COMVIISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE 
COM(91)30A cief. 
Bruxelles, 30 luglio 1991 
Proposta di 
REGOLAMENTO (CEE) DEL CONSIGLIO 
che istituisce misure comunitarie di lotta 
contro l'influenza aviare 
(presentata dalla Commissione) 
- 4b*"o-
REtAZIONE 
L'influenza avi are, nella sua forma altamente patogena, è una grave 
malattia contagiosa dei vol at 111. Essa è provocata da un virus la cui 
patogenicità e I cui sintomi sono estremamente vari nei volatili 
recettivi. La malattia è diffusa in tutto il mondo ed il virus può essere 
presente anchi negli uccelli migratori, in particolare quelli acquatici. 
La direttiva 90/539/CEE del Consiglio, del 15 ottobre 1990, relativa alle 
norme di polizia sanitaria per gli scambi intracomunltarI e le importazioni 
in provenienza dai paesi terzi di pollame e uova da cova (1), prevede 
all'articolo 19 l'adozione di misure di lotta contro l'influenza aviare 
prima del 1' luglio 1991. 
Le misure proposte intendono eradicare e prevenire la diffusione 
dell'influenza aviare qualora dovessero scoppiare delie epidemie. Questo 
risultato sarà ottenuto eliminando il pollame con o senza vaccinazione, e 
controllando accuratamente gli spostamenti del pollame, dei prodotti a base 
di pollame, del veicoli e di qualsiasi altra sostanza suscettibile di 
trasmettere il virus della malattia. Le misure devono essere introdotte non 
appena si sospetta la presenza dell'influenza aviare, cosi da consentire un 
intervento immediato ed efficace. 
Per mettere in pratica le azioni di cui sopra, la presente proposta 
prevede, per gli Stati membri, vari obblighi tra cui: 
- organizzare un'indagine per confermare o escludere la presenza di 
influenza aviare in caso di sospetta infezione; 
- sorvegliare le aziende e proibire trasporti da e verso le stesse durante 
il periodo di sorveglianza in caso di sospetta presenza dell'influenza 
aviare; 
- uccidere e distruggere i volatili infetti una volta che l'influenza 
aviare sia stata confermata; 
2) (1) GU n* L 303 del 31.10.1990, pag. 6 
- 2 -
- effettuare un'inchiesta epizootica accurata una volta che la presenza 
dell'influenza aviare sia stata sospettata e confermata; 
- istituire zone di protezione (3 km) e di sorveglianza (10 km) attorno 
alle aziende infette; 
- istituire laboratori che forniscano l'assistenza tecnica necessaria ad 
una corretta applicazione delle misure di lotta contro la malattia; 
- Informare la Commissione in merito ai programmi di vaccinazione; 
- preparare un piano di emergenza. 
~lUo-
Proposta 
Regolamento (CEE) del Consiglio 
che istituisce misure comunitarie di 
lotta contro l'influenza aviare 
LA CONSIGLIO DELLE COMUNITÀ EUROPEE, 
Visto il trattato che istituisce la Comunità economica europea, in 
particolare I'articolo 43, 
Vista la proposta della Commissione, 
Visto il parere del Parlamento europeo, 
Visto il parere del Comitato economico e sociale, 
Considerando che i volatili sono compresi nell'allegato II dei trattato; 
che la loro commercializzazione costituisce un importante fonte di reddito 
per la popolazione agricola; 
considerando la necessità di istituire, a livello comunitario, le misure di 
lotta da prendere in caso di insorgenza dell'influenza aviare in forma 
altamente patogena, provocata da un virus dell'influenza con 
caratteristiche specifiche, in prosieguo denominata "influenza aviare", 
allo scopo di garantire lo sviluppo del settore avicolo e contribuire alla 
protezione sanitaria degli animali nella Comunità. 
considerando che l'insorgere dell'influenza aviare può rapidamente assumere 
un carattere di epizoozia provocando mortalità e perturbazioni tali da 
compromettere gravemente la redditività dell'allevamento del pollame in 
generale; 
- 2^1 -
considerando che è indispensabile agire non appena si sospetta la presenza 
di tale malattia, in modo da prendere provvedimenti immediati ed efficaci 
di lotta in caso di successiva conferma; 
considerando che occorre evitare la diffusione del Sa malattia fin dalla sua 
prima comparsa, sottoponendo ad attento controllo i trasporti degli animali 
e l'uso di prodotti che possano essere contaminati e procedendo ad 
eventuale vaccinazione; 
considerando che la diagnosi della malattia deve essere effettuata sotto 
l'egida di laboratori responsabili, il cui operato deve essere coordinato 
da un laboratorio di riferimento comunitario; 
considerando che il mantenimento di un livello zoosanitario uniforme nella 
Comunità presuppone l'adozione di misure comuni per la lotta contro 
I'influenza aviare; 
considerando l'opportunità di affidare alla Commissione il compito di 
prendere le necessarie misure di applicazione, 
HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO: 
Articolo 1 
1. Il presente regolamento definisce le misure comunitarie di lotta da 
applicare in caso di comparsa dell'influenza aviare nei volatili da 
cortile, fatte salve le disposizioni che disciplinano gli scambi 
intracomuni tar i. 
2. Il presente regolamento non si applica se la malattia viene individuata 
in altri volatili: tuttavia, in questo caso, gli Stati membri mettono al 
corrente la Commissione sulle misure eventualmente adottate. 
- 3 -
Articolo 2 
1. Ai fini del presente regolamento si applicano, se del caso, le 
definizioni di cui all'articolo 2 della direttiva 90/539/CEE del 
Consiglio, relativa alle norme di polizia sanitaria per gli scambi 
intracomunitari e le importazioni in provenienza dei paesi terzi di 
pollame e uova da cova (1^. 
2. Inoltre si intende per: 
a) "pollame infetto" qualsiasi volatile: 
- in cui sia stata ufficialmente confermata la presenza 
dell'influenza aviare, ai sensi dell'allegato I, a seguito di un 
esame effettuato da un laboratorio riconosciuto oppure 
- nel caso di un secondo focolaio constatato o di focolai successivi, 
che presenti sintomi clinici o lesioni post-mortem che possano 
essere attribuiti all'influenza aviare; 
b) "pollame sospetto di infezione": qualsiasi volatile che presenti 
sintomi clinici o lesioni post-mortem tali da indurre ragionevolmente 
a sospettare la presenza dell'influenza aviare, o nel quale sia stata 
accertata la presenza del virus A dell'influenza, sottotipo H5 o H7; 
e) "pollame sospetto di contaminazione": qualsiasi volatile che abbia 
potuto essere esposto, direttamente o indirettamente, al virus 
dell'influenza aviare, oppure al virus A dell'influenza, sottotipo H5 
O H7; 
d) "autorità competente": l'autorità veterinaria all'uopo designata 
dall'amministrazione nazionale del paese in questione, la quale 
risponde direttamente e riferisce a detta amministrazione nell'ambito 
del presente regolamento; 
e) "veterinario ufficiale": il veterinario designato dal l'autorità 
competente dello Stato membro. 
(1) GU n° L 303 del 31.10.1990, pag. 6 
- 4 
Articolo 3 
Qualsiasi caso sospetto di influenza aviare deve essere notificato 
immediatamente all'autorità competente. 
Articolo 4 
1. Qualora si sospetti che il pollame sia infetto o contaminato 
dall'influenza aviare, il veterinario ufficiale deve avviare 
immediatamente un'indagine allo scopo di confermare o escludere la 
presenza della malattia e, in particolare, prelevare o far prelevare i 
campioni necessari per gli esami di laboratorio. 
2. Non appena è notificato un caso sospetto di infezione, l'autorità 
competente pone l'azienda interessata sotto controllo ufficiale e 
dispone in particolare che: 
a) venga compilato un registro di tutte le categorie di volatili 
presenti nell'azienda specificando, per ciascuna di esse/quanti 
volatili sono morti, quanti presentano sintomi clinici e quanti non 
presentano sintomi.Il registro in questione deve essere tenuto 
aggiornato ed essere presentato su richiesta, potendo essere 
controllato in occasione di ciascuna visita; 
b) tutti i volatili presenti nell'azienda restino sequestrati nei locali 
in cui sono allevati o in qualsiasi altro locale in cui possano 
essere isolati e senza contatti con altri volatili; 
e) nessun volatile possa entrare nell'azienda o uscirne; 
d) qualsiasi movimento: 
- di persone, di altri animali e di veicoli in provenienza 
dall'azienda o a destinazione della stessa 
- di carni o carcasse di volatili, mangimi, attrezzi, rifiuti, 
lettiere o qualsiasi altro materiale che possa trasmettere il virus 
dell'influenza aviare dall'azienda 
venga proibito, salvo autorizzazione del veterinario ufficiale; 
- 5 -
e) dall'azienda non siano fatte uscire uova, tranne le uova da mensa che 
siano state previamente disinfettate in modo ritenuto soddisfacente 
dal veterinario ufficiale; 
f) venga fatto ricorso a mezzi appropriati di disinfezione alle entrate 
e alle uscite dei fabbricati in cui sono allevati i volatili, nonché 
de 11'az ienda stessa ; 
g) venga effettuata una indagine epidemiologica conformemente 
all'articolo 7. 
3. Finché le misure ufficiali di cui al paragrafo 2 restano in vigore, il 
proprietario o l'allevatore del pollame sospetto di infezione adopera 
per garantire il rispetto del paragrafo 2, in particolare delle lettere 
(b), (e), (d) e (e). 
4. L'autorità competente può estendere qualsiasi misura di cui al 
paragrafo 2 ad altre aziende qualora, tenuto conto dell'ubicazione e 
della configurazione dei fabbricati o di eventuali contatti con 
l'azienda nella quale si sospetta la presenza della malattia, vi siano 
fondati motivi per sospettare un'eventuale contaminazione. 
5. Le misure di cui ai paragrafi 2, 3 e 4 rimangono applicabili finché ia 
sospetta presenza dell'influenza aviare sia escBusa dal veterinario 
ufficiale. 
Articolo 5 
1. Non appena viene confermata ufficialmente la presenza dell'influenza 
aviare in una azienda, l'autorità competente dispone, oltre 
all'applicazione delle misure elencate nell'articolo 4, paragrafo 2: 
a) che tutti i volatili presenti nell'azienda siano abbattuti in loco. I 
volatili morti o abbattuti e tutte le uova devono essere distrutti. 
Le operazioni di cui sopra devono essere eseguite in modo da ridurre 
al minimo il rischio di diffusione della malattia. 
- 6 -
b) che tutti i materiali e i rifiuti, come il mangime, la lettiera o il 
letame, che potrebbero essere contaminati, vengano distrutti o 
sottoposti a trattamento; quest'ultimo, eseguito conformemente alle 
istruzioni del veterinario ufficiale, deve garantire la distruzione 
del virus dell'influenza aviare eventualmente presente; 
e) che, qualora i volatili siano stati macellati durante il periodo 
presunto di incubazione della malattia, le carni da essi ottenute 
vengano, nella misura del possibile, individuate e distrutte; 
d) che le uova da cova deposte durante il presunto periodo di 
incubazione e uscite dall'azienda siano individuate e distrutte;! 
pulcini già nati da queste uova devono essere posti sotto controllo 
ufficiale; le uova da mensa deposte durante il presunto periodo di 
incubazione e uscite dall'azienda devono, nella misura del possibile, 
essere individuate e distrutte; 
e) che, ultimate le operazioni di cui alla lettera a), i fabbricati 
adibiti all'allevamento e. le loro vicinanze nonché i veicoli usati 
per il trasporto e tutte le attrezzature che possono essere 
contaminate vengano puliti e disinfettati conformemente alle 
disposizioni dell'articolo 11; 
f) che nell'azienda non vengano reintrodotti volatili per almeno 21 
giorni a decorrere dall'ultimazione delle operazioni di cui alla 
lettera e); 
g) che venga effettuata un'indagine epidemiologica conformemente 
al l'articolo 7. 
L'autorità competente può estendere le misure di cui al paragrafo 1 ad 
altre aziende qualora, tenuto conto dell'ubicazione e della 
configurazione dei fabbricati o di eventuali contatti con l'azienda 
nella quale é stata confermata la presenza della malattia, esistano 
fondati motivi di sospettare un'eventuale contaminazione. 
_ 7 -
Articolo g 
1. Nel caso di allevamenti costituiti da due o più branchi separati, 
l'autorità competente può derogare alle disposizioni dell'articolo 5, 
paragrafo 1, lettera a) per i branchi sani di una azienda infetta, a 
condizione che il veterinario ufficiale confermi che le operazioni ivi 
effettuate lasciano i branchi completamente separati per quanto riguarda 
la stabulazione, il governo e l'alimentazione, per cui il virus non può 
propagarsi da un branco all'altro. 
2. La Commissione può, conformemente alla procedura di cui all'articolo 21, 
definire i criteri da applicare per concedere una deroga a norma del 
paragrafo 1. 
Articolo 7 
1. L'indagine epidemiologica verte sui seguenti aspetti: 
- il periodo nel quale può essere stata presente nell'azienda 
I'influenza aviare; 
- l'origine probabile dell'influenza aviare e l'identificazione delle 
altre aziende il cui pollame può essere stato infettato o contaminato 
dalla stessa fonte del virus; 
- i movimenti di persone, pollame o altri animali, veicoli, uova, carni 
e carcasse, nonché attrezzi o materiali che abbiano potuto veicolare 
il virus della malattia nell'azienda in questione o in provenienza da 
esse. 
2. Per coordinare pienamente tutte le misure necessarie al reradicazione 
dell'influenza aviare con la massima tempestività e per condurre 
l'indagine epidemiologica, viene istituita un'unità di crisi. 
[3) 
- 8 -
Le norme general I riguardanti le unità di crisi nazionali e l'unità di 
crisi comunitaria sono contenute nel regolamento (CEE) n del 
Consigilo<1>. 
Articolo 8 
1. Qualora il veterinario uffidale abbia fondati motivi per sospettare che 
il pollame di una azienda possa essere stato contaminato in conseguenza 
di movimenti di persone, animali o veicoli o in qualsiasi altro modo, 
l'azienda in questione é sottoposta a controllo ufficiale conformemente 
al paragrafo 2. 
2. Il controllo ufficiale ha lo scopo di individuare immediatamente 
qualsiasi caso sospetto di influenza aviare, di tenere un registro del 
pollame detenuto nell'azienda e di controllarne i movimenti nonché, ove 
occorra, di prendere le misure elencate al paragrafo 3. 
3. Quando una azienda é sottoposta a controllo ufficiale conformemente alle 
disposizioni del paragrafo 2, l'autorità competente vieta l'uscita di 
volatili dall'azienda tranne per il loro trasferimento diretto in un 
macello, sotto controllo ufficiale, ai fini della loro immediata 
macellazione. L'autorizzazione é concessa previa esecuzione, da parte 
del veterinario ufficiale, di un esame clinico del pollame da cui 
risulti l'assenza dell'influenza aviare nell'azienda. Le suddette 
restrizioni ai movimenti degli animali saranno applicate per un periodo 
di almeno 21 giorni a decorrere dall'ultima data in cui può essersi 
verificata la contaminazione. Tali restrizioni devono comunque essere 
applicate per un periodo di almeno sette giorni. 
4. Qualora ritenga che le condizioni lo permettono, l'autorità competente 
può limitare le misure di cui al presente articolo a una parte 
dell'azienda e al pollame che si trova in tale parte, a condizione che 
il pollame in questione sia stato completamente separato dal restante 
quanto al ricovero, al governo e all'alimentazione e che le relative 
operazioni siano state eseguite da addetti diversi. 
(1) GU n. L ... del pag 
- 9 -
Articolo 9 
1. Non appena é ufficialmente confermata la presenza dell'influenza aviare, 
l'autorità competente delimita, attorno all'azienda infetta, una zona 
infetta che comprende una zona di protezione di almeno 3 km di raggio e 
una zona di sorveglianza di almeno 10 km di raggio. Nel delimitare 
queste zone si tiene conto dei confini naturali e dell'epidemiologia del 
foco I a i o. 
2. Le misure applicate nella zona di protezione comprendono: 
a) l'identificazione di tutte le aziende che detengono pollame situate 
ne 11 a zona ; 
b) visite periodiche di tutte le aziende che detengono pollame, l'esame 
clinico del pollame in questione, compresa, ove occorra, la raccolta 
di campioni da sottoporre ad esami di laboratorio; va tenuto inoltre 
un registro delle visite e dei risultati degli esami; 
e) il sequestro di tutto il pollame nei locali in cui è allevato o in 
qualsiasi altro locale in cui possa essere tenuto isolato-, 
d) il ricorso a mezzi appropriati di disinfezione agli ingressi e alle 
uscite delle aziende; 
e) il controllo dei movimenti degli addetti alla manipolazione del 
pollame, delle carcasse di pollame e delle uova, nonché dei veicoli 
adibiti al trasporto di pollame, di carcasse e di uova all'interno 
della zona; in linea di massima il trasporto del pollame é vietato, 
fatta eccezione per il transito sui grandi assi stradali o 
ferroviari ; 
f) il divieto di uscita del pollame e di uova da cova dall' azienda in 
cui si trovano, tranne qualora l'autorità competente abbia 
autorizzato il trasporto: 
- 10 -
i) di pollame destinato alla macellazione immediata in un macello 
situato, di preferenza, nella zona infetta o, in casi di 
impossibilità, in un macello designato dall'autorità competente 
al di fuori della zona infetta. 
Le carni di tale pollame devono recare il marchio sanitario 
speciale previsto all'articolo 6, paragrafo 1 del 
regolamento.../.../CEE del Consiglio relativo alle norme di 
polizia sanitaria per gli scambi intracomunitari e le 
importazioni in provenienza dai paesi terzi di carni fresche di 
volatili da cortile e di selvaggina da penna allevata (1); 
(il) di pulcini di un giorno o di pollastre pronte per la 
deposizione in una azienda situata nella zona infetta, in cui 
non è presente altro pollame. L'azienda destinataria deve 
essere sottoposta al controllo ufficiale di cui all'articolo 8, 
paragrafo 2; 
(iii) di uova da cova in un incubatoio situato nella zona infetta o 
in incubatoio esterno alla zona infetta, designato 
dall'autorità competente; prima della spedizione, le uova e gli 
imballaggi che le contengono devono essere disinfettati. 
I trasporti autorizzati di cui ai punti (i), (ii) e (iii), devono essere 
effettuati direttamente e sotto controllo ufficiale. Essi sono 
autorizzati soltanto previa esecuzione, da parte del veterinario 
ufficiale, di una ispezione sanitaria dell'azienda. I mezzi di trasporto 
usati devono essere puliti e disinfettati prima e dopo l'uso. 
g) il divieto di spostare o spandere letame o lettiere di pollame senza 
autorizzazione; 
h) il divieto di fiere, mercati, esposizioni e altri raduni di pollame o 
di altri volati Ii. 
3. Le misure applicate nella zona di protezione restano in vigore per 
almeno 21 giorni dopo l'esecuzione delle operazioni preliminari di 
pulizia e di disinfezione dell'azienda infetta, conformemente 
all'articolo 11. La zona di protezione entra allora a far parte della 
zona di sorveglianza. 
(1) COM(89)507 def. 
- 11 -
4. Le misure applicate nella zona di sorveglianza comprendono: 
a) l'identificazione di tutte le aziende che detengono pollame situate 
ne 11 a zona ; 
b) il controllo dei movimenti di pollame e di uova da cova nell'ambito 
de 11 a zona ; 
e) il divieto di uscita del pollame dalla zona per i primi 15 giorni, 
tranne per il trasporto diretto dei volatili ad un macello situato 
fuori dalla zona di sorveglianza, designato dall'autorità competente. 
Le carni di tale pollame devono recare il marchio sanitario speciale 
previsto all'articolo 6 del regolamento .../.../CEE del Consiglio 
relativo alle norme di polizia sanitaria per gli scambi 
intracomunitari e le importazioni in provenienza dai paesi terzi di 
carni fresche di volatili da cortile e di selvaggina da penna 
al levata; 
d) il divieto di uscita di uova da cova dalla zona di sorveglianza, 
tranne per il trasporto ad uno stabilimento designato dall'autorità 
competente.Prima della spedizione le uova e gli imballaggi che le 
contengono devono essere disinfettati; 
e) il divieto di uscita, dalla zona, di concime e lettiera di pollame; 
f) il divieto di fiere, mercati, esposizioni o altri raduni di pollame o 
di altri volati 11 ; 
g) fatte salve le disposizioni di cui alle lettere b) e e), il divieto 
di trasporto di pollame, fatta eccezione per il transito sui grandi 
assi stradali o ferroviari. 
5. Le misure applicate nella zona di sorveglianza restano in vigore per 
almeno 30 giorni dopo l'esecuzione delle operazioni preliminari di 
pulizia e di disinfezione dell'azienda infetta, conformemente 
al l'articolo 11. 
- 12 -
Articolo 10 
1. L'autorità competente stabilisce le procedure che le consentono di 
seguire i movimenti di uova e di pollame. 
2. Il proprietario o il responsabile dell'allevamento dei pollame é tenuto 
a fornire all'autorità competente, su richiesta di quest'ultima, le 
informazioni relative al pollame e alle uova che entrano o escono 
dal l'azienda. 
3. Le persone addette al trasporto o alla commercializazione di pollame e 
di uova devono poter comunicare all'autorità competente le informazioni 
relative agli spostamenti del pollame e delle uova da esse trasportato o 
commercializzato e a fornire qualsiasi altro dettaglio in materia. 
Articolo 11 
1. I disinfettanti da usare e le relative concentrazioni devono essere 
approvati dall'autorità competente. 
2. Le operazioni di pulizia e disinfezione vanno effettuate sotto controllo 
ufficiale, conformemente alle istruzioni impartite dal veterinario 
ufficiale. 
Articolo 12 
La raccolta dei campioni e gli esami di laboratorio volti ad accertare la 
presenza del virus dell'influenza aviare devono essere effettuati 
conformemente all'allegato I. 
Articolo 13 
1. Ogni Stato membro provvede a designare: 
a) uno o più laboratori nazionali muniti delle attrezzature e del 
personale specializzato necessari per poter procedere alla 
valutazione della patogenesi degli isolati del virus dell'influenza 
(allegato I, capitolo 7), nonché all'identificazione dei virus 
dell'influenza dei sottotipi H5 o H7; 
- 13 -
b) uno o più laboratori nazionali per l'esecuzione delle prove sui 
reagenti da usare nei laboratori regionali; 
e) uno o più istituti o laboratori nazionali dove vaccini autorizzati 
possono essere provati al fine di controllare la loro conformità con 
quanto viene specificato dall'autorizzazione di mercato. 
2. I laboratori nazionali di cui all'allegato II sono competenti per il 
coordinamento delle norme e dei metodi di diagnosi, per l'uso dei 
reagenti e per la prova dei vaccini. 
3. I laboratori nazionali che si occupano dell'influenza aviare menzionati 
al paragrafo 2 sono competenti per il coordinamento delle norme e dei 
metodi diagnostici definiti in ciascuno dei laboratori specializzati 
nella malattia all'interno dello Stato membro. A questo scopo essi: 
a) possono fornire i reagenti diagnostici ai laboratori regionali; 
b) controllano la qualità di tutti i reagenti diagnostici usati nello 
Stato membro; 
e) organizzano periodicamente prove comparative; 
d) detengono isolati del virus dell'influenza aviare, provenienti da 
casi individuati nello Stato membro; 
e) garantiscono la conferma di risultati positivi ottenuti nei 
laboratori diagnostici regionali. 
4. I laboratori nazionali elencati nell'allegato II si mantengono in 
contatto col laboratorio comunitario di riferimento di cui all'articolo 
14. 
Articolo 14 
Il laboratorio comunitario di riferimento per l'influenza aviare é indicato 
nell'allegato III. Le sue mansioni e attribuzioni, nella misura in cui non 
siano disciplinate dall'articolo 28 della decisione 90/424/CEE del 
Consiglio relativa a talune spese nel settore veterinario^, vengono 
fissate secondo la procedura descritta all'articolo 21. 
(1) GU n. L 224 del 18.8.1990, pag. 19 
- 14 -
Articolo 15 
1. La vaccinazione contro l'influenza aviare mediante vaccini autorizzati 
dall'autorità competente può essere praticata soltanto per integrare le 
misure di lotta messe in applicazione in caso di comparsa della 
malattia. 
2. La decisione di introdurre la vaccinazione per integrare le misure di 
lotta viene adottata dalla Commissione, in collaborazione con lo Stato 
membro interessato, secondo la procedura descritta all'articolo 21. Tale 
descisione tiene conto dei seguenti elementi: 
- concentrazione di volatili nella zona colpita, 
- caratteristiche e composizione dei vaccini da utilizzare, 
- modalità di controllo della distribuizone, della conservazione e 
de II'i mp iego de i vacc ini, 
- spese e categorie di volatili da sottoporre a vaccinazione, 
- zone nelle quali deve essere eseguita la vaccinazione. 
3. Qualora uno Stato membro venga autorizzato, a norma del paragrafo 2, ad 
effettuare la vaccinazione d'emergenza in una parte delimitata del 
proprio territorio, tale misura non modifica lo status del territorio 
restante purché le misure di immobilizzazione degli animali vaccinati 
restino in vigore per un periodo di tre mesi dalla fine delle operazioni 
di vaccinazione. 
Articolo 16 
1. Qualora, in una determinata regione, una epizoozia di influenza aviare 
si riveli eccezionalmente grave e presenti tendenza a diffondersi, lo 
Stato membro interessato: 
- dichiara "zona ad alto rischio sanitario" una sezione territorialmente 
delimitata, comprendente almeno tutte le zone di protezione e di 
sorveglianza che vi si trovano; 
- 15 -
- mette in applicazione nella "zona ad alto rischio sanitario" le misure 
previste all'articolo 9, paragrafo 3; 
- vieta l'uscita dalla "zona ad alto rischio sanitario" di tutto il 
pollame vivo e delle uova da cova; 
- informa la Commissione e gli altri Stati membri, nell'ambito del 
comitato veterinario permanente, in merito all'evolversi 
dell'epizoozia e alle misure di lotta applicate. 
2. I confini della "zona ad alto rischio sanitario" possono essere 
riesaminati in funzione della progressiva eliminazione di zone di 
sorveglianza. Le misure di cui al paragrafo 1 sono abrogate quando à 
stata eliminata l'ultima zona di sorveglianza. 
3. In caso di persistenza di una situazione di eccezionale gravità, le 
misure che lo Stato membro interessato deve adottare, in particolare 
l'istituzione della "zona ad alto rischio sanitario" e il ricorso alle 
disposizioni dell'articolo 15, possono essere decise conformemente alla 
procedura di cui all'articolo 21. 
Articolo 17 
1. Ciascuno Stato membro redige un piano d'allarme nel quale vengono 
specificate le misure nazionali da applicare in caso di comparsa 
de 11'i nfIuenza avI are. 
Il piano deve consentire l'accesso agli edifici, alle attrezzature, al 
personale e a tutti gli altri materiali necessari per una rapida ed 
efficace eradicazione della malattia. Esso deve precisare il fabbisogno 
di vaccino che ciascuno Stato membro ritiene necessario per 
l'eventualità di una vaccinazione di emergenza. 
- 16 -
2. I criteri da seguire per la stesura del piano sono definiti dalla decisione 
91/42/CEE della Commissione^, dell'8 gennaio 1991, che stabilisce i 
criteri da osservare per l'elaborazione dei piani di allarme per la lotta 
contro l'afta epizootica in applicazione dell'articolo 5 della direttiva del 
Consiglio 90/423/CEE, che si applica mutatis mutandis. 
Secondo la procedura di cui all'articolo 21, la Commissione può modificare o 
completare tali criteri, tenendo conto della natura specifica dell'influenza 
aviare. 
3. I piani redatti in conformità con i criteri di cui ai paragrafo 2 vengono 
presentati alla Commissione non oltre 12 mesi dopo l'entrata in vigore del 
presente regolamento. 
4. La Commissione esamina i piani allo scopo di determinare se essi consentano 
di raggiungere l'obiettivo perseguito e suggerisce allo Stato membro 
interessato gli eventuali emendamenti necessari, in particolare, a garantirne 
la compatibilità con quelli degli altri Stati membri. 
La Commissione approva i piani, se necessario modificati, in conformità con 
la procedura prevista all'articolo 21. 
I piani possono successivamente essere modificati o completati secondo la 
stessa procedura, in modo da tener conto dell'evolversi della situazione. 
Articolo 18 
Se necessario per garantire l'applicazione uniforme del presente regolamento, 
esperti veterinari della Commissione possono, in collaborazione con le autorità 
dello Stato membro interessato, effettuare controlli in loco-, la Commissione 
informa gli Stati membri sui risultati dell'ispezione. 
(1) GU n. L 23 del 29.1.1991, pag. 29 
- 17 -
Lo Stato membro sul cui territorio viene effettuata l'ispezione presta tutta 
l'assistenza necessaria affinché gli esperti possano espletare le loro mansioni. 
Le disposizioni generali per l'attuazione del presente articolo vengono 
determinate In conformità con la procedura prevista all'articolo 21. 
Articolo 19 
Le modalità per la partecipazione finanziaria della Comunità alle azioni 
previste nel presente regolamento sono fissate nella decisione 90/424/CEE del 
Consiglio relativa a talune spese nel settore veterinario. 
Articolo 20 
Gli allegati al presente regolamento possono essere modificati dalla Commissione 
in conformità con la procedura dì cui all'articolo 21, soprattutto per tener 
conto dell'evoluzione dei metodi diagnostici. 
Articolo 21 
1. La Commissione é assistita dal comitato veterinario permanente, istituito con 
decisione 68/361/CEE del Consiglio (1), in appresso denominato "iI 
comitato". 
2. Ove si faccia ricorso alla procedura di cui al presente articolo, si 
applicano le seguenti disposizioni. 
Il rappresentante della Commissione sottopone al comitato un progetto delle 
misure da adottare, il comitato, entro un termine che il presidente può 
fissare in funzione del l'urgenza del la questione in esame, formula il suo 
parere sul progetto, eventualmente procedendo a votazione. 
Il parere é iscritto a verbale-, inoltre, ciascuno Stato membro ha il diritto 
di chiedere che la sua posizione figuri a verbale. 
(1) GU n. L 255 del 18.10.1968, pag. 23 
- 18 - • 
La Commissione tiene in massima considerazione il parere formulato dal 
comitato. Essa lo informa del modo in cui ha tenuto conto del suo parere 
Articolo 22 
Il presente regolamento entra in vigore il 1* luglio 1991. 
Il presente regolamento è obbligatorio un tutti i suoi elementi e direttamente 
applicabile in ciascuno Stato membro. 
Fatto a Bruxelles, Per il Consiglio 
-</$.-
ALLEGATO I 
METODI DIAGNOSTICI PER LA CONFERMA E LA DIAGNOSI 
DIFFERENZIALE DELL'INFLUENZA AVIARE 
I metodi sotto descritti per isolare e individuare i virus dell'influenza aviare 
devono essere considerati come orientamenti e criteri minimi da applicare nella 
suddetta diagnosi. 
Ai fini delle procedure diagnostiche per la conferma e la diagnosi differenziale 
dell'influenza aviare si applica la seguente definizione: 
Per "influenza aviare" si intende un'infezione dei volatili causata da qualsiasi 
virus A dell'influenza avente un indice di patogenicità intravenosa superiore a 
1,2 nei pulcini di sei settimane, ovvero qualsiasi infezione provocata da virus 
A dell'influenza, sottotipo H5 o H7, per il quale il sequenziamento dei 
nucleotidi abbia rivelato la presenza di molteplici amminoacidi basici nel sito 
di clivaggio dell'emoagglutinina. 
CAPITOLO 1 
Campionatura e trattamento dei campioni 
1. campioni 
Frammenti prelevati mediante tampone nell'intestino (o feci) e nella trachea 
di volatili malati; feci o contenuti dell'intestino, tessuti cerebrali, 
trachea, polmoni, fegato, milza e altri organi dell'animale malato, prelevati 
da volatili morti di recente. 
2. Trattamento dei campioni 
Gli organi e i frammenti di tessuto sopra elencati possono essere trattati 
insieme, salvo per quanto riguarda le feci, per le quali é essenziale un 
trattamento separato. I materiali prelevati devono essere immersi 
completamente in un quantitativo sufficiente di antibiotico. I campioni di 
feci e gì I organi devono essere omogeneizzati (in un miscelatore chiuso o in 
un mortalo con pestello e sabbia sterile) in un mezzo antibiotico e portati 
in sospensione in tale mezzo al 10-20% p/v. Le sospensioni devono essere 
lasciate riposare per circa due ore a temperatura ambiente (o per un 
intervallo superiore a 4*C) e successivamente chiarificati mediante 
centrifugazione (ad esempio da 800 a 1000 x g per 10 minuti). 
- 20-
3. Mezzo antibiotico 
Numerosi laboratori hanno utilizzato con successo mezzi antibiotici di varia 
composizione e i laboratori nazionali potranno essere consultati in proposito 
nel rispettivi paesi. Per i campioni di feci occorre una elevata 
concentrazione di antibiotici; una miscela tipica è la seguente: 
10.000 unità/mi di penecillina, 10 mg/mi di streptomicina, 0,25 mg/mi di 
gentamicina e 5.000 unità/mi di micostatina in una soluzione salina tampone 
di fosfato. Queste dosi possono essere ridotte fino a 5 volte per i tessuti e 
per i prelievi di trachea. Per l'accertamento della CI ami di a. si possono 
aggiungere 50 mg/mi di ossitetraciclina. Nel la preparazione del mezzo 
antibiotico, occorre assolutamente controllare il pH dopo l'aggiunta degli 
antibiotici e portarlo al valore 7,0-7,4. 
CAPITOLO 2 
Isolamento del virus 
Isolamento dei virus nelle uova embrionate di galline 
Inoculare 0,1-0,2 mi del liquido sopranatante chiarificato nella cavità 
allant foca di almeno 4 uova embrionate di gallina previamente sottoposte a 
incubazione per 8-10 giorni. Idealmente si dovrebbero utilizzare uova 
provenienti da un branco indenne da organismi patogeni specifici, ma, in caso di 
impossibilità, si possono utilizzare uova provenienti da un branco nel quale sia 
comprovata l'assenza di anticorpi dell'influenza aviarie. Le uova inoculate sono 
mantenute alla temperatura di 37° C ed esaminate ogni giorno in controluce. Le 
uova nelle quali si constata che l'embrione è morto o è morente, nonché tutte le 
uova restanti 6 giorni dopo l'inoculazione, vengono refrigerate a 4*C e il 
liquido al tantoico-amniotico sottoposto alla prova dell'attività 
emoagglut inante. Qualora non si constati emoagglut inazione, il procedimento 
sopra descritto deve essere ripetuto inoculando nelle uova liquido 
allantoico/amniotico non diluito. 
Quando viene constatata emoagglut inazione, la presenza di batteri deve essere 
esclusa mediante coltura. In caso di presenza di batteri, far passare i liquidi 
attraverso un filtro a membrana di 450 mn, quindi aggiungere altri antibiotici e 
procedere nuovamente, come indicato sopra, alla inoculazione in uova embrionate. 
CAPITOLO 3 
Diagnosi differenziale 
1. Differenziazione preliminare 
Data l'importanza di porre in atto al più presto possibile provvedimenti 
volti a limitare la propagazione del virus, ciascun laboratorio regionale 
dovrebbe essere in grado di identificare qualsiasi virus isolato che provoca 
emoagglut inazione, come i virus dell'influenza di sottotipo H5 o H7, oltre al 
virus della malattia di Newcastle. 
Occore pertanto utilizzare i liquidi emoaggluti nanti eseguendo una prova di 
inibizione del I'emoaggIut inazione come descritto ai Capitoti 5 e 6. Una 
inibizione positiva, cioè pari a 24 o più, con l'antisiero poli e Iona le 
specifico dei sottotipi H5 o H7 dell'influenza A ed avente un titolo noto, 
pari almeno a 29, potrà servire per una identificazione preliminare sulla 
cui base istituire misure provvisorie di contenimento. 
2. identificazione di conferma 
Dal momento che esistono 13 sottotipi di emoagglut inina e 9 sottotipi di 
neuraminidasi dei virus dell'influenza, con varianti all'interno di ciascuno 
di essi, non è pratico né economicamente fattibile, per i singoli laboratori 
nazionali, conservare antisieri che consentano di effettuare una 
caratterizzazione antigenica completa degli isolati d'influenza. Nondimeno, 
ciascun laboratorio nazionale è tenuto a: 
(i) confermare che l'isolato è un virus A dell'influenza, mediante 
prova di doppia immunodiffusione atta a rivelare l'antigene del 
gruppo, come indicato al capitolo 9 del presente allegato (si 
possono Impiegare altresì, secondo le preferenze del laboratorio 
nazionale, le tecniche di immunofluorescenza o ELISA); 
-n 
(M) determinare se l'isolato appartiene al sottotipo H5 o H7; 
(iii) eseguire una prova dell'indice di patogeni e ita intravenosa su 
pulcini di sei settimane, come indicato al capitolo 7. Indici di 
patogenicità intravenosa superiori a 1,2 denotano la presenza di 
virus e richiedono quindi la gamma completa delle misure 
profilattiche (è utile che i laboratori nazionali eseguano prove 
anche per determinare l'attitudine di un isolato a produrre 
placche nelle colture di cellule, come specificato ai capitolo 8) 
I laboratori nazionali devono trasmettere immediatamente al laboratorio 
comunitario di riferimento, per una caratterizzazione completa, tutti gli 
iso tati di Influenza aviare e di virus H5 e H7. 
3. Altre prove di individuazione del tipo e delle caratteristiche degli Isolati 
I laboratori nazionali dovrebbero trasmettere al laboratorio comunitario di 
riferimento tutti i virus emoagglutinanti, da sottoporre ad ulteriori esami 
antigeni ci e genetici, ai fini di una maggiore comprensione 
dell'epidemiologia della malattia/delle malattie nella Comunità europea, 
conformemente al compiti assegnati al laboratorio di riferimento. 
Oltre a questi compiti, il laboratorio comunitario di riferimento effettua 
una tipizzazione antigenica completa di tutti i virus dell'influenza 
ricevuti. Per i virus H5 e H7 con indici di patogenicità intravenosa non 
superiori a 1,2, si dovrebbe effettuare altresì un sequenziamento dei 
nucieotidi del gene del l'emoagglutinina per determinare l'eventuale presenza 
di amminoacidi basici multipli nel sito di clivaggio della proteina 
de 11'emoaggI ut In i na. 
-Zi-
CAPITOLO 4 
Prove sierologiche per individuare gii anticorpi del virus 
dell'influenza aviare 
1. Nei programmi di eradicazione in cui è noto il sottotipo H del virus, oppure 
se si usa come antigene il virus omologo, il monitoraggio sierologico per la 
rivelazione dell'infezione può essere effettuato mediante le prove 
d'inibizione dell'emoagglutinazione di cui ai capitoli 5 e 6. 
Se il sottotipo di emoagglutinina non è noto, l'infezione da virus A 
dell'influenza può essere dimostrata mediante la rivelazione di anticorpi 
contro gli antigeni specifici del gruppo. A questo scopo si può ricorrere 
alla prova di doppia immunodiffusione (descritta al capitolo 9) oppure alla 
prova ELISA (che presenta peraltro il problema di essere specifica 
all'ospite, in quanto dipende dalla rivelazione delle immunogIobuIine 
dell'ospite). La prova di doppia immunodiffus ione dà raramente risultati 
positivi negli uccelli acquatici, tranne quando è noto il sottotipo; si può 
quindi utilizzare su questo tipo di volatili soltanto per la ricerca di 
anticorpi dei sottotipi H5 e H7. 
2. (a) campioni 
Prelevare campioni di sangue da tutti i volatili, se il branco è costituito 
da meno di 20 capi, e da 20 esemplari in caso di branchi più numerosi (si ha, 
in tal modo, una probabilità superiore al 99% di individuare almeno un caso 
siero-positivo se almeno il 25% degli individui del branco é positivo, 
indipendentemente dalle dimensioni del branco stesso). Lasciar coagulare il 
sangue e asportare il siero da sottoporre alla prova. 
(b) Ricerca deoli anticorpi 
Verificare la capacità di singoli campioni di siero di inibire l'antigene 
emoagglut inante del virus del l'I.A. mediante prove standard di inibizione 
dell'emoagglutinazione come indicato nel capitolo 6. 
-Zk-
Un aspetto discusso é se nella prova di inibizione del l'emoagglutinante occorre 
usare 4 o 8 unità di emoagglutinina. Entrambe le ipotesi sembrano valide; la 
scelta deve essere quindi lasciata a discrezione dei laboratori nazionali. 
Tuttavia l'antigene usato incide sul livello al quale un siero è considerato 
positivo: usando 4 unità di emoagglutinina, un siero è considerato positivo se 
rivela un titolo uguale o superiore a 24; usando 8 unità dì emoagglutinina, un 
siero ò considerato positivo se rivela un titolo uguale o superiore a 23' 
CAPITOLO s 
PROVA PI EMOAGGLUTINAZIONE (HA) 
Reagent i 
1. Soluzione salina isotonica tamponata con fosfato (0.05M) al pH 7,0-7,4. 
2. Prelevare globuli rossi da almeno 3 volatili esenti da organismi patogeni 
specifici (in caso di impossibilità, il sangue può' essere prelevato da 
volatili regolarmente sottoposti a controllo e che non presentano anticorpi 
del I'influenza aviare), raggrupparli e aggiungerli ad un volume uguale di 
soluzione di Al sever. Prima dell'uso, i globuli rossi devono essere lavati 3 
volte in soluzione salina tamponata con fosfato. Per l'esecuzione della prova 
si raccomanda una sospensione all' 1% (globuli confezionati v/v) in soluzione 
sai ina tamponata. 
3. Il laboratorio comunitario di riferimento fornirà o raccomanderà, come 
antigene standard, I virus H5 e H7 a bassa virulenza. 
Procedimento 
1. Porre 0,025 mi di soluzione in ciascuno dei pozzetti di una piastra di 
microtitolazione in materiale plastico (usare pozzetti a V). 
2. Versare 0,025 mi di sospensione del virus (ad esempio liquido ailantoico) nel 
primo pozzetto. 
3. Usare un diluente da microtitolazione per raddoppiare la diluizione (da 1:2 a 
1:4096) di virus nella piastra. 
4. Aggiungere altri 0,25 di soluzione salina in ogni pozzetto. 
5. Aggiungere 0,025 mi di globuli rossi all' 1% in ogni pozzetto. 
-zy-
6. Mescolare agitando leggermente e porre a riposo alla temperatura di 4*C. 
7. La lettura viene effettuata 30-40 minuti dopo, una vol ta stabi Iizzati i 
globuli rossi di controllo. La lettura si effettua inclinando la piastra ed 
osservando la presenza o l'assenza di globuli rossi raggruppati a forma di 
goccia. Il flusso nei pozzetti che non presentano emoagglutinazione deve 
essere identico a quello constatato presso i globuli rossi di controlio 
esenti dal virus. 
8. Il titolo di emoagglut inazione é costituito dalla diluizione più elevata che 
provoca agglutinazione dei globuli rossi. Tale diluizione può' essere 
considerata come contenente una unità emoagglutinante (HAU). Un metodo più 
accurato per la determinazione del titolo di emoagglutinazione consiste 
nel l'effettuare prove di agglutinazione sul virus in una serie di diluizioni 
iniziali progressive, ad esempio 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, ecc. Si raccomanda 
questa procedura per una preparazione accurata dell'antigene per le prove di 
inibizione del l'emoagglutinazione (Capitolo 6). 
CAPITOLO e 
PROVA DI INIBIZIONE DELL'EMOAGGLUTINAZIONE 
Reagent i 
1. Soluzione salina tamponata con fosfato. 
2. Liquido ailantoico contenente il virus, diluito nella soluzione sai ina in 
modo da avere un contenuto di 4 o 8 unità di emoagglutinazione per 0,025 mi. 
3. Globuli rossi di pollame: 1% 
4. Siero di pollame negativo di controllo. 
5. Siero positivo di controllo. 
Procedimento 
1. Versare 0,025 mi di soluzione salina tamponata con fosfato in tutti i 
pozzetti di una piastra di microtitolazione in materiale plastico (i pozzetti 
devono avere una forma a V). 
2. Versare 0,025 mi di siero nel primo pozzetto della piastra. 
'lb-
3. Usare un diluente da microtitolazione per ottenere una diluizione di 1:2 di 
siero sul la piastra. 
4. Aggiungere 0,025 mi di liquido ailantoico diluito contenente 4 o 8 unità di 
emoaggI utinazione. 
5. Mescolare picchiettando e conservare alla temperatura di 4*C per almeno 60 
minuti o a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. 
6. Aggiungere 0,025 mi di globuli rossi all' 1% in tutti i pozzetti. 
7. Mescolare picchiettando leggermente e porre a riposo alla temperatura di 4*C. 
8. La lettura delle piastre è effettuata dopo 30-40 minuti, dopo che i globuli 
rossi di controllo si sono stabilizzati. La lettura viene effettuata 
inclinando la piastra e osservando se nel flusso del liquido vi é o meno 
formazione di gocce in misura uguale a quelle dei pozzetti di controllo che 
contengono unicamente globuli rossi (0,025 mi) e soluzione salina (0,05 mi). 
9. Il titolo di inibizione delremoagglut inazione é costituito dalla diluizione 
massima di antisiero che comporta una inibizione totale di 4 o 8 unità di 
virus (ciascuna prova dovrebbe comprendere una titolazione di 
emoagglutinazione a scopo di conferma della presenza delle unità di 
agglutinazione richieste). 
10. I risultati sono validi se si ottiene un titolo inferiore a 2* per 4 unità 
di agglutinazione o 22 per 8 unità di agglutinazione con il siero negativo 
di controllo ed un titolo inferiore o uguale a 1 con una diluizione del 
siero di controllo positivo del titolo noto. 
CAPITOLO 7 
PROVA DELL'INDICE DI PATOGENICITÀ ENDOVENOSA M VP M 
1. Diluire di IO-1, in una soluzione isotonica salina sterile, liquido 
ailantoico infetto prelevato dall'ultimo livello di passaggio disponibile, 
preferibilmente dall'isolamento iniziale senza selezione. 
2. Iniettare per via endovenosa 0,1 mi di virus diluito in dieci pulcini di se 
settimane (deve trattarsi di animali esenti dallo specifico patogeno). 
3. Esaminare i pulcini per 10 giorni, ad intervalli di 24 ore. 
-Il--
4. Classificare ognuno del pulcini ad ogni osservazione nel modo seguente: 0 
normale; 1 - malato; 2 - gravemente malato; 3 - morto. 
5. L'indice è calcolato come ne II'esempio che segue: 
Sintomi clinici Giorni successivi all'inoculaz Punteggio 
~~ totale 
1234 56789 10 
normale 10 2000000 0 0 12x0- 0 
malato 0 4 2 0 0 0 0 0 0 0 6x1- 6 
gravemente malato 0 2 2220000 0 6x2- 12 
morto 0 2 6 8 10 10 10 10 10 10 76 x 3 - 228 
TOTALE - 246 
L'INDICE É COSTITUITO DAL PUNTEGGIO MEDIO PER PULCINO PER OGNI 
OSSERVAZIONE, OSSIA 246/100 - 2,46 
* Deve trattarsi di un giudizio clinico soggettivo; in questo caso, tuttavia, i 
volatili presentano generalmente uno o più dei seguenti sintomi: 
complicazioni respiratorie, depressione, diarrea, cianosi del l'epidermide o 
del bargiglio, edema facciale o cranico, sintomi neuropatologici. 
CAPITOLO 6 
VALUTAZIONE DELLA CAPACITA DI FORMAZIONE PI PLACCA 
1. Il procedimento migliore consiste nel l'utiIizzare tutta una gamma di 
diluizioni di virus per essere certi di disporre.sulla piastra dei numeri 
ottimali di piacche. Dieci diluizioni fino a 10 
in soluzione salina fosfatata dovrebbero essere sufficienti. 
2. Monostrati confluenti di cellule di embrione di votatile o una linea 
cellulare adeguata (ad esempio rene bovino Madin-Darby) sono preparati e 
disposti in scatole di Petri aventi 5 cm di diametro. 
3. Aggiungere in due scatole di Petri 0,2 mi di ciascuna delle diluizioni di 
virus e lasciar assorbire il virus per 30 minuti. 
4. Lavare 3 volte con la soluzione salina le cellule infette, indi ricoprirle 
con il mezzo pertinente, contenente I'1% p/v di agar e 0,01 mg/mi di 
tripsina, oppure non contenente tripsina; é importante non aggiungere siero 
ai mezzo di copertura. 
2cP-
5. Dopo una incubazione a 37°C per 72 ore, le placche dovrebbero avere una 
dimensione sufficiente. Per una migliore osservazione delle placche, 
asportare lo strato di agar di copertura e colorare il monostrato cellulare 
con cristalvioletto (0,5% p/v) in metanolo al 25% v/v. 
6. Tutti i virus dovrebbero fornire placche evidenti, se incubati alla presenza 
di tripsina nello strato di copertura. Se nel mezzo di copertura non vi é 
tripsina, soltanto I virus virulenti per i volatili producono placche. 
CAPITOLO 9 
IMMUNODIFFUSIONS DOPPIA 
Il metodo raccomandato per rivelare la presenza del virus A dell'influenza 
consiste nel I'individuare gli antigeni del nucleocapside o della matrice, che 
sono comuni a tutti i virus A dell'influenza. A ciò si perviene generalmente 
mediante le prove di immunodiffusione doppia, utilizzando preparazioni di virus 
concentrati o estratti di membrana cor io-ai tanto idea infetta. 
Idonei preparati di virus concentrati si possono ottenere semplicemente 
centrifugando ad alta velocità liquido ailantoico infetto e sottoponendolo ad un 
trattamento a base di detergente lauro!Isarcosinato di sodio, in modo che dal 
frazionamento del virus siano liberati gli antigeni che si trovano all'interno 
del nucleocapside e della matrice. Si può usare anche un precipitante acido, 
aggiungendo al liquido ailantoico HCL 1N, per ottenere un pH finale di 3,5-4,0, 
refrigerando per circa un'ora a 0°C e centrifugando a bassa velocità (1000 g) 
per 10 minuti. Il liquido supernatante può essere eliminato ed il precipitato 
contenente il virus può essere rimesso in sospensione in un volume minimo di 
tampone gìicina-sarcosile (lauroiIsarcosinato di sodio all' 1% tamponato con 
glicina 0.5M, fino ad ottenere un pH di 9,0). Queste preparazioni possiedono 
antigeni sia del nucleocapside che della matrice. 
Beard (1970) ha descritto la preparazione di antigeni ricchi di nucleocapside 
ottenuti dalle membrane cor io-ailantoidee prelevate da uova infette. Il 
procedimento si svolge come segue: si estraggono le membrane cor io-ailantoidee 
dalle uova infette con emoagglutinina positiva; si frantumano od omogeneizzano 
le membrane; si congela e sgela tre volte, centrifugando quindi per 10 minuti a 
1000 g; si elimina il deposito formatosi e si tratta il liquido supernatante con 
formalina allo 0,1% per utilizzarlo come antigene. 
-l%-
Entrambi questi antigeni possono essere utilizzati per la prova di 
immunodiffus ione doppia, con gel di agarosio o di agar contenente cloruro di 
sodio ali'8% portato a molar ita 0,1 con tampone fosfato a pH 7,2. li virus A 
dell'influenza é confermato dal le linee di precipitina formate dall'antigene di 
prova e dall'antigene positivo noto, prendendo come termine di riferimento un 
antisiero positivo noto che, coalescendo, producono una linea d'identità. 
-io-
ALLEGATO 11 
Elenco dei laboratori nazionali designati per l'influenza aviare 
Belgio 
Danimarca 
Germania 
Francia 
Grecia 
Irlanda 
Italia 
Lussemburgo 
Paesi Bassi 
Por toga I lo 
Spagna 
Regno Unito Institut national de recherches vétérinaires, 
Groeselenberg 99, B-1180 Bruxelles 
National Veterinary Laboratory, Poultry Disease 
Division, Hangovej 2, DK-8200 Aarhus N. 
Institut fur Kleintierzucht der Bundesforschungs-
anstalt fur Landwirtschaft, Braunschweig-
Vôlkenrode, Postfach 280, D-3100 Celle 
Centre National d'Etudes Vétérinaires er Alimen­
tation - Laboratoire Central de Recherches 
Agricoles et Porcine, B.P. 53, F-22440 Pioufragan 
Veterinary Research Laboratory, Abbotstown, 
Casti eknock, Dublin 15 
Istituto Patologia Aviare, Facoltà di Medicina 
Veterinaria, Università di Napoli, 
Via Aniezzo Falcone 394, 
I - 80127 Napoli-F Delfino 1 
Institut National de Recherches Vétérinaires, 
Groeselenberg 99, B-1180 Bruxelles 
Centraal Diergeneeskundig Instituut, Vestiging 
Virologie, Hourtibweg 39, NL-8221 RA Lelystad 
Laboratòrio Nacional de Investigaçao Veterinaria 
(LNIV), Estrada de Benfica 701, 1500 Lisboa 
Central Veterinary Laboratory, New Haw, Weybridge 
GB-Surrey KT15 3NB 
ALLEGATO Ml 
Laboratorio Comunitario di riferimento per l'influenza aviare 
Central Veterinary Laboratory 
New Haw 
Weybridge 
Surrey KT15 3NB 
United Kingdom 
ISSN 0254-150S 
COM(91)304def. 
DOCUMENTI 
IT 03 
N. di catalogo : CB-CO-91-344-IT-C 
ISBN 92-77-74819-2 
Ufficio delle pubblicazioni ufficiali delle Comunìtà europee 
L-2985 Lussemburgo