose. 
Ant talpyklos dugno plonu sluoksniu (5–10 mm storio) paskleidžiamas smulkus kvarco sm ėlis. Taip pat įrodyta (pvz., Merck, Art 8117), kad diato ­
mitas yra tinkamas substratas (pakanka plonesnio sluoksnio, vos keli ų mm 
storio). Po to užpilamas keli ų centimetr ų storio vandens sluoksnis. Jeigu 
reikia, įpilama papildomo vandens, kad b ūtų atkuriamas išgarav ęs kiekis ir 
sustabdomas dži ūvimas. Jeigu reikia, vanden į leidžiama pakeisti. Tur ėtų būti 
užtikrinamas nuosaikus aeravimas. Lerv ų auginimo indai tur ėtų būti laikomi 
tinkamuose narvuose, kad išsin ėrę suaugusieji vabzdžiai nepaj ėgtų pasprukti. 
Narvas tur ėtų būti ganėtinai erdvus, kad gal ėtų spiestis išsin ėrę suaugusieji 
vabzdžiai; antraip populiacija gali nesusiformuoti (mažiausi matmenys yra 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Narvai tur ėtų būti laikomi kambario temperat ūroje arba pastovi ų aplinkos 
sąlygų patalpoje 20 ± 2 °C temperat ūroje; šviesiojo laikotarpio trukm ė 16 
val. (šviesos intensyvumas apie 1 000 liuks ų), 8 val. tamsos. Parengta atas ­
kaitų, kuriose nurodoma, kad jeigu oro dr ėgnumas yra mažesnis negu 60 % 
RH, gali sumaž ėti reprodukcija).  
Skiedimo vanduo  
3. Leidžiama naudoti bet kok į tinkamą natūralų ar sintetin į vandenį. Paprastai 
naudojamas šulinio vanduo, vanduo, iš kurio pašalintas chloras, ir dirbtin ės 
terpės (pvz., Elendt „M4“ arba „M7“ priemon ė, žr. toliau). Prieš naudojim ą 
vanduo turi b ūti aeruojamas. Jeigu b ūtina, kult ūrų auginimo vanden į 
leidžiama atnaujinti pilant panaudot ą vandenį iš kultūrų auginimo ind ų ar 
jį leidžiant per sifon ą; būtina stengtis nepažeisti lerv ų vamzdži ų. 
Lervų šėrimas  
4. Chironomus  lervos tur ėtų būti šeriamos žuv ų maisto dribsniais (Tetra Min®, 
Tetra Phyll® arba kita panašia patentuota žuv ų maisto rūšimi); vienam indui 
per dieną skiriama apie 250 mg pašaro. Pašar ą galima pateikti saus ą, sumaltą 
milteliais arba kaip vandens suspensij ą: 1,0 g maisto dribsni ų įdedama į 20 
ml skiedimo vandens ir išmaišoma, kol gaunamas vienalytis mišinys. Šio ruošinio apie 5 ml per dien ą leidžiama įdėti į kiekvien ą indą (prieš naudojant 
būtina pakratyti). Vyresn ėms lervoms duodama daugiau pašaro.
 
5. Šėrimas koreguojamas atsižvelgiant į vandens kokyb ę. Jeigu auginimo terp ė 
„susidrums čia“, duodamo pašaro kiekis tur ėtų būti sumažinamas. Duodamo 
pašaro kiekiai turi b ūti kruopščiai stebimi. Jeigu duodamas per mažas pašaro 
kiekis, lervos persikelia į vandens storym ę, o skiriant per daug pašaro suin ­
tensyvėja mikroorganizm ų veikla ir sumaž ėja deguonies koncentracija. 
Abiem min ėtomis sąlygomis sumaž ėja augimo greitis.  
6. Ruošiant naujus kult ūrų auginimo indus į juos taip pat galima šiek tiek įdėti 
žaliųjų dumblių (pvz.,  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ). 
Išsinėrusių suaugusi ųjų mašalų šėrimas  
7. Kai kurie tyrin ėtojai pasi ūlė, kad išsin ėrusius suaugusius mašalus b ūtų 
galima šerti naudojant prisotintame sacharoz ė tirpale išmirkytus vilnos 
tamponus.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Lervų išsinėrimas  
8. Suaug ę mašalai ima rastis iš lerv ų auginimo ind ų po 13–15 dien ų 20 ± 2 °C 
temperatūroje. Patin ėliai lengviau atpaž įstami žiūrint į jų plunksniškus čiup­
tuvėlius. 
Kiaušinėlių masė 
9. Kol suaug ę mašalai b ūna veisimo narve, visi lerv ų auginimo indai tur ėtų būti 
tikrinami tris kartus per savait ę, ar juose n ėra drebučių pavidalo kiaušin ėlių 
masės. Jeigu randama šios kiaušin ėlių masės, ji turėtų būti atsargiai pašali ­
nama. Kiaušin ėliai turėtų būti sudedami į mažą indelį su veisimo vandens 
ėminiu. Kiaušin ėlių masė naudojama pradedant inde auginti nauj ą kultūrą 
(pvz., 2–4 kiaušin ėlių masė viename inde) arba atliekant toksiškumo 
bandymus.  
10. Pirmos stadijos lervos tur ėtų išsiristi po 2–3 dien ų. 
Naujų kultūrų auginimo ind ų ruošimas  
11. Išauginus kult ūras turėtų būti įmanoma kiekvien ą savaitę ar rečiau paruošti 
naują lervų kultūros auginimo ind ą atsižvelgiant į bandymo atlikimo reika ­
lavimus ir pašalinant senesnius indus, kai išsineria suaug ę mašalai. Taikant 
šią sistemą mažomis pastangomis reguliariai tiekiami suaug ę mašalai.  
Bandymo tirpal ų „M4“ ir „M7“ ruošimas  
12. Elendtas (1990) apraš ė „M4“ terp ę. „M7“ terp ė ruošiama kaip „M4“ terp ė, 
išskyrus 1 lentel ėje išvardytas chemines medžiagas, kuri ų koncentracijos 
„M7“, palyginti su „M4“, yra keturis kartus mažesn ės. Leidinys apie „M7“ 
terpę yra rengiamas (Elendto pateiktas pranešimas). Bandomasis tirpalas 
neturėtų būti ruošiamas pagal Elendt ą ir Bias (1990), jeigu norima gauti 
NaSiO  3 5 H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 ir K  2 HPO  4 koncentracijas, nes pradini ų 
tirpalų ruošimas n ėra tapati veikla.  
„M7“ terp ės ruošimas  
13. Kiekvienas pradinis tirpalas (I) paruošiamas atskirai ir iš ši ų pradinių 
tirpalų (I) paruošiamas kombinuotasis pradinis tirpalas (II) (žr. 1 lentel ę). 
50 ml kombinuotojo pradinio tirpalo (II) ir 2 lentel ėje nurodyti kiekvieno 
makroelement ų pradinio tirpalo kiekiai praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto 
vandens, kad taip b ūtų pasiruošta „M7“ terp ė. Vitamin ų pradinis tirpalas 
pasiruošiamas į dejonizuot ą vandenį įmaišius tris vitaminus kaip nurodyta 
3 lentelėje ir 0,1 ml kombinuotojo vitamin ų pradinio tirpalo įmaišoma į 
galutinę „M7“ terp ę prieš pat naudojimo pradži ą. (Vitamin ų pradinis tirpalas 
laikomas sušaldytas mažomis alikvotin ėmis dalimis.) Terp ė aeruojama ir 
stabilizuojama.  
LITERAT ŪRA 
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
1 lentelė 
„M4“ ir „M7“ terpei skirt ų mikroelement ų pradiniai tirpalai  
Pradiniai tirpalai (I)  Kiekis (mg), 
praskiedžiamas 
iki 1 litro dejoni ­
zuoto vandens  Ruošiant kombinuot ą pradinį 
tirpalą (II): maišomi nurodyti 
pradinių tirpalų (I) kiekiai (mg) ir 
praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto 
vandens  Galutinės bandom ųjų tirpalų 
koncentracijos (mg/l)  
M4 M7  M4  M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190  1,0  0,25  2,86  0,715  
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210  1,0  0,25  0,361  0,090  
LiCl (  1 ) 6 120  1,0  0,25  0,306  0,077  
RbCl (  1 ) 1 420  1,0  0,25  0,071  0,018  
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040  1,0  0,25  0,152  0,038  
NaBr (  1 ) 320  1,0  0,25  0,016  0,004  
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260  1,0  0,25  0,063  0,016  
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335  1,0  0,25  0,017  0,004  
ZnCl  2 260 1,0  1,0  0,013  0,013  
CaCl  2 · 6 H  2 O 200  1,0  1,0  0,010  0,010  
KI 65  1,0  1,0  0,0033  0,0033  
Na 2 SeO  3 43,8 1,0  1,0  0,0022  0,0022  
NH  4 VO  3 11,5 1,0  1,0  0,00058  0,00058  
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000  20,0  5,0  2,5  0,625  
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991  20,0  5,0  1,0  0,249  
( 1 ) Šios medžiagos skiriasi M4 ir M7 kaip pirmiau nurodyta. 
( 2 ) Šie tirpalai ruošiami atskirai, tada sumaišomi ir nedelsiant apdorojami autoklave.  
2 lentelė 
M4 ir M7 terp ėms skirti makroelement ų pradiniai tirpalai  
Kiekis praskiedžiamas 
iki 1 litro dejonizuoto 
vandens 
(mg)  Ruošiant M4 ir M7 terp ę 
įdedamas makroelement ų 
pradinių tirpalų kiekis 
(ml/l)  Galutinės bandom ųjų 
tirpalų M4 ir M7 
koncentracijos 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800  1,0  293,8  
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600  0,5  123,3  
KCl 58 000  0,1  5,8  
NaHCO  3 64 800  1,0  64,8  
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000  0,2  10,0  
NaNO  3 2 740  0,1  0,274  
KH  2 PO 4 1 430  0,1  0,143  
K 2 HPO  4 1 840  0,1  0,184  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
3 lentelė 
M4 ir M7 terpei skirtas vitamin ų pradinis tirpalas. Visi trys vitamin ų tirpalai maišomi 
siekiant paruošti vien ą vitaminų pradinį tirpalą 
Kiekis praskiedžiamas 
iki 1 litro dejonizuoto 
vandens 
(mg)  Ruošiant M4 ir M7 terp ę 
įdedamas vitamin ų pradinio 
tirpalo kiekis 
(ml/l)  Galutinės bandom ųjų 
tirpalų M4 ir M7 
koncentracijos 
(mg/l)  
Tiamino hidrochloridas  750  0,1  0,075  
Ciankobalaminas (B12)  10  0,1  0,0010  
Biotinas  7,5  0,1  0,00075  
LITERAT ŪRA 
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25–33.  
Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
3 priedėlis 
SINTETINI Ų NUOSĖDŲ RUOŠIMAS  
Nuosėdų sudėtis 
Sintetinės nuosėdos turėtų būti sudarytos iš ši ų sudedam ųjų dalių: 
Sudedamoji dalis  Charakteristikos  Nuosėdų sausosios 
procentin ė dalis)  
Durpės Naujosios Zelandijos kimin ų 
durpės, jų pH kiek įmanoma 
atitinka 5,5–6,0, joki ų augalų 
matomų liekanų, smulkiai 
sumaltos (kiet ųjų dalelių 
dydis ≤ 1 mm), džiovintos 
ore 4–5 
Kvarcinis sm ėlis Gr ūdelių dydis: > 50 % 
dalelių dydžio vert ės inter­
valas turėtų būti 0–200 μm 75–76  
Kaolito molis  Kaolinito kiekis ≥ 30 %  20  
Organinė anglis  Pakoreguota pridedant durpi ų 
ir smėlio 2 (± 0,5)  
Kalcio karbonatas  CaCO  3 , milteliai, cheminiu 
atžvilgiu grynas  0,05–0,1  
Vanduo  Laidumas ≤ 10 μS/cm  30–50  
Pasiruošimas  
Durpės džiovinamos ore ir malamos tol, kol gaunami smulk ūs milteliai. Suspen ­
sija iš nustatyto durpi ų miltelių kiekio ir dejonizuoto vandens pasiruošiama 
didelio našumo homogenizavimo įrenginiu. Naudojant CaCO  3 koreguojama, 
kad šios suspensijos pH vert ė būtų 5,5 ± 0,5. Švelniai maišant suspensija kondi ­
cionuojama ne trumpiau negu dvi dienas 20 ± 2 °C temperat ūroje siekiant stabi ­
lizuoti pH ir paruošti stabili ą mikroorganizm ų populiacij ą. pH matuojama dar 
kartą ir jo vert ė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Tada durpi ų suspensija maišoma su kitomis 
sudedamosiomis dalimis (sm ėliu ir kaolino moliu) ir dejonizuotu vandeniu 
siekiant gauti vienalytes nuos ėdas, kuriose vandens kiekis sudaro 30—50 % 
sausosios mas ės. Dar kart ą matuojama galutinio mišinio pH vert ė ir, jeigu reikia, 
naudojant CaCO  3 koreguojama, kol pH vert ė ima atitikti 6,5–7,5 vert ę. Imami 
nuosėdų ėminiai siekiant nustatyti saus ąją masę ir organin ės anglies kiek į. Taip 
pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuos ėdas naudoti chironomid ų toksiš­
kumo bandymui, sintetin ės nuosėdos būtų kondicionuojamos septynias dienas 
tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui.  
Sandėliavimas  
Sintetinių nuosėdų ruošimo visas sudedam ąsias sausas dalis galima laikyti 
sausoje ir v ėsioje vietoje kambario temperat ūroje. Sintetin ės (drėgnos) nuos ėdos 
neturėtų būti sandėliuojamos prieš jas imant naudoti atliekamam bandymui. Jos 
turėtų būti naudojamos iš karto po 7 dienas trukusio kondicionavimo laikotarpio, 
kuriuo baigiamas ruošimo etapas.  
LITERAT ŪRA 
Chapter C.8 of this Annex. Toxicity for Earthworms.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. 
SAFEty 39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
4 priedėlis 
Tinkamo skiedimo vandens chemin ės charakteristikos  
Cheminė medžiaga  Koncentracijos  
Kietosios dalel ės < 20 mg/l  
Bendroji organin ė anglis  < 2 mg/l  
Nejonizuotas amoniakas  < 1 mg/l  
Kietumas (kaip CaCO  3 ) < 400 mg/l (*)  
Liekamasis chloras  < 10 mg/l  
Suminis organini ų fosforo pesticid ų kiekis  < 50 ng/l  
Suminis organini ų chloro pesticid ų ir polichlorint ų 
bifenilų kiekis  < 50 ng/l  
Suminis organinio chloro kiekis  < 25 ng/l  
(*) Tačiau jeigu galima daryti prielaid ą, kad vandens kietumo jonai gali s ąveikauti su 
bandomąja chemine medžiaga, tur ėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadi ­
nasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
5 priedėlis 
Chironomid ų lervų išsiritimo steb ėjimo gair ės 
Į bandymo stiklines įdedamos išsiritimo gaudykl ės. Gaudykl ės reikalingos nuo 20 
dienos iki bandymo pabaigos. Gaudykl ės brėžinio pavyzdys pateiktas toliau:
  
A: nailono ekranas  
B: apversti plastiko gaubtai  
C: bebriaun ė laboratorin ė poveikio stiklin ė D: vandens keitimo ekrano angos  
E: vanduo  
F: nuosėdos ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C.28.  TOKSIŠKUMO BANDYMAS SU CHIRONOMIDAIS NUOS ĖDOSE 
IR VANDENYJE, NAUDOJANT VANDEN Į SU ĮTERPTA BANDOM ĄJA 
CHEMINE MEDŽIAGA  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires Nr. 219 (2004). Šiuo 
bandymo metodu siekiama įvertinti ilgalaik į chemini ų medžiag ų poveikį 
nuosėdose gyvenan čioms gėlųjų vandenų dvisparnio vabzdžio  Chironomus  
sp. lervoms. Šis metodas iš esm ės pagrįstas BBA gair ėmis; šiuo atveju 
naudojama nuos ėdų—vandens sistema su dirbtiniu dirvožemiu ir vandens 
storymės poveikio scenarijumi (1). Atliekant š į bandymą taip pat atsižvel ­
giama į turimus toksiškumo bandymo su  Chironomus riparius  ir Chiro­
nomus tentans  protokolus, kurie parengti Europoje (1) (2) (3) ir Šiaur ės 
Amerikoje (4) (5) (6) (7) (8) ir patikrinti tarplaboratorinio lyginimo bandy ­
mais (1) (6) (9). Taip pat leidžiama naudoti kitas dvisparni ų vabzdžių rūšis, 
pvz.,  Chironomus yoshimatsui  (10) (11), kurios tinkamai pagr įstos doku ­
mentais.  
2. Taikant š į bandymo metod ą kaip poveikio scenarijus pasirenkamas bando ­
mosios chemin ės medžiagos įterpimas į vandenį. Atitinkamo poveikio 
scenarijaus pasirinkimas priklauso nuo numatomo bandymo taikymo. 
Vandens poveikio scenarijumi, kai, be kita ko, į vandens storym ę įterpiama 
bandomoji chemin ė medžiaga, ketinama modeliuoti pesticid ų sklidimą ir 
scenarijus apima pradines didžiausias koncentracijas por ų vandenyje. Šis 
scenarijus taip pat taikytinas kit ų poveikio tip ų atvejais ( įskaitant chemini ų 
medžiagų išsiliejim ą), išskyrus ilgiau negu bandymo laikotarpis trunkan čius 
kaupimosi procesus.  
3. Chemin ės medžiagos, kurias b ūtina ištirti siekiant nustatyti j ų poveikį nuosė­
dose gyvenantiems organizmams, paprastai šiame skyriuje išlieka ilg ą laiko­
tarpį. Nuosėdose gyvenan čius organizmus galima veikti keliais b ūdais. Kiek ­
vieno poveikio b ūdo santykin ė svarba ir laikas, sugaištamas, kol taikant 
kiekvieną būdą užtikrinamas bendrasis toksiškas poveikis, priklauso nuo 
atitinkamos chemin ės medžiagos fizini ų ir chemini ų savybių. Jei tai lengvai 
absorbuojamos chemin ės medžiagos (pvz., kai K  ow > 5) ar kovalentiniais 
saitais su nuos ėdomis susijusios chemin ės medžiagos, užteršto maisto nuri ­
jimas gal ėtų būti tinkamas poveikio b ūdas. Siekiant, kad stipriomis lipofili ­
nėmis savyb ėmis pasižymin čių cheminių medžiagų toksiškus b ūtų reikiamai 
vertinamas, galima svarstyti galimyb ę, ar nereik ėtų į nuosėdas įterpti pašaro 
prieš taikant bandom ąją cheminę medžiag ą. Norint atsižvelgti į visus 
galimus poveikio b ūdus pagrindinis d ėmesys taikant š į bandymo metod ą 
skiriamas ilgalaikiam poveikiui. Bandymo trukm ė naudojant  C. Riparius  ir 
C. Yoshimatsui  yra 20–28 dienos ir 28–65 dienos, jeigu pasirenkama  C. 
tentans . Jeigu konkre čiam tikslui, pvz., tiriant nestabili ų cheminių medžiagų 
poveikį, būtini trumpalaikiai duomenys, papildomus kartotinius ėminius 
galima paimti po dešimties par ų laikotarpio.  
4. Išmatuotas poveikis yra bendras išsiritusi ų suaugusi ųjų skaičius ir išsiritimo 
trukmė. Rekomenduojama, kad lerv ų išgyvenimo ir augimo rodikliai b ūtų 
matuojami tik po dešimties par ų laikotarpio, jeigu b ūtini papildomi trumpa ­
laikiai duomenys ir jeigu reikia naudoti papildomus pakartotinius ėminius.  
5. Rekomenduojama naudoti sintetines nuos ėdas. Sintetin ės nuosėdos keliais 
atžvilgiais yra tinkamesn ės negu nat ūralios nuos ėdos: 
— kintamumas darant bandym ą yra sumažinamas, nes kintamumas sudaro 
atkuriamą „standartin ę matricą“ ir nėra būtina nustatyti neužteršt ą ir 
švarų nuosėdų šaltinį, 
— bandymus galima prad ėti bet kuriuo metu ir nepaisyti bandom ųjų 
nuosėdų sezoninio kintamumo bei šiuo atveju neb ūtina iš anksto apdo ­
roti nuosėdų, kad iš j ų būtų pašalinta b ūdingoji fauna; naudojant sinte ­
tines nuos ėdas taip pat sumažinamos išlaidos, išleidžiamos lauke renkant 
įprastiems bandymams reikaling ą nuosėdų kiekį, ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— naudojant sintetines nuos ėdas galima lyginti toksiškum ą ir atitinkamai 
klasifikuoti chemines medžiagas: toksiškumo bandym ų, kuriems 
naudotos nat ūralios ir dirbtin ės nuosėdos, duomenys buvo lyginami 
atsižvelgiant į kelias chemines medžiagas (2).  
6. Taikom ų sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 pried ėlyje. 
BANDYMO METODO ESM Ė 
7. Pirmos stadijos chironomid ų lervos veikiamos tam tikros koncentracijos 
bandomąja chemine medžiaga nuos ėdų-vandens sistemose. Prad ėjus 
bandymą viena pirmosios stadijos lerva įdedama į bandymo stiklin ę, kurioje 
yra nuosėdų–vandens sistema ir į kurios vanden į vėliau įleidžiama bando ­
mosios chemin ės medžiagos. Bandymo pabaigoje matuojama chironomid ų 
išsinėrimo ir augimo sparta. Taip pat galima matuoti lerv ų išgyvenim ą ir 
masę po 10 par ų, jeigu reikia (naudojant kartotinius ėminius, kai b ūtina). Šie 
duomenys analizuojami taikant regresijos model į ir siekiant įvertinti 
koncentracij ą, kuri būtų x % sumažinusi lerv ų išsinėrimą, arba lerv ų išgy­
venimą ar augim ą (pvz., EC  15 , EC  50 ir t. t.) arba hipotez ę tikrinant statisti ­
niais kriterijais siekiant nustatyti NOEC/LOEC (stebimo poveikio nedaran čią 
koncentracij ą ir (arba) mažiausi ą stebimo poveikio koncentracij ą). Pastaruoju 
atveju pasitelkus statistinius kriterijus poveikio vertes b ūtina lyginti su kont ­
rolinėmis vertėmis. 
INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ CHEMIN Ę MEDŽIAG Ą 
8. Turėtų būti žinomas bandomosios chemin ės medžiagos tirpumas vandenyje, 
jos garų slėgis, išmatuotas ar apskai čiuotas nuos ėdų susidarymas ir stabi ­
lumas vandenyje bei nuos ėdose. Tur ėtų būti prieinamas analiz ės metodas 
kiekybiniam bandomosios chemin ės medžiagos kiekiui nustatyti pavirši ­
niame vandenyje, por ų vandenyje ir nuos ėdose su žinomu ir praneštu tiks ­
lumu bei aptikimo riba. Naudinga informacija laikytina bandomosios 
cheminės medžiagos strukt ūrinė formulė ir grynumas. Bandomosios 
cheminės medžiagos cheminis išliekamumas (pvz., išsklaidymas, abiotinis 
ir biotinis suirimas ir t. t.) taip pat laikytinas naudinga informacija. Išsamios 
bandomųjų chemini ų medžiag ų, su kurioms d ėl jų fizinių ir chemini ų 
savybių sunku daryti bandym ą, gairės pateiktos (12).  
ETALONIN ĖS CHEMIN ĖS MEDŽIAGOS  
9. Bandymus su etalonin ėmis chemin ėmis medžiagomis galima atlikti perio ­
diškai ir juos darant b ūtų užtikrinama, kad bandymo protokolas ir bandymo 
sąlygos būtų patikimos. Etalonin ės toksiškos medžiagos, tinkamos naudoti 
atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandymus ir patvirtinimo tyrimus: lindanas, trifluralinas, pentachlorfenolis, kadmio chloridas ir kalio chloridas (1) (2) (5) (6) (13).
 
BANDYMO VALIDUMAS  
10. Bandymas laikomas validuotu, jeigu taikomos šios s ąlygos:  
— lervų išsinėrimas kontroliniuose ėminiuose bandymo pabaigoje turi b ūti 
ne mažesnis negu 70 %; (1) (6),  
— C. riparius  ir C. yoshimatsui  iš kontrolini ų indų suaugėliais turėtų tapti 
12–23 dienomis po lerv ų įleidimo į indus;  C. tentans , šis laikotarpis turi 
būti 20–65 dienos,  
— bandymo pabaigoje pH vert ė ir ištirpusio deguonies koncentracija tur ėtų 
būti matuojama kiekviename inde; deguonies koncentracijos vert ė esant 
naudojamai temperat ūrai turėtų būti bent 60 % soties ore vert ės ir pavir­ 
šinio vandens pH vert ė visuose bandymo induose tur ėtų atitikti 6–9 
intervalą, ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— vandens temperat ūra neturėtų skirtis daugiau negu ± 1,0 °C. Vandens 
temperatūrą galima reguliuoti naudojant izotermin ę patalpą ir šiuo atveju 
patalpos temperat ūra turėtų būti patvirtinama atitinkamais laiko interva ­
lais. 
BANDYMO METODO APRAŠYMAS  
Bandymo indai  
11. Tyrimas atliekamas naudojant 600 ml laboratorines stiklines (skersmuo 
8 cm). Leidžiama rinktis kitus indus, ta čiau juos naudojant tur ėtų būti užtik­
rinamas tinkamas paviršinio vandens ir nuos ėdų storis. Nuos ėdų paviršiaus 
plotas tur ėtų būti toks, kad vienai lervai tekt ų 2–3 cm  2 . Nuosėdų storio ir 
paviršinio vandens sluoksnio storio santykis tur ėtų būti 1:4. Bandymo indai 
ir kiti įrenginiai, kurie liesis su bandymo sistema, tur ėtų būti vien iš stiklo ar 
kitos cheminiu atžvilgiu neutralios medžiagos (pvz., teflono).  
Rūšių pasirinkimas  
12. Renkantis atliekant bandym ą naudojam ą rūšį pirmenyb ė teikiama  Chiro­
nomus riparius . Taip pat leidžiama naudoti  Chironomus tentans , tačiau 
juos sunkiau priži ūrėti ir jiems b ūtinas ilgesnis bandymo laikotarpis. Be 
to, leidžiama naudoti  Chironomus yohimatsui . Su  Chironomus riparius  
susiję kultūrų auginimo metodai aprašyti 2 pried ėlyje. Taip pat pateikiama 
informacija apie kit ų rūšių, t. y.  Chironomus tentans  (4) ir  Chironomus 
yoshimatsui  (11), kult ūrų auginimo s ąlygos. Rūšies tapatyb ės nustatymas 
turi būti patvirtinamas prieš bandym ą, tačiau patvirtinimas n ėra būtinas 
prieš kiekvien ą bandym ą, jeigu organizmas paimtas iš vietoje išaugintos 
kultūros. 
Nuosėdos 
13. Pirmenyb ė teikiama pasiruoštoms nuos ėdoms (jos dar vadinamos pertvarky ­
tomis, dirbtin ėmis ar sintetin ėmis nuos ėdomis). Ta čiau jeigu naudojamos 
natūralios nuos ėdos, turėtų būti nurodomos j ų charakteristikos (bent pH, 
organinės anglies kiekis, kit ų parametr ų apibrėžtis, pvz., C/N santykis, ir 
taip pat rekomenduojama pateikti granuliometrin ę sudėtį) ir nuosėdose neturi 
būti jokių teršalų ir kitų organizm ų, kurie gal ėtų konkuruoti su chironomi ­
dais ar juos vartoti. Taip pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuos ėdas 
naudoti toksiškumo bandymui su chironomidais, nat ūralios nuos ėdos kondi ­
cionuojamos septynias dienas tomis pa čiomis sąlygomis, kurios taikomos 
kitam bandymui. Atliekant š į bandym ą (1) (15) (16) rekomenduojama 
naudoti iš dirbtinio dirvožemio, kuris naudojamas taikant bandymo metod ą 
C.8 (14), pasiruoštas sintetines nuos ėdas: 
a) 4–5 % durpi ų (sausoji mas ė): pH vert ė kiek įmanoma turi b ūti 5,5–6,0; 
privaloma naudoti smulkiai sumaltus (daleli ų dydis ≤ 1 mm) durpi ų 
miltelius; jos turi b ūti džiovintos tik ore;  
b) 20 % (sausoji mas ė) kaolino molio (pageidautina, kad kaolinito jame 
būtų daugiau kaip 30 %);  
c) 75–76 % (sausoji mas ė) kvarcinio sm ėlio (smulkusis sm ėlis turėtų suda­
ryti didžiausi ą dalį, daugiau negu 50 % daleli ų dydis 50–200 μm); 
d) įpilama dejonizuoto vandens, kad galutiniame mišinyje dr ėgnumas suda ­
rytų 30–50 %;  
e) įdedama chemijos poži ūriu gryno kalcio karbonato (CaCO  3 ), kad galu ­
tinio nuos ėdų mišinio pH vert ė būtų 7,0 ± 0,5;  
f) galutinio mišinio sud ėtyje turėtų būti be 2 % (± 0,5 %) organin ės anglies 
ir jos kiekis turi b ūti koreguojamas atitinkamais durpi ų ir smėlio kiekiais 
atsižvelgiant į a–c. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Turėtų būti žinomas durpi ų, kaolino molio ir sm ėlio gavimo šaltinis. 
Nuosėdų sudedamosios dalys tur ėtų būti patikrinamos, ar jose n ėra chemin ės 
taršos pėdsakų (pvz., sunki ųjų metalų, chlororganini ų komponent ų, fosforor ­
ganinių komponent ų ir t. t.). Sintetini ų nuosėdų pasiruošimo pavyzdys apra ­ 
šytas 3 pried ėlyje. Taip pat leidžiama maišyti saus ąsias sudedam ąsias dalis, 
jeigu įmanoma įrodyti, kad užpylus paviršinio vandens n ėra atskiriamos 
nuosėdų sudedamosios dalys (pvz., neima pl ūduriuoti kietosios durpi ų 
dalelės) ir kad durp ės ar nuos ėdos yra kondicionuotos pagal reikalavimus.  
Vanduo  
15. Kaip bandymo vanden į leidžiama rinktis bet kok į vandenį, atitinkant į 2 ir 4 
priedėliuose išvardytas skiedimui tinkamo vandens chemines savybes. Bet 
kokį tinkamą vandenį, natūralų vandenį (paviršin į ar gruntin į), regeneruot ą 
vandenį (žr. 2 pried ėlį) arba vandentiekio vanden į, iš kurio pašalintas 
chloras, leidžiama rinktis kaip kult ūros auginimo vanden į ir bandymo 
vandenį, jeigu chironomidai jame be streso požymi ų išgyvena kult ūros 
veisimo ir bandymo laikotarpiu. Bandymo vandens pH vert ė pradedant 
bandymą turėtų būti 6–9, o bendrasis kietumas ne didesnis negu 400 mg/l 
kaip CaCO  3 . Tačiau jeigu galima daryti prielaid ą, kad vandens kietumo 
jonai gali s ąveikauti su bandom ąja chemine medžiaga, tur ėtų būti naudo­
jamas mažesnio kietumo vanduo (vadinasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4). Atliekant tyrim ą turėtų būti naudojamas to paties tipo 
vanduo. 4 pried ėlyje išvardyt ų vandens kokyb ės charakteristik ų vertės turėtų 
būti matuojamos ne re čiau negu du kartus per metus arba kilus įtarimui, kad 
šios charakteristikos yra gerokai pakitusios.
 
Pradiniai tirpalai. Vanduo su įterpta bandom ąja chemine medžiaga  
16. Bandymo koncentracijos apskai čiuojamos remiantis vandens storym ės 
koncentracijomis, t. y. paviršiniu nuos ėdų vandeniu. Pasirinkt ų koncentracij ų 
bandomieji tirpalai paprastai pasiruošiami skiedžiant pradin į tirpalą. Pradi­
niai tirpalai vis ų pirmiausiai tur ėtų būti ruošiami bandom ąją cheminę 
medžiagą tirpinant bandymo terp ėje. Norint pasiruošti tinkamos koncentra ­
cijos pradinio tirpalo tam tikrais atvejais gali tekti naudoti tirpiklius ar 
dispergatorius. Tinkami tirpikliai – acetonas, etanolis, metanolis, metoksie ­
tanolis, etilenglikolio dimetileteris, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Naudotini dispergatoriai – „Cremophor RH40“, „Tween 80“, metilceliulioz ė 
0,01 % ir HCO-40. Soliubilizavimo priemon ės koncentracija galutin ėje 
bandymo terp ėje turėtų būti kuo mažesn ė (t. y. ≤ 0,1 ml/l) ir vienoda 
kiekvieną kartą veikiant bandom ąja chemine medžiaga. Jeigu naudojama 
soliubilizavimo priemon ė, ji neturi daryti jokio didesnio poveikio chirono ­
midų lervų išgyvenimui arba akivaizdaus neigiamo poveikio šioms lervoms, 
kaip kad nustatoma darant kontrolin į bandymą vien tik su tirpikliu. Ta čiau 
turėtų būti imamasi vis ų priemoni ų, kad šios medžiagos neb ū
tų naudojamos.  
BANDYMO PLANAS  
17. Sudarant bandymo plan ą pasirenkamos bandymo koncentracijos ir j ų 
paskirstymas, kiekvienos koncentracijos ind ų skaičius ir lerv ų skaičius 
inde. Pateikiamas EC taško nustatymo, NOEC nustatymo ir ribos bandymo 
atlikimo aprašymas. Pirmenyb ė teikiama regresinei analizei, o ne hipotez ės 
tikrinimo metodui.  
Regresinės analizės planas  
18. Bandymui naudotos koncentracijos b ūtinai turi apr ėpti poveikio koncentra ­
ciją (pvz., EC  15 , EC  50 ) ir dominan čio medžiagos poveikio koncentracijos 
verčių diapazon ą. Apskritai tikslumo ir ypa č validumo vertes, kurias naudo ­
jant galima įvertinti poveikio koncentracijas (EC  x ), įmanoma patikslinti,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
jeigu poveikio koncentracijos vert ės atitinka bandymo koncentracij ų inter­
valą. Nereikėtų ekstrapoliuoti gerokai mažesni ų negu mažiausioji teigiamoji 
koncentracija arba didesni ų negu didžiausioji koncentracija ver čių. Pradinis 
intervalo nustatymo bandymas praver čia renkantis naudotin ų koncentracij ų 
intervalą (žr. 27 pastraip ą). 
19. Jeigu turi b ūti nustatomos poveikio koncentracijos (EC  x ), turėtų būti atlie­
kami bent penki bandymai naudojant kiekvien ą koncentracijos vert ę ir trys 
kartotiniai bandymai. Bet kuriuo atveju rekomenduojama naudoti pakan ­
kamą bandymo koncentracij ų skaičių, kad būtų užtikrinamas reikiamas 
modelio įvertinimas. Koncentracij ų koeficiento vert ė neturėtų būti didesnė 
negu 2 (išimt į leidžiama taikyti tais atvejais, jeigu doz ės ir reakcijos 
santykio kreiv ė turi nuolaid ų statumą). Kartotini ų ėminių skaičių atliekant 
kiekvieną apdorojim ą galima mažinti, jeigu padid ėja skirting ą atsaką suke­
liančių bandymo koncentracij ų skaičius. Didinant kartotini ų ėminių skaičių 
arba mažinant bandymo koncentracij ų intervalo ribas b ūtų taikomi siauresni 
bandymo pasikliovimo intervalai. Papildomi kartotiniai ėminiai būtini tuo 
atveju, jeigu b ūtina įvertinti 10 par ų lervų išlikimą ir augim ą. 
NOEC/LOEC įvertinimo planas  
20. Jeigu turi b ūti vertinama LOEC arba NOEC, tur ėtų būti naudojamos ne 
mažiau negu keturi ų kartotini ų bandymų penkios bandomosios koncentra ­
cijos ir koncentracij ų koeficiento vert ė neturėtų viršyti 2. Kartotini ų 
bandymų skaičius turėtų būti pakankamas siekiant užtikrinti reikiam ą statis­
tinę galią, kad būtų aptinkamas 20 % skirtumas nuo kontrolinio 5 % reikš ­
mingumo lygmens (p = 0,05). Nustatant vystymosi greit į paprastai naudo ­
jama dispersin ė analizė (ANOVA), pvz., Dunnett bandymas ir Williams 
bandymas (17) (18) (19) (20). Nustatant išskridimo norm ą galima naudoti 
Cochran-Armitage, Fisher (su Bonferroni pataisa) arba Mantel-Haentzal 
bandymus.  
Ribinis bandymas  
21. Ribin į bandymą galima atlikti (viena bandomoji koncentracija ir kontrolinis 
ėminys), jeigu darant pradin į intervalo nustatymo bandym ą nebuvo nustatyta 
jokių poveikių. Atliekant ribin į bandym ą siekiama nurodyti, kad toksin ė 
bandomosios chemin ės medžiagos vert ė yra didesn ė negu darant bandym ą 
nustatyta ribin ė koncentracija. Naudojant š į bandymo metod ą negalima 
pateikti joki ų pasiūlymų dėl rekomenduojamos koncentracijos; ši teis ė 
suteikta pareig ūnui. Paprastai b ūtini ne mažiau negu šeši pakartotiniai 
bandymai poveikiui bandom ąja medžiaga ir kontroliniai bandymai. Tur ėtų 
būti įrodoma pakankama statistin ė galia aptikti 20 % skirtum ą nuo kontro ­
linės vertės esant 5 % reikšmingumo lygiui (p = 0,05). Jeigu atsakas nuro ­
domas metriniais vienetais (vystymosi greitis ir mas ė), t-bandymas yra 
tinkamas statistinis metodas, jeigu duomenys atitinka šio bandymo reikala ­
vimus (atitiktis, vienalyt ės dispersijos). Jeigu ši ų reikalavim ų nesilaikoma, 
leidžiama naudoti nelygiavert ės dispersijos t-bandym ą arba ne parametrin į 
bandymą, pvz., Wilcoxon-Mann-Whithey bandym ą. Nustatant išsin ėrimo 
normą atliktinas Fisher bandymas.  
PROCED ŪRA 
Poveikio s ąlygos  
Vandens–nuos ėdų sistemos su įterpta bandom ąja chemine medžiaga paruo ­ 
šimas  
22. Į bandymo indus įdedami atitinkami sintetini ų nuosėdų kiekiai (žr. 13–14 
dalis ir 3 pried ėlį), kad būtų paruoštas ne plonesnis negu 1,5 cm sluoksnis. 
Vandens pilama tiek, kol nusistovi 6 cm vandens storym ė (žr. 15 pastraip ą). 
Nuosėdų sluoksnio ir vandens storym ės santykis netur ėtų viršyti 1:4 bei 
nuosėdų sluoksnio storis netur ėtų būti didesnis negu 3 cm. Nuos ėdų–van­
dens sistema prieš įdedant į ją bandomuosius gyv ūnus turėtų būti švelniai 
aeruojama septynias dienas (žr. 14 pastraip ą ir 3 pried ėlį). Kad į vandens 
storymę pilant bandymo vanden į nuosėdų sudedamosios dalys neatsiskirt ų ir 
kietosios dalel ės vėl nebūtų suspenduojamos skystyje, nuos ėdas leidžiama 
uždengti plastiko disku, kol vanduo pilamas ant nuos ėdų, ir vėliau diskas 
nedelsiant nuimamas. Taip pat leidžiama naudoti kitus įtaisus.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Bandymo indai tur ėtų būti uždengiami (pvz., stiklo plokšt ėmis) Jeigu b ūtina, 
atliekant tyrim ą leidžiama įpilti vandens, kad b ūtų užtikrinamas pradinis 
vandens t ūris ir kompensuojama išgaruojanti vandens dalis. Papildomai 
turėtų būti pilamas distiliuotas ar dejonizuotas vanduo siekiant užkirsti 
kelią, kad nesusidaryt ų druskos.  
Bandomųjų organizm ų įdėjimas  
24. Keturias ar penkias dienas prieš bandomuosius organizmus įdedant į 
bandymo indus, kiaušin ėlių masė turėtų būti paimama iš s ėjimo kult ūrų ir 
sudedama į mažus indus auginimo terp ėje. Leidžiama naudoti iš kamienin ės 
kultūros gautą terpę arba švieži ą pasiruošt ą terpę. Jeigu naudojama pastaroji, 
į auginimo terp ę turėtų būti įdedamas mažas kiekis pašaro, pvz., žali ųjų 
dumblių ir (arba) įlašinami keli lašeliai smulkiai sumalt ų žuvų maisto gaba ­
lėlių suspensijos filtrato (žr. 2 pried ėlį). Turėtų būti naudojamos tik neseniai 
padėtų kiaušinėlių masės. Paprastai lervos ima ristis po keli ų dienų nuo 
kiaušinėlių padėjimo ( Chironomus riparius  20 °C temperat ūroje išsirita 
per 2–3 dienas,  Chironomus tentans  23 °C temperat ūroje išsirita per 1–4 
dienas ir  Chironomus yoshimatui  25 °C temperat ūroje) ir lervos augdamos 
pereina keturias stadijas, iš kuri ų kiekviena trunka 4–8 dienas. Atliekant 
bandymą turėtų būti naudojamos pirmosios stadijos lervos (2–3 arba 1–4 
dienų po išsiritimo). Mašal ų stadiją įmanoma nustatyti pagal galvut ės apval­
kalo plotį (6). 
25. Pirmos stadijos dvidešimt lerv ų buka pipete atsitiktinai paskirstoma kiek ­
vienam bandymo indui, kuriame yra nuos ėdų su įterpta bandom ąja chemine 
medžiaga ir vandens. Vandens aeravimas turi b ūti nutraukiamas, kol lervos 
dedamos į bandymo ind ą, ir ši būsena išlaikoma dar 24 valandas po lerv ų 
įdėjimo (žr. 24 ir 32 pastraipas). Pagal taikom ą bandymo plan ą (žr. 19 ir 20 
pastraipas) kiekviena koncentracija veikiama ne mažiau negu 60 lerv ų, jeigu 
nustatomas ES taškas, arba 80 lerv ų, jeigu apibr ėžiama NOEC.  
26. Po dvidešimt keturi ų valandų nuo lerv ų įdėjimo, į paviršinio vandens 
storymę įleidžiama bandomoji chemin ė medžiaga ir vanduo v ėl imamas 
šiek tiek aeruoti. Maži bandomosios chemin ės medžiagos tirpal ų kiekiai 
pipete įterpiami po vandens paviršiumi. Tada paviršinis vanduo tur ėtų būti 
išmaišomas (stengiamasi nesukelti nuos ėdų). 
Bandomosios koncentracijos  
27. Intervalo nustatymo bandymas gali b ūti naudingas siekiant apibr ėžti darant 
galutinį bandym ą pasirinktin ų koncentracij ų intervalą. Šiuo tikslu naudo ­
jamos labai besiskirian čių bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ų 
serijos. Siekiant užtikrinti galutiniam bandymui naudojam ų chironomid ų 
vienodą paviršiaus tankum ą, jie veikiami kiekviena bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija tol, kol įvertinamos atitinkamos bandomosios 
koncentracijos ir kartotiniai ėminiai nėra reikalingi.  
28. Atliekant galutin į bandymą naudojamos bandomosios koncentracijos pasi ­
renkamos atsižvelgiant į intervalo nustatymo bandymo rezultat ą. Turėtų būti 
naudojamos ne mažiau negu penkios koncentracijos kaip aprašyta 18–20 
pastraipose.  
Kontroliniai ėminiai  
29. Kontrolini ų ėminių indai be jokios bandomosios chemin ės medžiagos, ta čiau 
su nuosėdomis, tur ėtų būti naudojami atliekant bandym ą su atitinkamu skai ­ 
čiumi kartotini ų ėminių (žr. 19–20 pastraip ą) Jeigu taikant bandom ąją 
cheminę medžiag ą naudotas tirpiklis (žr. 16 pastraip ą), turėtų būti įdedama 
tirpiklio kontrolinis ėminys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Bandymo sistema  
30. Naudojama statin ė sistema. Išskirtiniais atvejais leidžiama naudoti pusiau 
statines ar dinamines sistemas su tr ūkiuoju ar tolygiu paviršinio vandens 
atnaujinimu, pvz., jeigu vandens kokyb ės reikalavimai neatitinka taikom ų 
bandomajam organizmui ar daro poveik į cheminei pusiausvyrai (pvz., ištir ­
pusio deguonies lygiai pernelyg sumaž ėja, labai padid ėja šalinimo produkt ų 
koncentracija arba iš nuos ėdų ima sunktis mineral ų skystis ir daro poveik į 
pH ir (arba) vandens kietumo vert ėms. Tačiau paprastai pakanka kit ų pavir­ 
šinio vandens kokyb ės gerinimo metod ų, pvz., aeracijos, ir jiems teiktina 
pirmenyb ė. 
Pašaras  
31. Lervas b ūtina šert; pageidautina kiekvien ą dieną ar bent tris kartus per 
savaitę. Per pirm ąsias 10 par ų jaunoms lervoms per dien ą turėtų pakakti 
0,25–0,5 mg ( C. yoshimatui  lervoms 0,35–0,5 mg) žuv ų maisto (vandens 
suspensija arba smulkiai sumaltas maistas, pvz., Tetra-Min arba Tetra-Phyll, 
išsami informacija pateikta 2 pried ėlyje). Senesn ėms lervoms reikia šiek tiek 
daugiau pašaro: likusiai bandymo daliai kiekvien ą dieną lervoms tur ėtų 
pakakti 0,5–1 mg. Pašaro kiekis tur ėtų būti mažinamas vis ų poveikių bando­
mąja chemine medžiaga atvejais ir kontroliuojamas, jeigu nustatomas 
grybelio atsiradimas arba jeigu aptinkama, kad gaišta kontrolin ės grupės 
gyvūnai. Jeigu grybelio augimo nepavyksta sustabdyti, bandymas turi b ūti 
pakartotas. Jeigu bandymai atliekami su lengvai absorbuojamomis chemi ­
nėmis medžiagomis (pvz., kai K  ow > 5) ar kovalentiniais saitais su nuos ė­
domis susijusiomis chemin ėmis medžiagomis, išgyvenimui ir nat ūraliam 
augimui b ūtiną pašaro kiek į galima įterpti į sintetines nuos ėdas prieš stabi ­
lizavimo laikotarp į. Šiuo tikslu turi b ūti naudojamas ne žuv ų maistas, o 
augalinis pašaras, pvz., pridedama 0,5 % (sausoji mas ė) smulkiai sumalt ų 
lapų, pvz., didžiosios dilg ėlės (Urtica dioeca ), baltojo šilkmedžio ( Morus 
alba), persinio dobilo ( Trifolium repens ), daržinio špinato ( Spinacia 
oleracea ) arba galima naudoti kit ą augalinę medžiag ą (Cerophyl  arba alfa 
celiuliozę). 
Inkubacijos s ąlygos  
32. Rekomenduojama vis ų pirma 24 valandas po lerv ų įdėjimo nestipriai aeruoti 
bandymo ind ų paviršin į vandenį ir vėliau aeruojama per vis ą bandymo 
atlikimo trukm ę (privaloma steb ėti, ar ištirpusio deguonies koncentracijos 
vertė nėra mažesn ė negu 60 % soties ore vert ės (ASV)). Aeruojant naudo ­
jama stiklin ė Pastero pipet ė, pritvirtinta 2–3 cm virš nuos ėdų sluoksnio (t. y. 
vienas ar keli burbulai per sek.). Darant bandymus su lakiosiomis chemi ­
nėmis medžiagomis galima apsispr ęsti ir neaeruoti nuos ėdų–vandens 
sistemos.  
33. Atliekant bandym ą išlaikoma pastovi 20 °C (± 2 °C) temperat ūra. Atliekant 
bandymą su C. tentans  ir C. yoshimatui  atitinkamai rekomenduojama pasi ­
rinkti 23 °C(± 2 °C) temperat ūrą. Naudojamas 16 val. apšvietimo laiko ­
tarpis; šviesos intensyvumo vert ės turėtų būti 500–1 000 liuks ų. 
Poveikio trukm ė 
34. Poveikis prasideda lervas įdėjus į indus su bandom ąją chemine medžiaga ir 
kontrolini ų ėminių indus. Jeigu naudojami  C. riparius  ir C. yoshimatsui , 
poveikio trukm ė yra 28 dienos, o kai pasirenkama  C. tentans  – 65 dienos. 
Jeigu mašalai atsiranda anks čiau, bandym ą galima nutraukti ne anks čiau 
negu po penki ų dienų atsiradus paskutiniam kontrolin ės grupės suaugu ­
siajam.  
STEBĖJIMAI  
Lervų išsinėrimas  
35. Nustatoma vystymosi trukm ė ir bendras vis ų iki galo išsin ėrusių mašalų 
patinų ir patelių skaičius. Patin ėliai lengviau atpaž įstami žiūrint į jų plunks­
niškus čiuptuvėlius. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Bandymo indai tur ėtų būti stebimi bent tris kartus per savait ę siekiant 
nustatyti bet koki ą neįprastą veikseną (pvz., nuos ėdų susidarym ą, neįprastą 
plūduriavimą) palyginti su kontroliniais indais. Numatomo lerv ų išsinėrimo 
laikotarpiu b ūtina skaičiuoti kasdien ą atsirandan čius mašalus. Kiekvien ą 
dieną registruojami visi atsirad ę mašalai ir nurodoma j ų lytis. Nusta čius 
tapatybę mašalai pašalinami iš ind ų. Turėtų būti registruojamos visos prieš 
užbaigiant bandym ą padėtos kiaušin ėlių masės ir po to pašalinamos, kad 
lervos pakartotinai neb ūtų įdėtos į nuosėdas. Taip pat registruojamas 
matomų lėliukų skaičius, kurios n ėra išsiritusios. Išsinerian čių lervų skaičia­
vimo gair ės pateiktos 5 pried ėlyje. 
Augimas ir išgyvenimas  
37. Jeigu privaloma pateikti duomenis apie 10 par ų lervų išlikimą ir augim ą, iš 
pradžių turi būti įtraukiami papildomi bandymo indai, kad juos b ūtų galima 
naudoti v ėliau. Šių papildom ų indų nuosėdos sijojamos 250 μm sietu 
siekiant surinkti lervas. Gaišimo kriterijai yra nejudumas ar nepakankamas 
atsakas į mechaninius dirgiklius. Neatsigavusios lervos taip pat tur ėtų būti 
laikomos nugaišusiomis (bandymo pradžioje nugaišusios lervos gal ėjo būti 
žuvusios nuo mikrob ų). Nustatoma bandymo inde išgyvenusi ų lervų sausoji 
masė (be pelen ų) ir apskai čiuojama vidutin ė pavienio indo sausoji mas ė. 
Tikslinga nustatyti, kurios stadijos yra išgyvenusi lerva; šiuo tikslu galima 
matuoti kiekvieno individo galvos apvalkalo plot į. 
Analiziniai matavimai  
Bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija  
38. Bandymo pradžioje (geriausiai b ūtų vieną valandą po bandomosios 
cheminės medžiagos įterpimo) ir jo pabaigoje rekomenduojama analizuoti 
bent paviršinio vandens, por ų vandens ir nuos ėdų ėminius esant didžiausiai 
koncentracijai ir mažesnei koncentracijai. Nusta čius bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracij ą gaunama informacijos apie bandomosios chemin ės 
medžiagos elgsen ą ir (arba) pasiskirstym ą vandens–nuos ėdų sistemoje. 
Bandymo pradžioje imant nuos ėdų ėminius gali b ūti padarytas poveikis 
bandymo sistemai (pvz., pašalinamos bandomosios lervos); vadinasi, tur ėtų 
būti naudojami papildomi bandymo indai siekiant bandymo pradžioje ir j į 
atliekant, jeigu reikia, atlikti analizinius nustatymus (žr. 39 pastraip ą). 
Nuosėdų matavim ų gali nereik ėti atlikti, jeigu bandomosios chemin ės 
medžiagos pasiskirstymas tarp vandens ir nuos ėdų buvo aiškiai apibr ėžtas 
atlikus vandens ir (arba) nuos ėdų tyrimą palyginamomis s ąlygomis (pvz., 
nuosėdų ir vandens santykis, poveikio tipas, organin ės anglies kiekis nuos ė­
dose).  
39. Jeigu atliekami tarpiniai matavimai (pvz., 7 dien ą) ir jeigu analizei atlikti 
reikalingi dideli ėminiai, kuriuos pa ėmus bandymo sistemai b ūtų padarytas 
poveikis, analiziniai nustatymai tur ėtų būti atliekami naudojant iš panašiai 
apdorotų papildom ų bandymo ind ų paimtus ėminius (įskaitant bandom ųjų 
organizm ų buvimą), tačiau biologiniam steb ėjimui nenaudot ų indų. 
40. Siekiant izoliuoti laisv ąjį vandenį rekomenduojama 30 min. taikyti centrifu ­
gavimą, pvz., 10 000 g ir 4 °C. Ta čiau jeigu įrodoma, kad bandomosios 
cheminės medžiagos filtrai neadsorbuoja, taip pat galima rinktis filtravim ą. 
Tam tikrais atvejais gali neb ūti įmanoma analizuoti por ų vandens koncent ­
racijų, nes ėminys yra pernelyg mažas.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Fiziniai ir cheminiai parametrai  
41. Tinkamu b ūdu turėtų būti matuojama bandymo induose esan čio bandymo 
vandens pH, ištirpusio deguonies ir temperat ūros vertės (žr. 10 pastraip ą). 
Bandymo pradžioje ir jo pabaigoje tur ėtų būti matuojama kontrolini ų ėminių 
ir vieno bandymo indo kietumo ir amoniako vert ės esant didžiausiai 
koncentracijai.  
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Rezultatų apdorojimas  
42. Šio bandymo tikslas – nustatyti bandomosios chemin ės medžiagos poveik į 
mašalų patelių ir patinėlių vystymosi grei čiui ir bendram j ų skaičiui, arba, 
jeigu atliekamas 10 par ų bandymas, poveik į lervų išgyvenimui ir j ų masei. 
Jeigu neturima duomen ų apie statistiniu poži ūriu skirting ą lyčių jautrumą, 
atliekant statistin ę analizę patinėlių ir pateli ų rezultatus galima sujungti. 
Apie lyčių jautrumo skirtumus galima spr ęsti naudojant statistines prie ­
mones, pvz., atliekant χ 2 -r × 2 lentel ės bandym ą. Jeigu reikia, po 10 par ų 
turi būti nustatomas lerv ų išgyvenimas ir vidutin ė kiekvieno indo sausoji 
masė. 
43. Paviršinio vandens koncentracijomis išreikštos poveikio koncentracijos vis ų 
pirmiausiai apskai čiuojamos remiantis bandymo pradžioje išmatuotomis 
koncentracijomis (žr. 38 pastraip ą). 
44. Norint apskai čiuoti EC  50 arba bet kokio kito EC  x taškinį įvertį indo statisti ­
nius duomenis leidžiama naudoti kaip patikimus kartotinius duomenis. 
Apskaičiuojant kiekvieno EC  x pasikliovimo interval ą turėtų būti atsižvel ­
giama į kiekvieno indo skirtingum ą arba būti įrodoma, kad šis kintamumas 
yra toks mažas, kad jo galima nepaisyti. Jeigu modeliui taikomas mažiau ­
siųjų kvadratų metodas, kiekvieno indo statistikos duomenims taikoma 
transformacija siekiant pagerinti dispersijos vienalytiškum ą. Tačiau EC  x 
vertės turėtų būti apskaičiuojamos atsak ą transformavus į pradinę vertę. 
45. Jeigu taikant statistin ę analizę siekiama apibr ėžti NOEC/LOEC ir šiuo tikslu 
tikrinama hipotez ė, turi būti atsižvelgiama į su indais susijus į skirtingum ą, 
pvz., įterpiant ANOVA. Antraip jeigu susiklosto situacijos, kad įprastos 
ANOVA prielaidos gali b ūti pažeidžiamos, galima naudoti išsamesnius 
bandymus (21).  
Išsinėrimo santykis  
46. Išsin ėrimo santykiai yra kiekybiniai duomenys ir juos galima analizuoti 
atliekant Cochran-Armitage bandym ą, taikom ą mažėjimo tvarka, jeigu 
laikoma, kad doz ės ir atsakos santykis b ūsiąs monotoniškas ir šie duomenys 
atitinka min ėtą prielaidą. Jeigu ne, šiuo atveju leidžiama rinktis Fisher arba 
Mantel-Haentzal bandym ą su pakoreguotomis pagal Bonferroni-Holm p 
vertėmis. Jeigu turima įrodymų, kad naudojant t ą pačią koncentracij ą karto­
tinių ėminių kintamumas yra didesnis negu b ūtų galima nustatyti atsižvel ­
giant į binomin į skirstinį (dažnai vadinam ą „pertekline dispersija“), šiuo 
atveju tur ėtų būti pasirenkamas (21) pasi ūlytas išsamus Cochran-Armitage 
arba Fisher bandymas.  
47. Viename inde išsiritusi ų mašalų skaičius ne nustatomas ir dalinamas iš įdėtų 
lervų skaičiaus n  a : 
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
kur: 
ER = išsin ėrimo santykis  
n e = viename inde išsin ėrusių mašalų skaičius 
n a = į indą įdėtų lervų skaičius 
48. Jeigu ėminiai yra dideli ir jeigu nustatoma perteklin ė dispersija, šiuo atveju 
galima rinktis kit ą alternatyv ą, t. y. išsin ėrimo santyk į laikyti nenutr ūksta­
muoju atsaku ir rinktis Williamso bandym ą, jeigu daroma prielaida, kad 
atsakas į dozę būsiąs monotoninis ir atitiksi ąs šiuos ER duomenis. Jeigu 
monotoniškumas n ėra užtikrinamas, pirmenyb ė teiktina Duneto bandymui. 
Didelio ėminio dydis šiuo atveju apibr ėžiamas išsin ėrusių mašalų ir neišsi­
nėrusių mašalų skaičiumi, kuris abiem atvejais viršija penkis, atsižvelgiant į 
kartotinį ėminį (indą). 
49. Norint taikyti ANOVA metod ų vertes, ER vert ės pirmiausiai tur ėtų būti 
transformuojamos naudojant arksinuso kvadratin ės šaknies transformacij ą 
arba Tukey-Freeman transformacij ą siekiant gauti apytiksl į įprastą skirstinį 
ir suvienodinti dispersijas. Leidžiama naudoti Cochran-Armitage, Fisherio 
(Bonferroni) arba Mantel-Haentzal bandymus, jeigu taikomi absoliutieji 
dažniai. Arksinuso kvadratin ės šaknies transformacija taikoma pasirenkant 
ER vertės kvadratin ės šaknies arksinus ą (sin  –1 ). 
50. Išsin ėrimo santyki ų EC  x vertės apskaičiuojamos naudojant regresijos analiz ę 
(arba, pvz., probit (22), logit, Weitbull, atitinkam ą komercin ę programin ę 
įrangą ir t. t.). Jeigu regresijos analiz ė nepavyksta (pvz., jeigu t ėra mažiau 
negu du daliniai atsakai), naudojami kiti ne parametriniai metodai, pvz., slankiojo vidurkio metodas ar interpoliacijos metodas.
 
Vystymosi greitis  
51. Vidutin ė vystymosi trukm ė yra vidutinis laikotarpis nuo lerv ų įdėjimo 
(nulinė bandymo diena) ir iki eksperimentin ės mašalų kohortos išsin ėrimo. 
(Apskaičiuojant tikr ąją vystymosi trukm ę turėtų būti atsižvelgiama į lervų 
amžių, kai jos buvo įdedamos). Vystymosi greitis yra atvirkštinis dydis 
vystymosi trukm ės atžvilgiu (vienetas: 1/diena) ir atitinka t ą lervos vysty ­
mosi atkarp ą, kuris vyksta per vien ą dieną. Vystymosi grei čiui, palyginti su 
šių nuosėdų toksiškumo tyrim ų įvertinimu, teikiama pirmenyb ė, nes jo 
dispersija yra mažesn ė, ir jis vienalytiškesnis bei glaudžiau atitinka įprastą 
pasiskirstym ą, jeigu lyginama su vystymosi trukme. Vadinasi, leidžiama 
veikiau rinktis patikim ą parametrin į bandym ą su vystymosi grei čiu negu 
su vystymosi trukme. Vystymosi grei čio kaip nenutr ūkstamo atsako EC  x 
vertes galima įvertinti naudojant regresijos analiz ę (pvz., (23), (24)).  
52. Atliekant šiuos statistinius tyrimus laikoma, kad tikrinimo x dien ą pastebėtas 
mašalų skaičius išsinėrė per vidutin į laiko interval ą nuo x dienos iki x-1 
dienos (l = tikrinimo intervalo trukm ė (paprastai viena diena)). Vienam indui 
taikoma vidutin ė vystymosi grei čio vertė (x) apskaičiuojama pagal ši ą lygtį: 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
kur: 
x: indui taikoma vidutin ė vystymosi grei čio vertė 
i: tikrinimo intervalo indeksas  
m: didžiausias tikrinimo interval ų skaičius ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : per tikrinimo interval ą i išsinėrusių mašalų skaičius 
n e : bendras eksperimento pabaigoje išsin ėrusių mašalų skaičius (= P ƒ i ) 
x i : per interval ą i išsinėrusių mašalų vystymosi greitis  
x i ¼ 1= Í 
diena  i Ä l i 
2 Î 
kur: 
diena  i : tikrinimo diena (diena po poveikio)  
l i : tikrinimo intervalo i trukm ė (dienos, paprastai 1 diena)  
Bandymo ataskaita  
53. Į bandymo ataskait ą turi būti įtraukiama bent ši informacija:  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— fizinis pob ūdis ir, jeigu reikia, fizin ės bei chemin ės savybės (tirpumas 
vandenyje, gar ų slėgis, pasiskirstymo dirvoje koeficientas (ar nuos ėdose, 
jeigu žinomas), stabilumas vandenyje ir t. t.),  
— chemin ės tapatyb ės nustatymo duomenys (bendrinis pavadinimas, 
cheminis pavadinimas, strukt ūrinė formulė, CAS numeris ir t. t.), įskai­
tant grynum ą ir analin ės metodas atliekant bandomosios chemin ės 
medžiagos kiekybin į nustatym ą. 
Bandomosios r ūšys: 
— naudojami bandomieji gyv ūnai: rūšis, mokslinis pavadinimas, organizmo 
gavimo šaltinis ir veisimo s ąlygos,  
— informacija apie kiaušin ėlių masės ir lervų tvarkymą, 
— gyvūnų amžius, kai jie buvo įdėti į bandymo indus.  
Bandymo s ąlygos:  
— naudotos nuos ėdos, t. y. nat ūralios ar sintetin ės nuosėdos, 
— jei naudojamos nat ūralios nuos ėdos, nuos ėdų ėminių ėmimo vieta ir jos 
aprašymas, įskaitant, jeigu įmanoma, taršos aprašas; charakteristikos: pH, 
organinės anglies kiekis, C/N santykis ir granuliometrin ė analizė (jeigu 
reikia),  
— sintetini ų nuosėdų pasiruošimas: sudedamosios dalys ir charakteristikos 
(organinės anglies kiekis, pH, dr ėgmė ir t. t. bandymo pradžioje),  
— bandymo vandens pasiruošimas (jeigu naudojamas regeneruotas vanduo) 
ir charakteristikos (deguonies koncentracija, pH. Laidumas, kietumas ir t. 
t. bandymo pradžioje),  
— nuosėdų ir vandens sluoksni ų storis,  
— paviršinio vandens ir por ų vandens t ūris; drėgnųjų nuosėdų masė su 
porų vandeniu ir be jo,  
— bandymo indai (medžiaga ir dydis),  
— pradini ų tirpalų ruošimo metodai ir bandomosios koncentracijos,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— bandomosios chemin ės medžiagos taikymas: naudotos bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracijos, kartotini ų ėminių skaičius ir naudoti 
tirpikliai, jeigu buvo naudoti,  
— inkubacijos s ąlygos: temperat ūra, šviesos ciklas ir intensyvumas, aeracija 
(dažnumas ir intensyvumas),  
— išsami informacija apie pašar ą, įskaitant jo tip ą, paruošim ą, kiekį ir 
maitinimo tvark ą. 
Rezultatai:  
— nominaliosios bandomosios koncentracijos, išmatuotos bandomosios 
koncentracijos ir vis ų analizių rezultatai siekiant bandymo inde nustatyti 
bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą, 
— vandens kokyb ė bandymo induose, t. y. pH, temperat ūra, ištirp ęs 
deguonis, kietumas ir amoniako kiekis,  
— išgaruojan čio bandymo vandens papildymas, jeigu taikoma,  
— iš kiekvieno indo per dien ą išsinėrusių mašalų patinų ir patelių skaičius, 
— lervų, kurios iš indo neišsin ėrė kaip mašalai, skai čius, 
— vidutin ė pavienė lervų sausoji mas ė inde ir tam tikros stadijos lerv ų 
sausoji mas ė inde, jeigu reikia,  
— išsinėrusių mašalų skaičius atliekant tapat ų bandym ą ir bandomoji 
koncentracija (mašal ų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),  
— atliekant tapat ų bandymą išsinėrusių mašalų vidutinis vystymosi greitis ir 
apdorojimo norma (mašal ų patinėlių ir patelių skaičius sujungtas),  
— toksinio poveikio įvertinimai, pvz., EC  x (ir susiję pasikliovimo inter ­
valai), NOEC ir (arba) LOEC bei jiems nustatyti naudoti statistikos metodai,
 
— rezultat ų aptarimas, įskaitant bet kok į poveikį bandymo rezultatams, 
kuris būtų padarytas nukrypus nuo šio bandymo metodo.  
LITERAT ŪRA 
1. BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. 
Köpp. Berlin 1995.  
2. Fleming R  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK.
 
3. SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioas ­
says for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands.
 
4. ASTM International/E1706–00 (2002). Test Method for Measuring the Toxi ­
city of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 
1125–1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
 
5. Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997.  
6. US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second 
edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated 
June 1994.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
7. US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inverte ­
brates.  
8. US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
9. Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxi ­
city using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chiro­
nomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontario, Canada.
 
10. Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides  
in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
11. Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
12. OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and SAFEty Publica ­
tions, Series on Testing and Assessment No. 23.  
13. Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxi ­
city Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxi ­
cant. Report EPS 1/RM/30. September 1995.  
14. Šio priedo C.8 skyrius. Toksiškumas sliekams.  
15. Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
16. Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chiro ­
nomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.  
17. Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.  
18. Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482–491.  
19. Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117.
 
20. Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose 
control. Biometrics 28: 510–531.  
21. Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered 
binary data. Biometrics 48:577–585.  
22. Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
23. Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485–1494.  
24. Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
1 priedėlis 
SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS  
Šiame metode vartojam ų terminų apibrėžtys:  
Pasiruoštosios nuos ėdos ar regeneruotos, dirbtin ės arba sintetin ės nuosėdos yra 
natūralių nuosėdų fizines sudedam ąsias dalis atitinkan čių medžiag ų mišinys.  
Paviršinis vanduo  – bandymo inde ant nuos ėdų užpiltas vanduo.  
Laisvasis vanduo  ar porų vanduo – ertmes tarp nuos ėdų ir dirvožemio kiet ųjų 
dalelių užpildantis vanduo.  
Vanduo su įterpta bandom ąja chemine medžiaga  – bandymo vanduo, į kurias 
prileista bandomosios chemin ės medžiagos.  
Bandomoji chemin ė medžiaga  – bet kokia naudojant š į bandymo metod ą 
tiriama chemin ė medžiaga ar mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
2 priedėlis 
Rekomendacijos d ėl Chironomus riparius  auginimo  
1. Chironomus  lervas galima auginti kristalizatoriuose ar didel ėse talpyklose. 
Ant talpyklos dugno plonu sluoksniu (5–10 mm storio) paskleidžiamas smulkus kvarco sm ėlis. Taip pat įrodyta (pvz., Merck, Art 8117), kad diato ­
mitas yra tinkamas substratas (pakanka plonesnio sluoksnio, vos keli ų mm 
storio). Po to įpilamas keli ų centimetr ų storio vandens sluoksnis. Jeigu 
reikia, įpilama papildomo vandens, kad b ūtų atkuriamas išgarav ęs kiekis ir 
užkertamas kelias džiuvimui. Jeigu reikia, vanden į leidžiama pakeisti. Tur ėtų 
būti užtikrinamas nuosaikus aeravimas. Lerv ų auginimo indai tur ėtų būti 
laikomi tinkamuose narvuose, kad išsin ėrę suaugusieji vabzdžiai nepaj ėgtų 
pasprukti. Narvas tur ėtų būti ganėtinai erdvus, kad gal ėtų spiestis išsin ėrę 
suaugusieji vabzdžiai; antraip populiacija gali nesusiformuoti (mažiausi matmenys yra 30 × 30 × 30 cm).
 
2. Narvai tur ėtų būti laikomi kambario temperat ūroje arba pastovi ų aplinkos 
sąlygų patalpoje 20 ± 2 °C temperat ūroje; šviesiojo laikotarpio trukm ė 16 
val. (šviesos intensyvumas apie 1 000 liuks ų), 8 val. tamsos. Parengta atas ­
kaitų, kuriose nurodoma, kad jeigu oro dr ėgnumas yra mažesnis negu 60 % 
RH, gali sumaž ėti reprodukcija).  
Skiedimo vanduo  
3. Leidžiama naudoti bet kok į tinkamą natūralų ar sintetin į vandenį. Paprastai 
naudojamas šulinio vanduo, vanduo, iš kurio pašalintas chloras, ir dirbtin ės 
terpės (pvz., Elendt „M4“ arba „M7“ priemon ė, žr. toliau). Prieš naudojant 
vanduo turi b ūti aeruojamas. Jeigu b ūtina, kult ūrų auginimo vanden į 
leidžiama atnaujinti pilant panaudot ą vandenį iš kultūrų auginimo ind ų ar 
jį leidžiant per sifon ą; būtina stengtis nepažeisti lerv ų vamzdži ų. 
Lervų šėrimas  
4. Chironomus  lervos tur ėtų būti šeriamos žuv ų maisto dribsniais (Tetra Min®, 
Tetra Phyll® arba kita panašia patentuota žuv ų maisto rūšimi); vienam indui 
per dieną skiriama apie 250 mg pašaro. Maist ą galima pateikti saus ą, 
sumaltą milteliais arba kaip vandens suspensij ą: 1,0 g maisto dribsni ų 
įdedama į 20 ml skiedimo vandens ir išmaišoma, kol gaunamas vienalytis 
mišinys. Šio ruošinio apie 5 ml per dien ą leidžiama įdėti į kiekvien ą indą 
(prieš naudojant b ūtina pakratyti). Vyresn ėms lervoms b ūtina duoti daugiau 
pašaro.  
5. Šėrimas koreguojamas atsižvelgiant į vandens kokyb ę. Jeigu auginimo terp ė 
„susidrums čia“, duodamo pašaro kiekis tur ėtų būti sumažinamas. Duodamo 
pašaro kiekiai turi b ūti kruopščiai stebimi. Jeigu duodamas per mažas pašaro 
kiekis, lervos persikelia į vandens storym ę, o skiriant per daug pašaro suin ­
tensyvėja mikroorganizm ų veikla ir sumaž ėja deguonies koncentracija. 
Abiejų tipų sąlygomis gali sumaž ėti augimo greitis.  
6. Ruošiant naujus kult ūrų auginimo indus į juos taip pat galima šiek tiek įdėti 
žaliųjų dumblių (pvz.,  Scenedesmus subspicatus , Chlorella vulgaris ). 
Išsinėrusių suaugusi ųjų mašalų šėrimas  
7. Kai kurie tyrin ėtojai pasi ūlė, kad išsin ėrusius suaugusius mašalus b ūtų 
galima šerti naudojant prisotintame sacharoz ė tirpale išmirkytus vilnos 
tamponus.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Lervų išsinėrimas  
8. Suaug ę mašalai ima rastis iš lerv ų auginimo ind ų po 13–15 dien ų 20 ± 2 °C 
temperatūroje. Patin ėliai lengviau atpaž įstami žiūrint į jų plunksniškus čiup­
tuvėlius. 
Kiaušinėlių masė 
9. Kol suaug ę mašalai b ūna veisimo narve, visi lerv ų auginimo indai tur ėtų 
būti tikrinami tris kartus per savait ę, ar juose n ėra drebučių pavidalo kiau ­ 
šinėlių masės. Jeigu randama šios kiaušin ėlių masės, ji turėtų būti atsargiai 
pašalinta. Kiaušin ėliai turėtų būti sudedami į mažą indelį su veisimo 
vandens ėminiu. Kiaušin ėlių masė naudojama pradedant inde auginti nauj ą 
kultūrą (pvz., 2–4 kiaušin ėlių masė viename inde) arba atliekant toksiškumo 
bandymus.  
10. Pirmos stadijos lervos tur ėtų išsiristi po 2–3 dien ų. 
Naujų kultūrų auginimo ind ų ruošimas  
11. Išauginus kult ūras turėtų būti įmanoma kiekvien ą savaitę ar rečiau paruošti 
naują lervų kultūros auginimo ind ą atsižvelgiant į bandymo atlikimo reika ­
lavimus ir pašalinant senesnius indus, kai išsineria suaug ę mašalai. Taikant 
šią sistemą mažomis pastangomis reguliariai tiekiami suaug ę mašalai.  
Bandymo tirpal ų „M4“ ir „M7“ ruošimas  
12. Elendtas (1990) apraš ė „M4“ terp ę. „M7“ terp ė ruošiama kaip „M4“ terp ė, 
išskyrus 1 lentel ėje išvardytas chemines medžiagas, kuri ų koncentracijos 
„M7“, palyginti su „M4“, yra keturis kartus mažesn ės. Leidinys apie 
„M7“ terp ę yra rengiamas (Elendto pateiktas pranešimas). Bandomasis 
tirpalas netur ėtų būti ruošiamas pagal Elendt ą ir Bias (1990), jeigu norima 
gauti NaSiO  3 5 H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 ir K  2 HPO  4 koncentracijas, nes 
pradinių tirpalų ruošimas n ėra tapati veikla.  
Terpės „M7“ ruošimas  
13. Kiekvienas pradinis tirpalas (I) paruošiamas atskirai ir iš ši ų pradinių 
tirpalų (I) paruošiamas kombinuotasis pradinis tirpalas (II) (žr. 1 lentel ę). 
50 ml kombinuotojo pradinio tirpalo (II) ir 2 lentel ėje nurodyti kiekvieno 
makroelement ų pradinio tirpalo kiekiai skiedžiami iki 1 litro dejonizuoto 
vandens, kad taip b ūtų pasiruošta „M7“ terp ė. Vitamin ų pradinis tirpalas 
pasiruošiamas į dejonizuot ą vandenį įmaišius tris vitaminus kaip nurodyta 
3 lentelėje ir 0,1 ml kombinuotojo vitamin ų pradinio tirpalo įmaišoma į 
galutinę „M7“ terp ę prieš pat naudojimo pradži ą. (Vitamin ų pradinis tirpalas 
laikomas sušaldytas mažomis alikvotin ėmis dalimis). Terp ė aeruojama ir 
stabilizuojama.  
1 lentelė 
M4 ir M7 terpei skirt ų mikroelement ų pradiniai tirpalai  
Pradiniai tirpalai (I)  Kiekis (mg), 
praskiedžiamas 
iki 1 litro dejoni ­
zuoto vandens  Ruošiant kombinuot ą pradinį 
tirpalą (II): maišomi nurodyti 
pradinių tirpalų (I) kiekiai (mg) ir 
praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto 
vandens  Galutinės bandom ųjų tirpalų 
koncentracijos (mg/l)  
M4 M7  M4  M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190  1,0  0,25  2,86  0,715  
MnCl  2 • 4 H  2 O (  1 ) 7 210  1,0  0,25  0,361  0,090  
LiCl (  1 ) 6 120  1,0  0,25  0,306  0,077  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Pradiniai tirpalai (I)  Kiekis (mg), 
praskiedžiamas 
iki 1 litro dejoni ­
zuoto vandens  Ruošiant kombinuot ą pradinį 
tirpalą (II): maišomi nurodyti 
pradinių tirpalų (I) kiekiai (mg) ir 
praskiedžiami iki 1 litro dejonizuoto 
vandens  Galutinės bandom ųjų tirpalų 
koncentracijos (mg/l)  
M4 M7  M4  M7  
RbCl (  1 ) 1 420  1,0  0,25  0,071  0,018  
SrCl  2 • 6 H  2 O (  1 ) 3 040  1,0  0,25  0,152  0,038  
NaBr (  1 ) 320  1,0  0,25  0,016  0,004  
Na 2 MoO  4 • 2 H  2 O (  1 ) 1 260  1,0  0,25  0,063  0,016  
CuCl  2 • 2 H  2 O (  1 ) 335  1,0  0,25  0,017  0,004  
ZnCl  2 260 1,0  1,0  0,013  0,013  
CaCl  2 • 6 H  2 O 200  1,0  1,0  0,010  0,010  
KI 65  1,0  1,0  0,0033  0,0033  
Na 2 SeO  3 43,8 1,0  1,0  0,0022  0,0022  
NH  4 VO  3 11,5 1,0  1,0  0,00058  0,00058  
Na 2 EDTA • 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000  20,0  5,0  2,5  0,625  
FeSO4 • 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991  20,0  5,0  1,0  0,249  
( 1 ) Šios medžiagos skiriasi M4 ir M7 kaip pirmiau nurodyta. 
( 2 ) Šie tirpalai ruošiami atskirai, tada sumaišomi ir nedelsiant apdorojami autoklave.  
2 lentelė 
M4 ir M7 terp ėms skirti makroelement ų pradiniai tirpalai  
Kiekis praskiedžiamas 
iki 1 litro dejonizuoto 
vandens 
(mg)  Ruošiant M4 ir M7 terp ę 
įdedamas makroelement ų 
pradinių tirpalų kiekis 
(ml/l)  Galutinės bandom ųjų 
tirpalų M4 ir M7 
koncentracijos 
(mg/l)  
CaCl  2 • 2 H  2 O 293 800  1,0  293,8  
MgSO  4 • 7 H  2 O 246 600  0,5  123,3  
KCl 58 000  0,1  5,8  
NaHCO  3 64 800  1,0  64,8  
NaSiO  3 • 9 H  2 O 50 000  0,2  10,0  
NaNO  3 2 740  0,1  0,274  
KH  2 PO 4 1 430  0,1  0,143  
K 2 HPO  4 1 840  0,1  0,184  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
3 lentelė 
M4 ir M7 terpei skirtas vitamin ų pradinis tirpalas  
Visi trys vitamin ų tirpalai maišomi siekiant paruošti vien ą vitaminų pradinį tirpalą. 
Kiekis praskiedžiamas 
iki 1 litro dejonizuoto 
vandens 
(mg)  Ruošiant M4 ir M7 terp ę 
įdedamas vitamin ų pradinio 
tirpalo kiekis 
(ml/l)  Galutinės bandom ųjų 
tirpalų M4 ir M7 
koncentracijos 
(mg/l)  
Tiamino hidrochloridas  750  0,1  0,075  
Ciankobalaminas (B12)  10  0,1  0,0010  
Biotinas  7,5  0,1  0,00075  
LITERAT ŪRA 
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25–33.  
Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
3 priedėlis 
SINTETINI Ų NUOSĖDŲ RUOŠIMAS  
Nuosėdų sudėtis 
Sintetinės nuosėdos turėtų būti sudarytos iš ši ų sudedam ųjų dalių: 
Sudedamoji dalis  Charakteristikos  nuosėdų sausosios 
procentin ė dalis)  
Durpės Naujosios Zelandijos kimin ų 
durpės, jų pH kiek įmanoma 
atitinka 5,5–6,0, joki ų augalų 
matomų liekanų, smulkiai 
sumaltos (kiet ųjų dalelių 
dydis ≤ 1 mm), džiovintos 
ore 4–5 
Kvarcinis sm ėlis Gr ūdelių dydis: > 50 % 
dalelių dydžio vert ės inter­
valas turėtų būti 0–200 μm 75–76  
Kaolito molis  Kaolinito kiekis ≥ 30 %  20  
Organinė anglis  Pakoreguota pridedant durpi ų 
ir smėlio 2 (±0,5)  
Kalcio karbonatas  CaCO  3 , milteliai, cheminiu 
atžvilgiu grynas  0,05–0,1  
Vanduo  Laidumas ≤ 10 μS/cm  30–50  
Pasiruošimas  
Durpės džiovinamos ore ir malamos tol, kol gaunami smulk ūs milteliai. Suspen ­
sija iš nustatyto durpi ų miltelių kiekio ir dejonizuoto vandens pasiruošiama 
didelio našumo homogenizavimo įrenginiu. Naudojant CaCO  3 koreguojama, 
kad šios suspensijos pH vert ė būtų 5,5 ± 0,5. Švelniai maišant suspensija kondi ­
cionuojama ne trumpiau negu dvi dienas 20 ± 2 °C temperat ūroje siekiant stabi ­
lizuoti pH ir paruošti stabili ą mikroorganizm ų populiacij ą. pH matuojama dar 
kartą ir jo vert ė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Tada durpi ų suspensija maišoma su kitomis 
sudedamosiomis dalimis (sm ėliu ir kaolino moliu) ir dejonizuotu vandeniu 
siekiant gauti vienalytes nuos ėdas, kuriose vandens kiekis sudaro 30—50 % 
sausosios mas ės. Dar kart ą matuojama galutinio mišinio pH vert ė ir, jeigu reikia, 
naudojant CaCO  3 koreguojama, kol pH vert ė ima atitikti 6,5–7,5 vert ę. Imami 
nuosėdų ėminiai siekiant nustatyti saus ąją masę ir organin ės anglies kiek į. Taip 
pat rekomenduojama, kad prieš pradedant nuos ėdas naudoti chironomid ų toksiš­
kumo bandymui, sintetin ės nuosėdos būtų kondicionuojamos septynias dienas 
tomis pačiomis sąlygomis, kurios taikomos kitam bandymui.  
Sandėliavimas  
Sintetinių nuosėdų ruošimo visas sudedam ąsias sausas dalis galima laikyti 
sausoje ir v ėsioje vietoje kambario temperat ūroje. Sintetin ės (drėgnos) nuos ėdos 
neturėtų būti sandėliuojamos prieš jas imant naudoti atliekamam bandymui. Jos 
turėtų būti naudojamos iš karto po 7 dienas trukusio kondicionavimo laikotarpio, 
kuriuo baigiamas ruošimo etapas.  
LITERAT ŪRA 
Chapter C.8 of this Annex. Toxicity for Earthworms.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial MEDIA. Ecotox. and Environ. 
SAFEty 39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
4 priedėlis 
Tinkamo skiedimo vandens chemin ės charakteristikos  
Cheminė medžiaga  Koncentracijos  
Kietosios dalel ės < 20 mg/l  
Bendroji organin ė anglis  < 2 mg/l  
Nejonizuotas amoniakas  < 1 mg/l  
Kietumas (kaip CaCO  3 ) < 400 mg/l (*)  
Liekamasis chloras  < 10 mg/l  
Suminis organini ų fosforo pesticid ų kiekis  < 50 ng/l  
Suminis organini ų chloro pesticid ų ir polichlorint ų 
bifenilų kiekis  < 50 ng/l  
Suminis organinio chloro kiekis  < 25 ng/l  
(*) Tačiau jeigu galima daryti prielaid ą, kad vandens kietumo jonai gali s ąveikauti su 
bandomąja chemine medžiaga, tur ėtų būti naudojamas mažesnio kietumo vanduo (vadi ­
nasi, šiuo atveju neleidžiama rinktis Elendt Medium M4).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
5 priedėlis 
Chironomid ų lervų išsiritimo steb ėjimo gair ės 
Į bandymo stiklines įdedamos išsiritimo gaudykl ės. Gaudykl ės reikalingos nuo 20 
dienos iki bandymo pabaigos. Gaudykl ės brėžinio pavyzdys pateiktas toliau:
  
A: nailono ekranas  
B: apversti plastiko gaubtai  
C: bebriaun ė laboratorin ė poveikio stiklin ė D: vandens keitimo ekrano angos  
E: vanduo  
F: nuos ėdos ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  LENGVAS BIOLOGINIS SKAIDUMAS. CO  2 SANDARIUOSE 
INDUOSE (VIRŠUTIN ĖS ERDV ĖS TYRIMAS)  
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 310 (2006). 
Šis metodas yra atrankos metodas, kur į naudojant įvertinamas lengvas biolo ­
ginis chemini ų medžiag ų skaidumas, ir pateikiama panaši informacija 
šešiems bandymo metodams, aprašytiems šio priedo C.4 skirsnyje A–F dalyse. Tod ėl cheminę medžiagą, kurios rezultatai pagal š į bandymo metod ą 
yra teigiami, galima laikyti lengvai biologiškai skaidoma ir, vadinasi, spar ­ 
čiai suyran čia aplinkoje.
 
2. Bandant mažai tirpias chemines medžiagas ir gerai adsorbuojamas 
medžiagas, pirmiausiai b ūtų pasirenkamas gerai paruoštas anglies dioksido 
(CO  2 ) metodas (1), pagr įstas Sturmo originaliu bandymu (2), kuriuo orga ­
ninių cheminių medžiagų biologinis skaidumas vertinamas matuojant anglies 
dioksidą, kurį išskiria mikroorganizmai. Šis metodas taip pat pasirenkamas 
tiriant tirpi ąsias (tačiau ne laki ąsias) chemines medžiagas, nes anglies diok ­
sido išsiskyrim ą daugelis specialist ų laiko vieninteliu akivaizdžiu mikroor ­
ganizmų veiklos įrodymu. Ištirpusi ą organinę anglį galima šalinti taikant 
fizinius–cheminius procesus – adsorbcij ą, lakiųjų junginių šalinimą, nusodi­
nimą, hidrolizę – bei naudojant mikroorganizm ų veiklą ir daugel į ne biolo ­
ginių reakcijų, kurioms vykstant naudojamas deguonis; retais atvejais CO  2 iš 
organinių chemini ų medžiag ų išsiskiria vykstant abiotiniams procesams. 
Naudojant original ų ir modifikuot ą Sturmo bandym ą (1) (2) CO  2 į absor­
buojantį indą iš skystosios faz ės pašalinamas naudojant borbatavim ą (t. y. 
pučiant oro burbulus, kad CO  2 būtų šalinamas per skyst ą terpę), o pasirinkus 
Larsono (3) (4) CO  2 versiją CO  2 iš reakcijos indo į absorberius perkeliamas 
per viršutin ės erdvės orą, kuriame n ėra CO  2 , ir, be to, nenutr ūkstamai 
kratant bandymo ind ą. Reakcijos indas yra kratomas tik naudojant Larsono 
modifikacij ą; maišymas nurodomas tik netirpiosioms chemin ėms medžia ­
goms (žr. standart ą ISO 9439 (5)) ir originalioje JAV versijoje (6); abiejuose 
nurodomas veikiau borbatavimas negu viršutin ės erdvės pakeitimas. Kitame 
oficialiame JAV EPA metode (7), pagr įstame Gledhillo metodu (8), 
kratomas reakcijos indas užsandarinamas nuo atmosferos ir išsiskyr ęs CO  2 
surenkamas vidin ėje šarmin ėje gaudykl ėje tiesiogiai iš dujin ės fazės, kaip 
įprastose Warburg/Barcroft respiratorin ėse kolbose.  
3. Tačiau įrodyta, kad įprastą, modifikuot ą Sturmo bandym ą atliekant su tam 
tikromis chemin ėmis medžiagomis (9), neorganin ė anglis (IC) kaupiasi 
terpėje. Skaidant 20 mg C/l anilino nustatyta, kad IC koncentracija buvo 
gana didel ė, t. y. 8 mg/l. Vadinasi, šarmin ėse gaudykl ėse surenkamas CO  2 , 
iš tikrųjų neatitina viso to CO  2 kiekio, kuris mikrobiologiškai išskiriamas 
tarpiniais laikotarpiais, kai vyksta skaidymas. Tod ėl reikalavimas, kad > 
60 % teorinio didžiausio CO  2 išsiskirian čio ThCO  2 ) kiekio turi b ūti suren­
kama per „10 par ų langą“ (10 par ų iš karto po to, kai užtikrinamas 10 % 
biologinis skaidymas), jeigu bandom ąją cheminę medžiag ą ketinama laikyti 
lengvai biologiškai skaidoma, neb ūtų taikomas tam tikroms chemin ėms 
medžiagoms, kurios b ūtų klasifikuojamos atsižvelgiant į šalinamą ištirpusios 
organinės anglies (DOC) kiek į. 
4. Jeigu procentin ė skaidymo dalis yra mažesn ė negu tik ėtasi, IC, ko gero, 
kaupiasi bandomajame tirpale. Vadinasi, skaidomum ą galima nustatyti 
taikant kitus lengvo biologinio skaidumo bandymus.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Kiti Sturmo metodikos tr ūkumai (nepatogi, reikia gaišti daug laiko, lengvai 
įmanoma padaryti eksperimentin ę klaidą ir netaikoma lakiosioms chemin ėms 
medžiagoms) jau anks čiau paskatino kurti sandari ųjų indų metodiką, tačiau 
ne Gledhillo, o veikiau pratekan čių dujų (10) (11). Boatman ir kt. (12) 
apžvelgė ankstesnius metodus ir pri ėmė uždarosios viršutin ės erdvės 
sistemą, kurią taikant inkubacijos pabaigoje terp ė parūgštinama ir CO  2 išlei­
džiamas į viršutin ę erdvę. CO  2 kiekis matuotas naudojant duj ų 
chromatografijos (GC)/IC analiz ę; ėminiai automatiškai imti iš viršutin ės 
erdvės, tačiau nebuvo atsižvelgiama į skystosios faz ės ištirpusi ą neorganin ę 
anglį (DIC). Be to, buvo naudoti labai maži indai (20 ml), į kuriuos tilpdavo 
tik 10 ml terp ės, todėl sunkiai sekdavosi, pvz., įterpti reikiamus labai mažus 
netirpių bandomųjų cheminių medžiag ų kiekius, ir (arba) terp ėje su sėjimo 
kultūra galėdavo būti nepakankamas bandom ąsias chemines medžiagas 
galinčių suskaidyti mikroorganizm ų kiekis arba gal ėdavo jų apskritai neb ūti. 
6. Šie tr ūkumai pašalinti ėmus naudoti nepriklausomus Struijs ir Stoltenkamp 
(13) bei Birch ir Fletcher tyrimus; pastarieji tyr ėjai visų pirmiausiai r ėmėsi 
savo patirtimi naudojant aparat ą, būtiną atliekant anaerobin į biologinio skai ­
dymo bandym ą (15). Taikant ankstesn į metodą (13) CO  2 kiekis matuojamas 
viršutinėje erdvėje, kai užtikrinamas par ūgštinimas ir pusiausvyra, o pasi ­
rinkus pastar ąjį (14) matuojamas dujin ės ir skystosios faz ės DIC kiekis be 
apdorojimo; daugiau negu 90 % susiformavusio IC buvo skystosios faz ės. 
Abu metodai pranašesni už Sturmo bandym ą, nes pirm ųjų atveju bandymo 
sistema yra mažesn ė ir lengvai tvarkoma bei pritaikyti tirti laki ąsias 
chemines medžiagas ir nenumatyta galimyb ė atidėti susiformavusio CO  2 
kiekio matavim ą. 
7. Abu metodai įtraukti į ISO Viršutin ės erdvės CO  2 standartą (16), kuris 
patikrintas atliekant tarplaboratorinio lyginimo bandym ą (17), ir b ūtent šiuo 
standartu grindžiamas šis bandymo metodas. Šie du metodai taip pat įtraukti į 
JAV EPA metod ą (18). Rekomenduojama taikyti du CO  2 kiekio matavimo 
metodus, b ūtent CO  2 viršutinėje erdvėje po rūgštinimo (13) ir IC skystojoje 
fazėje, kai pridedama perteklinio šarmo. Pastar ąjį metodą pasiūlė Petersonas 
atliekant CONCAWE tarplaboratorinio lyginimo bandym ą (19), kai šis viršu ­
tinės erdvės metodas buvo modifikuotas siekiant matuoti savit ąjį biologin į 
skaidumą. Pakeitimai, padaryti šio priedo d ėl lengvo biologinio skaidumo 
C.4 skyriuje 1992 m. (20) persvarstant metodus, įtraukti į šį bandymo 
metodą, kad sąlygos (terp ė, trukmė ir t. t.) kitais atžvilgiais b ūtų tapačios 
persvarstyto Strumo bandymo (20) s ąlygoms. Birch ir Fletcher (14) įrodė, 
kad atliekant š į viršutinės erdvės bandym ą buvo gauti labai panaš ūs rezultatai 
kaip kad su tomis pa čioms chemin ėmis medžiagomis darant persvarstyt ų 
bandymo metod ų OECD tarplaboratorinio lyginimo bandym ą (21).  
BANDYMO METODO ESM Ė 
8. Bandomoji chemin ė medžiaga (paprastai 20 mg/l) – vienintelis anglies ir 
energijos šaltinis – inkubuojama į buferinę mineralini ų druskų terpę, į kurią 
įsėjama įvairių mikroorganizm ų populiacija. Bandymas atliekamas sanda ­
riose kolbose su viršutine oro erdve, kuri yra deguonies šaltinis aerobiniam 
biologiniam skaidymui. CO  2 išsiskyrimas vykstant visiškam bandomosios 
cheminės medžiagos biologiniam skaidymui nustatomas matuojant IC 
kiekį, išsiskyrus į bandymo kolbose ir viršijant į tuščiojo bandinio kolbose, 
į kurias įdėta tik terp ės su sėjimo kult ūra, išsiskiriant į IC kiekį. Biologinio 
skaidymo apimtis išreiškiama kaip teorinio didžiausio IC išsiskyrimo (ThIC) 
procentin ė dalis atsižvelgiant į iš pradži ų įdėtą bandomosios chemin ės 
medžiagos kiek į (kaip organin ės anglies).  
9. Taip pat galima matuoti pašalinam ą DOC kiek į ir (arba) bandomosios 
cheminės medžiagos pirminio biologinio skaidymo apimt į (20).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMACIJA APIE BANDOM ĄJĄ CHEMIN Ę MEDŽIAG Ą 
10. Bandomosios chemin ės medžiagos organin ės anglies kiekis (% w/w) turi 
būti žinomas arba atsižvelgiant į jos chemin ę struktūrą, arba nustatomas 
matuojant, kad b ūtų galima apskai čiuoti procentin ę skaidymo dal į. Jei tai 
lakiosios bandomosios chemin ės medžiagos, išmatuota ar apskai čiuota 
Henrio d ėsnio konstanta naudinga apibr ėžiant tinkam ą viršutinės erdvės 
skysčio tūrio santyk į. Informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos 
toksiškum ą mikroorganizmams praver čia pasirenkant tinkam ą tiriamąją 
koncentracij ą ir aiškinant maž ą biologin į skaidym ą patvirtinan čius rezul­
tatus: rekomenduojama įtraukti slopinimo nustatymo bandym ą, jeigu n ėra 
žinoma, ar bandomoji chemin ė medžiaga slopina mikroorganizm ų veiklą (žr. 
24 pastraip ą). 
METODO PRITAIKOMUMAS  
11. Šiuo bandymu tiriamos vandenyje tirpios ir netirpios bandomosios chemin ės 
medžiagos, tod ėl turėtų būti užtikrinama reikiama bandomosios chemin ės 
medžiagos dispersija. Pasirinkus viršutin ėje erdvėje rekomenduojam ą taikyti 
skysčio tūrio santyk į 1:2, galima bandyti laki ąsias chemines medžiagas, 
kurių Henrio d ėsnio konstanta yra 50 Pa.m  3 mol  –1 , nes šių bandom ųjų 
cheminių medžiag ų proporcija viršutin ėje erdvėje neviršys 1 % (13). Atlie ­
kant bandymus su lakesn ėmis chemin ėmis medžiagomis galima rinktis 
mažesnę viršutinę erdvę, tačiau šių medžiag ų biologinis pasisavinamumas 
gali būti apribotas tuo atveju, jeigu jos mažai tirpsta vandenyje. Ta čiau 
vartotojai turi užtikrinti, kad viršutin ės erdvės santykis su skys čio tūriu ir 
bandomosios chemin ės koncentracija b ūtų toks, jog užtekt ų deguonies 
visiško biologinio skaidymo procesui (pvz., nenaudoti didel ės substrato 
koncentracijos ir mažo viršutin ės erdvės tūrio). Gair ės dėl šio klausimo 
pateiktos (13) (23).  
ETALONIN ĖS CHEMIN ĖS MEDŽIAGOS  
12. Siekiant patikrinti bandymo proced ūrą tuo pačiu metu tur ėtų būti daromas 
bandymas naudojant etalonin ę cheminę medžiag ą, kurios biologinis skaido ­
mumas yra žinomas. Šiuo tikslu galima naudoti anilin ą, natrio benzoat ą ar 
etilenglikol į, jeigu tiriamos vandenyje tirpios bandomosios chemin ės 
medžiagos, ir 1-oktanol į tiriant mažai tirpias bandom ąsias chemines 
medžiagas (13). Ši ų cheminių medžiag ų biologinio skaidomumo vert ė per 
14 dienų turi atitikti > 60 % teorinio didžiausio neorganin ės anglies (IC) 
išsiskyrimo.  
ATKURIAMUMAS  
13. Atliekant ISO metodo (17) tarplaboratorinio lyginimo bandym ą nustatyti 
toliau pateikti rezultatai; j į atliekant taikytos rekomenduotos s ąlygos, įskai­
tant 20 mg anglies bandomosios chemin ės medžiagos litre.  
Bandomoji 
cheminė medžiaga  Vidutinė biologinio 
skaidymo procentin ė 
dalis 
(28d)  Variacijos koefi ­
cientas 
(%) Laboratorij ų 
skaičius 
Anilinas  90  16  17  
1-oktanolis  85  12  14  
Kintamumo (atkartojamumo) vert ė atliekant bandym ą su anilinu buvo maža 
ir variacijos koeficientai atliekant beveik visus bandymus nebuvo didesni negu 5 %. Šiais dviem atvejais, kai atkartojamumas buvo mažas, didesn į 
kintamum ą, ko gero, suk ėlė didesnis išsiskiriantis IC kiekis tuš čiojo 
bandinio kolbose. Atkartojamumo vert ė buvo mažesn ė darant bandymus 
su 1-oktanoliu, ta čiau vis d ėlto mažesn ė negu 10 % iš atlikt ų 79 % 
bandymų. Didesnį kintamum ą atliekant bandymus gal ėjo sukelti dozavimo 
paklaidos, nes į sandarias bandymo kolbas reik ėdavę įterpti mažus 1-okta ­
nolio kiekius (3–4 μl). Didesni variacijos koeficientai gal ėjo būti nustatomi 
todėl, kad buvo naudojama mažesn ės koncentracijos bandomoji chemin ė 
medžiaga, vis ų pirma tuo atveju, kai koncentracijos buvo mažesn ės negu 
10 mg C/l. Ši ą priklausomyb ę iš dalies įmanoma panaikint s ėjimo kultūroje 
sumažinant bendrosios neorganin ės anglies (TIC) koncentracij ą.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. ES atlikus tarplaboratorinio lyginimo bandymus (24) su penkiomis pavir ­ 
šinio aktyvumo medžiagomis (10 mg/C/l) nustatyti šie rezultatai:  
Bandomoji chemin ė 
medžiaga  Vidutinė procentin ė 
biologinio skaidymo 
dalis 
(28d)  Variacijos 
koeficientas 
(%) Laboratorij ų 
skaičius 
Tetrapropilenas 
Benzensulfonatas  17 45  10  
Diizooktilsulfo-sukci ­
natas 
(anijoninė) 72 22  9  
Heksadeciltrimetil (*) 
amonio chloridas chlo ­
ride 
(katijonin ė) 75 13  10  
Izo-nonilfenolis-(etok ­
silatas)  9 
(nejoninis)  41 32  10  
Kokamidopropil 
dimetilhidroksi 
sulfobetainas 
(amfoterin ė) 60 23  11  
(*) SiO  2 buvo įdėta siekiant neutralizuoti toksiškum ą. 
Nustatytais rezultatais įrodoma, kad apskritai kintamumas buvo didesnis 
mažesniosios gerai skaidom ų paviršini ų medžiag ų dalies. Atliekant 
bandymus mažesnis negu 15 % kintamumas nustatytas daugiau negu 90 % atvej ų, o didžiausia kintamumo vert ė buvo 30–40 %.
 
PASTABA: Daugelis paviršini ų medžiag ų nėra sudarytos iš vieno dydžio 
molekulių, nes jas sudaro izomerfai, homologai ir t. t., kurie 
suskyla po skirtingos charakteristikos v ėlinimo laikotarpi ų ir 
veikiant skirtingoms kinetin ėms greičio konstantoms, tod ėl 
randasi „neryškios“ sumaž ėjusios kreiv ės ir 60 % atitikties 
vertė gali neb ūti užtikrinama per „10 par ų langą“ net tuo 
atveju, kai kiekvieno pavienio dydžio molekul ės sudarys > 
60 % per 10 dien ų, jeigu bandymas atliekamas su vieno dydžio 
molekulėmis. Šio reikalavimo laikym ąsi taip pat įmanoma 
užtikrinti naudojant kitus sud ėtingus mišinius.  
METODO APRAŠYMAS  
Aparatūra 
15. Įprasta laboratorin ė įranga:  
a) stiklin ės serumo kolbos, užkimštos butilkau čiuko kamš čiais ir apspau ­
džiamaisiais aliuminio sandarikliais; rekomenduojamas „125 ml“ dydis; 
šiuo atveju bendras t ūris būtų apie 160 ml (Vadinasi, tur ėtų būti žinoma, 
kad kiekvienos kolbos t ūris yra 160 ± 1 ml); leidžiama naudoti mažesn ę 
kolbą, jeigu rezultatai atitinka 66 ir 67 pastraipose aprašytas s ąlygas;  
b) anglies analizatorius arba kitas įtaisas (pvz., duj ų chromatografas) neor ­
ganinei angliai išmatuoti;  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) didelio tikslumo švirkštai duj ų ir skysčio ėminiams imti;  
d) rotacinis kratytuvas reguliuojamos temperat ūros aplinkoje;  
e) oro be CO  2 dujų tiekimas – šio oro tiekim ą galima užtikrinti leidžiant or ą 
per natrio kalkes arba naudojant 80 % N  2 /20 % 0  2 dujų mišinį (pasirink ­
tinas) (žr. 28 pastraip ą); 
f) membraninis filtravimo įtaisas (por ų dydis 0,20–0,45 μm) (pasiren ­
kamas);  
g) organin ės anglies analizatorius (pasirenkamas).  
Cheminiai reagentai  
16. Naudojami visais atžvilgiais analiziškai gryni cheminiai reagentai.  
Vanduo  
17. Turėtų būti naudojamas distiliuotas arba dejonizuotas vanduo, kuriame yra ≤ 
1 mg/l bendros organin ės anglies. Šis kiekis sudaro ≤ 5 % pradinio orga ­
ninės anglies kiekio, įterpto rekomenduojama bandomosios chemin ės 
medžiagos doze.  
Mineralini ų druskų terpės pradiniai tirpalai  
18. Pradiniai tirpalai ir mineralini ų druskų terpė yra tapat ūs nurodytiesiems ISO 
standarte 14 593 (16) ir C.4 „lengvo biologinio skaidumo“ bandymuose (20). Didesn ės koncentracijos amonio chlorid ą (2,0 g/l vietoj 0,5 g/l) tur ėtų 
būti privaloma naudoti tik labai išskirtiniais atvejais, pvz., kai bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracija yra > 40 mg C/l. Pradiniai tirpalai tur ėtų 
būti laikomi šaldytuve ir šalinami po šeši ų mėnesiu arba anks čiau, jeigu 
aptinkama įrodymų, kad yra padid ėjęs mikrob ų augimas. Pasiruošiami šie 
pradiniai tirpalai:
 
a) kalio dihidrofosfato (KH  2 PO 4 ), 8,50 g  
bevandenio kalio dihidrofosfato (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
dinatrio vandenilio fosfato dihidrato (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g  
amonio chlorido (NH  4 Cl) 0,50 g  
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro. Šio tirpalo pH vert ė 
turėtų būti 7,4 (± 0,2). Jeigu ši vert ė neužtikrinama, pasiruošiamas naujas 
tirpalas.  
b) kalcio chlorido dihidrato (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g  
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.  
c) magnio sulfato heptahidrato (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g  
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro.  
d) geležies (III) chlorido (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g  
Ištirpinama vandenyje ir praskiedžiama iki 1 litro bei įlašinamas vienas 
lašas koncentruoto HCl.  
Mineralin ės terpės pasiruošimas  
19. 10 ml a tirpalo maišoma su maždaug 800 ml vandens (17 pastraipa), tada 
įpilama po 1 ml b, c ir d tirpal ų ir su vandeniu praskiedžiama iki 1 litro (17 
pastraipa).  
Kiti cheminiai reagentai  
20. Koncentruota ortofosforo r ūgštis (H  3 PO 4 ) (> 85 % mas ė tūrio vienetui).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Natrio hidroksido tirpalas 7M  
21. 280 g natrio hidroksido (NaOH) ištirpinama 1 litre vandens (17 pastraipa). 
Nustatoma ištirpusios neorganin ės anglies koncentracija šiame tirpale ir ši 
vertė taikoma apskai čiuojant bandymo rezultat ą (žr. 55 ir 61 pastraipas), 
ypač atsižvelgiant į 66 pastraipos b punkto pagr įstumo kriterij ų. Paruošiamas 
šviežias tirpalas, jeigu ištirpusios neorganin ės anglies (DC) koncentracija yra 
per didelė. 
Bandomoji chemin ė medžiaga  
22. Iš gan ėtinai vandenyje tirpios bandomosios chemin ės medžiagos (17 
pastraipa) ar iš bandomojoje terp ėje tirpios bandomosios chemin ės 
medžiagos (19 pastraipa) pasiruošiamas pradinis tirpalas, kurio koncentracija turi būti 100 kart ų didesnė negu atliekant bandym ą naudotina galutin ė 
koncentracija; gali tekti koreguoti pradinio tirpalo pH vert ę. Pradinis tirpalas 
turėtų būti įterpiamas į mineralin ę terpę siekiant užtikrinti 2–40 mg C/l 
galutinę organinės anglies koncentracij ą (tinkamiausia koncentracija b ūtų 
20 mg/l). Jeigu naudojamos mažesn ės koncentracijos negu nurodytosios, 
gali būti neužtikrinamas reikiamas tikslumas. Į kolbas galima įšvirkšti aukš ­
taslėgiais švirkštais tirpi ų ir netirpi ų skystųjų chemini ų medžiag ų. Mažai 
tirpias ir netirpias bandom ąsias chemines medžiagas gali tekti specialiai 
apdoroti (25). Galima rinktis:
 
a) tiesiogin į žinomos mas ės kiekio įdėjimą; 
b) dispergavim ą ultragarsu prieš įdėjimą; 
c) privalom ą dispergavim ą emulsikliais siekiant nustatyti, ar jie sukelia kok į 
nors slopinam ąjį ar skatinam ąjį poveikį mikroorganizm ų veiklai prieš 
pridėjimą; 
d) skystųjų bandomųjų cheminių medžiagų arba tirpalo adsorbcij ą į tinkamą 
lakųjį tirpiklį, į inertinę terpę ar inertin ę medžiag ą (pvz., stiklo pluošto 
filtrą) ir tolesn į tirpiklio garinim ą, jeigu naudojamas, ir tiesiogin į žinomo 
kiekio įdėjimą; 
e) bandomosios chemin ės medžiagos tirpalo lakiame tirpiklyje žinomo 
kiekio įdėjimą į tuščią bandymo ind ą ir vėlesnį tirpiklio išgarinim ą. 
C, d ir e punktuose nurodytos medžiagos arba tirpikliai turi b ūti išbandyti 
siekiant nustatyti, ar jie sukelia kok į nors skatinam ąjį arba slopinam ąjį 
poveikį mikroorganizm ų veiklai (žr. 42 pastraipos b punkt ą). 
Etaloninė cheminės medžiaga  
23. Iš (tirpios) etalonin ės cheminės medžiagos vandenyje pasiruošiamas pradinis 
tirpalas (17 pastraipa), kurio koncentracija b ūtų 100 kart ų didesnė negu 
naudotina atliekant bandym ą galutinė koncentracija (20 mg/l).  
Slopinimo poveikio tikrinimas  
24. Jeigu taikomos lengvo biologinio skaidymo vertinimo s ąlygos, šiuo atveju 
bandomosios chemin ės medžiagos dažnai n ėra kiek nors labiau suskai ­
domos. Viena iš galim ų priežasčių – bandomoji chemin ė medžiaga slopina 
sėjimo kultūrą būdama tokios koncentracijos, kokios ši medžiaga naudojama 
atliekant bandym ą. Slopinimo poveikio tikrinim ą galima įtraukti į bandymo 
planą siekiant palengvinti slopinimo nustatym ą (nukreipt ą atgal), nes šis 
slopinimas gali b ūti tikėtina priežastis arba skatinimo veiksnys. Antraip 
atlikus slopinimo poveikio tikrinim ą galima atmesti min ėtus trukdžius ir 
įrodyti, kad nulinis ar nedidelis skaidymas priskirtinas tik atsparumui mikro ­
organizm ų poveikiui laikantis bandymo s ąlygų. Siekiant gauti informacijos 
apie bandomosios chemin ės medžiagos toksiškum ą (aerobiniams) mikroor ­
ganizmams bandomojoje terp ėje pasiruošiamas tirpalas, į kurį įtraukiama 
bandomoji chemin ė medžiaga ir etalonin ė cheminė medžiaga (19 pastraipa), 
atitinkamai kiekvienos įdedama vienodos koncentracijos (žr. 22 ir 23 
pastraipas).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Sėjimo kultūra 
25. Sėjimo kult ūrą galima gauti iš įvairių šaltinių: veikliojo dumblo; nuotek ų 
ištakio (neapdoroto chloru); paviršini ų vandenų ir dirvožemi ų; ar iš pastar ųjų 
mišinio (20). Naudojant etalonin ę cheminę medžiag ą turėtų būti nustatomas 
šaltinio biologinio skaidymo veiksmingumas. Kad ir koks b ūtų šaltinis, 
bandomąja chemine medžiaga anks čiau paveikti mikroorganizmai netur ėtų 
būti naudojami, jeigu proced ūra turi būti taikoma kaip lengvo biologinio 
skaidumo bandymas.  
Įspėjimas. Veikliajame dumble, nuotekose ir nuotek ų ištakyje yra patoge ­
ninių organizm ų, todėl turi būti dirbama laikantis atsargumo 
priemonių. 
26. Remiantis patirtimi optimalus s ėjimo kult ūros kiekis:  
— kurio pakanka reikiamai biologinio skaidymo veiklai užtikrinti,  
— kuris suskaido nustatyt ą procentin ę etaloninės cheminės medžiagos dal į 
(žr. 66 pastraip ą), 
— kurį naudojant išauga 10  2 –10  5 koloniją sudarančių vienetų milimetre 
galutinio mišinio,  
— kurį naudojant galutiniame mišinyje paprastai užtikrinama 4 mg/l 
suspenduot ų medžiag ų koncentracija, jeigu pasirenkamas veiklusis 
dumblas; leidžiama naudoti ne didesnes negu 30 mg/l koncentracijas, 
tačiau tuščiojo bandinio kolbose (26) gali išsiskirti gerokai daugiau CO  2 , 
— kurio ind ėlis į pradinę organinės anglies, įterptos naudojant bandom ąją 
cheminę medžiag ą, koncentracij ą yra mažesnis negu 10 %,  
— paprastai yra 1–10 ml s ėjimo kult ūros 1 litrui bandomojo tirpalo.  
Veiklusis dumblas  
27. Veiklusis dumblas surenkamas šviežias iš nuotek ų valymo įrenginio aera ­
cijos rezervuaro ar laboratorinio įrenginio, kuriuo valomos vis ų pirma 
buitinės nuotekos. Jeigu reikia, stambiosios dalel ės turėtų būti pašalinamos 
per sietą (pvz., naudojant siet ą, kurio akut ės dydis 1 mm  2 ) ir dumblas turi 
būti laikomas aerobin ėmis sąlygomis, kol j į bus imta naudoti.  
28. Antraip pašalinus visas stambi ąsias daleles, dumblas nusodinamas ar cent ­
rifuguojamas (pvz., 1 100 × g, 10 minu čių). Nupilamas nusistoj ęs skystis. 
Dumblą galima nuplauti į mineralin į tirpalą. Koncentruotas dumblas suspen ­
duojamas mineralin ėje terpėje, kad būtų gautos 3–5 g koncentracijos suspen ­
duotos medžiagos. Po to jis aeruojamas atsižvelgiant į nustatytus reikala ­
vimus.  
29. Dumblas tur ėtų būti imamas iš tinkamai veikian čio įprasto valymo įrenginio. 
Jeigu dumblas turi b ūti imamas iš didelio našumo valymo įrenginio arba 
jeigu manoma, kad dumble yra inhibitori ų, šis dumblas turi b ūti plaunamas. 
Gerai sumaišytas, pakartotinai suspenduotas dumblas paliekamas nusistoti arba centrifuguojamas, nupilamas nuo jo skystis ir išplautas dumblas dar kartą suspenduojamas kitame mineralin ės terpės tūryje. Šie veiksmai karto ­
jami tol, kol galima manyti, kad substrato pertekliaus arba inhibitori ų neliko.
 
30. Visiškai užbaigus pakartotin į suspendavim ą arba iš neapdoroto dumblo prieš 
pradedant naudoti imamas ėminys, kad b ūtų nustatyta suspenduot ų 
medžiagų sausoji mas ė. 
31. Pagal kit ą būdą homogenizuojamas aktyvusis dumblas (3–5 g/l suspenduot ų 
medžiagų.) Dumblas maišomas 2 min. vidutiniu grei čiu mechaniniame 
maišiklyje. Sumaišytas dumblas paliekamas 30 min. arba ilgiau, jei to reikia, 
ir dekantuojamas skystis, kuris naudojamas kaip s ėjimo kultūra, pagal norm ą 
10 ml/l mineralin ės terpės ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Iš tuš čiojo bandinio kolbos išsiskiriant į CO  2 kiekį galima dar labiau suma ­ 
žinti, jeigu dumblas per nakt į būtų aeruojamas CO  2 neturinčiu oru. Atliekant 
šį bandymą (13) 4 mg/l veikliojo dumblio kiet ųjų medžiagų naudojama kaip 
sėjimo kult ūros koncentracija.  
Biologinio nuotek ų valymo ištakis  
33. Antraip s ėjimo kultūrą galima paimti iš biologinio nuotek ų valymo įrenginio 
ištakio arba laboratorinio įrenginio, kuriam tiekiamos vien buitin ės nuotekos. 
Ėminys laikomas aerobin ėmis sąlygomis ir naudojamas pa ėmimo dien ą arba, 
jeigu reikia, iš anksto kondicionuojamas. Ištakis tur ėtų būti filtruojamas per 
stambų filtrą siekiant pašalinti dideles kiet ąsias daleles ir tada išmatuojama 
pH vertė. 
34. Norint jame sumažinti IC kiek į, filtratas 1 val. borbatuojamas CO  2 netu­
rinčiu oru (15-e pastraipa), ir naudojant ortofosforo r ūgštį (20 pastraipa) 
kartu išlaikoma pH vert ė 6,5. Naudojant natrio hidroksid ą atkuriama pradin ė 
pH vertė ir po maždaug 1 val. trukm ės nusodinimo iš s ėjimo kult ūros 
paimamas reikiamas kiekis nusistojusio skys čio. Taikant ši ą borbatavimo 
procedūrą sėjimo kult ūroje sumažinamas IC kiekis. Pvz., jeigu didžiausias 
rekomenduotas filtruoto ir borbatuoto ištakio kiekis (100 ml) litrui buvo naudotas kaip s ėjimo kult ūra, IC kiekis tuš čiojo bandinio kolbose atitiko 
0,4–1,3 mg/l (14), t. y. atitiko bandomosios chemin ės medžiagos 2–6,5 % 
C esant 20 mg C/l koncentracijai ir 4–13 % esant 10 mg C/l koncentracijai.
 
Paviršiniai vandenys  
35. Ėminys imamas iš atitinkamo paviršinio vandens. Jis tur ėtų būti laikomas 
aerobinėmis sąlygomis ir naudojamas pa ėmimo dien ą. Jeigu reikia, ėminio 
koncentracija tur ėtų būti didinama filtruojant arba centrifuguojant. Kiekvie ­
name bandymo inde naudotinos s ėjimo kult ūros kiekis tur ėtų atitikti 26 
pastraipoje nustatytus kriterijus.  
Dirvožemiai  
36. Paimamas tinkamo dirvožemio ėminys; jis imamas iš ne didesnio negu 
20 cm gylio nuo dirvožemio paviršiaus. Prieš imantis sietu, kurio aku čių 
dydis 2 mm, sijoti dirvožemio ėminį iš jo tur ėtų būti išrenkami akmenys, 
augalų liekanos ir bestuburiai (jeigu ėminys yra pernelyg dr ėgnas, kad b ūtų 
galima jį sijoti nedelsiant, šiuo atveju ėminys iš dalies džiovinamas oru – 
tokį ėminį sijoti būtų lengviau). Ėminys tur ėtų būti laikomas aeravimo s ąly­
gomis ir naudojamas pa ėmimo dien ą (jeigu ėminys turi b ūti gabenamas 
nesandariai užrištame juodos spalvos polietileno maiše, ėminį galima laikyti 
ne ilgiau negu vien ą mėnesį 2–4 °C temperat ūroje).  
Pradinis s ėjimo kultūros kondicionavimas  
37. Sėjimo kult ūrai leidžiama taikyti pradin į kondicionavim ą, kad ji atitikt ų 
bandymo s ąlygas, tačiau ėminio neleidžiama iš naujo pritaikyti prie bando ­
mosios chemin ės medžiagos. Taikant pradin į kondicionavim ą gali būtų 
sumažinamas CO  2 išsiskyrimas iš tuš čiojo bandinio kolb ų. Pradinis kondi ­
cionavimas – tai 30 mg/l bandymo terpe atskiesto veikliojo dumblo aera ­
vimas 5–7 dienas bandymo temperat ūroje CO  2 neturinčiu oru.  
BANDYMO ATLIKIMO TVARKA  
Kolbų skaičius 
38. Bandymui reikaling ų kolbų skaičius (15-a pastraipa) priklauso nuo analiz ės 
atlikimo dažnumo ir bandymo trukm ės. 
39. Rekomenduojama, kad po pakankamo laiko interval ų skaičiaus, pvz., tokio, 
kad būtų galima identifikuoti 10 par ų langą, būtų atliekama trij ų kolbų 
analizė. Bandymo pabaigoje taip pat analizuojamos ne mažiau negu penkios 
kolbos (15-a pastraipa) iš a, b ir c rinkini ų (žr. 42 pastraip ą) siekiant užtik ­
rinti 95 % pasikliovimo intervalus, kad b ūtų apskaičiuota vidutin ė biologinio 
skaidymo procentin ė vertė. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Terpė su sėjimo kultūra 
40. Naudojamos s ėjimo kultūros koncentracija turi b ūti 4 mg/l veikliojo dumblo 
sausosios mas ės. Nedelsiant prieš naudojim ą pasiruošiamas pakankamas 
kiekis terp ės su sėjimo kult ūra, pvz., šiuo atveju 2 ml tinkamai apdoroto 
veikliojo dumblo (27–32 pastraipos) įdedama į 2 000 mg/l–1 litr ą minera­
linių druskų terpės (19 pastraipa). Jeigu turi b ūti naudojamas biologinio 
valymo įrenginio ištakis, ne daugiau negu 100 ml ištakio (33 pastraipa) 
įdedama į 900 ml mineralini ų druskų terpės (19 pastraipa) ir terpe atskie ­
džiama iki 1 litro.  
Kolbų paruošimas  
41. Alikvotin ės terpės su sėjimo kult ūra dalys paskleidžiamos kolbose, kad 
viršutinės erdvės ir skys čio santykis b ūtų 1:2 (pvz., įdedama į 107–160 
ml talpos kolbas). Leidžiama pasirinkti kitus santykius, ta čiau šiuo atveju 
atsižvelgtina į 11 pastraipoje išd ėstytą įspėjimą. Naudojant bet kurio iš ši ų 
dviejų tipų sėjimo kultūrą turi būti siekiama užtikrinti, kad terp ė su įmaišyta 
sėjimo kult ūra būtų reikiamai išmaišyta, nes tik šitaip įmanoma garantuoti 
tolygų terpės pasiskirstym ą bandymo kolbose.  
42. Kolb ų rinkiniai (15a pastraipa) paruošiami taip, kad juose b ūtų: 
a) bandymo indai (žymimi F  T ) su bandom ąja chemine medžiaga;  
b) tuščiojo bandinio kolbos (žymimos F  B ), kuriose yra tik bandomoji terp ė 
ir sėjimo kult ūra; taip pat turi b ūti pridedamos visos chemin ės 
medžiagos, tirpikliai, priemon ės ar stiklo pluošto filtrai, naudojami 
bandomąją cheminę medžiag ą įterpiant į bandymo indus;  
c) proced ūros tikrinimo indai (žymimi F  C ), kuriuose yra etalonin ė cheminė 
medžiaga;  
d) jeigu reikia, tikrinant galim ą slopinimo poveik į naudojami indai (žymimi 
F I ) su bandom ąja chemine medžiaga ir tokios pa čios koncentracijos 
etalonine chemine medžiaga (24 pastraipa) kaip atitinkamai kolbose F  T 
ir F  C ; 
e) tikrinant galim ą abiotinį skaidym ą naudojami indai (žymimi F  S ) kaip 
a + 50 mg/l HgCl  2 arba sterilizuoti kitomis priemon ėmis (pvz., naudojant 
autoklavą). 
43. Siekiant užtikrinti 10–20 mg C/l koncentracij ą kaip vandeniniai pradiniai 
tirpalai (22, 23 ir 24 pastraipos) įterpiamos vandenyje tirpios bandomosios 
cheminės medžiagos ir etalonin ės cheminės medžiagos.  
44. Netirpios bandomosios chemin ės medžiagos ir netirpios etalonin ės cheminės 
medžiagos atsižvelgiant į bandomosios chemin ės medžiagos pob ūdį įvairiais 
būdais įdedamos į kolbas (žr. 22a-e pastraipas); šiuo atveju prieš įdedant 
terpę su sėjimo kult ūra ar terp ę įdėjus (šiuo atveju paisoma bandomosios 
cheminės medžiagos poveikio metodo). Jeigu naudojama viena iš 22a-e 
pastraipoje nurodyt ų procedūrų, šiuo atveju tuš čiojo bandinio kolbos F  B 
(42b pastraipa) tur ėtų būti tvarkomos panašiu b ūdu, tačiau išskyrus bando ­
mąją cheminę medžiag ą arba etalonin ę cheminę medžiag ą. 
45. Lakios bandomosios chemin ės medžiagos į sandarias kolbas (47 pastraipa) 
turėtų būti įšvirkščiamos mažais švirkštais. Doz ė apskaičiuojama atsižvel ­
giant į įšvirkštą tūrį ir bandomosios chemin ės medžiagos tank į. 
46. Jeigu reikia, tur ėtų būti įpilama vandens, kad kiekviename inde b ūtų 
vienodas skys čio tūris. Privaloma užtikrinti, kad viršutin ės erdvės ir skysčio 
santykis (paprastai 1:2) ir bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija 
būtų tokia, kad viršutin ėje erdvėje būtų pakankamas visiškam biologiniams 
suskaidymui reikalingas deguonies kiekis.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Tada visos kolbos sandarinamos, pvz., butilkau čiuko sandarikliais ir aliu ­
minio gaubteliais. Šiame etape (45 pastraipa) tur ėtų būti įterpiamos lakios 
bandomosios chemin ės medžiagos. Jeigu turi b ūti stebimas DOC koncent ­
racijos bandomajame tirpale sumaž ėjimas ir laiko atskaitos pradžioje atlie ­
kama pradin ės IC koncentracijos analiz ė (sterilūs kontroliniai bandiniai, 42e 
pastraipa) ar analizuojamos kitos tiriamosios medžiagos, iš bandymo indo 
paimamas atitinkamas ėminys. Po to bandymo indas ir jo turinys yra šali ­
namas.  
48. Užkimštos kolbos dedamos į rotacinį kratytuv ą (15d pastraipa); kratymo 
dažnis turi b ūti toks, kad kolb ų turinys b ūtų tinkamai maišomas ir suspen ­
duojamas (pvz., 150–200 s ūk./min.) ir inkubuojama tamsoje 20 °C tempe ­
ratūroje (± 1 °C).  
Ėminių ėmimas  
49. Ėminių ėmimo tvarka priklauso nuo v ėlavimo faz ės ir nuo bandomosios 
cheminės medžiagos biologinio skaidymo kinetinio grei čio. Kolbos paauko ­
jamos, kad ėminių ėmimo dien ą būtų galima atlikti analiz ę; ėminiai imami 
bent kartą per savait ę ar dažniau (pvz., du kartus per savait ę), jeigu b ūtina 
nubrėžti visiško suskaidymo kreiv ę. Reikiamas lygiagre čiai paruošt ų kolbų 
skaičius paimamas iš kratytuvo, t. y. F  T , F B ir F  C ir, jeigu naudojama, F  I ir 
F S (žr. 42 pastraip ą). Bandymas paprastai daromas 28 dienas. Jeigu atsiž ­
velgiant į biologin į skaidym ą daroma išvada, kad kreiv ės plokščioji dalis 
užtikrinama anks čiau negu per 28 dienas, bandym ą galima užbaigti anks čiau 
negu per 28 dienas. Ėminiai imami iš penki ų kolbų, paliktų atlikti analiz ę 
28-ają bandymo dien ą, ir rezultatai naudojami apskai čiuojant procentin ės 
biologinio skaidymo dalies pasikliautinuosius r ėžius ar variacijos koefi ­
cientus. Iš kolb ų, kurios naudojamos nustatant slopinimo poveik į ar abiotin į 
skaidymą, ėminių nebūtina imti taip dažnai kaip iš kit ų kolbų; pakanka juos 
imti 1 ir 28 dien ą. 
Neorganin ės anglies (IC) analiz ė 
50. CO  2 išsiskyrimas kolbose nustatomas inkubacijos laikotarpiu matuojant 
neorganin ės anglies (IC) koncentracijos padid ėjimą. Rekomenduojami atlie ­
kant bandym ą išsiskyrusios IC anglies kiekio matavimo du metodai ir jie 
aprašyti toliau. Naudojant šiuos metodus gali b ūti nustatomi šiek tiek besis ­
kiriantys rezultatai, tod ėl atliekant bandym ą turėtų būti naudojamas tik 
vienas metodas.  
51. A Metodas rekomenduojamas tuo atveju, jeigu terp ėje galėtų būti, pvz., 
stiklo filtro popieriaus ir (arba) netirpios bandomosios chemin ės medžiagos 
likučių. Šią analizę galima atlikti naudojant duj ų chromatograf ą, jeigu netu ­
rimas anglies analizatorius. Privaloma pasir ūpinti, kad analizuojant viršu ­
tinės erdvės dujas kolb ų temperat ūros vertė atitiktų ar beveik atitikt ų 
bandymo temperat ūros vertę. B metodas gali b ūti patogesnis taikyti labora ­
torijose, kuriose IC kiekis matuojamas anglies analizatoriais. Svarbu, kad natrio hidroksido tirpalas (21 pastraipa), kur į naudojant CO
 2 verčiamas 
karbonatu, b ūtų šviežiai pasiruoštas arba jo kiekis žinomas, kad į jį būtų 
galima atsižvelgti apskai čiuojant bandymo rezultatus (66-b pastraipa).  
A metodas: r ūgštinimas iki pH < 3  
52. Prieš pradedant kiekvien ą analizės dalį IC analizatorius kalibruojamas 
naudojant atitinkam ą IC standart ą (pvz., 1 % w/w CO  2 mišinyje su N  2 
dujomis). Koncentruota ortofosforo r ūgštis (20 pastraipa) įšvirkščiama per 
kiekvienos kolbos sandarikl į; kolbos pasirenkamos siekiant sumažinti terp ės 
pH vertę iki < 3 (pvz., įšvirkščiama 1 ml į 107 ml bandomosios terp ės). 
Kolbos v ėl sudedamos į kratytuv ą. Kolbas vien ą valandą pakračius kraty­
tuvu esant bandymo temperat ūrai, jos išimamos iš kratytuvo; alikvotin ės 
dujų dalys (pvz., 1 ml) paimamos iš kiekvienos kolbos viršutin ės erdvės 
ir įleidžiamos į IC analizatori ų. Išmatuotos IC koncentracijos registruojamos 
kaip mg C/l.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Šio metodo esm ė – užbaigus r ūgštinti, kai pH < 3 ir užtikrinus pusiausvyr ą 
20 °C, CO  2 pasiskirstymo tarp skystosios ir dujin ės fazės bandymo kolbose 
pusiausvyros konstantos vert ė yra 1,0, jeigu matuojama kaip koncentracija. 
Šis dalykas bandymo sistemos atžvilgiu bent vien ą kartą turėtų būti 
įrodomas taip:  
Naudojant bevandenio natrio karbonato (Na  2 CO 3 ) tirpalą, pasiruošt ą iš CO  2 
neturinčio vandens, koncentruota ortofosforo r ūgštimi (20 pastraipa) r ūgšti­
nant vanden į, kol pH vert ė pasidaro 6,5, borbatuojant CO  2 neturinčiu oru ir 
naudojamu šarmu užtikrinus neutral ų pH, pasiruošiamos kolbos su 5 ir 10 
mg/l IC koncentracija. Užtikrinama, kad viršutin ės erdvės tūrio santykis su 
skysčio tūriu būtų toks pats kaip atliekant bandymus (pvz., 1:2). R ūgštinama 
ir užtikrinama pusiausvyra kaip aprašyta 52 pastraipoje bei matuojama IC 
koncentracijos viršutin ės erdvės ir skystosiose faz ėse. Patikrinama, ar dvi 
koncentracijos atitinka tokias pa čias paklaidas. Jeigu paklaidos n ėra tapa­ 
čios, operatorius tur ėtų persvarstyti proced ūras. Šis IC pasiskirstymas tarp 
skystosios ir dujin ės fazės neturi b ūti tikrinimas kiekvien ą kartą atliekant 
bandymą; jį galima atlikti kartu su kalibravimu.  
54. Jeigu turi b ūti matuojamas pašalinamas DOC kiekis (tik vandenyje tirpi ų 
bandomųjų cheminių medžiag ų), turėtų būti imami skystos faz ės ėminiai iš 
atskirų kolbų (neparūgštintų), filtruojami membraniniu filtru ir įleidžiami į 
DOC analizatori ų. Šias kolbas galima naudoti atliekant kitas analizes, jeigu 
reikia, siekiant nustatyti pirmin į biologinį skaidum ą. 
B metodas: CO  2 perskaičiavimas į karbonat ą 
55. Prieš pradedant kiekvienos partijos analizes, IC analizatorius kalibruojamas 
naudojant atitinkam ą standartą, pvz., 0–20 mg/l koncentracijos, išreikštos 
IC, natrio vandenilio karbonato (NaHCO  3 ) tirpalą CO  2 neturinčiame vande ­
nyje (žr. 53 pastraip ą). Natrio hidroksido tirpalo (7M, 21 pastraipa) (pvz., 1 
ml į 107 ml terp ės) įšvirkščiama per kiekvienos pasirinktos kolbos sandarikl į 
ir kolbos kratomos 1 val. esant bandymo temperat ūrai. Visose kolbose, 
panaudotose konkre čią dieną, tačiau nebūtinai kiekvieno ėminio ėmimo 
atveju per vis ą bandymą, naudojamas tas pats NaOH tirpalas. Jeigu vis ų 
ėminių ėmimo atvejais b ūtinos absoliu čios tuščiosios IC vert ės, kiekvien ą 
kartą naudojant NaOH tirpal ą privaloma nustatyti IC. Kolbos išimamos iš 
kratytuvo ir paliekamos nusistoti. Pakankamas kiekis (pvz., 50–1000 μl) 
skystosios faz ės iš kiekvienos kolbos ištraukiama švirkštu. Ėminiai įlei­
džiami į IC analizatori ų ir užrašomos IC koncentracijos. Tur ėtų būti užtik­
rinama, kad naudojamas analizatorius b ūtų tinkamai pritaikytas analizuoti 
pagal min ėtą metodą paruoštus šarminius ėminius.  
56. Šio metodo esm ė – įdėjus šarmo ir užbaigus kratym ą, IC koncentracija 
viršutinėje erdvėje nėra reikšminga. Š į bandymo sistemos parametr ą galima 
patikrinti naudojant IC standartus, pridedant šarmo ir užtikrinant pusiausvyr ą 
bei IC koncentracij ą matuojant viršutin ėje erdvėje ir skystosios faz ės (žr. 53 
pastraipą). Koncentracijos vert ė viršutinėje erdvėje turėtų būti beveik lygi 
nuliui. Šio patikrinimo d ėl beveik visiškos CO  2 absorbcijos neb ūtina atlikti 
kiekvieną kartą darant bandym ą. 
57. Jeigu turi b ūti matuojamas šalinamas DOC kiekis (tik vandenyje tirpios 
bandomosios chemin ės medžiagos), skystosios faz ės ėminiai tur ėtų būti 
imami iš atskir ų kolbų (į kurias nebuvo d ėta šarmo), filtruojami membra ­
niniu filtru ir įleidžiami į DOC analizatori ų. Šias kolbas galima naudoti 
atliekant kitas analizes, jeigu reikia, kad b ūtų išmatuotas pirminis biologinis 
skaidumas  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Rezultatų apskaičiavimas  
58. Darant prielaid ą, kad bandomoji chemin ė medžiaga 100 % skyla į CO  2 , 
teorinis didžiausias išsiskyr ęs neorganin ės anglies (IC) kiekis, viršijantis 
išsiskiriant į tuščiuose kontroliniuose bandiniuose, yra lygus TOC, kuri 
įdedama į kiekvien ą kolbą bandymo pradžioje, t. y.:  
ThIC ¼ TOC : 
Bendroji neorganin ės anglies (TIC) mas ė (mg) kiekvienoje kolboje yra: 
TIC ¼ ðmg C skystyje þ mg C viršutin ėje erdvėjeÞ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ 1 lygtis  
kur: 
V L = skysčio kolboje t ūris (litrais)  
CL = IC koncentracija skystyje (kaip anglies mg/l)  
VH = viršutin ės erdvės tūris (litrais)  
CH = IC koncentracija viršutin ėje erdvėje (kaip anglies mg/l)  
TIC apskai čiavimai taikant du analiz ės metodus, naudojamus išmatuoti IC, 
kai atliekamas šis bandymas, aprašyti toliau 60 ir 61 pastraipose. Procentin ė 
biologinio skaidymo dalis ( % D ) kiekvienu atveju apskai čiuojama pagal ši ą 
lygtį: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 2 lygtis  
kur: 
TIC  t = bendroji neorganin ė anglis (TIC) mg bandymo kolboje t laiko 
momentu  
TIC  b = vidutin ė bendroji neorganin ė anglis (TIC) mg tuš čiojo bandinio 
kolbose t laiko momentu  
TOC = į bandymo ind ą iš pradži ų įdėta TOC (mg).  
Procentin ė biologinio skaidymo dalis % D apskai čiuojama bandymo (F  T ), 
etaloninės (F  C ) ir, jeigu įtraukta, slopinimo steb ėjimo kontrolin ės (F  I ) kolbų 
atsižvelgiant į atitinkamus TIC kiekius, išsiskyrusius iki kiekvieno ėminio 
ėmimo laiko.  
59. Jeigu bandymo laikotarpiu gerokai padid ėja TIC kiekis steriliuose kontro ­
liniuose bandiniuose (F  S ), šiuo atveju galima daryti išvad ą, kad bandomoji 
cheminė medžiaga buvo abiotin ėmis sąlygomis suskaidyta, ir š į procesą turi 
būti atsižvelgiama apskai čiuojant 2 lygties D vert ę. 
Rūgštinimas iki pH < 3  
60. Rūgštinimu užtikrinus pH < 3 ir pusiausvyr ą, suvienod ėja TIC koncentracija 
skystojoje ir dujin ėje fazėse; IC koncentracij ą būtina matuoti tik dujin ėje 
fazėje. Vadinasi, naudojantis 1 lygtimi  
TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , kur V  B = serumo kolbos t ūris. 
CO  2 perskaičiavimas į karbonat ą 
61. Pasirinkus š į metodą apskaičiavimai atliekami pagal 1 lygt į, tačiau mažo IC 
kiekio dujin ėje fazėje nepaisoma, t. y  V H Ü C H ¼ 0, ir TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Rezultatų išraiška  
62. Biologinio skaidymo kreiv ė gaunama procentin ę biologinio skaidymo dal į 
D, kaip linij ą brėžiant atsižvelgiant į inkubacijos trukm ę, jeigu įmanoma, 
vėlavimo faz ę, biologinio skaidymo faz ę, 10 parų langą ir kreivės plokščio­
sios dalies faz ę, t. y. faz ę, kai nurodoma užtikrinama didžiausia skaidymo 
vertė ir biologinio skaidymo kreiv ė išsilygina. Jeigu panaši ų bandymo ind ų 
F T (< 20 % skirtumas) nustatomi palyginamieji rezultatai, br ėžiama vidutin ė 
kreivė (žr. 2 pried ėlio 1 pav.); jeigu jie nenustatomi, br ėžiama kiekvieno 
indo atskira kreiv ė. Kreivės plokščiosios dalies tarpsnio biologinio skaidymo 
procentin ės dalies vidutin ė vertė apibrėžiama arba įvertinama didžiausia 
vertė (pvz., kai kreiv ė leidžiasi kreiv ės plokščiosios dalies faz ėje), tačiau 
svarbu įvertinti, ar pastaruoju atveju vert ė nėra išskirtis. Šis didžiausias 
biologinio skaidymo lygis bandymo ataskaitoje pavadinamas „bandomosios cheminės medžiagos biologinio skaidymo laipsniu“. Jeigu bandymo ind ų 
skaičius buvo nepakankamas, kad b ūtų galima nurodyti kreiv ės plokščiąją 
dalies tarpsn į, apskaičiuojant vidutin ę vertę naudojami paskutin ę bandymo 
dieną išmatuoti duomenys. Ši paskutin ė vertė, vidutinė penkių tapačių indų 
vertė
, naudojama nurodant procentin ės biologinio skaidymo dalies nusta ­
tymo glaudum ą. Taip pat nurodoma 10 par ų lango pabaigoje nustatyta vert ė. 
63. Tuo pa čiu būdu brėžiama etalonin ės cheminės medžiagos kreiv ė F C , ir, jeigu 
įtraukta, abiotinio šalinimo patikrinimo F  s ir slopinimo kontrol ės F I kreivės. 
64. Tuščiuose kontroliniuose bandiniuose (F  B ) esantys TIC kiekiai užrašomi; 
taip pat užrašomi F  s kolbose (abiotini ų sąlygų tikrinimas) esantys kiekiai, 
jeigu šie indai buvo naudojami atliekant bandym ą. 
65. Apskai čiuojama F  I indų D vertė remiantis teorine IC išeiga, numatoma tik 
pagal etaloninio mišinio komponent ą. Jeigu 28 dien ą [[(D  FC ( 1 ) – 
D FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, galima daryti prielaid ą, kad bandomoji chemin ė 
medžiaga slopina s ėjimo kult ūrą, ir todėl šiuo poveikiu galima pagr įsti 
mažas D  FT vertes, nustatytas taikant bandymo s ąlygas. Šiuo atveju bandym ą 
galima pakartoti naudojant mažesn ę bandymo koncentracij ą ir verčiau suma­ 
žinant DIC s ėjimo kultūroje ir tuš čiuose kontroliniuose bandiniuose susifor ­
mavusią bendrąją neorganin ę anglį, nes naudojant mažesn ę koncentracij ą vis 
tiek sumažinamas metodo tikslumas. Antraip galima naudoti kit ą sėjimo 
kultūrą. Jeigu bandymo kolboje Fs (abiotin ėmis sąlygomis) nustatomas 
gerokas (> 10 %) TIC kiekio padid ėjimas, šiuo atveju gali b ūti įvykę abio­
tinio skaidymo procesai.  
Rezultatų validumas  
66. Bandymas laikomas validuotu, jeigu:  
a) vidutin ė skaidymo procentin ė dalis induose F  C su etalonin ėmis chemi ­
nėmis medžiagomis yra > 60 % iki 14 inkubacijos dienos ir  
b) tuščiuose kontroliniuose bandiniuose F  B esantis vidutinis TIC kiekis 
bandymo pabaigoje yra > 3 mg C/l.  
Jeigu šios ribin ės vertės nėra užtikrinamos, bandymas tur ėtų būti kartojamas 
naudojant iš kito šaltinio paimt ą sėjimo kultūrą ir (arba) tur ėtų būti persvars ­
tytos proced ūros. Pvz., jeigu tuš čiuosiuose bandiniuose susidaro didelis IC 
kiekis, tur ėtų būti taikoma 27–32 pastraipose nurodyta proced ūra. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Skaidymo F  C induose, kuriuose yra etalonin ė cheminė medžiaga, procentin ė dalis. 
( 2 ) Procentin ė skaidymo dalis F  I induose.
 67. Jeigu bandomosios chemin ės medžiagos kiekis nesudaro 60 % ThIC ir jeigu 
įrodoma, kad ši medžiaga n ėra inhibitorius (65 pastraipa), bandymas tur ėtų 
būti kartojamas pasirinkus didesn ę sėjimo kultūros koncentracij ą (ne daugiau 
negu 30 mg/l veikliojo dumblo ir 100 ml/l ištakio) arba s ėjimo kult ūrą iš 
kitų šaltinių, ypač tuo atveju, jeigu skaidymo vert ė 20–60 %.  
Rezultatų interpretavimas  
68. Biologinio skaidymo per 10 par ų langą vertė > 60 % ThIC atliekant 
bandymą įrodo, kad aerobin ėmis sąlygomis bandomoji chemin ė medžiaga 
yra lengvai biologiškai skaidoma.  
69. Jeigu 60 % ThIC vert ė nėra užtikrinama, nustatoma terp ės pH vert ė kolbose, 
kurios nebuvo paveiktos r ūgštimi arba šarmu; mažesn ė negu 6,5 vert ė galėtų 
būti laikoma įrodymu, kad vyko nitrifikacijos procesas. Šiuo atveju karto ­
jamas bandymas su didesn ės koncentracijos buferiniu tirpalu.  
Bandymo ataskaita  
70. Paruošiama kiekvieno bandymo (F  T ) % D, etalonin ės (F  C ) ir, jeigu įtraukta, 
kiekvienos ėminių ėmimo dienos slopinimo kontrolin ės kolbos (F  C ) verčių 
lentelė. Jeigu gaunami lygiagre čiai paruošt ų kolbų palyginamieji rezultatai, 
brėžiama vidutin ės % D vert ės kreivė atsižvelgiant į laiką. Registruojamas 
TIC kiekis tuš čiojo bandinio kolbose (FB) ir DOC vert ė steriliuose kontro ­
liniuose bandiniuose (FS) ir (arba) kitos tiriamosios medžiagos bei procen ­
tinė jų šalinimo dalis.  
71. Nustatoma vidutin ė kreivės plokščiosios dalies tarpsnio vert ė % D arba 
naudojama didžiausia vert ė, jeigu biologinio skaidymo kreiv ė leidžiasi 
kreivės plokščiosios dalies tarpsnyje, ir šis dalykas pranešamas kaip „bando ­
mosios chemin ės medžiagos biologinio skaidymo laipsnis“. B ūtina užtik ­
rinti, kad pastaruoju atveju didžiausia vert ė nebūtų išskirtis.  
72. Į bandymo ataskait ą turi būti įtraukta ši informacija:  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— bendrasis pavadinimas, cheminis pavadinimas, CAS numeris, strukt ūrinė 
formulė ir atitinkamos fizin ės-cheminės savybės, 
— bandomosios chemin ės medžiagos grynumas (priemaišos).  
Bandymo s ąlygos:  
— nuoroda į šį bandymo metod ą, 
— naudotos bandymo sistemos aprašymas (pvz., indo t ūris, viršutin ės 
erdvės ir skysčio santykis, maišymo metodas ir t. t.),  
— bandomosios chemin ės medžiagos ir etalonin ės chemin ės medžiagos 
taikymo bandymo sistemoje: naudotos bandomosios koncentracijos ir anglies kiekis, įdėtas į kiekvien ą bandymo kolb ą, bet koks tirpikli ų 
naudojimas,
 
— išsami informacija apie naudot ą sėjimo kult ūrą, bet koks išankstinis 
apdorojimas ir išankstinis kondicionavimas,  
— inkubacijos temperat ūra, 
— IC analiz ės principo pagrindimas,  
— pagrindin ės naudotų IC analizatori ų charakteristikos (ir bet kokie kiti 
naudoti analiz ės metodai),  
— pakartotini ų bandymų skaičius. 
Rezultatai:  
— lentelėje pateikti neapdoroti duomenys ir apskai čiuotos biologinio skai ­
dymo vert ės, ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— bandom ųjų ir etalonini ų cheminių medžiagų skaidymo procentin ės dalies 
grafikas atsižvelgiant į laiką, vėlavimo faz ė, skaidymo faz ė, 10 parų 
langas ir statumas,  
— procentin ė šalinimo dalis kreiv ės plokščiosios dalies faz ėje, bandymo 
pabaigoje ir po 10 par ų lango,  
— bet kokio bandymo rezultat ų atmetimo priežastys,  
— bet kokie kiti faktai, susij ę su taikyta proced ūra, 
— rezultat ų aptarimas.  
LITERAT ŪRA 
1. Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas. CO  2 išsis­
kyrimo tyrimo metodas (Metodas C.4-C).  
2. Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 
159–167.  
3. Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161.  
4. Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide reco ­
very in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210.
 
5. ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate 
aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
 
6. US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substances Washington, DC.  
7. US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
8. Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929.  
9. Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon 
dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812.
 
10. Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biode ­
gradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185.  
11. Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53.  
12. Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measu ­
ring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243.
 
13. Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. SAFEty 19: 204–211.
 
14. Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 
23: 507–524.  
15. Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, 
and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegrada ­
tion. Chemosphere 19: 1527–1550.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
16. ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegra ­
dability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of 
inorganic carbon in sealed vessels (C0  2 headspace test).  
17. Battersby NS (1997). The ISO headspace C0  2 biodegradation test, Chemosp ­
here 34: 1813–1822.  
18. US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel 
carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic 
Substance, Washington, DC.  
19. Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
and Starkey M (1999). An „inherent“ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 
3219–3235.
 
20. Šio priedo C.4 skyrius. Lengvo biologinio skaidumo nustatymas.  
21. OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegra ­
dability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris.
 
22. Šio priedo C.11 skyrius. Veikliojo dumblo respiracijos slopinimo bandymas.  
23. Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. 
Biodegradation 6: 319–327.  
24. ES (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, 
May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK.  
25. ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evalua ­
tion of their biodegradability in an aqueous medium.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
1 priedėlis 
SANTRUMPOS IR S ĄVOKŲ APIBRĖŽTYS  
IC –  neorganin ė anglis.  
ThCO  2 – teorinis anglies dioksidas (mg) yra anglies dioksido kiekis, apskai ­ 
čiuotas kaip išsiskiriantis iš žinomo ar išmatuoto anglies kiekio bandomojoje 
cheminėje medžiagoje, visiškai j ą suskaidžius; taip pat išreikštas kaip mg anglies 
dioksido, išsiskyrusio iš bandomosios chemin ės medžiagos mg.  
DOC –  ištirpusi organin ė anglis – tirpale esanti organin ė anglis arba perlei ­
džiama per 0,45 mikrometro filtr ą ar liekanti nusistojusiame skystyje anglis 
užbaigus 15 minu čių centrifugavim ą taikant maždaug 4 000 g vert ę (apie 
40 000 m sek  -2 ). 
DIC –  ištirpusi neorganin ė anglis.  
ThIC –  teorinė neorganin ė anglis.  
TIC –  bendroji neorganin ė anglis.  
Lengvai biologiškai skaidoma –  siekiant nustatyti visišk ą biologin į skaidym ą 
atliekamų tam tikr ų speciali ų atrankos bandym ų reikalavimus atitinkan čių 
cheminių medžiagų sutartinis klasifikavimas; atliekant šiuos bandymus laikomasi 
labai griežt ų reikalavim ų, todėl daroma prielaida, kad šios chemin ės medžiagos 
turi būti greitai ir visiškai skaidomos vandens aplinkoje aerobin ėmis sąlygomis.  
10 parų langas –  10 parų iš karto po 10 % biologinio skaidymo užtikrinimo.  
Būdingasis biologinis skaitomumas –  chemini ų medžiag ų klasifikavimas 
remiantis neabejojamais biologinio skaidymo (pirminio ar visiško) įrodymais 
atliekant bet kok į biologinio skaidomumo bandym ą. 
Visiškas biologinis skaidymas –  užtikrinamas skaidymo lygis, kai bandom ąją 
cheminę medžiag ą visiškai sunaudoja mikroorganizmai ir kai išskiriamas anglies 
dioksidas, vanduo, mineralin ės druskos ir naujos mikrobiologin ės ląstelinės sude­
damosios dalys (biomas ė). 
Mineralizacija –  visiškas organinio junginio skilimas į CO  2 ir H  2 O aerobin ėmis 
sąlygomis, ir į CH  4 , CO  2 bei H  2 O anaerobin ėmis sąlygomis.  
Vėlavimo tarpsnis –  trukmė nuo bandymo pradžios iki skaidan čiųjų mikroorga ­
nizmų aklimatizavimo ir (arba) prisitaikymo ir bandomosios chemin ės medžiagos 
arba organin ės medžiagos biologinio skaidymo padid ėjimo tiek, kad j į įmanoma 
nustatyti (pvz., 10 % didžiausio teorinio biologinio skaidymo ar mažesnio atsiž ­
velgiant į matavimo metodikos tikslum ą). 
Skaidymo tarpsnis –  trukmė nuo vėlavimo faz ės pabaigos iki tos akimirkos, kai 
užtikrinamas 90 % aukš čiausio skaidymo lygio.  
Kreivės plokščiosios dalies tarpsnis –  kreivės plokščiosios dalies faz ė – tokia 
fazė, kai užtikrinamas didžiausias skaidymas ir biologinio skaidymo kreiv ė išsi­
tiesina.  
Bandomoji chemin ė medžiaga –  bet kokia naudojant š į bandymo metod ą 
tiriama chemin ė medžiaga ar mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
2 priedėlis 
Biologinio skaidymo kreiv ės pavyzdys  
1 paveikslas  
CO  2 esančio 1-oktanolio biologinis skaidymas viršutin ėje erdvėje
 
Žodynėlis 
biologinis skaidymas  
skaidymo tarpsnis  
aukščiausias biologinio skaidymo lygis  
kreivės plokščiosios dalies faz ė 
10 parų langas  
bandymo trukm ė (dienomis)  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30.  BIOLOGINIS KAUPIMASIS DUGNO MAŽAŠER ĖSE KIRM ĖLĖSE 
ĮVADAS  
1. Šis bandymo metodas atitinka OECD bandymo gaires (TG) Nr. 317 (2010). 
Iš bandymo metod ų, susijusių su išliekamumu aplinkoje, atitinkamai 1996 
m. ir 2008 m. buvo paskelbta – Biologinio kaupimosi koncentracijos did ė­
jimas: bandymas su žuvimis pratek ėjimo sąlygomis (šio priedo 49 pastraipa, 
C.13 skyrius) ir Biologinis kaupimasis nuos ėdose gyvenan čiose Oligo­
chaetes  (53). Vandens aplinkos biologinio kaupimosi duomen ų ekstrapolia ­
vimas sausumos organizmams, pvz., sliekams, sunkiai įvykdomas, jeigu 
apskritai įmanomas. Vertinant biologin į chemini ų medžiag ų kaupimąsi 
dirvožemyje šiuo metu naudojami bandomosios chemin ės medžiagos lipofi ­
linėmis savyb ėmis, pvz., (14) (37), pagr įsti skaičiavimo modeliai, pvz., ES 
Techninių gairių dokumente (19). Poreikis parengti su terpe susijus į specialų 
bandymo metod ą jau yra patenkintas, pvz., (55). Šis metodas yra ypa č 
svarbus įvertinant antrin į apsinuodijim ą sausumos mitybos grandin ėse (4). 
Keli nacionaliniai bandym ų metodai yra skirti biologiniam kaupimuisi orga ­
nizmuose, išskyrus žuvis, pvz. (2) ir (72). Biologinio kaupimosi sliekuose 
((Eisenia fetida , Savigny)  ir enchitrėjuose iš užteršt ų dirvožemi ų matavimo 
metodą parengė Amerikos bandym ų ir medžiag ų draugija (ASTM) (3) . 
Tarptautiniu mastu priimtas biologinio kaupimosi dirvožemyje su bandom ąja 
medžiaga įvertinimo metodas pad ėtų geriau įvertinti chemini ų medžiag ų 
keliamą riziką sausumos ekologin ėms sistemoms, pvz., (25) (29).  
2. Dirvožem į vartojan čius bestuburius veikia dirvožemyje esan čios chemin ės 
medžiagos. Be vis ų kitų gyvūnų, dugno mažašer ės kirmėlės yra svarbios 
išlaikant dirvožemi ų struktūrą ir jų veiksmingum ą (15) (20). Mažašer ės 
kirmėlės gyvena dirvožemyje ir iš dalies dirvožemio paviršiuje (ypa č 
miško paklot ėje); biomas ės atžvilgiu jos dažnai b ūna gausiausia r ūšis (54). 
Permaišydami dirvožemio sudedam ąsias dalis ir b ūdami kitų gyvūnų grobiu 
minėti gyvūnai gali daryti didel į poveikį chemines medžiagas pasisavinan ­
tiems kitiems gyv ūnams, kaip antai, bestuburiams (pvz., pl ėšriosioms 
erkėms ir vabalams, pvz., (64)) arba stuburiniams (pvz., lap ėms ir kirams). 
Kai kurios dugno mažašeri ų kirmėlių rūšys, dabartiniu metu naudojamos 
atliekant ekotoksikologinius bandymus, aprašytos 5 pried ėlyje. 
3. ASTM Pavyzdin ėse gairėse dėl dirvožemio toksiškumo arba biologinio 
kaupimosi laboratorini ų bandym ų atlikimo naudojant  Lumbricid  sliekus  
Eisenia fetida  ir enchitr ėjus Enchytraeus albidus  (3) pateikta daug esmini ų 
ir nauding ų nurodym ų taikant esam ą biologinio kaupimosi dirvožemyje 
bandymo metod ą. Kiti dokumentai, į kuriuos daroma nuoroda šiame 
bandymo metode, yra šio priedo C.13 skyrius, Biologinio kaupimosi 
koncentracijos did ėjimas: bandymas su žuvimis pratek ėjimo sąlygomis 
(49) ir OECD TG 315: Biologinis kaupimasis nuos ėdose gyvenan čiuose  
Oligochates  (53). Praktin ė patirtis atliekant biologinio kaupimosi dirvože ­
myje tyrimus ir leidiniai, pvz., (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) 
(76) (78) (79), taip pat yra svarb ūs šio bandymo metodo informacijos šalti ­
niai. 
4. Šis bandymo metodas daugiausiai taikomas tiriant stabilias, neutralias orga ­
nines chemines medžiagas, kurias paprastai adsorbuoja dirvožemiai. Naudo ­
jant šį metodą galima tirti biologin į stabilių metaloorganini ų medžiag ų 
kaupimąsi dirvožemyje. J į taip pat galima taikyti tiriant metalus ir kitus 
mikroelementus.  
BŪTINOS S ĄLYGOS  
5. Chemin ės medžiagos biologinio kaupimosi dugno mažašer ėse kirmėlėse 
bandymai buvo atlikti naudojant sunkiuosius metalus (žr., pvz., (63)) ir patvarias organines medžiagas (j ų log Kow vert ės 3,0–6,0 (40)). Šie 
bandymai taip pat taikomi:
 
— chemin ėms medžiagoms, kuri ų log K  ow vertė didesnė negu 6,0 (ypa č 
hidrofobin ės cheminės medžiagos),  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— chemin ėms medžiagoms, laikomoms organin ėmis chemin ėmis medžia ­
gomis, kurioms b ūdinga savyb ė biologiškai kauptis gyvuose organiz ­
muose, pvz., aktyviosios paviršiaus chemin ės medžiagos arba didel ės 
sugerties chemin ės medžiagos,  
— chemin ėms medžiagoms, kurioms savyb ė biologiškai kauptis b ūdinga 
atsižvelgiant į jų struktūros ypatybes, pvz., analogin ės chemin ės 
medžiagos, kuri ų žinomas biologinio kaupimosi potencialas, ir  
— metalams.  
6. Prieš pradedant tyrim ą turėtų būti žinoma informacija apie bandom ąją 
cheminę medžiag ą, pvz., bendrasis pavadinimas, cheminis pavadinimas 
(geriausiai nurodyti IUPAC pavadinim ą), struktūrinė formulė, CAS registra ­
cijos numeris, grynumas, atsargumo priemon ės, privalomosios sand ėliavimo 
sąlygos ir analiz ės metodai. Be to, tur ėtų būti žinoma ši informacija:  
a) tirpumas vandenyje;  
b) oktanalio ir vandens pasiskirstymo koeficientas K  ow ; 
c) dirvožemio ir vandens pasiskirstymo koeficientas, išreikštas K  oc ; 
d) garų slėgis; 
e) skaidomumas (pvz., dirvožemyje, vandenyje);  
f) žinomi metabolitai.  
7. Galima naudoti žym ėtąsias ir nežym ėtąsias bandom ąsias chemines 
medžiagas. Ta čiau siekiant palengvinti analiz ę rekomenduojama naudoti 
žymėtąsias bandom ąsias chemines medžiagas. Sprendimas priimamas atsiž ­
velgiant į aptikimo ribas arba pradin ės bandomosios chemin ės medžiagos ir 
metabolit ų matavimo reikalavim ą. Jeigu naudojama žym ėtoji bandomoji 
cheminė medžiaga ir matuojamas bendrasis radioaktyvi ųjų liekanų kiekis, 
svarbu užtikrinti, kad žym ėtosios liekanos dirvožemyje ir bandomuosiuose 
organizmuose b ūtų apibūdinamos procentine pradin ės chemin ės medžiagos 
ir žymėtosios nepradin ės cheminės medžiagos dalimi, pvz., stabilioje b ūse­
noje paimtuose ėminiuose ar ėmimo tarpsnio pabaigoje siekiant sudaryti 
galimybę apskaičiuoti atitinkamos pradin ės bandomosios chemin ės 
medžiagos ir dirvožemio metabolit ų (žr. 50 pastraip ą) biologinio kaupimosi 
kriterijų. Šį aprašytąjį metodą gali tekti modifikuoti, pvz., pateikti pakan ­
kamą kiekį biomasės siekiant išmatuoti nežym ėtosios organin ės bandomo ­
sios chemin ės medžiagos arba metal ų kiekį. Matuojant bendr ąjį radioakty ­
viųjų liekanų kiekį (skystiniu blyksimuoju skaitikliu, kai užbaigiama ekstra ­
kcija, deginimas ar audinio soliubilizavimas) biologinio kaupimosi kriterijus (toliau – BAF) yra grindžiamas pradine bandom ąja chemine medžiaga ir 
metabolitais. Apskai čiuojant BAF vis ų pirmiausiai tur ėtų būti atsižvelgiama 
į pradinės bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą organizmuose ir 
bendrąsias radioaktyvi ąsias liekanas. V ėliau biotos-sediment ų akumuliacijos 
faktorius (toliau – BSAF), perskai čiuotas į kirmėlių lipidų kiekį ir dirvo­ 
žemio organin ės anglies (OC) kiek į, turėtų būti apskaičiuotas naudojantis 
BAF, kad b ūtų užtikrintas skirting ų
 biologinio kaupimosi bandym ų rezultatų 
palyginamumas.  
8. Turėtų būti žinomas bandomosios chemin ės medžiagos toksiškumas bando ­
mųjų rūšių gyvūnams, pvz., poveikio koncentracija (ECx) ar mirtinoji 
koncentracija (LCx) sugerties tarpsnio laikotarpiu (pvz., (19)). Vis ų pirmiau­
siai turėtų būti pasirenkama tokia bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracija, kad šios medžiagos aštrios asimptotin ės LC  50 ji sudaryt ų 
apie 1 % ir b ūtų bent dešimt kart ų didesnė negu jos aptikimo riba dirvože ­
myje naudojant analiz ės metodą. Jeigu turima, pirmenyb ė turėtų būti 
teikiama toksiškumo vert ėms, nustatytoms atliktais ilgalaik ės trukmės tyri­
mais apie subletalinius poveikius (51) (52). Jeigu šie duomenys neprieinami, 
naudinga informacija b ūtų gaunama atlikus ūmaus toksiškumo bandym ą 
(žr. pvz., 23 pastraip ą). ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Turėtų būti naudojamas žinomo tikslumo, glaudumo ir jautrumo analiz ės 
metodas kiekybiškai nustatyti chemin ę medžiag ą bandomuosiuose tirpa ­
luose, dirvožemyje ir biologin ėse medžiagose bei žinoma išsami informacija 
apie ėminio ruošim ą ir sandėliavimą bei medžiag ų saugos duomen ų lapai. 
Taip pat tur ėtų būti žinomos bandomosios medžiagos aptikimo ribos dirvo ­ 
žemyje ir kirm ėlės audinyje. Jeigu naudojama 14C pažym ėta bandomoji 
cheminė medžiaga, tur ėtų būti žinomas savitasis radioaktyvumas (t. y. Bq 
mol-1) ir procentin ė su priemaišomis susijusi radioaktyvumo dalis. Bando ­
mosios chemin ės medžiagos savitasis radioaktyvumas tur ėtų būti ganėtinai 
didelis siekiant palengvinti analiz ę ir pasirinktos bandomosios koncentracijos 
neturėtų sukelti toksiško poveikio.  
10. Bandym ą leidžiama atlikti su dirbtiniu dirvožemiu arba su nat ūraliu dirvo ­ 
žemiu. Prieš pradedant bandym ą turėtų būti žinoma informacija apie naudo ­
jamo natūralaus dirvožemio charakteristikas, pvz., dirvožemio kilm ė arba jo 
sudedamosios dalys, pH, organin ės anglies kiekis, granuliometrin ė sudėtis 
(procentin ė smėlio, nuosėdų ir molio dalis) ir vandens sulaikymo geba (3) 
(48).  
BANDYMO METODO ESM Ė 
11. Bandomosios chemin ės medžiagos biologin į kaupimąsi apibūdinantys para ­
metrai – biologinio kaupimosi kriterijus (BAF), sugerties grei čio konstanta 
(k s ) ir šalinimo grei čio konstanta (k  e ). Sąvokų apibrėžtys pateiktos 1 prie ­
dėlyje. 
12. Bandym ą sudaro dvi dalys: sugerties (poveikio) tarpsnis ir šalinimo tarpsnis 
(tarpsnis po poveikio). Sugerties tarpsnyje tapa čios kirmėlių grupės sulei­
džiamos į dirvožem į, į kurį yra įterpta bandomoji chemin ė medžiaga. Be 
bandomųjų gyvūnų, kontrolini ų kirmėlių grupės laikomos tomis pa čiomis 
sąlygomis, ta čiau be bandomosios chemin ės medžiagos. Išmatuojama bando ­
mųjų organizm ų sausoji mas ė ir lipidų kiekis. Š į matavim ą galima atlikti 
naudojant kontrolin ės grupės kirmėles. Analiz ės fono vertes (tuš čiąsias 
vertes) galima gauti analizuojant kontrolini ų kirmėlių ėminius ir dirvožem į. 
Šalinimo tarpsniui kirm ėlės perkeliamos į dirvožem į be bandomosios 
cheminės medžiagos. Šalinimo tarpsnis visada b ūtinas, nebent bandomosios 
cheminės medžiagos įsisavinimas sugerties etape b ūtų gana nedidelis. Pasi ­
rinkus šalinimo tarpsn į gaunama informacija apie greit į, kuriuo bandomieji 
organizmai (pvz., 27)) šalina bandom ąją cheminę medžiagą. Jeigu per suger ­
ties tarpsn į stabili būsena nėra užtikrinama, nustatant kinetinius parametrus – 
biologinio kaupimosi kinetin į kriterijų BAFk, sugerties ir šalinimo grei čio 
konstantą (-as) – vis ų pirmiausiai tur ėtų būti remiamasi vienalaikiu sugerties 
ir šalinimo tarpsni ų rezultatų pritaikymu. Bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracija kirm ėlėse ir jas veikian čios medžiagos koncentracija stebima 
per abu bandymo etapus.  
13. Sugerties tarpsniu atliekami matavimai; ėminiai imami ne daugiau negu 14 
dienų (enchytraeids ) arba 21 dien ą (sliekų atveju), kol užtikrinama nuostovi 
būsena (11) (12) (67). Nuostovi b ūsena užtikrinama tuo atveju, kai kirm ėlių 
koncentracija atsižvelgiant į laiką yra lygiagreti laiko ašiai ir atlikus paimt ų 
ne trumpesniais negu dviej ų dienų intervalais ėminių tris einan čias viena po 
kitos koncentracijos analizes j ų tarpusavio rezultatai skiriasi ne daugiau negu 
± 20 % (remiamasi statistiniais palyginimais, pvz., dispersine analize, regre ­
sijos analize).  
14. Per šalinimo tarpsn į bandomieji organizmai perkeliami į indus su tuo pa čiu 
substratu, ta čiau be bandomosios chemin ės medžiagos. Per šalinimo tarpsn į 
atliekami matavimai imant ėminius 14 dien ų (enchytraeids ) arba 21 dien ą 
(sliekų atveju), jeigu po ankstesnio analizinio nustatymo neužregistruojama, 
kad bandomosios chemin ės medžiagos liku čių kiekis kirm ėlėse sumaž ėjo 
90 %. Bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija kirm ėlėse šalinimo 
tarpsnio pabaigoje registruojama kaip nepašalintieji liku čiai. Biologinio  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
kaupimosi kriterijus esant nuostoviajai b ūsenai (BAFss) vis ų pirmiausiai 
apskaičiuojamas ir kaip koncentracijos kirm ėlėse (Ca) bei dirvožemyje 
(Cs) santykis akivaizdžiai nuostovioje b ūsenoje, ir kaip kinetinis biologinio 
kaupimosi kriterijus (BAFK), t. y. kaip sugerties iš dirvožemio grei čio 
konstantos (ks) ir šalinimo grei čio konstantos (ke) santykis (žr. 1 pried ėlyje 
pateiktas s ąvokų apibrėžtis); šiuo atveju daroma prielaida d ėl pirmojo 
laipsnio kinetikos (apskai čiavimai nurodyti 2 pried ėlyje). Jeigu yra 
akivaizdu, kad pirmojo laipsnio kinetika n ėra taikoma, tur ėtų būti pasiren ­
kami kiti modeliai.  
15. Naudojant kompiuterizuotas modelines lygtis (gair ės pateiktos 2 pried ėlyje) 
apskaičiuojama sugerties grei čio konstanta, šalinimo grei čio konstanta (ar 
konstantos, jeigu naudojami kiti modeliai), kinetinis biologinio kaupimosi kriterijus (BAFK) ir, jeigu įmanoma, kiekvieno iš ši ų parametr ų pasikliau ­
tinieji rėžiai. Bet kokio modelio atitikt į galima nustatyti taikant koreliacijos 
koeficient ą arba mišrios koreliacijos koeficient ą (jeigu koeficient ų vertė yra 
beveik lygi vienetui, šiuo atveju atitiktis yra pakankama) ar taikant chi kvadrato kriterij ų. Be to, įvertintųjų parametr ų standartin ės paklaidos ar 
pasikliautinojo r ėžio dydžiu galima remtis apsisprendžiant d ėl modelio 
atitikties.
 
16. Siekiant sumažinti lipofilišk ų bandomųjų cheminių medžiagų rezultatų kinta­
mumą biologinio kaupimosi kriterijai tur ėtų būti išreiškiami atsižvelgiant į 
lipidų kiekį ir organin ės anglies kiek į (dirvožemio kg organin ės 
anglies (OC) kg-1 kirm ėlių lipidų kiekis). Šis metodas grindžiamas tuo, 
kad chemini ų medžiag ų tam tikr ų klasių atžvilgiu galima nurodyti aišk ų 
jų biologinio kaupimosi gebos ir lipofiliškumo s ąryšį; šis santykis gerai 
pagrįstas tiriant žuvis (47). Nustatytas lipid ų kiekio žuvyje ir ši ų cheminių 
medžiagų biologinio kaupimosi s ąryšis. Panašus tarpusavio ryšys nustatytas 
bentosiniams organizmams, pvz., (30) (44). Panašiai šis tarpusavio ryšys įrodytas dugno mažašer ėms kirmėlėms, pvz., (5) (6) (7) (14). Jeigu turimas 
pakankamas kiekis kirm ėlės audinio, bandom ųjų gyvūnų lipidų kiekį galima 
nustatyti naudojant t ą pačią biologinę medžiagą, kuri buvo pasirinkta apibr ė­ 
žiant bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą. Matuojant lipid ų 
kiekį antraip galima naudoti kontroliniu gyv ūnus. 
BANDYMO VALIDUMAS  
17. Bandymas laikomas validuotu, jeigu laikomasi ši ų kriterijų: 
— bandymo pabaigoje bendrasis gaištamumas sugerties tarpsniu ir šalinimo 
tarpsniu netur ėtų viršyti 10 % (sliekai) arba 20 % ( enchytraeids ) viso 
naudotų kirmėlių skaičiaus, 
— jei tai  Eisenia fetida  ir Eisenia andrei , sugerties tarpsnio ir šalinimo 
tarpsnio pabaigoje išmatuota vidutin ė sumažėjusi masė neturėtų būti 
didesnė negu 20 %, palyginti su pradine švieži ų gyvūnų mase (š. m.) 
kiekvieno tarpsnio pradžioje.  
METODO APRAŠYMAS  
Bandomųjų gyvūnų rūšys 
18. Atliekant biologinio kaupimosi bandym ą rekomenduojama pasirinkti keli ų 
rūšių dugno mažašeres kirm ėles. Dažniausiai naudojamos  Eisenia fetida  arba  
Eisenia andrei  (Lumbricidae ), arba  Enchytraeus albidus, Enchytraeus cryp ­
ticus , ar Enchytraeus luxuriosus  (Enchytraeidae )) rūšys aprašytos 5 pried ė­
lyje. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Aparatūra 
19. Būtina pasir ūpinti, kad neb ūtų naudojamos medžiagos, įrangos bet kokios 
dalys, galin čios tirpdyti, adsorbuoti bandom ąją cheminę medžiag ą ar paša­
linti kitas chemines medžiagas ir neigiamai paveikti bandomuosius gyv ūnus. 
Atsižvelgiant į apkrovos dyd į, t. y. bandom ųjų dugno mažašeri ų kirmėlių 
skaičių, leidžiama naudoti iš cheminiu atžvilgiu inertiškos medžiagos paga ­
mintus ir tinkamos talpos įprastus keturkampio arba cilindro formos indus. 
Su bandymo terpe besilie čianti bet kokia įranga gali b ūti iš nerūdijančio 
plieno, plastiko ar stiklo. Bandymo indai tur ėtų būti tinkamai uždengti, 
kad iš j ų neištrūktų mažašer ės kirmėlės, tačiau taip pat užtikrinamas 
reikiamas oro tiekimas. Naudojant chemines medžiagas, kurioms b ūdingas 
didelis sugerties koeficientas, pvz., sintetinius piretroidus, gali tekti rinktis 
silanizuot ą stiklą. Susiklos čius aprašytosioms situacijoms įrangą tenka 
šalinti, kai ji baigiama naudoti (49). Privaloma pasir ūpinti, kad atliekant 
bandymus naudotos žym ėtosios priemon ės ir lakiosios chemin ės medžiagos 
nepatektų į aplinką. Gaudykl ės (pvz., stiklin ės dujų plovimo kolbos) tur ėtų 
būti naudojamos su tinkamais adsorbentais, galin čiais sulaikyti bet kokias iš 
bandymo ind ų garuojan čias liekanas.  
Dirvožemis  
20. Atliekant bandym ą naudojamas tokios kokyb ės dirvožemis, kad b ūtų užtik­
rinamas bandom ųjų organizm ų išgyvenimas ir ypa č dauginimasis aklimati ­
zavimo laikotarpiu bei bandymo laikotarpiais ir kad šie gyv ūnai neįgautų 
neįprastos išvaizdos ar neprad ėtų keistai elgtis. Mažašer ės kirmėlės turėtų 
įsirausti į dirvožem į. 
21. Atliekant bandymus kaip substrat ą rekomenduojama naudoti šio priedo (48) 
C.8 skyriuje aprašyt ą dirbtinį dirvožem į. Atliekant biologinio kaupimosi 
bandymus naudotino dirbtinio dirvožemio pasiruošimo ir dirbtino dirvo ­ 
žemio sand ėliavimo rekomendacijos pateiktos 4 pried ėlyje. Ore džiovint ą 
dirbtinį dirvožem į, kol jis bus prad ėtas naudoti, galima sand ėliuoti kambario 
temperatūros sąlygomis.  
22. Tačiau iš neužteršt ų vietovių paimtus nat ūralius dirvožemius galima naudoti 
kaip bandymo ir (arba) kirm ėlių auginimo dirvožem į. Natūralūs dirvožemiai 
turėtų būti apibūdinami bent savo kilme (pa ėmimo vieta), pH, organin ės 
anglies kiekiu, granuliometrine sud ėtimi (procentin ė smėlio, nuos ėdų ir 
molio dalis), vandens sulaikymo geba ir procentine vandens kiekio dalimi 
(3). Prieš pradedant naudoti, jeigu atliekama dirvožemio arba jo sudedam ųjų 
dalių mikroteršal ų analizė, šiuo atveju b ūtų gaunama naudingos informa ­
cijos. Jeigu naudojamas žem ės ūkio paskirties žem ės lauko dirvožemis, 
prieš imant ėminius (50) jis netur ėtų būti buvęs apdorotas jav ų apsaugos 
produktais ar ne trumpiau negu vienerius metus netr ęštas gyvuli ų mėšlu ir 
ne trumpiau negu šešis m ėnesius netr ęštas organin ėmis trąšomis. Nat ūralių 
dirvožemi ų tvarkymo proced ūros prieš imantis juos naudoti ekotoksikologi ­
niams bandymams su mažašer ėmis kirmėlėmis aprašyti (3). Nat ūralių dirvo­ 
žemių laikymo trukm ė laboratorijoje tur ėtų būti kiek įmanoma trumpesn ė. 
Bandomosios chemin ės medžiagos taikymas  
23. Bandomoji chemin ė medžiaga įterpiama į dirvožem į. Turėtų būti atsižvel ­
giama į bandomosios chemin ės medžiagos fizines ir chemines savybes. 
Vandenyje tirpi bandomoji chemin ė medžiaga prieš įmaišant j ą į dirvožem į 
turėtų būti visiškai ištirpinama vandenyje. Įterpiant mažai vandenyje tirpi ą 
bandomąją cheminę medžiagą rekomenduojama taikyti toki ą įterpimo proce ­
dūrą, kai viena ar daugiau (dirbtinio) dirvožemio sudedam ųjų dalių 
dengiama bandom ąja chemine medžiaga. Pvz., kvarcin į smėlį ar jo dal į 
galima mirkyti tinkamame organiniame tirpiklyje ištirpytos bandomosios  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
cheminės medžiagos tirpale; v ėliau šis tirpiklis yra iš l ėto išgarinamas. 
Padengtą sudedam ąją dalį vėliau galima įmaišyti į dirvožem į. Pagrindinis 
šios proced ūros pranašumas – į dirvožem į nepakliūna tirpiklio. Jeigu naudo ­
jamas nat ūralus dirvožemis, bandomoji chemin ė medžiaga įterpiama į ore 
džiovintą dirvožemio dal į kaip aprašyta pirmiau (ruošiantis dirbtin į dirvo­ 
žemį) arba bandomoji chemin ė medžiaga įmaišoma į drėgną dirvožem į ir 
vėliau taikoma garinimo proced ūra, jeigu buvo naudota stabilizavimo prie ­
monė. Apskritai kiek įmanoma tur ėtų būti stengiamasi, kad dr ėgnas dirvo ­ 
žemis susiliest ų su tirpikliu. Tur ėtų būti atsižvelgiama į šiuos dalykus (3):  
— jeigu naudojamas ne vanduo, o kitas tirpiklis, pastarasis turi b ūti 
tinkamas maišyti su vandeniu ir (arba) j į turi būti įmanoma pašalinti 
(pvz., išgarinti), kad dirvožemyje likt ų tik bandomoji chemin ė medžiaga,  
— jeigu naudojamas tirpiklio kontrolinis ėminys, neigiamo kontrolinio 
mėginio naudoti neb ūtina. tirpiklio kontrolinio ėminio koncentracija 
turėtų būti didžiausia į dirvožem į įterpto tirpiklio koncentracija ir tur ėtų 
būti naudojamas tos pa čios partijos tirpiklis, kuris buvo pasirinktas 
ruošiantis pradin į tirpalą; renkantis tinkam ą soliubilizavimo priemon ę 
pagrindiniai kriterijai tur ėtų būti tirpiklio toksiškumas ir lakumas bei 
bandomosios chemin ės medžiagos tirpumas pasirinktame tirpiklyje.  
24. Pasirinkus vandenyje ir organiniuose tirpikliuose mažai tirpias chemines 
medžiagas, 2,0–2,5 g smulkiai malto kvarcinio sm ėlio grūstuvėje ar piestoje 
galima sumaišyti vienam bandymo indui su tam tikru bandomosios cheminės medžiagos kiekiu, kad b ūtų pasiruošta reikiama bandomoji 
koncentracija. Šis kvarcinio sm ėlio ir bandomosios chemin ės medžiagos 
mišinys įterpiamas į iš anksto sudr ėkintą dirvožem į ir kruopš čiai sumai ­ 
šomas su reikiamu dejonizuoto vandens kiekiu siekiant užtikrinti b ūtiną 
drėgmės kiekį. Galutinis mišinys paskirstomas po bandymo indus. Proced ūra 
kartojama pasirinkus kiekvien ą bandomąją procedūrą ir taip pat pasiruošiami 
atitinkami kiekvieno bandymo indo kontroliniai bandiniai su 2,0–2,5 g 
smulkiai sumalto kvarcinio sm ėlio.
 
25. Bandom ąją cheminę medžiag ą įterpus į dirvožem į turėtų būti nustatyta jos 
koncentracija. Bandomosios chemin ės medžiagos tolydus pasiskirstymas 
dirvožemyje turi b ūti patikrintas prieš į dirvožem į įdedant bandomuosius 
gyvūnus. Į ataskaitą turėtų būti įtrauktas pasirinkto bandomosios chemin ės 
medžiagos įterpimo metodo apib ūdinimas ir nurodomos jo pasirinkimo prie ­ 
žastys.  
26. Dirvožemio ir por ų vandens faz ės pusiausvyr ą geriausiai b ūtų užtikrinti prieš 
įdedant organizmus; rekomenduojama pasirinkti keturi ų dienų laikotarp į su 
20 °C temperat ūra. Daugelio mažai vandenyje tirpstan čių organini ų 
cheminių medžiag ų laikotarpis, kol nusistovi tikroji pusiausvyra tarp adsor ­
buojamų ir ištirpusi ų frakcijų, gali trukti kelias dienas ar m ėnesius. Atsiž ­
velgiant į tyrimo tiksl ą, pvz., jeigu turi b ūti modeliuojamos aplinkos s ąlygos, 
dirvožem į su įterpta bandom ąja chemine medžiaga galima „brandinti“ 
ilgesnį laikotarp į, pvz., metal ų šis laikotarpis gali trukti tris savaites 20 °C 
temperatūroje (22).  
Bandomųjų organizm ų auginimas  
27. Mažašer ės kirmėlės visų pirmiausiai tur ėtų būti laikomos skaidrioje labora ­
torinėje kultūroje. Laboratorin ės kultūros, skirtos  Eisenia fetida, Eisenia 
andrei,  ir Enchytraeid  rūšims, metod ų gairės pateiktos 5 pried ėlyje (žr. 
taip pat (48) (51) (52)).  
28. Atliekant bandymus naudojamos mažašer ės kirmėlės neturėtų sirgti jokiomis 
įmanomomis nustatyti ligomis, neb ūtų kokiu nors atžvilgiu ne įprastos ar 
apniktos parazit ų. 
BANDYMO ATLIKIMAS  
29. Bandomuosius organizmus sugerties tarpsnio laikotarpiu veikia bandomoji 
cheminė medžiaga. Sugerties tarpsnio trukm ė turėtų būti 14 dien ų (enchy­
traeids ) arba 21 diena (sliekai), jeigu n ėra įrodoma, kad nebuvo užtikrinta 
nuostovi b ūsena. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Šalinimo tarpsniui mažašer ės kirmėlės perkeliamos į dirvožem į be bando ­
mosios chemin ės medžiagos. Pirmasis ėminys tur ėtų būti imamas 4–24 val. 
po šalinimo tarpsnio pradžios. Ėminių ėmimo pavyzdžiai pasirinkus 21 
dienos sugerties tarpsn į ir 21 dienos šalinimo tarpsn į yra pateikti 3 pried ė­
lyje. 
Bandomieji organizmai  
31. Daugelio r ūšių dirvožemio enchitr ėjų masė yra labai maža (pvz., 5–10 mg  
Enchytraeus albidus  individo šlapioji mas ė ir dar mažesn ė Enchytraeus 
crypticus  ir Enchytraeus luxuriosus  masė); norint išmatuoti mas ę ir atlikti 
cheminę analizę gali tekti sujungti tapa čių bandymo ind ų mažašeres 
kirmėles (t. y. siekiant gauti vien ą audinio analiz ės rezultat ą turėtų būti 
naudojamos visos tapataus indo mažašer ės kirmėlės). Į kiekvien ą tapatų 
indą įleidžiama po 20 enchitr ėjų individų ir turėtų būti naudojami bent 
trys tapat ūs indai. Jeigu bandomosios chemin ės medžiagos analizinio nusta ­
tymo riba yra didel ė, gali tekti naudoti daugiau mažašeri ų kirmėlių. Jeigu 
pasirenkami t ų rūšių gyvūnai, kurių individo mas ė yra didesn ė (Eisenia 
fetida  ir Eisenia andrei ), galima naudoti vien ą individą iš tapačių indų. 
32. Atliekant bandym ą naudojami sliekai tur ėtų būti panašios mas ės (pvz.,  
Eisenia fetida  ir Eisenia andrei  individų masė turėtų būti 250–600 mg). 
Enchitrėjų (pvz.,  Enchytraeus albidus ) ilgis tur ėtų būti maždaug 1 cm. 
Visos mažašer ės kirmėlės, naudojamos specialiam bandymui, tur ėtų būti 
gautos iš to paties šaltinio ir b ūti suaugę gyvūnai su kliteliumu ( clitellum ) 
(žr. 5 pried ėlį). Gyvūno amžius ir mas ė gali daryti įtaką BAF vert ėms (pvz., 
atsižvelgiant į skirtingą lipidų kiekį ir (arba) kiaušin ėlių turėjimą), todėl 
šiuos parametrus privalomas tiksliai užrašyti ir į juos atsižvelgtina aiškinant 
rezultatus. Be to, kokonus galima pad ėti per sugerties tarpsn į, kuris taip pat 
darys poveik į BAF vert ėms. Rekomenduojama, kad bandom ųjų mažašeri ų 
kirmėlių ėminio dalis b ūtų pasveriama prieš bandym ą siekiant įvertinti vidu ­
tinę sausąją ir šlapiąja masę. 
33. Turėtų būti pasirinkamas didelis dirvožemio ir mažašeri ų kirmėlių santykis 
siekiant užtikrinti, kad sugerties tarpsniu bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracija dirvožemyje sumaž ėtų kuo mažiau. Rekomenduojama, kad 
bandymo inde, jeigu pasirinkta  Eisenia fetida  ir Eisenia andrei , vienai maža ­ 
šerei kirm ėlei tektų ne mažiau negu 50 g sausosios mas ės (s. m.), o enchi ­
trėjams būtų skirta ne mažiau negu 10–20 g sausosios mas ės. Šiuose 
induose tur ėtų būti 2–3 cm dirvožemio sluoksnis (enchitr ėjams) arba 
4–5 cm sluoksnis sliekams.  
34. Atliekant bandym ą naudojamos mažašer ės kirmėlės išimamos iš auginimo 
kultūros (pvz., enchitr ėjai išimami juvelyro žnyplel ėmis). Suaug ę gyvūnai 
perkeliami į bandymo dirvožem į be bandomosios chemin ės medžiagos, kur 
jie aklimatizuojami ir šeriami (žr. 36 pastraip ą). Jeigu bandymo s ąlygos 
skiriasi nuo auginimo s ąlygų, 24–72 val. aklimatizavimo tarpsnio tur ėtų 
pakakti, kad mažašer ės kirmėlės prisitaikyt ų prie bandymo s ąlygų. Po akli­
matizavimo sliekai nuplaunami juos perkeliant į stiklinius indus (pvz., Petrio 
lėkšteles) su švariu vandeniu, tada pasveriami ir suleidžiami į bandymo 
dirvožem į. Prieš pasveriant mažašer ės kirmėlės atsargiai prispaudžiamos 
prie lėkštelės krašto, kad nuo j ų nutekėtų perteklinis vanduo, arba kruopš čiai 
ir sausai nušluostomos šiek tiek suvilgyta popierine servet ėle. 
35. Bandom ųjų gyvūnų įsirausimas į dirvožem į turėtų būti stebimas ir apra ­ 
šomas. Atliekant bandymus su sliekais, gyv ūnai (kontroliniai ir poveik į 
patyrę gyvūnai) į dirvožem į įsirausia per kelias valandas; ši trukm ė turėtų 
būti tikrinama ne v ėliau negu po 24 valand ų nuo sliek ų suleidimo į 
bandymo indus. Jeigu sliekai ne įsirausia į dirvožem į (pvz., daugiau negu  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
10 % per ilgesn į laikotarp į negu pus ė sugerties tarpsnio), vadinasi, bandymo 
sąlygos nėra tinkamos ar bandomieji organizmai n ėra sveiki. Šiuo atveju 
bandymas tur ėtų būti nutraukiamas ir kartojamas iš naujo. Enchitr ėjai 
daugiausiai gyvena plyšiuose tarp dirvožemio por ų ir dažnai su aplinkiniu 
substratu gali liestis tik j ų apvalkalas; laikoma, kad poveikis besirausian ­
tiems ir nesirausiantiems enchitr ėjams yra vienodas ir su nesirausian čiais 
enchitrėjais nėra būtina pakartoti bandym ą. 
Šėrimas  
36. Šėrimas turėtų būti numatomas tuo atveju, jeigu pasirenkamas dirvožemis su 
mažu bendru organin ės anglies kiekiu. Jeigu naudojamas dirbtinis dirvo ­ 
žemis, rekomenduojama savaitin ė šėrimo norma (t. y. mažašer ės kirmėlės 
turėtų būti šeriamos kart ą per savait ę) yra 7 mg sauso m ėšlo vienam dirvo ­ 
žemio sausosios mas ės gramui, kai šeriami sliekai, ir rekomenduojama 
savaitinė 2–2,5 mg malt ų avižų dribsnių norma vienam dirvožemio sauso ­
sios masės gramui, kai šeriami enchitr ėjai (11). Pirmoji pašaro dalis į dirvo­ 
žemį turėtų būti įmaišoma iš karto prieš į jį įleidžiant bandomuosius orga ­
nizmus. Tikslinga rinktis to paties tipo pašar ą, kuris naudotas auginant (žr. 5 
priedėlį). 
Šviesa ir temperat ūra 
37. Bandymai tur ėtų būti atliekami pasirinkus reguliuojam ą 16/8 valand ų 
šviesos ir tamsos cikl ą bei bandymo ind ų vietoje užtikrinant 400–800 lx 
apšvietim ą. Atliekant bandym ą visą laiką turėtų būti naudojama 20 ± 2 °C 
temperatūra. 
Bandomosios koncentracijos  
38. Naudojama pavien ė koncentracija. Atvejai, kai b ūtina taikyti papildom ą (-as) 
koncentracij ą (-as), tur ėtų būti pagrindžiami. Jeigu bandomosios chemin ės 
medžiagos toksiškumas (ECx) beveik tapatus analizinei aptikimo ribai, reko ­
menduojama naudoti žym ėtąją bandomąją cheminę medžiag ą (didelio savi ­
tojo radioaktyvumo žymekl į). Jeigu naudojami metalai, koncentracijos audi ­
nyje ir dirvožemyje tur ėtų būti didesnės negu fono lygis.  
Tapatūs indai  
39. Norint atlikti kinetinius matavimus (sugerties ir šalinimo tarpsnis), vienoje 
ėminių ėmimo vietoje tur ėtų būti ne mažiau negu trys tapat ūs indai. Bendro 
pasiruoštų tapačių indų skaičiaus turėtų pakakti, kad b ūtų aprėpiama visa 
ėminių ėmimo trukm ė per sugerties ir šalinimo tarpsnius.  
40. Biologiniams steb ėjimams ir matavimams atlikti (pvz., sausosios ir šlapio ­
sios mas ės santykis, lipid ų kiekis) ir fono koncentracijoms mažašer ėse 
kirmėlėse ir dirvožemyje analizuoti tur ėtų būti paruošta ne mažiau negu 
12 tapačių indų neigiamai kontrolei (iš keturi ų indų ėminiai imami 
pradžioje, keturi – sugerties pabaigoje ir dar keturi – šalinimo pabaigoje), 
jeigu kaip tirpiklis naudojamas tik vanduo. Jeigu taikant bandom ąją cheminę 
medžiagą naudojama kokia nors soliubilizavimo priemon ė, be paveikt ų 
tapačių indų, turėtų būti paruošti tirpiklio kontroliniai ėminiai (ėminiai 
imami iš keturi ų tapačių indų sugerties tarpsnio pradžioje ir jo pabaigoje 
ir ėminiai imami iš keturi ų indų šalinimo tarpsnio pabaigoje) su visomis 
sudedamosiomis dalimis, išskyrus bandom ąjį objektą. Šiuo atveju taip pat 
galima pateikti keturis papildomus neigiamos kontrol ės (be tirpiklio) tapa ­ 
čius indus siekiant užtikrinti pasirenkam ąjį ėminių ėmimą sugerties tarpsnio 
pabaigoje. Šiuos tapa čius indus biologiniu atžvilgiu galima lyginti su 
tirpiklio kontroliniais ėminiais siekiant gauti informacijos apie galim ą 
tirpiklio poveik į bandymo organizmams. Rekomenduojama paruošti pakan ­
kamą papildom ų rezervini ų tapačių indų skaičių (pvz., aštuonis) poveikiui ir 
kontroliniam (-iams) ėminiui (-iams).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Dirvožemio kokyb ės matavimo dažnumas  
41. Dirvožemio pH, dirvožemio dr ėgnumas ir temperat ūra (nuolat) bandymo 
patalpoje tur ėtų būti matuojama sugerties ir šalinimo tarpsni ų pradžioje ir 
pabaigoje. Dirvožemio dr ėgnumas vien ą kartą per savait ę turėtų būti kore­
guojamas pasveriant bandymo indus ir tikr ąsias mases palyginant su pradi ­
nėmis masėmis bandymo pradžioje. Sumaž ėjęs vandens kiekis tur ėtų būti 
kompensuojamas pripilant dejonizuoto vandens.  
Mažašeri ų kirmėlių ir dirvožemio ėminių ėmimas bei analiz ė 
42. Sugerties ir šalinimo tarpsni ų tvarkaraš čio pavyzdys atliekant biologinio 
kaupimosi bandymus su mažašer ėmis kirmėlėmis ir enchitr ėjais pateiktas 3 
priedėlyje. 
43. Dirvožemio ėminys imamas iš bandymo ind ų, kad pirmiau negu į juos 
įleidžiami sliekai, ir sugerties bei šalinimo tarpsniais b ūtų nustatyta bando ­
mosios chemin ės medžiagos koncentracija. Atliekant bandym ą bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracijos nustatomos sliekuose ir dirvožemyje. 
Apskritai matuojamos bendrosios dirvožemio koncentracijos. Antraip galima 
matuoti koncentracijas por ų vandenyje; šiuo atveju prieš pradedant tyrim ą 
numatomas atitinkamas pagrindimas ir b ūtini metodai, kurie įtraukiami į 
ataskaitą. 
44. Sugerties ir šalinimo tarpsniais sliek ų bei dirvožemio ėminiai imami ne 
mažiau negu šešis kartus. Jeigu įrodoma, kad bandomoji chemin ė medžiaga 
yra stabili, imam ų dirvožemio ėminių skaičių galima sumažinti. Rekomen ­
duojama, kad sugerties tarpsnio pradžioje ir pabaigoje b ūtų analizuojami ne 
mažiau negu trys kartotiniai ėminiai. Jeigu sugerties tarpsnio pabaigoje 
išmatuota dirvožemio koncentracija nuo pradin ės koncentracijos skiriasi 
daugiau negu 30 %, taip pat tur ėtų būti analizuojami kitomis dienomis 
paimti dirvožemio ėminiai.  
45. Iš nustatyto tapataus indo dirvožemio sliekai išimami kiekvienu ėminių 
ėmimo metu (pvz., tapataus indo dirvožem į paskleidus plokš čiame pad ėkle 
ir lanksčiomis juvelyro žnyplel ėmis išrinkus sliekus), neatid ėliotinai nuplau ­
nami vandeniu negilioje stiklin ėje ar plieniniame pad ėkle. Pašalinamas 
perteklinis vanduo (žr. 34 pastraip ą). Sliekai atsargiai sudedami į iš anksto 
pasvertą indą, nedelsiant pasveriami, įskaitant j ų virškinimo trakto turin į. 
46. Tada sliekams ( Eisenia sp .) turėtų būti leidžiama valytis savo virškinam ąjį 
traktą visą naktį, pvz., ant dr ėgno filtravimo popieriaus, uždengtoje Pietrio 
lėkštutėje (žr. 34 pastraip ą). Po virškinamojo trakto valymo tur ėtų būti 
nustatoma sliek ų masė siekiant įvertinti galim ą biomasės sumažėjimą atlie­
kant bandym ą (žr. validumo kriterijus 17 pastraipoje), Enchitr ėjai sveriami ir 
jų audinio analiz ė atliekama be j ų virškinamojo trakto valymo, nes ši ą 
valymo proced ūrą sunku atlikti atsižvelgiant į mažą šių sliekų dydį. Nusta­ 
čius galutin ę masę sliekai tur ėtų būti nedelsiant nudobiami naudojant pat į 
tinkamiausi ą metodą (pvz., skystuoju azotu ar sušaldomi –18 °C temperat ū­
roje).  
47. Užteršt ą virškinamojo trakto turin į sliekai per šalinimo tarpsn į pakeičia 
švariu dirvožemiu. Vadinasi, matuojant iš karto prieš šalinimo tarpsn į 
paimto ėminio sliekus su nevalytu virškinamuoju traktu (šiuo atveju enchi ­
trėjus) yra įtraukiamas užterštas virškinamojo trakto dirvožemis. Daroma 
prielaida, kad didesnioji dalis g ėlavandeni ų mažašeri ų kirmėlių virškinamojo 
trakto turinio po 4–24 val. trukm ės šalinimo tarpsnio pakei čiama švariomis 
nuosėdomis, pvz., (46). Panašios išvados buvo pateiktos d ėl sliekų atlikus 
tyrimus apie žym ėtojo kadmio ir cinko kaupim ąsi (78). Atliekant bandym ą 
su enchitr ėjais šio šalinimo tarpsnio pirmojo ėminio koncentracij ą galima 
laikyti audinio koncentracija pašalinus virškinamojo trakto turin į. Siekiant 
atsižvelgti į tiriamo objekto koncentracijos skiedim ą, kuris neužterštu dirvo ­ 
žemiu atliekamas per sugerties tarpsn į, virškinamojo trakto turinio mas ę 
galima vertinti remiantis šlapi ąja sliekų mase ir sliek ų pelenų mase arba 
sliekų sausąja mase ir sliek ų pelenų masės santykiais.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Dirvožemio ir sliek ų ėminiai vis ų pirma tur ėtų būti analizuojami iš karto po 
pašalinimo (t. y. per 1–2 dienas) siekiant užkirsti keli ą skaidymuisi ar 
kitiems nuostoliams ir rekomenduojama apskai čiuoti apytiksl į sugerties ir 
šalinimo greit į vykdant bandym ą. Jeigu analiz ė atidedama, ėminiai tur ėtų 
būti laikomi reikiamomis s ąlygomis, pvz., užšaldyti ( ≤ –18 °C).  
49. Turėtų būti patikrinama, ar chemin ės analizės glaudumas ir atkuriamumas 
bei bandomosios chemin ės medžiagos regeneracija iš dirvožemio ir sliek ų 
ėminiai atitinka nustatytam metodui taikomus reikalavimus; ataskaitoje 
turėtų būti nurodomas šalinimo veiksmingumas, aptikimo riba (LOD) ir 
kiekybinio nustatymo riba (LOQ). Taip pat tur ėtų būti patikrinama, ar kont ­
roliniuose induose n ėra nustatomos tokios bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracijos, kurios viršyt ų fono koncentracij ą. Jeigu kontro ­
linės grupės sliekuose bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija 
bandomajame organizme Ca yra > 0, šis veiksnys įtraukiamas apskai čiuojant 
kinetinius parametrus (žr. 2 pried ėlį). Atliekant bandym ą visi ėminiai tur ėtų 
būti tvarkomi taip, kad tarša ir nuostoliai b ūtų kuo mažesni (pvz., d ėl 
bandomosios chemin ės medžiagos įgerties į ėminių ėmimo įtaisą). 
50. Dirbant su žym ėtosiomis bandomosiomis chemin ėmis medžiagomis, 
įmanoma analizuoti pradin ę medžiag ą ir metabolitus. Po to ėminiai tur ėtų 
būti „išvalomi“, kad pradin ę bandom ąją cheminę medžiag ą atskirai b ūtų 
įmanoma įvertinti kiekybiškai. Jeigu pavieniai metabolitai analizuojamame 
(-uose) ėminyje (-iuose) viršija 10 % bendrojo radioaktyvumo, rekomenduo ­
jama nustatyti ši ų metabolit ų tapatybę. 
51. Turėtų būti registruojamas ir įtraukiamas į ataskaitą bendrasis regeneravimas 
ir bandomosios chemin ės medžiagos regeneravimas iš sliek ų, dirvožemio ir, 
jeigu naudojamos, gaudykli ų su adsorbentais, siekiant sulaikyti išgaravusi ą 
bandomąja medžiag ą. 
52. Atliekant bandymus su enchitr ėjais, kurie yra mažesni negu sliekai, iš atitin ­
kamo bandymo indo paimtus pavienius individus leidžiama sujungti į 
visumą. Jeigu pasirinkus sujungim ą tenka mažinti tapa čių indų skaičių, 
šiuo atveju apribojimas statistini ų procedūrų, kurias galima taikyti duome ­
nims, skai čius. Jeigu b ūtina taikyti speciali ą statistinę procedūrą ir statistin ę 
galią, atliekant bandym ą šiuo atveju tur ėtų būti naudojamas atitinkamas 
tapačių bandymo ind ų skaičius, kad b ūtų užtikrinamas norimas sujungimas 
į visumą arba taikoma proced ūra ir galia.  
53. Rekomenduojama, kad BAF b ūtų išreiškiamas kaip bendros sausosios mas ės 
funkcija, jeigu reikia (t. y. hidrofobišk ų chemini ų medžiag ų), arba kaip 
lipidų kiekio funkcija. Tur ėtų būti taikomi tinkami lipid ų kiekio nustatymo 
metodai (šiam tikslui tur ėtų būti pritaikomi keli esami metodai, pvz., (31) 
(58)). Šie metodai – chloroformo ir (arba) metanolio ekstrakcijos metodika. Tačiau siekiant išvengti chlorint ų tirpiklių naudojimo reik ėtų rinktis modi ­
fikuotą Bligh ir Dyer metod ą (9) (aprašymas pateiktas (17)). Renkantis 
skirtingus metodus gali nepavykti nustatyti tapa čių verčių, todėl svarbu 
pateikti išsami ą informacij ą apie naudot ą metodą. Jeigu įmanoma, t. y. 
jeigu turimas pakankamas slieko audinio kiekis, lipid ų analizę geriausia 
atlikti naudojant t ą patį bandinį ar ekstrakt ą, kuris naudotas analizuojant 
bandomąją cheminę medžiag ą, nes lipidai dažnai turi b ūti pašalinami iš 
ekstrakto prieš j į pradedant analizuoti chromatografu (49). Antraip kontro ­
linius gyv ūnus galima naudoti matuojant lipid ų kiekį, kuriuo v ėliau galima 
remtis normalizuojant BAF vertes. Pasirinkus pastar ąjį metodą sumažinama 
įrangos tarša bandom ąja chemine medžiaga.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
DUOMENYS IR ATASKAIT Ų TEIKIMAS  
Rezultatų apdorojimas  
54. Bandomosios chemin ės medžiagos sugerties kreiv ė gaunama aritmetin ėje 
skalėje brėžiant šios chemin ės medžiagos koncentracij ą sliekuose ir jiems 
poveikį sugerties tarpsiu daran čią koncentracij ą atsižvelgiant į jos kitim ą 
laike. Kai kreiv ė pasiekia kreiv ės plokščiąją dalį ar nuostovi ąją būseną 
(žr. sąvokų apibrėžtis 1 pried ėlyje), biologinio kaupimosi kriterijus nuosto ­
vioje būsenoje (BAFss) apskai čiuojamas taip:  
C a nuostoviojeb ūsenojearbasugertiestarpsniopabaigoje ðvidutinisÞ 
C s nuostoviojeb ūsenojearbasugertiestarpsniopabaigoje ðvidutinisÞ 
C a yra bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija bandomajame orga ­
nizme  
C a yra bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija dirvožemyje  
55. Jeigu nuostovioji b ūsena nėra užtikrinama, grei čio konstantomis grindžiamas 
BAFK tur ėtų būti nustatomas vietoje BAFss kaip aprašyta toliau:  
— biologinio kaupimosi kriterijus (BAF  K ) nustatomas kaip santykis k  s /k e , 
— sugerties ir šalinimo greitis vis ų pirmiausiai apskai čiuojami vienu metu 
(žr. 2 pried ėlio 11 lygt į), 
— šalinimo grei čio konstanta (k  e ) paprastai apskai čiuojama atsižvelgiant į 
šalinimo kreiv ę (t. y. tiriamojo objekto koncentracijos sliekuose kreiv ę 
šalinimo tarpsniu); tada šalinimo grei čio konstanta k  s apskaičiuojama 
atsižvelgiant į k e ir C  a vertę, kuri gaunama remiantis sugerties kreive, 
žr. 2 pried ėlį, kuriame aprašyti šie metodai; Tinkamiausias BAFK ir 
greičio konstant ų ks ir ke nustatymo metodas – netiesinio parametro 
įvertinimo metodai naudojant kompiuter į. Jeigu šalinimas akivaizdžiai 
nėra pirmo laipsnio, šiuo atveju tur ėtų būti taikomi sud ėtingesni modeliai  
Bandymo ataskaita  
56. Į bandymo ataskait ą turėtų būti įtraukiama ši informacija:  
Bandomoji chemin ė medžiaga:  
— bet kokia turima informacija apie bandomosios chemin ės medžiagos 
ūmųjį ar ilgalaik į toksiškum ą (pvz., EC  x , LC  x „ NOEC) dirvožemio slie ­
kams,  
— grynumas, fizinis pob ūdis, fizinės ir chemin ės savybės, pvz., log K  ow , 
tirpumas vandenyje,  
— chemin ės tapatyb ės nustatymo duomenys, bandomojo objekto šaltinis, 
bet kokio naudoto tirpiklio tapatyb ė ir koncentracija,  
— jeigu naudojama žym ėtoji bandomoji chemin ė medžiaga, šiuo atveju 
nurodoma tiksli žym ėtųjų atomų padėtis, savitasis radioaktyvumas ir 
radiocheminis grynumas.  
Bandomųjų rūšių gyvūnai: 
— mokslinis pavadinimas, veisl ė, bet koks išankstinis apdorojimas, aklima ­
tizavimas, gyv ūnų amžiaus intervalas ir t. t.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Bandymo s ąlygos:  
— naudotos bandymo proced ūros, 
— pasirinkto apšvietimo tipas ir charakteristikos bei apšvietimo laikotarpio 
(ių) trukmė, 
— bandymo planas (pvz., bandymo ind ų skaičius ir dydis, dirvožemio mas ė 
ir dirvožemio sluoksnio storis, tapa čių indų skaičius, sliek ų skaičius 
tapačiame inde, bandom ųjų koncentracij ų skaičius, sugerties ir šalinimo 
tarpsnių trukmė, ėminių ėmimo dažnumas),  
— bandymo indo medžiagos pasirinkimo pagrindimas,  
— tiriamojo objekto paruošimo metodas ir naudojimas bei konkretaus 
metodo pasirinkimo priežastys,  
— nominaliosios bandymo koncentracijos, išmatuot ų verčių vidurkiai ir j ų 
standartiniai nuokrypiai bandymo induose bei ši ų verčių nustatymo 
metodai,  
— dirbtinio dirvožemio sudedam ųjų dalių šaltinis arba, jeigu naudojama, 
natūrali terpė, dirvožemio kilm ė, bet kokio išankstinio apdorojimo apra ­ 
šymas, kontrolini ų bandinių rezultatai (išgyvenimas, biomas ės didėjimas, 
veisimasis), dirvožemio charakteristikos (pH, bendros organin ės anglies 
kiekis, granuliometrin ė sudėtis (procentin ė smėlio, nuos ėdų ir molio 
dalis), vandens sulaikymo geba (WHC  didž. ) procentin ė vandens dalis 
bandymo pradžioje ir pabaigoje ir bet kokie kiti atlikti matavimai,  
— išsami informacija apie dirvožemio ir sliek ų ėminių apdorojim ą, įskaitant 
duomenis apie ruošimo, sand ėliavimo, bandomosios medžiagos įterpimo 
procedūras, bandomojo objekto sliekuose ir dirvožemyje ekstrakcijos bei 
analizės procedūras (ir glaudum ą) ir lipidų kiekį (jeigu matuojamas) bei 
bandomojo objekto regeneravim ą. 
Rezultatai:  
— sliekų iš kontrolini ų indų ir sliekų iš kiekvieno bandymo indo gaišta ­
mumas bei bet koks pasteb ėtas neprastas elgesys (pvz., vengimas 
įsirausti į dirvą, dauginimosi nebuvimas su enchitr ėjais atliekant biolo ­
ginio kaupimosi bandym ą), 
— dirvožemio ir bandom ųjų organizm ų sausosios mas ės santykis su 
šlapiąja mase (naudingas atliekant normalizavim ą), 
— šlapioji kirm ėlių masė kiekvien ą kartą imant ėminius; šlapioji sliek ų 
masė bandymo pradžioje ir kiekvien ą kartą imant ėminius prieš virški ­
namojo trakto turinio pašalinim ą ir jį pašalinus,  
— bandom ųjų organizm ų lipidų kiekis (jeigu nustatomas),  
— bandomosios chemin ės medžiagos sugerties kirm ėlėse ir jos šalinimo iš 
kirmėlių kinetiką ir trukm ę iki nuostoviosios b ūsenos apib ūdinančios 
kreivės, 
— visų ėminių ėmimo laiko C  a ir C  s (su standartiniu nuokrypiu ir intervalu, 
jeigu reikia) (C  a išreiškiama viso k ūno sausosios ir šlapiosios mas ės 
kg –1 , C  s išreiškiama dirvožemio sausosios ir šlapiosios mas ės kg  –1 ). 
Jeigu būtinas nuos ėdų akumuliacijos faktorius (BSAF) (pvz., siekiant 
lyginti su skirtingo lipid ų kiekio gyv ūnais atlikt ų dviejų ar daugiau 
bandymų rezultatus), C  a taip pat galima išreikšti organizmo lipid ų kiekiu 
(g kg  –1 ) ir Cs galima išreikšti kaip dirvožemio organin ės anglies kiek į 
(g kg-1),  
— BAF (išreikštas kaip dirvožemio kg kirm ėlių –1 kg), dirvožemiui 
poveikio grei čio konstanta k  s (išreikšta g dirvožemio kg  –1 kirmėlių 
dienų –1 ) ir šalinimo grei čio konstanta (išreikšta diena  –1 ); BSAF (išreikšt ą 
kg dirvožemio OC kg  –1 kirmėlių lipidų kiekio) galima pateikti papil ­
domai,  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— jeigu buvo išmatuota: procentin ė dalis dirvožemyje ir bandomuosiuose 
gyvūnuose aptiktos pradin ės cheminės medžiagos, metabolit ų ir susijusi ų 
liekanų (t. y. bandomosios chemin ės medžiagos, kurios ne įmanoma ekst ­
rahuoti naudojant įprastus ekstrahavimo metodus, procentin ė dalis),  
— naudoti duomen ų statistinės analizės metodai.  
Rezultatų įvertinimas:  
— rezultat ų atitiktis 17 pastraipoje išvardytiems validumo kriterijams,  
— netikėti ar neįprasti rezultatai, pvz., nevisiškas bandomosios chemin ės 
medžiagos pašalinimas iš bandom ųjų gyvūnų. 
LITERAT ŪRA 
1. Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ-HCH) 
in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra.  
2. ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688–00a.
 
3. ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Interna ­
tional, E1676–04: 26 pp.  
4. Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G 
(2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): 
Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin 
Heidelberg: 235–276.
 
5. Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.  
6. Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens 
J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms 
(Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. SAFEty 25: 
154–165.  
7. Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C 
(1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms ( Eisenia 
andrei ). Ecotox. Environ. SAFEty 31: 185–191.  
8. Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.  
9. Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.  
10. Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, 
Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p.  
11. Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). 
Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestris ­
chen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency 
(Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416.  
12. Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccu ­
mulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Enchytraeus 
luxuriosus  and Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). 
Hydrobiologia 463: 185–196.  
13. Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures 
of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia 
fetida.  J. Soils Sediments 3: 13–20.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
14. Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to 
Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100.  
15. Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2–29.  
16. Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd., The 
Netherlands, pp. 555–576.  
17. De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. 
Round 1 SBT-2, Exercise 1000, ES, Standards, Measurement and Testing Programme.
 
18. Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bach ­
mann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following 
field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145.
 
19. 2006 m. gruodžio 18 d. Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EB) 
Nr. 1907/2006 d ėl chemini ų medžiagų registracijos, įvertinimo, autorizacijos 
ir apribojim ų (REACH), įsteigiantis Europos chemini ų medžiagų agentūrą, iš 
dalies kei čiantis Direktyv ą 1999/45/EB bei panaikinantis Tarybos 
reglament ą (EEB) Nr. 793/93, Komisijos reglament ą (EB) Nr. 1488/94, 
Tarybos direktyv ą 76/769/EEB ir Komisijos direktyvas 91/155/EEB, 
93/67/EEB, 93/105/EB bei 2000/21/EB, OL L 396, 2006 12 30, p. 1.  
20. Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp.  
21. OECD (2008),  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates , 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris.  
22. Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). 
Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten 
Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to 
the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: 149 pp. Galima parsisi ųsti šiuo adresu: 
http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
 
23. Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). SAFEty factors in 
pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 
325: 57 pp.
 
24. Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. 
Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.  
25. EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection 
products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208.
 
26. Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.  
27. Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501–1514.  
28. Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexach ­
lorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlor ­
prop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbricidae). 
Dissertation University Mainz, 156 pp.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
29. Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflan ­
zenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 
78–84.  
30. Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcent ­
ration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.  
31. Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for 
lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105.  
32. Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707.
 
33. Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sedi ­
ments 1: 15–20.  
34. Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxiko ­
logische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisent ­
raeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.  
35. ISO 11268–2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida ). Part 2: Determination of effects on reproduction.  
36. Jaenike J (1982). „ Eisenia foetida “ is two biological species. Megadrilogica 
4: 6–8.  
37. Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 
17: 2080–2090.  
38. Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  
(Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.  
39. Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong 
A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of poly ­
cyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligochaeta) in 
field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 
767–775.  
40. Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.  
41. Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Compa ­
rison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 20: 305–312.  
42. Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.  
43. Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University 
München, 137 pp.  
44. Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.  
45. Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumu ­
lation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. SAFEty 36: 17–26.  
46. Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
47. Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumula ­
tion in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
48. Šio priedo C.8 skyrius. Toksiškumas sliekams.  
49. Šio priedo C.13 skyrius. Biologinis kaupimasis: bandymas su žuvimis prate ­
kėjimo sąlygomis.  
50. Šio priedo C.21 skyrius. Dirvožemio mikroorganizmai: azoto transformacijos 
bandymas.  
51. OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.  
52. Oecd (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), 
Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paris.  
53. OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris.
 
54. Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388.  
55. Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 
1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.  
56. Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.
 
57. Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
58. Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of 
selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ. ­
Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.  
59. Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulations ­
tests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S.  
60. Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an inter ­
national ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp.
 
61. Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: 
Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
 
62. Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secon ­
dary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: 
Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. SAFEty 27: 107–127.  
63. Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
 
64. Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 
413–433.
 
65. Schmelz R and Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 
57: 93–100.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
66. Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 
31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys.  
67. Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
 
68. Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.  
69. Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins 
RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. 
S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, 
Pensacola, 67–81.
 
70. Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. Toxicol. 
Chemistry 22: 1167–1171.
 
71. UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
72. US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of 
sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, 
MN, March 2000.  
73. Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination 
of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277–285.  
74. Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity 
of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
75. Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. 
Chemosphere 21: 1023–1033.  
76. Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioa ­
vailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inverte ­
brates. Environmental Pollution 136: 409–417.  
77. Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.  
78. Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated floodplain 
soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
 
79. Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
 ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
1 priedėlis 
SĄVOKŲ APIBRĖŽTYS  
Biologinis kaupimasis  – bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos padi ­
dėjimas organizme ar jo paviršiuje, palyginti su bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija aplinkin ėje terpėje. Biologin į kaupimąsi sukelia biolo ­
ginės koncentracijos ir su užterštu maistu ar grobiu susij ęs bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracijos organizme did ėjimo procesai (žr. toliau).  
Biologinio kaupimosi koncentracijos did ėjimas  – su chemin ės medžiagos pasi ­
savinimu vis ų pirmiausiai iš aplinkin ės terpės (t. y. per k ūno pavirši ų ir prary­
jamą dirvožem į) susijęs bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos padi ­
dėjimas organizme ar jo paviršiuje, palyginti su bandomosios chemin ės koncent ­
racija aplinkin ėje terpėje. 
Su užterštu maistu ar grobiu susij ęs bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracijos organizme did ėjimas  – su pasisavinimu iš užteršto maisto ar 
grobio susij ęs bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos padid ėjimas 
organizme ar jo paviršiuje, palyginti su bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracijos maiste ar grobyje. D ėl su užterštu maistu ar grobiu susijusio 
bandomosios chemin ės medžiagos koncentracijos organizme did ėjimo bando ­
masis objektas gali b ūti perduodamas į maisto grandines ar jose kauptis.  
Bandomosios chemin ės medžiagos  šalinimas  – šios chemin ės medžiagos išsky ­
rimas iš bandomojo organizmo audinio veikliaisiais ar pasyviaisiais procesais, kurie vyksta neatsižvelgiant į bandomojo objekto buvim ą ar jo nebuvim ą aplin­
kinėje terpėje
 
Biologinio kaupimosi kriterijus  (BAF) bet kuriuo sugerties tarpsnio metu atlie ­
kant šį biologinio kaupimosi bandym ą – bandomosios chemin ės medžiagos 
koncentracija bandomajame organizme ar jo paviršiuje ((C  a g·kg -1 kirmėlių 
sausosios mas ės), padalinta iš chemin ės medžiagos koncentracijos aplinkin ėje 
terpėje (C  s kaip g·kg -1 dirvožemio sausosios mas ės); BAF vienetas yra dirvo ­ 
žemio kg kirm ėlių kg -1 ). 
Nuostoviosios b ūsenos biologinio kaupimosi kriterijus  (BAF  ss ) yra nuostovo ­
sios būsenos BAF ir ilg ą laiką bent kiek labiau nesikei čia, bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracija aplinkin ėje terpėje (C  s kaip g kg  -1 dirvožemio sausosios 
masės) yra pastovus šiuo laikotarpiu.  
Biologinio kaupimosi kriterijai , apskaičiuoti tiesiogiai naudojantis pasisavinimo 
iš dirvožemio grei čio konstantos ir šalinimo grei čio konstantos (k  s ir k  e , žr. 
toliau) santykiu, vadinami kinetiniu biologinio kaupimosi kriterijumi (BAF  K ). 
Biotos-nuos ėdų akumuliacijos kriterijus  (BSAF) – pagal į lipidų kiekį norma­
lizuota bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija bandomajame organizme 
ar jo paviršiuje, padalyta iš pagal organin ę anglį normalizuotos bandomosios 
cheminės medžiagos koncentracijos dirvožemyje esant nuostoviajai b ūsenai. 
Tada C  a yra išreikšta kaip g kg  -1 organizmo lipid ų kiekio ir C  s išreikšta kaip g 
kg -1 dirvožemio organin ės anglies kiekio; BSAF matuojamas kg OC kg  -1 lipidų 
vienetais.  
Nuostovioji b ūsena  yra apibr ėžiama kaip sugerties ir šalinimo proces ų pusiaus­
vyra, nusistovinti vienu metu per sugerties tarpsn į. Nuostovioji b ūsena užtikri ­
nama brėžiant BAF kreiv ę atsižvelgiant į laiką, kai kreiv ė būna lygiagreti laiko 
ašiai ir kai trij ų viena pa kitos atlikt ų ėminių, kurie paimti ne trumpesniais negu 
dviejų dienų intervalais, BAF analizi ų rezultatai vieni nuo kit ų skiriasi ne daugiau 
negu 20 % ir trims ėminių ėmimo laikotarpiams neb ūdingi statistiškai reikšmingi 
skirtumai. Jeigu naudojamos l ėčiau pasisavinamos bandomosios chemin ės 
medžiagos, tinkamesnis b ūtų septynių dienų intervalas (49).  
Organinės anglies ir vandens pasiskirstymo koeficientas  (K  oc ) – chemin ės 
medžiagos koncentracijos dirvožemio organin ės anglies dalyje ar prie jos santykis 
su chemin ės medžiagos koncentracija vandenyje esant pusiausvyrai.  
Oktanolio ir vandens pasiskirstymo koeficientas  (K ow ) – n-oktanolio cheminis 
tirpumas vandenyje esant pusiausvyrai, taip pat kartais išreiškiamas kaip P  ow . 
K ow (log K  ow ) logaritmas naudojamas apib ūdinant vandens organizm ų biologinio 
kaupimo chemin į potencial ą. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Pasisavinimo arba sugerties tarpsnis  yra laikotarpis, per kur į bandomuosius 
organizmus veikia bandomoji chemin ė medžiaga.  
Pasisavinimo iš dirvožemio grei čio konstanta  (k  2 ) – skaitin ė vertė, kuria 
apibrėžiamas bandomojo objekto koncentracijos did ėjimas bandomajame orga ­
nizme arba jo paviršiuje, kai š į didėjimą sukelia pasisavinimo iš dirvožemio 
tarpsnis. k  s išreiškiamas kaip g dirvožemio kg  -1 kirmėlių d -1 . 
Šalinimo tarpsnis  – laikotarpis po bandom ųjų organizm ų iš užterštos terp ės 
perkėlimo į terpę be bandomojo objekto; šiuo laikotarpiu tiriamas chemin ės 
medžiagos šalinimas (ar grynasis jos kiekio maž ėjimas) iš bandom ųjų organizm ų. 
Šalinimo grei čio konstanta  (k e ) – skaitin ė vertė, kuria apibr ėžiamas bandomojo 
objekto koncentracijos bandomajame organizme ar jo paviršiuje maž ėjimo greitis 
po to, kai bandomieji organizmai iš terp ės su bandomuoju objektu perkeliami į 
terpę be šios chemin ės medžiagos; k  e išreiškiamas d  -1 . 
Bandomoji chemin ė medžiaga –  bet kokia naudojant š į bandymo metod ą 
tiriama chemin ė medžiaga ar mišinys.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
2 priedėlis 
Pasisavinimo ir šalinimo parametr ų skaičiavimas  
Svarbiausias biologinio kaupimosi bandymo rezultatas yra biologinio kaupimosi 
kriterijus BAF. Išmatuot ą BAF galima apskai čiuoti koncentracij ą bandomajame 
organizme C  a dalinant iš koncentracijos dirvožemyje C  s esant nuostoviajai 
būsenai. Jeigu nuostovioji b ūsena per sugerties tarpsn į nėra užtikrinama, BAF  K 
apskaičiuojamas pagal grei čio konstantas, o ne pagal BAF  ss . Tačiau pabrėžtina, 
ar BAF grindžiamas nuostoviosios b ūsenos koncentracijomis ar negrindžiamas.  
Kinetinis biologinio kaupimosi kriterijus (BAF  K ), pasisavinimo iš dirvožemio 
greičio konstanta (k  s ) ir šalinimo grei čio konstanta (k  e ) gaunama įprastu būdu, 
t. y. naudojant kompiuterinius netiesinio parametro apskai čiavimo metodus, pvz., 
taikant (68) aprašytus modelius. Jeigu duota koncentracijos kitimo laike duomen ų 
aibė ir lygčių modelis 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [1 lygtis]  
arba 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [2 lygtis]  
kur: 
C a = chemin ės medžiagos koncentracija kirm ėlėse [g kg-1 šlapiosios arba 
sausosios mas ės] 
k s = sugerties grei čio konstanta audinyje [g dirvožemio kg-1 kirm ėlių d-1]  
C a = chemin ės medžiagos koncentracija dirvožemyje [g kg-1 šlapiosios arba 
sausosios mas ės] 
k e = šalinimo grei čio konstanta [d-1]  
t c = laikotarpis sugerties tarpsnio pabaigoje,  
taikant šias kompiuteri ų programas apskai čiuojamos BAF  K , k s ir k  e vertės. 
Jeigu nepaveikt ų kirmėlių, pvz., nulin ę dieną, fono koncentracija gerokai skiriasi 
nuo nulin ės vertės (ši situacija gali susiklostyti, pvz., metal ų atžvilgiu, ši fono 
koncentracija (C  a,0 ) turėtų būti įtraukta į šias lygtis, kurios įgauna šią formą: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [3 lygtis]  
ir 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [4 lygtis]  
Tais atvejais, jeigu sugerties tarpsniu nustatomas didelis bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracijos sumaž ėjimas dirvožemyje, galima rinktis šiuos mode ­
lius, pvz., (67) (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ [5 lygtis]  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
kur: 
C s = chemin ės medžiagos koncentracija dirvožemyje [g kg-1 šlapiosios arba 
sausosios mas ės] 
k 0 = skilimo grei čio dirvožemyje konstanta [d-1]  
C 0 = pradin ė cheminės medžiagos koncentracija dirvožemyje [g kg-1 šlapiosios 
arba sausosios mas ės] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [6 lygtis]  
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [7 lygtis]  
kur: 
C a = chemin ės medžiagos koncentracija kirm ėlėse [g kg-1 šlapiosios arba 
sausosios mas ės] 
k s = sugerties grei čio konstanta audinyje [g dirvožemio kg-1 kirm ėlių d-1]  
k 0 = skilimo grei čio dirvožemyje konstanta [d-1]  
k e = šalinimo grei čio konstanta [d-1]  
t c = laikotarpis sugerties tarpsnio pabaigoje.  
Jeigu nuostovioji b ūsena užtikrinama per sugerties tarpsn į (t. y. t = ∞), 1 lygtį 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [1 lygtis]  
galima suprastinti iki:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
arba 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [8 lygtis]  
Tada k  s /k e x C  s yra arti bandomojo objekto koncentracijos kirm ėlės audinyje 
nuostoviosios b ūsenos sąlygomis (C  a,ss ). 
Biotos-nuos ėdų akumuliacijos kriterij ų (BSAF) galima apskai čiuoti taip: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [9 lygtis]  
kur f  oc yra dirvožemio organin ės anglies dalis ir f  lip yra kirmėlės lipidų dalis; abi 
vertės visų pirmiausiai nustatomos pagal iš bandymo paimtus ėminius bei 
remiantis atitinkamai saus ąja arba šlapi ąja mase.  
Šalinimo kinetik ą galima modeliuoti naudojantis šalinimo tarpsnio duomenimis ir 
taikant toliau nurodyt ą pavyzdin ę lygtį ir kompiuterin į ne linijinio parametro 
apskaičiavimo metod ą. Jeigu duomen ų taškai br ėžiami kaip laiko funkcija ir 
gaunama bandomojo objekto koncentracijos gyv ūnuose tolygi ir proporcinga 
mažėjimo linija, galima naudoti vieno skyriaus model į (9 lygtis) siekiant aprašyti 
šalinimo trukm ę. 
C a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [10 lygtis]  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Šalinimo procesai kartais b ūna dviejų tarpsnių ir patvirtina greit ą C a vertės 
mažėjimą pirmuosiuose tarpsniuose; tada bandom ųjų objektų netekimas l ėtėja 
vėlesniais šalinimo tarpsniais, pvz., (27) (68). Du tarpsnius galima paaiškinti 
darant prielaid ą, kad organizme yra du skirtingi skyriai, iš kuri ų bandomasis 
objektas šalinamas skirtingu grei čiu. Šiais atvejais tur ėtų būti studijuojama 
speciali literat ūra, pvz., (38) (39) (40) (78).  
Naudojant pirmiau nurodytas pavyzdines lygtis taip pat galima apskai čiuoti kine ­
tinius parametrus (k  s ir k  e ) ir šiuo tikslu visiems sugerties tarpsnio ir šalinimo 
tarpsnio duomenims tuo pa čiu metu taikant pirmojo laipsnio kinetikos model į. 
Nuorodos į metodo, kur į taikant šiuo jungtiniu b ūdu galima apskai čiuoti sugerties 
greičio ir šalinimo grei čio konstantas, aprašym ą pateiktos 41), 73) ir 70). 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[11 lygtis]  
Pastaba:  Kai sugerties ir šalinimo parametrai vienu metu apskai čiuojami 
remiantis jungtiniais sugerties ir šalinimo duomenimis, 11 lygtyje pateiktasis „m“ yra deskriptorius, kur į naudojant kompiuterio programa 
atitinkamo tarpsnio duomen ų rinkiniams įmanoma priskirti papildomus 
lygties dėmenis ir teisingai atlikti įvertinimą ((m = 1 naudojamas suger ­
ties tarpsniui; m = 2 naudojamas šalinimo tarpsniui).
 
Vis dėlto šias pavyzdines lygtis reik ėtų naudoti apdairiai, ypa č tuo atveju, kai 
atliekant bandym ą kinta bandomosios chemin ės medžiagos biologinis įsisavina­
mumas ar (biologinis) skaidymas (žr. pvz., 79)).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
3 priedėlis 
DIRVOŽEMIO BIOLOGINIO KAUPIMOSI BANDYM Ų TVARKA ­
RAŠČIO PAVYZDŽIAI  
Bandymas su sliekais  
a) Sugerties tarpsnis su 8 ėminių ėmimo datomis, naudojamomis apskai čiuojant 
kinetiką 
Diena  Veikla  
– 6 Pasiruošto dirvožemio kondicionavimas 48 val.;  
– 4 Bandomosios chemin ės medžiagos įtepimas į dirvožemio dal į; bet 
kokio tirpiklio garinimas; dirvožemio sudedam ųjų dalių 
maišymas; dirvožemio paskirstymas bandymo indams; pusiausvy ­
ros užtikrinimas bandymo s ąlygomis 4 dienas (3 savait ės, jeigu į 
dirvožem į įterpiamas metalas);  
nuo – 3 iki – 1  Bandom ųjų organizm ų išėmimas iš auginimo kult ūros siekiant 
juos aklimatizuoti; dirvožemio sudedam ųjų dalių pasiruošimas ir 
drėkinimas;  
0 Dirvožemio temperat ūros ir pH matavimas; dirvožemio ėminių 
pašalinimas iš paveikt ų indų ir tirpiklio kontrolini ų ėminių, kad 
būtų nustatyta bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija; 
maisto normos d ėjimas; kirm ėlių svėrimas ir atsitiktinis paskirs ­
tymas po bandymo indus; pakankam ų kirmėlių ėminių dalies 
išlaikymas siekiant nustatyti analizines fono vertes, šlapi ąją ir 
sausąją masę ir lipidų kiekį; visų bandymo ind ų svėrimas siekiant 
kontroliuoti dirvožemio dr ėgmės kiekį; oro tiekimo kontrol ė, 
jeigu naudojama uždaroji bandymo sistema;  
1 Oro tiekimo kontrol ė, kirmėlių elgsenos ir temperat ūros registra ­
vimas dirvožemio ir kirm ėlių ėminių ėmimas siekiant nustatyti 
bandomojo objekto koncentracij ą; 
2 Tas pats kaip 1 dien ą; 
3 Oro tiekimo, kirm ėlių elgsenos ir temperat ūros kontrol ė; 
4 Tas pats kaip 1 dien ą; 
5–6 Tas pats kaip 3 dien ą; 
7 Tas pats kaip 1 dien ą; maisto normos davimas dirvožemio 
drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompen ­
suojant išgaravus į vandenį; 
8–9 Tas pats kaip 3 dien ą; 
10 Tas pats kaip 1 dien ą; 
11–13  Tas pats kaip 3 dien ą; 
14 Tas pats kaip 1 dien ą; maisto normos davimas dirvožemio 
drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompen ­
suojant išgaravus į vandenį; 
15–16  Tas pats kaip 3 dien ą; 
17 Tas pats kaip 1 dien ą; 
18–20  Tas pats kaip 3 dien ą; ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Diena  Veikla  
21 Tas pats kaip 1 dien ą; dirvožemio temperat ūros ir pH matavimas; 
dirvožemio dr ėgnumo kontrol ė iš naujo pasveriant bandymo 
indus; sugerties tarpsnio pabaiga; kirm ėlių perkėlimas iš likusi ų 
paveiktų tapačių indų į indus su švariu dirvožemiu šalinimo 
tarpsniui (virškinamojo trakto turinys n ėra šalinamas); dirvožemio 
ir kirmėlių ėminių ėmimas iš tirpiklio kontrolini ų ėminių. 
Veiklos iki poveikio (pusiausvyros nustatymo tarpsnis) tur ėtų 
būti planuojamos atsižvelgiant į bandomosios chemin ės 
medžiagos savybes.  
3 dienoms numatyta veikla tur ėtų būti vykdoma kasdien (bent 
darbo dienomis).  
b) Šalinimo tarpsnis  
Diena  Veikla  
– 6 Dirvožemio sudedam ųjų dalių pasiruošimas ir dr ėkinimas; pasi ­
ruošto dirvožemio kondicionavimas 48 val.;  
– 4 Dirvožemio sudedam ųjų dalių maišymas; dirvožemio paskirs ­
tymas po bandymo indus; inkubacija bandymo s ąlygomis 4 
dienas;  
0 (sugerties tarpsnio 
pabaiga)  Dirvožemio temperat ūros ir pH matavimas; sv ėrimas ir atsitiktinis 
kirmėlių paskirstymas po bandymo indus; maisto normos 
įdėjimas; kirm ėlių iš likusi ų paveiktų tapačių indų perkėlimas į 
indus su švariu dirvožemiu; dirvožemio ir kirm ėlių ėminių 
ėmimas po 4–6 val. siekiant nustatyti bandomosios chemin ės 
medžiagos koncentracij ą; 
1 Oro tiekimo kontrol ė, kirmėlių elgsenos ir temperat ūros registra ­
vimas; dirvožemio ir kirm ėlių ėminių ėmimas siekiant nustatyti 
bandomosios chemin ės medžiagos koncentracij ą; 
2 Tas pats kaip 1 dien ą; 
3 Oro tiekimo, kirm ėlių elgsenos ir temperat ūros kontrol ė; 
4 Tas pats kaip 1 dien ą; 
5–6 Tas pats kaip 3 dien ą; 
7 Tas pats kaip 1 dien ą; maisto normos davimas dirvožemio 
drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompen ­
suojant išgaravus į vandenį; 
8–9 Tas pats kaip 3 dien ą; 
10 Tas pats kaip 1 dien ą; 
11–13  Tas pats kaip 3 dien ą; 
14 Tas pats kaip 1 dien ą; maisto normos davimas dirvožemio 
drėgmės kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus ir kompen ­
suojant išgaravus į vandenį; 
15–16  Tas pats kaip 3 dien ą; 
17 Tas pats kaip 1 dien ą; ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Diena  Veikla  
18–20  Tas pats kaip 3 dien ą; 
21 Tas pats kaip 1 dien ą; dirvožemio temperat ūros ir pH matavimas; 
dirvožemio dr ėgnumo kontrol ė iš naujo pasveriant bandymo 
indus; dirvožemio ir kirm ėlių ėminių ėmimas iš tirpiklio kontro ­
linių ėminių. 
Dirvožemis prieš šalinimo tarpsn į turėtų būti pasiruošiamas taip 
pat kaip prieš sugerties tarpsn į. 
3 dienoms numatyta veikla tur ėtų būti vykdoma kasdien (bent 
darbo dienomis).  
Bandymas su enchitr ėjais 
a) Sugerties tarpsnis su 8 ėminių ėmimo datomis, naudojamomis apskai čiuojant 
kinetiką 
Diena  Veikla  
– 6 Pasiruošto dirvožemio kondicionavimas 48 val.;  
– 4 Bandomosios chemin ės medžiagos įtepimas į dirvožemio dal į; bet 
kokio tirpiklio garinimas; dirvožemio sudedam ųjų dalių 
maišymas; dirvožemio paskirstymas bandymo indams; pusiausvy ­
ros užtikrinimas bandymo s ąlygomis 4 dienas (3 savait ės, jeigu į 
dirvožem į įterpiamas metalas);  
nuo – 3 iki – 1  Bandom ųjų organizm ų išėmimas iš auginimo kult ūros siekiant 
juos aklimatizuoti; dirvožemio sudedam ųjų dalių pasiruošimas ir 
drėkinimas;  
0 Dirvožemio temperat ūros ir pH matavimas; dirvožemio ėminių 
pašalinimas iš paveikt ų indų ir tirpiklio kontrolini ų ėminių, kad 
būtų nustatyta bandomosios chemin ės medžiagos koncentracija; 
maisto normos d ėjimas į dirvožem į; kirmėlių svėrimas ir atsitik ­
tinis paskirstymas po bandymo indus; pakankam ų kirmėlių 
ėminių dalies išlaikymas siekiant nustatyti analizines fono vertes, 
šlapiąją ir sausąją masę ir lipidų kiekį; visų bandymo ind ų 
svėrimas siekiant kontroliuoti dirvožemio dr ėgmės kiekį; oro 
tiekimo kontrol ė, jeigu naudojama uždaroji bandymo sistema;  
1 Oro tiekimo kontrol ė, kirmėlių elgsenos ir temperat ūros registra ­
vimas; dirvožemio ir kirm ėlių ėminių ėmimas siekiant nustatyti 
bandomojo objekto koncentracij ą; 
2 Tas pats kaip 1 dien ą; 
3 Oro tiekimo, kirm ėlių elgsenos ir temperat ūros kontrol ė; 
4 Tas pats kaip 1 dien ą; 
5–6 Tas pats kaip 3 dien ą; 
7 Tas pats kaip 1 dien ą; maisto normos davimas į dirvožem į; dirvo­ 
žemio dr ėgmės kontrol ė iš naujo pasveriant bandymo indus ir 
kompensuojant išgaravus į vandenį; 
9 Tas pats kaip 1 dien ą; 
10 Tas pats kaip 3 dien ą; ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Diena  Veikla  
11 Tas pats kaip 1 dien ą; 
12–13  Tas pats kaip 3 dien ą; 
14 Tas pats kaip 1 dien ą; maisto normos d ėjimas į dirvožem į; dirvo­ 
žemio temperat ūros ir pH matavimas; dirvožemio dr ėgnumo 
kontrolė iš naujo pasveriant bandymo indus; sugerties tarpsnio 
pabaiga; kirm ėlių perkėlimas iš likusi ų paveiktų tapačių indų į 
indus su švariu dirvožemiu šalinimo tarpsniui (virškinamojo 
trakto turinys n ėra šalinamas); dirvožemio ir kirm ėlių ėminių 
ėmimas iš tirpiklio kontrolini ų ėminių. 
Veiklos iki poveikio (pusiausvyros nustatymo tarpsnis) tur ėtų 
būti planuojamos atsižvelgiant į bandomosios chemin ės 
medžiagos savybes.  
3 dienoms numatyta veikla tur ėtų būti vykdoma kasdien (bent 
darbo dienomis).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
4 priedėlis 
Dirbtinis dirvožemis. Ruošimo ir sand ėliavimo rekomendacijos  
Natūralūs dirvožemiai apskritus metus iš konkretaus šaltinio gali b ūti neprieinami 
ir vietiniai organizmai bei esami mikroteršalai gali daryti įtaką bandymui, tod ėl 
atliekant š į bandymą rekomenduojama naudoti šio priedo C.8 skyriuje Toksiš ­
kumas sliekams (48) nurodyt ą dirbtinį substratą, dirbtinį dirvožem į. Kelių rūšių 
bandomieji gyv ūnai gali išgyventi, augti ir daugintis šiame dirvožemyje ir tod ėl 
užtikrinamas didžiausias bandym ų ir kultūros auginimo s ąlygų standartizavimas 
bei bandymo palyginamumas laboratorijoje ir tarplaboratorinis bandymo palygi ­
namumas.  
Sudedamosios dirvožemio dalys: 
Durpės: 10 %  Kimin ų durpės pagal OECD gaires 207 (48);  
Kvarcinis sm ėlis: 70 %  Pramoninis kvarcinis sm ėlis (džiovintas ore); 
grūdelių dydis: daugiau negu 50 % kiet ųjų 
dalelių turėtų būti 50–200 μm, tačiau visos 
dalelės turėtų būti ≤ 2 mm;  
Kaolinito molis:  20 %  Kaolinito kiekis ≥ 30 %;  
Kalcio karbonatas:  ≤ 1 %  CaCO  3 , milteliai, chemini ų atžvilgiu gryni.  
Dirbtinio dirvožemio organin ės anglies kiek į leidžiama sumažinti, pvz., durpi ų 
kiekį mažinant iki 4–5 % sauso dirvožemio kiekio ir atitinkamai didinant sm ėlio 
kiekį. Taip sumažinus organin ės anglies kiek į galima apriboti dirvožemio (orga ­
ninės anglies) geb ą sugerti bandom ąją cheminę medžiagą ir todėl galėtų padidėti 
bandomosios chemin ės medžiagos prieinamumas kirm ėlėms. Įrodyta, kad  Enchy­
traeus albidus  ir Eisenia fetida  gali atitikti dauginimuisi taikomus validumo 
kriterijus, jeigu bandant naudojami lauko dirvožemiai su mažesniu organin ės 
anglies kiekiu, pvz., 2,7 % (33), 61), ir yra patvirtinta patirtimi, kad š į dalyką 
taip pat galima užtikrinti naudojant dirbtin į dirvožem į su 5 % durpi ų. 
Paruošimas  
Dirvožemio sausosios sudedamosios dalys kruopš čiai išmaišomos (pvz., dide ­
liame laboratorijos maišytuve). Jos sumaišomos maždaug prieš savait ę iki 
bandymo pradžios. Sumaišytos sausosios dirvožemio sudedamosios dalys tur ėtų 
būti drėkinamos dejonizuotu vandeniu bent prieš 48 val. iki bandomojo objekto 
įterpimo siekiant užtikrinti r ūgštingumo pusiausvyr ą ir (arba) j į stabilizuoti. 
Nustatant pH vert ę naudojamas dirvožemio ir 1 M KCl tirpalas (santykis 1:5). 
Jeigu pH vert ė neatitinka privalomojo intervalo (6,0 ± 0,5), į dirvožem į įter­
piamas pakankamas kiekis CaCO  3 arba pasiruošiama nauja dirvožemio partija.  
Dirbtinio dirvožemio didžiausia vandens sulaikymo geba (WHC) nustatoma pagal 
standartą ISO 11268-2 (35). Bent dvi dienos iki bandymo pradžios sausas dirb ­
tinis dirvožemis yra dr ėkinamas įpilant reikiam ą kiekį dejonizuoto ar regeneruoto 
vandens siekiant užtikrinti maždaug pus ę galutinio vandens kiekio. Galutinis 
vandens kiekis tur ėtų būti 40 %–60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos. 
Iš anksto sudr ėkintas dirvožemis bandymo pradžioje išskirstomas į tiek dali ų, 
kiek atliekant bandym ą numatoma naudoti bandom ųjų koncentracij ų ir kontro ­
linių bandinių, bei naudojant bandomojo objekto tirpal ą ir (arba) įpilant dejoni ­
zuoto arba regeneruoto vandens užtikrinama, kad dr ėgmės kiekio vert ė būtų 
40–60 % didžiausios vandens sulaikymo gebos. Dr ėgmės kiekis nustatomas 
bandymo pradžioje ir pabaigoje (105 °C temperat ūroje). Drėgmės kiekis tur ėtų 
kuo geriausiai atitikti tam tikros r ūšies gyvūnų reikalavimus (dr ėgmės kiekį taip 
pat galima tikrinti taip: dirvožem į nestipriai suspaudus delne, tarp piršt ų turi 
atsirasti vandens lašeliais).  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Sandėliavimas  
Drėgnosios dirbtinio dirvožemio sudedamosios dalys iki naudojimo pradžios turi 
būti laikomos kambario temperat ūros sąlygomis. Pasiruošt ą, iš anksto sudr ėkintą 
dirvožem į galima lakyti v ėsioje vietoje ne ilgiau negu tris dienas iki tiriamojo 
objekto įterpimo į dirvožem į; būtina pasir ūpinti, kad išgaruot ų kuo mažesnis 
vandens kiekis. Dirvožemis su įterptu bandomuoju objektu tur ėtų būti naudo­
jamas nedelsiant, jeigu neturima informacijos, iš kurios b ūtų matyti, kad tam 
tikrą dirvožem į leidžiama laikyti nepadarant jokio poveikio bandomojo subjekto 
toksiškumui ir biologiniam įsisavinamumui. Po to dirvožemio su įterptu bando ­
muoju objektu ėminius galima sand ėliuoti tam tikram bandomajam objektui reko ­
menduojamomis s ąlygomis, kol bus atliekama analiz ė. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
5 priedėlis 
Atliekant biologinio kaupimosi iš dirvožemio bandymus rekomenduojamos 
naudoti dugno mažašeri ų kirmėlių rūšys 
Sliekai  
Rekomenduojama bandomoji r ūšis yra  Eisenia fetida  (Savigny 1826), priklau ­
santi  Lumbricidae  šeimai. Nuo 1972 m. ji skiriama į du porūšius ( Eisenia fetida  
and Eisenia andrei  (10)). Pagal Jaenike (36) jos yra iš tikr ųjų atskiros r ūšys. 
Eisenia fetida  yra lengvai atpaž įstami pagal švie čias segmentus jungian čias juos­
teles, o  Eisenia Andrei  yra vienaly čiai, tamsiai raudonos spalvos. Jie, ko gero, yra 
kilę iš Juodosios j ūros regiono ir šiandien išplit ę po visą pasaulį, ypač žmogaus 
modifikuotose buvein ėse, pvz., komposto kr ūvose. Abiej ų rūšių sliekus galima 
naudoti atliekant ekotoksikologinius ir biologinio kaupimosi bandymus.  
Eisenia fetida  ir Eisenia andrei  galima įsigyti rinkoje, pvz., kaip masal ą žuvims. 
Palyginti su kit ų rūšių sliekais, min ėtieji gyvena trumpiau, subr ęsta maždaug per 
2–3 mėnesius (kambario temperat ūros sąlygomis). Jiems tinkamiausia tempera ­
tūra yra maždaug 20–24 °C. Jie m ėgsta palyginti dr ėgnus substratus, kuri ų pH 
yra beveik neutralus ir kuri ų didelę dalį sudaro organin ės medžiagos. Ši ų rūšių 
gyvūnai jau maždaug 25 metus pla čiai naudojami atliekant standartinius ekotok ­
sikologijos bandymus, tod ėl jų auginimas yra gerai reglamentuotas (48) (77).  
Abiejų rūšių gyvūnus galima auginti įvairių tipų gyvūninėse atliekose. Standarte 
ISO (35) rekomenduojama iš arkli ų ar galvij ų mėšlo ir durpi ų (50:50) paruošta 
auginimo terp ė. Terpės pH vert ė turėtų būti maždaug 6–7 (koreguojama naudo ­
jant kalcio karbonat ą), mažas joninis laidumas (mažesnis negu 6 mS/cm arba 
mažesnis negu 0,5 % druskos koncentracijos) ir netur ėtų būti pernelyg užteršta 
amoniaku arba gyv ūnų šlapimu. Taip pat leidžiama naudoti rinkai pateikiam ą 
sodininkyst ės dirvožem į be pried ų arba dirbtin į dirvožem į pagal OECD (48) ar 
jų abiejų mišinį santykiu 50:50. Substratas tur ėtų būti drėgnas, tačiau ne 
pernelyg. Galima naudoti 10–50 litr ų auginimo d ėžes. 
Siekiant gauti standartinio amžiaus ir mas ės sliekus geriausia juos išsiauginti iš 
kokonų. Todėl suaugę sliekai sudedami į auginimo d ėžę su šviežiu substratu 
kokonams auginti. Remiantis sukaupta patirtimi galima tvirtinti, kad neblogas auginimo greitis užtikrinamas tuo atveju, kai maždaug 100 suaugusi ų sliekų 
laikomi 1 kg substrato (šlapioji mas ė) Po 28 dien ų suaugę sliekai yra pašalinami. 
Iš kokonų išsiritę sliekai bandymams naudojami subrend ę, t. y. ne anks čiau negu 
po 2 mėnesių, tačiau ne vėliau negu po 12 m ėnesių.
 
Minėtų rūšių sliekus galima laikyti sveikais, jeigu jie rausiasi substrate, nem ėgina 
iš jo išsirangyti ir be perstojo dauginasi. Jeigu sliekai šliaužia labai l ėtai arba 
jiems susiformuoja geltonos spalvos užpakalinis galas (turima omenyje ( Eisenia 
fetida ), šiuo atveju galima manyti, kad substrato yra per daug . Šiuo atveju reko ­
menduojama naudoti švieži ą substratą ir (arba) d ėžėje sumažinti individ ų skaičių. 
Papildomos parinktos nuorodos  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. London, 6: 1–58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1–81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
 
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49–55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180–201.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
London, 31: 1–171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, 
London. 331–338 pp.  
Enchitrėjai 
Rekomenduojamoji r ūšis yra  Enchytraeus albidus  Henle 1837 (baltieji sliekai).  
Enchytraeus albidus  yra viena iš didžiausi ų (ne didesn ės negu 15 mm)  Enchy­
traeidae  šeimos mažašer ės kirmėlės ir jos išplitusios visame pasaulyje, pvz., (8).  
Enchytraeus albidus  gyvena j ūrose, ežeruose ir sausumoje esan čiose buvein ėse; 
jos daugiausiai veisiasi p ūvančiose organin ėse medžiagose (j ūros dumbliuose, 
komposte) ir retai j ų pasitaiko pievose (42). Šios kirm ėlės veisiasi skirtingoje 
ekologinėje aplinkoje ir pagal tam tikrus ši ų kirmėlių sandaros skirtumas galima 
daryti išvad ą, kad gali b ūti skirting ų šios rūšies porūšių. 
Enchytraeus albidus  tiekiamos rinkai ir parduodamos kaip žuv ų pašaras. Priva ­
loma patikrinti, ar kult ūra nėra užteršta kitomis, paprastai mažesni ų rūšių gyvū­
nais (60). Jeigu nustatoma tarša, visos kirm ėlės turėtų būti nuplaunamos vandeniu 
Petrio lėkštelėje. Tada naudojant stereomikroskop ą išrankiojami suaug ę Enchy­
traeus albidus  individai, kurie b ūtų naudojami pradedant nauj ą auginimą. Visos 
kitos kirm ėlės pašalinamos. J ų gyvenimo ciklas yra trumpas, nes šios kirm ėlės 
subręsta per 33 dienas (18 °C temperat ūroje) ir per 74 dienas (12 °C temperat ū­
roje). Atliekant bandym ą turėtų būti naudojamos tik tos kult ūros, kurios labora ­
torijoje buvo laikytos ne trumpiau negu 5 savaites (viena karta) ir d ėl kurių 
nekilo joki ų sunkumų. 
Kitos  Enchytraeus  rūšys taip pat yra tinkamos, vis ų pirma  Enchytraeus luxu ­
riosus.  Šios rūšies gyvūnai dažniausiai gyvena dirvožemyje (j ų naujas aprašymas 
pateiktas (65)). Jeigu naudojamos kitos  Enchytraeus  rūšys, jos tur ėtų būti aiškiai 
identifikuojamos ir nurodomos šios r ūšies pasirinkimo priežastys.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) yra r ūšis, priklausanti tai 
pačiai grupei kaip  Enchytraeus luxuriosus . Patikimai nenustatyta, kad ji b ūtų 
išplitusi laukuose, nes jos aprašymai susij ę tik su sliek ų auginimu ir komposto 
krūvomis (Römbke 2003). Tod ėl jai taikomi pirminiai ekologiniai reikalavimai 
nėra nustatyti. Ta čiau pastaruoju metu atlikus įvairių sričių laboratorinius tyrimus 
nustatyta, kad šios r ūšies kirmėlės prisitaiko prie gana dideli ų dirvožemio savybi ų 
parametrų paklaidų, pvz., pH ir tekst ūros (Jänsch ir kt. 2005). Pastaraisiais metais 
šios rūšies individai dažnai naudoti atliekant ekotoksikologijos tyrimus, nes juos 
lengva auginti ir patogu naudoti, pvz., Kuperman ir kt. 2003). Ta čiau šios 
kirmėlės yra mažos (3–12 mm; vidutinis dydis 7 mm (Westheide & Müller 
1996) ir tod ėl jas būna sunkiau tvarkyti, jeigu lyginama su  Enchytraeus albidus . 
Jeigu ši r ūšis naudojama vietoj  Enchytraeus albidus , galima rinktis mažesn į 
bandymo ind ą, tačiau šia pasirinktimi n ėra privaloma naudotis. Be to, nereik ėtų 
užmiršti, kad šios r ūšies individai veisiasi labai greitai, t. y. nauja palikuoni ų 
karta išauga grei čiau negu per 20 dien ų 20 ± 2 °C temperat ūros sąlygomis 
(Achazi ir kt. 1999) ir net grei čiau, jeigu auginami aukštesn ės temperat ūros 
sąlygomis.  
Enchytraeus albidus  (taip pat kit ų Enchytraeus  rūšių) rūšies enchitr ėjus galima 
auginti didel ės plastiko d ėžėse (pvz., 30 × 60 × 10 cm arba 20 × 12 × 8 cm, 
pritaikytose mažoms kirm ėlėms auginti), pripildytose dirbtinio dirvožemio ir 
rinkai pateikiamo neužteršto sodo dirvožemio be pried ų mišinio. Kompostavimo 
medžiagos nereik ėtų rinktis, nes joje gali b ūti toksiškų cheminių medžiagų, pvz., 
sunkiųjų metalų. Prieš naudojant auginimo dirvožem į jo gyvūnija turėtų būti 
pašalinama, t. y. šiuo tikslu jis tur ėtų būti tris kartus sušaldomas. Taip pat 
leidžiama naudoti dirbtin į dirvožem į be priemaiš ų, tačiau šiuo atveju dauginimosi 
greitis būtų mažesnis, palyginti su tuo grei čiu, kuris yra užtikrinamas pasirinkus 
mišrius substratus. Substrato pH vert ė turėtų būti 6,0 ± 0,5. Auginimo kult ūra 
laikoma inkubatoriuje 15 ± 2 °C temperat ūroje, be šviesos. Bet kokiu atveju 
turėtų būti vengiama aukštesn ės negu 23 °C temperat ūros. Dirbtinis ir (rba) 
natūralus dirvožemis tur ėtų būti drėgnas, tačiau ne šlapias. Dirvožem į šiek tiek 
suspaudus delne tur ėtų rastis tik nedideli vandens lašeliai. Bet kokiu atveju 
neturėtų būti sukuriamos bedeguon ės sąlygos (pvz., jeigu naudojamas dangtis, 
jame turi b ūti pakankamai ang ų, kad būtų užtikrinama reikiama oro kaita). Augi ­
nimo dirvožemis tur ėtų būti aeruojamas, t. y. atsargiai maišomas kart ą per 
savaitę. ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Traiškytomis avižomis, kurios beriamos į dirvožemio paviršiaus ertmes ir užbe ­
riamos dirvožemiu, kirm ėlės turėtų būti šeriamos bent kart ą per savait ę be apri­
bojimų. Jeigu ankstesnio š ėrimo pašaras dar yra lik ę dėžėje, duodamo pašaro 
kiekis tur ėtų būti atitinkamai koreguojamas. Jeigu likus į pašarą apninka grybelis, 
pašarą būtina keisti kitu traiškyt ų avižų kiekiu. Siekiant skatinti dauginim ąsi, 
traiškytas avižas kas dvi savaites galima papildyti rinkai pateikiamais vitaminais 
papildytais baltym ų milteliais. Po trij ų mėnesių gyvūnai perkeliami į šviežiai 
pasiruoštą auginimo ar veisimo substrat ą. Sandariuose induose laikytinas traiš ­
kytas avižas prieš naudojant reik ėtų apdoroti autoklave ar pakaitinti, kad b ūtų 
išvengta milt ų erkių (pvz.,  Glyzyphagus sp. , Astigmata, Acarina) ar pl ėšriųjų 
erkių (pvz.,  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , Gamasida, Acarina) sukeliam ų 
infekcijų. Užbaigus dezinfekavim ą pašaras turi b ūti sumalamas taip, kad j į 
būtų įmanoma lengvai paskleisti dirvožemio paviršiuje. Pašar ą taip pat gali atstoti 
kepimo miel ės ar žuvų maistas „TetraMin  ® “. 
Apskritai auginimo s ąlygos laikomos tinkamomis, jeigu kirm ėlės nemėgina išsi­
gauti iš substrato, greitai šliaužti dirvožemiu, kirm ėlėse nematyti blizgaus išorinio 
paviršiaus su prilipusiomis dirvožemio dalel ėmis, kirm ėlės būna daugiau ar 
mažiau baltos spalvos ir jeigu galima pamatyti skirtingo amžiaus kirm ėlių. 
Tiesą sakant, kirm ėles galima laikyti sveikomis, jeigu jos nuolat dauginasi.  
Papildomos parinktos nuorodos  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.
 
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83.
 
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.
 
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607–616.  
Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species 
(Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.  
Westheide W and Graefe U (1996). Cinematographic documentation of enchy ­
traeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.  ▼M4 2008R0440 — LT — 24.08.2014 — 005.001 — 1467