A.

Blokuojamasis arba konkurencinis ELISA tyrimas atliekamas pagal šį protokolą: Konkurenciniu ELISA tyrimu, naudojant monokloninį antikūną 3-17-A3, galima nustatyti visų žinomų mėlynojo liežuvio ligos viruso serotipų antikūnus (BTV). Tyrimo principas yra reakcijos tarp BTV antigeno ir grupei būdingo monokloninių antikūno (3-17-A3) pertraukimas pridedant tiriamojo serumo. BTV antikūnai tiriamajame serume blokuoja monokloninio antikūno (Mab) reaktyvumą ir susilpnina lauktos spalvos ryškumą, pridėjus pažymėtų fermentų priešpelinio antikūnų ir chromogeno/substrato. Serumas gali būti tiriamas vieną kartą atskiedžiant 1: 5 (lašinė analizė – 1 priedėlis) arba gali būti titruojamas (serumo titravimas – 2 priedėlis) kol pasiekiamas tirpalo ekvivalentinis taškas. Slopinimo vertės, didesnės nei 50 %, traktuojamos kaip teigiamos. 1. Atitinkamos ELISA mikrotitro plokštelės. 2. Antigenai: pateikiami kaip koncentratas, ekstrahuotas iš ląstelių, paruoštas, kaip aprašyta toliau ir laikomas –20 °C arba –70 °C. 3. Blokuojamasis buferinis tirpalas: fosfato buferiuotas fiziologinis tirpalas (PBS), turintis 0,3 % BTV neigiamo suaugusio galvijo serumo, 0,1 % (V/V) Tween-20 (pateikiamo kaip polioksietileno sorbitono monolaurato sirupas) PBS. 4. Monokloninis antikūnas: 3-17-A3 (pateikiamas kaip hibridomos audinio kultūros paviršinis sluoksnis, nukreiptas prieš prieš grupei būdingą polipeptidą p7, laikomas –20 °C temperatūroje arba sausai užšaldytas ir prieš naudojimą skiedžiamas 1/100 su blokuojamuoju buferiniu tirpalu. 5. Konjugatas: prieš pelių ląsteles veikiantis triušio globulinas (adsorbuotas ir išplautas), konjuguotas su krieno peroksidaze ir laikomas tamsoje, 4 °C temperatūroje. 6. Chromogenas ir substratas: Ortofenileno diamino (OPD-chromogenas) galutinė koncentracija – 0,4 mg/ml steriliame distiliuotame vandenyje. Vandenilio peroksido (30 % w/v substratas) 0,05 % v/v, pridedama nedelsiant prieš panaudojimą (5μl H2O2/10 ml OPD). (Su OPD elgtis atsargiai – dėvėti gumines pirštines – įtariamas mutagenas). 7. 1 molio sieros rūgštis: 26,6 ml įpilama į 473,4 ml distiliuoto vandens. (Atminkite, visada pilkite rūgštį į vandenį, o ne vandenį į rūgštį). 8. Sukamoji purtyklė. 9. ELISA plokštelių skaitytuvas (tyrimą galima skaityti vizualiai). Cc: konjugatų kontrolė (be serumo/be monokloninio antikūno); C++: stipri teigiama serumo kontrolė; C+: silpna teigiama serumo kontrolė; C–: neigiama serumo kontrolė; Cm monokloninio antikūno kontrolė (be serumo).



1 priedėlis: Lašinis praskiedimas (1:5) formatas (40 serumo/plokštelių) Kontrolė Tiriamieji serumai 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C– 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C + C + F C + C + G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



2 priedėlis: Serumo titravimo formatas (10 serumo/plokštelių) Kontrolė Tiriamieji serumai 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C– 1:5 1:5 B Cc C– 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Konjugatų kontrolė (Cc) : 1A ir 1B duobutėse yra tuščioji kontrolė, kurią sudaro iš BTV antigenas ir konjugatas. Gali būti naudojama išvalyti ELISA skaitytuvui. Mab kontrolė (Cm) : 1 ir 2 stulpeliuose bei G ir H eilutėse yra monokloninio antikūno kontrolė ir apima BTV antigeną, monokloninį antikūną ir konjugatą. Šios duobutės reprezentuoja intensyviausią spalvą. Šios kontrolės optinio tankio duomenų reikšmė reprezentuoja 0 % slopinimo vertę. Teigiama kontrolė (C++, C–) : 1 ir 2 stulpeliai, C-D-E-F eilutės. Šiose duobutėse yra BTV antigenas, atitinkamai, BTV stiprus ir silpnas teigiami antiserumai, Mab ir konjugatas. Neigiama kontrolė (C–) : 2A ir 2B duobutėse yra neigiama kontrolė, jose yra BTV antigenas, neigiamas antiserumas, Mab ir konjugatas. Tiriamieji serumai : Plataus masto serologiniams tyrimams ir grupiniams patikrinimams, serumas gali būti tiriamas skiedžiant vieną kartą – 1:5 (1 priedėlis). Alternatyviai – 10 serumų gali būti tiriami praskiedimų diapazone nuo 1:5 iki 1:640 (2 priedėlis). Tai bus tam tikras antikūnų titro rodmuo tiriamame serume. 1. Atskieskite BTV antigeną fosfato buferiuotame fiziologiniame tirpale iki iš anksto titruotos koncentracijos, trumpai paveikite garsu išsklaidydami susikaupusį virusą (jei nėra garso prietaiso, stipriai pumpuokite pipete) ir įpilkite 50 μl į visas plokštelės duobutes. Pabarbenkite plokštelės kraštus, kad antigenas išsisklaidytų. 2. Inkubuokite 60 minučių 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. Išplaukite plokšteles tris kartus užpildami ir ištuštindami duobutes su nesteriliu PBS ir nusausinkite su sugeriamuoju popieriumi. 3) Kontrolinës duobutës: á Cc duobutes ápilkite 100 μl blokuojamojo buferio. Ápilkite 50 μl teigiamo ir neigiamo kontrolinio serumo, skiediant 1:5 (10 μl serumo + 40 μl blokuojanèio buferio) á atitinkamas duobutes C–, C+ ir C++. Á Mab kontrolines duobutes ápilkite 50 μl bokuojančio buferinio tirpalo. Lašinio titravimo metodas: Ápilkite praskiesto santykiu 1:5 kiekvieno tiriamojo serumo su blokuojamuoju buferiniu tirpalu á dvigubas 3 ir 12 stulpeliø duobutes (10 μl serumo + 40 μl blokuojamojo buferinio tirpalo), arba Serumo titravimo metodas: Paruoškite dvigubo skiedimo kiekvieno tyrimo mėginio (nuo 1:5 iki 1:640) blokuojamajame buferiniame tirpale serijas išilgai aštuonių duobučių viengubuose stulpeliuose nuo 3 iki 12. 4. Vos įpylę tiriamuosius serumus, atskieskite Mab 1:100 blokuojamajame buferiniame tirpale ir į visas, išskyrus tuščiosios kontrolės, plokštelės duobutes įpilkite 50 μl. 5. Inkubuokite 60 minučių 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. Išplaukite plokšteles su PBS ir nusausinkite sugeriamuoju popieriumi. 6. Prieš pelių ląsteles veikiantį triušio koncentratą atskieskite iki 1/5000 blokuojamajame buferiniame tirpale ir į visas plokštelės duobutes įpilkite 50 μl. 7. Inkubuokite 60 minučių 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. Išplaukite plokšteles su PBS ir nusausinkite sugeriamuoju popieriumi. 8. Pašildykite OPD ir nedelsiant prieš naudojimą į kiekvieną 10 ml OPD įpilkite 5 μl 30 % vandenilio peroksido. Į visas plokštelės duobutes įpilkite 50 μl. Palaukite kol atsiras spalva maždaug 10 minučių ir sustabdykite reakciją 1 M sieros rūgšties (50 μl duobutei). Spalva turėtų atsirasti Mab kontrolinėse duobutėse ir serumu be BTV antikūnų užpildytose duobutėse (BTV). 9. Patikrinkite ir užregistruokite plokštelių parodymus vizualiai arba naudodami spektrofotometrinį skaitytuvą. Naudodami programinės įrangos paketą, išspausdinkite OD vertes ir procentinį slopinimą (PI), tyrimo ir kontroliniam serumui, pagrįstą vidurkiu, užregistruotu antigeno kontrolinėse duobutėse. Duomenys, gauti kaip OD ir PI vertės, naudojami nustatant, ar tyrimas atliktas tinkamose ribose. Viršutinės kontrolės ribos (UCL) ir apatinės kontrolės ribos (LCL) Mab kontrolei (antigenas plus Mab be tyrimo serumo) yra tarp OD verčių 0,4 ir 1,4. Visos plokštelės, kurios neatitinka anksčiau minėtų kriterijų, turi būti pašalintos. Jei nėra programinės įrangos paketo, OD vertes išspausdinkite, naudodami ELISA printerį. Suskaičiuokite antigeno kontrolinių duobučių OD vertės vidurkį, kuris yra lygus 100 % vertės. Apibrėžkite 50 % OD vertę ir paprastai suskaičiuokite kiekvieno mėginio teigiamumą ir neigiamumą. Procentinio slopinimo (PI) vertė = 100 – (kiekvieno tyrimo kontrolės OD/Cm vidutinį OD) × 100. Dvigubos neigiamo serumo kontrolės duobutės ir dvigubos tuščiosios kontrolės duobutės turėtų registruoti PI vertes tarp +25 % ir –25 % bei, atitinkamai, tarp +95 % ir +105 %. Neatitinkanti šių ribų plokštelė nelaikoma netinkama, suponuojant, kad ryškėja fono spalva. Stiprūs ir silpni teigiami kontrolės serumai turėtų registruoti PI vertes tarp +81 % ir +100 %, bei atitinkamai tarp +51 % ir +80 %. Diagnostinis slenkstis tyrimo serumui yra 50 % (PI 50 % arba OD 50 %). Registruojančių PI vertes mėginių > 50 % yra neigiami. Mėginiai, dvigubose duobutėse registruojantys PI vertes aukščiau ir žemiau slenksčio, laikomi abejotinais; tokie mėginiai dar kartą tiriami lašiniu tyrimu arba/ir titravimu. Teigiami mėginiai taip pat gali būti titruojami siekiant nustatyti teigiamumo laipsnį. Vizualus skaitymas: Teigiami ir neigiami mėginiai lengvai atskiriami plika akimi; silpnai teigiamus ar stipriai neigiamus pavyzdžius gali būti sunkiau atskirti plika akimi. 1. Tris kartus išplaukite susiliejančioms BHK-21 ląstelėms skirtų 40–60 Roux butelių, su serumo neturinčia Eagle terpe ir infekuokite su mėlynojo liežuvio ligos viruso 1 serotipu, paskleistu serumo neturinčioje Eagle terpėje. 2. Inkubuokite 37 °C temperatūroje ir kasdien tikrinkite ar nėra citofatinio efekto (CPE). 3. Jei CPE įvyksta nuo 90 % iki 100 % ląstelių lakšto kiekviename Roux butelyje, surinkite virusą nukratydami visas prikibusias prie stiklo ląsteles. 4. Išcentriškai sukite nuo 2 000 iki 3 000 apsisukimų per minutę, kad ląstelės susigranuliuotų. 5. Pašalinkite paviršinį sluoksnį ir ląsteles vėl suspenduokite maždaug 30 ml PBS, kuriame yra 1 % Sarkosyl ir 2 ml fenilmetilsulfonilo fluorido (lizės buferio). Tai gali sukelti ląstelių gelio formavimąsį, todėl šiam efektui sumažinti gali būti pridėta dar lizės buferio. (NB: fenilmetilsulfonilo fluoridas yra žalingas – elgtis ypač atsargiai.) 6. Suardykite ląsteles, 60 sekundžių veikdami ultragarso zondu 30 mikronų amplitudėje. 7. Išcentriškai sukite 10 minučių 10 000 apsisukimų per minutę. 8. Paviršinį sluoksnį laikykite +4 °C temperatūroje ir likusias ląstelių granules vėl suspenduokite nuo 10 iki 20 ml lizės buferyje. 9. Paveikite garsu ir skaidrinkite, iš viso tris kartus, kiekviename etape saugodami paviršinį sluoksnį 10. Kartu supilkite paviršinius sluoksnius ir išcentriškai sukite 24 000 apsisukimų per minutę (100 000 g) 120 minučių +4 °C temperatūroje virš 5 ml 40 % saharozės pagalvės (w/v PBS), naudodami 30 ml Bekmano centrifugos mėgintuvėlius bei SW 28 rotorių. 11. Pašalinkite paviršinį sluoksnį, kruopščiai nusausinkite mėgintuvėlius ir veikdami garsu vėl įdėkite granules į PBS. Antigeną laikykite alikvotomis –20 °C temperatūroje. Mėlynojo liežuvio ligos ELISA antigenas titruojamas netiesiogine ELISA. Dvigubi antigeno tirpalai titruojami lyginant su pastoviu monokloninio antikūno 3-17-A3 tirpalu (1/100). Protokolas yra toks: 1. Titruokite BTV antigeno, ištirpinto 1:20 PBS, tirpalą mikrotitro plokštelėje dvigubo skiedimo serijomis (50 μl/duobutė), naudodami daugiakanalę pipetę. 2. Inkubuokite vienai valandai 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. 3. Išplaukite tris kartus plokšteles su PBS. 4. Į visas mikrotitro plokštelės duobutes įpilkite 50 μl (atskiesto 1/100) monokloninio antikūno 3-17-A3. 5. Inkubuokite vienai valandai 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. 6. Išplaukite tris kartus plokšteles su PBS. 7. Įpilkite 50 μl prieš pelių ląsteles veikiančio triušio globulino, konjuguoto su krieno peroksidaze, atskiesto iki iš anksto titruotos optimalios koncentracijos, į kiekvieną mikrotitro plokštelės duobutę. 8. Inkubuokite vienai valandai 37 °C temperatūroje sukamojoje purtyklėje. 9. Kaip ankščiau aprašyta, įpilkite chromogeno ir substrato. Po 10 minučių sustabdykite reakciją, pridėdami 1 molio sieros rūgšties (50 μl/duobutė). Atliekant konkurencinę analizę, turi būti monokloninio antikūno perviršis, todėl pasirenkamas tas antigeno skiedinys, kuris atitinka titravimo kreivę (ne plokščiojoje dalyje), kai OD vertė po 10 minučių būna lygi maždaug 0,8.