10.

IV priedas pakeičiamas tokiu tekstu ir grafiku:



„IV PRIEDAS VAŠKO KIEKIO NUSTATYMAS DUJŲ IR SKYSČIŲ KAPILIARINIŲ STULPELIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU 1. TAIKYMO SRITIS Šiame metode aprašomas būdas vaško kiekiui kai kuriuose riebaluose ir aliejuose nustatyti, esant bandymo sąlygoms. Konkrečiai jis gali būti naudojamas, kai reikia atskirti spaudimo būdu gautą maišytą alyvuogių aliejų nuo alyvuogių aliejaus, gauto ekstrahavimo būdu (maišytas alyvų išspaudų aliejus). 2. METODO ESMĖ Į riebalus arba aliejų dedamas vidinis etalonas ir atliekamas chromatografinis frakcionavimas kolonėlėje su hidratuotu silikageliu. Regeneruojama frakcija, kuri bandymo sąlygomis išplaunama pirmoji (jos poliškumas yra mažesnis kaip trigliceridų), vėliau dujų ir skysčių kapiliarinių stulpelių chromatografijos metodu atliekama tiesioginė analizė. 3. ĮRANGA 3.1. 25 ml talpos Erlenmejerio kolba. 3.2. Stiklinė chromatografijos kolonėlė, vidinis skersmuo 15 mm, ilgis 30–40 cm. 3.3. Tinkamas dujų ir skysčių chromatografas su kapiliarine kolonėle ir tiesioginio mėginio įpurškimo įtaisu. Chromatografą sudaro: 3.3.1 Termostatinė kontroliuojama kolonėlių krosnis, kurioje norimą temperatūrą galima palaikyti 1 °C tikslumu. 3.3.2. Šaltas inžektorius mėginiui į kolonėlę tiesiogiai įpurkšti. 3.3.3. Liepsnos jonizacijos detektorius ir konverteris-stiprintuvas. 3.3.4. 3.3.4.Darbui kartu su konverteriu-stiprintuvu (3.3.3) skirtas kintamo popieriaus tiekimo greičio savirašis-integratorius, kurio inertiškumas mažiau kaip viena sekundė. 3.3.5. Stiklinis arba lydyto kvarco 10–15 m ilgio kapiliarinė kolonėlė, kurios vidinis skersmuo 0,25–0,32 mm, iš vidaus padengta 0,10–0,30 μm storio skystos fazės S-52 arba S-54 plėvele arba ją atitinkančios medžiagos plėvele. 3.4. 10 μl talpos mikrošvirkštai su kietinta adata, pritaikyti mėginiui tiesiogiai įpurkšti į kolonėlę. 4. REAGENTAI 4.1. Silikagelis, 70/230 mešų, artikulas 7754 Merck. Silikagelis dedamas į krosnį, ir keturias valandas kaitinamas 500 °C temperatūroje. Ataušinama ir įpilama 2 % vandens. Gauta suspensija homogenizuojama gerai sumaišant. Prieš naudojimą laikoma tamsoje ne mažiau kaip 12 valandų. 4.2. n-heksanas, tinkamas chromatografijai. 4.3. Dietileteris, tinkamas chromatografijai. 4.4. n-heptanas, tinkamas chromatografijai. 4.5. Etaloninis 0,1 % (m/v) laurileikozanato tirpalas heksane (vidinis etalonas). 4.6. Nešančiosios dujos: grynas vandenilis, tinkamas dujų ir skysčių chromatografijai. 4.7. Pagalbinės dujos: — grynas vandenilis, tinkamas dujų ir skysčių chromatografijai, — grynas oras, tinkamas dujų ir skysčių chromatografijai. 5. METODIKA 5.1. Vaško trinties atskyrimas. 5.1.1 Chromatografinės kolonėlės paruošimas. 15 g silikagelio, hidratuoto 2 %, suspenduojama bevandeniame n-heksane ir supilama į kolonėlę. Silikageliui leidžiama savaime nusėsti. Kad chromatografinė juosta būtų vienalytiškesnė, nusodinimas užbaigiamas su elektrine purtykle. Bet kokioms priemaišoms pašalinti per silikagelį perleidžiama 30 ml n-heksano. 5.1.2. Chromatografija kolonėlėje Į 25 ml talpos kolbą tiksliai pasveriama 500 mg mėginio ir įdedama kiek reikia vidinio etalono, atsižvelgiant į numatomą vaško kiekį mėginyje, t. y., įdedama 0,1 mg laurileikozanato maišyto alyvuogių aliejaus atveju ir 0,25–0,5 mg maišyto alyvų išspaudų aliejaus atveju. Paruoštas mėginys dviem 2 ml n-heksano porcijomis supilamas į chromatografijos kolonėlę, paruoštą pagal 5.1 punktą. Tirpikliui leidžiama ištekėti iki 1 mm lygio virš absorbento viršutinio paviršiaus. Paskui pradedamas chromatografinis eliuavimas; surenkama 140 ml n-heksano/dietileterio mišinio, paruošto tūriu santykiu 99: 1, esant 15 lašų per 10 sekundžių srauto greičiui (2,1 ml/minutę). Gauta frakcija džiovinama sukamajame garintuve, kol išgarinamas beveik visas tirpiklis. Paskutinieji 2–3 ml tirpiklio pašalinami silpnoje azoto srovėje, paskui įpilama 10 ml n-heptano. 5.2. Dujų ir skysčių chromatografinė analizė 5.2.1. Paruošiamieji darbai, kolonėlės kondicionavimas 5.2.1.1. Kolonėlė prijungiama prie dujų ir skysčių chromatografo, kolonėlės pradžią sujungiant su kolonėlės tiesioginio įpurškimo įtaisu, galą – su detektoriumi. Patikrinamas dujų ir skysčių chromatografijos įrenginys (dujų kilpų veikimas, detektoriaus ir savirašio veikimas ir t. t.). 5.2.1.2. Jei kolonėlė naudojama pirmą kartą, patartina ją kondicionuoti. Per kolonėlę paleidžiama nestipri dujų srovė, paskui įjungiamas dujų ir skysčių chromatografas. Laipsniškai kaitinama, kol temperatūra nepakyla bent 20 °C aukščiau nei naudojama darbe (pastaba). Ši temperatūra palaikoma ne mažiau kaip dvi valandas, po to nustatomos įrenginio darbo sąlygos (reguliuojamas dujų srautas, užkuriama liepsna, prijungiamas elektroninis savirašis, nustatoma kolonėlės krosnies temperatūra, reguliuojamas detektorius ir t. t.). Signalas užrašomas esant jautrumui, kuris būtų bent du kartus didesnis nei reikalingas analizei atlikti. Pagrindo linija turi būti brėžiama tiesi, be jokių smailių ir nukrypimų. Neigiamas tiesinis nuokrypis rodo, kad neteisingi kolonėlės sujungimai; teigiamas nuokrypis rodo, kad kolonėlė nepakankamai kondicionuota. Kondicionuojama temperatūroje visą laiką bent 20 °C žemesnėje, nei didžiausia naudojamam eliuentui nurodyta temperatūra. 5.2.2. Darbo sąlygų parinkimas. 5.2.2.1. Paprastai darbo sąlygos yra tokios: — kolonėlės temperatūra: pradinė temperatūra 80 °C, kėlimas 30 °C/minutę greičiu iki 120 °C ir toliau programuotas didinimas 5 °C/minutę greičiu iki 340 °C, — detektoriaus temperatūra: 350 °C, — nešančiųjų dujų linijinis greitis: vandenilis 20–35 cm/s, — prietaiso jautrumas: 4–16 kartų didesnis nei mažiausias silpninimas, — savirašio jautrumas: 1–2 mV per visą skalę, — popieriaus greitis: 30 cm/val, — įpurkštos medžiagos kiekis: 0,5–1 μl tirpalo. Šios sąlygos gali būti keičiamos pagal kolonėlės bei dujų ir skysčių chromatografo savybes (kad būtų gautos chromatogramos, atitinkančios tokias sąlygas: C32 vidinio etalono sulaikymo trukmė turi būti 25 ± 2 minutės ir iškiliausios vaškų smailės aukštis sudaro 60–100 % visos skalės aukščio). 5.2.2.2. Smailių integravimo parametrai nustatomi taip, kad būtų gautas teisingas nagrinėjamų smailių plotų įvertinimas. 5.2.3. Analizė 5.2.3.1. 10 μl talpos mikrošvirkštu įsiurbiama 1μl tirpalo; stūmoklis patraukiamas atgal, kol adata ištuštėja. Adata įkišama per įpurškimo įtaisą ir po vienos dviejų sekundžių tirpalas greitai įšvirkščiamas. Maždaug po penkių sekundžių adata atsargiai ištraukiama. 5.2.3.2. Užrašoma, kol vaškai visiškai išplaunami. Pagrindo linija turi visuomet atitikti nustatytas sąlygas (5.2.1.2). 5.2.4. Smailių identifikavimas Smailės identifikuojamos pagal sulaikymo trukmes, lyginant jas su žinomas sulaikymo trukmes turinčių vaškų mišiniais, analizuojamais tomis pačiomis sąlygomis. Pirmojo spaudimo alyvuogių aliejaus vaškų chromatograma parodyta 1 brėžinyje. 5.2.5. Kiekybinė analizė 5.2.5.1. Integratoriumi išmatuojami vidinį etaloną ir alifatinius esterius C40-C46 atitinkančių smailių plotai. 5.2.5.2. Kiekvieno vašką sudaranŁio esterio kiekis, skaiŁiuojant mg/kg riebalų, nustatomas pagal formulę: kurioje: Ax = kiekvieną esterį atitinkančios smailės plotas; As = laurileikozanatą atitinkančios smailės plotas; ms = pridėto laurileikozanato masė, miligramais; m = nustatymui paimto mėginio masė, gramais. 6. REZULTATŲ PATEIKIMAS Pateikiamas atskirų vaškų kiekis ir šių kiekių suma, skaičiuojant mg/kg riebalų.



PAPILDYMAS Dujų linijinio greičio nustatymas Į normalioms darbo sąlygoms nustatytą dujų ir skysčių chromatografą įpurškiama 1–3 μl metano arba propano ir matuojamas laikas, kurį dujos užtruks tekėdamos per kolonėlę nuo įpurškimo momento iki smailės iškilimo momento (tM). Linijinis greitis, cm/s, gaunamas pagal formulę L/tM, kurioje L yra kolonėlės ilgis, centimetrais, tM yra išmatuotas laikas sekundėmis.