Protocollo all'accordo europeo per lo scambio dei reattivi per la determinazione dei gruppi sanguigni



Gazzetta ufficiale n. L 037 del 07/02/1987 pag. 0033 - 0043

edizione speciale finlandese: capitolo 11 tomo 11 pag. 0378

edizione speciale svedese/ capitolo 11 tomo 11 pag. 0378



PROTOCOLLO ALL'ACCORDO EUROPEO per lo scambio dei reattivi per la determinazione dei gruppi sanguigni DISPOSIZIONI GENERALI 1. Specificità Un reattivo per la determinazione dei gruppi sanguigni deve reagire a tutti i campioni di sangue esaminati contenenti l'antigeno omologo dell'anticorpo o delle altre sostanze indicate sull'etichetta. Se un reattivo è utilizzato con la tecnica raccomandata dal produttore, non deve manifestarsi alcuno dei fattori o fenomeni seguenti: a) proprietà emolitiche; b) anticorpi o sostanze diverse da quelle indicate sull'etichetta; c) prodotti batterici che possono provocare reazioni anomale, positive o negative; d) pseudo-agglutinazione mediante formazione di ammassi; e) fenomeno di prozono. 2. Potenza Il grado viene misurato operando delle diluizioni con successivi sdoppiamenti del reattivo, da esaminare in ambiente appropriato. Ad ogni diluizione viene aggiunta una sospensione di globuli rossi di pari volume. Il grado è il contrario della cifra che rappresenta la maggiore diluizione in cui si può rilevare una reazione ; in tal caso, la diluizione è calcolata escludendo dal volume totale il volume della sospensione di globuli. Nel caso dell'anti-A dell'anti-B e degli altri reattivi destinati ad essere utilizzati su vetrini, l'avidità è espressa in funzione del tempo necessario all'agglutinazione su vetrino. 3. Campioni internazionali ed unità internazionali L'Organizzazione mondiale della Sanità ha definito taluni standard internazionali di reattivi per la determinazione dei gruppi sanguigni anti-A, anti-B e anti-D incompleto ed altri sono allo studio per i gruppi di sangue che presentano altre specificità. Una preparazione standard internazionale contiene, per definizione, un certo numero di unità internazionali/mg o ml, e questa definizione è indipendente dai tassi osservati su globuli rossi particolari (1). (1)La potenza dei reattivi per la determinazione della maggior parte dei gruppi sanguigni è espressa dal grado di agglutinazione osservato, in una serie di diluizioni, in una sospensione di globuli rossi. Il grado indica la diluizione del reattivo utilizzato nell'ultima miscela nella quale avviene l'agglutinazione (visibile al microscopio). La potenza dei reattivi per la determinazione dei gruppi sanguigni, per i quali esistono standard internazionali (anti-A, anti-B e anti-D incompleto, al momento), può essere espressa in unità internazionali (Vedasi Bulletin WBO OMS 1954, 10, 937, 941, e Bulletin WBO OMS 1950, 3 ; 301) in base ad una titolazione del reattivo sconosciuta, raffrontata alla preparazione standard internazionale o ad un campione nazionale. Gli standard internazionali di sieri per la determinazione dei gruppi sanguigni sono distribuiti in ampolle contenenti siero umano essiccato. Ridotti al volume di 1 ml, i sieri anti-A e anti-B contengono, per definizione, 256 UI/ml. Essi vengono forniti gratuitamente dal Laboratorio internazionale degli standard biologici dell'Organizzazione mondiale della Sanità, statens Serum-Institut, Copenaghen. Nella tabella che segue figura un esempio di titolazione comparativa del siero standard internazionale anti-A (5) e di un reattivo anti-A «sconosciuto» (U) in presenza di globuli rossi A1 e di globuli rossi A2B. >PIC FILE= "T0045095"> 4. Stabilità e data di scadenza Immagazzinato alle condizioni raccomandate dal produttore ogni reattivo dovrebbe conservare le qualità richieste per almeno un anno. Per i reattivi allo stato liquido la data di scadenza indicata sull'etichetta non deve superare di più di un anno la data dell'ultimo controllo di attività risultato soddisfacente. La data di scadenza può essere prorogata per periodi di un anno dopo nuovi controlli. Per quanto riguarda i reattivi allo stato essiccato, la data di scadenza indicata sull'etichetta dipenderà dal risultato delle prove di stabilità ; essa dovrà essere inoltre approvata dalle autorità nazionali di controllo. 5. Conservazione I reattivi per la determinazione dei gruppi sanguigni possono essere conservati sia allo stato liquido sia essiccati. I reattivi essiccati devono essere posti in un'atmosfera di gas inerte o sotto vuoto in un recipiente di vetro sigillato in modo da preservarli dall'umidità. Un reattivo essiccato nuovamente con anidride fosforica ad una pressione non eccedente 0,02 mm di mercurio per 24 ore perde, in peso, più dello 0,5 %. I reattivi devono essere preparati in ambiente asettico e non essere contaminati da batteri. Per impedire la proliferazione dei batteri l'autorità nazionale competente può decidere di aggiungere al reattivo (o al solvente fornito con i reattivi essiccati) un antisettico e/o un antibiotico, sempreché, in presenza della sostanza aggiunta, il reattivo risponda alle norme di specificità e di potenza. I sieri per la determinazione dei gruppi sanguigni di origine umana devono contenere almeno 2,5 mg di azoto proteico/ml di siero liquido o ricostituito. I reattivi, sia allo stato liquido, sia ricostituiti, devono essere limpidi e non presentare deposito, gel o particelle visibili. 6. Colorazione È preferibile che i reattivi per la determinazione dei gruppi sanguigni destinati ad essere oggetto di scambi internazionali non vengano colorati artificialmente, almeno fino a quando un accordo internazionale non istituisca un sistema uniforme. Qualsiasi sostanza colorante aggiunta deve essere priva di effetti sulle reazioni specifiche. 7. Distribuzione e volume I reattivi per la determinazione dei gruppi sanguigni devono essere distribuiti in modo e in volumi tali che il reattivo contenuto in un recipiente basti per effettuare i test con globuli testimoni positivi e negativi, oltre ai test con globuli sconosciuti. Il volume contenuto in ciascun recipiente deve essere tale che si possa procedere, se del caso, ai test di potenza descritti nel presente protocollo. 8. Registri e campioni Il laboratorio produttore dovrà annotare nei suoi registri tutte le fasi della produzione e del controllo dei reattivi per la determinazione dei gruppi sanguigni. Campioni di tutti i reattivi distribuiti devono essere conservati dal laboratorio fino a quando si presuma che le rispettive partite non vengano più utilizzate. 9. Classificazione dei reattivi I reattivi utilizzabili per la determinazione dei gruppi sanguigni possono contenere sostanze di origine umana, animale, vegetale (o minerale), costituenti, le une, il principio attivo, le altre, i coadiuvanti necessari per rafforzarne l'attività o mantenere la stabilità. Per motivi tecnici questi reattivi sono stati raggruppati in tre capitoli, a seconda dell'origine del loro costituente attivo. Ciò non significa che i reattivi di origine umana contengano unicamente prodotti di origine umana e che i reattivi animali o vegetali non possano contenere sostanze di origine umana. 10. Etichettatura, avvertenza e certificato Un'etichetta in inglese e in francese, stampata nero su bianco, verrà incollata a ciascun recipiente definitivo e recherà le seguenti indicazioni: 1. Nome ed indirizzo dello stabilimento produttore. 2. Nome del reattivo, quale risulta dal titolo delle specificazioni corrispondenti. 3. Nome e quantità dell'antisettico e/o dell'antibiotico - se del caso - ovvero indicazione della sua assenza. 4. Volume o, se il reattivo è essiccato, volume e composizione del liquido necessario per la sua ricostituzione. 5. Data di scadenza. 6. Numero della partita. Inoltre, su questa etichetta o sull'etichetta del collo che raggruppi vari recipienti definitivi o sull'avvertenza che accompagna i recipienti, figureranno le seguenti indicazioni: 1. Nome ed indirizzo dello stabilimento produttore. 2. Nome del reattivo, quale risulta dal titolo delle specificazioni corrispondenti. 3. Volume o, se il reattivo è essiccato, volume e composizione del liquido necessario per la sua ricostituzione. 4. Data dell'ultimo controllo di attività. 5. Data di scadenza (se del caso). 6. Numero della partita. 7. Descrizione appropriata delle modalità d'impiego raccomandate dal produttore. 8. Condizioni di magazzinaggio delle ampolle non ancora aperte e precauzioni da prendere dopo la loro apertura. 9. Composizione esatta, compreso (eventualmente) l'antisettico e/o l'antibiotico. 10. Indicazione della presenza o meno di qualsiasi prodotto di origine umana. Ogni spedizione deve essere accompagnata da un certificato, in conformità delle disposizioni dell'articolo 4 dell'accordo e dell'allegato del presente protocollo. Modelli di etichetta e di avvertenza sono allegati al presente protocollo. DISPOSIZIONI PARTICOLARI A. REATTIVI DI ORIGINE UMANA PER LA DETERMINAZIONE DEI GRUPPI SANGUIGNI a) SIERI PER LA CLASSIFICAZIONE DEL SANGUE AB0 DI ORIGINE UMANA i) Siero anti-A per la classificazione del sangue (umano) Il siero anti-A è ricavato dal sangue di persone del gruppo B selezionate, immunizzate o non dai globuli rossi del gruppo A o dalle sostanze specifiche del gruppo A. Il siero anti-A agglutina i globuli rossi umani contenenti gli antigeni A, ovvero quelli dei gruppi A e AB, compresi i sottogruppi A1, A2, A1B e A2B, e non agglutina i globuli rossi umani privi degli antigeni A, ovvero quelli dei gruppi 0 e B. Potenza Titolazione Un siero anti-A deve essere titolato separatamente su globuli A1, A2 e A2B in sospensione, parallelamente alla preparazione standard internazionale ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-A o ad una preparazione equivalente di riferimento. La potenza del siero non deve, in alcun caso, essere inferiore a 64 unità internazionali/ml. Determinazione dell'avidità Dopo aver miscelato, sul vetrino, siero anti-A ed un eguale volume di globuli A1, A2 e A2B in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,05-0,1 - l'agglutinazione di ogni sospensione deve prodursi prima del doppio del tempo necessario per l'agglutinazione utilizzando, nelle medesime condizioni, la preparazione standard internazionale (ricostituita, ma non diluita) di siero per la classificazione del sangue anti-A o una preparazione standard della stessa avidità. ii) Siero anti-B per la classificazione del sangue (umano) Il siero anti-B è ricavato dal sangue di persone del gruppo A selezionate, immunizzate o non dai globuli rossi del gruppo B dalle sostanze specifiche del gruppo B. Il siero anti-B agglutina i globuli rossi umani contenenti l'antigene B, ovvero quelli dei gruppi B e AB, e non agglutina i globuli rossi umani privi dell'antigene B, ovvero quelli dei gruppi 0 e A. Potenza Titolazione Un siero anti-B deve essere titolato su globuli B in sospensione parallelamente alla preparazione standard internazionale ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-B o ad una preparazione di riferimento equivalente. La potenza del siero non dev'essere inferiore a 64 unità internazionali/ml. Determinazione dell'avidità Dopo aver miscelato, sul vetrino, siero anti-B ed un volume eguale di globuli B in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,05 - 0,1 - l'agglutinazione deve prodursi prima del doppio del tempo necessario per l'agglutinazione, utilizzando nelle medesime condizioni, la preparazione standard internazionale (ricostituita, ma non diluita) di siero per la classificazione del sangue anti-B o una preparazione standard della stessa avidità. iii) Siero anti-A + anti-B (gruppo 0) per la classificazione del sangue (umano) Il siero anti-A + anti-B (gruppo 0) è ricavato dal sangue di persone del gruppo 0 selezionate, immunizzate o non dai globuli rossi A e B o dalle sostanze specifiche dei gruppi A e B. Il siero anti-A + anti-B (gruppo 0) agglutina i globuli rossi umani contenenti gli agglutinogeni A o B, o gli agglutinogeni A e B, ovvero quelli del gruppo A, compresi i sottogruppi A1 e A2, quelli del gruppo B e quelli del gruppo AB, compresi i sottogruppi A1B e A2B e non agglutina i globuli rossi umani privi degli agglutinogeni A o B, ovvero quelli del gruppo 0. Esso agglutina i globuli rossi umani contenenti l'antigene Ax (Ay o Ao) (che non vengono, in genere, agglutinati dal siero anti-A ricavato dal sangue di donatori del gruppo B). Potenza Titolazione Un siero anti-A + anti-B (gruppo 0) deve essere titolato separamente su globuli A1 e A2 in sospensione del sangue anti-A ricostituita, ma non diluita, o ad una preparazione equivalente di riferimento. Esso deve essere titolato anche su globuli B in sospensione parallelamente alla preparazione standard internazionale di siero per la classificazione del sangue anti-B ricostituita, ma non diluita, o ad una preparazione di riferimento equivalente. La potenza del siero non deve, in alcun caso, essere inferiore a 64 unità internazionali/ml. Il siero anti-A + anti-B (gruppo 0) per la classificazione del sangue, non diluito, deve produrre anche un'agglutinazione facilmente rilevabile dei globuli del gruppo Ax (Ay o Ao). Determinazione dell'avidità Dopo aver miscelato, sul vetrino, siero anti-A + anti-B (gruppo 0) ed un volume eguale di globuli A1 e A2 in sospensione - frazione volumetrica pari 0,05-0,1 - l'agglutinazione di ciascuna sospensione deve prodursi prima del doppio del tempo necessario per l'agglutinazione utilizzando, nelle stesse condizioni, la preparazione standard internazionale, ricostituita ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-A o una preparazione standard della stessa avidità. Dopo aver miscelato, sul vetrino, siero anti-A + anti-B (gruppo 0) con un volume eguale di globuli B in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,05-0,1 - l'agglutinazione deve prodursi prima del doppio del tempo necessario per l'agglutinazione utilizzando, nelle medesime condizioni, la preparazione standard internazionale ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-B o una preparazione standard della stessa avidità. Quando un siero anti-A + anti-B (gruppo 0) viene miscelato, sul vetrino, con un volume eguale di globuli Ax (Ay o Ao) in sospensione - frazione volumetrica pari 0,05- 0,1 - l'agglutinazione deve prodursi in meno di 5 minuti ad una temperatura compresa tra 18 e 25 °C. b) SIERI PER LA CLASSIFICAZIONE DEL SANGUE RH DI ORIGINE UMANA A prescindere dalla loro specificità, i sieri per la classificazione del sangue Rh possono essere di due varietà, a seconda delle condizioni in cui viene effettuata l'agglutinazione dei globuli omologhi. Taluni sieri, detti «completi», agglutinano i globuli in ambiente salino. Altri, detti «incompleti», sono capaci di provocare soltanto un'agglutinazione in presenza di taluni colloidi, ad esempio l'albumina bovina, o con altre tecniche appropriate. I sieri devono essere utilizzati nelle condizioni stabilite dal laboratorio che li prepara. Taluni sieri «incompleti» agglutinano anche, sul vetrino, i globuli rossi omologhi in sospensione nel proprio siero o plasma. Le condizioni sottoindicate, relative alla potenza dei sieri per la classificazione Rh potranno essere rivedute una volta disponibili le preparazioni standard internazionali. i) Siero anti-D (anti-Rho) per la classificazione del sangue (di origine umana) Il siero anti-D è ricavato dal sangue di una o più persone immunizzate dall'antigene D del sistema Rh. Esso reagisce in presenza di sospensioni di globuli rossi umani contenenti l'antigene D, ma non in presenza di globuli rossi umani privi dell'antigene D. Potenza Titolazione I sieri anti-D «completi» non devono avere una titolazione inferiore a 32 sui globuli CcDee in sospensione in ambiente salino (9 g di NaCl/1). I sieri anti-D «incompleti» devono essere titolati sui globuli CcDee parallelamente alla preparazione standard internazionale di anti-D (anti-Rho) incompleto ricostituita, ma non diluita, o ad una preparazione di riferimento equivalente. La potenza del siero non deve, in alcun caso, essere inferiore a 32 unità internazionali/ml. I sieri devono reagire a tutti i globuli contenenti l'antigene D e, inoltre, per quanto possibile, ai globuli contenenti l'antigene Du. Determinazione dell'avidità I sieri anti-D destinati ad essere impiegati nel test su vetrino di Diamond e Abelson, dopo essere stati miscelati sul vetrino ad un egual volume di globuli CcDee in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,4-0,5 - dovrebbero produrre a circa 40 °C, un'agglutinazione in meno di 30 secondi ; l'agglutinazione dovrebbe risultare completa in meno di 120 secondi. ii) Siero anti-C (anti-Rh') per la classificazione del sangue (di origine umana) Il siero anti-C è ricavato dal sangue di una o più persone immunizzate dall'antigene C del sistema Rh. Esso reagisce in presenza di globuli rossi umani in sospensione contenenti l'antigene C, ma non in presenza di globuli rossi umani privi dell'antigene C. Si ritiene che l'antigene C comprenda l'antigene Cw. La maggior parte dei sieri anti-C per usi diagnostici contiene un anticorpo anti-C «completo» nonché un anticorpo anti-D «incompleto». Questi sieri sono dunque specifici per l'antigene C unicamente se i globuli rossi da sperimentare sono in sospensione in una soluzione di 9 g di NaCl/l. Potenza Titolazione I sieri anti-C («completi» o «incompleti») non dovrebbero avere una titolazione inferiore ad 8 su globuli Ccddee. Determinazione dell'avidità I sieri anti-C destinati ad essere impiegati nel test su vetrino di Diamond e Abelson (e che non devono contenere alcuna forma di anti-D), dopo essere stati miscelati sul vetrino ad un egual volume di globuli Ccddee in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,4-0,5 - dovrebbero produrre a circa 40 °C un'agglutinazione visibile in meno di 30 secondi ; l'agglutinazione dovrebbe risultare completa in meno di 120 secondi. iii) Siero anti-E (anti-Rh") per la classificazione del sangue (di origine umana) Il siero anti-E è ricavato dal sangue di una o più persone immunizzate dall'antigene E del sistema Rh. Esso reagisce in presenza di globuli rossi umani in sospensione contenenti l'antigene E, ma non in presenza di globuli rossi umani privi dell'antigene E. Potenza Titolazione I sieri anti-E («completi» o «incompleti») non dovrebbero avere una titolazione inferiore a 8 su globuli CcdEe. Determinazione dell'avidità I sieri anti-E destinati ad essere utilizzati nel test su vetrino di Diamond e Abelson (e che non devono contenere alcuna forma di anti-D), dopo essere stati miscelati sul vetrino ad un egual volume di globuli ccddEe in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,4-0,5 - dovrebbero produrre a circa 40 °C un'agglutinazione visibile in meno di 30 secondi ; l'agglutinazione dovrebbe risultare completa in meno di 120 secondi. iv) Siero anti-D + C (anti-Rhorh') per la classificazione del sangue (di origine umana) Siero anti-D + E (anti-Rhorh") per la classificazione del sangue (di origine umana) Sieri di specificità anti-D + C o anti-D + E possono essere ricavati direttamente dal sangue di persone immunizzate o possono essere preparati miscelando un siero anti-D con un siero anti-C o anti-E. In un dato siero i due anticorpi devono essere attivi simultaneamente nelle condizioni di reazione specificate dal fabbricante. Ogni siero deve reagire a tutti i tipi di globuli rossi che reagirebbero con l'uno o l'altro degli anticorpi che li compongono e non deve reagire ai globuli rossi privi dell'agglutinogeno C o dell'agglutinogeno D e privi dell'antigene D nel caso dell'anti-D + E. Le titolazioni non dovrebbero essere inferiori a quelle prescritte per gli anticorpi che li compongono, ma nel caso dell'anti-D + C (combinazione frequente nel siero delle persone immunizzate) è auspicabile che la titolazione dell'anti-C non sia inferiore a 32 e nel caso dell'anti-D + E che la titolazione dell'anti-E non sia inferiore ad 8. Se un siero è destinato ad essere utilizzato nel test su vetrino di Diamond e Abelson i tempi di agglutinazione per tutti i tipi di globuli rossi suscettibili di reazione non dovrebbero essere inferiori a quelli prescritti per ciascun costituente di anticorpi. B. REATTIVI DI ORIGINE NON UMANA a) SIERI DI ORIGINE ANIMALE i) Reattivo anti-A per la classificazione del sangue (animale) Il siero anti-A è ricavato dal sangue di animali immunizzati e non dai globuli rossi del gruppo A o dalle sostanze specifiche del gruppo A. Il siero anti-A agglutina i globuli rossi umani contenenti gli antigeni A, cioè quelli dei gruppi A e AB, compresi i sottogruppi A1, A2, A1B e A2B, e non agglutina i globuli rossi umani privi degli antigeni A, cioè quelli dei gruppi O e B. Potenza Titolazione Un siero anti-A deve essere titolato separatamente su sospensioni di globuli A1, A2 e A2B, parallelamente alla preparazione standard internazionale, ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-A, o ad una preparazione di riferimento equivalente (1). La potenza del siero non deve, in alcun caso, essere inferiore a 64 unità internazionali/ml. Determinazione dell'avidità Dopo aver miscelato, sul vetrino, siero anti-A con un volume eguale di globuli A1, A2 e A2B in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,05-0,1 - l'agglutinazione di ciascuna sospensione deve prodursi prima del doppio del tempo necessario per l'agglutinazione utilizzando, nelle medesime condizioni, la preparazione standard internazionale ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-A o una preparazione standard della stessa avidità. ii) Siero anti-B per la classificazione del sangue (animale) Il siero anti-B è ricavato dal sangue di animali immunizzati o non dai globuli rossi del gruppo B o dalle sostanze specifiche del gruppo B. Il siero anti-B agglutina i globuli rossi umani contenenti l'antigene B, ovvero quelli dei gruppi B e AB, e non agglutina i globuli rossi umani privi dell'antigene B, ovvero quelli dei gruppi O e A. Potenza Titolazione Un siero anti-B deve essere titolato su una sospensione di globuli B parallelamente alla preparazione standard internazionale, ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-B o ad una preparazione equivalente di riferimento (1). La potenza del siero non deve essere inferiore a 64 unità internazionali/ml. Determinazione dell'avidità Dopo aver miscelato, sul vetrino, siero anti-B con un volume eguale di globuli B in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,5-0,1 - l'agglutinazione deve prodursi prima del doppio del tempo necessario per l'agglutinazione utilizzando, nelle stesse condizioni, la preparazione standard internazionale ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-B o una preparazione standard della stessa avidità. iii) Siero anti-globuline umane (animale) (2) Il siero anti-globuline di origine umana da utilizzare nella sierologia dei gruppi sanguigni deve contenere anticorpi agglutinanti anti-IgG ed anticorpi agglutinanti in presenza di fattori complementari. Esso è ricavato dal sangue di animali immunizzati con iniezione di proteine di siero umano. Esso deve agglutinare tutti i globuli rossi umani rivestiti d'IgG umana e/o di fattori complementari. Impiegato conformemente alle prescrizioni del fabbricante non agglutina i globuli rossi umani non rivestiti, qualunque sia il loro gruppo sanguigno. Specificità La specificità di un siero anti-globuline umane da utilizzare nella sierologia dei gruppi sanguigni deve essere controllata con globuli rossi umani sensibilizzati da una varietà di anticorpi : globuli rossi sensibilizzati da anticorpi umani incompleti anti-D, anti-K e anti-Fya, globuli rossi sensibilizzati da anticorpi incompleti che fissano il complemento anti-Lea in presenza di siero umano fresco, globuli rossi sensibilizzati da anticorpi incompleti del (1) La «preparazione standard internazionale» è di origine umana ; la preparazione standard equivalente da impiegarsi, se del caso, potrà essere sia di origine umana, sia di origine animale. (2)Coombs, R.R.A. ; Mourant, A.E. e Race, R.R. (1945) ; Lancet, ii, 15. Coombs, R.R.A. ; Mourant, A.E. e Race, R.R. (1945) ; Brit. J. exp. Path., 26, 255. tipo freddo, globuli rossi «tannati» rivestiti d'IgG umana ed, infine, 10 campioni differenti di globuli rossi umani non rivestiti, contenenti gli antigeni A e B, privi, rispettivamente, degli antigeni A e B. Potenza Titolazione Un siero anti-globuline umane nello stato in cui viene fornito o dopo diluizione secondo le indicazioni figuranti sull'etichetta, deve agglutinare fortemente i globuli rossi umani sensibilizzati da anticorpi incompleti anti-D di origine umana, la cui titolazione è pari a 4 (o inferiore), se viene titolato su globuli rossi D positivi con il metodo «Albumin-Replacement». Alla stessa diluizione deve agglutinare i globuli rossi umani K positivi sensibilizzati da anticorpi anti-K deboli selezionati e i globuli rossi Fya positivi sensibilizzati da anticorpi anti-Fya deboli, appositamente selezionati. Alla stessa diluizione o ad una diluizione differente (specificata, se del caso, sull'etichetta) esso deve agglutinare anche i globuli rossi umani sensibilizzati da anticorpi incompleti che fissano il complemento anti-Lea in presenza di siero umano fresco. Per gli usi clinici consueti è auspicabile che la sensibilizzazione provocata da tutti i tipi di anticorpi incompleti sopramenzionati sia rilevabile con una sola diluizione di siero anti-glubuline umane. b) REATTIVI DI ORIGINE VEGETALE i) Reattivo anti-A per la classificazione del sangue (di origine vegetale) Il reattivo anti-A è ricavato dai semi o da qualsiasi altra parte di pianta adatta e successivamente sottoposto, se del caso, ad un processo di purificazione. Il reattivo anti-A agglutina i globuli rossi umani contenenti gli antigeni A, cioè quelli dei gruppi A e AB, compresi i sottogruppi A1, A2, A1B e A2B, e non agglutina i globuli rossi umani privi degli antigeni A, cioè quelli dei gruppi 0 e B. Potenza Titolazione Un reattivo anti-A deve essere titolato separatamente su globuli A1, A2, e A2B in sospensione parallelamente alla preparazione standard internazionale ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-A, o ad una preparazione di riferimento equivalente (1). La potenza del reattivo non deve, in alcun caso, essere inferiore a 64 unità internazionali/ml. Determinazione dell'avidità Dopo aver miscelato, sul vetrino, un reattivo anti-A con un volume eguale di globuli A1, A2 e A2B in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,05-0,1 - l'agglutinazione di ciascuna sospensione deve prodursi prima del doppio del tempo necessario per l'agglutinazione utilizzando, nelle stesse condizioni, la preparazione standard internazionale ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-A o una preparazione standard della stessa avidità. ii) Reattivo anti-B per la classificazione del sangue (di origine vegetale) Il reattivo anti-B è ricavato dalla parte più consona di una pianta adatta a quest'uso e successivamente sottoposto, se del caso, ad un processo di purificazione. Il reattivo anti-B agglutina i globuli rossi umani contenenti l'antigene B, ovvero quelli dei gruppi B e AB, e non agglutina i globuli rossi umani privi dell'antigene B, ovvero quelli dei gruppi 0 e A. Potenza Titolazione Un reattivo anti-B deve essere titolato su una sospensione di globuli B parallelamente alla preparazione standard internazionale ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-B o ad una preparazione di riferimento equivalente (1). La potenza del reattivo non dev'essere inferiore a 64 unità internazionali/ml. Determinazione dell'avidità Dopo aver miscelato, sul vetrino, un reattivo anti-B con un volume eguale di globuli B in sospensione - frazione volumetrica pari a 0,05-0,1 - l'agglutinazione deve prodursi prima del doppio del tempo necessario per l'agglutinazione utilizzando, nelle medesime condizioni, la preparazione standard internazionale ricostituita, ma non diluita, di siero per la classificazione del sangue anti-B o una preparazione standard della stessa avidità. (1) La «preparazione standard internazionale» è di origine umana ; la preparazione standard equivalente da impiegarsi, se del caso potrà, essere sia di origine umana, sia di origine animale. MODELLI D'ETICHETTA CONSIGLIO D'EUROPA ACCORDO EUROPEO PER LO SCAMBIO DEI REATTIVI PER LA DETERMINAZIONE DEI GRUPPI SANGUIGNI >PIC FILE= "T0045096"> MODELLO DI AVVERTENZA CONSIGLIO D'EUROPA ACCORDO EUROPEO PER LO SCAMBIO DEI REATTIVI PER LA DETERMINAZIONE DEI GRUPPI SANGUIGNI 1. Laboratorio centrale di trasfusione sanguigna, 1 Main Street, Metropolis, Westland 2. Siero anti-E («anti-rh») (umano) 3. 10 ml 4. Data dell'ultimo controllo di attività : 30 maggio 1961 5. Data di scadenza : 30 maggio 1962 6. N. 5432 7. Lavare i globuli rossi da esaminare una o più volte con una soluzione di sale alla concentrazione di 9 g/l. Prepare, poi, una sospensione di globuli rossi - frazione volumetrica pari a ± 0,03 - miscelando un volume o una goccia di sedimento globulare con 30 volumi o gocce della soluzione salina isotonica. Con un pò di esperienza la concentrazione di una sospensione può essere valutata in modo soddisfacente ad occhio nudo. Deporre una gocciolina di siero in una provetta per emolisi (6 mm x 30 mm) con l'ausilio di una pipetta Pasteur. Aggiungervi una gocciolina della sospensione di globuli rossi. (Con un pò di esperienza si possono fare dei notevoli risparmi distribuendo il siero e la sospensione globulare con l'ausilio di pipette graduate a ¶l). Miscelare il contenuto della provetta e metterlo ad incubare per 2 ore a 37 °C. Prelevare il contenuto della provetta e spanderlo accuratamente sul portaoggetti del microscopio. Se l'agglutinazione non è chiaramente visibile ad occhio nudo, controllare al microscopio se si è prodotta e determinarne l'intensità. 8. Conservare ad una temperatura inferiore o pari a -20 °C. Se il prodotto non viene utilizzato lo stesso giorno dell'apertura, aggiungere 0,1 ml di N3Na in soluzione alla concentrazione di 100 g/l. 9. - Siero umano anti-E («anti-rh») : 5 ml - Albumina bovina alla concentrazione di 300 g/l : 5 ml 10. Questo reattivo contiene una sostanza di origine umana. ALLEGATO DEL PROTOCOLLO CONSIGLIO D'EUROPA ACCORDO EUROPEO PER LO SCAMBIO DELLE SOSTANZE TERAPEUTICHE DI ORIGINE UMANA >PIC FILE= "T0045097">